(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
球面収差を補正する補正装置を有し、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得する顕微鏡装置と、
画素間の画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから複数のコントラスト値を算出し、算出した前記複数のコントラスト値に基づいて、前記顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出する演算手段と、を備え、
前記演算手段は、前記複数のコントラスト値を算出する処理において、各々が、画素値の差分が算出される画素間の異なる間隔である、複数のシフト量を使用し、
前記評価式は前記複数のシフト量の画素値の差分の和をシフト量の数で割る
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項２】
請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記演算手段は、前記複数の画像データの各々のコントラスト値を、前記評価式を用いて算出する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡装置は、前記複数の画像データを複数回取得し、
前記演算手段は、前記設定目標値を複数回算出し、算出された複数の前記設定目標値に基づいて、前記複数の設定目標値よりも確からしい第２の設定目標値を算出する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡装置は、前記複数の画像データを複数回取得し、
前記演算手段は、前記設定目標値を複数回算出し、算出された複数の前記設定目標値に基づいて、前記複数の設定目標値から最も確からしい第２の設定目標値を選択する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項５】
請求項３または請求項４に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記演算手段は、算出した前記設定目標値の信頼性の高低を判定し、
前記顕微鏡装置は、前記設定目標値の信頼性が低いと判定した場合に、前記複数の画像データを再度取得する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項６】
請求項５に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
前記演算手段は、前記設定目標値の信頼性の高低を、前記複数のコントラスト値に基づいて判定する
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
前記顕微鏡装置は、さらに、対物レンズを有し、
前記補正装置は、前記対物レンズ内のレンズを移動させる補正環を含む
ことを特徴とする顕微鏡システム。
【請求項８】
球面収差を補正する補正装置の設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得し、
画素間の画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、前記補正装置を有する顕微鏡装置が取得した前記複数の画像データから複数のコントラスト値を算出し、
前記複数のコントラスト値に基づいて、前記顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出し、
前記複数のコントラスト値は、画素値の差分が算出される画素間の異なる間隔である複数のシフト量を使用して、前記評価式を用いて前記複数のシフト量の画素値の差分の和をシフト量の数で割ることにより算出される
ことを特徴とする算出方法。
【請求項９】
画素間の画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、球面収差を補正する補正装置の設定値が異なる複数の状態で顕微鏡装置が取得した複数の画像データから複数のコントラスト値を算出し、
前記複数のコントラスト値に基づいて、前記顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出し、
前記複数のコントラスト値は、画素値の差分が算出される画素間の異なる間隔である複数のシフト量を使用して、前記評価式を用いて前記複数のシフト量の画素値の差分の和をシフト量の数で割ることにより算出される
処理をコンピュータに実行させることを特徴とするプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡システム、顕微鏡システムが備える球面収差を補正する補正装置の設定値を算出する算出方法、及び、プログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、補正環は、専らカバーガラスの厚さに起因する球面収差を補正する手段として用いられてきたが、サンプル（例えば、生体試料）の深部を観察する手法が開発され普及した近年では、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を補正する目的にも使用可能である。
【０００３】
ところで、球面収差が補正された状態では、球面収差が補正されていない状態に比べて、コントラストの高い画像が得られる。このため、球面収差が補正されているか否かの判定は、画像のコントラストを評価した評価値に基づいて行うことができる。このような技術は、例えば、特許文献１に記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１６０２１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、オートフォーカスの分野で一般的に利用されている、J.F.Brennerらによって提案されたBrenner gradientと呼ばれるコントラストの評価式では、画像のコントラストを適切に評価することができない場合がある。画像のコントラストを適切に評価することができなければ、球面収差が補正された状態を正しく特定することは困難である。
【０００６】
なお、カバーガラスの厚さや観察対象面の深さによって変化する球面収差を補正する手段として補正環を例示したが、球面収差を補正する任意の手段において、同様の課題が生じうる。
【０００７】
以上のような実情を踏まえ、本発明は、球面収差が良好に補正される設定を特定する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、球面収差を補正する補正装置を有し、前記補正装置の設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得する顕微鏡装置と、画素間の画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、前記顕微鏡装置で取得された前記複数の画像データから複数のコントラスト値を算出し、算出した前記複数のコントラスト値に基づいて、前記顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出する演算手段と、を備え、前記演算手段は、前記複数のコントラスト値を算出する処理において、各々が、画素値の差分が算出される画素間の異なる間隔である、複数のシフト量を使用し、前記評価式は前記複数のシフト量の画素値の差分の和をシフト量の数で割る顕微鏡システムを提供する。
【０００９】
