(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドであって、配列番号１を含み、ここで、１つ以上のチミン塩基がウラシル塩基で置換される、前記１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害剤。
【請求項２】
前記２本鎖２次構造が、周囲温度においてＰＣＲ混合物中で安定である、請求項１に記載の可逆的阻害剤。
【請求項３】
配列番号２〜４から選択される、請求項１又は２に記載の可逆的阻害剤。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害剤を設計する方法であって、配列番号１を含む、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する工程を含み、ここで、１以上のチミン塩基がウラシル塩基で置換されている、前記方法。
【請求項５】
前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの混合物から、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を使用して選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物中のＤＮＡポリメラーゼを可逆的に阻害する方法であって、前記反応混合物を、配列番号１を含む、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、ここで、１以上のチミン塩基がウラシル塩基で置換されている、前記方法。
【請求項７】
前記混合物をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼと接触させる工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記接触が４０〜６５℃の温度範囲で行われる、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記試料をポリアミンと接触させる工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリアミンが、スペルミジン、スペルミン、及びトリメチレンジアミンから選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸を増幅する方法であって、増幅前に、標的核酸を含有する反応混合物を、配列番号１を含む、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させる工程を含み、ここで１以上のチミン塩基がウラシル塩基で置換されている、前記方法。
【請求項１２】
増幅前に、前記試料をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼと接触させる工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料をポリアミンと接触させる工程をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリアミンが、スペルミジン、スペルミン、及びトリメチレンジアミンから選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的核酸を増幅するためのキットであって、
（１）配列番号１を含む、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害剤であって、１以上のチミン塩基がウラシル塩基で置換されている、前記可逆的阻害剤と、
（２）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼと、
（３）ポリアミンと
を含む、前記キット。
【請求項１６】
前記ポリアミンが、スペルミジン、スペルミン、及びトリメチレンジアミンから選ばれる、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
標的核酸を増幅するための反応混合物であって、
（１）配列番号１を含む、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、ＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害剤であって、１以上のチミン塩基がウラシル塩基で置換されている、前記可逆的阻害剤と、
（２）ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼと、
（３）ポリアミンと
を含む、前記反応混合物。
【請求項１８】
前記ポリアミンが、スペルミジン、スペルミン、及びトリメチレンジアミンから選ばれる、請求項１７に記載の反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野、具体的にはポリメラーゼの可逆的オリゴヌクレオチド阻害剤の使用を介する、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅の低減、に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びリアルタイムＰＣＲは、標的核酸を検出するための迅速で特異的な方法として、研究と臨床分野で広く受け入れられている。しかし、非特異的増幅すなわち非標的配列の増幅の問題はしばしば、臨床用途に要求される高感度と高特異性の達成において制限因子となっている。Mackay, I.M. (2004), Real-time PCR in the microbiology laboratory, Clin. Microbiol. Infect. 10: 190を参照。
【０００３】
非特異的増幅は、ゲノム中の２次的で部分的に相補的な部位にアニーリングされるプライマーの伸長、又はプライマーの交差アニーリング、又は自己アニーリングから生じると考えられている。非特異的伸長生成物の存在は、そのような部分的に相補的なプライマー−鋳型２本鎖が安定である周囲温度における、ポリメラーゼ活性に帰せられている（Chou et al. (1992), Prevention of pre-PCR mis-priming and primer dimerization improves low-copy-number amplifications, Nucleic Acid Res. 20: 1717）。従って、周囲温度においてポリメラーゼのプライマー伸長活性を阻害する方法が考案されている。「ホットスタート (hot start)」と呼ばれるこれらの方法は、非特異的プライマー−鋳型複合体を不安定化するのに充分に温度が高い時のみ、ポリメラーゼが完全に活性となり、従って非特異的部位でのプライマーの伸長が回避されることを確実にする。
【０００４】
１つのホットスタート法は、低温においてポリメラーゼに結合しかつこれを阻害するが高温ではこれを引き起こさないオリゴヌクレオチドが関与する。Dang and Jayasena (1996), Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR, J. Mol. Biol. 264: 268を参照。これらのオリゴヌクレオチドは、標的酵素に対して極めて特異的であり、高い親和性を有する。
【０００５】
