(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
上下に配置され、かつ２つの側面を有する１つの多孔性第１膜（１１．１）によって互いに分離される第１ウェル（２．１）および第２ウェル（２．２）を有する、細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイスのための半製品であって、
前記第１ウェル（２．１）は、１つのベースプレート（１）の上側に形成され、前記第２ウェル（２．２）は、前記ベースプレート（１）の下側に形成され、
第２壁（２．１．２）が、前記第１膜（１１．１）の側面の１つを通って前記第１ウェル（２．１）の第２細胞基材（６．２）として形成され、第２壁（２．２．２）が、他方の側面の１つを通って前記第２ウェル（２．２）の第３細胞基材（６．３）として形成され、
前記第１ウェル（２．１）が、その両端部において１点まで幅が狭くなっており、その中間部では矩形であるように形成され、１点で終端する端部のうちの一方は、第１流体流（１２．１）が前記第１ウェル（２．１）に入るための第１入口開口部（４．１）に通じ、１点で終端する端部のうちの他方は、前記第１流体流（１２．１）が前記第１ウェル（２．１）から出るための第１出口開口部（５．１）に通じ、前記第１流体流（１２．１）の層流がもたらされ、
前記第２ウェル（２．２）が矩形であり、第２流体流（１２．２）が前記第２ウェル（２．２）に入るための第２入口開口部（４．２）と、前記第２流体流（１２．２）が前記第２ウェル（２．２）から出るための第２出口開口部（５．２）とにチャネル状狭窄部を通して接続されている、デバイスのための半製品。
【請求項２】
前記ベースプレート（１）が、その上側およびその下側に接合箔（３）をそれぞれ有し、前記第１ウェル（２．１）および前記第２ウェル（２．２）は、前記接合箔（３）によって環境に対して封止されている、ことを特徴とする請求項１に記載の細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイスのための半製品。
【請求項３】
前記ベースプレート（１）が、互いに流体連結された４つのウェル（２．１〜２．４）を有する、ことを特徴とする請求項１に記載の細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイスのための半製品。
【請求項４】
請求項１に記載の２つまたは少なくとも３つの半製品が、上下に取り付けられ、かつ前記第１ウェル（２．１）および前記第２ウェル（２．２）の相互に当接する縁部（１３）に沿って液密式に互いに接続され、前記デバイスの環境内に外側に面する前記ウェル（２．１、２．１）が、第１壁（２．１．１、２．２．１）によって覆われ、前記環境から液密式に封止される、細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイス。
【請求項５】
前記デバイスが、測定データの蛍光に基づく非接触収集のための測定点（１４）を有することを特徴とする請求項４に記載の細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイス。
【請求項６】
前記入口開口部（４．１、４．２）の各々が、別のウェルの出口開口部（５．１、５．２）に流体接続されることを特徴とする請求項４または５に記載の細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイス。
【請求項７】
２つの半製品が上下に取り付けられ、前記ベースプレート（１．１、１．２）が、それらのそれぞれの下側により互いに対して配置され、上側が接合箔（３）によって封止されている、ことを特徴とする請求項４に記載の細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイス。
【請求項８】
標準化された標本スライド設計のマイクロ流体チップシステムとして構成される、ことを特徴とする請求項４に記載の細胞層（１０．１、１０．２、…）のインビトロ産生および培養デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞層の配列のインビトロ産生方法およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞層の配列のインビトロ産生（生体外産生）およびその培養のためのさまざまな方法およびデバイス（装置）が知られている。細胞培養インサートによって、細胞過程を静的条件下でしか調査することができない。したがって、それぞれの細胞培養物の上に異化物質が豊富にあり、そのため、細胞培養物の成長および生存性が低減しかつ時間が限られる。培養は静的条件下でのみ可能であるため、細胞において液体を通して、いかなるせん断力も発生させることができない。しかしながら、大量の細胞に対して、それらがたとえば人体内で発生するように生理学的に正確な特性を採用するように、これらのせん断力は必要である。
【０００３】
異化物質の豊化を防止するように、Ｂｏｙｄｅｎチャンバ内で細胞および組織を灌流することができ、細胞または組織に対して新鮮な栄養培地を供給することができ、細胞または組織において上述したせん断力を発生させることができる。しかしながら、このシステムには、細胞が栄養培地によって一方の側（大部分、管腔側（ａｐｉｃａｌ））からしか効率的に灌流されないという重大な不都合がある。基底膜側（ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ）から細胞を灌流することができない。これによってまた、細胞成長および細胞生存性が低減し、時間的に制限される。さらに、システムは、よくても２次元細胞領域または組織領域での培養に限られる。
【０００４】
