(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
以下の（１）〜（２）のいずれかから選択される、請求項１に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１）配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント；並びに
（２）上記（１）の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖Ｎ末端のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
以下の（１）〜（２）のいずれかから選択される、請求項２に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント：
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体；並びに
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であって、ただし、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号２のアミノ酸番号４４８のリジンを欠く重鎖、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
【請求項４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項３に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、請求項３に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
【請求項６】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
以下の（ａ）〜（ｂ）からなる群より選択される、ポリヌクレオチド：
（ａ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び
（ｂ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
以下の（ａ）及び/又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び／又は
（ｂ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項９】
以下の（ａ）及び/又は（ｂ）を含む、発現ベクター：
（ａ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド；及び／又は
（ｂ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１０】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞。
（ａ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、宿主細胞。
（ａ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１２】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
（ａ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項２（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産する方法。
（ａ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項４に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体、及び／又は、請求項５に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体、並びに、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗ヒトＰＡＩ−１抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１；ＰＡＩ−１）は、血管内皮等から産生されるセリンプロテアーゼインヒビターの一つである。ＰＡＩ−１は、セリンプロテアーゼであるプラスミノーゲンアクチベーター（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ＰＡ）と結合し、ＰＡの酵素活性を失活させる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１９９０、Ｖｏｌ．６８、ｐ．１−１９）。ＰＡＩ−１には、活性型ＰＡＩ−１、潜在型ＰＡＩ−１、及びＰＡと結合して複合体を形成したＰＡＩ−１が存在し、このＰＡを阻害するＰＡＩ−１の特性は、活性型ＰＡＩ−１のみが有する（Ｂｌｏｏｄ、１９８７、Ｖｏｌ．７０、ｐ．１０９０−１０９８）。ＰＡには、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ｔＰＡ）とウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ｕＰＡ。ウロキナーゼとも称する）の２種が存在し、いずれもプラスミノーゲンを活性化してプラスミンに変換することによって、血液凝固で生成したフィブリンを溶解する反応（以下、線溶系と称する）を触媒する。活性型ＰＡＩ−１はｔＰＡ及びｕＰＡと結合し、複合体を形成する。ＰＡを失活させる生物学的特性は十分に解明済みであり、活性型ＰＡＩ−１がＰＡと結合する結果として、線溶系を阻害し血栓形成を促進する。【０００３】
活性型ＰＡＩ−１の立体構造の特徴は、ＰＡとの結合部位である活性中心ループが蛋白の外側に伸展及び露出される点である（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１、Ｖｏｌ．２７６、ｐ．４４９１２−４４９１８）。循環血液中では、活性型ＰＡＩ−１は、その補因子であるビトロネクチンと結合し複合体を形成することができる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、Ｖｏｌ．２６３、ｐ．１５４５４−１５４６１）。ビトロネクチンは、ＰＡＩ−１の活性型から潜在型への立体構造変化を抑制する（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９０、Ｖｏｌ．２６５、ｐ．１８４９０−１８４９８）。潜在型ＰＡＩ−１は、活性中心ループが内部へ折り畳まれた、安定な立体構造であり、一旦潜在型となると、ＰＡＩ−１はＰＡとは結合できなくなる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８、Ｖｏｌ．２８３、ｐ．１８１４７−１８１５７。Ｎａｔｕｒｅ、１９９２、Ｖｏｌ．３５５、ｐ．２７０−２７３）。また、ｔＰＡ又はｕＰＡと複合体を形成したＰＡＩ−１はそれぞれｔＰＡ又はｕＰＡと結合しているため、当該ＰＡＩ−１は別のＰＡと新たに結合できない。すなわち、活性型ＰＡＩ−１には、単量体として存在する活性型ＰＡＩ−１と、ビトロネクチンとの複合体として存在する活性型ＰＡＩ−１があり、これらがＰＡに結合し、ＰＡを失活させる機能を有する。【０００４】
血漿中活性型ＰＡＩ−１の増加は、ＰＡの阻害を介して組織の線維化や血栓形成に関与することが示唆されており、その結果として特発性肺線維症等の肺線維症、間質性肺炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、糖尿病性腎症、ループス腎炎、移植片対宿主病、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎線維症、慢性閉塞性肺疾患、急性腎障害、急性肺障害、急性呼吸不全、加齢黄斑変性、播種性血管内凝固症候群、術後癒着、症候性硝子体黄斑癒着、糖尿病網膜症、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、肺梗塞、緑内障手術後の結膜の瘢痕化等の眼線維化を伴う疾患、腹膜硬化症等の疾患に関与すると考えられている。【０００５】
肺線維症との関連としては、特発性肺線維症患者の肺生検由来の線維芽細胞においてＰＡＩ−１の発現及び分泌が増加していることが報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０１０、Ｖｏｌ．２８５、Ｎｏ．１１、ｐ．８１９６−８２０６）。加えて、ブレオマイシン誘発性の肺線維症病態モデルマウスを用いた試験において、ＰＡＩ−１の遺伝的欠損マウスにおいては肺の線維化が抑制されたことが確認されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９６、Ｖｏｌ．９７、Ｎｏ．１、ｐ．２３２−２３７）。また、前記病態モデルマウスに対して低分子ＰＡＩ−１阻害剤及びＰＡＩ−１のｓｉＲＮＡを投与した場合に、ＰＡＩ−１抑制によって肺の線維化が抑制されることも確認されている（Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２００８、Ｖｏｌ．２８、ｐ．６７２−６７７。Ｔｈｏｒａｘ、２０１０、Ｖｏｌ．６５、ｐ．３３４−３４０）。【０００６】
従って、活性型ＰＡＩ−１に特異的に結合し、活性型ＰＡＩ−１による作用を阻害する活性を有するモノクローナル抗体を開発することができれば、活性型ＰＡＩ−１が病態形成に関与する各種疾患の予防及び治療に有用であることが期待される。【０００７】
活性型ヒトＰＡＩ−１に対して機能阻害作用を示す抗体としては、マウスモノクローナル抗体ＭＡ−３３Ｂ８（特許文献１）、ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７（非特許文献１）、ＭＡ−５５Ｆ４Ｃ１２（非特許文献１）、及びＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０（特許文献２）、並びにＭＡ−３３Ｂ８のヒト化抗体ＣＴ１４０（特許文献１）、及びファージで作製された完全ヒト型抗体ＭＥＤＩ−５７９（ＣＡＴ−１００１又はＰＩＣＫ１６７＿Ａ０１−ｆｇｌ  ＩｇＧ１とも称する。特許文献３）等が報告されている。その中でも、ＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０及びＭＥＤＩ−５７９は、活性型以外の立体構造のヒトＰＡＩ−１と比較して、活性型ヒトＰＡＩ−１に対してそれぞれ、約４．０倍及び約２０倍高い結合活性を示す（特許文献２及び特許文献３）。また、ＭＥＤＩ−５７９は、マウスＰＡＩ−１にも阻害作用を示し、ループス腎炎、強皮症、糖尿病性腎症及び血栓症の病態モデルマウスを用いた実験結果から、これら疾患に対する薬効が期待されている（特許文献３）。【０００８】
抗ヒトＰＡＩ−１抗体を抗体医薬として使用する場合、その有効投与量を規定する主な要因としては、抗体が有する活性型ＰＡＩ−１とＰＡとの結合阻害活性及び活性型ＰＡＩ−１への選択性、並びに体内に存在する活性型ＰＡＩ−１及びその他の立体構造のＰＡＩ−１の量が挙げられる。ここで、その他の立体構造のＰＡＩ−１とは、潜在型ＰＡＩ−１、及び、ｔＰＡ又はｕＰＡと複合体を形成したＰＡＩ−１を意味する。【０００９】
ヒト血漿中の総ＰＡＩ−１の９０％以上が血小板に貯蔵されている。血小板を除いた血漿中では総ＰＡＩ−１の約３分の２が活性型である（Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１９８８、Ｖｏｌ．７０、ｐ．３２７−３３３。Ｂｌｏｏｄ、１９８８、Ｖｏｌ．７１、ｐ．２２０−２２５）。血漿中のＰＡＩ−１活性（ｔＰＡとの結合能で示される活性型ＰＡＩ−１活性）だけでなく、血漿中の総ＰＡＩ−１量（全てのＰＡＩ−１を検出する抗ＰＡＩ−１抗体により検出されるＰＡＩ−１の総量）や、血漿中のＰＡＩ−１とｔＰＡとの複合体の量（抗ＰＡＩ−１抗体と抗ｔＰＡ抗体との組み合わせで検出される複合体の量）は、様々なヒト病態で上昇する（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．、２００８、Ｖｏｌ．１２２、ｐ．４６６−４７２。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．、２０００、Ｖｏｌ．２０、ｐ．２０１９−２０２３。Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９６、Ｖｏｌ．２、ｐ．８００−８０３）。血小板を除く血漿においても、ｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体が活性型ＰＡＩ−１量の約３分の１存在する。（Ｂｌｏｏｄ、１９９０、Ｖｏｌ．７６、ｐ．９３０−９３７）。また、組織中では、ｔＰＡだけでなくｕＰＡも存在し、ＰＡＩ−１とｕＰＡの複合体も存在する。結論として、活性型ＰＡＩ−１以外の他のＰＡＩ−１が、全ＰＡＩ−１量において無視できない割合でヒト体内に存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０２５４９７９号
【特許文献２】国際公開第２００２／０３４７７６号
【特許文献３】国際公開第２０１１／１３９９７３号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】「ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、（米国）、２０００、Ｖｏｌ．２７５、ｐ．６３７５−６３８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の課題は、従来の抗ヒトＰＡＩ−１抗体と比較して活性型ヒトＰＡＩ−１をより選択的に阻害することで肺線維症を予防又は治療する抗ヒトＰＡＩ−１抗体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、活性型ヒトＰＡＩ−１に選択性の高い抗ヒトＰＡＩ−１抗体の作製において相当の創意検討を重ねた結果、配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を作製し（実施例１〜３）、当該抗ヒトＰＡＩ−１抗体が血漿中の活性型ヒトＰＡＩ−１を阻害すること（実施例５）、及びビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトＰＡＩ−１に対する高い選択性を有すること（実施例６）を見出した。これらの結果、前記抗ヒトＰＡＩ−１抗体を提供し、本発明を完成した。【００１４】
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含むものである。
（１）配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（２）以下の１）〜２）のいずれかから選択される、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
１）配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント；並びに
２）１）の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、（１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３）配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、（２）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（４）配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、（２）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（５）翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、（２）又は（４）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（６）ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（７）ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（８）ヒトＩｇγ１定常領域である重鎖定常領域を含み、ヒトＩｇκ定常領域である軽鎖定常領域を含む、（１）〜（５）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（９）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（１０）一本鎖可変領域フラグメント、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である、（１）〜（８）のいずれかに記載の抗原結合フラグメント。