本発明の別の態様は、球面収差を補正する補正装置の設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得し、画素間の画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、前記補正装置を有する顕微鏡装置が取得した前記複数の画像データから複数のコントラスト値を算出し、前記複数のコントラスト値に基づいて、前記顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出し、前記複数のコントラスト値は、画素値の差分が算出される画素間の異なる間隔である複数のシフト量を使用して、前記評価式を用いて前記複数のシフト量の画素値の差分の和をシフト量の数で割ることにより算出される算出方法を提供する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、画素間の画素値の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、球面収差を補正する補正装置の設定値が異なる複数の状態で顕微鏡装置が取得した複数の画像データから複数のコントラスト値を算出し、前記複数のコントラスト値に基づいて、前記顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する前記補正装置の設定値である設定目標値を算出し、前記複数のコントラスト値は、画素値の差分が算出される画素間の異なる間隔である複数のシフト量を使用して、前記評価式を用いて前記複数のシフト量の画素値の差分の和をシフト量の数で割ることにより算出される処理をコンピュータに実行させるプログラムを提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、球面収差が良好に補正される設定を特定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図２】図１に例示される演算装置の構成を例示した図である。
【図３】図１に例示される顕微鏡の構成を例示した図である。
【図４】球面収差補正処理のフローチャートである。
【図５】目標値算出処理のフローチャートである。
【図６Ａ】目標値算出処理において最初に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。
【図６Ｂ】目標値算出処理において２回目に決定した複数の設定値によって得られる複数の評価値を示した図である。
【図７】従来のコントラスト評価式の空間周波数特性と光学系の変調伝達関数（Modulation Transfer Function）との関係を例示した図である。
【図８】顕微鏡システムで使用するコントラスト評価式の空間周波数特性と従来のコントラスト評価式の空間周波数特性とを比較した図である。
【図９】画像データの領域毎に領域目標値を算出した例を示した図である。
【図１０】別の目標値算出処理のフローチャートである。
【図１１】図１０に示す目標値算出処理について説明するための図である。
【図１２】更に別の目標値算出処理のフローチャートである。
【図１３】目標値の信頼性と評価値の関係について説明するための図である。
【図１４Ａ】目標値を複数回算出したときの目標値の変化の様子を例示した図である。
【図１４Ｂ】第２の目標値を複数回算出したときの第２の目標値の変化の様子を例示した図である。
【図１５】屈折率表示処理のフローチャートである。
【図１６】屈折率算出処理のフローチャートである。
【図１７】変化率と屈折率の関係を示した図である。
【図１８】屈折率の算出方法について説明するための図である。
【図１９】実施例２に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【図２０】実施例３に係る顕微鏡システムの構成を例示した図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【００１３】
図１は、本実施例に係る顕微鏡システム１の構成を例示した図である。図２は、図１に例示される演算装置２０の構成を例示した図である。図３は、図１に例示される顕微鏡１００の構成を例示した図である。
【００１４】
図１に示す顕微鏡システム１は、顕微鏡１００と、顕微鏡制御装置１０と、演算装置２０と、表示装置３０と、演算装置２０への指示を入力するための複数の入力装置（キーボード４０、補正環操作装置５０、Ｚ駆動部操作装置６０）を備えている。
【００１５】
顕微鏡制御装置１０は、演算装置２０からの指示に従って顕微鏡１００の動作を制御する装置であり、顕微鏡１００の各種電動部の動作を制御する制御信号を生成する。顕微鏡制御装置１０は、光源の出力を制御する光源制御装置１１と、ズーム倍率を制御するズーム制御装置１２と、観察対象面の光軸方向の位置（以降、単に、観察対象面の位置と記す）を制御するＺ制御装置１３と、補正環１１１の設定値を制御する補正環制御装置１４と、を備えている。ここで、補正環１１１の設定値とは、例えば、基準位置に対する補正環１１１の回転角度のことである。
【００１６】
演算装置２０は、各種の演算処理を行うコンピュータであり、例えば、図２に示すように、ＣＰＵ（Central Processing Unit）２１、メモリ２２、入力Ｉ／Ｆ装置２３、出力Ｉ／Ｆ装置２４、記憶装置２５、及び、可搬記録媒体２７が挿入される可搬記録媒体駆動装置２６を備え、これらがバス２８によって相互に接続されている。なお、図２は、演算装置２０の構成の一例であり、演算装置２０はこの構成に限定されるものではない。
【００１７】
ＣＰＵ２１は、所定のプログラムを実行して演算処理等を行う。メモリ２２は、例えば、ＲＡＭ（Random Access Memory）であり、プログラムの実行の際に、記憶装置２５または可搬記録媒体２７に記憶されているプログラムまたはデータを一時的に格納する。
【００１８】
入力Ｉ／Ｆ装置２３は、キーボード４０、補正環操作装置５０、Ｚ駆動部操作装置６０、及び表示装置３０からの信号を受信する。また、入力Ｉ／Ｆ装置２３は、図３において後述する顕微鏡１００のＡ／Ｄ変換器１０８からの信号も受信する。出力Ｉ／Ｆ装置２４は、表示装置３０及び顕微鏡制御装置１０へ信号を出力する。
【００１９】
記憶装置２５は、例えば、ハードディスク記憶装置であり、主に各種データやプログラムの保存に用いられる。可搬記録媒体駆動装置２６は、光ディスクやコンパクトフラッシュ（登録商標）等の可搬記録媒体２７を収容するもので、可搬記録媒体２７は、記憶装置２５を補助する役割を有する。
【００２０】
演算装置２０は、記憶装置２５または可搬記録媒体２７に記憶されているプログラムをＣＰＵ２１がメモリ２２にロードして実行することで、様々な機能を実現する。演算装置２０は、例えば、顕微鏡１００からの出力に基づいて画像データを生成する手段（画像データ生成手段）、画像データのコントラスト値を算出する手段（コントラスト算出手段）、球面収差が補正される補正環１１１の設定値である設定目標値を算出する手段（目標値算出手段）、サンプルＳの屈折率を算出する手段（屈折率算出手段）、及び、表示装置３０を制御する手段（表示制御手段）として動作する。
【００２１】
表示装置３０は、例えば、液晶ディスプレイ装置、有機ＥＬディスプレイ装置、ＣＲＴディスプレイ装置などである。なお、表示装置３０は、タッチパネルセンサを備えてもよく、その場合、入力装置としても機能する。
【００２２】
補正環操作装置５０は、補正環１１１の設定値を指示するための入力手段である。利用者が補正環操作装置５０で補正環１１１の設定値を指示すると、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定値を指示された値に変更する。
【００２３】
Ｚ駆動部操作装置６０は、観察対象面の位置の変更を指示するための入力手段である。利用者がＺ駆動部操作装置６０で観察対象面の位置の変更を指示すると、Ｚ制御装置１３は、Ｚ駆動部１０９を光軸方向に移動させて観察対象面の位置を変更する。
【００２４】
顕微鏡１００は、２光子励起顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料であるが、生体試料に限られない。顕微鏡１００は、図３に示すように、照明光路上に、レーザー１０１と、走査ユニット１０２と、瞳投影光学系１０３と、ミラー１０４と、ダイクロイックミラー１０５と、対物レンズ１１０とを備えている。
【００２５】
レーザー１０１は、例えば、超短パルスレーザーであり、近赤外域のレーザー光を発振する。レーザー１０１の出力は、光源制御装置１１によって制御される。即ち、光源制御装置１１は、サンプルに照射するレーザー光のパワーを制御するレーザー制御装置である。
