(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含み、それによって、分解安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択する、分解安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択するための方法：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基または該Asn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつAspまたはAsnが111Å2以上の溶媒露出表面積（SASA）を有するC末端側アミノ酸残基を有する1つまたは複数の抗体を選択する段階、
ここで、前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）であり、および
（i）配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことであり、
（ii）配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
（iii）中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことであり、および
（iv）高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
【請求項２】
以下の段階を含み、それによって、アスパラギン（Asn）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン（Asn）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するC末端側アミノ酸残基を有する各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
（d）各抗体Fv領域内の、111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asn残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）前記2つ以上の抗体から、以下のAsn残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階：
（i）配座柔軟性を有するCα原子を有し、かつC末端側アミノ酸残基としてAsp、Pro、Thr、またはAsnを有する、CDRループ1内のAsn残基、
（ii）配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するC末端側アミノ酸残基を有する、Asn残基、または
（iii）配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出（SASA＞89.4Å2）を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化がそのAsn残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asn残基、
ここで、前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）であり、および
（i）配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことであり、
（ii）配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
（iii）中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことであり、および
（iv）高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
【請求項３】
以下の段階を含み、それによって、アスパラギン酸（Asp）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン酸（Asp）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asp残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）前記2つ以上の抗体から、以下のAsp残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階：
（i）配座的に柔軟なCα原子を有し、111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するC末端側アミノ酸残基を有する、Asp残基、
（ii）中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するC末端側アミノ酸を有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる、Asp残基、
（iii）中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、C末端側アミノ酸残基としてGlyを有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asp残基、
ここで、前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）であり、および
（i）配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことであり、
（ii）配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
（iii）中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことであり、および
（iv）高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
【請求項４】
以下の段階を含む、抗体を生産するための方法：
（a）請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
（b）該細胞または培養培地から該抗体を回収し、それによって該抗体を生産する段階。
【請求項５】
前記ホモロジーモデルアンサンブルが抗体Fv断片によって作られることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、Cys、またはAspであることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
111Å2未満の溶媒露出表面積（SASA）を有するアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、またはCysであることを特徴とする、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、抗体を生産するための方法：
（a）請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、および
（b）細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を生産する段階。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、構造ベースのアプローチに基づいた、抗体のアミノ酸配列中のアスパラギンおよびアスパラギン酸の分解部位の同定および除去に関する、抗体安定性を向上させるための方法を報告する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
モノクローナル抗体および抗体ドメインベースの分子は、臨床試験が進められているタンパク質治療薬の大部分を占める（1、2）。モノクローナル抗体は、多岐にわたる治療的適応症に効力を有し、作製も容易である。抗体の特異性は主として、可変ドメインに位置するCDR内の配列によって決まる。臨床候補を選択する過程は、多数のモノクローナル抗体の機能特性に関するスクリーニングから始まる。スクリーニングに続いて、所望の機能的基準のすべてを満たし、さらに化学的および生物物理学的な安定性も示すモノクローナル抗体を同定するために、数百種にも及ぶ分子の詳細なインビトロプロファイリングが行われる。すなわち、製造中および貯蔵中の、ならびに適用後のインビボでの望まれない分解を避けるためには、その構造および生物学的機能に影響を及ぼす恐れのある不安定性という問題を抱えるモノクローナル抗体を同定して、選択から除外しなければならない。
【０００３】
タンパク質に起こる分解反応の1つは、アスパラギン（Asn）残基（3）およびアスパラギン酸（Asp）残基（4、5）の化学的分解である。これらの反応は、適切な製剤化条件によって抑制することができる（6〜9）。Asn残基およびAsp残基が抗原認識に関与する場合、それらの化学的変化が抗体の効力の低下につながる恐れがある（10〜14）。
【０００４】
Asn残基およびAsp残基の分解性に影響を及ぼしうるパラメータには、さまざまなものが提唱されており、これには例えば、一次配列（3、5、16、33、40、51〜56）、溶媒誘電率、温度、およびpHがあり、ほとんどはペプチドに関するものであるが（52、53、57〜59）、タンパク質に関するものもある（7、10、35、60）。既に1980年代に、タンパク質脱アミド化の主要な決定要因についてはいくつかの構造的必要条件が示唆されており（5、61）、それらは後に確認され、拡張されている（34、37、38、40、46、51、62〜64）。
【０００５】
分解機序およびその環境的必要条件に関する知識が蓄積されているにもかかわらず、モノクローナル抗体における自然発生的な脱アミド化および異性化は未解決の問題となっている。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書では、ポリペプチドにおけるAsp残基およびAsn残基の分解と、構造パラメータのセットとの相関について報告する。分解ホットスポットは、（i）それらの配座柔軟性、（ii）C末端側の隣接アミノ酸残基のサイズ、および（iii）二次構造パラメータによって特徴づけることができることが見いだされた。これらのパラメータを用いて、Asn残基およびAsp残基の分解性の予測方法が確立された。
【０００７】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、分解（＝修飾）安定性を有する抗体を選択するための方法である：
（a）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ／または該Asp残基もしくはAsn残基が大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
【０００８】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含み、それによって、分解（＝修飾）安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択する、分解（＝修飾）安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択するための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ／または該Asp残基もしくはAsn残基が大型のC末端側アミノ酸残基を有する1つまたは複数の抗体を選択する段階。
【０００９】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、抗体を選択から除外する（＝多数の抗体から除くために選択する）ための方法である：