（１１）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の翻訳後修飾により生じた抗体である、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（１２）翻訳後修飾が、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失である、（１１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（１３）配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、（１１）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（１４）（９）又は（１３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体と活性型ヒトＰＡＩ−１との結合を阻害し、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトＰＡＩ−１に結合し、かつ、潜在型ヒトＰＡＩ−１にも、プラスミノーゲンアクチベーターと複合体を形成したヒトＰＡＩ−１にも結合しない、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１５）（９）又は（１３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体と同じヒトＰＡＩ−１エピトープに結合する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（１６）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１７）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１８）（１６）及び／又は（１７）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１９）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、（１８）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２０）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、（１８）に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（ａ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２１）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法。
（ａ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２２）以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産する方法。
（ａ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
（２３）（２１）に記載の方法で生産された抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（２４）（２２）に記載の方法で生産された抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（２５）（１）〜（１５）、（２３）、及び（２４）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（２６）（３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、（４）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（２７）（９）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体、（１３）に記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
（２８）肺線維症の予防又は治療用医薬組成物である、（２５）〜（２７）のいずれかに記載の医薬組成物。
（２９）肺線維症が特発性肺線維症である、（２８）に記載の医薬組成物。
（３０）（１）〜（１５）、（２３）、及び（２４）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、肺線維症を予防又は治療する方法。
（３１）肺線維症が特発性肺線維症である、（３０）に記載の方法。
（３２）肺線維症の予防又は治療に使用するための、（１）〜（１５）、（２３）、及び（２４）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
（３３）肺線維症が特発性肺線維症である、（３２）に記載の使用。
（３４）肺線維症の予防又は治療用医薬組成物の製造における、（１）〜（１５）、（２３）、及び（２４）のいずれかに記載の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用。
（３５）肺線維症が特発性肺線維症である、（３４）に記載の使用。【００１５】
前記抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、他のペプチド及び蛋白質との融合抗体や、修飾剤を結合させた修飾抗体も含まれる。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、活性型ヒトＰＡＩ−１の機能阻害により、活性型ヒトＰＡＩ−１が病態形成に関与する疾患、例えば、特発性肺線維症等の肺線維症の予防又は治療剤として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】完全ヒト型ＨＯＴ−１のサル血中活性型ＰＡＩ−１阻害作用を示す。縦軸は血漿中活性型ＰＡＩ−１濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下に、本発明について詳述する。
【００１９】
抗体にはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥの５つのクラスが存在する。抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２万〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してＩｇγ、Ｉｇμ、Ｉｇα、Ｉｇδ、Ｉｇεとよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスが存在し、それぞれに対応する重鎖はＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３、Ｉｇγ４とよばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれＩｇλ、Ｉｇκとよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２０】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（Ｉｇμ、Ｉｇεには五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位又はドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）とよばれている。可変領域よりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラス又はサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれている（各ドメインは、それぞれ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３又はＣＬと表される）。
【００２１】
抗体の抗原決定部位はＶＨ及びＶＬによって構成され、結合の特異性はこの部位のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種Ｆｃ受容体発現細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。軽鎖と重鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよんでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２２】
抗体のＶＨ及びＶＬを含む各種抗原結合フラグメントも抗原結合活性を有し、このような代表的な抗原結合フラグメントとして、一本鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2が挙げられる。Ｆａｂは、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、軽鎖と、ＶＨ、ＣＨ１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される、一価の抗体フラグメントであり、このヒンジ領域の部分には重鎖間Ｓ−Ｓ結合を構成していたシステイン残基が含まれる。Ｆ（ａｂ’）2フラグメントは、２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域中の重鎖間Ｓ−Ｓ結合で結合した二価の抗体フラグメントである。ｓｃＦｖは、リンカーで連結されたＶＨとＶＬから構成される、一価の抗体フラグメントである。
【００２３】
＜本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体＞
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、以下の特徴を有する抗ヒトＰＡＩ−１抗体が含まれる。
配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００２４】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記の特徴を有し、重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含む抗体が好ましい。定常領域としては、どのようなサブクラスの定常領域（例えば、重鎖としてＩｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４、軽鎖としてＩｇλ又はＩｇκの定常領域）も選択可能であり得るが、重鎖定常領域としてヒトＩｇγ１定常領域が好ましい。
【００２５】
ヒトＩｇγ１定常領域としては、例えば、配列番号２のアミノ酸番号１１９から４４８までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇγ１定常領域が挙げられる。
【００２６】
軽鎖定常領域としては、ヒトＩｇκ定常領域が好ましい。
【００２７】
ヒトＩｇκ定常領域としては、例えば、配列番号４のアミノ酸番号１０９から２１４までのアミノ酸配列からなるヒトＩｇκ定常領域が挙げられる。
【００２８】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントとしては、上記の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、重鎖定常領域がヒトＩｇγ１定常領域であり、軽鎖定常領域がヒトＩｇκ定常領域である、抗ヒトＰＡＩ−１抗体がより好ましい。
【００２９】
１つの実施形態において、本発明の抗原結合フラグメントは、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦ（ａｂ’）2である。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体である。
【００３１】
抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２００８、Ｖｏｌ．９７、ｐ．２４２６−２４４７）。
【００３２】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、翻訳後修飾を受けた抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。翻訳後修飾を受けた本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの例としては、重鎖可変領域Ｎ末端のピログルタミル化及び／又は重鎖Ｃ末端のリジン欠失を受けた抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化又はＣ末端リジン欠失による翻訳後修飾が抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００６、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．２４−３９）。
【００３３】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、下記の特徴を有する抗ヒトＰＡＩ−１抗体である。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖であって、ただし、配列番号２のアミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾され及び／又は配列番号２のアミノ酸番号４４８のリジンを欠く重鎖、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
【００３４】
さらに１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、下記の特徴を有する抗ヒトＰＡＩ−１抗体である。
配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
【００３５】
本発明には、以下の特徴を有する抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。
配列番号２のアミノ酸番号３１から３５までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号２のアミノ酸番号５０から６６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号２のアミノ酸番号９９から１０７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む重鎖可変領域、並びに、配列番号４のアミノ酸番号２４から３４までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸番号５０から５６までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ２、及び配列番号４のアミノ酸番号８９から９７までのアミノ酸配列からなるＣＤＲ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント。
