(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型ＲＮＡ分子から核酸産物を生成する方法であって、鋳型ＲＮＡを得た後に、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、前記鋳型ＲＮＡの予め選択された核酸領域でアニーリングさせること、
ｂ）該第１のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることによって、第１の伸長された鎖を得ること、
ｃ）該ＲＮＡ鋳型を除去すること、
ｄ）１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを前記第１の伸長された鎖にアニーリングさせること、
ｅ）鎖置換活性を欠くポリメラーゼを用いて、及び／又はポリメラーゼによる鎖置換に抵抗性を有するプライマーを使用して、前記第１の伸長された鎖にアニーリングされたプライマーを置換することなく、前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長し、更なる伸長産物を生成すること、
ここで、工程ａ）〜ｅ）は、１つの引き続き増大していく流体容量で実施される、
ｆ）前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に伸長された核酸部分を含む前記の更なる伸長産物の伸長産物を単離及び／又は増幅すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記鎖置換活性を欠くポリメラーゼが、Ｔ７、Ｔ４若しくはＱ５  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ポリメラーゼによる鎖置換に抵抗性を有するプライマーが、ＬＮＡ若しくは２’フルオロ修飾を有するヌクレオチドを有するプライマーである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ａ）〜ｅ）が、洗浄することなく実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ａ）〜ｅ）が、流体を除去することなく実施される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記予め選択された核酸領域は、３’末端核酸領域である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記３’末端核酸領域は、ポリＡテールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、３’ポリヌクレオチドテールを前記鋳型ＲＮＡの３’末端に付加する工程を更に含み、前記予め選択された３’末端核酸領域は、前記３’ポリヌクレオチドテールを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＤＮＡである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、非アニーリング配列タグ又はリンカー配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記非アニーリング配列タグ又はリンカー配列は、増幅プライマー結合のために使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記非アニーリング配列タグ又はリンカー配列は、バーコードを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記非アニーリング配列タグ又はリンカー配列は、ランダムバーコードを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることｂ）は、逆転写によって行われ、かつ該第１の伸長された鎖は、ＤＮＡ鎖である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ鋳型を除去することｃ）は、酵素的ＲＮＡ消化、アルカリ性分解、又は二価カチオンの存在下での加熱を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素的ＲＮＡ消化がＲＮアーゼにより実施され、前記アルカリ性分解がＮａＯＨ処理により実施され、又は前記加熱がＭｎ２＋若しくはＭｇ２＋の存在下で実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムプライマー及び／又は少なくとも１０種の異なるプライマーを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムプライマー及び／又は少なくとも２０種の異なるプライマーを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムプライマー及び／又は少なくとも１００種の異なるプライマーを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記予め選択された核酸領域は、１つ又は複数の関心の鋳型ＲＮＡに存在する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、それぞれ１種の鋳型ＲＮＡ又は該ＲＮＡにある遺伝子配列に特異的である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、１つ又は複数の関心のＲＮＡの特異的領域にアニーリングする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つよりも多い種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることｅ）は、クラウディング剤の存在下で実施される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記クラウディング剤が、ＰＥＧである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記鋳型ＲＮＡは、１番目のプライマーアニーリングの前に断片化される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
工程ｅ）の伸長産物を精製する工程を更に含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記更なる伸長産物に対して、該伸長産物の配列タグ又はリンカー配列に特異的なプライマーを使用してＰＣＲを実施することを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＣＲの少なくとも１種のプライマーは、更なる配列タグ又はリンカー配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットの使用であって、該キットは、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、補因子又はポリメラーゼに必要とされる金属イオンの塩、プライマー、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｑ５若しくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを含む、使用。
【請求項３０】
前記金属イオンが、Ｍｇ２＋である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記キットが、ＲＮＡ分解剤及び／又はクラウディング剤、例えばＰＥＧを更に含む、請求項２９又は３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡ分析の方法、特に転写産物量アッセイ及び転写産物型推定アッセイの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現は、遺伝子からの情報を機能性遺伝子産物の合成に使用する過程である。これらの産物は、機能性ＲＮＡであり、そのうち１つの主たる重要なクラスは、上記過程で酵素、輸送分子等のようなあらゆる種類のタンパク質に翻訳される、タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ、つまりｍＲＮＡからなる。細胞及び組織におけるｍＲＮＡ含有量及びそのプロセシング段階の知識は、細胞発生、疾患の発生、生物の薬物応答性及び他の生物学的過程の理解のために重要である。
【０００３】
生物学的な細胞過程は、多くの内的パラメータ及び外的パラメータによって影響を受ける。このとき、全ＲＮＡ、特にｍＲＮＡプール（トランスクリプトーム）は中心的な役割を担う。一般的な哺乳動物細胞は、１０ｐｇから３０ｐｇの間の全ＲＮＡを含み、それは、平均して３．６・１０５のｍＲＮＡ分子に相当する。最新のヒトゲノムデータベースは、２０７６９種のコーディング遺伝子アノテーション、４８４６１種のＧｅｎｅｓｃａｎによる遺伝子予測を含んでいる。遺伝子アノテーション及び遺伝子予測についての数は、かなり安定しているが、アノテーションが付けられた転写産物の数（現在１９５５６５種の転写産物）はＲＮＡ分析の向上により増え続けている（Ensembl release 73、２０１３年９月）。多くの調査の主な着目点は、タンパク質をコードするＲＮＡ、ｍＲＮＡ又は転写産物の定量化である。個々の遺伝子は、非常に多数の種々の転写産物、いわゆるスプライスバリアントを発現することができる。上記転写産物は、それらのエキソン領域の差によって、及び／又は調節過程にとって重要な非翻訳領域の開始部位と終止部位との差によって特徴付けられている。
【０００４】
ｍＲＮＡ又は遺伝子発現レベルのいずれかを種々の精度で測定する様々な方法が開発されている。
【０００５】
発現配列タグ、つまりＥＳＴは、ｃＤＮＡの短い部分配列であり、クローニングされたｃＤＮＡの一回のシーケンシングによる結果である。発現配列タグは、過去に遺伝子転写産物の同定のために使用された。何百万ものＥＳＴが公共データベースにおいて入手可能であり、相応する遺伝子が発現される条件についての情報も提供されている。該ＥＳＴは、遺伝子発現を測定するためのＤＮＡマイクロアレイ用のプローブの設計を可能にする。
【０００６】
マイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイのような遺伝子発現測定のための古典的な方法又は大規模並列シーケンシング若しくは次世代シーケンシング、つまりＮＧＳによるｍＲＮＡシーケンシングのようなつい最近の方法は、それらの方法の固有の誤差により制限されており、その誤差は、最近では、より深い読みのシーケンシングのようなより多量の測定によって、或る程度までは補うことはできるが、大規模の試料処理量で分析を実施することができない程度までの費用増大が余儀なくされる。しかしながら、上記測定における精度も費用も、薬理学的調査及び大規模臨床研究における最重要な必要条件である。マイクロアレイは、予め決められた配列プローブが実験前に設計されているエキソンレベル又は配列レベルで、遺伝子を検出することができるにすぎない。そのようなハイブリダイゼーションプローブの限られた数及びミスハイブリダイゼーションは、高精度の遺伝子発現実験の場合には、しばしば不明瞭な結果をもたらす。マイクロアレイは、それらが種々の３’ＵＴＲ（３’非翻訳領域）のうちの或る特定の数しか網羅することができず、新たな３’ＵＴＲを同定することができないという理由から、設計により制限される。
【０００７】
１９９６年の終わりに、新たなハイスループットシーケンシング技術（特許文献１）が出回り始め、そしてその技術は、サンガー法以降それまで一般的であったジデオキシ法に対して、次世代シーケンシング、つまりＮＧＳとして知られるようになった。新たなシーケンシング技術の開発によって、全体のトランスクリプトームのシーケンシングを試みることが可能となった。ＮＧＳは、何百万もの短い、つまり５０塩基長から４００塩基長の間のシングルリード又はペアエンドリードをシーケンシングするために小型化され並列化されたフローセルを使用する。空間的に隔離されたクローン増幅されるＤＮＡ鋳型は、合成によって相補鎖へと個々のヌクレオチドを付加しながら解読を行うようにしてシーケンシングされる。光学的スキャニング（Illumina社（米国）製のＩｌｌｕｍｉｎａシステム；Life Technologies（米国）製のＳＯＬｉＤシステム；454 Life Sciences、Roche Diagnostics社（米国）製のＲｏｃｈｅ  ４５４）及びアレイ状に配置されたマイクロチップ電界効果トランジスタ（Life Technologies（米国）製のＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）による非常に小さいｐＨ変化の検出は、種々のマイクロ流体プラットフォームで使用されている。何百万ものショートリードを、既知の配列にアライメントせねばならないか、さもなければデノボアセンブルせねばならない。しかしながら、ＲＮＡ調査については、個々の遺伝子からの転写産物の配列が大きな範囲で重複しているため、その状況は更に複雑である。今まで見出された転写産物バリアントのアノテーションは、個々のエキソン、エキソン−エキソン接合部及びカバレッジ率の発見を基礎として引き続いての転写産物アセンブリを導く枠組みを提供する。正しい転写産物アセンブリだけが、リードをそれらの親ＲＮＡ分子に割り当てることを可能にし、更にそれぞれのコピー数の計算を可能にする。
【０００８】
