(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の反応の（経路１）から（経路１０）を触媒する各酵素を発現し、グルコースから1,4-ブタンジオールを生成することができる、遺伝子組換え微生物：
（経路１）グルコキナーゼ、
（経路２）イノシトール-3-リン酸シンターゼ、
（経路３）イノシトールリン酸ホスファターゼ、
（経路４）ミオイノシトールオキシゲナーゼ、
（経路５）ウロン酸デヒロドゲナーゼ、
（経路６）グルカル酸デヒドラターゼ、
（経路７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ、
（経路８）アルコールデヒドロゲナーゼ、
（経路９）デカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）アルコールデヒドロゲナーゼ：
[反応]
0006622564.tif 000037
。
【請求項２】
以下の反応の（経路１）から（経路１０）を触媒する国際酵素分類により特定された各酵素を発現し、グルコースから1,4-ブタンジオールを生成することができる、遺伝子組換え微生物：
（経路１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.2に分類されるグルコキナーゼ、
（経路２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（経路３）国際酵素分類においてEC: 3.1.3.25に分類されるホスファターゼ、
（経路４）国際酵素分類においてEC: 1.13.99.1に分類されるオキシゲナーゼ、
（経路５）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.203に分類されるデヒドロゲナーゼ、
（経路６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.40に分類されるデヒドラターゼ、
（経路７）国際酵素分類においてEC: 4.2.1.41に分類されるデヒドラターゼ、
（経路８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.74に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ：
[反応]
0006622564.tif 000038
。
【請求項３】
以下の酵素１〜酵素１０を発現する、遺伝子組換え微生物：
グルコキナーゼ活性を有する酵素１が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：1に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：2に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性を有する酵素２が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：3に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：4に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
イノシトールリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素３が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：5に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：6に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有する酵素４が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：7に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：8に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
ウロン酸デヒロドゲナーゼ活性を有する酵素５が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：9に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：10に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素６が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：11に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：12に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素７が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：13に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：14に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素８が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
デカルボキシラーゼ活性を有する酵素９が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：17又は19に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、又は、
（ｄ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素１０が、以下からなる群から選択される：
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体。
【請求項４】
微生物が、以下からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の微生物：
エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ピキア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属、ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、及びトリコデルマ（Trichoderma）属。
【請求項５】
（工程１）グルコースからグルコース−6リン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000039
（工程２）グルコース−6リン酸からmyo-イノシトール-3リン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000040
（工程３）myo-イノシトール-3リン酸からmyo-イノシトールを生成する工程：
0006622564.tif 000041
（工程４）myo-イノシトールからグルクロン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000042
（工程５）グルクロン酸からグルカル酸を生成する工程：
0006622564.tif 000043
（工程６）グルカル酸から5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸を生成する工程：
0006622564.tif 000044
（工程７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸から2-オキソグルタル酸セミアルデヒドを生成する工程：
0006622564.tif 000045
（工程８）2-オキソグルタル酸セミアルデヒドから2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000046
（工程９）2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸から4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドを生成する工程：
0006622564.tif 000047
（工程１０）4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドから1,4-ブタンジオールを生成する工程：
0006622564.tif 000048
からなる、グルコースから1,4-ブタンジオールを生産する方法であって、（工程１）〜（工程１０）の各工程が、以下の酵素により触媒される方法：
（工程１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.2に分類されるグルコキナーゼ、
（工程２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（工程３）国際酵素分類においてEC: 3.1.3.25に分類されるホスファターゼ、
（工程４）国際酵素分類においてEC: 1.13.99.1に分類されるオキシゲナーゼ、
（工程５）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.203に分類されるデヒドロゲナーゼ、
（工程６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.40に分類されるデヒドラターゼ、
（工程７）国際酵素分類においてEC: 4.2.1.41に分類されるデヒドラターゼ、
（工程８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.74に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（工程１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
【請求項６】
（工程１）〜（工程１０）を触媒する各酵素が、以下に特定されるものである、請求項５記載の方法：
（工程１）を触媒する、グルコキナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：1に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：2に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程２）を触媒する、イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：3に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：4に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程３）を触媒する、イノシトールリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：5に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：6に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程４）を触媒する、ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：7に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：8に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程５）を触媒する、ウロン酸デヒロドゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：9に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：10に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程６）を触媒する、グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：11に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：12に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程７）を触媒する、5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：13に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：14に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程８）を触媒する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程９）を触媒する、デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：17又は19に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程１０）を触媒する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択される、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｄ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と９０%以上の同一性を有するタンパク質誘導体。
【請求項７】
グルコースと請求項１〜４のいずれか一項記載の微生物とを混合し、該微生物を培養する工程を含む、1,4-ブタンジオールを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は1,4ブタンジオール生産能を付与された遺伝子組換え微生物を用いた1,4-ブタンジオールの製造方法に関する。より具体的にはグルコースから1,4-ブタンジオール合成する生合成能を付与した微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
