(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
紫蘇子（Ｐｅｒｉｌｌａｅ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）６０重量部、カッコウ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｉｓ  Ｈｅｒｂａ）２０重量部およびサルオガセ（Ｕｓｎｅａ）２０重量部を含む原料から作られる抗菌漢方薬組成物。
【請求項２】
紫蘇子（Ｐｅｒｉｌｌａｅ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）８０重量部、カッコウ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｉｓ  Ｈｅｒｂａ）１０重量部およびサルオガセ（Ｕｓｎｅａ）１０重量部を含む原料から作られる抗菌漢方薬組成物。
【請求項３】
紫蘇子（Ｐｅｒｉｌｌａｅ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）７０重量部、カッコウ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｉｓ  Ｈｅｒｂａ）１５重量部およびサルオガセ（Ｕｓｎｅａ）１５重量部を含む原料から作られる抗菌漢方薬組成物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の抗菌漢方薬組成物を製造する方法であって、
紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合する工程と、
エタノール・パーコレーション抽出を行い、前記抗菌漢方薬組成物を得る工程とを含む、製造方法。
【請求項５】
前記混合工程の後且つ前記抽出工程の前に、リパーゼを利用して酵素分解を行う工程を更に含む、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記混合工程は、
紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合する工程、
水を添加し、６０〜２００メッシュまですり潰す工程、および
ｐＨ４〜ｐＨ７に調整する工程を含む、請求項４又は５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記抽出工程は２４時間〜３０時間抽出が行われ、
前記抽出後に、
濾過を行い、濾液を収集する工程、および
前記濾液に対して、濃縮と定量とエージングとの順で処理することで、前記抗菌漢方薬組成物を得る工程を更に含む、請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか一つに記載の抗菌漢方薬組成物、又は請求項４〜７のいずれか一つに記載の製造方法によって調製された抗菌漢方薬組成物の、薬品、化粧品又は食品のための防腐剤としての使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ここにその開示を参考文献として合体させる、２０１５年８月２８日出願の、発明の名称が「抗菌漢方薬組成物、その製造方法および使用方法」である中国特許出願第２０１５１０５４０２３５．４号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、漢方薬の分野に属し、特に、抗菌漢方薬組成物、その製造方法および使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般に、「抗菌」という用語は、殺菌、静菌、抗黴、抗腐食等を指す。抗菌剤又は防腐剤は、微生物の成長を抑制することができる物質である。日常生活では、化粧品は微生物によって汚染され、容易に劣化をもたらす。通常の状況下では、外観に反映されうる。例えば、通常、黴や酵母によってパッケージの縁部に黴スポットが生じ、濁り、沈殿、色変化、ｐＨ変化、発泡、および味の変化が微生物によって汚染された製品中に生じる可能性がある。もしも、製品が乳状物であるならば、乳化破壊、塊り等が現れる可能性がある。化粧品に防腐剤を添加することは、製品を微生物の汚染から保護することである。添加される防腐剤の量が不十分であれば、周囲の成長環境に対して微生物が耐性を示し、薬剤耐性が生じることによって、抗腐食がなくなる可能性がある。
【０００４】
現在、化粧品に使用されている一般的な防腐剤としては、ヒダントイン（ＤＭＤＭＨ）、Ｋａｔｈｏｎ（商標）シリーズ、ブロノポール、ブチルカルバミン酸３−ヨード−２−プロピニル（ＩＰＢＣ）、ニパギンエステル、トリクロサン等がある。但し、これらの防腐剤には限界がある。例えば、ＤＭＤＭＨは、使用中にメタノールを放出し、潜在的な安全性リスクをもたらすことがある。Ｋａｔｈｏｎ（商標）シリーズは塩素を含有し、ある種の皮膚に対して刺激を引き起こす可能性がある。ブロノポールの使用は、発がん物質である亜硝酸アミンを容易に発生させる。ＩＰＢＣは、ユーザにヨウ素を過剰摂取させる可能性がある。ニパギンエステルは、脂肪組織中に容易に蓄積される。更に、ｐ−ヒドロキシ安息香酸防腐剤は、女性ホルモンと擬似する物質として働くことが所定のシステムにおいて証明され、ヒトの安全と生理系に悪影響を与えることが示されている。トリクロサンは、環境に対して悪影響を与えることが示されている。従って、低毒性、高効率、無汚染の天然防腐剤が至急求められている。
【０００５】
近年、自然回帰、緑と健康の享受の熱い波のもとで、化粧品に純粋の天然製品としての防腐剤を添加することが、国内外において宣伝、開発されるようになってきた。天然物から、強力で広範な抗菌性を有し、且つ安全で無毒な天然抗菌剤を抽出することは、将来の重要な開発方向となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記に鑑み、本発明の課題は、抗菌漢方薬組成物、その製造方法および使用方法を提供することにある。本発明によって提供される前記抗菌漢方薬組成物は、薬効範囲の広い抗菌活性を有し、天然且つマイルドである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る抗菌漢方薬組成物は、紫蘇子（Ｐｅｒｉｌｌａｅ  Ｆｒｕｃｔｕｓ）、カッコウ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎｉｓ  Ｈｅｒｂａ）、およびサルオガセ（Ｕｓｎｅａ）を含む原料から作られる。
【０００８】
好ましくは、前記原料は、紫蘇子を６０〜８０重量部、カッコウを１０〜２０重量部、およびサルオガセをＡ重量部含み、０＜Ａ≦２０である。
【０００９】
好ましくは、前記原料は、紫蘇子を６０重量部、カッコウを２０重量部、およびサルオガセを２０重量部含む。
【００１０】
好ましくは、前記原料は、紫蘇子を８０重量部、カッコウを１０重量部、およびサルオガセを１０重量部含む。
【００１１】
好ましくは、前記原料は、紫蘇子を７０重量部、カッコウを１５重量部、およびサルオガセを１５重量部含む。
【００１２】
また、本発明は、抗菌漢方薬組成物を製造する方法を提供し、当該製造方法は、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合する工程、およびパーコレーション抽出を行い前記抗菌漢方薬組成物を得る工程を含む。
【００１３】
好ましくは、前記混合工程後で前記抽出の前に、前記製造方法は、リパーゼを利用して酵素分解を行う工程を更に含む。
【００１４】
より好ましくは、前記酵素分解は、５Ｕ／ｇ〜１０Ｕ／ｇの活性を有するリパーゼを使用して１時間〜２時間、４０℃〜６０℃で行われる。
