(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、該オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含み、変異部位の番号付け「７９０」が、配列番号２９のアミノ酸配列の番号付けに基づく、オリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号１または配列番号２の配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号１の配列を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記修飾されたヌクレオチドが、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基、ヌクレオチド間の修飾された結合、または前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾された塩基が、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、またはピリジン修飾Ｕである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
前記修飾されたヌクレオチドが、両末端の３塩基の間のホスホロチオエート結合および３’末端のコレステロール−トリエチレングリコール（コレステロール−ＴＥＧ）基を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８の配列を有する連続ヌクレオチドを含み、欠失部位の番号付け「７４６−７５０」が、配列番号２９のアミノ酸配列の番号付けに基づく、オリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記修飾されたヌクレオチドが、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基、ヌクレオチド間の修飾された結合、または前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記修飾された塩基が、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、またはピリジン修飾Ｕである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記修飾されたヌクレオチドが、両末端の３塩基の間のホスホロチオエート結合および３’末端のコレステロール−トリエチレングリコール（コレステロール−ＴＥＧ）基を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号９〜１５からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含み、変異部位の番号付け「８５８」が、配列番号２９のアミノ酸配列の番号付けに基づく、オリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
前記修飾されたヌクレオチドが、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基、ヌクレオチド間の修飾された結合、または前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
前記修飾された塩基が、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、またはピリジン修飾Ｕである、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記修飾されたヌクレオチドが、両末端の３塩基の間のホスホロチオエート結合および３’末端のコレステロール−トリエチレングリコール（コレステロール−ＴＥＧ）基を含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドをコードする配列を含むベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体をさらに含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターが、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ＸＬ６４７（Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（（（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル）メトキシ）キナゾリン−４−アミン）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、ＢＭＳ−６６９０５１４（（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−［［４−［（３−メトキシフェニル）アミノ］ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル］メチル］ピペリジン−３−オール）、ゲフィチニブ、またはエルロチニブである、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記ＥＧＦＲ特異的抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ
Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害するための組成物であって、該細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質の発現を特異的に阻害するための請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項２２】
阻害しなければＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失タンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害するための組成物であって、該細胞内のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失タンパク質の発現を特異的に阻害するための請求項７〜１０のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項２３】
阻害しなければＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ
Ｌ８５８Ｒ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害するための組成物であって、該細胞内のＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒタンパク質の発現を特異的に阻害するための請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのいずれかを含む、組成物。
【請求項２４】
被験体におけるＥＧＦＲ依存性癌を処置するための組成物であって、有効量の請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項２５】
手術、放射線療法、または化学療法の後に補助療法として使用することができる、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
被験体においてＥＧＦＲ依存性癌を処置するための組み合わせ物であって、ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体および請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む、組み合わせ物。
【請求項２７】
前記ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体および請求項１〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを同時、連続的、または個別に投与することができる、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項２８】
前記ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターが、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ＸＬ６４７（Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（（（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル）メトキシ）キナゾリン−４−アミン）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、ＢＭＳ−６６９０５１４（（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−［［４−［（３−メトキシフェニル）アミノ］ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル］メチル］ピペリジン−３−オール）、ゲフィチニブ、またはエルロチニブである、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項２９】
前記ＥＧＦＲ特異的抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項３０】
前記ＥＧＦＲ依存性癌が肺癌である、請求項２４に記載の組成物または請求項２６に記載の組み合わせ物。
【請求項３１】
前記肺癌がＮＳＣＬＣである、請求項３０に記載の組成物または組み合わせ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＥＧＦＲの発現をサイレンシングするためのＤＮＡザイムに関する。特に、本発明は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は、上皮表面に発現する膜貫通タンパク質である。ＥＧＦＲは、上皮の修復および再生で重要な生理学的役割を果たす。上皮成長因子（ＥＧＦ）は、唾液腺および上皮表面に関連する他の腺によって分泌されるペプチドであり、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン内の特定領域に結合する。結合の際、ＥＧＦは細胞の内側に伝達されるシグナルを生成する。ＥＧＦ結合の結果としての第１の細胞内事象は、ＥＧＦＲの細胞内ドメインの立体構造の変化であり、それにより、アデノシン５’−三リン酸（ＡＴＰ）がいわゆるチロシンキナーゼ（ＴＫ）ドメイン（チロシン残基を含むポケット）に侵入し、リン酸基をチロシン残基に供与する。リン酸化チロシンを保有する細胞内ＥＧＦＲは、他の細胞内タンパク質と会合することができるようになり、非常に複雑なネットワークを介して下流に伝播する一連の生化学反応が開始される。このネットワークの最も知られているアームは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）経路（この経路によって活性化の際に腫瘍細胞が分裂する）およびＡＫＴ経路（この経路によって活性化の際に細胞生存が増強される）。したがって、ＥＧＦＲ活性化により、細胞増殖が増加し、種々の傷害に対する細胞耐性が増強される。多数の腫瘍は、隣接する正常な組織またはこれらのに由来する上皮表面と比較してＥＧＦＲを過剰発現するか、内因的に活性化されたか活性化に対する感受性が増強されたＥＧＦＲの変異バージョンを有する。かかる過剰発現は、腫瘍細胞が成長優位性（悪性表現型の重要な特徴）を獲得する多数の機構のうちの１つであると考えられる。したがって、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の遮断は、多数のヒト悪性腫瘍の処置の合理的なストラテジーであると考えられる。ＥＧＦＲシグナル伝達経路の上流を阻害する方法は、基本的に以下の２つが存在する：１）特異的モノクローナル抗体の使用によってＥＧＦおよび他の天然ペプチドリガンドが細胞外ＥＧＦＲドメインに結合するのを防止すること、および２）ＴＫポケット内に構造的に非常に良好に適合する小分子（すなわち、ゲフィチニブおよびエルロチニブなどのＥＧＦＲ  ＴＫインヒビター）の使用によってＡＴＰおよび他のリン酸供与体が細胞内ＥＧＦＲドメインのＴＫポケットに侵入するのを防止すること。
【０００３】
肺癌は癌関連死の主因であり、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は肺癌の約８５％を占める。ＮＳＣＬＣ患者の１つの固有の小集団では、肺癌細胞は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の活性化変異を有し、かつ細胞生存のために異常なＥＧＦＲシグナル伝達に依存的である。活性化変異のうち、ＥＧＦＲにおけるＬ８５８Ｒ変異およびＬＲＥＡ欠失は、薬物感受性変異の９０％超を占め、野生型ＥＧＦＲと比較してチロシンキナーゼインヒビター（ＴＫＩ）に対する結合親和性が増加する。ＴＫＩの投与により、ＥＧＦＲ−変異体肺癌細胞における内因性アポトーシス経路が首尾よく誘導されるが、正常細胞における野生型ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害が同時に起こることによって発疹および下痢などの用量制限副作用が不可避に誘発される。さらに、ＮＳＣＬＣ処置の開始時はチロシンキナーゼインヒビターが首尾よく使用されるが、５０％の薬物耐性患者で認められるＥＧＦＲのゲートキーパー残基７９０での二次変異（Ｔ７９０Ｍ）が獲得されることにより、ＴＫＩとＥＧＦＲとの間の相互作用が弱められる。用量制限毒性およびＴ７９０Ｍ由来薬物耐性は、依然として未解決のＮＳＣＬＣ処置における主な問題である。
【０００４】
リボザイムは、アンチセンスオリゴヌクレオチドよりも強力な薬剤にする触媒部位を含む天然に存在するＲＮＡ分子である。しかし、リボザイムは、化学的および酵素的な分解に対する感受性、および標的部位特異性の制限によって、より広範な使用が妨げられていた。特異的ＲＮＡ配列に触媒活性を有するＤＮＡ分子を含む新世代の触媒核酸が記載されている。これらのＤＮＡ酵素は、ハンマーヘッド型リボザイムより触媒効率が高く、自発的なＲＮＡ切断速度に対しておよそ１０００万倍の高い速度をもたらし、基質特異性がより高く、化学的および酵素的な分解により高い耐性を示し、合成よりはるかに安価である。合理的な設計により、転写物特異的レベルまたは対立遺伝子特異的レベルで標的遺伝子の発現をサイレンシングするように特異的ｍＲＮＡに作用することができる核酸薬剤（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｇｅｎｔ）が数十年間にわたって世界中の多くの研究室で利用されている。これらのうちで、ＤＮＡザイムは、種々の遺伝子のサイレンシングについて包括的に研究されており、治療薬として使用するのに有望な結果が得られている。ＤＮＡザイムの基本構造は、標的化されたｍＲＮＡ配列に相補的な配列を有する２つの基質結合アームに隣接した触媒ドメインからなる。ＤＮＡザイムは、ｍＲＮＡ切断部位で異なるヌクレオチド組成物に向かって異なる反応速度を示した。その上、ｍＲＮＡ切断のためのＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成するのにダイサータンパク質が必要なｓｉＲＮＡと異なり、細胞基質中に豊富なＭｇ２＋またはＣａ２＋などの２価の金属イオンはＤＮＡザイム機能を触媒するのに十分である。これらの要因を組み合わせると、ＤＮＡザイムは、安価であり、安定であり、操作が容易な核酸薬剤であり、癌治療においてｍＲＮＡ切断活性の効率が高くかつ非特異的毒性が低い。
Ｇａｒｙ  Ｂｅａｌｅらは、Ａ４３１細胞内でのＥＧＦＲ発現の阻害におけるいくつかのリボザイムおよびＤＮＡザイムを提供している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００３  Ｖｏｌ．１１（７），ｐｐ．４４９−４５６）。しかし、先行技術文献は、これらのリボザイムおよびＤＮＡザイムの阻害有効性が低いことを示している。Ｃｒｉｓｐｉｎ  Ｒ．Ｄａｓｓらは、癌との戦いにおいてＤＮＡザイムが上昇することを実証し、この上昇が有望なバイオ技術であると予測されるという総説を発表した（Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７（２）：２４３−５１）。米国特許出願公開第２０１２０２２５８７０号は、抗ＥｒｂＢ治療薬または抗ＭＥＴ治療薬がリボザイム、触媒性ＲＮＡ、酵素性ＲＮＡ、触媒性ＤＮＡ、アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム、調節可能なリボザイム、触媒性オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素、エンドリボヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、ミニザイム、レッドザイム、オリゴザイム、またはＤＮＡ酵素などの酵素性核酸であり得ることを開示している。しかし、この文献では実質的に酵素性核酸を提供していない。