（a）（多数の抗体Fv領域の）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）Cα原子が中程度ないし高度の配座柔軟性を有しかつ／または該Asp残基もしくはAsn残基が小型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を、（多数の抗体Fv領域からの）選択から除外する／除く段階。
【００１０】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、1つまたは複数の抗体を選択から除外するための方法（＝多数の抗体から除くために選択する）ための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）（多数の抗体Fv領域の）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してすぐC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）Cα原子が中程度ないし高度の配座柔軟性を有しかつ／または該Asp残基もしくはAsn残基が小型のC末端側アミノ酸残基を有する1つまたは複数の抗体を（多数の抗体Fv領域からの）選択から除外する／除く段階。
【００１１】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、アスパラギン（Asn）分解（脱アミドおよび／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい抗体を同定するかまたは選択から除外するための方法である：
（a）抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）小型のC末端側アミノ酸残基を有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
（c）小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現／存在、および該Asn残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
（d）以下の場合にアスパラギン（Asn）分解（脱アミドおよび／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい抗体を同定するかまたは選択から除外する段階：
（i）該Asn残基がCDRループ1内にあり、そのCα原子が配座的に柔軟であり、かつC末端側アミノ酸残基がAsp、Pro、ThrもしくはAsnである場合、
（ii）該AsnのCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ該Asn残基のC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
（iii）該Asn残基のCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつ該Asn残基を基準として連続3アミノ酸残基超の範囲内でアミノ末端側の二次構造の変化が起こる場合。
【００１２】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、アスパラギン（Asn）分解（脱アミドおよび／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい1つまたは複数の抗体を同定するかまたは選択から除外するための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）小型のC末端側アミノ酸残基を有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
（d）小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現／存在、および該Asn残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）以下の場合にアスパラギン（Asn）分解（脱アミドおよび／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい1つまたは複数の抗体を同定するかまたは選択から除外する段階：
（i）該Asn残基がCDRループ1内にあり、そのCα原子が配座的に柔軟であり、かつC末端側アミノ酸残基がAsp、Pro、ThrもしくはAsnである場合、
（ii）該AsnのCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ該Asn残基のC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
（iii）該Asn残基のCα原子が配座的に柔軟であり、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつ該Asn残基を基準として連続3アミノ酸残基超の範囲内でアミノ末端側の二次構造の変化が起こる場合。
【００１３】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含み、それによって、アスパラギン（Asn）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン（Asn）安定性が向上した（脱アミドおよび／またはスクシンイミド形成が低下した）1つまたは複数の抗体を選択するための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）小型のC末端側アミノ酸残基を有する各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
（d）各抗体Fv領域内の、小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現／存在、および該Asn残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、
（e）以下のAsn残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を、前記2つ以上の抗体から除く／削除する／選択から除外する段階：
（i）配座柔軟性を有するCα原子を有し、かつC末端側アミノ酸残基としてAsp、Pro、ThrもしくはAsnを有する、CDRループ1内のAsn残基、
（ii）配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度未満の骨格二面角を有し、かつ小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asn残基、または
（iii）配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化がそのAsn残基を基準として連続3アミノ酸残基超の範囲内で起こる、Asn残基。
【００１４】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階のうちの1つまたは複数を含む、アスパラギン（Asn）分解（脱アミドおよび／またはスクシンイミド形成）が低下した抗体を得るための方法である：
‐Cα原子の配座柔軟性を低下させる段階、
‐該Asn残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを増加させる段階。
【００１５】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、アスパラギン酸（Asp）分解（異性化および／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい抗体を同定するかまたは選択から除外するための方法である：
（a）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現／存在、および該Asp残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、
（d）以下の場合にAsp分解（異性化および／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい抗体を同定するかまたは選択から除外する段階：
（i）該Asp残基のCα原子が高度の配座柔軟性を有し、かつ該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
（ii）該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基に対するアミノ酸残基が小型であり、カルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる場合、または
（iii）該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基のC末端側にあるアミノ酸残基がGly残基であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として3アミノ酸残基より長い距離で起こる場合。
【００１６】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、アスパラギン酸（Asp）分解（異性化および／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい1つまたは複数の抗体を同定するかまたは選択から除外するための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現／存在、および該Asp残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）以下の場合にAsp分解（異性化および／またはスクシンイミド形成）を起こしやすい1つまたは複数の抗体を同定するかまたは選択から除外する段階：
（i）該Asp残基のCα原子が高度の配座柔軟性を有し、かつ該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
（ii）該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基に対するアミノ酸残基が小型であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる場合、または
（iii）該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、該Asp残基のC末端側にあるアミノ酸残基がGly残基であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基を基準として3アミノ酸残基より長い距離で起こる場合。
【００１７】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含み、それによって、アスパラギン酸（Asp）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン酸（Asp）安定性が向上した（異性化および／またはスクシンイミド形成が低下した）1つまたは複数の抗体を選択するための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現／存在、および該Asp残基を基準としてこの変化が起こったアミノ酸残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）以下のAsp残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を、前記2つ以上の抗体から除く／削除する／選択から除外する段階：
（i）配座的に柔軟なCα原子を有し、かつ小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asp残基、
（ii）中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、小型のC末端側のアミノ酸を有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる、Asp残基、または
