(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型に比べて、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性を有する改変微生物であって、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の活性の低減が、遺伝的改変によって実現され、改変微生物が由来する野生型がバスフィア属に属し、前記野生型が遺伝的に改変されていない天然の微生物を指す、上記改変微生物。
【請求項２】
改変微生物が由来する野生型が、配列番号1、又は配列番号1と少なくとも96%の配列相同性を示す配列の16S rDNAを有する、請求項１に記載の改変微生物。
【請求項３】
改変微生物が由来する野生型が、バスフィア・スクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）種に属する、請求項１に記載の改変微生物。
【請求項４】
改変微生物が由来する野生型が、ドイツのDSMZにDSM 18541として寄託されたバスフィア・スクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）株DD1である、請求項３に記載の改変微生物。
【請求項５】
野生型のwcaJ遺伝子が、以下：
a）配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸；
b）配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸；
c）a）又はb）の核酸と少なくとも70%同一である核酸であって、同一性がa）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である核酸；
d）a）又はb）の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa）又はb）の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸；及び
e）a）又はb）のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a）又はb）の核酸とは異なる核酸；
からなる群より選択される核酸を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項６】
wcaJ遺伝子が改変されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項７】
wcaJ遺伝子の改変が、wcaJ遺伝子又は少なくともその一部の欠失、wcaJ遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はwcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入によって達成される、請求項６に記載の改変微生物。
【請求項８】
wcaJ遺伝子における少なくとも一つの変異が、wcaJ遺伝子によってコードされるトランケートされた酵素の発現をもたらす、請求項７に記載の改変微生物。
【請求項９】
トランケートされた酵素において、wcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸がC末端から欠失している、請求項８に記載の改変微生物。
【請求項１０】
前記微生物が野生型と比べて、
i）低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性、
ii）低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性、又は
iii）低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性及び低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性をさらに有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の改変微生物。
【請求項１１】
前記微生物が、
A）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
B）pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
C）pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
D）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び
pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；又は
E）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び
pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
を含む、請求項１０に記載の改変微生物。
【請求項１２】
I）請求項１〜１１のいずれか一項に規定される改変微生物を、改変微生物が有機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で培養し、それによって有機化合物を含む発酵ブロスを得るステップ；
II）プロセスステップI）で得られる発酵ブロスから有機化合物を回収するステップ
を含む、有機化合物の生産方法であって、有機化合物がカルボン酸、ジカルボン酸又はトリカルボン酸である、上記方法。
【請求項１３】
有機化合物が、コハク酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
同化可能な炭素源が、ショ糖、マルトース、D-グルコース、グリセロール、グリセロールとD-グルコースの混合物、グリセロールとショ糖の混合物、グリセロールとD-キシロースの混合物、グリセロールの混合物及びマルトースとD-グルコースとフルクトースの混合物からなる群より選択される、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法がプロセスステップ：
III）少なくとも一つの化学反応による、前記有機化合物と異なる二次有機産物への、プロセスステップI）で得られる発酵ブロスに含まれる有機化合物の変換、又はプロセスステップII）で得られる回収される有機化合物の変換
をさらに含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
有機化合物がコハク酸であり、二次有機産物が、コハク酸エステル又はそのポリマー、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ブタンジオール（BDO）、γ-ブチロラクトン（GBL）及びピロリドンからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
有機化合物の発酵生産のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の改変微生物の使用。
【請求項１８】
有機化合物がコハク酸である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変微生物、有機化合物を生産するための方法及び改変微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
6以下の炭素を有する小さなジカルボン酸等の有機化合物は、多くの用途を有する商業的に重要な化学物質である。例えば、小さな2価酸として、1,4-2価酸、例えばコハク酸、リンゴ酸及び酒石酸、及び5炭素分子イタコン酸が挙げられる。他の2価酸として、2炭素シュウ酸、3炭素マロン酸、5炭素グルタル酸及び6炭素アジピン酸が挙げられ、かかる2価酸の多くの誘導体も同様に存在する。
【０００３】
群として、小さな2価酸は、幾つかの化学的類似性を有し、ポリマー生産におけるその使用は、樹脂に特殊化された特徴を提供し得る。かかる多用途性は、それらが下流の化学インフラ市場に容易に適合することを可能とする。例えば、1,4-2価酸分子は、様々な産業用の化学物質（テトラヒドロフラン、ブチロラクトン、1,4-ブタンジオール、2-ピロリドン）及びスクシネート誘導体であるスクシンジアミド、スクシノニトリル、ジアミノブタン及びスクシネートのエステルに変換されるという点で、大規模な化学無水マレイン酸の使用の多くを満たす。酒石酸は、食品、革、金属及び印刷産業において多くの用途を有する。イタコン酸は、3-メチルピロリドン、メチル-BDO、メチル-THF等の生産の出発材料を形成する。
【０００４】
特に、コハク酸又はスクシネート−これらの用語は、本明細書では交換可能に用いられる−は、食品、化学及び医薬産業において多くの産業的に重要な化学物質の前駆物質として用いられてきたため、かなりの関心を集めてきた。実際、アメリカ合衆国エネルギー省の報告は、コハク酸は、バイオマスから製造される12の上位の化学的ビルディングブロック（building block）の一つであると報告している。したがって、細菌において2価酸を作製する能力は、重要な商業的意義を有する。
【０００５】
WO-A-2009/024294は、元々ルーメンから単離され、グリセロールを炭素源として利用する能力を有するパスツレラ科（Pasteurellaceae）の科のメンバーであるコハク酸生産細菌株、及び前記能力を維持するそれに由来する変異株、特にDSM 18541（ID 06-614）の寄託番号を有し、DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig、ドイツ）に寄託され、DD1と名付けられた、コハク酸を生産する能力を有する細菌株を開示している。DD1株は、バスフィア・スクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）種、及びKuhnert et al., 2010によって分類されたパスツレラ科（Pasteurellaceae）の科に属する。ldhA遺伝子及び／又はpflD若しくはpflA遺伝子が破壊されたこれらの株の変異がWO-A-2010/092155に開示されており、これらの変異株は、WO-A-2009/024294に開示されたDD1野生型に比べて、嫌気条件下での、グリセロール又はグリセロールとマルトース等の炭水化物の混合物等の炭素源からのコハク酸の顕著に増加した生産によって特徴づけられる。
【０００６】
しかしながら、WO-A-2009/024294又はWO-A-2010/092155に開示されたもの等の細菌株を、コハク酸等の有機化合物の生産に使用する場合には、炭素源を所望の有機化合物に変換する選択性、及びまた所望の有機化合物の収率もまた、依然として改良可能である。
【０００７】
さらに、先行技術の細菌株を使用する場合は、時として発酵プロセスの最後に発酵ブロスからバイオマスを分離することが難しいことが観察されていた。通常、コハク酸等の有機化合物の発酵生産は、微生物が所望の機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で適切な培養条件で微生物を培養し、続いて発酵ブロスから有機化合物を回収するステップを含み、ここで回収プロセスの第一ステップにおいて、微生物（すなわちバイオマス）は、通常、例えば沈降又は遠心分離によって培養培地から分離される。先行技術の微生物を使用する場合、（発酵ブロスの一部がどういうわけかバイオマスに捕捉されるため）バイオマスは発酵ブロスから容易に分離することができず、これにより、時として発酵ブロスのいくらかの量の損失が（したがって、所望の有機化合物のいくらかの量の損失も）もたらされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2009/024294号