【００２６】
走査ユニット１０２は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナなどを含んでいる。走査ユニット１０２の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット１０２の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。
【００２７】
瞳投影光学系１０３は、走査ユニット１０２を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。ダイクロイックミラー１０５は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。
【００２８】
対物レンズ１１０は、補正環１１１を備えた乾燥系又は液浸系の対物レンズであり、Ｚ駆動部１０９に装着されている。Ｚ駆動部１０９は、対物レンズ１１０を対物レンズ１１０の光軸方向に移動させる手段であり、Ｚ駆動部１０９の移動（即ち、対物レンズ１１０の移動）は、Ｚ制御装置１３によって制御される。
【００２９】
補正環１１１は、その設定値を変更することにより対物レンズ１１０内のレンズを移動させて、球面収差を補正する補正装置である。補正環１１１の設定値は、補正環制御装置１４（補正装置制御装置）によって変更される。なお、補正環１１１の設定値は、補正環１１１を直接操作することで、手動で変更することもできる。
【００３０】
顕微鏡１００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー１０５の反射光路）上に、瞳投影光学系１０６と、光検出器１０７とを備えている。光検出器１０７から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器１０８に出力される。
【００３１】
瞳投影光学系１０６は、対物レンズ１１０の瞳を光検出器１０７に投影する光学系である。光検出器１０７は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器１０８は、光検出器１０７からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、演算装置２０に出力する。
【００３２】
以上のように構成された顕微鏡システム１では、顕微鏡１００は、走査ユニット１０２を用いてレーザー光で対物レンズ１１０の光軸と直交する方向にサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器１０７で検出する。そして、演算装置２０は、光検出器１０７からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット１０２からの信号とに基づいて、画像データを生成する。即ち、顕微鏡システム１では、顕微鏡１００と演算装置２０により構成される顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。
【００３３】
図４は、顕微鏡システム１で行われる球面収差補正処理のフローチャートである。以下、図４を参照しながら、顕微鏡システム１において補正環１１１を利用して行われる球面収差を補正する処理について説明する。
【００３４】
顕微鏡システム１は、まず、顕微鏡装置で観察される観察対象面の位置を特定する（ステップＳ１）。ここでは、例えば、利用者がＺ駆動部操作装置６０を操作して観察対象面の位置を指定する。これにより、演算装置２０がＺ駆動部操作装置６０から指定された観察対象面の位置に関する情報（深さ情報）を受信し、観察対象面の位置を特定する。
【００３５】
次に、顕微鏡システム１は、ステップＳ１で決定した観察対象面における球面収差が補正される補正環１１１の設定値（以降、設定目標値、又は、単に目標値、と記す）を算出する（ステップＳ２）。目標値は、顕微鏡装置で発生した球面収差量に対応する。ここでは、顕微鏡装置が取得した画像データに基づいて、演算装置２０が目標値を算出する。なお、目標値を算出する処理については、後に詳述する。
【００３６】
顕微鏡システム１は、目標値が算出されると、補正環１１１の設定値を目標値に設定する（ステップＳ３）。ここでは、補正環制御装置１４が補正環１１１の設定値をステップＳ２で算出された目標値に変更する。なお、補正環制御装置１４は、自動的に、即ち、演算装置２０からの指示に従って、ステップＳ２で算出した目標値に補正環１１１の設定値を変更してもよい。また、手動により、即ち、ステップＳ２で算出された目標値が表示装置３０に表示され、表示された目標値に基づいて利用者が補正環操作装置５０を操作することにより、補正環制御装置１４が補正環１１１の設定値を目標値に変更してもよい。また、利用者が補正環１１１を直接操作して補正環１１１の設定値を目標値に変更してもよい。
【００３７】
最後に、顕微鏡システム１は、レーザー１０１の出力を設定する（ステップＳ４）。ここでは、光源制御装置１１が、補正環１１１の設定値が目標値であるときに顕微鏡装置で取得された画像データに基づいて、サンプルＳに照射するレーザー光のパワーを制御する。例えば、ステップＳ３で補正環１１１の設定値を変更した後に改めて画像データを取得して、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定してもよい。また、ステップＳ２で補正環１１１の設定値が目標値であるときの画像データが既に取得されている場合には、その画像データから算出される画像の明るさに基づいてレーザー１０１の出力を設定してもよい。
【００３８】
顕微鏡システム１は、図４に示す球面収差補正処理を実行することで、観察対象面の深さに応じて変化する球面収差を補正することができる。これにより、顕微鏡１００が有する光学性能を十分に発揮して、高品質な画像を得ることができる。また、球面収差が補正された状態では、一般に、球面収差が補正されていない状態に比べて明るい画像が得られる。このため、球面収差が補正された状態で取得された画像データに基づいてレーザー１０１の出力を設定することで、レーザー１０１の出力を抑えて、生体試料へのダメージを抑制することができる。なお、この効果は、より大きな出力が必要とされるサンプルＳの深部を観察する場合に、特に顕著である。
【００３９】
以下、図４のステップＳ２で行われる目標値算出処理について、具体的に説明する。図５は、顕微鏡システム１で行われる目標値算出処理のフローチャートである。図６Ａ及び図６Ｂは、図５に示す目標値算出処理について説明するための図である。図６Ａには、最初に決定した複数の設定値で得られる複数の評価値が、図６Ｂには、２回目に決定した複数の設定値で得られる複数の評価値が示されている。図７は、従来のコントラスト評価式の空間周波数特性と光学系の変調伝達関数（以降、ＭＴＦと記す）との関係を例示した図である。図８は、顕微鏡システム１で用いるコントラスト評価式の空間周波数特性と従来のコントラスト評価式の空間周波数特性とを比較した図である。
【００４０】
顕微鏡システム１は、まず、補正環１１１の複数の設定値を決定する（ステップＳ１１）。ここでは、顕微鏡装置でサンプルの画像データを取得する際の補正環１１１の設定値を演算装置２０が複数個決定する。例えば、図６Ａに示すように、演算装置２０は、補正環１１１が回転可能な範囲（動作可能範囲）自体又はそれより少しだけ狭い範囲を探索範囲に決定し、探索範囲を均等に分割する予め決められた数（ここでは１０）の設定値（補正環位置）を、複数の設定値として決定する。なお、図６Ａでは、θ１からθ１０までの１０個の設定値（補正環位置）が決定される例が示されている。
【００４１】
次に、顕微鏡システム１は、補正環１１１の設定値をステップＳ１１で決定した設定値に変更する（ステップＳ１２）。ここでは、補正環制御装置１４が演算装置２０からの指示に従ってステップＳ１１で決定した複数の設定値のいずれかに設定する。例えば、補正環制御装置１４は、補正環１１１の設定値をθ１に変更する。
【００４２】