特許文献１に記載されている装置は、その設計の特徴により、最大１つの細胞層のみの培養を可能にする。さらに、構造の結果として、ウェル内において灌流条件下で細胞の直接的な顕微鏡検査を行うことができず、それは、培養物の表面の下の供給チャネルシステムが、顕微鏡の光学的観察軸を妨げるためである。
【０００５】
特許文献２に記載されている装置は、流動条件下で細胞および組織が観察されるのを可能にするが、別個の液体流を通してウェルを個別に灌流することができない。さらに、システムは、その設計の特徴のために、ウェル内で細胞に対して複数の培養面を提供するのには適しておらず、それにより、インビトロでの器官の機能の現実的な像に対して重要な、異なる細胞層の間の相互作用を、十分に考慮することができない。
【０００６】
特許文献３からの技術的教示は、たとえば、膜等の多孔性構成物の上の、対向して配置された細胞層の培養を可能にする。膜は、２つの培養チャンバを互いに垂直に分離する。チャンバシステムの構造に基づいて、たとえば、細胞の接着および／または遊走を、顕微鏡を通して直接観察することは不可能である。このシステムは、２つの細胞層を受け取ることに限られる。通常、多層オルガノイド構造をモデル化するために、少なくとも３つの細胞層が必要である。
【０００７】
特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている可能性もまた、２つの細胞層に限られる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１１／００９１９３０号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１０２００９０３５５０２号明細書
【特許文献３】米国特許第８，３５７，５２８号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７／００３７２７７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００９／００２３６０８号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２０１０／０２１６２４４号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、細胞層を所定の方法で配列し、培養し、調査することができるようにする、細胞層のインビトロ産生および配列に対するさらなる可能性を提案することである。同様に本発明の目的は、細胞層の複雑な配列もまた培養し調査することができるようにするデバイスを提案することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、独立請求項の主題を通して満たされる。有利な実施形態は、従属請求項に示されている。
【００１１】
その目的は、細胞層の配列のインビトロ産生方法であって、
Ａ  入口開口部および出口開口部を除いて環境から閉鎖され、第１細胞基材としての第１壁、第２細胞基材としての、間隙によって第１壁から分離されている対向する第２壁とを有する、第１ウェルを提供するステップと、
Ｂ  細胞によってコロニーが形成される細胞基材の自由面が地球の重力に対して直交して向けられるように、第１ウェルを位置合わせするステップと、
Ｃ  細胞を含む細胞懸濁液で第１ウェルを充填し、コロニーが形成される細胞基材の上に細胞を沈降させ、第１細胞層が形成されるように、コロニーが形成される細胞基材に細胞を接着させるステップと、
Ｄ  細胞でコロニーが形成される細胞基材が地球の重力に対して直交して向けられるように第１ウェルを再度位置合わせするステップであって、コロニーが形成される細胞基材が、すでにコロニーが形成された細胞基材かまたは他方の細胞基材のいずれかである、ステップと、
Ｅ  細胞を含む細胞懸濁液で第１ウェルを再充填し、コロニーが形成される細胞基材の上に細胞を沈降させ、さらなる細胞層が形成されるように、コロニーが形成される細胞基材に細胞を接着させるステップと、
Ｆ  第１ウェル内で細胞層の所望の配列が産生されるまで、ステップＤおよびＥを繰り返すステップと、
を含む方法において満たされる。
【００１２】
「ウェル」は、以降、くぼみを意味する。隣接する壁によってウェルを囲むことができ、ウェルは、空間を形成することができる。壁の頂部はウェルの縁部を形成する。
【００１３】
細胞基材は、細胞が接着し、生理学的に適切に供給された場合に生存することができる、人工のまたは天然の材料を含む表面である。細胞基材は、たとえば、プラスチック、金属またはガラスの表面である（人工材料）。細胞基材はまた、細胞層、組織層、または生体分子、たとえばバイオポリマーで覆われた表面でもあり得る（天然材料）。人工材料から作製された細胞基材は、接着を促進する表面凹凸、たとえば粗さまたはコーティング（たとえば、陰イオン／陽イオン、疎水性／親水性、タンパク質、ポリマー、細胞）を有することができる。
【００１４】
壁の対向する表面が互いに分離され、以降流体とも呼ぶ気体培地または液体培地がそれらの間を流れることができる場合、２つの壁の間に間隙がある。本発明による方法が、成長する細胞層を通して行われている間、この間隙を低減させることができる。
【００１５】
本発明による方法では、細胞は、重力の作用を利用することによって、コロニーが形成される細胞基材の上に配置される。細胞は、コロニーが形成される細胞基材の上に沈降し、そこに接着する。したがって、接着する細胞は、細胞基材に接合され、細胞懸濁液が流出するとき、およびウェルの向きが変化するとき、細胞基材の上に残る。
【００１６】
少なくともいくつかの細胞が細胞基材に接着するとき、細胞層が存在する。したがって、細胞懸濁液からの細胞によって、細胞基材を完全に覆うことができる。主流となっている生理学的条件、細胞基材の品質、ならびに細胞懸濁液の細胞の生物学的特徴、生化学的特徴および生物物理学的特徴に応じて、細胞基材の表面の一部のみ、たとえば５％、２５％、５０％または７５％を覆うことができる。細胞培養物は、１つまたは複数の細胞層によって形成される。
