(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞由来の標的細胞内含有物を抽出する装置であって：
（ａ）ｘｙｚコントローラに搭載され、ナノピペットの内部の第１疎水性電解液と共に用いるために適応させた第１電極に取り付けられたナノピペットと；
（ｂ）ナノピペットの外側にあり、細胞の外側に接触する第２の異なる電解液と接触するように配置し、適応させた第２電極と；
（ｃ）電流検出回路および電圧制御回路と；を備え、前記電流検出回路は電極間のイオン電流を検出し、前記電圧制御回路は、所定の時間で第１電極と第２電極との間の電圧を逆転することにより、液体のナノピペットへの流入及び流出を制御し、
（ｄ）前記装置に対して、
前記電流検出装置が感知したイオン電流の変化に応じて操作させ、
前記電圧制御回路を用いて、第１バイアス電圧を提供して前記ナノピペット内で第１電解液を保持させ、
前記電圧制御回路を用いて、第２の異なるバイアス電圧を提供して細胞内から前記ナノピペット内への標的細胞内含有物の流入を引き起こさせ、前記標的細胞内含有物は、細胞小器官、細胞小器官含有物、または細胞質内含有物を含み、
前記電圧制御回路を用いて、第３の異なるバイアス電圧を提供して前記ナノピペットから前記標的細胞内含有物の流出を引き起こさせる、命令とを備える、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、前記ｘｙｚコントローラは、サブミクロンのｘステップ及びｙステップでナノピペットを機械的に移動させ、かつ、細胞に向かう、または離れるｚ方向に前記ナノピペットを移動させるためにナノピペットに取り付けられ、前記ｘｙｚコントローラはユーザが定義した制御に従って前記機械的な移動を制御する電子制御を有し、前記電圧制御回路は、前記ｘｙｚコントローラが細胞内にナノピペットの先端を位置させた際に電圧を逆にする、装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置であって、前記ナノピペットのｚ方向は第１電極および第２電極の間を流れるイオン電流により生成される信号によって制御される、装置。
【請求項４】
請求項１に記載の装置であって、前記第１電極は、銀製である、装置。
【請求項５】
請求項１に記載の装置であって、前記第１電極は、銀テトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（AgTBACI）である、装置。
【請求項６】
請求項１に記載の装置であって、前記第１電解液は、疎水性液体およびイオン性物質を有する、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置であって、前記疎水性液体は１−２ジクロロエタンであり、イオン性物質はボレートである、装置。
【請求項８】
請求項７に記載の装置であって、前記ボレートはテトラヘキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）である、装置。
【請求項９】
請求項１に記載の装置であって、該ナノピペットは石英製である、装置。
【請求項１０】
個別の細胞から標的細胞内含有物を抽出する方法であって、
（ａ）標的細胞内含有物を有する少なくとも１個の細胞を含む溶液を抽出用に用意するステップと；
（ｂ）バイアス電圧を生成するために、ｘｙｚコントローラ、内部電極および外部電極に連結され、さらに、疎水性溶液を含み先端を有するナノピペットを有するナノピペットSICM（走査型イオンコンダクタンス顕微鏡）装置を提供するステップと；
（ｃ）ナノピペットSICM装置を操作して、ナノピペットの先端を流れるイオン電流の変化を感知することで、前記１個の細胞に接近するステップと；
（ｄ）内側電極と外側電極との間に正の電圧を生成し、細胞内への挿入の間、液体がナノピペット内の疎水性溶液に入るのを防止するステップと；
（ｅ）ナノピペットを位置づけ、前記標的細胞内含有物を含む細胞の所定場所に貫通させ、その先端が細胞の所定場所にあるように細胞内に挿入するステップと；
（ｆ）標的細胞内含有物をナノピペットに流入させ抽出するために、内部電極と外部電極との間の電圧を調整するステップであって、前記標的細胞内含有物は、細胞小器官、細胞小器官含有物、または細胞質内含有物を含むステップと；
（ｇ）標的細胞内含有物がナノピペットから出るのを防止するため、電圧をさらに調節するステップと；
（ｈ）電圧をさらに調節して、抽出した標的細胞内含有物をサンプル容器に流出させるステップと；
（ｉ）抽出した標的細胞内含有物を分析するステップであって、抽出した前記標的細胞内含有物は、細胞小器官、細胞小器官含有物、または細胞質内含有物を含むステップと；
を備える方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記イオン電流の変化は、イオン電流の降下である、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、抽出した該標的細胞内含有物が、核酸またはタンパク質を含む標的細胞質内含有物を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、前記核酸はRNAを含む方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記標的細胞内含有物は細胞小器官含有物を含み、該細胞小器官含有物はミトコンドリアDNAである方法。
【請求項１５】
請求項１０に記載の方法であって、前記電圧は
（ａ）標的細胞内含有物をナノピペット内に流入させる−１００ｍＶ〜−１０００ｍＶ；
（ｂ）流入を停止させ、かつ、ナノピペットからの流出を防止する１００ｍＶ〜５００ｍＶ；
（ｃ）抽出した標的細胞内含有物を流出させる＋０．５Ｖ〜２Ｖ；
の一以上である、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ステップ（ａ）での流入が１秒〜５秒間続く方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法であって、核酸保存緩衝液を含むサンプル容器内に流出させる、方法。
【請求項１８】
請求項１０に記載の方法であって、抽出した標的細胞内含有物が単一ミトコンドリアに由来するDNAであり、ミトコンドリアDNAのシーケンスの一部を決定するステップをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１３年３月４日に出願された米国仮特許出願第６１／７８１８４１号に基づく優先権を主張し、前掲米国仮特許出願の内容全体をここに、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
〔政府支援の陳述〕
【０００２】
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により助成を受けた契約番号第ＨＧ０００２０５号および米国国立がん研究所により助成を受けた契約番号第Ｕ５４ＣＡ１４３８０３号の下、政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に対し一定の権利を有する。
〔配列表、コンピュータプログラム、コンパクトディスクについて〕
【０００３】
この出願には、ASCIIテキストファイルで提出され、その全体をここに、本明細書の一部を構成するものとして援用する配列表を含む。このテキストファイルは、２０１４年２月１８日に作成し、「482_35_1_PCT_Seq_List.txt」と名付けた。そのファイルの大きさは７１７バイトである。
【技術分野】
【０００４】
本発明は、細胞内含有物、特にミトコンドリアDNAの単一細胞抽出のためのナノデバイス分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
下記に記載するのは本発明の特定の態様に関する背景情報である。これらは、［発明を実施するための形態］において言及する、ただし、詳細に記載しているとは限らない、技術的特徴に関するものである。つまり、本発明で用いる個別の組成物または方法は、下記に記載する刊行物および特許において詳細に記載されており、これは、当業者が、特許請求した本発明の特定の態様を構成するまたは用いる際にさらなる手引きとすることができる。下記の考察は、記載する特許または刊行物との関連性、またはその先行技術効果を容認するものとして理解するべきではない。
【０００６】
人体内の生理学的および病理学的プロセスは、動的微小環境のコンテキスト内で複雑な細胞同士の相互作用によって管理されている。細胞の生体分子分析は、クローン集団細胞が同一の動きをするという仮説の下、伝統的に実施されてきた。本仮定は実験的な証拠があったわけではなく、個別細胞を分析できる手段がなかったために生まれたものである。さらに、単一細胞レベルで表現型（すなわち、遺伝子発現、タンパク質活性、イオン変動、シグナル伝達）を動的に測定する能力が、複雑な環境における細胞の挙動を理解する鍵である（参考文献１〜４）。
【０００７】
１９９０年に、James Eberwineのグループが、ガラス製マイクロピペットを用いて培養物内の単一細胞を分離し、細胞から抽出したRNAを増幅および分析できることを証明した（参考文献５）。この実験は単一細胞生物学の分野を開拓し、Eberwineのグループはこの技術を神経機能の分子基礎を理解することに適用することに成功した（参考文献６）。この２０年で、生体分子分析はハイスループットシーケンシングの開発とともに躍進し、それにより研究者は現在、単一読み出しの細胞において活性遺伝子の集積を獲得できるようになった（参考文献７）。しかしながら、単一細胞の初期捕集は依然として技術的課題として残っている（参考文献１）。Eberwineがガラス製マイクロピペットを用いて成功して以降、科学者らは単一細胞を分離するため、細胞を組織から解放させる酵素消化から無傷細胞の均質集団を組織切片から切り離すレーザ顕微解剖まで、種々の技術を用いてきた。しかしながら、これらの方法は、天然環境においても最初のマイクロピペットにおいても、細胞を試験することができず、分離した細胞をプローブするに留まる（参考文献８）。
【０００８】
処置具としてのナノ装置
ナノスケール装置は、高空間的・高時間的分解研究に対するその能力の高さから、単一細胞の処置具として理想的である（参考文献９および１０）。最近では、２グループが単一細胞分析用に細胞ナノエンドスコープをそれぞれ独立して開発した。Singhal等（参考文献１１）は、ガラス製マイクロピペットの頂点にカーボンナノチューブを取り付け、細胞の照合、流体の移送、単一細胞小器官レベルでの光学的および電気化学的診断の実施に対し、その能力を証明した。同様に、Yan等（参考文献１２）は、光ファイバの先端に取り付けたナノワイヤ導波管を開発し、これは、可視光を生きた哺乳動物細胞の細胞内区画に誘導することと、細胞下領域からの光信号を検出することの両方を可能とする。これらのナノエンドスコープが円筒形であることにより、細胞内奥の細胞小器官をプローブすることが可能となったが、これらの技法は、いかなる自動化機能も欠く。これらのエンドスコープは細胞内に手動で位置づけるものであり、多数のサンプルの分析を必要とする複雑な生物学的問題の研究は不可能である。
【０００９】
これらのナノエンドスコープを走査型プローブ技術と統合することでこの制約は克服することができ、自動化およびハイスループット分析が潜在的に可能となる。２００３年に、Osadaおよび共同研究者が原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）の先端を生細胞に挿入し、mRNAを抽出した（参考文献１３）。該mRNAはPCR法を用いて分析して、抽出プロトコルを検証した（参考文献１４）。より最近では、Wickramasingheのグループが、プラチナでＡＦＭ先端をコーティングすることによりこの方法を最適化し、誘電泳動を介したmRNA分子の抽出を可能にした。Wichramasingheの技術は標準的なアッセイ法とうまく組み合わせ、乳がん細胞中のRNA分子の検出に用いられている（参考文献１５および１６）。
【００１０】
単一細胞の操作および分析が、細胞の機能および運命を制御するプロセスを理解する上で、次なるフロンティアである。ハイスループットシーケンシングの導入で、現在は単一細胞内で活性遺伝子の集積を獲得することが可能となったが、細胞の遺伝物質の初期捕集は、以前として主要な課題のままある。さらに、単一細胞操作用の現在の方法では、多くの場合、１クラスの検体のみ検出可能である。
【００１１】
〔具体的な特許および刊行物〕
参考文献２６（Seger et al., “Voltage controlled nano-injection system for single-cell surgery,” Nanoscale 4(19): 5843-5846 (2012)）には、ラベルフリーセンシングプラットフォームとして用いるナノピペットの開発（参考文献２０〜２４）および培養液中の単一細胞への多成分注入を可能にするＩＣＭの応用が開示されている。
【００１２】
参考文献２７（Laforge et al., “Electrochemical attosyringe,” Proceedings of the National Academy of Sciences 104(29): 11895-11900 (2007)）には、エレクトロウェッティングを介して生細胞内に微量の液体を送達するガラス製ナノピペットに基づく電気化学的アトシリンジが開示されている。
【００１３】
特許文献１：国際公開ＷＯ２００８／０５４４８８号パンフレット（Mirkin等）（発明の名称：「Electrochemical Attosyringe and Its Use as an Electrochemical Nanopump Driver」、２００８年５月８日公開）には、有機溶媒で充填したナノピペットおよび水溶液の吸引および送達を引き起こす外部電圧が開示されている。
【００１４】
少なくとも１名の発明者が本発明と共通し譲受人が同一である特許文献２：米国特許公開第２０１２／０２２５４３５号明細書（Seger等）（発明の名称：「Nanopipette apparatus for manipulating cells」、２０１２年９月６日公開）には、ｘｙｚコントローラと組み合わせたナノピペット、および、ハイスループットな方法で細胞への被害を最小化して細胞内に物質を電気浸透的に注入するナノピペットの、ボアにおける電圧差の電子制御について開示されている。細胞から物質を抽出し、ナノピペットから吐出した後で該物質を分析することも、さらなる分析のため天然形態において生体物質を除去することも、本出願にには開示されていない。
【００１５】
参考文献２６（Seger et al., “Voltage controlled nano-injection system for single-cell surgery,” Nanoscale 4(19): 5843-5846 (2012)）には、上述の付与前公報に似た開示が含まれている。
【００１６】
特許文献３：米国特許公開第２０１１／０１３１６９０号明細書（Pavel等）（発明の名称：「Scanning Ion Conductance Microscopy」、２０１１年６月２日公開）には、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡、ならびに、細胞および複雑なマトリックス構造などの柔らかい表面や境界面の研究におけるその使用法について開示されている。そこに開示されているように、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）は走査型プローブ顕微鏡（SPM）の形態をしており、これにより、接触も力の相互作用もなく、そして対象を通常の液体環境に置いたまま、柔らかい表面の高解像度撮像が可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００８／０５４４８８号パンフレット
【特許文献２】米国特許公開第２０１２／０２２５４３５号明細書
【特許文献３】米国特許公開第２０１１／０１３１６９０号明細書
【特許文献４】米国特許公開第２０１２／０１７１６８５号明細書
【特許文献５】米国特許第５３９４７４１号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１３／０２７３６６７号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２０１２／０２８９４２８号明細書
【特許文献８】米国特許第４２８９７４８号明細書
【特許文献９】米国特許第６８７８５１５号明細書
【特許文献１０】国際公開ＷＯ２００８／１４２３７８号パンフレット
【特許文献１１】欧州特許公開第１８４１８８４号明細書
【特許文献１２】米国特許第６８７８５１５号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】He J, Evers DL, O'Leary TJ. et al. Immunoliposome-PCR: a generic ultrasensitive quantitative antigen detection system. J Nanobiotechnology. J Nanobiotechnology. 2012;10:26
【非特許文献２】Hansma, P.K., et al., The Scanning Ion-Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): p. 641-643
【非特許文献３】Maillard et al., “Two liquids wetting and low hysteresis wetting on dielectric applications,” Langmuir 25(11) 6162-6167 (2009)）
【非特許文献４】Tariq MA, Kim HJ, Jejelowo O, Pourmand N. Whole-transcriptome RNAseq analysis from minute amount of total RNA. Nucleic Acids Res 2011;39:e120
【非特許文献５】Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol 2002;20:473-7
【非特許文献６】Soderberg O, Gullberg M, Jarvius M et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.Nat Methods2006; 3:995-1000
【非特許文献７】Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad SciUSA2004;101:8420-4.