【特許文献２】国際公開第2010/092155号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、先行技術の不都合を解消することであった。
【００１０】
特に、本発明の目的は、コハク酸等の有機化合物の発酵生産に用いられ得、グリセロール、グルコース、ショ糖、キシロース、ラクトース、フルクトース又はマルトース等の多量の同化可能な炭素源から、好ましくは少量だけの副産物と共に、コハク酸等の所望の有機産物を生産するだけでなく、後の有機化合物の回収プロセスにおいて、少量だけの発酵ブロスがバイオマスに捕捉され、容易に分離され得る微生物を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記目的を達成するための貢献は、野生型に比べて、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性を有する改変微生物によって提供される。上記目的を達成するための貢献は、特に、wcaJ遺伝子又はその一部が欠失した、又はwcaJ遺伝子の調節エレメント又はその一部が欠失した、又はwcaJ遺伝子へ少なくとも一つの変異が導入された改変微生物によって提供される。
【００１２】
驚くべきことに、例えばwcaJ遺伝子又はその一部の欠失による、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素（この酵素はおそらくグルコーストランスフェラーゼである）の活性の低減によって、適切な培養培地におけるコハク酸等の有機化合物の発酵生産後に、この酵素の活性が低下していない対応微生物と比較して、培養培地からバイオマスとしてより容易に分離され得る微生物がもたらされることが見出された。本発明に従う改変微生物を用いる場合、精製プロセスにおいて分離されるバイオマスに、より少ない発酵ブロスが捕捉され、これは発酵プロセスにおいて用いた、有機化合物が単離されるバイオマスのグラムあたり、より高量の発酵ブロス（及びしたがって、より高量のコハク酸等の所望の有機化合物）が得られ得ることを意味する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1は、plasmid pSacB（配列番号5）の模式的なマップを示す。
【図２】図2は、plasmid pSacBΔldhA（配列番号6）の模式的なマップを示す。
【図３】図3は、plasmid pSacBΔpflA（配列番号7）の模式的なマップを示す。
【図４】図4は、plasmid pSacBΔwcaJ（配列番号8）の模式的なマップを示す。
【図５】図5は、plasmid pSacBΔpflD（配列番号9）の模式的なマップを示す。
【図６】図6は、異なる培養培地の沈降によって得られる細胞のペレットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
「（その）野生型に比べて、X遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性を有する改変微生物」という表現の文脈において、（ここで、x遺伝子はfruA遺伝子及び任意に、以下で記載する通り、ldhA遺伝子、pflA遺伝子及び／又はpflD遺伝子である）用語「野生型」は、x遺伝子によってコードされる酵素の活性が低下していない微生物、すなわち、そのゲノムがx遺伝子の遺伝的改変の導入前と同じ状態で存在する微生物を指す。好ましくは、表現「野生型」は、そのゲノム、特にそのx遺伝子が、進化の結果として自然に生じた状態で存在する微生物（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞等）を指す。本用語は、微生物全体及び個々の遺伝子の両方について用いられる。結果として、用語「野生型」は、好ましくは、特にその遺伝子配列がヒトによって組換え法によって少なくとも部分的に改変された微生物、又は遺伝子を包含しない。したがって、用語「改変微生物」は、それが由来する天然の野生型微生物と比べて、変更された、改変された又は異なる遺伝子型及び／又は表現型を示すように（例えば、遺伝的改変が微生物のコード核酸配列に影響する場合）、遺伝的に変更された、改変された又は操作された（例えば遺伝的に操作された）微生物を含む。本発明に従う改変微生物の特定の好ましい実施形態に従えば、改変微生物は組換え微生物であり、これは微生物が組換えDNAを用いて得られたことを意味する。本明細書で使用される表現「組換えDNA」は、複数の供給源から遺伝材料を集め、そうでなければ生物に見出されないであろう配列を作製する、実験室的方法（分子クローニング）の使用によって生じるDNA配列を指す。かかる組換えDNAの例は、異種DNA配列が挿入されたプラスミドである。
【００１５】
本発明に従う微生物が由来する野生型は、酵母、真菌又は細菌に由来し得る。好適な細菌、酵母又は真菌は、特に、細菌、酵母又は真菌株としてDeutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH（DSMZ）（Brunswick、ドイツ）に寄託された細菌、酵母又は真菌である。本明細書で使用される表現「野生型に由来する改変微生物」は、制御された遺伝的改変（例えば遺伝的操作）によって、制御されない（ランダムな）遺伝的改変（例えば、変異誘発化学剤、X線、UV光等による処理）によって、又はこれらの方法の組み合わせによって得られた微生物を指す。本発明に従う改変微生物調製のさらなる詳細は、以下に示される。
【００１６】
本発明に従う好適な細菌は、http://www.dsmz.de/species/bacteria.htmに詳しく記載された属に属し、本発明に従う好適な酵母は、http://www.dsmz.de/species/yeasts.htmに詳しく記載された属に属し、また本発明に従う好適な真菌は、http://www.dsmz.de/species/fungi.htmに詳しく記載された属に属する。
【００１７】
好ましくは、本発明に従う改変微生物が由来する野生型は、細菌細胞である。本明細書で使用される用語「細菌細胞」は、原核生物、すなわち細菌を意味する。細菌は、その生化学的性質及び微生物学的性質、並びにその形態に基づいて分類することができる。これらの分類基準は当技術分野で周知である。
【００１８】
本発明に従う改変微生物の好ましい実施形態に従えば、改変微生物が由来する野生型は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、パスツレラ科（Pasteurellaceae）、バチルス科（Bacillaceae）又はコリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）の科に属する。
【００１９】
「腸内細菌科」は、サルモネラ菌及び大腸菌等の、多くのよりなじみのある細菌を含む、細菌の大きな科を表す。それらはプロテオバクテリア門（Proteobacteria）に属し、独自の目（腸内細菌目(Enterobacteriales)）が与えられている。腸内細菌科のメンバーは棒状である。他のプロテオバクテリアの様に、それらはグラム陰性株を有し、かつ通性嫌気性菌であり、糖を発酵して乳酸及び様々な他の最終産物、例えばコハク酸を生産する。大部分はまた、硝酸塩を亜硝酸塩に還元する。大部分の似た細菌とは異なり、腸内細菌科は一般にシトクロームC酸化酵素を欠く。大部分は、動き回る（move about）ために使用する多くの鞭毛を有するが、少数の属は非運動性である。それらは、非胞子形成性であり、かつ大抵、カタラーゼ陽性である。この科の多くのメンバーは、ヒト及び他の動物の腸に見られる腸管内菌叢の正常な一部であり、一方で、水又は土の中に見られるもの、あるいは様々な動物及び植物に寄生するものもある。エシェリキア・コリ（Escherichia coli）(大腸菌(E. coli)としてよりよく知られている）は、最も重要なモデル生物の1つであり、その遺伝学及び生化学が詳細に研究されている。腸内細菌科の大部分のメンバーは、細菌細胞の宿主への接着に関与する周毛性のI型線毛を有する。腸内細菌科の例としては、大腸菌、プロテウス菌、サルモネラ菌、及びクレブシエラ菌がある。
【００２０】
「パスツレラ科（Pasteurellaceae）」は、ヘモフィルス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）等の細菌から動物及びヒトの粘膜の共生生物までにわたるメンバーを有するグラム陰性プロテオバクテリアの大きな科を含む。大部分のメンバーは、鳥類及び哺乳動物の粘膜表面上、特に上気道中に共生生物として生息する。パスツレラ科は、典型的には、棒状であり、通性嫌気性菌の有名な群である。それらは、オキシダーゼの存在によって関連する腸内細菌科から区別することができ、鞭毛の非存在によって大部分の他の似た細菌から区別することができる。パスツレラ科の細菌は、代謝特性並びに16S及び23SRNAの配列に基づいて多くの属に分類されている。パスツレラ科の多くは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子を含み、炭素源を有機酸に嫌気的に発酵する能力を有する。
【００２１】
「バチルス科（Bacillaceae）」は内生胞子を生産し得るグラム陽性、従属栄養性、棒状の細菌の科である。この科の運動性のメンバーは、周毛性の繊毛によって特徴づけられる。バチルス科の幾つかは好気性であるが、他のものは通性嫌気性又は偏性嫌気性細菌である。大部分は非病原性であるが、バチルス（Bacillus）種は、ヒトにおいて疾患を生じさせることが知られている。この科は、2つの目、バチルス目（Bacillales）及びラクトバチルス目（Lactobacillales）を含むバチルス（Bacilli）属を含む。バチルス種は、37℃で好気的条件下で増殖することができる、大きな円筒状の細菌を表す。それらは典型的には非病原性である。バチルス属には、アリシクロバチルス科（Alicyclobacillaceae）、バチルス科（Bacillaceae）、カリオファノン科（Caryophanaceae）、リステリア科（Listeriaceae）、パニバチルス科（Paenibacillaceae）、プラノコッカス科（Planococcaceae）、スポロラクトバチルス科（Sporolactobacillaceae）、スタフィロコッカス科（Staphylococcaceae）、サーモアクチノミセス科（Thermoactinomycetaceae）、ツリシバクター科（Turicibacteraceae）が含まれる。バチルスの多くは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子を含み、炭素源を有機酸に嫌気的に発酵する能力を有する。
【００２２】
「コリネバクテリア科（Corynebacteriaceae）」は、真正細菌（Eubacteriales）目の大部分のグラム陽性及び好気性及び非運動性の棒状菌の大きな科である。この科はまた、グラム陽性、棒状細菌の属である、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属も含む。コリネバクテリアは、自然界に広く分布しており、ほとんど無害である。C.グルタミカム（C. glutamicum）等、幾つかは産業状況において有用である。
【００２３】
本発明に従う改変微生物の好ましい特定の実施形態に従えば、改変微生物が由来する野生型は、パスツレラ科の科に属する。この文脈において、本発明に従う改変微生物が由来する野生型が、バスフィア（Basfia）属に属することがさらに好ましく、改変微生物が由来する野生型が、バスフィア・スクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）種に属することが特に好ましい。
【００２４】