【００１７】
細胞懸濁液に、１つの細胞タイプの細胞が存在する可能性がある。本発明による方法の他の構成では、細胞懸濁液に異なる細胞タイプの細胞が存在することも可能である。
【００１８】
本発明による方法により、細胞基材に細胞によってコロニーを形成することが可能になる。そうする際、細胞基材のうちの１つまたは複数の上に、一連の細胞層を連続的に配置することができる。それにしたがって、層の所定順序で、かつ異なる細胞基材の細胞層または一連の細胞層の所定の構成で、選択された細胞タイプの細胞層により所定の方法で、ウェルを順序付けることができる。これらの可能性は、特に、コロニーが形成される細胞基材として細胞層が使用される場合に、細胞層の利用可能な空間および互いとの適合性によってのみ制限される。
【００１９】
ウェルの内側の細胞基材の上に細胞層を配置することが有利である。したがって、個々の細胞基材に対して別個にコロニー形成し、それから組立を通してウェルを生成する、という必要はなく、それは、たとえば、細胞基材が互いに対向して配置されるためである。さらに、本発明による方法の結果として、組立中に細胞層に損傷を与えるかまたは他の方法で物理的に影響を与えるリスクが防止される。
【００２０】
すでに言及したように、ステップＣおよびＥにおいて異なる細胞タイプの細胞を含む細胞懸濁液を使用することが可能であり、それにより、異なる細胞タイプの細胞によって少なくとも第１細胞層およびさらなる細胞層が形成される。
【００２１】
本発明による方法を有利に用いて、オルガノイドを産生することができる。オルガノイドは、たとえば肝類洞の器官、または器官の個々の領域の人工的な複製である。
【００２２】
この目的で、第１ウェルおよび第２ウェルを有するデバイスが使用される。第２ウェルは、第１ウェルと同様に、細胞基材として、間隙によって互いに分離される２つの対向する壁を有し、第１ウェルの第２壁は、多孔性膜の第１側面によって形成され、膜の第２側面は、第２ウェルの壁としての役割を果たす。細胞基材のうちの少なくとも２つの上に、１つの細胞タイプの少なくとも１つの細胞層が産生される。
【００２３】
第１流体流が第１チャンバを通して案内され、第２流体流が第２チャンバを通して案内され、第１流体流および第２流体流が栄養を含む、本発明による上述した方法のうちの１つに従って産生される細胞層の配列の細胞層、またはオルガノイドの生物学的機能を維持することができる。
【００２４】
栄養は、たとえば、カロリー等価物、砂糖、ＡＴＰ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＨまたは成長因子、ホルモン、酵素、合成有効成分等である。
【００２５】
これに関して、第２壁とこの第２壁の細胞基材とが多孔性膜によって形成されるデバイスが使用される場合に、特に有利である。この場合、第２壁の上の細胞層は、第１ウェルを通りかつ第２ウェルを通る灌流を通して供給することができる。
【００２６】
第１ウェルおよび第２ウェルにおける流量は、ウェルの形状の選択によって影響を受ける可能性がある。したがって、第１ウェルを通る第１流体流および第２ウェルを通る第２流体流の層流は、第１ウェルおよび第２ウェルの細長い形状を通して達成される。
【００２７】
第１ウェルを通る第１流体流および第２ウェルを通る第２流体流の乱流は、第１ウェルおよび第２ウェルの丸い形状を通して達成される。
【００２８】
流量比は、ウェルにおける入口および出口の寸法決め、配置および向きを通してさらに影響を受ける可能性がある。
【００２９】
有利には、第１流体流および／または第２流体流の材料組成が、制御された方法で調整され、細胞層において測定データが取得されることが可能になる。
【００３０】
化学的パラメータおよび／または物理的パラメータの測定データは、少なくとも第１流体流および第２流体流において収集することができる。これは、好ましくは、それらが第１ウェルまたは第２ウェルから出る際に行われる。測定データを用いて、第１流体流および／または第２流体流の材料組成を制御することができるが、ウェル内の細胞層におけるプロセスに関する結論を引き出すことも可能である。測定データを検出し評価するこれらの可能性により、試験方法が可能になる。
【００３１】
本方法のさらなる実施形態では、インピーダンス測定によって測定データを収集することができる。
【００３２】
膜は、第１ウェルおよび第２ウェルにおける異なる圧力比を調整することによって曲げられ、曲げの量および曲げの方向は、圧力比を調整することによって制御されることがさらに可能である。この可能性の結果として、膜の上に存在する細胞層の細胞を引き延ばすかまたは圧縮することができる。これにより、細胞に対して機械的応力が所定方法で作用するのを可能にすることができる。
【００３３】
上述した目的は、さらに、細胞層のインビトロ産生および培養デバイスの半製品を通して満たされる。これらの半製品は、上下に配置され、かつ２つの側面を有する多孔性膜によって互いに分離される第１ウェルおよび第２ウェルを有し、１つの壁が、膜の側面を通って第１ウェルの細胞基材として形成され、１つの壁が、他方の側面を通って第２ウェルの細胞基材として形成される。第１ウェルは、第１流体の第１流体流が第１ウェルに入るための少なくとも１つの入口開口部と、第１流体流が第１ウェルから出るための少なくとも１つの出口開口部とを有し、第２ウェルは、第２流体の第２流体流が第２ウェルに入るための少なくとも１つの入口開口部と、第２流体流が第２ウェルから出るための少なくとも１つの出口開口部とを有する。
【００３４】
流体は、たとえば、細胞懸濁液および／または栄養培地であり得る。それらの特性、たとえばそれらの化学的組成および／または物理的組成、温度、粘度は、時間的に調節または制御される方法で変更することができる。
【００３５】
