(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
BCOR 遺伝子のexon 16の３’側末端領域に起こる遺伝子内縦列重複の発現を検出することを特徴とする腎腫瘍の診断補助方法。
【請求項２】
exon 16の３’側末端領域に遺伝子内縦列重複が起きた異常BCOR遺伝子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎腫瘍の診断補助方法、診断マーカー、診断キット、及び、異常BCOR遺伝子に由来するタンパク質を検出可能な抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
小児腎腫瘍には種々の疾患が含まれるが、多くは小型円形細胞の形態を示すため、病理学的な鑑別が困難な場合が多い。小児腎腫瘍の中でも、ウイルムス腫瘍は最も頻度が高く、約85%を占め、予後は比較的良好とされるが、診断に有用なバイオマーカーが無い（非特許文献１）。
【０００３】
一方、約5%を占める先天性間葉芽腎腫では、t(12;15)(p13;q25)染色体転座に起因するETV6-NTRK3融合遺伝子が、また約2%を占める腎横紋筋肉腫様腫瘍ではSMARCB1 (hSNF5/INI1)遺伝子の機能喪失が、それぞれ有用なバイオマーカーとされ、その診断に有用である。
【０００４】
これに対して、腎明細胞肉腫は小児腎腫瘍の約5％を占める悪性度の高い腫瘍で予後不良群に分類され、男児に多く、2歳以上の年長児に多い（非特許文献２）。病理組織診断では腫瘍細胞を毛細血管網（firovascular network）が取り囲む像が診断に有益な情報となるが適切なバイオマーカーが無いため、他の種類の腎腫瘍と鑑別することが難しく、正確な診断には高度かつ専門的な経験が必要である。
【０００５】
近年、腎明細胞肉腫のバイオマーカーとしてt(10;17)(q22;p13) 染色体転座に起因するYWHAE-FAM22が報告されたが（非特許文献３）、欧米におけるその頻度は腎明細胞肉腫の12%にしか過ぎず、わが国ではさらに頻度が低い可能性があることから有用性が低い。
【０００６】
一方、成人では腎細胞がんと腎盂がんが主である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dome JS, Cotton CA, Perlman EJ, et al: Treatment of anaplastic histology Wilms' tumor: results from the fifth National Wilms' Tumor Study. J Clin Oncol 20;24(15):2352-8, 2006
【非特許文献２】Green DM, Breslow N, Beckwith JB, et al.: Treatment of children with Clear-Cell Sarcoma of the Kidney: A report from the National Wilms’ Tumor Study Group. J Clin Oncol 12: 2132-2137, 1994
【非特許文献３】O'Meara E1, Stack D, Lee CH, Garvin AJ, Morris T, Argani P, Han JS, Karlsson J, Gisselson D, Leuschner I, Gessler M, Graf N, Fletcher JA, O'Sullivan MJ. Characterization of the chromosomal translocation t(10;17)(q22;p13) in clear cell sarcoma of kidney. J Pathol. 2012 May;227(1):72-80. doi: 10.1002/path.3985. Epub 2012 Feb 17.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、腎腫瘍の診断補助方法及び診断マーカー等を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかる腎腫瘍の診断補助方法は、BCOR 遺伝子のexon 16の特定領域に起こる遺伝子内縦列重複（internal tandem duplication(ITD)）の発現を検出することを特徴とする。
【００１０】
本発明にかかる腎腫瘍の診断マーカーは、exon 16の特定領域に遺伝子内縦列重複が起きた異常BCOR 遺伝子である。
