(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｄ）；
（ａ）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号１で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
のいずれかに記載の第１の３’ＤＮＡと、
前記第１の３’ＤＮＡの３’末端に連結される前記植物体で作動可能なターミネーター領域を有する第２のＤＮＡと、
を含む、植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進するための目的タンパク質発現促進剤。
【請求項２】
前記ターミネーター領域は、Ｎｏｓターミネーターである、請求項１に記載の目的タンパク質発現促進剤。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の前記第１の３’ＤＮＡ及び前記第２の３’ＤＮＡを含む、発現カセット。
【請求項４】
前記第１の３’ＤＮＡの上流側に目的タンパク質をコードするＤＮＡの挿入部位を備える、請求項３に記載の発現カセット。
【請求項５】
さらに、以下のいずれかに記載の第３のＤＮＡを含む、請求項３又は４に記載の発現カセット。
（ａ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【請求項６】
請求項３〜５のいずれかに記載の発現カセットを備えるベクター。
【請求項７】
請求項１又は２に記載のタンパク質発現促進剤を、外来性の目的タンパク質をコードするＤＮＡの下流に保持する形質転換植物細胞。
【請求項８】
前記種子における１種又は２種以上の内在性タンパク質の発現が抑制されている、請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
前記内在性タンパク質は、１２Ｓ１グロブリン遺伝子及び１２Ｓ４グロブリン遺伝子からなる群から選択される１種又は２種である、請求項８に記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
請求項７〜９のいずれかに記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
【請求項１１】
前記外来性の目的タンパク質発現増大機能が付与された請求項１０に記載の形質転換植物体。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
【請求項１３】
シロイヌナズナである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の形質転換植物体。
【請求項１４】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
【請求項１５】
請求項１０〜１３のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、
請求項６に記載のベクターであって外来性の目的タンパク質のコードするＤＮＡを含むベクターを植物細胞に導入して請求項７〜９のいずれかに記載の形質転換細胞を取得し当該形質転換細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、植物体の生産方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、植物体種子の生産方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１３のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、前記目的タンパク質の生産方法。
【請求項１９】
植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進させるためのＤＮＡ材料のスクリーニング方法であって、
前記種子において発現するタンパク質の１又は２以上の３’−ＵＴＲ領域を前記ＤＮＡ材料の候補として、
任意のプロモーターの制御下で評価用タンパク質をコードするＤＮＡの下流に前記候補及びさらに３’側に前記植物体において作動可能なターミネーターを連結させたＤＮＡを保持する形質転換細胞から植物体を再生し、
前記植物体から収穫した種子における前記評価用タンパク質の発現量を評価する工程と、
を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年４月１０日に出願された特願2013-82247に基づく優先権を主張するものであり、この日本出願に記載された全ての内容を援用するものである。
本明細書は、植物体の種子において目的タンパク質の発現や蓄積を促進させることができるＤＮＡ材料及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物体を利用してタンパク質を生産することは多くの利点がある。動物トランスジェニックによる場合に比較したコストの低減、生産規模調節の容易性、動物由来の病原体の混入の回避等が挙げられる。【０００３】
植物体の種子においてタンパク質の発現を促進させる技術については種々試みられている。例えば、所望のタンパク質と窒素トランスポーターの同時発現や種子特異的なプロモーターの利用が報告されている（特許文献１、２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１２−２４０５２号公報
【特許文献２】特開２０１２−１３９２３８号公報
【発明の概要】
【０００５】
本明細書は、植物体の種子における目的タンパク質の発現の増大に寄与するＤＮＡ材料を新たに見出したので、これらの利用を開示する。
【０００６】
本発明者らは、シロイヌナズナの種子のタンパク質組成について検討していたところ、種子におけるタンパク質含有量は２５〜３５質量％であり、そのうち、１２Ｓ１α、β；１２Ｓ３α、β；１２Ｓ４α、βの１２Ｓグロブリンと２Ｓ３アルブミンで全体の９０％を占めているという知見を得た。さらに、検討を進めてタンパク質が由来するｍＲＮＡ量を測定したところ、タンパク質組成とは相関していないという知見を得た。そこで、含有量の高い１２Ｓ１タンパク質のｍＲＮＡ上の５’−ＵＴＲ領域、コード領域及び３’−ＵＴＲ領域の各領域について発現量、すなわち、翻訳量への影響を評価した。その結果、３’−ＵＴＲ領域がそのｍＲＮＡの翻訳効率に大きく寄与しているという知見を得た。本明細書の開示によれば、これらの知見に基づき、以下の手段が提供される。
【０００７】
（１）植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡ。
（ａ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（２）前記ＤＮＡは、以下のいずれかである、（１）に記載のＤＮＡ。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ１）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ１）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ２）配列番号で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（３）植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進する、下記（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載のＤＮＡを含む目的タンパク質発現促進剤。