半製品は、さらなる処理および／または他の半製品もしくはデバイスとの組立の後にのみ、別個の技術的ユニットを構成する有形の製品である。
【００３６】
半製品のウェルに対して液密シール、好ましくは液密かつ気密シールを提供することが可能であり、それにより、ウェルは環境に対して封止される。箔（接合）による液密封止の結果として、半製品から少なくとも１つのチャンバが形成され、そのチャンバは、膜によって、少なくとも、第１ウェルおよび第２ウェルに対応する頂部チャンバ半体および底部チャンバ半体に分割される。
【００３７】
細胞層のインビトロ産生および培養デバイスは、２つまたは少なくとも３つの半製品が、上下に取り付けられ、かつ第１ウェルおよび第２ウェルの相互に当接する縁部に沿って液密式に互いに接続され、デバイスの環境内に外側に面するウェルが、壁によって覆われ、環境から液密式に封止されることを特徴とする。
【００３８】
デバイスのさらなる有利な実施形態では、デバイスは、測定データの蛍光に基づく非接触収集のための測定点を有することができる。たとえば、すでに上述した方法は、これらの測定点を用いて実施することができる。
【００３９】
デバイスの非常に有利なさらなる展開では、入口開口部の各々を、別のチャンバの出口開口部に流体接続して、第１流体流および第２流体流が第１ウェルおよび／または第２ウェルを通って流れるようにすることができる。この種の構成により、使用者が、複数のウェルを接続することが可能になる。
【００４０】
本発明による半製品を組み立てて、細胞層のインビトロ産生および培養デバイスであって、半製品のうちの２つが、上下に取り付けられ、かつ第１ウェルおよび第２ウェルの当接する縁部に沿って液密式に互いに接続され、デバイスの環境内に外側に面するウェルが、壁によって覆われ、環境から液密式に封止される、デバイスを形成することができる。
【００４１】
たとえば、対応するウェルの上に置かれウェルの縁部に接続され、たとえば接着または接合される箔により、環境に対する液密シールが可能である。
【００４２】
半製品のうちの少なくとも３つが、上下に取り付けられ、かつ第１ウェルおよび第２ウェルの相互に当接する縁部に沿って液密式に互いに接続され、デバイスの環境内に外側に面するウェルが、壁によって覆われ、環境から液密式に封止されることも可能である。
【００４３】
本発明によるデバイスはまた、バイオチップとしても知られるチップとして構成することも可能である。これに関して、たとえば、光学顕微鏡法から既知であるような標本スライドの寸法を有する支持体の上に、少なくとも１つのウェルが設けられる。
【００４４】
チップは、同じチップまたはさらなるチップの他のウェルにマイクロチャネルシステムを通して接続することができる少なくとも１つのウェルを備える。各ウェルにおいて、流体流を発生させることができ、流体、たとえば、細胞懸濁液または栄養を含む溶液は、入口開口部からウェルを通って出口開口部まで流れる。膜が存在するため、すべてのウェルの膜の上の細胞層に対して、バイオチップの他のウェルから独立して、下部マイクロチャネルシステムを通して栄養培地をさらに供給することができる。すべてのウェルに、多孔性かつ自立型の膜が配置され、その材料組成ならびに利用される孔サイズおよび孔密度は、細胞によって膜に完全にコロニーを形成することができるように選択される。同時に膜の品質により、光吸収または光散乱が増大することなく光学顕微鏡法を用いる細胞の観察が可能である場合、非常に有利である。これにより、たとえば、膜は透明であり、それは、たとえば、ただし排他的にではなく、ポリエステル（ＰＥＴ）またはポリカーボネート（ＰＣ)またはポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ)等の材料を通して達成される。
【００４５】
チップは、好ましくは、生体適合性材料、たとえば環状オレフィンコポリマー（たとえば、ＺＥＯＮＯＲ（登録商標）またはＴＯＰＡＳ（登録商標）から作製される。利用される材料により、自家蛍光を妨げることなく蛍光顕微鏡法によって、チップ内に位置する細胞または組織を分析することができる。
【００４６】
本発明による半製品は、１つまたは複数の膜に位置する細胞層に、本発明によるデバイスにおける膜を通して栄養を供給する可能性を有利に提供する。基部灌流（ｂａｓｅ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）または基底灌流（ｂａｓａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）とも呼ぶことができるこの供給により、細胞層のより厚くかつより複雑な配列が構築されることが可能であり、同時に、膜の近くの最下細胞層への供給を確実にすることも可能である。
【００４７】
培地は、ウェルの出口開口部から完全にまたは部分的にウェルの入口開口部に再度案内されることが可能である。たとえば、この種の流体短絡を通して限られた量の培地によって、基底灌流を達成することができる。
【００４８】
本発明は、好ましくは標準化された標本スライド設計で構成されるマイクロ流体チップシステムについて記載する。したがって、実験室で一般的な液体処理および分析用の標準化されたハードウェアでの使用が可能である。本システムは、細胞培養インサート（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（著作権）システム）およびＢｏｙｄｅｎチャンバ等の既存のシステムのそれぞれの利点を結合する。
【００４９】
構造のために、２つの個々のチップを互いに結合して、２つの膜を備えたチャンバ本体を形成することができる。本システムは、最大４つの別個の細胞層または組織層が培養されるのと、最大３つの独立したチャネルシステムを介するシステムの灌流とを可能にする。デバイスの構造に基づいて、調査のためには小さい体積のみが必要である。さらに、バイオチップ内での細胞過程の非破壊調査、たとえば、詳細な顕微鏡による分析および／または分光器による分析が可能である。チップは、血管、肝臓、腸の構造および機能ならびに腫瘍モデルのレプリカの構成に対する基礎としての役割を果たす。器官構造のこれらの所定の構造特徴および抽出されたモデルならびにマイクロ流体チップにおけるその機能的モデル化は、同様に、本発明の主題である。
