(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タグ化核酸断片ライブラリを調製する方法であって、
（ａ）１個の細胞からなる細胞集合を溶解試薬に直接接触させて細胞溶解物を生成するステップであって、前記溶解試薬は１つまたは複数のプロテアーゼを含み、前記細胞溶解物は標的核酸を含む、ステップと；
（ｂ）前記１つまたは複数のプロテアーゼを不活性化させて不活性化細胞溶解物を形成するステップと；
（ｃ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを、前記標的核酸および前記トランスポゾン末端組成物が転移反応する条件下で前記不活性化細胞溶解物に直接適用して混合物を生成するステップであって、
（ｉ）前記標的核酸を断片化して複数の標的核酸断片を生成し、
（ｉｉ）前記トランスポゾン末端組成物の移動鎖を複数の前記標的核酸断片それぞれの5’末端に連結して複数の5’タグ化標的核酸断片を生成し、
前記標的核酸が二本鎖ＤＮＡであり、該標的核酸は、ステップ（ｃ）においてトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物を適用させる前は二本鎖ＤＮＡのままである、ステップと、を含む方法。
【請求項２】
（ｉ）ステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は単一の反応管において実行される、
（ｉｉ）前記細胞集合が最小の細胞集合であり、
（ｉｉｉ）前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、サブチリシン及びその変異体である、
（ｉｖ）前記細胞溶解物中の１つ若しくは複数のプロテアーゼの濃度は、４．５ｍＡＵ／ｍＬ〜５００ｍＡＵ／ｍＬである、任意に、前記細胞溶解物中の１つ若しくは複数のプロテアーゼの濃度は、２２．５ｍＡＵ／ｍＬである
（ｖ）前記細胞集合はステップ（ａ）においてｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０で前記溶解試薬に接触する、任意に、前記細胞集合はｐＨ７．０〜ｐＨ９．０で前記溶解試薬に接触する
（ｖｉ）前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、ステップ（ｂ）において、温度を上昇させることにより不活性化させる、任意に、前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、温度を５０℃〜８０℃まで上昇させることにより不活性化させる、任意に、前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、温度を７０℃まで上昇させることにより不活性化させる、又は
（ｖｉｉ）前記１つ若しくは複数のプロテアーゼは、該１つ若しくは複数のプロテアーゼの１つ若しくは複数の阻害剤を加えることにより不活性化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶解試薬は１つまたは複数の界面活性剤を含み、
任意に、前記１つまたは複数の界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり、任意に、前記１つまたは複数の界面活性剤はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ａ）と（ｃ）との間に、事前のＤＮＡ精製または増幅ステップがない、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的核酸は、ゲノムＤＮＡである、染色体ＤＮＡ若しくはその断片を含む、又はゲノム若しくは部分ゲノムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのトランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼであり、
任意に、前記少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物はＴｎ５トランスポゾン末端を含む、又は、前記移動鎖は、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインのうち１つ若しくは複数を含むタグドメインを備える、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（ｄ）前記5’タグ化標的核酸断片に3’タグが連結する条件下で、ステップ（ｃ）による混合物を、少なくとも１つの核酸修飾酵素とともに直接インキュベーションして、複数のジタグ化標的核酸断片を生成するステップをさらに含み、
任意に、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）は単一の反応管において実行される、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸修飾酵素はポリメラーゼであり、前記3'タグは、前記5'タグ化標的核酸断片の3'末端を伸長することにより形成され、
任意に、
（ｉ）前記核酸修飾酵素はリガーゼであり、前記3'タグは、前記5'タグ化標的核酸断片の3'末端にオリゴヌクレオチドをライゲーションすることにより形成される、又は
（ｅ）１つ若しくは複数のジタグ化標的核酸断片を増幅して、該ジタグ化核酸断片の5'末端および／若しくは3'末端に追加の配列を有する、タグ化核酸断片のライブラリを生成するステップをさらに含む、
請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）は、単一の反応管において実行され、
任意に、
（ｉ）前記増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在増幅反応、若しくはループ介在増幅反応のうち１つ若しくは複数の使用を含む、
（ｉｉ）前記増幅は、前記ジタグ化標的ＤＮＡ断片の3'タグに対し相補的な単一プライマーを用いるＰＣＲを含む、又は
（ｉｉｉ）前記増幅は第１プライマーおよび第２プライマーを用いるＰＣＲを含み、前記第１プライマーの少なくとも3'末端部は前記ジタグ化標的核酸断片の3'タグの少なくとも一部に対し相補的であり、前記第２プライマーの少なくとも3'末端部は、前記ジタグ化標的核酸断片の5'タグの少なくとも一部の配列を示し、任意に、前記第１プライマーの5'末端部は前記ジタグ化標的核酸断片の3'タグに対し非相補的であり、前記第２プライマーの5'末端部は前記ジタグ化標的核酸断片の5'タグの少なくとも一部の配列を示さず、任意に、前記第１プライマーは、第１ユニバーサル配列を含み、および／若しくは、前記第２プライマーは第２ユニバーサル配列を含む
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タグ化核酸断片をシークエンシングするステップをさらに含み、
任意に、
（ｉ）前記タグ化核酸断片のシークエンシングには、合成によるシークエンシング、ブリッジＰＣＲ、チェーンターミネーションシークエンシング、ハイブリッド形成によるシークエンシング、ナノポアシークエンシング、およびライゲーションによるシークエンシングのうち１つまたは複数の使用を含む、
（ｉｉ）前記タグ化核酸断片のシークエンシングには次世代シークエンシングの使用を含む、
（ｉｉｉ）コピー数多型を分析するステップをさらに含む、又は
（ｉｖ）一塩基多型を分析するステップをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）１つまたは複数のプロテアーゼを有する溶解試薬、および、
（ｂ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを有する転移反応組成物を含み、
任意に、前記１つまたは複数のプロテアーゼはサブチリシンおよびその変異体である、
請求項１の方法でタグ化核酸断片ライブラリを調製するためのキット。
【請求項１２】
前記溶解剤は１つまたは複数の界面活性剤を含み、
任意に、前記１つまたは複数の界面活性剤はトリトンを含む、
請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物は、タグドメインと、前記移動鎖を含む3'部分とを含み、
任意に、
（ｉ）前記タグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインのうち１つ若しくは複数を含む、又は
（ｉｉ）前記転移反応組成物は２つ以上のトランスポゾン末端組成物を含み、該２つ以上のトランスポゾン末端組成物はそれぞれ、少なくとも１ヌクレオチドが異なる移動鎖を含む、
請求項１１に記載のキット。
【請求項１４】
（ｉ）前記トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである、
（ｉｉ）前記トランスポゾン末端組成物はＴｎ５トランスポゾン末端を含む、
（ｉｉｉ）キットはポリメラーゼをさらに含む、
（ｉｖ）キットはリガーゼをさらに含む、又は
（ｖ）増幅反応用試薬をさらに含む、
請求項１１に記載のキットであって、
任意に、前記増幅反応用試薬はＰＣＲ用試薬であり、
任意に、前記増幅反応用試薬は少なくとも１つのプライマーを含み、
任意に、（ａ）前記少なくとも１つのプライマーは、前記移動鎖の少なくとも一部分の配列を示す3'部分を含む、（ｂ）前記少なくとも１つのプライマーは、ユニバーサル配列を含む5'部分を含む。
【請求項１５】
（ｉ）サイズ選択試薬をさらに含み、任意に、前記サイズ選択試薬はＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（商標）ビーズを含む
（ｉｉ）ライブラリ正規化試薬をさらに含む、又は
（ｉｉｉ）固体表面を有する装置をさらに含み、任意に、ａ）前記装置はフローセル装置である、若しくはｂ）前記固体表面は、分子を規則正しいパターンで固定するのに適したパターン付き表面を含む、
請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は概して、核酸断片のライブラリを調製する方法に関し、具体的には、例えば次世代ＤＮＡシークエンシングを含む種々の用途のために、単一の管においてプロテアーゼを用いて核酸断片ライブラリを調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡシークエンシングで鋳型として用いるため、および／または、コピー数多型分析のためなど、断片化およびタグ化された核酸のライブラリを生成することが望ましい種々の方法および用途がある。
【０００３】
Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）により開発されたものなど、最近開発された「次世代」ＤＮＡシークエンシング技術は、大規模並列フォーマットまたは多重フォーマットを用いて、一回の配列ランで最大数百万のシークエンシング鋳型から配列データを生成することを可能にする。この「次世代」シークエンシングの大規模並列という性質は、標的核酸サンプル、例えばゲノムＤＮＡから、核酸断片の集積または集合を含んだ核酸断片ライブラリを生成することを必要とする。さらに重要なことに、それは、これらの核酸断片の組み合わせが、標的核酸サンプルに由来する配列を質的および／または量的に表す配列を示すことを必要とする。核酸サンプルが細胞に由来する場合、核酸断片ライブラリを生成する現在の方法は典型的に、核酸の断片化の前に、標的核酸を細胞から単離する別のステップを必要とする。この核酸抽出ステップは通常、標的核酸サンプルを無駄にし、通常、調製した核酸を、サンプルに由来する標的核酸を質的に代表できないようにする。これは、サンプルの量が限られている、または得にくい場合に特に重大な問題となる。この問題を解決するため、いくつかの現行の方法は断片化の前に核酸増幅を用いる。しかしながら、増幅前の抽出中に標的核酸はなお部分的に失われることから、増幅は標的核酸の代表性を保証することはできない。
【０００４】
したがって、核酸断片ライブラリを迅速かつ効率的に調製することを可能にする新しい方法に対する必要性が存在する。本開示は、プロテアーゼを用い、単一の反応混合物、例えば単一の管において核酸断片ライブラリを調製する方法を提供することにより、この必要性に対処する。関連する利点も同様に提供する。
【発明の概要】
【０００５】
一態様において、本明細書で提供するのは、タグ化核酸断片ライブラリを調製する方法であって、（ａ）細胞集合を溶解試薬に直接接触させて細胞溶解物を生成するステップであって、前記溶解試薬は１つまたは複数のプロテアーゼを含み、前記細胞溶解物は標的核酸を含む、ステップと；（ｂ）前記１つまたは複数のプロテアーゼを不活性化させて不活性化細胞溶解物を形成するステップと；（ｃ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを、前記標的核酸および前記トランスポゾン末端組成物が転移反応する条件下で前記不活性化細胞溶解物に直接適用して混合物を生成するステップであって、（ｉ）前記標的核酸を断片化して複数の標的核酸断片を生成し、（ｉｉ）前記トランスポゾン末端組成物の移動鎖を複数の前記標的核酸断片それぞれの5’末端に連結して複数の5’タグ化標的核酸断片を生成する、ステップと、を含む方法である。
【０００６】
一部の実施形態では、本明細書で提供するステップ（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）は、単一の反応混合物、例えば管において実行する。一部の実施形態では、細胞の集合は細胞の最小集合である。一部の実施形態では、細胞の最小集合は、１個、２個、３個、４個、または５個の細胞を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択する。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼはサブチリシンおよびその変異体である。一部の実施形態では、細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は、４．５ｍＡＵ／ｍＬ〜５００ｍＡＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は、２２．５ｍＡＵ／ｍＬである。
【０００８】
一部の実施形態では、細胞集合をステップ（ａ）において、ｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０の溶解試薬に接触させる。一部の実施形態では、細胞集合をｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の溶解試薬に接触させる。
【０００９】
一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、ステップ（ｂ）において温度を上昇させることにより不活性化させる。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、温度を５０℃〜８０℃まで上昇させることにより不活性化させる。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、温度を７０℃まで上昇させることにより不活性化させる。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、該１つまたは複数のプロテアーゼの１つまたは複数の阻害剤を加えることにより不活性化させる。
【００１０】
一部の実施形態では、溶解試薬は１つまたは複数の界面活性剤を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の界面活性剤は非イオン性界面活性剤である。一部の実施形態では、１つまたは複数の界面活性剤はトリトン（Triton）を含む。
【００１１】
一部の実施形態では標的核酸は二本鎖ＤＮＡであり、該標的核酸は、ステップ（ｃ）においてトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物を適用するまで二本鎖ＤＮＡのままである。一部の実施形態では、標的核酸はゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は染色体ＤＮＡまたはその断片を含む。一部の実施形態では、標的核酸はゲノムまたは部分ゲノムを含む。
【００１２】
一部の実施形態では、少なくとも１つのトランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。一部の実施形態では、少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物は、Ｔｎ５トランスポゾン末端を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、移動鎖はタグドメインを含み、該タグドメインには１つまたは複数の制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインが含まれる。
【００１４】
一部の実施形態において、本明細書で提供する方法はさらに、（ｄ）前記5’タグ化標的核酸断片に3’タグが連結する条件下で、ステップ（ｃ）による混合物を、少なくとも１つの核酸修飾酵素とともに直接的にインキュベーションして、複数のジタグ化（di-tagged）標的核酸断片を生成するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を単一の反応管にて行う。
【００１５】
一部の実施形態において核酸修飾酵素はポリメラーゼであり、前記3'タグは5'タグ化標的核酸断片の3'末端を伸長することにより形成する。一部の実施形態において核酸修飾酵素はリガーゼであり、3'タグは、オリゴヌクレオチドを5'タグ化標的核酸断片の3'末端にライゲーションすることにより形成する。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はさらに、（ｅ）１つまたは複数のジタグ化標的核酸断片を増幅して、ジタグ化核酸断片の5'末端および／または3'末端において追加の配列を有するタグ化核酸断片のライブラリを生成するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｅ）を単一の反応管にて行う。
【００１７】
一部の実施形態では、増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、ＴＭＡ反応、またはループ介在増幅反応のうち１つまたは複数の使用が含まれる。一部の実施形態では、増幅にはジタグ化標的ＤＮＡ断片の3'タグに対し相補的な単一プライマーを用いるＰＣＲが含まれる。一部の実施形態では、増幅には第１プライマーおよび第２プライマーを用いるＰＣＲが含まれ、ここにおいて、第１プライマーの少なくとも3'末端部はジタグ化標的核酸断片の3'タグの少なくとも一部に対し相補的であり、第２プライマーの少なくとも3'末端部は、ジタグ化標的核酸断片の5'タグの少なくとも一部の配列を示す。一部の実施形態では、第１プライマーの5'末端部はジタグ化標的核酸断片の3'タグに対し非相補的であり、第２プライマーの5'末端部はジタグ化標的核酸断片の5'タグの少なくとも一部の配列を示さない。一部の実施形態では、第１プライマーは第１ユニバーサル配列を含み、および／または、第２プライマーは第２ユニバーサル配列を含む。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はさらに、タグ化核酸断片をシークエンシングするステップを含む。一部の実施形態では、タグ化核酸断片のシークエンシングには、合成によるシークエンシング（sequencing by synthesis）、ブリッジＰＣＲ、チェーンターミネーションシークエンシング、ハイブリッド形成によるシークエンシング（sequencing by hybridization）、ナノポアシークエンシング、およびライゲーションによるシークエンシングのうち１つまたは複数の使用を含む。一部の実施形態では、タグ化核酸断片のシークエンシングには次世代シークエンシングの使用を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法にはさらに、コピー数多型を分析するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はさらに、一塩基多型を分析するステップを含む。
【００２０】
別の態様において、本開示は、（ａ）１つまたは複数のプロテアーゼを有する溶解試薬、および、（ｂ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを有する転移反応組成物を含む、タグ化核酸断片ライブラリを調製するためのキットを提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼからなる群から選択する。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼはサブチリシンおよびその変異体である。一部の実施形態では、溶解剤は１つまたは複数の界面活性剤を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の界面活性剤はトリトンを含む。
【００２２】
一部の実施形態では、少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物は、タグドメインと、移動鎖を含む3'部とを含む。一部の実施形態では、タグドメインは、制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインのうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、転移反応組成物は２つ以上のトランスポゾン末端組成物を含み、該２つ以上のトランスポゾン末端組成物はそれぞれ、少なくとも１ヌクレオチドが異なる移動鎖を含む。一部の実施形態では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。一部の実施形態では、トランスポゾン末端組成物はＴｎ５トランスポゾン末端を含む。
【００２３】
