(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニワトリ由来ＩｇＭ軽鎖、およびニワトリ由来改変ＩｇＭ重鎖を含み、
ニワトリ由来改変ＩｇＭ重鎖が、Ａ）可変領域およびＣ末端欠失定常領域から構成される重鎖領域、ならびにＢ）重鎖領域に融合した可溶性タンパク質を含み、
Ｃ末端欠失定常領域が、ａ）ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域、またはｂ）ＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である、改変単量体ＩｇＭ。
【請求項２】
可溶性タンパク質が酵素である、請求項１記載の改変単量体ＩｇＭ。
【請求項３】
請求項１または２記載の改変単量体ＩｇＭを発現する形質転換細胞。
【請求項４】
形質転換細胞が哺乳動物細胞である、請求項３記載の形質転換細胞。
【請求項５】
請求項１または２記載の改変単量体ＩｇＭを用いて、サンプルにおいて標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変単量体ＩｇＭ、形質転換細胞、および標的物質の測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体を所定のタンパク質とコンジュゲートさせることにより、タンパク質の機能が付与された抗体を作製できることが知られている。例えば、抗体を酵素とコンジュゲートさせることにより、酵素免疫測定用の標識抗体を作製する方法が一般的に行われている。コンジュゲートの作製に利用される抗体は単純な構造を有するほど好ましいことが知られており、ＩｇＧ１をペプシン消化および還元して得られるＦ（ａｂ’）断片を、その遊離システイン残基を介して酵素とコンジュゲートさせる方法が汎用されている。【０００３】
また、タンパク質の機能が付与された抗体を作製するため、抗体とタンパク質とのコンジュゲーションの代わりに、抗体をタンパク質と融合させることも試みられている（特許文献１〜３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１０−１７１１３号公報
【特許文献２】特開平８−７０８７５号公報
【特許文献３】特開平１０−３２３１８７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多量体ＩｇＭ（五量体または六量体として存在）は、凝集し易いなど不安定である。また、免疫測定用の抗体として用いる場合、血清等の検体中の物質と非特異反応を起こし易く、擬陽性の原因となる。したがって、タンパク質により改変されるべき抗体として多量体ＩｇＭを使用することは、一般的に好まれない。
また、多量体ＩｇＭの分子量は大きく（五量体の場合、約９０万）、化学的な手法によりＩｇＭをタンパク質で標識する場合、標識され得る部位が多数存在する。結果として、得られたタンパク質標識多量体ＩｇＭ（コンジュゲート）としては、タンパク質による多量体ＩｇＭの標識部位や標識数が多様であり不均一なものが得られる。したがって、コンジュゲートのロット間差の低減が困難という問題がある。
さらに、ペプシン消化によりＩｇＭのＦ（ａｂ’）断片を調製することも可能ではあるが、このような断片を調製するための反応の制御が難しく、非効率的である。
また、宿主として動物細胞を用いて作製された組換えＩｇＭは、多量体形成に問題があることが多い。したがって、このような問題を生じ得る多量体形成を回避することができれば、有益である。
以上より、本発明の目的は、多量体抗体であるＩｇＭ特有の問題を克服したタンパク質改変ＩｇＭを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意検討した結果、所定の改変定常領域にタンパク質を融合させた改変ＩｇＭが、本来は多量体として機能する抗体にもかかわらず、単量体として抗体の機能を発揮し、しかも融合されたタンパク質の機能も良好に維持することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ＩｇＭ軽鎖、および改変ＩｇＭ重鎖を含み、
改変ＩｇＭ重鎖が、Ａ）可変領域およびＣ末端欠失定常領域から構成される重鎖領域、ならびにＢ）重鎖領域に融合したタンパク質を含む、改変単量体ＩｇＭ。
〔２〕前記定常領域が、ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である、〔１〕の改変単量体ＩｇＭ。
〔３〕前記定常領域が、ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である、〔１〕の改変単量体ＩｇＭ。
〔４〕前記定常領域が、ＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である、〔１〕の改変単量体ＩｇＭ。
〔５〕タンパク質が酵素である、〔１〕〜〔４〕のいずれかの改変単量体ＩｇＭ。
〔６〕ＩｇＭ軽鎖、および改変ＩｇＭの重鎖領域が鳥類に由来する、〔１〕〜〔５〕のいずれかの改変単量体ＩｇＭ。
〔７〕鳥類がニワトリである、〔６〕の改変単量体ＩｇＭ。
〔８〕〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変単量体ＩｇＭを発現する形質転換細胞。
〔９〕前記細胞が哺乳動物細胞である、〔８〕の細胞。
〔１０〕〔１〕〜〔７〕のいずれかの改変単量体ＩｇＭを用いて、サンプルにおいて標的物質を測定することを含む、標的物質の測定方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗体は、培養上清中に良好に分泌され、また、抗原に対する結合能を保持できる。本発明の抗体は、培養上清からの精製により容易に調製できることから、製造プロセスの大幅な簡略化に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、異なる長さのＣ末端領域を欠失させたＩｇＭ（抗体１）重鎖とＡＬＰとの融合タンパク質（改変ＩｇＭ重鎖）を有する種々の改変抗体のウエスタンブロッティングを示す図である。略号は、以下のとおりである（Ｃｏｎｊ：コンジュゲート；ＡＬＰ：アルカリホスファターゼ；Ｓ：培養上清；Ｍ：膜画分。以下同様）。
【図２】図２は、異なる長さのＣ末端領域を欠失させたＩｇＭ（抗体２）重鎖とＡＬＰとの融合タンパク質（改変ＩｇＭ重鎖）を有する種々の改変抗体のウエスタンブロッティングを示す図である。