【００１１】
本発明にかかる腎腫瘍の診断キットは、BCOR 遺伝子のexon 16の特定領域に起こる遺伝子内縦列重複の発現を診断マーカーとして使用することを特徴とする。
【００１２】
本発明にかかる抗体は、exon 16の特定領域に遺伝子内縦列重複が起きた異常BCOR 遺伝子に由来するタンパク質を検出可能な抗体である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、BCOR遺伝子の異常を同定することにより的確に腎明細胞肉腫等の腎腫瘍を診断することができる。BCOR遺伝子の遺伝子内縦列重複は腎明細胞肉腫患者では全例に認められるが、他の小児腎腫瘍患者では全く認められない。このBCOR遺伝子の異常の有無を指標に、例えば、腎腫瘍の中で腎明細胞肉腫の確定診断を簡便かつ正確に行なう事ができる。なお、近年アントラサイクリン系の抗腫瘍性抗生物質であるドキソルビシンを併用することによって腎明細胞肉腫の治療成績が向上する可能性が報告されており、本件発明にかかる診断法を用いて腎明細胞肉腫につき正確かつ迅速な診断を行なう事で、腎明細胞肉腫の適切な治療をただちに開始することが可能となり、その予後の改善にも寄与できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】BCOR遺伝子の４つのisoformのexon構造とタンパク構造を示す。
【図２】小児腎腫瘍におけるBCOR遺伝子exon 16領域のゲノムPCRを示す。
【図３】腎明細胞肉腫（CCSK） 20症例に認められたBCOR遺伝子の異常におけるtype 1を示す。
【図４】腎明細胞肉腫20症例に認められたBCOR遺伝子の異常におけるtype 2a及び2bを示す。
【図５】腎明細胞肉腫20症例に認められたBCOR遺伝子の異常におけるtype 3を示す。
【図６】腎明細胞肉腫20症例に認められたBCOR遺伝子の異常におけるtype 4a及び4bを示す。
【図７】RT-PCRによる女児腎明細胞肉腫症例におけるアレル発現確認を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１６】
本発明者は、腎明細胞肉腫等の腎腫瘍ではBCOR (BCL6 corepressor)遺伝子のexon 16の特定領域に特徴的な遺伝子内縦列重複が起ることを見出し、かかる新知見に基づいて本発明を完成させた。
【００１７】
BCORタンパク質は、ヒトにおいてはXp11.4に存在する遺伝子にコードされるタンパク質であり、4つのアイソフォームがある。腎明細胞肉腫では、PCRによってゲノムDNAあるいはmRNAから合成したcDNAのexon 16の翻訳領域を含む一定領域を増幅した場合に、遺伝子断片の長さの異常、即ち正常よりも長い遺伝子断片が増幅、検出されるので、簡便なスクリーニング診断に応用できる。さらに、増幅した遺伝子断片の塩基配列をシーケンシングによって確認することにより、診断を確定することができる。また、異常遺伝子によって産生されるBCORの異常タンパクを正常タンパクと識別可能な抗体を作成することで、免疫染色による診断薬として応用も可能である。
【００１８】
図１はBCOR遺伝子の４つのisoformのexon構造とタンパク構造を示す。Variant 3（V3）は、配列番号1（NM_001123383.1）、配列番号２（NP_001116855）である。Variant 4（V4）は、配列番号3（NM_001123384.1）、配列番号4（NP_001116856.1）である。Variant 5（V5）は、配列番号5（NM_001123385.1）、配列番号6（NP_001116857.1）である。Variant 1（V1）は、配列番号7（NM_017745.5）、配列番号8（NP_060215.4）である。
【００１９】
BCORタンパク質は、BCL6タンパク質への結合やHistone修飾に関連することや異性型PRC1因子の一つであると考えられている。BCORタンパク質は、BCL6 結合ドメイン、ankyrin repreat、及びPCGF ubiquitin-like fold discriminator ドメインを有することを特徴としている。C末端側の PCGF ubiquitin-like fold discriminatorドメインは、例えば、ヒトであれば配列番号6で表されるアミノ酸配列の1634〜1748位のアミノ酸配列に該当する。
【００２０】