逆転写酵素が５０℃未満の温度を必要とする逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）用途には、このホットスタート手法は適していない。いくつかの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写活性を有し、同じ反応混合物中でｃＤＮＡの逆転写と増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）とを行うための、単一の酵素の使用を可能にする。Myers and Gelfand (1991), Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase, Biochemistry 30: 7661を参照。しかし、ポリメラーゼ活性に必要な２価イオンの存在下で、ＲＮＡは高温では不安定である。このため、逆転写は、伝統的なＰＣＲ熱サイクリングの開始前に、より低温（５０〜６０℃）で行われる。典型的なオリゴヌクレオチドアプタマーは６０℃近辺に融解温度を有し、低温ではポリメラーゼの阻害を充分に排除しない。従って、低温で阻害を排除できる可逆的ポリメラーゼ阻害剤を得ることが望ましい。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
ある実施態様において本発明は、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤であって、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記可逆的阻害剤である。２本鎖２次構造は、ＰＣＲ混合物中において周囲温度で安定であり得る。いくつかの実施態様において、可逆的阻害剤は配列番号１を有し、ここで、１つ以上のチミン塩基はウラシル塩基で置換される（例えば配列番号２〜４）。
【０００７】
別の実施態様において本発明は、核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤を設計する方法であって、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計する工程を含み、ここで、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記方法である。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの混合物から、指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment）（ＳＥＬＥＸ）を使用して選択することができる。
【０００８】
さらに別の実施態様において本発明は、反応混合物中の核酸ポリメラーゼを可逆的に阻害する方法であって、反応混合物を、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記方法である。本方法は、任意に４０〜６５℃の温度範囲で、混合物をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼと接触させることをさらに含んでよい。本方法は、試料を、例えばスペルミジン、スペルミン、及びトリメチレンジアミンから選択されるポリアミンと接触させることをさらに含んでよい。
【０００９】
さらに別の実施態様において本発明は、標的核酸を増幅する方法であって、増幅前に、標的核酸を含有する反応混合物を、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、ここで前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記方法である。本方法は、増幅前に、試料をウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、及び任意に例えばスペルミジン、スペルミン、又はトリメチレンジアミンなどのポリアミンと接触させることをさらに含んでよい。
【００１０】
さらに別の実施態様において本発明は、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤を含む、標的核酸を増幅するためのキットであって、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記キットである。本キットは、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、及び任意に例えばスペルミジン、スペルミン、又はトリメチレンジアミンなどのポリアミンをさらに含んでよい。
【００１１】
さらに別の実施態様において本発明は、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤を含む、標的核酸を増幅するための反応混合物であって、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記反応混合物である。本反応混合物は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、及び任意に例えばスペルミジン、スペルミン、又はトリメチレンジアミンなどのポリアミンをさらに含んでよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、オリゴヌクレオチド配列番号１の推定される２次構造と、配列番号２〜４を形成するためにＴがＵで置換されている位置とを示す。
【図２】図２は、種々の温度における配列番号１〜４の存在下のプライマー伸長の結果を示す。
【図３】図３は、種々の温度における配列番号１〜４の存在下のプライマー伸長の結果を示す。
【図４】図４は、種々の温度における配列番号１〜４の存在下のプライマー伸長の結果を示す。
【図５】図５は、種々の温度における配列番号１〜４の存在下のプライマー伸長の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
用語「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は、標的配列及びプローブを指す。これらの用語は長さにより限定されるのではなく、デオキシリボヌクレオチド（１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、及びプリン又はピリミジン塩基（アデノシン、グアノシン、シチジン、チミジン、及びウリジンを含む）の任意の他のＮ−グリコシド、及びこれらの塩基の修飾物、の線状ポリマーの総称である。
【００１４】
核酸塩基、ヌクレオシド３リン酸、又はヌクレオチドに言及する時、用語「従来型の」又は「天然の」は、記載されているポリヌクレオチド中の天然に存在するものを指す（すなわち、ＤＮＡについて、これらはアデニンすなわちｄＡＴＰ、グアニンすなわちｄＧＴＰ、シトシンすなわちｄＣＴＰ、及びチミンすなわちｄＴＴＰであり、ＲＮＡについて、これらはアデニンすなわちＡＴＰ、グアニンすなわちＧＴＰ、シトシンすなわちＣＴＰ、及びウラシルすなわちＵＴＰである）。
【００１５】