1,4-ブタンジオールは繊維、エンプラ、フィルムなどの利用価値のあるポリエチレンテレフタレートに代表されるポリエステル及びポリウレタンの製造に使用されるモノマーとして、また環状化合物の合成用出発原料としてテトラヒドロフランやγ-ブチロラクトンの製造など、広範囲な用途を有する化合物である。
【０００３】
1,4-ブタンジオールの製造方法としては、化学合成による方法が知られている。アセチレンを原料に1,4−ブチンジオール合成し、水素化させることで1,4-ブタンジオールを生産する方法とブタジエンを原料に生産する方法などが挙げられる。デメリットとして化学合成法では高温高圧設備が必要であり、原料として化石資源に依存するため、資源枯渇による原料高騰の恐れがある。
【０００４】
近年、化石資源の枯渇問題や地球温暖化問題の観点から、再生可能資源としてバイオマス(植物資源)由来の原料からの化学品・エネルギー生産体系の確立に対して社会的に需要が高まってきている。
【０００５】
バイオマス由来の原料を用いた生物学的な手法としては、遺伝子組換え微生物によるグルコースから宿主由来の代謝ルートを一部利用し、CoA中間体を経由して1,4-ブタンジオールを生産する方法が知られている（特許文献１）。
【０００６】
しかし、これまでにバイオマス由来の原料から1,4−ブタンジオールを製造した報告は少なく、特許文献1の手法においても、デメリットとしては宿主由来の代謝ルートの利用によりCoA中間体を経由するため、反応ステップも多く生産制御が難しいと予想される。そこで、さらに新規なバイオマスなどの再生可能資源からの1,4−ブタンジオールのより効率的な製造方法が望まれていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2011/066076
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、バイオマス（植物資源）の再生可能資源を原料とし、1,4−ブタンジオールを生産することができる微生物の提供を課題とする。また本発明は、目的の機能を有する微生物を用いて1,4−ブタンジオールを製造できる方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
再生可能資源であるバイオマスを原料として1,4−ブタンジオールを製造するための方法を開発することを目的として、本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、グルコキナーゼ遺伝子、イノシトール-3-リン酸シンターゼ遺伝子、イノシトールリン酸ホスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子、ウロン酸デヒロドゲナーゼ遺伝子、グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子、5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、デカルボキシラーゼ遺伝子を保有する遺伝子組換え微生物を作製し、当該遺伝子組換え微生物による発酵でグルコースからケト酸中間体を経由する人工代謝経路で1,4-ブタンジオールを製造できることに成功した。具体的には、以下に示される経路を経ることにより、グルコースから1,4−ブタンジオールを製造することに成功した。
（経路１）グルコースからグルコース−6リン酸
0006622564.tif 000002
（経路２）グルコース−6リン酸からmyo-イノシトール-3リン酸
0006622564.tif 000003
（経路３）myo-イノシトール-3リン酸からmyo-イノシトール
0006622564.tif 000004
（経路４）myo-イノシトールからグルクロン酸
0006622564.tif 000005
（経路５）グルクロン酸からグルカル酸
0006622564.tif 000006
（経路６）グルカル酸から5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸
0006622564.tif 000007
（経路７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸から2-オキソグルタル酸セミアルデヒド
0006622564.tif 000008
（経路８）2-オキソグルタル酸セミアルデヒドから2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸
0006622564.tif 000009
（経路９）2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸から4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒド
0006622564.tif 000010
（経路１０）4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドから1,4-ブタンジオール
0006622564.tif 000011
。
【００１０】
本発明者らは以上の知見により、微生物が有する代謝産物である酵素群を利用して、上記酵素を含む微生物において1,4-ブタンジオールを生成することに成功し、これにより本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち、本発明は、1,4-ブタンジオール生産微生物を提供する。あるいは本発明は、当該微生物を用いた1,4-ブタンジオールの効率的な生産方法を提供するものであり、具体的には、以下の〔１〕〜〔１０〕を提供する。
〔１〕以下の反応の（経路１）から（経路１０）を触媒する各酵素を発現し、グルコースから1,4-ブタンジオールを生成することができる、遺伝子組換え微生物：
（経路１）グルコキナーゼ、
（経路２）イノシトール-3-リン酸シンターゼ、
（経路３）イノシトールリン酸ホスファターゼ、
（経路４）ミオイノシトールオキシゲナーゼ、
（経路５）ウロン酸デヒロドゲナーゼ、
（経路６）グルカル酸デヒドラターゼ、
（経路７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ、
（経路８）アルコールデヒドロゲナーゼ、
（経路９）デカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）アルコールデヒドロゲナーゼ。
[反応]
0006622564.tif 000012
〔２〕以下の反応の（経路１）から（経路１０）を触媒する国際酵素分類により特定された各酵素を発現し、グルコースから1,4-ブタンジオールを生成することができる、遺伝子組換え微生物：
（経路１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.-に分類されるグルコキナーゼ、
（経路２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（経路３）国際酵素分類においてEC:3.1.3.-に分類されるホスファターゼ、
（経路４）国際酵素分類においてEC:1.13.-.-に分類されるオキシゲナーゼ、
（経路５）国際酵素分類においてEC:1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（経路７）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（経路８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.-に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ：
[反応]
0006622564.tif 000013
。
〔３〕各酵素が、以下に特定される、〔２〕記載の遺伝子組換え微生物：
（経路１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.2に分類されるグルコキナーゼ、
（経路２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（経路３）国際酵素分類においてEC: 3.1.3.25に分類されるホスファターゼ、
（経路４）国際酵素分類においてEC: 1.13.99.1に分類されるオキシゲナーゼ、
（経路５）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.203に分類されるデヒドロゲナーゼ、
（経路６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.40に分類されるデヒドラターゼ、
（経路７）国際酵素分類においてEC: 4.2.1.41に分類されるデヒドラターゼ、
（経路８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.74に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
〔４〕以下の酵素１〜酵素１０を発現する、遺伝子組換え微生物：
グルコキナーゼ活性を有する酵素１が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：1に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：2に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：2に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性を有する酵素２が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：3に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：4に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：4に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
イノシトールリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素３が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：5に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：6に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：6に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有する酵素４が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：7に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：8に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：8に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
ウロン酸デヒロドゲナーゼ活性を有する酵素５が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：9に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：10に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：10に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素６が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：11に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：12に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：12に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素７が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：13に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：14に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：14に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素８が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
デカルボキシラーゼ活性を有する酵素９が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：17又は19に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、又は、
（ｅ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素１０が、以下からなる群から選択される：
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体。
〔５〕微生物が、以下からなる群から選択される、〔１〕〜〔４〕のいずれか記載の微生物：
エシェリヒア（Escherichia）属、バチルス（Bacillus）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、セラチア（Serratia）属、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属、コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロドコッカス（Rhodococcus）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、サッカロマイセス（Saccharomyces）属、クライベロマイセス（Kluyveromyces）属、シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属、チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属、ヤロウイア（Yarrowia）属、トリコスポロン（Trichosporon）属、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属、ピキア（Pichia）属、キャンディダ（Candida）属、ノイロスポラ（Neurospora）属、アスペルギルス（Aspergillus）属、セファロスポリウム（Cephalosporium）属、及びトリコデルマ（Trichoderma）属。
