(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる単離されたＰ４５０酵素であって、配列番号４の配列のＰ４５０酵素のモノオキシゲナーゼ活性の少なくとも２００％以上のモノオキシゲナーゼ活性を示し、前記配列は、２２５位に対応する位置にトレオニンを含み、かつ２８９位に対応する位置にアスパラギン酸を含む前記Ｐ４５０酵素。
【請求項２】
配列番号１の配列からなる、請求項１に記載の酵素。
【請求項３】
請求項１または２に記載の酵素をコードするヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる、単離された核酸。
【請求項４】
発現制御配列と作動可能に結びついた、請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項５】
アドレノドキシン（Ａｄｘ）をコードする核酸配列および／またはアドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
請求項３に記載の核酸または請求項４もしくは５に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項７】
遺伝子操作された微生物である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項６または７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
コレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質をステロイドホルモン前駆体に変換することができる遺伝子操作された微生物であって、請求項３に記載の核酸、ならびに場合により、アドレノドキシン（Ａｄｘ）をコードする核酸配列および／またはアドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）をコードする核酸配列を含む前記微生物
。
【請求項１０】
請求項１または２に記載の酵素を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）請求項６〜８のいずれか１項に記載の宿主細胞を、請求項１または２に記載の酵素の発現を得るために適した条件下で培養する工程と、
ｂ）発現した該酵素を回収する工程と
を含む前記方法。
【請求項１１】
ステロイドホルモン前駆体を産生するための、請求項１または２に記載の酵素の使用。
【請求項１２】
ステロイドホルモン前駆体を産生するための方法であって、
ａ）請求項７〜９のいずれか１項に記載の微生物を用意する工程と、
ｂ）前記微生物を、請求項１または２に記載の酵素の発現が可能になる条件下で培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた微生物培養物を、コレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質と、該微生物による前記基質からのステロイドホルモン前駆体の産生が可能になる条件下で接触させる工程と、
ｄ）産生された該ステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む前記方法。
【請求項１３】
ステロイドホルモン前駆体を産生するための方法であって、
ａ）請求項１または２に記載の酵素を、単離されたアドレノドキシン（Ａｄｘ）ポリペプチド、単離されたアドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）ポリペプチド、ならびにコレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質と、前記基質のステロイドホルモン前駆体への転換が可能になる条件下で接触させる工程と、
ｂ）得られた該ステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む前記方法。
【請求項１４】
ステロイドホルモン前駆体はプレグネノロンである、請求項１２または１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素活性が増大したチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物ミトコンドリアＰ４５０は、ミトコンドリア内で特定の反応を行い、種々の疎水性化合物の代謝において重要な役割を果たす、チトクロムの小さなファミリーを構成する。例えば、Ｐ４５０ｃ１１ベータおよびＰ４５０ｃ１１ＡＳ（ＣＹＰ１１Ｂ１遺伝子およびＣＹＰ１１Ｂ２遺伝子によりコードされる）は、それぞれグルココルチコイド生合成およびミネラルコルチコイド生合成の最終的なステップを行う。Ｐ４５０ｃ１１ベータは、１１デオキシコルチゾールをヒドロコルチゾンに変換する古典的なステロイド１１ベータ−ヒドロキシラーゼであり、Ｐ４５０ｃ１１ＡＳは、３つの連続したステップでデオキシコルチコステロンのアルドステロンへの転換を触媒する。ミトコンドリア内部Ｐ４５０の別の例はＣＹＰ２７Ａ１であり、これは、ステロール２７−ヒドロキシラーゼおよびビタミンＤ２５ヒドロキシラーゼである。最後に、ＣＹＰ１１Ａ１遺伝子によりコードされる最も象徴的なミトコンドリアＰ４５０は、２つの連続したヒドロキシル化および最終的な切断によってコレステロール側鎖を切断することによって、コレステロールをプレグネノロンに転換するＰ４５０ｓｃｃ（側鎖切断酵素）である。Ｐ４５０ｓｃｃは、ステロールをステロイドに転換することによってステロイド生合成の最初の重要なステップを行う。
【０００３】
膨大な数の基質の位置特異的、化学特異的かつ立体特異的酸化を触媒するＰ４５０の能力はそれらの生物学的役割を反映しており、その能力が故にこれらはバイオテクノロジーへの適用のための重要な候補である。特に、ステロイドホルモンは、抗炎症薬、避妊薬および抗増殖薬として広く使用されている。哺乳動物では、これらのステロイドの合成は、コレステロールのプレグネノロンへの側鎖切断反応から開始される。プレグネノロンは、ヒドロコルチゾンのような別のステロイドホルモンの産生の基礎となっており、コレステロールおよび植物由来のその類似体のような低価格の基質からの工業的な大規模変換に大きな関心が持たれている。しかし、コレステロールのプレグネノロンへの側鎖切断反応は、ステロイド全体プロセスにおける律速ステップ（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｓｔｅｐ）である。哺乳動物では、このステップは膜に結合したＣＹＰ１１Ａ１酵素によって触媒される。
【０００４】
しかし、多くの理由から、Ｐ４５０のバイオテクノロジーおよび工業的使用は、実行するのが難しく、満足のいくものではない。ミトコンドリアＰ４５０は２種のタンパク質、すなわち、アドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）およびアドレノドキシン（Ａｄｘ）とも称されるフェレドキシンレダクターゼ（ＦｄｘＲ）およびフェレドキシン（Ｆｄｘ１）で構成される電子伝達体の特定の連鎖を使用する。ｉｎ  ｖｉｖｏにおける天然の状況では、ＦｄｘＲはＮＡＤＰＨから電子を得、Ｆｄｘ１は電子をＦｄｘＲからミトコンドリアＰ４５０にシャトルする。ＦｄｘＲを触媒濃度（０．５μＭ）にし、Ｆｄｘ１を飽和濃度（１０μＭ）にしたｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が開発されている。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を効率的なものにするためには、電子をＰ４５０に適切に流入させなければならない。
【０００５】
これらの困難を克服しようとするために、一部の著者らは、３種のペプチド、Ｐ４５０ｓｃｃ（またはＰ４５０ｃ１１ベータ）、Ｆｄｘ１およびＦｄｘＲを、可変性のヒンジまたはリンカー配列を使用して融合した。この三重融合により機能的なタンパク質がもたらされた場合でも、その効能は「真正な」ポリペプチドと比較して低く、また、そのタンパク質は工業規模で使用することができない。さらに、ミトコンドリア環境は微生物組換え系において模倣するのが難しい。例えば、Ｐ４５０ｓｃｃポリペプチドを酵母ミトコンドリアに適正にターゲティングすることができる。しかし、ターゲティングされたポリペプチドは、ミトコンドリア中に基質が存在しないこと、および／またはＰ４５０ｓｃｃの不適切なフォールディングもしくはターゲティングに起因して、ステロールをプレグネノロンに変換することができない。
【０００６】
植物ステロールから、生合成されたプレグネノロンを産生するために、様々な組換え系が使用されている。例えば、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおける生合成系が開発された。この系では、Ｐ４５０ｓｃｃをミトコンドリアの外側、原形質膜にＦｄｘＲおよびＦｄｘ１と共にターゲティングし、膜においてステロールが産生されるようにステロール経路を経路設定する。また、Ｐ４５０ｃ１１ベータをＦｄｘおよびＦｄｘＲ１と共にミトコンドリアにターゲティングすることができ、そこで、１１−デオキシコルチゾールをコルチゾールに変換させることができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて生物変換系が開発された。この系では、成熟型Ｐ４５０ｓｃｃ、Ｆｄｘ１およびＦｄｘＲ１によってコレステロールをプレグネノロンに変換することができる。生合成は、基質が宿主によって単純な炭素源から可溶性分子として生成され、したがって、界面活性剤を使用する負担が回避されるので、工業規模において最も魅力的な技術のままである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
最近、性質が改善された新しいＰ４５０ｓｃｃポリペプチドを得るための試みがなされている。例えば、Ｋ１９３Ｅ変異を有する組換えＰ４５０ｓｃｃ変異体を作製された。この変異体は、組換え野生型ポリペプチドよりも可溶性が高く、したがって、凝集を起こしにくい。したがって、この変異体を用いると、その酵素的特性を変化させることなく、より高い発現レベルが得られる。しかし、工業的プロセスに特に適したステロイドホルモンの最適化された産生を可能にする、酵素活性が増大した改善されたＰ４５０ｓｃｃポリペプチドが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、特定の変異を有する新しいＰ４５０ｓｃｃポリペプチドを開発した。この変異体は、予想外に、基質のステロイドホルモンへの変換に関して改善された酵素活性を示す。
