(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子であって、
ａ）配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のうちのいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を有し、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ、および
ｂ）配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡであって、前記ＤＮＡは異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されている、組換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
前記ＤＮＡは、配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のいずれかのＤＮＡ配列と少なくとも９０％の配列同一性を有し、遺伝子調節活性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記ＤＮＡは、配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のいずれかのＤＮＡ配列と少なくとも９５％の配列同一性を有し、遺伝子調節活性を有する、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記異種性の転写可能なＤＮＡ分子は、農学上関心対象の遺伝子を含む、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５】
前記農学上関心対象の遺伝子は、植物における除草剤耐性を与える、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項６】
前記農学上関心対象の遺伝子は、植物における昆虫抵抗性を与える、請求項４に記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項７】
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、
ａ）配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有し、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ、および
ｂ）配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のいずれかを含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡからなる群から選択されるＤＮＡであって、前記ＤＮＡは、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されている、トランスジェニック植物細胞。
【請求項８】
前記トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である、請求項７に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項９】
前記トランスジェニック植物細胞は、双子葉植物細胞である、請求項７に記載のトランスジェニック植物細胞。
【請求項１０】
ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部分であって、
ａ）配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のいずれかと少なくとも９０％の配列同一性を有し、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ、および
ｂ）配列番号１〜８、１０〜１９、２１〜２２、２４〜２７および２９〜３１のいずれかを含むＤＮＡ配列を有するＤＮＡ
からなる群から選択されるＤＮＡであって、前記ＤＮＡは、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されている、トランスジェニック植物またはその部分。
【請求項１１】
前記トランスジェニック植物の子孫植物またはその部分は、前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック植物の子孫植物。
【請求項１２】
前記トランスジェニック植物の種子は前記組換えＤＮＡ分子を含む、請求項１０に記載のトランスジェニック植物の種子。
【請求項１３】
請求項１０に記載のトランスジェニック植物またはその部分を得ること、およびそこから商品用産物を生産することを含む、商品用産物を生産する方法。
【請求項１４】
前記商品用産物は、タンパク質濃縮物、タンパク質分離物、穀粒、デンプン、種子、食品、粉類、バイオマスまたは種子油である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
トランスジェニック植物を作出する方法であって、
ａ）形質転換した植物細胞を産生するために、請求項１に記載の組換えＤＮＡ分子を用いて植物細胞を形質転換すること、および
ｂ）前記形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２０１３年３月１４日出願の米国仮出願番号第６１／７８５，２６８号の利益を請求する。
【０００２】
（配列表の組み込み）
５２．７キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）において測定された大きさ）であり、かつ２０１４年３月１１日に作成されたファイル名「ＭＯＮＳ３３２ＷＯ．ｔｘｔ」に含まれている配列表は、本明細書とともに電子提出によって出願され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
（本発明の分野）
本発明は、植物における遺伝子発現を調節するのに有用な植物分子生物学、植物遺伝子工学、およびＤＮＡ分子の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
調節エレメントは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節することによって遺伝子活性を調節する遺伝的要素である。このようなエレメントにはプロモーター、リーダー、イントロン、および３’非翻訳領域を含み、植物分子生物学および植物遺伝子工学の分野において有用である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、植物における使用のための新規の調節エレメント、ならびに当該調節エレメントを含む植物およびコンストラクトを提供する。本発明はまた、当該調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、および種子を提供する。本明細書に開示される一実施形態において、調節エレメントは、転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されている。ある実施形態において、当該転写可能なＤＮＡ分子は、当該調節配列に関して異種性である。また、当該調節エレメントを含むコンストラクト、ならびに当該調節エレメントに関して異種性である転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された当該調節エレメントを含むトランスジェニック植物細胞、植物、および種子を含む、本明細書に開示される調節エレメントを作製および使用するための方法も本明細書が提供される。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、（ａ）配列番号１〜３７のうちのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号１〜３７のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および（ｃ）配列番号１〜３７のうちのいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を提供し、この中で、当該ＤＮＡ配列は、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結される。「異種性の転写可能なＤＮＡ分子」によって意図されるのは、当該転写可能なＤＮＡ分子が、当該ＤＮＡ分子が操作可能に連結されている当該ＤＮＡ配列に関して異種性であることである。具体的な実施形態において、当該組換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜３７のうちのいずれかのＤＮＡ配列と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を含む。詳細な実施形態において、当該異種性の転写可能なＤＮＡ分子は、植物における除草剤抵抗性または病虫害抵抗性を提供することのできる遺伝子などの農学上関心対象の遺伝子を含む。さらに他の実施形態において、本発明は、本明細書に提供されるような組換えＤＮＡ分子を含むコンストラクトを提供する。
【０００７】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、（ａ）配列番号１〜３７のうちのいずれかと少なくとも約８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号１〜３７のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および（ｃ）配列番号１〜３７のうちのいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物細胞であって、この中で、当該断片は遺伝子調節活性を有し、この中で当該ＤＮＡ配列は異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結される。ある実施形態において、当該トランスジェニック植物細胞は、単子葉植物細胞である。他の実施形態において、当該トランスジェニック植物細胞は、双子葉植物細胞である。
【０００８】
さらにまた別の態様において、本明細書にさらに提供されるのは、（ａ）配列番号１〜３７のうちのいずれかと少なくとも８５％の配列同一性を有するＤＮＡ配列、（ｂ）配列番号１〜３７のうちのいずれかを含むＤＮＡ配列、および（ｃ）配列番号１〜３７のうちのいずれかの断片からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物またはその部分であって、この中で当該断片は遺伝子調節活性を有し、この中で当該ＤＮＡ配列は異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結される。具体的な実施形態において、当該トランスジェニック植物は、出発トランスジェニック植物に対する何らかの世代の子孫植物であり、当該組換えＤＮＡ分子を含む。生育した場合にこのようなトランスジェニック植物を作出する組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック種子も本明細書で提供される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物またはその部分を得ること、および当該トランスジェニック植物またはその部分から商品用産物を生産することを含む、商品用産物を生産する方法を提供する。一実施形態において、当該商品用産物とは、加工した種子、穀粒、植物部分、および食品である。
【００１０】
さらにまた別の態様において、本発明は、形質転換した植物細胞を産生するために本発明の組換えＤＮＡ分子を用いて植物細胞を形質転換すること、および当該形質転換した植物細胞からトランスジェニック植物を再生することを含む、本発明の組換えＤＮＡ分子を含むトランスジェニック植物を作出する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の発現カセットの配置を示す。
【００１２】
（配列の簡単な説明）
配列番号１〜３０、３８〜４１、４９および５６は３’ＵＴＲ配列である。
【００１３】
配列番号３１、３５、４２、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５４および５５は、イントロン配列へ操作可能に５’で連結されたリーダー配列へ操作可能に５’で連結されたプロモーター配列、または、リーダー配列へ操作可能に５’で連結されたプロモーター配列を含む、調節発現エレメント群（ＥＸＰ）のＤＮＡ配列である。
【００１４】
配列番号３２、３６、および４３は、プロモーター配列である。
【００１５】
配列番号３３および３７は、リーダー配列である。
【００１６】
配列番号３４は、イントロン配列である。
【００１７】
配列番号４４は、加工可能なイントロンを有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）についてのコード配列である。
【００１８】
配列番号４５および４６は、ルシフェラーゼコード配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、植物における遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を提供する。これらのＤＮＡ分子のヌクレオチド配列は配列番号１〜３７として提供される。これらのＤＮＡ分子は、植物組織における操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響することができ、それゆえ、トランスジェニック植物において操作可能に連結された導入遺伝子の遺伝子発現を調節する。本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物細胞、植物、植物部分および種子を含む組成物、ならびにこれらを調製および使用するための方法を提供する。
【００２０】
以下の定義および方法は、本発明をより良好に定義するよう、および本発明の実施において当業者を誘導するよう提供される。別段の記載がない限り、用語は、関連技術分野における当業者による従来の使用法に従って理解されることになっている。
【００２１】
ＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」は、ゲノム起源または合成起源の二本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、デオキシリボヌクレオチド塩基の重合体を指す。本明細書で使用する場合、用語「ＤＮＡ配列」は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列に対するものである。本明細書で使用する命名法は、合衆国法典の特許、商標および著作権に関する連邦規則第１．８２２条の命名法に対応し、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５（１９９８）、補遺２、表１および表３における表に示されている。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「組換えＤＮＡ分子」とは、人間の介在無しでは互いに天然に生じることがないであろうＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子である。例えば、組換えＤＮＡ分子は、互いに関して異種性の少なくとも２つのＤＮＡ分子から構成されたＤＮＡ分子、天然に存在するＤＮＡ配列から逸脱するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子、または遺伝子形質転換によって宿主細胞のＤＮＡへと組み込まれたＤＮＡ分子であってもよい。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「配列同一性」とは、２つの最適に整列したＤＮＡ配列が同一である程度を指す。最適な配列整列化は、２つの配列、例えば、基準配列および別のＤＮＡ配列を手動で整列させて、適切な内部ヌクレオチド挿入、欠失、または間隙を伴う配列整列化におけるヌクレオチドの一致数を最大限にすることによってなされる。本明細書で使用する場合、用語「基準配列」とは、配列番号１〜３７として提供されたＤＮＡ配列を指す。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「パーセント配列同一性」または「パーセント同一性」または「％同一性」とは、１００を乗じられた同一性分率である。基準配列と最適に整列したＤＮＡ配列についての「同一性分率」とは、基準配列におけるヌクレオチドの総数、例えば完全な基準配列の全長におけるヌクレオチドの総数によって除された最適な整列化におけるヌクレオチド一致数である。したがって、本発明の一実施形態は、配列番号１〜３７として本明細書に提供される基準配列に対して最適に整列した場合に、基準配列と少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約８６％％の同一性、少なくとも約８７％の同一性、少なくとも約８８％の同一性、少なくとも約８９％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、少なくとも約９９％の同一性、または少なくとも約１００％の同一性を有するＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００２５】
調節エレメント
プロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロン、および転写終結領域（もしくは３’ＵＴＲ）などの調節エレメントは、生細胞における遺伝子の全体的な発現における統合部分を担っている。用語「調節エレメント」とは、本明細書で使用する場合、遺伝子調節活性を有するＤＮＡ分子を指す。用語「遺伝子調節活性」とは、本明細書で使用する場合、例えば操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写および／または翻訳に影響することによって、当該操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現に影響する能力を指す。植物において機能するプロモーター、リーダー、エンハンサー、イントロンおよび３’ＵＴＲなどの調節エレメントはそれゆえ、遺伝子工学を通じて植物の表現型を修飾するのに有用である。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「調節発現エレメント群」または「ＥＸＰ」配列とは、エンハンサー、プロモーター、リーダー、およびイントロンなどの操作可能に連結された調節エレメントの群を指してもよい。したがって、調節発現エレメント群は、例えば、リーダー配列へ５’で操作可能に連結されたプロモーターから構成されてもよく、これが順にイントロン配列へ５’で操作可能に連結される。
【００２７】