ＮＧＳ技術とは無関係に、配列情報と頻度情報との同時の測定は、複雑な配列混合物を調査するにあたっての一つの主要な問題である。その配列のみがその分子の性質を決めるので、同じ分子をそれらの存在量に比例して繰り返しシーケンシングすることは、それらの相応のコピー数をカウントするためには避けられないと思われる。６桁のダイナミックレンジとするには、低含量の分子について統計学的に妥当な値に到達するまで、何百万もの同一の非常に多量の分子にわたる繰り返しのシーケンシングが必要となる。そのようなアプローチは、シーケンシングと引き続いてのデータ分析との間にリソース及び時間を消費する。必要とされるリードデプス（read depth）は、試料の複雑性に大きく依存する（非特許文献１；非特許文献２）。結局、一つの主な難題は、個々の遺伝子内で、重複するリードを重複する多数の転写産物アノテーションにアライメントすることのもつれ合いである。リードデプス及び計算における労力及び費用は莫大である。したがって、１つのｍＲＮＡ分子当たりちょうど１つのリードを生成することによって、重複するリードのアライメントの必要性を排除する種々のアプローチが開発されている。そのような複数のリードのグループ化及びカウントは、ｍＲＮＡ測定及び遺伝子発現測定を簡単なものにする（特許文献２）。
【０００９】
ｍＲＮＡ前駆体のポリアデニル化は、真核性遺伝子発現及び調節の一つの重要な工程である。多くの遺伝子は、選択的ポリアデニル化部位、つまりＡＰＡと別個の３’ＵＴＲとを有するｍＲＮＡを産生し、上記遺伝子は、様々に調節されてよく、又は様々なタンパク質アイソフォームをコードしてもよい。したがって、１つのｍＲＮＡ当たりちょうど１つのリードを生成することによる遺伝子発現値の測定の単純さと、ポリアデニル化部位の正確な同定とを組み合わせるために、これらのＡＰＡを排他的にターゲティングする方法が開発された。
【００１０】
そのような方法の一つは、ポリＡ部位をゲノムワイドに、そして鎖特異的に同定することである（非特許文献３）。ここでは、ＮＧＳシーケンシングのためのライブラリーは、ＲＮＡ試料を熱断片化し、固相可逆固定化（ＳＰＲＩ）を行い、バッファー交換により精製することで更なる断片化を停止させ、ビオチン化されたアンカー用のポリＴ（Ｖ）プライマーアダプターでプライミングした後に逆転写を行い、ＳＰＲＩ精製を行うことで全ての非ポリＡ含有断片を除去し、そして溶液を交換し、ＲｎアーゼＨで処理してＲＮＡを分解し、そしてより小さいＲＮＡ断片を、第二鎖合成のためのランダムな開始配列として、可能な限り長い二本鎖を生成する（それというのも、全ての他の内側に広がるプライミング部位は鎖置換を通じて置換されるであろうからである）ＤＮＡポリメラーゼＩと一緒に使用し、ＳＰＲＩ精製を行い、ストレプトアビジン親和性精製を行い、そして以下の３工程、つまり酵素末端修復、シングルｄＡテーリング、別のアダプターのライゲーションのそれぞれの後に溶液交換を可能にする結合を行い、それに引き続きエンリッチメントＰＣＲ及びＳＰＲＩ精製を行うことによって調製される。
【００１１】
得られたＮＧＳライブラリーは、１つのｍＲＮＡ分子当たりちょうど１つのリードを含むが、１つのｍＲＮＡ当たり１つのリードが、理論上の最高を示す。実際的な問題として、ライブラリー生成の多くの反応工程のそれぞれは１００％を下回る効率を有するので、その結果が表すのは、歪められた、そして実現が望まれるには比例的に歪められた転写産物量である。転写産物種１つ当たりのリードの数は、それらのコピー数に比例しており、それらの長さ又は任意の他の配列特異的なバイアスには比例していないことが重要である。その労力と、化学と、消耗品とを集約した方法は、遺伝子発現測定に有利である。それというのも、該方法は、各転写産物からたった１つのリードしか産生されないので、単純なリードのカウントによりＲＮＡ量の定量化を可能にするからである。該方法は、実際のシーケンシングが始まる前に、プライマーアダプターのポリＴストレッチを黙々と読み通す特定のＮＧＳプロトコルを続ける。この部分は、３’Ｔ−フィル（3'T-fill）法と呼ばれる。さらに、ポリＡ部位アイソフォームの発現レベルは、単一ヌクレオチド配列の精度で検出及び定量化することができるか、又はそれぞれのクラスターに近接したポリＡ部位を併合した後に検出及び定量化することができる。リード生成のより良い質の他に、該プロトコルにおける主な改善は、それらの最後の転写産物からのシーケンシングを可能にした上記３’Ｔ−フィルの導入であった。
【００１２】
他のポリＡ部位エンリッチメント方法は以前から開発されているが、それは上述の３’Ｔ−フィルを用いるものではなかった。転写産物バリアントの内部参照を欠いているので、該方法の種々の品質を判定しづらい。一つのより単純な方法は、ポリＡ結合配列の多重化分析（ＭＡＰＳ）である（非特許文献４）。ここでは、ビオチン化されたオリゴｄＴ（ＮＶ）を含むアダプター配列がｃＤＮＡ合成のプライミングのために使用される。固相選択に際し、第二鎖合成は、別のアダプター配列に結合されているランダムプライマーを使用することによって開始される。最後に、上記ライブラリーは、ストレプトアビジン被覆ビーズから放出され、そして通常のプライマーと一緒にバーコード付きプライマーを使用して増幅される。この方法は、同様に遺伝子発現を力強く検出する能力を有する。読み取り方向が当初ｍＲＮＡの３’末端に向けられ、かつ該ライブラリーの非常に狭いサイズの選択だけがポリＡ部位中への読取りを可能にすることとなるが、該アダプター（プライマー）配列の交換及び上記の３’Ｔ−フィル法との組み合わせは、また、全てのリードでポリＡ部位の正確な検出を可能にする。
【００１３】
上記方法には幾つかの落とし穴がある。その目的は全長ｃＤＮＡを合成することであり、該ｃＤＮＡの末端をジデスオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）で保護してから、該ｃＤＮＡをストレプトアビジンビーズ表面に結合させ、該ｃＤＮＡをこれらの手段によって精製し、プライミングし、そしてＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼで第二鎖を伸長させている。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を介して任意の対向した下流の鎖を分解するとともに、１つのｃＤＮＡにつき１つだけの第二鎖、つまりポリＡ部位から最も遠くでプライミングされた鎖が、述べられた親和性結合法を通じて二本鎖産物を精製する前に産生されることを保証するように選択されている。ｃＤＮＡが長いので、上記ＮＧＳライブラリーは長い傾向にあり、それは後のＮＧＳクラスター生成において長さのバイアスに導くこととなる。上記第二鎖合成はビーズ表面で行われるが、それは、特にビオチン化された第１のプライマー配列の配列に向かう境界領域で阻止される。表面限定の反応によって支援される多数の精製工程は、確実なポリＡ部位リードの生成において一連の長さ及び配列のバイアスをもたらす。
【００１４】
もう一つのディープシーケンシングをベースとする方法は、定量的ポリＡ部位シーケンシング（ＰＡＳシーケンシング）である（非特許文献５）。この方法は、所望のサイズ範囲のＲＮＡ断片を生成するための断片化工程から始まる。またしても、第１のアダプター配列は、アンカー用のオリゴｄＴ（ＮＶ）プライマーの一部である。この方法は、逆転写酵素の末端トランスフェラーゼ活性を利用している。ｍＲＮＡ断片の５’末端に到達すると、ＭＭＬＶ−Ｖ  ＲＴは、幾つかの鋳型にないデオキシシトジン（deoxycytodines）をｃＤＮＡの３’末端へと付加する。それらの末端は、三重Ｇ配列を含む第２のアダプターとハイブリダイズする。該逆転写酵素は、鋳型を切り替え、そしてここで両方のアダプター配列だけ伸長されたｍＲＮＡ断片のコピーを合成することまで継続する。
【００１５】
この非常に単純な方法の主たる欠点は、わずか１％〜１０％という非効率性、バイアス及び鋳型切り替えの不正確性である。低い効率は、低含量の転写産物の損失をもたらすと考えられる。切り替える鋳型は、鋳型切り替えプライマーに排他的にカップリングされず、そして人工的な融合転写産物が、種々のＲＮＡ鋳型への切り替えによって生成されることがある。また、該鋳型切り替えプライマーは、大過剰に準備する必要があり、後続のライブラリー増幅前の精製工程を必須のものとする。
【００１６】
もう一つのポリＡ−ｓｅｑ法は、非特許文献６によって記載されている。該プロトコルは、第１のアダプター配列を含むアンカー用のポリＴプライマーを用いた第一鎖合成、事前にＲＮＡを消化するためのＲＮアーゼＨ処理、第２のアダプター配列を含むランダムプライマーによるプライミング、及び第二鎖の合成のためのクレノウ伸長を使用する。クレノウＤＮＡポリメラーゼＩ断片は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているが、該断片は、不変の鎖置換活性を含む。したがって、それぞれの第一鎖ｃＤＮＡは、幾つかのランダムにプライミングされた第二鎖を生成し得る。ｍＲＮＡ量とリードのカウントとの明白な全射的相関は保証されない。
【００１７】
特許文献３は、第一鎖合成の間にプロセッシブＲＴ酵素と耐熱性ＲＴ酵素との間で前後して回すことを含む方法により全長ｃＤＮＡを生成する方法に関する。
【００１８】
特許文献４は、第一鎖及び第二鎖の合成方法に関する。第一鎖合成のために、ビーズに固定化されたプライマーが使用され、第二鎖合成のためにはランダムヘキサマーが使用される。第二鎖合成は、鎖置換活性を含むクレノウの混合物を用いる。
【００１９】
非特許文献７は、ＲＮＡ−ｓｅｑを使用したトランスクリプトーム研究に関する。
【００２０】
非特許文献８は、３’領域抽出及びディープシーケンシングによる選択的開裂及びポリアデニル化の分析に関する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第９８／４４１５１号
【特許文献２】国際公開第０２／０５９３５７号
【特許文献３】米国特許第６，４０６，８９１号
【特許文献４】欧州特許出願公開第１３７１７２６号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Hopper, 2010
【非特許文献２】Wendl, 2009
【非特許文献３】Wilkening, 2013
【非特許文献４】Fox-Walsh, 2011
【非特許文献５】Shepard, 2011
【非特許文献６】Dertiら[2012]
【非特許文献７】Costaら[2010]
【非特許文献８】Mainul Hoqueら[2012]
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
遺伝子発現のカウントのためには、ｍＲＮＡ存在量とリードのカウントとの間の全射的相関を有するＮＧＳライブラリーアンプリコンを生成するための確実で効率的で簡単かつ費用的に効率的な方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明は、鋳型ＲＮＡ分子の核酸産物を生成する方法であって、場合により鋳型ＲＮＡを得た後に、
ａ）第１のオリゴヌクレオチドプライマーを、上記鋳型ＲＮＡの予め選択された核酸領域でアニーリングさせること、
ｂ）該第１のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることによって、通常は該鋳型ＲＮＡを含む二本鎖の状態にある第１の伸長された鎖を得ること、
ｃ）該ＲＮＡ鋳型を少なくとも上記二本鎖から除去すること、
ｄ）１又は複数種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを上記第１の伸長された鎖にアニーリングさせること、
ｅ）上記１又は複数種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを、鋳型特異的に、１）上記第１の伸長された鎖にアニーリングされたプライマーを置換することなく、又は２）置換された鎖を破壊するポリメラーゼを用いて伸長させることによって、更なる伸長産物を生成すること、
ｆ）上記第１のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に（又は相補して）伸長された核酸部分を含む上記更なる伸長産物の伸長産物を単離及び／又は増幅すること、
を含む、方法を提供する。
【００２５】
本発明は、また、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、補因子、例えばポリメラーゼに必要とされる金属イオン、好ましくはＭｇ２＋の塩、プライマー、好ましくはポリＴプライマー、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｑ５若しくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又は置換された鎖を破壊するポリメラーゼ、例えば全長Ｂｓｔ、大腸菌のＩ型ＤＮＡポリメラーゼ及びランダムオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットに関する。該キットは、本発明による方法を、好ましい特徴のいずれか１つ又は該特徴の組み合わせを伴う、いずれかの実施形態に従って実施するのに適切であり得る。
【００２６】
