(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの対物レンズ（２）と、
試料支持体フレーム用の冷却可能なホルダ（８）と、前記ホルダ（８）が内部に配置される開口部（７）と、を備えた試料ステージ（３）と、
を備え、前記開口部（７）は、カバー（６）により覆われている、クライオ顕微鏡法用の光学顕微鏡において、
前記試料ステージ（３）は、２つの水平方向（４）に移動可能であり、前記カバー（６）が浮動式に前記試料ステージ（３）上に載置されており、前記対物レンズ（２）は、前記カバー（６）の、該対物レンズ（２）に対応する開口部（１２）を貫通し、
前記ホルダ（８）は、前記ホルダ（８）内への液体窒素の供給により冷却され、これにより、前記試料ステージ（３）が冷却可能であることを特徴とする、クライオ顕微鏡法用の光学顕微鏡。
【請求項２】
前記カバー（６）の前記開口部（１２）は、円形の孔であり、該孔の直径は、前記対物レンズ（２）の、前記カバー（６）を通じてガイドすべき部分の直径よりも、２ｍｍ未満だけ大きい、請求項１記載の光学顕微鏡。
【請求項３】
前記試料ステージ（３）は、試料支持体フレーム用の前記ホルダ（８）へと試料支持体フレームを供給するための開口（５）を有している、請求項１または２記載の光学顕微鏡。
【請求項４】
試料支持体フレームを供給するための前記開口（５）は、閉鎖装置（１１）により閉鎖可能である、請求項３記載の光学顕微鏡。
【請求項５】
前記カバー（６）は、透明な二重ガラス（６’）を有している、請求項１から４までのいずれか１項記載の光学顕微鏡。
【請求項６】
請求項１から４までのいずれか１項記載のクライオ顕微鏡法用の光学顕微鏡（１）において、試料支持体フレーム用のホルダ（８）を、前記ホルダ（８）内の、少なくとも１つの端部において開放している冷却管路（１５）を液体窒素が通流することにより、冷却する方法であって、
液体窒素の量を、前記冷却管路（１５）の前記少なくとも１つの開放した端部（１６）において全体的な窒素がガス状で存在するように計量することを特徴とする、クライオ顕微鏡法用の光学顕微鏡（１）において試料支持体フレーム用のホルダ（８）を冷却する方法。
【請求項７】
前記冷却管路（１５）の前記少なくとも１つの開放した端部（１６）を、金属製フリット（１７）により閉鎖する、請求項６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの対物レンズと、試料ステージとを備えたクライオ顕微鏡法用の光学顕微鏡であって、試料ステージは、試料支持体フレーム用の、顕微鏡において冷却可能なホルダのための開口部を有しており、該開口部は、カバーにより覆われている、光学顕微鏡に関する。
【０００２】
凍結固定（Kryofixierung）は、電子顕微鏡法においてしばしば使用される試料準備法である。この場合、水を含有する試料は、極めて迅速に−１５０℃よりも低い温度に凍結される（凍結固定）。つまり、試料は、氷晶の形成を阻止するために極めて迅速に冷却される。凍結固定は、構造生物学的な調査のために特に適していることが判った。調査すべき対象物、たとえば細胞、酵素、ウイルスまたは脂質層は、これにより薄いガラス化された氷層に包埋される。凍結固定の大きな利点は、生物学的な構造が、その自然な状態で維持され得ることにある。とりわけ、生物学的な過程が、任意の時点で凍結固定により停止されて、このガラス化された状態で、たとえばクライオ電子顕微鏡において、または相応する試料冷却を伴う光学顕微鏡においても、調査され得る。この場合、クライオ光学顕微鏡は、とりわけ、試料における重要な領域を見つけ出すために働く。この領域は予めマークされ、次いでクライオ電子顕微鏡においてより詳しく観察される。
【０００３】
大抵の場合は、たとえば走査電子顕微鏡のための網／グリッドまたはピン（Stift）のような、自体公知の電子顕微鏡の試料支持体上に位置している凍結された試料は、上述の低温条件でかつ水分を除外しつつ対応する試料支持体フレーム内にもたらされなければならない。この試料支持体フレームは、次いで上述の顕微鏡における適切な保持部内にもたらされ得る。本発明に関連して使用するための典型的な試料支持体フレームは、たとえば米国特許第８３９５１３０号明細書から公知である。この試料支持体フレームでは、試料支持体として低温試料を支持する網がクランプエレメントによって対応するフレーム内に位置固定され得る。このためには、液体窒素がたとえば発泡スチロール容器内に予め保持されている。この容器内で、試料支持体フレーム内への網の結合のために必要な操作ステップが行われる。液体窒素から低温の窒素ガスを形成することにより、一方では必要な低い温度が確保され、他方では水分のない雰囲気が達成されるので、試料の水による汚染および続く氷晶による汚染が阻止される。
【０００４】
