(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
染色体核酸を代表する核酸を含む生体サンプルの核酸における再編成に関連する分断点をインビトロで予測するための方法であって：
(a)該生体サンプルの核酸を、分子コーミング、又は関連する直接マッピング法を用いて、マッピングする工程；
(b)該再編成のサイズ及び／又はサイズの信頼区間を決定し、該再編成の一方の末端における１つの分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を予測し、並びに再編成配列のもう一方の末端における分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を予測する工程；
(c)該核酸の相同性が決定された各配列ストレッチが少なくとも２００  ｂｐの長さを有する場合に、該配列ストレッチの全長にわたって、ヌクレオチドの８０〜９８％のヌクレオチド同一性を有する相同な配列ストレッチの存在を決定することにより、該分断点として予測された位置の予測配列の間での配列の相同性をローカルアラインメント検索によって決定する工程であって、そのような予測配列がリファレンスデータベースから取得される、前記工程；
(d)工程(c)の同定された相同配列ストレッチ内で、相同核酸配列の一部分に対する厳密な配列同一性を決定する工程であって、該厳密な同一性が、２５  ｂｐ〜８０  ｂｐの配列部分にわたって存在する、前記工程；並びに
(e)工程(d)の相同核酸配列のそのような部分が存在する場合、そのような厳密な配列の同一性を表示し、そのような部分が配列再編成の該分断点を含む可能性があることを予測する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
染色体核酸を代表する核酸を含む生体サンプルの核酸において再編成に関連する分断点を検出するための方法であって：
(a)該生体サンプルの核酸を、分子コーミング、又は関連する直接マッピング法を用いて、マッピングする工程；
(b)該再編成のサイズ及び／又はサイズの信頼区間を決定し、該再編成の一方の末端における１つの分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を予測し、並びに再編成配列のもう一方の末端における分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を予測する工程；
(c)該核酸の相同性が決定された各配列ストレッチが少なくとも２００  ｂｐの長さを有する場合に、該配列ストレッチの全長にわたって、ヌクレオチドの８０〜９８％のヌクレオチド同一性を有する相同な配列ストレッチの存在を決定することにより、該分断点として予測された位置の予測配列の間での配列の相同性をローカルアラインメント検索によって決定する工程であって、そのような予測配列がリファレンスデータベースから取得される、前記工程；
(d)工程(c)の該同定された相同配列ストレッチ内で、相同核酸配列の一部分に対する厳密な配列同一性を決定する工程であって、該厳密な同一性が、２５  ｂｐ〜８０  ｂｐの配列部分にわたって存在する、前記工程；
(e)工程(d)の相同核酸配列のそのような部分が存在する場合、そのような厳密な配列の同一性を表示し、そのような部分が配列再編成の該分断点を含む可能性があると予測する工程；並びに
(f)分子的検査により、該分断点の位置を検出する工程
を含む、前記方法。
【請求項３】
前記工程(c)が、ポリ−Ｎセグメント、すなわち、所与のヌクレオチド（Ｎ）のリピートであり、そのようなヌクレオチドが少なくとも５回連続してリピートするようなセグメントの相同性を決定することを除外する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
相同性の水準が８５〜９５％の範囲内のヌクレオチド同一性である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
相同性が２００〜５００  ｂｐを有する配列について決定される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
分断点の予測又は検出が、核酸配列の増幅、核酸配列の欠失からなる再編成に関連する、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
分断点の予測又は検出が、核酸配列における再編成を検出した後に実施される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
分断点の予測又は検出が、乳癌及び／又は卵巣癌の素因に関連する遺伝子、リンチ症候群又は結腸癌の素因に関連する遺伝子などの疾患に又は疾患の素因に関連することの知られる遺伝子を含む、ゲノム座位上で行われる、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記分断点がＢＲＣＡ１遺伝子座の中に検出される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記分断点の確認が、以下のように選択されたプライマーペアを用いたＰＣＲにより実施される、請求項２〜９のいずれか一項記載の方法であって：
一本のフォワードプライマーが、前記再編成の一方の末端において、分断点の可能性のある位置から５  ｋｂ未満に位置し、かつ
一本のリバースプライマーが、該再編成のもう一方の末端における分断点の可能性のある位置から５  ｋｂ未満に位置し、かつこれらプライマーが野生型サンプルにおけるＰＣＲによっては増幅することができないように配向している、前記方法。
【請求項１１】
疾患の素因を検出するための、又は疾患を検出するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項記載の、分断点の予測又は検出を実施することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記疾患が乳癌又は卵巣癌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記染色体核酸が、ヒト染色体核酸である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項１４】
前記乳癌及び／又は卵巣癌の素因に関連する遺伝子が、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２であり、かつリンチ症候群又は結腸癌の素因に関連する遺伝子が、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、及びＰＭＳ２である、請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
（なし）
（連合から資金を受けた研究開発であることの宣言）
（なし）
（ＣＤ上の材料の参照）
（なし）
【０００２】
（発明の背景）
（発明の技術分野）
本発明はＢＲＣＡ１遺伝子座で配列の増幅を検出するための方法に関する。該配列はＢＲＣＡ１遺伝子座中に少なくとも２つ存在する配列ストレッチからなる末端を有するか、又はこれらにより区切られており、かつ、該増幅により、増幅配列のタンデムなコピーが少なくとも２つ、又は少なくとも３つ、特に３つもたらされる。また、本発明は、卵巣癌又は乳癌の素因を含む、これらの増幅に関連する疾患又は障害の素因を決定するための方法に関する。また、本発明は他の座位における同様の特徴を伴う増幅を検出するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
（関連技術の記載）
乳癌は、女性の最も一般的な悪性腫瘍であり、女性人口のおよそ１０％に影響を及ぼしている。発生率は毎年増加しつつあり、約１４０万人の女性が毎年世界中で乳癌であると診断され、約４６０，０００人がこの疾患が原因で死亡すると推定される。遺伝性乳癌及び卵巣癌感受性遺伝子ＢＲＣＡ１（ＭＩＭ＃１１３７０５）及びＢＲＣＡ２（ＭＩＭ＃  ６００１８５）の生殖系列変異は浸透率が高い（Ｋｉｎｇらの文献、２００３）、（Ｎａｔｈａｎｓｏｎらの文献、２００１）。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子は、ＮＢＲ２遺伝子などの他の遺伝子とともに同定され、特徴づけられ、ヒトゲノム中にマッピングされたものであり、これらのデータは公開されている。スクリーニングは、家族歴陽性の個体の遺伝子カウンセリング及び変異保有者における早期診断又は予防に重要である。ＢＲＣＡ１又はＢＲＣＡ２の変異が同定された場合、予測的検査が１８歳を超える家族全員に提案される。女性が検査で陰性反応を示した場合、その人のリスクは再び、一般集団のリスクになる。女性が検査で陽性反応を示した場合、個別の監視プロトコルが提案され：これには、若年齢からの乳房撮影スクリーニング、及び場合により、予防的手術が含まれる。抗エストロゲン剤による乳癌の化学的予防も、現在、臨床試験で検討されており、今後、処方される可能性がある。
【０００４】
大半の有害な変異は、未成熟な終止コドンを生じる小さなフレームシフト（挿入もしくは欠失）又は点変異か、保存されたドメイン中のミスセンス変異か、或いは異常な転写物プロセッシングをもたらすスプライス部分変異かのいずれかからなる（Ｓｚａｂｏらの文献、２０００）。しかしながら、変異には、ＤＮＡシークエンシングと組み合わせた従来のＰＣＲベースの変異スクリーニングによる検出から漏れる大きなゲノム領域の欠失及び２倍化を含む、より複雑な再編成も含まれる（Ｍａｚｏｙｅｒの文献、２００５）。これまでのところ、３つ以上のコピーが関与する１件の増幅しか報告されていない。この増幅はエキソン１７−１９と関与するＢＲＣＡ１遺伝子の３’部分の３倍化であり、Ａｌｕ組換えにより引き起こされる。
【０００５】
これらの複雑な再編成を検出することができる技術としては、ロングレンジＰＣＲ又はタンパク質トランケーションテスト（ＰＴＴ）と組み合わせたサザンブロット解析、短い蛍光断片の定量的マルチプレックスＰＣＲ（ＱＭＰＳＦ）（Ｈｏｆｍａｎｎらの文献、２００２）、リアルタイムＰＣＲ、蛍光ＤＮＡマイクロアレイアッセイ、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ）（Ｃａｓｉｌｌｉらの文献、２００２）、（Ｈｏｆｍａｎｎらの文献、２００２）、及び高解像度オリゴヌクレオチドアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション（ａＣＧＨ）（Ｒｏｕｌｅａｕらの文献、２００７）、（Ｓｔａａｆらの文献、２００８）が挙げられる。ｑＰＣＲ−ＨＲＭ及びＥＭＭＡなどの、事前スクリーニングと定量的情報の両方を提供する新しい手法が最近になって開発され、大量並列シークエンシングと組み合わせたゲノム捕捉が、乳癌及び卵巣癌に関与する２１の遺伝子に影響を及ぼす小さな変異と大きな再編成の同時検出のために提案されている（Ｗａｌｓｈらの文献、２０１０）。これらの複雑な遺伝子再編成を検出するための記載のある他の技術としては、分子コーミング（Ｈｅｒｒｉｃｋ及びＢｅｎｓｉｍｏｎの文献、２００９）；（Ｓｃｈｕｒｒａ及びＢｅｎｓｉｍｏｎの文献、２００９）；（Ｇａｄらの文献、２００１）、（Ｇａｄらの文献、２００２ａ）、（Ｇａｄらの文献、２００３）；（Ｃｈｅｅｓｅｍａｎらの文献、２０１２）；（ＵＳ  ６１５５３９０６）が挙げられる。
【０００６】
そのような増幅が、増幅配列の２以上の追加的なコピーに関与する場合、及び／又は増幅配列が野生型ＢＲＣＡ１遺伝子又は周辺の遺伝子座中の複数のコピーに存在する配列部分を含む場合、及び／又は増幅配列が非常に高いリピート含量をもつＢＲＣＡ１遺伝子座の一部に属する場合、従来技術の方法では増幅を検出し、かつ／又は特徴づけることは不可能である。本明細書では、発明者らはそのような増幅を検出し、かつ／又は特徴づけ、並びに他のゲノム座位にあって同様の特徴を共有する増幅を検出し、かつ／又は特徴づけるための方法を提供する。
【発明の概要】
【０００７】
（発明の簡潔な概要）
ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子は、乳癌及び卵巣癌感受性に高い浸透率で関与している。ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２点変異について陰性である家族歴陽性の乳癌患者の約２％〜４％は、これら２つの遺伝子のうちの１つ、特に、ＢＲＣＡ１に大きなゲノム変化（詳細には、欠失又は２倍化）を保有すると予想することができる。しかしながら、大きな再編成の一部は、従来技術では見落とされる。この大きな再編成にはタンデムな配列の増幅が含まれ、増幅配列の２以上の余分なコピーが導入されるという事実により特徴づけられ、及び／又は野生型遺伝子座内において、及び／又は増幅配列がリピートに富んでいる場合には、増幅配列の末端が、反復された配列単位として、複数のコピー中に存在し、互いに完全な、又は高度な相同性を有するという事実により特徴づけられる。
【０００８】