【００１５】
好ましくは、前記混合は、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合し、水を添加し、６０〜２００メッシュまですり潰し、ｐＨ４〜ｐＨ７に調整する工程である。
【００１６】
好ましくは、前記抽出時間は２４時間〜３０時間である。
【００１７】
抽出後、前記方法は、更に、濾過を行い濾溶液を収集する工程と、前記濾液に対して、濃縮と定量とエージングとの順で処理をすることで、前記抗菌漢方薬組成物を得る工程とを含む。
【００１８】
従来技術と比較して、本発明において提供される前記抗菌漢方薬組成物は、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを含む原料から作られる。当該抗菌漢方薬組成物の合理的な調合作用（ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ  ｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ）と相乗効果により、抽出された組成物は、薬効範囲の広い抗菌活性を有し、天然防腐剤として使用するのに適したものである。実験によって、前記組成物は、黄色ブドウ菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、緑膿菌緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）および黒色こうじ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）のそれぞれに対して、単一の植物よりも良好な抗菌作用を有することが示された。これは、１＋１が２以上となる結果を達成し得るものであり、すなわち、植物間の抗菌作用の相乗効果を発揮することになる。
【００１９】
本発明は、さらに、前記抗菌漢方薬組成物の薬剤、化粧品又は食品用の防腐剤としての使用方法を提供する。
【００２０】
本発明の実施例は、上述の抗菌漢方薬組成物を化粧品に適用して抗腐食試験（チャレンジテスト）を行うものである。その結果、前記化粧品サンプルが、黄色ブドウ菌、大腸菌、緑膿菌、カンジダ・アルビカンスおよび黒色こうじ菌の抗腐食試験において極めて優れた結果ことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、抗菌漢方薬組成物、その製造方法および使用方法に関する。当業者は、本願明細書の開示を参照利用して、技術的パラメータを改善しても同様の結果を得ることが可能である。具体的には、いかなる類似の置換と変更は当業者にとって自明であり、それらは本発明の範囲に含まれるものと見なされるであろうことが明記される。本発明の方法と用途は、好適実施例を参照して記載されるが、当業者であれば、ここに記載の方法と用途の改造と組み合わせを、本発明の内容、要旨および範囲から逸脱することなく、本発明の技術を実施、利用することが可能であることが明白であろう。
【００２２】
本発明において提供される抗菌漢方薬組成物は、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを含む原料から作られる。
【００２３】
本発明において、前記原料は紫蘇子を含む。「中国薬局方（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）」には、紫蘇子の性質はマイルドでその味は薬味がきいており、それは肺に戻ると記録されている。それは、痰を切り、喘息を軽減し、腸を湿らす作用を有する。
【００２４】
本発明において、前記原料はカッコウを含む。「中国薬局方」には、カッコウはシソ科に属するパチョリ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ  （Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ）の乾燥した地面より上の部分であり、薬剤作用において、パチョリ（ｐｏｇｏｓｔｏｎｅ）は、カンジダ・アルビカンス、クリプトコッカス症（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クロネ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｎｉｇｒｉｃａｎｓ）およびその他の菌に対して生体内において大きな抑制作用を有し、パチョリ（Ｐｏｇｏｓｔｅｍｏｎ  ｃａｂｌｉｎ  （Ｂｌａｎｃｏ）Ｂｅｎｔｈ）からの葉は、黄色ブドウ球菌、白色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の成長に対してある程度の抑制作用を有し、パチョリ（ｐｏｇｏｓｔｏｎｅ）は、ペニシリン等の黴の成長を抑制することができ、経口液用の防腐剤として使用可能であると記録されている。
【００２５】
本発明において、前記原料は、地衣類（Ｌｉｃｈｅｎｅｓ）、サルオガセ類に属するサルオガセ（学術名：Ｕｓｎｅａ  ｄｉｆｆｒａｃｔａ  Ｖａｉｎ）を含む。それは古木の枝、山のアルパインロック上で成長し、頂部から糸状にぶら下がる。「中国薬局方」には、サルオガセ類およびその他の地衣類は、抗菌物質、特に、顕著な抗菌作用を有するウスニン酸を含む。試験管内での実験によれば、ウスニン酸は、肺炎球菌、溶血性連鎖球菌、ジフテリア菌、結核菌に対する強力な抑制作用を有し、黄色ブドウ球菌に対する抑制作用は、上述したものと比較すると弱いものではあるが、グラム陰性菌に対する抑制作用よりは強力であることが示された。
【００２６】
本発明は、主として、紫蘇子，カッコウおよびサルオガセを原料として配合されており、薬効範囲の広い抗菌活性を有する。本発明の抗菌活性は、単一の薬用植物よりも良好で、単一種の薬用植物による制限（ｓｔｒａｉｎ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）を克服し、顕著な静菌作用を示す。
【００２７】
本発明の好適実施例において、前記原料は、紫蘇子を６０〜８０重量部、カッコウを１０〜２０重量部、およびサルオガセをＡ重量部含み、０＜Ａ≦２０である。本発明の三種類の漢方薬材の好適な配合比により、菌の成長を最大に抑制することができる。
【００２８】
本発明の一実施例において、前記原料は、紫蘇子を６０重量部、カッコウを２０重量部、およびサルオガセを２０重量部含む。本発明の別実施例において、前記原料は、紫蘇子を８０重量部、カッコウを１０重量部、およびサルオガセを１０重量部含む。本発明の別実施例において、前記原料は、紫蘇子を７０重量部、カッコウを１５重量部、およびサルオガセを１５重量部含む。
【００２９】
また、本発明は、前記抗菌漢方薬組成物の製造方法を提供し、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合する工程と、エタノール・パーコレーション抽出を行い前記抗菌漢方薬組成物を得る工程とを有する。
【００３０】
本発明の実施例における技術的手段は、漢方薬の抽出における強烈なにおいの発生、有効成分の低抽出率、不純物の大量存在、抗菌範囲の狭窄および強刺激性といった従来の漢方薬抽出工程における問題点を克服することができる。
【００３１】
本発明の実施例において、所定量の紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合し、その後、エタノール・パーコレーションによって抽出を行うことで抗菌漢方薬組成物を得る。
【００３２】
