(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの修飾塩基を含むポリヌクレオチドであって、前記少なくとも１つの修飾塩基が、式：
【化１】
0006574239.tif 000067
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド部分をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記修飾塩基が、前記デオキシリボヌクレオチド部分に共有結合されている、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも１つのペプチド核酸部分を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記修飾塩基が、前記ポリヌクレオチド中の前記少なくとも１つのペプチド核酸部分に共有結合されている、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
ＰＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも２つの修飾塩基を含み、前記少なくとも２つの修飾塩基中のＺが、同じであるか、または異なる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
その３’末端に、またはその３’末端から１つ目の塩基に前記修飾塩基を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
マイナーグルーブ結合剤またはインターカレーターをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
糖修飾をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記糖修飾が、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソース、および二環式の糖から成る群から選択される、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
骨格修飾をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記骨格修飾が、修飾糖リン酸骨格、ロックド核酸骨格、ペプチド骨格、ホスホトリエステル骨格、ホスホルアミデート骨格、シロキサン骨格、カルボキシメチルエステル骨格、アセトアミデート骨格、カルバメート骨格、チオエーテル骨格、架橋ホスホン酸メチレン骨格、ホスホロチオエート骨格、メチルホスホン酸骨格、アルキルホスホン酸骨格、リン酸エステル骨格、アルキルホスホノチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、炭酸骨格、リン酸トリエステル骨格、カルボキシメチルエステル骨格、メチルホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、ｐ−エトキシ結合を有する骨格、および上述のいずれかのうちの２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択される、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
ＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ酵素により伸長可能である３’末端ヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
３０個よりも少ないヌクレオチドを含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、９〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチドに結合した蛍光消光剤をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
修飾塩基を含むポリヌクレオチドと、反応混合物中に存在すると推測される核酸標的配列とのハイブリダイゼーションのための方法であって、
（ａ）ポリヌクレオチドを含み、かつ標的核酸配列を含むと推測される反応混合物を、前記反応混合物中に存在する場合に前記標的核酸配列との前記ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションに好適な条件下でインキュベートする工程、および
（ｂ）前記反応混合物中の前記標的核酸配列の存在を検出するか、または前記標的核酸配列の非存在を確認する工程であって、前記ポリヌクレオチドが、前記核酸標的配列内の配列に相補的であり、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾塩基を含み、前記少なくとも１つの修飾塩基が、式：
【化２】
0006574239.tif 000068
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される工程
を含む方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドが、検出可能な標識、および蛍光消光剤から成る群から選択される部分をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）ポリヌクレオチド配列
を含む二重鎖であって、前記少なくとも１つのポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチド配列の少なくとも４つの連続塩基と相補的でありそれらとハイブリダイズされている４つまたはそれ以上の連続塩基を含み、前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つの修飾塩基を含み、前記少なくとも１つの修飾塩基が、式：
【化３】
0006574239.tif 000069
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される二重鎖。
【請求項２３】
前記ポリヌクレオチドが、検出可能な標識、および蛍光消光剤から成る群から選択される部分をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項２４】
式：
【化４】
0006574239.tif 000070
（式中、
Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、
Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、
Ｑは、ヒドロキシル保護基である）で表される修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項２５】
式：
【化５】
0006574239.tif 000071
（式中、
Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、
Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、
Ｑ１およびＱ２は独立して、Ｈもしくは窒素保護基であるか、またはＱ１およびＱ２は一緒に、窒素保護基であり、
Ｑ３は、Ｈまたはカルボキシル保護基である）で表される修飾ペプチド核酸モノマー。
【請求項２６】
式：
【化６】
0006574239.tif 000072
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される修飾チミジンヌクレオシド。
【請求項２７】
式：
【化７】
0006574239.tif 000073
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される修飾チミジンヌクレオチド５’−三リン酸。
【請求項２８】
発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光化合物、磁気標識、ミクロスフェア、コロイド金属、免疫学的標識、リガンド及び蛍光色素から成る群から選択される標識をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２９】
少なくとも１つの修飾塩基が、５’から３’方向で表される場合、前記ポリヌクレオチドの１位、前記ポリヌクレオチドの２位、前記ポリヌクレオチドの３位、前記ポリヌクレオチドの４位、前記ポリヌクレオチドの５位、前記ポリヌクレオチドの６位、前記ポリヌクレオチドの７位、前記ポリヌクレオチドの８位、前記ポリヌクレオチドの９位、前記ポリヌクレオチドの１０位、前記ポリヌクレオチドの１１位、前記ポリヌクレオチドの１２位、前記ポリヌクレオチドの１３位、前記ポリヌクレオチドの１４位、前記ポリヌクレオチドの１５位、前記ポリヌクレオチドの１６位、前記ポリヌクレオチドの１７位、前記ポリヌクレオチドの１８位、前記ポリヌクレオチドの１９位、及び前記ポリヌクレオチドの２０位から成る群から選択される位置にある、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
固体支持体に結合される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記固体支持体がビーズ、アレイ、及びマイクロアレイから成る群から選択される、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
修飾糖部分と結合した１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
前記修飾糖部分が２’置換糖及びロックド核酸糖から成る群から選択される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３４】
１つまたは複数の非標準塩基をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記１つまたは複数の非標準塩基が、修飾プリン及び修飾ピリミジンから成る群から選択される、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
１つまたは複数のペンダント基をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記１つまたは複数のペンダント基が、親油性基、マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、キレート剤及び架橋剤から成る群から選択される、請求項３６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ポリヌクレオチドの３’もしくは５’末端のいずれかで、または両方の末端で結合される尾部部分をさらに含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記尾部部分が、リン酸、リン酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基及び親油性基から成る群から選択される、請求項３８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４１】
前記修飾塩基が、前記デオキシリボヌクレオチド部分に共有結合されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つのペプチド核酸部分を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４３】
前記修飾塩基が、前記ポリヌクレオチド中の前記少なくとも１つのペプチド核酸部分に共有結合されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ポリヌクレオチドがＰＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項２０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも２つの修飾塩基を含み、前記少なくとも２つの修飾塩基中のＺが、同じであるか、または異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリヌクレオチドがその３’末端に、またはその３’末端から１つ目の塩基に前記修飾塩基を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリヌクレオチドがマイナーグルーブ結合剤またはインターカレーターをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリヌクレオチドが糖修飾をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項４９】
前記糖修飾が、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソース、および二環式の糖から成る群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドが骨格修飾をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項５１】
前記骨格修飾が、修飾糖リン酸骨格、ロックド核酸骨格、ペプチド骨格、ホスホトリエステル骨格、ホスホルアミデート骨格、シロキサン骨格、カルボキシメチルエステル骨格、アセトアミデート骨格、カルバメート骨格、チオエーテル骨格、架橋ホスホン酸メチレン骨格、ホスホロチオエート骨格、メチルホスホン酸骨格、アルキルホスホン酸骨格、リン酸エステル骨格、アルキルホスホノチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、炭酸骨格、リン酸トリエステル骨格、カルボキシメチルエステル骨格、メチルホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、ｐ−エトキシ結合を有する骨格、および上述のいずれかのうちの２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポリヌクレオチドが、ＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ酵素により伸長可能である３’末端ヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポリヌクレオチドが３０個よりも少ないヌクレオチドを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポリヌクレオチドが、９〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記検出する工程が、前記ポリヌクレオチドに結合した検出可能な標識を検出することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項５６】
前記検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドに結合した蛍光消光剤をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドが、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光化合物、磁気標識、ミクロスフェア、コロイド金属、免疫学的標識、リガンド及び蛍光色素から成る群から選択される標識をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの修飾塩基が、５’から３’方向で表される場合、前記ポリヌクレオチドの１位、前記ポリヌクレオチドの２位、前記ポリヌクレオチドの３位、前記ポリヌクレオチドの４位、前記ポリヌクレオチドの５位、前記ポリヌクレオチドの６位、前記ポリヌクレオチドの７位、前記ポリヌクレオチドの８位、前記ポリヌクレオチドの９位、前記ポリヌクレオチドの１０位、前記ポリヌクレオチドの１１位、前記ポリヌクレオチドの１２位、前記ポリヌクレオチドの１３位、前記ポリヌクレオチドの１４位、前記ポリヌクレオチドの１５位、前記ポリヌクレオチドの１６位、前記ポリヌクレオチドの１７位、前記ポリヌクレオチドの１８位、前記ポリヌクレオチドの１９位、及び前記ポリヌクレオチドの２０位から成る群から選択される位置にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチドが固体支持体に結合される、請求項２０に記載の方法。
【請求項６１】
前記固体支持体がビーズ、アレイ、及びマイクロアレイから成る群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドが修飾糖部分と結合した１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項６３】
前記修飾糖部分が２’置換糖及びロックド核酸糖から成る群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポリヌクレオチドが１つまたは複数の非標準塩基をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つまたは複数の非標準塩基が、修飾プリン及び修飾ピリミジンから成る群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリヌクレオチドが１つまたは複数のペンダント基をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項６７】
前記１つまたは複数のペンダント基が、親油性基、マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、キレート剤及び架橋剤から成る群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの３’もしくは５’末端のいずれかで、または両方の末端で結合される尾部部分をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項６９】
前記尾部部分が、リン酸、リン酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基及び親油性基から成る群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
（ｃ）増幅反応を実施する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７１】
前記増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、定量的ＰＣＲ、核酸配列ベースの増幅、転写媒介性増幅、リガーゼ連鎖反応、ローリングサイクル増幅及び鎖置換増幅から成る群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記増幅反応が自動サーマルサイクラーで実施される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
（ｃ）ＤＮＡシーケンシング反応を実施する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７４】
（ｃ）プライマー伸長反応を実施する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７５】
（ｃ）前記ポリヌクレオチドをアレイに結合させる工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７６】
前記アレイが、チップアレイ、プラットフォームアレイ、ビーズアレイ、液相アレイ及びジップコードアレイから成る群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記アレイが、ニトロセルロース、ガラス、シリコンウエハー又は光ファイバーを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
（ｃ）５’ヌクレアーゼ反応を実施する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項７９】
前記検出する工程が、前記ポリヌクレオチドに結合した検出可能な標識又は蛍光消光剤を検出することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項８０】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド部分をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８１】
前記修飾塩基が、前記デオキシリボヌクレオチド部分に共有結合されている、請求項８０に記載の二重鎖。
【請求項８２】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つのペプチド核酸部分を含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８３】
前記修飾塩基が、前記ポリヌクレオチド中の前記少なくとも１つのペプチド核酸部分に共有結合されている、請求項８２に記載の二重鎖。
【請求項８４】
前記ポリヌクレオチドがＰＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８５】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも２つの修飾塩基を含み、前記少なくとも２つの修飾塩基中のＺが、同じであるか、または異なる、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８６】
前記ポリヌクレオチドがその３’末端に、またはその３’末端から１つ目の塩基に前記修飾塩基を含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８７】
前記ポリヌクレオチドがマイナーグルーブ結合剤またはインターカレーターをさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８８】
前記ポリヌクレオチドが糖修飾をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項８９】
前記糖修飾が、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソース、および二環式の糖から成る群から選択される、請求項８８に記載の二重鎖。
【請求項９０】
前記ポリヌクレオチドが骨格修飾をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項９１】
前記骨格修飾が、修飾糖リン酸骨格、ロックド核酸骨格、ペプチド骨格、ホスホトリエステル骨格、ホスホルアミデート骨格、シロキサン骨格、カルボキシメチルエステル骨格、アセトアミデート骨格、カルバメート骨格、チオエーテル骨格、架橋ホスホン酸メチレン骨格、ホスホロチオエート骨格、メチルホスホン酸骨格、アルキルホスホン酸骨格、リン酸エステル骨格、アルキルホスホノチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、炭酸骨格、リン酸トリエステル骨格、カルボキシメチルエステル骨格、メチルホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、ｐ−エトキシ結合を有する骨格、および上述のいずれかのうちの２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択される、請求項９０に記載の二重鎖。
【請求項９２】
前記ポリヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ酵素により伸長可能である３’末端ヌクレオチドをさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項９３】
前記ポリヌクレオチドが３０個よりも少ないヌクレオチドを含む、請求項９２に記載の二重鎖。
【請求項９４】
前記ポリヌクレオチドが、９〜２５個のヌクレオチドを含む、請求項９３に記載の二重鎖。
【請求項９５】
前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つの検出可能な標識をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項９６】
前記検出可能な標識が、フルオロフォアである、請求項９５に記載の二重鎖。
【請求項９７】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドに結合した蛍光消光剤をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項９８】
前記ポリヌクレオチドが、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光化合物、磁気標識、ミクロスフェア、コロイド金属、免疫学的標識、リガンド及び蛍光色素から成る群から選択される標識をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項９９】
少なくとも１つの修飾塩基が、５’から３’方向で表される場合、前記ポリヌクレオチドの１位、前記ポリヌクレオチドの２位、前記ポリヌクレオチドの３位、前記ポリヌクレオチドの４位、前記ポリヌクレオチドの５位、前記ポリヌクレオチドの６位、前記ポリヌクレオチドの７位、前記ポリヌクレオチドの８位、前記ポリヌクレオチドの９位、前記ポリヌクレオチドの１０位、前記ポリヌクレオチドの１１位、前記ポリヌクレオチドの１２位、前記ポリヌクレオチドの１３位、前記ポリヌクレオチドの１４位、前記ポリヌクレオチドの１５位、前記ポリヌクレオチドの１６位、前記ポリヌクレオチドの１７位、前記ポリヌクレオチドの１８位、前記ポリヌクレオチドの１９位、及び前記ポリヌクレオチドの２０位から成る群から選択される位置にある、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１００】
前記ポリヌクレオチドが固体支持体に結合される、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１０１】
前記固体支持体がビーズ、アレイ、及びマイクロアレイから成る群から選択される、請求項１００に記載の二重鎖。
【請求項１０２】
前記ポリヌクレオチドが、修飾糖部分と結合した１つまたは複数のヌクレオチドをさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１０３】
前記修飾糖部分が２’置換糖及びロックド核酸糖から成る群から選択される、請求項１０２に記載の二重鎖。
【請求項１０４】
前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数の非標準塩基をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１０５】
前記１つまたは複数の非標準塩基が、修飾プリン及び修飾ピリミジンから成る群から選択される、請求項１０４に記載の二重鎖。
【請求項１０６】
前記ポリヌクレオチドが、１つまたは複数のペンダント基をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１０７】
前記１つまたは複数のペンダント基が、親油性基、マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、キレート剤及び架橋剤から成る群から選択される、請求項１０６に記載の二重鎖。
【請求項１０８】
前記ポリヌクレオチドが、前記ポリヌクレオチドの３’もしくは５’末端のいずれかで、または両方の末端で結合される尾部部分をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１０９】
前記尾部部分が、リン酸、リン酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基及び親油性基から成る群から選択される、請求項１０８に記載の二重鎖。
【請求項１１０】
前記二重鎖が固体支持体に結合される、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１１１】
前記固体支持体がビーズ、アレイ、及びマイクロアレイから成る群から選択される、請求項１１０に記載の二重鎖。
【請求項１１２】
ＺがＯである、請求項２４に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１３】
Ｑがトリチル、メトキシトリチル、またはジメトキシトリチルである、請求項２４に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１４】
前記二座保護基がｏ−ベンジレン、α−メチル−ｏ−ベンジレン、またはα，α−ジメチル−ｏ−ベンジレンである、請求項２４に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１５】
Ｘ１およびＸ２は独立して、
【化８】
0006574239.tif 000074
で表される構造
（式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、またはフェニルであり、
ｎおよびｍは独立して、０、１、２、３または４であり、
Ｘは、ＯまたはＮＲ４であり、
Ｙは、ＯまたはＳであり、
Ｚは、結合、ＯまたはＮＲ４であり、
Ｒ３はそれぞれ、同じであるか、または異なり、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルオキシ、ＮＲ５ａＲ５ｂまたはフェニルであり、
Ｒ４、Ｒ５ａおよびＲ５ｂはそれぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルまたはフェニルである）を有する、
請求項２４に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１６】
Ｘ１およびＸ２は独立して、
【化９】
0006574239.tif 000075
の構造
（式中、Ｌは、結合、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ２〜Ｃ８ヘテロアルキレン、又はＣ２〜Ｃ８アルケニレンであり、
Ｗは、Ｈ、シアノ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、ＮＯ２、Ｎ＋ＲａＲｂＲｃ、Ｃ６Ｈ４ＮＯ２、Ｃ６Ｈ４Ｃｌ、Ｃ６Ｈ３（ＮＯ２）２、Ｃ６Ｈ２（ＮＯ２）３、ＳＯ２Ｒｃ、またはＳ（Ｏ）２ＯＲｃであり、
ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、ＣＦ３、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり、
Ｒｃは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールである）を有する、
請求項２４に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１７】
Ｌが結合であり、ＷがＨである、請求項１１６に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１８】
Ｘ１およびＸ２がそれぞれ独立して、ピバロイルオキシベンジル基である、請求項２４に記載の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【請求項１１９】
Ｑ１がＨであり、Ｑ２がＦｍｏｃであり、Ｑ３がＨである、請求項２５に記載の修飾ペプチド核酸モノマー。
【請求項１２０】
前記ポリヌクレオチドが、フルオロフォアの部分をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ポリヌクレオチドが、フルオロフォアの部分をさらに含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１２２】
前記ポリヌクレオチドが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体により認識されるエピトープ、クマリン、クマリン誘導体、シアニン色素、エオシン、エリスロシン、ランタニドイオンの大環状キレート、ローダミン色素及び蛍光エネルギー移動色素から成る群から選択される標識を更に含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２３】
前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、及び２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖から成る群から選択される、請求項３２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２４】
前記１つまたは複数の非標準塩基が、無置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン及び５−置換ピリミジンから成る群から選択される、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２５】