このようなタイプの増幅を検出し、かつ／又は特徴づけるためのインビトロでの方法が、本発明の１つの目的である。このような方法には、ＢＲＣＡ１のエキソン１ａ、１ｂ、及び２、並びにＮＢＲ２遺伝子の断片を包含する配列断片の３倍化を検出するための、インビトロでの方法が含まれる。この領域は特にＡｌｕ配列に富み、一般的なコピー数評価技術ではこの３倍化を正しく特徴づけることはできない。このタンデムな３倍化の分断点では、４８塩基対にわたる完全な配列同一性が共有される。この４８塩基対（ｂｐ）の配列は、リファレンスヒトゲノム配列中のＢＲＣＡ１及びＮＢＲ２遺伝子の両方に見出されている。この４８−ｂｐ配列の周辺の配列は、２００〜３００  ｂｐにわたって高い相同性（８０〜９５％）を示す。
【０００９】
本発明は、染色体の核酸、詳細にはヒト染色体の核酸を代表する核酸を含む、生体サンプルの核酸再編成に関連する分断点を、予測し、又は検出するための方法に関する。
【００１０】
本発明は、この３倍化及び関連する増幅についての、分子コーミングを用いた検査又は方法に関する。この直接可視化する手法を用いると、これらの増幅を短時間で検出し、特徴づけることが可能となり、かつこれらの増幅にリピート配列が多く含まれていても、末端が相同であっても、コピー数が多くても、その妨げとならない。また、本発明はこの３倍化及び関連する増幅をインビトロで検出し、特徴づけることが可能な検査又は方法にも関わり、該検査又は方法は、３倍化を含む特定のＤＮＡポリヌクレオチドについての生体サンプルの濃縮に基づいている。これらの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、シークエンシング法、及び他の関連技術に基づいている。また、そのような方法を実施するためのキットも、本発明中にある。該方法及びキットはそのような増幅を検出できない既存の方法を上回る実質的な改善をもたらす。
【００１１】
４人の無関連の患者についての結果が開示され、４人の患者のサンプルの全てに３倍化があることを示す。また、患者は従来技術の他の技術を用いても検査されたが、３倍化は正しく検出されず、又は特徴づけられず、発明者らが既存の技術にもたらした実質的な改善を示していた。
【００１２】
また、本発明はこれらの検査又は方法に基づいて、卵巣癌又は乳癌の素因（参照集団に対して、高リスクであることも指す）を決定するための方法に関わる。さらに、発明者らは、医療追跡検査及び／又は治療に、乳癌又は卵巣癌のリスクの高い患者、及び／又はこのファミリーの増幅とリンクした卵巣乳癌を有する患者を適応させるための方法を記載する。
【００１３】
また、本明細書に記載される３倍化の分断点を構成する４８  ｂｐ配列は、ＢＲＣＡ１遺伝子及び周辺の遺伝子座の中の他のところにも存在し、同様の特性を有する配列増幅は、ゲノム中の他のところに見出すことができる。そのため、本発明はそのような増幅を検出し、そのような増幅を検出することのできない既存の方法を上回る、実質的な改善をもたらすための方法及びキットに関わる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
（図面の簡単な説明）
特許または出願ファイルは、色つきに仕上げた少なくとも１つの図面を含む。
【図１】ＢＲＣＡ１ゲノム領域を高解像度で物理的にマッピングするために設計され、インシリコで生成されたゲノムモールスコード４．０（ＧＭＣ  ４．０）。  （Ａ）  完全なＢＲＣＡ１  ＧＭＣ  ４．０は、２００  ｋｂのゲノム領域をカバーし、異なる色（緑、赤、又は青）の１４個のシグナル（ａ１／ａ２、Ｓ１、Ｓｅｘ２１、Ｓ２、Ｓ３Ｂｉｇ、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６、Ｓｙｎｔ１、Ｓ７、Ｓ８、Ｓ９、ｂ２／ｂ３、Ｓ１０）からなる。各シグナルは１〜２本の小さな水平バーからなり、各バーは単一のＤＮＡプローブと対応する。ＢＲＣＡ１（８１．２  ｋｂ）及びＮＢＲ２（１９．５  ｋｂ）遺伝子をコードする領域は８つの「モチーフ」（ｍ１ｂ１〜ｍ８ｂ１）からなる。各モチーフは１〜３本の小さな水平バー及び黒い「ギャップ」（シグナルなし）からなる。（Ｂ）  ＢＲＣＡ１遺伝子特異的シグナル及び２４個のエキソンの相対位置の拡大表示。
【００１５】
【図２】乳癌細胞株１０７９９００１の分子コーミング解析。  乳癌患者から採取されたＥＢＶ不死化Ｂリンパ球（細胞株１０７９９００１）から単離したＤＮＡを、分子コーミングにより解析した。  （Ａ）  ＢＲＣＡ１のｖ  ４．０  ＧＭＣによるコンピュータシミュレーションが上に示され、顕微鏡による可視化後に得られたＢＲＣＡ１のシグナルが下に示されている。各アリルについて、３つの顕微鏡シグナルが示されている。  ３倍化、ＳＹＮＴ１の赤いシグナル及びＳ７の緑のシグナルのタンデムリピートの３倍化として視認できる。検出された３倍化の位置は、オレンジ色の縦の点線で示されている。ｗｔ  ＝  野生型アリル；ｍｕｔ  ＝  ３倍化を有する変異アリル。（Ｂ）  （Ａ）と同じであるが、ＤＮＡプローブＳ７の色は緑から青に変更されており、変異に関与するプローブの性質が確認される。
【００１６】
【図３】ＢＲＣＡ１のエキソン１ａ、１ｂ、及び２の３倍化の物理的マッピング。  （Ａ）  分子コーミング実験により得た予備的物理的マップ及び関連する測定値。上は、変異アリル（３倍化を有する）及び野生型アリル（リファレンスヒトゲノム配列に対応する）の物理的マップであり、下に拡大図がついている。実線は変異アリル中の未変化のままの配列を表し、一方点線は変異アリル中の増幅された配列を表す。縦の波線は推定分断点の位置（及び変異アリル中のその複製物）である。Ｓｙｎｔ１及びＳ７は対応するプローブに由来する全長シグナルを指し、一方（Ｓｙｎｔ１）はＳｙｎｔ１プローブから生じる部分的なシグナルを指す。ｂｐで表示されたサイズは、プローブ及びギャップの実際のサイズであり、一方ｋｂのインターバルで表示されたサイズは分子コーミング実験からの推定値である。分断点を増幅するためのプライマー位置の代表例として、４つのプライマーが示されている。（Ｂ）〜（Ｃ）  細胞株１０７９９００１又は対照細胞株４０において実施されたＰＣＲに由来するＤＮＡ断片。
【００１７】
【図４】エキソン１ａ、１ｂ、及び２のＢＲＣＡ１  ３倍化の精密物理的マッピング  上図は、両分断点の予測位置の配列を比較した際に相同性を示すことが見出された位置を、対応するゲノム座標とともに示す。これらの２８６  ｂｐの配列ストレッチの間の全体の相同性は８６．５％であり、４８  ｂｐの部分は１００％の同一性を示す（実線、及び対応するゲノム座標）。  下図は分断点のシークエンシング結果を示す：Ｆ７Ｒ７  ＰＣＲ断片及びリファレンスヒトゲノム配列からの配列データの間の配列の一致は、対応するゲノム座標とともに、実線の水平バーで示され、配列の相同は点線で示される。
【００１８】
【図５】臨床サンプルにおいてＢＲＣＡ１の３倍化をスクリーニングするための最適化されたＰＣＲ反応。  （Ａ）  ＢＲＣＡ１の３倍化に特異的な断片は８つのプライマーペアから得られた。１つの単一ＤＮＡ断片であって、いかなる妨害的な非特異的断片も伴わないものは、変異陽性細胞株１０７９９００１におけるプライマーペアＦ５／Ｒ２、Ｆ５／Ｒ３、及びＦ６／Ｒ３について見出されたが、対照細胞株３８においては見出されなかった。（Ｂ）  増幅を保有する３人の無関連の患者に観察されるプライマーペアＦ５／Ｒ２、Ｆ５／Ｒ３、及びＦ６／Ｒ３に由来するＰＣＲ断片の特異的増幅。２つの陰性対照についてはＰＣＲ産物は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は染色体の核酸、詳細にはヒト染色体の核酸を代表する核酸を含む、生体サンプルの核酸再編成に関連する分断点を、予測し、又は検出するための方法に関する。
【００２０】
本明細書に開示される発明は、染色体を代表する核酸、詳細にはヒト１７番染色体を代表する核酸、及び詳細には１７番染色体のゲノム核酸を含む、生体サンプル中の遺伝子配列（例えば、ＤＮＡストレッチ）の増幅の存在をインビトロで検査するための方法であって：
該生体サンプルをＢＲＣＡ１遺伝子のエキソン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての領域を物理的にマッピングすることを可能とする手順にかけること；
ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての６  ｋｂから８  ｋｂの配列から、３以上の連続する例（コピー）（２倍化、又はそれより多く、詳細には、３倍化）を検出すること
を含む前記方法を、提供する。
【００２１】
また、本発明は、本明細書に記載された方法を用いてサンプル中の遺伝子配列の増幅の存在をインビトロで検査するためのキットも提供する。
【００２２】
本発明は、染色体核酸、詳細には、ヒト染色体核酸を代表する核酸を含む生体サンプルの核酸において、再編成、詳細には大きな再編成に関連する分断点を、インビトロで予測するための方法であって：
生体サンプルの核酸を、特に分子コーミング、又は関連する直接マッピング法を用いて、マッピングする工程；
再編成のサイズ及び／又はサイズの信頼区間、再編成の一方の末端における１つの分断点の位置及び／又は位置の信頼区間、並びに再編成配列のもう一方の末端における分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を決定する工程；
核酸の相同性が決定された各配列ストレッチが少なくとも２００  ｂｐの長さを有する場合に、配列ストレッチの全長にわたって、ヌクレオチドの８０〜９８％のヌクレオチド同一性を有する相同な配列ストレッチの存在を決定することにより、分断点として決定された位置の予測配列の間で配列の相同性を決定する工程であって、そのような予測配列がリファレンスデータベース、詳細にはヒトリファレンスゲノムから取得される、前記工程；
該同定された相同配列ストレッチ内で、相同核酸配列の一部分に対する厳密な配列同一性を決定する工程であって、該厳密な同一性が、約２５  ｂｐ〜約８０  ｂｐの配列部分にわたって、詳細には少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５  ｂｐ、かつ特に８０  ｂｐ未満の配列にわたって存在する、前記工程；
及びそのような部分が存在する場合、そのような配列の同一性を表示し、そのような部分が配列再編成の分断点を含む可能性があることを報告する工程
を含む、前記方法に関する。
【００２３】
また、本発明は、染色体核酸、詳細にはヒト染色体核酸を代表する核酸を含む生体サンプルの核酸における、再編成、詳細には、大きな再編成に関連する分断点を検出するための方法であって：
生体サンプルの核酸を、特に分子コーミング、又は関連する直接マッピング法を用いて、マッピングする工程；
再編成のサイズ及び／又はサイズの信頼区間、再編成の一方の末端における１つの分断点の位置及び／又は位置の信頼区間、並びに再編成配列のもう一方の末端における分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を決定する工程；
核酸の相同性が決定された各配列ストレッチが少なくとも２００  ｂｐの長さを有する場合に、配列ストレッチの全長にわたって、ヌクレオチドの８０〜９８％のヌクレオチド同一性を有する相同な配列ストレッチの存在を決定することにより、分断点として決定された位置の予測配列の間で配列の相同性を決定する工程であって、そのような予測配列がリファレンスデータベース、詳細にはヒトリファレンスゲノムから取得される、前記工程；
該同定された相同配列ストレッチ内で、相同核酸配列の一部分に対する厳密な配列同一性を決定する工程であって、該厳密な同一性が、約２５  ｂｐ〜約８０  ｂｐの配列部分にわたって、詳細には少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５  ｂｐ、かつ特に８０  ｂｐ未満の配列にわたって存在する、前記工程；
そのような部分が存在する場合、そのような配列の同一性を表示し、そのような部分が配列再編成の分断点を含む可能性があると結論付ける工程；
分子的検査、詳細にはＰＣＲ増幅若しくは機能的に関連する方法、及び／又はシークエンシングにより、分断点の位置を確認する工程
を含む、前記方法にも関わる。
【００２４】
本発明に基づく方法の特定の実施態様に基づいて、サンプルの核酸内の相同性及び同一性は、ローカルアラインメント検索、詳細には連続的アラインメント検索により決定される。
【００２５】
本発明に基づく方法の特定の実施態様において、相同性検索では、ポリＮセグメント、すなわち、所与のヌクレオチド（Ｎ）のリピートであって、そのようなヌクレオチドが少なくとも５回連続してリピートされるものについて、相同性を決定することは除外される。
【００２６】
特定の実施態様において、本発明は、方法に関し、ここで、相同性の水準は、同一のヌクレオチドの８５〜９５％の範囲内である。
【００２７】
特に、本発明の方法に基づいて、相同性は２００〜５００  ｂｐ、詳細には２００〜３００  ｂｐ、詳細には約３００  ｂｐを有する配列上で決定される。
【００２８】
本発明のさらに特定の実施態様において、本明細書に定義される方法は、分断点の予測又は検出が、核酸配列の増幅、ゲノム核酸における配列の欠失からなる再編成に関連することを意図するものである。
【００２９】
本発明の方法の特定の実施態様において、分断点の予測又は検出は、ヒトゲノム配列を代表する核酸配列における再編成を検出した後に実施される。