核酸塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドに言及する時、用語「非従来型の」、「非天然の」、又は「修飾された」は、自然界の核酸中には存在せず、従来型の塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドの修飾物、誘導物、又は類似体である核酸塩基、ヌクレオシド、又はヌクレオチドを含む。例えば、ｄＩＴＰ及び７−デアザ−ｄＧＴＰは自然界の核酸中には存在せず、しばしばｄＧＴＰの代わりに使用され、７−デアザ−ｄＡＴＰは、ｄＡＴＰの代わりにインビトロＤＮＡ合成反応（例えば配列決定）で使用することができる。いくつかの非従来型のヌクレオチドは、従来型のｄＮＴＰと比較して、リボース糖の２’位で修飾される。リボヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの基質としての非従来型のヌクレオチドである。本明細書において非従来型のヌクレオチドは、特に限定されないが、核酸配列決定のためのターミネーターとして使用される化合物を含む。ターミネーター化合物の例には、特に限定されないが、２’，３’ジデオキシ構造を有する化合物が挙げられ、ジデオキシヌクレオシド３リン酸、例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ、及びｄｄＧＴＰと呼ばれる。ターミネーター化合物の追加の例は、リボヌクレオチドの２’−ＰＯ4類似体を含む（米国特許第７，９４７，８１７号を参照）。他の非従来型のヌクレオチドには、ホスホロチオエートｄＮＴＰ（［［α］−Ｓ］ｄＮＴＰ）、５’−［α］−ボラノ−ｄＮＴＰ、［α］−メチルホスホネートｄＮＴＰ、及びリボヌクレオシド３リン酸（ｒＮＴＰ）がある。非従来型の塩基は、放射性同位元素、例えば32Ｐ、33Ｐ、又は35Ｓ；蛍光標識物；化学発光標識物；生物発光標識物；ビオチンなどのハプテン標識物；又はストレプトアビジン若しくはアビジンなどの酵素標識物、で標識することができる。蛍光標識物は、フルオレセイン群の色素などの陰性荷電した色素、又はローダミン群の色素などの中性荷電の色素、又はシアニン群などの陽性荷電した色素が挙げられる。フルオレセイン群の色素には、例えばＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、及びＺＯＥが挙げられる。ローダミン群の色素には、例えばテキサスレッド、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、及びＴＡＭＲＡが挙げられる。ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＮＡＮ、ＺＯＥ、ＲＯＸ、Ｒ１１０、Ｒ６Ｇ、テキサスレッド、及びＴＡＭＲＡで標識された種々の色素又はヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, Mass.)、Applied Biosystems (Foster City, Cal.)、又は Invitrogen/Molecular Probes (Eugene, Ore.) から販売されている。シアニン群の色素には、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、及びＣｙ７が挙げられ、例えばGE Healthcare Biosciences (Pittsburgh, Penn.) から販売されている。
【００１６】
用語「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つの核酸モノマー単位（例えばヌクレオチド）を含む核酸ポリマーを指す。オリゴヌクレオチドは典型的には、約６〜約１７５個のヌクレオチド、より一般的には約８〜約７５個のヌクレオチド、例えば約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、又はそれ以上のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの因子に依存するであろう。オリゴヌクレオチドの調製のために多くの方法が存在し、例えば、既存の又は天然の配列の単離、ＤＮＡ複製若しくは増幅、逆転写、クローニング、及び適切な配列の制限消化、又はNarang et al. (Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979) のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979) のホスホジエステル法; Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981) のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191, 1981) のトリエステル法などの方法がある。
【００１７】
用語「プローブ」は、適切な条件下で標的核酸に選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。
【００１８】
用語「標的配列」又は「標的」は、分析すべき核酸配列の領域を指す。
【００１９】
用語「試料」は、核酸を含有するか又は含有すると推定される任意の組成物を指す。これは、個体から単離された組織又は液体の試料、例えば皮膚、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、臓器、骨髄、及び腫瘍（新鮮な又は新鮮凍結した組織及びホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）を含む）を含む試料、及び個体から採取された細胞から樹立されたインビトロ培養物、及びそこから単離された核酸の試料を含む。
【００２０】
用語「アプタマー」は、ＤＮＡポリメラーゼを特異的に認識しこれに結合し、かつ米国特許第５，６９３，５０２号に記載のように、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害するオリゴヌクレオチドを指す。
【００２１】
本発明のＤＮＡポリメラーゼの文脈において用語「変異体」は、対応する天然に存在するか又は修飾されていないＤＮＡポリメラーゼに対して、１つ以上のアミノ酸置換を含む、ポリペプチド、典型的には組み換え体を意味する。
【００２２】
用語「熱安定性ポリメラーゼ」は、高温で安定であり、熱耐性であり、以後のプライマー伸長反応を進めるための充分な活性を保持し、２本鎖核酸の変性を引き起こすのに必要な時間高温に供された時、不可逆的に変性（不活性化）されることがない酵素を指す。好熱性細菌からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼには、例えばサーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス（Thermus）種Ｓｐｓ１７、サーマス（Thermus）種Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、バシルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・ネオポリターナ（Thermotoga  neopolitana）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）が挙げられる。
【００２３】
用語「熱活性」は、ＰＣＲ反応のアニーリングと伸長工程について一般的に使用される温度（すなわち、４５〜８０℃）で、その触媒特性を維持する酵素を指す。熱活性酵素は、熱安定性であっても熱安定性でなくてもよい。熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、特に限定されないが、大腸菌（Escherichia coli）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney murine leukemia viruses）、及びトリ骨髄芽球症ウイルス（Avian myoblastosis virus）を含む、好熱性種又は中温性種由来のＤＮＡ又はＲＮＡでもよい。
【００２４】
ＤＮＡポリメラーゼの文脈において、別の配列（例えば、領域、断片、ヌクレオチド、又は配列中のアミノ酸位置）への「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸の位置に従って番号付けし、次に配列同一性の割合を最大にするように配列を整列させる慣例に基づく。ある「対応する領域」内の必ずしもすべての位置が同一である必要は無いため、対応する領域内の一致しない位置は「対応する位置」と見なすことができる。従って本明細書において、特定のＤＮＡポリメラーゼの「アミノ酸位置［Ｘ］に対応するアミノ酸位置」への言及は、他のＤＮＡポリメラーゼ及びポリメラーゼ群中の、整列に基づく同等の位置を指す。
