(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含む抗体であって、
第１の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ）を含み、且つ第２の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ）を含むか；
第１の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ）を含み、且つ第２の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｔ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ）を含むか；または、
第１の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｃ）を含み、且つ第２の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ）を含む、抗体。
【請求項２】
前記の第１の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号５（ＯＡ）によるアミノ酸配列を含み、且つ前記の第２の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号７（ＯＢ）によるアミノ酸配列を含むか；
前記の第１の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号５（ＯＡ）によるアミノ酸配列を含み、且つ前記の第２の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号１１（ＯＤ）によるアミノ酸配列を含むか：または、
前記の第１の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号９（ＯＣ）によるアミノ酸配列を含み、且つ前記の第２の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号７（ＯＢ）によるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記の第２の免疫グロブリン重鎖は、三重置換（Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ）を含み、前記の第１の免疫グロブリン重鎖は、正電荷を帯びるアミノ酸置換を有し、且つプロテインＡ結合活性を保持し、また、第２の免疫グロブリン重鎖は、負電荷を帯びるアミノ酸置換を有し、且つ改変された又は著しく低下されたプロテインＡ結合親和性を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記の第２の免疫グロブリン重鎖のＣＨ３ドメインは、配列番号７（ＯＢ）によるアミノ酸配列を含み、前記の第１の免疫グロブリン重鎖は、正電荷を帯びるアミノ酸置換を有し、且つプロテインＡ結合活性を保持し、また、第２の免疫グロブリン重鎖は、負電荷を帯びるアミノ酸置換を有し、且つ改変された又は著しく低下されたプロテインＡ結合親和性を有する、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記の抗体は、野生型モノクローナル抗体と比較して、低下されたプロテインＡ結合親和性を示し、さらに、前記の抗体において２つの免疫グロブリン重鎖のうちの１つのみがプロテインＡ結合活性を保持することによって、ｐＨ３．０ではなくｐＨ４．０でプロテインＡカラムから前記の抗体を溶出することができる、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
前記の第１および第２の免疫グロブリン重鎖は、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、モノクローナル抗体、一価抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、抗体薬物複合体、モノボディ、ダイアボディ、ナノボディ、プロボディ、酵素ドメイン、リガンドまたは受容体融合タンパク質、およびミニ結合ドメイン（ｍｉｎｉ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）から選択される１つまたは２つの結合ドメインをさらに含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項７】
１つ以上の抗体軽鎖をさらに含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項８】
前記の抗体は、ヒト又はヒト化ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤ、或いはそれらのサブタイプ、或いはそれらのハイブリッドである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項９】
前記の抗体は、ヒト又はヒト化ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、或いはそれらのサブタイプ、或いはそれらのハイブリッドである、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項１０】
非天然アミノ酸、抗体薬物複合体、または検出可能なマーカーをさらに含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項１１】
２つの重鎖のＦｃ領域間に１つのジスルフィド架橋をさらに含む抗体であって、この１つのジスルフィド架橋は２つの重鎖ポリペプチドにおける１つのアミノ酸をシステインで置換することにより形成された、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項１２】
前記の請求項１または２に記載の分子の前記第１の免疫グロブリン重鎖および前記第２の免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸ベクターであって、前記のヌクレオチド配列は、同じベクターまたは別個のベクターに存在してもよく、また、前記第１鎖および前記第２鎖をコードする核酸の比率は変化しても良い、核酸ベクター。
【請求項１３】
前記の第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖をコードする核酸の比率が１：１である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
前記の第１鎖をコードする核酸は、配列番号６（ＯＡ）を含み、且つ前記の第２鎖をコードする核酸は、配列番号８（ＯＢ）を含むか；
前記の第１鎖をコードする核酸は、配列番号６（ＯＡ）を含み、且つ前記の第２鎖をコードする核酸は、配列番号１２（ＯＤ）を含むか；、または、
前記の第１鎖をコードする核酸は、配列番号１０（ＯＣ）を含み、且つ前記の第２鎖をコードする核酸は、配列番号８（ＯＢ）を含む、請求項１２または１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１２に記載の核酸ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の抗体の調製方法であって、
ａ、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖におけるアミノ酸残基を修飾し、前記の抗体の第１の免疫グロブリン重鎖と第２の免疫グロブリン重鎖との間の発現比率が約１：１になる工程、
ｃ、前記の第１の免疫グロブリン重鎖および前記の第２の免疫グロブリン重鎖を発現して抗体を形成する細胞系を培養する工程、
ｄ、宿主細胞培養物から前記の抗体を精製する工程、を含む、調製方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【優先権の主張】
【０００１】
本願は、２０１６年８月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５３２５の国内段階出願である。国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４５３２５は、２０１５年８月２６日の出願日を有する米国仮出願第６２／２０９，９７８号に基づく優先権の利益を主張するものである。本願は、これらの出願の両方の優先権を主張し、その両方の内容が本願に参考のため援用される。
【シーケンスリスト】
【０００２】
本願はシーケンスデータを含む。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、多重特異性抗体プラットフォーム、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体、およびそれらを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗体は、抗原に応答してＢリンパ球由来の形質細胞によって分泌される大きな糖タンパク質である。抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤの５つの主要な種類がある。ＩｇＧは、ヒトの体内の血清抗体の約７５％を占め、血液循環中に最も一般的な抗体である。すべての５つの主要な種類の抗体において、基本単位は、２本の同一の重鎖（ＨＣ）および２本の同一の軽鎖（ＬＣ）からなるＹ字型モノマーである。それぞれのＬＣは、１つの可変領域（ＶＬ）と１つの定常領域（ＣＬ）を有する。それぞれのＨＣは、１つの可変領域（ＶＨ）と３つの定常領域（ＣＨ）を有する。Ｙ字型構造の「アーム」は、抗原結合断片（Ｆａｂ）を形成する。このアームは、可撓性ヒンジ領域によって、Ｙ字型構造の「ベース」となるホモ二量体Ｆｃ断片（結晶化可能な断片）に連結される。抗体と免疫系の他の成分との情報伝達能力は、Ｆｃ領域により媒介される。本分野では、哺乳動物細胞系においてホモ二量体Ｆｃ領域を産生することが知られている。このようなホモ二量体Ｆｃ領域は、例えば、抗体様特性を融合タンパク質に付与するために使用することができる。
【０００５】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、２つの異なる抗体の断片からなる人工タンパク質であり、その結果としてＢｓＡｂは２つの異なるタイプの抗原に結合する。二重特異性抗体は多重特異性抗体に属する。多重特異性抗体は、二重特異性抗体、三重特異性抗体、または四重特異性抗体であってもよい。このような多重特異性抗体のＦｃ断片はヘテロ二量体であることが好ましい。通常、二重特異性抗体、ならびに他の多重特異性抗体は、広範囲の臨床および診断用途において、非常に大きな可能性を示している。欧州連合（ＥＵ）と米国で承認された腫瘍性疾患の治療用の２種の二重特異性抗体薬（ＣａｔｕｍａｘｏｍａｂおよびＢｌｉｎａｔｕｍａｂ）がある。そのユニークな特徴のために、二重特異性抗体および多重特異性抗体は、一般的に、次世代の抗体治療薬に対する非常に魅力的なフォーマットとなる。
【０００６】
臨床研究分野では、特異的な抗体の診断への応用がいくつかの刊行物に記載されている（例えば、Ｆａｎｇｅｒら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２，１２：１０１〜１２４；  Ｎｏｌａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９０，１０４０：１〜１１；  Ｓｏｎｇ−Ｓｉｖｉｌａｉら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０，７９：３１５）。しかしながら、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の最も印象深い用途は、免疫‐腫瘍分野にある。理論的には、ＢｓＡｂの一方のアームは、腫瘍細胞における腫瘍抗原に結合することができ、ＢｓＡｂの別のアームは、免疫エフェクター細胞マーカーに結合することができる。そして、ＢｓＡｂは、架橋剤（ｂｒｉｄｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として、免疫エフェクター細胞（ナチュラルキラー細胞またはエフェクターＴ細胞）を集め、またそれらを局所腫瘍部位に運んで、腫瘍細胞を殺すことができる。これらの治療への応用は、多数の刊行物に記載されている（Ｈｓｅｉｈ−Ｍａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９２，５２：６８３２〜６８３９；  Ｗｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９３，５３：９４〜１００；  Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９２，１７５：２１７；  Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，１５２：２３８５）。
【０００７】