望ましくない副作用より低下させながらＥＧＦＲの発現を有効にサイレンシングするか、ＴＫＩ耐性を克服することができるＤＮＡザイムを開発することが依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０２２５８７０号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａｕｇｕｓｔ  ２００３  Ｖｏｌ．１１（７），ｐｐ．４４９−４５６
【非特許文献２】Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ２００８；７（２）：２４３−５１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。
【０００８】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。
【０００９】
本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８の配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。
【００１０】
本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号９〜１５からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドまたは修飾された配列をコードする配列を含むベクターおよび宿主をさらに提供する。
【００１２】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドもしくはその修飾された配列、本発明のベクターまたは宿主、および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００１３】
本発明はまた、特異的にＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡを切断するかＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡ発現を阻害する方法であって、前記ｍＲＮＡと、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかとを、前記分子が前記ｍＲＮＡを切断するかｍＲＮＡの発現を阻害することが可能な条件下で接触させる工程を含む方法をさらに提供する。
【００１４】
本発明はまた、被験体におけるＥＧＦＲ依存性癌を処置する方法であって、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を被験体に投与する工程を含む方法をさらに提供する。
【００１５】
本発明はまた、被験体におけるＥＧＦＲ依存性癌を処置する方法であって、ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体ならびに本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を被験体に投与する工程を含む方法をさらに提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目２）
前記ＥＧＦＲ変異が、ＥＧＦＲ  Ｇ７１９、Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、Ｔ７９０、Ｌ８５８、Ｄ７６１、Ｖ７６５、およびＴ７８３である、項目１に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目３）
オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、該オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目４）
配列番号１または配列番号２の配列を有する、項目３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目５）
配列番号１の配列を有する、項目３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目６）
前記修飾された配列が、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基、ヌクレオチド間の修飾された結合、または前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を含む、項目３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目７）
前記修飾された塩基が、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、またはピリジン修飾Ｕである、項目６に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目８）
前記修飾された配列が、両末端の３塩基の間のホスホロチオエート結合および３’末端のコレステロール−ＴＥＧ基を含む、項目３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目９）
オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号８の配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１０）
前記修飾された配列が、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基、ヌクレオチド間の修飾された結合、または前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を含む、項目９に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１１）
前記修飾された塩基が、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、またはピリジン修飾Ｕである、項目１０に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１２）
前記修飾された配列が、両末端の３塩基の間のホスホロチオエート結合および３’末端のコレステロール−ＴＥＧ基を含む、項目９に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１３）
オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして、細胞内でのその翻訳を阻害し、ここで、前記オリゴヌクレオチドが、配列番号９〜１５からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１４）
前記修飾された配列が、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基、ヌクレオチド間の修飾された結合、または前記オリゴヌクレオチドの５’末端もしくは３’末端に官能基を含む、項目１３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１５）
前記修飾された塩基が、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、またはピリジン修飾Ｕである、項目１４に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１６）
前記修飾された配列が、両末端の３塩基の間のホスホロチオエート結合および３’末端のコレステロール−ＴＥＧ基を含む、項目１３に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列。
（項目１７）
項目１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列をコードする配列を含むベクター。
（項目１８）
項目１７に記載のベクターを含む宿主。
（項目１９）
項目１のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物。
（項目２０）
ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体をさらに含む、項目１９に記載の薬学的組成物。
（項目２１）
前記ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターが、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ＸＬ６４７（Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（（（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル）メトキシ）キナゾリン−４−アミン）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、ＢＭＳ−６６９０５１４（（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−［［４−［（３−メトキシフェニル）アミノ］ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル］メチル］ピペリジン−３−オール）、ゲフィチニブ、またはエルロチニブである、項目２０に記載の薬学的組成物。
（項目２２）
前記ＥＧＦＲ特異的抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、項目２０に記載の薬学的組成物。
（項目２３）
阻害しなければＥＧＦＲ変異タンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、該細胞を項目１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかと接触させて、該細胞内のＥＧＦＲ変異タンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む、方法。
（項目２４）
阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ
Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、該細胞を項目１〜８のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと接触させて、該細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む、方法。
（項目２５）
阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ
Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、該細胞を項目９〜１２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと接触させて、該細胞内のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失タンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む、方法。
（項目２６）
阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ
Ｌ８５８Ｒ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、該細胞を項目１３〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと接触させて、該細胞内のＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒタンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む、方法。
（項目２７）
被験体におけるＥＧＦＲ依存性癌を処置する方法であって、有効量の項目１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目２８）
手術、放射線療法、または化学療法の後に補助療法として使用することができる、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
被験体においてＥＧＦＲ依存性癌を処置する方法であって、ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体および項目１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を該被験体に投与する工程を含む、方法。
（項目３０）
前記ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体および項目１〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を同時、連続的、または個別に投与することができる、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターが、アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ＸＬ６４７（Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（（（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル）メトキシ）キナゾリン−４−アミン）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、ＢＭＳ−６６９０５１４（（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−［［４−［（３−メトキシフェニル）アミノ］ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル］メチル］ピペリジン−３−オール）、ゲフィチニブ、またはエルロチニブである、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記ＥＧＦＲ特異的抗体がセツキシマブまたはパニツムマブである、項目２９に記載の方法。
（項目３３）
前記ＥＧＦＲ依存性癌が肺癌である、項目２７または２９に記載の方法。
（項目３４）
前記肺癌がＮＳＣＬＣである、項目３３に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】図１は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムを示す。
【図１Ｂ】図１は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムを示す。
【００１７】
【図２Ａ】図２は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現レベルを特異的に弱めることを示す。
【図２Ｂ】図２は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡ発現レベルを特異的に弱めることを示す。
【００１８】
【図３Ａ】図３は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の総ＥＧＦＲ発現および下流ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することを示す。
【図３Ｂ】図３は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の総ＥＧＦＲ発現および下流ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することを示す。
【図３Ｃ】図３は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の総ＥＧＦＲ発現および下流ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することを示す。
【図３Ｄ】図３は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の総ＥＧＦＲ発現および下流ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害することを示す。
【００１９】
【図４Ａ】図４は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【図４Ｂ】図４は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【図４Ｃ】図４は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【図４Ｄ】図４は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【図４Ｅ】図４は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【図４Ｆ】図４は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【００２０】
