(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の対象から得られた１つまたは複数の試料と関連づけられた複数のＲＮＡを得ることであって、試料と関連づけられた前記ＲＮＡが別個の反応コンパートメント内に存在すること；
酵素反応を利用して生成されかつユニバーサルプライミング配列、バーコード配列及び結合部位を含むアダプター分子を、前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加すること；ならびに
前記バーコード配列を、前記試料と関連づけられた１つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込み、それにより関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させること
を含む、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドの生成方法であって、
前記アダプター分子が、鋳型分子を１つまたは複数の酵素と接触させることにより生成され、前記鋳型分子が、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーターを含むＤＮＡ分子であり、前記１つまたは複数の酵素が、ＲＮＡポリメラーゼを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡＰプロモーターが、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記鋳型分子が、固体担体に結合されており、
前記固体担体が、水溶液と接触しており、かつ
前記アダプター分子が、生成されると水溶液中に放出される、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アダプター分子を１つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加することが、前記水溶液を、前記ＲＮＡが存在している前記反応コンパートメントと混和することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液が、１つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡと同じ反応コンパートメント内に存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記鋳型分子が、エンドヌクレアーゼ制限部位を含み、
前記１つまたは複数の酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、かつ
前記アダプター分子が、前記鋳型分子の一部を含み、前記鋳型分子が前記制限エンドヌクレアーゼと接触すると前記一部が生成されて前記水溶液中に放出される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記固体担体が、ビーズ、クロマトグラフィー樹脂、マルチウェルプレートまたはマイクロ遠沈管である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記アダプター分子を１つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加する前は、前記アダプター分子が溶液中で遊離している、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を１つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加することが、前記コンパートメントを、前記ＲＮＡが存在している反応コンパートメントと混和することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記ＲＮＡが存在している反応コンパートメント内で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記ＲＮＡが存在している反応コンパートメント内で生成されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素反応が、等温性反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アダプター分子が、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アダプター分子が、ＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
複数のｃＤＮＡを得るために、前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡを逆転写することをさらに含み、ＲＮＡを逆転写することが、逆転写酵素及び第一鎖プライマーを用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を１つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加することが、前記コンパートメントを、前記ＲＮＡが存在している前記反応コンパートメントと混和することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ｃＤＮＡの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応コンパートメントと混和する前に合成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｃＤＮＡの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応コンパートメントと混和した後に合成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡを逆転写することが、前記ＲＮＡに付加された前記アダプター分子が生成されたのと同じ反応コンパートメント内で起こる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記反応コンパートメント内の緩衝液が、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．８のｐＨ範囲で、トリス、カリウムイオン、塩素イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、酢酸イオン、またはマグネシウムイオンのうちの少なくとも１種を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記逆転写酵素が、鋳型切替え活性を有し、
前記試料と関連づけられたｃＤＮＡの少なくとも幾つかの第一鎖が、３'オーバーハングを含み、
前記アダプター分子の結合部位が、３'オーバーハングに相補的である３'部分を含み、かつ
前記バーコード配列が、前記試料と関連づけられたｃＤＮＡの第一鎖に組み込まれるように、前記アダプター分子が前記逆転写酵素のための鋳型として働く、
請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記３'オーバーハングが、１つまたは複数のＣヌクレオチドを含み、前記結合部位の３'部分が、１つまたは複数のＧヌクレオチドを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第一鎖プライマーが、ポリＴトラクトを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
関心対象のポリヌクレオチドを生成させることが、第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて前記試料のｃＤＮＡの前記第一鎖を増幅することを含み、前記第二のプライマーが、前記第一鎖プライマーの少なくとも一部と同じ配列を有し、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一のプライマーが、前記アダプター分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一鎖プライマーが、ポリＴトラクトを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞が、血液細胞、免疫細胞、組織細胞、または腫瘍細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、Ｂ細胞またはＴ細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、少なくとも１、３、１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００種のｍＲＮＡを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、細胞のトランスクリプトームの少なくとも一部を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、細胞の総ＲＮＡを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
試料あたり少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００種の関心対象のポリヌクレオチドが、生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたは複数の試料が、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個の細胞を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
前記試料を溶解緩衝液と接触させることをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
前記試料を核酸マーカーと接触させ、それにより前記核酸マーカーを前記試料のサブセットと結合させること；及び
前記試料を洗浄し、それにより前記核酸マーカーが結合していない試料から前記核酸マーカーを除去すること
をさらに含み、
前記サブセット内の試料については、前記試料と関連づけられたＲＮＡに付加された前記アダプター分子もまた、前記核酸マーカーに付加され、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドが、前記核酸マーカーを用いて生成される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記核酸マーカーが、分子標識に連結された核酸を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記分子標識が、抗体、抗原、またはタンパク質である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記分子標識が、１つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸が、ＲＮＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸が、ＤＮＡである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＤＮＡが、ＲＮＡＰプロモーターを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料が、第一の核酸マーカー及び第二の核酸マーカーと接触しており、
前記第一の核酸マーカーが、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、
前記第二の核酸マーカーが、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含み、
前記第一の核酸及び第二の核酸が、異なる配列領域を含み、かつ
前記第一の分子標識と第二の分子標識が異なっている、
請求項４３〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記１つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記１つまたは複数の試料が、少なくとも３、１０、３０、または１００種の異なる対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、内容全体が全ての目的で参照により本明細書に取り込まれる、２０１３年１２月３０日に出願された表題「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｂａｒｃｏｄｅｓ」の米国特許仮出願第６１/９２２，０１２の利益を主張するものである。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出された「配列表」、表、またはコンピュータ・プログラム・リスティング・アペンディクスの参照
２０１４年１２月３０日に作成されたファイル９７５１９−９２０７７７．ｔｘｔ（１８，２２７，２００バイト、機器フォーマット：ＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーションシステム）に記載された配列表は、全ての目的で全体として参照により本明細書に取り込まれる。ファイルＴａｂｌｅ  １８．［ｂａｒｃｏｄｅ＿ｐａｒｔ１］．ｔｘｔ（２，０３９，８０８バイト）に記載されたＴａｂｌｅ  １８．［ｂａｒｃｏｄｅ＿ｐａｒｔ１］；ファイルＴａｂｌｅ  １８．［ｂａｒｃｏｄｅ＿ｐａｒｔ２］．ｔｘｔ（９０，１１２バイト）に記載されたＴａｂｌｅ  １８．［ｂａｒｃｏｄｅ＿ｐａｒｔ２］；ファイルＴａｂｌｅ  ２２．［ｉ５  ｉｎｄｅｘ  ｐｒｉｍｅｒｓ］．ｔｘｔ（４，０９６バイト）に記載されたＴａｂｌｅ  ２２．［ｉ５  ｉｎｄｅｘ  ｐｒｉｍｅｒｓ］；ファイルＴａｂｌｅ  ３２．［ｗｅｌｌ−ｂａｒｃｏｄｅ］．ｔｘｔ（４，０９６バイト）に記載されたＴａｂｌｅ  ３２．［ｗｅｌｌ−ｂａｒｃｏｄｅ］；ファイルＴａｂｌｅ  ３２．［ｐｌａｔｅ−ｂａｒｃｏｄｅ］．ｔｘｔ（４，０９６バイト）に記載されたＴａｂｌｅ  ３２．［ｐｌａｔｅ−ｂａｒｃｏｄｅ］は、全て２０１４年１２月２４日に作成され（機器フォーマット：ＩＢＭ−ＰＣ、ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーションシステム）、全ての目的で全体として参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫グロブリン（Ｉｇ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子などの可変遺伝子は、ジャンクションの間にＰ／Ｎヌクレオチド付加を有するＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの再構成から形成される。完全に機能的なＩｇまたはＴＣＲタンパク質が、２つの遺伝子、即ちＩｇの場合には重鎖及び軽鎖遺伝子、αβＴＣＲの場合にはα及びβ遺伝子、そしてγδＴＣＲの場合にはγ及びδ遺伝子の会合により形成される。このコンビナトリアルアプローチは、極めて多様性のある異なる可能な配列をもたらす。
【０００４】
このレパートリーは、生物体が未だ遭遇していない新規な免疫学的損傷への応答を可能にする。免疫グロブリン遺伝子は、レパートリーサイズをさらに増加させる体細胞高頻度突然変異も受ける。
【０００５】
それに応じて、機能的特性を研究するためのネイティブＩｇまたはＴＣＲタンパク質の発現を可能にする可変遺伝子の任意の核酸分析は、個々のＢ（Ｉｇ遺伝子の場合）またはＴ細胞（ＴＣＲ遺伝子の場合）の配列決定を必要とするだけでなく、該タンパク質を構成する２種の遺伝子のネイティブ対形成（ｎａｔｉｖｅ  ｐａｉｒｉｎｇ）も必要とする。これは、単一細胞クローニング及びサンガー配列決定により実施し得るが、緩徐で手間がかかる（例えば、Ｗｒａｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００８，  ４５３：６６７−６７１（非特許文献1）参照）。
【０００６】
ハイスループットの方法が、ネイティブ対形成された遺伝子のハイスループット配列決定のために開発され、２つのアプローチに分類された。第一のアプローチは、固有核酸バーコード識別子を細胞からの核酸に付着させることであり、それらの遺伝子が同じバーコードを共有する、つまり同じ細胞を起源とする場合には、遺伝子を互いに生物情報工学的につなぐことにより対形成が実現される（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０００２２１（特許文献1））。第二のアプローチは、２種の遺伝子からの核酸を互いに物理的につなぐことである（例えば、米国特許第７，７４９，６９７号（特許文献2）参照）。
【０００７】
第一のアプローチは、多重遺伝子（特異的Ｔ細胞またはＢ細胞サブセットを同定するＢまたはＴ細胞共発現遺伝子など）のための対形成を可能にするために優れているが、第二のアプローチは、数種の核酸を物理的につなぐことに限定される。今日まで、実験データは、２つ以下の核酸を物理的につなぐ例のみについて存在する。
【０００８】
核酸をつなぐことにより互いに関連づける（第二のアプローチ）よりむしろ、核酸を単一細胞に一義的に関連づけること（第一のアプローチ）が、利点を有する。核酸が互いに関連づけられる場合、ＰＣＲ及び配列決定エラーを真の生物学的多様性と識別することが困難になり得る。配列決定のプラットフォームの正確さと、類似性カットオフ％に基づいて異なる配列に恣意的に割りつけられた測定値について、仮説を設定しなければならず、即ち、９５％を超える類似性を有する測定値は全て、配列に割りつけられ、それらの間の差は、配列決定エラーによるものと推定される。これは、互いに非常に類似した配列を区別することはできない（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１２，  ３：３１５（非特許文献2）参照）。
【０００９】
さらに、同一配列を共有する細胞数に関する仮説は、配列に割りつけられた測定値の相対的頻度を利用してなされる。これは、近似測定であり、当該分野で周知の通りＰＣＲ増幅バイアスによる影響を受ける。それゆえ、ＩｇまたはＴＣＲ核酸を互いに関連づけることは、近似値だけでなく、配列決定されたレパートリーの真の表示を与えることもできる（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１２，  ３：３１５（非特許文献2）参照）。
【００１０】
しかし、核酸バーコードを利用して核酸を単一細胞と関連づけることは、各測定値を１つの細胞に割りつけることができるため、単一ＢまたはＴ細胞からの類似のまたは同一の配列の間の明確な識別を可能にする。
【００１１】
その上、細胞と関連づけられた全ての測定値によってコンセンサス配列を構築することにより、非常に正確でほぼ完全にエラーを含まない配列を得ることができ、配列決定されたレパートリーの正確な表示を得ることができる。これは、１つの細胞にある全ての核酸の分析に一般化することもできる。
【００１２】
ただし、固有バーコードを各単一細胞に配することの技術的困難が残っている。核酸バーコードを可変遺伝子に付着させる現在最良の技術は、水溶液中に固有バーコードを存在させ、各バーコードは、バーコードを可変遺伝子核酸に付着させる反応の前にも関わらず別個の貯蔵容器内に存在し（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０００２２１（特許文献1））、さもなければ核酸バーコードが使用前に混合されてしまう。これにより、個々のバーコードを含むために必要となる容器が多数になるため、何千もの細胞をバーコード化することの物流的困難さが生じる。
【００１３】
多数の貯蔵容器が必要になることで、このアプローチは、固有バーコードを各個別の反応容器（単一細胞も含む）の中に個別にピペット注入し得ない任意の種類のアプローチとも不適合になる。一例が、ナノウェルアプローチなどのナノリットルサイズの反応容器であり、それは、数千〜数十万のナノウェルが存在するが、各ナノウェルに個別に固有バーコードをピペット注入するというのは実現不能である。
【００１４】
これは、油中水エマルションを利用してドロップレットを生成させるナノドロップレットアプローチにおいても、数十万のナノドロップレットがわずかの水流と共に生成されるため実行不可能であり（例えば、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓまたはＲａｉｎｄａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる製品について参照）、ナノドロップレットに送達する前に個々の貯蔵容器内に固有バーコードを存在させるのは不可能である。
【００１５】
固有バーコードを個々の反応容器に送達する一方法は、固有バーコードを反応容器の大部分に滞留させる限界希釈を利用することによる。それぞれに１種の特定バーコードの複数のコピーを付着させる、ビーズなどの操作可能な物体に付着させたバーコードの限界希釈を実施してもよく、または溶液中のバーコードの限界希釈を実施してもよい。そのようなビーズを希釈すると、１種の特定核酸バーコードの複数のコピーが反応容器内に存在するが、溶液中のバーコードを希釈すれば、特定核酸バーコードの単一コピーのみが反応容器に存在する。
【００１６】
その上、導入されたバーコードが増幅されて反応チャンバー内のバーコードの十分量での存在が確実になれば、反応容器内に存在する関心対象の試料由来核酸への核酸バーコードの付加は、より完璧になるであろう。例えば典型的な哺乳類細胞は、概ね４００，０００コピーのｍＲＮＡを含む。全体的な単一細胞分析の効率を最大にするために、できる限り多くのｍＲＮＡコピーがバーコード化されなければならない。それゆえ、最少でも、ｍＲＮＡコピーと概ね同数の、特定核酸バーコードのコピー数が、反応容器に存在する必要がある。溶液中のバーコードの限界希釈は、反応容器内の特定バーコードを丁度１コピーにするが、バーコードを担う小さな（例えば、１〜２μｍ径）ビーズの希釈は、最大で数万のコピーを提供すると予測される。したがって、試料由来核酸の最大数へのバーコード付加を成功させるような十分量の特定核酸バーコードを反応容器内で生成させるためには、いずれの例でもバーコードを増幅させることが重要である。しかし、ビーズは、有意により多くの出発材料を提供し、それゆえ有意に良好なバーコード増幅をもたらすと予測される。また、十分に大きなビーズは、数十万の核酸バーコード分子を含み得る。この場合、ビーズからの核酸バーコードの切断が、反応容器内で十分量の特定核酸バーコードを生成させるのに十分になり得る。
【００１７】
その上、核酸が固体表面に付着すると、それらは溶液中の核酸に比較して自由に動きまわらなくなるであろう。核酸相補性塩基対形成の場合の固相の反応速度は、水相反応速度よりもかなり緩徐であり、対象核酸へのバーコード付加の効率がかなり低くなり得る。好ましくは核酸バーコードは、バーコード化反応に参加する前に水相に存在しなければならない。
【００１８】
本発明は、通常は単一細胞であるが任意のタイプの試料に一般化可能である各試料に、固有バーコードを付着させるために、過去の発明（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０００２２１（特許文献1））を改善している。本発明は、任意のタイプの反応容器への固有バーコードの送達を可能にし、ナノリットルサイズの反応容器にも適しており、別個の貯蔵容器に固有核酸バーコードを入れておく必要はない。各反応容器に固有バーコードを手作業でピペット注入するように修正可能であるが、必須ではない。各反応容器に固有バーコードまたは固有バーコードセットの１つまたは複数のコピーが送達され、バーコードが、急速な水相反応速度の水相で起こる反応において、対象核酸に付着される。該反応が、バーコードを細胞内の関心対象の全ての核酸に、即ち細胞内の全ての逆転写されたＲＮＡに付着させるため、本発明は、単一細胞のトランスクリプトミクス分析を可能にし、免疫グロブリン可変遺伝子を特異的試料と関連づけることに限定されない。さらに、該増幅反応は、中温性酵素（さもなければ高温では不活性になる）がバーコードを対象核酸に付加し得るのに適合する、十分な低温で起こる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０００２２１
【特許文献２】米国特許第７，７４９，６９７号
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｗｒａｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２００８，  ４５３：６６７−６７１
【非特許文献２】Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１２，  ３：３１５
【発明の概要】
【００２１】
本明細書に開示されるのは、核酸バーコードを用いて単一細胞と関連づけられた核酸を分析するための方法及び組成物である。関心対象の１つまたは複数のポリペプチドを生成させるために本明細書に開示される一方法は、１つまたは複数の試料と関連づけられた複数の核酸を得ることを含み、該試料は１つまたは複数の対象から得られ、試料と関連づけられた該核酸は別個の反応ボリュームに存在する。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ分子）であり得る。幾つかの実施形態において、アダプター分子が、試料と関連づけられた核酸に付加される。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、酵素反応を利用して生成され、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む。幾つかの実施形態において、該バーコード配列は、試料と関連づけられた１つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込まれ、それにより関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させる。幾つかの実施形態において、該方法は、酵素反応を利用して生成されかつユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含むアダプター分子を、試料と関連づけられた核酸に付加すること、ならびに試料と関連づけられた１つまたは複数のポリヌクレオチドにバーコードを組み込み、それにより関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させること、を含む。
【００２２】
本明細書に開示されるのは、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させる方法である。該方法は、１つまたは複数の対象から得られた１つまたは複数の試料と関連づけられた複数のＲＮＡを得ることであって、試料と関連づけられた前記ＲＮＡが別個の反応ボリューム内に存在する、こと；酵素反応を利用して生成されかつユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含むアダプター分子を、試料と関連づけられたＲＮＡに付加すること；ならびに該バーコード配列を、試料と関連づけられた１つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込み、それにより関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させることを含む。幾つかの実施形態において、各ＲＮＡ、または複数のＲＮＡの少なくとも１つは、１つまたは複数の試料からの単一試料と関連づけられる。該方法の幾つかの実施形態は、酵素反応を利用してアダプター分子を生成させることをさらに含む。
【００２３】
幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、鋳型分子を１つまたは複数の酵素と接触させることにより生成される。幾つかの実施形態において、該鋳型分子は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーターを含むＤＮＡ分子であり、該１つまたは複数の酵素は、ＲＮＡポリメラーゼを含む。ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択され得る。幾つかの実施形態において、該鋳型分子は、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位を含むＤＮＡ分子であり、該１つまたは複数の酵素は、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。該ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択され得る。該鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、及びＢｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔの操作された変異体からなる群から選択され得る。該ＤＮＡ分子は、二本鎖分子、または二本鎖分子を生成させるための鋳型として有用である一本鎖分子であり得る。
【００２４】
幾つかの実施形態において、該鋳型分子は、固体担体に結合されており、該固体担体は、水溶液と接触しており、該アダプター分子は、生成されると水溶液中に放出される。幾つかの態様において、アダプター分子を１つの試料と関連づけられたＲＮＡに付加することは、該水溶液を、該ＲＮＡが存在している反応ボリュームと混和することを含む。幾つかの実施形態において、該水溶液は、１つの試料と関連づけられたＲＮＡと同じ反応ボリューム内に存在する。幾つかの実施形態において、該鋳型分子は、エンドヌクレアーゼ制限部位を含み、該１つまたは複数の酵素は、制限エンドヌクレアーゼを含み、該アダプター分子は、該鋳型分子の一部を含み、鋳型分子が制限エンドヌクレアーゼと接触すると前記一部が生成されて該水溶液中に放出される。幾つかの実施形態において、該固体担体は、ビーズまたは表面（例えば、マイクロタイターウェルまたはチューブの表面）である。
【００２５】
該方法の幾つかの実施形態において、該アダプター分子を１つの試料と関連づけられたＲＮＡに付加する前は、該アダプター分子は溶液中で遊離している。幾つかの実施形態において、該アダプター分子はコンパートメント内で生成され、該アダプター分子を１つの試料と関連づけられたＲＮＡに付加することは、該コンパートメントを、該ＲＮＡが存在している反応ボリュームと混和することを含む。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、該アダプター分子が付加される該ＲＮＡが存在している反応ボリューム内で生成される。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、該アダプター分子が付加される該ＲＮＡが存在している反応ボリューム内で生成されない。幾つかの実施形態において、該酵素反応は、等温性反応である。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、ＲＮＡ分子である。該アダプター分子は、ＲＮＡＰを利用して生成され得る。
【００２６】
該方法の幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、ＤＮＡ分子である。該アダプター分子は、ＤＮＡＰを利用して生成され得る。
【００２７】
幾つかの実施形態において、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させることは、試料と関連づけられたＲＮＡを逆転写して、それにより複数の第一鎖ｃＤＮＡを合成することを含み、該試料と関連づけられたＲＮＡの少なくとも幾つかは、該アダプター分子の結合部位に相補的である配列領域を含み、かつ該バーコード配列が、該試料と関連づけられた第一鎖ｃＤＮＡに組み込まれるように、該アダプター分子が、逆転写のためのプライマーとして使用される。これらの実施形態において、該結合部位は、ポリ−Ｔトラクトまたはランダムトラクトを含み得る。該結合部位は、該アダプター分子の３'末端に存在し得る。該アダプター分子はコンパートメント内で生成することができ、該試料と関連づけられたＲＮＡを逆転写することは、該コンパートメントを、該ＲＮＡが存在している反応ボリュームと混和すると起こり得る。該試料と関連づけられたＲＮＡを逆転写することは、該ＲＮＡに付加されたアダプター分子が生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こり得る。
【００２８】
該方法の幾つかの実施形態は、複数のｃＤＮＡを得るために、該試料と関連づけられたＲＮＡを逆転写することをさらに含み、ＲＮＡを逆転写することは、逆転写酵素及び第一鎖プライマーを用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成することを含む。これらの実施形態において、該逆転写酵素は、ＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素であり得る。該アダプター分子はコンパートメント内で生成することができ、１つの試料と関連づけられたＲＮＡに該アダプター分子を付加することは、該コンパートメントを、該ＲＮＡが存在している反応ボリュームと混和することを含むことができる。ｃＤＮＡの第一鎖は、該コンパートメントを該反応ボリュームと混和する前、または混和した後に合成され得る。
【００２９】
幾つかの実施形態において、該試料と関連づけられたＲＮＡを逆転写することは、該ＲＮＡに付加されたアダプター分子が生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こる。これらの実施形態において、該反応ボリューム内の緩衝液は、ｐＨ８．０〜ｐＨ８．８のｐＨ範囲で、トリス、カリウムイオン、塩素イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、酢酸イオン、またはマグネシウムイオンのうちの少なくとも１種を含み得る。
【００３０】
幾つかの実施形態において、該逆転写酵素は、鋳型切替え活性を有し、該試料と関連づけられたｃＤＮＡの少なくとも幾つかの第一鎖は、３'オーバーハングを含み、該アダプター分子の結合部位は、３'オーバーハングに相補的である３'部分を含み、かつ該バーコード配列が、該試料と関連づけられたｃＤＮＡの第一鎖に組み込まれるように、該アダプター分子は逆転写酵素のための鋳型として働く。これらの実施形態において、該３'オーバーハングは、１つまたは複数のＣヌクレオチドを含むことができ、該結合部位の３'部分は、１つまたは複数のＧヌクレオチドを含み得る。該第一鎖プライマーは、ポリＴトラクトまたはランダム配列を含むことができる。
【００３１】
幾つかの実施形態において、対象ポリヌクレオチドを生成させることは、第一の（例えば、フォワード）プライマー及び第二の（例えば、リバース）プライマーを用いて各試料のｃＤＮＡの第一鎖を増幅することを含み、ここで該第二のプライマーは、第一鎖プライマーの少なくとも一部と同じ配列を有し、該第一のプライマーまたは該第二のプライマーは、該アダプター分子である。これらの実施形態において、該第一のプライマーまたは該第二のプライマーは、該アダプター分子であり得る。該第一鎖プライマーは、ポリＴトラクトまたはランダム配列を含み得る。
【００３２】
該方法の幾つかの実施形態において、各試料は、細胞を含む。該細胞は、血液細胞、免疫細胞、組織細胞、または腫瘍細胞であり得る。幾つかの実施形態において、該細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。該Ｂ細胞は、形質芽細胞、記憶Ｂ細胞、または形質細胞であり得る。幾つかの実施形態において、各試料と関連づけられたＲＮＡは、ｍＲＮＡ、例えば少なくとも１、３、１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００種のｍＲＮＡを含む。幾つかの実施形態において、各試料と関連づけられた該ＲＮＡは、細胞のトランスクリプトームまたは細胞の総ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態において、試料あたり少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００種の関心対象のポリヌクレオチドが、生成される。幾つかの実施形態において、該１つまたは複数の試料は、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個の細胞を含む。幾つかの実施形態において、該１つまたは複数の試料は、同じ対象から得られる。幾つかの実施形態は、該試料を溶解緩衝液と接触させることをさらに含む。
【００３３】
幾つかの実施形態は、該試料を核酸マーカーと接触させ、それにより該核酸マーカーを該試料のサブセットと結合させること；及び該試料を洗浄し、それにより該核酸マーカーが結合していない試料から該核酸マーカーを除去すること、をさらに含み、該サブセット内の試料については、該試料と関連づけられたＲＮＡに付加された該アダプター分子もまた、該核酸マーカーに付加され、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドが、標識された核酸マーカーを用いて生成される。これらの実施形態において、該核酸マーカーは、分子標識に連結された核酸を含み得る。該分子標識は、抗体、抗原、またはタンパク質である。該分子標識は、１つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有し得る。幾つかの実施形態において、該核酸は、ＲＮＡである。幾つかの実施形態において、該核酸は、ＤＮＡであり、ＲＮＡＰプロモーターを含み得る。幾つかの実施形態において、該試料は、第一の核酸マーカー及び第二の核酸マーカーと接触しており、ここで第一の核酸マーカーは、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、該第二の核酸マーカーは、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含む。該第一の核酸及び第二の核酸は、異なる配列領域を含み得る。幾つかの実施形態において、該第一の分子標識と第二の分子標識は異なっている（例えば、異なる細胞表面抗原に対して２つの異なる抗体）。したがって該方法は、アダプター分子を含む核酸マーカーによる単一細胞などの試料の多重標識、及び該試料と関連づけられた関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドの生成を可能にする。
【００３４】
該方法の幾つかの実施形態において、該１つまたは複数の試料は、同じ対象から得られる。幾つかの実施形態において、該１つまたは複数の試料は、少なくとも３、１０、３０、または１００種の異なる対象から得られる。
【００３５】
同じく本明細書に開示されるのは、バーコードアダプター構築物である。幾つかのそのようなバーコードアダプター構築物は、ＲＮＡＰプロモーター、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む。ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択され得る。他のバーコードアダプター構築物は、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む。該ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択され得る。
【００３６】
本明細書でさらに開示されるのは、先に記載されたバーコードアダプター構築物を含む固体担体である。幾つかの実施形態において、該バーコードアダプター構築物は、共有結合を介して該固体担体に結合されている。幾つかの実施形態において、複数のコピーの該バーコードアダプター構築物が、該固体担体に結合されている。例えば、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００コピーの該バーコードアダプター構築物が、該固体担体に結合され得る。幾つかの実施形態において、該バーコードアダプター構築物の各コピーは、同じバーコード配列を含む。複数のコピーの該アダプター構築物に連結された複数の固体担体を含むアダプター鋳型ライブラリーもまた、本明細書で開示される。幾つかの実施形態において、該複数の固体担体は、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００種の固体担体を含む。幾つかの実施形態において、該固体担体の少なくとも２つは、異なるバーコード配列またはＵＭＩ配列を有するアダプター構築物を含む。幾つかの実施形態において、該複数の固体担体の各固体担体は、異なるバーコード配列または異なるＵＭＩ配列を有するアダプター構築物を含む。
【００３７】
同じく本明細書で開示されるのは、分子標識に連結された核酸を含む核酸マーカーである。幾つかの実施形態において、該分子標識は、抗体、抗原、またはタンパク質である。幾つかの実施形態において、該分子標識は、１つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する。幾つかの実施形態において、該核酸は、ＲＮＡである。幾つかの実施形態において、該核酸は、ＤＮＡである。該ＤＮＡは、ＲＮＡＰプロモーター配列を含み得る。幾つかの実施形態において、複数の核酸マーカーが記載され、該複数のうちの少なくとも１つは、第一の分子標識（即ち、第一の抗体）を含み、該複数のうちの少なくとも１つは、第二の分子標識（即ち、第二の抗体）を含む。幾つかの実施形態において、該第一の分子標識と第二の分子標識は、異なっており、したがって本明細書に記載された核酸マーカーによる異なる細胞表面部分（例えば、異なる細胞表面抗原）の多重標識に有用な組成物を提供する。
【００３８】
本明細書にさらに開示されるのは、本明細書に記載されたアダプター構築物を含むキットである。該キットは、本明細書に記載されたアダプター構築物に連結された複数の固体担体を含み得る。幾つかの実施形態において、該キットは、複数のアダプター構築物を含むアダプター鋳型ライブラリーを含む。幾つかの実施形態において、該キットは、複数の固体担体に連結された複数のアダプター構築物を含むアダプター鋳型ライブラリーを含む。該キットは、酵素反応によりアダプター構築物から本明細書に記載されたアダプター分子を生成させるための酵素をさらに含み得る。幾つかの実施形態において、該キットは、本明細書に記載された細胞懸濁緩衝液を含む。
【００３９】
本明細書にさらに開示されるのは、浸透圧保護剤を含む細胞懸濁緩衝液である。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、ベタイン、または構造的に近いその類似体である。例えば該浸透圧保護剤は、グリシンベタインであり得る。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、糖またはポリオールである。例えば該浸透圧保護剤は、トレハロースであり得る。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、アミノ酸である。例えば該浸透圧保護剤は、プロリンであり得る。該細胞懸濁緩衝液の幾つかの実施形態において、該緩衝液の浸透圧は、約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌである。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、該緩衝液の浸透圧の最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に寄与している。幾つかの実施形態において、該緩衝液は、約２３０〜３３０ｍＭベタイン及び約１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
【００４０】
同じく本明細書に開示されるのは、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に付着させる方法である。該方法は、ａ）逆エマルションの親水性コンパートメントを生成させるステップであって、該親水性コンパートメントが固体担体と、バーコード配列を含むバーコードオリゴヌクレオチドと、捕捉部分を介して該固体担体の表面に結合されたオリゴヌクレオチドとを含み、該結合されたオリゴヌクレオチドが、該バーコードオリゴヌクレオチドの３'配列に相補的である３'配列を含む、ステップと、ｂ）該固体担体上の該結合されたオリゴヌクレオチドに該バーコード配列を組み込むためにポリメラーゼ伸長反応を実施するステップと、を含む。幾つかの実施形態において、該バーコードオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲリバースプライマー配列と同一の、または該ＰＣＲリバースプライマー配列に相補的である５'配列をさらに含む。これらの実施形態は、フルオロフォア標識リバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施することをさらに含み得る。幾つかの実施形態において、該固体担体は、ビーズである。幾つかの実施形態において、該捕捉部分は、ストレプトアビジンである。幾つかの実施形態において、該捕捉部分は、カルボキシル基、エポキシ基、またはヒドロキシル基を含む。幾つかの実施形態において、該捕捉部分は、チオール化オリゴヌクレオチドを捕捉するための金を含む。
【００４１】
幾つかの実施形態において、該バーコードオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む。該バーコードオリゴヌクレオチドは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択されるＲＮＡＰプロモーターをさらに含み得る。代わりまたは追加として、該バーコードオリゴヌクレオチドは、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択されるニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含み得る。該結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドであり得る。
【００４２】
バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に付着させる別の方法も、開示される。該方法は、ａ）固体担体と、Ｗ配列を含む第一のバーコードオリゴヌクレオチドと、捕捉部分を介して該固体担体の表面に結合されたオリゴヌクレオチドとを提供し、該結合されたオリゴヌクレオチドが、（ｉ）Ｓ１ｘ配列、及び（ｉｉ）該第一のバーコードオリゴヌクレオチドの３'配列に相補的である配列、を含む、ステップと；ｂ）ポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施して該Ｗ配列を該結合されたオリゴヌクレオチドに組み込むステップと；ｃ）（ｉ）Ｓ２ｙ配列、及び（ｉｉ）ステップｂ）から得られた結合されたオリゴヌクレオチドの３'末端に相補的である３'配列、を含む第二のバーコードオリゴヌクレオチドを提供するステップと；ｄ）ポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施して該結合されたオリゴヌクレオチドに該Ｓ２ｙ配列を組み込み、それにより、ポリヌクレオチドを該固体担体に付着させ、該ポリヌクレオチドがバーコード配列を含み、該バーコード配列がＳ１ｘ、Ｗ、及びＳ２ｙ配列を含む、ステップと、を含む。
【００４３】
該方法の幾つかの実施形態において、該固体担体は、ビーズである。幾つかの実施形態において、該捕捉部分は、ストレプトアビジンである。幾つかの実施形態において、該捕捉部分は、カルボキシル基、エポキシ基、またはヒドロキシル基を含む。幾つかの実施形態において、該捕捉部分は、チオール化オリゴヌクレオチドを捕捉するための金を含む。幾つかの実施形態において、該第一のバーコードまたは該第二のバーコードのいずれかである選択されたバーコードオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む。該選択されたバーコードオリゴヌクレオチドは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択されるＲＮＡＰプロモーターをさらに含み得る。代わりまたは追加として、該選択されたバーコードオリゴヌクレオチドは、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択されるニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含み得る。該結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドであり得る。
【００４４】
本明細書にさらに開示されるのは、前述の方法の任意の実施形態により調製され、バーコード配列を含むポリヌクレオチドに付着された固体担体である。同じく開示されるのは、複数のこれらの固体担体を含むバーコードライブラリーである。
【００４５】
加えて、細胞と、バーコードアダプター鋳型と、ポリヌクレオチドを生成させる試薬と、を封入するマイクロ流体ドロップレットデバイスが、本明細書で開示される。該デバイスは、（ａ）３つの独立して制御される圧力源と、（ｂ）３つのマイクロ流体経路と、（ｃ）３つのフローセンサーと、（ｄ）２つの試料ループと、（ｅ）マイクロ流体ドロップレットチップと、（ｆ）試料回収容器と、を含み、（ａ）〜（ｆ）が流体連通するように、各圧力源は該マイクロ流体経路の１つに連結されて、該マイクロ流体経路を通るように流体を流し、該フローセンサーの１つは、各圧力源の下流で各マイクロ流体経路に沿って配置され、第一のマイクロ流体経路は、第一の試料ループを通過し、第二のマイクロ流体経路は、第二の試料ループを通過し、該第一及び該第二の試料ループは、熱冷却ユニットと接触しており、該第一及び第二のマイクロ流体経路は第一のジャンクションで合流して、組み合わせられた経路を形成しており、該組み合わせられた経路及び第三のマイクロ流体経路が第二のジャンクションで合流して試料経路を形成しており、該第二のジャンクションは、該マイクロ流体ドロップレットチップ内かつ該第一のジャンクションの下流に存在し、該試料経路は、該第二のジャンクションの下流の該試料回収容器内に入っている。
【００４６】
該デバイスの幾つかの実施形態において、各圧力源は、圧力ポンプを含む。幾つかの実施形態において、各圧力源は、シリンジポンプを含む。幾つかの実施形態において、該第一の試料ループは、該マイクロ流体ドロップレットチップに向かう水溶液の流れを計量するように構成されており、該水溶液は、細胞及びバーコードアダプター鋳型を含む。幾つかの実施形態において、該第二の試料ループは、該マイクロ流体ドロップレットチップに向かう反応混合物の流れを計量するように構成されており、該反応混合物は、細胞溶解のための試薬及び対象ポリヌクレオチドを生成させるための試薬を含む。幾つかの実施形態において、該第三のマイクロ流体経路は、油／界面活性剤ミックスを該マイクロ流体ドロップレットチップに送達するように構成されている。幾つかの実施形態において、該熱冷却ユニットは、ペルティエデバイスを含む。幾つかの実施形態において、該熱冷却ユニットは、氷の箱を含む。幾つかの実施形態において、該第一のジャンクションは、該ドロップレットチップ内に存在する。幾つかの実施形態において、該第三のマイクロ流体経路は、該マイクロ流体ドロップレットチップの上流で２つの準経路に分割されており、該２つの準経路は、該第二のジャンクションで該組み合わせられた経路と合流し、該第二のジャンクションは、フローフォーカシング配置を有する。幾つかの実施形態において、該第二のジャンクションは、Ｔ字形ジャンクション配置を有する。幾つかの実施形態において、該第一のマイクロ流体経路は、細胞を収容するように構成されており、該第二のマイクロ流体経路は、固体担体に結合されたバーコードアダプター鋳型を収容するように構成されている。