ＢｓＡｂまたは多重特異性抗体の調製に用いるいくつかの異なる方法が当分野で公知である。１９８０年代に、２つの異なるハイブリドーマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）のクロスハイブリッド（ｃｒｏｓｓ−ｈｙｂｒｉｄ）によって二重特異性抗体を産生した（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  １９８３，３０５：５３７〜５３９）。２つの異なる重鎖と２つの異なる軽鎖とがランダムな対合（ｐａｉｒｉｎｇ）を形成するために、これらのハイブリドーマ（クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）とも呼ばれる）は、異なる抗体の組合せを１０種類も生成することができるが、そのうち１つのみが所望のＢｓＡｂ形式である。この状況は、正確なＢｓＡｂ形式の精製が煩雑で且つ低収率となる。ランダムな対合の問題を克服するためには、２つの異なる修飾されたＦｃドメインが互いに結合するときにホモ二量体の形成よりヘテロ二量体の形成を好むように、２つの異なる修飾されたＦｃドメインを調製することが好ましい。各修飾されたＦｃは、ユニークな結合特異性を有するＦａｂまたはＳｃＦｖと融合することができる。異なる結合特異性を有する２つの異なる修飾されたＦｃ含有断片が哺乳類動物の細胞培養物において共発現される場合、それらは優れた収率でヘテロ二量体の二重特異性抗体になることができる。
【０００８】
ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２００７／１４７９０１および米国特許第８，５９２５６２号には、２つの異なる修飾されたＣＨ３ドメインがホモ二量体の形成よりヘテロ二量体の形成を好むように、第１のＣＨ３ドメインおよび第２のＣＨ３ドメインの電荷が再分配される別のアプローチを開示した。しかしながら、一般的に、哺乳類動物の細胞において２つの異なるＦｃ重鎖の共発現により、いくつかのヘテロ二量体Ｆｃ断片が形成ができるが、多数のホモ二量体Ｆｃ断片の形成できる。コトランスフェクトされた細胞培養物または加工された安定な細胞系の上清からヘテロ二量体断片を精製することは、煩雑かつ高価である。
【０００９】
この問題はすでにある程度で改善された。例えば、米国特許第５，８０７，７０６号は、ＣＨ３ドメインにおけるいわゆる「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」突然変異を開示した。例えば、米国特許出願第２０１４／０３４８８３９号および第２０１３／０２４５２３３号には、「ノブ・イン・ホール」の対策を用いることにより、いくつかの他の方法を開示した。この技術により、多いヘテロ二量体の形成ができるが、一部の「ホール」ホモ二量体および「ノブ」モノマーが依然として存在することになった。米国特許出願番号第２０１２／０１１６０５７号には、野生型ＣＨ３ドメインにおいて、アラニンで３６４位のセリンを置換してヘテロ二量体化を改善することが好ましいことを開示した。そのような置換は、ヘテロ二量体Ｆｃの凝集の増加を引き起こす。
【００１０】
治療用組成物の開発において、抗体はますます重要になってくる。二重特異性抗体を含む多重特異性抗体誘導体は、癌治療に用いることができる次世代の標的生物製剤とすることが考えられる。多重特異性抗体は、少なくとも２つの抗原またはエピトープに結合する。実験的癌治療における多重特異性抗体の応用には、異なる細胞表面タンパク質に結合して、増殖または血管新生の関連経路の分子をより完全に阻害するのを達成することが含まれる。多特異的抗体は、免疫エフェクター細胞を腫瘍に送達するための媒介体（ｖｅｈｉｃｌｅ）として使用することもできる。したがって、多重特異性抗体は、２つ以上の抗原に結合する能力があるため、望ましい。しかしながら、二重特異性抗体を含む多重特異性抗体の調製と精製は、まだ技術的な課題であり、非常に高価でもある。したがって、高純度のこのような抗体を作製するために、新しい方法が必要である。
【００１１】
当分野において様々な手段が知られているが、本明細書に記載の本発明によって解決される問題の全てに対処することはできない。本発明の一実施形態を図面に示し、以下でより詳細に説明する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、下記の望ましくて有用な利点および目的などが付与される。本明細書に記載の発明は、新規多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、新規抗体および抗体誘導体のプラットフォームと、前記抗体の製作の新規方法および高度に精製された新規多重特異性抗体の製作の新規方法を提供する。
【００１３】
本発明は、２つの異なる修飾された哺乳動物のＩｇＧのＦｃ領域ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥとＩｇＭのＦｃ領域のヘテロ二量体化を高めるために、新規の二重または多重特異性抗体プラットフォームを提供する。また、本発明はヒンジ領域における任意の修飾を提供する。さらに、本発明は高純度のヘテロ二量体を達成するために、簡略化された一段階精製を提供する。
【００１４】
本発明の目的は、ＣＨ３を含む第１のポリペプチドとＣＨ３を含む第２のポリペプチドとの間の界面を処理してヘテロ二量体化するために、抗体ＣＨ３ドメインを修飾する方法を提供することである。特に、アミノ酸の置換によって、少なくとも２つ、好ましくは２〜６つ、最も好ましくは３〜４つの正電荷を帯びるアミノ酸（例えば、アルギニン、リジンまたはヒスチジンが挙げられるが、これらに限定されるものではない）を第１のポリペプチドの界面に導入し、正電荷を増加させる。同時に、アミノ酸の置換によって、少なくとも２つ、好ましくは２〜６つ、最も好ましくは３〜４つの負電荷を帯びるアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない）を第２のポリペプチドの相補的な界面に導入し、ポリペプチド鎖の負電荷を増加させる。ホモ二量体の形成ではなくヘテロ二量体の形成を促進するために、２つの相補的なＣＨ３ドメインの界面におけるそれらの異なる修飾は、これらの２つの鎖の間にはるかに強い静電引力を提供することが推測される。さらに、システイン分子は、荷電アミノ酸とともに、２つの相補的なＣＨ３ドメインの両方の界面の適切な位置に導入され、鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にして、ヘテロ二量体の形成をさらに強化する。
【００１５】
本発明の別の目的は、このようなアミノ酸置換を生成する方法であって、第１のポリペプチド鎖に導入された正電荷を帯びるアミノ酸が、第２のポリペプチド鎖の相補的な界面に最も近接した位置にある反対の負電荷を帯びるアミノ酸と相互作用する最も適切に配向された位置に、存在する方法を提供する。これらのアミノ酸置換が適切に配置されると、ヘテロ二量体の形成は静電的に有利である。例えば、反対の電荷は、２つのペアになったＣＨ３ドメインの界面の最も近接した位置にある。
【００１６】
さらに、本発明の別の目的は、二重特異性または多重特異性の結合タンパク質であり得るヘテロ二量体抗体の調製方法を提供することである。ヘテロ二量体抗体は、界面で会合し、集まってヘテロ二量体の形成を増強する、修飾されたＣＨ３を含む第１のポリペプチドおよび修飾されたＣＨ３を含む第２のポリペプチドを含むことができる。１つの局面において、前記分子は、二重特異性、三重特異性または四重特異性の抗体であり得る。ＣＨ３を含む第１のポリペプチドのＮ末端は、重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨおよびＣＨＩ）、ＳｃＦｖ、プロボディ（ｐｒｏｂｏｄｙ）、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｙ）、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、リガンドまたは受容体、或いはいずれの種類の結合ドメインと融合させることができる。ＣＨ３を含む第１のポリペプチドのＣ末端は、異なる重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨおよびＣＨＩ）、ＳｃＦｖ、プロボディ、モノボディ、ダイアボディ、ナノボディ、リガンドまたは受容体、或いはいずれの種類の結合ドメインと融合させることができる。融合する結合単位と第１のポリペプチド鎖との間にペプチドリンカーを使用することができる。同時に、ＣＨ３を含む第２のポリペプチドのＮ末端は、他の異なる重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨおよびＣＨＩ）、ＳｃＦｖ、プロボディ、モノボディ、ダイアボディ、ナノボディ、リガンドまたは受容体、或いはいずれの種類の結合ドメインと融合しても良い。前記ＣＨ３を含む第２のポリペプチドのＣ末端は、他の異なる重鎖Ｆａｂ領域（ＶＨおよびＣＨＩ）、ＳｃＦｖ、プロボディ、モノボディ、ダイアボディ、ナノボディ、リガンドまたは受容体の融合体、或いはいずれのミニ結合ドメインと融合しても良い。融合する結合単位と第２鎖との間にペプチドリンカーを導入することができる。
【００１７】
さらに、本発明の別の目的は、一過性トランスフェクションの細胞培養系、安定的に改変された細胞系またはインビトロ無細胞タンパク質合成系を用いて、このようなヘテロ二量体タンパク質を産生する方法を提供することである。これらのシステムは、第１鎖および第２鎖をコードする核酸を含む。これらの２つの鎖は、同じベクターまたは２つの独立したベクターにおいてコードされても良い。使用可能な細胞培養系は、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３または骨髄腫ＮＳＯ細胞）、昆虫細胞、酵母細胞または細菌細胞系を含むが、これに限定されない。一実施形態では、ＣＨ３を含む第１のポリペプチドをコードする核酸とＣＨ３を含む第２のポリペプチドをコードする核酸との比は、１：２から変化すること（２：１を除く）ができる。好ましい実施形態では、１：１の比が使用される。
【００１８】
さらに、本発明の別の目的は、前記ヘテロ二量体タンパク質を精製する方法である。ヘテロ二量体抗体の精製には、標準のモノクローナル抗体精製技術を用いることができる。これらの技術には、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ならびにアンモニウム沈殿が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
好ましい実施形態では、負電荷を帯びるアミノ酸で置換された第２のポリペプチドは、プロテインＡとの結合特性をほとんど失った。このユニークな特徴は、前記ヘテロ二量体タンパク質の精製に用いる技術の利点を与える。ヘテロ二量体抗体において、第一のポリペプチドのみがプロテインＡに結合し、第二のポリペプチドは結合しないので、プロテインＡに結合する２つの鎖を有する通常のＦｃホモ二量体に比べて、ヘテロ二量体はプロテインＡカラムに対する結合親和性が低く、高いｐＨで溶出することができる。本発明による分子はｐＨ４で溶出することができるが、ホモ二量体は依然としてプロテインＡカラムに保持される。
【００２０】
一実施形態では、ＣＨ３を含むポリペプチドは、ヒト、マウス、ウシ、ウマ、ニワトリ、ラット、非ヒト霊長類、ラクダ、ラマ（Ｌｌａｍａ）、アルパカ（Ａｌｐａｃａ）、グアナコ（ｇｕａｎａｃｏ）またはサメから由来する免疫グロブリン分子であり得る。また、他の局面において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥおよびＩｇＤまたはそれらのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４など）であり得る。ＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、非天然アミノ酸、Ｆｃエフェクター機能突然変異およびグリコシル化部位突然変異のような他の改変を含むことができる。
【００２１】
さらに、本発明の別の態様は、前記ヘテロ二量体抗体が医薬組成物または治療組成物として用いられることである。ヘテロ二量体タンパク質は、他の薬学的に許容される緩衝液、成分または賦形剤を含有する組成物として調製することができる。このような医薬組成物は、疾患を治療または予防するために、患者に投与することができる。
【００２２】
さらに、本発明の別の目的は、一対の抗体断片を含む分子を提供することである。それぞれの前記抗体断片はヘテロ二量体の形成を促進する修飾されたＣＨ３ドメインを含む。１つの局面において、比較可能な発現系で発現されると、この分子は、野生型抗体Ｆｃと実質的に同じ収率を有する。別の局面において、前記分子の第１の断片由来の修飾されたＣＨ３ドメインは、エッジ界面（ｅｄｇｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）で３つまたは４つのアミノ酸置換を含むことが好ましく、そのうち、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つが、既にアルギニン、ヒスチジンまたはリジンから選択される正電荷を帯びるアミノ酸に改変された。１つのアミノ酸は、正電荷を帯びるアミノ酸、システインまたは他の荷電していないアミノ酸に改変させることができる。また、他の局面において、該分子の第２の断片由来の修飾されたＣＨ３ドメインは、エッジ界面で３つまたは４つのアミノ酸置換を含むことが好ましく、そのうち、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つが、既にアスパラギン酸またはグルタミン酸から選択される負電荷を帯びるアミノ酸に改変された。１つのアミノ酸は、負電荷を帯びるアミノ酸、システインまたは他の荷電していないアミノ酸に改変させることができる。
【００２３】