以下の詳細な開示は、本発明の全ての態様及び実施形態を包含している。方法の記載も、上記方法を実施するのに適したパーツを含んでよいキットを包含する。キットの構成要素はまた、そのような構成要素をそれらの機能に従って実施又は使用することができる方法を包含し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本発明による方法の略図である。該反応は、引き続き反応物を添加することによって進行し、以下の段階に分けられる。ａ）ｃＤＮＡ合成は、既に存在するか（ここではｍＲＮＡのポリ（Ａ））又は先行する反応で結合されたかいずれかの既知の領域又はタグにプライミングすることによって開始される。Ｐ１は、上記の既知の領域に相補的であり、更にユニバーサルタグとしてはたらく非相補的な特異的配列を５’末端に含む。ｂ）ＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素によってｃＤＮＡへと逆転写される。ｃ）ｃＤＮＡ合成後に、該ＲＮＡ鋳型はＲＮアーゼ、ｐＨ変化（ＮａＯＨ及び熱）又は二価カチオン（Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋及び熱）のいずれかによって加水分解又は分解される。ｄ）次いで、該一本鎖ｃＤＮＡは、多数のランダムプライマー、Ｐ（ｎ）、Ｐ（ｎ＋１）．．．Ｐ（ｎ＋ｎ）によってプライミングされる。ｅ）そして第二鎖は、鎖置換を伴わないＤＮＡ依存性ポリメラーゼを使用して合成される。ｆ）鎖置換の欠如は、最も３’側の断片だけが、２つのタグ、つまり一方は、ｃＤＮＡ合成プライマー由来のものであり、かつもう一方が第二鎖合成プライマー由来のものであるタグを含むであろうことを保証する。この最も３’側の断片が単離及び／又は増幅される。
【図２】該アッセイにおいて生ずる例示的な核酸分子の略図である。２つのオリゴ（配列番号２及び配列番号３）は、一本鎖ＤＮＡ鋳型（配列番号９）にハイブリダイズされる。鎖置換を伴わないポリメラーゼは、配列番号３の伸長の結果として６５ｎｔ長の断片（配列番号４）を生じ、配列番号２の伸長の結果として８５ｎｔ長の断片（配列番号５）を生ずることとなる。鎖置換を伴うポリメラーゼは、配列番号２の伸長及び配列番号３の置換の結果として１５０ｎｔ長の断片（配列番号６）を生ずることとなる。さらに、配列番号３の伸長の結果として６５ｎｔ長の断片（配列番号４）と、鎖置換が不十分な場合には８５ｎｔ（配列番号５）から１５０ｎｔ（配列番号６）の間の産物とが生ずることもある。
【図３】種々の反応温度での鎖置換活性を有するポリメラーゼと鎖置換活性を有さないポリメラーゼとの比較を示す図である。３種の異なるポリメラーゼである、両者とも鎖置換を伴わないＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ及びＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ並びに鎖置換を伴うクレノウ断片３’−５’Ｅｘｏ−を、種々の反応温度で試験した。白色で中塗りされた矢印は、部分的に置換された鎖置換停止産物を示している。変性工程なしでの一本鎖鋳型の二次構造は、黒色の矢印で示されている。
【図４】種々の反応温度での鎖置換活性を有するポリメラーゼと鎖置換活性を有さないポリメラーゼとの更なる比較を示す図である。Ｔ４については２５℃が３７℃よりも推奨することができる。それというのも、３７℃では固有のエキソヌクレアーゼが該反応を肩代わりするからである。
【図５】ＭｎＣｌ２、高められた温度単独、ＮａＯＨ処理又はＲＮアーゼによる種々のＲＮＡ分解法の比較を示す図である。マウス肝臓から単離された全ＲＮＡは、１１１ｎｔの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（配列番号７）でスパイクした（レーン１及びレーン１０を参照のこと）。標準的なＲＴバッファーである５０ｍＭのトリスＨＣｌ（２５℃でのｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＤＴＴ中での、９５℃で３０分間並びに９８℃で５分間、９８℃で１０分間、９８℃で２０分間及び９８℃で３０分間の熱処理によって、該ＲＮＡは分解されるが、該ＲＮＡは完全に除去されない。ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ混合物をＲＮアーゼ  Ｈ／Ａ／Ｔ１ミックスと一緒に、２５℃又は３７℃のいずれかで３０分間にわたりインキュベートすることで、該ＲＮＡは一本鎖ＤＮＡを分解することなく完全に除去される。高められた温度で１０分間（５５℃）、０．１ＮのＮａＯＨの存在下でインキュベートすることで、該ＲＮＡは分解されるものの、完全には分解されない。０．１ＮのＮａＯＨ中にて９５℃で１０分後に、該ＲＮＡは完全に除去されるが、上記ｓｓＤＮＡも分解し始める（レーン７〜１０）。１０ｍＭのＭｎＣｌ２をＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ／ＲＴバッファー混合物に添加して、９８℃で５分間、１０分間、２０分間、そして３０分間にわたり熱処理することで、ｓｓＤＮＡを分解することなく、該ＲＮＡの完全な分解がもたらされる。
【図６】初期ＲＮＡ断片化のライブラリーサイズ及び効率に対する効果を示す図である。ａ）及びｂ）は、６ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で断片化され、そして最終的に１４回のＰＣＲサイクルにわたり増幅されるが、ｃ）及びｄ）は、４ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で断片化され、２回の更なるＰＣＲサイクルが必要とされた。全ての断片化は、８５℃で３分間にわたって進行させた。
【図７】ＲＴプライマー濃度及び第二鎖合成プライマー濃度のライブラリーサイズ及び収率に対する影響を示す図である。ａ）５０ｎＭのアンカー用のポリｄＴ（ＲＴ）プライマー（配列番号８）及び１μＭの第二鎖合成オリゴ＋ｒｃ（配列番号９及び１０）、ｂ）２５ｎＭのアンカー用のポリｄＴ（ＲＴ）プライマー及び０．５μＭの第二鎖合成オリゴ＋ｒｃ、ライブラリーはロードする前に１：３希釈した、ｃ）５０ｎＭのアンカー用のポリｄＴ（ＲＴ）プライマー及び０．５μＭの第二鎖合成オリゴ＋ｒｃ、ライブラリーはロードする前に１：３希釈した、ｄ）２５ｎＭのアンカー用のポリｄＴ（ＲＴ）プライマー及び０．１μＭの第二鎖合成オリゴ＋ｒｃ。
【図８】ＲＮＡ分解法のＮＧＳライブラリーの質に対する影響を示す図である。該ＲＮＡは、ａ）１０ｍＭのＭｎＣｌ２、９５℃で１０分間、ｂ）５０００ＵのＲＮアーゼ  Ｈ、３７℃で３０分間、ｃ）逆転写用バッファー、９５℃で１０分間、ｄ）１００ｍＭのＮａＯＨ、９５℃で１０分間、及びｅ）２００ｍＭのＭｎＣｌ２を通じて分解されている。ＭＬ、低分子量マーカー；ＭＨ、高分子量マーカー；Ｐ、残留しているプライマー；ＬＬ、リンカー−リンカー断片。
【図９】第二鎖合成後のシリカカラムとＳＰＲＩ精製との間の比較を示す図である。ａ）ヒドロキシル変性された磁性ビーズと塩−ＰＥＧバッファーとを用いるＳＰＲＩ精製及びｂ）ｐＨ緩衝系を用いるシリカカラム精製。
【図１０】ヌクレオチド配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ＲＮＡ分子１つ当たり（ちょうど）１つの増幅産物を、第１のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に（若しくは相補して）伸長された核酸部分を含む伸長産物を目標とすることによって（例えば配列タグ若しくはリンカー配列を選択することによって、又はもう一つのプライマーの配列、例えば上記第１のプライマーに相補的な配列を選択することによって）提供するための簡単かつ経済的な方法であって、例えばオリゴｄＴ含有プライマーが使用される場合には、プライミング反応の３’末端特異性によって実現され、又は遺伝子若しくは転写産物に特異的な配列が第一鎖合成とそのような産物の引き続いての単離、選択若しくは増幅との間にターゲティングされる場合には、遺伝子／転写産物の特異性によって実現される、方法に関する。上記第１の伸長された鎖にアニーリングされたプライマーの置換を抑制することによって、又は置換された鎖を破壊することによって、１つだけの産物、すなわち工程ｆ）の選択、単離、増幅又は一般的にプロセシングの基準を満たす鋳型の予め選択された領域の最も近くに結合する工程ｄ）のプライマーから延びる産物が得られる。したがって、それぞれのＲＮＡ鋳型の種類（予め選択された配列を有する）の濃度又はコピー数は、本発明による方法によって最終的に得られる伸長産物と直接的に相関する。該方法は、先に概要で記載されており、かつ更に特許請求の範囲において記載される。該方法は、１つの単独の徐々に増大していく容量又は容器において、特に更なる試薬を反応混合物にただ更に加えていくことによって実施することができ、工程ａ）〜ｅ）において混合物から成分を単離することによって精製する必要はない。更なる試薬は、幾らかの程度まで、流体中に既に存在する成分を中和するか、又は該成分を構成してよい。このアプローチは、全ての中間反応生成物が１つの一貫した容量相内で常に保たれるため、処理を単純化するだけでなく、該方法の信頼性を高める。手動の調製において間で行われる任意の精製（複数の場合もある）を減らす他に、これは、自動化に適したチップ又はマイクロ流体デバイスへの該方法の実装を非常に容易にする。
【００２９】
遺伝子発現は、増幅産物又はリードを遺伝子アノテーションにアライメント及びグループ化し、かつこれらのリードをカウントすることによって測定され、ここでリードを、転写産物足場にアライメントする必要はなく、かつ引き続き、或る特定の長さ及び配列に特異的なバイアスを排除するために行われる、ＲＮＡ分子１つ当たり２つ以上のリードがある方法では必要とされる転写産物に特異的な正規化アルゴリズムにかけられない。
【００３０】
本発明による方法が短いのは、２つのプライミング事象、２つのポリメラーゼ反応、１つの中間体ＲＮＡ加水分解を必要とし、それに引き続き、ＲＮＡ鋳型の予め選択された核酸領域に相当する産物の選択を目的とする１つの最終的な単離、増幅又は精製が行われるからである。
【００３１】
転写産物１つ当たりわずか１つのリードは遺伝子発現のカウントにおいてより高い精度をもたらすことが知られている。本発明による方法の一つの新たな態様は、全長ｃＤＮＡと比較して限られた長さを有するわずか一部分を分析するときに行われる長さの正規化のために必要とされるリードデプスの低下である。
【００３２】
遺伝子発現シグナルをｍＲＮＡの予め選択された核酸領域に制限することにより、従来の全長シーケンシングと比べて目下約五分の一になると見積もられる、より低い相対シーケンシング費用と、試料調製物のレベルで長さの正規化が行われるため、より正確な遺伝子発現値とが可能となる。したがって、正確なＦＰＫＭ値（百万個のマッピングされたリード当たりの転写産物のキロベース数当たりの断片）の計算のために転写産物バリアントの長さに対して予知は必要とされない。ｍＲＮＡの領域によって提供される情報内容が、大規模分析において試料を分類する目的のために十分であるのは、その情報内容が全規模転写産物分析よりも少ないももの、単純な遺伝子発現が提供するであろうものより多いからである。
【００３３】
生成された核酸産物は、また、増幅産物として理解してもよい。それというのも、核酸増幅反応が使用されるが、もちろんその鋳型ＲＮＡそれ自体はその全体でコピーされず、そのため該方法によって多重化されないからである。該方法は、鋳型ＲＮＡの領域のコピーされた配列を含むポリヌクレオチドを「増幅」することか、又は該ポリヌクレオチドを単純に生成することを目的とする。このコピーされた配列は、鋳型ＲＮＡの一部であり、プライマー結合工程ａ）で使用される予め選択された核酸領域の５’方向にある。該コピーされた配列は、通常は、約２５ヌクレオチド〜２０００ヌクレオチドの長さを有し、おおよそ約１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、５００ｎｔ又は１０００ｎｔを有する。厳密な値は様々であり得るが、実施者によって使用されるパラメータ及び試薬によって影響される。実質的に、実施者は、例えば該反応で使用されるプライマー、特にランダムプライマーであってよい工程ｄ）のプライマーの量及び構成を変更することによって、得られる領域長さを調整することができる。実施者は、平均領域長さを、後続のＮＧＳ又は任意の他のシーケンシングに最適であるように調整することができる。
【００３４】
本発明の一つの可能性によれば、それぞれの転写産物（鋳型ＲＮＡ分子）又はターゲティングされる配列（予め選択された核酸領域は、転写産物１つ当たり２以上としてもよい）が、全転写産物に沿った多数のリードと比較してちょうど１つのリード（伸長産物に基づいて）を生成するとともに、これらのリードが、同じヌクレオチドで全て開始又は終止することができる場合、これらのリードが転写産物の異なるコピーから由来する場合か、又はそれらがＰＣＲ複製事象に由来する場合に、曖昧さを引き起こすかもしれない。したがって、場合により、バーコードを、第１の伸長反応の間に、プライミング事象ごとにタグ（バーコード）に対して使用し、こうして多数の転写産物コピーをクローナルＰＣＲ複製事象と区別して、真の再サンプリングの程度を決定することができる（米国特許出願公開第２０１１／０１６００７８、引用することにより本明細書の一部をなす）。理想的には、そのようなバーコードは、リンカー配列中にランダムバーコードとして導入される。好ましくは、それらはプライミング反応には加わらない。その際、それぞれのリード（又は伸長産物）は、他のリード（伸長産物）とは異なる個々に独自のバーコードを有することとなる。
【００３５】
比例的なＰＣＲ複製は、要求されるより高い精度を課するものではないが、適用されたリードデプスがＮＧＳライブラリーの複雑さを上回り、こうしてシーケンシングの実行が、同じインサートのコピーを再びシーケンシング（読み出し）し始めることを示している。
【００３６】
ＰＣＲ複製自体は問題ではないが、同じ配列で開始及び終止するリードを理解することは、ユーザーに、シークエンシングを深くしすぎていることか、又はライブラリーの複雑さが低すぎることを確信させることがある。転写産物からの全てのリードはポリＡテールに隣接した同じ配列（又は他のターゲティングされた配列）から始まり、しばしば好ましい配列で終わるので、上記リードは、大抵ＰＣＲ複製物であるように見えるが、そうではない。したがって、第一鎖合成の間に導入されるランダムバーコードのようなシグネチャは、複製物から本物の単一のリードを識別することを可能とする。