最も好ましくは、本発明に従う改変微生物が由来する野生型は、ブダペスト条約下でDSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, GmbH）（ドイツ）に寄託された、寄託番号DSM 18541を有するバスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1株である。この株は、元々ドイツ起源のウシのルーメンから単離された。パスツレラ科細菌は、動物及び好ましくは哺乳動物の胃腸管から単離され得る。細菌株DD1は、特に、ウシルーメンから単離され得、炭素源として（未精製のグリセロールを含む）グリセロールを利用することができる。本発明に従う改変微生物を調製するために用いられ得るバスフィア属のさらなる株は、寄託番号DSM 22022として寄託されたバスフィア株、又はヨーテボリ大学のカルチャーコレクション（Culture Collection of the University of Goteborg（CCUG））（スウェーデン）に寄託され、寄託番号CCUG 57335、CCUG 57762、CCUG 57763、CCUG 57764、CCUG 57765又はCCUG 57766を有するバスフィア株である。前記株は、ドイツ又はスウェーデン起源のウシのルーメンから元々単離された。
【００２５】
この文脈において、本発明に従う改変微生物が由来する野生型が、配列番号1又は配列番号1と少なくとも96%、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％若しくは少なくとも99.9％の配列相同性を示す配列の16S rDNAを有することが特に好ましい。本発明に従う改変微生物が由来する野生型が、配列番号2の又は配列番号2と少なくとも96%、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％若しくは少なくとも99.9％の配列相同性を示す配列の23S rDNAを有することも好ましい。
【００２６】
本発明に従う改変微生物について用いられる様々なポリペプチド又はポリヌクレオチドに関して言及されるパーセント値における同一性は、好ましくは、アライメントされた配列の全長にわたる残基の同一性として計算され、例えば、デフォルトパラメータ、すなわちギャップオープン（ギャップを空けるペナルティー）：10.0、−ギャップエクステンド（ギャップを伸張させるペナルティー）：0.5、データファイル（パッケージに含まれるマトリックスファイルを採点する）：EDNAFULを用いるバイオインフォマティクスソフトウェアパッケージEMBOSS（バージョン5.0.0, http://emboss.sourceforgenet/what/）からのプログラムニードル（needle）を用いて、（かなり類似した配列について）計算される同一性である。
【００２７】
本発明に従う組換え微生物は、上記野生型微生物、特にバスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1株だけでなく、これらの株の変異株にも由来し得ることに留意されたい。この文脈において、表現「変異株」は、野生型株と同じ又は本質的に同じ特徴を有する全ての株を含む。この文脈において、変異株の16S rDNAが、変異株が由来する野生型と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、より好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%及び最も好ましくは少なくとも99.9%の同一性を有することが特に好ましい。変異株の23S rDNAが、変異株が由来する野生型と、少なくとも90%、好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも99%、より好ましくは少なくとも99.5%、より好ましくは少なくとも99.6%、より好ましくは少なくとも99.7%、より好ましくは少なくとも99.8%及び最も好ましくは少なくとも99.9%の同一性を有することも特に好ましい。この定義の意味における変異株は、例えば野生型株を変異誘発化学剤、X線又はUV光で処理することによって得られ得る。
【００２８】
本発明に従う改変微生物は、野生型に比べて、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の活性が低減されていることを特徴とする。
【００２９】
酵素活性の低減（Δ活性）は、以下で定義される：
【数１】
0006608377.tif 000002
ここで、Δ活性を決定する際、野生型の活性及び改変微生物の活性は、正確に同じ条件で決定される。wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の活性の検出及び決定方法は、例えばNothaft et al. In vivo analysis of HPr reveals a fructose-specific phosphotransferase system that confers high-affinity uptake in Streptomyces coelicolor, Journal of bacteriology, Vol. 185 (3), pages 929-937に見出され得る。
【００３０】
本明細書で開示される酵素の低減された活性、特にwcaJ遺伝子によってコードされる酵素、乳酸デヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸ギ酸リアーゼの低減された活性は、微生物の野生型における前記酵素の活性に比べて少なくとも50%の酵素活性の低減、又は少なくとも90%の酵素活性の低減、又はより好ましくは少なくとも95%の酵素活性の低減、又はより好ましくは少なくとも98%の酵素活性の低減、又はさらにより好ましくは少なくとも99%の酵素活性の低減、又はさらにより好ましくは少なくとも99.9%の酵素活性の低減であり得る。用語「wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性」、又は以下で記載される「低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性」又は「低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性」は、これらの酵素の検出可能な活性を有さない改変微生物もまた包含する。
【００３１】
用語「酵素の低減された活性」は、例えば、前記遺伝的に処置された（manipulated）（例えば、遺伝的に操作された）微生物による、前記微生物の野生型によって発現されるより低いレベルの発現を含む。酵素の発現を低減するための遺伝的処置は、限定されるものではないが、酵素をコードする遺伝子又はその一部の欠失、（例えば、強力なプロモーター又は抑圧プロモーターの除去による）酵素をコードする遺伝子の発現に関わる調節配列又は部位の変更または改変、酵素をコードする遺伝子の転写及び／又は遺伝子産物の翻訳に関わるタンパク質（例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー及び転写アクチベーター等）の改変、又は本分野におけるルーチンである特定の遺伝子の発現を低下させる従来の任意の他の手段（限定されるものではないが、例えばアンチセンス核酸分子又はiRNAの使用又は標的タンパク質の発現をノックアウト又はブロックする他の手段）を含み得る。さらに、mRNAに不安定化エレメントを導入し、又はRNAのリボソーム結合部位（RBS）の悪化をもたらす遺伝的改変を導入し得る。翻訳効率及び速度が低減される様に、遺伝子のコドン使用頻度を変更することも可能である。
【００３２】
酵素の低減された活性は、酵素の低減された活性をもたらす一以上の遺伝子変異を導入することによっても達成され得る。さらに、酵素の活性の低減は、活性が低減される酵素を活性化するために不可欠な活性化酵素の不活性化（又は低減された発現）もまた含み得る。後者のアプローチによって、活性が低減される酵素は、好ましくは不活性化状態に維持される。
【００３３】
wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性を有する微生物は、天然に、すなわち自発的な変異によって生じ得る。微生物は、様々な技術、例えば化学的処理又は放射線によって、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素を欠く、又は該酵素の有意に低減された活性を有するように改変され得る。この目的のために、微生物は、例えば変異誘発化学剤、X線、又はUV光によって処理されるだろう。後のステップにおいて、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性を有する微生物が選択されるだろう。改変微生物は、微生物のゲノムにおけるwcaJ遺伝子を変異させ、破壊し、又は切除すること、又は遺伝子を、野生型遺伝子によってコードされる酵素と比べて低減された活性を有する酵素をコードする対応遺伝子と置換することを目的とする相同組換え技術によっても得られ得る。
【００３４】
本発明に従う改変微生物の好ましい実施形態に従えば、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の活性の低減は、wcaJ遺伝子の改変によって達成され、ここでこの遺伝子改変は、好ましくはwcaJ遺伝子又は少なくともその一部の欠失、プロモーター配列等のwcaJ遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はwcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入によって実現される。wcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入の文脈において、該少なくとも一つの変異の導入が、wcaJ遺伝子によってコードされるトランケートされた酵素の発現をもたらすことが特に好ましい。トランケートされた酵素において、wcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、最も好ましくは少なくとも160アミノ酸がC末端から欠失していることがさらに好ましい。wcaJ遺伝子にコードされるかかるトランケートされた酵素は、例えば、フレームシフト変異をもたらすwcaJ遺伝子中の適切な位置でのヌクレオチド挿入又は欠失によって得られ得、ここでフレームシフト変異によって停止コドンが導入される。例えば、リシンをコードするコドンへの、81位のチミンと82位のアデニンの間へのヌクレオチドの挿入は、フレームシフト変異をもたらし、それによって配列番号16に示される様に停止コドンが導入される。かかるwcaJ遺伝子の変異は、例えば部位特異的変異誘発又はランダム変異誘発、及びそれに続く組換えによる微生物のゲノムへの改変遺伝子の導入によって導入され得る。wcaJ遺伝子の変異体は、PCRによってwcaJ遺伝子配列 配列番号3を変異させることによって作製され得る。「Quickchange Site-directed Mutagenesis Kit」（Stratagene）が、特異的変異誘発を実施するために用いられ得る。配列番号3のコード配列全体、又はその一部のみに対するランダム変異誘発は、「GeneMorph II Random Mutagenesis Kit」（Stratagene）を用いて行われ得る。
【００３５】
以下、特に変異を導入するための、又は配列を欠失させるための、組換えの好適な技術を記載する。
【００３６】
