(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンおよび／またはその酵素分解産物を有効成分とする血管新生阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来の物質を有効成分とする血管新生阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
固形腫瘍、糖尿病性網膜症や緑内障や黄斑変性症をはじめとする眼科疾患、炎症、慢性関節リウマチ、尋常性乾癬、歯周病などの発症や進展に、血管新生が関与していることが知られている。従って、こうした疾患を予防や治療するための薬剤として、血管新生阻害剤の研究開発が古くから盛んに行われている中（例えば特許文献１）、近年、安全性が高い天然由来の物質を有効成分とする血管新生阻害剤が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３１３５６１６号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで本発明は、天然由来の物質を有効成分とする血管新生阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンやその酵素分解産物が、優れた血管新生阻害作用を持つことを見出した。
【０００６】
上記の知見に基づいてなされた本発明の血管新生阻害剤は、請求項１記載の通り、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンおよび／またはその酵素分解産物を有効成分とする。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、天然由来の物質としてサケ軟骨に含まれるプロテオグリカンやその酵素分解産物を有効成分とする血管新生阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１における、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンがヒト血管内皮細胞の管腔形成に対して優れた阻害作用を持つことを示す写真である。
【図２】同、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害作用が濃度依存的であることを示すグラフである。
【図３】比較例１における、ヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害作用はサメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸よりもサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンの方が優れていることを示すグラフである。
【図４】実施例２における、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害作用は熱処理によって低下しないことを示すグラフである。
【図５】実施例３における、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンがヒト血管内皮細胞の生育に影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図６】実施例４における、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンがマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現を低下させる作用を持つことを示すグラフである。
【図７】実施例５における、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを酵素分解することでヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害作用が高まることを示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の血管新生阻害剤は、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンやその酵素分解産物を有効成分とするものである。プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸とともに動物の軟骨を構成する主成分であり、保水性に優れるといった作用を持つことが古くから知られている。また、本発明者らの研究グループは、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンが、細胞増殖促進作用やヒアルロン酸合成促進作用を持つことを見出している（特許第５１９４２５３号公報）。しかしながら、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンやその酵素分解産物が持つ薬理作用の全容は未だ明らかにされていない。
【００１０】
本発明の血管新生阻害剤の有効成分としてのサケ軟骨に含まれるプロテオグリカンは、例えば、サケの鼻軟骨から分離精製されるものであってよい。サケの鼻軟骨からプロテオグリカンを分離精製する方法は特段限定されるものではなく、例えば、特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従い、ミンチにしたサケの鼻軟骨から溶出溶媒として酢酸を用いて粗プロテオグリカンを溶出した後、得られる溶出液を濾過してから遠心分離し、その上澄液に食塩飽和エタノールを加えて遠心分離することにより得られる粗プロテオグリカンを含む半固形沈殿物を酢酸に溶解し、次いで透析することにより分離精製することで調製されるものであってよい。このようにして調製されるサケの鼻軟骨に由来するプロテオグリカンは、約２５０〜４５０ｋＤａの分子量を有する高度に精製されたものであり、本発明の血管新生阻害剤の有効成分として好適である。なお、特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従って調製されるサケの鼻軟骨に由来するプロテオグリカンは、凍結乾燥粉末として既に市販もされている。また、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンは、特許第５２５２６２３号公報に記載の方法に従い、凍結させたサケの鼻軟骨を破砕し、これに水を加え、温度０〜２０℃、ｐＨ４．８〜７で処理する工程、得られた固液混合物を遠心分離し、最上部の脂質層と中間層の水層を取り除き、沈殿物を回収する工程、得られた沈殿物を乾燥し、微粉末化する工程、得られた乾燥微粉末に、溶媒としてエタノールを加え、残存脂質を抽出除去する工程、最後にエタノールを除去する工程によって調製されるものでもよい。
【００１１】
また、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンの酵素分解産物としては、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンの、糖鎖分解酵素やタンパク質分解酵素による分解産物が挙げられる。ここで、糖鎖分解酵素としては、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、精巣性ヒアルロニダーゼなどの、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンが有するグリコサミノグリカンを分解することができる公知の酵素が挙げられる。また、タンパク質分解酵素としては、アクチナーゼＥ、プロティナーゼＫ、トリプシン、パパインなどの、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンが有するコアタンパク質を分解することができる公知の酵素が挙げられる。こうした酵素を用いたサケ軟骨に含まれるプロテオグリカンの分解は、用いる酵素について知られている至適条件下において行えばよい。得られる酵素分解産物は、精製してもよいし、精製しなくてもよい（例えば糖鎖分解産物にコアタンパク質が含まれていたり、タンパク質分解産物にグリコサミノグリカンが含まれていたりする分解物の混合物であってもよい）。
【００１２】