【図５Ａ】図５は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがｉｎ  ｖｉｖｏでＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有腫瘍の成長を阻害することを示す。
【図５Ｂ】図５は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがｉｎ  ｖｉｖｏでＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有腫瘍の成長を阻害することを示す。
【図５Ｃ】図５は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがｉｎ  ｖｉｖｏでＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ保有腫瘍の成長を阻害することを示す。
【００２１】
【図６Ａ】図６は、コレステロール−ＴＥＧ修飾対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムの構造を示す。
【図６Ｂ】図６は、コレステロール−ＴＥＧ修飾対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムの構造を示す。
【図６Ｃ】図６は、コレステロール−ＴＥＧ修飾対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムの構造を示す。
【図６Ｄ】図６は、コレステロール−ＴＥＧ修飾対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムの構造を示す。
【００２２】
【図７Ａ】図７は、ＤＮＡザイムおよびアファチニブの併用療法を示す。
【図７Ｂ】図７は、ＤＮＡザイムおよびアファチニブの併用療法を示す。
【図７Ｃ】図７は、ＤＮＡザイムおよびアファチニブの併用療法を示す。
【００２３】
【図８Ａ】図８は、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失保有細胞において細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【図８Ｂ】図８は、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失保有細胞において細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【００２４】
【図９】図９は、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムがＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ保有細胞内の細胞アポトーシスを誘導することを示す。
【００２５】
【図１０】図１０は、ＤｚＴがＴ７９０Ｍ変異体細胞におけるＥＧＦ処置後にＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ発現および下流シグナル伝達に及ぼす抑制効果を保つことを示す。１００ｎＭのＤｚＣまたはＤｚＴでのトランスフェクション７２時間後に細胞を回収した。培養培地中に１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを投与した１５分後に細胞ライセートを回収した。細胞ライセートを、表示の一次抗体での免疫ブロッティングによって分析した。
【００２６】
【図１１】図１１は、ｃＤｚＴがＨ１９７５ＴＭ／ＬＲにおけるＥＧＦ処置後にＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ発現および下流シグナル伝達に及ぼす抑制効果を保つことを示す。１００ｎＭのｃＤｚＣまたはｃＤｚＴでのトランスフェクション７２時間後に細胞を回収した。培養培地中に１００ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦを投与した１５分後に細胞ライセートを回収した。細胞ライセートを、表示の一次抗体での免疫ブロッティングによって分析した。
【００２７】
【図１２】図１２は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置によってＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞におけるＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化が有意に抑制されることを示す。ＢＩＢＷ−２９９２（２００ｎＭ）を添加するか添加せずにインキュベートしたｃＤｚＣまたはｃＤｚＴ（５０ｎＭ）で処置したＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞の免疫ブロット分析。
【００２８】
【図１３Ａ】図１３は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置がＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体を保有する細胞における細胞生存率に相乗阻害効果を発揮することを示す。２５ｎＭ（●）、５０ｎＭ（■）、７５ｎＭ（★）、１００ｎＭ（▲）、１５０ｎＭ（▼）、または２５０ｎＭ（◆）のＢＩＢＷ−２９９２と組み合わせてｃＤｚＣまたはｃＤｚＴ（２５ｎＭ）で処置したＨ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞（ａ、ｂ）またはＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞（ｃ、ｄ）のＭＴＴアッセイ（ｎ＝３）。データを、平均±ＳＤとして示す。結果を、スチューデントｔ検定およびＣＩ計算によって分析した。アスタリスクは、統計的有意差を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置がＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体を保有する細胞における細胞生存率に相乗阻害効果を発揮することを示す。２５ｎＭ（●）、５０ｎＭ（■）、７５ｎＭ（★）、１００ｎＭ（▲）、１５０ｎＭ（▼）、または２５０ｎＭ（◆）のＢＩＢＷ−２９９２と組み合わせてｃＤｚＣまたはｃＤｚＴ（２５ｎＭ）で処置したＨ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞（ａ、ｂ）またはＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞（ｃ、ｄ）のＭＴＴアッセイ（ｎ＝３）。データを、平均±ＳＤとして示す。結果を、スチューデントｔ検定およびＣＩ計算によって分析した。アスタリスクは、統計的有意差を示す。
【図１３Ｃ】図１３は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置がＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体を保有する細胞における細胞生存率に相乗阻害効果を発揮することを示す。２５ｎＭ（●）、５０ｎＭ（■）、７５ｎＭ（★）、１００ｎＭ（▲）、１５０ｎＭ（▼）、または２５０ｎＭ（◆）のＢＩＢＷ−２９９２と組み合わせてｃＤｚＣまたはｃＤｚＴ（２５ｎＭ）で処置したＨ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞（ａ、ｂ）またはＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞（ｃ、ｄ）のＭＴＴアッセイ（ｎ＝３）。データを、平均±ＳＤとして示す。結果を、スチューデントｔ検定およびＣＩ計算によって分析した。アスタリスクは、統計的有意差を示す。
【図１３Ｄ】図１３は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置がＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体を保有する細胞における細胞生存率に相乗阻害効果を発揮することを示す。２５ｎＭ（●）、５０ｎＭ（■）、７５ｎＭ（★）、１００ｎＭ（▲）、１５０ｎＭ（▼）、または２５０ｎＭ（◆）のＢＩＢＷ−２９９２と組み合わせてｃＤｚＣまたはｃＤｚＴ（２５ｎＭ）で処置したＨ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞（ａ、ｂ）またはＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞（ｃ、ｄ）のＭＴＴアッセイ（ｎ＝３）。データを、平均±ＳＤとして示す。結果を、スチューデントｔ検定およびＣＩ計算によって分析した。アスタリスクは、統計的有意差を示す。
【００２９】
【図１４Ａ】図１４は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の相乗効果を示す。（ａ〜ｃ）併用処置により、ＥＧＦＲシグナル伝達がサイレンシングされ、アポトーシスが誘発され、異種移植片の腫瘍成長が抑制される。（ａ）異種移植片マウスにＨ１９７５ＴＭ／ＬＲを接種した１０日後（矢印で示す）に、ｃＤｚＴ（５００ピコモル）を腫瘍内に注射し（１週間に２回）、ＢＩＢＷ−２９９２（２０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した（１週間に３回）（ｎ＝７）。データを平均±ＳＤで示し、スチューデントｔ検定で分析した。アスタリスクは統計的有意差を示す（Ｐ＜０．００５）。（ｂ）異種移植片の腫瘍組織を免疫染色のために処理した。スケールバーは、Ｈ＆Ｅ画像において２００  ｍを示し、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ画像およびカスパーゼ−３画像において１００  ｍを示す。（ｃ）異種移植片の腫瘍組織を、免疫ブロッティングのために処理した。
【図１４Ｂ】図１４は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の相乗効果を示す。（ａ〜ｃ）併用処置により、ＥＧＦＲシグナル伝達がサイレンシングされ、アポトーシスが誘発され、異種移植片の腫瘍成長が抑制される。（ａ）異種移植片マウスにＨ１９７５ＴＭ／ＬＲを接種した１０日後（矢印で示す）に、ｃＤｚＴ（５００ピコモル）を腫瘍内に注射し（１週間に２回）、ＢＩＢＷ−２９９２（２０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した（１週間に３回）（ｎ＝７）。データを平均±ＳＤで示し、スチューデントｔ検定で分析した。アスタリスクは統計的有意差を示す（Ｐ＜０．００５）。（ｂ）異種移植片の腫瘍組織を免疫染色のために処理した。スケールバーは、Ｈ＆Ｅ画像において２００  ｍを示し、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ画像およびカスパーゼ−３画像において１００  ｍを示す。（ｃ）異種移植片の腫瘍組織を、免疫ブロッティングのために処理した。
【図１４Ｃ】図１４は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の相乗効果を示す。（ａ〜ｃ）併用処置により、ＥＧＦＲシグナル伝達がサイレンシングされ、アポトーシスが誘発され、異種移植片の腫瘍成長が抑制される。（ａ）異種移植片マウスにＨ１９７５ＴＭ／ＬＲを接種した１０日後（矢印で示す）に、ｃＤｚＴ（５００ピコモル）を腫瘍内に注射し（１週間に２回）、ＢＩＢＷ−２９９２（２０ｍｇ／ｋｇ）を経口投与した（１週間に３回）（ｎ＝７）。データを平均±ＳＤで示し、スチューデントｔ検定で分析した。アスタリスクは統計的有意差を示す（Ｐ＜０．００５）。（ｂ）異種移植片の腫瘍組織を免疫染色のために処理した。スケールバーは、Ｈ＆Ｅ画像において２００  ｍを示し、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ画像およびカスパーゼ−３画像において１００  ｍを示す。（ｃ）異種移植片の腫瘍組織を、免疫ブロッティングのために処理した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、対立遺伝子特異的レベルでＥＧＦＲの発現をサイレンシングすることができるＤＮＡザイムを開発する。ＥＧＦＲ変異（特にＴ７９０Ｍ）に対するこれらの対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、ＥＧＦＲ野生型ｍＲＮＡをインタクトに保ちながらＥＧＦＲｍＲＮＡ（特に、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡ）の発現をノックダウンするであろう。それ故、ＥＧＦＲ変異（特に、Ｔ７９０Ｍ）に対するこれらの対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、ＥＧＦＲ依存性癌（ＮＳＣＬＣなど）患者において正常細胞に及ぼす望ましくない副作用を抑えながらＥＧＦＲ変異由来ＴＫＩ耐性を克服することができる。特に、ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体と組み合わせた本発明のＤＮＡザイムは、ＮＳＣＬＣなどのＥＧＦＲ依存性癌の処置において相乗効果が得られる。
【００３１】
用語「ａ」および「ａｎ」は、この冠詞の文法上の対象が１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）であることをいう。
【００３２】
用語「核酸」には、任意の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、およびそのアナログまたは誘導体が含まれるが、これらに限定されない）が含まれるものとするが、これらに限定されない。核酸を形成するヌクレオチドは、ヌクレオチドアナログまたはその誘導体であり得る。核酸は非ヌクレオチドを組み込むことができる。
【００３３】
用語「ヌクレオチド」には、ヌクレオチドおよびそのアナログまたは誘導体が含まれるものとするが、これらに限定されない。例えば、ヌクレオチドは、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ、ならびにその誘導体を含むことができる。これらの塩基の誘導体は当該分野で周知であり、ＰＣＲシステム、試薬、および消耗品（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  １９９６−１９９７，Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ）に例示されている。
【００３４】
用語「核酸酵素」は、化学反応を触媒する核酸分子をいう。核酸酵素は、核酸酵素であるままで１つ以上の他の分子と共有結合することができる。他の分子の例には、色素、クエンチャー、タンパク質、および固体支持体が含まれる。核酸酵素は、完全に、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドとの組み合わせから構成することができる。
【００３５】
用語「ＤＮＡザイム」は、一本鎖および二本鎖の標的配列の両方を切断することができる一本鎖ポリヌクレオチドをいう。
【００３６】
用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、哺乳動物における疾患の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）をいい、（ａ）疾患からの防御（すなわち、臨床症状を発症させない）；（ｂ）疾患の阻止（すなわち、臨床症状の発症の停止、改善、低減、または抑制）；および／または（ｃ）疾患の軽減（すなわち、臨床症状の後退）が含まれる。当業者は、人間医学において、究極的な誘導事象が未知または潜在性であり得るか、事象の発生から十分な期間が経過するまで患者を確認できないので、常に「防止」と「抑制」とを区別することが可能ではないことを理解するであろう。したがって、本明細書中で使用する場合、用語「予防」は、「処置」の要素として本明細書中で定義される「防止」および「抑制」の両方を含むことが意図される。用語「防御」は、本明細書中で使用する場合、「予防」が含まれることを意図する。
【００３７】
用語「有効量」は、障害または病状が処置されるのに十分な投薬量を意味する。これは、患者、疾患、施される処置に応じて変化するであろう。
【００３８】
用語「投与」は、当業者に公知の種々の方法および送達系のいずれかによる投与をいう。例えば、インプラントを介して、または経粘膜、経皮、および皮下に投与することができる。好ましい実施形態では、投与は、局所投与、好ましくは皮膚投与である。
【００３９】
用語「ハイブリダイズする」は、配列相補性に基づいたある一本鎖核酸分子の別の核酸分子へのアニーリングをいう。核酸間のハイブリダイゼーションの性質は、その環境の温度およびイオン強度、核酸の長さ、ならびに相補性の程度に依存する。ハイブリダイゼーションに対するこれらのパラメータの影響は、当該分野で周知である。
【００４０】
用語「阻害する」は、遅延化するか、停止させるか、そうでなければ妨害することを意味する。
【００４１】
用語「薬学的に許容され得るキャリア」は、当業者に公知の種々のキャリアのいずれかをいう。１つの実施形態では、キャリアは、アルコール、好ましくはエチレングリコールである。別の実施形態では、キャリアはリポソームである。以下の薬学的に許容され得るキャリアを、その最も一般的に関連する送達系に関して例として記載し、本発明の薬学的組成物は皮膚に送達することが好ましいという事実を述べておく。
【００４２】