【非特許文献８】Bjarnegard M,Enge M, Norlin J et al. Endothelium-specific ablation of PDGFB leads to pericyte loss and glomerular, cardiac and placental abnormalities. Development2004;131:1847-57
【非特許文献９】Gustafsdottir SM, Nordengrahn A, Fredriksson S et al. Detection of individual microbial pathogens by proximity ligation. Clin Chem2006;52:1152-60
【非特許文献１０】Fredriksson S, Horecka J, Brustugun OT et al. Multiplexed proximity ligation assays to profile putative plasma biomarkers relevant to pancreatic and ovarian cancer. Clin Chem 2008; 54: 582-9
【非特許文献１１】Blokzijl A, Friedman M, Ponte F & Landegren U Profiling protein expression and interactions: proximity ligation as a tool for personalized medicine. (Review) JInternMed2010;268:232-245
【非特許文献１２】Weibrecht I, Grundberg I, Nilsson M, Soderberg O（2011）Simultaneous Visualization of Both Signaling Cascade Activity and End-Point Gene Expression in Single Cells. PLoS ONE 6(5): e20148. doi:10.1371/journal.pone.0020148
【発明の概要】
【００１９】
以下の概要に本発明の特徴および態様を全て含めることは意図しておらず、本発明は以下の概要に記載する特徴および態様を全て含まなければならないということもない。
【００２０】
特定の態様において、本発明は、先端を含むナノピペットと、ナノピペット内で、またはナノピペットに隣接して第１電解質に接触する第１電極と、を備える装置に関する。本発明は、電流検出回路の増幅器入力と、ナノピペットおよび細胞の外側で第２電解質を含む溶液に接触し、第１電極および電流検出回路に接続するように配置した第２電極と、に接続するように配置する。ここにおいて、第１電解質および第２電解質は、イオン電流が電極間で、そして、先端のナノスケール開口を通って流れることを可能にする。いくつかの態様において、ナノピペットは石英製であり、直径１０ｎｍ〜１０００ｎｍの、好ましくは５０ｎｍ〜２００ｎｍ程度の先端において、ボアを有することができる。
【００２１】
さらに、ナノピペット装置はｘｙｚコントローラを備える。前記ｘｙｚコントローラはナノピペットに取り付けられ、サブミクロンのｘステップ及びｙステップでナノピペットを機械的に移動させ、そして、細胞に向かう、または離れるｚ方向に前記ナノピペットを移動させる。前記ｘｙｚコントローラは、さらに、ユーザが定義した制御に従って前記の機械的な移動を制御する、電子制御を有する。いくつかの態様において、ナノピペットのｚ方向は、第１電極および第２電極の間を流れるイオン電流により生成される信号により制御する。このような装置は、高解像度で細胞の表面を撮像可能な装置、例えば、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）に連結する。
【００２２】
このような装置は、本明細書において「ナノピペットSICM」装置といい、上述の特許文献２に詳述されるように、電圧を制御するための回路を備えることができる。
【００２３】
本発明の特定の態様において、ナノピペット装置の第１電極は、銀テトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（AgTBACI）である。
【００２４】
本発明の特定の態様において、第１電解液は、例えばテトラヘキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）等のイオン性物質を含む、１−２ジクロロエタン等の疎水性液体である。
【００２５】
本発明は、また、特定の態様において、予め選択した生体物質を単一細胞の細胞質または細胞小器官内から分析用に抽出するために、ナノピペットSICM装置を制御する方法を含む。この方法論は、本明細書において「ナノ生検」と称す。従来の生検とは異なり、本発明に係る生検は単一細胞内で実行する。細胞は、好適には真核細胞であり、好適には宿主生物から抽出し、顕微鏡で使用するためサンプルステージに置いた動物細胞である。細胞は、従来の生検によって抽出されたものでも、例えば採血、骨髄吸引等の他の手段によって生体外で採取されたものでもよい。細胞はナノ生検の前に一定期間生体外で培養することができる。抽出した物質は、親和性化合物または科学的処理に依存することなく、得ることができる。材料は、天然状態で、免疫反応性または配列同一性等に基づいた選択バイアスを導入することなく、得られる。
【００２６】
本発明の特定の態様において、ナノピペット装置は次のように制御する。
１．ナノピペットに液体有機溶媒および内側電極を供給する。該内側電極は、ナノピペットの外部で、ただし、分析する細胞に接触する溶液（培養液）内で、別の電極と接続する。
２．内側電極は、正のバイアス（例えば、２００ｍＶ）で分極され、培養液が細胞内に流入することを防止する。
３．ナノピペットは、イオン伝導度を測定することで細胞表面に誘導されナノピペットが細胞表面の真上にある際に素早く下降させ細胞を貫通させる。このステップは、対象の細胞成分を撮像できる光学顕微鏡または他の顕微鏡により誘導することができる。例えば、ミトコンドリアは一般的に長さが約１μＭ〜１０μＭであり、光学顕微鏡で見ることができる。細胞は、選択したミトコンドリアを視覚的に確認するため、染色することができる。
４．ナノピペットの先端が細胞内に入ると、ナノピペットバイアスは所定時間、正のバイアスから負のバイアス（例えば、−５００ｍＶ、または−２００ｍＶ〜−１０００ｍＶの範囲）に切り替わり、標的生体物質をナノピペット内に流入させる。「標的細胞内含有物」、すなわち生体物質は、細胞内での物理的位置、および、集積すべき分子、例えば、ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、mRNA、rRNA、細胞質タンパク質、核タンパク質、リソソームタンパク質または膜、多糖類等の性質によって、標的とされる。
５．ステップ４に続き、２００ｍＶまたは２００ｍＶ〜５００ｍＶの範囲の正電圧に切り替えることでナノピペットへの含有物の流入を止め、流出もさせないようにする。
６．ナノピペットを素早く引き上げ、細胞およびその周りの培養液より除去し、移送容器に移動させる。ここにおいて、電圧を再び正（例えば、＋１Ｖまたは５００ｍＶ〜１０００ｍＶの範囲）に切り替え、吸引した含有物を分析用サンプル容器に流出させる。サンプル容器は、例えば、ヌクレアーゼを含まないPBS溶液、または、特許文献４：米国特許公開第２０１２／０１７１６８５号明細書に記載された種々の緩衝液等の核酸保存緩衝液を含むことができる。
【００２７】
本発明の特定の態様において、ステップ６で吸引した含有物を分析して、サンプル中のDNAのシーケンスを決定または確認する。これは、リアルタイムPCR法または次世代シーケンシング（NGS）等の種々の方法により行うことができる。
【００２８】
したがって、上記の装置は、単一細胞から細胞内含有物を抽出する装置として特徴づけることができ、該装置は、ｘｙｚコントローラに搭載し、ナノピペットの内部の第１疎水性電解液と共に用いるために取り付けた第１電極を備えるナノピペットと；ナノピペットの外部にあり、細胞の外側に接触する第２の異なる電解液と接触するように配置し、適応させた第２電極と；電流検出回路および電圧制御回路と；を備え、前記電流検出回路は電極間のイオン電流を検出し、前記電圧制御回路は、所定の時間で第１電極と第２電極との間の電圧を逆転することにより、液体のナノピペットへの流入及び流出を制御するように構成する。
【００２９】
装置の種々の実施形態は、さらに、前記ｘｙｚコントローラは、サブミクロンのｘステップ及びｙステップでナノピペットを機械的に移動させ、かつ、細胞に向かう、または離れるｚ方向に前記ナノピペットを移動させるためにナノピペットにを取り付けるように、さらに構成することもできる。ここにおいて、前記ｘｙｚコントローラは、さらに、ユーザが定義する制御に従って前記の機械的な移動を制御する電子制御を有し、前記電圧制御は、前記ｘｙｚコントローラがナノピペットの先端を細胞内に位置づけた際、電圧を逆転する。該装置の種々の実施形態は、さらに、ナノピペットのｚ方向を、第１電極および第２電極の間を流れるイオン電流により生成される信号により制御するように構成することができる。該装置の種々の実施形態は、さらに、第１電極が銀テトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（AgTBACI）であるように構成することができる。該装置の種々の実施形態は、さらに、第１電解液が、例えば１−２ジクロロエタン等の疎水性液体、および、テトラキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）を含むイオン性物質を含むように構成することができる。該装置の種々の実施形態は、さらに、ナノピペットが石英製であるように構成することができる。
【００３０】
上記装置は、（ａ）第１バイアス電圧を提供してナノピペット内で第１電解液を保持するステップと；（ｂ）第２の異なるバイアス電圧を提供して細胞内から物質の流入を引き起こすステップと；（ｃ）第３の異なるバイアス電圧を提供してナノピペットから流体の流出を引き起こすステップと；に従って、該装置を操作するプログラムされた命令を備えることができる。
【００３１】
該装置の種々の実施形態は、さらに、電流検出装置が感知したイオン電流の変化に応じて装置を操作する、一連のプログラムされた命令を備えるように構成することができる。
【００３２】
本発明の特定の態様において、本発明に係る方法により天然形態で細胞から抽出した細胞内含有物は、細胞小器官または核酸のいずれかを含む。いくつかの態様において、抽出した核酸は、ゲノムDNA、RNA（リボソーム由来のrRNAおよびmRNAを含む。）、または、ミトコンドリアDNAを含む。他の態様において、細胞小器官はミトコンドリアである。加えて、細胞質、または、タンパク質、小分子、細胞プロセスの代謝物を含む小胞の一部を抽出することができる。
【００３３】
特定の態様において、本発明に係る発明は、また、細胞から細胞内含有物を機械的に抽出する方法に関するものである。該方法は、（ａ）標的細胞内含有物を有する細胞を含む溶液を抽出のために用意するステップと；（ｂ）本明細書に記載するようにSICMナノピペットを作動させ、イオン電流を感知することで細胞に接近するステップと；（ｃ）ナノピペットを用いて細胞の表面を貫通するステップと；（ｄ）標的細胞内含有物をナノピペット内に抽出する制御流入を引き起こすため、イオン電流を調整し、所定の時間及び電圧の負のバイアスを生成するステップと；（ｅ）抽出した含有物がナノピペットから出るのを防止し、さらに、ナノピペットの含有物を次の分析用容器に放出するため、イオン電流を調節して負のバイアスを生成するステップと；を含む。
【００３４】
該方法の種々の実施形態は、さらに、標的細胞内含有物を個別の細胞から抽出するステップをさらに含むことができる。該ステップは、標的細胞内含有物を有する少なくとも１個の細胞を含む溶液を抽出用に用意するステップと；バイアス電圧を生成するために、ｘｙｚコントローラ、内部電極および外部電極を有し、さらに、疎水性溶液を含み先端を有するナノピペットを備えるナノピペットSICM装置を提供するステップと；ナノピペットSICM装置を操作して、先端を流れるイオン電流の降下を感知することで、前記１個の細胞に接近するステップと；を含む。
【００３５】
該方法の種々の実施形態は、さらに、内側電極と外側電極との間に正の電圧を生成し、細胞内にナノピペットを挿入する間、液体がナノピペット内の疎水性溶液に入るのを防止するステップと；ナノピペットを位置づけ細胞の所定場所に貫通させ、細胞内に挿入するステップと；標的細胞内含有物をナノピペットに流入させ抽出するために、電圧を調整するステップと；標的細胞内含有物がナノピペットから出るのを防止するため、電圧をさらに調節するステップと；電圧をさらに調節して、抽出した標的細胞内含有物をサンプル容器に流出させるステップと；を含む。
【００３６】
該方法の種々の実施形態は、さらに、抽出した標的細胞内含有物が、核酸を含む、DNAまたはRNAを含む、および／またはミトコンドリアDNAを含むステップを含むことができる。
【００３７】