一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはポリメラーゼをさらに含む。一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはリガーゼをさらに含む。
【００２４】
一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはさらに、増幅反応のための試薬を含む。一部の実施形態では、増幅反応用試薬はＰＣＲ用試薬である。一部の実施形態では、増幅反応用試薬は少なくとも１つのプライマーを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプライマーは移動鎖の少なくとも一部の配列を示す3'部を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのプライマーは、ユニバーサル配列を含む5'部分を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはさらに、サイズ選択試薬を含む。一部の実施形態では、サイズ選択試薬はAMPure XPビーズを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはさらに、ライブラリ正規化試薬を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはさらに、固体表面を有する装置を含む。一部の実施形態では、前記装置はフローセル装置である。一部の実施形態では、前記固体表面は、分子を規則正しいパターンで固定するのに適したパターン付き表面を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼで処理した全細胞または核を用いたシークエンシングにおける、ユニークにマッピングされたリードのパーセンテージを示すヒストグラムである。
【図２】バルクＤＮＡ、十分なプロテアーゼ活性で処理した単一細胞、および不十分なプロテアーゼ活性で処理した単一細胞を用いた、コピー数の分析結果についてのヒストグラムを示す図である。
【図３Ａ】０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、または２ ｍｇ／ｍＬの前加熱不活性化プロテアーゼで処理した単一細胞における、コピー数の分析結果についてのヒストグラムを示す図である。
【図３Ｂ】０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、反応温度下にある２ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ、または２ｍｇ／ｍＬの前加熱不活性化プロテアーゼで処理した単一細胞、および細胞なしの対照サンプルのシークエンシングにおける、ユニークにマッピングされたリードのパーセンテージについてのヒストグラムを示す図である。
【図３Ｃ】０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、または２ｍｇ／ｍＬの前加熱不活性化プロテアーゼで処理した単一細胞、および細胞なしの対照サンプルについてのシークエンシングにおける、隣接するビン間のリードカウント差（隣接するビン間のリードカウント差の四分位区間）についてのヒストグラムを示す図である。
【図４Ａ】ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、またはｐＨ１０．０下でのプロテアーゼの相対活性を示すヒストグラムである。
【図４Ｂ】ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、またはｐＨ１０．０下で、プロテアーゼで処理した単一細胞のシークエンシング実験における、ユニークにマッピングされたリードのパーセンテージについてのヒストグラムを示す図である。
【図４Ｃ】ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、またはｐＨ１０．０下で、プロテアーゼで処理した単一細胞のシークエンシング実験における、隣接するビン間のリードカウントの差（隣接するビン間のリードカウントの差の四分位区間）についてのヒストグラムを示す図である。
【図５Ａ】室温、５０℃、６０℃、または７０℃で前加熱した相対プロテアーゼ活性を示すヒストグラムである。
【図５Ｂ】室温、５０℃、６０℃、または７０℃で前加熱したプロテアーゼで処理した、単一細胞、３細胞、または１５ｐｇのゲノムＤＮＡについてのシークエンシング実験における、ユニークにマッピングされたリードのパーセンテージについてのヒストグラムを示す図である。
【図５Ｃ】室温、５０℃、６０℃、または７０℃で前加熱したプロテアーゼで処理した、単一細胞、３個の細胞、または１５ｐｇのゲノムＤＮＡについてのシークエンシング実験における、隣接するビン間のリードカウントの差（隣接するビン間のリードカウントの差の四分位区間）についてのヒストグラムを示す図である。
【図６Ａ】１μＬのＴｎ５または２μＬのＴｎ５の処理で生成したライブラリの挿入サイズを示す図である。
【図６Ｂ】１μＬのＴｎ５または２μＬのＴｎ５の処理で生成したライブラリの挿入サイズを示す図である。
【図６Ｃ】１μＬのＴｎ５または２μＬのＴｎ５の処理で生成したライブラリの多様性を示す図である。
【図７】１６サイクル、１８サイクル、または２０サイクルのＰＣＲを用いる、本明細書で提供する方法に従った単一細胞のシークエンシング実験におけるカウントおよびコピー数の分析結果についてのヒストグラムを示す図である。
【図８Ａ】３単一細胞のシークエンシング実験のリード分布を示す図である。
【図８Ｂ】単一細胞のシークエンシング、３細胞のシークエンシング、または５細胞のシークエンシングのリード分布を示す図である。
【図８Ｃ】単一細胞、３細胞、または５細胞を用いた、平均ライブラリ多様性および想定されるゲノムカバレッジについてのヒストグラムを示す図である。
【図８Ｄ】全体のプロトコル成功率を示す図である。
【図９Ａ】REPLIg Single Cell（MDA）をNexteral XT Library Prepとともに用いたコピー数分析を示す図である。
【図９Ｂ】SurePlexをNexteral XT Library Prepとともに用いたコピー数分析を示す図である。
【図９Ｃ】本明細書で提供するNextera Single Cellを用いたコピー数分析を示す図である。
【図１０Ａ】単一のＧＭ５０１２１細胞の３つの複製を用いた１８番染色体のコピー数分析データを示す図である。
【図１０Ｂ】単一のＧＭ２０９１６細胞の３つの複製を用いた、カウント数データを示す図である。
【図１０Ｃ】単一のＧＭ２０９１６細胞の３つの複製を用いた、１５番染色体、Ｘ染色体、および１０番染色体のコピー数分析データを示す図である。
【図１０Ｄ】単一のＧＭ１０２３９細胞の３つの複製を用いた、１番染色体および１１番染色体のコピー数分析データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本開示は概して、核酸断片のライブラリを調製する方法、具体的には、例えば次世代シークエンシングを含む種々の用途のために、単一反応混合物、例えば単一の管においてプロテアーゼを用いて核酸断片ライブラリを調製する方法に関する。
【００２９】
〔定義〕
本明細書で用いる場合、「含む（includes）」、「含んで（including）」、「含む（includes）」、「含有する（contains）」、「含有して（containing）」、「有する（have）」、「有して（having）」という用語、およびその任意の変化は、プロセス、方法、プロダクトバイプロセスなどの非排他的包含を対象とすることを目的とするか、または、要素または要素リストを含む、または含有する物質の組成物は、それらの要素のみならず、明確にリストに挙げられていない他の要素、または、そのようなプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、もしくは物質の組成物に固有の他の要素も含み得る。
【００３０】
本明細書で用いる場合、本発明を記載する文脈における（特に以下の請求項の文脈における）「１つ（a）」、「１つ（an）」、および「その（the）」という用語、および同様の指示対象は、本明細書で別段の指示がない限り、または、文脈により明確に否定されない限り、単数および複数の両方を対象にすると解釈されるべきである。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「約（about）」、または「ほぼ（approximately）」という用語は、所定の値または範囲の５％内を意味する。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「細胞の最小集合」という用語は、タグメンテーション（tagmentation）前のＤＮＡ抽出といった別のステップを欠く、核酸シークエンシング機能に満たないＤＮＡコピー量を含む細胞集合を意味する。例示的な別のステップには、細胞溶解物からのＤＮＡ含量の抽出および／またはＤＮＡ増幅が含まれる。細胞の最小集合には、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つの細胞が含まれ得る。細胞の最小集合は単一細胞であってよい。本明細書で用いる場合、「核酸シークエンシング機能」は、ゲノムのコピー数多型のクリーンなデータを生成することが可能なシークエンシング機能を意味する。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「核酸」という用語は、ヌクレオチドモノマーの一本鎖ポリマーおよび二本鎖ポリマーを意味し、これは、インターヌクレオチドホスホジエステル結合リンケージまたはインターヌクレオチドアナログ、ならびに、例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、テトラアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、およびＮａ＋等の関連対イオンにより連結した、2'-デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含む。核酸はポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む。核酸は全体が、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそのキメラ混合物から構成され得る。ヌクレオチドモノマーユニットは、本明細書に記載のヌクレオチドのいずれかを含み得、これには天然発生ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログが含まれるがこれらに限定されない。核酸の大きさは典型的に、数モノマーユニット、例えば５〜４０から数千モノマーヌクレオチドユニットまである。