調節エレメントは、その遺伝子発現パターン、例えば、恒常的、時間的、空間的、発達上の、組織の、環境の、生理学的、病理学的、細胞周期の、および／もしくは化学的に応答性のある発現、ならびにこれらの何らかの組み合わせによって、ならびに定量的もしくは定性的なによって示度によって特徴づけられることがある。本明細書で使用する場合、「遺伝子発現パターン」とは、操作可能に連結されたＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子への転写に関する何らかのパターンである。転写されたＲＮＡ分子は、タンパク質分子を生成するよう翻訳されもよく、またはアンチセンス分子もしくは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびこれらに類するものなど、他の調節ＲＮＡ分子を提供してもよい。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質発現」とは、転写されたＲＮＡ分子からタンパク質分子への翻訳に関する何らかのパターンである。タンパク質発現は、時間的、空間的、発達上の、もしくは形態学的な量によって、および定量的もしくは定性的な示度によって特徴づけられてもよい。
【００２９】
プロモーターは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして有用である。本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」とは概して、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼＩＩおよび、トランス作用型転写因子などの他のタンパク質の認識および結合に関与するＤＮＡ分子を指す。プロモーターは、遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）から初期的に識別され得る。あるいは、プロモーターは、合成で生成されたまたは操作されたＤＮＡ分子であってもよい。プロモーターはまた、キメラであってもよい。キメラプロモーターは、２つ以上の異種性ＤＮＡ分子の融合を通じて生成される。本発明を実施する上で有用なプロモーターには、その断片またはバリアントを含む配列番号３２および３６を含む。本発明の具体的な実施形態において、請求されるＤＮＡ分子および本明細書に説明されるようなその何らかのバリアントまたは誘導体は、プロモーター活性を含むものとしてさらに定義され、すなわち、トランスジェニック植物などにおける宿主細胞におけるプロモーターとして作用することができる。さらなる具体的な実施形態において、断片は、由来する出発プロモーター分子によって有されるプロモーター活性を呈示するものとして定義してもよく、または断片は、基本レベルの転写を提供しかつ転写の開始のためのＲＮＡポリメラーゼＩＩの認識および結合のためのＴＡＴＡボックスまたは等価のＤＮＡ配列から構成された「最小プロモーター」を含んでもよい。
【００３０】
一実施形態において、本明細書に開示されるプロモーター配列の断片が提供される。プロモーター断片は、先に説明したようにプロモーター活性を含んでいてもよく、単独で、またはキメラプロモーターを構築するなどの上で他のプロモーターおよびプロモーター断片と組み合わせで、あるいは他のＥＸＰおよびＥＸＰ断片と組み合わせで有用であってもよい。具体的な実施形態において、本明細書に開示されるようなプロモーター活性を有するＤＮＡ分子の少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１２５、少なくとも約１５０、少なくとも約１７５、少なくとも約２００、少なくとも約２２５、少なくとも約２５０、少なくとも約２７５、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約７５０、少なくとも約８００、少なくとも約９００、または少なくとも約１０００の連続したヌクレオチドまたはそれより長いものを含むプロモーターの断片が提供される。このような断片を出発プロモーター分子から生成するための方法は、当該技術分野で周知である。
【００３１】
内部のもしくは５’の欠失など、配列番号３２および３６として呈されるプロモーターのうちの何らかに由来する組成物は、例えば、発現に及ぼす正もしくは負のいずれかの効果を有する要素を除去すること、発現に及ぼす正もしくは負の効果を有する要素を複製すること、および／または発現に及ぼす組織特異的もしくは細胞特異的な効果を有する要素を複製もしくは除去することによって発現を改善もしくは変更するために、当該技術分野で周知の方法を用いて生成することができる。ＴＡＴＡボックスエレメントまたはその等価の配列および下流の配列が除去された３’での欠失から構成された、配列番号３２および３６として呈されるプロモーターのうちのいずれかに由来する組成物を使用して、例えば、エンハンサーエレメントを作ることができる。さらなる欠失は、発現に及ぼす正もしくは負の、組織特異的、細胞特異的、もしくはタイミング特異的（概日リズムなどだがこれに限定されない。）な効果を有する何らかのエレメントを除去するために行うことができる。配列番号３２および３６として呈されるプロモーターのうちの何らか、およびそこから由来する断片もしくはエンハンサーを使用して、キメラ転写調節エレメント組成物を作ることができる。
【００３２】
本発明に従って、プロモーターまたはプロモーター断片は、公知のプロモーターエレメント、すなわち、ＴＡＴＡボックスおよび他の公知の転写因子結合部位モチーフなどの、ＤＮＡ配列特徴の存在について分析されてもよい。このような公知のプロモーターエレメントの識別は、元のプロモーターと類似の発現パターンを有するプロモーターのバリアントを設計するために、当業者によって使用されてもよい。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「リーダー」とは、遺伝子の非翻訳５’領域（５’ＵＴＲ）から識別されるＤＮＡ分子を指し、概して、転写出発部位（ＴＳＳ）とタンパク質コード配列出発部位の間のヌクレオチドセグメントとして定義される。あるいは、リーダーは、合成で生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。リーダーは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための５’調節エレメントとして使用することができる。リーダー分子は、異種性のプロモーターとともにまたはその天然のプロモーターとともに使用してもよい。本発明を実施する上で有用なリーダーには、配列番号３３および３７またはその断片もしくはバリアントを含む。具体的な実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、例えば、トランスジェニック植物細胞を含む宿主細胞におけるリーダーとして作用することができるものとして定義してもよい。一実施形態において、このようなＤＮＡ配列は、リーダー活性を含むものとして解読されてもよい。
【００３４】
配列番号３３および３７として呈されるリーダー配列は、調節エレメントから構成されてもよく、または操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に及ぼす効果を有することのできる二次構造を採用してもよい。配列番号３３および３７として呈されるリーダー配列は本発明に従って使用して、操作可能に連結されたＤＮＡ分子の転写もしくは翻訳に影響するキメラ調節エレメントを作ることができる。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「イントロン」とは概して、遺伝子から識別されてもよくかつ翻訳の前に伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）プロセシングの間にスプライスして外れる領域として定義されてもよいＤＮＡ分子を指す。あるいは、イントロンは、合成で生成または操作されたＤＮＡエレメントであってもよい。イントロンは、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための調節エレメントとして使用してもよい。コンストラクトはイントロンを含んでいてもよく、当該イントロンは、転写可能なＤＮＡ分子に関して異種性であってもよくまたは異種性でなくてもよい。当該技術分野におけるイントロンの例として、コメアクチンイントロンおよびトウモロコシＨＳＰ７０イントロンがある。
【００３６】
植物において、遺伝子コンストラクトにおけるいくつかのイントロンの包含は、当該イントロンを欠失するコンストラクトと比較して高いｍＲＮＡおよびタンパク質の蓄積をもたらす。この効果は、遺伝子発現の「イントロン仲介性亢進」（ＩＭＥ）と呼ばれる。植物における発現を刺激することが公知のイントロンは、トウモロコシ遺伝子において（例えば、ｔｕｂＡ１、Ａｄｈ１、Ｓｈ１、およびＵｂｉ１）、コメ遺伝子において（例えば、ｔｐｉ）、ならびにペチュニア（例えば、ｒｂｃＳ）、ジャガイモ（例えば、ｓｔ−ｌｓ１）由来およびシロイヌナズナ（例えば、ｕｂｑ３およびｐａｔ１）由来のもののような双子葉植物遺伝子においてすでに識別されている。イントロンのスプライシング部位内の欠失もしくは突然変異が遺伝子発現を低下させることはすでに示されており、このことは、スプライシングがＩＭＥに必要かもしれないことを示す。しかしながら、双子葉植物におけるＩＭＥは、シロイヌナズナ由来のｐａｔ１遺伝子のスプライシング部位内の点突然変異によって示されている。１つの植物における同じイントロンの複数回使用は、ある状況においては、不利を呈することが示されている。それらの場合において、適切な組換えＤＮＡエレメントの構築のための基本制御エレメントの収集を有することは必要である。
【００３７】
本発明を実施する上で有用なイントロンは、配列番号３４を含む。配列番号３４として呈されるイントロンに由来する組成物は、シス調節エレメントの内部の欠失もしくは複製から構成することができ、ならびに／またはイントロン／エキソンスプライシング接合部を含む５’および３’ＤＮＡ配列の変化は、プロモーター＋リーダーもしくはキメラプロモーター＋リーダーおよびコード配列へ操作可能に連結された場合、発現もしくは発現の特異性を改善するよう使用することができる。伝令ＲＮＡから最終転写産物へのプロセシングの間に望ましくない開始コドンが形成される可能性を排除するために、イントロン／エキソン境界配列を修飾する場合、ヌクレオチド配列ＡＴまたはヌクレオチドＡをスプライシング部位（ＧＴ）の５’末端の直前に、およびヌクレオチドＧまたはヌクレオチド配列ＴＧをそれぞれスプライシング部位（ＡＧ）の３’末端の直後に使用するのを回避することは有益かもしれない。イントロンの５’末端または３’末端スプライシング接合部位の周りのＤＮＡ配列はしたがって、この様式で修飾することができる。本明細書に説明されるようにおよび当該技術分野で公知の方法を通じて変化したイントロンおよびイントロンバリアントは、作業実施例において説明したように経験的に検査して、操作可能に連結されたＤＮＡ分子の発現に及ぼすイントロンの効果を判定することができる。また、イントロン／エキソンスプライシング接合部を含む５’領域および３’領域の変化を生じて、伝令ＲＮＡのプロセシングおよびスプライシングの後に結果として生じる転写産物において誤った開始コドンおよび誤った停止コドンの導入が生じる可能性を低下させることができる。イントロンは、作業実施例において説明するように経験的に検査して、導入遺伝子の発現に及ぼすイントロンの効果を判定することができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「３’転写終結分子」、「３’非翻訳領域」または「３’ＵＴＲ」とは、ｍＲＮＡ分子の３’部分の非翻訳領域への転写中に使用されるＤＮＡ分子を指す。ｍＲＮＡ分子の３’非翻訳領域は、特異的開裂およびポリＡ尾部としても公知の３’ポリアデニル化によって生じてもよい。３’ＵＴＲは、転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されて当該ＤＮＡ分子の下流に位置してもよく、ポリアデニル化シグナルおよび転写、ｍＲＮＡプロセシング、または遺伝子発現に影響することにできる他の調節シグナルを含んでもよい。ポリＡ尾部は、ｍＲＮＡの安定性において、および翻訳の開始において機能すると考えられている。当該技術分野における３’転写終結分子の例は、ノパリンシンターゼの３’領域、コムギｈｓｐ１７の３’領域、エンドウマメリブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニットの３’領域、ワタＥ６の３’領域、およびコイキシン（ｃｏｉｘｉｎ）の３’ＵＴＲである。
【００３９】
３’ＵＴＲによって、典型的には、特異的ＤＮＡ分子の組換え発現のための有益な使用が見出される。弱い３’ＵＴＲは、リードスルーを生じる能力を有し、このことは、隣接する発現カセットに位置するＤＮＡ分子の発現に影響するかもしれない。転写終止の適切な制御は、下流に局在するＤＮＡ配列（例えば、他の発現カセット）へのリードスルーを防止することができ、さらに、ＲＮＡポリメラーゼの効率的な再利用が遺伝子発現を改善することを可能にすることができる。転写の効率的な終止（ＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩの放出）は、転写の再開のための前提条件であり、それにより全体的な転写レベルに直接影響する。転写終結の後、成熟ｍＲＮＡは、合成部位から放出され、テンプレートは細胞質へと輸送される。真核生物ｍＲＮＡは、インビボでポリ（Ａ）形態として蓄積され、そのことによって、従来の方法によって転写終結部位を検出することは困難となる。しかしながら、バイオインフォマティクス法による機能的かつ効率的な３’ＵＴＲの予測は、有効な３’ＵＴＲの容易な予測を許容するであろう保存されたＤＮＡ配列がほとんどない点で困難である可能性がある。
【００４０】
実務的な見地から、発現カセットにおいて使用される３’ＵＴＲが次の特徴を有することは典型的には有益である。３’ＵＴＲは、導入遺伝子の転写を効率的かつ有効に終結することができるべきであり、かつある転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）、またはＴ−ＤＮＡが挿入した隣接する染色体ＤＮＡに存在する多重発現カセットにおけるような別の発現カセットから構成することのできる何らかの隣接するＤＮＡ配列への転写産物のリードスルーを防止することができるべきである。植物生物工学において、３’ＵＴＲはしばしば、形質転換した植物から抽出される逆転写したＲＮＡの増幅反応の刺激に使用され、かつ（１）植物染色体へ一旦組み込まれた発現カセットの転写活性または発現を評価するために、（２）当該植物ＤＮＡ内の挿入のコピー数を評価するために、および（３）育種後に結果として生じる種子の接合状態を評価するために使用される。３’ＵＴＲはまた、挿入されたカセットの無傷性を特徴づけるために、形質転換された植物から抽出されたＤＮＡの増幅反応において使用される。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「エンハンサー」または「エンハンサーエレメント」とは、全体的な発現パターンの態様を与えるが、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写を駆動するために単独では通常不十分な、シス作用性調節エレメント、別名シスエレメントを指す。プロモーターと違い、エンハンサーエレメントは通常、転写開始部位（ＴＳＳ）あるいはＴＡＴＡボックスまたは等価のＤＮＡ配列を含まない。プロモーターまたはプロモーター断片は、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の転写に影響する１つ以上のエンハンサーエレメントを天然に含んでもよい。エンハンサーエレメントはまた、プロモーターへ融合してキメラプロモーターシスエレメントを生成してもよく、このことが遺伝子発現の全体的な調節の態様を与える。
【００４２】
多くのプロモーターエンハンサーエレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質を結合しおよび／またはＤＮＡトポロジーに影響すると考えられており、ＤＮＡテンプレートへのＲＮＡポリメラーゼのアクセスを選択的に許容または制限し、あるいは転写開始部位における二重らせんの選択的開口を容易にする局所的なコンフォメーションを生じる。エンハンサーエレメントは、転写を調節する転写因子を結合するよう機能し得る。いくつかのエンハンサーエレメントは、１つを超える転写因子を結合し、転写因子は、１つを超えるエンハンサードメインと異なる親和性で相互作用し得る。エンハンサーエレメントは、欠失分析、すなわち５’末端からまたはプロモーターに対して内部の１つ以上のヌクレオチドを欠失すること、ＤＮａｓｅ  Ｉフットプリント法を用いるＤＮＡ結合タンパク質分析、メチル化干渉、電気泳動移動度−シフトアッセイ、ライゲ―ション仲介性ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるインビボでのゲノムフットプリント法、および他の従来のアッセイを含むいくつかの技術によって、あるいはＢＬＡＳＴなどの従来のＤＮＡ配列比較法を用いて標的配列または標的モチーフとして公知のシスエレメントモチーフまたはエンハンサーエレメントを用いるＤＮＡ配列類似性分析によって識別することができる。エンハンサードメインの微細構造は、１つ以上のヌクレオチドの突然変異誘発（または置換）によって、または当該技術分野で公知の他の従来法によってさらに研究することができる。エンハンサーエレメントは、化学合成によってまたはこのようなエレメントを含む調節エレメントからの分離によって得ることができ、当該エレメントは、有用な制限酵素部位を含有してその後の操作を容易にする追加的な隣接するヌクレオチドを用いて合成することができる。したがって、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための、本明細書に開示される方法によるエンハンサーエレメントの設計、構築、および使用は、本発明によって包含される。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「キメラの」とは、第一のＤＮＡ分子を第二のＤＮＡ分子と融合させることによって生成される単一のＤＮＡ分子を指し、ここで、第一のＤＮＡ分子も第二のＤＮＡ分子もその立体配置で正常に見られず、すなわち、もう一方に融合している。キメラＤＮＡ分子はしたがって、天然では通常見出されない新たなＤＮＡ分子である。本明細書で使用する場合、用語「キメラプロモーター」とは、ＤＮＡ分子のこのような操作を通じて生成されるプロモーターを指す。キメラプロモーターは、２つ以上のＤＮＡ断片、例えば、プロモーターのエンハンサーエレメントへの融合を組み込んでもよい。したがって、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子の発現を調節するための本明細書に開示される方法によるキメラプロモーターの設計、構築、および使用は、本発明によって包含される。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「バリアント」とは、第一のＤＮＡ分子と組成においては類似しているが同一ではない、調節エレメントなどの第二のＤＮＡ分子を指し、この中で第二のＤＮＡ分子は、第一のＤＮＡ分子の一般的な機能性、すなわち同じまたは類似の発現パターンを、例えばより高いもしくはより低いもしくは等価の転写活性もしくは翻訳活性を通じてなおも維持する。バリアントは、第一のＤＮＡ分子のより短いもしくは先端を切ったバージョンならびに／あるいは、異なる制限酵素部位を有するものおよび／または内部の欠失、置換、および／もしくは挿入を有するもの第一のＤＮＡ分子の配列の変化したバージョンであってもよい。「バリアント」はまた、基準配列の1つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を含むヌクレオチド配列を有する調節エレメントを包含することができ、この中で、当該派生した調節セレメントは、対応する親調節分子よりも高いもしくは低いもしくは等価の転写活性もしくは翻訳活性を有する。調節エレメントの「バリアント」はまた、細菌細胞および植物細胞の形質転換中にまたはその結果として天然に生じる突然変異から生じるバリアントを包含する。本発明において、配列番号１〜３７として提供されるＤＮＡ配列を使用して、元の調節エレメントの一般的な機能性、すなわち同じまたは類似の発現パターンをなおも維持しながら、元の調節エレメントのＤＮＡ配列と組成では類似にあるが当該ＤＮＡ配列と同一ではないバリアントを作製してもよい。本発明のこのようなバリアントの生成は、本開示の点において当該技術分野の通常の技術内に十分あり、および本発明の範囲内に包含される。