さらに、本発明の別の目的は、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含む多重特異性ヘテロ二量体抗体分子を提供することである。そのうち、第１重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含み、第２重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含む。ここで、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの突然変異は、２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの正電荷を帯びるアミノ酸に突然変異され；且つ、第２重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの突然変異は、２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくはつ〜４つの負電荷を帯びるアミノ酸に突然変異される；ならびに、各突然変異は、Ｙ３９１からＳ４００までのエッジ界面、Ｑ３４７からＥ３５７までのエッジ界面、またはＤ４０１からＬ４１０までの中間界面（ｍｉｄｄｌｅ  ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）にそれぞれ位置する。
【００２４】
さらに、本発明の別の目的は、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含む多重特異性ヘテロ二量体抗体分子を提供することである。そのうち、第１重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含み、第２重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含む。ここで、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの変異は、２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの正電荷を帯びるアミノ酸に突然変異され；且つ、第２重鎖のＣＨ３ドメインにおける２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの変異は、２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの負電荷を帯びるアミノ酸に突然変異され；そのうち、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおける置換は、Ｙ３９１Ｋ、Ｙ３９１Ｒ、Ｙ３９１Ｈ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｈ、Ｔ３９３Ｋ、Ｔ３９３Ｒ、Ｔ３９３Ｈ、Ｔ３９４Ｋ、Ｔ３９４Ｒ、Ｔ３９４Ｈ、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９５Ｒ、Ｐ３９５Ｈ、Ｐ３９６Ｋ、Ｐ３９６Ｒ、Ｐ３９６Ｈ、Ｖ３９７Ｋ、Ｖ３９７Ｒ、Ｖ３９７Ｈ、Ｖ３９７Ｃ、Ｌ３９８Ｋ、Ｌ３９８Ｒ、Ｌ３９８Ｈ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｈ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｓ４００Ｈ、Ｑ３４７Ｋ、Ｑ３４７Ｒ、Ｑ３４７Ｈ、Ｖ３４８Ｋ、Ｖ３４８Ｒ、Ｖ３４８Ｈ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｒ、Ｙ３４９Ｈ、Ｔ３５０Ｋ、Ｔ３５０Ｒ、Ｔ３５０Ｈ、Ｆ４０５Ｒ、Ｆ４０５Ｋ、Ｆ４０５Ｈ、Ｙ４０７Ｒ、Ｙ４０７Ｋ、及びＹ４０７Ｈからなる群から選択される。
【００２５】
さらに、本発明の別の目的は、第１の免疫グロブリン重鎖および第２の免疫グロブリン重鎖を含む多重特異性ヘテロ二量体抗体分子を提供することである。そのうち、第１重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含み、第２重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含む。ここで、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの突然変異は、２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの正電荷を帯びるアミノ酸に突然変異され；且つ、第２重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの突然変異は、２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの負電荷を帯びるアミノ酸に突然変異され；そのうち、第２重鎖のＣＨ３ドメインにおける置換は、Ｙ３９１Ｄ、Ｙ３９１Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９３Ｄ、Ｔ３９３Ｅ、Ｔ３９４Ｄ、Ｔ３９４Ｅ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９５Ｅ、Ｐ３９６Ｄ、Ｐ３９６Ｅ、Ｖ３９７Ｄ、Ｖ３９７Ｅ、Ｖ３９７Ｃ、Ｌ３９８Ｄ、Ｌ３９８Ｅ、Ｄ３９９Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｅ、Ｓ３５４Ｄ、Ｓ３５４Ｅ、Ｒ３５５Ｅ、Ｒ３５５Ｄ、Ｆ４０５Ｅ、Ｆ４０５Ｄ、Ｙ４０７Ｅ、Ｙ４０７Ｄ、Ｋ４０９Ｄ、及びＫ４０９Ｅからなる群から選択される。
【００２６】
さらに、本発明の別の目的は、第１重鎖および第２重鎖を含む多重特異性抗体分子を提供することである。そのうち、第１重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含み、第２重鎖のＣＨ３ドメインは、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸突然変異を含む。ここで、第１重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの変異は、第１重鎖のＣＨ３ドメインに２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの正電荷を導入し；且つ、第２重鎖のＣＨ３ドメインにおける少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの変異は、第２重鎖のＣＨ３ドメインに２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの負電荷を導入し；そのうち、第１重鎖のＣＨ３ドメインが配列番号５（ＯＡ）によるアミノ酸配列を含み、第２重鎖のＣＨ３ドメインが配列番号７（ＯＢ）または配列番号１１（ＯＤ）によるアミノ酸配列を含むか、或いは、第１重鎖のＣＨ３ドメインが配列番号９（ＯＣ）によるアミノ酸配列を含み、第２重鎖のＣＨ３ドメインが配列番号７（ＯＢ）によるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
さらに、本発明の別の目的は、前記の請求項のいずれか１項に記載の分子の第１重鎖および第２重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸ベクターを提供することである。前記のコードする配列は、同じベクターまたは別個のベクターにあっても良く、また、前記第１鎖および前記第２鎖をコードする核酸の比率は変化しても良い。
【００２８】
さらに、本発明の別の目的は、多重特異性抗体のＣＨ３ドメインを含む単離されたポリペプチド鎖である。前記ポリペプチド鎖は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、および３５からなる群から選択されるものによるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
さらに、本発明の別の目的は、多重特異性抗体を調製する方法であって、
ａ）第１のＣＨ３ドメイン、第１のＣＨ２ドメインおよび第１の抗原結合ドメインを含む第１ポリペプチドを提供する工程；
ｂ）第２のＣＨ３ドメイン、第２のＣＨ２ドメイン、および第２の抗原結合ドメインを含む第２ポリペプチドを提供する工程；
ｃ）第１ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸を、鎖の正電荷を増加させるように、置換する工程；
ｄ）第２ポリペプチドのＣＨ３ドメインにおいて、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つのアミノ酸を、鎖の負電荷を増加させるように、置換する工程；
ｅ）適切な細胞系において、工程ａ）とｂ）のポリペプチド鎖を共発現させる工程；
ｆ）細胞系によって発現される二量体から第１と第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体を単離する工程；必要に応じて
ｇ）他の単位をポリペプチドに融合させることにより、単離されたヘテロ二量体を修飾する工程、を含む方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】図１は、本発明における二重特異性または多重特異性抗体構造の例の概略図を示す。本発明は、二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体であり得る分子を提供する。図ＡおよびＢ（図１Ａ）は、２つの一般的な「Ｙ」字型二重特異性抗体構造である。
【図１Ｂ】図１は、本発明における二重特異性または多重特異性抗体構造の例の概略図を示す。本発明は、二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体であり得る分子を提供する。図ＣおよびＤ（図１Ｂ）は、図Ａに由来する三重特異性および四重特異性抗体の態様を示す。
【図１Ｃ】図１は、本発明における二重特異性または多重特異性抗体構造の例の概略図を示す。本発明は、二重特異性、三重特異性または四重特異性抗体であり得る分子を提供する。図ＥおよびＦ（図１Ｃ）は、図Ｂに由来する三重特異性および四重特異性抗体の態様を示す。
【図２】図２は、２つの修飾されたＣＨ３を含むポリペプチド断片の間におけるヘテロ二量体形成の評価に用いる実験方法の概略図である。長い鎖は、通常、正電荷を帯びるアミノ酸の置換を有するＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３を含むが、短鎖は通常、負電荷を帯びるアミノ酸の置換を有するヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３のみを含む。長鎖および短鎖をコードするＤＮＡを１：１の比率で混合し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。３日後、細胞培養上清を採取し、プロテインＡ磁気ビーズプルダウン（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄｓ  ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ）を行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により磁気ビーズに結合したタンパク質を解析した。
【図３】図３は種々のサンプルをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｍ：マーカー；レーン１：ＷＴ長鎖；レーン２：ＷＴ短鎖；レーン３：ＷＴ長鎖と短鎖のコトランスフェクション。中間部におけるヘテロ二量体のバンドに加えて、大量の長鎖ホモ二量体（上部）および短鎖ホモ二量体（下部）が存在する。レーン４：突然変異ＯＥ鎖；レーン５：突然変異ＯＦ鎖；レーン６：ＯＥとＯＦ鎖のコトランスフェクション；レーン７：突然変異ＯＡ鎖；レーン８：突然変異ＯＢ鎖。プロテインＡに対するＯＢの結合活性は失われていることが観察された。レーン９：ＯＡとＯＢ鎖のコトランスフェクション。ヘテロ二量体のバンドの強度は、レーン４のＷＴヘテロ二量体のバンドの強度に相当するが、長鎖および短鎖のホモ二量体のバンドはいずれも見えないことが観察された。
【図４】図４は種々のサンプルをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：突然変異ＯＡ鎖；レーン２：突然変異ＯＢ鎖；レーン３：ＯＡとＯＢ鎖のコトランスフェクション；レーン４：突然変異ＯＣ鎖；レーン５：突然変異ＯＤ鎖；レーン６：ＯＣとＯＤ鎖のコトランスフェクション。レーン６には２つのヘテロ二量体のバンドがあることが観察された。
【図５】図５は種々のサンプルをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＭ：マーカー；レーン１：突然変異ＯＡ鎖；レーン２：突然変異ＯＢ鎖；レーン３：突然変異ＯＣ鎖；レーン４：突然変異ＯＤ鎖；レーン５：ＯＡとＯＤ鎖のコトランスフェクション；レーン６：ブランク；レーン７：ＯＣとＯＢ鎖のコトランスフェクション。
【図６】図６は種々のサンプルをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１〜３：ＯＡとＯＢ鎖の３回の独立したコトランスフェクション；レーン４：ブランク；レーン５：対照としての野生型長鎖と短鎖のコトランスフェクション。
【図７】図７は種々のサンプルをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＭ：マーカー；レーン１：ＯＧとＯＨ鎖のコトランスフェクション；レーン２：ブランク；レーン３：０ＩとＯＪ鎖のコトランスフェクション；レーン４：ブランク；レーン５：ＯＭとＯＮ鎖のコトランスフェクション。