（iii）中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、C末端側アミノ酸残基としてGlyを有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から3アミノ酸残基より長い距離で起こる、Asp残基。
【００１８】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階の一方または両方を含む、アスパラギン酸（Asp）分解（異性化および／またはスクシンイミド形成）が低下した抗体を得るための方法である：
‐Cα原子の配座柔軟性を低下させる段階、
‐該Asn残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを増加させる段階。
【００１９】
一態様において、Asp残基のC末端側にあるアミノ酸残基は、大型のアミノ酸残基に変更される。
【００２０】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、長期貯蔵安定性を有する抗体を選択するための方法である：
（a）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ／またはAspもしくはAsnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
【００２１】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含み、それによって、長期貯蔵安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択する、長期貯蔵安定性を有する1つまたは複数の抗体を選択するための方法である：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルにより／において／を用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基またはAsn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ／またはAspもしくはAsnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
【００２２】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、抗体を生産するための方法である：
（a）本明細書において報告された方法によって選択された、または本明細書において報告された方法によって得られた抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
（b）該細胞または培養培地から該抗体を回収し、それによって該抗体を生産する段階。
【００２３】
本明細書において報告される一局面は、以下の段階を含む、抗体を生産するための方法である：
（a）本明細書において報告された方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
（b）細胞または培養培地から抗体を回収し、それによって抗体を生産する段階。
【００２４】
以下には、本明細書において報告されるすべての局面の態様が提示される。個々の態様のあらゆる組み合わせもこのリストの範囲に含まれることを明記しておく。
【００２５】
一態様において、配座柔軟性は、ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）である。一態様において、ホモロジーモデルアンサンブルは、アンサンブル（5つで1セット）である。
【００２６】
一態様において、
（i）配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下であることであり、
（ii）配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることであり、
（iii）中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åであることであり、
（iv）高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
【００２７】
一態様において、ホモロジーモデルアンサンブルは抗体Fv断片によって作られる。
【００２８】
一態様において、小型のアミノ酸残基は、Gly、Ala、Ser、Cys、またはAspである。一態様において、小型のアミノ酸残基は、Gly、Ala、Ser、またはCysである。
【００２９】
一態様において、本方法は、さらなる段階：
‐抗体Fv領域のアミノ酸配列を用意する段階、
を含む。
【００３０】
一態様において、高度の溶媒露出とは、SASA値が89.4Å2を上回ることである。
【００３１】
一態様において、ホモロジーモデルアンサンブルを作成するために、均一な質量分析実験データセットが用いられる。
【００３２】
一態様において、すべてのCDRがループモデリング手順に供されて、5つの構成要素からなる（five-membered）ホモロジーモデルアンサンブルが得られる。
【００３３】
一態様において、本方法は分子動力学的シミュレーションを必要としない。
【００３４】
一態様において、5つの構成要素からなるアンサンブルのうち少なくとも1つの構成要素が分解スポットと分類される場合には、その残基は分解スポットとみなされる。
【００３５】
一態様において、Pipeline Pilotに実装されている単一ツリー型の先読み可能な再帰分割アルゴリズムが用いられる。
【００３６】
一態様において、後続の骨格窒素の溶媒露出表面積をコンピュータ計算によって決定し、水素結合の数を算定した。
【００３７】
一態様において、側鎖Cγ原子からNn+1原子までの距離、側鎖二面角χ1、ならびに原子Cγ、O、Nn+1、およびCの間の角度と定義した二面角CGONCを測定することによって、遷移状態様の立体配座を詳細に調査した。
【００３８】
一態様において、各AspまたはAsnの溶媒露出表面積を決定した。
【００３９】
一態様において、C末端側の（後続の）アミノ酸サイズならびに骨格二面角φ（C'n-1-N-Cα-C'）およびψ（N-Cα-C'-Nn+1）を決定する。
【００４０】
一態様において、ホモロジーモデルアンサンブル（5つで1セット）におけるAsn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）は、そのアンサンブル内の構造的多様性を反映し、推定上の配座柔軟性を示すものとみなされる。
【００４１】
一態様において、二次構造要素（当該残基がヘリックス、シート、ターン、またはコイルの中に埋め込まれている）ならびに隣の異なるN末端側およびC末端側二次構造要素までの距離が、パラメータとして含められる。
【００４２】
一態様において、n-1番目の残基とn+1番目の残基のCα原子間の距離が決定される。
[本発明1001]
以下の段階を含む、分解安定性を有する抗体を選択するための方法：
（a）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基または該Asn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつAspまたはAsnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
[本発明1002]
以下の段階を含む、アスパラギン（Asn）分解を起こしやすい抗体を同定するための方法：
（a）抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）小型のC末端側アミノ酸残基を有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
（c）小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する、抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asn残基までの距離を決定する段階、ならびに
（d）以下の場合にアスパラギン（Asn）分解を起こしやすい抗体を同定する段階：
（i）該Asn残基がCDRループ1内にあり、そのCα原子が配座的に柔軟であり、かつC末端側アミノ酸残基がAsp、Pro、Thr、またはAsnである場合、
（ii）該Asn残基のCα原子が、配座的に柔軟であり、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ該Asn残基のC末端側にあるアミノ酸残基が小型である場合、または
（iii）該Asn残基のCα原子が、配座的に柔軟であり、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化が該Asn残基から3アミノ酸残基を超えて起こる場合。
[本発明1003]
以下の段階を含み、それによって、アスパラギン（Asn）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン（Asn）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）小型のC末端側アミノ酸残基を有する各抗体Fv領域内の各Asn残基に関して、骨格二面角φを決定する段階、
（d）各抗体Fv領域内の、小型のC末端側アミノ酸残基および-75.2度を上回る骨格二面角φを有する各Asn残基に関して、溶媒露出、および該Asn残基に対してN末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asn残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）前記2つ以上の抗体から、以下のAsn残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階：
（i）配座柔軟性を有するCα原子を有し、かつC末端側アミノ酸残基としてAsp、Pro、Thr、またはAsnを有する、CDRループ1内のAsn残基、
（ii）配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度未満の骨格二面角φを有し、かつ小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asn残基、または
（iii）配座的に柔軟なCα原子を有し、-75.2度を上回る骨格二面角φを有し、高度の溶媒露出を有し、かつアミノ末端側の二次構造の変化がそのAsn残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asn残基。
[本発明1004]
以下の段階を含む、アスパラギン酸（Asp）分解を起こしやすい抗体を同定するための方法：
（a）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asp残基までの距離を決定する段階、ならびに
（d）以下の場合にAsp分解を起こしやすい抗体を同定する段階：
（i）該Asp残基のCα原子が高度の配座柔軟性を有し、かつC末端側アミノ酸残基が小型である場合、または
（ii）該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、C末端側アミノ酸残基が小型であり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる場合、または
（iii）該Asp残基のCα原子が中程度の配座柔軟性を有し、C末端側アミノ酸残基がGlyであり、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化が該Asp残基から3アミノ酸残基を超えて起こる場合。
[本発明1005]
