(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペルオキシカルボン酸を生成するための方法であって、
（ａ）
（１）
（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘ＝式Ｒ6−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ6＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ6＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ6は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ5中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ5は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化１】
0006574377.tif 000040
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4は個々に、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化２】
0006574377.tif 000041
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ2＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、
（３）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを準備するステップと、
（ｂ）適切な条件下で前記反応成分セットを混合し、それによってペルオキシカルボン酸を生成するステップと、
（ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で生成される前記ペルオキシカルボン酸を希釈するステップと
を含む方法。
【請求項２】
硬質表面または無生物体を消毒、漂白、及び／又は脱染する方法であって、
請求項１に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）、及び、ｄ）硬質表面または無生物体を請求項１に記載されたステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成された前記ペルオキシカルボン酸と接触させるステップであって、それによって前記硬質表面または前記無生物体が消毒、漂白、脱染、またはそれらの組合せを受けるステップを含む、方法。
【請求項３】
前記無生物体が医療機器である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
衣類または織物が有益性を得る方法であって、
請求項１に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）、及び、ｄ）衣類または織物を、請求項１に記載されたステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成されたペルオキシカルボン酸と接触させるステップであって、それによって衣類または織物が有益性を得るステップを含む、方法。
【請求項５】
前記有益性が、消毒、衛生化、漂白、脱染、脱臭、およびそれらの組合せから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
木材パルプまたは製紙用パルプを漂白する方法であって、
請求項１に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）、及び、ｄ）木材パルプまたは製紙用パルプを、請求項１に記載されたステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）で生成されたペルオキシカルボン酸と接触させるステップであって、それによって木材パルプまたは製紙用パルプが漂白されるステップを含む、方法。
【請求項７】
前記基質が、モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシラン断片；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル；４−アセトキシ安息香酸；およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記基質がトリアセチンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記生成されるペルオキシカルボン酸が、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはそれらの混合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記酵素触媒が、微生物細胞、透過性になった微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素、または精製酵素の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（１）
（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘ＝式Ｒ6−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ6＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ6＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ6は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ5中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ5は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化３】
0006574377.tif 000042
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4は個々に、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化４】
0006574377.tif 000043
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ2＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、
（３）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを含む組成物。
【請求項１２】
過酸の発生および送達系であって、
（ａ）
（１）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
（２）
（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘ＝式Ｒ6−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ6＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ6＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ6は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ5中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ5は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化５】
0006574377.tif 000044
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4は個々に、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化６】
0006574377.tif 000045
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ2＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（３）任意選択の緩衝液と
を含む第１のコンパートメント、ならびに
（ｂ）
（１）過酸素源と、
（２）過酸化物安定化剤と
（３）任意選択の緩衝液と
を含む第２のコンパートメント
を含む過酸の発生および送達系。
【請求項１３】
前記基質がトリアセチンを含む、請求項１２に記載の過酸の発生および送達系。
【請求項１４】
ａ）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドであって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と、
ｂ）
（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘ＝式Ｒ6−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ6＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ6＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ6は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ5中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ5は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、
２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化７】
0006574377.tif 000046
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4は個々に、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化８】
0006574377.tif 000047
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）少なくとも１つの界面活性剤と
を含むランドリーケア組成物。
【請求項１５】
ａ）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドであって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と、
ｂ）
（ｉ）構造
［Ｘ］mＲ5
［式中、
Ｘ＝式Ｒ6−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ6＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ6＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ6は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ5＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ5中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ5は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ5中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、
２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化９】
0006574377.tif 000048
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ3およびＲ4は個々に、ＨまたはＲ1Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化１０】
0006574377.tif 000049
［式中、Ｒ1＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ2は、Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nまたは（ＣＨ2ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ）nＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と
を含む、パーソナルケア製品。
【請求項１６】
前記製品が、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所保湿剤、練り歯磨き、歯磨きゲル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、または局所クレンザーである、請求項１５に記載のパーソナルケア製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１２年３月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／６１８，３９３号明細書の利益を主張するものであり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ペルオキシカルボン酸の生合成および酵素触媒作用の分野に関する。より具体的には、過加水分解活性を有する酵素触媒を含む多成分過酸発生系を提供する。本酵素触媒を使用してペルオキシカルボン酸を生成する方法も提供する。
【背景技術】
【０００３】
ペルオキシカルボン酸組成物は、有効な抗微生物剤になり得る。ペルオキシカルボン酸を使用して、望ましくない微生物増殖に対して、硬質表面、織物、食肉加工品、生きた植物組織、および医療デバイスを清浄化、消毒、および／または衛生化する方法が記載されている（特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；および特許文献５）。ペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、木材パルプの漂白／脱リグニンおよびランドリーケア用途を含む種々の漂白用途にも使用されている（特許文献６；特許文献７；特許文献８；特許文献９；および特許文献１０）。ペルオキシカルボン酸の所望の効果的な濃度は、中性ｐＨ、１分〜５分の反応時間において、製品用途に応じて異なり得る（例えば、医療機器の消毒に対しては、約５００ｐｐｍ〜１０００ｐｐｍ、ランドリーの漂白または消毒用途に対しては、約３０ｐｐｍ〜８０ｐｐｍ）。
【０００４】
消毒（医療機器、硬質表面、織物など）、漂白（木材パルプまたは製紙用パルプの処理／脱リグニン、織物漂白、およびランドリーケア用途）のような用途、ならびに脱染、脱臭、および衛生化などの他のランドリーケア用途、ならびにパーソナルケア用途に対して効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を生成させるために、炭水化物エステラーゼのファミリー７（ＣＥ−７）のメンバーとして構造上分類される酵素が、水中にて、塩基性〜酸性のｐＨ範囲（約ｐＨ１０〜約ｐＨ５）で、過酸化水素（または代替の過酸化物試薬）とカルボン酸のアルキルエステルとの反応を触媒するペルヒドロラーゼとして使用されている（特許文献１１；特許文献１２；および特許文献１３；特許文献１４；ならびに特許文献１５；および特許文献１６）。ＣＥ−７酵素は、エステル、特にアルコール、ジオール、およびグリセロールのアセチルエステルの過加水分解に対して高い比活性を有することが見出されている。向上した性能を有する、いくつかの種に由来する変異体ＣＥ−７ペルヒドロラーゼがＤｉＣｏｓｉｍｏらにより報告されている（特許文献１７；特許文献１８；特許文献１９；特許文献２０；特許文献２１；特許文献２２；特許文献２３；特許文献２４；および特許文献２５；ならびに特許文献２６；および特許文献２７）。
【０００５】
以前に報告された、過加水分解活性を有するＣＥ−７炭水化物エステラーゼ（野生型およびその変異体の両方）は、Ｖｉｎｃｅｎｔら（非特許文献１）により定義される、保存的な構造「シグネチャー」モチーフを含んでいた。より具体的には、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼファミリーのメンバーを構造上同定し定義するために使用されるＣＥ−７シグネチャーモチーフは、以下の３つの保存サブモチーフを含む：１）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０の「ＲＧＱ」サブモチーフ、２）Ｇｌｙ１８６−Ｘａａ１８７−Ｓｅｒ１８８−Ｇｌｎ１８９−Ｇｌｙ１９０の「ＧＸＳＱＧ」サブモチーフ、および３）Ｈｉｓ３０３−Ｇｌｕ３０４の「ＨＥ」サブモチーフ（配列番号２として示されるサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）参照配列に関連した残基の番号付けおよび配向）。
【０００６】
ＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして分類される酵素の大部分は、Ｖｉｎｃｅｎｔらにより定義されるシグネチャーモチーフで構成されるが、「ＨＥ」サブモチーフを含有しない炭水化物エステラーゼのファミリー７には、いくつかのポリペプチド配列が加えられている（非特許文献２）。このサブグループ内に過加水分解活性の存在は報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，５４５，０４７号明細書
【特許文献２】米国特許第６，１８３，８０７号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５１８，３０７号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００３−００２６８４６号明細書
【特許文献５】米国特許第５，６８３，７２４号明細書
【特許文献６】欧州特許第１０４０２２２Ｂ１号明細書
【特許文献７】米国特許第５，５５２，０１８号明細書
【特許文献８】米国特許第３，９７４，０８２号明細書
【特許文献９】米国特許第５，２９６，１６１号明細書
【特許文献１０】米国特許第５，３６４，５５４号明細書
【特許文献１１】米国特許第７，９６４，３７８号明細書
【特許文献１２】米国特許第７，９５１，５６６号明細書
【特許文献１３】米国特許第７，７２３，０８３号明細書
【特許文献１４】米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献１５】米国特許出願公開第２０１２−０３１７７３３号明細書
【特許文献１６】米国特許出願公開第２０１２−０３２８５３４号明細書（Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  ｅｔ  ａｌ．）
【特許文献１７】米国特許第７，９２７，８５４号明細書；
【特許文献１８】米国特許第７，９２３，２３３号明細書；
【特許文献１９】米国特許第７，９３２，０７２号明細書；
【特許文献２０】米国特許第７，９１０，３４７号明細書；
【特許文献２１】米国特許第７，９６０，５２８号明細書；
【特許文献２２】米国特許第８，０６２，８７５号明細書；
【特許文献２３】米国特許第８，２０６，９６４号明細書；
【特許文献２４】米国特許第８，３８９，２５４号明細書；
【特許文献２５】米国特許第８，３８９，２５５号明細書；
【特許文献２６】米国特許出願公開第２０１１−０２３６３３６号明細書
【特許文献２７】米国特許出願公開第２０１１−０２３６３３８号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３０：５９３−６０６（２００３）
【非特許文献２】Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）：ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ”，ＮＡＲ，３７：Ｄ２３３−Ｄ２３８（２００９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一部の用途に過加水分解酵素技術を組み込むには、新規の過加水分解酵素の同定が必要となる場合がある。そのため、意味のある過加水分解活性を有するポリペプチドを含むさらなる酵素触媒を同定する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
効果的な濃度で過酸の生成に適した過加水分解活性を有するいくつかの酵素が同定されている。
【００１１】
一実施形態では、
（１）
（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、