凍結された試料の品質を損なわないようにするために、試料が、たとえば凍結固定装置、凍結割断（フリーズフラクチャ）装置、コーティング装置もしくは分析器のような使用される加工機器と、ここでは特にクライオ光学顕微鏡およびクライオ電子顕微鏡との間で、冷却されてコンタミネーションフリーに搬送されることが重要である。
【０００５】
真空クライオトランスファシステムは、たとえば、ライカマイクロシステムズ社の「Leica EM VCT100」システムである。この真空クライオトランスファシステムにより、試料支持体フレームは、液体窒素により冷却された操作容器から取り出されて、同様に液体窒素により冷却された、電子顕微鏡の観察チャンバ内へともたらされ得る。
【０００６】
同様に、このような装置により、試料支持体フレームは、クライオ光学顕微鏡の冷却された試料ステージ内へも搬送され得る。当業者にとっては、「冷却可能」という概念が、本発明との関連において、冷却可能と呼ばれた構成部材が、顕微鏡に設けられているか、もしくは該顕微鏡に接続されている特別な冷却システムによって冷却可能であり、これにより低温の試料の冷却を、顕微鏡による観察中に保証することができることを意味していることは明らかである。
【０００７】
クライオ顕微鏡法のための試料準備時に、水、ひいては氷晶による試料の汚染を阻止するために多大な手間がかけられることが明らかである。このことが、試料もしくは試料支持体または試料支持体フレームをクライオ光学顕微鏡の作業領域へと搬送した後にも確保されていなければならないことは明らかである。このためには、先行技術では、光学顕微鏡のための試料ステージが使用可能である。この試料ステージは、試料支持体フレーム用の冷却可能なホルダが位置する開口部を有している。ホルダの冷却の他に、この公知の試料ステージでは、開口部に液体窒素もしくは低温の窒素ガスが供給されるもしくは注がれる。この場合、開口部はカバーで覆われており、これにより、供給されたもしくは液体の窒素から発生する窒素ガスによって僅かな正圧が形成されるので、周辺空気が開口部から押し出されるか、もしくは流入を阻止されることによって、窒素需要を制限しかつ空気からの湿分の進入を阻止することができる。カバーは、この公知の解決手段では透明である。なぜならば、カバーは、光学顕微鏡の光線経路に位置しているからである。しかし、クライオ光学顕微鏡の対物レンズは、直接にカバーにまでしか接近され得ず、これにより、対物レンズと試料との間に些細ではない間隔が生じ、このことは小さな開口数、ひいては付随する小さな解像度をもたらす。
【０００８】
したがって本発明の根底を成す課題は、クライオ光学顕微鏡の先行技術による欠点を克服し、湿分に対して試料を確実に遮断しながら、観察時に大きな開口数を可能にすることである。
【０００９】
この課題を解決するために、冒頭で述べた形式の光学顕微鏡は、本発明により以下のように変更される。すなわち、試料ステージが２つの水平方向に移動可能であり、カバーは浮動式に試料ステージ上に載置されていて、対物レンズは、カバーの、該対物レンズに対応する開口部を貫通する。カバーの浮動式の支承により、対物レンズがカバーを貫通しているのにも拘わらず、試料ステージの水平方向の可動性が維持され得る。これにより対物レンズは、大きな開口数を達成するために直接に試料に接近することができる。
【００１０】
本発明の有利な態様によれば、カバーの開口部は円形の孔であり、開口部の直径は、対物レンズの、カバーを通じてガイドすべき部分の直径よりも、２ｍｍ未満だけ大きい。この寸法は、対物レンズを、試料ステージの開口部にカバーを被せた後でも、大きな手間なしに、カバーの開口部を通じてガイドし、かつ同時に、湿分を試料から確実に遠ざけておくために、適切な窒素需要において十分な大きさの正圧を形成することを可能にする。
【００１１】
既に述べたように、クライオ光学顕微鏡法では、試料ステージの開口部内に試料支持体フレーム用の冷却されたホルダが配置されている。試料ステージの領域から熱が試料へと放射することを阻止するために、本発明に係る光学顕微鏡は、有利には、試料ステージが冷却可能であるように変更されている。これによって、試料の周辺も確実に冷却され、試料の所望の状態が持続的に維持される。
【００１２】
好適には、試料ステージおよび／または試料支持体フレーム用のホルダは、液体窒素内部冷却を有している。このような冷却は、液体または低温のガス状の窒素を対応する冷却管路を通じて該当する部材の内部に導くことに基づいており、これにより、これらの部材の極めて効果的な冷却が生じる。この場合、窒素の流量および電気的な加熱を介して、冷却は正確に制御され得る。
【００１３】
好適には、試料ステージが、試料支持体フレーム用のホルダへと試料支持体フレームを供給するための開口を有している。このような開口は、有利には試料ステージの側方に設けられており、試料もしくは試料支持体フレームを試料ステージへと挿入することを可能にする。
【００１４】
しかし、試料ステージへの挿入が行われない場合に、操作容器内の試料への湿分を含む空気の到達をも阻止するために、本発明は有利には、試料支持体フレームを供給するための開口が、閉鎖装置により閉鎖可能であるように変更されている。この場合、閉鎖装置は、好適にはスライダ、フラップ等として形成されていてもよい。