【００３７】
鋳型ＲＮＡを得る又は提供する予備工程は、任意のＲＮＡ、例えば細胞由来の全ＲＮＡを含有する試料を準備することである。また、特殊なＲＮＡ画分、例えばｍＲＮＡ画分又は以下のＲＮＡ型のうちの一つを選択することができる。上記ＲＮＡは、好ましくは転写産物若しくはｍＲＮＡであり、特に好ましくは、該ＲＮＡは、ポリＡ部位若しくはポリＡテールを含み、もちろん、他のＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡ前駆体、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ前駆体、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ前駆体若しくはｒＲＮＡを使用及び分析してよく、そのいずれか１つは、単独で又は他のＲＮＡ型と組み合わせて、上記ＲＮＡ中に含まれてよい。好ましくは、上記鋳型ＲＮＡは、ポリＡ部位又はポリＡテールを含む。それ自体がＲＮＡ種類中に存在しなければ、テールは人工的にテーリング反応によって付加されてよい。もちろんまた、ポリＡ以外の他のテールは、例えばリガーゼ（キットの任意成分）を使用するライゲーション反応によって、例えば国際公開第２００７／０６２４４５号に記載されているように付加することができる。工程ａ）の第１のプライマーは、その際、この（人工的な）テールの配列にアニーリングすべきである。後続工程において、好ましくは、ｃＤＮＡは本発明による方法の間に、ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって、好ましくはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することによって生成される。代替的には、関心の転写産物、例えば癌、免疫不全等の病気の発生に関与する転写産物の特定の領域は、ＲＮＡの初期プライミングの間に転写産物特異的プライマーを使用してターゲティングすることができる。
【００３８】
上記ＲＮＡ鋳型は、任意の長さのものであってよいが、好ましくは２０ｎｔ〜１０００００ｎｔ（ヌクレオチド）の範囲、特に好ましくは３０ｎｔ〜５００００ｎｔの範囲、より好ましくは５０ｎｔ〜２５０００ｎｔの範囲、７５ｎｔ〜１００００ｎｔの範囲、又は１００ｎｔ〜８０００ｎｔの範囲である。
【００３９】
好ましくは、上記３’末端の（任意の）テーリングは、ターミナルトランスフェラーゼ（キットの任意成分）を使用して行われる。しかし、例えば定義された予め選択された配列であってよいテール配列のライゲーションのような他のテーリング法も開示されている。上記ターミナルトランスフェラーゼは、１つのヌクレオチド型から好ましくは一様に選択される或る特定の数のヌクレオチドを付加することができる。テーリング、つまりはテール配列を付加するための任意の他の手段は、例えば一様に１つの種類のヌクレオチド又は様々なヌクレオチドのものであってよいテール配列をライゲーションすることによって使用することもできる。そのようなテールは、好ましくは、５ヌクレオチドから５００ヌクレオチドの間の範囲、より好ましくは４００ヌクレオチド未満、３００ヌクレオチド未満、２００ヌクレオチド未満、１００ヌクレオチド未満、５０ヌクレオチド未満又は３０ヌクレオチド未満の範囲にある配列である。任意のそのようなテール（又はその一部分）は、工程ａ）における予め選択された３’末端の核酸領域であって、そこにプライマーがアニーリングすることができる領域として使用することができる。
【００４０】
本発明による方法は、種々の核酸配列を有する様々なＲＮＡ分子の複雑な混合物を分析するのに特に適している。好ましくは、種々の配列の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の、特に少なくとも２０の、少なくとも３０の、少なくとも４０の、少なくとも５０の、少なくとも７５の、少なくとも１００の、少なくとも２００の以上の種々のＲＮＡ鋳型が、本発明による方法で得られる、及び／又は使用される。
【００４１】
工程ａ）、つまり第１のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型ＲＮＡの予め選択された核酸領域でアニーリングさせる工程は、ハイブリダイゼーション条件下（二本鎖の溶融温度未満）で該予め選択された領域にアニーリング又はハイブリダイズする第１のプライマーを準備することを含む。したがって、該プライマーは、アニーリング反応又はハイブリダイゼーションのために十分な長さの相補的配列を含む。相補的領域は、当該技術分野で一般的に使用されるいずれかの領域とすることができ、それは、例えば６ｎｔ〜４０ｎｔの長さ、好ましくは少なくとも６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ以上のｎｔの長さである。予め選択された領域は、既知の配列又は予測された配列の１つ、例えば真核性ｍＲＮＡに共通するポリＡテールである。任意の他の既知の配列、例えば遺伝子特異的若しくは転写産物特異的な配列又は関心の１つ若しくは複数の特定のターゲットについて選択する配列を使用してよい。そのような１つ又は複数のターゲット配列を使用して、疾患特異的パネル、例えば癌又は免疫不全に関するもの等のパネルを作成することができる。上記予め選択された核酸領域は、関心の１つ又は多数の鋳型ＲＮＡに存在してよい。関心のこれらの鋳型は、共通の特性、例えば特定の病気又は状態に関連する共通の特性を共有し得る。好ましくは、関心の鋳型のこのパネルは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の、例えば少なくとも１５の、少なくとも２０の、その間の任意の範囲の、予め選択された核酸領域を含む鋳型を含む。多数の第１のプライマーを使用することで、このパネルに１つの反応においてアニーリングされるかもしれない（多重化）。
【００４２】
必ずしもそうではないが、好ましくは、それは、鋳型ＲＮＡの予め選択された３’末端領域、例えばポリＡテール又は上記のようにテーリングの間に付加される別のテールである。上記予め選択された領域は、関心のＲＮＡ型（例えば先に開示されたもの）にとって特徴的な配列を有してよい。また、先に述べたように、上記予め選択された領域は、人工的にＲＮＡ鋳型へと、例えばライゲーション又はテーリングによって結合され得る。
【００４３】
上記プライマーは、ＲＮＡ鋳型にアニーリングする配列、例えば塩基対形成によってハイブリダイズする相補的配列を有する１つの領域と、場合により、結合しない領域、例えば非相補的配列及び／又は更なるハイブリダイゼーションを妨げるこの領域とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドによってブロックされる配列を有することによって結合しない領域とを含んでよい。この非結合領域は、好ましくは、ＰＣＲ複製事象からの多数の転写産物コピーを区別するための（好ましくはランダムな）バーコードを含む。好ましくは、そのようなバーコードは、ブロック状の領域に位置している。上記アニーリング領域は、例えばオリゴｄＴ８〜オリゴｄＴ３５の領域であってよく、好ましくはオリゴｄＴ１５〜オリゴｄＴ３０の領域であってよく、例えばオリゴｄＴ１０又はオリゴｄＴ２５であってよく、該領域は、選択性を高め、そしてｍＲＮＡ内の内部Ａリッチ部位で、それらが鋳型ＲＮＡの所望の予め選択された領域ではない場合に生じ得る内部プライミング事象を減らす。
【００４４】
好ましくは、上記第１のプライマーは、ＤＮＡプライマー、場合によりランダムプライマーについて以下に記載されるように修飾されたＤＮＡプライマーである。
【００４５】
工程ｂ）、つまり第１のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させることにより第１の伸長された鎖を得る工程は、任意の鋳型特異的なオリゴヌクレオチド伸長反応で、好ましくはヌクレオチドポリメラーゼ、好ましくはＤＮＡポリメラーゼ、特に逆転写酵素を使用して、逆転写のための鋳型としてＲＮＡを用いて行うことができる。その際、上記第１の伸長された鎖は、通常、相補鎖として鋳型ＲＮＡを含む二本鎖の状態である。上述の第１の伸長された鎖は、後続工程における更なるプライマー伸長反応のための鋳型である。逆転写は、以下に更に記載される、鎖置換活性を有するか、又は鎖置換活性を有さない任意の逆転写酵素を使用して、例えばＭ−ＭＬＶ  ＲＴを用いて実施することができる。好ましくは、少なくとも幾らかの鎖置換は、該ポリメラーゼがＲＮＡ二次構造を解く（uncoil）のを可能にするために存在する。ＲＮＡ鋳型を使用する逆転写酵素の場合に、好ましい実施形態においては、逆転写は、ＲＮＡ鋳型の二次構造若しくは三次構造（ＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッド）の形成を可能にしない条件下で、又はこれらの二次構造を逆転写酵素によって鎖置換することを可能にする条件下で行われる。伸長反応の間に使用されるポリメラーゼは、ウイルスのポリメラーゼであってよく、かつＡＭＶ  ＲＴ（及びその突然変異体、例えばＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ）、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（及びその突然変異体、それらに限定されるものではないが、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩ、ＩＩ若しくはＩＩＩ、Ｍａｘｉｍａ  ＲＴ、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｐｒｅｍｉｕｍ、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ、ＧｏＳｃｒｉｐｔを含む）、ＨＩＶ  ＲＴ、ＲＳＶ  ＲＴ、ＥＩＡＶ  ＲＴ、ＲＡＶ２  ＲＴ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｃ．ヒドロゲノフォルマンス（C. hydrogenoformans）のＤＮＡポリメラーゼ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）及びそれらのＲＮアーゼＨ突然変異体からなる群から選択することができる。これらのポリメラーゼのいずれかの混合物を使用することができる。特に、ウイルスのポリメラーゼの混合物、例えばＭ−ＭＬＶとＡＳＬＶとの混合物を使用することができ、及び／又はＲＮアーゼＨ還元型類似体若しくはＲＮアーゼＨマイナス類似体を使用することができる。これらの方法及び組成物のいずれかにおいて、上記の任意のポリメラーゼを含む２種以上のポリメラーゼを使用することができる。
【００４６】
工程ｃ）、つまりＲＮＡ鋳型を少なくとも二本鎖から取り除く工程は、上述の第１の伸長された鎖が、少なくとも３’末端領域で、該ＲＮＡ鋳型から解放されることを意味する。該二本鎖は融解され、該ＲＮＡ鋳型は精製によって取り除くことができるが、そのような精製は、更なる面倒な工程を付け加えるためあまり好ましくはなく、又は上記ＲＮＡ鋳型は消化される。消化は、完全に又は部分的に行うことができる。短いＲＮＡ部分は、第１の伸長された鎖に残っていてもよい。それというのも、本発明による方法は、上記第１の伸長された鎖に対して全長での到達は必要としないからである。消化は、ＲＮアーゼ又は加熱を使用して、特に更なるＲＮＡ脱安定化剤の存在下で、例えばアルカリ性条件又は二価カチオン、例えばＭｎ２＋の存在下で実施することができる。好ましくは、ＲＮＡ鋳型の除去は、好ましくはＲＮアーゼによる酵素的ＲＮＡ消化、好ましくはＮａＯＨ処理によるアルカリ性分解を含むか、又は二価カチオン、好ましくはＭｎ２＋若しくはＭｇ２＋の存在下での加熱を含む。
【００４７】
工程ｅ）における反応は、１つだけの伸長産物が、鎖置換を伴わない条件を使用することによって、又は破壊によって、すなわち置換された鎖を、例えば適切なポリメラーゼを使用することにより解重合することによって（その場合には鎖置換は生じてよい）産生されることを保証する。鎖置換を伴わないと、予め選択された領域につき最も３’側に向けられたプライマーだけが第１のプライマーに相当する位置まで伸長に成功する。ＲＮＡ鋳型が、好ましくは逆転写後にこの反応と干渉することを防ぐために、該ＲＮＡは除去され、好ましくは完全に又は少なくとも第二鎖の合成の間に次に続く第２のプライマーよりも低い融解温度を有する短い断片だけしか残らないような程度まで加水分解される。
【００４８】
ＲＮＡは、二価カチオンが存在する場合に、高い温度で自発的分解を受ける。該二価カチオンは、キレート化剤、例えばＥＤＴＡ又はＥＧＴＡによって除去されない場合には後にマスクすることができる。試料が、更に沈殿若しくはカラムベースの精製法で精製されない場合に、キレート化剤の最終濃度は、キレート化剤が何らかの後続生成物を分解することから保護するが、活性のために二価カチオン（例えば、ポリメラーゼの場合のＭｇ２＋）を必要とすることもある後続の酵素反応を阻害しないようにバランスを取るべきである。ＲＮＡの迅速な加水分解は、例えば二価カチオンの存在下で、少なくとも７０℃の温度で、例えば７５℃で、及び／又は９８℃までの温度で起こる。
【００４９】
該ＲＮＡの加水分解は、好ましくはＭｎＣｌ２と、ｃＤＮＡをそのままに保つ一方でＲＮＡは破壊する高い温度とを使用して実施される。これは、ＲＮアーゼを使用するよりもかなり費用効率が高い。アルカリ性条件、例えばＮａＯＨの添加によるアルカリ性条件を使用してＲＮＡを加水分解することもできるが、ｃＤＮＡを同様に分解から、例えばより低温又はアルカリ性の低いｐＨを使用し、ＲＮＡは分解するがｃＤＮＡは分解しないように調節して保護することに、かなり大きな注意を払わねばならない。