（ａ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（４）前記ＤＮＡは、以下のいずれかである、（３）に記載の目的タンパク質発現促進剤。
（ａ１）配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ１）配列番号１で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ１）配列番号１で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ１）配列番号で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（５）（１）又は（２）に記載のＤＮＡを含む、発現カセット。
（６）前記ＤＮＡの上流側に目的タンパク質をコードするＤＮＡの挿入部位を備える、（５）に記載の発現カセット。
（７）さらに、以下のいずれかに記載のＤＮＡを含む、（５）又は（６）に記載の発現カセット。
（ａ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
（８）（５）〜（７）のいずれかに記載の発現カセットを備えるベクター。
（９）（１）又は（２）に記載のＤＮＡを、外来性の目的タンパク質をコードするＤＮＡの下流に保持する形質転換植物細胞。
（１０）前記種子における内在性タンパク質の発現が抑制されている、（９）記載の形質転換細胞。
（１１）（９）又は（１０）に記載の形質転換細胞を含む形質転換植物体。
（１２）前記外来性の目的タンパク質発現増大機能が付与された（１１）に記載の形質転換植物体。
（１３）（１１）又は（１２）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
（１４）シロイヌナズナである、（１１）〜（１３）のいずれかに記載の形質転換植物体。
（１５）（１１）〜（１３）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
（１６）（１１）〜（１４）のいずれかに記載の形質転換植物体の製造方法であって、
（８）記載のベクターであって外来性の目的タンパク質のコードするＤＮＡを含むベクターを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
（１７）（１１）〜（１４）のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、植物体の生産方法。
（１８）（１１）〜（１４）のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、植物体種子の生産方法。
（１９）（１１）〜（１４）のいずれかに記載の植物体を栽培する工程を備える、前記目的タンパク質の生産方法。
（２０）植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進させるためのＤＮＡ材料のスクリーニング方法であって、
種子において発現するタンパク質の１又は２以上の３’−ＵＴＲ領域を前記ＤＮＡ材料の候補として、種子で作動可能なプロモーターの制御下でレポータータンパク質をコードするＤＮＡの下流に前記候補を連結させたＤＮＡを保持する形質転換細胞から植物体を再生する工程と、
前記植物体から収穫した種子における前記レポータータンパク質の発現量を評価する工程と、を備える方法。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】シロイヌナズナ種子中のタンパク質含有量とｍＲＮＡ量とを示す図である。を示す図である。
【図２】１２Ｓ１遺伝子、１２Ｓ２遺伝子、１２Ｓ３遺伝子及び１２Ｓ４遺伝子の各遺伝子破壊株におけるＴ−ＤＮＡの挿入部位を示す図である。
【図３】シロイヌナズナ種子のグロブリン遺伝子の単一ノックアウト株（１２ｓ１株、１２ｓ２株、１２ｓ３株及び１２ｓ４株）における各種グロブリンタンパク質の発現状態を示す図である。
【図４】シロイヌナズナ種子のグロブリン遺伝子のダブルノックアウト株（１２ｓ１．３株及び１２ｓ１．４株）における各種グロブリンタンパク質の発現状態を示す図である。
【図５】１２Ｓ１ｍＲＮＡ構造と、１２ｓ１破壊株に導入したコード領域を含むＤＮＡコンストラクトの構造を示す図である。
【図６】コンストラクトを作製するために用いたプライマーを示す図である。
【図７】実施例３で作製した各種形質転換植物体から得た種子におけるグロブリンタンパク質の発現状態を示す図である。
【図８】実施例４で用いた導入コンストラクトを示す図である。
【図９】導入コンストラクトを作製するために用いたプライマーを示す図である。
【図１０】シロイヌナズナ種子のＩＣＬ、１２Ｓ３、１２Ｓ４及び２Ｓ３遺伝子の３’ＵＴＲのコード領域についての種子発現／蓄積促進効果について評価した結果を示す図である。
【図１１】シロイヌナズナ種子におけるpMDH1遺伝子の発現に対する１２Ｓ１遺伝子の３’ＵＴＲの効果の評価のためのＤＮＡコンストラクトを示す図である。
【図１２】導入コンストラクトを作製するために用いたプライマーを示す図である。
【図１３】シロイヌナズナ種子におけるpMDH1遺伝子の発現に対する１２Ｓ１遺伝子の３’ＵＴＲの効果の評価結果を示す図である。
【図１４】シロイヌナズナ種子において１２Ｓ１ ３’ＵＴＲで発現させたpMDH1の活性の評価結果を示す図である。
【図１５】シロイヌナズナ種子で発現させたpMDH1と市販のブタ由来のMDHとの活性の比較結果を示す図である。
【図１６】シロイヌナズナ種子の常温での貯蔵期間における活性の変化を示す図である。
【図１７】シロイヌナズナ種子に鉄貯蔵タンパク質Fer2の発現に対する３’ＵＴＲの効果を評価するためのＤＮＡコンストラクトを示す図である。
【図１８】導入コンストラクトを作製するために用いたプライマーを示す図である。
【図１９】シロイヌナズナ種子に鉄貯蔵タンパク質Fer2の発現に対する３’ＵＴＲの効果の評価結果を示す図である。
【図２０】シロイヌナズナ種子におけるヒトインターフェロンの発現を評価するためのＤＮＡコンストラクトを示す図である。
【図２１】シロイヌナズナ種子におけるヒトインターフェロンの発現の評価結果を示す図である。
【図２２】シロイヌナズナ種子における１２Ｓ１グロブリン遺伝子と１２Ｓ４グロブリン遺伝子の破壊とヒトインターフェロンの発現の評価結果を示す図である。
【図２３】実施例５で取得した種子におけるpMDH1タンパク質の細胞内局在性を確認した電子顕微鏡写真を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本明細書の開示は、植物体の種子における目的タンパク質の発現の促進に関するＤＮＡ材料及びその利用に関連する。本明細書の開示は、本発明者らが植物体の種子における目的タンパク質の発現促進に関する３’−ＵＴＲを新たに見出したことに基づいている。
【００１０】
本明細書の開示によれば、植物体の種子において目的タンパク質を意図的に発現させ、好ましくは主要なタンパク質として発現し蓄積させることができる。また、このため、収穫した種子からの目的タンパク質の精製が可能となり、好ましくは精製が容易である。さらに、植物体を用いた発現系は、動物系よりも生産コストの低減やスケールアップ等の生産量調節においてメリットが大きい。さらに、種子は、本来的にその成分の長期の保存ないし貯蔵を意図しているため、発現／蓄積させたタンパク質の活性を保持させた状態で安定的に保存するのに適している。特に、種子は、過酷な状況において、植物の発芽や生育のためのタンパク質や他の成分の活性を維持することを意図しているため、目的タンパク質は種子の形態で容易に保存することができる。
【００１１】
また、本明細書の開示によれば、種子におけるタンパク質組成を変更することができるため、新たな植物品種の育種や改良にも有用である。