【００５０】
本発明によるデバイスにより、かつ本発明による方法を適用することにより、たとえば、異なる組織またはさらにはオルガノイドを動的に接合することができる。たとえば、ウェルにおいて、または２つ以上のウェルを有する本発明によるデバイスにおいて、組織またはオルガノイドを提供することができる。これらのウェルは、さらなるウェルに接続され、それらの出口開口部はラインを通して他のウェルの入口開口部に接続される。他のウェルには、同一の組織もしくはオルガノイドまたは異なる組織もしくはオルガノイドが存在する可能性がある。組織またはオルガノイドを含むウェルを通って流れた培地は、その後、同一かまたは異なる組織またはオルガノイドが存在する別のウェルに達する。たとえば、本発明による第１デバイスに肝臓の細胞層が提供され、本発明の第２デバイスに腸の細胞層が提供されるように、肝臓−腸軸が構築されることが可能である。培地、または肝臓−腸軸の構造および実験構成に応じて複数の培地が、第１デバイスを通って流れた後に第２デバイスに達する。この種の構成を通して、生理学的プロセスを人工的にかつコンパクトに再現することができる。
【００５１】
本発明によるデバイスおよび本発明による方法により、複雑なオルガノイド構造、たとえば、ただし排他的にではなく、肝類洞、血管、腸、または腫瘍およびそれらに血液を供給する血管の構造を模倣することが可能になる。これに関して、栄養培地組成、灌流される培地の流量、酸素飽和および／または二酸化炭素飽和、ｐＨならびに温度等の細胞培養のパラメータの確定は、体積が小さいため容易にモニタリングすることができる。細胞層および組織層を供給する流体流が、互いに独立して制御可能であるため、各ウェルに対して、上述した細胞培養パラメータを独立して調整することができ、異なる条件下で、ウェル内で異なる細胞層を灌流することができる。これにより、個々の実験要件に対して最適な方法で適合することが可能になる。したがって、たとえば、ウェル内で、細胞培養培地に対する異なる要件を有する細胞層または組織層を同時に培養することができ、それらの相互作用を調査することができる。
【００５２】
有利な構造では、システムに対して、たとえば、培地におけるｐＨ値および部分的ガス圧測定のためのセンサ装置を備えることができる。さらに、電気抵抗測定を介して個々の膜の上の細胞コロニー形成密度、細胞機能および／または細胞生存性に関する推論を行うために、接合箔の上に電極を設け、たとえば蒸着させることができる。さらに、たとえば、さまざまなオルガノイドの間の相互作用を調査するために、直列に、またはチューブシステムを介してモジュール式に並列に、チップを互いに接続することができる。
【００５３】
チップの構造により、器官構造の技術的モデリングのための多層細胞配列を構築すること、および、細胞および組織の間またはその中の分子信号プロセスの診断、物質試験または調査の目的で、器官構造を模倣することが可能になる。チップ内で、異なる器官の構造をシミュレーションすることができ、それらを、マイクロ流体回路を介して接続して、マイクロ流体チップの技術的解決法において身体の伝達過程を再現することができる。
【００５４】
本発明の利点は、マイクロ流体工学に基づくチップにおいて、ヒトの器官、たとえば、ただし排他的にではなく、肝臓、腸または血管をモデル化することができるということである。このバイオチップシステムは、マイクロ流体工学に基づくチップと、互いに独立しかつ共通のウェル内で培養される少なくとも２つ、好ましくは３つの層を合わせて形成するある量の細胞および／または組織とを備える。バイオチップは、ヒトのオルガノイドの細胞性状を調査するための生物医学的研究に対して設計される。応用分野としては、たとえば、ただし排他的にではなく、治療のための薬剤に対するスクリーニング、微生物病原体または危険物質を介して運ばれる肝臓病理機序の調査、栄養添加剤の試験、および診断技術の開発が挙げられる。本システムは、ヒトおよび獣医学における動物実験に代わるように設計される。
【００５５】
本発明について、以下、例示および実施形態例を参照してより十分に記載する。図面は以下を示す。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】接合箔が部分的に示されている本発明による半製品の第１実施形態例の上面図である。
【図２】接合箔を含む、下方からの図における第１実施形態例による半製品である。
【図３】肝類洞の概略図である。
【図４】接合箔を含む半製品における本発明によって産生された細胞層の例である。
【図５】４つのウェルの流体連結（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ  ｌｉｎｋｉｎｇ）の概略図である。
【図６】本発明によるデバイスの第１実施形態例である。
【図７】細胞層を含む本発明によるデバイスの第１実施形態例の断面図である。
【図８】測定点を含む本発明によるデバイスの第２実施形態例である。
【図９】細胞層を含む本発明によるデバイスの第２実施形態例の断面図である。
【図１０】本発明によるデバイスの第２実施形態例のウェルにおける細胞層の概略図である。
【図１１】第１電極配置の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下の実施形態例では、デバイスおよび要素は、概略的にかつ簡略化されて示されている。同一の参照数字は、別段の定めのない限り、同一の技術的特徴を示す。細胞層の確定された細胞基材との関連は単に例示的なものである。
【００５８】