Ｘ＝式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ５＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ５は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ５中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化１】
0006574377.tif 000002
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化２】
0006574377.tif 000003
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアセチル化単糖類、アセチル化二糖類、またはアセチル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、ならびに
（３）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを含む酵素的過酸発生系であって、適切な反応条件下で反応成分を混合すると過酸が酵素的に生成される酵素的過酸発生系を提供する。
【００１２】
別の実施形態では、ペルオキシカルボン酸を生成するための方法であって、
（ａ）
（１）
（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、
Ｘ＝式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ５＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ５は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ５中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化３】
0006574377.tif 000004
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化４】
0006574377.tif 000005
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（２）過酸素源と、ならびに
（３）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
を含む反応成分セットを準備するステップと、
（ｂ）適切な条件下で反応成分セットを混合し、それによってペルオキシカルボン酸を生成するステップと、
（ｃ）任意選択で、ステップ（ｂ）で生成されるペルオキシカルボン酸を希釈するステップと
を含む方法も提供する。
【００１３】
別の実施形態では、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）において生成されるペルオキシカルボン酸を硬質表面、体表面、または少なくとも１点の衣類に接触させるステップ（ｄ）をさらに含む方法を提供する。
【００１４】
本方法では、反応成分が混合されると所望のペルオキシカルボン酸が生成する。反応成分は使用するまで分離させておくことができる。
【００１５】
さらなる態様では、ペルオキシカルボン酸の発生および送達系であって、
（ａ）
（１）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドを含む酵素触媒であって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない酵素触媒と
（２）
（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、
Ｘ＝式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ５＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ５は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ５中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化５】
0006574377.tif 000006
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化６】
0006574377.tif 000007
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
（３）任意選択の緩衝液と
を含む第１のコンパートメント、ならびに
（ｂ）
（１）過酸素源と、
（２）過酸化物安定化剤と
（３）任意選択の緩衝液と
を含む第２のコンパートメント
を含むペルオキシカルボン酸の発生および送達系を提供する。
【００１６】
さらなる実施形態では、ランドリーケア組成物であって、
ａ）過加水分解活性と、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列とを有するポリペプチドであって、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないペプチドと
ｂ）
（ｉ）構造
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、
Ｘ＝式Ｒ６−Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基であり；
Ｒ６＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ５＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒドロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ５は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ５中の炭素原子数までの範囲の整数である］を有し、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステル；
（ｉｉ）構造
【化７】
0006574377.tif 000008
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々に、ＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］を有する１つまたは複数のグリセリド；
（ｉｉｉ）式：
【化８】
0006574377.tif 000009
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎまたは（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステル；
（ｉｖ）１つまたは複数のアシル化単糖類、アシル化二糖類、またはアシル化多糖類；および
（ｖ）（ｉ）〜（ｉｖ）の任意の組合せ
からなる群から選択される少なくとも１つの基質と、
ｃ）過酸素源と、
ｄ）少なくとも１つの界面活性剤と
を含むランドリーケア組成物を提供する。
【００１７】
さらなる実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドを含むパーソナルケア製品であって、前記ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないパーソナルケア製品を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態では、パーソナルケア製品は、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所保湿剤、練り歯磨き、歯磨きゲル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、または局所クレンザーである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】配列番号２、４、６、８、１０、および１２のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントを示す図である。
【図１Ｂ】配列番号２、４、６、８、１０、および１２のＣＬＵＳＴＡＬＷアライメントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
生物学的配列の簡単な説明
以下の配列は、米国特許法施行規則第１．８２１〜１．８２５条（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む特許出願の要件−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に準拠し、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（２００９年）、ならびに欧州特許条約（ＥＰＣ）および特許協力条約（ＰＣＴ）の規則５．２および４９．５（ａの２）および実施細則の２０８項および付録Ｃの配列表の要件と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号およびフォーマットは、米国特許法施行規則第１．８２２条に記載の規則に準拠する。
【００２１】
配列番号１は、過加水分解活性を有するサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００２２】
配列番号２は、過加水分解活性を有するサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号３は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００２４】
配列番号４は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号５は、過加水分解活性を有するプロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００２６】
配列番号６は、過加水分解活性を有するプロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号７は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００２８】
配列番号８は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号９は、過加水分解活性を有するスタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００３０】
配列番号１０は、過加水分解活性を有するスタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号１１は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００３２】
配列番号１２は、過加水分解活性を有するストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号１３は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００３４】
配列番号１４は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７７Ｓ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号１５は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７７Ｔ変異体アセチルキシランエステラーゼをコードするコドン最適化コード領域の核酸配列である。
【００３６】
配列番号１６は、過加水分解活性を有するアクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７７Ｔ変異体アセチルキシランエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号１７は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｓのアミノ酸配列である（米国特許第８，０６２，８７５号明細書）。
【００３８】
配列番号１８は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）変異体Ｃ２７７Ｔのアミノ酸配列である（米国特許第８，０６２，８７５号明細書）。
【００３９】
過加水分解活性を有するポリペプチドであって、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないポリペプチドを含む組成物および方法を提供する。この組成物および方法は、ランドリーケア製品、消毒剤、化粧品、またはパーソナルケア製品での使用に適した少なくとも１つの過酸を酵素的に生成させるのに適している。
【００４０】
本開示では、いくつの用語および略語を使用する。特に別記しない限り、以下の定義を適用する。
【００４１】
本明細書で使用する場合、本発明の要素または成分の前にある冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その要素または成分の実例（すなわち存在）の数に関して非限定的になるように意図するものである。したがって「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、１つまたは少なくとも１つを含むと解釈されるべきであり、要素または成分の単数の語形は、その数が明らかに単数であることを意味しない限りは複数も含む。
【００４２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、特許請求の範囲において言及される所定の特徴、整数、ステップ、または成分の存在を意味するが、１つまたは複数の他の特徴、整数、ステップ、成分、またはそれらの群の存在または付加を排除しない。「含む」という用語は、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語によって包含される実施形態を含むことを意図するものである。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語によって包含される実施形態を含むことを意図するものである。
【００４３】
本明細書で使用する場合、使用される材料または反応物の量を修飾する「約」という用語は、例えば、実際に濃縮物または使用溶液を作製するために使用する典型的な測定手順および液体処理手順によって、これらの手順における故意でない誤差によって、組成物の作製または方法の実施のために使用される材料の製造、供給源、または純度の差異によって等により生じ得る数量の変動を指す。「約」という用語はまた、特定の初期混合物から得られる組成物に対する平衡条件が異なることにより異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されるか否かにかかわらず、特許請求の範囲はその量と同等の量を含む。
【００４４】
存在する場合、すべての範囲は、包括的かつ結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が記載される場合、記載範囲は、「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２および４〜５」、「１〜３および５」等の範囲を含むものと解釈されるべきである。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「多成分系」という用語は、使用するまで成分が分離されたままである、ペルオキシカルボン酸を酵素的に発生させる系を指す。そのため、多成分系は、少なくとも１つの第２の成分から分離されたままである、少なくとも１つの第１の成分を含むことになる。第１および第２の成分は、使用するまで、異なるコンパートメント中に分離されている（すなわち、第１および第２のコンパートメントを使用して）。多成分系の設計は、多くの場合、混合される成分の物理的形態に依存することになるが、詳細は以下に説明する。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「ペルオキシカルボン酸」という用語は、過酸、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙａｃｉｄ）、ペルオキシ酸（ｐｅｒｏｘｙ  ａｃｉｄ）、過カルボン酸、およびペルオキソ酸と同義である。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「過酢酸」という用語は、「ＰＡＡ」と略され、ペルオキシ酢酸、エタンペルオキソ酸、およびＣＡＳ登録番号７９−２１−０のすべての他の同義語と同義である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「モノアセチン」という用語は、グリセロールモノアセテート、グリセリンモノアセテート、およびグリセリルモノアセテートと同義である。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「ジアセチン」という用語は、グリセロールジアセテート；グリセリンジアセテート、グリセリルジアセテート、およびＣＡＳ登録番号２５３９５−３１−７のすべての他の同義語と同義である。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「トリアセチン」という用語は、グリセリントリアセテート；グリセロールトリアセテート；グリセリルトリアセテート；１，２，３−トリアセトキシプロパン；１，２，３−プロパントリオールトリアセテート；およびＣＡＳ登録番号１０２−７６−１のすべての他の同義語と同義である。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「モノブチリン」という用語は、グリセロールモノブチレート、グリセリンモノブチレート、およびグリセリルモノブチレートと同義である。
【００５２】
本明細書で使用する場合、「ジブチリン」という用語は、グリセロールジブチレートおよびグリセリルジブチレートと同義である。
【００５３】