〔６〕以下の工程からなる、グルコースから1,4-ブタンジオールを生産する方法：
（工程１）グルコースからグルコース−6リン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000014
（工程２）グルコース−6リン酸からmyo-イノシトール-3リン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000015
（工程３）myo-イノシトール-3リン酸からmyo-イノシトールを生成する工程：
0006622564.tif 000016
（工程４）myo-イノシトールからグルクロン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000017
（工程５）グルクロン酸からグルカル酸を生成する工程：
0006622564.tif 000018
（工程６）グルカル酸から5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸を生成する工程：
0006622564.tif 000019
（工程７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸から2-オキソグルタル酸セミアルデヒドを生成する工程：
0006622564.tif 000020
（工程８）2-オキソグルタル酸セミアルデヒドから2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000021
（工程９）2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸から4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドを生成する工程：
0006622564.tif 000022
（工程１０）4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドから1,4-ブタンジオールを生成する工程：
0006622564.tif 000023
。
〔７〕〔６〕記載の（工程１）〜（工程１０）の各工程が、以下の酵素により触媒される、グルコースから1,4-ブタンジオールを生産する方法：
（工程１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.-に分類されるグルコキナーゼ、
（工程２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（工程３）国際酵素分類においてEC:3.1.3.-に分類されるホスファターゼ、
（工程４）国際酵素分類においてEC:1.13.-.-に分類されるオキシゲナーゼ、
（工程５）国際酵素分類においてEC:1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（工程７）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（工程８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.-に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（工程１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
〔８〕（工程１）〜（工程１０）の各工程が、以下の酵素により触媒される、〔７〕記載の方法：
（工程１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.2に分類されるグルコキナーゼ、
（工程２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（工程３）国際酵素分類においてEC: 3.1.3.25に分類されるホスファターゼ、
（工程４）国際酵素分類においてEC: 1.13.99.1に分類されるオキシゲナーゼ、
（工程５）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.203に分類されるデヒドロゲナーゼ、
（工程６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.40に分類されるデヒドラターゼ、
（工程７）国際酵素分類においてEC: 4.2.1.41に分類されるデヒドラターゼ、
（工程８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.74に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（工程１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
〔９〕（工程１）〜（工程１０）を触媒する各酵素が、以下に特定されるものである、〔６〕記載の方法：
（工程１）を触媒する、グルコキナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：1に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：2に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：2に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程２）を触媒する、イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：3に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：4に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：4に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程３）を触媒する、イノシトールリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：5に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：6に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：6に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程４）を触媒する、ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：7に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：8に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：8に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程５）を触媒する、ウロン酸デヒロドゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：9に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：10に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：10に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程６）を触媒する、グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：11に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：12に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：12に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程７）を触媒する、5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：13に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：14に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：14に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程８）を触媒する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程９）を触媒する、デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：17又は19に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程１０）を触媒する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択される、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体。
〔１０〕グルコースと〔１〕〜〔５〕のいずれか記載の微生物とを混合し、該微生物を培養する工程を含む、1,4-ブタンジオールを生産する方法。
【００１２】
なお、上述の〔３〕及び〔８〕における（経路８）及び(経路１０)並びに（工程８）及び（工程１０）では、デヒドロゲナーゼ又はレダクターゼのいずれか又は両方であってよい。これは、当該経路を担う酵素は、アルデヒドの還元反応を進めることができる活性を有していることが十分条件だからである。従って、当該経路においては、デヒドロゲナーゼ又はレダクターゼのいずれか（又は両方）により、本願発明を実施することができる。従って、国際酵素分類を小分類まで特定する必要はない。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、再生可能資源由来の原料であるグルコースなどの炭水化物原料から効率よく1,4-ブタンジオールを生産することができる遺伝子組換え微生物が提供された。また、当該微生物を用いた1,4-ブタンジオールを製造する方法が提供された。本発明の方法は、より安価な原料を利用して1,4-ブタンジオールを製造することができるという点で工業的に有利である。本発明によって、再生可能資源を原料とした1,4-ブタンジオールの生産が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明における、グルコースを原料としてイノシトールを経由し、1,4-ブタンジオールを生産する一連の酵素反応を示す図である。
【図２】粗酵素液を用いた1,4-ブタンジオール生産を示す図である。
【図３】本発明の微生物による1,4-ブタンジオール生産を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、イノシトール-3-リン酸シンターゼ遺伝子、イノシトールリン酸ホスファターゼ遺伝子、ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子、ウロン酸デヒロドゲナーゼ遺伝子、グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子、5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子、デカルボキシラーゼ遺伝子を保有する形質転換体を作製することで解決される。
【００１６】
本発明は、以下の反応の（経路１）から（経路１０）を触媒する各酵素を発現し、グルコースから1,4-ブタンジオールを生成することができる、遺伝子組換え微生物を提供する：
（経路１）グルコキナーゼ、
（経路２）イノシトール-3-リン酸シンターゼ、
（経路３）イノシトールリン酸ホスファターゼ、
（経路４）ミオイノシトールオキシゲナーゼ、
（経路５）ウロン酸デヒロドゲナーゼ、
（経路６）グルカル酸デヒドラターゼ、
（経路７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ、
（経路８）アルコールデヒドロゲナーゼ、
（経路９）デカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）アルコールデヒドロゲナーゼ：
[反応]
0006622564.tif 000024
。
【００１７】
また、本発明は、以下の反応の（経路１）から（経路１０）を触媒する国際酵素分類により特定された各酵素を発現し、グルコースから1,4-ブタンジオールを生成することができる、遺伝子組換え微生物を提供する：
（経路１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.-に分類されるグルコキナーゼ、
（経路２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（経路３）国際酵素分類においてEC:3.1.3.-に分類されるホスファターゼ、
（経路４）国際酵素分類においてEC:1.13.-.-に分類されるオキシゲナーゼ、
（経路５）国際酵素分類においてEC:1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（経路７）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（経路８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.-に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ：
[反応]
0006622564.tif 000025
。
【００１８】
より好ましい態様において、本発明の微生物は、各酵素が、以下に特定される、遺伝子組換え微生物である：
（経路１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.2に分類されるグルコキナーゼ、