前記ポリヌクレオチドが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体により認識されるエピトープ、クマリン、クマリン誘導体、シアニン色素、エオシン、エリスロシン、ランタニドイオンの大環状キレート、ローダミン色素及び蛍光エネルギー移動色素から成る群から選択される標識を更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１２６】
前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、及び２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖から成る群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項１２７】
前記１つまたは複数の非標準塩基が、無置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン及び５−置換ピリミジンから成る群から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項１２８】
前記検出する工程が、前記ポリヌクレオチドに結合したフルオロフォアを検出することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ポリヌクレオチドが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体により認識されるエピトープ、クマリン、クマリン誘導体、シアニン色素、エオシン、エリスロシン、ランタニドイオンの大環状キレート、ローダミン色素及び蛍光エネルギー移動色素から成る群から選択される標識を更に含む、請求項２２に記載の二重鎖。
【請求項１３０】
前記修飾糖部分が、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、及び２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース糖から成る群から選択される、請求項１０２に記載の二重鎖。
【請求項１３１】
前記１つまたは複数の非標準塩基が、無置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン及び５−置換ピリミジンから成る群から選択される、請求項１０４に記載の二重鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１４年３月３０日に出願され、「修飾チミンポリヌクレオチドオリゴマーおよび方法」という表題の仮特許出願番号第６１／９７２，３８９号、および２０１５年３月３０日に出願され、「修飾チミンポリヌクレオチドオリゴマーおよび方法」という表題の非仮特許出願番号第１４／６７３，４０３号の有益性を主張し、それらの開示は、それらの全体が全ての目的に関して参照により本明細書に援用される。
【０００２】
発明の分野
本明細書中の技術は、核酸に関する。
【背景技術】
【０００３】
ポリヌクレオチドは、例えば、標的検出、診断用途、治療用途、核酸配列決定、法医学的分析、および標的増幅などの様々な用途で有用である。通常、かかる用途は、特に標的核酸が限られた量で利用可能である場合に、高い特異性および感度を有する相補なポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズするポリヌクレオチドを要する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
修飾塩基を有するヌクレオチドアナログは、核酸ハイブリダイゼーション、増幅および／または検出の強度、感度および特異性を変更させるためにポリヌクレオチド中に含めるために開発されてきた。それにもかかわらず、核酸の操作および分析に利用可能な一連のツールを拡張させるのに、新たな化学構造および方法が必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、とりわけ、アデニンまたは２，６−ジアミノプリン塩基と高められた塩基対形成を提供し得る新規の天然に存在しないチミジン様修飾塩基（本明細書中では「修飾チミン塩基」または単に「修飾塩基」とも称される）、かかる修飾塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマー、およびそれらの使用を提供する。
【０００６】
驚くべきことに、本発明の修飾塩基は、ポリヌクレオチドオリゴマーに組み込まれると、かかる修飾塩基を含有しないオリゴマーと比較した場合に、相補的な配列とのハイブリダイゼーションに関して、それらを含むオリゴマーの結合親和性および特異性を増大させることが発見された。この驚くべき見解により、オリゴマーとその相補的な標的配列との間の相補性のより短いオリゴマーまたはより短い領域の使用が可能となる。本発明の修飾チミン塩基のさらなる利点は、それらが、それらを含有するオリゴマーの水溶解度を高めることができるということである。これは、ＤＮＡおよびＲＮＡの溶解度と比較して、比較的水不溶性であることが周知であるポリ核酸（PNA）オリゴマーの溶解度を増大させるのに特に有用であり得る。水溶解度の増大（ハイブリダイゼーション中のアデニンなどの相補的な塩基に対するチミンおよびウラシルの塩基対形成親和性の強度の増大に加えて）もまた、水性条件で標識されたポリヌクレオチドオリゴマーの望ましくない沈殿および凝集を促進し得る芳香族フルオロフォアおよび消光剤部分の疎水性を相殺するのに有用であり得る。さらに、本発明の１つまたは複数の修飾塩基は、使用者の特定のニーズに応じて、オリゴマー塩基配列中のどこに位置させてよい。
【０００７】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、任意数の修飾塩基を含んでもよい。本発明の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、少なくとも１つの修飾塩基を含み、ここで修飾塩基は、式：
【０００８】
【化１】
0006574239.tif 000002
【０００９】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。本明細書中で上記式中に示されるような修飾塩基は、「チミジン様修飾塩基」、「修飾チミン塩基」、または単に「修飾塩基」と称される。
【００１０】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、任意数のデオキシヌクレオチド部分を含んでもよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド部分を含む。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、ポリヌクレオチドオリゴマー中のデオキシリボヌクレオチド部分に共有結合されている。
【００１１】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーはまた、任意数のペプチド核酸（PNA）部分を含んでもよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、少なくとも１つのペプチド核酸（PNA）部分を含む。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、ポリヌクレオチドオリゴマー中のペプチド核酸部分に共有結合されている。
【００１２】
幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、ＰＮＡ／ＤＮＡキメラであり、ここで本発明の修飾チミン塩基は、キメラのＰＮＡセグメント中、もしくはＤＮＡセグメント中に含まれるか、またはキメラのＰＮＡセグメントおよびＤＮＡセグメントの両方がそれぞれ、かかる修飾塩基を含む。
【００１３】
本発明のポリヌクレオチドは、任意数の修飾塩基を含んでもよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、複数の修飾塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、少なくとも２つの修飾塩基を含む。ポリヌクレオチドオリゴマーが、複数の修飾チミン塩基を含む場合、修飾チミン塩基は、同じであってもよく、または異なってもよい。
【００１４】
ポリヌクレオチドオリゴマー内で、修飾チミン塩基がどこに組み込まれ得るかに関して制限はない。本発明の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、ポリヌクレオチドオリゴマーの３’末端に修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、ポリヌクレオチドオリゴマーの３’末端から１つ目の塩基に修飾チミン塩基を含む。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数のさらなる化合物を含んでもよい。本発明の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、マイナーグルーブ結合剤を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、インターカレーターを含む。
【００１６】
本発明の好ましいポリヌクレオチドオリゴマーは、骨格が２’−デオキシリボースまたはリボースを含むポリヌクレオチドオリゴマーである。しかしながら、本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数の修飾を含んでもよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、糖修飾を含む。各種糖修飾が有用である。幾つかの非限定的な糖修飾として、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソース、または二環式の糖が挙げられる。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数の骨格修飾を含んでもよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、骨格修飾は、修飾糖リン酸骨格、ロックド核酸骨格、ペプチド骨格、ホスホトリエステル骨格、ホスホルアミデート骨格、シロキサン骨格、カルボキシメチルエステル骨格、アセトアミデート骨格、カルバメート骨格、チオエーテル骨格、架橋ホスホン酸メチレン骨格、ホスホロチオエート骨格、メチルホスホン酸骨格、アルキルホスホン酸骨格、リン酸エステル骨格、アルキルホスホノチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、炭酸骨格、リン酸トリエステル骨格、カルボキシメチルエステル骨格、メチルホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、ｐ−エトキシ結合を有する骨格、および上述のいずれかの２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択される。本発明の特定の実施形態では、骨格修飾は、修飾糖リン酸骨格である。
【００１８】
本発明の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ酵素により伸長可能である３’末端ヌクレオチドを含む。
【００１９】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、任意の有用な数のヌクレオチドを含んでもよい。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、３０個よりも少ないヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、約９〜約２５個のヌクレオチド、即ち９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドを含む。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数の検出可能な標識を含んでもよい。本発明の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、少なくとも１つの検出可能な標識を含む。検出可能な標識は制限される。幾つかの実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォアまたは蛍光消光剤である。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、フルオロフォアおよび消光剤を含む。
【００２１】
本発明はまた、ハイブリダイゼーションのための方法において、本発明の修飾チミン塩基を使用する方法を提供する。本明細書中に記載する修飾チミン塩基のいずれかが、ハイブリダイゼーションのための方法で使用されてもよい。本発明の幾つかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドオリゴマーと、反応混合物中に存在すると推測される核酸標的配列とのハイブリダイゼーションのための方法が提供される。幾つかの実施形態では、上記方法は、ポリヌクレオチドオリゴマーを含み、かつ標的核酸配列を含むと推測される反応混合物を、反応混合物中に存在する場合に標的核酸配列とのポリヌクレオチドオリゴマーのハイブリダイゼーションに好適な条件下でインキュベートする工程を含む。その方法で使用されるポリヌクレオチドオリゴマーは、反応混合物中に存在すると推測される核酸標的配列内の配列に相補的であり、式：
【００２２】
【化２】
0006574239.tif 000003
【００２３】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される少なくとも１つの修飾塩基を含む。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。
【００２４】
反応混合物をインキュベートして、それによりポリヌクレオチドオリゴマーと、反応混合物中に存在する場合には標的核酸配列との間で二重鎖を形成する。幾つかの実施形態では、上記方法は、反応混合物中の標的核酸配列の存在を検出するか、または標的核酸配列の非存在を確認する工程を含む。反応混合物中の標的核酸配列の存在は、かかる二重鎖の形成の結果として検出される。反応混合物中の標的核酸配列の非存在は、かかる二重鎖の無形成の結果として確認される。上記方法の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマーは、検出可能な標識、フルオロフォアおよび蛍光消光剤から成る群から選択される部分を含む。検出可能な標識、フルオロフォアおよび／または蛍光消光剤は、二重鎖、および／または標的核酸配列の検出を容易とする。
【００２５】
本発明はまた、本発明の修飾チミン塩基を含む任意数のポリヌクレオチドオリゴマーを含む二重鎖を提供する。本発明の幾つかの実施形態では、二重鎖は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオリゴマーおよびポリヌクレオチド配列を含む。少なくとも１つのポリヌクレオチドオリゴマーは、修飾チミン塩基、および相補的なポリヌクレオチド配列の少なくとも４つの連続塩基と相補的でありそれらとハイブリダイズされている４つまたはそれ以上の連続塩基を含む。かかる二重鎖は、本発明の任意のポリヌクレオチドオリゴマーで形成され得る。幾つかの実施形態では、二重鎖を伴うポリヌクレオチドオリゴマーは、下記式
【００２６】
【化３】
0006574239.tif 000004
【００２７】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される少なくとも１つの修飾塩基を含む。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。
【００２８】
幾つかの実施形態では、二重鎖内のポリヌクレオチドオリゴマーは、検出可能な標識、フルオロフォアおよび蛍光消光剤から成る群から選択される部分を含む。検出可能な標識、フルオロフォアおよび／または蛍光消光剤は、二重鎖、および／または二重鎖内のポリヌクレオチド配列の検出を容易とする。
【００２９】
本発明の幾つかの実施形態では、修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトが提供される。本発明の幾つかの実施形態では、修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式：
【００３０】
【化４】
0006574239.tif 000005
【００３１】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、Ｑは、ヒドロキシル保護基である）で表される。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。
【００３２】
本発明の幾つかの実施形態では、修飾ペプチド核酸モノマーが提供される。本発明の実施形態では、修飾ペプチド核酸モノマーは、式：
【００３３】
【化５】
0006574239.tif 000006
【００３４】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、Ｑ１およびＱ２は独立して、Ｈもしくは窒素保護基であるか、またはＱ１およびＱ２は一緒に、窒素保護基であり、Ｑ３は、Ｈまたはカルボキシル保護基である）で表される。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。
【００３５】
本発明の幾つかの実施形態では、修飾チミンヌクレオシドが提供される。本発明の幾つかの実施形態では、修飾チミンヌクレオシドは、式：
【００３６】
【化６】
0006574239.tif 000007
【００３７】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。
【００３８】
本発明の幾つかの実施形態では、修飾チミジンヌクレオチド５’−三リン酸が提供される。本発明の幾つかの実施形態では、修飾チミジンヌクレオチド５’−三リン酸は、式：
【００３９】
【化７】
0006574239.tif 000008
【００４０】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される。本発明の特定の実施形態では、ＺはＯである。
【００４１】
本発明の幾つかの実施形態を、以下に請求項形式で直接記載する：
【００４２】
請求項１．  少なくとも１つの修飾塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマーであって、該少なくとも１つの修飾塩基が、式：
【００４３】
【化８】
0006574239.tif 000009
【００４４】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、好ましくは、ＺはＯである）で表されるポリヌクレオチドオリゴマー。
【００４５】
請求項２．  複数のデオキシリボヌクレオチド部分、好ましくは少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド部分を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００４６】
請求項３．  前記修飾塩基が、前記少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド部分に共有結合されている、請求項２に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００４７】
請求項４．  複数のペプチド核酸部分、好ましくは少なくとも１つのペプチド核酸部分を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００４８】
請求項５．  前記修飾塩基が、前記少なくとも１つのペプチド核酸部分に共有結合されている、請求項４に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００４９】
請求項６．  ＰＮＡ／ＤＮＡキメラである、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５０】
請求項７．  少なくとも２つの修飾塩基を含み、該少なくとも２つの修飾塩基中のＺが、同じであるか、または異なる、請求項１から６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５１】
請求項８．  その３’末端に、またはその３’末端から１つ目の塩基に前記修飾塩基を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５２】
請求項９．  マイナーグルーブ結合剤またはインターカレーターをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５３】
請求項１０．  糖修飾をさらに含み、好ましくは、前記糖修飾が、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、ヘキソース、および二環式の糖から成る群から選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５４】
請求項１１．  骨格修飾をさらに含み、好ましくは、前記骨格修飾が、修飾糖リン酸骨格、ロックド核酸骨格、ペプチド骨格、ホスホトリエステル骨格、ホスホルアミデート骨格、シロキサン骨格、カルボキシメチルエステル骨格、アセトアミデート骨格、カルバメート骨格、チオエーテル骨格、架橋ホスホン酸メチレン骨格、ホスホロチオエート骨格、メチルホスホン酸骨格、アルキルホスホン酸骨格、リン酸エステル骨格、アルキルホスホノチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、炭酸骨格、リン酸トリエステル骨格、カルボキシメチルエステル骨格、メチルホスホロチオエート骨格、ホスホロジチオエート骨格、ｐ−エトキシ結合を有する骨格、および上述のいずれかのうちの２つまたはそれ以上の組合せから成る群から選択され、好ましくは、前記骨格修飾が、修飾糖リン酸骨格である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５５】
請求項１２．  ＤＮＡまたはＲＮＡ依存性ポリメラーゼ酵素により伸長可能である３’末端ヌクレオチドをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５６】
請求項１３．  ３０個よりも少ないヌクレオチドを含み、好ましくは前記オリゴヌクレオチドオリゴマーが、約９〜約２５個のヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５７】
請求項１４．  検出可能な標識、フルオロフォア、および蛍光消光剤から成る群から選択される部分をさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマー。
【００５８】
請求項１５．  請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマーと、反応混合物中に存在すると推測される核酸標的配列とのハイブリダイゼーションのための方法であって、
（ａ）請求項１から１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドオリゴマーを含み、かつ標的核酸配列を含むと推測される反応混合物を、該反応混合物中に存在する場合に該標的核酸配列との該ポリヌクレオチドオリゴマーのハイブリダイゼーションに好適な条件下でインキュベートする工程、および
（ｂ）該反応混合物中の該標的核酸配列の存在を検出するか、または該標的核酸配列の非存在を確認する工程であって、該ポリヌクレオチドオリゴマーが、該核酸標的配列内の配列に相補的であり、該ポリヌクレオチドオリゴマーが、少なくとも１つの修飾塩基を含み、該少なくとも１つの修飾塩基が、式：
【００５９】
【化９】
0006574239.tif 000010
【００６０】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、好ましくは、ＺはＯである）で表される工程
を含む方法。
【００６１】
請求項１６．  前記ポリヌクレオチドオリゴマーが、検出可能な標識、フルオロフォアおよび蛍光消光剤から成る群から選択される部分をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【００６２】
請求項１７．  （ｉ）請求項１から１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド、および
（ｉｉ）ポリヌクレオチド配列
を含む二重鎖であって、請求項１から１４のいずれか一項に記載の該少なくとも１つのポリヌクレオチドオリゴマーが、該ポリヌクレオチド配列の少なくとも４つの連続塩基と相補的でありそれらとハイブリダイズされている４つまたはそれ以上の連続塩基を含む二重鎖。
【００６３】
請求項１８．  式：
【００６４】
【化１０】
0006574239.tif 000011
【００６５】
（式中、
Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、好ましくは、ＺはＯであり、
Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、
Ｑは、ヒドロキシル保護基である）で表される修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト。
【００６６】
請求項１９．  式：
【００６７】
【化１１】
0006574239.tif 000012
【００６８】
（式中、
Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、好ましくは、ＺはＯであり、
Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、
Ｑ１およびＱ２は独立して、Ｈもしくは窒素保護基であるか、またはＱ１およびＱ２は一緒に、窒素保護基であり、
Ｑ３は、Ｈまたはカルボキシル保護基である）で表される修飾ペプチド核酸モノマー。
【００６９】
請求項２０．  式：
【００７０】
【化１２】
0006574239.tif 000013
【００７１】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、好ましくはＺはＯである）で表される修飾チミジンヌクレオシド。
【００７２】
請求項２１．  式：
【００７３】
【化１３】
0006574239.tif 000014
【００７４】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、好ましくはＺはＯである）で表される修飾チミジンヌクレオチド５’−三リン酸。
【００７５】
本発明のさらなる特徴および利点を、下記の説明で記載する。開示のこれらの特徴および他の特徴は、下記の説明から十分に明らかとなり、本明細書中に記載する原則の実施により習得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１Ａ】ポリヌクレオチドオリゴマー（Ｔ１、Ｔ２およびＴ１−２）の混合物のＲＰ（逆相）ＨＰＬＣ後の時間に対する吸光度（２６０ｎｍ）を示すクロマトグラムを図式的に表す図である。オリゴマーＴ１およびＴ２はそれぞれ、「ＴＢＰ」と称される本発明の修飾塩基を含み、オリゴマーＴ１−２は、２つのＴＢＰ部分を含む。図１Ａにおけるオリゴマーはそれぞれ、５’ジメトキシトリチル（DMT）保護基を含有する。さらなる詳細は、実施例５および表３に提供する。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ポリヌクレオチドオリゴマー（Ｔ１、Ｔ２およびＴ１−２）の混合物のＲＰ（逆相）ＨＰＬＣ後の時間に対する吸光度（２６０ｎｍ）を示すクロマトグラムを図式的に表す。オリゴマーＴ１およびＴ２はそれぞれ、「ＴＢＰ」と称される本発明の修飾塩基を含み、オリゴマーＴ１−２は、２つのＴＢＰ部分を含む。図１Ｂで示される混合物では、ＤＭＴ保護基は、オリゴマーから除去されている。さらなる詳細は、実施例５および表３に提供する。
【図２】それぞれが相補的なＤＮＡポリヌクレオチドとハイブリダイズされる、４つの修飾塩基（「ＴＢＰ」）を含むポリヌクレオチドオリゴマー、および標準的なＴ塩基（「未修飾」と称される）のみを含む第２のポリヌクレオチドオリゴマーから得られる、温度（℃）に対する２７０ｎｍでの吸光度（Ａ２７０）の一次導関数としてプロットされる融解曲線を図式的に表す図である。図は、ＴＢＰ置換されたオリゴマーが、４つの天然に存在しないＴＢＰ塩基の代わりに標準的な天然に存在するＴ塩基のみを含有する天然の同じ配列のＤＮＡポリヌクレオチドよりも、相補的な核酸配列に対して著しく強力なハイブリダイゼーション親和性を有することを示す。さらなる詳細は、実施例６および表３に提供する。
【図３Ａ】Ｐｆ１−Ｔ−１、Ｐｆ１−Ｔ−２、Ｐｆ１−Ｔ−３、Ｐｆ１−Ｔ−４およびＰｆ１−Ｔ−５として示される１〜６つのＴＢＰ置換を含む蛍光プローブを使用した５’ヌクレアーゼＰＣＲ反応から得られるサイクル数の関数としての蛍光（５１６ｎｍ、ＦＡＭ（Ｅｍ））のプロットを図式的に示す図である。Ｐｆ１は、修飾チミンプローブと同じヌクレオチド配列を有するが、天然の塩基、即ち未修飾チミン塩基のみを含む。さらなる詳細は、実施例７および表３に提供する。
【図３Ｂ】Ｐｆ１−Ｔ−６、Ｐｆ１−Ｔ−７、およびＰｆ１−Ｔ−８として示される１〜６つのＴＢＰ置換を含む蛍光プローブを使用した５’ヌクレアーゼＰＣＲ反応から得られるサイクル数の関数としての蛍光（５１６ｎｍ、ＦＡＭ（Ｅｍ））のプロットを図式的に示す図である。Ｐｆ１は、修飾チミンプローブと同じヌクレオチド配列を有するが、天然の塩基、即ち未修飾チミン塩基のみを含む。さらなる詳細は、実施例７および表３に提供する。
【図４】図４は、それぞれが、蛍光プローブ、および５’末端付近、中間位置付近、または３’末端付近に１つのＴＢＰ修飾塩基を含む３つのフォワードプライマー、および標準的な未修飾Ｔ塩基のみを含む２つのリバースプライマーの種々の対での組合せを使用した５’ヌクレアーゼＰＣＲ反応から得られるサイクル数の関数としての蛍光（５１６ｎｍ、ＦＡＭ（Ｅｍ））のプロットを図式的に示す図である。対での組合せは、Ｐ１Ｆ＋Ｐ１−１Ｒ、Ｐ１Ｆ＋Ｐ１Ｒ、Ｐ１Ｆ＋Ｐ２Ｒ、Ｐ２Ｆ＋Ｐ１−１Ｒ、Ｐ２Ｆ＋Ｐ１Ｒ、Ｐ２Ｆ＋Ｐ２Ｒとして示される。さらなる詳細は、実施例８および表３に提供する。
【図５】図５は、４つのポリヌクレオチドオリゴマー（未修飾PNAおよび３つの修飾PNAオリゴマー：ＰＮＡ−Ｔ１、ＰＮＡ−Ｔ２およびＰＮＡ−Ｔ３）の重ね合わせたＲＰ（逆相）ＨＰＬＣクロマトグラム（時間に対する吸光度（２７０ｎｍ））を図式的に表す図である。オリゴマーＴ１およびＴ２はそれぞれ、本発明の「ＴＢＰ」修飾塩基を含み、オリゴマーＴ３は、２つのＴＢＰ部分を含む。さらなる詳細は、実施例１２および表３に提供する。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
Ｉ．定義
本明細書および併記の特許請求の範囲の全体にわたって、「を含む」および「を包含する」という単語は、「を含む（単数形）」、「を含んでいる」、「を包含する（単数形）」および「を包含している」などのそれらの変形は、包括的に解釈されよう。即ち、これらの単語は、文脈において可能であれば、具体的に列挙されない他の要素または整数の考え得る包含を意味することが意図される。明細書中の言語は、本発明の実施に必須な任意の特許請求されない要素を示すと解釈されるべきではない。本明細書中で使用する場合、「から成る」という用語は、「から成る」という語句に続くものを含み、かつそれらに限定されることを意味すると意図される。したがって、「から成る」という語句は、列挙される要素が必要とされるか、または必須であること、および他の要素が存在し得ないことを示す。「から本質的に成る」という用語は、組成物、方法または構造が、さらなる成分、工程および／または部品を含んでもよいが、さらなる成分、工程および／または部品が、特許請求する組成物、方法または構造の基本的および新規特性を実質的に変更させない場合に限ることを意味する。
【００７８】
本発明について記載する文脈で（特に以降の請求項における文脈で）使用される単数形の用語および類似の指示対象は、本明細書中で別記されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限りは、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。
【００７９】