【００５０】
工程ｄ）、つまり１又は複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを第１の伸長された鎖へとアニーリングさせる工程は、少なくとも１つのプライマーを該第１の伸長された鎖に結合させることを必要とする。この工程は、本質的に、工程ａ）において第１のプライマーのアニーリングについて記載されたのと同じ原理に従って実施される。上記更なるプライマー（複数の場合もある）の配列は、関心のＲＮＡ鋳型に関して知られる配列であってよいか、又は未知の配列であってもよい。ランダムプライマーを使用することが好ましく、それは、相補的配列の知識を必要としない。上記の工程ａ）でのように、多重化が可能である。工程ｄ）においても、１つ又は複数の特定の選ばれたターゲット領域に場合により特異的にアニーリングすることにより、更なる１つのオリゴヌクレオチドプライマーにつき１つの鋳型ＲＮＡ又は該鋳型ＲＮＡにある遺伝子配列の特異的な選択を可能にする多数の更なるオリゴヌクレオチドプライマーも一つの選択肢である。
【００５１】
ランダムプライミングにおいて、ランダム配列、通常はランダムペンタマー、ヘキサマー、７マー、８マー、９マー、１０マー、１１マー、１２マー又はそれより長いオリゴマー配列のオリゴヌクレオチド集団を使用して、鋳型核酸鎖、ここでは第１の伸長された鎖内のどこかで伸長反応がプライミングされる。該プライマーは、もちろんこのランダムオリゴマー配列に加えて更なるヌクレオチドを含んでよい。場合により、追加のランダムバーコードを使用して、多数の転写産物のコピーをＰＣＲ複製事象から区別することができる。好ましくは、該更なるプライマーは、ＤＮＡであり、場合により以下に記載されるように修飾されたＤＮＡである。
【００５２】
「ランダムプライマー」は、プライマー配列の少なくとも一部分のランダムな合成のため高い多様性を有する異なるプライマー配列部分を有する異なるプライマーの混合物として理解されるべきである。ランダムプライマーは、上記配列のための全組合せ範囲をカバーし得る。該ランダムプライマーのランダム配列プライマー部分は、１、２、３、４、５、６、７、８又はより多くのランダムヌクレオチド又はユニバーサルヌクレオチドを包含することができる。ランダムヌクレオチドは、所定のヌクレオチド位置でランダムにＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ（Ｕ）から選択される。プライマーの配列のハイブリダイズに関して、本願明細書において配列Ｔ及びＵは互換的に使用される。ランダム配列部分についての組合せ可能性はｍｎ通りであり、ここでｍは、使用されるヌクレオチドの型（好ましくはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ（Ｕ）の４つ全て）の数であり、かつｎはランダムヌクレオチドの数である。したがって、それぞれ可能な配列が表されるランダムヘキサマーは、４６＝４０９６種の異なる配列からなる。ランダムプライマーは、Ａ、Ｔ、Ｃ又はＧがそうであるように相補的ヌクレオチドに特異的に結合しない１つ以上のヌクレオチドを含んでもよい。そのようなヌクレオチドは、「ゆらぎ塩基（wobble bases）」又は「ユニバーサル塩基」とも呼ばれる。ユニバーサル塩基を有するヌクレオチド、例えばデオキシイノシン、３−ニトロピロール２’−デオキシヌクレオシド及び５−ニトロインドール２’−デオキシヌクレオシドを使用することができる。ユニバーサル塩基は、任意のヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（Ｕ）又はそれらの少なくとも２種若しくは３種のヌクレオチドと塩基対を形成するであろう。そのようなランダムプライマーについて全ての可能性を含める必要はない。幾つかの実施形態においては、該ランダムプライマーは、少なくとも１つのランダムヌクレオチド（上記の１つの位置で入れ替え）及び／又は少なくとも１種のゆらぎヌクレオチドを含む。ランダムプライマー又は選択された配列のプライマーに関して、少なくとも１０の、好ましくは少なくとも２０の、特に好ましくは少なくとも１００の異なるプライマーが使用される。
【００５３】
特に、限定されるものではないが、ランダムにプライミングされた伸長における最適な表現について、プライマーは、１０ｎＭから１００μＭまでの濃度で、より好ましくは約１μＭで存在してよいが、少なくとも２００ｎＭであってもよい。好ましい実施形態においては、プライマーと鋳型核酸との比率（重量／重量）は、５：１から１：１０００の間、好ましくは２：１から１：５００の間、好ましくは１：１から１：３００の間、好ましくは１：２から１：２５０の間、好ましくは１：５から１：１５０の間、好ましくは１：１０から１：１００の間、好ましくは１：１２から１：５０の間である。プライマーと鋳型核酸とのモル比は、１００：１から１００００００：１の間、好ましくは１０００：１から１００００００：１の間、１００００：１から５０００００：１の間、又は２００００：１から３０００００：１の間であってよい。一例では、１００ｎｇのｍＲＮＡ出発材料を使用し、かつ５００ｎｔ〜５０００ｎｔのｍＲＮＡ長を２０００ｎｔの平均値で仮定し、かつ１ｎｍｏｌのプライマーを添加すると、プライマーは、６８００：１のモル過剰で存在する。
【００５４】
更なるプライマーは、第１の伸長された鎖にアニーリングする配列を有する１つの領域と、場合により、例えば非相補的配列を有することによって、及び／又は更なるハイブリダイゼーションを防ぐこの領域とハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドによってブロックされる配列を有することによって結合しない領域とを含んでよい。この非結合領域は、多数の転写産物のコピーをＰＣＲ複製事象から区別するために、バーコード、好ましくはランダムバーコードを含んでもよい。
【００５５】
工程ｅ）、つまり１又は複数種の更なるオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に、第１の伸長された鎖にアニーリングされたプライマーを置換することなく、又は置換された鎖を破壊することにより更なる伸長産物を生成するポリメラーゼを用いて伸長させる工程は、工程ｂ）と同様のコンセプトに従う。所定の鋳型、例えばＤＮＡに適したあらゆる伸長法を使用することができる。好ましい実施形態においては、（鋳型がＤＮＡであればＤＮＡ依存性であり、又は鋳型がＲＮＡであればＲＮＡ依存性である）ポリメラーゼ、好ましくは更なる伸長産物がＤＮＡであるべきであればＤＮＡポリメラーゼが使用される。
【００５６】
この工程におけるプライマー置換の抑制は、様々な措置によって、例えば置換活性を有さないポリメラーゼの選択によって、又はポリメラーゼによる置換に抵抗性を有するプライマーを提供することによって、又は置換された鎖を破壊するポリメラーゼを使用することによって達成することができる。
【００５７】
ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡオリゴヌクレオチドを二次構造又は三次構造を解くのに少なくとも十分にＤＮＡの鋳型鎖から置換し得るように、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、ポリメラーゼの鎖置換を止めるために増強することができる。特に強い鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、クレノウポリメラーゼ（クレノウ断片）である。置換の抑制は、オリゴヌクレオチド自体への修飾を使用することによって、又はオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを安定化するか、若しくはポリメラーゼを停止させるかのいずれかの添加剤を使用することによって達成することができる。ポリメラーゼの鎖置換活性を低減又は阻害するオリゴヌクレオチドへの修飾は、例えば２’フルオロヌクレオシド、ＰＮＡ、ＺＮＡ、Ｇ−クランプ（米国特許第６，３３５，４３９号、グアニンにクランプ結合することができるシトシン類似体）又はＬＮＡ（米国特許出願公開第２００３／００９２９０５号；米国特許第７，０８４，１２５号）である。これらの修飾は、一般に、オリゴヌクレオチドの融解温度を、該オリゴヌクレオチドの鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡ鎖への局所的ハイブリダイゼーションエネルギーの増大によって、修飾を伴わない同じオリゴヌクレオチドと比較して増大するか、又はオリゴヌクレオチドの糖リン酸骨格を強固にする。その幾らかはまた、糖リン酸骨格を強固にして、ポリメラーゼによる鎖置換を更に阻害する。鎖置換停止（ＳＤＳ）のための手段は、国際公開第２０１３／０３８０１０号（引用することにより本明細書の一部をなす）に開示されている。
【００５８】
それに代えて、又はそれに加えて、該プライマーの鋳型（例えば第１の伸長産物）へのハイブリダイゼーションは、該核酸に結合又はインターカレートする種々の添加剤を使用することによって変更することができる。例えば、エチジウムブロマイド、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ（米国特許第５，４３６，１３４号；米国特許第５，６５８，７５１号；米国特許第６，５６９，６２７号）又はアクリシジン、好ましくはＲＮＡ：ＤＮＡ若しくはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドに特異的なインターカレーターを使用することができる。ｄｓＮＡに結合することができる他の化合物は、アクチノマイシンＤ及び類似体、ネオマイシンファミリーのアミノグリコシド類（ネオマイシン、リボスタマイシン、パロモマイシン及びフラマイセチン）である。プライマーのハイブリダイゼーション特性を変える添加剤は、プライマー構造中に共有結合的に含まれていてもよい。
【００５９】
ハイブリダイゼーションエネルギー及びキネティクスを変更することで、ポリメラーゼによる鎖置換を、核酸結合タンパク質、例えば一本鎖結合タンパク質、例えばＴｔＨ  ＳＳＢ又はＴｔｈ  ＲｅｃＡの添加によって阻害することができる。
【００６０】
これらの添加剤が単なる例であり、かつプライマー−鋳型ハイブリッドの高められた安定性に導く任意の他の化合物、塩基修飾又は酵素を使用することで、Ｔｍを高め、したがって鎖置換を阻害するか、又は含まれる酵素の鎖置換能力を阻害することができることは当業者には明らかであろう。
【００６１】
Ｔｍの増大は、伸長ポリメラーゼによる、鋳型にアニーリングしたプライマー領域の５’末端ヌクレオチドのいずれか１つの置換を妨げるのに十分に大きいことが望ましい。特に、本発明によるＴｍの増大は、鋳型にアニーリングしているプライマー領域の５’末端に対して下流の３番目、２番目及び／又は１番目のヌクレオチドの置換を妨げる（更なるアニーリングされない５’ヌクレオチド、例えばリンカー領域又はバーコードが存在してよく、それらは修飾の必要はない）。
【００６２】
本発明の或る特定の実施形態においては、上記鎖置換は、下流プライマーのちょうど１番目の５’ヌクレオチドで停止する必要がある。
【００６３】
したがって、オリゴヌクレオチドプライマーの結合は、伸長ポリメラーゼをその置換から防ぐために、鋳型にアニーリングされた領域の該プライマーの５’末端で特異的にＴｍが高められることが好ましい。そのような修飾には、それらに限定されるものではないが、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＺＮＡ、アクリジン又は蛍光体が含まれる。
【００６４】
５’末端でＴｍが高められたオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡ修飾されたオリゴヌクレオチドは、後続のプライマーの開始点ちょうどで停止することを可能にする。ＬＮＡ修飾されたオリゴと一緒に鎖置換活性を有さないとともに反応温度を下げないポリメラーゼを使用することによる鎖置換の停止と、プライマーの鋳型への結合を高めるための種々の添加剤を使用することによる鎖置換の停止とを組み合わせることは本発明の範囲内である。
【００６５】
好ましくはＣ及び／又はＧヌクレオチドは修飾される。修飾されていなくとも、これらのヌクレオチドは、相補的にアニーリングされるときに増大された水素結合の形成のためＡ又はＴよりも高いＴｍを有する。好ましい実施形態においては、上記オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、Ｇ又はＣから選択される修飾されたヌクレオチドを含む。これらの修飾されたヌクレオチドは、好ましくは上述のように鋳型にアニーリングするプライマー配列の５’末端にある。
【００６６】
最も効果的な鎖置換停止は、Ｇ又はＣの塩基によって、それらの塩基がプライマー又はストッパーの局所的Ｔｍを高めるので達成される。したがって、セミランダムプライマー（ヘキサマー、ヘプタマー、オクタマー、ノナマー等）は、少なくとも２つの、より好ましくは３つ以上のＧ若しくはＣ又は複数のＧとＣとの組合せを含む。これらのＧ又はＣが修飾されて、ＬＮＡ修飾された塩基を使用する場合のように局所的融解温度を高める場合に最も好ましい。少なくとも１つの、少なくとも２つの、又は少なくとも３つのＬＮＡ修飾塩基は、アニーリングされるプライマー領域の５’末端で使用されることが最も好ましい。したがって、少なくとも２つの、少なくとも３つの修飾されたヌクレオチドが使用され、該ヌクレオチドが、場合によりＧ又はＣから選択されることが好ましい。
【００６７】