補正環１１１の設定値が変更されると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの画像データを取得する（ステップＳ１３）。ここでは、顕微鏡装置が演算装置２０からの指示に従って画像データを取得する。例えば、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定値がθ１の状態で画像データを取得する。
【００４３】
その後、顕微鏡システム１は、ステップＳ１１で決定したすべての設定値で画像データを取得したか否かを判断し（ステップＳ１４）、すべての設定値で画像データを取得していない場合には、ステップＳ１２からステップＳ１４の処理を繰り返す。これにより、顕微鏡装置は、補正環１１１の設定値が異なる複数の状態の各々で、サンプルＳの観察対象面の画像データを取得し、その結果、複数の画像データを取得する。
【００４４】
すべての設定値で画像データが取得されると、顕微鏡システム１は、ステップＳ１３で取得した複数の画像データから複数の評価値を算出する（ステップＳ１５）。ここでは、演算装置２０が、画素間の画素値（輝度値）の差分に基づいて画像のコントラストを評価する評価式を用いて、複数の画像データから、複数のコントラスト値を算出する。なお、一般に、球面収差が補正された画像ほど高いコントラストを有していることから、コントラスト値は、球面収差が補正されているかどうかを評価する評価値として好適である。
【００４５】
画像のコントラストを評価する評価式としては、例えば、ｘ方向にｎ画素分ずれた位置にある２つの画素の画素値の差分の２乗を、画像データ全体で積算してコントラスト値を算出する、下式が知られている。下式は、J.F.Brennerらによって提案された評価式であり、Brenner gradientと呼ばれている。
【数１】
0006562547.tif 000002
【００４６】
ここで、ＦＢｒｅｎｎｅｒはコントラスト値であり、ｘは画像データを構成する画素の列を特定する変数であり、ｙは画像データを構成する画素の行を特定する変数である。Ｗは画像データを構成する画素のｘ方向の画素数（即ち、列数）であり、Ｈは画像データを構成する画素のｙ方向の画素数（即ち、行数）である。ｆは画素の画素値であり、ｎはシフト量であり、画素値の差分が算出される画素間の間隔を示す整数（例えば、２など）である。
【００４７】
顕微鏡の分野では、Brenner gradientのシフト量を２に設定するのが通常である。しかしながら、Brenner gradientのシフト量を特定の値に固定して画像のコントラストを評価すると、光学系が情報を伝達することができる空間周波数領域内に、画像のコントラストに対する感度が極端に低い領域が生じてしまう。このため、画像のコントラストを適切に評価することができない場合がある。
【００４８】
例えば、画素サイズが０．０５ｍｍであり、ｘ方向の画素数が１０２４画素である撮像素子を用いる場合、シフト量２におけるBrenner gradient（評価式）は、図７の線ＬＢｒｅｎｎｅｒで示す空間周波数特性を有する。また、図７の線ＬＭＴＦは光学系のＭＴＦを示している。従って、この場合、光学系によってコントラスト情報が伝達されているにもかかわらず、撮像素子上で1000[line/mm]程度の空間周波数を有する成分については、そのコントラストが低く評価されてしまう。なお、図７では、シフト量２におけるBrenner gradientの特性を例示したが、他のシフト量におけるBrenner gradientでも、コントラストに対する感度が低い空間周波数領域が存在する。
【００４９】
そこで、ステップＳ１５では、例えば、異なる複数のシフト量を使用する以下の評価式により、ステップＳ１３で取得した複数の画像データの各々のコントラスト値を算出する。なお、図６Ａには、ステップＳ１３で取得した複数の画像データのコントラスト値が示されている。
【数２】
0006562547.tif 000003
【００５０】
例えば、５つのシフト量（ｎ＝１、２、３、５、１０）を用いる場合、評価式（２）は、図８の線Ｌｗｉｄｅに示す空間周波数特性を有する。なお、図８では、評価式（１）の空間周波数特性と評価式（２）の空間周波数特性との比較を容易にするため、評価式（２）のコントラスト値を評価式（２）で使用するシフト量の数（５つ）で割った値で線Ｌｗｉｄｅを描いている。
【００５１】
図８に示すように、評価式（２）によれば、従来の評価式（１）に比べて、広い空間周波数領域でコントラストを安定して評価することができる。このため、画像に含まれる周波数成分によらず、即ち、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。
【００５２】
複数の評価値が算出されると、顕微鏡システム１は、所定の条件を満たしているか否かを判断する（ステップＳ１６）。所定の条件としては、例えば、ステップＳ１２からステップＳ１６までの処理の繰り返し回数が所定回数に達しているか否かであってもよく、複数の設定値の平均間隔が所定値以下であるか否かであってもよい。
【００５３】
ステップＳ１６で所定の条件を満たしていない場合には、顕微鏡システム１は、改めて複数の設定値を決定し（ステップＳ１７）、その後、ステップＳ１２からステップＳ１６の処理を繰り返す。
【００５４】
ステップＳ１７では、演算装置２０は、以下の２つの条件を満たすように複数の設定値を決定する。第１の条件は、ステップＳ１７で決定する複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔が、先の複数の設定値の分布範囲及び平均間隔と比較して、狭いことである。第２の条件は、ステップＳ１７で決定する複数の設定値の分布範囲内に、ステップＳ１５で算出された最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれることである。なお、本明細書において、評価値に対応する設定値とは、ある画像データから算出された評価値に対するその画像データが取得されたときの補正装置の設定値のことをいうものとする。また、設定値に対応する評価値とは、ある画像データが取得されたときの補正装置の設定値に対するその画像データから算出された評価値のことをいうものとする。
【００５５】
これにより、顕微鏡装置は、設定値が異なる複数の状態で複数の画像データを取得する処理を、複数の状態で設定される補正環１１１の複数の設定値の分布範囲と平均間隔とが繰り返し毎に狭まり、且つ、その分布範囲内に演算装置２０が算出した最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が含まれるように、繰り返す。そして、演算装置は、繰り返し毎に、複数の画像データから複数の評価値を算出する。
【００５６】
図６Ｂは、ステップＳ１７で決定した複数の設定値に基づいて取得した複数の画像データのコントラスト値が示されている。図６Ａと図６Ｂを比較すると、図６Ｂに示す複数の設定値（補正環位置）は、上記２つの条件を満たしていることが確認できる。なお、図６Ａと図６Ｂでは、いずれも１０個の設定値（補正環位置）が決定されている例が示されているが、設定値の数は、繰り返し毎に設定値の平均間隔が狭くなる限り、同一に限られず、増加しても減少してもよい。
【００５７】
ステップＳ１６で所定の条件を満たしている場合には、顕微鏡システム１は、ステップＳ１５で算出した複数の評価値と、それら複数の評価値に対応する複数の設定値と、に基づいて目標値を算出し（ステップＳ１８）、目標値算出処理を終了する。ここでは、例えば、最後の繰り返しにおいてステップＳ１５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が目標値として算出されてもよい。また、最後の繰り返しに限らずステップＳ１５で算出された複数の評価値のうちの最大の評価値に対応する補正環１１１の設定値が目標値として算出されてもよい。なお、演算装置２０は、算出した目標値と観察対象面の位置の組み合わせを、記憶装置２５に記憶させる。
【００５８】
顕微鏡システム１は、図５に示す目標値算出処理を実行することで、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。このため、画像のコントラストを適切に評価して目標値を算出することができる。即ち、球面収差が良好に補正される補正装置の設定を特定することができる。また、比較的少ない画像データの取得回数で目標値を高精度に算出することもできる。従って、図４に示す球面収差補正処理及び図５に示す目標値算出処理を実行する顕微鏡システム１によれば、短時間で球面収差を良好に補正することができる。