本発明において、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセの内容物は上述したものと同じであって、ここでは繰り返さない。好ましくは、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセは、それぞれ別々に粉砕され、それらの粉体が混合される。好ましくは、前記混合は、紫蘇子、カッコウおよびサルオガセを混合し、水を添加し、６０〜２００メッシュまですり潰し、ｐＨ４〜ｐＨ７に調整する工程である。本発明において、前記「粉砕」、「すり潰し」等は、当業者にとって周知の技術である。本発明の一実施例において、粉砕材料のｐＨはｐＨ５〜ｐＨ６、好ましくはｐＨ５に調整することができる。
【００３３】
本発明の実施例において、ｐＨ値が調整された後、エタノール・パーコレーションによって抽出を行うことで抗菌漢方薬組成物を得ることができる。本発明において、エタノール・パーコレーションによる抽出の前に、リパーゼが添加され酵素分解を行うことが好ましい。リパーゼによる酵素分解によって、刺激性が大幅に低減される。
【００３４】
好ましくは、混合後で抽出前に、本発明の実施例は、リパーゼを使用する酵素分解を更に含み、ここで、酵素活性が５Ｕ／ｇ〜１０Ｕ／ｇ、酵素分解が、４０℃〜６０℃で１時間〜２時間行われる。本発明において、酵素分解に使用されるリパーゼは、市販のものであってよく、好ましくは、５Ｕ／ｇ〜１０Ｕ／ｇの活性を有する。前記酵素分解は、当該分野において一般的に使用されるものであってよく、好適な温度は４５℃〜５５℃である。
【００３５】
本発明の実施例において、エタノールを添加し、エタノール・パーコレーションによる抽出を行い、抗菌漢方薬組成物を得る。本発明において、前記エタノール・パーコレーションは、溶媒としてエタノールを使用し、適度に粉砕された材料をパーコレータに投入し、その上部からエタノールを添加し続け、溶媒が薬剤層を通して下へ流していく過程で薬剤成分を抽出する方法である。本発明では、パーコレーション法を使用することにより、揮発性物質の損失を低減させることができる。
【００３６】
本発明の実施例において、８０ｗｔ％〜９５ｗｔ％のエタノール溶液を抽出溶媒として使用することができる。本発明の一実施例において、前記エタノール溶液の濃度は８０ｗｔ％〜９５ｗｔ％、好ましくは、前記エタノール溶液と、上述した（薬草）原料との質量比は、（２０００〜３０００）：１００であった。好適な抽出時間は、２４時間〜３０時間である。本発明の一実施例において、パーコレーション抽出時間は２４時間であった。
【００３７】
抽出終了後、本発明は、好ましくは、濾過を行い、濾液を収集する工程と、前記濾液を、濃縮、定量、およびエージングの順で処理することで、前記抗菌漢方薬組成物を得る工程とを更に含む。
【００３８】
本発明において前記濾過方法について限定は無く、当該分野における一般的な濾過方法であってよい。本発明の実施例において、濾過で得られた濾液は、低温および減圧の条件下で濃縮されて溶媒を除去し、その後、当該溶媒がジプロピレングリコール又はカプリル／カプリン酸グリセリド、又はその他のオイル、ポリオールに置き換えられて定量を行う。ここで、前記低温減圧濃縮は当業者にとって周知の技術手段である。その温度は好ましくは１００℃以下、より好ましくは５０℃以下である。その減圧は、真空減圧を意味し、通常は、負圧下で減圧が行われる。負圧は、通常、０Ｐａより低く、たとえば、−０．０２ＭＰａである。本発明の実施例において、最終的に、上述した原料の質量の１〜５倍となるように定量することができる。
【００３９】
本発明の実施例において、所定の質量に定量した後、エージングを行い、分層後に濾過を行い、上澄み液を収集することで、天然保存抽出物、即ち、本発明の前記抗菌漢方薬組成物を得る。ここで、前記エージングの温度は−５℃〜１０℃であり、エージング時間は好ましくは１０時間〜２０時間、より好ましくは１２時間〜１５時間である。本発明において、パーコレーション法によれば、揮発性物質の損失が低減される。また、エージングによって一部の不純物を除去することで、小分子物質が良好に保留され、抗菌漢方薬組成物を得ることができる。
【００４０】
本発明において、抗菌漢方薬組成物を得た後、静菌テストを行う。テストの結果から、次のことが示されている。すなわち、本発明において提供される工程によれば、抗菌漢方薬組成物の広範な抑制作用を確保すると共に、当該組成物の着色を大幅に低減させる。本願発明の工程により製造された製品は、良好な安定性を有し、化粧品等の製品に添加して防腐剤として使用することに好適である。
【００４１】
また、本発明は、上記技術的手段にかかる前記抗菌漢方薬組成物を、薬剤、化粧品又は食品の防腐剤とする使用方法を提供する。
【００４２】
薬剤、化粧品又は食品の分野において、前記抗菌漢方薬組成物は、天然の防腐剤として、抗腐食および抗菌作用を有する。ここで、前記菌の種類は、黄色ブドウ菌、大腸菌、緑膿菌、カンジダ・アルビカンスおよびクロコウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）からなる群のうちのいずれか一つ又は複数である。本発明で使用される薬品は、通常、外用皮膚薬や、日常用化粧品等の化粧品である。但し、本発明にかかる抗菌漢方薬組成物の使用方法はそれらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明において提供される化粧品は、前記抗菌漢方薬組成物を含む。本発明では、化粧品に抗菌漢方薬組成物を添加することによって、化粧品中の微生物の繁殖が効果的に抑制され、化粧品の陳列期限が延長されると共に、製品の安全性が保障され、消費者が微生物汚染を受けた製品を使用するによって起こされる感染のおそれは回避される。
【００４４】
本発明の実施例において、前記化粧品は、水性成分、油性成分、前記抗菌漢方薬組成物および機能性成分を含む。ここで、好ましくは、前記水性成分は、水、グリセロール、キレート剤、および水溶性乳化剤を含み、前記油性成分は、植物油、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、および水中油型乳化剤を含む。本発明において前記機能性成分は、非限定的具体例として、しわ取り成分、保湿成分、および美白成分を含む。本発明の一実施例において、前記機能性成分はコラーゲンと大麦β−グルカンとを含む。
【００４５】
本発明の好適実施例において、前記化粧品成分は、水、グリセロール、キレート剤、および水溶性乳化剤、植物油、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、および水中油型乳化剤、上述した抗菌漢方薬組成物、および機能性成分、を含む。
【００４６】
ここで、前記化粧品は、好ましくは４ｗｔ％〜１０ｗｔ％のグリセロール、より好ましくは５％のグリセロールを含む。前記化粧品は、好ましくは０．０１ｗｔ％〜０．０５ｗｔ％のキレート剤を含み、前記キレート剤は、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム等である。前記化粧品は、好ましくは、０．１ｗｔ％〜０．５ｗｔ％の水溶性乳化剤を含み、前記水溶性乳化剤は、例えば、アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリドン（ＶＰ）コポリマーであり、当該コポリマーは、ＡＶＣと略すことができる。
【００４７】
前記化粧品は、好ましくは、５ｗｔ％〜１０ｗｔ％の植物油、より好ましくは８ｗｔ％の植物油を含む。本発明の一実施例において、前記植物油は椿種子油であった。前記化粧品は、好ましくは、１ｗｔ％〜５ｗｔ％のＣ１６〜Ｃ１８アルコール、より好ましくは、２ｗｔ％〜４ｗｔ％のＣ１６〜Ｃ１８アルコールを含む。前記化粧品は、好ましくは、１ｗｔ％〜２ｗｔ％の水中油型乳化剤を含み、前記水中油型乳化剤がＡ−１６５乳化剤であってもよい。
