(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（1）；
【化１】
0006512546.tif 000009
（式中、XはL又はD体のフェニルアラニン（Phe）、アラニン（Ala）、プロリン（Pro）
、バリン（Val）及びトリプトファン（Trp）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を示
す）
で表されるミモシン誘導体又はミモシンを有効成分として含有するシクロオキシゲナーゼ阻害剤。
【請求項２】
下記一般式（1）；
【化２】
0006512546.tif 000010
（式中、XはL又はD体のフェニルアラニン（Phe）、アラニン（Ala）、プロリン（Pro）
、バリン（Val）及びトリプトファン（Trp）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を示
す）
のミモシン誘導体又はミモシンを有効成分として含有するNADPH-シトクロムP450レダクターゼ阻害剤。
【請求項３】
Mi-L-Pro、Mi-D-Pro、Mi-L-Val、Mi-D-Val、Mi-L-Trp及びMi-D-Trpよりなる群から選ばれるミモシン誘導体を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤。
【請求項４】
ミモシン誘導体が、Mi-L-Pro、Mi-L-Val、Mi-D-Val及びMi-D-Trpよりなる群から選ばれるものである請求項３記載のチロシナーゼ阻害剤。
【請求項５】
ミモシン誘導体が、Mi-L-Val又はMi-D-Valである請求項３記載のチロシナーゼ阻害剤。
【請求項６】
ミモシン誘導体が、Mi-D-Valである請求項３記載のチロシナーゼ阻害剤。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれかに記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミモシン又はその誘導体に関し、更に詳細には、優れたシクロオキシナーゼ阻害活性、NADPH-シトクロムP450レダクターゼ阻害活性及びチロシナーゼ阻害活性を有するミモシン又はその誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体内のほとんどの化学反応は酵素によって触媒されており、様々な疾患にも酵素が関与している。このため、特定の酵素の作用を阻害する物質が薬剤として利用されている。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）はリュウマチ性関節炎などの様々な炎症性疾患に対し治療効果を有するが、NSAIDsの作用は、主にアラキドン酸からプロスタグランジンへの変換における律速酵素であるシクロオキシナーゼ（COX）の阻害に基づくものである。COXには、COX-1，COX-2と呼ばれる2つのアイソザイムが存在する。COX-1は、主に哺乳動物の細胞や組織に発現し、ホメオスタシスを維持するプロスタグランジン類を産生する機能を有する。一方、COX-2は、脳、肝臓、卵巣などに発現し、炎症性の刺激に反応して誘導される。COX-2選択的阻害剤は、消化管阻害作用などが少ない理想的な抗炎症剤となり得ると考えられる（非特許文献1〜5）。
【０００３】
またシトクロムP450（CYP）は、薬物の酸化的代謝などにおいて重要な役割を担っており、またその生体内活性化や腫瘍の形成及び発達における役割からがん治療のための標的となっている。電子移動ジフラボタンパク質であるNADPH-シトクロムP450レダクターゼ（CPR）は、多くのCYP反応の触媒反応に必須であり、また多くの他のたんぱく質や低分子化合物に電子を供給する。CPRはまた、酸化ストレスやDNA損傷を起こす活性酸素種（ROS）を生成することが報告されている。このためCPR阻害剤は、CYPが関与する疾患の治療や活性酸素種の抑制において有用であると考えられる（非特許文献6〜11）。
【０００４】
一方、皮膚におけるメラニンの形成は、紫外線による癌から保護する作用を有するが、メラニンが異常蓄積すると、メリスマ、しみ、炎症後黒皮症、日光性色素斑などの皮膚障害を引き起こす。メラニンの生成は、メラニン生成経路の重要な酵素であるチロシナーゼや、チロシナーゼ関連タンパク質（TRP-1）、ドーパクロムトートメラーゼ（TRP-2）などの他の酵素によって制御される。チロシナーゼは、モノフェノラーゼ反応とジフェノラーゼ反応による3，4-ジヒドロキシフェニルアラニンからo-ドーパキノンへの酸化によってチロシンを水酸化する。このようにチロシナーゼは、メラニン形成において重要な役割を果たすため、その阻害剤は美白剤として利用できる可能性がある（非特許文献12〜18）。
【０００５】
これらの酵素の阻害剤としていくつかの物質が知られているが（特許文献1〜2）、その活性や安全性が十分でないものもあり、なお天然物由来で強力かつ安全性の高い阻害剤が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開昭５６−７７１０号公報
【特許文献２】特開昭６３−１７４９１０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gautam, R.; Jachak, S. M.; Kumar, V.; Mohan, C. G. Synthesis, biological evaluation and molecular docking studies of stellatin derivatives as cyclooxygenase (COX-1, COX-2) inhibitors and anti-inflammatory agents. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2011, 21, 1612-1616.
【非特許文献２】Ulbrich, H.; Fiebich, B.; Dannhardt, G. Cyclooxygenase-1/2 (COX-1/COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LOX) inhibitors of the 6,7-diary-2,3-1H-dihydropyrrolizine type. Eur. J. Med. Chem. 2002, 37, 953-959.
【非特許文献３】Jain, H. K.; Mourya, V. K.; Agrawal, R. K. Inhibitory mode of 2-acetoxyphenyl alkyl sulfides against COX-1 and COX-2: QSAR analyses. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 5280-5284.
【非特許文献４】Vitale, P.; Tacconelli, S.; Perrone, M. G.; Malerba, P.; Simone, L.; Scilimati, A.; Lavecchia, A.; Dovizio, M.; Marcantoni, E.; Bruno, A.; Patrignani, P. Synthesis, pharmacological characterization, and docking analysis of a novel family of diarylisoxazoles as highly selective cyclooxygenase-1 (COX-1) inhibitors. J. Med. Chem. 2013, 56, 4277-4299.
