(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と
を含む抗Ｎｏｄａｌ抗体。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
さらに、ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク及びヒトＶＬカッパ亜群Ｉコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも１つのフレームワークを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号１３におけるエピトープに結合する請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、抗体断片である請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２の断片から選択される請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
Ｎｏｄａｌ活性の阻害のための、請求項１に記載の抗体を含む組成物であって、Ｎｏｄａｌを発現している細胞に曝露されることを特徴とする、組成物。
【請求項９】
Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害を有する対象におけるＮｏｄａｌ活性の阻害のための、請求項１に記載の抗体を含む組成物。
【請求項１０】
前記障害が癌である請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記癌が、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌または白血病から成る群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
試料中のＮｏｄａｌを検出する方法であって、前記試料を請求項１に記載の抗体と接触させることを含む方法。
【請求項１３】
前記試料が、生体試料である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生体試料が、血液、血清、体液、生検細胞、腸剥離物、喀痰、肺浸出物、尿及び組織から成る群から選択される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体試料が、癌細胞および／または腫瘍細胞を含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌が、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌または白血病から成る群から選択される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料中のＮｏｄａｌのレベルを定量することを含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
Ｎｏｄａｌが免疫アッセイによって検出される請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体を固体支持体に付着させる請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体のＮｏｄａｌへの結合が、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識及び／または色素標識から選択される標識によって検出される請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１４年１０月７日に出願された米国仮特許出願番号第６２／０６０，９７４号に対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、Ｎｏｄａｌに関連する障害または疾患を診断する、予防する及び治療するための抗Ｎｏｄａｌ抗体及び抗Ｎｏｄａｌ抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
進行性の腫瘍細胞は多数の特徴を胚性前駆細胞と共有している。脊椎動物の発生の間に、多能性前駆細胞はシグナル伝達分子の自己分泌または傍分泌の送達を介して徐々に特定の運命に特殊化され、癌の進行の間に、悪性細胞は同様に、腫瘍の増殖と転移を促進する指示を放出し、受け取る。たとえば、黒色腫細胞のような進行性の腫瘍細胞は、脱分化した多能性の可塑性表現型（微細環境の因子に応答すると同様にエピジェネティックなメカニズムを介して細胞に影響を及ぼすことができる）を表す分子署名によって明らかにされるような幹細胞様の可塑性を示す（Ｂｉｔｔｎｅｒら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０６：５３６−５４０；Ｈｅｎｄｒｉｘら，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，３：４１１−４２１）。さらに、進行性の黒色腫細胞は血管擬態が可能であり、すなわち、それらは内皮細胞型に関連する遺伝子を同時に発現しながら血管様のネットワークを形成することができる（Ｓｅｆｔｏｒら，２００２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｈｅｍａｔｏｌ．４４：１７−２７；Ｍａｎｉｏｔｉｓら，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：７３９−７５２；Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎら，２０１２，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：２７２６−２７３２）。
【０００４】
以前の研究は、腫瘍細胞の挙動を調節する胚性微細環境の能力を調べることによって癌細胞と幹細胞との間の類似性を十分に利用した（Ｐｉｅｒｃｅら，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：１０８２−１０８７；Ｇｅｒｓｃｈｅｎｓｏｎら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ.８３：７３０７−７３１０；Ｌｅｅら，２００５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３３：１５６０−１５７０；Ｍｉｎｔｚら，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３５８５−３５８９）。たとえば、Ｐｉｅｃｅ及びその共同研究者らは、神経胚段階のマウス胚は神経芽細胞腫の細胞を調節し、胎児の皮膚が黒色腫の増殖を阻害することを報告した（Ｐｉｅｒｃｅら，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：１０８２−１０８７；Ｇｅｒｓｃｈｅｎｓｏｎら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：７３０７−７３１０）。研究は腫瘍細胞の調節における胚性シグナルの役割に焦点を当てているが、ほとんどが、それによって癌細胞がその微細環境及び結果的に生じる相互の相互作用を調節する分子メカニズムを発見するツールとして胚性モデルを利用していない。
【０００５】
幹細胞の可塑性に寄与する主要な因子の１つがＮｏｄａｌである。Ｎｏｄａｌは形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリーに属する高度に保存された形態形成因子である（Ｓｃｈｉｅｒら，２００３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：５８９−６２１）。原腸形成の前に組織化シグナルを生じることによって、Ｎｏｄａｌは胚軸の形成を開始し、以前の研究は、Ｎｏｄａｌの異所性の発現が異所性の位置にて中内胚葉の運命を誘導することを明らかにした（Ｗｈｉｔｍａｎ，２００１，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ，１：６０５−６１７；Ｓｃｈｉｅｒ，２００３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：５８９−６２１；Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら，１９９２，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．１９４：１９８−２０８；Ｓｍｉｔｈ，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７：８５６−８６１；Ｚｈｏｕら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６１：５４３−５４７；Ｒｅｂａｇｌｉａｔｉら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：９９３２−９９３７；Ｔｏｙａｍａら，１９９５，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２１：３８３−３９１）。
【０００６】
Ｎｏｄａｌの活性化には、共受容体であるＣｒｉｐｔｏ−１への結合とそれに続くＩ型及びＩＩ型のアクチビン様キナーゼ受容体（ＡＬＫ）のリン酸化が含まれる。次にＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３が活性化される（Ｌｅｅら，２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２：８８２−８８４）。さらに、ヒトの胚性幹細胞はＮｏｄａｌを発現し、たとえば、ＬｅｆｔｙＡ／ＢのようなＮｏｄａｌの内在性の阻害剤を分泌する（Ｂｅｓｓｅｒ，Ｄ．，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４５０７６−４５０８４）。それぞれマウスのＬｅｆｔｙ１及びＬｅｆｔｙ２に対するヒトのホモログであるＬｅｆｔｙＢ及びＬｅｆｔｙＡは染色体ｑ４２上でおよそ５０ｋｂ離れて、互いに９６％同一である（Ｋｏｓａｋｉら，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６４：７１２−２１）。ＬｅｆｔｙＡ及びＬｅｆｔｙＢはＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーであり、とりわけＮｏｄａｌの最も強力な阻害剤であると見なされている。
Ｎｏｄａｌは進行性の癌の多数の異なる形態にて再活性化され、異常に上方調節されるが、Ｌｅｆｔｙは発現停止されており−Ｎｏｄａｌが無秩序にシグナルを送るのを許している（Ｐｏｓｔｏｖｉｔら，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５：４３２９−４３３４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｉｔｔｎｅｒら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ，４０６：５３６−５４０
【非特許文献２】Ｈｅｎｄｒｉｘら，２００３，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，３：４１１−４２１
【非特許文献３】Ｓｅｆｔｏｒら，２００２，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｈｅｍａｔｏｌ．４４：１７−２７
【非特許文献４】Ｍａｎｉｏｔｉｓら，１９９９，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５５：７３９−７５２
【非特許文献５】Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎら，２０１２，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：２７２６−２７３２
【非特許文献６】Ｐｉｅｒｃｅら，１９８２，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：１０８２−１０８７
【非特許文献７】Ｇｅｒｓｃｈｅｎｓｏｎら，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ.８３：７３０７−７３１０
【非特許文献８】Ｌｅｅら，２００５，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３３：１５６０−１５７０
【非特許文献９】Ｍｉｎｔｚら，１９７５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３５８５−３５８９
【非特許文献１０】Ｓｃｈｉｅｒら，２００３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１９：５８９−６２１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は抗Ｎｏｄａｌ抗体及びその使用方法に関する（たとえば、Ｎｏｄａｌに関連する障害または疾患を診断する、予防する及び治療するための抗Ｎｏｄａｌ抗体の使用）。
【０００９】
従って、一実施形態では、本発明はＮｏｄａｌに結合する抗体を提供する。好まれる実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗体またはその断片はプレヘリックスループ領域におけるヒトＮｏｄａｌのエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、抗体はＮｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達を阻害する。別の実施形態では、抗体はヒトのＮｏｄａｌ（ｈＮｏｄａｌ）に結合する。別の実施形態では、抗体は＜１０ｎＭのＫＤでＮｏｄａｌに結合する。別の実施形態では、抗体は＜５ｎＭのＫＤでＮｏｄａｌに結合する。別の実施形態では、抗体は完全長のＮｏｄａｌに結合する。別の実施形態では、抗体はＣｒｉｐｔｏ−１へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＣｒｉｐｔｏ−１共受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＮｏｄａｌ及び／またはＮｏｄａｌ／Ｃｒｉｐｔｏ−１複合体の下流のシグナル伝達を阻害する。別の実施形態では、抗体はＮｏｄａｌの発現を下方調節する。別の実施形態では、抗体は増殖のマーカーを下方調節する。
【００１０】
さらなる実施形態では、Ｎｏｄａｌに結合するモノクローナル抗体が提供され、その際、該抗体は、（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、及び／または（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。一実施形態では、抗体はさらに少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＨアクセプター２フレームワークを含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＬカッパ亜群Ｉのコンセンサスフレームワークを含む。
【００１１】
別の実施形態では、Ｎｏｄａｌに結合するモノクローナル抗体が提供され、その際、該抗体は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、モノクローナル抗体は、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを有する。一実施形態では、モノクローナル抗体は配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインとを有する。一実施形態では、抗体はさらに少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＨアクセプター２フレームワークを含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＬカッパ亜群Ｉのコンセンサスフレームワークを含む。
【００１２】
さらなる実施形態では、Ｎｏｄａｌに結合するモノクローナル抗体が提供され、その際、抗体は、（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と、（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、及び（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。一実施形態では、抗体はさらに少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＨアクセプター２フレームワークを含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＬカッパ亜群Ｉのコンセンサスフレームワークを含む。
【００１３】
別の実施形態では、Ｎｏｄａｌに結合するモノクローナル抗体が提供され、その際、該抗体は、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、モノクローナル抗体は、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、抗体はさらに少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＨアクセプター２フレームワークを含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＬカッパ亜群Ｉのコンセンサスフレームワークを含む。
【００１４】
別の実施形態では、Ｎｏｄａｌに結合するモノクローナル抗体が提供され、その際、該抗体は、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。一実施形態では、抗体はさらに少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＨアクセプター２フレームワークを含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＬカッパ亜群Ｉのコンセンサスフレームワークを含む。
【００１５】
別の実施形態では、Ｎｏｄａｌに結合するモノクローナル抗体が提供され、その際、該抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む。一実施形態では、抗体はさらに少なくとも１つのヒトフレームワーク領域を含む。一実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＨアクセプター２フレームワークを含む。別の実施形態では、ヒトフレームワーク領域はヒトＶＬカッパ亜群Ｉのコンセンサスフレームワークを含む。
【００１６】
本発明はまた配列番号１３におけるエピトープに結合する単離された抗体も提供する。別の実施形態では、Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域に結合する単離された抗体が提供される。
【００１７】
一実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２の断片から選択される抗体断片である。一実施形態では、抗体は抗原を結合する抗体断片である。別の実施形態では、抗体は単鎖Ｆｖである。別の実施形態では、抗体はヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００１８】
追加の実施形態では、本発明はまた、上記実施形態のいずれか１つが個々に使用される（たとえば、組成物または診断キットにて個々に存在する）ことも提供する。別の実施形態では、上記実施形態のいずれかは実施形態の他の１つとの組み合わせで使用される。
【００１９】
本発明は本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体を用いてＮｏｄａｌの活性を阻害する方法も提供する。一実施形態では、本発明は上記実施形態のいずれかに従って、Ｎｏｄａｌを発現している細胞を抗体に曝露することを含む、Ｎｏｄａｌの活性を阻害する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害を治療する方法を提供し、該方法は有効量の本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体を対象（たとえば、それを必要とする対象）に投与することを含む。一実施形態では、障害は癌である。一実施形態では、抗体は少なくとも１以上の治療剤と共に併用でまたは順次投与される。本発明は特定の作用剤に限定されない。実際、本明細書に記載されている化学療法剤（単数）または化学療法剤（複数）を含むが、これらに限定されない種々の作用剤が本発明の抗体と共に投与されてもよい。一実施形態では、治療剤はＬｅｆｔｙタンパク質（たとえば、組換えＬｅｆｔｙタンパク質）である。一実施形態では、本発明の抗体及び治療剤（単数）または治療剤（複数）は対象に別々に投与される。別の実施形態では、本発明の抗体及び治療剤は同時投与される。
【００２０】
本発明はまた腫瘍細胞の増殖を抑制する方法も提供し、該方法は有効量の本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体を対象（たとえば、それを必要とする対象（例えば癌を有する対象））に投与することを含む。別の実施形態では、本発明は癌の転移を抑制する方法を提供し、該方法はそれを必要とする対象に有効量の本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体を投与することを含む。本発明は特定の型の腫瘍または転移癌または他のＮｏｄａｌが主導する疾患に限定されない。実際、本明細書に記載されているように、本明細書に記載されているものを含むが、これらに限定されない種々の癌、新生物、腫瘍、及びそれらの転移形態が治療されてもよい。一実施形態では、癌は乳癌である。別の実施形態では、癌は黒色腫である。別の実施形態では、癌は前立腺癌である。
【００２１】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。一実施形態では、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つＮｏｄａｌの活性を阻害する。別の実施形態では、ＶＨ鎖領域は配列番号１０のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ３とを含む。別の実施形態では、ＶＨ鎖領域は配列番号３を含む。別の実施形態では、本発明は上記実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された細胞を提供する。本発明はまた、ポリペプチドの産生に適する条件下で上記実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された細胞を培養することと、産生されたポリペプチドを単離することとを含む、Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生させる方法も提供する。
【００２２】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。一実施形態では、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つＮｏｄａｌの活性を阻害する。別の実施形態では、ＶＨ鎖領域は配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３とを含む。別の実施形態では、ＶＨ鎖領域は配列番号２を含む。別の実施形態では、本発明は上記実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された細胞を提供する。本発明はまた、ポリペプチドの産生に適する条件下で上記実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された細胞を培養することと、産生されたポリペプチドを単離することとを含む、Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生させる方法も提供する。
【００２３】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＬ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸も提供する。一実施形態では、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つＮｏｄａｌの活性を阻害する。別の実施形態では、ＶＬ鎖領域は配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含む。別の実施形態では、ＶＬ鎖領域は配列番号１を含む。別の実施形態では、本発明は上記実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された細胞を提供する。本発明はまた、ポリペプチドの産生に適する条件下で上記実施形態のいずれか１つの核酸を含む単離された細胞を培養することと、産生されたポリペプチドを単離することとを含む、Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＬ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生させる方法も提供する。
【００２４】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸も提供し、その際、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ抗体はＮｏｄａｌの活性を阻害する。一実施形態では、抗体は、配列番号１０のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ３とを含むＶＨ鎖領域と、配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含むＶＬ鎖領域とを含む。一実施形態では、ＶＨ鎖領域は配列番号３を含み、且つＶＬ鎖領域は配列番号１を含む。一実施形態では、抗体は配列番号３のＶＨ鎖領域と配列番号１のＶＬ鎖領域とを含むモノクローナル抗体のヒト化形態である。一実施形態では、抗体はＣｒｉｐｔｏ−１へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。
【００２５】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸も提供し、その際、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ抗体はＮｏｄａｌの活性を阻害する。一実施形態では、抗体は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３とを含むＶＨ鎖領域と、配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含むＶＬ鎖領域とを含む。一実施形態では、ＶＨ鎖領域は配列番号２を含み、且つＶＬ鎖領域は配列番号１を含む。一実施形態では、抗体は配列番号２のＶＨ鎖領域と配列番号１のＶＬ鎖領域とを含むモノクローナル抗体のヒト化形態である。一実施形態では、抗体はＣｒｉｐｔｏ−１へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。
【００２６】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸も提供し、その際、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ抗体はＮｏｄａｌの活性を阻害する。一実施形態では、抗体は、配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含むＶＬ鎖領域を含む。一実施形態では、ＶＬ鎖領域は配列番号１を含む。一実施形態では、抗体は配列番号３のＶＨ鎖領域と配列番号１のＶＬ鎖領域とを含むモノクローナル抗体のヒト化形態である。一実施形態では、抗体はＣｒｉｐｔｏ−１へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。
【００２７】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸も提供し、その際、抗体は配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ抗体はＮｏｄａｌの活性を阻害する。一実施形態では、抗体は、配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含むＶＬ鎖領域を含む。一実施形態では、ＶＬ鎖領域は配列番号１を含む。一実施形態では、抗体は配列番号２のＶＨ鎖領域と配列番号１のＶＬ鎖領域とを含むモノクローナル抗体のヒト化形態である。一実施形態では、抗体はＣｒｉｐｔｏ−１へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。別の実施形態では、抗体はＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する。
【００２８】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域に結合するモノクローナル抗体も提供する。一実施形態では、抗体はＮｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達を阻害する。一実施形態では、抗体は転移細胞（たとえば、転移性黒色腫細胞）にてＮｏｄａｌの発現を低減する。一実施形態では、抗体はＳｍａｄ２及び／またはＭＡＰＫ（たとえば、黒色腫細胞における）のリン酸化を低減する。一実施形態では、抗体は転移細胞（たとえば、転移性黒色腫細胞）の肺でのコロニー形成を低減する。一実施形態では、抗体は試験管内での黒色腫細胞の生存率を減らし、黒色腫の細胞死を誘導する。一実施形態では、抗体は生体内で腫瘍（たとえば、乳癌腫瘍）の増殖を阻害する。一実施形態では、抗体は対照に比べて乳癌の腫瘍体積を低減する。
【００２９】
本発明はまた、Ｎｏｄａｌを結合するのに十分な条件下でＮｏｄａｌに結合する本発明の抗体またはその断片と対象に由来する試料（たとえば、本明細書に記載されている生体試料）を接触させることを含む、対象にて癌を診断する方法も提供し、その際、正常な非癌対照に比べたＮｏｄａｌの上昇は癌を示す。本発明は検出される癌の型によって限定されない。実際、本明細書に記載されている任意の癌（膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌及び白血病を含むが、これらに限定されない）が検出されてもよい。好まれる実施形態では、癌はＮｏｄａｌタンパク質を発現する。本明細書に記載されている抗体またはその断片は本発明の診断法で使用されてもよい。組織、血液、糞便、血漿、体液、血清、唾液、肺浸出液、喀痰、尿及び腸剥離物を含むが、これらに限定されない、対象／患者に由来する任意の種類の生体試料がＮｏｄａｌの発現について調べられてもよい。一実施形態では、Ｎｏｄａｌへの抗体の結合は標識によって検出される。本発明は標識の種類によって限定されない。酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識及び色素標識を含むが、これらに限定されない種々の標識が使用されてもよい。酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射性免疫アッセイまたはそれらの変形を含むが、これらに限定されない当該技術で既知の免疫アッセイ用いてＮｏｄａｌが検出されてもよい。抗体を用いてタンパク質を捕捉する標識を含まない技術を用いてもＮｏｄａｌが検出されてもよい。標識を含まない技術には、ＳＰＲ、バイオレイヤーインターフェロメトリー（ＢＬＩ）、長周期グレーティング（ＬＰＧ）等が挙げられる。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
Ｎｏｄａｌに結合し、且つＮｏｄａｌ活性を阻害するモノクローナル抗体。
（項目２）
前記抗体がＮｏｄａｌのプレヘリックスループ領域を結合する項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記抗体が完全長Ｎｏｄａｌに結合する項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記抗体がヒトＮｏｄａｌ（ｈＮｏｄａｌ）に結合する項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記抗体が＜５ｎＭのＫＤでＮｏｄａｌに結合する項目１に記載の抗体。
（項目６）
前記抗体が＜１０ｎＭのＫＤでＮｏｄａｌに結合する項目１に記載の抗体。
（項目７）
前記抗体がＮｏｄａｌのＣｒｉｐｔｏ−１への結合を阻害する項目１に記載の抗体。
（項目８）
前記抗体が
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目１に記載の抗体。
（項目９）
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む項目１に記載の抗体。
（項目１０）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号１のアミノ酸配列を含む項目９に記載の抗体。
（項目１１）
前記抗体が
（ａ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と
（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と
（ｃ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目１に記載の抗体。
（項目１２）
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む項目１に記載の抗体。
（項目１３）
前記抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目１に記載の抗体。
（項目１４）
前記抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目１に記載の抗体。
（項目１５）
さらに、ヒトＶＨアクセプター２フレームワーク及びヒトＶＬカッパ亜群Ｉコンセンサスフレームワークから選択される少なくとも１つのフレームワークを含む項目９に記載の抗体。
（項目１６）
前記抗体が、配列番号１３におけるエピトープに結合する項目１に記載の抗体。
（項目１７）
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、または（Ｆａｂ’）２の断片から選択される抗体断片である項目１に記載の抗体。
（項目１８）
前記抗体が、抗原を結合する抗体断片である項目１に記載の抗体。
（項目１９）
前記抗体が、単鎖Ｆｖである項目１に記載の抗体。
（項目２０）
ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である項目１に記載の抗体。
（項目２１）
Ｎｏｄａｌ活性の阻害方法であって、前記方法がＮｏｄａｌを発現している細胞を項目１に記載の抗体に曝露することを含む、前記阻害方法。
（項目２２）
Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害の治療方法であって、前記方法がそれを必要とする対象に有効量の項目１に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
（項目２３）
前記障害が癌である項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記抗体が、少なくとも１つの治療剤と共に投与される項目２２に記載の方法。
（項目２５）
前記治療剤がＬｅｆｔｙタンパク質である項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記治療剤が化学療法剤である項目２４に記載の方法。
（項目２７）
前記抗体及び前記治療剤が対象に別々に投与される項目２４に記載の方法。
（項目２８）
腫瘍細胞の増殖の阻害方法であって、前記方法がそれを必要とする対象に有効量の項目１に記載の抗体を投与することを含む、前記阻害方法。
（項目２９）
癌の転移の阻害方法であって、前記方法がそれを必要とする対象に有効量の項目１に記載の抗体を投与することを含む、前記阻害方法。
（項目３０）
前記癌が黒色腫である項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記癌が乳癌である項目２９に記載の方法。
（項目３２）
Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害を治療するために薬物を製造するための項目１に記載の抗体の使用。
（項目３３）
癌を治療するために薬物を製造するための項目１に記載の抗体の使用。
（項目３４）
乳癌を治療するために薬物を製造するための項目１に記載の抗体の使用。
（項目３５）
黒色腫を治療するために薬物を製造するための項目１に記載の抗体の使用。
（項目３６）
薬物として使用するための項目１〜２０のいずれかに記載の抗体。
（項目３７）
Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害の治療における使用のための項目１〜２０のいずれかに記載の抗体。
（項目３８）
乳癌の治療における使用のための項目１〜２０のいずれかに記載の抗体。
（項目３９）
黒色腫の治療における使用のための項目１〜２０のいずれかに記載の抗体。
（項目４０）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合する、前記モノクローナル抗体。
（項目４１）
項目４０に記載の抗体のヒト化形態であって、前記ヒト化形態が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合する、前記ヒト化形態。
（項目４２）
さらに標識を含む項目４０に記載の抗体。
（項目４３）
Ｎｏｄａｌを特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記抗体が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つＮｏｄａｌ活性を阻害する、前記単離された核酸。
（項目４４）
前記ＶＨ鎖領域が、配列番号１０のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ３とを含む項目４３に記載の核酸。
（項目４５）
前記ＶＨ鎖領域が配列番号３を含む項目４３に記載の核酸。
（項目４６）
項目４３に記載の核酸を含む単離された細胞。
（項目４７）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＨ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドの産生方法であって、前記ポリペプチドの産生に適する条件下で項目４６に記載の細胞を培養することと、そのように産生されたポリペプチドを単離することとを含む、前記産生方法。
（項目４８）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＬ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離された核酸であって、前記抗体が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つＮｏｄａｌ活性を阻害する、前記単離された核酸。
（項目４９）
前記ＶＬ鎖領域が、配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含む項目４８に記載の核酸。
（項目５０）
前記ＶＬ鎖領域が配列番号１を含む項目４９に記載の核酸。
（項目５１）
項目４８に記載の核酸を含む単離された細胞。
（項目５２）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体のＶＬ鎖領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドの産生方法であって、前記ポリペプチドの産生に適する条件下で項目５１に記載の細胞を培養することと、そのように産生されたポリペプチドを単離することとを含む、前記産生方法。
（項目５３）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸であって、前記抗体が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ前記抗体がＮｏｄａｌ活性を阻害する、前記単離された核酸。
（項目５４）
前記抗体が、配列番号１０のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号１１のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号１２のＣＤＲ−Ｈ３とを含むＶＨ鎖領域、及び配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含むＶＬ領域を含む項目５３に記載の核酸。
（項目５５）
前記ＶＨ鎖領域が配列番号３を含み、且つ前記ＶＬ鎖領域が配列番号１を含む項目５４に記載の核酸。
（項目５６）
前記抗体が、配列番号３の前記ＶＨ鎖領域と配列番号１の前記ＶＬ鎖領域とを含むモノクローナル抗体のヒト化形態である項目５３に記載の核酸。
（項目５７）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸であって、前記抗体が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ前記抗体がＮｏｄａｌのＣｒｉｐｔｏ−１への結合を阻害する、前記単離された核酸。
（項目５８）
Ｎｏｄａｌに特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする単離された核酸であって、前記抗体が配列番号１３におけるエピトープに特異的に結合し、且つ前記抗体がＮｏｄａｌのＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体への結合を阻害する、前記単離された核酸。
（項目５９）
前記抗体が、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３とを含むＶＨ鎖領域、及び配列番号４のＣＤＲ−Ｌ１と配列番号５のＣＤＲ−Ｌ２と配列番号６のＣＤＲ−Ｌ３とを含むＶＬ領域を含む項目５３に記載の核酸。
（項目６０）
前記ＶＨ鎖領域が配列番号２を含み、且つ前記ＶＬ鎖領域が配列番号１を含む項目５３に記載の核酸。
（項目６１）
Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体がＮｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達を阻害し、且つ以下の活性：（ｉ）転移性黒色腫細胞におけるＮｏｄａｌの発現を低下させる；（ｉｉ）黒色腫細胞におけるＳｍａｄ２及び／またはＭＡＰＫのリン酸化を減らす；（ｉｉｉ）転移性黒色腫細胞の肺でのコロニー形成を減らす；（ｉｖ）試験管内での黒色腫細胞の増殖、生存率を減らし、及び／または黒色腫の細胞死を誘導する；または（ｉｉｉ）生体内での黒色腫の腫瘍増殖を抑制する、の少なくとも１つを有する、前記モノクローナル抗体。
（項目６２）
前記抗体が、生体内で乳癌の腫瘍増殖を抑制する項目６１に記載の抗体。
（項目６３）
前記抗体が、対照に比べて乳癌の腫瘍体積を減らす項目６２に記載の抗体。
（項目６４）
前記抗体が試験管内にて黒色腫の細胞死を誘導する項目６１に記載の抗体。
（項目６５）
前記抗体が、転移性黒色腫細胞の肺でのコロニー形成を低減する項目６１に記載の抗体。
（項目６６）
Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域に結合するモノクローナル抗体であって、前記抗体が配列番号１３のアミノ酸４９〜５０を含むポリペプチドに結合する、前記モノクローナル抗体。
（項目６７）
前記抗体がＮｏｄａｌ活性を阻害する項目６６に記載の抗体。
（項目６８）
Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域に結合し、且つＮｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体であって、前記抗体が結合についてＣｒｉｐｔｏ−１と競合する、前記モノクローナル抗体。
（項目６９）
Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域に結合し、且つＮｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体であって、前記抗体が配列番号１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、前記モノクローナル抗体。
（項目７０）
Ｎｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達の阻害方法であって、前記方法がＮｏｄａｌを発現している細胞を項目６１に記載の抗体に曝露することを含む、前記阻害方法。
（項目７１）
Ｎｏｄａｌの活性及び／またはシグナル伝達の阻害方法であって、前記方法がＮｏｄａｌを発現している細胞を項目６６に記載の抗体に曝露することを含む、前記阻害方法。
（項目７２）
Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害の治療方法であって、前記方法がそれを必要とする対象に有効量の項目６１に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
（項目７３）
Ｎｏｄａｌの高い発現または活性に関連する障害の治療方法であって、前記方法がそれを必要とする対象に有効量の項目６６に記載の抗体を投与することを含む、前記治療方法。
（項目７４）
対象における癌の診断方法であって、Ｎｏｄａｌを結合するのに十分な条件下でＮｏｄａｌに結合する抗体またはその断片に前記対象に由来する試料を接触させることを含み、正常な非癌性対照に比べたときＮｏｄａｌの上昇は癌を示す、前記診断方法。
（項目７５）
前記抗体またはその断片が＜１０ｎＭのＫＤでＮｏｄａｌに結合する項目７４に記載の方法。
（項目７６）
前記抗体またはその断片が＜５ｎＭのＫＤでＮｏｄａｌに結合する項目７４に記載の方法。
（項目７７）
前記抗体が
（ａ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と
（ｂ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２と
（ｃ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３と
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と
（ｅ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と
（ｆ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目７４に記載の方法。
（項目７８）
前記抗体が、配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む項目７４に記載の方法。
（項目７９）
前記重鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号１のアミノ酸配列を含む項目７８に記載の方法。
（項目８０）
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変ドメインと、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメインとを含む項目７４に記載の方法。
（項目８１）
前記抗体が、配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目７４に記載の方法。
（項目８２）
前記抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１と、配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３とを含む項目７４に記載の方法。
（項目８３）
前記癌が、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、黒色腫、乳癌、膵臓癌、卵巣癌、膀胱癌、結腸癌、前立腺癌または白血病である項目７４に記載の方法。
（項目８４）
前記試料が、血液、血清、体液、腸剥離物、喀痰、肺浸出物、尿及び組織から成る群から選択される項目７４に記載の方法。
（項目８５）
前記抗体のＮｏｄａｌへの結合が、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識、放射性標識及び／または色素標識から選択される標識によって検出される項目７４に記載の方法。
（項目８６）
Ｎｏｄａｌが免疫アッセイによって検出される項目７４に記載の方法。
（項目８７）
前記免疫アッセイが酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射性免疫アッセイである項目８６に記載の方法。
（項目８８）
前記抗体を固体支持体に付着させる項目７４に記載の方法。
（項目８９）
前記固体支持体がマイクロタイタープレート、ビーズまたはバイオセンサーまたは生体表面またはスライドである項目８８に記載の方法。
（項目９０）
前記アッセイが標識を含まない項目８９に記載の方法。
（項目９１）
前記ＶＨ鎖領域が、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１と配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２と配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３とを含む項目４３に記載の核酸。
（項目９２）
前記ＶＨ鎖領域が配列番号２を含む項目４３に記載の核酸。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】ＮｏｄａｌとＣｒｉｐｔｏ−１との間での相互作用界面の分子モデルを示す図である。
【図２】アミノ酸４３〜６９（配列番号１５）のヒトＮｏｄａｌタンパク質のアミノ酸配列を示す図である。
【図３】ＮｏｄａｌのＥ４９Ｅ５０残基を選択的に認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するものを特定するためにＥＬＩＳＡによって比較してスクリーニングしたハイブリドーマのクローンを示す図である。
【図４】完全長のＮｏｄａｌを結合するものを選択するためにｍＡｂをスクリーニングした結果を示す図である。
【図５】（ａ）抗体３Ｄ１及び（ｂ）抗体５Ｆ１０のＮｏｄａｌへのＳＰＲ用量依存性結合アッセイを示す図である。
【図６】Ｎｏｄａｌの抗体３Ｄ１へのＳＰＲ用量依存性結合アッセイを示す図である。
【図７】Ｃｒｉｐｔｏ−１とＮｏｄａｌとの間での相互作用を特徴付けるために行った２つの別々の結合アッセイを示す図である。相互作用の強度は約４ｎＭのＫＤを示した（測定した２つのＫＤ、Ａ及びＢの平均；ＡではＣｒｉｐｔｏへのＮｏｄａｌの結合が報告され；ＢではＮｏｄａｌへのＣｒｉｐｔｏの結合が報告される）。
【図８】３Ｄ１は不動化されたＮｏｄａｌへの可溶性Ｃｒｉｐｔｏ−１の結合を妨げることを示す図である。
【図９−１】（Ａ）３Ｄ１とＮｏｄａｌとの間の結合の根底にある残基のエピトープマッピングに利用したＮｏｄａｌ合成ペプチドのセットを示す図である。（Ｂ）野生型Ｎｏｄａｌと比べた３Ｄ１への結合百分率を示す図である。（Ｃ）不動化した免疫原及びＮｏｄａｌＥ４９Ａ／Ｅ５０Ａ二重変異した変異体への３Ｄ１の用量依存性結合を示す図である。
【図９−２】（Ａ）３Ｄ１とＮｏｄａｌとの間の結合の根底にある残基のエピトープマッピングに利用したＮｏｄａｌ合成ペプチドのセットを示す図である。（Ｂ）野生型Ｎｏｄａｌと比べた３Ｄ１への結合百分率を示す図である。（Ｃ）不動化した免疫原及びＮｏｄａｌＥ４９Ａ／Ｅ５０Ａ二重変異した変異体への３Ｄ１の用量依存性結合を示す図である。
【図９−３】（Ａ）３Ｄ１とＮｏｄａｌとの間の結合の根底にある残基のエピトープマッピングに利用したＮｏｄａｌ合成ペプチドのセットを示す図である。（Ｂ）野生型Ｎｏｄａｌと比べた３Ｄ１への結合百分率を示す図である。（Ｃ）不動化した免疫原及びＮｏｄａｌＥ４９Ａ／Ｅ５０Ａ二重変異した変異体への３Ｄ１の用量依存性結合を示す図である。
【図１０−１】３Ｄ１による免疫アッセイを示す図である。（ａ）ドットブロット：５０〜２００ｎｇの漸増濃度にてニトロセルロース膜上でスポットを作ったｒｈＮｏｄａｌタンパク質；（ｂ）（ａ）で示したドットブロットの定量；（ｃ）ウエスタンブロット解析：還元条件下でＮｏｄａｌタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ＧＡＭ−ＨＲＰ抗体及びＥＣＬ基質を検出に使用した。
【図１０−２】３Ｄ１による免疫アッセイを示す図である。（ａ）ドットブロット：５０〜２００ｎｇの漸増濃度にてニトロセルロース膜上でスポットを作ったｒｈＮｏｄａｌタンパク質；（ｂ）（ａ）で示したドットブロットの定量；（ｃ）ウエスタンブロット解析：還元条件下でＮｏｄａｌタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した。ＧＡＭ−ＨＲＰ抗体及びＥＣＬ基質を検出に使用した。
【図１１】セファロースＳ２００カラムによる３Ｄ１のサイズ排除分析を示す図である。
【図１２】Ｎｏｄａｌのシグナル伝達経路及びＮｏｔｃｈ４との分子クロストークの模式図である。
【図１３】Ｎｏｄａｌの細胞の背景に特異的な活性を示す図である。
【図１４】正常なヒト組織溶解物におけるＮｏｄａｌの発現を示す図である。
【図１５】種々の健常な組織と同様に癌性組織におけるＮｏｄａｌ発現の差異を示す図である。
【図１６】種々の細胞におけるＮｏｄａｌ、Ｌｅｆｔｙ及びＣｒｉｐｔｏ−１の発現を示す図である。
【図１７】Ｎｏｄａｌのシグナル伝達を示す図である。
【図１８】Ｎｏｄａｌの発現を直接調節するＮｏｔｃｈ４のシグナル伝達を示す図であり、その際、Ｃ８１６１及びＭＶ３黒色腫細胞におけるＮｏｔｃｈ４の発現のノックダウン（ｓｉＲＮＡによる）はＮｏｄａｌの下方調節を生じる。
【図１９】非進行性のヒト黒色腫細胞（ＵＡＣＣ１２７３）は、Ｎｏｄａｌの上方調節を生じるＮｏｔｃｈ４ＩＣＤ−ＦＬＡＧを受け取るまでＮｏｄａｌ陰性であることを示す図である。
【図２０】Ｎｏｄａｌ遺伝子の１０ｋｂ上流に位置するＮｏｄａｌエンハンサ要素（ＮＤＥ）はＮｏｔｃｈに対する２つの推定上のＲＢＰＪ結合部位を含有することを明らかにする図である。ＣｈＩＰはＮｏｔｃｈ４ＩＣＤがＮＤＥにてＲＢＰＪ−１結合部位に直接結合することを裏付けている。
【図２１】非進行性でＮｏｄａｌ陰性のＣ８１−６１黒色腫細胞はＮｏｄａｌのｃＤＮＡで形質移入した後、腫瘍形成性であることを示す図である。
【図２２】捕捉抗体としてモノクローナル抗体３Ｄ１を用いてＮｏｄａｌを検出する（検出限界５０ｐｇ／ウェル）ために開発されたサンドイッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２３−１】３Ｄ１を用い、血漿／血清におけるＮｏｄａｌの検出のためのｘＭＡＰ技術に基づいて本発明の一実施形態にて開発された特異的で感度の高いアッセイを示す図である。
【図２３−２】３Ｄ１を用い、血漿／血清におけるＮｏｄａｌの検出のためのｘＭＡＰ技術に基づいて本発明の一実施形態にて開発された特異的で感度の高いアッセイを示す図である。
【図２４−１】３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体が転移性黒色腫細胞にてＮｏｄａｌの発現、クローン形成性及び血管擬態を低下させたことを示す図である。
【図２４−２】３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体が転移性黒色腫細胞にてＮｏｄａｌの発現、クローン形成性及び血管擬態を低下させたことを示す図である。
【図２４−３】３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体が転移性黒色腫細胞にてＮｏｄａｌの発現、クローン形成性及び血管擬態を低下させたことを示す図である。
【図２５】３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体がＳｍａｄ２及びＭＡＰＫのリン酸化を減らしたことを示す図である。
【図２６】３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体がマウスにて転移性黒色腫細胞の肺コロニー形成を減らしたことを示す図である。
【図２７】ｈＬｅｆｔｙは、転移性黒色腫細胞において１０、５０及び１００ｎｇ／ｍｌにてＮｏｄａｌタンパク質の発現を阻害するのに有効であることを示す図である。
【図２８】３週間のクローン形成性アッセイ＋／−ｈＬｅｆｔｙは、ｈＬｅｆｔｙが転移性黒色腫細胞のクローン形成性を阻害するのに有効であることを明らかにすることを示す図である。
【図２９−１】従来のデカルバジン（ＤＴＩＣ）処理はＮｏｄａｌを発現し続ける残留黒色腫細胞の集団を残すことを示す図である。
【図２９−２】従来のデカルバジン（ＤＴＩＣ）処理はＮｏｄａｌを発現し続ける残留黒色腫細胞の集団を残すことを示す図である。
【図３０】ＤＴＩＣと抗Ｎｏｄａｌ抗体を併用する処理は細胞死を誘導したことを示す図である。
【図３１−１】ＤＴＩＣ治療の前と後でのヒト黒色腫患者の組織におけるＮｏｄａｌの発現（暗赤／茶色の染色）を示す図である。
【図３１−２】ＤＴＩＣ治療の前と後でのヒト黒色腫患者の組織におけるＮｏｄａｌの発現（暗赤／茶色の染色）を示す図である。
【図３２−１】Ｎｏｄａｌのノックダウンはヒト乳癌細胞株にて増殖及び進行性挙動を損傷することを示す図である。
【図３２−２】Ｎｏｄａｌのノックダウンはヒト乳癌細胞株にて増殖及び進行性挙動を損傷することを示す図である。
【図３２−３】Ｎｏｄａｌのノックダウンはヒト乳癌細胞株にて増殖及び進行性挙動を損傷することを示す図である。
【図３３−１】Ｎｏｄａｌのノックダウンは乳癌の生体内増殖を損傷することを示す図である。
【図３３−２】Ｎｏｄａｌのノックダウンは乳癌の生体内増殖を損傷することを示す図である。
【図３４】Ｎｏｄａｌのノックダウン細胞はｐ２７の発現の上昇に伴ってＧ１で静止することを示す図である。
【図３５】Ｎｏｄａｌのシグナル伝達がＣ−ｍｙｃの発現を調節することを示す図である。
【図３６−１】Ｎｏｄａｌが乳癌細胞においてＥＲＫの活性化を介してｐ２７及びｃ−ｍｙｃのタンパク質レベル並びに翻訳後修飾を調節することを示す図である。
【図３６−２】Ｎｏｄａｌが乳癌細胞においてＥＲＫの活性化を介してｐ２７及びｃ−ｍｙｃのタンパク質レベル並びに翻訳後修飾を調節することを示す図である。
【図３７】Ｎｏｄａｌのような幹細胞マーカーを発現する腫瘍細胞の亜集団を分離するためのＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳの使用を示す図である。
【図３８】標的ｍＲＮＡを検出することにおけるＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳの作用のメカニズムを示す図である。
【図３９】進行性の転移性黒色腫細胞Ｃ８１６１（Ａ）、ＭＶ３（Ｂ）、ＳＫ−ＭＥＬ２８（Ｃ）におけるＮｏｄａｌのｍＲＮＡの発現及び非進行性黒色腫細胞ＵＡＣＣ１２７３（Ｄ）におけるＮｏｄａｌｍＲＮＡの非発現を検出するためのＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳの使用を示す図である。
【図４０】高いＮｏｄａｌのｍＲＮＡの発現と低いＮｏｄａｌのｍＲＮＡの発現に基づいて黒色腫の亜集団を選別できることを示す図である。
【図４１−１】高いＮｏｄａｌのｍＲＮＡを発現している黒色腫の亜集団は付随してＣＤ１３３癌幹細胞マーカーを発現することを示す図である。
【図４１−２】高いＮｏｄａｌのｍＲＮＡを発現している黒色腫の亜集団は付随してＣＤ１３３癌幹細胞マーカーを発現することを示す図である。
【図４２】Ｎｏｄａｌ単量体のアミノ酸配列及び二次構造を示す図である。モノクローナル抗体を生成するのに使用したＮｏｄａｌ抗原を太字にして点線で囲む。３Ｄ１によって認識されるエピトープに下線を引く。Ｃｒｉｐｔｏ−１−１への結合に関与する残基Ｅ４９及びＥ５０に番号を付ける。
【図４３】ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡに基づくスクリーニングアッセイの結果を示す図である。ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）及びｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａを１．０μｇ／ｍＬ（３３０ｎＭ）で被覆した。ハイブリドーマ上清は５．０μｇ／ｍｌの総タンパク質で調べた。
【図４４】（ａ）抗Ｎｏｄａｌモノクローナル抗体のスクリーニングを示す図である。ＣＭ５センサーチップに不動化したｒｈＮｏｄａｌとの３Ｄ１及び５Ｆ１０ｍＡｂの間での相互作用を示すＳＰＲセンサーグラムのオーバーレイプロット。３Ｄ１（ｂ）について６〜１００ｎＭの間及び５Ｆ１０（ｃ）について１００〜７５０ｎＭの間の範囲でのｍＡｂの濃度にて相互作用をモニターし、用量依存性の結合曲線を得た。
【図４５】ペプシンによる３Ｄ１ｍＡｂの消化に続いて得られた生成物の非還元条件下（−）及び還元条件下（＋）での１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。Ｔ０：３Ｄ１抗体；Ｄｉｇ：６時間後の３Ｄ１のタンパク質分解消化。
【図４６】（ａ）プロテインＧアフィニティ精製のクロマト図、（ｂ）ペプシン消化によって得られた生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、（ｃ）保持容量を伴ったＳＥＣプロファイル及び（ｄ）ペプシン消化によって得られたＦ（ａｂ’）２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【図４７】（ａ）Ｆ（ａｂ’）２及びＦａｂ’に還元したＦ（ａｂ’）２の非還元条件下での１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析；（ｂ）Ｆａｂ’のＳＥクロマトグラフィのプロファイルを示す図である。
【図４８】還元し、アルキル化した３Ｄ１−Ｆａｂ’のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である：２つの分離した鎖のクロマトグラフィプロファイル（ａ）：軽鎖（ＬＣ）は１０．０７分に溶出し、３Ｄ１−Ｆａｂ’の重鎖（ＨＣ）は１１．３１分に溶出した。双方のピークについて得られた質量スペクトルの逆重畳積分も報告されている。ＬＣは単一で均質な生成物（ｂ）を示すのに対してＨＣはヒンジ領域のペプシンの非特異的な切断に由来する複数の生成物（ｃ）を示した。マウスＩｇＧ１重鎖における想定される切断部位の模式図（ｄ）。
【図４９】ＣＭ５センサーチップに不動化されたｒｈＮｏｄａｌへの３Ｄ１のＦ（ａｂ’）２（ａ）及びＦａｂ’（ｂ）の結合を示すＳＰＲセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す図である。２５〜５００ｎＭの間の範囲でのＦ（ａｂ’）２の濃度及び２５〜２００ｎＭの間の範囲でのＦａｂ’の濃度で相互作用をモニターし、用量依存性の結合曲線を得た。
【図５０】３Ｄ１の結合特性の性状分析を示す図である。（ａ）３Ｄ１ｍＡｂのエピトープのマッピング；ペプチドは１．０μｇ／ｍｌで被覆した。（ｂ）ヒトＮｏｄａｌの中心領域についての３Ｄ１の特異性を示す棒グラフ；ペプチドは１．０μｇ／ｍｌで被覆した。シグナルの１００％と想定される（Ｂ０）（４４〜６７）ペプチドに対して各ペプチドの吸光度（Ｂ）を基準化した。シグナルは４９０ｎｍで測定された相対吸光度の％として表し、Ｂ／Ｂ０×１００として算出した。
【図５１】ＣＭ５センサーチップに不動化された３Ｄ１ｍＡｂ（ａ）及びそのＦａｂ’断片（ｂ）双方とのｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）の結合を示すＳＰＲセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す図である。３Ｄ１へのｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）の結合については０．５〜１０μＭの範囲での及びＦａｂ’断片への結合については１〜１０μＭの範囲でのペプチドの濃度にて相互作用をモニターした。
【図５２】ＣＭ５センサーチップに不動化された３Ｄ１ｍＡｂ（ａ）及びそのＦａｂ’断片（ｂ）双方とのｈＮｏｄａｌ（４４〜５６）の結合を示すＳＰＲセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す図である。３Ｄ１については０．５〜２０μＭの範囲での及びＦａｂ’断片への結合については１〜２０μＭの範囲でのペプチドの濃度にて相互作用をモニターし、用量依存性の結合曲線を得た。
【図５３】ヒト胚性幹細胞溶解物における内在性のＮｏｄａｌと３Ｄ１のエピトープに相当するＮｏｄａｌペプチドとの間での競合アッセイを示す図である。３Ｄ１は４μｇ／ｍｌで使用し、ｈＮｏｄａｌ（４４〜５６）は１０μｇ／ｍｌで使用した。
【図５４】（ａ）還元条件下にて１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解された黒色腫細胞溶解物のウエスタンブロット解析を示す図である。陽性対照としてＨＥＫ−２９３細胞及び１００ｎｇのｒｈＮｏｄａｌを負荷した。３Ｄ１抗体は２．０μｇ／ｍｌで使用した。ＧＡＭ−ＨＲＰ抗体と基質としてのＥＣＬを用いて検出を達成した。３Ｄ１を用いたヒト黒色腫細胞株ＬＣＰ（ｂ）、Ａ３７５（ｃ）及びＷＭ２６６（ｄ）におけるＮｏｄａｌの細胞蛍光測定染色を示す図である。細胞の固定及び透過化の後にデータを回収した。無関係なＩｇＧ１アイソタイプの抗体を陰性対照として使用した。
【図５５】正常なヒト組織溶解物におけるＮｏｄａｌの発現を示す図である。Ｎｏｄａｌの発現について市販のウエスタンブロット等級のヒト組織溶解物を分析した。Ｈ９ｈＥＳＣに由来する溶解物を最初のレーンにてＮｏｄａｌについての陽性対照として使用した。正常なヒトの脳、腎臓、肝臓、膵臓及び心臓に由来する溶解物ではＮｏｄａｌは検出されなかった。正常な骨格筋試料１では低い発現が検出されたが、正常な骨格筋試料２では発現は検出されなかった。ＮｏｄａｌはＣ８１６１ヒト転移性黒色腫細胞では高度に発現されている。
【図５６−１】抗Ｎｏｄａｌ３Ｄ１ｍＡｂの特徴を示す図である。（Ａ）被覆されたｈＮｏｄａｌ［４４−６７］及びｈＮｏｄａｌ［４４−６７］Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａへの３Ｄ１ｍＡｂのＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。ペプチドは０．１８μｇ／ｍｌ（６０ｎＭ）で被覆した。ｍＡｂ３Ｄ１は１．０〜６７ｎＭの間の漸増濃度にて調べた。（Ｂ）３Ｄ１ｍＡｂとＣＭ５センサーチップに不動化されたｒｈＮｏｄａｌの間での相互作用を示すＳＰＲセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す図である。相互作用は、６．０〜１００ｎＭの間での範囲のｍＡｂの濃度でモニターし、用量依存性の結合曲線を得た。ｒｈＮｏｄａｌをＢｉａｃｏｒｅのＣＭ５センサーチップに不動化し、漸増濃度にて３Ｄ１ｍＡｂ溶液をチップに注入した。（Ｃ）ＳＰＲ濃度依存性の競合アッセイによるｒｈＮｏｄａｌ／ｒｈＣｒｉｐｔｏ−１複合体の阻害。増加する抗体濃度に対する％結合のプロットが報告されている。ｒｈＮｏｄａｌは５．０ｎＭの固定された濃度で用いたのに対して３Ｄ１は１：０．５、１：１及び１：２のモル比で用いた。
【図５６−２】抗Ｎｏｄａｌ３Ｄ１ｍＡｂの特徴を示す図である。（Ａ）被覆されたｈＮｏｄａｌ［４４−６７］及びｈＮｏｄａｌ［４４−６７］Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａへの３Ｄ１ｍＡｂのＥＬＩＳＡに基づく結合アッセイ。ペプチドは０．１８μｇ／ｍｌ（６０ｎＭ）で被覆した。ｍＡｂ３Ｄ１は１．０〜６７ｎＭの間の漸増濃度にて調べた。（Ｂ）３Ｄ１ｍＡｂとＣＭ５センサーチップに不動化されたｒｈＮｏｄａｌの間での相互作用を示すＳＰＲセンサーグラムのオーバーレイプロットを示す図である。相互作用は、６．０〜１００ｎＭの間での範囲のｍＡｂの濃度でモニターし、用量依存性の結合曲線を得た。ｒｈＮｏｄａｌをＢｉａｃｏｒｅのＣＭ５センサーチップに不動化し、漸増濃度にて３Ｄ１ｍＡｂ溶液をチップに注入した。（Ｃ）ＳＰＲ濃度依存性の競合アッセイによるｒｈＮｏｄａｌ／ｒｈＣｒｉｐｔｏ−１複合体の阻害。増加する抗体濃度に対する％結合のプロットが報告されている。ｒｈＮｏｄａｌは５．０ｎＭの固定された濃度で用いたのに対して３Ｄ１は１：０．５、１：１及び１：２のモル比で用いた。
【図５７】抗Ｎｏｄａｌ３Ｄ１ｍＡｂの試験管内の効果を示す図である。足場非依存性増殖アッセイの結果（Ａ）は対照細胞に比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理したＣ８１６１細胞の足場非依存性増殖における有意な低下を示す。（Ｂ）血管性ネットワーク形成アッセイの結果は対照細胞に比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理したＣ８１６１細胞の接合部及び細管を形成する能力の有意な低下を示す（*Ｐ＜０．０５）。ヒストグラムは平均値±ＳＥＭを表す。
【図５８】細胞のシグナル伝達及び細胞周期に関連する分子に対する抗Ｎｏｄａｌ３Ｄ１抗体の効果を示す図である。（Ａ）ＩｇＧ処理した対照に比べてＣ８１６１ヒト黒色腫細胞では、Ｐ−Ｓｍａｄ２及びＰ−ＥＲＫ１／２のレベルは３Ｄ１ｍＡｂの処理（４μｇ／ｍｌ）の４時間以内に低下する。（Ｂ）３Ｄ１ｍＡｂ処理の７２時間後、ＩｇＧ処理した対照に比べてＣ８１６１細胞では、ｐ２７の付随した上昇に伴ってＮｏｄａｌ、サイクリンＢ１及びＰ−Ｈ３の低下がある。
【図５９】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞に対する抗Ｎｏｄａｌ抗体３Ｄ１抗体の効果を示す図である。ウエスタンブロット解析の結果は、ＩｇＧ対照処理した細胞に比べて３Ｄ１（４μｇ／ｍｌ）で７２時間処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞にてＮｏｄａｌの４５％低下及び増殖／有糸分裂マーカーであるＰ−Ｈ３のレベルの４９％低下を示す。
【図６０】Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞に対する抗Ｎｏｄａｌ３Ｄ１ｍＡｂの生体内の効果を示す図である。（Ａ）対照ＩｇＧに比べて３Ｄ１ｍＡｂの直接腫瘍注入で処理したＣ８１６１のヌードマウスへの同所性異種移植にて腫瘍体積の低下が認められる。ヒストグラムは平均値±ＳＤを表す。（Ｂ）における代表的なＩＨＣは、対照ＩｇＧに比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理したＣ８１６１の同所性異種移植ヌードマウスにてＳｍａｄ２の核発現（活性化）の低下を示す（元々の拡大の２０×）。ヌードマウスにおけるＣ８１６１細胞（全身性導入の後）の肺コロニー形成（Ｈ＆Ｅ染色によって顕微鏡で示される）の可能性（Ｃ）（元々の拡大の４０×）は対照ＩｇＧ（Ｄ）に比べて３Ｄ１ｍＡｂのＩＰ投与によって処理された動物で有意に低下する。ヒストグラムは平均値±ＳＥＭを表す。（Ｅ）における代表的なＩＨＣ染色は、対照ＩｇＧに比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理されたヌードマウス（元々の拡大の６３×）のＣ８１６１肺コロニーにてＰ−Ｓｍａｄ２の核発現（活性化）の低下を示す（＊ｐ＜０．０５）。
【図６１】ヌードマウス＋／−３Ｄ１でのＣ８１６１肺コロニーにおけるサイクリンＢ１及びｐ２７の発現を示す代表的なＩＨＣの結果を示す図である。サイクリンＢ１の発現はＩｇＧ対照に比べて３Ｄ１で処理した腫瘍で低下する。対照的に、ｐ２７の発現は対照に比べて３Ｄ１で処理したヌードマウスにて上昇する（元々の拡大６３×対物レンズ）。
【図６２】Ａ３７５ＳＭ細胞におけるＢＲＡＦｉ（ダブラフェニブ）または３Ｄ１の効果を示す図である。（Ａ）７２時間後、ＥＲＫ１／２活性（Ｐ−ＥＲＫ１／２）は、対照に比べて１０ｎＭのＢＲＡＦｉ、ダブラフェニブで処理した場合、活性のあるＢＲＡＦ変異を抱くＡ３７５ＳＭヒト黒色腫細胞株にて低下する一方で、Ｎｏｄａｌは最小限にしか影響を受けない。対照的に、Ａ３７５ＳＭの７２時間の３Ｄ１処理（Ｂ）は、対照に比べてＮｏｄａｌの発現でさらに劇的な低下を示した。
【図６３】Ａ３７５ＳＭヒト黒色腫細胞に対する抗Ｎｏｄａｌ３Ｄ１ｍＡｂの生体内での効果を示す図である。（Ａ）８日後、Ａ３７５ＳＭの同所性ヌードマウス異種移植の平均腫瘍体積は、ＩｇＧ対照処理動物よりも３Ｄ１ｍＡｂで処理した動物にて有意に小さかった。ダブラフェニブ（ＢＲＡＦｉ）で処理した動物における腫瘍体積も対照に比べて腫瘍体積が低下する傾向を示した。ヒストグラムは平均値±ＳＤを表す。（Ｂ）対照ＩｇＧ、３Ｄ１ｍＡｂまたはＢＲＡＦｉで処理したヌードマウスにおけるＡ３７５ＳＭの同所性異種移植にて核染色を示すＰ−Ｓｍａｄ２の代表的なＩＨＣを示す図である（*Ｐ＜０．０５）。
【図６４】乳癌患者の血清にてＮｏｄａｌを検出するために開発されたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。（Ａ）組換えＮｏｄａｌを検出するために捕捉抗体として３Ｄ１ｍＡｂを用いた典型的な較正曲線を説明する一方で、（Ｂ）患者の血清で検出されたＮｏｄａｌ及び非浸潤性の乳癌に比べて浸潤性の乳癌患者に由来する試料にて高いＮｏｄａｌレベルの傾向を持つＮｏｄａｌを示す（点線＝中央値レベル）。
【図６５】正常な骨格筋におけるＮｏｄａｌの発現を示す図である。免疫組織化学分析は、転移性黒色腫及び転移性乳癌の組織切片にてＮｏｄａｌの染色を示す（挿入図：無関係なアイソタイプＩｇＧによる陰性対照）。対照的に骨格筋の組織切片ではＮｏｄａｌについて感知できるほどの染色は検出されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本発明の理解を円滑にするために、多数の用語を以下で定義する。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、キメラ抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、及び可溶性形態または結合された形態で標識することができる抗体、と同様にたとえば、酵素切断または化学切断、ペプチド合成または組換え技法のような、しかし、これらに限定されない既知の技法によって提供されるその断片、領域または誘導体を含むことにする。本明細書に記載されているように、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体はＮｏｄａｌを結合する（たとえば、及びＮｏｄａｌ活性を阻害する）。従って、用語「抗体」は、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体及び多重特異性抗体（たとえば、１を超える標的に特異的な抗体）、と同様に抗体断片（たとえば、完全長抗体と同じ標的への結合を示す）を指す。本発明の抗体はどんな型（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスであってもよい。本明細書では「免疫グロブリン」と呼ばれるネイティブな抗体は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトン（Ｇクラスのもの）のヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は多数の定常ドメインが後に続く可変ドメイン（ＶＨ）を有する。各軽鎖は可変ドメイン（ＶＬ）と定常ドメインとを有する。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、「抗Ｎｏｄａｌ抗体」は、ヒトのＮｏｄａｌに特異的に結合する（たとえば、Ｎｏｄａｌ活性を阻害するような方法で結合する）抗体を指す。一実施形態では、「抗Ｎｏｄａｌ抗体」は、Ｎｏｄａｌの発現及び／または活性に関連する疾患もしくは障害の検出、診断もしくは事前決定を可能にする、または本発明の治療用組成物にて使用される（たとえば、Ｎｏｄａｌ関連の障害または疾患を治療する及び／または予防するために）、ヒトのＮｏｄａｌに結合する抗体である。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「中和可能なエピトープ」は、適切な抗体によるその結合が結果的にタンパク質の機能の阻害を生じるそのタンパク質の決定基部分を指す。たとえば、「中和可能なＮｏｄａｌのエピトープ」は、Ｎｏｄａｌタンパク質の決定基部分であり、抗体によるその結合はＣｒｉｐｔｏ−１とのもしくはＣｒｉｐｔｏ−１受容体複合体とのＮｏｄａｌの相互作用を阻害し、またはＮｏｄａｌもしくはＣｒｉｐｔｏ−１とのその複合体からの下流のシグナル伝達を阻害する。本明細書の一部の実施形態では、中和可能なＮｏｄａｌのエピトープは配列番号１３、１５または１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、用語「中和抗体」は、タンパク質の中和可能なエピトープに特異的に結合することができ、且つタンパク質の生物学的な活性（たとえば、複合体形成、下流のシグナル伝達等）を実質的に阻害するまたは排除することができる抗体を指す。
【００３６】
（たとえば、抗体の可変ドメインの文脈にて）「可変ドメイン」にあるような用語「可変」は、抗体すべての間での配列にて、及び抗体とその特異的な標的との間に特異性を提供する抗体の部分にて広範に異なる可変ドメイン自体の構造的な特徴を指す。可変ドメイン内でのこれらの構造的な特徴は超可変領域（ＨＶＲ）または相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、軽鎖及び重鎖双方の可変ドメインに存在する。３つの重鎖ＨＶＲまたはＣＤＲ（ＨＶＲＨ１またはＣＤＲＨ１またはＨ１、ＨＶＲＨ２またはＣＤＲＨ２またはＨ２、及びＨＶＲＨ３またはＣＤＲＨ３またはＨ３）がある。同様に３つの軽鎖ＣＤＲ（ＨＶＲＬ１またはＣＤＲＬ１またはＬ１、ＨＶＲＬ２またはＣＤＲＬ２またはＬ２，及びＨＶＲＬ３またはＣＤＲＬ３またはＬ３）がある。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「フレームワーク」は、本明細書で定義されるようなＣＤＲ残基以外の可変領域の残基を指す。ＦＲは可変ドメインのさらに高度に保存された部分である。ネイティブの重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、大部分βシート構成を採用し、ループ連結を形成する、且つ場合によってはβシート構造の一部を形成する３つのＣＤＲによって接続される４つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域によってごく接近して、且つ他の鎖に由来するＣＤＲと共にまとめられ、抗体の標的結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７を参照のこと）。本明細書で使用されるとき、免疫グロブリンのアミノ酸残基の番号付けは、特に指示されない限り、Ｋａｂａｔらの免疫グロブリンのアミノ酸残基の番号付け方式に従って実施される。これら６つのＣＤＲを構成する残基は、以下のように、軽鎖可変領域における残基２４〜３４（ＣＤＲＬ１）、５０〜５６（ＣＤＲＬ２）及び８９〜９７（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変領域における３１〜３５（ＣＤＲＨ１）、５０〜６５（ＣＤＲＨ２）及び９５〜１０２（ＣＤＲＨ３）；参照によって本明細書に組み入れられるＫａｂａｔら、（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ．；ならびに軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＣＤＲＬ１）、５０〜５２（ＣＤＲＬ２）及び９１〜９６（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変領域における２６〜３２（ＣＤＲＨ１）、５３〜５５（ＣＤＲＨ２）及び９６〜１０１（ＣＤＲＨ３）；参照によって本明細書に組み入れられるＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７によって特徴付けられている。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「完全にヒトのフレームワーク」は、天然にヒトで見いだされるアミノ酸配列を持つフレームワークを意味する。完全にヒトのフレームワークの例には、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ及びＰＯＭが挙げられるが、これらに限定されない（たとえば、双方とも参照によって本明細書に組み入れられるＫａｂａｔら，（１９９１），Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，ＵＳＡ；及びＷｕら，（１９７０），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２，２１１−２５０を参照のこと）。特定の実施形態では、本発明のヒト化抗体は完全にヒトのフレームワークまたは１以上の変化したアミノ酸を伴ったフレームワーク（たとえば、本発明のＣＤＲを受け入れるための）を有する。
【００３９】
「ヒト化抗体」は、一般に組換え技法を用いて調製され、非ヒト種の免疫グロブリンに由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造及び／または配列に基づいた分子の残りの免疫グロブリン構造とを有するキメラ分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全な可変ドメインまたは可変ドメインの適当なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）のみのいずれかを含んでもよい。抗原結合部位は野生型であってもよく、または１以上のアミノ酸置換によって修飾されてもよい。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最少限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（たとえば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の標的結合配列）であってもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに相当し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン鋳型配列のものである少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むであろう。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（Ｆｃ）、通常、選択されるヒト免疫グロブリン鋳型のそれも含んでもよい。一実施形態では、ヒト化抗体は、元々の抗体の１以上のＣＤＲ「に由来する」１以上のＣＤＲとも呼ばれる、元々の抗体に関して変化している（たとえば、親和性成熟した）１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６）を有する。
【００４０】
用語「抗体断片」は完全長抗体の一部、一般に標的結合領域または可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖの断片が挙げられる。語句、抗体の「機能的な断片または類似体」は完全長抗体と共通する質的な生物活性を有する化合物である。たとえば、抗Ｎｏｄａｌ抗体の機能的な断片または類似体は、その受容体（たとえば、Ｃｒｉｐｔｏ−１またはＡｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体）に結合する及び／またはシグナル伝達（たとえば、Ａｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体を介した）を開始するＮｏｄａｌの能力を阻むまたは実質的に低下させるような方法でＮｏｄａｌに結合することができるものである。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、抗体に関して「機能的な断片」はＦｖ、Ｆ（ａｂ）、及びＦ（ａｂ’）２断片を指す。「Ｆｖ」断片は、強い非共有結合の会合で重鎖可変ドメイン１つと軽鎖可変ドメイン１つの二量体（ＶＨ−ＶＬ二量体）から成る。それは、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面で標的結合部位を定義するこの構成の中にある。合わせて、６つのＣＤＲが抗体に標的結合の特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または標的に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、全体の結合部位より親和性は低いが標的を認識し、結合する能力を有する。
【００４２】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片は抗体のＶＨ及びＶＬのドメインを含み、その際、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが標的結合に対して所望の構造を形成するのを可能にするＶＨドメインとＶＬドメインの間でのポリペプチドリンカーを含む。
【００４３】
用語「二重特異性抗体」は２つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同一ポリペプチド鎖にて軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。
【００４４】
Ｆ（ａｂ）断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）断片は、抗体のヒンジ領域に由来する１以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端での少数の残基の付加によってＦ（ａｂ）とは異なる。Ｆ（ａｂ’）断片はＦ（ａｂ’）２のペプシン消化生成物のヒンジのシステインでのジスルフィド結合の切断によって作出される。
【００４５】
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用されるとき、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在してもよい考えられる天然に存在する変異を除いて同一である。本明細書でのモノクローナル抗体は具体的に、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の種に由来する抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一でありまたは相同であり、鎖の残りが別の種に由来する抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における相当する配列と同一でありまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、と同様にそれらが所望の生物活性を示す限り、そのような抗体の断片を含む。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の標的部位に向けられる。さらに、通常、様々な決定基（エピトープ）に向けられた様々な抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体の調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は標的上の単一の決定基に向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが他の免疫グロブリンが混入しないハイブリドーマの培養によって合成されてもよい点で有利である。修飾語「モノクローナル」は抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を指し示し、特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されべきではない。たとえば、本発明と共に使用するためのモノクローナル抗体は周知の技法を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてもよい。本発明に従って使用される親モノクローナル抗体はＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作られてもよいし、または組換え法によって作られてもよい。