伸長反応が鋳型にアニーリングされた追加のプライマーの位置に達したときに伸長反応が停止されることを保証するために幾つかの方法及び手段が存在する。この停止は、また、本明細書においては鎖置換の抑制とも呼ばれる。既にコピーされたポリヌクレオチド部分の後続プライマー（複数の場合もある）をポリメラーゼが鎖置換するのを抑制する本発明による工程は、既にコピーがなされたポリヌクレオチド分子の任意の部分が再びコピーされないこと、特に第１の伸長された鎖において最も５’側にある部分であって、当初のＲＮＡ鋳型の最も３’側にある部分に相当する部分が再びコピーされないことを保証する。したがって、ポリヌクレオチドのコピーされた部分は、第２の鎖合成において過剰に現れないことになり、特に上記の最も５’側にあるコピーされた部分は、それぞれ合成された第１の鎖の鋳型から一度だけ合成される。この鎖置換の阻害は、種々の手段を通じて、例えば反応温度を低下させること、鎖置換活性を有さないポリメラーゼを使用すること、融解温度若しくは該プライマー：鋳型ハイブリッドのハイブリダイゼーションエネルギーを高めること、又はＲＮＡ若しくはプライマーの剛性の向上若しくは螺旋の安定化を通じて達成することができる。実際に、通常はこれらの手段の組合せが、鎖置換なくして最適な反応条件を実現するために選択される。当業者は、本明細書に記載されるか、又は特定の鋳型及び反応条件に合わせるために当該技術分野で知られる適切なパラメータを選択することは十分に可能である。
【００６８】
一つの選択肢は、反応温度を調節することである。一般的に、３７℃より高い、特に７０℃より高い反応温度は、より効果的な置換合成に導く鋳型において二次構造をより良好に解くために伸長の間に選択される。一実施形態においては、プライマーの鎖置換の停止は、反応温度を低下させることによって達成される。３７℃未満で、２５℃にまで下げ、そして更に４℃にまで下がる反応温度は、鎖置換を減らすために使用される。しかしながら、より低い反応温度であっても、鎖置換活性を有するポリメラーゼが使用される場合、及び／又は融解温度を変更する修飾を有さない単純なストッパーオリゴヌクレオチドが使用される場合には、鎖置換の停止は完全なものにならないであろう。重合が１２℃から３７℃の間で実施されることが好ましい。
【００６９】
一実施形態においては、該反応温度を低下させて、更なるプライマー又はストッパーの上記位置での伸長のより良い停止を達成する（とともに鎖置換を減らす）代わりに又はそれに加えて、鎖置換を欠いているポリメラーゼを使用することができる。ＤＮＡ−ＤＮＡポリメラーゼの場合に、好ましくはＴ７、Ｔ４又はＱ５  ＤＮＡポリメラーゼは、１又は複数種のオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型特異的に伸長させるにあたり使用される。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼは、特に効果的であり、全ての実施形態において好ましい。
【００７０】
該ポリメラーゼは、中温型又は高温型のポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼであってよい。
【００７１】
鎖置換を欠いている突然変異ポリメラーゼは、未修飾の場合に後続のプライマーを３ｎｔまでにわたり置換することが可能であってよい。反応温度を下げることによる鎖置換の停止と、置換型合成を欠いている突然変異体又は置換型合成が損なわれた任意の他のポリメラーゼを使用することとを組み合わせることは本発明の範囲内である。
【００７２】
一価対イオンの濃度の増大は、任意の鋳型−プライマーハイブリッドを安定化することとなるが二次構造も安定化することとなる。一価の正イオンの濃度は、好ましくは少なくとも２０ｍＭ、少なくとも３０ｍＭ、少なくとも４０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも６０ｍＭ、少なくとも７０ｍＭから選択される。
【００７３】
上記選択肢のいずれか一つの代わりに又はそれと組み合わせて、鎖置換の抑制は、クラウディング剤（crowding agent）、好ましくはＰＥＧの存在によって高めることができる。クラウディング剤は、高い濃度で使用することができ、かつ細胞内部でクラウディングするマクロ分子の効果を模擬するために使用することができる不活性分子である。例は、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）、トレハロース、フィコール及びデキストランである。クラウディング剤は、例えば米国特許第５，５５４，７３０号又は米国特許第８，０１７，３３９号に開示されている。クラウディング剤として作用する他の添加剤は、Ｔｗｅｅｎ−２０であり、ＮＰ−４０は、ＰＥＧに加えて又はＰＥＧに代えて添加することができる。本発明の範囲内では、好ましくは１２％〜２５％の最終ＰＥＧ−８０００（容量／容量）が使用される。様々なＰＥＧの分子量及び化合物を使用することができ、そして熟練した実験者は、該添加剤の同一性及び濃度を変更して結果を最適化することができることを理解する。クラウディング剤は、好ましくは、鎖置換の危険性を下げるために、工程ｅ）で存在する。クラウディング剤は、択一的に又は組み合わせて、任意の他の工程において、例えば精製工程、特に沈殿工程において存在してもよい。該キットは、クラウディング剤を、好ましくは反応工程ｅ）用のバッファー中に、例えばポリメラーゼのための補因子、例えばＭｇ２＋を含むバッファー中に含み得る。後に、上記クラウディング剤は、沈殿バッファー中に存在してもよく、該バッファー中でその濃度は、ポリヌクレオチドの、特に伸長産物の沈殿に十分であるような程度にまで高められるであろう。
【００７４】
工程ｆ）、つまり第１のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に（又は相補して）伸長された核酸部分を含む上記の更なる伸長産物の伸長産物を単離及び／又は増幅する工程は、当初の鋳型ＲＮＡの予め選択された核酸領域に相当する工程ｅ）の正しい伸長産物の選択である。工程ｅ）における鎖置換は留められるか、又は防止されるので、それぞれの鋳型（直接的には、第１の伸長された鎖であるが、また内在的に当初の鋳型ＲＮＡ）に関して工程ｅ）から得られる本質的に１つの伸長産物だけが存在することとなる。それというのも、他のアニーリングされたプライマーは、第１のプライマーが結合される上記予め選択された領域にまで伸長することができ、かつ更に上記第１のプライマーの全配列に沿って伸長することができる最も３’側のプライマーのブロッキング作用のため、該予め選択された核酸領域に相当する領域にまで伸長することが妨げられると考えられるからである。他のブロッキング事象は、工程ｃ）の除去が第１の伸長された鎖にアニーリングされた幾つかの短い分解産物を残すのであれば、ＲＮＡ鋳型の残余断片によるものかもしれず、それは完全なＲＮＡ鋳型の除去を通じて発生が防止されるべきである。それというのも、さもなければ、最後の最も３’側のプライマーを所望の予め選択された領域中へと効果的に伸長させる見込みも低下するからである。
【００７５】
その正しい更なる伸長産物の「選択」（それぞれの鋳型についての）は、例えば単離、精製若しくは増幅によって、又は一般的に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に伸長された核酸部分を含む更なる伸長産物に特異的な任意のプロセシングによって実現することができる。単離は、例えば固定化されたプローブへの結合を含んでよい。増幅を使用することで、プライマーを使用して鋳型鎖として更なる伸長産物を認識する選択的に産生される更なる伸長産物の相補鎖を得ることもできる。該増幅は、更なるプライマーアニーリングと鎖伸長反応とを含むＰＣＲサイクルであってよい。単離又は増幅のために、認識配列として、特にオリゴヌクレオチド結合のための認識配列として既知の配列を使用することができる。そのような既知の配列は、例えば、工程ａ）の鋳型ＲＮＡの当初の予め選択された核酸領域と同一の配列であり、該配列は、したがって第１のプライマーの選択的な配列領域に相当するか、又は以下に更に記載されるリンカー若しくはバーコード配列のような第１のプライマー中に含まれる任意の他の領域に相当する。
【００７６】
本発明の任意の好ましい実施形態によれば、工程ａ）の第１のオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は工程ｄ）の更なるオリゴヌクレオチドプライマーは、非アニーリング配列タグ又はリンカー配列を含む。そのような配列タグ又はリンカーは、別の伸長、特にＰＣＲ反応で結合する増幅プライマーのために使用することができる。該配列タグ又はリンカーは、それぞれのプライマー若しくはプライマー型に対するユニーク配列（特にランダムプライマーの場合において）又はユビキタス配列識別子（バーコード若しくはバーコード配列とも呼ばれる）を含んでもよい。配列の同一性又は識別子は、特定の実験若しくはバッチのプライマー（引き続いての伸長産物）、又は個々の若しくは群の伸長産物を同定することができる。該配列タグは、大規模並列シーケンシングによって更なる分析を可能にする。「非アニーリング」は、そのハイブリダイズする鋳型（ＲＮＡ鋳型、第１の又は更なる伸長鎖）へとアニーリングしない配列を選択することによって、及び／又は該非アニーリング配列を別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることで、このプライマー部分をブロックし、該鋳型とのハイブリダイゼーションを防ぐことによって達成することができる。
【００７７】
また、１番目のプライマーアニーリング（工程ａ）の前の鋳型ＲＮＡは、断片化されたＲＮＡであり、すなわち例えば試料から得られたＲＮＡを、断片化を受けるように処理することで、鋳型ＲＮＡを得ることも可能である。そのような断片化は、当該技術分野で既知の任意の手段を使用して実施することができる。断片化は、配列依存的に、例えばエンドヌクレアーゼ消化によって、又は配列非依存的な手段によって、例えば超音波処置若しくはせん断のような物理的手段によって、又は加水分解のような化学的手段によって開始することができる。配列依存的方法、例えば制限エンドヌクレアーゼ消化又は配列特異的増幅が使用されるのであれば、断片の末端は、配列バイアスを有することとなる。一つの好ましい実施形態は、限定分解又は工程ｃ）について先に記載した加水分解、例えば二価カチオンの存在における若しくはアルカリ性条件下での加熱によって、しかし限られた時間にわたって及び／又はより低い温度で断片化することで、より大きいＲＮＡ断片を保つことである。そのような断片は、例えば約１００ｎｔ〜５０００ｎｔの、好ましくは３００ｎｔ〜３０００ｎｔの、特に好ましくは５００ｎｔ〜２０００ｎｔの平均長を有してよい。該断片は、ターゲットとなる３’末端断片でインタクトとなるように選択的配列部分を保ち、工程ｅ）の間のランダムプライミングのために十分に長い配列を提供し、そしてゲノムアノテーション及び／又はトランスクリプトームアノテーションにマッピングすることができる相補的な第１のプライマー配列と第２のプライマー配列との間で十分に長い配列インサートを維持するために、５０ｎｔより長い、好ましくは１００ｎｔより長い、特に好ましくは１５０ｎｔより長い最小長さを維持する必要がある。該配列インサートは、１０ｎｔより長く、１５ｎｔより長く、好ましくは２０ｎｔより長いことが好ましく、それはしばしば、バイオインフォマティクスのＮＧＳシーケンシングのリードアライメントアルゴリズムについての最小所要長として定められる。
【００７８】
好ましくは、上記方法は、更なる伸長産物において、上記伸長産物の配列タグ又はリンカー配列に特異的なプライマー（若しくはプライマー対）を使用したＰＣＲを実施することを含む。そのようなリンカー又は配列タグは、工程ａ）におけるプライマー及び／又は工程ｄ）におけるプライマーによって導入することができる。
【００７９】
更なるＰＣＲのこれらの追加のプライマーは、改めてＰＣＲ増幅で使用することができる追加の配列タグ又はリンカー配列を含んでよい。また、これらのタグ又はリンカーは、配列識別子、例えば最初に述べたリンカー又は配列タグについて先に記載したバーコードを含んでもよい。
【００８０】
好ましくは、本発明による方法は、工程ｆ）において工程ｅ）の伸長産物の精製を更に含む。そのような精製は、工程ｅ）の伸長産物の期待される長さに相当する長さ、例えば１５０ｎｔ〜５００ｎｔを有するポリヌクレオチドの選択であってよい。工程ｅ）の伸長産物の長さは、例えばランダムプライマーのプライマー濃度を調節することによって制御することができる。すなわち、より多くのランダムプライマーは、第１の鎖においてより多くのプライミング事象をもたらすであろうから、後に工程ｆ）で選択される所望の伸長産物は、第１のプライミング部位に近くなり、そのためより短い長さであると考えられる。精製は、例えば１００ｎｔ未満の長さを有する短いポリヌクレオチドを溶解状態で保ち、その溶解状態のポリヌクレオチドを分離することで、伸長産物を沈殿させることによって行うことができる。５０ｎｔ〜１００ｎｔは、各側に１つずつ、２つの配列タグ又はリンカーを含むプライマー−プライマー産物についての典型的な長さである。好ましくは、精製は、７０ｎｔ以下の、又は５０ｎｔ以下の、又は４０ｎｔ以下の、又は３０ｎｔ以下の長さを有するそのような短いポリヌクレオチドを分離するためのものである。４０ｎｔから７０ｎｔの間の範囲は、プライマー及び配列タグ又はリンカーを含むプライマーにとって典型的な長さである。好ましくは、該方法は、定義されたサイズ範囲のポリヌクレオチドを、固体表面、例えばヒドロキシル基の部分を有する表面に選択的に結合し、該表面から選択的に放出する、固相可逆的固定化（Hawkins, 1995）を含む。サイズ依存的ポリヌクレオチド沈殿は、クラウディング剤によって、好ましくはＰＥＧによって定義された塩濃度及びｐＨ値を含む特定のバッファー条件を使用して適用することができる。好ましくは、除去されるべき短いポリヌクレオチドは、被覆されたビーズ上に結合されず、例えば沈殿されず、そして上清と一緒に除去され、その後に、所望のより長いオリゴヌクレオチドは、クラウディング剤を含まない又はほとんどクラウディング剤を含まない新たなバッファー中に放出される。好ましくは、そのようなビーズは磁性コアを含む（米国特許第５７０５６２８号）。他の精製方法には、サイズ依存的クロマトグラフィー法、例えばサイズ排除クロマトグラフィーが含まれる。