以下の段階を含み、それによって、アスパラギン酸（Asp）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択する、アスパラギン酸（Asp）安定性が向上した1つまたは複数の抗体を選択するための方法：
（a）2つ以上の抗体を用意する段階、
（b）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（c）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にあるアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（d）各抗体Fv領域内の各Asp残基に関して、該Asp残基に対してC末端側にある二次構造の変化の出現、およびこの変化が起こったアミノ酸残基から該Asp残基までの距離を決定する段階、ならびに
（e）前記2つ以上の抗体から、以下のAsp残基のうちの少なくとも1つを有する抗体を除く段階：
（i）配座的に柔軟なCα原子を有し、小型のC末端側アミノ酸残基を有する、Asp残基、
（ii）中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、小型のC末端側アミノ酸を有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から連続3アミノ酸残基未満の範囲内で起こる、Asp残基、
（iii）中程度の配座柔軟性を有するCα原子を有し、C末端側アミノ酸残基としてGlyを有し、かつカルボキシ末端側の二次構造の変化がそのAsp残基から3アミノ酸残基を超えて起こる、Asp残基。
[本発明1006]
以下の段階を含む、長期貯蔵安定性を有する抗体を選択するための方法：
（a）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、ホモロジーモデルアンサンブルを用いて、Cα原子の配座柔軟性を決定する段階、
（b）抗体Fv領域内の各Asp残基およびAsn残基に関して、該Asp残基または該Asn残基に対してC末端側のアミノ酸残基のサイズを決定する段階、
（c）Cα原子が配座的に柔軟ではなくかつ該Aspまたは該Asnが大型のC末端側アミノ酸残基を有する抗体を選択する段階。
[本発明1007]
以下の段階を含む、抗体を生産するための方法：
（a）本発明1001、1003、1005、および1006のいずれかの方法によって選択された抗体をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を培養する段階、
（b）該細胞または培養培地から該抗体を回収し、それによって該抗体を生産する段階。
[本発明1008]
前記配座柔軟性が、前記ホモロジーモデルアンサンブルにおける各Asn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）であることを特徴とする、本発明1001〜1007のいずれかの方法。
[本発明1009]
以下を特徴とする、本発明1008の方法：
（i）配座的に柔軟でないとは、RMSDが0.01Å以下のことである、
（ii）配座的に柔軟であるとは、RMSDが0.01Åを上回ることである、
（iii）中程度の配座柔軟性とは、RMSDが0.145Å〜0.485Åのことである、および
（iv）高度の配座柔軟性とは、RMSDが0.485Åを上回ることである。
[本発明1010]
前記ホモロジーモデルアンサンブルが抗体Fv断片によって作られることを特徴とする、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
小型のアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、Cys、またはAspであることを特徴とする、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
小型のアミノ酸残基がGly、Ala、Ser、またはCysであることを特徴とする、本発明1011の方法。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
モノクローナル抗体は、多様な適応症領域において最も有望なタンパク質治療薬である。モノクローナル抗体の作製のための標準的なアプローチにより、常にいくつかの適した候補が導かれる。製造時、貯蔵時、およびインビボでの分解を避けるためには、これらの候補から、化学的に安定であり、高い治療的効力を有するモノクローナル抗体を選択しなければならない。抗体はしばしば、アスパラギン（Asn）脱アミドおよびアスパラギン酸（Asp）異性化によって分解される。
【００４４】
Asn残基およびAsp残基は、先に環状のスクシンイミド中間体の形成を介する、共通の分解経路を有する（図1）（3、5、33）。スクシンイミドの形成は、Asn／Asp側鎖のγ-カルボニル基に対する後続のアミノ酸の骨格窒素による求核攻撃による、Asnの脱アミドまたはAspの脱水の後の分子内転位に起因する。準安定環状イミドは、その2つのカルボニル基のいずれか一方を加水分解して、加水分解条件および立体配座上の拘束に応じて、アスパルチル結合またはイソアスパルチル結合を種々の比で形成する（3、5、20、34〜36）。加えて、骨格カルボニル酸素による求核攻撃による環状イソイミドの形成（5、37、38）または、直接、水により促進されるAsnのAspへの加水分解（39、40）といった別の分解機序も提唱されている（10）。ほとんどはイオン交換クロマトグラフィーまたは等電点電気泳動などのチャージセンシティブな方法である、いくつかの分析方法により、分解産物、すなわちスクシンイミド、AspまたはisoAspのいずれかが検出されたことが記載されている（13、41、42）。タンパク質における分解部位の定量および位置決定のために最も適しているのは、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（LC-MS／MS）を介する分析である（12、13、38、43〜50）。
【００４５】
37種のモノクローナル抗体における部位特異的分解事象の均一な質量分析実験データセットと、ホモロジーモデルから導き出された構造パラメータとの組み合わせに基づいて、分解経路に寄与するパラメータ、および分解経路における当該パラメータ各々の寄与が同定された。化学的に安定なモノクローナル抗体の同定および選択のための方法が開発された。
【００４６】
「ホモロジーモデル」という用語は、問題のアミノ酸配列の三次元モデル（一態様においては三次元原子分解能モデル）を、関連する相同アミノ酸配列の実験的に決定された参照構造に基づいて構築することによって得られた、アミノ酸配列の三次元モデルを表す。ホモロジーモデルの作成は、問題のアミノ酸配列および同じ構造を有する可能性が高い参照アミノ酸配列における（普遍的）配列要素の決定、ならびにこれらのアミノ酸配列の（三次元）アライメントに基づく。
【００４７】
タンパク質構造は高度に保存されているため、配列類似性が高レベルであることは、通常、構造類似性がかなり高いことを意味する（Marti-Renom, M.A., et al. (2000) Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29: 291-325）。
【００４８】
一態様において、ホモロジーモデルは、以下の段階を含む方法によって作成される：
‐参照構造の選択、
‐問題の配列と参照構造とのアライメント
‐モデルの構築、および
‐モデルの評価。
【００４９】
配列のアライメントは、任意のアライメントプロトコール、例えば、FASTA、BLAST、PSI-BLASTなどを用いて行うことができる。
【００５０】
本発明の方法に用いられるホモロジーモデルは、任意のホモロジーモデル、例えばSWISS-モデル、CPHモデル、MODELER、またはLOOPERを用いて得られるモデルであってよい。一態様において、ホモロジーモデルは、MODELERアルゴリズムおよびLOOPERアルゴリズムを用いることによって得られる。
【００５１】
プログラムMODELER 9v7用の自動化ソフトウェアスクリプトを用いて、ホモロジーモデルを作成した（83）。モデリング用テンプレートは、最小分解能が2.8Åで可変領域内の内部残基を欠いていないヒト抗体、マウス抗体、およびキメラ抗体のFab断片の結晶構造からなる参照構造データベースから、配列保存性に基づいて選択した。各モノクローナル抗体に関して最も良い結果が得られたモデルを、ループ精密化手順のための基盤として用いた（LOOPER, Discovery Studio, Accelrys Inc., San Diego, USA）（84）。続いて、ループ精密化による最も可能性の高いソリューション上位5つを選択して、各モノクローナル抗体に関する構造のアンサンブルとして用いた。これらのホモロジーモデルアンサンブルから、コンピュータ計算によってパラメータを抽出した（表2）。「隣の異なるN末端側二次構造」、「隣の異なるC末端側二次構造」および「コイル内の位置」というパラメータは、Pipeline Pilot（Accelrys Inc., San Diego, USA）に実装されているブール則を用いて、周囲残基の二次構造情報から推定した。「C末端側アミノ酸残基のサイズ」は、溶媒露出表面積（SASA、85）をÅ2単位で表しており、以下の通りに定義される：Ala、64.78；Cys、95.24；Asp、110.21；Glu、143.92；Phe、186.7；Gly、23.13；His、146.45；Ile、151.24；Lys、177.37；Leu、139.52；Met、164.67；Asn、113.19；Pro、111.53；Gln、147.86；Arg、210.02；Ser、81.22；Thr、111.6；Val、124.24；Trp、229.62；Tyr、200.31。小型のC末端側アミノ酸残基は、111Å2未満のSASAを有する。大型のC末端側アミノ酸残基は、111Å2以上のSASAを有する。
【００５２】
抗体のアミノ酸配列は、各ポリペプチド鎖に関してN末端からC末端への順に提示される。アミノ酸配列において、各アミノ酸残基（N末端アミノ酸残基を除く）は、直前のアミノ酸残基を有する。この直前のアミノ酸残基は、問題のアミノ酸残基に対してN末端側に位置する。同じくアミノ酸配列において、各アミノ酸残基（C末端アミノ酸残基を除く）は後続のアミノ酸残基を有する。この後続のアミノ酸残基は、問題のアミノ酸残基に対してC末端側に位置する。したがって、「C末端側アミノ酸残基」という用語は、アミノ酸配列中で問題のAsn残基またはAsp残基のすぐC末端側にあるアミノ酸残基、すなわち、各々のAsn残基またはAsp残基に対するN末端アミド結合を有するアミノ酸残基を表す。
【００５３】
Fv領域という用語は、同族の抗体軽鎖可変ドメインと抗体重鎖可変ドメインの対を表す。
【００５４】
「カルボキシ末端側の二次構造の変化」という用語は、第1の二次構造から第2の異なる二次構造への変化を表す。「二次構造」という用語は、（α-）ヘリックス、（β-）シート、ターン、およびコイルという二次構造を表す。したがって、二次構造の変化とは、例えば、ヘリックスからシート、ターン、もしくはコイルのうちの1つへの変化、またはシートからヘリックス、ターン、もしくはコイルへの変化、またはコイルからヘリックス、シート、もしくはターンへの変化である。
【００５５】
抗体分解の部位および比率の実験的調査
37種の異なる治療用IgG1およびIgG4モノクローナル抗体のコレクションについて調べた（表1）。
【００５６】
（表１）AsnおよびAspのホットスポットの実験的コレクション。主な修飾は太字で記されている。分析したモノクローナル抗体37種のうち15種が、少なくとも1つのAsn／AspホットスポットをCDRの1つに含んでいた。
0006580570.tif 000002
iD＝異性化、suc＝スクシンイミド、dea＝脱アミド
* Aspのみが脱アミド種
‡ ホモロジーモデルによって表されないCDRグリコシル化部位との相互作用を理由としてホットスポットデータセットから除外
# 利用可能な方法（トリプシンペプチド、AspNペプチド、CID断片化、HCD断片化）では、修飾部位の証明が不可能
【００５７】
