(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＥのリスクのある対象におけるＳＬＥの可能性を診断するための方法であって、
（ａ）ＥＣ４ｄマーカー、ＢＣ４ｄマーカー、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、および二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓＤＮＡ）のそれぞれのマーカーの個別の量がそのマーカーの所定値以下である場合に、ＳＬＥのリスクのある対象者がＳＬＥに関して陰性であることを決定し、
（ｂ）前記（ａ）でＳＬＥに関して陰性であると決定されたＳＬＥのリスクのある対象から得る生物学的サンプル中の
（Ｉ）赤血球Ｃ４ｄ（ＥＣ４ｄ）マーカー、
（ＩＩ）Ｂ細胞Ｃ４ｄ（ＢＣ４ｄ）マーカー、および
（ＩＩＩ）抗核抗体（ＡＮＡ）、
である一次マーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを算出すること、
を含み、
前記リスクスコアが、前記対象がＳＬＥを有する可能性を示す、方法。
【請求項２】
前記方法が、さらに前記対象から得る生物学的サンプル中のＳＳ−Ｂ（Ｌａ）マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー、Ｊｏ−１マーカー、およびＣＥＮＰマーカーからなる群から選択される１種類以上の除外マーカーの量を決定することを含み、前記ＳＬＥリスクスコアの算出が、前記一次マーカーおよび１種類以上の前記除外マーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを計算することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法が、２種類以上の前記除外マーカーの量を決定することを含み、前記リスクスコアの算出が、前記一次マーカーおよび２種以上の前記除外マーカーのそれぞれの量に基づいて前記ＳＬＥリスクスコアを計算することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記方法が、３種類以上の前記除外マーカーの量を測定することを含み、前記リスクスコアの算出が、前記一次マーカーおよび３種以上の前記除外マーカーのそれぞれの量に基づいて前記ＳＬＥリスクスコアを計算することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、４種類すべての前記除外マーカーの量を決定することを含み、前記リスクスコアの算出が、前記一次マーカーおよび４種以上の前記除外マーカーのそれぞれの量に基づいて前記ＳＬＥリスクスコアを計算することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、さらに対象から得る生物学的サンプル中のＭＣＶマーカーの量を決定することを含み、前記ＳＬＥリスクスコアの算出が、前記一次マーカー、１種類以上の前記除外マーカー、および前記ＭＣＶマーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを計算することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＳＬＥリスクスコアの算出が、１種類以上の前記一次マーカーの量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の前記変換分析がロジスティック回帰分析を含み、前記ロジスティック回帰分析は、
（ｉ）前記一次マーカーのそれぞれの量を調整して、各一次マーカーの重み付きスコアを作成することと、
（ｉｉ）各一次マーカーの前記重み付きスコアを組み合わせて前記ＳＬＥリスクスコアを作成することと、
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＳＬＥリスクスコアの算出が、１種類以上の前記除外マーカーの量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＳＬＥリスクスコアの算出が、４種類すべての前記除外マーカーの量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の前記変換分析がロジスティック回帰分析を含み、前記ロジスティック回帰分析は、
（ｉ）前記一次マーカーのそれぞれの量および１種類以上の前記除外マーカーのそれぞれの量を調整して前記一次マーカーおよび１種類以上の前記除外マーカーに重み付きスコアを作成することと、
（ｉｉ）前記各一次マーカーおよび１種類以上の前記除外マーカーの前記重み付きスコアを組み合わせて前記ＳＬＥリスクスコアを作成することと、
を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＬＥリスクスコアが、
（ａ）蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって決定されたＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄの正味の平均蛍光強度の自然対数を決定することと、
（ｂ）ＡＮＡが所定の閾値に基づいて陰性（値が０）、中等度陽性（値が１）、または強陽性（値が２）であるかを決定することと、
（ｃ）前記除外マーカーのいずれかが所定の閾値を超えて陽性（値が１）であるか、または前記除外マーカーのいずれも所定の閾値を超えずにすべてが陰性（値が０）であるかを決定することと、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で決定された値を組み合わせてＳＬＥリスクスコアを得ることと、
によって計算される、請求項２〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＢＣ４ｄマーカー量の決定が、Ｂリンパ球の表面上のＢＣ４ｄの量を測定することを含み、前記ＥＣ４ｄマーカー量の決定が、赤血球の表面上のＥＣ４ｄの量を測定することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＢＣ４ｄマーカー量の決定が、細胞またはＢリンパ球を含む組織抽出物中のＢＣ４ｄの量を決定することを含み、前記ＥＣ４ｄマーカー量の決定が、細胞または赤血球を含む組織抽出物中のＥＣ４ｄの量を決定することを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＢＣ４ｄマーカーの量および前記ＥＣ４ｄマーカーの量が、Ｃ４ｄに特異的な抗体を用いて決定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連案件の相互参照
本出願は、２０１３年３月１５日に出願した米国特許仮出願第６１／７９２，２８４号の優先権を主張し、その全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は自己免疫疾患であり、血液中の異常な自己抗体の産生を特徴とする。これらの自己抗体はそれぞれの抗原と結合して、免疫複合体を形成し、これらは循環して最終的に組織に沈着する。この免疫複合体沈着は慢性炎症および組織損傷を引き起こす。
【０００３】
狼瘡を生じる異常な自己免疫の正確な理由は知られていない。受け継がれる遺伝子、ウイルス、紫外線、および薬剤がすべて何らかの役割を演じている可能性がある。遺伝的要因により自己免疫を発症する傾向は高まり、狼瘡、関節リウマチ、および免疫性甲状腺障害などの自己免疫疾患は、一般集団よりも狼瘡を有する患者の血縁者でより多く起こる。科学者によっては、狼瘡における免疫系はウイルスまたは紫外線のような外部因子によって、より容易に刺激されると考えている。時に狼瘡の症状は、太陽に短期間晒されるだけで引き起こされるか、又は悪化することがある。
【０００４】
ＳＬＥを有する患者は、広範な様々な症状および異なる組合せの臓器病変を有することがあり、１つの検査だけでＳＬＥの診断を確定することはできない。医師がＳＬＥの診断精度を改善する手助けをするため、１１項目の基準が米国リウマチ学会によって確立された。これらの１１項目の基準は、ＳＬＥを有する患者に認められる様々な症状と密接に関連する。患者がこれらの基準の４項目以上を有するとき、ＳＬＥの診断が強く示唆される。しかし、ＳＬＥを有することが疑われる患者でも、確定診断するための十分な基準を決して示さないことがある。別の患者は、わずか数ヶ月または数年の観察で十分な基準を示す。とはいえ、ある種の状況ではこれらの従来基準のいくつかしか有さない患者にもＳＬＥの診断がなされ得る。これらの患者では、何人かは後になって他の基準を示すことがあるが、多くの者は示さない。ＳＬＥの診断に通常用いられる１１項目の基準は：
１−顔面の頬を覆う頬部発疹または「蝶型」発疹
２−円板状皮膚発疹 ：瘢痕の原因となり得る斑状発赤
３−光過敏症：太陽光線暴露に反応した皮膚発疹
４−粘膜潰瘍：口腔、鼻腔、または咽喉の内膜の潰瘍
５−関節炎：四肢の２つ以上の腫脹した圧痛関節
６−胸膜炎／心膜炎：心臓または肺周辺の内膜組織の炎症、通常は呼吸時の胸痛と関連
７−腎臓の異常：異常な量の尿タンパク質、または円柱と呼ばれる細胞要素の集塊
８−脳の炎症：発作（けいれん）および／または精神異常として出現
９−血球数異常：白血球、赤血球、または血小板の減少
１０−免疫学的障害：免疫検査異常には、抗ｄｓＤＮＡ抗体、抗Ｓｍ（スミス）抗体、梅毒の血液検査偽陽性、抗カルジオリピン抗体、ループスアンチコアグラント、またはＬＥ細胞検査陽性が挙げられる
１１−抗核抗体：ＡＮＡ抗体検査陽性
である。
【０００５】
