(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集塊を構成する細胞の少なくとも一部を、少なくとも１つの蛍光または発光を生じさせる化学物質で標識する標識ステップと、
該標識ステップにおいて標識された前記細胞の複数枚のスライス画像を前記細胞集塊の少なくとも一部に対して取得する撮影ステップと、
該撮影ステップにより取得された複数枚のスライス画像に基づいて前記細胞の特性を評価する評価ステップと、
前記撮影ステップにより取得された複数枚のスライス画像を画像処理して前記細胞集塊の少なくとも一部の３次元の画像を構築する３次元画像構築ステップと、
該３次元画像構築ステップにより構築された前記細胞集塊の３次元の画像から、該細胞集塊の３次元座標上の重心位置を決定する重心決定ステップと、
該重心決定ステップにより決定された前記重心位置からの距離に対して、前記評価ステップにより得られた評価結果を整理する整理ステップとを含む細胞評価方法。
【請求項２】
前記整理ステップが、前記重心決定ステップにより決定された前記重心位置からの重力方向の距離に対して、前記評価結果を整理する請求項１に記載の細胞評価方法。
【請求項３】
前記整理ステップが、前記重心決定ステップにより決定された前記重心位置からの距離に応じて複数領域に分割し、各前記領域内に存在する複数の前記細胞の前記評価結果を各前記領域毎に整理する請求項１に記載の細胞評価方法。
【請求項４】
前記評価ステップが、各前記細胞内に検出される構成要素から発せられる光量を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項５】
前記評価ステップが、各前記細胞内に検出される構成要素の数を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項６】
前記評価ステップが、各前記細胞内に検出される構成要素の密度を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項７】
前記構成要素が、細胞核である請求項４から請求項６のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項８】
前記標識ステップが、細胞核を特異的に標識可能な第１の化学物質および、死細胞の細胞核を特異的に標識可能な前記第１の化学物質とは発生する光の波長の異なる第２の化学物質を用いて前記細胞核を標識し、
前記評価ステップが、死細胞の割合を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項９】
前記標識ステップが、細胞周期に応じて蛍光波長が変化する蛍光タンパクにより細胞を標識し、
前記評価ステップが、細胞周期の割合を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項１０】
各前記細胞内に検出される構成要素が、細胞質である請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項１１】
前記標識ステップが、細胞核を特異的に標識可能な化学物質を用いて前記細胞核を標識し、
前記評価ステップが、３次元画像構築ステップにより取得された細胞核および小核の３次元画像から所定の閾値より小さい体積を有する前記小核のみを抽出し、該小核の発生率を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項１２】
前記標識ステップが、細胞核を特異的に標識可能な化学物質を用いて前記細胞核を標識し、
前記評価ステップが、３次元画像構築ステップにより取得された断片化された細胞核の３次元画像から所定の閾値より小さい体積を有する断片化された前記細胞核を抽出し、該細胞核の断片化の割合を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項１３】
前記標識ステップが、細胞膜を特異的に標識可能な化学物質を用いて前記細胞膜を標識し、
前記評価ステップが、３次元画像構築ステップにより取得された前記細胞膜の３次元が像から、前記細胞膜内の内容積を演算することにより前記細胞の体積を評価する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項１４】