【図３】図３は、改変ＩｇＭ重鎖のＩｇＭ軽鎖との会合を示す図である。ＰＣ：ポジティブコントロール；ＮＣ：ネガティブコントロール；ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン。ポジティブコントロール用のコンジュゲートは、ＣＨＯ細胞により産生されたニワトリ由来の五量体ＩｇＭ（２５ＯＨ  ＶＤ３と抗２５ＯＨ  ＶＤ３抗体の親和性複合体を認識する抗体）をＡＬＰにコンジュゲートすることにより作製した。ＰＣ、ＮＣ、ＢＳＡ、ポジティブコントロール用のコンジュゲートは、以下同様である。
【図４】図４は、改変ＩｇＭ重鎖を有する改変抗体（抗体２から誘導）による、２５ＯＨ  ＶＤ３と抗２５ＯＨ  ＶＤ３抗体との親和性複合体（間接的には、２５ＯＨ  ＶＤ３）の測定を示す図である。ｐＮＰＰを、ＡＬＰの基質として用いた。ｐＮＰＰは、酵素反応により、４０５ｎｍの波長を吸収するパラニトロフェノールに変換される。本アッセイでは、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【図５】図５は、改変ＩｇＭ重鎖を有する種々の改変抗体（抗体２から誘導）のウエスタンブロッティングを示す図である。
【図６】図６は、改変ＩｇＭ重鎖を有する種々の改変抗体（抗体２から誘導）による、２５ＯＨ  ＶＤ３と抗２５ＯＨ  ＶＤ３抗体との親和性複合体（間接的には、２５ＯＨ  ＶＤ３）の測定を示す図である。ＡＭＰＰＤを、ＡＬＰの基質として用いた。ＡＭＰＰＤは、酵素反応により分解されて発光を生じる。本アッセイでは、その発光カウントを測定した。
【図７】図７は、改変ＩｇＭ重鎖を有する改変抗体（抗体３および４から誘導）による、ヒトＩｇＧの測定を示す図である。ＡＭＰＰＤを、ＡＬＰの基質として用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、改変単量体ＩｇＭを提供する。以下、本発明の改変単量体ＩｇＭを、必要に応じて、本発明の抗体と略称する。
【００１１】
本発明の抗体は、ＩｇＭに由来し得る。ＩｇＭとしては、ＩｇＭを産生する能力を有する任意の動物に由来するものを利用できる。このような動物としては、例えば、鳥類（例、ニワトリ、ウズラ、ダチョウ）、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ロバ、ブタ）が挙げられる。
【００１２】
本発明の抗体は、ＩｇＭ軽鎖を含む。ＩｇＭ軽鎖は、可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）から構成される。軽鎖としては、例えば、λ鎖およびκ鎖が挙げられる。
【００１３】
本発明の抗体はまた、改変ＩｇＭ重鎖を含む。通常のＩｇＭ重鎖は、可変領域（ＶＨ）、および定常領域（ＣＨ）から構成される。ＩｇＭ重鎖のＣＨは、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）から構成される。ＩｇＭ抗体の重鎖における定常領域中のドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）の帰属は、当該分野における技術常識により、重鎖のアミノ酸配列に基づいて決定することができる。
【００１４】
ＩｇＭの定常領域は、特定の動物種で保存されていることが知られている。すなわち、特定の動物種が産生する、ある抗原に対するＩｇＭの定常領域は、当該動物種が産生する、別の抗原に対するＩｇＭの定常領域と同一であり得る。これは、ＩｇＭにはサブタイプが存在せず１種のみであり、ＩｇＭの定常領域をコードするμ遺伝子が特定の動物種で同一のためである。例えば、ニワトリ由来ＩｇＭの定常領域のアミノ酸配列は、１）Ｘ０１６１３．１、２）ＣＡＡ２５７６２．１、および３）Ｐ０１８７５．２のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号またはＳｗｉｓｓ−ｐｒｏｔアクセッション番号で開示されているが、定常領域のアミノ酸配列は、これらのＩｇＭ間で一致している。これらのアクセッション番号により開示される定常領域等のアミノ酸配列を配列番号１として示す。配列番号１のアミノ酸配列において、ＣＨ１（Ｃμ１ドメイン）は、１〜１０５位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対応し、ＣＨ２（Ｃμ２ドメイン）は、１０６〜２０９位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対応し、ＣＨ３（Ｃμ３ドメイン）は、２１０〜３１６位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対応し、ＣＨ４（Ｃμ４ドメイン）は、３１７〜４２７位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に対応する。なお、配列番号１のアミノ酸配列において４２８〜４４６位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は、Ｃ末端領域と称される。
【００１５】
ところで、動物の系統や個体差に伴うμ遺伝子の変異、ならびに遺伝子再構成後の段階、例えばＩｇＭ抗体産生細胞の発生段階に生じ得るμ遺伝子の変異などにより、ＩｇＭ抗体の定常領域のアミノ酸配列において僅かなアミノ酸残基の変異が生じることがある。したがって、特定の動物種が産生する、ある抗原に対するＩｇＭの定常領域は、当該動物種が産生する、別の抗原に対するＩｇＭの定常領域と完全に同一ではなく、「実質的に同一」である場合もあり得る。本発明では、ＩｇＭの定常領域全体について、表現「実質的に同一」とは、上述したような変異により生じた１または数個のアミノ酸残基の変異を含む定常領域のアミノ酸配列が意図される。ここで、ＩｇＭの定常領域全体について、用語「１または数個のアミノ酸残基」とは、１〜４０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸残基を意味する。変異としては、例えば、置換、挿入、欠失および付加が挙げられる。
【００１６】
アミノ酸残基の変異が置換である場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００１７】
一実施形態では、ＩｇＭがニワトリに由来する場合、ＩｇＭの定常領域は、以下であってもよい。
ａ）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜４２７位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