図１に示されるように、腎明細胞肉腫では、BCOR遺伝子の矢印のexon16の部分の遺伝子配列が重複して余分に挿入される。このため、腎明細胞肉腫では、BCORに由来するタンパクの末端部分のアミノ酸配列が重複して余分に挿入される。この特徴的な遺伝子異常部分をPCRで検出すると、腎明細胞肉腫では正常の腎組織や、その他の腎腫瘍の場合に比較して、PCRのバンドのサイズが大きくなる。
【００２１】
本発明にかかる腎腫瘍を診断する診断キットは、BCOR 遺伝子のexon 16の特定領域に起こる遺伝子内縦列重複の発現を診断マーカーとして使用する。即ち、本発明にかかる診断キットは、患者から得られた試料において、BCOR 遺伝子のexon 16の特定領域に起こる遺伝子内縦列重複の発現を検出又は定量する手段を含む。キットには、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤等の試薬を含むことができる。
【００２２】
免疫学的手法により検査を行う場合には、exon 16の特定領域に遺伝子内縦列重複が起きた異常BCOR 遺伝子に由来するタンパク質を検出可能な抗体が用いられる。抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化(camelised)抗体、キメラ抗体、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆab断片、Ｆ(ab')２断片が包含される。
【００２３】
患者から得られる試料は、特に限定されるものではないが、例えば腫瘍組織、尿、血清、髄液、又はこれらの混合物である。
【実施例】
【００２４】
＜サンプル＞
小児腎腫瘍（20例の腎明細胞肉腫(CCSK)、16例の腎横紋筋肉腫様腫瘍(RTK)、10例の先天性間葉芽腎腫(CMN)、167例のウイルムス腫瘍(Wilms)を含む）の患児より得た腫瘍組織（腫瘍組織中の腫瘍細胞が少なくとも80%以上）から、illustra tissue & cells genomicPrep Mini Spin kit (GE Healthcare Bio-Sciences UK社)を使用してゲノムDNAを抽出した。なお、この研究は、日本ウィルムス腫瘍スタディ（JWiTS）グループの協力のもと本研究に係る組織の倫理審査員会の承認を得て進められた。
【００２５】
＜ゲノムPCR、サンガーシークエンシング＞
被験者の腎腫瘍組織から抽出したゲノムDNAをTaKaRa Ex Taq polymerase (タカラバイオ社）を用いたPCR増幅に供した。目的とするサイズの遺伝子断片の増幅をアガロースゲル電気泳動で確認した。原則的には、増幅された遺伝子断片を精製後、直接鋳型として用いて塩基配列を決定した。例外的に、腎明細胞肉腫の女児の場合には、2つのサイズの異なる遺伝子断片が増幅されたため（図２）、電気泳動によってそれぞれの断片を別々に精製したもの、あるいはpGEM-T easyベクター（PROMEGA社）にサブクローニングしたものを鋳型として用いて、それぞれ塩基配列を決定した。塩基配列の決定には、BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems社）とABI 3130xl Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を用いた。
【００２６】
＜RT-PCR、qRT-PCR＞
被験者の腎腫瘍組織（腫瘍組織中の腫瘍細胞が少なくとも80%以上）から抽出した全RNAから、First Strand cDNA Synthesis Kit with Oligo dT primer (Roche Diagnostics社)を使用してcDNAを合成した。得られたcDNAをTaKaRa Ex Taq polymerase (タカラバイオ社）を用いたPCR増幅に供した。目的とするサイズの遺伝子断片の増幅をアガロースゲル電気泳動で確認した
被験者の腎腫瘍組織から抽出した全RNAから、ReverTra Ace(登録商標) qPCR RT Master Mix（東洋紡社）を使用してcDNAを合成した。得られたcDNAをFast SYBR Green Master Mix (Life Technologies社)を用いた定量PCR（qPCR）増幅に供した。標準曲線法を用いて、Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR system (Life Technologies)により解析した。基準として、同一試料でのβ-actin（ActB）の増幅を用いた。
【００２７】
本実施例は、腎腫瘍組織におけるBCOR遺伝子のexon 16領域の新規internal tandem duplication (遺伝子内縦列重複)の異常の同定について記載する。