【００３０】
本発明に基づく方法のさらに特定の実施態様において、分断点の予測又は検出は、疾患または疾患の素因と関連することの知られる遺伝子、例えば乳癌及び／又は卵巣癌の素因に関連する遺伝子、詳細にはＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２、リンチ症候群又は結腸癌の素因と関連する遺伝子、詳細にはＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、及びＰＭＳ２を含むゲノムの遺伝子座上で行われる。
【００３１】
本発明の方法の具体的な実施態様において、分断点はＢＲＣＡ１遺伝子座中に検出される。
【００３２】
また、本発明は本明細書に定義される方法に関し、ここで、分断点の確認は以下のように選択されるプライマーペアを用いるＰＣＲにより実施される：
１本のフォワードプライマーが、再編成の一方の末端における分断点である可能性のある位置から、優先的に５  ｋｂ未満、より優先的に２  ｋｂ未満、さらにより優先的に１  ｋｂ未満、及びさらにより優先的に５００  ｂｐ未満に位置し、かつ
１本のリバースプライマーが、再編成のもう一方の末端における分断点である可能性のある位置から、優先的に５  ｋｂ未満、より優先的に２  ｋｂ未満、さらにより優先的に１  ｋｂ未満、及びさらにより優先的に５００  ｂｐ未満に位置し、かつここで、プライマーは野生型サンプルにおけるＰＣＲによっては増幅できないように配向する。
【００３３】
また、本発明は、疾患の素因を検出するための、又は疾患、詳細には癌、特に乳癌若しくは卵巣癌を検出するための方法であって、本明細書に定義される通りに分断点の予測若しくは検出を実施することを含む、前記方法に関する。
【００３４】
本明細書で使用される「核酸」、及び詳細には「染色体を代表する核酸」という用語は、本明細書に定義される支持体に付着し、及びその上で伸張することのできる、より詳細には分子コーミング技術を用いることにより伸張することのできる、任意の型の核酸の１分子又は数個の分子を指す。また、核酸、詳細には「染色体を代表する核酸」は、ＰＣＲ又はＰＣＲに関連する方法を用いて増幅することができる、又はシークエンシング法を用いてシークエンスすることができる任意の型の核酸の１分子又は数個の分子を指す。核酸分子はＤＮＡ（詳細にはゲノムＤＮＡ、特に染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡ）及びＲＮＡ（詳細にはｍＲＮＡ）を含む。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、二本鎖であることが好ましい。
【００３５】
「所与の染色体を代表する核酸」は、該核酸が遺伝子情報、又は本発明の目的に対して不可欠な情報の全体を含み、該染色体上に存在することを意味する。詳細にはそれは染色体ＤＮＡである。
【００３６】
本明細書で使用される「物理的マッピング」とは、指定された配列ストレッチ、ゲノムＤＮＡ上の変異又はマーカーなどの特定の要素の相対的な位置を定義する遺伝子マップを、分子生物学技術を利用して創出することである。物理的マッピングは解析するゲノムＤＮＡを事前にシークエンシングすることを必要としない。物理的マッピング法により得られる物理的マップは、特定の要素を隔てる距離またはおよその距離についての情報を含むことができ、これらの要素の連なり、すなわち対象のゲノム領域中にそれらが現れる順番に関する情報に限定され得る。
【００３７】
特定の実施態様において、本発明の方法は、ＦＩＳＨ又は分子コーミング又は関連する直接マッピング法を用いて、ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての領域の物理的マッピングを可能とすることを含む。
【００３８】
ＦＩＳＨ：蛍光インサイチューハイブリダイゼーション。
【００３９】
「分子コーミング」は、特殊処理されたガラス表面に均一に、不可逆的に付着した単一のＤＮＡ分子を直接可視化するための技術である。核酸を伸張させる前に、通常核酸の取り扱いにより核酸の鎖（複数可）が無作為な位置で切断される。分子コーミングはＷＯ  ９５／２２０５６、ＷＯ  ９５／２１９３９、ＷＯ  ２００８／０２８９３１、及びＵＳ  ６，３０３，２９６に記載されている。
【００４０】
本明細書で使用される「分子コーミング及び関連する直接マッピング法」又は「分子コーミング又は関連する直接マッピング法」とは、分子コーミングを含む、単一ＤＮＡ線維上の所与の配列を隔てる距離又はおよその距離を直接測定する手段を提供する点で機能的に分子コーミングと類似した方法を指す。一部の方法では、指定された配列間の距離を厳密に決定することが可能である。厳密な測定とは、正確に１０，０００  ｂｐ（１０  ｋｂ）、１，０００  ｂｐ（１  ｋｂ）、１００  ｂｐ、１０  ｂｐ、又は１  ｂｐの距離を提供することであると理解することができる。他の方法では、およその距離しか測定できない。さらに他の方法では、ＤＮＡ線維上の配列の連なり、すなわち、これらの配列がＤＮＡ線維上で整列される順番のみを決定することができる。そのような配列は、ＤＮＡ線維上で複数個存在する可能性がある。これらの方法は必ずしも、本明細書で取り扱う増幅配列のサイズを正確に測定する手段を提供するものではないが、にもかかわらずこれらの方法でも、発明者らにより開示された方法に従って設計するならば、そのような増幅を通常検出することができる。分子コーミング及び関連する直接マッピング法は、指定配列間の物理的距離を直接測定すること、又は指定配列間の物理的距離に直接関連する物理値を測定することに依存し得る。そのような物理値としては、例えばＤＮＡ線維が、指定配列の通過時間を記録する検出器を既知の速度で移動させられる場合、時間が挙げられる。また、そのような値としては、全蛍光強度が全核酸含量と関連し、ＤＮＡ線維が、指定配列に含まれる蛍光強度を記録することのできる検出器の内部を移動させられる場合、検出器を通過するそのような全蛍光強度も挙げることができる。また、そのような方法は、例えば対象の配列が異なるマーカー又は異なるマーカーの組合わせ、蛍光により、又は別段に標識されており、かつ該方法がマーカーの連なり、すなわち、ＤＮＡ線維上でマーカーが整列される順番を読み取るための手段を提供する場合、対象の配列の連なりを直接読み取るための手段も提供することができる。
【００４１】
特定の実施態様において、分子コーミング及び関連する直接マッピング法は、ＤＮＡ伸張法である。核酸サンプルは通常、制御された伸張係数を用いて、直線状で平行な鎖として支持体上に伸張される。「伸張係数」という語は、本明細書において、伸張された核酸について測定された物理的距離を、該核酸の配列長と結び付けることを可能とする変換係数を意味する。そのような係数は、Ｘ  ｋｂ／μｍ、例えば２  ｋｂ／μｍと表すことができる。「制御された伸張係数」という語は、本明細書において、伸張係数が十分に一定かつ均一であり、その結果、検査サンプル上で較正プローブを使用してもしなくても、測定された物理的長さからハイブリダイゼーションシグナルの配列長を、高い信頼性で導き出すことを可能とする技術を意味する。
【００４２】
他のＤＮＡ伸張法は、分子コーミングの代替法として使用することができる。これらの方法は、例えば：
ＥＣＦ−ＦＩＳＨ（伸張クロマチン線維蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）、ハロ調製法と名付けられた方法、及び（Ｈｅｎｇらの文献、１９９２；Ｈａａｆ及びＷａｒｄの文献、１９９４；Ｗｉｅｇａｎｔらの文献、１９９２；Ｆｌｏｒｉｊｎらの文献、１９９５；Ｖａｎｄｒａａｇｅｒらの文献、１９９８、Ｒａａｐの文献、１９９８、Ｐａｌｏｔｉｅらの文献、１９９６；Ｆｒａｎｓｚらの文献、１９９６）に記載の他の方法に由来する、界面活性剤及び／又は高塩濃度を用い、場合によりインターカレーターへのインキュベーション及び／又はＵＶ光と組み合わせてＤＮＡを抽出することに基づく方法；及び
場合によってマイクロメートルスケール、又はナノメートルスケールの装置において、水力学的流動作用を通じて、又は毛管現象、重力、又は機械的力によるＤＮＡ分子に対する機械的牽引を通じてＤＮＡを伸張させることに基づき、該ＤＮＡが固体支持体上に固定されてもされていなくても、ＤＩＲＶＩＳＨ（直接視覚ハイブリダイゼーション）と呼ばれる方法、光学的マッピング、及びＰａｒｒａ及びＷｉｎｄｌｅの文献、１９９３；Ｒａａｐの文献、１９９８；Ｈｅｉｓｋａｎｅｎらの文献、１９９４；Ｈｅｉｓｋａｎｅｎらの文献、１９９５；Ｈｅｉｓｋａｎｅｎらの文献、１９９６、Ｍａｎｎらの文献、１９９６、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの文献、１９９３；Ｓａｍａｄらの文献、１９９５、Ｊｉｎｇらの文献、１９９８；Ｄｉｍａｌａｎｔａらの文献、Ｐａｌｏｔｉｅらの文献、１９９６；Ｌａｒｓｏｎらの文献、２００６に記載された他の方法に由来する方法を含む。
【００４３】
また、特定の実施態様において、分子コーミング又は関連する直接マッピング法を可能にする工程を含む本発明の検出法は、ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２の５’領域にかけての領域の同定を可能とする少なくとも１つのプローブ、２以上のプローブのセットを用いて１７番染色体を代表する核酸のハイブリダイゼーションを行う工程も含む。該プローブ（複数可）を用いたハイブリダイゼーションにより、反復、詳細には本発明の増幅配列の２倍化又は３倍化の存在の有無を決定することができる。
【００４４】
特定の実施態様において、ハイブリダイゼーションの工程に続いて、結果として得たハイブリダイゼーションパターンの解析であって：
結果として得たハイブリダイゼーションパターンを理論上のハイブリダイゼーションパターン、すなわち野生型サンプルについて予測されたハイブリダイゼーションパターンと比較すること；
該結果として得たハイブリダイゼーションパターンが、該理論上のハイブリダイゼーションパターンとの比較に際し追加的シグナルを含む場合に、サンプルが配列の増幅を含むと結論付けること；
任意に、追加的シグナルを生成するプローブを明確に同定できない場合、追加的シグナルを生成するプローブを明確に同定することを可能とする改変したプローブセットによる追加のハイブリダイゼーション工程を実施すること；
任意に、該追加的シグナルが複数の同一のパターンからなるか、これらを含む場合、配列増幅により増幅シグナルの２以上のコピーが追加されたと結論付けることからなるか、又はこれらを含む、前記解析を行う。
【００４５】
特定の実施態様において、分子コーミング又は関連する直接マッピング法は、少なくとも以下に示すプローブを用いた、１７番染色体を代表する核酸のハイブリダイゼーションの工程を含む：
ＢＲＣＡ遺伝子のイントロン２の同定を可能とする１つのプローブ又はプローブセット；
及びＮＢＲ２遺伝子の５’領域の同定を可能とする１つのプローブ又はプローブセット；
及び任意に、位置を確認し、かつ／又は上記プローブ又はプローブセットを明確に同定するための他のプローブ。
【００４６】
本明細書で定義される「プローブ」とは、ポリヌクレオチド、核酸／ポリペプチドハイブリッド、核酸／ポリペプチドハイブリッド、又はポリペプチドであって、これらは本明細書で定義される染色体を代表する核酸と、詳細にはＲＮＡ及びＤＮＡと、従ってプローブの標的となる該染色体を代表する核酸と塩基対を形成することにより、ハイブリダイズすることができる。特定の実施態様において、プローブは標的核酸と実質的に、又は完全に相補的であり、従ってストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成することができ、検出することができる。この用語は、ＲＮＡ（詳細には、ｍＲＮＡ）及びＤＮＡ（詳細には、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）分子、並びにペプチド核酸（ＰＮＡ）、及びタンパク質ドメインをも包含する。該ポリヌクレオチド又は核酸ハイブリッドは通常、少なくとも１００、３００、５００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも７００、８００、又は９００ヌクレオチド、及びより好ましくは少なくとも１、２、３、４、又は５  ｋｂを含むか、又はこれらからなる。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５  ｋｂ又は１５  ｋｂより長い、詳細には３０、５０、又は１００  ｋｂのプローブを使用することができる。特定の実施態様において、使用されるプローブの長さは、０．５〜５０  ｋｂの範囲、好ましくは１〜３０  ｋｂの範囲、及びより好ましくは１〜１０  ｋｂの範囲、４〜２０  ｋｂの範囲、４〜１０  ｋｂの範囲、又は５〜１０  ｋｂの範囲である。該ポリペプチドは通常少なくとも６ヌクレオチド、及びより好ましくは少なくとも１０、１５、２０ヌクレオチドの配列に特異的に結合する。本明細書で使用されるプローブ配列は、プローブがポリペプチドである場合、該ポリペプチドが特異的に結合する配列であるものとして理解されなくてはならない。本明細書で使用される、ゲノムの所与の領域に特異的なプローブ、又は所与の配列に特異的なプローブは、特定の条件下でゲノムの該所与の領域に、又は該所与の配列にハイブリダイズすることができるプローブであり、一方同じ条件下でこのプローブは、ゲノムのほとんどの他の領域、又は該配列と有意に異なる配列とはハイブリダイズしない。