本明細書で使用する場合、「トリブチリン」という用語は、グリセロールトリブチレート；１，２，３−トリブチリルグリセロール；およびＣＡＳ登録番号６０−０１−５のすべての他の同義語と同義である。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「モノプロピオニン」という用語は、グリセロールモノプロピオネート、グリセリンモノプロピオネート、およびグリセリルモノプロピオネートと同義である。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「ジプロピオニン」という用語は、グリセロールジプロピオネートおよびグリセリルジプロピオネートと同義である。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「トリプロピオニン」という用語は、グリセリルトリプロピオネート、グリセロールトリプロピオネート、１，２，３−トリプロピオニルグリセロール、およびＣＡＳ登録番号１３９−４５−７のすべての他の同義語と同義である。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「アシル化糖」および「アシル化糖類」という用語は、少なくとも１つのアシル基を含む単糖類、二糖類、および多糖類を指し、ここで、アシル基は、Ｃ２〜Ｃ８の鎖長を有する直鎖脂肪族カルボキシレートからなる群から選択される。例としては、これらに限定されるものではないが、グルコースペンタアセテート、キシローステトラアセテート、アセチル化キシラン、アセチル化キシラン断片、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、およびトリ−Ｏ−アセチル−グルカールが挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「ヒドロカルビル」、「ヒドロカルビル基」、および「ヒドロカルビル部分」という用語は、炭素−炭素の単結合、二重結合、もしくは三重結合および／またはエーテル結合によって結合し、適宜水素原子により置換された炭素原子の直鎖状、分枝状、または環状の配置を意味する。このようなヒドロカルビル基は、脂肪族および／または芳香族であり得る。ヒドロカルビル基の例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、シクロプロピル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、メチルシクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル、ベンジル、およびフェニルが挙げられる。一実施形態では、ヒドロカルビル部分は、炭素−炭素単結合および／またはエーテル結合によって結合し、適宜水素原子により置換された炭素原子の直鎖状、分枝状、または環状の配置である。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「芳香族性」という用語は、通常複数の共役二重結合を含有する環系において電子の非局在化から生じる化学安定性の増大を特徴とする有機化合物または有機部分を指す。非局在化電子を有する平面共役単環は、（４ｎ＋２）π電子を有する場合、芳香族性になるはずである。芳香族化合物の例としては、ベンゼン誘導体（２−，３−，または４−アセトキシ安息香酸など）を挙げることができる。一実施形態では、エステル基質は４−アセトキシ安息香酸とすることができる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ヘテロ環式」という用語は、環の少なくとも１つの中に、炭素以外の１つまたは複数の原子を有する環構造がある有機化合物または有機部分を指す。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「ヘテロ芳香族」という用語は、ヘテロ環式かつ芳香族性である環構造を有する有機化合物または有機部分を指し、環はヘテロ原子である酸素、窒素、またはイオウの少なくとも１つを含む。ヘテロ芳香族部分の例としては、ピリジン部分、ピロール部分、フラン部分、およびチオフェン部分を挙げることができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールの「モノエステル」および「ジエステル」という用語は、式ＲＣ（Ｏ）Ｏ（式中、ＲはＣ１〜Ｃ７直鎖状ヒドロカルビル部分である）の少なくとも１つのエステル基を含む前記化合物を指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「適切な酵素反応製剤」、「ペルオキシカルボン酸の発生に適した成分」、「適切な反応成分」、「反応成分」、「反応製剤」、および「適切な水性反応製剤」という用語は、反応物と過加水分解活性を有する本変異体ポリペプチドを含む酵素触媒とを接触させて、所望のペルオキシカルボン酸を形成させる材料および水を指す。反応製剤の成分は、本明細書に提供され、また、当業者は、この方法に適した成分の変動範囲を認識している。一実施形態では、反応成分が混合されると、酵素反応製剤は、その場でペルオキシカルボン酸を生成する。そのため、反応成分は、使用されるまで反応成分の１つまたは複数が分離されたままである多成分系として提供され得る。複数の活性成分を分離および混合するための系および手段の設計は当技術分野で公知であり、一般に個々の反応成分の物理形態に依存することになる。例えば、複数の活性流体（液体−液体）系は、通常、所望の漂白剤が反応流体の混合で生成される一部の漂白用途で見出されるものなど、マルチチャンバーディスペンサーボトルまたは２相系を使用する（米国特許出願公開第２００５−０１３９６０８号明細書、米国特許第５，３９８，８４６号明細書、米国特許第５，６２４，６３４号明細書、米国特許第６，３９１，８４０号明細書、欧州特許第０８０７１５６Ｂ１号明細書、米国特許出願公開第２００５−０００８５２６号明細書、およびＰＣＴ公報国際公開第００／６１７１３号パンフレット）。カルボン酸エステルからペルオキシカルボン酸を酵素的に生成する多成分製剤および多成分発生系はそれぞれ、米国特許出願公開第２０１０−００８６５１０号明細書および同第２０１０−００８６６２１号明細書において、ＤｉＣｏｓｉｍｏらにより記載されている。ペルオキシカルボン酸の発生に使用される多成分系の他の形態としては、これらに限定されるものではないが、多くの市販の漂白組成物中に使用される粉末（例えば、米国特許第５，１１６，５７５号明細書）、多層錠剤（例えば、米国特許第６，２１０，６３９号明細書）、複数のコンパートメントを有する水溶解性パケット（例えば、米国特許第６，９９５，１２５号明細書）、および水を添加すると反応する固体凝集体（例えば、米国特許第６，３１９，８８８号明細書）など、１つまたは複数の固体成分または固体−液体成分の組合せのために設計されたものを挙げることができる。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「基質」または「カルボン酸エステル基質」という用語は、過酸化水素などの適切な過酸素源の存在下で本酵素触媒を使用して酵素的に過加水分解される反応成分を指す。一実施形態では、基質は、酵素触媒を使用して酵素的に過加水分解され得る少なくとも１つのエステル基を含み、それにより、ペルオキシカルボン酸が生成される。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「過加水分解」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための、選択された基質と過酸化水素源との反応として定義される。通常、触媒の存在下で無機過酸化物を選択された基質と反応させて、ペルオキシカルボン酸を生成させる。本明細書で使用する場合、「化学的過加水分解」という用語は、基質（ペルオキシカルボン酸前駆体など）を過酸化水素源と化合させる過加水分解反応を含むが、この場合、ペルオキシカルボン酸は酵素触媒の非存在下で形成される。本明細書で使用する場合、「酵素的過加水分解」という用語は、ペルオキシカルボン酸を形成するための、選択された基質と過酸化水素源との反応を指すが、この場合、反応は過加水分解活性を有する酵素触媒によって触媒される。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「ペルヒドロラーゼ活性」という用語は、タンパク質の単位質量（例えば、ミリグラム）、乾燥細胞重量、または固定化触媒重量あたりの触媒活性を指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「酵素活性の１単位」または「活性の１単位」または「Ｕ」は、所定温度で１分当たり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸生成物を生成するために必要とされるペルヒドロラーゼ活性の量として定義される。「酵素活性の１単位」はまた、所定温度で１分当たり１μｍｏｌのペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）を加水分解するために必要とされるペルオキシカルボン酸加水分解活性の量を指すために使用することができる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「酵素触媒」および「ペルヒドロラーゼ触媒」という用語は、過加水分解活性を有する酵素（すなわち、ポリペプチド）を含む触媒を指し、全微生物細胞、透過性になった微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分精製酵素、または精製酵素の形態とすることができる。酵素触媒はまた、化学修飾することができる（例えば、ペグ化、または架橋試薬との反応により）。ペルヒドロラーゼ触媒はまた、当業者に周知の方法を使用して可溶性または不溶性の支持体に固定化することができる；例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ；（第２版）Ｊｏｓｅ  Ｍ．Ｇｕｉｓａｎ編；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；２００６を参照のこと。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「ＣＥ−７酵素として構造上分類される」、「炭水化物エステラーゼファミリー７酵素として構造上分類される」、「ＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして構造上分類される」、および「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」は、ＣＥ−７炭水化物エステラーゼとして構造上分類される、過加水分解活性を有する酵素を指すために、本明細書で使用される（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）：ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ”，ＮＡＲ，３７：Ｄ２３３−Ｄ２３８（２００９）を参照のこと）。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「セファロスポリンＣデアセチラーゼ」および「セファロスポリンＣアセチルヒドロラーゼ」という用語は、セファロスポリンＣおよび７−アミノセファロスポラン酸などのセファロスポリンの脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．４１）を指す（Ｍｉｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６１（６）：２２２４−２２２９（１９９５）；米国特許第５，５２８，１５２号明細書；および米国特許第５，３３８，６７６号明細書）。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「アセチルキシランエステラーゼ」は、アセチル化キシランおよび他のアセチル化糖類の脱アセチル化を触媒する酵素（Ｅ．Ｃ．３．１．１．７２；ＡＸＥ）を指す。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）」という用語は、アセチルキシランエステラーゼ活性を有することが報告された細菌細胞（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＮＰ＿２２７８９３．１）を指す。一態様では、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）株は、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）ＭＳＢ８である。サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のペルヒドロラーゼ活性を有する野生型酵素のアミノ酸配列を、配列番号２として示す。
【００７３】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの基本的な化学構造単位を指す。所定のアミノ酸を特定するために以下の略語を本明細書では使用する。
【００７４】
【表１】
0006574377.tif 000010
【００７５】
本明細書で使用する場合、「生物学的汚染物質」という用語は、これらに限定されるものではないが、微生物、胞子、ウイルス、プリオン、およびそれらの混合物を含む、１つまたは複数の望まれないかつ／または病原性の生物学的実体を指す。本酵素は、生存可能な生物学的汚染物質の存在を低減および／または除去するために有用な少なくとも１つのペルオキシカルボン酸の効果的な濃度を生成するために使用することができる。好ましい実施形態では、生物学的汚染物質は生存可能な病原微生物である。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「消毒する」という用語は、生物学的汚染物質を破壊するかまたはその増殖を防止するプロセスを指す。本明細書で使用する場合、「消毒剤」という用語は、生物学的汚染物質の破壊、中和、または増殖阻害により消毒する薬剤を指す。通常、消毒剤は無生物体または表面を処理するために使用される。本明細書で使用する場合、「防腐剤」という用語は、疾患を伝搬する微生物の増殖を阻害する化学薬剤を指す。実施形態の一態様では、生物学的汚染物質は病原微生物である。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「衛生的」という用語は、通常健康に有害であり得る作用因子を除去、防止、または制御することによる、健康の回復または保持を意味するかまたはそれに関することを意味する。本明細書で使用する場合、「衛生化する」という用語は、衛生的にすることを意味する。本明細書で使用する場合、「清浄剤」という用語は、衛生化する薬剤を指す。本明細書で使用する場合、「衛生化」という用語は、衛生化する行為またはプロセスを指す。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「殺ウイルス剤（ｖｉｒｕｃｉｄｅ）」という用語は、ウイルスを阻害または破壊する薬剤を指し、「殺ウイルス剤（ｖｉｒｉｃｉｄｅ）」と同義である。ウイルスを阻害または破壊する能力を示す薬剤は、「殺ウイルス」活性を有すると記載される。ペルオキシカルボン酸は殺ウイルス作用を有し得る。本発明での使用に適し得る、当技術分野で公知の通常の代替殺ウイルス剤としては、例えば、アルコール、エーテル、クロロホルム、ホルムアルデヒド、フェノール、ベータプロピオラクトン、ヨウ素、塩素、水銀塩、ヒドロキシルアミン、エチレンオキシド、エチレングリコール、第四級アンモニウム化合物、酵素、および界面活性剤が挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「殺生物剤」という用語は、微生物を不活性化または破壊する、通常は広域スペクトルの化学薬剤を指す。微生物を不活性化または破壊する能力を示す化学薬剤は、「殺生物」活性を有すると記載される。ペルオキシカルボン酸は殺生物活性を有し得る。本発明での使用に適し得る、当技術分野で公知の通常の代替殺生物剤としては、例えば、塩素、二酸化塩素、クロロイソシアヌレート、次亜塩素酸塩、オゾン、アクロレイン、アミン、塩素化フェノール類、銅塩、有機硫黄化合物、および第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００８０】
本明細書で使用する場合、「最小殺生物濃度」という語句は、所定の接触時間の間に、標的微生物の生存可能集団に致死的かつ不可逆的な所望の低減をもたらすことになる殺生物剤の最小濃度を指す。有効性は、処理後の生存可能微生物のｌｏｇ１０低減によって測定することができる。一態様では、処理後の生存可能微生物の目標とする低減は、少なくとも３−ｌｏｇ１０低減、より好ましくは少なくとも４−ｌｏｇ１０低減、最も好ましくは少なくとも５−ｌｏｇ１０低減である。別の態様では、最小殺生物濃度は、生存可能微生物細胞の少なくとも６−ｌｏｇ１０低減である。
【００８１】
本明細書で使用する場合、「過酸素源」および「過酸素の源」という用語は、水溶液中にある場合、約１ｍＭ以上の濃度で過酸化水素を供給することができる化合物を指し、これらに限定されるものではないが、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸ナトリウムなどの過炭酸塩が含まれる。本明細書に記載するように、水性反応製剤中の過酸素化合物によって供給される過酸化水素の濃度は、反応成分を混合した際に最初は少なくとも１ｍＭ以上になる。一実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも０．５ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも１０ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも１００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は少なくとも２００ｍＭである。別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は５００ｍＭ以上である。さらに別の実施形態では、水性反応製剤中の過酸化水素濃度は１０００ｍＭ以上である。水性反応製剤中の過酸化水素とトリグリセリドなどの酵素基質とのモル比（Ｈ２Ｏ２：基質）は、約０．００２〜２０、好ましくは約０．１〜１０、最も好ましくは約０．５〜５とすることができる。
【００８２】
本明細書で使用する場合、「有益薬剤」という用語は、有用な利点、好ましい／望ましい効果または有益性を促進または増強する物質を指す。一実施形態では、消毒、漂白、脱染、脱臭、およびそれらの任意の組合せなど所望の有益性を達成するために、ペルオキシカルボン酸を含む組成物などの有益薬剤を、織物または衣類に適用する方法を提供する。別の実施形態では、過加水分解活性を有する本異性体ポリペプチドを、パーソナルケア製品（ヘアケア製品、スキンケア製品、ネイルケア製品、または口腔ケア製品など）で使用される過酸ベースの有益薬剤を生成するために使用することができる。一実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドを含むパーソナルケア製品であって、前記ポリペプチドが、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないパーソナルケア製品を提供する。これらのパーソナルケア製品は、所望の過酸有益薬剤の安全かつ効果的な濃度を供給するように製剤化される。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「パーソナルケア製品」は、毛髪、皮膚、頭皮、および歯の清浄化、漂白、および／または消毒に使用される製品を意味し、これらに限定されるものではないが、シャンプー、ボディーローション、シャワーゲル、局所保湿剤、練り歯磨き、歯磨きゲル、マウスウォッシュ、マウスリンス、アンチプラークリンス、および／または他の局所クレンザーが含まれる。一部の特に好ましい実施形態では、これらの製品はヒトに関して利用されるが、他の実施形態では、これらの製品は非ヒト動物での使用が見出されている（例えば、獣医学用途において）。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「歯のホワイトニング」および「歯の漂白」という用語は互換的に使用され、１本の歯または複数の歯の輝度を改善すること（例えば、ホワイトニング）を指す。この用語は、本発明、ならびに化学処理、温和な酸処理、研磨による歯のホワイトニング、およびレーザーによる歯のホワイトニングを含む、歯をホワイトニングするのに適した任意の方法を包含することを意図する。特に好ましい実施形態では、本発明は、歯をホワイトニングするのに適したペルヒドロラーゼおよびペルヒドロラーゼ含有組成物を提供する。
【００８５】
過加水分解活性を有するポリペプチド
過加水分解活性を有すると以前に報告されたＣＥ−７エステラーゼの「シグネチャーモチーフ」は、以下の３つの保存サブモチーフで構成される（参照配列である配列番号２；野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼに関連した残基位置番号付け）：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０；（「ＲＧＱモチーフ）」；
ｂ）Ｇｌｙ１８６−Ｘａａ１８７−Ｓｅｒ１８８−Ｇｌｎ１８９−Ｇｌｙ１９０；（「ＧＸＳＱＧモチーフ」）；および
ｃ）Ｈｉｓ３０３−Ｇｌｕ３０４；（「ＨＥモチーフ」）。
【００８６】
通常、アミノ酸残基位置１８７のＸａａは、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、またはスレオニンである。触媒三残基に属する３つのアミノ酸残基のうちの２つを太字にしている。
【００８７】
本過加水分解酵素はＲＧＱモチーフおよびＧＸＳＱＧモチーフを含有するが、表Ａおよび図１に示すように、本過加水分解酵素のいずれも、保存構造モチーフとして以前に報告された「ＨＥモチーフ」内にグルタミン酸を含有しない。
【００８８】
【表２】
0006574377.tif 000011
【００８９】
過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、ＣＡＺｙデータベース内のメンバーとして収載されているＣＥ−７炭水化物エステラーゼのより大きな総括的クラス内の新規のサブグループを表している可能性があると考えられる（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＡＺｙ）：ａｎ  ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  Ｇｌｙｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ”，ＮＡＲ，３７：Ｄ２３３−Ｄ２３８（２００９））。そのため、本出願内で使用される、過加水分解活性を有するポリペプチドは、以前に定義された「シグネチャーモチーフ」の一部を欠いているけれども、「ＣＥ−７炭水化物エステラーゼ」または「ＣＥ−７ペルヒドロラーゼ」と本明細書で呼ばれる。
【００９０】
別の実施形態では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、参照配列である配列番号２に対してアライメントされた場合に、モチーフの以下の組合せを有するとしてさらに定義される（参照配列である配列番号２；野生型サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）アセチルキシランエステラーゼに関連した残基位置番号付け）：
ａ）Ａｒｇ１１８−Ｇｌｙ１１９−Ｇｌｎ１２０；（「ＲＧＱモチーフ）」；
ｂ）Ｇｌｙ１８６−Ｘａａ１８７−Ｓｅｒ１８８−Ｇｌｎ１８９−Ｇｌｙ１９０；（「ＧＸＳＱＧモチーフ」）；および
ｃ）Ｈｉｓ３０３−Ｘａａ３０４；（「ＨＸモチーフ）」；ここで、Ｘａａはグルタミン酸ではない。
【００９１】
好ましい態様では、「ＨＸモチーフ」内の「Ｘ」アミノ酸残基は、アラニン、アスパラギン酸、またはセリンである。
【００９２】
別の態様では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、または１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない。
【００９３】