【００４８】
本発明において、前記化粧品は、好ましくは、０．５ｗｔ％〜１ｗｔ％の前記抗菌漢方薬組成物を含む。前記化粧品は、好ましくは、５ｗｔ％−１０ｗｔ％の機能性成分を含む。本発明の一実施例において、前記化粧品は、抗皺機能を有する、２％ｗｔのコラーゲンおよび５ｗｔ％のオートβ−グルカンを含み、抗皺機能を有する。本発明の一実施例において、化粧品が１００ｗｔ％となるように水の用量を調整している。
【００４９】
本発明において、前記化粧品の製造方法は特に限定されるものではなく、好ましくは、
水、グリセロール、およびキレート剤を混合し加熱し、水溶性乳化剤を添加して水相を得る工程と、
水中油型乳化剤、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコールおよび植物油を混合し加熱して油相を得る工程と、
油相を水相に添加し、均質化した後、抗菌漢方薬組成物、コラーゲン、および大麦β−グルカンを添加してかかる製品を得る工程とを含む。
【００５０】
上述の方法において、水相を調製するとき、８０℃〜９０℃の温度まで加熱することが好ましい。また、水相を調製するとき、撹拌を行うことが好ましく、撹拌の速度は、最高３００ｒｐｍ／分であってよい。油相を調製するとき、８０℃〜９０℃の温度まで加熱することが好ましい。また、油相を調製するとき、撹拌を行うことが好ましく、撹拌の速度は、最高３００ｒｐｍ／分であってよい。
【００５１】
本発明において、前記均質化は、当業者にとって周知の技術である。好ましくは、前記均質化速度は５００ｒｐｍ／分であり、均質化時間は５分間である。均質化終了後、本発明の実施例において、攪拌しながら温度を４０℃〜５０℃に低下させることが好ましい。本発明の実施例では、好ましくは攪拌条件下で、上記抗菌漢方薬組成物および機能性成分が添加される。攪拌速度は５００ｒｐｍ／分とすることができ、温度を更に室温にまで低下させて前記化粧品を得る。
【００５２】
前記化粧品を得た後、抗腐食試験を行った。その結果、前記化粧品サンプルは、黄色ブドウ菌、大腸菌、緑膿菌、カンジダ・アルビカンスおよび黒色こうじ菌の抗腐食試験において極めて優れていることが示された。
【００５３】
本発明をよりよく理解するために、以下、実施例を参照して本発明にかかる抗菌漢方薬組成物、その製造方法および使用方法を説明する。
【００５４】
下記例では、使用したリパーゼは食品グレードのものであってＺｈｅｎｇｚｈｏｕ  Ｒｕｉｊｉａ  Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．から購入され、椿種子油は、その材料名がＤｏｎｇｂａｃｋ（Ｔｓｕｂａｋｉ）Ｏｉｌであり、ＢＩＯＳＰＥＣＴＲＵＭ（韓国）から購入され、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコールは、その製品型番がＬａｎｅｔｔｅ  ＭＹであり、Ｋｅｎｉｎｇ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．（中国）から購入され、コラーゲンはＷｕｈａｎ  Ｂｉｏｃａｒ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄから購入され、大麦β−グルカンは、北京Ｈｕａ  Ｘｉａ  Ｚｈｏｎｇ  Ｆａｎｇ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．から購入されたものである。
【００５５】
実施例１
６０ｇの紫蘇子と２０ｇのカッコウと２０ｇのサルオガセとを別々に粉砕し、均一に混合し、１００ｇの水を添加し前記材料を、６０〜２００メッシュのサイズが得られるまですり潰し、前記システムのｐＨ値をｐＨ５に調整した。酵素活性が１０Ｕ／ｇに達するまでリパーゼを添加し、酵素分解を４０℃で２時間行った。２０００ｇの８０ｗｔ％のエタノール溶液を添加し、パーコレーション法により抽出を行った。パーコレーション抽出を２４時間行った後、濾過を行い、濾液を収集した。溶媒を低温減圧濃縮によって除去し、カプリル／カプリン酸グリシドによって置換し、２００ｇに定量した。エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、上清液を収集して前記天然防腐剤抽出物（抗菌漢方薬組成物）を得た。
【００５６】
実施例２
８０ｇの紫蘇子と、１０ｇのカッコウと１０ｇのサルオガセとを別々に粉砕し、よく混合し、１００ｇの水を添加し前記材料を、６０−２００メッシュのサイズが得られるまですり潰し、前記システムのｐＨを５に調節した。酵素活性が５Ｕ／ｇに達するまでリパーゼを添加し、酵素分解を６０℃で１時間行った。３０００ｇの  ９５ｗｔ％のエタノール溶液を、パーコレーション抽出のために添加し、これを２４時間行った。フィルタリングを行い、フィルタリング済溶液を収集した。溶媒を低温減圧濃縮で除去し、カプリル／カプリン酸グリセリドに置換して、２００ｇに定量した。エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、上清液を収集して前記天然防腐剤抽出物（抗菌漢方薬組成物）を得た。
【００５７】
実施例３
７０ｇの紫蘇子と１５ｇのカッコウと１５ｇのサルオガセとを別々に粉砕し、均一に混合させ、１００ｇの水を添加して前記原料を６０〜２００メッシュのサイズが得られるまですり潰し、前記システムのｐＨ値をｐＨ５に調整した。酵素活性が５Ｕ／ｇに達するまでリパーゼを添加し、酵素分解を６０℃で１時間行った。３０００ｇの９５ｗｔ％のエタノール溶液を添加し、パーコレーション抽出を２４時間行った。濾過を行い、濾液を収集した。低温減圧濃縮で溶液を除去した後、カプリル／カプリン酸グリシドに置換し、２００ｇに定量した。エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、上清液を収集して前記天然防腐剤抽出物（抗菌漢方薬組成物）を得た。
【００５８】
比較例１
（１）１００ｇの紫蘇子を粉砕し、３０００ｇの９５ｗｔ％エタノール溶液をパーコレーション抽出のために添加した。
（２）パーコレーション抽出を２４時間行った後、濾過を行い、濾液を収集した。
（３）溶媒を低温減圧濃縮によって除去し、カプリル／カプリン酸グリセリドに置換し、２００ｇに定量した。
（４）エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、上清液を収集して紫蘇子抽出物を得た。
【００５９】
比較例２
（１）１００ｇのカッコウを粉砕し、３０００ｇの９５ｗｔ％エタノール溶液をパーコレーション抽出のために添加した。
（２）パーコレーション抽出を２４時間行った後、濾過を行い、濾液を収集した。
（３）溶媒を低温減圧濃縮によって除去し、カプリル／カプリン酸グリセリドに置換し、２００ｇに定量した。
（４）エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、濾液を収集してカッコウ抽出物を得た。
【００６０】
比較例３
（１）１００ｇのサルオガセを粉砕し、３０００ｇの９５ｗｔ％エタノール溶液をパーコレーション抽出のために添加した。
（２）パーコレーション抽出を２４時間行った後、濾過を行い濾過された溶液を収集した。
（３）溶媒を低温減圧濃縮によって除去し、カプリル／カプリン酸グリセリドに置換し、２００ｇに定量した。
（４）エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、上清液を収集してサルオガセ抽出物を得た。
【００６１】
実施例４