【００３６】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトＰＡＩ−１（ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体とも称する）に結合する抗体である。生体内に存在する活性型ヒトＰＡＩ−１としては、単量体として存在する活性型ヒトＰＡＩ−１と、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体がある。このうち、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体については、ビトロネクチンとの結合によりヒトＰＡＩ−１の活性型から潜在型への立体構造変化が抑制され、単量体として存在する活性型ヒトＰＡＩ−１よりも、活性型ヒトＰＡＩ−１の構造がより安定に保持される。また、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体において、活性型ヒトＰＡＩ−１の活性中心ループ構造は影響を受けない（Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、２００３、Ｖｏｌ．１０、ｐ．５４１−５４４）。従って、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対する抗ヒトＰＡＩ−１抗体の結合活性を評価することによって、活性型ヒトＰＡＩ−１に対する抗体の選択性をより正確に評価することができる。
【００３７】
また、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体だけでなく、単量体として存在する活性型ヒトＰＡＩ−１にも結合する抗体も含まれる。
【００３８】
ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体又は単量体として存在する活性型ＰＡＩ−１に結合するか否かは、公知の結合活性測定方法を用いて確認することができる。結合活性を測定する方法としては、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）や表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、例示的な方法において、ビトロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２３８）を固相化し、ブロッキングの後に組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を固相化することでＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体を固相化させる。これに対して被験抗体を添加して反応させる。反応後、ホースラディッシュぺルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社））等を用いた活性測定を行うことによって、被験抗体がＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に結合するか否かを確認することができる。ＳＰＲを用いる場合は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥヘルスケアジャパン社）を用いることができる。例示的な方法において、被験抗体をセンサーチップの表面に固相化し、組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を流路に添加させる。抗体と活性型ヒトＰＡＩ−１との結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、及び解離定数（ＫＤ）を解析することによって、被験抗体が単量体として存在する活性型ヒトＰＡＩ−１に結合するか否かを確認することができる。
【００３９】
好ましくは、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に結合し、かつ、血漿中の活性型ヒトＰＡＩ−１に対する阻害活性を有する抗体である。より好ましくは、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に結合し、血漿中の活性型ヒトＰＡＩ−１に対する阻害活性を有し、かつ、潜在型ヒトＰＡＩ−１にも、ＰＡと複合体を形成したヒトＰＡＩ−１にも結合しない抗体である。血漿中の活性型ヒトＰＡＩ−１に対する阻害活性を具体的に評価する方法としては、後記実施例５に記載されるような方法を用いることができる。
【００４０】
「潜在型ヒトＰＡＩ−１に結合しない」とは、潜在型ヒトＰＡＩ−１に対する抗体の結合活性を評価した場合に、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）が＞１００００であることを意味し、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）＞１００００とは、最大活性の５０％を示す抗体濃度が１００００ｎｇ／ｍＬよりも大きいことを意味する。この評価に用いる方法は、以下に示すとおりである。
（潜在型ヒトＰＡＩ−１に対する結合活性評価）
組換え潜在型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ｌ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、潜在型ヒトＰＡＩ−１を固相化する。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置する。洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））で洗浄し、０．１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳで１０００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで８段階に希釈した被験抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置する。比較抗体として、被験抗体がヒトＦｃ領域を有する場合はＭＥＤＩ−５７９（特許文献３）を、被験抗体がマウスＦｃ領域を有する場合はＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＨＭ２１８２）を、それぞれ０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈し、ウェルに添加する。コントロールとして、被験抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルを準備する。洗浄液で３回洗浄した後、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を使用して２０００倍に希釈した検出抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加して反応させる。検出抗体としては、マウス抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１０１０−０５）を、ヒト抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、６１４５−０５）を用いる。室温にて３０分間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社）に含まれる発色液を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で１５分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を１００μＬ添加して、そのＯＤ４５０値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定する。被験抗体の各濃度におけるＰＡＩ−１結合率を算出するにあたり、被験抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルの測定値を０％とし、被験抗体の最大濃度における測定値を１００％と設定する。ただし、被験抗体がヒトＦｃ領域を有する場合、被験抗体を最大濃度（１０００００ｎｇ／ｍＬ）添加してもＭＥＤＩ−５７９の評価系における最大濃度（１００００ｎｇ／ｍＬ）の測定値に達しない時は、ＭＥＤＩ−５７９の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定する。被験抗体がマウスＦｃ領域を有する場合、被験抗体を最大濃度（１０００００ｎｇ／ｍＬ）添加してもＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度（１００００ｎｇ／ｍＬ）の測定値に達しない時は、ＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定する。算出されたＰＡＩ−１結合率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により被験抗体のＥＣ５０値を算出する。
【００４１】
「プラスミノーゲンアクチベーターと複合体を形成したヒトＰＡＩ−１に結合しない」とは、プラスミノーゲンアクチベーター（ＰＡ）であるｕＰＡ又はｔＰＡと複合体を形成したヒトＰＡＩ−１（それぞれｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体及びｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体とも称する）に対する抗体の結合活性を評価した場合に、それぞれの複合体に対してＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）が＞１００００であることを意味し、ＥＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）＞１００００とは、最大活性の５０％を示す抗体濃度が１００００ｎｇ／ｍＬよりも大きいことを意味する。この評価に用いる方法は、以下に示すとおりである。
（ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体に対する結合活性評価）
ｕＰＡ（ウロキナーゼ静注用６万単位「ベネシス（登録商標）」；田辺三菱製薬株式会社）をＰＢＳで１００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ｕＰＡを固相化する。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置する。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、ｕＰＡに捕捉させる。洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで８段階に希釈した被験抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置する。比較抗体として、被験抗体がヒトＦｃ領域を有する場合はＭＥＤＩ−５７９（特許文献３）を、被験抗体がマウスＦｃ領域を有する場合はＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＨＭ２１８２）を、それぞれ０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈し、ウェルに添加する。コントロールとして、被験抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルを準備する。洗浄液で３回洗浄した後、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を使用して２０００倍に希釈した検出抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加して反応させる。検出抗体としては、マウス抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１０１０−０５）を、ヒト抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、６１４５−０５）を用いる。室温にて３０分間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社）に含まれる発色液を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で１５分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を１００μＬ添加して、そのＯＤ４５０値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定する。被験抗体の各濃度におけるＰＡＩ−１結合率を算出するにあたり、被験抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルの測定値を０％とし、被験抗体の最大濃度における測定値を１００％と設定する。ただし、被験抗体がヒトＦｃ領域を有する場合、被験抗体を最大濃度（１０００００ｎｇ／ｍＬ）添加してもＭＥＤＩ−５７９の評価系における最大濃度（１００００ｎｇ／ｍＬ）の測定値に達しない時は、ＭＥＤＩ−５７９の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定する。被験抗体がマウスＦｃ領域を有する場合、被験抗体を最大濃度（１０００００ｎｇ／ｍＬ）添加してもＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度（１００００ｎｇ／ｍＬ）の測定値に達しない時は、ＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定する。���出されたＰＡＩ−１結合率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により被験抗体のＥＣ５０値を算出する。
（ｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体に対する結合活性評価）
ｔＰＡ（アクチバシン（登録商標）注６００万；協和発酵キリン株式会社）をＰＢＳで１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ｔＰＡを固相化する。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置する。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、ｔＰＡに捕捉させる。洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで８段階に希釈した被験抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置する。比較抗体として、被験抗体がヒトＦｃ領域を有する場合はＭＥＤＩ−５７９（特許文献３）を、被験抗体がマウスＦｃ領域を有する場合はＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＨＭ２１８２）を、それぞれ０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈し、ウェルに添加する。コントロールとして、被験抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルを準備する。洗浄液で３回洗浄した後、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を使用して２０００倍に希釈した検出抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加して反応させる。検出抗体としては、マウス抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１０１０−０５）を、ヒト抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、６１４５−０５）を用いる。室温にて３０分間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄する。ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社）に含まれる発色液を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で１５分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を１００μＬ添加して、そのＯＤ４５０値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定する。被験抗体の各濃度におけるＰＡＩ−１結合率を算出するにあたり、被験抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルの測定値を０％とし、被験抗体の最大濃度における測定値を１００％と設定する。ただし、被験抗体がヒトＦｃ領域を有する場合、被験抗体を最大濃度（１０００００ｎｇ／ｍＬ）添加してもＭＥＤＩ−５７９の評価系における最大濃度（１００００ｎｇ／ｍＬ）の測定値に達しない時は、ＭＥＤＩ−５７９の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定する。被験抗体がマウスＦｃ領域を有する場合、被験抗体を最大濃度（１０００００ｎｇ／ｍＬ）添加してもＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度（１００００ｎｇ／ｍＬ）の測定値に達しない時は、ＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定する。算出されたＰ���Ｉ−１結合率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により被験抗体のＥＣ５０値を算出する。