【非特許文献５】Gierse, J.; Nickols, M.; Leahy, K.; Warner, J.; Zhang, Y.; Cortes-Burgos, L.; Carter, J.; Seibert, K.; Masferrer, J. Evaluation of COX-1/COX-2 selectivity and potency of a new class of COX-2 inhibitors. Eur. J. Pharmacol. 2008, 588, 93-98.
【非特許文献６】Pandit, S.; Mukherjee, P. K.; Mukherjee, K.; Gajbhiye, R.; Venkatesh, M.; Ponnusankar, S.; Bhadra, S. Cytochrome P450 inhibitory potential of selected Indian spices-possible food drug interaction. Food Res. Int. 2012, 45, 69-74.
【非特許文献７】Sridhar, J.; Liu, J.; Foroozesh, M.; Stevens C. L. K. Inhibition of cytochrome P450 enzymes by quinones and anthraquinones. Chem. Res. Toxicol. 2012, 25, 357-365.
【非特許文献８】Gan, L.; von Moltke, L. L.; Trepanier, L. A.; Harmatz, J. S.; Greenblatt, D. J.; Court, M. H. Role of NADPH-cytochrome P450 reductase and cytochrome-b5/NADH-b5 reductase in variability of CYP3A activity in human liver microsomes. Drug Metab. Dispos. 2009, 37, 90-96.
【非特許文献９】Gray, J. P.; Mishin, V.; Heck, D. E.; Laskin, D. L. Laskin, J. D. Inhibition of NADPH cytochrome P450 reductase by the model sulfur mustard vesicant 2-chloroethyl ethyl sulfide is associated with increased production of reactive oxygen species. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2010, 247, 76-82.
【非特許文献１０】Pandey, A. V.; Fluck, C. E. NADPH P450 oxidoreductase: structure, function, and pathology of diseases. Pharmacol. Ther. 2013, 138, 229-254.
【非特許文献１１】Pillai, V. C.; Mehvar, R. Inhibition of NADPH-cytochrome P450 reductase by tannic acid in rat liver microsomes and primary hepatocytes: methodological artifacts and application to ischemia-reperfusion injury. J. Pharm. Sci. 2011, 100, 3495-3505.
【非特許文献１２】Huh, S.; Jung, E.; Lee, J.; Roh, K.; Kim, J.-D.; Lee, J.; Park, D. Mechanisms of melanogenesis inhibition by propafenone. Arch Dermatol Res. 2010, 302, 561-565.
【非特許文献１３】Morikawa, T.; Nakanishi, Y.; Ninomiya, K.; Matsuda, H.; Nakashima, S.; Miki, H.; Miyashita, Y.; Yoshikawa, M.; Hayakawa, T.; Muraoka, O. Dimeric pyrrolidinoindoline-type alkaloids with melanogenesis inhibitory activity in flower buds of Chimonanthus praecox. J Nat Med. 2014. DOI 10.1007/s11418-014-0832-1.
【非特許文献１４】Lee, J.; Jung, E.; Park, J.; Jung, K.; Park, E.; Kim, J.; Hong, S.; Park, J.; Park, S.; Lee, S.; Park, D. Glycyrrhizin induces melanogenesis by elevating a cAMP level in B16 melanoma cells. J Invest Dermatol. 2005, 124, 405-411.
【非特許文献１５】Liu, H.; Sui, X.; Li, X.; Li, Y. Lyoniresinol inhibits melanogenic activity through the induction of microphthalmia-associated transcription factor and extracellular receptor kinase activation. Mol Cell Biochem. 2013, 373, 211-216.
【非特許文献１６】Song, K.-K.; Huang, H.; Han, P.; Zhang, C.-L.; Shi, Y.; Chen, Q.-X. Inhibitory effects of cis- and trans-isomers of 3,5-dihydroxystilbene on the activity of mushroom tyrosinase. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 342, 1147-1151.
【非特許文献１７】Delogu, G.; Podda, G.; Corda, M.; Fadda, M. B.; Fais, A.; Era, B. Synthesis and biological evaluation of a novel series of bis-salicylaldehydes as mushroom tyrosinase inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2010, 20, 6138-6140.