ｂ）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜４２７位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００１８】
別の実施形態では、ＩｇＭがニワトリに由来する場合、ＩｇＭの定常領域は、配列番号１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。アミノ酸配列のパーセント同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であってもよい。本発明では、用語「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥプログラム（Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９７０；４８：４４３−４５３）検索において、デフォルト設定のパラメータを用いて得られた値（Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を意味する。このようなパラメータは、Ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ＝１０、Ｅｘｔｅｎｄ  ｐｅｎａｌｔｙ＝０．５、Ｍａｔｒｉｘ＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００１９】
改変ＩｇＭ重鎖は、以下Ａ）Ｂ）を含む：
Ａ）可変領域およびＣ末端欠失定常領域から構成される重鎖領域；ならびに
Ｂ）重鎖領域に融合したタンパク質。
【００２０】
Ａ）で挙げられた重鎖領域は、可変領域およびＣ末端欠失定常領域から構成される。Ｃ末端欠失定常領域は、単量体ＩｇＭの形成を可能にするように、そのＣ末端領域が欠失されている定常領域である。Ｃ末端領域の欠失は、Ｃ末端アミノ酸残基からその上流にある所定のアミノ酸残基までの連続単位（Ｃ末端側にある領域）を欠失させることにより行われる。単量体ＩｇＭは、天然ＩｇＭにより形成される多量体（５量体または６量体）ではなく、１価の単量体（即ち、Ｆａｂ様分子）または２価の単量体（即ち、Ｆ（ａｂ’）様分子）である。ジスルフィド結合による重鎖と軽鎖との架橋に関与するシステイン残基（以下、「ＣＨ１  Ｃｙｓ」と称することがある。）は、ＣＨ１中に位置し得る。ジスルフィド結合による重鎖間の架橋に関与するシステイン残基（以下、「ＣＨ２  Ｃｙｓ」と称することがある）は、ＣＨ２中に位置し得る。ジスルフィド結合による単量体ＩｇＭ間の架橋（即ち、多量体ＩｇＭの形成）に関与するシステイン残基（以下、「ＣＨ３  Ｃｙｓ」と称することがある）は、ＣＨ３中に位置し得る。
【００２１】
したがって、Ｃ末端欠失定常領域は、抗原結合部位の保持の観点から、定常領域として、Ｎ末端アミノ酸残基からＣＨ１  Ｃｙｓまでの必須領域を少なくとも含み、また、改変単量体ＩｇＭの形成の観点から、ＣＨ３  ＣｙｓからＣ末端アミノ酸残基までの領域を少なくとも欠失する。このようなＣ末端欠失定常領域を有する改変単量体ＩｇＭは、抗体の機能（例、分泌能および結合能）およびタンパク質の機能（例、酵素活性）の双方を有し得る。Ｃ末端欠失定常領域が、定常領域として、必須領域に加えて、ＣＨ１  ＣｙｓからＣＨ２  Ｃｙｓまでの領域をさらに含む場合、本発明の抗体は、２価の単量体であり得る。一方、Ｃ末端欠失定常領域が、定常領域として、必須領域に加えて、ＣＨ１  ＣｙｓからＣＨ２  Ｃｙｓまでの領域をさらに含まない場合、換言すれば、ＣＨ２  ＣｙｓからＣ末端アミノ酸残基までの領域を欠失する場合、本発明の抗体は、１価の単量体であり得る。
【００２２】
具体的には、本発明の抗体におけるＣ末端欠失定常領域としては、例えば、以下が挙げられる：
ｉ）ＣＨ１  ＣｙｓよりもＣ末端側にあるＣＨ１中の所定のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までを欠失する領域（即ち、ＣＨ１の一部から構成される領域）；
ｉｉ）ＣＨ２からＣ末端アミノ酸残基までを欠失する領域（即ち、ＣＨ１の全体から構成される領域）；
ｉｉｉ）ＣＨ２中の所定のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までを欠失する領域（即ち、ＣＨ１の全体およびＣＨ２の一部から構成される領域）；
ｉｖ）ＣＨ３からＣ末端アミノ酸残基までを欠失する領域（即ち、ＣＨ１の全体およびＣＨ２の全体から構成される領域）；ならびに
ｖ）ＣＨ３  ＣｙｓからＣ末端アミノ酸残基までを欠失する領域（即ち、ＣＨ１の全体、ＣＨ２の全体およびＣＨ３の一部から構成される領域）。
【００２３】
特定の実施形態では、Ｃ末端欠失定常領域は、ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域中、ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域中、またはＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である。このようなＣ末端欠失定常領域を有する本発明の抗体は、抗体の機能（例、分泌能および結合能）およびタンパク質の機能（例、酵素活性）の双方において特に優れ得る。
【００２４】
本発明では、ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域とは、ＣＨ１・ＣＨ２の境界（ＣＨ１−ＣＨ２）を基準にして、ＣＨ１のＣ末端アミノ酸残基の位置を「−１」、ＣＨ２のＮ末端アミノ酸残基の位置を「＋１」と仮定したとき（このとき、「０位」のアミノ酸残基は存在せず、「−１位」および「＋１位」のアミノ酸残基が互いにアミド結合により連結している）、ＣＨ１領域中の「−４位」のアミノ酸残基からＣＨ２領域中の「＋４位」のアミノ酸残基にわたる、連続する８個のアミノ酸残基からなる領域をいう。ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域中のアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基として有するＣ末端欠失定常領域は、上記ｉ）、ｉｉ）またはｉｉｉ）の領域に該当し得る。
【００２５】
ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域は、好ましくは、ａ）ＣＨ１領域中の「−３位」のアミノ酸残基からＣＨ２領域中の「＋３位」のアミノ酸残基にわたる、連続する６個のアミノ酸残基からなる領域、ｂ）ＣＨ１領域中の「−２位」のアミノ酸残基からＣＨ２領域中の「＋２位」のアミノ酸残基にわたる、連続する４個のアミノ酸残基からなる領域、またはｃ）ＣＨ１領域中の「−１位」のアミノ酸残基からＣＨ２領域中の「＋１位」のアミノ酸残基にわたる、連続する２個のアミノ酸残基からなる領域であってもよい。