【００４７】
特定の実施態様において、プローブ配列は、プローブがハイブリダイズするはずである、標的核酸の片方の鎖の一部の配列と、少なくとも９９％相補的であり、すなわち、少なくとも９９％同一であり、又は少なくとも９９％類似する。
【００４８】
本発明に関する「相補的配列」という用語は、「相補的な」及び「逆の」又は「反対の」配列、すなわち、該配列を有するＤＮＡ鎖とＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用により結合するであろうＤＮＡ鎖の配列を意味する。
【００４９】
通常、プローブは化学性又は放射性マーカーなどのマーカーでタグ付けされ、又は標識され、これらのマーカーは、プローブがその相補物と結合した際に、プローブを検出することを可能とする。本明細書に記載されるプローブは通常、青、緑、又は赤の色素など特定の色を有する蛍光色素などの視覚的マーカーでタグ付けされる。本発明に基づく一部のプローブは、ＢＲＣＡ１遺伝子及び周辺の遺伝子座の特定の部分又はセグメントを認識するように選択される。
【００５０】
特定の実施態様において、分子コーミング又は関連する直接マッピング法に使用される核酸サンプルは、ゲノムＤＮＡ、詳細には全ゲノムＤＮＡ、又はより好ましくは染色体ゲノムＤＮＡ（核ゲノムＤＮＡ）、及び／又はこれらの断片である。該断片はどのようなサイズでもよく、最も長い分子は数メガベース（数千ｋｂ）に到達する。該断片は通常１０〜２０００  ｋｂの間、より好ましくは２００〜７００  ｋｂの間に含まれ、及び平均で約３００  ｋｂである。
【００５１】
本発明の方法で使用される核酸サンプルは、体液から、又は生体起源の組織から取得することができ、組織を含む該生体サンプルは、例えばヒト（本明細書では患者とも呼ぶ）から単離される。
【００５２】
配列長は、本明細書ではｋｂ（キロ塩基対、すなわち、１０００塩基対）又はｂｐ（塩基対）と表現される。遺伝子配列の長さは通常二本鎖の核酸上で測定され、従って塩基対で表現される。ここで、各塩基対は、一方の鎖上の１つのヌクレオチド及び他方の鎖上の相補的ヌクレオチドでできている。一本鎖核酸に適用された場合、塩基対での測定は、対応する二本鎖核酸、すなわち、対象の一本鎖核酸が、逆方向の相補的核酸と対合してできた核酸の測定に対応すると理解される。
【００５３】
特定の実施態様において、本発明は：
１７番染色体を代表する核酸を、ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての領域、又はこの領域の一部を同定することを可能にする、少なくとも１つのプローブ又はプローブセットを含むプローブセットとハイブリダイズさせること；  
該プローブ又はプローブセットにより認識される領域のサイズを測定すること；
測定されたサイズを該領域又は該領域の該部分の単一コピーのサイズと比較すること；
測定されたサイズが該領域又は該領域の該部分の単一コピーのサイズより大きい場合、サンプルが該領域に配列増幅を含むと結論付けること；
及び、任意に、測定されたサイズが該領域又は該領域の該部分の２つのタンデムなコピーの予測サイズよりも大きい場合、サンプルが該領域に配列増幅を含み、増幅配列の２以上の追加的なコピーが伴うと結論付けることからなるか、又はこれらを含む。
【００５４】
特定の実施態様において、ハイブリダイゼーションの工程に続けて、解析の工程であって：
増幅配列の一方の末端上の、分断点の位置、及び／又は該分断点の位置の信頼区間を決定すること；
増幅配列のサイズ、及び／又は増幅配列のサイズの信頼区間を決定すること；
上記位置及びサイズ、並びに／又は位置、及び／若しくはサイズの信頼区間から、増幅配列のもう一方の末端にある、分断点の位置、及び／若しくは位置の信頼区間を決定することからなる、又はこれらを含む、前記工程を行う。
【００５５】
また、本明細書に開示される発明は、患者のゲノム中における遺伝子配列の増幅の存在の有無をインビトロで検査するための方法であって：
患者からＤＮＡサンプルを取得すること；
ＤＮＡサンプルをＢＲＣＡ１遺伝子のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけてのゲノム領域の物理的マッピングを可能とする手順にかけること；
ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての６  ｋｂ〜８  ｋｂの配列の３以上連続するコピーを検出することを含む、前記方法を提供する。
【００５６】
また、本発明は先の段落に記載された方法を用いて患者のゲノム中における遺伝子配列の増幅の存在の有無をインビトロで検査するためのキットも提供する。
【００５７】
「野生型」：この表現は所与の遺伝子又はゲノム領域の改変されていない配列、すなわちリファレンスヒトゲノム配列に公開された配列を有する遺伝子又はゲノム領域を指す。本明細書で考慮するのは大きな再編成、リファレンス配列と比較して１  ｋｂより大きい配列が改変された（欠失、増幅、逆位、又は別段に改変された）場合のみであるため、野生型という表現は、リファレンスヒトゲノム配列との１  ｋｂ未満の違いを有する配列を指す。
【００５８】
「ＰＣＲ」：ポリメラーゼ連鎖反応
「ＰＣＲ及び関連する方法」：本明細書で使用する場合、この表現は、その末端及びそのサイズの配列により特徴づけられる、１つ又は複数のＤＮＡ断片をサンプル中で検出し、かつ任意に定量することを可能とする、いかなる方法をも指す。この表現は、限定はされないが、ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、等温増幅法（Ｇｉｌｌ及びＧｈａｅｍｉの文献、２００８）、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（ＭＬＰＡ、Ｓｃｈｏｕｔｅｎらの文献、２００２）を含む。
【００５９】
「分断点」：本明細書で使用する場合、この表現は、ＤＮＡサンプル中に見出される再編成の末端のゲノム中の位置を指す。この表現は、分断点の一方の側では、ＤＮＡサンプルの配列がリファレンスヒトゲノム配列と同一であるのに対し、もう一方の側では、配列が野生型配列と異なることを示唆する。また、分断点と重なる配列も、リファレンスヒトゲノム配列と異なる。
【００６０】
「リファレンスヒトゲノム配列」：本明細書で使用されるリファレンス配列は、２０１３年３月１日更新のｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕで利用可能なヒトゲノムビルド  ＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９である。
【００６１】
「ゲノム位置」：ゲノム位置は、リファレンスヒトゲノムの番号に対応するヌクレオチドの位置として与えられる。本明細書で使用される「ゲノム座標」は、同じ意味である。別段に指定されない限り、本明細書において与えられるゲノム座標又はゲノム位置は、１７番染色体に由来する。ゲノム位置がセントロメアにより近い側に位置する（例えば、両方が１７番染色体の「ｑ」腕にある際に、より小さな位置番号を有する）場合、本明細書において、ゲノム位置は染色体の同じ腕にあるもう１つの位置の「上流」にあると記載される。反対に、ゲノム位置がセントロメアからより遠くに位置する（例えば、両方が１７番染色体の「ｑ」腕にある際に、より大きな位置番号を有する）場合、染色体の同じ腕にあるもう１つの位置の「下流」にあると記載される。
【００６２】
「医学的追跡調査の適応」：本明細書で使用される場合、この表現は例えば患者における癌のリスク又は素因が一般集団と比較して高い場合に、この患者に対する医学的又は臨床的調査を改変することを指す。例えば、一般集団に対しては、定期的な生物学的又は臨床的特性のモニタリングを所与の頻度で行うことが望ましい（例えば、乳癌の場合、マンモグラフィーは５年に１回行うことが推奨される）のに対し、疾患の高リスク患者に対しては、このモニタリングをより高頻度で行うことが望ましい（例えば、乳癌のリスクが高い場合、マンモグラフィーは毎年行うことが推奨される）。医学的追跡調査の適応は、処方箋でも、適応追跡調査を勧めることでもよい（それに際し患者が処方箋又は勧めに従うかどうかは問題ではない）。適応追跡調査の実施、又は医学的追跡調査に適応することを目的として実施される他の何らかの行為でもよい。
【００６３】
「予測的遺伝子検査」：出生後、多くの場合、中年期以降に現われる障害と関連する遺伝子変異を検出するために使用される、ヒト生体サンプル（例えば：血液）から単離されたＤＮＡ分子の直接解析を含むスクリーニング手順。これらの検査は、遺伝子障害を有する家族の一員がいるが、検査の時点で自分自身に障害の特徴がない人々にとって役立ち得る。予測的検査は、ヒトが、遺伝的基礎がある障害、例えば、特定のタイプの癌を発症する可能性を増大させる変異を同定することができる。
【００６４】
「ポリヌクレオチド」：この用語は、天然のＤＮＡ及びＲＮＡポリヌクレオチド分子（配列とも表記される）、並びに例えば、その安定性を増大させる改変された構造を有するＤＮＡ又はＲＮＡ類似体を包含する。分子コーミングに使用されるゲノムＤＮＡは、通常、生体サンプルから単離されるような、改変されていない形態にある。プライマーとして使用される、ポリヌクレオチド、通常、ＤＮＡは、改変されていなくても、改変されていてもよいが、ＤＮＡを増幅させる際に使用するのに好適な形態にある。同様に、プローブとして使用されるポリヌクレオチドは、相補的標的配列に結合することができる未改変又は改変ポリヌクレオチドであることができる。この用語は、他のポリヌクレオチドの断片、例えば、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、又はそれよりも多くの連続ヌクレオチドを有する断片であるポリヌクレオチドを包含する。
【００６５】
「ＢＲＣＡ１遺伝子座」：この遺伝子座は、８１ｋｂのサイズ（リファレンスゲノムビルドＧＲＣｈ３７／ｈｇ１９）を有する、塩基対４１，１９６，３１１〜塩基対４１，２７７，４９９の、１７番染色体の長（ｑ）腕のバンド２１に位置するヒトＢＲＣＡ１遺伝子（遺伝子ＩＤ：６７２、リファレンス配列ＮＭ＿００７２９４）のコード部分、並びにそのイントロン及びフランキング配列を包含する。フランキング配列に続いて、ＢＲＣＡ１  ＧＭＣには：ＢＲＣＡ１遺伝子の上流の１０２  ｋｂ（４１，２７７，５００〜４１，３７９，５００）及びＢＲＣＡ１遺伝子の下流の２４  ｋｂ（４１，１９６，３１０〜４１，１７２，３１０）が含まれている。従って、ＢＲＣＡ１  ＧＭＣは２０７  ｋｂのゲノム領域をカバーしている。
【００６６】
「ＢＲＣＡ１遺伝子及び周辺の遺伝子座」：本明細書において、この表現は、ＢＲＣＡ１遺伝子及び両側の〜３００  ｋｂのフランキング部分を含むヒトゲノム部分を指し、ゲノム位置４０，９００，０００〜４１，６００，０００に対応する。
【００６７】
「ＢＲＣＡ１のイントロン２」：本明細書で使用される場合、この表現はＢＲＣＡ１のエキソン２及びエキソン３の間、すなわちゲノム位置４１，２６７，７７０及び４１，２７６，０００の間に含まれるゲノム領域を指す。
【００６８】
「ＮＢＲ２遺伝子」：この遺伝子はヒトゲノムリファレンス配列において、位置４１，２７７，６００〜４１，２９２，３４２にマッピングされる。本明細書で使用されるＮＢＲ２の５'領域は、位置４１，２７７，６００及び４１，２８２，６００の間に含まれるゲノム領域である。
【００６９】
「ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての配列」：この表現は、一方の末端をＢＲＣＡ１のイントロン２の内部に有し、かつ一方の末端をＮＢＲ２遺伝子の内部に有する配列を指す。そのような配列は必然的にＢＲＣＡ１のエキソン１ａ、１ｂ、及び２を含む。そのような配列はゲノム位置４１，２７６，０００の上流に位置する一方の末端、及びゲノム位置４１，２７７，６００の下流に位置する一方の末端を有する。
【００７０】
「ＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけての領域」：この表現は、ゲノム位置４１，２７０，０００（ＢＲＣＡ１のエキソン２及び３の間に位置する位置）から４１，２８２，６００（ＮＢＲ２遺伝子中に位置する位置）にかけてのヒトゲノム部分を指す。
【００７１】
「生殖系列再編成」：体細胞で起こる体細胞再編成と区別されるべき、有性生殖する生物体の配偶子を生じる任意の生体細胞で起こる遺伝子再編成を伴う遺伝子変異。
【００７２】
本発明の中の「増幅配列」は、ゲノム中の反復された（すなわち、コピーされた）ＤＮＡストレッチ、詳細には、リピートされ、その結果精査されたゲノム及びゲノム座位の中に、該ＤＮＡの少なくとも２つの同一のストレッチ、又はＤＮＡの少なくとも３つの同一のストレッチが存在するＤＮＡストレッチを包含する。詳細には、精査されたＤＮＡのストレッチは２倍化するか（ＤＮＡストレッチの追加的コピーが１つ存在する、すなわち、同じ配列がゲノム又はゲノム座位の中に２つ存在する）、又は３倍化する（ＤＮＡストレッチの追加的コピーが２つ存在する、すなわち、同じ配列がゲノム又はゲノム座位の中に３つ存在する）。「タンデム増幅」：２倍化して２以上の隣接するコピーを生じさせて、タンデムリピート配列となったＤＮＡのストレッチにより特徴づけられる変異。