（経路２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（経路３）国際酵素分類においてEC: 3.1.3.25に分類されるホスファターゼ、
（経路４）国際酵素分類においてEC: 1.13.99.1に分類されるオキシゲナーゼ、
（経路５）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.203に分類されるデヒドロゲナーゼ、
（経路６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.40に分類されるデヒドラターゼ、
（経路７）国際酵素分類においてEC: 4.2.1.41に分類されるデヒドラターゼ、
（経路８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（経路９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.74に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（経路１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
【００１９】
またさらに、本発明の一態様として、以下の酵素１〜酵素１０を発現する、遺伝子組換え微生物が提供される：
グルコキナーゼ活性を有する酵素１が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：1に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：2に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：2に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性を有する酵素２が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：3に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：4に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：4に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
イノシトールリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素３が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：5に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：6に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：6に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有する酵素４が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：7に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：8に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：8に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
ウロン酸デヒロドゲナーゼ活性を有する酵素５が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：9に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：10に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：10に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素６が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：11に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：12に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：12に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素７が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：13に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：14に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：14に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素８が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
デカルボキシラーゼ活性を有する酵素９が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：17又は19に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、又は、
（ｅ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素１０が、以下からなる群から選択される：
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体。
【００２０】
本発明の形質転換体は様々な宿主微生物細胞を用いて作製し得る。特に原核微生物を宿主にすることは当該宿主細胞内に1,4-ブタンジオール生合成経路を新たに構築することを可能にするので、合成生物学的手法の適応において極めて魅力的である。本発明において各酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、各酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、各酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、例えば以下のような微生物を示すことができる。
エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属等宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属等宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属等宿主ベクター系の開発されているカビ
【００２１】
形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Sambrookら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。
【００２２】
微生物菌体内などにおいて、本発明の各酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中で安定に存在するプラスミドベクターまたはファージベクターへ本発明のDNAを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる。そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のDNA鎖の5'-側上流に、より好ましくはターミネーターを3'-側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーター等に関しては、例えば「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 （1990）、Yeast 8, 423-488 （1992）、等に詳細に記載されている。エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、例えばpBR、pUC系プラスミドを利用でき、lac（β−ガラクトシダーゼ）、trp（トリプトファンオペロン）、tac、trc（lac、trpの融合）、λファージPＬ、PＲ等に由来するプロモーター等が利用できる。また、ターミネーターとしては、trpA由来、ファージ由来、rrnBリボソーマルRNA由来のターミネーター等を用いることができる。
【００２３】
バチルス属においては、ベクターとしてpUB110系プラスミド、pC194系プラスミド等が利用可能であり、染色体にインテグレートさせることも可能である。また、プロモーターまたはターミネーターとしてapr（アルカリプロテアーゼ）、npr（中性プロテアーゼ）、またはamy（α−アミラーゼ）等が利用できる。
【００２４】
シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）等の宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドTOLプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（RSF1010等に由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）pKT240等が利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、リパーゼ（特開平5-284973）遺伝子等が利用できる。
【００２５】
ブレビバクテリウム属、特にブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、pAJ43（Gene 39, 281 （1985））等のプラスミドベクターが利用可能である。プロモーターまたはターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、pCS11（特開昭57-183799）、pCB101（Mol. Gen. Genet. 196, 175（1984）等のプラスミドベクターが利用可能である。
【００２６】
ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、pHV1301（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 （1985）、pGK1（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 （1985））等がプラスミドベクターとして利用可能である。
【００２７】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたpAMβ1（J. Bacteriol. 137, 614 （1979））等が利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus
rhodochrous）から単離されたプラスミドベクター等が利用可能である （J. Gen. Microbiol. 138,1003 （1992））。
【００２８】
ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、HopwoodらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories （1985）に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、pIJ486 （Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、pKC1064（Gene 103,97-99 （1991））、pUWL-KS （Gene 165,149-150（1995））等が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 （1997））。
【００２９】
サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、YRp系、YEp系、YCp系、YIp系プラスミド等が利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームDNAとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（EP 537456など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ADH（アルコール脱水素酵素）、GAPDH（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）、PHO（酸性ホスファターゼ）、GAL（β−ガラクトシダーゼ）、PGK（ホスホグリセレートキナーゼ）、ENO（エノラーゼ）等のプロモーターおよびターミネーターが利用可能である。
【００３０】
クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来2μm系プラスミド、pKD1系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390（1981））、キラー活性に関与するpGKl1由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子KARS系プラスミド、リボソームDNA等との相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（EP 537456など）などが利用可能である。また、ADH、PGK等に由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。
【００３１】
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のARS （自律複製に関与する遺伝子）、およびサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクター等が利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 （1986））。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のADHプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729（1987））。特に、pAUR224は、宝酒造から市販されており容易に利用できる。
