(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含むポリペプチドであって、前記フラグメントは配列番号３を含むことを条件とする、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターを含む細胞。
【請求項５】
配列番号２の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含むワクチンであって、前記フラグメントは配列番号３を含むことを条件とする、ワクチン。
【請求項６】
アジュバントをさらに含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
配列番号２の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む組成物であって、前記フラグメントは配列番号３を含むことを条件とする、組成物。
【請求項８】
必要とする対象におけるインフルエンザに対するワクチンを接種するための組成物であって、配列番号２の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含み、前記フラグメントは配列番号３を含むことを条件とする、組成物。
【請求項９】
前記組成物はアジュバントをさらに含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記インフルエンザはトリ起源Ｈ７Ｎ９インフルエンザである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
必要とする対象における抗Ｈ７抗体応答を増強するための組成物であって、配列番号２の全アミノ酸配列またはそのフラグメントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含み、前記フラグメントは配列番号３を含むことを条件とする、組成物。
【請求項１２】
前記組成物はアジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
対象における抗Ｈ７抗体応答を増強するためのキットであって、配列番号２のアミノ酸配列またはそのフラグメントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含み、前記フラグメントは配列番号３を含むことを条件とする、キット。
【請求項１４】
アジュバントをさらに含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府の後援を受けた研究および開発によってなされた発明に対する権利に関する記載
本発明は、米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって与えられた認可番号ＡＩ０８２６４２による米国政府の経済的支援によってなされたものである。米国政府は、本発明に特定の権利を有し得る。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本出願は、米国を指定している、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§３７１の下で２０１６年５月２日に出願されたＰＣＴ国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３０４２５号の国内段階出願であり、２０１５年５月４日に提出された米国仮特許出願第６２／１５６，７１８号に対する優先権を主張する。上記出願の全体を本明細書において引用により援用する。
【０００３】
電子提出された配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含んでおり、これによってその全体を引用により援用する。２０１７年１２月１１日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは「ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＬＩＳＴＩＮＧ  ＭＯＤＩＦＩＥＤ  Ｈ７＿ＳＴ２５」という名称であり、２０ＫＢバイトのサイズである。
【背景技術】
【０００４】
本発明は、インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７配列のＨ７赤血球凝集素糖タンパク質の配列改変である。
【０００５】
２つの別々に出現したインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ：ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ）、２００９パンデミック（ｐａｎｄｅｍｉｃ）Ｈ１Ｎ１（Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９）およびＨ７Ｎ９トリインフルエンザ（Ｈ７Ｎ９）に対して開発されたワクチンの免疫原性が一致しなかったことから、有効な体液性免疫応答の発達におけるＴ細胞の役割を評価する機会が提供された。たとえば、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９は感染性が高く、既存の抗体がなかったために出現から１２ヵ月以内に２００を超える国々に広がったが、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９インフルエンザによる罹患率および死亡率は予想より低かった。これはおそらく、季節性Ａ（Ｈ１Ｎ１）株に晒されたか、またはそのワクチン接種を受けた個体に既に存在したＴ細胞応答によるものと考えられる。２０１３年に中国で出現したＨ７Ｎ９は、それよりもかなり高い致死性を伴った。その致死性およびパンデミックの可能性についての懸念から、Ｈ７Ｎ９ワクチンの生成が優先され、ワクチンは開発された。
【０００６】
インフルエンザワクチンは、メモリーＴ細胞に防御免疫を生じさせてアジュバントの不在下で抗体応答を刺激するように要請できる。よって通常、季節性インフルエンザ株に対する防御免疫を生じさせるために、１回のワクチン接種のみが必要とされる。中国のトリ起源Ｈ７Ｎ９インフルエンザ（これに対する交差反応性体液性免疫は存在しないと推定される）の再出現に対処するために生成された従来の組み換えＨ７赤血球凝集素ワクチンは、他のサブユニットおよび季節性インフルエンザワクチンと比べて効力が低いことが明らかになった。Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９とはまったく対照的に、非アジュバントＨ７Ｎ９ワクチンは抗原性が低く、フェーズＩ治験における非アジュバントＨ７Ｎ９赤血球凝集素（ＨＡ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）によるワクチン接種の結果として得られた赤血球凝集阻害（ＨＩ：ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）セロコンバージョン率は、（類似の非アジュバントＡ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９サブユニットワクチンの８９％に比べて）わずか６％および１５．６％であった。これらのワクチンの治験では、これらのワクチンの抗原性を許容できる基準まで増加させるためにアジュバントの使用を必要としたが、米国の標準的な季節性インフルエンザワクチンにはアジュバントは使用されない。最近のフェーズＩＩ治験において、新型ウイルスに対する新たなメモリーＴヘルパー細胞を生じさせるために２用量のＨ７Ｎ９ワクチンをアジュバントとともに投与したときですら、対象の５９％しかセロコンバージョンしなかった。Ｈ７Ｎ９に感染したヒトにおけるＨ７Ｎ９に対する中和抗体の発達も、他のＩＡＶ感染に対する典型的な免疫応答に比べて遅く、Ｈ７Ｎ９  ＨＡに対するＩｇＧの結合活性は顕著に低い。他のＨ７サブタイプの治験において、弱毒Ｈ７Ｎ１ワクチンは低いＨＩ力価をもたらし、不活性化サブユニットＨ７Ｎ７ワクチンは免疫原性が低かった。
【０００７】
Ｈ７  ＨＡは一意に非抗原性であることを示す。２００３年のオランダにおけるＨ７Ｎ７の大流行において観察された関連Ｈ７  ＨＡに対するヒト抗体応答も、ＨＩ力価が減少した。まとめると、これらの研究は、自然感染の状況においてもＨ７Ｎ９感染に対する適応免疫応答は減少および遅延し得ることを示唆するものである。
【０００８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、アイソタイプ転換および親和性成熟を支援してＢ細胞を助ける。よって、Ｈ７  ＨＡに対する抗体応答の減少および遅延は、Ｔ細胞の助けが制限または抑制されたことを示唆する。Ｈ７Ｎ９配列に存在するＣＤ４＋Ｔヘルパーエピトープは、他のＩＡＶよりも少ない。エピトープ欠失の類似のパターンは、ヒト宿主に順応した慢性（「ヒット・アンド・ステイ」）のウイルス、たとえばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ：Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：Ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）などにおいて観察されているが、急性（「ヒット・アンド・ラン」）のウイルスでは観察されていない。エピトープ欠失が介在する免疫エスケープは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）およびＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ）に対するウイルス病原性の十分に確立された機構であるが、このエスケープ機構は過去にインフルエンザに対して記載されていない。
【０００９】
Ｈ７Ｎ９が宿主応答を最小化し得る別の手段は、我々のグループが識別した免疫エスケープの新たな機構である「免疫カムフラージュ」を採用することである。ヒトの配列との高いＴ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）「交差保存」を有する病原体に由来するＴ細胞エピトープは、ヒトゲノムに存在する配列パターンに対してＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープのＴＣＲに面するパターンを比較するアルゴリズムであるヤヌスマトリクス（ＪａｎｕｓＭａｔｒｉｘ）（エピバックス（ＥｐｉＶａｘ）、プロヴィデンス（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ）、ＲＩ、ＵＳＡ）を用いて識別され得る。ヤヌスマトリクスは、生の配列アライメントによって捉えられない抗原認識の態様を考慮する相同性分析ツールである。共生ウイルスは、ヒトへの慢性感染症を確立しないウイルスよりも、これらのヤヌスマトリクスに定められる「ヒト様」Ｔ細胞エピトープを有意に多数含有する。
【００１０】
ＨＣＶは、自身と高度に交差保存されたエピトープを含み、インビトロで制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ）を顕著に拡張させる。このペプチドに応答するＴ細胞はＴｒｅｇに特徴的なマーカーを示し、インビトロでバイスタンダーエフェクターＴ細胞応答を能動的に抑制する。こうしたエピトープを多く有することを示す慢性疾患ウイルスと、急性疾患病原性ウイルスとのこの著しい相違点は、免疫カムフラージュが、特定のヒト病原体が適応免疫応答をエスケープするための重要な方法であり得ることを示唆する。
【００１１】
新たなインフルエンザ株に含有されるエピトープに特異的な既存のヘテロタイプＴ細胞メモリーは、アジュバントの必要性をなくし、Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９に対して観察されたとおり、単一用量の後に有効な抗体力価が発達することがある（非特許文献１）。Ａ（Ｈ１Ｎ１）ｐｄｍ０９インフルエンザに対して観察されたとおり、既存の免疫を復活させるＴ細胞エピトープが複数のウイルスサブタイプに対する保護を助けることがある（非特許文献２）が、宿主配列に似たエピトープは免疫にとって有害であり得る。
【００１２】
大きいエピトープデータベースにおける発表済みのウイルスエピトープの遡及解析において、より大きなヒト交差保存は不在または制御性のＴ細胞応答に関連していた（非特許文献３）。まとめると、これらの知見は、特定のヒト病原体が重要なヒト制御性Ｔ細胞エピトープに似たＴ細胞エピトープを自身のプロテオームに含むように進化するかもしれないことを示す（「免疫カムフラージュ」）。
【００１３】
Ｈ７Ｎ９のＴ細胞エピトーププロファイル（わずかなエフェクターＴ細胞エピトープおよび多くの交差保存エピトープ）は、「ヒット・アンド・ラン」のウイルスよりも「ヒット・アンド・ステイ」ウイルスの方にかなり近い。ヒトからヒトへのＨ７Ｎ９の感染はまれであるが、このウイルスは「哺乳動物のシグネチャ」を有することが注目されている。限定されたヒトからヒトへの感染の症例が報告されている（非特許文献４）。ヒトからヒトへのＨ７Ｎ９の感染は疑われるよりも頻繁に起こるかもしれないが、抗体の低力価のために検出が困難になっている。Ｈ７Ｎ９プロテオームにおけるヒト様エピトープの発見は、Ｈ７Ｎ９の起源および進化ならびにそのヒトまたはその他の哺乳動物における循環期間に関する重要な疑問を提起している。
【００１４】
Ｈ７Ｎ９ゲノム（２０１３年４月２日にＧＩＳＡＩＤウェブサイトにおいて公的に入手可能となった）を、免疫情報学ツールキットを用いて分析した。この分析は、Ｈ７  ＨＡが予想よりも少ないＴ細胞エピトープを有しており、免疫原性が低いであろうことを示した。
【００１５】
したがって、抗原性を増すためのアジュバントを使用せずに中国のトリ起源Ｈ７Ｎ９インフルエンザの再出現に対処するための、より効力の高いインフルエンザワクチンがなおも必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＭＥら著、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３６１：２４０５〜１３、２００９
