(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミンポリペプチドの第一セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第一輸送体ポリペプチド、および少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドとを含む第一ポリペプチド構築物;ならびに
アルブミンポリペプチドの第二セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含み、
ａ）前記アルブミンの第一セグメントおよび前記アルブミンの第二セグメントが、前記アルブミンポリペプチドのループ上に存在するセグメント化部位におけるセグメント化により得られ、前記セグメント化部位において０〜３個のアミノ酸残基が欠失しており、
ｂ）前記第一輸送体ポリペプチドおよび前記第二輸送体ポリペプチドは、互いに異なり、ならびに
ｃ）前記第一および第二輸送体ポリペプチドが自己集合して、前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する、
ヘテロ多量体。
【請求項２】
前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、少なくとも６５℃の融解温度を有する、請求項１記載のヘテロ多量体。
【請求項３】
第一ポリペプチド構築物が、２つの第一カーゴポリペプチドを含む、請求項１または２記載のヘテロ多量体。
【請求項４】
前記第一カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項１〜３のいずれか一項記載のヘテロ多量体。
【請求項５】
抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する、請求項４記載のヘテロ多量体。
【請求項６】
前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドをさらに含むか、または第二ポリペプチド構築物が、２つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項７】
前記第二カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項６記載のヘテロ多量体。
【請求項８】
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する、請求項７記載のヘテロ多量体。
【請求項９】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＣＤ３に結合し、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１０】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ２に結合し、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ３に結合する、請求項６〜８のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１１】
前記第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合され、および／または前記第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１２】
セグメント化部位において０〜２個のアミノ酸残基が欠失しているか、またはセグメント化部位において０または１個のアミノ酸残基が欠失している、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１３】
前記セグメント化部位の位置が、配列番号１のアルブミンポリペプチドの配列の残基３３９および３４０の間、残基３００および３０１の間、残基３６４および３６５の間、残基４４１および４４２の間、残基１７１および１７２の間、残基２８１および２８２の間、または残基１１４および１１５の間であり、ここで、残基のナンバリングはシグナル配列の後ろの最初の残基から開始される、請求項１２記載のヘテロ多量体。
【請求項１４】
前記セグメント化部位の位置が、配列番号１のアルブミンポリペプチドの配列の残基８４および８５の間であり、ここで、残基のナンバリングはシグナル配列の後ろの最初の残基から開始され、残基８４が欠失している、請求項１２記載のヘテロ多量体。
【請求項１５】
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、リンカーを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１６】
リンカーが、ＧＧＧＧＳリンカーである、請求項１５記載のヘテロ多量体。
【請求項１７】
少なくとも１つのジスルフィド結合が、第一および第二輸送体ポリペプチドからの残基間に形成され、かつジスルフィド結合が前記アルブミンポリペプチドにおいても観察される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１８】
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号１の配列（1乃至29位のシグナル配列を除く）を有するヒト血清アルブミンである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項１９】
（ａ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号３９を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４０を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；
（ｂ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４１を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４２を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；
（ｃ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４３を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４４を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；
（ｄ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４５を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４６を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；
（ｅ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４７を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号４８を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；
（ｆ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号４９を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号５０を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；
（ｇ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号５１を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号５２を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有するか；または
（ｈ）前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号５３を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号５４を含む配列（1乃至27位のシグナル配列を除く）を有する、
請求項１記載のヘテロ多量体。
【請求項２０】
アルブミンポリペプチドの第一セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
アルブミンポリペプチドの第二セグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含み、
ａ）前記アルブミンの第一セグメントおよび前記アルブミンの第二セグメントが、前記アルブミンポリペプチドのループを除去するセグメント化により得られ、
ｂ）前記第一輸送体ポリペプチドは、前記第二輸送体ポリペプチドと異なり、
ｃ）前記第一および第二輸送体ポリペプチドの少なくとも１つがアミノ酸残基のシステインへの少なくとも１つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチドとジスルフィド結合を形成し、ここで、前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ１９４Ｃ、Ｌ１９８Ｃ、Ｗ２１４Ｃ、Ａ２１７Ｃ、Ｌ３３１ＣおよびＡ３３５Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含み、および／または前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ３３１Ｃ、Ａ３３５Ｃ、Ｖ３４３Ｃ、Ｌ３４６Ｃ、Ａ３５０Ｃ、Ｖ４５５Ｃ、およびＮ４５８Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含み、ここで、前記アミノ酸残基の位置は、成熟ヒト血清アルブミンポリペプチドの配列に関して同定される、かつ
ｄ）前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する、
ヘテロ多量体。
【請求項２１】
ａ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ２１７Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｖ３４３Ｃを含むか、
ｂ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ｌ３３１Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ａ３５０Ｃを含むか、
ｃ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ２１７Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ３６４Ｃを含むか、
ｄ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ｗ２１４Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｖ３４３Ｃを含むか、
ｅ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ３３５Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ３４６Ｃを含むか、
ｆ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ｌ１９８Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｖ４５５Ｃを含むか、
ｇ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ２１７Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｖ３３５Ｃを含むか、
ｈ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ２１７Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ３３１Ｃを含むか、
ｉ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ｌ１９８Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｎ４５８Ｃを含むか、または
ｊ）前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ１９４Ｃを含み、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｖ４５５Ｃを含む、
請求項２０記載のヘテロ多量体。
【請求項２２】
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも１つが、リンカーをさらに含む、請求項２０または２１に記載のヘテロ多量体。
【請求項２３】
リンカーが、ＧＧＧＧＳリンカーである、請求項２２記載のヘテロ多量体。
【請求項２４】
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号１の配列（1乃至29位のシグナル配列を除く）を有するヒト血清アルブミンである請求項２０〜２３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２５】
前記第一ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドをさらに含むか、または第一ポリペプチド構築物が、２つの第一カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２６】
第一カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項２５記載のヘテロ多量体。
【請求項２７】
抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する、請求項２６記載のヘテロ多量体。
【請求項２８】
前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドをさらに含むかまたは２つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項２９】
少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である、請求項２８記載のヘテロ多量体。
【請求項３０】
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２、またはＨＥＲ３に結合する、請求項２９記載のヘテロ多量体。
【請求項３１】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＣＤ３に結合し、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３２】
前記第一カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ２に結合し、かつ前記第二カーゴポリペプチドが、ＨＥＲ３に結合する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合され、および／または前記少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３４】
前記第一および第二輸送体ポリペプチドが、アルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３５】
前記ヘテロ多量体がＦｃＲｎに結合する、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３６】
前記アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記アルブミンポリペプチドの第二セグメントが、アロ−アルブミン由来である、請求項１〜１７ならびに２０〜２３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３７】
前記アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記アルブミンポリペプチドの第二セグメントが、同一型のアルブミン由来であるか、または異なる型のアルブミン由来である、請求項１〜１７ならびに２０〜２３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３８】
前記アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記アルブミンポリペプチドの第二セグメントが、哺乳動物アルブミン由来である、請求項１〜１７ならびに２０〜２３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項３９】
前記アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記アルブミンポリペプチドの第二セグメントが、非哺乳動物アルブミン由来である、請求項１〜１７ならびに２０〜２３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４０】
前記アルブミンポリペプチドの第一セグメントおよび前記アルブミンポリペプチドの第二セグメントの一方が、ヒト血清アルブミン由来であり、および他方がアロアルブミン由来である、請求項１〜１７ならびに２０〜２３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４１】
第一ポリペプチド構築物が、標的抗原に結合する少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記標的抗原が、ＩＬ−２Ｒのα−鎖（ＣＤ２５）、アミロイドベータ、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＲＳＶのＦプロテイン、Ｇ２５０、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＳＰ９０、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ，ＶＥＧＦ−Ａ、グルカゴン受容体、ＧＬＰ受容体、およびＬＤＬ受容体のうちの少なくとも１つである、請求項１〜４０のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４２】
前記第一カーゴポリペプチドが、酵素、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、化学毒素、放射性毒素、サイトカインもしくはその変異体またはその断片である、請求項１〜４１のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４３】
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に変更される、請求項１〜４２のいずれか一項記載のヘテロ多量体。
【請求項４４】
セグメント化部位で導入されるＣおよび／またはＮ末端が、ＧＧＧＧＳペプチド配列に融合される、請求項１〜４３のいずれか一項に記載のヘテロ多量体。
【請求項４５】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の有効量を含有する、癌の治療のための治療薬。
【請求項４６】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の有効量を含有する、腫瘍の増殖の抑制のための治療薬。
【請求項４７】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体の有効量を含有する、腫瘍の萎縮のための治療薬。
【請求項４８】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体をコードする、核酸または核酸のセット。
【請求項４９】
請求項４８に記載の核酸または核酸のセットを含む、ベクターまたはベクターのセット。
【請求項５０】
請求項４９に記載のベクターまたはベクターのセットを含む、宿主細胞。
【請求項５１】
請求項４８に記載の核酸または核酸のセットを発現させることを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体を製造する方法。
【請求項５２】
請求項１〜４４のいずれか一項に記載のヘテロ多量体およびアジュバントを含む薬学的組成物。
【請求項５３】
アルブミンから自己会合ポリペプチドを設計する方法であって、少なくとも１つのセグメント化部位で前記アルブミンをセグメント化して、自己集合してヘテロ多量体を形成する少なくとも２つのポリペプチドセグメントを獲得することを包含し、ここで前記ヘテロ多量体は前記アルブミンの擬似ネイティブ単量体構造を形成し、    ａ．  高度の溶媒接触表面積を有しかつ前記アルブミンの残りの構造との接触が限定されているアルブミンの少なくとも１つのループを選択するステップ、および    ｂ．  選択したループ当たり１つのセグメント化部位を導入し、少なくとも２つのポリペプチドセグメント間に相補的界面を生じるステップであり、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合うステップ、を包含する方法。
【請求項５４】
ポリペプチドセグメント間に少なくとも１つのジスルフィド結合を導入することを包含する、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
ヘテロ多量体がポリペプチドセグメント間に共有結合を含まないようセグメント化が実施されるか、またはヘテロ多量体がポリペプチドセグメント間に少なくとも１つの共有結合を含むようセグメント化が実施される、請求項５３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願６１／６７１，６４０（２０１２年７月１３日出願）、米国特許出願６１／６９７，２４５（２０１２年９月０５日出願）、米国特許出願６１／７５８，７０１（２０１３年１月３０日出願）および米国特許出願６１／８４５，９４５（２０１３年７月１２日出願）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明の技術分野は、生物学的療法のカスタム開発のための足場の合理的設計である。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
治療用タンパク質の領域において、それらの多価標的結合特徴を有する抗体は、薬剤候補の設計のための優れた足場である。これらの特徴をさらに進展させると、設計される二重特異性抗体およびその他の融合多重特異性治療薬は、二重または多重標的特異性を示し、そして新規作用様式を有する薬剤を創生する格好の機会を示す。好ましい薬物動態および機能的活性を有するこのような多価および多重特異性治療用タンパク質の開発が挑戦されてきた。
【０００４】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は成熟形態で５８５アミノ酸のタンパク質であり、血清の浸透圧に大きく関与し、また内因性および外因性リガンドの担体としても機能する。担体分子としてのアルブミンの役割およびその安定性は、ｉｎ ｖｉｖｏでのポリペプチドの担体および輸送体としての使用のための望ましい特性である。
【０００５】
ヒト血清アルブミンは、多数の望ましい特質を有する。ＨＳＡは身体全体に見出され、しかしさらに具体的には、間質空間および血中に４０ｇ／Ｌの血清濃度で見出され、これは、０．７ｍＭと等価である（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−１９０８（１９９２））。ＨＳＡは、血清の最も豊富なタンパク質であると考えられ、モル浸透圧濃度の維持に関与する。ＨＳＡは、好ましい薬物動態特性を有し、肝臓および腎臓により非常にゆっくり掃去されて、数週間までのｉｎ ｖｉｖｏ半減期を示す（Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１９０４−１９０８（１９９２）；Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．，ａｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ，ｐｐ．２５５−２７３（１９７７）；Ｓａｒａｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  ２０：１９４１−１９５２（２００９））。ＨＳＡは、酵素活性および抗原性を欠き、それにより潜在的に望ましくない副作用を排除する。ＨＳＡは、内因性ならびに外因性リガンドのための担体として作用する。ＨＳＡはまた、腫瘍の間質に浸透し、保持されることも既知である（Ｅｌｓａｄｅｋ  ａｎｄ  Ｋｒａｔｚ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ（２０１２）１５７：４−２８参照）。併せて、これらの特徴は、少なくとも部分的に、アルブミンベースの融合タンパク質に広げられ得る。その場合、治療用タンパク質により示される不十分な薬物動態特性が回避され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、多価ヘテロ多量体足場およびその設計方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様において、（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体であって；前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々が、アルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み; およびセグメント化がセグメント化部位での０〜３アミノ酸残基の欠失を生じるように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドが、セグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ；前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成するヘテロ多量体が提供される。
【０００８】
本発明の別の態様では、（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体であって；前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々が、アルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ；かつ前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成するように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドがアミノ酸残基のシステインまたはその類似体への少なくとも１つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチドとジスルフィド結合を形成するヘテロ多量体が提供される。
【０００９】
本発明の別の態様では、（ｉ）第一輸送体ポリペプチド;および（ｉｉ）ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ２またはＨＥＲ３と結合する抗原結合ポリペプチド構築物である少なくとも１つの第一カーゴポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;ならびに（ｉｉｉ）第二輸送体ポリペプチド;および（ｉｖ）少なくとも１つの第二カーゴポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体であって；前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々が、アルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ；前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成するヘテロ多量体が提供される。
【００１０】
本発明の別の態様では、本発明のヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞が提供される。
【００１１】
本発明の別の態様では、本発明のヘテロ多量体およびアジュバントを含む薬学的組成物が提供される。
【００１２】
本発明の別の態様では、癌の処置方法であって、それを必要とする患者に、本発明の薬学的組成物の有効量を提供することを包含する方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の態様では、腫瘍の増殖の抑制方法であって、本発明のヘテロ多量体の有効量と腫瘍を接触させることを包含する方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様では、腫瘍の萎縮方法であって、本発明のヘテロ多量体の有効量と腫瘍を接触させることを包含する方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様では、目的のタンパク質から自己会合ポリペプチドを設計する方法であって、少なくとも１つのセグメント化部位で前記タンパク質をセグメント化して少なくとも２つのポリペプチドセグメントを獲得し、これにより前記ポリペプチドセグメントが自己集合してヘテロ多量体を形成すること（ここで、前記ヘテロ多量体は、前記タンパク質の擬似ネイティブ単量体構造を形成する）を包含する方法であり、高度の溶媒接触表面積を有しかつタンパク質の残りの構造との接触が限定されている、目的タンパク質の少なくとも１つのループを選択するステップ；および選択ループ当たり１つのセグメント化部位を導入して、少なくとも２つのポリペプチドセグメント間に相補的界面を生じるステップ（ここで前記界面は無極性で、広大で、且つ互いに噛み合う）を包含する方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様では、本発明の方法により設計されるヘテロ多量体が提供される。
【００１７】
本発明の別の態様では、本発明の方法により設計されるヘテロ多量体を含む治療用足場が提供される。
【００１８】
多機能性ヘテロ多量体およびその設計方法が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、各ヘテロ多量体は、少なくとも１つのカーゴ分子および第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物;ならびに少なくとも１つのカーゴ分子および第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体であって；輸送体ポリペプチドが自己集合してタンパク質またはその類似体の擬似ネイティブ構造を形成するように、前記輸送体ポリペプチドは前記タンパク質のセグメント化により得られる。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子は薬剤または治療薬である。ある実施形態では、同一の性質を有する１つより多くのカーゴ分子が輸送体ポリペプチド上に存在する。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子は生体分子である。一実施形態では、少なくとも１つの生体分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡまたはポリペプチドである。一実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子はポリペプチドである。ある実施形態では、各輸送体ポリペプチドは不安定であり、少なくとも１つの他の輸送体ポリペプチドを有するヘテロ多量体を優先的に形成する。ある実施形態では、各輸送体ポリペプチドは安定であり少なくとも１つの他の輸送体ポリペプチドを有するヘテロ多量体を優先的に形成する。ある実施形態では、ヘテロ多量体化界面は少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。ある実施形態では、ヘテロ多量体化界面はジスルフィド結合を含まない。
【００１９】
ある実施形態では、少なくとも２つのポリペプチド構築物を含み、各ポリペプチド構築物が輸送体ポリペプチドと結合された少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、前記輸送体ポリペプチドがタンパク質のセグメント化により前記タンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸を含み、および前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記タンパク質またはその類似体の擬似ネイティブ単量体構造を形成するヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、ヘテロ多量体はヘテロ二量体である。一実施形態では、ヘテロ二量体は二重特異性である。一実施形態では、ヘテロ多量体は多重特異性である。ある実施形態では、ヘテロ多量体は二価である。一実施形態では、ヘテロ多量体は多価である。一実施形態では、ヘテロ多量体は多機能性である。ある実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドはアルブミンの誘導体である。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドは配列番号１のヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）に由来する。本明細書中に記載されるある実施形態では、輸送体ポリペプチドはアロアルブミン（ＨＡＡ）に由来する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドは、配列番号１のヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）と相同の配列に由来する。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドは、前記ＨＡＳが配列番号１で示されるような配列を含むヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）の断片に由来する。
【００２０】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体のいくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドはアネキシンタンパク質の誘導体である。一実施形態では、輸送体ポリペプチドは異なるアネキシンタンパク質に由来する。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドは同一のアネキシンタンパク質に由来する。一実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアネキシンＡ１またはリポコルチンＩに由来する。ヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドはすべて、配列番号１４のアネキシンＡ１に由来する。ヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは配列番号１４と相同の配列に由来する。一実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアネキシンＡ２またはアネキシンＩＩに由来する。ヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドはすべて、アネキシンＡ２またはリポコルチンＩＩに由来する。一実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアネキシン様タンパク質に由来する。ヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドはすべて、アネキシン様タンパク質に由来する。一実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは、アネキシンＡ１〜アネキシンＡ７からなる群に由来する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体の一実施形態では、輸送体ポリペプチドはすべて、アネキシンＡ１〜アネキシンＡ７、配列番号〜１４からなる群に由来する。ある実施形態では、第一アネキシンベースの輸送体ポリペプチドは配列番号１５からなる配列を有し、および第二アネキシンベースの輸送体ポリペプチドは配列番号１６からなる配列を有する。
【００２１】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体のいくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドはトランスフェリンの誘導体である。一実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはトランスフェリンに由来する。ヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは配列番号１９のトランスフェリンまたはその類似体に由来する。ヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはトランスフェリンと相同のポリペプチド配列に由来する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアポトランスフェリンに由来する。ある実施形態では、第一トランスフェリンベースの輸送体ポリペプチドは配列番号１５からなる配列を有し、および第二トランスフェリンベースの輸送体ポリペプチドは配列番号１６からなる配列を有する。
【００２２】
ヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子はカーゴポリペプチドである。本明細書中に記載されるヘテロ多量体の一実施形態では、すべてのカーゴ分子はカーゴポリペプチドである。ある実施形態では、カーゴポリペプチドは、治療用タンパク質あるいはその断片または変異体である。ある実施形態では、カーゴポリペプチドは、抗原またはその断片もしくは変異体である。ある実施形態では、カーゴポリペプチドは、抗原受容体またはその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、標的ポリペプチドに結合する抗体、抗体ドメイン、リガンドまたは受容体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは輸送体ポリペプチドと融合される。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが輸送体ポリペプチドのＮ末端に結合される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが輸送体ポリペプチドのＣ末端に結合される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは輸送体ポリペプチドと化学的に連結される。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドはＧＬＰ−１またはその断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドはグルカゴンまたはその断片もしくは変異体を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドはＥＧＦ−Ａ様ドメインを含む。
【００２３】
各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、ヘテロ多量体は多重特異性である。一実施形態では、ヘテロ多量体は二重特異性である。ヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドは同一タンパク質の誘導体である。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドはアルブミンの誘導体である。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドは配列番号１のヒト血清アルブミンに由来する。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドはアネキシンの誘導体である。一実施形態では、輸送体ポリペプチドはアネキシンＡ２の誘導体である。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドはトランスフェリンの誘導体である。
【００２４】
ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよびヒト血清アルブミンの第一セグメントを含む第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよびヒト血清アルブミンの第二セグメントを含む第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体であって；前記輸送体ポリペプチドが自己集合してアルブミンまたはその類似体の擬似ネイティブ構造を形成するヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、ヒト血清アルブミンの第一および第二セグメントは、タンパク質の非重複領域由来である。ある実施形態では、ヒト血清アルブミンの第一および第二セグメントの配列間に重複が存在する。いくつかの実施形態では、重複は５％重複である。一実施形態では、重複は１０％重複である。ある実施形態では、ヒト血清アルブミンの第一セグメントは配列番号２の配列を含み、かつヒト血清アルブミンの第二セグメントは配列番号３の配列を含む。ある実施形態では、ヒト血清アルブミンの第一セグメントは配列番号８の配列を含み、かつヒト血清アルブミンの第二セグメントは配列番号１０の配列を含む。
【００２５】
ある実施形態では、各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび配列番号２の配列を含む第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび配列番号３の配列を含む第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、各ヘテロ多量体が、少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび配列番号８の配列を含む第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび配列番号１０の配列を含む第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体が提供される。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドはアロアルブミンに由来する。ある実施形態では、両方の輸送体ポリペプチドがアロアルブミンに由来する。ある実施形態では、すべての輸送体ポリペプチドが同一アロアルブミンの誘導体である。いくつかの他の実施形態では、輸送体ポリペプチドは異なるアロアルブミンの誘導体である。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドは表２から選択されるアロアルブミンをベースにしたアロアルブミン誘導体である。ある実施形態では、第一ポリペプチド構築物は２つのカーゴポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、第二ポリペプチド構築物は２つのカーゴポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド構築物の少なくとも１つは突然変異を導入することにより改変される。ある実施形態では、導入される突然変異は、非突然変異化型の構築物と比較して、ポリペプチド構築物の機能性を改善する。ある実施形態では、導入される突然変異は、輸送体ポリペプチドの安定性、半減期およびヘテロ多量体形成のうちの１つ以上を改善する。
【００２６】
（ｉ）第一輸送体ポリペプチド;および（ｉｉ）少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;ならびに（ｉｉｉ）第二輸送体ポリペプチド;および（ｉｖ）少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体であって；前記二輸送体ポリペプチドが、前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが、前記タンパク質のセグメントと少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ前記輸送体ポリペプチドが自己集合して前記タンパク質の擬似ネイティブ構造を形成する、ヘテロ多量体が提供される。
【００２７】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、輸送体ポリペプチドがタンパク質のセグメント化による前記タンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むヘテロ多量体である。
【００２８】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、輸送体ポリペプチドがタンパク質のセグメント化による前記タンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むヘテロ多量体である。
【００２９】