本発明による半製品の第１実施形態例の重要な要素として、図１は、ベースプレート１と、第１ウェル２．１と、第１流体流１２．１（図５を参照）が第１ウェル２．１に入るための第１入口開口部４．１および第１流体流１２．１が出るための第１出口開口部５．１とを示す。第１ウェル２．１と第２ウェル２．２（図２を参照）との間に、第１膜１１．１が設けられている。
【００５９】
第１ウェル２．１は、その両端部において１点まで幅が狭くなっており、その中間部はおよそ矩形である。第１入口開口部４．１は、１点で終端する端部のうちの一方に通じ、第１出口開口部５．１は、１点で終端する他方の端部に通じている。この形状により、第１ウェル２．１を通して第１流体流１２．１の広範囲な層流がもたらされる。
【００６０】
図１には見えないベースプレート１の下側（図２を参照）に、第２ウェル２．２が設けられている。見えている上側に、第２流体流１２．２（図５を参照）が第２ウェル２．２に入るための第２入口開口部４．２と、第２流体流１２．２が出るための第２出口開口部５．２とが設けられている。
【００６１】
切断面Ａ−Ａに沿った断面の図を図４に示し、それについて記載する。
【００６２】
図１において、ベースプレート１に、第３ウェル２．３および第４ウェル２．４（図２を参照）が設けられている。また、第３流体流１２．３（図５を参照）が第３ウェル２．３に入るための第３入口開口部４．３と、第３流体流１２．３が出るための第３出口開口部５．３と、第４流体流１２．４（図５を参照）が第４ウェル２．４に入るための第４入口開口部４．４と、第４流体流１２．４が出るための第４出口開口部５．４とが設けられている。ウェル２．１〜２．４のすべてが、ベースプレート１を通して形成されている縁部１３によって包囲されている。
【００６３】
図１において、半製品は、第１ウェル２．１および第３ウェル２．３が、接合箔３（ウェル２．３の上に部分的にのみ示す）によって環境に対して気密かつ液密式に封止されている構成で示されている。
【００６４】
第１ウェル２．１の接合箔３を通して、第１細胞基材６．１を構成する第１壁２．１．１が形成されている。第１膜１１．１は、第２壁２．１．２内に保持される。第１膜１１．１は、第２壁２．１．２の一部であり、第２細胞基材６．２を構成する。
【００６５】
前述のものと同様に、第３ウェル２．３と第４ウェル２．４との間に第２膜１１．２が配置されている。
【００６６】
簡単のために、以下、第１ウェル２．１および第２ウェル２．２（切断面Ａ−Ａ）ならびに関連する要素について言及する。第３ウェル２．３および第４ウェル２．４の技術的要素は、適用可能な場合は図示しかつ示しているが、説明が必要な場合にのみ明示的に言及する。
【００６７】
図２に、ベースプレート１の下側を示す。第２ウェル２．２と、第３細胞基材６．３としての役割を果たす第１膜１１．１の下側とが見える。この斜視図は、第１膜１１．１が、図１に示す第１ウェル２．１の第２壁２．１．２の背面によって保持されかつ形成されている、第２ウェル２．２の第２壁２．２．２を示す。
【００６８】
第２ウェル２．２は、チャネル状狭窄部を通して、第２入口開口部４．２にかつ第２出口開口部５．２に接続されているが、その中間部ではおよそ矩形である。
【００６９】
本発明による半製品のさらなる実施形態では、ウェルの形状および寸法は互いに同一であり得る。
【００７０】
図３は、肝類洞を概略的に示す。種々の細胞タイプの細胞９および細胞タイプの層状配列を見ることができる。さらに、肝類洞内の流量比を矢印によって示す。連続した細胞層が図４に示すデバイスによって模倣される領域が、およそ中間において破線境界で示されている。
【００７１】
図４によるデバイスは、本発明による半製品（図１および図２参照）であり、それは、その上側およびその下側に接合箔３を有し、第１ウェル２．１および第２ウェル２．２は、接合箔３によって環境に対して封止されている。上側の接合箔３によって、第１細胞基材６．１としての役割を果たす、第１ウェル２．１の第１壁２．１．１が形成されている。下側の接合箔３によって、第４細胞基材６．４としての役割を果たす、第２ウェル２．２の第１壁２．２．１が形成されている。第１ウェル２．１の第１壁２．１．１と第１ウェル２．１の第２壁２．１．２との間に第１間隙７．１が設けられ、第２ウェル２．２の第１壁２．２．１と第２ウェル２．２の第２壁２．２．２との間に第２間隙７．２が設けられている。
【００７２】
拡大して示す断面には、第１細胞層１０．１〜第３細胞層１０．３を示し、これらの細胞層１０．１〜１０．３は、第２細胞基材６．２、第３細胞基材６．３および第４細胞基材６．４に提供されている。図３の境界付き領域に示すような細胞９を含む細胞層の配列が、第１細胞層１０．１〜第３細胞層１０．３、第１間隙７．１および第２間隙７．２によって複製される。
【００７３】
細胞層の配列を生成する１つの可能性では、第１ウェル２．１内に、第１細胞層１０．１の細胞タイプの細胞９を含む細胞懸濁液８が挿入される。第２壁２．１．２にコロニーが形成される第１ウェル２．１の第２壁２．１．２は、水平に向けられ、細胞９が、第２壁２．１．２にコロニーが形成される第１ウェル２．１の第２壁２．１．２の上に重力の作用によって沈降するように、下方位置に配置される。細胞９は、第１膜１１．１の上側に接着して第２細胞基材６．２としての役割を果たし、第１細胞層１０．１を形成する。
【００７４】
その後、第２ウェル２．２内に、第３細胞層１０．３の細胞タイプの細胞を含む細胞懸濁液８が挿入される。その位置は変化しないままである。第１壁２．２．１にコロニーが形成される第２ウェル２．２の第１壁２．２．１は、水平に向けられ、細胞９が、第１壁２．２．１にコロニーが形成される第２ウェル２．２の第１壁２．２．１の上に重力の作用によって沈降するように、下方位置に配置される。細胞９は、第２ウェル２．２の第１壁２．２．１に接着して第４細胞基材６．４としての役割を果たし、第３細胞層１０．３を形成する。
【００７５】