【００４２】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体と活性型ヒトＰＡＩ−１との結合を阻害し、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトＰＡＩ−１に結合し、かつ、潜在型ヒトＰＡＩ−１にも、プラスミノーゲンアクチベーターと複合体を形成したヒトＰＡＩ−１にも結合しない、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。
【００４３】
被験抗体が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体と活性型ヒトＰＡＩ−１との結合を阻害するか否かは、以下の方法を用いて確認することができる。ビトロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２３８）を固相化し、ブロッキングの後に活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を固相化することでＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体を固相化させる。これに対して被験抗体を添加して反応させる。反応後、ＨＲＰ等で標識した配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社））等を用いた活性測定を行う。被験抗体の添加により、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体の結合活性が有意に低下する場合、被験抗体が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体と活性型ヒトＰＡＩ−１との結合を阻害すると判断できる。
【００４４】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体と同じヒトＰＡＩ−１エピトープに結合する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。ここでエピトープとは抗体が認識する抗原部位をいう。
【００４５】
被験抗体が配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体と同じヒトＰＡＩ−１エピトープに結合するか否かは、公知のエピトープ決定方法を用いて確認することができる。エピトープを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析やＥＬＩＳＡ等の方法が挙げられる。ＥＬＩＳＡを用いる場合、例示的な方法において、ヒトＰＡＩ−１部分ペプチドを固相化し、これに対して被験抗体を添加して反応させる。反応後、ＨＲＰ等で標識した抗ＩｇＧ抗体等の二次抗体を反応させ、洗浄した後、その活性を検出する試薬（例えば、ＨＲＰ標識の場合、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社））等を用いた活性測定を行うことによって、被験抗体が当該ヒトＰＡＩ−１部分ペプチドに結合するか否かを確認することができる。種々のアミノ酸配列を有するヒトＰＡＩ−１部分ペプチドに対する結合活性を評価することにより、被験抗体のエピトープを決定することができる。被験抗体のエピトープが、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体のエピトープが同じ場合、被験抗体が、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又は配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体と同じヒトＰＡＩ−１エピトープに結合すると判断できる。
【００４６】
また、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体には、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に結合する抗体であれば、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体への結合に加え、ビトロネクチンと複合体を形成した他の動物由来の活性型ＰＡＩ−１（例えば、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型サルＰＡＩ−１）にも結合する抗体も含まれる。
【００４７】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、本明細書に開示される、本発明の抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＰＡＩ−１抗体＞に記載の方法に従い製造することができる。
【００４８】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、必要によりさらに精製された後、定法に従って製剤化され、特発性肺線維症等の肺線維症、間質性肺炎、全身性エリテマトーデス、強皮症、糖尿病性腎症、ループス腎炎、移植片対宿主病、糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、腎線維症、慢性閉塞性肺疾患、急性腎障害、急性肺障害、急性呼吸不全、加齢黄斑変性、播種性血管内凝固症候群、術後癒着、症候性硝子体黄斑癒着、糖尿病網膜症、動脈硬化、心筋梗塞、脳梗塞、肺梗塞、緑内障手術後の結膜の瘢痕化等の眼線維化を伴う疾患、腹膜硬化症等、活性型ＰＡＩ−１が病態形成に関与する疾患の予防又は治療に用いることができる。
【００４９】
＜本発明のポリヌクレオチド＞
本発明のポリヌクレオチドには、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドが含まれる。
【００５０】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５１】
配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列に示される重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１の塩基番号１から３５４までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５２】
好ましい実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５４】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５５】
配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３の塩基番号１から３２４までの塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５６】
好ましい実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００５７】
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００５８】
本発明のポリヌクレオチドは、その塩基配列に基づき、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、当該分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、ＷＯ９０／０７８６１に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００５９】
＜本発明の発現ベクター＞
本発明の発現ベクターには、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００６０】
好ましい本発明の発現ベクターとしては、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターが挙げられる。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドを発現させるために用いる発現ベクターとしては、真核細胞（例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母）及び／又は原核細胞（例えば、大腸菌）の各種の宿主細胞中で本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び／又は本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを発現し、これらによりコードされるポリペプチドを産生できるものである限り、特に制限されるものではない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等が挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（ロンザ社）を使用することができる。また、ＡＧ−γ１やＡＧ−κ（例えば、ＷＯ９４／２０６３２を参照）等の予めヒトＩｇ定常領域遺伝子を有する発現ベクターに可変領域遺伝子断片を導入して抗体遺伝子を発現することもできる。
【００６２】
本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。動物細胞で本発明のポリヌクレオチドを発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来プロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。細菌（例えば、エシェリキア属菌）で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。また、酵母で発現させるためのプロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。
【００６３】
宿主細胞として動物細胞、昆虫細胞、又は酵母を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン及び終止コドンを含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、エンハンサー配列、本発明の抗体又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、あるいは複製可能単位などを含んでいてもよい。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、本発明の発現ベクターは、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域、及び複製可能単位を含み得る。この場合、本発明の発現ベクターは、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００６４】
＜本発明の形質転換された宿主細胞＞
本発明の形質転換された宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００６５】
１つの実施形態において、本発明の形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
（ａ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；及び
（ｄ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００６６】
好ましい本発明の形質転換された宿主細胞としては、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、並びに、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００６７】
形質転換する宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、抗体を発現することができるものである限り、特に限定されるものではない。形質転換する宿主細胞としては、例えば、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、動物細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞）、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、細菌（エシェリキア属菌など）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）など）が挙げられ、好ましくは、ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞等）、２９３細胞、ＮＳ０細胞等の培養細胞を使用することができる。
【００６８】
宿主細胞を形質転換する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。
【００６９】
＜本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産する方法及び該方法により生産された抗ヒトＰＡＩ−１抗体＞
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産する方法には、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を発現させる工程を包含する、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産する方法が含まれる。
（ａ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞； 
（ｂ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターと該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体の重鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、該抗体の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７１】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程を包含している限り、特に限定されるものではない。該方法で使用される好ましい宿主細胞としては、前述の好ましい本発明の形質転換された宿主細胞が挙げられる。