一実施形態では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、本明細書に示す配列に対して少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５  ９６、９７、９８、９９、または１００％のアミノ酸同一性を有するが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない。
【００９４】
別の態様では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、配列番号６に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有する少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではない。別の態様では、過加水分解活性を有する本ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号６を含む。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「変異体ペルヒドロラーゼ」または「変異体」という用語は、本明細書に記載する必要なモチーフおよび付随する過加水分解活性が維持される限り、変異体が由来する対応する酵素（通常、野生型酵素）に比較したときに、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換をもたらす改変を有する過加水分解酵素を指す。ＣＥ−７変異体ペルヒドロラーゼはまた、本組成物および本方法で使用することができる。変異体の例として、配列番号１４および１６を提供する。
【００９６】
当業者は、実質的に同様のペルヒドロラーゼ配列も本組成物および本方法において使用することができることを認識する。一実施形態では、実質的に同様の配列とは、高度にストリンジェントな条件下で、本明細書に例示した配列に関連した核酸分子とハイブリダイズするその能力により定義される。別の実施形態では、配列アライメントアルゴリズムを使用して、本明細書に示すＤＮＡ配列またはアミノ酸配列に対するパーセント同一性に基づき、実質的に同様の酵素を定義することができる。
【００９７】
本明細書で使用する場合、核酸分子は、第１の分子の一本鎖が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の分子とアニーリングすることができる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｄ．，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，（２００１）に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、遠縁の生物に由来する相同配列など中程度に類似した分子から、近縁の生物に由来する機能性酵素を再現する遺伝子など高度に類似した分子までスクリーニングできるように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、通常、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件セットは、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間から始まり、次いで２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間を反復し、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を２回反復する一連の洗浄を使用する。より好ましい条件セットは、より高温を使用するが、その洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳにおける最後の２回の３０分間洗浄の温度を６０℃に上昇させることを除いて上記のものと同じである。別の好ましい高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件セットは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃であり、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で最終洗浄が行われる。
【００９８】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間のミスマッチが可能となるけれども、ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含有することが必要となる。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当技術分野で周知の変数である核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（Ｔｍの高さに対応する）は、ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡの順で低下する。長さが１００ヌクレオチド超のハイブリッドについては、Ｔｍの計算式が誘導されている（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）によるハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、またオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ）。一態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドの長さであり、より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは少なくとも３００ヌクレオチドの長さであり、最も好ましくは少なくとも８００ヌクレオチドの長さである。さらに、当業者は、プローブの長さなどの要因に応じて必要があれば、温度および洗浄溶液の塩濃度を調整することができることを認識する。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「パーセント同一性」という用語は、配列の比較により決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を指す。当技術分野では、「同一性」はまた、任意選択で、そのような配列文字列間の一致によって決定される、ポリペプチド間またはポリヌクレオチド間の配列関連性度を意味する。「同一性」および「類似性」は、これらに限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９１）に記載されるものを含む、公知の方法によって容易に算出することができる。同一性および類似性を決定する方法は、公的に入手できるコンピュータプログラムの中に成文化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス計算スイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  ｖ．７．０のＡｌｉｇｎＸプログラム（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）、またはＥＭＢＯＳＳ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６，（６）：２７６−２７７（２０００））を使用して実施することができる。配列の多重アライメントは、アライメントのＣＬＵＳＴＡＬ法（ＣＬＵＳＴＡＬＷ、例えばバージョン１．８３など）（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ、５：１５１−１５３（１９８９）；Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４）；およびＣｈｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１（１３）：３４９７−５００（２００３））、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅを介してＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手可能）を、デフォルトパラメータと共に使用して実施することができる。ＣＬＵＳＴＡＬＷタンパク質アライメントに適したパラメーターには、ＧＡＰ  Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅペナルティ＝１５、ＧＡＰ伸長＝０．２、マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ（例えば、Ｇｏｎｎｅｔ２５０）、タンパク質ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タン��ク質ＧＡＰＤＩＳＴ＝４、およびＫＴＵＰＬＥ＝１が含まれる。一実施形態では、速いまたは遅いアライメントをデフォルト設定と共に使用するが、遅いアライメントが好ましい。あるいは、ＣＬＵＳＴＡＬＷ法（例えば、バージョン１．８３）で使用するパラメーターを修正して、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ伸長＝１、マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６４）、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＴＯＰ  ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５を使用することもできる。
【０１００】
「触媒ヒスチジン」とは、セリンおよびアスパラギン酸と共に触媒三残基を形成する、本開示のペルヒドロラーゼ中のヒスチジン残基を意味する。例えば、配列番号６では、触媒ヒスチジンは、アミノ酸残基番号３０９である。ペルヒドロラーゼ活性を有する配列番号６の変異体では、ＣＬＵＳＴＡＬＷを使用して配列を比較する場合、その触媒ヒスチジンを配列番号６の触媒ヒスチジンと並置させるが、これは、変異体の触媒ヒスチジンが、必ずしもそうである必要はないが、変異体のアミノ酸位置３０９であり得ることを意味する。
【０１０１】
一態様では、適切な単離核酸分子は、本明細書に報告されるアミノ酸配列に対して、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。適切な核酸分子は、上記の相同性を有するだけでなく、通常は、約２１０〜３４０アミノ酸長、約３００〜約３４０アミノ酸長、好ましくは約３１０〜約３３０アミノ酸長、最も好ましくは約３１８〜約３２５アミノ酸長を有するポリペプチドをコードし、各ポリペプチドは、過加水分解活性を有することを特徴とする。
【０１０２】
カルボン酸エステルおよび過酸化水素からペルオキシカルボン酸を酵素触媒により調製するのに適した反応条件
過加水分解活性を有する酵素触媒の存在下で、カルボン酸エステルおよび無機過酸化物（過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、または過炭酸ナトリウムなど）により、少なくとも１つのペルオキシカルボン酸を含む水性製剤を製造する方法を提供する。ここで、酵素触媒は、一実施形態では、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するが、触媒ヒスチジンのＣ末端側に結合したアミノ酸残基が、グルタミン酸ではないポリペプチドを含む。さらなる実施形態では、過加水分解活性を有するポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、および１６から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を有する。
【０１０３】
一実施形態では、適切な基質は、以下の式：
［Ｘ］ｍＲ５
［式中、Ｘ＝式Ｒ６Ｃ（Ｏ）Ｏのエステル基
Ｒ６＝ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖状、分枝状、または環状のヒドロカルビル部分であり、ここで、Ｒ６＝Ｃ２〜Ｃ７の場合には、Ｒ６は、任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含み；
Ｒ５＝ヒドロキシル基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ６の直鎖状、分枝状、もしくは環状のヒドロカルビル部分、または５員環ヘテロ芳香族部分、または６員環の芳香族もしくはヘテロ芳香族部分であり；ここで、Ｒ５中の各炭素原子は個々に、１個以下のヒド
ロキシル基または１個以下のエステル基もしくはカルボン酸基を含み；Ｒ５は任意選択で、１つまたは複数のエーテル結合を含み；
ｍ＝１からＲ５中の炭素原子数までの範囲の整数である］により示され、２５℃で少なくとも５ｐｐｍの水溶解性を有する１つまたは複数のエステルを含む。
【０１０４】
別の実施形態では、Ｒ６＝任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含む、ヒドロキシル基またはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７の直鎖状ヒドロカルビル部分。さらに好ましい実施形態では、Ｒ６＝ヒドロキシル基で置換されていてもよく、かつ／または任意選択で１つまたは複数のエーテル結合を含む、Ｃ２〜Ｃ７の直鎖状ヒドロカルビル部分。
【０１０５】
一実施形態では、適切な基質として、２−アセトキシ安息香酸、３−アセトキシ安息香酸、４−アセトキシ安息香酸、またはそれらの混合物を挙げることができる。
【０１０６】
別の実施形態では、適切な基質はまた、式：
【化９】
0006574377.tif 000012
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ２１の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］の１つまたは複数のグリセリドを含む。一実施形態では、適切な基質は、上記の式［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよいＣ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ３およびＲ４は個々にＨまたはＲ１Ｃ（Ｏ）である］のグリセリドである。
【０１０７】
別の態様では、適切な基質はまた、式：
【化１０】
0006574377.tif 000013
［式中、Ｒ１＝ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ４アルコキシ基で置換されていてもよい、Ｃ１〜Ｃ７の直鎖または分枝鎖のアルキルであり、Ｒ２＝Ｃ１〜Ｃ１０の直鎖または分枝鎖のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルキルヘテロアリール、ヘテロアリール、（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ、または（ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−Ｏ）ｎＨであり、ｎは１〜１０である］の１つまたは複数のエステルを含むことができる。
【０１０８】
適切な基質はまた、アシル化された単糖類、二糖類、および多糖類からなる群から選択される１つまたは複数のアシル化糖類を含むことができる。別の実施形態では、アシル化糖類は、アセチル化キシラン、アセチル化キシランの断片、アセチル化キシロース（キシローステトラアセテートなど）、アセチル化グルコース（α−Ｄ−グルコースペンタアセテート；β−Ｄ−グルコースペンタアセテートなど）、β−Ｄ−ガラクトースペンタアセテート、ソルビトールヘキサアセテート、スクロースオクタアセテート、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、テトラアセチルキシロフラノース、α−Ｄ−グルコピラノースペンタアセテート、α−Ｄ−マンノピラノースペンタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。好ましい実施形態では、アセチル化糖類は、β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテート、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール、スクロースオクタアセテート、およびアセチル化セルロースからなる群から選択される。
【０１０９】
別の実施形態では、適切な基質は、モノアセチン；ジアセチン；トリアセチン；モノプロピオニン；ジプロピオニン；トリプロピオニン；モノブチリン；ジブチリン；トリブチリン；グルコースペンタアセテート；キシローステトラアセテート；アセチル化キシラン；アセチル化キシラン断片；β−Ｄ−リボフラノース−１，２，３，５−テトラアセテートトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−ガラクタール；トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール；１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオール、１，３−プロパンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、１，４−ブタンジオール、１，２−ペンタンジオール、２，５−ペンタンジオール、１，６−ペンタンジオール、１，２−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサンジオール、１，６−ヘキサンジオールのモノエステルまたはジエステル；およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１１０】
別の実施形態では、カルボン酸エステルは、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。別の実施形態では、基質は、１つまたは複数のエステル基を含むＣ１〜Ｃ６ポリオールである。好ましい実施形態では、Ｃ１〜Ｃ６ポリオール上のヒドロキシル基の１つまたは複数は、１つまたは複数のアセトキシ基で置換されている（１，３−プロパンジオールジアセテート、１，４−ブタンジオールジアセテート等）。さらなる実施形態では、基質は、プロピレングリコールジアセテート（ＰＧＤＡ）、エチレングリコールジアセテート（ＥＧＤＡ）、またはそれらの混合物である。
【０１１１】
別の実施形態では、適切な基質は、酢酸エチル；乳酸メチル；乳酸エチル；グリコール酸メチル；グリコール酸エチル；メトキシ酢酸メチル；メトキシ酢酸エチル；３−ヒドロキシ酪酸メチル；３−ヒドロキシ酪酸エチル；２−アセチルクエン酸トリエチル；グルコースペンタアセテート；グルコノラクトン；モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン（グリセリルジプロピオネート）、トリプロピオニン（１，２，３−トリプロピオニルグリセロール）、モノブチリン、ジブチリン（グリセリルジブチレート）、トリブチリン（１，２，３−トリブチリルグリセロール）などのグリセリド（モノ−、ジ−、およびトリグリセリド）；アセチル化糖類；およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【０１１２】
さらなる実施形態では、適切な基質は、モノアセチン、ジアセチン、トリアセチン、モノプロピオニン、ジプロピオニン、トリプロピオニン、モノブチリン、ジブチリン、トリブチリン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。さらに別の態様では、基質は、ジアセチン、トリアセチン、酢酸エチル、および乳酸エチルからなる群から選択される。最も好ましい実施形態では、適切な基質はトリアセチンを含む。
【０１１３】
カルボン酸エステルは、酵素触媒による過加水分解の際に、所望の濃度のペルオキシカルボン酸を生成するのに十分な濃度で水性反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルは、水性反応製剤中に完全に可溶性である必要はないが、ペルヒドロラーゼ触媒による、エステルの対応するペルオキシカルボン酸への変換を可能にするのに十分な溶解性を有する。カルボン酸エステルは、水性反応製剤の０．０００５重量％〜４０重量％の濃度、好ましくは水性反応製剤の０．０１重量％〜２０重量％の濃度、より好ましくは水性反応製剤の０．０５重量％〜１０重量％の濃度で水性反応製剤中に存在する。カルボン酸エステルの重量％は、任意選択で、カルボン酸エステルの溶解限度よりも大きくなることがあり、その結果、カルボン酸エステルの濃度は、水、酵素触媒、および過酸化物源で構成される水性反応製剤中で少なくとも０．０００５重量％になるが、カルボン酸エステルの残りは、二相の水性／有機性反応製剤の第２の分離相として留まる。加えたカルボン酸エステルのすべてが、直ちに水性反応製剤中で溶解する必要はなく、すべての反応成分の最初の混合後、連続的または間欠的な混合をさらに行うことは、任意選択である。