【００２５】
２種以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において用語「同一の」又は「同一性」又はパーセント同一性は、同じである２種以上の配列又はサブ配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムを使用して、又は用手的整列及び視覚的検査を使用して測定される比較ウィンドウ又は指定領域に対する最大の対応について比較され整列される時、配列が同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセント（例えば、特定の領域に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性）を有する場合、それらの配列は互いに「実質的に同一」である。これらの定義はまた、試験配列の相補体も指す。
【００２６】
２種以上のポリペプチド配列の文脈において用語「類似性」又は「パーセント類似性」は、比較ウィンドウ、又は以下の配列比較アルゴリズムの１つ又は用手的整列や視覚的検査を使用して測定される指定領域に対して、最大の対応性について比較され整列される時、保存的アミノ酸置換により定義されるものと同じであるか又は類似しているアミノ酸残基の特定の割合（例えば、６０％類似性、任意に、特定の領域に対して６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％類似）を有する２種以上の配列又はサブ配列を指す。配列は、互いに少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、又は少なくとも５５％類似である場合、配列は互いに「実質的に類似」である。
【００２７】
本明細書において「比較ウィンドウ」は、２０〜６００、一般的に約５０〜約２００、さらに一般的に約１００〜約１５０からなる群から選択される数の連続的位置の任意の１つのセグメントへの言及を含み、ここで配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続的位置の基準配列と比較される。比較のための配列の整列法は、当該分野で公知である。比較のための配列の最適整列は、例えば、Smith and Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482, 1970) のローカル相同性アルゴリズムにより、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443, 1970) の相同性整列アルゴリズムにより、Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988) の類似性探索法により、又はこれらのアルゴリズムのコンピューター化実行、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴＮ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡにより、又は用手的整列、及び視覚的検査により行われる（例えば Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement) 参照）。
【００２８】
用語「Ｃp値」すなわち「交差点」値、又は「Ｃt値」すなわち「閾値サイクル」値は同義に使用されて、投入した標的核酸の定量を可能にする値を指す。Ｃt値は、例えば２次導関数最大法に従って決定することができる（Van Luu-The et al., (2005), Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction, BioTechniques, 38: 287を参照）。
【００２９】
用語「ＰＣＲ効率」は、完全に一致したプライマー鋳型についてのサイクル対サイクル増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は、各条件について、式：％ＰＣＲ効率＝（１０(-傾き)−１）×１００を使用して算出され、ここで傾きは、ｙ軸上にプロットされた対数コピー数とｘ軸上にプロットされたＣtを用いて線形回帰により算出される。
【００３０】
本発明は、オリゴヌクレオチドの形態を有するＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害剤を含む。具体的にはこのオリゴヌクレオチドは、１つ以上のデオキシウリジン（ｄＵ）ヌクレオチドを含むＤＮＡオリゴヌクレオチドである（すなわち、デオキシリボヌクレオチドから成る）（ｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチド）である。このオリゴヌクレオチドの配列は、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を含む２次構造の形成を可能にする。このオリゴヌクレオチドは、例えばＰＣＲ混合物などの典型的な反応混合物中で、周囲温度条件下で、安定な２次構造を形成する。本発明において１つ以上のウラシルは、２本鎖２次構造の領域内に配置される。本発明のオリゴヌクレオチドの阻害特性は、正確なヌクレオチド配列に依存するのではなく、その構造の配列によって形成される２次構造のコンフォメーション、すなわち形状及び融解温度（Ｔm）に依存する。Ｔmよりも低い温度例えば周囲温度で、典型的な反応混合物中では、このオリゴヌクレオチドが取る形状は、これがオリゴヌクレオチド−酵素複合体を形成することを可能にする。このオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド−酵素複合体中で酵素に結合しながら、可逆的にポリメラーゼ酵素を阻害する。
【００３１】
非天然のヌクレオチドの導入は、オリゴヌクレオチドにより形成される２次構造の形成とＴm（従って安定性）に影響を与え、従ってその阻害特性に影響を与えることができる。このためにＤＮＡオリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、非従来型の塩基を有するヌクレオチド、非ヌクレオチドリンカー、又はこれらの組合せを含有するように修飾されている（例えば、阻害剤オリゴヌクレオチド中のこのような非天然のヌクレオチドの説明については、米国特許第６，１８３，６７９号を参照）。当業者は、特定の酵素に適した溶融温度と形状を有する阻害剤オリゴヌクレオチド（本発明のｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドを含む）を設計することができる。
【００３２】
いくつかの実施態様において、このｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは、既存のアプタマーＮＴＱ２１−４６Ａ（Ｕ０とも呼ばれる）（配列番号１）：
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3'
中の１つ以上のチミンをウラシルで置換することにより設計される。
【００３３】
この実施態様の変更態様において、ｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは以下の１つである：
【００３４】
Ｕ１ (配列番号２)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3'
Ｕ２ (配列番号３)
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3'
Ｕ３ (配列番号４)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3'.