【図８】図８は本発明の抗体に用いられるプロテインＡカラムの一段階精製の概略図である。短鎖は、プロテインＡ結合活性を失った突然変異を有し、また、それのホモ二量体が存在すれば、そのホモ二量体は洗浄工程中にカラムから流出する。一方、長鎖は、プロテインＡ結合を保持した突然変異を有し、また、それのホモ二量体が存在すれば、３を超えるｐＨで溶出されると、カラムに残される。長鎖および短鎖のヘテロ二量体のみが４．０〜５．０の間のｐＨで溶出される。
【図９】図９はプロテインＡカラムによるＯＡおよびＯＢヘテロ二量体の精製結果を示す。ＯＡとＯＢのコトランスフェクションのサンプルをプロテインＡカラムにロードした。洗浄後、まずｐＨ４．０でヘテロ二量体生成物を溶出し、次いでｐＨ２．８で溶出した。レーン２〜６はｐＨ４．０の溶出画分で、レーン７〜１０はｐＨ２．８の溶出画分である。レーン４と５に示すように、ＯＡおよびＯＢヘテロ二量体はｐＨ４．０で溶出することができる。
【図１０】図１０は２つの精製された二重特異性抗体生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。レーン１は分子マーカーで、レーン２〜６は第１の二重特異性抗体生成物であるＨｅｒ２ｘＣＤ３．１（抗Ｈｅｒ２および抗ＣＤ３．１のヘテロ二量体）の溶出画分である。レーン７〜１０は第２の二重特異性抗体生成物であるＨｅｒ２ｘＣＤ３．２（抗Ｈｅｒ２および抗ＣＤ３．２のヘテロ二量体）の溶出画分である。
【図１１】図１１は二重特異性ＥＬＩＳＡ結合の結果を示す。ＴＢＳとＰＢＳは緩衝液対照である。抗Ｈｅｒ２は、ＯＡ断片と融合したハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）に由来するｓｃＦｖである。抗ＣＤ３．１および抗ＣＤ３．２は、ＯＡ断片と融合した２つの異なるＣＤ３抗体に由来する２つのｓｃＦｖである。Ｈｅｒ２ｘＣＤ３．１は抗Ｈｅｒ２−ＯＢと抗ＣＤ３．１−ＯＡヘテロ二量体である。Ｈｅｒ２ｘＣＤ３．２は抗Ｈｅｒ２−ＯＢと抗ＣＤ３．２−ＯＡヘテロ二量体である。その結果は、２つのヘテロ二量体のみが二重特異的な結合活性を表したことを示している。他の単一の結合剤は二重特異的な結合活性を示さなかった。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本発明に使用される「アミノ酸」とは、天然に存在する２０種のアミノ酸の１つまたは特定の規定された位置に存在し得る任意の非天然の類似物を意味する。
【００３２】
本発明に使用される「アミノ酸突然変異」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入および／または欠失を意味する。本発明において、好ましいアミノ酸修飾は置換である。
【００３３】
本発明に使用される「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸に置換することを意味する。例えば、置換Ｐ３９５Ｄは、ポリペプチドの３９５位のアミノ酸であるプロリンがアミノ酸であるアスパラギン酸に置換された変異ポリペプチドを指す。
【００３４】
本発明に使用される「抗体」とは全長抗体および抗体断片を含む。抗体は、任意の生物由来の天然抗体、操作された抗体、或いは、実験、治療または他の目的に用いられる組換え技術によって生成された抗体であっても良い。用語「抗体」はモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を含む。抗体は、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体、中和抗体、阻害抗体、または刺激抗体であっても良い。
【００３５】
本発明に使用される「抗体断片」とは、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、或いは抗体の他の抗原結合部分配列のようなタンパク質を意味し、そのタンパク質は抗体全体の修飾によって生成されるか、または組換えＤＮＡ技術を用いてデノボ合成される。
【００３６】
本発明に使用される「二重特異性抗体」または「ＢｓＡｂ」とは、２つの異なる抗体の断片からなり、そして２つの異なるタイプの抗原に結合する人工タンパク質を意味する。
【００３７】
本発明に使用される「多重特異性抗体」とは、二重特異性抗体、三重特異性抗体または四重特異性抗体を意味する。多重特異性抗体は、２つ以上の異なる抗体の断片からなり、そして２つ、３つまたは４つの異なるタンパク質に結合する。
【００３８】
本発明に使用される「ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）」とは、抗体断片であるＶＬ−ＶＨ−ＣＨ３からなる人工抗体断片を意味する。
【００３９】
本発明に使用される「ナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）」とは、単一の単量体の可変抗体領域からなるラクダ科動物抗体断片を意味する。
【００４０】
本発明に使用される「プロボディ」（ｐｒｏｂｏｄｙ）とは、抗原結合側を活性化するまでにマスクされる人工抗体分子である。
【００４１】
本発明に使用される「ダイアボディー」とは、二量体化された一本鎖可変断片を有する人工抗体断片を意味する。
【００４２】
本発明に使用される「Ｆａｂ」または「Ｆａｂ領域」とは、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩ免疫グロブリンドメインまたは領域を含むポリペプチドを意味する。
【００４３】
本発明に使用される「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ断片」とは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）と、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインと、ならびにこれらのドメインのＮ末端の可撓性ヒンジの一部と、を含むポリペプチドを意味する。Ｆｃ領域の境界は変化しても良いが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、一般に、Ａ２３１からそのカルボキシル末端までの残基を含むと定義され、その番号付けはＥＵ番号付けスキームに従う。
【００４４】
本発明に使用される「ヒンジ」または「ヒンジ領域」とは、抗体の第１および第２の定常ドメイン（ＣＨ１およびＣＨ２）の間のアミノ酸を含む可撓性ポリペプチドを意味する。本発明の目的を達成するために、ヒンジは構造の面から定義され、また、ＩｇＧの場合のように、「ヒンジ領域」は残基番号２１６〜２３０を含み、その番号付けはＥＵ番号付けスキームに従う。
【００４５】
本発明に使用される「ＩｇＧ」とは、公知された免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされた抗体種類に属するタンパク質を意味する。ヒトでは、この種類はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。
【００４６】
本発明に使用される「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順番に番号を付けてもよく、或いは、例えばＫａｂａｔ又はＥＵの番号付けスキームなどの確立されたフォーマットに従って番号を付けても良い。例えば、位置２９７はヒト抗体ＩｇＧ１中の位置である。
【００４７】
本発明に使用される「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドを含む共有結合で連結した少なくとも２つのアミノ酸を意味する。
【００４８】
本発明に使用される「野生型またはＷＴ」とは、対立遺伝子変異を含む、自然界から見出されたアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【００４９】
この発明は、２つの異なる修飾された哺乳動物、好ましくはヒトのＩｇＧのＦｃ領域（即ち、ＩｇＧ１、２、３、４又はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）のヘテロ二量体化を増強するように、新規多重特異性抗体プラットフォームを提供する。前記修飾には、例えば、マウスのｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２Ａ、ｍＩｇＧ２ＢおよびｍＩｇＧ３などの他の哺乳動物の抗体を含んでも良い。
【００５０】
実際に、本発明の抗体はいずれの抗原を標的とすることができる。本発明の抗体の変形は、広範囲の抗体製品に使用することができる。一実施形態では、本発明の抗体の変形は、治療性、診断性または研究性の薬剤、好ましくは治療剤である。抗体の変形は、モノクローナル又はポリクローナルの抗体組成物に使用することができる。一態様において、本発明の抗体の変形は、例えば癌細胞などの標的抗原を有する標的細胞を殺滅するために使用される。一実施形態では、本発明の抗体の変形は、標的抗原を遮断、拮抗または作動させるために使用され、例えば、サイトカイン又はサイトカイン受容体を拮抗するために使用される。一態様において、本発明の抗体の変形は、標的抗原を遮断、拮抗または作動させて、標的抗原を有する標的細胞を殺滅するために使用される。本発明の抗体の変形は、様々な治療目的に使用することができる。種々の他の治療剤を、本発明の抗体の変形と共に使用することができる。一態様において、抗体は、抗血管新生剤と共に投与することができる。
【００５１】
本発明の抗体の変形および１つ或いは複数の治療効果を有する薬剤を配合する医薬組成物が考えられる。本発明の抗体の変形の製剤は、所望の純度を有する前記抗体と、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤とを混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｏｓｏｌ、Ａ．  Ｅｄ．，１９８０）、凍結乾燥製剤または水性製剤溶液として保存用に調製される。インビボ投与用の製剤は無菌であることが好ましい。これは、滅菌濾過膜または他の方法による濾過によって容易に達成される。本発明に開示される抗体および他の治療効果を有する薬剤は、免疫リポソームとして調製され、および／またはマイクロカプセルに閉じ込められる。
【００５２】
製剤において、治療効果を有する抗体の変形の濃度は、約０．１〜１００重量％の範囲で変化させることができる。一態様では、抗体の濃度は０．００３〜１．０モルの範囲である。患者を治療するために、本発明の抗体の変形の治療的有効量を投与することができる。本発明において、「治療的有効量」とは、それの投与による効果を生じる用量を意味する。正確な用量は治療の目的によるが、当業者が既知の技術によって決定することができる。投薬量は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上であってもよく、例えば０．１、１、１０または５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもく、１〜１０ｍｇ／ｋｇであることが好ましい。当技術分野で知られているように、抗体分解、全身送達または局所送達、および新しいプロテアーゼの合成速度、ならびに年齢、体重、全般的な健康状態、性別、食事、投与時間、薬物相互作用、および重症度に対する調整は必要であり、当業者が通常の実験によって決定することができる。
【００５３】
本発明の抗体の変形を含む医薬組成物の投与（好ましくは滅菌水溶液として）は、経口投与、皮下投与、静脈内投与、鼻腔内投与、眼内（ｉｎｔｒａｏｔｉｃａｌｌｙ）投与、経皮投与、局所投与（例えば、ゲル、膏薬、ローション、クリームなど）、腹腔内投与、筋肉内投与、肺内投与、非経口的投与、直腸投与または眼内投与などを含む様々な方法で行うことができるが、これらに限定されない。
【００５４】
野生型抗体Ｆｃは、２つの同様のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ポリペプチド断片からなる。２つのＣＨ３ドメイン間の結合相互作用は、２つのポリペプチド断片の二量体化をもたらす。本発明の基本的な考え方は、第１のＣＨ３ドメインにおける正電荷分布および第２のＣＨ３ドメインにおける負電荷分布を増加させることにより、ＣＨ３ドメインのヘテロ二量化を促進し、抗体生成の純度を高めることにある。これらの目標を達成するために、数種類の抗体Ｆｃ結晶構造における２つのＣＨ３ドメイン間の結合界面を研究した。タンパク質３Ｄ構造解析ソフトウェアＣｎ３Ｄ４．３．１を用いて、免疫グロブリン重鎖二量体構造を分析した。ＰＤＢデータベースから、１Ｌ６Ｘ、１ＨＺＨ、１０ＱＸ、１Ｈ３Ｘおよび４ＨＡＧのＩｇＧのＸ線結晶構造を詳細に調べた。２つの同様の重鎖間の最も近接した位置にあるため、ヒンジ領域、Ｎ３９０〜Ｓ４００とＱ３４７−Ｅ３５７のＣＨ３ドメインのエッジ界面、およびＤ４０１〜Ｌ４１０のＣＨ３中間界面に特に注目した。２つの同様の重鎖の間に、可能な相互作用アミノ酸対は、以下のように同定された。
【００５５】
ヒンジ領域：
Ｈ２２４−Ｈ２２４
Ｔ２２５−Ｔ２２５
Ｃ２２６−Ｃ２２６
Ｐ２２７−Ｐ２２７
Ｐ２２８−Ｐ２２８
Ｃ２２９−Ｃ２２９
【００５６】
ＣＨ３エッジ界面：
Ｙ３９１−Ｓ４００
Ｋ３９２−Ｄ３９９
Ｔ３９３−Ｌ３９８
Ｔ３９４−Ｖ３９７
Ｐ３９５−Ｐ３９６
Ｐ３９６−Ｐ３９５
Ｖ３９７−Ｔ３９４
Ｌ３９８−Ｔ３９３
Ｄ３９９−Ｋ３９２
Ｓ４００−Ｙ３９１
Ｓ３５４−Ｔ３５０
Ｒ３５５−Ｙ３４９
Ｅ３５６−Ｖ３４８
Ｅ３５７−Ｑ３４７
【００５７】
ＣＨ３中間界面：
Ｆ４０５−Ｋ４０９
Ｙ４０７−Ｙ４０７