【００７３】
「タンデムリピート配列」：配列の２以上の隣接するコピーからなるＤＮＡのストレッチ。リピート配列中のこの配列の単一のコピーを「リピート単位」と呼ぶ。自然に生じる遺伝子増幅は、通常、完全に保存的であるわけではない、すなわち、詳細には、リピート単位の両端は、再編成され、変異し、及び／又は切断され得る。本発明において、９０％を上回る相同性を有する２以上の隣接配列は、等価なリピート単位からなるリピート配列とみなされる。別途指定されない限り、タンデムリピート配列内のリピート単位の向きは想定されない。タンデムリピート配列内のそのようなリピート単位は、リピート配列に属さない１００個未満、又は１０個未満、又は５個未満又は０個のヌクレオチドによって隔たれ得る。
【００７４】
「複雑な再編成」：単純な欠失又は単純な２倍化とは区別することができる任意の遺伝子再編成。例として、転座、又は逆位、又は複数の２倍化の組み合わせ、又は欠失及び２倍化の組み合わせがある。
【００７５】
「検出可能な標識又はマーカー」：ポリヌクレオチドに付着させることができる任意の分子であって、その位置が、例えば、蛍光顕微鏡法、酵素検出、放射能などの手段によって決定されることができるか、又は２０１０年２月１８日に公開されたＵＳ出願第ＵＳ２０１０／００４１０３６Ａ１号に記載されている、前記分子。
【００７６】
「プライマー」：この用語は、ポリヌクレオチド合成の出発点としての役割を果たす核酸分子（配列とも表記される）としてのその従来の意味を有する。詳細には、プライマーは、２０〜４０ヌクレオチド長を有することができ、また、標的と塩基対形成しないヌクレオチドを含むことができ、その３'末端に十分なヌクレオチド、特に、少なくとも２０個の、該標的とハイブリダイズするヌクレオチドを提供する。本明細書に記載されている本発明のプライマーを対にしてＰＣＲ手順に使用したり、又は単独でシークエンシング手順に使用したりする。
【００７７】
「ゲノムモールスコード（複数可）」：ＧＭＣは、特定のゲノム領域を物理的にマッピングするために設計された、一連の「ドット」（特定のサイズ及び色を有するＤＮＡプローブ）及び「ダッシュ」（ＤＮＡプローブ間に位置する特定のサイズを有する無色のスペース）である。特定の遺伝子又は遺伝子座のＧＭＣは、他の遺伝子又は遺伝子座のＧＭＣによって得られるシグナルと区別することができる独特のカラー「シグネチャー」によって特徴付けられる。高解像度ＧＭＣ用のＤＮＡプローブの設計は、特殊なバイオインフォマティクス解析及び対象のゲノム領域のプラスミドベクターへの物理的クローニングを必要とする。低解像度ＣＢＣは、バイオインフォマティクス解析もクローニング手順もなしで確立されている。
【００７８】
「反復配列」：ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２遺伝子座は、様々な種類の反復配列：ＳＩＮＥ、ＬＩＮＥ、ＬＴＲ、及びＡｌｕを含む。そのような反復配列は、例えばプライマーが非特異的に結合するために、分子的検査を困難にすることが知られている。そのような反復配列、及び反復配列に富んだ領域は、おそらくは相同組換えや類似の機構が原因となって、再編成を受けやすいことが知られている（ｖａｎ  Ｂｉｎｓｂｅｒｇｅｎらの文献、２０１１）。
【００７９】
本明細書で使用される「サンプル」又は「生体サンプル」という用語は、１以上の対象成分を含む、通常、流体の形態にあるが、必ずしもそうである必要はない、材料又は材料の混合物に関する。分子コーミングのために、サンプルは、詳細には診断用途に好適で、通常患者から取得される、生体源由来のゲノムＤＮＡを含む。本発明は、サンプルに対するインビトロでの実施に好適な手段、特に、ポリヌクレオチド、及び方法に関わる。
【００８０】
「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリン及びピリミジン塩基だけでなく、改変されている他の複素環塩基も含む部分を含むことが意図される。そのような改変としては、メチル化されたプリン又はピリミジン、アシル化されたプリン又はピリミジン、アルキル化されたリボース又は他の複素環が挙げられる。さらに、「ヌクレオシド」及び「ヌクレオチド」という用語は、従来のリボース及びデオキシリボース糖だけでなく、他の糖も同様に含む部分を含む。改変されたヌクレオシド又はヌクレオチドは、例えば、水酸基の１つ又は複数が、ハロゲン原子もしくは脂肪族基と置換されているか、又はエーテル、アミンなどとして官能基化されている、糖部分上の改変も含む。
【００８１】
本明細書で使用される「ストリンジェントな条件」という用語は、所望のレベルの特異性をアッセイで提供するための相補性が十分な核酸、例えば、表面結合した及び溶液相の核酸の結合対の生成に適合している一方、所望の特異性を提供するための相補性が不十分な結合メンバー間での結合対の形成にはあまり適合していない条件を指す。ストリンジェントなアッセイ条件は、ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件の両方の合計又は組合わせ（全体）である。
【００８２】
核酸ハイブリダイゼーションに関する（例えば、分子コーミングに、又はＧＭＣに有用なプローブの同定に必要とされる）「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」及び「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる実験パラメータの下では異なる。本発明の範囲内の核酸を同定するために使用することができるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ＳＤＳを含むバッファー中、４２℃でのハイブリダイゼーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ＳＤＳを含むバッファー中、６５℃でのハイブリダイゼーション（どちらも０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳによる６５℃での洗浄を含む）を挙げることができる。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、４０％ホルムアミド、１  Ｍ  ＮａＣｌ、及び１％ＳＤＳのバッファー中、３７℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ中、４５℃での洗浄を挙げることもできる。或いは、フィルターに結合したＤＮＡとの、０．５  Ｍ  ＮａＨＰ０４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃での洗浄を利用することができる。またさらなるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、６０℃以上及び３×ＳＳＣ（４５０  ｍＭ塩化ナトリウム／４５  ｍＭクエン酸ナトリウム）でのハイブリダイゼーション、又は３０％ホルムアミド、１  Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％サルコシンナトリウム、５０  ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ  ６．５を含む溶液中、４２℃でのインキュベーションが挙げられる。当業者は、代替的ではあるが、同等のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供することができることを容易に認識するであろう。
【００８３】
所与のゲノム座位に「位置する」プローブ又はプライマーとは、ヒトゲノムのこの座位の配列にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを意味する。通常、プローブは二本鎖であり、したがって、所与の座位の配列と同一である鎖及び所与の座位の配列と逆相補的であるもう１つの鎖を含む。プライマーは一本鎖であり、別途文脈により指定又は指示されない限り、その配列は、所与の座位の配列と同一である。指定される場合、配列は、所与の座位の配列と逆相補的であってもよい。特定の実施態様において、洗浄条件のストリンジェンシーは、核酸が、表面結合した核酸に特異的にハイブリダイズするかどうかを決定する条件を示す。核酸を同定するために使用される洗浄条件としては、例えば、約０．０２  Ｍの塩濃度、ｐＨ  ７、及び少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度；又は約０．１５  Ｍ  ＮａＣｌの塩濃度、７２℃で約１５分間；又は約０．２×ＳＳＣの塩濃度、少なくとも約５０℃もしくは約５５℃〜約６０℃の温度で約１５〜約２０分間；又はハイブリダイゼーション複合体を、０．１％ＳＤＳを含む約２×ＳＳＣの塩濃度の溶液で、室温で１５分間、２回洗浄し、その後、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣで、６８℃で１５分間２回洗浄すること；又は同等の条件を挙げることができる。洗浄のためのストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、４２℃であることもできる。ストリンジェントなアッセイ条件の具体的な例は、合計の一価陽イオン濃度が１．５  Ｍである塩ベースのハイブリダイゼーションバッファー中、６５℃での回転ハイブリダイゼーションと、それに続く、０．５×ＳＳＣ及び０．１×ＳＳＣによる室温での洗浄である。ストリンジェントなアッセイ条件は、少なくとも上記の代表的な条件と同じくらいストリンジェントであるハイブリダイゼーション条件であり、その場合、所与の組の条件は、所望の特異性を提供するのに十分な相補性を欠くさらなる結合複合体が、上記の特定の条件と比べて該所与の組の条件で実質的に生じない場合、少なくともストリンジェントであるとみなされ、その場合、「実質的に超えない」とは、約５倍未満、通常、約３倍未満であることを意味する。その他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は当業者に公知であり、適宜、利用することができる。
【００８４】
「感度」は、サンプル中の対象の核酸を検出するアッセイの能力を説明するものである。例えば、サンプル中の低濃度の対象の核酸を検出することができる場合、アッセイは高い感度を有する。逆に、サンプル中の高濃度の対象の核酸しか検出しない場合、所与のアッセイは低い感度を有する。所与のアッセイの感度は、利用される試薬の特異性（例えば、標識の種類、結合分子の種類など）、利用されるアッセイ条件、利用される検出プロトコルなどを含む、いくつかのパラメータによって決まる。分子コーミング及びＧＭＣハイブリダイゼーションとの関連において、所与のアッセイの感度は、表面に固定した核酸の性質、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件の性質、標識系の性質、検出系の性質などのうちの１つ又は複数によって決まり得る。
【００８５】
従って、本発明は個別に、又は任意の組み合わせで行われる以下の実施態様のそれぞれ及びいずれかに関する。詳細には、本発明は以下の方法に関わる。
【００８６】
任意に、本発明の方法は、統計的計算により分断点の位置を指定することを含む。
【００８７】
任意に、本発明の方法は、分断点を含むと推測される領域の配列比較により分断点を指定することを含む。
【００８８】
任意に、本発明の方法は、潜在的な分断点を、相同性が８０％より高く、２００  ｂｐより大きく、１００％の同一性を有する２５  ｂｐより大きいストレッチを含む配列として同定することを含む。
【００８９】
任意に、本発明の方法は、ＰＣＲ及び関連する方法及び／又はシークエンシングにより分断点の位置をさらに指定し、確認することを含む。
【実施例】
【００９０】
（実施例）
（１．  材料及び方法）
（事前患者スクリーニング）
全ヒトゲノムＤＮＡを、キュリー研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｕｒｉｅ，  Ｐａｒｉｓ）から取得したＥＢＶ不死化リンパ芽球様細胞株番号１０７９９００１，  ３８及び４０から取得した。大きな再編成の事前スクリーニングは、Ｃａｓｉｌｌｉら及びＴｏｕｒｎｉｅｒらによって記載されている条件（Ｃａｓｉｌｌｉらの文献、２００２）でのＱＭＰＳＦアッセイ（短い蛍光小断片定量的マルチプレックスＰＣＲ）、ＢＲＣＡ１に対してはＳＡＬＳＡ  ＭＬＰＡキットＰ００２（ＭＲＣ  Ｈｏｌｌａｎｄ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用い、及びＢＲＣＡ２に対してはＰ０４５（ＭＲＣ  Ｈｏｌｌａｎｄ）を用いたＭＬＰＡ（マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅）によって実施した。ＢＲＣＡ１の解析については、患者より明文の承諾を得た。
【００９１】
（分子コーミング）