用語「特異的に切断する」は、標的ｍＲＮＡ分子に対する本発明の触媒性核酸分子の１つの作用をいう場合、触媒性核酸分子の２つの結合ドメインのいずれかと相補的な配列を欠く別のｍＲＮＡ分子を切断することなく、標的ｍＲＮＡ分子を切断することを意味するものとする。
【００４３】
用語「被験体」は、任意の動物（ヒト、霊長類、マウス、ラット、モルモット、またはウサギなど）を意味するものとする。
【００４４】
用語「ベクター」には、特定の核酸配列を生物のゲノム内に安定に導入するために使用することができる核酸分子が含まれるものとするが、これに限定されない。
【００４５】
以下の略語は、下記の意味を有するものとする：「Ａ」は、アデニンを意味するものとする。「ｂｐ」は塩基対を意味するものとする。「Ｃ」は、シトシンを意味するものとする。「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸を意味するものとする。「Ｇ」は、グアニンを意味するものとする。「ｍＲＮＡ」は、伝令リボ核酸を意味するものとする。「ＲＮＡ」は、リボ核酸を意味するものとする。「ＲＴ−ＰＣＲ」は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を意味するものとする。「ＲＹ」は、プリン：ピリミジンを意味するものとする。「Ｔ」は、チミンを意味するものとする。「Ｕ」はウラシルを意味するものとする。
【００４６】
１つの態様では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害する、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。１つの実施形態では、ＥＧＦＲ変異は、ＥＧＦＲ  Ｇ７１９、Ｅ７４６−Ａ７５０欠失、Ｔ７９０、Ｌ８５８、Ｄ７６１、Ｖ７６５、およびＴ７８３である。１つの好ましい実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害すし、ここで、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列が、配列番号１〜７からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。
【００４７】
配列番号１〜７の配列を以下のように列挙する。
ＤｚＴ７９０Ｍ−１：ＡＧＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣ（配列番号１）
ＤｚＴ７９０Ｍ−２：ＧＡＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＴＧＡＧＣＴ（配列番号２）
ＤｚＴ１：ＣＡＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＧ（配列番号３）
ＤｚＴ２：ＣＴＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＧＣＴＧＣＡ（配列番号４）
ＤｚＴ３：ＧＧＣＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＡＴＧ（配列番号５）
ＤｚＴ４：ＡＧＧＧＣＡＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴ（配列番号６）
ＤｚＴ５：ＴＧＡＧＴＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧ（配列番号７）
【００４８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の配列を有する。より好ましくは、オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列を有する。
【００４９】
前述の実施形態は、ＴＫＩ耐性を克服し、正常細胞に対する毒性を低減するための、Ｔ７９０Ｍに対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムの有効性を主に実証していた。ＥＧＦＲｍＲＮＡ配列の全変異を、対立遺伝子特異的様式でデザインし、機能させることができる。別の実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害し、前記オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列が、配列番号８の配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。１つのさらなる実施形態では、本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列であって、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ｍＲＮＡと特異的にハイブリダイズして細胞内でのその翻訳を阻害し、前記オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列が、配列番号９〜１５からなる群から選択される配列を有する連続ヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を提供する。
ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失に対するＤＮＡザイム：
ＤｚＥＧＦＲ＿ΔＥ７４６−Ａ７５０：ＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣ（配列番号８）
ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異体に対するＤＮＡザイム：
ＤｚＬ８５８Ｒ−１：ＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴ（配列番号９）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−２：ＧＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡ（配列番号１０）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−３：ＧＣＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴ（配列番号１１）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−４：ＧＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧ（配列番号１２）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−５：ＴＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣ（配列番号１３）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−６：ＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＣ（配列番号１４）；および
ＤｚＬ８５８Ｒ−７：ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＣＧＣＣ（配列番号１５）。
【００５０】
本発明の修飾された配列を、当該分野で公知の方法にしたがって得ることができる。ＤＮＡザイムはデオキシリボヌクレオチドから構成され、デオキシリボヌクレオチドは、標的化されたＲＮＡへの到達性を増加させ、基質に対するハイブリダイゼーション効率を増大させ、相補配列に対する切断活性を改善し、細胞内および血流中のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる分解に耐性を示し、循環系での血清半減期を延長するように容易に修飾することができる。可能な修飾には、ヌクレオチド構造上の修飾された塩基の導入、ヌクレオチド間の修飾された結合の導入、およびＤＮＡザイムの５’末端または３’末端での官能基の導入が含まれる。Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｓｃｏｔｔ  Ｋらは、化学修飾を有機合成によって７−デアザアデニン核酸塩基のＣ７位およびデオキシウリジン（ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｇ）核酸塩基のＣ５位に容易に導入することができ、これらの修飾された塩基を、適切なポリメラーゼによってＤＮＡザイムにたやすく組み込むことができ、例には、アミン修飾ｄＡ、フェノール修飾ｄＵ、イミダゾール修飾ｄＵ、およびピリジン修飾Ｕが含まれると述べている（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｓ．Ｋ．２００８．Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）ｆｏｒ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ−ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）：３４６７−３４８５）。Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｓｔｅｆｆｅｎらは、２’−Ｏ−メチル修飾、およびＣ３’−エンド立体構造を固定する２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン架橋を含むロックド核酸塩基が、ＤＮＡザイム切断活性を増強することができると述べている（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｓ．，Ｇｕｌ，Ｄ．Ｃ．，Ｇｒｕｎｅｒｔ，Ｈ．Ｐ．，Ｚｅｉｃｈｈａｒｄｔ，Ｈ．，Ｅｒｄｍａｎｎ，Ｖ．Ａ．，ａｎｄ  Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｊ．２００３．ＲＮＡ  ｃｌｅａｖｉｎｇ  ’１０−２３’  ＤＮＡｚｙｍｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：５９８２−５９９２）。さらに、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、３’末端での逆位チミジン、３’末端のコレステロール−ＴＥＧ基、およびＤＮＡザイムの５’末端または３’末端のＰＥＧ部分のサイズの相違が臨床治療の実行可能性を増大させることができる（Ｄａｓｓ，Ｃ．Ｒ．，Ｃｈｏｏｎｇ，Ｐ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｋｈａｃｈｉｇｉａｎ，Ｌ．Ｍ．２００８．ＤＮＡｚｙｍｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ：ｃｌｅａｖｅ  ａｎｄ  ｌｅｔ  ｄｉｅ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ  ７：２４３−２５１）。本発明は、両末端の３塩基間にホスホロチオエート結合および３’末端にコレステロール−ＴＥＧ基を有するＤＮＡザイムに関する好ましい実施形態を提供する。他の実施形態では、異なる修飾をＤＮＡザイムに導入することができる。
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、その相補ポリヌクレオチドを特異的に切断することができ、ＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡ（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡ、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡ、およびＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ｍＲＮＡなど）の発現を下方制御することができるＤＮＡザイムである。ＤＮＡザイムは、一本鎖および二本鎖の標的配列の両方を切断することができる一本鎖核酸薬剤である（Ｂｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９５；２：６（５５，Ｓａｎｔｏｒｏ，Ｓ．Ｗ．＆  Ｊｏｙｃｅ，Ｇ．Ｆ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９７；９４：４２６２）。ＤＮＡザイムの一般的なモデル（「１０−２３」モデル）が提案されている。Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ、Ｋｅｎｎｙらは、「８−１７」ＤＮＡザイムがｉｎ  ｖｉｔｒｏでのシングルターンオーバー条件下で０．０００１〜１０／分の異なる反応速度にて全てのジヌクレオチド組成物で切断反応を行うことができると述べている。この特徴により、相補的である任意の配列をサイレンシングするように「８−１７」ＤＮＡザイムを合理的にデザインすることが可能である。さらに、「１０−２３」ＤＮＡザイムは、プリン：ピリミジン接合（すなわち、ＧＣ、ＡＣ、ＧＵ／Ｔ、ＡＵ／Ｔ）でのみヌクレオチドを切断することができるが、他のジヌクレオチド接合ではできない。「１０−２３」ＤＮＡザイムは、この特徴的な選択能力によって対立遺伝子特異的サイレンシング遺伝子発現のための有利なツールとなる（Ｔａｂｌｅ  １，Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ，Ｋ．，Ｇｕ，Ｊ．，Ｌａｍ，Ｊ．Ｃ．，ａｎｄ  Ｌｉ，Ｙ．２００８．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ−ｃｌｅａｖｉｎｇ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｌｅａｖｅ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６：４７６８−４７７７）。触媒ドメインは、必要に応じて、触媒活性に必要なヌクレオチドに加えてステム−ループ構造を含むことができる。触媒デオキシリボ核酸分子の１つの実施形態では、触媒ドメインは、以下の配列：１０−２３触媒コア配列のＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１６）、８−１７触媒コア配列のＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡ（配列番号１７）、８−１７触媒コア配列のＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡ（配列番号１８）、および二分触媒コア配列のＡＧＧＡＧＧＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＴＣ（配列番号１９）を有し、コンセンサス配列プリン：ピリミジンでｍＲＮＡを切断する。１つの好ましい実施形態では、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡ（図１Ｂに記載）、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡ（以下の段落［００８４］に示す）、およびＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ  ｍＲＮＡ（以下の段落［００８５］に示す）中の１つ以上の切断部位で切断が起こる。
【００５２】
標準ＤＮＡザイムは、それぞれ４〜１２個のデオキシリボヌクレオチドの２つの基質認識ドメインに隣接している。これら２つの結合アームにより、ＤＮＡザイムとその相補標的との間に熱安定性および基質特異性が得られる。結合アームが非常に短いＤＮＡザイムについて、ＤＮＡザイムと基質との間の相互作用強度は、切断触媒作用を得るには低すぎるであろう。他方では、切断アーム長が長すぎる場合、切断特異性が損なわれるであろう。実際、ＤＮＡザイムの結合アーム中のヌクレオチド組成が異なる場合、そのハイブリダイゼーション能力およびその基質に対する切断活性が変化するであろう。標準ＤＮＡザイムについて、結合アーム領域中の配列は、その標的化された基質の配列に完全に適合すべきである。結合アーム領域中にミスマッチが増加するほどＤＮＡザイムと基質との間の安定性が低下する。さらに、触媒コア付近にミスマッチが存在する場合、触媒活性は著しく阻害されるであろう。最近、Ｙｉ、Ｊｚらは、触媒コアから１２〜１５ｂｐ離れた標準ＤＮＡザイムの５’末端への６オリゴバルジの導入によって標準ＤＮＡザイムの効率および特異性が増大すると述べている（Ｙｉ，Ｊ．Ｚ．，ａｎｄ  Ｌｉｕ，Ｃ．Ｑ．２０１１．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａｎ  ＡＳＯＮ−Ｂｕｌｇｅ−ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６）。切断反応のための最も適切な結合アーム長は、実験に基づいて試験されるべきである。１つの実施形態では、異なる結合アーム長および異なるバルジサイズをＤＮＡザイムに導入するであろう。本発明は、ＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡを対立遺伝子特異的にサイレンシングするＤＮＡザイムを提供する。好ましくは、本発明は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡを対立遺伝子特異的にサイレンシングするＤＮＡザイムを提供し、より好ましくは、本発明は、配列番号１〜７を提供する。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡに対する結合アーム長が異なるが、結合部位が同一の他のＤＮＡザイムも提供することができる。実験結果に基づいて、配列番号１は、Ｔ７９０Ｍ保有癌細胞に対して最も有効な抗増殖効果を示した。ＤＮＡザイムの詳細を、以下に記載する：