【００５９】
なお、図５のステップＳ１５では、シフト量を５つ使用する例を示したが、シフト量は複数使用されればよく、５つに限られない。また、画像データ毎に評価値を算出する例を示したが、画像データの全体領域を複数の領域に分割して、分割によって得られる領域毎に評価値（以降、画像データ毎に算出される評価値と区別するため、領域評価値と記す。）を算出してもよい。この場合、ステップＳ１８では、領域毎に目標値（全体領域に対して算出される目標値と区別するため、以降、領域目標値と記す。）を算出し、複数の領域目標値に基づいて、全体領域に対する目標値を算出する。
【００６０】
図９は、画像データの全体領域ＷＲを領域Ｒ１から領域Ｒ９の９つの領域に分割し、領域毎に領域目標値を算出した例を示している。全体領域に対する目標値は、例えば、領域目標値を昇順又は降順に並べた（θ３：θ３：θ４：θ４：θ５：θ５：θ５：θ６：θ６）中間値（θ５）に決定されてもよく、最頻値（θ５）に決定されてもよい。なお、分割数も９つに限られず、９つより少なくても多くてもよい。
【００６１】
領域毎に領域目標値を算出し、複数の領域目標値に対する統計的な処理により確からしい目標値を算出することで、画像データに他の画素データと比較して極端に高輝度又は低輝度を有する画素データが含まれる場合であっても、その影響を抑えて画像のコントラストを評価することができる。このため、球面収差が補正される設定値を正しく算出することができる。
【００６２】
また、図５のステップＳ１５（評価値算出処理）では、ステップＳ１３で取得した画像データ毎に、複数のシフト量を用いて単一のコントラスト値を算出する例を示した。しかしながら、ステップＳ１５では、複数の画像データから複数のシフト量を用いて複数のコントラスト値が算出されればよく、画像データの数と算出されるコントラストの数は一致しなくてもよい。
【００６３】
例えば、画像データ毎に、それぞれ異なるシフト量を用いて算出した複数のコントラスト値を算出してもよい。その場合、ステップＳ１８で、同じシフト量を用いて算出された複数の評価値と、それら複数の評価値に対応する複数の設定値と、に基づいて、そのシフト量における暫定的な目標値（以降、暫定目標値と記す）を算出し、各々が異なるシフト量における暫定目標値である、複数の暫定目標値から最終的な単一の目標値を算出してもよい。複数の暫定目標値から最終的な目標値を算出する処理は、例えば、複数の暫定目標値から最も確からしい値を選択する処理（例えば、中央値を選択する処理）であってもよく、複数の暫定目標値から確からしい値を算出する処理（例えば、平均値を算出する処理）であってもよい。
【００６４】
図１０は、顕微鏡システム１で行われる別の目標値算出処理のフローチャートである。図１１は、図１０に示す目標値算出処理について説明するための図である。図１０及び図１１を参照しながら、図１０に示す目標値算出処理について説明する。なお、図１０に示す目標値算出処理のステップＳ２１からステップＳ２５までの処理は、図５に示す目標値算出処理のステップＳ１１からステップＳ１５までの処理と同様であるので、詳細な説明は割愛する。
【００６５】
顕微鏡システム１は、ステップＳ２５で複数の評価値が算出されると、複数の画像データの座標情報に基づいて目標値を算出し（ステップＳ２６）、目標値算出処理を終了する。なお、画像データの座標情報とは、その画像データから算出された評価値とその評価値に対応する補正環１１１の設定値との組み合わせをいうものとする。
【００６６】
ステップＳ２６では、演算装置２０は、まず、ステップＳ２３で取得した複数の画像データから３つ以上の画像データを選択する。この３つ以上の画像データは、ステップＳ２５で算出した複数の評価値のうちの最大値が算出された画像データが含まれるように、選択される。
【００６７】
その後、演算装置２０は、選択した３つ以上の画像データの座標情報に基づいて目標値を算出する。具体的には、３つ以上の画像データの座標情報に基づいて、補間又は関数近似により関数を算出する。なお、この関数は、評価値と設定値に関する関数である。そして、算出した関数のピーク座標（評価値が最大となる座標）から得られる設定値が目標値として算出される。演算装置２０は、算出した目標値と観察対象面の位置の組み合わせを、記憶装置２５に記憶させる。
【００６８】
図１１には、最大の評価値が算出される画像データとその前後（つまり、設定値が近い）の画像データからなる３つの画像データを選択し、それらの画像データから得られる３つの座標情報からラグランジュ補間により二次関数を算出し、そのピーク座標から目標値を算出した例が示されている。なお、補間には、ラグランジュ補間、スプライン補間などの任意の補間法が採用され得る。また、関数近似にも、最小二乗法などの任意の近似法が採用され得る。
【００６９】
顕微鏡システム１は、図１０に示す目標値算出処理を実行することで、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。このため、画像のコントラストを適切に評価して目標値を算出することができる。即ち、球面収差が良好に補正される補正装置の設定を特定することができる。また、図５に示す目標値算出処理よりもさらに少ない画像データの取得回数で目標値を高精度に算出することができる。従って、図４に示す球面収差補正処理及び図１０に示す目標値算出処理を実行する顕微鏡システム１によれば、より短時間で球面収差を良好に補正することができる。
【００７０】
なお、図５に示す目標値算出処理と図１０に示す目標値算出処理を組み合わせて目標値を算出してもよい。例えば、図１０に示す目標値算出処理に図５のステップＳ１６及びステップＳ１７の処理を追加して、ステップＳ２６で算出した目標値が分布範囲に含まれるように、複数の設定値の分布範囲（即ち、探索範囲）及び平均間隔を徐々に狭めながら、目標値の算出を繰り返してもよい。これにより、目標値をより高い精度で算出することが可能となる。
【００７１】
図１２は、顕微鏡システム１で行われる更に別の目標値算出処理のフローチャートである。図１３は、目標値の信頼性と評価値の関係について説明するための図である。図１４Ａは、目標値を複数回算出したときの目標値の変化の様子を例示した図である。図１４Ｂは、第２の目標値を複数回算出したときの第２の目標値の変化の様子を例示した図である。図１２から図１４Ｂを参照しながら、図１２に示す目標値算出処理について説明する。なお、図１２に示す目標値算出処理のステップＳ３１からステップＳ３６までの処理は、図１０に示す目標値算出処理のステップＳ２１からステップＳ２６までの処理と同様であるので、詳細な説明は割愛する。
【００７２】
顕微鏡システム１は、ステップＳ３６で目標値が算出されると、目標値の信頼性の高低を判定済みか否かについて判定し（ステップＳ３７）、信頼性の高低を判定していない場合には、目標値の信頼性の高低を判定する（ステップＳ３８）。
【００７３】
図１３には、観察対象面の深さが１００μｍのときに取得した複数の画像データから算出した複数のコントラスト値（実測値）と、観察対象面の深さが６００μｍのときに取得した複数の画像データから算出した複数のコントラスト値（実測値）が、プロットされている。図１３に示すように、一般に観察対象面の位置が深くなるほど、球面収差が補正された状態での画像のコントラストは低下し、且つ、補正環の設定値の変更によるコントラストの変化も小さくなる。このため、球面収差が補正されている状態を正しく特定することが難しくなり、目標値の信頼性が低下する。
【００７４】
そこで、ステップＳ３８では、演算装置２０は、ステップＳ３５で算出した複数のコントラスト値に基づいて、ステップＳ３６で算出した目標値の信頼性の高低を判定する（ステップＳ３９）。より具体的には、演算装置２０は、例えば、複数のコントラスト値のうちの最大値のコントラスト値が所定の閾値以上であれば信頼性が高いと判定し、閾値未満であれば信頼性が低いと判定してもよい。また、演算装置２０は、観察対象面の深さに基づいて、目標値の信頼性の高低を判定してもよい。