【非特許文献１８】An, S. M.; Kim, H. J.; Kim, J.-E.; Boo, Y. C. Flavonoids, taxifolin and luteolin attenuate cellular melanogenesis despite increasing tyrosinase protein levels. Phytother. Res. 2008, 22, 1200-1207.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、本発明の課題は、シクロオキシゲナーゼ、NADPH-シトクロムP450レダクターゼ（CPR）又はチロシナーゼに対し優れた阻害活性を有するとともに、安全性の高い阻害剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ギンネム（ギンゴウカン）やミモザなどの熱帯〜亜熱帯植物中に含まれるミモシンや、これに特定のアミノ酸を結合したミモシンジペプチドは、シクロオキシゲナーゼ、CPR、チロシナーゼに対し優れた阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、下記一般式（1）；
【化１】
0006512546.tif 000002
（式中、XはL体又はD体のフェニルアラニン（Phe）、アラニン（Ala）、プロリン（Pro）
、バリン（Val）及びトリプトファン（Trp）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を示
す）
で表されるミモシン誘導体である。
【００１１】
また本発明は、上記ミモシン誘導体又はミモシンを有効成分として含有するシクロオキシゲナーゼ阻害剤、CPR阻害剤又はチロシナーゼ阻害剤である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に用いるミモシン又はその誘導体は、優れたシクロオキシゲナーゼ阻害作用、NADPH-シトクロムP450レダクターゼ（CPR）阻害作用、チロシナーゼ阻害作用を有するとともに、細胞毒性が低く安全性にも優れるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ミモシンジペプチドの反応スキームを示す図である。
【図２】0〜15μMの各ミモシン誘導体の存在下におけるラインウィーバー・バークプロットである。
【図３】B16F10細胞生存性に対する各ミモシン誘導体の影響を示すグラフである。
【図４】細胞内チロシナーゼに対する各ミモシン誘導体の阻害率を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のミモシン誘導体は、下記一般式（1）；
【化２】
0006512546.tif 000003
で表されるものである。
【００１５】
ミモシン（β-［N-（3-ヒドロキシ-4-ピリドン）］-α-アミノプロピオン酸）は、ピリジン環の窒素原子に結合したアラニン側鎖を有する非タンパク質アミノ酸であるが、上記一般式（1）のミモシン誘導体は、このミモシンに1つのアミノ酸が結合したジペプチドである。
【００１６】
上記一般式（1）中、Xは、アミノ酸残基であれば特に制限なく、例えば、アラニン（Ala;A）、アルギニン（Arg;R）、アスパラギン（Asn;N）、アスパラギン酸（Asp;D）システイン（Cys;C）、グルタミン（Gln;Q）、グルタミン酸（Glu;E）、グリシン（Gly;G）、ヒスチジン（His;H）、イソロイシン（Ile;I）、ロイシン（Leu;L）、リシン（Lys;K）、メチオニン（Met;M）、フェニルアラニン（Phe;F）、プロリン（Pro;P）、セリン（Ser;S）、トレオニン（Thr;T）、トリプトファン（Trp;W）、チロシン（Tyr;Y）、バリン（Val;V）などが例示される。このうち、フェニルアラニン（Phe；F）、アラニン（Ala；A）、プロリン（Pro；P）、バリン（Val；V）、トリプトファン（Trp；Y）が好適であり、その中でも、シクロオキシゲナーゼ阻害作用、NADPH-シトクロムP450レダクターゼ（CPR）阻害作用、チロシナーゼ阻害作用等に優れることから、フェニルアラニン（Phe；F）、アラニン（Ala；A）、プロリン（Pro；P）、バリン（Val；V）、トリプトファン（Trp；Y）が好適である。XはN末端側でミモシンとアミド結合している。
【００１７】
基Xを構成するアミノ酸に光学異性体が存在する場合は、D体であってもL体であってもよいが、D体は特にCPR阻害活性やチロシナーゼ阻害活性に優れる。
【００１８】
本発明のミモシン誘導体の好適な例として、シクロオキシゲナーゼ−１（COX-1）及びシクロオキシゲナーゼ−２（COX-2）阻害活性に優れることから、基Xとして、D-Ala、L-Pro、D-Pro、L-Val、L-Trp、D-Trpが好ましい。L-Pro、L-Val、L-Trp、D-Trpはシクロオキシナーゼ−２（COX-2）阻害活性が高いため好ましく、L-Val、L-Trpがより好ましい。L-ValはCOX-2選択性が高いために抗炎症剤として好適である。またCPR阻害活性に優れるため、D-Phe、D-Ala、D-Pro、D-Val、L-Trp、D-Trpが好適であり、特にL-Trp、D-Trpが好ましい。一方、チロシナーゼ阻害活性に優れることから、D-Phe、D-Ala、L-Pro、D-Pro、L-Val、D-Val、L-Trp、D-Trpが好ましく、L-Pro、L-Val、D-Valがより好ましく、特にD-Valが好ましい。
【００１９】
また本発明の好適なミモシン誘導体は下記一般式（2）
【化３】
0006512546.tif 000004
で表すこともできる。
【００２０】
上記一般式（2）中、Rは、ベンジル基、メチル基、ピロリジン基、イソプロピル基及び3-インドリルメチル基よりなる群から選ばれる基を示す。
【００２１】
また上記一般式（2）中、＊は不斉炭素の絶対配置（S又はR）を示す符号である。本発明のミモシン誘導体には、エナンチオマー、ジアステレオマーおよびラセミ体を含むこれらの混合物が包含される。
【００２２】
本発明の好適なミモシン誘導体の例として以下のものを例示することができる（Miはミモシン残基を示す）。
Mi-L-Phe
Mi-D-Phe
Mi-L-Ala
Mi-D-Ala
Mi-L-Pro
Mi-D-Pro
Mi-L-Val
Mi-D-Val
Mi-L-Trp
Mi-D-Trp
【００２３】
上記一般式（1）又は（2）で示される本発明のミモシン誘導体は、例えば以下の方法によって製造することができる。
【００２４】
ミモシンはギンネムやミモザのような熱帯・亜熱帯植物に含まれる。このギンネムは、ネムノキ科ギンゴウカン属の常緑低木で、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布する。
【００２５】
このギンネムの葉からミモシンを得るには、まず、ギンネムの葉、好ましくは新鮮な若葉を、好ましくは細切ないし細断して抽出原料とする。
【００２６】