【００３５】
アプタマーＮＴＱ２１−４６Ａ（Ｕ０）、及びＵ１、Ｕ２、及びＵ３の推定される２次構造は、図１に示される。
【００３６】
当業者は、オリゴヌクレオチド例えば配列番号１内の、又は別の公知の新規阻害剤オリゴヌクレオチドの配列中の、任意の他の位置で、チミンをウラシルにより置換することにより、又はウラシルを導入することにより、同様のｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドを容易に設計することができる。
【００３７】
後述の例は、サーマス（Thermus）種Ｚ０５（国際公開第ＷＯ１９９２／０６２００号）からのＤＮＡポリメラーゼを可逆的に阻害するための、本発明の方法の応用を記載する。しかし、この方法は他のＤＮＡポリメラーゼに等しく適用可能である。Ｘ線結晶構造の解析は、種々の生物からのＤＮＡポリメラーゼが、同様の３次元構造に折り畳まれることを証明した。ＤＮＡポリメラーゼの全体の折り畳みパターンは、ヒトの右手に似ており、「パーム (palm)」、「フィンガー (fingers)」、及び「サム (thumb)」とよぶ３つの異なるサブドメインを含有する（Beese et al., (1993), Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA, Science 260: 352; Patel et al., (1995), Insights into DNA polymerization mechanisms from structure and function analysis of HIV-1 reverse transcriptase, Biochemistry 34: 5351を参照）。フィンガー及びサムサブドメインの構造は、サイズや細胞機能が異なるポリメラーゼ間で大きく変動し、触媒性のパームサブドメインはすべて重ね合わせることができる。例えば、入ってくるｄＮＴＰと相互作用し化学触媒反応中に遷移状態を安定化させるモチーフＡは、約１Åの平均偏差で、哺乳動物ｐｏｌαと原核生物ｐｏｌＩ群のＤＮＡポリメラーゼ間で重ね合わせることができる（Wang et al., (1997), Crystal structure of a pol alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69, Cell 89: 1087）。ＤＮＡポリメラーゼの活性部位の１次アミノ酸配列は、例外的に保存されている。モチーフＡの場合、配列ＤＹＳＱＩＥＬＲ（配列番号６）は、数百万年の進化により分離された生物（例えば、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）、及び大腸菌（Escherichia coli）を含む）からのポリメラーゼで保持されている。
【００３８】
いくつかの実施態様において、本発明に係るＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドを設計することができ、ここに開示されたオリゴヌクレオチド配列は、他の熱安定性又は熱活性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス（Thermus）種Ｓｐｓ１７、サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、バシルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・ネオポリターナ（Thermotoga  neopolitana）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）からのＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらと少なくとも９５％同一である同様のＤＮＡポリメラーゼを、同様に可逆的に阻害するように、使用することができ、さらに最適化することができる。
【００３９】
さらに一般的には、本発明に係るＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは、他の熱安定性又は熱活性酵素、例えばリガーゼ、ヘリカーゼ、及びヌクレアーゼ（ＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性を含む）を同様に可逆的に阻害するように設計することができる。このような酵素の可逆的オリゴヌクレオチド阻害剤は、例えば米国特許第８，４７０，５３１号に記載されている。これらのオリゴヌクレオチド阻害剤は、本発明のＵ含有オリゴヌクレオチド阻害剤に変化させて、本明細書に記載の改良された特性から利益を得ることができる。
【００４０】
いくつかの実施態様において本発明は、核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤を設計する方法であって、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計することを含み、ここで、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記方法である。
【００４１】
本発明のＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは、米国特許第６，１８３，６７９号に記載されたインビトロの選択法である指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）を使用して、設計し最適化することができる。簡単に説明するとＳＥＬＥＸ法においては、異なる配列を有するオリゴヌクレオチドの混合物は、標的、例えば酵素と接触させられる。標的に対して最大親和性を有する少数のオリゴヌクレオチドが同定されるまで、標的に結合するオリゴヌクレオチドの混合物は分割され、増幅され、更なる選択操作に供される。
【００４２】
本発明のＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは、任意の適切な方法、例えばNarang et al. (Meth. Enzymol. 68: 90-99, 1979) のホスホトリエステル法；Brown et al. (Meth. Enzymol. 68: 109-151, 1979) のホスホジエステル法; Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981) のジエチルホスホルアミダイト法；Beaucage et al. (1981), Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862のジエチルホスホルアミダイト法；Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103: 3185-3191, 1981) のトリエステル法；自動合成法の任意の１つ；又は米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの化学合成により、調製することができる。