これらの基準は、狼瘡を他の関連する自己免疫疾患から区別するこれらの特徴の有効なリマインダーとしての役目を果たすが、誤りがちであることは避けられない。基準の有無の決定は、しばしば解釈を必要とする。徴候または症状の有無を決定するために大まかな基準が適用されれば、実際には狼瘡を有しない場合でも、患者が狼瘡を有するものとして容易に診断できる。同様にＳＬＥにおける臨床所見の範囲は１１項目の基準に記載されているよりもかなり広く、各所見は患者ごとに活動性および重篤度のレベルが変わり得る。ＳＬＥの症状が疾患の経過に従って絶えず変化することも、困難な診断をさらに複雑にする。これまで罹患していなかった器官で新しい症状が時間とともに起こり得る。従来、狼瘡の確定的な検査がないため、狼瘡はしばしば誤診断される。
【０００６】
疾患活動性のモニタリングも狼瘡を有する患者を治療する上で問題が多い。狼瘡は、一連の発赤または疾患の急性期で進行するが、その後に寛解期が続く。発赤の症状は、患者間および同一患者においてさえかなり異なり、これには、倦怠感、発熱、対称性の関節痛、および光過敏症（短期間の太陽暴露後の発赤の発症）が含まれる。狼瘡の他の症状には、脱毛、粘膜の潰瘍、胸痛を引き起こす心臓および肺の内膜の炎症が含まれる。
【０００７】
赤血球、血小板、および白血球は狼瘡で標的にされることがあり、貧血および出血障害を引き起こす。さらに重度では、血管における免疫複合体沈着および慢性炎症は、腎障害、そして時には透析または腎臓移植を必要とする腎不全を引き起こし得る。血管は狼瘡における自己免疫反応の主な標的であるため、期外収縮発作および心疾患はまれではない。しかし時間とともにこれらの再燃は不可逆的な臓器損傷を引き起こし得る。
【発明の概要】
【０００８】
第一の態様では、本発明は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のリスクのある対象を治療するための方法であって、
（ａ）ＳＬＥを有するリスクのある対象から得る生物学的サンプル中の下記の一次マーカーのそれぞれの量に基づいて対象のＳＬＥリスクスコアを算出することと、
（Ｉ）赤血球Ｃ４ｄ（ＥＣ４ｄ）マーカー、
（ＩＩ）Ｂ細胞Ｃ４ｄ（ＢＣ４ｄ）マーカー、および
（ＩＩＩ）抗核抗体（ＡＮＡ）、
ここで当該対象はＳＬＥを有するリスクがあり、なおかつ当該対象はＥＣ４ｄマーカー、ＢＣ４ｄマーカー、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、および二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓＤＮＡ）の個別の量に基づいてＳＬＥに関して陰性であり、
（ｂ）ＳＬＥリスクスコアに少なくとも部分的に基づいて、ＳＬＥまたは別の疾患のために対象を治療することと、を含む方法を提供する。
【０００９】
別の態様では、本発明はＳＬＥのリスクのある対象がＳＬＥを有する可能性を診断するための方法であって、
（ａ）ＥＣ４ｄマーカー、ＢＣ４ｄマーカー、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、および二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓＤＮＡ）の個別の量に基づいてＳＬＥのリスクのある対象がＳＬＥに関して陰性であることを決定することと、
（ｂ）ＳＬＥを有するリスクのある対象から得る生物学的サンプル中の下記の一次マーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを算出することと、を含み、
（Ｉ）赤血球Ｃ４ｄ（ＥＣ４ｄ）マーカー、
（ＩＩ）Ｂ細胞Ｃ４ｄ（ＢＣ４ｄ）マーカー、および
（ＩＩＩ）抗核抗体（ＡＮＡ）、
当該リスクスコアが、当該対象がＳＬＥを有する可能性を示す、方法を提供する。
【００１０】
本方法の一つの実施形態では、本方法は、さらに、対象から得る生物学的サンプル中のＳＳ−Ｂ（Ｌａ）マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー、Ｊｏ−１マーカー、およびＣＥＮＰマーカーからなる群から選択される１、２、３、または４種類すべての除外マーカーの量を測定することを含み、ＳＬＥリスクスコアの算出は、一次マーカーおよび１種類以上の除外マーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを計算することを含む。
【００１１】
別の実施形態では、本方法は、さらに、対象から得る生物学的サンプル中のＭＣＶマーカーの量を決定することを含み、ＳＬＥリスクスコアの算出は、一次マーカー、１種類以上の除外マーカー、およびＭＣＶマーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを計算することを含む。
【００１２】
さらなる実施形態では、ＳＬＥリスクスコアの算出は、一次マーカーの１種類以上の量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む。一つのそのような実施形態では、１つ以上の変換分析はロジスティック回帰分析を含み、ロジスティック回帰分析は、（ｉ）一次マーカーのそれぞれの量を調整して、各一次マーカーの重み付きスコアを作成することと、（ｉｉ）各一次マーカーの重み付きスコアを組み合わせてＳＬＥリスクスコアを作成することとを含む。
【００１３】
別の実施形態では、ＳＬＥリスクスコアの算出は、１、２、３、または４種類すべての除外マーカーの量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む。一つのそのような実施形態では、１つ以上の変換分析はロジスティック回帰分析を含み、ロジスティック回帰分析は、（ｉ）一次マーカーのそれぞれの量および１、２、３、または４種類すべての除外マーカーのそれぞれの量を調整し、一次マーカーおよび１、２、３、または４種類すべての除外マーカーの重み付きスコアを作成することと、（ｉｉ）各一次マーカーおよび１、２、３、または４種類すべての除外マーカーの重み付きスコアを組み合わせてＳＬＥリスクスコアを作成することとを含む。
【００１４】
さらなる実施形態では、ＳＬＥリスクスコアは、（ａ）蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定したＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄの正味の平均蛍光強度の自然対数を決定すること、（ｂ）ＡＮＡが所定の閾値に基づいて陰性（値が０）、中等度陽性（値が１）、または強陽性（値が２）であるかを決定すること、（ｃ）除外マーカーのいずれかが所定の閾値を超えて陽性（値が１）であるか、または除外マーカーのいずれも所定の閾値を超えずにすべてが陰性（値が０）であるかを決定すること、および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で決定された値を組み合わせてＳＬＥリスクスコアを得ることによって計算される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の方法の実施形態を説明する、２つの検出階層を含む細胞をベースとした補体活性化産物の血液サンプル中の量に基づくＳＬＥ診断のためのフローチャートである。
【図２】抗ｄｓＤＮＡ陰性対象のインデックススコアを示すグラフである。ＲＡ：関節リウマチ、ＰＭ／ＤＭ：多発性筋炎／皮膚筋炎、Ｓｃｌ：強皮症、ＳＳ：シェーグレン症候群、ＮＨＶ：健常ボランティア。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明の詳細な説明
本明細書に引用されるすべての参照は、参考文献によって組み込まれる。本明細書で開示されるすべての実施形態は、文脈で明確に示されない限り、本発明の同一または異なる態様における１つ以上の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００１７】
文脈で明確に要求されない限り、説明および請求項の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および類似用語は、排他的または網羅的な意味とは反対の包括的な意味で理解されるべきであり、すなわち「限定されずに、含む」の意味である。単数または複数を用いる用語は、それぞれ複数または単数も含む。さらに用語「本明細書で（ｈｅｒｅｉｎ）」、「前述（ａｂｏｖｅ）」、および「後述（ｂｅｌｏｗ）」ならびに同様の意味の用語は、本出願で使用されるとき、本出願を全体として言及し、本出願の特定部分に対するものではない。本明細書で使用されるとき、単数形「一つの（ａ）」、「（ａ）」、および「本（ｔｈｅ）」は、文脈で明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。本明細書で使用されるとき、「および（ａｎｄ）」は、明確に記載されていない限り、「または（ｏｒ）」と交換可能で使用される。
【００１８】
本開示の実施形態の説明は、網羅的でないか、または開示された正確な形式に開示を限定しないと意図される。本開示の具体的な実施形態または実施例は、説明を目的として本明細書で説明され、関連技術における当業者が認識するように、様々な同等な変更は本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の段階または機能は所定の順序で提示されるが、代替えの実施形態が異なる順序で機能を行うことがあり、または機能はほとんど同時に行われ得る。本明細書で示される本開示の教示は、必要に応じて他の処理または方法に適用できる。本明細書に記載される種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。
【００１９】