【００４５】
キメラ調節エレメントは、制限酵素切断およびライゲ―ション、ライゲ―ション非依存性クローニング、増幅中のＰＣＲ産物のモジュール組み立て、または調節エレメントの直接的な化学合成などの当該技術分野で公知の種々の方法、ならびに当該技術分野で公知の他の方法によって操作上連結されてもよい種々の構成因子エレメントを含むよう設計することができる。結果として生じる種々のキメラ調節エレメントは、当該キメラ調節エレメント、またはそのバリアントからなることができるが、構成因子エレメントは、構成因子部分が操作上連結できる連結している１つのもしくは複数のＤＮＡ配列を含む１つのもしくは複数のＤＮＡ配列において異なる。本発明において、配列番号１〜３０または３１〜３７として提供されるＤＮＡ配列は、調節エレメント基準配列を提供し得、この中で、当該基準配列を含む構成因子エレメントは、当該技術分野で公知の方法によって接合してもよく、ならびに１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／もしくは挿入、または細菌細胞および植物細胞の形質転換において天然に生じる突然変異を含んでもよい。
【００４６】
特定の転写可能なＤＮＡ分子の所望の発現態様に及ぼす、本明細書に説明される修飾、重複または欠失の効力は、結果を確証するために本明細書の作業実施例において説明されるものなど、安定したおよび一過性の植物アッセイにおいて経験的に検査してもよく、当該結果は、出発ＤＮＡ分子においてなされた変化および変化の目標に応じて変わり得る。
【００４７】
コンストラクト
本明細書で使用する場合、用語「コンストラクト」とは、少なくとも１つのＤＮＡ分子が別のＤＮＡ分子へ、機能的に操作する様式で連結された、すなわち操作可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込みまたは自己複製が可能な、何らかの源に由来する、プラスミド、コスミド、ウイルス、ファージ、または直鎖もしくは環状のＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子などの、何らかの組換えＤＮＡ分子を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」は、形質転換、すなわち、異種性ＤＮＡまたはＲＮＡの宿主細胞への導入の目的に使用してもよい何らかのコンストラクトを意味する。コンストラクトには典型的には、１つ以上の発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「発現カセット」とは、１つ以上の調節エレメント、典型的には少なくともプロモーターおよび３’ＵＴＲへ操作可能に連結された少なくとも転写可能なＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子を指す。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「操作可能に連結された」とは、第二のＤＮＡ分子へ結合した第一のＤＮＡ分子を指し、この中で当該第一のおよび第二のＤＮＡ分子は、当該第一のＤＮＡ分子が当該第二のＤＮＡ分子の機能に影響するよう配置される。当該２つのＤＮＡ分子は、単一の連続したＤＮＡ分子の一部であってもよくまたはそうでなくてもよく、隣接していてもよくまたはそうでなくてもよい。例えば、プロモーターは、転写可能なＤＮＡ分子の転写または翻訳に影響することができる場合、当該転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結されている。
【００４９】
本発明のコンストラクトは、一実施形態において、アグロバクテリウム・ツメファシエンスによって提供される転移分子とともに、植物細胞のゲノムへのＴ−ＤＮＡの組み込みを可能にするＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスから単離された二重腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミドの右の太線領域（ＲＢまたはＡＧＲｔｕ．ＲＢ）および左の太線領域（ＬＢまたはＡＧＲｔｕ．ＬＢ）を有するＴｉプラスミド境界コンストラクトとして提供してもよい（例えば、米国特許第６，６０３，０６１号を参照されたい。）。当該コンストラクトはまた、細菌細胞における複製機能および抗生物質選択を提供するプラスミド骨格ＤＮＡセグメント、例えば、大腸菌のｏｒｉ３２２などの複製起点、ｏｒｉＶまたはｏｒｉＲｉなどの広範な宿主範囲の複製起点、およびスペクチノマイシンもしくはストレプトマイシン、またはゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）選択的マーカー遺伝子に対する耐性を与えるＴｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）についてコードするＳｐｅｃ／Ｓｔｒｐなどの選択可能なマーカーについてのコード領域を含有してもよい。植物の形質転換については、宿主細菌株はしばしば、アグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＢＩ、Ｃ５８、またはＬＢＡ４４０４であるが、植物の形質転換に関する当業者に公知の他の株は、本発明において機能することができる。
【００５０】
転写可能なＤＮＡ分子が、タンパク質として翻訳および発現する機能的ｍＲＮＡ分子へと転写されるような様式で、コンストラクトを組み立てて細胞へと導入するための方法は、当該技術分野で公知である。本発明の実施のために、コンストラクトおよび宿主細胞を調製および使用するための従来の組成物および方法は、当業者に周知である。例えば、より高次の植物における核酸の発現に有用な典型的なベクターは、当該技術分野で周知であり、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドおよびｐＣａＭＶＣＮ転移制御ベクターに由来するベクターを含む。
【００５１】
種々の調節エレメントは、本明細書に提供されるもののうちの何らかを含むコンストラクトに含まれてもよい。このような何らかの調節エレメントは、他の調節エレメントと組み合わせて提供してもよい。このような組み合わせは、望ましい調節特徴を生じるよう設計または改変することができる。一実施形態において、本発明のコンストラクトは、３’ＵＴＲへ操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された少なくとも１つの調節エレメントを含む。
【００５２】
本発明のコンストラクトは、本明細書に提供されるまたは当該技術分野で公知の何らかのプロモーターまたはリーダーを含んでもよい。例えば、本発明のプロモーターは、熱ショックタンパク質遺伝子に由来するものなど、異種性の非翻訳の５’リーダーへ操作可能に連結されてもよい。あるいは、本発明のリーダーは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写プロモーターなどの異種性プロモーターへ操作可能に連結してもよい。
【００５３】
発現カセットはまた、特に葉緑体、白色体、もしくは他のプラスミド小器官、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、液泡、または細胞外位置へ操作可能に連結されたタンパク質の細胞内標的化に有用なペプチドをコードする移行ペプチドコード配列を含んでもよい。多くの葉緑体局在性タンパク質は、前駆体として核遺伝子から発現し、葉緑体移行ペプチド（ＣＴＰ）によって葉緑体へ標的化される。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、リブロース−１，５，−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドリダクターゼ、光収穫複合体タンパク質Ｉおよびタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、ならびにエノールピルビルシキマートホスファートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）と結合しているものを含むが、これらに限定されない。葉緑体移行ペプチドは、例えば、米国特許第７，１９３，１３３号に説明されている。非葉緑体タンパク質が、非葉緑体タンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された異種性ＣＴＰの発現によって、葉緑体へ標的化されてもよいことは実証されている。
【００５４】
転写可能なＤＮＡ分子
本明細書で使用する場合、用語「転写可能なＤＮＡ分子」とは、タンパク質コード配列を有するものおよび遺伝子抑制に有用な配列を有するＲＮＡ分子を生成するものを含むがこれらに限定されない、ＲＮＡ分子へ転写することのできる何らかのＤＮＡ分子を指す。ＤＮＡ分子の種類には、同じ植物由来のＤＮＡ分子、別の植物由来のＤＮＡ分子、異なる生体由来のＤＮＡ分子、あるいは遺伝子のアンチセンスメッセージを含有するＤＮＡ分子または導入遺伝子の人工的な、合成の、もしくは修飾されたバージョンをコードするＤＮＡ分子などの合成ＤＮＡ分子を含むことができるが、これらに限定されない。本発明のコンストラクトへの組み込みのための例示的な転写可能なＤＮＡ分子には、例えば、ＤＮＡ分子が組み込まれた種以外の種に由来するＤＮＡ分子または遺伝子、あるいは、同じ種に由来するもしくは存在するが、古典的な育種技術よりもむしろ遺伝子工学法によって受け手細胞へと組み込まれる遺伝子を含む。
【００５５】
「導入遺伝子」とは、少なくとも宿主細胞ゲノムにおけるその位置に関する宿主細胞に対して異種性の転写可能なＤＮＡ分子、および／または当該細胞の現行世代もしくは何らかの先行世代における宿主細胞のゲノムへ人工的に組み込まれた転写可能なＤＮＡ分子を指す。
【００５６】
本発明のプロモーターなどの調節エレメントは、当該調節エレメントに関して異種性である転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結してもよい。本明細書で使用する場合、用語「異種性の」とは、２つ以上のＤＮＡ分子の組み合わせが通常では天然に認められない場合のこのような組み合わせを指す。例えば、当該２つのＤＮＡ分子は異なる種に由来してもよく、および／または当該２つのＤＮＡ分子は、異なる遺伝子、例えば、同じ種由来の異なる遺伝子、または異なる種由来の同じ遺伝子に由来してもよい。調節エレメントはしたがって、このような組み合わせが通常天然では認められない場合、すなわち、転写可能なｄＮＡ分子が調節エレメントへ操作可能に連結されるのが天然では生じない場合、操作可能に連結された転写可能なＤＮＡ分子に関して異種性である。
【００５７】
転写可能なＤＮＡ分子は概して、転写産物の発現が所望の何らかのＤＮＡ分子であってもよい。このような転写産物の発現は結果的に、結果的として生じるｍＲＮＡ分子の翻訳、したがってタンパク質の発現を生じてもよい。あるいは例えば、転写可能なＤＮＡ分子は、特異的な遺伝子もしくはタンパク質の発現低下を究極的に生じるよう設計してもよい。一実施形態において、このことは、アンチセンス方向に向いている転写可能なＤＮＡ分子を用いることによって達成してもよい。当業者は、このようなアンチセンス技術を用いることに精通している。何らかの遺伝子はこの様式で負に調節されてもよく、一実施形態において、転写可能なＤＮＡ分子は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現を通じての特異的な遺伝子の抑制について設計してもよい。
【００５８】
したがって、本発明の一実施形態は、当該コンストラクトがトランスジェニック植物細胞のゲノムに組み込まれる場合に所望の水準でまたは所望のパターンで転写可能なＤＮＡ分子の転写を調節するよう、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された、配列番号１〜３７として提供されるものなどの、本発明の調節エレメントを含む組換えＤＮＡ分子である。一実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、遺伝子のタンパク質コード領域を含み、別の実施形態では、転写可能なＤＮＡ分子は、遺伝子のアンチセンス領域を含む。
【００５９】
農学上関心対象の遺伝子
転写可能なＤＮＡ分子は、農学上関心対象の遺伝子であってもよい。本明細書で使用する場合、用語「農学上関心対象の遺伝子」とは、特定の植物の組織、細胞、または細胞型において発現した場合に所望の特徴を与える、転写可能なＤＮＡ分子を指す。農学上関心対象の遺伝子の産物は、植物の形態、生理学的状態、生育、発達、収量、穀粒組成、栄養特性、疾患もしくは病害虫への抵抗性、および／または環境上のもしくは化学的な耐性に及ぼす効果を生じるために、当該植物内で作用してもよく、あるいは、当該植物において供給する病害虫の食餌における殺虫薬として作用してもよい。本発明の一実施形態において、本発明の調節エレメントは、農学上関心対象の遺伝子である転写可能なＤＮＡ分子へ調節エレメントが操作可能に連結されるよう、コンストラクトへと組み込まれる。このようなコンストラクトを含有するトランスジェニック植物において、農学上関心対象の遺伝子の発現は、有益な農学的形質を与えることができる。有益な農学的形質には、例えば、除草剤耐性、昆虫駆除、改変された収量、疾患抵抗性、病原体抵抗性、改変された植物の生育および発達、改変されたデンプン含有量、改変された含油量、改変された脂肪酸含有量、改変されたタンパク質含有量、改変された果実成熟、亢進した動物およびヒトの栄養状態、生体高分子産生、環境ストレス抵抗性、医薬ペプチド、改善されたプロセシングの質、改善された風味、複合種子産生有用性、改善された繊維産生、ならびに所望のバイオ燃料産生を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００６０】
当該技術分野で公知の農学上関心対象の遺伝子の例としては、除草剤抵抗性（米国特許第６，８０３，５０１号、第６，４４８，４７６号、第６，２４８，８７６号、第６，２２５，１１４号、第６，１０７，５４９号、第５，８６６，７７５号、第５，８０４，４２５号、第５，６３３，４３５号、および第５，４６３，１７５号）、収量の増加（米国特許第ＵＳＲＥ３８，４４６号、第６，７１６，４７４号、第６，６６３，９０６号、第６，４７６，２９５号、第６，４４１，２７７号、第６，４２３，８２８号、第６，３９９，３３０号、第６，３７２，２１１号、第６，２３５，９７１号、第６，２２２，０９８号、および第５，７１６，８３７号）、昆虫駆除（米国特許第６，８０９，０７８号、第６，７１３，０６３号、第６，６８６，４５２号、第６，６５７，０４６号、第６，６４５，４９７号、第６，６４２，０３０号、第６，６３９，０５４号、第６，６２０，９８８号、第６，５９３，２９３号、第６，５５５，６５５号、第６，５３８，１０９号、第６，５３７，７５６号、第６，５２１，４４２号、第６，５０１，００９号、第６，４６８，５２３号、第６，３２６，３５１号、第６，３１３，３７８号、第６，２８４，９４９号、第６，２８１，０１６号、第６，２４８，５３６号、第６，２４２，２４１号、第６，２２１，６４９号、第６，１７７，６１５号、第６，１５６，５７３号、第６，１５３，８１４号、第６，１１０，４６４号、第６，０９３，６９５号、第６，０６３，７５６号、第６，０６３，５９７号、第６，０２３，０１３号、第５，９５９，０９１号、第５，９４２，６６４号、第５，９４２，６５８号、第５，８８０，２７５号、第５，７６３，２４５号、および第５，７６３，２４１号）、菌類病抵抗性（米国特許第６，６５３，２８０号、第６，５７３，３６１号、第６，５０６，９６２号、第６，３１６，４０７号、第６，２１５，０４８号、第５，５１６，６７１号、第５，７７３，６９６号、第６，１２１，４３６号、第６，３１６，４０７号、および第６，５０６，９６２号）、ウイルス抵抗性（米国特許第６，６１７，４９６号、第６，６０８，２４１号、第６，０１５，９４０号、第６，０１３，８６４号、第５，８５０，０２３号、および第５，３０４，７３０号）、線虫抵抗性（米国特許第６，２２８，９９２号）、細菌病抵抗性（米国特許第５，５１６，６７１号）、植物の生育および発達（米国特許第６，７２３，８９７号および第６，５１８，４８８号）、デンプン産生（米国特許第６，５３８，１８１号、第６，５３８，１７９号、第６，５３８，１７８号、第５，７５０，８７６号、第６，４７６，２９５号）、改変された産油性（米国特許第６，４４４，８７６号、第６，４２６，４４７号、および第６，３８０，４６２号）、高い産油性（米国特許第６，４９５，７３９号、第５，６０８，１４９号、第６，４８３，００８号、および第６，４７６，２９５号）、改変された脂肪酸含有量（米国特許第６，８２８，４７５号、第６，８２２，１４１号、第６，７７０，４６５号、第６，７０６，９５０号、第６，６６０，８４９号、第６，５９６，５３８号、第６，５８９，７６７号、第６，５３７，７５０号、第６，４８９，４６１号、および第６，４５９，０１８号）、高いタンパク質産生（米国特許第６，３８０，４６６号）、果実成熟（米国特許第５，５１２，４６６号）、高い動物およびヒトの栄養状態（米国特許第６，７２３，８３７号、第６，６５３，５３０号、第６，５４１２，５９号、第５，９８５，６０５号、および第６，１７１，６４０号）、生体高分子（米国特許第ＵＳＲＥ３７，５４３号、第６，２２８，６２３号、および第５，９５８，７４５号、および第６，９４６，５８８号）、環状ストレス抵抗性（米国特許第６，０７２，１０３号）、医薬ペプチドおよび分泌性ペプチド（米国特許第６，８１２，３７９号、第６，７７４，２８３号、第６，１４０，０７５号、および第６，０８０，５６０号）、改善されたプロセシング形質（米国特許第６，４７６，２９５号）、改善された消化性（米国特許第６，５３１，６４８号）低ラフィノース（米国特許第６，１６６，２９２号）、産業用酵素産物（米国特許第５，５４３，５７６号）、改善された風味（米国特許第６，０１１，１９９号）、窒素固定（米国特許第５，２２９，１１４号）、複合種子産生（米国特許第５，６８９，０４１号）、繊維産生（米国特許第６，５７６，８１８号、第６，２７１，４４３号、第５，９８１，８３４号、および第５，８６９，７２０号）、ならびにバイオ燃料産生（米国特許第５，９９８，７００号）のためのものがある。
【００６１】