【００７２】
形質転換された宿主細胞の培養は公知の方法により行うことができる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。宿主細胞が動物細胞の場合、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９５９、Ｖｏｌ．１３０、Ｎｏ．３３７３、ｐ．４３２−７）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９５９、Ｖｏｌ．８、ｐ．３９６）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．、１９６７、Ｖｏｌ．１９９、ｐ．５１９）、１９９培地（Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、１９５０、Ｖｏｌ．７３、ｐ．１−８）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約３０〜４０℃で約１５〜７２時間行われる。宿主細胞が昆虫細胞の場合、培地としては、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ’ｓ培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８５、Ｖｏｌ．８２、ｐ．８４０４）等を用いることができる。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましく、培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜４０℃で約１５〜１００時間行われる。宿主細胞が大腸菌又は酵母である場合、培地としては、例えば、栄養源を含有する液体培地が適当である。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源又は有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源又は有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類など）、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）を含んでいてもよい。培地のｐＨは約５〜８であるのが好ましい。宿主細胞が大腸菌の場合、好ましい培地としては、例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｏｌ．Ｃｌｏ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２００１、Ｖｏｌ．３、Ａ２．２）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約１４〜３９℃で約３〜２４時間行われる。宿主細胞が酵母の場合、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８０、Ｖｏｌ．７７、ｐ．４５０５）等を用いることができる。培養は、必要により通気や撹拌しながら、通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行われる。上述のような培養により、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させることができる。
【００７３】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法は、本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを発現させる工程に加えて、さらには、該形質転換された宿主細胞から抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを回収、好ましくは単離又は精製する工程を含むことができる。単離又は精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。好ましくは、培養上清中に蓄積された抗体は、各種クロマトグラフィー、例えば、プロテインＡカラム又はプロテインＧカラムを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製することができる。
【００７４】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを生産する方法で生産された抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。
【００７５】
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、複数種の本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを含み得る。例えば、翻訳後修飾を受けていない抗体又はその抗原結合フラグメント、及び、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物も本発明に含まれる。
【００７７】
１つの実施形態において、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、並びに、該抗体又はその抗原結合フラグメントの翻訳後修飾により生じた抗体又はその抗原結合フラグメントである、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物。
【００７８】
本発明の医薬組成物には、重鎖Ｃ末端リジンの欠失抗体、Ｎ末端翻訳後修飾を受けた抗体又はその抗原結合フラグメント、重鎖Ｃ末端リジンを欠失しＮ末端翻訳後修飾を受けた抗体、及び／又は重鎖Ｃ末端リジンを有しＮ末端翻訳後修飾を受けていない抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
【００７９】
１つの実施形態において、抗ヒトＰＡＩ−１抗体を含有する本発明の医薬組成物には、下記（１）〜（４）のうち２種以上の抗ヒトＰＡＩ−１抗体を含有する医薬組成物も含まれる。
（１）配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（３）配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなり、アミノ酸番号１のグルタミン酸がピログルタミン酸に修飾された重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体。
【００８０】
さらに１つの実施形態において、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを含有する本発明の医薬組成物には、下記に記載の医薬組成物も含まれる。
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体、配列番号２のアミノ酸番号１から４４７までのアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＰＡＩ−１抗体、及び、薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【００８１】
上記製剤化に当たっての本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、活性型ヒトＰＡＩ−１が病態形成に関与する疾患、例えば、特発性肺線維症等の肺線維症の予防又は治療剤として用いることができる。
【００８３】
本発明には、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、特発性肺線維症等の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの治療有効量を投与する工程を包含する、特発性肺線維症等の肺線維症を治療又は予防する方法が含まれる。また、本発明には、特発性肺線維症等の肺線維症の予防又は治療に使用するための、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントが含まれる。さらに、本発明には、特発性肺線維症等の肺線維症の予防又は治療用医薬組成物製造における、本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントの使用が含まれる。
【００８４】
＜融合抗体及び修飾抗体＞
当業者であれば、当該分野で公知の方法を用いて、抗体又はその抗原結合フラグメントを、他のペプチド又は蛋白質を融合した融合抗体として作製することや、修飾剤を結合させた修飾抗体として作製することも可能である。本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、このような融合体や修飾体の形態の抗体又は抗原結合フラグメントも含まれる。例えば、配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む、抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントには、他のペプチド又は蛋白質と融合した抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメント、或いは修飾剤を結合させた抗ヒトＰＡＩ−１抗体又はその抗原結合フラグメントも含まれる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは融合抗体としてＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体との結合活性を有している限り、融合に用いられる他のペプチド又は蛋白質は特に限定されず、例えば、ヒト血清アルブミン、各種タグペプチド、人工ヘリックスモチーフペプチド、マルトース結合蛋白質、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、各種毒素、その他多量体化を促進しうるペプチド又は蛋白質等が挙げられる。本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは修飾抗体としてＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体との結合活性を有している限り、修飾に用いられる修飾剤は特に限定されず、例えば、ポリエチレングリコール、糖鎖、リン脂質、リポソーム、低分子化合物等が挙げられる。
【００８５】
本発明についてさらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００８６】
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。また、便宜上、濃度ｍｏｌ／ＬをＭとして表す。例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液は１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液であることを意味する。【００８７】
（実施例１：免疫抗原の検討及び抗ヒトＰＡＩ−１抗体産生ハイブリドーマの作製）
活性型ヒトＰＡＩ−１に選択性の高い抗体を取得するために、最適なヒトＰＡＩ−１ペプチド抗原を検討した。ペプチドの長さやアミノ酸配列を検討した結果、ヒトＰＡＩ−１中の１６アミノ酸残基のペプチド抗原ＳＴＡＶＩＶＳＡＲＭＡＰＥＥＩＩ（配列番号５）のＣ末端にＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ８（ＭＡＰ８）ペプチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、Ｖｏｌ．２６３、Ｎｏ．４、ｐ．１７１９−１７２５）をつなげたものを免疫した場合に、血漿中の活性型ヒトＰＡＩ−１を中和する抗体を取得できることが明らかになった。さらに抗原につなげる蛋白質や免疫方法等を創意検討した結果、このペプチド抗原のＣ末端にＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）蛋白質をつなげたものと組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を混合して同時に免疫した場合に、血漿中の活性型ヒトＰＡＩ−１を強力に中和し、かつビトロネクチンと複合体を形成した活性型ヒトＰＡＩ−１（ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体）に選択性の高い抗体を取得できることが明らかになった。【００８８】
ヒトモノクローナル抗体開発技術「ベロシミューン」（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社（米国特許６５９６５４１号））マウスを用いて抗体を作製した。具体的には、ベロシミューンマウスに、免疫反応を惹起するアジュバントと共に、ヒトＰＡＩ−１中の１６アミノ酸残基のペプチド抗原ＳＴＡＶＩＶＳＡＲＭＡＰＥＥＩＩ（配列番号５）のＣ末端にＫＬＨ蛋白質をつなげたペプチド抗原と組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を免疫した。マウスに複数回免疫し、血漿中抗体価の上昇を確認した。最終的に７回免疫を行い、定法に従い、免疫したマウスのリンパ節を摘出しリンパ球を回収し、これをマウス由来ミエローマ細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８１）と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの限界希釈サンプルを作製し、単クローン化を行った。各クローンについて、拡大培養を行った後に無血清培地であるＣＤハイブリドーマメディウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に培地変更し、約１週間培養した。得られた培養上清からプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて抗体を精製した。ベロシミューン技術では、内因性の免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域が対応するヒト可変領域で置換されたトランスジェニックマウスを用いるため、得られた抗体は、ヒト抗体の可変領域とマウス抗体の定常領域を有する抗体（キメラ抗体とも称する）である。【００８９】
（実施例２：ＥＬＩＳＡアッセイ）
抗体の抗原特異的結合活性を測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを使用した。ここで、活性型ヒトＰＡＩ−１に対する選択性を評価するために、ビトロネクチンを固相化し、活性型ヒトＰＡＩ−１を添加して作製したプレートと、活性型ヒトＰＡＩ−１の代わりに潜在型ヒトＰＡＩ−１を添加して作製したプレートを用いて試験した。【００９０】
ビトロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２３８）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ビトロネクチンを固相化した。逆遠心によりビトロネクチン固相液を除去し、ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）又は組換え潜在型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ｌ）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で１時間静置した。逆遠心により溶液を除去し、ＰＢＳで３倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を１ウェルあたり２００μＬ添加した。室温で1時間静置した後、逆遠心によりブロッキング剤を除去した。ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を用いて、精製抗体サンプルを、活性型ヒトＰＡＩ−１を添加したプレートに対しては１０００ｎｇ／ｍＬから０．１ｎｇ／ｍＬまで、潜在型ヒトＰＡＩ−１を添加したプレートに対しては３０００ｎｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬまでそれぞれ７段階に希釈し、１ウェルあたり１００μＬ添加した。コントロールとして抗体の代わりにＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤溶液を添加したウェルを準備した。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤溶液で２０００倍に希釈したＨＲＰ標識ウサギ抗マウスＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社、Ｐ２６０）を１００μＬ添加した。室温にて３０分間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社）に含まれる発色液を１００μＬ加え、室温で１５分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を１００μＬ添加して、そのＯＤ４５０値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【００９１】
各抗体の各濃度におけるＰＡＩ−１結合率を算出するにあたり、抗体の代わりにＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を添加したウェルの測定値を０％とし、各抗体の測定値の最大値を１００％と設定した。測定値から算出したＰＡＩ−１結合率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＥＣ５０値を算出した。【００９２】
その結果、ＨＯＴ−１と命名した抗体（キメラ抗体）が、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対して選択的に、潜在型ＰＡＩ−１と比べて高い結合活性を有することが明らかになった。【００９３】
（実施例３：完全ヒト型抗体の作製）
前述の抗体は、可変領域がヒト由来であり、定常領域がマウス由来の抗体である。そこで、本発明者らは、哺乳細胞発現用ベクターであるＧＳベクター（Ｌｏｎｚａ社）を用いて、重鎖及び軽鎖の両遺伝子を含む発現ベクターを構築し、完全ヒト型抗体を作製した。具体的には、実施例２で同定されたＨＯＴ−１について、ハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ増幅キット（ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｃＤＮＡを作製した。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、重鎖及び軽鎖の可変領域を伸長及び増幅した。ＨＯＴ−１の重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１９８７、Ｖｏｌ．１、Ｎｏ．６、ｐ．４９９−５０５）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（配列番号１の塩基番号３５５から１３４４までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この重鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ６．４に挿入した。また、ＨＯＴ−１の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（Ｎｉｇｅｌ  Ｗｈｉｔｔｌｅら、前出）をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号３のアミノ酸番号３２５から６４２までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げ、この軽鎖遺伝子をＧＳベクターｐＥＥ１２．４に挿入した。【００９４】
ｐＥＥ６．４に挿入した抗体の重鎖遺伝子配列、ｐＥＥ１２．４に挿入した抗体の軽鎖遺伝子配列をシークエンサーで解析し、その結果得られたアミノ酸配列から、Ｋａｂａｔらのデータベース（“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＵＳ  Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ）を参照してＣＤＲ配列を決定した。【００９５】
作製したＨＯＴ−１の完全ヒト型抗体（完全ヒト型ＨＯＴ−１）の重鎖の塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２に、該抗体の軽鎖の塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。配列番号２で示される重鎖の可変領域は、配列番号２のアミノ酸番号１から１１８までのアミノ酸配列からなり、重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号２のアミノ酸番号３１から３５、５０から６６、９９から１０７までのアミノ酸配列からなる。配列番号４で示される軽鎖の可変領域は、配列番号４のアミノ酸番号１から１０８までのアミノ酸配列からなり、軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、それぞれ配列番号４のアミノ酸番号２４から３４、５０から５６、８９から９７までのアミノ酸配列からなる。【００９６】
完全ヒト型ＨＯＴ−１の重鎖と軽鎖の遺伝子がそれぞれ挿入された前述のＧＳベクターをＮｏｔＩとＰｖｕＩで制限酵素切断し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（タカラバイオ社）を用いてライゲーションを行い、重鎖と軽鎖の両遺伝子が挿入されたＧＳベクターを構築した。当該ＧＳベクターを用いて、一過性発現及び恒常的発現の２種類の方法で抗体発現を行った。一過性発現については、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で約１００万個／ｍＬに培養されたＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に対し、当該ＧＳベクターを遺伝子導入試薬ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてトランスフェクトし、７日間培養した。その培養上清からプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、完全ヒト型抗体の精製抗体を得た。恒常的発現については、当該ＧＳベクターをエレクトロポレーション法を用いてＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ社）にトランスフェクションすることにより抗体を発現させた。その培養上清からプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア社）を用いて、完全ヒト型抗体を精製した。【００９７】
（実施例４：完全ヒト型抗体のアミノ酸修飾分析）
精製した完全ヒト型ＨＯＴ−１のアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｃ末端のリジン欠失が生じていた。【００９８】
（実施例５：ヒト血漿中活性型ＰＡＩ−１阻害活性測定）
実施例２で同定したＨＯＴ−１（キメラ抗体）及び実施例３で作製した完全ヒト型ＨＯＴ−１についてヒト血漿中の活性型ＰＡＩ−１阻害活性を評価するために、肥満患者の血漿を用いて、活性型ＰＡＩ−１阻害アッセイを実施した。健常人の血漿を用いた場合、活性型ＰＡＩ−１の濃度が低くアッセイ系の構築が困難であるため、血漿中活性型ＰＡＩ−１濃度が高いことが知られている肥満患者の血漿を用いた（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９６、Ｖｏｌ．２、ｐ．８００−８０３）。【００９９】
ｕＰＡ（ウロキナーゼ静注用６万単位「ベネシス」（登録商標）；田辺三菱製薬株式会社）をＰＢＳで５０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、アッセイプレートであるヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ｕＰＡを固相化した。固相液を逆遠心で除去し、ＰＢＳで３倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を１ウェルあたり２００μＬ添加し室温にて１時間静置した。【０１００】
その間に、肥満患者血漿及び抗体サンプルの混合液（血漿−抗体混合液）を調製した。具体的には、０．１％ウシ血清由来アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳを用いて、血漿−抗体混合液を調製した時に肥満患者血漿が３５倍希釈になるように血漿を希釈した（血漿−抗体混合液に含まれるヒト血漿由来活性型ＰＡＩ−１の濃度は約３６０ｐｇ／ｍＬ）。また、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、抗体の終濃度が７段階の希釈系列で１０００ｎｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまでになるように抗体サンプルを希釈した。その後、前記血漿及び抗体サンプルを混合し、血漿−抗体混合液を調製した。検量線用サンプルとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１００００ｐｇ／ｍＬから１０ｐｇ／ｍＬまで７段階に希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を調製した。コントロールサンプルとして、抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを肥満患者血漿と混合したサンプルを準備した。これら血漿−抗体混合液、検量線サンプル、及びコントロールサンプルを室温で３０分間静置し、プレインキュベートした。【０１０１】
前記アッセイプレート中のブロッキング剤を逆遠心で除去した後、前記プレインキュベートした血漿−抗体混合液、検量線用サンプル、及びコントロールサンプルをアッセイプレートに１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液で３０００倍に希釈した抗ＰＡＩ−１抗体（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社、ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温で３０分間静置したのち、プレートを洗浄液で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液で２０００倍に希釈したビオチン化抗マウスＩｇ抗体（Ａｎｃｅｌｌ社、２３４０１０）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温で３０分間静置したのち、プレートを洗浄液で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液で１０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識ストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温にて３０分間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄した。２ｍＭトリス（ｐＨ９．８）含有０．１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液で５倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＡＰ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）を１ウェルあたり１００μＬ加えて、そのシグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【０１０２】
検量線を用いて活性型ヒトＰＡＩ−１濃度を算出した。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、平均値を算出した。抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを肥満患者血漿と混合したサンプルを添加したウェルの活性型ヒトＰＡＩ−１濃度を１００％として設定し、抗体１０００ｎｇ／ｍＬを肥満患者血漿と混合したウェルの活性型ヒトＰＡＩ−１濃度を０％として設定した。算出された活性型ヒトＰＡＩ−１抑制率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＩＣ５０値を算出した。【０１０３】
その結果、ＨＯＴ−１（キメラ抗体）のＩＣ５０値は１１．３ｎｇ／ｍＬであり、完全ヒト型ＨＯＴ−１のＩＣ５０は６．０ｎｇ／ｍＬであって、いずれの抗体もヒト血漿中の活性型ＰＡＩ−１のｕＰＡ結合活性を阻害することが明らかとなった。【０１０４】
（実施例６：ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対する結合選択性評価）
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、実施例３で作製した完全ヒト型ＨＯＴ−１のＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対する結合選択性を評価した。次の（１）〜（４）の４通りのヒトＰＡＩ−１固相化プレートを作製し、各プレートを用いて試験した。
（１）ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体固相化プレート
ビトロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、３５４２３８）をＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ビトロネクチンを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、ビトロネクチンに捕捉させた。本プレートでの試験により、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１に対する抗体の結合活性を評価した。
（２）潜在型ヒトＰＡＩ−１固相化プレート
組換え潜在型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ｌ）をＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、潜在型ヒトＰＡＩ−１を固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置した。本プレートでの試験により、潜在型ヒトＰＡＩ−１に対する抗体の結合活性を評価した。
（３）ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体固相化プレート
ｕＰＡ（ウロキナーゼ静注用６万単位「ベネシス」（登録商標）；田辺三菱製薬株式会社）をＰＢＳで１００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ｕＰＡを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、ｕＰＡに捕捉させた。本プレートでの試験により、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体に対する抗体の結合活性を評価した。
（４）ｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体固相化プレート