【０００９】
したがって、本発明は、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる新しい単離されたＰ４５０酵素であって、前記配列は、２２５位に対応する位置にトレオニンを含み、かつ／または２８９位に対応する位置にアスパラギン酸変異を含むＰ４５０酵素に関する。一部の実施形態では、新しいＰ４５０酵素は、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。
【００１０】
本発明は、前記酵素をコードするヌクレオチド配列を含むまたはそれからなる単離された核酸、発現制御配列と作動可能に結びついた、前記核酸を含むベクター、および前記核酸または前記ベクターを含有する宿主細胞にも関し、前記宿主細胞は、例えば、微生物である。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、基質をステロイドホルモン前駆体に変換することができる遺伝子操作された微生物を提供する。基質は、例えば、コレステロール、コレステロール類似体またはコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールであってよい。遺伝子操作された微生物は、例えば、本発明において特徴付けられる新しいＰ４５０酵素をコードする核酸、ならびに場合により、アドレノドキシン（Ａｄｘ）をコードする核酸配列および／またはアドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）をコードする核酸配列を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）宿主細胞を、Ｐ４５０酵素の発現を得るために適した条件下で培養する工程と、
ｂ）発現した酵素を回収する工程と
を含む方法を提供する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素を、ステロイドホルモン前駆体を産生するために使用する。
【００１４】
本発明は、さらに、ステロイドホルモン前駆体を産生するための方法であって、
ａ）本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素を発現する微生物を用意する工程と、
ｂ）前記微生物をＰ４５０酵素の発現が可能になる条件下で培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた微生物培養物を、コレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質と、微生物による前記基質からのステロイドホルモン前駆体の産生が可能になる条件下で接触させる工程と、
ｄ）産生されたステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む方法に関する。
【００１５】
本発明は、ステロイドホルモン前駆体を産生するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法のような方法であって、
ａ）本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素を、単離されたアドレノドキシン（Ａｄｘ）ポリペプチド、単離されたアドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）ポリペプチド、ならびにコレステロール、コレステロール類似体および誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質と、前記基質のステロイドホルモン前駆体への転換が可能になる条件下で接触させる工程と、
ｂ）得られたステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む方法にも関する。
【００１６】
ステロイドホルモンは、抗炎症薬、避妊薬および抗増殖薬として広く使用されている。本発明は、ステロイドホルモン前駆体を産生させるために有用であり、ヒトにおいて使用するためのステロイドホルモンの合成を補助するものである。プレグネノロンのようなステロイドホルモン前駆体は、ヒドロコルチゾンのような別のステロイドホルモンを産生するための基礎としての機能を果たし、その工業的な大規模変換に大きな関心が持たれている。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】チトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）およびＳＡ４（配列番号４の配列を有する対照）による２０μＭのコレステロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。説明文：Ｓ：基質、Ｐ：主産物、ＤＯＣ：１１−デオキシコルチコステロン。
【図２】チトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）による異なる基質のプレグネノロンへのｉｎ  ｖｉｖｏにおける変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムからのプレグネノロンの定量を示すグラフである。
【図３】２４時間後のチトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）およびＳＡ６（配列番号６の配列を有する対照）による３００μＭのコレステロールのｉｎ  ｖｉｖｏにおける変換を示すＨＰＬＣクロマトグラムである。説明文：Ｃｈｏｌ．：コレステロール、Ｐｒｏｇ．：プレグネノロン。
【図４】チトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）およびＳＡ６（配列番号６の配列を有する対照）による３００μＭのコレステロールのｉｎ  ｖｉｖｏにおける変換についての時間経過を示すグラフである。
【図５】ＳＡ１（配列番号１１）をコードするｐＳＭＦ２．１＿ＣＹＰ１１Ａ１ＢＹＭのベクターマップである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
酵素
「単離された」酵素またはポリペプチドとは、酵素またはポリペプチドが、もはや、それが最初に発現した生物体内の天然の環境中にないことを意味する。酵素またはポリペプチドについて言及する場合、「精製された」とは、示されている分子が、同じ型の他の生物学的巨大分子が実質的に存在しない中に存在することを意味する。用語「精製された」とは、本明細書で使用される場合、同じ型の生物学的巨大分子が、少なくとも７５重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９５重量％、または少なくとも９８重量％が存在することを意味する。
【００１９】
用語「チトクロムＰ４５０酵素」または「Ｐ４５０酵素」とは、Ｖａｎ  Ｂｏｇａｅｒｔら、２０１１年、ＦＥＢＳ  Ｊ．２７８巻（２号）：２０６〜２２１頁もしくはＵｒｌａｃｈｅｒおよびＧｉｒｈａｒｄ、２０１１年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０巻（１号）：２６〜３６頁、またはウェブサイトｄｍｅｌｓｏｎ．ｕｔｈｓｃ．ｅｄｕ／ＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅＰ４５０．ｈｔｍｌにおいて概説されているもののようなある特定の反応を触媒することができるモノオキシゲナーゼを指す。そのような野生型Ｐ４５０酵素の例として、配列番号４の配列は、成熟型Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  ＣＹＰ１１Ａ１を表す。輸送ペプチドを含めたＢｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  ＣＹＰ１１Ａ１の完全な配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（最新の配列アップデート：１９８６年７月２１日）においてＰ００１８９として参照される。
【００２０】
本発明において特徴付けられるチトクロムＰ４５０酵素は、それらのそれぞれの元の宿主において膜に結合したもの（不溶性）であっても細胞質内のもの（可溶性）であってもよい。例えば、Ｐ４５０ｓｃｃ（配列番号４）は、コレステロール、コレステロール類似体およびそれらの誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールの、非限定的な例としてプレグネノロンまたは他のステロイドホルモン前駆体および誘導体への側鎖切断反応を触媒する。
【００２１】
本発明者らは、酵素活性が改善された、配列番号１の配列の新しいＰ４５０酵素を開発した。配列番号４（２２５位にＲを有し、２８９位にＮを有する野生型ｓｃｃ酵素）と比較して、配列番号１のアミノ酸配列は、２つの変異：配列番号４の配列の２２５位に対応する位置におけるアルギニンからトレオニンへの変異および配列番号４の配列の２８９位に対応する位置におけるアスパラギンからアスパラギン酸への変異を含む。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明において特徴付けられる新しいＰ４５０酵素は、コレステロールのプレグネノロンへの転換を触媒するモノオキシゲナーゼ活性を示す。特定の実施形態では、新しいＰ４５０酵素は、配列番号４の配列のＰ４５０酵素のモノオキシゲナーゼ活性の少なくとも８０％以上、具体的には少なくとも８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、より具体的には少なくとも３００％以上を示す。
【００２３】
本発明において特徴付けられる単離されたＰ４５０酵素は、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、前記配列は、２２５位に対応する位置にトレオニンを含み、かつ／または２８９位に対応する位置にアスパラギン酸を含む。一部の実施形態では、新しいＰ４５０酵素は、配列番号１と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。