（１）８０ｇの紫蘇子と１０ｇのカッコウと１０ｇのサルオガセとを別々に粉砕し、均一に混合させた。３０００ｇの９５ｗｔ％エタノール溶液をパーコレーション抽出のために添加した。
（２）パーコレーション抽出を２４時間行った後、濾過を行い、濾過された溶液を収集した。
（３）溶媒を低温減圧濃縮によって除去し、カプリル／カプリン酸グリセリドに置換し、２００ｇに定量した。
（４）エージングを−１０℃で１２時間行い、分層した後、濾過を行い、上清液を収集して前記天然防腐剤抽出物（抗菌漢方薬組成物）を得た。
【００６２】
実施例５：静菌テスト
【００６３】
１．テスト種
黄色ブドウ菌（ＡＴＣＣ  ８７３９）、大腸菌（ＡＴＣＣ  ６５３８）、緑膿菌（ＡＴＣＣ  ９０２７）、カンジダ・アルビカンス（ＡＣＴＴ  １０２３１）および黒色こうじ菌（ＡＴＣＣ  １６４０４）。
【００６４】
２．培養培地
ＴＳＢ固体培地：１０ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌのイースト抽出物、１５ｇ／Ｌの寒天を蒸留水中に溶解させ、ｐＨ値をｐＨ７．２±０．２に調整し、１１５℃で２０分間高圧滅菌を行った。ＴＳＢ液体培地：１０ｇ／Ｌのペプトン、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ、２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、３ｇ／Ｌのイースト抽出物を蒸留水中で溶解させ、ｐＨ値をｐＨ７．２±０．２に調整し、１１５℃で２０分間高圧滅菌を行った。
【００６５】
ＳＤＢ固体培地：１０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース、２．５ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５ｇ／Ｌのイースト抽出物、１５ｇ／Ｌの寒天を蒸留水中に溶解させ、１１５℃で２０分間高圧滅菌を行った。ＳＤＢ液体培地：１０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース、３ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、５ｇ／Ｌのイースト抽出物を蒸留水中に溶解させ、１１５℃で２０分間高圧滅菌を行った。
【００６６】
３．菌懸濁液の調製と注入
１００μＬのグリセリンで保存した黄色ブドウ菌、大腸菌、緑膿菌を、ＴＳＢ固体培地に塗布して３７℃で２日間培養した。懸濁液を、生理食塩水によって再懸濁して菌懸濁液を得て、平板培養法によって計数した。テスト菌の濃度を１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍＬに調整した。
【００６７】
１００μＬのカンジダ・アルビカンスと黒色こうじ菌を、ＳＤＢ固体培地に塗布して３０℃で２日間培養した。懸濁液を、生理食塩水によって再懸濁して菌懸濁液を得て、平板培養法によって計数した。テスト菌の濃度を１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍＬに調整した。
【００６８】
４．サンプル静菌テスト
【００６９】
４．１円筒平板法
【００７０】
ＴＳＢ又はＳＤＢ固体培地を培養皿に注いだ。凝固後、１００μＬの前記テスト菌を、前記培養培地に均一に塗布した。二つの滅菌オックスフォードカップ（ｓｔｅｒｉｌｅ  Ｏｘｆｏｒｄ  ｃｕｐｓ）［内径（６．０±０．１）ｍｍ、外径（８．０±０．１）ｍｍ、高さ（１０．０±０．１）ｍｍ］を、前記培地上に等距離に置いた。テスト対象の２００μＬサンプルを前記カップ中に注入し、生理食塩水又は５０μＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルフィド）を含有する食塩水を対照とした。インキュベータ内での３７℃又は３０℃、２日間のインキュベーション後、薬剤の抑制ゾーンをルーラで測定し平均を採った。
【００７１】
４．２マイクロプレート法
１００μＬのサンプル（初期濃度）をマイクロウェルに添加し、１ｘ１０５ＣＦＵ／ｍＬの菌濃度の前記テスト菌を含む２ｘＴＳＢ又は２ｘＳＤＢ液体培地１００μＬを添加し混合してテストサンプルを調製した。即ち、テストサンプルのテスト濃度は、初期濃度の５０ｗｔ％であった。インキュベータ内での３７℃又は３０℃、２日間のインキュベーション後、菌成長の有無が観察された。結果判定の前提は、成長の対照が良好であること、および、ブランク対照において、菌成長の不存在が明りょうであったことである。
【００７２】
５．最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）テスト
５．１  黄色ブドウ菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）、大腸菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）、緑膿菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）、カンジダ・アルビカンスの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）の測定方法は以下に示す。
（１）サンプルの調製  テストサンプルを生理食塩水でテスト濃度にまで希釈する。
（２）菌懸濁液の調製  菌懸濁液を２ｘＴＳＢ又は２ｘＳＤＢ液体培地で１０５ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度にまで希釈する。
（３）培養と結果読み取り  １００μＬの菌懸濁液と１００μＬの薬剤サンプルとをマイクロウェルに添加する。菌を含まない陰性対照と薬剤を含まない正常成長対照を設ける。各薬剤に対しては三つの並行実験（ｐａｒａｌｌｅｌ）を設け、平均値を採る。３７℃又は３０℃の湿度室で培養、４８時間後結果を観察し、直接法でデータを取得する。結果判定の前提は、成長対照が良好、ブランク対照において菌成長不存在が明りょうであること、他のウェルでは、薬剤濃度勾配の増大に従い、菌の成長が抑制されることであった。
【００７３】
５．２  黒色こうじ菌の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ値）の測定テスト
【００７４】
円筒平板法を使用した。ＳＤＢ固体培地を培養皿に注入した。凝固後、１００μＬの黒色こうじ菌（１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を、前記培養培地に均一に塗布した。三つの滅菌オックスフォードカップ［内径（６．０±０．１）ｍｍ、外径（８．０±０．１）ｍｍ、高さ（１０．０±０．１）ｍｍ］を、前記培地上に等距離に置いた。濃度が異なるサンプル（生理食塩水で希釈）を２００μＬ前記カップ中に注入した。また、測定サンプルを含まない正常成長対照と生理食塩水対照を設ける。結果測定の前提は、正常成長対照および生理塩水対照においては、菌成長が良好であること、他のウェルでは、薬剤濃度勾配が増大につれて菌の成長が抑制されることであった。
【００７５】
単一の漢方薬と比較した本発明の前記製品の静菌作用は表１に示す。表１は、実施例１〜４と比較例１〜３のＭＩＣ値である。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