（サンプル調製）
全ヒトゲノムＤＮＡをＥＢＶ不死化リンパ芽球様細胞株から得た。４５  μＬの１０６個の細胞のＰＢＳ懸濁液を、事前に５０℃で平衡化した１×ＰＢＳ中で調製した等容量の１．２％  Ｎｕｓｉｅｖｅ  ＧＴＧアガロース（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と混合した。プラグを４℃で３０分間固化させておき、その後、細胞膜を可溶化し、タンパク質を、２５０  μＬの０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０、１％サルコシル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）、及び２  ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，  Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，  Ｆｒａｎｃｅ）中、５０℃での終夜インキュベーションにより消化し、プラグを、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０中、室温で３回洗浄した。その後、プラグを、０．５  Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０中、４℃で保存するか、又はすぐに使用した。保存したプラグは、使用前に、１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１  ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ  ８．０中で３０分間、３回洗浄した。
【００９２】
（プローブ調製）
全てのＢＲＣＡ１プローブは、ＰＣＲアンプリコンをインサートとして用いて、ＴＯＰＯクローニングによりｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏ又はｐＣＲ−ＸＬ−Ｔｏｐｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドにクローニングした。アンプリコンは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）を鋳型ＤＮＡとして用いて得られた。ＢＲＣＡについて、２０７  ｋｂのＢＡＣ  ＲＰ１１−８３１Ｆ１３（ｃｈ１７：  ４１１７２４８２〜４１３７９５９４、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）をプローブのクローニングに使用した。プラスミドの全体を、ランダムプライミングによるプローブ標識のための鋳型として使用した。簡潔に述べると、ビオチン（Ｂｉｏｔ）標識のために、２００ｎｇの鋳型を、終夜標識反応で、製造業者の指示に従って、ＤＮＡ  Ｂｉｏｐｒｉｍｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。Ａｌｅｘａ−４８８（Ａ４８８）又はジゴキシゲニン（Ｄｉｇ）標識のために、同じキット及びプロトコルを使用したが、関連する標識ｄＮＴＰ、すなわち、Ｄｉｇ−１１−ｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  Ｍｅｙｌａｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）又はＡ４８８−７−ＯＢＥＡ  ｄＣＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びその非標識同等品をどちらも１００  μＭで、かつ他の全てのｄＮＴＰを２００  μＭで含むようにｄＮＴＰ混合物を改変した。標識プローブを２０℃で保存した。各カバースリップについて、５  μＬの各標識プローブ（標識反応産物の１／１０）を１０  μｇのヒトＣｏｔ  １及び１０  μｇのニシン精子ＤＮＡ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）と混合し、エタノール中で沈殿させた。その後、ペレットを、２２  μＬの５０％ホルムアミド、３０％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ａｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ＳＳＣ、２．５％サルコシル、０．２５％ＳＤＳ、及び５  ｍＭ  ＮａＣｌに再懸濁させた。
【００９３】
Ｓｙｎｔ１：本明細書に記載されるＳｙｎｔ１プローブは、鋳型としてのＢＡＣ  ＲＰ１１−８３１Ｆ１３及び２つの以下のプライマー：Ｓｙｎｔ１−Ｆ
【化１】
0006445469.tif 000002
及びＳｙｎｔ１−Ｒ
【化２】
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を使用したＰＣＲ増幅の結果である。Ｓｙｎｔ１プローブの予測配列は以下の通りである（ゲノム座標４１，２６９，７８５〜４１，２７４，２６９と対応する）：
【化３】
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【００９４】
Ｓ７：本明細書に記載されるＳ７プローブは、鋳型としてのＢＡＣ  ＲＰ１１−８３１Ｆ１３及び位置４１，２７５，３９９
【化４】
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及び４１，２７８，７０７
【化５】
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のリファレンスヒトゲノム配列に対応するプライマーを使用したＰＣＲ増幅の結果である。Ｓ７プローブの予測配列は以下の通りである（ゲノム座標は、４１２７５３９９〜４１２７８７０７に対応する）：
【化６】
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【００９５】
（ゲノムＤＮＡコーミング及びプローブハイブリダイゼーション）
ゲノムＤＮＡを、３  μＭ  Ｙｏｙｏ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含む４０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２  ｍＭ  ＥＤＴＡ中、暗所、室温での１時間のインキュベーションにより染色した。その後、プラグを１  ｍＬの０．５  Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ  ５．５に移し、６８℃で２０分間インキュベートして、アガロースを融解させ、その後、１．５ＵのβアガラーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）とともに、４２℃で一晩インキュベートした。該溶液を、１  ｍＬの０．５  Ｍ  ＭＥＳ  ｐＨ  ５．５を既に含むコーミング容器に移し、ＤＮＡコーミングを、専用カバースリップ（コーミカバースリップ（Ｃｏｍｂｉｃｏｖｅｒｓｌｉｐ））（両方ともＧｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｓｉｏｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ製）上で、分子コーミングシステムを用いて実施した。その後、ＤＮＡがコーミングされたコーミカバースリップを６０℃で４時間焼く。該カバースリップを−２０℃で保存するか、又はすぐにハイブリダイゼーションに使用した。コーミングの質（ＤＮＡ分子の直線性及び密度）を、ＦＩＴＣフィルターセット及び４０倍空気対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡下で推定した。新たにコーミングされたカバースリップを、１  μＬのＹｏｙｏ−１溶液を含む１  ｍｌのＰｒｏＬｏｎｇ−ｇｏｌｄ溶液（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のうちの２０  μＬにマウントする。ハイブリダイゼーションの前に、カバースリップを、７０％、９０％、及び１００％エタノール浴中での３分間の連続インキュベーションにより脱水し、その後、室温で１０分間風乾させた。プローブミックス（２０  μＬ；プローブ調製を参照）をカバースリップ上で行き渡らせ、その後、９０℃で５分間変性させておき、ハイブリダイザー（Ｄａｋｏ）中、３７℃で一晩ハイブリダイズさせておいた。カバースリップを、５０％ホルムアミド、１×ＳＳＣ中で、５分間３回、その後、２×ＳＳＣ中で、３×３分間洗浄した。ランダムプライミング反応で利用された改変ヌクレオチド（上記参照）に応じて、連続２層又は３層のフルオロフォア又はストレプトアビジンコンジュゲート抗体で検出を実施した。ビオチン標識プローブの検出のために、使用された抗体は、１番目及び３番目の層については、ストレプトアビジン−Ａ５９４（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、２番目の層についてはビオチン化ヤギ抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）であり；Ａ４８８標識プローブの検出のために、使用された抗体は、１番目については、ウサギ抗Ａ４８８（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、２番目の層については、ヤギ抗ウサギＡ４８８（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であり；ジゴキシゲニン標識プローブの検出のために、使用された抗体は、１番目の層については、マウス抗Ｄｉｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、２番目の層については、ラット抗マウスＡＭＣＡ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）、及び３番目の層については、ヤギ抗マウスＡ３５０（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であった��２０分間のインキュベーション工程を、各層について、湿潤チャンバー中、３７℃で実施し、層と層の間を、２×ＳＳＣ、０．１％Ｔｗｅｅｎ中、室温で、連続３回３分間洗浄した。ＰＢＳ中でのさらに３回の３分間の洗浄、並びに７０％、９０％、及び１００％エタノール中での連続３分間の洗浄による脱水を実施した後、カバースリップを標本化した。
【００９６】
（画像の獲得）
画像の獲得は、カスタマイズされた自動化蛍光顕微鏡（Ｉｍａｇｅ  Ｘｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を４０倍の倍率で用いて実施し、画像解析及びシグナル測定は、ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ）及びＪＭｅａｓｕｒｅ（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｓｉｏｎ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いて実施した。ＢＲＣＡ１プローブに対応するハイブリダイゼーションシグナルは、プローブの連なりによって作られる特定のパターンに基づいて操作者によって選択された。同じＤＮＡ線維に属する全てのモチーフシグナルについて、操作者は、各セグメントの末端を同定し、その同一性及び長さ（ｋｂ）を１：１スケールの画像上で決定した。その後、データをスプレッドシートとして出力した。最終的な解析では、無傷のシグナルのみを検討した。すなわち、線維の切断がＢＲＣＡ１モチーフ内で生じなかった場合のシグナルのみを検討した。
【００９７】
（統計解析）
分子コーミングは、ＤＮＡ分子が２  ｋｂ／μｍに近い伸張係数で均一に伸張することを可能とする（Ｍｉｃｈａｌｅｔらの文献、１９９７）。各モチーフについて、以下の値が決定された：測定画像数（ｎ）、理論計算長（ｋｂ単位）、平均測定長（ｋｂ）、標準偏差（ｓｄ、ｋｂ単位）、分散係数（ＣＶ、％単位）、測定長及び計算長の差（Δ、ｋｂ単位）。
【００９８】
（２．  結果）
（高解像度のＢＲＣＡ１ゲノムモールスコードｖ４．０の設計）
設計されたＢＲＣＡ１  ＧＭＣ  ｖ４．０を電子的に再構成したものが、図１に示されている。ＢＲＣＡ１  ＧＭＣは、２００  ｋｂの領域をカバーし、上流の遺伝子であるＮＢＲ１、ＮＢＲ２、ＬＯＣ１００１３３１６６、及びＴＭＥＭ１０６Ａ、並びに偽遺伝子ＢＲＣＡ１Ｐ１を含んでいる。完全なＢＲＣＡ１  ＧＭＣは１４個のシグナルからなる。ＧＭＣを認識し、測定する助けとするため、ＢＲＣＡ１＋ＮＢＲ２遺伝子上のシグナルを一緒にして、「モチーフ」と呼ぶ８つの特定のパターン（ｍ１ｂ１〜ｍ８ｂ１）にグループ分けした。
【００９９】
（分子コーミングによるＢＲＣＡ１のエキソン１ａ、１ｂ、及び２における新規タンデムリピート３倍化の特徴づけ）