本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で別記されない限り、範囲内に収まる別個の値それぞれに個別に言及する簡便な方法として役割を果たすと単に意図され、別個の値それぞれが、本明細書中で個別に列挙されているかのように、明細書中に組み込まれる。範囲は、「約」（または「およそ」）ある特定の値から、および／または「約」（または「およそ」）別の特定の値として本明細書中で表され得る。かかる範囲が表される場合、別の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、値が、先行する「約」または「およそ」の使用により、近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、範囲それぞれの終点は、他の終点に関連して、および他の終点とは無関係に重要であることが理解されよう。また、多数の本明細書中に開示する値が存在すること、およびその各値が、値自体の他に「約」その特定の値としても開示されると理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、当業者により適切に理解されるように、値が、「その値未満、またはその値に等しい」または「その値よりも大きいか、またはその値に等しい」値が開示される場合、これらの値間での考え得る範囲もまた、開示されることが理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０未満、または１０に等しい」ならびに「１０とりも大きいか、または１０に等しい」もまた開示される。
【００８０】
本明細書中に記載する方法は全て、本明細書中で別記されない限り、または他の箇所で文脈により明らかに矛盾しない限りは、任意の適切な順序で実施することができる。さらに、本明細書中に記載し、かつ１つよりも多い工程を有する方法は全て、１人よりも多い人または実在者により実施することができる。したがって、人または実在者は、方法の工程（ａ）を実施することができ、別の人または別の実在者は、方法の工程（ｂ）を実施することができ、さらなる別の人またはさらなる別の実在者は、方法の工程（ｃ）を実施することができるなどである。本明細書中に提供する任意および全ての例、または例示的な言語（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良好に明らかにすると単に意図されるものであり、他の箇所で特許請求している本発明の範囲に対して限定を課すものではない。
【００８１】
単位、接頭辞および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）の認められる形態で表される。別記されない限り、核酸は、５’から３’への配向性で左から右へ描かれ、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシへの配向性で左から右へ描かれる。
【００８２】
本明細書中に開示する本発明の代替的な要素または実施形態の分類は、限定と解釈されるべきではない。各群の成員は、個別に、または本明細書中に見出される群または他の要素の他の成員との任意の組合せで、言及され、特許請求され得る。群の１つまたは複数の成員は、利便性および／または特許性の理由で、群に包含され得るか、または群から削除され得る。任意のかかる包含または削除が行われると、明細書は、修飾されるような群を含有すると本明細書中でみなされ、したがって、併記の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュ群の書面による明細を満たす。
【００８３】
本明細書中で使用する見出しは、構成的な目的のみのためであり、説明および特許請求の範囲を限定するのに使用されることは意図されず、それらは、全体として明細書に対する参照により付され得る。したがって、以下で即座に規定される用語は、その全体が明細書に対する参照によって、より完全に規定される。
【００８４】
説明は、本発明の好ましい実施形態について記載する方法の目的のためであり、本発明をそれに限定するものと解釈されるべきではない。
【００８５】
別記されない限り、本明細書中で使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。下記の参照文献は、本発明で使用する用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９１）。本明細書中で使用する場合、下記用語は、他の箇所で明記されない限り、それらに帰する意味を有する。
【００８６】
本明細書中で使用する場合、「約」という用語は、明記される値の１０％プラスまたはマイナスの範囲を指す。例えば、「約２００」という語句は、文脈により明らかに矛盾しない限りは、２００の１０％プラスまたはマイナス、すなわち１８０〜２２０を含む。
【００８７】
本明細書中で使用する場合、「増幅」という用語は、通常は、核酸配列を増幅させるための広範囲の技法を含むが、限定されない鋳型依存性様式で、直線的に、または指数関数的に、少なくとも１つの標的核酸またはその配列相補体の少なくとも部分的な配列が生ずる任意の手段を指す。非限定的な例示的増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（Q-PCR）、核酸配列ベースの増幅（NASBA）、転写媒介性増幅（TMA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、ローリングサイクル増幅（RCA）、鎖置換増幅（SDA）、リガーゼ検出反応（LDR）、マルチプレックスライゲーション依存性プローブ増幅（MLPA）、ライゲーション、続くＱ−複製酵素増幅、プライマー伸長、鎖置換増幅（SDA）、超分岐鎖置換増幅、多重置換増幅（MDA）、核酸鎖ベースの増幅（NASBA）、２工程多重化増幅、デジタル増幅等が挙げられる。かかる技法の説明は、数ある情報源の中でも、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）；Ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｂｏｏｋ，Ｃｈａｎｇ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）；Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００２）；およびＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に見出すことができる。
【００８８】
本明細書中で使用する場合、「増幅条件」または「伸長条件」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、ポリメラーゼが、ポリヌクレオチドの３’末端に、１つまたは複数のヌクレオチドを付加し得る条件を指す。かかる増幅または伸長条件は当該技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９８７−２００７，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓに記載されている。
【００８９】
本明細書中で使用する場合、「アレイ」または「マイクロアレイ」は概して、基板上のポリヌクレオチドプローブなどのハイブリダイズすることが可能なアレイ要素の秩序配置を指す。「アレイ」は通常、例えばオリゴヌクレオチド配列またはＲＮＡなどのヌクレオチド配列産物またはオリゴヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質の、空間的にまたは論理的に系統的な収集である。アレイ要素は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ断片、ポリヌクレオチド等であり得る。アレイ要素は、遺伝子発現が定性的にまたは定量的に決定され得るように、標的配列に特異的に結合することが可能である、固体支持体上に固定化された任意の要素を含み得る。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、試料中の多数のＲＮＡに関する遺伝子発現プロフィールを決定するのに特に有用である。アレイ要素は、合成的にまたは生合成的に調製することができる。アレイ要素は、同一であり得るか、または互いに異なり得る。アレイは、様々な形式、例えば可溶性分子のライブラリー、樹脂ビーズ、シリカチップ、または他の固体支持体に係留された化合物のライブラリーを取ることができる。アレイは、アレイ上の試料スポットのサイズに応じて、マクロアレイまたはマイクロアレイのいずれかであり得る。マクロアレイは一般的に、約３００ミクロンまたはそれよりも大きい試料スポットサイズを含有し、ゲルおよびブロットスキャナーにより容易に画像化することができる。マイクロアレイは一般的に、３００ミクロン未満のスポットサイズを含有する。多重ウェルアレイは、試料スポットを含有するための多重チャンバーを含む支持体である。好ましいアレイ要素は、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーである。アレイ上の好ましい分子は、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーである。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、アレイに結合される。
【００９０】
本明細書中で使用する場合、「〜に結合する」もしくは「〜に結合される」またはそれらの文法的な等価体は、〜上に留めること、〜と一緒に留めること、〜へ添えること、〜へ取り付けること、〜に取り付けること、〜上に取り付けること、〜へ接続すること、または〜に連結することを意味する。「結合」は、結合する行為または結合されている状態を意味する。結合は、直接的にまたは間接的であり得る。例えば、部品Ａは、部品Ｂへ直接的に結合され得る。あるいは、部品Ａは、まず部品Ａを部品Ｃに結合すること、続いて部品Ｃを部品Ｂに結合することによって、部品Ｂへ間接的に結合され得る。１つよりも多い中間部品が、部品Ａを部品Ｂに結合するのに使用することができる。結合は、永続的、一時的、または長時間であり得る。例えば、また本発明の方法または本発明の方法の工程を実施するのに必要な時間、一時的に固体支持体またはアレイに結合され得る。あるいは、例えば本発明の方法または本発明の方法の工程が実施されない場合にも、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、長時間、固体支持体またはアレイに結合され得る。また、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、固体支持体またはアレイへ永続的に結合され得る。
【００９１】
本明細書中で使用する場合、「塩基」という用語は、相補的なヌクレオチド塩基またはヌクレオチド塩基アナログ、例えばプリン、７−デアザプリンまたはピリミジンと、ワトソン−クリック型水素結合を形成することが可能な窒素含有複素環式部分を意味する。典型的な塩基は、天然に存在する塩基であるアデニン、シトシン、グアニン、チミンおよびウラシルである。塩基としてはまた、デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノ−プリン、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、５−メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、５−ブロモウラシル、５−プロピルウラシル、６−アミノプリン、２−クロロ−６−アミノプリン、キサンチン、ヒポキサンチン等などの天然に存在する塩基のアナログが挙げられる。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、「ビーズ」という用語は、球形、円筒形、楕円形、長円形、またはドーム形状の物体などの幾つかの丸みを帯びた態様または表面を有する小さな物体を意味する。
【００９３】
本明細書中で使用する場合、「生物学的流体」は、宿主由来の流体を指し、全血、血清、血漿、尿、涙、粘液、腹水、口腔液、精液、糞便、痰、脳脊髄液および胎児液（fetal fluid）を含む。生物学的流体は、細胞を含んでもよく、または細胞を欠如し得る。
【００９４】
本明細書中で使用する場合、「生物学的試料」は、核酸またはポリペプチドを含有する生物学的組織または生物学的流体を意味する。かかる試料は通常、ヒト由来であるが、非ヒト霊長類またはげっ歯類、例えばマウスおよびラットから単離される組織を含む。また、生物学的試料として、外科的生検、微細針吸引生検および部検試料などの組織の切片、組織学的目的で採取した凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙、粘液、毛髪、皮膚等が挙げられ得る。また、生物学的試料として、患者組織に由来する外植片または初代および／もしくは形質転換細胞培養物が挙げられる。「生物学的試料」はまた、動物由来の細胞もしくは細胞の集団または大量の組織もしくは流体を指す。ほとんどの場合、生物学的試料は、動物から取り出されているが、「生物学的試料」という用語はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏで、即ち動物から取り出すことなく分析される細胞または組織を指すこともできる。通常、「生物学的試料」は、動物由来の細胞を含有するが、この用語はまた、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現レベルを測定するのに使用することができる血液、唾液または尿の非細胞分画などの非細胞生物学的材料を指すこともできる。組織生検または血液試料を含むが、それらに限定されない多数のタイプの生物学的試料が、本発明で使用され得る。本明細書中で使用する場合、「組織生検」は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは霊長類、最も好ましくはヒトから取り出されたある量の組織を指す。「生物学的試料」は、試薬による処理、洗浄、核酸試料（さらなる操作に適した核酸を含む試料）を得るための処理、またはＣＤ４＋Ｔリンパ球、グリア細胞、マクロファージ、腫瘍細胞、末梢血単核球（PBMC）等などのある特定の細胞集団の濃縮によるなど、それらの調達後に何らかの形で操作された試料を包含する。「生物学的試料」という用語は、臨床試料を包含し、また培養物、細胞上清、組織試料、臓器、骨髄等中の細胞も含む。本明細書中で使用する場合、「生物学的試料を供給すること」は、本発明に記載する方法における使用のために生物学的試料を得ることを意味する。ほとんどの場合、これは、対象由来の細胞の試料を取り出すことにより成されるが、同様に予め単離した細胞（例えば、別の人により、別の時間に、および／または別の目的で単離される）を使用することにより、または本発明の方法をｉｎ  ｖｉｖｏで実施することにより達成され得る。治療または転帰歴を有する保存記録組織は特に有用である。生物学的試料はまた、患者、別の動物またはがん細胞株から移植された異種移植片腫瘍を保有する動物に由来し得る。
【００９５】
本明細書中で使用する場合、「相補的な」という用語は、オリゴマー配列の、互いにハイブリダイズして、互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は通常、逆平行ポリヌクレオチド（オリゴマー）鎖中のヌクレオチド単位間の水素結合により形成される。相補的なポリヌクレオチドオリゴマー鎖は、ワトソン−クリック様式（例えば、Ａ対Ｔ、Ａ対Ｕ、Ｃ対Ｇ）で、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で、塩基対形成することができる。標的配列に対するプローブ配列の「相補性」のパーセントは、標的の配列、または標的の配列の相補体に対するプローブ配列の「同一性」パーセントである。プローブと標的配列との間の「相補性」度を決定する際、「相補性」度は、プローブの配列と標的配列の配列またはそれと最良に整列する標的配列の配列の相補体との間の同一性パーセントとして表される。例示的なプローブは、本明細書に記載されるようなオリゴヌクレオチドオリゴマーである。
【００９６】
本明細書中で使用する場合、「異なる」という用語は、同じではないこと、同じ同一性ではないことを意味する。
【００９７】
本明細書中で使用する場合、「二重鎖」という用語は、相補的な（または部分的に相補的な）単鎖ポリヌクレオチドオリゴマー、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡをアニーリングすること（ハイブリダイズすること）により形成される二重鎖ハイブリダイゼーション複合体を指す。
【００９８】
「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、優先的に特定のヌクレオチド配列への、幾つかの実施形態ではストリンジェントな条件下での核酸分子の結合、二重鎖形成またはアニーリングである「特異的なハイブリダイゼーション」に関して本明細書中で使用される。「ストリンジェントな条件」という用語は、プローブが、優先的にその標的配列とハイブリダイズして、また他の配列とより少ない程度にハイブリダイズするか、または他の配列と全くハイブリダイズしない条件を指す。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、核酸ハイブリダイゼーションの状況で、配列依存的であり、種々の環境パラメーター下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションの広範な手引きは、例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈ．２，”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙｓ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹに見出される。概して、フィルターハイブリダイゼーションのための非常にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の「熱融解温度」または「Ｔｍ」とも称される熱融点よりも約５℃低いように選択される。緩衝液組成、温度およびプローブ強度に関するハイブリダイゼーションストリンジェンシーの依存性は、当業者に周知である（例えば、Sambrook and Russell （2001） Molecular Cloning: A Laboratory Manual （3rd ed.） Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NYを参照）。ハイブリダイゼーション強度としても公知である、標的配列とのオリゴマー（またはポリヌクレオチドオリゴマー）のハイブリダイゼーション度は、当該技術分野で周知である方法により決定される。好ましい方法は、所定のハイブリッド二重鎖のＴｍを決定することである。これは、溶液中で形成される二重鎖を、徐々に上昇する温度へ付すことにより、および例えば、変性に付随する塩基対のアンスタッキングに伴って増大する紫外線の吸収により、二重鎖の変性をモニタリングすることにより達成され得る。Ｔｍは一般的に、ＤＮＡ鎖の半分が単鎖（ｓｓＤＮＡ）状態で存在する温度として定義される。Ｔｍは、ハイブリダイズされる相補的な鎖配列の長さ、それらの特異的なヌクレオチド配列、塩基組成、および相補鎖の濃度などの各種パラメーターに依存する。
【００９９】
本明細書で使用する場合、「標識」または「検出可能な標識」という用語は、生体分子、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドオリゴマーに結合されると、かかる生体分子、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドオリゴマーを適切な検出手段により検出可能にさせる部分を指す。例示的な標識として、フルオロフォア、発色団、放射性同位体、スピン標識、酵素標識、化学発光標識、電気化学発光化合物、磁気標識、ミクロスフェア、コロイド金属、免疫学的標識、リガンド、酵素等が挙げられる。幾つかの実施形態では、標識は、フルオレセイン型またはローダミン型色素などの蛍光色素である。幾つかの実施形態では、標識は、放射標識、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼなどの酵素、ストレプトアビジン、ビオチン、抗体により認識されるエピトープ、およびそれらの等価体から成る群から選択される。
【０１００】
「不適正ヌクレオチド」は、例えば増幅反応において、興味が持たれる配列および標的配列がハイブリダイズされる場合に、相当する配列中の相当するヌクレオチドに対して相補的ではない興味が持たれる配列中のヌクレオチドに関して本明細書中で使用される。Ｃの相補体はＧであり、Ａの相補体はＴである。換言すると、興味が持たれる配列中の「Ｃ」は、標的配列における「Ｔ」、「Ｃ」または「Ａ」とは不適正であるとみなされる。
【０１０１】
本明細書中で使用する場合、「修飾ヌクレオチド塩基」または「修飾塩基」という用語は、天然に存在する塩基の構造を有さない、したがって天然に存在しない塩基を指す。例えば、本明細書中に開示する好ましい修飾塩基は、修飾チミン塩基またはチミジン様修飾塩基である。
【０１０２】
本明細書中で使用する場合、「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」、「修飾オリゴヌクレオチドオリゴマー」および「修飾オリゴマー」という用語は、少なくとも１つの修飾塩基を含む本発明のポリヌクレオチドオリゴマーを指す。例えば、本明細書中に開示する好ましい修飾塩基は、修飾チミン塩基またはチミジン様修飾塩基である。本明細書中で使用される場合に交換可能であるとみなされる「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」、「修飾オリゴヌクレオチドオリゴマー」および「修飾オリゴマー」という用語はまた、例えばそれらの二重鎖および単鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、アルファ−アノマー形態等を含むポリヌクレオチドオリゴマー、オリゴヌクレオチドオリゴマーまたはオリゴマーの天然に存在しない修飾形態の直鎖ポリマーを指す。本発明の好ましい修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、修飾チミン塩基を含むものである。修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは全体的に、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドもしくはそれらのアナログで構成され得るか、または２つもしくはそれ以上の種々のモノマータイプのブロックもしくは混合物を含有し得る。これらの用語はまた、「オリゴヌクレオチドアナログ」または「核酸アナログ」とも称される、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかを含む配列を包含する。様々な参照文献が、例えばホスホルアミデート（Beaucage et al, Tetrahedron 49（10）: 1925 （1993）およびその中の参照文献；Letsinger, J. Org. Chem. 35:3800 （1970）；Sprinzl et al., Eur. J. Biochem. 81 :579 （1977）； Letsinger et al., Nucl. Acids Res. 14:3487 （1986）； Sawai et al., Chem. Lett. 805 （1984）, Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 1 10:4470 （1988）；およびPauwels et al., Chemica Scripta 26: 141 91986））、ホスホロチオエート（Mag et al.., Nucleic Acids Res. 19: 1437 （1991）および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Briu et al., J. Am. Chem. Soc. 111:2321 （1989））、Ｏメチルホホロアミダイト結合（Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Pressを参照）、およびペプチド核酸骨格および結合（Egholm, J. Am. Chem. Soc. 114: 1895 （1992）；Meier et al., Chem. Int. Ed. Engl. 31 : 1008 （1992）；Nielsen, Nature 365:566 （1993）；Carlsson et al., Nature 380:207 （1996）を参照、それらは全て、参照により援用される）を含むかかる核酸アナログを開示している。他のアナログ核酸として、正の骨格（Denpcy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6097 （1995））、；非イオン性骨格（米国特許第５，３８６，０２３号、同第５，６３７，６８４号、同第５，６０２，２４０号、同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号； Kiedrowshi et al., Angew. Chem. Intl. Ed. English 30:423 （1991）；Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 110:4470 （1988）； Letsinger et al., Nucleoside & Nucleotide 13: 1597 （1994）; Chapters 2 and 3, ASC Symposium Series 580, "Carbohydrate Modifications in Antisense Research",. Ed. Y.S. Sanghui and P. Dan Cook； Mesmaeker et al., Bioorganic & Medicinal Chem. Lett. 4:395 （1994）； Jeffs et al., J. Biomolecular NMR 34: 17 （1994）； Tetrahedron Lett. 37:743 （1996）、および米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０３４，５０６号、ならびにＣｈａｐｔｅｒｓ  ６  ａｎｄ  ７，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，”Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載されるものを含む非リボース骨格を有するものが挙げられる。１つまたは複数の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の１つの定義内に含まれる（Jenkins et al., Chem. Soc. Rev. pp 169 176 （1995）を参照）。幾つかの核酸アナログは、Ｒａｗｌｓ，Ｃ＆Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ  ２，１９９７  ｐａｇｅ  ３５に記載される。これらの参照文献は全て、参照により明確に本明細書に援用される。
【０１０３】
本明細書中で使用する場合、「天然に存在する」という用語は、核酸分子の状況で、自然に存在するヌクレオチド配列を有し、かつ自然に存在する塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドなどの構成要素のみを含むＲＮＡまたはＤＮＡ分子（単鎖または二重鎖）を指す。
【０１０４】
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオシド」という用語は、ベータ−グリコシド結合を介してリボースまたはデオキシリボース糖に結合されている本明細書中で言及されるタイプの窒素性塩基で構成される分子を指す。ヌクレオシドの例として、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジンおよびイノシンが挙げられる。通常、塩基が、ＡまたはＧである場合、リボース糖は、塩基のＮ９位に結合される。塩基が、Ｃ、ＴまたはＵである場合、リボース糖は、塩基のＮ１位に結合される（Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed., Freeman, San Francisco, Calif., （1992））。
【０１０５】
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオチド」という用語は、独立したモノマーとしての、またはポリヌクレオチド内のサブユニットとしての、ヌクレオシドのリン酸エステルを意味する。ヌクレオチドモノマーとしては、例えば、ヌクレオチド５‘−一リン酸、５‘−二リン酸、５‘−三リン酸、および３‘−一リン酸が挙げられる。ヌクレオチド三リン酸は、特にリボース糖の構造特性を指摘するのに場合によっては「ＮＴＰ」、「ｄＮＴＰ」（２‘−デオキシペントース）または「ｄｄＮＴＰ」（２‘，３‘−ジデオキシペントース）と示される。「ヌクレオチド５−三リン酸」は、５‘位に三リン酸エステル基を有するヌクレオチドを指す。三リン酸エステル基は、１つまたは複数のリン酸酸素原子に対して硫黄置換、例えば、アルファ−チオヌクレオチド５’−三リン酸を含んでもよい。ヌクレオチド一リン酸、二リン酸または三リン酸は、核酸または核酸中間体の修飾を触媒する核酸プロセシング酵素に対する基質として機能を果たし得る。
【０１０６】
本明細書中で使用する場合、「ヌクレオチドプロセシング酵素」という用語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドもしくは核酸を修飾またはプロセシングする酵素を指し、プライマー伸長酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、制限酵素、ニッキング酵素、修復酵素およびライゲーション酵素が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１０７】
本明細書中で使用する場合、「複数」という用語は、１つよりも多いことを意味する。例えば、複数の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、少なくとも２つの修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、少なくとも３つの修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、または少なくとも４つの修飾ポリヌクレオチドオリゴマー等を意味する。本発明の実施形態が、１つよりも多い修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを含む場合、それらはまた、第１の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、第２の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、第３のポリヌクレオチドオリゴマー等と称され得る。
【０１０８】
本明細書中で使用する場合、本明細書中で使用される場合には交換可能であるとみなされる「ポリヌクレオチドオリゴマー」、「オリゴヌクレオチドオリゴマー」および「オリゴマー」という用語は、本発明の「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」、「修飾オリゴヌクレオチドオリゴマー」および「修飾オリゴマー」とは異なる天然に存在するヌクレオチドモノマーの直鎖ポリマーを指す。通常、「ポリヌクレオチドオリゴマー」のヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合により連結される。しかしながら、非ホスホジエステル結合を含有する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーもまた意図される。「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」はまた、ペプチド核酸（PNA、例えば、核酸塩基が非アミド骨格窒素を介して結合されるアミド連結Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンサブユニットの骨格を含むポリマー。Nielsen et al., Science 254: 1497-1500（1991）を参照）などの、１つまたは複数の天然に存在しないモノマーおよび／またはサブユニット間結合を含有するポリマーを包含する。ポリヌクレオチドオリゴマーおよび修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは通常、サイズが数個のモノマー単位、例えば８〜４０個から数千個のモノマー単位までの範囲である。ポリヌクレオチドオリゴマーまたは修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが、「ＡＴＧＣＣＴＧ」などの文字の配列で表されるときは常に、ヌクレオチドは、別記しない限り、左から右へ５’→３’の順序で存在し、「Ａ」はアデノシンを示し、「Ｃ」はシチジンを示し、「Ｇ」はグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｕ」はウリジンを示すことが理解されよう。従来の５’および／または３’末端を有さない骨格（例えば、PNA）に関しては、通常の二重鎖ＤＮＡの逆平行相補鎖の場合と同様に、塩基配列は、配列が、３’→５’配向性を有する相補的な配列と、逆平行様式でハイブリダイズするような５’→３’の順序であるように提供される。
【０１０９】