表１は、１００μＬ／ｍＬの濃度内において、紫蘇子はカンジダ・アルビカンスに対して抗菌作用を有さず、緑膿菌に対する抗菌作用は弱く、黄色ブドウ菌に対する抗菌作用は一般的レベルにあることを示している。１００μＬ／ｍＬの濃度内において、カッコウは大腸菌、緑膿菌およびカンジダ・アルビカンスに対して抗菌作用を持たない。１００μＬ／ｍＬの濃度内において、サルオガセは、大腸菌、緑膿菌および黒色こうじ菌に対して抗菌作用を持たず、黄色ブドウ菌に対する抗菌作用は一般的レベルにあり、カンジダ・アルビカンスに対する抗菌作用は弱い。
【００７８】
上述したことから、第１に、本発明が、植物間における合理的な調合作用によって広い範囲の抗菌作用を達成するものであることが判る。第２に、各種菌の単体についても、調合後の組成物の抗菌作用は、単一の植物の抗菌作用よりも優れ、１＋１が２以上となる効果が達成され、植物間の抗菌作用の相乗効果を発揮している。
【００７９】
本発明にかかる組成物は、その抗菌作用顕著なものであり、単一の薬草よりも良好な抗菌作用を有し、単一の薬草による菌種における制限を解消し、天然防腐剤としての使用に適したものである。また、本発明の三種類の漢方薬草の比率は、菌成長の抑制を最大化することができる。又、本発明の工程は、組成物の広範な抗菌作用を維持すると共に、製品の着色を大幅に低減し、製品の安定性が優れており、化粧品に添加して防腐剤としての使用に好適なものである。
【００８０】
実施例６
１．配合
実施例１で得られた天然抗菌剤                              １％
椿種子油                                                  ８％
Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール                                  ２％
Ａ−１６５乳化剤                                      １．５％
ＡＶＣ（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリジン（ＶＰ）コポリマー                                                  ０．２％
グリセロール                                              ５％
コラーゲン                                                ２％
大麦β−グルカン（含有率１％）                            ５％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム                  ０．０２％
水                                  １００％まで（１００ｇまで）
【００８１】
２．調製方法
（１）水、グリセロールおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを反応器に添加し、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、ＡＶＣを徐々に添加し、水相を得た。
（２）Ａ−１６５、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、椿種子油を反応器に加え、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、油相を得た。
（３）工程（２）で得られた油相を工程（１）で得られた水相に添加し、５分間均質化（速度５００ｒｐｍ／分）し、攪拌し４５℃まで冷却する。
（４）実施例１で得られた天然抗菌剤、コラーゲン、および大麦β−グルカンを工程（３）の冷却後の系に添加し、攪拌（速度５００ｒｐｍ／分）し、室温にまで冷却して化粧品を得た。
【００８２】
実施例７
１．配合 
実施例２で得られた天然抗菌剤                              １％
椿種子油                                                  ８％
Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール                                  ２％
Ａ−１６５乳化剤                                      １．５％
ＡＶＣ（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリジン（ＶＰ）コポリマー                                                  ０．２％
グリセロール                                              ５％
コラーゲン                                                ２％
大麦β−グルカン（含有率１％）                            ５％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム                  ０．０２％
水                                  １００％まで（１００ｇまで）
【００８３】
２．調製方法
（１）水、グリセロールおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを反応器に添加し、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、ＡＶＣを徐々に添加し、水相を得た。
（２）Ａ−１６５、Ｃ１６−１８アルコール、椿種子油を前記反応器に加え、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、油相を得た。
（３）工程（２）で得られた油相を工程（１）で得られた水相に添加し、５分間均質化（速度５００ｒｐｍ／分）し、攪拌し４５℃まで冷却する。
（４）実施例２の天然抗菌剤、コラーゲン、および大麦βグルカンを工程（３）の冷却後の系に添加し、攪拌（速度５００ｒｐｍ／分）し、室温にまで冷却して化粧品を得た。
【００８４】
実施例８
１．配合
実施例１で得られた天然抗菌剤                        ０．５％
１，２−オクタンジオール                            ０．２％
椿種子油                                                ８％
Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール                                ２％
Ａ−１６５乳化剤                                    １．５％
ＡＶＣ（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリジン（ＶＰ）コポリマー                                                ０．２％
グリセロール                                            ５％
コラーゲン                                              ２％
大麦β−グルカン（含有率１％）                          ５％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム              ０．０２％