【００７５】
顕微鏡システム１は、ステップＳ３９で信頼性が高いと判定された場合には、目標値算出処理を終了する。一方、ステップＳ３９で信頼性が低いと判定された場合には、複数の画像データを再度取得して、それらの画像データに基づいて目標値を再度算出する（ステップＳ３１からステップＳ３６）。これにより、顕微鏡システム１では、顕微鏡装置によって複数の画像データが複数回取得され、演算装置２０によって目標値が複数回算出される。
【００７６】
顕微鏡システム１は、ステップＳ３７で信頼性の高低を判定済みと判断すると、さらに、目標値を所定回数以上算出済みか否かを判定する（ステップＳ４０）。ここでは、演算装置２０は、例えば、予め決められた回数（例えば、３回）以上目標値を算出しているか否かを判定する。目標値の算出回数が予め決められた回数に達していないと判定されると、顕微鏡システム１は、複数の画像データを再度取得して、それらの画像データに基づいて目標値を再度算出する（ステップＳ３１からステップＳ３６）。
【００７７】
顕微鏡システム１は、ステップＳ４０で所定回数以上目標値を算出済みであると判断すると、複数の目標値に基づいて第２の目標値を算出し（ステップＳ４１）、目標値算出処理を終了する。ここでは、演算装置２０は、ステップＳ３６で算出した複数の目標値に基づいて、第２の目標値を算出する。第２の目標値を算出する処理は、例えば、複数の目標値から最も確からしい値を選択する処理（例えば、中央値を選択する処理）であってもよく、複数の目標値から確からしい値を算出する処理（例えば、平均値を算出する処理）であってもよい。
【００７８】
図１４Ａには、観察対象面の深さが１００μｍのときに算出された複数の目標値と、観察対象面の深さが６００μｍのときに算出された複数の目標値が、プロットされている。図１４Ｂには、観察対象面の深さが１００μｍのときに算出された複数の目標値を３つ毎に平均した第２の目標値と、観察対象面の深さが６００μｍのときに算出された複数の目標値を３つ毎に平均した第２の目標値と、がプロットされている。図１４Ａに示すように、画像のコントラストが低くなるサンプル深部（ここでは、深さ６００μｍの部位）では、目標値は、算出される度に比較的大きく変動する。しかしながら、図１４Ｂに示すように、平均化処理によって算出される第２の目標値では、算出される度に生じる変動幅が小さくなり、観察対象面の深さによらず、ほぼ一定の値を示している。つまり、第２の目標値を算出することで、データの信頼性が向上する。
【００７９】
顕微鏡システム１は、図１２に示す目標値算出処理を実行することで、サンプルや光学系の倍率などによらず、画像のコントラストの評価を安定して行うことができる。このため、画像のコントラストを適切に評価して目標値を算出することができる。即ち、球面収差が良好に補正される補正装置の設定を特定することができる。また、顕微鏡システム１は、画像のコントラストが低く目標値の信頼性が低い場合には、複数回目標値を算出し、より信頼性の高い第２の目標値を算出することができる。従って、図４に示す球面収差補正処理及び図１２に示す目標値算出処理を実行する顕微鏡システム１によれば、観察対象面の深さによらず、球面収差を良好に補正することができる。
【００８０】
なお、図１２では、目標値の信頼性の高低を判定して、第２の目標値を算出するか否かを決定する例を示したが、第２の目標値は、目標値の信頼性の高低を判定することなく算出されてもよい。また、図５に示す目標値算出処理と図１２に示す目標値算出処理を組み合わせて第２の目標値を算出してもよい。例えば、図５に示す目標値算出処理に図１２のステップＳ３７からステップＳ４１の処理を追加してもよい。
【００８１】
また、図１２では、複数の目標値から第２の目標値を算出することで、目標値（第２の目標値）の信頼性の向上を図る例を示したが、信頼性を向上させる方法はこの方法に限られない。複数の評価値を設定値毎に取得し、複数の評価値から第２の評価値を設定値毎に算出し、異なる設定値で算出された複数の第２の評価値から信頼性の高い目標値を算出してもよい。この場合、ステップＳ３６の処理を省略し、ステップＳ４１において、同じ設定値で取得した複数の評価値から、最も確からしい値を選択する処理（例えば、中央値を選択する処理）、又は、確からしい値を算出する処理（例えば、平均値を算出する処理）により、設定値毎に第２の評価値を算出してもよい。その上で、さらに、異なる設定値に対応する複数の第２の評価値から目標値を算出してもよい。なお、複数の第２の評価値から目標値を算出する処理は、例えば、ステップＳ３６と同様の処理に、座標情報に基づく処理であってもよい。このような方法でも、複数の画像データの情報から目標値が算出されるため、目標値の信頼性が向上することができる。
【００８２】
図１５は、顕微鏡システム１で行われる屈折率表示処理のフローチャートである。図１６は、顕微鏡システム１で行われる屈折率算出処理のフローチャートである。図１７は、変化率と屈折率の関係を示した図である。以下、図１５から図１７を参照しながら、サンプルＳの任意の部位の屈折率を算出して、その屈折率に関する情報（以降、屈折率情報と記す。）を表示する屈折率表示処理について説明する。
【００８３】
顕微鏡システム１は、まず、球面収差を補正する（ステップＳ５１）。ここでは、顕微鏡システム１は、図４に示す球面収差補正処理を行って、顕微鏡装置で発生する球面収差を補正する。球面収差補正処理を終了すると、顕微鏡システム１は、サンプルＳの二次元画像データを取得する（ステップＳ５２）。ここでは、顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。さらに、顕微鏡システム１は、屈折率を算出する（ステップＳ５３）。ここでは、演算装置２０が、図１６に示す屈折率算出処理を実行して、サンプルＳの現在の観察対象面における屈折率を算出する。
【００８４】
具体的には、まず、演算装置２０は、観察対象面の位置の情報を取得する（ステップＳ６１）。演算装置２０は、例えば、図４のステップＳ１で受信した観察対象面の深さ情報を取得する。次に、演算装置２０は、複数の目標値を取得する（ステップＳ６２）。演算装置２０は、例えば、現在の観察対象面近傍の２つの深さ位置に観察対象面を移動させて、それぞれの位置で目標値を算出することで、２つの目標値と２つの深さ情報を取得する。また、現在の観察対象面における目標値と深さ情報は既知であるので、現在の観察対象面近傍の１つの深さ位置に観察対象面を移動させて、その位置で目標値を算出することで、２つの目標値と２つの深さ情報を取得してもよい。
【００８５】
その後、演算装置２０は、複数の目標値に基づいて、現在の観察対象面の位置における、光軸方向へ観察対象面の移動量（観察対象面の位置の変化量）と目標値の変化量との関係を算出する（ステップＳ６３）。演算装置２０は、例えば、ステップＳ６２で取得した２つの目標値の差分（目標値の変化量Δθ）に対する、ステップＳ６２で取得した２つの深さ情報の差分（観察対象面の移動量ΔＤ）の比を算出する。
【００８６】
そして、最後に、演算装置２０は、ステップＳ６３で算出した関係に基づいて、現在の観察対象面の位置におけるサンプルＳの屈折率を算出する（ステップＳ６４）。演算装置２０は、例えば、記憶装置２５に記憶されている図１７に示す変化率と屈折率との関数Ｆに基づいて、ステップＳ６３で算出した関係（変化率）から屈折率を算出する。なお、変化率と屈折率の関数Ｆは、対物レンズ毎に異なるため、記憶装置２５には、対物レンズ毎の変化率と屈折率の関数Ｆが記憶されていることが望ましい。また、記憶装置２５には、関数Ｆの代わりに、変化率と屈折率の関係を示すデータが記憶されていてもよい。
【００８７】
屈折率が算出されて図１６に示す処理が終了すると、顕微鏡システム１は、二次元画像上に屈折率情報を表示する（ステップＳ５４）。ここでは、演算装置２０は、サンプルＳの屈折率に関する情報をステップＳ５２で取得した二次元画像と関連付けて表示装置３０に表示させる。
【００８８】