Ｋ４０９−Ｆ４０５
【００５８】
より強いイオン同士の相互作用力を提供して、２つの異なる修飾された重鎖間のヘテロ二量体の形成を促進するために、アミノ酸突然変異スキャンアプローチ（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）により２つのＣＨ３ドメイン間の前記した界面を通り抜け、最良の突然変異の組み合わせを同定した。様々な数のアミノ酸突然変異対を試験した。ＣＨ３突然変異に加えて、可能性のあるヒンジ領域突然変異も突然変異スキャンによって評価した。
【００５９】
つまり、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの正電荷を帯びるアミノ酸（アルギニン、ヒスチジン又はリシンなど）を、連続的にまたは別々に第１重鎖における可能な相互作用アミノ酸位置に導入した。同時に、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの負電荷を帯びるアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を、連続的にまたは別々に前記した領域中の第２重鎖における可能な相互作用アミノ酸位置に導入した。突然変異を誘発するためのＤＮＡ構築物はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１は、ヒト伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１プロモーターに駆動されたＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３断片の発現に用いられ、宿主細胞から発現産物を分泌させるように、通常の分子クローニングによってＣＨＩのＮ末端の前にＩＬ−２分泌シグナル配列を加えた。ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２は、同じプロモーターによって駆動されたヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３断片の発現に用いられる。
【００６０】
アミノ酸突然変異の誘発は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを用いて行った。すべてのＤＮＡ突然変異誘発オリゴプライマーはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。一連のアミノ酸置換グループを以下に記載するように生成した。
【００６１】
ヒンジ領域：
１．鎖Ａにおけるヒンジ領域（ＨＩ）：
Ｈ２２４Ｅ、Ｔ２２５Ｐ、Ｐ２２７Ｇ、Ｐ２２８Ｅ
鎖Ａは、配列番号１によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号２の核酸配列によってコードされる。
【００６２】
２．鎖Ｂにおけるヒンジ領域（Ｈ２）：
Ｔ２２５Ｒ、Ｐ２２７Ｋ、Ｐ２２８Ｓ
鎖Ｂは、配列番号３によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号４の核酸配列によってコードされる。
【００６３】
ＣＨ３エッジ界面：
３．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＡ）：
Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ
鎖ＯＡは、配列番号５によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号６の核酸配列によってコードされる。
【００６４】
４．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＢ）：
Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ
鎖ＯＢは、配列番号７によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号８の核酸配列によってコードされる。
【００６５】
５．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＣ）：
Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｃ
鎖ＯＣは、配列番号９によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号１０の核酸配列によってコードされる。
【００６６】
６．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＤ）：
Ｔ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ
鎖ＯＤは、配列番号１１によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号１２の核酸配列によってコードされる。
【００６７】
７．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＧ）：
Ｐ３９５Ｒ、Ｐ３９６Ｒ、Ｖ３９７Ｒ
鎖ＯＧは、配列番号１３によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号１４の核酸配列によってコードされる。
【００６８】
８．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＨ）：
Ｔ３９４Ｅ、Ｐ３９５Ｅ、Ｐ３９６Ｅ
鎖ＯＨは、配列番号１５によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号１６の核酸配列によってコードされる。
【００６９】
９．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＩ）：
Ｔ３９３Ｋ、Ｔ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ
鎖ＯＩは、配列番号１７によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号１８の核酸配列によってコードされる。
【００７０】
１０．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＪ）：
Ｐ３９６Ｄ、Ｖ３９７Ｄ、Ｌ３９８Ｄ
鎖ＯＪは、配列番号１９によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号２０の核酸配列によってコードされる。
【００７１】
１１．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＭ）：
Ｔ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ
鎖ＯＭは、配列番号２１によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号２２の核酸配列によってコードされる。
【００７２】
１２．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＮ）：
Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ、Ｖ３９７Ｄ
鎖ＯＮは、配列番号２３によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号２４の核酸配列によってコードされる。
【００７３】
１３．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＰ）：
Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ、Ｌ３９８Ｋ
鎖ＯＰは、配列番号２５によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号２６の核酸配列によってコードされる。
【００７４】
１４．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＱ）：
Ｔ３９３Ｄ、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ
鎖ＯＱは、配列番号２７によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号２８の核酸配列によってコードされる。
【００７５】
１５．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＳ）：
Ｓ３５４Ｄ、Ｒ３５５Ｄ
鎖ＯＳは、配列番号３３によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号３４の核酸配列によってコードされる。
【００７６】
１６．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＴ）：
Ｖ３４８Ｋ、Ｙ３４９Ｋ、Ｔ３５０Ｋ
鎖ＯＴは、配列番号３５によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号３６の核酸配列によってコードされる。
【００７７】
ＣＨ３中間界面：
１７．鎖Ａにおける中間界面（ＯＥ）：
Ｆ４０５Ｅ、Ｙ４０７Ｅ、Ｋ４０９Ｅ
鎖ＯＥは、配列番号２９によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号３０の核酸配列によってコードされる。
【００７８】
１８．鎖Ｂにおける中間界面（ＯＦ）：
Ｆ４０５Ｋ、Ｙ４０７Ｋ
鎖ＯＦは、配列番号３１によるアミノ酸配列を有し、また、配列番号３２の核酸配列によってコードされる。
【００７９】
他の可能な突然変異は、以下のリストから選択することができる。
１９．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＵ）：
Ｙ３９１Ｋ、Ｋ３９２、Ｔ３９３Ｋ
２０．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＶ）：
Ｌ３９８Ｄ、Ｄ３９９、Ｓ４００Ｄ
２１．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＫ）：
Ｋ３９２、Ｔ３９３Ｋ、Ｔ３９４Ｋ
２２．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＬ）：
Ｄ３９９、Ｌ３９８Ｄ、Ｖ３９７Ｄ
２３．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＷ）：
Ｖ３９７Ｋ、Ｌ３９８Ｋ、Ｄ３９９Ｋ
２４．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＸ）：
Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９３Ｄ、Ｔ３９４Ｄ
２５．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＹ）：
Ｌ３９８Ｋ、Ｄ３９９Ｋ、Ｓ４００Ｋ
２６．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＺ）：
Ｙ３９１Ｄ、Ｋ３９２Ｄ、Ｔ３９３Ｄ
２７．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＳ）：
Ｓ３５４Ｄ、Ｒ３５５Ｄ
２８．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＴ）
Ｖ３４８Ｋ、Ｙ３４９Ｋ、Ｔ３５０Ｋ
２９．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＲＳ）：
Ｓ３５４Ｄ、Ｒ３５５Ｅ
３０．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＲＴ）
Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｒ、Ｔ３５０Ｒ
【００８０】
本発明の他の局面において、突然変異ＨＩは突然変異ＯＡおよびＯＣと組み合わせることができる。突然変異Ｈ２は突然変異ＯＢおよびＯＤと組み合わせることができる。さらに、別の実施形態では、突然変異ＯＥはＯＡ、ＯＢ、ＯＣおよびＯＤと組み合わせることができる；突然変異ＯＦは突然変異ＯＡ、ＯＢ、ＯＣおよびＯＤと組み合わせることができる。前記した鎖の他の組み合わせもを調製することができる。
【００８１】
本ヘテロ二量体分子を構築するために、供給源抗体として、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒトまたはヒト化抗体、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（例えば、ナノボディ）、フィブロネクチン結合ドメイン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎｓ）、多重特異性抗体および抗体複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を含む多種の抗体を使用することができる。供給源抗体は、いずれのアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＹなど）およびいずれのサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｍＩｇＧ２ａおよびｍＩｇＧ２ｂなど）に由来するものであっても良い。供給源抗体は、当分野で知られている種々のタンパク質または非タンパク質の標的を認識することができる。