水                                １００％まで（１００ｇまで）
【００８５】
２．調製方法
（１）水、グリセロールおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを反応器に添加し、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、ＡＶＣを徐々に添加し、水相を得た。
（２）Ａ−１６５乳化剤、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、椿種子油を前記反応器に添加し、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、油相を得た。
（３）工程（２）で得られた油相を工程（１）で得られた水相に添加し、５分間均質化（速度５００ｒｐｍ／分）し、攪拌し４５℃まで冷却した。
（４）実施例１の天然抗菌剤、１，２−オクタンジオール、コラーゲン、およびオーツβグルカンを工程（３）で得られた冷却後の系に添加し、攪拌（速度５００ｒｐｍ／分）し、室温にまで冷却して化粧品を得た。
【００８６】
比較例４
【００８７】
１．配合
実施例１の天然抗菌剤                                ０．５％
椿種子油                                                ８％
Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール                                ２％
Ａ−１６５乳化剤                                    １．５％
ＡＶＣ（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリジン（ＶＰ）コポリマー                                                ０．２％
グリセロール                                            ５％
コラーゲン                                              ２％
大麦β−グルカン（含有率１％）                          ５％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム                  ０．０２％
水                                １００％まで（１００ｇまで）
【００８８】
２．調製方法
（１）水、グリセロールおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを反応器に加え、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、ＡＶＣを徐々に添加し、水相を得た。
（２）Ａ−１６５乳化剤、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、椿種子油を前記反応器に添加し、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、油相を得た。
（３）工程（２）で得られた油相を工程（１）で得られた水相に添加し、５分間均質化（速度５００ｒｐｍ／分）し、攪拌し４５℃に冷却した。
（４）実施例１の天然抗菌剤、コラーゲン、および大麦β−グルカンを工程（３）で得られた冷却後の系に添加し、攪拌（速度５００ｒｐｍ／分）し、室温にまで冷却して化粧品を得た。
【００８９】
比較例５
【００９０】
１．配合
１，２−オクタンジオール                            ０．２％
椿種子油                                                ８％
Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール                                ２％
Ａ−１６５乳化剤                                    １．５％
ＡＶＣ（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリジン（ＶＰ）コポリマー                                                ０．２％
グリセロール                                            ５％
コラーゲン                                              ２％
大麦β−グルカン（含有率１％）                          ５％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム                ０．０２％
水                                １００％まで（１００ｇまで）
【００９１】
２．調製方法
（１）水、グリセロールおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを反応器に添加し、８５℃まで加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、ＡＶＣを徐々に添加し、水相を得た。
（２）Ａ−１６５乳化剤、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、椿種子油を反応器に加え、８５℃まで加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、油相を得た。
（３）工程（２）で得られた油相を工程（１）で得られた水相に添加し、５分間均質化（速度５００ｒｐｍ／分）し、攪拌し４５℃まで冷却した。
（４）１，２−オクタンジオール、コラーゲン、および大麦β−グルカンを工程（３）の冷却後の系に添加し、攪拌（速度５００ｒｐｍ／分）し、室温にまで冷却して化粧品を得た。
【００９２】
実施例９
１．配合
実施例４の天然抗菌剤                                    １％
椿種子油                                                ８％
Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール                                ２％
Ａ−１６５乳化剤                                    １．５％
ＡＶＣ（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ビニルピロリジン（ＶＰ）コポリマー                                                ０．２％
グリセロール                                            ５％
コラーゲン                                              ２％
大麦β−グルカン（含有率１％）                          ５％
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム                  ０．０２％
水                                １００％まで（１００ｇまで）