あるいは、農学上関心対象の遺伝子は、例えば、アンチセンス（例えば、米国特許第５，１０７，０６５号を参照されたい）、阻害性ＲＮＡ（例えば、公開された出願Ｕ．Ｓ．２００６／０２００８７８およびＵ．Ｓ．２００８／００６６２０６において、ならびに米国特許出願第１１／９７４，４６９号において説明されるようなｍｉＲＮＡ仲介性、ｓｉＲＮＡ仲介性、トランス作用性ｓｉＲＮＡ仲介性、および段階的なｓＲＮＡ仲介性の機序による遺伝子発現の調節を含む、「ＲＮＡｉ」）、または共抑制仲介性機序によって内在性遺伝子の遺伝子発現の標的化された調節を生じるＲＮＡ分子をコードすることによって、先に記載した植物の特徴または表現型に影響することができる。当該ＲＮＡはまた、所望の内在性ｍＲＮＡ産物を開裂するよう操作された触媒性ＲＮＡ分子（例えば、リボザイムまたはリボスイッチ、例えば、Ｕ.Ｓ. ２００６／０２００８７８を参照されたい）であり得る。遺伝子抑制を生じることのできる分子へと転写可能なＤＮＡ分子が転写されるような様式で、コンストラクトを構築して細胞へと導入するための方法は、当該技術分野で公知である。
【００６２】
選択可能なマーカー
選択可能なマーカー導入遺伝子はまた、本発明の調節エレメントともに使用してもよい。本明細書で使用する場合、用語「選択可能なマーカー導入遺伝子」とは、トランスジェニック植物、組織または細胞における発現あるいはその欠失がいくつかの方法でスクリーニングされ、または点数化することのできる何らかの転写可能なＤＮＡ分子を指す。本発明の実施における使用のための選択可能なマーカー遺伝子ならびにその関連する選択およびスクリーニングの技術は、当該技術分野で公知であり、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、抗生物質抵抗性を与えるタンパク質、および除草剤耐性を与えるタンパク質をコードする転写可能なＤＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。
【００６３】
細胞の形質転換
本発明はまた、転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む形質転換した細胞および植物を作る方法に関する。
【００６４】
用語「形質転換」とは、受け手宿主へのＤＮＡ分子の導入を指す。本明細書で使用する場合、用語「宿主」とは、細菌、真菌、または植物の何らかの細胞、組織、器官、または子孫を含む、細菌、真菌、または植物を指す。特定の関心対象の植物の組織および細胞には、原形質体、カルス、根、塊茎、種子、茎、葉、実生、胚、および花粉を含む。
【００６５】
本明細書で使用する場合、用語「形質転換した」とは、コンストラクトなどの外来のＤＮＡ分子が導入された細胞、組織、器官、または生体を指す。導入されたＤＮＡ分子は、導入されたＤＮＡ分子はその後の子孫によって受け継がれるよう、受け手の細胞、組織、器官、または生体のゲノムＤＮＡへと組み込まれてもよい。「トランスジェニック」細胞もしくは生体または「形質転換した」細胞もしくは生体はまた、当該細胞もしくは当該生体の子孫、あるいは交差における親のようなトランスジェニック生体を採用しかつ外来のＤＮＡ分子の存在から結果的に生じる変化した表現型を呈する育種プログラムから生じる子孫を含んでもよい。導入されたＤＮＡ分子はまた、導入されたＤＮＡ分子はその後の子孫によって受け継がれないように、受け手の細胞へと一過性に導入されてもよい。用語「トランスジェニック」とは、１つ以上の異種性のＤＮＡ分子を含有する細菌、真菌、または植物を指す。
【００６６】
植物細胞へＤＮＡ分子を導入するための、当業者に周知の多くの方法がある。当該過程は概して、適切な宿主細胞を選択する工程、当該宿主細胞をベクターで形質転換する工程、および当該形質転換した宿主細胞を得る工程を含む。本発明の実施においてコンストラクトを植物ゲノムへ導入することによって植物細胞を形質転換するための方法および材料には、周知のおよび実証された方法のうちの何らかを含むことができる。適切な方法にはとりわけ、細菌感染（例えば、アグロバクテリウム）、バイナリーＢＡＣベクター、ＤＮＡの直接的な送達（例えば、ＰＥＧ仲介性形質転換、乾燥／阻害仲介性ＤＮＡ取り込み、電気穿孔法、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌、ならびにＤＮＡ被覆した粒子の加速）が含まれるがこれらに限定されない。
【００６７】
宿主細胞は、植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細胞、または昆虫細胞などの何らかの細胞または生体であってもよい。具体的な実施形態において、宿主細胞および形質転換した細胞には、作物植物由来の細胞を含んでもよい。
【００６８】
トランスジェニック植物はその後、本発明のトランスジェニック植物細胞から再生してもよい。従来の育種技術または自家受粉を使用して、種子は、このトランスジェニック植物から産生してもよい。このような種子、およびこのような種子から生育する結果として生じる子孫植物は、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有し、それゆえトランスジェニックである。
【００６９】
本発明のトランスジェニック植物は自家受粉して、本発明のホモ接合性トランスジェニック植物（組換えＤＮＡ分子についてホモ接合性）のための種子を提供することができ、または非トランスジェニック植物もしくは異なるトランスジェニック植物と交雑して本発明のヘテロ接合性トランスジェニック植物（組換えＤＮＡ分子についてヘテロ接合性）のための種子を提供することができる。このようなホモ接合性およびヘテロ接合性のトランスジェニック植物は両方とも、本明細書で「子孫植物」と呼ばれる。子孫植物とは、元のトランスジェニック植物から下った、および本発明の組換えＤＮＡ分子を含有する、トランスジェニック植物である。本発明のトランスジェニック植物を用いて産生した種子は、収穫して、本発明のコンストラクトを含みおよび農業上関心対象の遺伝子を発現する本発明のトランスジェニック植物、すなわち、子孫植物の世代を生育させることができる。異なる作物に通常使用される育種方法に関する説明は、いくつかの参考書籍のうちの１つに見ることができ、例えば、Ａｌｌａｒｄ，植物育種の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク，カリフォルニア大学，カリフォルニア州デイヴィス市，５０〜９８（１９６０）、Ｓｉｍｍｏｎｄｓ，作物改良の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃｒｏｐ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ），Ｌｏｎｇｍａｎ社，ニューヨーク，３６９〜３９９（１９７９）、ＳｎｅｅｐおよびＨｅｎｄｒｉｋｓｅｎ，植物育種の展望（Ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ），Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ（編），Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ（１９７９）、Ｆｅｈｒ，ダイズ：改良、生産および使用（Ｓｏｙｂｅａｎｓ：Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ），第２版，モノグラフ，１６：２４９（１９８７）、Ｆｅｈｒ，種の発達、理論および技術に関する原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｖａｒｉｅｔｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ），（第１巻）ならびに作物種ダイズ（Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｏｙｂｅａｎ）（第２巻），アイオワ州立大学，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂ．社，ニューヨーク，３６０〜３７６（１９８７）を参照されたい。
【００７０】
形質転換した植物は、関心対象の１つのまたは複数の遺伝子の存在、ならびに本発明の調節エレメントによって与えられる発現水準および／または発現特性について分析してもよい。当業者は、形質転換した植物の分析について利用可能な数多くの方法に気付いている。例えば、植物分析のための方法には、サザンブロットもしくはノザンブロット、ＰＣＲ系のアプローチ、生化学的分析、表現型スクリーニング法、現地調査、および免疫診断アッセイを含むがこれらに限定されない。転写可能なＤＮＡ分子の発現は、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州フォスター市）試薬および製造元によって説明されるような方法、ならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）検査マトリックスを用いて測定されるＰＣＲサイクル時間を用いて測定することができる。あるいは、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ウィスコンシン州マジソン市）試薬および製造元によって説明されるような方法を使用して、導入遺伝子の発現を評価することができる。
【００７１】
本発明はまた、本発明の植物の複数の部分を提供する。植物の複数の部分には、葉、茎、根、塊茎、種子、内胚乳、胚珠および花粉を含むがこれらに限定されない。本発明の複数の植物部分は、生存可能、生存不可能、再生可能および／または再生不可能であってもよい。本発明はまた、本発明のＤＮＡ分子を含む形質転換した植物細胞を含みおよび当該植物細胞を提供する。本発明の形質転換した植物細胞またはトランスジェニック植物細胞には、再生可能なおよび／または再生不可能な植物細胞を含む。
【００７２】
本発明はまた、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物またはその植物部分から生産される商業用産物を提供する。本発明の商業用産物は、配列番号１〜３７からなる群から選択されるＤＮＡ配列を含む検出可能な量のＤＮＡを含有する。本明細書で使用する場合、「商業用産物」とは、本発明の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェニック植物、種子、植物細胞、または植物部分に由来する材料から構成される何らかの組成物または産物を指す。商業用産物には、加工した種子、穀粒、植物部分、および食品を含むが、これらに限定されない。本発明の商業用産物は、本発明の組換えＤＮＡ分子に対応する検出可能な量のＤＮＡを含有する。試料中のこのＤＮＡのうちの１つ以上の検出は、商業用産物の含有量または源を測定するのに使用してもよい。本明細書に開示される検出方法を含む、ＤＮＡ分子についての検出に関する何らかの標準的な方法を使用してもよい。
【００７３】
本発明は、以下の実施例に対する参照を通じてより容易に理解され得、当該実施例は、説明として提供されているものであって、別段の指定がない限り、本発明を制限するよう意図するものではない。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するよう本発明者らによって発見された技術を表すことは当業者によって認められるべきである。しかし、当業者は、本開示の点において、多くの変更が開示された具体的な実施形態においてなされることができ、ならびに本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様なまたは類似の結果をなおも得ることができることを認めるべきであり、それゆえ、添付の図に明らかにされまたは示されるものはすべて、実例として解釈されることになっており、制限する意味にはない。
【実施例】
【００７４】
（実施例１）
調節発現エレメント群（ＥＸＰ）および転写終結領域（３’ＵＴＲ）を双子葉種タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）（タルウマゴヤシ（Ｂａｒｒｅｌ  Ｍｅｄｉｃ））のゲノムＤＮＡから識別およびクローニングした。タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の３’ＵＴＲの選択は一部、相同のダイズ遺伝子において観察される発現パターンを基にしていた。
【００７５】
タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）の３’ＵＴＲの識別およびクローニングは、ダイズ組織調査および特許で保護された転写特性判定実験におけるダイズ遺伝子の発現パターンを基にした、関心対象のダイズ遺伝子の選択で始まった。次に、選択されたダイズ遺伝子を使用して、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）における相同の遺伝子を、公共的に入手可能なＤＮＡ配列を用いて見出した。次に、タルウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ）由来の組織試料を、異なる環境条件の下で生育した植物から分離した。次に、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を当該タルウマゴヤシ組織から分離し、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）実験において用い、当該タルウマゴヤシ遺伝子の発現パターンを判定した。これらの実験から、当該タルウマゴヤシゲノムのサブセットをクローニングおよび特徴づけのために選択した。
【００７６】
公共のタルウマゴヤシ配列データを用いて、バイオインフォマティクス分析を実施し、選択したタルウマゴヤシ遺伝子座内で調節エレメントを識別した。例えば、バイオインフォマティクス分析を実施して、ｍＲＮＡのポリアデニル化領域および終結領域を含む３’ＵＴＲ配列、ならびに識別された遺伝子座の末端へとさらに伸長する配列を識別した。次に、増幅プライマーを設計および使用して、３’ＵＴＲ  ＤＮＡ断片、プロモーター、リーダーおよびイントロンを含むＤＮＡ断片、ならびにプロモーターおよびリーダーを含むＤＮＡ断片など、識別した調節エレメントＤＮＡ断片の各々を増幅した。結果として生じるＤＮＡ断片を、元となる植物発現ベクターへとライゲートし、配列決定した。
【００７７】
適用可能なＤＮＡ断片について、次に、調節エレメントの転写開始部位（ＴＳＳ）およびイントロン／エキソンスプライシング接合部の分析を、形質転換した植物原形質体を用いて実施した。本分析において、当該原形質体は、異種性の転写可能なＤＮＡ分子へ操作可能に連結したクローン化したＤＮＡ断片を含む植物発現ベクターを用いて形質転換した。次に、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅のための５’ＲＡＣＥシステム第２．０版（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、郵便番号９２００８、カリフォルニア州カールスバッド市）を用いて、生成したｍＲＮＡ転写産物のＤＮＡ配列を分析することによって、調節エレメントのＴＳＳおよびイントロン／エキソンスプライシング接合部を確認した。
【００７８】
識別した３’ＵＴＲのＤＮＡ配列は、配列番号１〜３０として本明細書に提供する。加えて、識別したプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号３２および３６として本明細書に提供し、識別したリーダーＤＮＡ配列は、配列番号３３および３７として本明細書に提供し、識別したイントロンＤＮＡ配列は、配列番号３４として提供する。さらに、識別したＥＸＰのＤＮＡ配列は、配列番号３１および３５として本明細書に提供される。調節発現エレメント群ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２−１：１：２（配列番号３１）は、イントロンエレメントＩ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２−１：１：２（配列番号３４）へ５’で操作可能に連結されたリーダーエレメントＬ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２−１：１：１（配列番号３３）へ５’で操作可能に連結されたプロモーターエレメントＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２−１：１：１（配列番号３２）を含み、調節発現エレメント群ＥＸＰ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８：１：１（配列番号３５）は、リーダーエレメントＬ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号３７）へ５’で操作可能に連結されたプロモーターエレメントＰ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：２：１（配列番号３６）を含む。タルウマゴヤシから識別およびクローン化したＤＮＡ配列の各々は、表１に列挙する。
表１．タルウマゴヤシからクローン化した３’ＵＴＲ、調節発現エレメント群、プロモーター、リーダー、およびイントロン
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【００７９】
（実施例２）
（ダイズ葉原形質体における恒常的ＧＵＳ発現に及ぼす３’ＵＴＲの効果の分析）
ダイズ葉原形質体をベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトを用いて形質転換し、発現に及ぼす選択したタルウマゴヤシ３’ＵＴＲの効果を評価した。タルウマゴヤシ３’ＵＴＲへ操作可能に連結したβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する恒常的ＥＸＰ配列を含有するＤＮＡベクターを用いて、ダイズ葉原形質体を形質転換した。これらのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲで形質転換したダイズ葉原形質体を、ＧＵＳ導入遺伝子の発現が恒常的プロモーターによって駆動されたダイズ葉原形質体、およびＧＵＳ導入遺伝子をワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲへと操作可能に連結したダイズ葉原形質体と比較した。
【００８０】