【００２４】
酵素をコードする核酸配列に、酵素のアミノ酸配列の変化をもたらす１つまたはそれ以上のコドンの置換、欠失または挿入を行うことにより、アミノ酸配列の変動を導入することができる。アミノ酸置換は保存的なものであっても非保存的なものであってもよい。一部の実施形態では、置換は、１つのアミノ酸が、類似の構造的性質および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換された保存的置換である。
【００２５】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似の側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換ではタンパク質の機能的性質は実質的に変化しない。化学的性質が類似の側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミドを含有する側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リシン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに７）硫黄を含有する側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。保存的アミノ酸置換群は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００２６】
例えば、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列は、特定のアミノ酸残基において少なくとも１つの置換を有するポリペプチドであり得る。一部の実施形態では、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列は、配列番号１の配列に対して少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のアミノ酸配列同一性を有する。アミノ酸配列同一性とは、配列をアラインメントし、最大の配列同一性の百分率を実現するために必要であればギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考えずに、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列内の、配列番号１の参照配列内のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基の百分率と定義される。配列同一性は、少なくとも８０％同一の配列の全長、参照配列の全長、またはその両方にわたって決定することができる。アミノ酸配列の同一性の百分率は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅを使用して、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２行列をギャップ開始ペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）１０およびギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）０．５で使用して、２つの配列の全長にわたって最適なアラインメント（ギャップを含む）を見いだすためのＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアラインメントアルゴリズムに基づくペアワイズグローバルアラインメントを実施することによって算出することができる。
【００２７】
配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＰ４５０酵素では、配列番号１と比較したアミノ酸修飾は、一般には、酵素の生物活性が有意に損なわれることがない位置にある。実際に、配列番号１と少なくとも８０％同一であるチトクロムＰ４５０のアミノ酸配列は、配列番号１の配列のポリペプチドと少なくとも同じ生物活性を示す。
【００２８】
「同じ生物活性」とは、同じ生物学的機能を示し得る。したがって、配列番号１の配列のポリペプチドと同じ生物活性を有するポリペプチドは、例えば、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドであってよい。酵素のモノオキシゲナーゼ活性を決定するための技法は当業者には周知である。例えば、配列番号１の配列のポリペプチドと同じ生物活性を有するポリペプチドは、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールの、非限定的な例としてプレグネノロンまたは他のステロイドホルモン前駆体および誘導体への側鎖切断反応を触媒することができるポリペプチドであってよい。この場合、化合物の触媒活性は、当業者が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて（Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｔ．、Ｊ．Ｓａｄｌｅｉｒら（１９９８年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｐ４５０ｓｃｃ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−４６２．」；Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３５３巻（１号）；１０９〜１５頁に示されている通り）、またはｉｎ  ｖｉｖｏにおいて（Ｄｕｐｏｒｔ，Ｃ．、Ｒ．Ｓｐａｇｎｏｌｉら（１９９８年）「Ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｙｅａｓｔ．」；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６巻（２号）；１８６〜９頁に示されている通り）、例えば、実施例１に記載のプロトコールによって容易に評価することができる。
【００２９】
一般には、触媒活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換アッセイにおいて試験することができ、その場合、ｐＨ７．４に調整した、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を反応緩衝液として適用することができる。１単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼは、５ｍＭのグルコース−６−リン酸を基質として用い、ＮＡＤＰＨ再生系としての機能を果たし得る。一般には、ＣＹＰ１１Ａ１、ＡｄｘおよびＡｄＲの濃度は、それぞれ１μＭ、２０μＭおよび０．５μＭ、または０．２５μＭ、５μＭおよび０．１２５μＭであってよい。４５％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させた２０μＭのコレステロールがＣＹＰ１１Ａ１の基質としての機能を果たし得る。一般には、試料を予め３７℃に温め、ＮＡＤＰＨを最終濃度１００μＭまで添加することによって反応を開始させる。混合物を、３７℃で撹拌しながら３０秒インキュベートすることができる。試料を湯中で３０秒煮沸することによって反応を停止させることができる。２４０ｎｍにおける測光検出を可能にするために、ステロイドを、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｅｃからのコレステロールオキシダーゼを使用してそれらの３−ケト−Δ４誘導体に変換することができる。一般には、コレステロールオキシダーゼ溶液（コレステロールオキシダーゼ５ｍｇおよびＮａ−コール酸５ｍｇをｐＨ７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍｌに溶解させたもの）２０μｌを試料に添加する。３７℃で１時間インキュベートした後、１１−デオキシコルチコステロン（ＤＯＣ）を内部標準として反応混合物に添加し、その後、等体積の酢酸エチルを用いた抽出を２回行うことができる。蒸発させた後、抽出物をアセトニトリル／水に溶解させることができる。
【００３０】
触媒活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏ変換アッセイにおいて試験することもでき、その場合、３００μＭのコレステロールのプロゲステロンへの変換は、一般には、２４時間後にＨＰＬＣによって評価する。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＴＢ培地中、３７℃、１８０ｒｐｍで振とうしながら培養することができる。タンパク質の発現を、水１ｍＬに溶解させたキシロース０．２５ｇを添加し、その後、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させた基質を添加することによって誘導することができる。
【００３１】
配列番号１の配列と、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列とのアラインメントを実施することができる。これらの２つの配列は同一性の百分率が高いので、それらのアミノ酸の大部分は同一である。したがって、両方の配列に対して、アミノ酸番号付けを、両方の配列内の同じ番号を有する位置に存在するアミノ酸の少なくとも８０％が同一になるように（最大の配列同一性の百分率を実現するために、必要であればギャップを導入することにより）定義することができる。この場合、配列番号１の配列の「Ｘ位に対応する位置」とは、配列番号１と少なくとも８０％同一である配列の、前記番号Ｘを有する位置を示す。したがって、配列番号１の配列は、アラインメントされた配列両方における「対応する位置」に存在するアミノ酸の少なくとも８０％が同一になるように、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列とのアラインメントにおいてアミノ酸位を番号付けするための「参照配列」とみなすことができる。
【００３２】