【非特許文献２】Ｌａｕｒｉｅ  ＫＬら著、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０２：１０１１〜２０、２０１０
【非特許文献３】Ｈｅ  Ｌら著、ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１５：Ｓ１、２０１４
【非特許文献４】Ｇａｏ  ＨＮら著．、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２９Ｃ：２５４〜８、２０１４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７配列のＨ７赤血球凝集素糖タンパク質の配列改変を提供する（配列番号２）。野生型ウイルスの３つのアミノ酸を変更した結果、免疫原性を損なわずに交差反応性を低くした配列が得られた。さらに、本発明はアジュバントの使用を伴うか、または伴わずにより高い効力を有するワクチンを提供する。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７配列の改変Ｈ７赤血球凝集素糖タンパク質（配列番号２）をコードする核酸とともに、その核酸を含むベクター、およびさらにそのベクターを含む細胞を提供する。
【００１９】
別の実施形態においては、選択された改変アミノ酸配列の配列番号３、配列番号２の全アミノ酸配列またはその配列番号３を含むフラグメントを含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む組成物を対象に投与するステップによって、インフルエンザに対するワクチンを接種するための方法が提供される。
【００２０】
さらなる実施形態において、インフルエンザに対するワクチンを接種するための前記方法は、アジュバントを使用する。
【００２１】
別の実施形態において、ワクチンを接種するための方法は、インフルエンザのトリ起源Ｈ７Ｎ９インフルエンザに対するものである。
【００２２】
さらに別の実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列または配列番号２の全アミノ酸配列を含む１つまたはそれ以上のポリペプチドを含む組成物を投与するステップを含む、抗Ｈ７抗体応答を増強するための方法を提供する。
【００２３】
上記実施形態において、アジュバントが用いられてもよい。
【００２４】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列を含む１つもしくはそれ以上のポリペプチド、または配列番号２の全アミノ酸配列を含む１つもしくはそれ以上のポリペプチドを含み、さらにアジュバントを含んでもよいキットを含む。
【００２５】
さらに別の実施形態において、選択病原体に対するワクチン抗原の効力を改善するための方法であって、（ａ）ヒトプロテオームまたはヒトミクロビオームのいずれかに由来するタンパク質とＴＣＲコンタクトを共有する成分Ｔ細胞エピトープを識別するステップと、（ｂ）ＭＨＣ結合を低減させるか、および／または前記標的Ｔ細胞エピトープのＴＣＲコンタクトとヒトプロテオームもしくはヒトミクロビオームとの相同性を低減させるように前記Ｔ細胞エピトープに対する改変を行うステップであって、ここで前記ワクチン抗原に対して産生された抗体と、関連野生型タンパク質との間の機能的対応があることを条件とする、ステップとを含む、方法が提供される。
【００２６】
前の実施形態の別の態様において、エピトープは制御性Ｔ細胞と結合するか、またはエフェクターＴ細胞と結合できない。
【００２７】
同じ実施形態のさらなる態様は、前記標的Ｔ細胞エピトープのアミノ酸配列を異なるＴ細胞エピトープのアミノ酸配列に置換する改変を提供する。
【００２８】
同じ実施形態のさらに別の拡張において、前記標的Ｔ細胞エピトープと、ヒトゲノム、ヒトミクロビオーム、またはそれら両方のいずれかとの相同性を低減させるために改変が行われる。
【００２９】
同じ実施形態のさらなる変更は、前記ワクチン抗原に対して産生された抗体と、関連野生型タンパク質との間の機能的対応が、前記標的Ｔ細胞エピトープに対して行われる改変によって妨げられないこと；前記標的Ｔ細胞エピトープの置換されたアミノ酸配列は、ワクチン抗原の変異配列に由来すること；前記標的Ｔ細胞エピトープの置換されたアミノ酸配列は、前記標的Ｔ細胞エピトープと相同であるタンパク質のアミノ酸配列に由来すること；および／または、置換されたアミノ酸配列はワクチン抗原を含む病原体の株もしくはクレードに存在し、かつ改変されたＴ細胞エピトープは、前記ワクチン抗原をもたらすウイルスに過去に晒されていない対象におけるメモリーＴ細胞からの応答を誘導することを提供する。
【００３０】
前の実施形態のさらに他の形において、対象は、過去にワクチン接種または自然感染によって病原体に晒されたヒトの対象である。
【００３１】
同じ実施形態の付加的な要素は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を標的とする抗原を含み、このインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、またはインフルエンザＣであってもよく、より特定的にはインフルエンザＡおよびその血清型Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、またはＨ７Ｎ９であってもよく、最も特定的にはＨ７Ｎ９血清型インフルエンザＡ／上海／２／２０１３であってもよい。
【００３２】
本発明のさらなる実施形態は、選択病原体に対するワクチン抗原の効力を改善するための方法であって、（ａ）前記ワクチン抗原に対して産生された抗体と、その関連野生型タンパク質との間の機能的対応を保存しながらの改変に対する良好な候補であり得るワクチン抗原に見出されるアミノ酸残基を識別するステップと、（ｂ）前記アミノ酸残基をＴ細胞エピトープと置換することによって前記ワクチン抗原を改変するステップとを含む、方法を提供する。
【００３３】
前の実施形態は、ワクチン抗原の変異配列に由来するＴ細胞エピトープ；改変された前記ワクチン抗原と相同であるタンパク質のアミノ酸配列に由来する前記Ｔ細胞エピトープの挿入アミノ酸配列；ワクチン抗原を含む病原体の別の株またはクレードに見出されるＴ細胞エピトープを使用してもよく、Ｔ細胞エピトープは対象におけるメモリー細胞応答を誘導することが既知である。
【００３４】
最後の実施形態のさらなる変形は、過去にワクチン接種または自然感染によって病原体に晒されたヒトの対象を含む。
【００３５】
加えて同じ実施形態は、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質を標的とするワクチン抗原を提供してもよく、このインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、またはインフルエンザＣであり、より好ましくはインフルエンザＡおよびその血清型Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、またはＨ７Ｎ９であり、より特定的にはＨ７Ｎ９血清型であり、最も特定的にはインフルエンザＡ／上海／２／２０１３である。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、インフルエンザＡに対するワクチン抗原の効力を改善するための方法が提供され、この方法は（ａ）前記インフルエンザＡの株を取得するステップと、（ｂ）前記インフルエンザＡ株に存在する推定Ｔ細胞エピトープを識別するステップであって、前記Ｔ細胞エピトープは複数のタンパク質とＴＣＲコンタクトを共有し、かつ前記Ｔ細胞エピトープは対象における制御性Ｔ細胞応答を誘導する、ステップと、（ｃ）前記Ｔ細胞エピトープに見出された既存のアミノ酸残基を選択アミノ酸残基と交換することによって、インフルエンザＡの前記株の前記推定Ｔ細胞エピトープを置換するステップとを含む。
【００３７】
この実施形態は、以下を含むようにさらに狭められてもよい。ヒトタンパク質、ヒトの対象、インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７株において、３２１番目の位置、３２２番目の位置、および３２４番目の位置のアミノ酸残基が交換されたもの、より特定的には３２１番目の位置のアルギニンがアスパラギンに交換され、３２２番目の位置のセリンがスレオニンに交換され、３２４番目の位置のロイシンがリジンに交換されたもの。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、病原体に対する改変されたワクチン抗原であり、前記抗原はＴ細胞メモリー、Ｂ細胞メモリー、および前記病原体のタンパク質に特異的な抗体を誘導する。
【００３９】
同じ実施形態の別の態様において、改変病原体はインフルエンザＡ、インフルエンザＢ、またはインフルエンザＣであり、より特定的にはインフルエンザＡおよびその血清型Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、またはＨ７Ｎ９であり、さらにより特定的にはＨ７Ｎ９であり、最も特定的にはインフルエンザＡ／上海／２／２０１３である。
【００４０】
加えてこの実施形態は、タンパク質がインフルエンザＡ、より特定的には血清型Ｈ７Ｎ９、最も特定的にはインフルエンザＡ／上海／２／２０１３のＨ７タンパク質であるように狭められてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】最近の季節性インフルエンザＡ株ＨＡタンパク質に対するＨ７−ＨＡの抗原性の可能性を比較するＥｐｉＭａｔｒｉｘ免疫原性スケールを示す図である。
【図２】改変Ｈ７赤血球凝集素（配列番号２）の完全配列を示す図である。下線を付けた配列（１）は、改変クラスタ３２１（配列番号３）である。
【図３】インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７（配列番号４）の完全配列を示す図である。下線を付けた配列（２）は、改変のために識別されたＴ細胞エピトープクラスタ（配列番号５）である。
【図４】インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７エピトープクラスタ３２１（配列番号５）のＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析を示す図である。結果を、ＣＰＲＹＶＫＱＲＳ（配列番号７）、ＰＲＹＶＫＱＲＳＬ（配列番号８）、ＲＹＶＫＱＲＳＬＬ（配列番号９）、ＹＶＫＱＲＳＬＬＬ（配列番号１０）、ＶＫＱＲＳＬＬＬＡ（配列番号１１）、ＫＱＲＳＬＬＬＡＴ（配列番号１２）、ＱＲＳＬＬＬＡＴＧ（配列番号１３）、ＲＳＬＬＬＡＴＧＭ（配列番号１４）、ＳＬＬＬＡＴＧＭＫ（配列番号１５）、ＬＬＬＡＴＧＭＫＮ（配列番号１６）、ＬＬＡＴＧＭＫＮＶ（配列番号１７）、ＬＡＴＧＭＫＮＶＰ（配列番号１８）、ＡＴＧＭＫＮＶＰＥ（配列番号１９）について示す。
【図５】インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７のエピトープクラスタ３２１のヤヌスマトリクス分析ヒトエピトープネットワークを示す図である。
【図６】エピバックスＭＯＤ１  Ｈ７赤血球凝集素（配列番号２）に対するインフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７（配列番号４）のクラスタ３２１（配列番号５）に対する改変（配列番号６）を示す図である。結果を、ＣＰＲＹＶＫＱＮＴ（配列番号２０）、ＰＲＹＶＫＱＮＴＬ（配列番号２１）、ＲＹＶＫＱＮＴＬＫ（配列番号２２）、ＹＶＫＱＮＴＬＫＬ（配列番号２３）、ＶＫＱＮＴＬＫＬＡ（配列番号２４）、ＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号２５）、ＱＮＴＬＫＬＡＴＧ（配列番号２６）、ＮＴＬＫＬＡＴＧＭ（配列番号２７）、ＴＬＫＬＡＴＧＭＫ（配列番号２８）、ＬＫＬＡＴＧＭＫＮ（配列番号２９）、ＫＬＡＴＧＭＫＮＶ（配列番号３０）、ＬＡＴＧＭＫＮＶＰ（配列番号１８）、ＡＴＧＭＫＮＶＰＥ（配列番号１９）について示す。
【図７】インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７（配列番号３）の改変エピトープクラスタ３２１のＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析を示す図である。
【図８】改変インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７エピトープクラスタ３２１のヤヌスマトリクス分析ヒトエピトープネットワークを示す図である。
【図９】組み換えエピバックスＯｐｔ１  Ｈ７赤血球凝集素ワクチンの免疫原性をテストするために用いられるマウスモデルを示す図である。
【図１０Ａ】サイトスケープ（Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ）ネットワークで視覚化した、ヒトゲノムとのヒト配列交差保存に対してヤヌスマトリクスで分析した異なるカテゴリのペプチドを示す図である。図１０Ａは、Ｈ７以外のＩＡＶ株、すなわちＡ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ３Ｎ２）、およびＡ（Ｈ５Ｎ１）の、免疫優性および高度に保存されたＨＡエピトープの変異体を表すペプチドを示す。各ペプチドをダイヤモンド形で表す。ソースペプチドに含まれるＨＬＡ結合９量体フレームを四角形として示す。各９量体フレームに対して、類似のＨＬＡ結合親和性および同一のＴＣＲに面する残基を有するヒト９量体を三角形として示し、それらが由来するヒトタンパク質を円形として示す。
【図１０Ｂ】サイトスケープ（Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ）ネットワークで視覚化した、ヒトゲノムとのヒト配列交差保存に対してヤヌスマトリクスで分析した異なるカテゴリのペプチドを示す図である。図１０Ｂは、ヒトゲノムとのＴＣＲ交差保存によって順序付けたＨ７Ｈ９  ＩＣＳペプチドを示す。各ペプチドをダイヤモンド形で表す。ソースペプチドに含まれるＨＬＡ結合９量体フレームを四角形として示す。各９量体フレームに対して、類似のＨＬＡ結合親和性および同一のＴＣＲに面する残基を有するヒト９量体を三角形として示し、それらが由来するヒトタンパク質を円形として示す。