【００１２】
さらに、本明細書の開示によれば、動物等において栄養上、疾患など健康障害の予防又は治療上有用なタンパク質を大量発現させた種子を供給できるようになる。すなわち、種子を食糧あるいは医薬品原料等として供給できるようになる。さらにまた、本明細書の開示によれば、風味や栄養素（アミノ酸のスコア）が改善された種子を提供できるようになる。
【００１３】
さらに、本明細書の開示によれば、有用なタンパク質をその本来の生理活性を維持したまま、その本来の細胞内局在性を維持して種子において発現させ蓄積させることができる。有用タンパク質の本来に近い形で維持して蓄積できることから、有用タンパク質を生産し蓄積させるのに好適な種子となっている。
【００１４】
本明細書において、「植物体」とは、特に制限はなく、単子葉植物であってもよく、双子葉植物であってもよい。単子葉植物としては、例えばイネ、コムギ、オオムギ、ハトムギ、エンバク、トウモロコシ、ソルガム、イタリアンライグラス、ペレニアルライグラス、チモシー、メドーフェスク、ヒエ、キビ、アワ、サトウキビ等のイネ科植物が挙げられる。また、本明細書における単子葉植物として、より好ましくは、イネを挙げることができる。また、コムギ、オオムギも好ましい。さらに、ソルガム、トウモロコシも好ましい。また、双子葉植物としては、シロイヌナズナ、ナタネ等のアブラナ科植物、エゴマ、ラベンダー等のシソ科植物、ゴマ等のゴマ科植物、ヒマワリ、ベニハナ等のキク科植物、アマなどのアマ科植物、ケナフ、ワタ、カカオ（アオギリ科に分類されることもある。）等のアオイ科植物、カボチャ等のウリ科植物、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、ライマメ、エンドウ、ベニハナインゲン、ソラマメ、ササゲ、ヒヨコマメ、リョクトウ、レンズマメ、イナゴマメ、クラスタマメ、ナタマメ、キマメ、ラッカセイ等のマメ科植物、アーモンド等のバラ科植物、カシューやピスタチオなどのウルシ科植物、ヘーゼル等のカバノキ科植物、マカダミア等のヤマモガシ科植物、クリ等のブナ科植物等が挙げられる。ダイズ、クローバーなどのマメ科植物、ナタネなどのアブラナ科植物も挙げられる。また、ポプラなどのヤナギ科植物も挙げられる。スパイクモスなどのイワヒバ科植物も挙げられる。本明細書においては、好ましくはシロイヌナズナが挙げられる。
【００１５】
本明細書において「種子」とは、植物体の種子のほか、果実、頴花を含んでいる。
【００１６】
本明細書において「目的タンパク質」とは、特に由来や機能が限定されるものではない。単子葉植物及び双子葉植物を含む植物、ヒトを含む動物のほか、微生物、ウイルスなどのいずれかの生物に由来するものであってもよい。また、生物由来のタンパク質を改変し、あるいは部分的に利用し、あるいは完全に人工的に創製された人工タンパク質であってもよい。また、目的タンパク質は、植物体に本来的に内在しない外来性のものであってもよいし、植物体に内在するが意図的に種子において発現促進させるものであってもよい。
【００１７】
以下、本開示の代表的かつ非限定的な実施形態について、適宜図面を参照して詳細に説明する。この詳細な説明は、本発明の好ましい例を実施するための詳細を当業者に示すことを単純に意図しており、本開示の範囲を限定することを意図したものではない。また、以下に開示される追加的な特徴ならびに発明は、さらに改善された「植物体の種子における目的タンパク質の発現」を提供するために、他の特徴や発明とは別に、又は共に用いることができる。
【００１８】
また、以下の詳細な説明で開示される特徴や工程の組み合わせは、最も広い意味において本開示を実施する際に必須のものではなく、特に本開示の代表的な具体例を説明するためにのみ記載されるものである。さらに、上記及び下記の代表的な具体例の様々な特徴、ならびに、独立及び従属クレームに記載されるものの様々な特徴は、本開示の追加的かつ有用な実施形態を提供するにあたって、ここに記載される具体例のとおりに、あるいは列挙された順番のとおりに組合せなければならないものではない。
【００１９】
本明細書及び／又はクレームに記載された全ての特徴は、実施例及び／又はクレームに記載された特徴の構成とは別に、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、個別に、かつ互いに独立して開示されることを意図するものである。さらに、全ての数値範囲及びグループ又は集団に関する記載は、出願当初の開示ならびにクレームされた特定事項に対する限定として、それらの中間の構成を開示する意図を持ってなされている。
【００２０】
以下、本明細書の開示に関し、種子における目的タンパク質の発現促進に関連するＤＮＡ、種子におけるタンパク質の発現促進剤、発現カセット、ベクター、形質転換細胞、形質転換植物体、その生産方法等に関し順次説明する。
【００２１】
（植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進するＤＮＡ）
植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進するＤＮＡとしては、本発明者らが、シロイヌナズナから見出した以下の塩基配列が挙げられる。
（ａ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
【００２２】
配列番号１で表される塩基配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の１２Ｓ１グロブリンα及びβをコードする１２Ｓ１グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲとして本発明者らが特定している。この塩基配列は、５’側から４０ｂｐの５’ＵＴＲ、１５７５ｂｐのＣＤＳ及び１７９ｂｐの３’ＵＴＲからなる１２Ｓ１遺伝子のｍＲＮＡの３’ＵＴＲである。
【００２３】
配列番号２で表される塩基配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の１２Ｓ３グロブリンα及びβをコードする１２Ｓ３グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲとして本発明者らが特定している。この塩基配列は、５’側から３５ｂｐの５’ＵＴＲ、１３６８ｂｐのＣＤＳ及び２３０ｂｐの３’ＵＴＲからなる１２Ｓ３遺伝子のｍＲＮＡの３’ＵＴＲである。
【００２４】
配列番号３で表される塩基配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の１２Ｓ４グロブリンα及びβをコードする１２Ｓ４グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲとして本発明者らが特定している。この塩基配列は、５’側から４２ｂｐの５’ＵＴＲ、１４１９ｂｐのＣＤＳ及び１９６ｂｐの３’ＵＴＲからなる１２Ｓ４遺伝子のｍＲＮＡの３’ＵＴＲである。
【００２５】
配列番号４で表される塩基配列は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）の２Ｓ３アルブミンをコードする２Ｓ３アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲとして本発明者らが特定している。この塩基配列は、５’側から３５ｂｐの５’ＵＴＲ、４９５ｂｐのＣＤＳ及び２３３ｂｐの３’ＵＴＲからなる２Ｓ３遺伝子のｍＲＮＡの３’ＵＴＲである。
【００２６】
これらのＤＮＡは、３’ＵＴＲとして連結されるタンパク質のコード領域でコードされるタンパク質を種子において発現させることができ、好ましくは、種子においてより優勢的に発現させることができる。
【００２７】