これらの実験に利用する植物ベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域、除草剤グリホサートまたは抗生物質スペクチノマイシンのいずれかに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞の選択のための第一の導入遺伝子発現カセット（両方ともシロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動）、タルウマゴヤシ、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）に由来する３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結された加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのＤＮＡ配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ５’で操作可能に連結したＥＸＰまたはプロモーター配列を含む、３’ＵＴＲの活性を評価するのに使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域を含んでいた。タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲを含むベクター（すなわち、ｐＭＯＮ１０９５９３、ｐＭＯＮ１１６８０３、ｐＭＯＮ１１６８１２、ｐＭＯＮ１１６８１３、ｐＭＯＮ１１６８１５、ｐＭＯＮ１１６８２６、ｐＭＯＮ１１６８２７、ｐＭＯＮ１１６８３０、ｐＭＯＮ１２２８５２、ｐＭＯＮ１２２８５３、ｐＭＯＮ１２２８５４、ｐＭＯＮ１２２８５５、ｐＭＯＮ１２２８５６、ｐＭＯＮ１２２８５７、ｐＭＯＮ１２２８５８、ｐＭＯＮ１２２８５９、ｐＭＯＮ１２２８６２、ｐＭＯＮ１２２８６４、ｐＭＯＮ１２２８６５、ｐＭＯＮ１２２８６６、ｐＭＯＮ１２２８６７、およびｐＭＯＮ１２２８６８）は、恒常的調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）を用いてＧＵＳを駆動した。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むベクター（すなわち、ｐＭＯＮ８１３４５、ｐＭＯＮ８１３４７、およびｐＭＯＮ８３００２）は、恒常的プロモーターＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−１：１：１１（配列番号４３）を用いてＧＵＳを駆動した。
【００８１】
表２は、本実施例に呈する実験におけるダイズ原形質体を形質転換するのに使用した対応する３’ＵＴＲおよび配列番号を有するプラスミドコンストラクトを提供する。
表２．ダイズ葉原形質体を形質転換するのに使用したプラスミドコンストラクト、および３’ＵＴＲの種類 
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【００８２】
同時形質転換およびデータの標準化における使用のための２つの植物ベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトも、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。これらのプラスミドコンストラクトの各々は、恒常的ＥＸＰによって駆動する特異的ルシフェラーゼコード配列を含有していた。植物ベクターｐＭＯＮ１９４３７は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号４９）由来の３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結したホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＬＵＣＩＦＥＲＡＳＥ：１：３、配列番号４５）へ５’で操作可能に連結したイントロン（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：１、配列番号４７）へ５’で操作可能に連結したリーダー配列へ５’で操作可能に連結したプロモーターを含む恒常的ＥＸＰを備えた発現カセットを含んでいた。植物ベクターｐＭＯＮ６３９３４は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスノパリンシンターゼ遺伝子（Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３、配列番号４９）由来の３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結したウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼコード配列（ＣＲ−Ｒｅｎ．ｈＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃｉｆｅ−０：０：１、配列番号４６）へ５’で操作可能に連結したリーダー配列（ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ−Ｌｈｃｂ１、配列番号４８）へ５’で操作可能に連結したプロモーターを含む恒常的ＥＸＰ配列を備えた発現カセットを含んでいた。
【００８３】
ダイズ葉原形質体は、当該技術分野で周知のように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系の形質転換法を用いて形質転換した。各原形質体細胞は、ｐＭＯＮ１９４３７プラスミドコンストラクト、ｐＭＯＮ６３９３４プラスミドコンストラクト、および表２に呈するプラスミドコンストラクトのうちの１つを用いて形質転換した。形質転換後、形質転換したダイズ葉原形質体をすべて暗所で一晩インキュベートした。次に、ＧＵＳおよびルシフェラーゼの測定を、形質転換した細胞の溶解した調製物の一定分量を２つの異なる小ウェルトレイへと分注することによって実施した。１つのトレイはＧＵＳ測定に使用し、第二のトレイは、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マジソン市、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，第５７号，１９９６，２頁を参照されたい）を用いる二重ルシフェラーゼアッセイを実施するのに使用した。
【００８４】
表２に呈する各プラスミドコンストラクトについて、１回または２回の形質転換を実施した。各３’ＵＴＲについての平均発現値は、各形質転換由来のいくつかの試料から測定した。試料の測定は、各プラスミドコンストラクト形質転換の４つの複製物を用いて、またはそれに替わるものとして、２回の形質転換実験のうちの１回につき各プラスミドコンストラクトの３つの複製物を使用して行った。平均のＧＵＳ値およびルシフェラーゼ発現値は、表３に提供する。この表において、ホタルルシフェラーゼ値（例えば、ｐＭＯＮ１９４３７の発現に由来）は、「ＦＬｕｃ」と標識した列に提供し、ウミシイタケルシフェラーゼ値（例えば、ｐＭＯＮ６３９３４の発現に由来）は、「ＲＬｕｃ」と標識した列に提供する。
表３．形質転換したダイズ葉原形質体における平均のＧＵＳおよびルシフェラーゼのアッセイ値
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【００８５】
さらに、各３’ＵＴＲの相対的な活性を比較するために、ＧＵＳ値をルシフェラーゼ活性に対するＧＵＳの比として表し、タルウマゴヤシ以外の最良に発現する３’ＵＴＲ、すなわち、Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１（配列番号４１）に対して標準化した。表４は、ＧＵＳ／ルシフェラーゼ比および標準化した比を示す。この表においてもまた、ホタルルシフェラーゼ値は「ＦＬｕｃ」と標識し、ウミシイタケルシフェラーゼ値は、「ＲＬｕｃ」と標識する。
表４．形質転換したダイズ葉原形質体におけるＴ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１（配列番号４１）に関して標準化したＧＵＳ／ＦＬｕｃおよびＧＵＳ／ＲＬｕｃの発現比
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【００８６】
表４に示すように、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲと比較して、選択したタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを全部使用すると、ＧＵＳ発現が亢進した。例えば、ＧＵＳの発現は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来のものの最もよく発現する３’ＵＴＲであるＴ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１に関して標準化したＧＵＳ／ＦＬｕｃ比を基に、タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲを使用すると２．１〜１８．３倍高かった。同様に、ＧＵＳの発現は、Ｔ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１に関して標準化したＧＵＳ／ＲＬｕｃ比を基にしてタルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲを使用すると、１．６１〜１０．４８倍高かった。
【００８７】
（実施例３）
（安定して形質転換したダイズ植物における恒常的ＧＵＳ発現に及ぼす３’ＵＴＲの効果の分析）
ダイズ植物をベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトを用いて形質転換して、発現に及ぼす選択したタルウマゴヤシ３’ＵＴＲの効果を評価した。具体的には、ダイズ植物は、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲへ操作可能に連結したβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する恒常的ＥＸＰ配列を含有するベクターを用いて形質転換した。これらのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲで形質転換したダイズ植物を、恒常的プロモーターによってＧＵＳ導入遺伝子の発現が駆動された形質転換したダイズ植物、およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲへＧＵＳ導入遺伝子が操作可能に連結された、形質転換したダイズ植物と比較した。
【００８８】
これらの実験に利用する植物ベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞の選択のための第一の導入遺伝子発現カセット（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動）、タルウマゴヤシまたはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）に由来する３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ５’で操作可能に連結した調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣａＭＶ／３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）を含む、３’ＵＴＲの活性を評価するのに使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域を含んでいた。タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲを含むベクターは、ｐＭＯＮ１０９５９３、ｐＭＯＮ１１６８０３、ｐＭＯＮ１１６８１２、ｐＭＯＮ１１６８１３、ｐＭＯＮ１１６８１５、ｐＭＯＮ１１６８２６、ｐＭＯＮ１１６８２７、ｐＭＯＮ１１６８３０、ｐＭＯＮ１２２８５０、ｐＭＯＮ１２２８５１、ｐＭＯＮ１２２８５２、ｐＭＯＮ１２２８５３、ｐＭＯＮ１２２８５４、ｐＭＯＮ１２２８５５、ｐＭＯＮ１２２８５６、ｐＭＯＮ１２２８５７、ｐＭＯＮ１２２８５８、ｐＭＯＮ１２２８５９、ｐＭＯＮ１２２８６１、ｐＭＯＮ１２２８６２、ｐＭＯＮ１２２８６３、ｐＭＯＮ１２２８６４、ｐＭＯＮ１２２８６５、ｐＭＯＮ１２２８６６、ｐＭＯＮ１２２８６７、およびｐＭＯＮ１２２８６８であった。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むベクターは、ｐＭＯＮ１０２１６７であった。
【００８９】
表５は、本実施例に呈する実験においてダイズ植物を形質転換するのに使用した対応する３’ＵＴＲおよび配列番号を備えたプラスミドコンストラクトを提供する。
表５．ダイズ植物を形質転換するのに使用したプラスミドコンストラクト、および３’ＵＴＲの種類
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【００９０】
ダイズ植物を当該技術分野で公知のアグロバクテリウム仲介性形質転換法を用いて形質転換した。選択した組織の組織学的切片を用いて、ＧＵＳの発現を定性的にアッセイした。組織化学的ＧＵＳ分析については、組織全体の切片をＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ｍｇ／ｍｌ）とともに適切な長さの時間インキュベートし、すすぎ、青色の着色について目視検査した。ＧＵＳ活性は、選択された植物の器官および組織を用いた直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に判定した。Ｒ０世代植物をＶｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、Ｒ１葉柄、Ｒ１花、黄色莢胚（およそＲ８発達期）、黄色莢子葉（およそＲ８発達期）、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３莢、およびＲ５子葉における発現について検査した。
【００９１】
ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１０２１６７によって分け与えられる発現に対するＧＵＳ発現の定量的な変化も、表６〜１３に示すように分析した。この定量的分析については、形質転換した植物の選択した組織から総タンパク質を抽出した。５０μｌの総反応容積において、総タンパク質１μｇを蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｅｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とともに使用した。反応産物４−メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｈｌｙｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）（４−ＭＵ）は、高ｐＨで最大に蛍光を発し、当該ｐＨではヒドロキシ基がイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の添加は、本アッセイを即時停止させ、蛍光産物を定量化するためにｐＨを調整した。励起時２ｎｍ、発光時３ｎｍにスリット幅を設定したＭｉｃｒｏｍａｘ  Ｒｅａｄｅｒを備えたＦｌｕｏｒｏｍａｘ−３（堀場製作所、日本国京都市）を用いて、励起時３６５ｎｍ、発光時４４５ｎｍで蛍光を測定した。
【００９２】
表６および表７は、Ｒ０世代植物の組織において測定した平均の定量的な発現水準を示す。アッセイしていない組織は、両表において空のセルとして示す。
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【００９３】
表６および表７に示すように、同じＥＸＰによって駆動される発現は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲと比較した場合、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む安定して形質転換したダイズ植物の組織において異なっていた。
【００９４】
表８および表９は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲと比較した場合、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む安定して形質転換したダイズ植物の組織における倍数発現の違いを示す。
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【００９５】
表８および表９に示すように、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む形質転換したダイズ植物の組織における発現は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１０２１６７で形質転換したダイズ植物の組織における発現と比較した場合、異なっていた。例えば、２つのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）およびＴ−Ｍｔ．Ｌｏｘ−１−１：２：１（配列番号１４）は、組織全部を通じて恒常的なＥＸＰであるＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）の高い発現を生じた。他のタルウマゴヤシ３’ＵＴＲは、いくつかの組織においては恒常的なＥＸＰの高い発現を提供したが、その他の組織においては発現を低下させた。例えば、当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１（配列番号２６）は、Ｖｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、黄色莢胚、および黄色莢子葉における発現において２．１９〜８．０５倍の上昇を提供したが、Ｒ１花およびＲ５子葉においては発現を低下させた。さらに、当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１（配列番号２）は、Ｖｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、黄色莢胚、黄色莢子葉、Ｒ３未成熟種子、およびＲ５子葉における発現において１．８８〜４．１２倍の上昇を提供したが、Ｒ１元の葉、Ｒ１花において発現を低減させ、かつＲ３子葉においては発現を比較的同程度に維持した。加えて、当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）は、Ｖｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、黄色莢胚、黄色莢子葉、およびＲ３莢における発現において２．１９〜１０．９０倍の上昇を提供したが、Ｒ１花およびＲ５子葉における発現を低下させ、かつＲ３未成熟種子においては発現を比較的同程度に維持した。
【００９６】
異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む形質転換したダイズ植物のいくつかをＲ１世代にした。表１０および表１１は、アッセイした組織の平均ＧＵＳ発現値を示す。表１２および表１３は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲに対する発現の倍数差を示す。
0006580027.tif 000015
【００９７】
表１０および表１１に示すように、同じＥＸＰによって駆動される発現は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲと比較した場合、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む安定して形質転換したダイズ植物の組織において異なっていた。表１２および表１３は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１０２１６７を用いて形質転換した組織と比較して、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む安定して形質転換したダイズ植物の組織における倍数発現の違いを示す。
0006580027.tif 000016