第一の態様では、本発明は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のリスクのある対象を治療するための方法であって、
（ａ）ＳＬＥを有するリスクのある対象から得る生物学的サンプル中の下記の一次マーカーのそれぞれの量に基づいて対象のＳＬＥリスクスコア（本明細書では「インデックススコア」ともいう）を算出することと、
（Ｉ）赤血球Ｃ４ｄ（ＥＣ４ｄ）マーカー、
（ＩＩ）Ｂ細胞Ｃ４ｄ（ＢＣ４ｄ）マーカー、および
（ＩＩＩ）抗核抗体（ＡＮＡ）、
ここで当該対象はＳＬＥを有するリスクがあり、なおかつ当該対象はＥＣ４ｄマーカー、ＢＣ４ｄマーカー、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、および二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓＤＮＡ）の個別の量に基づいてＳＬＥに関して陰性であり、
（ｂ）ＳＬＥリスクスコアに少なくとも部分的に基づいてＳＬＥまたは別の疾患のために対象を治療することと、
を含む、方法を提供する。
【００２０】
第二の態様では、本発明はＳＬＥのリスクのある対象におけるＳＬＥの可能性を診断するための方法であって、
（ａ）ＥＣ４ｄマーカー、ＢＣ４ｄマーカー、抗スミス（抗Ｓｍ）抗体、および二本鎖ＤＮＡ抗体（抗ｄｓＤＮＡ）の個別の量に基づいてＳＬＥのリスクのある対象がＳＬＥに関して陰性であることを決定することと、
（ｂ）ＳＬＥを有するリスクのある対象から得る生物学的サンプル中の下記の一次マーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを算出することと、を含み、
（Ｉ）赤血球Ｃ４ｄ（ＥＣ４ｄ）マーカー、
（ＩＩ）Ｂ細胞Ｃ４ｄ（ＢＣ４ｄ）マーカー、および
（ＩＩＩ）抗核抗体（ＡＮＡ）、
ここで当該リスクスコアが、当該対象がＳＬＥを有する可能性を示す、方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法は、従来技術の方法と比べて全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の診断および治療に改善をもたらす。いずれかの態様の一つの実施形態では、本方法はさらに対象から得る生物学的サンプル中のシェーグレン症候群Ｂ型抗原（ＳＳ−Ｂ（Ｌａ））マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー（トポイソメラーゼＩ）、Ｊｏ−１マーカー、およびセントロメアＢタンパク質（ＣＥＮＰ）マーカーからなる群から選択される１種類以上（例、１、２、３、または４種類すべて）の除外マーカーの量を決定することを含み、ＳＬＥリスクスコアの算出は、一次マーカーおよび１種類以上の除外マーカーのそれぞれの量に基づいてＳＬＥリスクスコアを計算することを含む。この実施形態では、ＳＬＥ診断の特異性が従来技術の方法と比べて大きく改善される。
【００２２】
マーカーは１種類以上の除外マーカーに対する生物学的サンプル中の抗体などの任意の適切なマーカーであり得る。例えば、Ｊｏ−１マーカーは抗Ｊｏ−１抗体であることができ、ＳＳ−Ｂ（Ｌａ）マーカーは抗ＳＳ−Ｂ（Ｌａ）抗体であることができ、Ｓｃｌ−７０マーカーは抗Ｓｃｌ−７０抗体であることができ、およびＣＥＮＰマーカーは抗ＣＥＮＰ抗体であることができる。さらなる実施形態では、除外マーカーはさらに抗ＭＣＶ抗体などのＭＣＶ（変異シトルリン化ビメンチン）マーカーを含み得る。
【００２３】
種々の組織サンプル中のこれらのマーカーのそれぞれの量および正常な量を測定するためのプローブおよびアッセイは従来技術の当業者に知られており、そのような測定をするためのキットが幅広い様々な製造元から入手でき、これには、限定されないが、後述の実施例で言及されるものが含まれる。
【００２４】
いずれかの態様の別の実施形態では、ＳＬＥリスクスコアの算出は、一次マーカーの１種類以上の量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む。限定されないが、ロジスティック回帰分析を含むそのような任意の変換分析を、使用できる。そのような実施形態では、ロジスティック回帰分析は、（ｉ）一次マーカーのそれぞれの量を調整して各一次マーカーの重み付きスコアを作成することと、（ｉｉ）各一次マーカーの重み付きスコアを組み合わせてＳＬＥリスクスコアを作成することとを含むことができる。
【００２５】
別の実施形態では、ＳＬＥリスクスコアの算出は、１種類以上の一次マーカーの量および１種類以上（１、２、３、または４種類すべて）の除外マーカーの量を１つ以上の変換分析によって調整することを含む。そのような実施形態では、１つ以上の変換分析は、（ｉ）一次マーカーのそれぞれの量および１種類以上の除外マーカーのそれぞれの量を調整して、一次マーカーおよび１種類以上の除外マーカーの重み付きスコアを作成することと、（ｉｉ）各一次マーカーおよび１種類以上の除外マーカーの重み付きスコアを組み合わせてＳＬＥリスクを作成することとを含むロジスティック回帰分析を含むことができる。
【数１】
0006453299.tif 000002
【００２６】
そのような実施形態では、平均蛍光強度（例えば、フローサイトメーターからのアウトプット）を（ＥＣ４ｄ）および（ＢＣ４ｄ）について測定して、対数をとる。「ＡＮＡ２０」は、陽性率を指し、サンプル１ｍＬあたりのＡＮＡ単位の閾値を超える場合はＡＮＡ２０＝１であり、１ｍＬあたりの単位が閾値より下ではＡＮＡ２０＝０である。従来技術の当業者によって理解されるように、マーカーを「陽性」かそうでないか決定するための「閾値」は製造業者／アッセイによって異なるべきでないが、従来技術の当業者によって容易に決定され得る。「除外」は、アッセイがいずれかの「除外」マーカーについて陽性である場合に１、すべての「除外」マーカーが陰性の場合に０として決定される。
【００２７】
一つの実施形態では、ＳＬＥリスクスコアは、（ａ）ＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄについて正味の平均蛍光強度（蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定）の自然対数を決定すること、（ｂ）ＡＮＡが所定の閾値（キット製造業者または最終使用者によって定められた閾値など）に基づいて陰性（値が０）、中等度陽性（値が１）、または強陽性（値が２）であるかを決定すること、（ｃ）除外マーカーのいずれかが所定の閾値を超えて陽性（値が１）であるか、または除外マーカーのいずれも所定の閾値を超えずにすべてが陰性（値が０）であるかを決定すること、および（ｄ）（ａ）〜（ｃ）で決定された値を組み合わせてＳＬＥリスクスコアを作成することによって計算でき、任意で１つ以上の変換分析によって１種類以上のマーカーの量を調整することを含む。
【００２８】
さらなる実施形態では、ＢＣ４ｄマーカー量の決定はＢリンパ球の表面上のＢＣ４ｄの量を決定することを含み、ＥＣ４ｄマーカー量の測定は赤血球の表面上のＥＣ４ｄの量を決定することを含む。例えば、ＢＣ４ｄマーカー量の決定は、細胞中またはＢリンパ球を含む組織抽出物中のＢＣ４ｄの量を決定することを含むことができ、ＥＣ４ｄマーカー量の決定は、細胞中または赤血球を含む組織抽出物中のＥＣ４ｄの量を決定することを含むことができる。さらなる実施形態では、ＢＣ４ｄマーカーの量およびＥＣ４ｄマーカーの量は従来技術で知られているようなＣ４ｄに特異的な抗体を使用して決定される。
【００２９】
本発明は、個別マーカーの量を用いる最初の評価に基づいて陰性と考えられる全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有するリスクのある対象を診断および治療するための改良された方法を提供する。
【００３０】
対象は好ましくはヒト対象（成人または小児）である。ＳＬＥは血液中の異常な自己抗体の産生を特徴とする自己免疫疾患である。これらの自己抗体はそれぞれの抗原と結合して免疫複合体を形成し、循環して最終的に組織に沈着する。ＳＬＥのリスクのある対象は、限定されないが、倦怠感、発熱、慢性炎症、組織損傷；顔面の頬を覆う頬部発疹または「蝶型」発疹；円板状皮膚発疹、すなわち瘢痕の原因となり得る斑状発赤；光過敏症、すなわち太陽光線暴露に反応した皮膚発疹；粘膜潰瘍、すなわち口腔、鼻腔、または咽喉の内膜の潰瘍；関節炎、すなわち四肢の２つ以上の腫脹した圧痛関節；胸膜炎／心膜炎、すなわち心臓または肺周辺の内膜組織の炎症、呼吸時の胸痛；脱毛；腎臓の異常、すなわち異常な量の尿タンパク質または円柱と呼ばれる細胞要素の集塊；脳の炎症、すなわち発作（けいれん）および／または精神異常として出現する；血球数異常；免疫学的障害；ならびに梅毒の血液検査偽陽性を含む症状を有する可能性がある。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「生物学的サンプル」は、対象の体から得られる。対象から得られる適切な生物学的サンプルはいずれも使用できる。本発明の方法の使用に特に適したサンプルは血液サンプル、限定されないが腎バイオプシーを含むバイオプシーサンプルである。一つの実施形態では、血清学的マーカー（ＡＮＡ、ＣＥＮＰ、Ｊｏ−１、Ｌａ／ＳＳ−Ｂ、およびＳｃｌ−７０マーカーなど）は血液サンプルから得られるが、一方ＥＣ４ｄ、ＰＣ４ｄ、ＥＣＲ１、および／またはＢＣ４ｄマーカーは循環中の血液細胞に沈着されている。
【００３２】