ある実施形態では、ヘテロ多量体はヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。例示的実施形態では、各輸送体ポリペプチドはアルブミン誘導体である。いくつかの実施形態では、前記第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも１つは、該システインが別の輸送体ポリペプチド上のシステイン残基とジスルフィド結合を形成するように、アミノ酸残基のシスチンへの少なくとも１つの突然変異を含む。ある実施形態では、該システインが別の輸送体ポリペプチド上のシステイン残基とジスルフィド結合を形成するように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドは、アミノ酸残基のシスチンへの少なくとも１つの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドがアルブミン誘導体であり、前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ１９４Ｃ、Ｌ１９８Ｃ、Ｗ２１４Ｃ、Ａ２１７Ｃ、Ｌ３３１ＣおよびＡ３３５Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含む、ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、第二輸送体ポリペプチドは、Ｌ３３１Ｃ、Ａ３３５Ｃ、Ｖ３４３Ｃ、Ｌ３４６Ｃ、Ａ３５０Ｃ、Ｖ４５５Ｃ、およびＮ４５８Ｃから選択される少なくとも１つの突然変異を含むアルブミン誘導体である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号３５を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号３６を含む配列、またはその類似体もしくは変異体を有する、本明細書中に記載のヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号３７を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号３８を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。ある実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号３９を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号４０を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。例示的実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号４１を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号４２を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。ある実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号４３を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号４４を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。一実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号４５を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号４６を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。一実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号４７を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号４８を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。ある実施形態では、前記第一輸送体ポリペプチドは配列番号４９を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、および前記第二輸送体ポリペプチドは配列番号５０を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する。
【００３１】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは標的抗原を結合し、および前記標的抗原は、ＩＬ−２Ｒのａ−鎖（ＣＤ２５）、アミロイドベータ、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＲＳＶのＦプロテイン、Ｇ２５０、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ２／ｎｅｕ Ｒ、ＨＳＰ９０、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＶＥＧＦ−Ａ、グルカゴン受容体、ＧＬＰ受容体、およびＬＤＬ受容体のうちの少なくとも１つである。
【００３２】
各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、表２に列挙されるタンパク質あるいはその断片、変異体または誘導体から選択される。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、表２に列挙される１つ以上のタンパク質に対するリガンド、受容体または抗体、あるいは前記リガンド、受容体または抗体の断片、変異体または誘導体から選択される。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ７０、ＣＤ７４、ＣＤ７９、ＣＤ１０５、Ｃｄ１３８、ＣＤ１７４、ＣＤ２０５、ＣＤ２２７、ＣＤ３２６、ＣＤ３４０、ＭＵＣ１６、ＧＰＮＭＢ、ＰＳＭＡ、Ｃｒｉｐｔｏ、ＥＤ−Ｂ、ＴＭＥＦＦ２、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、インテグリン、メソテリン、ＥＧＦＲ、ＴＡＧ−７２、ＧＤ２、ＣＡＩＸ、５Ｔ４からなる群から選択される細胞表面抗原を標的にする。ある実施形態では、各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体であって、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが抗体またはその断片もしくは変異体であるヘテロ多量体が本明細書中で提供される。ある実施形態では、すべてのカーゴポリペプチドは抗体またはその断片もしくは変異体である。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、表２に列挙されるタンパク質と結合する抗体である。いくつかの実施形態では、抗体断片は抗体ＦｃまたはＦａｂまたはＦｖ領域を含む。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、治療的関連標的と結合する非抗体タンパク質、例えばナノボディ、アフィボディ、マキシボディ、アドネクチン、ドメイン抗体、エビボディ、アンキリン反復タンパク質、アンチカリン、カムリドあるいはリガンドタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗体またはその断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する。ある実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択される亜型である。ある実施形態では、抗体は多重特異性である。
【００３３】
各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体であって、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが治療用抗体であるヘテロ多量体が本明細書中で提供される。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、治療用抗体、あるいはその断片または変異体であり、抗体は、アバゴボマブ、アダリムマブ、アレムツズマブ、アウログラブ、バピネウズマブ、バシリキシマブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ブリアキヌマブ、カナキヌマブ、カツマキソマブ、セルトリズマブ  ペゴール、セルツキシマブ、ダクリズマブ、デノスマブ、エファリズマブ、ガリキシマブ、ゲムツズマブ  オザガミシン、ゴリムマブ、イブリツモマブ  チウキセタン、インフリキシマブ、イピィムマブ、ルミリキシマブ、メポリズマブ、モタビズマブ、ムロモナブ、ミコグラブ、ナタリズマブ、ニモツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ、オマリズマブ、パリビズマブ、パニツムマブ、ペルツズマブ、ラニズマブ、レスリズマブ、リツキシマブ、テプリズマブ、トクリズマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、プロキシニウム、レンカレックス、ウステキヌマブおよびザルツムマブから選択される。ある実施形態では、治療用抗体は、疾患関連標的抗原、例えば癌抗原、炎症性疾患抗原または代謝性疾患抗原に結合する。ある実施形態では、標的抗原は、細胞表面のタンパク質であってもよく、および細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、間質細胞、内皮細胞、血管細胞、骨髄細胞、造血細胞または癌腫細胞の群に属し得る。
【００３４】
各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴ分子、断片を含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴ分子および第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体であって、少なくとも１つのカーゴポリペプチドが、酵素、酵素阻害薬、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、放射性毒素および化学毒素、例えば、神経毒素、インターフェロン、サイトカイン融合毒素およびケモカイン融合毒素（これらに限定されない）、サイトカイン、抗体融合タンパク質またはその変異体もしくは断片であるヘテロ多量体が、本明細書中で提供される。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のいくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＧＬＰ−１またはその断片もしくは変異体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、グルカゴンまたはその断片もしくは変異体を含む。一実施形態では、少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、ＥＧＦ−Ａ様ドメインを含む。ある実施形態では、毒素は、免疫毒素、例えばデニロイキン  ジフチトックス、ならびに抗ＣＤ２２免疫毒素、例えばＣＡＴ−３８８８およびＣＡＴ−８０１５である。ある実施形態では、毒素はサポリンである。いくつかの実施形態では、毒素はマイトトキシンである。いくつかの実施形態では、毒素はジフテリア毒素である。いくつかの実施形態では、毒素はＡ型ボツリヌス毒素である。いくつかの実施形態では、毒素はリシンまたはその断片である。いくつかの実施形態では、毒素は、ＲＴＸファミリーの毒素からの毒素である。
【００３５】
各ヘテロ多量体が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一ポリペプチド構築物；ならびに少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび第二輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体であって、カーゴポリペプチドが、化学的連結、ネイティブライゲーション、化学的ライゲーション、ジスルフィド結合、あるいは直接的融合またはリンカーを介した融合により輸送体ポリペプチドと結合されるヘテロ多量体が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、カーゴ分子、例えばカーゴポリペプチドを輸送体ポリペプチドと結合するためのリンカーは、ＵＳ５４８２８５８、ＵＳ５２５８４９８およびＵＳ５８５６４５６、ＵＳ２００９０６０７２１、ＵＳ６４９２１２３、ＵＳ４９４６７７８、ＵＳ５８６９６２０、ＵＳ７３８５０３２、ＵＳ５０７３６２７、ＵＳ５１０８９１０、ＵＳ７９７７４５７、ＵＳ５８５６４５６、ＵＳ７１３８４９７，ＵＳ５８３７８４６、ＵＳ５９９０２７５、ＥＰ１０８８８８８（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されたリンカーから選択される。
【００３６】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、第一ポリペプチド構築物をコードする核酸および第二ポリペプチド構築物をコードする核酸は、単一ベクター中に存在する。ある実施形態では、第一ポリペプチド構築物をコードする核酸および第二ポリペプチド構築物をコードする核酸は、別々のベクター中に存在する。
【００３７】
ヘテロ多量体の製造方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードする核酸が発現されるよう、本明細書中に記載される宿主細胞を培養すること；および細胞培養物からヘテロ多量体を回収することを包含する方法が、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は原核生物細胞または真核生物細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。ある実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は出芽酵母である。いくつかの実施形態では、酵母はピキアである。ある実施形態では、酵母はピキア・パストリスである。いくつかの実施形態では、酵母はグリコシル化欠損性、および／またはプロテアーゼ欠損性である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は細菌細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体を発現する宿主細胞は、哺乳動物細胞である。ある実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳＯ細胞、ＣＯＳ細胞またはヒト細胞である。
【００３８】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体、ならびに薬学的に許容可能なアジュバントを含む薬学的組成物が提供される。疾患または障害に罹患している個体の処置方法であって、本明細書中に記載される処方物または薬学的組成物の有効量を個体に投与することを包含する方法も提供される。ある実施形態では、患者における癌の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、患者における免疫障害の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法が提供される。患者における感染性疾患の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法も提供される。ある実施形態では、患者における心臓血管性疾患の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、患者における呼吸器障害の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、代謝障害の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、患者における先天性副腎過形成、ゴーシェ病、ハンター症候群、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ニーマン・ピック病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、ポルフィリン症、テイ・サックス病およびウィルソン病のうちの１つ以上の処置方法であって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の治療的有効量を患者に投与することを包含する方法が提供される。癌の処置方法であって、それを必要とする患者に、本明細書中に記載される薬学的組成物の治療的有効量を提供することを包含する方法が提供される。ある実施形態では、腫瘍の増殖を抑制する方法であって、当該腫瘍を、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の有効量と接触させることを包含する方法が提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍の萎縮方法であって、当該腫瘍を、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の有効量と接触させることを包含する方法が提供される。
【００３９】
個体における目的の生体マーカーの存在を検出するためのキットであって、（ａ）本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある量であって、少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、これにより前記カーゴポリペプチドが目的の生体マーカーと結合し得るヘテロ多量体であって、前記少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含むヘテロ多量体；ならびに（ｂ）使用説明書を含むキットが提供される。
【００４０】
少なくとも２つのポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体タンパク質であって、前記ポリペプチド構築物が自己集合してヘテロ多量体を形成するように、各ポリペプチド構築物が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよびアルブミンベースのポリペプチドを含む、ヘテロ多量体タンパク質が本明細書中で提供される。
【００４１】
ある実施形態では、カーゴポリペプチドは、アルブミンまたはアロアルブミンベースの輸送体ポリペプチドと融合される。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、トランスフェリンベースの輸送体ポリペプチドと融合される。ある実施形態では、カーゴポリペプチドは、アネキシンベースの輸送体ポリペプチドと融合される。いくつかの実施形態では、融合は輸送体ポリペプチドのＮ末端である。ある実施形態では、融合は輸送体ポリペプチドのＣ末端である。いくつかの実施形態では、融合は架橋リンカーまたはスペーサー分子を含む。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、輸送体ポリペプチドと化学的に連結される。ある実施形態では、カーゴポリペプチドは、化学的ライゲーションまたはジスルフィド結合により輸送体ポリペプチドと結合される。
【００４２】
少なくとも２つのポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体タンパク質であって、各ポリペプチド構築物が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよび輸送体ポリペプチドを含み、これにより前記輸送体ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体を形成するヘテロ多量体タンパク質が、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドはアロアルブミンベースのポリペプチドであり、したがってアロアルブミンベースのポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体を形成する。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドはトランスフェリンベースのポリペプチドである。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドはアネキシンベースのポリペプチドである。ある実施形態では、各単量体輸送体ポリペプチドは不安定であり少なくとも１つの他の輸送体ポリペプチドとヘテロ多量体を優先的に形成する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体はヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは抗体、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、化学毒素、放射性毒素、サイトカインまたはその変異体もしくは断片である。いくつかの実施形態では、１つのポリペプチド構築物のカーゴポリペプチドは、別のポリペプチド構築物のカーゴポリペプチドと相乗的に機能する。
【００４４】
少なくとも２つのポリペプチド構築物を含むヘテロ多量体タンパク質であって、各ポリペプチド構築物が少なくとも１つのカーゴポリペプチドおよびアネキシンベースのポリペプチドを含み、これにより前記アネキシンベースのポリペプチドが自己集合して単量体アネキシンまたはその類似体の擬似ネイティブ構造を伴うヘテロ多量体を形成するヘテロ多量体が、本明細書中で提供される。いくつかの実施形態では、アネキシンはアネキシンＡ１である。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体はヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、抗体、酵素、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、化学毒素、放射性毒素、サイトカイン、受容体に対するリガンド、受容体またはその変異体もしくは断片である。いくつかの実施形態では、あるポリペプチド構築物のカーゴポリペプチドは、別のポリペプチド構築物のカーゴポリペプチドと相乗的に機能する。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、別のポリペプチド構築物のカーゴポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００４５】
少なくとも２つの単量体融合タンパク質を含むヘテロ二量体タンパク質であって、各単量体融合タンパク質がアルブミン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、これにより前記アルブミン由来ポリペプチドが自己集合して多機能性ヘテロ二量体を形成するヘテロ二量体タンパク質が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、アルブミン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第一単量体；およびアルブミン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第二単量体を含むヘテロ二量体タンパク質が提供される。ある実施形態では、第一単量体の少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第二単量体の少なくとも１つのカーゴポリペプチドとは異なる。ある実施形態では、第一単量体の少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第二単量体の少なくとも１つのカーゴポリペプチドと同一である。
【００４６】
ある実施形態では、少なくとも２つの単量体融合タンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質であって、各単量体融合タンパク質がアロアルブミン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、これにより前記アロアルブミン由来ポリペプチドが自己集合して多機能性ヘテロ多量体を形成するヘテロ多量体タンパク質が提供される。ある実施形態では、少なくとも２つの単量体融合タンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質であって、各単量体融合タンパク質がトランスフェリン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、これにより前記トランスフェリン由来ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体を形成するヘテロ多量体タンパク質が提供される。ある実施形態では、少なくとも２つの単量体融合タンパク質を含むヘテロ多量体タンパク質であって、各単量体融合タンパク質がアネキシン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含み、これにより前記アネキシン由来ポリペプチドが自己集合してヘテロ多量体を形成するヘテロ多量体タンパク質が提供される。ある実施形態では、アネキシンはアネキシンＡ２である。
【００４７】
ある実施形態では、アロアルブミン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物；およびアロアルブミン由来ポリペプチドと融合される少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物を含む、ヘテロ多量体タンパク質が提供される。ある実施形態では、第一ポリペプチド構築物の少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第二ポリペプチド構築物の少なくとも１つのカーゴポリペプチドとは異なる。ある実施形態では、第一ポリペプチド構築物の少なくとも１つのカーゴポリペプチドは、第二ポリペプチド構築物の少なくとも１つのカーゴポリペプチドと同一である。
【００４８】
各々が輸送体ポリペプチドを含む少なくとも２つの単量体および前記輸送体ポリペプチドと結合される少なくとも１つのカーゴ分子を任意に含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドが全タンパク質のセグメント化により得られ、したがって前記輸送体ポリペプチドが自己集合して擬似ネイティブ全タンパク質を形成するヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、ヘテロ多量体は多重特異性である。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドは抗体に由来しない。いくつかの実施形態では、各単量体は、一単量体またはホモ多量体と比較してヘテロ多量体を優先的に形成する。ヘテロ多量体の一実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子は、治療薬または生体分子である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子は、ポリペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡまたはＲＮＡから選択される生体分子である。いくつかの実施形態では、各輸送体ポリペプチドはアルブミンまたはアロアルブミンの誘導体である。一実施形態では、各輸送体ポリペプチドはアネキシンの誘導体である。ある実施形態では、各輸送体ポリペプチドはトランスフェリンの誘導体である。
【００４９】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるアルブミンベースのおよび／またはアロアルブミンベースのヘテロ多量体タンパク質、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む薬学的処方物が提供される。ある実施形態では、本明細書中に記載されるトランスフェリンベースのヘテロ多量体タンパク質、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む薬学的処方物が提供される。ある実施形態では、本明細書中に記載されるアネキシンベースのヘテロ多量体タンパク質、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む薬学的処方物が提供される。ある実施形態では、本明細書中に記載されるアネキシン−Ａ２ベースのヘテロ多量体タンパク質、および薬学的に許容可能な希釈剤または担体を含む薬学的処方物が提供される。ある実施形態では、本明細書中に記載される処方物は、キットまたは容器の一部として提供される。ある実施形態では、キットまたは容器は、治療用タンパク質の保存期限の延長に関する使用説明書とともに包装される。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、個体における疾患または疾患症候を処置し（たとえば改善し）、防止し、または診断する方法であって、個体に前記処方物を投与するステップを包含する方法に用いられる。
【００５０】
任意の当該輸送タンパク質をベースにした既知数の連結部位を有する融合タンパク質足場を獲得する方法が、本明細書中で提供される。
【００５１】
本明細書中に記載される単量体融合タンパク質をコードし発現するために本明細書中に記載される核酸分子を含有するよう修飾されたトランスジェニック生物体も、提供される。
【００５２】
[本発明1001]
（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含むヘテロ多量体であって；
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々がアルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
セグメント化がセグメント化部位での0〜3個のアミノ酸残基の欠失を生じるように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する
ヘテロ多量体。
[本発明1002]
ａ）前記セグメント化部位が、高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有し、かつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているアルブミンポリペプチドのループ上に存在し、ｂ）前記セグメント化が輸送体ポリペプチド間に相補的界面を生じ、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1003]
セグメント化が、セグメント化部位での0〜2個のアミノ酸残基の欠失を生じる本発明1001または1002のヘテロ多量体。
[本発明1004]
セグメント化が、セグメント化部位での0または1個のアミノ酸残基の欠失を生じる本発明1001または1002のヘテロ多量体。
[本発明1005]
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも1つが、リンカーをさらに含む本発明1001〜1004のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1006]
リンカーが、ＧＧＧＧＳリンカーである本発明1005のヘテロ多量体。
[本発明1007]
単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、65℃より高い融解温度を有する本発明1001〜1006のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1008]
単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、70℃より高い融解温度を有する本発明1001〜1006のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1009]
単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造が、75℃より高い融解温度を有する本発明1001〜1006のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1010]
少なくとも1つのジスルフィド結合が、第一および第二輸送体ポリペプチドからの残基全体を通して形成され、かつジスルフィド結合が前記アルブミンポリペプチドにおいても観察される本発明1001〜1009のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1011]
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号1の配列を有するヒト血清アルブミンまたはその類似体もしくは変異体である本発明1001〜1010のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1012]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号39を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号40を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1013]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号41を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号42を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1014]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号43を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号44を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1015]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号45を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号46を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1016]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号47を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号48を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1017]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号49を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号50を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1018]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号51を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号52を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1019]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号53を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号54を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1020]
前記第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも1つが、アミノ酸残基のシステインまたはその類似体への少なくとも1つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチド上の対応するシステイン残基とジスルフィド結合を形成する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1021]
前記第一および第二輸送体ポリペプチドが、アミノ酸残基のシステインへの少なくとも1つの突然変異を含み、これにより前記システインが別の輸送体ポリペプチド上のシステイン残基とジスルフィド結合を形成する本発明1020のヘテロ多量体。
[本発明1022]
前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ194Ｃ、Ｌ198Ｃ、Ｗ214Ｃ、Ａ217Ｃ、Ｌ331ＣおよびＡ335Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1021のヘテロ多量体。
[本発明1023]
前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ331Ｃ、Ａ335Ｃ、Ｖ343Ｃ、Ｌ346Ｃ、Ａ350Ｃ、Ｖ455Ｃ、およびＮ458Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1021のヘテロ多量体。
[本発明1024]
（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物;および
（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含むヘテロ多量体であって；
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々がアルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、かつ
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成するように、前記第一および第二輸送体ポリペプチドの少なくとも1つがアミノ酸残基のシステインまたはその類似体への少なくとも1つの突然変異を含み、これにより前記システインが他方の輸送体ポリペプチドとジスルフィド結合を形成する
ヘテロ多量体。
[本発明1025]
セグメント化部位が、ａ）高度の溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を有し、かつアルブミン構造の残りとの接触が限定されているアルブミンポリペプチドのループ上に存在し、ｂ）輸送体ポリペプチド間に相補的界面を生じ、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合う本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1026]
前記第一輸送体ポリペプチドが、Ａ194Ｃ、Ｌ198Ｃ、Ｗ214Ｃ、Ａ217Ｃ、Ｌ331ＣおよびＡ335Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1024または1025の単離ヘテロ多量体。
[本発明1027]
前記第二輸送体ポリペプチドが、Ｌ331Ｃ、Ａ335Ｃ、Ｖ343Ｃ、Ｌ346Ｃ、Ａ350Ｃ、Ｖ455Ｃ、およびＮ458Ｃから選択される少なくとも1つの突然変異を含む本発明1024または1025の単離ヘテロ多量体。
[本発明1028]
第一および第二輸送体ポリペプチドのうちの少なくとも1つが、リンカーをさらに含む本発明1024〜1027のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1029]
リンカーが、ＧＧＧＧｓリンカーである本発明1028のヘテロ多量体。
[本発明1030]
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号1の配列を有するヒト血清アルブミンまたはその類似体もしくは変異体である本発明1024〜1029のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1031]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号19を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号20を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1032]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号21を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号22を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1033]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号23を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号22を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1034]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号25を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号26を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1035]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号27を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号28を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1036]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号29を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号30を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1037]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号31を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号32を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1038]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号33を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号34を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1039]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号35を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号36を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1040]
前記第一輸送体ポリペプチドが配列番号37を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有し、かつ前記第二輸送体ポリペプチドが配列番号38を含む配列またはその類似体もしくは変異体を有する本発明1024のヘテロ多量体。
[本発明1041]
前記第一ポリペプチド構築物が、少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1042]
第一ポリペプチド構築物が、2つの第一カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1041のヘテロ多量体。
[本発明1043]
少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1041または1042のヘテロ多量体。
[本発明1044]
抗原結合ポリペプチド構築物が、ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2、またはＨＥＲ3に結合する本発明1043のヘテロ多量体。
[本発明1045]
前記第二ポリペプチド構築物が、少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1041〜1044のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1046]
第二ポリペプチド構築物が、2つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1045のヘテロ多量体。
[本発明1047]
少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1045または1046のヘテロ多量体。
[本発明1048]
前記少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2、またはＨＥＲ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される本発明1047のヘテロ多量体。
[本発明1049]
前記第一ポリペプチド構築物が少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記第二ポリペプチド構築物が少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1001〜1048のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1050]
前記第一カーゴポリペプチドがＣＤ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドがＣＤ19またはＣＤ20に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1049のヘテロ多量体。
[本発明1051]
前記第一カーゴポリペプチドがＨＥＲ2に結合する抗原結合ポリペプチド構築物であり、かつ前記第二カーゴポリペプチドがＨＥＲ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である本発明1050のヘテロ多量体。