単独で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、従来のＤＮＡまたはＲＮＡモノマー単位で、即ち、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ塩基で置換されているデオキシリボースまたはリボース糖環で、主としてまたは全体的に構成され、従来のリン酸骨格部分により連結されるポリヌクレオチドオリゴマーを指す。
【０１１０】
本明細書中で使用する場合、「プライマー」という用語は、標的核酸鎖に対して相補的であるポリヌクレオチド鎖を合成するための出発点として有効であるオリゴマーまたは修飾オリゴマーを指す。例えば、ＰＣＲにおける使用のためのプライマーは、フォワードおよびリバースプライマーを含み、ここで、フォワードプライマーは、標的核酸鎖の領域に対して相補的である配列を含有し、相補鎖の合成を誘導する。リバースプライマーは、反対の鎖に対して相補的な配列を含有し、標的核酸鎖の反対の鎖に沿って合成を誘導する。
【０１１１】
本明細書中で使用する場合、「プローブ」という用語は、標的核酸配列の領域に対して相補的な配列を含有する標識オリゴヌクレオチドまたは標識修飾オリゴヌクレオチドを指し、プローブを、標的配列と二重鎖を形成させて、標的配列の領域の存在を示す検出可能なシグナルを発生させることが可能である。検出可能なシグナルは、直接的に、または間接的に、ハイブリダイゼーション中または後に発生する。５’−ヌクレアーゼＰＣＲにおけるプライマー伸長中などの幾つかの用途において、プローブは、伸長可能な３’水酸基を欠如させて、プローブのポリメラーゼ媒介性伸長を防ぐ。
【０１１２】
「プライマー」または「プローブ」は通常、標的核酸分子の少なくとも６個の連続ヌクレオチドの配列に対して相補的である領域を含むオリゴマーまたは修飾オリゴマーであるが、プライマーおよびプローブは、６個未満の連続ヌクレオチドを含むことができる。幾つかの実施形態では、標的核酸分子の６個またはそれ以上、７個またはそれ以上、８個またはそれ以上、９個またはそれ以上、１０個またはそれ以上、１１個またはそれ以上、１２個またはそれ以上、１３個またはそれ以上、１４個またはそれ以上、１５個またはそれ以上、１６個またはそれ以上、１７個またはそれ以上、１８個またはそれ以上、１９個またはそれ以上、２０個またはそれ以上、２１個またはそれ以上、２２個またはそれ以上、２３個またはそれ以上、２４個またはそれ以上、２５個またはそれ以上、約５０個またはそれ以上、または最大約１００個の連続ヌクレオチドに対して同一であるか、または相補的である配列を含む修飾オリゴマーが提供される。プライマーまたはプローブが、標的核酸分子の少なくともｘ個の連続ヌクレオチドに対して「相補的」である領域を含む場合、「プライマー」または「プローブ」は、標的核酸分子の少なくともｘ個の連続ヌクレオチドに対して少なくとも９５％相補的である。幾つかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、標的核酸分子に対して、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％相補的である。好ましい「プローブ」または「プライマー」は、修飾塩基、好ましくは修飾チミン塩基を含む「プローブ」または「プライマー」である。
【０１１３】
本明細書中で使用する場合、「保護基（protecting group）」、「保護性基（protective group）」、または「保護形態」という用語は、その官能性を保存して、および／または続く化学反応において化学選択性を得ると意図される官能基（例えば、リン酸基またはホスホン酸基）の易動性化学修飾を指す。保護基は、脱保護処理（例えば、濃アンモニア水による処理）により最終生成物から除去される。幾つかの実施形態では、リン酸およびホスホン酸保護基Ｘ１およびＸ２は、独立して、自動ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成におけるホスフィチル化試薬の保護に使用され、および／または自動ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチド合成の条件に適合する保護基から選択される。ある特定の実施形態ではＸ１基およびＸ２基は、独立して、任意選択により置換されているベンジル、任意選択により置換されているアルキル（例えば、シアノエチル）、および任意選択により置換されているヘテロアルキルである。例示的なアミノ保護基として、ホルミル、アセチル、トリフルオロアセチル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、２−トリメチルシリル−エタンスルホニル（ＳＥＳ）、トリチルおよび置換トリチル基、アリルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびニトロ−ベラチルオキシカルボニル（ＮＶＯＣ）が挙げられるが、それらに限定されない。例示的なヒドロキシ保護基として、ベンジルおよびトリチルエーテルならびにアルキルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、トリアルキルシリルエーテルおよびアリルエーテルなどの、ヒドロキシ基がアシル化またはアルキル化されたものが挙げられる。また、Ｃｈａｐｔｅｒ  １：  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｂｙ  Ｅｔｉｅｎｎｅ  Ｓｏｎｖｅａｕｘ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２６，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９４）；Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐ．Ｗｕｔｚ  ａｎｄ  Ｔ．Ｇｒｅｅｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００６）；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，”Ｆｍｏｃ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５１：６１７９−６１９４（１９９５）；および”Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”，Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３：１７５−１８３（１９９５）を参照されたい。それらは、かかる開示に関して参照により本明細書に援用される。
【０１１４】
本明細書中で使用する場合、「塩」という用語は、本明細書中に記載する化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的無毒性の酸または塩基を用いて調製される本明細書中に記載する修飾部分などの化合物の塩を指す。本発明の化合物が、比較的酸性の官能性を含有する場合、塩基付加塩は、ニートで、または適切な不活性溶媒中で、かかる化合物の中性形態を、十分量の所望の塩基と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される塩基付加塩の例として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノ、もしくはマグネシウム塩、または同様の塩が挙げられる。本発明の化合物が、比較的塩基性の官能性を含有する場合、酸付加塩は、ニートで、または適切な不活性溶媒中で、かかる化合物の中性形態を、十分量の所望の酸と接触させることにより得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例として、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸、またはホスホン酸等のような無機酸に由来するもの、ならびに酢酸、プロピオン酸、イソ酪酸、マレイン酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的無毒性の有機酸に由来する塩が挙げられる。また、アルギン酸塩等などのアミノ酸の塩、およびグルクロン酸またはガラクツロン酸（galactunoric acids）等のような有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge et al., 1977, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Science, 66: 1-19を参照）。本発明のある特定の化合物は、化合物を塩基または酸付加塩のいずれかへと変換するのを可能にする塩基性および酸性官能性の両方を含有する。化合物の中性形態は、従来の様式で、塩を塩基または酸と接触させること、および親化合物を単離することにより再生され得る。化合物の親形態は、極性溶媒中での溶解度などのある特定の物理特性において、各種塩形態とは異なるが、他の場合では、塩は、本発明の目的で、本発明の親形態と等しい。
【０１１５】
本明細書中で使用する場合、「固体支持体」という用語は、粒子（例えば、ビーズ）、繊維、モノリス、膜、フィルター、プラスチック片、アレイ等を含む任意の不溶性材料を指す。
【０１１６】
本明細書中で使用する場合、「実質的な相補的な」という用語は、２０％以下（例えば、１５％、１０％または５％以下）の標的配列と不適正な当該配列中のヌクレオチドを有する配列を指す。幾つかの実施形態では、ハイブリダイゼーション複合体の相補鎖は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上のヌクレオチドミスマッチを有する。
【０１１７】
本明細書中で使用する場合、「標的核酸」または「標的核酸分子」という用語は、幾つかの実施形態で、ハイブリダイゼーション、増幅用などの、即ち検出の目的での標的である核酸またはポリヌクレオチドオリゴマーを指す。幾つかの実施形態では、標的核酸は、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーに部分的にまたは完全に相補的であるＲＮＡまたはＤＮＡを含む。
【０１１８】
本明細書中で使用する場合、「標的配列」、「標的核酸配列」または「標的ヌクレオチド配列」という用語は、標的核酸内の配列を指す。標的配列は通常、ＤＮＡの４つの塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）またはＲＮＡの４つの塩基（Ａ、Ｕ、ＧおよびＣ）を使用して記載することができる。
【０１１９】
ＩＩ．組成物
本開示は、改善されたハイブリダイゼーション特性を示し、ハイブリダイゼーション反応で、およびポリメラーゼ酵素に対する基質として有用である１つまたは複数の修飾塩基（「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」）を含むポリヌクレオチドオリゴマーを提供する。さらに、本開示は、例えば、プローブおよび／またはプライマーとしての、およびヌクレオチドアレイにおけるかかる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用に関する。
【０１２０】
かかる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを含む組成物、方法およびキットが、さらに提供される。修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、かかる修飾塩基を欠如するオリゴマーと比較した場合に、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーと、相補的なポリヌクレオチド配列との間の塩基対形成において優れた安定性を提供する。
【０１２１】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＤＮＡ／ＰＮＡキメラオリゴマーを含む。本発明の修飾塩基および修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、相補的な配列に関するより大きな二重鎖安定性、および１つまたは複数の塩基ミスマッチがハイブリダイゼーション複合体中に存在する場合のミスマッチ識別の改善を提供する。
【０１２２】
また、本発明の修飾塩基を含有するヌクレオシドおよびヌクレオチドも提供される。かかるヌクレオシドは、相当する一、二および三リン酸エステルの合成用の前駆体として、または酵素基質として使用され得る。本発明のヌクレオチドは、ポリメラーゼ媒介性プライマー伸長により、ポリヌクレオチドオリゴマーに組み込まれ得る。
【０１２３】
本開示の様々な実施形態が、以下で詳細に論述される。具体的な実施が論述されているが、これは、単に説明の目的で成されていることが理解されるべきである。他の構成要素および設定は、本開示の趣旨および範囲を逸脱することなく使用され得る。
【０１２４】
Ａ．修飾チミジン様塩基
本開示は、改善されたハイブリダイゼーション特性を示し、ハイブリダイゼーション反応で、およびポリメラーゼ酵素に対する基質として有用である１つまたは複数の修飾塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマーを提供する。本発明の修飾塩基は、天然に存在しない。
【０１２５】
本明細書中に開示する修飾塩基は、ピリミジン環構造の５位へリンカー部分により連結されるリン酸またはホスホン酸基を含む。本発明の修飾塩基は、従来の塩基チミンおよびウラシルのアナログであるとみなされ得る。チミンに関しては、以下でさらに示すように、チミンの５−メチル置換基が、リンカーリン酸またはリンカーホスホン酸部分で置換されている。ウラシルに関しては、５−水素が、リンカーリン酸またはリンカーホスホン酸部分で置換されている。本開示では、修飾塩基は、場合によっては修飾チミン塩基（例えば、ＴＢＰまたはＴＰＰ）として表されるが、それらはまた、望ましい場合には、修飾ウラシル塩基：
【０１２６】
【化１４】
0006574239.tif 000015
【０１２７】
として表すこともできる。
【０１２８】
本発明の修飾塩基は、式：
【０１２９】
【化１５】
0006574239.tif 000016
【０１３０】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、Ｘ１およびＸ２は独立して、Ｈもしくは保護基であるか、または一緒に、保護基であり、破線は、オリゴマー骨格へ、またはデオキシリボヌクレオシドのリボース環、デオキシリボヌクレオチドのリボース環もしくはＰＮＡアミノ酸モノマーの骨格などの単量体骨格部分への修飾塩基の結合点を示す）で一般的に表され得る。Ｘ１およびＸ２がともに、保護基である場合、Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであってもよく、または異なってもよく、Ｘ１およびＸ２は一緒になって、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン：
【０１３１】
【化１６】
0006574239.tif 000017
【０１３２】
などの二座保護基であり得る。本発明の特定の実施形態では、式Ｉによる本発明の修飾塩基は、修飾塩基（式中、Ｚは、Ｏであり、Ｘ１およびＸ２は一緒になって、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン：
【０１３３】
【化１７】
0006574239.tif 000018
【０１３４】
である）である。
【０１３５】
リン酸およびホスホン酸保護基ならびにそれらの導入方法のさらなる説明は、Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐ．Ｗｕｔｚ  ａｎｄ  Ｔ，Ｇｒｅｅｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６に見出すことができ、それは、かかる開示に関して参照により本明細書に援用される。
【０１３６】
通常、ホスホルアミダイト法によるポリヌクレオチドオリゴマーの、またはペプチド合成によるＰＮＡオリゴマーの合成の場合のように、オリゴマー合成中の損傷または修飾から、リン酸またはホスホン酸部分を保護することが望ましい場合には、Ｘ１およびＸ２はともに、保護基である。本発明の修飾塩基を含有するポリヌクレオチドオリゴマーでは、増大した塩基対形成親和性および水溶解度を提供するために、保護基は通常、オリゴマーが相補的なポリヌクレオチドオリゴマーとハイブリダイズするのに使用される前に除去される。好ましくは、Ｘ１、Ｘ２または両方が、保護基（単数）であるか、または保護基（複数）であるときは常に、保護基（複数可）は、アンモニア処理により除去可能である。
【０１３７】
ＺがＯである幾つかの実施形態では、修飾塩基は、リン酸部分を含む。
【０１３８】
ＺがＣＨ２である幾つかの実施形態では、修飾塩基は、ホスホン酸部分を含む。
【０１３９】
以下でさらに記載するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、ホスホルアミデート、修飾ＰＮＡモノマー、修飾ヌクレオシド、および修飾ヌクレオチドは、上述する修飾塩基（式Ｉ）の１つまたは複数を含む。
【０１４０】
Ｂ．修飾ポリヌクレオチドオリゴマー
本開示は、改善されたハイブリダイゼーション特性を示し、ハイブリダイゼーション反応で、およびポリメラーゼ酵素に対する基質として有用である１つまたは複数の修飾塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマーを提供する。それらは、本明細書中で「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」と称され、また天然に存在しない。本開示はさらに、例えば、プローブおよび／またはプライマーとしての、およびヌクレオチドアレイにおけるかかる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用に関する。
【０１４１】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、上記式に従って、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上の修飾塩基を含む（式Ｉを参照）。修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の修飾塩基の数は、特定の用途のニーズに最適であることを決定するために、種々のオリゴマー構築物に関して融解研究または他の実験により、本明細書中に記載するように決定することができる、オリゴマー配列中のＴ塩基の数および望ましい結合親和性の増大の量に依存する。
【０１４２】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、式：
【０１４３】
【化１８】
0006574239.tif 000019
【０１４４】
（式中、
Ｙ１はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルであるか、またはＹ３と任意選択により組み合わせて、５〜７員環を形成し、
Ｙ２はそれぞれ独立して、Ｏ、ＳまたはＮＨであり、
Ｙ３はそれぞれ独立して、Ｈ、ＦまたはＯＲａであり、
Ｒａはそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはヒドロキシ保護基であり、
Ｚはそれぞれ独立して、Ｐ（Ｏ）ＯＨ、Ｐ（Ｓ）ＯＨまたはＰ（Ｏ）ＣＨ３であり、
ｎは、１〜９８であり、
Ｑ１およびＱ２はそれぞれ独立して、Ｈ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、蛍光レポーター色素、または消光剤、好ましくは蛍光消光剤であり、
Ｂはそれぞれ独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウリジン、ジアミノプリンであるが、但し、少なくとも１つのＢが、式：
【０１４５】
【化１９】
0006574239.tif 000020
【０１４６】
で表される修飾塩基であり、ここで、Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、Ｘ１およびＸ２は、同じであるか、または異なり、別個になって、Ｈもしくは保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン：
【０１４７】
【化２０】
0006574239.tif 000021
【０１４８】
などの二座保護基である）で表される。
【０１４９】
幾つかの実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、Ｈである。幾つかの実施形態では、ＺはＯである。幾つかの実施形態では、ＺはＣＨ２である。
【０１５０】
特定の実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、式：
【０１５１】
【化２１】
0006574239.tif 000022
【０１５２】
（式中、
Ｙ１はそれぞれ、Ｈであり、
Ｙ２はそれぞれ、Ｏであり、
Ｙ３はそれぞれ、Ｈであり、
Ｒａはそれぞれ、Ｈであり、
Ｚはそれぞれ独立して、Ｐ（Ｏ）ＯＨであり、
ｎは、１〜９８であり、
Ｑ１およびＱ２はそれぞれ独立して、Ｈ、一リン酸、二リン酸、三リン酸、蛍光レポーター色素、または消光剤、好ましくは蛍光消光剤であり、
Ｂはそれぞれ独立して、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウリジン、ジアミノプリンであるが、但し少なくとも１つのＢが、式：
【０１５３】
【化２２】
0006574239.tif 000023
【０１５４】
で表される修飾塩基であり、ここで、ＺはＯであり、Ｘ１およびＸ２は一緒になって、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン：
【０１５５】
【化２３】
0006574239.tif 000024
【０１５６】
である）で表される。
【０１５７】
本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは通常、１００個よりも少ないヌクレオチドを有する単鎖ポリヌクレオチドを含むか、またはそれで構成されるが、何百もしくは何千またはそれ以上のより長い配列もまた意図される。
【０１５８】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、３０個よりも少ないヌクレオチドを含み、好ましくは、オリゴヌクレオチドオリゴマーは、約９〜約２５個のヌクレオチド、即ち９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のヌクレオチドを含む。
【０１５９】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、２〜約１００個、２〜約５０個、２〜約２５個、２〜約１５個、５〜約５０個、５〜約２５個、５〜約１５個、約１０〜約５０個、約１０〜約２５個、約１０〜約２０個、約１０〜約１５個、約１２〜約５０個、約１２〜約２５個、約１２〜約２０個のヌクレオチドを含むか、またはそれらで構成される。オリゴマーは、それらの長さによって称され得る。例えば、１５個のヌクレオチドオリゴマーは、１５量体と称され得る。
【０１６０】
当業者が理解するように、修飾チミン塩基が組み込まれ得る修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、プローブ、プライマーまたはＰＮＡ内の位置は限定されない。修飾チミン塩基が様々な位置で組み込まれるポリヌクレオチドオリゴマー、プローブ、プライマーまたはＰＮＡが本明細書中で開示される。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの２位に存在する（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−１、Ｐｆ１−Ｔ−４、Ｐｆ１−Ｔ−５、Ｐｆ１−Ｔ−７、Ｐｆ１−Ｔ−８；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの３位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの４位に存在する（例えば、Ｐ１−１Ｒ、ＰＮＡ−Ｔ１、ＰＮＡ−Ｔ３；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの５位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの６位に存在する（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−２、Ｐｆ１−Ｔ−４、Ｐｆ１−Ｔ−５、Ｐｆ１−Ｔ−８；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの７位に存在する（例えば、ＰＮＡ−Ｔ２、ＰＮＡ−Ｔ３；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾シトシン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの８位に存在する（例えば、Ｔ１、Ｔ１−２、Ｏ４；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの９位に存在する（例えば、Ｏ４、Ｐ１Ｒ；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１０位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１１位に存在する（例えば、Ｏ４、Ｐｆ１−Ｔ−３、Ｐｆ１−Ｔ−５；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１２位に存在する（例えば、Ｔ２、Ｔ１−２、Ｏ４、Ｐｆ１−Ｔ−６、Ｐｆ１−Ｔ−７、Ｐｆ１−Ｔ−８；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１３位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１４位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１５位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１６位に存在する（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−６、Ｐｆ１−７−７、Ｐｆ１−Ｔ−８、プローブ；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１７位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１８位に存在する（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−６、Ｐｆ１−Ｔ−７、Ｐｆ１−Ｔ−８、プローブ；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの１９位に存在する。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの２０位に存在する（例えば、Ｐ１Ｆ；表３を参照）。幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、５’→３’方向で描かれる場合、ポリヌクレオチドの２１位に存在する（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−６、Ｐｆ１−Ｔ−７、Ｐｆ１−Ｔ−８；表３を参照）。
【０１６１】
当業者が理解するように、ポリヌクレオチドオリゴマー、プローブまたはプライマー内の修飾チミン塩基の数は限定されない。様々な数の修飾チミン塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマー、プローブ、プライマーおよびＰＮＡが本明細書中に開示される。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、１個の修飾チミン塩基を含む（例えば、Ｔ１、Ｔ２、Ｐｆ１−Ｔ−１、Ｐｆ１−Ｔ−２、Ｐｆ１−Ｔ−３、Ｐ１Ｆ、Ｐ１Ｒ、Ｐ１−１Ｒ、ＰＮＡ−Ｔ１、ＰＮＡ−Ｔ２；表３を参照）。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、２個の修飾チミン塩基を含む（例えば、Ｔ１−２、Ｐｆ１−Ｔ−４、プローブ、ＰＮＡ−Ｔ３；表３を参照）。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、３個の修飾チミン塩基を含む（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−５、表３を参照）。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、４個の修飾チミン塩基を含む（例えば、Ｏ４、Ｐｆ１−Ｔ−６；表３を参照）。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、５個の修飾チミン塩基を含む（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−７；表３を参照）。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、６個の修飾チミン塩基を含む（例えば、Ｐｆ１−Ｔ−８；表３を参照）。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも１個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも２個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも３個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも４個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも５個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも６個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも７個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも１０個の修飾チミン塩基を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡは、少なくとも１２個の修飾チミン塩基を含む。
【０１６２】
ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡが、少なくとも２つの修飾チミン塩基を含む幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、互いに隣接している（例えば、Ｏ４；表３を参照）。ポリヌクレオチドオリゴマー、プライマー、プローブまたはＰＮＡが、少なくとも２つの修飾チミン塩基を含む幾つかの実施形態では、修飾チミン塩基は、１つまたは複数の天然に存在する塩基により、互いに分離される。
【０１６３】
幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、固体支持体に結合される。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ビーズに結合される。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、アレイに結合される。幾つかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドオリゴマーは、マイクロアレイに結合される。
【０１６４】
１．さらなる修飾を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマー
幾つかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の修飾塩基を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、修飾塩基もしくは塩基アナログおよび／または検出可能な標識、蛍光および／または化学発光消光剤および／またはマイナーグルーブ結合剤および／または１つまたは複数の塩基修飾、糖修飾および／または骨格修飾を含むなどの他の型の修飾をさらに含む。
【０１６５】
下記パラグラフにおいて、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーのさらなる修飾が、明瞭化のために個別に記載されるが、個別に記載される修飾はそれぞれ、互いと組み合わせることができることを当業者は理解するであろう。例えば、さらなる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、糖修飾および骨格修飾を含む。別の非限定的な例では、さらなる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、糖修飾および標識を含む。さらに別の例では、さらなる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、骨格修飾および標識を含む。さらに別の非限定的例では、さらなる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、標識および塩基修飾を含む。