【図１０Ｃ】サイトスケープ（Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ）ネットワークで視覚化した、ヒトゲノムとのヒト配列交差保存に対してヤヌスマトリクスで分析した異なるカテゴリのペプチドを示す図である。図１０Ｃは、図１０Ｂに示した選択されたＨ７Ｈ９  ＩＣＳペプチドのヒト類似体を示す。各ペプチドをダイヤモンド形で表す。ソースペプチドに含まれるＨＬＡ結合９量体フレームを四角形として示す。各９量体フレームに対して、類似のＨＬＡ結合親和性および同一のＴＣＲに面する残基を有するヒト９量体を三角形として示し、それらが由来するヒトタンパク質を円形として示す。
【図１１】免疫情報学的予測とインビトロのＨＬＡ結合との比較を示す図である。各ペプチドに対するＨＬＡクラスＩＩ結合の結果を、対応するＨＬＡ対立因子に対するそのＥｐｉＭａｔｒｉｘＺスコアと比較した。真陽性（黒色）のバーは、正しく予測されたＨＬＡ結合ペプチドの結果を反映する。偽陽性（灰色）のバーは、誤って予測されたＨＬＡ結合ペプチドの結果を反映する。偽陰性（白色）のバーは、誤って予測された非結合ペプチドの結果を反映した。
【図１２】図１２Ａおよび図１２Ｂは、個々のＨ７Ｎ９ペプチドおよび対照に対するヒトＩＦＮγ応答を示す図である。図１２Ａは、ドナー（ｎ＝１８）の個別（円形）および平均（バー）のＳＩを示すチャートである。ヤヌスマトリクス・デルタによって測定された、ヒトゲノムのペプチドとの予測される交差保存の程度に従って、チャート上にＨ７Ｎ９ペプチドを配置している。図１２Ｂは、ＳＩによって測定された、１８人の健康なドナーにおける各ペプチドへの平均応答を、自身との交差保存の尺度であるヤヌスマトリクス・デルタと負の相関をさせてプロットしたグラフである。
【図１３】プールされたＨ７Ｎ９ペプチドに対するヒトＩＦＮγ応答のグラフを示す図である。
【図１４】図１４Ａおよび図１４Ｂは、Ｈ７Ｎ９からのヒト様ペプチドによって誘導されるＴｒｅｇ細胞の拡張を示す図である。図１４Ａについては、ゲーティング戦略は生ＣＤ３＋リンパ球に基づくものであり、次いでＣＤ４対ＦｏｘＰ３に対して分析した。図１４Ｂについては、単一の対象に対する代表的な結果をドットプロットで示しており、３人の対象に対する平均を下のチャートに示している。＊ｐ＜０．０１。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、季節性インフルエンザ免疫優性ＨＡエピトープのＨ７相同体の抑制的活性を表すさまざまなグラフの図である。免疫優性ＨＡエピトープのＨ７Ｎ９変異体であるペプチドＨ７Ｎ９−１３は、他のペプチドと同時投与されたときにＴ細胞応答の低減に関連した。Ｈ７Ｎ９ペプチドのプールに対する健康なドナーのＥＬＩＳｐｏｔ応答は、Ｈ７Ｎ９−１３の存在下で有意に減少した（ｎ＝７）（図１５Ａ）が、ヒトとの類似が少ないペプチドであるＨ７Ｎ９−９では減少しなかった（ｎ＝４）（図１５Ｂ）。Ｈ７Ｎ９−１３は、循環するＩＡＶ株の他の免疫優性ＨＡペプチドに対する応答を抑制できた（ｎ＝２）（図１５Ｃ）。＊ｐ＜０．０５。＊＊ｐ＜０．０１。
【図１６】ＨＬＡ  ＤＲ３トランスジェニックマウスにおいてＯｐｔ１  Ｈ７Ｎ９  ＶＬＰワクチンによって刺激されたＨＡＩ抗体の保護レベルを示す図である。
【図１７】乱交雑インフルエンザエピトープのＥｐｉＢａｒおよびＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析を含む免疫原性インフルエンザＨＡペプチドの例を示す。インフルエンザＨＡペプチドのスコアはＥｐｉＭａｔｒｉｘにおいて８つの対立因子すべてに対して極度に高く、そのクラスタスコアは２２である。１０のクラスタスコアは有意とみなされる。帯状のＥｐｉＢａｒパターンは、乱交雑エピトープの特徴である。結果を、ＰＲＹＶＫＱＮＴＬ（配列番号２１）、ＲＹＶＫＱＮＴＬＫ（配列番号２２）、ＹＶＫＱＮＴＬＫＬ（配列番号２３）、ＶＫＱＮＴＬＫＬＡ（配列番号２４）およびＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号２５）について示す。Ｚスコアは９量体フレームが所与のＨＬＡ対立因子に結合する可能性を示す。上位５％のすべてのスコアを「ヒット」とみなし、簡略化のため、１０％未満の非ヒット（＊）は図１７においてマスクされる。
【図１８】ヤヌスマトリクスアルゴリズムは、ＭＨＣに面するアグレトープおよびＴＣＲに面するエピトープの両方のアミノ酸含有量をどのように考慮したかを示す。示したように、各ＭＨＣリガンドは２つの面を有する。すなわち、ＭＨＣ結合面（アグレトープ、ＭＨＣ／ＨＬＡに対して下向きの矢印のアミノ酸残基）、およびＴＣＲ相互作用面（エピトープ、ＴＣＲに対して上向きの矢印のアミノ酸残基）である。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書において開示されるのは、Ｈ７赤血球凝集素の改変配列である（図２）。この配列改変は、インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７クラスタ３２１に対する３アミノ酸の変更である（図６）。このクラスタは改変のための免疫情報学的分析によって、予測されたＴ細胞エピトープ含有量、およびヒトタンパク質に対する交差反応性の予測が高いことから選択された（図４および図５）。この３アミノ酸の変更によって、著しく低いヒト交差保存を有する配列が生じ（図６および図８）、一方でＨＬＡ結合の可能性は保持される（図７）。
【００４３】
ＥｐｉＭａｔｒｉｘツールキット（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）を用いた、最近の季節性インフルエンザＡ株ＨＡタンパク質に対するＨ７  ＨＡの免疫原性の可能性の比較では、Ｈ７  ＨＡタンパク質に対する免疫原性の非常に低い可能性が予測された。加えてこの分析は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に面する残基において、ヒトゲノム中のＴ細胞エピトープとの高度の交差保存を有する主要Ｈ７Ｎ９  ＨＡエピトープを識別した。
【００４４】
最初の公的に入手可能な（ＧＩＳＡＩＤ  ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｔｆｏｒｍ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ／）インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７の配列（図３）に対して、免疫情報学を用いた。この分析は、図３の下線を付けた配列（２）のＨ７クラスタ３２１を改変の標的として識別した。ＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスタ分析は、Ｈ７クラスタ３２１が８つの主要なＭＨＣクラスＩＩスーパータイプの間で高度に保存されることを予測した（図４）。クラスタ３２１に対するヤヌスマトリクス分析（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）は、クラスタ３２１がＴ細胞受容体に面する残基において、ヒトゲノム中のＴ細胞エピトープとの高度の交差保存を有することを予測した。ヤヌスマトリクスヒトエピトープネットワーク（図５）は、このエピトープを星形の中心の四角形として示しており、その記号からの各々の伸長は、Ｈ７クラスタに対する交差反応性を有するヒトタンパク質配列を表す。
【００４５】
Ａ／上海／２／２０１３  Ｈ７クラスタ３２１エピトープに対して、３つの配列変更が行われた（図６）。これらの変更は、インフルエンザの古典的Ｈ３エピトープＣＰＲＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）に対する同一性を有する配列を導入した。図６に示されるとおり、位置３２１（１）のアミノ酸がアルギニンからアスパラギンに変更され、位置３２２（２）はセリンからスレオニンに変更され、位置３２４（３）はロイシンからリジンに変更された。Ｈ７赤血球凝集素の完全な改変配列は図２に提供されており、改変クラスタ３２１は下線付きの配列（１）として示される。
【００４６】
改変クラスタのＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析は、Ａ／上海／２／２０１３  Ｈ７のクラスタ３２１に対する３つの単一のアミノ酸改変が、エピトープ含有量または８つの主要なＭＨＣクラスＩＩスーパータイプのクラスタの保存を変更しないことを示す（図７）。
【００４７】
図８のヤヌスマトリクス分析エピトープネットワーク図に示されるとおり、Ａ／上海／２／２０１３  Ｈ７のクラスタ３２１に対する３つの単一の配列改変は、Ｔ細胞受容体に面する残基のヒトゲノム中のＴ細胞エピトープとの交差保存を低減した。
【００４８】
ヤヌスマトリクスツール（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）を用いて、ヒトタンパク質の複数の予測ＨＬＡリガンドと交差保存されたＨ７Ｎ９のエピトープを識別した。ＨＣＶにおけるヒト様Ｔｒｅｇエピトープの発見に基づき（Ｌｏｓｉｋｏｆｆ  ＰＴら、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、ｐｉｉ：Ｓ０１６８−８２７８（１４）００６１３〜８、２０１４）、Ｈ７Ｎ９における同様に交差保存されたエピトープは、Ｈ７Ｎ９に対する適応免疫の減弱の原因となる可能性があることを見出した。Ｈ７Ｎ９インフルエンザＴ細胞エピトープペプチドに対するＨ７Ｎ９ナイーブ対象のＰＢＭＣの応答を評価し、それらのＴＣＲ面におけるヒトゲノムとの交差保存の程度と逆相関することを見出した（図１２Ｂ）。
【００４９】
Ｔｒｅｇは、インビトロでヒト様Ｈ７エピトープとの共培養において拡張することを発見した（図１４Ａおよび図１４Ｂ）。バイスタンダー抑制アッセイにおける拡張Ｔｒｅｇの機能を学んだ（図１５Ａ〜１５Ｃ）。ヒト様Ｈ７Ｎ９エピトープに応答するＴｒｅｇ細胞の正確な起源をなおも定める必要があり（胸腺由来の天然Ｔｒｅｇまたは誘導された末梢Ｔｒｅｇ）、ワクチン開発に対する関連は明瞭である。Ｈ７Ｎ９感染において報告されているとおり（Ｇｕｏ  Ｌら、Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、２０：１９２〜２００、２０１３）、自然感染またはＨ７Ｎ９  ＨＡを用いた非アジュバントワクチン接種の状況において、Ｔｒｅｇ応答はこれらのエピトープによって誘導され、体液性免疫応答は減少および遅延するかもしれない。
【００５０】
ＴＣＲ−ＨＬＡ−ＩＩ−ペプチド相互作用のレベルでヤヌスマトリクスを用いると、位置２、３、５、７、および８のアミノ酸を、同じＨＬＡによって制限されることが予測されるペプチドの組における相同エピトープを識別するために用いられる「ＴＣＲに面する」ものと指定することを支持する証拠が存在する。加えて、中央の結合溝の外側、特にＮ末端に位置するクラスＩＩ  ＨＬＡリガンド内のいくつかの位置に対する役割がある。
【００５１】
他のヒト病原体またはヒト共生生物に由来するエピトープとのＴＣＲ交差保存の影響を評価することなく、選択されたＨ７Ｎ９  ＩＣＳペプチドと交差保存されたヒト由来ペプチドに対する「類似体」を比較するために、ヤヌスマトリクスを用いた。クラスＩ  ＨＬＡ制限エピトープに焦点を合わせて、ウイルス感染の範囲における免疫調節（「異種免疫」と名付けられる）に対する証拠が公知である。加えて、ヒトミクロビオームと交差保存されたエピトープが記載されており、これはＴ細胞反応性に寄与し得る（Ｓｕ  ＬＦら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３８：３７３〜８３、２０１３）。
【００５２】
ヒトゲノム対ヒトミクロビオーム交差保存の比率は、エフェクターではなく制御性Ｔ細胞応答に関連することが報告されている（Ｍｏｉｓｅ  Ｌら．、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９：１５７７〜８６、２０１３）。エフェクターＴ細胞応答の大きさと有意に相関したヤヌスマトリクス・デルタのスコア（図１２Ｂ）を用いた。
【００５３】
未露出ドナーのＰＢＭＣを用いた再刺激アッセイにおけるＴ細胞応答を分析した。ナイーブドナーのインビトロ調査は、観察される応答がＨ７Ｎ９未露出のヒト対象のワクチン接種または感染後に生じ得る応答を代表し得るため、関連するものと定めた。
【００５４】
ヒト宿主との高度な交差保存を有するＨ７Ｎ９インフルエンザＴ細胞エピトープは、自身との交差保存が低いエピトープとは対照的に、インビトロでＴｒｅｇを拡張でき、他のＨ７Ｎ９ペプチドと共インキュベートされたときにＰＢＭＣにおけるＩＦＮγ分泌を低減できる（図１４Ａ、図１４Ｂおよび図１５Ａ〜Ｃ）。Ｔヘルパーエピトープとヒトプロテオームのエピトープ配列との交差保存は、ウイルス病原体に対する免疫応答の重要なモジュレーターである。
【００５５】
請求されるヒト様エピトープによるＴおよびＢ細胞応答の調節は、ワクチン接種および感染におけるＨ７Ｎ９  ＨＡに対する中和抗体の力価および親和性を低減させる。Ｈ７Ｎ９ワクチンを開発するために現在使用される従来のアプローチの成功に対する障壁を提示することに加え、ヒト病原体がヒトの免疫防御をエスケープまたは調節する機構のリストには「免疫カムフラージュ」が加えられ得る。
【００５６】
ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）を用いて、Ｈ７Ｎ９の免疫原性の可能性を評価した。他のインフルエンザ株に見出される類似のエピトープよりもヒト配列との交差保存が多いいくつかのＨ７Ｎ９  ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを識別した（図１０）。Ａ（Ｈ３Ｎ２）およびＡ（Ｈ１Ｎ１）の免疫優性エピトープと配列の場所が対応するＨ７  ＨＡ配列は、ＴＣＲに面する位置に、ＨＬＡ−ＤＲ提示の状況における自己抗原との類似を増加させる突然変異を有する。Ｈ７Ｎ９ワクチン効力を低減させて、より低い力価、より低い親和性の抗体の開発に寄与するために、ヒト様Ｈ７Ｎ９エピトープを予測した。ナイーブなヒトドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ）を用いてインビトロＴ細胞アッセイを行い、ヒトゲノムと交差保存されたＨ７Ｎ９クラスＩＩ制限Ｔ細胞エピトープに応答する細胞の表現型および機能を調べ、これらのペプチドに対する応答と、ヒトタンパク質に由来する対応ペプチドおよびＨ７Ｎ９における交差保存の低いペプチドに対する応答とを比較した。Ｈ７Ｎ９タンパク質配列に含まれる高度に交差保存されたエピトープは低い免疫原性を示し、機能性Ｔｒｅｇを刺激し、これはＨ７Ｎ９ワクチンおよびウイルス免疫病原性に対する顕著な意味を有する発見である（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１３、図１４Ａ、図１４Ｂ、および図１５Ａ〜１５Ｃ）。
【００５７】
定義
本明細書において用いられる「アジュバント」という用語は、ワクチンの効果を助けて増強する物質を示す。
【００５８】
本明細書において用いられる「アミノ酸配列」という用語は、アミノ酸がペプチド鎖を形成するように連結する、すなわちペプチド結合によってともに連結される順序を示す。
【００５９】
本明細書において用いられる「抗体」という用語（「免疫グロブリン」としても公知である）は、形質細胞によって生成されて、たとえばウイルスなどの外来物体を識別および中和するために免疫系によって用いられるタンパク質を示す。
【００６０】
本明細書において用いられる「産生された抗体」という用語は、病原体に感染したか、またはワクチン接種を受けた対象の形質細胞によって生成された抗体を示す。
【００６１】
本明細書において用いられる「抗原」という用語は、免疫系が外来または危険であると認知した物質を示す。
【００６２】
本明細書において用いられる「クレード」という用語は、祖先およびそのすべての子孫からなる生活形群を示す。
【００６３】
本明細書において用いられる「エフェクターＴ細胞（単数または複数）」という用語は、特異的免疫応答を開始できる（細胞傷害性Ｔ細胞としての）形態に分化するために誘導された１つまたはそれ以上の（Ｔ細胞としての）リンパ球を示し、エフェクターリンパ球とも呼ばれる。
【００６４】
本明細書において用いられる「相同性」（または「相同性（複数）」）という用語は、同じ種または異なる種の有機体間でのタンパク質または核酸の配列の類似性を示す。
【００６５】
本明細書において用いられる「ヒトミクロビオーム」という用語は、ヒトの身体の内側または上で生きることのできる微生物の集合体を示す。
【００６６】
本明細書において用いられる「ヒトプロテオーム」という用語は、特定のときにヒトのゲノム、細胞、組織、または有機体によって発現されるタンパク質全体の組を示す。より特定的には、ヒトプロテオームとは定義された条件下で所与の時間に所与のタイプの細胞または有機体において発現されるヒトタンパク質の組である。
【００６７】
本明細書において用いられる「応答を誘導する」（または「応答（複数）を誘導する」）という用語は、ある実体が別の実体を機能させる能力を示す。
【００６８】
本明細書において用いられる「ｃＤＮＡ」という用語は「相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）ＤＮＡ」を示し、これは逆転写酵素という酵素の反応によって特定のＲＮＡから転写された合成ＤＮＡである。
【００６９】
本明細書において集合的に用いられる「トランスフェクト」または「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」という用語は、核酸を標的細胞に計画的に導入するプロセスを示す。
【００７０】
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、遺伝子材料を標的細胞に移すために用いられる媒体を示し、「クローニング部位」とはＤＮＡフラグメントのコピーを作製できるベクターの部分である。
【００７１】
本明細書において用いられる「Ｏｐｔ＿１」という用語は、意図的に改変されたバージョンを示す。
【００７２】
本明細書において用いられる「ＷＴ」という用語は、「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）」バージョンすなわち天然に見出されるバージョンを示す。
【００７３】
本明細書において用いられるインフルエンザウイルスとは、６つの属、すなわちインフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、インフルエンザウイルスＣ、イサウイルス、ソゴトウイルス、およびクアランジャウイルスを含むＲＮＡウイルスのファミリーを示す。最初の３つの属は、トリ（トリインフルエンザも参照）、ヒト、およびその他の哺乳動物を含む脊椎動物においてインフルエンザを引き起こすウイルスを含む。イサウイルスはサケに感染し、ソゴトウイルスは脊椎動物ならびにたとえばマダニおよびカなどの無脊椎動物に感染する。核タンパク質およびマトリックスタンパク質の抗原の相違によって識別される３つの属のインフルエンザウイルスは、次の脊椎動物に感染する。インフルエンザウイルスＡはヒト、その他の哺乳動物、およびトリに感染し、すべてのインフルエンザのパンデミックを引き起こす。インフルエンザウイルスＢは、ヒトおよびアザラシに感染する。インフルエンザウイルスＣはヒト、ブタ、およびイヌに感染する。
【００７４】
本明細書において用いられる「メモリーＢ細胞（単数または複数）」という用語は、再感染の場合の加速した、より頑強な抗体介在免疫応答（二次免疫応答としても公知である）の生成に重要な、一次感染後に胚中心内で形成される１つまたはそれ以上のＢ細胞サブタイプを示す。
【００７５】
本明細書において用いられる「メモリーＴ細胞」という用語は、過去に自身の同族抗原に遭遇して応答した感染およびおそらくは感染と戦ったＴ細胞（Ｔリンパ球としても公知である）の部分集合を示す。
【００７６】
本明細書において用いられる「自然感染」という用語は、通常体内に存在しないたとえば細菌、ウイルス、および寄生生物などの微生物の侵入および増殖を示す。感染は症状を引き起こさず無症状性のこともあるし、症状を引き起こして臨床的に明白となることもある。感染は局在化したままのこともあるし、血管またはリンパ管を通じて広がって全身性（身体全体）になることもある。侵入する微生物は意図的に、すなわち注射によって宿主に導入されたのではなく、たとえば呼吸または摂食などの自然な身体の機能の結果として、たとえば眼、外耳道、口、鼻腔および肺、および尿道などの通常の露出範囲、またはたとえば切り傷、引っ掻き傷、もしくはその他の擦過傷などの開放創を介して入る。
【００７７】
本明細書において用いられる「核酸」という用語は、生細胞に存在する複雑な有機物質、特にＤＮＡまたはＲＮＡを示し、それらの分子は連結されて長鎖になった多くのヌクレオチドからなる。
【００７８】
本明細書において用いられる「病原体」という用語は、疾患を引き起こし得る細菌、ウイルス、またはその他の微生物を示す。
【００７９】
本明細書において用いられる「ポリペプチド」という用語は、ともに結合されて鎖となり、タンパク質分子の一部（または全部）を形成する多数のアミノ酸残基からなる直鎖有機ポリマーを示す。
【００８０】
本明細書においてアミノ酸配列を示すときに用いられる「位置」という用語は、アミノ酸の配列において特定のアミノ酸残基が見出され得る場所を示す。たとえば、あるアミノ酸がポリペプチドの最初の位置にあると述べるとき、それは前記ポリペプチドのＮ末端に位置する始まりのアミノ酸であることを示す。
【００８１】
本明細書においてワクチンを考察するときに用いられる「に対して産生された」という用語は、病原体に感染したか、または抗原のワクチン接種を受けた対象の形質細胞によって生成された抗体を示す。
【００８２】
本明細書において用いられる「制御性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇｓ」とも呼ばれ、以前は「サプレッサーＴ細胞」として公知であった）」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原に対する耐性を維持し、自己免疫疾患を抑止するＴ細胞の部分母集団を示す。これらの細胞は一般的に、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制またはダウンレギュレートする。
【００８３】
本明細書において用いられる「選択アミノ酸残基」という用語は、所与のポリペプチドの特定のアミノ酸残基を置換するように、アミノ酸が有する特定の特性および生理化学的特質に対して発明者が注意深く選択したアミノ酸を示す。
【００８４】
本明細書において用いられる「血清型」という用語は、細菌またはウイルスの種の中の別個のバリエーションを示す。
【００８５】
本明細書において用いられる「株」という用語は、微生物（例、ウイルスまたは細菌または真菌）の遺伝学的サブタイプを示す。
【００８６】
本明細書において用いられる「Ｔ細胞エピトープ（抗原決定因子としても公知である）」という用語は、免疫系、特定的にはＴ細胞によって認識される抗原の部分を示す。
【００８７】
本明細書において用いられる「ワクチン接種」という用語は、病原体に対する適応免疫を発達させるために個体の免疫系を刺激するための抗原材料の投与を示す。
【００８８】
本明細書において用いられる「ワクチン」という用語は、メモリーＴ細胞および抗体の生成を刺激して、１つまたはいくつかの疾患に対する免疫を提供するために用いられる物質を示し、ワクチンは、疾患を誘導することなく抗原として作用するように処理された疾患の原因媒介物、その生成物、または合成代用物から調製される。
【００８９】
本明細書において用いられる「変形物（変異体）」という用語は、あるものの形態またはバージョンであって、同じものの他の形態または標準とは何らかの点で異なるものを示す。
【００９０】
本明細書において用いられる「野生型」という用語は、ある種の自然に発生する典型的な形態の表現型を示す。
【００９１】
本明細書において用いられる略語は、次のとおりに定義される。
ＡＰＣ  抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）
ＣＥＦＴ  サイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、エプスタイン・バーウイルス、インフルエンザウイルス、破傷風トキソイドウイルス（Ｃｙｔｏ−ｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＨＣＭＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ、Ｆｌｕ  ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｏｉｄ  ｖｉｒｕｓ）
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）
ＤＰＢＳ  ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）
ＨＢＳＳ  ハンクス平衡塩類溶液（Ｈａｎｋ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
ＨＬＡ  ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）
ＨＰＬＣ  高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
ＩＡＶ  インフルエンザＡウイルス
ＩＣＳ  免疫原性コンセンサス配列（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）
ＭＨＣ  主要組織適合複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）
ＰＢＭＣ  末梢血単核細胞
ＰＨＡ  フィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）
ＴＣＲ  Ｔ細胞受容体
Ｔｒｅｇ  制御性Ｔ細胞
ＴＲＦ  時間分解蛍光（ｔｉｍｅ  ｒｅｓｏｌｖｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）
【００９２】
本明細書において用いられる「および／または」という用語は、一方または他方または両方を有する可能性と定義される。たとえば「Ａおよび／またはＢ」は、Ａのみ、またはＢのみ、またはＡとＢとの組み合わせを有するシナリオを提供する。請求項がＡおよび／またはＢおよび／またはＣと読めるとき、その構成はＡのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、Ｃ以外のＡおよびＢ、Ａ以外のＢおよびＣ、Ｂ以外のＡおよびＣ、またはＡ、ＢおよびＣの３つすべてを構成要素として含んでもよい。
【００９３】
Ａ／上海／２／２０１３  Ｈ７のインシリコ分析
ＥｐｉＭａｔｒｉｘシステム（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）を用いて、全体的および局所的の両方の免疫原性の可能性に対して、Ｈ７Ｎ９インフルエンザのアミノ酸配列を分析した。識別された推定エピトープクラスタを、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）（米国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、ＭＤ、ＵＳＡ）より入手可能な非冗長タンパク質データベースと、ラホーヤアレルギー免疫研究所（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（ラホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ、ＵＳＡ）の免疫エピトープデータベースと、エピバックス社（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）が維持する公知のＭＨＣリガンドおよびＴ細胞エピトープのデータベースとに対してさらにスクリーニングした。