一実施形態では、本発明において特徴付けられる単離されたＰ４５０酵素は、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むまたはそれからなり、前記配列は、２２５位に対応する位置にトレオニンを含み、かつ２８９位に対応する位置にアスパラギン酸を含む。
【００３３】
別の実施形態では、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素は、配列番号１、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列を含むまたはそれからなる。
【００３４】
さらに別の実施形態では、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素は、配列番号１の配列からなる。
【００３５】
本発明において特徴付けられる酵素は、その精製を容易にすることができる１つまたはそれ以上のタグを含んでよい。例えば、タグは、ポリ−ヒスチジン（ポリ−Ｈｉｓ）タグであってよい。
【００３６】
核酸、ベクター、宿主細胞および酵素を産生する方法
一実施形態では、本発明は、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素をコードする配列を含むまたはそれからなる単離された核酸を特徴とする。
【００３７】
本発明において特徴付けられる単離された核酸は、ポリヌクレオチドとも称され、遺伝暗号の縮重を考慮に入れながら、「酵素」の節で定義されたＰ４５０酵素をコードするＤＮＡ分子であってもＲＮＡ分子であってもよい。単離された核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＮＡ増幅もしくは重合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの遺伝子合成、オリゴヌクレオチドライゲーションによってなど、当業者に周知の標準の技法によって、またはこれらの技法の組合せによって得ることができる。
【００３８】
本発明において特徴付けられる核酸は、単離または精製された形態であることが有利である。用語「精製された」および「単離された」とは、上で定義されているものと同じ意味を有する。
【００３９】
当業者には理解される通り、いくつかの場合には、天然のヌクレオチド分子には天然に存在しないコドンを有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を作製することが有利であり得る。例えば、組換えポリペプチド発現の率を上昇させるために特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンを選択することができる。
【００４０】
本発明において特徴付けられる核酸は、タグ、担体タンパク質、シグナルペプチド、または分子の発現もしくは安定性を増大させる非転写配列もしくは非翻訳配列をコードする配列も含んでよい。
【００４１】
本発明において特徴付けられる核酸は、適切な発現系において組換えＰ４５０酵素を産生するために使用することができる。用語「発現系」とは、例えば、ベクターに保有され、宿主細胞に導入される外来核酸によってコードされるタンパク質を発現させるために適した条件下にある宿主細胞および適合するベクターを意味する。
【００４２】
一般には、任意の適切なベクターに核酸を含めることができる。
【００４３】
したがって、一部の実施形態では、本発明は、発現制御エレメントと作動可能に結びついた、上で定義されている核酸を含むベクター、および前記核酸または前記ベクターを含有する宿主細胞を特徴とする。
【００４４】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」とは、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するためにＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞に導入することができるビヒクルを意味する。
【００４５】
プラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージまたはウイルスベクターのような任意の発現ベクターを使用することができる。プラスミドの例としては、例えば、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなどのような、複製開始点を含む複製性プラスミド、または組込みプラスミドが挙げられる。
【００４６】
ベクターの他の例としては、ｐＡＧＥ１０７（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈら、１９９０年）、ｐＡＧＥ１０３（Ｍｉｚｕｋａｍｉ  Ｔら、１９８７年）、ｐＨＳＧ２７４（Ｂｒａｄｙ  Ｇら、１９８４年）、ｐＫＣＲ（Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋら、１９８１年）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Ｍｉｙａｊｉ  Ｈら、１９９０年）などのような動物細胞に対するベクターが挙げられる。
【００４７】
ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクターおよびＡＡＶベクターが挙げられる。組換えウイルスは、パッケージング細胞をトランスフェクトすることによって、またはヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いて一過性にトランスフェクトすることによってなど、当技術分野で公知の技法によって作製することができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例としては、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。そのような複製欠損組換えウイルスを作製するための詳細なプロトコールは、例えば、ＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６およびＷＯ９４／１９４７８において見いだすことができる。
【００４８】
発現ベクターは、発現制御配列と作動可能に連結した、本発明において特徴付けられるポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現カセットのような機能的な発現カセットを含んでよい。
【００４９】
「発現制御配列（複数可）」とは、ポリペプチドの発現、および場合により、その調節のために必要なエレメント（複数可）を指す。発現制御配列（複数可）は、前記ポリペプチドの発現を引き起こすまたは導くための、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのような、プロモーター配列、翻訳の開始および終結のシグナル、ならびに翻訳の調節に適した領域を含んでよい。
【００５０】
一実施形態では、本発明において特徴付けられるベクターは、マーカー遺伝子、例えば、形質転換された生物体とトランスフェクトされた外来ＤＮＡを含有しない生物体との間の選択を可能にする遺伝子も含んでよい。マーカー遺伝子は、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子であってよい。
【００５１】
特定の実施形態によると、本発明において特徴付けられるベクターは、アドレノドキシン（Ａｄｘ）をコードする核酸配列および／またはアドレノドキシンレダクターゼ（ＡｄＲ）をコードする核酸配列をさらに含んでよい。ＡｄｘおよびＡｄＲは、Ｐ４５０酵素の酸化還元（ｏｘｙｄｏ−ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）パートナーである。
【００５２】
「ＡｄＲ」とは、ミトコンドリアチトクロムＰ４５０電子伝達系の第１の構成成分として公知であり、全てのステロイドホルモンの生合成に関与する酵素である、アドレノドキシンレダクターゼ（ＥＣ：１．１８．１．６）またはアドレノドキシン−ＮＡＤＰ＋レダクターゼを指す。
【００５３】
特定の実施形態では、前記ＡｄＲ酵素は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＲ（ａｒｈ１遺伝子によりコードされるＮＡＤＰＨ：アドレノドキシンオキシドレダクターゼ（ＥＣ＝１．１８．１．６））およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のＦＮＲ（ｆｐｒ遺伝子によりコードされるフェレドキシン−ＮＡＤＰレダクターゼ（ＥＣ＝１．１８．１．２））からなる群から選択される。
【００５４】
特定の実施形態では、ＡｄＲ酵素は、ウシ由来のＡｄＲ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、最新の配列アップデート：１９９８年７月１５日においてＰ０８１６５として参照される）である。別の特定の実施形態では、前記ＡｄＲのタンパク質配列は配列番号７である。別の特定の実施形態では、前記ＡｄＲのタンパク質配列は、配列番号７の生物活性を保持するという条件で、配列番号７のバリアントである。
【００５５】
「Ａｄｘ」とは、アドレノドキシンレダクターゼからＣＹＰ１１Ａ１に電子を移行させる活性が公知のタンパク質である、アドレノドキシンまたはフェレドキシン１を意味する。
【００５６】
特定の実施形態では、前記Ａｄｘタンパク質は、哺乳動物起源のＦｄｘ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ由来のＥｔｐ１ｆｄおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＹａｈ１からなる群から選択される。
【００５７】
特定の実施形態では、Ａｄｘタンパク質は、ウシ由来のＡｄｘ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、最新の配列アップデート：１９８９年７月１日においてＰ００２５７として参照される）である。別の特定の実施形態では、前記Ａｄｘのタンパク質配列は配列番号８である。別の特定の実施形態では、前記Ａｄｘのタンパク質配列は、配列番号８の生物活性を保持するという条件で、配列番号８のバリアントである。
【００５８】