１０−２３触媒コア配列：ＧＧＣＴＡＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡ（配列番号１６）。
８−１７触媒コア配列：ＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡ（配列番号１７）。
【化１】
0006574136.tif 000002
【００５３】
別の態様では、本発明は、本発明の核酸分子のいずれかをコードする配列を含むベクターを提供する。本発明は、さらに、宿主中にベクターを含む宿主を提供する。本発明は、なおさらに、核酸分子のいずれかを産生する方法であって、いずれかの触媒核酸分子をコードする配列を含むベクターを細胞内に有する細胞を前記細胞による核酸分子の発現が可能な条件下で培養する工程を含む、方法を提供する。発現させるための細胞培養方法および発現させるための条件は、当該分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと。かかる方法は、任意選択的に、核酸産物を回収するさらなる工程を含むことができる。
【００５４】
本発明はまた、本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列、ベクターまたは宿主、および薬学的に許容され得るキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００５５】
本発明の組成物を、単剤（単独）として使用することができるか、さらに、ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体と組み合わせて使用することができる。ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターは、任意の１つまたは任意の数の以下の薬物（それらの全てが含まれる）を含むことができる：アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）、ＸＬ６４７（Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−（（（３ａＲ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル）メトキシ）キナゾリン−４−アミン）、ネラチニブ（ＨＫＩ−２７２）、ダコミチニブ（ＰＦ−００２９９８０４）、ＢＭＳ−６６９０５１４（（３Ｒ，４Ｒ）−４−アミノ−１−［［４−［（３−メトキシフェニル）アミノ］ピロロ［２，１−ｆ］［１，２，４］トリアジン−５−イル］メチル］ピペリジン−３−オール）、ゲフィチニブ、およびエルロチニブ。ＥＧＦＲ特異的抗体は、任意の１つまたは任意の数の以下の薬物（それらの全てが含まれる）を含むことができる：セツキシマブおよびパニツムマブ。したがって、本発明の薬学的組成物は、さらに、ＥＧＦＲ  ＴＫインヒビターおよび／またはＥＧＦＲ特異的抗体を含むことができる。
【００５６】
本発明の薬学的組成物を、当業者によく知られているであろう従来の薬学的技術にしたがって配合することができる。生理学的に許容され得るキャリア、賦形剤、および安定剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０．ｓｕｐ．ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（２０００）に記載されている。投与に望ましい調製形態に応じた種々の形態のキャリアを提供することができる。本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列、ベクター、宿主、および組成物を、全身または局所に投与することができる。全身という用語には、本明細書中で使用する場合、皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）注射、硝子体内注射、注入、吸入、経皮投与、経口投与、直腸投与、および術中滴下が含まれる。以下は、本発明の組成物のいくつかの例である。
【００５７】
経口送達のために、賦形剤処方物またはキャリア処方物は、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムおよび（ａ）結合剤（例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩（ａｌｉｇｎａｔｅ）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシア）、（ｂ）保湿剤（例えば、グリセロール）、（ｃ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモデンプンまたはタピオカデンプン、アルギン酸、一定のケイ酸複合体、および炭酸ナトリウム）、（ｄ）湿潤剤（例えば、セチルアルコール、およびグリセロールモノステアラート）、（ｅ）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイト）、（ｆ）充填剤（ラクトース、デンプン、サッカリド、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、および（ｇ）潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、またはその混合物などの不活性な慣用の成分またはキャリアを含むことができる。これらおよび他の適切な薬学的に許容され得る賦形剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄ．Ａｒｔｈｕｒ  Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９９）に記載されている。
【００５８】
非経口投与のために、ゴマ油またはピーナッツ油、水性プロピレングリコール、または滅菌水溶液に溶解した本発明のオリゴヌクレオチドもしくはその修飾された配列、ベクター、宿主、または薬学的組成物の溶液を使用することができる。かかる水溶液を必要に応じて適切に緩衝化し、液体希釈物を最初に十分な生理食塩水またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用される滅菌水性媒質は全て、当業者に公知の標準的技術によって容易に利用可能である。静脈内投与では、化合物を、生理学的に適合する物質（生理学的条件に適合する緩衝ｐＨを有する滅菌塩化ナトリウムなど）を含む適切な静脈内送達ビヒクル（例えば、生理食塩水）中に溶解することができる。注射用懸濁液も調製することができ、この場合、適切な液体キャリアおよび懸濁剤などを使用することができる。
【００５９】
局所送達のために、クリーム、ゲル、軟膏、またはエアロゾル軟膏を、典型的には、例えば固定油もしくは炭化水素（白色ペトロラタムまたは鉱油など）を含む油脂性基剤または、例えば、吸収性無水物質（例えば、脱水ラノリン）からなる吸収性基剤を使用して調製する。基剤の形成の後、所望の濃度の有効成分を添加する。
【００６０】
クリームは、一般に、典型的には固定油、および炭化水素（ワックス、ペトロラタム、および鉱油など）などを含む油相（内相）ならびに水および任意の水溶性物質（添加塩など）を含む水相（連続相）を含む。二相を、乳化剤（例えば、界面活性剤（ラウリル硫酸ナトリウムなど）；親水コロイド（アカシアコロイド粘土およびビーガム（ｂｅｅｇｕｍ）など））の使用によって安定化する。エマルジョン形成の際、有効成分を所望の濃度で添加する。
【００６１】
ゲルは、前述のような油脂性基剤、水、またはエマルジョン−懸濁液基剤から選択される基剤から構成される。基剤に、ゲル化剤を添加する。このゲル化剤は、基剤中にマトリックスを形成し、それによって半固体の硬さまでその粘度を増加させる。ゲル化剤の例は、ヒドロキシプロピルセルロース、およびアクリル酸ポリマーなどである。ゲル化剤の添加前に所望の濃度の有効成分を処方物に添加する。
【００６２】
直腸送達のために、適切な薬学的組成物は、例えば、局所調製物、坐剤、または浣腸である。坐剤を、脂肪性のエマルジョンまたは懸濁液から調製することが有利である。
【００６３】
１つのさらなる態様では、本発明は、ＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡを特異的に切断する方法であって、前記ｍＲＮＡを本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと、前記分子がｍＲＮＡを切断可能な条件下で接触させる工程を含む方法に関する。１つの実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡを特異的に切断する方法であって、前記ｍＲＮＡを本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと、前記分子が前記ｍＲＮＡを切断することが可能な条件下で接触させる工程を含む方法に関する。別の実施形態では、ＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡを特異的に切断する方法であって、前記ｍＲＮＡを本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと、前記分子が前記ｍＲＮＡを切断することが可能な条件下で接触させる工程を含む方法に関する。別のさらなる実施形態では、本発明は、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異ｍＲＮＡを特異的に切断する方法であって、前記ｍＲＮＡを本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと、前記分子が前記ｍＲＮＡを切断することが可能な条件下で接触させる工程を含む方法に関する。前述の条件は、当該分野で周知であり、生理学的条件が含まれる。本発明は、さらに、細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡを特異的に切断する方法であって、細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡを特異的に切断するために、前記ｍＲＮＡを含む細胞を本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかと接触させる工程を含む方法を提供する。ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡを含む細胞は、例えば、天然に存在する細胞またはトランスジェニック細胞であり得る。
【００６４】
本発明は、さらに、阻害しなければＥＧＦＲ変異タンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞を本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかと接触させて、前記細胞内のＥＧＦＲ変異タンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む方法を提供する。１つの実施形態では、本発明は、阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞を本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと接触させて、前記細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む方法に関する。別の実施形態では、本発明は、阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞を本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと接触させて、前記細胞内のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失タンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む方法に関する。別の実施形態では、本発明は、阻害しなければＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質を発現するであろう細胞内のＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異ｍＲＮＡの発現を特異的に阻害する方法であって、前記細胞を本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列のいずれかと接触させて、前記細胞内のＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒタンパク質の発現を特異的に阻害する工程を含む方法に関する。本発明は、さらに、被験体の細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質の発現を特異的に阻害する方法であって、被験体の細胞内のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍタンパク質の発現を特異的に阻害するのに有効な量の本発明のオリゴヌクレオチドのいずれかを被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００６５】
１つのさらに別の態様では、本発明は、被験体におけるＥＧＦＲ依存性癌の処置方法であって、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドまたはその修飾された配列を被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。本発明は、さらに、被験体におけるＥＧＦＲ依存性癌の処置方法であって、ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体および本発明のオリゴヌクレオチドを被験体に投与する工程を含む、方法を提供する。本発明によれば、ＴＫＩインヒビターまたはＥＧＦＲ特異的抗体および本発明のオリゴヌクレオチドを、同時、連続的、または個別に投与することができる。１つの実施形態では、ＥＧＦＲ依存性癌は、肺癌、好ましくは、ＮＳＣＬＣである。本発明によれば、本発明のオリゴヌクレオチドを、手術、放射線療法、または化学療法の後に施すアジュバント療法で使用することができる。
【００６６】
標的療法は、癌処置のための有効かつ有望な様式と証明されている。いくつかの習慣性の発癌経路は、ＥＧＦＲまたはＫＲＡＳなどの変異遺伝子が関与する。ＤＮＡザイムは、任意の遺伝子に対してその発現を異なる程度にサイレンシングするように作用することができる。さらに、そのｍＲＮＡ配列特異性により、ＤＮＡザイムは、他のｍＲＮＡをインタクトに保持しながら変異ｍＲＮＡの発現をノックダウンすることができる。この場合、対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、正常細胞に副作用を引き起こすことなく癌細胞を攻撃することができる。さらに、種々の研究により、遺伝子の転写物バリアントが相反する役割を有することができ、オルタナティブスプライシングが癌進行の主要な要因であることが公知であることが示されている。例えば、細胞の生存／アポトーシスに関連するＢｃｌ−ｘは、２つのアイソフォーム（Ｂｃｌ−ｘＬおよびＢｃｌ−ｘＳ）を有する。長い方のＢｃｌ−ｘＬアイソフォームはアポトーシスインヒビターとして作用するのに対して、短い方のＢｃｌ−ｘＳアイソフォームはアポトーシスアクチベーターとして作用する。特定のスプライスバリアントに対するＤＮＡザイムは、細胞生存経路を活性化することなく細胞アポトーシスを特異的に誘発することができる。さらに、ＤＮＡザイムは、抗ｍＲＮＡ核酸薬剤のうちのｓｉＲＮＡにとっては困難であった、ｍＲＮＡ発現のサイレンシングにおいて補体としての機能を果たすことができる。最近の研究により、ｍＲＮＡノックダウン効率が特定の細胞におけるｍＲＮＡの代謝回転に依存することが明らかとなった。換言すれば、短命の転写物はｓｉＲＮＡによるサイレンシングがより困難である。基質配列およびその到達性に応じて、８−１７ＤＮＡザイムの観察される反応速度定数が９．２分−１ほどの高さであり得るのに対して、ＲＩＳＣの速度定数は１．１分−１ほどの高さであり得る。ＤＮＡザイムは、その高速な動態学的反応に基づいてｓｉＲＮＡの代用物となり得る。
【００６７】