さらに、本明細書の開示によれば、上記以外の他の態様（ｂ）のＤＮＡも包含される。
（ｂ）配列番号１〜４で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ
【００２８】
こうしたＤＮＡであっても、植物体の種子において目的タンパク質の発現促進活性を有していればよい。目的タンパク質の発現促進活性は、例えば、以下の方法で取得できる。すなわち、任意のプロモーターの制御下にレポータータンパク質をコードする遺伝子を保持するとともに当該遺伝子の下流に上記（ｂ）に相当するＤＮＡ、さらにその下流に任意のターミネーターを備える評価用カセットを保持する評価用の形質転換細胞を取得し、当該形質転換細胞から再生した植物体の種子においてレポータータンパク質の発現量を測定する。他方、上記（ｂ）に相当するＤＮＡを保持しない以外は同様の形態のコントロールカセットを保持する形質転換細胞を取得し、当該形質転換細胞から再生した植物体の種子におけるレポータータンパク質の発現量を測定する。コントロールカセットを保持する植物体の種子におけるレポータータンパク質の発現量と評価用カセットを保持する植物体の種子質の発現量とを比較することで、目的タンパク質の発現促進活性を評価できる。なお、ストリンジェントな条件については後述する。
【００２９】
なお、「植物体の種子において目的タンパク質の発現促進活性を有している」とは、種子において作動可能なプロモーターの制御下において、目的タンパク質又はレポータータンパク質のコード領域及び３’ＵＴＲを有する３’ＵＴＲ保持植物体の種子において、３’ＵＴＲを有しない以外は同一の構成を有する３’ＵＴＲ非保持植物体の種子よりも目的タンパク質又はレポータータンパク質の発現量が多いことをいう。種子において作動可能なプロモーターとしては、例えば、後述する１２Ｓ１遺伝子のプロモーターを利用できる。好ましくは、目的タンパク質又はレポータータンパク質が種子における全タンパク質の３％以上であり、より好ましくは５％以上であり、さらに好ましくは８％以上であり、一層好ましくは１０％以上であり、さらに一層好ましくは１２％以上である。
【００３０】
さらに、本明細書の開示によれば、さらに他の態様（ｃ）のＤＮＡも包含される。
（ｃ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列と９０％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ
【００３１】
こうしたＤＮＡであっても、上記（ｂ）と同様、植物体の種子において目的タンパク質の発現促進活性を有していればよい。配列同一性は、好ましくは９５％以上であり、より好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、一層好ましくは９９％以上である。配列の同一性については、後述する。
【００３２】
さらに、本明細書の開示によれば、さらに他の態様（ｄ）のＤＮＡも包含される。
（ｄ）配列番号１、２、３又は４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００３３】
こうしたＤＮＡであっても、上記（ｂ）と同様、植物体の種子において目的タンパク質の発現促進活性を有していればよい。なお、塩基の置換、欠失、挿入又は付加は、好ましくは、２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、さらに好ましくは１０個以下であり、一層好ましくは５個以下である。
【００３４】
本明細書において塩基配列又はアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、２以上のタンパク質あるいは２以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性 ”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性（配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換）によって決定される。なお、類似性は、後述するＢＬＡＳＴの配列相同性検索結果においてSimilarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、AltschulらによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム（たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschyl SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997))を利用し決定することができる。ＢＬＡＳＴのようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
【００３５】
ストリンジェントな条件とは、たとえば、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、塩基配列の同一性が高い核酸、すなわち、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡ又はその一部の相補鎖がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸の相補鎖がハイブリダイズしない条件が挙げられる。より具体的には、ナトリウム塩濃度が１５〜７５０ｍＭ、好ましくは５０〜７５０ｍＭ、より好ましくは３００〜７５０ｍＭ、温度が２５〜７０℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、ホルムアミド濃度が０〜５０％、好ましくは２０〜５０％、より好ましくは３５〜４５％での条件をいう。さらに、ストリンジェントな条件では、ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件が、通常はナトリウム塩濃度が１５〜６００ｍＭ、好ましくは５０〜６００ｍＭ、より好ましくは３００〜６００ｍＭ、温度が５０〜７０℃、好ましくは５５〜７０℃、より好ましくは６０〜６５℃である。なお、以上のことから、さらなる他の一態様として、所定の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは９８％以上、さらに一層好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列を有する。
【００３６】
本明細書の開示によれば、１２Ｓ１、１２Ｓ３、１２Ｓ４の各グロブリン遺伝子及び２Ｓ３アルブミン遺伝子のうち、好ましくは、１２Ｓ１グロブリン遺伝子及び２Ｓ３遺伝子の３’ＵＴＲ（すなわち、配列番号１及び４で表される塩基配列）を含むＤＮＡを用いる。より好ましくは配列番号１で表される塩基配列を含むＤＮＡを用いる。これらの３’ＵＴＲが種子におけるタンパク質発現促進活性が優れる傾向があるからである。なお、これらのＤＮＡについては、以下に示すように、既に説明した各種態様のＤＮＡも好ましく用いられる。
【００３７】
（ａ）配列番号１又は４で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｂ）配列番号１又４はで表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｃ）配列番号１又は４で表される塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上であり、さらに好ましくは９８％以上であり、一層好ましくは９９％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｄ）配列番号１又は４で表される塩基配列において１又は複数個の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００３８】