該方法の種々の実施形態は、さらに、電圧が（ａ）標的細胞内含有物をナノピペット内に流入させる−１００ｍＶ〜−１０００ｍＶ；（ｂ）流入を停止させ、かつ、ナノピペットからの流出を防止する１００ｍＶ〜５００ｍＶ；（ｃ）抽出した標的細胞内含有物を流出させる＋０．５Ｖ〜２Ｖ；の一以上であるステップを備えることができる。該方法の種々の実施形態は、さらに、ステップ（ａ）での流入が１秒〜５秒間続くステップを含むことができる。
【００３８】
該方法の種々の実施形態は、さらに、核酸保存緩衝液を含むサンプル容器内に流出するステップを備えることができる。該方法の種々の実施形態は、さらに、抽出した標的細胞内含有物が単一ミトコンドリアに由来するDNAであるステップを備え、さらに、ミトコンドリアDNAのシーケンスの一部を決定するステップを備えることができる。
【００３９】
該方法の種々の実施形態は、さらに、個別の細胞から細胞内含有物を抽出する方法であって、（ａ）バイアス電圧を生成するために、ｘｙｚコントローラ、内部電極および外部電極を有し、かつ、単一細胞を貫通するための先端を含むナノピペットをさらに有するナノピペット装置を提供するステップと；（ｂ）ナノピペット装置を操作し、細胞の標的細胞内含有物をナノピペットに流入させ抽出するステップと；抽出した標的細胞内含有物がナノピペットから出ることを防止するため、電圧をさらに調節するステップと；（ｄ）電圧をさらに調節して、抽出した標的細胞内含有物をサンプル容器に流出させるステップと；（ｅ）抽出した標的細胞内含有物を、（ｉ）抽出した標的細胞内含有物由来のmRNAの分析、（ｉｉ）抽出した標的細胞内含有物由来の一つ以上の選択したタンパク質の分析、のうち一つまたは両方により分析するステップと；を備える方法を備えることができる。
【００４０】
該方法の種々の実施形態において、さらに、前記mRNAの分析は、細胞由来の少なくとも５００ｐｇのmRNAを分析することを含むステップ、または、該mRNAの分析に、細胞内のmRNAシーケンスの少なくとも９０％を分析することを含むステップを備えることができる。
【００４１】
該方法の種々の実施形態において、さらに、タンパク質の分析ステップは、例えば近接連結法等で特定のタンパク質を検出する、超高感度アッセイ、例えば免疫アッセイを含むことができる。分析にはタンパク質種分析を含むことができ、該タンパク質種分析は、EGFR、MKK1、ERK1/2、JAK、AP1/Jun、およびSTATのうち少なくとも一つを分析するステップと；リン酸化タンパク質を、リン酸化されていない同一のタンパク質から差別化するステップと；分析を、同じ細胞について、時間をずらして複数回実行するステップと；リン酸化タンパク質を、リン酸化されていない同一のタンパク質から差別化するステップと；および／または、翻訳後修飾を有するタンパク質をそのように修飾されていない同一のタンパク質から差別化するステップと；を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】単一細胞ナノ生検および単一細胞小器官または細胞質の含有物の吸引後分析への移行を示す一連の図面のセットである。図１Ａは、ナノピペットの先端が細胞の表面に自動で接近することを示す図であり、ここで、ナノピペットの先端は細胞を浸漬する液体の水面下にある。図１Ｂは、先端を細胞シトゾル内に貫通させ、続いて細胞質内物質を制御吸引することを示すである。図1Ｃは、ナノピペットの後退を示す図である。図1Ｄは、生検材料を分析用チューブへ送達することを示す図である。媒体内の外部電極は図示していない。
【図２】ナノピペット内でのエレクトロウェッティングの結果を示す図である。生検時に、ナノピペットを＋１００mVでバイアスし、次に−５００ｍＶに切り替え、続いて＋５００ｍＶに切り替える。得られる曲線は、１５回の「吸引−放出」サイクルの結果の平均であり、異なる電圧状態におけるイオン電流の流れの変化を示す。
【図３】単一細胞ナノ生検時のクロノアンペロメトリーを示す図である。ナノピペットを＋１００ｍＶでバイアスし、いずれの水溶液もナノピペットに侵入することを防止する。バイアスを−５００ｍＶに切り替えると、細胞の細胞質がナノピペットバレルに侵入することによりイオン電流が増加する。
【図４】GFP−HeLa細胞（ＰＣ、つまりポジティブコントロール、２回使用）およびヒトＢＪ線維芽細胞（ＮＣ、つまりネガティブコントロール）のGFP遺伝子用に、cDNAの合成後のフラグメントサイズの決定（予定サイズ〜２５０塩基対）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅用にSYBR（登録商標）goldで染色したゲルの画像である。
【図５】HeLa細胞由来のGFP RNAを対象にqPCR法により行った生検後分析を示す折れ線グラフであり、ポジティブコントロールである〜１０００個の細胞のライセートから抽出した全RNA（定量サイクル値、Ｃｑ２０）、単一細胞から抽出した生検材料（定量サイクル値、Ｃｑ２０）、ネガティブコントロールとしての水（定量サイクル値、Ｃｑ３３）を示す。
【図６】ポジティブコントロール（丸）が〜１０００個のGFP−HeLa細胞のライセートから抽出した全RNAで構成されることを示す線グラフである。ナノ生検材料（四角）は、単一細胞の標準ナノ生検材料の含有物で始めるqPCRを示す。ネガティブコントロール（三角）は、５個のサンプルを表し、４個のナノ生検サンプルは、細胞貫入の後、−５００ｍＶを印加せずに我々の標準プロトコルに準拠させ（したがって、吸引ステップを欠く）、一方、５番目のサンプルには出発物質として水を用いる。電圧を印加しない４個のサンプルと、水を含むサンプルはすべて、当検査で用いたナノ生検サンプルとポジティブコントロールに比べ、負の増幅を示す結果になった。
【図７】１個のポジティブコントロールサンプルと、５個のネガティブコントロールサンプル（サンプル番号１〜番号５）の、qPCR法を用いた生検後分析を示す線グラフである。
【図８】ミトコンドリアDNAの、フラグメントサイズの決定（予定サイズ〜７０００塩基対）およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅用にSYBR（登録商標）goldで染色したゲルの画像である。レーン１〜５は、５個のヒトＢＪ線維芽細胞におけるミトコンドリア生検である。サンプルレーン６は、生検を行わなかった（DNAの投入なし）ネガティブコントロールであり、レーン７はポジティブコントロール（投入材料としてミトコンドリアPCR産物を投入）である。
【図９】ＵＣＳＣゲノムブラウザに表示される、吸引物のRNAシーケンシングのリードカバレッジを示す一連の画像である。ゲノム位置はX軸に沿って表示され、カバレッジの深度はY軸で表される。図９Aは、遺伝子PABPC１における選択的３'エクソンの使用を表す図である。アンサンブル（Ensemble）の遺伝子予測が下に表示され、線はイントロンを、長方形はエクソンを表す。これらの遺伝子予測は逆鎖上でなされ、３’から５’方向で表示される。遺伝子PABPC１における選択的３'エクソンの使用は、Ｍ３とＭ７とを、Ｍ８に対比させることで分かる。Ｍ８はより長いアイソフォームの３’領域にかかるカバレッジを示し、一方、Ｍ３およびＭ７は、より短いアイソフォームにかかるカバレッジを示す。図９Bは、リードのカバレッジが遺伝子MCCC２の全ての長さに広がることを示す図であり、ナノ生検により特定した転写物から完全長cDNAを作成することの実現可能性を証明する。遺伝子MCCC２は下部において、５’から３’の方向で表示される。
【図１０】細胞の集団から抽出されたDNAならびに、単一細胞から吸引した２個のミトコンドリア吸引物のシーケンシング結果を示すグラフである。シーケンシング結果は吸引物 におけるヘテロプラスミー頻度の可変保全性を証明する。推定頻度が５％〜９９％の間にあるヘテロプラスミー変異体は、円で表示され、丸の面積は観測頻度に比例する。変異体のヌクレオチドは、文字「Ａ」、「Ｃ」、「Ｔ」、または「Ｇ」で、丸の近くまたは丸内に示す。14713 A->T変異体は、吸引物と集団で類似の頻度を示し、一方、16278 C->T変異体は、吸引物においてヘテロプラズスミー頻度がより大きく変動することを示す。頻度の低い変異体は両吸引物にはあったが、集団にはなかった。
【図１１】本発明に係るナノピペット法を用いた単一細胞のタンパク質分析であって、特定のタンパク質を定量するタンパク質分析の概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
〔定義〕
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似した、または同等の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、好適な方法および材料を記載する。一般に、細胞および分子生物学ならびに化学に関連して用いる用語およびその技術は、当技術分野において周知であり、一般的に用いられている。特に限定はされないが、特定の実験技術が、当該技術分野において周知で慣習的な方法に従って、また、本明細書全体で記載および議論する種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載されているように、一般的に実行されている。明確性のため、次の用語を以下のように定義する。
【００４４】
用語「エレクトロウェッティング」は、本明細書において従来の意味で用い、液滴とフィルムを移動させるために印加電界を利用した作用を指す。エレクトロウェッティングは、負の電圧を印加したときに細胞の溶液をナノピペットに流入させ、バイアスが逆になったときに流出させるために、本明細書では用いる。例として、Laforgeおよび共同研究者が、エレクトロウェッティングをナノピペットにおいて利用し、培地の生細胞に蛍光色素を注入したことが挙げられる（参考文献２６）。
【００４５】
用語「イオンコンダクタンス顕微鏡法（ICM）」または「走査イオンコンダクタンス顕微鏡法（SICM）」は、本明細書において、高い空間解像度（参考文献１７）および時間解像度（参考文献１８）で生細胞を画像化する能力を有する走査プローブ技術を指すために用いる。ＩＣＭは、ナノピペットの開口部にイオン流を生成するようにバイアスした、電解液で満たしたガラスナノピペットを用いる。その後、ナノピペットで表面を走査し、測定したイオン電流の大きさの変化が、観察したサンプルのトポグラフィーの変化を反映する（参考文献１８および１９）。先端がサンプルを横切って走査すると、画像が描画される（参考文献２８）。
【００４６】
用語「ナノピペット」は、本明細書において従来の意味で用い、ナノスケール、つまり約０．０５ｎｍ〜約５００ｎｍ、好適には約５０ｎｍ（±２０％）の円錐状の先端開口（つまりナノポア）を有する、中空自立型で不活性の、非生物学的構造体を指す。該中空構造体は、ガラスまたは石英製とすることができ、その内部またはナノポアの片側に、ナノポアの開口部を通過する液体を保持するのに適している。ナノピペットの内部は、分析物の非特異的な結合を最小化するように選択または修正される。内部は、ナノピペット内の溶液に接触する電極を挿入できるような大きさにする。ナノピペットは、好適にはレーザでガラスまたは石英製の毛細管を引っ張って作製する。ナノピペットの内径は１０〜１００ｎｍ程度、外径は２００〜８００ｎｍ程度であり、典型的な長さは約１０μｍである。これらの寸法は、特定の用途に適した大きさであり、ナノポアの大きさの調整は重要な考慮事項である。「マルチバレル式ナノピペット」は、２つ以上の平行したボアを有するナノピペットで、一般的に共通の壁を共有する。ボアは同軸で、一般的には半径方向に間隔を置いて配置されるが、同心円状とすることもできる。それらは、市販の多穴毛細管で作製することができる。
【００４７】
用語「マイクロマニピュレータ」または「ｘｙｚコントローラ」は、ｘ方向およびｙ方向が一般的に水平面として、ｚ方向が一般的に垂直方向として知られる三次元を移動する機械装置を指す。ｘｙｚコントローラは、原子プローブ顕微鏡など種々のマイクロスケール使用機器に用いることが知られている。典型的なｘｙｚコントローラのさらなる詳細については、特許文献５：米国特許第５３９４７４１号明細書（Kajimura等）（発明の名称：「Atomic probe microscope」）を参照のこと。
【００４８】
用語「電流検出回路」または「電圧制御回路」は、制御可能な増幅回路と高感度な電圧・電流検出器を備える、既知の電子回路および電子装置を指す。これらは、１０〜１００００ピコアンペアの基準電流に基づき、１〜１０ピコアンペア程度の電流の変化を検出し、さらにその変化に応じて電圧および／または電流を変化させる高感度装置を備えることができる。この用語は、さらに、時間応答型で、温度に比較的依存しない回路、つまり、補償する温度の変化を見込んだ回路を指す。それには、既知の電圧を供給する回路に入力する必要がある。高感度検出回路は既知であり、これは電圧クランプ増幅回路とインピーダンス変換増幅回路を備える。
【００４９】
用語「ナノピペットSICM装置」は、プローブとしてナノピペットを用いる走査型イオン顕微鏡装置を意味する。この装置は、流体をナノピペットのボア内で保持し、ボアへ投入し、ボアから放出するために内部バイアスを効率的に設定する制御回路を有する。バイアス電圧は、ナノピペットボア内の電解液中にある内部電極と、ナノピペットの外部にあるが、操作中はナノピペットに接触している導電性溶液中にある外部電極と、により設定する。用語「バイアス」電圧は、一般的な意味で用いるが、好適には固定DC電圧である。
【００５０】