本発明において特徴付けられるベクターまたは核酸を使用して、一般に当業者に公知の技法に従って宿主細胞を形質転換することができる。前記ベクターの宿主細胞への挿入は一過性であっても安定したものであってもよい。
【００５９】
ベクターは、翻訳されたタンパク質の分泌、または細胞区画もしくは細胞小器官へのそのターゲティングを誘発する特定のシグナルをコードする配列も含有してよい。これらの種々の制御シグナルは宿主細胞に応じて選択し、宿主細胞において自己複製するベクター、または前記宿主のゲノムに組み込まれるベクターに挿入することができる。
【００６０】
宿主細胞は、これだけに限定されないが、市販されている細胞株を含め、細菌、酵母、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含めた、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。一部の実施形態では、発現宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、具体的にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、プロバイオティクス細菌、ピキア酵母、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、昆虫細胞、植物細胞、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞である。一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、具体的には細菌細胞である。別の特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞のような酵母細胞のような真核細胞である。
【００６１】
一般的な発現系としては、細菌宿主細胞とプラスミドベクター、昆虫宿主細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳動物宿主細胞とベクターが挙げられる。特定の例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞株（例えば、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、ならびに初代または樹立哺乳動物細胞培養物（例えば、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経の細胞、脂肪細胞などから作製したもの）が挙げられる。マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（「ＤＨＦＲ遺伝子」とも称される）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  Ｇら；１９８０年）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、「ＹＢ２／０細胞」とも称される）なども例として挙げられる。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、本発明において提供される核酸および／またはベクターによってトランスフェクト、感染または形質転換された細胞を特徴とする。したがって、本発明は、さらに、本明細書に記載の核酸および／またはベクターを含有する宿主細胞、ならびにそのような宿主細胞の後代および／または誘導体に関する。一実施形態では、宿主細胞は、遺伝子操作された微生物である。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「微生物」とは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅであってよい。
【００６４】
Ｗｏｏｄｓ，Ｓ．Ｔ．、Ｊ．Ｓａｄｌｅｉｒら（１９９８年）（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｐ４５０ｓｃｃ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−４６２．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３５３巻（１号）；１０９〜１５頁）に示されている通り、ヒト酵素のより便利な供給源をもたらすため、および部位特異的変異誘発を使用した構造−機能試験の実施を可能にするために、成熟型ヒトＰ４５０ｓｃｃをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて発現させた。この発現系により、以前胎盤ミトコンドリアから単離されていたものよりも大量の活性なチトクロムを産生することが可能になった。発現させたＰ４５０ｓｃｃをほぼ均一になるまで精製し、ヒト胎盤から精製された酵素に匹敵する触媒性が示された。成熟型ヒトアドレノドキシンも大腸菌において発現させ、ウシアドレノドキシンを使用して観察されたものとＶｍａｘが同じであるが、Ｋｍが高いコレステロール側鎖切断活性が裏付けられた。ヒトＰ４５０ｓｃｃにおけるＩｌｅ−４６２からＬｅｕへの変異により、コレステロールを基質として用いた触媒速度定数（ｋｃａｔ）の低下、２２Ｒ−ヒドロキシコレステロールに対するＫｍの増大が引き起こされたが、２０アルファ−ヒドロキシコレステロールについての動力学定数には影響はなかった。
【００６５】
Ｄｕｐｏｒｔ，Ｃ．、Ｒ．Ｓｐａｇｎｏｌｉら（１９９８年）（Ｓｅｌｆ−ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎｅｎｏｌｏｎｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  ｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｙｅａｓｔ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６巻（２号）；１８６〜９頁）に示されている通り、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいてステロイド産生経路の最初の二ステップを再現した。デルタ２２−デサチュラーゼ遺伝子を破壊することによってステロール生合成を工学的に操作し、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａデルタ７−レダクターゼ活性を導入し、ウシ側鎖切断チトクロムＰ４５０、アドレノドキシン、およびアドレノドキシンレダクターゼを同時発現させることにより、単純な炭素源からのプレグネノロン生合成が導かれる。ヒト３ベータ−水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ／イソメラーゼをさらに同時発現させることに続いて、プレグネノロンがさらに代謝されてプロゲステロンになった。ステロイド形成は、酵母ステロール生合成と連関すると思われた。
【００６６】
Ｓｚｃｚｅｂａｒａ，Ｆ．Ｍ．、Ｃ．Ｃｈａｎｄｅｌｉｅｒら（２００３年）（Ｔｏｔａｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃａｒｂｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ；Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１巻（２号）；１４３〜９頁）では、哺乳動物の主要な副腎グルココルチコイドであり、ステロイド系薬合成の重要な中間体であるヒドロコルチゾンが、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株によって単純な炭素源から産生されることが報告されている。１３種の工学的に操作された遺伝子が関与する人工的および完全に自足的な生合成経路を構築し、単一の酵母株において発現させた。内在性ステロール生合成は、経路の異種部分の基質として適合したステロールを産生するように経路変更された。生合成には、８種の哺乳動物タンパク質（成熟型ＣＹＰ１１Ａ１、アドレノドキシン（ＡＤＸ）、およびアドレノドキシンレダクターゼ（ＡＤＲ）；ミトコンドリア型のＡＤＸおよびＣＹＰ１１Ｂ１；３ベータ−ＨＳＤ、ＣＹＰ１７Ａ１、およびＣＹＰ２１Ａ１）が関与した。最適化には、２つのミトコンドリア系を調節すること、ならびにＡＴＦ２遺伝子産物、ＧＣＹ１遺伝子産物、およびＹＰＲ１遺伝子産物に関連する望ましくない副反応を破壊することが伴った。産生された主要なステロイドはヒドロコルチゾンであった。この研究により、高等真核生物由来の複雑な生合成経路を微生物に移入することの実現性が実証された。
【００６７】
特定の実施形態では、微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、具体的にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＭＳ９４１と称される株である。「Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＭＳ９４１株」という表現は、ＷｉｔｔｃｈｅｎおびＭｅｉｎｈａｒｄｔ、１９９５年、Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２巻：８７１〜８７７頁において言及されており、ＤＳＭ３１９株（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｔａｍｍｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）に由来する株を指す。
【００６８】
以前に記載された大腸菌を使用する系およびＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを使用する系は、大腸菌を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、またはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを用いてｉｎ  ｃｅｌｌｕｌｏでステロールおよびステロール誘導体の変換を実現することができる２つの系である。これらの技術により、Ｐ４５０ｓｃｃと基質の共に機能する能力を評価することができる。どちらの技術にも、酵素に接触可能になるように基質を可溶化するための効率的な方法が必要である。この可溶化は、工業レベル（大量）では、財政的な点および科学的な点で困難になり得る。