後述する実施例から明らかなように、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンやその酵素分解産物は、サメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸よりも優れた血管新生阻害作用を持つ。その作用は熱処理をしても低下することがなく、血管内皮細胞の生育に影響を与えない。また、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンを酵素分解すると血管新生阻害作用が高まる。従って、本発明の血管新生阻害剤は、固形腫瘍、糖尿病性網膜症や緑内障や黄斑変性症をはじめとする眼科疾患、炎症、慢性関節リウマチ、尋常性乾癬、歯周病などの予防や治療に用いることができる。
【００１３】
投与対象者への本発明の血管新生阻害剤の投与は、経口投与や非経口投与により行うことができる。投与に際してはそれぞれの投与方法に適した剤型に製剤化すればよい。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、舌下錠、坐剤、軟膏、乳剤、懸濁剤、シロップ、点眼剤、眼軟膏などが挙げられ、これら製剤の調製は、無毒性の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、矯味剤、緩衝剤などの添加剤を使用して自体公知の方法にて行うことができる。無毒性の添加剤としては、例えば、でんぷん、ゼラチン、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ペトロラタム、グリセリン、エタノール、シロップ、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸、ポリビニルピロリドン、水などが挙げられる。製剤中における有効成分の含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に０．０１〜１００重量％の濃度であることが望ましい。製剤の投与量は、投与対象者の性別や年齢や体重の他、症状の軽重、医師の診断などにより広範に調整することができるが、一般に１日当り０．０１〜３００ｍｇ／Ｋｇとすることができる。上記の投与量は、１日１回または数回に分けて投与すればよい。また、本発明の血管新生阻害剤は、種々の形態の食品（サプリメントを含む）として食することもできる。
【実施例】
【００１４】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。なお、実験は、サケ軟骨に含まれるプロテオグリカンとして、特許第３７３１１５０号公報に記載の方法に従ってサケの鼻軟骨から分離精製されたプロテオグリカンの凍結乾燥粉末（分子量３４４ｋＤａ、ヘキソサミン：ウロン酸：硫酸＝１．００：０．９９：０．６７、和光純薬株式会社、以下「サケ鼻軟骨由来プロテオグリカン」と略称する）を用いて行った。
【００１５】
実施例１：サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンの血管新生モデルであるヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する作用
（実験方法）
不死化ヒト臍帯静脈内皮細胞株（ＥＡ．ｈｙ９２６）を、基底膜成分（ＢＭＥ）（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ  Ｉｎｃ．ＭＤ，ＵＳＡ）で作られたゲル上で培養することにより、管腔形成を誘導した。具体的には、０．０５ｍＬのＢＭＥを９６穴プレートの各ウェルに入れ、３７℃で３０分間保持してゲル化させた後、０．１ｍＬの１９９培地に約５，０００細胞数のＥＡ．ｈｙ９２６を懸濁した液を、各ウェルのゲル上に重層した。この際、１９９培地に、水に溶解したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で０から１ｍｇ／ｍＬの各種の濃度になるように添加した。３７℃で１６〜２４時間培養した後、位相差顕微鏡にてゲル上に形成された血管様の管状網の写真を撮影し、画像分析プログラムＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ，ＵＳＡ）とＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ａｎａｌｙｚｅｒ  ｐｌｕｇ−ｉｎ（Ｇｉｌｌｅｓ  Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ．ＩｍａｇｅＪ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ：Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｎａｌｙｚｅｒ．ＩｍａｇｅＪ  Ｎｅｗｓ，５  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１２．）を用いて管様構造の総数と総延長を測定した。
【００１６】
（実験結果）
図１のＡにサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを添加しない場合の血管様の管状網の写真を示し、Ｂにサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した場合の写真を示す。また、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で０から１ｍｇ／ｍＬの各種の濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を図２のＡとＢにそれぞれ示す（被験物質を添加しない場合の測定結果を１００％とした相対値）。図１から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、血管様の管状網の形成を効果的に阻害した。また、図２から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する阻害作用は濃度依存的であり、ウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した場合、血管新生を約７０％阻害した。
【００１７】
比較例１：サメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸のヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する作用
（実験方法）
サメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｃ：生化学工業  Ｃａｔ．Ｎｏ．４００６７５）について、実施例１と同様にして血管新生阻害作用を調べた。
【００１８】
（実験結果）
図３の右にサメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸をウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を示す（「コンドロイチン硫酸」のカラム）。また、図３の中央にサケ鼻軟骨プロテオグリカンをウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を示す（「プロテオグリカン」のカラム）。図３から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは血管新生を約７０％阻害したが、サメ軟骨に由来するコンドロイチン硫酸は血管新生を約３５％しか阻害しなかった（被験物質を添加しない場合の測定結果を１００％（左の「未処理」のカラム）とした相対値）。
【００１９】
実施例２：熱処理したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する作用
水に溶解して５分間煮沸したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンについて、実施例１と同様にして血管新生阻害作用を調べたところ、熱処理による作用の低下は認められず、熱処理していないサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンと同程度の作用を持っていた（図４）。
【００２０】