用語「超高感度アッセイ」は、以下で定義するPLA、および、タンパク質および他の細胞の非核酸高分子、特にタンパク質を検出できるアッセイを含む。超高感度とは、単一細胞の含有物に基づき有意味の結果（タンパク質修飾および／または定量化）を得られる能力を指す。この超高感度アッセイは、細胞質内の分泌性タンパク質に特に適用可能である。
【００５１】
超高感度イムノアッセイの例としては、特許文献６：米国特許出願公開第２０１３／０２７３６６７号明細書（発明の名称：「Wide range luminescent immunoassays」）、特許文献７：米国特許出願公開第２０１２／０２８９４２８号明細書（発明の名称：「Ultra-sensitive detection of molecules or particles using beads or other capture objects」）、特許文献８：米国特許第４２８９７４８号明細書（発明の名称：「Ultrasensitive enzymatic radioimmunoassay method」）がある。
【００５２】
用語「翻訳後修飾」は、官能基またはタンパク質の共有結合的付加、調節サブユニットのタンパク質分解切断、または全タンパク質分解により修飾されたタンパク質を指す。これらの修飾には、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、脂質化、およびタンパク質分解が含まれ、標準の細胞生物学および病原論のほぼすべての面に影響を与える。このように修飾 されていないタンパク質は、非修飾タンパク質ということができる。
【００５３】
用語「PLA」は、本明細書に記載するように近接ライゲーションアッセイを意味し、ここにおいて抗体は、該抗体に結合したオリゴヌクレオチドが相互作用するような距離内で、空間的に近接するエピトープに結合する。このオリゴヌクレオチドの相互作用により、例えばPCRなどの、ポリヌクレオチド検出に基づいた高感度検出が可能になる。さらに明確にするために、PLAの例として、非特許文献１：He J, Evers DL, O'Leary TJ. et al. Immunoliposome-PCR: a generic ultrasensitive quantitative antigen detection system. J Nanobiotechnology. J Nanobiotechnology. 2012;10:26、または、特許文献９：米国特許第６８７８５１５号明細書（Ulf Landegren）（発明の名称：「Ultrasensitive immunoassays」）を挙げる。
【００５４】
用語「EGFR」は、「上皮成長因子受容体」、例えば、ヒト上皮成長因子受容体を意味し、詳細はUniprot Q504U8 (Q504U8_HUMAN)に記載してある。
【００５５】
用語「MKK1」はMAP kinase skh1/pek1、例えばUniprot Q02750 (MP2K1_HUMAN)を意味する。
【００５６】
用語「ERK1/2」は、細胞外シグナル調整キナーゼ、例えば、Uniprot P27361 (MK03_HUMAN)を意味する。
【００５７】
用語「JAK」は、ヤヌスキナーゼ２、例えばUniprot O60674 (JAK2_HUMAN)を意味する。
【００５８】
用語「AP1/Jun」は、活性化タンパク質１（AP-1）のファミリーを意味し、c-Fos、c-Jun、ATFおよびJDPファミリーに属するタンパク質で構成されるヘテロ二量体タンパク質である転写因子を指す。Jun因子としても知られるAP-1（アクチベータタンパク質−１）転写因子は、多くの誘導性遺伝子応答を調節する、広く作用する因子である。例として、PELI３つまりUniprot Q8N2H9 (PELI3_HUMAN)があり、それはAP1/JUNおよびELK1を活性化する。
【００５９】
用語「STAT」は、シグナル伝達兼活性化因子を意味し、活性化されるまで細胞質に存在する転写潜在転写因子のファミリーである。哺乳類の７つのSTATは、C末端付近に保存されたチロシン残基を有し、該チロシン残基はJAKによりリン酸化される。例として、Uniprot P42226 (STAT6_HUMAN)がある。
【００６０】
本明細書に開示するのは、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）に組み込んだナノピペットを使用して、細胞小器官および細胞小器官含有物を含む細胞から細胞内含有物を抽出するシステムのための装置および方法である。本技術は、単一細胞シーケンシング技術（参考文献３２）に適用することで、空間的および時間的情報を有する、生体組織における不均一性を詳細に観測することを可能とする。単一細胞を操作する現在の方法は、大抵分析物の一つのクラスのみ検出できるが、本明細書に記載されているナノ生検プラットフォームは、ゲノミクス、プロテオミクスおよびメタボロミクス分析に適用することができる（参考文献３３）。本技術は、プログラムされた命令を備えるコンピュータと、コンピュータで読み取り可能な形式で具現化した、本方法を実行するプログラムされた命令により、実行することができる。
【００６１】
統合ナノピペットSICM装置
ナノピペットは下記で詳述するように作製し、SICMセットアップに統合することで、ナノピペットを細胞上数百ナノメートルのところに自動で位置付けることを可能とする（参考文献２５）。SICM装置は、以前、非導電性柔表面のトポグラフィーを撮像するために考案された。これについては、例えば、非特許文献２：Hansma, P.K., et al., The Scanning Ion-Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): p. 641-643を参照されたい。このような従来技術の装置では、ＸＹＺ走査、Ｚフィードバック、および制御ロジックを用いる（Ｚは、操作する表面に対し垂直な方向であると考えられる）。
【００６２】
簡潔に言えば、一般的なSICM構成は、疎水性電解液で埋め戻し、電界槽に浸漬したナノピペットから構成される。電極はナノピペット内に置き、設置電極は槽から少し遠方に置く。ナノピペットを有機溶液で充填し、水溶液に浸漬すると、ナノピペットの開口に液液界面が形成される。その後、この界面全体に電圧を印加すると、水溶液をナノピペットの内側／外側に流入／流出させることのできる力が生成される（参考文献２８）。イオン電流は、また、フィードバック信号として作用し、細胞の表面上の所定の距離でナノピペットの高さを正確に制御する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ナノピペットの先端は、抽出すべき標的細胞内物質の大きさに基づいて作製し、調節する。さらに、先端は、細胞壁または細胞膜を貫通するのに十分な耐久性があり、そして、頑丈であるように設計する。
【００６４】
加えて、本装置の特徴は、単一細胞から対象物を抽出し、または、単一細胞内で結合している分子を測定するための関連装置に組み込むことができることである。
【００６５】
細胞内抽出
図１Ａ〜図１Ｄに示すように、細胞から細胞内含有物を抽出する方法には、本明細書に記載するナノピペット装置を、以下のステップで用いることが含まれる。
【００６６】
１）細胞表面への接近（図１Ａ）；細胞が、細胞核１０２およびミトコンドリア１０４を有しているのが分かる。このステップは、好適には、細胞表面へのナノピペット先端１０６の近接を検出する感知回路を用いて実行する。本明細書で記載するように、これは、先端が細胞を含むサンプル表面に沿って走査する際、ナノピペット先端１０６に流れるイオン電流の変化を測定することで行うことができる。細胞を浸漬している液体の表面は１０１で示す。図１Ａは、ピペット内の小さな正のバイアスが流入を防止していることを示す。
【００６７】
２）細胞表面の貫通（図１Ｂ）；ここで対象の細胞小器官を置き、ナノピペットの先端をその上に直接配置する。その後、例えばｘｙｚマニュプレータにより該ナノピペットを素早く下方に移動させ、細胞の外部膜を貫通させ、そして、細胞小器官の膜も貫通させる。貫通深度は、既知の細胞の寸法に基づいて、予めプログラムすることができる。例えば、ヒトのリンパ球は、直径５μｍ〜１２μｍの範囲にあり得る。典型的なヒトの細胞は、直径約１０μｍである。繊維芽細胞は、活性化形態でも非活性化形態でも、種々の形状とサイズである。例えば、細菌のサイズは、典型的には０．５μｍ〜１．５μｍの範囲である。図１Ｂは、ピペット内の負のバイアスを用いて、細胞内からの流入を引き起こすことを示す。
【００６８】
３）標的細胞内物質の吸引（抽出）（図１Ｂ）；ここで、ナノピペットのバイアス電圧を負電位に切り替え、細胞物質がナノピペットに流入するようにする。ジロロクロロエタン（DCE）で充填したナノピペットを水溶液に浸漬すると、DCEが持つ疎水性の性質により、液液界面がナノポア内腔に形成される。この界面全体に電圧を印加することで、DCEの表面張力に変化を誘発する。この効果はエレクトロウェッティングといい、該効果は負の電圧を印加した際には水溶液の流入を引き起こし、バイアスを逆転した際には流出を引き起こす。例えば、http://murov.info/orgsolvents.htm.に掲載されているような、水への溶解度が０．５ｇ／１１０ｇであるその他の疎水性溶媒も使うことができる。
【００６９】
４）ナノピペットの後退（図１Ｃ）；この時点では、ナノピペットは細胞を浸す液体を取り除くまで、保持状態にバイアスする。図１Ｃは、流出を防止する、ピペット内の保持電位を示す。
【００７０】
５）抽出物質の分析（図１Ｄ）；ここで、ナノピペットは含有物を放出させるため、正の状態にバイアスする。図１Ｄは、サンプル容器内への放出を引き起こす、ピペット内の大きな正のバイアスを示す。
【００７１】
使用前に、ナノピペットは電解質を含む疎水性液体で最初に充填する。そして、コーティングしたワイヤ電極を、ナノピペットのバレル内にある電解液中に置く。繰り返すが、ナノピペットの先端を、SICMまたは光学顕微鏡のうちいずれかと、ナノスケールの移動が可能なｘｙｚコントローラを用いて、対象の細胞成分の上に位置付ける。それを、細胞を囲む、好適には第２電解質と増殖培養液とを含む溶液内に降下させる。ここでは、ナノピペットのバレル内の電解質は正のバイアスで分極し、不要な溶液がバレル内に流入するのを防止する。このバイアスは、ナノピペットバレル内の電極と、細胞を囲む培養液中の電極との間の電位差により生成される。以下に記載するように、電圧制御回路は電極に接続され、種々のバイアス電圧を好適にはコンピュータ制御の下で提供する。このバイアスは液液界面を流れるイオン電流を発生させ、これは、フィードバック増幅器またはパッチクランプ増幅装置によって提供される、フィードバックループへの入力として用いる。
【００７２】
この界面全体に電圧を印加することで、エレクトロウェッティングを通して電解質の表面張力に変化を誘発する。エレクトロウェッティングには、例えば疎水性（水性）液および親水性（水性）液等よりなる不混和性液体の間の界面を要する。
【００７３】
エレクトロウェッティングは、ナノピペットボアに入れたその他の非対極性液体を用いて実行することもできる。これの確認のためには、非特許文献３：Maillard et al., “Two liquids wetting and low hysteresis wetting on dielectric applications,” Langmuir 25(11) 6162-6167 (2009)）を参照することができる。
【００７４】
典型的な非水系電解液は、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上のテトラブチルアンモニウムテトラフェニルボレート（TBA-TPB）を含むニトロベンゼン溶媒、または、０．０１ｍｏｌ／Ｌ以上のTBA-TPBを含む１−２ジクロロエタン溶媒である。非水系電解液は、また、例えばTEA、テトラペンチアンモニウム等の他のテトラアルキル化アンモニウムカチオンでTBAを置き換えた溶媒で形成することができる。
【００７５】
TBA-TPBアニオンは、同様に、例えばテトラキス[３,５-ビス(トリフルオロメチル)フェニル]ほう酸塩等の追加官能化フェニルほう酸塩、または、ヨウ化物アニオン等の単純ハロゲン化物とも交換することができる。本明細書に挙げた溶媒および電解質は、非水系電解液の包括的なリストを提供するわけではないが、少なくとも一つの典型的な溶媒、少なくとも一つの典型的なカチオン、および、少なくとも一つの典型的なアニオンの組合せは、エレクトロウェッティング効果を補助するのに適した非水系電解液を生成するのに用いることができる。特許文献１０：国際公開ＷＯ２００８／１４２３７８号パンフレット（Monroe等）（発明の名称：「Electrowetting devicees」）を参照のこと。
【００７６】
実施例におけるナノピペットは、１０ｍＭのテトラキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）を含む１−２ジクロロエタン（DCE）の溶液で充填した。それを、PBS（リン酸緩衝生理食塩水）槽に浸漬した。図２では、ナノピペットは＋１００ｍＶにバイアスし、いずれの水溶液もナノピペットボア内に流入するのを防止する。しきい値イオン電流が検出されるまで、ナノピペットは生検対象物、この場合は細胞、の上に手動または自動で下降させる。イオン電流の特定のしきい値が検出されたら、ナノピペットを、細胞膜貫通を起こすために、高速でさらに降下させる。例示装置においては、制御回路がイオン電流の０．５％の降下を検出するまで、カスタマイズして書いたソフトウェアによりナノピペットは細胞に向けられる。これは細胞表面への近接を示す。この時点において、ソフトウェアは接近を停止し、ナノピペットを１μＭほど素早く降下させ、細胞を穿刺する。