表１３．黄色莢胚、黄色莢子葉、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３莢およびＲ５子葉におけるＲ１世代形質転換ダイズ植物における倍数発現の違い
0006580027.tif 000017
【００９８】
表１２および表１３に示すように、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲのいくつかは、Ｒ１世代における、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１０２１６７を用いて形質転換した植物と比較して、恒常的ＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）の発現を亢進した。例えば、当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）は、アッセイした組織全部におけるＧＵＳ発現の３．１０〜２１．６５倍の亢進を提供した。当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１（配列番号２６）は、アッセイした組織全部におけるＧＵＳ発現の１．５２〜８．９０倍の亢進を提供した。当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）は、ほとんどの組織において亢進を提供したが、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）を用いて形質転換した植物と比較して、Ｒ３未成熟種子における発現を低下させた。
【００９９】
先の実験は、タルウマゴヤシ由来の３‘ＵＴＲエレメントが、選択した特異的３’ＵＴＲに応じて異なる方法で、恒常的ＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）の発現に影響したことを示す。多くの場合、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１０２１６７を用いて形質転換した植物と比較して、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含む植物発現ベクターを用いて形質転換した植物のある組織においては、発現の亢進があった。しかしながら、亢進効果は、すべての植物組織において見られることはなく、多くの場合、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲを用いると、発現はいくつかの組織においては減弱し、その他においては亢進した。したがって、選択したタルウマゴヤシ３’ＵＴＲの使用によって、あるものは特定の導入遺伝子の発現特性を「微調整」することができ、特異的な転写可能なＤＮＡ分子にとってあまり望ましくない組織における発現を低下させながら、特異的な組織における差異的な発現を提供するよう転写可能なＤＮＡ分子と操作可能に連結して、プロモーター、リーダーおよびイントロンなど、異なる発現エレメントと併用することができる。
【０１００】
（実施例４）
（安定して形質転換したダイズ植物における種子に好ましいＧＵＳ発現に及ぼす３’ＵＴＲの効果の分析）
ベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトを用いてダイズ植物を形質転換して、発現に及ぼす選択したタルウマゴヤシ３’ＵＴＲの効果を評価した。具体的には、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲへ操作可能に連結したβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する種子発現型ＥＸＰ配列を含有するＤＮＡベクターを用いて、ダイズ植物を形質転換した。これらのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲで形質転換したダイズ植物を、ＧＵＳ導入遺伝子の発現が種子発現型ＥＸＰ配列によって駆動される形質転換したダイズ植物、およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲへＧＵＳ導入遺伝子が操作可能に連結した形質転換したダイズ植物と比較した。
【０１０１】
これらの実験において利用する植物ベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞の選択のための第一の導入遺伝子発現カセット（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動）、タルウマゴヤシまたはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）に由来する３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結された加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのＤＮＡ配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ５’で操作可能に連結した、種子に好ましい発現を提供するＥＸＰエレメントＥＸＰ−Ｇｍ．Ｓｐｈａｓ１：１：１（配列番号５０）を含む、３’ＵＴＲの活性を評価するのに使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域を含んでいた。タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲを含む植物発現ベクターは、ｐＭＯＮ１１６８３２、ｐＭＯＮ１１６８３４、ｐＭＯＮ１１６８３５、ｐＭＯＮ１１６８４１、ｐＭＯＮ１２２８６９、ｐＭＯＮ１２２８７０、ｐＭＯＮ１２２８７１、ｐＭＯＮ１２２８７２、ｐＭＯＮ１２２８７３、ｐＭＯＮ１２２８７４、ｐＭＯＮ１２２８７５、ｐＭＯＮ１２２８７６、ｐＭＯＮ１２２８７８、ｐＭＯＮ１２２８７９、ｐＭＯＮ１２２８８０、ｐＭＯＮ１２２８８１、ｐＭＯＮ１２２８８２、ｐＭＯＮ１２２８８３、ｐＭＯＮ１２２８８５、ｐＭＯＮ１２２８８７、ｐＭＯＮ１２２８８８、およびｐＭＯＮ１２６１２２であった。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）に由来する３’ＵＴＲを含むベクターは、ｐＭＯＮ８３０２８であった。
【０１０２】
表１４は、定量的アッセイのデータが提供される、対応する３’ＵＴＲ、配列番号、および世代を備えたプラスミドコンストラクトを提供する。
表１４．ダイズ植物を形質転換するのに使用するプラスミドコンストラクト、および対応する３’ＵＴＲ
0006580027.tif 000018
【０１０３】
実施例３において説明したように、ダイズ植物を形質転換してＧＵＳをアッセイした。表１５および表１６は、安定して形質転換したダイズ植物のＲ０世代についての定量的な平均ＧＵＳ値を提供する。
表１５．黄色莢胚、黄色莢子葉、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３莢およびＲ５子葉における形質転換ダイズ植物のＲ０世代における平均ＧＵＳ発現
0006580027.tif 000019
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表１６．Ｖｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、Ｒ１葉柄、およびＲ１花におけるＲ０世代形質転換ダイズ植物における平均ＧＵＳ発現
0006580027.tif 000021
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【０１０４】
表１５および表１６に見ることができるように、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲのほとんどは、種子に好ましいＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−Ｇｍ．Ｓｐｈａｓ１：１：１（配列番号５０）の発現に、種子由来の組織においてのみ影響したが、例外はＴ−Ｍｔ．Ａｐｘ−１：１：２（配列番号５）で、Ｒ１元の葉、R1葉柄、およびＲ１花におけるＧＵＳ発現を亢進した。Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）、Ｔ−Ｍｔ．ＲＤ２２−１：２：１（配列番号２４）、およびＴ−Ｍｔ．ＡＣ１５３１２５Ｖ１０−１：２：１（配列番号４）など、いくつかのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲは、黄色莢胚および黄色莢子葉における高い発現を提供した。したがって、これらの３’ＵＴＲは、種子発達のより後期の間、種子プロモーターの発現を高めるのに理想的であるかもしれない。当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｅｘｐｒ１−１：２：１（配列番号７）は、他の３’ＵＴＲの多くと比較して、Ｒ５子葉および黄色胚子葉の両方における高い発現を提供し、したがって、種子発達のより長い時間に対する高い子葉発現を提供する上で有用であるかもしれない。Ｔ−Ｍｔ．ＦＢＡ−１：２：１（配列番号９）、Ｔ−Ｍｔ．Ｚｆｐ−１：２：１（配列番号３０）、Ｔ−Ｍｔ．Ｐｉｐ１−１：２：１（配列番号１８）、およびＴ−Ｍｔ．Ｐｔ２−１：２：２（配列番号２３）を使用する場合などのいくつかの場合、当該３’ＵＴＲは、黄色莢胚および黄色莢子葉の両方におけるより均一な水準の種子発現を提供した。
【０１０５】
Ｔ−Ｍｔ．Ｚｆｐ−１：２：１（配列番号３０）、Ｔ−Ｍｔ．Ａｐｘ−１：１：２（配列番号５）、Ｔ−Ｍｔ．Ｓｕｉ１−１：１：２（配列番号２９）、およびＴ−Ｍｔ．ＥＦ１ａ−１：１：２（配列番号６）を含むＲ０世代植物は、種子を播いておき、Ｒ１世代の試験のために植えた。表１７は、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲを含むこれらのＲ１世代植物およびワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）に由来する３’ＵＴＲであるＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）を含むｐＭＯＮ８３０２８を用いて形質転換した植物を含む事象についての平均の定量的アッセイデータの比較を示す。
表１７．黄色莢胚、黄色莢子葉、およびＲ５子葉におけるＲ１世代形質転換ダイズ植物における平均ＧＵＳ発現
0006580027.tif 000023
【０１０６】
表１７に見ることができるように、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲは、胚組織および子葉組織におけるＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１とは異なって発現に影響した。例えば、Ｔ−Ｍｔ．Ａｐｘ−１：１：２（配列番号５）およびＴ−Ｍｔ．Ｓｕｉ１−１：１：２（配列番号２９）は、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１と比較して、黄色莢胚、黄色胚子葉、およびＲ５子葉における種子に好ましいＥＸＰエレメントの発現を亢進した。Ｔ−Ｍｔ．ＥＦ１ａ−１：１：２（配列番号６）は、黄色莢胚および黄色莢子葉における発現を亢進したが、Ｒ５子葉においては亢進しなかった。Ｔ−Ｍｔ．Ｚｆｐ−１：２：１（配列番号３０）は、より後期に発達している黄色莢胚および黄色莢子葉における発現を低下させたが、Ｒ５子葉における発現を亢進した。
【０１０７】
したがって、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲの各々は、種子に好ましいプロモーターと操作可能に連結した場合、発達中の種子において発現に異なって影響する。発現に及ぼす効果におけるこれらの違いは、種子発現に対するより精巧かつ個別化したアプローチを提供するために利用することができ、種子発現が所望である特異的な転写可能なＤＮＡ分子の発現特性を「微調整する」ための理想的に適しているのかもしれない。
【０１０８】
（実施例５）
（安定して形質転換したダイズ植物における恒常的ＧＵＳ発現に及ぼす３’ＵＴＲの効果の分析）
ベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトを用いてダイズ植物を形質転換して、発現に及ぼす選択したタルウマゴヤシ３’ＵＴＲの効果を評価した。具体的には、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲへ操作可能に連結したβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する恒常的発現特性を呈する２つの異なるＥＸＰエレメントを含有するベクターを用いて、ダイズ植物を形質転換した。これらのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲで形質転換した植物を、ＧＵＳ導入遺伝子の発現をワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲへ操作可能に連結した形質転換したダイズ植物と比較した。
【０１０９】
これらの実験において利用する植物ベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞の選択のための第一の導入遺伝子発現カセット（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動）、タルウマゴヤシまたはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）に由来する３’ＵＴＲへ５’で操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ５’で操作可能に連結した、ＥＸＰエレメントＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２）またはＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１）を含む、３’ＵＴＲの活性を評価するのに使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域を含んでいた。タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲを含むベクターは、ｐＭＯＮ１１８７６８、ｐＭＯＮ１５３７０１およびｐＭＯＮ１１６８０３であった。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むベクターは、ｐＭＯＮ１２１０４２およびｐＭＯＮ１０２１６７であった。
【０１１０】
表１８は、本実施例において呈するダイズ植物を形質転換するのに使用した対応するＥＸＰエレメント、３’ＵＴＲおよび配列番号を備えたプラスミドコンストラクトを提供する。
表１８．ダイズ植物を形質転換するのに使用したプラスミドコンストラクトならびに対応するＥＸＰエレメントおよび３’ＵＴＲ
0006580027.tif 000024
【０１１１】
実施例３において説明したとおり、植物を形質転換してＧＵＳをアッセイした。表１９および表２０は、安定して形質転換したダイズ植物のＲ０世代についての定量的な平均ＧＵＳ値を提供する。
0006580027.tif 000025
【０１１２】
表１９および表２０において示したように、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１（配列番号２６）およびＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１（配列番号２）は、恒常的ＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２（配列番号５１）の発現に、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲであるＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）とは異なって影響した。試料採取した組織の多くにおいて、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲを用いた発現の亢進があった。当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１に関して、ＥＸＰエレメントＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）も含む植物におけるほとんどの組織において亢進が見られた。表２１および表２２は、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１２１０４２（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０））によって分け与えられる発現に対する定量的なＧＵＳ発現の倍数の違いを示す。
0006580027.tif 000026
【０１１３】
タルウマゴヤシ３’ＵＴＲの各々が、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むｐＭＯＮ１２１０４２（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０））と比較して恒常的ＥＸＰエレメントの各々の発現水準に及ぼす異なる効果を有することを、先の実験は示している。例えば、ＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２の発現は、Ｖｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、Ｒ１葉柄、Ｒ１花、黄色莢胚、黄色莢子葉、Ｒ３莢、およびＲ５子葉においては１．１４〜１５．１３倍亢進したが、Ｔ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１を用いたＲ３未成熟種子においては低下した。この同じＥＸＰエレメントは、Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１と組み合わせた場合、Ｖｎ５根、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、Ｒ１葉柄、Ｒ１花、黄色莢胚、黄色莢子葉、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３莢、およびＲ５子葉においては１．３４〜１３．４２倍の亢進を結果的に生じたが、Ｖ５沈み込んだ葉においてはＴ−Ｇｂ.Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）とほぼ同じ程度に留まった。黄色莢胚における発現は、Ｔ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１を用いる黄色莢子葉の約２倍であった（１５．１３倍の亢進対７．２３倍の亢進）が、これら２つの組織における発現は、Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１を用いた場合、比較的同程度であった（９．１９倍の亢進対９．１３倍の亢進）。ＥＸＰエレメントＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３に関して、Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１との併用は、この同じ３’ＵＴＲをＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２と組み合わせた場合よりも、試料採取した組織の多くにおいて低い亢進を生じた。Ｒ１花においては、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３をＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１と組み合わせた場合、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１に対する発現の低下があった。ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３とＴ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１との組み合わせは、Ｖｎ５根、Ｖｎ５沈み込んだ葉、Ｖｎ５元の葉、Ｒ１元の葉、黄色莢胚、および黄色莢子葉における亢進を提供したが、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）に対するＲ１花およびＲ５子葉における発現を低下させた。