【００２６】
Ｃ末端欠失定常領域が、ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である場合、Ｃ末端欠失定常領域は、ニワトリ由来であってもよい。この場合、Ｃ末端欠失定常領域は、以下であってもよい。
ａ１）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｘ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
ｂ１）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｘ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Ｘは、１０２以上１０９以下の任意の整数であり、好ましくは１０３以上１０８以下の任意の整数であり、より好ましくは１０４以上１０７以下の任意の整数であり、さらにより好ましくは１０５または１０６である。
また、Ｃ末端欠失定常領域は、配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｘ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。Ｘは、上述したとおりである。アミノ酸配列のパーセント同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であってもよい。パーセント同一性の決定は、上述したとおり行うことができる。
【００２７】
本発明では、ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域とは、ＣＨ２・ＣＨ３の境界（ＣＨ２−ＣＨ３）を基準にして、ＣＨ２のＣ末端アミノ酸残基の位置を「−１」、ＣＨ３のＮ末端アミノ酸残基の位置を「＋１」と仮定したとき（このとき、「０位」のアミノ酸残基は存在せず、「−１位」および「＋１位」のアミノ酸残基が互いにアミド結合により連結している）、ＣＨ２領域中の「−４位」のアミノ酸残基からＣＨ３領域中の「＋４位」のアミノ酸残基にわたる、連続する８個のアミノ酸残基からなる領域をいう。ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域中のアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基として有するＣ末端欠失定常領域は、上記ｉｉｉ）、ｉｖ）またはｖ）の領域に該当し得る。
【００２８】
ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域は、好ましくは、ａ）ＣＨ２領域中の「−３位」のアミノ酸残基からＣＨ３領域中の「＋３位」のアミノ酸残基にわたる、連続する６個のアミノ酸残基からなる領域、ｂ）ＣＨ２領域中の「−２位」のアミノ酸残基からＣＨ３領域中の「＋２位」のアミノ酸残基にわたる、連続する４個のアミノ酸残基からなる領域、またはｃ）ＣＨ２領域中の「−１位」のアミノ酸残基からＣＨ３領域中の「＋１位」のアミノ酸残基にわたる、連続する２個のアミノ酸残基からなる領域であってもよい。
【００２９】
Ｃ末端欠失定常領域が、ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である場合、Ｃ末端欠失定常領域は、ニワトリ由来であってもよい。この場合、Ｃ末端欠失定常領域は、以下であってもよい。
ａ２）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｙ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
ｂ２）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｙ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Ｙは、２０６以上２１３以下の任意の整数であり、好ましくは２０７以上２１２以下の任意の整数であり、より好ましくは２０８以上２１１以下の任意の整数であり、さらにより好ましくは２０９または２１０である。
また、Ｃ末端欠失定常領域は、配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｙ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。Ｙは、上述したとおりである。アミノ酸配列のパーセント同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上であってもよい。パーセント同一性の決定は、上述したとおり行うことができる。
【００３０】
本発明では、ＣＨ３上流領域とは、ＣＨ３のＮ末端アミノ酸残基の位置を「＋１」と仮定したとき、ＣＨ３領域中の「＋１位」のアミノ酸残基から「＋１８位」のアミノ酸残基にわたる、連続する１８個のアミノ酸残基からなる領域をいう。ＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基として有するＣ末端欠失定常領域は、上記ｖ）の領域に該当し得る。
【００３１】
ＣＨ３上流領域は、好ましくは、ＣＨ３領域において、「＋１位」のアミノ酸残基から、「＋１７位」、「＋１６位」、「＋１５位」、「＋１４位」、「＋１３位」、「＋１３位」、「＋１２位」、「＋１１位」、「＋１０位」、「＋９位」、「＋８位」、「＋７位」、「＋６位」、「＋５位」、「＋４位」、「＋３位」、または「＋２位」のアミノ酸残基にわたる、連続するアミノ酸残基からなる領域であってもよい。
【００３２】
Ｃ末端欠失定常領域が、ＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基を、Ｃ末端アミノ酸残基として有する定常領域である場合、Ｃ末端欠失定常領域は、ニワトリ由来であってもよい。この場合、Ｃ末端欠失定常領域は、以下であってもよい。
ａ３）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｚ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または