ｍＲＮＡ配列特異性を有する本発明の対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、他のｍＲＮＡをインタクトに保持しながら特定の変異ｍＲＮＡの発現をノックダウンするであろう。これらの対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、伝統的なチロシンキナーゼインヒビターより臨床的に有用であり、かつより優れた耐容性を示し得る。本発明で提供したＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対するこれらの対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、ＥＧＦＲ野生型ｍＲＮＡをインタクトに保持しながらＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ  ｍＲＮＡ発現をノックダウンするであろう。それ故、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対するこれらの対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムは、ＮＳＣＬＣ患者における正常細胞に対する望ましくない副作用を低下させながらＴ７９０Ｍ由来ＴＫＩ耐性を克服することができる。
【００６８】
本発明は、以下の実施例を参照してより深く理解されるが、当業者は、詳述した特定の実験が本発明の例示のみを目的とし、本発明はその後に続く特許請求の範囲においてより十分に記載されていると認識するであろう。
【実施例】
【００６９】
方法と材料
細胞培養
Ａ５４９（ＥＧＦＲ野生型）、ＣＬ１−５（ＥＧＦＲ野生型）、Ｈ１９７５（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）、およびＣＬ９７（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）を、５％ＣＯ２を使用して、１０％（ｖ／ｖ）熱失活ウシ胎児血清を補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＵＳＡ）中にて３７℃で培養した。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲおよび定量リアルタイムＰＣＲ
Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ１９７５、またはＣＬ９７を、６ウェル上に３×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。４８時間後、総ｍＲＮＡを、製造者のプロトコールにしたがってＭｅｓｔｒｉｓｏｌによってＤＮＡザイム処置細胞から抽出した。ｃＤＮＡを、プライマーとしてランダムヘキサマーを使用するＲＴ  ＩＩＩキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって合成した。ＰＣＲプライマーを、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＢｉｏＳｃｉ＆Ｔｅｃｈ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）によって合成した。ＰＣＲプライマーの配列を以下に列挙する。
ＥＧＦＲ：順方向プライマー：ＡＣＣＴＧＣＴＣＡＡＣＴＧＧＴＧＴＧＴＧ（配列番号２０）；逆方向プライマー：
ＣＣＡＡＴＧＣＣＡＴＣＣＡＣＴＴＧＡＴＡ（配列番号２１）
ＡＣＴＢ：順方向プライマー：ＴＣＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＧＣＴＡ（配列番号２２）；逆方向プライマー：ＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＡＣＴＴＧ（配列番号２３）
【００７１】
ＰＣＲのパラメータは以下のとおりであった：９５℃で１０分間、次いで、９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７２℃で６０秒間のＰＣＲを２５サイクル。３％アガロースゲルを、ＰＣＲ産物の電気泳動のために使用した。バンド強度を、Ｉｍａｇｅ  Ｊによって定量した。定量ＲＴ−ＰＣＲを、４０ｎｇの総ｍＲＮＡに対してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して行った。ＰＣＲミックスは、５μｌの２×Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒミックス、１００ｎＭのＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、２００ｎＭの順方向プライマーおよび逆方向プライマー、０．１ｕｌのＲＮＡｓｅｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および０．０２５ｕｌのＲＴＩＩＩ酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を総体積１０μｌで含んでいた。ＰＣＲパラメータは以下のとおりであった：５０℃で４０分間、次いで、９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、および７２℃で２秒間のＰＣＲを４５サイクル。データを、ＬＣ４８０ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって分析した。ＥＧＦＲｍＲＮＡの相対量を、ＡＣＴＢｍＲＮＡに対して正規化した。ＰＣＲプライマーの配列は以下である。
ＥＧＦＲ：順方向プライマー：ＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２４）；逆方向プライマー：ＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣ（配列番号２５）
ＡＣＴＢ：順方向プライマー：ＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣ（配列番号２６）；逆方向プライマー：ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴ（配列番号２７）
【００７２】
ウェスタン免疫ブロッティング
Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ１９７５、またはＣＬ９７を、６ウェル上に３×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。トランスフェクトしたＡ５４９およびＣＬ１−５細胞を、２４時間血清飢餓状態にし、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦにて３７℃で１５分間処置した。トランスフェクションの７２時間後、細胞を分析のために回収した。細胞を、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、次いで、総タンパク質を、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液によって抽出した。上清由来の５０μｇの総タンパク質を、９５℃で５分間ボイルした。サンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース膜上に移した。ＥＧＦＲ発現および下流シグナル伝達を、１０００倍希釈のヒトｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｔＥＧＦＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｔＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｔＡＫＴ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ｐＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ｔＥＲＫ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および切断ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に特異的な一次抗体ならびに１００００倍希釈のβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）に特異的な一次抗体をそれぞれ使用して検出した。ウサギＩｇＧまたはマウスＩｇＧに対する二次抗体を、５０００倍希釈で使用した。膜上のタンパク質バンドを、化学発光基質への曝露によって視覚化した。
【００７３】
細胞増殖アッセイ
Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ１９７５、またはＣＬ９７を、６ウェル上に播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。細胞をトリプシン処理し、トランスフェクションの０時間後、２４時間後、４８時間後、または７２時間後にカウントした。
【００７４】
アポトーシスアッセイ
Ｈ１９７５またはＣＬ９７を、１０ｃｍ皿上に播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。４８時間後、細胞を回収し、アネキシンＶおよびＰＩで二重染色し、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＤｅａｄ  ｃｅｌｌアポトーシスキットのプロトコールにしたがってフローサイトメトリーによって分析した。
【００７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍発生アッセイ
８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、２×１０６個のＨ１９７５細胞を皮下接種した。７日後、マウスを、各群中に１０匹のマウスからなる２群（ＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１）に無作為に分けた。リポフェクタミン２０００と混合した５００ピコモルのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１を、実験が完了するまで１週間に２回の頻度で腫瘍内に注射した。腫瘍サイズを、３〜４日毎に測定した。全動物研究を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａによって承認されたプロトコールにしたがって行った。マウスの屠殺後、腫瘍組織を切り取り、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。異種移植片腫瘍スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡で分析した。
【００７６】
統計的分析
データを、平均±ＳＤで示す。両側Ｐ＜０．０５を有する全統計検定は、統計的に有意とみなした。
【００７７】
実施例１  ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対するＤＮＡザイムの合成
２つのＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイム（以後、ＤｚＴ７９０Ｍ−１およびＤｚＴ７９０Ｍ−２という）は、触媒コア中に１５個のデオキシリボヌクレオチドを含む１０−２３サブタイプである。ＤｚＴ７９０Ｍの結合アーム領域内の配列は、ＣからＵへのヌクレオチド置換であるＴ７９０Ｍ変異を保有するＥＧＦＲのｍＲＮＡ配列と相補的である。ＤｚＴ７９０Ｍ−１では、ｍＲＮＡ切断部位は、単一ヌクレオチド変異から４ヌクレオチド離れている（Ａｂｄｅｌｇａｎｙ，２００５）。ＤｚＴ７９０Ｍ−１の配列がＴ７９０Ｍ変異を保有するｍＲＮＡと完全に適合する一方で、ＤｚＴ７９０Ｍ−１は野生型ｍＲＮＡと１ヌクレオチドミスマッチを形成する。他方では、野生型Ｔ７９０ＭよりもむしろＴ７９０Ｍ  ｍＲＮＡに対するＤｚＴ７９０Ｍ−２の対立遺伝子特異性は、異なるヌクレオチド接合に対するＤＮＡザイムの異なる反応速度に基づく。以前の研究（Ｃａｉｒｎｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｋｉｎｇ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｌ．Ｑ．２００３．Ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐａｉｒｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＲＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ｐｕｒｉｎｅ−ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：２８８３−２８８９）によれば、１０−２３骨格を有するＤＮＡザイムは、シミュレーションした生理学的条件下でのＡＣ接合と比較して高いＡＵ接合に対する切断速度を示した。それ故、ＤｚＴ７９０Ｍ−２は、野生型ｍＲＮＡと比較して高いＴ７９０Ｍ  ｍＲＮＡに対する切断速度を示し得る。その上、コントロールＤＮＡザイム（ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ）の配列は、ヒト細胞内の任意のｍＲＮＡと相補的でない。ホスホロチオエート結合（下線）を、ヌクレアーゼ分解に耐性を示すためにＤＮＡザイムの両末端に導入する。ＤＮＡ配列を、以下に列挙する（図１）。
【化２】
0006574136.tif 000003
【００７８】
実施例２  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムによるＥＧＦＲｍＲＮＡ発現レベルの減衰
ＤｚＴ７９０Ｍ−１の対立遺伝子選択性を試験するために、ＥＧＦＲｍＲＮＡノックダウン効率を、野生型ＥＧＦＲを保有する２つの細胞株（Ａ５４９、ＣＬ１−５）およびＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異を含む２つの細胞株（Ｈ１９７５、ＣＬ９７）において検出した。Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ１９７５、またはＣＬ９７を、６ウェル上に３×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。４８時間後、総ｍＲＮＡを抽出した。図２Ａでは、リアルタイムＰＣＲの結果は、ＤｚＴ７９０Ｍ−１がＨ１９７５細胞およびＣＬ９７細胞においてＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲｍＲＮＡの発現を有意にサイレンシングし（それぞれ、３２％および５４％のｍＲＮＡ発現が残存した）、一方で、野生型ＥＧＦＲｍＲＮＡ発現はＡ５４９細胞およびＣＬ１−５細胞において阻害されなかった（それぞれ、１２１％および９５％のｍＲＮＡ発現が残存した）ことを示した。類似の結果が定量リアルタイムＰＣＲで確認された（図２Ｂ）。ＤｚＴ７９０Ｍ−１は、Ｈ１９７５細胞およびＣＬ９７細胞においてそれぞれ６８．２％および７７．４％のＴ７９０Ｍ  ＥＧＦＲｍＲＮＡ発現をノックダウンした。対照的に、Ａ５４９細胞およびＣＬ１−５細胞では、たった１．１％および１９．２％の野生型ＥＧＦＲｍＲＮＡ発現しか影響を受けなかった。ＤｚＴ７９０Ｍ−１は、Ｔ７９０Ｍ  ＥＧＦＲｍＲＮＡに対してその野生型対応物よりも少なくとも３．５倍増加したノックダウン効率を示した。
【００７９】
実施例３  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムによる総ＥＧＦＲ発現および下流ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害
ＥＧＦＲは、受容体型チロシンキナーゼに属する。その細胞外リガンドの結合により、受容体二量体化、チロシン残基リン酸化、および下流シグナル伝達活性化（シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）、Ａｋｔ、および細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）などが含まれる）を誘発する。ＥＧＦＲのタンパク質発現レベルおよびその下流シグナル伝達に及ぼすＤｚＴ７９０Ｍの影響を試験するために、ウェスタン免疫ブロッティングを、ＤｚＴ７９０Ｍをトランスフェクトした細胞に対して行った。Ａ５４９、ＣＬ１−５、Ｈ１９７５、またはＣＬ９７を、６ウェル上に３×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。トランスフェクトされたＡ５４９細胞およびＣＬ１−５細胞を、２４時間血清飢餓状態にし、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦにて３７℃で１５分間処置した。トランスフェクション７２時間後に分析のために細胞を回収した。細胞を氷冷ＰＢＳによって２回洗浄し、次いで、総タンパク質を、プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＩＰＡ緩衝液によって抽出した。野生型ＥＧＦＲを保有する細胞株（Ａ５４９およびＣＬ１−５）では、ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ群と比較してＤｚＴ７９０Ｍ−１またはＤｚＴ７９０Ｍ−２のトランスフェクション後にＥＧＦＲのタンパク質レベルは減少しなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。また、ＥＧＦ処置後の下流のＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫシグナル伝達の活性化は、ＤｚＴ７９０Ｍ−１またはＤｚＴ７９０Ｍ−２のトランスフェクションによって阻害されなかった。対照的に、ＤｚＴ７９０Ｍ−１は、両方のＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体細胞株（Ｈ１９７５およびＣＬ９７）においてＥＧＦＲタンパク質発現を有意にサイレンシングした。ＤｚＴ７９０Ｍ−１でトランスフェクトしたＨ１９７５細胞およびＣＬ９７細胞では、ＥＧＦＲ上のチロシン残基１０６８、ＳＴＡＴ３上のチロシン残基７０５、ＡＫＴ上のセリン残基４７３、およびＥＲＫ上のトレオニン残基２０２／チロシン残基２０４（Ｈ１９７５細胞では検出されなかった）のリン酸化の減少が検出された（図３Ｃおよび３Ｄ）。ＤｚＴ７９０Ｍ−２でトランスフェクトしたＨ１９７５細胞において類似の結果が確認された。