【０１６６】
（ａ）糖修飾を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマー
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数の修飾糖部分を含む。様々な糖部分を使用して、本発明の修飾ポリヌクレオチドを修飾することができる。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の糖修飾の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを修飾するための糖部分として、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースが挙げられるが、それに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを修飾するための糖部分は、アラビノース、ｄ−アラビノ−ヘキシトール、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースから成る群から選択される。
【０１６７】
幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、修飾糖部分が結合された１つまたは複数のヌクレオチドを含む。様々な糖部分が、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーに組み込まれるヌクレオチドに結合させるために使用される。幾つかの実施形態では、ヌクレオチドに結合される糖部分は、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、または２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース（２’ＭＯＥ）糖などの２’置換糖である。幾つかの実施形態では、ヌクレオチドに結合された糖部分は、２’−Ｏ−アルキル−リボース糖、２’−アミノ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−デオキシリボース糖、２’−フルオロ−アラビノース糖、および２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース（２’ＭＯＥ）糖などの２’置換糖から成る群から選択される。本発明の特定の実施形態では、ヌクレオチドに結合される糖部分は、２’−Ｏ−メトキシエチル−リボース（２’ＭＯＥ）糖である。
【０１６８】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ロックド核酸（「ＬＮＡ」）糖を含む。ＬＮＡ糖は二環式の糖、即ち、Ｃ−４’とＣ−２’位にある酸素原子との間にメチレン架橋を含有する二環式の糖である。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ＬＮＡ糖を有する１つまたは複数のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ＬＮＡ糖部分を有するヌクレオチドで構成される１つまたは複数の領域を含有する。幾つかの実施形態では、修飾オリゴヌクレオチドオリゴマーは、デオキシリボヌクレオチドが散在しているＬＮＡ糖部分を有するヌクレオチドを含有する。例えば、Ｆｒｉｅｄｅｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．１４（１１）：１１３８−１１４２を参照されたい。
【０１６９】
（ｂ）骨格修飾を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマー
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、骨格修飾を含む。様々な骨格修飾が、修飾オリゴヌクレオチドに導入され得る。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の骨格修飾の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。
【０１７０】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数のホスホジエステル結合を含む。幾つかの実施形態では、ヌクレオチドアナログは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用などの骨格修飾を含む。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホン酸メチレン、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸、アルキルホスホン酸、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロジチオエート、炭酸、リン酸トリエステル、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ結合、およびそれらの組合せなどの修飾結合を含む。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホン酸メチレン、ホスホロチオエート、メチルホスホン酸、アルキルホスホン酸、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロジチオエート、炭酸、リン酸トリエステル、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ｐ−エトキシ結合、およびそれらの組合せから成る群から選択される修飾結合を含む。
【０１７１】
例えば、ＰＮＡは、従来のＤＮＡ塩基（Ａ、Ｃ、ＴおよびＧ）または非従来型塩基を含有するように容易に合成することができるが、ＰＮＡモノマー単位は、糖−リン酸骨格ではなく、ポリアミド骨格により連結される。
【０１７２】
（ｃ）塩基修飾を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマー
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数の非標準塩基（即ち、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル以外の）を含む。様々な非標準塩基が、修飾オリゴヌクレオチドに導入され得る。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の塩基修飾の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。かかる非標準塩基は、例えば、ハイブリダイゼーションを安定化もしくは不安定化するための、プローブ分解を促進もしくは阻害するための、または検出可能な部分もしくは消光剤部分の結合点としての多数の目的に役立ち得る。修飾塩基（本発明の修飾塩基以外）および塩基アナログの多数の例は、上述しており、当該技術分野で公知であり、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーをさらに修飾するのに使用することができる。
【０１７３】
幾つかの実施形態では、修飾オリゴマーは、アミン修飾ヌクレオチド、即ち、反応性アミン基を含有するように修飾されたヌクレオチドである修飾塩基を含む。
【０１７４】
本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、例えば、無置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン塩基（例えば、ＰＰＧおよびＰＰＡ）、３−置換ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、修飾プリン、修飾ピリミジン、５−置換ピリミジンまたはユニバーサル塩基などの一般的な塩基または修飾塩基の任意の組合せを含み得る。
【０１７５】
（ｄ）標識を含む修飾オリゴヌクレオチドオリゴマー
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、標識、好ましくは検出可能な標識を含む。検出可能な標識を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが、本明細書中に記載するように、例えば、プローブとして、またはプライマーとして使用される。様々な標識が、修飾オリゴヌクレオチドに導入され得る。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の標識の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。
【０１７６】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、その配列の一方の末端にフルオロフォア、および／またはその配列の他の末端に蛍光消光剤を含み、その結果、蛍光消光剤は、蛍光共鳴エネルギー移動（「FRET」）などのエネルギー移動メカニズムを介して、無傷のプローブ（即ち、プローブとして使用される修飾ポリヌクレオチドオリゴマー）中のフルオロフォアの蛍光シグナルを抑制する。ポリメラーゼは、プローブが同様にハイブリダイズされた鋳型に沿ってプライマーを伸長する場合、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性は、プローブ（即ち、修飾ポリヌクレオチドオリゴマー）を切断し、それによりフルオロフォアが蛍光消光剤から離れて拡散するのを可能にし、その結果、蛍光シグナルがそこで検出される。シグナルは、切断されるプローブの量に比例して、したがって増幅生成物（アンプリコン、標的配列）の量に比例して、各ＰＣＲサイクルに伴って増大する。これにより、標的ＤＮＡ配列の直接的な検出および定量化が可能となる。幾つかの実施形態では、フルオロフォアは、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの配列の末端から少なくとも１つのヌクレオチド分、離れた位置である塩基に結合され、および／または蛍光消光剤は、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの他の末端から少なくとも１つのヌクレオチド分、離れた位置である塩基に結合される。幾つかの実施形態では、フルオロフォアおよび／または蛍光消光剤は、修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の内部に位置する。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内のフルオロフォアおよび／または蛍光消光剤の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。
【０１７７】
幾つかの実施形態では、フルオロフォアおよび蛍光消光剤は、ＦＲＥＴプローブの末端に存在しない。幾つかの実施形態では、フルオロフォアの発光スペクトルは、蛍光消光剤の吸収スペクトルと大幅に重複する。しかしながら、例えば、消光が衝突メカニズムを包含する場合、かかるスペクトルの重複は、あまり重要でないか、もしくは必要とされず、または重複は、例えば、反応条件またはプローブ構造に起因して増大される。
【０１７８】
幾つかの実施形態では、ＦＲＥＴプローブ上で（即ち、FRETプローブとして使用される修飾ポリヌクレオチドオリゴマー上で）使用される標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬなどのＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ；７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリンおよびヒドロキシクマリンなどのクマリンならびにその誘導体；Ｃｙ３およびＣｙ５などのシアニン色素；エオシンおよびエリスロシン；フルオレセインイソチオシアネートなどのフルオレセインおよびその誘導体；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｙｅ（商標）などのランタニドイオンの大環状キレート；Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ；ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびローダミン６Ｇなどのローダミン色素；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；チアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体などの蛍光エネルギー移動色素；およびＴＯＴＡＢなどの比色分析用色素またはフルオロフォアを含む。
【０１７９】
本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを修飾するのに使用することができる有用な色素の具体例として、上記で同定するもの、ならびにＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０；ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６５５、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲおよびＢＯＤＩＰＹ−ＴＲなどのアミン反応性ＢＯＤＩＰＹ色素；Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＳＹＰＲＯ、ＴＡＭＲＡ、２’，４’，５’，７’−テトラブロモスルホン−フルオレセイン、ＴＥＴおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８０】
本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを修飾するのに使用することができるフルオロフォア／蛍光消光剤対（即ち、供与体／受容体対）の例として、フルオレセイン／テトラメチルローダミン；ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン；ＥＤＡＮＳ／ダブシル；フルオレセイン／フルオレセイン；ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ；フルオレセイン／ＱＳＹ  ７またはフルオレセイン／ＱＳＹ  ９が挙げられるが、それらに限定されない。供与体および受容体が同じである場合、ＦＲＥＴは、幾つかの実施形態では、蛍光脱分極により検出され得る。フルオロフォア／消光剤対（即ち、供与体／受容体）のある特定の具体例として、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／ＱＳＹ３５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／ダブシル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ＱＳＹ  ３５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ダブシル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ＱＳＹ  ７またはＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／ＱＳＹ  ７またはＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／ＱＳＹ  ７またはＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／ＱＳＹ  ２１；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４／ＱＳＹ  ２１；およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７／ＱＳＹ  ２１が挙げられるが、それらに限定されない。幾つかの実施形態では、同じ消光剤は、多重フルオロフォア、例えば、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（Ｒ）消光剤（Integrated DNA Technologies、Coralville、A）またはＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）（またはBHQ（商標））（Biosearch Technologies、Petaluma、CA）などの広域スペクトル消光剤に使用され得る。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、フルオレセイン／テトラメチルローダミン；ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオレセイン；ＥＤＡＮＳ／ダブシル；フルオセレイン／フルオレセイン；ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ；フルオレセイン／ＱＳＹ  ７；フルオレセイン／ＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌ��ｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／ＱＳＹ３５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０／ダブシル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ＱＳＹ  ３５；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ダブシル；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８／ＱＳＹ  ７またはＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５／ＱＳＹ  ７またはＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／ＱＳＹ  ７またはＱＳＹ  ９；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８／ＱＳＹ  ２１；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４／ＱＳＹ  ２１；および；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７／ＱＳＹ  ２１から成る群から選択されるフルオロフォア／蛍光消光剤対を含む。
【０１８１】
幾つかの実施形態では、例えば、２つまたはそれ以上の部分が同時に検出される多重反応では、同じ反応で同時に検出される場合に、フルオロフォアが区別され得るように、修飾ポリヌクレオチドオリゴマープローブはそれぞれ、検出可能に異なるフルオロフォアを含み得る。当業者は、上記で開示するフルオロフォア／蛍光消光剤由来の多重反応における使用のための検出可能に異なるフルオロフォアおよび当該技術分野で公知の他のもののセットを選択することができる。当業者が理解するように、フルオロフォアおよび／または蛍光消光剤の選択、ならびに本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内のフルオロフォアおよび／または蛍光消光剤の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。
【０１８２】
（ｅ）他の修飾を含む修飾オリゴヌクレオチドオリゴマー
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、１つまたは複数のペンダント基をさらに含む。様々なペンダント基が、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを修飾するのに使用され得る。当業者が理解するように、ペンダント基の選択、および本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内のペンダント基の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。ペンダント基は、１つもしくは複数の内部に位置する塩基へ、３’−末端に、５’−末端に、両方の末端に、または内部にかつ修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの一方もしくは両方の末端で結合される親油性基、マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、キレート剤または架橋剤などの部分であり得る。したがって、幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーに結合されるペンダント基は、親油性基、マイナーグルーブ結合剤、インターカレーター、キレート剤および架橋剤から成る群から選択される部分である。かかるペンダント基を結合するのに適した方法は、当該技術分野で一般的に知られている。
【０１８３】
幾つかの実施形態では、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、低分子量「尾部部分」を含む。様々な「尾部部分」が、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーをさらに修飾するのに使用され得る。当業者が理解するように、「尾部部分」の選択、および本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内の「尾部部分」の位置は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。幾つかの実施形態では、尾部部分は、３’もしくは５’末端のいずれかで、または修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの両方の末端で結合される。尾部分子は、リン酸、リン酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基または親油性油であり得る。したがって、幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーに結合される尾部部分は、リン酸、リン酸エステル、アルキル基、アミノアルキル基および親油性基から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、尾部部分は、インターカレーター、親油性基、マイナーグルーブ結合剤（MGB）、レポーター基、キレート剤または架橋官能性を、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーに連結させる。例えば、ＭＧＢは、修飾オリゴヌクレオチドオリゴマーの一方または両方の末端で結合され得る。さらに、または代わりに、１つまたは複数のＭＧＢは、修飾オリゴヌクレオチドオリゴマー内の内部位置に結合され得る。当業者が理解するように、かかる選択は、修飾オリゴヌクレオチドオリゴマーの長さに依存し得る。
【０１８４】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、不自然な比率の原子同位体を含む。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、放射標識される。適切な放射標識として、トリチウム（３Ｈ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、リン（３２Ｐ）または炭素−１４（１４Ｃ）が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８５】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、塩形態で供給される。修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、各種塩形態で供給することができる。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの塩形態は、様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの塩形態として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム、有機アミノもしくはマグネシウム塩、または同様の塩などの塩基付加塩が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１８６】
幾つかの実施形態では、本明細書中に記載する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、塩基性および／または酸性官能性を含む。任意のイオン性基の電荷状態は、環境のｐＨに依存する。例えば、修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内のリン酸基の非架橋酸素原子は、塩基性ｐＨ条件下よりも、酸性ｐＨ条件下でよりプロトン化される傾向にある。したがって、構造は、特定のプロトン化状態（例えば、完全にプロトン化されたリン酸二酸部分）で示され得るが、修飾ポリヌクレオチドオリゴマー内のイオン性基の真のプロトン化状態は、溶媒のｐＨ、含水量および塩濃度などの要因に依存する。
【０１８７】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、不斉炭素原子または二重結合を保有し、例えばラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体および個々の異性体として供給され、それらは全て、本発明の範囲内に包含されると意図される。例えば、従来のＤＮＡおよびＲＮＡは、ヌクレオチドサブユニットのＤ−立体異性体を含むが、ＤＮＡおよびＲＮＡのＬ−立体異性体もまた、本開示により包含される。
【０１８８】
Ｃ．修飾ヌクレオシドホスホルアミダイト
本発明はまた、式：
【０１８９】
【化２４】
0006574239.tif 000025
【０１９０】
（式中、
Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、または異なるリン酸もしくはホスホン酸保護基であるか、あるいはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座リン酸またはホスホン酸保護基であり、
Ｑは、ヒドロキシル保護基である）で表される修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトを提供する。
【０１９１】
本発明の特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、式：
【０１９２】
【化２５】
0006574239.tif 000026
【０１９３】
（式中、Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、または異なるリン酸もしくはホスホン酸保護基であるか、あるいはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座リン酸またはホスホン酸保護基であり、Ｑは、ヒドロキシル保護基である）で表される。
【０１９４】
上記式において、好ましくは、Ｑは、酸性条件下で除去可能である。幾つかの実施形態では、Ｑは、トリチル、メトキシトリチル（ＭＭＴ）、またはジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。幾つかの実施形態では、Ｘ１およびＸ２は一緒になって、ｏ−ベンジレン、α−メチル−ｏ−ベンジレン、またはα，α−ジメチル−ｏ−ベンジレンなどの二座保護基である。
【０１９５】
修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトの幾つかの実施形態では、保護基Ｘ１およびＸ２が別個になって存在する場合、それぞれ、式：
【０１９６】
【化２６】
0006574239.tif 000027
【０１９７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、またはフェニルであり、ｎおよびｍは独立して、０、１、２、３または４であり、Ｘは、ＯまたはＮＲ４であり、Ｙは、ＯまたはＳであり、Ｚは、結合、ＯまたはＮＲ４であり、Ｒ３はそれぞれ、同じであるか、または異なり、独立して、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、シアノ、ニトロ、ハロゲン、Ｃ１〜Ｃ６アルキルオキシ、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルオキシ、ＮＲ５ａＲ５ｂまたはフェニルであり、Ｒ４、Ｒ５ａおよびＲ５ｂはそれぞれ独立して、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキルまたはフェニルである）で表される構造を有し得る（例えば、国際公開第２０００／０５５１７９  Ａ１号を参照）。
【０１９８】
修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトの幾つかの実施形態では、Ｒ１およびＲ２は独立して、構造：
【０１９９】
【化２７】
0006574239.tif 000028
【０２００】
（式中、Ｌは、結合、Ｃ１〜Ｃ８アルキレンまたはＣ２〜Ｃ８ヘテロアルキレン、Ｃ２〜Ｃ８アルケニレンであり、Ｗは、Ｈ、シアノ、Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、ＮＯ２、Ｎ＋ＲａＲｂＲｃ、Ｃ６Ｈ４ＮＯ２、Ｃ６Ｈ４Ｃｌ、Ｃ６Ｈ３（ＮＯ２）２、Ｃ６Ｈ２（ＮＯ２）３、ＳＯ２Ｒｃ、またはＳ（Ｏ）２ＯＲｃであり、ＲａおよびＲｂは独立して、Ｈ、ＣＦ３、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールであり、Ｒｃは、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ６〜Ｃ１０アリールである）を有する。かかる基は、それらが、従来のアンモニアまたは水酸化アンモニウム処理で除去することが可能であるため好適である。本発明の特定の実施形態では、上記式による修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトであり、ここで、Ｘ１およびＸ２は独立して、構造：
【０２０１】
【化２８】
0006574239.tif 000029
【０２０２】
（式中、Ｌは結合であり、ＷはＨである）を有する。
【０２０３】
幾つかの実施形態では、Ｘ１およびＸ２はそれぞれ独立して、ピバロイルオキシベンジル基である。
【０２０４】
本発明の修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、天然に存在しない。当業者が理解するように、修飾ヌクレオシドホスホルアミダイトは、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを合成するのに有用である。
【０２０５】
Ｄ．修飾ＰＮＡモノマー
本発明はまた、式：
【０２０６】
【化２９】
0006574239.tif 000030
【０２０７】
（式中、
Ｚは、ＣＨ２またはＯであり、
Ｘ１およびＸ２は別個になって、同じであるか、もしくは異なる保護基であるか、またはＸ１およびＸ２は一緒になって、二座保護基であり、
Ｑ１およびＱ２は独立して、Ｈもしくは窒素保護基であるか、またはＱ１およびＱ２は一緒に、窒素保護基であり、
Ｑ３は、Ｈまたはカルボキシル保護基である）で表される保護された修飾ＰＮＡモノマーを提供する。
【０２０８】
修飾ＰＮＡモノマーの幾つかの実施形態では、ＺはＯである。幾つかの実施形態では、ＺはＣＨ２である。本発明の特定の実施形態では、上記式に従う保護された修飾ＰＮＡモノマーは、保護された修飾ＰＮＡモノマー（式中、ＺはＯである）である。
【０２０９】
幾つかの実施形態では、Ｑ１はＨであり、Ｑ２はＦｍｏｃである。幾つかの実施形態では、Ｑ３はＨである。幾つかの実施形態では、Ｘ１およびＸ２は一緒になって、ｏ−ベンジレン、α−メチル−ｏ−ベンジレン、またはα，α−ジメチル−ｏ−ベンジレンなどの二座保護基である。好ましくは、Ｘ１、Ｘ２またはその両方は、常に保護基であり（単数または複数）、保護基（複数可）は、アンモニア処理により除去可能である。
【０２１０】
本発明の修飾ＰＮＡモノマーは、天然に存在しない。
【０２１１】
Ｅ．修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチド
本発明はまた、式：
【０２１２】
【化３０】
0006574239.tif 000031
【０２１３】
で表される修飾ヌクレオシドを提供する。
【０２１４】
本発明の特定の実施形態では、修飾ヌクレオシドは、式：
【０２１５】
【化３１】
0006574239.tif 000032
【０２１６】
で表される。