【００９４】
全体的免疫原性の評価−Ａ／上海／２／２０１３  Ｈ７のクラスＩＩ
入力配列を重複する９量体のフレームにパーズし、多くの付加的な「ファミリーメンバー」対立因子と機能的に同等またはほぼ同等な８つの一般的クラスＩＩ対立因子、すなわち「スーパータイプ」のパネルに関して、各フレームを評価した。８つのスーパータイプ対立因子と、それぞれのファミリーメンバーとは、ヒト母集団の９８％をはるかに超える部分を「包含」する（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ、Ｓら．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０（７）：３３６３〜７３、１９９８）。各々のフレームの対立因子による「評価」で、ＨＬＡ結合親和性を予測した。ＥｐｉＭａｔｒｉｘシステム評価スコアは約−３から＋３の範囲にわたり、正規分布した。１．６４より高いＥｐｉＭａｔｒｉｘシステム評価スコアを「ヒット」と分類し、これは中程度から高い親和性でＨＬＡ分子に結合する有意な確率を伴う、したがってそれらがたとえば樹状細胞またはマクロファージなどのＡＰＣの表面に提示され、そこで通過するＴ細胞に調べられ得る有意な確率を有する、免疫原性の可能性を示す。
【００９５】
所与のタンパク質に多くのＨＬＡリガンド（すなわちＥｐｉＭａｔｒｉｘのヒット）が含まれるほど、そのタンパク質が免疫応答を誘導する可能性が高くなる。所与のサイズのタンパク質に対して期待される予測Ｔ細胞エピトープの数と、ＥｐｉＭａｔｒｉｘシステムによって予測された推定エピトープの数との差であるＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアと呼ばれるスコアを、各タンパク質に与えた。ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアを、観察された免疫原性と相関させた。ＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアを「正規化」して、標準化スケール上にプロットした。「平均」タンパク質のＥｐｉＭａｔｒｉｘタンパク質スコアは０であり、０より高いスコアは過剰なＭＨＣリガンドの存在を示し、免疫原性の可能性が高いことを示すのに対し、０より低いスコアはＭＨＣリガンドの可能性の存在が期待より少ないことおよび免疫原性の可能性がより低いことを示す。＋２０より高いスコアの付いたタンパク質は、有意な免疫原性の可能性を有するとみなされる。
【００９６】
局所的免疫原性の評価−Ａ／上海／２／２０１３  Ｈ７のクラスＩＩ
クラスＩＩに対して、潜在的Ｔ細胞エピトープはタンパク質配列全体にランダムに分布するのではなく、特定の領域に「クラスタ化」する傾向がある。Ｔ細胞エピトープ「クラスタ」の長さは９から約２５アミノ酸の範囲であり、複数の対立因子および複数のフレームにまたがるそれらの親和性を考慮すると、４から４０の結合モチーフを含み得る。最も反応性の高いＴ細胞エピトープクラスタの多くが単一の９量体フレームを含み、それは少なくとも４つの異なるＨＬＡ対立因子に対して反応性であることが予測されることが発見された（以後「ＥｐｉＢａｒ」と呼ぶ）。ＥｐｉＢａｒを含有する配列は、インフルエンザ赤血球凝集素３０６−３１８（クラスタスコア２２）、破傷風毒素８２５−８５０（クラスタスコア４６）、およびＧＡＤ６５  ５５７−５６７（クラスタスコア２３）を含む。ＥｐｉＢａｒの視覚的表示を図１７に示し、それは、乱交雑インフルエンザエピトープのＥｐｉＢａｒおよびＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析の例を示す。インフルエンザＨＡペプチドは乱交雑の免疫原性であることが公知のエピトープである。ＥｐｉＭａｔｒｉｘにおいて、そのスコアは８つの対立因子すべてに対して極度に高い。上記で述べたように、そのクラスタスコアは２２である。１０より高いクラスタスコアは有意とみなされる。帯状のＥｐｉＢａｒパターンは、乱交雑エピトープの特徴である。結果を、ＰＲＹＶＫＱＮＴＬ（配列番号２１）、ＲＹＶＫＱＮＴＬＫ（配列番号２２）、ＹＶＫＱＮＴＬＫＬ（配列番号２３）、ＶＫＱＮＴＬＫＬＡ（配列番号２４）およびＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号２５）について図１７に示す。Ｚスコアは９量体フレームが所与のＨＬＡ対立因子に結合する可能性を示す。上位５％のすべてのスコアを「ヒット」とみなし、簡略化のため、１０％未満の非ヒット（＊）は図１７においてマスクされる。
【００９７】
Ｔ細胞エピトープクラスタ、特に「ＥｐｉＢａｒ」を含む配列はＨＬＡクラスＩＩ分子の範囲に非常に良好に結合し、かつヒト対象から採取した血液サンプルのアッセイにおいて非常に免疫原性が高い傾向があることが見出された。ＭｃＭｕｒｒｙ  ＪＡら（Ｖａｃｃｉｎｅ、２５（１６）：３１７９〜９１、２２／０１／２００７）によって報告されるとおり、自然感染によって野兎病またはワクシニアのいずれかに晒された対象のほぼ１００％が、各々約２０ペプチドを含むＴ細胞エピトープクラスタのプールに対するエクスビボＴ細胞応答を生じた。ＥｐｉＢａｒおよびＴ細胞エピトープクラスタは非常に強力な免疫原であることを観察した。１つまたはそれ以上の優性Ｔ細胞エピトープクラスタの存在によって、別様には低いスコアのタンパク質に対しても有意な免疫応答が可能になった。
【００９８】
潜在的Ｔ細胞エピトープクラスタを見出すために、異常に高密度の推定Ｔ細胞エピトープを有する領域について、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析結果をスクリーニングした。次いで、これらの領域に含まれる有意なＥｐｉＭａｔｒｉｘスコアを総計して、ＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスタ免疫原性スコアを作成し、ここで正のスコアは免疫原性の可能性の増加を示し、負のスコアはランダムに生成した配列または「平均的」配列よりも可能性が減少したことを示す。＋１０より高いスコアの付いたＴ細胞エピトープクラスタは、有意な免疫原性の可能性を有するものとみなした。
【００９９】
ヤヌスマトリクスアルゴリズムは、図１８に示すとおり、ＭＨＣに面するアグレトープおよびＴＣＲに面するエピトープの両方のアミノ酸含有量を考慮したものである。図１８に示すように、各ＭＨＣリガンドは２つの面を有する。すなわち、ＭＨＣ結合面（アグレトープ、ＭＨＣ／ＨＬＡに対して下向きの矢印のアミノ酸残基）、およびＴＣＲ相互作用面（エピトープ、ＴＣＲに対して上向きの矢印のアミノ酸残基）である。同一のエピトープと変異体アグレトープとを有する予測リガンドは、それらが同じＭＨＣ対立因子と結合するときには、交差反応性Ｔ細胞応答を刺激し得る。入力配列を重複する９量体のフレームにパーズし、選択した参照データベースに対してスクリーニングした。適合するアグレトープ（すなわち、入力ペプチドと同じＨＬＡに結合することがＥｐｉＭａｔｒｉｘによって予測されたもの）を有し、かつ入力ペプチドのＴＣＲコンタクトに正確に一致する参照配列が戻された。
【０１００】
結果
行ったインシリコ分析は、インフルエンザＡのＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７株の３２４番目の位置に有意なＴ細胞エピトープの存在を識別した（「エピトープ３２１」）。その結果を図４に報告する。加えて、エピトープ３２１のＴＣＲコンタクトとヒトゲノム内にあるＴ細胞エピトープとの対応を確立した。図５を参照。インフルエンザＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７の改変エピトープクラスタ３２１のＥｐｉＭａｔｒｉｘ分析を図７に示す。加えて、行ったインシリコ分析は、一般的変異体のＴＣＲコンタクトと、ヒトゲノムに含まれるＴ細胞エピトープとの間に有意な対応がないことを発見した。図８を参照。インフルエンザのＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７株の提案される改変を図６に示す。図２は、本出願において構想され、構築され、テストされて請求されるＡ／上海／２／２０１３  Ｈ７変異体の配列である。
【０１０１】
ゲノム分析およびエピトープ予測
ＧＩＳＡＩＤ（ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｔｆｏｒｍ．ｇｉｓａｉｄ．ｏｒｇ／）からの４つのヒトＨ７Ｎ９インフルエンザ配列（Ａ／杭州（Ｈａｎｇｚｈｏｕ）／１／２０１３、Ａ／安徽／１／２０１３、Ａ／上海／１／２０１３、およびＡ／上海／２／２０１３）のＨＬＡクラスＩＩ制限エピトープについて分析し、広いＨＬＡおよび株の適用範囲を可能にするように構築免疫原性コンセンサス配列（ＩＣＳ）を構築した。それぞれ正の対照およびＨ７Ｎ９ペプチドのヒト「類似体」の働きをするための、Ａ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ３Ｎ２）、およびＡ（Ｈ５Ｎ１）からの４つの公的に利用可能なインフルエンザＡエピトープと、ヒトタンパク質からの５つのペプチドとに加えて、自身とのさまざまな程度の交差保存を有する１５の代表的なＩＣＳを選択した。ヒト類似体ペプチドは、ヤヌスマトリクス（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）によって、選択されたＨ７Ｎ９ペプチドによる模倣の標的であり得ると識別されたペプチドに含まれるものであった。
【０１０２】
循環するＩＡＶとのペプチド類似性およびヒトゲノムとの交差保存
Ｈ７Ｎ９ペプチドと他のＩＡＶ株との類似性が報告されている（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳら、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９：９５０−６、２０１３）。ヤヌスマトリクス（エピバックス、プロヴィデンス、ロードアイランド（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）、ＵＳＡ）を用いて、ヒトゲノムとの交差保存を評価した。ユニプロット（ＵｎｉＰｒｏｔ）で概観されるヒトゲノムデータベースを、比較のためのヒト配列のソースとして翻訳した（Ｔｈｅ  ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、４０：Ｄ７１〜５、２０１２）。
【０１０３】
Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳら（Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９：９５０〜６、２０１３）に記載されるとおりに、Ｈ７Ｎ９  ＩＣＳペプチドを生成した。複数のＨＬＡ結合９量体フレームを含有するペプチドを与えられると、ヤヌスマトリクスはこうしたフレームの各々をＴ細胞受容体に面する残基（位置２、３、５、７、および８）と、ＨＬＡ結合残基（位置１、４、６、および９）とに分けた。その後、ヤヌスマトリクスはヒトゲノムデータベースにおいて交差保存エピトープの可能性があるもの（１００％のＴＣＲ面の同一性および同じＨＬＡスーパータイプの少なくとも１つに結合することが予測されるもの）をサーチした。ヒトゲノムにおいて見出された各ＴＣＲ一致９量体（この研究の目的のためにヒト９量体のＺスコアの１０％に設定された）に対するソースペプチドにおける各ＥｐｉＭａｔｒｉｘヒットに、ユーザが定めた演繹を適用することによって、「ヤヌスマトリクス・デルタ」スコアと呼ばれるヒトゲノム交差保存の定量的尺度を算出した。ヤヌスマトリクス・デルタが高くなることは、それら自体がクエリペプチドとＨＬＡ制限を共有する自己（ヒト）ペプチドに、より多数のＴＣＲが一致していることを示す。それらのペプチドに対するヤヌスマトリクス・デルタ値は０から３７．８９の範囲だった。演繹の後、ソースペプチドにおけるヒットを合計して、ヤヌスマトリクス調整クラスタスコアを算出するために用いた。ペプチドの元のＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスタスコアと、そのヤヌスマトリクス調整クラスタスコアとの差を算出した（以後「ヤヌスマトリクス・デルタ」と呼ぶ）。すなわち、ヤヌスマトリクス・デルタ＝ＥｐｉＭａｔｒｉｘクラスタスコア−ヤヌスマトリクス調整クラスタスコア。
【０１０４】
ヤヌスマトリクス・デルタ値が高くなることは、ヒトゲノムとの交差保存が大きいことによって免疫原性に対する元の可能性が割り引かれたことを示した。
【０１０５】
ペプチドの完全なリストとともに、それらの循環ＩＡＶ株の対応ペプチドとの配列類似性、およびヒトゲノムとの交差保存を表１に提供する。
【０１０６】
【表１】
0006622326.tif 000002
【０１０７】
列１：ペプチドの免疫学的特徴に基づいて割り当てられたグループ。
【０１０８】
列２：ペプチドの名称。Ｈ７Ｎ９  ＩＣＳペプチドの名称は、ヤヌスマトリクス・デルタによって順序付けられた。ヒト類似体ペプチドには、対応するＨ７Ｎ９ペプチドに従って番号が付けられた。
【０１０９】
列３：ペプチド配列。
【０１１０】
列４：ＩＡＶまたはヒトプロテオームのいずれかからの、各ペプチドのソースタンパク質。
【０１１１】
列５：ＩＡＶとの類似性のパーセンテージ。２０１２／１３  ＴＩＶからの２つのＩＡＶ株のいずれかにおける対応配列と、各ペプチドとを比較することによって、ＩＡＶの循環株との類似性を定めた。どのペプチドに対しても、インフルエンザＢ株ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）／１／２０１０との保存はなかった。８０％より低い任意のパーセンテージを「−」で表した。
【０１１２】
列６：ヤヌスマトリクス・デルタと、ヒトデータベースに見出される一致の数とによって表された、各ペプチドとヒトゲノムとの交差保存。