核酸には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、断片化核酸、ミトコンドリアまたはクロロプラストなどの細胞内オルガネラから得られる核酸、微生物から得られる核酸、または、生体サンプル上もしくは生体サンプル内に存在し得るＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルスから得られる核酸が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「標的核酸」という用語は、分析または行為の対象となる核酸を意味することを意図する。分析または行為には、コピー、増幅、シークエンシング、および／または核酸調査のための他の手順に核酸を供することを含む。標的核酸は、分析する標的配列に加えヌクレオチド配列を含み得る。例えば、標的核酸は１つまたは複数のアダプターを含み得、これには、分析する標的核酸配列の側面に位置する、プライマー結合部位として機能するアダプターが含まれる。捕捉オリゴヌクレオチドまたは捕捉プライマーにハイブリダイズした標的核酸は、全ての標的核酸が伸長の対象となるわけではない方法で、捕捉オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端を超えて伸長するヌクレオチドを含み得る。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「単離する」および「精製する」という用語は、本明細書で用いる場合、物質を単離または精製するサンプルまたは供給源から、少なくとも１つの（タンパク質および／または核酸配列などの）汚染物質の量を低減させることを意味する。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「サイズ選択」という用語は、核酸断片の小集合であって、その大部分が定義された範囲に収まる多数のヌクレオチドを有する小集合を核酸断片集合から選択し、そのため、定義された範囲に収まる多数のヌクレオチドを有する核酸断片のパーセンテージが増加する手順を意味する。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「プロテアーゼ」という用語は、ポリペプチドまたはポリペプチド部を有する基質を加水分解する能力を示す、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを意味する。本方法で提供するプロテアーゼは、広範な特異性を有する単一プロテアーゼとすることが可能である。本方法は、種々のプロテアーゼの混合物を用いることが可能である。本明細書で提供するプロテアーゼは、易熱性とすることが可能であり、したがって、熱により不活性化させることが可能である。ある実施形態では、本明細書で提供するプロテアーゼは、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、または約８５℃を上回る温度で不活性化させることが可能である。本明細書で提供するプロテアーゼは、クロマチンタンパク質および他のＤＮＡ結合タンパク質を消化して裸のゲノムＤＮＡを解放することが可能であり、そしてまた、内因性ＤＮａｓｅを消化してＤＮＡ分解を防ぐことも可能である。本明細書で提供するプロテアーゼにはセリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。典型的に、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼは水分子を活性化し、これはペプチド結合に対して求核攻撃を行ってそれを加水分解する。セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼは典型的に、求核残基を用いて求核攻撃を行い、プロテアーゼを基質タンパク質に共有結合的に連結させ、産物の前半を解放する。この共有結合アシル酵素中間体をその後、活性水により加水分解して、産物の後半を解放し、遊離酵素を再生成することにより触媒反応を完了する。本明細書で用いる例示的プロテアーゼには、組み換え型バチルス株から単離したセリンプロテアーゼが含まれる。本明細書で用いる例示的プロテアーゼにはサブチリシンおよびその変異体が含まれ、これにはサブチリシンカールスバーグ、アルカラーゼ、およびサブチリシンＳ４１が含まれる。サブチリシンおよびその変異体は当業者には既知であり、例えば、アルカラーゼ、アウカラーゼ０．６Ｌ、アルカラーゼ２．５Ｌ、ＡＬＫ−酵素、バシロペプチダーゼＡ、バシロペプチターゼＢ、バシラス・サブチリスアルカリ性プロテイナーゼビオプラーゼ、ビオプラーゼＡＬ１５、ビオプラーゼＡＰＬ３０、コリスチナーゼ、サブチリシンＪ、サブチリシンＳ４１、サブチリシンセンダイ、サブチリシンＧＸ、サブチリシンＥ、サブチリシンＢＬ、ゲネナーゼＩ、エスペラーゼ、マキサターゼ、サモアーゼＰＣ１０、プロテアーゼＸＸＶＩＩ、サモアーゼ、セパラーゼ、サブチリシンカールスバーグサブチリシンＤＹ、ズブチロペプチダーゼ、ＳＰ２２６、サビナーゼ８．０Ｌ、サビナーゼ４．０Ｔ、カズサーゼ、プロテアーゼＶＩＩＩ、オプティクリーン（登録商標）、プロチンＡ３Ｌ、サビナーゼ、サビナーゼ１６．０Ｌ、サビナーゼ３２．０Ｌ・ＥＸ、オリエンターゼ１０Ｂ、プロテアーゼＳ、セリンエンドペプチダーゼが含まれる。本明細書に示す方法および組成物の特定の実施形態では、Davail et al., 1994, J. Biol. Chem., 26:17448-17453（これは全体が参照により本明細書に組み込まれる）の例示的開示に示されるように、サブチリシンなどの易熱性プロテアーゼおよびサブチリシンの易熱性変異体を用いることが可能である。
【００３８】
本明細書で用いる場合、「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、ペプチドを加水分解するプロテアーゼの機能を少なくとも部分的に減じることが可能な基質、例えば化合物を意味する。
【００３９】
本明細書で用いる場合、「リガーゼ」という用語は核酸修飾酵素を意味し、これは、核酸鎖の5'-リン酸終端と3'-ヒドロキシル終端の間のホスホジエステル結合の分子内形成および分子間形成に触媒作用を及ぼす。リガーゼには例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡの末端を連結することが可能なＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（登録商標）ｓｓＤＮＡリガーゼなどの鋳型非依存性リガーゼ、ならびに、二本鎖ＤＮＡのニックを封じる鋳型依存性リガーゼが含まれる。本明細書で用いる場合、「鋳型依存性リガーゼ」は、相補的ポリヌクレオチドにアニールした場合に互いに隣接するＤＮＡ鎖の、5'-リン酸終端と3'-ヒドロキシル終端の間のホスホジエステル結合の分子内形成および分子間形成に触媒作用を及ぼすＤＮＡリガーゼを意味する。ライゲーションすべきＤＮＡ末端の両方が隣接してアニールする相手であるポリヌクレオチドを、本明細書では「ライゲーション鋳型」といい、ライゲーションを「鋳型依存性ライゲーション」という。ライゲーション鋳型は、生体サンプル中のゲノムＤＮＡもしくは他のＤＮＡの相補的ＤＮＡ配列であってよく、または、ライゲーション鋳型は、特定のアッセイもしくは方法で用いるために特異的に合成および／もしくは提供される、「架橋オリゴデオキシリボヌクレオチド」もしくは「ライゲーションスプリントオリゴデオキシリボヌクレオチド」（もしくは「ライゲーションスプリント」）であってもよい。鋳型依存性ＤＮＡリガーゼの例には、ライゲーション鋳型の存在下でのみｓｓＤＮＡ分子の分子内ライゲーションに触媒作用を及ぼす、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡリガーゼ、ＴｆＩ ＤＮＡリガーゼ、およびＡＭＰＬＩＧＡＳＥ（登録商標）ＤＮＡリガーゼ（アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソンのEPICENTRE Biotechnologies社）などのＮＡＤ型ＤＮＡリガーゼ、ならびに、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼまたはＦＡＳＴＬＩＮＫ（商標）ＤＮＡリガーゼ（EPICENTRE Biotechnologies社）などのＡＴＰ型ＤＮＡリガーゼが含まれる。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「タグメンテーション」という用語は、トランスポゾン末端配列を含むアダプターと複合体化したトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体による、ＤＮＡの修飾を意味する。タグメンテーションは、ＤＮＡの断片化と、二重断片の両鎖の5'末端へのアダプターのライゲーションを同時に引き起こす。追加の配列を、例えばＰＣＲ、ライゲーション、または当業者に既知の任意の他の適切な手法により、適応断片の末端に加えることが可能である。本明細書で用いる場合、「トランスポソーム複合体」という用語は、二本鎖核酸に非共有結合的に結合したトランスポザーゼ酵素を意味する。例えば、複合体は、非共有結合的な複合体形成を支持する条件下で、二本鎖トランスポゾンＤＮＡとともにプレインキュベーションしたトランスポザーゼ酵素とすることが可能である。二本鎖トランスポゾンＤＮＡには、限定されるものではないが、Ｔｎ５ＤＮＡ、Ｔｎ５ＤＮＡの一部、トランスポゾン末端組成物、トランスポゾン末端組成物の混合物、または、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼなどのトランスポザーゼと相互作用可能な他の二本鎖ＤＮＡが含まれ得る。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「転移反応」という用語は、１つまたは複数のトランスポゾンが、標的核酸の例えばランダムまたはほぼランダムな部位に挿入される反応を意味する。転移反応における必須成分はトランスポザーゼおよびトランスポゾンのヌクレオチド配列を示すＤＮＡオリゴヌクレオチドであり、移動トランスポゾン配列およびその相補体（非移動トランスポゾン末端配列）、ならびに機能性転移複合体またはトランスポソーム複合体を形成するのに必要な他の成分が含まれる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドはさらに、必要に応じてまたは所望に応じて追加の配列（例えば、アダプター配列またはプライマー配列）を含むことが可能である。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼおよびＴｎ５型トランスポゾン末端（Goryshin and Reznikoff, 1998, J. Biol. Chem., 273: 7367）により、または、ＭｕＡトランスポザーゼ、および、Ｒ１末端配列とＲ２末端配列とを含むＭｕトランスポゾン末端（Mizuuchi, 1983, Cell, 35: 785; Savilahti et al., 1995, EMBO J., 14: 4893）により形成される転移複合体を用いることにより例示される。しかしながら、その意図する目的のために標的ＤＮＡを5'-タグ化および断片化するのに十分な効率で、ランダムまたはほぼランダムにトランスポゾン末端を挿入可能である任意の転移系を本発明において用いることが可能である。