ｔＰＡ（アクチバシン（登録商標）注６００万；協和発酵キリン株式会社）をＰＢＳで１０００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ透明９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ｔＰＡを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて３０分間静置した。０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００ｎｇ／ｍＬに希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を１ウェルあたり１００μＬ添加し、ｔＰＡに捕捉させた。本プレートでの試験により、ｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体に対する抗体の結合活性を評価した。【０１０５】
作製した各ヒトＰＡＩ−１固相化プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで８段階に希釈した完全ヒト型ＨＯＴ−１を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。比較抗体として、完全ヒト型抗ヒトＰＡＩ−１抗体であるＭＥＤＩ−５７９（特許文献３）、マウス抗ヒトＰＡＩ−１抗体であるＭＡ−３３Ｂ８（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）、ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社）、ＭＡ−５５Ｆ４Ｃ１２（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＨＭ２１８０）、及びＭＡ−５６Ａ７Ｃ１０（Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、ＨＭ２１８２）を０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈し、１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。また、コントロールとして、抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルを作製した。洗浄液で３回洗浄した後、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を使用して２０００倍に希釈した検出抗体を１ウェルあたり１００μＬ添加して反応させた。検出抗体としては、マウス抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、１０１０−０５）を、ヒト抗体のＦｃ領域を有する被験抗体の検出用にＨＲＰ標識ウサギ抗ヒトＩｇ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、６１４５−０５）を用いた。室温にて３０分間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社）に含まれる発色液を１ウェルあたり１００μＬ加え、室温で１５分間程度静置した後、前記発色キットに含まれる反応停止液を１００μＬ添加して、そのＯＤ４５０値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【０１０６】
プレートごとに、各抗体の試験をデュプリケートで行い、平均値を算出した。各抗体の各濃度におけるＰＡＩ−１結合率を算出するにあたり、抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルの測定値を０％とし、各抗体における最大濃度の測定値を１００％と設定した。ただし、完全ヒト型ＨＯＴ−１については、潜在型ヒトＰＡＩ−１、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体、及びｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体に対する結合活性評価系において、最大濃度添加しても同じヒトＦｃ領域を有するＭＥＤＩ−５７９の最大濃度の測定値に達しなかったため、ＭＥＤＩ−５７９の各評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定した。また、ＭＡ３３−Ｂ８については、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対する結合活性評価系において、最大濃度添加しても同じマウスＦｃ領域を有するＭＡ５６−Ａ７Ｃ１０の最大濃度の測定値に達しなかったため、ＭＡ５６−Ａ７Ｃ１０の評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定した。算出されたＰＡＩ−１結合率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＥＣ５０値を算出した。
表１：抗ヒトＰＡＩ−１抗体の各種ヒトＰＡＩ−１に対する結合活性
【表１】
0006512213.tif 000002
＞１０００００は、ＭＥＤＩ−５７９の各評価系における最大濃度の測定値の５０％を示す抗体濃度が１０００００ｎｇ／ｍＬよりも大きいことを意味する。【０１０７】
その結果、完全ヒト型ＨＯＴ−１は、ＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対して強い結合活性を示し、かつ極めて高い選択的結合活性を有することが明らかになった。【０１０８】
完全ヒト型ＨＯＴ−１は、各比較抗体と比較してＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対して極めて高い選択的結合活性を有することから、完全ヒト型ＨＯＴ−１は、従来知られていた抗ヒトＰＡＩ−１抗体とはＰＡＩ−１との結合部位が異なり、ヒトＰＡＩ−１の活性中心又はその周辺により近い部位に結合していることが示唆された。【０１０９】
（実施例７：単量体活性型ヒトＰＡＩ−１に対する結合評価）
完全ヒト型ＨＯＴ−１の単量体活性型ヒトＰＡＩ−１への結合活性を測定するために、ＳＰＲ解析を行った。ＳＰＲ解析においては、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ２００（ＧＥヘルスケアジャパン）及び組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を用いて解析を行った。その結果、完全ヒト型ＨＯＴ−１が単量体として存在する活性型ヒトＰＡＩ−１に結合することが明らかとなった。【０１１０】
（実施例８：サルＰＡＩ−１に対する結合選択性評価）
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ビトロネクチンと複合体を形成した活性型サルＰＡＩ−１（ＶＴＮ−サルＰＡＩ−１複合体とも称する）に対する完全ヒト型ＨＯＴ−１の結合選択性を評価した。次の（１）〜（４）の４通りのサルＰＡＩ−１固相化プレートを作製し、各プレートを用いて試験した。比較抗体としてＭＥＤＩ−５７９を使用した。【０１１１】
（１）ＶＴＮ−サルＰＡＩ−１複合体固相化プレート
実施例６（１）に記載の方法に従って、ＶＴＮ−サルＰＡＩ−１に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え活性型ヒトＰＡＩ−１の代わりに、組換え活性型サルＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＣＹＰＡＩ）を使用した。また、完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９を１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈して使用した。
（２）潜在型サルＰＡＩ−１固相化プレート
実施例６（２）に記載の方法に従って、潜在型サルＰＡＩ−１に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え潜在型ヒトＰＡＩ−１の代わりに、組換え潜在型サルＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＣＹＰＡＩ−Ｌ）を使用した。また、完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９を１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈して使用した。
（３）ｕＰＡ−サルＰＡＩ−１複合体固相化プレート
実施例６（３）に記載の方法に従って、ｕＰＡ−サルＰＡＩ−１複合体に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え活性型ヒトＰＡＩ−１の代わりに、組換え活性型サルＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＣＹＰＡＩ）を使用した。また、完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９を１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈して使用した。
（４）ｔＰＡ−サルＰＡＩ−１複合体固相化プレート
実施例６（４）に記載の方法に従って、ｔＰＡ−サルＰＡＩ−１複合体に対する抗体の結合活性を評価した。但し、組換え活性型ヒトＰＡＩ−１の代わりに、組換え活性型サルＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＣＹＰＡＩ）を使用した。また、完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９を１００００ｎｇ／ｍＬから０．０１ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈して使用した。【０１１２】
作製した各サルＰＡＩ−１固相化プレートを用いて、実施例６に記載の方法に従い、各抗体のＥＣ５０値を算出した。ただし、完全ヒト型ＨＯＴ−１については、潜在型サルＰＡＩ−１、ｕＰＡ−サルＰＡＩ−１複合体、及び、ｔＰＡ−サルＰＡＩ−１複合体に対する結合活性評価系において、最大濃度添加しても同じヒトＦｃ領域を有するＭＥＤＩ−５７９の最大濃度の測定値に達しなかったため、ＭＥＤＩ−５７９の各評価系における最大濃度の測定値を１００％と設定した。
表２：抗ＰＡＩ−１抗体の各種サルＰＡＩ−１に対する結合活性
【表２】
0006512213.tif 000003
＞１００００は、ＭＥＤＩ−５７９の各評価系における最大濃度の測定値の５０％を示す抗体濃度が１００００ｎｇ／ｍＬよりも大きいことを意味する。【０１１３】
その結果、完全ヒト型ＨＯＴ−１抗体は、ＶＴＮ−サルＰＡＩ−１複合体に対して強い結合活性を示し、かつ極めて高い選択的結合活性を有することが明らかになった。【０１１４】
（実施例９：ヒト及びサル血漿中活性型ＰＡＩ−１阻害活性測定）
完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９のヒト及びサル血漿中の活性型ＰＡＩ−１阻害活性の評価を実施した。ヒト血漿については、実施例５と同様に肥満患者の血漿を用いた。サル血漿については、カニクイザルにＬＰＳを静脈内投与し、採取した血漿を用いた。【０１１５】
ヒト血漿中の活性型ＰＡＩ−１阻害活性の評価に関しては、実施例５の方法に従った。サル血漿中の活性型ＰＡＩ−１阻害活性の評価に関しては、実施例５に記載の方法の内、ヒト血漿の代わりに、サル血漿を用いた。サル血漿については、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、血漿−抗体混合液を調製した時にサル血漿が１２０倍希釈になるように血漿を希釈した。両評価系とも、各抗体の終濃度は、３００ｎｇ／ｍＬから０．３ｎｇ／ｍＬ（７段階希釈）で実施した。検量線用サンプルとして０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで３０００ｐｇ／ｍＬから３ｐｇ／ｍＬまで７段階に希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を使用した。【０１１６】
検量線を用いて各活性型ＰＡＩ−１濃度を算出した。各抗体についてデュプリケートで試験を行い、平均値を算出した。抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを肥満患者血漿又はサル血漿と混合したサンプルを添加したウェルの活性型ＰＡＩ−１濃度を１００％として設定し、ＭＥＤＩ−５７９抗体３００ｎｇ／ｍＬを肥満患者血漿又はサル血漿と混合したウェルの各活性型ＰＡＩ−１濃度を０％として設定した。算出された各活性型ＰＡＩ−１抑制率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＩＣ５０値を算出した。【０１１７】
その結果、ヒト血漿中活性型ＰＡＩ−１のｕＰＡ結合活性に対する、完全ヒト型ＨＯＴ−１のＩＣ５０値は４．２ｎｇ／ｍＬであり、ＭＥＤＩ−５７９のＩＣ５０値は０．７３ｎｇ／ｍＬであった。サル血漿中活性型ＰＡＩ−１のｕＰＡ結合活性に対する、完全ヒト型ＨＯＴ−１のＩＣ５０値は３７ｎｇ／ｍＬであり、ＭＥＤＩ−５７９のＩＣ５０値は０．８３ｎｇ／ｍＬであった。【０１１８】
完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９はヒト及びサル血漿中の活性型ＰＡＩ−１のｕＰＡ結合活性を阻害することが明らかとなった。【０１１９】
（実施例１０：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管内再現系でのＰＡＩ−１阻害活性測定）
血管壁においてｕＰＡ及びｔＰＡが血管内皮から産生されて、血管内皮に結合していることが知られている（Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．、１９９３、Ｖｏｌ．６、Ｎｏ．３、ｐ．５５９−５７６。Ｂｌｏｏｄ、２０１１、Ｖｏｌ．１１８、Ｎｏ．１１、ｐ．３１８２−３１８５）。つまり、ｕＰＡ及びｔＰＡは血中だけでなく血管壁にも存在する。実施例９では、抗ＰＡＩ−１抗体による血漿中の活性型ＰＡＩ−１の阻害活性を測定したが、この実験系は血漿中成分のみを抽出していることから血管壁の影響が考慮されていない。そのため、実際の血管中における生体反応を反映しているとは言い難いと考えられる。そこで、実際の血管内状態を模した系として、ｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体を固相化したアッセイプレートに活性型ＰＡＩ−１、ｕＰＡ及びｕＰＡ基質ペプチドを混合した評価系を用いて、完全ヒト型ＨＯＴ−１及びＭＥＤＩ−５７９の活性をｕＰＡの活性を指標に測定した。【０１２０】
組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）をＰＢＳで１０μｇ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で２０分間プレートを静置することで、活性型ＰＡＩ−１を固相化した。固相液を逆遠心で除去し、ブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を１ウェルあたり２００μＬ添加し室温にて１５分間静置した。逆遠心で溶液を除去した後、ＰＢＳで３倍に希釈したブロッキング剤でｕＰＡ（ウロキナーゼ静注用６万単位「ベネシス」（登録商標）；田辺三菱製薬株式会社）を５０Ｕｎｉｔ／ｍＬになるように希釈して１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温で２０分間静置した後、重炭酸緩衝液（シグマ社、Ｃ３０４１−５０ＣＡＰ）を１ウェルあたり２００μＬ添加して、３７℃で一晩静置した。【０１２１】