【００４７】
本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の対象から得られた１つまたは複数の試料と関連づけられた複数のｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライブラリーを得ることを含む、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させる方法であり、各ｃＤＮＡは、該１つまたは複数の試料中の単一試料と関連づけられ、各試料と関連づけられた該ｃＤＮＡは、別個の容器またはコンパートメント内に存在する。幾つかの実施形態において、アダプター分子が、各試料と関連づけられたｃＤＮＡに付加されて、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させる。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、ユニバーサルプライミング配列、バーコード、及びｃＤＮＡ結合部位を含むアダプター構築物から生成される。
【００４８】
幾つかの態様において、該アダプター分子は、等温反応を利用して生成される。幾つかの態様において、該アダプター構築物は、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーターをさらに含む。幾つかの態様において、該ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択される。幾つかの態様において、該アダプター構築物は、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含む。幾つかの態様において、該ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される。幾つかの態様において、該アダプターは、ＲＮＡＰにより生成されたＲＮＡアダプターである。幾つかの態様において、該アダプターは、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼにより生成されたＤＮＡアダプターである。幾つかの態様において、該鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、及びＢｓｔ２．０などの操作された変異体からなる群から選択される。
【００４９】
幾つかの態様において、該方法は、該アダプター分子の３'末端を、該ライブラリー内の各ｃＤＮＡの３'末端に付着させて、関心対象の該１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させることをさらに含む。
【００５０】
幾つかの態様において、該アダプターは、逆転写反応の際に生成されたｃＤＮＡの３'テールに該アダプターをアニーリングさせることにより付加される。幾つかの態様において、各ｃＤＮＡは、各ｃＤＮＡの３'末端に位置する少なくとも１つのＣヌクレオチドを含み、該アダプター領域は、該アダプター領域の３'末端に位置する少なくとも１つのＧヌクレオチドを含み、該アダプター領域は、該ＧとＣの間の結合を介して各ｃＤＮＡに付着されている。幾つかの実施形態において、該アダプター分子は、一本鎖であり、酵素によって該アダプター分子を二本鎖にさせることにより各ｃＤＮＡにアダプター分子の相補性を組み込むことをさらに含む。幾つかの態様において、該アダプター分子の該相補性は、各ｃＤＮＡに組み込まれて、ＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素により対象ポリヌクレオチドを生成させる。
【００５１】
幾つかの態様において、各試料は、細胞を含む。幾つかの態様において、該細胞は、血液細胞、免疫細胞、組織細胞、または腫瘍細胞である。幾つかの実施形態において、該細胞は、Ｂ細胞またはＴ細胞である。幾つかの態様において、該Ｂ細胞は、形質芽細胞、記憶Ｂ細胞、または形質細胞である。
【００５２】
同じく開示されるのは、ａ）逆エマルションの親水性コンパートメントを生成させるステップであって、該親水性コンパートメントが、捕捉部分を介して表面に結合されていてバーコードオリゴヌクレオチド上の３'配列に相補的である３'配列を含むオリゴヌクレオチドを含む、該コンパートメントの内部に含まれる固体担体と；該結合されたオリゴヌクレオチドの３'末端に相補的である３'配列及びバーコード配列を含むバーコードオリゴヌクレオチドと、を含む、ステップと、ｂ）該固体担体上の結合されたオリゴヌクレオチドに該バーコードの配列を付加するためにポリメラーゼ伸長反応を実施するステップと、を含む、バーコードを固体担体に付着させる方法である。
【００５３】
幾つかの態様において、該バーコードオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲリバースプライマーと同一の、または該プライマーに相補的である５'配列をさらに含む。幾つかの態様において、該方法は、フルオロフォア標識リバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施することをさらに含む。
【００５４】
幾つかの態様において、該固体担体は、ビーズまたは表面である。幾つかの態様において、該捕捉部分は、ストレプトアビジンである。幾つかの態様において、該バーコードオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーター及び／またはエンドヌクレアーゼ制限部位、ユニバーサルプライミング配列、ｃＤＮＡ結合部位をさらに含む。幾つかの態様において、該ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択される。幾つかの態様において、該ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される。幾つかの態様において、該ｃＤＮＡ結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドである。
【００５５】
同じく本明細書で開示されるのは、ａ）Ｓ１ｘ配列と第一のバーコードオリゴヌクレオチド上の３'配列に相補的である配列とを含む、捕捉部分を介して固体担体に結合されたオリゴヌクレオチド；ならびに該結合されたオリゴヌクレオチドの配列に相補的である３'配列及びＷ配列を含む第一のバーコードオリゴヌクレオチドを有する、該固体担体を提供するステップと；ｂ）該固体担体上の結合されたオリゴヌクレオチドのＳ１ｘ配列に該Ｗ配列を付加するためにポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施するステップと；ｃ）ステップｂ）で伸長されたオリゴヌクレオチドの３'末端に相補的である３'配列を含むＳ２ｙ配列を有する第二のバーコードオリゴヌクレオチドを提供するステップと；ｄ）該固体担体上の結合されたオリゴヌクレオチドのＳ１ｘ及びＷ配列にＳ２ｙ配列を付加するためにポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施するステップと、を含み、バーコード配列がＳ１ｘ、Ｗ、及びＳ２ｙ配列を含む、バーコードを固体担体に付着させる方法である。
【００５６】
幾つかの態様において、該固体担体は、ビーズである。幾つかの態様において、該捕捉部分は、ストレプトアビジンである。幾つかの態様において、該第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーター及び／またはニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位、ユニバーサルプライミング配列、ｃＤＮＡ結合部位をさらに含む。幾つかの態様において、該ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択される。幾つかの態様において、該エンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される。幾つかの態様において、該ｃＤＮＡ結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドである。
【００５７】
同じく本明細書に開示されるのは、先に開示された方法のいずれかにより生成された付着されたバーコードを有する固体担体である。同じく本明細書で開示されるのは、該付着されたバーコードを有する複数のそのような固体担体を含むビーズ化されたバーコードライブラリーである。
【００５８】
同じく本明細書で開示されるのは、ユニバーサルプライミング配列、バーコード、及びｃＤＮＡ結合部位を含むバーコードアダプター構築物である。幾つかの態様において、該構築物は、ＲＮＡＰプロモーターをさらに含む。幾つかの態様において、該ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６からなる群から選択される。幾つかの態様において、該構築物は、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含む。幾つかの態様において、該ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される。
【００５９】
同じく本明細書で開示されるのは、固体担体と、該固体担体に捕捉部分を介して結合されたバーコードアダプター分子と、を含むバーコードアダプター鋳型ビーズであり、該バーコードアダプター分子は、バーコード配列及びｃＤＮＡ結合部位を含む。幾つかの態様において、該ｃＤＮＡ結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、該バーコード配列は、配列Ｓ１ｘ−Ｗ−Ｓ２ｙを含む。同じく本明細書で開示されるのは、先に開示された複数のバーコードアダプター鋳型ビーズを含むビーズ化されたバーコードライブラリーである。
【００６０】
同じく本明細書で開示されるのは、固体担体と、該固体担体に捕捉部分を介して結合されたバーコードアダプター分子と、を含む複数のバーコードアダプター鋳型ビーズを含むポリヌクレオチドライブラリーであり、該バーコードアダプター分子は、バーコード配列及びｃＤＮＡ結合部位を含み、ｃＤＮＡ領域が、該アダプターの３'末端に連結している。
【００６１】
幾つかの態様において、該ｃＤＮＡ結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、該バーコード配列は、配列Ｓ１ｘ−Ｗ−Ｓ２ｙを含む。
【００６２】
幾つかの態様において、該ｃＤＮＡは、Ｂ細胞に由来する。幾つかの態様において、該Ｂ細胞は、形質芽細胞、記憶Ｂ細胞、または形質細胞である。幾つかの態様において、該ｃＤＮＡは、Ｂ細胞由来の可変免疫グロブリン領域である。
【００６３】
同じく本明細書で開示されるのは、図１７〜１９に示されたマイクロ流体ドロップレットデバイスである。
[本発明1001]
1つまたは複数の対象から得られた1つまたは複数の試料と関連づけられた複数のＲＮＡを得ることであって、試料と関連づけられた前記ＲＮＡが別個の反応ボリューム内に存在する、こと；
酵素反応を利用して生成されかつユニバーサルプライミング配列、バーコード配列及び結合部位を含むアダプター分子を、前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加すること；ならびに
前記バーコード配列を、前記試料と関連づけられた1つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込み、それにより関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させること
を含む、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドの生成方法。
[本発明1002]
前記酵素反応を用いて前記アダプター分子を生成させることをさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記アダプター分子が、鋳型分子を1つまたは複数の酵素と接触させることにより生成される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記鋳型分子が、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーターを含むＤＮＡ分子であり、前記1つまたは複数の酵素が、ＲＮＡポリメラーゼを含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記ＲＮＡＰプロモーターが、Ｔ7、Ｔ3、及びＳＰ6からなる群から選択される、本発明1004の方法。
[本発明1006]
前記鋳型分子が、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位を含むＤＮＡ分子であり、前記1つまたは複数の酵素が、ニッキングエンドヌクレアーゼ及び鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
前記ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位が、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される、本発明1006の方法。
[本発明1008]
前記鎖置換ＤＮＡポリメラーゼが、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、及びＢｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔの操作された変異体からなる群から選択される、本発明1006の方法。
[本発明1009]
前記鋳型分子が、固体担体に結合されており、
前記固体担体が、水溶液と接触しており、かつ
前記アダプター分子が、生成されると水溶液中に放出される、
本発明1003の方法。
[本発明1010]
前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加することが、前記水溶液を、前記ＲＮＡが存在している前記反応ボリュームと混和することを含む、本発明1009の方法。
[本発明1011]
前記水溶液が、1つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡと同じ反応ボリューム内に存在する、本発明1009の方法。
[本発明1012]
前記鋳型分子が、エンドヌクレアーゼ制限部位を含み、
前記1つまたは複数の酵素が、制限エンドヌクレアーゼを含み、かつ
前記アダプター分子が、前記鋳型分子の一部を含み、前記鋳型分子が前記制限エンドヌクレアーゼと接触すると前記一部が生成されて前記水溶液中に放出される、本発明1009の方法。
[本発明1013]
前記固体担体が、ビーズまたは表面である、本発明1009の方法。
[本発明1014]
前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加する前は、前記アダプター分子が溶液中で遊離している、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加することが、前記コンパートメントを、前記ＲＮＡが存在している反応ボリュームと混和することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記ＲＮＡが存在している反応ボリューム内で生成される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記アダプター分子が、前記アダプター分子が付加される前記ＲＮＡが存在している反応ボリューム内で生成されない、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記酵素反応が、等温性反応である、本発明1001の方法。
[本発明1019]
前記アダプター分子が、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
前記アダプター分子が、ＲＮＡ分子である、本発明1001の方法。
[本発明1021]
前記アダプター分子が、ＲＮＡＰを利用して生成される、本発明1020の方法。
[本発明1022]
前記アダプター分子が、ＤＮＡ分子である、本発明1001の方法。
[本発明1023]
前記アダプター分子が、ＤＮＡＰを利用して生成される、本発明1022の方法。
[本発明1024]
関心対象の前記1つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させることが、前記試料と関連づけられたＲＮＡを逆転写して、それにより複数の第一鎖ｃＤＮＡを合成することを含み、
前記試料と関連づけられたＲＮＡの少なくとも幾つかが、前記アダプター分子の結合部位に相補的である配列領域を含み、かつ
前記バーコード配列が、前記試料と関連づけられた第一鎖ｃＤＮＡに組み込まれるように、前記アダプター分子が逆転写のためのプライマーとして使用される、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記結合部位が、ポリ−Ｔトラクトを含む、本発明1024の方法。
[本発明1026]
前記結合部位が、ランダムトラクトを含む、本発明1024の方法。
[本発明1027]
前記結合部位が、前記アダプター分子の3'末端に存在する、本発明1024の方法。
[本発明1028]
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡを逆転写することが、前記コンパートメントを、前記ＲＮＡが存在している前記反応ボリュームと混和すると起こる、本発明1024の方法。
[本発明1029]
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡを逆転写することが、前記ＲＮＡに付加された前記アダプター分子が生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こる、本発明1024の方法。
[本発明1030]
複数のｃＤＮＡを得るために、前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡを逆転写することをさらに含み、ＲＮＡを逆転写することが、逆転写酵素及び第一鎖プライマーを用いてｃＤＮＡの第一鎖を合成することを含む、本発明1001の方法。
[本発明1031]
前記逆転写酵素が、ＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素である、本発明1030の方法。
[本発明1032]
前記アダプター分子がコンパートメント内で生成され、前記アダプター分子を1つの試料と関連づけられた前記ＲＮＡに付加することが、前記コンパートメントを、前記ＲＮＡが存在している前記反応ボリュームと混和することを含む、本発明1030の方法。
[本発明1033]
ｃＤＮＡの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応ボリュームと混和する前に合成される、本発明1032の方法。
[本発明1034]
ｃＤＮＡの第一鎖が、前記コンパートメントを前記反応ボリュームと混和した後に合成される、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡを逆転写することが、前記ＲＮＡに付加された前記アダプター分子が生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こる、本発明1030の方法。
[本発明1036]
前記反応ボリューム内の緩衝液が、ｐＨ8．0〜ｐＨ8．8のｐＨ範囲で、トリス、カリウムイオン、塩素イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、酢酸イオン、またはマグネシウムイオンのうちの少なくとも1種を含む、本発明1035の方法。
[本発明1037]
前記逆転写酵素が、鋳型切替え活性を有し、
前記試料と関連づけられたｃＤＮＡの少なくとも幾つかの第一鎖が、3'オーバーハングを含み、
前記アダプター分子の結合部位が、3'オーバーハングに相補的である3'部分を含み、かつ
前記バーコード配列が、前記試料と関連づけられたｃＤＮＡの第一鎖に組み込まれるように、前記アダプター分子が前記逆転写酵素のための鋳型として働く、
本発明1030の方法。
[本発明1038]
前記3'オーバーハングが、1つまたは複数のＣヌクレオチドを含み、前記結合部位の3'部分が、1つまたは複数のＧヌクレオチドを含む、本発明1037の方法。
[本発明1039]
前記第一鎖プライマーが、ポリＴトラクトを含む、本発明1037の方法。
[本発明1040]
前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、本発明1037の方法。
[本発明1041]
関心対象のポリヌクレオチドを生成させることが、第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて前記試料のｃＤＮＡの前記第一鎖を増幅することを含み、前記第二のプライマーが、前記第一鎖プライマーの少なくとも一部と同じ配列を有し、前記第一のプライマーまたは前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、本発明1030の方法。
[本発明1042]
前記第一のプライマーが、前記アダプター分子である、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記第二のプライマーが、前記アダプター分子である、本発明1041の方法。
[本発明1044]
前記第一鎖プライマーが、ポリＴトラクトを含む、本発明1041の方法。
[本発明1045]
前記第一鎖プライマーが、ランダム配列を含む、本発明1041の方法。
[本発明1046]
前記試料が、細胞を含む、本発明1001の方法。
[本発明1047]
前記細胞が、血液細胞、免疫細胞、組織細胞、または腫瘍細胞である、本発明1046の方法。
[本発明1048]
前記細胞が、Ｂ細胞またはＴ細胞である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡを含む、本発明1046の方法。
[本発明1050]
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、少なくとも1、3、10、30、100、300、1，000、3，000、10，000、30，000、100，000、300，000、または1，000，000種のｍＲＮＡを含む、本発明1049の方法。
[本発明1051]
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、細胞のトランスクリプトームの少なくとも一部を含む、本発明1049の方法。
[本発明1052]
前記試料と関連づけられた前記ＲＮＡが、細胞の総ＲＮＡを含む、本発明1046の方法。
[本発明1053]
試料あたり少なくとも10、30、100、300、1，000、3，000、10，000、30，000、100，000、300，000、または1，000，000種の関心対象のポリヌクレオチドが、生成される、本発明1046の方法。
[本発明1054]
前記1つまたは複数の試料が、少なくとも10、30、100、300、1，000、3，000、10，000、30，000、100，000、300，000、または1，000，000個の細胞を含む、本発明1046の方法。
[本発明1055]
前記1つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、本発明1046の方法。
[本発明1056]
前記試料を溶解緩衝液と接触させることをさらに含む、本発明1046の方法。
[本発明1057]
前記試料を核酸マーカーと接触させ、それにより前記核酸マーカーを前記試料のサブセットと結合させること；及び
前記試料を洗浄し、それにより前記核酸マーカーが結合していない試料から前記核酸マーカーを除去すること
をさらに含み、
前記サブセット内の試料については、前記試料と関連づけられたＲＮＡに付加された前記アダプター分子もまた、前記核酸マーカーに付加され、関心対象の1つまたは複数のポリヌクレオチドが、前記核酸マーカーを用いて生成される、本発明1046の方法。
[本発明1058]
前記核酸マーカーが、分子標識に連結された核酸を含む、本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記分子標識が、抗体、抗原、またはタンパク質である、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記分子標識が、1つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記核酸が、ＲＮＡである、本発明1058の方法。
[本発明1062]
前記核酸が、ＤＮＡである、本発明1058の方法。
[本発明1063]
前記ＤＮＡが、ＲＮＡＰプロモーターを含む、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記試料が、第一の核酸マーカー及び第二の核酸マーカーと接触しており、
前記第一の核酸マーカーが、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、
前記第二の核酸マーカーが、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含み、
前記第一の核酸及び第二の核酸が、異なる配列領域を含み、かつ
前記第一の分子標識と第二の分子標識が異なっている、
本発明1058〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記1つまたは複数の試料が、同じ対象から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1066]
前記1つまたは複数の試料が、少なくとも3、10、30、または100種の異なる対象から得られる、本発明1001の方法。
[本発明1067]
ＲＮＡＰプロモーター配列、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む、アダプター構築物。
[本発明1068]
前記ＲＮＡＰプロモーターが、Ｔ7、Ｔ3、及びＳＰ6からなる群から選択される、本発明1067のアダプター構築物。
[本発明1069]
ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列、及び結合部位を含む、アダプター構築物。
[本発明1070]
前記ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位が、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択される、本発明1069のアダプター構築物。
[本発明1071]
固有分子識別子（ＵＭＩ）配列をさらに含む、本発明1067または1069のアダプター構築物。
[本発明1072]
本発明1067、1069または1071のアダプター構築物を含む固体担体。
[本発明1073]
前記アダプター構築物が、共有結合を介して前記固体担体に結合されている、本発明1072の固体担体。
[本発明1074]
前記アダプター構築物の複数のコピーが、前記固体担体に結合されている、本発明1072の固体担体。
[本発明1075]
少なくとも10、30、100、300、1，000、3，000、10，000、30，000、100，000、300，000、または1，000，000コピーの前記アダプター構築物が、前記固体担体に結合されている、本発明1074の固体担体。
[本発明1076]
前記アダプター構築物の各コピーが、同じバーコード配列を含む、本発明1074の固体担体。
[本発明1077]
本発明1072の複数の固体担体を含むアダプター鋳型ライブラリー。
[本発明1078]
前記複数が、少なくとも10、30、100、300、1，000、3，000、10，000、30，000、100，000、300，000、または1，000，000個の固体担体を含む、本発明1077のアダプター鋳型ライブラリー。
[本発明1079]
抗体、抗原、またはタンパク質である分子標識に連結された核酸を含む核酸マーカー。
[本発明1080]
前記分子標識が、1つまたは複数の細胞表面部分への親和性を有する、本発明1079の核酸マーカー。
[本発明1081]
前記核酸が、ＲＮＡである、本発明1079の核酸マーカー。
[本発明1082]
前記核酸が、ＤＮＡである、本発明1079の核酸マーカー。
[本発明1083]
前記ＤＮＡが、ＲＮＡＰプロモーターを含む、本発明1082の核酸マーカー。
[本発明1084]
少なくとも1つの核酸マーカーが、第一の分子標識に連結された第一の核酸を含み、少なくとも1つの核酸マーカーが、第二の分子標識に連結された第二の核酸を含み、
前記第一の核酸及び第二の核酸が、異なる配列領域を含み、前記第一の分子標識と第二の分子標識が異なっている、本発明1079〜1083のいずれかの複数の核酸マーカー。
[本発明1085]
本発明1067、1069もしくは1071のアダプター構築物、本発明1072の固体担体、本発明1077のアダプター鋳型ライブラリー、または本発明1079〜1083のいずれかの核酸マーカーを含む、キット。
[本発明1086]
本発明1067または1069のアダプター構築物から、ユニバーサルプライミング配列、バーコード配列及び結合部位を含むアダプター分子を生成させるための酵素をさらに含む、本発明1085のキット。
[本発明1087]
浸透圧保護剤を含む細胞懸濁緩衝液をさらに含む、本発明1085または1086のキット。
[本発明1088]
前記浸透圧保護剤が、ベタイン、または構造的に近いその類似体である、本発明1087のキット。
[本発明1089]
前記浸透圧保護剤が、グリシンベタインである、本発明1088のキット。
[本発明1090]
前記浸透圧保護剤が、糖またはポリオールである、本発明1087のキット。
[本発明1091]
前記浸透圧保護剤が、トレハロースである、本発明1090のキット。
[本発明1092]
前記浸透圧保護剤が、アミノ酸である、本発明1087のキット。
[本発明1093]
前記浸透圧保護剤が、プロリンである、本発明1092のキット。
[本発明1094]
前記緩衝液の浸透圧が、約250〜350ｍＯｓｍ／Ｌである、本発明1087のキット。
[本発明1095]
前記浸透圧保護剤が、前記緩衝液の浸透圧の最大10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％に寄与している、本発明1087のキット。
[本発明1096]
前記緩衝液が、約230〜330ｍＭベタイン及び約10ｍＭ  ＮａＣｌを含む、本発明1087のキット。
[本発明1097]
ａ）逆エマルションの親水性コンパートメントを生成させるステップであって、前記親水性コンパートメントが
固体担体と、
バーコード配列を含むバーコードオリゴヌクレオチドと、
捕捉部分を介して前記固体担体の表面に結合されたオリゴヌクレオチドと
を含み、前記結合されたオリゴヌクレオチドが、前記バーコードオリゴヌクレオチドの3'配列に相補的である3'配列を含む、ステップと、
ｂ）前記固体担体上の前記結合されたオリゴヌクレオチドに前記バーコード配列を組み込むためにポリメラーゼ伸長反応を実施するステップと
を含む、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に付着させる方法。
[本発明1098]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、ＰＣＲリバースプライマー配列と同一の、または前記ＰＣＲリバースプライマー配列に相補的である5'配列をさらに含む、本発明1097の方法。
[本発明1099]
フルオロフォア標識リバースプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施することをさらに含む、本発明1098の方法。
[本発明1100]
前記固体担体が、ビーズまたは表面である、本発明1097の方法。
[本発明1101]
前記捕捉部分が、ストレプトアビジンである、本発明1097の方法。
[本発明1102]
前記捕捉部分が、カルボキシル基、エポキシ基、またはヒドロキシル基を含む、本発明1097の方法。
[本発明1103]
前記捕捉部分が、チオール化オリゴヌクレオチドを捕捉するための金を含む、本発明1097の方法。
[本発明1104]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む、本発明1097の方法。
[本発明1105]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、Ｔ7、Ｔ3、及びＳＰ6からなる群から選択されるＲＮＡＰプロモーターをさらに含む、本発明1104の方法。
[本発明1106]
前記バーコードオリゴヌクレオチドが、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択されるニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含む、本発明1104の方法。
[本発明1107]
前記結合部位が、1つまたは複数のＧヌクレオチドである、本発明1104の方法。
[本発明1108]
ａ）固体担体と、
Ｗ配列を含む第一のバーコードオリゴヌクレオチドと、
（ｉ）Ｓ1ｘ配列、及び（ｉｉ）前記第一のバーコードオリゴヌクレオチドの3'配列に相補的である配列を含む、捕捉部分を介して前記固体担体の表面に結合されたオリゴヌクレオチドと
を提供するステップと；
ｂ）前記Ｗ配列を前記結合されたオリゴヌクレオチドに組み込むためにポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施するステップと；
ｃ）（ｉ）Ｓ2ｙ配列、及び（ｉｉ）ステップｂ）から得られた結合されたオリゴヌクレオチドの3'末端に相補的である3'配列を含む第二のバーコードオリゴヌクレオチドを提供するステップと；
ｄ）前記結合されたオリゴヌクレオチドに前記Ｓ2ｙ配列を組み込むためにポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を実施するステップであって、それにより、ポリヌクレオチドを前記固体担体に付着させ、前記ポリヌクレオチドが、バーコード配列を含み、前記バーコード配列が、Ｓ1ｘ、Ｗ、及びＳ2ｙ配列を含む、ステップと
を含む、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に付着させる方法。
[本発明1109]
前記固体担体が、ビーズまたは表面である、本発明1108の方法。
[本発明1110]
前記捕捉部分が、ストレプトアビジンである、本発明1108の方法。
[本発明1111]
前記捕捉部分が、カルボキシル基、エポキシ基、またはヒドロキシル基を含む、本発明1108の方法。
[本発明1112]
前記捕捉部分が、チオール化オリゴヌクレオチドを捕捉するための金を含む、本発明1108の方法。
[本発明1113]
前記第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む、本発明1108の方法。
[本発明1114]
前記第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、Ｔ7、Ｔ3、及びＳＰ6からなる群から選択されるＲＮＡＰプロモーターをさらに含む、本発明1113の方法。
[本発明1115]
前記第一または第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩからなる群から選択されるニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含む、本発明1113の方法。
[本発明1116]
前記結合部位が、1つまたは複数のＧヌクレオチドである、本発明1113の方法。
[本発明1117]
バーコード配列を含むポリヌクレオチドに付着されている、本発明1097〜1116のいずれかの方法により調製された固体担体。
[本発明1118]
本発明1117の複数の固体担体を含むバーコードライブラリー。
[本発明1119]
（ａ）3つの独立して制御される圧力源と、（ｂ）3つのマイクロ流体経路と、（ｃ）3つのフローセンサーと、（ｄ）2つの試料ループと、（ｅ）マイクロ流体ドロップレットチップと、（ｆ）試料回収容器と
を含み、
（ａ）〜（ｆ）が流体連通するように、
各圧力源が前記マイクロ流体経路の1つに連結されて、該マイクロ流体経路を通るように流体を流し、
前記フローセンサーの1つが、前記各圧力源の下流の各マイクロ流体経路に沿って配置され、
第一のマイクロ流体経路が、第一の試料ループを通過し、
第二のマイクロ流体経路が、第二の試料ループを通過し、
前記第一及び前記第二の試料ループが、熱冷却ユニットと接触しており、
前記第一及び第二のマイクロ流体経路が第一のジャンクションで合流して、組み合わせられた経路を形成しており、
前記組み合わせられた経路及び第三のマイクロ流体経路が第二のジャンクションで合流して試料経路を形成しており、前記第二のジャンクションが、前記マイクロ流体ドロップレットチップ内かつ前記第一のジャンクションの下流に存在し、
前記試料経路が、前記第二のジャンクションの下流の前記試料回収容器内に入っている、
細胞と、バーコードアダプター鋳型と、関心対象のポリヌクレオチドを生成するための試薬とを封入するためのマイクロ流体ドロップレットデバイス。
[本発明1120]
前記各圧力源が、圧力ポンプを含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1121]
前記各圧力源が、シリンジポンプを含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1122]
前記第一の試料ループが、前記マイクロ流体ドロップレットチップに向かう水溶液の流れを計量するように構成されており、前記水溶液が、細胞及びバーコードアダプター鋳型を含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1123]
前記第二の試料ループが、前記マイクロ流体ドロップレットチップに向かう反応混合物の流れを計量するように構成されており、前記反応混合物が、細胞溶解のための試薬及び関心対象のポリヌクレオチドを生成させるための試薬を含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1124]
前記第三のマイクロ流体経路が、油／界面活性剤ミックスを前記マイクロ流体ドロップレットチップに送達するように構成されている、本発明1119のデバイス。
[本発明1125]
前記熱冷却ユニットが、ペルティエデバイスを含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1126]
前記熱冷却ユニットが、氷の箱を含む、本発明1119のデバイス。
[本発明1127]
前記第一のジャンクションが、前記ドロップレットチップ内に存在する、本発明1119のデバイス。
[本発明1128]
前記第三のマイクロ流体経路が、前記マイクロ流体ドロップレットチップの上流で2つの準経路に分割されており、前記2つの準経路が、前記第二のジャンクションで前記組み合わせられた経路と合流し、前記第二のジャンクションが、フローフォーカシング配置を有する、本発明1119のデバイス。
[本発明1129]
前記第二のジャンクションが、Ｔ字形ジャンクション配置を有する、本発明1119のデバイス。
[本発明1130]
前記第一のマイクロ流体経路が、細胞を収容するように構成されており、前記第二のマイクロ流体経路が、固体担体に結合されたバーコードアダプター鋳型を収容するように構成されている、本発明1119のデバイス。
[本発明1131]
前記固体担体の少なくとも2つが、異なるバーコード配列またはＵＭＩ配列を有するアダプター構築物を含む、本発明1077のアダプター鋳型ライブラリー。
[本発明1132]
前記複数の固体担体の各固体担体が、異なるバーコード配列または異なるＵＭＩ配列を有するアダプター構築物を含む、本発明1131のアダプター鋳型ライブラリー。
【００６４】
これら及び他の特色、態様、及び利点は、以下の説明及び添付の図面と関連づければより良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、発明の幾つかの態様によるアダプター分子、またはアダプター分子を生成させるための鋳型分子のマップである。アダプター分子の配列は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及び／またはニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位、続いてユニバーサルプライミング配列（プライマーをアニーリングするために次のＰＣＲで用いられる）、続いてバーコード配列及び核酸結合配列を含み得る。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、本発明の幾つかの実施形態によるアダプター分子を増幅または生成させる方法を示す。図２Ａにおいて、ＲＮＡバーコードアダプターは、線形増幅反応において、ＤＮＡ鋳型上のプロモーター配列に結合して一本鎖バーコードアダプターＲＮＡを合成するＴ７などのＲＮＡＰにより合成される。図２Ｂにおいて、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ（ＮＥＢ）などのニッキングエンドヌクレアーゼを用いて、ＤＮＡ鋳型のセンス鎖にニックを導入する。その後、ＤＮＡバーコードアダプターが、増幅反応において、ニックを伸長して一本鎖バーコードアダプターを置換するＫｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−などの鎖置換酵素により合成される。
【図３】図３は、本発明の幾つかの実施形態による第一鎖ｃＤＮＡへのバーコード配列の組み込みを示す。ここではＲＮＡバーコードアダプターが、ｃＤＮＡのバーコード化を実証するために合成されている。ＤＮＡバーコードアダプター（図２Ｂで合成）を用いてもよい。ＲＮＡＰがプロモーターからプライミングして、ＲＮＡバーコードアダプターを合成する（図３左上）。同じ反応において、逆転写が起こり、第一鎖ｃＤＮＡが生成される（右上）。ＭＭＬＶに基づくＨ−逆転写酵素は、３'テーリング活性を有し、複数のｄＣを第一鎖ｃＤＮＡの３'末端に付加する。テーリングされたｄＣ（下）を有するバーコードアダプター塩基対及び逆転写酵素が、該バーコードアダプターを鋳型として用いて転写を継続し、第一鎖ｃＤＮＡに該バーコード配列を組み込む。それにより、反応における全てのｍＲＮＡが、バーコード化される。
【図４】図４は、ＲＮＡバーコードアダプターが、本発明の実施形態においてＤＮＡバーコードアダプターよりも低いバックグランドを有することを示す。図３のバーコード化反応において、両方のオリゴ（ｄＴ）及びバーコードアダプターが存在し、両方のオリゴが、逆転写反応をプライミングし得る。反応がオリゴ（ｄＴ）でプライミングされると（図４上）、反応は通常通り進行する。ＲＴ反応が、ＤＮＡバーコードアダプターでミスプライミングされると（中）、ＰＣＲの間に、フォワードプライマーが、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方からプライミングして、望ましくない生成物を増幅させる可能性がある。ＲＴ反応が、ＲＮＡバーコードアダプターでプライミグされた場合（下）、ＰＣＲ１においてプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼが用いられれば、成長する鎖はＲＮＡヌクレオチドを鋳型として用いることができず、結果として、ミスプライミングされたｃＤＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方にバーコードアダプター配列を含まないであろう。それゆえ、望ましくない生成物は、指数関数的に増幅することはなく、有意に低いバックグランドが生じるはずである。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、本発明の幾つかの実施形態により、バーコードアダプターを生成させて逆転写を実施するための反応ボリュームの隔離を示す図案である。バーコードアダプター分子を、図５Ａの垂直線により表されたドロップレットなどの複数の第一の反応ボリュームにおいて酵素的に生成させることができる。各第一の反応ボリュームは、水溶液中に、全てが同じバーコード配列を有するバーコードアダプター分子を含むことができる。別個に、ＲＮＡ分子を、図５Ｂの水平線により示される複数の第二の反応ボリュームにおいて逆転写することができる。各第二の反応ボリュームは、全てが同じ試料に由来するＲＮＡ分子を含むことができる。その後、第一の反応ボリュームと第二の反応ボリュームが、図５Ｃの交差する線により表される通り、例えばドロップレットの合流などにより混和され得る。図５Ａ及び５Ｂにおける反応の生成物は、互いに混合され、それにより１つのバーコード配列が、各試料に対応する反応ボリュームに導入される。該バーコード配列は、第一鎖ｃＤＮＡまたはＰＣＲ産物に組み込まれ得る。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、本発明の様々な実施形態においてバーコードアダプター分子を生成させるためのバーコードアダプター鋳型の増幅を示す。図６Ａは、ビーズなどの固体表面に付着されたバーコードアダプター鋳型を示す。図６Ｂは、図６Ａにおけるバーコードアダプター鋳型の増幅により生じた水溶液中のバーコードアダプター分子を示す。図６Ｃは、単一のバーコードアダプター鋳型分子を示す。該分子は、水溶液中にあり、容器の内部に保持されている。図６Ｄは、単一鋳型分子の増幅により生じた複数のバーコードアダプター分子を有する図６Ｃの容器を示す。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、固体表面に付着された鋳型からのバーコードアダプター分子の生成を示す。生成の際、バーコードアダプター分子は、水溶液中にある。図７Ａ及び７Ｂは、固体表面に付着されたバーコードアダプター鋳型を示す。図７Ｃは、図７Ａにおいてバーコードアダプター鋳型から酵素的に増幅されたバーコードアダプター分子を示す。図７Ｄは、固体表面からの図７Ｂのバーコードアダプター鋳型の化学的または酵素的切断の際に溶液中に放出されたバーコードアダプター分子を示す。
【図８】図８は、ＤＮＡバーコードアダプターを用いたｃＤＮＡの第一鎖へのバーコード配列の組み込みを示す。（上）３'ポリ−Ｔトラクトを含むバーコードアダプターが、ＤＮＡポリメラーゼを用いてバーコードアダプター鋳型から生成される。バーコードアダプター分子は、水溶液中にある。（下）該バーコードアダプターは、ｍＲＮＡのポリ−Ａテールにアニーリングし、逆転写のプライマーとして働く。該バーコード配列は、ｃＤＮＡの第一鎖の５'末端に組み込まれる。
【図９】図９は、ＤＮＡバーコードアダプターを用いたｃＤＮＡの第一鎖へのバーコード配列の組み込みを示す。（上）３'ランダムまたはセミランダム配列トラクトを含むバーコードアダプターが、ＤＮＡポリメラーゼを用いてバーコードアダプター鋳型から生成される。バーコードアダプター分子は、水溶液中にある。（下）該バーコードアダプターは、３'配列トラクトに少なくとも部分的に相補的であるＲＮＡの領域にアニーリングすることにより、逆転写のプライマーとして働く。該バーコード配列は、ｃＤＮＡの第一鎖の５'末端に組み込まれる。
【図１０】図１０は、個別のピペット注入ステップを排除するバーコード化ワークフローの略図である。手短に述べると、バーコード化反応が油中水ドロップレット中で起こり、細胞及びバーコードアダプターを含むビーズが、ドロップレット生成デバイスにより分配される。バーコードアダプターは、酵素的に増幅されるか、またはビーズなどの固体表面から放出され、バーコードは、細胞からの全ての転写産物に付加される。
【図１１】図１１は、ＲＴ−ＰＣＲのフォワードプライマーとして働くＤＮＡバーコードアダプターを用いたアンプリコンへのバーコード配列の組み込みを示す。該バーコードアダプターは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型から酵素的に生成される（左上）。バーコードアダプター分子は、水溶液中にある。別の反応ボリュームにおいて、または同じ反応ボリュームにおいて、ｃＤＮＡの第一鎖が、ｍＲＮＡ鋳型、逆転写酵素、ポリ−Ｔトラクトを含むプライマー、及び鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドを用いて合成される（右上）。鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドは、バーコードアダプター内の配列領域に相補的である配列領域を含む。その後、該バーコード配列は、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の際にアンプリコンに組み込まれる（下）。該バーコードアダプターは、ＰＣＲのフォワードプライマーとして働く。
【図１２】図１２は、ＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマーとして働くＤＮＡバーコードアダプターを用いたアンプリコンへのバーコード配列の組み込みを示す。該バーコードアダプターは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型から酵素的に生成される（左上）。バーコードアダプター分子は、水溶液中にある。別の反応ボリュームにおいて、または同じ反応ボリュームにおいて、ｃＤＮＡの第一鎖は、ｍＲＮＡ鋳型、逆転写酵素、ポリ−Ｔトラクトを含むプライマー、及び鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドを用いて合成される（右上）。該プライマーは、該バーコードアダプター内の３'配列領域に相補的である５'配列領域を含む。その後、該バーコード配列は、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の際にアンプリコンに組み込まれる（下）。該バーコードアダプターは、ＰＣＲのリバースプライマーとして働く。
【図１３】図１３は、ＲＴ−ＰＣＲのリバースプライマーとして働くＤＮＡバーコードアダプターを用いたアンプリコンへのバーコード配列の組み込みを示す。該バーコードアダプターは、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ鋳型から酵素的に生成される（左上）。バーコードアダプター分子は、水溶液中にある。別の反応ボリュームにおいて、または同じ反応ボリュームにおいて、ｃＤＮＡの第一鎖は、ｍＲＮＡ鋳型、逆転写酵素、３'ランダム配列トラクトを含むプライマー、及び鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドを用いて合成される（右上）。該プライマーは、ランダム配列トラクトを通してｍＲＮＡにアニーリングすることができ、該バーコードアダプター内の３'配列領域に相補的である５'配列領域も含む。その後、該バーコード配列は、ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の際にアンプリコンに組み込まれる（下）。該バーコードアダプターは、ＰＣＲのリバースプライマーとして働く。