本方法で用いることが可能な、当技術分野で既知の転移系の例には、黄色ブドウ球菌Ｔｎ５５２（Colegio et al., 2001, J Bacterid., 183: 2384-8; Kirby et al., 2002, MoI Microbiol, 43: 173-86）、ＴｙＩ（Devine and Boeke, 1994, Nucleic Acids Res., 22: 3765-72および国際公開９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Craig, 1996, Science. 271 : 1512; Craig, 1996, Review in: Curr Top Microbiol Immunol, 204: 27-48）、ＴｎＩＯおよびＩＳｌＯ（Kleckner et al., 1996, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 49-82）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Lampe et al., 1996, EMBO J., 15: 5470-9）、Ｔｃｉ(Plasterk, 1996, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 125-43)、P因子 (Gloor, 2004, Methods MoI Biol, 260: 97-114)、ＴｎＪ（Ichikawa and Ohtsubo, 1990, J Biol Chem. 265: 18829-32）、細菌挿入配列（Ohtsubo and Sekine, 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:1-26）、レトロウイルス（Brown et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2525-9）、およびイーストのレトロトランスポゾン（Boeke and Corces, 1989, Annu Rev Microbiol. 43: 403-34）が含まれるが、これらに限定されない。トランスポゾン末端を標的配列に挿入する方法は、適切なin vitro転移系を利用可能な、または、当技術分野の知識に基づいて開発することが可能な、任意の適切なトランスポゾン系を用いてin vitroで実行することが可能である。該して、本明細書で提供する方法で用いるための適切なin vitro転移系は、最低でも、十分な純度、十分な濃度、および十分なin vitro転移活性を有するトランスポゾン酵素、ならびに、転移反応に触媒作用を及ぼすことが可能な各トランスポザーゼとの機能的複合体を、トランスポザーゼとともに形成するトランスポゾン末端を必要とする。本発明で用いることが可能な適切なトランスポザーゼトランスポゾン末端配列には、野生型、誘導体形、または突然変異形のトランスポザーゼから選択したトランスポザーゼと複合体を形成する、野生型、誘導体、または突然変異のトランスポゾン末端配列が含まれ得るが、これらに限定さ���ない。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「トランスポザーゼ」という用語は、トランスポゾン末端含有組成物（例えばトランスポゾン、トランスポゾン末端、トランスポゾン末端組成物）と機能的複合体を形成でき、そして、例えばin vitro転移反応においてともにインキュベーションされる二本鎖標的核酸へのトランスポゾン末端含有組成物の挿入または転移に触媒作用を及ぼすことが可能な酵素を意味する。本明細書で提示するトランスポザーゼにはまた、レトロトランスポゾンおよびレトロウイルスに由来するインテグラーゼも含まれ得る。トランスポザーゼ、トランスポソーム、およびトランスポソーム複合体は概して、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の公開により例示されるように、当業者にとって既知である。本明細書に記載する多くの実施形態はＴｎ５トランスポザーゼおよび／または高活性Ｔｎ５トランスポザーゼについて言及するが、その意図する目的のために、標的核酸を5'-タグ化および断片化するのに十分な効率でトランスポゾン末端を挿入可能な任意の転移系を本発明において用いることが可能であることが理解されよう。特定の実施形態において転移系は、トランスポゾン末端をランダムまたはほぼランダムに挿入して、標的核酸を5'-タグ化および断片化することが可能である。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「トランスポゾン末端」という用語は、in vitro転移反応において機能的なトランスポザーゼ酵素またはインテグラーゼ酵素と複合体を形成するのに必要な、ヌクレオチド配列（「トランスポゾン末端配列」）のみを示す二本鎖ＤＮＡを意味する。トランスポゾン末端は、該トランスポゾン末端を認識しそれに結合するトランスポザーゼまたはインテグラーゼとともに、「複合体」、「シナプス複合体」、「トランスポソーム複合体」、または「トランスポソーム組成物」を形成し、この複合体は、in vitro転移反応においてともにインキュベーションされる標的ＤＮＡにトランスポゾン末端を挿入または転移することが可能である。トランスポゾン末端は、「移動鎖」と「非移動鎖」からなる２つの相補的配列を示す。例えば、in vitro転移反応において活性である高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、アメリカ合衆国ウィスコンシン州マディソンのEPICENTRE Biotechnologies社のＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ）と複合体を形成するトランスポゾン末端の１つは、5' AGATGTGTATAAGAGACAG 3'（配列番号１）のような「移動トランスポゾン末端配列」を示す移動鎖と、5' CTGTCT CTTATACACATCT 3'（配列番号２）のような「非移動トランスポゾン末端配列」を示す非移動鎖を含む。移動鎖の3’末端は、in vitro転移反応において標的核酸に連結または移動する。非移動鎖は移動トランスポゾン末端配列に対し相補的なトランスポゾン末端配列を示すが、これはin vitro転移反応において標的核酸に連結も移動もしない。
【００４４】
本明細書で用いる場合、「トランスポゾン末端組成物」という用語は、移動トランスポゾン末端配列の5'-および／または非移動トランスポゾン末端配列の3'-にオプションとして追加の配列を含んでよい、トランスポゾン末端（トランスポザーゼとともに作用して転移反応することが可能な最小の二本鎖ＤＮＡセグメント）を含む組成物を意味する。例えば、タグに連結したトランスポゾン末端は「トランスポゾン末端組成物」である。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「移動鎖」という用語は、（トランスポゾン末端がタグまたは他の部分に連結しているか否かに関係なく）「トランスポゾン末端」と「トランスポゾン末端組成物」の両方の移動部分を意味する。同様に、「非移動鎖」という用語は、「トランスポゾン末端」と「トランスポゾン末端組成物」の両方の非移動部分を意味する。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「タグ」という用語は、非標的核酸成分、概してＤＮＡを意味し、これはタグが連結した核酸断片をアドレスする手段を提供する。例えば、一部の実施形態では、タグは、（例えば、ＤＮＡポリメラーゼによる伸長用プライマーなどのオリゴヌクレオチド、または、捕捉もしくはライゲーション反応用のオリゴヌクレオチドをアニールするための部位を提供することにより、）タグが連結したＤＮＡを特定し、認識し、および／または、分子的もしくは生化学的に操作することを可能にするヌクレオチド配列を含む。本明細書ではタグを核酸分子に連結するプロセスを場合により「タグ付け（tagging）」といい、タグ付けされたまたはタグを含む核酸は「タグ化（tagged）」という（例えば、「タグ化ＤＮＡ」）。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「タグドメイン」という用語は、所望の意図する目的または用途のための配列を示すタグの部分またはドメインを意味する。タグドメインの１つは「トランスポゾン末端ドメイン」であり、このタグドメインは移動トランスポゾン末端配列を示す。一部の実施形態では、移動鎖も、移動トランスポゾン末端配列の5'-に１つまたは複数の他のヌクレオチド配列を示し、タグも5'-部分において１つまたは複数の他の「タグドメイン」を有し、このタグドメインはそれぞれ任意の所望の目的のために提供される。例えば、一部の実施形態はトランスポゾン末端組成物を含み、これは、制限部位タグドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、および転写プロモータドメインの１つまたは複数から選択されるタグドメインを含む。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「制限部位ドメイン」という用語は、制限エンドヌクレアーゼを用いた切断を容易にするという目的のための配列を示すタグドメインを意味する。例えば、制限部位ドメインを用いて、ジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を生成することが可能である。制限部位ドメインを用いて、タグドメインにおいて適合する二本鎖5'-末端を生成することも可能であり、その結果、この末端を、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼを用いて別のＤＮＡ分子にライゲーションすることが可能である。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「捕捉タグドメイン」という用語は、タグドメインが連結する核酸断片の捕捉を容易にするという目的のための配列を示すタグドメインを意味する（例えば、ビーズまたは他の表面上のジタグ化直鎖ｓｓＤＮＡ断片を捕捉するためのアニーリング部位または親和性タグを提供するためであり、例えば、タグドメイン配列のアニーリング部位は、ビーズ上、マイクロチップもしくはマイクロアレイ上のプローブ、またはシークエンシングビーズ上のプローブなど、表面上の特異的配列にアニールすることにより捕捉を可能にする）。一部の実施形態では、捕捉タグドメインは、親和性結合分子を含む化学基または化学的部分に連結した移動鎖の5'-部分を含む（例えば、ビオチン、ストレプトアビジン、抗原、または該抗原に結合する抗体であり、これは、第１親和性結合分子と特異的結合対を形成する第２親和性結合分子が連結する表面上で、ジタグ化直鎖状ｓｓＤＮＡ断片を捕捉することを可能にする）。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「シークエンシングタグドメイン」という用語は、タグが連結する核酸断片のシークエンシングを容易にするという目的のための（例えば、合成によるシークエンシングのためのプライミング部位を提供するため、または、ライゲーションによるシークエンシングのためのアニーリング部位を提供するため、または、ハイブリダイゼーションによるシークエンシングのためのアニーリング部位を提供するための）配列を示すタグドメインを意味する。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「増幅タグドメイン」という用語は、前記タグが付加された核酸の増幅を容易にするという目的のための配列を示すタグドメインを意味する。例えば、一部の実施形態において、増幅タグドメインは、ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅反応、鎖置換増幅反応、もしくはローリングサークル増幅反応）のためのプライミング部位、または、核酸増幅反応（例えば、ライゲーション連鎖反応）において鋳型依存性リガーゼを用いるプローブのライゲーションのためのライゲーション鋳型を提供する。