次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、適量の水を加熱し、得られた熱水で抽出する。この熱水抽出は、70℃以上、好ましくは75℃ないし沸騰状態の熱水で行うことができるが、ミモシン分解酵素を失活させ、純度の高いミモシンを得るためには、沸騰水（100℃程度）の熱水を用いることが特に好ましい。また、抽出時間は、5ないし30分程度であり、特に10分間程度煮沸抽出を行うことが好ましい。抽出に用いる抽出溶媒としては、蒸留水が好ましく、また、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌することが望ましい。
【００２７】
このギンネム葉抽出液中に、強陽イオン交換樹脂を加えて、ミモシンを含む被吸着成分を吸着させる。次いで、このイオン交換樹脂を、水や、水-エタノール混液で洗浄した後、アンモニア水中等に浸漬し、ミモシンをイオン交換樹脂から溶出させる。この溶出液を必要により活性炭処理した後、濃縮処理し、低温で放置することによりミモシン塩が析出してくるので、これを集めることでミモシンが得られる。得られたミモシンは必要に応じて再結晶等の手段により精製してもよい。
【００２８】
このようにして得られたミモシンに、ペプチド固相合成法などの公知のペプチド合成法を用いてアミノ酸を結合させることにより本発明のミモシン誘導体を得ることができる。
【００２９】
ミモシンおよびアミノ酸は、アミノ基を、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Fmoc）やt-ブチルオキシカルボニル基（Boc）などの保護基で保護することが好ましい。
【００３０】
ペプチド結合を形成するための縮合剤としては、例えば、ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）、N，N-ジシクロヘキシルカルボジイミド（DCC）等が挙げられる。また、これらの縮合剤をN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBt）と混合して用いることもできる。
【００３１】
ペプチド又はアミノ酸のアミノ末端アミノ基の保護基であるBocおよびFmocは、トリフルオロ酢酸（TFA）、ピペリジンなどにより除去することができる。
【００３２】
また、ペプチド固相合成樹脂としては、Wang樹脂などを用いることができる。ペプチドをペプチド固相合成樹脂より脱離させるにあたっては、例えば、TFAなどが用いられる。
【００３３】
本発明のミモシン誘導体を製造するためのFmoc固相合成法による反応スキームを図1に示す。このスキームにおいては、N-（9-フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド（Fmoc-OSu）のFmoc基をミモシンに結合してFmoc-ミモシンを調製し、これをWang樹脂に結合したアミノ酸と結合させることによって、ミモシンジペプチドを形成させている。以下、より具体的に説明する。
【００３４】
（Fmoc-ミモシンの調製）
ミモシンおよび炭酸ナトリウムを蒸留水に溶解し、この溶液にFmoc-OSuをジオキサンに溶解した溶液を滴下し、室温で一晩インキュベートする。次いで、炭酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した後、この溶液をろ過し、次いで酢酸エチルで洗浄して、未反応のFmoc-OSuや副産物を除去する。氷浴中で、塩酸を用いて水画分のpHを4程度にまで下げることによって、Fmoc-ミモシンの結晶が析出する。
【００３５】
（ミモシンジペプチドの固相合成）
Fmoc-アミノ酸（L体又はD体）、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール（HOBt）およびN，N’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）を添加したN，N-ジメチルホルムアミド（DMF）溶液に、ジクロロメタン中で膨張させたWang樹脂を添加し、攪拌する。この樹脂をろ過し、DMF、ジクロロメタンおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥する。25％ピぺリジンによりFmocの脱保護を行った後、Fmoc-ミモシン、HOBt、HBTUおよびN，N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA）の混合溶液を添加し、攪拌してFmoc-ミモシンをアミノ酸に結合させてジペプチドを形成する。95％トリフルオロ酢酸（TFA）で振とうした後、樹脂をろ過し、TFAで洗浄し、得られたろ液から氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせることによって、ミモシンジペプチドが得られる。
【００３６】
以上のようにして得られた本発明のミモシン誘導体は、そのまま、あるいは必要に応じ、液体高速クロマトグラフィーなど公知の方法によって精製した後、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、CPR阻害剤又はチロシナーゼ阻害剤として利用することができる。
【００３７】
一方、ミモシン誘導体だけでなく、ミモシン自体も優れたシクロオキシゲナーゼ阻害作用及びCPR阻害作用を有するため、本発明のシクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤の有効成分としてミモシンを用いることができる。
【００３８】
例えば、ミモシン又はミモシン誘導体を有効成分とするシクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤の調製は、治療有効量のミモシン又はミモシン誘導体を、製薬上許容される任意成分、例えば、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等と組み合わせ、混合することにより行うことができる。
【００３９】
本発明のシクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤は、経口でも非経口でも投与することができる。経口投与による場合の本発明シクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤は、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合には、本発明のシクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。
【００４０】
本発明のシクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤は、投与方法、患者の年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人1日あたり約10〜200mgであり、好ましくは、約10〜20mgであり、これを必要に応じて数回に分け投与すれば良い。また、非経口投与の場合は、成人1日あたり約5〜100mg、好ましくは、約5〜10mgを投与すれば良い。
【００４１】