【０１１４】
本反応成分により生成されるペルオキシカルボン酸は、本酵素触媒を使用する限り、選択された基質に応じて異なり得る。一実施形態では、生成されるペルオキシカルボン酸は、過酢酸、過プロピオン酸、過酪酸、過オクタン酸、過乳酸、過グリコール酸、過メトキシ酢酸、過β−ヒドロキシ酪酸、またはそれらの混合物である。
【０１１５】
過酸素源としては、これらに限定されるものではないが、過酸化水素、過酸化水素付加物（例えば、尿素−過酸化水素付加物（過酸化カルバミド））、過ホウ酸塩、および過炭酸塩を挙げることができる。あるいは、過酸化水素は、オキシダーゼ活性を有する酵素（例えば、これらに限定されるものではないが、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、ソルビトールオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ、グリコール酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、オキサレートオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ピラノースオキシダーゼ、カルボキシアルコールオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、グリシンオキシダーゼ、グルタメートオキシダーゼ、リシンオキシダーゼ、およびウリカーゼ）により触媒される、基質と酸素の反応によって、その場で生成させることができる。反応製剤中の過酸素化合物の濃度は、０．００３３重量％〜約５０重量％の範囲、好ましくは０．０３３重量％〜約４０重量％の範囲、より好ましくは０．３３重量％〜約３０重量％の範囲とすることができる。
【０１１６】
多くのペルヒドロラーゼ触媒（全細胞、透過性になった全細胞、および部分精製された全細胞抽出物）は、カタラーゼ活性を有することが報告されている（ＥＣ  １．１１．１．６）。カタラーゼは、過酸化水素の酸素および水への変換を触媒する。一態様では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒には、カタラーゼ活性がない。別の態様では、ペルヒドロラーゼ活性を有する酵素触媒のカタラーゼ活性が十分低いため、前記カタラーゼ活性の存在により、ペルヒドロラーゼに触媒されるペルオキシカルボン酸の生成が顕著に妨害されることはない。別の態様では、カタラーゼ阻害剤が水性反応製剤に添加される。適切なカタラーゼ阻害剤の例としては、これらに限定されるものではないが、アジ化ナトリウムおよび硫酸ヒドロキシルアミンが挙げられる。当業者は、必要に応じてカタラーゼ阻害剤の濃度を調節することができる。カタラーゼ阻害剤の濃度は、通常、０．１ｍＭ〜約１Ｍ；好ましくは約１ｍＭ〜約５０ｍＭ；より好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭの範囲である。一態様では、アジ化ナトリウムの濃度は、通常、約２０ｍＭ〜約６０ｍＭの範囲であり、一方硫酸ヒドロキシルアミンの濃度は、通常、約０．５ｍＭ〜約３０ｍＭ、好ましくは１０ｍＭである。
【０１１７】
宿主細胞中のカタラーゼ活性は、これらに限定されるものではないが、トランスポゾン変異誘発、ＲＮＡアンチセンス発現、標的化変異誘発、およびランダム変異誘発を含む周知の技術を使用して、カタラーゼ活性の原因遺伝子の発現を破壊することにより下方制御または除去することができる。好ましい実施形態では、内因性カタラーゼ活性をコードする遺伝子が下方制御または破壊（すなわち、「ノックアウト」）される。本明細書で使用する場合、「破壊された」遺伝子は、改変された遺伝子によってコードされるタンパク質の活性および／または機能がもはや存在しない遺伝子である。遺伝子を破壊する手段は、当技術分野において周知であり、対応するタンパク質の活性および／または機能が存在しなくなる限り、これらに限定されるものではないが、遺伝子への挿入、欠失、または突然変異を含むことができる。さらに好ましい実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥからなる群から選択されるカタラーゼ遺伝子の破壊を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生宿主である（米国特許第７，９５１，５６６号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。別の実施形態では、産生宿主は、ｋａｔＧおよびｋａｔＥカタラーゼ遺伝子の両方における下方制御および／または破壊を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。ｋａｔＧおよびｋａｔＥの二重ノックアウトを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が作製されており、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＫＬＰ１８（米国特許第７，９５１，５６６号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．））として記載されている。
【０１１８】
水性反応製剤中の触媒濃度は、触媒の比触媒活性に依存し、所望の反応速度を得るように選択される。過加水分解反応における触媒重量は、通常、全反応容積の１ｍＬ当たり０．０００１ｍｇ〜５０ｍｇ、好ましくは１ｍＬ当たり０．０００５ｍｇ〜１０ｍｇ、より好ましくは１ｍＬ当たり０．００１０ｍｇ〜２．０ｍｇの範囲である。触媒はまた、当業者に周知の方法を使用して可溶性または不溶性の支持体に固定化することができ；例えば、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｓ（第２版）；Ｊｏｓｅ  Ｍ．Ｇｕｉｓａｎ編；Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；２００６を参照されたい。固定化触媒を使用すると、その後の反応における触媒の回収および再使用が可能になる。酵素触媒は、全微生物細胞、透過性になった微生物細胞、微生物細胞抽出物、部分精製酵素または精製酵素、およびそれらの混合物の形態とすることができる。
【０１１９】
一態様では、カルボン酸エステルの化学的過加水分解と酵素的過加水分解を組み合わせることにより発生するペルオキシカルボン酸の濃度は、所望のｐＨでの消毒、漂白、衛生化、脱臭、または脱染のために、ペルオキシカルボン酸の有効濃度を供給するのに十分である。別の態様では、ペルオキシカルボン酸は、毛髪、皮膚、爪、または歯エナメル質、歯外皮、または歯茎などの口腔組織に適用されるパーソナルケア製品での使用に適した安全かつ効果的な濃度で発生される。別の態様では、本方法は、ペルオキシカルボン酸の所望の有効濃度を生成するための酵素と酵素基質の組合せを提供するが、この場合、酵素を添加しないと、極めて低濃度のペルオキシカルボン酸しか生成されない。無機過酸化物と酵素基質との直接化学反応により酵素基質が一部化学的過加水分解され得るが、所望の用途におけるペルオキシカルボン酸の有効濃度を供給するのに十分な濃度のペルオキシカルボン酸が発生されない可能性があり、全ペルオキシカルボン酸濃度の顕著な増加は、水性反応製剤に適切なペルヒドロラーゼ触媒を添加することにより達成される。
【０１２０】
本発明の一態様では、酵素的過加水分解により発生するペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の濃度は、酵素的過加水分解反応の開始から５分以内、より好ましく１分以内に、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも３００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも約２０００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸、最も好ましくは少なくとも１０，０００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸である。本発明の第２の態様では、酵素的過加水分解により発生するペルオキシカルボン酸（例えば、過酢酸）の濃度は、酵素的過加水分解反応の開始から５分以内、より好ましくは１分以内に（すなわち、製剤を形成させるために反応成分を混合してから測定される時間）、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも３０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約４０ｐｐｍのペルオキシカルボン酸、より好ましくは少なくとも５０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも６０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約８０ｐｐｍのペルオキシカルボン酸、最も好ましくは少なくとも１００ｐｐｍのペルオキシカルボン酸である。
【０１２１】
ペルオキシカルボン酸を含む水性製剤は、任意選択で、所望の低い標的濃度のペルオキシカルボン酸製剤を生成するように、水を含む希釈剤または主として水で構成される溶液で希釈してもよい。一態様では、ペルオキシカルボン酸の所望の濃度（または濃度範囲）を生成するのに必要な反応時間は、約２０分以内、好ましくは約５分以内、最も好ましくは約１分以内である。
【０１２２】
他の態様では、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された表面または無生物体を、前記反応成分の混合から約１分〜約１６８時間以内もしくは約１分〜約４８時間以内に、または前記反応成分の混合から約１分〜約２時間以内に、あるいはこの中の任意の時間間隔で、本明細書に記載する方法に従って形成されたペルオキシカルボン酸と接触させる。
【０１２３】
別の態様では、本明細書に記載の方法に従って形成されたペルオキシカルボン酸をランドリーケア用途で使用し、そこでは、消毒、漂白、脱染、脱臭、および／またはそれらの組合せなどの有益性を供与するために、ペルオキシカルボン酸を衣類または織物と接触させる。ペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、ランドリー処理剤または織物予洗処理剤、ランドリー洗剤またはランドリー添加剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含む、種々のランドリーケア製品で使用することができる。一実施形態では、標的表面に対してペルオキシカルボン酸を生成する本方法は、その場で実行される。
【０１２４】
ランドリーケア用途の文脈では、「衣類または織物に接触させる」という用語は、衣類または織物を本明細書に開示する製剤に曝露することを意味する。この目的のために、衣類または織物を処理するために使用することができる製剤にはいくつかの形態があり、例えば、これらに限定されるものではないが、液体、固体、ゲル、ペースト、バー、錠剤、スプレー、発泡体、粉末、または顆粒があり、手動投入、ユニット投入、基板からの投入、スプレー、ランドリー洗濯機または乾燥機からの自動投入を介して送達させることができる。粒状組成物も、コンパクトな形態にすることができ；液体組成物も、濃縮形態にすることができる。
【０１２５】
本明細書に開示する製剤をランドリー洗濯機で使用する場合、製剤はランドリー洗剤に典型的な成分をさらに含有することができる。例えば、典型的な成分としては、これらに限定されるものではないが、界面活性剤、漂白剤、漂白活性化剤、追加の酵素、石鹸泡抑制剤、分散剤、石灰石鹸分散剤、土壌懸濁剤、および再付着防止剤、柔軟剤、腐食防止剤、変色防止剤、および殺菌剤、ｐＨ調整剤、非ビルダーアルカリ源、キレート剤、有機および／または無機の充填剤、溶媒、ヒドロトロープ、蛍光増白剤、染料、および香料が挙げられる。本明細書に開示する製剤はまた、固体または液体の形態で、洗剤添加物製品として使用することができる。そのような添加物製品は、従来の洗剤組成物の性能を補足または増強することを意図するものであり、クリーニングプロセスの任意の段階で添加することができる。
【０１２６】
漂白、染み抜き、臭い低減の１つまたは複数のために過酸を発生させる、ランドリーケアのための本系および本方法に関連して、少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解により発生する過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、少なくとも約２ｐｐｍ、好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、好ましくは少なくとも１００ｐｐｍ、またより好ましくは少なくとも約２００ｐｐｍの過酸とすることができる。消毒または衛生化のために過酸を発生させる、ランドリーケアのための本系および本方法に関連して、少なくとも１つのカルボン酸エステルの過加水分解により発生する過酸（例えば、過酢酸）の濃度は、過加水分解反応の開始から１０分以内、好ましくは５分以内、より好ましくは１分以内に、少なくとも約２ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも２０ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも２００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも５００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも７００ｐｐｍ、より好ましくは少なくとも約１０００ｐｐｍの過酸、最も好ましくは少なくとも２０００ｐｐｍの過酸である。過酸を含む製品製剤は、任意選択で、水、または主として水で構成される溶液で希釈して、所望の低濃度の過酸を含む製剤を生成することができる。本方法および本系の一態様では、所望の濃度の過酸を生成するのに必要な反応時間は、約２時間以内、好ましくは約３０分以内、より好ましくは約１０分以内、さらにより好ましくは約５分以内、また最も好ましくは約１分以内である。
【０１２７】
反応の温度は、反応速度および酵素触媒活性の安定性の両方を制御するように選択される。反応の温度は、水性反応製剤の氷点のすぐ上（ほぼ０℃）から約８５℃までの範囲とすることができ、反応温度の好ましい範囲は約５℃〜約７５℃である。
【０１２８】
ペルオキシカルボン酸を酵素的に生成する間の水性反応製剤のｐＨは、約５．０〜約１０．０、好ましくは約６．５〜約８．５、またさらにより好ましくは約６．５〜約７．５の範囲のｐＨに維持される。一実施形態では、水性反応製剤のｐＨは、反応成分の混合後少なくとも３０分間、約６．５〜約８．５の範囲にある。水性反応製剤のｐＨは、これらに限定されるものではないが、リン酸、ピロリン酸、重炭酸、酢酸、またはクエン酸を含む適切な緩衝剤の添加または組み込みにより調節または制御することができる。一実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤、重炭酸緩衝剤、または硬水（ランドリーケア用途をシミュレートする水道水）と過炭酸（過酸化水素を発生するために使用される過炭酸ナトリウムに由来する）の組合せにより形成される緩衝剤から選択される。緩衝剤の濃度は、使用する場合、通常、０．１ｍＭ〜１．０Ｍ、好ましくは１ｍＭ〜３００ｍＭ、最も好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭである。本発明の別の態様では、ペルオキシカルボン酸を酵素的に生成させる間、反応混合物に緩衝剤を添加しない。
【０１２９】
さらに別の態様では、酵素的過加水分解の水性反応製剤は、分散剤として作用して水性反応製剤中のカルボン酸エステルの溶解速度を増強する有機溶媒を含有することができる。そのような溶媒としては、これらに限定されるものではないが、プロピレングリコールモノメチルエーテル、アセトン、シクロヘキサノン、ジエチレングリコールブチルエーテル、トリプロピレングリコールメチルエーテル、ジエチレングリコールメチルエーテル、プロピレングリコールブチルエーテル、ジプロピレングリコールメチルエーテル、シクロヘキサノール、ベンジルアルコール、イソプロパノール、エタノール、プロピレングリコール、およびそれらの混合物が挙げられる。
【０１３０】
別の態様では、酵素的過加水分解製品は、望ましい機能性を付与する追加の成分を含有することができる。これらの追加の成分としては、これらに限定されるものではないが、緩衝剤、洗剤ビルダー、増粘剤、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、腐食防止剤（例えば、ベンゾトリアゾール）、酵素安定剤、および過酸化物安定剤（例えば、金属イオンキレート剤）が挙げられる。追加の成分の多くは、洗剤産業で周知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，９３２，５３２号明細書を参照のこと）。乳化剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンが挙げられる。増粘剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ＬＡＰＯＮＩＴＥ（登録商標）ＲＤ（合成層状シリケート）、コーンスターチ、ＰＶＰ、ＣＡＲＢＯＷＡＸ（登録商標）（ポリエチレングリコールおよび／またはメトキシポリエチレングリコール）、ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（アクリル酸架橋ポリマー）、ＣＡＢＯＳＩＬ（登録商標）（合成アムフォルマスヒュームド二酸化ケイ素）、ポリソルベート２０、ＰＶＡ、およびレシチンが挙げられる。緩衝系の例としては、これらに限定されるものではないが、一塩基性リン酸ナトリウム／二塩基性リン酸ナトリウム；スルファミン酸／トリエタノールアミン；クエン酸／トリエタノールアミン；酒石酸／トリエタノールアミン；コハク酸／トリエタノールアミン；および酢酸／トリエタノールアミンが挙げられる。界面活性剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ａ）エチレンオキシドまたはプロピレンオキシドのブロックコポリマー、エトキシル化もしくはプロポキシル化の直鎖状および分枝状の第一級および第二級アルコール、ならびに脂肪族ホスフィンオキシドなどの非イオン性界面活性剤；ｂ）第四級アンモニウム化合物、特に、３つのＣ１〜Ｃ２アルキル基に付加的に結合した窒素原子に結合したＣ８〜Ｃ２０アルキル基を有する第四級アンモニウム化合物などの陽イオン性界面活性剤；ｃ）アルカンカルボン酸（たとえば、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸）、アルキルホスホネート、アルカンスルホネート（たとえば、ドデシル硫酸ナトリウム「ＳＤＳ」）または直鎖状もしくは分枝状のアルキルベンゼンスルホネート、アルケンスルホネートなどの陰イオン性界面活性剤；ならびにｄ）アミノカルボン酸、アミノジカルボン酸、アルキベタイン、およびそれらの混合物などの両性および双性イオン性界面活性剤が挙げられる。追加の成分としては、芳香剤、染料、過酸化水素の安定剤（例えば、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸（ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）２０１０、Ｓｏｌｕｔｉａ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート剤）、ＴＵＲＰＩＮＡＬ（登録商標）ＳＬ（エチドロン酸）、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５２０（ホスホネート）、ＤＥＱＵＥＳＴ（登録商標）０５３１（ホスホネート）、酵素活性の安定剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、ならびに洗剤ビルダーを挙げることができる。
【０１３１】
別の態様では、酵素的過加水分解製品は、消毒すべき表面または無生物体に接触させる前に所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために、予め混合することができる。
【０１３２】
別の態様では、消毒すべき表面または無生物体に接触させる前に所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させるために、酵素的過加水分解製品を予め混合しないが、その代わりに、所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生する水性反応製剤の成分を消毒および／または漂白もしくは脱染すべき表面または無生物体と接触させて、所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。一部の実施形態では、水性反応製剤の成分をその場所で混合するかまたは混ぜる。一部の実施形態では、反応成分をその場所に送達または適用し、続いて混ぜるかまたは混合して、所望濃度のペルオキシカルボン酸を発生させる。
【０１３３】
ペルヒドロラーゼ触媒を使用するペルオキシカルボン酸の生成