これらの抗体を、典型的な製剤pH 6.0で40℃という制御された熱ストレス下に2週間供し（ストレス試料）、その後、ストレス試料および対応する参照試料において影響を受けた残基の位置を特定するとともに、それらにおける修飾の量を定量する質量分析によって、分解事象に関して分析した。
【００５８】
37種のモノクローナル抗体のFv領域における全体で559個のAsn残基およびAsp残基のうち、60個の残基（11％）は定量可能な量の修飾を呈する。これらを19のホットスポット、13のウィークスポット、および28の反応性スポットに下位分類した。ホットスポットという用語は、ストレス試料における修飾が3％以上であることに対応し、ウィークスポットという用語は1％から最大3％未満までに対応し、反応性スポットという用語は1％未満の修飾に対応する。
【００５９】
分解部位の場所
3％以上の修飾を有する分解ホットスポットはCDRループ内に位置することが見いだされた（表1参照）。ほとんどのホットスポットは軽鎖CDR1および重鎖CDR3に位置し、一方、重鎖CDR1はホットスポットを全く含まない。分析したモノクローナル抗体37種のうち15種は、少なくとも1つのAsn／AspホットスポットをCDRの1つに含んでいた。モノクローナル抗体mAb3、mAb4、mAb9、mAb10、mAb12、mAb16、mAb18、mAb19、mAb21、mAb27、mAb28、mAb29、mAb31、mAb33、ベバシズマブ、セツキシマブ、アダリムマブ、デノスマブ、エファリズマブ、バシリキシマブ、パリビズマブ、およびパニツマブのFv領域には、ホットスポットは全く観察されなかった。
【００６０】
本明細書において報告されるすべての局面の一態様は、軽鎖CDR1および／または重鎖CDR3における脱アミド／異性化／スクシンイミド形成（またはAsn／Asp分解）ホットスポットを決定するための方法である。
【００６１】
以前の研究により、AsnおよびAspの後続のアミノ酸残基はタンパク質におけるスクシンイミド形成の比率に影響を及ぼすことが示されている（40、51）。これまでに、治療用抗体のFv領域内での化学的分解に関与する8種類の異なる配列モチーフ（Asnの後ろがGly、Ser、またはThr、および、Aspの後ろがGly、Ser、Thr、Asp、またはHis）が記載されている（10〜14、35、46、65〜73）。以前の観察所見と一致して、Asn-GlyモチーフおよびAsp-Glyモチーフは群を抜いて修飾を受けやすく、それぞれCDRモチーフ内のホットスポットの67％および36％に相当する（図2）。
【００６２】
分解部位の構造の系統的分析
抗体のFv断片におけるすべてのAsn残基およびAsp残基（すなわち、分解性および非分解性）の構造環境を、分解機序において役割があると推定される20種のパラメータのセットによって特徴づけた。最新式のホモロジーモデリング用ソフトウェアを用いてFab断片のホモロジーモデルを作成し、当該プログラムから得られたソリューションを、モデリングスコアに基づいて評価した。パラメータは、自動化手順によってインシリコでホモロジーモデルから抽出した。一般に、テンプレート構造との相同性が高ければ、フレームワーク領域および短いCDR領域の正確なホモロジーモデルを得られる。しかし、長いCDRループのモデリングではモデリングの不確定性が大きくなりやすく、その原因の一部は、そのようなループに固有の柔軟性の高さである（74〜77）。このため、すべてのCDRをループモデリング手順に供し、5つの構成要素からなるホモロジーモデルアンサンブルを得た。これと同様にして、異なる推定上のCDR立体配座に関する他の情報も、分子動力学的シミュレーションを課すことを必要とせずに取得した。構造パラメータとインビトロ分解との相関については機械学習アルゴリズムによって調べた。この予測モデルは、従来の配列モチーフに基づく方法に比較して、十分な精度および予測誤りの少なさを示すことが見いだされた。
【００６３】
Asn／Asp両方の分解ホットスポットと、安定なAsn／Asp残基とを、一次配列のみに基づいて判別することは、大きな過大予測につながりやすいことから（51）、20種の構造パラメータのセットを、これらのアミノ酸の三次元環境を反映するように同定した。これらのパラメータは以下に記載されている。それらは、分解機序におけるそれらの推定される役割に基づいて同定され（図1および3、表2）、コンピュータ計算によってホモロジーモデルアンサンブルから抽出された。
【００６４】
（表２）Asn残基およびAsp残基の二次元環境および三次元環境を定めるパラメータ。図3に示されているパラメータには星印を付している。
0006580570.tif 000003
【００６５】
環状イミド形成のための必要条件は、Asp側鎖のヒドロキシル基またはAsn側鎖のアミノ基の脱離傾向である。この傾向を推定するために、側鎖酸素原子または側鎖窒素原子に対する水素結合の数を算定した。スクシンイミド形成が起こるためには、Asp側鎖のカルボキシル基がプロトン化されていなければならない（33、78）。プロトン化状態の確度は、確立されたPROPKAアルゴリズムを用いて構造依存的なAsp pKa値を計算することによって得た（79）。後続の骨格窒素のアクセスしやすさおよび求核性の高さは、スクシンイミド形成のための別の潜在的な必要条件である（図1参照）。このため、後続の骨格窒素の溶媒露出表面積をコンピュータ計算によって決定し、水素結合の数を算定した。
【００６６】
スクシンイミド形成反応の遷移状態では、AspまたはAsnの頭部基が、後続の残基の骨格窒素に接近する必要がある。側鎖Cγ原子からNn+1原子までの距離（図1、3（61））、側鎖二面角χ1、ならびに原子Cγ、O、Nn+1、およびCの間の角度と定義した二面角CGONCを測定することによって、遷移状態様の立体配座を詳細に調査した。さらに、各AspまたはAsnの溶媒露出表面積をコンピュータ計算によって決定した。n+1側鎖はスクシンイミド形成の比率に影響を及ぼすことが示されている（3、5、16、29、33、51、52、54）。このため、後続のアミノ酸のサイズを記録し、骨格二面角φ（C'n-1-N-Cα-C'）およびψ（N-Cα-C'-Nn+1）も記録した。当該骨格二面角は、局所的構造の立体配座に関する必須の三次元情報を提供し、ひいては遷移状態の潜在的なアクセスしやすさを提供する。
【００６７】
さらに別のパラメータは、より広範な構造環境を記述している。ホモロジーモデルアンサンブルにおけるAsn／Asp残基のCα原子の根平均二乗偏差（RMSD）は、そのアンサンブル内の構造的多様性を反映し、推定上の配座柔軟性を示すものと考えられる。二次構造要素（残基がヘリックス、シート、ターン、またはコイルの中に埋め込まれている）（34、62）、ならびに隣の異なるN末端側およびC末端側の二次構造要素までの距離（51）が、追加のパラメータとして含められる。残基がコイル二次構造内に位置する場合には、コイル内でのその位置（縁または中心）について注釈を付けた。コイル先端の「ベンド」を定量するために、n-1番目およびn+1番目の残基のCα原子間の距離を測定した。最後に、Fab断片内での各残基の場所（つまり、CDRのうちの1つの中、フレームワーク内、またはCH1／CLドメイン内）を指定した。
【００６８】
分類には抗体のFv部分における残基のみを用いたが、これはCH1／CLにおけるホットスポットが全く観察されなかったのが理由である。185のホモロジーモデル（37×5つのモデル）から導き出された2460個のAsn残基およびAsp残基（492個の残基×5つのモデル）を統計分析のために用いたが、これらは95個のホットスポット（19×5つのモデル）を含み、ストレス試料では3％以上の修飾を有し、さらに397個の非ホットスポットも含む。分類器の訓練は、ランダムな75％訓練用データセット（5つの構成要素からなるアンサンブルを常に一緒に保ちながら）を用いて行い、誤りに導く分類を避けるために、末端残基ならびにウィークスポットおよび反応性スポットを除外した。ベイズ分類、再帰分割、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、正則化判別分析、およびニューラルネットワークによる検討を、ランダムな訓練セットの指定による40回の反復試験において、20種のパラメータすべてを用いて行った（図4および5）。
【００６９】
（表３）偽陽性および偽陰性Asn／Asp残基の平均数；TPR（真の陽性率）＝真の陽性の数を陽性の数で割ったもの；FPR（偽陽性率）＝偽陽性の数を陰性の数で割ったもの。
0006580570.tif 000004
【００７０】
AsnおよびAspの分類は別々に取り扱ったが、これはAsn分解が異なる機序をたどる可能性があるためである（5、37〜40）（図1）。この分離は最終的には、改良された分類スキームにつながった。5つの構成要素からなるアンサンブルの少なくとも1つの構成要素がそのように分類される場合、残基は推定ホットスポットとみなされる。9種の異なる分類モデルから最適な分類器を同定するために、二項分類系の成績を示すためによく適用される受信者動作特性曲線（ROC）分析を用いた。この場合、陽性中の真の陽性の割合（真の陽性率、TPR）を、陰性中の偽陽性の割合（偽陽性率、FPR）に対してプロットする。真の陽性率の高さを最も重要な基準として重視して、Pipeline Pilotに実装されている単一ツリー型の先読み可能な再帰分割アルゴリズムを、最も適した分類器として選択した（図4および5）。各段階で、再帰分割アルゴリズムが、1つのクラス（ホットスポットまたは非ホットスポット）に属する均質なサブセットへとデータセットを分割する最良のパラメータを選択し、ここで分割点はノードと呼ばれ、クラスはリーフと呼ばれる。組み込まれた先読み機能により、選択された分割パラメータおよび値は、その所与の段階に対してだけでなく、以降の段階に対しても至適である。これと同様にして、このモデルは、ホットスポットと非ホットスポットとを判別するために最も重要なパラメータを同定する。この分類器により、予測の目的で以後の最適化手順を行った後でさえも、高いTPR、AsnおよびAsp分解性の予測のために依然として許容されるFPR、ならびに優れたアルゴリズム解釈可能性という最良の組み合わせが得られる。
【００７１】
AsnおよびAspの単一ツリー型の先読み可能な再帰分割アルゴリズムを、新たなデータに対するモデル成績を向上させるため、および過剰適合を避けるために最適化した。このために、AsnおよびAspのツリーのプルーニングを行い、すなわち分枝を系統的に除去して、より小さいツリーを得た。プルーニングされたモデルの予測性を検討するために、それらを25％試験セットに対する40回の独立した試行によって検証した（図6）。最終的なAsnおよびAspアルゴリズムを、100％のデータによって訓練させて、対応するROCプロット（図6）およびツリーの有意味な解釈可能性に基づいて選択した。それらは、図7および8にデシジョンツリーとして表示されている。
【００７２】
ランダム化した75％訓練セットによって訓練したモデルに対する試験セット検証の40回の試行の後に、8個のAspホットスポットのうち平均0.5個は認識されず、一方、285個のAsp非ホットスポットのうち平均6.6個は偽陽性と指定された。これは、真の陽性の数（7.5）を陽性の数（8）で割ったものであるTPR 0.94に相当し、偽陽性の数（6.6）を陰性の数（285）で割ったものと定義されるFPRは0.02である（図4a）。Asnの場合には、11個のAsnホットスポットのうち平均0.6個が偽陰性と指定され（TPR＝0.95）、188個の非ホットスポットのうち8.1個は偽陽性として得られた（FPR＝0.04）（図4b）。これは、非常に過大な予測（Asp TPR＝1.0、FPR＝0.31；Asn TPR＝0.91、FPR＝0.43）に至った一次配列情報のみに基づく予測よりも、有意な改良である（図4）。
【００７３】
AspおよびAsnの分解性は、残基の柔軟性、後続残基のサイズ、および二次構造に依存する