【００３２】
チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ （Zygosaccharomyces rouxii）由来の pSB3（Nucleic Acids Res. 13, 4267（1985））などに由来するプラスミドベクター等が利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来 PHO5 プロモーター、およびチゴサッカロマイセス・ロウキシ由来 GAP-Zr（グリセルアルデヒド−3−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 （1990））等が利用可能である。
【００３３】
ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（Pichia angusta、旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（HARS1、HARS2）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443（1991））。また、メタノールなどで誘導されるAOX（アルコールオキシダーゼ）、FDH（ギ酸脱水素酵素）のプロモーター等が利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子 （PARS1、PARS2）等を利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 （1985））、高濃度培養とメタノールで誘導可能なAOXなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 （1987））。
【００３４】
キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa）、キャンディダ・アルビカンス（Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス （Candida utilis） 等において宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ARSがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 （1987））、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターの強力なプロモーターが開発されている（特開平08-173170）。
【００３５】
アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー （Aspergillus niger） 、アスペルギルス・オリジー （Aspergillus oryzae） 等がカビの中で最もよく研究されており、プラスミド、および染色体へのインテグレーションの利用が可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 （1989））。
【００３６】
トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーター等が利用できる（Biotechnology 7, 596-603 （1989））。また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 （1985））、菜種、トウモロコシ、またはジャガイモ等の植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており好適に利用できる。
【００３７】
本発明による1,4-ブタンジオールの製造方法において原料となる発酵性基質としては、グルコースなどの糖類の他、用いる宿主微生物によっては他の糖類やグリセロールなど微生物が異化代謝することができ、その代謝産物としてmyo-イノシトール、グルカル酸等を生成しうるものであれば好適に用いることができる。
【００３８】
単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
【００３９】
1,4-ブタンジオールを生産するための原料である発酵性基質の濃度に特に制限はないが、通常０．１〜３０％程度、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％の濃度が用いられる。
【００４０】
なお、本発明における「％」は、いずれも「重量/容量(w/v)」を意味する。
【００４１】
また、原料は発酵開始時に一括して添加することも可能であるが、発酵液中に連続的、もしくは間欠的に添加することも可能である。
【００４２】
また、本発明の遺伝子組換え微生物は、好ましくは、式１で示される反応を触媒する酵素遺伝子を単離した後、大腸菌などを宿主として活性を増強させた遺伝子組換え大腸菌を用いることができる。本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌は、一般的に大腸菌の培養に用いられる培地で培養することができ、公知の方法によって発現誘導することによって高発現させることができる。例えば、当該酵素活性が増強された大腸菌を２×ＹＴ培地（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中で培養し、イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって発現誘導させ、十分に増殖させた後に、培養液をそのまま、もしくは、菌体を回収して1,4-ブタンジオール生産に用いることができる。
【００４３】
1,4-ブタンジオール生産に使用する本発明の遺伝子組換え微生物は、下記の発酵性基質を含む1,4-ブタンジオール生産用発酵液で生育させながら1,4-ブタンジオールを生産させても良く、予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体を用いても良い。予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体の量は、通常は、発酵性基質を含む1,4-ブタンジオール生産用発酵液量に対して０．１〜１００％、好ましくは０．５〜５０％、より好ましくは１〜２０％程度用いることができる（ここで言う「％」は、1,4-ブタンジオール生産用発酵液に対する植菌率を示しており、「[予め増殖させた培養液]／[1,4-ブタンジオール生産用発酵液](ｖ／ｖ)」を意味する）。
【００４４】
1,4-ブタンジオール生産用発酵液は、1,4-ブタンジオールを生産するための発酵性基質以外にも、必要に応じて1,4-ブタンジオールの生産を促進するものが含まれていることが好ましく、本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌の栄養源となる培地成分を含んでいてもよい。具体的には、大腸菌の培養に用いられる培地であるＬＢ（１．０％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）、２×ＹＴ（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）、Ｍ９培地（６．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４９３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）などを挙げることができる。予め培養して十分量の菌体を１，４−ブタンジオール生産用発酵液に供する場合は、より高濃度の発酵性基質の存在下で1,4-ブタンジオールの生産を行うことができ、上記培地を除くこともできる。また、必要に応じて発酵中のｐＨを1,4-ブタンジオール生産に適したｐＨに維持させるための成分、例えば緩衝剤を１０ｍＭ〜８００ｍＭ、好ましくは、５０〜５００ｍＭ、より好ましくは１００〜２５０ｍＭ含んでいてもよく、具体的には、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液などを挙げることができる。発酵温度は本発明の遺伝子組換え微生物が発酵性基質の資化能力を発現でき、且つ、式１で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、1,4-ブタンジオールを生成できる温度であれば良く、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。またｐＨも、式１で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、1,4-ブタンジオールを生成できるｐＨであれば良く、通常はｐＨ４〜１２、好ましくは、ｐＨ５〜1１、より好ましくはｐＨ６〜９で行うことができる。また、発酵は攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。また、発酵性基質をより効率的に1,4-ブタンジオールに変換させるために、十分量の酸素を供給した好気的条件下、酸素供給量を制限した微好気的条件下、もしくは、酸素を供給しない嫌気的条件下の反応培地で行うことができる。
【００４５】
本発明の1,4-ブタンジオールの製造は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、バッチ式、流加式、連続式のいずれの生産方式で行うことも可能であり、固定化菌体、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００４６】
反応により生成した1,4-ブタンジオールの精製は、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００４７】
たとえば、微生物菌体を含む発酵液を遠心分離や膜濾過等によって微生物菌体を除去、タンパク質を除去した後、水溶液中から、濃縮、蒸留などの公知の方法により1,4-ブタンジオールを精製することができる。
【００４８】
本発明の図１で示す酵素としては、下記(a)から(e)のいずれかに記載の酵素を挙げることができる。
（ａ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１のいずれかに記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素
（c）配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１のいずれかに記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質
【００４９】
本発明において、「ある特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる酵素」のホモログは、「ある特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列において、1若しくは複数（２以上、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜５）のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を有する酵素」と表すことができる。当該ホモログは、特定の配列番号に記載されたアミノ酸配列からなる酵素と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において「機能的に同等」とは、本明細書に記載する、各酵素の酵素活性（触媒反応、化学反応等）と同じ機能を有することを意味する。ある特定の配列番号に記載のアミノ酸配列において、たとえば100以下、通常50以下、好ましくは30以下、より好ましくは15以下、更に好ましくは10以下、あるいは5以下のアミノ酸残基の変異は許容される。一般にタンパク質の機能の維持のためには、置換するアミノ酸は、置換前のアミノ酸と類似の性質を有するアミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸残基の置換は、保存的置換と呼ばれている。例えば、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Glnが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、AspおよびGluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、Lys、Arg、Hisが挙げられる。これらの各グループ内のアミノ酸置換は許容される。
【００５０】
当業者であれば、本明細書において開示された塩基配列からなる各酵素のDNAに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487(1982), Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991) ）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することにより各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。各酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、各酵素のホモログを得ることが可能である。
【００５１】
さらに、本発明の各酵素のホモログとは、各酵素に対応した配列番号に示されるアミノ酸配列と少なくとも50％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは80％、より好ましくは85％、より好ましくは90％、さらにより好ましくは95％以上（例えば、95%、96%、97%、98%、又は99%以上）の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、例えばSWISS-PROT, PIR, DADなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやDDBJ、EMBL、あるいはGene-BankなどのDNA配列に関するデータベース、DNA配列を元にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、BLAST、FASTAなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。