ペルオキシカルボン酸は、いったん生成すると、かなり反応性があり、これらに限定されるものではないが、温度およびｐＨを含む変数に依存して、長時間にわたって濃度が減少する可能性がある。そのため、特に液体製剤については、種々の反応成分を分離しておくことが望ましいことがある。一態様では、過酸化水素源を基質またはペルヒドロラーゼ触媒のいずれか、好ましくはその両方から分離する。このことは、これに限定されるものではないが、マルチコンパートメントチャンバーのあるディスペンサー（米国特許第４，５８５，１５０号明細書）の使用を含む、種々の手法を使用して達成することができ、使用時に過酸素源（過酸化水素など）および本基質とペルヒドロラーゼ触媒を物理的に混合して、水性酵素的過加水分解反応を開始させる。ペルヒドロラーゼ触媒は、任意選択で、反応チャンバーの本体内部に固定するか、または処理の対象となる表面および／または物体と接触させる前にペルオキシカルボン酸を含む反応生成物から分離（例えば、濾過等）することができる。ペルヒドロラーゼ触媒は、液体マトリックスまたは固体形態（例えば、粉末または錠剤）であっても、固体マトリックス内に埋め込まれていてもよく固体マトリックスをその後基質と混合して酵素的過加水分解反応を開始させる。さらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒を、溶解性または多孔性のパウチ内に含有することができ、水性基質マトリックスに添加して、酵素的過加水分解を開始させることができる。さらにさらなる態様では、ペルヒドロラーゼ触媒は、溶解性または多孔性のパウチの別のコンパートメント内に含有される内容物を含むことができ、このパウチには、エステル基質および／または過酸化物源を含む封入内容物に対する少なくとも１つの追加のコンパートメントがある。追加のさらなる態様では、酵素触媒を含む粉末を基質（例えば、トリアセチン）中に懸濁し、使用時に水中の過酸素源と混合する。
【０１３４】
ペルオキシカルボン酸および過酸化水素の濃度の決定方法
反応物および生成物を分析するために、本方法では種々の分析法を使用することができ、その方法としては、これらに限定されるものではないが、滴定、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）、質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）、Ｕ．Ｋａｒｓｔら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６９（１７）：３６２３−３６２７（１９９７））により記載されたＨＰＬＣ分析法、および米国特許第７，９５１，５６６号明細書に記載される２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾタゾリン（ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈａｚｏｌｉｎｅ））−６−スルホネート（ＡＢＴＳ）アッセイ（Ｕ．Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ  １２２：５６７−５７１（１９９７）；Ｓ．Ｍｉｎｎｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ３７８：２９３−２９８（１９９９）および国際公開第２００４／０５８９６１Ａ１号パンフレットを参照のこと）が挙げられる。
【０１３５】
ペルオキシカルボン酸の最小殺生物濃度の決定
Ｊ．Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎら（Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ５０：６３−７３（２００２））により記載される方法を、ペルオキシカルボン酸、または過酸化水素および酵素基質の最小殺生物濃度（ＭＢＣ）の決定に使用することができる。このアッセイ法は、ＸＴＴの還元阻害に基づいており、ここで、ＸＴＴ（（２，３−ビス［２−メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル］−５−［（フェニルアミノ）カルボニル］−２Ｈ−テトラゾリウム、分子内塩、モノナトリウム塩）は、４９０ｎｍまたは４５０ｎｍで測定される光学密度（ＯＤ）の変化によって微生物の呼吸活性を示す酸化還元色素である。しかしながら、消毒剤および防腐剤の活性を試験するために利用可能な種々の他の方法があり、その方法としては、これらに限定されるものではないが、生菌プレートカウント、直接顕微鏡カウント、乾燥重量、濁度測定、吸光度、および生物発光が挙げられる（例えば、Ｂｒｏｃｋ，Ｓｅｍｏｕｒ  Ｓ．，Ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ，第５版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ；２００１を参照のこと）。
【０１３６】
酵素的に調製されたペルオキシカルボン酸組成物の使用
本方法に従って生成した、酵素触媒により発生のペルオキシカルボン酸は、生物学的汚染物質の濃度を低減するために、種々の硬質表面／無生物体に適用して使用することができ、例えば、医療機器（例えば、内視鏡）、織物（衣服およびカーペットなど）、食品調理表面、食品貯蔵および食品包装装置、食品包装に使用される材料、鶏の孵化場および成育施設、動物の囲い、ならびに微生物および／または殺ウイルス活性を有する使用済みプロセス水の汚染除去に使用することができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、プリオン（例えば、特定のプロテアーゼ）を不活性化し、さらに殺生物活性を示すように設計された製剤に使用することができる（米国特許第７，５５０，４２０号明細書（ＤｉＣｏｓｉｍｏ  ｅｔ  ａｌ．）を参照のこと）。
【０１３７】
一態様では、ペルオキシカルボン酸組成物は、オートクレーブができない医療機器および食品包装装置のための消毒剤として有用である。ペルオキシカルボン酸含有製剤は、ＧＲＡＳ（一般に安全と認識される）または食品用成分（酵素、酵素基質、過酸化水素、および緩衝剤）を使用して調製することができるので、酵素により発生のペルオキシカルボン酸はまた、動物の屠殺体、食肉、果物、および野菜の汚染除去のため、または加工食品の汚染除去のために使用することができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、その最終形態が粉末、液体、ゲル、フィルム、固体、またはエアロゾルである製品に組み込むことができる。酵素により発生のペルオキシカルボン酸は、効果的な汚染除去が依然として可能な濃度まで希釈することができる。
【０１３８】
効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物は、表面または物体と本方法によって生成の生成物とを接触させることによって、病原性微生物汚染など生物学的汚染物質で汚染された（または汚染された疑いのある）表面および／または物体を消毒するために使用することができる。本明細書で使用する場合、「接触させる」とは、清浄化および消毒するのに十分な時間、有効濃度のペルオキシカルボン酸を含む消毒組成物と、生物学的汚染物質で汚染された疑いのある表面または無生物体とを接触させた状態に置くことを指す。接触には、スプレー、処理、浸漬、フラッシング、注入（上または中に）、混合、合体、ペインティング、コーティング、塗布、貼付、および効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を含むペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物、または効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を形成するペルオキシカルボン酸溶液もしくは組成物と、ある濃度の生物学的汚染物質で汚染された疑いのある表面また無生物体とを他の方法で連結することも含まれる。清浄化および消毒の両方を行うために、消毒組成物を清浄化組成物と組み合わせることができる。あるいは、単一組成物で清浄化および消毒の両方を行うために、清浄化剤（例えば、界面活性剤または洗剤）を製剤に組み込むことができる。
【０１３９】
効果的な濃度のペルオキシカルボン酸を含む組成物はまた、少なくとも１つの追加の抗微生物剤、プリオン分解プロテアーゼの組合せ、殺ウイルス剤、殺胞子剤、または殺生物剤を含有することができる。生物学的汚染物質で汚染された（汚染された疑いのある）表面および／または物体を清浄化および消毒するために使用する場合、これらの薬剤と、特許請求の方法によって生成されるペルオキシカルボン酸とを組み合わせることにより、増大したおよび／または相乗的な効果を得ることができる。適切な抗微生物剤としては、所望する程度の微生物防御を得るのに十分な量の、カルボン酸エステル（例えば、ｐ−ヒドロキシアルキルベンゾエートおよびアルキルシンナメート）；スルホン酸（例えば、ドデシルベンゼンスルホン酸）；ヨード化合物または活性ハロゲン化合物（例えば、元素ハロゲン、ハロゲン酸化物（例えば、ＮａＯＣｌ、ＨＯＣｌ、ＨＯＢｒ、ＣｌＯ２）、ヨウ素、ハロゲン間化合物（ｉｎｔｅｒｈａｌｉｄｅ）（例えば、一塩化ヨウ素、二塩化ヨウ素、三塩化ヨウ素、四塩化ヨウ素、塩化臭素、一臭化ヨウ素、または二臭化ヨウ素）、ポリハロゲン化物、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、次亜臭素酸塩、次亜臭素酸、クロロ−およびブロモ−ヒダントイン、二酸化塩素、および亜鉛素酸ナトリウム）；過酸化ベンゾイル、アルキル過酸化ベンゾイル、オゾン、一重項酸素発生剤、およびそれらの混合物を含む有機過酸化物；フェノール誘導体（例えば、ｏ−フェニルフェノール、ｏ−ベンジル−ｐ−クロロフェノール、ｔｅｒｔ−アミルフェノール、およびＣ１〜Ｃ６アルキルヒドロキシベンゾエート）；第四級アンモニウム化合物（例えば、塩化アルキルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、およびそれらの混合物）；ならびにこのような抗微生物剤の混合物が挙げられる。有効量の抗微生物剤としては、約０．００１重量％〜約６０重量％の抗微生物剤、約０．０１重量％〜約１５重量％の抗微生物剤、または約０．０８重量％〜約２．５重量％の抗微生物剤が挙げられる。
【０１４０】
一態様では、本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、ある場所の上および／またはある場所で適用する場合、生存可能な生物学的汚染物質（微生物集団など）の濃度を低減するために使用することができる。本明細書で使用する場合、「場所」は、消毒または漂白に適した標的表面の一部またはすべてを含む。標的表面には、潜在的に生物学的汚染物質で汚染され得るすべての表面が含まれる。非限定的な例としては、食品または飲料産業において見られる装置の表面（タンク、コンベヤ、床、ドレーン、冷却器、冷凍庫、装置表面、壁、バルブ、ベルト、パイプ、ドレーン、ジョイント、割れ目、それらの組合せ等）；建物の表面（壁、床、および窓など）；非食品産業関連のパイプおよびドレーン、例えば、水処理施設、プールおよび温泉場、ならびに発酵タンク；病院または動物病院の表面（壁、床、ベッド、装置（内視鏡など）、病院／動物病院または他のヘルスケア環境で着用される衣類、例えば衣類、スクラブ（ｓｃｒｕｂ）、靴、および病院または動物病院の他の表面など）；レストランの表面；浴室の表面；トイレ；衣服および靴；家禽、ウシ、乳牛、ヤギ、ウマ、およびブタなどの家畜のための納屋または畜舎の表面；家禽またはエビのための孵化場；ならびに医薬品または生物医薬品の表面（例えば、医薬品または生物医薬品の製造装置、医薬品または生物医薬品の成分、医薬品または生物医薬品の賦形剤）が挙げられる。さらなる硬質表面としては、例えば牛肉、家禽、豚肉、野菜、果物、シーフード、およびそれらの組合せ等の食品が挙げられる。場所としては、感染したリネンまたは他の織物などの水吸収材料も挙げられる。さらに場所として、収穫した植物または植物製品、例えば種子、球茎、塊茎、果実、および野菜、生育中の植物、特に作物用に生育中の植物、例えば穀草類、葉野菜およびサラダ用作物、根菜、豆類、ベリー状果実、柑橘果実および堅い果物も挙げられる。
【０１４１】
硬質表面材料の非限定例としては、金属（例えば、鋼、ステンレス鋼、クロム、チタン、鉄、銅、真鍮、アルミニウム、およびそれらの合金）、鉱物（例えば、コンクリート）、ポリマーおよびプラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリアクリロニトリル、ポリブタジエン、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン、スチレン）、ポリ（アクリロニトリル、ブタジエン）、アクリロニトリルブタジエンなどのポリオレフィン；ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステル、およびナイロンなどのポリアミド）がある。さらなる表面としては、レンガ、タイル、セラミック、磁器、木材、木材パルプ、紙、ビニル、リノリウム、およびカーペットが挙げられる。
【０１４２】
本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、消毒、衛生化、漂白、脱染、および脱臭を含む、衣類および織物に対する有益性を提供するために使用することができる。本方法によって形成されるペルオキシカルボン酸は、これらに限定されるものではないが、少し例を挙げると、織物予洗処理剤、ランドリー洗剤、ランドリー洗剤またはランドリー添加剤、染み抜き剤、漂白組成物、脱臭組成物、およびリンス剤を含む、多くのランドリーケア製品で使用することができる。
【０１４３】
本方法により形成されるペルオキシカルボン酸は、特に過酢酸を使用する場合、木材パルプまたは製紙用パルプの漂白／脱リグニンプロセスの１つまたは複数のステップで使用することができる（例えば、欧州特許第１０４０２２２Ｂ１号明細書および米国特許第５，５５２，０１８号明細書（Ｄｅｖｅｎｙｎｓ，Ｊ）を参照のこと）。
【０１４４】
パーソナルケア用途
本明細書に記載する過加水分解酵素は、少し例を挙げると、ヘアケア（漂白、脱毛）、スキンケア（皮膚美白、抗微生物）、および口腔ケア用途（歯のホワイトニング／漂白または消毒）など、パーソナル用途のための過酸有益薬剤を生成するために使用することができる。本明細書に記載する組成物および方法は、ヘアケア、スキンケア、ネイルケア、または他のパーソナルケア製品での使用が公知であるか、そうでなければそれらの使用に有効な１つまたは複数の皮膚科学的にまたは美容的に許容される成分をさらに含むことができる。ただし、この任意選択の成分は、本明細書に記載する必須成分と物理的および化学的に適合性があるか、そうでなければ製品の安定性、美観、または性能を過度に損なわないものである。そのような任意選択成分の非限定例が、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，第９版，２００２，およびＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第１０版，２００４に開示されている。
【０１４５】
一実施形態では、皮膚科学的／美容的に許容される担体は、約１０重量％〜約９９．９重量％、あるいは約５０重量％〜約９５重量％、またあるいは約７５重量％〜約９５重量％の皮膚科学的に許容される担体を含むことができる。組成物との使用に適した担体としては、例えば、ヘアスプレー、ムース、トニック、ゲル、皮膚保湿剤、ローション、およびリーブオンコンディショナーの製剤で使用されるものを挙げることができる。担体は、水；有機油；シリコーン、例えば、揮発性シリコーン、アミノまたは非アミノのシリコンガムまたは油、およびそれらの混合物；鉱油；植物油、例えば、オリーブ油、ヒマシ油、菜種油、ヤシ油、小麦麦芽油、甘扁桃油、アボカード油、マカダミア油、アプリコット油、サフラワー油、ククイ油、亜麻仁油、タマヌ油、レモン油、およびそれらの混合物；ワックス；および有機化合物、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルカン、アセトン、メチルエチルケトン、揮発性有機Ｃ１〜Ｃ１２アルコール、Ｃ１〜Ｃ２０酸およびＣ１〜Ｃ８アルコールのエステル（エステルの選択は、ペルヒドロラーゼに対するカルボン酸エステル基質として機能し得るか否かに依存し得るという理解の下で）、例えば、酢酸メチル、酢酸ブチル、酢酸エチル、およびミリスチン酸イソプロピル、ジメトキシエタン、ジエトキシエタン、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルコール、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、およびベヘニルアルコール；Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪酸、例えば、ラウリン酸およびステアリン酸；Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アミド、例えば、ラウリン酸ジエタノールアミド；Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルキルエステル、例えば、Ｃ１０〜Ｃ３０脂肪アルキル安息香酸エステル；ヒドロキシプロピルセルロース；ならびにそれらの混合物である。一実施形態では、担体は、水、脂肪アルコール、揮発性有機アルコール、およびそれらの混合物を含む。本発明の組成物はさらに、組成物に所望の粘度を付与する助けとなる、約０．１％〜約１０％、あるいは約０．２％〜約５．０％のゲル化剤を含むことができる。適切な任意選択のゲル化剤の非限定例としては、架橋カルボン酸ポリマー；非中和型架橋カルボン酸ポリマー；非中和型修飾架橋カルボン酸ポリマー；架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー；非中和型架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー（例えば、Ｍｏｎｓａｎｔｏから市販されるＥＭＡ８１）；非中和型架橋アルキルエーテル／アクリレートコポリマー（例えば、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販されるＳＡＬＣＡＲＥ（商標）ＳＣ９０）；ポリアクリル酸ナトリウム、鉱油、およびＰＥＧ−１  ｔｒｉｄｅｃｅｔｈ−６の非中和型架橋コポリマー（例えば、Ａｌｌｉｅｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓから市販されるＳＡＬＣＡＲＥ（商標）ＳＣ９１）；メチルビニルエーテルおよび無水マレイン酸の非中和型架橋コポリマー（例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓから市販されるＳＴＡＢＩＬＥＺＥ（商標）ＱＭ−ＰＶＭ／ＭＡコポリマー）；疎水的修飾非イオン性セルロースポリマー；疎水的修飾エトキシレートウレタンポリマー（例えば、Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅから市販されるアルカリ膨潤性ポリマーのＵＣＡＲＥ（商標）Ｐｏｌｙｐｈｏｂｅ  Ｓｅｒｉｅｓ）；ならびにそれらの組合せが挙げられる。この文脈において、「非中和型」という用語は、任意選択のポリマーおよびコポリマーゲル化剤材料が非中和型酸モノマーを含有することを意味する。好ましいゲル化剤としては、水溶性非中和型架橋エチレン／無水マレイン酸コポリマー、水溶性非中和型架橋カルボン酸ポリマー、水溶性疎水的修飾非イオン性セルロースポリマー、および界面活性剤／脂肪アルコールゲルネットワーク、例えば、ヘアコンディショニング製品での使用に適したものなどが挙げられる。
【０１４６】
組換え微生物発現