【００７７】
細胞膜を貫通した後、回路は負のバイアスに切り替えて、ナノピペット内の細胞の細胞質内にある細胞含有物を、ナノピペット内へ吸引することの制御を可能にする。図２を再び参照すると、バイアスを−５００ｍＶに切り替えると、ナノピペット内に、ナノピペットバレルを初めに充填した有機液体よりも高い伝導性を持つ水溶液が流入することにより、測定イオン電流は増加する。
【００７８】
次に、バイアスを切り替えて正のバイアスに戻し、細胞含有物のナノピペットへの流入を停止させる。正のバイアスは十分強く、すでに吸引した含有物がナノピペットから流出するのを防ぐことができる。図２は、電圧を＋５００ｍＶに切り替えると、吸引した水溶液は放出されて測定イオン電流は低下し、細胞内含有物のサンプルを提供することを示す。
【００７９】
その後、細胞から抽出した細胞含有物は、既知の分子生物学技術を用いて分析する。ナノ生検プラットフォームにより、ミトコンドリアを含む細胞小器官のサンプリングが可能となる。これは、例えばガンおよび神経変異性疾患等の研究に対し、大きな意味を持つ。
【００８０】
本発明の一実施形態においては、マルチバレル式ナノピペットを、複数のバレル内の少なくとも２個の電極とともに用いる。１つのバレルは細胞含有物を引き出すために用いることができ、もう１つのバレルは、同操作の間、細胞内に物質を注入するために用いることができる。複数のバレルは、また、一回の注入の間、異なる時点で異なるサンプルを収集するのに用いることができる。
【００８１】
細胞内含有物：ミトコンドリアDNA
ミトコンドリアDNA（mtDNA）を単一細胞およびミトコンドリアより抽出し、分子生物学技術を用いて分析した。DNAは、いずれの化学的処理も細胞に適用せずに、また、細胞を溶解せずに抽出した。
【００８２】
mtDNAは、真核生物のミトコンドリア内にあるDNAである。ミトコンドリアは、細胞のエネルギー源として用いるアデノシン三リン酸（ATP）を細胞に供給する役割を担う細胞小器官である。mtDNAは、一本、またはより一般的には二本の鎖よりなり、通常円形または線形である。ミトコンドリアゲノムは、３７の遺伝子をコード化する１６５９６個の核酸塩基対よりなる。そのうち、１３遺伝子は電子伝達向け、２２遺伝子はtRNA、２遺伝子はrRNAである。mtDNA分析は、mtDNAが母性遺伝していることから母方の系譜を遡るのに用いることができる。それは、遺伝ミトコンドリア病の診断に用いることができる。例えば、特許文献１１：欧州特許公開第１８４１８８４号明細書（発明の名称：「Inherited mitochondrial dna mutations in cancer」）を参照すると、そこには、OXPHOS系における複合体III、IV、および／またはＶのミスセンス変異を被験者において確認することが記載されている。したがって、本明細書において実行する分析により検出できる変異体には、前掲特許文献に記載されている、C5911T、G5913A、A5935G、G5949A、G5973A、G6081A、G6150A、T6124C、T6253C、G6261A、G6267A、G6285A、C6340T、G6480A、A6663G、G6924T、G7041A、T7080C、A7083G、A7158G、A7305C、A14769G、C8932T、およびT7389Cがある。変異体は、OXPHOS（酸化的リン酸化）を阻害し、ROS（活性酸素種）を増加させる効果を有し得る。
【００８３】
細胞の核にある核DNAは、mtDNAよりも多くの塩基を含む。しかしながら、細胞内にははるかに多くのミトコンドリアがあるため、各DNAよりもmtDNAのコピーがより多く存在し、mtDNAは本発明に係る方法による分析の特に好適な標的となる。
〔実施例で用いる方法および道具〕
【００８４】
ナノピペットの作製
ナノピペットは、フィラメントを有し、外形が１．０ｍｍ、内径が０．７ｍｍ、長さが７．５ｃｍの石英製キャピラリー（Sutter Instrument社、品番QF100-70-7.5）より作製した。平均径は（１０６±１６）nm（偏差１５％）である。
【００８５】
SICMの組立て
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）は、ナノピペットバイアスおよび電流測定のための低ノイズ増幅器（カリフォルニア州サニーベールのMolecular Devices社、Axopatch 200B）と、Ｘ、Ｙ、Ｚ方向の粗調整用のマイクロマニュプレータ（カリフォルニア州ノバートのSutter Instrument社、MP-285）と、Ｘ、Ｙ、Ｚ方向の微調整用のピエゾアクチュエータ（Physik Instrumente社、Nano-cube）と、システムハードウェア制御用のフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（Field Programmable Gate Array、FPGA）（National Instruments社、PCIe-7851R）とで構成される。システムは、LabVIEW(1)で書いた、カスタムコード化したソフトウェアを用いて制御する。
【００８６】
細胞培養
ヒトＢＪ線維芽細胞を、Stemgent社カタログ番号08-0027より購入し、フェノールレッドなしで補足物（Lonza社カタログ番号CC-4181）と一緒にストローマ細胞基本培養液（ＳＣＭＢ）（Lonza社カタログ番号CC-3204）で培養した。緑色蛍光タンパク質を発現するHeLa細胞（Cell Biolabs社カタログ番号AKR-213）を、製造元が示唆するように、１０％のウシ胎児血清、０．１ｍＭの必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、および、１％のペニシリン−ストレプマイシンで補足した、７０％のＤＭＥＭ培養液で培養した。全ての細胞はＣＯ２５％、３７度で培養した。細胞は、１％ゼラチンでコーティングしたグリッド無プレートおよびグリッド付プレートの両方（ibidi社、μ-Dish 35mm, highGrid-500、非コーティング、滅菌）で平板培養した。細胞は、各ディッシュ当たり５×１０４個の細胞に平板培養された。
【００８７】
THATPBCl塩の合成
テトラキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）は、テトラキシルアンモニウムブロマイド（Aldrich社、番号263834）およびカリウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（Fluka社、60591）をメタセシスにより合成して作製した。両製品とも、水／メタノール（１：３）の混合液に溶解し、エタノール（２）で再結晶した。
【００８８】
カルシウム撮像
ナノバイオプシープラットフォームの侵襲性は、極小手術の処置前、間、後の[Ca2+]を監視することで試験した。ヒト線維芽細胞は、上記の「細胞培養」の節で記載した培養液中で、実験の前に５μＭのFluo-4AM(Invitrogen)で染色した。その後、細胞を３０分間３７℃で培養した。細胞は増殖培地で２回洗浄した。
【００８９】
分子生物学技法
Real-time qPCR Master Mix、すなわち、SYBR Green I（カタログ番号697676）を用いるSYBR Advantage qPCR Premixを、製造業者の推奨に従って用いた。
【００９０】
iScript（登録商標）cDNA合成キット（カタログ番号639505および639506）を、次の製造業者の推奨に従って用いた。
PCRプライマー：HeLa−GFP
リバースプライマー：GCGCCGAGGTGAAGTTCGAGG  (SEQ ID NO: 1)
フォワードプライマー：GCCGTCGCCGATGGGGGTGTT  (SEQ ID NO: 2)
プライマー対を使用して、ミトコンドリアDNAに対し３０サイクルの増幅をおこなった。
プライマー：３９６８塩基対
ゲル電気泳動
２％ゲル（１００ｍｌのＴＡＥ緩衝液中２ｇのアガロース）内で実行
条件：３０分間９５ボルト
【００９１】
ミトコンドリアの可視化
ミトコンドリアは、MitoTracker Green FM（インビトロジェン）（励起波長４９０ｎｍ、発光波長５１６ｎｍ ）で標識した。MitoTracker Greenは１ｍＭの濃度でジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解し、−２０℃で保存した。接着線維芽細胞は、培養液の中で、最終濃度を５００ｎＭとしたMitoTracker Green１ｍＭの希釈液で染色した。細胞を３０分間３７℃の培養下に置き、２回洗浄した。その後、１ｍＬの培養液を実験研究のため細胞に添加した。ペトリ皿を蛍光灯の下に置いた際、ミトコンドリアのみが顕著に染色されているようだった。
【００９２】
タンパク質およびプロテオミクスの細胞内分析用のナノピペット装置および方法
上記の用途に加え、本機器は、谷つ細胞内の特定タンパク質種およびタンパク質の相互作用の検出および定量化のために用いることが可能である。前述したように、本出願では、先端に５０ｎｍのポアを有し、個別の細胞由来の細胞質から少量（１５ピコリットル（全細胞の〜１％））のサンプルを回収し送付することができる、ナノピペットを用いる。ナノピペットは、上述したように、先端を位置づけて単一細胞を解像する走査型フィードバック技術と統合する。ナノピペット先端のイオン電流を監視することで、ナノピペットの正確な位置を決定し、細胞膜を〜２００ｎｍの範囲で制御することが可能である。細胞の上に最初に位置づけた後、細胞含有物を採取したい場合は、ナノピペットを制御した速度、角度および深さで細胞内に挿入する。その後、ナノピペットは素早く（１００μｍ／ｓ）で１μｍほど降下させ、細胞膜を貫通させる。挿入したら、ナノピペットは細胞内含有物を少量注入または吸引するために用いることが可能である。
【００９３】
ナノピペットは、走査型イオンコンダクタンス顕微鏡を用いて個別の生細胞を標的とし、ユーザは、時間分解能で単一細胞の分子生態を監視することが可能となる。単一細胞における遺伝子発現の変化を分析するために、単一細胞内のトランスクリプトームの複数測定を可能にする、核酸増幅およびシーケンシング用の効率的な上記方法を採用することができる（非特許文献４：Tariq MA, Kim HJ, Jejelowo O, Pourmand N. Whole-transcriptome RNAseq analysis from minute amount of total RNA. Nucleic Acids Res 2011;39:e120）。
【００９４】
本方法の重要な特徴は、多重化近接リガンドアッセイ（PLA）である。これは例えば、非特許文献５：Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol 2002;20:473-7、非特許文献６：Soderberg O, Gullberg M, Jarvius M et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.Nat Methods2006; 3:995-1000、非特許文献７：Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E et al. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proc Natl Acad SciUSA2004;101:8420-4.、非特許文献８：Bjarnegard M,Enge M, Norlin J et al. Endothelium-specific ablation of PDGFB leads to pericyte loss and glomerular, cardiac and placental abnormalities. Development2004;131:1847-57、非特許文献９：Gustafsdottir SM, Nordengrahn A, Fredriksson S et al. Detection of individual microbial pathogens by proximity ligation. Clin Chem2006;52:1152-60、非特許文献１０：Fredriksson S, Horecka J, Brustugun OT et al. Multiplexed proximity ligation assays to profile putative plasma biomarkers relevant to pancreatic and ovarian cancer. Clin Chem 2008; 54: 582-9、非特許文献１１：Blokzijl A, Friedman M, Ponte F & Landegren U Profiling protein expression and interactions: proximity ligation as a tool for personalized medicine. (Review) JInternMed2010;268:232-245