【０１１３】
予測される免疫学的特性によるペプチドのグループ化
サイトスケープ（サイトスケープ・コンソーシアム、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア、ＵＳＡ）を用いて、各ペプチドとヒトゲノムとの予測交差反応性の定性分析を提供した。図１０Ａ〜１０Ｃは、各々のペプチドに対するサイトスケープネットワークを示す。
【０１１４】
ヒトＰＢＭＣを用いてインビトロでのＩＡＶエピトープに対する免疫応答を比較するために、いくつかのタイプの可能な免疫応答を誘発し得るＩＡＶペプチドを選択した。図１０Ａに示したように、第１のグループは、Ｈ７以外のＩＡＶ株、すなわちＡ（Ｈ１Ｎ１）、Ａ（Ｈ３Ｎ２）、およびＡ（Ｈ５Ｎ１）の、免疫優性および高度に保存されたＨＡエピトープの変異体を表すペプチドからなっていた。
【０１１５】
図１０Ｂに示したように、第２のグループのペプチドは、Ｈ７Ｎ９抗原に由来するＩＣＳペプチド（Ｈ７Ｎ９  ＩＣＳペプチド）のリストから選択した（Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ  ＡＳら、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９：９５０〜６、２０１３）。この研究のために、最大の乱交雑ＨＬＡ結合の可能性、ペプチド合成に困難をもたらすことが公知であるシステインおよび疎水性ドメインがないこと、ならびに上述のヤヌスマトリクスアルゴリズムを用いたヒトゲノムとの予測ＴＣＲ／ＨＬＡ一致に基づいて、ＥｐｉＡｓｓｅｍｂｌｅｒアルゴリズム（エピバックス、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）によって生成した１０１のＩＣＳの部分集合を選択した。Ｈ７Ｎ９  ＩＣＳペプチドは、それらのヤヌスマトリクス・デルタスコアによって順序付けられる。記載されるアッセイのいくつかにおいて、このペプチドの組は、ヒトゲノムとの交差保存の程度に従ってさらにプールに分離された。
【０１１６】
最も広範なヒト交差保存を有するＨ７Ｎ９ペプチドに対して、対応するＨ７Ｎ９ペプチドがＴＣＲに面する残基を共有するヒト配列の１つまたは２つのペプチドを、図１０Ｃに示したように、合成のために選択した。これらのヒト「類似体」ペプチドに、それらがＴＣＲに面するアミノ酸を共有するＨ７Ｎ９ペプチドによって番号を付けた。たとえば、１２−ＨＵＭＡＮはペプチドＨ７Ｎ９−１２のヒト類似体である。
【０１１７】
ペプチド合成
本発明のペプチドは、いずれも当業者に公知の標準的な合成法および手順を用いることによって、商業的に入手可能な出発材料、文献において公知の化合物を用いるか、または容易に調製される中間物質から、さまざまなやり方で調製された。有機分子の調製ならびに官能基の転換および操作のための標準的な合成法および手順は、当該技術分野の関連科学文献または標準的な教科書から得ることができる。任意の１つまたはいくつかの供給源に限定されないが、たとえば本明細書において引用により援用されるＳｍｉｔｈ、Ｍ．Ｂ．およびＭａｒｃｈ、Ｊ．、Ｍａｒｃｈ’ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ、ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１；Ｇｒｅｅｎｅ、Ｔ．Ｗ．、Ｗｕｔｓ、Ｐ．Ｇ．Ｍ．、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９；Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ、Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｌ．ＦｉｅｓｅｒおよびＭ．Ｆｉｅｓｅｒ、Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ’ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；ならびにＬ  Ｐａｑｕｅｔｔｅ、ｅｄ．、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）などの古典的テキストは、当業者に公知の有機合成の有用かつ認知された参照教科書である。
【０１１８】
２１ｓｔセンチュリー・バイオケミカルズ（２１ｓｔ  Ｃｅｎｔｕｒｙ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（マールボロ（Ｍａｒｌｂｏｒｏ）、ＭＡ、ＵＳＡ）による９−フルオロニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ：ｆｌｕｏｒｏｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）化学物質を用いて、合成ペプチドを製造した。約２０．１ｍｇのペプチドが生成され、分析逆相ＨＰＬＣによって確認したペプチド純度は＞８０％であった。ペプチド質量は、タンデム質量分析によって確認した。調製したペプチドは白色粉末の外観を有した。
【０１１９】
クラスＩＩ  ＨＬＡ結合アッセイ
計算的予測を検証するために、ＨＬＡクラスＩＩ結合親和性アッセイを行った。５つの一般的ＨＬＡ  ＤＲＢ１対立因子、すなわちＨＬＡ  ＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、およびＤＲＢ１＊０８０１に対する競合アッセイにおける結合親和性について、２４のペプチドすべてを評価した（図１１）。３つの濃度（１、１０、および１００μΜ）の非ビオチン化テストペプチドを用いて、可溶性クラスＩＩ分子（ベナロヤ研究所（Ｂｅｎａｒｏｙａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ）、ＷＡ、ＵＳＡ）へのビオチン化標準ペプチド（２５ｎＭ）の結合に対して競合させた。反応を３７℃にて２４時間インキュベートして、平衡に到達させた。次いで、パン抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体、たとえばＬ２４３、抗ＨＬＡ−ＤＲＡ（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、ウエストレバノン（Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ）、ＮＨ、ＵＳＡ）などでコートした９６ウェルプレート上に、クラスＩＩ  ＨＬＡ−ペプチド複合体を捕捉した。次いでこのマイクロウェルプレートを洗浄して過剰なペプチドを除去し、ユーロピウム標識したストレプトアビジン（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ホプキントン（Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ）、ＭＡ、ＵＳＡ）とともに室温にて１時間インキュベートした。ユーロピウム活性化緩衝剤（パーキンエルマー、ホプキントン、ＭＡ、ＵＳＡ）を加えてプレートを室温にて１５〜２０分間現像してから、時間分解蛍光（ＴＲＦ）プレートリーダー（ＢＭＧラボテック社（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  ＧＭＢＨ）、オルテンベルク（Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ）、ＤＥ）においてプレートを読取った。アッセイは３つ組で行った。２４のペプチドすべてについて、クラスＩＩ  ＨＬＡ対立因子結合ポケットの広い表現を提供するＨＬＡクラスＩＩ対立因子の選択である５つの対立因子、すなわちＤＲＢ１＊０１０１、ＤＲＢ１＊０３０１、ＤＲＢ１＊０４０１、ＤＲＢ１＊０７０１、およびＤＲＢ１＊０８０１に対して結合アッセイを行った。
【０１２０】
アッセイしたすべてのペプチド−ＨＬＡ結合相互作用のうち、５０％は標的対立因子への強い結合親和性を示し（推定ＩＣ５０＜１μΜ）、１３％は中程度の結合を示し（１μＭ＜推定ＩＣ５０＜１０μΜ）、１１％は弱い結合親和性を示し（１０μＭ＜推定ＩＣ５０＜１００μΜ）、１１％は有意な親和性を示さなかった（推定ＩＣ５０＞１００μΜ）。１８のケースにおいては、データが結合親和性を確立するには不十分であった。
【０１２１】
ペプチド−ＨＬＡ結合対を真陽性（ＴＰ：ｔｒｕｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、偽陽性（ＦＰ：ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、真陰性（ＴＮ：ｔｒｕｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）、または偽陰性（ＦＮ：ｆａｌｓｅ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）のいずれかに分類することによって、計算的予測と結合アッセイの結果との一致を評価した。所与のＨＬＡ対立因子に対して、ＥｐｉＭａｔｒｉｘＺスコア≧１．６４であることはそのペプチドが予測バインダーの上位５％に入っていることを示し、「ヒット」とみなされる。不確定の測定値を除き、全体の予測の成功率は８５％であった。予測と結合との相関は、ＤＲＢ＊０１０１に対して８２％、ＤＲＢ１＊０３０１に対して７５％、ＤＲＢ１＊０４０１に対して９５％、ＤＲＢ１＊０７０１に対して７３％、ＤＲＢ１＊０８０１に対して１００％であった（図１１）。これらの相関は、ＥｐｉＭａｔｒｉｘおよびその他のエピトープマッピングツールを用いて予測されたＩＡＶペプチドに対する過去に発表された結果の範囲内である（Ｍｏｉｓｅ  Ｌら、Ｈｕｍ．Ｖａｃｃｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、９：１５９８−１６０７、２０１３）。
【０１２２】
ＰＢＭＣの単離
非特定化した健康なドナーから白血球除去フィルターが得られ（ロードアイランド・ブラッドセンター（Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒ）、プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）、年齢を特定した健康なドナーからバフィーコートが得られた（リサーチ・ブラッド・コンポーネンツ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ）、ブライトン（Ｂｒｉｇｈｔｏｎ）、ＭＡ、ＵＳＡ）。ヒト血液を用いたすべての研究は、ＮＩＨの規定に従い、ロードアイランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）機関審査委員会の承認を得て行った。
【０１２３】
すべての白血球除去フィルターおよびバフィーコートは、血液を採取したのと同じ日に取得および処理した。以下のとおりに、フィコール・パーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンシズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ）、ＰＡ、ＵＳＡ）によって、白血球除去フィルターまたはバフィーコートから新鮮なＰＢＭＣを単離した。ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、ＶＡ、ＵＳＡ）ならびに２．５％スクロースおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ＝７．２）によって、白血球除去フィルターを逆流させた。シリンジによってバフィーコートを取り出し、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）（サーモフィッシャー・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、ＭＡ、ＵＳＡ）で希釈した。フィルターまたはバフィーコートからの血液の下にフィコール（ヒストパーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）１０７７）（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ＭＯ、ＵＳＡ）を敷いてから、単核細胞を単離するために遠心分離した。ＰＢＭＣを別のチューブに移し、ＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、ＰＢＭＣを次の細胞培地に再懸濁した。ＲＰＭＩ  １６４０（セルグロ、マナッサス、ＶＡ、ＵＳＡ）ならびに１０％ヒトＡＢ血清（バレーバイオメディカル（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）、ウィンチェスター（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ）、ＶＡ、ＵＳＡ）、１％Ｌ−グルタミン（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＣＡ、ＵＳＡ）、および０．１％ゲンタマイシン（セルグロ、マナッサス、ＶＡ、ＵＳＡ）。
【０１２４】
ＰＢＭＣの培養