前記重心決定ステップが、前記細胞集塊全体のスライス画像の面積が最大となる画像に基づいて前記重心位置を決定する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【請求項１５】
前記重心決定ステップが、各前記細胞の構成要素の３次元の画像の分布に基づいて前記細胞集塊の前記重心位置を推定する請求項１から請求項３のいずれかに記載の細胞評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞評価方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、より生体内に近い環境における医薬品の効用を調べるために、細胞を立体的に培養する３次元培養が行われている。このような３次元培養において、複数の細胞が立体的に集合した細胞集塊の培養状態を観察するために、細胞集塊を含む画像から細胞集塊の体積を推定する処理の精度を向上させるキャリブレーション方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１４−１４９２３５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、特許文献１の技術は、細胞集塊全体の解析を行うため、細胞集塊を構成する個々の細胞の解析については考慮されていない。細胞ベースの研究や薬剤スクリーニングでは、細胞集塊を構成する個々の細胞の反応を定量化する必要がある。特に、細胞集塊を構成している細胞の内、内側の細胞と外側の細胞とでは反応が異なるため、細胞集塊全体の解析では、個々の細胞の解析を行うことができないという問題がある。
【０００５】
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、より生体内に近い細胞集塊の状態で培養されている細胞を細胞集塊内の位置に関連づけて評価することができる細胞評価方法を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、細胞集塊を構成する細胞の少なくとも一部を、少なくとも１つの蛍光または発光を生じさせる化学物質で標識する標識ステップと、該標識ステップにおいて標識された前記細胞の複数枚のスライス画像を前記細胞集塊の少なくとも一部に対して取得する撮影ステップと、該撮影ステップにより取得された複数枚のスライス画像に基づいて前記細胞の特性を評価する評価ステップと、前記撮影ステップにより取得された複数枚のスライス画像を画像処理して前記細胞集塊の少なくとも一部の３次元の画像を構築する３次元画像構築ステップと、該３次元画像構築ステップにより構築された前記細胞集塊の３次元の画像から、該細胞集塊の３次元座標上の重心位置を決定する重心決定ステップと、該重心決定ステップにより決定された前記重心位置からの距離に対して、前記評価ステップにより得られた評価結果を整理する整理ステップとを含む細胞評価方法を提供する。
【０００７】
本態様によれば、標識ステップにおいて細胞の少なくとも一部が化学物質で標識された細胞集塊の少なくとも一部に対して、撮影ステップにおいて細胞の複数枚のスライス画像が取得され、取得されたスライス画像に基づいて評価ステップにおいて細胞の特性が評価される。また、３次元画像構築ステップにおいて、複数枚のスライス画像が画像処理されることにより３次元の画像が構築され、重心決定ステップにおいて細胞集塊の重心位置が決定される。そして、整理ステップにおいて、評価ステップによる特性の評価結果が重心位置からの距離に対して整理される。これにより、より生体内に近い細胞集塊の状態で培養されている細胞を細胞集塊内の位置に関連づけて評価することができる。
【０００８】
上記態様においては、前記整理ステップが、前記重心決定ステップにより決定された前記重心位置からの重力方向の距離に対して、前記評価結果を整理してもよい。
このようにすることで、細胞集塊内に存在する各細胞の重力方向の位置による評価の相違を評価することができる。
【０００９】
また、上記態様においては、前記整理ステップが、前記重心決定ステップにより決定された前記重心位置からの距離に応じて複数領域に分割し、各前記領域内に存在する複数の前記細胞の前記評価結果を各前記領域毎に整理してもよい。
このようにすることで、外部の環境に接触している細胞集塊の外側の領域と外部の環境に接触していない内側の領域とに分けて各細胞を評価することができる。
【００１０】
また、上記態様においては、前記評価ステップが、各前記細胞から発せられる光量を評価してもよい。