[本発明1052]
前記少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1041〜1051のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1053]
前記少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1041〜1051のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1054]
（ｉ）第一輸送体ポリペプチド;および（ｉｉ）ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2またはＨＥＲ3と結合する抗原結合ポリペプチド構築物である少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドを含む第一ポリペプチド構築物、ならびに
（ｉｉｉ）第二輸送体ポリペプチド;および（ｉｖ）少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドを含む第二ポリペプチド構築物
を含むヘテロ多量体であって、
前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々がアルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含み;かつ
前記第一および第二輸送体ポリペプチドがセグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、
前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成する
ヘテロ多量体。
[本発明1055]
前記第一ポリペプチド構築物が、2つの第一カーゴポリペプチドを含む本発明1054のヘテロ多量体。
[本発明1056]
2つの第一カーゴポリペプチドが、ＣＤ3、ＨＥＲ2、ＨＥＲ3、またはＣＤ19に結合する本発明1055のヘテロ多量体。
[本発明1057]
2つの第一カーゴポリペプチドが、互いに異なる本発明1055または1056のヘテロ多量体。
[本発明1058]
前記2つの第一カーゴポリペプチドのうちの一方がＣＤ3に結合し他方がＣＤ19に結合する本発明1057のヘテロ多量体。
[本発明1059]
前記2つの第一カーゴポリペプチドのうちの一方がＨＥＲ2に結合し他方がＨＥＲ3に結合する本発明1058のヘテロ多量体。
[本発明1060]
前記第二ポリペプチド構築物が、ＣＤ3、ＣＤ19、ＣＤ20、ＨＥＲ2またはＨＥＲ3に結合する抗原結合ポリペプチド構築物である少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドを含む本発明1054〜1059のヘテロ多量体。
[本発明1061]
前記第二ポリペプチド構築物が、2つの第二カーゴポリペプチドを含む本発明1060のヘテロ多量体。
[本発明1062]
2つの第二カーゴポリペプチドが、ＣＤ3、ＨＥＲ2、ＨＥＲ3またはＣＤ19に結合する本発明1061のヘテロ多量体。
[本発明1063]
2つの第二カーゴポリペプチドが、互いに異なる本発明1061のヘテロ多量体。
[本発明1064]
前記2つの第二カーゴポリペプチドのうちの一方がＣＤ3に結合し他方がＣＤ19に結合する本発明1063のヘテロ多量体。
[本発明1065]
前記2つの第二カーゴポリペプチドのうちの一方がＨＥＲ2に結合し他方がＨＥＲ3に結合する本発明1063のヘテロ多量体。
[本発明1066]
前記アルブミンポリペプチドが、配列番号1の配列を有するヒト血清アルブミンまたはその類似体もしくは変異体である本発明1054〜1065のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1067]
前記少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドが、前記第一輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1054〜1065のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1068]
前記少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドが、前記第二輸送体ポリペプチドにリンカーで融合される本発明1054〜1065のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1069]
リンカーが、ＧＧＧＧｓリンカーである本発明1068のヘテロ多量体。
[本発明1070]
前記ヘテロ多量体がＦｃＲｎに結合する本発明1001〜1069のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1071]
少なくとも1つの輸送体ポリペプチドが、アロ−アルブミン誘導体である本発明1001〜1069のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1072]
輸送体ポリペプチドが、同一型のアルブミンポリペプチドに由来する本発明1001、1024または1025のヘテロ多量体。
[本発明1073]
輸送体ポリペプチドが、異なる型のアルブミンポリペプチドに由来する本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1074]
第一ポリペプチド構築物が標的抗原に結合する少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ第二ポリペプチド構築物が毒素部分である少なくとも1つの第二カーゴポリペプチドをさらに含む本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1075]
第一ポリペプチド構築物が標的抗原に結合する少なくとも1つの第一カーゴポリペプチドをさらに含み、かつ前記標的抗原がＩＬ−2Ｒのａ−鎖（ＣＤ25）、アミロイドベータ、抗ＥｐＣＡＭ、抗ＣＤ3、ＣＤ16、ＣＤ20、ＣＤ22、ＣＤ23、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ52、ＣＤ80、ＣＴＬＡ−4、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＲＳＶのＦプロテイン、Ｇ250、糖タンパク質ＩＩＢ／ＩＩＩａＲ、ＨＥＲ2、ＨＥＲ3、ＩＧＦ1Ｒ、ＥＧＦＲ、ＨＳＰ90、ＩｇＥ抗体、ＩＬ−12、ＩＬ−23、ＩＬ−1ｂ、ＩＬ−5、ＩＬ−6、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＩＬ，ＶＥＧＦ−Ａ、グルカゴン受容体、ＧＬＰ受容体、およびＬＤＬ受容体のうちの少なくとも1つである本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1076]
少なくとも1つのカーゴポリペプチドが、酵素、ホルモン、治療用ポリペプチド、抗原、化学毒素、放射性毒素、サイトカインまたはその変異体もしくは断片である本発明1001〜1040のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1077]
前記輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも95％の同一性を有するアミノ酸配列を含む本発明1001〜1076のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1078]
前記輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来し、各輸送体ポリペプチドが前記タンパク質のセグメントと少なくとも99％の同一性を有するアミノ酸配列を含む本発明1001〜1076のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1079]
本発明1001〜1075のいずれかのヘテロ多量体をコードする核酸を含む宿主細胞。
[本発明1080]
第一ポリペプチド構築物をコードする核酸および第二ポリペプチド構築物をコードする核酸が、単一ベクター中に存在する本発明1079の宿主細胞。
[本発明1081]
第一ポリペプチド構築物をコードする核酸および第二ポリペプチド構築物をコードする核酸が、別々のベクター中に存在する本発明1079の宿主細胞。
[本発明1082]
本発明1041〜1078のヘテロ多量体およびアジュバントを含む薬学的組成物。
[本発明1083]
それを必要とする患者に本発明1082の薬学的組成物の有効量を提供することを包含する癌の処置方法。
[本発明1084]
本発明1041〜1078のいずれかのヘテロ多量体の有効量と腫瘍を接触させることを包含する腫瘍の増殖の抑制方法。
[本発明1085]
本発明1041〜1078のいずれかのヘテロ多量体の有効量と腫瘍を接触させることを包含する腫瘍の萎縮方法。
[本発明1086]
目的のタンパク質から自己会合ポリペプチドを設計する方法であって、少なくとも1つのセグメント化部位で前記タンパク質をセグメント化して少なくとも2つのポリペプチドセグメントを獲得し、これにより前記ポリペプチドセグメントが自己集合してヘテロ多量体を形成することを包含し、ここで前記ヘテロ多量体は前記タンパク質の擬似ネイティブ単量体構造を形成し、
ａ．  高度の溶媒接触表面積を有しかつ前記タンパク質の残りの構造との接触が限定されている目的のタンパク質の少なくとも1つのループを選択するステップ、および
ｂ．  選択したループ当たり1つのセグメント化部位を導入し、少なくとも2つのポリペプチドセグメント間に相補的界面を生じるステップであり、ここで界面は無極性であり、広大で且つ互いに噛み合うステップ
を包含する方法。
[本発明1087]
ポリペプチドセグメント間に少なくとも1つのジスルフィド結合を導入することを包含する本発明1086の方法。
[本発明1088]
単量体タンパク質がアルブミンである本発明1086の方法。
[本発明1089]
ヘテロ多量体がポリペプチド間に共有結合を含まないようセグメント化が実施される本発明1086の方法。
[本発明1090]
ヘテロ多量体がポリペプチド間に少なくとも1つの共有結合を含むようセグメント化が実施される本発明1086の方法。
[本発明1091]
本発明1086の方法により設計されるヘテロ多量体。
[本発明1092]
本発明1086の方法により設計されるヘテロ多量体を含む治療用足場。
[本発明1093]
擬似ネイティブ単量体構造が、アルブミンに匹敵する熱安定性を有する本発明1024〜1078のいずれかのヘテロ多量体。
[本発明1094]
熱安定性が、擬似ネイティブ単量体構造の融解温度（Ｔｍ）を測定することにより測定される本発明1093のヘテロ多量体。
[本発明1095]
擬似ネイティブ単量体の熱安定性が、アルブミンの熱安定性の約20℃以内である本発明1094のヘテロ多量体。
[本発明1096]
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に変更される本発明1041〜1078のヘテロ多量体。
[本発明1097]
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に弱められる本発明1041〜1078のヘテロ多量体。
[本発明1098]
カーゴポリペプチドの活性が、輸送体ポリペプチドへの融合においてその非融合フォーマットに対し選択的に2〜100倍弱められる本発明1041〜1078のヘテロ多量体。
[本発明1099]
セグメント化部位で導入されるＣおよびＮ末端が、ＧＧＧＧＳペプチド配列に融合される本発明1001のヘテロ多量体。
[本発明1100]
ＧＧＧＧＳペプチド配列をセグメント化部位で導入されるＣおよびＮ末端に融合するステップをさらに包含する本発明1086の方法。
本発明の他の態様および特徴は、本発明の具体的実施形態についての以下の説明を添付の図面とともに検討すれば、当業者には明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本発明の実施形態を例証する図面において、
【図１】ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）分子の構造を示す。二次構造のαヘリックス部分を、棒として表された結合と一緒に模式的に示す。
【図２】２つのアルブミンベースのポリペプチドの界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットである。ＡＢＨ１は左の構造により表され、一方、ＡＢＨ２は右の構造により表される。
【図３】別々に発現される２つのアルブミンベースのポリペプチドを示す。２つのポリペプチドは、それぞれ明灰色および暗灰色で示されている。各ポリペプチドは、機能性カーゴタンパク質のための２つの融合部位を含み、これらの部位は球として表されている。構造中のジスルフィド残基は棒として示されている。
【図４】本明細書中に記載される多重特異性ヘテロ多量体に基づく二重特異性およびその他の多機能性治療薬の模式図である。アルブミンベースの、またはアロアルブミンベースのポリペプチドを、Ａ１およびＡ２で示す。多機能性ヘテロ多量体は、抗原結合モチーフ、サイトカインおよびその他の型のシグナル伝達分子、化学毒素、放射性毒素またはその他の機能的に関連する免疫複合体をＡ１およびＡ２上のＮおよび／またはＣ末端と結合することにより得られ、これを記号□で表す。
【図５】ヘテロ二量体Ｆｃドメイン由来の二重特異性抗体の模式図である。アルブミンまたはアロアルブミンベースのポリペプチドはＦｃのＣ末端と連結されてヘテロ二量体の形成を選択的に駆動する。
【図６】図６Ｂは、ＨＳＡベースの輸送体ポリペプチドの同時発現により形成される、全長ＨＳＡならびにヘテロ二量体足場であるアルブミンベースのヘテロ多量体−１（ＡＢＨ１）およびアルブミンベースのヘテロ多量体−２（ＡＢＨ２）の、ネイティブゲル電気泳動プロフィールを示す。図６Ａは、ＡＢＨ２、ＡＢＨ１およびＷＴ  ＨＳＡの非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールを示す。ＡＢＨ１およびＡＢＨ２の２つの断片ポリペプチドを、図の上部の比により示されるような異なるＤＮＡ比で同時発現させた。対照として、およびホモ二量体化を観察するために、断片ＡおよびＢを独立して発現させた。図６Ｃは、ＷＴ−ＨＳＡ（ｖ２２５）およびＡＢＨ２（ｖ２２１）のＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後の、初期、フロースルー、洗浄および最終溶出のネイティブゲルである。
【図７】示差走査熱量測定を用いて試験した野生型ＨＳＡならびにヘテロ二量体足場ＡＢＨ１およびＡＢＨ２の安定性を示す。
【図８】３０００ＲＵを超える平衡結合等温線３０００ｎＭ  ＦｃＲＮ  ３倍希釈シリーズを示す。図８Ｂはアルブミンを示し、図８Ａはヘテロ多量体足場ＡＢＨ１を示す。
【図９】抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよび抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ生物活性融合体を含む、多価アルブミンベースのヘテロ多量体の模式図である。
【図１０】表８に記載したヘテロ多量体ＡＢＨ２融合体の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を含有する。ゲルは、すべての構築物が予測分子量を有する妥当な複合体を形成することを示している。
【図１１】ＰＤＢ構造  １ＭＣＸに基づくアネキシン分子の構造を示す。アネキシン分子を分割することにより得られる２つの単量体は、明灰色および暗灰色単位として色分けされている。カーゴタンパク質のための融合の部位は球として表されている。
【図１２】アネキシンベースの輸送体ポリペプチド−１、およびアネキシンベースの輸送体ポリペプチド−２の界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットを示す。
【図１３】ＰＤＢ構造  １Ｈ７６に基づくトランスフェリン分子の構造を示す。トランスフェリン分子を分割することにより得られる２つの単量体は、明灰色および暗灰色単位として色分けされている。カーゴタンパク質のための融合の部位は球として表されている。
【図１４】本明細書中に記載される２つのトランスフェリンベースの輸送体ポリペプチドの界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットを示す。本明細書中で設計されるような残基位置３３０近くのスプリットトランスフェリンは、約１８００Å２の埋没表面積を有するヘテロ二量体を形成する。
【図１５−１】（図１５Ａ〜Ｄ）自己会合して擬似ネイティブ単量体アルブミンを形成するアルブミンベースの輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体を示す。輸送体ポリペプチドの各対は、他とは異なる独自の部位でのアルブミンのセグメント化により得られる。
【図１５−２】（図１５Ｅ〜Ｈ）同上
【図１５−３】（図１５Ｉ〜Ｌ）同上
【図１５−４】（図１５Ｍ〜Ｐ）同上
【図１６】それぞれ、ＡＢＨ２およびＡＢＨ１の構造を提供する。両図は、ａ）アルブミンベースのタンパク質を作成するためのＷＴ−ＨＳＡにおける切断部位の位置、ｂ）新規のＣ'およびＮ'切断部位の位置ならびにｃ）多数の後述の実施例で利用される、ＡＢＨ１およびＡＢＨ２の両方を示す簡略化した円を包含する。
【図１７】ＡＢＨ２に結合され得る抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖの種々の１、２、３および４価立体配置を示す。対照は、ＡＢＨ２足場、抗ＨＥＲ  ｓｃＦｖ、単腕Ｆｃおよび２価Ｆｃを包含した。さらに、Ｈｅｒ２を発現するＳＫＯＶ細胞に結合する種々のＡＢＨ２構築物の能力が表内にＫＤ値で示されている。
【図１８Ａ】図１８Ａは、４つの抗Ｈｅｒ３×Ｈｅｒ２負荷構築物（ｖ１０８７、ｖ１０８８、ｖ１０８９およびｖ１０９０）の、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞への結合曲線を示す。ＦＩＴＣ標識化抗ＨＳＡ抗体とともにＦＡＣＳを用いて、細胞に対する親和性を評価した。下左のグラフは線形スケールでの濃度を示し、一方、下右は対数スケールである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、前記４つの構築物の、ＳＫＯＶ−３細胞への結合曲線を示す。下左のグラフは線形スケールでの濃度を示し、一方、下右は対数スケールである。
【図１９−１】（図１９Ａ〜Ｂ）ヒト血清における４つの抗Ｈｅｒ２（ｖ５１９、ｖ５２０、ｖ５１８およびｖ５１７）装填ＡＢＨ２の安定性を実証する。ＦＩＴＣ標識化抗ＨＳＡ抗体とともにＦＡＣＳを用いて、ＳＫＯＶ−３細胞に対する結合親和性を評価した。
【図１９−２】（図１９Ｃ〜Ｄ）同上
【図２０Ａ】ｖ１０８７（ＭＭ−１１１）対照と比較した場合の、二重特異性抗Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３  ＡＢＨ２（ｖ１３７８）のＦｃＲｎに対する結合親和性を示す。グラフは、経時的にＲｅｓｐ．  Ｄｉｆｆ．として表される２つの化合物の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）曲線を表す。
【図２０Ｂ】同上
【図２１】３つの温度（３７℃、室温および４℃）で５日間インキュベートされたＡＢＨ２足場（ｖ２２１）および一価抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２（ｖ５１７）の両方のネイティブゲルプロフィールを示す。
【図２２Ａ】図２２Ａは、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後の、トータル、フロースルー、洗浄および溶出画分のネイティブゲルプロフィールを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ゲル濾過カラムに適用されたＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製後のＷＴ−ＨＳＡのクロマトグラムである。異なるピークは異なるタンパク質産物を表す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、ゲル濾過カラムへの適用により分画された、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後のＷＴ−ＨＳＡのクロマトグラムである。
【図２３Ａ】ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製およびゲル濾過後のＷＴ−ＨＳＡ（ｖ２２５）の液体クロマトグラフィー分析のクロマトグラムである。
【図２３Ｂ】図２３Ｂ〜２３Ｅは、画分に分離されゲル濾過ＬＣにより分析された、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後の、それぞれＡｌｂｕＣＯＲＥ足場  １（ｖ２２５）、３（ｖ１６３６）、６（ｖ１６３８）および９（ｖ１６４０）のクロマトグラムである。
【図２３Ｃ】同上
【図２３Ｄ】同上
【図２３Ｅ】同上
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後のアルブミン足場（ｖ２２１）のゲル濾過ＬＣ分析を表す。ＣＨＯ細胞における一過性同時発現により発現産物をスケールアップした。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、同じ変異体の非還元型（−ＤＴＴで示される）および還元型（＋ＤＴＴで示される）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールを示す。
【図２５Ａ】図２５Ａは、ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後のＷＴ−ＨＳＡおよびＡｌｂｕＣＯＲＥ−Ａタンパク質のトータル、フロースルー、洗浄および最終溶出画分のネイティブゲルプロフィールを表す。
【図２５Ｂ−１】図２５Ｂは、同じ２つのタンパク質のＬＣ／ＭＳ分析を表す。
【図２５Ｂ−２】同上
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＡＢＨ２における４つの末端間の空間的分離の程度を示す図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、正常抗体分子の可変領域間の空間的分離の程度を実証する比較図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、他の抗原結合のための異なる且つ可変的な末端間距離を有する４つのＡｌｂｕＣＯＲＥ足場を示す。
【図２７】ＡｌｂｕＣＯＲＥ足場１、３、６および９のＤＳＣ融解曲線を示す。各グラフにおいて、各アルブミンベースの足場の曲線および融点を、ＷＴ  ＨＳＡの曲線および７５℃の融点と比較する。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＷＴ−ＨＳＡまたは継ぎ合わせたアルブミン足場上の抗ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性二価ヘテロ多量体を模式的に示したものである。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、追加の一価抗ＣＤ３ヘテロ多量体構築物ならびに一価および多価の両方の抗ＣＤ１９ヘテロ多量体構築物を模式的に表す。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、各々が懸濁増殖ヒトＣＨＯ系で発現された後の、前記構築物の非還元型ＰＡＧＥゲルを表す。
【図２９】ＷＴ−ＨＳＡまたは継ぎ合わせたアルブミン足場における４つの抗ＣＤ３×ＣＤ１９二重特異性二価ヘテロ多量体のＫａおよびヒル勾配測定値を提供する。結合試験は、ＦＡＣＳを用いて分析した場合のＪｕｒｋａｔまたはＲａｊｉ細胞に結合する変異体の能力を評価した。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＢｉＴＥ様対照（ｖ８９１）、抗ＣＤ３×ＣＤ１９アルブミンベースのヘテロ多量体（ｖ１０９２）および抗ＣＤ３×ＣＤ１９  Ｈｅｔ−Ｆｃ−ベースのヘテロ多量体（ｖ８７３）のＦＡＣＳ細胞集団グラフを示す。ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ細胞への結合を評価した。
【図３０Ｂ−１】図３０Ｂは、アルブミン対照（ｖ２２１）と比較した場合の、３つの前記構築物の追加のＦＡＣＳグラフを示す。
【図３０Ｂ−２】同上
【図３１】図３１Ａは、Ｃｏ２＋アフィニティーを用いた精製の前、最中および後のｖ２１８発現産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図３１Ｂは、ゲル濾過による追加の精製後の同じ構築物のクロマトグラムである。
【図３２】その三次元構造から導かれるヒト血清アルブミンにおける残基のサブセットによりなされる残基接触のプロット。
【図３３】ヒト血清アルブミンにおける選択ホットスポット残基により達成される接触および相互作用の性質のプロット。
【図３４】ヒト血清アルブミンにおけるホットスポット残基またはホットスポット残基のクラスター（パッチ）の構造表示。
【図３５】導入システイン残基を含むいくつかのアルブミンベースのヘテロ多量体の発現を実証するゲルを示す。
【図３６Ａ】図３６Ａは、ヘテロ多量体変異体  １６３５、１６３８、１６３９および１６４１の発現を示す非還元型ゲルを提供する；図３６Ｂは、ヘテロ多量体変異体  １６３４、１６３６、１６３７、１６４０、および２２１の発現を示す非還元型ゲルを提供する。ＣＨＯ細胞を以下のＤＮＡ比でトランスフェクトした：比Ａ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  １００％：０％；比Ｄ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ６６％：３４％；比Ｂ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ５０％：５０％；比Ｈ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ３４％：６６％；および比Ｆ＝プラスミドＡ：プラスミドＢ  ０％／１００％。
【図３６Ｂ】同上
【発明を実施するための形態】
【００５４】
詳細な説明
治療用タンパク質の領域において、二重特異性分子は、二元的標的特異性を示し、あるいは薬剤作用のために必要な時空間的機構を提供することにより、多数の機能的役割を同時に実施し得る。一態様において、二重特異性分子は、治療作用方式が腫瘍細胞のような標的に対してエフェクター細胞または分子を再標的化することを包含する場合、特に興味深い［Ｍｕｌｌｅｒ  Ｄ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  Ｒ．Ｅ．（２０１０）Ｂｉｏｄｒｕｇｓ  ２４，８９−９８］。安定かつ均質な条件での好ましい薬物動態および機能的活性を有する二重特異性治療用タンパク質の開発は困難な課題である。多数のアプローチを用いて、多数の抗原結合ドメインから二重特異性単位を編成する試みがなされてきた。これらの技術は、ヘテロ多量体抗体ＩｇＧ分子を用いること、Ｆｏｓ／Ｊｕｎ対などのロイシンジッパータンパク質または抗体中の可変ドメインの軽鎖および重鎖の交互組織化から集合されるその他の足場を用いることを包含している。ＫｉｐｒｉｙａｎｏｖとＬｅ  Ｇａｌｌは、種々の二重特異性構築物の設計を概説している［Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  Ｓ．Ｍ．＆Ｌｅ  Ｇａｌｌ  Ｆ．（２００４）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｄｅｖ  ７，２３３−２４２］。突然変異が抗体のＣＨ３ドメインに導入されてヘテロ二量体を達成し、それゆえ１分子中に２つの独自の抗原結合部位を導入するヘテロ二量体抗体ＩｇＧ分子の使用は、この構築物の天然免疫グロブリン様構造のために、非常に魅力的である。さらに、この抗体のＦｃ部分はエンドサイトーシス・サルベージ経路を媒介する新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との相互作用に関与し、これは抗体分子の血清半減期が改善されたためであると考えられる［Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  Ｄ．＆Ａｋｉｌｅｓｈ  Ｓ．（２００７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，７１５−７２５］。他方で、抗体ベースの二重特異性分子は、二重特異性抗体のＦｃ部分を介して導入される共存エフェクター活性の結果としての強力なサイトカイン応答のため、臨床試験において問題があった［Ｗｅｉｎｅｒ  Ｌ．Ｍ．；Ａｌｐａｕｇｈ  Ｒ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４２，１４１−１５０］。これは、二重特異性および免疫複合体分子の設計を手助けし得る新規の足場の必要性を強調している。
【００５５】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）タンパク質は、血液の最も豊富な構成成分であって、約４０ｍｇ／ｍｌの濃度で血清中の総タンパク質の６０％近くを占めている。アルブミンは、循環系における最長寿タンパク質の１つでもあり、半減期は約１９日である。興味深いことに、抗体分解を防止するＦｃＲｎ分子に依存する同じエンドサイトーシス・サルベージ経路は、ＨＳＡ分子とも相互作用することが知られている［Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  Ｃ．；Ｍｅｈｎａｚ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９７，３１５−３２２］。
【００５６】
ＨＳＡ（図１に示されている）は、非グリコシル化５８５−残基単一ポリペプチドタンパク質であり、このタンパク質の三次元構造はカーターと共同研究者等によりＸ線結晶法を用いて最初に観察された［Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．＆Ｈｏ，Ｊ．Ｘ．（１９９４）Ａｄｖ  Ｐｒｏｔ  Ｃｈｅｍ  ４５，１５３−２０３で概説］。ＨＳＡタンパク質は、遺伝子複製に帰因する３つの相同ドメイン：ＤＩ、ＤＩＩ、ＤＩＩＩからなり、これは他の種の血清アルブミンにも共通の特徴である［Ｇｒａｙ  Ｊ．Ｅ．＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ．Ｆ．（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  １，２８９−３０２］。３つのドメインの各々は、発現され、別々に特性化され、そして独立して安定であることが示されている［Ｄｏｃｋａｌ  Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ  Ｄ．Ｃ．＆Ｒｕｋｅｒ  Ｆ．（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，２９３０３−２９３１０］。各ドメインは１０のらせんセグメントで構成され、そしてらせん間の統合に基づき各ドメインはさらに、それぞれヘリックス１〜６および７〜１０からなる２つのサブドメインに分類される。ＨＳＡは合計１７のジスルフィド結合を有し、連結を形成するこれらのすべてのシステイン対は個々のドメイン内にある。概して、ＨＳＡは、多数のジスルフィド結合ならびに大部分のらせんフォールディングのため、非常に安定である。多数の種に渡るアルブミン分子の配列同一性は非常に大きく、ヒト、ウマ、ウシ、ラット等に由来するアルブミンｃＤＮＡの間では７０％より大きい［Ｃａｒｔｅｒ，Ｄ．Ｃ．＆Ｈｏ，Ｊ．Ｘ．（１９９４）Ａｄｖ  Ｐｒｏｔ  Ｃｈｅｍ  ４５，１５３−２０３］。
【００５７】
機能的プロテオミクスの領域におけるタンパク質−タンパク質相互作用を理解するためのセンサーとして、スプリットタンパク質対が用いられている。当該アプローチは、再構成して活性なネイティブ様タンパク質を形成し得る適切なセグメントをタンパク質から同定することを含む。新規のスプリットタンパク質を生成することは技術的に困難である。機能的に有用な方法でスプリットされるべきタンパク質に関して、セグメント化部位は、互いに会合される際に擬似ネイティブタンパク質へと効率的に再構成する２つのセグメントを産生しなければならない。さらに、製造収率および精製が経済的であるよう、構成成分タンパク質セグメントは、溶液中にとどまり相手セグメント（partner segments）と選択的に会合するため十分に可溶性であるべきである。単量体ネイティブタンパク質に類似する擬似ネイティブ構造を形成するために再結合するスプリットタンパク質セグメントを得ることは、非常に困難な課題である［Ｔａｆｅｌｍｅｙｅｒ  Ｐ．，Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  Ｎ．＆Ｊｏｈｎｓｓｏｎ  Ｋ．Ｃｈｅｍ  ＆  Ｂｉｏｌ  １１，６８１−６８９］。このようなスプリットタンパク質は、過去において、タンパク質治療薬の設計において、あるいはカーゴ送達ビヒクルとして、用いられたことはなかった。
【００５８】
本発明は、（ｉ）第一輸送体ポリペプチドを含む第一単量体;ならびに（ｉｉ）第二輸送体ポリペプチドを含む第二単量体を含むヘテロ多量体であって；前記第一および第二輸送体ポリペプチドの各々が、アルブミンポリペプチドのセグメントと少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含み;および前記第一および第二輸送体ポリペプチドが、セグメント化部位での前記アルブミンポリペプチドのセグメント化により得られ、前記輸送体ポリペプチドが自己集合して単量体形態の前記アルブミンポリペプチドの擬似ネイティブ構造を形成するヘテロ多量体を提供する。一実施形態では、セグメント化部位は、高度の溶媒接触表面積（ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ：ＳＡＳＡ）を有し残りのアルブミン構造との接触が限定されているアルブミンポリペプチドのループ上に存在し、ｂ）輸送体ポリペプチド間に相補的界面を生じる（ここで前記界面は無極性で、広大で、且つ互いに噛み合う）ように選択される。このようなヘテロ多量体は、野生型アルブミンの安定性に匹敵する安定性を示す。第一および第二単量体は、少なくとも１つのカーゴポリペプチドをさらに含み得る。前記の少なくとも１つのカーゴポリペプチドを含むヘテロ多量体は、疾患の処置のための治療薬として用いられ得る。
【００５９】
定義
本発明は、本明細書中に記載される特定のプロトコール、細胞株、構築物および試薬に限定されず、このようなものとして変化し得る、と理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するために過ぎず、本発明の範囲を限定するよう意図されず、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、ということも理解されるべきである。
【００６０】
本明細書中で用いる場合、そして添付の特許請求の範囲において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、そうでないことが明らかに示されない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば「ＨＳＡ」、「ＨＡ」、「アルブミン」、「ヒト血清アルブミン」および種々の大文字の、ハイフンでつないだ、そしてハイフンなしの形態に対する言及は、１つ以上のこのようなタンパク質への言及であり、当業者に既知のその変異体、誘導体、断片、等価物等を含む。
【００６１】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似の、または等価の任意の方法、装置および材料が本発明の実行または試験に用いられ得るが、好ましい方法、装置および材料をここに記載する。
【００６２】
本明細書中で記述される出版物および特許はすべて、例えば、本明細書中に記載される本発明とともに用いられ得る出版物中に記載される構築物および方法を記載し、開示する目的のために、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。本明細書中で考察される出版物は、本出願の出願日前に、それらの開示のために提供されるだけである。本発明人等は、以前の発明に基づいて、または任意の他の理由のためにこのような開示に先行するよう授与されない、ということの承認として意図されるべきことは、本明細書中にはない。
【００６３】
「ヘテロ多量体」または「ヘテロ多量体ポリペプチド」は、第一輸送体ポリペプチドを含む少なくとも１つの第一単量体および第二輸送体ポリペプチドを含む第二単量体を含む分子であって、第二ポリペプチドが少なくとも１つのアミノ酸残基により第一ポリペプチドとアミノ酸配列が異なる分子である。ヘテロ多量体は、第一および第二輸送体ポリペプチドにより形成される「ヘテロ二量体」を含み得る。ある実施形態では、ヘテロ多量体は、より高次の三次構造、例えば三量体および四量体（これらに限定されない）を形成し得る。いくつかの実施形態では、第一および第二輸送体ポリペプチドのほかに輸送体ポリペプチドが存在する。ある実施形態では、ヘテロ多量体を形成するための輸送体ポリペプチドの集合は、表面積の埋没により駆動される。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を優先することおよび／またはホモ多量体形成に不利であることによりヘテロ多量体形成を駆動する静電相互作用および／または塩橋相互作用によって、互いに作用する。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を優先することおよび／またはホモ多量体形成に不利であることにより、互いに作用する。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドは共有結合形成により互いに作用する。ある実施形態では、共有結合は、天然に存在するかまたは導入されたシステイン間に形成されヘテロ多量体形成を駆動する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、単量体間に共有結合は形成されない。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を優先することおよび／またはホモ多量体形成に不利であることによりヘテロ多量体形成を駆動するパッキング／サイズ相補性／ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ／隆起−空洞型相互作用により、互いに作用する。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドは、ヘテロ多量体形成を優先することおよび／またはホモ多量体形成に不利であることによりヘテロ多量体形成を駆動するカチオン・パイ相互作用により、互いに作用する。ある実施形態では、個々の輸送体ポリペプチドは溶液中で単離された単量体として存在し得ない。ある実施形態では、ヘテロ多量体は、単量体と比較して、個々の輸送体ポリペプチドの好ましい状態である。
【００６４】
「二重特異性の」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばヘテロ多量体、単量体、タンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質またはペプチド複合体を含むよう意図される。例えば、いくつかの実施形態では、分子は、（ａ）細胞表面標的分子および（ｂ）エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体と結合するか、相互作用し得る。本明細書中に記載のヘテロ多量体のある実施形態では、異なる結合特異性を有する２つのカーゴ分子を同一輸送体ポリペプチドに取り付けることにより形成される少なくとも１つの単量体が二重特異性である。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、異なる特異性を有する少なくとも２つのカーゴ分子を輸送体ポリペプチドに取り付けることにより形成されるヘテロ多量体は、それ自体二重特異性である。「多重特異性分子」または「ヘテロ特異性分子」という用語は、２つより多い異なる結合特異性を有する任意の作用物質、例えばタンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質またはペプチド複合体を含むよう意図される。例えば、分子は、（ａ）細胞表面標的分子、例えば細胞表面抗原（これに限定されない）、（ｂ）エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体、そして（ｃ）少なくとも１つのその他の構成成分、と結合するかまたは相互作用し得る。したがって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の実施形態は、二重特異性、三重特異性、四重特異性およびその他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、これらの分子は、ＣＤ３０などの細胞表面抗原に関するものであり、ならびにその他の標的、例えばエフェクター細胞上のＦｃ受容体に関する。
【００６５】
別記しない限り、「多価の」という表現は、標的分子のための結合の少なくとも２つの部位を含むヘテロ多量体を意味するために、本明細書全体を通して用いられる。多価ヘテロ多量体は、所望の標的のための多数結合部位を有するよう設計される。ある実施形態では、結合部位は、輸送体ポリペプチドと結合される少なくとも１つのカーゴ分子上にある。ある実施形態では、少なくとも１つの結合部位は輸送体ポリペプチド上にある。「二価の」という表現は、２つの標的結合部位を含むヘテロ多量体を意味するために、本明細書全体を通して用いられる。二価ヘテロ多量体のある実施形態では、両結合部位は同一単量体上にある。「三価の」という表現は、３つの標的結合部位を含むヘテロ多量体を意味するために本明細書全体を通して用いられる。「四価の」という表現は、４つの標的結合部位を含むヘテロ多量体を意味するために本明細書全体を通して用いられる。
【００６６】
「融合タンパク質」およびポリペプチドは、本来は別個のポリペプチドをコードする２つ以上の遺伝子を繋ぐことにより作成される。この融合遺伝子の翻訳は、元のポリペプチドの各々に由来する機能特性を有する単一ポリペプチドを生じる。本明細書中に記載されるヘテロ多量体の実施形態では、少なくとも１つの単量体は、輸送体ポリペプチドのＮまたはＣ末端への少なくとも１つのカーゴポリペプチドの融合により形成される融合タンパク質を含み得る。
【００６７】
「実質的に精製された」という用語は、その天然環境、すなわちネイティブ細胞、またはある実施形態では組換え的に産生されたヘテロ多量体の場合には宿主細胞、において見出されるような、普通はタンパク質を伴うかまたはタンパク質と相互作用する構成成分を実質的にまたは本質的に有し得ない本明細書中に記載されるヘテロ多量体、またはその変異体を指し、細胞物質を実質的に有さず約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量で）の夾雑タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む本明細書中に記載されるヘテロ多量体、またはその変異体を指す。ヘテロ多量体またはその変異体が宿主細胞により組換え的に産生される場合、タンパク質は、ある実施形態では、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％またはそれ未満で存在する。ヘテロ多量体またはその変異体が宿主細胞により組換え的に産生される場合、タンパク質は、ある実施形態では、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌまたはそれ未満で培地中に存在する。ある実施形態では、本明細書中に記載される方法により産生される「実質的に精製された」ヘテロ多量体は、適切な方法、例えばＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣおよびキャピラリー電気泳動により測定して、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、厳密には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より厳密には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％またはそれ以上の純度レベルを有する。
【００６８】
「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入のために用いられる方法、例えば直接取り込み、形質導入、ｆ−接合、または組換え宿主細胞を作成するために当該技術分野で既知のその他の方法とは関係なく、外来性ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えばプラスミドとして保持されてもよく、または、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。
【００６９】
本明細書中で用いる場合、「培地」または「培地（複数）」という用語は、任意の宿主細胞、例えば細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、大腸菌またはシュードモナス宿主細胞、および細胞内容物を支持または含有し得る任意の培養媒質、溶液、固体、半固体または剛性支持体を含む。したがって、当該用語は、宿主細胞が増殖された培地、例えばタンパク質が分泌された培地、例えば増殖段階の前または後の培地を包含する。当該用語はまた、本明細書中に記載されるヘテロ多量体が細胞内で産生されかつ宿主細胞が溶解または崩壊されてヘテロ多量体を放出する場合のように、宿主細胞溶解物を含有する緩衝液または試薬も包含する。
【００７０】
「リフォールディング」は、本明細書中で用いる場合、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを不適正にフォールディングされた状態または非フォールディング状態から、ジスルフィド結合に関してネイティブまたは適正にフォールディングされた立体配置へと変換する任意の過程、反応または方法を表す。
【００７１】
「コフォールディング」は、本明細書中で用いる場合、具体的には、互いに相互作用する少なくとも２つの単量体ポリペプチドを用い、非フォールディングまたは不適正にフォールディングされたポリペプチドをネイティブな、適正にフォールディングされたポリペプチドへと変換させるリフォールディング過程、反応または方法を指す。
【００７２】