【００２８】
小児腎腫瘍におけるBCOR遺伝子のexon 16領域を解析するため、intron 15とexon 16の非翻訳領域に設定したプライマーを用いて213例の小児腎腫瘍患児より得た腫瘍組織のゲノムPCR解析を行った。
【００２９】
電気泳動により増幅された遺伝子断片のサイズを確認したところ、16例の腎横紋筋肉腫様腫瘍、10例の先天性間葉芽腎腫、167例のウイルムス腫瘍では、予想された566 bp（配列番号9）の遺伝子断片のみが検出されたのに対し、20例の腎明細胞肉腫では全例で予測されたサイズよりも大きな遺伝子断片の増幅が検出された（図２）。図に示すように、腎明細胞肉腫の男児例（12例中の3例を提示）ではサイズの大きな遺伝子断片のみが、また女児例（8例中の3例を提示）では正常サイズとサイズの大きな遺伝子断片との2本が検出された。
【００３０】
そこで、増幅された遺伝子断片を精製してシーケンシングによってexon 16の翻訳領域の塩基配列（配列番号10で表される塩基配列）を決定した結果、腎明細胞肉腫の患児の腫瘍組織から増幅されたサイズの大きな遺伝子断片は、そのすべてにおいて、exon 16の翻訳領域内に遺伝子内縦列重複が存在することが確認された。この遺伝子内縦列重複には6種類の異なった重複（配列番号12, 14, 16, 18, 20, 22）が認められた。その内訳は、図３に示すように配列番号12(Type 1)が3例、図４に示すように配列番号14(Type 2a)及び16(Type 2b)が各1例、図５に示すように配列番号18(Type 3)が6例、図６に示すように配列番号 20(Type 4a)が5例、配列番号22(Type 4b)が4例であった。
【００３１】
配列番号12 (Type 1)の異常では、正常のBCOR遺伝子のexon 16翻訳領域（配列番号10）の236位と237位の塩基配列の間に123位から236位の塩基配列が重複して挿入されており、これによってアミノ酸配列では、配列番号11に示す78位と79位のアミノ酸配列の間に、Glu（正常の場合の配列番号 10 の塩基配列235位から237位のGly をコードするコドンgggが、上記塩基配列の挿入によってggaに変わるため）に続いて42位から78位のアミノ配列が挿入され、その結果、配列番号13に示すポリペプチドが産生されると予測された（図３）。
【００３２】
配列番号14(Type 2a)の異常では、正常のBCOR遺伝子のexon 16（配列番号10）の250位と251位の塩基配列の間に160位から247位の塩基配列が重複して挿入されており、これによってアミノ酸配列では、配列番号11に示す82位と83位のアミノ酸配列の間に、配列番号11に示す、53位から82位のアミノ配列が挿入され、その結果、配列番号15のポリペプチドが産生されると予測された（図４）。
【００３３】
配列番号16(Type 2b)の異常では、重複配列が配列番号14(Type 2a)とほぼ類似していたが、正常のBCOR遺伝子のexon 16（配列番号10）の247位と248位の塩基配列の間にagの2塩基の挿入に続いて配列番号10の160位から247位の塩基配列が重複して挿入されており、これによってアミノ酸配列では、配列番号11に示す82位と83位のアミノ酸配列の間に、Serの1アミノ酸の挿入に続いて、配列番号11に示す54位から82位のアミノ配列が挿入され、その結果、配列番号17のポリペプチドが産生されると予測された（図４）。
【００３４】
配列番号18 (Type 3)の異常では、正常のBCOR遺伝子のexon 16翻訳領域（配列番号10）の228位と229位の塩基配列の間に188位から229位の塩基配列が重複して挿入されており、これによってアミノ酸配列では、配列番号11に示す93位と94位のアミノ酸配列の間に63位から93位のアミノ配列が挿入され、その結果、配列番号19に示すポリペプチドが産生されると予測された（図５）。
【００３５】
配列番号20(Type 4a)の異常では、正常のBCOR遺伝子のexon 16（配列番号10）の290位と291位の塩基配列の間に195位から291位の塩基配列が重複して挿入されており、これによってアミノ酸配列では、配列番号11に示す96位C末端アミノ酸の後ろに、配列番号11に示す65位から96位のアミノ配列が挿入され、その結果、配列番号21のポリペプチドが産生されると予測された（図６）。
【００３６】