【００４６】
ポリクローナル抗体は抗原で免疫された動物の血清に由来する抗体分子の不均質な集団である。モノクローナル抗体は抗原に特異的な抗体の実質的に均質な集団を含有し、その集団は実質的に類似するエピトープ結合部位を含有する。ｍＡｂは当業者に既知の方法によって得られてもよい。たとえば、その内容が参照によって全体として本明細書に組み入れられるＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９８７，１９９２）；ならびにＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）；Ｃｏｌｌｉｇａｎら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）を参照のこと。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡを含むどんな免疫グロブリンのクラス及びそのどんなサブクラスであってもよい。本発明のｍＡｂを産生するハイブリドーマは、試験管内、原位置、または生体内で培養されてもよい。
【００４７】
キメラ抗体は、主として適用における免疫原性を減らし、産生における収率を高めるのに使用される、たとえば、マウスｍＡｂに由来する可変領域とヒトの免疫グロブリン定常領域とを有するもののような異なる動物種に由来する分子−その異なる部分であり、たとえば、マウスのｍＡｂはハイブリドーマからの高い収率を有するが、ヒトにおける高い免疫原性を有するので、ヒト／マウスのキメラｍＡｂが使用される。キメラ抗体及びその産生の方法は、当該技術（Ｃａｂｉｌｌｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３２７３−３２７７（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６４３−６４６（１９８４）；Ｃａｂｉｌｌｙら，欧州特許出願１２５０２３（１９８４年１１月１４日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２６８−２７０（１９８５）；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら，欧州特許出願１７１４９６（１９８５年２月１９日に公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願１７３４９４（１９８６年３月５日公開）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，ＰＣＴ出願ＷＯ  ８６／０１５３３，（１９８６年３月１３日に公開）；Ｋｕｄｏら，欧州特許出願１８４１８７（１９８６年６月１１日公開）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，欧州特許出願１７３４９４（１９８６年３月５日公開）；Ｓａｈａｇａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：１０６６−１０７４（１９８６）；Ｒｏｂｉｎｓｏｎら，国際特許公開＃ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９（１９８７年５月７日公開）；Ｌｉｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３４３９−３４４３（１９８７）；Ｓｕｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：２１４−２１８（１９８７）；Ｂｅｔｔｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３（１９８８）；ならびにＨａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））にて既知である。これらの参考文献は参照によって全面的に本明細書に組み入れられる。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、用語「二重特異性の抗体」は、異なる抗体配列によって定義される２つの異なる抗原結合領域を有する免疫反応剤を指す。異なる標的は、別々の標的種におけるエピトープ（たとえば、１つの標的種におけるＮｏｄａｌ及びＣｒｉｐｔｏ−１または異なるエピトープ（たとえば、Ｎｏｄａｌ）であってもよい。
【００４９】
本明細書で使用されるとき、用語「抗体／薬剤結合体」は、任意で治療剤または細胞傷害剤であってもよい１以上の化学剤に化学的に連結される、たとえば、抗体またはその抗原結合断片のような免疫反応剤を指す。抗体／薬剤結合体は、抗体（または断片）と、細胞傷害剤または治療剤と、薬剤の抗体への連結または結合を可能にするリンカーとを含んでもよい。抗体／薬剤結合体は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれらの間での好適な範囲の薬剤負荷した種を含む、抗体に結合された１〜１０の薬剤を含んでもよい。抗体／薬剤結合体に含まれてもよい薬剤の非限定例には、有糸分裂阻害剤、抗腫瘍抗生剤、免疫調節剤、遺伝子治療のベクター、アルキル化剤、抗血管形成剤、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学保護剤、ホルモン、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、光活性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種作用剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、及び放射性増感剤である。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「患者」は好ましくは、治療（たとえば、癌または前癌性の状態もしくは病変を治療すること）を必要とするヒトを指す。しかしながら、用語「患者」はまた、とりわけ治療の必要がある、非ヒト動物、好ましくは、たとえば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類のような哺乳類も指すことができる。
【００５１】
用語「群」は患者の亜群と同様に患者の群を指す。
【００５２】
本明細書で使用されるとき、用語「精製された」または「精製する」は試料からの混入物の除去を指す。たとえば、抗Ｎｏｄａｌ抗体は混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製されてもよく；それらはまた、同一抗原に結合しない免疫グロブリンの除去によっても精製される。非免疫グロブリンタンパク質の除去及び／または特定の抗原に結合しない免疫グロブリンの除去は、結果的に試料にて抗原特異的な免疫グロブリンの比率の上昇を生じる。別の例では、組換えの抗原特異的なポリペプチドが細菌の宿主細胞で発現され、宿主細胞タンパク質の除去によって該ポリペプチドを精製し、それによって組換えの抗原特異的なポリペプチドの比率が試料にて高められる。
【００５３】
本明細書で使用されるとき、「単離された」抗体または抗体断片は、その天然環境の成分から特定され、分離され、及び／または回収されているものである。その天然環境の混入成分は、抗体または抗体断片の診断用途または治療用途を妨害することになる物質であり、それらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様のまたは非タンパク質様の溶質が挙げられてもよい。特定の実施形態では、単離された抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって測定したときポリペプチドの９５重量％を超えるまで、好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピンカップシークエネータの使用によってＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、（３）クマシーブルー染色もしくは銀染色を用いた還元もしくは非還元の条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで、または（４）クロマトグラフィを用いて精製される。単離された抗体には、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内の原位置での抗体が含まれる。しかしながら、普通、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製されるであろう。
【００５４】
本明細書で使用されるとき、用語「治療」は治療上の処置及び予防上または防止上の対策の双方を指す。治療を必要とするものには、すでに障害を持っているものと同様に障害が予防されるべきであるもの（たとえば、特定の疾患または障害を有すると疑われるものまたはそのリスクがあるもの）が含まれる。
【００５５】
抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体は、抗体の抗原結合部位と一般に関連する独特の決定基を認識する抗体である。抗Ｉｄ抗体は、ｍＡｂの供給源と同じ種及び遺伝子型の動物を抗Ｉｄが調製されるｍＡｂで免疫することによって調製することができる。免疫された動物は、これらイディオタイプ決定基に対する抗体（抗Ｉｄ抗体）を産生することによって免疫抗体のイディオタイプ決定基を認識し、それに応答するであろう。
【００５６】
抗Ｉｄ抗体も「免疫原」として用いてさらに別の動物で免疫応答を誘導してもよく、いわゆる抗抗Ｉｄ抗体を産生させてもよい。抗抗Ｉｄは抗Ｉｄを誘導した元々のｍＡｂとエピトープ上は同一であってもよい。従って、ｍＡｂのイディオタイプ決定基に対する抗体を用いて同一の特異性の抗体を発現している他のクローンを特定することが可能である。
【００５７】
抗体鎖のポリペプチド配列に関して、用語「実質的に同一の」は、参照ポリペプチド配列に対する少なくとも７０％または８０％または９０％または９５％の配列同一性を示す抗体鎖として解釈されてもよい。核酸配列に関するその用語は、参照核酸配列に対する少なくとも８５％または９０％または９５％または９７％の配列同一性を示すヌクレオチドの配列として解釈されてもよい。
【００５８】
用語「同一性」または「相同性」は、配列を並べ、ギャップを導入し、必要に応じて配列全体について最大のパーセント同一性を達成した後、配列同一性の一部として保存された置換を考慮せずに、それが比較される相当する配列の残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の比率を意味するように解釈されるべきである。Ｎ末端またはＣ末端の伸長も挿入も同一性または相同性を減らすと解釈されるべきではない。配列比較のための方法及びコンピュータプログラムは当該技術で周知である。配列同一性は配列解析ソフトウエアを用いて測定されてもよい。
【００５９】
細胞生物、細胞または細胞株のＤＮＡによる「形質転換」は、染色体外の要素として、または染色体への組み込みによってＤＮＡが複製可能であるように標的細胞にＤＮＡを導入することを意味する。ＤＮＡによる細胞または生物への「形質移入」は、任意のコーディング配列が実際発現されるか否かの、細胞または生物によるＤＮＡ、たとえば、発現ベクターの取り込みを指す。用語「形質移入された宿主細胞」及び「形質転換された」はＤＮＡが導入された細胞を指す。細胞は「宿主細胞」と呼ばれ、それは原核細胞または真核細胞のいずれであってもよい。典型的な原核生物の宿主細胞にはＥ．ｃｏｌｉの種々の株が挙げられる。典型的な真核生物の宿主細胞は、たとえば、チャイニーズハムスターの卵巣またはヒト起源の細胞のような哺乳類細胞である。導入されるＤＮＡ配列は、宿主細胞と同一の種もしくは宿主細胞とは異なる種に由来してもよく、または一部の外来ＤＮＡと一部の相同ＤＮＡとを含有するハイブリッドＤＮＡ配列であってもよい。
【００６０】
用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」には子孫が含まれる。故意のまたは不測の突然変異のせいで子孫はすべてＤＮＡ含量が正確に同一であるわけではなくてもよいことも理解される。元々形質転換された細胞にてスクリーニングされるような、同一の機能または生物特性を有する変異体子孫が含まれる。本発明で使用される「宿主細胞」は一般に原核宿主または真核宿主である。
【００６１】
用語「ベクター」は、好適な宿主にてＤＮＡの発現を達成することができる好適な制御配列に操作可能に連結されるＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ構築物を意味する。そのような制御配列には、転写を達成するプロモータ、そのような転写を制御する任意のオペレータ配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単純に可能性のあるゲノム挿入物であってもよい。好適な宿主でいったん形質転換されると、ベクターは、宿主ゲノムとは無関係に複製し、機能してもよく、場合によってはゲノム自体に統合してもよい。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般に使用される形態なので、相互交換可能に使用されることがある。しかしながら、本発明は、当該技術と同等の、且つ当該技術で既知であるまたは当該技術で既知になる機能を果たすベクターのそのような他の形態を含むように意図される。
【００６２】
単語「標識」は本明細書で使用されるとき、分子またはタンパク質、たとえば、抗体に直接または間接的に結合することができる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体検出可能であってもよく（たとえば、放射性同位元素標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または基質組成物の化学変化を触媒してもよい。
【００６３】
本明細書で使用されるとき、「固相」は本発明の抗体が付着することができる非水性マトリクスを意味する。固相の例には、ガラス（たとえば、制御された細孔ガラス）多糖類（たとえば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンで部分的にまたは全体的に形成されたものが挙げられる。特定の実施形態では、文脈に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを含むことができ；他では、それは精製カラム（たとえば、アフィニティクロマトグラフィカラム）である。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、用語「固形腫瘍」には、たとえば、肉腫、黒色腫、癌腫、前立腺癌、肺癌、結腸癌、または他の固形腫瘍癌が含まれる。
【００６５】
用語「癌」、「癌性の」または「悪性の」は、通常、無秩序な細胞増殖を特徴とする哺乳類における生理的な状態を指し、またはそれを記載する。癌の例には、たとえば、白血病、リンパ腫、芽腫、癌腫及び肉腫が挙げられる。そのような癌のさらに詳しい例には、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞癌、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、直腸結腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、頭頚部の癌、胃癌、胚細胞腫瘍、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＭＬ）及び本明細書に記載されている他の癌が挙げられる。
【００６６】
「白血病」は、血液形成臓器の進行性で悪性の疾患であり、一般に血液及び骨髄における白血球及びその前駆細胞の歪んだ増殖及び発生を特徴とする。白血病は一般に臨床的に（１）疾患の持続時間及び特徴−急性または慢性、（２）関与する細胞の型；骨髄系（骨髄性）、リンパ系（リンパ性）または単球性、及び（３）血液における異常細胞の数の増加または非増加−白血性または非白血性（亜白血性）に基づいて分類される。白血病には、たとえば、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性顆粒球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、非白血性白血病、白血球性白血病、好塩基球性白血病、芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病、皮膚白血病、胚性白血病、好酸球性白血病、グロス白血病、ヘアリー細胞白血病、血芽性白血病、血球芽細胞性白血病、組織球性白血病、幹細胞白血病、急性単核球性白血病、白血球減少性白血病、リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、微小骨髄球性白血病、単核球性白血病、骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病、骨髄性単球性白血病、ナエゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、前骨髄球性白血病、リーダー細胞白血病、シリング白血病、幹細胞白血病、亜白血病性白血病、および未分化細胞白血病が挙げられる。特定の態様では、本発明は、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、及び／またはフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）のための治療を提供する。
【００６７】
用語「Ｎｏｄａｌタンパク質の過剰発現」及び「Ｎｏｄａｌタンパク質の異常発現」は、特定の組織または臓器の正常細胞における発現のレベルに比べて患者のその組織または臓器の中での細胞（たとえば、癌または腫瘍またはＮｏｄａｌが上昇している他の疾患過程の中での）における胚性Ｎｏｄａｌのシグナル伝達経路の再活性化またはＮｏｄａｌタンパク質の発現の異常なレベルを示すように意図される。たとえば、Ｎｏｄａｌの過剰発現または異常発現を特徴とする癌を有する患者は、当該技術で既知の標準的なアッセイによって決定することができる。免疫組織化学（ＩＨＣ）の検出を用いて凍結組織切片またはパラフィン包埋組織切片の固定された細胞にて過剰発現または異常発現を測定することができる。組織学的な染色と合わせると、標的とされるタンパク質の局在を決定することができ、その発現（たとえば、腫瘍内で）の程度を質的に及び半定量的にの双方で測定することができる。
【００６８】
用語「Ｎｏｄａｌ陽性の癌」は、Ｎｏｄａｌの過剰発現または異常発現を特徴とする乳癌、黒色腫または本明細書に記載されている他の種類の癌のような癌疾患を指す。
【００６９】
用語「再発癌」は、前の治療に当初応答したが、治療応答が維持されなかった腫瘍患者における異常細胞の制御されない増殖を指す。用語「再発したＮｏｄａｌ陽性癌」は、抗Ｎｏｄａｌ抗体による前の治療に当初応答したが、抗Ｎｏｄａｌ抗体による治療の間に治療応答が維持されなかった腫瘍患者におけるＮｏｄａｌタンパク質の過剰発現または異常発現を特徴とする異常細胞の制御されない増殖を指す。
【００７０】
治療応答（ＲＥ）は、患者の治療を評価するための当該技術で一般に既知の臨床データ及び検査データの結果によって確かめられる内科医の医学判断に基づいて立証することができる。そのようなデータは、例として、臨床検査、細胞学及び組織学の技法、内視鏡検査及び腹腔鏡検査、超音波、ＣＴ及びＭＲＩ走査、胸部Ｘ線及びマンモグラフィ、及びＮｏｄａｌのような腫瘍マーカーを測定することによって得られてもよい。好ましくは、ＲＥＣＩＳＴ基準を使用して腫瘍の応答（ＲＥ）を判定してもよい（Ｔｈｅｒａｓｓｅら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．９２，（２０００），２０５−２１６）。
【００７１】
これらのＲＥＣＩＳＴ基準によれば、固形腫瘍についての腫瘍の応答（Ｔｈｅｒａｓｓｅ，ら．Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．９２，（２０００），２０５−２１６）は腫瘍の容積の進行または退行に応じて（たとえば、ＣＴによって測定される）４つのレベル：完全奏効（ＣＲ）、不完全奏効（ＰＲ）、安定（ＳＤ）及び進行（ＰＤ）に分類される。さらに、欧州癌研究治療機構（ＥＯＲＴＣ）は、２−［１８Ｆ］−フルオロ−２−デオキシグルコースポジトロン放出断層撮影法（ＦＤＧ−ＰＥＴ）（Ｙｏｕｎｇ，Ｈ．ら，，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃ．３５（１９９９），１７７３−１７８２及びＫｅｌｌｏｆ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１１（２００５），２７８５−２８０８）によって測定された腫瘍の代謝に応じた４つのレベル：完全代謝応答（ＣＭＲ）または部分代謝応答（ＰＭＲ）、安定な代謝疾患（ＳＭＤ）及び進行性の代謝疾患（ＰＭＤ）へのカテゴリー化を提案した。
【００７２】
「応答（ＲＥ）」及び「非応答（ＮＲ）」は、双方とも上記で記載されているＲＥＣＩＳＴ及びＲＤＧ−ＰＥＴの基準を用いたコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）及び２−［１８Ｆ］−フルオロ−２−デオキシグルコースポジトロン放出断層撮影法（ＦＤＧ−ＰＥＴ）（Ｋｅｌｌｏｆ，Ｇ．Ｊ．ら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．１１，（２００５），２７８５−２８０８及びＹｏｕｎｇ,Ｈ．ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃ．３５,（１９９９）,１７７３−８２）の組み合わせによって取得されるデータに基づいて立証されてもよい。
【００７３】
用語「薬物の製造方法」は本明細書で指定されるような適応における使用のための、特に腫瘍、腫瘍転移または一般に癌の治療で使用するための薬物の製造を指す。
【００７４】
用語「治療すること」は本明細書で使用されるとき、特に指示されない限り、患者にて腫瘍の増殖、腫瘍の転移、または他の癌が原因のもしくは腫瘍性の細胞を部分的にまたは完全に反転する、緩和する、その進行を抑制する、または防ぐことを意味する。用語「治療」は本明細書で使用されるとき、特に指示されない限り、治療の行動を指す。
【００７５】
語句「治療方法」またはその同等物は、たとえば、癌に適用される場合、患者において癌細胞の数を減らすもしくは排除する、または癌の症状を緩和するように設計される行為の手順または経過を指す。癌または別の増殖性疾病を「治療する方法」は、癌細胞もしくは疾病が実際に排除される、細胞の数もしくは疾病が実際に軽減される、または癌もしくは他の疾病の症状が実際に緩和されることを必ずしも意味しない。癌を治療する方法は成功の確率が低くても実施されるが、それは、患者の既往歴及び生存能力を考えると、それでもやはり、全体的に有益な行動過程であると見なされることが多い。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、用語「転移」は患者における原発腫瘍からの１以上のどこかの部位への癌性細胞の伝搬を指す。癌が転移しているかどうかを判定する手段は当該技術で既知であり、それには、骨走査、胸部Ｘ線、ＣＡＴ走査、ＭＲＩ走査及び腫瘍マーカー検査が挙げられる。
【００７７】
用語「転移を防ぐ薬物」または「転移を減らす薬物」は本明細書で使用されるとき、患者（たとえば、癌の（たとえば、患者における原発腫瘍からの１以上のどこかの部位への癌性細胞のさらなる伝搬を抑制する又は低減するために）における転移に対する予防剤としての薬物の使用を指す。従って、一実施形態では、原発の腫瘍または癌、転移性の腫瘍または癌の転移が予防され、遅延させられ、または抑制される。
【００７８】
詳細な説明
本発明は、抗Ｎｏｄａｌ抗体及びＮｏｄａｌに関連する障害または疾患を診断する、予防する及び治療するための抗Ｎｏｄａｌ抗体の使用に関連する。
【００７９】
抗Ｎｏｄａｌ抗体の治療上の使用
本発明の抗体は単独で、または治療剤として使用するための１以上の他の作用剤との併用で投与されてもよい。一部の実施形態では、本発明は、Ｎｏｄａｌが関連する及び／またはＮｏｄａｌが介在する疾患、障害または状態の治療のために患者（たとえば、好ましくはヒト患者）に本発明の抗体を投与することが関与する抗体に基づく治療法を指向する。一実施形態では、本発明の治療剤（たとえば、抗Ｎｏｄａｌ抗体を含む）を患者に投与して患者における腫瘍の増殖、腫瘍の転移、または他の癌が原因の細胞または腫瘍性の細胞を（たとえば、部分的にまたは完全に）反転する、緩和する、その進行を抑制する。それらを予防する。
【００８０】
抗Ｎｏｄａｌ抗体の投与の量及び投与のタイミングは治療される患者の種類（たとえば、種、性別、年齢、体重等）及び状態ならびに治療される疾患または状態の重症度に左右されるであろう。普通、典型的な投与量の抗Ｎｏｄａｌ抗体が使用される。たとえば、本発明に係る抗体の投与のための投与量は、１以上の別々の投与によってまたは連続点滴によって約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（たとえば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体であることができる。典型的な毎日の投与量は約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。好まれる態様では、抗体は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇの範囲での用量にて２〜３週間ごとに投与される。例となる用量は、連続点滴として投与される４ｍｇ／ｋｇの負荷用量と、疾患の進行が検出されるまで連続点滴として投与される２ｍｇ／ｋｇ〜６ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２ｍｇ／ｋｇのそれに続く３週間の点滴である。別の例となる用量は、ＩＶ点滴としての１４日に１回の５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、さらに好まれる５ｍｇ／ｋｇである。
【００８１】
好まれる実施形態では、本発明の治療用組成物は癌の対象を治療する方法にて使用される。たとえば、一実施形態では、本発明は、癌を患っている患者にて転移を防ぎまたは軽減し、そのような患者の生存期間を延ばし、そのような患者の無増悪生存を延ばし、及び応答の持続時間を延ばし、結果として生存期間、無増悪生存、応答率または応答の持続時間によって測定されるような治療された患者の統計的に有意な且つ臨床上意味のある改善を生じる方法を提供する。好まれる実施形態では、薬物は患者の群にて応答率を高めるのに有用である。
【００８２】
本発明の治療用組成物を受け取っている対象は特定の治療を必要とする哺乳類であってもよく、たとえば、哺乳類は特定の疾病、たとえば、Ｎｏｄａｌに関連するものであると診断されている。治療上許容できる用量の本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体（単数）または抗体（複数）、または本抗体のカクテルを、または種々の供給源の他の抗体との併用で、単独で、または１以上の本明細書に記載されている１以上の他の治療剤（たとえば、Ｌｅｆｔｙ）との併用で投与する方法を用いて、治療される哺乳類（たとえば、ヒト）にて本疾患の症状を改善または予防してもよい。
【００８３】
本発明の抗体を用いて哺乳類を治療してもよい。前臨床データを得る目的で抗体を非ヒト哺乳類に投与してもよい。治療される例となる非ヒト哺乳類には、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、齧歯類、及び前臨床試験が実施される他の哺乳類が挙げられる。そのような哺乳類は、抗体で治療される疾患について確立された動物モデルであってもよいし、または対象とする抗体の毒性を試験するのに使用されてもよい。これらの実施形態のそれぞれでは、哺乳類にて用量漸増試験が実施されてもよい。
【００８４】
本発明の治療用化合物には、本発明の抗体（本明細書に記載されているようなその断片、類似体及び誘導体を含む）及び本明細書に記載されているような本発明の抗体をコードする核酸（本明細書に記載されているようななその断片、類似体及び誘導体及び抗イディオタイプ抗体を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体を用いて、本明細書に記載されている疾患、障害または状態のいずれか１以上を含むが、これらに限定されないＮｏｄａｌの異常な発現及び／または活性に関連する疾患、障害または状態を治療する、抑制するまたは予防することができる。Ｎｏｄａｌの過剰発現、または異常な発現及び／または活性に関連する疾患、障害または状態の治療及び／または予防には、疾患、障害または状態に関連する少なくとも１つの症状を緩和することが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の抗体は当該技術で知られるようなまたは本明細書に記載されているような薬学上許容できる組成物で提供されてもよい。
【００８５】
本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体は種々の疾患にて治療上使用されてもよい。一実施形態では、本発明は、哺乳類にてＮｏｄａｌが介在する疾患を予防するまたは治療する方法を提供する。該方法は、疾患を予防するまたは治療する量の抗Ｎｏｄａｌ抗体を哺乳類に投与することを含む。一実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体はＮｏｄａｌに結合し、その機能を阻害する。別の実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体を用いて癌の転移を阻害する。一実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体を含む組成物は、患者にて原発腫瘍からの１以上のどこかの部位への癌性細胞の伝搬を抑制するまたは低減することを介して癌を患っている患者を予防上及び／または治療上治療する方法にて使用される（たとえば、本発明の方法及び組成物を用いて、原発の腫瘍または癌、転移性の腫瘍または癌の転移が防がれる、遅延されるまたは抑制される）。
【００８６】
本発明は治療される癌の型によって限定されない。実際、以下：膀胱（進行性及び転移性の膀胱癌を含む）、乳腺、結腸（結腸直腸癌を含む）、腎臓、肝臓、肺（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、及び肺腺腫を含む）、卵巣、前立腺、精巣、尿生殖器、リンパ系、直腸、咽頭、膵臓（外分泌膵臓癌を含む）、食道、胃、胆嚢、子宮頸部、甲状腺、及び皮膚（有棘細胞癌を含む）の癌腫含む癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫、組織球性リンパ腫、及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系系列の造血系腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、及び前骨髄球性白血病を含む骨髄性系列の造血系腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、及び奇形癌を含む他の腫瘍；黒色腫、切除不能なステージＩＩＩまたはＩＶの悪性黒色腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、消化器癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、及び頭頚部癌、胃癌、生殖細胞腫瘍、骨癌、骨腫瘍、骨の成人悪性線維性組織球腫；骨の小児悪性線維性組織球腫、肉腫、小児肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、新生物、形質細胞新生物；骨髄異形成症候群；神経芽細胞腫；精巣生殖細胞腫瘍、眼内黒色腫、骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、滑膜肉腫、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、フィラデルフィア染色体陽性急性リンパ芽球性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、肥満細胞症及び肥満細胞症に関連する任意の症状、及びそれらの転移を含むが、これらに限定されない種々の癌が治療されてもよい。加えて、障害には他の癌に加えて、色素性蕁麻疹、びまん性皮膚肥満細胞症のような肥満細胞症、ヒトにおける単独型肥満細胞腫、と同様にイヌ肥満細胞腫及び水疱性、紅皮性及び血管拡張性の肥満細胞症のような若干稀な亜型、関連する血液障害を伴った肥満細胞症、たとえば、骨髄増殖性または骨髄異形成性の症候群、または急性白血病、肥満細胞症の関連した骨髄増殖性障害、肥満細胞白血病が挙げられる。以下：膀胱、尿路上皮癌、乳腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、精巣、特に精巣精上皮腫、及び皮膚の癌腫を含むが、これらに限定されない癌腫；扁平上皮癌を含む癌腫；消化管間質腫瘍（“ＧＩＳＴ”）；白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ヘアリー細胞リンパ腫及びバーキットリンパ腫を含むリンパ系列の造血系腫瘍；急性及び慢性の骨髄性白血病及び前骨髄球性白血病を含む骨髄系列の造血系腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；黒色腫、精上皮腫、奇形癌、神経芽細胞腫及び神経膠腫を含む他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を含む中枢神経系及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋肉腫、及び骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；及び他の腫瘍、黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌、奇形癌、化学療法難治性非精上皮腫生殖細胞腫瘍、及びカポジ肉腫、及びそれらの転移を含むが、これらに限定されない他の癌も障害の範囲内に含まれる。
【００８７】
本発明は、本発明の抗体組成物と共に同時投与される組成物または作用剤の種類によって限定されない。たとえば、本発明の文脈で、そのような作用剤の効果を高める１以上の細胞傷害性、化学療法性及び／または抗癌性の作用剤または化合物は、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体と共に使用されてもよく、及び／または投与されてもよい。例となる作用剤には、アルキル化剤またはアルキル化作用を持つ作用剤、たとえば、サイクロホスファミド（ＣＴＸ；たとえば、ＣＹＴＯＸＡＮ）、クロラムブシル（ＣＨＬ；たとえば、ＬＥＵＫＥＲＡＮ）、シスプラチン（ＣｉｓＰ；たとえば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ）、ブスルファン（たとえば、ＭＹＬＥＲＡＮ）、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣ、等；代謝拮抗剤、たとえば、メソトレキセート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；たとえば、ＶＥＰＥＳＩＤ）、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオグアニン（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（たとえば、ＸＥＬＯＤＡ）、デカルバジン（ＤＴＩＣ）、等；抗生剤、たとえば、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；たとえば、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン等；アルカロイド、たとえば、ビンカアルカロイド、たとえば、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチン、等；及び他の抗腫瘍剤、たとえば、パクリタキセル（たとえば、ＴＡＸＯＬ）及びパクリタキセル誘導体、細胞増殖抑制剤、グルココルチコイド、たとえば、デキサメタゾン（ＤＥＸ；たとえば、ＤＥＣＡＤＲＯＮ）及びコルチコステロイド、たとえば、プレドニゾン、ヌクレオシド酵素阻害剤、たとえば、ヒドロキシ尿素、アミノ酸枯渇酵素、たとえば、アスパラギン、リューコボリン及び他の葉酸誘導体、及び類似の多様な抗腫瘍剤が挙げられるが、これらに限定されない。以下の作用剤：アミフォスチン（たとえば、ＥＴＨＹＯＬ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、サイクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（たとえば、ＤＯＸＩＬ）、ゲムシタビン（たとえば、ＧＥＭＺＡＲ）、ダウノルビシンリポ（たとえば、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ）、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（たとえば、ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルデスロイキン、カルボプラチン、オキサリプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ１１（イリノテカン）、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イフォスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ、ミトキサントロン、トポテカン、リュープロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルも追加の作用剤として使用されてもよい。
【００８８】
一実施形態では、抗ホルモン剤が本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体と共に使用され、または同時投与される。
【００８９】
化学療法投薬計画における本明細書に記載されている細胞傷害剤及び他の抗癌剤の使用は一般に癌治療技術においてよく特徴付けられており、本明細書におけるその使用は、忍容性及び有効性をモニタリングすることについてならびに投与の経路及び投与量を制御することについて同じ検討事項に該当する。有効な細胞傷害剤の典型的な投与量は製造元によって推奨される範囲内にあることができ、試験管内の応答または動物モデルにおける応答によって示される場合、約一桁の濃度または量まで減らすことができる。従って、実際の投与量は、内科医の判断、患者の状態、及び初代培養された悪性細胞または組織培養された組織試料の試験管内の応答性または適当な動物モデルで認められた応答に基づく治療方法の有効性に左右されるであろう。
【００９０】
別の実施形態では、有効量の電離放射線が実行されてもよく、及び／または放射性医薬品が使用されてもよい。放射線の線源は治療される患者の外側にあっても内側にあってもよい。線源が患者の外側にある場合、治療法は、外照射療法（ＥＢＲＴ）として知られる。放射線の線源が患者の内側にある場合、治療は近接照射療法（ＢＴ）と呼ばれる。本発明の文脈で使用するための放射性原子は、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、及びインジウム−１１１を含むが、これらに限定されない群から選択することができる。一実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体はそのような放射性同位元素によって標識されてもよい。
【００９１】
放射線療法は、切除不能なまたは手術できない腫瘍及び／または腫瘍の転移を制御する標準の治療である。放射線療法を化学療法と併用すると改善された成績が見られている。放射線療法は、標的領域に送達される高線量の放射線が腫瘍組織及び正常組織の双方における複製細胞の死を生じるという原理に基づく。放射線投与計画は一般に放射線の吸収線量（Ｇｙ）、時間及び分割という点で定義され、腫瘍学者によって慎重に定義されなければならない。患者が受ける放射線の量は種々の検討事項に左右されるが、２つの最も重要なことは、身体の他の重大な構造または臓器に関連した腫瘍の位置及び腫瘍が広がっている程度である。放射線療法を受ける患者にとっての治療の典型的な治療単位は、週に５日、約１．８〜２．０Ｇｙの単回１日分割で患者に投与される１０〜８０Ｇｙの総線量にて１〜６週間にわたる治療計画であろう。本発明の好まれる実施形態では、ヒト患者における腫瘍が本発明の治療と放射線との併用で治療されると相乗性がある。言い換えると、本発明の併用または単一療法を含む作用剤による腫瘍増殖の阻害は、放射線と、任意で追加の化学療法剤または抗癌剤と併用すると高められる。
【００９２】
Ｎｏｄａｌの異常な発現及び／または活性に関連する疾患または障害の治療、抑制及び予防に有効であるであろう抗体の量は標準の臨床的な技法によって決定することができる。投与量は、治療される疾患の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的で投与されるのか、または治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の既往歴及び抗体への応答、ならびに主治医の裁量に左右されるであろう。抗体は、疾患に一致する治療計画で、たとえば、１日〜数日にわたって単回用量または数回用量で投与されて病状を改善することができ、または長い時間定期的な用量で投与されて疾患の進行を抑制し、疾患の再発を防ぐことができる。加えて、試験管内アッセイを任意で採用して最適な投与量範囲を特定するのに役立ててもよい。製剤で採用される正確な用量は、投与の経路及び疾患または障害の深刻さにも左右されるであろうし、内科医の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な用量は試験管内のまたは動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線から外挿されてもよい。
【００９３】
患者に投与される本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体の投与量についての追加の例となる実施形態は通常、患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜１５０ｍｇ／ｋｇである。好ましくは、患者に投与される投与量は、患者の体重の０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの間、さらに好ましくは１ｍｇ／患者の体重のｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの間である。一般に、外来ポリペプチドに対する免疫応答のせいで、ヒト抗体は、他の種に由来する抗体よりもヒト体内で長い半減期を有する。従って、少ない投与量のヒト抗体及び少ない回数の投与が可能であることが多い。さらに、本発明の抗体の投与量及び投与の回数は、たとえば、脂質化またはペグ化のような修飾によって抗体の安定性、取り込み及び組織への浸透を高めることにより減らされてもよい。状態に応じた数日以上にわたる反復投与については、治療は疾患の症状の所望の抑制が生じるまで持続される。しかしながら、他の投与計画が有用であってもよい。この治療の進行は従来の技法及びアッセイによって容易にモニターされる。