ＢＲＣＡ１上に大きな再編成が存在することは、初めはハイブリダイゼーションシグナルを目で精査することにより同定された。検出されたシグナル画分は、Ｓ７及びＳ８プローブのシグナルの間に、Ｓｙｎｔ１及びＳ７プローブの色と対応する、２対の追加的なシグナルが存在する点で、正常なパターンとは異なるハイブリダイゼーションパターンを示していた（図２Ａ）。
【０１００】
ＧＭＣ中の一部のプローブの色を改変して、対応するハイブリダイゼーションシグナルの変化を観察する色交換実験により、該シグナルはこれらのプローブに起因することが示された。一実験において、例えば、Ｓ７プローブを緑から青に変更したところ、２倍化シグナルの色が同じ形で変化した（図２Ｂ）。
【０１０１】
Ｓ７プローブについての２倍化シグナルは、Ｓ７プローブの全長と対応することが見出された一方、Ｓｙｎｔ１プローブについての追加的なシグナルは、Ｓｙｎｔ１プローブの一部のみと対応することが見出された。このことは、このサンプル中には改変されていない野生型アリルに加え、Ｓｙｎｔ１プローブから、Ｓ７及びＳ８プローブ間のギャップにかけての領域に増幅を有する、変異アリルが存在することを示唆していた。
【０１０２】
両アリルに由来するシグナルについて独立に測定を実施し、該シグナルはハイブリダイゼーションパターンに基づいて、操作者によりいずれかのアリルに帰属された。
【０１０３】
一実験において、改変されていないモチーフ（野生型アリルに由来するものでも、変異アリルの未改変の領域に由来するものでもよい）の測定から、ＳＦが１．８  ｋｂ／μｍであることが確立された。変異アリルにおいて、Ｓｙｎｔ１からＳ８までの距離を測定すると、野生型アリルについての予測サイズである２３．６  ｋｂより１４．９  ｋｂ長い、３８．５  ｋｂであった。この距離は、増幅配列の追加された２コピー分の測定値と対応すると期待され、従って増幅配列は、７．４  ｋｂのサイズであることが決定された。サイズの９５％信頼区間を７．４  ｋｂ  ＋／−  ２．ｓｄ√ｎ（ここで、ｎは計算に使用した測定数である）として計算したところ、６．６  ｋｂ〜８．２  ｋｂであることが見出された。
【０１０４】
別の実験において、Ｓｙｎｔ１及びＳ７に対応する第一及び第二の追加的シグナル対のサイズは、それぞれ６．６  ｋｂ及び７．０  ｋｂであると測定され（追加的なＳｙｎｔ１プローブのシグナルの一端から、近傍のＳ７プローブのシグナルの他端まで）、両方の対の追加的シグナルにまたがる領域のサイズは１４．２  ｋｂである（第一の追加的なＳｙｎｔ１プローブのシグナルの一端から、第二の追加的なＳ７プローブの他端まで）と測定された。シグナル対の測定はおそらく一部の増幅配列を除外し（Ｓ７プローブとＳ８プローブの間に含まれる部分）、従って増幅配列を過小評価すると考えられた。個別に測定された両方の対の和と、両方の対にまたがる領域を直接測定した値との相違は、Ｓ７及びＳ８プローブの間に含まれる増幅配列の一部の測定値である。この値は平均０．６４  ｋｂであると測定され、上記のように計算した９５％の信頼区間は０．２  ｋｂ〜１．１  ｋｂであった。
【０１０５】
直接測定された両方の対にまたがる領域のサイズについての上記９５％信頼区間は、上で定義したように、１３．４  ｋｂ〜１４．９  ｋｂであった。この測定値は、Ｓ７及びＳ８プローブの間に含まれる増幅配列の一部分の１コピーを除外すると、増幅配列の２コピーに対応する。従って、増幅配列のサイズについての９５％信頼区間は、上記決定を用いる測定から除外された部分を考える場合、６．８  ｋｂ〜８．０  ｋｂである。
【０１０６】
ここで、ＢＲＣＡ１遺伝子のイントロン２からＮＢＲ２遺伝子にかけて、６  ｋｂ〜８．０  ｋｂの配列の３倍化を同定し、特徴づけたことを報告する。増幅配列の一方の末端はＳ７プローブの末端から２  ｋｂ以内（従ってビルドｈｇ１９におけるゲノム座標４１，２７８，７００〜４１，２８０，７００の範囲内）にあり、他方は、増幅配列のサイズから決定したところ、ビルドｈｇ１９のゲノム座標４１，２７０，７００〜４１，２７４，７００の範囲内にある。このことは、ＢＲＣＡ１のＡｌｕに富んだこの５’領域におけるゲノム増幅の最初の報告であり、変異は過去ＢＲＣＡ１において報告された第二の３倍化である（Ｈｏｒｇｅｒｖｏｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００３、Ｓｌｕｉｔｅｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１１）。
【０１０７】
（３．  分断点の予測）
再編成は配列相同性が原因となって生じる（ｖａｎ  Ｂｉｎｓｂｅｒｇｅｎらの文献、２０１２）。そこで分断点の潜在的な位置をより厳密に定義するため、３倍化に寄与し得るそのような相同性の存在の有無を探した。そのゲノム座標によって、上に定義される分断点を含むと期待される配列を、ローカルアラインメント検索にかけた。Ｌａｌｉｇｎプログラムを使用した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＬＡＬＩＧＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ；Ｈｕａｎｇ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズムを実行する、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  （１９９１）  １２：３３７−３５７に刊行されている）。ｂｌｏｓｕｍ５０マトリックスを使用し、開始ギャップペナルティを−３０、伸長ギャップペナルティを−４とした。ギャップは配列間の相互作用を大幅に減少させるであろうと仮定し、そのため比較的高い開始ギャップペナルティを使用した。相同性が８０％を上回り、完全に相同な少なくとも２５  ｂｐのストレッチ（Ｎを所与の塩基としたときの、ポリＮセグメントでは構成されないものとする）を含む、最低２００  ｂｐの長さを分断点と潜在的に関与する相同性の基準として設定した。この検索により、ゲノム座標（ｈｇ１９中）４１２７２５１０〜４１２７２８０５及び４１２７９７６９〜４１２８００６４の間のゲノム領域にあり、２９６  ｂｐより長く、８６．５％である１つの潜在的な配列相同性が明らかとなった。これらの領域は、位置４１２７９９４２〜４１２７９９８９及び４１２７２６８３〜４１２７２７３０において共通の４８  ｂｐ配列を共有する。２つの同一の４８  ｂｐ配列間の配列サイズは、７．３  ｋｂであり、このサイズは増幅配列の推定と完璧に適合した。
【０１０８】
（４．  ＰＣＲ及びシークエンシングによるＢＲＣＡ１  ３倍化の分断点の特徴づけ）
分断点の位置の推定に基づき、３倍化を有するサンプルの分断点を含む配列を特異的に増幅するためにＰＣＲプライマーペアを設計した。
（ＰＣＲ増幅）
ＰＣＲは５０  μＬ反応中で実施した。サイクル条件は、ポリメラーゼと増幅する配列の長さに基づいて選択した。ＲｏｃｈｅのＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙは、各反応について以下のＰＣＲ条件で利用した：２００  μＭ  ｄＮＴＰ、３００  μＭ  プライマー、１．５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．６  Ｕ  Ｔａｑ。ＰＣＲ増幅条件は、プライマーペアＦ７／Ｒ７及びＦ９／Ｒ８については：１０サイクルの（９４℃  １５秒、５７℃  ３０秒、７２℃  ２分）、３０サイクルの（９４℃  １５秒、５７℃  ３０秒、７２℃  ２分）、７２℃  ７分とし；他のプライマーペアについては：９５℃  ５分、３０サイクルの（９４℃  ３０秒、６０℃  ６０秒、７２℃  １分）、７２℃  １０分とした。ＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲｓａｆｅ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社）を１  μｇのＭａｒｋｅｒ  Ｈｙｐｅｒｌａｄｄｅｒ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）とともに含む１％アガロースゲル状で解析した。
【０１０９】
プライマーはＰｒｉｍｅｒ３  ｖ．０．４．０ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｆｒｏｄｏ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｐｒｉｍｅｒ３／）を用いて設計し、ＭＷＧ／Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ社によって合成した。プライマー配列及びアニーリング温度は以下の通りである：
【化７】
0006445469.tif 000014
以下のプライマーペアをＰＣＲにより検査し、確認した。Ｆ７／Ｒ７（配列番号．３／配列番号．４）、Ｆ９／Ｒ８（配列番号．５／配列番号．６）、Ｆ１／Ｒ１（配列番号．７／配列番号．８）、Ｆ１／Ｒ２（配列番号．７／配列番号．１０）、Ｆ１／Ｒ３（配列番号．７／配列番号．１２）、Ｆ２／Ｒ７（配列番号．９／配列番号．４）、Ｆ３／Ｒ４（配列番号．１１／配列番号．１４）、Ｆ３／Ｒ７（配列番号．１１／配列番号．４）、Ｆ４／Ｒ７（配列番号．１３／配列番号．４）、Ｆ５／Ｒ２（配列番号．１５／配列番号．１０）、Ｆ５／Ｒ３（配列番号．１５／配列番号．１２）、Ｆ６／Ｒ３（配列番号．１６／配列番号．１２）、Ｆ７／Ｒ１（配列番号．３／配列番号．８）、及びＦ７／Ｒ２（配列番号．９／配列番号．１０）、Ｆ７／Ｒ３（配列番号．３／配列番号．１２）。
【０１１０】
（ＤＮＡのゲル精製及びシークエンシング）
ＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋキット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、製造業者の指示に従って精製した。続いて精製した断片をＳａｎｇｅｒシークエンシング法（Ｐｌａｔｅ−ｆｏｒｍｅ  ｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃａｇｅ  ｅｔ  ｇｅｎｏｍｉｑｕｅ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｃｏｃｈｉｎ、Ｐａｒｉｓ）によりシークエンスした。続いてＤＮＡ配列を生物学的配列アラインメントエディタＢｉｏＥｄｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ｂｉｏｅｄｉｔ／ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ）を用いて解析し、かつＢＬＡＳＴソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を用いてバイオインフォマティクス解析を実施した。
【０１１１】
（結果）
我々はプライマーペアＦ７／Ｒ７及びＦ９／Ｒ８を利用して、ＢＲＣＡ１の３倍化を有する細胞株１０７９９００１に特異的であるが、対照細胞株４０には特異的でない２つのＤＮＡ  断片を、ＰＣＲで増幅することに成功した（図３Ｂ〜３Ｃ）。明瞭な６００  ｂｐのＤＮＡ断片がプライマーＦ７／Ｒ７を用いたＰＣＲにより増幅され、明瞭な４００  ｂｐのＤＮＡ断片がプライマーＦ９／Ｒ８を用いたＰＣＲにより増幅された。
【０１１２】
断片のシークエンシングにより、５７４（プライマーＦ７）、５６１（プライマーＲ７）、３３７（プライマーＦ９）、及び３０６（プライマーＲ８）塩基の長さのＤＮＡ断片を得た。バイオインフォマティクス解析により、プライマーＦ７／Ｒ７及びＦ９／Ｒ８により増幅されたＤＮＡ断片は同一であり、Ｆ９／Ｒ８を用いたものはＦ７／Ｒ７断片より短いことが確認された。
【０１１３】
リファレンスヒトゲノム配列を用いた配列比較により、増幅断片が位置４１，２７２，６８３からテロメア方向にかけてのＢＲＣＡ１のイントロン２領域、及び位置４１，２７９，９８９からセントロメア方向にかけてのＮＢＲ２の５’領域で構成され、ＢＲＣＡ１のイントロン２の中の４１，２７２，６８３及びＮＢＲ２の５’領域の中の４１，２７９，９４２の両方の位置に共通な４８  ｂｐの配列により連結されていることが示された（図４）。４８  ｂｐ共通配列は、以下の通りである：
【化８】
0006445469.tif 000015
。
この配列はこれら２つの位置の間に含まれる７．３  ｋｂの配列断片の３倍化と完全に適合し、分断点は完全に配列が同一であるストレッチの中に生じている。ＢＲＣＡ１  ３倍化の精密な物理的マッピングを、図に示す。また、このマップは、分断点位置の推定に基づく配列比較により確立した分断点の予測とも一致する。
【０１１４】
（ダイレクトＰＣＲ検査）
プライマーペアＦ７／Ｒ７及びＦ９／Ｒ８を用いたＰＣＲ増幅により、増幅を伴わない対照サンプル中でもＰＣＲ産物が増幅されたので、本明細書に報告する増幅を有するサンプルに特異的に産物を増幅する追加のプライマーペアを設計した。
【０１１５】
図５Ａに示すように、ＢＲＣＡ１の３倍化に特異的な断片は、８組のプライマーペア（Ｆ１／Ｒ１、Ｆ１／Ｒ２、Ｆ１／Ｒ３、Ｆ２／Ｒ７、Ｆ５／Ｒ２、Ｆ５／Ｒ３、Ｆ６／Ｒ３、Ｆ７／Ｒ２）から得られ、サイズはプライマー及び分断点の相対位置と一致していた。プライマーペアＦ５／Ｒ２、Ｆ５／Ｒ３、及びＦ６／Ｒ３は変異陽性細胞株１０７９９００１においてのみ増幅産物を示したが、対照細胞株３８では増幅産物を示さなかった。