（発現カセット）
本明細書に開示される発現カセットは、以上で説明した各種態様のＤＮＡを３’ＵＴＲとして含むことができる。上記各種態様のＤＮＡは、３’ＵＴＲとして連結されるタンパク質のコード領域によってコードされるタンパク質を種子において発現させることができ，好ましくはより優勢に発現させることができる。
【００３９】
発現カセットは、適当なプロモーターを備えることができる。プロモーターとしては、植物体において利用可能な公知の各種プロモーターを採用できる。また、公知の種子特異的プロモーターも利用できる。さらに、発現カセットは、適当なターミネーターを備えることができる。ターミネーターとしては、植物体において利用可能なＮＯＳターミネーター等の各種のターミネーターを用いることができる。
【００４０】
また、発現カセットは、既に説明した３’ＵＴＲとともに、又は３’ＵＴＲを備えることなく、以下のいずれかに記載のＤＮＡを種子においてプロモーター機能を備える限りプロモーターとして含むことができる。これらのプロモーターは、それぞれ、それぞれ種子において目的タンパク質を発現させるのに有利なプロモーターとして利用できる。
【００４１】
（ｅ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列を有するＤＮＡ；
（ｆ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ；
（ｇ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、一層好ましくは９９％以上の同一性の塩基配列を有するＤＮＡ；及び
（ｈ）配列番号５、６、７又は８で表される塩基配列において１又は複数個、好ましくは、２０個以下であり、より好ましくは１５個以下であり、さらに好ましくは１０個以下であり、一層好ましくは５個以下の塩基の置換、欠失、挿入又は付加を有する塩基配列からなるＤＮＡ
【００４２】
配列番号５で表される塩基配列は、シロイヌナズナの１２Ｓ１グロブリン遺伝子のプロモーターとして本発明者らが特定している。配列番号６で表される塩基配列は、１２Ｓ３グロブリン遺伝子のプロモーターとして本発明者らが特定している。配列番号７で表される塩基配列は、シロイヌナズナの１２Ｓ４グロブリン遺伝子のプロモーターとして本発明者らが特定している。配列番号８で表される塩基配列は、シロイヌナズナの２Ｓ３アルブミン遺伝子のプロモーターとして本発明者らが特定している。
【００４３】
これらのプロモーターは、既に説明した同じ遺伝子に由来する３’ＵＴＲの上流側でプロモーターとして機能させるように発現カセットに備えていてもよい。また、これらのプロモーターは、プロモーターが由来する遺伝子とは異なる遺伝子に由来する３’ＵＴＲの上流側でプロモーターとして機能させるように発現カセットに備えられていてもよい。例えば、１２Ｓ１グロブリン遺伝子のプロモーターを、１２Ｓ３グロブリン遺伝子、１２Ｓ４グロブリン遺伝子及び２Ｓ３アルブミン遺伝子の３’ＵＴＲの上流側で機能させるように備えていてもよい。
【００４４】
上記プロモーターのうち、好ましくは１２Ｓ１グロブリン遺伝子及び２Ｓ３アルブミン遺伝子のプロモーター（すなわち、配列番号５及び８で表される塩基配列）を含むＤＮＡを用いる。より好ましくは配列番号５で表される塩基配列を含むＤＮＡを用いる。これらのプロモーターが種子におけるタンパク質発現促進活性が優れる傾向があるからである。なお、これらのＤＮＡについては、上記配列番号で表される塩基配列を有するＤＮＡに関して既に説明した各種態様のＤＮＡも好ましく用いられる。
【００４５】
発現カセットは、上記した各種の発現のための要素を目的タンパク質のコード領域に対して配置できるように、適宜、制限酵素等による組換え部位（クローニング部位）を備えることができる。
【００４６】
本明細書に開示される３’ＵＴＲや発現カセットを用いることにより、目的タンパク質を種子において発現させ、好ましくは優勢に発現させて蓄積させることができる。
【００４７】
目的タンパク質の発現をより促進するには、種子における内在性のタンパク質の発現を抑制しておくことが好ましい。より好ましくは、種子における内在性の主要タンパク質の発現を抑制しておく。例えば、シロイヌナズナにおいて、種子における主要タンパク質をコードする１２Ｓ１、１２Ｓ３，１２Ｓ４及び２Ｓ３の各遺伝子の３’ＵＴＲを用いて目的タンパク質の発現を意図する場合、内在性のこれら遺伝子のいずれかあるいは２以上を破壊し抑制しておくことが好ましい。特に、使用しようとする３’ＵＴＲが由来する内在性の遺伝子を破壊しておくことが好ましい。こうすることで、同種の３’ＵＴＲを備えるｍＲＮＡの競合を抑制でき、より効果的に目的タンパク質を発現、蓄積させることができる。
【００４８】
例えば、シロイヌナズナにおいては、１２Ｓ１遺伝子及び１２Ｓ４遺伝子のいずれかあるいは双方を破壊してこれらの遺伝子の発現を抑制しておくことが好ましい。これらはシロイヌナズナ種子の最も主要なタンパク質であるからである。
【００４９】
植物細胞における特定遺伝子のノックアウトには、Ｔ−ＤＮＡ挿入による方法、アンチセンス法、コサプレッション法及びＲＮＡｉ法等を適宜選択して使用できる。これらの方法は当業者に周知であり、当業者であれば、必要に応じて意図した遺伝子の破壊株を得ることができるほか、商業的に特定遺伝子が破壊された株（細胞や種子等）を入手できる。
【００５０】
以上のことから、本明細書に開示されるベクターと、種子において発現する内在性タンパク質をコードする内在性遺伝子をノックアウトするためのベクターとを、キットとしてもよい。特に、ベクターにおいて使用される３’ＵＴＲが由来する内在性遺伝子をノックアウトするＤＮＡコンストラクトを含むベクターをキット化することが好ましい。
【００５１】
（べクター）
本明細書の開示によれば、上記ＤＮＡやこうした発現カセットを備えるベクターも提供される。本ベクターは、上記ＤＮＡのほか、植物細胞内で本ＤＮＡの発現を増強するための要素を含んだ発現ベクターとすることができる。本ベクターは、適当な媒体を介して染色体に組み込み可能に設けられていることが好ましい。
【００５２】
本ベクターは、当業者であれば、例えば、当業者に公知の各種プラスミドなど商業的に入手可能な材料を利用して構築することができる。例えば、プラスミド「pBI121」、「pBI221」、「pBI101」（いずれもClontech社製）などのほか、形質転換植物体作製のために植物細胞内で本遺伝子を発現させるベクターを用いて構築することができる。本ベクターの植物細胞への導入等については後述する。
【００５３】
（植物体の種子における目的タンパク質の発現促進剤）
本明細書の開示によれば、既に開示した３’ＵＴＲ、プロモーター、発現カセット及びベクターのいずれかを有効成分とする、植物体の種子における目的タンパク質の発現促進剤が提供される。
【００５４】
（形質転換細胞及び形質転換植物体並びにこれらの作製方法）
本明細書の開示によれば、目的タンパク質をコードするコード領域を保持する本ベクターが導入されて得られる形質転換細胞も提供される。本明細書に開示される形質転換植物体は、こうした形質転換細胞を含んでいる。本形質転換植物体は、その種子において目的タンパク質が発現され、好ましくは優勢に発現され蓄積されている。
【００５５】
本ベクターが導入される宿主細胞としての植物細胞としては特に制限はない。例えば、既に記載した各種の単子葉植物及び双子葉植物に由来の植物細胞を用いることができる。また、穀物植物由来の細胞であってもよい。植物細胞としては、懸濁培養細胞等の培養細胞の他、プロトプラスト、カルスも含まれる。また、植物細胞には、苗条原基、多芽体、毛状根などのほか、葉の切片等の植物体中の細胞も含まれる。