【００９４】
良質の医療のための原則に矛盾しない方法で抗体組成物が製剤化され、服用され、投与されてもよい。この文脈で考慮するための因子には、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、作用剤の送達の部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医療関係者に既知の他の因子が挙げられる。
【００９５】
本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体は単独で、または他の種類の治療との併用で投与されてもよい。好まれる実施形態では、抗体は実質的に精製される（たとえば、その効果を限定するまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。
【００９６】
注射、たとえば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへの被包、化合物を発現することができる組換え細胞（遺伝子操作した）、受容体が介在するエンドサイトーシス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築、等を含む種々の送達系が知られ、本発明の抗体を投与するのに使用することができる。
【００９７】
抗Ｎｏｄａｌ抗体を許容できる方法で哺乳類に投与することができる。導入の方法には、非経口、皮下、腹腔内、肺内、鼻内、硬膜外、吸入及び経口の経路、及び免疫抑制治療について所望であれば、病変内投与が挙げられるが、これらに限定されない。非経口注入には、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内、または腹腔内の投与が挙げられる。抗Ｎｏｄａｌ抗体またはそれを含む組成物は、従来の経路、たとえば、点滴またはボーラス注射によって、上皮または皮膚粘膜の内層（たとえば、口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜等）を介した吸収によって投与されてもよく、他の生物学的に活性のある作用剤（たとえば、本明細書に記載されているもの）と一緒に投与されてもよい。投与は全身性または局所性であることができる。加えて、脳室内投与及び髄腔内投与を含む好適な経路によって本発明の治療用の抗体又は組成物を中枢神経系に導入することが望ましくてもよい。加えて、抗体は、パルス注入によって、特に漸減用量の抗体と共に好適に投与される。好ましくは、投与が手短かまたは慢性的かに応じて、投薬は注射、さらに好ましくは静脈内または皮下の注射によって与えられる。
【００９８】
一実施形態では、たとえば、吸入器またはネブライザの使用及び噴霧剤を伴った製剤によって肺投与が採用される。抗体はまた乾燥粉末組成物の形態で患者の肺に投与されてもよい。
【００９９】
特定の実施形態では、治療を必要とする領域に本発明の治療用の抗体または組成物を投与することが望ましくてもよく；これは、たとえば、局所注入、局所塗布によって、注射によって、カテーテルによって、坐薬によってまたはインプラントによって達成されてもよく、前記インプラントは、膜または繊維を含む多孔性、非多孔性またはゼラチン様の物質である。別の実施形態では、抗体は制御放出系で送達される。
【０１００】
本発明は医薬組成物も提供する。そのような組成物は治療上有効な量の抗Ｎｏｄａｌ抗体と生理学的に許容できるキャリアとを含む。特定の実施形態では、用語「生理学的に許容できる」は、哺乳類、且つさらに詳しくはヒトでの使用について連邦政府もしくは州政府の規制当局によって認可されている、または米国薬局方もしくは一般に認識されている他の薬局方にてリストにされていることを意味する。従って、薬学上許容できるキャリアは対象への作用剤の送達について当該技術で既知である任意のキャリアである。用語「キャリア」は治療剤が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤またはビヒクルを指す。そのような生理的なキャリアは、たとえば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等のような石油、動物、植物または合成の起源のものを含む、たとえば、水及び油類のような無菌の液体であることができる。医薬組成物が静脈内に投与される場合、水が好まれるキャリアである。生理食塩水溶液及び水性のデキストロース及びグリセロールの溶液も特に注射溶液用の液体キャリアとして採用することができる。好適な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、胡粉、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は所望であれば、軽微な量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルション、錠剤、丸薬、カプセル、粉剤、持続放出製剤等の形態を取ることができる。組成物は、たとえば、トリグリセリドのような従来の結合剤及びキャリアと共に坐薬として製剤化することができる。経口製剤は、たとえば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準のキャリアを含むことができる。好適なキャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」にて記載されている。そのような組成物は、患者への適正な投与のための形態を提供するように好適な量のキャリアと一緒に有効量の抗体を好ましくは精製された形態で含有するであろう。一実施形態では、治療上有効な量の抗Ｎｏｄａｌ抗体と生理学的に許容できるキャリアとを含む組成物が投与の特定の方式のために具体的に製剤化される。
【０１０１】
たとえば、一実施形態では、組成物は、ヒトへの静脈内投与に適する医薬組成物として日常の手順に従って製剤化される。通常、静脈内投与用の組成物は無菌等張の水性緩衝液における溶液である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤及びリグノカインのような局所麻酔剤を含んで注射の部位での痛みを和らげてもよい。一般に、成分は、たとえば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェのような密閉された容器における乾燥させた凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、別々に供給され、または単位剤形にて一緒に混合される。組成物が注入によって投与されるべきである場合、無菌で医薬等級の水または生理食塩水を含有する注入ビンにそれを分配することができる。組成物が注射で投与される場合、成分が投与に先立って混合されてもよいように注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上で満たされた１以上の容器を含む医薬パックまたは医薬キットも提供する。そのような容器に任意で関連するものは、医薬品または生物製剤の製造、使用または販売を規制する政府の当局によって指示された形態の通知であることができ、その通知はヒト投与のための製造、使用または販売の当局による認可を反映する。一実施形態では、容器には添付文書が含まれる。本明細書で使用されるとき、「添付文書」は治療用製品の市販包装に通例含まれる指示書を指し、それは、そのような治療用製品の使用に関する適応、用途、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報を含んでもよい。
【０１０２】
本発明はまた、所望の程度の純度を有する抗Ｎｏｄａｌ抗体を、通常当該技術で採用される任意の「薬学上許容できる」キャリア、賦形剤または安定剤（そのすべてが「賦形剤」と呼ばれる）、すなわち、緩衝剤、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、及びその他の添加剤と混合することによって凍結乾燥製剤または水性溶液として保存するために調製される治療用製剤も提供する。ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと。そのような添加剤は採用される投与量及び濃度にてレシピエントに対して非毒性でなければならない。
【０１０３】
例となる緩衝剤には、たとえば、クエン酸緩衝液（たとえば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物、等）、コハク酸緩衝液（たとえば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物、等）、酒石酸緩衝液（たとえば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物、等）、フマル酸緩衝液（たとえば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、等）、フマル酸緩衝液（たとえば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物、等）、グルコン酸緩衝液（たとえば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物、等）、シュウ酸緩衝液（たとえば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物、等）、乳酸緩衝液（たとえば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物、等）及び酢酸緩衝液（たとえば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物、等）のような有機酸及び無機酸の双方及びそれらの塩が挙げられる。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、及びトリスのようなトリメチルアミン塩が使用されてもよい。一実施形態では、緩衝液を利用して生理的状態を近似する範囲でｐＨを維持する。緩衝液は、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在してもよい。
【０１０４】
保存剤を加えて微生物の増殖を妨害してもよく、０．２％から１％（ｗ／ｖ）に及ぶ量で加えてもよい。例となる保存剤には、フェノール、ベンジルアルコール、メタ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化合物（たとえば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、及びメチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン、カテコール、レゾシノール、シクロヘキサノール、及び３−ペンタノールが挙げられる。
【０１０５】
同様に、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、たとえば、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールのような種々の安定剤が使用されてもよい。安定剤は、治療剤を安定化し、または変性もしくは容器壁への付着を防ぐのに役立つ結合剤から添加剤までの機能に幅があり得る広いカテゴリーの賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記で列挙された）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニン等のようなアミノ酸、有機糖または糖アルコール、たとえば、ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロール等、イノシトールのようなシクリトールを含む；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；イオウ含有還元剤、たとえば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、アルファ−モノチオグリセロール及びチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（すなわち、＜１０残基）；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン、単糖類、たとえば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース；ラクトース、マルトース、スクロースのような二糖類及びラフィノースのような三糖類；及びデキストランのような多糖類であることができる。安定剤は、活性タンパク質の重量部当たり０．１〜１０，０００重量部の範囲で存在してもよい。
【０１０６】
たとえば、ポリソルベート（２０、４０、６０、８０、等）、ポロキサマー（１８４、１８８等）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ、ポリオール等のような非イオン性の界面活性剤またはデタージェントが使用されてもよい。非イオン性界面活性剤は、それより少し（たとえば、０．０５ｍｇ／ｍｌを下回る）またはそれより多く（たとえば、１．０ｍｇ／ｍｌ）使用されてもよいけれども、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲で存在してもよい。
【０１０７】
追加の様々な賦形剤には、増量剤（たとえば、デンプン）、キレート剤（たとえば、ＥＤＴＡ）、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）及び共溶媒が挙げられる。本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応のために必要に応じて１を超える活性化合物も、好ましくは、互いに有害に影響しない相補性の活性を持つものも含有してもよい。たとえば、免疫抑制剤をさらに提供することが望ましくてもよい。そのような分子は、意図される目的に効果的である量にて併用で好適に存在する。有効成分は、コアセルベーション法によって、または界面重合によって、たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンのマイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセルによって、コロイド状薬剤送達系（たとえば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）において、またはマクロエマルションにおいて調製されるマイクロカプセルに被包されてもよい。そのような技法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓａｌ，Ｅｄ．（１９８０）にて開示されている。
【０１０８】
持続放出製剤が使用されてもよい。持続放出製剤の好適な例には、抗体変異体を含有する固形疎水性のポリマーの半透過性のマトリクスが挙げられ、そのマトリクスは造形品、たとえば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクチド、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドで構成される注射用マイクロスフェア）及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１０９】
Ｎｏｄａｌ免疫原
実施例に記載されているように、本発明はＮｏｄａｌ免疫原及びそれを用いて抗体を生成する方法を提供する。Ｎｏｄａｌ免疫原は組換えで製作されてもよく、または合成法を用いて作製されてもよい。Ｎｏｄａｌ免疫原は天然の供給源（たとえば、内在性の細胞性Ｎｏｄａｌタンパク質）から単離され、及び／または精製されてもよい。抗体を調製するのに有用なＮｏｄａｌ免疫原の複数の形態は当業者に容易に明らかであろう。
【０１１０】
たとえば、Ｎｏｄａｌタンパク質（たとえば、完全長のヒトＮｏｄａｌまたはその一部）を免疫原として使用してもよい。他の実施形態では、Ｎｏｄａｌを発現している細胞を免疫原として使用する。そのような細胞は天然の供給源（たとえば、癌細胞株）に由来することができ、または組換え法によってＮｏｄａｌを過剰発現するように形質転換されている細胞であってもよい。一実施形態では、ヒトＮｏｄａｌをコードする遺伝子またはｃＤＮＡをプラスミドまたは他の発現ベクターにクローニングし、当業者に周知の方法に従って多数の発現系のいずれかにて発現させる。遺伝子コードの既知の縮重に基づいてＮｏｄａｌタンパク質またはＮｏｄａｌポリペプチドをコードする種々のヌクレオチド配列が使用されてもよい。たとえば、天然に存在するＮｏｄａｌをコードするヌクレオチド配列に適用されるような標準のトリプレット遺伝子コードに従って異なるコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによってヌクレオチド配列が異なってもよい（たとえば、それによって所望の変化したＮｏｄａｌ配列を作製するのを可能にする）。これらのポリペプチドのいずれか１つを動物の免疫に用いてＮｏｄａｌを結合する抗体を生成してもよい。本明細書に記載されているように、本発明は、野生型と同様に変異体のＮｏｄａｌタンパク質（たとえば、断片）、及び完全長、野生型Ｎｏｄａｌに特異的に結合する抗体を特定するためのそれを用いた抗体の生成を提供する。
【０１１１】
非ヒトＮｏｄａｌタンパク質（たとえば、組換え及び／または内在性の）を免疫原として使用してもよい。Ｎｏｄａｌタンパク質を他のタンパク質／断片及び／または免疫原性物質（たとえば、スカシガイのヘモシアニン（ＫＬＨ）に融合させてもよいし、及び／または結合させてもよい。結合体及び／または融合体を用いて、たとえば、融合タンパク質がアフィニティクロマトグラフィにより単離され、精製されるのを可能にすることによってタンパク質の精製を支援してもよいが、それを用いて免疫原性を高めることもできる。融合タンパク質は、タンパク質のカルボキシル末端及び／またはアミノ末端のいずれかに連結された融合セグメントを含むタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することによって製作することができる。融合セグメントには、免疫グロブリンＦｃ領域、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、二価の金属イオンを結合することができるポリヒスチジンセグメント、及びマルトース結合タンパク質が挙げられてもよいが、これらに限定されない。
【０１１２】
実施例で示されるように、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを生成するために野生型及び変異体双方のＮｏｄａｌタンパク質を用いてマウスを免疫した。さらに記載されているように、特異性を持って野生型のヒトＮｏｄａｌに結合するが、変異体ヒトＮｏｄａｌに結合しないモノクローナル抗体を特定する方法が提供される。一実施形態では、本発明は、配列番号１３、１５、１７のすべてまたは一部を含む例となるポリペプチドまたはその変異体を提供する。
【０１１３】
好まれる実施形態では、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体は完全長のヒトＮｏｄａｌタンパク質に結合する。さらに好まれる実施形態では、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体は野生型Ｎｏｄａｌタンパク質に結合するが、変異体Ｎｏｄａｌタンパク質（たとえば、プレへリックスループ領域で変異させた（たとえば、ｈＮｏｄａｌＥ４９Ａ、Ｅ５０Ａ変異体タンパク質））には結合しない。従って、別の好まれる実施形態では、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体は特異性を持って、プレへリックスループ領域にて完全長のヒトＮｏｄａｌタンパク質に結合する。従って、一実施形態では、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体は、患者（たとえば、Ｎｏｄａｌ関連の疾患または障害を伴う）に投与されると、患者にて予防上の及び／または治療上の利益を提供する。
【０１１４】
抗Ｎｏｄａｌ抗体の生成
本発明のＮｏｄａｌ特異抗体は当該技術で既知の好適な方法によって生成されてもよい。本発明の抗体はポリクローナル抗体を含んでもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は技量のある熟練者に既知である（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＨａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９８８））。本発明の抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、ヘテロ結合抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって製作される断片、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（たとえば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、及び上記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。本発明は、本明細書で開示されているような抗体または抗体変異体をコードする単離された核酸配列と、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物と、そのようなベクターを含む宿主細胞と、抗体の産生のための組換え法とを提供する。
【０１１５】
Ｎｏｄａｌ免疫原を含む免疫原性組成物を用いて、たとえば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルまたはヒトのような哺乳類を免疫し、ポリクローナル抗体を作出することができる。所望であれば、Ｎｏｄａｌ免疫原をキャリアタンパク質、たとえば、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン、スカシガイのヘモシアニン、または本明細書に記載されている他のキャリアに結合することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。そのようなアジュバントには、フロイントのアジュバント、鉱物ゲル（たとえば、水酸化アルミニウム）及び表面活性物質（たとえば、リソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、本明細書に記載されているナノエマルション、スカシガイのヘモシアニン、及びジニトロフェノール）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトで使用されるアジュバントのうちで、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【０１１６】
Ｎｏｄａｌ免疫原に特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養における連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製することができる。これらの技法には、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶハイブリドーマ法が挙げられるが、これらに限定されない（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７，１９８５；Ｋｏｚｂｏｒら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８１，３１４２，１９８５；Ｃｏｔｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２０２６−２０３０，１９８３；Ｃｏｌｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２，１０９−１２０，１９８４を参照のこと）。そのような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤを含む任意の免疫グロブリンのクラス及びそれらのサブクラスであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは試験管内または生体内で培養されてもよい。従って、一実施形態では、本発明はまた、本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体を産生する種々の細胞株（たとえば、不死化されたＢ細胞株）も提供する。
【０１１７】
加えて、「キメラ抗体」の製作のために開発された技法である、適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得るためのマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングを使用することができる（たとえば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１−６８５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，６０４−６０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ，３１４，４５２−４５４，１９８５を参照のこと）。モノクローナル抗体及び他の抗体を「ヒト化して」、それが治療上使用される際、患者が抗体に対する免疫応答を開始するのを防ぐこともできる。そのような抗体は、治療で直接使用されるヒト抗体に配列が十分類似してもよいし、またはわずかな重要な残基の変化を必要としてもよい。齧歯類の抗体とヒトの抗体との間での配列の差異は、個々の残基の部位特異的変異誘発によって、または相補性決定領域全体の移植によってヒト配列におけるものとは異なる残基を置き換えることにより最少化することができる。
【０１１８】
或いは、ヒト化抗体は組換え法を用いて産生させることができる。特定の抗原に特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号にて開示されたように部分的にまたは完全にヒト化されている抗原結合部位を含有することができる。別の実施形態では、ヒト患者の治療上の処置には完全にヒト抗体を用い、それが特に望ましい。ヒト抗体は、ヒトの免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを用いたファージディスプレイ法を含む当該技術で既知の種々の方法によって作製することができる。
【０１１９】
或いは、単鎖抗体の製作のために記載されている技法は、特定の抗原に特異的に結合する単鎖抗体を製作する当該技術で既知の方法を用いて適応させることができる。関連する特異性を持つが、異なるイディオタイプ組成の抗体は、無作為コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリからの鎖移動によって生成することができる（たとえば、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０−２３，１９９１を参照のこと）。
【０１２０】
たとえば、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いたＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて単鎖抗体を構築することもできる（たとえば、Ｔｈｉｒｉｏｎら，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５０７−１１を参照のこと）。単鎖抗体は単一特異性または二重特異性であることができ、二価または四価であることができる。四価で二重特異性の単鎖抗体は、たとえば、Ｃｏｌｏｍａ及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−６３にて教示されている。二価で二重特異性の単鎖抗体は、たとえば、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ及びＶｏｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９−２０６にて教示されている。
【０１２１】
単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、以下で記載されているように、手動または自動のヌクレオチド合成を用いて構築し、標準の組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物にクローニングし、細胞に導入してコーディング配列を発現させることができる。或いは、単鎖抗体は、たとえば、糸状ファージ法を直接用いて製作することができる（たとえば、Ｖｅｒｈａａｒら，１９９５，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，６１，４９７−５０１；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５，８１−９１を参照のこと）。
【０１２２】
特定の抗原に特異的に結合する抗体は、リンパ球集団にて生体内での産生を誘導することによって、または免疫グロブリンのライブラリまたは文献にて開示されたような高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによって製作することもできる（たとえば、Ｏｒｌａｎｄｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３−３８３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３４９，２９３−２９９，１９９１を参照のこと）。
【０１２３】
キメラ抗体はＷＯ９３／０３１５１にて開示されたように構築することができる。たとえば、ＷＯ９４／１３８０４にて記載された「二重特異性抗体」のような免疫グロブリンに由来し、且つ多価及び多重特異性である結合タンパク質も調製することができる。抗体は当該技術で周知の方法によって精製することができる。たとえば、抗体は、関連抗原が結合されているカラムを通すことによって親和性精製することができる。次いで高塩濃度の緩衝液を用いて、結合した抗体を溶出することができる。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明は、既知の技法によって生成された特異的なエピトープ（たとえば、ヒトＮｏｄａｌ（たとえば、プレヘリックスループ領域））を認識する抗体断片を提供する。従来、抗体断片はインタクトな抗体のタンパク分解消化を介して導き出された（たとえば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７（１９９２）；Ｂｒｅｎｎａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。たとえば、本発明のＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、たとえば、パパイン（Ｆａｂ断片を生じる）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生じる）のような酵素を用いた免疫グロブリン分子のタンパク分解切断によって製作されてもよい。Ｆ（ａｂ’）２断片は可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１ドメインを含有する。しかしながら、これらの断片は今や組換え宿主細胞によって直接作出することができる。たとえば、抗体断片は抗体ファージライブラリから単離することができる。或いは、Ｆ（ａｂ’）２−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的にカップリングさせてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３（１９９２））。別のアプローチに従って、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞の培養物から直接単離することができる。抗体断片の作出の他の技法は技量のある実行者に明らかであろう。
【０１２５】
別の実施形態では、ヘテロ結合抗体を本発明で利用することができる。ヘテロ結合抗体は２つの共有結合した抗体で構成される。そのような抗体は、たとえば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を向けるように提案されている（米国特許第４，６７６，９８０号）。
【０１２６】
抗Ｎｏｄａｌ抗体
本明細書に記載されているように、本発明はＮｏｄａｌを結合し、且つＮｏｄａｌの活性を阻害する（たとえば、Ｃｒｉｐｔｏ−１及び／またはＡｌｋ４／７ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体へのＮｏｄａｌの結合を阻害する、Ｎｏｄａｌまたはその複合体の下流のシグナル伝達を阻害する、Ｎｏｄａｌの発現を下方調節する、等）モノクローナル抗体を提供する。本発明はまた、Ｎｏｄａｌを結合し、且つＮｏｄａｌが介在する細胞性のシグナル伝達を阻害するモノクローナル抗体も提供する。本発明の抗体には１Ｂ４、９Ｂ９、２Ｄ１２、１０Ｂ１２、３Ｄ１及び５Ｆ１０と名付けられた抗体が含まれる。特に好まれる実施形態では、３Ｄ１と名付けられた抗体が使用される。本発明にはまた、３Ｄ１と同じエピトープに結合する抗体も含まれる。抗Ｎｏｄａｌ抗体は実施例にて記載されているように定義され、性状分析された。本発明の抗体は、それらが認識し、または特異的に結合するＮｏｄａｌのエピトープまたは一部という点で記載されてもよいし、指定されてもよい。エピトープまたはポリペプチドの部分は、本明細書に記載されているように、たとえば、Ｎ末端及びＣ末端の位置によって、隣接するアミノ酸残基のサイズによって指定されてもよく、または表及び図にてリストにされてもよい。
【０１２７】
本発明の抗体はその交差反応という点でも記載され、または指定されてもよい。Ｎｏｄａｌポリペプチドを結合し、Ｎｏｄａｌポリペプチドに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、及び少なくとも５０％の同一性（当該技術で既知であり、且つ本明細書に記載されている方法を用いて算出したとき）を有する抗体も本発明に含まれる。本明細書に記載されているように、抗Ｎｏｄａｌ抗体はまた約１０−７Ｍ未満、約１０−６Ｍ未満または約１０−５Ｍ未満のＫＤで他のタンパク質も結合してもよい。
【０１２８】
本発明はまた、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でＮａｄａｌタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを結合する抗Ｎｏｄａｌ抗体も提供する。本発明の抗体はまた、本発明のポリペプチドの結合親和性という点で記載され、または指定されてもよい。好まれる結合親和性には、１０−８Ｍ〜１０−１５Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍまたは１０−１０Ｍ〜１０−１２Ｍの平衡解離定数またはＫＤを持つものが挙げられる。本発明はまた、競合結合を測定するための当該技術で既知の方法、たとえば、本明細書に記載されている免疫アッセイによって測定されるような本発明のエピトープへの抗体の結合を競合して阻害する抗体も提供する。好まれる実施形態では、抗体は、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、及び少なくとも５０％エピトープへの抗体の結合を競合して阻害する。
【０１２９】
一実施形態では、本発明は、本明細書で開示されるような抗体または抗体変異体をコードする単離された核酸配列と、本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むベクター構築物と、そのようなベクターを含む宿主細胞と、抗体の産生のための組換え技法とを提供する。
【０１３０】
抗体の組換え産生については、それをコードする核酸を単離し、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（たとえば、抗体変異体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）を用いて容易に単離され、配列決定される。本発明の抗体を発現している細胞株の調製にはクローニング及び形質変換の標準的な技法が使用されてもよい。
【０１３１】
本発明はまた、本発明の抗体及びその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドまたは核酸、たとえば、ＤＮＡも提供する。例となるポリヌクレオチドには、本明細書に記載されているアミノ酸配列の１以上を含む抗体鎖をコードするものが挙げられる。本発明はまた、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドと、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でまたは低いストリンジェントの条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチドも包含する。当該技術で既知の任意の方法によってポリヌクレオチドが得られてもよいし、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定されてもよい。
【０１３２】
本明細書に記載されているように、本発明の抗体は、抗体の合成についての当該技術で既知の任意の方法によって、特に化学合成によって、または好ましくは組換え発現法によって作出することができる。たとえば、本発明の抗体、またはその断片、誘導体または類似体（たとえば、本発明の抗体の重鎖または軽鎖または本発明の単鎖抗体）の組換え発現は、抗体または抗体の断片をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。抗体分子をコードするポリヌクレオチドがいったん得られると、抗体の産生用のベクターは組換えＤＮＡ技術によって作出されてもよい。抗体のコーディング配列と適当な転写及び翻訳の制御シグナルとを含有する発現ベクターが構築される。これらの方法には、たとえば、試験管内組換え法、合成法及び生体内遺伝子組換えが挙げられる。発現ベクターは従来の技法によって宿主細胞に移され、次いで形質移入された細胞は従来の技法によって培養されて本発明の抗体を産生する。本発明の態様の１つでは、重鎖及び軽鎖の双方をコードするベクターが免疫グロブリン分子全体の発現のために宿主細胞で同時発現されてもよい。
【０１３３】
種々の宿主／発現ベクター系を利用して本発明の抗体分子を発現させてもよい。そのような宿主／発現系は、対象とするコーディング配列が生成され、続いて精製されてもよい媒体を表すが、適当なヌクレオチドコーディング配列で形質転換または形質移入されると原位置で本発明の抗体分子を発現してもよい細胞も表す。大腸菌のような細菌細胞及び真核細胞は、組換え抗体分子の発現に、特に組換え抗体分子全体の発現に一般に使用される。たとえば、ＣＨＯのような哺乳類細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモータ要素のようなベクターと併せて抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら，Ｇｅｎｅ，４５：１０１，（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２，（１９９０））。
【０１３４】
好適な宿主細胞の特定及び使用は当該技術で周知である。たとえば、挿入された配列の発現を調節する、または所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾し、処理する宿主細胞株が選択されてもよい。タンパク質産物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）及び処理（たとえば、切断）はタンパク質の機能にとって重要であってもよい。様々な宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後の処理及び修飾に特徴的で特異的なメカニズムを有する。適当な細胞株または宿主系を選択して発現される外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確保することができる。この目的で、一次転写物の適正な処理、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞機構を持つ真核宿主細胞が使用されてもよい。そのような哺乳類の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＮＩＨ３Ｔ３または骨髄腫細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
本発明の抗体（たとえば、動物によって産生された、化学的に合成された、または組換えで発現された）は、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術で既知の方法、たとえば、クロマトグラフィ（たとえば、イオン交換、アフィニティ、特にプロテインＡの後の特異抗原のための親和性による、サイズ排除クロマトグラフィ）、遠心分離、差次的溶解性によって、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技法によって精製されてもよい。加えて、本発明の抗体またはその断片は、本明細書に記載されているまたはさもなければ当該技術で既知の異種のポリペプチド配列に融合されて精製を円滑にすることができる。
【０１３６】
本発明は、ポリペプチドに組換えで融合されたまたは化学的に結合された（共有結合及び非共有結合の双方を含む）抗体を包含する。本発明の融合されたまたは結合された抗体は精製の容易さに使用されてもよい。加えて、本発明の抗体またはその断片を、たとえば、ペプチドのようなマーカー配列に融合させて精製を円滑にすることができる。一実施形態では、マーカーのアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、ＨＡタグ（たとえば、インフルエンザ血球凝集タンパク質に由来する）またはＦＬＡＧタグである。
【０１３７】
本明細書の実施形態は、１以上の追加の機能的な作用剤との抗体または抗体断片の結合体を包含する。たとえば、一部の実施形態では、抗体／薬剤結合体または断片／薬剤結合体が提供される（たとえば、その際、機能的な作用剤は薬剤である）。一部の実施形態では、抗体の標的エピトープへの結合は機能的な作用剤（たとえば、薬剤）を標的細胞に局在化させ、それによって機能的な作用剤の有効性を高める。一部の実施形態では、機能的な作用剤と抗体の有効性は相加性である。他の実施形態では、機能的な作用剤の作用の様式と抗体の間での相乗効果は個々の成分の結合体の有効性における相加的上昇よりも大きな上昇を生じる。一部の実施形態では、任意の目的（たとえば、同時投与）のための本明細書に記載されている好適な薬剤または薬剤のクラスは、抗体／薬剤結合体または断片／薬剤結合体の調製及び使用にて使用されてもよい。特定の実施形態では、癌の治療に有用な他の作用剤の化学療法剤を本発明の範囲で抗体または抗体断片に結合する（たとえば、直接または好適なリンカーを介して）。
【０１３８】