【００５２】
本明細書で用いる場合、「検出タグドメイン」という用語は、タグ化核酸断片の検出を容易にするという目的のための、配列、検出可能な化学的部分、または検出可能な生化学的部分を示すタグドメインを意味する（例えば、可視色素、蛍光色素、化学発光色素、または他の検出可能色素；基質の存在下で検出可能な酵素、例えば、ＮＢＴに加えＢＣＩＰを伴うアルカリホスファターゼ、または、適切な基質を有するペルオキシダーゼ；検出可能タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質；および、検出可能部分に結合した親和性結合分子、または、別の検出可能親和性結合分子と親和性結合対もしくは特異的結合対を形成することが可能な親和性結合分子；または、当技術分野で既知である、多くの他の検出可能分子または系のいずれか）。
【００５３】
本明細書で用いる場合、「アドレスタグドメイン」という用語は、特定のサンプルの同定を可能にする配列を示すタグドメインを意味する（例えば、移動鎖は、サンプルごとに異なる配列を示す異なるアドレスタグドメインを有する）。
【００５４】
本明細書で用いる場合、核酸または核酸反応に関連して用いる「増幅する（amplify）」、または「増幅された(amplified)」「増幅して（amplifying）」という用語は、標的核酸などの特定の核酸、またはタグ化核酸のコピーを作成するin vitro方法を意味する。核酸を増幅する非常に多くの方法が当技術分野では知られ、増幅反応としてはポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応が挙げられるが、これらに限定されない。増幅される核酸はＤＮＡとすることが可能である。核酸分子の増幅により生じた産物（「増幅産物」）は、開始核酸がＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方であれ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドの両方の混合物のいずれであってもよく、または、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡのヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでよい。「コピー」は必ずしも標的配列に対し相補的または同一の、完全な配列を意味するわけではない。例えば、コピーには、デオキシイノシンもしくはデオキシウリジンなどのヌクレオチドアナログ、意図的な配列改変（例えば、標的配列にハイブリダイズすることが可能だが相補的ではない配列を含むプライマーを介して生じる配列改変）、および／または増幅中に生じる配列エラーが含まれ得る。
【００５５】
本明細書で用いる場合、「タグ化核酸断片ライブラリ」という用語は、全ゲノムなどのリソースから生成される（ジタグ化核酸断片などの）タグ化核酸断片の集積または集合を意味し、集積または集合中のタグ化核酸断片の組み合わせは、該タグ化核酸断片を生成した元であるリソース、例えば全ゲノムの配列を質的および／または量的に表す配列を示す。タグ化核酸断片のライブラリは、リソースにより示される各配列を表すタグ化核酸断片を含まないことがあり得る。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「核酸修飾酵素」という用語は、核酸、例えばＤＮＡに作用して、例えば切断、ライゲーション、重合、リン酸化などの修飾に影響を与える任意の酵素を意味する。核酸修飾酵素には、例えば、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、リガーゼ、ホスホリラーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、トランスポザーゼなどが含まれる。「ＤＮＡ修飾酵素」にはＤＮＡに作用する酵素が含まれ、これにはＲＮＡなど他の基質にも作用する酵素が含まれる。
【００５７】
本明細書で用いる場合、「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのＤＮＡ鎖への重合に触媒作用を及ぼす修飾酵素を意味する。ＤＮＡポリメラーゼには、ポリマー中に付加するデオキシリボヌクレオチドの並び順を決定するために鋳型核酸を必要とする「鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ」が含まれるか、または、それらが鋳型配列を参照することなく重合に触媒作用を及ぼす「鋳型非依存性」であってよい。ＤＮＡポリマーの合成に加え、ＤＮＡポリメラーゼは他の特徴または作用を有してよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、5'から3'のエキソヌクレアーゼ活性（これは5'エキソヌクレアーゼ活性または5'ヌクレアーゼ活性ともいう）、3'から5'のエキソヌクレアーゼ活性、および鎖置換能を有するまた有さないことで特徴付けることができる。
【００５８】
本明細書で用いる場合、「プライマー」という用語はオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）であり、通常、核酸ポリメラーゼにより伸長することが可能なフリーの3'-OH基を有する。鋳型依存性ポリメラーゼでは、通常、プライマーオリゴの少なくとも3'-部分は、オリゴが水素結合および他の分子力により鋳型に「結合」（または「複合体化」、「アニール」、又は「ハイブリダイズ」）する鋳型核酸の一部に対し相補的であり、ＤＮＡポリメラーゼによる合成開始のためのプライマー／鋳型複合体を提供し、ＤＮＡ合成プロセス中に、3'末端に連結した、鋳型に対し相補的な共有結合的に連結した塩基が付加されることで伸張する。その結果がプライマー伸張産物である。
【００５９】
本明細書で用いる場合、「ユニバーサル配列」という用語は、２つ以上の核酸分子に共通の、または該核酸分子により共有される、ヌクレオチド配列領域を意味する。オプションとして、２つ以上の核酸分子はまた、配列が異なる領域を有する。したがって、例えば、5'タグは同一またはユニバーサルな核酸配列を含み得、3'タグは同一またはユニバーサルな配列を含み得る。異なるメンバーの複数の核酸分子に存在し得るユニバーサル配列は、該ユニバーサル配列に対して相補的である単一ユニバーサルプライマーを用いて、多数の異なる配列の複製または増幅を可能にし得る。
【００６０】
本明細書で用いる場合、「固体表面」、「固体支持体」、および本明細書にある他の文法的同等物は、ポリヌクレオチドの連結に適した、または、連結に適するように修正することが可能な、任意の物質を意味する。想定される基質には、ガラス、修正したまたは機能性をもたせたガラス、（アクリル、スチレンと他の材料とのポリスチレンおよびコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）などを含む）プラスチック、多糖類、ナイロンもしくはニトロセルロース、セラミックス、樹脂、シリカ、もしくは、シリコンおよび修正シリコンを含むシリカ系物質、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、ならびに、種々の他のポリマーが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、固体支持体および固体表面はフローセル装置内に位置する。一部の実施形態では、固体支持体はトランスポソーム複合体を規則正しいパターンで固定するのに適した、パターン付き表面を備える。「パターン付き表面」は、固体支持体の露出層にある、または該露出層上の異なる領域の配置を意味する。一部の実施形態では、固体支持体は表面上にウェルまたは窪みのアレイを備える。固体支持体の組成物およびジオメトリーは、その用途とともに変化し得る。一部の実施形態では、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ、および／またはアレイといった平面構造である。このように、基質の表面は平面層の形状とすることが可能である。一部の実施形態では、固体支持体は１つまたは複数のフローセル面を備える。本明細書で用いる場合、「フローセル」という用語は、１つまたは複数の流体試薬が流れることが可能な固体表面を備えたチャンバを意味する。本開示の方法で容易に用いることが可能な、フローセルおよび関連する流体系、ならびに検出プラットフォームは、例えば、Bentley et al., Nature456:53-59 (2008)、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７０５７０２６号明細書、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７３２９４９２号明細書、同第７２１１４１４号明細書、同第７３１５０１９号明細書、同第７４０５２８１号明細書、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、固体支持体またはその表面は、管または容器の内面または外面のように非平面的である。一部の実施形態では、固体支持体は小球体またはビーズを備える。「小球体」、「ビーズ」、「粒子」、または本明細書における文法的同等物は、種々の物質でできた小さい離散的な粒子を意味することを意図とし、該物質にはプラスチック、セラミック、ガラス、およびポリスチレンが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態では、小球体は磁性の小球体またはビーズである。あるいは、または、加えて、ビーズは多孔質である。ビーズのサイズは、ナノメートル例えば１００ｎｍからミリメートル例えば１ｍｍに及ぶ。
【００６１】
タグ化核酸断片ライブラリの調製方法
本開示は概して、核酸断片ライブラリを調製する方法に関し、具体的には、単一反応混合物、例えば単一の反応管または他の容器において、例えば次世代ＤＮＡシークエンシング、コピー数多型の分析、および一塩基多型の分析を含む種々の用途向けに、プロテアーゼを用いて核酸断片ライブラリを調製する方法に関する。
【００６２】