本明細書中で用いる場合、「調整された血清半減期」という用語は、本明細書中に記載されるヘテロ多量体により含まれるカーゴポリペプチドの、そのネイティブ形態と比較した場合の、循環半減期における正のまたは負の変化を意味する。血清半減期は、ヘテロ多量体の投与後、いくつかの時点で血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を決定することにより測定される。血清濃度と時間の相関は、血清半減期の算定を可能にする。増大された血清半減期は望ましくは少なくとも約２倍であるが、例えば十分な用量投与レジメンを可能にするか毒性作用を回避する場合は、より小さな増大が有用であり得る。いくつかの実施形態では、増大は、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍である。
【００７３】
「調整された治療的半減期」という用語は、本明細書中で用いる場合、本明細書中に記載されるヘテロ多量体により含まれる治療的有効量のカーゴポリペプチドの、その非修飾化形態と比較した場合の、半減期における正のまたは負の変化を意味する。治療的半減期は、投与後のいくつかの時点で、分子の薬物動態および／または薬力学的特性を測定することにより測定される。増大された治療的半減期は望ましくは、特定の有益な用量投与レジメン、特定の有益な総用量を可能にし、あるいは望ましくない作用を回避する。いくつかの実施形態では、増大された治療的半減期は、効力増大、修飾された分子とその標的との結合の増大または減少、プロテアーゼなどの酵素による分子の分解の増大または減少、あるいは別のパラメーターまたは非修飾化分子の作用機序における増大または減少あるいは分子の受容体媒介性クリアランスの増大または減少に起因する。
【００７４】
「単離された」という用語は、核酸またはタンパク質に適用される場合、核酸またはタンパク質が、天然状態でそれと会合する細胞構成成分のうちの少なくともいくつかを有さないことを意味し、あるいは核酸またはタンパク質がそのｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ産生の濃度より高いレベルに濃縮されていることを意味する。それは均質状態であり得る。単離された物質は、乾燥または半乾燥状態であってよく、あるいは溶液、例えば水溶液（これに限定されない）中に存在し得る。それは追加の薬学的に許容可能な担体および／または賦形剤を含む薬学的組成物の構成成分であり得る。純度または均質度は、典型的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を用いて決定される。調製物中に存在する優勢種であるタンパク質は、実質的に精製される。特に、単離された遺伝子は、遺伝子に隣接しおよび当該遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じることを意味する。特に、それは、核酸またはタンパク質が、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％またはそれ以上純粋であることを意味する。
【００７５】
「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドならびにそのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、当該用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体、を含有する核酸を包含する。具体的に限定しない限り、当該用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデート等）を含むオリゴヌクレオチド類似体も指す。別記しない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換（これに限定されない））および相補配列ならびに明白に示される配列も無条件に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択（またはすべての）コドンの第三位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００７６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。すなわち、ポリペプチドに向けられる記述は、ペプチドの記述およびタンパク質の記述に等しく当てはまり、その逆も言える。当該用語は、天然アミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が非天然コード化アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書中で用いる場合、当該用語は、全長タンパク質を包む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結される。
【００７７】
「アミノ酸」という用語は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）、ならびにピロリシンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を有する化合物を指し、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合される炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどである。このような類似体は、修飾化Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾化ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸への言及は、例えば、天然タンパク質原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学修飾化アミノ酸、例えばアミノ酸変異体および誘導体；天然非タンパク質原性アミノ酸、例えばβ−アラニン、オルニチン等；ならびにアミノ酸に特徴的であることが当該技術分野で既知の特性を有する化学合成化合物、を包含する。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖中に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、ならびに側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基に置換されるアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成非ネイティブアミノ酸、置換アミノ酸または１つ以上のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸を本発明のタンパク質中に組み入れることは、多数の異なる意味で有益であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有同等物と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性増大を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み入れるペプチドなどの構築は、より大きな細胞内安定性が所望されるかまたは必要とされる場合、特に有用であり得る。さらに具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに抵抗性であり、それにより、分子の生物学的利用能改善、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの寿命延長が望ましい場合そのような特性を提供する。さらに、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞に対する主要組織適合複合体クラスＩＩ制限提示のために効率的にプロセシングされ得ず、したがって、生物体全体における体液性免疫応答を誘導しにくい。
【００７８】
アミノ酸は、それらの一般的に既知の３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎに推奨される１文字記号により、本明細書中で言及され得る。同様にヌクレオチドは、一般に認められている１文字暗号により言及され得る。
【００７９】
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾変異体」は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の指定タンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンは、コード化ポリペプチドを変更することなく表される対応コドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、「サイレント変異」であって、これは、保存的修飾変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のすべての考え得るサイレント変異を表す。核酸における各コドン（ただし、ＡＵＧは、普通はメチオニンに関する唯一のコドンであり、ＴＧＧは、普通はトリプトファンに関する唯一のコドンである）は修飾されて、機能的に同一の分子を産生し得る、と当業者は理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は各記載配列に潜在する。
【００８０】
アミノ酸配列に関しては、コード化配列中の単一アミノ酸または小部分のアミノ酸を変更、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的修飾変異体」であって、ここで変更によりアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる、と当業者は理解する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。このような保存的修飾変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子のほかに存在し、それらを排除しない。
【００８１】
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。以下の８群は、各々、互いに関して保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３参照）。
【００８２】
「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況では、同一である２つ以上の配列または亜配列を指す。配列が比較され、および比較ウィンドウ全体、または指定領域での最大対応のために整列される際に以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または手動整列および目視検査により測定されるように、配列は、それらが、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ（すなわち、特定領域に亘って約５０％同一性、約５５％同一性、６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一性）を有すると、「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸または７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長である領域全体に、あるいは特定されない場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全配列を通して存在し得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト以外の種からのホモログを含み、本発明のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識化プローブを用いる厳しいハイブリダイゼーション条件下でのライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに全長ｃＤＮＡおよび前記ポリヌクレオチド配列を含有するゲノムクローンを単離するステップを包含する工程により獲得され得る。このようなハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知である。
【００８３】
配列比較のために、典型的には１つの配列が参照配列としての役割を果たし、これに対し試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列はコンピューターに入力され、必要であればサブ配列配置が指定され、および配列アルゴリズムプログラムパラメーターが指定される。デフォルトプログラムパラメーターが用いられてもよく、あるいは他のパラメーターが設計され得る。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列と比較した試験配列に関する配列同一性パーセントを算定する。
【００８４】
「比較ウィンドウ」は、本明細書中で用いる場合、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続位置の数のうちのいずれか１つのセグメントに対する言及を含み、ここで２つの配列が最適に整列された後にある配列が同数の連続位置の参照配列と比較され得る。比較のための配列の整列方法は当業者に既知である。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  （１９７０）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２ｃの局所的相同アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ  （１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の相同アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  （１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性に関する検索により、これらのアルゴリズムのコンピューター処理履行により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、あるいは手動アラインメントおよび目視検査により（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９５  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）参照））実行され得るが、これらに限定されない。
【００８５】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ワールド・ワイド・ウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．で利用可能な国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーター  Ｗ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）  １１、期待値（Ｅ）  １０、  Ｍ＝５、  Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関しては、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長  ３および期待値（Ｅ）  １０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）  ５０、期待値（Ｅ）  １０、  Ｍ＝５、  Ｎ＝−４および両鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑度」フィルターを遮断して実施される。
【００８６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然起きる確率の指標を提供する。例えば、ある核酸は、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小和確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満である場合、参照配列と類似してるとみなされる。
【００８７】
「〜と選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（例えば総細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、厳しいハイブリダイゼーション条件下でそのヌクレオチド配列だけに分子が結合し、二重化し、またはハイブリダイズすることを指す。
【００８８】
「厳しいハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野で既知であるように、低イオン強度および高温の条件下での、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の核酸、あるいはその組合せの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、厳しい条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（例えば、総細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中のその標的亜配列とハイブリダイズするが、複合混合物中の他の配列とはハイブリダイズしない。厳しい条件は配列依存性であり、異なる環境では異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。
【００８９】
本明細書中で用いる場合、「真核生物」という用語は、系統学的ドメインの真核生物に属する生物体、例えば動物（例えば、哺乳動物、昆虫、爬虫類、鳥類等（これらに限定されない））、繊毛虫類、植物（例えば、単子葉類、双子葉類、藻類等（これらに限定されない））、真菌、酵母、鞭毛虫類、微胞子虫類、原生動物等を指す。
【００９０】
本明細書中で用いる場合、「原核生物」という用語は、原核生物体を指す。例えば、非真核生物体は、真正細菌（例えば、大腸菌、高度高熱菌、バシルス・ステアロサーモフィルス、蛍光菌、緑膿菌、シュードモナス・プチダ等（これらに限定されない））系統学的ドメイン、または古細菌（例えば、メタン細菌（メタノコッカス・ヤナシイ）、メタン生成菌（メタノバクテリウム・サーモオートフィクム）、ハロバクテリウム属、例えばハロフェラックス・ヴォルカニイおよびハロバクテリウム種ＮＲＣ−１、アーケオグロブス・フルギズス、ピロコッカス・フリオズス、ピロコッカス・ホリコシ、エウロピエム・ペルニックス等（これらに限定されない））系統学的ドメインに属し得る。
【００９１】
「被験体」という用語は本明細書中で用いる場合、動物を指し、いくつかの実施形態では哺乳動物を指し、および他の実施形態ではヒトを指し、処置、観察または実験の対象である。動物は、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ等）、農場動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）または実験室動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）であり得る。
【００９２】
「有効量」という用語は、本明細書中で用いる場合、投与されているヘテロ多量体の量を指し、これは、処置されている疾患、症状または障害の徴候のうちの１つ以上をある程度まで軽減する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体を含有する組成物は、予防的、増強的および／または治療的処置のために投与され得る。
【００９３】
「増強する」または「増強すること」という用語は、所望の作用の効力または持続期間を増強するかまたは延長することを意味する。したがって、治療薬の作用を増強することに関しては、「増強する」という用語は、系に及ぼす他の治療薬の作用を、効力または持続時間において、増大するかまたは延長する能力を指す。「増強する有効量」は本明細書中で用いる場合、所望の系における別の治療薬の作用を増強するのに適切な量を指す。患者に用いる場合、この使用のために有効な量は、疾患、障害または症状の重症度および経過、以前の療法、患者の健康状態および薬剤に対する応答、ならびに処置医の判断によって決まる。
【００９４】
「修飾された」という用語は、本明細書中で用いる場合、所定のポリペプチドに対してなされる任意の変化、例えばポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造、ポリペプチドの同時翻訳修飾、または翻訳後修飾に対する変化を指す。「(修飾された)」形態という用語は、検討されているポリペプチドが任意に修飾されることを意味し、すなわち、検討中のポリペプチドは修飾されてもよくあるいは非修飾であってもよい。
【００９５】
「翻訳後に修飾された」という用語は、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾を指し、それがポリペプチド鎖中に組み入れられた後にそのようなアミノ酸に対して起こる。当該用語は、単なる例として、同時翻訳的ｉｎ ｖｉｖｏ修飾、同時翻訳的ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾（例えば、無細胞翻訳系における）、翻訳後ｉｎ ｖｉｖｏ修飾、および翻訳後ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾を包含する。
【００９６】
「セグメント化」という用語は元のタンパク質配列の精確な内部継ぎ合わせを指し、これによりヘテロ多量体として優先的に会合して擬似ネイティブタンパク質構造を形成するタンパク質配列の「セグメント」を生じる。あるいは、セグメント化は、１つより多いアミノ酸残基の欠失を包含する。一実施形態では、欠失は１つのアミノ酸残基である。別の実施形態では、欠失は２つのアミノ酸残基である。別の実施形態では、欠失は３つのアミノ酸残基である。
【００９７】
擬似ネイティブ単量体構造
単量体ネイティブタンパク質またはその構造に関連して、擬似ネイティブタンパク質および／または「擬似ネイティブ構造」または擬似ネイティブ単量体構造は、単量体ネイティブタンパク質のセグメント由来のポリペプチドのヘテロ多量体集合体であり、したがって前記ヘテロ多量体集合体は単量体ネイティブタンパク質に匹敵する機能および構造特質を提示する。いくつかの実施形態では、セグメントは、他の分子実体も含むポリペプチド構築物の構成成分である。例えばＸ線結晶学により得られた一つの構造をタンパク質のネイティブ構造とみなしているが、タンパク質は天然には動的分子であり構造的立体配置の集合を示。擬似ネイティブ構造は、集合体における代替的な構造的立体配置のひとつに似ているとみなされ得る。異なる面では、相同タンパク質配列または共通の構造ファミリーに属するタンパク質は、同様の構造幾何学外形に折りたたまれる傾向がある。このファミリーに属する成員タンパク質は、互いに関して擬似ネイティブ構造を達成すると考えられる。タンパク質ファミリーにおける独特の配列のいくつかはまた、類似の機能的属性を示し、それゆえ互いに関して擬似ネイティブタンパク質として言及され得る。その各々が輸送体ポリペプチド構成成分を有する２つ以上のタンパク質構築物からなるここで記載されるヘテロ多量体の場合、輸送体ポリペプチドは集合して、輸送体ポリペプチドが由来するタンパク質のネイティブ単量体形態のタンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する。この場合の参照ネイティブタンパク質は各輸送体ポリペプチドが由来する単量体タンパク質であり、参照ネイティブ構造は輸送体ポリペプチドが由来するタンパク質の構造である。２つ以上の異なるポリペプチドが自己集合して、それ自体は単量体であるネイティブタンパク質に匹敵する構造的および機能的特質を有するヘテロ二量体を形成する場合を記載する。いくつかの実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも５０％を有する。いくつかの実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも６０％を有する。具体的実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも７５％を有する。いくつかの実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも８０％を有する。特定の実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも９０％を有する。いくつかの実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも９５％を有する。いくつかの実施形態では、集合ヘテロ多量体は、単量体ネイティブタンパク質の活性の少なくとも９９％を有する。ある実施形態では、自己集合してネイティブアルブミン様構造特質および／またはＦｃＲｎ、ＳＰＡＲＣおよび／またはｇｐ６０結合などの機能特質を示すヘテロ多量体を形成するように、アルブミンまたはアロアルブミン由来の輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質から得られるアミノ酸セグメントと少なくとも７５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質から得られるアミノ酸セグメントと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。例示的実施形態では、輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質から得られるアミノ酸セグメントと少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。具体的実施形態では、輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質から得られるアミノ酸セグメントと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質から得られるアミノ酸セグメントと少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質から得られるアミノ酸セグメントと少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、ネイティブ単量体タンパク質は、哺乳動物アルブミンあるいはその誘導体または類似体である。ある実施形態では、ネイティブ単量体タンパク質はヒト血清アルブミンである。ある実施形態では、自己集合してネイティブトランスフェリン様構造および機能特質を示すヘテロ多量体を形成する、トランスフェリン由来のポリペプチドセグメントが提示される。ある実施形態では、自己集合してアネキシン様構造および機能特質を示すヘテロ多量体を形成する、アネキシン由来のポリペプチドセグメントが提示される。これらのヘテロ多量体は擬似ネイティブであると言及される。
【００９８】
輸送体ポリペプチド
本明細書中で用いる場合、「輸送体ポリペプチド」または「輸送体ポリペプチド」または「輸送体ペプチド」または「輸送体」という用語は、前記輸送体ポリペプチドが溶液中で他のこのような輸送体ポリペプチドをとヘテロ多量体タンパク質を形成できるようなポリペプチドであって、前記ヘテロ多量体タンパク質が、少なくとも１つの輸送体ポリペプチドが由来する単量体タンパク質の擬似ネイティブ構造を有するような、ポリペプチドを指す。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、すべての輸送体ポリペプチドは同一アルブミンまたはアロアルブミンに由来する。ある他の実施形態では、ヘテロ多量体は、種々のアルブミンおよびアロアルブミンタンパク質由来の輸送体ポリペプチドにより形成される。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、輸送体ポリペプチドはトランスフェリンに由来する。本明細書中に記載されるヘテロ多量体のある実施形態では、すべての輸送体ポリペプチドはアネキシンタンパク質に由来する。ある実施形態では、ヘテロ多量体は、同一アネキシンタンパク質に由来する輸送体ポリペプチドにより形成される。いくつかの実施形態では、ヘテロ多量体は、異なるアネキシンタンパク質に由来する輸送体ポリペプチドにより形成される。一実施形態では、ヘテロ多量体はアネキシンＡ２由来の輸送体ポリペプチドにより形成される。
【００９９】
ある実施形態では、輸送体ポリペプチドは単量体全タンパク質のセグメントであって、この場合、前記セグメントはヘテロ多量体を形成するために集合し、したがって前記ヘテロ多量体はネイティブ単量体全タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する。一実施形態では、輸送体ポリペプチドはベータ・バレルタンパク質からのセグメントである。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも８０％の同一性を有する、アミノ酸配列を含むヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。ある実施形態では、集合してネイティブ単量体タンパク質と類似の擬似ネイティブ構造を形成する輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体であって、各輸送体ポリペプチドがネイティブ単量体タンパク質のセグメントと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ヘテロ多量体が提供される。いくつかの実施形態では、ネイティブ単量体タンパク質はβ−プロペラタンパク質である。いくつかの実施形態では、ネイティブ単量体タンパク質は、ヘリックスバンドルタンパク質である。実施形態において、輸送体ポリペプチドは、例えば、亜鉛フィンガーモチーフ、へリックス・ターン・へリックスモチーフまたはベータ・ヘアピンモチーフを含むタンパク質（これらに限定されない）から生成される。いくつかの実施形態では、輸送体ポリペプチドは、構造的に安定でありかつ好ましい生物学的特性を有する非免疫原性タンパク質から得られ���セグメントを含む。
【０１００】
輸送体ポリペプチドは、セグメント化部位でのタンパク質のセグメント化によるタンパク質に由来する。セグメント化部位は、以下の２つの決定基準に基づいて設計される。
【０１０１】
第一に、セグメント化部位が、相対的ＳＡＳＡが高くかつ残りのタンパク質構造との接触が限定されているタンパク質内のループ上に存在するよう、セグメント化部位は選択される。一実施形態では、セグメント化部位は、柔軟で且つ接近可能であるループ中に存在する。別の実施形態では、セグメント化部位は、タンパク質コア安定性にあまり寄与せず、したがって無傷タンパク質構造と比べ集合擬似ネイティブタンパク質構造の安定性にあまり影響を与えないループ中に存在する。
【０１０２】
第二に、セグメント化部位により輸送体ポリペプチド間に相補的界面を生じる（この場合、前記界面は無極性で、広大で、且つ互いに噛み合う）よう、セグメント化部位は選択される。界面の無極性は界面における無極性アミノ酸の数に関連する。当該技術分野で既知であるように、アミノ酸は極性および無極性残基として大きく分類され得る。極性残基は溶媒環境中で水と好都合に相互作用するが、一方タンパク質中の無極性残基は水とはエネルギー的に有利に接触しない。この理由により、タンパク質中の無極性残基は他の無極性残基とクラスター化してそれらの局所的環境から水分子を排除する傾向があり、このことがエネルギー的に好ましい。無極性残基が関与するこのような相互作用は、疎水的接触としても言及される。
【０１０３】
界面での埋没した表面積は、分子の損失、または相互作用する２つのポリペプチドの非会合と会合状態との間の溶媒接触表面に由来する。一実施形態では、界面埋没面積は約６０００Å２〜約２０００Å２である。別の実施形態では、界面埋没面積は約４０００Å２〜２０００Å２である。別の実施形態では、界面埋没面積は約３０００Å２〜２０００Å２である。一実施形態では、界面埋没面積に対する無極性の寄与は、界面での正味埋没表面積の５０％より大きい。
【０１０４】
界面およびその嵌合に関して、任意のタンパク質−タンパク質相互作用および複合体形成を駆動する重要な因子は、２つの接触タンパク質間に形成される界面での表面残基の接触である。会合形態での２つの接触タンパク質表面の物理化学的および構造的相補性は、好ましい且つ安定な複合体形成の顕著な特徴である。物理化学的相補性は好ましい相互作用により定義され、水素結合、電荷ベースの塩橋、種々の型の静電相互作用、相互作用するタンパク質表面に渡る疎水性およびファンデルワールス接触を含み得る。三次元レベルでのタンパク質表面は、表面領域を構成する種々のアミノ酸のサイズおよび配向における差異のために形成される隆起および空洞により決定される。好ましいタンパク質−タンパク質界面において、２つのタンパク質表面からの隆起および空洞は、嵌合して構造的相補性を生じる。相互作用タンパク質間の界面がより大きく、より広範であるほど、タンパク質−タンパク質接触はより安定する可能性がある。
【０１０５】
一実施形態では、２つの輸送体ポリペプチド間の界面は、ホットスポット残基、すなわち、良好に連結された相互作用のネットワークに関与する個々の残基または残基の群、が豊富である。相互作用は、タンパク質において観察される典型的な相互作用、例えば水素結合、塩橋などの荷電残基相互作用、ファンデルワールス接触（強力な構造的相補性および疎水性残基クラスターを示す）を基礎にし得る。これは、界面安定性を最大にし、複合体が解離するのを防止する。
【０１０６】
一実施形態では、セグメント化部位はタンパク質中に存在する天然ジスルフィド結合を保持するために選択され、そこから２つのセグメントがセグメント化部分を越えて共有結合するように輸送体ポリペプチドが得られる。それは、セグメント化後に２つの得られたセグメントから自己集合するヘテロ多量体化擬似ネイティブタンパク質様構造の安定性をさらに増大することを意図する。この実施形態では、ここに記載されるジスルフィド判定基準、すなわちループ領域中のセグメント化部位に非常に近いジスルフィドを有すること、を満たす、タンパク質配列中のループ領域が選択される。２つの鎖を共有結合的に架橋する機能のほかに、このジスルフィドはまたループを開くための代用物としても役立ち得る。
【０１０７】
別の実施形態では、２つのセグメントを横断するジスルフィド結合は、２つの得られた各々のセグメント上の選択された位置で個々のアミノ酸にシステイン突然変異を導入することにより、改変される。
【０１０８】
別の実施形態では、２つのセグメントの界面でのアミノ酸を改変して界面でのホットスポットをさらに増大するかまたは改善しあるいは集合擬似ネイティブアルブミン構造における２つのセグメント間の構造的および物理化学的相補性を増強する。
【０１０９】
アルブミン
本明細書中で用いる場合、「アルブミン」は、集合的に、アルブミンの１つ以上の機能的活性（例えば、生物学的活性）を有するアルブミンタンパク質またはアミノ酸配列、あるいはアルブミンセグメントまたは変異体を指す。特に、「アルブミン」は、ヒトアルブミンまたはそのセグメント（例えば、ＥＰ  ２０１２３９、ＥＰ  ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７参照）、特に、図１に示したような成熟形態のヒトアルブミン、あるいは他の脊椎動物からのアルブミンまたはそのセグメント、あるいはこれらの分子の類似体または変異体、またはその断片を指す。ある実施形態では、アルブミンはアルブミンの切断化バージョンを指す。
【０１１０】
「擬似ネイティブアルブミン」という用語は、全アルブミンと同様の構造および／または機能を有するヘテロ多量体分子を指し、前記ヘテロ多量体分子は、全アルブミンの配列を基礎にして設計される２つ以上の単量体ポリペプチドの集合により形成される。ある実施形態では、本明細書の当該ポリペプチドは、ヘテロ多量体対として優先的に会合して擬似ネイティブタンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブタンパク質は擬似ネイティブアルブミンである。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは全アルブミンの活性の９０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは全アルブミンの活性の７５％を有する。一実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは全アルブミンの活性の５０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブネイティブアルブミンは全アルブミンの活性の５０〜７５％を有する。一実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは全アルブミンの活性の８０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは、分子モデリングにより測定して全アルブミンの構造の９０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の８０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の７０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の５０％を有する。いくつかの実施形態では、擬似ネイティブアルブミンは、分子モデリングにより測定して、全アルブミンの構造の５０％〜７５％を有する。
【０１１１】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は、本明細書中で互換的に用いられる。「アルブミンおよび血清アルブミン」という用語は、より広範であり、ヒト血清アルブミン（そしてその断片および変異体）、ならびに他の種からのアルブミン（そしてその断片および変異体）を包含する。
【０１１２】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体の各アルブミンベースの単量体は、正常ＨＡの変異体を基礎にしている。本発明のヘテロ多量体タンパク質の各カーゴポリペプチド部分も、本明細書中に記載されるような治療用タンパク質の変異体であり得る。「変異体」という用語は、保存的または非保存的な、挿入、欠失および置換を含み、この場合、このような変化は、アルブミンの膠質性、有用なリガンド結合および非免疫原性特性、または活性部位、あるいは治療用タンパク質の治療活性を付与する活性ドメインのうちの１つ以上を実質的に変更しない。ある実施形態では、変異体はまた、その一次配列における代替的な位置でアルブミンをセグメント化することにより得られる代替的なヘテロ多量体種も意味する。
【０１１３】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、ヒトアルブミンの天然多形変異体およびヒトアルブミンの断片、例えばＥＰ  ３２２０９４に開示される断片（すなわち、ＨＡ（Ｐｎ）、ここで、ｎは３６９〜４１９である）を包含する。
【０１１４】
ある実施形態では、アルブミンは、任意の脊椎動物、とくに任意の哺乳動物、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、ラット、マウス、ウサギ、ウマ、イヌまたはブタ（これらに限定されない）に由来する。ある実施形態では、アルブミンは、非哺乳動物アルブミン、例えば雌鶏およびサケ（これらに限定されない）に由来する。
【０１１５】
ヒトアルブミンの配列は、配列番号１として示されるものである：
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＧＶＦＲＲＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ。
【０１１６】
アロアルブミン
「アロアルブミン」は、アルブミンの遺伝的変異体である。ある実施形態では、アロアルブミンはヒトアロアルブミン（ＨＡＡ）である。電気泳動移動度がアルブミンと異なるアロアルブミンは、臨床的電気泳動の過程で、または供血者調査において、集団遺伝学調査により同定されている。突然変異および移動のマーカーとして、アロアルブミンは、遺伝学者、生化学者および人類学者にとって興味深いが、しかしこれらのアロアルブミンのほとんどが、疾患と関連付けられていない（Ｍｉｎｃｈｉｏｔｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ２９（８），  １００７−１０１６（２００８））。
表１：  配列番号１のＨＡと比較した場合の、種々のアロアルブミンに含まれる置換の一覧。熱安定性、半減期の情報およびその他のＨＡＡは、Ｋｒｏｇｈ−ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７４７，  ８１−８８（２００５）；およびＷＯ２０１１０５１４８９（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）で提供されている。
【表１−１】
0006498601.tif 000002
【表１−２】
0006498601.tif 000003
【０１１７】
アネキシン
本明細書中で用いる場合、「アネキシン」は、真核生物体に見出される細胞タンパク質の一群を指す。アネキシンはリポコルチンとしても既知である。本明細書中で用いる場合、「アネキシン」は、任意のアネキシンタンパク質を指し、または特定のアネキシンタンパク質、例えば「アネキシンＡ１」、「アネキシンＡ２」および「アネキシンＡ５」を指し得る。アネキシンは、負に荷電したリン脂質（すなわち、膜壁）と結合するそれらのカルシウム依存性能力により特徴付けられる。アネキシンは、３０〜５０ｋＤａのサイズに限定される反復タンパク質足場により特徴付けらされ、組織にかなり普遍的に分布する。アネキシンの基本構造は２つのドメイン：すなわち構造的に保存されるＣ末端「コア」領域と多様なＮ末端ドメイン、からなる。コア領域はＣａ２＋依存的にリン脂質細胞膜と結合する。Ｎ末端領域は細胞質タンパク質と結合する。アネキシンは種々の細胞性および生理学的過程において重要であり、膜足場を提供する。Ｃ末端コアは４つのアネキシン反復からなる。アネキシンは、その固有の膜感知能力に影響を及ぼすその柔軟な反復様の性質により特徴付けらされる。例えば、特定の生体膜に対する親和性は反復の数により制御され得る。特徴的なリン脂質感知を備えていることで、アネキシンは薬剤送達のために腸接合部を感知し／標的にするために有用であり得る。アネキシンの別の適用可能性は、腸の密着接合部および密着帯領域（ＺＯ−１）をターゲッティングすることであり、これは、より大きいタンパク質治療薬の横断が特に困難で、薬剤吸収を著しく減損することが知られている。
【０１１８】
「擬似ネイティブアネキシン」という用語は、全アネキシンと類似の構造および／または機能を有するヘテロ多量体分子を指し、ここで前記ヘテロ多量体分子は、全アネキシンの配列をベースにして設計される２つ以上の単量体ポリペプチドの集合体により形成される。ある実施形態では、単量体ポリペプチドは、ヘテロ多量体対として優先的に会合して擬似ネイティブタンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態では、擬似アネキシンは全アネキシンの９０％の活性を有する。いくつかの実施形態では、擬似アネキシンは全アネキシンの７５％の活性を有する。一実施形態では、擬似アネキシンは全アネキシンの５０％の活性を有する。いくつかの実施形態では、擬似アネキシンは全アネキシンの５０〜７５％の活性を有する。一実施形態では、擬似アネキシンは全アネキシンの８０％の活性を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似アネキシンは全アネキシンの９０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似アネキシンは全アネキシンの８０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似アネキシンは全アネキシンの７０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似アネキシンは全アネキシンの５０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似アネキシンは全アネキシンの５０〜７５％の構造を有する。
【０１１９】
ヒト野生型アネキシンＡ２の配列を以下に示す：
配列番号１４：
ＧＳＡＶＳＰＹＰＴＦＮＰＳＳＤＶＡＡＬＨＫＡＩＭＶＫＧＶＤＥＡＴＩＩＤＩＬＴＫＲＮＮＡＱＲＱＱＩＫＡＡＹＬＱＥＴＧＫＰＬＤＥＴＬＫＫＡＬＴＧＨＬＥＥＶＶＬＡＬＬＫＴＰＡＱＦＤＡＤＥＬＲＡＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＫＥＩＲＤＩＮＲＶＹＲＥＥＬＫＲＤＬＡＫＤＩＴＳＤＴＳＧＤＦＲＮＡＬＬＳＬＡＫＧＤＲＳＥＤＦＧＶＮＥＤＬＡＤＳＤＡＲＡＬＹＥＡＧＥＲＲＫＧＴＤＶＮＶＦＮＴＩＬＴＴＲＳＹＰＱＬＲＲＶＦＱＫＹＴＫＹＳＫＨＤＭＮＫＶＬＤＬＥＬＫＧＤＩＥＫＣＬＴＡＩＶＫＣＡＴＳＫＰＡＦＦＡＥＫＬＨＱＡＭＫＧＶＧＴＲＨＫＡＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＭＮＤＩＫＡＦＹＱＫＭＹＧＩＳＬＣＱＡＩＬＤＥＴＫＧＤＹＥＫＩＬＶＡＬＣＧＧＮ
【０１２０】
トランスフェリン
トランスフェリンはすべての脊椎動物に存在する分子量約７６ＫＤａの単量体タンパク質であり、鉄結合および輸送タンパク質として機能する。組換えヒトトランスフェリンおよびその融合体は、幹細胞移植中にならびに炭疽菌により引き起こされる急性感染性疾患の処置において、サラセミア、無トランスフェリン血症、加齢性黄斑変性、２型糖尿病を含む種々の疾患の管理用に考えられているものである。トランスフェリンは消化管環境中で安定であり、多数の試験により無傷タンパク質−トランスフェリン複合体は経口的に送達されかつ生物活性を保持することを示している。
【０１２１】