本発明のシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、COX-1及び／又はCOX-2を有効に阻害する。特にMi-D-Ala、Mi-L-Pro、Mi-D-Pro、Mi-L-Val、Mi-L-Trp、Mi-D-Trp、ミモシンはCOX-1阻害剤として好適であり、COX-1阻害により治療、予防又は改善され得る疾患又は症状を治療、予防又は改善することができる。COX-1阻害により治療、予防又は改善され得る疾患又は症状としては、例えば、炎症や血栓形成の予防等が例示される。Mi-L-Pro、Mi-L-Val、Mi-L-Trp、Mi-D-Trp、ミモシンはCOX-2阻害剤として好適であり、特にMi-L-Val、MI-L-Trp、ミモシンが好適である。COX-2阻害により治療、予防又は改善され得る疾患又は症状を治療、予防又は改善することができる。COX-2阻害により治療、予防又は改善され得る疾患又は症状としては、例えば、炎症、関節炎、アルツハイマー、疼痛、大腸癌等が例示される。Mi-L-Val、ミモシンはCOX-2選択性が高いために消化管障害の少ない抗炎症剤として好適である。また本発明のCPR阻害剤は、シトクロムP450触媒反応の律速酵素であるCPRを有効に阻害し、CPRはヘムオキシゲナーゼ、スクアレンモノオキシゲナーゼ、シトクロムb5を含む多くのタンパク質や低分子化合物に対する電子供与体として働くものであるため、活性酸素消去剤の他、これらが関与する疾患や症状に対する治療、予防又は改善剤となる。CPR阻害剤として、Mi-D-Phe、Mi-D-Ala、Mi-D-Pro、Mi-D-Val、Mi-L-Trp、Mi-D-Trpが好適であり、特にMi-L-Trp、Mi-D-Trpが好ましい。
【００４２】
一方、本発明のチロシナーゼ阻害剤は上記ミモシン誘導体を有効成分とする。ミモシン誘導体として、Mi-D-Phe、Mi-D-Ala、Mi-L-Pro、Mi-D-Pro、Mi-L-Val、Mi-D-Val、Mi-L-Trp、Mi-D-Trpが好ましく、Mi-L-Pro、Mi-L-Val、Mi-D-Valがより好ましく、特にMi-D-Valが好ましい。チロシナーゼ阻害剤も上記シクロオキシゲナーゼ阻害剤又はCPR阻害剤と同様にして、色素沈着過剰、低色素沈着等の皮膚異常の治療用途のための経口あるいは非経口の医薬として製剤化することができる。また皮膚外用剤とすることもでき、例えば、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、pH調整剤等の成分を加えて調製することができる。
【００４３】
本発明のチロシナーゼ阻害剤の添加量は、添加対象物の種類、投与経路、剤形等の諸条件によって異なるが、例えば、医薬製剤（全重量）中に2質量％〜5質量％含有させることが好適である。
【００４４】
また本発明のチロシナーゼ阻害剤の投与量は、特に限定されるものではなく、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができるが、例えば、経口投与の場合には、成人1日あたり約10〜200mgであり、好ましくは、約10〜20mgである。また非経口投与の場合は、成人1日あたり約5〜100mg、好ましくは、約5〜10mgを投与すれば良い。
【００４５】
さらに、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、メラニンの産生や沈着を抑制し、美白作用を有するため、化粧料に配合し美白化粧料とすることもできる。例えば、公知の化粧料基剤にチロシナーゼ阻害剤を、3〜5質量％程度配合し、常法に従って、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状の形態とすることにより製造され、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等として提供される。
【００４６】
また、上記美白化粧料の製造にあたっては、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧料に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、pH調整剤等を加えることができる。
【実施例】
【００４７】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【００４８】
参  考  例  １
ミモシンの調製：
琉球大学農学部周辺で採取したギンネムの葉1.5kgを、5Lの水で10分間煮沸した。抽出液を冷却後、吸引濾過によって濾過し（アズワン社製、 Shaking Baths SB-20）、ろ液にイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０プラス（Ｈ））2kgを添加した。この抽出液・樹脂混合物を30分間撹拌した後一晩放置した。このイオン交換樹脂を蒸留水で5〜6回すすぎ、クロロフィルを取り除くために80％のエタノール5Lを滴下した。この樹脂を2N水酸化アンモニウム6Lで溶出して粗ミモシンを得た。この溶出物を40℃、減圧下で300mLまで濃縮し、pHを6N塩酸で4.5〜5.0に調節し、冷凍庫に一晩置いて結晶化させた。得られた結晶を5N  NaOHを用いてpH9.0とした後、これに6N  HClを加えてpH4.5〜5.0とすることで再結晶させ、さらに4℃で放置することで精製ミモシンを得た。ミモシンは-20℃で保管した。
【００４９】
製  造  例  1
ミモシン誘導体の調製（Mi-L-Phe）：
Fmoc固相合成法により、ミモシン（Mi）にアミノ酸を結合してジペプチドの合成を行った。ハイペップ研究所から入手したFmoc  L-アミノ酸を用いてジペプチドを形成した。より具体的な製法を以下に示す。
【００５０】
（Fmoc-ミモシンの調製）
2.5gのミモシンおよび2.75gの炭酸ナトリウムを37.5mLの蒸留水に溶解した水溶液に、6.25gのFmoc-Osuを37.5mLのジオキサンに溶解した溶液を滴下した。混合液を室温で20時間撹拌し、次に150mLの炭酸ナトリウム溶液（0.1M）を添加した。25℃で7時間攪拌した後、得られた溶液をろ過し、75mLの酢酸エチルで洗浄してFmoc-OSu及び副産物を除去した。氷浴中で、6N塩酸を用いて水画分のpHを4に下げ、4℃で一夜放置した。結晶を濾過し、蒸留水で洗浄して減圧条件下で乾燥し精製Fmoc-ミモシンを得た。
【００５１】
（ミモシンジペプチドの固相合成）
Fmoc-L-Phe 2.35mmol、1-ヒドロキシ-1H-ベンゾトリアゾール（HOBt）2.35mmol（360mg）およびN，N’-ジイソプロピルカルボジイミド（DIC）2.35mmol（365μL）を5mLのDMF中で予め活性化し、この溶液に2mLのジクロロメタン中で30分膨張させたWang樹脂0.5gを添加し、次に500μL  DMFに0.235mmol（29mg）のN，N-ジメチル-4-アミノピリジン（DMAP）を添加した溶液を加えた。この混合物を室温で3時間撹拌した。この操作を2回繰り返した。この樹脂をDMF，ジクロロメタン、メタノールで洗浄し、減圧条件下で乾燥した。樹脂（5mg）をFmoc基含有量の分析に使用した。室温で45分間浸透し、25％ピぺリジンによりFmocの脱保護を行った後、Fmocミモシン（樹脂のアミノ酸に対し4当量）、HOBt（4当量）、HBTU（3.6当量）：N，N-ジイソプロピルエチルアミン（DIEA；8当量）を含む混合液に、アミノ酸-樹脂のDMF懸濁液を加え、室温で1時間撹拌した。