本発明の配列の遺伝子および遺伝子産物は、異種宿主細胞、特に微生物宿主細胞において、生成させることができる。本発明の遺伝子および核酸分子の発現のための好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌ファミリーの中に見出すことができ、広範な温度、ｐＨ値、および溶媒耐性にわたって増殖する微生物宿主である。例えば、細菌、酵母、および糸状菌のいずれも本発明の核酸分子の発現の適切な宿主になり得ると考えられる。ペルヒドロラーゼは、細胞内、細胞外、または細胞内および細胞外の両方の組合せで発現され得るが、細胞外発現では、発酵産物からの所望のタンパク質の回収が、細胞内発現により産生されるタンパク質の回収方法よりも容易になる。転写、翻訳、およびタンパク質生合成装置は、細胞バイオマスを生成するために使用される細胞の供給原料に比較して、変化しないものであり、機能遺伝子はそれに関係なく発現される。宿主株の例としては、これらに限定されるものではないが、細菌、真菌、または酵母種、例えば、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ファフィア属（Ｐｈａｆｆｉａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エリスロバクター属（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、クロマチウム属（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サイトファーガ属（Ｃｙｔｏｐｈａｇａ）、ロドバクター属（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリア属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ディノコッカス属（Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、パンテア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スフィンゴモナス属（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター属（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、メチロサイナス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ）、メチロミクロビウム属（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、メチロシスティス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス属（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、およびミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）が挙げられる。一実施形態では、細菌宿主株には、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）が含まれる。好ましい実施形態では、細菌宿主細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【０１４７】
工業生産
ペルヒドロラーゼ触媒を製造するために種々の培養方法を適用することができる。組換え微生物宿主から過剰発現される特定の遺伝子産物の大規模生産は、バッチ培養、流加培養、および連続培養の方法によって行うことができる。バッチ培養法および流加培養法は一般的であり、当技術分野において周知であり、その例は、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９）およびＤｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ  Ｖ．，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６：２２７（１９９２）に見出すことができる。
【０１４８】
一実施形態では、所望のペルヒドロラーゼ触媒の商業的生産は連続培養で達成される。連続培養は、処理の間、合成培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に等量の馴化培地を除去する開放系である。連続培養は、一般に、細胞が主に対数増殖期にあるときに、細胞を一定の高い液相密度に維持する。あるいは、連続培養は、固定化細胞を用いて実施することもでき、そこでは、炭素および栄養素を連続的に添加し、有用産物、副産物、または老廃物を細胞塊から連続的に取り出す。細胞の固定化は、天然および／または合成材料で構成される広範な固体支持体を使用して実施することができる。
【０１４９】
バッチ発酵もしくは流加発酵または連続培養から所望のペルヒドロラーゼ触媒を回収することは、当業者に公知のいずれかの方法によって達成することができる。例えば、酵素触媒が細胞内で産生される場合、細胞ペーストを遠心分離または膜濾過によって培地から分離し、任意選択で水または所望のｐＨの緩衝水溶液で洗浄し、次いで、所望のｐＨの緩衝水溶液中の細胞ペースト懸濁液を、ホモジナイズして、所望の酵素触媒を含有する細胞抽出物を生成する。酵素触媒溶液から不要なタンパク質を沈殿させる加熱処理の前に、任意選択で、この細胞抽出物を、セライトまたはシリカなどの適切な濾過助剤を通して濾過して、細胞片を除去してもよい。次いで、所望の酵素触媒を含有する溶液を、加熱処理工程の間に生じた、細胞片およびタンパク質の沈殿から、膜濾過または遠心分離によって分離し、得られる部分精製酵素触媒溶液をさらなる膜濾過により濃縮し、次いで、任意選択で、適切な賦形剤（例えば、マルトデキストリン、トレハロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、またはそれらの混合物）と混合し、噴霧乾燥して、所望の酵素触媒を含む固体粉末を生成させることができる。あるいは、上記のように調製して得られる部分精製酵素触媒溶液を、任意選択で、さらなる膜濾過により濃縮してもよく、次いで、部分精製酵素触媒溶液または得られる酵素濃縮物を、任意選択で、１つまたは複数の安定化剤（例えば、グリセロール、ソルビトール、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ポリオール、ポリマーポリオール、ポリビニルアルコール、またはそれらの混合物）、１つまたは複数の塩（例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、またはそれらの混合物）、および１つまたは複数の殺生物剤を混合し、使用するまで水溶液として保持する。
【０１５０】
量、濃度、または他の値もしくはパラメーターを、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値の一覧のいずれかとして与える場合、これは、範囲が別々に開示されているか否かにかかわらず、任意の上側の範囲限界または好ましい値と、任意の下側の範囲限界または好ましい値との任意の対から形成されるすべての範囲を具体的に開示するものと理解されるべきである。本明細書において数値の範囲を列挙する場合、他に記載されない限り、その範囲は、その両端点ならびに範囲内のすべての整数および分数を含むことを意図する。範囲を定義する場合、列挙される特定の値に本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１５１】
一般的方法
以下の実施例は、種々の実施形態を実証するために提供するものである。以下の実施例において開示される手法は、本明細書において開示される方法の実施において十分に機能することが発明者によって発見された手法であり、したがって、その実施のための好ましい方式を構成するものとみなされ得ることを、当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本発明の開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得るものであり、しかもそれでも本発明で開示される方法の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【０１５２】
すべての試薬および材料は、他に記載がない限り、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、またはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手したものである。
【０１５３】
本明細書における以下の略語は、以下のように、測定、手法、特性、または化合物の単位に相当する：「ｓｅｃ」または「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」または「ｈｒ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ｐｐｍ」は１００万分の１を意味し、「ｗｔ」は重量を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、
【数１】
0006574377.tif 000014
は重力を意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィを意味し、「ｄｄＨ２Ｏ」は蒸留および脱イオン水を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＡＴＣＣ」または「ＡＴＣＣ（登録商標）」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を意味し、「Ｕ」はペルヒドロラーゼ活性の単位を意味し、「ｒｐｍ」は１分間の回転数を意味し、「ＥＤＴＡ」はエチレンジアミン四酢酸を意味し、「ＩＰＴＧ」はイソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトシドを意味し、「ＢＣＡ」はビシンコニン酸を意味し、「ＡＢＴＳ」は２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホネートを意味する。
【０１５４】
実施例１
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＣＵ３５７７６．１；ＧＩ：２５５９２０２６５）に報告される、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号３）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９１として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドｐＭＰ９１を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９１として同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９１を、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数２】
0006574377.tif 000015
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数３】
0006574377.tif 000016
で３０分間、遠心分離し、抽出物上清中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＣＥ−７酵素（配列番号４）の発現を確認し、ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の１１％を構成することが示された。
【０１５５】
実施例２
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＥＥ７１４７８．１；ＧＩ：３３２６７４６６２）に報告される、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号５）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９２として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドｐＭＰ９２を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９２として同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９２を、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数４】
0006574377.tif 000017
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数５】
0006574377.tif 000018
で３０分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＣＥ−７酵素（配列番号６）の発現を確認し、ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の１３％を構成することが示された。
【０１５６】
実施例３
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＣＡＸ００５０６．１；ＧＩ：２２５７０２５４４）に報告される、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号７）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９３として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドｐＭＰ９３を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９３として同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９３を、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数６】
0006574377.tif 000019
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数７】
0006574377.tif 000020
で３０分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＣＥ−７酵素（配列番号８）の発現を確認し、ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の２６％を構成することが示された。
【０１５７】
実施例４
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、スタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＤＤ４２７８６．１；ＧＩ：２９０５６９８２１）に報告される、スタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号９）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９４として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドｐＭＰ９１を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９４として同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９４を、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数８】
0006574377.tif 000021
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数９】
0006574377.tif 000022
で３０分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＣＥ−７酵素（配列番号１０）の発現を確認し、ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の３３％を構成することが示された。
【０１５８】
実施例５
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼのクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＡＭ９８９４９．１；ＧＩ：２２５３３０４
５）に報告される、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ａｇａｌａｃｔｉａｅ）由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号１１）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９５として同定されるプラスミドを作製した。プラスミドｐＭＰ９５を使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９５として同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９５を、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数１０】
0006574377.tif 000023
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数１１】
0006574377.tif 000024
で３０分間、遠心分離し、抽出物上清中の全可溶性タンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用してＣＥ−７酵素（配列番号１２）の発現を確認し、ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用してゲルを解析することにより、ペルヒドロラーゼが全可溶性タンパク質の７．３％を構成することが示された。
【０１５９】
実施例６
ペルヒドロラーゼ活性のアッセイ
抽出物上清中のペルヒドロラーゼ活性は、２２．５ｍＭのトリアセチン、２２．５ｍＭの過酸化水素、および６．２５μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質を含有する反応物により決定した。外気温（２２〜２４℃）で１０分間インキュベートした。反応を、１００ｍＭのオルト−フェニレンジアミンを含有する１．２５Ｍのリン酸を等量加えることにより停止させた。３０分後、４５８ｎｍの吸光度を測定した（表１）。追加のペルヒドロラーゼ活性測定を、１０ｍＭのトリアセチンおよび１０ｍＭの過酸化水素、または５０ｍＭのトリアセチンおよび５０ｍＭの過酸化水素を含有する反応物中で行った（表１）。Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８中で産生させ（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）、ペルヒドロラーゼアッセイに対する陽性対照として使用した。ＣＥ−７酵素を含有しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８抽出物を陰性対照として使用した。
【０１６０】
【表３】
0006574377.tif 000025
【０１６１】
実施例７
ＣＥ−７エステラーゼによる、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（全容積１０ｍＬ）は、トリアセチン（１０ｍＭ）と、過酸化水素（２０ｍＭ）と、実施例１〜５に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）（配列番号６）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（配列番号８）、スタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）（配列番号１０）、またはストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（配列番号１２）に由来するＣＥ−７エステラーゼを含有する、５．０μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（ＣＥ−７エステラーゼを発現するために使用された）から単離された、５．０μｇ／ｍＬの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例１の手順に従って調製した。さらに、第２の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。さらに、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼ（配列番号２）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した（細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の１１％）。
【０１６２】
過酢酸の生成についての反応試料の分析は、過酢酸によるＡＢＴＳ酸化の比色定量検出を使用して、Ｐｉｎｋｅｒｎｅｌｌら（Ａｎａｌｙｓｔ，１２２：５６７（１９９７））に記載される方法に従って行った。反応試料５０μＬを５ｍＭのＨ３ＰＯ４９５０μＬに加え、酵素反応を停止し（最終ｐＨはｐＨ２〜３の間）、得られた溶液５０μＬを、０．２５Ｍの酢酸、０．１２５ｇ／ＬのＡＢＴＳ、および５．０ｍｇ／ＬのＫＩを含有する水溶液２００μＬを含有する、９６ウェルマイクロタイタープレートウェルに加えた。この溶液を５分間、発色させた後、マイクロプレートリーダーを使用して、溶液の吸光度を４０５ｎｍで測定した。各試料中の過酢酸濃度を、過酢酸試薬溶液を使用して同時に発色させて得られた標準曲線から算出した（表２）。
【０１６３】
【表４】
0006574377.tif 000026
【０１６４】
実施例８