その後、デバイスを１８０度回転させて、第２ウェル２．２がここでは上部ウェルであるようにする。第２壁２．２．２にコロニーが形成される第２ウェル２．２の第２壁２．２．２は、水平に向けられ、細胞９が、第２壁２．２．２にコロニーが形成される第２ウェル２．２の第２壁２．２．２の上に重力の作用によって沈降するように、ここでは下方位置に配置される。細胞９は、第１膜１１．１の側部に接着して第３細胞基材６．３としての役割を果たし、第２細胞層１０．２を形成する。
【００７６】
すでに存在する第１細胞層１０．１を維持するために、第１ウェル２．１において、第１細胞層１０．１に、好適な流体、たとえば栄養培地が供給される。
【００７７】
３つの細胞層１０．１〜１０．３の配列を産生した後、図３におけるしるしが付けられた領域に対応する細胞層１０．１〜１０．３の配列が複製され、オルガノイドが産生される。
【００７８】
図５において概略的に例として示すように、ベースプレート１の４つのウェル２．１〜２．４を互いに流体連結することができる。これに関して、第１出口開口部５．１は第３入口開口部４．３に接続され、第２出口開口部５．２は第４入口開口部４．４に接続され、それにより、第１流体流１２．１は、第１ウェル２．１から第３ウェル２．３に流れ込み、第３流体流１２．３として第３ウェル２．３を通って流れる。第２流体流１２．２は、第２ウェル２．２を通って流れ、第２出口開口部５．２を介して第４入口開口部４．４に到達し、第４流体流１２．４として第４ウェル２．４に入る。
【００７９】
本発明のさらなる実施形態では、異なるベースプレート１またはデバイスのウェルの間でもまた上述した原理を使用することができる（たとえば、図６〜図９を参照）。さらに、流体流１２．１〜１２．４を異なるように案内することができる。したがって、本発明のさらなる実施形態では、第４ウェル２．４内に第１流体流１２．１を案内することができ、第３ウェル２．３内に第２流体流１２．２を案内することができる。
【００８０】
流体流１２．１〜１２．４が、互いの中に案内されるか、または分割されて異なるウェル内に案内されることがさらに可能である。流体流１２．１〜１２．４の一部のみが後続するウェル内に案内されることも可能である。したがって、流体流１２．１〜１２．４の一部を、通過したばかりのウェル内に戻るように案内することができ、その部分は、そこを再度通って流れることができる。
【００８１】
図６は、本発明によるデバイスの第１実施形態例を示す。第１ベースプレート１．１および第２ベースプレート１．２は、第１ベースプレート１．１および第２ベースプレート１．２の縁部１３が接触するように、それらのそれぞれの下側が互いに対して配置される（図は組立中の状態を示す）。２つのベースプレート１．１および１．２は、すでに記載したように、それらのそれぞれの上側において接合箔３によって封止されている。第２ベースプレート１．２も同様に、上述したロジックに従って、第５ウェル２．５〜第８ウェル２．８であるウェルを有する（第５ウェル２．５および第７ウェル２．７のみを示し、第６ウェル２．６および第８ウェル２．８は図６では矢印によって参照されているのみである）。第２ベースプレート１．２は、第３膜１１．３および第４膜１１．４をさらに有する。両ベースプレート１．１および１．２は、液密式に互いに接続され、たとえば接着されている。ベースプレート１．１の第２ウェル２．２（図１も参照）および第４ウェル２．４（図１も参照）は、ベースプレート１１．２の第５ウェル２．５の上でまたは第７ウェル２．７の上で動かされ、各場合に、共通のウェル、すなわち第５ウェル２．５および第７ウェル２．７をそれぞれ形成する。
【００８２】
図７において、このように提供される本発明によるデバイスの構造を、切断線Ａ−Ａ（図６）に沿った断面図として示す。上に示した第１ベースプレート１．１によって、第１ウェル２．１が形成される。この第１ウェル２．１は、第１膜１１．１によって第５ウェル２．５から分離されている。第５ウェル２．５は、さらに、第３膜１１．３によって第６ウェル２．６から分離されている。第６流体流１２．６が、第６入口開口部４．６および第６出口開口部５．６を介して第６ウェル２．６を通って流れる。
【００８３】
断面拡大図に、第１ウェル２．１、第５ウェル２．５、第６ウェル２．６、第１膜１１．１および第３膜１１．３を示す。２つの膜１１．１および１１．３の両側に細胞層１０．１〜１０．４が設けられている。
【００８４】
図８に、測定点１４を含む本発明によるデバイスの第２実施形態例を示す。流体流１２．１〜１２．４（たとえば図５を参照）の成分の蛍光特性に基づいて測定値を収集するための測定点１４は、すべてのウェル２．１〜２．４において図１に従って構成されるベースプレート１の上に配置される（第１ウェル２．１および第３ウェル２．３のみを示す）。それらは、評価および制御ユニット１７にデータ通信可能に接続されており、評価および制御ユニット１７により、収集された測定データに基づいて制御されるように、流体流１２．１〜１２．４の組成、圧力および温度を調整することができる。さらに、さらなる評価のための測定データは、後に呼び出すために格納される。測定点１４は、細胞層の細胞９のグルコースおよび部分的酸素消費量の非接触測定に役立つ。
【００８５】
第１ウェル２．１および第２ウェル２．２内に、記載した方法にしたがって、肝臓のオルガノイド（肝オルガノイドＩ）が提供され、一方で、第３ウェル２．３および第４ウェル２．４内に、腸のオルガノイド（腸オルガノイドＩＩ）が提供される。第１出口開口部５．１は、第３入口開口部４．３に流体接続されている。第２入口開口部４．２を通して、第２流体流１２．２が、第２ウェル２．２内に細胞層を供給し、第１ウェル２．１内の第１膜１１．１の上に細胞層に供給するために、第２ウェル２．２に供給される。第２流体流１２．２は、第２出口開口部５．２を介して出るように案内され、新鮮な流体と部分的に混合された後、この混合物は、第２入口開口部４．２を介して再度第２ウェル２．２内に達する。同じことが第４ウェル２．４に適用される。第１入口開口部４．１を通して、第１流体流１２．１が、第１ウェル２．１を通して第１出口開口部５．１に案内され、そこから、第３入口開口部４．３を介して第３ウェル２．３内に進み、第３流体流１２．３として第３ウェル２．３を通って流れ、第３出口開口部５．３を介して出るように案内される。この構成を通して、オルガノイドおよびそれらの互いに対する生理学的影響が、実験環境においてインビトロでシミュレーションされ、それを収集し評価することができる。