血液サンプルは、補体活性を阻害するために、好ましくはＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で処理する。サンプルは室温で維持できるか、または４℃で保存できる。いくつかの実施形態では、全血サンプルは異なる成分に分画化できる。例えば、一つの実施形態では、赤血球は分画遠心分離によってサンプル中の他の細胞型から分離される。赤血球に結合した補体活性化産物（例、ＥＣ４ｄおよびＥＣＲ１）の分析は、分離された赤血球で実施できる。いくつかの実施形態では、白血球は血液サンプルの他の成分から分離される。例えば、白血球（バフィーコート）は、遠心分離によって血漿および赤血球から分離できる。白血球の各型（例、リンパ球、単球など）は、細胞型に特異的な既知細胞表面マーカーに対する抗体の利用によって分離できる。白血球の細胞表面マーカーに対する抗体は、従来技術の当業者に知られている。例えば、細胞表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＣＤ１９に特異的なモノクローナル抗体が市販されており、リンパ球を選択するために使用できる。ＢＣ４ｄのような白血球の表面上に認められる補体活性化産物の分析は、分離された白血球分画で実施できる。血小板分画を他の血液成分から得て、ＰＣ４ｄなどの血小板結合補体活性化産物の分析ができる。血小板分離は従来技術で知られている方法で実施でき、分画遠心分離または血小板に特異的な抗体（例、ＣＤ４２ｂ）を用いた免疫沈降が含まれる。 
【００３３】
特定のバイオマーカーの量（例、数量または量）は、従来技術の当業者に知られている様々な方法を用いてサンプル中で決定できる。このような方法には、限定されないが、フローサイトメトリー、赤血球、血小板、または白血球の溶解物（例、リンパ球溶解物）を用いたＥＬＩＳＡ、およびラジオイムノアッセイが含まれる。一つの実施形態では、Ｃ４ｄの量の決定は、各分子に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いた直接的または間接的免疫蛍光によって測定が実施されるフローサイトメトリー法を使用して行われる。これらの各分子は別々のサンプル（例、赤血球特異的分画、白血球特異的分画、または血小板特異的分画）または１つのサンプル（例、全血）を用いて測定できる。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「変換分析」は任意の適切な数学的操作であることができ、限定されないが、一般化モデル（例、ロジスティック回帰、一般加法モデル）、多変量解析（例、判別分析、主成分分析、因子分析）、および時間事象「生存」分析が含まれる。
【００３５】
本明細書の教示に基づいて従来技術の当業者によって理解されるように、重み付き係数は様々な技法によって決定することができ、幅広く変動し得る。適切な重み付き係数を決定する一つの例では、患者の２群、例えばＳＬＥを有する群および有さない群、で認められるマーカー量を用いて多変量ロジスティック回帰（ＭＬＲ）を行う。ＭＬＲで使用できる変数（マーカー）の選択にはいくつかの方法があり、これによって、選択されないマーカーはモデルから排除され、モデルに残った各予測的マーカーに対する重み付き係数を決定する。次にこれらの重み付き係数に、例えばサンプル中のマーカー量（限定されないが、重量／容量、重量／重量、重量／沈降細胞数などの任意の適切な単位で表示される）を乗じて、例えば合計すると、ＳＬＥリスクスコアを算出することができる。
【００３６】
一つの限定されない実施形態では、インデックススコア（例えば、ＡＮＡおよび除外マーカー）を構成するいくつかの成分は、所定の閾値／カットオフ値（例えば、ＡＮＡ成分は０、１、または２の値を有することができ、除外マーカーは０または１の値を有することができる）と関連することができる。このような状況では、インデックスはＡＮＡまたは除外マーカーの閾値判定限界での分析誤差によって、陽性から陰性（またはこの逆）に変動する可能性があり得る。そのため、いくつかの実施形態では、インデックススコアを決めるために使用される成分を、閾値／カットオフ値（例、ＡＮＡおよび／または除外マーカー）を用いて評価して、閾値の２０％以内である（従って、インデックスの陽性または陰性に影響する可能性がある）場合に、当該インデックスについて「不確かな結果」を定義することができる。この実施形態では、スコアは不確かとして注記されるべきである。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「組み合わせる」は閾値と比べることができる一つのスコアが得られるようにマーカーを組み合わせて使用する任意の数学的操作（加減乗除、およびこれらの組み合わせ）を含む。これらの方法では、マーカーの量は適切な重み付き係数を用いて調整できる。
【００３８】
本方法は、測定したＳＬＥリスクスコアと標準ＳＬＥリスクスコアの比較を使用することができる。任意の適切な比較標準を用いることができ、これには限定されないが、正常者またはＳＬＥを有する対象の集団のＳＬＥリスクスコアの所定の量または範囲、または本明細書で説明されるそれ以外の量又は範囲が含まれる。本明細書で使用されるとき、「所定の量」または「所定の範囲」は、コントロール対象（すなわち健常者）またはＳＬＥのような自己免疫疾患もしくは非ＳＬＥ自己免疫障害に罹患した対象の集団で測定された特定のＳＬＥリスクスコアの数値または量（例、絶対値または濃度）から決定することができる値または値の範囲を意味する。ＳＬＥリスクスコアの所定の量または所定の範囲は、最大の統計学的有意性を達成するＳＬＥリスクスコア値の値または範囲を計算することによって選択できる。いくつかの実施形態では、所定の量はコントロール／正常対象の集団から得るＳＬＥリスクスコアの分散に基づくことができる。例えば、所定の量は正常範囲ＳＬＥリスクスコアをより少なくとも２、３、４、または５標準偏差上であることができる。ＳＬＥリスクスコアの所定の量または所定の範囲は、その量または範囲内のＳＬＥリスクスコアを有する患者の５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％超がＳＬＥを有するＳＬＥリスクスコアの量または範囲を計算することによっても決定することができる。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「診断する／診断」はＳＬＥの存在または性質を特定することを意味する。診断方法は、その感度および特異性が異なる。診断アッセイの「感度」は、検査が陽性である疾患患者の割合である（「真の陽性」率）。アッセイで検出されない疾患患者は「偽陰性」である。疾患がなく、アッセイで検査陰性の対象は「真の陰性」という。診断アッセイの「特異性」は、１から偽陽性率を引いた値であり、「偽陽性」率は検査陽性であるが疾患を有さない対象の比率として定められる。特定の診断方法は状態の確定診断を提供しないかもしれないが、この方法が診断の助けとなる陽性の指標を提供すれば十分である。
【００４０】
ＳＬＥリスクスコアに少なくとも一部基づいてＳＬＥまたは別の疾患について対象を「治療する」とは、ＳＬＥリスクスコアに基づいてＳＬＥを有する可能性があるものと特定されたこれらの対象が、主治医または他の医療従事者によって適切であるとみなされてＳＬＥのために治療されることを意味する。このような治療には、限定されないが、免疫抑制剤（例、シクロホスファミド、コルチコステロイドなど）および／または疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ、例、メトトレキサート、アザチオプリン、レフルノミド、ベリムマブ、ならびにプラキニルおよびヒドロキシクロロキンなどの抗マラリア剤）が含まれる。疾患修飾性抗リウマチ剤（ＤＭＡＲＤ）は、疾患過程である再燃の発生を減少させて、ステロイド使用の必要性を低下させるために予防的に用いられ、再燃が生じた場合はコルチコステロイドで治療される。
【００４１】
本明細書で説明されるように本発明のすべての態様の方法は、手作業で実施でき、または自動化システムもしくはコンピュータと連結されて使用できる。例えば、本方法は自動化システムを用いて実施でき、自動化システムでは、対象の血液サンプルを分析して、特定のバイオマーカーの量を決定し、所定の量または所定の範囲との比較を、この目的に適したソフトウェアによって自動的に実行する。本発明の方法に使用するためのコンピュータソフトウェアまたはコンピュータ読み取り可能メディアには、（ａ）赤血球またはリンパ球（例Ｂ細胞）の表面上に沈着した補体成分Ｃ４ｄの決定に対応するデータを受け取る、および生物学的サンプルにおけるこのようなサンプルであるＡＮＡ、ＳＳＢ（Ｌａ）マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー、Ｊｏ−１マーカー、ＣＥＮＰマーカー、および／または抗ｄｓＤＮＡ抗体の量に対応するデータを受け取るためのコード、（ｂ）個別のこのような細胞の表面上に沈着した補体成分Ｃ４ｄの所定量を回収する、およびこのような実例であるＡＮＡ、ＳＳＢ（Ｌａ）マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー、Ｊｏ−１マーカー、ＣＥＮＰマーカー、および／または抗ｄｓＤＮＡ抗体の所定量を回収するためのコード、ならびに（ｃ）（ａ）のデータを（ｂ）の所定の量と比べて正確なＳＬＥ診断ができるか、または他のバイオマーカーの追加測定が必要かどうか決定するためのコード、を含むコンピュータ読み取り可能メディアが含まれる。
【００４２】
本発明の特定の実施形態では、バイオマーカー量の１つ以上の所定の量または所定の範囲はデジタルコンピュータに関連するメモリに保存できる。そのようなサンプルである補体Ｃ４ｄ、ＡＮＡ、ＳＳ−Ｂ（Ｌａ）マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー、Ｊｏ−１マーカー、ＣＥＮＰマーカー、および／または抗ｄｓＤＮＡ抗体の決定に対応するデータが（適切な分析装置から）得られた後、デジタルコンピュータは測定したバイオマーカーデータを１つ以上の適切な所定の量または所定の範囲と比較できる。比較が実施された後、デジタルコンピュータはデータがＳＬＥの診断を示すかどうか自動的に計算できる。