【００５２】
本発明に記載の各酵素は、当該酵素と機能的に同等な活性を有する限り、付加的なアミノ酸配列を結合することができる。たとえば、ヒスチジンタグやＨＡタグのような、タグ配列を付加することができる。あるいは、他のタンパク質との融合タンパク質とすることもできる。また本発明の各酵素あるいはそのホモログは、各酵素と機能的に同等な活性を有する限り、断片であってもよい。
【００５３】
本発明に記載された各酵素をコードするポリヌクレオチドは、以下のような方法によって単離することができる。例えば、各酵素に対応した配列番号に示される塩基配列を元にPCR用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAもしくは、cDNAライブラリーを鋳型としてPCRを行うことにより本発明のDNAを得ることができる。さらに、得られたDNA断片をプローブとして、酵素生産株の染色体DNAの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやcDNAライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、各酵素のポリヌクレオチドを得ることができる。
【００５４】
なお、本発明におけるハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」を具体的に例示すれば、例えば6×SSC、0.5%(W/V) SDS、100μg/ml 変性サケ精子DNA、5×デンハルト溶液（１×デンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、および0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、45℃、好ましくは55℃、より好ましくは60℃、さらに好ましくは65℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて、4×SSC、0.5% SDS、20分を３回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、2×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 4×SSC、0.5% SDS、20分を2回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。より好ましくはハイブリダイゼーション後の洗浄を、ハイブリダイゼーションと同じ温度にて 2×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 1×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.5×SSC、0.5% SDS、20分を1回、続いて 0.1×SSC、0.5% SDS、20分を1回行う条件である。
【００５５】
また、PCRにより得られたDNA断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のDNAの外側に伸長させるためのPCRプライマーを設計し、酵素生産株の染色体DNAを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりDNAを鋳型として逆PCRを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、RACE法（Rapid Amplification of cDNA End、「PCR実験マニュアル」p25-33, HBJ出版局）などにより各酵素のポリヌクレオチドを得ることも可能である。
【００５６】
なお本発明において、各酵素のポリヌクレオチドとしては、以上のような方法によってクローニングされたゲノムDNA、あるいはcDNAの他、合成によって得られたDNAが含まれる。
【００５７】
グルコキナーゼ活性測定法−１
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)、10mM グルコース、5mM 塩化マグネシウム、0.3mM ATP、0.3mM NADPからなる組成液を、25℃、3分間平衡化した後、グルコキナーゼとグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼを含む無細胞抽出液を添加する。グルコキナーゼによってグルコースのリン酸化が行われグルコース-6-リン酸が生成し、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼよって6-ホスホ-グルコノ-1,5-ラクトンが生成される。グルコース-6-リン酸の酸化におけるNADPHの増加に伴う340nmの吸光度の増加を測定する。1分間に1μmolのNADPHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００５８】
イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性測定法−２
1 ml 50 mM TrisHCl緩衝液(pH 8.0)、5 mM グルコース6リン酸、0.2 mM DTT, 2 mM NH4Cl、1 mM NAD+からなる組成液を、37℃、3分間平衡化し、Ino1を含む細胞抽出液を添加し37℃  ６０分間反応させ、100 μl 20%トリクロロ酢酸を加え酵素反応を停止させる。4℃、10000xgで15分遠心し、上澄みを採取する。0.5ml上澄み溶液と0.1 ml 0.2 M NaIO4を混合し37℃ ６０分間反応させる。この操作によって、グルコース６リン酸が酸化してリン酸が遊離する。酵素活性は、BioAssay system製malachite green phosphate assay kitを用いて遊離リン酸測定を行う。Kitの説明書に従い混合を行い色素620nmの吸光度を測定する。0.1mM KH2PO4標準溶液から検量線を作成し、定量する。1分間に1 μmolの基質を触媒する酵素量を1Uとすることができる。退色を避けるため、これらの操作は染色後2時間以内に行う。
【００５９】
イノシトールリン酸ホスファターゼ（SuhB）活性測定法−３
1ml 50 mM TrisHCl緩衝液(pH 8.0)、0.7 mM d-myo-inositol-1-phosphate、10 mM MgCl2, 2５０mM KClからなる組成液を、37℃、3分間平衡化し、SuhBを含む細胞抽出液を添加し37℃, 2時間反応させ、100 μl 20%トリクロロ酢酸を加え酵素反応を停止させる。4℃、10000xgで15分遠心したあと上澄みを採取する。Ino1と同じく酵素活性は、BioAssay system製malachite green phosphate assay kitを用いて遊離リン酸測定を行う。Kitの説明書に従い混合を行い色素620nmの吸光度を測定する。0.1mM KH2PO4標準溶液から検量線を作成し、定量する。1分間に1μmolの基質を触媒する酵素量を1Uとすることができる。退色を避けるため、これらの操作は染色後2時間以内に行う。
【００６０】
ミオイノシトールオキシゲナーゼ（MIOX）活性測定法−４
50 mM TrisHCl緩衝液(pH 8.0)、2 mM L-システイン, 1 mM Fe(NH4)(SO4)2、60 mM myo-inositolからなる組成液を30℃、10分間平衡化し、MIOXを含む細胞抽出液を添加し30℃,６０分反応させ、1/10量の20%トリクロロ酢酸を加え酵素反応を停止させる。4℃、10000xgで15分遠心したあと、上澄みを採取する。活性測定はサンプルとorcinol溶液＝１:2で混合し、98℃, 30分反応させ室温で冷却し、670nmの吸光度の増加を測定する。グルクロン酸の既知濃度の標準溶液から検量線を作成し、定量する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。
オリシカル溶液（orcinol solution）組成：
10 ml 5 M HC1に40 mg orcinol および5.4 mg FeCl3混合
【００６１】
ウロン酸デヒドロゲナーゼ（Udh）活性測定法-５
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 8.0)、10mM グルクロン酸、1mM NAD+からなる組成液を、25℃、3分間平衡化した後、ウロン酸デヒドロゲナーゼを含む無細胞抽出液を添加し、グルクロン酸の酸化におけるNADHの増加に伴う340nmの吸光度の増加を測定する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００６２】
グルカル酸デヒドラターゼ（GudD）活性測定法-６
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)、10mM グルカル酸、5mM 塩化マグネシウムからなる組成液を、30℃、3分間平衡化した後、グルカル酸デヒドラターゼを含む無細胞抽出液を添加し、グルカル酸の脱水によって5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸が生成される。反応後、組成液に1%酢酸ナトリウム/1%塩酸セミカルバジド溶液を等量添加し、30℃、１時間で保温してセミカルバゾン誘導体を生成させ、250nmの吸光度の増加を測定する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００６３】
5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ（KdgD）活性測定法-７
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)、10mM 5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸、5mM 塩化マグネシウム、0.3mM NADPHからなる組成液を、25℃、3分間平衡化した後、5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼとアルコールデヒドロゲナーゼ(yjgB)を含む無細胞抽出液を添加する。5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼによって5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸の脱水が行われ2-オキソグルタル酸セミアルデヒドが生成し、アルコールデヒドロゲナーゼによる還元によって2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸が生成される。2-オキソグルタル酸セミアルデヒドの還元におけるNADPHの減少に伴う340nmの吸光度の減少を測定する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００６４】
アルコールデヒドロゲナーゼ（YjgB）活性測定法-８
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)、5mM ペンタナール、0.3mM NADPHからなる組成液を、25℃、3分間平衡化した後、アルコールデヒドロゲナーゼを含む無細胞抽出液を添加し、ペンタナールの還元によるNADPHの増加に伴う340nmの吸光度の増加を測定する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００６５】
デカルボキシラーゼ（KivD/KdcA）活性測定法-９
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 6.5)、10mM ３-メチル-２-オキソブチル酸、5mM 塩化マグネシウム、1mM ピロリン酸チアミン、0.3mM NADPHからなる組成液を、25℃、3分間平衡化した後、デカルボキシラーゼとアルコールデヒドロゲナーゼ(yjgB)を含む無細胞抽出液を添加する。デカルボキシラーゼによって３-メチル-２-オキソブチル酸の脱炭酸が行われ２-メチル-プロパナール が生成し、アルコールデヒドロゲナーゼによる還元によって２-メチル-プロパノールが生成される。２-メチル-プロパナールの還元におけるNADPHの減少に伴う340nmの吸光度の減少を測定する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００６６】
アルコールデヒドロゲナーゼ（YqhD）活性測定法-１０
100mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)、5mM ブタナール、0.3mM NADPHからなる組成液を、25℃、3分間平衡化した後、アルコールデヒドロゲナーゼを含む無細胞抽出液を添加し、ペンタナールの還元によるNADPHの増加に伴う340nmの吸光度の増加を測定する。1分間に1μmolのNADHの増加を触媒する酵素量を1Uとすることができる。また、タンパク質の定量は、Bovine serum albuminを標準タンパク質として、バイオラッド製タンパク質アッセイキットを用いた色素結合法により行う。
【００６７】
また、本発明は、以下の工程からなる、グルコースから1,4-ブタンジオールを生産する方法を提供する：
（工程１）グルコースからグルコース−6リン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000026
（工程２）グルコース−6リン酸からmyo-イノシトール-3リン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000027
（工程３）myo-イノシトール-3リン酸からmyo-イノシトールを生成する工程：
0006622564.tif 000028
（工程４）myo-イノシトールからグルクロン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000029
（工程５）グルクロン酸からグルカル酸を生成する工程：
0006622564.tif 000030
（工程６）グルカル酸から5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸を生成する工程：
0006622564.tif 000031