【図１４】図１４Ａ〜Ｃは、本発明の実施形態による、核酸マーカーを用いて選択された表現型に関して細胞集団を照合する方法を示す。細胞からのバーコードＲＮＡに加えて、非細胞供給源からのＲＮＡをはじめとする任意のＲＮＡを、バーコード化することができる。非細胞ＲＮＡは、核酸マーカーでの細胞の標識によるなど、任意の手段により反応ボリュームに導入され得る。このマーカーは、抗体（図１４Ａ）、抗原（図１４Ｂ）、またはｐＭＨＣ（図１４Ｃ）などの分子標識に連結された核酸を含み得る。核酸マーカーは、細胞の表現型及び該分子標識への親和性に応じて、該集団内の細胞の一部または全てに結合し得る。その後、該集団中の細胞全てを溶解することができ、各細胞内のｍＲＮＡをバーコード化することができる。核酸マーカーに結合する細胞の場合、関連づけられた核酸もまた、バーコード化され得る。この核酸は、ＲＮＡ、またはＴ７、Ｔ３もしくはＳＰ６プロモーターなどのＲＮＡＰプロモーターを有するｄｓＤＮＡ鋳型であり得る。その後、配列決定により、非内在性ＲＮＡ配列を特異的細胞と関連づけ、それによりどの細胞が分子標識に結合したかを検出することができる。異なる分子標識を、異なる核酸配列に連結させて、複数の細胞表現型の同定を可能にする。
【図１５】図１５は、本発明の幾つかの実施形態による、一反応におけるバーコードアダプター鋳型ビーズの合成を示す。（左）ビーズは、オリゴヌクレオチドに連結される。連結は、ストレプトアビジンをコートしたビーズにビオチン化オリゴを連結させることにより実施することができ、当該分野で公知の他の手段を利用して連結してもよい。（右）連結されたビーズ、フォワード及びリバースプライマー、ならびにバーコード配列とフォワード及びリバースプライマーに相補的である配列とを含むバーコードオリゴが全て、反応容器内に存在し、該バーコードオリゴは、好ましくは単一コピーのみで存在する。その後、ＰＣＲを実施してバーコード配列を増幅し、それをビーズ連結オリゴヌクレオチドに組み込んで、アダプター鋳型ビーズを形成させる。
【図１６】図１６は、本発明の幾つかの実施形態による多段階でのバーコードアダプター鋳型ビーズの合成を示す。（上）ビーズを、固有Ｓ１配列を含むオリゴヌクレオチド（複数のコピー）に連結させる。複数の別個の連結反応を実施するが、各連結反応は異なる固有Ｓ１配列を含むオリゴヌクレオチドを用いる。その後、それぞれが異なる固有Ｓ１配列を有するオリゴヌクレオチドに連結したビーズを、一緒にプールして、Ｓ１ｘ配列を有するビーズのライブラリーを形成させる（中）。その後、これらのビーズを、伸長反応に用いる。各反応において、固有Ｗ配列を含むオリゴヌクレオチドが、ビーズに連結したＳ１ｘ含有オリゴヌクレオチドと相補的に塩基対形成し、ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応を実施する。全ての伸長反応から得られたビーズをプールして、Ｓ１ｘ配列それぞれと固有Ｗ配列との組み合わせを含むビーズのライブラリーを形成させる。（下）前のステップから得られた二本鎖ＤＮＡを変性させて、アンチセンス鎖をビーズから洗い流す。更なる別の伸長反応を、前と同じようにビーズで実施したが、ビーズに連結されたＳ１ｘ及びＷ含有オリゴヌクレオチドと相補的に塩基対形成するオリゴヌクレオチドは、各別個の反応において異なる固有Ｓ２配列を含む。全ての伸長反応から得られたビーズをプールして、バーコードアダプター鋳型を含むビーズのライブラリーを得て、Ｓ１ｘ、Ｗ及びＳ２ｙ配列の組み合わせによりバーコード配列を形成させる。したがって、多数の固有バーコード配列を、このコンビナトリアルアプローチで得ることができる。さらに、複数の固有Ｗ配列を、それぞれＳ１ｘ及びＳ２ｙ配列と組み合わせて、一般式Ｓ１ｘ−Ｗｚ−Ｓ２ｙで示されるバーコードを生成させる。
【図１７】図１７は、本発明の実施形態によるドロップレットデバイスを示す。３つのドロマイトＰ−ポンプに、フローセンサーを備えつける。第一のＰ−ポンプは、ラインを２つのインプットに分割されるＴ−ジャンクションを組み込むマイクロ流体配管を介して、二試薬ドロップレットチップに直接連通されている。これは、油のインプットとラインである。他の２つのＰ−ポンプは、流体配管を介してＦＥＰ試料ループに連通され、デバイスが運転している時には試料を凍結状態に保つために用いられるペルティエデバイスの溝に該ループが取り付けられ、これらのループのそれぞれが二試薬ドロップレットチップに連通されている。各試料ループは、前方の端部に四方弁を組み込んでいるため、試料がシリンジによってループ内に投入され得る。第一の試料ループには、細胞及びバーコード化ビーズ懸濁液が充填され、第二のループには、ＲＴ／溶解ミックスが充填される。試料ループは、水平方向に、ドロップレットチップのレベル以上に配列され、それにより細胞及びビーズの輸送が困難になり得る任意の上り区分を回避することができる。
【図１８】図１８は、図１７に示されたドロップレットデバイスの構成の詳細を示す。ＩＤＥＸ  Ｈ＆Ｓ部品番号により示された部品：１．０．Ａ）１５２８（１１０ｍｍ）；１．０．Ｂ）Ｐ−７３２；１．０．Ｃ）Ｐ−２３２／Ｐ−２４８；１．０．Ｄ）１６８８（３００ｍｍ）；１．０．Ｅ）Ｍ−６４５；１．０．Ｆ）Ｐ−６３０；１．０．Ｈ）Ｐ−６３２；１．０．Ｊ）Ｐ−７０２；１．０．Ｋ）１５２９（５０ｍｍ）；１．０．Ｌ）Ｖ−１０１Ｄ；１．０．Ｎ）Ｐ−７３２；１．０．Ｏ）Ｐ−６２４；１．０．Ｔ）１５３１（９００ｍｍ）；１．２．Ａ）Ｐ−６３０；１．２．Ｂ）１５１６（５００ｍｍ）；１．２．Ｃ）Ｐ−７０２；１．２．Ｄ）１５２９（１５０ｍｍ）；１．２．Ｅ）Ｐ−７０２；１．２．Ｇ）１５６０（１５０ｍｍ）；１．３．Ａ）１５２８（１３５ｍｍ）；１．５．Ａ）１５１６（１５０ｍｍ）；１．５．Ｂ）１５２９（３００ｍｍ）；１．７．Ａ）６１００５；１．７．Ｂ）６５０２０；２．０．Ａ）１４７７（１２５４ｍｍ）；２．０．Ｂ）１５２７（１２５４ｍｍ）；２．０．Ｃ）１５２０（１２０ｍｍ）；２．０．Ｄ）１５２０（６００ｍｍ）；２．０．Ｅ）１５２０（２００ｍｍ）；２．０．Ｆ）１５２０（２００ｍｍ）。出口の配管（チップから試料回収管まで）は、１８０ｍｍの１５６２である。
【図１９】図１９は、本明細書に記載されたドロップレットデバイスの別の実施形態を示す。試料ループは、氷の箱に接触している。
【図２０】図２０は、多段階アプローチを利用して生成されたバーコードアダプター鋳型ビーズから増幅されたＲＮＡバーコードアダプターを示す。バーコードアダプター鋳型ビーズを、インビトロ転写反応で用いた。それぞれＳ１−オリゴ＋Ｗ−オリゴ−ａ＋Ｓ２−オリゴ−ａ、及びＳ１−オリゴ＋ｗ−オリゴ−ｂ＋Ｓ２−オリゴ−ｂを用いて生成されたビーズによるバンドが存在した。
【図２１】図２１は、様々な緩衝液中で実施されたバーコード化反応を示す。１、２、及び３は、３つの反応緩衝液を指し、それぞれ以下に記載された０．５×ＭＭＬＶ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ  ＤＦ及び０．５×ＴＡＥ緩衝液であった。Ｋ、Ｌ、及びＧは、κ、λ、及びγ免疫グロブリン鎖を指す。鎖は全て、用いられた異なる反応緩衝液中で増幅された。
【図２２】図２２は、バーコード化反応がＲＮＡバーコードを用いるとより良好に進むことを示す。１、２、及び３は、３つの反応緩衝液を指し、ＲＮＡバーコードアダプターを用いた１×ＭＭＬＶ及び０．５×ＭＭＬＶ条件、ならびにＤＮＡバーコードアダプターを用いた１×ＭＭＬＶであった。Ｋ、Ｌ、及びＧは、κ、λ、及びγ免疫グロブリン鎖を指す。ＤＮＡアダプターを利用した反応におけるバンドは、バックグランドが高かったため不明瞭となった。
【図２３】図２３は、バーコードアダプター鋳型を有するドロップレット反応容器における単一Ｂ細胞のバーコード化から得られた増幅産物を示している。κ及びλ軽鎖（「Ｋ／Ｌ」）及びμ重鎖（「Ｍ」）に対応するバンドが、明瞭に認められる。
【図２４】図２４は、油中水エマルション中でのバーコード化ビーズとの共封入に続く、軽鎖（κ／λ）及び重鎖（γ）ターゲットのＲＴ／ＰＣＲ増幅を示す。各試料を、一対のレーン（一方はκ／λ軽鎖用（左）であり、もう一方はγ重鎖（右））で泳動させた。エマルション試料には、細胞＋ビーズが共封入された実験試料（試料＋ビーズ）と、一方ではバーコード鋳型アダプタービーズが水性バーコードアダプター鋳型と置き換えられていること（細胞＋ａｑＢＣ）、そしてもう一方では細胞がＡＬＬＣｅｌｌから得られた純粋なヒトＰＢＭＣ  ＲＮＡ鋳型と置き換えられていること（細胞＋ビーズ）以外を同一にして調製された２つの対照試料と、が含まれた。エマルションデバイスに入らないバルク陽性及び陰性対照（それぞれＲ−及びＲ＋１）も含まれた。生成物のバンドは、実験試料及び全ての陽性対照では目視できたが、陰性対照には存在しなかった。
【図２５】図２５は、複数のバーコードアダプター鋳型タイプを用いてバーコードアダプター鋳型ビーズを生成させる方法を示す。バーコードを含むオリゴの生成に成功し、８２ｂｐ長と推測された（左上）。単色のバーコードアダプター鋳型ビーズの獲得に成功した（右）。上のグラフは、最初、ＡＦ６４７ビーズでゲーティングし、下のグラフは、最初、ＦＡＭ−Ｃｙ３−ビーズでゲーティングしたため、両方のグラフに描かれたゲートは単色のビーズのみを示している。ビーズは、ＲＮＡをバーコード化するための使用に成功した（左下）。ここで、Ｔ細胞受容体α及びβ鎖は、バーコード化及び増幅に成功した。過去に生成されたビーズを、陽性対照として用い（レーン１〜２）、単色のバーコードアダプター鋳型ビーズを（レーン４〜７）、陰性対照（レーン３）と比較した。ＤＮＡを２％アガロースゲルで分析したが、１００ｂｐラダーを左のレーンに載せた。
【図２６】図２６は、バーコードアダプター鋳型及び細胞を様々なサイズのドロップレット中に封入することによる、Ｔ細胞受容体α鎖の効率的バーコード化を示す。バーコード化されたＲＮＡを、バーコード化された後に増幅し、２％アガロースゲルで分析した。
【図２７】図２７は、ＴＣＲα及びβ鎖のライブラリーＰＣＲ増幅産物を示す。生成物は、２％アガロースゲルで視覚化した。１００ｂｐラダーを、右のレーンに載せた。
【図２８】図２８は、ＩＦＮγ、ＣＤ８及びＣＤ４遺伝子のライブラリーＰＣＲ増幅産物を示す。生成物は、２％アガロースゲルで視覚化した。１００ｂｐラダーを、右のレーンに載せた。
【図２９】図２９は、トランスクリプトミクスライブラリーのライブラリーＰＣＲ増幅産物を示す。生成物は、２％アガロースゲルで視覚化した。１００ｂｐラダーを、右のレーンに載せた。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
定義
本明細書で用いられる、ポリヌクレオチドへ配列を「組み込む」という用語は、一連のヌクレオチドを、ホスホジエステル結合により、例えばポリヌクレオチドの３'または５'末端にある、ポリヌクレオチドの残り部分と共有結合によりつなぎ、該ヌクレオチドを配列により定められた順序でつなぐことを指す。ポリヌクレオチドが配列またはその相補鎖を含んでいれば、配列がポリヌクレオチドに「組み込まれている」、または同等に、該ポリヌクレオチドが該配列を「組み込んでいる」。ポリヌクレオチドへの配列の組み込みは、酵素的に（例えば、ライゲーションまたは重合により）、または化学合成を利用して（例えば、ホスホルアミダイトの化学作用により）起こり得る。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「増幅する」及び「増幅」は、ポリヌクレオチドの配列の全てまたは一部を酵素的にコピーすることで、同じく該配列またはその相補鎖を含むより多くのポリヌクレオチドを生成させることを指す。コピーされる配列は、鋳型配列と称される。増幅の例としては、ＲＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ鋳型でのＲＮＡ合成、逆転写酵素によるＲＮＡ鋳型での第一鎖ｃＤＮＡ合成、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いたＤＮＡ鋳型でのＰＣＲ増幅が挙げられる。増幅は、全てのプライマー伸長反応を含む。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「等温」は、一定温度または一定範囲の温度で実施される酵素反応などの反応を指す。
【００６９】
用語「関連づけられた」は、本明細書において、試料と、その試料を起源とする、またはその試料に由来するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、またはポリヌクレオチドと、の関連性を指すために用いられる。ポリヌクレオチドは、それが内在性ポリヌクレオチドであれば、即ち試料が選択された時点でその試料の中に存在すれば、または内在性ポリヌクレオチドに由来すれば、試料と関連づけられる。例えば、細胞に内在性のｍＲＮＡは、その細胞と関連づけられる。これらのｍＲＮＡの逆転写により生じたｃＤＮＡ、及び該ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅により生じたＤＮＡアンプリコンは、ｍＲＮＡの配列を含み、該細胞にも関連づけられる。試料と関連づけられたポリヌクレオチドは、試料内に位置する、または試料内で合成される必要はなく、試料が破壊された後（例えば、細胞が溶解された後）であっても、試料と関連づけられると考えられている。分子バーコード化または他の技術を用いて、混合物中のどのポリヌクレオチドが特定の試料と関連づけられるかを決定することができる。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「反応ボリューム」（または同等に「容器」または「コンパートメント」）は、一定容量の液体、例えば水溶液が保持されていて、他のそのような容量の液体または周囲の媒体から隔離（例えば、単離）された状態にある空間である。反応ボリュームと周囲との隔離は、反応ボリュームの周囲の固体バリアから、または相分離から得ることができる。例えば、水は担体液と非混和性であるため、疎水性担体液中に懸濁された水性マイクロ流体ドロップレットは反応ボリュームを構成し得る。したがって担体液中で互いに分離された２つのドロップレットは、隔離されたままであり、１つのドロップレットに溶解された核酸または他の親水性の種は、ドロップレットから出ること、または別のドロップレットに移行することができない。反応ボリュームは、例えばフラスコ、ビーカー、遠沈管、及びマルチウェルプレートのウェルにより画定することもできる。
【００７１】
試料と関連づけられたＲＮＡへのバーコードアダプターの「付加」は、これらのＲＮＡを含む反応ボリュームにアダプター分子を導入することを含むため、該ＲＮＡはバーコード化反応に参加することができる。バーコードアダプターは、付加されると、例えばＲＮＡとのハイブリダイズにより、１つもしくは複数のＲＮＡと直接反応することができ、またはＲＮＡ分子が鋳型として働く重合反応もしくは一連の反応（例えば、逆転写またはＲＴ−ＰＣＲ）に参加することができる。
【００７２】
幾つかの態様において、組成物は、ポリヌクレオチドを含み得る。用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、ならびにそれらの類似体（例えば、ヌクレオチド類似体または核酸の化学作用を利用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡ）などの核酸を指す。所望なら、該ポリヌクレオチドを合成的に、例えば当該技術分野で認識された核酸化学作用を利用して、または酵素的に、例えばポリメラーゼを用いて、作製することもでき、そして所望なら修飾することができる。典型的な修飾としては、メチル化、ビオチン化、及び他の当該技術分野で公知の修飾が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってもよく、所望なら、検出可能な部分につなぐことができる。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡ及びＲＮＡを含む、ハイブリッド分子を含み得る。
【００７３】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」及び「Ｕ」は、それぞれ一般にグアニン、シトシン、アデニン、チミジン及びウラシルを塩基として含むヌクレオチドを表す。しかし、用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」が、修飾ヌクレオチドまたは代わりの置換部分も指し得ることは、理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン及びウラシルを他の部分により置換することができ、その場合そのような置換部分を担うヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に改変しないことを十分に承知している。例えば限定ではないが、イノシンを塩基として含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン及びウラシルを含むヌクレオチドと塩基対形成し得る。このため、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、例えばイノシンを含むヌクレオチドにより、ヌクレオチド配列内で置換され得る。別の例において、オリゴヌクレオチド内の任意の位置にあるアデニン及びシトシンを、それぞれグアニン及びウラシルで置換して、標的ｍＲＮＡとのＧ−Ｕゆらぎ塩基対を形成し得る。そのような置換部分を含む配列は、本明細書に記載された組成物及び方法に適している。
【００７４】
他に断りがなければ、本明細書で用いられる、第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列と関連づけて記載するのに用いられる場合の用語「相補的である」は、当業者に理解される通り、該第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと特定条件下で、該第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの、ハイブリダイズして二重鎖構造を形成する能力を指す。そのような条件は、例えばストリンジェントな条件になる可能性があり、この場合のストリンジェントな条件は、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ６．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０℃または７０℃で１２〜１６時間、そしてその後、洗浄することを含み得る。生物体内で遭遇し得るような生理学的に関連する条件などの他の条件は、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的適用により２つの配列の相補性のテストに最も適した条件のセットを決定することができる。
【００７５】
相補性配列は、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの領域を、第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの領域に、一方または両方のヌクレオチド配列の長さ全体にわたり、またはその長さの一部で塩基対形成することを含む。そのような配列は、本明細書において互いに関して「相補的である」と言うことができる。しかし、第一の配列が、本明細書において第二の配列に関して「実質的に相補性」と言われる場合、２つの配列は、相補性であり得るが、またはそれらは塩基対形成された領域内に１つまたは複数の、一般には約５、４、３、もしくは２以下のミスマッチ塩基対を含み得る。２つの配列がミスマッチ塩基対を有する場合、該配列は、２つのヌクレオチド配列が互いに塩基対を介して結合する限りは、「実質的に相補的である」と見なされよう。
【００７６】
本明細書で用いられる「相補性」配列はまた、ハイブリダイズする能力に関して先の実施形態が満たされる限りにおいて、非ワトソン・クリック塩基対及び／または非天然及び修飾ヌクレオチドから形成された塩基対を含むか、または全体として該塩基対から形成され得る。そのような非ワトソン・クリック塩基対としては、Ｇ：Ｕゆらぎまたはフーグスティーン塩基対形成が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７７】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における用語「同一性」％は、以下に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ、または当業者に入手され得る他のアルゴリズム）または目視による検査の１つを利用して測定すると、最大に対応するように比較され、割りつけられた場合に、同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の特定の割合を有する２つ以上の配列または部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を指す。適用に応じて、「同一性」％の割合は、比較される配列の領域にわたり、例えば機能的ドメインにわたり存在し得るか、あるいは比較される２つの配列の長さ全体にわたり存在し得る。
【００７８】
配列比較については、典型的には１つの配列が、テスト配列を比較する参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを用いる場合、テスト及び参照配列をコンピューターにインプットし、サブシーケンス座標（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ）を必要に応じて指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。その後、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対するテスト配列の配列同一性％を計算する。
【００７９】
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２  （１９８１）に記載の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３  （１９７０）に記載の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ'ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  （１９８８）に記載の類似性探索方法、コンピューターによるこれらのアルゴリズムの実行（ウィスコンシン州マディソン  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐによるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、または目視による検査(一般には上掲のＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．,参照)により実行され得る。
【００８０】
配列同一性％及び配列類似性％を決定するのに適したアルゴリズムの一例が、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０  （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アルゴリズムの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較をデフォルトとして使用する。
【００８１】
同一の配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたり、第二のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに対して、第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの１００％同一性を含む。そのような配列は、本明細書において互いに関して「完全に同一」と言うことができる。しかし幾つかの態様において、第一の配列が本明細書において第二の配列に関して「実質的に同一」と言われる場合、その２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらはアラインメントの際に１つまたは複数の、一般には約５、４、３、もしくは２以下のミスマッチヌクレオチドを有し得る。幾つかの態様において、第一の配列が本明細書において第二の配列に関して「実質的に同一」と言われる場合、その２つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらは互いに少なくとも約５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であり得る。本明細書に記載された２つのヌクレオチド配列の同一性％を決定するために、先に記載されたＢＬＡＳＴＮのデフォルト設定を用いることができる。
【００８２】
第一の配列が、本明細書において第二の配列の同一性に関して「区別可能」と言われる場合、その２つの配列は、アラインメントの際に少なくとも１つまたは複数のミスマッチヌクレオチドを有する。幾つかの態様において、判別可能な配列は、アラインメントの際に２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはより多くのミスマッチヌクレオチドを有し得る。幾つかの態様において、判別可能な配列は、互いに約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の、または１００％未満が同一であり得る。幾つかの態様において、第一の配列が、本明細書において第二の配列に関して「区別可能」と言われる場合、その２つの配列は、実質的または完全に同一の配列を有し得るが、代わりにその配列内の異なる修飾パターンに基づいて互いに異なり得る。そのような修飾は、メチル化など、当該技術分野で一般に知られている。
【００８３】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライブラリー内に存在し得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含み得る。幾つかの態様において、該複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、単一試料に由来し得る。幾つかの態様において、単一試料は、Ｂ細胞などの単一細胞を含み得る。
【００８４】
ヌクレオチド配列を記載するのに、本明細書では従来の表記法が用いられており、一本鎖ヌクレオチド配列の左側の末端は、５'末端であり、二本鎖ヌクレオチド配列の左方向は、５'方向と称される。新生ＲＮＡ転写産物へのヌクレオチドの５'から３'への付加方向は、転写方向と称される。ｍＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖は、「コード鎖」と称され；そのＤＮＡから転写されたｍＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写産物の５'末端までの５'に位置するＤＮＡ鎖上の配列は、「上流配列」と称され；該ＲＮＡと同じ配列を有し、コードするＲＮＡ転写産物の３'末端までの３'にあるＤＮＡ鎖上の配列は、「下流配列」と称される。
【００８５】
用語「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」は、イントロンを含まず、ポリペプチドに翻訳され得るＲＮＡを指す。
【００８６】
用語「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡと相補的であるか、または同一であり、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態であるＤＮＡを指す。
【００８７】
用語「アンプリコン」は、核酸増幅反応、例えばＲＴ−ＰＣＲの増幅産物を指す。
【００８８】
用語「ハイブリダイズする」は、相補性核酸と配列特異的な非共有結合の相互作用を指す。ハイブリダイゼーションは、核酸配列の全てまたは一部で起こり得る。当業者は、核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性がＴｍにより決定され得ることを、認識しているであろう。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる手引きは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９，  ６．３．１−６．３．６、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，  Ｖｏｌ．  ３に見出すことができる。
【００８９】
本明細書で用いられる「領域」は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の連続部分を指す。領域の例は、本明細書に記載されており、同定領域、試料同定領域、プレート同定領域、アダプター領域などが挙げられる。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、２未満、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはそれを超える数よりも少ない領域を含み得る。幾つかの態様において、領域は、連結され得る。幾つかの態様において、領域は、動作可能に連結され得る。幾つかの態様において、領域は、物理的に連結され得る。
【００９０】
本明細書で用いられる「可変領域」は、最終的な発現された遺伝子産物を生成させるための、上流のＶＨ遺伝子セグメントと再構成されたＶＤＪ遺伝子の間のＶ（Ｄ）Ｊ組換え及び相同組換えなどの遺伝子組換えまたは遺伝子変換事象から生じた可変ヌクレオチド配列を指す。例は、免疫グロブリン遺伝子及びＴ細胞受容体遺伝子であるが、これらに限定されない。例えばそれは、活性化Ｔ細胞または活性化Ｂ細胞などの関心対象のＴ細胞またはＢ細胞から単離された免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体配列のＶ、Ｊ、及び／またはＤ領域を含み得る。
【００９１】
本明細書で用いられる「Ｂ細胞可変免疫グロブリン領域」は、Ｂ細胞から単離された可変免疫グロブリンヌクレオチド配列を指す。例えば可変免疫グロブリン配列は、記憶Ｂ細胞、活性化Ｂ細胞、または形質芽細胞などの関心対象のＢ細胞から単離された免疫グロブリン配列のＶ、Ｊ、及び／またはＤ領域を含み得る。
【００９２】
本明細書で用いられる「バーコード」または「バーコード配列」は、例えば後期での少なくとも１つのヌクレオチド配列の同定のために、少なくとも１つのヌクレオチド配列に連結され得る任意の固有配列標識を指す。
【００９３】
本明細書で用いられる「バーコードセット」は、例えば後期でのヌクレオチド配列の同定のために、ヌクレオチド配列が該セットの１つのバーコード配列に連結された、試料からのヌクレオチド配列に連結され得る任意の固有配列セットを指す。
【００９４】
用語「バーコードアダプター」、「バーコード化アダプター」及び「バーコードアダプター分子」は、本明細書では互換的に用いられており、固有バーコード配列を含むオリゴヌクレオチドを指す。
【００９５】
用語「バーコードアダプター鋳型」、「アダプター鋳型」、「鋳型分子」、「バーコードアダプター構築物」、及び「アダプター構築物」は、本明細書では互換的に用いられており、一本鎖バーコードアダプター分子を増殖及び生成させるために鋳型として用いられ得るバーコード配列を含む核酸分子を指す。
【００９６】
本明細書で用いられる「バーコードアダプター鋳型ビーズ」は、１つまたは複数のバーコードアダプター鋳型に連結されたビーズを指す。
【００９７】
本明細書で用いられる「バーコード化」または「バーコード化反応」は、バーコード配列、またはバーコード配列の相補鎖に核酸をつなぐ反応を指す。バーコードアダプターは、必ずしも核酸と共有結合でつながれる必要はなく、バーコード配列の情報そのものが、核酸とつながれている、または核酸の中に組み込まれている。「核酸をバーコード化すること」、「細胞をバーコード化すること」、「細胞からの核酸をバーコード化すること」、「反応容器からの核酸をバーコード化すること」、及び「反応容器をバーコード化すること」は、互換的に用いられる。
【００９８】
本明細書で用いられる「同定領域」は、例えば後期段階での少なくとも１つのヌクレオチド配列の同定のために、少なくとも１つのヌクレオチド配列に連結され得るヌクレオチド配列標識（例えば、固有バーコード配列）を指す。幾つかの態様において、バーコード配列が、試料同定領域として用いられる。幾つかの態様において、バーコードセットが、試料同定領域として用いられる。
【００９９】
本明細書で用いられる「免疫グロブリン領域」は、抗体の一方または両方の鎖（重鎖及び軽鎖）からのヌクレオチド配列の隣接部分を指す。
【０１００】
本明細書で用いられる「アダプター領域」または「アダプター分子」は、第一のヌクレオチド配列を第二のヌクレオチド配列に連結させるリンカーを指す。幾つかの態様において、アダプター領域は、リンカーとして働くヌクレオチド配列の隣接部分を含み得る。幾つかの態様において、アダプター領域またはアダプター分子は、ｃＤＮＡ結合部位などの結合部位を含み得る。例えば結合部位は、配列ＧＧＧを有することができ、ＧＧＧとＣＣＣの間の結合を介して第一の配列を第二の配列に連結させる。幾つかの態様において、該アダプター領域または該アダプター分子は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位、ユニバーサルプライミング配列、バーコード、及びｃＤＮＡ結合部位などの要素を含み得る。
【０１０１】
用語「試料」は、対象（例えば、哺乳類対象、動物対象、ヒト対象、または非ヒト動物対象）から採取されたＲＮＡ、ＤＮＡ、単一細胞、複数の細胞、細胞断片、または体液のアリコットを包含し得る。試料は、遠心分離、静脈穿刺、採血、排泄、スワビング、射出、マッサージ、生検、細針吸引、洗浄試料、剥離、外科的切除、レーザキャプチャー法、勾配分離、または当該技術分野で公知の介入もしくは他の手段をはじめとする現在知られている、または最近発見された任意の手段を利用して、当業者により選択され得る。試料はまた、関心対象の試料と関連づけられることが公知の１種または複数のマーカーを用いて、当業者により選択され得る。試料はまた、細胞選別及びＦＡＣＳなどの当該技術分野で公知の方法を利用して選択され得る。
【０１０２】
発明の詳細な説明
本発明の実施形態は、固有核酸バーコード化アダプターが水相にあるが、それらが生成された鋳型が固体表面に付着され得る（ビーズに付着されるなど）か、または溶液中で遊離し得るように、各反応容器内で該核酸バーコード化アダプターを生成させる方法を提供する。核酸バーコード化アダプターは、固有バーコード配列を含む任意のポリヌクレオチド配列であり、修飾（例えば、ビオチン化されているか、またはＣ１８スペーサーを含む）を有していても、もしくは有していなくてもよく、または修飾されたポリヌクレオチド（２'−Ｏ−メチルＲＮＡ塩基など）を含んでいてもよい。
【０１０３】
同じく提供されるのは、本明細書に開示された方法を用いて生成された組成物である。したがって本発明は、それらの生成のためのＲＮＡ及びＤＮＡアダプター及び構築物の組成物を提供する。同じく提供されるのは、中でもバーコードアダプター鋳型ビーズのライブラリー、ＲＮＡバーコードアダプターを添加されたエマルションドロップレットライブラリー、バーコードライブラリーを細胞と共に含むエマルション、バーコード化ｃＤＮＡライブラリー、及びマイクロ流体ドロップレット生成デバイスである。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、該バーコード化アダプター鋳型は、以下の配列を含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型である：５'−Ｔ７プロモーター−ユニバーサルプライミング配列−バーコード配列−３'。Ｔ７プロモーター配列は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼにより鋳型からのＲＮＡバーコード化アダプターの合成を可能にする。ユニバーサルプライミング配列は、下流で用いられるＰＣＲプライマーへの相補性のために用いられる。該結合配列は、１つまたは複数のグアニン塩基（Ｇ'ｓ）からなり、第一鎖ｃＤＮＡの３'末端へのバーコード化アダプターの相補性塩基対形成を可能にする（図１）。
【０１０５】
非限定的にＴ３及びＳＰ６プロモーター配列などの他のプロモーター配列を用いて、それぞれＴ３及びＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡバーコード化アダプターを合成させることができる。バーコード化アダプターの全長またはほぼ全長が大きな割合で合成される限りは、特異的プロモーター配列を有さない他のＲＮＡポリメラーゼも用いることができる（図２Ａ）。典型的には、バーコード化アダプターの全長またはほぼ全長が大きな割合で合成される限りは、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ及びＫｌｅｎｏｗ  ３'→５'ｅｘｏ−などの鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、等温増幅を利用することもできる。用いられる等温増幅法に応じて、特異的プライマーまたはニッキングエンドヌクレアーゼ配列をプロモーター配列の代わりに用いることができる（図２Ｂ）。こうして生成されたバーコード化アダプターは、ＲＮＡヌクレオチドの代わりにＤＮＡヌクレオチドを含むことになる。ＲＮＡまたはＤＮＡの両方のバーコード化アダプターを、対象ポリヌクレオチドに付着させることができる。
【０１０６】
第一鎖ｃＤＮＡの３'末端へのバーコード化アダプターの付着は、過去に記載されている（ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０００２２１）。手短に述べると、Ｈ−ＭＭＬＶ逆転写酵素は、３'ｄＣテーリング活性を有し、非鋳型ｄＣを第一鎖ｃＤＮＡに付加する。少なくとも１つのＧで終結するバーコード化アダプターも存在する場合、該アダプターは、第一鎖ｃＤＮＡの３'ｄＣと塩基対形成することができ、該逆転写酵素は、鋳型スイッチングを受け、該バーコード化アダプターを鋳型として用いて転写を継続する。したがって、該逆転写酵素は、ホスホジエステル結合を介して該バーコード配列を第一鎖ｃＤＮＡの３'末端に共有結合で付加する（図３）。
【０１０７】
幾つかの実施形態において、バーコード化アダプターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて、５'Ｔ７プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）から線形増幅される。幾つかの実施形態において、該バーコード化アダプターは、逆転写反応と同様の反応において線形増幅される。ｄｓＤＮＡ鋳型からのバーコード化アダプターの増幅は、少なくとも以下の利点を提供する：
１．バーコード化アダプター鋳型をビーズ（ビーズごとに固有のバーコード）に付着させて、同じ貯蔵容器で保存することができる
２．個別のピペット注入ステップを利用せずに、複数のコピーの固有バーコード化アダプターを反応容器に送達することができる
３．各ビーズに付着され得るポリヌクレオチドが限られた量であるが、それでもなおバーコード化アダプターが増幅される
４．増幅されたバーコードが水相にあり、固相の反応速度よりもかなり急速な液相を利用する。
【０１０８】
ＤＮＡバーコード化アダプターよりむしろＲＮＡバーコード化アダプターを用いることに関与する利点もある：
１．逆転写酵素が典型的にはＤＮＡよりもむしろＲＮＡを鋳型として用いること、及び鋳型スイッチングがインビボで逆転写酵素により用いられてレトロウイルスの複製においてＲＮＡ鋳型に切り替わることから、ＲＮＡバーコード化アダプターは、対象ポリヌクレオチドに該バーコード配列を付着させる鋳型スイッチング反応においてより効率的になり得る。
２．ＲＮＡ転写産物全体をアダプターとして用いることで、下流のＰＣＲ反応においてプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼを用いた場合にバックグランドが低くなる。バーコードアダプターがミスプライミングして、逆転写を開始した場合にバックグランドが生じ、第一鎖ｃＤＮＡの５'及び３'の両末端に付加されたバーコードアダプター配列が得られる。これらは、バーコードアダプターに相補的である１つのプライマーだけからＰＣＲで増幅され得る。しかし、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼをＰＣＲで用いる場合、それらはＲＮＡプライマーを転写せず（図４）、バーコードアダプターのミスプライミングからバックグランドが排除される。
【０１０９】
次世代配列決定は、含まれるバーコード化反応の数が多数であるため、バーコード化核酸を配列決定して、同じ反応容器からの核酸を互いに生物情報工学的に関連づけるのに最も適している。更なるバーコードを、別の試料セットと判別可能な試料セットと関連づけてもよく、ＰＣＲプライマーを用いて固有バーコード配列と関連づけることができる。これらの更なるバーコードは、プレートＩＤとも称される。プレートＩＤは、実施された同じ配列決定で異なる試料セットを判別すること、または異なる試料セット間の任意の潜在的混入を生物情報工学的に追跡して排除することなどの利点を付与する。
【０１１０】
ＰＣＲ及び次世代配列決定のエラーは、回避できないため、本明細書に記載されたバーコードが、配列空間において合理的距離（例えば、ハミング距離または編集距離）で離れるように設計することができ、それにより任意の２つのバーコードの配列が、少なくとも複数のヌクレオチドにより互いに異なるであろう。したがってバーコード配列決定の測定値の大部分を正しく割りつけることができ、アンアサイン（ｕｎａｓｓｉｇｎｅｄ）またはミスアサインのバーコードの割合が小さくなる。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、所定のバーコード配列は、最小のハミング距離または編集距離で離れるように設計されている。幾つかの実施形態において、バーコードは、（Ｎ）１５などのランダムヌクレオチドを含み、これは、４１５すなわち約１０億個の固有バーコード配列の可能な合計空間となる。バーコード化される試料の数が、この合計空間よりもかなり少ない場合、例えば１００万個、すなわち合計バーコード空間の０．１％である場合、本発明者らは、バーコードが互いに十分な距離で離れているはずで、バーコードの大部分が正しく割りつけられるはずであると予測する。
【０１１２】
ミスアサインメントの割合が十分に低い限りは、ミスアサインされたバーコード配列につながれた核酸がコンセンサス配列と異なるために、ミスアサインされた配列決定の測定値を単に検出して廃棄することができる。バーコード配列は、十分な距離で離れて存在するように設計されるため、本発明者らは、正しく割りつけられた測定値から組み立てられるバーコード配列と関連づけられた各遺伝子（例えば、γ重鎖、ＴＣＲα鎖）のコンセンサス配列を予測する。
【０１１３】
反応容器内の試料を、固有バーコードまたは固有バーコードセットのいずれかでバーコード化することができる。固有バーコードセットは、例えば反応容器あたりに２つ以上のバーコードアダプター鋳型ビーズを送達することにより、用いることができ、試料の各核酸は、固有バーコードセット内のバーコードの１つでバーコード化される。その後、核酸は、固有バーコードセットの使用により試料と関連づけられる。
【０１１４】
どの試料でそのバーコードセットが用いられたかを判別する一方法は、ＮｅｘＧｅｎ配列決定からの測定値を検査することによる。バーコード配列は、固有バーコードセットにおいて再使用されるため、各バーコード配列は、異なる試料から組み立てられたコンティグと関連づけられると予測される。しかし同じ試料からのコンティグは、同一であると予測される。例えば、同一の免疫グロブリンγ重鎖コンティグは、バーコード配列ａ、ｂ及びｃを用いていると観察され得る。そしてバーコード配列ａ、ｂ及びｄは、別の免疫グロブリンγ重鎖コンティグと関連づけられると観察され得る。このことから本発明者らは、ａ、ｂ及びｃがバーコードセット１を含み、ａ、ｂ及びｄが、バーコードセット２を含むと結論づけることができる。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、Ｎ個の固有バーコード配列のバーコードアダプター鋳型ビーズのライブラリーは、ｎ個の試料をバーコード化するのに十分多様であり、そのような大部分の試料が固有バーコードまたは固有バーコードセットのいずれかでバーコード化される。バーコードアダプター鋳型ビーズの数が、Ｎを大きく超える場合、復元抽出を近似させることができ、固有バーコードでバーコード化された試料数Ｕは、二項分布に従い、
0006608368.tif 000002
により与えられ、式中、ｋ＝１、及びｐ＝１／Ｎである。
【０１１６】
従って、固有バーコードでバーコード化されていない（したがって、互いに関連づけられた試料を２つ以上有する）試料の分率は、
0006608368.tif 000003
により与えられる。
【０１１７】
Ｎと、ｎと、固有バーコードでバーコード化されていない試料の分率と、の関連性を、表１に示す。
【０１１８】
（表１）固有バーコードでバーコード化されていない試料の分率
0006608368.tif 000004
【０１１９】
理解される通り、Ｎ＝１０ｎであれば、９０％を超える試料が、固有バーコードでバーコード化されることになる。
【０１２０】
セットにおいてｘ個のバーコードを有する固有バーコードセットでバーコード化された試料数ＵＳＥＴもまた、二項分布に従い、固有バーコードの組み合わせ数
0006608368.tif 000005
（Ｎは十分に大きく、組み合わせは本質的に反復を含まないと仮定される）、及びｎ個の試料をバーコード化するのに用いられるバーコード数ｎｘを有するバーコードライブラリーと見なすことができ、
0006608368.tif 000006
により与えられ、式中、ｋ＝１、及び
0006608368.tif 000007
である。
【０１２１】
固有バーコードでバーコード化されていない（したがって、互いに関連づけられた試料を２つ以上有する）試料の分率は、
0006608368.tif 000008
により与えられる。
【０１２２】
Ｎと、ｎと、ｘと、固有バーコードでバーコード化されていない試料の分率と、の関連性を、表２及び３に示す。
【０１２３】
（表２）ｘ＝２の場合の、固有バーコードセットでバーコード化されていない試料の分率
0006608368.tif 000009
【０１２４】
（表３）ｘ＝３の場合の、固有バーコードでバーコード化されていない試料の分率
0006608368.tif 000010
【０１２５】
理解される通り、固有バーコードの代わりに固有バーコードセットを用いた場合、バーコードアダプターライブラリーにおいて類似数の試料をバーコード化するのに必要となる固有バーコード数がかなり少なくなるため、試料の大部分を固有バーコードセットで同定することができる。
【０１２６】
Ｉ．方法
Ａ．対象ポリヌクレオチドの生成
幾つかの態様において、本発明は、関心対象の１つまたは複数のポリヌクレオチドを生成させる方法を提供する。そのようなポリヌクレオチドは、バーコード化された核酸、例えばバーコードを含むｃＤＮＡまたはＤＮＡアンプリコンであってもよく、共通のバーコードまたはバーコードセットによって、ポリヌクレオチドの群が同じ試料に由来することが示される。該方法によれば、１つまたは複数の試料と関連づけられた複数のＲＮＡは、以下に記載される通り得られる。各試料と関連づけられたＲＮＡは、別個の反応ボリューム内に存在する。その後、アダプター分子が、各試料と関連づけられたＲＮＡに付加され、バーコード配列を該ＲＮＡに由来する１つまたは複数のポリヌクレオチドに組み込む。
【０１２７】
バーコード化反応の反応速度を最大にするために、該バーコードアダプターは、好ましくはＲＮＡに付加される前、または付加された時点では溶液中で遊離している。バーコードアダプターの付加は、ピペット注入により、１つの反応ボリュームを別の反応ボリュームに注ぐことにより、または２つ以上の反応ボリュームを溶け合わせることにより、実現され得る。例えば該バーコードアダプターは、１つの反応ボリューム内で生成させること、及び／または封入させることができ、その後、１つの試料と関連づけられたＲＮＡを含む別の反応ボリュームと混和することができる（図５Ａ〜Ｃ）。幾つかの実施形態において、試料からのＲＮＡに付加されるバーコードアダプターは、ＲＮＡが存在している反応ボリューム内でインサイチュで生成される。
【０１２８】
幾つかの実施形態において、バーコードアダプターは、バーコードアダプター鋳型から酵素的に生成される。バーコードアダプター鋳型は、バーコード配列、ならびにバーコードアダプターの生成と、続く核酸のバーコード化を容易にする他の配列領域と、を含む二本鎖ＤＮＡ分子であり得る（図１）。バーコードアダプター鋳型は、標準的な分子クローニング技術を利用して調製され得る。幾つかの実施形態において、バーコードアダプター鋳型は、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターなどのＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）のためのプロモーターを含む。その後、ＲＮＡバーコードアダプターは、該鋳型分子を適切なＲＮＡＰと接触させて、インビトロ転写を起こさせることにより生成され得る（図２Ａ）。幾つかの実施形態において、バーコードアダプター鋳型は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、またはＮｔ．ＢｓｍＡＩ部位などのニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位を含む。ＤＮＡバーコードアダプターは、該鋳型を該制限部位に特異性のあるニッキングエンドヌクレアーゼと接触させ、その後、該鋳型を鎖置換ＤＮＡポリメラーゼに暴露することにより、そのような鋳型から生成され得る（図２Ｂ）。適切な鎖置換ＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ｋｌｅｎｏｗ  ｅｘｏ−、Ｂｓｔ  Ｌａｒｇｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ、及びそれらの操作された変異体が挙げられる。一般に、バーコードアダプターは、バーコードアダプター鋳型を１つまたは複数の酵素と接触させることにより、該鋳型から生成される。幾つかの実施形態において、該酵素反応は、等温反応である。
【０１２９】
バーコードアダプター鋳型は、バーコードアダプターを生成させるために用いられる時には溶液中で遊離されていてもよく、または固体担体に結合されていてもよい。本発明の方法及び組成物の実施形態において用いられ得る固体担体の例としては、ビーズ、クロマトグラフィー樹脂、マルチウェルプレート、マイクロ遠沈管、または固体表面を有する他の物体が挙げられる。バーコードアダプター鋳型は、任意の望ましいメカニズムまたは捕捉的化学作用、例えばビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、または金−チオール相互作用を利用して固体担体に結合され得る。幾つかの実施形態において、バーコードアダプター鋳型が付着された任意の固体担体は、水溶液に接触しており、該鋳型から生成されたバーコードアダプター分子は、それらが生成されるとこの溶液に放出される（図６Ａ、６Ｂ、７Ａ〜Ｄ）。該水溶液は、該バーコードアダプター分子が付加されるべき、試料と関連づけられたＲＮＡ分子と、同じ反応ボリューム内に存在してもよい。即ち、該バーコードアダプター分子は、バーコード化反応のためにインサイチュで生成され得る。あるいはバーコードアダプター鋳型のための固体担体と接触している水溶液は、標的ＲＮＡと異なる反応ボリュームに保持することができ、該鋳型から生成されたバーコードアダプターは、２つの反応ボリュームを混和するとこれらのＲＮＡに付加することができる。