新しく単離したＰＢＭＣを個々のペプチド（１０μｇ／ｍｌ）またはペプチドのプール（１０μｇ／ｍｌ）とともに、５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて８日間培養して、抗原特異的Ｔ細胞を拡張させた。ペプチドを培養物に入れる前に、ペプチドをＤＭＳＯに溶解し、培地でさらに希釈した。ウェル当りのペプチド当りのＤＭＳＯの最大濃度は０．２％であった。４８ウェル細胞培養プレートのウェルにおいて、１５０μｌの培地中の２×１０６の細胞を、１５０μｌの各個々のペプチドまたはプールで刺激した。正の対照ウェルは、１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック、ウォルサム、ＭＡ、ＵＳＡ）、または１０μｇ／ｍｌのＣＥＦＴペプチドプール（ＣＴＬ、シェーカーハイツ（Ｓｈａｋｅｒ  Ｈｅｉｇｈｔｓ）、ＯＨ、ＵＳＡ）を受取った。負の対照ウェルは、培地および０．２％ＤＭＳＯのみを受取った。３日目および６日目に、細胞に１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２（ＢＤファーミンゲン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、ＣＡ、ＵＳＡ）を半培地交換によって補充した。８日目に、ＰＢＭＣを集めて洗浄し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによってサイトカイン分泌を測定するための抗原再刺激の準備をした。ＨＬＡ−ＤＲ遮断実験のために、同じドナーからのＰＢＭＣを５μｇ／ｍｌの精製ＮＡ／ＬＥ（登録商標）マウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＢＤファーミンゲン、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）の存在下または不在下で培養した。
【０１２５】
ＨＬＡ−ＤＲ遮断アッセイ
ペプチドがＨＬＡ−ＤＲによって提示されたかどうかを識別するために、３人の健康なドナーにおけるＩＦＮγ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）によるエピトープ特異的Ｔ細胞応答に対する抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体の影響を調べた。１０のペプチド（ＩＡＶ−１、Ｈ７Ｎ９−２、−４、−７、−９、−１２、−１３、−１４Ａ、５−ＨＵＭＡＮ−Ａ、および−Ｂ）に対して、ＨＬＡ−ＤＲを遮断することによってペプチド特異的スポット形成が１００％阻害され、これらのペプチドはＨＬＡ−ＤＲによって制限されることを示した（表２）。
【０１２６】
【表２】
0006622326.tif 000003
【０１２７】
方法に記載されるとおり、抗ＨＬＡ−ＤＲ遮断抗体の存在下または不在下で、ＰＢＭＣをＨ７Ｎ９ペプチドおよび対照とともにインキュベートした。ほとんどのペプチド特異的応答は抗体の添加によって阻害され、これらのペプチドが確かにＨＬＡ−ＤＲ分子によって提示されたことを示唆した。阻害は常に完全ではなく、１つのケース（Ｈ７Ｎ９−１１）では遮断抗体の存在下で応答が増加したため、他のクラスＩＩ対立因子（ＤＰ、ＤＱ）および／またはクラスＩ  ＨＬＡによる提示の可能性は除外できない。
【０１２８】
Ｎ／Ａ：遮断Ａｂの不在下の応答はアッセイバックグラウンド未満であった。
【０１２９】
７つのペプチド（ＩＡＶ−２、−３、−４、Ｈ７Ｎ９−１、−３、−８、および−１０）は、ＨＬＡ−ＤＲに加えて、またはその代わりにたとえばＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはクラスＩ  ＨＬＡなどの別のＨＬＡ分子によって提示されたために、ＨＬＡ−ＤＲ遮断によって部分的にしか阻害されないＴ細胞応答を誘導した。ペプチドのいくつかは、ＥｐｉＭａｔｒｉｘ（エピバックス  プロヴィデンス、ＲＩ、ＵＳＡ）によって識別されたクラスＩ  ＨＬＡ結合モチーフを含有していた。ペプチドＨ７Ｎ９−１１のケースでは、ＨＬＡ−ＤＲが遮断されたときを除いて応答は不在であり、他のＨＬＡ対立因子がこのペプチドを提示するかもしれないことを示唆した。
【０１３０】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
１８人の個別の健康なドナーからのＰＢＭＣを、培養物中で個々のペプチドによって８日間にわたって刺激した。ΙＦΝγ  ＥＬＩＳｐｏｔキットを用いた製造者のプロトコル（マブテック（Ｍａｂｔｅｃｈ）ＡＢ、シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）、ＯＨ、ＵＳＡ）に従うＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、個々のペプチドによる再刺激に応答したヒトΙＦΝγ生成を測定した（図１２Ａ）。ペプチドに対するエクスビボ応答は２４〜４８時間ではバックグラウンドより有意に高く上昇せず、前駆体集団を拡張せずに検出するにはエピトープ特異的Ｔ細胞の頻度が低過ぎたことを示唆したため、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは８日間の拡張期間の後に行われた。抗ヒトΙＦΝγ捕捉抗体を予めコートしたＥＬＩＳｐｏｔプレートに、細胞を１×１０５／ウェルまたは１．５×１０５／ウェルにて移し、対応するペプチド１０μｇ／ｍｌによって再刺激した。正の対照ウェルを、１μｇ／ｍｌのＰＨＡまたは１０μｇ／ｍｌのＣＥＦＴによって刺激した。負の対照は、ペプチド刺激培養物に存在するのと同じ濃度のＤＭＳＯ（０．２％）を伴う培地のみを受取った。すべての刺激および対照を３つ組のウェルに投与した。ＥＬＩＳｐｏｔプレートを５％ＣＯ２雰囲気下で３７℃にて２４時間インキュベートし、洗浄し、二次ＨＲＰ標識抗ΙＦΝγ検出抗体とともにインキュベートし、ＴＭＢ基質を加えることによって現像した。免疫スポットリーダー、すなわちＣＴＬ  Ｓ５  ＵＶアナライザー（セルラーテクノロジー・リミテッド（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）、シェーカーハイツ、ＯＨ、ＵＳＡ）を用いて、生のスポットカウントを記録した。スポット数が百万ＰＢＭＣ当りバックグラウンドより５０を超えて多く、かつバックグラウンドの少なくとも２倍であるとき、その応答を陽性とみなした。各ペプチドの３つ組の平均スポット数を負の対照ウェルの平均スポット数で割ることによって、ＥＬＩＳｐｏｔ  ＳＩを定めた。
【０１３１】
各応答のＳＩ（刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｘ））を算出することによって、データを分析した。図１２Ｂに示すとおり、有意な負の相関（ｐ＜０．０５）が観察された。
【０１３２】
マルチカラーフローサイトメトリ
約３×１０６のＰＢＭＣを、０．５μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４９ｄおよび抗ＣＤ２８抗体（ＢＤファーミンゲン）（ＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンホゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）、ＣＡ、ＵＳＡ）の存在下で８日間にわたり、１０μｇ／ｍｌの個々のペプチドもしくはプールされたペプチド、または負の対照としての０．２％ＤＭＳＯを有する培地によって刺激した。３日目および６日目にＩＬ−２（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。８日目に、ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌの対応ペプチドまたは負の対照によって２４時間再刺激した。９日目に細胞を集めて洗浄し、フローサイトメトリ分析の準備をした。
【０１３３】
再刺激したＰＢＭＣを、最初に固定可能な生存率染色剤４５０（ＢＤホライゾン（ＢＤ  Ｈｏｒｉｚｏｎ））（ＢＤバイオサイエンシズ、サンホゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）とともに室温にて１５分間インキュベートした。その後、Ｔ細胞表面抗原に対する蛍光色素コンジュゲート抗ヒトモノクローナル抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００抗ＣＤ３、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ４、ＡＰＣ抗ＣＤ２５、およびＦＩＴＣ抗ＣＤ３９）（ＢＤファーミンゲン）（ＢＤバイオサイエンシズ、サンホゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって、４℃にて３０分間細胞を染色した。次いで細胞を固定し、ＦｏｘＰ３固定／透過処理溶液、すなわちＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝剤セット（ｅバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を室温にて３０分間用いることによって透過性にしてから、ＰＥコンジュゲート抗ヒトＦｏｘＰ３抗体、すなわちクローン２５９Ｄ／Ｃ７（ＢＤファーミンゲン）（ＢＤバイオサイエンシズ、サンホゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって室温にて少なくとも３０分間染色した。ＦｏｘＰ３透過処理緩衝剤（ｅバイオサイエンス、サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって細胞を洗浄し、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメータ（ＢＤバイオサイエンシズ、サンホゼ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いたフローサイトメトリによって取得した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ツリースター（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）、アッシュランド（Ａｓｈｌａｎｄ）、ＯＲ、ＵＳＡ）においてデータを分析した。
【０１３４】
プールされたペプチドのＴ細胞反応性
上述の観察をＨ７Ｎ９感染および／またはワクチン接種とより特定的に関係付けるために、２つのペプチドプールによって同じ実験を行った（図１３）。第１のプールは、１０から２０のヤヌスマトリクス・デルタ値を有するＨ７Ｎ９  ＩＣＳペプチドを含んだ（Ｈ７Ｎ９−４から−１２）。第２のプールは、２０より高いヤヌスマトリクス・デルタ値を有するペプチドを含んだ（Ｈ７Ｎ９−１３から−１４Ｂ）。第１のプールには第２のプールよりも多くのペプチドがあったため、体積単位当たりの合計が同じになるようにプール濃度を等しくした。最もヒトに近いＨ７Ｎ９ペプチドからなる第２のプールのＳＩは、第１のプールよりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。これらの結果は５人のドナーの平均応答を反映する。ペプチドは、それらの循環するＩＡＶとの類似性、ヒト配列との交差保存、または自己抗原としての状態に基づくそれらの予測される免疫学的特性に従うグループにプールされ、その結果はプール内の個々のペプチドに対して観察されたものと一致した。
【０１３５】
Ｔｒｅｇ表現型決定
加えて、ペプチドが健康なドナーのＰＢＭＣにおいてＴｒｅｇを拡張する能力について、ペプチドを個別にテストした。２０より大きいヤヌスマトリクス・デルタ値を有する３つのペプチドはすべて、インビトロで培地よりも有意に高い割合のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の拡張を誘導した（ｎ＝３）（図１４Ｂ、ｐ＜０．０５）。並行して行ったアッセイにおけるＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋およびＣＤ３９＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの頻度にも同様の傾向が観察されたが、ＣＤ３９＋ＦｏｘＰ３＋頻度の増加のみが統計学的に有意であった。プールされたインフルエンザＡエピトープは、インビトロでＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋およびＣＤ３９＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞の類似の拡張を誘導しなかった（ｎ＝９）。
【０１３６】
バイスタンダー抑制
公知のＨＬＡ乱交雑およびヒトＴＣＲシグネチャを有するペプチドは、自然感染またはワクチン接種において起こり得る隣接炎症応答に対して制御効果を及ぼし得るかどうかを定めるために、バイスタンダー抑制実験を行った。ヤヌスマトリクス・デルタ値２１．８５を有する季節性インフルエンザＨＡ免疫優性エピトープのＨ７相同体であるペプチドＨ７Ｎ９−１３の存在下または不在下で、正常な対象のＰＢＭＣをＨ７Ｎ９  ＩＣＳペプチドのプール（Ｈ７Ｎ９−１、−２、−９、および−１３を除くすべてを含む）によって刺激した。Ｈ７Ｎ９−１３の添加によってプールが希釈されないことを確実にするために、両方の培養物が同じ絶対濃度のプールされたペプチドを有し、Ｈ７Ｎ９−１３の添加が唯一の変数となるように、濃度を調整した。Ｈ７Ｎ９−１３との共インキュベーションは、プールされたペプチドに対するＴ細胞応答を有意に抑制した（ｎ＝７）（図１５Ａ、ｐ＜０．０１）。これに対し、Ｈ７Ｎ９−１３ほどヒトゲノムとの交差保存がないペプチドＨ７Ｎ９−９との共インキュベーションは、Ｈ７Ｎ９エピトープのプールに対するＴ細胞応答を抑制せず（ｎ＝４）（図１５Ｂ）、Ｈ７Ｎ９−１３の免疫抑制活性はペプチド特異的であることを示唆した。
【０１３７】
他のＩＡＶ株からのペプチドを用いた効果を確認するために、循環ＩＡＶ株（ＩＡＶ−１から−４）のＨＡからの個々のペプチドもしくはプールされたペプチド、または循環ＩＡＶ株の配列と高い類似性を有するＭ１からのＨ７Ｎ９ペプチド（Ｈ７Ｎ９−３）を用いて、同じ実験を行った。２人の個別のドナーからのＰＢＭＣを用いて、ペプチドＨ７Ｎ９−１３は、Ｈ７Ｎ９−３不在下のＩＡＶ−３に対する応答に比べて、Ｈ７Ｎ９−３と共培養されたときにＩＡＶ−３に対するＴ細胞応答を有意に抑制し、Ｈ７Ｎ９−３が存在するときの第１のドナーにおけるペプチドＩＡＶ−１および第２のドナーにおけるＩＡＶ−２に対して類似のＴ細胞応答の低減が観察された（図１５Ｃ、すべてｐ＜０．０５）。統計学的に有意ではないが、高いヤヌスマトリクス・デルタスコア（＞２０）を有したＨ７Ｎ９−１３、−１４Ａおよび−１４Ｂの存在下でも、ＩＡＶペプチド（１〜４）のプールに対する応答の低減が観察された。
【０１３８】
統計分析