【００８０】
実施例４  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムによる細胞アポトーシスの誘導
ＥＧＦＲおよび下流シグナル伝達経路は、重要な細胞機能（細胞増殖および生存が含まれる）を調節する。細胞生存に対するＤｚＴ７９０Ｍ−１の機能的影響を試験するために、それぞれＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１でのトランスフェクション後に細胞を計数した。Ａ５４９細胞およびＣＬ１−５細胞（ＥＧＦＲ野生型）では、細胞増殖速度または細胞数は、ＤｚＣｏｎｔｒｏｌおよびＤｚＴ７９０Ｍ−１でトランスフェクトされた群の間で異ならなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。Ｈ１９７５細胞およびＣＬ９７細胞（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）では、ＤｚＴ７９０Ｍ−１処置細胞数は減少した際に、ＤｚＣｏｎｔｒｏｌでトランスフェクトされた細胞はトランスフェクション後に成長し続けた（図４Ｃおよび４Ｄ）。ＤｚＴ７９０Ｍ−１処置細胞が細胞アポトーシスを受けたかどうかを明らかにするために、ＰＡＲＰの切断された形態に対する免疫ブロッティングならびにアネキシンＶおよびＰＩの免疫染色を行った。カスパーゼ−３活性の増加によってＰＡＲＰが切断され、この切断が細胞アポトーシスのマーカーとしての機能を果たす。結果は、ＤｚＴ７９０Ｍ−１シグナル伝達がＥＧＦＲのタンパク質発現を有意にノックダウンする場合、Ｈ１９７５細胞およびＣＬ９７細胞においてＤｚＣｏｎｔｒｏｌ処置群と比較して切断ＰＡＲＰレベルがの増加が検出されることを示した（図４Ｅ）。ＤｚＣｏｎｔｒｏｌでトランスフェクトされたＨ１９７５細胞においてたった３．６％の細胞しかアポトーシスを経験せず、かつ１２．４％の細胞が死滅した一方で、ＤｚＴ７９０Ｍ−１処置群において１８．６％の細胞がアポトーシス細胞として検出され、かつ３２．６％の細胞がアネキシンＶおよびＰＩに二重陽性を示した（図４Ｆ）。結果は、ＤｚＴ７９０Ｍ−１が細胞アポトーシスを有意に誘導したことを示した。ＣＬ９７細胞において類似の結果が確認された（図４Ｅおよび４Ｆ）。ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ処置群と比較して、ＤｚＴ７９０Ｍ−１処置は、細胞集団全体においてアポトーシス細胞の割合（５．２％から２７．４％）および死細胞の割合（１７％から２５．１）を劇的に増加させた。
【００８１】
実施例５  Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムによるＥＧＦＲシグナル伝達のノックダウンおよび異種移植片腫瘍成長の阻害
８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、２×１０６個のＨ１９７５細胞を皮下接種した。７日後、マウスを、各群中に１０匹のマウスからなる２群（ＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１）に無作為に分けた。リポフェクタミン２０００と混合した５００ピコモルのＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１を、実験が完了するまで１週間に２回の頻度で腫瘍内に注射した。腫瘍サイズを、３〜４日毎に測定した。結果は、Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムが腫瘍内注射後に腫瘍成長を有意に抑制したことを示した（図５Ａ）。マウスの屠殺後、腫瘍組織を切り取り、１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。異種移植片腫瘍スライドをヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、顕微鏡で分析した。ＤｚＴ７９０Ｍ−１で処置した腫瘍組織において重度の壊死が検出された一方で、ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ処置群における腫瘍組織はインタクトなままであった（図５Ｂ）。ＥＧＦＲ発現および下流シグナル伝達に対するＤｚＴ７９０Ｍ−１の影響を評価するために、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスから採取した腫瘍をウェスタンブロッティングのために処理した。結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの異種移植片腫瘍組織における総ＥＧＦＲ発現、下流のｐＥＧＦＲ、ｐＳＴＡＴ３、ｐＡＫＴ、ｐＥＲＫの発現が有意に抑制されたことを示した（図５Ｃ）。
【００８２】
実施例６  コレステロール修飾した、Ｔ７９０Ｍ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイムおよびその抗増殖効果の増大
材料と方法
細胞生存性アッセイ
ＣＬ１−５（ＥＧＦＲ野生型）またはＨ１９７５（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）を、１２ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う１００ｎＭのコレステロール修飾ＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で７２時間個別に処置した。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回リンスし、５０μｌのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で３時間のインキュベーション後、ＭＴＴ溶液をＤＭＳＯと置換した。細胞増殖を、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍでの吸光度によって測定した。
【００８３】
ウェスタンブロッティング
ＣＬ１−５（ＥＧＦＲ野生型）またはＨ１９７５（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）を、６ウェル上に３×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う５０ｎＭのコレステロール修飾ＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。トランスフェクトされたＣＬ１−５細胞を、２４時間血清飢餓状態にし、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦにて３７℃で１５分間処置した。トランスフェクション７２時間後、上記手順にしたがってウェスタンブロッティング分析のために細胞を回収した。ＥＧＦＲの発現および下流シグナル伝達を、１０００倍希釈のヒトｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）、ｔＥＧＦＲ、ｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）、ｔＳＴＡＴ３、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｔＡＫＴ、ｐＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、およびｔＥＲＫに対する一次抗体ならびに１００００倍希釈のβ−アクチンに対する一次抗体によってそれぞれ試験した。
【００８４】
ｓｉＲＮＡまたはアンタゴミアのコレステロール修飾は、これらの治療薬のエンドソーム回避能力を増大させることが証明されている。それ故、発明者らは、ＤＮＡザイムの３’末端上にコレステロール−ＴＥＧ基を付加させた（図６Ａ）。リポフェクタミントランスフェクションにより、コレステロール修飾したＤＮＡザイムは、非コレステロール修飾群と比較して、Ｈ１９７５（ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ）において抗増殖効果が５０％から８０％に有意に増加した（図６Ｂ）。また、このコレステロール修飾ＤＮＡザイムは、依然としてその対立遺伝子特異性が維持され、ＣＬ１−５細胞（ＥＧＦＲ野生型）において細胞生存率に影響を及ぼさなかった（図６Ｂ）。さらに、ＥＧＦＲ発現および下流シグナル伝達に対する対立遺伝子特異的阻害効果を、Ｔ７９０Ｍ保有細胞において、非コレステロール修飾ＤｚＴ７９０Ｍ−１と比較してコレステロール修飾ＤｚＴ７９０Ｍ−１の半用量投与によって得ることができるが、野生型発現細胞においては得ることができない（図６Ｃおよび６Ｄ）。
【００８５】
実施例７  アファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）でのコレステロール修飾ＤｚＴ７９０Ｍの併用処置
材料と方法
Ｈ１９７５を６ウェル上に３×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う５０ｎＭのコレステロール修飾ＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で個別に処置した。同時に、ＤＭＳＯまたは１００ｎＭのＢＩＢＷ２９９２を培養培地中に添加した。トランスフェクション７２時間後、上記手順にしたがってウェスタンブロッティング分析のために細胞を回収した。ＥＧＦＲの発現および下流シグナル伝達を、１０００倍希釈のヒトｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）、ｔＥＧＦＲ、ｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）、ｔＳＴＡＴ３、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）、ｔＡＫＴ、ｐＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）、およびｔＥＲＫならびに１００００倍希釈のβ−アクチンに対する一次抗体によってそれぞれ試験した。
【００８６】
細胞生存率アッセイ
Ｈ１９７５を、１２ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、ＤＭＳＯまたは１００ｎＭのＢＩＢＷ２９９２と組み合わせた、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を伴う５０ｎＭのコレステロール修飾ＤｚＣｏｎｔｒｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１で細胞を７２時間個別に処置した。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回リンスし、５０μｌのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で３時間のインキュベーション後、ＭＴＴ溶液をＤＭＳＯと置換した。細胞増殖を、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍでの吸光度によって測定した。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍発生アッセイ
８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウスに、２×１０６個のＨ１９７５細胞を皮下接種した。１０日後、マウスを、各群中に１０匹のマウスからなる以下の４群に無作為に分けた：（１）ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ−ｃｈｏｌ＋ＰＢＳ、（２）ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ−ｃｈｏｌ＋ＢＩＢＷ２９９２、（３）ＤｚＴ７９０Ｍ−１−ｃｈｏｌ＋ＰＢＳ、および（４）ＤｚＴ７９０Ｍ−１−ｃｈｏｌ＋ＢＩＢＷ２９９２。コレステロール修飾ＤＮＡザイム処置のために、リポフェクタミン２０００と混合した５００ピコモルのＤｚＣｏｎｔｒｏｌ−ｃｈｏｌまたはＤｚＴ７９０Ｍ−１−ｃｈｏｌを、実験が完了するまで１週間に２回の頻度で腫瘍内に注射した。ＢＩＢＷ２９９２処置のために、ＢＩＢＷ２９９２をＰＢＳに懸濁し、経口経管栄養によって２０ｍｇ／ｋｇマウスにて実験が完了するまで１週間に３回の頻度で投与した。腫瘍サイズを、３〜４日毎に測定した。全ての動物研究を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａによって承認されたプロトコールにしたがって行った。
【００８８】
コレステロール修飾ＤｚＴ７９０Ｍ−１を、単剤として使用することができるか、あるいは、ＥＧＦＲ  ＴＫＩまたはＥＧＦＲ特異的抗体などの他の臨床薬とさらに組み合わせて使用することができる。本発明では、Ｔ７９０Ｍ由来薬物耐性に対するコレステロール修飾されたＤｚＴ７９０Ｍ−１およびアファチニブ（ＢＩＢＷ２９９２）の併用処置の有効性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの両方において評価した。コレステロール修飾ＤｚＴ７９０Ｍが総ＥＧＦＲ、ｐＥＧＦＲ（Ｙ１０６８）、およびｐＳＴＡＴ３（Ｙ７０５）の発現を有意にサイレンシングした一方で、ｐＡＫＴ（Ｓ４７３）およびｐＥＲＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）のレベルはわずかに抑制された。他方では、ＥＧＦＲおよびｐＳＴＡＴ３の総レベルが影響を受けなかったところ、ＢＩＢＷ２９９２は、ｐＥＧＦＲ、ｐＡＫＴ、およびｐＥＲＫの発現を劇的に阻害した。コレステロール修飾ＤｚＴ７９０ＭのＢＩＢＷ２９９２との併用処置により、ＥＧＦＲ発現および下流のＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫのシグナル伝達にさらなる阻害効果が得られた（図７Ａ）。さらに、ＥＧＦＲ野生型細胞の細胞生存率がわずかしか影響を受けなかったところ、ＢＩＢＷ２９９２のコレステロール修飾ＤｚＴ７９０Ｍとの併用処置により、用量依存様式でＴ７９０Ｍ保有細胞の細胞死が誘発された（図７Ｂ）。さらに、併用療法の実現可能性を、異種移植片動物モデルで評価した。コントロール群と比較して、３つ全ての薬物処置群において腫瘍成長速度が異なるレベルで阻害された。併用処置群は、異種移植腫瘍成長を抑制する効力が最も高かった（図７Ｃ）。要約すると、コレステロール修飾ＤｚＴ７９０ＭのＢＩＢＷ２９９２との併用処置により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＧＦＲシグナル伝達およびＴ７９０Ｍ保有癌細胞の生存率が有意に抑制され、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長が阻害された。
【００８９】
実施例８  Ｅ７４６−Ａ７５０欠損またはＬ８５８Ｒ変異に対する対立遺伝子特異的ＤＮＡザイム
Ｅ７４６−Ａ７５０欠失に対するＤＮＡザイム
ＤＮＡザイム：ＤｚＥＧＦＲ＿ΔＥ７４６−Ａ７５０（ＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＴＧＡＴＡＧＣＧＡＣ；配列番号８）を、以下のＥＧＦＲ  Ｅ７４６−Ａ７５０欠失のｍＲＮＡ配列に基づいてデザインした。
【化３】
0006574136.tif 000004
【００９０】
Ｌ８５８Ｒ変異に対するＤＮＡザイム
７種のＤＮＡザイムを、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異体のｍＲＮＡ配列に基づいてデザインした。
【化４−１】
0006574136.tif 000005
【化４−２】
0006574136.tif 000006
【００９１】
ＤＮＡザイム配列を、以下に列挙する。
ＤｚＬ８５８Ｒ−１：ＴＴＴＧＧＣＣＡＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＣＣＡＡＡＡＴ（配列番号９）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−２：ＧＴＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡ（配列番号１０）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−３：ＧＣＣＣＧＣＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴ（配列番号１１）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−４：ＧＧＣＣＣＧＣＣＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧ（配列番号１２）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−５：ＴＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＡＧＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＣＡＡＡＡＴＣ（配列番号１３）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−６：ＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＧＣＣＣＧＣＣＣ（配列番号１４）；