【００４３】
従って、本発明のいくつかの実施形態はデジタルコンピュータによって実行されるコンピュータコードによって具体化される。デジタルコンピュータは、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）をベースとしたオペレーションシステムなどの標準的または専門的オペレーションシステムを用いたマイクロ、ミニ、または大型コンピュータであることができる。コードは、任意の適切なコンピュータ読み取り可能メディアに保存できる。コンピュータ読み取り可能メディアの例には磁気、電子、または光ディスク、テープ、スティック、チップなどが含まれる。コードは従来の通常な技術の当業者によって、Ｃ、Ｃ＋＋などを含む適切なコンピュータプログラム言語で書くことができる。
【００４４】
このため、本発明はさらに、サンプル中のマーカー量を測定するための装置に本発明のいずれかの態様または実施形態の方法を実行させるための使用説明書のセットを含む、非一時的コンピュータ読み取り可能ストレージメディアを含む。さらなる態様では、本発明は、血液サンプルのようなサンプル中の列挙されたマーカーの量を測定するための装置に連結されたコンピュータ上で本発明の方法を自動的に実行するための非一時的コンピュータ読み取り可能ストレージメディアを提供する。本明細書で使用される場合、「コンピュータ読み取り可能メディア」は、ＣＰＵによって読み取り可能な磁気ディスク、光ディスク、有機メモリ、および他の任意の揮発性（例、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」））または非揮発性（リードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」））大容量ストレージシステムを含む。コンピュータ読み取り可能メディアは連携または相互接続したコンピュータ読み取り可能メディアを含み、これは処理システムのみに存在すか、または処理システムに対してローカルもしくはリモートであり得る複数の相互接続した処理システム間で分配される。限定されないが、フローサイトメトリー装置およびＥＬＩＳＡを実施する装置を含む、マーカーの量を測定するのに適切な任意の装置を使用することができる。
【００４５】
本発明はまた、ＳＬＥを診断するためのキットおよびテストの組み合わせを提供する。一つの実施形態では、本発明はＥＣ４ｄの量のための第一テスト、ＢＤ４ｄの量のための第二テスト、ＳＳ−Ｂ（Ｌａ）マーカー、Ｓｃｌ−７０マーカー、Ｊｏ−１マーカー、およびＣＥＮＰマーカーの１種類以上（１、２、３、または４種類すべて）の量のための第三テスト、ＡＮＡの量のための第四テスト、および抗ｄｓＤＮＡ抗体の量のための第五テストのうち少なくとも３テスト（すなわち３、４、および５テストすべて）を含むＳＬＥの診断のために有効なテストの組み合わせを含む。特定のバイオマーマーカーの量を測定するためのキットまたはテストには、本明細書で説明される方法に従って測定を実施するための様々な試薬が含まれる。例えば、一つの実施形態では、キットまたはテストにはバイオマーカーそれぞれの免疫蛍光測定を実施するための試薬が含まれ、列挙された標的に特異的な１種類以上のマーカーに特異的なモノクローナル抗体と蛍光部分の共役体などが含まれる。さらに本キットには、例えば緩衝液、放射性物質標識抗体、比色試薬、全血から異なる細胞分画を分離するための説明書、およびバイオマーカーの特定の所定量に基づいてＳＬＥを診断するための説明書が、このタイプのアッセイを実施する上で必要な他の材料として含まれる。
【００４６】
別の実施形態では、本キットまたはテストは、ＥＬＩＳＡまたはラジオイムノアッセイのような、バイオマーカーのそれぞれについて他の標準アッセイを実施するための試薬を含む。このような実施形態では、本キットまたはテストは放射性ヨウ素、アビジン、ビオチン、またはペルオキダーゼのような酵素などの適切な標識と共役体化された、列挙された標的に特異的なモノクローナル抗体または他のマーカーを含む。さらに本キットは緩衝剤、抗体共役体化酵素の基質、全血から異なる細胞分画を分離するための説明書、およびバイオマーカーの特定の所定量に基づいてＳＬＥを診断するための説明書を含む。
【００４７】
本明細書で説明される実施例および実施形態は説明の目的のためだけであり、これを踏まえた様々な改良または変更は従来技術の当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内および添付の請求項の範囲内に含まれるものと理解される。本明細書に引用されるすべての参照文献、刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のためにそれらの全体として参照によって組み込まれる。
【００４８】
実施例
諸言
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己抗体媒介組織損傷および生命を脅かす可能性がある多臓器不全を引き起こす慢性自己免疫疾患である（１）。この異成分からなる炎症性疾患は米国で１６１，０００から３２２，０００名の成人に罹患しており、女性が男性よりも９倍多く罹患している（２）。さらに有病率は白人に比べてアフリカ系アメリカ人およびヒスパニック系で高く、社会人口統計学的背景が予後不良を予測的に示している（３）。ＳＬＥの所見は多様であり、発疹、関節炎、貧血、血小板減少症、漿膜炎、腎炎、発作、および精神異常が含まれる。これらの症状は異成分からなり、非特異的、進行的であり、しばしば他の疾患と類似した症状であるため、ＳＬＥの診断は複雑であり、医師にとって困難となり得る。ＳＬＥの診断は、患者の病歴、現在の症状、および臨床検査の組み合わせに依存する。１９８２年に公表された改訂版米国リウマチ学会基準（４）は患者がＳＬＥを有するものとして分類するために１１項のうち４項目の存在を要求しているが、臨床診療におけるこれらの基準の利用は統一されていない（５）。ＳＬＥの診断を支援するために一般的に使用されている標準的な臨床検査の中で、主なものは抗核抗体（ＡＮＡ）および抗二本鎖ＤＮＡ（抗ｄｓＤＮＡ）抗体である（６）。それでもＡＮＡおよび抗ｄｓＤＮＡ抗体には限度があり、これらの血清学的マーカーはいずれもＳＬＥを診断する上で適切なバランスの感度および／または特異性を提供しない。補体活性化がＳＬＥの発病の中心であること（７）、赤血球およびＢ細胞に沈着した細胞結合Ｃ４ｄフラグメントがＳＬＥの診断を容易にすることができる（８〜１１）ことは十分認識されている。さらに、疾患の活動性にＣＢ−ＣＡＰが関与する可能性が報告によって確立されており（１２，１３）、治療にあたる医師がＳＬＥ患者を管理するのをこれらの測定が支援する可能性がある。
【００４９】
本発明者らは、大規模な多施設横断試験においてＳＬＥの診断に対するＣＢ−ＣＡＰの関与をすでに確立し（１４）、本発明者らのデータによって赤血球、Ｂ細胞、血小板上の過剰なＣ４ｄ補体沈着、または赤血球上の低いＣＲ１発現が、ＳＬＥでは他の疾患と比べて一般的に７倍異なることが確証された（１４）。しかし、これらのマーカーの発現の有意な重なりがＳＬＥと他のリウマチ疾患の間で認められ、これによって個別ＣＢ−ＣＡＰのいずれも、適切なバランスの臨床感度と特異性を単独で達成しないことが示された（１５）。この試験では、抗ｄｓＤＮＡは感度がないが（２９．５％）、なおも特異的マーカー（＞９５％）であり、一方ＡＮＡは、感度はあるが特異性に乏しいマーカーであった。本発明者らは抗ｄｓＤＮＡの高い特異性（低い偽陽性率）を頼りにして、ＣＢ−ＣＡＰのＡＮＡおよび抗ＭＣＶの診断価値が増加するか否かを評価した。抗ｄｓＤＮＡ陰性者では、対数標準化したＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄマーカーの段階的追加によって、十分な特異性を維持しつつ、感度が有意に増加した。抗ＭＣＶによってさらに寄与される特異性の増加は、関節リウマチ（ＲＡ）に依存し（ＲＡに対する特異性は抗ＭＣＶなしでは８７．７％であるのに対してＭＣＶと併せると９７．４％であった）、全体的なＳＬＥ感度を高める、より最適なカットオフの選択を可能にした。ＡＮＡ、ＥＣ４ｄ、ＢＣ４ｄの重み付けされた合計を抗ＭＣＶと一緒に組み合わせるインデックススコア（＞０）は、ＳＬＥに対して感度があり（７１．６％）、特異的（９０．１％）であった。結局、抗ＤＮＡとインデックススコアの組み合わせは、抗ＤＮＡ単独と比較して臨床感度を２９．５％から８０．０％に改善した。この臨床感度の５０．５％の改善は、特異性が９６．１％から８６．５％へと９．６％低下したことよりも大きく価値がある。さらに抗ｄｓＤＮＡおよびＡＮＡの組み合わせと比べたとき、抗ｄｓＤＮＡとインデックススコアの組み合わせによって、特異性が３０．３％改善し（５９．０％対８９．３％）、感度の低下は１０％のみ（８９．０％対７９．０％）であった。
【００５０】
しかし、我々の診断方法の特異性はＲＡを有する患者に対して高いが、強皮症、皮膚筋炎、血管炎、およびシェーグレン症候群を含む他の疾患に対する特異性は７５％より有意に低く、従って臨床診療における本診断方法の価値はおそらく限定された。
【００５１】
方法
臨床試験計画およびバリデーション計画
多変量インデックスの性能特性を、２０１０年５月から８月（コホート１）および２０１１年６月から２０１３年９月（コホート２）に登録した対象の２群のコホートで確立した。
【００５２】
試験設計および計画
２つの独立した試験（コホート１および２）は多施設横断試験であり、対象の１回の受診が必要であった。診断の方法論の性能特性を評価するために経過観察の受診は要求されなかった。対象のインフォームドコンセントを得た後、下記の処置を実施した。