【０１１６】
ａＣＧＨ検査により増幅を有すると推測された３人の無関連の患者（フランスの異なる地域に生まれ、また細胞株１０７９９００１の樹立元となった患者とも無関連である）からの追加のサンプルをプライマーペアＦ５／Ｒ２、Ｆ５／Ｒ３、及びＦ６／Ｒ３によるＰＣＲ増幅にかけた。本明細書に報告する増幅について予測されるサイズの特異的なＰＣＲ産物が得られ、このＰＣＲ産物は対照サンプル中には観察されなかった（図５Ｂ）。これらのＰＣＲ産物をシークエンスすると、結果は細胞株１０７９９００１と同一であった。このことから、４つの無関連なサンプルにおいて、分断点位置が同じである増幅が同一の性質を有することが確認された。
【０１１７】
本明細書に記載されるプライマーペアは、報告された分断点を特異的に検出することを可能とするプライマーペアの例である。実際、野生型サンプルでは、これらのいずれのペアのフォワード及びリバースプライマーの相対的配向も、特異的増幅が不可能であるようになっている：フォワードプライマーはセントロメアに向けたポリメラーゼ反応の開始を可能とする一方、リバースプライマーの上流に位置する。タンデム増幅は、フォワードプライマーに対応する配列の追加的コピーをもたらす（図３を参照されたい）。この追加的コピーがリバースプライマーの下流である場合、両プライマー間の配列ストレッチの増幅が可能となる。そのような手法を使用すれば、当業者は、同等の特性を有する他のプライマーペアを設計することが可能となる。そのようなプライマーペアは、ＢＲＣＡ１遺伝子の中の分断点位置（すなわち、ゲノム位置４１，２７９，９９０及び４１，２８４，９９０の間；優先的には位置４１，２７９，９９０及び４１，２８１，９９０の間；より優先的には位置４１，２７９，９９０及び４１，２８０，９９０の間、並びにさらにより優先的には位置４１，２７９，９９０及び４１，２８０，４９０の間）から優先的には５  ｋｂ未満、より優先的には２  ｋｂ未満、さらにより優先的には１  ｋｂ未満、及びさらにより優先的には５００  ｂｐ未満に位置する、テロメアからセントロメアの方向に向いた一本のフォワードプライマー；及び
ＮＢＲ２遺伝子の中の分断点位置（すなわち、ゲノム位置４１，２６７，６８３及び４１，２７２，６８３の間；優先的には位置４１，２７０，６８３及び４１，２７２，６８３の間；より優先的には位置４１，２７１，６８３及び４１，２７２，６８３の間、並びにさらにより優先的には位置４１，２７２，１８３及び４１，２７２，６８３の間）から優先的には５  ｋｂ未満、より優先的には２  ｋｂ未満、さらにより優先的には１  ｋｂ未満、及びさらにより優先的には５００  ｂｐ未満に位置する、セントロメアからテロメアの方向に向いた一本のリバースプライマーで構成されなければならず；ここで、フォワードプライマーはリバースプライマーの上流に位置する。
【０１１８】
（考察）
本明細書に報告される増幅は、第一に、ＢＲＣＡ１のエキソン１ａ、１ｂ、及び２、及び間に入るイントロンを含む領域中の配列の増幅の報告であり、第二に、ＢＲＣＡ１遺伝子座において報告される３倍化である。注目すべきは、このＢＲＣＡ１の領域は、反復配列に非常に富んでいることである。従来技術はそのような増幅について低い検出能を有する方法に依存していたが、検出能が低かったのは、それらの方法では反復配列に富む領域をカバーすることができなかったためか、又はそれらの方法では３倍化により誘導されるコピー数変化を２倍化により誘導されるコピー数変化と識別することができなかったためであった。
【０１１９】
本明細書では、そのような領域に分子コーミング又は関連する直接マッピング法を用いることにより、そのような増幅を正しく検出し、特徴づけることができることを示す。本明細書に例示されるプローブセットは、分子コーミングを用いた場合にこの目的で使用可能なプローブセットの例である。分子コーミングについてであれ、関連する直接マッピング法についてであれ、この設計を適応させることは可能であり、当業者には、容易に実現することができる。そのような方法を用いると、増幅は一般に、検出される配列の連なりの変化、又は対象領域の長さの増大のいずれかによって検出される。
【０１２０】
また、本明細書に報告した３倍化に関与する領域などの一部の領域では、反復配列の存在により特異的なＰＣＲ増幅が困難となるものの、分断点位置についての十分な知識があれば、増幅に特異的な産物を得ることができることを示す。産物の性質はシークエンシングにより確認することができ、それにより、もたらされた再編成を明確に特徴づけることができる。
【０１２１】
本明細書で必要とされる分断点の位置についての十分な知識は、分子コーミング又は関連する直接マッピング法を通じて取得されるマッピング結果を注意深く解析することにより得ることができる。マッピング結果をバイオインフォマティクス解析と組み合わせて潜在的な分断点を明らかにすることにより、この知識をさらに詳細化することができる。先に記載の通り、そのような潜在的な分断点の位置は、例えば２００  ｂｐより長くにわたって８０％を超える相同性を示し、ポリ−Ｎではない２５  ｂｐより長い完全一致の配列ストレッチを含む分断点を含むと決定された領域中の配列として同定することができる。
【０１２２】
本明細書に報告するＢＲＣＡ１のイントロン２からＮＢＲ２の５’領域にかけての領域の増幅のケースにおいては、これは頻発する事例であるようだが、増幅は本明細書に開示するプライマーペアなどの、前もって確認されたプライマーペアを用いることによりすぐに特徴づけることができる。加えて、本明細書に開示する分断点の厳密な記述は、当業者が代替の方法（又は異なるプライマーペアを用いたＰＣＲ）を用いてこの増幅を検出することを可能にするだろう。
【０１２３】
そのような増幅が頻発性である、すなわち、無関連のサンプルに生じることが報告されるケースにおいては、体系的スクリーニングを考慮することもできる。事前にマッピングされていない、こうした頻発する増幅を直接検査することは、サンプル中のそのような増幅を効率的に明らかにすることができる可能性がある。
【０１２４】
以下の番号の振られた段落は、本発明の様々な実施態様を表している：
１．  染色体核酸、詳細にはヒト染色体核酸を代表する核酸を含む生体サンプルの核酸における、再編成、詳細には、大きな再編成に関連する分断点をインビトロで予測するための方法であって：
生体サンプルの核酸を、特に分子コーミング、又は関連する直接マッピング法を用いて、マッピングする工程；
再編成のサイズ及び／又はサイズの信頼区間、再編成の一方の末端における１つの分断点の位置及び／又は位置の信頼区間、並びに再編成配列のもう一方の末端における分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を決定する工程；
核酸の相同性が決定された各配列ストレッチが少なくとも２００  ｂｐの長さを有する場合に、配列ストレッチの全長にわたって、ヌクレオチドの８０〜９８％のヌクレオチド同一性を有する相同な配列ストレッチの存在を決定することにより、分断点として決定された位置の予測配列の間で配列の相同性を決定する工程であって、そのような予測配列がリファレンスデータベース、詳細にはヒトリファレンスゲノムから取得される、前記工程；
該同定された相同配列ストレッチ内で、相同核酸配列の一部分に対する厳密な配列同一性を決定する工程であって、該厳密な同一性が、約２５  ｂｐ〜約８０  ｂｐの配列部分にわたって、詳細には少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５  ｂｐ、かつ特に８０  ｂｐ未満の配列にわたって存在する、前記工程；
及びそのような部分が存在する場合、そのような配列の同一性を表示し、そのような部分が配列再編成の分断点を含む可能性があることを報告する工程を含む、前記方法。
２．  染色体核酸、詳細にはヒト染色体核酸を代表する核酸を含む生体サンプルの核酸において、再編成、詳細には大きな再編成に関連する分断点を検出するための方法であって：
生体サンプルの核酸を、特に分子コーミング、又は関連する直接マッピング法を用いて、マッピングする工程；
再編成のサイズ及び／又はサイズの信頼区間、再編成の一方の末端における１つの分断点の位置及び／又は位置の信頼区間、並びに再編成配列のもう一方の末端における分断点の位置及び／又は位置の信頼区間を決定する工程；
核酸の相同性が決定された各配列ストレッチが少なくとも２００  ｂｐの長さを有する場合に、配列ストレッチの全長にわたって、ヌクレオチドの８０〜９８％のヌクレオチド同一性を有する相同な配列ストレッチの存在を決定することにより、分断点として決定された位置の予測配列の間で配列の相同性を決定する工程であって、そのような予測配列がリファレンスデータベース、詳細にはヒトリファレンスゲノムから取得される、前記工程；
該同定された相同配列ストレッチ内で、相同核酸配列の一部分に対する厳密な配列同一性を決定する工程であって、該厳密な同一性が、約２５  ｂｐ〜約８０  ｂｐの配列部分にわたって、詳細には少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも４５  ｂｐ、及びかつ８０  ｂｐ未満の配列にわたって存在する、前記工程；
そのような部分が存在する場合、そのような配列の同一性を表示し、そのような部分が配列再編成の分断点を含む可能性があると結論付ける工程；
分子的検査、詳細にはＰＣＲ増幅若しくは機能的に関連する方法、及び／又はシークエンシングにより、分断点の位置を確認する工程
を含む前記方法。
３．  サンプルの核酸内の相同性及び同一性を、ローカルアラインメント検索により、詳細には、連続アラインメント検索により、決定することを含む、段落１又は２記載の方法。
４．ホモロジー検索が、ポリ−Ｎセグメント、すなわち、所与のヌクレオチド（Ｎ）のリピートであり、そのようなヌクレオチドが少なくとも５回連続してリピートするようなセグメントの相同性を決定することを除外する、段落１〜３のいずれか一に記載の方法。
５．  相同性の水準が同一のヌクレオチドの８５〜９５％の範囲内である、段落１〜４のいずれか一に記載の方法。
６．  相同性が２００〜５００  ｂｐ、詳細には２００〜３００  ｂｐ、詳細には約３００  ｂｐを有する配列について決定される、段落１〜５のいずれか一に記載の方法。
７．  分断点の予測又は検出が、核酸配列の増幅、ゲノム核酸の配列の欠失からなる再編成に関連する、段落１〜６のいずれか一に記載の方法。
８．  分断点の予測又は検出が、ヒトゲノム配列を代表する核酸配列における再編成を検出した後に実施される、段落１〜７のいずれか一に記載の方法。
９．  分断点の予測又は検出が、乳癌及び／又は卵巣癌の素因に関連する遺伝子、特にＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２、リンチ症候群又は結腸癌の素因に関連する遺伝子、特にＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ６、及びＰＭＳ２などの疾患及び／又は疾患の素因に関連することの知られる遺伝子を含む、ゲノム座位上で行われる、段落１〜８のいずれか一に記載の方法。
１０．  前記分断点がＢＲＣＡ１遺伝子座の中に検出される、段落１〜９のいずれか一に記載の方法。
１１．  前記分断点の確認が、以下のように選択されたプライマーペアを用いたＰＣＲにより実施される、段落２〜１０のいずれか一に記載の方法であって：
一本のフォワードプライマーが、再編成の一方の末端において、分断点の可能性のある位置から優先的には５  ｋｂ未満、より優先的には２  ｋｂ未満、さらにより優先的には１  ｋｂ未満、及びさらにより優先的には５００  ｂｐ未満に位置し、かつ
一本のリバースプライマーが、再編成のもう一方の末端における分断点の可能性のある位置から優先的には５  ｋｂ未満、より優先的には２  ｋｂ未満、さらにより優先的には１  ｋｂ未満、及びさらにより優先的には５００  ｂｐ未満の位置し、かつこれらプライマーが野生型サンプルにおけるＰＣＲによっては増幅することができないように配向している、前記方法。
１２．  疾患、詳細には癌、特に乳癌又は卵巣癌の素因を検出するための、又は疾患を検出するための方法であって、段落１〜１１のいずれか一に記載の、分断点の予測又は検出を実施することを含む、前記方法。
【０１２５】
（参考文献）
【化９】
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0006445469.tif 000019
0006445469.tif 000020
【図１】
0006445469.tif 000021
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
0006445469.tif 000024
【図３Ｂ】
0006445469.tif 000025
【図３Ｃ】
0006445469.tif 000026
【図４】
0006445469.tif 000027
【図５Ａ】
0006445469.tif 000028
【図５Ｂ】
0006445469.tif 000029
【配列表】
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