当該技術は本発明の抗体の精製にて有用である種々の材料及び方法を周知である。組換え法を使用する場合、抗体変異体は細胞内で、細胞周辺腔で産生され得るし、または培地に直接分泌され得る。抗体変異体が細胞内で産生されるならば、最初の段階として粒子状の残渣、宿主細胞または溶解された断片は、たとえば、遠心分離または限外濾過によって取り除かれてもよい。Ｃａｒｔｅｒら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔に分泌される抗体を単離する手順を記載している。抗体変異体が培地に分泌される場合、市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえば、ＡＭＩＣＯＮまたはＭＩＬＩＰＯＲＥの限外濾過ユニットを用いてそのような発現系からの上清を一般に先ず濃縮する。細胞から生成された及び／または単離された抗体は、たとえば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製することができる。親和性リガンドとしてのプロテインＡの好適性は抗体変異体に存在する免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに左右される。プロテインＡを用いて、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４の重鎖に基づく抗体を精製することができる（Ｌｉｎｄｍａｒｋら，ＪＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１（１９８３））。プロテインＧはマウスのアイソタイプすべてとヒトのＩｇＧ３について推奨される（Ｇｕｓｓら，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７（１９８６））。親和性リガンドが結合するマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリクスも利用できる。制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定したマトリクスはアガロースで達成できるものより速い流速及び短い処理時間を可能にする。たとえば、イオン交換カラムにおける分画化、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースにおけるクロマトグラフィ、アニオンまたはカチオン交換樹脂におけるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安沈殿のようなタンパク質精製のための他の技法は当該技術で周知であり、抗体の特定の種類に基づいて選択することができる。任意の精製工程に続いて、溶出緩衝液（たとえば、約２．５〜４．５の間のｐＨにて、好ましくは低塩濃度（たとえば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される）を用いて、抗体及び混入物を含む混合物をさらに、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィに供してもよい。
【０１３９】
抗Ｎｏｄａｌ抗体の診断上の使用
本発明の抗体を用いて試験管内及び生体内双方の診断法にてＮｏｄａｌを検出してもよい。たとえば、本発明の抗体は、生体試料におけるＮｏｄａｌのレベルを定性的に及び定量的に測定するための免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ，直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ等）、ウエスタンブロット、免疫組織化学法、タンパク質アレイ、免疫ＰＣＲ等）にて使用されてもよい（たとえば、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，第２版（１９８８）を参照のこと）。本発明は生体試料の特定の種類に限定されない。実際、Ｎｏｄａｌタンパク質が見いだされる任意の試料を含むが、これらに限定されない種々の試料が本発明の診断法を用いて特徴付けられてもよい。一部の実施形態では、試料は組織、体液、血液、血清、尿、唾液、喀痰、または肺浸出物である。一部の実施形態では、試料は、Ｎｏｄａｌ、Ｃｒｉｐｔｏ−１またはＮｏｄａｌとＣｒｉｐｔｏ−１の双方を発現しているまたは発現することが疑われる細胞を含む。一部の実施形態では、試料は、Ｎｏｄａｌを発現しないが、傍分泌シグナル伝達のためにＮｏｄａｌについて陽性である細胞を含む。本発明の抗体は検出アッセイで標識として有用な分子に組換えで融合されてもよいし、または結合されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されている（たとえば、治療用途のために）好適な抗体、抗体断片、二重特異性抗体、結合抗体、等も診断応用で使用されてもよい。一部の実施形態では、試料におけるＮｏｄａｌの検出は臨床家に診断情報及び／または予後情報を提供する。一部の実施形態では、試料におけるＮｏｄａｌの検出は癌の進行性の形態を示すまたはその診断である。一部の実施形態では、本明細書に記載されているＮｏｄａｌの診断は、対象が患っている癌の種類を判定する、及び／または対象のための一連の治療行動を決定する（たとえば、抗Ｎｏｄａｌ抗体による治療、他の癌治療等）１以上の追加の診断アッセイと共に実施される。
【０１４０】
本発明の抗体は修飾されてもよい（たとえば、抗体へのある部分の共有結合を介して）。好まれる実施形態では、本発明の抗体は、それへの部分の結合がＮｏｄａｌへの抗体の結合を妨害しないような方法で修飾される。本発明の抗体は、ビオチン化、酵素への結合、または抗体の検出を可能にする他の種類の部分の結合を介して修飾されてもよい。
【０１４１】
たとえば、一実施形態では、抗体またはその断片は診断剤に結合される。抗体を診断上用いて、特定の細胞、組織、血漿、血液もしくは血清にて対象とする標的の発現を検出することができ；または臨床検査法の一部として免疫応答の発生または進行をモニターし、たとえば、所与の治療計画の有効性を判定することもできる。抗体を検出可能な物質にカップリングすることによって検出を円滑にすることができる。検出可能な物質の例は当該技術で既知であり、それには、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射性物質、種々のポジトロン放出断層撮影を用いたポジトロンを放出する金属、及び非放射性常磁性金属イオンが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能な物質を直接抗体（またはその断片）に、または当該技術で既知の技法を用いて中間体（たとえば、当該技術で既知のリンカー）を介して間接的に抗体（またはその断片）にカップリングしてもよいし、または結合してもよい。一部の実施形態では、標識は間接的に抗体に結合される（たとえば、ビオチン／アビジン結合）。一実施形態では、検出には免疫アッセイ（たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイまたは放射性免疫アッセイ）が使用される。本発明の抗体は、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の検出アッセイにて使用されてもよい。一実施形態では、Ｎｏｄａｌの検出は、ＳＰＲ、バイオ−レイヤー干渉分光法（ＢＬＩ）、長期グレーティング（ＬＰＧ）で使用されるもののような好適なバイオチップの表面または生体表面に不動化された本発明の抗Ｎｏｄａｌ抗体を採用する標識を含まない技法を用いても達成することができる。
【０１４２】
別の実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体の検出は抗Ｎｏｄａｌ抗体を検出する抗体（たとえば、二次抗体）の使用を介する。たとえば、Ｎｏｄａｌに特異的に結合する抗体及びその誘導体及び類似体を診断目的で用いて、Ｎｏｄａｌの異常な発現、過剰発現及び／または活性に関連する疾患、障害及び／または状態を検出し、診断し、またはモニターすることができる。一実施形態では、本発明は、本発明の１以上のＮｏｄａｌ特異的な抗体を用いて対象または患者（たとえば、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象または患者）に由来する生体試料におけるＮｏｄａｌの発現及び／または活性を特徴付けることと、発現のレベルを標準（たとえば、癌ではない対照）の発現レベルと比較することとを含むＮｏｄａｌの検出（たとえば、Ｎｏｄａｌの過剰発現または異常発現）を提供し、それによって標準の発現レベルに比べたＮｏｄａｌの発現及び／または活性の増加または低下が異常な発現及び／または活性を示す。
【０１４３】
抗Ｎｏｄａｌ抗体を用いて試料におけるＮｏｄａｌを検出することができる。検出することは、試料を抗Ｎｏｄａｌ抗体と接触させることと、試料に結合する抗体の量を測定することとを含んでもよい。免疫組織化学法については、試料は新鮮であってもよいし、もしくは凍結されてもよく、またはパラフィンに包埋されてもよく、たとえば、ホルマリンのような保存剤で固定されてもよい。酵素標識、放射性同位元素、発光標識、蛍光標識、ローダミン及びビオチンを含むが、これらに限定されない当該技術で既知の種々の標識が本明細書に記載されている検出方法で使用されてもよい。標識を含まないＮｏｄａｌの検出については、検出は、バイオセンサーまたは生体表面を本発明の不動化された抗Ｎｏｄａｌ抗体と接触させることと、特定のバイオセンサーまたは生体表面に好適な装置を用いて遊離のタンパク質の量を測定することとを含んでもよい。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明は、１以上の本発明の抗体を用いて対象／患者の生体試料におけるＮｏｄａｌの発現を特徴付けることと、Ｎｏｄａｌ発現のレベルを標準のタンパク質発現のレベルと比較することとを含む、疾患または障害を診断するための診断アッセイを提供し、それによって標準の発現レベルに比べたアッセイされた発現レベルの増加または低下が特定の疾患または障害を示す。別の実施形態では、生体試料または調製された生体試料にてＮｏｄａｌを検出する方法は、本発明の抗体を試料に接触させることと、試料にてＮｏｄａｌに結合した抗Ｎｏｄａｌ抗体を観察することまたは試料にてＮｏｄａｌに結合した抗Ｎｏｄａｌ抗体の量を測定することとを含む。本発明はまた、対象に本発明の抗体を投与することと、対象にてＮｏｄａｌに結合した抗Ｎｏｄａｌ抗体の量及び／または位置を観察すること及び／または決定することとを含む、対象にてＮｏｄａｌを検出する方法も提供する。従って、本発明は、Ｎｏｄａｌに関連する疾患または障害（たとえば、対象におけるＮｏｄａｌの異常発現及び／または過剰発現に関連する疾患または障害）のための検出及び／または診断の組成物及び方法を提供する。
【０１４５】
たとえば、一実施形態では、Ｎｏｄａｌを結合するのに有効な量の抗Ｎｏｄａｌ抗体を対象／患者（たとえば、癌を有するまたは癌を有することが疑われる対象）に投与することと、Ｎｏｄａｌを発現している対象の中での部位を抗Ｎｏｄａｌ抗体が結合できるのに十分な特定の時間（たとえば、分、時間、日）の後、投与に続いて対象をモニターすることとを含む、対象を特徴付けるまたは診断する方法が提供される。一実施形態では、時間は未結合のＮｏｄａｌが対象から一掃されるのを可能にする（たとえば、バックグランドのシグナルを減らす及び／または排除するように）。別の実施形態では、抗Ｎｏｄａｌ抗体は標識される。さらなる実施形態では、バックグランドの抗Ｎｏｄａｌ抗体のレベルが決定される。好まれる実施形態では、対象にておけるバックグランドのレベルを上回る標識された抗Ｎｏｄａｌ抗体を検出することがＮｏｄａｌ関連の障害または疾患を持つ対象／患者を示す。当該技術はバックグランドのレベルを決定する種々の方法を周知している。さらなる実施形態では、本明細書に記載されている方法を用いたＮｏｄａｌの検出は、後の日付で検出されたＮｏｄａｌのレベルが前の日付で検出されたＮｏｄａｌのレベルと比較できるように（たとえば、疾患／障害の進行及び／または治療への応答に関する情報を提供するように）時間間隔（たとえば、１、２、３、６、９、１２ヵ月）ごとに繰り返される。
【０１４６】
一実施形態では、本発明の抗体はキット（たとえば、Ｎｏｄａｌの検出のための（たとえば、生体内または試験管内の診断用途のための）で提供される。本明細書に記載されている情報に加えて、当該技術は、キットが試料におけるＮｏｄａｌの検出に有用な種々の他の試薬を含んでもよいことを周知している。
【実施例】
【０１４７】
本発明の特定の好まれる実施形態及び態様を明らかにし、さらに説明するために以下の実施例が提供されるが、それらは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１４８】
実施例１
Ｃｒｉｐｔｏ−１が介在するＮｏｄａｌのシグナル伝達を阻害する及び／または中和することができるＮｏｄａｌ特異的な抗体の生成について相互作用を標的とすることができるかどうかを判定するためにＮｏｄａｌとＣｒｉｐｔｏ−１との間の相互作用の接点を検討した。Ｃｒｉｐｔｏ−１及びＮｏｄａｌの種々の領域、ならびにその間での相互作用を図１にて示す。図１から分かるように、Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ及びへリックス３の領域はＣｒｉｐｔｏ−１のＮｏｄａｌ認識に含まれる。アミノ酸Ｅ４９及びＥ５０はＣｒｉｐｔｏ−１のＥＧＦ様ドメインへの結合に重要な残基である（たとえば、Ｃａｌｖａｎｅｓｅ，Ｌ．ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２０１０）。
【０１４９】
抗Ｎｏｄａｌ抗体を生成する試みで種々のＮｏｄａｌ免疫原を利用した。特に、Ｎｏｄａｌペプチド免疫原が生成され、それを使ってマウスを免疫する戦略を開発した。次いで生成された抗体をスクリーニングして、免疫原として使用したペプチド及び完全長の野生型Ｎｏｄａｌに特異性を持って結合するが、変異体のＮｏｄａｌタンパク質断片には特異性をもって結合しない抗体を特定した。
【０１５０】
ＮｏｄａｌのＣｒｉｐｔｏ−１のＥＧＦ様ドメインとの相互作用に関与する残基を含有するヒトＮｏｄａｌペプチド（４３〜６９）を作り出した（図２を参照）。以下の合成免疫原を使用して、抗Ｎｏｄａｌ抗体を生成するためにマウスを免疫した。
ａ）ｈＮＯＤＡＬ（４４−６９）野生型    
Ａｃ−ＰＮＰＶＧＥＥＦＨＰＴＮＨＡＹＩＱＳＬＬＫＲＹＱＰＨ−ＮＨ２（配列番号１３）
【０１５１】
アセチル化及びアミド化双方の誘導体またはアミド化のみの誘導体としてＮｏｄａｌペプチド（４４〜６９）及び変異させた変異体Ｎｏｄａｌ（４４〜６９）Ｅ４９Ａ〜Ｅ５０Ａを合成した。Ｎ末端を介してアミド化のみの誘導体をＫＬＨに結合することによって免疫原を調製し、それを用いてＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。以下で報告されるペプチド［ａ］及び［ｂ］
【０１５２】
中和抗体を特定し、性状分析するために、ＥＬＩＳＡに基づくスクリーニングアッセイに
ａ）ｈＮＯＤＡＬ（４４−６９）野生型    
Ａｃ−ＰＮＰＶＧＥＥＦＨＰＴＮＨＡＹＩＱＳＬＬＫＲＹＱＰＨ−ＮＨ２（配列番号１３）
ｂ）ｈＮＯＤＡＬ（４４−６９）Ｅ４９Ａ〜Ｅ５０Ａ
Ａｃ−ＰＮＰＶＧＡＡＦＨＰＴＮＨＡＹＩＱＳＬＬＫＲＹＱＰＨ−ＮＨ２（配列番号１４）
を使用し、以下に記載されているように実施した。
【０１５３】
免疫の後、複数のクローンの上清を回収し、野生型及び変異させたペプチド［ａ］及び［ｂ］の双方を不動化することによるＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。図３は、Ｎｏｄａｌのプレヘリックスループ領域のＥ４９Ｅ５０残基を選択的に認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を分泌するものを特定するＥＬＩＳＡによって比較してスクリーニングしたハイブリドーマのクローンを示す。さらなる検討のために野生型ペプチドを選択的に認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を選択した。
【０１５４】
完全長のＮｏｄａｌを結合するｍＡｂを特定するために野生型のヒトＮｏｄａｌ（Ｅ４９Ｅ５０）を選択的に認識する抗体（ｍＡｂ）をさらにスクリーニングした。表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー直接結合アッセイを用いた。組換えヒトＮｏｄａｌタンパク質（ｒｈＮｏｄａｌ，Ｅ．ｃｏｌｉに由来するＮ末端Ｍｅｔを伴うＨｉｓ２３８Ｌｅｕ３４７，受入＃Ｑ９６Ｓ４２，カタログ番号３２１８ＮＤ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）をＣＭ５センサーチップ上に不動化した。生成された種々の抗体すべてのうちで、抗体クローンのたった２つ：３Ｄ１及び５Ｆ１０だけが完全長タンパク質を結合することができた（図４を参照）。完全長のヒトＮｏｄａｌを結合することができる抗体のうちで、クローン３Ｄ１だけが野生型Ｎｏｄａｌペプチドに対する選択性を示した（図３を参照）。
【０１５５】
図５は抗体３Ｄ１及び抗体５Ｆ１０についてＮｏｄａｌに対するＳＰＲ用量依存性の結合アッセイを示す。
【０１５６】
ＣＭ５センサーチップ上にｈＮｏｄａｌを不動化し、示した濃度で３Ｄ１を注入してデータが生成された。３Ｄ１は高親和性でｈＮｏｄａｌに結合する。ＫＤは約１．３ｎＭだった。
【０１５７】
ＣＭ５センサーチップ上にｈＮｏｄａｌを不動化し、示した濃度で５Ｆ１０を注入してデータが生成されている。５Ｆ１０は３Ｄ１よりも弱くｈＮｏｄａｌに結合する。ＫＤは約６４ｎＭだった。
【０１５８】
ＣＭ５センサーチップ上に不動化された３Ｄ１抗体へのヒト組換えＮｏｄａｌの用量依存性の結合を特徴付けた。推定ＫＤは６．６ｎＭだった（図６を参照）。
【０１５９】
次に、ＮｏｄａｌとＣｒｉｐｔｏ−１との間の結合を阻害する３Ｄ１抗体の能力を評価するためにＳＰＲ実験を介して実験を行った。実験は不動化したＣｒｉｐｔｏ−１を伴ったＣＭ５センサーチップ上で実施した。図７にて示すように、ＮｏｄａｌとＣｒｉｐｔｏ−１との間の相互作用を評価し、約４ｎＭ（測定された２つのＫＤの平均）のＫＤを有すると判定された。
【０１６０】
図８にて示すように、３Ｄ１は不動化されたＮｏｄａｌへの可溶性Ｃｒｉｐｔｏ−１の結合を妨げる。漸増量の３Ｄ１を５ｎＭのＮｏｄａｌと共にインキュベートし、Ｃｒｉｐｔｏ−１で誘導体化したチップ上に注入し、それは結果的にＣｒｉｐｔｏ−１とＮｏｄａｌの間の結合の低下を生じた。１：１のモル比での抗体はｈＮｏｄａｌのｈＣｒｉｐｔｏ−１への結合を７０％阻んだ。従って、本発明は、一実施形態にて３Ｄ１を用いてＣｒｉｐｔｏ−１とＮｏｄａｌの間の結合を阻むことができることを提供する（たとえば、本明細書に記載されている治療上の用途のために（たとえば、Ｃｒｉｐｔｏ−１が介在するＮｏｄａｌのシグナル伝達を阻害する及び／または中和するために）。
【０１６１】
Ｎｏｄａｌ合成ペプチドのセットを用いたエピトープマッピングによって３Ｄ１とＮｏｄａｌの結合に内在する残基を調べた（図９を参照）。図９Ａは３Ｄ１の認識に関与する残基をマッピングするために使用された合成ペプチドのセットを示す。図９Ｂは図９Ａで報告したペプチドの３Ｄ１への結合を示す。ペプチドを１μｇ／ｍＬで不動化し、５μｇ／ｍＬの３Ｄ１で探索した。データは、ペプチドｈＮｏｄａｌ（４４〜６９）野生型（ＷＴ）の結合に対して基準化した。図９Ｃは不動化したｈＮｏｄａｌ（４４〜６９）ＷＴ及びＥ４９Ａ−Ｅ５０Ａ二重変異させた変異体への３Ｄ１の用量依存性結合を示す。データは３Ｄ１が４３〜５６の領域を包含する残基と相互作用することを示している。ほとんどの相互作用はＣ４３、Ｐ４６、Ｖ４７、Ｅ４９、Ｅ５０によって立証された。Ｙ５８の効果はペプチドの立体構造上にあり得る。
【０１６２】
３Ｄ１を用いて種々の免疫アッセイを行った。図１０は以下を示す。
（ａ）ドットブロット：５０〜２００ｎｇの間での漸増濃度にてニトロセルロース膜上でスポットを作ったｈＮｏｄａｌタンパク質。
（ｂ）（ａ）で示したドットブロットの定量。
（ｃ）ウエスタンブロット解析：還元条件下でのＮｏｄａｌタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷している。ＧＡＭ−ＨＲＰ抗体及びＥＣＬ基質を検出に用いた。
【０１６３】
セファロースＳ２００カラムによる３Ｄ１のサイズ排除解析を図１１に示す。ＩｇＧについて予想される溶出容積にて１本の単一ピークが観察される。凝集体の存在は観察されなかった。
【０１６４】
３Ｄ１の重鎖と軽鎖の核酸配列を決定した。相補性決定領域（ＣＤＲまたはＡＢＲ、抗原結合領域）を含有する双方の鎖の可変領域を増幅するプライマーを用いて重鎖と軽鎖の３Ｄ１配列を配列決定した。
【０１６５】
抗体軽鎖について１本の確かな配列が得られたのに対して、異なるプライマーにより重鎖ＣＤＲを増幅することによって２つの独立した重鎖が得られた。プライマーｎ°１０によって得られた重鎖は、ＣＤＲ３ｍＲＮＡの３’末端に位置する余分な塩基のために非機能的なタンパク質をコードしている可能性がある。組換え過程の間に生じているこの余分な塩基はＲＮＡの読み取りフレームを変更し、多分下流の未成熟停止コドンを生じる。実際、この配列では、ＣＤＲ１とＣＤＲ２と、ＣＤＲ３のＮ末端とを検出することが可能だったが、ＣＤＲ３のＣ末端及びＦＲＡＭＥ４のＮ末端を検出することは可能ではなかった。
【０１６６】
３Ｄ１の配列は以下のとおりである。
＞Ｌｉｇｈｔ＿Ｃｈａｉｎ＿Ａ＿３Ｄ１＿ＣＨＡＩＮ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ（軽鎖）ＤＩＫＭＴＱＳＰＡＳＬＳＡＳＶＧＥＴＶＴＩＴＣＲＡＳＧＮＩＨＮＹＬＡＷＹＱＱＫＱＧＫＳＰＱＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＤＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＱＹＳＬＫＩＮＳＬＱＰＥＤＦＧＳＹＹＣＱＨＦＷＳＴＰＨＶＲＣＷＤＱＡＧＴＥＴＥＡＷ（配列番号１）
ＡＢＲ１（ＣＤＲＬ１）：ＧＮＩＨＮＹＬＡ（２７〜３４）（配列番号４）
ＡＢＲ２（ＣＤＲＬ２）：ＬＬＶＹＮＡＫＴＬＡＤ（４６〜５６）（配列番号５）
ＡＢＲ３（ＣＤＲＬ３）：ＱＨＦＷＳＴＰＨＶＲＣＷＤＱＡ（８９〜１０３）（配列番号６）
＞Ｈｅａｖｙ＿Ｃｈａｉｎ＿Ｂ＿３Ｄ１＿ＣＨＡＩＮ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ（重鎖）ＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＴＰＥＫＲＬＥＷＶＡＳＩＳＳＧＧＣＴＹＹＰＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＮＩＬＹＬＱＭＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＳＭＩＴＡＤＧＮＳＬＬＬＣＹＧＬＬＧＳＲＮＬＸＨＲ（配列番号２）
ＡＢＲ１（ＣＤＲＨ１）：ＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（２６〜３４）（配列番号７）
ＡＢＲ２（ＣＤＲＨ２）：ＷＶＡＳＩＳＳＧＧＣＴＹＹ（４６〜５８）（配列番号８）
ＡＢＲ３（ＣＤＲＨ３）：ＡＲＧＳＭＩＴＡＤＧＮ（９５〜１０５）（配列番号９）
＞Ｈｅａｖｙ＿Ｃｈａｉｎ＿Ｃ＿３Ｄ１＿ＣＨＡＩＮ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ（重鎖）ＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＭＫＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＲＮＹＷＭＳＷＶＲＱＳＰＥＫＧＬＥＷＶＡＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＡＲＹＡＥＳＶＫＧＫＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＲＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＧＩＹＹＣＴＧＩＲＲＦＡＹＷＧＱＧＴＬ（配列番号：３）
ＡＢＲ１（ＣＤＲＨ１）：ＦＴＦＲＮＹＷＭＳ（２６〜３４）（配列番号１０）
ＡＢＲ２（ＣＤＲＨ２）：ＷＶＡＥＩＲＬＫＳＤＮＹＡＡＲＹ（４６〜６１）（配列番号１１）
ＡＢＲ３（ＣＤＲＨ３）：ＧＩＲＲＦＡＹ（９９〜１０５）（配列番号１２）
【０１６７】
幹細胞特性を持つ腫瘍細胞にてＮｏｄａｌのシグナル伝達を標的として進行性の癌を抑制すること。
【０１６８】
Ｎｏｄａｌのシグナル伝達経路（図１２を参照）は、癌幹細胞の表現型；上方調節された腫瘍の増殖及び転移；薬剤耐性の獲得；及びＮｏｔｃｈ４幹細胞シグナル伝達との分子クロストークを含む異常な細胞増殖の複数の態様の根底にある。従来、Ｎｏｄａｌは分泌されるタンパク質であり、Ｎｏｄａｌを発現している腫瘍細胞を単離し、定量することは難題であるとされているので、Ｎｏｄａｌを研究するのは困難であった。
【０１６９】
正常な成人組織は一般にＮｏｄａｌ及びＮｏｔｃｈ４を発現しない。Ｎｏｄａｌは初期発生にて重要な胚性形態形成因子であり、進行性の腫瘍細胞にて再発現される。Ｎｏｄａｌは、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーに属する胚性増殖因子である。ＮｏｄａｌはＣｒｉｐｔｏ−１／Ａｌｋ４／７／ＡｃｔＲＩＩＢ受容体複合体への結合を介してシグナル伝達する。ＮｏｄａｌはｈＥＳＣの多能性を維持し、軸形成及びＬ−Ｒのパターン形成に関与する。これもＴＧＦ−ベータスーパーファミリーのメンバーであるＬｅｆｔｙはＮｏｄａｌの天然の阻害剤である。Ｎｏｄａｌはそれ自体の発現を誘導することができる。ヒトでは、Ｎｏｄａｌの発現は胚性組織に大きく制約され、正常な成人組織では失われる。Ｎｏｄａｌは進行性の腫瘍細胞で再活性化される一方で、Ｌｅｆｔｙは発現停止される。発生において見られるように、Ｎｏｔｃｈの発現は腫瘍細胞にてＮｏｄａｌを上方調節することができる。
【０１７０】
正常なヒト組織溶解物にてＮｏｄａｌの発現を調べた（図１４を参照；図５６も参照）。ＡＢＣＡＭから購入したＷＢ等級の正常ヒト組織溶解物と共にＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（Ｈ−１１０；１：１０００）のポリクローナル抗Ｎｏｄａｌ抗体を用いた。３０μｇの総タンパク質を各試料について負荷した。膜をウサギ抗Ｎｏｄａｌと共に室温で１時間インキュベートした。Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ試薬によってバンドを検出した。最初のレーンにおける陽性対照としてＨ９ｈＥＳＣの溶解物を使用した。
【０１７１】
図１５で示すように、Ｎｏｄａｌは貴重な予後生体マーカーである：患者組織における免疫組織化学分析（赤／茶染色）。Ｎｏｄａｌはまた形成異常母斑、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、白血病、卵巣癌、膀胱癌、及び結腸癌でも検出される。Ｎｏｄａｌタンパク質はｈＥＳＣ及び転移性腫瘍細胞によって高度に発現されるのが観察されており；Ｌｅｆｔｙ（Ｎｏｄａｌの阻害剤）は腫瘍細胞によって発現されない（図１６を参照）。
Ｍｅｌ−２：ヒト胚性幹細胞株；Ｈ１：ヒト胚性幹細胞株；Ｈ９：ヒト胚性幹細胞株；Ｃ８１６１：進行性ヒト黒色腫細胞株；メラニン細胞：正常ヒト色素性細胞株；ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：進行性ヒト乳癌細胞株；Ｈｓ５７８  Ｂｓｔ：正常ヒト乳腺細胞株；ＨＭＥｐＣ：正常ヒト乳腺上皮細胞株。
【０１７２】
ｈＥＳＣと対比してＣ８１６１のＮｏｄａｌ遺伝子には点突然変異は見いだされていない。
【０１７３】
Ｃ８１６１細胞ではＬｅｆｔｙはメチル化され、発現停止される。
【０１７４】
Ｎｏｄａｌのシグナル伝達は腫瘍細胞では上方調節される（ＰＮＡＳ、２００８）（図１７を参照）。
【０１７５】
図１８はＮｏｄａｌの発現を直接調節するＮｏｔｃｈ４のシグナル伝達を示す。Ｃ８１６１及びＭＶ３の黒色腫細胞におけるＮｏｔｃｈ発現のノックダウン（ｓｉＲＮＡによる）はＮｏｄａｌの下方調節を生じる。Ｎｏｄａｌ陰性で非進行性のＵＡＣＣ１２７３黒色腫細胞におけるＮｏｔｃｈ４の実験的上方調節はＮｏｄａｌの上方調節を生じる（図１９を参照）。
【０１７６】
Ｎｏｄａｌエンハンサ要素（ＮＤＥ）はＮｏｄａｌ遺伝子の１０ｋｂ上流に位置し、Ｎｏｔｃｈについての２つの推定上のＲＢＰＪ結合部位を含有する。ＣｈＩＰはＮＤＥにおいてＲＢＰＪ−１結合部位に直接結合するＮｏｔｃｈ４ＩＣＤを確認している（図２０を参照）。
【０１７７】
図２１は、非進行性でＮｏｄａｌ陰性のＣ８１−６１黒色腫細胞がＮｏｄａｌのｃＤＮＡで形質移入された後、腫瘍形成性であることを示す。
【０１７８】
Ｎｏｄａｌを検出するために開発されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（検出限界５０ｐｇ／ウェル）用いて典型的な較正曲線を得た（図２２を参照）。アッセイは、様々な濃度のｒＮｏｄａｌ（組換えＮｏｄａｌ）を伴った溶液からｒＮｏｄａｌを捕捉するためにＥＬＩＳＡディッシュに被覆するための抗Ｎｏｄａｌ抗体（３Ｄ１と名付けられた）と、捕捉されたｒＮｏｄａｌを検出するための二次ウサギモノクローナル抗Ｎｏｄａｌ抗体とを使用した。次いで、西洋ワサビのペルオキシダーゼに結合した抗ウサギ抗体とＱｕａｎｔａＲｅｄ増強化学蛍光西洋ワサビペルオキシダーゼの基質とによって、得られた捕捉されたｒＮｏｄａｌ／抗体複合体を検出した。
【０１７９】
血漿／血清試料にてＮｏｄａｌの検出のために、本発明の３Ｄ１抗体を利用する特異的で感度の高いアッセイをｘＭＡＰ技術に基づいて開発したが、それを図２３にて示す。
【０１８０】
Ｎｏｄａｌ活性を阻害する３Ｄ１抗体の能力を評価し、特徴付けるために実験を実施した。３Ｄ１は転移性黒色腫細胞にてＮｏｄａｌの発現、クローン形成性及び血管擬態を低下させた（図２４を参照）。Ｃ８１６１黒色腫細胞をＩｇＧ対照（陰性対照）または４μｇ／ｍＬのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＳＣ）（陽性対照として用いた）または３Ｄ１機能阻止抗Ｎｏｄａｌ抗体で７２時間処理した。ウエスタンブロット解析はＮｏｄａｌタンパク質の発現の５４％（ＳＣ）及び５０％（３Ｄ１）の阻害を明らかにしている。
【０１８１】
未処理の細胞、またはＩｇＧ対照または３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体のいずれかで７２時間処理した細胞を軟寒天にて３週間培養した（軟寒天クローン形成アッセイ）。未処理の細胞及びＩｇＧ対照抗体で処理した細胞に比べて３Ｄ１で処理した細胞は非付着性の球状クラスターを形成する能力で低下を示した（クローン形成性の低下）。Ｃ８１６１細胞を４μｇ／ｍＬのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（ＳＣ）または３Ｄ１機能阻止抗Ｎｏｄａｌ抗体、またはＩｇＧ対照で処理し、三次元培養にて２４時間培養して血管擬態（ＶＭ）に関わるその能力を測定した。ＳＣまたは３Ｄ１抗体のいずれかで処理した細胞は対照細胞で見られるＶＭに特徴的であるネットワーク（＊）の形成を完成しなかった。
【０１８２】
３Ｄ１抗体がＳｍａｄ２またはＭＡＰＫのリン酸化を変えることができるかどうかを判定するために追加の試験を行った。３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体はＳｍａｄ２及びＭＡＰＫのリン酸化を低減した。未処理対照に対比して、３Ｄ１（４μｇ／ｍＬ）で１時間、２時間、４時間、６時間、または７２時間処理したＣ８１６１黒色腫細胞のウエスタンブロット解析（図２５を参照）。
【０１８３】
３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体はマウスにおける転移性黒色腫細胞の肺でのコロニー形成も低減した。肺の腫瘍組織量は、個々のマウス当たり少なくとも５枚の異なる肺切片から算出したＣ８１６１黒色腫細胞のコロニーが占める肺の平均比率として決定した（図２６を参照）。実験プロトコール：２５０，０００個のＣ８１６１黒色腫細胞をヌードマウスにｉ．ｖ．で注射し、肺のコロニー形成を樹立した。コロニー形成に続いて、次の１０日間にわたって２日に１回（合計５回の注射）、動物は３Ｄ１モノクローナル抗Ｎｏｄａｌ抗体（１００μｇ／注射）または対照ＩｇＧをｉ．ｐ．送達で受け取った。
【０１８４】
ヒト由来のＬｅｆｔｙ（ｈＬｅｆｔｙ）による処理を介した黒色腫腫瘍細胞におけるＮｏｄａｌの阻害がアポトーシスを誘導し、クローン形成性を低下させることは以前示されている。黒色腫腫瘍を持つ動物への５０ｎｇ／ｍｌのｈＬｅｆｔｙ（Ｎｏｄａｌの天然の阻害剤）の腫瘍内送達はアポトーシスを誘導し（赤色の蛍光腫瘍細胞を示すＴＵＮＥＬアッセイ）、ハンクス基礎塩溶液（ＨＢＳＳ、対照；Ｓｔｒｉｚｚｉら、２００９）を受け取っている腫瘍に対比してＮｏｄａｌ陽性腫瘍細胞における細胞増殖（Ｋｉ−６７茶色に染色するマーカー）を低下させる。生体内での黒色腫腫瘍へのｈＬｅｆｔｙ（５０ｎｇ／ｍｌ）の直接送達はＮｏｄａｌ陽性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する一方で；１０、５０及び１００ｎｇ／ｍｌでのｈＬｅｆｔｙによる試験管内での転移性黒色腫細胞の処理は軟寒天におけるＮｏｄａｌの発現を下方調節し、クローン形成性を低下させる。図２７は、ｈＬｅｆｔｙが１０、５０及び１００ｎｇ／ｍｌにて転移性黒色腫細胞におけるＮｏｄａｌタンパク質の発現を阻害することで有効であることを示す。図２８は、３週間のクローン形成アッセイ＋／−ｈＬｅｆｔｙは、ｈＬｅｆｔｙが転移性黒色腫細胞におけるクローン形成性を阻害することにおいて有効であることを実証することを示す。
【０１８５】
組み合わせ方法によって転移性黒色腫を標的とすることは単独療法よりも効果的である。デカルバジン（ＤＴＩＣ）は１９７０年代に転移性黒色腫についてＦＤＡが認可したものである。ほとんどの患者（８０＋％）で役に立たないにもかかわらず、それは今日未だに第一選択療法である。本発明の実施形態の開発の間に発生した作業仮説は、この作用剤は腫瘍細胞のＮｏｄａｌを発現している亜集団を標的としないのでＤＴＩＣ療法は無効であるということでだった。従って、ＤＴＩＣによって治療すること及びＮｏｄａｌを発現している細胞を標的とすることがＤＴＩＣ単独を超えて高い殺傷効果を有することになるのかどうかを調べた。
【０１８６】
ＤＴＩＣ治療がＮｏｄａｌを発現し続ける残留細胞集団を残すことが観察された（図２９Ａ及び２９Ｂを参照）。しかしながら、ＤＴＩＣと抗Ｎｏｄａｌ抗体による治療を組み合わせることが細胞死を誘導した（図３０を参照）。Ｃ８１６１転移性黒色腫細胞を処理せず、または５μｇ／ｍＬのＤＴＩＣで７２時間処理し、７２時間回復させ、次いで３μｇ／ｍＬのウサギＩｇＧと共にさらに７２時間インキュベートした、または未処理のままにした。対照に対比したパーセント細胞死における終点の変化（図３０）をフローサイトメトリーによって評価した（ｐ＜０．０５）。
【０１８７】
ＩｇＧ対照に対比したＤＴＩＣ処理の前とＤＴＩＣ処理の後の患者の黒色腫組織におけるＮｏｄａｌの局在確認の免疫組織化学を分析した（図３１を参照）。Ｎｏｄａｌ陽性の亜集団はＤＴＩＣ処理の前及び後に存在する。
【０１８８】
図３３３２に示すように、Ｎｏｄａｌのノックダウンはヒト乳癌細胞株にて増殖と進行性の挙動を損傷する。
【０１８９】
図３３に示すように、Ｎｏｄａｌのノックダウンは生体内での乳癌の増殖を損傷する。
【０１９０】
図３４は、Ｎｏｄａｌノックダウンの細胞がｐ２７の発現の上昇を伴ってＧ１で停止させられることを示す。
【０１９１】
図３５は、Ｎｏｄａｌのシグナル伝達がＣ−ｍｙｃの発現を調節することを示す。
【０１９２】
図３６は、Ｎｏｄａｌが乳癌細胞にてＥＲＫの活性化を介してｐ２７及びｃ−ｍｙｃのタンパク質レベル及び翻訳後修飾を調節することを示す。
【０１９３】
Ｎｏｄａｌのような幹細胞マーカーを発現している腫瘍細胞の亜集団を分離するためのＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳの使用を図３７にて示す。標的に結合しない場合、細胞は暗い。プローブは二本鎖オリゴに結合された金ナノ粒子を含有するが、その１つは金のコアへの近接によって消光される蛍光色素分子を含有する。標的（ｍＲＮＡ）はＮｏｄａｌであり、スクランブルオリゴの使用は対照として役立つ。標的が結合すると、フレアが出て、細胞は蛍光を発する。ナノ粒子がその標的に接触すると、それらはナノ粒子上の捕捉鎖に結合し、レポーター鎖を置き換える。今やレポーター鎖は消光されず、蛍光を発し、蛍光検出機構を用いて検出することができる。この方法はＦＡＣＳを用いた生細胞の選別に使用することができ；選別された腫瘍細胞を遺伝子発現についてＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質発現についてウエスタンブロットによって、軟寒天におけるクローン形成能について、及び生体内での腫瘍形成能について分析することができる。別の幹細胞マーカーであるＣＤ１３３と一緒にＮｏｄａｌのｍＲＮＡを画像解析するのに共焦点顕微鏡法を実施することができる。
【０１９４】
従って、単回のインキュベートと単一の試薬によって検出が一晩で現れ得る。細胞自体の機構を用いてＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥが細胞に侵入し、対象とするｍＲＮＡを検出し、細胞を出てさらなる実験を可能にする（図３８を参照）。
【０１９５】
ＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥを利用して転移性黒色腫細胞と同様に非進行性黒色腫細胞双方にてＮｏｄａｌの発現を測定した。
【０１９６】
図３９に示すように、進行性の転移性黒色腫細胞Ｃ８１６１（Ａ）、ＭＶ３（Ｂ）、ＳＫ−ＭＥＬ２８（Ｃ）及び非進行性の黒色腫細胞ＵＡＣＣ１２７３（Ｄ）を、ＮｏｄａｌのｍＲＮＡを検出するように調製された１００ｐＭのＣｙ３−標識したＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳによって培養にて１６時間処理し、次いで生細胞の画像解析用のＬＳＭ  ７００  ＸＬ  Ｓ１インキュベートシステムを備えたＺｅｉｓｓＬＳＭ７００共焦点顕微鏡を用いて生細胞の画像解析を行った。Ｃｙ３蛍光緑色シグナルとしてのＮｏｄａｌｍＲＮＡの検出は進行性黒色腫細胞（Ａ、Ｂ、Ｃ）で見られる一方で非進行性のＵＡＣＣ１２７３細胞（Ｄ）ではシグナルは見られない。陰性対照を表すＣｙ３標識したスクランブル配列ＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳはＣ８１６１細胞（Ｅ）にて緑色シグナルを示さない一方で、ＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳがＣ８１６１細胞（Ｃｙ５標識した、赤色蛍光）によって取り込まれることを示す陽性取り込み対照は、これら同じ細胞における赤色蛍光シグナル（Ｆ）によって及び赤色蛍光と微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）画像解析（Ｇ）によって示される（倍率はすべて＝４０×）。
【０１９７】
低いＮｏｄａｌの発現に対比した高いＮｏｄａｌの発現に基づいて黒色腫亜集団を選別することができる（図４０を参照）。Ｃ８１６１細胞をＮｏｄａｌのｍＲＮＡであるＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳによって１６時間処理し、次いでＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーターを用いてＮｏｄａｌ発現（高いＮｏｄａｌ）亜集団及びＮｏｄａｌ欠乏（低いＮｏｄａｌ）亜集団を表す高いまたは低い蛍光シグナルに基づいて亜集団に選別した。２つの亜集団におけるＮｏｄａｌｍＲＮＡの相対的な発現をリアルタイムポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイによって決定し（Ａ）、Ｎｏｄａｌタンパク質（プロ−Ｎｏｄａｌとして３９キロダルトンで検出される）の相対的な発現をウエスタンブロット解析（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓウサギモノクローナル抗Ｎｏｄａｌ抗体）によって決定した（Ｂ）。高いＮｏｄａｌと低いＮｏｄａｌで選別された細胞におけるプロ−Ｎｏｄａｌタンパク質の差異は、対照としてβ−アクチンタンパク質を用いて各レーンで負荷されたタンパク質について補正を行った後、未選別の細胞に比べて密度計で測定した。
【０１９８】
Ｎｏｄａｌを高く発現している黒色腫の亜集団は同時にＣＤ１３３癌幹細胞マーカーを発現する（図４１を参照）。ＮｏｄａｌのｍＲＮＡであるＳＭＡＲＴＦＬＡＲＥＳを用いて選別したＣ８１６１細胞のＮｏｄａｌが高い集団をガラスのカバーグラス上に置き、メタノールで固定し、透過化した。次いで細胞をＮｏｄａｌに対するウサギ一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；Ｈ−１１０）及びＣＤ１３３に対するマウス一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１７Ａ６．１）で処理し、その後、ウサギ抗体に対するアレクサ色素４８８を結合した二次抗体（緑色；Ｎｏｄａｌ）及びマウス抗体に対するアレクサ色素５９４を結合した二次抗体（赤色；ＣＤ１３３）で処理した。ＣＤ１３３の発現は高いＮｏｄａｌで選別した亜集団で濃縮されたと思われ（Ａ）、未選別の集団と対比したＮｏｄａｌが高い亜集団のＣＤ１３３タンパク質の発現に関するウエスタンブロット解析は未選別の亜集団に比べて高いＮｏｄａｌで選抜された亜集団でグリコシル化されたＣＤ１３３（１３０キロダルトン）の量の増加を示す（Ｂ；β−アクチンタンパク質を対照として用いてレーン当たりに負荷されたタンパク質の量を補正した）。
【０１９９】
実施例２
以前のドッキング試験及び結合試験に基づいて、Ｈ３−リストヘリックス及びプレへリックスループを含むヒトＮｏｄａｌの領域（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｑ９６Ｓ４２）をｈＮｏｄａｌ抗原として選択した(図４２）。内在性タンパク質（２３８〜３４７ａ．ａ．）の成熟形態を番号付けし、それに相当する１〜１１０残基を参照したｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチドは共受容体Ｃｒｉｐｔｏ−１への結合に関与し、相互作用を安定化する２つのグルタミン酸残基Ｅ４９及びＥ５０を含有する。これら２つのホットスポット残基を認識することができる抗Ｎｏｄａｌ抗体を選択するために、免疫及びハイブリドーマの生成の後、Ｅ４９及びＥ５０が２つのアラニンで置換されたｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａと名付けられた変異ペプチドを並行して用いて細胞上清をスクリーニングするスクリーニングの戦略を使用した。
【０２００】
Ｎ末端に遊離のアミノ基を持つ（ＫＬＨ及び免疫原調製物との結合用）、またはアセチル化及びアミド化されてタンパク質構造内でのペプチドをさらに良好に模倣するｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）及び変異させた変異体を合成した。
【０２０１】
エピトープを定義し、抗体による認識への特定の残基の寄与を調べるように、以下の表１を参照されたいｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）の一連の変異させた変異体を設計した。Ｎ末端での二重変異残基を持つｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）の変異体に含まれる１〜６（表１）のペプチド；さらに短いペプチド（表１、４から６までの項目）を用いてＮ末端領域におけるエピトープを確認した。表１の項目７〜９、Ｎｏｄａｌ（１〜３８）、Ｎｏｄａｌ（３９〜７５）及びＮｏｄａｌ（７６〜１１０）で報告されたペプチドを調製し、それらを用いてＮｏｄａｌの内部断片についての抗体の特異性を確認した。
【０２０２】
Ｎｏｄａｌの密接な構造ホモログである増殖分化因子（ＧＤＦファミリー）に属するヒトＧＤＦ５（Ｕｎｉｐｒｏｔ、Ｐ４３０２６）の領域４３３〜４４５、ヒトＧＤＦ６（Ｕｎｉｐｒｏｔ、Ｑ６ＫＦ１０）の領域３８６〜３９８及びヒトＧＤＦ７（Ｕｎｉｐｒｏｔ、Ｑ７Ｚ４Ｐ５）の領域３８２〜３９４を再現する表１におけるペプチド１０及び１１を調べてＴＧＦ−βファミリーリガンドの間での抗体の選択性を検証した。ＢＬＡＳＴサーバーを用いて実施したＴＧＦ−βリガンドすべてに対比したｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）の複数の配列比較に基づいて配列を選択した。
【表１】
0006574257.tif 000002
【０２０３】
ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）のＢＳＡを結合したペプチドを被覆しているＥＬＩＳＡによってハイブリドーマ上清のスクリーニングを行った。９つのクローンが陽性だった。並行してｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）とその変異させた変異体ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａとを用いて、予備選択したハイブリドーマ上清をスクリーニングした。結合していないペプチドを３３０ｎＭで被覆し、５.０μｇ／ｍＬ（３３ｎＭ）の総タンパク質濃度でハイブリドーマ上清を調べてアッセイを行った。９Ｂ９、３Ｄ１、１０Ｂ１２、５Ｆ１０、１Ｂ４、及び２Ｄ１２として示される６つのクローンに由来する上清は、程度は異なるものの不動化された抗原を認識した（図４３）。クローン９Ｆ１０、１Ｃ８及び８Ｅ３は非常に弱いシグナルを示したのでさらに検討しなかった。３Ｄ１が変異させた変異体よりもはるかに良好に野生型ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチドを認識したということは、共受容体であるＣｒｉｐｔｏ−１−１とのＮｏｄａｌの結合に決定的である２つのグルタミン酸残基を包含する領域の近傍で結合が起きることを示している。
【０２０４】
選択の後、精製したモノクローナル抗体の完全長組換えヒトＮｏｄａｌを結合する能力を評価した。ＳＰＲ直接結合によってスクリーニングを行った。ＭＡｂは当初１００ｎＭで調べ、この濃度では２つの抗体３Ｄ１及び５Ｆ１０しか完全長のｒｈＮｏｄａｌタンパク質を結合することができなかった（図４４）。親和性定数を推定するために、用量依存性の結合実験を行った。解析は、各試行の会合速度定数及び解離速度定数を決定する抗体の漸増用量を注入して実施した。３Ｄ１は１．４２ｎＭのＫＤ値で結合したのに対して５Ｆ１０はさらに弱い親和性（８３ｎＭ；表２）を特徴とした。３Ｄ１は速い会合速度定数（平均ｋａ＝６．９５×１０５Ｍ−１ｓ−１）及び遅い解離速度定数（平均ｋｄ＝６．５５×１０−４ｓ−１）を示し、タンパク質に対する高い結合親和性を生じた。５Ｆ１０は遅い会合速度定数（平均ｋａ＝１．９１×１０４Ｍ−１ｓ−１）及び速い解離速度定数（平均ｋｄ＝１．０８×１０−３ｓ−１）の結果のように低い親和性を示した。２つのｍＡｂの結合曲線は図４４ｂ、ｃにて報告されている。動態パラメータは表３ａ、ｂにて報告されている。
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【０２０５】
結晶化試験に有用な、またはＮｏｄａｌ検出のための追加の試薬としてさらに小さい抗体断片を作出する試みにて、酵素消化によって３Ｄ１に由来するＦａｂ断片を生じる実験を行った。３Ｄ１をＰＮＧアーゼＦによって脱グリコシル化し、２つの重鎖の各ＣＨ２ドメイン上のＡｓｎ２９７における単一のＮ結合グリカンを取り除いた。脱グリコシル化の後、抗体全体をペプシンで消化した。４時間のインキュベートの後、消化は完了した。ペプシンは他の断片を形成することなく、３Ｄ１を約１１０ｋＤａのＭＷを持つＦ（ａｂ’）２に変換した（図４５）。次に、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィとサイズ排除クロマトグラフィとを含む２工程精製手順によってＦ（ａｂ’）２断片を消化混合物から単離した（図４６ａ）。ＳＥＣクロマトグラフィのプロファイルは、凝集体の非存在及び高度に均質な生成物の存在を示し；さらにその溶出容量は予想分子量（約１１０ｋＤａ、図４６ｃ）に一致した。生成物の完全性及び純度は各工程の後、還元及び非還元の条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって確認した（図４６ｂ、ｄ）。Ｆａｂ’断片は、メルカプトエチルアミンを用いたＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合の選択的な還元によって得られた。非還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって示されるように還元は３時間後上手く達成された（図４７ａ）。さらなる解析を行うために、Ｆａｂ’をＩＡＭによってアルキル化し、次いでそれをサイズ排除クロマトグラフィによって精製し、その独自性を確認し、潜在的な凝集体の存在を評価した。１３．６５ｍＬで溶出された単一ピークによって示されるように（図４７ｂ）、凝集体は検出されなかった。軽鎖と重鎖を接続するジスルフィド架橋の選択的な還元の後、ＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳによっても３Ｄ１のＦａｂ’を特徴付けた。分離した鎖で行ったＬＣ−ＭＳ解析は（図４８ａ〜ｃ）、軽鎖についての単一の質量ピークと、不完全なＩＡＭの誘導体化を説明する重鎖についての４つの優勢なピーク（５７Ｄａの質量差）と、ヒンジ領域のレベルでの二重分割を示す。２つの主要ピーク間で見られる１８６Ｄａの質量差及びヒンジ領域内でのマウスＩｇＧ１の高度に保存された配列（図４８ｄ）は、ペプシンが矢印で示すようにＳ１１６Ｖ１１７残基の前と後だけの２つの切断を操作する（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ，Ｐ０１８６８）ことを示している。
【０２０６】
３Ｄ１Ｆ（ａｂ’）２／Ｆａｂ’断片のＳＰＲ競合結合解析
ＳＰＲにより実施される競合結合アッセイによってｒｈＮｏｄａｌタンパク質に結合するＦ（ａｂ’）２及びＦａｂ’断片の能力を評価した。３Ｄ１のＦ（ａｂ’）２及びＦａｂ’断片は類似の会合速度定数及び解離速度定数で、従って同じ親和性でも（ＫＤ＝１５ｎＭ、図４９ａ，ｂ）不動化されたｒｈＮｏｄａｌを結合した。このＫＤ値は、抗体全体によって示されるもの（ＫＤ＝１.４ｎＭ）に比べて１０倍高く、それによって親和性は１０倍低い（表３ｃ−ｄ）。
【０２０７】
エピトープマッピング
３Ｄ１抗体によって認識されるエピトープを細かく説明するために、ＥＬＩＳＡ及びＳＰＲの解析によって元々の抗原のマッピングを行った。この目的で、３Ｄ１及び機能的断片への結合についてＥＬＩＳＡ及びＳＰＲによってペプチド抗原及びその変異させた変異体（表１）を調べた。同じ濃度で異なるペプチドを被覆することによって行ったＥＬＩＳＡは、最強のシグナルが短い（４４〜５６）ペプチドで検出される（図５０ａ）のに対して弱いシグナルは変異させたＥ４９及びＥ５０を持つ変異体で得られることを示した。加えて、Ｐ４６及びＶ４７をアラニンに変異させた変異体と同様に他のＮ末端で切り詰めた短いペプチドでは結合は認められなかった。これらのデータは、Ｎ末端残基、特にＰ４６、Ｖ４７、Ｅ４９及びＥ５０に対する３Ｄ１の高い特異性を実証している。
【０２０８】
ペプチド（４４〜６７）及び（４４〜５６）でＳＰＲ用量反応結合アッセイを行ってＫＤ値を推定した（図５１ａ，ｂ、図５２ａ，ｂ、及び表４）。データは、領域（４４〜５６）が３Ｄ１ｍＡｂによって認識されるエピトープを含有し、４６〜５０の残基が結合に重要であることを裏付けている。特に、その領域はプレヘリックスループの中に入り、ＮｏｄａｌのＣｒｉｐｔｏ−１−１への結合に決定的な２つのグルタミン酸残基を包含する。データは、３Ｄ１が立体構造エピトープを認識するのではなく、むしろ線状エピトープを認識することを示している。
【表３】
0006574257.tif 000005
【０２０９】
特異性アッセイ
共受容体Ｃｒｉｐｔｏ−１−１との結合に関与するＮｏｄａｌ（４４〜５６）の領域についての３Ｄ１ｍＡｂの特異性をさらに評価するためにＥＬＩＳＡアッセイを行った。従って、新しいＮｏｄａｌペプチドを３Ｄ１への結合についてスクリーニングした。これらのペプチドは、ヒトＮｏｄａｌの成熟形態のタンパク質Ｎ末端部分を模倣するｈＮｏｄａｌ（１〜３８）（配列番号２７）；中央領域を模倣するｈＮｏｄａｌ（３９〜７５）（配列番号２８）；及びＣ末端部分を模倣するｈＮｏｄａｌ（７６〜１１０）（配列番号２９）であった。ＴＧＦ−βリガンドＧＤＦの領域を模倣する及びＮｏｄａｌの４４〜６７領域に一致する他のペプチド（ＧＤＦ５及びＧＤＦ６／７、表１）もこの目的で使用した。抗体を生成するのに使用した領域４４〜６７を含有するＮｏｄａｌのＮｏｄａｌ（３９〜７５）だけが類似の効率で結合したのに対して他のペプチドは本質的に不活性だった（図５０ｂ）。
【０２１０】
その抗原及び完全長のタンパク質への３Ｄ１の結合の特異性をさらに裏付けるために、ｈＮｏｄａｌ（４４〜５６）（配列番号２５）を用いてヒト胚性幹細胞にて発現される内在性のＮｏｄａｌの染色を阻止した。実験は、３Ｄ１単独で及びペプチドとの予備インキュベートの後、ブロットを探索することによって実施した。内在性のＮｏｄａｌの双方の形態は、ｍＡｂをペプチドと予備インキュベートした場合、もはや検出されなかった（図５３）ということは、３Ｄ１がネイティブのタンパク質上でも同じエピトープを認識することを示している。
【０２１１】
内在性のＮｏｄａｌタンパク質の検出
ウエスタンブロット解析を行ってヒト黒色腫細胞におけるＮｏｄａｌタンパク質の内在性の形態を認識するｍＡｂの能力を調べた。ヒト黒色腫細胞株のパネル及び陽性対照として使用した非黒色腫細胞であるＨＥＫ−２９３細胞において３Ｄ１は未成熟形態プロＮｏｄａｌ（およそ３７ｋＤａ）を染色することができた（図５４ａ）。およそ１３ｋＤａのＮｏｄａｌのさらに小さな成熟形態はほとんど検出されなかったということは、それが多分高度に不安定であるか、またはこの形態はほとんど分泌されていることを示している。黒色腫細胞株における内在性Ｎｏｄａｌを認識する３Ｄ１の能力はサイトメトリー解析によっても裏付けられた。ＦＡＣＳ解析（図５４ｂ〜ｄ）は、３Ｄ１が、非常に低い濃度（０．１μｇ／ｍＬ）で、且つ抗体濃度の上昇に伴うシグナル強度の上昇によって明らかにされたように用量依存性にインタクトな細胞でもネイティブのＮｏｄａｌタンパク質を結合することを示した。成熟Ｎｏｄａｌ及びプロＮｏｄａｌは双方ともウエスタンブロット解析にて３Ｄ１によって検出される（図５４ａ）。
【０２１２】
実施例３
以下に記載されるのは上記実施例２にて記載されている実験を行ったのに使用された材料及び方法である。
【０２１３】
ペプチドの合成、精製及び特定
野生型ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチド、その変異させた変異体、及びヒトＧＤＦペプチド５及び６／７は、自動ＳＹＲＯシステムを用いた標準のＦｍｏｃ化学反応に続いてＣ末端アミド化変異体として段階的な固相合成によって調製した。０．５７ミリモル／ｇの置換等級のリンク−アミドＭＢＨＡ樹脂及び標準の保護を伴ったアミノ酸誘導体を合成すべてにおいて使用した。それぞれカップリング反応ＨＡＴＵ／ＤＩＥＡ事前活性化及び５倍過剰のＦｍｏｃ保護アミノ酸を用いてペプチド合成の標準条件下でポリペプチドを作った。カップリング及び脱保護の時間はそれぞれ３０分及び２０分で保持した。Ｆｍｏｃ化学反応についての標準の側鎖保護基を残基すべてに使用した。Ｎ末端のアセチル化は、５％ＤＩＥＡを伴ったＤＭＦ中の０．５Ｍでの無水酢酸を用いた樹脂上で室温にて２０分間行った。固相支持体からのペプチドの切断は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／トリ−イソプロピルシラン（ＴＩＳ）／水（９０／５／５、ｖ／ｖ／ｖ）混合物で室温にて９０分間処理することによって行った。粗精製ペプチドを冷却ジエチルエーテルにて沈殿させ、水／アセトニトリル（１／１、ｖ／ｖ）混合物に溶解し、凍結乾燥した。凍結乾燥の後、０．１％ＴＦＡを含有するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ  ９５／５ｖ／ｖの溶液にペプチドを溶解した。次いで、半分取用１０×１ｃｍのＩＤ  Ｃ１８モノリスＯｎｙｘカラムを用い、１５ｍＬ／分の流速にてＣＨ３ＣＮ中０．０５％ＴＦＡの１０分間にわたる５％〜７０％の線形勾配を適用し、２１４ｎｍでの吸光度をモニターするＷＡＴＥＲＳのＰｒｅｐ１５０ＬＣ分取システムにおける逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってそれらを精製した。回収した分画を凍結乾燥した。ペプチドの純度及び独自性は液体クロマトグラフィ／質量分光分析（ＬＣ−ＭＳ）によって確認した；解析は、ＯＰＴＯＮＥＳＩ光源と完全な測量ＨＰＬＣシステムを備えたＬＣＱ  ＤＥＣＡ  ＸＰイオン捕捉質量分光計にて実施した。ペプチドを溶出するのに適用した典型的な勾配は以下の通りである：０．２ｍＬ／分の流速；５％溶媒Ｂ（ＡＣＮ、０．０５％ＴＦＡ）から６０％溶媒Ｂまでの１０分間の勾配。溶媒ＡはＨ２Ｏ、０．０８％ＴＦＡだった。ＢｉｏｂａｓｉｃＣ１８  ５０×２ｍｍのＩＤカラムを用いてＬＣ−ＭＳ解析の間、ペプチドを分離した。
【０２１４】
免疫原の調製
０．２％ｖ／ｖのグルタールアルデヒド（ストック溶液２５％）を含有する２０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２．０ｍＬにて室温で混合物を３時間撹拌することによって非アセチル化ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチドを３．０ｍｇのキャリアタンパク質（ＫＬＨ及びＢＳＡ）に結合させた。１．０Ｍのグリシン水溶液１．０ｍＬの添加によって反応をブロックし、次いで溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液に対して激しく透析し、その後凍結乾燥した。ペプチド／タンパク質の結合体の量はＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて決定した。
【０２１５】
抗体の生成
機関の指針に従ってＢＡＬＢ／ｃマウスを飼育し、取り扱った。完全フロイントアジュバントで乳化した１００μｇのＫＬＨ結合ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチド混合物を含有する３００μＬの懸濁液の皮下注射によって５週齢のメスＢＡＬＢａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を免疫した。免疫の前に２５０μＬの血液試料を各マウスの尾静脈から採取し、免疫前対照（Ｔ０試料）として使用した。１８日目と３０日目に不完全フロイントアジュバントにおける同じ量の免疫原でマウスを追加免疫した；後に続く免疫ごとにその前に血液試料（２５０μＬ）を尾静脈から採取し、ＥＬＩＳＡによって調べて抗体の力価をモニターした。最高の抗体力価を示すマウスに最後の抗原追加免疫を皮下で投与し、７日後、屠殺し、以下で記載されているように脾臓を取り出した。屠殺したマウスの脾臓から採取した細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１３００〜１６００と７．５％ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ−ＧＭにて５：１の比で骨髄腫ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ）細胞と融合させた。
【０２１６】
融合させたハイブリドーマ細胞を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、１００μＭのヒポキサンチン、１６μＭのチミジン及び４００ｎＭのアミノプテリン（ＲＰＭＩ−ＨＡＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリア）を含有するＲＰＭＩ−ＧＭ培地を含有する３０ｍＬの選抜培地に再浮遊させた。細胞浮遊液（２００μＬ）を９６穴プレートに分配し、５％ＣＯ２の雰囲気にて３７℃でインキュベートした。１２〜１４日目の間で、ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチドへの結合及びグルタミン酸４９及び５０が２つのアラニンで置換された変異させた変異体ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａへの結合についてＥＬＩＳＡによって上清をスクリーニングした。
【０２１７】
ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）ペプチドとの強い反応性を持つ（しかし、変異させた変異体とは反応しない）３Ｄ１と名付けたハイブリドーマクローンを限界希釈によって２回再クローニングし、その反応性をＥＬＩＳＡによって再確認した。サブクローニングしたハイブリドーマ細胞を１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−ＨＡＴで培養し、ゆっくり無血清培地に取り入れた。１０％ＦＢＳを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地。適応させた細胞をＯＰＴＩ−ＭＥＭ培地で培養し、次いで大規模な生産のためのバイオ反応器（Ｂｉｏ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移した。
【０２１８】
選抜されたクローンによって産生された抗Ｎｏｄａｌ抗体のアイソタイプは、製造元の指示書（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｒａｐｉｄマウス抗体アイソタイプキット，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従ってマウス抗体専用の市販のキットを用いることによって決定した。
【０２１９】
ＥＬＩＳＡ：マウス血清における抗体の滴定
マウス血清における抗体の力価を測定するために、９６穴ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ中１μｇ／ｍＬのＢＳＡ結合したｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）５０μＬで４℃にて一晩被覆した。次いで０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）でプレートを３回洗浄した。プレートの非特異的部位を５％ＢＳＡでブロックし、室温で１２０分間インキュベートした。次いでＰＢＳ−Ｔでウェルを３回洗浄し、１：１００から開始して１：１００，０００までの３倍連続希釈で血清（５０μＬ）をウェルに加えた。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、再びＰＢＳ−Ｔで洗浄した。次いで１：１０００希釈のＨＲＰ結合したウサギ抗マウスＩｇ（１．０ｍｇ／ｍＬ）５０μＬをウェルに加え、３７℃で１時間インキュベートを行った。洗浄の後、１００μＬの２,２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質溶液を各ウェルに加えた。１５分後、１％ＳＤＳ水溶液５０μＬを各ウェルに加えることによって反応を止めた。マイクロプレートリーダーによって４１５ｎｍにて光学密度（ＯＤ）を測定した。１：１０，０００の免疫血清の希釈と共にインキュベートした３つ組ウェルの平均吸光度が免疫前血清と共にインキュベートしたウェルで測定されたものの少なくとも３倍である場合、抗体力価は十分に高いと評価された。
【０２２０】
ＥＬＩＳＡ：ハイブリドーマ上清のスクリーニング
ハイブリドーマ上清のスクリーニングのために、ｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）及びｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）Ｅ４９Ａ−Ｅ５０ＡをＰＢＳで希釈した３３０ｎＭにてポリスチレン製円錐平底９６穴プレートに４℃で一晩被覆した（１００μＬ／ウェル）。インキュベートの後、被覆したウェルを、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ（３００μＬ／ウェル）と共に３７℃で１時間インキュベートすることによって非特異的な結合部位をブロックした。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＰＢＳで３３ｎＭに希釈したハイブリドーマの上清を３７℃で１時間インキュベートした（１００μＬ／ウェル）。インキュベートの後、プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、ＰＢＳで１：１０００に希釈したヤギ抗マウスＨＲＰ結合抗体（１ｍｇ／ｍＬ，ブロッティング等級アフィニティ精製したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））を二次抗体として加え（１００μＬ／ウェル）、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート及びＰＢＳ−Ｔによる３回の洗浄の後、０．１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．２）にてＨ２Ｏ２（０．４ｍｇ／ｍＬ）を含有する１００μＬ／ウェルの新鮮に調製したＯ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ（商標）ＯＰＤ  ｔａｂｌｅｔ  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えることによって、結合した抗体を検出した。５０μＬ／ウェルの２．５ＭのＨ２ＳＯ４と共に５分の後、ペルオキシダーゼ反応が停止され、マイクロプレートリーダーを用いて４９０ｎｍにて光学密度を測定した。６０ｎＭでのペプチドを被覆し、０．１〜６６ｎＭの間での濃度の３Ｄ１を用いることによって不動化したｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）及びｈＮｏｄａｌ（４４〜６７）Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａへの３Ｄ１の用量依存性の結合を行った。
【０２２１】
ＥＬＩＳＡ：エピトープマッピング及び特異性アッセイ
３Ｄ１ｍＡｂのエピトープマッピング及び特異性アッセイに使用したペプチドをＰＢＳで希釈して１．０μｇ／ｍＬで被覆した；ＰＢＳに溶解した３Ｄ１ｍＡｂは１．０μｇ／ｍＬで一次抗体として使用した。
【０２２２】
モノクローナル抗体及びＦ（ａｂ’）２／Ｆａｂ’断片の精製
抗体及びＦ（ａｂ’）２／Ｆａｂ’断片を標準の手順によって精製した。４℃で４０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離した後、モノクローナルＩｇＧを含有するハイブリドーマ細胞／培養上清を０．２２μｍのフィルターで濾過し、ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷した。AＫＴＡ  ＦＰＬＣ（商標）機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて０．６ｍＬ／分の流速で、２８０ｎｍでの吸光度をモニターして精製を行った。負荷緩衝液としてのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて未結合の物質を洗い流した後、溶出緩衝液として１００ｍＭのグリシンｐＨ２．７を用いてｐＨ条件を大幅に変えることによって結合した抗体を回収した。１／１０容量の２ＭのトリスｐＨ９．０を加えることによって、溶出した抗体を素早く中和した。精製したｍＡｂ及び関連する断片の安定性を確保するために、緩衝液をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に交換し、適当な遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｃｉｔｙＤａｒｍｓｔａｄｔ，ｓｔａｔｅ，ＵＳＡＧｅｒｍａｎｙ）を用いて濃縮した。Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを用いて濃度を推定した。濃縮したタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によって評価した。
【０２２３】
ランニング緩衝液としてＰＢＳｐＨ７．４を用い、０．５ｍＬ／分の一定流速で２５ｍＬの溶出容量にて２８０ｎｍでの吸光度をモニターしながら、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（商標）２００  ＨＲ１０／３００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ，ＵＳＡ）にてサイズ排除クロマトグラフィによる精製を行った。
【０２２４】
ＳＰＲ解析
ＣＭ５センサーチップ及び認定されたＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，０．１５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．４，Ｐ２０，０．００５％）を用いて、ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａｃｏｒｅ３０００機器にてＳＰＲ解析を行った。５μＬ／分で操作する、表面不動化ウイザード手順を用いた標準のアミンカップリング化学反応に続いてタンパク質の不動化を行った。チャンネルをＥＤＣ／ＮＨＳで７分間活性化し；精製したｍＡＢのＮｏｄａｌタンパク質への結合アッセイのために、予め選択した酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で適当に希釈したｒｈＮｏｄａｌを４０００ＲＵのレベルが達成されるまでカップリングさせた。センサーチップ表面上の残留する反応基を１．０Ｍの塩酸エタノールアミンｐＨ８．５で失活させた。ＨＢＳ−ＥＰにおける漸増濃度（６〜１００ｎＭ）での３Ｄ１（６０μＬ）の溶液を２０μＬ／分で注入して抗体結合を調べた。１０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いてチップ表面を再生した。
【０２２５】
単一用量のスクリーニングの後、完全長タンパク質を結合することができる２つの抗体３Ｄ１及び５Ｆ１０で用量依存性結合の解析を行った。６〜１００ｎＭの間の範囲の濃度で３Ｄ１の結合を行った。５Ｆ１０については、さらに高い濃度（１００、２５０、５００及び７５０ｎＭ）を必要とした。解離は少なくとも５００秒間モニターした。３Ｄ１のマッピングを行うために、抗体全体を１０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ５における５μｇ／ｍＬにて標準のアミンカップリング化学反応によって５μＬ／分の流速でＣＭ５センサーチップ上に不動化した。ｍＡｂで達した不動化のレベルは約５３５０ＲＵだった。同じセンサーチップの別のチャンネル上で、標準のアミンカップリング化学反応に続いて１０ｍＭのＮａＡｃ緩衝液ｐＨ４.５における１０μｇ／ｍＬにて５μＬ／分の流速で３Ｄ１のＦａｂ’を不動化した。不動化したＦａｂ’の量は約２５７０ＲＵだった。残留反応基を１Ｍの塩酸エタノールアミンｐＨ８．５で失活させた。すでに記載されているようにブランクのチャンネルを準備した。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液を用いて６０μＬの一定の試料容量を注入して２０μＬ／分の流速にてリアルタイムの結合解析を行った。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で適当に希釈したペプチドを以下の濃度：０．５、１、２．５、５、１０及び２０μＭで注入した。解離は少なくとも５００秒間モニターした；再生溶液は５ｍＭのＮａＯＨだった。
【０２２６】
各解析について、実験センサーグラムを並べ、ブランクのシグナルを差し引き、重ね合わせた。数学的操作及びフィッティングのすべてはＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアバージョン４．１を用いて実施した。実験データはすべて１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合相互作用を想定して処理した場合、最適のフィッティングを与えた。
【０２２７】
抗体の脱グリコシル化及びペプシン分解
ペプシンによる抗体の分割を改善して機能的な断片を入手するために、３Ｄ１を先ず、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ｃｉｔｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）によって供給されたペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）による脱グリコシル化反応に供した。最初の予備的な小規模の試みに続いて、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した１．５ｍｇのｍＡｂを１１単位のＰＮＧアーゼＦと共に３７℃でインキュベートすることによって規模の大きな脱グリコシル化反応を行った。最適な脱グリコシル化の時間は４８時間であると特定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニターされるペプシン分解反応は、１：２５のペプシン対抗体の最終ｗ／ｗ比を用い、３７℃の水槽で４時間混合物をインキュベートして２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０にて最適化された。
【０２２８】
Ｆａｂ’断片の調製
５ｍＭの２−メルカプトエチルアミンを用いてＦ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を選択的に還元することによってＦａｂ’断片を製作した。ＰＢＳｐＨ７．４におけるＦ（ａｂ’）２断片に２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．０を加えてｐＨを６．０に合わせ、２ｍＭのＥＤＴＡも加えた。混合物を３７℃で３時間インキュベートした。インキュベートの後、ＰＢＳを混合物に加えてｐＨを中性に合わせた。Ｆ（ａｂ’）２のＦａｂ’断片への還元は非還元条件下での１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによってチェックし、確認した。還元の後、Ｆａｂ’断片を室温にて暗所で２５ｍＭのＩＡＭ（ヨードアセトアミド）と共に３０分間インキュベートして反応性チオールをブロックした。
【０２２９】
３Ｄ１Ｆａｂ’のＬＣ−ＥＳＩ−ＴＯＦＭＳ解析
質量分光分析によって分析した試料を３７℃で１時間２０ｍＭのＤＴＴを用いて還元した。Ａｇｉｌｅｎｔ６２３０飛行時間型（ＴＯＦ）ＬＣ／ＭＳシステムに連結したＡｇｉｌｅｎｔ１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣシステムにて質量分光分析の解析を行った。二元溶媒ポンプ脱気装置、カラムヒーター、及び自動試料採取器と共に光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器及び６２３０飛行時間型ＭＳ検出器に液体クロマトグラフィＡｇｉｌｅｎｔ１２９０ＬＣモジュールを連結した。製造元の推奨に基づいて、ポンプを勾配二元溶媒系：溶媒Ａ、Ｈ２Ｏにおける０．０１％のＴＦＡ（ｖ／ｖ）及び溶媒Ｂ、ＣＨ３ＣＮにおける０．０１％ＴＦＡ（（ｖ／ｖ）に接続した。クロマトグラフィ解析は、１５分での２５％から６５％までの溶媒Ｂの線形勾配を適用するＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＡＥＲＩＳ  ＷＩＤＥＰＯＲＥ逆相Ｃ４  ３．６ｍｍ（５０×２．１ｍｍ）を用いて行った。２０℃で一定のヒーターと共にカラムの流速を０．２ｍＬ／分で保持した。ＵＶスペクトルは２００〜４００ｎｍの範囲でモニターした。注入容量は１μＬであり、針の洗浄が続いた。１００から３２００ｍ／ｚまでの質量走査と共に正のイオン走査モードで操作するように質量分析計Ａｇｉｌｅｎｔ６２３０ＴＯＦＭＳを設定した。イオン供給源は、改善された参照質量送達のために元々のＡｇｉｌｅｎｔＪｅｔＳＴｒｅａｍ（ＡＪＳ）供給源から二重噴霧器バージョンに等級を高めた。乾燥気体及びネブライザ気体として窒素を使用した。機器は、以下のパラメータ：乾燥気体温度、３２５℃；乾燥気体流量、１０Ｌ／分；ネブライザ、２０ｐｓｉ；シースガス温度、４００℃；シースガス流量、１１Ｌ／分；ＶＣａｐ．３．５００Ｖ；ノズル、０Ｖ；フラグメンター、２００Ｖ；スキマー、６５Ｖを用いてデータを獲得し、８極子ＲＦＶｐｐは７５０だった。機器の状態は拡張動的範囲モード（２ＧＨｚ）に設定した。試料が流れる前に調整及び較正を行った。データの回収及び統合はＭａｓｓＨｕｎｔｅｒワークステーションソフトウエア（バージョンＢ.０５．００）を用いて実施した。データは獲得の間に質量中心及びプロファイル双方の形式で保存した。参照ネブライザを介したＡｇｉｌｅｎｔＴＯＦの参照溶液の一定流量は、システムが２つの独立した参照ロック質量イオンであるプリン（ｍ／ｚ１１９．０３６３２）及びＨＰ−９２２（ｍ／ｚ９２２．０００７２５）を用いることによって質量のドリフトについて連続して補正し、質量の精度と再現性を保証するのを可能にした。ＡｇｉｌｅｎｔＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ定性ソフトウエアを用いた正確な質量走査データから標的化合物を検出し、報告した。
【０２３０】
３Ｄ１抗原ペプチドと内在性Ｎｏｄａｌタンパク質との間の競合
以前記載されたように得られたＨ９及びＨ１４ヒト胚性幹細胞の総タンパク質溶解物３０μｇを還元条件下で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにて分離し、分解されたタンパク質をＰＶＤＦ膜上に移した。５０ｎｇのｒｈＮｏｄａｌタンパク質を陽性対照として用いた。ウエスタンブロットの手順を実施した：膜をブロックし、次いでＴＢＳ−Ｔ中の２．５％ＮＦＤＭにおける４．０μｇ／ｍＬの３Ｄ１のみによって、及びその抗原であるｈＮｏｄａｌ（４４〜５６）ペプチド１０μｇ／ｍＬと共に予備インキュベートした４．０μｇ／ｍＬの３Ｄ１ｍＡｂによって探索した。ＧＡＭ−ＨＲＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）１：１０００（１．０μｇ／ｍＬ）によって検出を達成した。製造元の指示書に従って増強化学発光ウエスタンブロット基質（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）によってブロットをブロットを発色させ、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳビデオデンシトメータ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて捕捉した。
【０２３１】
黒色腫細胞における内在性のヒトＮｏｄａｌの検出
以下のヒト皮膚の悪性黒色腫細胞株：ＰＥＳ、Ａ−３７５、ＳＫ−ＭＥＬ、ＷＭ２６６及びＬＣＭを用いて内在性のＮｏｄａｌタンパク質の検出のためのウエスタンブロット解析を行った。ＨＥＫ−２９３（ヒト胚性腎臓）細胞及び１００ｎｇのｒｈＮｏｄａｌタンパク質を陽性対照として使用した。プロテアーゼ阻害剤のカクテル及びＰＭＳＦ（フェニル−フッ化メタンスルホニル）を添加した５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５，５００ｍＭのＮａＣｌ，１％のＮＰ−４０，１０ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，１ｍＭのＣａＣｌ２，１０％のグリセロールにて３回の凍結融解サイクルを行うことによって細胞を溶解した。細胞溶解物を１２，０００ｒｐｍで４℃にて２０分間遠心分離することによって透明にし、上清をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって定量した。各試料に由来する５０μｇの細胞溶解物を還元条件下で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに適用し、８０Ｖで３時間電気泳動した。分離したタンパク質を１００％のメタノールに５分間予め浸したポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移した。振盪のもとで室温にて１時間、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）における５％ミルク（ＮＦＤＭ）でブロットをブロックし；次に振盪のもとで４℃にて一晩、ＴＢＳ−Ｔ中の２．５％ＮＦＤＭにおける２μｇ／ｍＬの一次抗体としての３Ｄ１ｍＡｂによって膜を探索した。膜をＴＢＳ−Ｔで３回洗浄し、撹拌のもとで室温にて１時間、ＴＢＳ−Ｔ中の１：１０００に希釈した二次抗体としてのＧＡＭ−ＨＲＰと共にインキュベートした。製造元の指示書に従って、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社によって提供されたＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏキットによる増強化学発光基質法を用いて標的タンパク質を検出した。Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウエアを用いたＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳビデオデンシトメータによってシグナルを捕捉した。
【０２３２】
ＦＡＣＳ解析
ＬＣＰ、Ａ３７５及びＷＭ２６６の黒色腫細胞を遠心分離によって回収した。上清の吸引の後、細胞を５００μＬのＰＢＳに再浮遊させ、ホルムアルデヒドを加えて４％の最終濃度を得た。細胞を室温で１０分間固定した。固定の後、５００μＬのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０を加えることによって細胞を透過化した。１×１０６個の細胞を各バイアルに分配し；１ｍＬのＰＢＳ（インキュベート緩衝液）を各バイアルに加え、細胞を４０００ｒｐｍにて４℃で５分間の遠心分離によって洗浄した。以下の濃度：０．１、０．５、１．０及び２．０μｇ／ｍＬにてＰＢＳで希釈した３Ｄ１抗Ｎｏｄａｌ抗体（一次抗体）の１００μＬ溶液に細胞を再浮遊させた。標準のＩｇＧ１アイソタイプを陰性対照として使用した。振盪のもとで細胞を一次抗体と共に４℃で１時間インキュベートした。インキュベートの後、１ｍＬのＰＢＳにおける遠心分離によって細胞を洗浄し、再浮遊させ、振盪のもと暗所にて４℃で４０分間、ＰＢＳで１：１０００に希釈した（１．０μｇ／ｍＬ）ＦＩＴＣを結合した抗マウス抗体（二次抗体）と共にインキュベートした。１ｍＬのインキュベート緩衝液との遠心分離によって細胞を洗浄し、５００μＬのＰＢＳに再浮遊させ、フローサイトメータで解析した。ＢＤのＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒシステムを用いて蛍光を評価した。
【０２３３】
実施例４
種々のヒト組織におけるＮｏｄａｌの発現
本明細書での実施形態の開発の間に実験を行って、Ｎｏｄａｌの発現についてＷＢ解析によって一連の正常ヒト組織抽出物を調べた。Ｎｏｄａｌの堅実な発現を示すことが知られている、対照として使用したＨ９ヒト胚性幹細胞株（Ｈ９）の溶解物にて検出されたＮｏｄａｌと比べて、脳、腎臓、肝臓、膵臓または心臓といった主要な臓器では感知できるほどのＮｏｄａｌタンパク質の発現は観察されなかった（図５５）。しかしながら、Ｈ９及びＣ８１６１細胞溶解物で検出されたものに類似する分子量を持つが、かなり低い強度のバンドが調べた２つの骨格筋試料の１つに由来する溶解物にて観察された。
【０２３４】
抗ＮｏｄａｌｍＡｂの生成及び性状分析
抗ＮｏｄａｌｍＡｂの産生及び選択
３Ｄ１は抗原ｈＮｏｄａｌ［４４〜６７］を結合するのに対して、変異させたペプチド変異体であるｈＮｏｄａｌ［４４〜６７］Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａをあまり確実には認識しないということ（図５６ａ）は、それがＣｒｉｐｔｏ−１−１との結合に関与する２つのグルタミン酸残基と優先的に相互作用し、Ｎｏｄａｌ／Ｃｒｉｐｔｏ−１−１受容体複合体の相互作用についての中和活性を潜在的に有することを示している。
【０２３５】
抗ＮｏｄａｌｍＡｂのｒｈＮｏｄａｌへの結合
３Ｄ１のｒｈＮｏｄａｌを結合する能力は、Ｂｉａｃｏｒｅのセンサーチップ上にタンパク質を不動化し、漸増濃度で精製抗体を注入することによるＳＰＲによって評価した（図５７ｂ）。会合速度定数及び解離速度定数は熱力学的解離定数（ＫＤ）と一緒に各試行について決定し、平均した。３Ｄ１ｍＡｂとタンパク質との間の相互作用についてこの方法で１．４２ｎＭのＫＤ値が推定された。
【０２３６】
競合アッセイ
ｒｈＣｒｉｐｔｏ−１−１で誘導体化したＢｉａｃｏｒｅのセンサーチップを用いて競合アッセイを行った。ｒｈＣｒｉｐｔｏ−１−１とｒｈＮｏｄａｌとの間の結合は、漸増濃度でＮｏｄａｌタンパク質の溶液を注入することによって評価した。ｒｈＮｏｄａｌを５ｎＭにて１：０．５、１：１、及び１：２のモル比（タンパク質：ｍＡｂ）に一致する濃度での３Ｄ１ｍＡｂと共にインキュベートした。３Ｄ１ｍＡｂは５ｎＭ（１：２のモル比）にてＮｏｄａｌのＣｒｉｐｔｏ−１−１への結合をおよそ７０％阻害したということ（図５６ｃ）は、ＮｏｄａｌとＣｒｉｐｔｏ−１−１共受容体との間の相互作用を阻止する３Ｄ１の能力を明らかにしている。
【０２３７】
試験管内での３Ｄ１ｍＡｂの機能阻止効果
３Ｄ１ｍＡｂがＣ８１６１黒色腫の腫瘍コロニー形成能に影響を及ぼす潜在力を有するかどうかを判定するために、未処理の細胞またはＩｇＧ対照もしくは３Ｄ１ｍＡｂのいずれかで７２時間処理した細胞を軟寒天にて３週間培養した（足場非依存性の増殖を測定する）。３Ｄ１ｍＡｂで処理した細胞は、未処理の細胞及びＩｇＧ対照で処理した細胞に比べて非付着性の球形クラスターを形成する能力の低下を示した（足場非依存性の増殖の低下を表す）（図５７ａ）。Ｎｏｄａｌは癌幹細胞の表現型に関連する腫瘍細胞の可塑性の根底にあることが示されている。特に、Ｎｏｄａｌは、それによって黒色腫細胞が血管擬態（ＶＭ）として知られる過程にて毛細管様構造の形成を介して内皮様の表現型を取ることができる表現型の切り替えを誘導し、それは試験管内の試験についての三次元（３Ｄ）培養にて繰り返すことができる。Ｃ８１６１細胞を４ｍｇ／ｍＬの３Ｄ１ｍＡｂまたはＩｇＧ対照で処理し、次いで３Ｄ培養にて２４時間増殖させてＶＭに携わるその能力を測定した場合、ＡｎｇｉｏＳｙｓソフトウエアパッケージを用いて接合部と細管の数の低下によって測定されるように、対照に比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理した細胞はＶＭに特徴的な完全なネットワークを形成することができなかった（図５７ｂ）。
【０２３８】
Ｎｏｄａｌのシグナル伝達及び細胞サイクル調節因子に対する３Ｄ１ｍＡｂの効果
黒色腫細胞
４μｇ／ｍＬの３Ｄ１ｍＡｂによるＣ８１６１細胞の処理はＮｏｄａｌ関連のシグナル伝達分子であるＳｍａｄ２及びＥＲＫ１／２のリン酸化の低下を引き起こし、それは４時間後明らかであり、７２時間の実験の間ずっと維持された（図５８ａ）。また、３Ｄ１ｍＡｂ処理の７２時間後、Ｎｏｄａｌ発現にて関連する低下があった（図５８ｂ）。有糸分裂に関与し、活発に増殖している細胞で発現が高い調節性タンパク質であるサイクリンＢ１はもまた、３Ｄ１ｍＡｂで７２時間処理したＣ８１６１細胞で低下した（図５８ｂ）。付随して、Ｇ１相で細胞周期停止を起こす細胞周期の阻害因子タンパク質であるｐ２７及び有糸分裂特異的な増殖マーカーであるホスホヒストンＨ３（Ｐ−Ｈ３）の上昇が対照に対比して同じ３Ｄ１で処理したＣ８１６１細胞で観察された（図５８ｂ）。
【０２３９】
乳癌細胞
同じ時間の３Ｄ１ｍＡｂによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞の処理を含めるように解析を拡大した。これらの結果はＷＢによってＰ−Ｈ３と同様にＮｏｄａｌ発現の注目に値する低下を示している（図６０）。
【０２４０】
これらの結果は、黒色腫細胞ににおける３Ｄ１ｍＡｂの処理がＮｏｄａｌの発現と同様にＳｍａｄ２及びＥＲＫ１／２の下流のリン酸化を低下させ、サイクリンＢ１を低下させる一方でｐ２７を上昇させること、及び乳癌細胞でも同様の効果を見ることができることを示している。
【０２４１】
生体内での３Ｄ１ｍＡｂの効果