【００５６】
本形質転換植物体は、本形質転換細胞から植物体を再生させることにより得ることができる。植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。例えば、ポリエチレングリコールによるプロトプラストへ遺伝子導入（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによるプロトプラストへ遺伝子導入（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）等の各種方法が挙げられる。また、転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネであればFujimuraら（Plant Tissue Culture Lett. 2:74 (1995)）の方法が挙げられ、トウモロコシであればShillitoら（Bio/Technology 7:581 (1989)）の方法やGorden-Kammら（Plant Cell 2:603(1990)）が挙げられ、シロイヌナズナであればAkamaら（Plant Cell Reports12:7-11 (1992)）の方法が挙げられる。
【００５７】
形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Toki et al. (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K. (1995) In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.) pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al. (1991) Bio/technology, 9: 957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al. (1994) Plant J. 6: 271-282.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これらの方法を好適に用いることができる。なお、例えば、シロイヌナズナにおいては、受粉前の花序をアグロバクテリウムバクテリウム液に浸すことでカルス細胞を経由しないで形質転換個体を得ることができる花序浸し法がある（Clough et al.(1998), Plant J. 16:735-43)。
【００５８】
ゲノム上に目的タンパク質のコード領域を含み、本明細書に開示される３’ＵＴＲ等が組み込まれた形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本明細書の開示には、既に説明した（１）植物細胞、（２）該細胞を含む植物体のほか、（３）該植物体の子孫およびクローン、並びに（４）該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
【００５９】
このようにして作出された植物体は、種子における目的タンパク質の発現／蓄積促進機能が付与又は増大されている。
【００６０】
（植物体、その種子、及び目的タンパク質の生産方法）
本明細書に開示される植物体の生産方法は、本形質転換植物体又はその子孫等（以下、本植物体という。）を栽培する工程を備えることができる。本生産方法によれば、種子において目的タンパク質を含有する、好ましくは優勢に含有する植物体を得ることができる。栽培工程は、いずれも、当業者であれば、本植物体の種類に応じて適宜設定することができる。
【００６１】
また、本明細書に開示される植物体の種子の生産方法は、本植物体を栽培する工程を備えることができる。本生産方法によれば、目的タンパク質を発現した、好ましくは優勢に発現し蓄積した種子を得ることができる。本生産方法は、本植物体の種子を収穫する工程備えていてもよい。収穫工程は、いずれも、当業者であれば、本植物体の種類に応じて適宜設定することができる。
【００６２】
また、本明細書に開示される目的タンパク質の生産方法は、本植物体を栽培する工程を備えることができる。さらに、本植物体の種子を収穫する工程を備え、さらに、種子から目的タンパク質を分離する工程を備えていてもよい。目的タンパク質を効率的に得ることができる。種子からの目的タンパク質の分離工程は、当業者であれば、目的タンパク質の種類等に応じて適宜設定することができる。
【００６３】
（スクリーニング方法）
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、植物体の種子において目的タンパク質の発現を促進させるためのＤＮＡ材料のスクリーニング方法である。このスクリーニング方法は、種子において発現するタンパク質の１又は２以上の３’−ＵＴＲ領域を前記ＤＮＡ材料の候補として、種子で作動可能なプロモーターの制御下でレポータータンパク質をコードするＤＮＡの下流に前記候補を連結させたＤＮＡを保持する形質転換細胞から植物体を再生する工程と、前記植物体から収穫した種子における前記レポータータンパク質の発現量を評価する工程と、を備えることができる。好ましくは、種子において優勢に、より好ましくは主要なタンパク質の３’ＵＴＲを候補とする。レポータータンパク質、形質転換細胞、及び形質転換植物体の再生については、当業者であれば既出の記載事項ほか本願出願時の技術常識に基づいて容易に実施できる。
【実施例】
【００６４】
以下、本発明を、実施例を挙げて具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００６５】
本実施例は、シロイヌナズナの種子中のタンパク質とそのmRNA量とを測定した。結果を図１に示す。図１に示すシロイヌナズナ種子中の12S1, 12S3, 12S4, 2S3は主要タンパク質であり、これらでおおよそ全タンパク質の９０％を占めている。一方、ICL（イソクエン酸リアーゼ）, pMDH1（リンゴ酸脱水素酵素１）, LEA1（グアニンヌクレオシド交換因子）は種子に比較的少量、またはほとんど発現／蓄積しないタンパク質である。シロイヌナズナの種子の主要なタンパク質である12S1, 12S3, 12S4, 2S3のmRNA量は発現／蓄積しないタンパク質であるICL, pMDH1, LEA1のmRNA量に大きな違いがないことがわかった。このことから、シロイヌナズナ種子において12S1, 12S3, 12S4, 2S3が独占的に発現／蓄積するためにはそれらのmRNAが優先的に翻訳されてタンパク質となるシステムが想定された。
【実施例２】
【００６６】
本実施例では、シロイヌナズナ種子に主要に発現するタンパク質のうち、12S1, 12S2, 12S3, 12S4の各遺伝子について４種のＴ−ＤＮＡ挿入による単一破壊株をそれぞれに入手した（GK-283D09(NASC)、SALK_010957（ABRC）、SALK_085866（ABRC）、SALK_002668（ABRC））。さらに、12s1破壊株と12s3破壊株を交配して１２Ｓ１及び１２Ｓ３の2重破壊株（１２ｓ１．３）を作製した。また、１２Ｓ１破壊株と１２Ｓ４破壊株を交配して１２Ｓ１及び１２Ｓ４の2重破壊株（１２ｓ１．４）を作製した。なお、使用した各破壊株におけるＴ−ＤＮＡ挿入部位を図２に示す。【００６７】
収穫した種子からタンパク質を常法により抽出し、各種の単一破壊株（１２ｓ１、１２ｓ２、１２ｓ３，１２ｓ４）については１２．５％アクリルアミドゲル電気泳動により、２種類の２重破壊株（１２ｓ１．３、１２ｓ１．４）については１５％アクリルアミドゲル電気泳動にてタンパク質を分離した。結果を図３及び図４に示す。【００６８】