【００６９】
第３の生物体Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、この点について特に有利な生物体である；その大きな発酵は立法メートルまたはより高レベルで十分に確立されており、また、グルコースおよび／またはエタノールのような単純な炭素源からプレグネノロンのようなステロイドを産生し、したがってベータ−シクロデキストリンのような界面活性剤または可溶化化学物質を回避する強力な能力を有する（上記の通り：Ｄｕｐｏｒｔ，Ｃ．、Ｒ．Ｓｐａｇｎｏｌｉら（１９９８年）；Ｓｚｃｚｅｂａｒａ，Ｆ．Ｍ．、Ｃ．Ｃｈａｎｄｅｌｉｅｒら（２００３年））。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるステロイド合成を可能にするために、Ｐ４５０ｓｃｃ適合性ステロールが産生されるようにステロール生合成を経路設定した。
【００７０】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅによる発酵は大規模で十分に習得されるので、新しく記載されたＰ４５０ｓｃｃ  ｃＤＮＡを、適切な電子運搬体の存在下で、カンペステロール、または基質として記載される他のステロールに経路設定された適切なＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに導入することは、ステロイドの産生に役立つ。この組換え生物体は、本明細書に記載の新しいＰ４５０ｓｃｃ  ｃＤＮＡを評価するために使用することができる。
【００７１】
したがって、別の特定の実施形態では、微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００７２】
用語「遺伝子操作された」微生物とは、当技術分野で当業者に公知の遺伝子工学の技法によって改変された任意の微生物を指す。特定の微生物に関連する方法に関しては、当業者は、例えば酵母に関して：「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ」
−  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｃｏｕｒｓｅ  ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｍ  Ｒｏｓｅ、Ｆ  ＷｉｎｓｔｏｎおよびＰ  Ｈｉｅｔｅｒ．１９８頁、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．１９９０年．ＩＳＢＮ  ０−８７９６９−３５４−１などの参考マニュアルを参照することができる。
【００７３】
これらの技法は、別段の指定のない限り、バイオインフォマティクス、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の分野における従来の技法であり、当技術分野の技術の範囲内に入る。そのような技法は、文献において十分に説明されている。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「遺伝子工学の技法」とは、当分野で当業者に公知の遺伝子発現の発現または過剰発現を可能にする技術に関する。目的の遺伝子の発現または過剰発現は、細胞または微生物にそのような目的の遺伝子を含む外因性核酸配列を当業者に公知の任意の形質転換技術によって導入することによって実現することができる。
【００７５】
用語「形質転換」または「トランスフェクション」とは、「外来」（すなわち異種）遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を宿主細胞に導入し、したがって、宿主細胞が導入された遺伝子または配列を発現して、導入された遺伝子または配列によりコードされる所望の物質、一般にはタンパク質または酵素を産生させることを意味する。宿主細胞のトランスフェクションは、化学的形質転換、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿またはリポフェクションのような、任意の標準の技法を使用して実施することができる。形質転換技法としては、例えば、ＰＥＧ媒介性プロトプラスト形質転換技法も挙げられる（Ｂａｒｇら、２００５年、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  １６５〜１８４頁）。
【００７６】
「外因性核酸配列（複数可）」とは、検討されている微生物において、または微生物の天然の株におけるようには（例えば発現レベルに関して）、本来かつ／または天然には発現されない核酸配列（複数可）であって、上記の遺伝子操作された微生物を得るために前記微生物を形質転換するために使用されている核酸配列に関する。特定の実施形態では、外因性核酸配列の起源は、検討されている微生物とは別の種（例えば、別の種の微生物または生物体）である。別の特定の実施形態では、外因性配列の起源は同じ微生物である。
【００７７】
前記外因性核酸配列（複数可）は、チトクロムＰ４５０ならびに酸化還元パートナーであるＡｄＲおよびＡｄｘのような目的のタンパク質をコードし得、「外因性ＤＮＡ」の発現とは、個々の配列それぞれを示す場合もあり、個々の配列それぞれを含む配列全体を包含する場合もある。非限定的な例として、前記外因性核酸配列を前記微生物のゲノムに相同組換えによってなど、当分野で公知の技法によって組み込む。
【００７８】
一態様では、本発明は、コレステロール、コレステロール類似体および誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質をステロイドホルモン前駆体に変換することができる遺伝子操作された微生物であって、本発明において特徴付けられる核酸、ならびに場合により、Ａｄｘをコードする外因性核酸配列および／またはＡｄＲをコードする外因性核酸配列を含む微生物を提供する。
【００７９】
特定の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００８０】
別の特定の実施形態では、遺伝子操作された微生物は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、具体的にはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＭＳ９４１株である。
【００８１】
本発明は、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素を調製するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
ａ）宿主細胞を、Ｐ４５０酵素の発現を得るために適した条件下で培養する工程と；
ｂ）発現した酵素を回収する工程と
を含む方法にも関する。
【００８２】
「Ｐ４５０酵素の発現を得るために適した条件」は当業者には周知である。一般には、宿主細胞の培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）には、ＬＢ培地（２５ｇ／Ｌ）、ＴＢ培地（酵母抽出物１Ｌ当たり２４ｇ、トリプトン１Ｌ当たり１２ｇ、０．４％グリセリン、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液）またはＥｎＰｒｅｓｓｏ（商標）Ｔａｂｌｅｔ培地のいずれかを使用する。１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する培地５０ｍＬにプレートまたはグリセリンストックからの細胞を接種することによって前培養を実施することができる。次いで、１０μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含有する培地５０ｍＬに前培養の試料５００μＬを接種することによって本培養を実施することができる。本培養では、一般には、光学濃度が約０．４に到達するまで成長させる。蒸留水１ｍＬに溶解させたキシロース０．２５ｇを添加した後、タンパク質の発現を誘導することができる。
【００８３】
次いで、Ｐ４５０酵素を、精製に関する周知の手順によって精製することができ：Ｐ４５０酵素は、溶解物もしくは細胞抽出物から、封入体、または培養上清から、ＨＰＬＣクロマトグラフィー、特異的抗体を用いた免疫親和性による技法などのような方法によって精製することができる。
【００８４】
あるいは、Ｐ４５０酵素は、細胞溶解物または再構成された系におけるその発現に必要なエレメントを含有するＤＮＡまたはＲＮＡマトリックス由来の無細胞転写および翻訳系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させることができる（例えば、Ｒａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓまたはＲｅｔｉｃ  Ｌｙｓａｔｅ  ＩＶＴ（商標）、Ａｍｂｉｏｎ）。
【００８５】
ステロイドホルモン前駆体を産生する方法
実施例２〜４に示されている通り、本発明者らは、基質のステロイドホルモン前駆体への変換に関して改善された酵素活性を示す特定の変異を有する新しいＰ４５０ｓｃｃ酵素を開発した。
【００８６】
したがって、別の態様では、本発明は、ステロイドホルモン前駆体を産生するための、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素の使用に関する。
【００８７】
本発明は、さらに、下記の通りステロイドホルモン前駆体を産生するための方法を提供する。
【００８８】
ステロイドホルモン前駆体を産生するための第１の方法は、
ａ）上記の微生物を用意する工程と、
ｂ）前記微生物を、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素の発現が可能になる条件下で培養する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた微生物培養物を、コレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質と、微生物による前記基質からのステロイドホルモン前駆体の産生が可能になる条件下で接触させる工程と、