・ありとあらゆるリウマチ状態の診断に関連する対象の病歴を得、組み入れ／除外基準およびこれらの状態の診断に関する詳細を検討した。
・診断の日付をＳＬＥおよび他のリウマチ状態について記録し、適合した具体的なＳＬＥ診断基準を文書で記録した（ＳＬＥ分類のための改訂ＡＲＣ基準)（Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２；Ｈｏｃｈｂｅｒｇ，１９９７）。
・対象の人口統計学的データを記録した（誕生日、性別、人種／民族）。
・試験紙による尿妊娠検査を妊娠可能なすべての女性に実施した。
・ＣＢ−ＣＡＰＳ（ＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄ）、ＡＮＡ、抗ｄｓＤＮＡ、抗ＭＣＶ、およびＥＮＡ抗体の分析用に患者の血液を約１５ｍＬ採取し、血液サンプルは空腹または非空腹のいずれかの条件で得た。サンプルは７．５ｍＬのＥＤＴＡ採血管（薄紫色キャップ）１本、および発送前に遠心分離を必要とするＳＳＴ採血管（濃赤色キャップ）１本で構成された。すべての生物学的サンプルは試験施設からＥｘａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓに（提供された輸送キットを用いて）翌日到着で送られた。ＣＢ−ＣＡＰＳはサンプル採取から４８時間以内で分析されるべきであるため（分析前の変数プロジェクトＩＤ２５９４５参照）、サンプルは土曜日には受け付けず、従って対象は月曜日から木曜日でのみ登録された（木曜日の出荷期限時刻は午前１０：００であった）。
・血液を採取して、施設からＥｘａｇｅｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、基幹施設）に発送した。分析検査室における盲検性を維持するため、対象の診断を開示するＣＲＦおよび対象の任意の情報を、Ｅｘａｇｅｎ臨床プロジェクト管理者にファックス送信して、一方、分析用の血液サンプルは、記入済みの対象の個別の依頼書を添付して、分析検査室に直接送付された。これらの検査の結果は、試験の実施中は治験責任医師が利用できないようにされた。検体は対象の番号およびイニシャルによってのみ特定され、分析検査室には対象の特定の診断が知らされなかった。臨床チームのみが試験を通して患者の診断にアクセスできた。
・赤血球およびＢリンパ球を分離、洗浄して、Ｃ４ｄに特異的なモノクローナル抗体および／またはポリクローナル抗体を用いて蛍光標識し、および本発明者らの臨床検査室でバリデートされたアッセイを用いてフローサイトメトリーによって分析した。平均蛍光強度を、各細胞表面マーカーの発現量の指標として使用して、ｄｓＤＮＡ、ＡＮＡ、抗ＭＣＶ、およびＥＮＡに対する抗体を、インビトロ診断薬としてＦＤＡによって承認された固相イムノアッセイを用いて測定した。製造業者のカットオフを、抗ＭＣＶ以外のすべてのＥＬＩＳＡに使用した。
【００５３】
試験集団の選択
組み入れ基準：
・読む、理解する、そしてインフォームドコンセント書式に署名できる
・年齢が１８歳以上
・同意を得て血液サンプルを採取することができる
・リウマチ状態を有する対象は、次の２つの分類の一つに該当しなければならない。
・ＳＬＥの分類に関する改訂ＡＣＲ基準に従ってＳＬＥと診断される
表１にＳＬＥの分類に関する基準を示す。
【表１】
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・病歴のいずれかの時点で十分に立証された１１項目の基準の４項目以上のいずれかの組み合わせがあれば、患者がＳＬＥを有している可能性がある。
・次のリウマチ障害の１つを有すると診断される：
抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、線維筋痛症（ＡＮＡ陽性患者のみ）、全身性硬化症、関節リウマチ、多発性筋炎、皮膚筋炎、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、クリオグロブリン血管炎、白血球破砕性血管炎、他の免疫学的血管炎、原発性シェーグレン症候群
・さらに約２００名の健常者ボランティア（除外規定参照）を登録した。
【００５４】
除外基準
健常ボランティアのみに適用：心血管、精神、神経、胃腸管（例、胃または十二指腸潰瘍、炎症性大腸炎、ＧＩ出血歴）、代謝、肺（例、喘息、ＣＯＰＤ）、腎臓（腎不全を含む）、肝臓、血液、免疫、内分泌の病的状態（例、甲状腺機能低下、糖尿病）、活動性感染症、または慢性感染症（Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎またはＨＩＶ）の病歴、新生物疾患、および／または減量手術の既往を含む、治験責任医師の判断に基づく臨床的に重要な同時期の病的状態
・原発性免疫不全症候群の明白なまたは検査による証拠
・妊婦または授乳中の女性
【００５５】
試験方法
米国内の約１５か所の参加施設から集めた約３００名のＳＬＥ、３００名の非ＳＬＥリウマチ疾患、および２００名の健常者からなる合計８００名の被験者に基づくデータを、被験者の２つのコホートのために計画した。参加施設はバランスのとれたサンプルを確保するためにＳＬＥを有する被験者および他のリウマチ状態を有する対象を同じ人数採用するように促された。ＣＢ−ＣＡＰＳおよび他の血清学的マーカー用に各対象から血液を採取した。
【００５６】
試験依頼者に提出されたすべてのデータおよび血液サンプルは、対象のＩＤ番号を使用して厳密に名前が伏せられた。各施設には２桁の場所番号が割り当てられ、各施設は第二ＩＤ番号を割り当てられた。各施設はその場所での試験番号および関連する対象の名前のリストを維持する責任を有した。すべての対象の識別子は解説文書から除かれ、すべての血液サンプルは被験者ＩＤ番号およびイニシャルによってのみ識別された。さらに試験依頼者の臨床検査室には、すべての被験者の診断が隠された。
【００５７】
統計分析
統計分析をＲソフトウェアのバージョン２．１５．０を用いて実施した。統計分析は、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積（ＳＬＥ対健常対象を除く非ＳＬＥ患者）、ならびに診断感度および特異性の計算を利用した。受信者動作特性を、それぞれのマーカー（単変量分析）関して必要に応じて使用し、またインデックス値の決定後に多変量ロジスティック回帰式のアウトプットとして使用した。性能の評価として感度および特異性を計算した。報告された性能統計値（感度、特異性）、ＲＯＣ  ＡＵＣは一つ抜き交差検証によって計算した。
【００５８】
臨床成績
全３０４名のＳＬＥ患者、および他のリウマチ疾患を有する２８５名の患者（女性が８７．８％、平均年齢４８歳）が分析に適格であった。他のリウマチ疾患を有する２８５名の群には、ＲＡ（患者１６１名、女性８５％、平均年齢５９歳）、全身性硬化症（患者３５名、女性８０％、平均年齢５３歳）、多発性筋炎／皮膚筋炎（ＰＭ／ＤＭ：患者２７名、女性８１％、平均年齢５６歳）、原発性シェーグレン症候群（患者３３名、女性９４％、平均年齢５６歳）、他の種々なリウマチ疾患を有する患者２９名（女性８３％、平均年齢５５歳）（多発性血管炎を有する肉芽腫症［５名］、線維筋痛症［１３名］、血管炎［１０名］、抗リン脂質症候群［１名］）が含まれた。また全部で２０５名の健常者（女性６６％、平均年齢４１歳）も登録した（表２）。
【表２】
0006453299.tif 000004
【００５９】
患者３０４名の特性を表３に示す。
【表３】
0006453299.tif 000005
【００６０】
ＳＬＥ診断法で使用されるマーカーの単変量分析
血清学的マーカー（ＡＮＡ、抗−ｄｓＤＮＡ、抗ＭＣＶ、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、ＣＥＮＰ、Ｓｃｌ−７０、スミス)およびＣＢ−ＣＡＰを、登録したすべての対象で決定した（ｎ＝７９４）。ＡＮＡ（≧２０単位）は感度のよいマーカーであった（陽性９１．７％、試験したＳＬＥ患者２７９名）が、他のリウマチ疾患に対してかなり非特異的であった（５２．３％）（表４）。
【００６１】
ＳＬＥ患者３０４名のうち、これらのＳＬＥ患者の計１０１名が固相アッセイによる抗ｄｓＤＮＡ検査陽性であり（３３．２％）、９７例の検査結果がＣｒｉｔｈｉｄｉａ  Ｌｕｃｉｌｉａｅ間接免疫蛍光アッセイ（ＩＮＯＶＯ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｃｓ）を用いて陽性が確証され、このため３１．９％（９７／３０４）の最終感度を得た。計１１名の非ＳＬＥ対象（ＲＡが６名、強皮症が２名、血管炎が２名、健常者が１名）が、ＥＬＩＳＡによる抗ｄｓＤＮＡ検査陽性（＞３０１単位）であったが、これらのうち３名（ＲＡが２名、強皮症が１名）はＣｒｉｔｈｉｄｉａアッセイによって陽性が確証されず、そのため他の疾患に対して９７．２％（２７７／２８５）および健常者に対して９９．５％（２０４／２０５）の特異性を得た。抗スミスは感度が不良であった（１４％）が、ＳＬＥの非常に特異的なマーカーであった（１００％）。または、抗ＭＣＶ（カットオフ７０単位）、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ（＞１０単位）、Ｓｃｌ−７０（＞１０単位）、およびＪｏ−１（＞１０単位）はそれぞれ、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、およびＰＭ／ＤＭ患者に特異的であった（表４）
【表４】
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【００６２】