この技術は、本明細書で時として「キャンベル組換え（Campbell recombination）」とも称される（Leenhouts et al., 1989, Appl Env Microbiol 55, 394-400）。本明細書で用いる「キャンベルイン（Campbell in）」とは、環状二本鎖DNA分子（例えばプラスミド）の全体が、単一の相同組換え事象（クロスイン事象）によって染色体に組み込まれ、それにより、該環状DNA分子の線状型が、該環状DNA分子の第一DNA配列に相同な染色体の第一DNA配列に効率的に挿入される、元の宿主細胞の形質転換体を指す。「キャンベルドイン（Campbelled in）」とは、「キャンベルイン」形質転換体の染色体に組み込まれている線状化DNA配列を指す。「キャンベルイン」は、第一相同DNA配列の重複を含有し、その各コピーは、相同組換えクロスオーバーポイントのコピーを含み、それを取り囲む。
【００３７】
本明細書で用いる「キャンベルアウト（Campbell out）」とは、第二相同組換え事象（クロスアウト事象）が、「キャンベルドイン」DNAの線状化挿入DNA上に含まれる第二DNA配列と、該線状化挿入の第二DNA配列に相同な染色体由来の第二DNA配列との間で起きている、「キャンベルイン」形質転換体の子孫である細胞を指す。第二組換え事象は、組み込まれたDNA配列の一部の欠失（放出）をもたらすが、重要なことに、組み込まれた「キャンベルドイン」DNAの一部（これはわずか単一塩基であり得る）の染色体中への残存ももたらし、元の宿主細胞と比べて「キャンベルアウト」細胞は、染色体における1つ以上の意図的な変化を含む（例えば、単一塩基置換、複数塩基置換、異種遺伝子若しくはDNA配列の挿入、相同遺伝子若しくは改変相同遺伝子のさらなるコピーの挿入、あるいは上に挙げたこれらの例の2つ以上を含むDNA配列の挿入）。「キャンベルアウト」細胞は、好ましくは、「キャンベルドイン」DNA配列の一部（放出されることが望ましい一部）に含まれる遺伝子、例えば、約5％〜10％ショ糖の存在下で増殖する細胞中で発現されると致死である、枯草菌（Bacillus subtilis）sacB遺伝子に対する対抗選択によって得られる。対抗選択を行っても、又は行わなくても、所望の「キャンベルアウト」細胞は、任意のスクリーニング可能な表現型、例えば限定されるものではないが、コロニーの形態、コロニーの色、抗生物質耐性の存在又は不在、ポリメラーゼ連鎖反応によるあるDNA配列の存在又は不在、栄養要求性の存在又は不在、酵素の存在又は不在、コロニー核酸ハイブリダイゼーション、抗体スクリーニング等を用いて、所望の細胞をスクリーニングすることによって得るか又は同定し得る。「キャンベルイン」及び「キャンベルアウト」という用語はまた、上記方法又はプロセスを参照するために、様々な時制の動詞として使用され得る。
【００３８】
「キャンベルイン」又は「キャンベルアウト」をもたらす相同組換え事象が、相同なDNA配列内のDNA塩基の範囲にわたって起こり得ることは理解され、相同な配列は少なくともこの範囲の一部では互いに同一であるため、クロスオーバー事象が起きた正確な場所を特定することは通常可能ではない。すなわち、どの配列が挿入されたDNAに由来するか、そしてどの配列が染色体DNAに由来するかを正確に特定することはできない。さらに、第一相同DNA配列及び第二相同DNA配列は、通常、部分的に非相同な領域によって分離され、「キャンベルアウト」細胞の染色体に残ったままであるのはこの非相同領域である。
【００３９】
好ましくは、第一及び第二相同DNA配列は、少なくとも約200塩基対長であり、最大数千塩基対長であり得る。しかしながら、本手順は、より短い又はより長い配列で機能するようにすることができる。例えば、第一及び第二相同配列の長さは約500〜2000塩基であることができ、「キャンベルイン」から「キャンベルアウト」を得ることは、第一及び第二相同配列をほぼ同じ長さにすることによって、好ましくは200塩基対未満異なる、最も好ましくは2つのうち短い方を塩基対が長い方の長さの少なくとも70％であるようにすることによって、促進される。
【００４０】
本発明に従う改変微生物において活性が低減されるwcaJ遺伝子は、好ましくは、以下：
a）配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸；
b）配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸；
c）a）又はb）の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がa）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である核酸；
d）a）又はb）の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa）又はb）の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸；
e）a）又はb）に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸；及び
f）a）又はb）のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a）又はb）の核酸とは異なる核酸；
からなる群より選択される核酸を含む。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ハイブリダイゼーション」は、「核酸分子の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するあらゆるプロセス」を含む（J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York）。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸分子間の対合の強度）は、核酸分子間の相補性の程度、関係するストリンジェンシーの条件、形成されるハイブリッドのTm、及び核酸分子中のG:C比等の要素に影響される。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「Tm」は、「融解温度」を参照するために用いられる。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が、一本鎖へと半分解離する温度である。核酸分子のTmを計算するための式は、本分野で周知である。標準的な参考文献に示される様に、Tm値の簡単な推定は、核酸分子が1 M NaClの水溶液中にある場合、式：Tm＝81.5 + 0.41(% G+C)によって計算され得る（例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照されたい）。他の参考文献は、Tmの計算に構造並びに配列特徴を考慮する、より洗練された計算を含む。ストリンジェントな条件は当業者には知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出され得る。
【００４３】
特に、用語「ストリンジェンシー条件」は、相補鎖核酸分子（DNA、RNA、ssDNA又はssRNA）の断片又はこれと同一である100連続ヌクレオチド以上、150連続ヌクレオチド以上、200連続ヌクレオチド以上又は250連続ヌクレオチド以上が、50℃での7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5 M NaPO4、1 mM EDTAでのハイブリダイゼーション、かつ50℃又は65℃、好ましくは65℃での2×SSC、0.1% SDSでの洗浄と同等の条件で特定の核酸分子（DNA、RNA、ssDNA又はssRNA）とハイブリダイズする条件を指す。好ましくは、ハイブリダイズ条件は、50℃での7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTAでのハイブリダイゼーション、かつ50℃又は65℃、好ましくは65℃での1×SSC、0.1% SDSでの洗浄と同等であり、より好ましくは、ハイブリダイズ条件は、50℃での7%ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、0.5M NaPO4、1mM EDTAでのハイブリダイゼーション、かつ50℃又は65℃、好ましくは65℃での0.1×SSC、0.1% SDSでの洗浄と同等である。好ましくは、相補ヌクレオチドは、wcaJ核酸の断片又は全体とハイブリダイズする。あるいは、好ましいハイブリダイゼーション条件は、65℃での1×SSCにおける又は42℃での1×SSC及び50%ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション、それに続く65℃での0.3×SSCにおける洗浄、又は50℃での4×SSC又は40℃での6×SSC及び50%ホルムアミドにおけるハイブリダイゼーション、それに続く50℃での2×SSCでの洗浄を包含する。さらに好ましいハイブリダイゼーション条件は、0.1% SDS、0.1 SSD及び65℃である。
【００４４】
上記「キャンベル組換え」によって欠失され得る、又は少なくとも一つの変異が上記「キャンベル組換え」によって導入されるwcaJ遺伝子又はその一部は、好ましくは上記核酸を含む。
【００４５】
配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸は、バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1株のwcaJ遺伝子に対応する。
【００４６】
本発明に従う改変微生物の好ましい実施形態に従って、この微生物は、野生型に比べて、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性によってだけでなく、
i）低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性、
ii）低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性、又は
iii）低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性及び低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性
によっても特徴づけられる。
【００４７】
乳酸デヒドロゲナーゼ欠損及び／又はピルビン酸ギ酸リアーゼ活性欠損の改変微生物はWO-A-2010/092155、US2010/0159543及びWO-A-2005/052135に開示されており、微生物、好ましくはパスツレラ属の細菌細胞、特に好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1株において乳酸デヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸ギ酸リアーゼの活性を低減する異なるアプローチに関する開示を、参照により本明細書に組込む。ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性を決定するための方法は、例えば"Effects of pH and Energy Supply on Activity and Amount of Pyruvate-Formate-Lyase in Streptococcus bovis", Appl. Environ. Microbiol. (2000), Vol. 66, pages 3773-3777においてAsanuma N. and Hino T.に開示されており、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を決定するための方法は、例えば、"Methods of Enzymatic Analysis", 3rd Edition, Volume III, pages 126-133, Verlag Chemie, WeinheimにおいてBergmeyer, H.U., Bergmeyer J. and Grassl, M.に開示されている。
【００４８】