このようにすることで、光量の違いにより、細胞集塊内の位置による細胞の特性の違いを評価することができる。
【００１１】
また、上記態様においては、前記評価ステップが、各前記細胞内に検出される構成要素の数を評価してもよい。
また、上記態様においては、前記評価ステップが、各前記細胞内に検出される構成要素の密度を評価してもよい。
【００１２】
また、上記態様においては、前記構成要素が、細胞核であってもよい。
また、上記態様においては、前記標識ステップが、細胞核を特異的に標識可能な第１の化学物質および、死細胞の細胞核を特異的に標識可能な前記第１の化学物質とは発生する光の波長の異なる第２の化学物質を用いて前記細胞核を標識し、前記評価ステップが、死細胞の割合を評価してもよい。
【００１３】
また、上記態様においては、前記標識ステップが、細胞周期に応じて蛍光波長が変化する蛍光タンパクにより細胞を標識し、前記評価ステップが、細胞周期の割合を評価してもよい。
また、上記態様においては、各前記細胞内に検出される構成要素が、細胞質であってもよい。
【００１４】
また、上記態様においては、前記標識ステップが、細胞核を特異的に標識可能な化学物質を用いて前記細胞核を標識し、前記評価ステップが、３次元画像構築ステップにより取得された細胞核および小核の３次元画像から所定の閾値より小さい体積を有する前記小核のみを抽出し、該小核の発生率を評価してもよい。
【００１５】
また、上記態様においては、前記標識ステップが、細胞核を特異的に標識可能な化学物質を用いて前記細胞核を標識し、前記評価ステップが、３次元画像構築ステップにより取得された断片化された細胞核の３次元画像から所定の閾値より小さい体積を有する断片化された前記細胞核を抽出し、該細胞核の断片化の割合を評価してもよい。
【００１６】
また、上記態様においては、前記標識ステップが、細胞膜を特異的に標識可能な化学物質を用いて前記細胞膜を標識し、前記評価ステップが、３次元画像構築ステップにより取得された前記細胞膜の３次元画像から、前記細胞膜内の内容積を演算することにより前記細胞の体積を評価してもよい。
【００１７】
また、上記態様においては、前記重心決定ステップが、前記細胞集塊全体のスライス画像の面積が最大となる画像に基づいて前記重心位置を決定してもよい。
また、上記態様においては、前記重心決定ステップが、各前記細胞の構成要素の３次元の画像の分布に基づいて前記細胞集塊の前記重心位置を推定してもよい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、より生体内に近い細胞集塊の状態で培養されている細胞を細胞集塊内の位置に関連づけて評価することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明の一実施形態に係る細胞評価方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の細胞評価方法を実施するために使用される顕微鏡システムを示す図である。
【図３】図１の細胞評価方法の３次元画像構築ステップにより構築された細胞集塊の３次元画像の一例を示す図である。
【図４】図１の細胞評価方法の重心決定ステップによる細胞集塊の重心の決定方法を説明する図である。
【図５】図１の細胞評価方法により構築された細胞集塊の３次元画像の断面を模式的に示す図である。
【図６】図１の細胞評価方法による評価結果の一例を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明の一実施形態に係る細胞評価方法について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る細胞評価方法は、図１に示されるように、細胞集塊Ｘを構成する細胞Ｙを化学物質で標識する標識ステップＳ１と、標識された細胞Ｙの複数枚のスライス画像を取得する撮影ステップＳ２と、取得された複数枚のスライス画像に基づいて細胞Ｙの特性を評価する評価ステップＳ３と、複数枚のスライス画像から細胞集塊Ｘの３次元画像を構築する３次元画像構築ステップＳ４と、構築された３次元画像から細胞集塊Ｘの重心位置Ｏを決定する重心決定ステップＳ５と、決定された重心位置Ｏからの距離との関係で評価結果を整理する整理ステップＳ６とを含んでいる。
【００２１】
本実施形態に係る細胞評価方法は、以下の顕微鏡システム１により実施される。