Aspの場合、データセットは、非ホットスポットAsp残基と区別される必要のあるわずか2.7％のホットスポットからなる。デシジョンツリーの最初の2つの分割は、すべての非ホットスポットのうち93％を分離することができる（第1の分割で1105個；第2の分割で260個）。非ホットスポットは、柔軟でないか、または、その後続のカルボキシ末端側アミノ酸が大型（例えば、Pro、Thr、asn、Val、Leu、Glu、His、Gln、Ile、Met、Lys、Phe、Tyr、Arg、もしくはTrpなど）である。したがって、これから分類される残りのAspは、柔軟であり、かつ、その後ろが（Gly、Ala、Ser、Cys、またはAspであり得る）小型のアミノ酸である。これらから、最大である第1のAspホットスポットクラスが分離されるが、これは、配座柔軟性が高いこと（RMSD＞0.485Å）およびその後ろがAsp、Cys、Ser、Ala、またはGlyであることを特徴とする。これは、5つのホットスポット（それぞれ5つの構成要素）および2つの偽陽性Asp残基（それぞれ5つの構成要素）を含む。
【００７４】
次のノードでは、ホットスポットクラス2が分離される。その3つの構成要素（うち1つは5つのホモロジーモデル構成要素を有し、1つは2つの構成要素を有し、1つは1つの構成要素のみを有する）は、配座柔軟性が中程度であること（RMSDが0.145Å〜0.485Å）、その後ろがAsp、Cys、Ser、Ala、またはGlyであり得ること、およびカルボキシ末端側の二次構造の変化が連続3アミノ酸未満の範囲内にあることを特徴とする。
【００７５】
ホットスポットクラス3は、Asp-Glyモチーフ内にAsp残基があることを特徴とする。さらに、ホットスポットクラス3は、クラス2のように、配座柔軟性が中程度であること（RMSDが0.145Å〜0.485Å）、およびカルボキシ末端側の二次構造の変化が3残基を超える範囲内にあることを特徴とする。ホットスポットクラス3は、2つのホットスポット（うち1つは4つのホモロジーモデル構成要素を有し、1つは3つの構成要素を有する）および1つの偽陽性Asp（5つの構成要素）を含む。
【００７６】
Asn分解ホットスポット分類についても同様に、主な基準は、カルボキシ末端側アミノ酸のサイズおよび配座柔軟性である（図8）。Aspデータセットと比較して、非ホットスポットに対するAsnホットスポットの割合は2倍であり、5.5％に相当する。この場合も同様に、デシジョンツリーの最初の2つの分割は、非ホットスポットの大部分を分離することができる（72％；第1の分割で395個；第2の分割で320個）。非ホットスポットは、その後続のカルボキシ末端側アミノ酸が大型である（Val、Leu、Glu、His、Gln、Ile、Met、Lys、Phe、Tyr、Arg、またはTrp）か、または柔軟でない（RMSD＜0.01Å）。次の分割基準は、後続残基のサイズであり、それにより、後続残基のサイズが102.7Å2未満であるAsn残基を含む分岐、または後続残基のサイズが102.7Å2を上回るAsn残基を含む分岐の2つに至る。後者は、CDRループの場所によってさらにカテゴリー化することができる。すなわち、第1のAsnホットスポットクラスは、CDRループ1内に残基を含むことに加えて、カルボキシ末端側の残基がAsp、Pro、Thr、またはAsnであること、および柔軟でない（RMSD＞0.01Å）ことによってさらに特徴づけられる。このクラスは3つのホットスポット構成要素（それぞれ5つのホモロジーモデル構成要素）を含む。
【００７７】
後続残基のサイズが102.7Å2未満である残基は、それらの骨格二面角φによってさらに分類される。後続がGly、Ala、Ser、またはCys（102.7Å2未満）であるAsn残基は、柔軟でなく、かつそのφ角は-75.2度よりも小さく、最大である第2のホットスポットクラス2を構成する。このクラスは6つのホットスポット構成要素（うち4つは5つのホモロジーモデル構成要素を有し、1つは4つの構成要素を有し、1つは2つの構成要素を有する）を含み、4つの偽陽性（うち1つは5つのホモロジーモデル構成要素を有し、2つは3つの構成要素を有し、1つは1つの構成要素を有する）をさらに含む。
【００７８】
ホットスポットクラス3は、クラス2と同じ柔軟性および後続残基の特性によって定義されるが、その4つの構成要素（うち2つは5つのホモロジーモデル構成要素を有し、1つは3つの構成要素を有し、1つは1つの構成要素のみを有する）は、-75.2度を上回るφ角、高度の溶媒露出（SASA＞89.4Å2）（例えば、PyMOLによって計算される）、およびアミノ末端側の二次構造の変化が連続3アミノ酸超の範囲内にあることを特徴とする。2つの偽陽性Asn残基（1つおよび2つのホモロジーモデル構成要素）もこのクラスの一員である。
【００７９】
概要
治療用タンパク質におけるAsn残基およびAsp残基の自然分解は、生産時、貯蔵時、およびインビボで起こりうる。標的との結合に関与する場合、分解産物であるスクシンイミド、イソAsp、およびCDR内に埋め込まれたAspの形成は、標的への結合効力の低下、および薬物効力の低下につながる恐れがある。
【００８０】
安定性のある抗体候補の選択を容易にするために、インシリコ予測ツールを開発した。この目的のために、まず、抗体分解産物に関する定性的および定量的なデータを含む均一なデータセットを導き出した。これらの検出された修飾は、既知のホットスポット情報と一致した。
【００８１】
分解機序が起こるためには、アスパルチル残基において側鎖カルボキシル基がプロトン化されることが必要だが、これは、カルボン酸のヒドロキシル基が、対応する陰イオンよりも優れた脱離基であるためである。pHを高めることにより、後続の残基の骨格窒素原子のイオン化が促進され、それがより求核性になる。pHが6を上回る値に達すると、これらの相反的な駆動力が互いに打ち消し合う傾向を持つようになり、pH依存性は明らかには認められなくなる（81）。
【００８２】
関連するAsn分解の検出には幾分酸性のpHが最も適しているが、これはヒドロキシルイオン濃度の上昇が、方法により誘導されるpHアーチファクトと関連する分解部位とを判別できないようにする人為的に高い脱アミド率をもたらすためである（49）。
【００８３】
アルカリ性pHでの安定性試験からの情報は、幾分酸性の条件下では失われないことが見いだされている。アルカリ性pH依存性ホットスポットは発酵の過程（pH 7.4）で修飾され、参照試料およびストレス試料における分解率が同程度であり、それ故、pH 6での誘導性分解後に有意な増加はみられないことが特徴である。通常、スクシンイミド加水分解後には、Aspとイソ-Aspの混合物がさまざまな比で得られる（3、53、57）。Aspであることが示されている唯一の産物の出現は、イソイミドが生じる別の求核攻撃機序（37）を介するかまたは直接的なAsn側鎖加水分解（39）を介するスクシンイミド非依存的な分解経路が考えられることを示すものである。この現象は、トラスツズマブにおいてAsn-Thrモチーフで観察されている。
【００８４】
驚いたことに、観察されたすべてのホットスポットは、試験した抗体のCDRループに位置している（表1）。したがって、Fab断片およびFvフレームワークは安定的なスカフォールドである。本発明者らの治療用モノクローナル抗体コレクションの、天然の抗体の点からみた妥当性を評価するために、公知のAsnおよびAsp分解配列モチーフ（NG、NN、NS、NT、DG、DS、DT、DD、DH）の頻度を、本発明者らのモノクローナル抗体コレクション（KabatおよびChothiaの定義を組み合わせた（82））のCDRと、国際的なImMunoGeneTics（IMGT）情報システム（登録商標）モノクローナル抗体データベース（www.IMGT.org）由来の16286種の天然のヒトモノクローナル抗体配列（9990種のV-D-J配列および6296種のV-J配列）との間で比較した。比較したデータセットのサイズが著しく異なるにもかかわらず、AsnモチーフおよびAspモチーフが存在する頻度はかなり等しい分布であり、調べた抗体分子の配列組成に偏りがないことが示された（図2）。唯一の例外は、NTモチーフが、治療用モノクローナル抗体においてIMGTにおけるよりも2倍高い頻度で見いだされたことである。明らかに、分解にかかわる最も関連性の高いモチーフであるAsn-GlyおよびAsp-Glyは、いずれのデータセットにおいても、他の配列モチーフと比較して高い頻度では存在しなかった。
【００８５】
当技術分野において報告されているように、Asn／Asp分解性の予測は、一次配列情報および三次元構造情報に基づいて実施することができる（5、34、37、38、40、46、51、61〜64）。タンパク質におけるAsn脱アミドの予測のためのツールは、Robinson & Robinsonによって2001年に提示されている（51）。この著者らは、多種多様な実験条件下で観察されている、23種類のタンパク質における198個のAsn残基において、および61種のヒトヘモグロビン変異体における70個のAsn残基において報告されている脱アミド率を利用している。本発明者らの研究との主な違いは、（i）予測がAsnのみに対して適用可能であること、（ii）ホットスポットコレクション、それ故に予測の基盤となるものが、均一な実験的背景を持たないこと、（iii）三次元情報がホモロジーモデルではなく実験的X線構造に由来するものであること、（iv）一般ユーザーとしては、2001年までにPDBに項目として含められたタンパク質についてのみ予測が可能であること、および（v）X線情報が入手可能な場合にのみ、新たなタンパク質に対して適用可能であることである。この方法と比較して、本明細書において報告されている方法は、治療用抗体の可変領域に対して適合化されており、インシリコ計算に基づいていて、実験によるX線構造を必要としない。本明細書において報告されている方法の必要条件は、（i）抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列、（ii）ホモロジーモデリング用ツール、（iii）分子可視化用ソフトウェアスイート、ならびに（iv）本明細書において報告されている統計モデルである。誤って指定されるホットスポット（Asp 2.3％、Asn 4.3％）が、配列のみに基づく予測（Asp 31％、Asn 43％）と比較して少ないことは、時間および資源を節約する上で有利である。非ホットスポットとホットスポットとの比は、Fab断片のFv部分のみを用いて作業を進めることによって低下したが、これは可変領域のみが分解を受けやすいAsnおよびAspを含んでいたためである。CDRループ内に埋め込まれた残基のみを用いる分類は、より予測性の低い統計値につながる。
【００８６】
本明細書において、抗体分解の部位を予測するためのツールが報告され、それにより、モノクローナル抗体の可変領域における不安定なAsnおよびAspアミノ酸と安定なそれらを判別する上での主な特徴が明らかになった：高い柔軟性および小型の後続残基を有するAsn残基およびAsp残基は分解を受けやすい。それらは、二次構造要素によってさらに特徴づけることができる。驚いたことに、Cγ原子とカルボキシ末端側のアミノ酸の骨格窒素原子との距離、AspのpKa値、または側鎖二面角χ1といった、反応機序を最も直接的に示すパラメータ（図1）は、分類上、重要ではなかった。
【００８７】
本明細書において報告されている方法を用いることにより、モノクローナル抗体のより効率的な予備選択を行うことができる。さらなる開発が行われて臨床に適用される可能性のある、最も安定性が高く、同時に最も有効なリード候補分子を探索する過程において、後期での失敗を回避することができ、患者に対する最大限の利益を確保することができる。
【００８８】