【００８６】
図９では、第１ウェル２．１および第２ウェル２．２における測定点１４の配置を、切断面Ｂ−Ｂ（図８を参照）に沿った断面図で示す。肝オルガノイドまたは腸オルガノイドの領域を、ローマ数字ＩおよびＩＩで指定し、図１０に拡大して示す。
【００８７】
図１０の左側の断面拡大図に、肝オルガノイドＩを示す。第１膜１１．１の上の第１ウェル２．１の第２壁２．１．２には、第２細胞層１０．２ＦＢ（線維芽細胞）および第３細胞層１０．３ＥＣＭ（細胞外マトリックス）の上のＨＩＭＥＣ（ヒト腸管微小血管内皮細胞）層として、第１細胞層１０．１がある。第１膜１１．１の上の第２ウェル２．２の第２壁２．２．２には、第４細胞層１０．４ＨＣＥＣ（ヒト結腸上皮細胞、ヒト腸上皮細胞）がある。
【００８８】
図１０の右側の断面拡大図に、腸オルガノイドＩＩを示す。第２膜１１．２の上の第３ウェル２．３の第２壁２．３．２には、ＨＳＥＣ（ヒト類洞内皮細胞）層として第５細胞層１０．５がある。これには、共培養としてコロニーが形成されたｍｏＭΦ細胞（一次ヒト単球由来マクロファージ）が散在している。第２膜１１．２の上の第４ウェル２．４の第２壁２．４．２には、第６細胞層１０．６ＨＳＣ（ヒト星細胞）がある。第１壁２．４．１が第８細胞基材６．８としての役割を果たす第４ウェル２．４の第１壁２．４．１には、第７細胞層１０．７としてＨＨＣ（ヒト分化肝細胞）層があり、これには共培養されたＢＣ（毛細胆管）が散在している。
【００８９】
さらなる実施形態では、より多くの細胞層１０．１、１０．２、…がある場合があり、それらは、さらに、さまざまな細胞基材６．１、６．２、…の上に他の細胞タイプ、他の連続した細胞層および／または細胞層１０．１、１０．２、…の他の配列の細胞９を有することができる。
【００９０】
図１１に、本発明による半製品においてかつ本発明によるデバイスにおいて測定データを収集する１つの可能性を概略的に示す。ベースプレート１の上側に、第１電流供給電極１５．１および第１測定電極１５．２が配置されている。ベースプレート１の下側に、第２電流供給電極１５．３および第２測定電極１５．４が配置されている。これらの電極１５．１、１５．２および１５．３、１５．４は、接合箔３の上に印刷されている。さらなる実施形態では、それらはまた、ベースプレート１の上に組み込まれ、または配置され、たとえば印刷されることも可能である。各電極１５．１〜１５．４は、電気接点および／または測定接点のための接触面６を有している。
【００９１】
電極１５．１〜１５．４に電圧を印加することにより、収集された電圧、電流、オーム抵抗および／またはインピーダンスの測定データを取得し評価することができる。
【００９２】
たとえばインピーダンス測定のための電極１５．１〜１５．４は、第１膜１１．１および／または第２膜１１．２のすぐ上または下の接合箔３の上に配置され、たとえば焼結されるかまたは押圧される。接触面６において、電界を蓄積する交流の供給が行われる。２つの電流供給電極１５．１および１５．３は、たとえば、液体供給側の第１ウェル２．１および液体除去側の第２ウェル２．２内で、互いに対向して位置する。
【符号の説明】
【００９３】
１  ベースプレート
１．１  第１ベースプレート
１．２  第２ベースプレート
２．１  第１ウェル
２．１．１  （第１ウェル２．１の）第１壁
２．１．２  （第１ウェル２．１の）第２壁
２．２  第２ウェル
２．２．１  （第２ウェル２．２の）第１壁
２．２．２  （第２ウェル２．２の）第２壁
２．３  第３ウェル
２．３．２  （第３ウェル２．３の）第２壁
２．４  第４ウェル
２．４．１  （第４ウェル２．４の）第１壁
２．４．２  （第４ウェル２．４の）第２壁
２．５  第５ウェル
２．６  第６ウェル
２．７  第７ウェル
２．８  第８ウェル
３  接合箔
４．１  第１入口開口部
４．２  第２入口開口部
４．３  第３入口開口部
４．４  第４入口開口部
４．６  第６入口開口部
５．１  第１出口開口部
５．２  第２出口開口部
５．３  第３出口開口部
５．４  第４出口開口部
５．６  第６出口開口部
６．１  第１細胞基材
６．２  第２細胞基材
６．３  第３細胞基材
６．４  第４細胞基材
６．８  第８細胞基材
７．１  第１間隙
７．２  第２間隙
８  細胞懸濁液
９  細胞
１０．１  第１細胞層
１０．２  第２細胞層
１０．３  第３細胞層
１０．４  第４細胞層
１０．５  第５細胞層
１０．６  第６細胞層
１０．７  第７細胞層
１１．１  第１膜
１１．２  第２膜
１１．３  第３膜
１１．４  第４膜
１２．１  第１流体流
１２．２  第２流体流
１２．３  第３流体流
１２．４  第４流体流
１２．６  第６流体流
１３  縁部
１４  測定点
１５．１  第１電流供給電極
１５．２  第１測定電極
１５．３  第２電流供給電極
１５．４  第２測定電極
１６  接触面
１７  評価および制御ユニット
Ｉ  肝オルガノイド
ＩＩ  腸オルガノイド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006626884.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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