【００４３】
いくつかの実施態様において、Ｕ含有阻害剤オリゴヌクレオチドの３’末端は、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長を防ぐためにブロックされる。いくつかの実施態様においてブロッキング基（化学的成分）は、オリゴヌクレオチド中の末端３’−ＯＨ又は２’−ＯＨに付加される。ブロッキング基のいくつかの非限定例には、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスフェート基、ホスホチオエート基、アルカン−ジオール成分、又はアミノ基が挙げられる。他の例では、３’−ヒドロキシル基は、水素をフッ素で置換することにより、又はエステル、アミド、硫酸塩、又はグリコシドの形成により修飾される。さらに別の例において、３’−ＯＨ基は（ジデオキシヌクレオチドを形成するために）水素で置換される。
【００４４】
他の実施態様において本発明は、ｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドによるＤＮＡポリメラーゼの阻害を修飾する方法である。本発明のオリゴヌクレオチドはウラシルを含有する。ＤＮＡ配列中のウラシルの存在は、このオリゴヌクレオチドをウラシルＤＮＡポリメラーゼの標的とする。これらの酵素は、１本鎖又は２本鎖ＤＮＡ中に存在するウラシルを認識し、ウラシル塩基とデオキシリボースとの間のＮ−グリコシド結合を切断し、非塩基部位を残す。例えば米国特許第６，７１３，２９４号を参照。「ＵＤＧ」又は「ＵＮＧ」と略されるウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、ＵＮＧ（ＥＣ３．２．２．２．３）、ミトコンドリアＵＮＧ１、核ＵＮＧ２、ＳＭＵＧ１（１本鎖選択的ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）、ＴＤＧ（ＴＵミスマッチＤＮＡグリコシラーゼ）、ＭＢＤ４（メチル結合ドメインを有するウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）、及び他の真核生物及び原核生物酵素を含む（Krokan H. E. et al. (2002), Uracil in DNA--occurrence, consequences and repair, Oncogene 21: 8935-9232を参照）。
【００４５】
従って本発明の方法において、反応混合物は、その２次構造を解明し、オリゴヌクレオチド−酵素複合体中の酵素の阻害を排除するために阻害性オリゴヌクレオチドのＴmを超える温度に加熱する必要は無い。その代わり、本発明のＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドを含有する反応混合物は、例えばＵＮＧなどのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼの１つに接触させられる。便利なことに、ＵＮＧは標準的ＰＣＲ反応混合物中で活性である。これは、組み立てられたＰＣＲ反応物に又はさらにはＰＣＲマスターミックスにＵＮＧを付加することを可能にする。熱サイクリングの開始前に、反応混合物は、ＰＣＲマスターミックスの文脈内のＵＮＧ活性に最適な温度（約５０℃）で、又はＵＮＧが活性な場合の温度範囲内で、インキュベートされる。ＵＮＧは、ｄＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチド中のウラシルを切断除去して、非塩基部位を残すであろう。非塩基部位を有するＤＮＡの骨格は、特に高温で、高ｐＨ条件下で不安定であることは知られている。本発明において、ＵＮＧ切断により得られる１つ以上のウラシル及び１つ以上の非塩基部位は、２本鎖２次構造の領域に位置し、この構造は、切断と以後の骨格切断により明らかになるであろう。
【００４６】
いくつかの実施態様において、本方法は、反応混合物を、ポリアミン、例えば米国特許出願第２０１０／００９３０４１号に記載されたスペルミジン、スペルミン、又はトリメチレンジアミンと接触させることをさらに含む。いくつかの実施態様においてポリアミンは、挿入剤（intercalator）アミンである。この群のポリアミンは、核酸中の塩基対間又は塩基間に挿入することができる挿入成分を有する。ポリアミン上の挿入成分の例は、アレーン類及びポリアレーン類、例えばナフタレン及びアントラキノンを含む。いくつかの実施態様において挿入剤成分自体はまた、１つ以上のポリアミン側鎖で置換してもよい。ポリアミンの付加は、ＵＮＧ切断から生じる非塩基ＤＮＡの分解を促進することが証明されている。具体的には５０℃で、この分解は１０００倍改善される。
【００４７】
本発明の方法において、Ｕ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは、以前記載されたオリゴヌクレオチド阻害剤より低い温度で、安定な２次構造から解明された構造に変換することができる。この特徴は、酵素阻害を排除するのに必要な温度で典型的な反応混合物中で不安定であるＲＮＡ鋳型を含む反応混合物及び方法にとって、特に有益である。低温での阻害を排除することは、利用可能な鋳型の量を増加させることにより、ＲＴ−ＰＣＲの逆転写工程の効率を上昇させるであろう。
【００４８】
一般に、本発明のＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼの可逆的阻害が望ましい任意の方法で使用することができる。例えば、このオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ又はＲＮＡ増幅、逆転写、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、又はプライマー伸長で、例えば単一ヌクレオチドプライマー伸長による単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出において、使用することができる。
【００４９】
いくつかの実施態様において本発明は、反応混合物（任意に、ＤＮＡポリメラーゼ以外のＰＣＲのすべての成分を含むＰＣＲ反応混合物）中の試料を、ＤＮＡポリメラーゼ及びＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドの形態のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤と接触させることを含む、標的核酸配列の増幅と任意の検出の方法である。この態様の変更態様において本方法は、反応混合物を、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ酵素と接触させ、インキュベートすることをさらに含む。この実施態様の変更態様において本方法は、反応混合物を、任意にスペルミジン、スペルミン、又はトリメチレンジアミンから選択されるポリアミンとともに、同時に又は以後インキュベートすることをさらに含む。インキュベーションは、４０〜６５℃、又は４０、４５、５０、５５、６０、又は６５℃の任意の１つ、又はこれらの間の任意の温度、例えば５０℃で行うことができる。この方法はさらに、ＰＣＲによる標的核酸の増幅及び任意の検出を含む。