ホットスポットの注意喚起に関する規則は以下の通りである：5つからなる1セットのホモロジーモデルにおいて少なくとも1つのAsn／Aspがホットスポットであると予想される場合には、当該残基それ自体をそのように分類する。ホットスポット分類に関する確率は、アンサンブルの各構成要素に関して最小0.5から最大1.0までの範囲にわたりうる。したがって、予測アウトプットは定性的であるだけでなく定量的でもあり、各構成要素がホットスポットである確率の平均に標準偏差を含めて表現される。これと同様にして、アンサンブルの1つ、2つ、3つ、4つ、または5つの構成要素がホットスポットの立体配座である場合の情報を、予測アウトプットに含めていく。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】アスパラギンおよびアスパラギン酸の分解経路。アスパラギンの脱アミドまたはアスパラギン酸の脱水は、C末端側の隣接アミノ酸のα-アミノ基による求核攻撃によって起こる。これは準安定スクシンイミド（環状イミド）中間体の形成をもたらし、それが加水分解されて、アスパルチル結合物とイソ-アスパルチル結合物との混合物になる。または、骨格カルボニル酸素による求核攻撃によって環状のイソイミド中間体が生じ、加水分解後に、入り込む水分子の攻撃箇所とは無関係にアスパルチル残基のみが生じる。アスパラギン残基は、脱アミドされ、直接、水により促進される加水分解によってAspとなることができる。標準的なアミノ酸（Asn、Asp）は黒のボックスによって囲まれている。
【図２】治療用mAbコレクションおよび天然の抗体のセット（IMGT）のCDRにおけるAsnおよびAspアミノ酸モチーフの出現。黒三角は、37種のmAbからなる実験的コレクションのAsnモチーフおよびAspモチーフ内でのホットスポットの割合（％）を示している。バーは、可変領域（上のパネル）またはCDR領域のみ（下のパネル）における全Asn残基またはAsp残基の中での、示された配列モチーフの割合（％）を表している。塗りつぶしたバーとして示された割合（％）は、分析評価した37種の治療用モノクローナル抗体の重複のないコレクションを表しており、薄いグレーの縞の入ったバーは、IMGTデータベース由来の天然抗体の9990個のV-D-J領域および6296個のV-J領域のコレクションに属する；（a）Asn配列モチーフ、（b）Asp配列モチーフ。
【図３】例示的なAsp残基における外形図を描かれた構造環境におけるAsn残基およびAsp残基を特徴づけるパラメータ。カルボキシル／アミノ基脱離傾向、遷移状態のアクセスしやすさ、Nn+1求核性、および構造環境を示すパラメータが、それぞれピンク、淡青色、紫色、および濃青色によって示されている。パラメータ名は表2に用いたものと同じである。
【図４】三次元分類器と配列に基づく予測との比較に関するROCプロットは、偽陽性率の有意な減少を示している。複数の異なる統計方法による評価を、配列のみに基づく予測と比較した。統計的分類方法に関して、偽陽性および偽陰性Asn／Asp残基の平均数は、40回の試験セット検証の結果である。TPR（真の陽性率）＝真の陽性の数を陽性の数で割ったもの。FPR（偽陽性率）＝偽陽性の数を陰性の数で割ったもの。ツリー（×）、rpart（◇）、PP（Pipeline Pilot）ツリー（●）、およびランダムフォレスト（○）は再帰分割アルゴリズムである；svm（△）、ksvm（□）はサポートベクターマシンアルゴリズムである；rda（＊）は正則化判別分析アルゴリズムである；nnet（+）はニューラルネットワークである；配列ベースとは、配列モチーフNG、NS、NT、およびDG、DS、DT、DD、DHに基づく予測である。●として示されているPipeline Pilotツリーを、プルーニングレベル4での予測アルゴリズムとして選択した；（a）アスパラギン酸の検証、（b）アスパラギンの検証。
【図５】ROCプロット（図4）の拡大図および三次元分類器の比較のための表。偽陽性および偽陰性Asn／Asp残基の平均数は40回の試験セット検証の結果である。TPR（真の陽性率）＝真の陽性の数を陽性の数で割ったもの。FPR（偽陽性率）＝偽陽性の数を陰性の数で割ったもの。ツリー、rpart、PP（Pipeline Pilot）ツリー、およびランダムフォレストは、再帰分割アルゴリズムである；svm、ksvmはサポートベクターマシンアルゴリズムである；rdaは正則化判別分析アルゴリズムである。●として示されているPipeline Pilotツリーを、プルーニングレベル4での予測アルゴリズムとして選択した；（a）アスパラギン酸の検証、（b）アスパラギンの検証。
【図６】種々のプルーニングレベルのデシジョンツリーの比較のためのROCプロット。デシジョンツリーを、Pipeline Pilot（Accelrys Inc., San Diego, USA）に実装された通りに自動的にプルーニングした。偽陽性および偽陰性Asn／Asp残基の平均数は、40回の試験セット（25％）検証の結果である。TPR（真の陽性率）＝真の陽性の数を陽性の数で割ったもの。FPR（偽陽性率）＝偽陽性の数を陰性の数で割ったもの。ツリー1〜3および5〜6は球として、ツリー4は黒三角として示されている。ツリー1はプルーニングされていないツリーモデルである。ツリー4を予測のために選択した。全体的に、プルーニングレベル検証はROCプロットに基づき、拡大部分は種々のプルーニングレベルの標準偏差の重なりを示している。
【図７】プルーニングレベル4、先読み深度4、先読み選択肢7つの、アスパラギン酸のデシジョンツリー。このモデルは1425個の非ホットスポット（白色）および40個のホットスポット（黒色）によって訓練した。ノードおよびリーフの外枠には、そこに存在するクラスの重み付き多数決により色付けした。各ノード／リーフの右側にあるバーの塗りつぶされたレベルは、データセットの割合を示している。ノード／リーフでの各クラスの割合は、円の着色割合によって示されている。主な判断基準は、配座柔軟性（RMSD）およびC末端側のアミノ酸のサイズ（後続残基のサイズ）である；白色＝非ホットスポット；黒色＝ホットスポット。
【図８】プルーニングレベル4、先読み深度4、先読み選択肢7つの、アスパラギンのデシジョンツリー。このモデルを940個の非ホットスポット（白色）および55個のホットスポット（黒色）によって訓練した。ノードおよびリーフの外枠には、そこに存在するクラスの重み付き多数決により色付けした。各ノード／リーフの右側にあるバーの塗りつぶされたレベルは、データセットの割合を示している。ノード／リーフでの各クラスの割合は、円の着色割合によって示されている。主な判断基準は、後続のアミノ酸のサイズおよび配座柔軟性（RMSD）である；白色＝非ホットスポット；黒色＝ホットスポット。
【実施例】
【００９０】
実施例および図面は本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の趣旨を逸脱することなく、示された手順に変更を加えうることは理解されるであろう。
【００９１】
材料および方法
モノクローナル抗体の出所
24種のモノクローナル抗体は、ヒトまたはヒト化IgG1またはIgG4抗体である。13種のモノクローナル抗体は市販品であり、これには、アバスチン（Avastin）（ベバシズマブ、Genentech／Roche）；CYT387（ニモツズマブ、Oncoscience、Ch.B.：911017W002）；エルビタックス（Erbitux）（セツキシマブ、Bristol-Myers Squibb and Eli Lilly and Company、ロット：7666001）；ハーセプチン（Herceptin）（トラスツズマブ、RO-45-2317／000、ロット．HER401-4、Genentech）；ヒュミラ（Humira）（アダリムマブ、Abbott, Ch.B.：90054XD10）；プラリア（Prolia）（デノスマブ、Amgen, Ch.B.：1021509）；ラプティバ（Raptiva）（エファリズマブ、Genentech、Merck Serono、ロット：Y11A6845）；レミケード（Remicade）（インフリキシマブ、Centocor, Ch.B.：0RMA66104）；シムレクト（Simulect）（バシリキシマブ、Novartis, Ch.B.：S0014）；シナジス（Synagis）（パリビズマブ、Medimmune、ロット.：122-389-12）；タイサブリ（Tysabri）（ナタリズマブ、BiogenIdec and Elan、LotA：080475）；ベクチビックス（Vectibix）（パニツムマブ、Amgen, Ch.B.：1023731）；およびゾレア（Xolair）（オマリズマブ、Genentech／Novartis, Ch.B.：S0053）が含まれる。
【００９２】
実施例1
分解が誘導された試料の作製
すべての治療用モノクローナル抗体を誘導分解に供した（ストレス試料）。2mgの各抗体を、D-Tube Dialyzers（Novagen、MWCO 6〜8kDa）において、希釈緩衝液（20mMのヒスチジン塩化物、pH 6.0）に対する4℃での一晩の透析処理にかけた。濃度を決定し（Nanodrop）、希釈緩衝液によって5mg／mlに調整した。無菌濾過（Pall Nanosep MF、0.2μm）および滅菌ねじ蓋付きチューブ内に移した後、すべてのモノクローナル抗体試料を、静止下にて40℃で2週間インキュベートした。
【００９３】
実施例2
トリプシンペプチドマッピング実験のためのモノクローナル抗体試料の調製
80μgのモノクローナル抗体参照試料およびストレス試料の変性および還元を、最終容積124.5μLの100mM Tris、5.6Mグアニジン塩酸塩、10mM TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、Pierce Protein Biology Products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）、pH 6.0中にて37℃で1時間かけて実施した。緩衝液を、0.5mlのZeba Spin Desalting Column（Pierce Protein Biology Products, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）中にて、20mMヒスチジン塩化物、0.5mM TCEP、pH 6.0に交換した。抗体1μg当たり0.05μgのトリプシン（Promega、Madison）を最終容積140μLとして添加することにより、モノクローナル抗体を37℃で一晩かけて消化した。7μLの10％ギ酸（FA）溶液の添加によって消化を停止させ、さらに分析を行うまで試料を-80℃で凍結した。
【００９４】
実施例3
液体クロマトグラフィータンデム質量分析法による修飾ペプチドの検出
消化された抗体14μgを、分離のために、Varian（Darmstadt, Germany）製のVarian Polaris 3 C18‐Etherカラム (1×250mm；粒径3μm、孔径180Å）でのRP-HPLC（Agilent 1100 Cap LC, Agilent Technologies, Boeblingen, Germany）にアプライした。さらに、mAb2、mAb14、およびニモツズマブ消化物を、RP-UPLC（ACQUITY BEH300 C18カラム、1×150mm、ビーズサイズ1.7μm、孔径300Å、Waters, Manchester, UK）によって分離した。Triversa NanoMate（Advion, Ithaca, NY, USA）を用いてHPLCまたはUPLCの溶出液を分け、陽イオンモードで動作させているLTQ Orbitrap古典的タンデム質量分析計（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）に380nL／分で注入した。RP-HPLCの移動相は、0.1％ギ酸を含む水（溶媒A）および0.1％ギ酸を含むアセトニトリル（溶媒B）からなった。HPLCは、流速60μL／分で、溶媒Bを2％から開始して、5分目から15分目までに15％に上昇させ、15分目から70分目までに32％に、70分目から80分目までに38％に、80分目から90分目までに100％に上昇させた上で、最後に92分目から110分目までに2％までに低下させる段階的な勾配を用いて実施した。UPLCは、0〜130分かけて溶媒Bを1〜40％にする直線的勾配を用いて行った。UV吸光を220nmおよび280nmで測定した。データ取得は、Xcalibur（商標）ソフトウェア（Thermo Fisher Scientific、Waltham, MA, USA）による制御下で行った。MS／MS測定に関しては、LTQにおいてヘリウムを衝突ガスとし、衝突エネルギー35％とする低エネルギーCIDによって、断片化を誘導した。mAb14およびニモツズマブに関する断片イオンに対してより高度の分解能を得るために、Orbitrapにおいて親質量リスト、単離幅3、親質量幅0.2Da、AGC Target 400000、および取得時間5000msを用いて断片化を行った。