【０１１４】
２つのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｓａｌｉ３−２−１：２：１およびＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４０９１４ｖ２０−１：２：１の各々は、２つの異なる恒常的ＥＸＰエレメントＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２およびＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３の発現に異なって影響した。多くの組織においては、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）に対する発現の亢進があったが、いくつかの組織においては、発現の低下が生じた。したがって、異なるタルウマゴヤシ３’ＵＴＲを用いることによって、当該植物における発現をより精確に制御しかつ特異的な転写可能なＤＮＡ分子の発現をより良好に「微調整」して、当該植物に負に影響し得る組織における発現を低下させながら、転写可能なＤＮＡ分子の発現が必要とされる最適な発現を提供することができるのかもしれない。
【０１１５】
（実施例６）
（タルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２は、安定して形質転換したダイズ植物における多くの異なるＥＸＰエレメントと併用した場合にＧＵＳ発現の亢進を生じる）
ベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトを用いてダイズ植物を形質転換して、発現に及ぼすタルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）の効果を評価した。具体的には、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）へ操作可能に連結したβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現を駆動する恒常的発現特性を備えたいくつかの異なるＥＸＰを含有するベクターを用いて、ダイズ植物を形質転換した。これらのタルウマゴヤシ３’ＵＴＲで形質転換したダイズ植物を、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲへＧＵＳ導入遺伝子を操作可能に連結した形質転換したダイズ植物と比較した。
【０１１６】
これらの実験において利用する植物ベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞の選択のための第一の導入遺伝子発現カセット（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動）、タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）、またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲであるＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）もしくはＴ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１（配列番号４１）へ５’で操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ５’で操作可能に連結したＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８：１：１（配列番号３５）、ＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）、ＥＸＰ−ＢＳＡｃＶＮＶ.ＦＬＴ：１：２（配列番号５２）、ＥＸＰ−ＣＥＲＶ.ＦＬＴ：１：２（配列番号５３）、ＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２（配列番号５１）、ＥＸＰ−ＣＵＣｍｅ．ｅＥＦ１ａ：１：１（配列番号５４）、もしくはＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）を含む３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）の活性を評価するのに使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域を含んでいた。Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）を含むベクターは、ｐＭＯＮ１１８７９８、ｐＭＯＮ１１６８１５、ｐＭＯＮ１１８７６９、ｐＭＯＮ１５３７０９、ｐＭＯＮ１１８７７１、ｐＭＯＮ１５３７０７、およびｐＭＯＮ１５５５０２であった。特に、ベクターｐＭＯＮ１１８７９８は、当該ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）と同じ遺伝子座からクローン化したリーダーエレメントへ操作可能に連結したプロモーターエレメントから構成される天然のＥＸＰ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８：１：１を含んでいた。ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲを含むベクターは、ｐＭＯＮ１０２１６７、ｐＭＯＮ１１３８７４、ｐＭＯＮ１２１０３０、ｐＭＯＮ１２１０４２、ｐＭＯＮ１４０８２７、およびｐＭＯＮ１２５８４１であった。
【０１１７】
表２３は、本実施例に呈するダイズ植物を形質転換するのに使用した対応するＥＸＰエレメント、３’ＵＴＲ、および配列番号を備えたプラスミドコンストラクトを提供する。
表２３．ダイズ植物を形質転換するのに使用したプラスミドコンストラクト、ならびに対応するＥＸＰエレメントおよび３’ＵＴＲ
0006580027.tif 000027
【０１１８】
実施例３において説明したとおり、ダイズ植物を形質転換してＧＵＳをアッセイした。表２４および表２５は、安定して形質転換したダイズ植物のＲ０世代についての定量的な平均ＧＵＳ値を提供する。「ｂｄｌ」と標識した表のセルは、定量的に分析したが発現が検出水準を下回った組織を示す。表２６および表２７は、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）と比較した、Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２へ操作可能に連結した各ＥＸＰエレメントの発現における倍数変化を提供する。
0006580027.tif 000028
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0006580027.tif 000030
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【０１１９】
表２４および表２５に示すように、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）は、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）に対する６個の恒常的ＥＸＰエレメントの発現を後押ししたが、特異的ＥＸＰエレメントおよび組織に応じて異なる方法においてであった。ＥＸＰエレメントＥＸＰ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８：１：１は、ＧＵＳを駆動するのに使用してその天然の３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２へ操作可能に連結した場合、アッセイした組織全部において非常に低く発現し、Ｒ３未成熟種子、Ｒ３莢、およびＲ１花において検出不可能であった。ＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２および３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２を含む植物のいくつかの組織は、ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２およびＴ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１の組み合わせに対する低い発現を示した。この低い発現は、Ｒ３未成熟種子、Ｒ１花、およびＲ１葉柄において見られたのに対し、対照的に、Ｖｎ５沈み込んだ葉およびＲ５子葉の発現は、４倍を超えて亢進した。ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２およびいずれかの３’ＵＴＲを用いた根の発現（Ｖｎ５根）において変化はなかった。
【０１２０】
調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＥＲＶ．ＦＬＴ：１：２およびＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２は、最高水準の発現を提供した。表２６および表２７に示すように、これら２つのＥＸＰは、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）と組み合わせた同じＥＸＰに対してＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２を用いた組織全部において亢進した。調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＣＥＲＶ．ＦＬＴ：１：２は、発達中の黄色莢子葉において６０．５０倍亢進し、黄色莢胚においてはそれより低い程度で亢進した（２１．５０倍）のに対し、調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＤａＭＶ．ＦＬＴ：１：２は、黄色莢子葉よりも黄色莢胚においてより高い程度まで亢進した（それぞれ１５．７６倍の亢進対２６．８０倍の亢進）。これらの実験および亢進の違いは、より後期に発達する種子における導入遺伝子の個別化した発現を提供する機会を提唱する。Ｔ−ＧＢ．Ｅ６−３ｂ：１：１と組み合わせた場合、調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＢＳＡｃＶＮＶ．ＦＬＴ：１：２は、Ｒ３莢およびＶｎ５根において最高に発現した（表２５および表２６を参照されたい）。これら２つの組織におけるＥＸＰ−ＢＳＡｃＶＮＶ．ＦＬＴ：１：２の発現は、特にＶｎ５根において、Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２と組み合わせた場合に劇的に亢進した。さらに、ＥＸＰ−ＢＳＡｃＶＮＶ．ＦＬＴ：１：２の発現は、Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１９（配列番号４０）と組み合わせた同じＥＸＰに対して、Ｔ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２と組み合わせた場合、５８．６３倍押し上げた。
【０１２１】
要約すると、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）は、植物および植物ウイルスゲノムＤＮＡの両方に由来する６個の異なる恒常的ＥＸＰエレメントの発現を亢進した。加えて、この３’ＵＴＲは、種子に好ましいＥＸＰエレメントであるＥＸＰ−Ｇｍ．Ｓｐｈａｓ１：１：１（配列番号５４）の発現を、他のタルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲのほとんどと比較して亢進した。したがって、この３’ＵＴＲは、コンストラクトにおけるプロモーターの高い発現または操作可能に連結した発現エレメントの組み合わせの高い発現を提供するのに適している。
【０１２２】
（実施例７）
（安定して形質転換したダイズ植物におけるＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）の分析）
ＧＵＳコード配列へ操作可能に連結した恒常的調節発現エレメント群ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）を含むベクター、具体的にはプラスミドコンストラクトを用いて、ダイズ植物を形質転換した。次に、これらの形質転換した植物を、安定して形質転換したダイズ植物におけるＧＵＳ発現についてアッセイした。
【０１２３】
これらの実験において利用する植物ベクターは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域、抗生物質スペクチノマイシンに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞の選択のための第一の導入遺伝子発現カセット（シロイヌナズナアクチン７プロモーターによって駆動）、タルウマゴヤシ由来の３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２（配列番号１）、またはワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲであるＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１（配列番号４０）もしくはＴ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１（配列番号４１）へ５’で操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）についてのコード配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ５’で操作可能に連結したＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２を含むＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）の活性を評価するのに使用する第二の導入遺伝子発現カセット、ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域を含んでいた。
【０１２４】
実施例３において説明したとおり、結果として生じるベクターを用いてダイズ植物を形質転換した。表２８および表２９は、安定して形質転換したダイズ植物についての種々の組織および発達時点においてアッセイした平均の定量的ＧＵＳ発現値を示す。
表２８．ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）を含む安定して形質転換したダイズ植物についての葉、根および花における平均ＧＵＳ発現
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表２９．ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）を含む安定して形質転換したダイズ植物についての莢組織および種子組織における平均ＧＵＳ発現
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【０１２５】
表２８および表２９に示すように、ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２（配列番号３１）は、安定して形質転換したダイズ植物における転換可能なＤＮＡ分子の恒常的発現を駆動することができる。さらに、異なる３’ＵＴＲは、各組織における発現の程度に影響する。例えば、ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２をＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１と組み合わせることは結果的に、他の２つの３’ＵＴＲであるＴ−Ｇｂ．ＦｂＬ２−１：１：１およびＴ−Ｍｔ．ＡＣ１４５７６７ｖ２８−１：１：２よりも、アッセイした組織全部における低い発現を生じた。しかしながら、どの３’ＵＴＲを適用したかとは無関係に、ＥＸＰ−Ｍｔ．Ｕｂｑ２：１：２は、中程度から高い恒常的発現を提供し、その程度は、どの３’ＵＴＲがＥＸＰへ操作可能に連結されているかの選択によって調節することができる。
【０１２６】
（実施例８）
（調節エレメント由来のエンハンサー）
エンハンサーは、配列番号３２および３６など、本明細書に提供されるプロモーターエレメントに由来し得る。エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結されたまたはプロモーターへ操作可能に連結された追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結された場合、転写可能なＤＮＡ分子の発現を亢進もしくは調節することができ、あるいは特異的な細胞型もしくは植物器官におけるまたは発達もしくは該日リズムの特定の時点における転写可能なＤＮＡ分子の発現を提供することができる１つ以上のシス調節エレメントから構成してもよい。エンハンサーは、ＴＡＴＡボックスもしくは機能的に類似のエレメント、および、プロモーターもしくはプロモーター断片から開始できるように転写する何らかの下流の配列を除去することによって作られる。
【０１２７】