「擬似トランスフェリン」という用語は、全トランスフェリンと類似の構造および／または機能を有するヘテロ多量体分子を指し、ここで前記ヘテロ多量体分子は、全トランスフェリンの配列をベースにして設計される２つ以上の単量体ポリペプチドの集合体により形成される。ある実施形態では、単量体ポリペプチドは、ヘテロ多量体対として優先的に会合して擬似ネイティブタンパク質を形成する「セグメント」である。いくつかの実施形態では、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの９０％の活性を有する。いくつかの実施形態では、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの７５％の活性を有する。一実施形態では、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの５０％の活性を有する。いくつかの実施形態では、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの５０〜７５％の活性を有する。一実施形態では、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの８０％の活性を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの９０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの８０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの７０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの５０％の構造を有する。いくつかの実施形態では、分子モデリングにより確定した場合、擬似トランスフェリンは全トランスフェリンの５０〜７５％の構造を有する。
【０１２２】
野生型ヒトトランスフェリンの配列を以下に示す：
配列番号１９：
ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶ  ＣＡＶＬＧＬＣＬＡＶ  ＰＤＫＴＶＲＷＣＡＶ  ＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳ  ＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰ  ＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫ  ＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡ  ＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴ  ＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹ  ＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶ  ＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰ  ＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶ  ＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱ  ＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧ  ＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰ  ＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥ  ＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡ  ＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣ  ＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣ  ＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴ  ＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡ  ＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤ  ＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦ  ＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤ  ＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴ  ＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣ  ＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶ  ＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤ  ＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱ  ＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥ  ＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫ  ＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧ  ＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡ  ＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴ  ＡＩＲＮＬＲＥＧＴＣ  ＰＥＡＰＴＤＥＣＫＰ  ＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥ  ＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮ  ＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡ  ＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩ  ＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ  ＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫ  ＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮ  ＹＮＫＳＤＮＣＥＤＴ  ＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶ  ＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷ  ＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨ  ＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮ  ＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩ  ＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳ  ＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤ  ＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳ  ＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫ  ＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦ  ＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡ  ＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮ  ＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡ  ＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬ  ＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶ  ＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲ  ＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫ  ＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬ  ＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮ  ＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬ  ＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦ  ＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬ  ＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬ  ＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮ  ＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬ  ＥＡＣＴＦＲＲＰ
【０１２３】
カーゴ分子：
本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つのカーゴ分子、および少なくとも１つの輸送体ポリペプチドを含むポリペプチドを含み、前記カーゴ分子および輸送体ポリペプチドは、遺伝子融合または化学的連結を含むがこれらに限定されない方法により、互いに会合する。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは輸送体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合される。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは輸送体ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端の両方と融合される。いくつかの実施形態では、カーゴポリペプチドは、ヒトアルブミンをセグメント化することにより得られる輸送体ポリペプチドのシステイン３７位置に結合される。ある実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子は治療薬である。ある作用物質において、カーゴ分子は毒素である。ある実施形態では、カーゴ分子は抗原、またはその類似体である。一実施形態では、カーゴ分子は天然生成物、類似体、またはそのプロドラッグである。ある実施形態では、カーゴ分子は、細胞毒素などの治療薬、例えば細胞増殖抑制剤または殺細胞剤、治療薬または放射性金属イオン、例えば２１３Ｂｉなどの例えばアルファ線放出剤である。細胞毒素または細胞毒性薬としては、細胞に有害である任意の作用物質が挙げられる。例としては、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにその類似体または相同体が挙げられる。治療薬としては、抗代謝薬（例えば、メトトレキセート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル・デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ・クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂薬（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
ある実施形態では、カーゴ分子は生体分子である。一実施形態では、カーゴ分子は天然または合成核酸である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのカーゴ分子は、ＤＮＡ、ＰＮＡおよび／またはＲＮＡオリゴマーのうちの１つ以上である。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つのカーゴポリペプチド、あるいはその断片または変異体、および少なくとも１つの輸送体ポリペプチドを含む単量体タンパク質を含み、前記カーゴポリペプチドおよび輸送体ポリペプチドは遺伝子融合または化学的連結（これらに限定されない）により互いに会合する。
【０１２５】
本明細書中で用いる場合、「カーゴポリペプチド」は、１つ以上の治療的および／または生物学的活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチドあるいはその断片または変異体を指す。本発明に包含されるカーゴポリペプチドとしては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、治療的に適切な標的タンパク質に対する基質またはリガンドおよび生物製剤が挙げられるが、これらに限定されない（ペプチド、タンパク質およびポリペプチドという用語は、本明細書中で互換的に用いられる）。具体的には、「カーゴポリペプチド」という用語は抗体ならびにその断片および変異体を包含する。したがって、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、カーゴポリペプチドの少なくとも１つの断片または変異体、および／または抗体の少なくとも１つの断片または変異体を含有し得る。さらにに、ある実施形態では、「カーゴポリペプチド」という用語は、カーゴポリペプチドの内在性または天然に生じる相関物を指す。
【０１２６】
非限定例として、「カーゴ生体分子」は、疾患、症状または障害を処置し、防止または改善するために有用であるタンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡ（これらに限定されない）などの生体分子である。非限定例として、「カーゴポリペプチド」は、特定の細胞型（正常な（例えば、リンパ球）または異常な（例えば、癌細胞））と特異的に結合し、したがって化合物（薬剤、例えば細胞毒性薬）をその細胞型へと特異的に標的させるために用いられるものであり得る。
【０１２７】
別の非限定例では、「カーゴ分子」は、生物学的活性、特に、疾患を処置、防止しまたは改善するために有用である生物学的活性、を有する分子である。カーゴ分子、例えばカーゴポリペプチド、に保有され得る生物学的活性の非包括的一覧としては、免疫応答を増強すること、血管新生を促進すること、血管新生を抑制すること、造血機能を調節すること、神経成長を刺激すること、免疫応答を増強すること、免疫応答を抑制すること、または本明細書中に記載される生物学的活性のうちのいずれか１つ以上が挙げられる。
【０１２８】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質、例えば細胞表面および分泌タンパク質、のカーゴポリペプチド部分に対応するカーゴポリペプチドは、しばしば１つ以上のオリゴ糖基の結合により修飾される。この修飾（グリコシル化として言及される）は、タンパク質の物理的特性に劇的に作用し、タンパク質の安定性、分泌および局在化に重要であり得る。グリコシル化は、ペプチド主鎖に沿った特定位置で起こる。通常２つの主な型のグリコシル化が存在する：すなわち、Ｏ結合型オリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化（セリンまたはトレオニン残基に結合される）；ならびにＮ結合型オリゴ糖により特徴付けられるグリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列中のアスパラギン残基に結合される（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸であり得る））である。Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸としても既知）は、通常は、Ｎ結合型およびＢ結合型オリゴ糖の両方の末端残基である。例えばタンパク質構造および細胞型などの変数は、異なるグリコシル化部位において鎖内の炭水化物の数および性質に影響を及ぼす。グリコシル化異性体もまた、所定の細胞型内の同一部位で一般的である。
【０１２９】
表２は、本明細書中に記載されるヘテロ多量体のカーゴポリペプチド部分に対応するカーゴポリペプチドの非包括的一覧を提供する。「カーゴポリペプチド」の欄は、カーゴポリペプチド分子を開示し、その後の括弧内に、カーゴポリペプチドあるいはその断片または変異体を含むか、またはそれからなる科学名および商標名を記す。一実施形態では、カーゴ分子は、「カーゴポリペプチド」欄に、またはＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８（１），Ｄ７８７−Ｄ７９１（２００９））；Ｗｉｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３６，Ｄ９０１−Ｄ９０６（２００８））；Ａｈｍｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，Ｄ９６０−Ｄ９６７（２０１１））（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に開示されたタンパク質、あるいは治療用標的分子のクラスに属するタンパク質と結合する分子である。
【０１３０】
「カーゴポリペプチド」は、本明細書中で用いる場合、個々のカーゴポリペプチド分子（ＣＡＳおよびＧｅｎｂａｎｋ寄託番号から獲得可能なアミノ酸配列により限定される）を指し、またはこの欄に開示される所定のカーゴポリペプチド分子と関連したカーゴポリペプチドの全群、またはこの欄に開示されるポリペプチド分子と結合するカーゴポリペプチドを指し得る。
【表２−１】
0006498601.tif 000004
【表２−２】
0006498601.tif 000005
【表２−３】
0006498601.tif 000006
【表２−４】
0006498601.tif 000007
【表２−５】
0006498601.tif 000008
【表２−６】
0006498601.tif 000009
【表２−７】
0006498601.tif 000010
【表２−８】
0006498601.tif 000011
【表２−９】
0006498601.tif 000012
【表２−１０】
0006498601.tif 000013
【表２−１１】
0006498601.tif 000014
【表２−１２】
0006498601.tif 000015
【表２−１３】
0006498601.tif 000016
【表２−１４】
0006498601.tif 000017
【表２−１５】
0006498601.tif 000018
【表２−１６】
0006498601.tif 000019
【表２−１７】
0006498601.tif 000020
【表２−１８】
0006498601.tif 000021
【表２−１９】
0006498601.tif 000022
【表２−２０】
0006498601.tif 000023
【表２−２１】
0006498601.tif 000024
【表２−２２】
0006498601.tif 000025
【表２−２３】
0006498601.tif 000026
【表２−２４】
0006498601.tif 000027
【表２−２５】
0006498601.tif 000028
【０１３１】
一実施形態では、カーゴポリペプチドは抗原結合ポリペプチド構築物である。別の実施形態では、カーゴポリペプチドは、抗体、あるいはその断片または変異体である抗原結合ポリペプチド構築物である。一実施形態では、抗原結合ポリペプチド構築物は、抗体のＦａｂ断片、またはｓｃＦｖ、あるいは単一ドメイン抗体またはその断片である。
【０１３２】
一実施形態では、カーゴポリペプチドは、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＨＥＲ、またはＨＥＲ３と結合する抗原結合ポリペプチド構築物から選択される。抗原結合ポリペプチド構築物の適切な例は当該技術分野で既知であり、抗ＣＤ３、抗ＣＤ１９、抗ＨＥＲ２、および抗ＨＥＲ３抗体由来のものが挙げられる。
【０１３３】
機能的活性：
「機能的活性を有するポリペプチド」は、全長、プロタンパク質、および／または成熟型のカーゴポリペプチドに関連した１つ以上の既知の機能的活性を示し得るポリペプチドを指す。このような機能的活性としては、生物学的活性、抗原性［抗ポリペプチド抗体と結合する（または結合に関してポリペプチドと競合する）能力］、免疫原性（本明細書中に記載される特定のポリペプチドと結合する能力）、本明細書中に記載されるポリペプチドと多量体を形成する能力、ならびにポリペプチドの受容体またはリガンドと結合する能力が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態では、機能的活性は、相手タンパク質の発現および安定性を改善する能力を包含する。
【０１３４】
「生物学的活性を有するポリペプチド」は、用量依存性の有無にかかわらず、特定の生物学的検定で測定されるような、成熟形態を含む、本明細書中に記載される治療用タンパク質の活性と類似であるが必ずしも同一でない活性を示すポリペプチドを指す。用量依存性が存在する場合、そのポリペプチドのものと同一である必要はないが、むしろ、本明細書中に記載されるポリペプチドと比較して、所定の活性において用量依存性と実質的に類似する（すなわち、候補ポリペプチドは、本明細書中に記載される、または表２に示されるポリペプチドに比して、より大きな活性を示すかまたは約２５分の１以上であるか、または約１０分の１以上であるか、または約３分の１以上である活性を示す）。
【０１３５】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、カーゴ分子が輸送体ポリペプチドと連結されない場合、前記カーゴ分子と関連した少なくとも１つの生物学的および／または治療的活性を有する。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、カーゴポリペプチドが輸送体ポリペプチドと連結されない場合、前記カーゴポリペプチドと関連した少なくとも１つの生物学的および／または治療的活性を有する。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、カーゴポリペプチドがアルブミンまたはアロアルブミンベースのポリペプチドと連結されない場合、前記カーゴポリペプチド部分（あるいはその断片または変異体）と関連した少なくとも１つの生物学的および／または治療的活性を有する。
【０１３６】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、当該技術分野で既知の検定ならびに本明細書中に記載される検定を用いてまたは日常的に変更して、機能的活性（例えば、生物学的活性）に関して検定され得る。さらに、当業者はアルブミンまたはアロアルブミンベースの単量体ポリペプチドのカーゴタンパク質部分に対応するタンパク質の断片を、表２の対応する列（例えば、表２のカラム３）で参照される検定を用いて、活性に関して日常的に検定し得る。ある実施形態では、当該技術分野で既知の検定を用いるおよび／または以下の実施例の節に記載されるような、ヘテロ多量体のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質の断片の活性に関する検定が提供される。
【０１３７】
例えば、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質が抗カーゴポリペプチド抗体および／または抗アルブミン抗体との結合に関してカーゴポリペプチドと結合するかまたは競合する能力に関して検定する一実施形態では、当該技術分野で既知の種々の免疫検定、例えば、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」免疫検定、免疫放射線測定検定、ゲル拡散沈降反応、免疫核酸検定、ｉｎ ｓｉｔｕ免疫検定（例えば、コロイド金、酵素または同位体標識を用いる）、ウェスタン・ブロット、沈降反応、凝集検定（ゲル凝集検定、凝血検定）、補体結合検定、免疫蛍光検定、プロテインＡ検定および免疫電気泳動検定等（これらに限定されない）のような技法を用いる競合的および非競合的検定系が用いられ得る。一実施形態では、抗体結合は、一次抗体上の標識の検出により検出される。別の実施形態では、一次抗体は、二次抗体または試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。さらなる一実施形態では、二次抗体が標識される。多数の手段が、免疫検定における結合を検出するために当該技術分野で既知であり、本発明の範囲内である。
【０１３８】
結合相手（例えば、受容体またはリガンド）が本明細書中に記載されるヘテロ多量体により含まれるカーゴ分子に関して同定されるある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体によるその結合相手との結合は、例えば、当該技術分野で周知の手段により、例えば還元および非還元型ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングにより検定される（一般的に、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）参照）。別の実施形態では、ヘテロ多量体のカーゴタンパク質部分に対応するポリペプチドの基質（単数または複数）と結合するヘテロ多量体タンパク質の生理学的相関物の能力は、当該技術分野で既知の技法を用いて慣例的に検定され得る。
【０１３９】
生物学的活性
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、１つ以上の生物学的活性に関して試験するための検定に用いられる。ヘテロ多量体が特定の検定で活性を示す場合、ヘテロ多量体の１つ以上の単量体により含まれる少なくとも１つのカーゴタンパク質は、その生物学的活性に関連した疾患に関与すると思われる。したがって、ヘテロ多量体は関連疾患の処置に有用である。
【０１４０】
ある実施形態では、疾患または障害の処置方法であって、このような処置、防止または改善が所望される患者に、本明細書中に記載されるヘテロ多量体を、疾患または障害を処置し、防止し、または改善するのに有効な量で投与することを包含する方法が提供される。
【０１４１】
細胞により産生される単量体アルブミンまたはアロアルブミンベースの融合タンパク質であって、前記タンパク質がポリヌクレオチドによりコードされ、前記単量体タンパク質が少なくとも１つのカーゴタンパク質、ならびにアルブミンまたはアロアルブミン由来のポリペプチドを含み、これにより前記単量体が溶液中でヘテロ多量体を形成する融合タンパク質が、本明細書中で提供される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドを用いて細胞からコードされたタンパク質を発現する場合、その細胞の天然分泌およびプロセシング段階は少なくとも１つのシグナル配列を欠くタンパク質を産生する。シグナル配列の具体的アミノ酸配列は、当該技術分野で周知である。
【０１４２】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、内分泌系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、神経系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。
【０１４３】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、免疫系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、呼吸器系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。
【０１４４】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、心臓血管系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、生殖器系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。
【０１４５】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、消化器系の疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、血液に関連した疾患および／または障害の診断、予後、防止および／または処置に用いられる。
【０１４６】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、少なくとも１つの目的の遺伝子が発現される少なくとも１つの組織（単数または複数）に関連した疾患および／または障害の診断および／または予後に用いられ、ここで本明細書中に記載されるヘテロ多量体は少なくとも１つの目的の遺伝子と結合するカーゴ分子を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体および／または本明細書中に記載されるヘテロ多量体を形成するために会合するアルブミン／アロアルブミンベースの単量体をコードするポリヌクレオチドが、プロホルモン活性化、神経伝達物質活性、細胞のシグナル伝達、細胞の増殖、細胞の分化および細胞の移動を含むがこれらに限定されない活性と関連する疾患および／または障害の診断、検出および／または処置に用いられる。
【０１４８】
治療的使用：
一態様において、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は抗体ベースの療法に向けられ、この療法は抗体、その断片または変異体であるカーゴポリペプチド（単数または複数）を含む本明細書中に記載されるヘテロ多量体を、開示された疾患、障害または症状のうちの１つ以上を処置するために患者に投与することを包含する。本明細書中に記載される治療用化合物としては、本明細書中に記載されるヘテロ多量体、本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
具体的一実施形態では、抗体ベースの療法であって、１つ以上の疾患、障害または症状、例えば、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、生殖器障害、消化管障害、肺障害、心臓血管性障害、腎障害、増殖障害および／または癌性疾患および症状、および／または本明細書の他の箇所に記載されるような疾患、障害または症状（これらに限定されない）を処置するために、抗体の少なくとも断片または変異体を含む本明細書中に記載されるヘテロ多量体を患者に投与することを包含する療法が提供される。
【０１５０】
少なくとも抗体の断片または変異体を含む本発明のヘテロ多量体タンパク質が治療的に用いられる方法の概要は、身体で局所的にまたは全身的に結合すること、あるいは、例えば補体（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）に介在されるような、抗体の直接的細胞傷害性による方法を包含する。これらのアプローチのいくつかは、以下でさらに詳細に記載される。本明細書中で提供される教示により、過度の実験なしに、診断、モニタリングまたは治療目的のために本明細書中に記載されるヘテロ多量体を用いる方法を当業者は知り得る。
【０１５１】
少なくとも抗体の断片または変異体を含む本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍薬）と組み合わせて投与され得る。一般的に、患者の種と同一種の種起源または種反応性（抗体の場合）の生成物の投与が好ましい。したがって、一実施形態では、ヒト抗体、断片、誘導体、類似体、または核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０１５２】
遺伝子療法：
具体的一実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質をコードする配列を含む核酸は、遺伝子療法として、タンパク質の異所性発現および／または活性と関連する疾患または障害を処置し、抑制し、または防止するために投与される。遺伝子療法とは、発現されたまたは発現可能な核酸を被験体に投与することにより実施される療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療的効果を媒介するそれらのコード化タンパク質を産生する。当該技術分野で利用可能な遺伝子療法のための方法のいずれかが用いられ得る。
【０１５３】
治療的または予防的活性の実証：
本明細書中に記載されるヘテロ多量体または薬学的組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療的または予防的活性に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定は、細胞株または患者組織試料に及ぼす化合物の作用を包含する。細胞株および／または組織試料に及ぼす化合物または組成物の作用は、当業者に既知の技法、例えばロゼット形成検定および細胞溶解検定を利用して確定され得る。本発明に従って、具体的な一化合物の投与が示されるか否かを決定するために用いられ得るｉｎ ｖｉｔｒｏ検定はｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養検定を包含し、検定では患者組織試料が培養中で増殖され、ヘテロ多量体に曝露されるか、またはそうでなければヘテロ多量体を投与され、かつ組織試料に及ぼすこのようなヘテロ多量体の作用が観察される。
【０１５４】
治療的／予防的投与および組成物：
有効量の本明細書中に記載されるヘテロ多量体または薬学的組成物の被験体への投与による処置、抑制および予防の方法が提供される。一実施形態では、ヘテロ多量体は、実質的に精製される（例えば、その作用を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。ある実施形態では、被験体は、動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等（これらに限定されない）であり、ある実施形態では、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１５５】
種々の送達系が既知であり本明細書中に記載されるヘテロ多量体処方物を投与するために用いることができ、例えばリポソーム、微小粒子、マイクロカプセル中の封入、化合物を発現し得る組換え体細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウィルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築等である。導入方法としては、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外および口腔経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の便利な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内張り（例えば、口腔粘膜、直腸および小腸粘膜等）を通した吸収により投与されてよく、また他の生物学的に活性な作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、ある実施形態では、任意の適切な経路により、例えば脳室内およびくも膜下腔内注射により、本明細書中に記載されるヘテロ多量体組成物を中枢神経系に導入することが望ましい；脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａレザバーのようなレザバーに取り付けられる脳室内カテーテルにより容易になり得る。例えば、吸入器またはネブライザー、ならびにエアロゾル化剤を伴う処方物の使用により、肺内投与も用いられ得る。
【０１５６】
具体的一実施形態では、処置を必要とする区域に局所的に、本明細書中に記載されるヘテロ多量体または組成物を投与することが望ましい；これは、例えば外科手術中の局所注入、局所的適用（例えば術後に創傷用包帯とともに）、注射により、カテーテルにより、坐薬により、または移植片により（これらに限定されない）達成され得るが、前記移植片は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性物質であり、シリコーン膜などの膜、または繊維を含む。好ましくは、本発明のタンパク質、例えば抗体を投与する場合、タンパク質が吸収しない物質を用いるよう注意しなければならない。
【０１５７】
別の実施形態では、ヘテロ多量体または組成物は、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３  （１９９０）；  Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  （ｅｄｓ．），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３５３−３６５  （１９８９）；  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，  ｐｐ．  ３１７−３２７参照；一般的に同書参照）。
【０１５８】
さらに別の実施形態では、ヘテロ多量体または組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態では、ポリマー物質が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  （ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）参照；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照）。さらに別の実施形態では、制御放出系が、治療標的、例えば脳の近位に配置され、したがって全身用量の一部を要するだけである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０１５９】
その他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３  （１９９０））による概説で考察されている。
【０１６０】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードする核酸を含む具体的一実施形態では、核酸は、それが細胞内に存在するよう適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築することにより、そのコード化タンパク質の発現を促すためにｉｎ ｖｉｖｏで投与でき、例えばレトロウィルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）により、または直接注射により、または微小粒子衝撃の使用（例えば、遺伝子銃;Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）により、あるいは脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト化剤で被覆することにより、あるいは核に進入することが既知であるホメオボックス様ペプチドと連結してそれを投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）参照）などにより投与され得る。または相同組換えにより、核酸は細胞内に導入されて発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れられ得る。
【０１６１】
薬学的組成物も提供される。このような組成物は、治療的有効量の化合物、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む。具体的一実施形態では、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物に、さらに特定的にはヒトに用いるために、連邦政府または州政府の規制行政庁により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認知されている薬局方に列挙された、ということを意味する。「担体」という用語は、それと一緒に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。薬学的組成物が静脈内投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射溶液用に用いられ得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は、所望により、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性処方物等の形態をとり得る。組成物は、伝統的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを伴って、坐薬として処方され得る。経口処方物は、標準的担体、例えば薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は、患者への適正投与のための形態を提供するために、治療的有効量の化合物（好ましくは精製形態で）を適量の担体と一緒に含有する。処方物は、投与方式に合わせるべきである。
【０１６２】
ある実施形態では、ヘテロ多量体を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合される薬学的組成物として、慣例的手法に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤および局所麻酔薬、例えばリグノカインも含み、注射部位での疼痛を楽にし得る。一般的に、成分は、別々にまたは単位剤形中に一緒に混合して供給され、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物としてアンプルまたはサッシェなどの密閉容器中で活性作用物質の量を示して供給される。組成物が注入により投与されるべきものである場合、それは滅菌薬学的等級水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るよう、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１６３】
ある実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、中性または塩形態として処方される。薬学的に許容可能な塩としては、陰イオンを有して生成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの、および陽イオンを有して生成されるもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものを包含する。
【０１６４】
治療用タンパク質の異所性発現および／または活性と関連した疾患または障害の処置、抑制および防止に有効である本明細書中に記載される組成物の量は、標準臨床技法により決定され得る。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ検定は、最適投与量範囲を同定するのを手助けするために任意に用いられ得る。処方物中に用いられるべき精確な用量は、投与経路、ならびに疾患または障害の重篤度によっても決まり、かつ開業医の判断および各患者環境によって決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−応答曲線から推定される。
【０１６５】
ヘテロ多量体タンパク質の組換えおよび合成的産生方法：
ある実施形態では、酵母、例えば細菌などの微生物、あるいはヒトまたは動物細胞株からの分泌により組換え分子として産生されるヘテロ多量体が提供される。実施形態では、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
【０１６６】
実施形態は、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質を発現するよう形質転換される細胞、例えば酵母細胞を包含する。形質転換宿主細胞それ自体に加えて、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、またはモノクローナル培養物由来の培養物が提供される。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞を伴って、あるいはそれらが濾過されまたは遠心分離されていた場合には細胞を伴わずに、ポリペプチドを含有する。多数の発現系が既知であり用いられ得るが、例としては、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）、酵母（例えば、出芽酵母、クルイベロミセス・ラクチスおよびメタノール資化酵母）、糸状真菌（例えばアスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【０１６７】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、慣用的方法で、例えば宿主染色体中または遊離プラスミド上に挿入されるコード配列から産生される。酵母は、通常の方法のいずれか、例えば電気穿孔で、所望のタンパク質のためのコード配列で形質転換される。電気穿孔による酵母の形質転換方法は、Ｂｅｃｋｅｒ  ＆  Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示されている。
【０１６８】
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞は、周知の技法により同定され得る。例えば、発現構築物の導入に起因する細胞は、増殖されて、所望のポリペプチドを産生し得る。細胞は収穫され、溶解されて、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８により記載された方法と同様の方法を用いて、ＤＮＡの存在に関してそれらのＤＮＡ含有物が調べられる。または、上清中のタンパク質の存在が、抗体を用いて検出され得る。
【０１６９】
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、一般的に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．  ９２０３７，  ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐｓ）であって、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を含む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメア型プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。