図３及び図４に示すように、単一破壊株の１２ｓ１，１２ｓ３，１２ｓ４及び２重破壊株の１２ｓ１．３、１２ｓ１．４ではそれぞれノックアウトされた遺伝子由来のタンパク質のバンドが消失していた。なお、１２Ｓ２タンパク質は種子で発現しないことから、１２ｓ２破壊株の種子のタンパク質のバンドパターンは野生型（ＷＴ）と同じであった。
【実施例３】
【００６９】
本実施例では、野生型、実施例２で作製した12s１破壊株、当該破壊株にＡ；１２Ｓ１遺伝子のコード領域（配列番号９）のみ、Ｂ；（５’ＵＴＲ（配列番号１０）＋コード領域）、Ｃ：（コード領域＋３’ＵＴＲ）、Ｄ；（５’ＵＴＲ＋コード領域＋３’ＵＴＲ）をそれぞれ１２Ｓ１遺伝子のプロモーター（配列番号５）の作動下に連結するとともにＮＯＳターミネーター（配列番号１１）を付加したコンストラクトを作製しアグロバクテリウム法により導入して得た形質転換植物体を取得した。【００７０】
１２Ｓ１ｍＲＮＡ構造と、破壊株に導入したコード領域を含むＤＮＡコンストラクトの構造を図５に示す。それぞれのコンストラクトに用いるＤＮＡ断片は以下のようにして調製した。【００７１】
シロイヌナズナの開花後9日目の種子より全RNAを抽出し、PCR法により12S1mRNAを取得した。取得した12S1mRNAに対し、5’, 3’UTRをともに含まず12S1CDSのみを含むよう設計されたプライマーセットを用いてPCRを行うことで1CDSを、5’UTRと12S1CDSを含むよう設計されたプライマーセットを用いてPCRを行うことで5’-1CDSを、12S1CDSと3’UTRを含むよう設計されたプライマーセットを用いてPCRを行うことで1CDS-3’を、5’UTR, 12S1CDS, 3’UTRをすべて含むよう設計されたプライマーセットを用いてPCRを行うことで5’-1CDS-3’を得た。さらにこれらを１２ｓ１プロモーター（12S1pro）（配列番号５）およびＮＯＳターミネーター（NOSter）（配列番号１１）を含むプラスミドベクターへ導入した。以上のＰＣＲに用いたプライマーを図６に示す。【００７２】
こうして作製したコンストラクトをアグロバクテリウムに導入した。プラスミドを保持しているアグロバクテリウムをYEB液体培地で培養し、菌体を回収、0.05％のSilwet L-77、0.044 μMのベンジルアミノプリンおよび5％のショ糖と添加したムラシゲ・スクーグ液体培地に懸濁し、600nmにおける吸光度が0.8〜1.2となるよう調整した。この懸濁溶液にシロイヌナズナの花序を30秒ほど浸すことでアグロバクテリウムを感染させた。アグロバクテリウムを感染させた植物体を生育させて種子を収穫し、40μMのハイグロマイシンB、1％ショ糖を含むムラシゲ・スクーグ寒天固形培地に播種した。播種後7日目でハイグロマイシンB耐性を示す個体を選抜した。【００７３】
この形質転換植物体から種子を収穫し、当該種子から常法に従い全タンパク質を抽出し、その１０μｇを、１２．５％のＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動に供した。これらの結果を図７に示す。【００７４】
図７に示すように、導入コンストラクトが３’ＵＴＲを備えるとき（図中、Ｃ及びＤ）のとき、１２Ｓ１タンパク質（α及びβ）が発現されることがわかった。すなわち、１２Ｓ１ｍＲＮＡの翻訳には、１２Ｓ１の３’ＵＴＲが必要であることがわかった。
【実施例４】
【００７５】
本実施例では、シロイヌナズナ種子のＩＣＬ、１２Ｓ３、１２Ｓ４及び２Ｓ３遺伝子の３’ＵＴＲのコード領域（それぞれ配列番号２０、配列番号２，配列番号３及び配列番号４）についての種子発現／蓄積促進効果について評価した。図８に示すように、ICL、12S1, 12S3, 12S4, 2S3の3’UTRを12S1CDSに付加させたものを実施例３と同様に12S1プロモーターの下流に連結したコンストラクトを構築し、実施例３と同様の手法で形質転換体を取得し、その種子を収穫した。以上のＰＣＲに用いたプライマーを図９に示す。【００７６】
これらの種子につき、実施例３と同様にしてタンパク質を抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供した。なお、結果を図１０に示す。【００７７】
図１０に示すように、ICLの3’UTRは12S1タンパク質を種子に発現させる機能がなく、それ以外の12S1, 12S3, 12S4, 2S3の3’UTRは発現させる機能を有することがわかった。以上の結果から、種子に主要なタンパク質として発現しているタンパク質をコードする遺伝子の3’UTR領域にはそのmRNAを優先的にタンパク質に翻訳させ、発現させる機能があることがわかった。
【実施例５】
【００７８】
本実施例では、通常、シロイヌナズナの種子には発現しないペルオキシソーム型リンゴ酸脱水素酵素をコードするpMDH1遺伝子の種子での発現について評価した。【００７９】
まず、図１１に示すように、12S1プロモーター下流にpMDH1遺伝子のコード領域（配列番号３９）を連結したDNAコンストラクト（pMDH1）と、pMDH1遺伝子にシロイヌナズナ12S1遺伝子の3’UTR領域を連結させて12S1プロモーター下流に連結したDNAコンストラクト（pMDH1-3’ ）を作製した。なお、pMDH1遺伝子の最初の32アミノ酸（遺伝子上では先頭の96塩基）はペルオキシソームという細胞内小器官への移行シグナルとして機能し、ペルオキシソーム内で切断されることが分かっている。移行シグナルの影響を排除するため、予め先頭の96塩基を削ったものを作成した（pMDH1(+96)CDS）。これらのコンストラクトを実施例３と同様の方法で12s1.4形質転換細胞に導入し、形質転換植物体を取得した。得られた形質転換体はpMDH1が導入されたものをpMDH1/12s1.4, pMDH1-3’が導入されたものをpMDH1-3’/12s1.4と記す。以上のＰＣＲに用いたプライマーを図１２に示す。【００８０】
野生株ＷＴのほか、親株となる12s1.4、pMDH1/12s1.4の独立系統1〜4、pMDH1-3’/12s1.4の独立系統1〜4の種子をすりつぶし、全タンパク質を抽出した。各タンパク質１０μｇについてのＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動の結果を図１３に示す。【００８１】
図１３に示すように、pMDH1/12s1.4の独立系統1〜4では種子で強力に発現を促進させる12S1プロモーターを使用しているにも関わらず、pMDH1タンパク質は種子中の主要なタンパク質とはなりえていなかった。一方、pMDH1-3’/12s1.4の独立系統1〜4ではすべての系統において多量のpMDH1タンパク質の発現が確認でき、pMDH1タンパク質が種子中で最も主要なタンパク質（全タンパク質の約４０％）であった。これにより組み換えタンパク質を種子中の主要なタンパク質として多量に発現／蓄積させることが可能であることを確認した。【００８２】
pMDH1はリンゴ酸脱水素酵素なので酵素活性を測定することで、種子に発現／蓄積させたpMDH1タンパク質が活性を保持したまま蓄積しているかどうかを確認した。すなわち、それぞれの種子からタンパク質を抽出し、酵素活性を測定した。結果を図１４に示す。【００８３】
図１４に示すように、12S1３’ＵＴＲを付加してpMDH1を蓄積させた種子ではMDH1活性は12S1３’ＵＴＲを付加させなかったものに比べ、４０〜５０倍の活性を示した。これは種子に発現／蓄積させた組換えタンパク質は活性を保持した状態で蓄積していることを示す。【００８４】
さらに、種子に蓄積させたｐMDH1タンパク質の活性が市販のブタ心臓由来のMDHの活性と比較して、妥当な値かどうか（実は大部分が不活性で、活性が極端に低くないか）を検討した。結果は図１５に示すように、pＭＤＨ１タンパク質は、市販のMDH1と同程度の活性を有していることがわかった。
【実施例６】