【００５０】
さらに別の実施態様において本発明は、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである本発明のＵ含有阻害剤オリゴヌクレオチドを含む、核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤を含有する標的核酸を増幅するための反応混合物であって、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記反応混合物である。この反応混合物は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、例えばＵＮＧをさらに含む。この反応混合物は好ましくは、任意にスペルミジン、スペルミン、又はトリメチレンジアミンから選択されるポリアミンをさらに含有する。この実施態様の更なる変更態様において、本キットはまた、特に限定されないが、核酸前駆体（ｄＮＴＰ又はＮＴＰ）、ポリメラーゼ酵素、オリゴヌクレオチド（プライマー及び任意にプローブ）、及び酵素の活性を支持するのに適した緩衝剤を含む、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲのための試薬を含む。いくつかの実施態様において、標的核酸はＲＮＡである。いくつかの実施態様においてポリメラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス（Thermus）種Ｓｐｓ１７、サーマス（Thermus）種Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、バシルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・ネオポリターナ（Thermotoga  neopolitana）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）からのＤＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施態様において、ポリメラーゼは、サーマス（Thermus）種Ｚ０５又はサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）からのＤＮＡポリメラーゼである。
【００５１】
さらに別の実施態様において本発明は、２本鎖２次構造の１つ以上の領域を有する１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである本発明の阻害剤オリゴヌクレオチドを含む、核酸ポリメラーゼの可逆的阻害剤を含む標的核酸を増幅するためのキットであって、前記領域の少なくとも１つが少なくとも１つのウラシル塩基を含む、前記キットである。本キットは、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ、例えばＵＮＧをさらに含む。本キットは好ましくは、任意にスペルミジン、スペルミン、及びトリメチレンジアミンから選択されるポリアミンをさらに含有する。この実施態様の更なる変更態様において、本キットはまた、特に限定されないが、核酸前駆体（ｄＮＴＰ又はＮＴＰ）、ポリメラーゼ酵素、オリゴヌクレオチド（プライマー及び任意にプローブ）、及び酵素の活性を支持するのに適した緩衝剤を含む、ＰＣＲ又はＲＴ−ＰＣＲのための試薬を含む。いくつかの実施態様においてポリメラーゼは、サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、サーマス・アクアチカス（Thermus aquaticus）、サーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）、サーマス・フラブス（Thermus flavus）、サーマス・フィリフォルミス（Thermus filiformis）、サーマス（Thermus）種Ｓｐｓ１７、サーマス（Thermus）種Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス（Thermus caldophilus）、バシルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax）、サーモトガ・ネオポリターナ（Thermotoga  neopolitana）、及びサーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）からのＤＮＡポリメラーゼから選択される。いくつかの実施態様において、ポリメラーゼは、サーマス（Thermus）種Ｚ０５又はサーマス・サーモフィルス（Thermus thermophilus）からのＤＮＡポリメラーゼである。
【実施例】
【００５２】
実施例１
Ｕ含有阻害剤オリゴヌクレオチド（Ｕ−アプタマー）の設計
既存のアプタマーＮＴＱ２１−４６Ａ（Ｕ０）（配列番号１）：
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTATGATCG-3'
をｄＵをｄＴで置換することにより修飾して、以下のＵ−アプタマーを作成した：
【００５３】
Ｕ１ (配列番号２)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTTGTTCTTGTGTAUGAUCG-3'
【００５４】
Ｕ２ (配列番号３)
5’-CGATCATCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTATGATCG-3'
【００５５】
Ｕ３ (配列番号４)
5’-CGAUCAUCTCAGAACATTCTTAGCGTTTUGUUCUUGTGTAUGAUCG-3'
【００５６】
これらのアプタマーの推定された２次構造は図１に示される。
【００５７】
実施例２
Ｕ−アプタマーの溶融温度の測定
Ｕ０、Ｕ１、Ｕ２、及びＵ３アプタマー（配列番号１、２、３、及び４）の溶融温度を、５０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．５×のSYBR（登録商標）Green I（Molecular Probes  (Life Technologies、Inc.) Carlsbad、Cal.)、２０ｎＭ  ＤＮＡポリメラーゼＺ０５−Ｄ（記載される場合）、及び０．２μＭのアプタマーの１つ、を含有する反応混合物中で測定した。溶融曲線分析を、製造業者の説明書に従ってLIghtCycler（登録商標）480（Roche Molecular Diagnostics, Indianapolis, Ind.）で行なった。結果は表１に示される。これらの結果は、ＴをＵで置換することは、オリゴヌクレオチド２次構造の溶融温度を低下させることを示す。