【００８２】
図２は、２つの修飾された重鎖間のヘテロ二量体の形成を評価する実験方法の概略図を示す。図２では、例えば、第１鎖はＣＨＩ、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３を含む長鎖である。第２鎖はヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３のみを含む短鎖である。アミノ酸置換によって第１鎖のＣＨ３ドメインを突然変異させて、ＣＨ３ドメインの正電荷を増加させる。第１鎖は２つ〜６つのアミノ酸突然変異を含むことが好ましいが、３つまたは４つのアミノ酸突然変異が最も好ましい結果を与える。突然変異部位は、Ｙ３９１〜Ｓ４００のエッジ界面（例えば、Ｙ３９１、Ｋ３９２、Ｔ３９３、Ｔ３９４、Ｐ３９５、Ｐ３９６、Ｖ３９７、Ｌ３９８、Ｄ３９９、Ｓ４００）、Ｑ３４７〜Ｅ３５７のエッジ界面（Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｙ３４９、Ｔ３５０、Ｓ３５４、Ｒ３５５、Ｅ３５６、Ｅ３５７）、及びＤ４０１〜Ｌ４１０の中間界面（Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９）からなる群より選択することが好ましい。最も好ましい置換は、Ｔ３９３Ｋ、Ｔ３９４Ｋ、Ｐ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｖ３９７Ｋ、Ｖ３９７Ｃ、Ｌ３９８Ｋ、Ｖ３４８Ｋ、Ｙ３４９ＫおよびＴ３５０Ｋからなる群より選択する。但し、置換の組合せによってＣＨ３ドメインの正電荷が増加する限り、他の置換も使用することができる。なお、本発明では、ＥＵ抗体アミノ酸番号付けシステムを使用した。
【００８３】
図２に示す第２鎖は、例えば、ヒンジ領域、ＣＨ２およびＣＨ３のみを含む短鎖である。第２鎖のＣＨ３は、第２鎖におけるアミノ酸置換によって突然変異させて、ＣＨ３ドメインの負電荷を増加させる。第２鎖は２つ〜６つのアミノ酸突然変異を含むことが好ましいが、３つまたは４つのアミノ酸突然変異が最も好ましい結果を与える。突然変異部位は、Ｙ３９１〜Ｓ４００のエッジ界面（Ｙ３９１、Ｋ３９２、Ｔ３９３、Ｔ３９４、Ｐ３９５、Ｐ３９６、Ｖ３９７、Ｌ３９８、Ｄ３９９、Ｓ４００）、Ｑ３４７〜Ｅ３５７のエッジ界面（Ｑ３４７、Ｖ３４８、Ｙ３４９、Ｓ３５４、Ｒ３５５、Ｅ３５６、Ｅ３５７）、及びＤ４０１〜Ｌ４１０の中間界面（Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９）からなる群より選択することが好ましい。最も好ましい置換は、Ｔ３９３Ｄ、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ、Ｐ３９６Ｄ、Ｖ３９７Ｄ、Ｖ３９７Ｃ、Ｌ３９８Ｄ、Ｓ３５４ＤおよびＲ３５５Ｄからなる群から選択する。但し、置換の組合せによってＣＨ３ドメインの負電荷が増加する限り、他の置換も使用することができる。
【００８４】
突然変異された鎖の相補的対をヒト胎児腎臓ＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトした。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、およびマウスＮＳＯ細胞などの他の哺乳動物細胞系も使用することができる。コトランスフェクションの結果として、図２の右側に示されたように、突然変異された長鎖と短鎖は３つの可能な方法で二量体化する。二量体の一部は長鎖ホモ二量体であり、それらの別の部分は長鎖／短鎖ヘテロ二量体であり、それらの第３部分は短鎖ホモ二量体である。好ましいヘテロ二量体抗体は長鎖／短鎖ヘテロ二量体である。図１では、１つのこのような二重特異性抗体の構造を概略的に示す。図１に示されるような短い重鎖は、増加された負電荷を有する突然変異ＣＨ３、非突然変異のＣＨ２、及び抗原Ａに対する一本鎖可変断片ＳｃＦｖに結合したヒンジ領域を含む。長い重鎖は、増加された正電荷を含むように突然変異したＣＨ３ドメイン、非突然変異のＣＨ２、及び抗原Ｂに対する抗原結合断片Ｆａｂに結合したヒンジ領域を含む。図１における図Ｃと図Ｄは、図Ａに由来する三重特異性および四重特異性抗体の態様を示す。図Ｅと図Ｆは、図Ｂに由来する三重特異性および四重特異性抗体の態様である。
【００８５】
長い重鎖における増加された正電荷および短い重鎖における増加された負電荷は、２つの鎖のＣＨ３ドメインにおける負電荷と正電荷の間のより強い静電引力のために、短鎖／長鎖ヘテロ二量体の収率を増加させる（図２参照）。従って、好ましいヘテロ二量体の収率はより高い。
【００８６】
短い重鎖ＣＨ３ドメインにおける増加された負電荷は、本発明の抗体の別の特定の特徴にもつながる。すなわち、正電荷を帯びる長鎖ＦｃのみがプロテインＡ（一種の抗体精製試薬である）に結合することができるが、負電荷を帯びる短鎖ＦｃはプロテインＡに結合しない。この特徴は、コトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞培養物から産生されたヘテロ二量体抗体をさらに精製するために利用できる。
【００８７】
図２に示すように、得られた抗体は長鎖ホモ二量体、長鎖／短鎖ヘテロ二量体および短鎖ホモ二量体の３つの異なるタイプのものがある。図８は、前記の短鎖／長鎖ヘテロ二量体の特定の特徴による精製工程の概略図を示す。コトランスフェクトされた細胞培養物から得られた抗体の産出物がプロテインＡアフィニティーカラムを通ると、短鎖ホモ二量体はプロテインＡに結合しなくなるので、カラムから流出する。長鎖ＦｃのみがプロテインＡへの結合を提供するという事実のために、２本の長鎖を有するホモ二量体は、カラムにおけるプロテインＡに強固に結合するが、ヘテロ二量体は、より低い親和性でプロテインＡに結合する。ｐＨ４以上の溶離液でカラムを溶出することにより、ヘテロ二量体が溶出されるが、長鎖ホモ二量体は、カラムへの結合がより強いので、溶出することはない。以上により、ヘテロ二量体はこのｐＨで溶出される唯一のものである。
【００８８】
それで、本発明は、少なくとも以下の２つの利点を提供する。まず、ＣＨ３ドメインにおける負電荷と正電荷の間の強い引力のために、コトランスフェクションにおける長鎖／短鎖ヘテロ二量体形成の収率が増加する。９０〜９５％の二量体はヘテロ二量体であることが好ましい。次に、好ましい短鎖／長鎖ヘテロ二量体は、より高いｐＨの溶離液を用いることにより、一段階のプロテインＡアフィニティーカラムで精製することができる。
【００８９】
前記の説明において、図１に示される例示的な二重特異性抗体が短い重鎖と長い重鎖を有するので、重鎖は短鎖と長鎖であると記載される。しかし、短い重鎖と長い重鎖を有する必要はない。２つの鎖がＳｃＦｖ抗原結合断片に結合してもよく、或いは、２つの鎖がＦａｂ抗原結合断片を有してもよい。前記の説明において、図１に示される抗体は、２つの異なるタンパク質に対する２つの結合部位を有する二重特異性抗体であるが、この抗体は三重特異性または四重特異性で、且つ３つまたは４つの異なる抗原結合部位を有しても良い。異なる特異性を有するそれらの結合ドメインは、図１Ｃ〜Ｆに示されるように、２つの二量体重鎖のＮ末端またはＣ末端に融合することができる。
【００９０】
本発明の別の態様によれば、重鎖のヒンジ領域に別の突然変異が形成される。ヒンジ領域における突然変異は、Ｈ２２４、Ｔ２２５、Ｐ２２９またはＰ２２８位の１つ以上のアミノ酸に位置することが最も好ましい。第１重鎖の少なくとも１つのヒンジ領域突然変異はＨ３３４Ｅ、Ｔ２２５Ｐ、Ｐ２２９Ｇ及びＰ２２８Ｇからなる群より選択され、且つ第２重鎖ヒンジ領域の少なくとも１つの突然変異はＴ２２５Ｒ、Ｐ２２７Ｓ及びＰ２２８Ｋからなる群より選択されることが好ましい。
【００９１】
本明細書に記載した抗体プラットフォームは、Ｆｃ領域を有するいずれかのタイプの二重特異性抗体または多重特異性抗体に適用できることを理解すべきである。なお、抗原結合断片は、必要に応じて選択できることを理解すべきである。本発明の抗体は抗がん抗原抗体であってもよく、それらは癌の発生または侵襲性に関する非癌タンパク質（ｎｏｎ−ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）に特異的であってもよく、或いは、それらは例えばウイルスに関するタンパク質に特異的であっても良い。実質的に、本発明の抗体は、以下のタンパク質のリストに属するタンパク質、サブユニット、ドメイン、モチーフ及びエピトープを含む何れかの抗原を標的とすることができるが、これらに限定されない。例えば、ＣＤ２；ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤｌｌａ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３（プロテインｐ６７）、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＧＤ３、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ；ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ２、ＴＮＦα、ＴＮＦαβ、ＴＮＦ−Ｒ１、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ，ＣＤ３０Ｌ，４−１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＬＩＧＨＴ、ＶＥＧ１、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ受容体−１、Ａｌアデノシン受容体、リンフォトキシンβ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＥＰＯ；ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＥｐＣＡＭ、インテグリンβ１、インテグリンβ２、インテグリンα４／β７、インテグリンα２、インテグリンα３、インテグリンα４、インテグリンα５、インテグリンα６、インテグリンαＶ、αＶβ３インテグリン、ＦＧＦＲ−３、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、Ｌ−セレクチン、抗Ｉｄ、Ｅ−セレクチン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＶＮＲインテグリン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、エオタキシン１、ＢｌｙＳ（Ｂリンパ球刺激因子）、補体Ｃ５、ＩｇＥ、第ＶＩＩ因子、ＣＤ６４、ＣＢＬ、ＮＣＡ９０、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ４）、組織因子、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、エンドセリン受容体、ＶＬＡ−４、ハプテンＮＰ−ｃａｐ又はＮＩＰ−ｃａｐ、Ｔ細胞受容体α／β、Ｅ−セレクチン、ジゴキシン、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）と精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ（ＣＥＡ）、トランスフェリン受容体、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＭＦＧ  ＰＥＭ、ムチンＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ヘパラナーゼＩ、ヒト心筋ミオシン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）関連抗原、Ｇｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｉｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、Ｌｅｗｉ���  Ｙ関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶ  ｇｐ１２０、ＨＣＭＶ、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶ  Ｆ、ＲＳＶＦ  Ｆｇｐ、ＶＮＲインテグリン、ＩＬ−８、サイトケラチン腫瘍関連抗原、Ｈｅｐ  Ｂ  ｇｐ１２０、ＣＭＶ、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ＨＩＶ  ＩＩＩＢ  ｇｐ１２０  Ｖ３ループ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆｇｐ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＤ糖タンパク質、ＨＳＶ  ｇＢ糖タンパク質、ＨＣＭＶ  ｇＢエンベロープ糖タンパク質、及びクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）毒素が挙げられる。
【００９２】