この文脈において、乳酸デヒドロゲナーゼの活性の低減は、（乳酸デヒドロゲナーゼ；LdhA；EC1.1.1.27又はEC1.1.1.28をコードする）ldhA遺伝子の不活性化によって達成され、ピルビン酸ギ酸リアーゼの低減は、（ピルビン酸ギ酸リアーゼのアクチベーター；PflA；EC1.97.1.4をコードする）pflA遺伝子又は（ピルビン酸ギ酸リアーゼ；PflD；EC2.3.1.54をコードする）pflD遺伝子の不活性化によって達成されることが好ましく、ここでこれらの遺伝子（すなわち、ldhA、pflA及びpflD）の不活性化は、好ましくは、これらの遺伝子又はその一部の欠失、これらの遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はこれらの遺伝子への少なくとも一つの変異の導入によって、特に好ましくは上記「キャンベル組換え」によって達成される。
【００４９】
本発明に従う改変微生物において活性が低減されるldhA遺伝子は、好ましくは以下：
α1）配列番号10のヌクレオチド配列を有する核酸；
α2）配列番号11のアミノ酸配列をコードする核酸；
α3）α1）又はα2）の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がα1）又はα2）の核酸の全長にわたる同一性である核酸；
α4）α1）又はα2）の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がα1）又はα2）の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸；
α5）α1）又はα2）に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸；及び
α6）α1）又はα2）のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記α1）又はα2）の核酸とは異なる核酸；
からなる群より選択される核酸を含む。
【００５０】
本発明に従う改変微生物において活性が低減されるpflA遺伝子は、好ましくは以下：
β1）配列番号12のヌクレオチド配列を有する核酸；
β2）配列番号13のアミノ酸配列をコードする核酸；
β3）β1）又はβ2）の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がβ1）又はβ2）の核酸の全長にわたる同一性である核酸；
β4）β1）又はβ2）の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がβ1）又はβ2）の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸；
β5）β1）又はβ2）に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸；及び
β6）β1）又はβ2）のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記β1）又はβ2）の核酸とは異なる核酸；
からなる群より選択される核酸を含む。
【００５１】
本発明に従う改変微生物において活性が低減されるpflD遺伝子は、好ましくは以下：
γ1）配列番号14のヌクレオチド配列を有する核酸；
γ2）配列番号15のアミノ酸配列をコードする核酸；
γ3）γ1）又はγ2）の核酸と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一である核酸であって、同一性がγ1）又はγ2）の核酸の全長にわたる同一性である核酸；
γ4）γ1）又はγ2）の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、少なくとも99.5%、少なくとも99.6%、少なくとも99.7%、少なくとも99.8%又は少なくとも99.9%、最も好ましくは100%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がγ1）又はγ2）の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸；
γ5）γ1）又はγ2）に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸；及び
γ6）γ1）又はγ2）のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記γ1）又はγ2）の核酸とは異なる核酸；
からなる群より選択される核酸を含む。
【００５２】
この文脈において、本発明に従う改変微生物は、さらに：
A）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
B）pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
C）pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
D）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び
pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；又は
E）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び
pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
を含むことが好ましい。
【００５３】
本発明に従う改変微生物の特に好ましい実施形態は：
−wcaJ遺伝子又は少なくともその一部が欠失した、又は少なくとも一つの変異がwcaJ遺伝子に導入されたパスツレラ科、特に好ましくはバスフィア属、及びさらにより好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンス種の改変細菌細胞であって、ここで少なくとも一つの変異の導入が、好ましくはwcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、最も好ましくは少なくとも160アミノ酸がC末端から欠失している酵素の発現をもたらす、改変細菌細胞；
−wcaJ遺伝子又は少なくともその一部が欠失した、又は少なくとも一つの変異がwcaJ遺伝子に導入されたパスツレラ科、特に好ましくはバスフィア属、及びさらにより好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンス種の改変細菌細胞であって、ここで少なくとも一つの変異の導入が、好ましくはwcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、最も好ましくは少なくとも160アミノ酸がC末端から欠失している酵素の発現をもたらし、かつ野生型に比べて、好ましくはldhA遺伝子の改変によって、特に配列番号10に記載の核酸配列を有し、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって、乳酸デヒドロゲナーゼの活性が低減されている、改変細菌細胞；
−wcaJ遺伝子又は少なくともその一部が欠失した、又は少なくとも一つの変異がwcaJ遺伝子に導入されたパスツレラ科、特に好ましくはバスフィア属、及びさらにより好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンス種の改変細菌細胞であって、ここで少なくとも一つの変異の導入が、好ましくはwcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、最も好ましくは少なくとも160アミノ酸がC末端から欠失している酵素の発現をもたらし、かつ野生型に比べて、好ましくはpflA遺伝子又はpflD遺伝子の改変によって、特に配列番号12に記載の核酸配列を有し、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有するPflAをコードするpflA遺伝子の改変によって、又は配列番号14に記載の核酸配列を有し、配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するPflDをコードするpflD遺伝子の改変によって、ピルビン酸ギ酸リアーゼの活性が低減されている、改変細菌細胞；
−wcaJ遺伝子又は少なくともその一部が欠失した、又は少なくとも一つの変異がwcaJ遺伝子に導入されたパスツレラ科、特に好ましくはバスフィア属、及びさらにより好ましくはバスフィア・スクシニシプロデュセンス種の改変細菌細胞であって、ここで少なくとも一つの変異の導入が、好ましくはwcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸、好ましくは少なくとも125アミノ酸、より好ましくは少なくとも150アミノ酸、最も好ましくは少なくとも160アミノ酸がC末端から欠失している酵素の発現をもたらし、かつ野生型に比べて、好ましくはldhA遺伝子及びpflA遺伝子の改変によって、好ましくはldhA遺伝子及びpflA遺伝子の改変によって、特に配列番号10の核酸配列を有し、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって又は配列番号12に記載の核酸配列を有し、配列番号13に記載のアミノ酸配列を有するPflAをコードするpflA遺伝子の改変によって、又はldhA遺伝子及びpflD遺伝子の改変によって、特に配列番号10の核酸配列を有し、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有するLdhAをコードするldhA遺伝子の改変によって又は配列番号14に記載の核酸配列を有し、配列番号15に記載のアミノ酸配列を有するPflDをコードするpflD遺伝子の改変によって、乳酸デヒドロゲナーゼ及びピルビン酸ギ酸リアーゼの活性が低減されている、改変細菌細胞；
である。
【００５４】
最初に記載した課題を解決するための貢献は、さらに：
I）本発明に従う改変微生物を、改変微生物が有機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で培養し、それによって有機化合物を含む発酵ブロスを得るステップ；
II）プロセスステップI）で得られる発酵ブロスから有機化合物を回収するステップ
を含む、有機化合物の生産方法によって提供される。
【００５５】
プロセスステップI）において、本発明に従う改変微生物は、改変微生物が有機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で培養され、それによって有機化合物を含む発酵ブロスが得られる。本発明に従うプロセスによって生産され得る好ましい有機化合物は、カルボン酸、例えばギ酸、乳酸、プロピオン酸、2-ヒドロキシプロピオン酸、3-ヒドロキシプロピオン酸、3-ヒドロキシ酪酸、アクリル酸、ピルビン酸又はこれらのカルボン酸の塩、ジカルボン酸、例えばマロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、グルタル酸、イタコン酸、アジピン酸又はそれらの塩、トリカルボン酸、例えばクエン酸又はその塩、アルコール、例えばメタノール又はエタノール、アミノ酸、例えばL-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-アルギニン、L-イソロイシン、L-グリシン、L-グルタミン、L-グルタミン酸、L-システイン、L-セリン、L-チロシン、L-トリプトファン、L-トレオニン、L-バリン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-メチオニン、L-リシン、L-ロイシン等を含む。
【００５６】