【００５２】
結合の完全性を調べるために、カイザー試験を行った。最終的な開裂の後、樹脂を95％トリフルオロ酢酸を用いて90分間強く振とうし、濾過した後、TFAで洗浄した。洗浄液から氷冷したジエチルエーテルで沈殿を生じさせた。得られた沈殿物を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄後、減圧乾燥し、目的のミモシンジペプチド（Mi-L-Phe）を得た。得られた粗ペプチドは白色固体であり、収量は132mgであった。この粗ペプチドをさらに下記条件の液体クロマトグラフィーによって精製した。
【００５３】
（HPLC条件）
カラム：Phenomenexカラム（150×14.6mm；4μm）
移動相：溶媒A：水／0.1％TFA、溶媒B：アセトニトリル／0.1％TFA
流量：1mL／分
吸収波長：210nm
【００５４】
以下に得られたミモシンジペプチド（Mi-L-Phe）の1H及び13C  NMRスペクトルを示す。なお、1H及び13Cスペクトルは、D2OのJEOL JNM-ECA400（JEOL、日本)で記録した。ケミカルシフトは、ＴＭＳに関連づけられたｐｐｍ（δ）で表現した。
【００５５】
1H NMR (D2O, 400 MHz) δ 7.44 (s, 1H, OH), 7.32-7.37 (m, 4H, aromatic), 6.60 (s, 1H, OH), 4.57 (s, 1H, NH), 4.43 (s, 2H, NH2), 3.99-4.19 (q, 1H, CH), 3.31 (d, 2H, CH2), 3.26 (d, 2H, CH2), 3.15 (d, 2H, CH2), 3.09 (d, 2H, CH2). 13C NMR (D2O, 400 MHz) δ 181.52, 173.89, 148.2, 140.2, 135.05, 129.32, 129.07, 127.65, 114.79, 97.49, 71.12, 55.99, 36.30. ESI-MS: m/z 345.13. 
【００５６】
製  造  例  ２
ミモシン誘導体の調製（Mi-D-Phe）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-D-フェニルアラニン（Phe）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-D-Phe）を得た（収量48.5mg）。
【００５７】
製  造  例  ３
ミモシン誘導体の調製（Mi-L-Ala）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-L-アラニン（Ala）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-L-Ala）を得た（収量45mg）。得られたミモシンジペプチド（Mi-L-Phe）の1H及び13Cスペクトルを示す。
【００５８】
δ 7.70 (s, 1H, OH), 6.61 (s, 1H, OH), 4.64 (s, 1H, NH), 4.45 (s, 2H, NH2), 4.20 (q, 1H, CH), 3.79-3.81 (m, 4H, aromatic), 3.75 (q, 1H, CH), 1.65 (d, 2H, CH2), 1.49 (d, 2H, CH2), 1.30 (d, 2H, CH3). 13C NMR (D2O, 400 MHz) δ 181.55, 175.75, 148.2, 140.2, 138.52, 130.70, 129.07, 127.65, 114.82, 97.79, 50.47, 42.80, 16.08. ESI-MS: m/z 269.10. 
【００５９】
製  造  例  ４
ミモシン誘導体の調製（Mi-D-Ala）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-D-アラニン（Ala）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-D-Ala）を得た（収量79mg）。
【００６０】
製  造  例  ５
ミモシン誘導体の調製（Mi-L-Pro）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-L-プロリン（Pro）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-L-Pro）を得た（収量105.5mg）。
【００６１】
製  造  例  ６
ミモシン誘導体の調製（Mi-D-Pro）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-D-プロリン（Pro）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-D-Pro）を得た（収量43mg）。
【００６２】
製  造  例  ７
ミモシン誘導体の調製（Mi-L-Val）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-L-バリン（Val）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-L-Val）を得た（収量17mg）。
【００６３】
製  造  例  ８
ミモシン誘導体の調製（Mi-D-Val）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-D-バリン（Val）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-D-Val）を得た（収量25mg）。
【００６４】
製  造  例  ９
ミモシン誘導体の調製（Mi-L-Trp）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-L-トリプトファン（Trp）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-L-Trp）を得た（収量98mg）。得られたミモシンジペプチド（Mi-L-Trp）の1H及び13Cスペクトルを示す。
【００６５】
δ 7.52 (s, 1H, OH), 7.31 (s, 1H, NH), 7.28 (s, 1H, OH), 7.17-7.26 (s, 1H, CH), 6.58 (d, 1H, NH), 4.52 (s, 2H, CH), 4.40 (s, 1H, CH), 4.16 (s, 1H, CH), 4.03 (m, 1H, CH), 3.51 (t, 2H, NH2), 3.49 (s, 1H, CH), 3.46 (m, 2H, CH2), 3.27 (m, 2H, CH2). 13C NMR (D2O, 400 MHz) δ 181.52, 174.43, 148.2, 138.31, 136.34, 132.77, 124.97, 122.08, 119.41, 118.39, 111.89, 107.04, 98.99, 90.77, 68.44, 55.00, 48.07, 26.32. ESI-MS: m/z 384.14.