等に詳述してある。
【００９５】
タンパク質分析は、同一細胞内にある複数のタンパク質の反応を十分に測定できるほど高感度であることが重要である。PLAでは、オリゴヌクレオチドに融合したハイブリッド抗体を使用する。抗体−抗原結合は、タンパク質レベルを高感度に定量測定できるｑPCRを用いて検出する。PLAの種々の実施形態は特許文献１２：米国特許第６８７８５１５号明細書（Landegren）（発明の名称：「Ultrasensitive immunoassays」）に詳述してある。
【００９６】
例えば、ガンに関与する、確定した細胞内シグナル伝達経路である上皮成長因子受容体（EGFR）を用いることができる。上皮成長因子（EGF）がEGFRと結合する際、プロテインキナーゼ経路のカスケードがガン細胞内で活性化し、細胞増殖に影響を与える遺伝子発現の変化を引き起こすことが知られている。原理を証明するため、多重化PLAアッセイで、トリプルネガティブ乳がん（triple negative breast cancer (TNBC)）細胞株MDA-MB-231における遺伝子発現を引き起こすEGF刺激を媒介するタンパク質リン酸化現象の数を測定することができる。これらの細胞はEGFＲシグナル伝達の研究に広範囲で使用されており、単一MDA-MB-231細胞における遺伝子発現の研究にナノピペットがすでに用いられ始めている。
【００９７】
多重化EGFRPLAは本発明に係るナノピペット計装に統合し、PLAの感度により、同一細胞におけるEGF刺激前後のキナーゼ活性化経路を測定することが可能である。さらに、同一細胞におけるEGFシグナル伝達を経時的に測定する際、ナノピペット単一細胞PLAと全トランスクリプトーム解析（WTA）とを、統合することができる。これにより、単一がん細胞において経時的に、タンパク質翻訳後読み出しおよびゲノム読み出しが同時にできる新しいナノピペット技術が提供される。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）ナノバイオプシープラットフォームの組立て
１１５±１５ｎｍのポア径（図示なし）を有する石英製ナノピペットを、通常のレーザプラー（Sutter Instruments社、Ｐ２０００）を用いて作製し、１０ｍＭのテトラキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）を含む１−２ジクロロエタン（DCE）溶液で充填した。
【００９９】
単一細胞バイオプシープラットフォームとしてSICMを適応させるため、ナノピペットは、DCE中に１０ｍＭのTHATPBClを含む溶液で充填し、銀テトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（AgTBACI）でコーティングした銀線をナノピペットバベルに取り付けた。DCE充填済みナノピペットを水溶液に浸漬すると、DCEの持つ疎水性性質により、液液海面がナノポア内腔に形成される。この界面全体に電圧を印加することで、DCEの表面張力に変化を誘発する。ナノピペット内の疎水性液体とナノピペットの外側にある電解液との間の界面全体に電圧を印加することで、疎水性液体の表面張力に変化を誘発する。このエレクトロウェッティング効果により、水溶液は、負の電圧を印加した際にはナノピペット内に流入し、電圧バイアスを逆転した際にはナノピペットから流出する。
【０１００】
充填したナノピペットを、細胞を培養する増殖培養液で満たしたペトリ皿に浸漬した。細胞培地内に浸漬する間、ナノピペットは正のバイアスで分極し、培養液がバレルないに流入するのを防止する。このバイアスは、液液界面を流れるイオン電流を発生させ、これは、フィードバックループへの入力として用いる。イオン電流の０．５％の降下が検出されるまで、カスタマイズして書いたソフトウェアによりナノピペットは細胞に向けられる。この時点でソフトウェアは、接近を停止し、ナノピペットを高速（１００μｍ／ｓ）で１μｍほど降下させ、ナノピペットの先端を細胞の細胞質内に挿入して細胞膜を貫通するようにｘｙｚコントローラに指示をする。
【０１０１】
この段階ではナノピペットのバイアスはソフトウェアにより−５００ｍＶに５秒間切り替え、これにより細胞の細胞質をナノピペット内へ制御流入させる（図３）。
【０１０２】
その後、バイアスはソフトウェアにより２００ｍＶに切り替える。２００ｍＶは、流入は停止するが、吸引した含有物の放出は開始させないのに十分な電圧である。その後、ナノピペットはソフトウェアにより素早く引き上げ、吸引した含有物をｘｙｚコントローラにより、２分間＋１Ｖを再びソフトウェア制御の下で印加することにより５μＬのRNaseフリー水の液滴内に移送し、４℃に保った。
【０１０３】
（実施例２）緑色蛍光タンパク質転写物の生検
緑色蛍光タンパク質（GPF）を発現するHeLa細胞について生検を行い、PCR法を用いてGFP転写物の選択的増幅を標的ことにより、プロトコルの成功を確認した（図４）。単一細胞内から吸引した含有物について、iScrip（登録商標）cDNA合成キット(BioRad社)を用いてcDNAの合成を行った。このプロセスでは、生検下にある全てのRNAをcDNAに逆転写した。その後、リアルタイムPCRをcDNAについて実行し、GFP転写生物の存在を確認した。リアルタイムPCR実験では、十分な量の増幅産物が蓄積され検出可能な蛍光シグナルを発生するまで、蛍光はバックグラウンドレベル（図５のサイクル１〜１８）に留まる。検出可能な蛍光シグナルが発生するサイクル数を、定量サイクルまたはＣｑという。２つの反応のＣｑ値における差Ｘは、出発物質の量における２Ｘの差を反映するものである。
【０１０４】
リアルタイムPCRの増幅曲線において、ポジティブコントロールはＣｑ値２０を示し、ここにおいてHeLa−GFP細胞ライセート由来の全RNAがcDNA合成反応で急増したことを示す。そして、投入したRNAが生検含有物の場合Ｃｑ値は３０を、cDNA合成にRNAを加えないネガティブコントロールではＣｑ値は３３示した。ポジティブコントロールとして、〜１０００個のHeLa−GFP細胞から抽出した全RNAを用いた。ポジティブコントロールと生検サンプルとのＣｑ値の差は１０であり、これは投入した物質における１０２４（２１０）倍の差に対応する。したがって、増幅曲線は単一細胞内より抽出したRNA量と整合していると結論付けることが可能である。リアルタイムPCRプロトコルは、二本鎖DNAに入り込んだ際に蛍光発色する傾向色素（Sybr gold）に頼るものである。ネガティブコントロールにおける蛍光の増加は、プライマーダイマーの形成により引き起こされる。我々は、ナノバイオプシープロトコルの再現性を念入りに検討した。個別の細胞は異なる遺伝子発現パターンを有することが知られている。我々場〜１０００個のGFPHeLa細胞のライセートを含む溶液において吸引を実行し、ナノ生検プロトコルの再現性を試験したところ、qPCRを介した吸引後分析（図６）により、ナノ生検プロトコルの高い再現性が確認された。
【０１０５】
生検は、遺伝子物質の電圧制御吸引に依存しており、ナノピペット側壁上の物理吸着には依存しない。細胞内に挿入した後電圧をナノピペットに印加せず、バルク溶液中で吸引を行う場合、増幅は観察されない（図７）。これが、ナノ生検技術を、ＡＦＭを基礎とするプラットフォームと差別化する重要な要素である。WickramasingheとOsadaの両グループは、ＡＦＭプローブを用いて培養中の細胞からRNAを抽出したが、いずれも固定化した相補的RNAのプローブへの物理吸着またはハイブリダイゼーションに基づくものである（参考文献１４および１５）。これとは対照的に、ナノピペットプローブの中空という性質は、流体吸引を可能にしつつ、RNA抽出への応用を制限しないものである。
【０１０６】
（実施例３）ヒトＢＪ線維芽細胞ミトコンドリアの生検
ナノ生検プラットフォームは、決して、単一細胞からのRNA抽出に限定されるものではなく、細胞小器官のサンプリングに同様に使用することが可能である。ヒトＢＪ線維芽細胞（皮膚線維芽細胞、ATCC CRL 2522）を、ミトコンドリアの蛍光標識であるmitotracker（Invitrogen）で染色した（データなし）。ナノピペットは、ミトコンドリアが多量にある領域の上に置き、生検を上述したのと同じプロトコルで実行した（データなし）。ナノピペットの先端ないの蛍光は、ミトコンドリアの吸引が成功したことを示す（データなし）。生検ミトコンドリアのPCR分析を用いて、ミトコンドリアDNAの存在を確認した。ミトコンドリアDNAはミトコンドリアゲノムに特異的なプライマーを用いて増幅し、増幅したミトコンドリアDNAのゲル電気泳動により、採取した５つのサンプル全てにおいてヒトミトコンドリアDNAを表す正確な長さでバンドを示すことが分かる（図８）。
【０１０７】
（実施例４）ナノピペットの低侵襲性
Ca2＋の細胞質濃度の調節は、異物の挿入により引き起こされる機械的ストレスの指標になると考えられている（参考文献１１、３０、３１）。単一細胞生検プラットフォームの低侵襲性を実証するため、ナノ生検の前、間、後で細胞内の[Ca2+]を測定した（データなし）。ヒトＢＪ線維芽細胞は、Fluo4 AMで標識した（データなし）。光学顕微鏡写真により低侵襲性処置を確認する。低侵襲性処置により、ナノ生検中に辛うじて検出可能な[Ca2+]が生成される。細胞は吸引後５秒内に完全に回復し、吸引前レベルに一致する[Ca2+]濃度に達する。
【０１０８】
（実施例５）内因性mRNA発言を分析するためのナノ生検
ナノピペット内でのエレクトロウェッティング
ナノピペットは、P-2000レーザプーラー（カリフォルニア州ノバート、Sutter Instrument社）を用いて、石英製キャピラリー（カリフォルニア州ノバート、Sutter Instrument社）より作製した。平均直径＝（１０６±１６）ｎｍの石英製ナノピペットを、１０ｍＭのテトラキシルアンモニウムテトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（THATPBCl）を含む１−２ジクロロエタン（DCE）の溶液で充填した。その後、銀テトラキス（４−クロロフェニル）ボレート（AgTBACI）でコーティングした銀線をナノピペットのバレル内に挿入し、その間、Ag/AgCl線を浴液に浸漬し、参照／対向電極として作用させた。
【０１０９】
SICMの組立て
走査型イオンコンダクタンス顕微鏡（SICM）は、ナノピペットバイアスおよび電流測定のための低ノイズ増幅器Axopatch 200B（カリフォルニア州サニーベール、Molecular Devices社）と、Ｘ、Ｙ、Ｚ方向の粗調整用のマイクロマニュプレータMP-285（カリフォルニア州ノバート、Sutter Instrument社）と、Ｘ、Ｙ、Ｚ方向の微調整用のピエゾアクチュエータNano-cube（カリフォルニア州アーバイン、Physik Instrumente社）と、システムハードウェア制御用のフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイPCIe-7851R（FPGA）（National Instruments社）とで構成される。システムは、LabVIEW8で書いた、カスタムコード化したソフトウェアを用いて制御する。
【０１１０】
細胞培養
ヒトＢＪ線維芽細胞を、Stemgent社より購入し、フェノールレッドなしで補足物（ジョージア州アルファレッタ、Lonza社）と一緒にストローマ細胞基本培養液（SCMB）（ジョージア州アルファレッタ、Lonza社）で培養した。緑色蛍光タンパク質を発現するHeLa細胞（カリフォルニア州サンディエゴ、Cell Biolabs社）を、製造元が示唆するように、１０％のウシ胎児血清、０．１ｍＭの必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン、および、１％のペニシリン−ストレプマイシンで補足した、７０％のＤＭＥＭ培養液で培養した。全ての細胞はCO2５％、３７度で培養した。細胞は、１％ゼラチンでコーティングしたグリッド無プレートおよびグリッド付プレートの両方（ibidi社製μ-Dish 35mm, highGrid-500、非コーティング、滅菌）で平板培養した。細胞は、各ディッシュ当たり５×１０４個の細胞に平板培養した。
【０１１１】
cDNA合成およびｑPCR
iScrip（登録商標）cDNA合成キット（カリフォルニア州ハーキュリーズ、BioRad社）を製造業者の推奨に従って用いて、ナノ生検する細胞由来の全RNAよりcDNAを合成した。定量PCR（qPCR）を用いて、製造業者の推奨に従ってClontech社のAdvantage qPCR Premix SYBR Green I Master Mix（カリフォルニア州マウンテンビュー、Clontech社）を用いることで、ナノ生検プロトコルの成功を確認した。PCRプライマー：HeLa-GFP、リバースプライマー: GCGCCGAGGTGAAGTTCGAGG (SEQ ID NO: 1)、 フォワードプライマー: GCCGTCGCCGATGGGGGTGTT (SEQ ID NO: 2)を用いて吸引したミトコンドリアDNAを増幅して、ゲル電気泳動で可視化する３９６８塩基対を増幅した。
【０１１２】
cDNA合成およびRNAシーケンシング