【０１７０】
相補的付着末端を介してベクターにＤＮＡを操作可能的に連結するために、種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー領域が、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加され得る。ベクターおよびＤＮＡセグメントは、次に、相補的ホモポリマー尾部間で水素結合により繋ぎ合わされて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１７１】
１つ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに接合する代替的方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１で処理されるが、これらは、それらの３’５’−エキソヌクレオチド分解性活性で突出する一本鎖末端を除去し、それらの重合活性で凹んだ３’末端を充填する酵素である。
【０１７２】
したがって、これらの活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。次いで、平滑末端セグメントは、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒し得る酵素、例えばバクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、多余分モル量のリンカー分子とともにインキュベートされる。したがって、反応の生成物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を保有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは、次に、適切な制限酵素で切断されて、ＤＮＡセグメントの末端と適合性の末端を産生する酵素で切断されている発現ベクターにライゲーションされる。
【０１７３】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、多数の供給元、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  Ｃｏｎｎ．，  ＵＳＡから市販されている。
【０１７４】
アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実行において有用であると予想される酵母の例示的な属は、ピキア（以前はハンセヌラとして分類されていた）、サッカロミセス、クルイベロミセス、アスペルギルス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、シゾサッカロミセス、シテロミセス、パキソレン、ジゴサッカロミセス、デバロミセス、トリコデルマ、セファロスポリウム、フミコラ、ムコール、ニューロスポラ、ヤロウィア、メトシュニコヴィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドマイコプシス等である。好ましい属は、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、クルイベロミセス、ピキアおよびトルラスポラからなる群から選択される。サッカロミセス種の例は、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクスおよびＳ．ロウキシイである。
【０１７５】
クルイベロミセス種の例は、Ｋ．フラギリス、Ｋ．ラクチスおよびＫ．マルキシアヌスである。適切なトルラスポラ種は、Ｔ．デルブルエッキイである。ピキア（ハンセヌラ）種の例は、Ｐ．アングスタ（以前はＨ．ポリモルファ）、Ｐ．アノマラ（以前はＨ．アノマラ）およびＰ．パストリスである。Ｓ．セレビシエの形質転換のための方法は、一般的に、ＥＰ  ２５１  ７４４、ＥＰ  ２５８  ０６７およびＷＯ  ９０／０１０６３（これらはすべて、その記載内容が参照により本明細書中で援用される）に教示されている。
【０１７６】
サッカロミセスの好ましい例示的な種としては、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクス、Ｓ．ジアスタティクスおよびジゴサッカロミセス・ロウキシイが挙げられる。クルイベロミセスの好ましい例示的な種としては、Ｋ．フラギリスおよびＫ．ラクチスが挙げられる。ハンセヌラの好ましい例示的な種としては、Ｈ．ポリモルファ（今は、ピキア・アングスタ）、Ｈ．アノマラ（今は、ピキア・アノマラ）およびピキア・カプスラタが挙げられる。ピキアの付加的な好ましい例示的な種としては、Ｐ．パストリスが挙げられる。アスペルギルスの好ましい例示的な種としては、Ａ．ニガーおよびＡ．ニヅランスが挙げられる。ヤロウィアの好ましい例示的な種としては、Ｙ．リポリチカが挙げられる。多数の好ましい酵母種が、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、アルブミン融合タンパク質の発現において有用である：サッカロミセス・セレビシエ、ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３  ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２２７３１）；サッカロミセス・セレビシエ  ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３  ｈｓｐ１５０突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２１２６６）；サッカロミセス・セレビシエ  ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３  ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２３７９２）；サッカロミセス・セレビシエ  ハンセン、テレオモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４；および６２９９５）；サッカロミセス・ジアスタティクス  Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｘ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号６２９８７）；クルイベロミセス・ラクチス（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号７６４９２）；ピキア・アングスタ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎ等）  Ｋｕｒｔｚｍａｎ、テレモルフ（ハンセヌラ・ポリモルファ  ｄｅ  Ｍｏｒａｉｓ  ｅｔ  Ｍａｉａ、テレモルフとして寄託）（ＡＴＣＣ寄託番号２６０１２）；アスペルギルス・ニガー  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号９０２９）；アスペルギルス・ニガー  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号１６４０４）；アスペルギルス・ニヅランス（Ｅｉｄａｍ）  Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号４８７５６）；およびヤロウィア・リポリチカ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ等）  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ  ｅｔ  ｖｏｎ  Ａｒｘ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号２０１８４７）。
【０１７７】
サッカロミセス・セレビシエに関する適切なプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２に関連するもの、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、アルファ−接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］に関する遺伝子、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および５’調節領域の部分と他のプロモーターの５’調節領域の部分との、または上流の活性化部位とのハイブリッドを包含するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８  ０６７のプロモーター）が挙げられる。
【０１７８】
シゾサッカロミセス・ポンベにおいて用いるための便利な調節可能プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ  （１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  １０８５７−１０８６４により記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制性プロモーター、ならびにＨｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｗｉｎｓｔｏｎ  （１９９０）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２４，  ８０７−８１６により記載されたようなグルコース抑制性ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
【０１７９】
外来遺伝子の発現のためにピキアを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、ならびに種々のＰｈｉｌｌｉｐｓ特許（例えば、米国特許第４，８５７，４６７号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））に教示されており、ピキア発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，  Ｌｅｅｋ，  ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆから市販されている。適切なプロモーターとしては、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２，３４５９−３４６５は、ハンセヌラベクターおよび形質転換に関する情報を包含しており、適切なプロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；一方、ＥＰ  ３６１  ９９１、Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒからのその他の出版物は、クルイベロミセス種における外来タンパク質を発現する方法を教示しており、適切なプロモーターはＰＧＫＩである。
【０１８０】
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化のための適正なシグナルを含有する真核生物遺伝子の３’フランキング配列である。適切な３’フランキング配列は、例えば、用いられる発現制御配列と天然に連結された遺伝子の配列であり、すなわち、プロモーターに対応し得る。また、それらは、サッカロミセス・セレビシエＡＤＨＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい場合には異なり得る。
【０１８１】
ある実施形態では、所望のヘテロ多量体タンパク質は最初、分泌リーダー配列を伴って発現され、分泌リーダー配列は選択される酵母において有効な任意のリーダーであり得る。サッカロミセス・セレビシエに有用なリーダーとしては、接合因子アルファポリペプチド（ＭＦα−１）由来のものおよびＥＰ−Ａ−３８７  ３１９のハイブリッドリーダーが挙げられる。このようなリーダー（またはシグナル）が酵母により切断された後、成熟アルブミンが周囲培地中に放出される。さらに、このようなリーダーとしては、ＪＰ  ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として特許付与）に開示されたサッカロミセス・セレビシエインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）、ＭＦα−１のプレ配列、０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；サッカロミセス・ジアスタティクスグルコアミラーゼＩｌ；サッカロミセス・カールスベルゲンシスα−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；クルイベロミセス・ラクチスキラー毒素；およびカンジダ・グルコアミラーゼのものが挙げられる。
【０１８２】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞、ならびに合成および組換え技法によるヘテロ多量体タンパク質の産生が提供される。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスベクターであり得る。レトロウィルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損性であり得る。後者の場合、ウィルス増殖は、一般的に、相補する宿主細胞でのみ起こる。
【０１８３】
ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含有するベクターと結合される。一般的に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物中に導入され、あるいは荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウィルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージされ、次いで、宿主細胞中に形質導入され得る。
【０１８４】
ある実施形態では、ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター、例えばファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｒａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウィルスＬＴＲのプロモーター等に、操作可能的に連結される。その他の適切なプロモーターは、当業者に既知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位を含み、かつ、転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。当該構築物により発現される転写体のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを、そして最後に適切に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を包含する。
【０１８５】
上記のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。このようなマーカーとしては、ジヒドロフォレートレダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、あるいは真核生物培養に関するネオマイシン耐性、ならびに大腸菌およびその他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス（ＡＴＣＣ寄託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞に関する適切な培地および培養条件は、当該技術分野で既知である。
【０１８６】
細菌において用いるために選択されるベクターとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ；ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能）。好ましい真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。酵母系で用いるための好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。その他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかになる。
【０１８７】
一実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の局在化を原核生物または真核生物細胞の特定区画に向ける、および／または原核生物あるいは真核生物細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指図するシグナル配列と融合される。例えば、大腸菌では、タンパク質の発現をペリプラズム空間に向けたいと考え得る。細菌のペリプラズム空間にポリペプチドの発現を向けるために、ヘテロ多量体タンパク質が融合されるシグナル伝達配列またはタンパク質（またはその断片）の例としては、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢ−サブユニットのシグナル配列、ならびにアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の局在化を指図する融合タンパク質の構築のためのいくつかのベクターが市販されており、例としては、ｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−．ｒｈｏ．シリーズ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）が挙げられる。具体的一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクテートリアーゼシグナル配列と融合されて、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増大し得る。米国特許第５，５７６，１９５号および第５，８４６，８１８号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照のこと。
【０１８８】
哺乳動物細胞におけるその分泌を指図するためにヘテロ多量体タンパク質と融合されるシグナルペプチドの例としては、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）、ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ）、およびコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウィルス発現系とともに用いられ得る適切なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）である。
【０１８９】
選択可能マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを用いるベクターは、それぞれ、薬剤メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキセートの存在下で増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞株（例えば、ネズミ骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現系は、内因性遺伝子の働きを防止するために付加的阻害薬を提供することにより、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）においても機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成成分は、ＰＣＴ公告：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／１００３６；ＷＯ８９／１０４０４；およびＷＯ９１／０６６５７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳述されている。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．）から獲得され得る。ネズミ骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を用いるモノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  １１：１（１９９５）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１９０】
本明細書中に記載されるベクター構築物を含有する宿主細胞、ならびに付加的に、当該技術分野で既知の技法を用いて、１つ以上の非相同制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と操作可能的に連携するヌクレオチド配列を含有する宿主細胞も提供される。宿主細胞は、高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）、または下等真核生物細胞、例えば酵母細胞であってよく、あるいは宿主細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現を調整するか、あるいは所望の特異的方式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主系統が、選択され得る。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下で増大され得る;したがって、遺伝子改変ポリペプチドの発現は、制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、リン酸化、開裂）のための特質および特異的機構を有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを保証するために、適切な細胞株が選択され得る。
【０１９１】
宿主細胞中への本発明の核酸および核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染またはその他の方法により実行され得る。このような方法は、多数の標準的実験室マニュアル、例えばＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８６）に記載されている。本発明のポリペプチドは、実際に、組換えベクターを欠く宿主細胞により発現され得る、ということが具体的に意図される。
【０１９２】
本明細書中に記載されるベクター構築物を含有する宿主細胞を包含するほかに、本発明は、内因性遺伝物質を欠失するかまたは置換するよう（例えば、カーゴポリペプチドに対応するコード配列がカーゴポリペプチドに対応するヘテロ多量体タンパク質と置換される）、および／または遺伝物質を含むよう改変されている、脊椎動物起源の、特に哺乳動物起源の一次、二次および不死化宿主細胞も包含する。内因性ポリヌクレオチドと操作可能的に連携する遺伝物質は、内因性ポリヌクレオチドを活性化し、変更し、および／または増幅し得る。
【０１９３】
さらに、当該技術分野で既知の技法を用いて、非相同ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、あるいはその断片または変異体）および／または非相同制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、相同組換えにより、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と操作可能的に連携し得る（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号  ＷＯ  ９６／２９４１１；国際公開番号  ＷＯ  ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）参照）。
【０１９４】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、周知の方法、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養から回収され、精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製のために用いられる。
【０１９５】
ある実施形態では、本発明のヘテロ多量体タンパク質は、陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばＱ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ポロスＨＱ、ポロスＤＥＡＦ、トヨパールＱ、トヨパールＱＡＥ、トヨパールＤＥＡＥ、リソース／ソースＱおよびＤＥＡＥ、フラクトゲルＱおよびＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィー（これらに限定されない）を用いて、精製される。
【０１９６】
具体的実施形態では、本明細書中に記載されるタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィー、例えばＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＣＭ、トヨパールＳＰ、トヨパールＣＭ、リソース／ソースＳおよびＣＭ、フラクトゲルＳおよびＣＭカラム、ならびにそれらの等価物および匹敵物上でのクロマトグラフィー（これらに限定されない）を用いて、精製される。
【０１９７】
さらに、本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質は、当該技術分野で既知の技法を用いて化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．ＹおよびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）参照）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、ポリペプチド配列中に置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般のアミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、およびアミノ酸類似体が概して挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１９８】
例えば、、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドとの連結等により、翻訳中または翻訳後に異なって修飾されたヘテロ多量体が提供される。任意の多数の化学的修飾が、既知の技法、例えば、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元;ツニカマイシンの存在下での代謝合成等（これらに限定されない）、により実行され得る。
【０１９９】
本明細書中に包含される付加的翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖の化学的修飾、ならびに原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。ヘテロ多量体タンパク質は、検出可能な標識で、例えば酵素、蛍光、同位体または親和性標識で修飾されて、タンパク質の検出および単離を可能にする。
【０２００】
適切な酵素標識の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、イオウ、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
【０２０１】
具体的実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に結合される。
【０２０２】
記述したように、本明細書中に記載されるヘテロ多量体は、天然過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野で周知の化学修飾技法により修飾される。ある実施形態では、同一型の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同一または種々の程度で存在し得る。ある実施形態では、本明細書中に記載されるヘテロ多量体からのポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝され、およびいくつかの実施形態では、分枝を伴って、または伴わずに、環状である。環状分枝鎖および分枝鎖環状ポリペプチドは、翻訳後天然過程の結果であるか、あるいは合成方法により作成される。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合的架橋の形成、システインの生成、ピログルタメートの生成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、例えばアルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加、およびユビキチン化が挙げられる(例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ．  １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８２：６２６−６４６（１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【０２０３】
ある実施形態では、ヘテロ多量体タンパク質は固体支持体と結合され、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質により結合され、それと結合し、またはそれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製のために特に有用である。このような固体支持体としては、硝子、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
ヘテロ多量体タンパク質が抗体のＶＨドメインのみを含む実施形態では、ＶＨ−アルブミン融合タンパク質およびＶＬタンパク質が翻訳後に（共有結合的または非共有結合的に）会合するよう、当該タンパク質を同一抗体のＶＬドメインと同時発現することが必要であり、および／または望ましい。
【０２０５】
ヘテロ多量体タンパク質が抗体のＶＬドメインのみを含む実施形態では、ＶＬ−アルブミン融合タンパク質およびＶＨタンパク質が翻訳後に（共有結合的または非共有結合的に）会合するよう、融合タンパク質を同一抗体のＶＨドメインと同時発現することが必要であり、および／または望ましい。
【０２０６】
ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の増大、または免疫原性の低減などの付加的利点を提供し得るヘテロ多量体タンパク質の化学修飾誘導体も、本明細書中で提供される（米国特許第４，１７９，３３７号）。誘導体化のための化学的部分は、水溶性ポリマー、例えばポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等から選択され得る。タンパク質は、分子内の無作為位置、または分子内の予定位置で修飾され、１、２、３またはそれ以上の結合した化学部分を含み得る。
【０２０７】
ポリマーは任意の分子量であってよく、および分枝鎖または非分枝鎖であり得る。ポリエチレングリコールに関しては、取扱いおよび製造を容易にするために、好ましい分子量は約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、いくつかの分子は提示された分子量より重く、いくつかの分子は軽いことを示す）である。所望の治療的プロフィール（例えば、所望される持続的放出の継続期間、もしあるならば生物学的活性に及ぼす作用、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如ならびに治療用タンパク質または類似体に対するポリエチレングリコールのその他の既知の作用）によって、他の大きさも用いられ得る。例えば、ポリエチレングリコールは、平均分子量約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１０５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ｋＤａを有し得る。
【０２０８】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質の存在および量は、当該技術分野で周知の免疫検定であるＥＬＩＳＡを用いて決定され得る。本明細書中に記載されるヘテロ多量体を検出し／定量するために有用である一ＥＬＩＳＡプロトコールは、抗ヒト血清アルブミン抗体でＥＬＩＳＡプレートを被覆するステップ、非特異的結合を防止するためにプレートをブロックするステップ、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄するステップ、本明細書中に記載されるタンパク質を含有する溶液を付加する（１つ以上の異なる濃度で）ステップ、（本明細書中に記載されるような、またはそうでなければ当該技術分野で既知の）検出可能標識と結合された二次抗カーゴポリペプチド特異的抗体を付加するステップ、および二次抗体の存在を検出するステップを包含する。このプロトコールの代替的バージョンでは、ＥＬＩＳＡプレートは、抗カーゴポリペプチド特異的抗体で被覆され標識化二次試薬は抗ヒトアルブミン特異的抗体であり得る。
【０２０９】
種々の出版物が本明細書中で引用されているが、その開示内容は参照により本明細書中で援用される。
【実施例】
【０２１０】
以下の実施例は、本発明の実行を例証するために示される。それらは、本発明の全範囲を制限または限定するよう意図されない。
【０２１１】
実施例１：タンパク質スプリット方法
特定のタンパク質−タンパク質会合は、相互作用する相手と、随伴する構造的および熱力学的変化との間の強力な表面相補性により駆動される。表面相補性は、好ましい静電的および疎水性相互作用の創生を支持する接触を形成する機会を提供する。静電的相互作用は、塩橋、水素結合および広範な分散相互作用の形成を含む。界面での溶媒排除および非極性原子群周囲の再組織化ならびにその会合エントロピー作用は、結合熱力学の疎水性構成成分において役割を果たす。互いの疎水的作用のために最適化された形状を有する残基は、接触（すなわち、タンパク質−タンパク質界面を安定化するために好ましいスタッキング、パイ−パイ、カチオン−パイ接触）を形成する。同様の熱力学的作用は、二次構造単位および三次ドメインの前組織化を含む多段階のタンパク質フォールディング過程を制御し、この後それらは会合して折りたたまれた四次構造状態のタンパク質を形成する。タンパク質フォールディングおよび結合の代替的機序は、最終的にタンパク質の四次構造状態を生じる連動したタンパク質フォールディングおよび結合過程を含む。複合体タンパク質の四次構造形成中に両過程が作用する局面が存在すると考えることは合理的である。いくつかのタンパク質−タンパク質会合の状況において、個々のタンパク質構成成分は同一媒質中で同時発現されるかまたは存在する必要があり、構成成分または単量体の各々は、その必須の相手との会合時にのみ、その最終構造状態へと安定にフォールディングする（図６）。本明細書中に記載されるように、スプリットタンパク質の生成は、自己集合してヘテロ多量体を一緒に形成することにより擬似ネイティブタンパク質構造を効率的に形成する少なくとも２つの輸送体ポリペプチドを産生する配列、二次構造およびフォールドからの情報を用いて、ネイティブタンパク質におけるセグメント化部位を認識することを含む。例えば、これらのスプリットタンパク質輸送体ポリペプチドは、同時発現されると選択的に自己集合して擬似ネイティブ状態を形成する。輸送体ポリペプチドのスプリットタンパク質相補対を生成すると同時に、試みはある意味で、非複合体状態では非機能性である一方で複合体として機能性を示す、多数の天然に起こる必須のタンパク質−タンパク質複合体を模倣することである。この戦略がうまくいけば、選択的に自己集合して互いにヘテロ多量体を形成するポリペプチドを生じ、生じたポリペプチドは個々の実体として可溶性であり、機能に関して環境中の他の構成成分のフォールディング、結合および活性を減損しない。互いを伴って再構成するポリペプチドの固有の性質は、それ自体では多量体の形成に効率的でないカーゴ分子からヘテロ多量体融合体を作成するという領域で適用できる。いくつかの実施形態では、スプリットタンパク質セグメントの機能的役割は、ヘテロ多量体化および輸送体ポリペプチドに融合される多数のカーゴ分子の空間的局在化を駆動する輸送体ポリペプチドとして作用することである。
【０２１２】
本発明のヒト血清アルブミン内のセグメント化部位を、以下の決定基準に基づいて設計した。（１）セグメント化部位は、相対的ＳＡＳＡが高くタンパク質の残りの部分との接触が限定されているループ上に存在すべきである。これは、タンパク質コアの安定性にそれほど寄与せず、したがってヒト血清アルブミンに対する集合化擬似ネイティブアルブミン構造の安定性に影響するとはあまり考えられない柔軟で且つ接近可能なループを見出す機会を最大限にするためであった。（２）界面はホットスポット残基に富んでいるべきである。ホットスポットとは、十分に連結された相互作用ネットワークに関与する個々の残基または残基の群を意味する。相互作用は、水素結合、塩橋などの荷電残基相互作用、、ファンデルワールス接触（強力な構造的相補性おｙ日疎水性残基クラスターを示す）のような、タンパク質において観察される典型的な相互作用を基礎にし得る。それは、界面安定性を最大にして複合体が解離しないようにするためである。（３）界面は、できるだけ無極性で、広大で、且つ互いに噛み合うものである必要がある。この場合もやはり、それは、２つの鎖が恒久的複合体として存在してその個々の構成成分に解離しない機会を最大にするためである。（４）一実施形態では、２つの鎖が共有結合するように、セグメント化区分を越えてヒト血清アルブミン中に存在する天然のジスルフィド結合を保持することを目指す。それは、セグメント化後に２つの得られたセグメントから自己集合するヘテロ多量体化擬似ネイティブアルブミン様構造の安定性をさらに増大することを意図した。ここに記載されるジスルフィド判定基準を満たす、すなわちループ領域中のセグメント化部位に非常に近接したジスルフィドを有する、ヒト血清アルブミン構造／配列中のループ領域を見つける。２つの鎖を共有結合的に架橋することの明白な利点のほかに、このジスルフィドはまたセグメント化の際、開いているループの代用物としても役立つ。（５）一実施形態では、２つの得られたセグメントの各々の上の選定位置において個々のアミノ酸にシステインへの突然変異を導入することにより、２つのセグメントに渡るジスルフィド結合を改変する。（６）一実施形態では、界面でのホットスポットをさらに増大または改善するため、あるいは集合化擬似ネイティブアルブミン構造における２つのセグメント間の構造的および物理化学的相補性を増強するために、２つのセグメントの界面でアミノ酸を改変する。
【０２１３】
以下の表３は、ＡｌｂｕＣＯＲＥ足場に関する界面パラメーターおよび会合自由エネルギーを示す。ＨＳＡに由来する第一および第二セグメントの集合に由来する擬似ネイティブ構造間の埋没界面面積は、当該技術分野で既知のアルゴリズムを用いる構造ベースのコンピューター処理を用いてコンピューター計算され得る（例えば、Ｈ．Ｅｄｅｌｓｂｒｕｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｅｈｌ．Ｔｈｅ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ａ  ｓｐａｃｅ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｄｉａｇｒａｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００，２２０３−２２０８（２００３））。コンピューター処理面積は、極性および無極性表面積にさらに分類され得る。無極性面積は、界面での埋没した疎水性アミノ酸側鎖の指標である。ΔΔＧａｓｓｏｃは、２つのセグメント構造の会合状態と非会合状態との間のコンピューター処理自由エネルギー差を指す。理論的コンピューター処理自由エネルギーは、２つの接触しているセグメント表面間の水素結合およびその他の静電的相互作用、ファンデルワールス接触、脱溶媒和作用および表面相補性を説明する。会合の自由エネルギーをコンピューター処理する方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｓｏｎ  Ｔ，Ａｒｃｈｏｎｔｉｓ  Ｇ，Ｋａｒｐｌｕｓ  Ｍ．Ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｃｏｍｅ  ｏｆ  ａｇｅ：ｐｒｏｔｅｉｎ−ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ．Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．（２００２）３５，４３０−７）。
【表３】
0006498601.tif 000029
【０２１４】
図３２は、三次元構造から導いたヒト血清アルブミンにおける残基のサブセットにより生じる残基接触のプロットを示す。残基接触は、特定距離範囲内で起こる、残基間のまたはある残基内の原子−原子相互作用により決定でき、ある種の物理化学的性質である。強力な残基接触を有する残基または残基の群は、ホットスポットとして認識され得る。このような残基接触分析はまた、ループ（または３Ｄタンパク質構造における非構造化二次構造領域）残基、例えば限定残基接触を作るもの、を決定するためにも用いられ得る。プロットはまた、残基についての溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）も示し、これは、当該技術分野で既知のアルゴリズムを用いてコンピューター処理され得る（例えば、Ｈ．Ｅｄｅｌｓｂｒｕｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｋｏｅｈｌ．Ｔｈｅ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｏｆ  ａ  ｓｐａｃｅ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｄｉａｇｒａｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００，２２０３−２２０８（２００３））。
【０２１５】
図３３は、ヒト血清アルブミンにおいて選択ホットスポット残基により達成される接触および相互作用の性質のプロットを示す。図３４は、ヒト血清アルブミンにおけるホットスポット残基またはホットスポット残基のクラスター（パッチ）のグラフである。
表４．  ＨＳＡにおける新規のセグメント化部位（ＡｌｂｕＣＯＲＥ）およびセグメント化が導入されたループの性質。「ループ長」欄は、２つの最も近い二次構造要素を繋ぐループの長さ（アミノ酸残基で）を指し、および「ｓｅｃ  ｓｔｒ距離」欄は、それらの同じ二次構造要素（この場合、すべてα−ヘリックス）のＮ末端およびＣ末端のＣα炭素間の距離を示す。界面Ｓ−Ｓは、得られたセグメント（輸送体ポリペプチド）の界面でのジスルフィド結合を示す。
【表４】
0006498601.tif 000030
【０２１６】
実施例２：ＨＡ／アロアルブミンベースのヘテロ多量体タンパク質の調製
安定にフォールドし自己集合して元のタンパク質の擬似ネイティブ四次構造を形成する単量体ポリペプチド鎖を生じる、ＨＳＡ配列および構造に沿ったセグメント化部位を決定するための方法が示される。このような安定会合のための重要な要件の１つは、ポリペプチド鎖間の界面における表面相補性の大きな埋没面積の形成である。元のタンパク質のネイティブフォールドは、タンパク質内の領域の天然の相補性の指標を提供する。
【０２１７】
図２は、セグメント化点がタンパク質配列に沿って移動される際、ＨＳＡの擬似ネイティブ構造へと理想的にフォールドする２つのアルブミンベースのポリペプチドの界面で埋没される溶媒接触表面積を示す。分析は、スプリットセグメント化が２〜３の例外を伴って残基３０〜５２０間のどこかに導入されると、疎水性界面を保持しつつ、２０００Å２以上のオーダーの大きな表面積が埋没されことを示す。いくつかの実施形態では、コンピューターで計算された分子表面積が、溶媒接触表面積の代わりに用いられる。いくつかの実施形態では、埋没表面積は、２０００Å２〜６０００Å２の範囲である。より大きい埋没表面積が非共有結合ＡＢＨ１に関して観察された。さらに、分析はまた、いくつかのループ領域が相対的曝露された表面であることも明らかにした。アルブミンは、ネイティブタンパク質構造の安定性に寄与する例外的に多数のジスルフィド架橋を有する。残基１１０、１９０、３００、３９０および５００付近のタンパク質の区分は、２つの輸送体ポリペプチドを横断するジスルフィド結合に関与する残基を分割しないセグメント化の部位を提供する。他の領域におけるセグメント化は、２つの輸送体ポリペプチド対間に架橋ジスルフィド結合を有するヘテロ二量体を生じるであろう。図３は、ＨＳＡ配列中の残基２９４〜３０３からのループの除去により得られる、１つのこのような擬似ネイティブアルブミン構造のモデルを表示する。本明細書中で示される配列番号２および配列番号３の２つのアルブミンベースのポリペプチドに関する総埋没表面積は、約２５００Å２である。これは、多数のタンパク質−タンパク質ヘテロ二量体およびホモ二量体共複合体構造で観察される平均範囲である１９１０〜３８８０Å２以内である［Ｂａｈａｄｈｕｒ  Ｒ．Ｐ．＆Ｚａｃｈａｒｉａｓ  Ｍ．（２００８）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ６５，１０５９−１０７２］。このことは、２つのポリペプチドのフォールディング経路が互いに十分に独立しているならば、この２つのポリペプチドが互いと選択的に会合する可能性が高いことを示唆する。
【０２１８】