ｂ３）配列番号１のアミノ酸配列中の１〜Ｚ位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸残基の変異を含むアミノ酸配列からなるポリペプチド。
Ｚは、２１０以上２２７以下の任意の整数である。好ましくは、Ｚは、２２６以下、２２５以下、２２４以下、２２３以下、２２２以下、２２１以下、２２０以下、２１９以下、２１８以下、２１７以下、２１６以下、２１５以下、２１４以下、２１３以下、２１２以下、または２１１以下であってもよい。
【００３３】
Ｂ）で挙げられたタンパク質は、重鎖領域に融合されている。融合は、タンパク質のＮ末端アミノ酸残基を、重鎖領域のＣ末端アミノ酸残基にアミド結合を介して連結することにより行われる。このような融合タンパク質は、重鎖領域をコードするポリヌクレオチドの下流に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、読み枠を合わせて連結し、次いで、連結ポリヌクレオチドの発現ベクターへの導入、および発現ベクターの細胞への導入を行い、最後に、細胞において融合タンパク質を発現させることにより、調製することができる。融合は、１または数個（例、１〜５０個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、または１〜５個）のアミノ酸残基からなるリンカーを介して、行われてもよい。
【００３４】
本発明において、タンパク質は、本発明の抗体に何らかの性質を付与するアミノ酸重合体である。代表的なタンパク質としては、例えば、検出可能な物性（例、吸光度）を有し得る物質、もしくは検出可能なシグナル（例、発光、蛍光）を発生し得る物質を生成し得るタンパク質（例、酵素）、または検出可能な物性を有し得る、もしくは検出可能なシグナルを発生し得るタンパク質（例、蛍光タンパク質）が挙げられる。このようなタンパク質としては、例えば、上述した物質を生成し得る酵素（例、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ）、シグナルを発生し得るタンパク質（例、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質）が挙げられる。タンパク質としては、可溶性タンパク質が好ましい。タンパク質の分子量は、例えば、１０ｋＤａ以上、２０ｋＤａ以上、３０ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以上、または５０ｋＤａ以上であってもよい。タンパク質の分子量はまた、例えば、２００ｋＤａ以下、１８０ｋＤａ以下、または１６０ｋＤａ以下であってもよい。
【００３５】
本発明の抗体は、抗原性を有する任意の抗原を認識することができる。このような抗原としては、例えば、低分子物質、タンパク質、ポリサッカリド、アレルゲンが挙げられる。
用語「低分子物質」とは、分子量１，５００未満の化合物をいう。低分子物質は、天然物質または合成物質である。低分子物質の分子量は、１，２００未満、１，０００未満、８００未満、７００未満、６００未満、５００未満、４００未満または３００未満であってもよい。低分子物質の分子量はまた、５０以上、１００以上、１５０以上または２００以上であってもよい。低分子物質としては、例えば、リガンド、ホルモン、脂質、脂肪酸、ビタミン、オピオイド、神経伝達物質（例、カテコールアミン）、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、単糖、オリゴ糖、アミノ酸、およびオリゴペプチド、あるいは医薬、毒物、および代謝産物が挙げられる。ホルモンとしては、例えば、ステロイドホルモン、甲状腺ホルモン、ペプチドホルモンが挙げられる。
タンパク質としては、免疫グロブリン等の可溶性タンパク質、および膜タンパク質が挙げられる。免疫グロブリンとしては、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＹが挙げられる。免疫グロブリン等のタンパク質は、上述したような任意の動物（好ましくは、ヒト等の哺乳動物）に由来するものを利用できる。
【００３６】
本発明の抗体は、親和性複合体を認識するものであってもよい。用語「親和性複合体」とは、２以上の因子の会合または凝集（即ち、非共有結合）により形成される複合体をいう（例、ＷＯ２０１３／０４２４２６を参照）。親和性複合体を構成する少なくとも一つの因子は、好ましくは、タンパク質であってもよい。このようなタンパク質としては、例えば、親和的結合の能力を有するタンパク質（例、抗体）、凝集能を有するタンパク質が挙げられる。親和性複合体を構成する因子であるタンパク質が抗体である場合、本発明の抗体は、例えば、二次抗体として使用できる。親和性複合体を構成する少なくとも一つの因子はまた、低分子物質であってもよい。
【００３７】
一実施形態では、低分子物質は、ビタミンであってもよい。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ６、Ｂ１２、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋが挙げられる。好ましくは、ビタミンは、脂溶性ビタミン（例、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ）であり、より好ましくは、以下に示すようなビタミンＤである。低分子物質はまた、ビタミンの代謝産物であってもよい。ビタミンの代謝産物としては、例えば、上述したようなビタミンにヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体（例、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体）が挙げられる。低分子物質はさらに、ビタミン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。
【００３８】
【化１】
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【００３９】