【０１３０】
幾つかの実施形態において、バーコードアダプターは、固体担体からバーコードアダプター鋳型を切断することにより生成される（図７Ｂ及び７Ｄ）。鋳型分子は、適切な酵素（例えば、制限エンドヌクレアーゼ）への暴露の際に鋳型分子の切断を容易にするエンドヌクレアーゼ制限部位を含み得る。そのような切断の際に溶液に放出される核酸分子は、バーコードアダプターとして働き、直接バーコード化反応に参加すること、またはさらなる酵素反応（例えば、インビトロ転写）に供してアダプター分子を生成させることができる。
【０１３１】
どのようにしてバーコードアダプター分子が生成されるかにかかわらず、これらの分子のライブラリーは、多くの試料からの核酸をバーコード化するために調製され得る。各反応ボリュームが、例えば平均で１つのアダプター分子を含むように、アダプター分子を異なる反応ボリュームに隔離することができる。あるいは各反応ボリュームが、複数のコピーのアダプター分子を含み、各コピーが同じバーコード配列を含むことができる。該反応ボリュームは、マイクロ流体ドロップレットであっても、またはマイクロ遠沈管もしくは他の容器に密封されていてもよい
【０１３２】
バーコードアダプター分子は、バーコード配列に加えて、以下の「組成物」の下に記載された通りユニバーサルプライミング配列またはユニバーサルプライミング領域と、結合部位と、を含むことができる。該アダプター分子はまた、固有分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み得る。幾つかの実施形態において、ＵＭＩ配列は、ランダム化されたヌクレオチドを含み、該バーコード配列とは独立してバーコードアダプター（または該アダプターが生成されるバーコードアダプター鋳型）に組み込まれる。したがって、同じバーコード配列を含むバーコードアダプター分子のセットは、異なるＵＭＩ配列を含み得る。該同じバーコード配列と、異なるＵＭＩ配列を含む該バーコードアダプター分子のセットが１つの試料と関連づけられたＲＮＡに付加される実施形態において、各ＲＮＡ配列は、バーコード化の際に異なるＵＭＩ配列につなげられ得る。各ビーズ上の鋳型分子が同じバーコード配列と、異なるＵＭＩ配列のライブラリーとを含む、ＵＭＩ配列を有するバーコードアダプター鋳型ビーズを調製する方法は、以下の実施例１２及び１３に開示されている。
【０１３３】
バーコードアダプターは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子、またはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドであり得る。例えばアダプターが、共通のオリゴヌクレオチド鎖内のＤＮＡヌクレオチドに共有結合でつなげられたＲＮＡヌクレオチドを含み得る。バーコードアダプターは、一本鎖または二本鎖でもあり得る。二本鎖であれば、バーコードアダプターは、１つまたは複数の平滑末端、または一本鎖オーバーハングを有する末端を有し得る。
【０１３４】
幾つかの実施形態において、該バーコードアダプターは、一本鎖ＤＮＡ分子であり、逆転写のためのプライマーとして働く。該バーコードアダプターは、ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）を用いて生成され得る。この場合、該バーコードアダプターの結合部位は、ＲＮＡ結合部位（例えば、ｍＲＮＡ結合部位）であり、１つまたは複数のＲＮＡ内の配列領域に相補的である配列領域を含む。幾つかの実施形態において、該結合部位は、バーコードアダプターが付加される試料中の全てのＲＮＡに共通する配列領域に相補的である。例えば該結合部位は、ポリ−Ｔトラクトであってもよく、真核生物ｍＲＮＡのポリ−Ａテールに相補的である（図８）。代わりまたは追加として、該結合部位は、ランダム配列トラクトを含み得る（図９）。試料と関連づけられたＲＮＡに該バーコードアダプターを付加すると、逆転写を起こすことができ、ｃＤＮＡの第一鎖を合成することができ、それにより該バーコード配列が、ｃＤＮＡの第一鎖に組み込まれる。逆転写が適切な条件、例えば適切な緩衝液及び逆転写酵素の存在、ならびにＲＮＡへのバーコードアダプターのアニーリング及び酵素活性に適した温度を必要とすることは、認識されよう。同じく、ＤＮＡプライマー及びＲＮＡ鋳型を含む逆転写は、該プライマーの３'末端が鋳型に相補的であって該鋳型を直接アニーリングし得る場合に、最も効率的になる。したがって、結合部位がアダプター分子の３'末端で起こるように、該バーコードアダプターが設計され得る。
【０１３５】
該バーコードアダプターが、逆転写において第一鎖ｃＤＮＡ合成のプライマーとして用いられる場合、そして逆転写を含む本発明の方法の別の実施形態において（以下に記載）、逆転写反応は、バーコードアダプターが生成されたのと同じ反応ボリューム内で起こり得る。したがって該バーコードアダプターは、バーコードアダプターが生成された時点で、試料に、または試料と関連づけられたＲＮＡに付加され得る。例えば、マイクロ流体ドロップレットは、バーコードアダプター鋳型が結合されたビーズと、細胞とを含み得る（図１０）。バーコードアダプター分子は、１つまたは複数の酵素、例えばニッキングエンドヌクレアーゼ、鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼも、該ドロップレット中に存在する場合に、生成され得る。その後、溶解試薬が該ドロップレット中に存在して細胞からＲＮＡを放出する場合、そして逆転写酵素、プライマー、及び他の適切な試薬が存在する場合に、逆転写が起こり得る。バーコードアダプターを生成させて、溶解及び逆転写を容易にするための酵素及び試薬が、例えば該酵素及び試薬を含むドロップレットを、ビーズ及び細胞を含むドロップレットと溶け合わせることにより、一度にドロップレットに添加することができ、または数段階で添加することができる。
【０１３６】
本発明の方法の幾つかの実施形態において、各試料と関連づけられたＲＮＡは、逆転写されるが、バーコードアダプターは、第一鎖ｃＤＮＡ合成をプライミングしない。代わりに、ポリ−Ｔトラクト、ランダム配列、または他のＲＮＡ結合部位を含む標準的ＤＮＡプライマーが用いられる。これらの実施形態において、該バーコードアダプターは、第一鎖ｃＤＮＡ合成が起こるのと同じコンパートメントまたは反応ボリュームにおいて生成され得る。この場合、約ｐＨ８．０〜ｐＨ８．８のｐＨの、トリス、カリウムイオン、塩素イオン、硫酸イオン、アンモニウムイオン、酢酸イオン、及び／またはマグネシウムイオンを含む該反応ボリューム内に、緩衝液を含むことが、有益になり得る。あるいは、異なるコンパートメント内で、該バーコードアダプターを生成させ、そして第一鎖ｃＤＮＡ合成を起こすことができ、その場合、該コンパートメントは、所望なら、第一鎖ｃＤＮＡ合成の前または後に混和することができる。該コンパートメントは、バーコードアダプターが生成される前、または生成された後に混和することもできる。酵素反応の実施、及びコンパートメントの混和に関する異なる可能性が、反応条件を最適化するための柔軟性を提供する。しかし、該バーコードアダプターがどのようにして試料と関連づけられたＲＮＡに付加されるかにかかわらず、バーコードアダプターは、第一鎖ｃＤＮＡ合成の際、または該合成の直後に酵素的バーコード化反応に参加し得る。
【０１３７】
先に記載された通り、本発明の方法は、鋳型ＲＮＡの５'末端に達すると、新生ｃＤＮＡ鎖の末端に１つまたは複数の非鋳型化ヌクレオチド（Ｃｓなど）を付加する逆転写酵素（例えば、ＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素）を用いることができる。これらのヌクレオチドは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖の一方の末端で３'ＤＮＡオーバーハングを形成する。第二のＲＮＡ分子が、非鋳型化ヌクレオチドに相補的であって非鋳型化ヌクレオチドに結合する配列領域、例えば３'末端のポリ−Ｇトラクトを含む場合、逆転写酵素は、鋳型を切り替えて、新たに第二のＲＮＡ分子を鋳型として用いて、ｃＤＮＡの伸長を継続することができる。そのような第二のＲＮＡ分子は、本明細書で参照され、そして鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドとして当該技術分野で公知である。
【０１３８】
本方法の実施形態において、該バーコードアダプターは、逆転写のための鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドとして働く（図３）。したがって、該バーコード配列は、鋳型スイッチングの後にｃＤＮＡの第一鎖に組み込まれ、ｃＤＮＡの第一鎖の増幅（例えば、ＰＣＲによる）から得られたＤＮＡ分子中に存在する。これらの実施形態において、鋳型スイッチング活性を有する任意の逆転写酵素が、用いられ得る。該バーコードアダプターの結合部位は、ｃＤＮＡ結合部位であり、好ましくは該アダプター分子の３'末端に存在する。該結合部位は、Ｇ−トラクト（１つまたは複数のＧヌクレオチドを含む）または逆転写酵素により生成された３'オーバーハングの配列と少なくとも部分的に相補的である任意の他の配列を含み得る。該オーバーハング配列、そしてつまりバーコード配列の結合部位に適した配列が、該方法で用いられる逆転写酵素の選択に依存し得ることは、認識されよう。
【０１３９】
他の実施形態において、各試料と関連づけられたＲＮＡは、逆転写されるが、バーコード配列は、ｃＤＮＡの第一鎖に全く組み込まれない。即ち、該バーコードアダプターは、第一鎖ｃＤＮＡ合成のプライマーとして、または鎖スイッチングオリゴヌクレオチドとして働かない。むしろ該バーコードアダプターは、ｃＤＮＡの第一鎖またはその相補鎖のＰＣＲ増幅のためのプライマーとして働く。これらの実施形態において、該ｃＤＮＡは、フォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅され、該リバースプライマーは、第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーの少なくとも一部と同じ配列を有する。該バーコードアダプターは、フォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれかであってもよく、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。該バーコードアダプターが、フォワードプライマーである場合、それは、鎖スイッチングに続くｃＤＮＡの伸長により生じた第一鎖ｃＤＮＡ（またはその相補鎖）の一部にアニーリングし得る（図１１）。あるいは該バーコードアダプターは、試料からのＲＮＡ上で鋳型化された第一鎖ｃＤＮＡの一部にアニーリングし得る。したがって、本発明のこれらの実施形態を実施するのに、鋳型スイッチング、及び、試料の反応ボリュームへの鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドの添加を行う必要はない。該バーコードアダプターが、リバースプライマーである場合、それは、ランダム配列を含むプライマーなど、第一鎖ｃＤＮＡ合成のための任意のプライマーと協調的に用いることができる（図１２及び１３）。
【０１４０】
本発明の方法は、任意の望ましい試料で実施され得る。幾つかの実施形態において、各試料は、細胞を含み、例えば単一細胞であり得る。細胞を、マイクロ流体ドロップレットなどの反応ボリューム内に密封することができ、所望なら、溶解されてＲＮＡ分子を反応ボリューム内に放出することができる。この目的で、該細胞を、任意の簡便な時間に溶解緩衝液と接触させることができる。該細胞は、Ｂ細胞、例えば形質芽細胞、記憶Ｂ細胞もしくは形質細胞、または任意の他の種類の細胞であり得る。
【０１４１】
本発明者らは、有利には、溶解の前に細胞が浸透圧保護剤を含む細胞懸濁緩衝液中に懸濁され得ることを見出した。浸透圧保護剤は、細胞を浸透圧ストレスから防御することができ、細胞にバーコード化の前に生理学的に安定した状態、または平静な状態を確実に保たせることができる。幾つかの実施形態において、細胞は、バーコードアダプター分子及び／またはバーコードアダプター鋳型と共に細胞懸濁緩衝液に懸濁される。幾つかの実施形態において、細胞は、逆転写、ＰＣＲ、及び／または溶解のための試薬と接触させる前に、細胞懸濁緩衝液に懸濁される。細胞懸濁緩衝液は、任意の反応ボリュームに含ませることができ、水性反応ボリュームを形成するため、そして混和するための本明細書に記載された方法と適合性がある。
【０１４２】
幾つかの実施形態において、細胞懸濁緩衝液中の浸透圧保護剤は、ベタインまたは構造的に近いその類似体である。ベタインまたは構造的に近いその類似体の例としては、グリシンベタイン（Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシンとも呼ばれる）、プロリンベタイン（スタキドリンとも呼ばれる）、β−アラニンベタイン、エクトイン、コリン−Ｏ−スルファート、トリゴネリン、ジメチルスルホニオプロピオナート（ＤＭＳＰ）、及びジメチルテチンが挙げられる。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、グリシンベタインである。ベタインは、浸透圧保護剤として働くことに加え、ＰＣＲにおいて二次構造の形成を減少させること、及び増幅の特異性を改善することが示されている。それゆえベタインは、本発明の方法に含まれることが一般に有益となる可能性がある。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、トレハロースなどの糖またはポリオールである。他の有用な糖またはポリオールとしては、スクロース、フルクトース、ラフィノース、マンニトール、及びミオイノシトールが挙げられる。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、プロリンなどのアミノ酸である。単一の浸透圧保護剤を、細胞懸濁緩衝液中に含ませることができ、または複数の浸透圧保護剤を、組み合わせて含ませることができる。各浸透圧保護剤は、任意の有用な濃度で存在し得る。幾つかの実施形態において、該細胞懸濁緩衝液の浸透圧は、約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌである。幾つかの実施形態において、該浸透圧保護剤は、該緩衝液の浸透圧の最大１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％に寄与している。本明細書で用いられる例示的な細胞懸濁緩衝液（例えば、実施例７〜９、１１及び１４参照）は、約２３０〜３３０ｍＭベタイン及び約１０ｍＭ  ＮａＣｌを含む。
【０１４４】
各試料が少なくとも１つの細胞を含む実施形態において、該試料と関連づけられたＲＮＡは、ｍＲＮＡを包含し得る。該試料は、例えば少なくとも１、３、１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００種のｍＲＮＡ分子を含むことができ、それは、任意の数の遺伝子、対立遺伝子、リーディングフレーム、または判別可能な配列を表すことができる。幾つかの実施形態において、該試料と関連づけられたＲＮＡとしては、試料からのｍＲＮＡの全て、該細胞の全てもしくは一部のトランスクリプトーム、または該細胞からの総ＲＮＡが挙げられる。
【０１４５】
より多数のバーコードアダプター分子が各試料の反応ボリュームに送達され得れば、試料あたりより多くのＲＮＡをバーコード化することができ、より多くの対象ポリヌクレオチドを生成させることができることが、認識されよう。しかし、任意の理論に束縛されるものではないが、本発明の方法は、試料あたりのバーコード化され得るＲＮＡ数を限定しない。したがって、生成される対象ポリヌクレオチド数は、試料あたり少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００であり得る。関心対象の各ポリヌクレオチドは、複数のコピーで存在し得る。さらに、該方法の１回の実施でバーコード化され得る細胞または試料の数は、固有バーコード配列を有する多くのバーコードアダプター鋳型を調製するというチャレンジ（先に議論）のみによって限定される。幾つかの実施形態において、該１つまたは複数の試料は、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００個の細胞を含む。試料（例えば、それぞれが単一細胞である）は、同じ対象または異なる対象から得ることができる。例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００種の異なる対象が、試料を提供し得る。
【０１４６】
本発明の方法は、核酸マーカーを用いて関心対象の表現型に関して細胞集団を照合するために用いることもできる。該核酸マーカーは、表現型を表す、または表さない集団からの細胞のサブセットに特異的に結合し得る結合剤につなげられた核酸を包含する。例えば該結合剤は、特定のタンパク質、糖タンパク質、糖脂質、または幾つかの細胞の表面に存在する他の部分に結合し得る。幾つかの実施形態において、該結合剤は、抗体、抗原、またはタンパク質などの分子標識である（図１４Ａ〜Ｃ）。幾つかの実施形態において、該結合剤は、ペプチド−ＭＨＣ複合体である。核酸は、非共有結合的捕捉部分、または望ましい他の手段を用いて結合剤に共有結合でつながり得る。
【０１４７】
表現型に関して細胞を照合するために、細胞を核酸マーカーと接触させ、その後、洗浄する。したがって酢酸マーカーは、結合剤が結合した細胞表面のみに保持される。該細胞は、その後、反応ボリューム内に密封されて、先に記載された通り溶解することができ、それにより細胞内のＲＮＡをバーコード化することができる。バーコード化反応の際に、核酸マーカーの核酸もバーコード化されて、それにより該マーカー配列が、マーカーを保持する細胞についてのＲＮＡまたはアンプリコン配列決定データに表れる。幾つかの実施形態において、該核酸マーカーの核酸は、該集団の細胞に内在性でない配列を有するＲＮＡ分子である。幾つかの実施形態において、該核酸は、ＲＮＡＰプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡ分子である。したがって該核酸は、細胞（またはその溶解物）と同じ反応ボリュームにありながら転写することができ、得られたＲＮＡ分子は、細胞からのＲＮＡと共にバーコード化することができる。
【０１４８】
細胞は、それぞれの核酸マーカーが異なる核酸配列につなげられた異なる結合剤を含む該核酸マーカーを複数用いて複数の表現型について照合され得る。例えば細胞は、第一の核酸マーカー及び第二の核酸マーカーと接触させることができるが、ここで各核酸マーカーは、核酸につなげられた分子標識を含む。２つの核酸マーカーの分子標識は、互いに異なり得る（例えば、異なるタンパク質である、または異なる細胞表面部分への親和性を有する）。これらの分子標識につなげられた核酸は、全体または一部が互いに異なる配列を含み得る。細胞は、同時に、または連続して２つ以上の核酸マーカーと接触し得る。
【０１４９】
さらなる例として、３つの抗体を異なる非内在性ＲＮＡ配列につなげることができ、これらの抗体で処理された細胞に関するバーコード化配列決定データから、各細胞が抗体のいずれにもターゲットを提示するか、または一部もしくは全てにターゲットを提示するかを明らかにすることができる。バーコード化アンプリコンのコピー数は、表現型の度合い、例えば核酸マーカーにより標的となる異なる細胞の細胞表面部分の相対的存在率を明らかにすることもできる。
【０１５０】
Ｂ．固体担体へのポリヌクレオチドの付着
本発明の別の態様は、バーコード配列を含むポリヌクレオチドを、固体担体に付着させる方法を提供する。該ポリヌクレオチドは、バーコードアダプター鋳型、またはそのような鋳型の前駆体であり得る。したがってポリヌクレオチドを先に記載された通り使用して、バーコードアダプターを酵素的に生成させ、該バーコード配列をＲＮＡ由来のアンプリコンに組み込むことができる。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、該方法は、逆エマルションの親水性コンパートメント（即ち、水性ドロップレット）を生成させることを含む。該コンパートメントは、所望なら、例えば疎水性担体液中で水溶液と混合し、場合により該混合物を撹拌することにより、生成され得る。該水溶液は、固体担体、オリゴヌクレオチド、及びそれに懸濁された試薬を有することができ、それにより各コンパートメントは、コンパートメントが形成された時に固体担体にポリヌクレオチドを付着させるために必要な成分全てを含む。これらの実施形態において、コンパートメントに固体担体を付加する前に、オリゴヌクレオチドを、捕捉部分を介して固体担体の表面に結合させる。このオリゴヌクレオチドは、本明細書において「結合されたオリゴヌクレオチド」と称され、バーコードオリゴヌクレオチドの３'配列に相補的である３'配列を含む。したがって該ポリヌクレオチドは、結合されたオリゴヌクレオチド及びバーコードオリゴヌクレオチドを含むポリメラーゼ伸長反応を通して固体担体上で形成され、この反応はコンパートメント内で実施される。
【０１５２】
好ましい実施形態において、親水性コンパートメントが形成された時、該バーコードオリゴヌクレオチドは、低濃度または限定的濃度（例えば、コンパートメントあたりに１分子）で存在する。この濃度は、ランダム化配列を有するバーコードオリゴヌクレオチドのライブラリーを用いて複数のバーコード鋳型ビーズを調製する場合に簡便である。各バーコードオリゴヌクレオチドが、異なるバーコード配列を有すると仮定され、各コンパートメント内の固体担体が、唯一のバーコード配列を有することが望ましい場合、１つのバーコードオリゴヌクレオチド（最大または平均）が、コンパートメントあたりに存在し得る。この条件が満たされれば、複数の固体担体（例えば、複数のビーズ）が、コンパートメント内に存在することができ、または結合されたオリゴヌクレオチドの複数のコピーが、各固体担体に結合することができるが、コンパートメント内でのポリメラーゼ伸長反応により生じたポリヌクレオチドの全てが、同じバーコード配列を含むことになる。
【０１５３】
本発明での使用に好ましい固体担体は、ビーズ、例えば金属及び／またはポリマー材料で作製された約０．１〜１０マイクロメートルの範囲内の直径を有する球体ビーズである。代わりまたは追加として、他の特性を有するビーズを用いることができる。固体担体は、結合されたオリゴヌクレオチドを表面に付着させるための捕捉部分と共にて機能し得る（図１５左）。捕捉部分の例としては、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、カルボキシル基、エポキシ基、ヒドロキシル基、チオール基、及び金が挙げられる。幾つかの捕捉部分は、特異的に、そして非共有結合で結合する結合パートナーを有する。例えばストレプトアビジンは、結合パートナーとしてビオチンを採用する。そのような捕捉部分は、固体担体に直接（例えば、共有結合で）連結することができ、結合パートナーは、逆も同様に結合されたオリゴヌクレオチドに連結することができ、それにより結合されたオリゴヌクレオチドは、非共有結合での相互作用を通して固体担体に結合される。他の捕捉部分は、結合されたオリゴヌクレオチドと固体担体との直接的な共有結合でのつながりを提供する。
【０１５４】
結合されたオリゴヌクレオチドは、好ましくは５'末端で固体担体に結合された一本鎖ＤＮＡ分子である。したがって結合されたオリゴヌクレオチドの３'末端は、溶液中で遊離しており、該バーコードオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされると、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素により伸長され得る。伸長反応は、バーコードオリゴヌクレオチドを用いて鋳型化され、それによりバーコード配列は、ビーズに結合されたＤＮＡ鎖に組み込まれる。所望なら、結合されたオリゴヌクレオチド及び／またはバーコードオリゴヌクレオチドが、分子内二次構造を最小にするように設計された配列を有し得る。
【０１５５】
該バーコードオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライミング配列及び／または結合部位などの先に議論された配列領域を含み得る。結合されたオリゴヌクレオチド及びバーコードオリゴヌクレオチドとのプライマー伸長反応を実施すると、これらの配列領域は、固体担体に結合されたポリヌクレオチドに組み込まれることになる。該ポリヌクレオチドが、次にバーコードアダプター鋳型として用いられれば、該配列領域は、該鋳型から生成されたバーコードアダプター分子中にも存在することになる。ＲＮＡＰプロモーター及び／またはニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位などの他の配列をバーコードオリゴヌクレオチド内に含ませて、バーコードアダプター分子の酵素的生成を容易にすることができる。ＲＮＡＰプロモーターは、Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターからなる群から選択され得る。該ニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位は、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、及びＮｔ．ＢｓｍＡＩ部位からなる群から選択され得る。バーコードオリゴヌクレオチド内の結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチドを含み得る。
【０１５６】
幾つかの実施形態において、該バーコード配列及び他の配列領域は、ＰＣＲを用いて、結合されたオリゴヌクレオチド及び／または固体担体に付着されたポリヌクレオチドに組み込まれる（図１５右）。これらの実施形態において、該バーコードオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの鋳型として働き、結合されたオリゴヌクレオチドは、プライマーとして働き、結合されたオリゴヌクレオチドの酵素的伸長は、３'末端から進行する。該バーコードオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲリバースプライマー配列と同一の、または該配列と相補的である５'配列も含む。したがってリバースプライマーは、該バーコードオリゴヌクレオチド（またはその相補鎖）の５'末端にアニーリングして、結合されたオリゴヌクレオチドと反対方向への伸長をプライミングすることができる。所望なら、このリバースプライマーは、フルオロフォア標識させることができ、それによりＰＣＲにより生成されて固体担体に付着されたポリヌクレオチドは、蛍光性になる。該標識を用いて、固体担体（例えば、ビーズ）がバーコード配列を含むポリヌクレオチドへの付着に成功したかどうかを決定することができる。
【０１５７】
先の方法は、一段階で実施することができる。本発明の方法の別の実施形態において、バーコード配列を含むポリヌクレオチドは、多段階で固体担体に付着される。これらの実施形態において、該バーコード配列は、複数の配列領域、例えばＳ１ｘ、Ｗ、及びＳ２ｙ領域で構成される。これらの配列領域は、２つ以上のバーコードオリゴヌクレオチドの一部としてポリヌクレオチドに導入することができ、各バーコードオリゴヌクレオチドは別のステップまたは酵素反応において用いることができる。該別のステップから得られたポリヌクレオチドにおいて、Ｓ１ｘ、Ｗ、及びＳ２ｙ領域は、必ずしも隣接していない。様々なＳ１ｘ、Ｗ、及びＳ２ｙ配列を異なる固体担体上で組み合わせて、異なるバーコード配列またはバーコード配列のライブラリーを形成させることができる。
【０１５８】
バーコード配列を含むポリヌクレオチドを固体担体に多段階で付着させるために、固体担体と、固体担体に結合されたオリゴヌクレオチドが、先に記載された通り提供される。該固体担体及び結合されたオリゴヌクレオチドは、エマルションの親水性コンパートメント内で、または任意の他の望ましい反応ボリューム内で提供され得る。同じく提供されるのは、第一のバーコードオリゴヌクレオチドである（図１６の上及び中）。該結合されたオリゴヌクレオチドは、Ｓ１ｘ配列と、第一のバーコードオリゴヌクレオチドの３'配列に相補的である配列と、を含む。第一のバーコードオリゴヌクレオチドは、Ｗ配列を含む。多段階手順の第一のステップにおいて、ポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応が実施されて、Ｗ配列を結合されたオリゴヌクレオチドに組み込む。したがってこのステップの後、Ｓ１ｘ及びＷ配列は、固体担体に結合された同じ核酸鎖内に存在する。伸長反応が用いられる場合、一段階手順で先に議論された通り、結合されたオリゴヌクレオチドは、プライマーとして働くことができ、第一のバーコードオリゴヌクレオチドが、鋳型として働くことができ、そのため、結合されたオリゴヌクレオチドは、３'末端から伸長する。幾つかの実施形態において、結合されたオリゴヌクレオチド内のＳ１ｘ配列に相補的である第一のバーコードオリゴヌクレオチドの一部が、イノシントラクトを含む。
【０１５９】
次に、第二のバーコードオリゴヌクレオチドが、Ｓ２ｙ配列を結合されたオリゴヌクレオチドに組み込むために提供される（図１６下）。該第二のバーコードオリゴヌクレオチドは、Ｓ２ｙ配列に加え、多段階手順の第一のステップで得られた結合されたオリゴヌクレオチドの３'末端に相補的である３'配列を含む。したがって該第二のバーコードオリゴヌクレオチドは、該第一のバーコードオリゴヌクレオチドの一部と相補的である、または該一部と同一の配列領域を含み得る。該第二のバーコードオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ伸長反応またはライゲーション反応を通して結合されたオリゴヌクレオチドと反応される（ここでは、Ｓ１ｘ配列及びＷ配列の両方を含むように伸長される）。このステップの後、Ｓ１ｘ、Ｗ及びＳ２ｙ配列は全て、固体担体に結合された同じ核酸鎖内に存在する。
【０１６０】
所望なら、同じまたは異なる反応条件を、多段階手順の第一及び第二のステップで用いて、ポリヌクレオチドを固体担体に付着さることができる。例えば同じ酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）または異なる酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼ）を、第一のバーコードオリゴヌクレオチド及び第二のバーコードオリゴヌクレオチドの反応に用いることができるが、同じ酵素の使用が、より簡便になり得る。試薬と固体担体を連続したステップで混合するために、試薬を反応ボリュームに割り当てることができ、反応ボリュームが、所望なら全て、分割、混和されるか、または他の方法で取り扱われ得る。例えば固体担体及び結合されたオリゴヌクレオチドは、多くの反応ボリューム内に分配させることができ、異なる第一のバーコードオリゴヌクレオチドを、各反応ボリュームに添加することができ、それにより異なるＷ配列を同じＳ１ｘ配列に連結させる。その一方で、これらの反応ボリュームのそれぞれは、第二のバーコードオリゴヌクレオチドの添加のために多くの別の反応ボリュームに分割することができ、それにより多くのＳ２ｙ配列が、各Ｗ配列に連結される。幾つかの実施形態において、固体担体が洗浄されて、非結合オリゴヌクレオチドを除去する。幾つかの実施形態において、Ｗ配列を結合されたオリゴヌクレオチドに組み込んだ後に固体担体を加熱して、結合されたオリゴヌクレオチドと第一のバーコードオリゴヌクレオチドとの二重鎖を融解して、結合されたオリゴヌクレオチド及び第二のバーコードオリゴヌクレオチドをアニーリングさせる。
【０１６１】
ユニバーサルプライミング配列、結合部位、ＲＮＡＰプロモーター、またはニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位などのバーコードアダプター分子及び／またはバーコードアダプター鋳型に含まれ得る配列領域は、所望なら、第一のバーコードオリゴヌクレオチドと第二のバーコードオリゴヌクレオチドの間に分配され得る。例えばそのような配列は全て、１つのバーコードオリゴヌクレオチドに含ませることができるが、または一部を１つのバーコードオリゴヌクレオチドに含ませ、一部を他のオリゴヌクレオチドに含ませることができる。幾つかの実施形態において、第一のバーコードオリゴヌクレオチドまたは第二のバーコードオリゴヌクレオチドのいずれかである選択されたバーコードオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルプライミング配列及び結合部位をさらに含む。幾つかの実施形態において、この選択されたバーコードオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡＰプロモーターまたはニッキングエンドヌクレアーゼ制限部位も含む。本発明の方法は、異なる配列領域をバーコードアダプター鋳型に組み込むための多くの選択肢を提供する。これらの鋳型の最適な設計及びそれらを調製するために用いられるオリゴヌクレオチドは、バーコードアダプター分子を酵素的に生成させ、そしてＲＮＡをバーコード化するのに用いられるメカニズムに依存し得る。
【０１６２】
ポリヌクレオチドを固体担体に付着させるための本明細書に記載された方法のいずれかを用いて、試料、細胞、またはＲＮＡをバーコード化する際に使用される１つまたは複数の固体担体を調製することができる。各固体担体に付着されたポリヌクレオチドは、バーコード配列を含み、バーコードアダプター鋳型として働く。本発明の方法は、各固体担体がバーコード配列と関連づけられた該固体担体を複数含むバーコードライブラリーを調製するために用いることもできる。任意の２つの固体担体（例えば、ビーズ）は、全てまたは一部が互いに異なるバーコード配列を有し得る。幾つかの実施形態において、バーコードライブラリー内の各固体担体は、異なるバーコード配列と関連づけられる。
【０１６３】
本発明の方法により調製されたバーコードアダプター鋳型ビーズは、バーコードアダプター鋳型に結合されたビーズを含む。該ビーズは、鋳型分子の複数のコピー、例えば、少なくとも１０、３０、１００、３００、１，０００、３，０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、３００，０００、または１，０００，０００コピーに結合され得る。幾つかの実施形態において、１つのビーズに結合された鋳型分子の各コピーは、同じバーコード配列を含む。鋳型分子が式Ｓ１ｘ−Ｗ−Ｓ２ｙで示されるバーコード配列を有する実施形態において、１つのビーズに結合された鋳型分子の各コピーは、同じＳ１ｘ、Ｗ、及び／またはＳ２ｙ配列を含む。本発明の方法は、複数のバーコードアダプター鋳型ビーズを含むビーズ化バーコードライブラリーの調製も可能にする。ライブラリー内の各ビーズは、異なるバーコード配列と関連づけることができ、各ビーズ上のバーコードアダプター鋳型のコピーは、同じバーコード配列を含み得る。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、本発明の方法を用いて、バーコードアダプター鋳型ビーズ上の１つまたは複数の試料（例えば、細胞）から調製または獲得されたｃＤＮＡを物理的に捕捉することにより、ポリヌクレオチドライブラリーを調製することができる。各ビーズは、３'末端にｃＤＮＡ結合部位を有する鋳型分子を含む。該ビーズは、酵素と接触して結合部位を一本鎖にすることができる（例えば、溶液中で遊離した鋳型分子の末端に３'オーバーハングを残している）。該ビーズは、その後、試料からの１つまたは複数のｃＤＮＡと接触し、それによりｃＤＮＡは該結合部位を通して鋳型分子のコピーに結合する。好ましい実施形態において、該結合部位は、１つまたは複数のＧヌクレオチド、例えばポリ−Ｇトラクトを含み、逆転写酵素によりｃＤＮＡの末端に付加された非鋳型化ポリ−Ｃトラクトに相補的である。
【０１６５】
ポリヌクレオチドライブラリー内のビーズを用いて、所望なら、例えば複数の試料からのｃＤＮＡを配列決定すること、または異なる試料からのｃＤＮＡを分離することができる。後者の場合、異なる試料に対応するビーズを、遠心分離または磁気作用を利用してペレット化し、その後、標準的方法を利用して再懸濁させ、分離することができる。所望なら、ｃＤＮＡをビーズ上の鋳型分子に結合させた後、鋳型分子を酵素的に伸長させ、それによりｃＤＮＡ配列をビーズに結合されたＤＮＡ二重鎖に組み込み、これらの配列をバーコード配列と関連づけることができる。試料からのｃＤＮＡ分子のコピー数が、ビーズ上のバーコードアダプター鋳型のコピー数と同等であれば、これらのｃＤＮＡ分子を少数のビーズ（例えば、試料あたり最大で約１、３、１０、３０、１００、３００または１０００個のビーズ）で捕捉することができる。試料からのＲＮＡを、標準的方法を用いて、または先に議論された通り、逆転写して、ｃＤＮＡを生成させることができる。Ｂ細胞（例えば、形質芽細胞、記憶Ｂ細胞、及び形質細胞）を試料として用いることができ、幾つかの実施形態において、該ｃＤＮＡは、Ｂ細胞由来の可変性免疫グロブリン領域である。
【０１６６】
ＩＩ．組成物
Ａ．ポリヌクレオチド
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、試料同定（バーコード）−アダプター領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、試料同定（バーコード）領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、アダプター領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、ユニバーサルプライマー領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、アンプリコン領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、プレート同定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第一のプレート同定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二のプレート同定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、制限部位領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第一の制限部位領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二の制限部位領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列決定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第一の配列決定領域を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、第二の配列決定領域を含み得る。
【０１６７】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載された複数の任意の領域を含み得る。例えばポリヌクレオチドは、第一の試料同定（バーコード）領域及び第二の試料同定（バーコード）領域を含み得る。幾つかの態様において、該第一の試料同定（バーコード）領域及び第二の試料同定（バーコード）領域は、同一または実質的に同一である。幾つかの態様において、該第一の試料同定（バーコード）領域及び第二の試料同定（バーコード）領域は、区別可能である。幾つかの態様において、同定（バーコード）領域は、可変免疫グロブリン領域に連結されている。
【０１６８】
幾つかの態様において、領域の配列は、少なくとも、ＰＣＲ反応におけるプライマーまたはプローブのための標的配列として働くのに十分長いであろう。幾つかの態様において、領域は、１〜５０００を超える塩基対の長さであり得る。例えば領域は、内部の全てのサブレンジを含む１〜１０，０００ヌクレオチド長、例えば２〜３０ヌクレオチド長であり得る。非限定的例として、領域は、１〜３０ヌクレオチド、１〜２６ヌクレオチド、１〜２３ヌクレオチド、１〜２２ヌクレオチド、１〜２１ヌクレオチド、１〜２０ヌクレオチド、１〜１９ヌクレオチド、１〜１８ヌクレオチド、１〜１７ヌクレオチド、１８〜３０ヌクレオチド、１８〜２６ヌクレオチド、１８〜２３ヌクレオチド、１８〜２２ヌクレオチド、１８〜２１ヌクレオチド、１８〜２０ヌクレオチド、１９〜３０ヌクレオチド、１９〜２６ヌクレオチド、１９〜２３ヌクレオチド、１９〜２２ヌクレオチド、１９〜２１ヌクレオチド、１９〜２０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチド、２０〜２６ヌクレオチド、２０〜２５ヌクレオチド、２０〜２４ヌクレオチド、２０〜２３ヌクレオチド、２０〜２２ヌクレオチド、２０〜２１ヌクレオチド、２１〜３０ヌクレオチド、２１〜２６ヌクレオチド、２１〜２５ヌクレオチド２１〜２４ヌクレオチド、２１〜２３ヌクレオチド、または２１〜２２ヌクレオチドであり得る。幾つかの態様において、領域は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。幾つかの態様において、領域は、５０未満、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、４００〜５００、５００〜６００、６００〜７００、７００〜８００、８００〜９００、９００〜１０００または１０００を超えるヌクレオチド長であり得る。幾つかの態様において、領域は、１０００未満、１０００〜２０００、２０００〜３０００、３０００〜４０００、４０００〜５０００、５０００〜６０００、６０００〜７０００、７０００〜８０００、８０００〜９０００、９０００〜１００００、または１００００を超えるヌクレオチド長であり得る。幾つかの態様において、領域は、少なくとも２ヌクレオチド長、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０またはそれを超えるヌクレオチドの、本明細書に開示されたポリヌクレオチドを含み得る。
【０１６９】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、単一試料に由来され得る、または関連づけられ得る。幾つかの態様において、領域は、単一試料に由来され得る、または関連づけられ得る。幾つかの態様において、ｃＤＮＡ領域は、単一試料に由来され得る、または関連づけられ得る。幾つかの態様において、アンプリコン領域は、単一試料に由来され得る、または関連づけられ得る。「単一試料」は、単一供給源から採取されたポリヌクレオチドを含む試料を包含する。幾つかの態様において、単一供給源は、特定の時点または特定の場所で、例えば対象または細胞フラスコまたは細胞プレートにおいて、採取された試料を包含する。幾つかの態様において、第一の単一試料は、第一の時点で第一の対象から採取され、第二の単一試料は、第一の時点と判別可能な第二の時点で第一の対象から採取される。幾つかの態様において、第一の単一試料は、第一の場所で第一の対象から採取され、第二の単一試料は、第一の場所と判別可能な第二の場所で第一の対象から採取される。幾つかの態様において、第一の単一試料は、ある時点で第一の対象から採取され、第二の単一試料は、ある時点で第二の対象から採取される。幾つかの態様において、第一の単一試料は、ある場所で第一の対象から採取され、第二の単一試料は、ある場所で第二の対象から採取される。一実施形態において、試料は、１つまたは複数のＢ細胞に由来するｍＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、試料は、１つまたは複数のＢ細胞に由来するｃＤＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。別の実施形態において、単一試料は、９６ウェルまたは３８４ウェルプレートの１つのウェルに選別された１つまたは複数のＢ細胞に由来するｍＲＮＡを含む。試料は、原核細胞（例えば、細菌細胞）、真核細胞（例えば、哺乳類及び酵母細胞）、またはウイルスもしくはファージなどの他の遺伝子材料供給源に遺伝子的に由来する。本明細書で用いられる用語「哺乳類」または「哺乳類の」は、ヒト及び非ヒトの両方を含み、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、及びブタが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの態様において、本発明の方法は、少なくとも９６ウェル、少なくとも３８４ウェル、少なくとも１５３６ウェル、またはより多くのウェルを有するプレート内の単一試料に適用される。さらなる態様において、本発明の方法は、それぞれが少なくとも９６ウェルを有するプレートの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、３０、またはそれを超える数のプレート内の単一細胞に適用される。
【０１７０】
幾つかの態様において、５'アダプター領域配列及び／または試料同定領域は、例えばＲＴの際に、単一試料からのｃＤＮＡの全てに付加され、Ｉｇ遺伝子には付加されない。幾つかの態様において、３'遺伝子特異性プライマー（ＧＳＰ）を用いて、単一試料中の任意の発現遺伝子を増幅させることができる。幾つかの態様において、５'可変領域、例えばＴ細胞受容体及びＢ細胞受容体を有する遺伝子が増幅され、関心対象の遺伝子を増幅するのに複数の縮重５'プライマーを必要としない。ＧＳＰは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＴＣＲ鎖、及び関心対象の他の遺伝子に特異性のあるプライマーを含み得る。
【０１７１】
幾つかの態様において、例えばネステッドＧＳＰを用いて、複数回のＰＣＲを実施することもできる。そのようなネステッドＧＳＰの場合、２回目のＰＣＲのためのＧＳＰが、１回目のＰＣＲで用いられたＧＳＰによりハイブリダイズされた位置に対し、配列に沿って５'位の標的遺伝子配列にハイブリダイズする。
【０１７２】
幾つかの態様において、ｃＤＮＡ領域またはアンプリコン領域は、ＤＮＡポリヌクレオチドを含み得る。幾つかの態様において、ｃＤＮＡ領域またはアンプリコン領域は、ｃＤＮＡポリヌクレオチドを含み得る。幾つかの態様において、ｃＤＮＡ領域またはアンプリコン領域は、ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされたＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。幾つかの態様において、ｃＤＮＡ領域またはアンプリコン領域は、ｃＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされたｍＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。
【０１７３】
幾つかの態様において、ユニバーサルプライマー領域は、任意のヒトエクソンに完全に相補的であるわけではない。幾つかの態様において、ユニバーサルプライマー領域は、任意の発現されたヒト遺伝子に完全に相補的であるわけではない。幾つかの態様において、ユニバーサルプライマー領域は、最小の二次構造を有する。
【０１７４】
幾つかの態様において、アンプリコン領域は、免疫グロブリン重鎖アンプリコン配列域を含む。幾つかの態様において、アンプリコン領域は、免疫グロブリン軽鎖アンプリコン配列を含む。幾つかの態様において、アンプリコン領域は、Ｔ細胞受容体αアンプリコン配列を含む。幾つかの態様において、アンプリコン領域は、Ｔ細胞受容体βアンプリコン配列を含む。
【０１７５】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライブラリー内に存在し、ポリヌクレオチドの領域に基づくライブラリー内に存在する他のポリヌクレオチドと識別され得る。
【０１７６】
幾つかの態様において、第一の単一試料に由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の試料に由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と区別可能である。幾つかの態様において、第一の単一試料に由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の試料に由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と少なくとも１ヌクレオチド異なる。幾つかの態様において、第一の単一試料に由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の試料に由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはより多くのヌクレオチドが異なる。幾つかの態様において、第一の単一試料に由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の試料に由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、または１００％未満が同一であり得る。幾つかの態様において、第一の単一試料に由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの試料同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の試料に由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの試料同定領域の配列と１００％未満が同一である。幾つかの態様において、試料同定領域は、単一試料から逆転写された全ての第一鎖ｃＤＮＡ上でデジタルバーコードとして働く。幾つかの態様において、該試料同定領域は、少なくとも１ヌクレオチド長である。幾つかの態様において、試料同定領域は、少なくとも３ヌクレオチドであり、試料同定領域は、互いに少なくとも１ヌクレオチド異なり得る。幾つかの態様において、試料同定領域は、３〜１５ヌクレオチド長であり、互いに少なくとも１ヌクレオチド異なり得る。幾つかの態様において、試料同定領域は、少なくとも６４の変異体を（３ヌクレオチド長で、各試料ＩＤが互いに少なくとも１ヌクレオチド異なる試料同定領域を用いる）、または幾つかの態様においてより多くの変異体を含み得る。幾つかの態様において、試料同定領域に対して３'に付着された配列は、少なくとも１つのＧを含むアダプター領域であり得る。好ましい実施形態において��試料同定領域に対して３'に付着された配列は、少なくとも２つのＧ'ｓを含むアダプター領域であり得る。一実施形態において、試料同定領域の５'末端に付着された配列は、次の５'ユニバーサルプライマー配列（ライゲーションまたは別の方法による）の付加で、または可変５'領域での遺伝子増幅のための複数の縮重５'プライマーの使用で必要とならないように、ＰＣＲ増幅の際に用いられ得るユニバーサルプライマー配列である。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と区別可能である。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と少なくとも１ヌクレオチド異なる。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはより多くのヌクレオチドが異なる。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、または１００％未満が同一であり得る。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第一のプレート同定領域の配列と１００％未満が同一である。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セット��由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と区別可能である。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と少なくとも１ヌクレオチド異なる。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料と判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはより多くのヌクレオチドが異なる。幾つかの態様において、第二のプレート同定領域の配列は、ポリヌクレオチド上の第一のプレート同定領域の配列と同一である。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、または１００％未満が同一であり得る。幾つかの態様において、第一の単一試料セットに由来するライブラリー内の各ポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列は、第一の単一試料セットと判別可能な１つまたは複数の単一試料セットに由来するライブラリー内の他のポリヌクレオチドの第二のプレート同定領域の配列と１００％未満が同一である。幾つかの態様において、プレート同定領域（例えば、第一のプレート同定領域または第二のプレート同定領域）は、少なくとも２ヌクレオチド含むことができ、プレート同定領域は、互いに少なくとも１ヌクレオチド異なる。一実施形態において、 プレート同定領域は、２〜１０ヌクレオチド長であり、互いに少なくとも１ヌクレオチド異なる。幾つかの態様において、異なる試料同定領域をより多く使用すれば（分析される単一試料あたり１つ）、プレート同定領域の必要性が排除され得るため、プレート同定領域の使用が、幾つかの実施形態のみで見出される。幾つかの態様において、プレート同定領域を使用して、合成される必要がある試料同定領域を含む固有オリゴヌクレオチドの数を減少させる。