本発明に従うプロセスの好ましい実施形態に従えば、有機化合物はコハク酸である。本発明の文脈において用いられる用語「コハク酸」は、最も広い意味において理解されるべきであり、その塩（すなわちスクシネート）、例えばコハク酸のNa+及びK+塩等のアルカリ金属塩又はMg2+及びCa2+塩等のアルカリ土類金属塩又はアンモニウム塩又は無水物も包含する。
【００５７】
本発明に従う改変微生物は、好ましくは約10〜60℃又は20〜50℃又は30〜45℃の範囲の温度で、5.0〜9.0又は5.5〜8.0又は6.0〜7.0のpHで培養培地でインキュベートされる。
【００５８】
好ましくは、有機化合物、特にコハク酸は、嫌気条件下で生産される。嫌気条件は、従来技術によって、例えば二酸化炭素又は窒素又はそれらの混合物及び任意に水素を、例えば0.1〜1又は0.2〜0.5 vvmの流速で導入することによって、反応培地の成分を脱気し、嫌気条件を維持することによって確立され得る。好気条件は、従来技術によって、例えば空気又は酸素を、例えば0.1〜1又は0.2〜0.5 vvmの流速で導入することによって確立され得る。適切な場合、0.1〜1.5 barのわずかに過剰な圧力が、本プロセスにおいて適用され得る。
【００５９】
同化可能な炭素源は、好ましくはショ糖、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、グリセロール及びそれらの混合物、又は前記化合物の少なくとも一つを含む組成物から選択されるか、デンプンの分解産物、セルロース、ヘミセルロース及び／又はリグノセルロースから選択される。好ましくは、同化可能な炭素源は、D-グルコース、マルトース、ショ糖、グリセロール又はこれらの化合物の少なくとも二つの混合物を含み、ここでグリセロールとD-グルコース、グリセロールとショ糖、グリセロールとD-キシロース、グリセロールとマルトース及びD-グルコースとフルクトースの混合物が特に好ましい。
【００６０】
同化可能な炭素源の初発濃度は、好ましくは5〜100g/l、好ましくは5〜75g/l及びより好ましくは5〜50g/lの範囲の値に調整され、培養の間、前記範囲で維持され得る。反応培地のpHは、好適な塩基、例えば気体アンモニア、NH4HCO3、(NH4)2CO3、NaOH、Na2CO3、NaHCO3、KOH、K2CO3、KHCO3、Mg(OH)2、MgCO3、Mg(HCO3)2、Ca(OH)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、CaO、CH6N2O2、C2H7N及び／又はそれらの混合物の添加によって制御され得る。これらのアルカリ中和剤は、発酵プロセスの経過において形成される有機化合物がカルボン酸又はジカルボン酸である場合に、特に必要とされる。有機化合物がコハク酸である場合には、Mg(OH)2及びMgCO3が特に好ましい塩基である。
【００６１】
本発明に従う発酵ステップI）は、例えば撹拌された発酵槽、気泡塔（bubble column）及びループリアクター（loop reactor）において実施され得る。撹拌タイプを含む可能な方法タイプ及び幾何学的デザインの包括的な概要は、Chmiel, Bioprozesstechnik: Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Volume 1に見出され得る。本発明に従うプロセスでは、利用可能な典型的な変形は、当業者に知られる又は説明される、例えばChmiel, Hammes and Bailey: Biochemical Engineeringの以下の変形、例えば、バイオマスのリサイクルを伴うか伴わない、バッチ、フェッドバッチ（fed-batch）、反復フェッドバッチ又は他の連続培養である。生産株に応じて、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素又は適切な気体混合物の注入が、良い収率（YP/S）を達成するために行われ得る。
【００６２】
プロセスステップI）において、有機酸、特にコハク酸を生産するために特に好ましい条件は：
同化可能な炭素源：グリセロール、ショ糖、D-グルコース、マルトース、グリセロール＋D-グルコース、グリセロール＋ショ糖、グリセロール＋マルトース、グリセロール＋D-キシロース、D-グルコース＋フルクトース
温度：30〜45℃
pH：5.5〜7.0
供給ガス：CO2
である。
【００６３】
プロセスステップI）において、同化可能な炭素源は有機化合物、好ましくはコハク酸に、少なくとも0.5g/g及び最大約1.28g/gの炭素収率YP/Sで；例えば少なくとも0,6g/g、少なくとも0.7g/g、少なくとも0.75g/g、少なくとも0.8g/g、少なくとも0.85g/g、少なくとも0.9g/g、少なくとも0.95g/g、少なくとも1.0g/g、少なくとも1.05g/g、少なくとも1.1g/g、少なくとも1.15g/g、少なくとも1.20g/g、少なくとも1.22g/g、又は少なくとも1.24g/g（有機化合物／炭素、好ましくはコハク酸／炭素）の炭素収率YP/Sで変換されることがさらに好ましい。
【００６４】
プロセスステップI）において、同化可能な炭素源は有機化合物、好ましくはコハク酸に、少なくとも0.6g g DCW-1h-1有機化合物、好ましくはコハク酸、又は少なくとも0.65g g DCW-1h-1、少なくとも0.7g g DCW-1h-1、少なくとも0.75g g DCW-1h-1又は少なくとも0.77 g g DCW-1h-1有機化合物、好ましくはコハク酸の比生産性収率で有機化合物、好ましくはコハク酸に変換されることがさらに好ましい。
【００６５】
プロセスステップI）において、同化可能な炭素源は、有機化合物、好ましくはコハク酸の少なくとも2.2g/(L×h)又は少なくとも2.5g/(L×h)、少なくとも2.75g/(L×h)、少なくとも3g/(L×h)、少なくとも3.25g/(L×h)、少なくとも3.5g/(L×h)、少なくとも3.7g/(L×h)、少なくとも4.0g/(L×h)、少なくとも4.5g/(L×h)又は少なくとも5.0g/(L×h)の有機化合物、好ましくはコハク酸空時収率で、有機化合物、好ましくはコハク酸に変換されることがさらに好ましい。本発明に従うプロセスの他の好ましい実施形態に従えば、プロセスステップI）では、改変微生物は、少なくとも20g/L、より好ましくは少なくとも25g/l及びさらにより好ましくは少なくとも30g/lの同化可能な炭素源、好ましくはショ糖、マルトース、D-フルクトース、D-グルコース、D-キシロース、L-アラビノース、D-ガラクトース、D-マンノース、及び／又はグリセロールから選択される同化可能な炭素源を、少なくとも20g/l、より好ましくは少なくとも25g/l及びさらにより好ましくは少なくとも30g/lの有機化合物、好ましくはコハク酸に変換する。
【００６６】
本明細書に記載の異なる収率パラメーター（「炭素収率」又は「YP/S」；「比生産性収率」；又は「空時収率（STY）」）は、本分野で周知であり、例えばSong and Lee, 2006によって記載される通りに決定される。「炭素収率」及び「YP/S」（それぞれ、生産される有機化合物の質量／消費される同化可能な炭素源の質量で表される）は、本明細書において同義語として用いられる。比生産性収率は、乾燥バイオマスのgあたりL発酵ブロス及びhあたり生産されるコハク酸の様な産物の量を記載する。「DCW」として記載される乾燥細胞重量は、生化学反応における生物学的に活性な微生物の量を記載する。本値は、hあたりgDCWあたりg産物（すなわち、ggDCW-1h-1）として示される。空時収率（STY）は、培養の全時間にわたる、培養の容積に対する、発酵プロセスにおいて形成される有機化合物の総量の比として定義される。空時収率は、「容積生産性（volumetric productivity）」としても知られる。
【００６７】
プロセスステップII）において、有機化合物、好ましくはコハク酸は、プロセスステップI）において得られる発酵ブロスから回収される。
【００６８】
通常、回収プロセスは、発酵ブロスからいわゆる「バイオマス」として組換え微生物を分離するステップを含む。バイオマスを除去するためのプロセスは当業者には知られており、濾過、沈降、浮揚又はそれらの組み合わせを含む。結果的に、バイオマスは、例えば遠心分離機、セパレーター、デカンター、フィルターを用いて又は浮揚装置において除去され得る。価値のある産物の最大の回収のために、例えば透析濾過の形態でのバイオマスの洗浄がしばしば望ましい。方法の選択は、発酵ブロスのバイオマス含量及びバイオマスの性質、及びバイオマスと有機化合物（すなわち、価値のある産物）との相互作用にも依存する。一実施形態では、発酵ブロスは滅菌（sterilize）又は殺菌（pasteurize）され得る。さらなる実施形態では、発酵ブロスは濃縮される。要求に応じて、この濃縮はバッチ式又は連続的に行われ得る。圧力及び温度範囲は、第一に産物の損傷が生じない様に、第二に最小限の装置及びエネルギーの使用が必要である様に選択されるべきである。特に多段階蒸発のための圧力及び温度レベルの熟練した選択が、エネルギーの保全を可能にする。
【００６９】
回収プロセスは、有機化合物、好ましくはコハク酸がさらに精製される追加の精製ステップをさらに含み得る。しかしながら、有機化合物が下記の通り化学反応によって二次有機産物に変換される場合、有機化合物のさらなる精製は、反応の種類及び反応条件によっては必ずしも必要でない。プロセスステップII）において得られる有機化合物の精製のため、好ましくはコハク酸の精製のために、当業者に知られる方法、例えば結晶化、濾過、電気透析法及びクロマトグラフィーが用いられ得る。有機化合物がコハク酸である場合には、例えば、コハク酸は、中和のために水酸化、酸化、炭酸カルシウム又は炭酸水素塩を用いることによってコハク酸をコハク酸カルシウム産物として沈殿させ、沈殿物を濾過することによって単離され得る。コハク酸は、沈殿したコハク酸カルシウム産物から、硫酸による酸性化、及びそれに続く沈殿する硫酸カルシウム（石こう）を除去するための濾過によって回収される。得られる溶液は、望ましくない残渣イオンを除去するために、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製され得る。あるいは、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム又はそれらの混合物が発酵ブロスを中和するために用いられた場合、プロセスステップI）で得られる発酵ブロスは、培地中に含まれるコハク酸マグネシウムを酸形態（すなわちコハク酸）に変換するために酸性化され得、次にこの酸形態は、酸性化された培地を冷却することによって結晶化され得る。さらなる好適な精製プロセスの例は、EP-A-1005562、WO-A-2008/010373、WO-A-2011/082378、WO-A-2011/043443、WO-A-2005/030973、WO-A-2011/123268及びWO-A-2011/064151及びEP-A-2360137に開示されている。
【００７０】
本発明に従うプロセスの好ましい実施形態に従えば、プロセスは、さらにプロセスステップ：
III）少なくとも一つの化学反応による、前記有機化合物と異なる二次有機産物への、プロセスステップI）で得られる発酵ブロスに含まれる有機化合物の変換、又はプロセスステップII）で得られる回収される有機化合物の変換
を含む。
【００７１】
有機化合物がコハク酸である場合には、好ましい二次有機産物は、コハク酸エステル及びそのポリマー、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ブタンジオール（BDO）、γ-ブチロラクトン（GBL）及びピロリドンからなる群より選択される。
【００７２】
THF、BDO及び／又はGBLの生産のための好ましい実施形態に従えば、このプロセスは：
b1）プロセスステップI）又はII）で得られるコハク酸の、THF及び／又はBDO及び／又はGBLへの直接的触媒水素化、又は