表５に示すように、ＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄの量はＳＬＥでは他の疾患または正常対象よりも７倍高かった。７５単位を超えるＥＣ４ｄまたは２００単位を超えるＢＣ４ｄ量が、ＳＬＥに対して非常に特異的であった。他の疾患を有する対象では２８５名中２名のみ（ＲＡが１名、血管炎が１名）が、それぞれ７５および２００単位を超えるＥＣ４ｄまたはＢＣ４ｄ量を示した（特異性９９．３％）。または、ＳＬＥ患者の計４８名（１６％）が高いＥＣ４ｄまたはＢＣ４ｄを示した。
また、１２ＭＦＩを超えるＥＣ４ｄ量は、ＳＬＥとＮＨＶを区別するのに９７％特異的であり、一方４８単位を超えるＢＣ４ｄ量は９６％特異的であった。
【表５】
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【００６３】
多変量インデックスアッセイ−分析後のデータ整理
使用した診断方法論では二階層法を用いた。第一階層では、抗ｄｓＤＮＡ陽性（＞３０１単位、Ｃｒｉｔｈｉｄｉａによって確証）、または抗スミス陽性（＞１０単位、製造業者のカットオフ、ＳＬＥの基準）、または高いＥＣ４ｄ（＞７５単位）、またはＢＣ４ｄ（＞２００単位）は、ＳＬＥを示唆する。第一階層で陰性の対象で決定される第二階層では、重み付きインデックススコアは、ＡＮＡ成分（ＡＮＡ≧２０単位、≧６０単位）、ＣＢＣＡＰＳ成分（対数標準化したＥＣ４ｄ＋ＢＣ４ｄ）、ならびに抗ＭＣＶ（＞７０単位、ＲＡマーカー）、またはＳＳ−Ｂ／Ｌａ（＞１０単位、シェーグレン疾患マーカー）、またはＣＥＮＰ／Ｓｃｌ−７０（＞１０単位、強皮症マーカー）、またはＪｏ−１（＞１０単位、多発性筋炎／皮膚筋炎）の陽性率からなる特異性成分を累加する。インデックス＞０はＳＬＥを示唆し、二階層の組み合わせが全体の性能特性の結果となる。図１は、使用した二階層診断方法論を要約する。
【００６４】
第一階層：性能特性
登録した対象７９４名のうち、これらの計１５０名が第一段階マーカーの少なくとも１つに対して陽性の試験結果であった（Ｃｒｉｔｈｉｄｉａによって確証されたｄｓＤＮＡ＞３０１単位、または抗Ｓｍ＞１０単位、またはＥＣ４ｄ＞７５単位、またはＢＣ４ｄ＞２００単位）。これらの対象１５０名のうち、１４０名がＳＬＥを有し（感度４６．１％、１４０／３０４）、一方これらの９名は他のリウマチ疾患を有した（ＲＡが５名、全身性硬化症が１名、血管炎が２名、ＡＰＳが１名、正常１名を含む）（９６．８％の特異性、２７６／２８５）。健常対象を区別する特異性は９９．５％（２０４／２０５）であった（表６）。
【表６】
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【００６５】
第一階層で陽性のＳＬＥ患者１４０名のうち、全体でこれらの４８名（３４．３％）がＥＣ４ｄ＞７５単位またはＢＣ４ｄ＞２００単位で陽性の試験結果であった。これによって、第一階層で試験結果が陰性であった全６４５名（ＳＬＥが１６５名、他の疾患が２７６名、健常者が２０４名）を、第二階層でロジスティック回帰によって分析した。
【００６６】
第二階層性能特性
ＳＬＥ（ｎ＝１６５）および他の疾患（ｎ＝１１１）を有する患者でのロジスティック回帰分析は、ＥＬＩＳＡによるＡＮＡの陽性率（ＡＮＡ成分）を、対数標準化したＥＣｄ４およびＢＣ４ｄ量（ＣＢＣＡＰＳ成分）ならびに抗ＭＣＶ（＞７０単位）、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ（＞１０単位）、ＣＥＮＰ（＞１０単位）、Ｓｃｌ−７０（＞１０単位）、またはＪｏ−１（＞１０単位）の陽性率の複合抗体特異性成分とともに使用した。
【００６７】
多変量ロジスティック回帰のＡＮＡ成分は２つの閾値を使用した。これは陰性ＡＮＡ（ＡＮＡ＜２０単位、この場合ＡＮＡ成分に０の値を割り当てた）、中等度陽性（ＡＮＡ２０〜６０単位、この場合ＡＮＡ成分に１の値を割り当てた）、および強陽性（ＡＮＡ＞６０単位、この場合ＡＮＡ成分に２の値を割り当てた）から構成された。抗体特異性成分の陽性率は、他の疾患を有する対象の４０．２％（１１１／２７６対象）と比べてＳＬＥでは９．１％（１５／１６４陽性）であった。３名の正常対象だけが第二階層の特異性成分が陽性であった。
【表７】
0006453299.tif 000009
【００６８】
表８は第二階層における多変量ロジスティック回帰の推定値を明らかにしている。推定値は健常者を除くＳＬＥおよび非ＳＬＥ対象を用いて計算した。
【表８】
0006453299.tif 000010
【００６９】
ロジスティック回帰モデルのアウトプットに対応するインデックス方程式は次の通りである。
方程式１  第一階層陰性患者におけるインデックス方程式
【数２】
0006453299.tif 000011
【００７０】
ＡＮＡ成分（ＡＮＡＣｏｍｐ）：ＡＮＡ＜２０単位の場合、ＡＮＡ成分は０の値を割り当てられた。ＡＮＡが中等度陽性（ＡＮＡ２０〜６０単位）の場合、ＡＮＡ成分は１の値を割り当てられた。ＡＮＡが強陽性（≧６０）の場合、ＡＮＡ成分は２の値を割り当てられた。
特異性成分（Ｓｐｅｃ．Ｃｏｍｐ）：特異性成分のすべてのマーカー部分（抗ＭＣＶ＞７０単位、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ＞１０単位、ＣＥＮＰ＞１０単位、Ｓｃｌ−７０＞１０単位、またはＪｏ−１＞１０単位）がそれぞれのカットオフ値より下である場合、結果を０として入力した。反対に、特異性成分のマーカーのいずれかがそれぞれのカットオフを超える場合、結果を１と入力した。ｌｏｇはＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄの正味ＭＦＩの自然対数に対応する。
【００７１】
インデックス計算の例を表９に示す。
【表９】
0006453299.tif 000012
【００７２】
インデックススコアは他の疾患では−１．７４（中央値）（ＩＱ範囲：−２．５４；−０．９０）、ＳＬＥでは０．４７（中央値）（ＩＱ範囲：−０．６４；１．７９）であった（図２）。ＮＨＶでは−１．４６（中央値）（ＩＱ範囲：−１．１７；１．８６）であった。表１０はＳＬＥおよび対照群（非ＳＬＥおよびＮＨＶ）で認められたインデックス値の中央値を明らかにする。感度は６３．６％、他の疾患に対する特異性は、患者に関して８８．８％（２４５／２７６）および健常対象に対して９７．５％（１９９／２０４）であった。−２．５単位でカットオフを設定すると、ＳＬＥに対する９８．７％の感度および他のリウマチ疾患に対する２４．９％特異性（健常者に対して５．８％特異性）が得られた。または＋２．５単位でカットオフを設定すると、ＳＬＥに対して５０．０％の感度および他のリウマチ疾患に対して９６．１％の特異性が得られる（健常者に対して１００％特異性）。
【表１０】
0006453299.tif 000013
【００７３】
全体的な性能特性−２階層組み合わせ
第一階層とインデックススコア（カットオフゼロを使用）の組み合わせにより、ＳＬＥについて８０．３％（２４４／３０４）の感度、およびＳＬＥと他のリウマチ疾患を区別する８５．５％（２３６／２７６）の特異性を得た。ＳＬＥを健常対象と区別する特異性は９７．１％（１９９／２０５）であった。組み合わせた２階層分析の結果を表１１に示す。
【表１１】
0006453299.tif 000014
【００７４】
基本モデルへのＣＢＣＡＰＳおよび特異性成分の段階的追加
二階層法の性能特性を、ＣＢＣＡＰ（ＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄ）および特異性成分を加えずに得た性能特性（基本モデル）とも比較した。基本モデルは第一階層の抗ｄｓＤＮＡおよび抗Ｓｍ、ならびに第二階層のＡＮＡ成分による二階層分析から構成した。ＣＢＣＡＰＳおよび特異性成分の段階的追加を表１２に示す。表１３に示すように、ＣＢＣＡＰおよび特異性成分の追加により、性能特性および基本モデルが改善され、０．８９４のＡＵＣを生じ、８０％の感度、および他の疾患とＳＬＥを区別する８６％の特異性を得た。抗体特異性成分はＲＡ、原発性シェーグレン症候群、ＰＭ／ＤＭ、および全身性硬化症に関する診断方法論の特異性を最大にする。ＳＬＥと正常対象を区別する特異性は、基本モデルで９０．２％、ＣＢＣＡＰＳを加えたモデルで９４．１％、および全モデルで９７．１％であった。
【表１２】
0006453299.tif 000015
【表１３】
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【００７５】
コホート分析および従来法との比較
２つのコホート間の感度の差（コホート１＝８１％対コホート２＝７９％）は統計学的に有意でなかった（ｐ＝０．６５２）（全体感度＝８０％）。また、ＳＬＥを他の疾患から区別する特異性の差も統計学的に有意でなかった（コホート１＝８７％対コホート２＝８４％、ｐ＝０．４８５）（全体特異性＝８６％）。また、本発明者らは、本二階層法の性能特性を従来のアッセイの特性と比較した（表１４）。結合組織疾患に特異的な血清学的マーカー（ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、Ｓｃｌ−７０、ＣＥＮＰ、Ｊｏ−１）の追加によって、診断方法論の特異性が６４％から７９％に改善する。（組み合わせたデータセット：ｐ＝０．０２４）。
【表１４】
0006453299.tif 000017
【００７６】
インデックスの分析再現性
インデックスの日間再現性もまた、ＳＬＥを有する患者１１名から得る全１９サンプルについて決定した。複数回インデックス決定を行う患者では、１週間隔で血液を採取した。これらの患者は臨床バリデーション試験（コホート１およびコホート２）の対象ではなかった。ＡＮＡ、ＣＢＣＡＰＳ、および抗体特異性成分の複合インデックスを３日連続で連続３回測定した。表１５に日間変動を明らかにする。
【表１５】