【０１７７】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数のアダプター領域を含む。幾つかの態様において、アダプター領域は、１つまたは複数のＧ'ｓを含む。幾つかの態様において、アダプター領域は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多いＧ'ｓを含む。幾つかの態様において、アダプター領域は、ＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素の鋳型スイッチング特性を利用してｃＤＮＡの３'末端に付着される。非限定的に、５'隣接アダプター領域の配列を有するプライマーを用いたＰＣＲの実施、粘着末端及び平滑末端のライゲーション、鋳型スイッチングを介したヌクレオチド付加、またはヌクレオチドをポリヌクレオチドの５'末端へ、３'末端へ、もしくは５'及び３'末端へ共有結合で付着させる別の方法など、アダプター領域を付着させるための異なる方法が存在する。これらの方法は、分子生物学で一般に使用される酵素の特性を利用し得る。ＰＣＲは、例えば高熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用し得る。相補的である、または実質的に相補的である粘着末端は、オーバーハングした末端を残す制限酵素でのｄｓＤＮＡ切断、またはＴｄＴ（ターミナルトランスフェラーゼ）などの酵素の３'テーリング活性、のいずれかを通して生成される。その後、粘着末端及び平滑末端は、Ｔ４リガーゼなどのリガーゼを利用して相補的であるアダプター領域と共にライゲートされ得る。鋳型スイッチングは、１つまたは複数のシトシン（Ｃ'ｓ）をｃＤＮＡの３'末端に付加するＭＭＬＶ  Ｈ−逆転写酵素の３'テーリング活性と、ｍＲＮＡからの鋳型を、相補性Ｇ'ｓを有するアダプター領域に切り替える能力と、を利用する。幾つかの態様において、ｃＤＮＡは、３'末端に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはより多くのＣ'ｓを含む。
【０１７８】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制限部位領域を含む。制限部位領域は、１つまたは複数の制限部位を含む。制限部位としては、ＮｈｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｂｖＣＩ、ＰｓｐＸＩ、ＡｇｅＩ、ＡｐａＩ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＸｍａＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＰａｃＩ、ＦｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、及びＡｓｃＩを挙げることができる。幾つかの態様において、任意の８塩基認識レアカッター酵素制限部位を用いることができる。
【０１７９】
幾つかの態様において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域は、該ポリヌクレオチドの１つまたは複数の他の領域に動作可能に連結され得る。幾つかの態様において、単一ポリヌクレオチドの２つ以上の判別可能な領域は、動作可能に連結され得る。例えばユニバーサルプライマー領域は、アダプター領域に動作可能に連結され得る。幾つかの態様において、配列が互いに実質的に同一である、または種類（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）が同一である２つ以上の領域が、一緒に動作可能に連結され得る。例えば第一の試料同定領域は、第二の試料同定領域に動作可能に連結され得る。幾つかの態様において、第一の試料同定領域の配列と第二の試料同定領域の配列は、同一であるか、または実質的に同一である。幾つかの態様において、第一の試料同定領域の配列と第二の試料同定領域の配列は、異なるか、または区別可能である。
【０１８０】
幾つかの態様において、本明細書に記載されたポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域は、該ポリヌクレオチドの１つまたは複数の領域に連結され得る。幾つかの態様において、単一ポリヌクレオチドの２つ以上の判別可能な領域が、連結され得る。例えば、ユニバーサルプライマー領域は、アダプター領域に連結され得る。幾つかの態様において、配列が互いに実質的に同一である、または種類が同一である２つ以上の領域が、一緒に連結され得る。例えば第一の試料同定領域は、第二の試料同定領域に連結され得る。幾つかの態様において、第一の試料同定領域の配列と第二の試料同定領域の配列は、同一であるか、または実質的に同一である。幾つかの態様において、第一の試料同定領域の配列と第二の試料同定領域の配列は、異なるか、または区別可能である。
【０１８１】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列５'−Ａ−Ｂ−３'（ここで、Ａは、試料同定領域であり、Ｂは、アダプター領域である）を含む。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−３'（ここで、Ａは、ユニバーサルプライマー領域であり、Ｂは、試料同定領域であり、Ｃは、アダプター領域である）を含む。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−３'（ここで、Ａは、試料同定領域であり、Ｂは、アダプター領域であり、Ｃは、単一試料由来のアンプリコン領域である）を含む。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−３'（ここで、Ａは、ユニバーサルプライマー領域であり、Ｂは、試料同定領域であり、Ｃは、アダプター領域であり、Ｄは、単一試料由来のアンプリコン領域である）を含む。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−３'（ここで、Ａは、プレート同定領域であり、Ｂは、ユニバーサルプライマー領域であり、Ｃは、試料同定領域であり、Ｄは、アダプター領域であり、Ｅは、単一試料由来のアンプリコン領域である）を含む。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、配列５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−３'（ここで、Ａは、第一の制限部位領域であり、Ｂは、ユニバーサルプライマー領域であり、Ｃは、試料同定領域であり、Ｄは、アダプター領域であり、Ｅは、単一試料由来のアンプリコン領域であり、Ｆは、第二の制限部位領域である）を含む。
【０１８２】
幾つかの態様において、先の配列それぞれの領域は、異なる順序、例えば５'−Ｃ−Ａ−Ｄ−Ｂ−３'または５'−Ｅ−Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｄ−Ｆ−３'または５'−Ｂ−Ａ−３'で再構成され得る。幾つかの態様において、先の配列の１つまたは複数の領域は、欠失され、例えば５'−Ａ−Ｄ−３'または５'−Ｂ−Ｃ−３'になり得る。幾つかの態様において、１つまたは複数のさらなる領域は、先の配列に付加され、例えば５'−Ａ−Ａ２−Ｂ−３'または５'−Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−３'になり得る。そのような例において、１つまたは複数のさらなる領域は、本明細書に開示された任意の領域またはその均等物であり得る。幾つかの態様において、先の配列の１つまたは複数の領域は、修飾することができ、例えばメチル化することができる。
【０１８３】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドは、アダプター分子を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドアダプター分子は、ユニバーサルプライマー領域、試料同定領域、及びアダプター領域を含むことができ、該ユニバーサルプライマー領域の３'末端は、試料同定領域の５'末端に連結され、試料同定領域の３'末端は、アダプター領域の５'末端に連結される。幾つかの態様において、アダプター分子が、第一鎖ｃＤＮＡの３'末端で逆転写酵素により付加されたＣ'ｓに結合する少なくとも２つのヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、アダプター分子は、３〜６個のＧ'ｓを含むデオキシリボースポリヌクレオチド（ＤＮＡ  Ｇ'ｓ）を含む。別の実施形態において、アダプター分子は、３〜６個のＧ'ｓからなるリボースポリヌクレオチド（ＲＮＡ  Ｇ'ｓ）を含む。別の実施形態において、アダプター分子は、ヌクレオチド類似体、そのようなロックされた核酸（ＬＮＡ）、例えばＬＮＡ  Ｇ'ｓを利用し得る。他の実施形態において、該ヌクレオチド塩基は、Ｃ'ｓ及び他のヌクレオチドに任意の組み合わせで塩基対形成し得る５−ニトロインドール及び３−ニトロピロールなどのユニバーサルまたは縮重塩基でもあり得る。
【０１８４】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドが、プライマーまたはプローブを含み得る。幾つかの態様において、プライマーは、ユニバーサルプライマー領域及びプレート同定領域を含むことができるが、プレート同定領域の３'末端は、ユニバーサルプライマー領域の５'末端に連結される。
【０１８５】
幾つかの態様において、組成物が、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーを含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチド組成物ライブラリーは、複数のポリヌクレオチド組成物を含む。幾つかの態様において、各組成物は、別個の容器に存在する。幾つかの態様において、容器は、試験管であり得る。幾つかの態様において、容器は、プレート内のウェルであり得る。幾つかの態様において、容器は、９６ウェルプレートであり得る。幾つかの態様において、容器は、３８４ウェルプレート内のウェルであり得る。幾つかの態様において、各組成物は、単一試料に由来するｃＤＮＡ領域を含む。幾つかの態様において、各組成物は、アダプター領域に連結された試料同定領域を含む試料同定アダプター領域を含む。幾つかの態様において、ライブラリー内の各試料同定アダプター領域の試料同定領域の配列は、ライブラリー内の各別個の容器に存在する他の試料同定アダプター領域の試料同定領域のヌクレオチド配列と区別可能である。幾つかの態様において、該試料同定アダプター領域は、ｃＤＮＡ領域に付着される。幾つかの態様において、該試料同定アダプター領域は、３'領域の間の結合によりｃＤＮＡ領域に付着される。幾つかの態様において、該試料同定アダプター領域は、Ｇ：Ｃ結合によりｃＤＮＡ領域に付着されている。幾つかの態様において、該ｃＤＮＡ領域は、ＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされたＲＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、該ｃＤＮＡ領域は、ｃＤＮＡポリヌクレオチドにハイブリダイズされたｍＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
【０１８６】
幾つかの態様において、ポリヌクレオチドライブラリー内の複数のポリヌクレオチド組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１０００、少なくとも３０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも３，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも３０，０００，０００、またはそれを超える構成要素を含み得る。幾つかの態様において、ポリヌクレオチドライブラリー内の複数のポリヌクレオチド組成物は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１０００、少なくとも３０００、少なくとも１０，０００、少なくとも３０，０００、またはそれを超える、細胞試料の全トランスクリプトームの遺伝子を含み得る。別の態様において、ポリヌクレオチドライブラリー内の複数のポリヌクレオチド組成物は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも３０、少なくとも１００、少なくとも３００、少なくとも１０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも１，０００，０００，０００またはそれを超える、個体の血液中に存在する異なる抗体種を含む。これらの抗体種は、形質芽細胞、形質細胞、記憶Ｂ細胞、長期生存形質細胞、ナイーブＢ細胞、他のＢ系列細胞、またはそれらの組み合わせにより発現され得る。
【０１８７】
Ｂ．ベクター
幾つかの態様において、組成物は、ベクターを含み得る。用語「ベクター」は、複製され得る細胞の中に核酸配列を導入するために挿入され得る担体核酸分子を指すために用いられる。ベクターは、核酸配列での宿主細胞の形質転換において用いることができる。幾つかの態様において、ベクターは、本明細書に記載された１つまたは複数のポリヌクレオチドを含み得る。一実施形態において、標的ポリヌクレオチドをコードする核酸配列のライブラリーが、細胞集団に導入され、それによりライブラリーをスクリーニングすることができる。核酸配列は、「外在性」または「異種性」であってもよく、つまりそれがベクターを導入している細胞にとって外来性であること、または配列が細胞内の配列と相同性があるが該配列が通常見出されない宿主細胞核酸内の位置にある。ベクターとしては、プラスミド、コスミド及びウイルス（例えば、バクテリオファージ）が挙げられる。当業者は、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４（両者とも参照により本明細書に取り込まれる）に記載された標準的な組換え技術を通してベクターを構築し得る。幾つかの態様において、ベクターは、予め操作された抗体の定常領域を有するベクターであり得る。この方法において、当業者は、関心対象の抗体のＶＤＪ領域そのものをクローニングすることができ、予め操作されたベクター内にそれらの領域をクローニングすることができる。
【０１８８】
用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含むベクターを指す。一部の例において、ＲＮＡ分子は、その後、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド内に翻訳される。発現ベクターは、様々な「制御配列」を含み得るが、制御配列は、特定の宿主生物体内で動作可能に連結されたコード配列の転写のため、そしてことによると翻訳のための核酸配列を指す。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、同じく他の機能もつかさどる核酸配列を含み得る。
【０１８９】
幾つかの態様において、ベクターは、プロモーターを含み得る。幾つかの態様において、ベクターは、エンハンサーを含み得る。「プロモーター」は、転写の開始及び速度を制御する核酸配列の領域である制御配列である。それは、ＲＮＡ分子は、ポリメラーゼ及び他の転写因子などの調節タンパク質及び分子が結合し得る遺伝要素を含み得る。語句「動作可能に配置された」、「動作可能につなげられた」、「制御の下」、及び「転写制御の下」は、プロモーターが核酸配列の転写開始及び／または発現を制御するためにそれらの配列に関して正しい機能的位置及び／または配位であることを意味する。プロモーターは、「エンハンサー」と協調的に使用される場合、または使用されない場合があり、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性調節配列を指す。
【０１９０】
プロモーターは、コードセグメント及び／またはエクソンの上流に位置する５'非コード配列を単離することにより得ることができるため、自然に遺伝子または配列と関連づけられるものであり得る。そのようなプロモーターは、「内在性」と言うことができる。同様にエンハンサーは、自然に核酸配列と関連づけられ、その配列の下流または上流のいずれかに位置するものであり得る。あるいは特定の利点が、組換えまたは異種プロモーターの制御の下でコード核酸セグメントを配置することにより得られるが、ここで組換えまたは異種プロモーターは、通常は自然環境にある核酸配列と関連づけられないプロモーターを指す。組換えまたは異種エンハンサーもまた、通常は自然環境の核酸配列と関連づけられないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、ならびに「天然由来でない」、即ち異なる転写調節領域の異なる要素及び／または発現を改変する突然変異を含む、プロモーターまたはエンハンサーを含み得る。配列は、プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を生成させることに加え、本明細書に開示された組成物に関係して、ＰＣＲなどの組換えクローニング及び／または核酸増幅技術を用いて生成させることができる（それぞれ参照により本明細書に取り込まれる米国特許第４，６８３，２０２、米国特許第５，９２８，９０６を参照されたい）。
【０１９１】
幾つかの態様において、発現のために選択された細胞型におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指揮するプロモーター及び／またはエンハンサー。用いられ得るそのようなプロモーターの一例が、大腸菌アラビノースまたはＴ７プロモーターである。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの利用について熟知しているであろう。例えば、参照により本明細書に組み入れられるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）を参照されたい。用いられるプロモーターは、組換えタンパク質及び／またはペプチドの大規模生産において有利であるなど、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指揮するのに適した条件下で、構成的、組織特異性、誘導性、及び／または有用であり得る。該プロモーターは、異種性でも、または内在性でもあり得る。
【０１９２】
幾つかの態様において、ベクターは、開始シグナル及び／または内部リボソーム結合部位を含み得る。特異的開始シグナルはまた、コード配列の効率的翻訳のために含まれ得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接の配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外在性翻訳制御シグナルが、提供される必要がない場合がある。当業者は、即座に、これを決定して必要なシグナルを提供することが可能であろう。開始コドンを、所望のコード配列のリーディングフレームと共に「インフレーム」にして、挿入部全体の翻訳を確実にしなければならないことは周知である。外在性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然でも、または合成でもあり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素を含めることにより増強され得る。
【０１９３】
幾つかの態様において、ベクターは、関心対象の遺伝子をコードするＤＮＡセグメントの発現レベルを増加または最適化する配列を含み得る。そのような配列の例としては、発現されたｍＲＮＡ内のイントロン付加が挙げられる（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  Ｒ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）  Ｉｎｔｒｏｎｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５，  ８３６−４０；  Ｃｈｏｉ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｉｎｔｒｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １１，  ３０７０−４）。ＤＮＡセグメントの発現を最適化する方法の別の例が、「コドン最適化」である。コドン最適化は、ＤＮＡセグメント内にサイレント突然変異を挿入して、タンパク質翻訳を最適化するためのレアコドンの使用を減少させることを含む(Ｃｏｄｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｒｔｏｎ  ＪＭ，  Ｓａｕｅｒｗａｌｄ  Ｔ，  Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ  Ｐ，  Ｍｏｒｓｅ  Ｂ，  Ｐｅｆｆｅｒ  Ｎ，  Ｂｅｃｋ  Ｈ，  Ｌｕ  Ｊ，  Ｃｏｔｔｙ  Ａ，  Ａｍｅｇａｄｚｉｅ  Ｂ，  Ｓｗｅｅｔ  Ｒ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．  ２００７  Ｏｃｔ；５５（２）：２７９−８６．  Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｊｕｎ  １６．）
【０１９４】
幾つかの態様において、ベクターは、多重クローニング部位を含み得る。ベクターは、多重制限酵素部位を含む核酸領域である多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含むことができ、該多重制限酵素部位のいずれも、ベクターを消化する標準的組換え技術と併せて使用され得る（参照により本明細書に取り込まれるＣａｒｂｏｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９、Ｌｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８及びＣｏｃｅａ，  １９９７を参照されたい）。「制限酵素消化」は、核酸分子内の特異的位置のみで機能する酵素による核酸分子の触媒的切断を指す。これらの制限酵素の多くは、市販されている。そのような酵素の使用は、当業者に理解される。多くの場合、ベクターは、ＭＣＳ内で切断する制限酵素を用いて直線化または断片化されて、外在性配列をベクターにライゲートさせることができる。「ライゲーション」は、互いに隣接し得る、または隣接し得ない２つの核酸断片の間のホスホジエステル結合を形成する工程を指す。制限酵素及びライゲーション反応を含む技術は、組換え技術の当業者に周知である。
【０１９５】
幾つかの態様において、ベクターは、終結シグナルを含み得る。該ベクターまたは構築物は、一般に少なくとも１つの終結シグナルを含むであろう。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写産物の特異的終結に関与するＤＮＡ配列で構成される。したがって特定の実施形態において、ＲＮＡ転写産物の生成を終了させる終結シグナルが、企図される。ターミネーターは、インビボで所望のメッセージレベルを実現するのに必要になり得る。
【０１９６】
使用が企図されるターミネーターとしては、非限定的に例えばｒｈｏ依存性またはｒｈｏ非依存性ターミネーターをはじめとする、本明細書に記載された、または当業者に知られる転写の任意の公知ターミネーターが挙げられる。特定の実施形態において、終結シグナルは、配列トランケーションなどが原因で、転写可能または翻訳可能な配列を欠如し得る。
【０１９７】
幾つかの態様において、ベクターは、複製起点を含み得る
【０１９８】
ベクターを宿主細胞内で増殖させるために、それは、複製が開始される特異的核酸配列である１つまたは複数の複製起点部位（多くの場合「ｏｒｉ」と称される）を含み得る。
【０１９９】
幾つかの態様において、ベクターは、１つまたは複数の選択マーカー及び／またはスクリーニング可能なマーカー（ｓｃｒｅｅｎａｂｌｅ  ｍａｒｋｅｒｓ）を含み得る。特定の実施形態において、核酸構築物を含む細胞が、発現ベクター内にマーカーを含むことによりインビトロまたはインビボで同定され得る。そのようなマーカーは、同定可能な変化を細胞に付与して、発現ベクターを含む細胞の容易な同定を可能にする。一般に選択マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。正の選択マーカーは、マーカーの存在が選択を可能にするものであり、負の選択マーカーは、その存在が選択を妨害するものである。正の選択マーカーの例は、薬物耐性マーカーである。
【０２００】
通常、形質転換体、例えばネオマイシン、プロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、及びヒスチジノールに耐性を付与する遺伝子のクローニング及び同定において薬物選択マーカー助剤を含めたものは、有用な選択マーカーになる。実施条件に基づいて形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、基本原理が比色分析である、ＧＦＰなどの選択マーカーを含む別のタイプのマーカーもまた企図される。あるいは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのスクリーニング可能な酵素を、使用することもできる。当業者は、免疫マーカーを、ことによるとＦＡＣＳ分析と併せて、使用する方法も知っているであろう。用いられるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現され得る限りは、重要でないと考えられる。さらに、選択マーカー及びスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０２０１】
一態様において、ベクターは、関心対象の複数のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントを発現することができる。例えば免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の両方をコードするＤＮＡセグメントを、単一ベクターによりコード及び発現することができる。一態様において、両方のＤＮＡセグメントを、別個のポリヌクレオチドとしてＤＮＡセグメントを発現させるために用いられる同じ発現ＲＮＡ及び内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）配列上に含ませることができる（Ｐｉｎｋｓｔａｆｆ  ＪＫ，  Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ＳＡ，  Ｍａｕｒｏ  ＶＰ，  Ｅｄｅｌｍａｎ  ＧＭ，  Ｋｒｕｓｈｅｌ  ＬＡ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｖｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍＲＮＡｓ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２００１  Ｆｅｂ  ２７；９８（５）：２７７０−５．  Ｅｐｕｂ  ２００１  Ｆｅｂ  ２０．）。別の態様において、各ＤＮＡセグメントは、それ自体のプロモーター領域を有し、別個のｍＲＮＡの発現をもたらす（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＣＲ，  Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＬＳ，  Ｂａｅｒ  Ａ，  Ｔｏｌｓｔｒｕｐ  ＡＢ，  Ｗｅｉｌｇｕｎｙ  Ｄ．    Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｏｎｅ  ＣＭＶ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｔｗｏ  Ｃｏｒｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．    Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１０  Ｎｏｖ  ２７．［Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ］）。
【０２０２】
Ｃ．宿主細胞及び発現系
一部の態様において、組成物は、宿主細胞を含有してもよい。一部の態様において、宿主細胞は、本明細書に記述されるポリヌクレオチドまたはベクターを含有してもよい。一部の態様において、宿主細胞は、真核細胞（たとえば昆虫、酵母、または哺乳類）または原核細胞（たとえば細菌）を含有してもよい。異種核酸配列の発現に関連して、「宿主細胞」とは、原核細胞を指し、ならびにベクターを複製することができ、及び／またはベクターによりコードされた異種遺伝子を発現することができる、形質転換可能な任意の生物体を含有する。宿主細胞は、ベクターのレシピエントとして用いることができ、及びベクターのレシピエントとして用いられている。宿主細胞は、「トランスフェクト」されていてもよく、または「形質転換」されていてもよく、それらは、外来性核酸が当該宿主細胞に移送または導入されるプロセスを指す。形質転換された細胞は、初代の対象細胞及びその子孫細胞を含有する。
【０２０３】
特定の実施形態において、宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞である。これら細菌は、内膜と外膜の間に細胞周辺腔を保有しているという点、特にペリプラズムと細胞質の間の前述の内膜（細胞膜としても知られる）を保有しているという点で、使用に適している。ゆえに、そのような細胞周辺腔を有する任意の他の細胞を使用してもよい。グラム陰性細菌の例としては、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、ヘモフィルスインフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｏｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉ）、エルウィニア‐アミロボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）、根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）が挙げられる。グラム陰性細菌はさらに、選択されたリガンドと結合することができる結合ポリペプチドの候補を含有する融合ポリペプチドのコード配列を用いて形質転換された細菌細胞として定義されてもよい。当該ポリペプチドは、細胞周辺腔に面した、細胞膜の外面に固定され、及び抗体コード配列または他の配列を含有してもよい。当該ポリペプチドを発現する１つの手段は、そのような指示を行うことができるポリペプチドにリーダー配列を付加することである。
【０２０４】
多くの原核細胞株及び培養物が、宿主細胞として使用が可能であり、それらは、生物培養物及び遺伝物質の保管所として機能する組織である、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）を通じて入手することができる。適切な宿主は、ベクターの背景事情、及び所望される結果を考慮し、当業者により決定することができる。たとえば、プラスミドまたはコスミドを、多くのベクターの複製を目的とした原核宿主細胞に導入してもよい。ベクター複製及び／または発現のための宿主細胞として用いられる細菌としては、ＤＨ５−α、ＪＭ１０９、及びＫＣ８、ならびに多くの市販の細菌性宿主（たとえば、ＳＵＲＥ（商標）コンピテント細胞及びＳＯＬＯＰＡＣＫ（商標）Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌｓ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ（商標）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）が挙げられる。一部の態様において、他の細菌細胞（たとえば大腸菌ＬＥ３９２）の宿主細胞としての使用が予期される。
【０２０５】
様々な細胞型及び生物由来の多くの宿主細胞が利用可能であり、当分野の当業者に公知である。同様に、特にベクターの複製または発現に許容的な原核宿主細胞と合わせてウイルスベクターを使用してもよい。一部のベクターでは、原核細胞及び真核細胞の両方で複製及び／または発現を行うことができる対照配列を用いてもよい。当業者であれば、上述の宿主細胞のすべてが維持され、ベクターの複製が可能となるインキュベートの条件を理解するであろう。また、ベクターの大量生産、ならびにベクターによりコードされた核酸、及びその関連したポリペプチド、タンパク質またはペプチドの生産が可能となる技術及び条件が理解され、公知である。
【０２０６】
一部の態様において、宿主細胞は、哺乳類である。例としては、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、またはＣＨＯ−Ｓ細胞が挙げられる。他の哺乳類宿主細胞としては、ＮＳ０細胞及びＣＨＯ細胞（ｄｈｆｒ−である、たとえば、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−、ＤＵＫＸ−Ｂ１１  ＣＨＯ細胞、及びＤＧ４４  ＣＨＯ細胞がある）が挙げられる。
【０２０７】
本明細書に開示される組成物の少なくとも一部またはすべてを含有することができる多くの発現系が存在している。発現系は、真核細胞発現系及び原核細胞発現系を含有してもよい。そのような系は、たとえば、特定のリガンドに結合することができるとして特定されるポリペプチド産物の産生を目的として用いられてもよい。原核細胞をベースとした系は、核酸配列、またはその関連ポリペプチド、タンパク質及びペプチドを産生するために用いられてもよい。多くのそのような系が市販されており、広く利用可能である。発現系の他の例は、たとえばＴ７、Ｔａｃ、Ｔｒｃ、ＢＡＤ、ｌａｍｂｄａ  ｐＬ、テトラサイクリンまたはＬａｃプロモーター等の強力な原核細胞プロモーターを含有するベクターを含有する（ｐＥＴ発現系及び大腸菌発現系）。
【０２０８】
Ｄ．ポリペプチド
一部の態様において、組成物は、ポリペプチドを含有してもよい。一部の態様において、本明細書に開示されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、たとえば宿主細胞から発現されてもよい。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、天然型タンパク質、すなわち、天然型であり、組み換えがされていない細胞により産生されるタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を含有し；または遺伝的に改変された、もしくは組み換えされた細胞により産生され、天然型タンパク質のアミノ酸配列を有する分子を含有し、または天然型配列のアミノ酸の１つ以上の欠失、付加、及び／または置換を有する分子を含有する。当該用語はまた、１以上のアミノ酸が、対応する天然型アミノ酸及びポリマーの化学的アナログであるアミノ酸ポリマーを含有する。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質、抗体、または抗原結合タンパク質のアミノ酸の１つ以上の欠失、付加、及び／または置換を有する配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、天然型の全長タンパク質と比較して、アミノ末端の欠失、カルボキシ末端の欠失、及び／または内部分の欠失を有するポリペプチドを指す。また、そのような断片は天然型タンパク質と比較し、改変されたアミノ酸を含有してもよい。ある実施形態において、断片は、約５〜５００アミノ酸の長さである。たとえば、断片は、少なくとも５、６、８、１０、１４、２０、５０、７０、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、または４５０アミノ酸の長さであってもよい。有用なポリペプチド断片としては、結合ドメインを含有する、抗体の免疫学的に機能的な断片が挙げられる。結合抗体の場合、有用な断片としては、限定されないが、ＣＤＲ領域、重鎖及び／もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部、または２つのＣＤＲを含有するその可変領域等が挙げられる。
【０２０９】
「単離タンパク質」という用語は、（１）通常、存在しているときに共にある他のタンパク質の少なくとも一部の他のタンパク質が無い対象タンパク質、（２）たとえば同種由来等の、同じ源由来のタンパク質が実質的に無い対象タンパク質、（３）異種由来の細胞により発現された対象タンパク質、（４）自然の状態で関連性があるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離されている対象タンパク質、（５）自然の状態では関連性がないポリペプチドと（共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用により）操作可能に関連づけられている対象タンパク質、または（６）自然の状態では存在していない対象タンパク質を意味する。典型的には、「単離タンパク質」は、所与の試料の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約５０％を構成する。ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ、合成源の核酸、またはそれらの任意の組み合わせが、当該単離タンパク質をコードしていてもよい。好ましくは、単離タンパク質は、治療、診断、予防、研究または他の用途に干渉しうる、自然環境中で存在するタンパク質またはポリペプチドまたは他の混合物が実質的に無い状態である。
【０２１０】
一部の態様において、ポリペプチドは、抗原結合タンパク質（ＡＢＰ）を含有してもよい。本明細書において用いられる「抗原結合タンパク質」（「ＡＢＰ」）は、特定の標的抗原に結合する任意のタンパク質を意味する。「抗原結合タンパク質」には、限定されないが、抗体及びその結合部分（たとえば免疫学的に機能的な断片）が含まれる。ペプチボディは、抗原結合タンパク質の他の例である。本明細書において、抗体またはイムノグロブリン鎖（重鎖または軽鎖）抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片」（またはシンプルに「断片」）という用語は、全長鎖において存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが、それでも抗原に特異的に結合することができる抗体の一部（当該部分がどのように獲得された、または合成されたかに関わらない）を含有する、ある種の抗原結合タンパク質である。そのような断片は、標的抗原に結合するという点で生物学的に活性であり、及び所与のエピトープへの結合に対し、他の抗原結合タンパク質（元のままの抗体）と拮抗しうる。一部の実施形態において、当該断片は、中和断片である。これら生物学的に活性な断片は、組み換えＤＮＡ技術により製造されてもよく、または抗原結合タンパク質（元の抗体を含む）の酵素的開裂または化学的開裂により製造されてもよい。免疫学的に機能的なイムノグロブリン断片としては、限定されないが、Ｆａｂ、ダイアボディ（軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド上に重鎖可変ドメインがあり、当該同じ鎖上で当該２つのドメインの間に対を形成するには短すぎる短ペプチドリンカーを介して連結されている）、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、ドメイン抗体及び一本鎖抗体が挙げられ、及び任意の哺乳類の源（限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ラクダ科、またはウサギを含む）から誘導されてもよい。さらに、本明細書に開示される当該抗原結合タンパク質の機能的部分（たとえば、１以上のＣＤＲ）は、身体の特定の標的に指向する治療剤を作製するために、第二のタンパク質、または小分子に共有結合されていることが予期され、それらは二機能性の治療特性を保有していること、または血清半減期が延長されていることが予期される。抗原結合タンパク質は、非タンパク質性の構成要素でありうることが当業者には予期される。たとえば改変、変異体、作製方法及びスクリーニング方法等の抗原結合タンパク質及び抗体に関するさらなる詳細に関しては、米国特許出願公開２０１１００２７２８７（すべての目的に対し、その全体において参照により本明細書に援用される）に見いだされる。
【０２１１】
一部の態様において、ポリペプチドは抗体を含有してもよい。「抗体」という用語は、任意のアイソタイプの損なわれていないイムノグロブリン、または標的抗原への特異的結合に関し、当該損なわれていないイムノグロブリンと競合しうるその断片を指し、及びたとえば、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、及び二特異性抗体が挙げられる。「抗体」は、ある種の抗原結合タンパク質である。損なわれていない抗体は、通常、少なくとも２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖を含有するが、一部の例においては、ラクダ科で自然に存在する抗体（重鎖のみを含有する）等、少数の鎖を含有してもよい。抗体は、ただ１つの源由来であってもよく、または「キメラ」であってもよく、すなわち当該抗体の異なる部分が、２つの異なる抗体から誘導されたものであってもよい。抗原結合タンパク質、抗体、または結合断片は、ハイブリドーマ中で産生されてもよく、組み換えＤＮＡにより製造されてもよく、または損なわれていない抗体の酵素的開裂もしくは化学的開裂により製造されてもよい。他で示されていない限り、「抗体」という用語は、２つの全長重鎖と２つの全長軽鎖を含有する抗体に加え、それらの誘導体、変異体、断片及び突然変異体を含む。さらに、明示的に除外されていない限り、抗体は、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（一部の場合においては、本明細書において、「抗体模倣体」と呼称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物（一部の場合においては、本明細書において、「抗体複合体」と呼称される）、及びそれぞれ、それらの断片を含む。一部の実施形態において、当該用語はまたペプチボディを包含する。
【０２１２】
ＡＢＰの治療有効量が、その必要のある対象に投与されてもよい。ＡＢＰは、医薬組成物中に処方されてもよい。これら組成物は、１以上のＡＢＰに加え、薬学的に受容可能な添加剤、担体、緩衝剤、安定化剤または当業者公知の他の物質を含有してもよい。そのような物質は、非毒性であり、当該活性成分の効能に干渉しないものでなければならない。当該担体または他の物質の正確な性質は、投与経路に依存しうる（たとえば、経口、静脈内、皮内または皮下、鼻腔内、筋肉内、腹腔内の経路）。
【０２１３】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末、または液状形態であってもよい。錠剤は、たとえばゼラチンまたはアジュバント等の固形担体を含有してもよい。液状の医薬組成物は、通常、たとえば水、石油、動物性油もしくは植物性油、鉱油、または合成油等の液状担体を含有する。生理学的生理食塩水、デキストロースまたは他の糖類溶液またはグリコール類（たとえばエチレングリコール、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール等）が含有されてもよい。
【０２１４】
静脈内注射、皮内注射もしくは皮下注射、または傷害箇所での注射に対しては、活性成分は、発熱物質がなく、適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口用水性溶液の形態である。当分野における当該関連技術により、たとえば等張性ビヒクル（たとえば塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、乳酸リンゲル液注射等）を用いた適切な溶液を調製することができる。保存剤、安定化剤、緩衝剤、抗酸化剤及び／または他の添加剤が、必要に応じて含有されてもよい。
【０２１５】
ＡＢＰ投与は、好ましくは、「治療有効量」または「予防有効量」（場合によっては、予防が治療とみなされうる）で行われ、これは、個体に対し利益をもたらすのに十分な量である。投与される実際の量ならびに投与速度及び投与経過は、治療される疾患の性質と重症度に依存する。たとえば投与量の決定等の治療の処方は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内であり、通常、治療される疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、及び開業医に公知の他の因子が考慮される。上述の技術及びプロトコールの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  （ｅｄ），  １９８０に見いだされる。
【０２１６】
組成物は、治療される状態に基づき、単独で、または他の治療を併用され、同時または連続的に投与されてもよい。
【０２１７】
ＩＩＩ．免疫細胞
試料は、免疫細胞を含有してもよい。当該免疫細胞は、Ｔ細胞及びＢ細胞を含有してもよい。Ｔ細胞（Ｔリンパ球）としては、たとえば、Ｔ細胞受容体を発現している細胞が挙げられる。Ｂ細胞としては、たとえば、活性化Ｂ細胞、ブラストＢ細胞、形質細胞、形質芽細胞、記憶Ｂ細胞、Ｂ１細胞、Ｂ２細胞、辺縁体Ｂ細胞、及び濾胞性Ｂ細胞が挙げられる。Ｔ細胞としては、Ｔ細胞、ブラストＴ細胞、ヘルパーＴ細胞（エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、記憶Ｔ細胞、中心記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞、及び制御性Ｔ細胞が挙げられる。試料は、１つの細胞（たとえば１つのＴ細胞または１つのＢ細胞）を含有してもよく、または少なくとも１，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２５０，０００、少なくとも５００，０００、少なくとも７５０，０００、または少なくとも１，０００，０００個の細胞を含有してもよい。
【０２１８】
Ａ．Ｂ細胞
本明細書において、「Ｂ細胞」とは、少なくとも１つの再構成イムノグロブリン遺伝子座を有する任意の細胞を指す。Ｂ細胞は、少なくとも１つの再構成イムノグロブリン重鎖遺伝子座または少なくとも１つの再構成イムノグロブリン軽鎖遺伝子座を含有してもよい。Ｂ細胞は、少なくとも１つの再構成イムノグロブリン重鎖遺伝子座及び少なくとも１つの再構成イムノグロブリン軽鎖遺伝子座を含有してもよい。Ｂ細胞は、適応免疫系の一部のリンパ球である。Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）として細胞表面上に膜結合型で、または分泌型抗体としてのいずれかで抗体を発現する任意の細胞を含んでもよい。Ｂ細胞は、イムノグロブリンを発現することができる（抗体、Ｂ細胞受容体）。抗体は、重鎖イムノグロブリンと軽鎖イムノグロブリンから形成されるヘテロ二量体を含有してもよい。重鎖は、可変領域を形成するための、可変で、多様性に富み、結合性（ＶＤＪ）の遺伝子の遺伝子再構成から形成され、定常領域に結合される。軽鎖は、可変領域を形成するための、可変で、結合性（ＶＪ）の遺伝子の遺伝子再構成から形成され、次いで定常領域に結合される。結合の組み合わせが非常に膨大な数になるため、抗体遺伝子の可変領域（ＢＣＲでもある）は高い多様性に富んでおり、それにより、Ｂ細胞は、任意の外来性抗原を認識し、それに対する反応を開始することができる。
【０２１９】
Ｂ．Ｂ細胞活性化と分化
Ｂ細胞は、炎症性免疫応答に関連し、抗原を認識した際に、活性化され、分化する。通常、活性化されるための２つのシグナルがＢ細胞に含有され、シグナルの１つはＢＣＲ（再構成イムノグロブリンの膜結合型）を介して伝達され、他は、ＣＤ４０を介して、または他の共刺激性分子を介して伝達される。この第二のシグナルは、その表面上にＣＤ４０に対するリガンド（ＣＤ４０Ｌ）を発現しているヘルパーＴ細胞との相互作用を介してもたらされてもよい。次いで、Ｂ細胞は増殖し、体細胞超変異を経て、抗体遺伝子のヌクレオチド配列にランダム変化が発生し、高い親和性を有する抗体を有するＢ細胞が選択される。また、Ｂ細胞は「クラススイッチ」を経てもよく、ＩｇＭアイソタイプをコードする重鎖の定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＥアイソタイプをコードする定常領域へと変化（スイッチ）する。Ｂ細胞の分化は、記憶Ｂ細胞で終了し、それらは通常、親和性が高く、クラススイッチが行われているが、一部の記憶Ｂ細胞はＩｇＭアイソタイプのままである。また、記憶Ｂ細胞は、活性化され、形質芽細胞に分化し、最終的に形質細胞へと分化してもよい。また、Ｂ細胞の分化は、最初に形質芽細胞になり、次いで、形質細胞になるよう分化してもよい。