【０２１７】
本発明の修飾ヌクレオシドは、天然に存在しない。それらは、例えば、化学的であろうと、または酵素的であろうと任意の反応での基質として有用であり、それに関して、相当する従来のＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシドチミジンが基質である。例えば、ヌクレオシドは、適切なキナーゼ酵素により、一、二および三リン酸へと変換され得る。かかる修飾チミンヌクレオシドを作製するための一般的な手順を、例えば実施例１３に提供する。
【０２１８】
本発明はまた、式：
【０２１９】
【化３２】
0006574239.tif 000033
【０２２０】
（式中、
Ｒ＝（ＨＯ）２（Ｏ＝）Ｐ−、または
Ｒ＝（ＨＯ）２（Ｏ＝）Ｐ−Ｏ−［（ＨＯ）（Ｏ＝）Ｐ］−、または
Ｒ＝（ＨＯ）２（Ｏ＝）Ｐ−Ｏ−［（ＨＯ）（Ｏ＝）Ｐ］−Ｏ−［（ＨＯ）（Ｏ＝）Ｐ］−）で表される修飾ヌクレオチドを提供する。
【０２２１】
本発明の特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、式：
【０２２２】
【化３３】
0006574239.tif 000034
【０２２３】
（式中、
Ｒ＝（ＨＯ）２（Ｏ＝）Ｐ−、または
Ｒ＝（ＨＯ）２（Ｏ＝）Ｐ−Ｏ−［（ＨＯ）（Ｏ＝）Ｐ］−、または
Ｒ＝（ＨＯ）２（Ｏ＝）Ｐ−Ｏ−［（ＨＯ）（Ｏ＝）Ｐ］−Ｏ−［（ＨＯ）（Ｏ＝）Ｐ］−）で表される。
【０２２４】
かかる修飾チミンヌクレオチド５’−三リン酸を作製するための一般的な手順を、例えば実施例１４に提供する。また、本発明の修飾ヌクレオチドは、従来のヌクレオチドと同じ様式でヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用してポリヌクレオチドオリゴマーに導入することができ、こうして、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを生ずる。
【０２２５】
本発明の修飾ヌクレオチドは、天然に存在しない。かかるヌクレオチドは、本発明の修飾塩基を使用することが望ましい任意の酵素または合成反応において、相当する従来のチミジンリン酸エステルに代わって使用され得る。例えば、本発明の修飾塩基を含むヌクレオチド５’−三リン酸は、ＤＮＡポリメラーゼにより修飾ポリヌクレオチドオリゴマーに組み込むことができる。これは、例えば、結果として得られるプライマー伸長産物（複数可）のハイブリダイゼーション親和性を高めるために行われ得る。非限定的な例では、これは、下記の通りに行われる：（ａ）鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、本発明のヌクレオチド５’−三リン酸、および任意選択により、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび／または従来のＴＴＰ、およびＭｇ２＋および／またはＭｎ２＋イオンなど他の緩衝液構成要素などの１つまたは複数のデオキシヌクレオチド三リン酸を含む混合物を供給すること、および（ｂ）ポリメラーゼが、修飾塩基（即ち、修飾ヌクレオチド）および存在する場合には他のＮＴＰを、伸長されたプライマーに組み込むことができるように、プライマーを、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖における相補的な配列へアニーリングさせて、それにより本発明の修飾塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマーを形成すること。また、プライマー伸長に関する適切な反応条件に関しては、Ｋｕｔｙａｖｉｎ，Ｉ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７：１３６６６−１３６７３（２００８），”Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂａｓｅ−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｐｌｅｘ−Ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ５’−Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”を参照されたい。
【０２２６】
Ｆ．二重鎖
幾つかの実施形態では、本発明は、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーおよびポリヌクレオチド配列を含む二重鎖を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、複数の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーおよびポリヌクレオチド配列を含む二重鎖を提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの修飾ポリヌクレオチドオリゴマーおよびポリヌクレオチド配列を含む二重鎖を提供する。かかる二重鎖内の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが、天然に存在しないオリゴマーである一方で、幾つかの実施形態では、二重鎖内のポリヌクレオチド配列は、天然に存在するポリヌクレオチド配列である。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列の両方が、天然に存在しない。本発明の二重鎖の幾つかの実施形態では、少なくとも１つの修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ポリヌクレオチド配列の少なくとも４つの連続塩基と相補的でありそれらとハイブリダイズされている４つまたはそれ以上の連続塩基を含む。
【０２２７】
当業者が理解するように、本明細書中に記載する任意の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーおよび本明細書中に記載するような任意のさらなる修飾を含む任意の修飾ポリヌクレオチドを使用して、ポリヌクレオチド配列を有する二重鎖を形成することができる。また、ポリヌクレオチド配列は、非限定的である。修飾ポリヌクレオチドに対して相補性を有する少なくとも４つまたはそれ以上の連続ヌクレオチドを有する任意のポリヌクレオチドを使用することができる。
【０２２８】
幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、原核生物ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、真核生物ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、ウイルスヌクレオチド配列を含む。
【０２２９】
二重鎖の幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーよりも長く、即ち、ポリヌクレオチド配列は、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーよりも多いヌクレオチドを含む。
【０２３０】
幾つかの実施形態では、二重鎖は、固体支持体に結合される。幾つかの実施形態では、本発明の二重鎖は、ビーズに結合される。幾つかの実施形態では、本発明の二重鎖は、アレイに結合される。幾つかの実施形態では、本発明の二重鎖は、マイクロアレイに結合される。
【０２３１】
ＩＩＩ．方法
Ａ．修飾チミン塩基を含む修飾ポリヌクレオチド、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および他の部分の合成
本発明の修飾チミン塩基を含有するオリゴマー、ヌクレオシド、ヌクレオチド、および他の部分は、任意の適切な方法により合成することができ、通常、化学的に、および／または酵素的に合成される。好ましい方法を、本明細書中に記載する。例えば、実施例１〜実施例１２を参照されたい。
【０２３２】
例えば、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ホスホルアミダイト法および適切に保護された２’−デオキシヌクレオシド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧおよびｄＴ）、リボヌクレオシド（Ａ、Ｃ、ＧおよびＴ）または化学的に修飾されたヌクレオシド、例えばＬＮＡ、ＢＮＡ等に由来するホスホルアミダイト構成要素を使用して、固相合成により実験室で合成することができる。ポリヌクレオチド鎖構築は通常、「合成サイクル」と称される日常的な手順に倣うことにより、３’から５’末端への方向で進行する。１回の合成サイクルの完了は、成長中の鎖へ１つのヌクレオチド残基の付加をもたらす。ＨＰＬＣおよび当該技術分野で公知の他の方法を使用して、所望の配列を有する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを単離する。
【０２３３】
ポリヌクレオチドおよびそれらのアナログを合成する方法は、多数の出版物に記載されており、周知であり、本発明の修飾部分を合成するのに実施例１〜実施例１２に記載する方法に加えて使用することができる。例えば、Ｇａｉｔ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、およびＳ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．２０，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（１９９３）を参照されたい。修飾ＰＮＡオリゴマー合成に関して、従来のペプチド合成法を使用してもよく、当該技術分野で公知である（例えば、Nielsen et al., Science 254: 1497-1500 （1991）を参照）。ＤＮＡポリメラーゼにより媒介されるプライマー伸長または適切なキナーゼを使用した５’位でのヌクレオシドのリン酸化などの酵素法もまた使用することができる。
【０２３４】
本発明のポリヌクレオチドオリゴマーの様々な特性は、本明細書中で実施例５〜実施例１２でさらに説明する。
【０２３５】
本明細書中の実施例９〜実施例１２は、本発明に従う幾つかの例示的なＰＮＡオリゴマーの合成および特性決定について記載する。
【０２３６】
Ｂ．修飾チミン塩基を含む修飾ポリヌクレオチド、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および他の部分の例示的な有用性
当業者がこの開示に目を通すと理解するように、本明細書中に記載する修飾塩基、ならびにそれらを含有する修飾ポリヌクレオチドオリゴマー、修飾ヌクレオシド、修飾ヌクレオチド、および他の修飾部分は、核酸加工処理および操作の分野で様々な用途を見出している。例えば、それらは、例えばポリヌクレオチド二重鎖および三重鎖などのハイブリダイゼーション複合体において二重鎖安定性を高めるのに有用である。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、例えばＤＮＡシーケンシング、ライブラリー構築、アレイ、サザンブロット、ＡＳＯ分析、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、人工遺伝子合成において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等用のプライマーとして、ライゲーションアッセイ（例えば、公知のヌクレオチド多型の検出用の）においてなど、分子プローブとして使用される。上記で列挙される方法は、当該技術分野で公知である。当業者にとっては、例えば、それらの方法のいずれかで使用される天然に存在する塩基、天然に存在するヌクレオシド、天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在するポリヌクレオチドオリゴマーを、本明細書に記載するような天然に存在しない修飾チミン塩基で、本明細書中に記載するような天然に存在しない修飾ヌクレオシドで、天然に存在しない修飾ヌクレオチドで、または本明細書中に記載するような修飾ポリヌクレオチドオリゴマーで置換することは難しくない。
【０２３７】
幾つかの実施形態では、本発明の１つまたは複数の修飾チミン塩基を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、プライマー伸長反応の効率を改善する。本発明の修飾チミン塩基により提供される二重鎖安定性の付加により、当業者は、かかる修飾チミン塩基を欠如する天然に存在するポリヌクレオチドオリゴマーを用いた場合よりも高い温度で、プライマー伸長を実施することが可能となる。それにより、プライマー伸長時間および／または変性温度とアニーリング温度との間の移行勾配時間を低減させることができる。より高い反応温度はまた、標的分子における潜在的に問題のある二次構造を最低限に抑えるのに好適であり、プライマー二量体の形成を低減させることができる。さらに、理論により拘束されないが、より高い反応温度の使用はまた、ノイズも低減させると考えられる。
【０２３８】
下記は、本明細書中に記載するような天然に存在しない修飾チミン塩基、天然に存在しない修飾ヌクレオシド、天然に存在しない修飾ヌクレオチドおよび天然に存在しない修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの幾つかの非限定的な使用について記載する。
【０２３９】
１．アレイ用途における修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、アレイを含む用途で使用される。当業者は、アレイを含む多数の用途を認識している。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが結合されたアレイを含む用途の選択は様々であってもよく、本明細書中の開示に限定されない。幾つかの実施形態では、アレイ用途は、例えば、ハイブリダイゼーションまたは遺伝子発現のアレイベースの解析に関するものである。例示的な非限定的なアレイとして、チップまたはプラットフォームアレイ、ビーズアレイ、液相アレイ、「ジップコード」アレイ等が挙げられる。標的ヌクレオチド配列との塩基対形成における修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの優れた安定性は、特にハイブリダイゼーションまたはアレイベースの解析で好適である単一ヌクレオチドレベルで、関連配列の識別の改善をもたらす。ニトロセルロース、ガラス、シリコンウエハー、光ファイバー等などのアレイの構築に適した材料は、当業者に公知である。
【０２４０】
したがって、本発明の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが結合されたアレイが提供される。本発明の幾つかの実施形態では、複数の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが結合されたアレイが提供される。本発明の幾つかの実施形態では、複数の異なる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが結合されたアレイが提供される。複数の異なる修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの異なるさらなる修飾、または異なる配列を有する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを含んでもよい。
【０２４１】
２．プローブとしての修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、プローブである。幾つかの実施形態では、プローブは、検出可能な標識または部分を含む。検出可能な標識は、本明細書中で使用する場合、蛍光色素（フルオロフォア）などの直接的に検出可能な部分、および結合対の成員などの間接的に検出可能な部分の両方を含む。検出可能な部分が、結合対の成員である場合、幾つかの実施形態では、プローブを、結合対の第２の成員に結合されている検出可能な標識とともにインキュベートすることにより、プローブは検出可能であり得る。幾つかの実施形態では、プローブが、例えばマイクロアレイまたはビーズ上では捕捉プローブである場合などは、プローブは標識されない。幾つかの実施形態では、プローブは、例えばポリメラーゼにより伸長不可能である。幾つかの実施形態では、プローブは伸長可能である。
【０２４２】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ＦＲＥＴプローブである。ＦＲＥＴプローブは、５’末端で蛍光色素により、また３’末端で蛍光消光剤により、即ち基が極めて接近している（即ち、同じプローブに結合される）場合に色素からの蛍光放出を吸収（即ち、抑制）する化学基により標識されてもよい。
【０２４３】
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、５’ヌクレアーゼＰＣＲプローブ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ（商標）またはＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プローブである。
【０２４４】
３．ハイブリダイゼーション法における修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用
相補的な修飾ポリヌクレオチドオリゴマーとのオリゴマーおよび核酸のハイブリダイゼーションは、当業者により理解されるように、多種多様な用途で有用である。例えば、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを含むハイブリダイズされた二重鎖の形成は、例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）技法と同様に、二重鎖の検出可能なシグナルまたは特徴の変化の結果として直接的に検出することができる。したがって、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、かかる検出を容易とするための非標識または標識プローブとして提供され得る。二重鎖はまた、例えば真のシグナルをバックグラウンドと識別するために、固相または電気泳動分離に付されてもよい。幾つかの実施形態では、ハイブリダイズされた修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、相補的な標的配列とハイブリダイズすることの結果として何らかの方法で化学的に変更される。例えば、ＰＣＲなどのプライマー伸長プロセスにおいて、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、「修飾プライマー」と称され得る。かかる修飾プライマーは、伸長されて、次のＰＣＲサイクル用の鋳型として機能し得るプライマー伸長産物を形成することができる。５’−ヌクレアーゼ反応では、修飾ポリヌクオチドオリゴマーは、「修飾オリゴマープローブ」と称され得る。かかる修飾オリゴマープローブは、ＴａｑポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により切断されて、蛍光または他の手段により検出され得る切断断片を生じ得る。かかる用途では、プライマーの伸長またはプローブの切断は、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが、相補的な核酸配列とのハイブリダイゼーションにより二重鎖を形成したという証拠である。さらに、反応条件は、特定の用途に関してハイブリダイゼーションを最大化するのに最も適切な条件を決定するように調節することができる。特に、反応温度は通常、その標的に関するオリゴマーのＴｍ付近、Ｔｍよりもわずかに下、または場合によってはＴｍよりもわずかに上であるように選択される。反応温度が高すぎる場合、オリゴマーは、その標的配列とハイブリダイズせず、プライマー伸長またはプローブ切断の効率が低減される。
【０２４５】
本発明はまた、ハイブリダイゼーションのための方法において、本発明の修飾チミン塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマー（本明細書中では「修飾ポリヌクレオチドオリゴマー」とも称される）を使用する方法を提供する。本明細書中に記載する修飾チミン塩基のいずれかは、ハイブリダイゼーションのための方法で使用され得る。本発明の幾つかの実施形態では、反応混合物中に存在すると推測される核酸標的配列との、修飾チミン塩基を含むポリヌクレオチドオリゴマーのハイブリダイゼーションのための方法が提供される。幾つかの実施形態では、この方法は、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを含み、かつ標的核酸配列を含むと推測される反応混合物を、反応混合物中に存在する場合に標的核酸配列との修飾ポリヌクレオチドオリゴマーのハイブリダイゼーションに好適な条件下でインキュベートする工程を含む。その方法で使用される修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、反応混合物中に存在すると推測される核酸標的配列内の配列に相補的であり、式：
【０２４６】
【化３４】
0006574239.tif 000035
【０２４７】
（式中、Ｚは、ＣＨ２またはＯである）で表される少なくとも１つの修飾塩基を含む。
【０２４８】
本発明の特定の実施形態では、その方法で使用される修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、反応混合物中に存在することが推測される核酸標的配列内の配列に相補的であり、式：
【０２４９】
【化３５】
0006574239.tif 000036
【０２５０】
（式中、ＺはＯである）で表される少なくとも１つの修飾塩基を含む。
【０２５１】
反応混合物はインキュベートされ、それにより、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーと、反応混合物中に存在する場合には標的核酸配列と二重鎖を形成する。幾つかの実施形態では、上記方法は、反応混合物中の標的核酸配列の存在を検出するか、または標的核酸配列の非存在を確認する工程を含む。反応混合物中の標的核酸配列の存在は、かかる二重鎖の形成の結果として検出される。反応混合物中の標的核酸配列の非存在は、かかる二重鎖の非形成の結果として確認される。上記方法の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、検出可能な標識、フルオロフォアおよび蛍光消光剤から成る群から選択される部分を含む。検出可能な標識、フルオロフォアおよび／または蛍光消光剤は、二重鎖および／または標的核酸配列の検出を容易にする。
【０２５２】
幾つかの実施形態では、反応混合物は、生物学的試料を含む。幾つかの実施形態では、反応混合物は、生物学的試料から調製される核酸試料を含む。生物学的試料から核酸サンプルを調製する方法が当該技術分野で公知である。
【０２５３】
本発明は、生物学的試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。幾つかの実施形態では、この方法は、（ａ）生物学的試料の標的核酸を、修飾チミン塩基を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーと接触させる工程であって、標的核酸が、修飾ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする工程、および（ｂ）標的核酸と修飾ポリヌクレオチドオリゴマーとの間の二重鎖形成を検出する工程を含む。
【０２５４】
幾つかの実施形態では、本発明は、（ａ）標的核酸を含有すると推測される核酸試料を供給する工程、（ｂ）修飾チミン塩基および標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを供給する工程、および（ｃ）核酸試料および修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを、標的核酸と修飾ポリヌクレオチドオリゴマーとの間での二重鎖形成を可能にするハイブリダイゼーション条件下で組み合わせる工程を含む方法を提供する。
【０２５５】
幾つかの実施形態では、本発明は、（ａ）（ｉ）標的核酸を含有すると推測される核酸試料および（ｉｉ）修飾チミン塩基および標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを、標的核酸と修飾ポリヌクレオチドオリゴマーとの間での二重鎖形成を可能にするハイブリダイゼーション条件下で組み合わせる工程、および（ｂ）標的核酸と修飾ポリヌクレオチドオリゴマーとの間での二重鎖形成を検出する工程を含む方法を提供する。
【０２５６】
幾つかの実施形態では、本発明は、（ａ）（ｉ）標的核酸を含有すると推測される核酸試料および（ｉｉ）修飾チミン塩基および標的核酸に相補的なヌクレオチド配列を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを、標的核酸と修飾ポリヌクレオチドオリゴマーとの間での二重鎖形成を可能にするハイブリダイゼーション条件下で組み合わせる工程、および（ｂ）核酸試料中の標的核酸の非存在を確認する工程を含む方法を提供する。
【０２５７】
当業者が理解するように、ハイブリダイゼーションおよび試料中の標的核酸の存在の検出または標的核酸の非存在の確認の方法は、標的の幾つかの情報が利用可能である限り、任意の標的核酸を用いて実施することができ、その結果、標的核酸に対して少なくとも４つの連続した相補的なヌクレオチドを有する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを調製することができる。
【０２５８】
４．プライマーとしての修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、プライマーである。本明細書中で使用し、また場合によっては修飾プライマーと称されるプライマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、鋳型依存性ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより一方の末端、通常３’末端で伸長される修飾ポリヌクレオチドオリゴマーである。鋳型、ポリメラーゼならびに適切な緩衝液および試薬の存在下で、修飾プライマーは伸長されて、標的配列に相補的である修飾プライマー伸長産物（伸長プライマーとも称される）を形成することができる。幾つかの実施形態では、修飾プライマーは、標識を含むか、または重合用の前駆物質の１つもしくは複数（例えば、ヌクレオシド三リン酸）は、標識を含み得る。修飾プライマー伸長産物（複数可）は、当業者に公知の多数の技法のいずれかにより検出することができる。幾つかの実施形態では、修飾プライマーは、標識されない。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、増幅用のプライマーとして使用される。
【０２５９】
５．増幅用の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、増幅反応で使用される。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを使用することができる増幅反応は限定されない。増幅の例示的な非限定的な例として、ポリメラーゼ連鎖反応（「PCR」）、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、定量的ＰＣＲ（Q-PCR）、核酸配列ベースの増幅（NASBA）、転写増幅（TMA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、ローリングサークル増幅（RCA）、または鎖置換増幅（SDA）が挙げられる。したがって、幾つかの実施形態では、増幅のための方法が提供される。幾つかの実施形態では、この方法は（ａ）修飾ポリヌクレオチドプライマーを標的配列へアニーリングさせる工程、および（ｂ）修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを伸長させて、修飾ポリヌクレオチドオリゴマー伸長産物を形成する工程を含む。
【０２６０】
増幅のための方法の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、固体支持体に結合される。増幅のための方法の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、ビーズに結合される。増幅のための方法の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、アレイに結合される。増幅のための方法の幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、マイクロアレイに結合される。
【０２６１】
ＰＣＲなどの多くの増幅反応は、反復プライマー依存性重合を利用する。幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、標的核酸配列にハイブリダイズすることが可能であり、いったんハイブリダイズされると、鋳型として標的核酸配列を使用して（ヌクレオチド三リン酸などのヌクレオチド基質の存在下で）重合用酵素により伸長されることが可能であるプライマーである。重合用酵素として、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等が挙げられるが、それらに限定されない。種々の重合用酵素による重合に好適な条件は、当業者に周知である。
【０２６２】
増幅反応は、所望の温度でのインキュベーション時間を容易にするために好ましくは自動サーマルサイクラーで実施される。幾つかの実施形態では、増幅は、少なくとも１つのプライマー（即ち、修飾ポリヌクレオチドオリゴマー）を、少なくとも１つの標的核酸中の相補的または実質的に相補的な配列とアニーリングさせること、ポリメラーゼを使用して、鋳型依存性様式でヌクレオチドの少なくとも１つの鎖を合成すること、および新たに形成された核酸二重鎖を変性させて、鎖を分離させることの逐次手順の少なくとも１回のサイクルを含む。サイクルは、反復されてもよく、または反復されなくてもよい。増幅は、熱循環を含むことができるか、または等温的に実施することができる。
【０２６３】
幾つかの実施形態では、増幅は、約９０℃〜約１００℃で約１〜約１０分の初期変性、続く約５５℃〜約７５℃で約１〜約３０秒のアニーリング、約５５℃〜約７５℃で約５〜約６０秒の伸長および約９０℃〜約１００℃で約１〜約３０秒の変性を含む循環を含む。他の時間およびプロフィールも使用され得る。例えば、プライマーアニーリングおよび伸長は、同じ工程で、単一温度で実施されてもよい。
【０２６４】
幾つかの実施形態では、サイクルは、少なくとも５回、少なくとも１０回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも２５回、少なくとも３０回、少なくとも３５回、少なくとも４０回、または少なくとも４５回実施される。
【０２６５】
特定のサイクル回数および温度は、増幅される特定の核酸配列に依存し、当業者により容易に決定することができる。
【０２６６】
６．治療用途における修飾ポリヌクレオチドオリゴマーの使用
幾つかの実施形態では、修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、治療用途において有用性を見出す。当業者が理解するように、本発明の修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを使用することができる治療用途は限定されない。治療用途の例示的な非限定的な例として、ＲＮＡに結合するアンチセンスオリゴマーまたはｓｉＲＮＡとしての修飾ポリヌクレオチドの使用、ＤＮＡに結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドとしての修飾ポリヌクレオチドの使用、アプタマーとしての修飾ポリヌクレオチドの使用、デコイとしての修飾ポリヌクレオチドの使用、またはタンパク質に結合するＣｐＧオリゴマーとしての修飾ポリヌクレオチドの使用が挙げられる。修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、遺伝子発現を調節するのに、およびアンチセンス遺伝子療法において使用することができる。
【０２６７】
ＩＶ．キット
上記で提示される診断、研究および治療用途における使用のために、キットもまた本発明により提供される。診断および研究用途では、かかるキットは、１つまたは複数の修飾塩基、１つまたは複数のポリヌクレオチドオリゴマー、１つまたは複数の修飾ヌクレオシド、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド、１つまたは複数の修飾ＰＮＡ、１つまたは複数の修飾因子部分、１つまたは複数のアッセイ試薬、１つまたは複数の緩衝液等のいずれかまたは全てを含み得る。治療用製品は、滅菌生理食塩水または別の薬学的に許容されるエマルジョンおよび懸濁液基剤を含み得る。任意選択により、キットは、本明細書中に記載するような修飾部分の作製および／または使用について記載する取扱説明書を含む。通常、取扱説明書以外のこれらの構成要素は、１つまたは複数の容器中に供給される。
【０２６８】
幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載するような修飾部分を含むキットを提供する。幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載するような修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを含むキットを提供する。幾つかの実施形態では、キットは、熱安定性ポリメラーゼ酵素などの少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む。幾つかの実施形態では、キットは、ｄＮＴＰをさらに含む。幾つかの実施形態では、キットは、プライマーおよび／またはプローブをさらに含む。
【０２６９】
幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書中に記載するような、核酸試料を加工処理すること、酵素反応を実施すること、ハイブリダイゼーションを実施すること、二重鎖を形成することなどを含むが、それらに限定されない本発明の方法を実施するための組成物を含むキットを提供する。
【０２７０】
指導的材料は、本発明の方法の実施のための指示書（即ち、プロトコール）を含有し得る。説明書は、様々な形態で対象キット中に存在してもよく、それらの１つまたは複数が、キット中に存在してもよい。指導的材料は通常、資料または印刷物を含むが、それらはそれらに限定されない。かかる説明書を保管して、それらを最終使用者へ伝達することが可能な任意の媒体が本発明により意図される。かかる媒体として、電子保管媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）等が挙げられるが、それらに限定されない。かかる媒体は、かかる指導的材料を提供するインターネットサイトへのアドレスを含んでもよい。
【０２７１】
当業者が理解するように、多種多様なキットおよび構成要素は、キットの意図される使用者および使用者の特定のニーズに応じて、本発明に従って調製することができる。本発明のさらなるキット実施形態は、当業者が本明細書中に記載する方法の変形のいずれかを実施するのを可能にする任意選択の機能的構成要素を含む。
【０２７２】
本発明を実施するための本発明者らに公知である最良の形態を含む本発明の好ましい実施形態を本明細書中に記載する。当然のことながら、好ましい実施形態に対する変動、変化、修飾および等価体の置換は、上述の説明に目を通すことで当業者に明らかとなる。本発明者らは、必要に応じて、当業者がかかる変動、変化、修飾および等価体の置換を用いると見込んでおり、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載する以外で本発明が実施されると意図する。当業者は、本質的に類似した結果をもたらすように変化、変動または修飾することができる様々な重要ではないパラメーターを容易に認識する。したがって、本発明は、適用法により認可されるような併記の特許請求の範囲に列挙される主題の修飾および等価体全てを包含する。さらに、それらの全ての考え得る変形における上述の要素の任意の組合せは、本明細書中で別記しない限り、または他の場合で文脈により明らかに矛盾しない場合に、本発明により包含される。
【０２７３】
本発明の要素それぞれが、多重の実施形態を含有するとして本明細書中に記載されているが、別記しない限り、本発明の所定の要素の実施形態それぞれは、本発明の他の要素の実施形態それぞれとともに使用されることが可能であり、かかる使用はそれぞれ、本発明の別個の実施形態を形成すると意図されることが理解されるべきである。
【０２７４】
参照される特許、特許公開、および本明細書中で言及される科学文献は、個々の出版物、特許または特許公開が、参照により援用されるために具体的におよび個別に示されているかのように、それらの全体が参照により援用される。本明細書中で引用される任意の参照文献と、本明細書の具体的な教示との間の任意の矛盾は、後者を支持して解決されるべきである。同様に、単語または語句の当該技術分野で理解される定義と、本明細書中で具体的に教示するような単語または語句の定義との間の任意の矛盾は、後者を支持して解決されるべきである。
【０２７５】
上記開示から理解され得るように、本発明は、多種多様な用途を有する。本発明は、下記の実施例でさらに説明されるが、実施例は、単に例示的であり、どのような場合でも本発明の定義および範囲を限定するものと意図されない。
【実施例】
【０２７６】
Ｖ．実施例
一般的な方法および推奨
下記実施例は、本明細書中に記載する本発明を説明するのに提供されるが、本明細書中に記載する本発明を限定しない。
【０２７７】
空気および水分感受性の反応は、全てアルゴン（Ａｒ）下で行った。無水溶媒および試薬は、別記しない限り、商業的供給源から入手した。フラッシュクロマトグラフィーは、２３０〜４００メッシュのシリカゲル（ＶＷＲ）で実施した。
【０２７８】
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｃｋｅｒ  ４００分光計で、２０℃で実行し、１Ｈに関しては標準物質Ｍｅ４Ｓｉ、および３１Ｐに関してはＨ３ＰＯ４に対するｐｐｍで報告した。
【０２７９】
融点は、オープンキャピラリーでＭｅｌ−Ｔｅｍｐ融点装置を使用して決定し、未補正である。
【０２８０】
ＵＶ−可視吸収スペクトルは、Ｃａｒｙ  Ｖａｒｉａｎ分光光度計で、２００〜４００ｎｍの範囲で記録した。
【０２８１】
薄層クロマトグラフィーは、シリカゲル６０  Ｆ−２５４アルミニウム裏打ちＴＬＣ板（ＥＭ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ）で実施した。
【０２８２】
ＨＰＬＣ分析は、クォータナリポンプ、オートサンプラーおよびダイオードアレイ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００機器で行い、別記しない限り、２７０ｎｍでの吸光度をモニタリングした。
【０２８３】
オリゴヌクレオチド合成は、Ｍｅｒｍａｄｅ  １２  ＤＮＡ合成機（BioAutomation）で実施した。標準的なホスホルアミダイト合成サイクルを使用して、カップリング時間は、修飾ホスホルアミダイトに関しては３６０秒に増やした。全ての融解実験に関して、各オリゴヌクレオチドの濃度は１μＭであり、緩衝液内容物は、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８であった。固体支持体からの切断および脱保護は、濃アンモニア水中で、室温で２４時間行った。
【０２８４】
本発明の実施は、本明細書中で別記しない限り、当該技術分野の技量内の細胞生物学、分子生物学、微生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ等の従来の技法を用いる。かかる技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  Ｅｄ．，１９８４）、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８７）、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．１９８７），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｉ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ  Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，ｅｄｓ．，１９８７）を参照されたい。
【０２８５】
下記の具体的な実施例では、実施例後に関連反応スキームが続く。
【０２８６】
実施例１．ＤＭＴ−ＴＢＰホスホルアミダイト（Ｍ５）の合成
実施例１は、１−ブチニルリンカーによりピリミジン５−炭素に連結された、保護されたリン酸部分を含む修飾チミン３’−ホスホルアミダイトモノマー（ＴＢＰと称される）の保護形態であるＭ５を調製するための合成手順について記載する。Ｍ５の５’−ヒドロキシルはＤＭＴ基で保護されており、リン酸部分の２つの水酸基は、ピバロイルオキシベンジル基で保護されている。
【０２８７】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−ヨード−２’−デオキシウリジン。この化合物は、一般的にＡｈｍａｄｉａｎ，Ｍ．，Ｚｈａｎｇ，Ｐ．，ａｎｄ  Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，Ｄ．Ｅ．（１９９８）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖ．２６，Ｎｏ．１３，ｐｐ．３１２７−３１３５に記載される手順に倣って合成した。
【０２８８】
【化３６】
0006574239.tif 000037
【０２８９】
トリエチルアミン（１０．４３ｍＬ、７５ｍｍｏｌ）を含有する無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の４−ヒドロキシベンジルアルコール（６．２１ｇ、５０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、塩化ピバロイル（６．７９ｍＬ、５５ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で室温にて滴下した。６０分間攪拌した後、反応混合物を水（０．２ｍＬ）でクエンチして、一晩放置した。次に、ＥｔＯＡｃ（およそ４００ｍＬ）で希釈して、飽和ＮａＨＣＯ３（３×１００ｍＬ）および塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。続いて、それをＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、濃縮した。生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル／ヘキサン（４：６）中でＲｆおよそ０．４）を、酢酸エチル／ヘキサン（４：６）で溶出させるシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを使用して単離した。純粋な分画をプールして、濃縮して、真空中で乾燥させて、無色油状物質７．７５ｇ（７４％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．３５（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、５．２２（ｔ，１Ｈ）、４．５０（ｄ，２Ｈ）、１．３１（ｓ，９Ｈ）。
【０２９０】
【化３７】
0006574239.tif 000038
【０２９１】
化合物Ｍ１（上記を参照、７．７９ｇ、３７．４ｍｍｏｌ）を、アルゴン下でＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８．１４ｍＬ、４６．８ｍｍｏｌ）を含有する無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解して、得られた溶液を氷水浴中で０℃に冷却した。ジイソピロピル亜ホスホルアミドジクロリド（３．４６ｍＬ、１８．８ｍｍｏｌ）を、攪拌および冷却しながら、５分かけてシリンジで滴下した。反応混合物を室温にまで加温して、一晩攪拌した。沈殿した塩を濾過により除去して、濾液を真空中で濃縮した。残渣を酢酸エチル（およそ１５０ｍＬ）中に溶解して、５％ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍＬ）、続いて塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、濃縮した。生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（２０：８０：２）中でＲｆおよそ０．６）を、ヘキサン／トリエチルアミン（１００：２）で充填して、かつ酢酸／ヘキサン／トリエチルアミン（２０：８０：２）で溶出させるシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを使用して単離した。純粋な分画をプールして、濃縮して、無色油状物質８．１ｇ（７９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．３７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．０７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、４．７６〜４．６３（ｍ，４Ｈ）、３．７０〜３．６１（ｍ，２Ｈ）、１．３０（ｓ，１８Ｈ）、１．１６（ｄ，１２Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １４７．３０。
【０２９２】
【化３８】
0006574239.tif 000039
【０２９３】
３−ブチン−１−オール（１．１８ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）および化合物Ｍ２（以下を参照、８．１ｇ、１４．８ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で無水ＴＨＦ中に溶解した。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（６６ｍＬ、アセトニトリル中０．２５Ｍ）の溶液を一度に添加して、反応混合物を室温で１時間攪拌した。ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液（４．０ｍＬ、デカン中５〜６Ｍ）を添加して、混合物をさらに２時間攪拌した。次に、溶媒を真空下で除去して、残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）中に溶解して、飽和ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、濃縮した。生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル／ヘキサン（１：１）中でＲｆおよそ０．３５）を、２０〜５０％のヘキサン中の酢酸エチルのステップ勾配を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。無定形固体５．３ｇ（６７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４２（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、７．１１（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）、５．０７（ｄ，４Ｈ，Ｊ＝８．２Ｈｚ）、４．０７〜４．０１（ｍ，２Ｈ）、２．９３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ）、２．５６〜２．５２（ｍ，２Ｈ）、１．３１（ｓ，１８Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  −１．２。
【０２９４】
【化３９】
0006574239.tif 000040
【０２９５】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（６５６ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコ中でＰｄ（ＰＰｈ３）４（１１６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）および化合物Ｍ３（上記を参照、６３７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）と合わせた。フラスコを排気させて（evacuate）、アルゴンガスで満たして、セプタムおよびアルゴン風船で密封した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１０ｍＬ）およびトリエチルアミン（６９７μＬ、５ｍｍｏｌ）を、シリンジを使用してセプタムに通して添加して、混合物をＡｒ雰囲気下で外気温にて攪拌した。Ｃ１８ＲＰ  ＨＰＬＣまたはＴＬＣを使用して、出発ヌクレオシドの消失をモニタリングして、反応の進行を管理した。１２〜７２時間後、反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈して、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（２×５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、油状物質にまで濃縮した。反応生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル中でＲｆおよそ０．５）を、酢酸エチル／ヘキサン（２：１）で充填して、かつ純粋な酢酸エステルで溶出させるシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。褐色ガラス状固体５７６ｍｇを得た（５７６ｍｇ、５４％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．６４（ｓ，１Ｈ）、７．９３（ｓ，１Ｈ）、７．４１〜６．８７（ｍ，２１Ｈ）、６．１２（ｔ，１Ｈ）、５．３４（ｄ，１Ｈ）、５．０４（ｄ，４Ｈ）、４．３４〜４．２９（ｍ，１Ｈ）、３．９５〜３．８７（ｍ，３Ｈ）、３．７２（ｓ，６Ｈ）、３．２８〜３．０５（ｍ，２Ｈ）、２．５６〜２．５２（ｍ，２Ｈ）、２．２９〜２．１５（ｍ，２Ｈ）、１．３０（ｓ，１８Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  −１．３１。
【０２９６】
【化４０】
0006574239.tif 000041
【０２９７】
０℃に維持したＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４８μＬ、２．０ｍｍｏｌ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の化合物Ｍ４（上記を参照、５７６ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（１５９μＬ、０．７１ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下した。反応混合物を室温にまで加温して、３０分後にメタノール（０．１ｍＬ）を添加した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈して、５％ＮａＨＣＯ３水（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、油状物質にまで濃縮した。粗製生成物を、酢酸エチル／トリエチルアミン（１００：２）中でのシリカゲルカラム（３×１５ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。純粋な分画をプールして、真空下で濃縮して、オフホワイト色の泡状物質（Ｍ５、３５０ｍｇ、５１％）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４７．５４、１４７．１９。
【０２９８】
【化４１】
0006574239.tif 000042
【０２９９】
実施例２．ＤＭＴ−ＴＰＰホスホルアミダイト（Ｍ１０）の合成
実施例２は、リン原子が１−ペンチニルリンカーによりピリミジン５−炭素に連結された、保護されたホスホン酸部分を含む修飾チミン３’−ホスホルアミダイトモノマー（ＴＰＰと称される）の保護形態である化合物Ｍ１０を調製するための合成手順について記載する。Ｍ１０の５’−ヒドロキシルはＤＭＴ基で保護されており、リン酸部分の２つの水酸基は、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン保護基で保護されている。
【０３００】
【化４２】
0006574239.tif 000043
【０３０１】
この化合物は、Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｒ．，Ｍａｎｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｆ．，Ｅｌｌｅｒｖｉｋ，Ｕ．（２００６）  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，ｖ．７１，ｐｐ．３４４４−３４５１に記載されるプロトコールに倣って合成した。
【０３０２】
【化４３】
0006574239.tif 000044
【０３０３】
空気冷却器を取り付けた１００ｍＬの丸底フラスコに、５−クロロ−１−ペンチン（１５．０ｍＬ、０．１４ｍｏｌ）および亜リン酸トリエチル（２５．７ｍＬ、０．１５ｍｏｌ）を入れた。フラスコの内容物を還流するまで加熱した（１２０℃の鉱油浴）。還流は、断続的に２週間継続し、その期間中に、沸点が徐々に１８０℃まで上昇した。その時点で、ほんの微量の亜リン酸トリエチルが、３１Ｐ  ＮＭＲにより反応混合物中で検出可能であった。加熱を中断して、混合物を外気温まで冷却して、およそ１ｍｍ，Ｈｇで真空蒸留した。９１〜９２℃／およそ１ｍｍで沸騰する分画を収集して、無色液体１４．０ｇ（４８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ４．０４〜３．９３（ｍ，４Ｈ，）、２．８２（ｔ，１Ｈ）、２．２６（ｄｔ，２Ｈ）、１．８５〜１．７４（ｍ，２Ｈ）、１．６９〜１．５８（ｍ，２Ｈ）、１．２３（ｔ，６Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ３１．２０。
【０３０４】
【化４４】
0006574239.tif 000045
【０３０５】
化合物Ｍ７（上記を参照、２．０４ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を、Ａｒ雰囲気下で室温にてブロモトリメチルシラン（３．９６ｍＬ、３０．０ｍｍｏｌ）中に溶解して、５０ｍＬの丸底フラスコ中で一晩、密封状態を維持した。揮発性物質を減圧下で除去して、残渣を高真空中で３０分間、乾燥させた。フラスコの内容物を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．１ｍＬ）を含有する無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中に溶解して、アルゴン下で−２０℃に冷却した。溶液を、攪拌しながら塩化オキサリル（３．４３ｍＬ、４０．０ｍｍｏｌ）滴下で処理した。反応混合物を室温にまで加温して、２時間攪拌した。次に、それを減圧下で蒸発させて、残渣を高真空中で１時間乾燥させた。残存する黄褐色固体を、無水ジクロロメタン（５．０ｍＬ）中に溶解して、得られた溶液を−２０℃に冷却した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．９６ｍＬ、４０．０ｍｍｏｌ）を含有するジクロロメタン（５ｍＬ）中の化合物Ｍ６（上記を参照、１．５２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）の溶液を、攪拌しながら滴下した。反応混合物を外気温まで加温して、一晩攪拌して、続いて、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈した。得られた溶液は、５％ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍＬ）および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、濃縮した。生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル／ヘキサン（１：１）中でＲｆおよそ０．２、または酢酸エチル中でＲｆおよそ０．６）を、２０〜８０％のヘキサン中の酢酸エチルのステップ勾配を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。収量：２．０５ｇ（７８％、わずかに着色した油）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４３〜７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．２３〜７．１３（ｍ，２Ｈ）、２．７９（ｔ，１Ｈ）、２．２４（ｂｔ，２Ｈ）、１．９９〜１．８９（ｍ，２Ｈ）、１．７３（ｄｓ，６Ｈ）、１．６８〜１．５７（ｍ，２Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ２２．３４。
【０３０６】
【化４５】
0006574239.tif 000046
【０３０７】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（９８４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコ中でＰｄ（ＰＰｈ３）４（１７３ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（５７ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）と合わせた。フラスコを排気させて、アルゴンガスで満たして、セプタムおよびアルゴン風船で密封した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２０ｍＬ）中の化合物Ｍ８（上記を参照、５１７ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．０５ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）の溶液を、シリンジを使用してセプタムに通して添加して、混合物を、Ａｒ雰囲気下で外気温にて攪拌した。１５時間後、反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈して、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（２×５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、油状物質にまで濃縮した。反応生成物Ｍ１０（ＴＬＣ：酢酸エチル中でＲｆおよそ０．２５）を、酢酸エチル／ジクロロメタン（１：１）で充填して、かつ０〜１５％の酢酸エチル中のアセトンのステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。黄褐色泡状物質を得た（７２７ｍｇ、６１％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．６２（ｓ，１Ｈ）、７．８５（ｓ，１Ｈ）、７．４２〜７．０６（ｍ，１３Ｈ）、６．８９〜６．８６（ｍ，４Ｈ）、６．１２（ｔ，１Ｈ）、５．３４（ｄ，１Ｈ）、４．３３〜４．２８（ｍ，１Ｈ）、３．９５〜３．９０（ｍ，１Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．２９〜３．２３（ｍ，１Ｈ）、３．１１〜３．０７（ｍ，１Ｈ）、２．３０〜２．１９（ｍ，４Ｈ）、１．９４〜１．８５（ｍ，２Ｈ）、１．７２（ｄｓ，６Ｈ）、１．６１〜１．５２（ｍ，２Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ２２．４３。
【０３０８】
【化４６】
0006574239.tif 000047
【０３０９】
０℃に維持したＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５２２μＬ、３．０ｍｍｏｌ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中の化合物Ｍ９（上記を参照、６９８ｍｇ、０．８８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（２５４μＬ、１．１４ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下した。反応混合物を室温にまで加温して、３０分後にメタノール（０．１ｍＬ）を添加した。反応混合物を酢酸エチル（１５０ｍＬ）で希釈して、５％ＮａＨＣＯ３水（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、油状物質にまで濃縮した。生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル／アセトニトリル／トリエチルアミン（８０：２０：２））中でＲｆおよそ０．３５）を、０〜２０％の酢酸エチル／トリエチルアミン（１００：２）中のアセトニトリルのステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（３×２０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを使用して単離した。純粋な分画をプールして、減圧下で濃縮して、クリーム色の泡状物質（４８８ｍｇ、５６％）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４７．５８、１４７．１９、２２．４２、２２．４０。
【０３１０】
【化４７】
0006574239.tif 000048
【０３１１】
実施例３．ＤＭＴ−ＴＢＰ−ホスホルアミダイトＭ１４の合成
実施例３は、上記Ｍ５のように、リン酸部分を含む修飾チミン３’−ホスホルアミダイトモノマーの保護形態であるＭ１４を調製するための合成手順について記載するが、Ｍ１０におけるホスホン酸のように、Ｍ１４におけるリン酸部分が、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン保護基で保護されている。
【０３１２】
【化４８】
0006574239.tif 000049
【０３１３】
化合物Ｍ６（上記を参照、３．４２ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で無水ＴＨＦ（５０ｍＬ）中に溶解して、得られた溶液をアセトン−ドライアイス浴中で−２０℃に冷却した。攪拌および冷却しながら、ジイソピロピル亜ホスホルアミドジクロリド（５．０ｇ、２４．７ｍｍｏｌ）を、続いてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９．８０ｍＬ、５６．３ｍｍｏｌ）を滴下した。反応混合物を室温にまで加温して、一時間攪拌した。続いて、それを酢酸エチル（およそ１５０ｍＬ）で希釈して、５％ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍＬ）、続いて塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、濃縮した。生成物（ＴＬＣ：ヘキサン／トリエチルアミン（１００：２）中でＲｆおよそ０．８５）を、ヘキサン／トリエチルアミン（１００：２）で溶出させるシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーを使用して単離した。純粋な分画をプールして、濃縮して、無色油状物質５．５８ｇ（８８％）を得て、それは、−２０℃での保管時には凝固した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．２３〜７．１３（ｍ，２Ｈ）、６．９７〜６．８２（ｍ，２Ｈ）、３．６７〜３．５４（ｍ，２Ｈ）、１．６９（ｓ，３Ｈ）、１．５６（ｓ，３Ｈ）、１．１９〜１．１４（ｍ，１２Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １３０．７５。
【０３１４】
【化４９】
0006574239.tif 000050
【０３１５】
３−ブチン−１−オール（１．５０ｍＬ、１８．９ｍｍｏｌ）および化合物Ｍ１１（上記を参照、５．５８ｇ、１９．８ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下で無水アセトニトリル（５０ｍＬ）中に溶解した。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（８７ｍＬ、アセトニトリル中０．２５Ｍ）の溶液を一度に添加して、反応混合物を室温で１時間攪拌した。ｔ−ブチルヒドロペルオキシド溶液（５．０ｍＬ、デカン中５〜６Ｍ）を添加して、混合物をさらに２時間攪拌した。次に、溶媒を真空下で除去して、残渣を酢酸エチル（２００ｍＬ）中に溶解して、飽和ＮａＨＣＯ３（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、濃縮した。生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル／ヘキサン（１：１）中でＲｆおよそ０．３３）を、３０〜５０％のヘキサン中の酢酸エチルのステップ勾配を使用したシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。無色油状物質４．７９ｇ（９１％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  ７．４５〜７．３５（ｍ，２Ｈ）、７．２５〜７．１３（ｍ，２Ｈ）、４．１３〜４．０５（ｍ，２Ｈ）、２．８５（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝２．７Ｈｚ）、２．５５〜２．４９（ｍ，２Ｈ）、１．７９（ｓ，３Ｈ）、１．７３（ｓ，３Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  −１２．４５。