選択できる抗体は、ＰＳＭＡ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１又はＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＣＤ３、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγ、ＴＣＲδ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＥｐＣＡＭ、メソセリン（ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）、グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎｓ）、ＣＤ２８、Ｅｒｂｌ、Ｅｒｂ２、Ｂ７−Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ、ＢＭＰ４、ＣＳＦ１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＰＤＧＦＲ、ＴＩＧＩＴ、ＣＳ１、ＴＷＥＡＫ、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ１３、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＩＰ−１０、フコシル−ＧＭ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６、インテグリン、ＲＡＮＫリガンド、ＣＥＡ、ＤＬＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦＲ、ＡＤＡＭＳ、ミオスタチン（ｍｙｏｓｔａｔｉｎ）、ＰＣＳＫ９、ＣＸＣＲ４、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＭＩＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１５、ＩＬ−９、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＰＥＧ２などの抗原に対する抗体を含むが、これらに限定されない。
【００９３】
或いは、本発明の抗体は、例えば、ＨＩＶタンパク質、ＨＰＶタンパク質、ＣＭＶタンパク質、インフルエンザウイルスタンパク質、又はプリオンタンパク質などのウイルス関連標的に特異的であり得る。
【００９４】
本発明の一態様では、本発明の分子は診断および治療用途に使用することができる。より具体的には、本発明の分子は、２つ以上の標的抗原に結合できる二重特異性または多特異性抗体の生成に用いられる。前記標的抗原は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＭＩＦ、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ｒ、ＩＬ−１５；ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ；ＩＬ−９、ＩＬ−５、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６、ＩＬ−２５、ＩＬ−１３、ＡＤＡＭＳ、ＰＥＧ２、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２及びＨｅｒ３からなる群より選択するが、これらに限定されるものではない。当業者では他の可能な標的を認識することができる。
【００９５】
実施例
以下、非限定的な実施例によって本発明を説明する。
実施例１：免疫グロブリンＦｃ領域におけるイオン相互作用を担うアミノ酸残基の同定
タンパク質３Ｄ構造解析ソフトウェアＣｎ３Ｄ４．３．１を用いて、免疫グロブリン重鎖二量体の構造を分析した。ＰＤＢデータベースから、１Ｌ６Ｘ、１ＨＺＨ、１０ＱＸ、１Ｈ３Ｘ及び４ＨＡＧなどのＩｇＧのＸ線結晶構造を詳細に調べた。２つの同様の重鎖間の密接な近接性のため、ヒンジ領域、Ｎ３９０〜Ｓ４００のＣＨ３ドメインエッジ界面、及びＤ４０１〜Ｌ４１０のＣＨ３中間界面に特別に注目した。２つの同様の重鎖間の可能な相互作用アミノ酸残基対を以下に示す。
【００９６】
ヒンジ領域：
Ｈ２２４−Ｈ２２４
Ｔ２２５−Ｔ２２５
Ｃ２２６−Ｃ２２６
Ｐ２２７−Ｐ２２７
Ｐ２２８−Ｐ２２８
Ｃ２２９−Ｃ２２９
【００９７】
ＣＨ３エッジ界面：
Ｙ３９１−Ｓ４００
Ｋ３９２−Ｄ３９９
Ｔ３９３−Ｌ３９８
Ｔ３９４−Ｖ３９７
Ｐ３９５−Ｐ３９６
Ｐ３９６−Ｐ３９５
Ｖ３９７−Ｔ３９４
Ｌ３９８−Ｔ３９３
Ｄ３９９−Ｋ３９２
Ｓ４００−Ｙ３９１
Ｓ３５４−Ｔ３５０
Ｒ３５５−Ｔ３４９
Ｅ３５６−Ｖ３４８
Ｅ３５７−Ｑ３４７
【００９８】
ＣＨ３中間界面：
Ｆ４０５−Ｋ４０９
Ｙ４０７−Ｙ４０７
Ｋ４０９−Ｆ４０５
【００９９】
本発明では、ＥＵ抗体アミノ酸番号付けシステムを利用してアミノ酸を番号付ける。
【０１００】
実施例２：ヘテロ二量体の形成を促進するための重鎖中のアミノ酸の修飾
適切なイオン相互作用力を提供し、２つの異なる修飾された重鎖間のヘテロ二量体形成を促進するために、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの正電荷を帯びるアミノ酸（アルギニン又はリシンなど）を、連続的にまたは別々に第１重鎖における可能な相互作用アミノ酸位置に導入した。同時に、少なくとも２つ、好ましくは２つ〜６つ、最も好ましくは３つ〜４つの負電荷を帯びるアミノ酸（アスパラギン酸またはグルタミン酸など）を、連続的にまたは別々に前記した領域中の第２重鎖における可能な相互作用アミノ酸位置に導入した。突然変異を誘発するためのベクター構築物はＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。ｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１は、ヒト伸長因子（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１プロモーターに駆動されたＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３断片の発現に用いられ、宿主細胞から発現産物を分泌させるように、通常の分子クローニングによってＣＨＩのＮ末端の前にＩＬ−２分泌シグナル配列を加えた。ｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃ２は、同じプロモーターによって駆動されたヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３断片の発現に用いられる。
【０１０１】
アミノ酸突然変異の誘発は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したＱｕｉｋｃｈａｎｇｅ突然変異誘発キットを用いて行った。すべてのＤＮＡ突然変異誘発オリゴプライマーはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。アミノ酸突然変異スキャンアプローチ（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ａｐｐｒｏａｃｈ）により重鎖ヒンジ領域、ＣＨ３エッジ界面および中間界面を通り抜け、高純度のヘテロ二量体を生成する最良の突然変異の組み合わせを同定した。一連のアミノ酸置換グループを以下に示す。
【０１０２】
ヒンジ領域：
１．鎖Ａにおけるヒンジ領域（ＨＩ、負電荷）：
Ｈ２２４Ｅ，Ｔ２２５Ｐ，Ｐ２２７Ｇ，Ｐ２２８Ｅ
２．鎖Ｂにおけるヒンジ領域（Ｈ２、正電荷）：
Ｔ２２５Ｒ，Ｐ２２７Ｋ，Ｐ２２８Ｓ
【０１０３】
ＣＨ３エッジ界面：
３．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＡ、正電荷）：
Ｐ３９５Ｋ，Ｐ３９６Ｋ，Ｖ３９７Ｋ
４．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＢ、負電荷）：
Ｔ３９４Ｄ，Ｐ３９５Ｄ，Ｐ３９６Ｄ
５．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＣ、正電荷及びジスルフィド結合の形成）：
Ｐ３９５Ｋ，Ｐ３９６Ｋ，Ｖ３９７Ｃ
６．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＤ、負電荷及びジスルフィド結合の形成）：
Ｔ３９４Ｃ，Ｐ３９５Ｄ，Ｐ３９６Ｄ
７．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＧ、正電荷）：
Ｐ３９５Ｒ，Ｐ３９６Ｒ，Ｖ３９７Ｒ
８．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＨ、負電荷）：
Ｔ３９４Ｅ，Ｐ３９５Ｅ，Ｐ３９６Ｅ
９．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＩ、正電荷）：
Ｔ３９３Ｋ，Ｔ３９４Ｋ，Ｐ３９５Ｋ
１０．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＪ、負電荷）：
Ｐ３９６Ｄ，Ｖ３９７Ｄ，Ｌ３９８Ｄ
１１．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＭ、正電荷）：
Ｔ３９４Ｋ，Ｐ３９５Ｋ，Ｐ３９６Ｋ
１２．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＮ、負電荷）：
Ｐ３９５Ｄ，Ｐ３９６Ｄ，Ｖ３９７Ｄ
１３．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＰ、正電荷）：
Ｐ３９６Ｋ，Ｖ３９７Ｋ，Ｌ３９８Ｋ
１４．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＱ、負電荷）：
Ｔ３９３Ｄ，Ｔ３９４Ｄ，Ｐ３９５Ｄ
１５．鎖Ａにおけるエッジ界面（ＯＳ、負電荷）：
Ｓ３５４Ｄ，Ｒ３５５Ｄ
１６．鎖Ｂにおけるエッジ界面（ＯＴ、正電荷）：
Ｖ３４８Ｋ，Ｙ３４９Ｋ，Ｔ３５０Ｋ
【０１０４】
ＣＨ３中間界面：
１７．鎖Ａにおける中間界面（ＯＥ、負電荷）：
Ｆ４０５Ｅ，Ｙ４０７Ｅ，Ｋ４０９Ｅ
１８．鎖Ｂにおける中間界面（ＯＦ、正電荷）：
Ｆ４０５Ｋ，Ｙ４０７Ｋ
【０１０５】
突然変異ＨＩは突然変異ＯＡまたはＯＣと組み合わせることもできる。突然変異Ｈ２は突然変異ＯＢまたはＯＤと組み合わせることができる。これらの組合せ変異は、プロテインＡに結合するタンパク質を十分な量で産生するだけでなく、ヘテロ二量体の形成にも有利である。しかしながら、最終生成物にかなりの量の単鎖単量体が存在し、これを除去するために少なくともさらに１つの精製工程を必要とすることがある。
【０１０６】
突然変異ＯＥは、ＯＡ、ＯＢ、ＯＣ及びＯＤと組み合わせることができる。突然変異ＯＦは突然変異ＯＡ、ＯＢ、ＯＣ及びＯＤと組み合わせることができる。しかしながら、これらの組合せ変異は、プロテインＡに結合するタンパク質を十分な量で産生することができない。
【０１０７】
実施例３：ＨＥＫ２９３細胞のコトランスフェクション及びタンパク質産物分析
ヘテロ二量体の形成の効果を評価するための実験方法を図２に示す。正電荷を帯びるアミノ酸の突然変異を導入したポリペプチド鎖Ａ（通常は図中の長鎖である）、および負電荷を帯びるアミノ酸の突然変異を導入したポリペプチド鎖Ｂ（通常は図中の短鎖である）は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの２９３ｆｅｃｔｉｎトランスフェクション試薬を用いて、単独でまたは共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされた。ＨＥＫ２９３細胞において、種々の正電荷および負電荷を帯びるポリペプチド鎖の組合せを共発現させた。本発明では、正電荷を帯びるポリペプチド鎖と負電荷を帯びるポリペプチド鎖との間の好ましい比率は１：１であるが、他の比率であっても良い。トランスフェクトされた３日後、遠心分離により細胞培養上清を採取し、プロテインＡ磁気ビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）プルダウンを行った。磁気ビーズに結合したタンパク質産物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動におけるそれらの移動度に基づいて特徴を表す。結合したタンパク質を有する回収されたプロテインＡ磁性ビーズを、３０μｌのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、３０μｌのＳＤＳローディングバッファーと混合して、５分間煮沸した。半量の煮沸したサンプルを１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードして、長鎖ホモ二量体、長鎖と短鎖ヘテロ二量体、および短鎖ホモ二量体を分離した。代表的なヘテロ二量体の形成の結果を図３、４、５、６および７に示す。
【０１０８】
図３は、以下のサンプルをロードしたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｍ：マーカー；レーン１：ＷＴ長鎖；レーン２：ＷＴ短鎖；レーン３：ＷＴ長鎖とＷＴ短鎖のコトランスフェクションである。中間のヘテロ二量体バンドに加えて、大量の長鎖ホモ二量体（上）および短鎖ホモ二量体（下）が存在することに注目した。レーン４：ＯＥ突然変異鎖；レーン５：ＯＦ突然変異鎖；レーン６：ＯＥとＯＦ鎖のコトランスフェクション；レーン７：ＯＡ突然変異鎖；レーン８：ＯＢ突然変異鎖；レーン９：ＯＡとＯＢ鎖のコトランスフェクションである。図面の左側に、各タンパク質バンドに対応する構造を示す。レーン３、６および９には、長鎖／短鎖ヘテロ二量体が明らかに存在する。また、レーン３には、かなりの量の長鎖ホモ二量体と短鎖ホモ二量体を示す。同様に、レーン６には、ヘテロ二量体バンドに加えて２つのホモ二量体を示すが、レーン３よりも少ない量である。レーン９には、２つのホモ二量体が殆どなく、主にヘテロ二量体を示す。この結果に基づいて、ＯＡ鎖とＯＢ鎖の共発現は、高収率の短鎖／長鎖ヘテロ二量体抗体をもたらすと思われる。ＯＡ鎖の突然変異はＰ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ及びＶ３９７Ｋである。ＯＢ鎖の突然変異は、Ｔ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ及びＰ３９６Ｄである。二番目に良い組み合わせは、ＯＥとＯＦの共発現であると思われる。ＯＥの突然変異はＦ４０５Ｅ、Ｙ４０７Ｅ及びＫ４０９Ｅである。ＯＦの突然変異はＦ４０５Ｋ、Ｙ４０７Ｋである。