【表１】
0006608826.tif 000002
【００５８】
実施例３
ＵＮＧの存在下でのＵ−アプタマーの溶融温度の測定
Ｕ０、Ｕ１、Ｕ２、及びＵ３アプタマー（配列番号１、２、３、及び４）の溶融温度を、０．５Ｕ／μｌのＵＮＧを添加したと記載されている場合以外は、実施例１に記載の反応混合物中で測定した。ＵＮＧ切断を可能にするために、すべての反応混合物を３７℃でインキュベート後、溶融曲線分析を行なった。結果は表２に示される。結果は、ＴをＵで置換し次にＵＮＧで切断することが、オリゴヌクレオチド２次構造の溶融温度を実質的に低下させることを示す。
【表２】
0006608826.tif 000003
【００５９】
実施例４
異なる温度におけるＵ−アプタマーとＵＮＧの存在下でのプライマー伸長
オリゴヌクレオチド阻害剤の存在下のＤＮＡポリメラーゼ活性を、種々の濃度のＵ０、Ｕ１、Ｕ２、又はＵ３アプタマー（配列番号１、２、３、及び４）の存在下のプライマー伸長により測定した。このアッセイは、以下の配列（配列番号５）を有するオリゴヌクレオチドでプライムしたＭ１３  ｍｐ１８  １本鎖ＤＮＡ（M13；GenBank Accession No. X02513）を使用して行なった：
5'-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC-3'。
【００６０】
９６ウェルＰＣＲプレート中で、１ｎＭのプライムされたＭ１３鋳型を含有する反応マスターミックス１２．５μｌに、１２．５μｌのＭｇＣｌ2を添加して反応を開始した。プライムされた鋳型の伸長は、LightCycler（登録商標）480サーマルサイクラーで記載の温度で、６秒毎に９９サイクル追跡した。マスターミックスは、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、４つのｄＮＴＰすべての混合物、２０ｎＭのＺ０５−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．５×のSYBR（登録商標）Green I（Life Technologies, Carlsbad, Cal.）を含有し、これはプライマー鎖伸長の蛍光検出を可能にした。Ｚ０５−Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼに対してアプタマーが０、２．５、１０、又は１００×モル過剰で存在することを確実にするために、試験したアプタマーの濃度範囲は、０、５０、２００、２０００ｎＭであった（図２〜５中の図の凡例を参照）。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、線形範囲で蛍光の経時的上昇の傾きを測定することにより定量した。相対活性は、各温度でアプタマーの非存在下で行われたすべての反応の平均傾きに標準化することにより算出した。結果は図２〜５に示される。結果は、ＵＮＧの添加が、特にＵ３についてＤＮＡポリメラーゼのアプタマー阻害を劇的に低下させることを示す。
【００６１】
実施例５
Ｕ−アプタマーとＵＮＧの存在下のＫＲＡＳコドン１２標的のリアルタイムＰＣＲ増幅
本例では、種々の濃度のＵ０、Ｕ１、Ｕ２、又はＵ３アプタマー（配列番号１、２、３、及び４）の存在下で、ヒトＤＮＡ中のＫＲＡＳ標的の増幅が行われる。ＫＲＡＳ標的の性質は、これを、プライマーダイマー化と非特異的増幅を特に受けやすいものにしている。ホットスタートが無い場合、非特異的増幅は、標的の濃度の差をあいまいにし、定量分析を不可能にする。本例では、ＫＲＡＳ標的の連続１０倍希釈物を加えて、本方法の定量範囲と特異性を評価した。増幅は、３ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭトリシン、ｐＨ８．０、５５ｍＭ酢酸カリウム、各２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＧＴＰ、３００μＭ  ｄＵＴＰ、３０μＭ  ｄＴＴＰ、２０ｎＭのＺ０５ＤＮＡポリメラーゼ、及び０．２×のSYBR（登録商標）Green I (Life Technologies, Carlsbad, Cal.)、及び記載される場合ＵＮＧを含有する反応混合物中で行なった。LightCycler装置の温度プロフィールは、９５℃で１５秒、５０、５５、又は６０℃で４０秒を５０サイクル行なった。増幅は、種々の濃度のＵ０、Ｕ１、Ｕ２、又はＵ３アプタマー（配列番号１、２、３、及び４）の存在下でＣt値を測定することにより検出した。Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼに対してアプタマーが０、１０、１００、又は２００×モル過剰で存在することを確実にするために、試験したアプタマーの濃度範囲は、０、２００、１０００、及び２０００ｎＭであった。結果は表３〜６に示される。
【表３】
0006608826.tif 000004
【表４】
0006608826.tif 000005
【００６２】
表３〜４の結果は、Ｃt値に基づき、６０℃でＵＮＧの非存在下では、濃度を測定するにはアプタマーが必要であることを示し、Ｕ含有アプタマー（配列番号２、３、及び４）が、親アプタマー（配列番号１）と同様の挙動をすることを示す。
【表５】
0006608826.tif 000006
【表６】
0006608826.tif 000007
【００６３】
表５〜６の結果は、低いアニーリング温度と上昇したアプタマー濃度では、低いＣt値により示されるように、ＵＮＧの添加が、ＤＮＡポリメラーゼのｄＵ含有アプタマー阻害を、特にＵ３について劇的に低下させることを示す。
【００６４】
実施例６
Ｕ−アプタマーとＵＮＧの存在下のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅
本例では、実施例５に記載されたように、標準的ＰＣＲ条件下で、ＵＮＧを含有する反応混合物中で、種々の濃度のＵ０、Ｕ１、Ｕ２、又はＵ３アプタマー（配列番号１、２、３、及び４）の存在下で、ＲＮＡ標的（ＨＶＣ  ＪＰ２〜５、反応毎に１０００コピー）の増幅を行なった。試験したアプタマーの濃度範囲は、Ｚ０５  ＤＮＡポリメラーゼに対して０、１００倍、及び２００倍モル過剰であった。結果は表７に示される。
【表７】
0006608826.tif 000008
【００６５】
表７の結果は、低いアニーリング温度（例えば５５℃）では、低いＣt値により示されるように、ＵＮＧの存在下のｄＵ含有アプタマーがＤＮＡポリメラーゼの阻害を低下させたことを、示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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