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【００７７】
標準偏差の中央値は０．１２（０．０３〜０．２６の範囲）であった。
【００７８】
不確かな結果の定義
不確かなＡＮＡおよび特異性成分に基づく不確かなインデックス結果
インデックススコア（ＡＮＡおよび抗体特異性成分）を構成する３成分のうち２成分はカットオフと関連することから（ＡＮＡ成分は０、１、２の値を有し得る、抗体特異性成分は０または１の値を有し得る）、インデックスは、ＡＮＡ（２０単位、６０単位）、または特異性成分を形成する各マーカー（抗ＭＣＶ［７０単位］、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ［１０単位］、ＣＥＮＰ［１０単位］、Ｊｏ−１［１０単位］、もしくはＳｃｌ−７０［１０単位］）に関する医学的判定限界での分析誤差に基づいて陽性から陰性（またはこの逆）に変わる可能性がある。例えば、表１６に示すように、１０単位の判定限界でのＳＳ−Ｂ／Ｌａの２単位の差（９単位対１１単位）に基づいて、インデックスが−１．０（ケース２、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ＝９単位、特異性成分＝０）から＋１．５（ケース１、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ＝１１単位、特異性成分＝１）に変化し得る。
【表１６】
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【００７９】
このことから、ＡＮＡおよび／または特異性成分を形成するマーカーがカットオフ値近辺である（従ってインデックスの陽性または陰性におそらく影響を及ぼすことができる）場合、インデックスについて不確かな結果を定義しなければならない。本発明者らは、ＡＮＡ量が１６から２４単位の範囲（２０単位のカットオフで２０％ＣＶ）、または４８から７２単位の範囲（６０単位のカットオフで２０％ＣＶ）のときに不確かなＡＮＡ成分を定義した。または、抗ＭＣＶ量が５６から８４単位の範囲（７０単位のカットオフで２０％ＣＶ）のとき、またはＳＳ−Ｂ／Ｌａ、ＣＥＮＰ、Ｓｃｌ−７０、およびＪｏ−１が８から１２単位の範囲（１０単位のカットオフで２０％ＣＶ）のときに不確かな抗体特異性成分を定義した。
【００８０】
表１７に示すように、陽性から陰性へのインデックス値の変動はまた、インデックス方程式中のＣＢＣＡＰＳ成分に大きく依存する。インデックスに関する不確かな結果に基づく決定則を確立した。登録した対象７９４名中、計３９名（４．９％）が不確かな結果を示した。
【表１７】
0006453299.tif 000020
【００８１】
方法
ＦＡＣＳ測定
赤血球およびＢリンパ球に沈着したＣ４ｄ（ＥＣ４ｄおよびＢＣ４ｄ）を、バリデートされたＦＡＣＳアッセイを用いて測定した。
【００８２】
ＥＣ４ｄ：全血（５０μＬ）をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、５分間遠心分離（８００ｇ）して赤血球ペレットを１％正常ヤギ血清溶液（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）５００μｌに浮遊させた。続いて１０μＬの赤血球浮遊液をヒトＣ４ｄに対する精製マウスモノクローナル抗体（マウス抗ヒトＣ４ｄ、Ｑｕｉｄｅｌ  ｉｎｃ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）で染色、または非特異的マウス抗ヒトＩｇＧ１κ抗体（ＭＯＰＣ−１２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて４℃で４５分間染色した。ついでサンプルを前述のように洗浄した。赤血球ペレットをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）と共役体化したヤギ抗マウス抗体を含む溶液（２５μＬ）に４℃（暗所）で４５分間浮遊させた。染色、洗浄して、冷却した１％正常ヤギ血清溶液２５０μＬに浮遊させた後、赤血球を細胞表面上に沈着したＣ４ｄ検出のためにＦＡＣＳ分析した。
【００８３】
ＢＣ４ｄ量：塩化アンモニウムをベースとした試薬（ＢＤ  Ｐｈａｒｍ  Ｌｙｓｅ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）および遠心分離（８００ｇで５分間）を用いた全血（７００μＬ）から赤血球の溶解後、細胞ペレットを１％正常ヤギ血清溶液５００μＬに浮遊させて、前述のようにモノクローナルＣ４ｄ抗体を用いて染色した（２〜８℃で４５分間）。続いて、２５μＬの細胞浮遊液を前述のヒトＣ４ｄに対する精製マウスモノクローナル抗体または非特異的マウス抗ヒトＩｇＧκ抗体を用いて４℃で４５分間染色した。細胞表面Ｃ４ｄ染色をヤギ抗マウスフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗体を用いて検出した（２〜８℃で４５分間、暗所）。Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）と共役体化したヒトＣＤ１９（ＣＤ１９はＢ細胞分化および成熟のすべての段階で発現される９５ｋＤａのＩ型膜貫通糖タンパク質と反応する）に対するモノクローナル抗体を使用して、Ｂリンパ球に特異的なＣ４ｄ補体活性化由来フラグメントを検出した。
【００８４】
すべてのＦＡＣＳ分析はベックマンコールターＦＣ５００サイトメーターおよびＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ  ＣＡ）を使用した。アイソタイプバックブランドコントロールおよび各補体タンパク質（Ｃ４ｄ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得て、ついで特異的なＭＦＩ結果から非特異的なＭＦＩを減じて正味のＭＦＩを決定した。低、中、および高強度のＥＣ４ｄ量について日間（５連続日）変動係数の中央値を、リウマチ疾患を有する４４名の患者の血液を用いて確立したところ、ＥＣ４ｄについて３．３〜９．６％の範囲であった。ＢＣ４ｄでは、リウマチ疾患を有する患者３４名における低、中、および高強度の日間変動係数は５．３〜１２．１％の範囲であった。すべてのＦＡＣＳ実験には、フローサイトメーターの適切な校正、補正、および直線性を確立するコントロールが含まれた。
【００８５】
ＡＮＡ、ｄｓＤＮＡ、および抗ＭＣＶのＥＬＩＳＡ測定
ＡＮＡ、抗ｄｓＤＮＡ、および抗変異シトルリン化ビメンチン抗体［抗ＭＣＶ、抗シトルリン化ペプチド抗体］（１６）は酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。使用したすべてのＥＬＩＳＡ法は、インビトロ診断で使用するために安全および有効なものとして米国食品医薬品局によって承認されている。ＡＮＡおよび抗ｄｓＤＮＡはＩＮＯＶＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＩＮＯＶＡ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）から入手し、抗ＭＣＶはＯｒｇｅｎｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。すべての方法の日内および日間変動係数を、我々の臨床検査室で確立したところ、２０％未満であった。すべてのＥＬＩＳＡ試験に、適切な陽性および陰性コントロールを含めた。
【００８６】
ＣＥＮＰ、Ｊｏ−１、Ｌａ／ＳＳ−Ｂ、Ｒｏ／ＳＳ−Ａ、ＳＣｌ−７０、スミスの蛍光酵素イムノアッセイ測定
血清または血漿におけるＳＳ−Ａ／Ｒｏ（６０ｋＤａ、５２ｋＤａ）、ＳＳ−Ｂ／Ｌａ、セントロメアＢ（ＣＥＮＰ）、Ｓｃｌ−７０（抗トポイソメラーゼＩ）、Ｊｏ−１、およびスミス抗核ＩｇＧ抗体の定性的測定を、Ｐｈａｄｉａ  ２５０装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）でＥｌｉＡ  ＩｇＧ法を用いて実施した。各分析物について、製造業者によって推奨されるカットオフを使用した。分析の繰り返し精度および再現性は、我々の臨床検査室においてすべての分析物で２０％未満であった。
【００８７】
統計分析
統計分析をＲソフトウェアのバーション２．１５．０を用いて実施した。受信者動作曲線を、各マーカー（単変数分析）に関して必要であれば用い、およびインデックス値の決定後にも、多変量ロジスティック回帰式のアウトプットとして使用した。性能の測定として、感度および特異性（１−偽陽性率）を計算した。報告された性能の統計値（感度、特異性）、ＲＯＣ  ＡＵＣはｋ分割交差検証の１０回繰り返し（ｋ＝１０）（報告結果は平均値）を用いて計算した。さらに性能特性を他の３つのバリデーション法（データ提示なし）によって計算したところ、すべてが報告した性能と非常に類似した結果であった。追加のバリデーションモデルは、一つ抜き交差検証、分割サンプルの平均検証（訓練用に３分の２、検証用に３分の１）、および疑似検証（再代入としても知られている）であった。適用できる場合、一連の検証は疾患による階層化によって得た（（書籍）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｐｄａｔｉｎｇ．Ｅｗｏｕｔ  Ｗ．  Ｓｔｅｙｅｒｂｅｒｇ．２００９）。
【００８８】
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【図１】
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【図２】
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