【００９３】
２．調製方法
（１）水、グリセロールおよびエチレンジアミン四酢酸二ナトリウムを反応器に添加し、８５℃に加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、ＡＶＣを徐々に添加し、水相を得た。
（２）Ａ−１６５乳化剤、Ｃ１６〜Ｃ１８アルコール、椿種子油を前記反応器に添加し、８５℃まで加熱し、３００ｒｐｍ／分の速度で攪拌し、油相を得た。
（３）工程（２）で得られた油相を工程（１）で得られた水相に添加し、５分間均質化（速度５００ｒｐｍ／分）し、攪拌し４５℃に冷却した。
（４）実施例４の天然抗菌剤、コラーゲン、および大麦β−グルカンを工程（３）で得られた冷却後の系に添加し、攪拌（速度５００ｒｐｍ／分）し、室温にまで冷却して化粧品を得た。
【００９４】
実施例１０：抗腐食試験（チャレンジテスト）
１．抗腐食試験のための接種の手段と量
接種のために混合菌を使用した。黄色ブドウ球菌、大腸菌、および緑膿菌を、菌濃度が１０５〜１０６ＣＦＵ／ｇ又は１０５〜１０６ＣＦＵ／ｍＬになるようにテストサンプルに植え込んだ。カンジダ・アルビカンスと黒色こうじ菌の接種濃度は１０４ＣＦＵ／ｇ又は１０４ＣＦＵ／ｍＬであり、それぞれ三つの並行実施例を設け、生理食塩水をブランク対照として使用した。
【００９５】
２．抗腐食試験の分離検出
植え込み後のサンプルを、０時間、４８時間、７日、１４日、２１日および２８日という特定の時間に分離し検出した。サンプリング後、実験の必要性に応じて、サンプルを生理食塩水で希釈した後、１００μＬの希釈済みサンプルをＴＳＢおよびＳＤＢ培地プレート上に塗布し、２８℃±１℃又は３６℃±１℃での培養後にコロニーを計数した。
【００９６】
３．判定基準
菌が７日目で９９．９％減少し、黒色こうじ菌とカンジダ・アルビカンスがそれぞれ９０％減少し、かつ、２８日間以内に減少し続ける場合には、抗腐食試験をクリアすることを意味する。
【００９７】
前記混合菌の三つの並行実験のいずれかでは、微生物の平均値が７日目に１００ＣＦＵ／ｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）以下に減少し、三つの並行実験のすべてでは、２８日目に０ＣＦＵ／ｇ（ＣＦＵ／ｍＬ）又は＜１０ＣＦＵ／ｇ（ＣＦｕ／ｍＬ）に減少する場合、抗腐食効果が極めて優れたものとみなされた。抗腐食試験の結果は表２〜７に示され、表２〜７は、０時間、４８時間、７日、１４日、２１日および２８日の順で抗腐食試験の結果を示している。
【００９８】
本発明の用途に関する４つの実施例（実施例６〜９）と比較例（比較例４および５）とのサンプルの抗腐食試験において、４つの実施例では、黄色ブドウ球菌，大腸菌、緑膿菌、カンジダ・アルビカンスおよび黒色こうじ菌に対して、７日目に、菌濃度がいずれも１０ＣＦＵ／ｇ未満であり、２８日目に、菌濃度が相変わらず１０ＣＦＵ／ｇ未満であったことから、４つの実施例では、黄色ブドウ球菌、大腸菌、緑膿菌、カンジダ・アルビカンスおよび黒色こうじ菌に対する抗腐食試験において極めて優れた性能を示していることが判った。
【００９９】
表２は、０時間の抗腐食試験（チャレンジテスト）の結果を示す。
【表２】
0006626902.tif 000003
【０１００】
表３は、４８時間後の抗腐食試験の結果を示す。
【表３】
0006626902.tif 000004
【０１０１】
表４は、７日間抗腐食試験の結果を示す。
【表４】
0006626902.tif 000005
【０１０２】
表５は、１４日間抗腐食試験の結果を示す。
【表５】
0006626902.tif 000006
【０１０３】
表６は、２１日間抗腐食試験の結果を示す。
【表６】
0006626902.tif 000007
【０１０４】
表７は、２８日間抗腐食試験の結果を示す。
【表７】
0006626902.tif 000008
【０１０５】
実施例１１：反復皮膚刺激性試験
１．露出方法
１６匹の普通のニュージーランド・ラビットを４つのグループに分けた。各グループが４匹からなり、オスとメスとが半々である。試験前に、実験動物の脊椎の後ろの両側の毛を除去し、除毛範囲は、左右側の約３ｃｍ×３ｃｍであり、受検物質を０．５ｇ取り、動物の左側の皮膚に塗布し、塗布面積は、２．５ｃｍ×２．５ｃｍである。１日には、１回の塗布を行い、当該塗布は、連続して１４日間行う。他方側の皮膚は、ブランク対照とする。二日目から、塗布前に毛の除去を行い、純水で残量の受検物質を洗浄し、対照群に対して同じ処理を行う。一時間後に結果を観察する。
【０１０６】
２．結果の観察
皮膚の反応を自然光の下で観察し、皮膚紅斑と浮腫とを表８（皮膚刺激性試験の評価基準）に従って採点し、当該観察を１４日間連続して行う。
【０１０７】
３．結果の判定
各日に各動物の平均得点を下記式に従って計算し、刺激強度を評価した。
各日に各動物の平均得点＝（Σ紅斑と浮腫／テスト動物）／１４
【０１０８】
表８は、皮膚刺激性反応の評価基準を示す。
【表８】
0006626902.tif 000009
【０１０９】
４．各グループのサンプルのテスト結果を表９〜１２に示す。
【０１１０】
【表９】
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【０１１１】
【表１０】
0006626902.tif 000011
【０１１２】
【表１１】
0006626902.tif 000012
【０１１３】
【表１２】
0006626902.tif 000013
【０１１４】
用途に係る４つの実施例（実施例６〜９）の比較から、酵素分解の工程に基づいて調製された天然抗菌剤は、酵素分解を受けることのない条件下で調製された抗菌剤と比べて遥かに刺激が少ないことが判った。すなわち、酵素分解は抗菌剤の刺激性を大幅に低減することができることが示される。
【０１１５】
実施例１２：ヒト皮膚のパッチテスト
１．パッチテストの方法：
前記テストサンプルを約０．０２０ｇ〜０．０２５ｇクローズドバッチ法で認可パッチテスト装置に使用し、外用テープを対象体の前腕側に取り付けた。２４時間後テストサンプルを取り外し、テストサンプルを除去してから３０分経過後、くぼみが消えた後に皮膚の反応を観察した。『化粧品衛生基準」（２００７年版）の皮膚反応グループ分け基準に従って結果を記録した。
２．結果の評価：
表１３（皮膚副作用グループ分け基準）に示されたグループ分け基準に従い、反応結果を記録する。その結果を表１４に示す。すなわち、表１４は、実施例６〜９のサンプルによるヒト皮膚パッチテストの結果を表１４に示す。
【０１１６】
【表１３】
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【０１１７】
【表１４】
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【０１１８】
表１４に示された各グループのヒト皮膚のパッチテストの結果から、下記のことが示された。即ち、実施例６〜８では、３０名の受験者の皮膚はいずれも、陰性反応を示しており、実施例９では、５名の場合に疑いが存在し、かすかな紅斑のみを示す（評価級数：０級）。『化粧品衛生規範』（２００７年版）のヒト皮膚のパッチテストの判断基準に基づき、実施例６〜８により得られたサンプルは、人の皮膚に対して不良な反応を示していない。これに対して、実施例９で得られたサンプルには、疑わしい反応が見られている。これにより、本願発明にかかる酵素分解の意義をより説明することができた。
【０１１９】
以上は、本発明の好適実施例に過ぎず、当業者によって、本発明の範囲内に属するとみなされるべき本発明の趣旨から逸脱することなく複数の改変および修飾を行うことが可能であることが明記される。