顕微鏡システム１は、図２に示されるように、照射光を発生する光源２と、照射光を照射して細胞集塊Ｘを撮影する顕微鏡３と、取得されたスライス画像を処理する画像処理部４と、処理された結果を表示するモニタ５とを備えている。
【００２２】
標識ステップＳ１は、蛍光色素あるいは蛍光タンパク等の化学物質を細胞集塊Ｘに供給することにより、細胞核、細胞膜、ミトコンドリア等の特定の器官、ＤＮＡ／ＲＮＡ等を標識するようになっている。
細胞集塊Ｘは、細胞Ｙの集合・塊であって、３次元構造を有するものを意味し、スフェロイド、スフェア、コロニー、ＥＢ（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）、オルガノイド等を挙げることができる。
【００２３】
撮影ステップＳ２は、図２に示されるように、細胞集塊Ｘからなる試料のスライス画像を取得する顕微鏡３により実施される。
顕微鏡３は、図２に示されるように、例えば、レーザ走査型共焦点顕微鏡であって、試料を収容した容器６を搭載して、３次元的に移動させるステージ７と、該ステージ７の上方に配置された対物レンズ８とを備えている。容器６としては、例えば、マルチウェル、ディッシュ、スライド等の顕微鏡観察用容器の他、他の特殊な容器を採用してもよい。
【００２４】
撮影ステップＳ２においては、ステージ７を対物レンズ８に対して３次元的に移動させることによって、対物レンズ８の焦点位置に対して細胞集塊Ｘを３次元的に移動させながら、各位置においてレーザ光を走査させ、焦点位置に配置されている細胞Ｙのスライス画像を取得することにより、各細胞Ｙについて複数枚のスライス画像を取得するようになっている。
【００２５】
評価ステップＳ３、３次元画像構築ステップＳ４、重心決定ステップＳ５および整理ステップＳ６は、画像処理部４により実施される。
評価ステップＳ３は、撮影ステップＳ２において取得されたスライス画像に基づいて、標識ステップＳ１において供給された化学物質の種類に応じた細胞Ｙの特性評価が行われる。例えば、免疫染色の場合には、細胞Ｙが特定の蛍光色素に染まっているか否かが評価され、ＧＦＰのような蛍光タンパクが供給される場合には細胞Ｙが特定の反応をしているか否かが評価され、Ｆｕｃｃｉのようなインジケータが供給された場合には、細胞Ｙが細胞周期のいずれの周期に位置しているのかが評価される。
【００２６】
３次元画像構築ステップＳ４は、撮影ステップＳ２において取得された各細胞Ｙの複数枚のスライス画像を画像処理することにより、図３に示されるような細胞集塊Ｘ全体の３次元画像を構築する。
重心決定ステップＳ５は、例えば、図４に示されるように、３次元画像構築ステップＳ４において構築された細胞集塊Ｘ全体の３次元画像を特定方向の平面Ｐに沿ってスライスした横断面Ａを比較することにより、面積が最大となる横断面Ａを抽出し、該横断面Ａの重心位置Ｏを求めることにより決定される。
【００２７】
整理ステップＳ６は、重心決定ステップＳ５において決定された重心位置Ｏからの距離によって評価ステップＳ３において行われた特性評価の結果を整理するようになっている。
すなわち、図５に示されるように、細胞集塊Ｘの断面をとると、重心位置Ｏ近傍の内側領域Ｌ、その外側の中間領域Ｍ、さらにその外側の外側領域Ｎとで化学物質に対する反応が相違する場合がある。例えば、細胞集塊Ｘの重心Ｏ近傍に近づくほど外部環境との接触が周囲の細胞Ｙによって遮断されることによって例えば低酸素状態となり、細胞分裂しにくくなる。
【００２８】
整理ステップＳ６においては、重心位置Ｏからの距離に応じて細胞集塊Ｘ内の領域Ｌ，Ｍ，Ｎを分割し、細胞Ｙの特性を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に整理するようになっている。例えば、細胞Ｙの特性に応じて異なる色（緑色と赤色等）の蛍光を発生するような化学物質を投与し、評価ステップＳ３において各細胞Ｙの色を評価し、整理ステップＳ６においては、内側領域Ｌおよび外側領域Ｎにおける赤色の細胞Ｙと緑色の細胞Ｙの個数の比率を算出し、図６に示されるように、領域Ｌ，Ｎ毎にグラフ化するようになっている。
【００２９】
このように構成された本実施形態に係る細胞評価方法によれば、細胞集塊Ｘを全体として評価するのではなく、細胞集塊Ｘを構成する個々の細胞Ｙの特性を細胞集塊Ｘ内の位置に応じて評価することができるという利点がある。細胞集塊Ｘは、それ自体、より生体内の状態の近い状態で存在する細胞Ｙの集合であり、細胞Ｙ単体を培養する方法や、細胞Ｙを容器６に接着させて培養する方法と比較して、臨床評価に近い評価を精度よく得ることができる。