（工程７）5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸から2-オキソグルタル酸セミアルデヒドを生成する工程：
0006622564.tif 000032
（工程８）2-オキソグルタル酸セミアルデヒドから2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸を生成する工程：
0006622564.tif 000033
（工程９）2-オキソ-5-ヒドロキシ-ペンタン酸から4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドを生成する工程：
0006622564.tif 000034
（工程１０）4-ヒドロキシ-ブチルアルデヒドから1,4-ブタンジオールを生成する工程：
0006622564.tif 000035
。
【００６８】
またさらに、本発明は、上述の（工程１）〜（工程１０）の各工程が、以下の酵素により触媒される、グルコースから1,4-ブタンジオールを生産する方法を提供する：
（工程１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.-に分類されるグルコキナーゼ、
（工程２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（工程３）国際酵素分類においてEC:3.1.3.-に分類されるホスファターゼ、
（工程４）国際酵素分類においてEC:1.13.-.-に分類されるオキシゲナーゼ、
（工程５）国際酵素分類においてEC:1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（工程７）国際酵素分類においてEC:4.2.1.-に分類されるデヒドラターゼ、
（工程８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.-に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（工程１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
【００６９】
本発明のより好ましい態様において、上述の（工程１）〜（工程１０）の各工程は、以下の酵素により触媒される：
（工程１）国際酵素分類においてEC: 2.7.1.2に分類されるグルコキナーゼ、
（工程２）国際酵素分類においてEC:5.5.1.4に分類されるシンターゼ、
（工程３）国際酵素分類においてEC: 3.1.3.25に分類されるホスファターゼ、
（工程４）国際酵素分類においてEC: 1.13.99.1に分類されるオキシゲナーゼ、
（工程５）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.203に分類されるデヒドロゲナーゼ、
（工程６）国際酵素分類においてEC:4.2.1.40に分類されるデヒドラターゼ、
（工程７）国際酵素分類においてEC: 4.2.1.41に分類されるデヒドラターゼ、
（工程８）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ、
（工程９）国際酵素分類においてEC: 4.1.1.74に分類されるデカルボキシラーゼ、及び
（工程１０）国際酵素分類においてEC: 1.1.1.-に分類されるデヒドロゲナーゼ又はレダクターゼ。
【００７０】
また、本発明の一態様として、（工程１）〜（工程１０）を触媒する各酵素が、以下に特定される酵素である態様を挙げることができる：
（工程１）を触媒する、グルコキナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：1に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：2に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：2に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：1に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程２）を触媒する、イノシトール-3-リン酸シンターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：3に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：4に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：4に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：3に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程３）を触媒する、イノシトールリン酸ホスファターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：5に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：6に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：6に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：5に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程４）を触媒する、ミオイノシトールオキシゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：7に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：8に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：8に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：7に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程５）を触媒する、ウロン酸デヒロドゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：9に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：10に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：10に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：9に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程６）を触媒する、グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：11に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：12に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：12に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：11に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程７）を触媒する、5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：13に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：14に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：14に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：13に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程８）を触媒する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程９）を触媒する、デカルボキシラーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択され、
（ａ）配列番号：17又は19に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：18又は20に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：17又は19に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体、
（工程１０）を触媒する、アルコールデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素が、以下からなる群から選択される、
（ａ）配列番号：15又は21に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列において、1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列からなる酵素、
（ｃ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列によりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、
（ｄ）配列番号：16又は22に記載された塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるアミノ酸配列からなる酵素、及び、
（ｅ）配列番号：15又は21に記載のアミノ酸配列と８５%以上の同一性を有するタンパク質誘導体。
【００７１】
また、本発明は、グルコースと本発明の微生物とを混合し、該微生物を培養する工程を含む、1,4-ブタンジオールを生産する方法を提供する。
【００７２】
1,4-ブタンジオールを生産するための原料であるグルコース等の発酵性基質の濃度に特に制限はないが、通常０．１〜３０％程度、好ましくは０．５〜１５％、より好ましくは１〜１０％の濃度を用いることができる。
【００７３】
また、原料は発酵開始時に一括して添加することも可能であるが、発酵液中に連続的、もしくは間欠的に添加することも可能である。
【００７４】
また、本発明の遺伝子組換え微生物は、好ましくは、図１で示される反応を触媒する酵素遺伝子を単離した後、大腸菌などを宿主として活性を増強させた遺伝子組換え大腸菌を用いることができる。本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌は、一般的に大腸菌の培養に用いられる培地で培養することができ、公知の方法によって発現誘導することによって高発現させることができる。例えば、当該酵素活性が増強された大腸菌を２×ＹＴ培地（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）中で培養し、イソプロピル−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって発現誘導させ、十分に増殖させた後に、培養液をそのまま、もしくは、菌体を回収して1,4-ブタンジオール生産に用いることができる。
【００７５】
1,4-ブタンジオール生産に使用する本発明の遺伝子組換え微生物は、下記の発酵性基質を含む1,4-ブタンジオール生産用発酵液で生育させながら1,4-ブタンジオールを生産させても良く、予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体を用いても良い。予め培養して増殖させた培養液、もしくは、回収した菌体の量は、通常は、発酵性基質を含む1,4-ブタンジオール生産用発酵液量に対して０．１〜１００％、好ましくは０．５〜５０％、より好ましくは１〜２０％程度用いることができる（ここで言う「％」は、1,4-ブタンジオール生産用発酵液に対する植菌率を示しており、「[予め増殖させた培養液]／[1,4-ブタンジオール生産用発酵液](ｖ／ｖ)」を意味する）。
【００７６】
1,4-ブタンジオール生産用発酵液は、1,4-ブタンジオールを生産するための発酵性基質以外にも、必要に応じて1,4-ブタンジオールの生産を促進するものが含まれていることが好ましく、本目的のために用いられる遺伝子組換え大腸菌の栄養源となる培地成分を含んでいてもよい。具体的には、大腸菌の培養に用いられる培地であるＬＢ（１．０％バクト−トリプトン、０．５％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）、２×ＹＴ（２．０％バクト−トリプトン、１．０％バクト−酵母エキス、１．０％塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）、Ｍ９培地（６．８ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３．０ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、１．０ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．４９３ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、ｐＨ７．５）などを挙げることができる。予め培養して十分量の菌体を１，４−ブタンジオール生産用発酵液に供する場合は、より高濃度の発酵性基質の存在下で1,4-ブタンジオールの生産を行うことができ、上記培地を除くこともできる。また、必要に応じて発酵中のｐＨを1,4-ブタンジオール生産に適したｐＨに維持させるための成分、例えば緩衝剤を１０ｍＭ〜８００ｍＭ、好ましくは、５０〜５００ｍＭ、より好ましくは１００〜２５０ｍＭ含んでいてもよく、具体的には、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液などを挙げることができる。発酵温度は本発明の遺伝子組換え微生物が発酵性基質の資化能力を発現でき、且つ、式１で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、1,4-ブタンジオールを生成できる温度であれば良く、通常５〜６０℃、好ましくは１０〜５０℃、より好ましくは２０〜４０℃で行うことができる。またｐＨも、式１で示される反応を触媒する酵素活性を発現でき、1,4-ブタンジオールを生成できるｐＨであれば良く、通常はｐＨ４〜１２、好ましくは、ｐＨ５〜1１、より好ましくはｐＨ６〜９で行うことができる。また、発酵は攪拌下、あるいは静置下で行うことができる。また、発酵性基質をより効率的に1,4-ブタンジオールに変換させるために、十分量の酸素を供給した好気的条件下、酸素供給量を制限した微好気的条件下、もしくは、酸素を供給しない嫌気的条件下の反応培地で行うことができる。