本発明の一態様において、２つのポリペプチド（配列番号２および配列番号３により形成される対、または配列番号８および配列番号１０により形成される輸送体対）を用いる安定な擬似ネイティブ構造の選択的形成は、適切な目的のカーゴタンパク質を輸送体ポリペプチドとして用いられるアルブミンベースのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端と融合した後に、二重特異性またはその他の多機能性分子の形成を駆動するためにこれらのポリペプチドを用いる機会を与える。輸送体ポリペプチド対ヘテロ二量体を生じる多数の他の代替的セグメント化のパターンが設計され得る。融合されるカーゴタンパク質は、抗原結合ドメインまたはその他のペイロード、例えば化学毒素、放射性毒素またはサイトカインであり得る（図４に表示）。その結果生じるヘテロ二量体は、ＨＳＡに固有の好ましい多くの特性、例えば血清中の半減期および安定性、組織浸透性輸送特質および低免疫原性などを有する。伝統的なリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘがカーゴタンパク質と輸送体ポリペプチドとの融合のために用いられ得る。
【０２１９】
本発明の別の態様では、ＨＳＡベースの輸送体ポリペプチドの各々は、独立して、二重特異性Ｆｃ分子中の２つの重鎖のＣ末端と融合される（図５に表示）。２つの輸送体ポリペプチド（例えば、配列番号２および配列番号３）の強力かつ選択的対合はＦｃの選択的ヘテロ二量体化を駆動し、かつその安定性およびその他の有益な薬物動態特性にも寄与する。
【０２２０】
ＮＭ＿０００４７７．５，コンセンサスＣＤＳ（ＣＣＤＳ）ＩＤ  ３５５５．１からの血清アルブミンプレタンパク質ＮＰ＿０００４６８．１  ＧＩ  ４５０２０２７  ｍＲＮＡ配列
配列番号４：残基１〜２４（ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧ）は、切断されるＮ末端輸出シグナル配列領域である。この配列は、天然シグナル配列と同一の役割を遂行するが哺乳動物およびＣＨＯ細胞株に対して最適化されている。
【０２２１】
配列番号１：ｇｉ｜４５０２０２７｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０００４６８．１｜血清アルブミンプレプロタンパク質［ホモサピエンス］  括弧内は、切断されて血清アルブミンを生じるＮ末端輸送配列である。
（ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧ）ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【０２２２】
配列番号５：ヒト血清アルブミンヌクレオチドＣＣＤＳ配列（１８５２ｎｔ）
ＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＴＡＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＧＡ
【０２２３】
輸送体ポリペプチドとして有用なアルブミンベースのポリペプチドのタンパク質およびヌクレオチド配列は、以下のとおりである：
【０２２４】
アルブミンベースのヘテロ多量体１：
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ１：配列番号２：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶ
【０２２５】
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ  １をコードするヌクレオチド配列：配列番号６：
ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＧＴＧＡ
【０２２６】
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ１：配列番号３：
ＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【０２２７】
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ１をコードするヌクレオチド配列：配列番号７：
ＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＣＡＴＣＣＴＧＡＴＴＡＣＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＧＡ
【０２２８】
アルブミンベースのヘテロ多量体２：
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ２：配列番号８：
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＡ
【０２２９】
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド１−Ｖｅｒ  ２をコードするヌクレオチド配列：配列番号９：
ＧＡＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡＧＧＴＴＧＣＴＣＡＴＣＧＧＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＴＴＧＡＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＴＣＡＧＴＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＣＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＡＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＧＴＣＡＧＣＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＴＣＡＣＴＴＣＡＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＴＴＣＴＴＧＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＴＴＧＧＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＧＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＧＴＧＣＡＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＴＧＡＣＡＡＴＧＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＣＣＣＣＧＧＡＡＣＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＴＴＧＣＣＡＡＡＧＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡＣＴＣＡＡＧＴＧＴＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡＴＧＧＧＣＡＧＴＡＧＣＴＣＧＣＣＴＧＡＧＣＣＡＧＡＧＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＧＡＴＣＴＴＡＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＧＡＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＧＡＣＡＧＧＧＣＧＧＡＣＣＴＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＡＴＴＣＧＡＴＣＴＣＣＡＧＴＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＴＧＣＡＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＣＴＴＧＣＣＴＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＴＴＴＧＴＴＧＡＡＡＧＴＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＧＴＣＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＴＧＴＴＴＴＴＧＴＡＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＴＧＡ
【０２３０】
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ２：配列番号１０：
ＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ
【０２３１】
アルブミンベースの輸送体ポリペプチド２−Ｖｅｒ２をコードするヌクレオチド配列：配列番号１１：
ＴＣＴＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＣＣＡＣＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＴＣＧＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＣＣＴＣＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＴＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＡＡＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧＴＡＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＡＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＴＡＡＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＣＡＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＧＡＡＧＡＣＴＡＴＣＴＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＧＣＡＴＧＡＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＡＡＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＣＴＴＧＧＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＡＡＡＣＡＴＡＣＧＴＴＣＣＣＡＡＡＧＡＧＴＴＴＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＣＡＴＴＣＡＣＣＴＴＣＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＡＣＡＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＣＡＡＡＴＣＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＴＧＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＧＡＡＡＧＣＴＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＣＡＧＣＴＴＴＴＧＴＡＧＡＧＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＴＡＡＧＧＡＧＡＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＧＴＡＡＡＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＣＴＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＧＡ
【０２３２】
ＨＡまたはＨＡＡベースのヘテロ多量体の生成および発現
ヒト／哺乳動物発現に関して最適化されたコドンを用いて、遺伝子合成により、全長ＷＴ  ＨＡおよびＨＡベースの輸送体ポリペプチド単量体をコードする遺伝子を構築した。構築物は、シグナル配列ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧの排除後に、既知の全長ヒト血清アルブミンプレタンパク質（ＧＥＮＥＢＡＮＫ：ＮＰ＿０００４６８．１）から設計した。最終遺伝子生成物を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ）中にサブクローン化した。懸濁増殖ヒトＣＨＯ−３Ｅ７の一過性トランスフェクションによる高レベルおよびハイスループット組換えタンパク質産生を実施した。ここに記載される２つの足場の構築物境界に関しては、表３を参照されたい：アルブミンベースのヘテロ多量体１（ＡＢＨ１）およびアルブミンベースのヘテロ多量体２（ＡＢＨ２）。アルブミンベースのヘテロ多量体２は２つの輸送体ポリペプチド間に１つのジスルフィド結合を含み、一方アルブミンベースのヘテロ多量体１は完全に非共有結合的相互作用により形成される。図１６Ａおよび１６Ｂは、それぞれ、ＡＢＨ１およびＡＢＨ２のタンパク質構造および記号的表現を示す。２つの図が示すように、両ＡＢＨ構築物は２つの輸送体ポリペプチドＡおよびＢ（表３に記載された配列）からなる。図６Ａは、同時発現後の２つのヘテロ多量体構築物（ＡＢＨ１およびＡＢＨ２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）ゲル分析を提供する（異なるＤＮＡトランスフェクション比が示されている）。ＷＴ全長ＨＳＡは対照として示される。予測通り、ＡＢＨ２は非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥでジスルフィド結合を保持し、ＭＷはジスルフィド結合されていないＡＢＨ１のほぼ２倍である。図６Ａはまた、ＡＢＨ２におけるヘテロ二量体の形成がＤＮＡトランスフェクション比に依存し、１：１比でほとんどのヘテロ二量体生成物を産生することも実証している。最後に、６Ａは、ＡＢＨ２の断片Ａは、単独の分子として発現される場合、よりホモ二量体を形成しやすくまた単量体のまま留まり易い（これは図６Ｂで観察された結果でもある）ことを実証する。図６Ｂは、同時発現（１：１ＤＮＡレベル）後の、２つのアルブミンベースのヘテロ多量体構築物（ＡＢＨ１およびＡＢＨ２）のネイティブゲル分析を提供する。ＷＴ全長ＨＳＡは対照として示される。ＡＢＨ１およびＡＢＨ２はともに、全長ＷＴ  ＨＳＡに匹敵する予測された質量の複合体を形成する。さらに、発現時に、ＡＢＨ１を形成する輸送体ポリペプチドもＡＢＨ２を形成する輸送体ポリペプチドもホモ二量体化しない；むしろそれらは安定なヘテロ複合体を優先的に形成する（詳細に関しては、以下の表５参照）。
【表５】
0006498601.tif 000031
【０２３３】
ＷＴ−ＨＳＡおよび２つのアルブミンベースのヘテロ多量体（ＡＢＨ１およびＡＢＨ２）を、０．１％ｗ／ｖプルロニックおよび４ｍＭグルタミンを補足したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の懸濁液中で増殖させたＣＨＯ−３Ｅ７細胞株中で発現させた。トランスフェクション当日の細胞密度は約１．５〜２×１０６細胞／ｍｌであるべきで生存度は９７％より高くなければならない。５％ｐＴＴｏ−ＧＦＰプラスミド（トランスフェクション効率を決定するための緑色蛍光タンパク質、表４）、１５％ｐＴＴ２２−ＡＫＴプラスミド、２１％ＨＳＡプラスミド（各々１０．６３％）、６８．３７％のサケ精子ＤＮＡから作られたプラスミドＤＮＡの混合物を用いて、特許出願  ＷＯ  ２００９／１３７９１１に記載されたようにトランスフェクションを実行した。トランスフェクション後、次に、細胞を含有する振盪フラスコを、３７℃で５％ＣＯを有する加湿インキュベーター中で１２０ｒｐｍに設定したオービタル振盪器上に置いた。トランスフェクションの２４時間後、１％ｗ／ｖ  ＴＮ１および０．５ｍＭ  ＶＰＡ（バルプロ酸）を培養に添加した。次に、培養物を、３２℃に設定した５％ＣＯ２を有する加湿インキュベーター中に入れたオービタル振盪器（１２０ｒｐｍ）上に移した。２４〜４８時間において、フローサイトメトリーで測定した場合、ＧＦＰ陽性細胞が３０〜６０％存在するはずである。細胞をトランスフェクション７日後に収穫し、４，０００ｒｐｍで２０分間遠心した。０．４５μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて、上清をフィルター滅菌した（清澄化）。上清を短期貯蔵のために４℃で、長期保存のために−８０℃で保存した。精製前に、凍結上清を３７℃で解凍し、真空下で５〜１０分間０．４５μｍ膜フィルターを通して再濾過および脱気した。
【表６】
0006498601.tif 000032
【０２３４】
ＡＢＨ２、ＨＳＡおよびヘテロ多量体の精製
図６Ａから観察されるように、１：１ＤＮＡトランスフェクション比の２つの輸送体ポリペプチドは、最も高いレベルのヘテロ二量体ＡＢＨ２産物を生成した。この比の２つのポリペプチドを一過的に同時発現するＣＨＯ細胞を、上記のように培養した。その後のヘテロ二量体生成を以下のように実行した。野生型ヒトアルブミンをＣＨＯ細胞中にトランスフェクトしてＡＢＨ２と同様に精製した。
【０２３５】
Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリクス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を詰めた卓上型ＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  ５００カラムを用いて、自然流下方式により精製を実施した。Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリクスを、２０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡化した。試料を５ｍｌ／分の流量で充填し、その後２０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。１Ｍ  ＮａＣｌを追加した０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２でタンパク質を溶出して１ｍｌ画分中に収集した（合計２０ｍｌ）。ＨＳＡを含有する画分（Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質検定による）をプールし、１ｍｌ／ｍｌの流量を用いてＡＫＴＡ   Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と連結されたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ等級ゲル濾過カラム上に載せた。純度＞８５％のタンパク質を収集した；純粋試料を含有する画分をプールし、１００００  ＭＷＣＯのカットオフ重量のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ膜を用いて遠心分離により濃縮した。図６Ｃは、いずれも精製の最終段階後のＡＢＨ２ヘテロ多量体およびＷＴ  ＨＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析を示す。両構築物は、予測されたＭＷを示す。
【０２３６】
精製収率は約１０ｍｇ／Ｌで、野生型全長ＨＳＡに匹敵した。この結果は、ＨＥＫ細胞で実施されたＶ１０８７対照により生成された９ｍｇ／Ｌにも匹敵した。収率は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅおよびサイズ排除クロマトグラフィー後に測定されたナノドロップ  Ａ２８０により決定した。
【０２３７】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いたアルブミンベースのヘテロ多量体の安定性測定
ＧＥまたはＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−毛細管計器を用いて、すべてのＤＳＣ実験を実行した。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に緩衝液交換して０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬに希釈し０．１３７ｍＬで試料セル中に充填し、１℃／分の走査速度にて２０〜１００℃で測定した。Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてデータを解析して、ＰＢＳ緩衝液バックグラウンドを差し引いた。結果として決定された融解温度に関しては、表７および図７を参照のこと。
【表７】
0006498601.tif 000033
【０２３８】
表面プラズモン共鳴を用いたＨＳＡおよびＡＢＨ２のＦｃＲｎ結合の評価
図８Ａ〜Ｂで観察されるように、ＨＳＡおよびＨＳＡベースのヘテロ多量体がＳＰＲ表面に固定化した際、ＦｃＲｎに対する親和性は、全長ＷＴ  ＨＳＡおよびＡＢＨ２間で同等であるように見え、このことはアルブミンのＦｃＲｎ結合機能性はアルブミンベースの輸送体ポリペプチドの自己集合により形成されるヘテロ多量体により保持されることを示している。以下の表８は、ＦｃＲｎ結合データを示す。括弧内の値は、標準偏差を指す。
【表８】
0006498601.tif 000034
【０２３９】
実施例３：抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕおよび抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ生物活性融合体を含む一価および四価を有するアルブミンベースのヘテロ多量体の生成および発現。
抗Ｈｅｒ２ｓｃＦｖ（４Ｄ５）および／または抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ（ＮＭ３Ｅ）であるカーゴポリペプチドへ一方または両方の末端で融合される単一単量体輸送体ポリペプチド、配列番号８および配列番号１０を発現することにより、多価ヘテロ多量体ＡＢＨ２を生成した。４Ｄ５という用語は、本明細書中で用いる場合、４Ｄ５抗体のヒト化配列を指し、ｓｃＦｖ分子フォーマットにおけるＶ１およびＶｈドメイン間にリンカー領域を伴うトラスツズマブ抗体中の可変ドメインのアミノ酸配列に対応する。これらは輸送体ポリペプチド１を基礎にした８つのベース構築物単量体ならびに輸送体ポリペプチド２を基礎にした８つのベース構築物単量体の一式を形成する。これらのベース構築物の異なる組合せは同時発現時に組み合わされて、一価から四価までの範囲で、２つの輸送体ポリペプチドの４つの末端位置のいずれかで２つのカーゴポリペプチドのすべての組合せを提示するヘテロ多量体を形成する。
【０２４０】
図９に示したように、生物活性カーゴポリペプチドを、単量体のＮ末端に関してはＧＧＳＧリンカーを介して、および他の単量体におけるすべての他の末端に関してはより長い（ＧＧＳ）４ＧＧリンカーを介して、ヘテロ多量体輸送体ポリペプチドに融合した。
【０２４１】
表９は、４Ｄ５およびＮＭ３Ｅカーゴポリペプチドを輸送体ポリペプチド１（Ｆ１）または輸送体ポリペプチド２（Ｆ２）のＮ末端またはＣ末端に融合することにより生成された１６のベース構築物（ベース構築物＃１〜ベース構築物＃１６）を示す。Ｆ１は配列番号８に対応し、およびＦ２は配列番号１０に対応する。
【表９】
0006498601.tif 000035
【０２４２】
多価構築物を、ヘテロ多量体ＡＢＨ２を用いて実施例２に略記したように生成した。最終遺伝子生成物を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ）中にサブクローン化した。懸濁増殖ヒトＣＨＯ−３Ｅ７の一過性トランスフェクションによる高レベルおよびハイスループット組換えタンパク質産生を実施した。これらの構築物の調製および発現に関する追加の詳細は、実施例１１に見出される。
【０２４３】
発現タンパク質を有する細胞上清を１ｍｌ／ｍｌの流量を用いて、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリクス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を詰めＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と連結されたＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  ５００カラムに適用することにより、精製を実施した。カラムは、２０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌからなる試料緩衝液で平衡化した。試料を５ｍｌ／分の流量で充填し、その後試料緩衝液で洗浄した。３００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲のＮａＣｌ勾配の適用により、タンパク質を溶出した。より高い塩濃度で溶出する画分が最も純粋であり、それをプールして濃縮し、その後１ｍｌ／ｍｌの流量を用いて、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と連結されたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ等級ゲル濾過カラムに適用した。純度＞８５％のタンパク質を収集した；純粋試料を含有する画分をプールし、１００００  ＭＷＣＯのカットオフ重量のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ膜を用いて遠心分離により濃縮した。図１０Ａ〜１０Ｂは、異なるカーゴポリペプチドと融合されたＡＢＨ２ヘテロ多量体ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析を示す。輸送体ポリペプチドと比較したヘテロ多量体中のそれらのポリペプチドの位置を、以下の表１０に略記する。全構築物が、予測された分子量を示した。
【表１０−１】
0006498601.tif 000036
【表１０−２】
0006498601.tif 000037
【０２４４】
単一抗ＣＤ１６ｓｃＦｖに融合される一価ＡＢＨ２のＳＰＲ結合
輸送体ポリペプチド  配列番号１０（構築物ｖ５１５）のＮ末端へ単一抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖに融合された精製ヘテロ多量体  ＡＢＨ２を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いる結合実験に用いた。可溶性ＣＤ１６をＣＭ５表面に共有的に固定化して、抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖに融合されたＡＢＨ２を捕捉し、結合反応速度を測定した。
【０２４５】
ＳＰＲ補給品：  ＧＬＭセンサーチップ、Ｂｉｏｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  アミンカップリングキット（ＥＤＣ、ｓＮＨＳおよびエタノールアミン）、ならびに１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  ＯＮ）から購入した。組換えＨｅｒ−２タンパク質は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＥＤＴＡおよびＮａＣｌは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入した。１０％Ｔｗｅｅｎ  ２０溶液は、Ｔｅｋｎｏｖａ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から購入した。
【０２４６】
ＳＰＲバイオセンサー検定：  表面プラズモン共鳴検定はすべて、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６計器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）Ｌｔｄ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ））を、ＨＢＳＴランニング緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）とともに２５℃で用いて、実行した。分析物（水平）方向に３０μＬ／分で３００秒間注入された標準ＢｉｏＲａｄ  ｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液の１：５希釈液により活性化されたＧＬＭセンサーチップを用いて、ＣＤ１６捕捉表面を生成した。活性化直後に、３０００共鳴単位（ＲＵｓ）が固定化されるまで、１０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．５中のＣＤ１６の４．０μｇ／ｍＬ溶液を２５μＬ／分の流量でリガンド（垂直）方向に注入した。残りの活性基を、分析物方向に３０μＬ／分で３００秒の１Ｍエタノールアミン注射によりクエンチし、これは模擬活性化インタースポットがブランク参照のために生じることも保証する。
【０２４７】
Ｖ５１５の５００ｎＭの３倍希釈液シリーズを、ブランク（Ｌ５）と比較される３０００  ＲＵｓの  ＣＤ１６ａＷＴ（Ｌ６）に対し注入した。流量  ５０ｕＬ／分で１２０秒間、解離相  ２４０秒。標準ランニング緩衝液（ＤＰＢＳ／３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）および追加の３５０ｍＭ  ＮａＣｌを含むランニング緩衝液で、注入を反復した。センサーグラムを整列し、緩衝液ブランク注入およびインタースポットを用いて二重参照して、その結果生じたセンサーグラムを、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒソフトウェア  ｖ３．０を用いて分析した。典型的には、平衡適合モデルを用いて結合等温線からＫＤ値を測定した。解離速度の遅い高親和性相互作用に関して、局所的Ｒｍａｘを用いて参照センサーグラムを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させることにより動的および親和性値を追加で決定し、および親和性定数（ＫＤＭ）を、結果として生じる速度定数（ｋｄｓ−１／ｋａＭ−１ｓ−１）から得た。ＫＤ値はすべて、３つの個々の実行からの平均および標準偏差として報告される。
【０２４８】
表１１に示すように、単一抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖに融合されるＡＢＨ２ヘテロ多量体は十分な活性を有し、良好な再現性および遊離の抗ＣＤ１６  ｓｃＦｖ（ＮＭ３Ｅ）と同様のＫＤで、その標的に結合する。
【表１１】
0006498601.tif 000038
【０２４９】
実施例４  カーゴタンパク質（単数または複数）が１つ以上のＥＧＦ−Ａ様ドメインを含むＨＡまたはＨＡＡベースのヘテロ多量体の調製。
低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）を特異的に結合し得る、ＰＣＳＫ９タンパク質中のＥＧＦ−Ａドメインのペプチド配列またはＥＧＦ−Ａドメインと相同の別のポリペプチド配列は、シーケンシングによりまたはＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから得られる。ＥＧＦ−Ａ様ドメインを含むカーゴポリペプチドに関するｃＤＮＡは、種々の手段により、例えばｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにより、ならびにＰＣＲにより（これらに限定されない）、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、すべて標準方法を用いて単離される。ある例では、カーゴタンパク質は、安定性、標的結合特徴またはその他の生物物理学的または治療的関連特性を改善するよう改変される。ポリペプチドは、高コレステロール血症の処置における適用を伴うヘテロ多量体の作成において、カーゴタンパク質として用いられる。第一および第二の単量体融合ポリペプチド配列は、カーゴタンパク質配列を、ＨＡまたはＨＡＡベースの輸送体ポリペプチド、例えば配列番号２、配列番号３、配列番号８または配列番号１０のＮ末端またはＣ末端に、直接的にまたは中間リンカーペプチドを用いて融合することにより得られる。この単量体融合タンパク質配列は逆翻訳されて発現ベクター中に導入されるその対応ＤＮＡ配列となり、配列は特定の目的の細胞株での発現のために最適化される。第一および第二の単量体融合タンパク質はトランスフェクトされ、目的の細胞株で同時発現される。ある場合には、トランスフェクションは２つのベクターに関して１：１比である。いくつかの例では、その比は１．５：１、２：１、１：１．５、１：２等から選択される。
【０２５０】
実施例５  カーゴタンパク質（単数または複数）がＧＬＰ−１および／またはグルカゴンであるＨＡまたはＨＡＡベースのヘテロ多量体タンパク質の調製。
ＧＬＰ−１受容体を特異的に結合し得るかまたはＧＬＰ−アゴニストとして作用し得るＧＬＰ−１のペプチド配列、またはこのペプチドと相同の別のポリペプチド配列は、シーケンシングによりまたはＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから得られる。あるいは、グルカゴン受容体を特異的に結合し得るかまたはグルカゴン受容体アゴニストとして作用し得るグルカゴンのペプチド配列、またはこのペプチドと相同の別のポリペプチド配列は、シーケンシングによりまたはＧｅｎＢａｎｋのようなデータベースから得られる。ＧＬＰ−１またはグルカゴンを含む各カーゴポリペプチドに関するｃＤＮＡは、種々の手段により、例えばｃＤＮＡライブラリーから、ＲＴ−ＰＣＲにより、ならびにＰＣＲにより（これらに限定されない）、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、すべて標準方法を用いて単離される。ある例では、これらのＧＬＰ−１またはグルカゴンベースのカーゴポリペプチドは、安定性、標的結合特徴またはその他の生物物理学的または治療的関連特性を改善するよう改変される。これらのＧＬＰ−１およびグルカゴンベースのポリペプチドは、２型糖尿病またはグルコース代謝に関連した別の疾患の処置における適用を伴うヘテロ多量体の作成において、１つ以上のカーゴ分子として用いられる。第一および第二の単量体融合ポリペプチド配列は、カーゴタンパク質配列を、ＨＡまたはＨＡＡベースの輸送体ポリペプチド、例えば配列番号２、配列番号３、配列番号８または配列番号１０のＮ末端またはＣ末端に、直接的にまたは中間リンカーペプチドを用いて融合することにより得られる。融合タンパク質は、ＧＬＰ−１またはグルカゴン様ポリペプチドに関して多重特異性であってよく、あるいはＧＬＰ−１およびグルカゴン様ポリペプチドの両方に関して二重特異性（共アゴニスト）であり得る。各単量体融合タンパク質配列は逆翻訳されて発現ベクター中に導入されるその対応ＤＮＡ配列となり、配列は特定の目的の細胞株での発現のために最適化される。第一および第二の単量体融合タンパク質はトランスフェクトされ、目的の細胞株で同時発現される。ある場合には、トランスフェクションは２つのベクターに関して１：１比である。いくつかの例では、その比は１．５：１、２：１、１：１．５、１：２等から選択される。
【０２５１】
カーゴ分子ＧＬＰ−１の配列
配列番号１２：  ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ
【０２５２】
カーゴ分子グルカゴンの配列
配列番号１３：  ＨＳＱＧＴＦＴＳＤＹＳＫＹＬＤＳＲＲＡＱＤＦＶＱＷＬＭＮＴ
【０２５３】
実施例６：膜センシング多価足場としてのアネキシンタンパク質反復
アネキシンを広範な界面で分割して２つの輸送体ポリペプチドを含む多価ヘテロ多量体足場を生成する。アネキシンは３４６残基のタンパク質（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＭＣＸ）である。残基１８６および１９４間の領域で分割されたアネキシンをベースにした２つの輸送体ポリペプチドを含むヘテロ多量体を図１１に示す。溶液中で同時発現されると、２つの輸送体ポリペプチド間の大きな界面面積はヘテロ二量体の自己集合をもたらす。２つの単位の自己集合は、アネキシンコアをベースにした輸送体ポリペプチドを伴う多価構築物の設計を可能にする。ブタおよびヒトの２つの構造が入手可能である。この２つの構造は、０．６Ａのｒｍｓｄで重ねることができる。以下の区間の配列が、ヒトアネキシン配列から除去され得る  ＤＲＳＥＤＦ（残基１６０〜１６５）。切断化はいかなる二次構造要素も破壊せず、任意のプロリン残基を導入するかまたは除去することを包含しない。
【０２５４】
ヒトアネキシンＷＴ配列
配列番号１４：
ＧＳＡＶＳＰＹＰＴＦＮＰＳＳＤＶＡＡＬＨＫＡＩＭＶＫＧＶＤＥＡＴＩＩＤＩＬＴＫＲＮＮＡＱＲＱＱＩＫＡＡＹＬＱＥＴＧＫＰＬＤＥＴＬＫＫＡＬＴＧＨＬＥＥＶＶＬＡＬＬＫＴＰＡＱＦＤＡＤＥＬＲＡＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＫＥＩＲＤＩＮＲＶＹＲＥＥＬＫＲＤＬＡＫＤＩＴＳＤＴＳＧＤＦＲＮＡＬＬＳＬＡＫＧＤＲＳＥＤＦＧＶＮＥＤＬＡＤＳＤＡＲＡＬＹＥＡＧＥＲＲＫＧＴＤＶＮＶＦＮＴＩＬＴＴＲＳＹＰＱＬＲＲＶＦＱＫＹＴＫＹＳＫＨＤＭＮＫＶＬＤＬＥＬＫＧＤＩＥＫＣＬＴＡＩＶＫＣＡＴＳＫＰＡＦＦＡＥＫＬＨＱＡＭＫＧＶＧＴＲＨＫＡＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＭＮＤＩＫＡＦＹＱＫＭＹＧＩＳＬＣＱＡＩＬＤＥＴＫＧＤＹＥＫＩＬＶＡＬＣＧＧＮ
【０２５５】
アネキシンベースの輸送体ポリペプチド−１の配列
配列番号１５：
ＳＡＶＳＰＹＰＴＦＮＰＳＳＤＶＡＡＬＨＫＡＩＭＶＫＧＶＤＥＡＴＩＩＤＩＬＴＫＲＮＮＡＱＲＱＱＩＫＡＡＹＬＱＥＴＧＫＰＬＤＥＴＬＫＫＡＬＴＧＨＬＥＥＶＶＬＡＬＬＫＴＰＡＱＦＤＡＤＥＬＲＡＡＭＫＧＬＧＴＤＥＤＴＬＩＥＩＬＡＳＲＴＮＫＥＩＲＤＩＮＲＶＹＲＥＥＬＫＲＤＬＡＫＤＩＴＳＤＴＳＧＤＦＲＮＡＬＬＳＬＡＫＧ
【０２５６】
アネキシンベースの輸送体ポリペプチド−２の配列
配列番号１６：
ＧＶＮＥＤＬＡＤＳＤＡＲＡＬＹＥＡＧＥＲＲＫＧＴＤＶＮＶＦＮＴＩＬＴＴＲＳＹＰＱＬＲＲＶＦＱＫＹＴＫＹＳＫＨＤＭＮＫＶＬＤＬＥＬＫＧＤＩＥＫＣＬＴＡＩＶＫＣＡＴＳＫＰＡＦＦＡＥＫＬＨＱＡＭＫＧＶＧＴＲＨＫＡＬＩＲＩＭＶＳＲＳＥＩＤＭＮＤＩＫＡＦＹＱＫＭＹＧＩＳＬＣＱＡＩＬＤＥＴＫＧＤＹＥＫＩＬＶＡＬＣＧＧＮ
【０２５７】
図１２は、アネキシンベースの輸送体ポリペプチド−１（ＡＢＴ−１）およびアネキシンベースの輸送体ポリペプチド−２（ＡＢＴ−２）の界面での埋没した溶媒接触接表面積のプロットを示す。残基位置１８６近くで分割されたアネキシンは、約３２００Å２の埋没表面積を有するヘテロ二量体を形成する。アネキシンをベースにしたＡＢＴ−１およびＡＢＴ−２などの輸送体ポリペプチドは、アルブミンベースの輸送体ポリペプチドに関して上記したものと同一の方法を用いて、カーゴ生体分子と結合するために用いられ得る。
【０２５８】
実施例７：多価足場としてのトランスフェリン
トランスフェリンの多数の治療的に関連する特性に基づいて、このタンパク質は、自己集合性タンパク質およびそのスプリット構成成分部分の作成後、多価タンパク質融合薬剤の設計のための興味深い足場分子であることを示す。トランスフェリンの構造は、タンパク質データバンクで入手可能な結晶構造（１Ｈ７６）に基づき図１３に示されている［Ｈａｌｌ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  ２００２，  ５８，  ７０−８０］。トランスフェリン分子は、残基３３３および３４２間の短いペプチドリンカーにより接続される２つの構造的に類似した丸い部分、すなわちＮ末端およびＣ末端ローブからなる。
【０２５９】
ヘテロ二量体は、トランスフェリンタンパク質をベースにして設計され、前記ヘテロ二量体は、トランスフェリンの残基１〜３３３を伴う第一輸送体ポリペプチド、および元のトランスフェリン配列の３４２からＣ−末端までの残基からなる第二輸送体ポリペプチドを含む。同時発現される場合、２つの輸送体ポリペプチドは独立してフォールドし、対合してその治療的関連特性を保持し得る擬似トランスフェリン足場を形成する。さらに、このようなトランスフェリン足場は、多価融合分子、例えばトランスフェリンをベースにした輸送体ポリペプチドとの多価ＧＬＰ−１融合体、の産生を可能にする。これらの融合体は、アルブミンベースの輸送体ポリペプチドを伴うＧＬＰ−１−融合ポリペプチドと類似であり得る。
【０２６０】
図１３はＰＤＢ構造  １Ｈ７６をベースにしたトランスフェリン分子の構造を提供する。トランスフェリン分子を分割することにより得られる２つの単量体輸送体ポリペプチドは、明灰色および暗灰色単位として色分けされている。カーゴ分子を融合する部位は、球として表されている。図１４は、２つのトランスフェリンベースのポリペプチドの界面での埋没した溶媒接触表面積のプロットを示す。以下に示す２つの輸送体ポリペプチドのような残基位置３３０近くで分割されたトランスフェリンは、約１８００Å２の埋没表面積を有するヘテロ二量体を形成する。
【０２６１】
トランスフェリンベースの輸送体ポリペプチド−１の配列：
配列番号１７：
ＭＲＬＡＶＧＡＬＬＶ  ＣＡＶＬＧＬＣＬＡＶ  ＰＤＫＴＶＲＷＣＡＶ  ＳＥＨＥＡＴＫＣＱＳ  ＦＲＤＨＭＫＳＶＩＰ  ＳＤＧＰＳＶＡＣＶＫ  ＫＡＳＹＬＤＣＩＲＡ  ＩＡＡＮＥＡＤＡＶＴ  ＬＤＡＧＬＶＹＤＡＹ  ＬＡＰＮＮＬＫＰＶＶ  ＡＥＦＹＧＳＫＥＤＰ  ＱＴＦＹＹＡＶＡＶＶ  ＫＫＤＳＧＦＱＭＮＱ  ＬＲＧＫＫＳＣＨＴＧ  ＬＧＲＳＡＧＷＮＩＰ  ＩＧＬＬＹＣＤＬＰＥ  ＰＲＫＰＬＥＫＡＶＡ  ＮＦＦＳＧＳＣＡＰＣ  ＡＤＧＴＤＦＰＱＬＣ  ＱＬＣＰＧＣＧＣＳＴ  ＬＮＱＹＦＧＹＳＧＡ  ＦＫＣＬＫＤＧＡＧＤ  ＶＡＦＶＫＨＳＴＩＦ  ＥＮＬＡＮＫＡＤＲＤ  ＱＹＥＬＬＣＬＤＮＴ  ＲＫＰＶＤＥＹＫＤＣ  ＨＬＡＱＶＰＳＨＴＶ  ＶＡＲＳＭＧＧＫＥＤ  ＬＩＷＥＬＬＮＱＡＱ  ＥＨＦＧＫＤＫＳＫＥ  ＦＱＬＦＳＳＰＨＧＫ  ＤＬＬＦＫＤＳＡＨＧ  ＦＬＫＶＰＰＲＭＤＡ  ＫＭＹＬＧＹＥＹＶＴ  ＡＩＲＮＬＲＥＧ．
【０２６２】
トランスフェリンベースの輸送体ポリペプチド−２の配列：
配列番号１８：
ＥＣＫＰＶＫＷＣＡＬＳＨＨＥ  ＲＬＫＣＤＥＷＳＶＮ  ＳＶＧＫＩＥＣＶＳＡ  ＥＴＴＥＤＣＩＡＫＩ  ＭＮＧＥＡＤＡＭＳＬ  ＤＧＧＦＶＹＩＡＧＫ  ＣＧＬＶＰＶＬＡＥＮ  ＹＮＫＳＤＮＣＥＤＴ  ＰＥＡＧＹＦＡＶＡＶ  ＶＫＫＳＡＳＤＬＴＷ  ＤＮＬＫＧＫＫＳＣＨ  ＴＡＶＧＲＴＡＧＷＮ  ＩＰＭＧＬＬＹＮＫＩ  ＮＨＣＲＦＤＥＦＦＳ  ＥＧＣＡＰＧＳＫＫＤ  ＳＳＬＣＫＬＣＭＧＳ  ＧＬＮＬＣＥＰＮＮＫ  ＥＧＹＹＧＹＴＧＡＦ  ＲＣＬＶＥＫＧＤＶＡ  ＦＶＫＨＱＴＶＰＱＮ  ＴＧＧＫＮＰＤＰＷＡ  ＫＮＬＮＥＫＤＹＥＬ  ＬＣＬＤＧＴＲＫＰＶ  ＥＥＹＡＮＣＨＬＡＲ  ＡＰＮＨＡＶＶＴＲＫ  ＤＫＥＡＣＶＨＫＩＬ  ＲＱＱＱＨＬＦＧＳＮ  ＶＴＤＣＳＧＮＦＣＬ  ＦＲＳＥＴＫＤＬＬＦ  ＲＤＤＴＶＣＬＡＫＬ  ＨＤＲＮＴＹＥＫＹＬ  ＧＥＥＹＶＫＡＶＧＮ  ＬＲＫＣＳＴＳＳＬＬ  ＥＡＣＴＦＲＲＰ
【０２６３】
実施例８：ジスルフィド安定化されたＨＡまたはＨＡＡベースのヘテロ多量体タンパク質の設計
アルブミンベースの輸送体ポリペプチドを設計したが、ここではアルブミンに対し、輸送体ポリペプチドの各々において特定位置がシステインに突然変異化されて２つの輸送体ポリペプチド間のジスルフィド結合の選択的形成を可能にし、擬似ネイティブアルブミン単量体構造を有する安定ヘテロ二量体を生じる。
【０２６４】
以下の因子を考慮に入れながら、システインの導入のための残基を選択した：
ａ．  ２つの輸送体ポリペプチド間に共有結合を形成して、それによりヘテロ多量体およびその結果生じる擬似ネイティブ単量体形態の安定性を増大する。
ｂ．  ジスルフィド結合を形成するためには、特定のＣＡ−ＣＡおよびＣＢ−ＣＢ境界内でなければならない。
ｃ．  適合性の局所的環境（一般的に、部分的な溶媒露出領域におけるより短い疎水性側鎖が好ましい）は、存在している極性接触を妨げにくい。
【０２６５】
突然変異をＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅにより実施し、そして上記の実施例１および２に提示したように発現および精製を実施した。
【０２６６】
以下の表１２は、設計された導入システインを含む多数のアルブミンベースのヘテロ多量体を示す。ＡＢＨ３〜８は、ＡＢＨ２デザインをベースに設計され、一方、ＡＢＨ９〜１２はＡＢＨ１デザインに基づいた。
【表１２】
0006498601.tif 000039
【０２６７】
変異体  ＡＢＨ３、ＡＢＨ４、ＡＢＨ５、ＡＢＨ６、ＡＢＨ７およびＡＢＨ８を、小規模の２ｍＬ  ＣＨＯ培養中で、ＤＮＡ比１：１（断片１：断片２）で発現させた。発現のゲルを図３５に示す。ＷＴ−アルブミン（ｖ２２５）も、先の変異体ＡｌｂｕＣＯＲＥ  １およびＡｌｂｕＣＯＲＥ  ２とともに、対照として発現させた。変異体ＡＢＨ３、ＡＢＨ５およびＡＢＨ７はＡＢＨ２と同様に発現したが、一方、残りの変異体は発現がより低く、およびジスルフィドの無秩序な組み合わせの可能性（非還元型ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおける多数のバンドにより認識される）を示し、これはおそらく導入したシステイン突然変異と同時に天然ジスルフィド位置が存在するためであると思われる。発現の回復は、切断部位を変えることにより（実施例９参照）、または異なるＤＮＡ比でトランスフェクトすることにより達成され得る。これらの構築物の末端にはリンカーは存在しなかった。ＡＢＨ９、ＡＢＨ１０、ＡＢＨ１１およびＡＢＨ１２のような変異体におけるジスルフィド結合システイン突然変異の導入は、それらが元の界面に天然ジスルフィド結合位置を欠くため、この問題に対処すると予測される。
【０２６８】
実施例９：異なるセグメント化部位をベースにしたＨＡまたはＨＡＡベースのヘテロ多量体タンパク質の設計
以下の表１３は、図１５Ａ〜１５Ｐに示されるようなおよび表１に列挙される種々の部位でアルブミンをセグメント化することにより設計される輸送体ポリペプチドを含む、本明細書中に記載されるようなヘテロ多量体構築物を提供する。実施例８に記載された先の構築物および前記のものとは異なり、実施例９におけるＡｌｂｕＣＯＲＥ構築物はすべて、断片１のＣ末端および断片２のＮ末端へ融合されるＧＧＧＧＳリンカーを用いて作成した。これは、以下の理由のために行なった：１）短いリンカーの存在は典型的な融合分子を再作成し、切断部位（単数または複数）とリンカーの存在の適合性を理解することができる。２）リンカーの存在はまた、いくつかの露出した疎水性パッチを遮蔽することを含め、切断部位周囲の局所的環境を安定化するのにも役立ち得る。３）リンカーの存在は、弾頭がその分子と融合される場合、その後の段階における変数の数を低減する。発現結果に関しては表１３を参照されたい。発現は最初に小規模のＣＨＯ培養にて、異なる組合せ比で実施された各ＡｌｂｕＣＯＲＥ変異体における２つの断片で試験した。図３５ＡおよびＢにおけるゲルは、発現結果を示す。
【表１３】
0006498601.tif 000040
【０２６９】
選択した変異体の発現を実施例２に記載されたとおりに実施し、一方、精製は実施例１７に記載されるように実行した。用いたリンカー、ジスルフィド架橋、および発現結果のまとめに関するこれらの分子の特質を表１４に示す。