エンハンサーエレメントは、本明細書に提供されるプロモーターエレメントに由来し、当該技術分野で公知の方法を用いてクローン化してプロモーターエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結され、またはプロモーターへ操作可能に連結された追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結され得る。あるいは、エンハンサーエレメントは、当該技術で公知の方法を用いておそらくクローン化して、プロモーターエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結したエンハンサーエレメントの１つ以上のコピーへ操作可能に連結し、またはプロモーターへ操作可能に連結した追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結した。さらに、エンハンサーエレメントは、異なる属の生体由来のプロモーターへ５’もしくは３’で操作可能に連結されるよう、あるいは他の属の生体由来の追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結され、あるいは同じもしくは異なる属のいずれかの生体に由来するプロモーターへ操作可能に連結された他の属の生体もしくは同じ属の生体に由来する追加的なエンハンサーエレメントへ５’もしくは３’で操作可能に連結されるようクローン化して、結果的にキメラ調節エレメントを生じることができる。先行実施例において説明したコンストラクトと類似のＧＵＳ発現植物形質転換ベクターはおそらく、当該技術分野で公知の方法を使用して構築し、当該先行実施例において、結果として生じる植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域；抗生物質もしくは除草剤に対する抵抗性を与え、形質転換した植物細胞の選択に利用する、第一の導入遺伝子選択カセット：ならびにＴ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１もしくはタルウマゴヤシ由来の先に説明したもののうちのいずれかなどの３’ＵＴＲへ操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（ＧＵＳ−２，配列番号４４）へ５’で操作可能に連結したリーダーエレメントへ５’で操作可能に連結したキメラプロモーターエレメントを形成するプロモーターへエンハンサーエレメントが操作可能に連結した、第二の導入遺伝子カセット；ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域を含有する。
【０１２８】
１つ以上のエンハンサーを含む調節エレメントによって駆動されるＧＵＳ発現はおそらく、転写可能なＤＮＡ分子の発現に及ぼすエンハンサーエレメントの効果を判定するために、本明細書に説明したような安定したもしくは一過性の植物アッセイにおいて評価した。１つ以上のエンハンサーエレメントに対する修飾または１つ以上のエンハンサーエレメントの複製はおそらく、経験的な実験法、および各調節エレメント組成を用いて観察される結果として生じる遺伝子発現調節を基に実施した、結果として生じる調節エレメントまたはキメラ調節エレメントにおける１つ以上のエンハンサーの相対的な位置を変更することは、調節エレメントまたはキメラ調節エレメントの転写活性または特異性に影響することがあるので、植物内での所望の導入遺伝子発現特性についての最良のエンハンサーを識別するよう経験的に判断される。
【０１２９】
（実施例９）
（安定して形質転換したトウモロコシ植物における恒常的ＧＵＳ発現に及ぼす３’ＵＴＲの効果の分析）
バイナリープラスミドコンストラクトを用いてトウモロコシ植物を形質転換し、トウモロコシ植物において頻繁に使用される２つの３’ＵＴＲに対する発現に及ぼすタルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）の効果を評価した。具体的には、タルウマゴヤシ３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）へ操作可能に連結したβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）導入遺伝子の発現を駆動する恒常的発現特性を呈するＥＸＰを含有するベクターを用いて、トウモロコシ植物を形質転換した。これらの形質転換したトウモロコシ植物を、ＧＵＳを当該３’ＵＴＲであるＴ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３（配列番号４９）または当該３’ＵＴＲであるＴ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１（配列番号５６）のいずれかへ操作可能に連結した形質転換したトウモロコシ植物と比較した。
【０１３０】
これらの実験において利用するバイナリープラスミドコンストラクトは、当該技術分野で公知のクローン化方法を用いて構築した。結果として生じるベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域；次の３つの３’ＵＴＲ、すなわちＴ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）、Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３（配列番号４９）もしくはＴ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１（配列番号５６）のうちの１つへ５’で操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ、恒常的調節発現エレメント群ＥＸＰ−ＦＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：２（配列番号５６）が５’で操作可能に連結した、３’ＵＴＲ配列をアッセイするための第一の発現カセット；除草剤グリホサートに対する抵抗性を与える形質転換した植物細胞に使用する第二の導入遺伝子発現カセット（コメアクチン１プロモーターによって駆動）；ならびにアグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の左側境界領域を含有していた。結果として生じるプラスミドを使用してトウモロコシ植物を形質転換した。
【０１３１】
形質転換した植物の定性的発現分析に組織化学的ＧＵＳ分析を用いた。組織全体の切片をＧＵＳ染色溶液Ｘ−Ｇｌｕｃ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−グルクロニド）（１ｍｇ／ｍｌ）とともに適切な長さの時間インキュベートし、すすぎ、青色の着色について目視検査した。ＧＵＳ活性は、選択された植物の器官および組織を用いた直接的な目視検査または顕微鏡下での検査によって定性的に判定した。Ｒ０植物を根および葉ならびに葯、生糸、ならびに発達中の種子および受粉後２１日胚（２１ＤＡＰ）における発現について検査した。
【０１３２】
形質転換したトウモロコシ植物についての定量的な分析も実施した。定量的な分析については、形質転換したトウモロコシ植物の選択した組織から総タンパク質を抽出した。５０μｌの総反応容積において、総タンパク質１μｇを蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル（ｍｅｔｈｙｌｅｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ）−β−Ｄ−グルクロニド（ＭＵＧ）とともに使用した。反応産物４−メチルウンベリフェロン（ｍｅｔｈｌｙｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）（４−ＭＵ）は、高ｐＨで最大に蛍光を発し、当該ｐＨではヒドロキシ基がイオン化されている。炭酸ナトリウムの塩基性溶液の添加は、本アッセイを同時に停止させ、蛍光産物を定量化するためにｐＨを調整した。励起時２ｎｍ、発光時３ｎｍにスリット幅を設定したＭｉｃｒｏｍａｘ  Ｒｅａｄｅｒを備えたＦｌｕｏｒｏｍａｘ−３（堀場製作所、日本国京都市）を用いて、励起時３６５ｎｍ、発光時４４５ｎｍで蛍光を測定した。
【０１３３】
表３０は、同じ恒常的な発現するＥＸＰに及ぼす各３’ＵＴＲの異なる効果を示す、測定された平均定量的ＧＵＳ発現を示す。
表３０．異なる３’ＵＴＲを用いて形質転換したトウモロコシ植物における平均ＧＵＳ発現
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【０１３４】
表３０でわかるように、各３’ＵＴＲは、ＥＸＰ−ＦＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｔａ．Ｌｈｃｂ１＋Ｚｍ．ＤｎａＫ：１：２（配列番号５６）によって駆動される恒常的発現に及ぼす異なる効果を有していた。例えば、３’ＵＴＲであるＴ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１（配列番号５６）は、その他の２つの３’ＵＴＲに対して、ＶＴ根およびＲ１Ｃｏｂ／生糸における発現を亢進するように見えた。３’ＵＴＲであるＴ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）は、Ｔ−ＡＧＲｔｕ．ｎｏｓ−１：１：１３（配列番号４９）およびＴ−Ｏｓ．ＬＴＰ：１（配列番号５６）に対して、２１ＤＡＰ内胚乳および２１ＤＡＰ胚の両方においてＲ３種子における発現を亢進するように見えた。花／葯における発現も、Ｔ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１（配列番号１７）を用いると、他の２つの３’ＵＴＲに対して高かった。各３’ＵＴＲの各々について観察される発現の違いは、発現を調節する上での各３’ＵＴＲの有用性を実証している。したがって、これらの実験は、３’ＵＴＲの選択が特定の転写可能なＤＮＡ分子の発現を微調整するために導入遺伝子カセットにおいて使用することができることを実証している。本実験は、Ｔ−Ｍｔ．Ｏｘｒ−１：２：１などの双子葉植物由来の３’ＵＴＲがトウモロコシなどの単子葉植物種における転写に影響する能力も実証した。
【０１３５】
（実施例１０）
（植物由来の原形質体を用いたＧＵＳ活性のイントロン亢進の分析）
概して、イントロンは、実験法との、ならびに導入遺伝子の最適な発現のためのベクター転移ＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）エレメント配置内でのイントロンおよび配置を経験的に選択するよう、イントロンの内ベクター対照との比較を基に選択される。例えば、グリホサートに対する耐性を与えるＣＰ４（ＵＳ  ＲＥ３９２４７）などの除草剤抵抗性遺伝子の発現において、除草剤を適用する場合に収量の損失を防止するために、生殖性組織内および栄養組織内で導入遺伝子発現を有することが望ましい。この場合におけるイントロンは、恒常的プロモーターへ操作可能に連結した場合、特にトランスジェニック植物の生殖性の細胞および組織の内部で除草剤抵抗性を与える導入遺伝子の発現を亢進する能力に関して選択される。ほとんどのユビキチン遺伝子において、５’ＵＴＲは、その内部にイントロン配列が埋め込まれたリーダーから構成される。このような遺伝子に由来する調節エレメントはそれゆえ、プロモーター、リーダー、およびイントロンを含む５’ＵＴＲ全体を用いてアッセイされる。異なる発現特性を達成するために、または導入遺伝子発現の水準を調節するために、このような調節エレメント由来のイントロンは、除去され得、または異種性のイントロンと置き換えられ得る。
【０１３６】
配列番号３４として本明細書で呈されるイントロンは、発現した配列タグクラスターとの比較におけるゲノムＤＮＡコンティグ、またはゲノムＤＮＡ内のエキソン配列およびイントロン配列を識別するためのｃＤＮＡコンティグを用いて識別した。加えて、また、５’ＵＴＲ配列またはリーダー配列を使用して、遺伝子配列が１つ以上のイントロンによって中断されるリーダー配列をコードする条件下で、１つ以上のイントロンのイントロン／エキソンスプライシング接合部を定義した。イントロンは、調節エレメントおよびリーダー断片へ３’で操作可能に連結するよう、および図１に呈される発現カセットなど、第二のリーダー断片またはコーディング配列のいずれかへ５’で操作可能に連結するよう、植物形質転換ベクターへと当該技術分野で公知の方法を用いてクローン化した。
【０１３７】
したがって、例えば、図１における発現カセット配置１などの第一の起こり得る発現カセットは、３’ＵＴＲエレメント（Ｅ）へ操作可能に連結したコード領域（Ｄ）へ操作可能に連結した検査イントロンエレメント（Ｃ）へ５’で操作可能に連結したリーダーエレメント（Ｂ）へ５’で操作可能に連結したプロモーターエレメントもしくはキメラプロモーターエレメント（Ａ）から構成される。あるいは、図１における発現カセット配置２などの第二の起こり得る発現カセットは、３’ＵＴＲエレメント（Ｋ）へ操作可能に連結したコード領域（Ｊ）へ操作可能に連結した、第二のリーダーエレメントもしくは第一のリーダーエレメント第二の断片（Ｉ）へ５’で操作可能に連結した検査イントロンエレメント（Ｈ）へ５’で操作可能に連結した第一のリーダーエレメントもしくは第一のリーダーエレメント断片（Ｇ）へ５’で操作可能に連結したプロモーターエレメントもしくはキメラプロモーターエレメント（Ｆ）から構成される。さらに、図１における発現カセット配置３などの第三の起こり得る発現カセットは、３’ＵＴＲエレメント（Ｑ）へ操作可能に連結したコード配列エレメント（Ｐ）の第二の断片へ５’で操作可能に連結したイントロンエレメント（Ｏ）へ５’で操作可能に連結したコード配列エレメント（Ｎ）の第一の断片へ５’で操作可能に連結したリーダーエレメント（Ｍ）へ５’で操作可能に連結したプロモーターエレメントもしくはキメラプロモーターエレメント（Ｌ）から構成される。明らかに、発現カセット配置３は、コード配列の第一の断片と第二の断片の間のフレームシフト無しで完全なオープンリーディングフレームを生じるような様式で、イントロンのスプライシングを可能にするよう設計される。
【０１３８】
本明細書で論議する場合、伝令ＲＮＡから最終的な転写産物へのプロセシングの間に望ましくない開始コドンが形成される能力を除去するよう、スプライシング部位（ＧＴ）の５’末端の直前のヌクレオチド配列ＡＴもしくはヌクレオチドＡまたはスプライシング部位（ＡＧ）の３’末端の直後にそれぞれ、ヌクレオチドＧもしくはヌクレオチド配列ＴＧを用いて回避することが好ましくあり得る。イントロンの５’末端または３’末端スプライシング接合部位の周りのＤＮＡ配列はしたがって、この様式で修飾することができる。
【０１３９】
イントロンは、一過性アッセイまたは安定植物アッセイにおける発現を亢進する能力を通じて亢進効果についてアッセイしてもよい。イントロン亢進の一過性アッセイについては、元の植物ベクターは当該技術分野で公知の方法を用いて構築される。イントロンは、（Ｔ−Ｇｂ．Ｅ６−３ｂ：１：１，配列番号４０）由来の３’ＵＴＲへ操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（ＧＵＳ−２、配列番号４４）へ操作可能に連結した検査イントロンエレメント（例えば、１つの配列番号３４）へ５’で操作可能に連結したＥＸＰ−ＣａＭＶ.３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）など、プロモーターおよびリーダーから構成される恒常的ＥＸＰから構成される発現カセットを含む元の植物ベクターへとクローン化される。ダイズまたは他の属の植物組織に由来する原形質体細胞は、先の実施例２において既に説明したとおり、元の植物ベクターおよびルシフェラーゼ制御ベクターを用いて形質転換することができる。
発現を亢進するイントロンの相対的な能力を比較するために、ＧＵＳ値をＧＵＳ：ルシフェラーゼ活性の比として表し、タバコ伸長因子４Ａ１０遺伝子であるＩ−Ｎｔ.ｅＩＦ４Ａ１０−１：１：１（配列番号５７）由来のイントロンとしてのものなどの公知のイントロン標準物質へ操作可能に連結した恒常的プロモーターを含むコンストラクト、および恒常的プロモーターを含むがプロモーターへ操作可能に連結したイントロンなしのコンストラクトによって分け与えられる水準と比較する。
【０１４０】
配列番号３４として呈されるイントロンの安定した植物アッセイのために、ＧＵＳ発現植物転換ベクターは、先行実施例において説明されたコンストラクトと同様に構築することができ、当該先行実施例において、結果として植物発現ベクターは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来の右側境界領域；ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）由来の３’ＵＴＲ（T-Gb.E6-3b:1:1、配列番号４０）へ操作可能に連結した加工可能なイントロンを有するＧＵＳについてのコード配列（GUS-2、配列番号４４）へ操作可能に連結した検査イントロンエレメント（例えば、配列番号３４）へ５’で操作可能に連結したＥＸＰ−ＣａＭＶ．３５Ｓ−ｅｎｈ＋Ｐｈ．ＤｎａＫ：１：３（配列番号４２）などの、プロモーターおよびリーダーから構成された恒常的ＥＸＰから構成された第一の発現カセットを含有する。トウモロコシまたは他の属の植物組織に由来する原形質体細胞は、先の実施例２において既に説明したとおり、元となる植物ベクターおよびルシフェラーゼ制御ベクターを用いて形質転換して、活性についてアッセイしてもよい。発現を亢進するイントロンの相対的な能力を比較するために、ＧＵＳ値をＧＵＳ：ルシフェラーゼ活性の比として表し、タバコ伸長因子４Ａ１０遺伝子であるＩ−Ｎｔ．ｅＩＦ４Ａ１０−１：１：１（配列番号５７）由来のイントロンとしてのものなどの公知のイントロン標準物質へ操作可能に連結した恒常的プロモーターを含むコンストラクト、ならびに恒常的プロモーターを含むがプロモーターへ操作可能に連結したイントロンのないコンストラクトによって分け与えられる水準と比較する。
【０１４１】
配列番号３４として呈されるイントロンが、発現を低下させ得るイントロン配列内での断片を欠失すること、または発現を亢進させ得るイントロンを用いた断片の複製など、いくつかの方法で修飾することができることは着目されるべきである。加えて、特定の細胞型もしくは組織のいずれかおよび器官に対する発現の特異性に影響し得るイントロン内でのＤＮＡ配列は、導入遺伝子の発現および発現パターンに影響するよう複製もしくは変化もしくは欠失することができる。加えて、本明細書に提供されるイントロンは、異なる、より長い、または先端を切断したタンパク質として不適切にスプライシングしたイントロンから発現することから意図せぬ転写産物を生じ得る何らかの起こり得る開始コドン（ＡＴＧ）を除去するよう修飾することができる。一旦、イントロンを経験的に検査したら、または実験法を基にイントロンを変化させたら、イントロンは、導入遺伝子の亢進を提供する限り、何らかの属の単子葉植物または双子葉植物であることができる安定して形質転換した植物における導入遺伝子の発現を高めるために使用され得る。イントロンはまた、操作可能に連結した導入遺伝子の発現の亢進または減弱または特異性を提供する限り、藻類、真菌類、または動物細胞など、他の生体における発現を亢進するのに使用することができる。
【０１４２】
本発明の原理を例証および説明したが、本発明が、このような原理から逸脱することなく配置および詳細において改変することができることは、当業者に対して明白である。本発明者らは、特許請求の範囲に関する精神および範囲内である改変をすべて請求する。本明細書に引用される公開物および公開された特許文書はすべて、各個々の公開物または特許出願が、参照により組み込まれるよう具体的かつ個々に示される場合と同じ程度まで、参照により本明細書により組み込まれる。
【図１】
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【配列表】
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