【００８１】
本発明の一つの好ましい実施形態（あらゆる他の実施形態と組み合わせることができる）は、本方法の工程ａ）〜ｅ）を、１つの引き続き増大していく流体容量で、例えば１つのウェル、１つの容器又は１つのチューブにおいて行うことである。溶液アリコートにおいてＲＮＡを供給した後に始まり、第１のオリゴヌクレオチドプライマーに相補的に伸長された核酸部分を含む所望の伸長産物の単離又は増幅までの全ての反応工程は、上記の１つの溶液において、そこに段階的に他の反応成分を更なる溶液の添加を通じて添加して行われる。本発明による方法の実施のために必要とされる試薬、例えば出発物質、酵素及び補因子を流体中に加えることで、反応混合物が生成する。本質的に、工程ａ）〜ｅ）の方法は、追加の精製工程を行わずに実施することができる。これにより、工程ａ）〜ｅ）についての措置自体は、精製とはみなされず、特に工程ｃ）のＲＮＡ除去とはみなされない。それというのも、分解後のＲＮＡの分解産物は溶解されたままであってよいからである。特に、１つの増大していく流体容量又は１つの容器において実施される工程ａ）〜ｅ）の本発明による方法は、好ましくは、反応混合物からの流体の除去を伴わない方法である。そのような方法は、手順の取り扱いをかなり簡単なものにする。また、中間生成物を精製し、かつ反応容量を分けることなく、試料及び引き続いての反応生成物を保持する助けにもなる。
【００８２】
本発明は、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、補因子又はポリメラーゼによって必要とされる金属イオン、好ましくはＭｇ２＋の塩、プライマー、好ましくはポリＴプライマー、鎖置換活性を有さないＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｑ５若しくはＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットを更に提供する。該キットは、本発明による方法を、好ましい特徴のいずれか１つ又は該特徴の組合せを伴う、いずれかの実施形態に従って実施するのに適切であり得る。上記プライマー、好ましくはポリＴプライマー又は多数の遺伝子特異的若しくは転写産物特異的なプライマーの一つ若しくは混合物は、工程ａ）のために適しており、かつ上記ランダムプライマーは、工程ｄ）で使用するのに適している。これらのプライマー又はプライマー調製物は、プライマー組成の点で異なり、かつ好ましくは個別の容器、例えばバイアル中で提供される。
【００８３】
上記キットは、高温ＲＮＡ分解のために使用されるべきＲＮＡ分解剤、例えば酵素若しくは二価カチオン及び／又はクラウディング剤、例えばＰＥＧを更に含んでよい。もちろん、上記のいずれも成分も、選択的な実施形態又はより好ましい実施形態において使用してよい。
【００８４】
本発明による核酸産物を生成する一つの更なる利点は、長さの正規化（全ての更なる伸長産物は類似の長さ又は狭い長さ分布を獲得する）であり、それは、全転写産物及びより長い転写産物から生成されるリードによって選択的に使用されているシーケンシング時間を無くす。遺伝子発現及び転写末端部位分布についての同じ情報を得るために省かれたシーケンシング時間として理解される利得は、１つの試料における、転写産物長さのバリエーションと、転写産物のダイナミックレンジ又は濃度範囲との間の関係性である。その関係性は、２つの境界条件で見た場合に最良に説明される。ｉ）全ての転写産物が同じ既知の長さを有することとなる場合に、例えば全ての転写産物が１ｋｂ長であり、かつ全ての生成した断片／リードが独自にマッピングされる場合に、例えば１００ｂｐへの長さ正規化は利益を有さないこととなる。したがって、上記利得は、平均長さの低下に依存しないが、長さ分布の低下に依存する。ｉｉ）全ての転写産物が異なる未知の長さを有することとなる場合、例えば転写産物が５００ｂｐ長から１００００ｋｂ長の間であり、かつ多くの生成される断片／リードが、同じ遺伝子から幾つかの転写産物バリアントによって共有されるエキソンにマッピングされるため独自に割り当てることができない場合、例えば１００ｂｐまでの長さ正規化は、明白にリードをカウントし、かつ全ての数のリードに対して正しい遺伝子発現値を決定するために利益を有することとなる。したがって、濃度重みづけされた長さ分布、配列アノテーション（事前知識）の正しさ及び正しい転写産物に明白に割り当てることができるリードを独自にマッピングする能力は、トランスクリプトームの複雑さについての関連の尺度である。この複雑さは、本発明による方法によって大きく減らすことができる。
【００８５】
本発明による方法の産業上の機会は、マイクロアレイによる遺伝子発現プロファイリングの置き換えと、完全ｍＲＮＡトランスクリプトーム分析を下回る中間的な分析ツールの提供において見られる。トキシコゲノミクス及びファーマコゲノミクスは、考えられる適用の例である。工程ａ）及び／又は工程ｄ）における領域特異的プライマー、遺伝子特異的プライマー又は転写産物特異的プライマーを使用することによって、ターゲティングされたシーケンシングパネルが可能である。ターゲティングされた（配列特異的、予め選択／予め定義されている）及びターゲティングされていない（例えば全ての関心のＲＮＡ配列によって共有される配列、例えばポリＡ又はランダム配列のようなユビキタスな配列に対する）第１のプライマー及び第２のプライマーとの任意の組合せ、例えばａ）標的特異的（ターゲティングされた）第１のプライマー及びターゲティングされていない第２のプライマー；ｂ）ターゲティングされていない第１のプライマー及びターゲティングされた第２のプライマー；ｃ）ターゲティングされた第１のプライマー及びターゲティングされた第２のプライマー；ｄ）ターゲティングされていない第１のプライマー及びターゲティングされていない第２のプライマーが可能である。もちろん、本発明による方法を１つの引き続き増大していく流体容量において実施する利点、特に流体を除去／洗浄しないで実施する利点は、これら全ての変法に当てはまる。ｂ）のための使用は、例えば３’側での潜在的な変異、例えば選択的スプライシング事象、選択的最終エキソン選択的ＰＡＡ及び融合事象を検出するためである。ａ）のための使用は、例えば５’側での潜在的な変異、例えば選択的スプライシング事象、選択的第一エキソン及び融合事象を検出するためである。
【００８６】
本発明を、更に以下の図面及び実施例において説明するが、これらの本発明の実施形態に限定されるものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１：Illumina社シーケンシングプラットフォーム用の３’末端ＮＧＳライブラリー生成
手短に言えば、ライブラリー生成の原理は、図１に記載されるようにして実施される。ａ）ｃＤＮＡ合成は、既に存在するか（ここではｍＲＮＡのポリ（Ａ））又は先行する反応で結合されたかいずれかの既知の領域又はタグにプライミングすることによって開始される。Ｐ１は、上記の既知の領域に相補的であり、ユニバーサルタグとしてはたらく非相補的な特異的配列を５’末端に更に含む。ｂ）ＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素によってｃＤＮＡへと逆転写される。ｃ）ｃＤＮＡ合成後に、該ＲＮＡ鋳型はＲＮアーゼ、ｐＨ変化（ＮａＯＨ及び熱）又は二価カチオン（Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋及び熱）のいずれかによって加水分解又は分解される。ｄ）次いで、該一本鎖ｃＤＮＡは、多数のランダムプライマー、Ｐ（ｎ）、Ｐ（ｎ＋１）．．．Ｐ（ｎ＋ｎ）によってプライミングされる。ｅ）そして第二鎖は、鎖置換を伴わないＤＮＡ依存性ポリメラーゼを使用して合成される。鎖置換の欠如は、最も３’側の断片だけが、２つのタグ、つまり一方は、ｃＤＮＡ合成プライマー由来のものであり、かつもう一方が第二鎖合成プライマー由来のものであるタグを含むであろうことを保証する。
【００８８】
個々の反応工程を、以下により詳細に説明する。
【００８９】
上記ライブラリー生成は逆転写を通じて第一鎖ｃＤＮＡ合成から開始する。ここでは、１つのＩｌｌｕｍｉｎａ適合配列を５’末端に含むオリゴｄＴプライマーがＲＮＡにハイブリダイズされ、その後に逆転写が行われる。この目的のために、１つの個々のライブラリー調製につき、５μｌのＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを含む逆転写に必要な全ての成分を含有するが酵素を有さない５μｌの第一鎖ｃＤＮＡ合成ミックス１と、ＰＣＲプレートの１つのウェル中で、選択的に８ウェルストリップの１つのウェル中で、又は任意の他のサーモサイクラー適合チューブ中で混合した。より少ないＲＮＡ容量が使用される場合に、ＲＮアーゼ不含の水を添加して全容量１０μｌを得る。次いで、その溶液ウェルをピペッティングにより混合し、ＰＣＲプレートをシールする。そのシールは密閉に適用される。該プレートを、全ての液体がウェルの底に集まるように遠沈させる。次いで、該ＲＮＡ／ＲＴ混合物を８５℃で３分間にわたりサーモサイクラー中で変性させ、次いで３７℃に冷やして、ＲＴプライマーａ）をハイブリダイズさせる。該プレートを遠沈させ、全ての液体がウェルの底に集まったのを確認してから、上記シールホイルを慎重に取り除く。
【００９０】
その後に、１０μｌの逆転写酵素希釈液を、それぞれの反応へとピペッティングによって混加して、それから該プレートを再びシールする。該液体は遠沈する必要があり、工程ｂ）において該プレートを３７℃で１５分間にわたりインキュベートする。
【００９１】
ｃ）ＲＮＡ鋳型を除去する。この工程の間に、ＲＮＡ鋳型は破壊され、それは、効果的な第二鎖合成のために必須である。第一鎖合成反応の後にシールホイルを取り除く前に、上記プレートを、全ての液体が確実にウェルの底に集まるまで素早く遠沈させる。５μｌのＲＮＡ除去溶液を、第一鎖合成反応に直接添加し、良く混合し、そして該プレートを新たなホイルを使用して再びシールする。該プレートは、９５℃で１０分間にわたりインキュベートしてから、２５℃に冷却し、そして遠沈せねばならない。ここで、該シールホイルを慎重に取り除き、５μｌの除去溶液２（該溶液は、基本的に除去溶液１で添加された成分を除去又は中和する）を添加し、そして該溶液を再び良く混合する。
【００９２】
ｄ）後続の第二鎖合成の間に、該ライブラリーをｄｓＤＮＡに変換する。第二鎖合成は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合リンカー配列を５’末端に含むランダムプライマーによって開始される。逆相補は、該リンカー配列がハイブリダイゼーションに加わることを防ぐ。この段階では、精製ビーズ（ＳＰＲＩビーズ）を室温に置き、該ビーズに平衡に十分な時間を与えることが推奨される。１５μｌの第二鎖合成ミックス１（ＤＮＡ依存性重合反応に必要な全ての成分を含む）を添加し、ピペッティングにより良く混合し、そして該プレートをシールする。ここで、該プレートをサーモサイクラー中にて９８℃で１分間にわたりインキュベートし、そして多くのサーモサイクラーで最高ランプ速度の１０％に相当する０．５℃毎秒にランプ速度を定めることによってゆっくりと２５℃に冷却する。該反応を、２５℃で３０分間にわたりインキュベートし、素早く遠沈してから、シールホイルを該プレートから取り除く。
【００９３】
ｅ）５μｌのＤＮＡ依存性ポリメラーゼ希釈液を添加する。該反応を、２５℃で１５分間にわたりインキュベートする。工程ｅ）まで、全反応は１つの連続的に増大していく容量で実施されている。該反応は、選択工程ｆ）に入るまで続く。
【００９４】
ｆ）Ｐ１配列を含まない望ましくない二本鎖を依然として含む二本鎖ライブラリーを、磁性ビーズを使用して精製する。精製ビーズ（ＰＢ）は、使用前に室温で３０分間にわたり平衡化されているべきである。ＰＢは沈降していてもよいが、反応に加える前に適切に再懸濁せねばならない。その後に、ＳＰＲＩ精製を、製造元（ＡＭＰｕｒｅ  Ｂｅａｄｓ；Agentcourt）の指示に従って実施する。ライブラリーを、２０μｌ水又は１０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）中で溶離させ、そしてライブラリーを含む１７μｌの澄明な上清を、新しいきれいなＰＣＲプレート中に移す。ビーズが一切その新しいプレート中に移らないように注意せねばならない。該ライブラリーを、後の増幅のために−２０℃で貯蔵してよい。
【００９５】
最も３’側の断片をＰＣＲ増幅によって単離する。該ライブラリーを、また増幅して、ＮＧＳ機器でのクラスター生成に必要な完成したアダプター配列を付加し、そして品質管理及び後続のレーン用混合物のために十分な材料を作製する。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを使用する標準的なＰＣＲ反応を実施し、その後にその産物を再び最終精製（製造元の指示に従うＳＰＰＲＩ精製）によって精製する。その精製においては、完成したライブラリーは、あらゆる残りのＰＣＲ成分から隔離され、両方の配列Ｐ１とＰｎとを含まない全てのインプットＤＮＡ材料は、ＰＣＲの相対希釈プロセスによって全体的な表現において置き換えられる。両方の配列Ｐ１及びＰｎを含まない残りの配列は、ＮＧＳプロセスでクラスターを生成することができないと考えられる。それというのも、クラスター生成は、両方の配列を含む単一分子のみから出発するＰＣＲ増幅を用いるからである。最終ライブラリーを、添加した２０μｌのＥＢ中で溶出させ、そしてビーズをＥＢ中で適切に再懸濁してから、室温で２分間にわたりインキュベートする。該プレートをマグネットプレート上に置き、５分間にわたり、又は上清が完全に澄明になるまでビーズを回収する。該上清を、新しいＰＣＲプレート中に移す。この時点で、ライブラリーは完成しており、品質管理、プーリング、クラスター生成及び更なるシーケンシングのための準備ができている。