【０１０９】
本実施例の１つの重要な側面は、突然変異ＯＥ／ＯＦおよび突然変異ＯＡ／ＯＢヘテロ二量体の産物の収率が野生型ヘテロ二量体の収率に相当することである。これは、これらの突然変異が、一般的な哺乳動物細胞発現系におけるタンパク質発現レベルを損なわないことを示唆した。この点は、多特異性抗体の大規模製造にとって重要である。
【０１１０】
本実施例の別の重要な側面は、レーン８に示されるように、突然変異ＯＢがプロテインＡとの全ての結合活性をほとんど失ったことである。ところが、それは依然として突然変異ＯＡとヘテロ二量体を形成することができる。突然変異したＦｃ鎖の１つがプロテインＡとの結合活性を失うことはヘテロ二量体の重鎖において稀ではないが、第２鎖が依然としてプロテインＡと結合し得る限り、プロテインＡを結合したヘテロ二量体を形成することができる（ＪＨ  Ｄａｖｉｓら、  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ、２０１０、２３：４、１９５−２０２）。図８では説明するように、ヘテロ二量体抗体の精製においてこの特定の特徴は技術的利点になる。
【０１１１】
図４は、以下のサンプルがロードされたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１：ＯＡ鎖；レーン２：ＯＢ鎖；レーン３：ＯＡ鎖とＯＢ鎖のコトランスフェクション；レーン４：ＯＣ鎖；レーン５：ＯＤ鎖；レーン６：ＯＣ鎖とＯＤ鎖のコトランスフェクションである。図面の左側に、各タンパク質バンドに対応する構造を示す。レーン１〜３のデータは、図３のレーン７〜９と同様の結果を示し、これらの結果が再現可能であることを示している。ＯＣ鎖の突然変異はＰ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ及びＶ３９７Ｃである。ＯＤ鎖の突然変異はＴ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｄ及びＰ３９６Ｄである。長鎖における正負電荷を帯びる３つのアミノ酸と短鎖における負電荷を帯びる３つのアミノ酸とはペアリングすることの代わりに、２つの鎖に２つのシステインを導入して、Ｖ３９７ＣとＴ３９４Ｃとの間に鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にし、これはヘテロ二量体の形成を促進すると考えられる。しかし、ＨＥＫ２９３細胞において、ＯＣ鎖とＯＤ鎖の共発現は、レーン６に示されるように、２つのヘテロ二量体バンドを生じた。これは、ジスルフィド結合の形成が不完全であり、生成物の異質性が増えることを示す。一部の刊行物によれば、一般的に、より低い中間バンドにおける他のジスルフィド結合を有するヘテロ二量体は、上部中間バンドにおける通常のヘテロ二量体より速く移動する（Ａ．Ｍ．Ｍｅｒｃｈａｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９８：１６）。さらに、この組合せに長鎖ホモ二量体が明らかに存在する。
【０１１２】
図５は、以下のタンパク質がロードされたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＭ：マーカー；レーン１：ＯＡ鎖；レーン２：ＯＢ鎖；レーン３：ＯＣ鎖；レーン４：ＯＤ鎖；レーン５：ＯＡ鎖とＯＤ鎖のコトランスフェクション；レーン６：ブランク；レーン７：ＯＣ鎖とＯＢ鎖のコトランスフェクションである。図面の左側に、各タンパク質バンドに対応する構造を示す。レーン５と７は、主要な短鎖／長鎖ヘテロ二量体抗体を示す。これらの２つのレーンも微量のホモ二量体を示す。この結果に基づいて、ＯＡ鎖とＯＤ鎖のコトランスフェクションおよびＯＣ鎖とＯＢ鎖のコトランスフェクションは、比較的に高収率のヘテロ二量体鎖をもたらすと思われる。ＯＡ鎖の突然変異はＰ３９５Ｋ、Ｐ３９５Ｋ及びＶ３９７Ｋである。ＯＤ鎖の突然変異はＴ３９４Ｃ、Ｐ３９５Ｄ及びＰ３９６Ｄである。ＯＣ鎖の突然変異はＰ３９５Ｋ、Ｐ３９６Ｋ、Ｃ３９７Ｃであり、ＯＢ鎖の突然変異はＴ３９４Ｄ、Ｐ３９５Ｄ及びＰ３９６Ｄである。
【０１１３】
図６は、以下のサンプルがロードされたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１〜３：ＯＡ鎖とＯＢ鎖の３回の独立したコトランスフェクション；レーン４：ブランク；レーン５：対照としてのＷＴ長鎖と短鎖のコトランスフェクションである。レーン１〜３は、実質的に純粋な長鎖／短鎖ヘテロ二量体抗体を示し、これはＯＡおよびＯＢヘテロ二量体の高純度産物が一致していることを示す。
【０１１４】
図７は、以下のサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析である。レーン１：ＯＧ鎖とＯＨ鎖のコトランスフェクション；レーン２：ブランク；レーン３：ＯＩ鎖とＯＪ鎖のコトランスフェクション；レーン４：ブランク；レーン５：ＯＭ鎖とＯＮ鎖のコトランスフェクションである。実施例２では、各鎖におけるアミノ酸突然変異を開示する。中間のヘテロ二量体バンドに加えて、３つの組合せは、何れも少なくとも１つのホモ二量体バンドを有する。レーン１と３は長鎖ホモ二量体バンド（上）を有するが、レーン５は短鎖ホモ二量体バンド（下）を有する。これは、ヘテロ二量体バンドの収率を最大にするように、長鎖と短鎖の比率を調整する必要があることを示唆している（例えば、１：２又は２：１などの１：１以外の比率に調整する必要がある）。レーン１ではより多くのＯＨが必要であり、レーン３ではより多くのＯＪが必要であり、レーン５ではより多くのＯＭが必要である。
【０１１５】
実施例４：一段階精製により高度に精製された抗体を提供する
図８は、抗体の一段階精製の原理を示す。Ｆｃを含むヘテロ二量体二重特異性または多重特異性抗体の精製は、当分野で公知の方法によって達成される。タンパク質精製プロセス後に高純度の二重特異性または多特異性抗体産物を得るために、一部の公知技術は、Ｆｃヘテロ二量体における２つの鎖の１つにアミノ酸突然変異（例えば、Ｈ４３５Ｒ又はＹ４３６Ｆ）を意図的に導入して、プロテインＡに対する結合活性を低下または除去することが提案されている。これらの方法は、ＵＳ２０１４／０３４８８３９（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ）、ＷＯ２０１０／１５１７９２、ＵＳ２０１４０２４８６６４（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、ＰＥＧＳ２０１５  ＧＢＲ１３０２ポスター（Ｇｌｅｎｍａｒｋ）に記載されている。ヘテロ二量体Ｆｃにおけるこのような修飾は、Ｆｃヘテロ二量体においてプロテインＡに結合する鎖を１つのみ残させる。結果として、このようなヘテロ二量体は、野生型ホモ二量体と比較してプロテインＡへの結合が弱いので、より高いｐＨ（ｐＨ４．０〜５．０）で溶出することができる一方、通常のＦｃホモ二量体はｐＨ２．８〜ｐＨ３．０でしか溶出できない。
【０１１６】
本発明において、突然変異体ＯＡとＯＢをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトしたことは、図３、４および６に示されるように、高収率でヘテロ二量体（９５％超）を産生することができる。これに応じて、突然変異体ＯＡはそのプロテインＡ結合活性を保持した（図３のレーン７、図４のレーン１および図５のレーン１に示されるように）が、変異体ＯＢはそのプロテインＡ結合をほとんど失った（図３のレーン８、図４のレーン２および図５のレーン２に示されるように）。したがって、前記の精製方法は、ＯＡ／ＯＢヘテロ二量体の精製に容易に適用することができる。ＯＡ／ＯＢヘテロ二量体の精製方法を図８に示す。
【０１１７】
一実施形態では、ＯＡとＯＢのコトランスフェクションの細胞培養上清を採取し、プロテインＡカラムに適用した。ＯＢはプロテインＡ結合活性を失ったので、そのホモ二量体が存在する場合、カラムから流出するか、或いは洗浄工程によって洗浄される。ＯＡ／ＯＢヘテロ二量体のみがｐＨ４．２（２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．２）でカラムから溶出される。このｐＨで、ＯＡホモ二量体はカラム中に残る。この単一の精製工程により、ＯＡ／ＯＢヘテロ二量体を高純度に精製することができる。
【０１１８】
ＯＡおよびＯＢヘテロ二量体の精製特性を図９に示す。ＯＡとＯＢコトランスフェクションのサンプルをプロテインＡカラムにロードした。洗浄後、ｐＨ４．０でヘテロ二量体生成物を溶出し、次いでｐＨ２．８で溶出した。レーン２〜６はｐＨ４．０の溶出画分であり、レーン７〜１０はｐＨ２．８の溶出画分である。レーン４および５に示すように、ＯＡおよびＯＢヘテロ二量体はｐＨ４．０で溶出することができる。
【０１１９】
ＯＡおよびＯＢヘテロ二量体が二重特異性抗体の形成を促進することを実証するために、標準の分子クローニング法を用いて、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）ＶＬおよびＶＨに由来する抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖを、リーディングフレームに適合するように、ＯＢ断片と融合させ、抗Ｈｅｒ２−ＯＢを生成した。さらに、標準の分子クローニング法を用いて、２つの異なる抗ＣＤ３マウス抗体ＶＬおよびＶＨに由来する２つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを、リーディングフレームに適合するように、ＯＡ  Ｆｃ断片（ＣＨＩ領域なし）と融合させて、抗ＣＤ３．１−ＯＡおよび抗ＣＤ３．２−ＯＡを生成した。２つの二重特異性抗体は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて、抗−Ｈｅｒ２−ＯＢと抗ＣＤ３．１−ＯＡまたは抗ＣＤ３．２−ＯＡをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェトすることにより生成された。精製された二重特異性抗体産物を図１０に示す。レーン１は分子マーカーであり；レーン２〜６は、第１の二重特異性抗体産物Ｈｅｒ２ｘＣＤ３．１（抗Ｈｅｒ２および抗ＣＤ３．１のヘテロ二量体）の溶出画分である。レーン７〜１０は、第２の二重特異性抗体産物Ｈｅｒ２ｘＣＤ３．２（抗Ｈｅｒ２および抗ＣＤ３．２のヘテロ二量体）の溶出画分である。
【０１２０】
これらの二重特異性抗体の二重特異性結合活性を確認するために、二重特異性結合ＥＬＩＳＡアッセイを行った。２μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３でＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、１％ＢＳＡブロッカーでブロッキングした。二重特異性抗体サンプルおよび対照サンプルをプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、Ｈｅｒ２抗原（２ｎｇ／ｍＬ）をプレートに加え、２時間インキュベートした。その後、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＨｕｍａｎ  ＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）ＥＬＩＳＡキットを用いて、標準の抗Ｈｅｒ２  ＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡ結果を図１１に示す。ＴＢＳおよびＰＢＳは緩衝液対照である。抗Ｈｅｒ２は、ＯＡ断片に融合したハーセプチンに由来するｓｃＦｖである。抗ＣＤ３．１および抗ＣＤ３．２は、ＯＡ断片に融合した２つの異なるＣＤ３抗体に由来する２つのｓｃＦｖである。Ｈｅｒ２ｘＣＤ３．１は抗Ｈｅｒ２−ＯＢおよび抗ＣＤ３．１−ＯＡヘテロ二量体である。Ｈｅｒ２ｘＣＤ３．２は抗Ｈｅｒ２−ＯＢおよび抗ＣＤ３．２−ＯＡヘテロ二量体である。結果として、２つの二重特異性抗体のみが二重特異性結合活性を示したことが明らかとなった。他の単一の特異性試薬は二重特異性結合活性を示されなかった。
【０１２１】
本発明は一定程度の詳細性で説明されるが、本開示は説明のためのみになされたものであり、本発明の意図と範囲を離れることなく、局部の構成と配置の詳細に対する様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、結核菌タンパク質をコードするセンダイウイルスベクターを含むワクチンを提供する。センダイウイルスは毒性が低く、細胞培養を使って大量に製造できるため、生きた組換えワクチンを安全かつ容易に製造することが期待できる。さらに、本発明のワクチンは、結核菌の感染および／または結核の発症および進展を阻止する有望なワクチン戦略を提供する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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