ｄ）産生されたステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む。
【００８９】
特定の実施形態によると、工程ｂ）とｃ）を同時に実施する。この場合、ステロイドホルモン前駆体を産生するための方法は、
ａ）上記の微生物を用意する工程と，
ｂ）前記微生物を、コレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質の存在下、本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素の発現を可能にし、かつ、微生物による前記基質からのステロイドホルモン前駆体の産生が可能になる条件下で培養する工程と、
ｃ）産生されたステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む。
【００９０】
ステロイドホルモン前駆体を産生するための第２の方法は、
ａ）本発明において特徴付けられるＰ４５０酵素を、単離されたＡｄｘポリペプチド、単離されたＡｄＲポリペプチド、ならびにコレステロール、コレステロール類似体およびコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールからなる群から選択される基質と、前記基質のステロイドホルモン前駆体への転換が可能になる条件下で接触させる工程と、
ｂ）得られたステロイドホルモン前駆体を回収する工程と
を含む。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「基質」とは、シクロアルテノールおよびラノステロールから誘導される植物ステロールのような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールを包含する。これらの基質の中で、「コレステロール、コレステロール類似体およびそれらの誘導体」とは、コレステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、エルゴスタ−５，２２−ジエノール、エルゴスタ−５，２４（２８）−ジエノール、エルゴスタ−５，２４（２８）−ジエン−３ベータ−オール、エルゴスタ−５，２４（２５）−ジエノールのようなエルゴスタジエノール、エルゴスタ−５，２２，２４（２５）−トリエノール、エルゴスタ−５，２２，２４（２８）−トリエノール、エルゴスタ−５，７，２２−トリエノールのようなエルゴスタトリエノール、エルゴスタ−５，７，２２，２４（２５）またはエルゴスタ−５，７，２２，２４（２８）のようなエルゴスタテトラエノール（ｅｒｇｏｓｔａｔｅｔｒｅｎｏｌ）、デスモステロール、ベータ−シトステロール、ジェネロール、オキシステロールの混合物、スチグマステロール、ビタミンＤ、７−デヒドロコレステロールおよびエルゴステロールからなる群から選択される基質の一覧を指す。ジェネロール１００およびＡＤＭ９０（ブラシカステロール＋カンペステロール＋スチグマステロール＋ベータ−シトステロールを異なる比率で含む）のような、工業的プロセスにおいて現在使用されているステロール混合物もこの基質の定義に包含される。
【００９２】
特定の実施形態では、基質は、コレステロール、カンペステロール、デスモステロールおよびエルゴスタ−５，２４（２８）−ジエン−３ベータ−オールからなる群から選択される。特定の実施形態では、基質はエルゴステロールである。
【００９３】
特定の実施形態では、「ステロイドホルモン前駆体」は、プレグネノロン、７−デヒドロプレグネノロン、ヒドロキシエルゴステロール、およびヒドロキシスチグマステロールからなる群から選択される。別の特定の実施形態では、前記ステロイドホルモン前駆体は、ヒドロキシル化コレステロール類似体およびセコステロイド（コレステロール類似体７−デヒドロコレステロールおよびエルゴステロールの誘導体としてのビタミンＤ２およびＤ３のような）の群から選択される。特定の実施形態では、ステロイドホルモン前駆体はプレグネノロンである。
【００９４】
「微生物を基質の存在下で培養する」とは、前記微生物と上で定義されている基質を物理的に相互作用させることを意味する。この相互作用は、培養培地中でなされるものであってもよく、そうでなくてもよい。特定の実施形態では、前記培養培地は、本発明による微生物を透過処理するためおよび／または本発明による基質を可溶化するための薬剤を含有する。これらの薬剤への基質の溶解は、微生物培養物への添加前に行うことができる。
【００９５】
「Ｐ４５０酵素を基質と接触させる」とは、前記Ｐ４５０酵素と上で定義されている基質を物理的に相互作用させることを意味する。この相互作用は、培地中でなされるものであってもよく、そうでなくてもよい。特定の実施形態では、前記培地は、本発明による基質を可溶化するための薬剤を含有する。これらの薬剤への基質の溶解は、前記培地への添加前に行うことができる。
【００９６】
基質を溶解させるために使用する薬剤は、エタノール、Ｔｗｅｅｎ−８０、ｔｅｒｇｉｔｏｌ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、サポニン（例えば、シャボンノキ、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａの粗抽出物中に含有されるキラヤサポニンのような）、シクロデキストリンおよびそれらの誘導体（例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）からなる群から選択することができる。別の特定の実施形態では、非限定的な例として、エタノールとＴｗｅｅｎ−８０の混合物、ｔｅｒｇｉｔｏｌとエタノールの混合物、サポニン（例えば、キラヤサポニン）とシクロデキストリンの混合物のような、これらの薬剤の混合物を使用することができる。２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン誘導体を使用することができる。別の特定の実施形態では、基質をポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）と共結晶化する。
【００９７】
別の実施形態では、基質を、微生物培養物に添加する前にまず２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させ、ここで、前記培養物はキラヤサポニンを含有する。別の実施形態では、基質を、１０％から６０％、例えば、２０％から５０％、例えば、４０％から５０％にわたる百分率の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、および１％から１０％、例えば、２％から８％、例えば、３％から６％にわたる百分率のキラヤサポニンを含む溶液に溶解させる。別の実施形態では、基質を、４５％２ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよび４％キラヤサポニンを含む溶液に溶解させる。
【００９８】
別の実施形態では、微生物培養物中の２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンの最終濃度は、実施例２において例示されているように、１％から４％の間、例えば、２．２５％のような、２％から３％の間である。別の実施形態では、微生物培養物中のキラヤサポニンの最終濃度は、０．０５％から０．２５％の間、例えば、０．０７５％から０．２２５％の間、例えば、０．１％から０．２％の間である。
【００９９】
「前記微生物を、前記外因性核酸配列の発現が可能になる条件下で培養する工程」は、Ｂｌｅｉｆら（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１２年）９３巻：１１３５〜１１４６頁）またはＫｏｒｎｅｌｉら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６３巻（２０１３年）８７〜９６頁）に記載されているような、バイオテクノロジー分野における任意の周知の培養および誘導方法に従って実施することができる。
【０１００】
「前記基質のステロイドホルモン前駆体への転換が可能になる条件」としては、前記基質のステロイドホルモン前駆体への転換に有利である、使用する試薬、試薬の濃度、温度、撹拌の使用、反応またはインキュベーションの持続時間などのような、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける条件が挙げられる。これらの条件は、当業者に公知の方法によって決定し、調整することができる。
【０１０１】
非限定的な例として、反応を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびグルコース−６−リン酸の存在下、一般には、例えば、ｐＨ７．４に調整した、一般には０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液中で実施することができる。Ｐ４５０酵素、ＡｄｘおよびＡｄＲの濃度は、例えば、それぞれ１μＭ、２０μＭおよび０．５μＭ、または０．２５μＭ、５μＭおよび０．１２５μＭであってよい。コレステロール、コレステロール類似体またはコレステロール誘導体のような、脂肪族側鎖を有する多環不飽和モノアルコールは、４５％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させることができる。試料を予め３７℃に温めることができ、ＮＡＤＰＨを最終濃度１００μＭまで添加することができる。混合物を３７℃で撹拌しながらインキュベートすることができる。
【０１０２】
特定の実施形態では、ステロイドホルモン前駆体を産生するための任意の方法において使用されるステロイドホルモン前駆体は、プレグネノロンである。本明細書で使用される場合、「プレグネノロン」とは、３β−ヒドロキシプレグン−５−エン−２０−オンとも称されるステロイドホルモンを指す。
【０１０３】
配列の簡単な説明
配列番号１は、２２５位にトレオニンを含み、２８９位にアスパラギン酸を含むＣＹＰ１１Ａ１（ポリペプチドＳＡ１）のアミノ酸配列を示す。
【０１０４】
配列番号２は、２２５位にトレオニンを含むＣＹＰ１１Ａ１のアミノ酸配列を示す。
【０１０５】
配列番号３は、２８９位にアスパラギン酸を含むＣＹＰ１１Ａ１のアミノ酸配列を示す。
【０１０６】