【００８５】
種子は内部に蓄積されたタンパク質を常温で安定的に保持することが予測される。そこで、本実施例では、組換えタンパク質であるpMDH1が種子内で常温で安定的に保持されるかどうかを検討した。実施例５で取得した種子を収穫後、90日間室温で放置し、pDH1の活性を経時的に測定した。結果を図１６に示す。【００８６】
図１６に示すように、収穫した種子を室温で保存しても、pMDH1の活性は変化しないことが分かった。これは種子に発現させた組換えタンパク質は室温で安定的に保持されることを示している。
【実施例７】
【００８７】
本実施例では、これはこの方法がpMDH1だけでなく他のタンパク質にも適応できるかどうかを確認した。【００８８】
図１７に示すように、シロイヌナズナの鉄貯蔵タンパク質であるFer2のコード領域（配列番号４０）に12S1の3’UTRを付加し、形質転換体を作成し、実施例５と同様にして種子から抽出した全タンパク質をポリアクリルアミドＳＤＳ電気泳動に供した。以上のＰＣＲに用いたプライマーを図１８に示し、結果を図１９に示す。なお、Fer2が導入されたものをFer2/12s1.4, Fer2-3’が導入されたものをFer2-3’/12s1.4と記す。【００８９】
図１９に示すように、Fer2-3’/12s1.4の独立系統1〜4でのみ種子中の最も主要なタンパク質としてFer2タンパク質の発現／蓄積が確認できた。すなわち、12S1の3’UTRを付加することでFer2も種子において主要タンパク質として発現／蓄積（全体の約15％）していることがわかった。以上のことから、タンパク質の種類を問わず、組み換えタンパク質を種子の主要なタンパク質として発現／蓄積させることが可能であることを確認した。
【実施例８】
【００９０】
本実施例では、ヒト由来タンパク質であるヒトインターフェロンをシロイヌナズナの種子の主要タンパク質としての発現／蓄積を確認した。【００９１】
既に作製した12s1.4二重欠損株に、図２０に示すヒトインターロイキン２８Ｂを発現させるためのコンストラクト12S1pro::IL28B-3’UTRを導入した遺伝子組換え体IL28B-3’UTR/12s1.4を実施例３に準じて作製した。なお、ヒトインターロイキン２８Ｂのコード領域は、配列番号４１で表され、このためのプライマーは、配列番号４２及び４３で表される。また、12s1.4二重欠損株に図２０に示すヒトインターロイキン２９を発現させるためのコンストラクト12S1pro::IL29-3’UTRを導入した遺伝子組換え体IL29-3’UTR/12s1.4を実施例３に準じて作製した。なお、ヒトインターロイキン２９のコード領域は、配列番号４４で表され、このためのプライマーは、配列番号４５及び４６で表される。12s1.4二重欠損株、IL28B-3’UTR/12s1.4株及びIL29-3’UTR/12s1.4株から種子を収穫し、タンパク質を抽出した。これらのタンパク質（１５μｇ／レーン）を、12.5％のポリアクリルアミドゲルに負荷して電気泳動した。泳動後、CBB染色にてタンパク質を染色した。結果を図２１に示す。【００９２】
図２１に示すようにIL28B-3’UTR/12s1.4株及びIL29-3’UTR/12s1.4株について、ＩＬ２８Ｂ及びＩＬ２９をそれぞれ確認できた。なお、IL28B、IL29の分子量がほとんど同じであるため、同じ高さのところにバンドが確認できている。以上のことから、本明細書に開示する３’−ＵＴＲ領域を用いることで、植物種子中にヒトのインターフェロンを主要タンパク質の１つとして発現／蓄積させることが可能であることがわかった。
【実施例９】
【００９３】
本実施例では、１２Ｓ１グロブリン遺伝子及び１２Ｓ４グロブリン遺伝子の欠損の目的タンパク質の発現に対する影響を確認した。【００９４】
野生株に図２０に示すコンストラクト12S1pro::IL29-3’UTRを導入した遺伝子組換え体IL29-3’UTR/WT)を実施例に準じて作製した。次いで、WT（野生株）、12s1.4二重欠損株、実施例８で作製したIL29-3’UTR/12s1.4 株及び作製したIL29-3’UTR/WT株から種子を収穫し、タンパク質を抽出した。これらのタンパク質（１５μｇ／レーン）を、12.5％のポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後、CBB染色にてタンパク質を染色した。結果を図２２に示す。【００９５】
図２２に示すように、IL29のタンパク質発現が確認できたのはIL29-3’UTR/12s1.4株のみで、 IL29-3’UTR/WT株ではCBB染色によるバンドは確認できなかった。以上のことから、12S1グロブリン遺伝子及び／又は１２S4グロブリン遺伝子の2重欠損株を使用することが種子における組換えタンパク質の大量発現／蓄積に重要であることがわかった。
【実施例１０】
【００９６】
本実施例では、シロイヌナズナ種子のＩＣＬ遺伝子の３’ＵＴＲのコード領域（配列番号４７）についての種子発現／蓄積促進効果について確認した。導入コンストラクトとしては、実施例４と同様、ICLを12S1CDSに付加させたものを実施例３と同様に12S1プロモーターの下流に連結したコンストラクトを構築し、実施例３と同様の手法で形質転換体を取得し、その種子を収穫した。ICLの3'UTRのクローニングには配列番号４８、配列番号４９で表される塩基配列からなるプライマーを用い、12S1CDSにICLの３’UTRを付加するには、配列番号５０で表される塩基配列からなるプライマーを用いた。【００９７】
この種子につき、実施例３と同様にしてタンパク質を抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、ICLの3’UTRは12S1タンパク質を種子に発現させる機能がないことを確認できた。
【実施例１１】
【００９８】
本実施例では、実施例５で得た種子においてpMDH1の局在性を電子顕微鏡にて確認した。Hayashi et al. (1998) Plant Cell 10, 183-195に従い、種子の電子顕微鏡用切片を作製し、ペルオキシソームマーカー酵素であるカタラーゼに対する抗体を付加した25nmの金粒子及びpMDH1の抗体を付加した15nmの金粒子をスライド上の切片に添加し反応させた後、過剰の金粒子を洗浄して除去して顕微鏡観察用とした。結果を図２３に示す。【００９９】
図２３においては、白抜きの矢頭はペルオキシソームマーカー酵素であるカタラーゼに対する抗体を付加した25nmの金粒子、黒の矢頭はpMDH1の抗体を付加した15nmの金粒子の局在を示す。OBはオイルボディ、PBはプロテインボディをそれぞれ示す。図２３に示すように、カタラーゼ抗体が付加した25nmの金粒子が写真中心のオルガネラに局在し、さらにpMDH1の抗体を付加した15nmの金粒子も同じオルガネラに局在したことを示している。すなわち、実施例５で本開示に従い作製した種子中に生産したpMDH1がペルオキシソームに局在していることを細胞において確認することができた。【０１００】
通常、種子の大部分はOBとPBで占められているが、本開示に従い蓄積させたpMDH1タンパク質はOBやPBには蓄積せず、PERに蓄積していた。pMDH1タンパク質は、それ自体ペルオキシソームに局在するタンパク質である。以上のことから、本開示によれば、外来タンパク質をその本来的な細胞内局在性を保ったまま生産しかつ蓄積させることができることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１０１】
配列番号１２〜１９、２１〜３８、４２、４３、４５、４６、４８〜５０：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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