以上のように、本実施例に係る顕微鏡システム１によれば、利用者は、サンプルを観察しながら、それと同時に観察対象面の屈折率を把握することができる。また、サンプルが、屈折率の異なる複数の層からなる積層構造物など、複雑な屈折率分布を有するものであっても、そのサンプルの構造によらず、任意の部位の屈折率を正確に算出することができる。この点については、後に詳述する。さらに、サンプルをスライスすることなくサンプルの深部の屈折率を算出することができるため、in vivoでの生体サンプルの屈折率の測定が可能となる。
【００８９】
図１８は、屈折率の算出方法について説明するための図である。図１８を参照しながら、サンプルの構造によらず、サンプル内の任意の部位の屈折率を正確に算出することができることについて、より詳細に説明する。
【００９０】
以降、図１８に示すように、観察対象面が、対物レンズ１１０から３層目の、屈折率ｎ３を有する媒質からなる第３層内に位置する場合を例に説明する。なお、対物レンズ１１０に隣接する屈折率ｎ１を有する媒質からなる第１層は、例えば、空気や浸液であり、屈折率ｎ２を有する媒質からなる第２層と屈折率ｎ３を有する媒質からなる第３層は、例えば、生体サンプルである。
【００９１】
対物レンズ１１０からの光線Ｒの、第１層と第２層との界面ＩＦ１への入射角をθ１、界面ＩＦ１からの出射角をθ２、第２層と第３層との界面ＩＦ２からの出射角をθ３とすると、スネルの法則から、以下の式（３）が導かれる。
【数３】
0006562547.tif 000004
【００９２】
さらに、図１８から幾何学的に次の関係も導かれる。なお、Ｄは第２層の厚さである。
【数４】
0006562547.tif 000005
【００９３】
これらの関係から、δは、下式（４）で表わされる。
【数５】
0006562547.tif 000006
【００９４】
さらに、図１８から幾何学的に次の関係も導かれる。
【数６】
0006562547.tif 000007
【００９５】
この関係から、ｄ２は、下式（５）で表わされる。
【数７】
0006562547.tif 000008
さらに、式（５）を用いて、式（４）を変形すると、式（６）が導かれる。
【数８】
0006562547.tif 000009
【００９６】
ここで、式（３）から次の関係が導かれる。
【数９】
0006562547.tif 000010
【００９７】
この関係を用いて、式（６）を変形すると、式（７）が導かれる。
【数１０】
0006562547.tif 000011
【００９８】
Ｄ＝０のときには、δは第２層のパラメータに依存しない。また、式（７）は、θ１＝０のときには、δは、屈折率差（屈折率比）のみに依存する。θ１＝０のときのδである近軸移動量δ０は、式（８）で表わされる。
【数１１】
0006562547.tif 000012
【００９９】
光線Ｒに生じる球面収差量Δは、δとδ０の差分である。このため、式（７）と式（８）から式（９）が導かれる。なお、顕微鏡装置で生じる球面収差量は、式（９）をθ１について０から対物レンズ１１０のＮＡで定まる最大入射角度θＭＡＸまで積分することで、算出される。
【数１２】
0006562547.tif 000013
【０１００】
さらに、式（９）をｄ１で微分することで、式（１０）が導かれる。式（１０）は、観察対象面の深さ変化量あたりの球面収差量の変化量で定義される、球面収差量の変化率を表わしている。
【数１３】
0006562547.tif 000014
【０１０１】
式（１０）には、第２層のパラメータが含まれない。このことから、球面収差量の変化率は、第１層と観察対象面を含む第３層に依存し、中間層である第２層には影響しないことがわかる。さらに、θ１は積分変数であり、ｎ１は対物レンズ１１０とサンプルＳの間の媒質の屈折率であって、一般に対物レンズ１１０によって定まる。これらを考慮すると、球面収差量の変化率を特定することで、式（１０）を用いて観察対象面を含む第３層の屈折率ｎ３を算出し得ることがわかる。従って、球面収差量の変化率を特定することで、サンプルの構造によらず、任意の部位の屈折率を正確に算出することができる。
【０１０２】
顕微鏡システム１では、球面収差量の変化率を直接算出する代わりに、補正環１１１の目標値の変化率（観察対象面の移動量と目標値の変化量の関係）を算出している。対物レンズが定まると目標値と球面収差量の関係は既知であり、球面収差の変化率を目標値の変化率に変換することができる。このため、目標値の変化率から屈折率を算出する顕微鏡システム１でも、サンプルの構造によらず、任意の部位の屈折率を正確に算出することができる。
【実施例２】
【０１０３】
図１９は、本実施例に係る顕微鏡２００の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、顕微鏡１００の代わりに顕微鏡２００を含む点が図１に示す顕微鏡システム１と異なっている。その他の点については、顕微鏡システム１と同様であるので、同一の構成要素については同一の符号で参照する。
【０１０４】
顕微鏡２００は、共焦点顕微鏡である。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。顕微鏡２００は、図１９に示すように、照明光路上に、レーザー２０１と、ビームエクスパンダ２０２と、ダイクロイックミラー２０３と、走査ユニット２０４と、瞳投影光学系２０５と、対物レンズ１１０とを備えている。なお、対物レンズ１１０、対物レンズ１１０を光軸方向に移動させるＺ駆動部１０９、対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である補正環１１１については、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。
【０１０５】
レーザー２０１は、例えば、可視域や紫外域、赤外域のレーザー光を発振する。レーザー２０１から発振されるレーザーの出力は、光源制御装置１１によって制御される。ビームエクスパンダ２０２は、レーザー２０１からのレーザー光（コリメート光）の光束を対物レンズ１１１の瞳径に応じて調整する光学系である。ダイクロイックミラー２０３は、励起光（レーザ光）とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長によりレーザー光と蛍光を分離する。
【０１０６】
走査ユニット２０４は、レーザー光でサンプルＳを２次元に走査するための走査手段であり、例えば、ガルバノスキャナやレゾナントスキャナなどを含んでいる。走査ユニット２０４の走査範囲が変化することでズーム倍率が変化する。走査ユニット２０４の走査範囲は、ズーム制御装置１２によって制御される。瞳投影光学系２０５は、走査ユニット２０４を対物レンズ１１０の瞳位置に投影する光学系である。
【０１０７】
顕微鏡２００は、さらに、検出光路（ダイクロイックミラー２０３の透過光路）上に、ミラー２０６と、共焦点レンズ２０７と、共焦点絞り２０８と、集光レンズ２０９と、光検出器２１０とを備えている。光検出器２１０から出力された信号は、Ａ／Ｄ変換器２１１に出力される。
【０１０８】
共焦点レンズ２０７は、共焦点絞り２０８上に、蛍光を集光するレンズである。共焦点絞り２０８は、対物レンズ１１０の焦点面と光学的に共役な位置に配置された絞りである。共焦点絞り２０８には、対物レンズ１１０の焦点位置から生じた蛍光を透過させるピンホールが形成されている。集光レンズ２０９は、共焦点絞り２０８を通過した蛍光を光検出器２１０に導くレンズである。
【０１０９】
光検出器２１０は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、入射した蛍光の光量に応じたアナログ信号を出力する。Ａ／Ｄ変換器２１１は、光検出器２１０からのアナログ信号をデジタル信号（輝度信号）に変換して、演算装置２０に出力する。
【０１１０】
以上のように構成された本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡２００は、走査ユニット２０４を用いてレーザー光でサンプルＳを走査して、サンプルＳの各位置からの蛍光を光検出器２１０で検出する。そして、演算装置２０は、光検出器２１０からの信号を変換したデジタル信号（輝度信号）と走査ユニット２０４の走査情報とに基づいて、画像データを生成する。即ち、本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡２００と演算装置２０により構成される顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。