【００９６】
実施例２：鎖置換活性を有する停止しないポリメラーゼ（クレノウ）と鎖置換活性を有さない停止するポリメラーゼ（Ｔ４及びＴ７）との種々の温度での比較（図２、図３及び図４）
アッセイの説明：
準備されたアッセイの概略図は図２に示されて説明されている。鎖置換を伴い、置換された鎖を破壊する能力を有する方と有さない方との異なるポリメラーゼ及び鎖置換を伴わないポリメラーゼを、図２で記載されるアッセイを使用して評価した。簡潔には、配列番号１、配列番号２及び配列番号３を、種々のポリメラーゼの相応のバッファー中でハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に、ポリメラーゼを添加（３ＵのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、１０ＵのＴ７  ＤＮＡポリメラーゼ又は５Ｕのクレノウ断片（３’−５’ｅｘｏ−）し、そして該反応を図３及び図４に示されるようにして実施した。反応時間は、指定した温度で１０分であった。その後に該反応を、シリカカラムを介して精製し、特にサイズ選択をせずにバッファー成分及び酵素を除去した。試料を、１０％のＰＡＡゲル（ローディングダイと混合し、９５℃で２分間にわたり変性されている）上にロードし、５８℃において１００Ｖで１０分間にわたって流し、次いで１８０Ｖで１２０分間にわたって流した。ゲルをＧＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した。
【００９７】
図３において、鎖置換を伴わないポリメラーゼの場合に鋳型における二次構造が重大な障害となるので、変性及びゆっくりとしたアニーリング工程（９５℃から室温へと、よりゆっくりとしたランプ（１５分かかる）で下げる）の重要性が実証されている。白色で中塗りされた矢印は、部分的に置換された鎖置換停止産物を示している。変性工程なしでの一本鎖鋳型の二次構造は、黒色の矢印で示されている。クレノウは、鎖置換（特により高い温度で）を常に示し、ここではまた、ｃＤＮＡにおける二次構造を避けるための変性工程は、該酵素がその固有の鎖置換によりこれらの二次構造を解くことができるため必須ではない（図２）。図４は、５種の異なるポリメラーゼの鎖置換を裏付けている。該アッセイは、上記のようにして、相応のバッファーを用いて、初期変性工程を伴って、そして図４に示される反応温度で行った。鎖置換を伴うポリメラーゼ：８ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大断片  レーン２；５ユニットのＤＮＡポリメラーゼＩの大（クレノウ）断片、レーン７〜８；及び２００ユニットのＭ−ＭＬＶ、レーン１１；並びに鎖置換を伴わないポリメラーゼ：レーン３、３ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、レーン４〜６、又は置換された鎖を破壊するポリメラーゼ、例えば５ユニットのＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの全長、レーン３、１０ユニットの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、レーン９〜１０。異なる反応温度を確認した：１２℃：レーン４；２５℃：レーン５、７、９；３７℃：レーン：２〜３、６、８、１０〜１１。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼは、３７℃で顕著になるエキソヌクレアーゼ活性を含む。配列番号１、配列番号５、配列番号２及び配列番号３の分解産物が確認することができる。Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの大断片、ＤＮＡポリメラーゼＩの大（クレノウ）断片及びＭ−ＭｌＶでは、鎖置換が存在し、配列番号６（全長産物）が確認することができる。さらに、配列番号５よりも大きい産物は、これらのポリメラーゼで確認され、それは、部分的な鎖置換から生ずるものである。他の鎖置換型のポリメラーゼ、例えばＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼの全長（レーン３）及び大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（レーン９〜１０）では、置換された鎖は破壊もされる。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼは、鎖置換を含まず、配列番号５が明らかに確認することができる。Ｔ４については２５℃が３７℃よりも推奨することができる。それというのも、３７℃では固有のエキソヌクレアーゼが該反応を肩代わりするからである（図４）。
【００９８】
実施例３：ＭｎＣｌ２、高められた温度単独、ＮａＯＨ処理又はＲＮアーゼによるＲＮＡ分解（図５）。ＲＮＡの分解はまたバッファー条件にも依存する。
マウス肝臓から単離された全ＲＮＡは、１１１ｎｔの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オリゴ（配列番号７）でスパイクした（レーン１及びレーン１０を参照のこと）。全ＲＮＡは長いため、ゲルではより小さいＲＮＡバンドしか確認することができず、その長いＲＮＡ断片はスロット中に残る。断片化に際し、より長いＲＮＡ断片は分解されることとなり、ポリアクリルアミドゲル上ではスメアとして確認することができる。標準的なＲＴバッファーである５０ｍＭのトリスＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのＤＴＴ中での、９５℃で３０分間並びに９８℃で５分間、９８℃で１０分間、９８℃で２０分間及び９８℃で３０分間の熱処理によって、該ＲＮＡは分解されるが、該ＲＮＡは完全に除去されない。ＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ混合物をＲＮアーゼ  Ｈ／Ａ／Ｔ１ミックスと一緒に、２５℃又は３７℃のいずれかで３０分間にわたりインキュベートすることで、該ＲＮＡは一本鎖ＤＮＡを分解することなく完全に除去される。高められた温度で１０分間（５５℃）、０．１ＮのＮａＯＨの存在下でインキュベートすることで、該ＲＮＡは分解されるものの、完全には分解されない。０．１ＮのＮａＯＨ中にて９５℃で１０分後に、該ＲＮＡは完全に除去されるが、上記ｓｓＤＮＡも分解し始める（レーン７〜１０）。１０ｍＭのＭｎＣｌ２をＲＮＡ／ｓｓＤＮＡ／ＲＴバッファー混合物に添加して、９８℃で５分間、１０分間、２０分間、そして３０分間にわたり熱処理することで、ｓｓＤＮＡを分解することなく、該ＲＮＡの完全な分解がもたらされる。試料を、精製せずに１０％のＰＡＡゲル（ローディングダイと混合し、９５℃で２分間にわたり変性されている）上にロードし、５８℃において１００Ｖで１０分間にわたって流し、次いで１８０Ｖで７０分間にわたって流した。ゲルをＧＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色した。
【００９９】
実施例４：ＲＮＡ分解法の、鎖置換を伴わないポリメラーゼを用いて合成されたＮＧＳライブラリーの品質に対する影響（図６）
５００ｎｇの全ＲＮＡを、配列番号８（２０μｌ中の最終濃度：２５ｎＭ）と混合し、そして４μｌの５×ＲＴバッファーを含有する１０μｌの容量で８５℃に３分間にわたり加熱した。３７℃に冷却した後に、１μｌの１ｍＭのｄＮＴＰ、２００ユニットのＭ−ＭＬＶを加え、そして３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。引き続いてのＲＮＡ加水分解は、図６に示されるように異なる。ＲＴ反応バッファーにおけるビオチン−ストレプトアビジンつり上げ（fishing）を、NEB製の５μｇのストレプトアビジンビーズを使用して２０分間（２５℃で１２５０ｒｐｍで振とう器において）にわたり実施した。ビーズを洗浄バッファーで２回洗浄し、そして１０μｌのＭＢ−Ｈ２Ｏ中にて８０℃で何分かにわたり加熱することによって試料をビーズから放出させた。マグネットを使用してビーズを回収し、そして澄明な上清を種々のチューブに移し、第二鎖ｃＤＮＡ合成を、３ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号９及び１０（２０μｌ中の最終濃度  ０．１μＭ）、８％のＰＥＧ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．５ｍＭのｄＮＴＰを使用して２０μｌの全容量で実施した。ポリメラーゼを添加する前に、９８℃で１分間の変性工程と、ゆっくりとしたアニーリング（１５分以内で２５℃にまで下降）とが含まれていた。次いで試料をＳＥＮＳＥユーザーガイドに従ってシリカにより精製して（第二鎖合成後の部分精製）、２５μｌの１０ｍＭのトリス（ｐＨ８）において溶出させた。１０μｌの精製された生成物を、次いでＳＥＮＳＥ  ｍＲＮＡ  Ｓｅｑ  ＰＣＲに従って配列番号１１及び１２をＰＣＲプライマーとして使用して１８サイクルにわたり増幅した。次いで試料をＳＥＮＳＥユーザーガイドに従ってシリカにより精製して（第二鎖合成後の部分精製）、１５μｌの１０ｍＭのトリス（ｐＨ８）において溶出させた。１μｌの精製されたＰＣＲ産物を、Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ＤＮＡ−Ｃｈｉｐ（Agilent）へと製造元の指示に従ってロードした。
【０１００】
該ＲＮＡのＲＮアーゼ及びＭｎＣｌ２分解により、ｃＤＮＡを損傷するか、又はｃＤＮＡを増幅不可能にする塩基修飾をもたらすかのいずれかをもたらすＮａＯＨ加水分解よりもかなり高い収率がもたらされる。
【０１０１】
実施例５：ＲＴバッファーにおけるＲＮＡの初期断片化がライブラリーサイズ及び該プロトコルの効率を決定する（図６）
ＲＮＡが変性される容量は、該変性の間に存在するＭｇＣｌ２濃度にも影響を及ぼし、これはまた、どれほどの長さのｃＤＮＡが、その僅かに断片化されたＲＮＡから生成されるのかも決める。
【０１０２】
５００ｎｇの全ＲＮＡを、配列番号８（２０μｌ中の最終濃度：２５ｎＭ）と混合し、そして４μｌの５×ＲＴバッファーを含有する１０μｌ（ａ及びｂ）又は１５μｌ（ｃ及びｄ）の容量で８５℃に３分間にわたり加熱した。３７℃に冷却した後に、１μｌの１ｍＭのｄＮＴＰ、２００ユニットのＭ−ＭＬＶを加え、そして３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。ＲＮＡは、１０ｍＭのＭｎＣｌ２の存在下で９８℃に１０分間にわたり加熱することによって加水分解した。その後に、１０ｍＭのＥＤＴＡを添加した。第二鎖合成は、第二鎖合成成分を反応に添加して、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのｄＮＴＰ、８％のＰＥＧ、配列番号９及び１０（それぞれ１００ｎＭの最終濃度）及び３ユニットのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼの最終濃度を４０μｌの全容量において得ることによって実施した。再び、ポリメラーゼを、９８℃に１分間にわたり加熱して、ゆっくりとしたアニーリング（１５分以内で２５℃にまで下降）を行った後に添加した。精製、ＰＣＲ増幅及び引き続いてのＰＣＲ精製並びにバイオアナライザーの実行は、実施例４に記載されるようにして実施した。
【０１０３】
実施例６：ライブラリーサイズ及び収率の、ＲＴプライマー濃度及び第二鎖合成オリゴ濃度による調整（図７）
全てのライブラリーは１７サイクル。全ての反応条件は、実施例５に従うが、以下の濃度に変える。ａ）逆転写（ＲＴ）工程の間に５０ｎＭの配列番号８並びに第二鎖合成（ＳＳＳ）において０．１μＭの配列番号９及び１０、ｂ）ＲＴの間に２５ｎＭの配列番号８並びにＳＳＳの間に０．５μＭの配列番号９及び１０、ライブラリーはロードする前に１：３希釈した、ｃ）ＲＴの間に５０ｎＭの配列番号８並びにＳＳＳの間に０．５μＭの配列番号９及び１０、ライブラリーはロードする前に１：３希釈した、ｄ）ＲＴの間に２５ｎＭの配列番号８並びにＳＳＳの間に０．１μＭの配列番号９及び１０。
【０１０４】
実施例７：シリカとＳＰＲＩ精製との対比（図８）
全ての工程は実施例６（ｃ）に記載される通りであるが、異なる精製を用いる。シリカ精製は、実施例５に記載されるようにして行い、かつヒドロキシル変性された磁性ビーズ及び塩−ＰＥＧバッファーを用いるＳＰＲＩ精製は、製造元（Agentcourt製のＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ）の指示に従って実施した。
【０１０５】
References
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WO 2013/038010 A2
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006608384.tif 000009
【図９】
0006608384.tif 000010
【図１０】
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【配列表】
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