ゲノムをシークエンシングするといった種々の用途のために、最小の細胞集合、例えば単一細胞から核酸断片ライブラリを調整することが望ましい、種々の方法および用途が存在する。核酸断片ライブラリを調製する現在の方法は、ＤＮＡの断片化の前に、核酸抽出および／または増幅という別のステップを必要とする。典型的には、細胞をまず処置して、細胞溶解物を生成し、ここから標的核酸含量を抽出し精製する。その後、別のステップにおいて、精製した標的核酸を、例えば、Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手できるNexteraトランスポソームを用いて断片化する。この別の核酸抽出ステップおよび反応管または容器間のサンプル移動は通常、標的核酸サンプルを無駄にし、そのため調製した核酸断片が、サンプルに由来する標的核酸を十分に表す可能性を低くする。この不十分な表示は、細胞サンプルの量が限定されているまたは得るのが困難な場合に特に難しくなる。前増幅ステップによりインプットされる細胞が単一または数個の場合に、この問題を解決するためにいくつかの方法が開発された。しかしながら、これらの方法は不十分な表示という問題を解決するには十分でなく、典型的に高ノイズを招く。本開示は、核酸断片ライブラリを精製するためのアドオンプロトコルとともに単一反応混合物、例えば単一の管を用いることによりこの問題に対する解決法を提供する。本明細書で提供する方法は、単一の反応管において細胞溶解物の生成およびタグメント化などの種々のステップを組み込み、オプションとして１つまたは複数の付加プロトコルを用いる。このような単一の管を付加した方法では、細胞からの開始核酸物質量が保存されることから、そこから生成したライブラリは標的核酸例えばゲノムをより良好に表すことが可能である。
【００６３】
一態様において、本開示は、タグ化核酸断片ライブラリを調製する方法であって、（ａ）細胞集合を溶解試薬に直接接触させて細胞溶解物を生成するステップであって、前記溶解試薬は１つまたは複数のプロテアーゼを有し、前記細胞溶解物は標的核酸を含む、ステップと、（ｂ）前記１つまたは複数のプロテアーゼを不活性化させて不活性化細胞溶解物を形成するステップと、（ｃ）少なくとも１つのトランスポザーゼと移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを、前記標的核酸および前記トランスポゾン末端組成物が転移反応する条件下で前記不活性化細胞溶解物に直接適用して混合物を生成するステップであって、（ｉ）前記標的核酸を断片化して複数の標的核酸断片を生成し、（ｉｉ）前記トランスポゾン末端組成物の移動鎖を複数の前記標的核酸断片それぞれの5'末端に連結して、複数の5'タグ化標的核酸断片を生成する、ステップを含む、方法を提供する。
【００６４】
一部の実施形態では、細胞サンプルを１つまたは複数のプロテアーゼを含む複合溶解試薬と直接接触させるため、本明細書で提供するプロテアーゼを無傷細胞と直接接触させることが可能である。一部の実施形態では、細胞サンプルを界面活性剤を含む第１溶解試薬と接触させて第１細胞溶解物を生成し、その後、１つまたは複数のプロテアーゼを含む第２溶解試薬を、第１細胞溶解物を含む反応管に加える。この選択肢では、本明細書で提供するプロテアーゼは細胞溶解物に接触する。下記で提供する実施例１では標的核酸を含む細胞溶解物を生成する方法を示す。界面活性剤およびQIAGEN社（カリフォルニア州サンディエゴ）のプロテアーゼ（Part No.19155）を含む例示的な溶解マスター混合物を、実施例１および表１〜３に示す。
【００６５】
本明細書で提供する方法による開始物質は、従来のシークエンシングプロトコルでは典型的に、標的核酸例えばゲノムの不十分な表示のために、ノイズが多いシークエンシングデータおよびコピー数多型しか生成することができない、最小の細胞集合とすることが可能である。一部の実施形態では、最小の細胞集合は１個、２個、３個、４個、または５個の細胞を含み得る。一部の実施形態では、最小の細胞集合は、１０細胞未満、１５細胞未満、２０細胞未満、２５細胞未満、３０細胞未満、３５細胞未満、４０細胞未満、４５細胞未満、５０細胞未満、６０細胞未満、７０細胞未満、８０細胞未満、９０細胞未満、または１００細胞未満とすることができる。一実施形態では、本方法で用いる開始物質は単一細胞のみを含む。一部の実施形態では、標的核酸はゲノムＤＮＡである。一部の実施形態では、標的核酸は染色体ＤＮＡまたはその断片を含む。一部の実施形態では、標的核酸はゲノムまたは部分ゲノムを含む。
【００６６】
本明細書で用いるプロテアーゼはクロマチンタンパク質、例えばヒストンおよび他のＤＮＡ結合タンパク質を消化して、裸のゲノムＤＮＡを解放することが可能である。加えて、本明細書で提供するプロテアーゼは内因性ＤＮａｓｅを消化して、ゲノム分解を防ぐことが可能である。一部の実施形態では、本明細書の方法は広範な特異性を有する一つのプロテアーゼのみを用い、そのため該プロテアーゼは、細胞にあるいくつかまたは多くのタンパク質を含む、種々の異なるタンパク質およびポリペプチドを消化することが可能である。一部の他の実施形態では、広範な特異性は種々のプロテアーゼの混合物を用いることにより実現することが可能であり、種々のプロテアーゼの組み合わせは、細胞にあるいくつかまたは多くのタンパク質などの種々の異なるタンパク質およびポリペプチドを消化することが可能である。例示的なプロテアーゼには、アルカラーゼ、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＳ４１、易熱性プロテイナーゼＫ、およびQIAGEN社のプロテアーゼなどのサブチリシンが含まれる。実施例４は、プロテアーゼ活性がゲノムＤＮＡへの均一なアクセスに有用であることを示す。異なるプロテアーゼおよび／またはプロテアーゼの混合物を、種々の条件、例えば細胞型およびサンプル量に応じて用いることが可能であることを理解すべきである。
【００６７】
本明細書で提供する、各反応で用いるプロテアーゼの量および濃度は、プロテアーゼの活性度と同様に、染色体ＤＮＡの量および／または用いる細胞の数に応じて変化させることが可能である。一部の実施形態では、細胞溶解物中の１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物中の１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は０．１ｍｇ／ｍＬ〜２．５ｍｇ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物中の１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は２ｍＡＵ／ｍＬ〜５００ｍＡＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物中の１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は４．５ｍＡＵ／ｍＬ〜５００ｍＡＵ／ｍＬである。一部の実施形態では、細胞溶解物中の１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は１０ｍＡＵ／ｍＬ〜１００ｍＡＵ／ｍＬである。本開示は、実施例５に示すように、プロテアーゼ、例えばQIAGEN社のプロテアーゼ（Part No.19155）を用いてプロテアーゼ濃度のテストおよび最適化を例示する。この例で示すように、単一細胞を通常の反応温度下（例えば、室温）で０．５ｍｇ／ｍＬ（２２．５ｍＡＵ／ｍＬと同等)または２ｍｇ／ｍＬ（９０ｍＡＵ／ｍＬと同等)のプロテアーゼで処置する場合、図３Ａの上２つのヒストグラムで示すように、クリーンなコピー数の分析結果が同様に得られる。従って、一部の実施形態では、細胞溶解物におけるプロテアーゼ濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬである。細胞溶解物におけるプロテアーゼ濃度の例には、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１．０ｍｇ／ｍＬ、１．１ｍｇ／ｍＬ、１．２ｍｇ／ｍＬ、１．３ｍｇ／ｍＬ、１．４ｍｇ／ｍＬ、１．５ｍｇ／ｍＬ、１．６ｍｇ／ｍＬ、１．７ｍｇ／ｍＬ、１．８ｍg/ｍＬ、１．９ｍｇ／ｍＬ、および２．０ｍｇ／ｍＬが含まれる。一部の実施形態では、細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼの濃度は２０ｍＡＵ／ｍＬ〜９０ｍＡＵ／ｍＬである。細胞溶解物における１つまたは複数のプロテアーゼ濃度の例には、２０ｍＡＵ／ｍＬ、３０ｍＡＵ／ｍＬ、４０ｍＡＵ／ｍＬ、５０ｍＡＵ／ｍＬ、６０ｍＡＵ／ｍＬ、７０ｍＡＵ／ｍＬ、８０ｍＡＵ／ｍＬ、９０ｍＡＵ／ｍＬが含まれる。
【００６８】
ｐＨ値などの種々の条件が、反応管におけるプロテアーゼによる消化と他の酵素の活性の両方に影響を与え得るため、これらの条件、例えばｐＨ値を最適化することが可能である。実施例６は、プロテアーゼ消化の反応のｐＨ条件を最適化し、プロテアーゼ活性とシークエンシング結果のバランスをとる。示すように、QIAGEN社のプロテアーゼの活性を異なるｐＨ条件下で分析し、プロテアーゼ活性はｐＨ値の上昇につれ高くなり、ｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０の範囲においてプロテアーゼ活性はｐＨ７．０で最も低く、ｐＨ１０．０で最も高い。その後、コピー数データにおけるユニークにマッピングされたリードおよびノイズの比率も種々のｐＨ条件下で分析する。示すように、ｐＨが７、８、または９の場合、クリーンな、ユニークにマッピングされたリードを約７０％得ることが可能である。しかしながらｐＨが１０の場合、得られるユニークにマッピングされたリードの比率はより少なく、データ変動が著しく増加する。同様に、ｐＨが７、８、または９である場合、隣接するビン間のカウント差は小さく（約２０％）、ばらつきも小さい一方で、ｐＨ１０．０では隣接するビン間のカウント差は著しく増加し、ばらつきも大きい。従って、一部の実施形態では、細胞集合はｐＨ７．０〜ｐＨ１０．０で溶解試薬と接触させる。一部の実施形態では、細胞集合はｐＨ７．０〜ｐＨ９．０で溶解試薬と接触させる。例示的なｐＨ条件には、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、およびｐＨ９．５が含まれる。
【００６９】
核酸調製ステップおよびタグメンテーションステップを同一の反応管で実行することから、本方法に従うプロテアーゼを、典型的に二本鎖ＤＮＡを必要とする次のタグメンテーションステップを妨げることなく、効果的に不活性化させることが可能であるということは有益であり得る。一部の実施形態では、プロテアーゼをタグメンテーションステップの前に温度を上昇させることにより不活性化させることが可能である。高温は二本鎖ＤＮＡ立体構造を変性し得る。従って、一部の実施形態では、本明細書で提供するプロテアーゼは、二本鎖ＤＮＡを変性することなく、比較的低い温度で不活性化させることが可能である。実施例７は、プロテアーゼの熱不活性化のテストについて説明する。示すように、プロテアーゼ活性を異なる温度でテストし、プロテアーゼ活性は温度が上昇するにつれ次第に低減し、７０℃で完全に不活性化させる。したがって、一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、温度を５０℃〜８０℃まで上昇させることにより不活性化させる。一部の実施形態では、１つまたは複数のプロテアーゼを、温度を７０℃まで上昇させることにより不活性化させる。