【００９５】
実施例4
MS／MS評価のためのmAb14およびニモツズマブ試料の調製
さらなる特性決定のために、mAb14およびニモツズマブのストレス試料を以下の通りに処理した。250μgのモノクローナル抗体を、最終容積が240μLとなるように変性緩衝液（0.4 M Tris（Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）、8Mグアニジン塩酸塩（Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany）、pH 8）を添加することによって変性させた。還元は、変性緩衝液によって新たに調製した20μLの0.24Mジチオトレイトール（DTT）（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を添加して、37℃でのインキュベーションを60分間行うことによって実施した。その後、20μLの0.6Mヨード酢酸（Merck KgaA、Darmstadt, Germany）水溶液中で、暗下にて室温で15分間かけて試料をアルキル化した。余分なアルキル化試薬は、30μLのDTT溶液の添加によって失活させた。続いて、NAP5 Sephadex G-25 DNAグレードカラム（GE Healthcare, Germany）を用いて、試料の緩衝液をおよそ480μLの50mM Tris／HCl、pH 7.5に交換した。抗体1μg当たり0.03μgのトリプシン（Promega、Madison）を最終容積500μLとして添加することにより、モノクローナル抗体を37℃で5時間かけて消化した。20μLの10％ギ酸溶液の添加によって消化を停止させ、さらに分析を行うまで試料を-80℃で凍結した。
【００９６】
実施例5
修飾レベルの定量のためのデータ分析
SIEVEソフトウェア・バージョン2.0（VAST Scientific Inc., Cambridge, MA）を用いて、ストレス試料と参照試料との間の差に関してデータのプレフィルター処理を行った。決定的なSIEVE設定は、フレーム時間幅1.0分、m／z幅8.0ppm、および強度閾値50,000カウントであった。モノアイソトピック質量（prelement＝0）に関してフィルター処理したSIEVEデータを、修飾ペプチドおよび非修飾ペプチドの理論的な質量電荷比を含むモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖のインシリコでのトリプシン消化によるデータとともに、マクロ動作可能なEXCELワークブックにインポートした。該当するペプチドのm／z値のシグナル強度または保持時間の差（参照とストレスとの比較）を、マクロ動作可能なEXCELワークブック（Microsoft, Redmond, WA, USA）によって半自動的な様式で検出した。得られた76種のペプチドマップからのプレフィルター処理されたペプチドを個別に検査し、AsnおよびAsp修飾をそれらの実験的質量スペクトル内のm／z値によって検証した。定量に関しては、関心対象のペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム（XIC）を、それらのモノアイソトピック質量に基づいて作成し、Xcaliburソフトウェア（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）を用いて荷電状態を検出した。修飾ペプチドおよび非修飾ペプチドの相対量を、対応するピーク面積を個別に積分した後に計算した。さらに、推定されるホットスポットモチーフ（Asn-Gly、Asn-Thr、Asn-Ser、Asn-Asn、Asp-Gly、Asp-Thr、Asp-Ser、Asp-Asp、Asp-His）を含むCDR領域内に位置するすべてのペプチドを、データの完全性を保証するためのSIEVEソフトウェア分析の後に注意喚起が行われなかった場合であっても分析した。
【００９７】
実施例6
ホモロジーモデリングならびに二次元および三次元パラメータの抽出
ホモロジーモデルは、プログラムMODELER 9v7用の自動化ソフトウェアスクリプトを用いて作成した（83）。モデリング用テンプレートは、最小分解能が2.8Åで可変領域内の内部残基を欠いていないヒト抗体、マウス抗体、およびキメラ抗体のFab断片の結晶構造からなる参照構造データベースから配列保存性に基づいて選択した。各モノクローナル抗体に関して最も良い結果が得られたモデルを、ループ精密化法のための基盤として用いた（LOOPER, Discovery Studio, Accelrys Inc., San Diego, USA）（84）。続いて、ループ精密化による最も可能性の高いソリューション上位5つを選択して、各モノクローナル抗体に関する構造のアンサンブルとして用いた。これらのホモロジーモデルアンサンブルから、コンピュータ計算によってパラメータを抽出した（表2）。pKa値は、プログラムpropkaをpdb2pqrの一部として用いて計算した（79）。二次構造要素（シート、ヘリックス、ターン、コイル）は、Discovery Studio（Accelrys Inc.、San Diego, USA）を、個別仕様のスクリプトを用いて抽出した。「隣の異なるN末端側二次構造」、「隣の異なるC末端側二次構造」および「コイル内の位置」というパラメータは、Pipeline Pilot（Accelrys Inc., San Diego, USA）に実装されているブール則（表2）を用いて、周囲残基の二次構造情報から推定した。「コイル内の「縁」位置」は、隣の異なる二次構造要素がN末端方向またはC末端方向のいずれかに1残基または2残基隔たっている場合に指定される。「コイル内の「中心」位置」は、N末端方向およびC末端方向のいずれかについて二次構造が4残基にわたって同じであるか、または両方向において4つを上回る残基がある場合に指定される。「Fabでの場所」というパラメータは、抗体に関するChothiaおよびKabatのCDR定義の組み合わせから導き出された番号である（82）（Kabat）。「Fabでの場所」の1番は、重鎖のフレームワーク（FRH）1に対応し、2番はCDRH1に、3番はFRH2に、4番はCDRH2に、5番はFRH3に、6番はCDRH3に、7番はFRH4に、8番は軽鎖のフレームワーク（FRL）1に、9番はCDRL1に、10番はFRL2に、11番はCDRL2に、12番はFRL3に、13番はCDRL3に、そして14番はFRL4に対応する。「CDRループ」は、軽鎖および重鎖のいずれについても同じく、1から3までの範囲にわたる番号である。「後続残基のサイズ」とは、Å2単位での溶媒露出表面積（85）であり、以下の通りに定義される：Ala、64.78；Cys、95.24；Asp、110.21；Glu、143.92；Phe、186.7；Gly、23.13；His、146.45；Ile、151.24；Lys、177.37；Leu、139.52；Met、164.67；Asn、113.19；Pro、111.53；Gln、147.86；Arg、210.02；Ser、81.22；Thr、111.6；Val、124.24；Trp、229.62；Tyr、200.31。本発明者らのデータコレクションにおいて、末端残基（φおよびψを欠く）に印を付している。他のすべてのパラメータは、PyMOLにおいて自ら書いたpythonスクリプトを用いて、PDBファイルから抽出した（5）（表2）。
【００９８】
実施例7
分類評価のために用いた機械学習アルゴリズム
可能な範囲の中で最良の分類器を見いだす目的で、この種の分類課題に最も適するとされるいくつかの異なる方法、すなわち、サポートベクターマシン、再帰分割アルゴリズム、正則化判別分析、およびニューラルネットワークによる検討を行った。それらは、統計ソフトウェアRまたはPipeline Pilot（Accelrys Inc., San Diego, USA）においてパッケージとして利用可能であった。サポートベクターマシン（SVM）は、いわゆる核関数の助けを借りて、所与のデータセットをより高次元に変換する別の手段を与える。本明細書では、パッケージe1071によるsvm法（86）およびkernlabパッケージによるksvm法（87）を用いた。再帰的分割法は、その所与のデータセットをサブセットに分割し、それによってデシジョンツリーを生成することにより、パラメータを段階的な様式で同定する。アルゴリズム間の違いは、主として、所与の段階で最良の分割パラメータを判断するための方法の違いによる。「ツリー」法（88）および「rpart」法（89）をRにて用い、その際に、いくつかの異なる分割方法について検討した。出所となる訓練セットのサブセットに基づくデシジョンツリーを、いわゆるランダムフォレストと組み合わせることによって、より一般的な形態の分類器を得ることもできる。正則化判別分析では、可能な範囲の中で最良の判別を行う目的で、正則化群共分散行列を用いて、入手可能なパラメータのサブセットを組み合わせることによって分類器を作成する。この方法は、klaRパッケージ（90）に「rda」機能として実装されている。ニューラルネットワークでは、相互に接続された1つまたはいくつかのニューロン層の基本的な機能をエミュレートするための試行を行う。Rの「nnet」法（91）に実装されている、いわゆる単隠れ層ニューラルネットワークを適用した。最後に、ある特定のクラスに属し、訓練データを与えるデータ試料の確率をベイズ定理を用いて計算する確率論的な方法である単純ベイズ分類器を、Rの「NaiveBayes」法を用いて検討した。
【００９９】
ホットスポットは極めて少ないが非ホットスポットを多く有する偏りの大きいデータセットを取り扱わなければならないことから、少数のクラスをより強調するためにクラスの重みづけを導入した。クラス頻度の逆数を用い、偽陰性率を特に重視して分類誤差の点で最良のものとして、標準的な重みづけスキームを同定した。
【０１００】
実施例8
再帰分割および予測
実施例7における方法の比較評価の後で、最も成績の良かった分類アルゴリズムは、Pipeline Pilot（Accelrys Inc., San Diego, USA）における単一ツリー型の先読み可能な再帰分割アルゴリズムであった。このモデルを、ホモロジーモデルのFv領域のみに由来する残基を用いて、AsnおよびAspの予測のために別々に訓練した。すなわち、1045個のAsn残基および1520個のAsp残基を用いて訓練を実施したところ、そのうちそれぞれ60個および35個がホットスポットであり、その学習特性はホットスポットと定義された。末端残基、ならびにストレス試料における修飾率が3％未満であった残基（ウィークスポットおよび反応性スポット）は訓練から除外した。記載した20種のパラメータすべてを訓練セットに与えた。Pipeline Pilotにおける単一ツリー型再帰分割分類アルゴリズムの主な特徴は、さらに別の分割を検討することによってより優れた分類を可能にする、ある特定の「先読み」深度が指定される見込みがあることである。
【０１０１】
得られる2つの予測モデルを、新たなデータに対して適用する。ホットスポットの注意喚起に関する規則は以下の通りである：5つからなる1セットのホモロジーモデルにおいて少なくとも1つのAsn／Aspがホットスポットであると予想される場合には、残基それ自体をそのように分類する。ホットスポット分類に関する確率は、アンサンブルの各構成要素に関して最小0.5から最大1.0までの範囲にわたりうる。したがって、予測アウトプットは定性的であるだけでなく定量的でもあり、各構成要素がホットスポットである確率の平均に標準偏差を含めて表現される。これと同様にして、アンサンブルの1つ、2つ、3つ、4つまたは5つの構成要素がホットスポットの立体配座である場合の情報を、予測アウトプットに含める。
【０１０２】
参考文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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