b2）プロセスステップI）又はII）で得られるコハク酸及び／又はコハク酸塩の、対応するジ低級アルキルエステルへの化学的エステル化、及びそれに続く前記エステルのTHF及び／又はBDO及び／又はGBLへの触媒水素化、
のいずれかを含む。
【００７３】
ピロリドンの生産のための好ましい実施形態に従えば、このプロセスは：
b）プロセスステップI）又はII）で得られるコハク酸アンモニウム塩の、それ自体は公知である方法におけるピロリドンへの化学的変換
を含む。
【００７４】
これらの化合物の調製の詳細については、US-A-2010/0159543及びWO-A-2010/092155を参照されたい。
【００７５】
最初に記載された課題を解決するための貢献は、さらに、有機化合物の発酵生産のための本発明に従う改変微生物の使用によって提供される。好ましい有機化合物は、本発明に従うプロセスに関して既に記載した化合物であり、コハク酸が最も好ましい有機化合物である。さらに、有機化合物、好ましくはコハク酸の発酵生産の好ましい条件は、本発明に従うプロセスのプロセスステップI）に関して既に記載した条件である。本発明の様々な態様を以下に示す。
１．野生型に比べて、wcaJ遺伝子によってコードされる酵素の低減された活性を有する改変微生物。
２．改変微生物が由来する野生型が、腸内細菌科、パスツレラ科、バチルス科、又はコリネバクテリウム科の科に属する、上記１に記載の改変微生物。
３．改変微生物が由来する野生型が、配列番号1、又は配列番号1と少なくとも96の配列相同性を示す配列の16S rDNAを有する、上記３に記載の改変微生物。
４．改変微生物が由来する野生型が、バスフィア（Basfia）属に属する、上記１又は２に記載の改変微生物。
５．改変微生物が由来する野生型が、バスフィア・スクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）種に属する、上記３に記載の改変微生物。
６．改変微生物が由来する野生型が、ドイツのDSMZにDSM 18541として寄託されたバスフィア・スクシニシプロデュセンス（Basfia succiniciproducens）株DD1である、上記４に記載の改変微生物。
７．wcaJ遺伝子が、以下：
a）配列番号3のヌクレオチド配列を有する核酸；
b）配列番号4のアミノ酸配列をコードする核酸；
c）a）又はb）の核酸と少なくとも70%同一である核酸であって、同一性がa）又はb）の核酸の全長にわたる同一性である核酸；
d）a）又はb）の核酸によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも70%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸であって、同一性がa）又はb）の核酸によってコードされるアミノ酸配列の全長にわたる同一性である核酸；
e）a）又はb）に記載のいずれかの核酸の相補的な配列にストリンジェントな条件でハイブリダイズし得る核酸；及び
f）a）又はb）のいずれかの核酸と同じタンパク質をコードするが、遺伝コードの縮重によって上記a）又はb）の核酸とは異なる核酸；
からなる群より選択される核酸を含む、上記１〜６のいずれかに記載の改変微生物。
８．wcaJ遺伝子が改変されている、上記１〜７のいずれかに記載の改変微生物。
９．wcaJ遺伝子の改変が、wcaJ遺伝子又は少なくともその一部の欠失、wcaJ遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はwcaJ遺伝子への少なくとも一つの変異の導入によって達成される、上記８に記載の改変微生物。
１０．wcaJ遺伝子における少なくとも一つの変異が、wcaJ遺伝子によってコードされるトランケートされた酵素の発現をもたらす、上記９に記載の改変微生物。
１１．トランケートされた酵素において、wcaJ遺伝子によってコードされる野生型酵素の少なくとも100アミノ酸がC末端から欠失している、上記１０に記載の改変微生物。
１２．前記微生物が野生型と比べて、
i）低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性、
ii）低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性、又は
iii）低減されたピルビン酸ギ酸リアーゼ活性及び低減された乳酸デヒドロゲナーゼ活性をさらに有する、上記１〜１１のいずれかに記載の改変微生物。
１３．前記微生物が、
A）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
B）pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
C）pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
D）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び
pflD遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflD遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflD遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；又は
E）ldhA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、ldhA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はldhA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入、及び
pflA遺伝子又は少なくともその一部の欠失、pflA遺伝子の調節エレメント又は少なくともその一部の欠失、又はpflA遺伝子への少なくとも一つの変異の導入；
を含む、上記１２に記載の改変微生物。
１４．I）上記１〜１３のいずれかに記載の改変微生物を、改変微生物が有機化合物を生産することを可能にする少なくとも一つの同化可能な炭素源を含む培養培地で培養し、それによって有機化合物を含む発酵ブロスを得るステップ；
II）プロセスステップI）で得られる発酵ブロスから有機化合物を回収するステップ
を含む、有機化合物の生産方法。
１５．有機化合物が、コハク酸である、上記１４に記載の方法。
１６．同化可能な炭素源が、ショ糖、マルトース、D-グルコース、グリセロール、グリセロールとD-グルコースの混合物、グリセロールとショ糖の混合物、グリセロールとD-キシロースの混合物、グリセロールの混合物及びマルトースとD-グルコースとフルクトースの混合物からなる群より選択される、上記１４又は１５に記載の方法。
１７．前記方法がプロセスステップ：
III）少なくとも一つの化学反応による、前記有機化合物と異なる二次有機産物への、プロセスステップI）で得られる発酵ブロスに含まれる有機化合物の変換、又はプロセスステップII）で得られる回収される有機化合物の変換
をさらに含む、上記１４〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．有機化合物がコハク酸であり、二次有機産物が、コハク酸エステル又はそのポリマー、テトラヒドロフラン（THF）、1,4-ブタンジオール（BDO）、γ-ブチロラクトン（GBL）及びピロリドンからなる群より選択される、上記１７に記載の方法。
１９．有機化合物の発酵生産のための、上記１〜１３のいずれかに記載の改変微生物の使用。
２０．有機化合物がコハク酸である、上記１９に記載の使用。
【００７６】
本発明を、図及び非制限的な例を用いてより詳細に以下で説明する。
【実施例】
【００７７】
実施例1：バスフィア・スクシニシプロデュセンスの形質転換の一般的な方法
【表１】
0006608377.tif 000003
【００７８】
バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1（野生型）は、以下のプロトコルを用いてエレクトロポレーションによりDNAを形質転換した：
前培養を調製するために、DD1を凍結ストックから100ml振盪フラスコ中の40ml BHI（ブレインハートインフュージョン、Becton, Dickinson and Company）に接種した。インキュベーションを、37℃；200rpmで一晩行った。本培養を調製するために、100mlのBHIを250ml振盪フラスコに入れ、0.2の最終OD（600nm）で前培養を接種した。インキュベーションを、37℃、200rpmで行った。約0.5、0.6、及び0.7のODで細胞を回収し、ペレットを一度4℃で10%の冷グリセロールで洗浄し、2mlの10%グリセロール（4℃）に再懸濁した。
【００７９】
100μlのコンピテントセルを、2〜8μgのプラスミドDNAと混合し、氷上で2分、0.2cmの幅を有するエレクトロポレーションキュベットで保持した。エレクトロポレーションは以下の条件：400Ω；25μF；2.5kV（Gene Pulser, Bio-Rad）。1mlの冷却したBHJをエレクトロポレーションの直後に加え、インキュベーションを37℃で約2h行った。
【００８０】
細胞を5mg/Lのクロラムフェニコールを含むBHIに播種し、形質転換体のコロニーが可視化されるまで、37℃で2〜5日インキュベートした。クローンの純度が得られるまで、クローンを単離し、5mg/Lのクロラムフェニコールを含むBHIに再画線した。
【００８１】
実施例2：欠失構築物の作製
変異／欠失プラスミドは、pSacBベクター（配列番号5）に基づいて構築した。図1は、pSacBプラスミドの模式的なマップを示す。欠失されるべき染色体フラグメントの5'及び3'フランキング領域（それぞれ約1500bp）は、バスフィア・スクシニシプロデュセンスの染色体DNAからPCRによって増幅し、標準的な方法を用いて前記ベクターに導入した。通常、少なくともORFの80%が欠失のために標的化された。かかる方法では、乳酸デヒドロゲナーゼldhAのための欠失プラスミド、pSacB_delta_ldhA（配列番号6）、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化酵素pflAのための欠失プラスミド、pSacB_delta_pflA（配列番号7）、推定フルクトース特異的トランスポーターwcaJのための欠失プラスミド、pSacB_delta_wcaJ（配列番号8）、及びピルビン酸ギ酸リアーゼpflDのための欠失プラスミド、pSacB_delta_ pflD（配列番号9）を構築した。図2、3、4及び5は、それぞれpSacB_delta_ldhA、pSacB_delta_pflA、pSacB_delta_wcaJ及びpSacB_delta_pflDプラスミドの模式的マップを示す。
【００８２】
pSacB（配列番号5）のプラスミド配列では、sacB遺伝子は塩基2380〜3801に含まれる。sacBプロモーターは塩基3802〜4264に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基526〜984に含まれる。大腸菌の複製開始点（ori EC）は塩基1477〜2337に含まれる（図1を参照されたい）。
【００８３】
pSacB_delta_ldhA（配列番号6）のプラスミド配列では、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるldhA遺伝子の5'フランキング領域は塩基1519〜2850に含まれ、一方バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるldhA遺伝子の3'フランキング領域は塩基62〜1518に含まれる。sacB遺伝子は塩基5169〜6590に含まれる。sacBプロモーターは塩基6591〜7053に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3315〜3773に含まれる。大腸菌の複製開始点（ori EC）は塩基4266〜5126に含まれる（図2を参照されたい）。