【０３１６】
【化５０】
0006574239.tif 000051
【０３１７】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（１．９７ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコ中でＰｄ（ＰＰｈ３）４（３４６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（１１４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）および化合物Ｍ１２（上記を参照、１．０４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）と合わせた。フラスコを排気させて、アルゴンガスで満たして、セプタムおよびアルゴン風船で密封した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（４０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２．０９ｍＬ、１５ｍｍｏｌ）を、シリンジを使用してセプタムに通して添加して、混合物をＡｒ雰囲気下で外気温にて攪拌した。Ｃ１８ＲＰ  ＨＰＬＣまたはＴＬＣを使用して、出発ヌクレオシドの消失をモニタリングして、反応の進行を管理した。１５時間後、反応混合物を酢酸エチル（およそ１５０ｍＬ）で希釈して、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（２×５０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、油状物質にまで濃縮した。反応生成物（ＴＬＣ：酢酸エチル中でＲｆおよそ０．３５）を、酢酸エチル／ＤＣＭ（１：１）で充填して、かつ純粋な酢酸エステルで溶出させるシリカゲルカラム（４×２５ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離した。純粋な分画をプールして、真空中で濃縮した。クリーム色の泡状物質を得た（１．６１ｇ、６８％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １１．６５（ｓ，１Ｈ）、７．８８（ｓ，１Ｈ）、７．４２〜６．８７（ｍ，１７Ｈ）、６．１２（ｔ，１Ｈ）、５．３６（ｄ，１Ｈ）、４．３３〜４．２７（ｍ，１Ｈ）、３．９６〜３．８７（ｍ，３Ｈ）、３．７３（ｓ，６Ｈ）、３．２８〜３．０７（ｍ，２Ｈ）、２．５６〜２．４９（ｍ，２Ｈ）、２．３０〜２．１７（ｍ，２Ｈ）、１．７４（ｓ，３Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  −１２．５２。
【０３１８】
【化５１】
0006574239.tif 000052
【０３１９】
０℃に維持したＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（８６９μＬ、５．０ｍｍｏｌ）を含有する無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の化合物Ｍ１３（上記を参照、１．５９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト（５８１μＬ、２．６ｍｍｏｌ）をアルゴン下で滴下した。反応混合物を室温にまで加温して、３０分後にメタノール（０．１ｍＬ）を添加した。反応混合物を酢酸エチル（およそ１５０ｍＬ）で希釈して、５％ＮａＨＣＯ３水（３×５０ｍＬ）、および塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、油状物質にまで濃縮した。粗製生成物を、酢酸エチル／ヘキサン／トリエチルアミン（８０：２０：２）で充填して、かつ０〜２０％の酢酸エチル／トリエチルアミン（１００：２）中のアセトニトリルのステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（４×２０ｃｍ）上でクロマトグラフィーに付した。純粋な分画をプールして、真空下で濃縮して、オフホワイト色の泡状物質（１．４２ｇ、７１％）を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ１４７．５５、１４７．１５、−１２．５１。
【０３２０】
【化５２】
0006574239.tif 000053
【０３２１】
実施例４．ＰＮＡ−ＴＢＰモノマーの合成
実施例４は、ＰＮＡモノマー骨格に連結されたＴＢＰ部分を含む修飾チミンＰＮＡモノマーの保護形態であるＭ１９を調製するための合成手順について記載する。モノマーは、α，α−ジメチル−ｏ−ベンジレン保護基で保護されているリン酸部分を含む。
【０３２２】
【化５３】
0006574239.tif 000054
【０３２３】
５−ヨードウラシル（７．４０ｇ、３１ｍｍｏｌ、１ｅｑ）を、アルゴン下で無水ＤＭＦ１００ｍＬ中に溶解して、固体Ｋ２ＣＯ３（４．７３ｇ、３４．２ｍｍｏｌ、１．１ｅｑ）を添加した。溶液を０℃に冷却して、ブロモ酢酸ｔ−ブチル（４．５９ｍＬ、３１ｍｍｏｌ）を５分かけて滴下した。０℃で５分間攪拌した後、反応混合物を室温で２４時間進行させた。形成した沈殿物を濾過により除去して、ＤＭＦで洗浄して、濾液を蒸発させた。残渣を、酢酸エチル３００ｍＬと水１５０ｍＬとの間で分配させて、有機層を分離して、水（３×１００ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過による乾燥剤の除去後、溶液を蒸発させて、生成物９．４３ｇ（８６％）を得て、それは、さらなる精製なしで、次工程で使用した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．４２（ｓ，９Ｈ）、４．３９（ｓ，２Ｈ）、８．２０（ｓ，１Ｈ）、１１．７６（ｓ，１Ｈ）。ＬＣ／ＭＳ  ｍ／ｚ  ３５３．１（Ｍ＋Ｈ＋）。
【０３２４】
【化５４】
0006574239.tif 000055
【０３２５】
化合物Ｍ１５（上記を参照、６．４５ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）および化合物Ｍ１２（上記を参照、４．８８ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）を、磁気攪拌子を備えた丸底フラスコ中で、アルゴン下で無水ＤＭＳＯ７５ｍＬ中に溶解して、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（２．１２ｇ、１．８ｍｍｏｌ）、ヨウ化銅（Ｉ）（３４９ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１２．７５ｍＬ、９１．５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を６５℃に加熱して、６５℃で１２時間攪拌して、続いて外気温で一晩攪拌させた。ＴＬＣにより不完全な変換が示され、ＣｕＩ（３４９ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を６５℃へ３時間加熱した。反応混合物をジクロロメタン（４００ｍＬ）で希釈して、水（４００ｍＬ）、０．１Ｍ  Ｎａ２ＥＤＴＡ（２×２５０ｍＬ）、水（２５０ｍＬ）、および塩水（２５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、油状物質にまで濃縮した。反応生成物を、１〜４％のジクロロメタン中のメタノールのステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（７×１８ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離して、３．６２ｇ（４０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．４０（ｓ，９Ｈ）、１．７３（ｓ，３Ｈ）、１．７９（ｓ，３Ｈ）、２．７６（ｔ，２Ｈ）、４．１４（ｍ，２Ｈ）、４．４０（ｓ，２Ｈ）、７．１４〜７．４２（ｍ，４Ｈ）、７．９１（ｓ，１Ｈ）、１１．６９（ｓ，１Ｈ）。
【０３２６】
【化５５】
0006574239.tif 000056
【０３２７】
ｔ−ブチルエステルＭ１６（上記を参照、３．５９ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン２０ｍＬ中に溶解して、溶液を０℃に冷却した。溶液に、ＴＦＡ（２０ｍＬ）を１分かけて１．５ｍＬずつ添加した。反応を０℃で２０分間進行させて、続いて反応混合物を徐々に外気温まで加温した。外気温で９０分後に、加水分解は、ＴＬＣにより完了していた。混合物を真空下で蒸発させて、残渣をアセトニトリル中に溶解して、溶液を３回蒸発させることにより、残留ＴＦＡを除去した。反応生成物は、１〜２％のアセトニトリル中の水のステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（５×１８ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離して、２．４９ｇ（７８％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．７２（ｓ，３Ｈ）、１．７８（ｓ，３Ｈ）、２．７５（ｔ，２Ｈ）、４．１２（ｍ，２Ｈ）、４．６０（ｓ，２Ｈ）、７．１３〜７．４２（ｍ，４Ｈ）、７．９１（ｓ，１Ｈ）、１１．６８（ｓ，１Ｈ）。
【０３２８】
【化５６】
0006574239.tif 000057
【０３２９】
化合物Ｍ１７（上記を参照、１．５３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｂｏｃ−エチレンジアミン（１．４０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で無水ＤＭＦ４０ｍＬ中に溶解して、得られた溶液を０℃に冷却した。ＤＩＥＡ（１．４０ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を、続いてＨＡＴＵ（１．６１ｇ、３．８ｍｍｏｌ）を添加して、０℃で１０分間攪拌した後、混合物を外気温まで加温して、外気温で一晩攪拌した。反応混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈して、１Ｍ  ＨＣｌ（２００ｍＬ）、水（２×１５０ｍＬ）、および塩水（１５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を分離して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させて、濾過して、油状物質にまで濃縮した。反応生成物を、１〜３％のジクロロメタン中のメタノールのステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（５×１８ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離して、化合物Ｍ１８  ２．０９ｇ（７３％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．４１（ｓ，９Ｈ）、１．７１（ｓ，３Ｈ）、１．７７（ｓ，３Ｈ）、２．６９（ｍ，２Ｈ）、３．０５〜３．４１（ｍ，４Ｈ）、３．９５（ｓ，１Ｈ）、４．０７〜４．３５（ｍ，５Ｈ）、４．７１（ｓ，１Ｈ）、７．１２〜７．４３（ｍ，８Ｈ）、７．６６〜７．９６（ｍ，５Ｈ）、１１．６９（ｓ，１Ｈ）。
【０３３０】
【化５７】
0006574239.tif 000058
【０３３１】
化合物Ｍ１８（上記を参照、２．０７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン２０ｍＬ中に溶解して、溶液を０℃に冷却した。溶液に、ＴＦＡ（２０ｍＬ）を１０分かけて少しずつ添加した。反応を外気温まで加温した。外気温で９０分後に、加水分解は、ＴＬＣにより完了していた。混合物を真空下で蒸発させて、残渣は、ジクロロメタンを用いて蒸発させて、真空下で乾燥させた。反応生成物は、２〜８％のジクロロメタン中のメタノールのステップ勾配で溶出させるシリカゲルカラム（３．５×１８ｃｍ）上でのフラッシュクロマトグラフィーにより単離して、１．４８ｇ（７７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ  １．７２（ｓ，３Ｈ）、１．７８（ｓ，３Ｈ）、２．７２（ｔ，２Ｈ）、３．２５〜３．４１（ｍ，４Ｈ）、４．００（ｓ，１Ｈ）、４．０７〜４．３５（ｍ，５Ｈ）、４．７３（ｓ，１Ｈ）、７．１３〜７．２０（ｍ，２Ｈ）、７．３１〜７．４３（ｍ，７Ｈ）、７．６４〜７．７４（ｍ，３Ｈ）、７．８８〜７．９０（ｍ，２Ｈ）、１１．６３（ｍ，１Ｈ）、１２．７５（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。
【０３３２】
【化５８】
0006574239.tif 000059
【０３３３】
実施例５．オリゴマー合成におけるＴＢＰホスホルアミダイトの性能
合成
実施例５では、２つの異なる位置に単一のＴＢＰ部分を含有するオリゴマーのいずれか（オリゴマーＴ１およびＴ２）、または両方の位置に２つのＴＢＰ部分を含有するオリゴマー（オリゴマーＴ１−２）を、増加アセトニトリル濃度の勾配を用いた逆相ＨＰＬＣに付した。図１Ａにおけるクロマトグラムは、ＤＭＴ５’−リン酸保護基がオリゴマー中で修飾塩基から除去されていない場合、オリゴマーは一緒に密接に溶出したことを示す。対比して、図１Ｂにおけるクロマトグラムは、ＤＭＴ基が全て除去された後、２つのＴＢＰ部分を有するオリゴマー（Ｔ１−２）は、単一のＴＢＰ部分を含むオリゴマー（Ｔ１およびＴ２）よりも迅速に溶出したことを示す。これらの結果により、ＴＢＰ部分は、ＤＮＡオリゴマーの親水性、したがって水溶解度を有意に改善させることができることが示される。
【０３３４】
１つまたは複数のＴＢＰ修飾塩基を含むオリゴマーは、ＡＢＩ  ３９４  ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成した。標準的なオリゴホスホルアミダイト合成サイクルを使用した。ポリヌクレオチドオリゴマーは、アセトニトリル／０．１Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７の線形勾配：ＤＭＴ−ｏｎのポリヌクレオチドオリゴマーに関しては２０分かけて１６〜２３％アセトニトリル、およびＤＭＴ基を除去したポリヌクレオチドオリゴマー（ＤＭＴ−ｏｆｆ）に関しては７〜１４％アセトニトリルで溶出させるＣ１８  Ｇｅｍｉｎｉカラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上での逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ  ＨＰＬＣ）を使用して分析した。オリゴマーは、下記配列を有していた：
Ｔ１      ＴＴＴ  ＡＧＡ  Ｃ（ＴＢＰ）Ｔ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ（配列番号１）
Ｔ２      ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＣＴ（ＴＢＰ）  ＧＧＡ  ＴＴＴ（配列番号２）
Ｔ１−２      ＴＴＴ  ＡＧＡ  Ｃ（ＴＢＰ）Ｔ  ＣＴ（ＴＢＰ）  ＧＧＡ  ＴＴＴ（配列番号３）
【０３３５】
オリゴ合成後のオリゴヌクレオチドの粗製混合物に関するＲＰ  ＨＰＬＣデータは、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）保護基ｏｎを用いた場合には図１Ａに、また酢酸による処理によりＤＭＴ保護基が除去された場合には図１Ｂに示される。図１Ｂからわかるように、２つのＴＢＰ部分を有するＴ１−２オリゴマーは、ＨＰＬＣにより分離される３つのオリゴマーのうちで最も親水性である。
【０３３６】
実施例６．４つのＴＢＰ置換を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーのハイブリダイゼーション
実施例６は、それぞれが相補的な１２量体ＤＮＡオリゴマーにハイブリダイズした場合に、４つのＴＢＰ部分（脱保護されたリン酸基を伴う）を含む１８量体ＤＮＡオリゴマーの親和性を、従来のＡ、Ｃ、ＧおよびＴヌクレオチドのみを含む相当する１８量体ＤＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション親和性と比較した実験について記載する。図２における融解曲線により示されるように、本発明の４つのＴＢＰ部分を含む１８量体オリゴマーは、未修飾１８量体のＴｍよりも約１０℃高いＴｍ（融解温度）を有することが観察された。
【０３３７】
４つのＴＢＰ置換を含む本発明の例示的なポリヌクレオチドオリゴマーのハイブリダイゼーション結合親和性を、下記配列を有する相補的なＤＮＡ鎖を使用して評価した：
Ｏ４      ５’ＴＴＴ  ＡＧＡ  Ｃ（ＴＢＰ）（ＴＢＰ）Ｃ（ＴＢＰ）（ＴＢＰ）ＧＧＡ  ＴＴＴ−３’（配列番号４）
ＯＣ      ５’−ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＴＣＴ−３’（配列番号５）
その３’→５％方向では、ＯＣは、３’−ＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＣＴ−５’（Ｏ４に対して相補性を示す）を読み取る。
【０３３８】
比較の目的で、無置換鎖（一般的なＤＮＡ）のハイブリダイゼーションもまた評価した。
ＯＯ      ５’−ＴＴＴ  ＡＧＡ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＧＡ  ＴＴＴ−３’（配列番号６）
【０３３９】
ハイブリダイゼーション融解データが図２に示され、ここでは無置換オリゴマーに関して観察された融解曲線は「未修飾」と称され、ＴＢＰ含有オリゴマーに関して観察された融解曲線は「ＴＢＰ」と称される。図２に示されるように、ＴＢＰ含有オリゴマーは、無置換オリゴマーと比較して、優れたハイブリダイゼーション親和性を示す。約１０℃のＴｍのシフトが観察された。
【０３４０】
実施例７．５’ヌクレアーゼＰＣＲプローブの性能
実施例７では、本発明の０、１、２、３、４、５または６つの修飾（ＴＢＰ）塩基を含む切断可能な蛍光プローブを使用して、５’−ヌクレアーゼＰＣＲ反応を実施した。図３Ａおよび図３Ｂに示されるＰＣＲプロフィールにより、ＴＢＰ部分を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーが全て、検出プローブとして効率的に作用したことが実証される。さらに、ＴＢＰ部分を含む修飾ポリヌクレオチドオリゴマーは、未修飾オリゴマーよりも相補的なオリゴマー配列に対して、より大きな親和性を有し、より高いＰＣＴ伸長温度およびより短いＰＣＲサイクル回数を可能にする。
【０３４１】
１〜６つのＴＢＰ修飾塩基を含む５’ヌクレアーゼＰＣＲプローブの性能を評価した。一貫性のために、これらのプローブは全て、５’−末端ＦＡＭ部分および３’−ＢＨＱ（商標）消光剤部分を含有していた。ヒトゲノムＤＮＡベータ−グロブリンハウスキーピング配列をＰＣＲ鋳型として使用した。ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐ（商標）機器で実施し、反応はそれぞれ、三重反復で試験した。下記のＰＣＲ濃度およびＰＣＲサイクルを使用した：
初期アンプリコン長−９６ｂｐ、１０，０００個のコピー／反応、
プライマー濃度−２００ｎＭ、
プローブ濃度−２００ｎＭ、
ＰＣＲサイクル（６８℃で３０秒のアニーリング／伸長、９５℃で８秒の変性）
【０３４２】
オリゴマーおよび修飾ポリヌクレオチドオリゴマープローブは、下記配列を有していた：
【０３４３】
【表１】
0006574239.tif 000060
【０３４４】
得られたＰＣＲデータを図３Ａおよび図３Ｂに示す。データにより実証されるように、５’ヌクレアーゼＰＣＲプローブにおけるＴＢＰ部分の存在は、ＰＣＲと完全に適合する。かかるプローブにおいてＴＢＰ部分を含むことにより、プローブ中の任意の位置または多重位置で含まれる場合に、相補的な塩基配列に対するハイブリダイゼーション親和性が増大した。
【０３４５】
実施例８．ＰＣＲプライマーにおけるＴＢＰ部分
実施例８は、切断可能な蛍光プローブならびにＴＢＰ部分を含有しない（プライマーＰ２ＦおよびＰ２Ｒ）か、または３つの異なる位置のうちの１つに単一のＴＢＰ部分を含有する（Ｐ１Ｆ、Ｐ１Ｒ、およびＰ１−１Ｒ）フォワードおよびリバースプライマーの種々の対での組合せを使用して、５’−ヌクレアーゼＰＣＲ反応を実施した実験について記載する。得られたＰＣＲプロフィールを図４に示す。ＴＢＰ部分を含むプライマーは全て、５’ヌクレアーゼＰＣＲにおけるＤＮＡポリメラーゼの基質として効率的に作用した。
【０３４６】
ＴＢＰ置換を有する修飾ポリヌクレオチドオリゴマーを、ＰＣＲプライマーとして評価した。３’末端付近の、中央における、および５’末端付近の単一のＴＢＰ置換を有するプライマーを合成および評価した。下記ＰＲＣ条件を使用した：プライマーおよびプローブの濃度２００ｎＭ；ＰＣＲ緩衝液、０．３％Ｔｗｅｅｎ２０；１０，０００個のコピー／ＨＧ  ＤＮＡの反応；９５℃で６０秒、続く５５回のＰＣＲサイクル（６０℃で３０秒、７２℃で１０秒；９５℃で８秒）。
Ｐ１Ｆ      ５’−ＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡ（ＴＢＰ）Ｔ  −３’（配列番号１６）
Ｐ１Ｒ      ５’−ＡＡＡＴＡＧＣＣ（ＴＢＰ）ＣＣＡＧＧＣＡ−３’（配列番号１７）
Ｐ１−１Ｒ      ５’−ＡＡＡ（ＴＢＰ）ＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧ  ＣＡ−３’（配列番号１８）
Ｐ２Ｆ      ５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号１９）
Ｐ２Ｒ      ５’−ＡＡＡＴＡＧＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡ−３’（配列番号２０）
Ｐｒｏｂｅ      ５’−ＦＡＭ−ＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡ（ＴＢＰ）Ｃ（ＴＢＰ）ＣＧＧＣ−ＢＨＱ１−３’（配列番号２１）
【０３４７】
上記フォワードおよびリバースプライマーおよびプローブの様々な組合せを用いた６つのＰＣＲ反応混合物を試験した。結果を図４に表す。図４は、上述のＴＢＰ修飾プライマーおよびプローブセットの性能を実証している。
【０３４８】
実施例９．ＴＢＰ部分を含む修飾ＰＮＡオリゴマーの合成
実施例９は、３つの９量体ＰＮＡオリゴマーが従来の固相ＰＮＡ合成により調製された合成プロトコールを提供する。
【０３４９】
Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓからのＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（０．１６ｍｍｏｌ／ｇ）を使用して、修飾ＰＮＡオリゴマー合成を手動で実施した。Ｆｍｏｃ保護されたモノマーおよびＨＡＴＵは、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．から入手し、溶媒は、ＥＭＤから入手した。ピペリジン、ＴＦＡ、ＤＩＥＡおよびｍ−クレゾールは、Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。樹脂は、使用前に少なくとも２時間、ＤＣＭ中で膨潤させ、続いてＤＣＭ（５×）およびＤＭＦ（５×）で洗浄した。
合成プロトコール：
脱保護：ＤＭＦ中で２０％ピペリジン、２×５分
洗浄：ＤＭＦ（５×）、ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１）（５×）
事前活性化：ＨＡＴＵ（４ｅｑ）、ＤＩＥＡ（４．５ｅｑ）、ＰＮＡモノマー（１ｅｑ）、ＤＭＦ、３分
カップリング：３０分
洗浄：ＤＭＦ／ＤＣＭ（１：１）（５×）
キャッピング：５％Ａｃ２Ｏ／５％ＤＩＥＡ、１０分
洗浄：ＤＭＦ（５×）
【０３５０】
ＴＦＡ／ｍ−クレゾール（９：１）を用いて、室温で９０分間、固体支持体からの切断を実施した後、Ｅｔ２Ｏ中に沈殿させた。固体を遠心分離により収集して、Ｅｔ２Ｏ洗浄／遠心分離を二回繰り返した。逆相ＨＰＬＣによる精製後、ＥＳＩ（＋）質量分析により、ＰＮＡについて特性決定した。
【０３５１】
実施例１０．ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成
実施例１０は、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラオリゴマーを公知の方法により作製することができる一般的な方法を提供し、ここで、本発明の修飾塩基を含むＰＮＡモノマーは、ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いて、または修飾ＰＮＡモノマーとして組み込まれる。
【０３５２】
ＰＮＡオリゴマーおよびＤＮＡ−ＰＮＡキメラは、これまでに報告されているように（Petraccone et al., J. Am. Chem. Soc., 2005, 16125-16223）、Ｆｍｏｃ保護されたＰＮＡモノマーおよびヌクレオシドホスホルアミダイトを使用した固相ストラテジーによって合成される。Ｎ−Ｆｍｏｃグリシンで官能基化されたＴｅｎｔａｇｅｌ−ＯＨ樹脂を、第１のＰＮＡ単位と反応させた後、５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−Ｏ−（２−シアノエチル）ホスホルアミダイトグアノシン、チミジン、アデノシンおよびシチジン単位と反応させて、キメラを得る。キメラは、５５℃で１２〜１６時間、濃アンモニア水で、固体支持体から脱離されて、脱保護した。溶液を蒸発させて、アンモニアを除去して、生成物を分取用逆相ＨＰＬＣによって単離する。
【０３５３】
実施例１１．ＤＮＡとのＴＢＰ修飾ＰＮＡのハイブリダイゼーション
実施例１１は、実施例９のプロトコールにより作製され、かつ各オリゴマーにおける４番目および／または７番目の位置に１つ（ＰＮＡ−Ｔ１およびＰＮＡ−Ｔ２）または２つ（ＰＮＡ−Ｔ３）のＴＢＰ部分を含むＰＮＡオリゴマーに関して、融解温度を決定した実験について記載する。実施例１１の表２に示すように、３つのＴＢＰ含有ＰＮＡオリゴマーは全て、相補的な標的ＤＮＡオリゴマーとともに形成されるハイブリダイゼーション二重鎖に関して測定された、対照ＤＮＡオリゴマーに関して観察されるＴｍ値よりも高いＴｍ値、したがってより高い結合親和性を有した。Ｔｍデータはまた、２つの介在する標準的なＰＮＡモノマーにより分離される２つの修飾塩基を含むＰＮＡオリゴマーが、単一のＴＢＰ部分のみを含む２つのオリゴマーよりもわずかに低いＴｍ値を有するようである（しかし、相当するＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＴｍを十分に上回る）ことを示す。したがって、幾つかのオリゴマー構築物を作製および評価して、特定の用途にとって最良であるＴＢＰ部分の数および位置を決定することは、有益であり得る。
【０３５４】
１つまたは２つのＴＢＰ部分を有するＰＮＡオリゴマーを調製して、以下の表２に概要するように、相補的な標的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性に関して、それらの融解温度（Ｔｍ）を決定した。ＰＮＡオリゴマーと同じ配列を有する相当する未修飾対照ＤＮＡのＴｍもまた、標的ＤＮＡとハイブリダイズした際に決定した。Ｔｍデータは、標準的な融解条件（各オリゴに関して１μＭ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８）を使用して得られた。下記表２は、オリゴマー配列および観察されたＴｍ値を列挙する。
【０３５５】
【表２】
0006574239.tif 000061
【０３５６】
表２からわかるように、ＰＮＡオリゴマーＰＮＡ−Ｔ１およびＰＮＡ−Ｔ２は、ＴＢＰ部分を含有しない対照ＤＮＡオリゴマーよりも高い融解温度、したがってハイブリダイゼーション時に相補的な配列に対してより強力な結合親和性を示した。
【０３５７】
実施例１２．ＴＢＰ修飾ＰＮＡオリゴマーのＨＰＬＣ
実施例１２は、実施例１１由来のＰＮＡオリゴマーを、増加アセトニトリル濃度の勾配を用いた逆相ＨＰＬＣに付した実験について記載する。図５中のクロマトグラムは、２つのＴＢＰ修飾塩基を含むＰＮＡオリゴマー（ＰＮＡ−Ｔ３）が、単一のＴＢＰ部分を含むオリゴマー（ＰＮＡ−Ｔ１およびＰＮＡ−Ｔ２）よりも実質的に早く溶出し、単一のＴＢＰ部分を含むオリゴマー（ＰＮＡ−Ｔ１およびＰＮＡ−Ｔ２）は、未修飾ＰＮＡオリゴマーよりも早く溶出したことを示す。これらの結果により、ＴＢＰ部分が、ＰＮＡオリゴマーの親水性、したがって水溶解度を有意に改善させることができることが示される。
【０３５８】
実施例１１由来のＴＢＰ修飾ＰＮＡオリゴマーを、ＲＰ  ＨＰＬＣ（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム、４．６×２５ｍｍ、ＴＥＡ重炭酸緩衝液（ｐＨ７．５）中で５％〜１５％のアセトニトリルの線形勾配で４０分間）で分析した。図５における重ね合わせたクロマトグラムにより示されるように、ＴＢＰ修飾ＰＮＡ配列は、未修飾ＰＮＡの保持時間と比較して、より少ない保持時間を有し、それにより、ＴＢＰ修飾が、ＰＮＡオリゴマーの親水性（したがって、水溶解度）を増大させることが実証される。
【０３５９】
実施例１３．ヌクレオシドの合成に関する一般的な方法
化合物ＮＳ１は、ホスホン酸部分を含む修飾塩基を含む修飾ヌクレオシドを示す。化合物ＮＳ１は、化合物Ｍ９（上記を参照）に類似して、５−ヨード−２’−デオキシウリジンおよび化合物Ｍ８から出発して、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４およびヨウ化銅（Ｉ）を触媒とするカップリング、続く２５％アンモニア水による保護基の除去によって調製される。
【０３６０】
【化５９】
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【０３６１】
化合物ＮＳ２は、リン酸部分を含む修飾塩基を含む修飾ヌクレオシドを示す。化合物ＮＳ２は、化合物Ｍ１３（上記を参照）に類似して、５−ヨード−２’−デオキシウリジンおよび化合物Ｍ１２（上記を参照）から出発して、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４およびヨウ化銅（Ｉ）を触媒とするカップリング、続く２５％アンモニア水による保護基の除去によって調製される。
【０３６２】
【化６０】
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【０３６３】
実施例１４．ヌクレオチド−５’−三リン酸の合成に関する一般的な方法
修飾ヌクレオチド三リン酸ＮＴ１およびＮＴ２は、相当する５’−ＤＭＴｒ誘導体Ｍ１３およびＭ９（上記を参照）から、３’−ヒドロキシ基のアセチル化、続く５’−ＤＭＴｒ基の除去およびＨｏｌｌｅｎｓｔｅｉｎ  Ｍ．，”Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ  ｔｈａｔ  Ｉｎｃｌｕｄｅ  Ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｕｒｅａ，ｏｒ  Ｓｕｌｆｏｎａｍｉｄｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ＤＮＡ，”  Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１２，１８，１３３２０−１３３３０により記載されるプロトコールを使用した相当する三リン酸への変換により合成された。
【０３６４】
【化６１】
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【０３６５】
実施例１５．配列の総合リスト
以下の表３は、記載されるように本明細書中で調製および使用される配列の総合リストを提供する。
【０３６６】
【表３−１】
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【０３６７】
【表３−２】
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【０３６８】
様々な実施例および他の情報を上記で提供して、特許請求の範囲内の態様を説明しているが、当業者は、これらの実施例を使用して、多種多様な実行を導き出すことが可能であるように、かかる実施例における特定の特徴または配置に基づいて、特許請求の範囲の限定を暗示すべきではない。さらに、幾つかの主題を、構造的特徴、条件または使用の実施例に特異的な言語で記載した部分もあるが、特許請求の範囲で規定される主題は、必ずしもそのように限定されるものではない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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