ＤｚＬ８５８Ｒ−７：ＣＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＧＡＡＧＧＣＣＣＧＣＣ（配列番号１５）
【００９２】
Ａ５４９細胞、ＰＣ９細胞、およびＨ１９７５細胞を、１２ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、Ａ５４９細胞およびＰＣ９細胞を、リポフェクタミン２０００を伴う５０、１００、または１５０ｎＭのコントロールＤＮＡザイムまたはＤｚＥＧＦＲ＿ΔＥ７４６−Ａ７５０で４８時間個別に処置した。Ａ５４９細胞およびＨ１９７５細胞を、リポフェクタミン２０００を伴う１００ｎＭのコントロールＤＮＡザイムまたは異なるＤｚＬ８５８Ｒで４８時間個別に処置した。製造者のプロトコールにしたがった従来のＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）法によってＲＮＡを精製した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して４０ｎｇの総ｍＲＮＡに対して定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲミックスは、５μｌの２×ＰｒｏｂｅＭａｓｔｅｒミックス、１００ｎＭのＵＰＬプローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｐｅｎｚｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および２００ｎＭのプライマー（各々）を総体積１０μｌで含んでいた。ＰＣＲ条件は、９５℃で１０分間、その後、９５℃で１０秒間、６０℃で１０秒間、および７２℃で２秒間を６０サイクルであった。データを、ＬＣ４８０ソフトウェア（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって分析した。ＥＧＦＲｍＲＮＡの相対量を、ＡＣＴＢｍＲＮＡに対して正規化した。ＰＣＲプライマーの配列は以下である。
ＥＧＦＲ：順方向プライマー：ＡＣＡＴＣＴＣＣＧＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＡ（配列番号２４）；逆方向プライマー：ＣＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＣ（配列番号２５）
ＡＣＴＢ：順方向プライマー：ＡＴＴＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＧＧＴＴＣ（配列番号２６）；逆方向プライマー：
ＧＧＡＴＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＡＴ（配列番号２７）
【００９３】
Ａ５４９細胞およびＰＣ９細胞を、１２ウェルプレート中に１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養した。次いで、細胞を、リポフェクタミン２０００を伴う５０、１００、または１５０ｎＭのコントロールＤＮＡザイムまたはＤｚＥＧＦＲ＿ΔＥ７４６−Ａ７５０で４８時間個別に処置した。細胞をＰＢＳ緩衝液で３回リンスし、５０μｌのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）を添加した。３７℃で３時間のインキュベーション後、ＭＴＴ溶液をＤＭＳＯと置換した。細胞増殖を、マイクロプレートリーダーを使用して５７０ｎｍでの吸光度によって測定した。
【００９４】
２つの細胞株（Ａ５４９（野生型ＥＧＦＲ）およびＰＣ９（Ｅ７４６−Ａ７５０欠失ＥＧＦＲ））を実験で使用した。Ａ５４９細胞およびＰＣ９細胞の両方から抽出したＥＧＦＲｍＲＮＡを配列決定し、結果は文献報告と合致した。サイドアーム配列がΔΕ７４６−Α７５０配列に相補的なＤｚＥＧＦＲ＿ΔＥ７４６−Ａ７５０は、野生型ＥＧＦＲに結合せず作用しなかった。他方では、変異体ＥＧＦＲ発現は、ＤｚＥＧＦＲ＿ΔＥ７４６−Ａ７５０によって抑制され、その結果、６０％のＰＣ９細胞が死滅し、一方、ＤｚＣｏｎｔｒｏｌ処置群を使用した場合、ｍＲＮＡが１００％発現し、ＰＣ９細胞の死滅は０％であった（図８Ａ）。Ａ５４９細胞の生存率は、１５０ｎＭのＤＮＡザイムによってわずかに（２０％）影響を受けた（図８Ｂ）。ＤＮＡザイムを、細胞に有毒であり得る高濃度のリポフェクタミン２０００でトランスフェクトした。しかし、この毒性は、送達系の変更またはＤＮＡザイム構造の修飾によって克服することができる。
【００９５】
図９に示すように、Ｌ８５８Ｒ  ＤＮＡザイムは、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ変異体を保有するＨ１９７５細胞株のＥＧＦＲｍＲＮＡ発現を選択的かつ有意にサイレンシングした。対照的に、Ｌ８５８Ｒ  ＤＮＡザイムは、Ａ５４９細胞株（野生型ＥＧＦＲ）においてＥＧＦＲのｍＲＮＡ発現にほとんど影響を及ぼさなかった。
【００９６】
実施例９  ＤｚＴまたはｃＤｚＴ処置は、Ｔ７９０Ｍ変異体細胞株においてＥＧＦ媒介シグナル伝達を抑制する
Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞およびＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞を、ＤｚＣまたはＤｚＴでのトランスフェクションの７２時間後に回収した。潜在的なＥＧＦ媒介シグナル伝達を、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの添加によって活性化し、１５分後に細胞ライセートを回収した。
【００９７】
ＥＧＦ処置後、ＤｚＣ処置群およびＤｚＴ処置群の両方は、Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲにおいて、ＥＧＦ処置を用いなかった２群と比較して、ＥＧＦＲ、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化レベルの上昇を示した（図１０、左のパネル）。このデータは、Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲにおけるＥＧＦ媒介シグナル伝達の首尾の良い活性化を示す。この条件下で、ＤｚＴは、ＥＧＦＲタンパク質発現および下流シグナル伝達（ＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３、およびＥＲＫが含まれるが、ＡＫＴは含まれない）に対する抑制効果を保持していた。類似の結果がＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞株で検出された（図１０、右のパネル）。ｃＤｚＴ処置Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞では、ｃＤｚＴ処置により、ＥＧＦ処置後にＥＧＦＲタンパク質発現および下流シグナル伝達（ＥＧＦＲ、ＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫが含まれる）が阻害された（図１１）。
【００９８】
実施例１０  ＤｚＴまたはｃＤｚＴ処置は、Ｔ７９０Ｍ変異体細胞株においてＥＧＦ媒介シグナル伝達を抑制する
Ｈ１９７５細胞およびＣＬ９７細胞を、培養培地に添加した２５、５０、７５、１００、１５０、２５０ｎＭのＢＩＢＷ−２９９２またはＤＭＳＯ（ビヒクルコントロール）と共に２５、５０ｎＭのｃＤｚＣまたはｃＤｚＴで処置した。処置７２時間後、細胞生存率を監視するためにＭＴＴアッセイを行った。併用係数（ＣＩ）値を、ＣｏｍｐｕＳｙｎバージョン３．０．１ソフトウェア（ＣｏｍｂｏＳｙｎ，Ｉｎｃ．，Ｐａｒａｍｕｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）を使用して以下のＣｈｏｕ−ＴａｌａｌａｙのＣＩ式によって計算した。
【化５】
0006574136.tif 000007
【００９９】
（Ｄｘ）１は細胞生存率をｘ％阻害するｃＤｚＴのみの用量であり、（Ｄｘ）２は細胞生存率をｘ％阻害するＢＩＢＷ−２９９２のみの用量である。ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の処置を併用した場合に得られるｘ％阻害において、（Ｄ）１はｃＤｚＴの部分であり、（Ｄ）２はＢＩＢＷ−２９９２の部分である。Ｆａ−ＣＩプロットのｘ軸上の「影響を受けた割合（Ｆａ）」は、薬物で処置された細胞における細胞生存率が阻害された割合を示した。１超、１、および１未満のＣＩ値は、それぞれ、拮抗作用、相加効果、および相乗効果を示す。
【０１００】
最適ではない濃度で、個々の薬物は、下流シグナル伝達を効率的に抑制しなかった（図１２）。この濃度で、ＣＬ９７ＴＭ／ＧＡにおいてｃＤｚＴのみでは主にＥＧＦＲリン酸化、ＥＧＦＲ発現、およびＳＴＡＴ３シグナル伝達を阻害した。ＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞においてＢＩＢＷ−２９９２のみでＥＧＦＲのリン酸化レベルを抑制した。ＣＬ９７ＴＭ／ＧＡにおいてＥＲＫシグナル伝達が抑制された。対照的に、併用処置は、全下流エフェクター（ＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化が含まれる）を有意に抑制した。
【０１０１】
結果は、ＢＩＢＷ−２９９２がＨ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞およびＣＬ９７ＴＭ／ＧＡ細胞の両方において濃度依存様式でｃＤｚＴの細胞死滅効果を増強することを示した（図１３ａおよび１３ｃ）。Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲにおけるＣＩ値はおよそ０．４〜０．６である（図１３ｂ）一方で、ＣＬ９７ＴＭ／ＧＡにおけるＣＩ値はおよそ０．５〜０．７であった（図１３ｄ）。これらのデータから、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置がＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体を保有する細胞において細胞生存率に相乗阻害効果を発揮することが示唆された。
【０１０２】
実施例１１  ｉｎ  ｖｉｖｏでのｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２を使用した併用処置の相乗抗腫瘍効果
全動物研究を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａによって承認されたプロトコールにしたがって行った。８週齢のＢａｌｂ／ｃヌードマウス（ＢｉｏＬＡＳＣＯ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）に、２×１０６個のＨ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞を皮下接種した（０日目）。併用処置研究では、マウスを１０日目に４群に無作為に分け、以下の薬物または薬物の組み合わせを投与した：（１）ｃＤｚＣ、（２）ｃＤｚＣ＋ＢＩＢＷ−２９９２、（３）ｃＤｚＴ、または（４）ｃＤｚＴ＋ＢＩＢＷ−２９９２。リポフェクタミン２０００と混合したＣｈｏｌ−ＴＥＧ修飾ＤＮＡザイム（５００ピコモル）を、１週間に２回腫瘍内注射した。ＢＩＢＷ−２９９２をＰＢＳに懸濁し、経口経管栄養によって２０ｍｇ／ｋｇを１週間に３回投与した。腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）を３〜４日毎にノギスを使用して測定し、腫瘍体積を（Ｌ×Ｗ２）／２として計算した。マウスの屠殺後、腫瘍組織を切り取った。腫瘍の小切片を免疫ブロット用に処理し、残りの腫瘍組織を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋した。異種移植片腫瘍スライドをヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）、抗ＥＧＦＲ（Ｌ８５８Ｒ変異体特異的；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、および抗カスパーゼ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）で染色した。
【０１０３】
異種移植片動物モデルにおいてｃＤｚＴおよび  ＢＩＢＷ−２９９２の相乗効果も認められた。コントロール群（ｃＤｚＣ）と比較して、３つの薬物処置群（ｃＤｚＣ＋ＢＩＢＷ−２９９２、ｃＤｚＴ、およびｃＤｚＴ＋ＢＩＢＷ−２９９２）全ては、Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞由来の腫瘍成長を異なる程度に阻害した（図１４ａ）。ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の併用処置は、異種移植片腫瘍成長の抑制において全ての処置のうちで効力が最も高かった。この群では、切り取った腫瘍の平均サイズは、コントロール群のおよそ１／４であった。腫瘍組織の免疫組織化学的分析により、併用処置群由来の腫瘍組織において重度の壊死が認められたが、コントロール群由来の組織では壊死が認められなかった（図１４ｂ、上のパネル）。Ｈ１９７５ＴＭ／ＬＲ細胞中のＥＧＦＲはＬ８５８Ｒ変異およびＴ７９０Ｍ変異の両方を含み、したがって、Ｌ８５８Ｒ変異体形態に特異的な抗体を使用して検出することができる。併用処置群由来の腫瘍切片は、コントロール群由来の切片と比較して、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ発現レベルが低く、同時にカスパーゼ−３タンパク質発現レベルが高かった（図１４ｃ、中央および下のパネル）。腫瘍組織を、ＥＧＦＲ発現および下流シグナル伝達についても評価した。結果は、コントロール群と比較してｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の組み合わせが総ＥＧＦＲ発現、腫瘍細胞におけるＥＧＦＲのリン酸化、ならびにＳＴＡＴ３、ＡＫＴ、およびＥＲＫのリン酸化形態レベルをさらに抑制することを示した（図１４ｄ）。まとめると、これらの結果は、ｃＤｚＴおよびＢＩＢＷ−２９９２の組み合わせがＥＧＦＲタンパク質発現および下流シグナル伝達を相乗的に阻害し、それによってＴ７９０Ｍ保有細胞のアポトーシスを誘発し、異種移植片腫瘍成長を抑制することを示す。
【図１Ａ】
0006574136.tif 000008
【図１Ｂ】
0006574136.tif 000009
【図２Ａ】
0006574136.tif 000010
【図２Ｂ】
0006574136.tif 000011
【図３Ａ】
0006574136.tif 000012
【図３Ｂ】
0006574136.tif 000013
【図３Ｃ】
0006574136.tif 000014
【図３Ｄ】
0006574136.tif 000015
【図４Ａ】
0006574136.tif 000016
【図４Ｂ】
0006574136.tif 000017
【図４Ｃ】
0006574136.tif 000018
【図４Ｄ】
0006574136.tif 000019
【図４Ｅ】
0006574136.tif 000020
【図４Ｆ】
0006574136.tif 000021
【図５Ａ】
0006574136.tif 000022
【図５Ｂ】
0006574136.tif 000023
【図５Ｃ】
0006574136.tif 000024
【図６Ａ】
0006574136.tif 000025
【図６Ｂ】
0006574136.tif 000026
【図６Ｃ】
0006574136.tif 000027
【図６Ｄ】
0006574136.tif 000028
【図７Ａ】
0006574136.tif 000029
【図７Ｂ】
0006574136.tif 000030
【図７Ｃ】
0006574136.tif 000031
【図８Ａ】
0006574136.tif 000032
【図８Ｂ】
0006574136.tif 000033
【図９】
0006574136.tif 000034
【図１０】
0006574136.tif 000035
【図１１】
0006574136.tif 000036
【図１２】
0006574136.tif 000037
【図１３Ａ】
0006574136.tif 000038
【図１３Ｂ】
0006574136.tif 000039
【図１３Ｃ】
0006574136.tif 000040
【図１３Ｄ】
0006574136.tif 000041
【図１４Ａ】
0006574136.tif 000042
【図１４Ｂ】
0006574136.tif 000043
【図１４Ｃ】
0006574136.tif 000044
【配列表】
0006574136000001.app