【０２２０】
Ｃ．親和性成熟及びクローンファミリー
クローンファミリーは一般的に、２以上の試料による、関連イムノグロブリン重鎖及び／または軽鎖Ｖ（Ｄ）Ｊ配列の使用により定義される。関連イムノグロブリン重鎖のＶ（Ｄ）Ｊ配列は、ゲノム中にコードされたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの共通利用により特定されてもよい。クローンファミリー内には、一般的に、そのＶ（Ｄ）Ｊセグメント内の共通変異に基づき変化するサブファミリーがあり、それはＢ細胞の遺伝子組み換え及び体細胞超変異の間に発生しうる。
【０２２１】
活性化Ｂ細胞は移動し、リンパ組織または他の組織内で胚中心を形成し、そこで親和性成熟を経る。また、Ｂ細胞は、胚中心の外側で親和性成熟を経てもよい。親和性成熟の間、Ｂ細胞には、その抗体遺伝子中でランダム変異が発生し、当該変異は、Ｂ細胞が活性化された標的抗原に直接結合し、認識する抗体部分をコードする遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）に集中している。これにより、オリジナルの増殖性Ｂ細胞から、オリジナルのクローンとはやや異なり、互い同士にもやや異なっているイムノグロブリンを発現する、サブクローンが形成される。クローンは抗原に対して競合し、高い親和性のクローンが選択される一方で、低い親和性のクローンはアポトーシスにより死亡する。このプロセスにより、Ｂ細胞の「親和性成熟」がもたらされ、その結果として、高い親和性で抗原に結合するイムノグロブリンを発現しているＢ細胞が産生される。同じ「親」Ｂ細胞を起源とするＢ細胞はすべて、クローンファミリーを形成し、これらクローンファミリーは、同じ、または類似の抗原エピトープを認識するＢ細胞を含有する。一部の態様において、我々は、親和性成熟の間に最も高い親和性のクローンが選択されるため、高い頻度で存在するクローンは、高い親和性で抗原に結合するクローンの典型であると予測した。一部の態様において、異なるＶ（Ｄ）Ｊセグメント使用を伴うクローンは、異なる結合特性を示す。一部の態様において、同じＶ（Ｄ）Ｊセグメント使用を伴うが、異なる変異を有するクローンは、異なる結合特性を示す。
【０２２２】
Ｄ．記憶Ｂ細胞
記憶Ｂ細胞は、通常、親和性成熟されたＢ細胞であり、クラススイッチがなされていてもよい。これらは、次の抗原刺激に対しより素早く応答することができ、ネイティブな生物体における約１４日から、約７日まで、抗原に対する親和性成熟抗体の分泌に要する時間を大幅に短縮させることができる。
【０２２３】
Ｅ．形質芽細胞及び形質細胞
形質細胞は、長命型、または短命型のいずれであってもよい。長命型の形質細胞は、当該生物体の生涯にわたり生存し、一方で短命型の細胞は、３〜４日間、持続しうる。長命型の形質細胞は、炎症領域、粘膜領域（ＩｇＡ分泌形質細胞の場合）、第二のリンパ組織（たとえば脾臓またはリンパ節）、または骨髄のいずれかに存在する。これら相違する領域に送達するために、長命型形質細胞になることを運命づけられた形質芽細胞は最初に血流を通って移動し、その後、様々なケモカイン勾配を利用して適切な領域へと移動する。形質芽細胞は、親和性成熟された細胞であり、典型的にはクラススイッチがなされており、通常、抗体を分泌するが、形質細胞により産生される抗体量よりも低量である。形質細胞は、抗体分泌専用の細胞である。
【０２２４】
Ｆ．ＴＣＲ遺伝子とＢＣＲ遺伝子の特徴
個々の適応免疫細胞のそれぞれのＤＮＡ中、ならびにそれらの関連ＲＮＡ転写物中に組み換えが存在していることを特定するために、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかを配列解析してもよい。Ｔ細胞またはＢ細胞由来の組み換え配列はまた、クローン型とも呼称されうる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、抗体をコードするイムノグロブリン（Ｉｇ）遺伝子、またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子由来の配列に対応しうる。たとえば、ＤＮＡ及びＲＮＡは、ＴＣＲのα、β、γ、またはδ鎖をコードする配列に相当する。Ｔ細胞の多くは、ＴＣＲがα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖は、ＶＪ再構成により生成され、β鎖受容体はＶ（Ｄ）Ｊ再構成により生成される。ＴＣＲβ鎖に関しては、ヒトにおいて、４８種のＶセグメント、２種のＤセグメント、及び１３種のＪセグメントが存在する。当該２種の結合部位の各々で、いくつかの塩基が欠失しており、他の塩基が付加されている（Ｎ及びＰヌクレオチドと呼ばれる）。Ｔ細胞の一部では、ＴＣＲはγ鎖とδ鎖からなる。ＴＣＲγ鎖は、ＶＪ再構成により生成され、ＴＣＲδ鎖はＶ（Ｄ）Ｊ再構成により生成される（Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｐａｕｌ  Ｔｒａｖｅｒｓ，  ａｎｄ  Ｍａｒｋ  Ｗａｌｐｏｒｔ，  Ｊａｎｅｗａｙ'ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２００７、その全体において、参照により本明細書に援用される）。
【０２２５】
当該方法において解析されたＤＮＡ及びＲＮＡは、定常領域（α、δ、γ、ε、またはμ）を有する重鎖イムノグロブリン（ＩｇＨ）、またはλ定常領域もしくはκ定常領域を有する軽鎖イムノグロブリン（ＩｇＫまたはＩｇＬ）をコードする配列に相当しうる。各抗体は、２つの同一の軽鎖と２つの同一の重鎖を有しうる。各鎖は、定常（Ｃ）領域と可変領域から構成される。重鎖に関しては、可変領域は、可変（Ｖ）、多様（Ｄ）、及び結合（Ｊ）セグメントから構成される。これらセグメントの各タイプをコードするいくつかの別の配列がゲノム中に存在する。特定のＶＤＪ再構成事象は、Ｂ細胞の発生中に起こり、それにより当該細胞は特定の重鎖を生成する。Ｄ領域が無く、ＶＪ再構成のみがあることを除き、同様の様式で軽鎖の多様性が形成される。多くの場合、体細胞突然変異は、再構成の部位の近傍で発生し、それにより、いくつかのヌクレオチドの付加または欠失が引き起こされ、さらに、Ｂ細胞により産生される重鎖と軽鎖の多様性が増加する。さらに、Ｂ細胞により産生される抗体の起こり得る多様性は、異なる重鎖と軽鎖による産物である。重鎖と軽鎖の可変領域は、抗原認識（または結合）領域または部位の形成に寄与する。一部のエピトープに対する特異的応答が開始された後に発生する体細胞超変異のプロセスがこの多様性に加わる。このプロセスにおいて、特定のエピトープを認識することができるＢ細胞において突然変異が発生し、これが抗体の多様性をより高め、それによってより強力に当該特定のエピトープに結合することができる。これら因子のすべてが、Ｂ細胞により産生される抗体の多様性の高さに寄与する。数十億、あるいは兆を超える異なる抗体が産生されうる。Ｔ細胞の多様性が生じる基本的な原理は、Ｂ細胞による抗体産生の原理と類似している。Ｔ細胞及びＢ細胞活性化の要素は、エピトープへのその結合である。特定の細胞の活性化により、ほぼ同じ細胞型の産生が導かれ、それによりクローン性増殖がもたらされる。
【０２２６】
相補性決定領域（ＣＤＲ）、または超可変領域は、抗原に結合することができる抗原受容体（たとえばＴ細胞受容体及びイムノグロブリン）の可変ドメイン中の配列である。各抗原受容体の鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含有する。Ｔ細胞（α及びβ）及びイムノグロブリン（ＩｇＨ及びＩｇＫまたはＩｇＬ）を構成する２つのポリペプチドは、３つのＣＤＲの形成に寄与する。
【０２２７】
ＴＣＲβによりコードされたＣＤＲ１及びＣＤＲ２の部位は、４７種の機能的Ｖセグメントのうちの１つにある。ＣＤＲの多様性のほとんどは、ＣＤＲ３に存在し、当該多様性は、Ｔリンパ球発生の間の体細胞性再構成により生じる。
【０２２８】
ＢＣＲの高い多様性は、個体間及び個体内に存在する。ＢＣＲは、抗体重鎖と抗体軽鎖をコードする２つの遺伝子、ＩｇＨ及びＩｇＫ（またはＩｇＬ）から構成される。抗原に結合する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列及びＭＨＣ分子は、ＩｇＨ及びＩｇＫ（またはＩｇＬ）において最も高い多様性を有している。ＩｇＨによりコードされるＣＤＲ１及びＣＤＲ２の部位は、４４種の機能的Ｖセグメントのうちの１つの中に存在する。ナイーブＢ細胞の多様性の大部分は、Ｂリンパ球発生の間の体細胞性再構成事象を通じて、ＣＤＲ３の形成中に発生する。再構成は、Ｖ、Ｄ及びＪセグメントの各１つを有する分子を形成する。ヒトにおいては、４４種のＶ、２７種のＤ、及び６種のＪセグメントが存在し、それにより、理論上、７，０００を超える組合せの可能性がある。少数のＢＣＲ（約５％）に、２つのＤセグメントが発見されている。さらに、２つの結合部位の各々で、いくつかの塩基が欠落し、及び他の塩基が付加されており（Ｎ及びＰヌクレオチドと呼ばれる）、それにより、高度な多様性がもたらされる。Ｂ細胞活性化の後、体細胞超変異を通じて親和性成熟のプロセスが発生する。このプロセスにおいて、活性化されたＢ細胞の子孫細胞に、遺伝子全体で異なる体細胞性突然変異が蓄積され（ＣＤＲ領域に変異が高度に集中している）、それにより抗原に対する高い親和性を有する抗体が産生される。体細胞超変異に加え、活性化Ｂ細胞は、アイソタイプスイッチのプロセスを経る。同じ可変セグメントを有する抗体が、定常セグメントに基づき異なる形態（アイソタイプ）を有しうる。一方で、すべてのナイーブＢ細胞は、ＩｇＭ（またはＩｇＤ）を発現し、活性化Ｂ細胞の大部分は、ＩｇＧだが、ＩｇＭ、ＩｇＡ及びＩｇＥも発現する。ＩｇＭ（及び／またはＩｇＤ）からＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＥへのこの発現スイッチは、再構成事象を通じて発生し、それにより、特定のアイソタイプの産生に特殊化された１つの細胞が生じる。各ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥに対しては１つのセグメントがあり、ＩｇＡに対しては２つのセグメントがあり、ＩｇＧに対しては４つのセグメントがある。
【０２２９】
ＩＶ．コンピューターによる実装
一部の態様において、本明細書に開示される１以上の方法がコンピューターに実装されてもよい。１つの実施形態において、コンピューターは、チップセットに連結されたプロセッサーを少なくとも１つ含有する。一部の実施形態において、チップセットは、メモリー、記憶装置、キーボード、グラフィックスアダプタ、ポインティングデバイス、及び／またはネットワークアダプタに連結されている。ディスプレイは通常、グラフィックスアダプタに連結されている。１つの実施形態において、チップセットの機能性は、メモリーコントローラーハブ、及びＩ／Ｏコントローラーハブによりもたらされる。他の実施形態において、メモリーは、チップセットの代わりにプロセッサーに直接連結される。
【０２３０】
記憶装置は、ハードドライブ、コンパクトディスク読み取り専用メモリー（ＣＤ−ＲＯＭ）、ＤＶＤ、または固体記憶装置のようなデータを保持することができる任意のデバイスである。メモリーはプロセッサーに使用される命令とデータを保持する。ポインティングデバイスは、マウス、トラックボール、または他のタイプのポインティングデバイスであってもよく、及びコンピューターシステムにデータを入力するためのキーボードと併せて用いられる。グラフィックスアダプタは、ディスプレイ上に画像及び他の情報を提示する。ネットワークアダプタは、ローカルネットワークまたは広域ネットワークに当該コンピューターシステムを繋げる。
【０２３１】
当分野で公知であるように、コンピューターは、前述のものとは異なる、及び／または他の構成要素を有してもよい。さらに、コンピューターは、ある構成要素を欠いてもよい。さらに、記憶装置は、ローカルであってもよく、及び／または当該コンピューターから離れていてもよい（たとえば、ストレージエリアネットワーク（ＳＡＮ）内に統合される）。
【０２３２】
当分野で公知であるように、コンピューターは、本明細書に記述される機能性を備える目的で、コンピュータープログラムモジュールを実行するよう適合される。本明細書において、「モジュール」という用語は、特定の機能性を備えるために用いられるコンピュータープログラム論理を指す。ゆえに、モジュールは、ハードウェア、ファームウェア、及び／またはソフトウェアに実装されていてもよい。１つの実施形態において、プログラムモジュールは、記憶デバイス上に保存され、メモリーにロードされ、プロセッサーにより実行される。
【０２３３】
本明細書に開示される実体の実施形態は、本明細書に記述されるものとは異なるモジュール及び／または他のモジュールを含有してもよい。さらに、当該モジュールに備わる機能は、他のモジュールまたは他の実施形態の異なるモジュールにより実行されてもよい。さらに、本記述は、明確性及び簡便性を目的とし、「モジュール」という用語を稀に省略する。
【０２３４】
Ｖ．キット
さらに、本明細書において、本明細書に記述されるアダプター構築物を含有するキットが開示される。キットは、本明細書に記述されるアダプター構築物に連結された複数の固体担体を含有してもよい。一部の実施形態において、当該キットは、複数のアダプター鋳型を含有するアダプター鋳型ライブラリーを含有する。一部の実施形態において、当該キットは、複数の固体担体に連結された複数のアダプター鋳型を含有するアダプター鋳型ライブラリーを含有する。当該キットはさらに、アダプター鋳型構築物から本明細書に記述されるアダプター分子（たとえばバーコードアダプター分子）を酵素反応により作製するための酵素を含有する。一部の実施形態において、当該キットは、本明細書に記述される細胞懸濁緩衝液を含有する。
【０２３５】
キットは、本明細書に記述されるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、及び／または宿主細胞、ならびに使用説明書を含有してもよい。当該キットは、適切な容器中で、本明細書に記述されるポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、及び／または宿主細胞、１以上の対照物、ならびに様々な緩衝剤、試薬、酵素、ならびに当分野公知の他の標準的な構成要素を含有してもよい。
【０２３６】
当該容器は、１以上のウェルを含有するプレート上に少なくとも１つのウェルを含有してもよい。当該容器は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、及び／または宿主細胞が配置され、及び一部の例においては適切に分注されている、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、または他の容器的手段を含有してもよい。追加の構成要素が備えられている場合、当該キットは、その構成要素が配置されうる追加の容器を含有してもよい。当該キットはまた、市販を目的として、厳重に密閉された、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドライブラリー、ベクター、及び／または宿主細胞、ならびに他の試薬の容器を含有するための手段を含有してもよい。そのような容器は、所望されるバイアルが保持される注射用のプラスチック容器または吹き込み成形されたプラスチック容器を含有してもよい。容器は、使用及び／または警告のための説明書を備えたラベルを含有してもよい。
【０２３７】
ＶＩ．デバイス
本発明の実施形態は、反応量を作製し、輸送するためのデバイスを含有する。これらの量は、マイクロ流体スケールで存在してもよく、及び分散媒から相分離されてもよい。当該デバイスにより操作されうる反応量の例としては、逆エマルション（すなわち、水／油エマルション）中の水性ドロップレットを含有する。当該デバイスにより、バーコードアダプター鋳型、バーコードアダプター分子、試料（たとえば細胞）、及び／またはこれら試料から得られたＲＮＡが、別々に、または一緒にドロップレット中に内包されることができる。また、当該デバイスにより、試薬がドロップレット中に導入され、それにより、バーコードアダプター分子が酵素的に生成され、個々の試料由来のＲＮＡがバーコード化されうる。
【０２３８】
本明細書において使用され、及び請求されるデバイスの非限定的な例を図１７〜１９に示す。当業者であれば、これらデバイスの改変が作製され、本発明方法において用いられ得ることを認識するであろう。通常、デバイスは３つのマイクロ流体経路を含有し、各々、圧力源とフローセンサーに連結される。マイクロ流体経路に対する圧力源により、液体が当該経路を通り、圧力源の下流にあるフローセンサーを用いて、当該経路を通る液体の速度が計測されうる。一部の実施形態において、第一の経路１０１及び第二の経路１０２は、第一のジャンクション１０４で統合され、統合経路を形成し、次いで、第二のジャンクション１０５で第三の経路１０３に統合される。当該第二のジャンクションは、マイクロ流体ドロップレットチップ中にあり、マイクロ流体ドロップレットが生成される場所にあってもよい。
【０２３９】
本明細書に記述されるデバイスは、ＩＤＥＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａｋｅ  Ｆｏｒｅｓｔ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能な管類構成要素及び流体工学的構成要素から、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｃｈａｒｌｅｓｔｏｗｎ，  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，  Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手可能なマイクロ流体ドロップレットチップを用いて、アセンブリされてもよい。当該マイクロ流体ドロップレットチップの特性の一部は、米国特許第７，２６８，１６７号、第７，３７５，１４０号、第７，７１７，６１５号、第７，７７２，２８７号、第８，７４１，１９２号、及び第８，８８３，８６４に記述されており、それらは参照により本明細書に援用される。適切な圧力源としては、シリンジポンプ及び圧力ポンプが挙げられる。圧力ポンプは、Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓから入手可能である。圧力源は、独立して制御されていてもよい。
【０２４０】
一部の実施形態において、第一及び第二のマイクロ流体経路は、水性溶液を輸送する。各経路はインジェクションポート及びバルブ（たとえば、四方向バルブ）を含有してもよく、それにより当該経路に沿って、当該インジェクションポートに導入された溶液が運ばれる。一部の実施形態において、水性分散媒を保持するレゼルボアが、各四方向バルブの上流に配置されている。当該水性分散媒は、当該分散媒が下流に運ばれながら、または当該水性溶液の栓が第一のジャンクションに向かう下流へと押されながら、当該四方向バルブ中で水性溶液と混合されてもよい。一部の実施形態において、フローレジスタが、各マイクロ流体経路に配置されている。
【０２４１】
水性溶液が第一及び第二のマイクロ流体経路に導入された時点で、当該水性溶液は、第一のジャンクションへと向かう溶液の流れを測定する試料ループを通過してもよい。測定は、要望に応じて、たとえば試料ループに沿って配置された流体抵抗またはバルブを用いて行われてもよい。一部の実施形態において、１つの試料ループが、第一及び第二のマイクロ流体経路の各々と関連づけられており、及び当該試料ループは、熱冷却ユニットと接触している。熱冷却ユニットは、当該水性溶液中の酵素、核酸、または他の生物学的成分の熱変性を防ぐために含有されてもよく、または酵素反応に最適な温度を確立するために含有されてもよい。第一及び第二のマイクロ流体経路に対する当該試料ループと接触している熱冷却ユニット部分は、独立して、または一緒に制御されてもよい。当該試料ループを通過する水性溶液の温度を大気温度から逸脱させることができるのであれば、任意の物質または装置を熱冷却ユニットとして用いてもよい。適切な熱冷却デバイスの例は、ペルティエデバイス及び氷の箱である。
【０２４２】
一部の実施形態において、第一のマイクロ流体経路を通り輸送される水性溶液は、細胞及びバーコードアダプター鋳型ビーズを含有する。一部の実施形態において、第二のマイクロ流体経路を通り輸送される水性溶液は、細胞溶解のための試薬及び関心対象のポリヌクレオチドを作製するための試薬（たとえば、バーコードアダプター分子を作製するための酵素等）を含有する。各マイクロ流体経路と関連づけられたインジェクションポート、バルブ、及び／または試料ループは、当該経路を通過する水性溶液の含有物を調整するために構成またはカスタマイズされていてもよい。たとえば、第一のマイクロ流体経路と関連づけられた試料ループは、細胞及びビーズを調整するために、拡張された内部直径を有していてもよい。第一及び第二のマイクロ流体経路の間に細胞、ビーズ及び試薬を配置するための多くの他のオプションが存在し、それによりこれら構成要素のすべてが、第一のジャンクションで結び付けられることが認識されるであろう。たとえば、細胞は、第一のマイクロ流体経路を通って輸送されてもよく、ビーズは、第二のマイクロ流体経路を通って輸送されてもよい。各経路は、運搬する水性溶液の含有物を考慮し、所望のとおりに構成されてもよい。
【０２４３】
第一のマイクロ流体経路及び第二のマイクロ流体経路の統合から生じた統合経路は、次に、マイクロ流体ドロップレットチップ中の第三のマイクロ流体経路と統合される。これは、第一のジャンクションから下流にある第二のジャンクションで発生する。任意の所望される距離が、第一のジャンクションと第二のジャンクションの間にあってもよい。一部の実施形態において、第一のジャンクションはまた、マイクロ流体経路ドロップレットチップ内に位置付けられている。一部の実施形態において、第一のジャンクションは、第二のジャンクションのすぐ上流にあり、それにより、統合経路中の流体が、ごくわずかな距離を移動し（たとえば、１０、３、１、０．３、または０．１ｃｍ未満）、次いで、第三のマイクロ流体経路由来の液体と混合される。この配置により、当該統合経路における成分の混合が低下しうる。一部の実施形態において、デバイス、当該マイクロ流体ドロップレットチップの内側及び／または外側のマイクロ流体経路の大きさは、液体の移動が、層流により制御される大きさである。
【０２４４】
第三のマイクロ流体経路は、マイクロ流体ドロップレットチップに油／界面活性剤混合物を送達するよう構成されていてもよい。ゆえに、当該デバイスの第二のジャンクションで、水性相と疎水相が混合され、マイクロ流体ドロップレットが形成されてもよい。第二のジャンクションの形状は、これらドロップレットが所望される特性を確実に有するよう選択されてもよい。たとえば、形状は、マイクロ流体経路において適切な流速で、所望されるサイズと、所望される距離で互いに分離された単分散ドロップレットの形成が促進されるよう選択されてもよい。一部の実施形態において、第三のマイクロ流体経路は、マイクロ流体ドロップレットチップの上流の２つの副経路へと別れ、次いで、第二のジャンクションで統合（水性）経路に沿って互いに統合される。当該２つの副経路は、大角度（たとえば、およそ、または少なくとも３０、６０、９０、１２０、１５０、または１８０度）で、互いに接近し、それにより、当該油／界面活性剤混合物が、当該第二のジャンクションに入るにつれ、当該水性混合物の周辺でシースを形成してもよい。この形状により、水性ドロップレットは、水性混合物から「摘み取られ」、当該ジャンクションを出る際に、当該水性混合物とほぼ同じ方向に流れる。ドロップレットを形成させるこの方法は、フローフォーカシング（ｆｌｏｗ  ｆｏｃｕｓｉｎｇ）に関する分野において公知である。他の実施形態において、当該統合水性経路は、直角で当該第三のマイクロ流体経路と相互作用し、それにより、当該第二のジャンクションは、ｔ−ジャンクションの形状をとる。これら実施形態において、油／界面活性剤混合物は、当該ジャンクションをまっすぐに流れる。当該水性混合物は、この混合物から形成されたドロップレットが当該ジャンクションから離れる方向に対して直角の方向で、当該ジャンクションに近づく。様々なマイクロ流体の形状におけるドロップレット形成に関する物理特性は、Ｔｈｏｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈｙｓ．  Ｒｅｖ．  Ｌｅｔｔ．  ８６，  ４１６３−４１６６，  ２００１及び他の文献に記述されている。
【０２４５】
水性混合物を含有する統合経路と、油／界面活性剤混合物を含有する第三のマイクロ流体経路の統合経路の統合から生じた、ドロップレットを含有する液体経路は、試料経路を構成する。当該試料経路は、第二のジャンクションの下流で、試料収集容器へと運ばれる。当該試料収集容器において、ドロップレットは、サーモサイクルに供されてもよい。また、当該ドロップレットがこじ開けられ、バーコード化された核酸が回収されてもよい。
【０２４６】
操作において、本明細書に記述されるデバイスを用いてバーコードアダプター鋳型ビーズと細胞を、水性マイクロ流体ドロップレットに封入し、それにより各ドロップレットが平均しておよそ１つのビーズと１つの細胞を含有するようにしてもよい。各ドロップレット中のビーズと細胞の数は、所望されるように調節されてもよく、たとえば、当該デバイスにロードされる溶液中のビーズと細胞の濃度を調節することにより、または当該３つのマイクロ流体経路の流速を調節することにより、調節されてもよい。各ドロップレットに含有される試薬により、バーコードアダプター分子が、当該ドロップレット中の１つのビーズから酵素的に生成される。これら試薬はまた、当該１つの細胞を溶解させ、当該細胞のＲＮＡにバーコード化反応を経させる。ゆえに、当該細胞のＲＮＡは、当該ドロップレット中でバーコード化されてもよく、これらＲＮＡ由来の核酸（及びバーコード配列を含有している）は、後の複数の細胞からの核酸が混合される際に、１つの細胞に遡ることができる。
【実施例】
【０２４７】
ＶＩＩ．実施例
Ａ．実施例１：１回の反応で、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する
以下に記述される方法を用いて、各ビーズに固有バーコードアダプター鋳型を付加するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うエマルションＰＣＲを用いて、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製した（図１５を参照）。
【０２４８】
（表４）１回の反応でバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製するために用いられたオリゴ
0006608368.tif 000011
【０２４９】
ストレプトアビジンでコートされたＭ−２７０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ビオチニル化オリゴヌクレオチド（「ｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅ２」）と連結させた。
１．ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
２．１ｍＬのＭ２７０ビーズ（およそ６．７ｘ１０８個のビーズ）を３つの１．５ｍＬマイクロチューブの各々に入れ、トータルで３ｍＬとした。
３．磁石上に３分間置いた。
４．上清を各チューブから取り除き、１ｍＬ（１ｘ量）のＢｉｎｄ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＷＢ；１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  トリス、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。
５．工程４を２回以上繰り返し、次いで、５４０μＬ量のＢＷＢに最終的に再懸濁した。
６．１００μＭのｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅ２を６０μＬ、ビーズに添加し、１５分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
７．インキュベーションの後、ビーズを１ｍＬのＢＷＢ緩衝液を用いて３回洗浄し、１つの試験管に混合した。
８．０．０１％アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを４℃で保存した。
９．１０ｍＭのトリスを用いて、使用する前に３回ビーズを洗浄した。
【０２５０】
エマルションベースＰＣＲにおいて、バーコードオリゴヌクレオチドならびにフォワードプライマー及びリバースプライマーを、上述の連結ビーズに添加した。
１．以下のＰＣＲミックス（総量で３ｍＬ）を、３つの１．５ｍＬ微小遠心管（ＶＷＲ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０１７０−６５０）で調製した。
0006608368.tif 000012
２．油−界面活性剤混合物を調製した（総量１ｍＬ）。
ａ．ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）  ９００μＬ
ｂ．ＥＭ９０（Ｅｖｏｎｉｋ）      １００μＬ
３．８００μＬの油−界面活性剤混合物、及び２００μＬのＰＣＲミックスを、１５個のＡｘｙｇｅｎ  ２．０ｍＬ  Ｍａｘｙｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ円錐底微小遠心管（ＭＣＴ−２００−Ｌ−Ｃ）の各々で混合した。遠心管を密封し、３秒間振とうした。
４．遠心管をＱｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩに置き、１４Ｈｚで５分間振とうした。
５．エマルションをＶＷＲ  ９６−ｗｅｌｌ  ＰＣＲプレート（８３００７−３７４）のウェルに分注した（ウェル当たり、１６０μＬのエマルションを添加した）。
６．遠心管を、以下のプログラムを用いてサーモサイクルを行った：
0006608368.tif 000013
【０２５１】
エマルションを壊し、ビーズを回収した。
１．ＰＣＲプレートの内容物を１．５ｍＬの微小遠心管（ＶＷＲ  ２０１７０−６５０）に移した（遠心管当たり、０．５ｍＬ以下のエマルション量）。
２．１００μＬの１μＭ  ｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅｆｒｅｅプライマーを各遠心管に添加した。
３．遠心管にイソブタノールを満たし、密封して、混合するためにしっかりと振とうした。
４．遠心管を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心した。
５．遠心管を磁気ストライプ上に置き、ビーズを遠心管の側面に引き寄せて、次いで、できるだけ多量の上清を吸引し、沈殿ビーズは遠心管に残した。
６．１ｍＬのイソブタノールを添加し、残留した油／エマルションがイソブタノールに分散されるまで、ピペッティングにより上下させて良く混合した。
７．磁気ストライプ上に遠心管を置き、遠心管の側面にビーズを引き寄せ、次いで、イソブタノールを吸引した。磁石上でビーズを集める時間を考慮し、最初に上清を吸引した遠心管に、他の遠心管の全量を移して混合させ、次いで上清を吸引し、それを繰り返すことにより、すべての遠心管のビーズを１本の遠心管へと混合した。
８．１ｍＬの新鮮なイソブタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
９．イソブタノールを吸引した。
１０．１ｍＬの１００％エタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１１．エタノールを吸引した。
１２．工程１０と工程１１を繰り返した。
１３．１ｍＬの７０％エタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１４．エタノールを吸引した。
１５．工程１３と工程１４を繰り返した。
１６．１ｍＬのＰＢＳを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１７．ＰＢＳを吸引した。
１８．工程１６と工程１７を繰り返した。
【０２５２】
次いで、ｅｍＢ＿Ｒｖ３リバースプライマーへと組み込まれたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素からの蛍光を利用し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩを用いて、バーコードアダプター鋳型を組み込んだビーズを、バーコード化されていないビーズからソーティングした。
【０２５３】
４℃での保管のため、０．０１％アジ化ナトリウム中でビーズを保存した。
【０２５４】
本実施例は、Ｔ７  ＲＮＡＰによるバーコードアダプター増幅のための、Ｔ７  ＲＮＡＰプロモーター配列を用いたバーコードアダプター鋳型ビーズの作製であることに注意されたい。ｅｍＢ−Ｔ７ｂｒｉｄｇｅ２のＴ７  ＲＮＡＰプロモーター配列
0006608368.tif 000014
を、他のＲＮＡＰプロモーター配列と置き換えることにより、他のＲＮＡＰを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばＮｔ．ＢｂｖＣＩの「ＣＣＴ  ＣＡＧ  Ｃ」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ（たとえば、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ）及び鎖置換（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）ＤＮＡＰ（たとえばＫｌｅｎｏｗ ｅｘｏ−）を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
【０２５５】
また、ｅｍＢ−ＢＣｂｒｉｄｇｅ２の
0006608368.tif 000015
により、約３億８７００万個の固有バーコードが得られる。たとえば１０００万個の細胞をバーコード化するために本バーコードライブラリーを用いたとしても、用いられる固有バーコードは２．５％のみである。大部分のバーコードは互いに十分に隔たりがあるため、ＰＣＲエラー及び配列解析のエラーに関わらず、次世代シークエンスのバーコード配列リードのほとんどが互いに（破棄されるリードの一部とともに）容易に識別化される。
【０２５６】
エマルションは、当分野公知の様々な方法を用いて作製することができ、この場合、振とう法を用いて作製することができ、得られたドロップレットは、平均ドロップレット直径約２５μｍで、多分散された。バーコードオリゴヌクレオチドは、フォワードプライマーとリバースプライマーを用いて増幅され、リバースプライマーは蛍光タグで標識されており（本実施例ではＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７−）、それにより非標識化ビーズからバーコードアダプター鋳型を組み込まれたビーズが識別された。次いで、バーコードアダプター鋳型を組み込んだ光る蛍光ビーズを、暗い非標識ビーズからＦＡＣＳソーティングした。
【０２５７】
本実施例におけるビーズ及びバーコードオリゴヌクレオチドの特定の濃度では、ポワソン分布に従い、ドロップレット当たりビーズは平均約７個で、ドロップレット中にビーズがロードされ、およそ２８％のドロップレットが、固有バーコードオリゴヌクレオチドのコピーを１以上含有し、一方で、残りのドロップレットはまったくバーコードオリゴヌクレオチドを含有しなかったという実験結果を得た。少なくとも１つのバーコードオリゴヌクレオチドを含有したドロップレットのうち、約７０％がまさに１つのバーコードオリゴヌクレオチドを含有し、一方で、残りの約３０％が２以上のバーコードを含有するはずである。ゆえに、約７０％のバーコード鋳型アダプタービーズライブラリーがモノクローナル（ビーズあたり、１つの固有バーコード配列）であり、約３０％がポリクローナルであった。
【０２５８】
以下に記述される方法の最終産物は、およそ１２００万個のバーコードアダプター鋳型ビーズであり、そのうち約８４０万個がモノクローナルなバーコードアダプター鋳型ビーズである。そして、ドロップレット当たり、平均で約７個のビーズでドロップレットが充てんされたにもかかわらず、エマルションを壊した後、ビーズの収率は約２％であった。２項分布に基づき、約７７０万個の固有バーコード配列が、本バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーに存在していた。
【０２５９】
ビーズとバーコードオリゴヌクレオチドの濃度を調節して、モノクローナルビーズとポリクローナルビーズの割合が異なりかつ存在する固有バーコード配列の数が異なるバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを得てもよい。これにより、１つの細胞由来のバーコード化核酸を、固有バーコード、または固有バーコードのセットを介して１つの細胞と関連づけられた、異なる割合の核酸とすることができ、また、次の解析で破棄されるバーコード化核酸の割合を変えることができる。
【０２６０】
このバーコードアダプター鋳型ビーズ作製方法を最適化させ、ある割合のモノクローナル：ポリクローナルビーズ（たとえば、９０％：１０％、９９％：１％、または任意の他の割合）を得てもよい。現在の約７０％：３０％の比率を超える改善は、いくつかの異なる方法により達成され（バーコード配列を含有するオリゴをさらに希釈する方法を含む（この場合、ｅｍＢ−ＢＣｂｒｉｄｇｅ２））、それにより、少数のコピーがエマルション中のドロップレットに分配され、それにより、複数のバーコード配列が任意の所与のドロップレットに封入されてしまうことが減少する。
【０２６１】
Ｂ．実施例２：１度の反応でバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する  ＩＩ
以下に記述される方法を用いて、各ビーズに固有バーコードアダプター鋳型を付加するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うエマルションＰＣＲを用いてバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する（図１５を参照）。
【０２６２】
（表５）１度の反応でバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製するために用いられたオリゴ  ＩＩ
0006608368.tif 000016
【０２６３】
ストレプトアビジンでコートされたＭ−２７０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ビオチニル化オリゴヌクレオチド（「ｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅＩｓｃｅＩ」）と連結させた。
１．ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
２．１ｍＬのＭ２７０ビーズ（およそ６．７ｘ１０８個のビーズ）を３つの１．５ｍＬマイクロチューブの各々に入れ、トータルで３ｍＬとした。
３．磁石上に３分間置いた。
４．上清を各チューブから取り除き、１ｍＬ（１ｘ量）のＢｉｎｄ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＷＢ；１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  トリス、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。
５．工程４を２回以上繰り返し、次いで、５４０μＬ量のＢＷＢに最終的に再懸濁した。
６．１００μＭのｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅＩｓｃｅＩを６０μＬ、ビーズに添加し、１５分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
７．インキュベーションの後、ビーズを１ｍＬのＢＷＢ緩衝液を用いて３回洗浄し、１つの試験管に混合した。
８．０．０１％アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを４℃で保存した。
９．１０ｍＭのトリスを用いて、使用する前に３回ビーズを洗浄した。
【０２６４】
エマルションベースＰＣＲにおいて、バーコードオリゴヌクレオチドならびにフォワードプライマー及びリバースプライマーを、上述の連結ビーズに添加した。
１．以下のＰＣＲミックス（総量で３ｍＬ）を、３つの１．５ｍＬ微小遠心管（ＶＷＲ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０１７０−６５０）で調製した。
0006608368.tif 000017
２．油−界面活性剤混合物を調製した（総量１ｍＬ）。
ａ．ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）  ９００μＬ
ｂ．ＥＭ９０（Ｅｖｏｎｉｋ）      １００μＬ
３．８００μＬの油−界面活性剤混合物、及び２００μＬのＰＣＲミックスを、１５個のＡｘｙｇｅｎ  ２．０  ｍＬ  Ｍａｘｙｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ円錐底微小遠心管（ＭＣＴ−２００−Ｌ−Ｃ）の各々で混合した。遠心管を密封し、３秒間振とうした。
４．遠心管をＱｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩに置き、１４Ｈｚで５分間振とうした。
５．エマルションをＶＷＲ  ９６−ｗｅｌｌ  ＰＣＲプレート（８３００７−３７４）のウェルに分注した（ウェル当たり、１６０μＬのエマルションを添加した）。
６．遠心管を、以下のプログラムを用いてサーモサイクルを行った：
0006608368.tif 000018
【０２６５】
エマルションを壊し、ビーズを回収した。
１．ＰＣＲプレートの内容物を１．５ｍＬの微小遠心管（ＶＷＲ  ２０１７０−６５０）に移した（遠心管当たり、０．５ｍＬ以下のエマルション量）。
２．１００μＬの１μＭ  ｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅｆｒｅｅＩｓｃｅＩ＿２プライマーを各遠心管に添加した。
３．遠心管にイソブタノールを満たし、密封して、混合するためにしっかりと振とうした。
４．遠心管を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心した。
５．遠心管を磁気ストライプ上に置き、ビーズを遠心管の側面に引き寄せて、次いで、できるだけ多量の上清を吸引し、沈殿ビーズは遠心管に残した。
６．１ｍＬのイソブタノールを添加し、残留した油／エマルションがイソブタノールに分散されるまで、ピペッティングにより上下させて良く混合した。
７．磁気ストライプ上に遠心管を置き、遠心管の側面にビーズを引き寄せ、次いで、イソブタノールを吸引した。磁石上でビーズを集める時間を考慮し、最初に上清を吸引した遠心管に、他の遠心管の全量を移して混合させ、次いで上清を吸引し、それを繰り返すことにより、すべての遠心管のビーズを１本の遠心管へと混合した。
８．１ｍＬの新鮮なイソブタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
９．イソブタノールを吸引した。
１０．１ｍＬの１００％エタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１１．エタノールを吸引した。
１２．工程１０と工程１１を繰り返した。
１３．１ｍＬの７０％エタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１４．エタノールを吸引した。
１５．工程１３と工程１４を繰り返した。
１６．１ｍＬのＰＢＳを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１７．ＰＢＳを吸引した。
１８．工程１６と工程１７を繰り返した。
【０２６６】
次いで、ｅｍＢ＿ＩｓｃｅＩ＿Ｒｖリバースプライマーへと組み込まれたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素からの蛍光を利用し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩを用いて、バーコードアダプター鋳型を組み込んだビーズを、バーコード化されていないビーズからソーティングした。
【０２６７】
４℃での保管のため、０．０１％アジ化ナトリウム中でビーズを保存した。
【０２６８】
本実施例は、Ｔ７  ＲＮＡＰによるバーコードアダプター増幅のための、Ｔ７  ＲＮＡＰプロモーター配列を用いたバーコードアダプター鋳型ビーズの作製であることに注意されたい。ｅｍＢ−Ｔ７ｂｒｉｄｇｅＩｓｃｅＩのＴ７  ＲＮＡＰプロモーター配列
0006608368.tif 000019
を、他のＲＮＡＰプロモーター配列と置き換えることにより、他のＲＮＡＰを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばＮｔ．ＢｂｖＣＩの「ＣＣＴ  ＣＡＧ  Ｃ」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ（たとえば、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ）及び鎖置換（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）ＤＮＡＰ（たとえばＫｌｅｎｏｗｅｘｏ−）を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
【０２６９】
また、ｅｍＢ−ＢＣｂｒｉｄｇｅＩｓｃｅＩ＿２の
0006608368.tif 000020
により、約３億８７００万個の固有バーコードが得られる。たとえば１０００万個の細胞をバーコード化するために本バーコードライブラリーを用いたとしても、用いられる固有バーコードは２．５％のみである。大部分のバーコードは互いに十分に隔たりがあるため、ＰＣＲエラー及び配列解析エラーに関わらず、次世代シークエンスのバーコード配列のリードのほとんどが互いに（破棄されるリードの一部とともに）容易に識別化される。
【０２７０】
本実施例におけるビーズ及びバーコードオリゴヌクレオチドの特定の濃度では、ポワソン分布に従い、ドロップレット当たりビーズは平均約７個で、ドロップレット中にビーズがロードされ、およそ２５％のドロップレットが、固有バーコードオリゴヌクレオチドのコピーを１以上含有し、一方で、残りのドロップレットはまったくバーコードオリゴヌクレオチドを含有しなかったという実験結果を得た。少なくとも１つのバーコードオリゴヌクレオチドを含有したドロップレットのうち、約７５％がまさに１つのバーコードオリゴヌクレオチドを含有し、一方で、残りの約２５％が２以上のバーコードを含有した。ゆえに、約７５％のバーコード鋳型アダプタービーズライブラリーがモノクローナル（ビーズあたり、１つの固有バーコード配列）であり、約２５％がポリクローナルであった。
【０２７１】
以下に記述される方法の最終産物は、およそ５０００万個のバーコードアダプター鋳型ビーズであり、そのうち約３７５０万個がモノクローナルビーズであった。ドロップレット当たり、平均で約７個のビーズでドロップレットが充てんされたにもかかわらず、エマルションを壊した後、ビーズの収率は約１１％であった。２項分布に基づき、固有バーコード配列を有するモノクローナルビーズは約２８００万個存在していた。
【０２７２】
ビーズとバーコードオリゴヌクレオチドの濃度を調節して、モノクローナルビーズとポリクローナルビーズの割合が異なりかつ存在する固有バーコード配列の数が異なるバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを得てもよい。これにより、１つの細胞由来のバーコード化核酸を、固有バーコード、または固有バーコードのセットを介して１つの細胞と関連づけられた、異なる割合の核酸とすることができ、また、次の解析で破棄されるバーコード化核酸の割合を変えることができる。
【０２７３】
Ｃ．実施例３：複数の工程で、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する
本実施例において、図１６に記載されるように反応が行われた（１つのＳ１、１つのＷ、及び１つのＳ２のバーコード配列のみを用いた点を除く）。したがって、異なるＳ１配列に連結されたビーズのプールは行われず、同様に、Ｓ１オリゴにＷ配列を付加するためのポリメラーゼ伸長反応後に、ビーズはプールされなかった。
【０２７４】
本実施例は、シンプルに、固有バーコード配列とともに複数のＳ１オリゴ、Ｗオリゴ、及びＳ２オリゴを有することにより、図１６に記述されるように容易に拡張されうる。
【０２７５】
（表６）１度の反応で、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製するために用いられたオリゴ
0006608368.tif 000021
【０２７６】
ストレプトアビジンでコートされたＭ−２７０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、個々の反応において、Ｓ１配列を含有するビオチニル化オリゴヌクレオチドと連結させた。
１．ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
２．Ｍ２７０ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を磁石上に３分間置いた。
３．上清を各チューブから取り除き、０．５ｘのＢｉｎｄ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＷＢ；１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  トリス、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）（１ｘ量）に再懸濁した。
４．工程４を２回以上繰り返し、次いで、ＢＷＢに最終的に再懸濁した。
５．１０μＭのＳ１−オリゴをビーズに添加し、１５分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
６．インキュベーションの後、ＢＷＢ緩衝液を用いてビーズを３回洗浄した。
７．０．０１％アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを４℃で保存した。
８．１０ｍＭのトリスを用いて、使用する前に３回ビーズを洗浄した。
【０２７７】
次いで、連結されたビーズをともにプールし、ｗ−オリゴを用いて伸長反応を行った。
【０２７８】
ｗ伸長反応：
0006608368.tif 000022
振とうインキュベーター中で、一晩、５５℃でインキュベートした（８００ｒｐｍで振とう）。
【０２７９】
ビーズをプールし、１ｘＢＷＢ緩衝液を用いて３回洗浄した。次いで、アンチセンス鎖を７０℃の溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  トリス  ｐＨ８．０）で溶解させた。磁石を用いてビーズを沈殿させ、上清を完全に除去し、次いで、１ｍＬ  ＴＥ０．１中でビーズを３回洗浄し、次いで、１ｍｇ／２０uＬでＴＥ０．１中に再懸濁した。