０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて、各抗体の終濃度が１０段階の希釈系列で５００ｎｇ／ｍＬから０．０１５ｎｇ／ｍＬまでになるように希釈した。各抗体溶液に、ＰＢＳで終濃度０．００２５μｇ／ｍＬになるように希釈した組換えヒト活性型ＰＡＩ−１、ＰＢＳで終濃度０．００２５μｇ／ｍＬになるように希釈したビトロネクチン、ＰＢＳで終濃度６５ｎｇ／ｍＬになるように希釈したｕＰＡの基質ペプチドであるＧｌｕｔａｒｙｌｇｌｙｃｙｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ ４−ｍｅｔｈｙｌｃｏｕｍａｒｙｌ−７−ａｍｉｄｅ（ペプチド研究所、３０９７−ｖ）、ＰＢＳで終濃度１．２５ｍｇ／ｍＬになるように希釈したＢＳＡ、並びに、ＰＢＳで終濃度０．０５ｕｎｉｔ／ｍＬになるように希釈したｕＰＡを混合した。また、コントロールとして、抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェル、並びに、抗体及び組換えヒト活性型ＰＡＩ−１の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ及びＰＢＳを混合したウェルを作製した。【０１２２】
プレートを洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄した後、上記混合液を１ウェルあたり５０μＬ添加して、室温で２４時間静置することでｕＰＡが基質ペプチドを切断する酵素反応を進ませた。基質ペプチドが切断されると蛍光物質である７−ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−ｃｏｕｍａｒｉｎがペプチド本体から切り離される。各ウェルのサンプルを１ウェルあたり２０μＬずつ採取してヌンク黒色３８４プレート（Ｎｕｎｃ社）に移し、励起波長４００ｎｍ及び蛍光波長５０５ｎｍの蛍光シグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【０１２３】
各抗体の試験をデュプリケートで行い、平均値を算出した。各抗体の各濃度におけるｕＰＡ活性率を算出するにあたり、抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルの測定値の平均値を０％とし、抗体及び組換えヒト活性型ＰＡＩ−１の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ及びＰＢＳを添加したウェルの測定値の平均値を１００％と設定した。算出されたｕＰＡ活性率を解析し、４パラメータロジスティック曲線回帰により抗体のＥＣ５０値を算出した。ＰＡＩ−１はｕＰＡ活性を阻害することから、抗体のヒトＰＡＩ−１阻害活性が高いほど、ｕＰＡ活性が高くなる。【０１２４】
その結果、本評価系におけるｕＰＡの活性を指標とした、完全ヒト型ＨＯＴ−１のＥＣ５０値は１２．７ｎｇ／ｍＬであり、ＭＥＤＩ−５７９のＥＣ５０値は４２．１ｎｇ／ｍＬであった。完全ヒト型ＨＯＴ−１の方が高いｕＰＡ活性化能を有することが明らかとなった。したがって、本評価系において、完全ヒト型ＨＯＴ−１の方が高いＰＡＩ−１阻害活性を有することが明らかとなった。【０１２５】
（実施例１１：サル血漿中抗体濃度測定）
実施例６の結果から、完全ヒト型ＨＯＴ−１はＶＴＮ−ＰＡＩ−１複合体に対して強い結合活性を示し、かつ極めて高い選択的結合活性を有することが明らかになった。一般的に、血中における抗体はそのまま代謝される以外に抗原に結合して抗原−抗体複合体として代謝されることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１２、Ｖｏｌ．１０１、Ｎｏ．１２、ｐ４３６７−４３８２）。血漿中におけるＰＡＩ−１はＶＴＮ−ＰＡＩ−１以外にも、潜在型ＰＡＩ−１及びｔＰＡ−ＰＡＩ−１複合体等の様々な複合体の状態で存在する（Ｂｌｏｏｄ、１９９０、Ｖｏｌ．７６、ｐ．９３０−９３７）ことから、選択性の低い抗ＰＡＩ−１抗体は様々なＰＡＩ−１と抗原−抗体複合体を形成して代謝される。一方で完全ヒト型ＨＯＴ−１はＶＴＮ−ＰＡＩ−１選択的に結合するため潜在型ＰＡＩ−１やＰＡ−ＰＡＩ−１との複合体としては代謝されにくく、そのため血中における濃度が長期間維持される可能性が考えられた。実際抗体の血中濃度持続はこの抗原−抗体複合体の代謝速度に大きく依存することが知られている（Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ、２０１１、Ｖｏｌ．３、Ｎｏ．６、ｐ．６５９−６７５）。実施例８の結果から、完全ヒト型ＨＯＴ−１はＶＴＮ−サルＰＡＩ−１複合体に対する高い選択的結合活性を示したことから、サルに抗体を投与した際の血漿中抗体濃度を測定した。比較抗体として、ＭＥＤＩ−５７９を使用した。【０１２６】
カニクイザルにＰＢＳで希釈した完全ヒト型ＨＯＴ−１又はＭＥＤＩ−５７９を静脈投与した。処置群を以下のように設定した。
［処置群］
ＨＯＴ−１投与群（３匹）：
完全ヒト型ＨＯＴ−１を投与した群（２．０ｍｇ／ｋｇ）
ＭＥＤＩ−５７９投与群（２匹）：
ＭＥＤＩ−５７９を投与した群（２．０ｍｇ／ｋｇ）
抗体投与前、及び、抗体投与０．２５、１、２、４、８、２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４時間後に採血を行い、血漿を得た。完全ヒト型ＨＯＴ−１に関しては追加で、６７２、９３６、１２００、１４４０時間後にも採血を行い、血漿を得た。【０１２７】
Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）アッセイにより、血漿中の各抗体濃度を測定した。【０１２８】
完全ヒト型ＨＯＴ−１のＥＣＬアッセイを以下に示す。ビトロネクチンをＴＢＳで１００ｎｇ／ｍＬとなるように希釈し、Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｌ１５ＸＡ−１）を用いて１ウェルあたり２５μＬ添加した。４℃で一晩プレートを静置することで、ビトロネクチンをプレートに固相化した。逆遠心によりビトロネクチン固相液を除去し、洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で３回洗浄し、ＴＢＳで１００ｎｇ／ｍＬに希釈した組換え活性型ヒトＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を１ウェルあたり２５μＬ添加し、４℃で１時間静置することで、固相化した。逆遠心により固相液を除去し、洗浄液で３回洗浄し、ブロッキング剤１（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり１５０μＬ添加した。室温で1時間静置した後、逆遠心によりブロッキング剤１を除去し、洗浄液で３回洗浄した。抗体投与のサル血漿を０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ブロッキング剤１溶液で１００倍に希釈し、さらに、抗体未投与のサル血漿を１％含む０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ブロッキング剤１溶液（以下、血漿−Ｔｗｅｅｎ含有ブロッキング剤１溶液と称する）を用いて検量線の範囲内になるように希釈し、１ウェルあたり２５μＬ添加した。検量線作成用に、血漿−Ｔｗｅｅｎ含有ブロッキング剤１溶液を用いて、１００ｎｇ／ｍＬから０．００１７ｎｇ／ｍＬまで１１段階に希釈した完全ヒト型ＨＯＴ−１を添加したウェルを準備した。コントロールとして、抗体の代わりに血漿−Ｔｗｅｅｎ含有ブロッキング剤１溶液を添加したウェルを準備した。室温にて１時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ブロッキング剤１溶液を用いて８０ｎｇ／ｍＬに希釈したサルイムノグロブリン吸収抗ヒトＩｇＧ軽鎖ビオチン(免疫生物研究所、１７２４９)を２５μＬ添加した。室温にて1時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ブロッキング剤１溶液を用いて２０ｎｇ／ｍＬに希釈したＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ３２ＡＤ−１）を２５μＬ添加した。室温にて1時間インキュベートした後、逆遠心により溶液を除去し、洗浄液で３回洗浄した。超純水（ＭｉｌｌｉＱ（登録商標）、メルク社）で２倍に希釈したＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（４ｘ）ｗｉｔｈ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ９２ＴＣ−２）を１５０μＬ添加し、その電気化学発光をＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社）で測定した。【０１２９】
完全ヒト型ＨＯＴ−１のＥＣＬアッセイの方法に従って、ＭＥＤＩ−５７９の血漿中濃度を測定した。但し、ビトロネクチン及び組換え活性型ヒトＰＡＩ−１の濃度は７５ｎｇ／ｍＬで使用した。また、組換え活性型ＰＡＩ−１を固相化した後のブロッキング工程として、ブロッキング剤１処理の代わりに、以下のブロッキング処理を行った。ＴＢＳで５ｗ／ｖ％に溶解したブロッキング剤２（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ９３ＢＡ−１）を１ウェルあたり１５０μＬ添加し、室温で１時間静置した。ブロッキング剤を除去し、洗浄液で３回洗浄した後、ブロッキング剤１で４倍希釈したブロッキング剤３（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社、Ｒ５１ＢＢ−３）を１ウェルあたり５０μＬ添加した。【０１３０】
抗体濃度を算出するにあたり、検量線を作成した。回帰式は５−パラメータロジスティックモデルにて解析を行った。重みづけは１／ｙ2とした。検量線から、各採血ポイントにおける抗体濃度を算出した。各血漿の試験をトリプリケートで行い、算出した濃度の平均値を求めた。得られた抗体濃度を各被験物質、各被験サルごとに、ＢｉｏＢｏｏｋ（ＩＤＢＳ社）にて解析し、縦軸を抗体濃度の対数値、横軸を採血時間として描いたグラフのβ層の傾きから半減期を算出した。【０１３１】
その結果、ＭＥＤＩ−５７９の半減期は５２．６時間であったのに対し、完全ヒト型ＨＯＴ−１の半減期は２５５時間であった。完全ヒト型ＨＯＴ−１の方がより長い時間血中で維持されることが明らかになった。【０１３２】
（実施例１２：サル血中活性型ＰＡＩ−１阻害活性測定）
サルの血中で長期間かつ強力にＰＡＩ−１活性を阻害することが、肺線維症等のＰＡＩ−１が病態に関与する疾患の予防又は治療に望ましい。そこで、完全ヒト型ＨＯＴ−１のサル血中における活性型ＰＡＩ−１阻害活性を評価した。比較抗体としてＭＥＤＩ−５７９を使用した。【０１３３】
実施例１１において完全ヒト型ＨＯＴ−１又はＭＥＤＩ−５７９を投与したサルから得た血漿を用いて血中活性型ＰＡＩ−１の阻害活性を測定した。【０１３４】
ｕＰＡ（ウロキナーゼ静注用６万単位「ベネシス（登録商標）」；田辺三菱製薬株式会社）をＰＢＳで５０ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように希釈し、ヌンクマキシソープ白色９６プレート（Ｎｕｎｃ社）に１ウェルあたり１００μＬ添加し、４℃で一晩プレートを静置することで、ｕＰＡを固相化した。逆遠心により固相液を除去し、ブロッキング剤（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、３７５３２）を１ウェルあたり２００μＬ添加し、室温にて１時間静置した。洗浄液（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＴＢＳ）で洗浄し、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０倍に希釈した血漿を１ウェルあたり１００μＬ添加し、室温で３０分間静置した。このとき、検量線用として、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを用いてヒト活性型ＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ社、ＰＡＩ−Ａ）を３００ｎｇ／ｍＬから０．００３ｎｇ／ｍＬまで７段階に希釈し、１ウェルあたり１００μＬ添加し、血漿と同時に室温で３０分間静置した。また、コントロールとして、抗体の代わりに０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳを添加したウェルを作製した。洗浄液で３回洗浄した後、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を使用して１００００倍に希釈したビオチン化（同仁化学研究所、ＬＫ０３）抗ＰＡＩ−１抗体（Ｐｒｏｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ社、ＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７）を１ウェルあたり１００μＬ添加して反応させた。ここで、実施例６の結果より、プレート上のｕＰＡ−ＰＡＩ−１複合体を認識する抗ＰＡＩ−１抗体としてＭＡ−３３Ｈ１Ｆ７を使用した。また、ビオチン化は同仁化学研究所のキットに指定された方法にて行った。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄し、ＰＢＳで２０倍に希釈したブロッキング剤（ナカライテスク社、０３９５３−９５）溶液を使用して１０００倍に希釈したストレプトアビジン−ＡＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社、２１３２４）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。室温にて１時間インキュベートした後、洗浄液で３回洗浄し、２ｍＭトリス（ｐＨ９．８）含有０．１ｍＭ塩化マグネシウム水溶液で５倍希釈したアルカリフォスファターゼ基質（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ＡＰ；ＳｕｒＭｏｄｉｃｓ社、ＡＰＵ４−０１００−０１）を１ウェルあたり１００μＬ加えた。３０分間室温に静置した後に、シグナル値をＥｎＶｉｓｉｏｎカウンター（パーキンエルマー社）で測定した。【０１３５】
検量線を用いて活性型ＰＡＩ−１濃度を算出した。各抗体のサル血漿中活性型ＰＡＩ−１阻害作用の結果を図１に示す。各血漿についてデュプリケートで試験を行い、平均値を算出した。その上で試験に用いた各群のサル血漿の値を平均した。抗体投与前の活性型ＰＡＩ−１濃度を１００％とし、検量線用活性型ＰＡＩ−１濃度０ｎｇ／ｍＬを０％として各血漿における活性型ＰＡＩ−１濃度から抑制割合を算出し、抗体投与後の血漿中活性型ＰＡＩ−１濃度を投与前比５０％以上抑制できる日数を求めた。【０１３６】
その結果、完全ヒト型ＨＯＴ−１を投与した群においては２８日、ＭＥＤＩ−５７９の投与群では７日であった。完全ヒト型ＨＯＴ−１はＭＥＤＩ−５７９と比較して血漿中における活性型ＰＡＩ−１をより長期的かつ強力に抑制することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１３７】
本発明の抗ヒトＰＡＩ−１抗体は、活性型ヒトＰＡＩ−１が病態形成に関与する各種疾患の予防又は治療に有用である。また、本発明のポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換された宿主細胞及び抗体を生産する方法は、前記抗ヒトＰＡＩ−１抗体を生産するのに有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３８】
以下の配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。具体的には配列表の配列番号１及び３で表される塩基配列は、それぞれ完全ヒト型ＨＯＴ−１の重鎖及び軽鎖の塩基配列であり、塩基番号２及び４で表されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び３によりコードされる重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列である。
【図１】
0006512213.tif 000004
【配列表】
0006512213000001.app