配列番号22(Type 4b)の異常は、配列番号14(Type 4a)とほぼ類似した重複配列を有していたが、正常のBCOR遺伝子のexon 16（配列番号10）の290位と291位の塩基配列の間にcの1塩基挿入に続いて196位から291位の塩基配列が重複して挿入されており、これによってアミノ酸配列では、配列番号11に示す96位C末端アミノ酸の後ろに、Cysの1アミノ酸の挿入に続いて、配列番号11に示す66位から96位のアミノ配列が挿入され、その結果、配列番号23のポリペプチドが産生されると予測された（図６）。
【００３７】
これに対して、腎明細胞肉腫の女児に認められた正常サイズの遺伝子断片及び腎明細胞肉腫以外の腫瘍の患児で認められた遺伝子断片はすべて正常の配列で、異常を認めないことが確認された。結果を表１にまとめる。
【００３８】
【表１】
0006608183.tif 000002
【００３９】
BCOR遺伝子はX染色体上に位置しているが、前述のように、腎明細胞肉腫の女児では、２本あるX染色体上に、正常とexon 16の翻訳領域内に遺伝子内縦列重複を有する異常なBCOR遺伝子が、それぞれ含まれていることが推測されたことから、そのBCOR遺伝子のメッセンジャーRNAの発現について検討した。RT-PCR及び定量PCRの結果、腎明細胞肉腫の女児ではexon 16の翻訳領域内に遺伝子内縦列重複を有する異常なBCOR遺伝子のみがメッセンジャーRNAとして発現していることが確認された（図７）。
【００４０】
ゲノムPCR及びシーケンシングフォワードプライマー：gggagcagaatgaaaggaca（配列番号24）
ゲノムPCR及びシーケンシングリバースプライマー：tgtttctaagtccttctgactgga（配列番号25）
以上の結果から、腎明細胞肉腫患者の腫瘍細胞では、全例でexon 16の翻訳領域内に遺伝子内縦列重複を有する異常なBCOR遺伝子が発現していることが示された。この異常は、小児腎腫瘍の中では、腎明細胞肉腫にのみ特徴的に認められ、その他の病形では全くみとめられないことから、この異常を検出することによって、腎明細胞肉腫を簡便かつ正確に診断できる可能性が示された。最近、腎明細胞肉腫に対して、ドキソルビシンを併用した化学療法が有効であることが報告されており、BCOR遺伝子exon 16の翻訳領域内の遺伝子内縦列重複の検出によって正確に腎明細胞肉腫を診断できれば、適切な治療法を選択することが可能となって、この腫瘍の治療成績を一層向上させることができると期待される。
【産業上の利用可能性】
【００４１】
腎明細胞肉腫の診断に利用できる。成人の腎腫瘍でも同様の変異が認められる可能性があり、応用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号1、3、5、及び7：BCORポリヌクレオチド（isoform a/variant 3、isoform b/variant 4、isoform c/variant 5、isoform a/variant 1）
配列番号2、4、6、及び8：BCORポリペプチド（isoform a/variant 3、isoform b/variant 4、isoform c/variant 5、isoform a/variant 1）
配列番号9:ゲノムPCRによって増幅されたBCOR遺伝子のintron 15の一部とexon 16の非翻訳領域を含むゲノムPCRによる増幅断片ポリヌクレオチド
配列番号10: 配列番号9に含まれるBCOR遺伝子のexon 16の翻訳領域内ポリヌクレオチド
配列番号11: BCOR遺伝子のexon 16の翻訳領域によってコードされるポリペプチド
配列番号12, 14, 16, 18, 20, 22:遺伝子内縦列重複の異常を有するBCOR遺伝子のexon 16の翻訳領域内ポリヌクレオチド（Type 1、Type 2a及びb、Type 3、Type 4a及びb）
配列番号13,15,17,19,21,23:遺伝子内縦列重複の異常を有するBCOR遺伝子のexon 16の翻訳領域内に相当するポリペプチド（Type 1、Type 2a及びb、Type 3、Type 4a及びb）
配列番号24:ゲノムPCRフォワードプライマー兼シーケンシングプライマー
配列番号25: ゲノムPCRリバースプライマー兼RT-PCRリバースプライマー、兼シーケンシングプライマー
配列番号26：RT-PCRフォワードプライマー兼定量RT-PCRフォワードプライマー
配列番号27：定量RT-PCRリバースプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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