別の実施形態では、低分子物質は、ステロイド化合物であってもよい。ステロイド化合物とは、ステロイド骨格（シクロペンタノペルヒドロフェナントレン骨格）を有する化合物をいう。ステロイド化合物としては、ステロイドホルモン、およびステロイド骨格を保持するその誘導体（例、タンパク質同化ステロイド、抗男性ホルモン剤および抗卵胞ホルモン剤等の合成ステロイド）が挙げられる。ステロイドホルモンとしては、例えば、男性ホルモン、卵胞ホルモン、黄体ホルモン、コルチコイド（例、糖質コルチコイド、鉱質コルチコイド）が挙げられるが、卵胞ホルモンが好ましい。卵胞ホルモンとしては、例えば、エストロン、エストラジオール、エストリオールが挙げられる。低分子物質はまた、ステロイド化合物の代謝産物であってもよい。ステロイド化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなステロイド化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および抱合体が挙げられる。抱合体としては、例えば、グルクロン酸抱合体、硫酸抱合体（例、エストラジオールの３位もしくは１７位のいずれかのヒドロキシル基、または３位および１７位の双方のヒドロキシル基に硫酸基が抱合された化合物）、グルタチオン抱合体、アセチル抱合体、アミノ酸抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、ステロイド化合物類似治療用薬物（例、エストラムスチン）またはその代謝産物（例、エストロムスチン）であってもよい。  
【００４０】
さらに別の実施形態では、低分子物質は、アミノ酸化合物であってもよい。アミノ酸化合物とは、アミノ基およびカルボキシル基を有する化合物をいう。アミノ酸化合物としては、例えば、α−アミノ酸（例、グリシン、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、リジン、オルニチン、シトルリン）、β−アミノ酸（例、β−アラニン）、γ−アミノ酸（例、γ-アミノ酪酸）、ならびに、アミノ基およびカルボキシル基を保持するそれらの誘導体が挙げられる。アミノ酸化合物は、Ｌ体またはＤ体であってもよい。低分子物質はまた、アミノ酸化合物の代謝産物であってもよい。アミノ酸化合物の代謝産物としては、例えば、上述したようなアミノ酸化合物にヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、アミノ酸化合物類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。
好ましくは、アミノ酸化合物は、チロシンから生合成されるチロシン誘導体であってもよい。チロシン誘導体としては、甲状腺ホルモン（例、トリヨードチロニン、チロキシン）が挙げられる。チロシン誘導体はまた、甲状腺ホルモンの代謝産物であってもよい。甲状腺ホルモンの代謝産物としては、例えば、甲状腺ホルモンにヒドロキシル基が付加された化合物、および上述したような抱合体が挙げられる。低分子物質はさらに、甲状腺ホルモン類似治療用薬物またはその代謝産物であってもよい。
【００４１】
本発明の抗体は、溶液中に溶解した形態で提供されてもよいが、支持体に固定された形態で提供されてもよい。支持体としては、例えば、粒子（例、磁性粒子）、メンブレン（例、ニトロセルロース膜）、ガラス、プラスチック、金属、プレート（例、マルチウェルプレート）、デバイスが挙げられる。本発明の抗体はまた、濾紙等の媒体に含浸された形態で提供されてもよい。
【００４２】
本発明の抗体は、本発明の抗体を発現する本発明の形質転換細胞を調製し、次いで、本発明の形質転換細胞を培養することにより得ることができる。
【００４３】
形質転換細胞の宿主としては、例えば、本発明の抗体を発現できる限り特に限定されず、例えば、原核生物細胞（例、大腸菌）、および真核生物細胞（例、酵母等の単細胞、および多細胞生物由来の細胞）を用いることができる。好ましくは、宿主は、任意の動物に由来する細胞を利用できる。このような動物としては、例えば、鳥類（例、ニワトリ、ウズラ、ダチョウ））、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ロバ、ブタが挙げられる。より好ましくは、宿主は、高品質タンパク質（例、抗体等のタンパク質医薬）の商業生産のために汎用されている細胞であってもよい。このような細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびその亜株（例、ＣＨＯ−Ｋ１、ＤＧ４４）、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞およびその亜株が挙げられる。
【００４４】
本発明の形質転換細胞の調製は、ＩｇＭ軽鎖および改変ＩｇＭ重鎖を発現する１又は２つのベクターを宿主に導入することにより行うことができる。具体的には、このような調製は、ＩｇＭ軽鎖の発現ベクター、および改変ＩｇＭ重鎖の発現ベクターを一緒に宿主に導入することにより、またはＩｇＭ軽鎖および改変ＩｇＭ重鎖を発現し得る単一の発現ベクターを宿主に導入することにより行うことができる。単一の発現ベクターは、ＩｇＭ軽鎖をコードするポリヌクレオチド、および改変ＩｇＭ重鎖をコードするポリヌクレオチドがそれぞれ異なるプロモーターに連結されている発現ベクターであっても、またはＩｇＭ軽鎖および改変ＩｇＭ重鎖をコードするポリヌクレオチドが１つのプロモーターに連結されている発現ベクターであってもよい。発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター（例、アデノウイルス、レトロウイルス）、人工染色体、および組込型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクター（例、レトロウイルス）が挙げられる。発現ベクターはまた、一過的発現または恒常的（すなわち、安定的）発現のためのベクターである。
【００４５】
本発明はまた、本発明の抗体を用いて、標的物質の測定方法を提供する。本発明の測定方法は、サンプルにおいて標的物質を測定することを含む。本発明の測定方法は、臨床検査、生物学的アッセイ等の試験に有用である。  
【００４６】
サンプルは、標的物質を含有する、または含有すると疑われるサンプルである。サンプルの由来は特に限定されず、生物由来の生物学的サンプルであってもよく、または環境サンプルなどであってもよい。生物学的サンプルが由来する生物としては、例えば、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ）等の動物、昆虫、微生物、植物が挙げられる。生物学的サンプルはまた、血清、血液、血漿、唾液、組織または細胞抽出液であってもよい。環境サンプルとしては、例えば、土壌、海水または淡水由来のサンプルが挙げられる。サンプルは、本発明の測定方法に付される前に、他の処理に付されてもよい。このような処理としては、例えば、遠心分離、抽出、ろ過、沈殿、分画が挙げられる。
【００４７】