吸引したRNAサンプルは、Ovation（登録商標）RNA-Seq system（カリフォルニア州サンカルロス、NuGEN Technologies社）を用いてcDNAに加工した。cDNAはライブラリ作製のため、個別の吸引別に作成した。単一細胞cDNAの質および量は、Agilent Bioanalyzer 2100 DNA High Sensitivity chip（カリフォルニア州パロアルト、Agilent社）を用いて評価した。
【０１１３】
ペアードエンド全トランスクリプトームライブラリ作製のため、各サンプルの〜０．５〜１．０μｇのcDNAを、製造業者の推奨するプロトコルに従ってCovaris-S2 sonicator（マサチューセッツ州ウーバン、Covaris社）を用い、２００〜３００ｂｐの範囲のサイズに切断した。断片化cDNAサンプルを、TruSeq v1 Multiplex Sample Preparation kit（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）を用いて、RNA-Seqライブラリの作製に用いた。簡単に言えば、cDNA断片は、製造業者の指示に従って、末端修復、ｄＡテーリング、およびマルチプレックスアダプタへの連結を行った。ライゲーション後、１５０ｂｐより小さいDNA断片は、AmPure XPビーズ（マサチューセッツ州ダンバース、Beckman Coulter Genomics社）で除去した。精製したアダプター連結産物を、ポリメラーゼ連鎖反応（１４サイクル）を用いて濃縮した。最終増幅ライブラリは、２．０％のアガロースゲルに溶解し、Caliper XT system（マサチューセッツ州ウォルサム、PerkinElmer社）を用いて３５０〜３８０ｂｐの範囲でサイズ選択を行った。最終RNA-Seqライブラリは、Agilent bioanalyzer 2100を用いて定量化し、シーケンシングのため、同一濃度内に一緒にプールした。プールした多重化ライブラリをシーケンシングし、MiSeq上（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）に２×１５０ｂｐのペアードエンドリードを生成する。
【０１１４】
ミトコンドリアDNAの増幅およびシーケンシング
吸引ミトコンドリアDNAは、フォワードプライマー：TCA TTT TTA TTG CCA CAA CTA ACC TCC TCG GAC TC  (SEQ ID NO: 3)、リバースプライマー：CGT GAT GTC TTA TTT AAG GGG AAC GTG TGG GCT AT (SEQ ID NO: 4)という対のプライマーを用いて、ロングレンジPCRにより増幅し、〜８Ｋｂｐ断片を生成した。吸引ミトコンドリアゲノムは、長く正確なポリメラーゼ連鎖反応（ＬＡ−PCR）用LA PCR Kit Ver. 2.1（Takara Bio社）を用いて増幅した。ミトコンドリアゲノム増幅は、吸引テンプレートDNA、２．５μＬの１０倍濃度Epicenter社製ブースト、２．５μＬの１０倍濃度LA PCR buffer II (Mg2+ plus)、４μＬのdNTP (２．５ｍＭ)、１．２５μＬの各プライマー（１０μＭ）、０．１２５μＬのLA Taq DNA Polymerase、１１．４μＬの滅菌蒸留水を含む２５μＬの反応混合液の中で行う。熱サイクリング条件は９５℃を２分間、続く３０サイクルは各サイクルが９４℃１５秒間、続いて６８℃８分間からなり、最終延長期間は６８℃で１３分間である。ミトコンドリアアンプリコンは、Covaris S2システムにより切断し、３００〜４００ｂｐの断片にし、これを自動装置に搭載のIllumina社製自動多重化ペアードエンドライブラリ作製にかけた。独自のインデックスシーケンスを各ミトコンドリアサンプルに用い、Illumina社製HiSeq 2000の単一レーンでシーケンシングを行った。
【０１１５】
バイオインフォマティクス法
ミトコンドリア実験由来のショートリードを前処理し、リードの３'末端からシーケンシングアダプタをトリミングした。ミトコンドリアリードを、非スプライスドアライナを用いて改訂版ケンブリッジリファレンスシーケンスと位置合わせを行う。５％〜９５％の間でヘテロプラズスミー変異が報告された。RNAシーケンシング実験由来のショートリードを前処理し、リードの３'末端からシーケンシングアダプタをトリミングした。RNA-seqリードの５'端末から１０塩基を読み取って、cDNAの第二鎖合成の間に導入された偏りを除去する。RNA-seqリードを、スプライスドアライメントツールを用いてhg19 UCSC human reference genome 33およびUCSCの既知遺伝子と位置合わせをする。少なくとも一つのリードが注釈付転写物に一意的にマッピングされた場合、遺伝子は発現していると考えた。遺伝子セット濃縮分析を検出遺伝子について行い、重複遺伝子オントロジーが報告された。詳細バイオインフォマティクス方法論は、補足情報の方法論セクションで利用可能である。
【０１１６】
ナノ生検プラットフォームは、単一の生細胞由来の内因性mRNA発現を分析するために用いることができる。成熟mRNAのcDNAを生成し、シーケンスを行い、そのリードはヒトのリファレンスゲノムにマッピングした。細胞質のPoly-A binding protein (PABPC1)における３'非翻訳領域（UTR）の特異的利用が観測された。ここにおいて、２つの吸引物は、非正規アイソフォームの優位発現を示す一方、３つ目は正規アイソフォームの発現を示している（図９Ａ）。また、カバレッジが３'UTRだけではなく、転写物全体で得られたインスタンスも観察された。メトロクロトニルCoAカルボキシラーゼ２（MCCC２）の全長にわたるリードカバレッジの一例を図９Ｂに示す。ナノ生検を内因性RNAの分析に用いることができる別の証明として、一つは代謝や形態形成に関連するプロセス用に濃縮する一方で、最重複遺伝子オントロジーを濃縮し、２つの吸引物は翻訳に関連する機構を主に発現することを発見した。
【０１１７】
（実施例６）ナノ生検ミトコンドリアのゲノムシーケンシング
実施例５のようなミトコンドリア生検に続き、次世代シーケンシングをナノ生検するミトコンドリアのゲノムをシーケンシングするのに使用する。ミトコンドリアDNAは、ミトコンドリアゲノムに特異的なプライマーを用いて増幅した。このアプローチは、我々が、より豊富な核DNAよりミトコンドリア核酸を分離する必要なく、ミトコンドリアゲノムのシーケンシングを選択的に行うことができるため、新規性があり、かつ、重要である。単一細胞由来の２つのミトコンドリア吸引のシーケンシング結果は、細胞集団から抽出したDNAと同様に、いくつかのヘテロプラズスミー変異の出現頻度が細胞内レベルでより保たれるということを明らかにした。例えば、２つのヘテロプラズスミー変異（14713 A->Tおよび16278 C->T）が細胞内吸引および全（プールした）ミトコンドリア集団由来のサンプルの両方に見られた。14713 A->T変異体の出願頻度は、全サンプルで類似しており、８３％、８７％、および７９％であった。しかしながら、16278 C->T変異体は、プールしたもの対選択ミトコンドリアそれぞれで相当に異なる出現頻度となり、６２％、９８％、および３８％であった。平均ヘテロプラズスミー変異体が集団に基づくシーケンシングで可観測だった一方、細胞内シーケンシングのみ細胞内で不均一な異変体が現れた。細胞内吸引物間でのヘテロプラズスミー出現頻度における差に加え、シーケンスリードの５％より大きい異変体の数も検出することができた。これらの結果は、新規のミトコンドリア向けゲノム技術とナノピペットとの組み合わせにより、単一細胞のミトコンドリアゲノムの小部分母集団をシーケンシングできることを示すものである。
【０１１８】
実施例５および６において、ナノ生検は、細胞物質を電圧制御吸引に依存するものであり、ナノピペット側壁への吸着に依存するものではない。細胞への挿入後、および、吸引をバルク溶液において行う際、負の電圧をナノピペットに印加しなければ増幅は観察されない。これが、ナノ生検技術を、AFMを基礎とするプラットフォームから差別化する一つの重要な要素である。
【０１１９】
（実施例７）MDA-MB-231細胞におけるEGFＲシグナル伝達を測定する、ナノピペット−PLAを基礎とする計器
EFGR作動は、MAPKおよびJNKをリン酸エステル化および刺激し、複数の転写因子（TF）を、遺伝子転写および細胞増殖において、最終的には変化させる。基礎条件の下、このプロテインキナーゼ伝達経路中の多くの酵素が非活性である。しかしながら、EGF刺激はリン酸化状態を切り替えることによりこれらのタンパク質を活性化する。マルチプレックス近接ライゲーションアッセイ（PLA）を用いて、MAPKおよびJMNK EGFRのシグナル伝達経路の異なる含有物のリン酸化を測定する。これは、MKK1のリン酸化を含み、これは、MAPK、EPK1/2のリン酸化を触媒し、その後、細胞の成長に関わる遺伝子の発現を調節するTFs AP-およびFos-Junをリン酸化する。
【０１２０】
この特定の実施例においては、細胞増殖を管理するSTATのリン酸化を刺激するリン酸化形態をとるJAK用のPLAを用いる。EGFのシグナル伝達を媒介する種々の他のリン酸化標的を研究することができ、そして、市販のプライマリーおよび二次抗体を好都合に獲得し、抗体−オリゴヌクレオチドのハイブリッドを生成することができる。PLAは同様に、各精製リン酸化標的を検出するように開発し、溶液中で検出されるタンパク質量に関して最適化してある。
【０１２１】
細胞（例えばEGFで処置した個別MDA-MB-231細胞または臨床腫瘍細胞）由来の細胞質を様々な量でサンプリングするために、そして、各PLAに必要な細胞サンプルの最低量を評価するために、ナノピペットを用いることができる。また、多重化PLAを用いて、ガン細胞に対するEGF処置の前後で同細胞のEGFシグナル伝達における変化を測定することができる。ナノピペットのセットアップを用いることで、基礎条件の下およびEGF刺激の後で、同細胞から別のサンプルを分離することができる。WTAを用いることで、EGFにより活性化された遺伝子クラスターを同定することができ、特定の遺伝子発現における変化はqPCRにより定量化される。該方法はまた、個別のリン酸化事象を特的に阻止するMAPKまたはJNKの選択的阻害因子、および、遺伝子発現の変化を試験し、ガン細胞における特異的なシグナル伝達を選択遺伝子の発現の調節に連結するために独自の方法を提供する。
【０１２２】
ここで図１１を参照すると、機械式プラットフォーム１１０が、ナノピペット１１２を支え、方向づけ、操作し、ナノピペットはプラットフォーム１１０に搭載され、さらに細胞１１６内にナノピペットの先端１１５を挿入するために、顕微鏡誘導システムおよびｘｙｚコントローラを備える。示すように、細胞１１６は真核生物であるが、先端１１４は細胞質ゾル区画内に挿入する。次に、矢印１１８で示すように、ナノピペットおよび細胞１１６より吸引した含有物は、矢印１２０で示すように容器１２２に移動させる。ここで、タンパク質または対象のタンパク質を抗体１２４に結合することができる。抗体１２４は、結合して同じタンパク質上でエピトープを分離する。例えば、一つのエピトープは、リン酸化アミノ酸で表すことができる。または、タンパク質中の他のアミノ酸である。１２に示すように、タンパク質が両抗原と結合する場合、オリゴタグは互いに接触し、互いに連結を可能とする。その後、プライマー１２６を用いてオリゴを橋絡し、結合したオリゴを増幅することが可能である。１２８で示す増幅は、増幅したタンパク質分子の数を検出しうるリアルタイムまたは定量的PCR法により実行することができる。
【０１２３】
図１１に示すように、細胞Xは、顕微鏡、例えばSICM（走査型イオンコンダクタンス顕微鏡）に搭載し、それに誘導されるナノピペットによって貫通する。上述したように、細胞内含有物（〜１％）の〜１５ピコリットルた、ナノピペットを用いるたびに吸引され、その量は、全RCAの〜１ｐｇに相当する。サンプルはRNA増幅にかけ（〜１０００倍）、cDNA合成およびシーケンシングに用いる。サンプルは、あるいは、単一細胞分子分析用ナノピペット計装は、同一の個別細胞において、ゲノム分析に加えてプロテオーム解析も実行できるようにすることができる。PLAは個別の標的タンパク質を選択的に検出するために、抗体を使用する増幅アッセイである。PLAは、タンパク質を定量化するため、PCRを組み込む。これは、PCRに使用するオリゴヌクレオチドをタンパク質抗体に融合させることで達成される。
【０１２４】
再び図１１を参照すると、本方法のPLA部分の概略図が示してある。同一のタンパク質の異なるエピトープを標的２つの抗体は、プライマーまたはブロックオリゴヌクレオチドのいずれかに連結している。タンパク質へ抗体を結合させることで各オリゴヌクレオチドは近接して配置され、ライゲーションおよび増幅が可能になる。その後、増幅産物はリアルタイムPCRで検出することが可能である。PLAを用いて、PDGFRおよびEGFRなどの成長因子受容体の数を測定した。
【０１２５】
PLAの手順はさらにEGFRに用い、EGFRの活性化において重要な第１ステップである受容体の二量体化を研究することができる。広範な研究によると、PLAは市販のELISAより１０００倍以上高感度であり、PCRによりサンプル中の比較的少量の標的タンパク質も検出することが可能である。in situ PLAは固定単一細胞においてリン酸化されたPDGFR βを検出するのに十分高感度であり、キナーゼ活性に対する薬物誘導性阻害を測定することが可能である。