配列番号４は、ＷＴ  Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ  ＣＹＰ１１Ａ１（ポリペプチドＳＡ４；ＷＴ  Ｐ４５０ｓｃｃ）のアミノ酸配列を示す。
【０１０７】
配列番号５は、配列番号１１のＳＡ１をコードするプラスミドｐＳＭＦ２．１＿ＣＹＰ１１Ａ１ＢＹＭの配列を示す。
【０１０８】
配列番号６は、ポリペプチドＳＡ６（Ｐ４５０ｓｃｃ−Ｉ１Ａ−Ｋ１９３Ｅ）のアミノ酸配列を示す。
【０１０９】
配列番号７は、ＡｄＲのアミノ酸配列を示す。
【０１１０】
配列番号８は、Ａｄｘのアミノ酸配列を示す。
【実施例１】
【０１１１】
材料および方法
タンパク質合成
ＣＹＰ１１Ａ１バリアントを遺伝子合成によって得、ｐＴＲＣ９９Ａにクローニングし、ポリ−Ｈｉｓタグと融合させた。Ｃ４３ＤＥ３−大腸菌細胞を、各ベクター、およびシャペロンをコードするｐＧｒｏ１２を用いて同時形質転換した。精製をＪａｎｏｃｈａら（Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．（２０１１年）１月；１８１４巻（１号）：１２６〜３１頁）に記載の通り実施した。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。ナトリウム亜ジチオン酸塩を用いて処理し、ＣＯに曝露させた後、精製されたタンパク質の濃度をＣＯ−差異スペクトル（ＣＯ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒａ）によって決定した。
【０１１２】
ＡｄｘおよびＡｄＲを、それぞれＵｈｌｍａｎｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１８８巻（１９９２年）、１１３１〜１１３８頁）およびＳａｇａｒａら（Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、１６巻（１９９３年）、６２７〜６３０頁）に従って精製した。
【０１１３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変換アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素アッセイのために、ｐＨ７．４に調整した、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０および１ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液を反応緩衝液として適用した。５ｍＭのグルコース−６−リン酸を基質として用い、１単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼがＮＡＤＰＨ再生系としての機能を果たした。
【０１１４】
ＷＴ  Ｐ４５０ｓｃｃ（「ＳＡ４」と示される、配列番号４）およびＰ４５０ｓｃｃ−Ｉ１Ａ−Ｋ１９３Ｅ（「ＳＡ６」と示される、配列番号６）に対しては、ＣＹＰ１１Ａ１、ＡｄｘおよびＡｄＲの濃度は、それぞれ１μＭ、２０μＭおよび０．５μＭであり、Ｐ４５０ｓｃｃ−Ｒ２２５Ｔ−Ｎ２８９Ｄ（「ＳＡ１」と示される、配列番号１）に対しては、ＣＹＰ１１Ａ１、ＡｄｘおよびＡｄＲの濃度は、それぞれ０．２５μＭ、５μＭおよび０．１２５μＭであった。
【０１１５】
４５％２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させた２０μＭのコレステロールがＣＹＰ１１Ａ１の基質としての機能を果たした。
【０１１６】
試料を予め３７℃に温め、ＮＡＤＰＨを最終濃度１００μＭまで添加することによって反応を開始させた。混合物を３７℃で撹拌しながら３０秒インキュベートした。試料を湯中で３０秒煮沸することによって反応を停止させた。
【０１１７】
２４０ｎｍにおける測光検出を可能にするために、ステロイドを、Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐｅｃからのコレステロールオキシダーゼを使用してそれらの３−ケト−Δ４誘導体に変換した。
【０１１８】
コレステロールオキシダーゼ溶液（コレステロールオキシダーゼ５ｍｇおよびＮａ−コール酸５ｍｇをｐＨ７、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液５ｍｌに溶解させたもの）２０μｌを試料に添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、１１−デオキシコルチコステロン（ＤＯＣ）を内部標準として反応混合物に添加し、その後、等体積の酢酸エチルを用いた抽出を２回行った。蒸発させた後、抽出物をアセトニトリル／水に溶解させた。
【０１１９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ変換アッセイ
３００μＭのコレステロールのプレグネノロンへのｉｎ  ｖｉｖｏにおける変換を２４時間後にＨＰＬＣによって評価した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍを、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有するＴＢ培地中、３７℃、１８０ｒｐｍで振とうしながら培養した（ｃｕｌｔｉｖａｔｅ）。タンパク質の発現を、水１ｍＬに溶解させたキシロース０．２５ｇを添加し、その後、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンに溶解させた基質を添加することによって誘導した。
【実施例２】
【０１２０】
チトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）およびＳＡ４（ＷＴ対照、配列番号４）によるコレステロールのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける変換
各Ｐ４５０ｓｃｃ調製物の濃度の急性評価後、ＳＡ１、ＳＡ４およびＳＡ６を以下のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで使用した。これらのアイソフォームのそれぞれを、飽和量のＡｄｘおよびＡｄＲ中、基質としてコレステロール（２０μＭ）の存在下、１μＭの濃度で再構成した。
【０１２１】
ＳＡ４およびＳＡ６は同一の活性を示したが、ＳＡ１はＳＡ４およびＳＡ６と比較して２〜３倍の活性を示した（図１）。インキュベート時間後に基質はすでに枯渇していたので、より長いインキュベート時間でＳＡ１とＳＡ１／ＳＡ４ポリペプチドの差異を評価することは難しかった。
【実施例３】
【０１２２】
チトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）およびＳＡ６（対照、配列番号６）によるコレステロールのｉｎ  ｖｉｖｏにおける変換
ＳＡ４とＳＡ６の間には測定可能な差異は観察されなかったので、本発明者らはＳＡ１ポリペプチドとＳＡ６ポリペプチドを比較することに関心を寄せた。Ｐ４５０ｓｃｃ、Ｆｄｘ１およびＦｄｘＲを発現する組換えＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍによって可溶化コレステロールの存在下でコレステロールが代謝されてプレグネノロンになる新しい系が最近開発された。ＳＡ１およびＳＡ６は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍコドンバイアスについて最適化したｃＤＮＡに対応し、適切な制限部位を使用してプラスミドｐＳＦＭ２．１に移入した。それぞれコドン最適化したＳＡ１およびＳＡ６を有するＰＳＦＭ２．１プラスミドをどちらも、古典的なプロトプラスト形質転換プロトコールを使用してＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ  ＭＳ９４１に移入した。
【０１２３】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおいて発現したＳＡ１ポリペプチドおよびＳＡ６ポリペプチドについて、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるコレステロール変換活性を２４時間後および４８時間後に評価した。
【０１２４】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける実験によると、ＳＡ１は、ＳＡ６と比較して今や２倍の活性を示した（図３および４）。
【実施例４】
【０１２５】
チトクロムＰ４５０ポリペプチドＳＡ１（配列番号１）による異なる基質のプレグネノロンへのｉｎ  ｖｉｖｏにおける変換
最後に、改善された系を使用して、バイオテクノロジー的に興味深い種々の基質：カンペステロール、デスモステロール、エルゴスタ−５，２４（２８）−ジエン−３β−オールおよび種々の２０，２２−ＯＨオキシステロールの混合物を用いてＳＡ１ポリペプチド変換能力を試験した。
【０１２６】
各基質は、プロゲステロンと同じ保持時間の１つの主産物に変換され、これにより、ＣＹＰ１１Ａ１がこれらの基質のそれぞれの側鎖を切断し、プレグネノロンをもたらすことができたことが示される。
【０１２７】
それぞれの基質についてプレグネノロン形成を定量した（図２）。極性オキシステロールは、コレステロールに匹敵する率で変換された（４８時間後に約３５ｍｇ／Ｌ）。より疎水性の高いステロールであるカンペステロール、デスモステロールおよびエルゴスタジエノールの変換は、４８時間後に、コレステロールと比較しておよそ１９％の率でのみ起こった。
【０１２８】
総合すると、結果から、試験したステロイドの全てがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの細胞膜を透過することができ、ＣＹＰ１１Ａ１  ＳＡ１変異体によってプレグネノロンに変換されたことが示される。
【０１２９】
したがって、本発明者らは、ここに、コレステロールを含めた種々のステロールへの変換活性の増大を示す、ＳＡ１と称する新しいＰ４５０ｓｃｃタンパク質を報告する。
【図１】
0006608372.tif 000002
【図２】
0006608372.tif 000003
【図３】
0006608372.tif 000004
【図４】
0006608372.tif 000005
【図５】
0006608372.tif 000006
【配列表】
0006608372000001.app