幾つかの異なる異種移植モデルがヌードマウスで確立された。先ず、Ｃ８１６１細胞を皮下注射することによって皮膚黒色腫の同所性のモデルが確立された。いったんマウスにて感知できるほどの腫瘍が検出されると、直接的な腫瘍内注射を介した３Ｄ１ｍＡｂまたは対照ＩｇＧによる処理が開始された。実験の８〜１４日目にて、３Ｄ１ｍＡｂで処理したマウスではＩｇＧ処理した対照に比べて腫瘍体積が有意に小さかった（図６０ａ）。これらのマウスにおけるＣ８１６１細胞によって形成された代表的な腫瘍の切片を分析してＮｏｄａｌのシグナル伝達に対する３Ｄ１ｍＡｂの効果を判定した。これらの切片におけるＰ−Ｓｍａｄ２についてのＩＨＣ染色は、ＩｇＧ処理した対照に比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理した動物にて強陽性の核Ｐ−Ｓｍａｄ２染色を伴った細胞の平均比率（±ＳＥＭ）で有意な低下を示した［ＩｇＧ＝８３％±８．２％（Ｎ＝４）対５１．３％±３．３％（Ｎ＝４）；Ｐ＜０．０５］（図６１ｂ）。転移性黒色腫は最も進行性で臨床的に難題の疾患形態を表すので、関連する転移モデルをＣ８１６１細胞の全身性の注入を介してヌードマウスにて確立した。このモデルでは、Ｃ８１６１は注射後７〜１０日以内に肺でコロニー形成し易く、これらの細胞はＮｏｄａｌに対する市販のポリクローナル抗体を用いて標的化できることが示されている。本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験では、ＩｇＧ対照で処理したヌードマウスを３Ｄ１ｍＡｂで処理したものと比べると、Ｃ８１６１のコロニーによって占められた肺組織（肺腫瘍組織量）の平均比率（±ＳＥＭ）で有意な低下が認められた（図６１ｃ）［３Ｄ１ｍＡｂ＝２５．８％±４．６％（Ｎ＝８）対ＩｇＧ対照＝５９．３％±１１．４％（Ｎ＝８）；Ｐ＜０．０５］（Ｆｉｇ．６０ｄ）。３Ｄ１ｍＡｂ及びＩｇＧで処理したマウスに由来するＣ８１６１肺コロニーの代表的な切片をＩＨＣ染色用に処理してＮｏｄａｌ関連のシグナル伝達に対する効果を判定した。皮下腫瘍と同様に、３Ｄ１ｍＡｂで処理したヌードマウスに由来する肺の切片は、ＩｇＧ対照で処理したマウスの切片における肺コロニーに比べてＰ−Ｓｍａｄ２の核局在化を伴った細胞の有意に低い平均比率（±ＳＥＭ）を示した［３Ｄ１ｍＡｂ＝３９±８．９（Ｎ＝６）対ＩｇＧ対照５９．４±９．９（Ｎ＝６）；Ｐ＜０．０１］（図６０ｅ）。これらの肺コロニー切片のさらなる染色は、ｐ２７について染まる細胞の平均比率（±ＳＥＭ）の３Ｄ１ｍＡｂで処理したヌードマウスにおける有意な上昇［３Ｄ１ｍＡｂ＝３９．５％±１７％（Ｎ＝６）対ＩｇＧ対照＝２１％±１５．３％（Ｎ＝６）；Ｐ＜０．００１］（図６１）と共に、サイクリンＢ１について染まる細胞の平均比率（±ＳＥＭ）の３Ｄ１で処理したヌードマウスにおける有意な低下［３Ｄ１ｍＡｂ＝２５．９％±９．４％（Ｎ＝６）対ＩｇＧ対照＝３８．８％±１０．５％（Ｎ＝６）；Ｐ＜０．００１］を示した。
【０２４２】
本明細書の実施形態の開発の間に実施された実験は、ヒト黒色腫細胞株Ａ３７５ＳＭ（活性のあるＢＲＡＦ変異を含有する）をＢＲＡＦｉダブラフェニブで処理すると、Ｐ−ＥＲＫ１／２は予想どおり有意に低下するが、Ｎｏｄａｌの発現は相対的に影響を受けないことを明らかにしている（図６２ａ）。しかしながら、Ｎｏｄａｌの発現は３Ｄ１ｍＡｂによって処理されるとＡ３７５ＳＭ細胞で有意に低下する（図６２ｂ）。さらに、ヌードマウスにて形成されたＡ３７５ＳＭ同所性異種移植の腫瘍体積は、ＢＲＡＦｉまたはＩｇＧ対照で処理されたマウスに比べて３Ｄ１ｍＡｂで処理したマウスにて有意に低下する（図６３ａ）。これらの処理した動物（図６３ｂ）に由来する代表的な組織切片におけるＰ−Ｓｍａｄ２のＩＨＣ染色は、ＢＲＡＦｉまたはＩｇＧ対照で処理されたマウスに比べて３Ｄ１で処理したマウスにて核Ｐ−Ｓｍａｄ２の平均比率（±ＳＥＭ）の有意な低下を示した［３Ｄ１＝２８．１％±２．６％（Ｎ＝４）；ＢＲＡＦｉ＝６８．７％±６．３％（Ｎ＝４）；ＩｇＧ＝５０．２％±７．３（Ｎ＝４）；Ｐ＜０．０５］。これらのデータは、生体内での３Ｄ１ｍＡｂ処理のＮｏｄａｌ機能の阻止活性及び腫瘍縮小効果を実証している。
【０２４３】
可溶性ＮｏｄａｌのＥＬＩＳＡによる検出
乳癌患者由来の血清試料でＮｏｄａｌを検出できるかどうかを判定するためにＮｏｄａｌのＥＬＩＳＡを開発した。可溶性組換えＮｏｄａｌを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡを用いた較正曲線を図６４ａにて示す。初めに、Ｎｏｄａｌを分泌するＨ９細胞用の馴化培地を採用してＥＬＩＳＡによる分泌されたＮｏｄａｌの評価におけるアッセイの妥当性を調べた。これらの知見は、分泌されたＮｏｄａｌを可能性のある生体マーカーとして特定する生体液（たとえば、血清）の試験をもたらす実行可能なやり方を支持した。このＥＬＩＳＡを用いて、Ｎｏｄａｌは１５／２３（６５％）の血清試料で検出された。血清試料が疾患の進行性に基づいて分類された場合（図６４ｂ）、非浸潤性の乳癌患者の血清に比べて浸潤性の血清で高いＮｏｄａｌレベルの傾向が指摘された［浸潤性乳癌についての中央値＝６８０７（範囲：０〜２３４６７；Ｎ＝１２）対非浸潤性乳癌についての中央値＝３５０９（範囲：０〜１１５４１；Ｎ＝１１）］。従って、これらの結果は、我々の新規の３Ｄ１ｍＡｂに基づくＥＬＩＳＡによって癌患者由来の血清にてＮｏｄａｌを検出することができることを示している。
【０２４４】
本発明の実施形態の開発の間に実験を行って、ヒトＮｏｄａｌを標的とし、機能的に阻止することができるｍＡｂである３Ｄ１の機能を提示し、明らかにした。データは、３Ｄ１ｍＡｂがＮｏｄａｌの強い結合能力があり、それがＧｌｕ４９及びＧｌｕ５０を包含するＣｒｉｐｔｏ−１−１共受容体との相互作用領域の近傍で結合することを明らかにしている。３Ｄ１抗体はまた、試験管内でのＮｏｄａｌのＣｒｉｐｔｏ−１−１への結合を効率的に阻止することができるということは従って、それが、Ｃｒｉｐｔｏ−１−１共受容体複合体に依存したＮｏｄａｌの下流のシグナル伝達を阻むことができることを示している。試験管内で処理された黒色腫細胞は、Ｎｏｄａｌタンパク質の発現レベルの有意な低下ならびにＳＭＡＤ２及びＥＲＫ１／２の活性化（リン酸化）形態の低下を示した。この処理はまた、足場非依存性の増殖及び血管擬態の低下、及び細胞周期阻害剤ｐ２７の上昇で補完される細胞増殖関連分子サイクリンＢ１とＰ−Ｈ３のレベルの低下も伴った。３Ｄ１ｍＡｂで処理した皮下同所モデル及び肺コロニー形成モデル双方のヌードマウス異種移植モデルは、それぞれ低下した腫瘍体積及び肺腫瘍組織量という点で抗腫瘍効果を示した。腫瘍切片におけるＰ−Ｓｍａｄ２、ｐ２７及びサイクリンＢ１についてのＩＨＣ染色の分析は試験管内の結果を裏付けた。Ｎｏｄａｌ発現の下方調節及びＰ−Ｈ３の付随する低下を示す乳癌細胞の３Ｄ１処理の効果。
【０２４５】
実施例５
以下に記載されているのは、上記実施例４にて記載されている実験を行うのに使用された材料及び方法である。
【０２４６】
試薬
ＴＲＩｚｏｌ及び制限エンドヌクレアーゼ酵素はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。プロテインＧカラムはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。ＳＰＲ解析は、ＣＭ５センサーチップ及び認定されたＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ，０．１５ＭのＮａＣｌ，ｐＨ７．２，Ｐ２０，０．００５％）を用いてＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａｃｏｒｅ３０００機器にて実施した。組換えヒトＮｏｄａｌ（ｒｈＮｏｄａｌ）及びヒトＣｒｉｐｔｏ−１−１（ｒｈＣｒｉｐｔｏ−１−１）はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，ＵＳＡ）が提供した。以下の抗体をＷＢに使用した：ウサギ抗−Ｎｏｄａｌ（Ｈ−１１０；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）；ウサギ抗−Ｐ−Ｓｍａｄ２（４４−２４４Ｇ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）；ウサギ抗−Ｓｍａｄ２／３（０７−４０８；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）；ウサギ抗−Ｐ−ｐ４４／４２  ＭＡＰＫ（Ｐ−ＥＲＫ１／２）（９１０１Ｓ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）；ウサギ抗−ｐ４４／２４ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）（４４−６５４−Ｇ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；マウス抗−アクチン（ＭＡＢ１５０１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）。以下の抗体を免疫組織化学法に使用した：ヤギ抗−ヒトＮｏｄａｌ抗体（ＬＳ−Ｂ３９５５；ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）１：１５０；ウサギ抗−Ｐ−Ｓｍａｄ２（ＡＢ３８４９；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１：１００〜１：２５０；抗−ｐ２７（２５５２；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）１：４００；ウサギ抗−サイクリンＢ１（ａｂ３２０５３；Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）１：２００。
【０２４７】
３Ｄ１の生成及び分析上の性状分析
ヒトＮｏｄａｌの領域４４〜６７に対して３Ｄ１抗体を生成した。抗原は、共受容体であるＣｒｉｐｔｏ−１−１との結合に関与する２つのグルタミン酸残基Ｅ４９及びＥ５０を含有する。これら２つのホットスポット残基を認識できる抗Ｎｏｄａｌ抗体を選択するために、ｈＮｏｄａｌ［４４〜６７］と、Ｅ４９及びＥ５０が２つのアラニンで置換された変異させたペプチドｈＮｏｄａｌ［４４〜６７］Ｅ４９Ａ−Ｅ５０Ａとを用いてクローンをスクリーニングした。典型的なＥＬＩＳＡアッセイでは、ペプチドを０．１８μｇ／ｍＬ（６０ｎＭ）で被覆し、１．０〜６７ｎＭの間での漸増濃度で抗体を用いて結合を探索した。野生型ペプチドを結合する抗体のみをさらに進展させ、ＥＬＩＳＡ及び表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の双方によって完全長の組換えＮｏｄａｌに対する結合について調べた。プロテインＧアフィニティクロマトグラフィ及び結合した分画のゲル濾過を含む２つのクロマトグラフィ工程によって３Ｄ１抗体を均質まで精製した。
【０２４８】
表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）解析
ＨＢＳをランニング緩衝液として用いて２５℃にてＳＰＲ解析を行った。５μｇ／分で操作する表面不動化ウイザード手順を用いた標準のアミンカップリング化学反応に従ってタンパク質の不動化を行った。ＥＤＣ／ＮＨＳ［Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳ）］によって７分間チャンネルを活性化し；結合アッセイのために、予め選択した酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５で適当に希釈したｒｈＮｏｄａｌを４０００ＲＵレベルが達成されるまでカップリングさせた。センサーチップ表面上の残留する反応基を１．０Ｍの塩酸エタノールアミンｐＨ８．５の添加によって失活させた。漸増濃度（６．０ｎＭ〜１００ｎＭ）での３Ｄ１のＨＢＳ溶液（６０μＬ）を２０μＬ／分で注入することによって抗体結合を調べた。１０ｍＭのＮａＯＨ溶液を用いてチップ表面を再生した。競合アッセイについては、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５における５μｇ／ｍＬで５μＬ／分の流速にてＣＭ５センサーチップ上にｒｈＣｒｉｐｔｏ−１−１を共有結合で不動化して、６００ＲＵの不動化レベルに達した。ＨＢＳ中５ｎＭのｒｈＮｏｄａｌを漸増濃度の３Ｄ１と共にインキュベートした。Ｎｏｄａｌ：抗体の１．０：０．５、１：１及び１．０：２．０の最終モル比を達成するために、センサーチップを通す前に各混合物を３０分間室温でインキュベートした。６０μＬの各溶液を２０μＬ／分の流速で注入した。各バイオチップ上で、誘導体化されない表面を準備し、対照ブランクとして使用した。一定容量の６０μＬの抗体を注入して、または種々の濃度でＨＢＳランニング緩衝液にて適宜希釈した競合溶液を注入して２０μＬ／分の流速で解析を行った。結合についての接触時間は３分だった。解離は少なくともさらに３分間モニターした。各解析について、実験センサーグラムを並べ、フランクのシグナルを差し引き、重ね合わせた。ＧＥ  ＨｅａｌｔｈｃａｒｅのＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエアバージョン４．１を用いて数学的な操作及びフィッティングを行った。実験データは１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合相互作用を想定して処理すると最適なフィッティングを与えた。
【０２４９】
細胞株
細胞株は、短縦列反復遺伝子型決定によって認証され、ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によってマイコプラズマの混入について日常的に調べられ、標準の手順に従って維持された。
【０２５０】
足場非依存性増殖アッセイ
０．３５％アガロース、ＲＰＭＩ１６４０；４μｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ対照（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｏｖｅ，ＰＡ）または３Ｄ１ｍＡｂ（２．８μｇ／ｍｌ）のいずれかを伴った１０％血清にＣ８１６１黒色腫細胞（５，０００個／ウェル）を浮遊させ、次いで６穴ディッシュにおける０．５％寒天；ＲＰＭＩ１６４０；１０％血清の固化層に重層した。３週間の培養の後、細胞クラスターを形成させ、スコア化した（５０個の細胞以上のクラスター）。別々の実験から３つ組ウェルを平均し、ＩｇＧ対照の比率（平均値±ＳＥＭ）として提示した。
【０２５１】
血管性ネットワーク形成アッセイ
７５μｌの氷冷マトリゲル（平均１２〜１５ｍｇ／ｍｌ；Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を１２穴培養ディッシュにて広げることによって三次元マトリクスを調製し、３７℃で１時間重合させた。次いで４μｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ対照または３Ｄ１ｍＡｂ（２．８μｇ／ｍＬ）の存在下で、Ｃ８１６１ヒト黒色腫細胞（１×１０５個／ウェル）を調製されたマトリゲルマトリクス上に置いた。追加の抗体は加えなかった。次いで管状ネットワークの形成を２４時間後観察し、Ｚｅｉｓｓモデル２５倒立顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）及びＨｉｔａｃｈｉ  ＨＶ−Ｃ２０  ＣＣＤカメラ（Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｄｅｎｓｈｉ  Ｌｔｄ．，Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，ＮＹ）を用いて画像をデジタルで捕捉した。ＩｇＧ対照及び３Ｄ１ｍＡｂで処理した培養物双方の少なくとも４つの異なる視野の画像から平均値を算出し、次いでＡｎｇｉｏＳｙｓソフトウエアパッケージ（ＴＣＳ  ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ，Ｌｔｄ．，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）を用いて解析し、解析した視野から接合部及び細管の平均数（±ＳＥＭ）を算出した。
【０２５２】
ウエスタンブロット解析
脳、腎臓、肝臓、膵臓、心臓及び骨格筋におけるＮｏｄａｌ発現のレベルを測定するために、ウエスタンブロット（ＷＢ）用のすぐ使える成人組織抽出物をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。細胞株のＷＢ実験については、全細胞溶解物を調製し、定量した。常法を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動及びＷＢ行った。製造元の推奨に応じて、ＰＶＤＦ膜を５％脱脂粉乳または５％ＢＳＡにてブロックし、５％脱脂粉乳または５％ウシ血清アルブミンのいずれかで希釈された抗体にて４℃で一晩ブロックした。Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）及びＸ線フィルムへの露出を用いてシグナルを検出した。
【０２５３】
生体内の実験
３Ｄ１ｍＡｂの生体内での効果を評価するために、２５０，０００個のＣ８１６１細胞をヌードマウスに静脈注射することによって転移性黒色腫の肺転移モデルを確立した。細胞が肺でコロニー形成する間の４日後、マウスを処理群と対照群に分離した。１０日間にわたって投与される対照群における５００μｇの無関係なアイソタイプＩｇＧに対比して、処理群は合計５００μｇの３Ｄ１ｍＡｂを受け取った（１００μｇの３Ｄ１ｍＡｂまたはＩｇＧの隔日の腹腔内注射（ＩＰ））。処理期間の終了時、マウスを屠殺し、肺を採取し、肺腫瘍組織量の組織学的評価及び免疫組織化学のために処理した。肺腫瘍組織量は、各群について少なくとも４匹の別々のマウスに由来する肺における低倍率（１０×対物レンズ）での少なくとも４つの別々の視野にてＣ８１６１によって占められる肺組織の、且つ２人の異なる観察者によって実施される平均比率を評価することによって決定された。最終的な平均値±ＳＥＭは個々の観察者によって決定された別々の平均値から算出された。
【０２５４】
原発黒色腫に対する３Ｄ１ｍＡｂの生体内での効果を判定するために実験を行った。この目的で、５００，０００個のＣ８１６１細胞をヌードマウスに皮下注射した。触診可能な腫瘍に直接、合計７００μｇの３Ｄ１ｍＡｂまたはＩｇＧ対照抗体を注入した（１４日間にわたって１００μｇの隔日の腫瘍内注射）。次いでマウスを屠殺し、皮下の腫瘍を回収し、以前記載したように処理した。ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）変異の存在下で３Ｄ１ｍＡｂの効果を評価するために、およそ１５０，０００個のＡ３７５ＳＭヒト転移性黒色腫細胞の皮下注射を介して第３の同所性異種移植モデルをヌードマウスにて確立した。マウスを上述のように３Ｄ１ｍＡｂまたはＩｇＧ対照、または３ｍｇ／ｋｇのダブラフェニブでＩＰ処理した。
【０２５５】
免疫組織化学法
厚さ４ミクロンのホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織切片を調製し、Ｄａｋｏ  Ｐｌｕｓ自動染色装置（ＤＡＫＯ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｐｅｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で免疫組織化学法を実施した。抗原回復及びブロッキングの工程に続いて、切片を一次抗体と共に６０分間インキュベートし、その後適当なビオチン化二次抗体（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｃｏｎｒａｄ，ＣＡ）及びストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）と共にインキュベートした。３,３’−ジアミノベンジジン基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ）によって発色させ、切片をヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ）で対比染色した。陰性対照として、一次抗体と同じ濃度での適当な種の無関係なＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）と共に隣接する連続切片をインキュベートした。上述の肺腫瘍組織量の評価と同様に、陽性染色±ＳＥＭの平均比率が２人の異なる観察者によって決定され、それぞれ、群当たり少なくとも２匹の異なるマウスに由来する４つの別々の高倍率視野（６３×対物レンズ）について陽性細胞／細胞の総数×１００の比率を評価した。
【０２５６】
サンドイッチＥＬＩＳＡ
市販のＮｏｄａｌ抗体及び３Ｄ１ｍＡｂのエピトープマッピングによって、後者がＥＬＩＳＡディッシュを被覆するための捕捉抗体として選択された一方で、ウサギモノクローナル抗Ｎｏｄａｌ（Ａｂｃａｍ）は結合したＮｏｄａｌを検出するのに役立った。ＱｕａｎｔａＲｅｄ増強化学蛍光西洋ワサビペルオキシダーゼ基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）と併せて西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗ウサギ抗体を用いて、その後、免疫複合体を定量した。確立したサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイは、ヒト胚性幹細胞に由来する馴化培地及び生体液における組換えタンパク質として７５ｐｇ／ウェルの検出限界（組換えＮｏｄａｌを用いて算出された）でＮｏｄａｌを検出する。乳癌患者に由来するヒト血清試料はＢｉｏＯｐｔｉｏｎｓ（Ｂｒｅａ，ＣＡ）から購入した。
【０２５７】
参考文献
以下の出版物はその全体が参照によって本明細書に組み入れられる。
Ｓｃｈｉｅｒ，  Ａ．Ｆ．  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２００３，  １９，  ５８９−６２１．
Ｓｈｅｎ，  Ｍ．Ｍ．  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２００７，  １３４，  １０２３−１０３４．
Ｓｃｈｉｅｒ，  Ａ．Ｆ．  Ｎｏｄａｌ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  ２００９，  １，  ａ００３４５９．
Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ａ．；  Ａｈｒｌｕｎｄ−Ｒｉｃｈｔｅｒ，  Ｌ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｎｏｄａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１２，  ７２，  １９１５−１９２０．
Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｌｉｐａｖｓｋｙ，  Ａ．；  Ｇａｄｉｏｔ，  Ｊ．；  Ｂｌａｎｋ，  Ｃ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｒ．Ｅ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｎｏｄａｌ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００９，  ４，  ６７−７８．
Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｈｉｌｌｍａｎ，  Ｄ．Ｗ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｃｈｅｎ，  Ｂ．；  Ｇｅｉｇｅｒ，  Ｘ．Ｊ．；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，  Ｅ．Ａ．；  Ｌｉｎｇｌｅ，  Ｗ．Ｌ．；  Ａｎｄｏｒｆｅｒ，  Ｃ．Ａ．；  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｎｏｄａｌ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１２，  １１，  Ｒ７５．
Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｍ．Ｇ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，  Ｄ．；  Ｃｏｌｌｉｎｓ，  Ａ．；  Ｋｅｒｒ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｔｕｒｎｅｒ，  Ｍ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，  Ｃ．Ｒ．；  Ｌａｉ，  Ｊ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．；  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ２０１１，  ７１，  １１９８−１２０９．
Ｑｕａｉｌ，  Ｄ．Ｆ．；  Ｓｉｅｇｅｒｓ，  Ｇ．Ｍ．；  Ｊｅｗｅｒ，  Ｍ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１３，  ４５，  ８８５−８９８．
Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａ，  Ｊ．Ｍ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｓａｍ，  Ａ．；  Ｈｅｓｓ，  Ａ．Ｒ．；  Ｗｈｅａｔｏｎ，  Ｗ．Ｗ．；  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，  Ｂ．Ｊ．；  Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋｉ，  Ｊ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｃｏｎｖｅｒｇｅ  ｖｉａ  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２００６，  １２，  ９２５−９３２．
Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ．  Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．  ２００８，  ２１，  ３４８−３５７．
Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｋｉｒｓａｍｍｅｒ，  Ｇ．Ｔ．；  Ｇｅｒａｍｉ，  Ｐ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  ２０１１，  ９１，  ８１９−８２４．
Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｒ．Ｅ．；  Ｗｅｌｄｏｎ，  Ｄ．Ｓ．；  Ｋｉｒｓａｍｍｅｒ，  Ｇ．Ｔ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｇｉｌｇｕｒ，  Ａ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ：  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  ｎｏｄａｌ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１４，  ４１，  ２５９−２６６．
Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｇｕｐｔａ，  Ｋ．；  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｇ．Ｆ．；  Ｓｃｏｌｙｅｒ，  Ｒ．Ａ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎｏｄａｌ  ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１５，  １３，  ６７０−６８０．
Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ａ．；  Ｌｉｐａｖｓｋｙ，  Ａ．；  Ｗｈｅａｔｏｎ，  Ｗ．Ｗ．；  Ａｂｂｏｔｔ，  Ｄ．Ｅ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｒ．Ｅ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００８，  １０５，  
４３２９−４３３４．
Ｃｏｓｔａ，  Ｆ．Ｆ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｂｉｓｃｈｏｆ，  Ｊ．Ｍ．；  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ａ．；  Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ａｒｎｄｔ，  Ｋ．；  Ｂｏｎａｌｄｏ  Ｍｄｅ，  Ｆ．；  Ｓｏａｒｅｓ，  Ｍ．Ｂ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００９，  １，  ３８７−３９８．
Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｃｏｓｔａ，  Ｆ．Ｆ．；Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ａ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｒ．Ｅ．Ｂ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．−Ｍ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ  ｏｆ  Ｎｏｄａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９，  ６９，  ７１３１−７１３４．
Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ａ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．；  Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｎｏｄａｌ  ｂｙ  Ｎｏｔｃｈ４  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０，  ７０，  １０３４０−１０３５０．
Ｂｉａｎｃｏ，  Ｃ．；  Ａｄｋｉｎｓ，  Ｈ．Ｂ．；  Ｗｅｃｈｓｅｌｂｅｒｇｅｒ，  Ｃ．；  Ｓｅｎｏ，  Ｍ．；  Ｎｏｒｍａｎｎｏ，  Ｎ．；  Ｄｅ  Ｌｕｃａ，  Ａ．；  Ｓｕｎ，  Ｙ．；  Ｋｈａｎ，  Ｎ．；  Ｋｅｎｎｅｙ，  Ｎ．；  Ｅｂｅｒｔ，  Ａ．；  ａｔ  ａｌ．  Ｃｒｉｐｔｏ−１  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｎｏｄａｌ−  ａｎｄ  ＡＬＫ４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２００２，  ２２，  ２５８６−２５９７．
Ｒｅｉｓｓｍａｎｎ，  Ｅ．；  Ｊoｒｎｖａｌｌ，  Ｈ．；  Ｂｌｏｋｚｉｊｌ，  Ａ．；  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｏ．；  Ｃｈａｎｇ，  Ｃ．；  Ｍｉｎｃｈｉｏｔｔｉ，  Ｇ．；  Ｐｅｒｓｉｃｏ，  Ｍ．Ｇ．；  Ｉｂanｅｚ，  Ｃ．Ｆ．；  Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，  Ａ．Ｈ．  Ｔｈｅ  ｏｒｐｈａｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡＬＫ７  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡＬＫ４  ｍｅｄｉａｔｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  Ｎｏｄａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２００１，  １５，  ２０１０−２０２２．
Ｃａｌｖａｎｅｓｅ，  Ｌ．；  Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ，  Ａ．；  Ｃａｐｏｒａｌｅ，  Ａ．；  Ｆｏｃa，  Ａ．；  Ｆｏｃa，  Ｇ．；  Ｄ’Ａｕｒｉａ，  Ｇ．；  Ｆａｌｃｉｇｎｏ，  Ｌ．；  Ｒｕｖｏ，  Ｍ．  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｔｏ  Ｃｒｉｐｔｏ，  ＡＬＫ７  ａｎｄ  ＡＬＫ４  ｏｆ  Ｎｏｄａｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｓｃｉ．  ２０１５，  ２１，  ２８３−２９３．
Ｄｅ  Ｌｕｃａ，  Ａ．；  Ｌａｍｕｒａ，  Ｌ．；  Ｓｔｒｉｚｚ，  Ｌ．；  Ｒｏｍａ，  Ｃ．；  Ｄ’Ａｎｔｏｎｉｏ，  Ａ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．；  Ｐｉｒｏｚｚｉ，  Ｇ．；  Ｈｓｕ，  Ｍ．Ｙ．；  Ｂｏｔｔｉ，  Ｇ．；  Ｍａｒｉ  Ｅ．；  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｒｍａｎｎｏ  Ｎ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＲＩＰＴＯ−１  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１，  １０５，  １０３０−１０３８．
Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｇｉｌｇｕｒ，  Ａ．；  Ｈａｒｄｙ，  Ｋ．Ｍ．；  Ｎｏｒｍａｎｎｏ，  Ｎ．；  Ｓａｌｏｍｏｎ，  Ｄ．Ｓ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｉｐｔｏ−１  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ．  ２０１３，  １２，  １４５０−１４５６．
Ｑｕａｉｌ，  Ｄ．Ｆ．；  Ｚｈａｎｇ，  Ｇ．；  Ｆｉｎｄｌａｙ，  Ｓ．Ｄ．；  Ｈｅｓｓ，  Ｄ．Ａ．；  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ，  Ｌ．Ｍ．  Ｎｏｄａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｖｉａ  ａ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１４，  ３３，  ４６１−４７３．
Ｋｉｒｓａｍｍｅｒ，  Ｇ．；  Ｓｔｒｉｚｚｉ，  Ｌ．；  Ｍａｒｇａｒｙａｎ，  Ｎ．Ｖ．；  Ｇｉｌｇｕｒ，  Ａ．；  Ｈｙｓｅｒ，  Ｍ．；  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，  Ｊ．；  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ，  Ｄ．Ａ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｅｍｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４，  ２９，  ４０−５０．
Ｋａｒｉｍｋｈａｎｉ，  Ｃ．；  Ｇｏｎｚａｌｅｚ，  Ｒ．；  Ｄｅｌｌａｖａｌｌｅ，  Ｒ．Ｐ．  Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２０１４，  １５，  ３２３−３３７．
Ｈａｏ，  Ｍ．；  Ｓｏｎｇ，  Ｆ．；  Ｄｕ，  Ｘ．；  Ｗａｎｇ，  Ｇ．；  Ｙａｎｇ，  Ｙ．；  Ｃｈｅｎ，  Ｋ．；  Ｙａｎｇ，  Ｊ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  Ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２０１５，  ３５９，  １−８．
Ｓｐａｇｎｏｌｏ，  Ｆ．；  Ｇｈｉｏｒｚｏ，  Ｐ．；  Ｏｒｇｉａｎｏ，  Ｌ．；  Ｐａｓｔｏｒｉｎｏ，  Ｌ．；  Ｐｉｃａｓｓｏ，  Ｖ．；  Ｔｏｒｎａｒｉ，  Ｅ．；  Ｏｔｔａｖｉａｎｏ，  Ｖ．；  Ｑｕｅｉｒｏｌｏ，  Ｐ．  ＢＲＡＦ−ｍｕｔａｎｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ，  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．  Ｏｎｃｏ  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５，  ８，  １５７−１６８．
Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，  Ａ．Ｍ．；  Ｋｉｒｋｗｏｏｄ，  Ｊ．Ｍ．  Ｒｅ−ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  Ｗｈａｔ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｉｎ  ３０  ｙｅａｒｓ？  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４，  １２，  １８２５−１８３６．
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Ｃａｌｖａｎｅｓｅ，  Ｌ．；  Ｍａｒａｓｃｏ，  Ｄ．；  Ｄｏｔｉ，  Ｎ．；  Ｓａｐｏｒｉｔｏ，  Ａ．；  Ｄ’Ａｕｒｉａ，  Ｇ．；  Ｐａｏｌｉｌｌｏ，  Ｌ．；  Ｒｕｖｏ，  Ｍ．；  Ｆａｌｃｉｇｎｏ，  Ｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｄａｌ−Ｃｒｉｐｔｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ：  Ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２０１０，  ９３，  １０１１−１０２１．
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ｄｅ  Ｃａｅｓｔｅｃｋｅｒ，  Ｍ．  Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．  ２００４，  １５，  １−１１．
Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｄ．Ｓ．；  Ｗｕ，  Ｊ．；  Ｐｅｌｕｓｏ，  Ｐ．；  Ｎｏｃｋ，  Ｓ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｅｐｓｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（１）  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  Ｆ（ａｂ’）（２）  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００２，  ２６０，  ２９−３６．
Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．；  Ｋｉｍ，  Ｈ．；  Ｋａｔｏ，  Ｋ．；  Ｍａｓｕｄａ，  Ｋ．；  Ｓｈｉｍａｄａ，  Ｉ．；  Ａｒａｔａ，  Ｙ．  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ．  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５，  １８１，  ２５９−２６７．
Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ，  Ｐ．；  Ｈｕｂｅｒ，  Ｒ．；  Ｏｏｓｔｈｕｉｚｅｎ，  Ｖ．；  Ｊａｃｏｂ，  Ｕ．  Ｔｈｅ  ３．２−Ａ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，  ４０６，  ２６７−２７３．
Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｇ．Ｂ．；  Ｎｏｂｌｅ，  Ｒ．Ｌ．  Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ９  ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ．  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．  １９９０，  ３５，  １６１−２１４．
Ｃａｒｔｅｒ，  Ｊ．Ｍ．  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９９４，  ３６，  １５５−１９１．
Ｂｒａｄｆｏｒｄ，  Ｍ．Ｍ．  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９７６，  ７２，  ２４８−２５４．
Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．；  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．  Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ．  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １９７６，  ６，  ５１１−５１９．
Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，  Ｂ．；  Ｌｏｆａｓ，  Ｓ．；  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，  Ｇ．  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｏｌｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９１，  １９８，  ２６８−２７７．
Ｍａｌｃｈｅｎｋｏ，  Ｓ．；  Ｇａｌａｔ，  Ｖ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｅ．Ａ．；  Ｖａｎｉｎ，  Ｅ．Ｆ．；  Ｃｏｓｔａ，  Ｆ．Ｆ．；  Ｓｅｆｔｏｒ，  Ｒ．Ｅ．；  Ｓｏａｒｅｓ，  Ｍ．Ｂ．；  Ｈｅｎｄｒｉｘ，  Ｍ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ：  Ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ．  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１０，  ２２５，  ３９０−３９３．
Ａｙｋｕｌ，  Ｓ．；  Ｎｉ，  Ｗ．；  Ｍｕｔａｔｕ，  Ｗ．；  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｈａｃｋｅｒｔ，  Ｅ．  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｒｂｅｒｕｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｎｏｄａｌ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｎｏｄａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１５，  １０，  ｅ０１１４９５４．