【００１５】
ユーザにとって、試料ステージの開口部が覆われているという状況にも拘わらず、観察領域への視覚的なコントロールを有することは重要である。したがって本発明は、好適には、カバーが透明な二重ガラスを有しているように変更されている。この透明度が、カバーを通じて視ることを可能にしているのに対して、二重ガラスを設けることは、試料ステージの内部と周辺との間の温度差に基づく不都合な凝集問題を抑制している。
【００１６】
本発明を以下に図面に概略的に示した実施の形態につき詳しく説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明に係るクライオ光学顕微鏡の全体図である。
【図２】本発明に係るクライオ光学顕微鏡の試料ステージを、試料ステージの開口部のカバーなしに示す斜視図である。
【図３】本発明に係るクライオ光学顕微鏡の試料ステージを、試料ステージの開口部のカバーと共に示す斜視図である。
【図４】カバーを通じた対物レンズの貫通ガイドを示す部分的な断面図である。
【図５】試料支持体フレーム用のホルダを示す部分的な断面図である。
【００１８】
図１には、符号１で本発明に係るクライオ光学顕微鏡が示されている。クライオ光学顕微鏡１は、特に対物レンズ２と、試料ステージ３とを有している。試料ステージ３は、高さだけではなく、２つの水平方向へも矢印４に相応して移動され得る。これにより、試料の重要な領域を試料ステージ３において見つけ出すことができる。試料ステージ３は、図２に図示されている試料支持体フレーム用のホルダ８へと試料支持体フレームを供給するための開口５を有している。カバー６は、浮動式に試料ステージ３上に載置されており、したがってこの試料ステージ３上で自由に移動され得る。対物レンズ２は、カバー６の開口部を通じてガイドされ、カバー６を、矢印４の方向への試料ステージ３の移動時に連行する。カバー６は、透明な二重ガラス６’を有している。
【００１９】
図２では、試料ステージ３の開口部７を確認することができる。この開口部７内には試料支持体フレーム用のホルダ８が位置している。試料支持体フレーム用のホルダ８は、クランプエレメント９を有している。このクランプエレメント９は、図示されていない試料支持体フレームをクランプ式に固定するために用いられる。試料支持体フレーム用のホルダ８は、低温の窒素のための供給部１０および排出部１０’を有している。これにより、試料支持体フレーム用のホルダ８を冷却することができる。このことは、図５に関連して詳しく説明される。図２では、さらに試料支持体フレームを供給するための開口５を確認することができる。開口５を閉鎖するための閉鎖装置１１は、スライダ１１の形態で形成されている。
【００２０】
図３では、カバー６が試料ステージ３の開口部７を完全に覆っていて、これにより周囲からの湿分の進入ができるだけ少なく維持され得ることを確認することができる。カバー６の開口部１２は、図１に示された対物レンズ２をカバー６の平面を貫通してガイドし、これにより直接に試料支持体フレーム用のホルダ８内の試料へともたらすことを可能にする。スリーブ１３が開口部１２に付設されており、対物レンズ２とカバー６との間の密閉作用をさらに高める。カバー６が浮動式に試料ステージ３上に載置されていることにより、カバー６は、簡単に対物レンズ２により連行され、ひいては試料ステージ３上で移動され得る。
【００２１】
図４は、開口部１２を通じた対物レンズ２の貫通ガイドを示している。スリーブ１３は多かれ少なかれ対物レンズ２に当て付けられ、これにより対物レンズ２とカバー６との間のシール作用を高める。図４ではさらに、凝集問題を防止するために、カバー６が二重ガラス６’を有していることを確認することができる。
【００２２】
図５では、窒素管路１４が供給部１０を通じてガイドされており、これにより低温の液体窒素が、試料支持体フレーム用のホルダ８の冷却管路１５内にガイドされ得ることを確認することができる。冷却管路１５は、開放した端部１６を有しており、該端部において金属製フリット１７が付設されている。窒素は、排出部１０’を通じて開口部７を出る。試料支持体フレーム用のホルダ８の上述の窒素内部冷却は、試料の確実な冷却のために用いられ、周辺の湿分を追い出す。
【符号の説明】
【００２３】
１  クライオ光学顕微鏡
２  対物レンズ
３  試料ステージ
４  矢印
５  開口
６  カバー
６’  透明な二重ガラス
７  開口部
８  試料ホルダ
９  クランプエレメント
１０  供給部
１０’  排出部
１１  閉鎖装置／スライダ
１２  開口部
１３  スリーブ
１４  窒素管路
１５  冷却管路
１６  開放した端部
１７  金属製フリット
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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