実施例３：サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのヒト血管内皮細胞に対する安全性
（実験方法）
９６穴プレートの各ウェルにて、約５，０００細胞数のＥＡ．ｈｙ９２６を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１９９培地で、３７℃で２４時間培養した。培地を各ウェルより除去した後、水に溶解したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で０から１ｍｇ／ｍＬの各種の濃度になるように添加した１９９培地を各ウェルに入れ、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、各ウェルに０．０１ｍＬのＣｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔ  ＳＦ（ナカライ）を加え、さらに３７℃で１時間培養し、マイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００２１】
（実験結果）
図５にサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で０から１ｍｇ／ｍＬの各種の濃度になるように添加した場合の細胞生存率を示す（被験物質を添加しない場合の細胞生存率を１００％とした相対値）。図５から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加してヒト血管内皮細胞を培養しても、その生育に影響を与えることはなかった。
【００２２】
実施例４：サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンのマトリックスメタロプロテアーゼ遺伝子の発現に対する作用
（実験方法）
１２穴プレートの各ウェルにて、約７６０，０００細胞数のＥＡ．ｈｙ９２６を、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１９９培地で、３７℃で２４時間培養した。培地を各ウェルより除去した後、水に溶解したサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した、０．５％のＦＢＳと０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１９９培地を各ウェルに入れ、さらに３７℃で２４時間培養した。その後、細胞から全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。全ＲＮＡからＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型としてＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）とＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＳｔｅｐＯｎｅ  ｐｌｕｓシステムによってリアルタイムＰＣＲを行い、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内部標準遺伝子として各種のマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子の発現量を推定した。なお、実験に用いたＴａｑＭａｎ  ｐｒｏｂｅのＩＤは次の通りである。
ＭＭＰ−１  ：Ｈｓ００８９９６５８＿ｍ１
ＭＭＰ−２  ：Ｈｓ０１５４８７２７＿ｍ１
ＭＭＰ−３  ：Ｈｓ００９６８３０５＿ｍ１
ＭＭＰ−７  ：Ｈｓ０１０４２７９６＿ｍ１
ＭＭＰ−９  ：Ｈｓ００９５７５５５＿ｍ１
ＭＭＰ−１４：Ｈｓ０１０３７００９＿ｇ１
ＧＡＰＤＨ  ：Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１
【００２３】
（実験結果）
図６にＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１４のｍＲＮＡの発現量を示す（被験物質を添加しない場合の発現量を１とした相対値）。図６から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１４のｍＲＮＡの発現量を２０〜２５％低下させた。なお、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９のｍＲＮＡの発現量は微量であり、解析が困難であった。
【００２４】
実施例５：サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンの酵素分解産物のヒト血管内皮細胞の管腔形成に対する作用
（実験方法）
０．３ｍｇのサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを、タンパク質分解酵素であるアクチナーゼＥ（１ｍｇ／ｍＬアクチナーゼＥ（科研製薬）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）を用いて３７℃で１８時間処理し、コアタンパク質を分解した後、５分間煮沸することにより酵素反応を停止することで、タンパク質分解産物を得た。また、０．３ｍｇのサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを、糖鎖分解酵素であるコンドロイチナーゼＡＢＣ（３００ｍＵコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、６０ｍＭ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ、０．０２％ＢＳＡ）を用いて３７℃で４８時処理し、グリコサミノグリカンを分解した後、５分間煮沸することにより酵素反応を停止することで、糖鎖分解産物を得た。また、０．３ｍｇのサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを、コンドロイチナーゼＡＢＣを用いて３７℃で４８時処理し、グリコサミノグリカンを分解した後、５分間煮沸することにより酵素反応を停止してから、引き続きアクチナーゼＥを用いて３７℃で１８時間処理し、コアタンパク質を分解した後、５分間煮沸することにより酵素反応を停止することで、糖鎖・タンパク質分解産物を得た。それぞれの分解産物について、実施例１と同様にして血管新生阻害作用を調べた。
【００２５】
（実験結果）
それぞれの分解産物をサケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した場合に相当する濃度で添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果と、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンをウロン酸換算で１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように添加した場合の管様構造の総数と総延長の測定結果を、図７にそれぞれ示す（被験物質を添加しない場合の測定結果を１００％とした相対値）。図７から明らかなように、サケ鼻軟骨由来プロテオグリカンを酵素分解することで、血管新生阻害作用を高めることができることがわかった（酵素反応を停止するための熱処理によって作用は低下しない）。血管新生阻害作用の上昇の程度は、タンパク質分解産物よりも糖鎖分解産物の方が大きかった。糖鎖・タンパク質分解産物の血管新生阻害作用は、糖鎖分解産物の血管新生阻害作用と同程度であった。
【００２６】
製剤例１：錠剤
サケ鼻軟骨由来プロテオグリカン、乳糖、でんぷん、カルボキシメチルセルロース、タルク、ステアリン酸マグネシウムの各成分をよく混合してから打錠することで製造した。
【００２７】
製剤例２：カプセル剤
サケ鼻軟骨由来プロテオグリカン、乳糖、でんぷん、ステアリン酸マグネシウムの各成分をよく混合してからカプセルに充填することで製造した。
【産業上の利用可能性】
【００２８】
本発明は、天然由来の物質としてサケ軟骨に含まれるプロテオグリカンやその酵素分解産物を有効成分とする血管新生阻害剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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