【００７７】
本発明の1,4-ブタンジオールの製造は、水中もしくは水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、酢酸エチル、酢酸ブチル、トルエン、クロロホルム、ｎ−ヘキサン、メチルイソブチルケトン、メチルターシャリーブチルエーテル、ジイソプロピルエーテルなどの有機溶媒中、もしくは、水性媒体との2相系、もしくは水に溶解する有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセトニトリル、アセトン、ジメチルスルホキシドなどとの混合系により行うことができる。本発明の反応は、バッチ式、流加式、連続式のいずれの生産方式で行うことも可能であり、固定化菌体、固定化酵素、膜リアクターなどを利用して行うことも可能である。
【００７８】
反応により生成した1,4-ブタンジオールの精製は、遠心分離や濾過などによる分離、有機溶媒による抽出、イオン交換クロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、吸着剤による吸着、凝集剤、脱水剤による脱水もしくは凝集、晶析、蒸留、などを適宜組み合わせることにより行うことができる。
【００７９】
たとえば、微生物菌体を含む発酵液を遠心分離や膜濾過等によって微生物菌体を除去、タンパク質を除去した後、水溶液中から、濃縮、蒸留などの公知の方法により1,4-ブタンジオールを精製することができる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００８１】
実施例1：プラスミドの構築
1) イノシトール-3-リン酸シンターゼ遺伝子発現プラスミドpSUSCIN1の構築
サッカロマイシス セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）由来イノシトール-3-リン酸シンターゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：3）を基に、大腸菌(Eschericha coli JM109株)の発現に最適化されたino1遺伝子の塩基配列（配列番号：4）を人工合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のNdeIサイト及びXhoIサイトに導入した。得られたpSUSCIN1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトール-3-リン酸シンターゼの高発現を確認した。
【００８２】
2) イノシトールリン酸ホスファターゼ遺伝子発現プラスミドpSUECSB1の構築
大腸菌(Eschericha coli)由来イノシトールリン酸ホスファターゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：5）を基に、大腸菌(Eschericha coli JM109株)の発現に最適化されたsuhB遺伝子の塩基配列（配列番号：6）を人工合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のNdeIサイト及びXhoIサイトに導入した。得られたpSUECSB1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのイノシトールリン酸ホスファターゼの高発現を確認した。
【００８３】
3) ミオイノシトールオキシゲナーゼ遺伝子発現プラスミドpSUECSB1の構築
マウス(Mus musculus)由来ミオイノシトールオキシゲナーゼキシゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：7）に、大腸菌(Eschericha coli JM109株)の発現に最適化されたmiox遺伝子の塩基配列（配列番号：8）を人工合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のNdeIサイト及びXhoIサイトに導入した。得られたpSUECSB1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのミオイノシトールオキシゲナーゼの高発現を確認した。
【００８４】
4) ウロン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子発現プラスミドpSUAUDH1の構築
アグロバクテリウム ツメファシエンス（agrobacterium tumefaciens）由来ウロン酸デヒドロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号：9）を基に、アグロバクテリウム ツメファシエンス（agrobacterium tumefaciens）のゲノムからPCR法によりudh遺伝子の塩基配列（配列番号：10）を合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のEcoRIサイト及びHindIIIサイトに導入した。得られたpSUAUDH1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのウロン酸デヒドロゲナーゼの高発現を確認した。
【００８５】
5) グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子発現プラスミドpSUECGD1の構築
大腸菌(Escherichia coli)由来グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：11）を基に、大腸菌(Escherichia coli W3110株)のゲノムからPCR法によりgudD遺伝子の塩基配列（配列番号：12）を合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のEcoRIサイト及びHindIIIサイトに導入した。得られたpSUECGD1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのグルカル酸デヒドラターゼの高発現を確認した。
【００８６】
6) 5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子発現プラスミドpSUABKD1の構築
アシネトバクター バイリィ(Acinetobacter baylyi)由来5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：13）を基に、大腸菌(Eschericha coliJM109)の発現に最適化されたkdgD塩基配列（配列番号：14）を人工合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のNdeIサイト及びXhoIサイトに導入した。得られたpSUABKD1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分での5-ケト-4-デオキシ-グルカル酸デヒドラターゼの高発現を確認した。
【００８７】
7) アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現プラスミドpSUECYB1の構築
大腸菌(Escherichia coli)由来アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：15）を基に、大腸菌(Escherichia coli W3110株)のゲノムからPCR法によりyjgB遺伝子の塩基配列（配列番号：16）を合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のEcoRIサイト及びHindIIIサイトに導入した。得られたpSUECYB1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのアルコールデヒドロゲナーゼの高発現を確認した。
【００８８】
8) デカルボキシラーゼ遺伝子発現プラスミドpSULLDC1とpSULLKA1の構築
ラクトコッカス ラクティス(Lactococcus lactis)由来デカルボキシラーゼ遺伝子(kivD、kdcA遺伝子)のアミノ酸配列（配列番号：17、19）を基に、大腸菌(Eschericha coli JM109株)の発現に最適化されたkivD遺伝子(pSULLDC1用)又はkdcA遺伝子(pSULLKA1用)の塩基配列（配列番号：18、20）を人工合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のNdeIサイト及びPacIサイトに導入した。得られたpSULLDC1とpSULLKA1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分を用いた酵素活性測定で活性が有ることを確認した。
【００８９】
9) アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子発現プラスミド pSU-EPD1
大腸菌(Escherichia coli)由来アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子のアミノ酸配列（配列番号：21）を基に、大腸菌(Escherichia coli W3110株)のゲノムからPCR法によりyjgB遺伝子の塩基配列（配列番号：22）を合成し、pSE420U (WO 2006-132145)のNdeIサイト及びPacIサイトに導入した。得られたpSU-EPD1プラスミドを形質転換した大腸菌JM109株をアンピシリン(50mg/L)含むLB培地で生育させ、lacオペロン発現システムを利用してタンパク質発現を行ったところ、当該大腸菌の可溶性画分でのアルコールデヒドロゲナーゼの高発現を確認した。
【００９０】
なお、大腸菌JM109株はグルコキナーゼを内在的に発現しているため（アミノ酸配列は配列番号：1、塩基配列は配列番号：2に示す）、形質転換用のプラスミドの作成は行わなかった。
【００９１】
実施例2：酵素反応による1,4-ブタンジオール生産
実施例1で得られた各プラスミドを形質転換したE. coli(JM109株)を、アンピシリン(50mg/L)を含む液体LB培地(1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)に植菌し、試験管中、30℃で終夜振とう培養した。この各培養菌体1.2mLを、アンピシリン(50mg/L)を含む1.2Lの液体LB培地(1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)を入れた発酵槽に植菌し、30℃、pH 7.2を維持し、0.5vvmでエアー通気下、600rpmで攪拌することによって好気条件下で培養を開始した。培養後、OD600が約0.4に達したところで50mMのイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)2.4mLを添加し、培養開始から24時間後に発酵槽の運転を停止させた。
【００９２】
運転停止後、培養液300mLから菌体を回収し、50mM KPB (pH7.5) 5mLに溶解させ、密閉式超音波破砕器で菌体破砕を行った(Run 30秒、Stop 60秒、Cycle 16)。破砕液を遠心分離し、上清を粗酵素液として抽出した。
【００９３】
上記で調製した各酵素液を基に下記の反応液を調製し、30℃の酵素反応を行ない、定期的に反応液200μlをサンプリングし、6倍希釈した反応液をHPLCで分析を行った。
【００９４】
0006622564.tif 000036
<HPLC分析条件>
カラム：ULTRON PS-80H (8.0 mm×300 mm)  (信和化工製)
溶離液：0.1% ギ酸水溶液
流速：0.7 mL/min
カラム温度：40℃
検出：RI / UV (210nm)
【００９５】
酵素反応開始後、6時間目から1,4-ブタンジオールのピークが確認でき、最大で1,4-ブタンジオール濃度14.8mMまで蓄積することを確認できた（図２）。
【００９６】
実施例３：酵素反応による1,4-ブタンジオール生産
実施例1で得られた酵素群を連結したプラスミドを形質転換したE. coli(JM109株)を、アンピシリン(50mg/L)を含む液体ＬＢ培地(1.0%トリプトン、0.5%酵母エキス、1.0%塩化ナトリウム、pH7.2)に植菌し、試験管中、37℃で終夜振とう培養した。この各培養菌体0.5mLを、アンピシリン(50mg/L)を含む10mlの液体DM培地(0.2%グルコース、0.7%K2HPO4, 0.3% KH2PO4, 0.1% (NH4)SO4, 0.01% MgSO4, pH7.2)+ 1ml/Ｌ 水道水を混合した試験管に植菌し、37℃振とうすることによって好気条件下で培養を開始した。培養後、OD660が約0.8に達したところでイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)を0.1 mM終濃度になるように添加し、定期的にサンプリングし、フィルター濾過した反応液をHPLCを用いて分析した。
<HPLC分析条件>
カラム：ULTRON PS-80H (8.0 mm×300 mm)  (信和加工製)
溶離液：0.1% ギ酸水溶液
流速：0.7 mL/min
カラム温度：40℃
検出：RI / UV (210nm)
【００９７】
グルコースから1,4-ブタンジオールの直接生産が確認でき、今回の培養条件では最大で1,4-ブタンジオール濃度1.8mMまで蓄積することを確認できた（図３）。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明の方法は、化石資源の枯渇や原料高騰に依存せずに1,4-ブタンジオールを製造することができるという点で工業的に有利である。本発明によって、再生可能資源を原料とした1,4-ブタンジオールの生産が可能となった。
【図１】
0006622564.tif 000049
【図２】
0006622564.tif 000050
【図３】
0006622564.tif 000051
【配列表】
0006622564000001.app