【０２８０】
ｓ２伸長反応（２５０μｇのビーズ当たり）：
0006608368.tif 000023
Ｓ２−オリゴ−ａは、Ｓ１＋ｗ−ａビーズとともに用いて、Ｓ２−オリゴ−ｂは、Ｓ１＋ｗ−ｂビーズとともに用いた。１０分間、６０℃でインキュベートした後、３７℃までゆっくりと冷却した。２時間、３７℃、８００ｒｐｍで振とうさせながらインキュベートした。次いで、反応物を室温まで冷却させた。
次いで、以下を添加した：
0006608368.tif 000024
反応物を３時間、２５℃、８００ｒｐｍで振とうしながらインキュベートした。毎時間ごとに、１μＬのｄＮＴＰを用いて反応物をリフレッシュさせた。
【０２８１】
ビーズをプールし、１ｘＢＷＢ緩衝液で３回洗浄した。０．０１％アジ化ナトリウムを用いてビーズを４℃で保存し、使用前に１０ｍＭ  トリスで３回洗浄した。
【０２８２】
また、ビーズ作製が成功したかどうかを測定するための、Ｔ７  ＲＮＡＰを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に、バーコードアダプター鋳型ビーズの少量の分注物を用いた。成功していた場合、Ｔ７  ＲＮＡＰは、ｓ１−オリゴ配列中に存在する二本鎖Ｔ７プロモーターからＲＮＡを転写することができる。Ｍｅｇａｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、メーカーの説明書に従った。５μＬの反応物を、ＲＮＡ  Ｆｌａｓｈｇｅｌ（Ｌｏｎｚａ）に泳動させた。図２０を参照のこと。
【０２８３】
Ｓ１、Ｗ、及びＳ２配列の組み合わせから形成される固有バーコード配列の数は、所望されるように増加または低下させることができる。たとえば、表１に示されるように、固有バーコードの数が、バーコード化される細胞の数よりも約１０倍多い場合（２項分布により決定される）、核酸がお互いにバイオインフォマティック連結される間に、約１０％の細胞が同じバーコードを共有し、それゆえ、破棄されることを予測することができる（これは、たとえば互いに関連づけられた２つのイムノグロブリン重鎖または２つのＴＣＲα鎖等の２以上の可変遺伝子核酸として検出可能である）。したがって、そのようなライブラリーから、約９０％のバーコード化細胞が、互いに適切な核酸のインフォマティクス結合を可能とする固有配列で成功裏にバーコード化されることが予測される。
【０２８４】
従って、必要とされるＳ１ｘ、Ｗ、及びＳ２ｙ配列の数は、バーコード化される細胞の所望される数に依存する。表７において、９６ウェルプレート中でＷ伸長反応が行われることが想定され、及び同数のＳ１ｘ、及びＳ２ｙ配列が用いられている。示されているように、１０００万個の細胞をバーコード化するために、最大で３２３種のＳ１ｘ、及びＳ２ｙオリゴが必要とされ、ならびに９６０種のＷｚオリゴが必要とされる。これらは操作可能な数であり、特に、もし当該反応が９６ウェルプレート中で行われる場合には、所望されるサイズのバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製する反応を行うためには、総数でたった１８個の９６ウェルプレートが必要とされる。
【０２８５】
（表７）所望される数の細胞の核酸をバーコード化するために十分なサイズのバーコードアダプター鋳型ライブラリーを得るために必要とされるＳ１ｘ、ＷＺ、及びＳ２ｙ配列の数。
0006608368.tif 000025
【０２８６】
また、Ｓ１ｘ、Ｗｚ、及びＳ２ｙのバーコードは、最小ハミング距離（この最小値は２である）であるよう、別々に設計されることが望ましい。この最小値の場合、バーコード配列に完全一致した次世代シークエンスのバーコード配列リードのみが用いられる；エラーを伴うバーコード配列リードは破棄される。もし用いられるハミング距離または編集距離が最小値３まで増加する場合、エラー修正が可能である。
【０２８７】
本実施例は、Ｔ７  ＲＮＡＰによるバーコードアダプター増幅のための、Ｔ７  ＲＮＡＰプロモーター配列を用いたバーコードアダプター鋳型ビーズの作製であることに注意されたい。ｅｍＢ−Ｔ７ｂｒｉｄｇｅ２のＴ７  ＲＮＡＰプロモーター配列
0006608368.tif 000026
を、他のＲＮＡＰプロモーター配列と置き換えることにより、他のＲＮＡＰを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばＮｔ．ＢｂｖＣＩの「ＣＣＴ  ＣＡＧ  Ｃ」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ（たとえば、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ）及び鎖置換（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）ＤＮＡＰ（たとえばＫｌｅｎｏｗｅｘｏ−）を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
【０２８８】
Ｄ．実施例４：水性バーコードアダプター鋳型の作製
本実施例において、ビーズに連結されない水性バーコードアダプター鋳型を合成し、本発明方法の広範な応用性を示す。
リアクションミックスは以下のように調整した：
0006608368.tif 000027
【０２８９】
次いで、リアクションミックスを、ウェル当たり２５μＬで９６ウェルＰＣＲプレートに分注し、以下のようにサーモサイクルを行った：
0006608368.tif 000028
【０２９０】
得られたＰＣＲ産物はバーコードアダプター鋳型であり、次いで、Ａオーバーハングを取り除くために平滑化した：
0006608368.tif 000029
【０２９１】
２．５μＬの平滑化ミックスを、各２５μＬの反応量に添加し、１５分間、１２℃でインキュベートした。次いで、１μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを、各２５μＬの反応量に添加し、２０分間、７５℃で加熱し、酵素を不活化させた。
【０２９２】
反応物を洗浄し、定量した：
１．次いで、反応物をプールし、メーカーの説明書に従い、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを用いて洗浄した。
２．Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＤＮＡを定量し、バーコードアダプター鋳型濃度を５５ｎｇ／μＬに調節した。
【０２９３】
本実施例は、Ｔ７  ＲＮＡＰによるバーコードアダプター増幅のための、Ｔ７  ＲＮＡＰプロモーター配列を用いたバーコードアダプター鋳型ビーズの作製であることに注意されたい。ｅｍＢ−Ｔ７ｂｒｉｄｇｅ２のＴ７  ＲＮＡＰプロモーター配列
0006608368.tif 000030
を、他のＲＮＡＰプロモーター配列と置き換えることにより、他のＲＮＡＰを用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。また、プロモーター配列を、たとえばＮｔ．ＢｂｖＣＩの「ＣＣＴ  ＣＡＧ  Ｃ」等のニッキングエンドヌクレアーゼ部位と置き換えることにより、ニッキングエンドヌクレアーゼ（たとえば、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ）及び鎖置換（ｓｔｒａｎｄ−ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）ＤＮＡＰ（たとえばＫｌｅｎｏｗｅｘｏ−）を用いてバーコードアダプターを増幅させることができる。
【０２９４】
Ｅ．実施例５：異なる反応緩衝液中での、バーコードアダプター鋳型のバーコードのｍＲＮＡへの付加
本実施例は、本発明方法が様々な異なる緩衝液中で使用可能であることを示すものである。バーコードアダプター鋳型は実施例４に記述されるように作製された。
【０２９５】
（表８）反応緩衝液の組成
0006608368.tif 000031
【０２９６】
以下の反応を設定した。
0006608368.tif 000032
【０２９７】
上述のものを３分間、５５℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
0006608368.tif 000033
【０２９８】
バーコードアダプター鋳型のバーコードアダプターのＴ７  ＲＮＡＰ線形増幅、逆転写、及びファーストストランドｃＤＮＡへのバーコードの付加を、２時間、４２℃で行った。
0006608368.tif 000034
【０２９９】
上述のものを３分間、５５℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
0006608368.tif 000035
【０３００】
バーコードアダプター鋳型のバーコードアダプターのＴ７  ＲＮＡＰ線形増幅、逆転写、及びファーストストランドｃＤＮＡへのバーコードの付加を、２時間、４２℃で行った。
0006608368.tif 000036
【０３０１】
上述のものを３分間、５５℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
0006608368.tif 000037
【０３０２】
バーコードアダプター鋳型のバーコードアダプターのＴ７  ＲＮＡＰ線形増幅、逆転写、及びファーストストランドｃＤＮＡへのバーコードの付加を、２時間、４２℃で行った。
【０３０３】
次いで、反応物を、改変標準フェノール／クロロホルム法を用いて洗浄した：
１．２００μＬのＴＥ０．１（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各リアクションミックスに添加した。
２．２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ）を各リアクションミックスに添加し、遠心前のＧｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  ｔｕｂｅｓ（５Ｐｒｉｍｅ）中でしっかりと振とうさせた。
３．Ｇｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  ｔｕｂｅｓを、３分間、１４，０００ｇで遠心し、上の水性分画をピペッティングでＡｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へと移し、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
４．次いで、４５０μＬ  ＴＥ（１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）をＡｍｉｃｏｎカラムにピペッティングで入れ、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
５．次いで、４５０μＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）をＡｍｉｃｏｎカラムにピペッティングで入れ、５分間、１４，０００ｇで遠心した。
６．Ａｍｉｃｏｎカラムを新しい採集管へと転倒させ、２分間、１０００ｇで遠心し、精製ｍＲＮＡ／ファーストストランドｃＤＮＡ二本鎖を含有した溶出物を回収した。
【０３０４】
次いで、２ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）を行った。
【０３０５】
（表９）ＰＣＲ１及びＰＣＲ２のプライマー配列
0006608368.tif 000038
【０３０６】
以下のＰＣＲ１  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、ＲＴ反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000039
【０３０７】
次いで、ＰＣＲ１の反応物を５０倍に希釈し、３つの別々のＰＣＲ２反応の鋳型として用いた（１つはκ軽鎖、１つはλ軽鎖、及び１つはγ重鎖）。
【０３０８】
以下のＰＣＲ２  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、ＲＴ反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000040
【０３０９】
５μＬの産物を、ゲルに泳動した（図２１）。示されているように、バーコード化反応は、様々な異なるイオン（たとえばカリウムイオン、アンモニウムイオン、塩化物イオン、硫酸イオン、及び酢酸イオン等）を含有する様々な異なる緩衝液中で良く進行した。
【０３１０】
Ｆ．実施例６：バーコードアダプター鋳型から増幅されたＲＮＡバーコードアダプターは、増幅されていないＤＮＡバーコードアダプターよりも良く機能する
本実施例は、本発明方法が、異なる塩濃度の様々な異なる緩衝液中で使用可能であることを示すものである。また、バーコードアダプター鋳型から生成された増幅ＲＮＡバーコードアダプターを使用すると、ＤＮＡバーコードアダプターを当該反応にただ添加するよりも良く機能する（すなわち、所望される増幅反応産物が得られる）ことから、ＲＮＡバーコードアダプターを用いた反応は、バックグラウンドが低いことが推測される（図４を参照）。バーコードアダプター鋳型は、上述の実施例４の通りに作製された。
【０３１１】
（表１０）追加のオリゴ配列
0006608368.tif 000041
【０３１２】
以下の反応を設定し、緩衝液の組成は表８の通りである。
0006608368.tif 000042
【０３１３】
上述のものを３分間、５５℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
0006608368.tif 000043
【０３１４】
バーコードアダプター鋳型からのバーコードアダプターのＴ７  ＲＮＡＰ線形増幅、逆転写、及びファーストストランドｃＤＮＡへのバーコードの付加は、２時間、４２℃で行われた。
0006608368.tif 000044
【０３１５】
上述のものを３分間、５５℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
0006608368.tif 000045
【０３１６】
バーコードアダプター鋳型からのバーコードアダプターのＴ７  ＲＮＡＰ線形増幅、逆転写、及びファーストストランドｃＤＮＡへのバーコードの付加を、２時間、４２℃で行った。
0006608368.tif 000046
上述のものを３分間、５５℃まで加熱し、次いで、以下を添加した。
0006608368.tif 000047
【０３１７】
逆転写、及びファーストストランドｃＤＮＡへのバーコードの付加は、２時間、４２℃で行われた。
【０３１８】
次いで、改変標準フェノール／クロロホルム法を用いて反応物を洗浄した：
１．２００μＬのＴＥ０．１（１０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を各リアクションミックスに添加した。
２．２００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ）を各リアクションミックスに添加し、遠心前のＧｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  ｔｕｂｅｓ（５Ｐｒｉｍｅ）中でしっかりと振とうさせた。
３．Ｇｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  ｔｕｂｅｓを、３分間、１４，０００ｇで遠心し、上の水性分画をピペッティングでＡｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へと移し、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
４．次いで、４５０μＬ  ＴＥ（１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）をＡｍｉｃｏｎカラムにピペッティングで入れ、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
５．次いで、４５０μＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）をＡｍｉｃｏｎカラムにピペッティングで入れ、５分間、１４，０００ｇで遠心した。
６．Ａｍｉｃｏｎカラムを新しい採集管へと転倒させ、２分間、１０００ｇで遠心し、精製ｍＲＮＡ／ファーストストランドｃＤＮＡ二本鎖を含有した溶出物を回収した。
【０３１９】
次いで、２ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）を行った。
【０３２０】
以下のＰＣＲ１  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、バーコードアダプター鋳型を用いたＲＴ反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000048
【０３２１】
以下のＰＣＲ１  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、ＤＮＡバーコードアダプターを用いたＲＴ反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000049
【０３２２】
次いで、ＰＣＲ１の反応物を５０倍に希釈し、３つの別々のＰＣＲ２反応の鋳型として用いた（１つはκ軽鎖、１つはλ軽鎖、及び１つはγ重鎖）。
【０３２３】
以下のＰＣＲ２  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、ＰＣＲ１反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000050
【０３２４】
５μＬの産物をゲルで泳動した（図２２）。示されているように、バーコード化反応は、異なる塩濃度の緩衝液中で良く進行した。Ｔ７  ＲＮＡＰの塩感受性を理由として、低塩緩衝液（０．５ｘＭＭＬＶ）中で当該反応はより良く進んだ一方、高塩緩衝液（１ｘＭＭＬＶ）中でも進んだ。ＤＮＡバーコードアダプターを用いた際、ＲＴ工程の間、非特異的プライミングにより（図４参照）、非常に高いバックグラウンドが存在し、所望のバンドは不明瞭であったことに注意されたい。
【０３２５】
Ｇ．実施例７：マイクロ流体ドロップレットデバイスを用いて作製されたドロップレットにおける、水性バーコードアダプター鋳型を用いた、細胞由来核酸のバーコード化
単分散エマルションを作製するためのデバイスを用いて、１つの細胞にバーコード化ビーズ及びバーコード化アッセイに必要な他の試薬を封入した。３つのＤｏｌｏｍｉｔｅ  Ｐ−Ｐｕｍｐに、フローセンサーを設置した（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ３２０００１６、３２０００９５、及び３２０００９８）。第一のＰ−Ｐｕｍｐは、当該ラインを２つのインプットに分けるためのＴ−ジャンクションを組み込んだマイクロ流体管を介して、２−Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｃｈｉｐ（Ｄｏｌｏｍｉｔｅ  ３２００２８７）に直接、連結された。これは油のインプットラインとなった。他の２つのＰ−Ｐｕｍｐは、デバイスが操作されている間、試料冷却を維持するために用いられる氷の箱の周囲に巻き付くＰＥＥＫ試料ループに、流体管を介して連結され、これらループの各々は、２−Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｃｈｉｐに連結された。各試料ループはフロントエンドで４方向バルブを組み込み、試料がシリンジにより当該ループ内へとロードされるようにした。第一の試料ループは細胞が充てんされ、一方で、第二のループはＲＴ／バーコード化／溶解ミックスが充てんされた。デバイス構成の例を図１７〜１９に示す。氷の箱は、使用前に氷を充てんした。
【０３２６】
マウスＢ２２０＋Ｂ細胞群にＦＡＣＳソートを行い、懸濁緩衝液として、１０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡとともに３００ｍＭベタインを用いて細胞懸濁液を調製した。細胞は、４，５００細胞／μＬの濃度で使用した。
ＲＴ／水性バーコードミックスは以下のように調製した。
0006608368.tif 000051
【０３２７】
シリンジを用いて、細胞懸濁液を１つの試料ループにロードし、ＲＴ／バーコード化／溶解ミックスを他の試料ループにロードした。細胞及びバーコード濃度は、１つのドロップレット中に複数の細胞またはバーコードが存在してしまうことを最小限としつつ、充分に多量の細胞がバーコードとともに封入されるために十分な高濃度が維持されるように選択された。四方向バルブは、試料ループがポンプと一致し、及び３つ全てのポンプが有効となるように切り替えられた。２つの水性インプットは、それらが１：２（細胞懸濁液：ＲＴ／バーコード化／溶解ミックス）の比率で混合される速度で流れた。当該水性インプット及び油性インプットは、直径が約５０μｍのドロップレットが形成される速度で流れ、及び細胞が当該デバイスを通過して流れるために十分に早い速度で流れた。エマルションは、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ０．２ｍＬ  ＰＣＲ管中に採取された。試料が生成された後、最初に前加熱工程（５５℃で３分）が行われ、次いで、４２℃で２時間インキュベートされ、反応を進ませた。反応の後、エマルションは、以下に記述される「非ビーズエマルションを破壊する」プロセスを用いて壊された。これにより、次なるＰＣＲ増幅及び配列解析のための精製ｃＤＮＡ試料が作製された。
【０３２８】
非ビーズエマルションは以下のように破壊された：
１．２００μＬのＴＥ、４００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、８００μＬのクロロホルムを、遠心前のＧｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ管にピペッティングで入れた。
２．各試料を、対応するＧｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ管にピペッティングで入れた。
３．管を、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
４．水層を、１００ｋＤａのＡｍｉｃｏｎチューブ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にピペッティングで入れた。
５．管を、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
６．４５０μＬのＴＥを、当該Ａｍｉｃｏｎチューブにピペッティングで入れた。
７．管を、３分間、１４，０００ｇで遠心した。
８．４５０μＬの１０ｍＭトリスを、当該Ａｍｉｃｏｎチューブにピペッティングで入れた。
９．管を、５分間、１４，０００ｇで遠心した。
１０．Ａｍｉｃｏｎチューブを、新しい採取管に転倒して置いた。
１１．管を、２分間、１，０００ｇで遠心した。
【０３２９】
次いで、表９に列記されるいくつかのプライマー配列に加え、以下のプライマーを用いて、２ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）を行った。
【０３３０】
（表１１）マウスイムノグロブリン遺伝子のＰＣＲに対する追加プライマー
0006608368.tif 000052
【０３３１】
以下のＰＣＲ１  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、バーコードアダプター鋳型を用いたＲＴ反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000053
【０３３２】
次いで、ＰＣＲ１の反応物を５０倍に希釈し、３つの別々のＰＣＲ２反応の鋳型として用いた（１つはκ軽鎖及びλ軽鎖、１つはμ重鎖、及び１つはγ重鎖）。
【０３３３】
以下のＰＣＲ２  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを、ＰＣＲ１反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000054
５μＬのＰＣＲ産物をゲルで泳動した（図２３）。κ及びλ軽鎖に相当するバンド、及びμ重鎖に相当するバンドは明確に確認された。Ｂ２２０＋Ｂ細胞のほとんどがナイーブＢ細胞（ＩｇＭ＋である）であることが予測されたため、μ重鎖のみが増幅された。
【０３３４】
次いで、増幅されたイムノグロブリン重鎖及び軽鎖が精製され、次世代シークエンス（たとえば、限定されないが、４５４シークエンス）のために調製された。本実施例では反応容器当たり、＞１個のコピー濃度でバーコードアダプター鋳型を用いたため、固有バーコードよりも、固有バーコードセットが各反応容器中の核酸に組み込まれる。対形成したイムノグロブリン重鎖と軽鎖は、固有バーコードではなく、固有バーコードセットを共有することにより互いに関連づけられる。
【０３３５】
また、限界希釈することにより、バーコードアダプター鋳型を含有する反応容器の大部分が、反応容器当たり１コピーで鋳型を含有する濃度で、バーコードアダプター鋳型を用いてもよい。この場合、対形成したイムノグロブリン重鎖と軽鎖は、固有バーコード配列を共有することにより互いに関連づけられる。
【０３３６】
Ｈ．実施例８：マイクロ流体ドロップレットデバイスを用いて作製されたドロップレット中における、バーコードアダプター鋳型ビーズを用いた細胞由来核酸のバーコード化
本実施例では、実施例に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態について記述する。実施例７に記述されるドロップレットを作製するためのマイクロ流体デバイスを用いる（第一の試料ループが、細胞、及び実施例１、２、または３で作製されたバーコードアダプター鋳型ビーズの両方を含有した点が唯一の差異である）。
【０３３７】
マウスＢ２２０＋Ｂ細胞群にＦＡＣＳソートを行い、懸濁緩衝液として、１０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡとともに３００ｍＭベタインを用いて、細胞及びバーコードアダプター鋳型ビーズの懸濁液を調製する。細胞は、４，５００細胞／μＬの濃度で含有され、ビーズは、６０，０００ビーズ／μＬの濃度で使用される。
【０３３８】
ＲＴミックスは以下のように調製する。
0006608368.tif 000055
【０３３９】
シリンジを用いて、細胞及びバーコード化ビーズの懸濁液を、１つの試料ループ中にロードし、ＲＴ／バーコード化／溶解ミックスを他の試料ループ中にロードする。四方向バルブは、試料ループがポンプと一致し、及び３つ全てのポンプが有効となるように切り替えられる。２つの水性インプットは、それらが１：２（細胞及びビーズ懸濁液：ＲＴ／バーコード化／溶解ミックス）の比率で混合される速度で流れる。当該水性インプット及び油性インプットは、直径が約５０μｍのドロップレットが形成される速度で流れ、ならびに細胞及びビーズが当該デバイスを通過して流れるために十分に早い速度で流れる。エマルションは、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ０．２ｍＬ  ＰＣＲ管中に採取される。試料が生成された後、最初に加熱工程（５５℃で３分）が行われ、次いで、４２℃で２時間インキュベートし、ＲＴ／バーコード化反応を進ませる。バーコード化反応の後、エマルションは、実施例７に記述される「非ビーズエマルションを破壊する」プロセスを用いて壊される。次なるＰＣＲ反応は、実施例７にあるとおりに行われる。
【０３４０】
増幅されたイムノグロブリン重鎖及び軽鎖は精製され、次世代シークエンスのために調製される（たとえば、限定されないが４５４シークエンス等）。本実施例は、反応容器当たり、約１個のビーズで、バーコードアダプター鋳型ビーズを使用するため、対形成されるイムノグロブリン重鎖と軽鎖は、固有バーコード配列の共有使用により対形成される。
【０３４１】
Ｉ．実施例９：ＤＮＡポリメラーゼを用いてバーコードアダプター鋳型ビーズをから増幅された、バーコードアダプターを用いた細胞の核酸のバーコード化
本実施例では、実施例に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態について記述する。実施例７に記述されるドロップレットを作製するマイクロ流体デバイスを用いる（第一の試料ループが、細胞、及び実施例１、２、または３で作製されたバーコードアダプター鋳型ビーズの両方を含有した点が唯一の差異である）。本実施例において、バーコードアダプター鋳型ビーズは、Ｔ７  ＲＮＡＰプロモーター配列ではなく、５'Ｎｔ．ＢｂｖＣＩニッキングエンドヌクレアーゼ配列を含有し、それにより、ＤＮＡポリメラーゼによるバーコードアダプターの増幅が可能となる。
【０３４２】
マウスＢ２２０＋Ｂ細胞群にＦＡＣＳソートを行い、懸濁緩衝液として、１０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡとともに３００ｍＭベタインを用いて、細胞及びバーコードアダプター鋳型ビーズの懸濁液を調製した。細胞は、４，５００細胞／μＬの濃度で含有され、ビーズは、６０，０００ビーズ／μＬの濃度で使用される。
【０３４３】
ＲＴミックスは以下のように調製する。
0006608368.tif 000056
【０３４４】
シリンジを用いて、細胞及びバーコード化ビーズの懸濁液を、１つの試料ループ中にロードし、ＲＴ／バーコード化／溶解ミックスを他の試料ループ中にロードする。四方向バルブは、試料ループがポンプと一致し、及び３つ全てのポンプが有効となるように切り替えられる。２つの水性インプットは、それらが１：２（細胞及びビーズ懸濁液：ＲＴ／バーコード化／溶解ミックス）の比率で混合される速度で流れる。当該水性インプット及び油性インプットは、直径が約５０μｍのドロップレットが形成される速度で流れ、ならびに細胞及びビーズが当該デバイスを通過して流れるために十分に早い速度で流れる。エマルションは、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ０．２ｍＬ  ＰＣＲ管中に採取される。試料が生成された後、最初に加熱工程（５５℃で３分）が行われ、次いで、４２℃で２時間インキュベートし、ＲＴ／バーコード化反応を進ませる。バーコード化反応の後、エマルションは、実施例７に記述される「非ビーズエマルションを破壊する」プロセスを用いて壊される。次なるＰＣＲ反応は、実施例７にあるとおりに行われる。
【０３４５】
増幅されたイムノグロブリン重鎖及び軽鎖は精製され、次世代シークエンスのために調製される（たとえば、限定されないが４５４シークエンス等）。本実施例は、反応容器当たり、約１個のビーズで、バーコードアダプター鋳型ビーズを使用するため、対形成されるイムノグロブリン重鎖と軽鎖は、固有バーコード配列の共有使用により対形成される。
【０３４６】
Ｊ．実施例１０：マルチウェルの反応容器中における、バーコードアダプター鋳型を用いた、細胞の核酸のバーコード化
本実施例は、実施例に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態について記述する。図１の組成を有するバーコードアダプター鋳型を、ベンダー（たとえば、ＩＤＴ）から、二本鎖オリゴとして合成する。各固有バーコードアダプター鋳型を、異なる保管容器中に保管し、バーコード配列の混合、または相互汚染を防ぐ。活性化Ｂ細胞（形質芽細胞）は、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いて、９６ウェルプレートのすべてのウェルへ、１０μＬの溶解緩衝液中にソートされた単一細胞である。各ウェルの緩衝液の組成は以下である。
0006608368.tif 000057
【０３４７】
次いで、プレートを３分間、５５℃でインキュベートし、その後、ＲＴ／バーコード化反応を発生させるために２時間、４２℃でインキュベートする。次いで、９６ウェルプレートのすべてのウェルにおける反応物をともにプールし、改変標準フェノール／クロロホルム法を用いて洗浄を行った。
１．４００μＬのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（Ｓｉｇｍａ）を添加し、遠心前のＧｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  ｔｕｂｅｓ（５Ｐｒｉｍｅ）中でしっかりと振とうさせる。
２．Ｇｅｌ  Ｐｈａｓｅ  Ｌｏｃｋ  ｔｕｂｅｓを、３分間、１４，０００ｇで遠心し、上の水性分画をピペッティングでＡｍｉｃｏｎ  １００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へと移し、３分間、１４，０００ｇで遠心する。
３．Ａｍｉｃｏｎカラムを通過する全水量を採取するために必要に応じて、工程２を繰り返す。
４．次いで、４５０μＬ  ＴＥ（１０ｍＭ  トリス、ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）をＡｍｉｃｏｎカラムにピペッティングで入れ、３分間、１４，０００ｇで遠心する。
５．次いで、４５０μＬの１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）をＡｍｉｃｏｎカラムにピペッティングで入れ、５分間、１４，０００ｇで遠心する。
６．Ａｍｉｃｏｎカラムを新しい採集管へと転倒させ、２分間、１０００ｇで遠心し、精製ｍＲＮＡ／ファーストストランドｃＤＮＡ二本鎖を含有した溶出物を回収する。
【０３４８】
以下のＰＣＲ１  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを設定する。
0006608368.tif 000058
【０３４９】
次いで、ＰＣＲ１の反応物を５０倍に希釈し、３つの別々のＰＣＲ２反応の鋳型として用いる（１つはκ軽鎖、１つはλ軽鎖、及び１つはγ重鎖）。
【０３５０】
以下のＰＣＲ２  Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）リアクションミックスを設定する。
0006608368.tif 000059
【０３５１】
増幅されたイムノグロブリン重鎖及び軽鎖は精製され、次世代シークエンスのために調製される（たとえば、限定されないが４５４シークエンス等）。本実施例は、各反応容器（この場合、９６ウェルプレートのウェル）に個々にピペッティングで入れた固有バーコードアダプター鋳型を用いるため、対形成されるイムノグロブリン重鎖と軽鎖は、固有バーコード配列の共有使用にとって、生物情報工学的に対形成される。
【０３５２】
Ｋ．実施例１１：マイクロ流体ドロップレットデバイスを用いて作製されるドロップレット中における、バーコードアダプター鋳型ビーズを用いた、細胞の核酸のバーコード化
以下に記述される方法を用いて、各ビーズに固有バーコードアダプター鋳型を付加するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が行われるエマルションＰＣＲを用いて、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製した（図１５を参照）。
【０３５３】
（表１２）１回の反応でバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製するために用いられるオリゴ
0006608368.tif 000060
【０３５４】
ストレプトアビジンでコートされたＭ−２７０  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ビオチニル化オリゴヌクレオチド（「ｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅＩｓｃｅＩ」）と連結させた。
１．ビーズを穏やかにかき混ぜることにより再懸濁した。
２．１ｍＬのＭ２７０ビーズ（およそ２ｘ１０９個のビーズ）を３つの１．５ｍＬマイクロチューブの各々に入れ、トータルで３ｍＬとした。
３．磁石上に３分間置いた。
４．上清を各チューブから取り除き、１ｍＬ（１ｘ量）のＢｉｎｄ／Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＢＷＢ；１Ｍ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  トリス、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁した。
５．工程４を２回以上繰り返し、次いで、５４０μＬ量のＢＷＢに最終的に再懸濁した。
６．１００μＭのｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅ２を６０μＬ、ビーズに添加し、１５分間、穏やかに回転させながらインキュベートした。
７．インキュベーションの後、ビーズを１ｍＬのＢＷＢ緩衝液を用いて３回洗浄し、１つの試験管に混合した。
８．０．０１％アジ化ナトリウムを用いて、ビーズを４℃で保存した。
９．１０ｍＭのトリスを用いて、使用する前に３回ビーズを洗浄した。
【０３５５】
エマルションベースＰＣＲにおいて、バーコードオリゴヌクレオチドならびにフォワードプライマー及びリバースプライマーを、上述の連結ビーズに添加した。
１．以下のＰＣＲミックス（総量で３ｍＬ）を、３つの１．５ｍＬ微小遠心管（ＶＷＲ  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ２０１７０−６５０）中で調製した。
0006608368.tif 000061
２．油−界面活性剤混合物を調製した（総量２０ｍＬ）。
ａ．ミネラルオイル（Ｓｉｇｍａ）   １８．４ｍＬ
ｂ．ＥＭ９０（Ｅｖｏｎｉｋ）        １．６ｍＬ
３．８００μＬの油−界面活性剤混合物、及び２００μＬのＰＣＲミックスを、１２個のＡｘｙｇｅｎ  ２．０ｍＬ  Ｍａｘｙｍｕｍ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ円錐底微小遠心管（ＭＣＴ−２００−Ｌ−Ｃ）の各々で混合した。管を密封し、３秒間振とうした。
４．管をＱｉａｇｅｎ  ＴｉｓｓｕｅＬｙｚｅｒ  ＩＩに置き、１４Ｈｚで５分間振とうした。
５．エマルションをＶＷＲ  ９６−ｗｅｌｌ  ＰＣＲプレート（８３００７−３７４）のウェルに分注した（ウェル当たり、１６０μＬのエマルションを添加した）。
６．管を、以下のプログラムを用いてサーモサイクルを行った。
0006608368.tif 000062
【０３５６】
エマルションを壊し、ビーズを回収した。
１．ＰＣＲプレートの内容物を１．５ｍＬの微小遠心管（ＶＷＲ  ２０１７０−６５０）に移した（遠心管当たり、０．５ｍＬ以下のエマルション量）。
２．１００μＬの１μＭ  ｅｍＢ＿Ｔ７ｂｒｉｄｇｅｆｒｅｅＩｓｃｅＩ＿２プライマーを各遠心管に添加した。
３．管にイソブタノールを満たし、密封して、混合するためにしっかりと振とうした。
４．管を１４，０００ｒｐｍで１分間遠心した。
５．管を磁気ストライプ上に置き、ビーズを遠心管の側面に引き寄せて、次いで、できるだけ多量の上清を吸引し、沈殿ビーズは管に残した。
６．１ｍＬのイソブタノールを添加し、残留した油／エマルションがイソブタノールに分散されるまで、ピペッティングにより上下させて良く混合した。
７．磁気ストライプ上に管を置き、管の側面にビーズを引き寄せ、次いで、イソブタノールを吸引した。磁石上でビーズを集める時間を考慮し、最初に上清を吸引した管に、他の管の全量を移して混合させ、次いで上清を吸引し、それを繰り返すことにより、すべての管のビーズを１本の遠心管へと混合した。
８．１ｍＬの新鮮なイソブタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
９．イソブタノールを吸引した。
１０．１ｍＬの１００％エタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１１．エタノールを吸引した。
１２．工程１０と工程１１を繰り返した。
１３．１ｍＬの７０％エタノールを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１４．エタノールを吸引した。
１５．工程１３と工程１４を繰り返した。
１６．１ｍＬのＰＢＳを添加し、よく混合し、６０秒間置いた。
１７．ＰＢＳを吸引した。
１８．工程１６と工程１７を繰り返した。
【０３５７】
次いで、ｅｍＢ＿ＩｓｃｅＩ＿ＲＶリバースプライマーへと組み込まれたＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７色素からの蛍光を利用し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩを用いて、バーコードアダプター鋳型を組み込んだビーズを、バーコード化されていないビーズからソーティングした。
【０３５８】
４℃での保管のため、０．０１％アジ化ナトリウム中でビーズを保存した。図１７〜１９に示され、及び実施例７に記述されるマイクロ流体デバイスを用いて、１つの細胞にバーコード化ビーズ及びバーコード化アッセイに必要な他の試薬を封入した。ＣＤ１９＋ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞群をＦＡＣＳソートし、完全ＩＭＤＭ培地（ＩＭＤＭ＋１０％  ＦＢＳ＋１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−２１、５０ｎｇ／ｍＬ  ＣＤ４０Ｌ、５μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ４０Ｌ  ｍＡｂ、及び１ｘ  Ｎｏｒｍｏｃｉｎ）中で６日間、培養し、その後、１０ｍＭ  ＮａＣｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡとともに３００ｍＭベタインを懸濁緩衝液として用いて、細胞懸濁液を調製した。細胞は、２，５００細胞／μＬの濃度で用いられ、バーコード化ビーズは、１００，０００ビーズ／ｕＬの濃度で用いられた。
【０３５９】
ＲＴ／水性バーコードミックスは、以下のように調製された。
0006608368.tif 000063
【０３６０】
シリンジを用いて、細胞懸濁液を１つの試料ループにロードし、ＲＴ／バーコード化／溶解ミックスを他の試料ループにロードした。細胞及びバーコード濃度は、１つのドロップレット中に複数の細胞またはバーコードが存在してしまうことを最小限としつつ、細胞とビーズが懸濁液と同じ速度で管を通って移動しないことに留意しつつ、効果的に希釈され、充分に多量の細胞がバーコードとともに封入されるために十分な高濃度が維持されるように選択された。四方向バルブは、試料ループがポンプと一致し、及び３つ全てのポンプが有効となるように切り替えられた。２つの水性インプットは、それらが１：２（細胞懸濁液：ＲＴ／バーコード化／溶解ミックス）の比率で混合される速度で流れた。当該水性インプット及び油性インプットは、直径が約１５０μｍのドロップレットが形成される速度で流れた（具体的には、１μＬ／分（細胞／ビーズ懸濁液ライン）、２μＬ／分（ＲＴミックスライン）、３μＬ／分（油性ライン））。エマルションは、Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ０．２ｍＬ  ＰＣＲ管中に採取された。試料が生成された後、最初に前加熱工程（５０℃で３分）が行われ、次いで、４２℃で２時間インキュベートされ、反応を進ませた。反応の後、エマルションは、以下に記述されるプロトコールを用いて壊された。これにより、次なるＰＣＲ増幅及び配列解析のための精製ｃＤＮＡ試料が作製された。
【０３６１】
以下の手順を用いて、エマルションを破壊し、産物を回収した：
１．Ｐｈａｓｅ  ｌｏｃｋ管（５Ｐｒｉｍｅ）を遠心し、ゲルを底に押し下げた。
２．試料、及び２００μＬ  ＴＥ緩衝液、４００μＬフェノールクロロホルム混合液、８００μＬクロロホルムを、各ｐｈａｓｅ  ｌｏｃｋ管に添加した。
３．管を１４，０００ｇで３分間、遠心した。
４．水層を第二の遠心前のｐｈａｓｅ  ｌｏｃｋ管へと移し、等量のフェノールクロロホルムを加えた。
５．管を１４，０００ｇで３分間、遠心した。
６．４５０μＬのＴＥをＡｍｉｃｏｎフィルターに加えた。
７．工程５及び６を繰り返した。
８．４５０μＬの１０ｍＭトリスをＡｍｉｃｏｎフィルターに加えた。
９．工程５を繰り返した。
１０．次いで、各フィルターユニットを新たな採集管に転倒させて置いた。
１１．管を２分間、１０００ｇで遠心し、清浄化された試料を採集管内へと集めた。
【０３６２】
次いで、表１３に列記された数種のプライマー配列に加え、以下のプライマーを用いて２ラウンドのＰＣＲ（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２）を行った。
【０３６３】
（表１３）
0006608368.tif 000064
【０３６４】
以下のＰＣＲ１  Ｑ５（ＮＥＢ）リアクションミックスを、バーコードアダプター鋳型を用いたＲＴ反応ごとに設定した。
0006608368.tif 000065
【０３６５】
次いで、ＰＣＲ１の反応物を、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で２５倍に希釈し、２つの別々のＰＣＲ２反応の鋳型として用いた（１つはκ軽鎖及びλ軽鎖、ならびに１つはγ重鎖）。
【０３６６】
以下のＰＣＲ２  Ｑ５（ＮＥＢ）リアクションミックスを、ＰＣＲ１反応ごとに設計した。
0006608368.tif 000066
【０３６７】
１０μＬのＰＣＲ産物をゲルで泳動した（図２４）。κ軽鎖とλ軽鎖に相当するバンド、ならびにγ重鎖に相当するバンドは明白に確認された。
【０３６８】
４５４  ＬｉｂＡシークエンスアダプターを付加するために、２つの４サイクルＰＣＲ反応を、重鎖及び軽鎖のアンプリコンに対して別々に行った。ＬｉｂＰＣＲ１において、「Ａ」アダプターは、アンプリコンの５'末端に付加され、「Ｂ」アダプターは、３'末端に付加された：ＬｉｂＰＣＲ２では逆に付加された。ＬｉｂＰＣＲの詳細は以下であり、ＬｉｂＰＣＲ１で用いられたＬｉｂ１−ＦＲプライマーミックス、及びＬｉｂＰＣＲ２で用いられたＬｉｂ２−ＦＲミックス、ならびにプライマーは、表１４に列記する。
0006608368.tif 000067
【０３６９】
（表１４）
0006608368.tif 000068
【０３７０】
次いで、メーカーの説明書に従い、０．６８：１のビーズ：ＤＮＡの比率を用いたＡｍｐｕｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）のビーズクリーンアップ、及びメーカーの説明書に従い、Ｆｌａｓｈｇｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙゲル（Ｌｏｎｚａ）を用いたゲル精製の両方を用いて、アンプリコンを精製した。
【０３７１】
次いで、アンプリコンを、メーカーの説明書に従い、Ｋａｐａ  ｑＰＣＲライブラリー定量（ＫＡＰＡ）を用いて定量し、適切な量の重鎖と軽鎖のアンプリコンライブラリーを、４５４エマルションＰＣＲに用いて、エマルションを破壊し、単一的に増幅された４５４ビーズを、メーカーの説明書に従い、配列解析のために４５４シークエンサーにロードした。Ａアダプター及びＢアダプターの両方ともが、アンプリコンの５'末端及び３'末端の両方に付加されているため、両方向からの配列解析が可能であり、フォワード及びリバースの両方のリードを得られた。
【０３７２】
配列解析は、標準的な４５４の実行から作製され、得られた配列を解析したが、他の次世代シークエンスプラットフォームも同様に用いることができる。
【０３７３】
配列は、コンピュータープログラムを書き出すことにより解析された。コンピュータープログラムは、４５４ピコ力価プレート領域からの配列リードに対して、以下の工程を行った。領域１の配列は、上述のように作製された重鎖ライブラリーから得られた。領域２の配列は、上述のように作製された軽鎖ライブラリーから得られた。各リードに対し、２つのグローバル−ローカルアライメントをコンピューターで計算し、表１５の配列Ｔ２'及びＴ１に合致する副配列を有するストランドを決定した。グローバル−ローカルアライメントは、合致を０、合致しないを−１として採点し、ならびにギャップオープンペナルティ、及びギャップ伸長ペナルティを−１として使用した。スコアは−４より大きいことが必要であり、さもなければリードは破棄された。重鎖領域に対しては、８４１ｘ１０３個のリードのうち、６１１ｘ１０３個が、アライメントスコア制限を満たした。軽鎖領域に対しては、８５６ｘ１０３個のリードのうち、６１７ｘ１０３個が、アライメントスコア制限を満たした。グローバル−ローカルアライメントに基づき、ＤＮＡバーコードの配列を、リードから抽出した。アライメントスコア制限を満たした重鎖領域リードに関しては、３９７ｘ１０３個のリードが、予測パターンと一致したバーコード配列を有し、順守（ｏｂｓｅｒｖｅｄ）バーコードを有すると指定された。アライメントスコア制限を満たした軽鎖領域リードに対しては、４３７ｘ１０３個のリードが予測パターンと一致したバーコード配列を有し、順守バーコードを有すると指定された。
【０３７４】
同じＤＮＡバーコード配列を有するリードは、アセンブリのために一緒にグループ化された。同じバーコードを有するリードのグループは、４５４アセンブラーであるｎｅｗｂｌｅｒを用いてアセンブリされた。領域２の配列と同じバーコード配列を有する領域１の配列に対する、アセンブリコンセンサス配列は、重鎖と軽鎖のペアセットにグループ化された。
【０３７５】
重鎖と軽鎖のペアセットは、Ｂ細胞、またはエマルションＲＴバブル中に存在するＢ細胞から誘導された重鎖配列及び軽鎖配列を包含した。
【０３７６】
重鎖と軽鎖のリードのペアセットのうち、２，５５１個が、重鎖領域から少なくとも１０個のリードを有し、軽鎖領域から少なくとも１０個のリードを有していた。そのような２，５５１ペアのうち、１，８２０個が、ただ１つの重鎖と、ただ１つの軽鎖にアセンブリされた。それらペアのうち６１個が、作製された配列の全データセットの中で、固有の重鎖と軽鎖を有していることが見いだされた。
【０３７７】
共有バーコード
0006608368.tif 000069
を有する、バーコード化重鎖と軽鎖のリードから作製された、重鎖配列と軽鎖配列のペアの例は
0006608368.tif 000070
（重鎖アミノ酸配列）と、
0006608368.tif 000071
（軽鎖アミノ酸配列）である。
【０３７８】
解析結果から、Ｂ細胞由来の重鎖と、Ｂ細胞由来の対応する軽鎖とを関連づける能力が示される。
【０３７９】
（表１５）Ｂ細胞由来のリードにおいて、ＤＮＡバーコードを特定するために用いられた配列。
0006608368.tif 000072
【０３８０】
Ｌ．実施例１２：マイクロ流体ドロップレットデバイスを用いて作製されたドロップレット中における、バーコードアダプター鋳型ビーズを用いた、細胞の核酸のバーコード化
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーは、実施例１１にあるように調製される（ｅｍＢ＿ＢＣｂｒｉｄｇｅＩＳｃｅＩ＿２が、ｅｍＢ＿ＢＣｂｒｉｄｇｅＩＳｃｅＩ＿Ｎで置き換えられ、ｅｍＢ＿ＩｓｃｅＩ＿ＲＶが、ｅｍＢ＿ＩＳｃｅＩ＿ＲＶ＿ｎで置き換えられている点を除く）。ｅｍＢ＿ＩＳｃｅＩ＿ＲＶ＿ｎは、固有の分子識別子（ＵＭＩ）を含有し、それにより、調製される際、バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーは、固有試料バーコード、及びランダムＨ（Ａ、Ｃ、Ｔヌクレオチド）オクトマー（ｏｃｔｏｍｅｒ）ＵＭＩを各々有するビーズを含有し、異なるＵＭＩで個々のｍＲＮＡ分子をバーコード化する。
【０３８１】