【表１４−１】
0006498601.tif 000041
【表１４−２】
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【表１４−３】
0006498601.tif 000043
【０２７０】
実施例１０：多重カーゴタンパク質
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質（例えば、輸送体アルブミンセグメントまたはその変異体に融合されるカーゴポリペプチド（あるいはその断片または変異体）を含有する）は、さらに他のタンパク質に融合されて「多重融合タンパク質」を生成し得る。これらの多重融合タンパク質は種々の用途のために用いられ得る。例えば、本明細書中に記載されるタンパク質とＨｉｓ−ｔａｇ  ＩｇＧドメインおよびマルトース結合タンパク質との融合は精製を容易にする（例えば、ＥＰ  Ａ  ３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３１：８４−８６（１９８８）参照）。ポリペプチドへ融合される各局在化シグナルは、特定の細胞内局在へとタンパク質を標的化し得る。さらに、本明細書中に記載されるタンパク質への付加的タンパク質配列融合は、ヘテロ多量体の溶解性および／または安定性をさらに増大し得る。上記のヘテロ多量体タンパク質は、当該技術分野で既知の技法を用いて、またはそれを慣例的に修正して、および／またはポリペプチドとＩｇＧ分子との融合を略記する以下のプロトコールを修正することにより、作製され得る。
【０２７１】
簡単に述べると、以下に記載される配列の５’および３’末端に及ぶプライマーを用いて、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分をＰＣＲ増幅し得る。これらのプライマーまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物または酵母発現ベクターへのクローニングを容易にする便利な制限酵素部位も有するはずである。
【０２７２】
例えば、ｐＣ４（ＡＴＣＣ寄託番号２０９６４６）が用いられる場合、ヒトＦｃ部分は、ＢａｍＨＩクローニング部位にライゲーションされ得る。３’ＢａｍＨＩ部位は破壊されるべきことに留意すべきである。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターをＢａｍＨＩで再制限酵素処理し、ベクターを線状化して、本明細書中に記載されるヘテロ多量体をコードするポリヌクレオチド（当該技術分野で既知の技法を用いて生成および単離）を、このＢａｍＨＩ部位にライゲーションする。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは停止コドンを伴わずにクローン化されることに留意されたい；さもなければ融合タンパク質を含有するＦｃは産生されない。
【０２７３】
本明細書中に記載されるヘテロ多量体タンパク質を産生するために天然シグナル配列を用いる場合、ｐＣ４は第二のシグナルペプチドを必要としない。または、天然シグナル配列が用いられない場合、ベクターは異種シグナル配列を含むよう修飾され得る（例えば、国際公告ＷＯ  ９６／３４８９１参照）。
【０２７４】
実施例１１．  抗Ｈｅｒ２、一重特異性、一価〜四価カーゴ装填アルブミンベースのポリペプチド；抗Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３二重特異性、二価カーゴ装填アルブミンベースのポリペプチド；および種々の対照の調製。
多数の異なるカーゴ装填アルブミンベースの輸送体ポリペプチドを、本実施例に記載するように調製した。実施例３の表８に記載した抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖｓを、以下のように調製した。簡単に述べると、ここに記載される方法に従って、ＡＢＨ２に抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖｓを、種々のシスおよびトランス立体配置で装填した。最終一重特異性ポリペプチドは、一価〜四価の範囲であった。構成成分ポリペプチドのアミノ酸および核酸配列の詳細も、表８に示されている。同様にして、ＡＢＨ２も、抗Ｈｅｒ２および抗Ｈｅｒ３  ｓｃＦｖｓを、シスおよびトランスの両立体配置で装填されて、二重特異性、二価分子を産生した。種々の実施例で利用される対照として、Ｖ１０８７、単一ｓｃＦｖｓ、単腕Ｆｃおよび二価Ｆｃも産生された。
【０２７５】
抗Ｈｅｒ２  ４Ｄ５  ｓｃＦｖを装填したＡＢＨ２。  ＡＢＨ２装填抗Ｈｅｒ２の異なる考え得る立体配置を図１７に模式的に示す。この図が示すように、ｓｃＦｖがＡＢＨ２の断片ＡまたはＢのいずれかのＮ末端またはＣ末端へ結合されることに依存する、多数のシスおよびトランス変異を調製した。短いＧＧＳＧリンカーをＡＢＨ２断片１の天然Ｎ末端に設計し、長い（ＧＧＳ）４ＧＧリンカーをＡＢＨ２断片１のＣ末端ならびにＡＢＨ２断片２のＮ末端およびＣ末端に設計した。最終遺伝子生成物を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ）中にサブクローン化した。懸濁増殖ヒトＣＨＯ−３Ｅ７の一過性トランスフェクションによる高レベルおよびハイスループット組換えタンパク質産生を実施した。発現タンパク質を有する細胞上清を１ｍｌ／ｍｌの流量を用いて、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と連結された、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリクス（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を詰めたＱＩＡＧＥＮ−ｔｉｐ  ５００カラムに適用することにより、精製を実施した。カラムは、２０ｍｌのＰＢＳ、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌからなる試料緩衝液で平衡化した。試料を５ｍｌ／分の流量で充填し、その後試料緩衝液で洗浄した。３００ｍＭ〜２０００ｍＭの範囲のＮａＣｌ勾配の適用により、タンパク質を溶出した。より高い塩濃度で溶出する画分が最も純粋であり、それをプールして濃縮し、その後１ｍｌ／ｍｌの流量を用いて、ＡＫＴＡＥｘｐｒｅｓｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と連結されたＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｒｅｐ等級ゲル濾過カラムに適用した。純度＞８５％のタンパク質を収集した；純粋試料を含有する画分をプールし、１００００  ＭＷＣＯのカットオフ重量のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ膜を用いて遠心分離により濃縮した。図１０Ａ〜１０Ｂは、異なるカーゴポリペプチドと融合されたＡＢＨ２ヘテロ多量体ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（非還元型）分析を示す。輸送体ポリペプチドと比較したヘテロ多量体中のそれらのポリペプチドの位置を、以下の表８に、そして図１７に略記する。全構築物が、予測された分子量を示した。
【０２７６】
１つの抗Ｈｅｒ２  ４Ｄ５  ｓｃＦｖ融合体へ融合される一価ＡＢＨ２は、表８に記載したような変異体５１７、５１８、５１９、５２０により例示される。２つまたは３つの抗Ｈｅｒ２  ４Ｄ５  ｓｃＦｖ融合体へ融合される二価および三価ＡＢＨ２は、表８に記載したような変異体５２５、５２６、５２７、５２８、５３１、５３２、５４０により例示される。これらの変異体はすべて、以下の段落に記載されるように、２つのアルブミン断片の同時発現により産生された。最後に、四価融合タンパク質を形成する４つすべての考え得る末端へ結合する抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖｓを、変異体５４２として言及した。
【０２７７】
抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ３  ｓｃＦｖｓを装填したＡＢＨ２（変異体１３７７、１３７８および１０９０）。
抗ＨＥＲ２および抗ＨＲ３へ融合されるアルブミンベースのヘテロ多量体の異なるバージョンを調製した。用いた抗ＨＥＲ２および抗ＨＥＲ３弾頭はＭＭ−１１１と同一受容体を標的にするが、主な差異は、抗ＨＥＲ２弾頭で、これはＭＭ−１１１に用いられる非中和Ｂ１Ｄ２弾頭または中和４Ｄ５弾頭であった。
【０２７８】
ＡｌｂｕＣＯＲＥ＿１（ＡＢＨ２）断片１を、ＧＧＧＳリンカーを介してＮ末端で抗ＨＥＲ３へ融合させて、抗ＨＥＲ２（４Ｄ５）へ融合された断片２と、断片２のＮ末端（変異体１３７８を生じる、トランスで弾頭を有する）あるいは断片２のＣ末端に（変異体ｖ１３７７を生じる、シスで弾頭を有する）置かれた（ＧＧＳＧ）４ＧＧリンカーを介して複合体を形成させた。ＧＧＧＳリンカーを介してそのＮ末端で抗ＨＥＲ３と融合される断片１ならびにＧＧＧＳリンカーを介してそのＣ末端で抗ＨＥＲ２と融合される断片２を組み合わせることにより、第三の型のＡｌｂｕＣＯＲＥ＿１（ＡＢＨ２）分子を形成した（変異体番号  １０９０）。この分子はシスで弾頭を有し、ＭＭ−１１１とほとんど同一である。ＭＭ−１１１ポリペプチドとＡＢＨ２ベースのポリペプチドとの間の主な差異は、１）ＭＭ−１１１ポリペプチドに用いられるリンカーはより疎水性であり、一方ＡＢＨ２ベースのポリペプチドに用いられるリンカーはポリ（ＧＬＹ）（Ｓ）であったこと、および２）ＡＢＨ２ベースのポリペプチドは、元々Ｍｅｒｒｉｍａｃｋにより導入されたＣ３４Ｓ／Ｎ５０４Ｑ突然変異を欠いている、ということである。
【０２７９】
ＭＭ−１１１および誘導体（変異体１０８７、１０８８、および１０８９）
ＭＭ−１１１分子は、修飾化ヒト血清アルブミンタンパク質の、それぞれＣ末端およびＮ末端に連結される２つのｓｃＦｖｓ、抗Ｈｅｒ２（Ｂ１Ｄ２）および抗Ｈｅｒ３（Ｈ３）、の単一ポリペプチド融合タンパク質であり、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋにより産生される。その結果生じる分子は二重特異性および二価である。対照として、ＭＭ−１１１分子の変異体が構築され、ここで抗Ｈｅｒ３（Ｈ３）弾頭は短いＡＡＳリンカーによりアルブミンのＮ末端に融合させ、一方、抗Ｈｅｒ２（Ｂ１Ｄ２）はＡＡＡＬリンカーを介してＣ末端へ融合させてベンチマーク対照変異体１０８７を作成した。この対照変異体は、それらのＭＭ−１１１分子においてＭｅｒｒｉｍａｃｋにより元々導入されたＣ３４Ｓ／Ｎ５０４Ｑ突然変異を欠く。追加のＭＭ−１１１関連分子を構築した：１）Ｎ末端で抗Ｈｅｒ３（Ｈ３）弾頭へのみ融合されるアルブミン（ｖ１０８８）、および２）Ｃ末端へ融合される抗Ｈｅｒ２（Ｂ１Ｄ２）（ｖ１０８９）。これらのいずれの場合も、用いたリンカーは、ＭＭ−１１１と同一であった。分子はすべて、ＣＨＯ細胞中で１：１比で発現させて、多量体４Ｄ５融合体に関して記載したように精製した。
【０２８０】
単一抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ
遊離の抗Ｈｅｒ２ヒトｓｃＦｖ（ｖ２１８）を１ＬのＣＨＯ３Ｅ７細胞中で発現させた（ｖ２１８）。（Ｈｉｓ）６タグを、ＴＥＶプロテアーゼ部位を含有する切断可能なリンカーを介して、Ｃ末端へ融合させた。フラクトゲル系と連結された金属（Ｃｏ２＋）アフィニティー（カラム容積＝１ｍＬ）、その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００サイズ排除クロマトグラフィーにより、タンパク質を精製した。精製後の収量は、３．６ｍｇの４Ｄ５  ｓｃＦｖ（Ｃｏ２＋アフィニティー後）および１．３８ｍｇ（サイズ排除後）であった。
【０２８１】
図３１Ａは、Ｃｏ２＋アフィニティー後のｖ２１８の精製を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥである。洗浄後、カラム溶出および脱塩した発現産物が提示されている。図３１Ｂは、サイズ排除カラムを通した二次精製後の変異体のクロマトグラフィープロフィールである。
【０２８２】
対照Ｆｃ分子（８７８、６２８および６３０）：
単一抗Ｈｅｒ２（４Ｄ５）ヒトｓｃＦｖを、Ｆｃ断片へ融合させて、一価の、一重特異性抗体生成物を産生した。ヘテロ二量体Ｆｃの形成を保証するために、ｈｅｔｅｒｏｄｒｉｖｅｒ突然変異をＦｃ鎖中に含めた。
【０２８３】
ｖ８７８：
ＯＡ４−ｓｃＦｖ−Ｂ１Ｄ２、  一価抗Ｈｅｒ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインは鎖Ａ上のｓｃＦｖであり、およびＦｃ領域は突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（鎖Ａ）およびＴ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（鎖Ｂ）を有するヘテロ二量体である。
【０２８４】
Ｖ６２８：
二価抗Ｈｅｒ２抗体であり、両Ｈｅｒ２結合ドメインはｓｃＦｖフォーマットであり、およびＦｃ領域は突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（鎖Ａ）およびＴ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（鎖Ｂ）を有するヘテロ二量体である。
【０２８５】
Ｖ６３０：
一価抗Ｈｅｒ２抗体であり、Ｈｅｒ２結合ドメインはｓｃＦｖであり、およびＦｃ領域は突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（鎖Ａ）およびＴ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ（鎖Ｂ）を有するヘテロ二量体である。
【０２８６】
表１５は、この節で記載される変異体に関するポリペプチド配列の一覧を提供する。
表１５：
【表１５】
0006498601.tif 000044
【０２８７】
実施例１２．  多価立体配置で抗Ｈｅｒ２  ４Ｄ５  ｓｃＦｖに融合されるＡＢＨ２によるＳＫＯＶ細胞への結合。
Ｈｅｒ２＋細胞に対するＡＢＨ２抗Ｈｅｒ２融合タンパク質の親和性を、この実施例で調べた。種々のｓｃＦｖ結合立体配置を図１７に提示する。ＡＢＨ２（ＡｌｂｕＣＯＲＥ（商標））単独、抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ単独、一価単腕Ｆｃ分子および二価二腕Ｆｃ分子を、対照として利用した。これらを図１７の「対照」パネルにまとめる。実施例２に従ってＡＢＨ２タンパク質を構築し、実施例１１に従って融合タンパク質を作成した。
【０２８８】
ＦＡＣＳ結合評価
Ｈｅｒ２を発現するＳＫＯＶ細胞に対する種々の抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２構築物および対照の結合親和性を、ＦＡＣＳにより評価した。検出は抗ＨＳＡポリクローナル（ＦＩＴＣ標識化）を用いて実施した。測定されたＫＤはすべて、見かけの値である。
【０２８９】
ＦＡＣＳプロトコールによる全細胞結合：
細胞が一旦十分な生存度に到達すると（すなわち、２ｘ１０６細胞／ｍｌ  細胞（＞８０％生存度））、培地をＴ７５培養フラスコから吸引し冷ＰＢＳで洗浄し、これをその後吸引した。フラスコ当たり３ｍＬの解離緩衝液を添加し、細胞を計数した。次に、懸濁液を１０５０ｒｐｍで５分間遠心分離して、細胞をＲＰＭＩ培地（５％ＦＢＳ＠  １×１０ｅ５細胞／１００μｌを含有）中に再懸濁した。１００ｕｌの細胞懸濁液をエッペンドルフチューブに添加し、その後１０μｌ／チューブの一次抗体（ヤギ抗ヒトＨＳＡ）を添加した。次に細胞を４℃で２時間、回転支持体上でインキュベートした。次に、チューブを室温で２分間２０００ｒｐｍで遠心分離した。培地を吸引し、ペレットを５００ｕｌＲＰＭＩ培地（５％ＦＢＳ含有）で洗浄して、再び遠心分離した。二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート抗ヤギＩｇＧ）を添加して、最終濃度を２ｕｇ／試料とした。ペレットを１００ｕｌ溶液中に再懸濁し、回転支持体上で４℃で１時間インキュベートして、２０００ｒｐｍで２分間、遠心分離した。次に細胞を５００ｕｌ  ＲＰＭＩ培地（５％ＦＢＳ含有）で洗浄して、再遠心分離し、フローサイトメトリー分析のために５００ｕｌ／ペレット中に再懸濁した。
【０２９０】
各構築物に関するＫＤ値を、図１７の代表的な表示の下に提示する。測定されたＫＤはすべて、見かけの値であり、値は分子当たり試験した６つの濃度（３μＭまで）の平均を表す。図で実証されているように、原子価が増大すると結合親和性が増大する傾向があり、これは見かけのＫＤ値の減少により示されている。一般的に、いずれかの断片ポリペプチドのＮ末端へ結合される抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖは、Ｃ末端に結合されるものより、Ｈｅｒ２に対しより大きい親和性を示す。いくつかの実施形態では、特定位置での融合において有効な親和性を低減する多重特異性多価種のこの特性は、いくつかの融合相手種の親和性および活性を弱めるために用いられ得る。
【０２９１】
実施例１３．  抗Ｈｅｒ２および抗Ｈｅｒ３  ｓｃＦｖへ融合されるＡＢＨ２の二重特異性結合。
抗Ｈｅｒ２および抗Ｈｅｒ３  ｓｃＦｖｓをシス立体配置で装填されたＡＢＨ２の、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対する結合親和性を評価し、ｖ１０８７対照と比較した。融合タンパク質および対照はいずれも実施例１１に従って構築した。
【０２９２】
二重特異性結合のＦＡＣＳ分析
例示的アルブミンベースのヘテロ多量体変異体１０９０（抗Ｈｅｒ２×抗Ｈｅｒ３  ＡＢＨ２）の、ＭＡＬＭＥ−３ＭおよびＳＫＯＶ細胞に対する結合親和性を、実施例１２に記載したように、ＦＩＴＣ標識化抗ＨＳＡ抗体とＦＡＣＳを用いて評価した。実施例１１に記載したように、ｖ１０９０は、Ｂ１Ｄ２／Ｈ３融合体、Ｍｅｒｒｉｍａｃｋリンカー長、および低疎水性リンカー・ポリＧＬＹ）（Ｓ）を含む。
【０２９３】
図１８Ａは、ＳＫＯＶ細胞での、対照１０８７と比較した変異体１０８８、１０８９および１０９０の結合を示す。図１８Ｂは、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞での、対照１０８７と比較した変異体１０８８、１０８９および１０９０の結合を示す。以下の表１６は、両細胞型におけるこれらの変異体の結合の特性に関するデータを提供する。表１６における単位はすべて、別記しない限りｎＭである。
【０２９４】
ＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞に対する１０８７および１０９０の結合は、それぞれ５〜５５ｎＭおよび２００〜１０，０００ｎＭであった。ＳＫＯＶ細胞に対する１０８７および１０９０の結合は、それぞれ１０ｎＭおよび９．４ｎＭであった。
【表１６】
0006498601.tif 000045
【０２９５】
実施例１４．  抗Ｈｅｒ２へ融合されたＡＢＨ２の血清安定性。
ヒト血清中における抗Ｈｅｒ２を装填されたＡＢＨ２の安定性を、リンカーの潜在的タンパク質分解的切断を評価するために実施した。５つの変異体を試験した：ｖ５１７、ｖ５１８、ｖ５１９、およびｖ５２０。
【０２９６】
ヒト血清インキュベーションおよびその後のＦＡＣＳ分析。
上記の抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２融合タンパク質を、ＳＫＯＶ細胞に対する結合に関して試験し、次に予め凍結させたヒト血清中で、１００μｇ／ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｈ４５２２）で、室温で２４時間インキュベートした後、ＳＫＯＶ細胞の同一ストックに対する結合に関して再試験した。検出は、ヤギＦＩＴＣ標識ポリクローナル抗ＨＳＡ抗体を用いて実施した。ＳＫＯＶ−３細胞に対する融合タンパク質の結合親和性をＦＡＣＳを用いて評価し、対照として予備インキュベーションタンパク質を用いた。  図１９Ａ〜Ｄは、試験した変異体の予備インキュベーション前および後インキュベーション後の試料の結合曲線を示す。
【０２９７】
図１９Ａ〜Ｄに示されるように、全ての融合体は安定であり血清インキュベーション後に標的抗原へ結合可能のように見えた。
【０２９８】
実施例１５．  抗Ｈｅｒ２および抗Ｈｅｒ３  ｓｃＦｖへ融合されるＡＢＨ２のＦｃＲｎ結合。
抗Ｈｅｒ２および抗Ｈｅｒ３  ｓｃＦｖをトランス立体配置で装填されたＡＢＨ２の親和性を、ＦｃＲｎに対する結合に関して評価し、野生型ＨＳＡおよび１０８７対照の両方と比較した。
【０２９９】
この実験に関しては、ベンチマーク対照ｖ１０８７およびＡｌｂｕＣＯＲＥ  ＨＥＲ２／ＨＥＲ３融合体のうちの１つ（ｖ１３７８）を用いた。図２０Ａは、ｖ１３７８融合体のトランス立体配置を示す。
【０３００】
ＦｃＲｎ結合。
ヒトＦｃＲｎ（ｈＦｃＲｎ）をＳＰＲ表面に固定化し、精製抗Ｈｅｒ３×Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２（ｖ１３７８）およびｖ１０８７をｐＨ６．０でフローオーバーさせた。方法は実施例２と同じであるが、但し、検定の方向性は逆であった。
【０３０１】
図２０Ａおよび２０Ｂは、それぞれ抗Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３  ＡＢＨ２およびＶ１０８７の異なる結合曲線を示す。抗Ｈｅｒ２×Ｈｅｒ３  ＡＢＨ２は０．９７μＭのＫＤでｈＦｃＲｎを結合し、一方Ｖ１０８７分子は２．７６μＭのＫＤでｈＦｃＲｎを結合した。図から、融合ＡＢＨ２およびｖ１０８７はともに、ＦｃＲｎ結合親和性において野生型ＨＳＡに匹敵することがわかる（Ｋｄ＝１．４mＭ、ｐＨ５．５、Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ，Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６  ４５，４９８３−４９９０に記載）。
【０３０２】
実施例１６．  ＡＢＨ２および一価抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２の卓上安定性。
ＡＢＨ２足場および一価ＡＢＨ２抗Ｈｅｒ２融合タンパク質（ｖ５１７）の両方の卓上安定性を、３つの異なる温度で５日間に亘って評価した。
【０３０３】
卓上安定性
各分子からの試料を９つの試験管に分け、各々は〜１０mｇのタンパク質を含有した。
１０mｇのタンパク質に対応する初期量の材料を、１ｍｇ／ｍＬでＰＢＳ中に入れ、３７℃（水浴）、室温（ＲＴ）または４℃（冷蔵庫）でインキュベートした；タンパク質安定性を、５日間に亘って評価した。各時点でアリコートを抽出し、クーマシーブルーローディング緩衝液と１：１に混合し、その後冷凍した。最終の時間ステップ後、すべてのアリコートを解凍して、ネイティブゲルならびに還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に載せた。
【０３０４】
図２１は、１、３および５日目の、ＡＢＨ２足場および抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２融合体のネイティブゲルである。図が実証するように、ＡＢＨ２足場および抗Ｈｅｒ２  ＡＢＨ２はともに、５日間の期間中ずっと安定であった。融合タンパク質に関して見られる二重のバンドは、ジスルフィドの２つの異なる還元状態を表すと思われる。還元剤の存在下では、２つのバンドは実際１つに縮約する。
【０３０５】
実施例１７．  ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）法を用いた精製最適化
溶出において何らかの量の残留夾雑物をもたらし高濃度の塩溶出を要する、実施例２に記載したＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製に代わるものとして、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）ベースのアフィニティー精製法を用いたバッチおよび直接方式のいずれにおいてもＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリクスに対する結合の試験は最適化手順を含み、異なる溶出プロトコールを異なるｐＨおよび温度とともに試験した。最終的にアルブミンおよびアルブミン融合体の精製に対して仕立てた特殊樹脂（すなわち、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標））を試験した。異なる塩の存在下での結合およびｐＨ勾配または競合界面活性剤を用いる溶出を含む、異なる結合および溶出条件を、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）を用いて試験した。
【０３０６】
野生型ＨＳＡの精製：Ｂｌｕｅ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅとＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）の比較
実施例２に記載した方法に従って、野生型ＨＳＡに関してＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製を実施した。図２２Ａは、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ精製中に得られたトータル画分、フロースルー画分、洗浄および溶出画分の非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルプロフィールである。図２２Ｂは、ゲル濾過（ＳＥＣ）後のＢｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ溶出画分のＬＣ分析を表す。クロマトグラムの多数のピークから分かるように、精製後でさえ顕著なタンパク質およびイオン夾雑物が存在した。
【０３０７】
ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）精製を野生型ＨＳＡに関して以下のように実施した。野生型ＨＳＡを含有する細胞上清をＰＢＳ中で可溶化した。予備充填ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）カラム（カラム容積：１ｍＬ）を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３中で平衡化した。上清を充填後、カラムを、５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含有するがｐＨが増大する（すなわち１回目はｐＨ６；２回目はｐＨ７）溶液で２回洗浄した。酢酸アンモニウム、ｐＨ８．０で最終洗浄を実施した。次いで５０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ７．０を含有し１０ｍＭオクタン酸ナトリウムを追加した溶液を用いて、目的のタンパク質を溶出した。ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）法は、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ法に匹敵する量のタンパク質を得るために１ステップを要しただけであった。５００ｍＬの初期ＣＨＯ培養からのタンパク質収量を以下の表１７に示す。
【表１７】
0006498601.tif 000046
【０３０８】
図２２Ｃは、ゲル濾過（ＳＥＣ）後のＡｌｂｕＰｕｒｅアフィニティーカラム溶出画分のＬＣ分析を表す。図２２Ｂおよび２２Ｃの比較は、ＡｌｂｕＰｕｒｅ法が、Ｂｌｕｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅからよりもずっと純度が高くより低量の高分子量凝集タンパク質を含む最終溶液を生じることを実証する。
【０３０９】
改変ＡｌｂｕＣＯＲＥの精製：ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）を用いた野生型ＨＳＡおよび改変ＡｌｂｕＣＯＲＥの比較
表１１に記載したＡｌｂｕＣＯＲＥ−１Ａ、３、６および９の２つの断片ペプチドを、別個のベクターを用いてＣＨＯ細胞中で一過的に同時発現した。異なるＡｌｂｕＣＯＲＥ分子を構成する２つの断片の発現のための最適ＤＮＡ比（断片１：断片２）は、ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１＝１：１；ＡｌｂｕＣＯＲＥ−３＝１：２；ＡｌｂｕＣＯＲＥ−６＝１：１；ＡｌｂｕＣＯＲＥ−９＝２：１であった。全発現が一過性であり、先のＡｌｂｕＣＯＲＥ分子と同様に実施した。野生型ＨＳＡもＣＨＯ細胞中で一過的に発現させた。融合タンパク質の発現収率は、ＷＴ−ＨＳＡ（約５０〜７０ｍｇ／Ｌ）の７５％以内であった。ＡｌｂｕＰｕｒｅ精製後にＡ２８０により材料の量を測定した。
【０３１０】
同時発現後、上記のＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）プロトコールを用いてＡｌｂｕＣＯＲＥ足場を精製した。純度を評価するために、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）アフィニティーカラムからの溶出物をゲル濾過系（ＳＥＣ）に通し、ＬＣを用いてフロースルーを分析した。野生型ＨＳＡに関し同じことを実施した。図２３Ａは野生型ＨＳＡのクロトマトグラムを表し、一方図２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄおよび２３Ｄは、それぞれＡｌｂｕＣＯＲＥ１、３、６および９のクロマトグラムを表す。これらの図が実証するように、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）精製収率は、野生型および改変ＡｌｂｕＣＯＲＥ間で同様の結果である。５００ｍＬの初期ＣＨＯ培養からの、ＡｌｂｕＰｕｒｅ（登録商標）精製後の精製タンパク質のｍｇに換算した収量は、ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１＝１６ｍｇ；ＡｌｂｕＣＯＲＥ−３＝２５ｍｇ；ＡｌｂｕＣＯＲＥ−６＝２７；ＡｌｂｕＣＯＲＥ−９＝２５ｍｇであると測定された。
【０３１１】
ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１のスケールアップ発現および精製
断片Ａ：Ｂを１：１の比でｐＴＴ５ベクターを用いて、ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１をＣＨＯ中で一過的に同時発現した（実施例２参照）。ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１のＣＨＯ細胞での精製収量は約１０ｍｇ／Ｌであり、これは同量の出発材料から算定すると、ｖ１０８７のＣＨＯ細胞での収量９ｍｇ／Ｌに匹敵する。
【０３１２】
上記のＡｌｂｕＰｕｒｅプロトコールを用いてＡｌｂｕＣＯＲＥ−１を精製した。アフィニティーカラム溶出液をゲル濾過−ＬＣ分析系に適用した。図２４ＡはＡｌｂｕＰｕｒｅ精製のクロマトグラムを表す。主ピークは目的のタンパク質を表す。
【０３１３】
精製試料もまた、図２４Ｂに示した還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図が実証するように、非還元条件では、重要な溶出生成物は全ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１タンパク質であり；還元条件では、ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１タンパク質は前述のように２つの断片に分離する。重要なことに、特に図２２Ａと比較した場合、夾雑物がほとんどない。
【０３１４】
ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１およびＷＴ  ＨＳＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ／ＭＳ分析
野生型ＨＳＡおよびＡｌｂｕＣＯＲＥ−１精製のトータル、フロースルー、洗浄および溶出物を収集し、非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図２５Ａに示したように、前記ゲルプロフィールの表示は、ＡｌｂｕＰｕｒｅ工程後に夾雑物がほとんどなく（図２５Ａおよび図２２Ａを比較）およびホモ二量体形成もないことを実証する。
【０３１５】
次に、ＬＣ／ＭＳを用いて精製タンパク質を分析した。高流動エレクトロスプレー界面を介してＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬハイブリッド質量分光分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ系を用いて、ＬＣ−ＭＳによりタンパク質試料を分析した。試料（２．５μｇ）を２．１×１０ｍｍ  Ｐｏｒｏｓ  Ｒ２カラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に注入し、２ｍＬ／分の２０〜９０％ＡＣＮ勾配、０．１％ＦＡを用いて、３分間に亘って溶出した。流れをカラム後に分割してエレクトロスプレー界面中に１００μＬ／分で向かわせた。カラムおよび溶媒を８０℃に加熱してタンパク質ピーク形状を改良した。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬをＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＬＴＱ正イオンＥＳＩ較正溶液（カフェイン、ＭＲＦＡおよびＵｌｔｒａｍａｒｋ  １６２１）を用いて較正し、２５ｕｇ／ｕＬのＢＳＡ溶液を用いて調整した。コーン電圧（ソース断片化設定）は４０Ｖ、ＦＴ分解能は７，５００および走査範囲はｍ／ｚ  ４００〜４，０００であった。ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＰｒｏｍａｓｓソフトウェアを用いてタンパク質スペクトルをデコンボリューションした（入力範囲：ｍ／ｚ  ２５００〜３０５０；出力質量範囲：１００，０００〜１６０，０００Ｄａ；ピーク幅：１．５；マージ幅：０．５；ベースライン除去：０．５（低））。ヘテロ−およびホモ二量体抗体種の豊富さを、得られた分子量プロフィールから直接決定した。一定の抗体混合物を用いて応答の直線性を確認した。検出限界は約２％であった。図２５Ｂは、精製されたＡｌｂｕＣＯＲＥ−１およびＷＴ−ＨＳＡのスペクトログラムを提供する。ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１に関するスペクトログラムが実証するように、ホモ二量体形成（例えば、Ａ：ＡまたはＢ：Ｂ）は認められない。理論的分子量からの変動は、イオン結合、種々雑多なリガンド、または糖化のためであり得る。
【０３１６】
実施例１８．  アルブミンベースのポリペプチドの末端の空間的組織化
アルブミンベースのポリペプチドは、カーゴ分子の送達のための抗体に対する代替的足場を提供する。図２６Ａおよび２６Ｂ間の差異が実証するように、改変したアルブミンベースのポリペプチドは、４つの末端間の空間的距離がより大きく変化するので、通常の抗体と比較べより大きい程度の位置的自由度を有する。利用可能な結晶構造のうちの１つへとＡｌｂｕＣＯＲＥ分子をモデル化した後、距離を測定した：ＰＤＢＩＤ＝４ＥＭＸ。さらに、４つの末端は異なる平面角度にも配向される。
【０３１７】
最後に、異なるセグメント化部位、結合ドメインおよび／またはリンカーを選択することにより、末端間の距離および角度はさらに調整され得る。図２６Ｃは、多価結合様式における抗原結合最適化のための末端間距離を変えるために利用可能な、代替的ＡｌｂｕＣＯＲＥ足場を示す。
【０３１８】
実施例１９．  ＤＳＣにより測定されるような追加のアルブミンベースのポリペプチドの安定性
追加のＡｌｂｕＣＯＲＥポリペプチドの安定性および融点を決定するために、ＤＳＣ実験をＡｌｂｕＣＯＲＥ−３、６および９、ならびに対照ＷＴ−アルブミンおよびＡｌｂｕＣＯＲＥ−１に関して実施した。ＤＳＣ実験は実施例２に記述したように実施した。図２７は、ＷＴ−ＨＳＡと比較した４つの足場の融解曲線を示す。図が示すように、足場３、６および９は、野生型が示す７５℃と非常によく似た融点を保有する。さらに、ＡｌｂｕＣＯＲＥ−６は、７６℃で、野生型ＨＳＡより熱的に安定であることが判明した。追加のＤＳＣ実験を、ＡｌｂｕＣＯＲＥ  １Ａおよび４に関して実施した。ＡｌｂｕＣＯＲＥ  １ＡのＴｍは６６℃で、ＡｌｂｕＣＯＲＥ−４のＴｍは７０℃であった。ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１Ａは、ＡｌｂｕＣＯＲＥ  １（ＡＢＨ１）における２つの断片間のギャップを１残基のみまで狭め、ＧＧＧＧＳリンカーを非天然のＮ末端およびＣ末端の両方に付加する。同じことがＡｌｂｕＣＯＲＥ  ２（ＡＢＨ２）およびＡｌｂｕＣＯＲＥ−２Ａに当てはまる。
【０３１９】
実施例２０：抗ＣＤ３×ＣＤ１９ヘテロ多量体構築物の調製。
以下のように抗ＣＤ３および抗ＣＤ１９  ｓｃＦｖｓをいくつかの異なる抗体プラットフォームへ結合した。アルブミンベースのポリペプチドプラットフォームはＡｌｂｕＣＯＲＥ−１であり；対照はＷＴ−ＨＳＡ、Ａｚｙｍｅｔｒｉｃ足場（ｖ８７３）および抗ＣＤ３×ＣＤ１９  ＢｉＴＥ対照ｖ８９１を包含した。
【０３２０】
抗ＣＤ１９×抗ＣＤ３  ｓｃＦｖｓを装填されたＡＢＨ２（１０９２、１０９３、１０９４および１０９５）：
抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３  ｓｃＦｖｓに関する配列は、現在臨床試験中でありかつ安定性および産生に関して十分に実証され試験されている２つの分子から選択した。抗ＣＤ１９および抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、ＢｉＴＥ分子  ブリナツモマブから直接採用した。抗ＣＤ３  ｓｃＦｖはＢｉＴＥで用いられたものと一致するＶＨ−ＶＬ配向で選択した。ベンチマーク分子はＢｉＴＥであった。抗ＣＤ弾頭を断片１の天然のＮ末端に、および抗ＣＤ１９を断片２のＣ末端に結合することにより、ＡｌｂｕＣＯＲＥ＿１（ＡＢＨ２）ＣＤ３／ＣＤ１９融合体を作成した（ｖ１０９２）。弾頭が逆である第二分子を作成した（すなわち、断片１の天然のＮ末端に抗ＣＤ１９弾頭、および断片２のＣ末端に抗ＣＤ３。ｖ１０９３）。用いたリンカーは、多価ＨＥＲ２  ＡｌｂｕＣＯＲＥ実験のために用いたものと同一であり：断片１のＮ末端にＧＧＧＳ、および断片２のＣ末端に（ＧＧＳＧ）４ＧＧ。多価ＨＥＲ２に関して発現および精製を前記のように実施した。それらの天然の末端に２つの異なる融合体を収容するように分子１０９３および１０９４を設計した。ｓｃＦｖ融合体を、Ｎ末端でのＧＧＳリンカーおよびＣ末端でのＧＧＳＧリンカーを介して、アルブミン分子と連結させた。リンカーの長さは、異なる配列型を有するにもかかわらず、ＭＭ−１１１分子に用いられるものを示す。これらの分子の模式図を図２９に示す。
【０３２１】
カーゴポリペプチドの相対位置が変えられた、ＡＢＨ２をベースにした追加の一価および多価ＣＤ１９ヘテロ多量体ならびに一価ＣＤ３ヘテロ多量体を、図２８Ｂに示したこれらのヘテロ多量体の模式図を用いて設計した。これらのヘテロ多量体は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（ＣＤ１９）および／または抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ（ＣＤ３）であるカーゴポリペプチドに一方または両方の末端で融合された、その単一単量体輸送体ポリペプチド  配列番号８および配列番号１０を発現することにより、生成した。これらのベース構築物の異なる組合せを同時発現時に組み合わせて、２つの輸送体ポリペプチドの４つの末端位置のいずれかで２つのカーゴポリペプチドの全組合せを表示する、一価から四価までの範囲のヘテロ多量体を形成した。表１８は、（輸送体ポリペプチド１（Ｆ１）または輸送体ポリペプチド２（Ｆ２）のＮ末端またはＣ末端へ融合することにより生成されたベース構築物を示す。Ｆ１：配列番号８に対応し、Ｆ２は配列番号１０に対応する。
表１８：ＣＤ３およびＣＤ１９一価および多価構築物に関するベース構築物
【表１８】
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【０３２２】
図２８Ｂに示したように、１つの単量体のＮ末端に関してはＧＧＳＧリンカーを、そして他の単量体におけるすべての他の末端に関してはより長い（ＧＧＳ）４ＧＧリンカーを介して、生物活性カーゴポリペプチドをヘテロ多量体輸送体ポリペプチドへ融合した。さらにそれらの非天然末端（すなわち、断片１のＣ’および断片２のＮ’）でより短いリンカー、（ＧＧＳ）４ＧＧの代わりに配列ＧＧＳＧＧＳＧで形成される、を用いて各融合タンパク質の一バージョンを作成した。
【０３２３】
調製されたヘテロ多量体のまとめを表１９に示す。
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【０３２４】
ヘテロ多量体ＡＢＨ２を用いて実施例２に略記したように多価構築物を生成した。最終遺伝子生成物を哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ，Ｃａｎａｄａ）（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ）中にサブクローン化した。懸濁増殖ヒトＣＨＯ−３Ｅ７の一過性トランスフェクションによる高レベルおよびハイスループット組換えタンパク質産生を、実施例２に記載したように実施した。
【０３２５】
発現結果を図２８Ｃに示す。一価のＣＤ３およびＣＤ１９融合体は同様のレベルで発現する。一価のＣＤ３およびＣＤ１９の発現はＨＥＲ２融合体で観察されたものと同一パターン（ＭＷに関して）を有し、これは非還元型ゲル上の移動の変動は弾頭型とは独立していることを示す。
【０３２６】
実施例２１：抗ＣＤ３×ＣＤ１９装填アルブミンベースのポリペプチドがＢ細胞およびＴ細胞に結合する能力。
ＣＤ３＋およびＣＤ１９＋細胞に対する抗ＣＤ３×ＣＤ１９装填ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１（ｖ１０９２および１０９３）の能力を、ＦＡＣＳを用いて評価し、同じ抗ＣＤ  ｓｃＦｖｓが装填されたＷＴ−ＨＳＡ（１０９４および１０９５）と比較した。ＡｌｂｕＣＯＲＥ−１構築物を、Ｂ細胞およびＴ細胞に関するＡｚｙｍｅｔｒｉｃ（商標）およびＢｉＴＥ  ＭＴ−１０３に対して、追加で以下のように試験した。当該方法を、実施例１３に記載したように、しかしＭＡＬＭＥ−３Ｍ細胞およびＳＫＯＶ細胞で実行した。
【０３２７】
結果を図２９に示すが、これは、ＪｕｒｋａｔおよびＲａｊｉ細胞における試験変異体に関するＫＤおよびヒル勾配データを示している。
【０３２８】
実施例２２：抗ＣＤ３×ＣＤ１９装填アルブミンベースのポリペプチドがＢ細胞およびＴ細胞に結合する能力
変異体１０９２、および１０９３がＢ細胞およびＴ細胞を架橋する能力を、以下のように測定した。
【０３２９】
ＦＡＣＳによる全細胞架橋
ＲＰＭＩ中に懸濁された１×１０６細胞／ｍｌを、０．３μＭの適切なＣｅｌｌＴｒａｃｅ標識で標識して混合し、水浴中で３７℃で２５分間インキュベートした。ペレットを２ｍｌのＬ１０＋ＧＳ１＋ＮａＮ３中に再懸濁して、最終濃度を５×１０６細胞／ｍｌとした。フローサイトメトリーにより細胞懸濁液を分析して（１／５希釈）、適切な細胞標識化およびレーザー設定を確認した。フローチェックおよびフローセットＦｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓを用いて、計器標準化、光学的アラインメントおよび流体工学を確認した。
【０３３０】
フローサイトメトリー確認後、および架橋前に、各細胞株を所望の比率で１ｘ１０６細胞／ｍｌの最終濃度にて一緒に混合した。
【０３３１】
Ｔ：Ｔ架橋をＪｕｒｋａｔ−バイオレット＋Ｊｕｒｋａｔ−ＦａｒＲｅｄで評価し、Ｂ：ＢをＲＡＪＩ−バイオレット＋ＲＡＪＩ−ＦａｒＲｅｄで評価し、およびＴ：Ｂ架橋をＪｕｒｋａｔ−バイオレット＋ＲＡＪＩ−ＦａｒＲｅｄで評価した。
【０３３２】
室温にて抗体変異体をＬ１０＋ＧＳ１＋ＮａＮ３で２倍に希釈し、その後細胞に添加し、静かに混合しながら３０分間インキュベートした。
【０３３３】
３０分間のインキュベーション後、２μｌのヨウ化プロピジウムを添加し静かに混合して、フローサイトメトリーにより直ちに分析した。
【０３３４】
架橋％を、バイオレットおよびＦａｒＲｅｄで同時に標識された事象のパーセンテージとして算定した。
【０３３５】
図３０Ａは、ｖ１０９２、二重特異性ＣＤ３／ＣＤ１９抗体（ｖ８７３）およびＢｉＴＥ様対照ｖ８９１がＪｕｒｋａｔ  ＣＤ３  Ｔ細胞（下右）とＲａｊｉ  ＣＤ１９  Ｂ細胞（上左）を架橋する能力をＦＡＣＳにより比較する。架橋されたＴ−Ｂ細胞は上右に出現する。この結果は、ｖ１０９２は０．３ｎＭという低い濃度でＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞およびＲａｊｉ  Ｂ細胞を特異的に架橋でき、架橋の程度はＢｉＴＥ（総細胞の２１％）およびヘテロ二量体Ｆｃを有する二重特異性ＣＤ３／ＣＤ１９抗体（２５％）と同程度（総細胞の３１％）であることを実証している。
【０３３６】
図３０Ｂは、ｖ１０９２の能力を、対照  ｖ８９１、ｖ８７３およびｖ２２１と比較する。この図は、ｖ１０９２が、ｖ８９１（ＢＩＴＥ）と同様の程度に、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞とＲａｊｉ  Ｂ細胞を架橋し得ることを示す。
【０３３７】
本明細書中で記述される出版物、特許および特許出願はすべて、各々の個々の出版物、特許または特許出願が、具体的に且つ独立して、本明細書中で参照により援用されるような程度に、本明細書中で参照により援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
0006498601.tif 000078
【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ−１】
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【図２５Ｂ−２】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
0006498601.tif 000098
【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ−１】
0006498601.tif 000100
【図３０Ｂ−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【配列表】
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