【０１１１】
本実施例に係る顕微鏡システムでは、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様の処理を行うことができる。このため、画像のコントラストを適切に評価して目標値を算出することが可能であり、短時間で球面収差を良好に補正することができる。また、サンプル内の任意の部位の屈折率を算出することもできる。
【実施例３】
【０１１２】
図２０は、本実施例に係る顕微鏡３００の構成を例示した図である。なお、本実施例に係る顕微鏡システムは、顕微鏡１００の代わりに顕微鏡３００を含む点が図１に示す顕微鏡システム１と異なっている。その他の点については、顕微鏡システム１と同様であるので、同一の構成要素については同一の符号で参照する。
【０１１３】
顕微鏡３００は、走査型ではない通常の蛍光顕微鏡である。なお、顕微鏡３００は、ズーム機能を備えているため、ズーム顕微鏡とも呼ばれる。サンプルＳは、例えば、マウスの脳などの生体試料である。顕微鏡３００は、図２０に示すように、照明光路上に、光源３０２を内蔵したランプハウス３０１と、コレクタレンズ３０３と、蛍光キューブ３０４と、ズームレンズ３０５と、対物レンズ１１０とを備えている。なお、対物レンズ１１０、対物レンズ１１０を光軸方向に移動させるＺ駆動部１０９、対物レンズ１１０内のレンズを移動させて球面収差を補正する補正装置である補正環１１１については、実施例１に係る顕微鏡１００と同様である。
【０１１４】
光源３０２は、例えば、ＬＥＤ光源、高出力の水銀ランプなどである。なお、光源３０２の出力は、光源制御装置１１によって制御される。コレクタレンズ３０３は、光源３０２からの励起光をコリメートする。蛍光キューブ３０４は、図示しないダイクロイックミラーと励起フィルタと吸収フィルタとを備えている。蛍光キューブ３０４は、励起光とサンプルＳからの検出光（蛍光）とを分離する光分離手段であり、波長により励起光と蛍光を分離する。
【０１１５】
ズームレンズ３０５は、ズームレンズ３０５を構成するレンズ間の距離が変化するように構成されている。ズーム制御装置１２がレンズ間の距離を図示しないモータ等によって変化させることでズーム倍率が変化する。即ち、ズームレンズ３０５は、ズーム制御装置１２によって制御される。
【０１１６】
顕微鏡３００は、さらに、検出光路（蛍光キューブ３０４の透過光路）上に、結像レンズ３０６と、撮像装置３０７を備えている。結像レンズ３０６は、対物レンズ１１０及びズームレンズ３０５を介して入射する蛍光を撮像装置３０７上に集光させて、サンプルＳの光学像を形成する。撮像装置３０７は、例えば、ＣＣＤカメラであり、サンプルＳの光学像を撮像してサンプルＳの画像データを生成する。撮像装置３０７は、生成した画像データを演算装置２０に出力する。本実施例に係る顕微鏡システムでは、顕微鏡３００である顕微鏡装置が、サンプルＳの画像データを取得する。
【０１１７】
本実施例に係る顕微鏡システムでは、実施例１に係る顕微鏡システム１と同様の処理を行うことができる。このため、画像のコントラストを適切に評価して目標値を算出することが可能であり、短時間で球面収差を良好に補正することができる。また、サンプル内の任意の部位の屈折率を算出することもできる。
【０１１８】
上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。顕微鏡システム、算出方法及びプログラムは、特許請求の範囲により規定される範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。この明細書で説明される個別の実施例の文脈におけるいくつかの特徴を組み合わせて単一の実施例としてもよい。
【０１１９】
Ｚ制御装置１３がＺ駆動部１０９を制御して観察対象面の位置を変化させる構成を例示したが、Ｚ制御装置１３は、顕微鏡のステージを光軸方向に移動させることにより観察対象面の位置を変化させてもよい。
【０１２０】
また、観察対象面の深さによって変化する球面収差を補正する補正装置として補正環１１１を例示したが、補正装置は、光路上で生じる球面収差の量を変化させることができるものであればよい。補正装置は、例えば、ＬＣＯＳ（Liquid crystal on silicon、商標）、ＤＦＭ（Deformable Mirror）、液体レンズなどを用いた装置であってもよい。また、発生する球面収差量が大きく単一の補正装置では十分に球面収差を補正しきれない場合には、補正する球面収差量を複数の補正装置で分担して、観察対象面で生じる球面収差を補正してもよい。
【０１２１】
また、画素分解能が光学分解能よりも大きい、即ち、画素分解能から算出されるピクセルサイズが光学的に識別し得る２点間の距離よりも大きい場合には、発生した球面収差が画像データに十分に反映していない可能性がある。このような場合には、発生した球面収差を画像データ、ひいては評価値に正しく反映させるため、画素分解能が光学分解能よりも小さくなるように、ズーム倍率を高くした状態で目標値算出処理を実行してもよい。これにより、観察対象面に生じた球面収差をより高い精度で補正する設定値を算出することが可能となる。
【０１２２】
また、評価値を算出する方法として、設定値毎に１枚の画像データを取得し、取得した画像データ毎に評価値を算出する例を示したが、設定値毎に複数の画像データを取得して、カルマンフィルタ等を用いて複数の画像データから評価値を算出してもよい。このような方法によれば、画像データの各々に含まれるノイズ成分を設定値毎の複数の画像データを用いて相殺させることができるため、より精度の高い評価値を算出することができる。
【符号の説明】
【０１２３】
１                        顕微鏡システム
１０                      顕微鏡制御装置
１１                      光源制御装置
１２                      ズーム制御装置
１３                      Ｚ制御装置
１４                      補正環制御装置
２０                      演算装置
３０                      表示装置
４０                      キーボード
５０                      補正環操作装置
６０                      Ｚ駆動部操作装置
１００、２００、３００    顕微鏡
１０１、２０１            レーザー
１０２、２０４            走査ユニット
１０３、１０６、２０５    瞳投影光学系
１０４、２０６            ミラー
１０５、２０３            ダイクロイックミラー
１０７、２１０            光検出器
１０８、２１１            Ａ／Ｄ変換器
１０９                    Ｚ駆動部
１１０                    対物レンズ
１１１                    補正環
２０２                    ビームエクスパンダ
２０７                    共焦点レンズ
２０８                    共焦点絞り
２０９                    集光レンズ
３０１                    ランプハウス
３０２                    光源
３０３                    コレクタレンズ
３０４                    蛍光キューブ
３０５                    ズームレンズ
３０６                    結像レンズ
３０７                    撮像装置
Ｓ                        サンプル
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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