本発明の測定方法は、定性的または定量的に行うことができる。本発明の測定方法はまた、免疫学的手法により行うことができる。このような免疫学的手法としては、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、磁性粒子法、免疫クロマト法、ルミネッセンス免疫測定法、スピン免疫測定法、ウエスタンブロット法、ラテックス凝集法が挙げられる。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。【００４９】
以下の実施例において、改変抗体の重鎖としては、ＷＯ２０１３／０４２４２６に開示される方法により調製された、２５ＯＨ  ＶＤ３と抗２５ＯＨ  ＶＤ３抗体（１次抗体）との複合体（親和性複合体）を認識する２種のニワトリ由来ＩｇＭ（抗体１、抗体２）において、異なる長さのＣ末端領域を欠失させた重鎖を、タンパク質（ＡＬＰ，分子量：１４０ｋＤａ）と融合させたものを用いた。あるいは、抗原としてヒトＩｇＧを用い、かつＡＤＬｉｂ（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ）システム（例、ＷＯ２００４／０１１６４４を参照）を利用することにより調製された、ヒトＩｇＧを認識する２種のニワトリ由来ＩｇＭ（抗体３、抗体４）において、異なる長さのＣ末端領域を欠失させた重鎖を、タンパク質（ＡＬＰ，分子量：１４０ｋＤａ）と融合させたものを、改変抗体の重鎖として用いた。
抗体１〜４のアミノ酸残基の位置と抗体領域との関係は、表１に記載のとおりである。【００５０】
【表１】
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【００５１】
表１の捕捉説明は、以下のとおりである。
１）抗体１〜４は、可変領域（Ｖμ）のアミノ酸配列は異なるが、定常領域（Ｃμ１、Ｃμ２、Ｃμ３、Ｃμ４）のアミノ酸配列は完全に同一である。例えば、抗体１および２の関係について説明すると、抗体１および２の可変領域を構成するアミノ酸残基の個数は、６個異なる。したがって、抗体１の各定常領域の開始および終了アミノ酸残基の位置（ｎ位）を基準とすると、抗体２の各定常領域の開始および終了アミノ酸残基の位置は、「（ｎ＋６）位」である。
２）ジスルフィド結合による重鎖と軽鎖との架橋に関与するシステイン残基は、Ｃμ１中に存在する（抗体１：１６０位のシステイン；抗体２：１６６位のシステイン：抗体３：１５８位のシステイン；抗体４：１５７位のシステイン）。
３）ジスルフィド結合による重鎖間の架橋（即ち、ＩｇＭ単量体の形成）に関与するシステイン残基は、Ｃμ２中に存在する（抗体１：３４７位のシステイン；抗体２：３５３位のシステイン：抗体３：３４５位のシステイン；抗体４：３４４位のシステイン）。
４）ジスルフィド結合によるＩｇＭ単量体間の架橋（即ち、ＩｇＭ多量体の形成）に関与するシステイン残基は、Ｃμ３中に存在する（抗体１：４２６位のシステイン；抗体２：４３２位のシステイン：抗体３：４２４位のシステイン；抗体４：４２３位のシステイン）。【００５２】
実施例１：改変ＩｇＭ重鎖を有する改変抗体の発現および分泌
異なる長さのＣ末端領域を欠失させた抗体重鎖（Ｈ鎖）断片の遺伝子とアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の遺伝子を連結（５’末端側：Ｈ鎖断片：３’末端側：ＡＬＰ。以下同様）した発現ベクター（抗体１および２について、それぞれ６種類の発現ベクター）、ならびにＩｇＭ抗体軽鎖（Ｌ鎖（λ））全長の発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にコトランスフェクトし、改変抗体を一過性に発現させた。得られたＣＨＯ細胞の培養上清について、ウエスタンブロッティング（ＷＢ）による分析を行った。作製した改変抗体は、改変ＩｇＭ重鎖について、「数字＋タンパク質（ＡＬＰ）」で表記している。例えば、２５０ＡＬＰは、「ＩｇＭ抗体Ｈ鎖の１番目から２５０番目までのアミノ酸残基から構成されるＨ鎖（換言すれば、２５１番目のアミノ酸残基からＣ末端アミノ酸残基までを欠失させたＨ鎖）とタンパク質（ＡＬＰ）を融合したもの」と「ＩｇＭ抗体Ｌ鎖全長」からなる改変抗体を意味する。
その結果、作製した全ての改変抗体は、少なくともその一部が膜画分（Ｍ）中に局在していることが認められた（図１、２）。このことは、全ての改変抗体が発現していることを示す。一方、培養上清（Ｓ）への分泌が認められた改変抗体は、２５０ＡＬＰ、３４２ＡＬＰ、および３６６ＡＬＰに対応する３種の改変ＩｇＭ重鎖（抗体１から誘導）、ならびに２５６ＡＬＰ、３４８ＡＬＰ、および３７２ＡＬＰに対応する３種の改変ＩｇＭ重鎖（抗体２から誘導）を有するもののみであった（図１、２）。【００５３】
実施例２：改変ＩｇＭ重鎖とＩｇＭ軽鎖との会合
実施例１で得られたＣＨＯ細胞の培養上清について、Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ後にＷＢを行った。その結果、抗ＡＬＰ抗体を用いて検出されたバンドの位置は、抗Ｌ鎖抗体を用いて検出されたバンドの位置と同じであった（データ省略）。
次いで、以下のアッセイ系Ａ〜Ｄにより、改変ＩｇＭ重鎖がＩｇＭ軽鎖と会合しているかを評価した。なお、改変抗体としては、抗体１（３６６ＡＬＰ）または抗体２（３７２ＡＬＰ）を含む、実施例１で得られたＣＨＯ細胞の培養上清を用いた。
（アッセイ系Ａ）
抗Ｌ鎖抗体（マウス由来）をＥＬＩＳＡプレートのウェル中に固定した。改変抗体、続いて抗ＡＬＰ抗体（ウサギ由来）をウェルに添加し、反応させた。
（アッセイ系Ｂ）
抗Ｌ鎖抗体（マウス由来）をＥＬＩＳＡプレートのウェル中に固定した。改変抗体、続いて抗Ｈ鎖抗体（ヤギ由来）をウェルに添加し、反応させた。
（アッセイ系Ｃ）
抗Ｈ鎖抗体（ヤギ由来）をＥＬＩＳＡプレートのウェル中に固定した。改変抗体、続いて抗Ｌ鎖抗体（マウス由来）をウェルに添加し、反応させた。
（アッセイ系Ｄ）
抗ＡＬＰ抗体（ウサギ由来）をＥＬＩＳＡプレートのウェル中に固定した。改変抗体、続いて抗Ｌ鎖抗体（マウス由来）をウェルに添加し、反応させた。
アッセイ系Ａ〜Ｄにおいて、反応後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇ抗体、続いてＴＭＢ（基質）をウェルに加え、ＨＲＰによる酵素反応を行なった後、硫酸で反応を停止させた。最後に、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
その結果、アッセイ系Ａ〜Ｄにより、シグナルが検出された（図３）。したがって、改変ＩｇＭ重鎖がＩｇＭ軽鎖と会合していることが確認された。【００５４】
実施例３：改変抗体の機能の確認（１）