【００８４】
pSacB_delta_pflA（配列番号7）のプラスミド配列では、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるpflA遺伝子の5'フランキング領域は塩基1506〜3005に含まれ、一方バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるpflA遺伝子の3'フランキング領域は塩基6〜1505に含まれる。sacB遺伝子は塩基5278〜6699に含まれる。sacBプロモーターは塩基6700〜7162に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3424〜3882に含まれる。大腸菌の複製開始点（ori EC）は塩基4375〜5235に含まれる（図3を参照されたい）。
【００８５】
pSacB_delta_wcaJ（配列番号8）のプラスミド配列では、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるwcaJ遺伝子の5'フランキング領域は塩基1506〜3122に含まれ、一方バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるwcaJ遺伝子の3'フランキング領域は塩基6〜1505に含まれる。sacB遺伝子は塩基5395〜6816に含まれる。sacBプロモーターは塩基6817〜7279に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3541〜3999に含まれる。大腸菌の複製開始点（ori EC）は塩基4492〜5352に含まれる（図4を参照されたい）。
【００８６】
pSacB_delta_pflD（配列番号9）のプラスミド配列では、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるpflD遺伝子の5'フランキング領域は塩基1533〜2955に含まれ、一方バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムに相同であるpflD遺伝子の3'フランキング領域は塩基62〜1532に含まれる。sacB遺伝子は塩基5256〜6677に含まれる。sacBプロモーターは塩基6678〜7140に含まれる。クロラムフェニコール遺伝子は塩基3402〜3860に含まれる。大腸菌の複製開始点（ori EC）は塩基4353〜5213に含まれる（図5を参照されたい）。
【００８７】
実施例3：改善されたスクシネート生産株の作製
a）バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1を、pSacB_delta_ldhAにより上記の通り形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムへの形質転換及び組込みは、バスフィア・スクシニシプロデュセンスのゲノムへのプラスミドの組込み事象のPCRで得られるバンドによって確認した。
【００８８】
その後、「キャンベルイン」株を、対抗選択培地としてショ糖を含む寒天プレートを用いて「キャンベルアウト」して、sacB遺伝子の（機能）欠失を選択した。したがって、「キャンベルイン」株を、37℃、220rpmで、25〜35mlの非選択培地（抗生物質を含まないBHI）で一晩インキュベートした。その後、一晩培養物を新たに調製したショ糖を含む（10%、抗生物質なし）BHIプレートに画線し、37℃で一晩インキュベートした（「第一ショ糖移行」）。第一移行で得られた単一コロニーを新たに調製したショ糖を含む（10%）BHIプレートに再度画線し、37℃で一晩インキュベートした（「第二ショ糖移行」）。この手順を、ショ糖における最小限の5回の移行が完了するまで繰り返した（「第三、第四、第五ショ糖移行」）。用語「第一〜第五ショ糖移行」は、sacB遺伝子及び周囲のプラスミド配列の欠失を有する株を選択するための、sacB-evan-sucrase遺伝子を含むベクターの染色体組込み後の、ショ糖及び増殖培地含有寒天プレートへの株の移行を指す。第五移行プレートからの単一コロニーを、25〜35mlの非選択培地（抗生物質を含まないBHI）に接種し、37℃、220rpmで一晩培養した。一晩培養物を段階希釈し、単離された単一コロニーを得るためにBHIプレートに播種した。
【００８９】
ldhA遺伝子の変異／欠失を含む「キャンベルアウト」株を、クロラムフェニコール感受性によって確認した。これらの株の中の変異／欠失変異体を、PCR分析によって同定し確認した。これにより、ldhA欠失変異体バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAを得た。
【００９０】
b）バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAを、上記pSacB_delta_pflDにより形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組込みをPCRによって確認した。その後、「キャンベルイン」株を上記の通り「キャンベルアウト」した。これらの株の中の欠失変異体を、PCR分析によって同定し確認した。これにより、ldhA pflD二重欠失変異体バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAΔpflDを得た。
【００９１】
c）バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAΔpflDを、上記pSacB_delta_wcaJにより形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組込みをPCRによって確認した。その後、「キャンベルイン」株を上記の通り「キャンベルアウト」した。これらの株の中の欠失変異体を、PCR分析によって同定し確認した。これにより、ldhA pflD wcaJ三重欠失変異体バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAΔpflDΔwcaJを得た。
【００９２】
d）バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAを、上記pSacB_delta_pflA形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組込みをPCRによって確認した。その後、「キャンベルイン」株を上記の通り「キャンベルアウト」した。これらの株の中の欠失変異体を、PCR分析によって同定し確認した。これにより、ldhA pflA二重欠失変異体バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAΔpflAを得た。
【００９３】
e）バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAΔpflAを、上記pSacB_delta_wcaJにより形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組込みをPCRによって確認した。その後、「キャンベルイン」株を上記の通り「キャンベルアウト」した。これらの株の中の欠失変異体を、PCR分析によって同定し確認した。これにより、ldhA pflA wcaJ三重欠失変異体バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔldhAΔpflAΔwcaJを得た。
【００９４】
f）バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1を、上記pSacB_delta_wcaJにより形質転換し、「キャンベルイン」して「キャンベルイン」株を得た。形質転換及び組込みをPCRによって確認した。その後、「キャンベルイン」株を上記の通り「キャンベルアウト」した。これらの株の中の欠失変異体を、PCR分析によって同定し確認した。これにより、wcaJ欠失変異体バスフィア・スクシニシプロデュセンスDD1ΔwcaJを得た。
【００９５】
実施例4：様々なDD1株のグルコース及びショ糖における培養
炭素源としてのグルコース又はショ糖の存在下で、DD1の生産性を、変異株DD1ΔwcaJの生産性と比較した。
【００９６】
炭素源としてのグルコース又はショ糖の存在下で、DD1ΔldhAΔpflDの生産性を、変異株DD1ΔldhAΔpflDΔwcaJの生産性と比較した。
【００９７】
炭素源としてのグルコース又はショ糖の存在下で、DD1ΔldhAΔpflAの生産性を、変異株DD1ΔldhAΔpflAΔwcaJの生産性と比較した。
【００９８】
生産性を、下記の培地及びインキュベーション条件を用いて分析した。
【００９９】
1．培地の調製
培養培地の組成及び調製は、以下の表2、3、4、及び5に記載される通りである。
【表２】
0006608377.tif 000004
【表３】
0006608377.tif 000005
【表４】
0006608377.tif 000006
【表５】
0006608377.tif 000007
【０１００】
2.培養及び分析
主培養増殖のために、BHI寒天プレートで新たに増殖させた細菌を用い、CO2雰囲気下で、表2及び3に記載された50mlの液体培地を含み、気密ブチルゴム栓を有する100ml血清ボトルにOD600=0.75で接種した。ボトルを、37℃及び160rpmでインキュベートした（振盪直径：2.5cm）。24h又は48h後に、C源の消費及びカルボン酸の生産を、HPLCを介して（HPLC法は、表10及び11に記載されている）定量した。細胞の増殖を、分光光度計（Ultrospec3000, Amersham Biosciences, Uppsala Sweden）を用いて600nmの吸光度（OD600）を測定することによって測定した。
【０１０１】
3.結果
異なるDD1株の培養実験の結果を表6、7及び8に示す。これらの結果からわかるように、ΔwcaJ細胞によってコードされる酵素の活性の低減が、コハク酸の増加した生産をもたらす。
【０１０２】
さらに、DD1ΔldhAΔpflD/DD1ΔldhAΔpflA株及びDD1ΔldhAΔpflDΔwcaJ／DD1ΔldhAΔpflAΔwcaJ株の24h又は48hのインキュベーション後に培養によって得られるサンプルを、遠心分離後に得られる上清容積を測定するために15mlチューブに移した。表9に示される様に、ΔwcaJ細胞によってコードされる酵素の活性の低減が、顕著に改善された沈降挙動を示し（遠心分離後に高密度な細胞ペレットが得られる）、したがって後の精製プロセスにおいて培養培地から簡単に除去し得る改変微生物をもたらす。
【表６】
0006608377.tif 000008
【表７】
0006608377.tif 000009
【表８】
0006608377.tif 000010
【表９】
0006608377.tif 000011
【表１０】
0006608377.tif 000012
【表１１】
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【０１０３】
配列
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0006608377.tif 000015
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【受託番号】
【０１０４】
0006608377.tif 000027
0006608377.tif 000028
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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