【００６６】
製  造  例  １０
ミモシン誘導体の調製（Mi-D-Trp）：
結合させるFmocアミノ酸としてFmoc-D-トリプトファン（Trp）を用いた以外は製造例1と同様にしてミモシンジペプチド（Mi-D-Trp）を得た（収量71.5mg）。
【００６７】
実  施  例  １
シクロオキシゲナーゼ(COX)阻害試験：
実験には、Colorimetric COX (ovine) Inhibitor Screening Assay（cat.760111,Cayman）を用いた。抗ウサギIgG抗体でコートした96ウェルマイクロタイタプレートにAssay Buffer(0.1 M Tris-HCl、pH8.0)を150μL、ヘムを10μL及び酵素（COX-1又はCOX-2）を10μL添加した。直ちに参考例1で得たミモシン又は製造例で調製したミモシンジペプチド試料10μLをinhibitor wellに添加し、100%活性wellとBackground wellには溶媒又は Bufferを10μL添加した。25℃で5分間インキュベートした後、colorimetric substrateを全てのwellに20μLずつ添加し、22mM  アラキドン酸を20μLずつ添加した。混合物を振とうした後、さらに25℃で5分間インキュベートした。マイクロプレートリーダー(ベンチマーク  プラス、ビオラッド社、イギリス)を使用し590nmの吸光度を測定した。インドメタシンを陽性コントロールとした。全ての試料と100％活性wellの補正後の吸光度は、back ground wellの吸光度を減じて計算し、下記の式で阻害率を算出した。結果を表1に示す。
阻害(％)  ＝（Ao-As）／Ao×100
Ao：補正後の100％活性の吸光度
As：補正後の試料の吸光度
【００６８】
なお、全ての試験において、統計処理は、statistical  analysis  sysytem（SAS）software Version 9.1.3（SAS  Institute  Inc.）を用いて行った。有意性分析においては、データを一元配置分散分析ANOVAで分析し、ダンカンテスト（P≦0.05）により平均値の有意差を判別した。IC50は各試料が50％の阻害活性を示すために必要とされる濃度としてグラフから求めた。
【００６９】
【表１】
0006512546.tif 000005
【００７０】
ミモシンは、COX-1とCOX-2に対し強い阻害活性を示したが、IC50はそれぞれ28.86μM，20.93μMであり、COX-1よりもCOX-2に対しより強い阻害剤であることが示された。ミモシンは、IC50が27.70μMであるインドメタシンに匹敵するCOX-2阻害活性を有している。したがってミモシンは、選択的COX-2阻害剤として胃腸障害を軽減した抗炎症剤あるいは炎症関連疾患の治療・予防剤として有用である。またすべてのミモシンジペプチドはミモシンよりも優れたCOX-1阻害作用を示し、そのIC50はミモシンが28.86μMであるのに対し、17.91〜26.18μMの範囲であった。Mi-L-Val（IC50  21.72μM）及びMi-L-Trp（IC50  19.31μM）はインドメタシンよりも優れたCOX-2阻害作用を示した。COX-1とCOX-2に対し、Mi-L-Trpが最も高い阻害活性を示し、ミモシンよりも高いものであった。
【００７１】
実  施  例  ２
NADPH-シトクロムP450リダクターゼ阻害試験：
阻害活性はcytochrome  c  reductase  assay  kit（Sigmaaldrich,Japan）を使って測定された。分析原理は、NADPHの存在下CPRによるシトクロムcの測定に基づく。分析は、基質としてシトクロムcを使って25℃で行った。すなわち、0.3Mリン酸カリウムバッファ（pH  7.8）、0.1mM  EDTA、0.45mg／mLシトクロムcを含有する希釈標準950μLを1mLキュベットに移し、20μLのCPRと試料として参考例1のミモシン又は製造例のミモシンジペプチドを30μL添加した。その後、50mM青酸カリ水溶液20μLを反応液に添加して反応を停止させた。反応は、100μLのNADPH溶液（0.85mg／mL）の添加によって開始された。分光光度計にて550nmの吸光度を測定した。酵素無添加の場合に与えられた値をブランクとした。阻害活性は、1％の水を使用したブランクを100％としてこれに対する割合として測定し、その結果からIC50を求めた。結果を表2に示す。
【００７２】
【表２】
0006512546.tif 000006
【００７３】
ミモシンはCPRに対しIC50  5.19μMと高い阻害作用を示した。またすべてのミモシンジペプチドがIC50  8.06〜31.08μMの範囲の強いCPR阻害活性を示した。いずれのアミノ酸についても、CPR阻害活性については、L-アミノ酸よりもD-アミノ酸の方が高い阻害活性を示した。
シトクロムP450触媒反応の律速酵素であるCPRは、ヘムオキシゲナーゼ、スクアレンモノオキシゲナーゼ、シトクロムb5を含む多くのタンパク質や低分子化合物に対する電子供与体として働く。このため、ミモシンが医薬、ステロイド、脂肪酸代謝、ヘム異化作用、ステロール生体合成において新規な役割を持ち得ると考えられる。
【００７４】
実  施  例  ３
チロシナーゼ阻害試験：
まず種々の濃度の試料（20μL）を、96ウェルプレートの各々のウエルに取り、これに20mMリン酸ナトリウムバッファ(pH6.8)120μLおよびバッファに溶解した20μLの500U／mLきのこチロシナーゼ酵素20μLを加え混合した。混合物を25℃で15分間インキュベートし、次に、0.85mM  L-チロシン溶液20μLを加えた。マイクロプレートリーダー(ベンチマーク  プラス、ビオラッド社、イギリス)を使用し、470nmでの吸光度を記録した。なお陽性コントロールとしてコウジ酸を使用した。