グラフパッドプリズム（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ）（グラフパッドソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．）、ラホーヤ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはマイクロソフトエクセル（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ）（マイクロソフト社（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、レドモンド（Ｒｅｄｍｏｎｄ）、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて、ｐ値および統計的有意性を定めるためのテストを行った。ヤヌスマトリクス・デルタとＳＩとを相関させるときに、ピアソン関数を用いてＲを定めた。スチューデントｔ検定を用いて、対応または独立のＴ細胞反応性値の統計的有意性を算出した。
【０１３９】
ＨＬＡ  ＤＲ３マウス免疫化
６〜８週齢の６匹の雌ＨＬＡ  ＤＲ３トランスジェニックマウスのグループを筋肉内刺激し、その４週間後に、野生型赤血球凝集素（図３）と、ノイラミニダーゼと、マトリックスタンパク質とで構成されるＡ／上海／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ウイルス様粒子か、またはクラスタ３２１を操作したＡ／上海／２／２０１３（Ｈ７Ｎ９）赤血球凝集素（図２）とともに調合された同じノイラミニダーゼと、マトリックスタンパク質とで構成されるウイルス様粒子のいずれかによって追加免疫した。インフルエンザマトリックスタンパク質（Ｍ１）、ノイラミニダーゼ、赤血球凝集素または操作された赤血球凝集素を発現するプラスミドで一過的にトランスフェクトされた哺乳動物細胞培養物発現系（ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞）において、ウイルス様粒子を生成した。細胞培養上清を集め、超遠心分離によってＶＬＰを精製した。ＨＡ含有量に従うワクチン用量は、タンパク質濃度に基づくものであった。用量当り０．１２μｇ（低）、０．６μｇ（中）、または３μｇ（高）のいずれかのＨＡによってマウスを免疫化した。野生型および操作免疫原の両方をイムジェクトアラム（Ｉｍｊｅｃｔ  Ａｌｕｍ）アジュバントと共調合した。赤血球凝集阻害アッセイによる中和抗体活性の測定のために、各免疫化の前および追加免疫化の４週間後に血清を集めた。クラスタ３２１操作Ａ／上海／２／２０１３ウイルス様粒子ワクチンによって免疫化したマウスは、防御レベルの赤血球凝集阻害抗体を発達させ、Ｈ７−ＨＡの改変は中和エピトープを保存したことを示唆した。加えて、クラスタ３２１操作Ａ／上海／２／２０１３ウイルス様粒子ワクチンは、野生型ウイルス様粒子ワクチンよりも早く、かつ低い用量で赤血球凝集阻害抗体を産生した（図１６）。
【０１４０】
赤血球凝集阻害アッセイ
ウマ赤血球の凝集を阻害できるＨＡに対する機能性抗体を評価するために、ＨＡＩ（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）アッセイを用いた。ＣＤＣ研究室に基づくインフルエンザ調査マニュアルからプロトコルを適応させた。非特異的阻害剤を不活性化するために、テストの前に血清を受容体破壊酵素（ＲＤＥ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｓｔｒｏｙｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）（デンカ生研株式会社（Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ、Ｃｏ．）、東京（Ｔｏｋｙｏ）、ＪＰ）で処理した。１部の血清に３部のＲＤＥを加え、３７℃にて一晩インキュベートした。５６℃にて約３０分間インキュベートすることによって、ＲＤＥを不活性化した。ＲＤＥ処理血清をｖ底マイクロタイタープレートにおいて２倍段階希釈した。約８ＨＡＵ／５０μＬに調整した等体積のリアソータントウイルスを各ウェルに加えた。リアソータントウイルスは、マウス適応株Ａ／プエルトリコ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ）／８／１９３４の内部遺伝子と、Ａ／上海／２／２０１３の表面タンパク質ＨＡおよびＮＡとを含んだ。プレートに蓋をして、室温にて２０分間インキュベートした後、１％ウマ赤血球（ＨＲＢＣ）（ランパイアバイオロジカルス（Ｌａｍｐｉｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、パイパーズビル（Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ）、ＰＡ、ＵＳＡ）のＰＢＳ溶液を加えた。赤血球を４℃にて保存し、調製から７２時間以内に使用した。撹拌によってプレートを混合し、蓋をし、室温にて１時間ＲＢＣを沈降させた。非凝集ＲＢＣを含有する最終ウェルの相互希釈度によって、ＨＡＩ力価を定めた。各プレートに対して、正および負の血清対照が含まれた。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、Ｈ７ポリペプチドすなわち図２のポリペプチドは、１つまたはそれ以上の置換、欠失、挿入、反転、融合、およびトランケーション、またはこれらのいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列が異なってもよい。変異体ポリペプチドは、１つまたはそれ以上の置換、欠失、挿入、反転、融合、およびトランケーション、またはこれらのいずれかの組み合わせによってアミノ酸配列が異なってもよい。変異体ポリペプチドは完全に機能性であってもよいし、１つまたはそれ以上の活性における機能を欠いていてもよい。完全に機能性の変異体は典型的に、保存的変異または重要でない残基もしくは重要でない領域の変異のみを含有する。加えて機能性変異体は、機能の変化をもたらさないか、または重要でない変化をもたらす類似アミノ酸の置換を含み得る。代替的に、こうした置換は機能にある程度の正または負の影響を与え得る。非機能性変異体は典型的に、１つまたはそれ以上の非保存的なアミノ酸の置換、欠失、挿入、反転、またはトランケーション、あるいは重要な残基または重要な領域における置換、挿入、反転、または欠失を含む。
【０１４２】
加えて本技術は、同一性の程度は低いが、本技術の核酸分子がコードするポリペプチドによって行われるのと同じ機能の１つまたはそれ以上を行うための十分な類似性を有するポリペプチドを包含する。類似性は、保存されたアミノ酸置換によって定められる。こうした置換とは、ポリペプチド内の所与のアミノ酸を類似の特徴の別のアミノ酸で置換するものである。保存的置換は、おそらく表現型的にサイレントである。保存的置換として典型的にみられるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅのうちの１つから別のものへの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの置換である。どのアミノ酸の変更が表現型的にサイレントになると考えられるかに関するガイダンスは、たとえばＢｏｗｉｅ、Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０、１９９０などに見出される。
【０１４３】
本明細書において用いられる、２つのポリペプチド（またはポリペプチドのある領域）が実質的に相同または同一であるとは、それらのアミノ酸配列が少なくとも約４５〜５５％、典型的には少なくとも約７０〜７５％、より典型的には少なくとも約８０〜８５％、より典型的には約９０％より高く、またはそれ以上で相同または同一であるときである。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント相同性または同一性を定めるために、それらの配列を最適な比較の目的のために整列させる（例、他方のポリペプチドまたは核酸分子との最適な整列のために、一方のポリペプチドまたは核酸分子の配列に間隙が導入されてもよい）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。一方の配列のある位置が、他方の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められているとき、それらの分子はその位置において相同である。本明細書において用いられるアミノ酸または核酸の「相同性」とは、アミノ酸または核酸の「同一性」と同等である。２つの配列間のパーセント相同性は、それらの配列が共有する同一位置の数の関数である（例、パーセント相同性は、同一の位置の数／位置の合計数×１００に等しい）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本技術は本発明のポリペプチドのポリペプチドフラグメントを含む。いくつかの実施形態において、本技術は本明細書に記載されるポリペプチドの変異体のフラグメントを包含する。本明細書において用いられるフラグメントは、少なくとも約５つの隣接アミノ酸を含む。有用なフラグメントは、ポリペプチドの生物活性の１つまたはそれ以上を保持するフラグメント、およびポリペプチド特異的抗体を生成するための免疫原として用いられ得るフラグメントを含む。生物活性フラグメントは、たとえば約６、９、１２、１５、１６、２０、もしくは３０、またはそれ以上のアミノ酸の長さである。フラグメントは分離して（他のアミノ酸またはポリペプチドに融合されずに）いてもよいし、もっと大きなポリペプチドの中にあってもよい。いくつかのフラグメントが単一のもっと大きなポリペプチドの中に含まれていてもよい。一実施形態において、宿主における発現のために設計されたフラグメントは、ポリペプチドフラグメントのアミノ末端に融合された異種プレポリペプチドおよびプロポリペプチド領域と、フラグメントのカルボキシル末端に融合された付加的領域とを有し得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本技術はキメラまたは融合ポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、本発明のポリペプチドが異種タンパク質、すなわちそのポリペプチドと実質的に相同でないアミノ酸配列を有するポリペプチドと動作的に連結されたものを含む。「動作的に連結された」とは、ポリペプチドと異種タンパク質とがインフレームで融合されたことを示す。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、単離されるポリペプチドは天然にそれを発現する細胞から精製されてもよいし、それを発現するように変更された（組み換え）細胞から精製されてもよいし、公知のタンパク質合成法を用いて合成されてもよい。いくつかの実施形態において、本技術のポリペプチドは組み換えＤＮＡ技術によって生成される。限定ではなく例として、ポリペプチドをコードする核酸分子が発現ベクターにクローニングされ、その発現ベクターが宿主細胞に導入され、その宿主細胞においてポリペプチドが発現される。次いで、標準的タンパク質精製技術を用いた適切な精製スキームによって、細胞からポリペプチドが単離され得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドはたとえば、Ｄ−立体異性体などの天然に発生するアミノ酸の改変形、天然に発生しないアミノ酸；アミノ酸類似体；および模倣体などを含み得る。
【０１４８】
本発明のワクチンは、投与の前後のペプチド凝集を防ぎ、かつ生物活性を保持する。本発明のワクチンは典型的に、投与前の再構成を必要としない無菌の貯蔵安定かつ薬学的に許容可能な、すぐに投与できる水溶液である。本発明のワクチンは対象への投与に好適であり、これはそれらのワクチンが薬学的に許容可能であり、無毒性であり、ペプチドの生物学的効果またはホルモン効果に悪影響を与え得るいかなる成分も含有しないことを意味する。
【０１４９】
請求されるワクチンは典型的に密閉された容器、バイアル、またはカートリッジの中に貯蔵され、それは典型的に長期貯蔵に好適である。「長期貯蔵に好適である」とは、そのバイアル、容器、またはカートリッジが、長期貯蔵の間に成分の脱出またはたとえば微生物などの外部成分の移入をさせないことを意味する。
【０１５０】
本発明のワクチンは、好ましくは注射によって、典型的には筋肉内注射によって投与される。
【０１５１】
本発明のワクチンは、単一用量または複数用量の密閉された容器、バイアル、またはカートリッジの中に貯蔵され得る。密閉された容器、バイアル、またはカートリッジは典型的に、単一または複数用量の注射ペンまたは薬物送達デバイスとともに用いるために好適である。密閉容器は１またはそれ以上の用量の本発明のワクチンを含んでもよく、各用量は有効量の本明細書に記載のワクチンを含む。
【０１５２】
単一用量注射ペンまたは薬物送達デバイスは、典型的にはディスポーザブルのデバイスであり、これは本明細書に記載されるワクチンの有効量の単一用量を含む密閉容器を使用する。複数用量注射ペンまたは薬物送達デバイスは、典型的には本明細書に記載される医薬組成物中に有効量のワクチンの２以上の用量を含有する。複数用量ペンは典型的に、本明細書に記載される貯蔵安定ワクチンの所望の体積を投与するように調整され得る。特定の実施形態において、複数用量注射ペンは、１本の針を複数回使用することによって起こり得る、微生物混入物の移入が容器またはカートリッジに入ることを防ぐ。
【０１５３】
本明細書において用いられる有効量とは、所望の応答を誘発するために十分な量を示す。本発明において、所望の生物学的応答とは、病原体、特にインフルエンザＡ／上海／２／２０１３に対する抗体を生成することを含む。
【０１５４】
本明細書において用いられる対象とは動物、たとえば哺乳動物、たとえばヒトなどであってもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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