２５ＯＨ  ＶＤ３と抗２５ＯＨ  ＶＤ３抗体（１次抗体）との複合体（親和性複合体）に対する本発明の抗体の機能を確認するため、ＷＯ２０１３／０４２４２６の実施例に開示される方法と同様の方法にしたがって、２５ＯＨ  ＶＤ３の測定をＥＬＩＳＡにより行った。先ず、異なる長さのＣ末端領域を欠失させた抗体重鎖（Ｈ鎖）断片の遺伝子とアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の遺伝子を連結した発現ベクター（抗体２について、３種類の発現ベクター）、およびＩｇＭ抗体軽鎖（Ｌ鎖（λ））全長の発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にコトランスフェクトし、抗体２から誘導された改変抗体を一過性に発現させた。次いで、得られたＣＨＯ細胞の培養上清を用いてアッセイを行った。
その結果、２５６ＡＬＰおよび３７２ＡＬＰに対応する２種の改変ＩｇＭ重鎖を有する改変抗体は、高い吸光度の値を示した。このことは、これらの改変抗体が、単量体として元の抗体（多量体ＩｇＭ）の機能（分泌能および結合能）およびタンパク質（ＡＬＰ）の機能（酵素活性）の双方を有することを示す（図４）。
以上より、重鎖架橋システイン（３５３位）よりもＮ末端側に位置するＣＨ１・ＣＨ２隣接領域中のアミノ酸残基、ならびに重鎖架橋システイン（３５３位）よりもＣ末端側に位置するＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基として有するＣ末端欠失定常領域を有する改変単量体抗体が、元の抗体の機能およびタンパク質の機能の双方を有し得ることが確認された。【００５５】
実施例４：改変抗体の機能の確認（２）
異なる長さのＣ末端領域を欠失させた抗体重鎖（Ｈ鎖）断片の遺伝子とアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の遺伝子を連結した発現ベクター（抗体２について、実施例１〜４とは異なる１１種類の発現ベクター、および先の実施例と同様の６種の発現ベクター）、ならびにＩｇＭ抗体軽鎖（Ｌ鎖（λ））全長の発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にコトランスフェクトし、抗体２から誘導された改変抗体を一過性に発現させた。得られたＣＨＯ細胞の培養上清を用いて２５ＯＨ  ＶＤ３を測定した。２５ＯＨ  ＶＤ３の測定は、ＷＯ２０１３／０４２４２６の実施例に開示される方法と同様の方法にしたがって、ＥＬＩＳＡにより行った。
その結果、改変ＩｇＭ重鎖を有する改変抗体のうち、ＥＬＩＳＡにおいて高いカウントを示した改変抗体は、３５７ＡＬＰ、３６２ＡＬＰ、３６７ＡＬＰ、３７２ＡＬＰ、３７３ＡＬＰ、３７４ＡＬＰ、および３７５ＡＬＰであった（図５、６）。また、ＷＢとＥＬＩＳＡの結果（図５、６）より、これらの改変抗体については、発現量と活性にある程度の相関性が確認された。２５０ＡＬＰについても、低いカウントを示したことから、僅かながらも機能の保持が確認された（図５、６）。
以上より、元の抗体の機能（分泌能および結合能）、ならびに抗体に融合されるタンパク質の機能（活性）の良好な保持の観点から、重鎖定常領域中のＣ末端アミノ酸残基の位置は、ＣＨ１・ＣＨ２隣接領域、あるいは重鎖架橋システインよりもＣ末端側の領域（特に、ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域またはＣＨ３上流領域）中にあることが重要であると考えられる。特に、優れた機能を有し得る改変抗体を培養上清中に大量に得るためには、重鎖架橋システインよりもＣ末端側の領域（特に、ＣＨ２・ＣＨ３隣接領域またはＣＨ３上流領域）中にあることが重要であり得る。【００５６】
実施例５：異なる抗原に結合能を有する抗体に由来する改変抗体の作製および評価
異なる長さのＣ末端領域を欠失させた抗体重鎖（Ｈ鎖）断片の遺伝子とアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の遺伝子を連結（５’末端側：Ｈ鎖断片：３’末端側：ＡＬＰ。以下同様）した発現ベクター（抗体３および４について、それぞれ１種類の発現ベクター）、ならびにＩｇＭ抗体軽鎖（Ｌ鎖（λ））全長の発現ベクターを、ＣＨＯ細胞にコトランスフェクトし、改変抗体である抗体３（３６４ＡＬＰ）および抗体４（３６３ＡＬＰ）を一過性に発現させた。抗体３（３６４ＡＬＰ）および抗体４（３６３ＡＬＰ）の定常領域は、抗体２（３７２ＡＬＰ）のものと同一である（表１を参照）。得られたＣＨＯ細胞の培養上清を用いて、ＥＬＩＳＡを行った。
ＥＬＩＳＡは、下記の手順により行った。アッセイプレートのウェルに、５μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧまたはバッファーのみを加え４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで１％  ＢＳＡ／ＴＢＳで１時間ブロッキングした後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。ウェルにＣＨＯ細胞の培養上清を加え一定時間放置した後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。ウェルにＡＭＰＰＤを加え、発光反応を行った。最後に、発光カウントを測定した。
その結果、ＣＨＯ細胞の培養上清において発光カウントが良好に測定された（図７）ことから、重鎖架橋システインよりもＣ末端側に位置するＣＨ３上流領域中のアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基として有するＣ末端欠失定常領域を有する改変単量体抗体が、元の抗体（多量体ＩｇＭ）の機能（分泌能およびヒトＩｇＧへの結合能）およびタンパク質（ＡＬＰ）の機能（酵素活性）の双方を有することが確認された。このことは、元の抗体が結合能を有する抗原の種類（即ち、元の抗体の可変領域のアミノ酸配列の種類）にかかわらず、上記と同様の領域中のアミノ酸残基をＣ末端アミノ酸残基として有するＣ末端欠失定常領域を有するように改変することで、元の抗体の機能およびタンパク質の機能の双方が維持された本発明の改変単量体抗体を作製できることを示す。
以上より、本発明は、種々の抗原に対する改変単量体抗体の作製に有用であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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