また強い活性を示した試料化合物について、反応速度論的な研究のために、いくつかの阻害剤濃度に対し、一定の基質濃度(L-チロシン)の範囲で反応させた。プレインキュベーションと測定時間は上記と同様にした。酵素の阻害様式はラインウィーバー・バークプロットによって決定した。また阻害定数Kiは阻害剤濃度に対するKm/Vmaxを再プロットして決定した。阻害率を下記式により算出し、これからIC50を求めた。
【００７５】
阻害(％)  ＝［（CE-CO）-（SE-SO）］／（CE-CO）×100
CE：酵素を含むコントロールの吸光度
CO：酵素を含まないコントロールの吸光度
SE：酵素を含む試料の吸光度
SO：酵素を含まない試料の吸光度
【００７６】
【表３】
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【００７７】
全ての合成ミモシンジペプチドは、ミモシンよりも良好なチロシナーゼ阻害活性を示した。アミノ酸の中でもトリプトファン、バリン又はプロリンとのジペプチドは、L体、D体とも高いチロシナーゼ阻害活性を示した。またいずれのアミノ酸についても、L体よりもD体の方が阻害活性が高くなる傾向にあった。特にMi-L-Pro、Mi-D-Trp、Mi-L-Val及びMi-D-Valの4つのミモシンジペプチドが優れた阻害活性を示し、IC50はそれぞれ13.11、16.91、11.52、10.39 μMであった。
これらの4つのミモシンジペプチドについて反応速度論的検討を行った。基質濃度の逆数1/[S]を横軸に、その時の反応速度の逆数1/vを縦軸にしたラインウィーバー・バークプロットを図2に示す。阻害剤の濃度の増加に伴いKm値が増大したが、Vmaxは変化しなかったことから、競合阻害剤であると考えられた。これらの化合物のKi値を表4に示す。Mi-D-Val(0.021 mM)の阻害定数は,Mi-L-Val、Mi-L-Pro、Mi-D-Trpよりも低く、Mi-D-Valはもっとも強力な効果を有することが示された。
【００７８】
【表４】
0006512546.tif 000008
【００７９】
実  施  例  ４
細胞毒性試験：
（B16F10細胞の培養）
B16F10細胞は、温度37℃、CO2濃度5％、飽和湿度の環境下で、10％ウシ胎仔血清（FBS）及び1％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ変法最小必須培地（DMEM）中で培養した。
【００８０】
（細胞生存率分析）
B16F10細胞生存率について、文献記載（Tada, H.; Shiho, O.; Kuroshima, K.-I.; Koyama, M.; Tsukamoto, K. An improved colorimetric assay for interleukin 2. J Immunol Methods. 1986, 93, 157-165.）の方法に従って試験を行った。この方法は、黄色のテトラゾリウム化合物である3-（4，5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2，5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（MTT）が酵素により開裂され紫色のホルマザン結晶に変化することに基づく。B16F10細胞を、5×103cells/wellの密度で各ウェルに播種し、24時間培養後、試料化合物を10%FBS及び1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEMに添加した。B16F10細胞は、温度37℃、CO2濃度5％、飽和湿度の環境下で40時間培養した。その後、各ウェルに0.5mg／mLのMTT溶液20μLを加え、3時間培養した。培地を除去し、ホルマザンを200μLのDMSOに溶解した。プレートを10分間振とうし、マイクロプレートリーダー(ベンチマーク  プラス、ビオラッド社、イギリス)を使用し、590nmでの吸収を測定した。ミモシン（100μM）及びコウジ酸（500μM）を陽性コントロールとした。ジメチルスルホキシド(DMSO)をブランクとした。試料及びコントロールの吸光度からブランクの吸光度を減じ、補正後の試料の吸光度を補正後のコントロールの吸光度で割り、100を乗じて細胞生存率の割合を求めた。結果を図3に示す。ほとんどのミモシンジペプチドは200μMの濃度まで細胞毒性を示さなかった。
【００８１】
実  施  例  ５
細胞内チロシナーゼ阻害試験：
B16F10細胞を5×103cells/wellの密度で96ウェルプレートに播種し、24時間培養した後、試料化合物（10-500μM）を添加した。48時間培養後、50mMの氷冷したリン酸バッファ（pH6.8）で2回洗浄し、50mMの1％Triton-X含有リン酸緩衝液（pH6.8）90μLで溶解し、-80℃で30分間冷凍した。解凍、混合後、各ウェルに5％L-DOPA  20μLを添加した。この混合物を37℃で2時間培養後、490nmで吸光度を測定した。ミモシン（100μM）とコウジ酸（500μM）を陽性コントロールとした。結果を図4に示す。
【００８２】
図4に示すとおり、すべてのミモシンジペプチドは200μMで細胞内のチロシナーゼ活性を56〜72％抑制した。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明のミモシン誘導体又はミモシンは、優れたシクロオキシゲナーゼ阻害活性及びNADPH-シトクロムP450リダクターゼ阻害活性を示すため、抗炎症剤、活性酸素消去剤やこれらが関連する疾患を治療・予防する医薬等として利用可能なものである。
【００８４】
また、本発明のミモシン誘導体は優れたチロシナーゼ阻害活性を有するため、皮膚障害を予防・治療するための医薬や美白化粧料等として利用できるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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