【０１２６】
第１の方法においては、リン酸化した標的を選択する抗体と、同一のタンパク質においてより一般的なエピトープを有する抗体の、２つの異なる抗体を用いる。抗体の組毎に、プライマーオリゴヌクレオチドを一方の抗体に連結し、ブロックオリゴヌクレオチドをもう一方に連結する。２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、コネクターオリゴヌクレオチドを用いることで達成される。qPCRを用いて、各PLAにおける増幅オリゴヌクレオチドを検出する。
【０１２７】
第２の方法は、最近記載された技術（非特許文献１２）に基づくものである。ここにおいて、PLAに使用するオリゴヌクレオチドは二次抗体に連結している。したがって、同一タンパク質で異なるエピトープを標的２つの抗体は第１の手法と同様に用いるが、この抗体は異なる種に由来するものである。相補的種に由来する二次抗体は、プライマーまたはブロックオリゴヌクレオチドのいずれかに連結する。この手法の潜在的な利点は、多重化アッセイで用いる各抗体にオリゴヌクレオチドを合成させるのではなく、この二次抗体はを各PLAで共通して用いることができる点である。目的１における初期の研究では、どちらの手法がアッセイ開発のために最適であるかを決定する。
【０１２８】
別の実施形態において、多重化アッセイを使うことはできるが、細胞ホモジネート（吸引）の一般的な細胞サンプル中においてリン酸化を測定するのに十分な感度を有するアッセイを決定する。ナノピペットは、研究対象である単一細胞の細胞質の増加量を吸引し、PLAが標的タンパク質を定量化できる細胞サンプルの最少量を決定するのに、用いられる。個別細胞からサンプリングする量は、ナノピペット先端に印加する電圧を変化させることで、変えることが可能である。最適には、〜１５ピコリットルの細胞内含有物（全細胞の〜１％）においてそれぞれを定量化することができる。それはこれが、我々がガン細胞内でWTAを測定できる細胞サンプルの量であり、この量の細胞質ゾルを多重サンプリングは、細胞を明らかに害さず、生存能力も弱めずに、吸引することができるためである。
【０１２９】
上記の方法を用いて、細胞経路活性剤で刺激する前後で細胞の状態も決定する。例えば、EGF（１μＭ）処置の前、および１時間後に個別のMDA-MB-231細胞をサンプリングし、PLAがEGFR、MAPK経路、JAK経路、and AP-1/JunおよびSTAT TFのリン酸化において予想する増加が確認できるかどうか判断する。重要なのは、EGFがMAPK-AP-1/JunおよびJAK-STATを介して発散シグナル伝達を刺激することが可能ということである。経路を一本遮断することで他の経路を介してEGFシグナル伝達に影響を与えることがないように、これらの経路各々には選択的阻害剤が存在し、リン酸化の特異性を確立している。
【０１３０】
PLAを開発してリン酸化したEGFR、MKK1、ERK1/2、JAK、AP1/JunおよびSTATを測定するために、マサチューセッツ州ビバリーのCell Signaling Technology, Inc.(CST)社製品（CS）、および、テキサス州ダラスのSanta Cruz Biotechnology, Inc.社製品（SC）より購入できる抗体を用いることができる。各標的に対して、２つの抗体を用いることができ、一つはリン酸化部位を選択的に標的とし、もう一方は同一タンパク質の異なるエピトープを標的とする。抗EGFR抗体に対しては、アミノ酸1156-1186を標的とするウサギポリクローナル06-847（CS）およびチロシン1197を標的とするマウスモノクローナル05-483（CS）を用いることができる。MKK1に対しては、Ｃ末端を標的とするモノクローナル04-376（ＣＳ）およびpSer218/222を標的とする抗リン酸化ポリクローナル444995を用いることができる。ERK1/2に対しては、残基325-345を標的とするマウスモノクローナル05-1152（CS）およびpThr202/Tyr204を標的とする抗リン酸化ウサギポリクローナルを用いることができる。JAK1に対しては、残基785-815を標的マウスモノクローナル抗体A-9（SC-1677）および、ウサギ抗リン酸化Tyr抗体1022（SC-101716）を用いることができる。リン酸化されたTFを検出するため、anti-c-Jun/AP-1マウスモノクローナル抗体OP55（CS）、および、c-Junのリン酸化serine65を標的とするウサギ抗リン酸化モノクローナルY172（CS）を用いることができる。STAT1に対し、ウサギポリクローナルSC-346およびtyrosine701を標的マウスモノクローナル抗リン酸化STAT1 (SC-8394)を用いることができる。
【０１３１】
抗体とオリゴヌクレオチドの合成には、上述した前の手順を用いることができる。抗体は、SMPB（Pierce社）の３０倍過剰量と反応させる。過剰SMPBはG-50カラム上で除去する。プライマーオリゴヌクレオチド(5’ thiol-AAA AAA AAA ATA TGA CAG AAC TAG ACA CTC TT) SEQ ID NO: 5、および、ブロックオリゴヌクレオチド(5’ thiol-AAA AAA AAA AGA CGC TAA TAG TTA AGA CGC TTU UU) SEQ ID NO: 6は、１０ｍＭのDTTで３０分間反応させる。DTTは除去し、その後、プライマーオリゴヌクレオチドは活性化抗体の一つに添加し、ブロックオリゴヌクレオチドは、各セットのもう一方の抗体に添加する。抗体−オリゴヌクレオチドはHPLCで精製することができる。二次抗体−オリゴヌクレオチドPLAプローブを試験する研究用に、ロバ抗ウサギIgG（Jackson Immunoresearch社、711-005-152）およびロバ抗マウスIgG（Jackson Immunoresearch社、715-005-150）を使用して、オリゴヌクレオチドの抗体への結合を記載したのと同じやり方で実行することができる。
【０１３２】
精製した標的（例えば、リン酸化EGFR）は、抗体（SCまたはCS）で同一の供給源から獲得することができ、そして、PLAの開発に使用することができる。PLAで１時間プレインキュベーションし、その後、プローブライゲーションを含む混合物で反応させた標的タンパク質は、コレクターオリゴヌクレオチド (5’ phosphate-CTA TTA GCG TCC AGT GAA TGC GAG TCC GTC TAA GAG AGT AGT ACA GCA GCC GTC AAG AGT GTC TA SEQ ID NO: 7 (Eurogentec) and 5’-phosphate-GTT CTG TCA TAT TTA AGC GTC TTA A) SEQ ID NO: 8 である。リアルタイムPCRに対し、８０μＭのATP、０．２ｍＭのdNTP、０．５μＭのプライマー、２００ｎＭの５'ヌクレアーゼアッセイ用プローブ、および、１．５ユニットのplatinum TaqDNA polymeraseを添加する。反応物はリアルタイムPCR機器に移送し、９５℃２分間、その後、９５℃１５秒間、続いて６０度６０秒間の温度サイクルにかけ、それを４５回繰り返す。
【０１３３】
二次抗体PLAブロー部を使用するPLAに対し、標的タンパク質は、上述したように、最初に一次抗体（オリゴヌクレオチドとの連結なし）でインキュベーションする。未結合抗体は洗浄により除去し、二次抗体PLAプローブ（抗ウサギおよび抗マウスの両方）を各一次抗体に結合した標的に添加する。PLAはその後、記載したのと同じ手順に従う。
【０１３４】
各PLAは、使用するPLAプローブの量、反応時間、洗浄手順、ライゲーションおよびハイブリダイゼーション反応に関し、最適化することが可能である。標的タンパク質の量を変更し、qPCR用に最適なタンパク質濃度を特定することもできる。同様の研究では、標的を調整したリン酸化EGFの供給源として、MDA-MB-231 細胞のホモジネートまたはEGFで刺激した試験細胞を使用し、PLAに影響を与え得る細胞因子の明細を明らかにする。特異性は、抗体ペプチドで各PLAをブロックすることにより確立することが可能である。
【０１３５】
ナノピペットを用いて、EGF（例えば、MDA-MB-231）で処理した個別細胞から種々の量で細胞質をサンプリングし、各PLAが各標的タンパク質のリン酸化を定量するのに必要な最低量の細胞サンプルを評価することができる。細胞吸引物は、我々のWTAで用いる量である〜１５ピコリットルという少量から全細胞含有物へ変化していくだろう。各PLAに対し、qPCRによるタンパク質の定量化に対し細胞内含有物の容量反応を開発することができる。分析は、３〜４個の異なる細胞で繰り返し、PLA読み出しのばらつきを判断すべきである。
【０１３６】
試験（例えば、MDA-MB-231）細胞において、EGF誘導性タンパク質リン酸化を定量化するための多重化PLA
上記で開発したPLAを多重化し、細胞サンプルを最小の量で対象のタンパク質マーカを試験して、細胞内の標的タンパク質の全てについてリン酸化（または他の修飾）を測定する。ナノピペットを用いて細胞サンプルの増加量を吸引する。その後各サンプルを均等に分割し、PLAを添加して各標的タンパク質を測定する。目的は、細胞内の各標的タンパク質の最適な読み出しを提供するのに必要となる、細胞吸引物の最少量を決定することである。その後、標準的アッセイにおいて該量の細胞吸引物を用いて、EGFシグナル伝達経路の各コンポーネントを測定する。その後、多重化PLAを用いて、EGF処理の前後でガン細胞におけるEGFシグナル伝達経路の変化を測定する。このため、ナノピペットを用いてカルボキシフルオレスセインを個別のガン細胞に注入する。その後、標識した細胞はEGF処置の前に１時間ほどサンプリングし、その後１時間たったら１μＭのEGFを添加する。PLAにより標的タンパク質のリン酸化における主要な増加を検出する。これは、基礎条件下において、各標的タンパク質が十分にリン酸化されるはずだからである。未処置のガン細胞から複数のサンプルを吸引し、細胞吸引自体が標的タンパク質のリン酸化を誘導するか否かを判定することもできる。もし誘導する場合、該刺激を、EGF刺激の効果を判定するための基礎尺度として用いることができる。
【０１３７】
PLAの特異性を試験し、EGFシグナル伝達を測定するため、我々はEGFにより調節されるいくつかのキナーゼの阻害剤が、単一MDA-MB-231細胞において、キナーゼおよびＴＦのリン酸化を下流で阻止するか否かを判定する。第１に、１μＭのEGFRキナーゼ阻害剤ゲフィチニブ（Cayman Europe社）が、EGFR、MKK1、ERK1/2、JAK、AP1/JunおよびSTATのリン酸化を阻害するか否かを判定することができる。MKK1阻害剤PD0325901（CS）が、EGFR、JAKおよびSTATのリン酸化に影響を与えずに、MKK1、ERK1/2およびAP1/Junのリン酸化を選択的に阻害するか否かを試験することもできる。この化合物はMKK1の活動およびERK1/2の後続のリン酸化を阻害するが、ERK1/2と直接相互作用するわけではない。本方法を、特徴付けられていない腫瘍細胞に適用するというさらなる態様のように、ERK1/2選択的阻害剤FR180204が、ERK1/2およびAP1-Junのリン酸化を阻害するか否か、そして、EGFシグナル伝達の他コンポーネントは阻害しないか否かを試験することができる。加えて、JAK阻害剤INCB018424（Chemitek社）がJAKおよびSTATのリン酸化を誘発するEGFを阻害するか否か、そして、MAPK経路のリン酸化を誘発するEGFを阻害するか否かを試験することができる。
【０１３８】
EGFR、MKK1、ERK1/2、JAK、AP1/JunおよびSTATのリン酸化を検出するPLAは、これらのタンパク質に対する市販のELISAよりも約１０００倍高い感度を有していよう。加えて、多重化PLAフォーマットは、単一細胞由来の１５〜１５０ピコリットルの単一吸引物中にある同タンパク質のリン酸化を検出することが可能である。また、単一腫瘍細胞、特にトリプルネガティブ細胞、例えばモデル細胞MDA-MB-231に対するEGF刺激は、非処置のコントロール群に比べ、標的タンパク質のリン酸化において有意（P ＜0.05）な増加を誘発すると期待される。
【０１３９】
上記の具体的な説明は、本発明を例示および図示することを意図しており、本発明の範囲を制限するものとして見るべきではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の文言および同等の範囲によって定義するものである。本明細書で言及したいずれの特許文献または刊行物は、本発明の特定の態様を実行するにあたり有用な方法および物質の詳細を伝えることを意図している。それを明確に述べることはできないが、当業者には理解されよう。言及した方法または道具を記載する、および、使用可能にするという目的のために、該特許文献または刊行物はここに、各々を具体的に、および、個別に本明細書の一部を構成するものとして援用した場合と同程度に、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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