【００３０】
したがって、本実施形態に係る細胞評価方法によれば、細胞Ｙベースの研究や薬剤スクリーニングに際し、個々の細胞Ｙの特性変化を生体内の状態に近い状態で定量的に評価することができるという利点がある。
【００３１】
なお、本実施形態においては、細胞集塊Ｘの重心位置Ｏからの距離によって細胞Ｙの特性評価の結果を整理することとしたが、これに代えて、重心位置Ｏからの重力方向の距離によって整理することにしてもよい。
例えば、薬剤スクリーニングによって細胞集塊Ｘに薬剤が供給される場合、下方の細胞Ｙほど重力の影響を受けるため、重力方向の距離に応じて評価結果を整理することにより、薬剤の効用を精度よく評価することができる。
【００３２】
また、本実施形態においては、化学物質を細胞集塊Ｘに供給する例を説明したが、これに代えて、発光を生じさせる薬剤を用いて標識ステップＳ１を行うことにしてもよい。
また、本実施形態においては、レーザ走査型共焦点顕微鏡を用いた例を説明したが、これに代えて、レーザ走査型多光子励起顕微鏡あるいはライトシート顕微鏡等、細胞集塊Ｘを構成する細胞Ｙのスライス画像を取得可能な任意の顕微鏡を用いて撮影ステップＳ２を行うことにしてもよい。
【００３３】
また、本実施形態においては、細胞集塊Ｘの３次元画像から特定方向の横断面積が最も大きくなる断面Ａの重心位置Ｏから細胞集塊Ｘの重心位置Ｏを求めることとしたが、これに代えて、細胞集塊Ｘを構成している各細胞Ｙの位置から推定してもよい。
また、本実施形態においては、各細胞Ｙの色を評価することとしたが、これに代えて、各細胞核の蛍光量を評価してもよい。
【００３４】
また、本実施形態においては、細胞集塊Ｘを構成する細胞Ｙを抽出することとしたが、これに代えて、細胞核の数を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に集計してもよいし、細胞Ｙの密度を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に算出してもよい。また、細胞核に代えて細胞質を用いてもよい。また、細胞核に特異的に標識する第１の化学物質と、死細胞の細胞核に特異的に標識する第２の化学物質を細胞集塊Ｘに供給し、死細胞の割合を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に評価することにしてもよい。
【００３５】
また、細胞周期によって蛍光波長が変化する蛍光タンパクを細胞集塊Ｘに供給して発現させ、細胞周期の状態に応じて発色する蛍光波長によって、細胞周期の割合を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に評価することにしてもよい。
また、細胞核および小核に特異的に標識する化学物質を供給し、取得されたスライス画像から細胞核および小核の３次元画像を構築し、所定の閾値より小さい体積を有する小核のみを抽出して、小核の発生割合を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に評価することにしてもよい。
【００３６】
また、断片化された細胞核を体積によって抽出し、細胞核の断片化の割合を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に評価することにしてもよい。
また、細胞膜に特異的に標識する化学物質を供給し、細胞膜の３次元画像を構築し、細胞膜内の容積を演算によって求めることにより、細胞Ｙの体積を領域Ｌ，Ｍ，Ｎ毎に評価することにしてもよい。
【符号の説明】
【００３７】
Ｓ１  標識ステップ
Ｓ２  撮影ステップ
Ｓ３  評価ステップ
Ｓ４  ３次元画像構築ステップ
Ｓ５  重心決定ステップ
Ｓ６  整理ステップ
Ｌ  内側領域（領域）
Ｍ  中間領域（領域）
Ｎ  外側領域（領域）
Ｏ  重心位置
Ｘ  細胞集塊
Ｙ  細胞
【図１】
0006622007.tif 000002
【図２】
0006622007.tif 000003
【図３】
0006622007.tif 000004
【図４】
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【図５】
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【図６】
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