Ｓｏｎｇ  Ｘ，  Ｚｈａｏ  Ｚ，  Ｂａｒｂｅｒ  Ｂ，  Ｆａｒｒ  ＡＭ，  Ｉｖａｎｏｖ  Ｂ  ａｎｄ  Ｎｏｖｉｃｈ  Ｍ．  Ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ．  ２０１５；  ３１（５）：９８７−９９１．
Ｇｏｇａｓ  ＨＪ，  Ｋｉｒｋｗｏｏｄ  ＪＭ  ａｎｄ  Ｓｏｎｄａｋ  ＶＫ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ａ  ｃｈａｎｇｅ？  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００７；  １０９（３）：４５５−４６４．
Ｈａｎ  ＳＦ，  Ｌｉｕ  Ｐ，  Ｚｈａｎｇ  Ｗ，  Ｂｕ  Ｌ，  Ｓｈｅｎ  Ｍ，  Ｌｉ  Ｈ，  Ｆａｎ  ＹＨ，  Ｃｈｅｎｇ  Ｋ，  Ｃｈｅｎｇ  ＨＸ，  Ｌｉ  ＣＸ  ａｎｄ  Ｊｉａ  ＧＬ．  Ｔｈｅ  ｏｐｐｏｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇｓ  ａｎｄ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  １  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００７；  １２４（１）：９０−９７．
Ｃｏｉｔ  ＤＧ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＡ，  Ａｎｄｔｂａｃｋａ  Ｒ，  Ａｎｋｅｒ  ＣＪ，  Ｂｉｃｈａｋｊｉａｎ  ＣＫ，  Ｃａｒｓｏｎ  ＷＥ，  ３ｒｄ，  Ｄａｎｉｅｌｓ  ＧＡ，  Ｄａｕｄ  Ａ，  Ｄｉｍａｉｏ  Ｄ，  Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＭＤ，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｒ，  Ｇｕｉｌｄ  Ｖ，  Ｈａｌｐｅｒｎ  ＡＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｌａｎｏｍａ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．２０１４．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃｏｍｐｒ  Ｃａｎｃ  Ｎｅｔｗ．  ２０１４；  １２（５）：６２１−６２９．
Ｈｏｄｉ  ＦＳ，  Ｏ’Ｄａｙ  ＳＪ，  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＤＦ，  Ｗｅｂｅｒ  ＲＷ，  Ｓｏｓｍａｎ  ＪＡ，  Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｒ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ，  Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ  Ｄ，  Ｈａｓｓｅｌ  ＪＣ，  Ａｋｅｒｌｅｙ  Ｗ，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｅｒｔｗｅｇｈ  ＡＪ，  Ｌｕｔｚｋｙ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１０；  ３６３（８）：７１１−７２３．
Ｃｈａｐｍａｎ  ＰＢ，  Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ  Ａ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ，  Ｈａａｎｅｎ  ＪＢ，  Ａｓｃｉｅｒｔｏ  Ｐ，  Ｌａｒｋｉｎ  Ｊ，  Ｄｕｍｍｅｒ  Ｒ，  Ｇａｒｂｅ  Ｃ，  Ｔｅｓｔｏｒｉ  Ａ，  Ｍａｉｏ  Ｍ，  Ｈｏｇｇ  Ｄ，  Ｌｏｒｉｇａｎ  Ｐ，  Ｌｅｂｂｅ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１１；  ３６４（２６）：２５０７−２５１６．
Ａｓｃｉｅｒｔｏ  ＰＡ，  Ｍｉｎｏｒ  Ｄ，  Ｒｉｂａｓ  Ａ，  Ｌｅｂｂｅ  Ｃ，  Ｏ’Ｈａｇａｎ  Ａ，  Ａｒｙａ  Ｎ，  Ｇｕｃｋｅｒｔ  Ｍ，  Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ  Ｄ，  Ｋｅｆｆｏｒｄ  ＲＦ，  Ｇｒｏｂ  ＪＪ，  Ｈａｍｉｄ  Ｏ，  Ａｍａｒａｖａｄｉ  Ｒ，  Ｓｉｍｅｏｎｅ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｔｒｉａｌ  （ＢＲＥＡＫ−２）  ｏｆ  ｔｈｅ  ＢＲＡＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ  （ＧＳＫ２１１８４３６）  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１３；  ３１（２６）：３２０５−３２１１．
Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＫＴ，  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ，  Ｈｅｒｓｅｙ  Ｐ，  Ｎａｔｈａｎ  Ｐ，  Ｇａｒｂｅ  Ｃ，  Ｍｉｌｈｅｍ  Ｍ，  Ｄｅｍｉｄｏｖ  ＬＶ，  Ｈａｓｓｅｌ  ＪＣ，  Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ  Ｐ，  Ｍｏｈｒ  Ｐ，  Ｄｕｍｍｅｒ  Ｒ，  Ｔｒｅｆｚｅｒ  Ｕ，  Ｌａｒｋｉｎ  ＪＭ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ＭＥＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ＢＲＡＦ−ｍｕｔａｔｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１２；  ３６７（２）：１０７−１１４．
Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ，  Ｈｏｄｉ  ＦＳ，  Ｂｒａｈｍｅｒ  ＪＲ，  Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ  ＳＮ，  Ｓｍｉｔｈ  ＤＣ，  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  ＤＦ，  Ｐｏｗｄｅｒｌｙ  ＪＤ，  Ｃａｒｖａｊａｌ  ＲＤ，  Ｓｏｓｍａｎ  ＪＡ，  Ａｔｋｉｎｓ  ＭＢ，  Ｌｅｍｉｎｇ  ＰＤ，  Ｓｐｉｇｅｌ  ＤＲ，  Ａｎｔｏｎｉａ  ＳＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓａｆｅｔｙ，  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１２；  ３６６（２６）：２４４３−２４５４．
Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ，  Ｋａｒａｓｚｅｗｓｋａ  Ｂ，  Ｓｃｈａｃｈｔｅｒ  Ｊ，  Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ  Ｐ，  Ｍａｃｋｉｅｗｉｃｚ  Ａ，  Ｓｔｒｏｉａｋｏｖｓｋｉ  Ｄ，  Ｌｉｃｈｉｎｉｔｓｅｒ  Ｍ，  Ｄｕｍｍｅｒ  Ｒ，  Ｇｒａｎｇｅ  Ｆ，  Ｍｏｒｔｉｅｒ  Ｌ，  Ｃｈｉａｒｉｏｎ−Ｓｉｌｅｎｉ  Ｖ，  Ｄｒｕｃｉｓ  Ｋ，  Ｋｒａｊｓｏｖａ  Ｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ  ａｎｄ  ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１５；  ３７２（１）：３０−３９．
Ｌｏｎｇ  ＧＶ，  Ｆｕｎｇ  Ｃ，  Ｍｅｎｚｉｅｓ  ＡＭ，  Ｐｕｐｏ  ＧＭ，  Ｃａｒｌｉｎｏ  ＭＳ，  Ｈｙｍａｎ  Ｊ，  Ｓｈａｈｈｅｙｄａｒｉ  Ｈ，  Ｔｅｍｂｅ  Ｖ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＪＦ，  Ｓａｗ  ＲＰ，  Ｈｏｗｌｅ  Ｊ，  Ｈａｙｗａｒｄ  ＮＫ，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＭＡＰＫ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ／ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＢＲＡＦ−ｍｕｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１４；  ５：５６９４．
Ｌａｒｋｉｎ  Ｊ，  Ｃｈｉａｒｉｏｎ−Ｓｉｌｅｎｉ  Ｖ，  Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｒ，  Ｇｒｏｂ  ＪＪ，  Ｃｏｗｅｙ  ＣＬ，  Ｌａｏ  ＣＤ，  Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ  Ｄ，  Ｄｕｍｍｅｒ  Ｒ，  Ｓｍｙｌｉｅ  Ｍ，  Ｒｕｔｋｏｗｓｋｉ  Ｐ，  Ｆｅｒｒｕｃｃｉ  ＰＦ，  Ｈｉｌｌ  Ａ，  Ｗａｇｓｔａｆｆ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ  ａｎｄ  Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｏｒ  Ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ  Ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１５．
Ｋｌｉｎａｃ  Ｄ，  Ｇｒａｙ  ＥＳ，  Ｍｉｌｌｗａｒｄ  Ｍ  ａｎｄ  Ｚｉｍａｎ  Ｍ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１３；  ３：５４．
Ｒｏｅｓｃｈ  Ａ．  Ｔｕｍｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ  ａｓ  ｅｌｕｓｉｖｅ  ｄｒｉｖｅｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ＭＡＰＫ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２０１５；  ３４（２３）：２９５１−２９５７．
Ａｓｃｉｅｒｔｏ  ＰＡ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ：  ｔｈｅ  ｆｏｃｕｓ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１５；  ６４（３）：２７１−２７４．
Ｓｍａｌｌｅｙ  ＫＳ，  Ｈａａｓｓ  ＮＫ，  Ｂｒａｆｆｏｒｄ  ＰＡ，  Ｌｉｏｎｉ  Ｍ，  Ｆｌａｈｅｒｔｙ  ＫＴ  ａｎｄ  Ｈｅｒｌｙｎ  Ｍ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｍｕｓｔ  ｂｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｏ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．  ２００６；  ５（５）：１１３６−１１４４．
Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｈａｒｄｙ  Ｋ，  Ｓｅｆｔｏｒ  Ｅ，  Ｃｏｓｔａ  Ｆ，  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  Ｄ，  Ｓｅｆｔｏｒ  Ｒ，  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  Ｌ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  Ｍ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ：  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ  ｏｆ  Ｎｏｄａｌ  ａｎｄ  Ｎｏｔｃｈ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９；  ６９：７１３１  −  ７１３４．
Ｓｈｅｎ  ＭＭ．  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｏｌｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  ２００７；  １３４（６）：１０２３−１０３４．
Ｃｏｓｔａ  ＦＦ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ，  Ｂｉｓｃｈｏｆ  ＪＭ，  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ＤＡ，  Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ａｒｎｄｔ  Ｋ，  Ｂｏｎａｌｄｏ  Ｍｄｅ  Ｆ，  Ｓｏａｒｅｓ  ＭＢ，  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．  Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ．  ２００９；１（２）：３８７−９８．  
Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｈａｒｄｙ  ＫＭ，  Ｋｉｒｓａｍｍｅｒ  ＧＴ，  Ｇｅｒａｍｉ  Ｐ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２０１１；  ９１（６）：８１９−８２４．
Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｈａｒｄｙ  Ｋ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  Ｎ，  Ｈｉｌｌｍａｎ  Ｄ，  Ｓｅｆｔｏｒ  Ｅ，  Ｃｈｅｎ  Ｂ，  Ｇｅｉｇｅｒ  Ｘ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｅ，  Ｌｉｎｇｌｅ  Ｗ，  Ａｎｄｏｒｆｅｒ  Ｃ，  Ｐｅｒｅｚ  Ｅ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  Ｍ．  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｎｏｄａｌ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１２；  １４（３）：Ｒ７５．
Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｍ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  Ｎ，  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ  Ｄ，  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ａ，  Ｋｅｒｒ  Ｋ，  Ｔｕｒｎｅｒ  Ｍ，  Ｓｅｆｔｏｒ  Ｅ，  Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  Ｃ，  Ｌａｉ  Ｊ，  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ａ，  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  Ｌ，  Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｊ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  Ｍ．  Ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｓｔａｔｅ．  ２０１１；  ７１：１１９８  −  １２０９．
Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  ＬＭ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ，  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ＤＡ，  Ｌｉｐａｖｓｋｙ  Ａ，  Ｗｈｅａｔｏｎ  ＷＷ，  Ａｂｂｏｔｔ  ＤＥ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＲＥ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００８；  １０５（１１）：４３２９−４３３４．
Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  ＬＭ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｌｉｐａｖｓｋｙ  Ａ，  Ｇａｄｉｏｔ  Ｊ，  Ｂｌａｎｋ  Ｃ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＲＥ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｎｏｄａｌ  ａｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２００９；  ４（１）：６７−７８．
Ｋｉｒｓａｍｍｅｒ  Ｇ，  Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｇｉｌｇｕｒ  Ａ，  Ｈｙｓｅｒ  Ｍ，  Ａｔｋｉｎｓｏｎ  Ｊ，  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ＤＡ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４；  ２９：４０−５０．
Ｈａｒｄｙ  ＫＭ，  Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｇｕｐｔａ  Ｋ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＦ，  Ｓｃｏｌｙｅｒ  ＲＡ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎｏｄａｌ  ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１５；  １３（４）：６７０−６８０．
Ｆｏｃa  Ａ，  Ｓａｎｇｕｉｇｎｏ  Ｌ  ，  Ｆｏｃa  Ｇ，  Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｉａｎｎｉｔｔｉ  Ｒ，  Ｐａｌｕｍｂｏ  Ｒ，  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪＣ，  Ｌｅｏｎａｒｄｉ  Ａ，  Ｒｕｖｏ  Ｍ，  Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ  Ａ．  Ｎｅｗ  ａｎｔｉ−Ｎｏｄａｌ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｎｏｄａｌ  ｐｒｅ−ｈｅｌｉｘ  ｌｏｏｐ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｃｒｉｐｔｏ−１  ｂｉｎｄｉｎｇ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ  ２０１５；  １６（９）：  ２１３４２−２１３６２．
Ｃａｌｖａｎｅｓｅ  Ｌ，  Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ  Ａ，  Ｃａｐｏｒａｌｅ  Ａ，  Ｆｏｃａ  Ａ，  Ｆｏｃａ  Ｇ，  Ｄ’Ａｕｒｉａ  Ｇ，  Ｆａｌｃｉｇｎｏ  Ｌ  ａｎｄ  Ｒｕｖｏ  Ｍ．  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｔｏ  Ｃｒｉｐｔｏ，  ＡＬＫ７  ａｎｄ  ＡＬＫ４  ｏｆ  Ｎｏｄａｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．  ２０１５；  ２１（４）：２８３−２９３．
Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋａ  ＪＭ，  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  ＬＭ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｓａｍ  Ａ，  Ｈｅｓｓ  ＡＲ，  Ｗｈｅａｔｏｎ  ＷＷ，  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ  ＢＪ，  Ｔｏｐｃｚｅｗｓｋｉ  Ｊ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｃｏｎｖｅｒｇｅ  ｖｉａ  Ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅｎｅｓｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ２００６；  １２（８）：９２５−９３２．
Ｍａｎｉｏｔｉｓ  ＡＪ，  Ｆｏｌｂｅｒｇ  Ｒ，  Ｈｅｓｓ  Ａ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ，  Ｇａｒｄｎｅｒ  ＬＭ，  Ｐｅ’ｅｒ  Ｊ，  Ｔｒｅｎｔ  ＪＭ，  Ｍｅｌｔｚｅｒ  ＰＳ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｉｃ  ｍｉｍｉｃｒｙ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．  １９９９；  １５５（３）：７３９−７５２．
Ｌｏ  ＪＡ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＤＥ．  Ｔｈｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎ：  ｆｒｏｍ  ＵＶ  ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｏ  ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２０１４；  ３４６（６２１２）：９４５−９４９．
Ｈｏｄｉｓ  Ｅ，  Ｗａｔｓｏｎ  ＩＲ，  Ｋｒｙｕｋｏｖ  ＧＶ，  Ａｒｏｌｄ  ＳＴ，  Ｉｍｉｅｌｉｎｓｋｉ  Ｍ，  Ｔｈｅｕｒｉｌｌａｔ  ＪＰ，  Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  Ｅ，  Ａｕｃｌａｉｒ  Ｄ，  Ｌｉ  Ｌ，  Ｐｌａｃｅ  Ｃ，  Ｄｉｃａｒａ  Ｄ，  Ｒａｍｏｓ  ＡＨ，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  ｄｒｉｖｅｒ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．  Ｃｅｌｌ．  ２０１２；  １５０（２）：２５１−２６３．
Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＦ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＢＪ，  Ｇｉｒｏｕａｒｄ  ＳＤ，  Ｆｒａｎｋ  ＮＹ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｋ  ＭＨ．  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｕｒｅ．  Ｍｏｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．  ２０１４；  ３９：３３−４９．
Ｖａｌｌｉｅｒ  Ｌ，  Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  Ｄ  ａｎｄ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ＲＡ．  Ｎｏｄａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｏｎｇ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ  ｄｅｆａｕｌｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．  ２００４；  ２７５（２）：４０３−４２１．
Ｌｉ  ＦＺ，  Ｄｈｉｌｌｏｎ  ＡＳ，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＲＬ，  ＭｃＡｒｔｈｕｒ  Ｇ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒａｏ  ＰＴ．  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１５；  ５：３１．
Ｑｕａｉｌ  ＤＦ，  Ｚｈａｎｇ  Ｇ，  Ｆｉｎｄｌａｙ  ＳＤ，  Ｈｅｓｓ  ＤＡ  ａｎｄ  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  ＬＭ．  Ｎｏｄａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｖｉａ  ａ  ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２０１４；  ３３（４）：４６１−４７３．
Ｈｕａｎｇ  Ｓ，  Ｈｏｌｚｅｌ  Ｍ，  Ｋｎｉｊｎｅｎｂｕｒｇ  Ｔ，  Ｓｃｈｌｉｃｋｅｒ  Ａ，  Ｒｏｅｐｍａｎ  Ｐ，  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ  Ｕ，  Ｇａｒｎｅｔｔ  Ｍ，  Ｇｒｅｒｎｒｕｍ  Ｗ，  Ｓｕｎ  Ｃ，  Ｐｒａｈａｌｌａｄ  Ａ，  Ｇｒｏｅｎｅｎｄｉｊｋ  ＦＨ，  Ｍｉｔｔｅｍｐｅｒｇｈｅｒ  Ｌ，  Ｎｉｊｋａｍｐ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．  ＭＥＤ１２  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｃｅｌｌ．  ２０１２；  １５１（５）：９３７−９５０．
Ｋｈａｌｋｈａｌｉ−Ｅｌｌｉｓ  Ｚ，  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ＤＡ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ，  Ｇｉｌｇｕｒ  Ａ，  Ｂｏｄｅｎｓｔｉｎｅ  ＴＭ，  Ｈｉｎｃｋ  ＡＰ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ（ｓ）  ｉｎ  ｎｏｄａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２０１５；  １３６（５）：Ｅ２４２−２５１．
Ｃａｌｖａｎｅｓｅ  Ｌ，  Ｍａｒａｓｃｏ  Ｄ，  Ｄｏｔｉ  Ｎ，  Ｓａｐｏｒｉｔｏ  Ａ，  Ｄ’Ａｕｒｉａ  Ｇ，  Ｐａｏｌｉｌｌｏ  Ｌ，  Ｒｕｖｏ  Ｍ  ａｎｄ  Ｆａｌｃｉｇｎｏ  Ｌ．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｄａｌ−Ｃｒｉｐｔｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ：  ａ  ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  ２０１０；  ９３（１１）：１０１１−１０２１．
Ｃａｌｖａｎｅｓｅ  Ｌ，  Ｆａｌｃｉｇｎｏ  Ｌ  ａｎｄ  Ｄ’Ａｕｒｉａ  Ｇ．  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｃａｐｔｕｒｅｓ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｍｏｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｊｅｒｄｏｓｔａｔｉｎ，  ａｎ  ＲＴＳ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ．  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ．  ２０１５；  １０３（３）：１５８−１６６．
Ｄｅｌｙｏｎ  Ｊ，  Ｍａｔｅｕｓ  Ｃ，  Ｌｅｆｅｕｖｒｅ  Ｄ，  Ｌａｎｏｙ  Ｅ，  Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  Ｌ，  Ｃｈａｐｕｔ  Ｎ，  Ｒｏｙ  Ｓ，  Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ  ＡＭ，  Ｒｏｕｔｉｅｒ  Ｅ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｉｎ  ｄａｉｌｙ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ  ｃｏｕｎｔｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１３；  ２４（６）：１６９７−１７０３．
Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｌｏｆａｓ  Ｓ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ  Ｇ．  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｄｅｘｔｒａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｇｏｌｄ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｓｅｎｓｏｒｓ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９９１；  １９８（２）：２６８−２７７．
Ｇａｄｄａｍｅｅｄｈｉ  Ｓ，  Ｋｅｍｐ  ＭＧ，  Ｒｅａｒｄｏｎ  ＪＴ，  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＪＭ，  Ｓｍｉｔｈ−Ｒｏｅ  ＳＬ，  Ｋａｕｆｍａｎｎ  ＷＫ  ａｎｄ  Ｓａｎｃａｒ  Ａ．  Ｓｉｍｉｌａｒ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ  ｒｅｐａｉｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．  ２０１０；  ７０（１２）：４９２２−４９３０．
Ｈａｒｄｙ  ＫＭ，  Ｋｉｒｓｃｈｍａｎｎ  ＤＡ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｐｏｓｔｏｖｉｔ  ＬＭ，  Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｎｏｄａｌ  ｂｙ  Ｎｏｔｃｈ４  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１０；  ７０（２４）：１０３４０−１０３５０．
Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ  ＪＭ，  Ｈａｒｔ  ＩＲ，  Ｆｉｄｌｅｒ  ＩＪ  ａｎｄ  Ｈａｎｎａ  Ｎ．  Ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｌｉｎｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔ  ｔｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｉｎ  ａｔｈｙｍｉｃ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  １９８４；  ７２（４）：９１３−９１７．
Ｂｏｄｅｎｓｔｉｎｅ  ＴＭ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＲＥ，  Ｓｅｆｔｏｒ  ＥＡ，  Ｋｈａｌｋｈａｌｉ−Ｅｌｌｉｓ  Ｚ，  Ｓａｍｉｉ  ＮＡ，  Ｍｏｎａｒｒｅｚ  ＪＣ，  Ｃｈａｎｄｌｅｒ  ＧＳ，  Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  ＰＡ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ．  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｍｐａｃｔ  ｍａｓｐｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２０１４；  １２（１０）：１４８０−１４９１．
Ａｄｋｉｎｓ  ＨＢ，  Ｂｉａｎｃｏ  Ｃ，  Ｓｃｈｉｆｆｅｒ  ＳＧ，  Ｒａｙｈｏｒｎ  Ｐ，  Ｚａｆａｒｉ  Ｍ，  Ｃｈｅｕｎｇ  ＡＥ，  Ｏｒｏｚｃｏ  Ｏ，  Ｏｌｓｏｎ  Ｄ，  Ｄｅ  Ｌｕｃａ  Ａ，  Ｃｈｅｎ  ＬＬ，  Ｍｉａｔｋｏｗｓｋｉ  Ｋ，  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｃ，  Ｎｏｒｍａｎｎｏ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｒｉｐｔｏ  ＣＦＣ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００３；１１２（４）：５７５−８７．  
Ｙｕ  Ｌ，  Ｈａｒｍｓ  ＰＷ，  Ｐｏｕｒｙａｚｄａｎｐａｒａｓｔ  Ｐ，  Ｋｉｍ  ＤＳ，  Ｍａ  Ｌ，  Ｆｕｌｌｅｎ  ＤＲ．  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎ  Ｎｏｄａｌ  ｉｎ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ．  Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ．  ２０１０；  ２３（９）：１２０９−１４．
Ｌｅｅ  ＣＣ，  Ｊａｎ  ＨＪ，  Ｌａｉ  ＪＨ，  Ｍａ  ＨＩ，  Ｈｕｅｎｇ  ＤＹ，  Ｌｅｅ  ＹＣ，  Ｃｈｅｎｇ  ＹＹ，  Ｌｉｕ  ＬＷ，  Ｗｅｉ  ＨＷ，  Ｌｅｅ  ＨＭ．  Ｎｏｄａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２０１０；  ２９（２１）：３１１０−２３．  
Ｆｕ  Ｇ，  Ｐｅｎｇ  Ｃ．  Ｎｏｄａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＦｏｘＯ３ａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｓｍａｄｓ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｃｙｃｌｉｎ  Ｇ２  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  ２０１１；  ３０（３７）：３９５３−６６．  
Ｊａｍｉｌ  Ｓ，  Ｃｅｄｅｒｖａｌｌ  Ｊ，  Ｈｕｌｔｍａｎ  Ｉ，  Ａｌｉ  Ｒ，  Ｍａｒｇａｒｙａｎ  ＮＶ，  Ｒａｓｍｕｓｏｎ  Ａ，  Ｊｏｈｎｓｅｎ  ＪＩ
Ｓｖｅｉｎｂｊoｒｎｓｓｏｎ  Ｂ，  Ｄａｌｉａｎｉｓ  Ｔ，  Ｋａｎｔｅｒ  Ｌ，  Ｏｒｒｅｇｏ  Ａ，  Ｓｔｒｉｚｚｉ  Ｌ，  Ｈｅｎｄｒｉｘ  ＭＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍａｔｕｒｅ  ｔｅｒａｔｏｍａ  ｒｅｖｅａｌ  ａ  ｔｒｏｐｉｓｍ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｏｏｓｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｅ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ．  ２０１３；  ４３（３）：８３１−８．
Ｄｕａｎ  Ｗ，  Ｌｉ  Ｒ，  Ｍａ  Ｊ，  Ｌｅｉ  Ｊ，  Ｘｕ  Ｑ，  Ｊｉａｎｇ  Ｚ，  Ｎａｎ  Ｌ，  Ｌｉ  Ｘ，  Ｗａｎｇ  Ｚ，  Ｈｕｏ  Ｘ，  Ｈａｎ  Ｌ，  Ｗｕ  Ｚ，  Ｗｕ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｄａｌ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  ｔｈｅ  Ｓｍａｄ２／３  ｐａｔｈｗａｙ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．  ２０１５；  ６（３）：１４９０−５０６．
Ｋｏｎｇ  Ｂ，  Ｗａｎｇ  Ｗ，  Ｅｓｐｏｓｉｔｏ  Ｉ，  Ｆｒｉｅｓｓ  Ｈ，  Ｍｉｃｈａｌｓｋｉ  ＣＷ，  Ｋｌｅｅｆｆ  Ｊ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｏｄａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ．  ２０１５；  １５（２）：１５６−６１．
【０２５８】
本出願で言及されている出版物及び特許はすべて参照によって本明細書に組み入れられる。本発明の記載されている方法及び組成物の種々の改変及び変化は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は特定の好まれる実施形態と併せて記載されてきたが、請求されているような本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、関連分野の当業者に明らかである本発明を実施するための記載されている形態の種々の改変は以下のクレームの範囲内にあるように意図される。
【図１】
0006574257.tif 000006
【図２】
0006574257.tif 000007
【図３】
0006574257.tif 000008
【図４】
0006574257.tif 000009
【図５】
0006574257.tif 000010
【図６】
0006574257.tif 000011
【図７】
0006574257.tif 000012
【図８】
0006574257.tif 000013
【図９−１】
0006574257.tif 000014
【図９−２】
0006574257.tif 000015
【図９−３】
0006574257.tif 000016
【図１０−１】
0006574257.tif 000017
【図１０−２】
0006574257.tif 000018
【図１１】
0006574257.tif 000019
【図１２】
0006574257.tif 000020
【図１３】
0006574257.tif 000021
【図１４】
0006574257.tif 000022
【図１５】
0006574257.tif 000023
【図１６】
0006574257.tif 000024
【図１７】
0006574257.tif 000025
【図１８】
0006574257.tif 000026
【図１９】
0006574257.tif 000027
【図２０】
0006574257.tif 000028
【図２１】
0006574257.tif 000029
【図２２】
0006574257.tif 000030
【図２３−１】
0006574257.tif 000031
【図２３−２】
0006574257.tif 000032
【図２４−１】
0006574257.tif 000033
【図２４−２】
0006574257.tif 000034
【図２４−３】
0006574257.tif 000035
【図２５】
0006574257.tif 000036
【図２６】
0006574257.tif 000037
【図２７】
0006574257.tif 000038
【図２８】
0006574257.tif 000039
【図２９−１】
0006574257.tif 000040
【図２９−２】
0006574257.tif 000041
【図３０】
0006574257.tif 000042
【図３１−１】
0006574257.tif 000043
【図３１−２】
0006574257.tif 000044
【図３２−１】
0006574257.tif 000045
【図３２−２】
0006574257.tif 000046
【図３２−３】
0006574257.tif 000047
【図３３−１】
0006574257.tif 000048
【図３３−２】
0006574257.tif 000049
【図３４】
0006574257.tif 000050
【図３５】
0006574257.tif 000051
【図３６−１】
0006574257.tif 000052
【図３６−２】
0006574257.tif 000053
【図３７】
0006574257.tif 000054
【図３８】
0006574257.tif 000055
【図３９】
0006574257.tif 000056
【図４０】
0006574257.tif 000057
【図４１−１】
0006574257.tif 000058
【図４１−２】
0006574257.tif 000059
【図４２】
0006574257.tif 000060
【図４３】
0006574257.tif 000061
【図４４】
0006574257.tif 000062
【図４５】
0006574257.tif 000063
【図４６】
0006574257.tif 000064
【図４７】
0006574257.tif 000065
【図４８】
0006574257.tif 000066
【図４９】
0006574257.tif 000067
【図５０】
0006574257.tif 000068
【図５１】
0006574257.tif 000069
【図５２】
0006574257.tif 000070
【図５３】
0006574257.tif 000071
【図５４】
0006574257.tif 000072
【図５５】
0006574257.tif 000073
【図５６−１】
0006574257.tif 000074
【図５６−２】
0006574257.tif 000075
【図５７】
0006574257.tif 000076
【図５８】
0006574257.tif 000077
【図５９】
0006574257.tif 000078
【図６０】
0006574257.tif 000079
【図６１】
0006574257.tif 000080
【図６２】
0006574257.tif 000081
【図６３】
0006574257.tif 000082
【図６４】
0006574257.tif 000083
【図６５】
0006574257.tif 000084
【配列表】
0006574257000001.app