（表１６）１回の反応で、試料バーコード及びＵＭＩを有するバーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを作製するために用いられた追加のオリゴ。
0006608368.tif 000073
【０３８２】
実施例１１に記述されるように、バーコード化反応のために、細胞はビーズとともにドロップレット中に封入される（活性化記憶Ｂ細胞ではなくＰＢＭCが用いられている点、及び使用されたオリゴ（ｄＴ）が、
0006608368.tif 000074
の配列を有するオリゴｄＴ＿ｎである点は異なる）。次いで、エマルションは、実施例１１に記述されるように破壊される。
【０３８３】
次いで、１ラウンドのＰＣＲが以下のプライマーを用いて行われる。
【０３８４】
（表１７）
0006608368.tif 000075
【０３８５】
以下のＰＣＲ  Ｑ５（ＮＥＢ）リアクションミックスを反応ごとに用いて、マルチ反応が設計され、各反応は、以下を用いるための最適なサイクル数を見出すために、１５〜２６サイクルの間の異なるサイクル数で行われる。
0006608368.tif 000076
【０３８６】
５μＬのＰＣＲ産物をゲルに泳動し、適量の産物が得られ、かつ過剰サイクルではないサイクル数を、次の下流工程で用いる。
【０３８７】
次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａのペアエンドシークエンスキットに従い、産物を調製し、フォワード末端をＩｌｌｕｍｉｎａハイスループットシークエンサーで配列解析したが、他のシークエンスプラットフォームも同様に用いることができる。配列が作製され、解析される。次いで、試料バーコードを用いて、個々の細胞にリードを割り当て、次いで、ＵＭＩを用いて、当分野に公知の方法（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１４  Ｆｅｂ；１１（２）：１６３−６．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．２７７２．  Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｄｅｃ  ２２）を用いて、単一細胞ＲＮＡ配列解析を行う。
【０３８８】
Ｍ．実施例１３：コンビナトリアル生成バーコードを用いたバーコードアダプター鋳型の合成
バーコードアダプター鋳型ビーズライブラリーを、本実施例で合成した。
【０３８９】
バーコード含有オリゴ（図１５を参照）を、２つのオリゴ（ＢＣ＿ｐａｒｔ１＿ｓｅｎｓｅ及びＢＣ＿ｐａｒｔ２＿ｔｙｐｅ（１、２、または３）＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）からコンビナトリアルに合成した。各ＢＣ＿ｐａｒｔ１＿ｓｅｎｓｅ及びＢＣ＿ｐａｒｔ２＿ｔｙｐｅ（１、２または３）＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅオリゴは、それぞれ、固有配列の「バーコードパート１」及び「バーコードパート２」を含有する。組み合わされたこれら配列は、固有バーコード配列を生成する。「バーコードパート１」及び「バーコードパート２」は、Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ＤＮＡ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  Ｈａｍｍｉｎｇ  ｃｏｄｅｓ，  Ｂｙｓｔｒｙｋｈ  ２０１２  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１２  ７：  ｅ３６８５２の方法に従い、それぞれ、（１６，１１）と（１２，７）のハミングコードである。したがって、設計されたバーコードは、エラー訂正を行う。
【０３９０】
また、ＢＣ＿ｐａｒｔ２オリゴは、３つのタイプ（ＢＣ＿ｐａｒｔ２＿ｔｙｐｅ１＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ、ＢＣ＿ｐａｒｔ２＿ｔｙｐｅ２＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ、及びＢＣ＿ｐａｒｔ２＿ｔｙｐｅ３＿ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）に分けられる。これにより、３つの異なる非ミスプライミングリバースプライマー（Ｒｖ＿ｔｙｐｅ１、Ｒｖ＿ｔｙｐｅ２、及びＲｖ＿ｔｙｐｅ３）を有するバーコードアダプター鋳型の作製するための増幅が可能となる。これらリバースプライマーの各々が異なる蛍光色素分子に共有結合される場合、作製されたバーコードアダプター鋳型ビーズは、異なる色の蛍光色素分子を介して特定されることができる。さらに、２以上のタイプのバーコード型を有するバーコードアダプター鋳型ビーズは、２以上の色で蛍光を発する。本実施例のバーコードアダプター鋳型ビーズは、限界希釈を利用してｅｍＰＣＲにて作製され、必要とされるプライマーとともに、１つのバーコードを含有するオリゴを有するビーズがドロップレット中に入る。ポアソン統計から、ごく一部のドロップレットが、２以上のバーコードを含有するオリゴを含有すること、事実上、非モノコードのバーコードアダプター鋳型ビーズが生成されることを示している。異なるタイプのバーコードアダプター鋳型ビーズを、異なる色で蛍光発色させ、その後に単一色ビーズのＦＡＣＳソーティングを行うことにより、バーコードアダプター鋳型ビーズのｅｍＰＣＲ生成を介して得られるモノコードのビーズの割合が大幅に上昇する。
【０３９１】
（表１８）コンビナトリアルに生成されたバーコード−配列
0006608368.tif 000077
［バーコードパート１］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７〜４５１２６；［バーコードパート２］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５１２７〜４７５６１。
【０３９２】
バーコード含有オリゴは、表１９の条件、及び以下のサーモサイクル条件を用いてＰＣＲで作製された：
９４℃で２分間、５３℃で２時間、９４℃で１５秒間、５３℃で３０秒間、６８℃で２０秒間を７サイクル、次いで、６８℃で１分間ののち、１０℃で維持。
反応物は、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーンアップ及び濃縮キットを用いて清浄化され、Ｑｕｂｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて濃度定量された。
【０３９３】
（表１９）バーコード含有オリゴを作製するためのマスターミックス
0006608368.tif 000078
【０３９４】
８２ｂｐのサイズのバーコード含有オリゴがゲルで確認された（図２５、上側左）。
【０３９５】
９．８μｍのＳｕｐｅｒＡｖｉｄｉｎマイクロスフィアビーズ（Ｂａｎｇ'ｓ  Ｌａｂ）に、ビオチニル化ＳＡＶ−ビーズ−リンカーオリゴを結合させた。１５００万個のビーズを、６０μＬの１０μＭオリゴとともに１時間インキュベートし、次いで、ＢＷＢ緩衝液（１Ｍ  ＮａＣｌのＴＥ溶液）を用いて３回洗浄し、次いで、１０ｍＭトリスで３回洗浄し、連結ＳＡＶ＿ビーズ＿リンカービーズを作製した。
【０３９６】
バーコードアダプター鋳型ビーズを作製するためのｅｍＰＣＲは以下のように行った。
【０３９７】
（表２０）バーコードアダプター鋳型ビーズを作製するためのマスターミックス
0006608368.tif 000079
【０３９８】
エマルションは、表２０のマスターミックスとエマルション油を振とうさせることにより作製した。エマルション油の内容は、１０ｍＬ  ＡＲ２０シリコンオイル（Ｓｉｇｍａ）、７．５ｍＬ  ７２２５Ｃ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ａｉｄ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）、７．５ｍＬ  ０７４９  Ｒｅｓｉｎ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）及び０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）であった。１２ｍＬのエマルション油を、４ｍＬのモックミックス（表２０のオリゴ、プライマー、及び酵素が無い）とともに、ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ）中で、５分間、３０Ｈｚで振とうさせ、次いで、４ｍＬのマスターミックスを添加した後、５分間、１２Ｈｚで振とうさせた。これにより、ほとんどが直径３０〜８０μｍの大きなドロップレットが得られた。サーモサイクルの条件は、以下であった。
0006608368.tif 000080
【０３９９】
エマルションは、ブレーキングミックス１、次いでブレーキングミックス２を用いて洗浄することにより破壊した後、次いで、７０％エタノールで洗浄し、ＴＥで洗浄した。ビーズは、０．００１％  Ｔｗｅｅｎ２０のＴＥ溶液中に再懸濁した。
0006608368.tif 000081
【０４００】
ビーズをＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｊａｚｚに流し、明るく、単色のビーズをソートした（図２５、右側）。実施例１４のバーコード化反応を行い、ビーズが、ＲＮＡバーコード化のためのバーコードアダプターとして使用可能であることを証明した（当該反応が、ＰＣＲチューブ中の複数のビーズ、及び精製ＰＢＭＣ  ＲＮＡを用いたオープンＰＣＲで行われた点を除く）。図２５、下段の左側に示されているように、ビーズが、ＲＮＡバーコード化のためのバーコードアダプター鋳型として実際に使用可能であることを示すバンドが得られた。
【０４０１】
Ｎ．実施例１４：様々な量のドロップレット中における、バーコードアダプター鋳型ビーズを用いた、Ｔ細胞由来の核酸のバーコード化
凍結保存されたＰＢＭＣを溶解し、ＡＩＭ  Ｖ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、一晩、３００万個の細胞／ｍＬの密度でインキュベートした。次いで、Ｔ細胞を、メーカーの説明書に従い、ＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いた磁気活性化細胞ソーティング（ｍａｇｎｅｔｉｃ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＭＡＣＳ）により単離した。簡潔に述べると、Ｔ細胞を１０分間、３００ｇで遠心した後、２０％  ＣＤ３マイクロビーズを含有するＭＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清及び２ｍＭ  ＥＤＴＡの１Ｘ  ＰＢＳ溶液）中で、１５分間、４℃で懸濁した。次いで、磁気標識されたＴ細胞を、磁気分離カラムを用いて分離し、次いで、１Ｘイオノマイシン、及び１Ｘホルボール１２ミリスチン酸１３酢酸（ＰＭＡ）とともに、３時間、共刺激を行った。両刺激物質を含有する培地を取り除いた後、細胞を、抗凝集剤として１ＸのＤＮＡｓｅ（Ｓｉｇｍａ）とともに１５分間、インキュベートした。
【０４０２】
細胞を遠心し、ＤＮＡｓｅを含有する上清を取り除き、５％の１Ｍ  ＮａＣｌ、１．５％の５００ｍＭ  ＥＤＴＡ、３３．８％の４Ｍベタイン、及び７．５％の２０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する細胞懸濁緩衝液（ＣＳＢ）を用いて３回洗浄した。また、細胞を、４０μｍの細胞ストレイナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を用いてろ過し、１ｍＬのＣＳＢに再懸濁した後、細胞凝集塊を取り除いた。次いで、細胞懸濁液を、実施例８のドロップレット生成デバイス上に流し、細胞とバーコードアダプター鋳型ビーズをドロップレット中に封入した（ビーズは、実施例１３の通りに作製された）。本実施例において、細胞及びビーズは、異なるサイズ（１．４、３．１、及び５．６ｎＬ）のドロップレット中に封入された。
【０４０３】
細胞とバーコードの両方を含有するドロップレットに、以下の最終反応緩衝液組成中で５０℃、３分間インキュベートし、次いで、３時間、４２℃でインキュベートすることにより逆転写を行った。
0006608368.tif 000082
【０４０４】
次いで、エマルションを、フェノール／クロロホルム混合液を用いて破壊し、実施例８のとおりにＡｍｉｃｏｎ１００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で濃縮した。ｃＤＮＡを、ＲＴ反応ごとに、以下に列記されるリアクションミックス、及び表２１に列記されるサーモサイクル条件を用いて、１８サイクルのＰＣＲ１にかけ、次いで、ＰＣＲ２を行った。表２２に、用いられたプライマーを示す。
0006608368.tif 000083
【０４０５】
（表２１）ＰＣＲ１及びＰＣＲ２のサーモサイクル条件
0006608368.tif 000084
【０４０６】
（表２２）ＰＣＲ１及びＰＣＲ２のプライマー配列
0006608368.tif 000085
［ｉ５インデックスプライマー］は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７５６２〜４７６０５。
【０４０７】
図２６に示されているように、検証した３つのドロップレット量で、当該反応は成功裏に完了した。
【０４０８】
Ｏ．実施例１５：バーコード化核酸のＴＣＲα遺伝子及びβ遺伝子の増幅ならびに配列解析
バーコード化Ｔ細胞ｃＤＮＡを、実施例１４に記述されるように作製した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、１Ｘのイオノマイシン、及びＰＭＡ（ＡＩＭ  Ｖ培地溶液）を用いて、３時間、共刺激した。ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８を発現するＴ細胞を磁気標識し、ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて別々に単離し、ドロップレットデバイスを通して、バーコードアダプター鋳型ビーズとともに細胞を封入した（実施例１３の通りに作製された）。細胞とバーコードの両方を含有するエマルションを、５０℃で３分、及び４２℃で３時間、逆転写した。次いで、フェノール／クロロホルム混合液を用いてエマルションを破壊し、Ａｍｉｃｏｎ１００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。
【０４０９】
逆転写、ならびにＰＣＲ１及びＰＣＲ２は、実施例１４の通りに行われ、異なるｉｎｄｅｘ＿ｓＩＤプライマー（各々、固有インデックスＩＤバーコードを有する）を、各試料に対して用いた。これにより、同じ次世代シークエンスをかけた試料のプール及びマルチプレックス化が可能となり、インデックスＩＤバーコードを介して異なる試料が互いに識別される。
【０４１０】
次いで、ＰＣＲ２産物を、メーカーの説明書に従い、Ａｍｐｕｒｅ磁気ビーズ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、１μｌのＰＣＲ２産物に対し、１．８μｌの磁気ビーズの比率で濃縮した。次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスのためのアダプターを付加するための追加のライブラリーＰＣＲを用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスのための試料を調製した。用いられたプライマーは表２３に列記する。
0006608368.tif 000086
ライブラリーＰＣＲのサーモサイクル条件
0006608368.tif 000087
【０４１１】
（表２３）ライブラリーＰＣＲ増幅で使用されたプライマー配列
0006608368.tif 000088
【０４１２】
増幅された産物は、Ｐｉｐｐｉｎ  Ｐｒｅｐ及びＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ及びＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて清浄化し、小断片を取り除き、アガロースゲル電気泳動を用いて解析し（図２７）、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスを用いて配列解析を行った。
【０４１３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスからのペアエンドリードは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）生殖細胞系列、ＴＣＲ  ＣＤＲ３を決定し、全長配列を推測するために解析された。配列解析により、２１，２０７，２２５個のフィルター済みのペアエンドリードが作製された。ＤＮＡバーコードを用いて、ペアリードを、フォワードリード配列に基づき、個々のＴ細胞内のＴＣＲの転写物へと割り当てた。フォワードリード内のＤＮＡバーコードの特定は、パイソンスクリプト（ｐｙｔｈｏｎ  ｓｃｒｉｐｔ）を用いて行われた。各フォワードリードに対し、固定配列１に対する編集距離は、グローバル／ローカルアライメントを用いてコンピューターにより算出された。２以下の編集距離が必要であり、さもなければ、リードのペアは破棄された。固定配列１の位置、ならびにバーコードパート１（ＢＣ１）及びバーコードパート２（ＢＣ２）の公知の長さから、候補となるＢＣ１及びＢＣ２の配列が、フォワードリードから抽出された。ＢＣ１及びＢＣ２は検査され、それぞれ、ハミング（１６，１１）またはハミング（１２，７）ＤＮＡバーコードに対するハミング条件を満たしたことが確認された（配列、及び指定配列の互いの相対的な位置に関しては、表１８を参照）。ＢＣ１及びＢＣ２に基づき、ペアリードは、特定のＴ細胞に割り当てられた。結果として、３，７１２，０１３個のリードのペアが、Ｔ細胞に割り当てられた。
【０４１４】
次いで、Ｔ細胞に割り当てられた、ペアリードを、ｂｌａｓｔｎプログラム（１０−５のｅ値カットオフ）を用いて、Ｖ、Ｊ及び定常生殖細胞系列のＴＣＲ配列の公知の変異体に対して比較した。もし当該対のいずれかのリードが、ｂｌａｓｔにより、生殖細胞系列に対するヒットとしてスコア化された場合、当該生殖細胞系列及び関連対立遺伝子のカウントは、対応する（ＢＣ１、ＢＣ２により特定された細胞の）ＴＣＲαまたはβ鎖に対し、１増加した。各生殖細胞系列の対立遺伝子の組み合わせ、及び特定の細胞に加えて、それらに対するヒットを有した配列のリストが保存された。
【０４１５】
次いで、ＢＣ１とＢＣ２の固有の組み合わせにより特定された各細胞に関し、α鎖及びβ鎖に対するｖ、ｊ及び／または定常の生殖細胞系列の対立遺伝子の組成が、上述のカウントの大多数に基づき、割り当てられた。そして、各生殖細胞系列に関しては、それに関連し最も長いＨＳＰを有した配列が、当該生殖細胞系列の代表的な転写部分として選択された。
【０４１６】
次に、ＣＤＲ３領域の組成を、以下の工程を用いて決定した。各ｊ生殖細胞系列に対しては、ＦＧ＊Ｇパターンを満たす４アミノ酸（ＡＡ）の配列の位置が、可能であれば決定され、及びその配列の最後の１０ＡＡにおいて、ＣＡの組み合わせを有したｖ生殖細胞系列のリストが特定された。各細胞に対して、ｊ生殖細胞系列の４ＡＡパターン、及びＣＡの組み合わせが、翻訳された代表的なｊの配列の３つ全てのフレームおいて探索された。ＣＤＲ３は、ＣＡと４ＡＡパターンの間のＡＡの配列であると決定された。ＴＣＲの推定ＡＡ配列は、ＣＡ、次いでＣＤＲ３配列、次いで４ＡＡパターンで始まるｊ生殖細胞系列のＡＡ配列までのｖ生殖細胞系列のＡＡを組み合わせることにより得られた。同様の方法を用いて、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列、及びＴＣＲの推定全長ヌクレオチド配列が決定された。
【０４１７】
Ｄ生殖細胞系列及びＤ対立遺伝子は、Ｄ生殖細胞系列とＣＤＲ３のヌクレオチド配列の間のグローバル−ローカルアライメントに基づいた編集距離を評価することにより分析された。Ｄ生殖細胞系列／対立遺伝子は、最も近い生殖細胞系列の配列までの編集距離が２以下であった場合に、ＴＣＲに割り当てられた。
【０４１８】
表２４は、処理された試料に対する統計解析の要約を示す（バーコード化された細胞の推定数、割り当てられたＴＣＲα鎖またはβ鎖を有する細胞の推定数、割り当てられたＴＣＲα鎖及びβ鎖の両方を有する細胞の推定数、及び推測全長α鎖及びβ鎖の数、を含む）。
【０４１９】
（表２４）ＴＣＲα鎖及びβ鎖
0006608368.tif 000089
【０４２０】
Ｐ．実施例１６：バーコード化核酸の細胞サブタイプ特異的遺伝子の増幅及び配列解析
バーコード化Ｔ細胞ｃＤＮＡは、実施例１５に記述されるように作製した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、１Ｘのイオノマイシン、及びＰＭＡ（ＡＩＭ  Ｖ培地溶液）を用いて、３時間、共刺激した。ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８を発現するＴ細胞を磁気標識し、ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて別々に単離し、ドロップレットデバイスを通した。細胞とバーコードの両方を含有するエマルションを、５０℃で３分、及び４２℃で３時間、実施例１４の通りに逆転写した。次いで、フェノール／クロロホルム混合液を用いてエマルションを破壊し、Ａｍｉｃｏｎ１００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。次いで、表２５に列記される、たとえばＣＤ４、ＣＤ８、及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）等のＴ細胞標的化サブセット遺伝子に対する特異的プライマーとともに、表２１のサーモサイクル条件を用いて、異なるサイクル数のＰＣＲ１及びＰＣＲ２を行った。リアクションミックスは、以下のように調製した。
0006608368.tif 000090
【０４２１】
（表２５）ＰＣＲ１及びＰＣＲ２に対するＴ細胞標的化遺伝子リバースプライマー配列（ＰＣＲ１及びＰＣＲ２において用いられた配列に追加）
0006608368.tif 000091
【０４２２】
次いで、ＰＣＲ２の産物を、実施例１５のようにＩｌｌｕｍｉｎａシークエンスのために調製し、当該産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスの前に、アガロースゲル電気泳動を用いて解析した（図２７）。
【０４２３】
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスから得たペアエンドリードを解析し、遺伝子特異的マーカーに基づき、Ｔ細胞サブタイプを決定した。シークエンスにより、１９，２０５，６１１個のフィルター済みペアエンドリードが作製された。ＤＮＡバーコードを用いて、ペアリードを、フォワードリード配列に基づき、個々のＴ細胞内の転写物へと割り当てた。フォワードリード内のＤＮＡバーコードの特定は、パイソンスクリプトを用いて行われた。各フォワードリードに対し、固定配列１に対する編集距離は、グローバル／ローカルアライメントを用いてコンピューターにより算出された。２以下の編集距離が必要であり、さもなければ、リードのペアは破棄された。固定配列１の位置、ならびにバーコードパート１（ＢＣ１）及びバーコードパート２（ＢＣ２）の公知の長さから、候補となるＢＣ１及びＢＣ２の配列が、フォワードリードから抽出された。ＢＣ１及びＢＣ２は検査され、それぞれ、ハミング（１６，１１）またはハミング（１２，７）ＤＮＡバーコードに対するハミング条件を満たしたことを確認された。ハミング条件を満たしたフォワードリードに対しては、候補分子バーコードは、Ｘ、固定配列２、及び分子バーコードの公知の長さに基づき抽出された（配列、及び指定配列の互いの相対的な位置に関しては、表１８を参照）。もし分子バーコード配列が「Ｃ」ヌクレオチドを有していなかった場合、当該ペアリードは、（ＢＣ１及びＢＣ２に基づき）Ｔ細胞に、及び（分子バーコードに基づき）当該Ｔ細胞内の特定の転写物に割り当てられた。３，９０２，５６９個のリードのペアが、個々のＴ細胞内の転写物に割り当てられた。
【０４２４】
次いで、Ｔ細胞転写物に割り当てられたペアリードを、ｂｌａｓｔｎプログラム（１０−６のｅ値カットオフ及びｐｅｒｃ＿ｉｄｅｎｔｉｔｙを９８に設定）を用いて、当該マーカー遺伝子の公知のスプライス変異体に対して比較した。もし当該対のいずれかのリードが、ｂｌａｓｔにより、ヒットとしてスコア化された場合、対応するＴ細胞の転写物（ＢＣ１、ＢＣ２及び分子バーコードにより特定されている）が、当該マーカー遺伝子と関連づけられる。
【０４２５】
ＢＣ１とＢＣ２の固有の組み合わせにより特定された各細胞に対し、所与のマーカー遺伝子からの転写物が認められた異なる時間の数は、当該所与のマーカー遺伝子と関連づけられたペアリードから観察された、異なる分子バーコードの数をカウントすることにより、決定した。
【０４２６】
検出された各タイプのＴ細胞の数は、マーカー遺伝子に基づき決定した。少なくとも１つのＣＤ４転写物と１つのＩＦＮγ転写物が割り当てられると決定されたＴ細胞は、Ｔｈ１細胞としてカウントされた。少なくとも１つのＣＤ４転写物が割り当てられるが、ＩＦＮγ転写物は割り当てられないと決定されたＴ細胞は、非Ｔｈ１  ＣＤ４試料としてカウントされた。少なくとも１つのＣＤ８転写物及び１つのＩＦＮγ転写物が特定されると決定されたＴ細胞は、ＩＦＮγ＋細胞傷害性Ｔ細胞としてカウントされた。少なくとも１つのＣＤ８転写物が割り当てられるが、ＩＦＮγ転写物は割り当てられないと決定されたＴ細胞は、ＩＦＮγ−細胞傷害性Ｔ細胞としてカウントされた。
【０４２７】
表２６は、本明細書に記述される手順を用いて３つの異なる試料を処理した結果得られた、検出されたＣＤ４  Ｔ細胞の総数、Ｔｈ１  ＣＤ４  Ｔ細胞の数、細胞傷害性Ｔ細胞及びＩＦＮγ＋細胞傷害性Ｔ細胞の総数を示す。
【０４２８】
（表２６）サブセットの要約
0006608368.tif 000092
【０４２９】
Ｑ．実施例１７：単一細胞トランスクリプトミクスの実施
バーコード化Ｔ細胞ｃＤＮＡは、実施例１５に記述されるように作製した。簡潔に述べると、ＰＢＭＣを、１Ｘのイオノマイシン、及びＰＭＡ（ＡＩＭ  Ｖ培地溶液）を用いて、３時間、共刺激した。ＣＤ３、ＣＤ４、またはＣＤ８を発現するＴ細胞を磁気標識し、ＭＡＣＳキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて別々に単離し、ドロップレットデバイスを通した。細胞とバーコードの両方を含有するエマルションを、５０℃で３分、及び４２℃で３時間、実施例１４の通りに逆転写した。次いで、フェノール／クロロホルム混合液を用いてエマルションを破壊し、Ａｍｉｃｏｎ１００ｋＤａカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。１ラウンドのＰＣＲを行い、全トランスクリプトームを増幅した。条件は以下である：
全トランスクリプトームＰＣＲ条件
0006608368.tif 000093
サーモサイクル条件
0006608368.tif 000094
【０４３０】
５サイクルのＰＣＲを用いてライブラリーにアダプターを付加した（上述と同じＰＣＲ条件及びサーモサイクル条件を用いた。ただし、フォワードプライマーとして代わりにＦＷ２−ｎ−Ｖ２を使用している）。次いで、試料をプールし、Ａｍｐｕｒｅビーズを用いて洗浄し、メーカーの説明書に従い（増幅工程において、５ｎｇのＤＮＡを鋳型として用いて、自家製で誂えたプライマーを代わりに用いた点を除く）、ＤＮＡを小断片へとタグメント化（ｔａｇｍｅｎｔ）するＮｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンスのために調製した。用いた自家製のプライマー、Ｎｅｘｔ＿ｉ５＿ｎ＿ｖ２及びＮｅｘｔ＿ｉ７＿ｎは、バーコードを含有するタグメント化断片のみを確実に増幅した。ゲルを泳動し、結果を図２９に示す。
【０４３１】
（表２７）全トランスクリプトーム増幅及びライブラリー調製に用いた追加プライマー
0006608368.tif 000095
【０４３２】
バーコード化アンプリコンライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シークエンス装置を用いて配列解析した。ペアエンドリードを解析して、個々の細胞とペアリードを関連づけ、及びそれら細胞中で発現された遺伝子を特定した。シークエンスにより、ろ過済み３７１，９１８，２２０個のペアエンドリードが作製された。ＤＮＡバーコードを用いて、ペアリードを、フォワードリード配列に基づき、個々の細胞内の転写物へと割り当てた。フォワードリード内のＤＮＡバーコードの特定は、パイソンスクリプトを用いて行われた。各フォワードリードに対し、固定配列１に対する編集距離は、グローバル／ローカルアライメントを用いてコンピューターにより算出された。２以下の編集距離が必要であり、さもなければ、リードのペアは破棄された。固定配列１の位置、ならびにＢＣ１及びＢＣ２の公知の長さから、候補となるＢＣ１及びＢＣ２の配列が、フォワードリードから抽出された。ＢＣ１及びＢＣ２は検査され、それぞれ、ハミング（１６，１１）またはハミング（１２，７）ＤＮＡバーコードに対するハミング条件を満たしたことを確認された。ハミング条件を満たしたフォワードリードに対しては、候補分子バーコードは、Ｘ、固定配列２、及び分子バーコードの公知の長さに基づき抽出された。もし分子バーコード配列が「Ｃ」ヌクレオチドを有していなかった場合、当該ペアリードは、（ＢＣ１及びＢＣ２に基づき）細胞に割り当てられ、及び（分子バーコードに基づき）当該細胞内の特定の転写物に割り当てられた。３７，１１０．１７２個のリードのペアが、個々の細胞内の転写物に割り当てられた。
【０４３３】
次いで、細胞転写物に割り当てられたペアリードを、ｂｌａｓｔｎプログラム（１０−６のｅ値のカットオフ、及びｐｅｒｃ＿ｉｄｅｎｔｉｔｙを９８に設定）を用いて、Ｅｎｓｅｍｂｌ（ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）のリリース７８において報告された遺伝子の公知のスプライス変異体と比較した。ペアのうちのいずれかのリードがｂｌａｓｔによりヒットとしてスコア化された場合、当該細胞由来の対応する転写物（ＢＣ１、ＢＣ２及び分子バーコードにより特定）が遺伝子と関連づけられた。もし２以上のｂｌａｓｔヒットがある場合、フォワードリード及びリバースリードに対するＨＳＰの最も大きな長さの総計を有する遺伝子を発見することにより、最も高くマッチしたものが選択された。２つの異なる遺伝子が同点となった場合、遺伝子へのペアリードの割り当ては不明瞭とみなされ、それ以上は考慮されなかった。
【０４３４】
ＢＣ１及びＢＣ２の固有の組み合わせにより特定された各細胞に対し、所与の遺伝子からの転写物が確認された異なる時間の数は、当該所与の遺伝子と関連づけられたペアリードから観察された異なる分子バーコードの数をカウントすることにより決定された。
【０４３５】
表３３は、本方法を用いて４つの試料を処理した後に最も高い頻度で検出された遺伝子を示す。表は、Ｅｎｓｅｍｂｌの遺伝子ＩＤ、Ｅｎｓｅｍｂｌの遺伝子の説明、及び当該遺伝子が検出された細胞の数を示す。
【０４３６】
Ｒ．実施例１８：ファーストストランドｃＤＮＡの５'末端へのバーコードアダプターの組み込み
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた、本発明の実施形態を記述するものである。細胞及びバーコードアダプター鋳型を共に反応容器に入れ、反応容器の大多数は、１つの細胞と１つの鋳型分子のみを有するか、またはたとえばドロップレット生成装置により、１つの細胞と１つのバーコードアダプター鋳型ビーズを有し、及び反応容器は、たとえば実施例１４のような油中水ドロップレットである。バーコードアダプター配列は、固定配列、バーコード配列、任意選択的にＵＭＩ、及びオリゴ（ｄＴ）またはランダム配列もしくはセミランダム配列（それぞれ、表２８において、バーコード＿アダプター＿５ｃ＿オリゴｄＴ及びバーコード＿アダプター＿５ｃ＿ランダマー）もしくはその組み合わせのいずれかを含有する。鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）は、固定配列、任意選択的にＵＭＩ、及びファーストストランドｃＤＮＡ相補鎖（表２８の５'アダプター）を含有する。
【０４３７】
逆転写反応を、以下の反応条件下で、５０℃で３分間、次いで、４２℃で３時間、行う。
0006608368.tif 000096
【０４３８】
バーコードアダプターが反応を開始させ、ファーストストランドｃＤＮＡの５'に組み込まれるＲＴ反応の間に、バーコード化は発生する。逆転写はプライマーとしてＤＮＡ及びＲＮＡの両方とも利用することができるため、（当該バーコードアダプター鋳型上の、適切なＲＮＡプロモーター、または鎖置換ＤＮＡＰ認識部位（たとえば切断酵素により生成された切断部位等）とともに）ＲＮＡＰまたはＤＮＡＰのいずれかから、バーコードアダプターは作製される（図８及び９）。
【０４３９】
エマルションは実施例１４のように破壊され、次いで、得られたバーコード化核酸ライブラリーをプールし、たとえば実施例１７のように、バーコード化反応において、それぞれ、５'アダプター、及びバーコード＿アダプター＿５ｃ＿オリゴｄＴまたはバーコード＿アダプター＿５ｃ＿ランダマーにより付加された、固定配列に対し相補的な配列を含有するフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅される。反応条件を以下に示す。
0006608368.tif 000097
サーモサイクル条件
0006608368.tif 000098
【０４４０】
関心対象の標的遺伝子はまた、遺伝子特異的配列を含有するフォワードプライマー、及びたとえば実施例１４及び１６のように、バーコード化反応においてバーコード＿アダプター＿５ｃ＿オリゴｄＴまたはバーコード＿アダプター＿５ｃ＿ランダマーにより付加された固定配列に対し相補的な配列を含有するリバースプライマーを用いた増幅を行うことにより、増幅されてもよい。２つの連続的なＰＣＲ反応におけるＴＣＲα鎖及びβ鎖の増幅に対する反応条件を以下に示す（ＰＣＲ１の産物は、ＰＣＲ２で使用される前に５０倍に希釈された）。
0006608368.tif 000099
ＰＣＲ１とＰＣＲ２のサーモサイクル条件
0006608368.tif 000100
【０４４１】
次いで、次世代シークエンス（たとえばＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム）のためにライブラリーを調製する。
【０４４２】
（表２８）プライマー配列
0006608368.tif 000101
【０４４３】
Ｓ．実施例１９：ＰＣＲが行われている間の、５'末端へのバーコードアダプターの組み込み
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測される結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。細胞及びバーコードアダプター鋳型を、反応容器に共に入れ、それにより、反応容器の大多数は、１つの細胞と１つの鋳型分子のみを有するか、または、たとえばドロップレット作製デバイスにより、１つの細胞と１つのバーコードアダプター鋳型ビーズを有し、当該反応容器は、たとえば実施例１４のような油中水ドロップレットである。鋳型スイッチオリゴ（ＴＳＯ）は、固定配列、任意選択的にＵＭＩ、及びファーストストランドｃＤＮＡ相補鎖（表２９の５'アダプター）を含有する。３'アダプター配列は、固定配列、任意選択的にＵＭＩ、及びオリゴ（ｄＴ）またはランダムもしくはセミランダム配列（それぞれ表２９における、３'＿アダプター＿オリゴｄＴ及び３'＿アダプター＿ランダマー）またはそれらの組み合わせのいずれかを含有する。
【０４４４】
細胞及びバーコードアダプター鋳型ビーズを用いた逆転写反応を、５０℃で３分間、次いで４２℃で３時間行い、その後、標準的なＰＣＲサイクル条件（以下の反応条件）を行う。
0006608368.tif 000102
【０４４５】
５'＿ＰＣＲ＿バーコード＿アダプター＿プライマーは、ＤＮＡＰのいずれかを用いて、バーコード＿アダプター＿鋳型から作製される（たとえば切断酵素により生成された切断部位等の、当該バーコード鋳型上の適切な鎖置換ＤＮＡＰ認識部位を用いる）。本明細書においては、ＫｌｅｎｏｗフラグメントをＤＮＡＰとして用いて、及びＮｔ．ＢｂｖＣＩをニッキングエンドヌクレアーゼとして用いて、ならびに当該認識部位は「ＣＣＴＣＡＧＣ」である。逆転写の後、ファーストストランドｃＤＮＡに付加されたアダプター配列に対し相補的な３'末端を有するプライマーを、５'＿ＰＣＲ＿バーコード＿アダプター＿プライマーのフォワードプライマー（バーコードアダプター鋳型から作製される）、及び３'＿ＰＣＲ＿プライマーのリバースプライマーとともに増幅に用いる。
【０４４６】
バーコードアダプター（５'＿ＰＣＲ＿バーコード＿アダプター＿プライマー）がフォワードプライマーである場合、バーコード化はＰＣＲ反応の間に発生し、当該バーコードアダプターはファーストストランドｃＤＮＡの５'末端に組み込まれる（図１１）。
【０４４７】
また、関心対象の標的遺伝子は、フォワードプライマーとして５'＿ＰＣＲ＿バーコード＿アダプター＿プライマーを、及び遺伝子特異的配列を含有するリバースプライマーを用いて増幅を行うことにより増幅されてもよい。
【０４４８】
次いで、ライブラリーをプールし、次世代シークエンス（たとえばＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム）のために調製を行う。
【０４４９】
（表２９）プライマー配列
0006608368.tif 000103
【０４５０】
Ｔ．実施例２０：ＰＣＲを行う間の、３'末端へのバーコードアダプターの組み込み
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測される結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。本実施例は、バーコードアダプター鋳型から作製されたバーコードアダプターが、ＰＣＲのリバースプライマーとして用いられている点を除き、実施例１９と類似している。実施例１９に記述されるように逆転写を行い、ＰＣＲにおいては、５'＿ＰＣＲ＿プライマーがフォワードプライマーであり、３'＿ＰＣＲ＿バーコード＿アダプター＿プライマーがバーコード＿アダプター＿鋳型から作製され、リバースプライマーとして用いられている(図１２)。細胞及びバーコードアダプター鋳型ビーズを用いた逆転写反応を、５０℃で３分間、次いで４２℃で３時間行い、その後、以下の反応条件で標準的なＰＣＲサイクル条件を行った。
0006608368.tif 000104
【０４５１】
また、関心対象の標的遺伝子は、遺伝子特異的配列を含有するリバースフォワードプライマー、及びリバースプライマーとして３'＿ＰＣＲ＿バーコード＿アダプター＿プライマーを用いて増幅を行うことにより、増幅することができる。
【０４５２】
次いで、ライブラリーをプールし、次世代シークエンス（たとえばＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔプラットフォーム）のために調製を行う。
【０４５３】
（表３０）プライマー配列
0006608368.tif 000105
【０４５４】
Ｕ．実施例２１：非細胞源からのＲＮＡのバーコード化
本発明の実施形態において、反応に用いられるプライマーが特定のＲＮＡに結合し、逆転写を開始することができるのであれば、反応容器中のすべてのＲＮＡがバーコード化される。それゆえ、外来性に導入されたＲＮＡもバーコード化されることができる。本実施例においては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いて作製されたＲＮＡがバーコード化された。
【０４５５】
ＳｐｉｋｅＩｎ配列を、ＩＤＴに注文し、プライマーとしてＳＰＩＫＥＩＮ−ＦＷ及びＳＰＩＫＥＩＮ−ＲＶを用いて、ＰｈｕｓｉｏｎＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲ増幅を行い、５'Ｔ７  ＲＮＡＰプロモーター配列及び３'ポリＡ  Ｔａｉｌを伴う二本鎖物質を得た。次いで、産物を、ＱｉａｇｅｎＭｉｎＥｌｕｔｅキットを用いて洗浄し、当該ＤＮＡ産物を、Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＴ７  ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔキットを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に用いた。次いで、得られたＲＮＡを洗浄により清浄化し、Ａｍｉｃｏｎ  ３０ｋＤＡカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて１０ｍＭトリスで濃縮した。
【０４５６】
８つの９６ウェルプレートの各ウェルで、０．５ｎｇの酵母ｔＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び０．１ｐｇのＳｐｉｋｅ−Ｉｎ  ＲＮＡとともに、単一記憶Ｂ細胞を逆転写した。ウェル当たり１０μＬの反応物を入れ、反応物は以下である。
0006608368.tif 000106
【０４５７】
反応物を５５℃で３分間、次いで４２℃で２時間、インキュベートした。９６ウェルプレートの各ウェルは、ＷｅｌｌＩＤ−アダプター中に異なるウェルバーコードを有していた。次いで、ファーストストランドｃＤＮＡと、ビオチニル化オリゴｄＴに結合するストレプトアビジン常磁性Ｃ１  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を結合させ、次いで、磁石を用いてファーストストランドｃＤＮＡを引き出し、ＢＷＢ緩衝液（２Ｍ  ＮａＣｌのＴＥ溶液）を用いて３回洗浄し、次いで、１０ｍＭトリスを用いて３回洗浄し、１５μＬの１０ｍＭトリス中に再懸濁することにより、反応物を清浄化した。
【０４５８】
２ラウンドのＰＣＲ増幅を行い、重鎖及び軽鎖イムノグロブリン遺伝子を増幅した。異なるプレートバーコード配列が、異なるプレートのすべてのプールされたバーコード化ｃＤＮＡに付加された。
ＰＣＲ１、１ウェル当たり：
0006608368.tif 000107
ＰＣＲ１の産物を５０倍希釈し、ＰＣＲ２に用いた。
ＰＣＲ２のウェル当たりの反応液：
0006608368.tif 000108
【０４５９】
得られた増幅物質の量は、標準化され、実施例１１のように、４５４シークエンスのために調製された。本実施例において用いられたプライマーは、表１３、１４、及び３２に示される。
【０４６０】
得られた４５４リードは、プレートＩＤ及びウェルＩＤバーコードに基づきビニングされた。したがって、リードは、特定のプレートの元のウェルに戻しビニングすることができる。リードは、バーコード配列からクリッピングされた後、Ｎｅｗｂｌｅｒを用いてアセンブリされた。各コンティグに対し、合致に対しては２、非合致に対しては−１、ギャップオープンに対しては−１、及びギャップ伸長に対しては−１のスコア化マトリクスを用いて、当該コンティグとＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを行った。＞８００のスコアを有するコンティグはすべて合致とみなした。合致が確認された各プレート上のウェルの数をカウントした。Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ配列は、大部分のウェルで検出された（表３１）。
【０４６１】
（表３１）Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が検出されたウェル
0006608368.tif 000109
【０４６２】
（表３２）用いられた配列
0006608368.tif 000110
［ウェル−バーコード］＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７６０６〜４７７１１；
［プレート−バーコード］＝ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７７１２〜４７７１９
【０４６３】
Ｖ．実施例２２：細胞群を同定するための、非細胞源由来ＲＮＡのバーコード化
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。実施例２１に示されるように、外来性に導入されたＲＮＡをバーコード化することができる。本実施例においては、バーコード化ＲＮＡを用いて、特定の細胞群を同定する。Ｓｐｉｋｅ−ＩｎＤＮＡは、実施例２１のとおりに作製される（ＳＰＩＫＥＩＮ−ＦＷが５'ＮＨ２修飾を有している点を除く）。それを、Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いて、抗ＣＤ４抗体に結合する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いてＳｐｉｋｅ−ＩｎＤＮＡから作製されたＲＮＡを、代わりに抗ＣＤ４抗体に結合してもよい。
【０４６４】
Ｔ細胞は、実施例１５のように調製及び配列解析され、追加の工程で、Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ結合抗ＣＤ４抗体とＴ細胞をインキュベートし、その後、Ｔ細胞をドロップレット生成機に流し、ＲＮＡをバーコード化する。得られたリードは、ｉｎｄｅｘ−ＩＤ、及びバーコードアダプターにより付加されたバーコードに基づき、ビニングする。したがって、リードは、元の反応容器に戻しビニングすることができる。合致に対しては２、非合致に対しては−１、ギャップオープンに対しては−１、及びギャップ伸長に対しては−１のスコア化マトリクスを用いて、当該コンティグとＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを行う。＞８００のスコアを有するコンティグはすべて合致とみなす。次いで、合致が確認された反応容器をカウントする。Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が検出された反応容器に対しては、Ｔ細胞は、ＣＤ４Ｔ細胞と特定される（図１４Ａ）。異なるＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が結合された複数の抗体を用いてもよく、最終結果としては、異なる細胞表面抗原を有する異なる細胞を、同じ実験の実施で特定することができる。
【０４６５】
Ｗ．実施例２３：抗原特異的Ｂ細胞を同定するための、非細胞源由来ＲＮＡのバーコード化
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。本実施例においては、外来性に導入されたＲＮＡがバーコード化され、抗原特異的Ｂ細胞を特定するために用いられる。Ｓｐｉｋｅ−ＩｎＤＮＡは、実施例２１のように作製される（ＳＰＩＫＥＩＮ−ＦＷが、５'ＮＨ２修飾を有する点は除く）。それを、Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いて、インフルエンザヘマグルチニン抗原に結合させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いてＳｐｉｋｅ−ＩｎＤＮＡから作製されたＲＮＡが、代わりにヘマグルチニンに結合されてもよい。
【０４６６】
インフルエンザワクチンで免疫化されたマウスのＢ細胞を、実施例８の通りに調製し、配列解析を行い、追加の工程で、Ｂ細胞をＳｐｉｋｅ−Ｉｎ結合抗原とともにインキュベートし、次いで、それらをバーコード化する。得られたリードは、ｉｎｄｅｘ−ＩＤ及びバーコードアダプターにより付加されたバーコードに基づき、ビニングする。したがって、リードは、元の反応容器に戻しビニングすることができる。合致に対しては２、非合致に対しては−１、ギャップオープンに対しては−１、及びギャップ伸長に対しては−１のスコア化マトリクスを用いて、当該コンティグとＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを行う。＞８００のスコアを有するコンティグはすべて合致とみなす。次いで、合致が確認された反応容器をカウントする。Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が検出された反応容器に対しては、Ｂ細胞は、ヘマグルチニン特異的であると特定される（図１４Ｂ）。異なるＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が結合された複数の抗原を用いてもよく、最終結果としては、異なる抗原に特異的な異なるＢ細胞を、同じ実験の実施で特定することができる。
【０４６７】
Ｘ．実施例２４：抗原特異的Ｔ細胞を特定するための、非細胞源由来ＲＮＡのバーコード化
本実施例は、実際に得られた結果ではなく、予測結果に基づいた本発明の実施形態を記述するものである。本実施例においては、外来性に導入されたＲＮＡがバーコード化され、抗原特異的Ｂ細胞を特定するために用いられる。Ｓｐｉｋｅ−ＩｎＤＮＡは、実施例２１のように作製される（ＳＰＩＫＥＩＮ−ＦＷが、５'ＮＨ２修飾を有する点は除く）。それを、Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を用いて、特定のペプチド−ＭＨＣ抗原に結合させる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いてＳｐｉｋｅ−ＩｎＤＮＡから作製されたＲＮＡが、代わりにペプチド−ＭＨＣ複合体に結合されてもよい。
【０４６８】
実施例１５のとおりにＴ細胞が調製及び配列解析され、追加の工程で、Ｔ細胞をＳｐｉｋｅ−Ｉｎ結合抗ＣＤ４抗体とともにインキュベートし、その後、Ｔ細胞をドロップレット生成機に流し、ＲＮＡをバーコード化する。得られたリードは、ｉｎｄｅｘ−ＩＤ及びバーコードアダプターにより付加されたバーコードに基づき、ビニングする。したがって、リードは、元の反応容器に戻しビニングすることができる。合致に対しては２、非合致に対しては−１、ギャップオープンに対しては−１、及びギャップ伸長に対しては−１のスコア化マトリクスを用いて、当該コンティグとＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを行う。＞８００のスコアを有するコンティグはすべて合致とみなす。次いで、合致が確認された反応容器をカウントする。Ｓｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が検出された反応容器に対しては、Ｔ細胞は、抗原特異的と特定される（図１４Ｃ）。異なるＳｐｉｋｅ−Ｉｎ配列が結合された複数の異なるペプチド−ＭＨＣを用いてもよく、最終結果としては、異なるペプチド−ＭＨＣを認識する異なるＴ細胞を、同じ実験の実施で特定することができる。
【０４６９】
（表３３）最も高い頻度で観察された遺伝子
0006608368.tif 000111
【０４７０】
本明細書に記述される実施例及び実施形態は、解説を目的としたものであり、それらを考慮し、様々な改変及び変更が当業者に示唆されうること、ならびに、それらが本明細書の主旨及び範囲の内であり、添付の請求項の範囲の内であることを理解されたい。本明細書に引用されるすべての公表文献、配列アクセッション番号、特許、及び特許出願は、すべての目的に対し、その全体で参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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