ＣＥ−７エステラーゼによる、プロピレングリコールジアセテートおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（全容積１０ｍＬ）は、プロピレングリコールジアセテート（１０ｍＭ）と、過酸化水素（２０ｍＭ）と、実施例１〜４に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）（配列番号６）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（配列番号８）、またはスタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）（配列番号１０）に由来するＣＥ−７エステラーゼを含有する、５．０μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（ＣＥ−７エステラーゼを発現するために使用された）から単離された、５．０μｇ／ｍＬの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例１の手順に従って調製した。さらに、第２の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるプロピレングリコールジアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼ（配列番号２）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した（細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の１１％）。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表３）。
【０１６５】
【表５】
0006574377.tif 000027
【０１６６】
実施例９
ＣＥ−７エステラーゼによる、α−Ｄ−グルコースペンタアセテートおよび過酸化水素か
らの過酢酸の生成
反応（全容積１０ｍＬ）は、α−Ｄ−グルコースペンタアセテート（１０ｍＭ）と、過酸化水素（２０ｍＭ）と、実施例１、３、および５に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（配列番号８）、またはストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（配列番号１２）に由来するＣＥ−７エステラーゼを含有する、５．０μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（ＣＥ−７エステラーゼを発現するために使用された）から単離された、５．０μｇ／ｍＬの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例１の手順に従って調製した。さらに、第２の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるα−Ｄ−グルコースペンタアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼ（配列番号２）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した（細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の１１％）。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表４）。
【０１６７】
【表６】
0006574377.tif 000028
【０１６８】
実施例１０
ＣＥ−７エステラーゼによる、Ｄ−ソルビトールヘキサアセテートおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（全容積１０ｍＬ）は、Ｄ−ソルビトールヘキサアセテート（１０ｍＭ）と、過酸化水素（２０ｍＭ）と、実施例１および３に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４）またはストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（配列番号８）に由来するＣＥ−７エステラーゼを含有する、５．０μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（ＣＥ−７エステラーゼを発現するために使用された）から単離された、５．０μｇ／ｍＬの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例１の手順に従って調製した。さらに、第２の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるＤ−ソルビトールヘキサアセテートの化学的過加水分解の結果であった。さらに、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼ（配列番号２）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した（細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の１１％）。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表５）。
【０１６９】
【表７】
0006574377.tif 000029
【０１７０】
実施例１１
ＣＥ−７エステラーゼによる、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（全容積５０ｍＬ）は、トリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカール（２ｍＭ）と、過酸化水素（１０ｍＭ）と、実施例１および３に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４）またはストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（配列番号８）に由来するＣＥ−７エステラーゼを含有する、５．０μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（ＣＥ−７エステラーゼを発現するために使用された）から単離された、５．０μｇ／ｍＬの抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例１の手順に従って調製した。さらに、第２の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリ−Ｏ−アセチル−Ｄ−グルカールの化学的過加水分解の結果であった。さらに、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼ（配列番号２）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した（細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の１１％）。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表６）。
【０１７１】
【表８】
0006574377.tif 000030
【０１７２】
実施例１２
ＣＥ−７エステラーゼによる、４−（アセチルオキシ）−安息香酸および過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（全容積１０ｍＬ）は、４−（アセチルオキシ）−安息香酸（ＣＡＳ  ２３４５−３４−８；２５ｍＭ）と、過酸化水素（２０ｍＭ）と、実施例１〜４に記載するように調製された、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）（配列番号６）、ストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）（配列番号８）、またはスタッケブランジチア・ナッソエンシス（Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔｉａ  ｎａｓｓａｕｅｎｓｉｓ）（配列番号１０）に由来するＣＥ−７エステラーゼを含有する、５．０μｇ／ｍＬの抽出物上清全可溶性タンパク質とを含有するリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２０℃で行った。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（ＣＥ−７エステラーゼを発現するために使用された）から単離された、５．０μｇ／ｍＬの加熱処理された抽出物全可溶性タンパク質を使用して、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、抽出物上清は実施例１の手順に従って調製した。さらに、第２の比較対照反応は、抽出物上清全可溶性タンパク質を添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素による４−（アセチルオキシ）−安息香酸の化学的過加水分解の結果であった。さらに、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣＥ−７アセチルキシランエステラーゼ（配列番号２）を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許出願公開第２００８−０１７６２９９号明細書に記載される）中に産生させ、比較反応における陽性対照として使用した（細胞抽出物上清中の全可溶性タンパク質の１１％）。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表７）。
【０１７３】
【表９】
0006574377.tif 000031
【０１７４】
実施例１３
アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＣＵ３５７７６．１；ＧＩ：２５５９２０２６５）に報告される、Ａ．ミルム（Ａ．ｍｉｒｕｍ））由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素の変異体をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号１３）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９１ａとして同定されるプラスミドを作製した。コードされた変異体タンパク質は、Ａｍｉ＿Ｃ２７６Ｓ（配列番号１４）と呼ばれる。プラスミドｐＭＰ９１ａを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９１ａとして同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９１ａを、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数１２】
0006574377.tif 000032
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数１３】
0006574377.tif 000033
で３０分間、遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して酵素の発現を確認し、デンシトメトリー（ＩｍａｇｅＪソフトウェア、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して酵素タンパク質を全タンパク質の約１６〜１８％と算出した。
【０１７５】
実施例１４
アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）アセチルキシランエステラーゼ変異体のクローニングおよび産生
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）（受託番号ＡＣＵ３５７７６．１；ＧＩ：２５５９２０２６５）に報告される、Ａ．ミルム（Ａ．ｍｉｒｕｍ）由来のアセチルキシランエステラーゼ酵素の変異体をコードする遺伝子を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）における発現のために最適化されたコドンを使用して合成した。核酸生成物（配列番号１５）を、ＰＪＥＸＰＲＥＳＳ４０４（登録商標）（ＤＮＡ  ２．０，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）にサブクローニングして、ｐＭＰ９１ｂとして同定されるプラスミドを作製した。コードされた変異体タンパク質は、Ａｍｉ＿Ｃ２７６Ｔ（配列番号１６）と呼ばれる。プラスミドｐＭＰ９１ｂを使用して大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８（米国特許第７，７２３，０８３号明細書に記載される）を形質転換して、ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９１ｂとして同定される菌株を作製した。ＫＬＰ１８／ｐＭＰ９１ｂを、ＬＢ培地中、３７℃で振盪しながら、ＯＤ６００ｎｍ＝０．４〜０．５になるまで増殖させ、その時点で、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように添加し、インキュベーションを２〜３時間継続した。細胞を
【数１４】
0006574377.tif 000034
で１５分間、遠心分離して回収した後、１．０ｍＭジチオスレイトール添加の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０に再懸濁した（２０％ｗ／ｖ）。再懸濁した細胞を、フレンチプレスセルに２回通した。溶解した細胞を、
【数１５】
0006574377.tif 000035
で３０分間、遠心分離し、上清中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して酵素の発現を確認し、デンシトメトリー（ＩｍａｇｅＪソフトウェア、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して酵素タンパク質を全タンパク質の約１６〜１８％と算出した。
【０１７６】
実施例１５
ペルヒドロラーゼ活性のアッセイ
抽出物中のペルヒドロラーゼ活性は、２２．５ｍＭのトリアセチン、２２．５ｍＭの過酸化水素、および１．５μｇ／ｍＬの全タンパク質を含有する反応物により決定した。外気温（２２〜２４℃）で１０分間インキュベートした。反応を、１００ｍＭのオルト−フェニレンジアミンを含有する１．２５Ｍのリン酸を等量加えることにより停止させた。３０分後、４５８ｎｍの吸光度を測定した（表８）。アセチルキシランエステラーゼ酵素を含有しない大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８抽出物を陰性対照として使用した。
【０１７７】
【表１０】
0006574377.tif 000036
【０１７８】
実施例１６
ＣＥ−７エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（１０ｍＬ全容積）は、トリアセチン（０．７５ｍＭ）と、過酸化水素（１．４ｍＭ）と、野生型アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４、実施例１に記載されるように調製された）、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７６Ｓ変異体（配列番号１４、実施例１３に記載されるように調製された）、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７６Ｔ変異体（配列番号１６、実施例１４に記載されるように調製された）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ（配列番号１７、米国特許第８，０６２，８７５号明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８中で産生された）、およびＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ（配列番号１８、米国特許第８，０６２，８７５号明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＬＰ１８中で産生された）に由来する、１．０μｇ／ｍＬまたは２．０μｇ／ｍＬのいずれかのＣＥ−７エステラーゼとを含有するリン酸カリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用するゲル分析と組み合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるＣＥ−７エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のＣＥ−７エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、ＣＥ−７エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表９）。
【０１７９】
【表１１】
0006574377.tif 000037
【０１８０】
実施例１７
ＣＥ−７エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（１０ｍＬ全容積）は、トリアセチン（１０ｍＭ）と、過酸化水素（２０ｍＭ）と、野生型アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４、実施例１に記載されるように調製された）、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７６Ｓ変異体（配列番号１４、実施例１３に記載されるように調製された）、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７６Ｔ変異体（配列番号１６、実施例１４に記載されるように調製された）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ（配列番号１７）、およびＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ（配列番号１８）に由来する、０．５μｇ／ｍＬのＣＥ−７エステラーゼとを含有するリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中、２５℃で行った。ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用するゲル分析と組み合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるＣＥ−７エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のＣＥ−７エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、ＣＥ−７エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表１０）。
【０１８１】
【表１２】
0006574377.tif 000038
【０１８２】
実施例１８
ＣＥ−７エステラーゼ変異体による、トリアセチンおよび過酸化水素からの過酢酸の生成
反応（１０ｍＬ全容積）は、トリアセチン（０．７５ｍＭ）と、過酸化水素（１．４ｍＭ、過炭酸ナトリウム由来）と、野生型アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）（配列番号４、実施例１に記載されるように調製された）、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７６Ｓ変異体（配列番号１４、実施例１３に記載されるように調製された）、アクチノシンネマ・ミルム（Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ  ｍｉｒｕｍ）Ｃ２７６Ｔ変異体（配列番号１６、実施例１４に記載されるように調製された）、Ｔ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｓ（配列番号１７）、およびＴ．マリティマ（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ）Ｃ２７７Ｔ（配列番号１８）に由来する、１．０μｇ／ｍＬまたは２．０μｇ／ｍＬのいずれかのＣＥ−７エステラーゼとを含有する炭酸ナトリウム緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ１０．５）中、２５℃で行った。ＩｍａｇｅＪ（パブリックドメインのＪａｖａ画像処理プログラム）を使用するゲル分析と組み合わせてＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによるＣＥ−７エステラーゼ含有細胞抽出物の分析を使用して、全可溶性タンパク質のパーセントとして細胞抽出物中のＣＥ−７エステラーゼ濃度を算出した。反応物および酵素を最初に混合するために、反応の最初の４５秒間のみ、反応物を攪拌した。比較対照反応を、ＣＥ−７エステラーゼを添加して使用することなく、直前に記載のものと同一の条件下で行った。ここで、エステラーゼを添加しない状態で生成された過酢酸は、所定の反応条件下での過酸化水素によるトリアセチンの化学的過加水分解の結果であった。過酢酸の生成についての反応試料の分析は、実施例７に記載される方法に従った（表１１）。
【０１８３】
【表１３】
0006574377.tif 000039
【図１Ａ】
0006574377.tif 000050
【図１Ｂ】
0006574377.tif 000051
【配列表】
0006574377000001.app