【００７０】
一部の実施形態では、本明細書で提供するプロテアーゼはまた、反応管にプロテアーゼ阻害剤を加えることにより不活性化させることが可能である。本明細書で提供するプロテアーゼ阻害剤は、タグメンテーションおよび同一の反応管において後で実行する増幅ステップを妨げない。例示的なプロテアーゼ阻害剤には、例えば、ＡＥＢＳＦ、ベスタチン、Ｅ−６４、ペプスタチンＡ、ホスホラミドン、ロイペプチン、アプロチニン、ベスタチンヒドロクロリド、ロイペプチン、ホスホラミドン二ナトリウム塩、エラスタチン、アプロチニン、ナファモスタットメシレート、アンチパイン、ＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニルフルオリド）、ペファブロック、ジイソプロピルフルオロホスフェート、およびストレプトマイセス属サブチリシン阻害剤が含まれる。
【００７１】
上記で述べたように、１つまたは複数の界面活性剤も細胞に加えることが可能である。一部の実施形態では、界面活性剤をプロテアーゼとともに細胞に加える。他の実施形態では界面活性剤をまず細胞に加え、続いてプロテアーゼを反応管に加える。本明細書で用いる界面活性剤の機能には、細胞膜を破壊することと、可溶形の細胞内物質を解放することを含む。一部の実施形態では、本明細書で用いる界面活性剤は、下流の酵素活性を妨げない。したがって、一部の実施形態では非イオン性界面活性剤を用いる。これらの界面活性剤は、タンパク質−脂質会合および脂質−脂質会合を壊すが、タンパク質−タンパク質の相互作用は壊さないため、他の下流酵素を妨げる可能性は低い。典型的に、非イオン性界面活性剤は非電荷で親水性の頭部基を含む。典型的な非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンまたはグリコシドを基盤とする。例示的な非イオン性界面活性剤には、Tween（登録商標）80、Tween（登録商標）20Tween、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-100-R、Triton（登録商標）X-114、NP-40、Genapol（登録商標）C-100、Genapol（登録商標）X-100、Igepal（登録商標）CA 630、Arlasolve（登録商標）200、Brij（登録商標）96/97Triton、Brij（登録商標）98、Brij（登録商標）58、Brij（登録商標）35Brijシリーズ、Pluronic（登録商標）L64、Pluronic（登録商標）P84、非界面活性型スルホベタイン（ＮＤＳＢ２０１）、amphipols（PMAL-C8）、CHAPS、オクチル-β-D-グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（C12E9、ポリドセノール（polidocenol））、ドデシル硫酸ナトリウム、N-ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、SB3-10、SB3-12、アミドスルホベタイン-14、オクチルチオグルコシド、マルトシド、HEGA、およびMEGAシリーズが含まれる。
【００７２】
プロテアーゼをいったん不活性化させたら、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物の間で形成される、または、別のトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物を用いる、安定した複合体を含むトランスポソーム組成物を加えることにより、in vitro転移反応を同一の反応混合物、例えば同一の反応管において実行することが可能である。トランスポザーゼにより触媒されたin vitro転移反応は、標的核酸をばらばらにして断片にすることと、タグを各断片の5'末端に連結することを同時に行う。トランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物の使用について記載する任意の方法も、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物とから作られるトランスポソーム組成物を用いることが可能であり、トランスポソーム組成物の使用について記載する任意の方法も、トランスポソーム組成物を構成する別のトランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物を用いることが可能であることを理解すべきである。
【００７３】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、標的核酸を含む不活性化細胞溶解物を、少なくとも１つのトランスポザーゼと、該トランスポザーゼがともに転移複合体を形成するトランスポゾン末端組成物と一緒に、前記標的核酸への多数の挿入が起きる条件下およびそれに十分な時間で、in vitro転移反応においてインキュベーションするステップであって、前記トランスポゾン組成物は、（ｉ）移動トランスポゾン末端配列およびオプションとして該移動トランスポゾン末端配列の5'-に追加配列を示す移動鎖と、（ｉｉ）移動トランスポゾン末端配列に対し相補的な配列を示す非移動鎖とを含み、前記挿入はそれぞれ、移動鎖を含む第１鎖を標的核酸のヌクレオチドの5'末端へ連結することにより標的核酸が断片化され、それぞれが5'末端に第１タグを有するアニールされた5'-タグ化ＤＮＡ断片の集合を生成、ステップを含む。
【００７４】
上記の方法を、別のトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物を用いて実行する。他の実施形態では、上記の方法を、トランスポザーゼとトランスポゾン末端組成物の間で形成された複合体を含むトランスポソーム組成物を用いて実行する。
【００７５】
一部の特定の実施形態では、本明細書で提供する方法を、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の開示に概ね記載されるように、Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）より入手可能なNexteraトランスポソームを用いて実行する。
【００７６】
トランスポザーゼおよびトランスポソーム組成物は、米国特許出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の開示により例示されるように、概して当業者に知られている。一部の実施形態では、本明細書で用いる方法は、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼとＴｎ５型トランスポゾン末端とで形成されたトランスポソーム組成物を用いる（Goryshin and Reznikoff, 1998, J. Biol. Chem., 273: 7367）。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ＭｕＡトランスポザーゼと、Ｒ１末端配列およびＲ２末端配列を含むＭｕトランスポゾンとで形成されたトランスポソーム組成物を用いる（Mizuuchi, 1983, Cell, 35: 785; Savilahti et al., 1995, EMBO J., 14: 4893）。その意図する目的のために標的核酸を5'-タグ化および断片化するのに十分な効率で、ランダムまたはほぼランダムにトランスポゾン末端を挿入可能である任意の転移系を本開示において用いることが可能である。例示的なトランスポソーム組成物系には黄色ブドウ球菌Ｔｎ５５２（Colegio et al., 2001, J Bacterid., 183: 2384-8; Kirby et al., 2002, MoI Microbiol, 43: 173-86）、ＴｙＩ（Devine and Boeke, 1994, Nucleic Acids Res.,22:3765-72および国際公開第９５／２３８７５号）、トランスポゾンＴｎ７（Craig, 1996, Science. 271 : 1512; Craig, 1996, Review in: Curr Top Microbiol Immunol, 204: 27-48）、ＴｎＩＯおよびＩＳｌＯ（Kleckner et al., 1996, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 49-82）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Lampe et al., 1996, EMBO J., 15: 5470-9）、Ｔｃｉ（Plasterk, 1996, Curr Top Microbiol Immunol, 204: 125-43）、Ｐ因子（Gloor, 2004, Methods MoI Biol, 260: 97-114）、ＴｎＪ（Ichikawa and Ohtsubo, 1990, J Biol Chem. 265: 18829-32）、細菌挿入配列（Ohtsubo and Sekine, 1996, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 204:1-26）、レトロウイルス（Brown et al., 1989, Proc Natl Acad Sci USA, 86: 2525-9）、ならびにイーストのレトロトランスポゾン（Boeke and Corces, 1989, Annu Rev Microbiol. 43: 403-34）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７７】
非限定的例として、トランスポゾン末端には、１９−ｂｐ外側末端（「ＯＥ」）トランスポゾン末端、内側末端（「ＩＥ」）トランスポゾン末端、野生型もしくは変異体のＴｎ５トランスポザーゼにより認識される「モザイク末端」（「ＭＥ」）トランスポゾン末端、または、米国出願公開第２０１０／０１２００９８号明細書（この内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の開示に記載のＲ１トランスポゾン末端およびＲ２トランスポゾン末端が含まれ得る。トランスポゾン末端には、in vitro転移反応においてトランスポザーゼまたはインテグラーゼ酵素とともに機能的複合体を形成するのに適切な、任意の核酸または核酸アナログが含まれ得る。例えば、トランスポゾン末端は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾塩基、非天然塩基、修飾バックボーンを含み得、一方または両方の鎖でニックを含み得る。
【００７８】
一部の実施形態では、移動鎖は3'-部分と5'-部分を含み、3'-部分は移動トランスポゾン末端配列を含み、移動鎖の5'-部分は、特定の目的のためのタグドメイン（例えば、次世代シークエンシングまたは増幅用の、シークエンシングタグドメインまたは増幅タグドメイン、および任意でアドレスタグドメイン）を１つまたは複数含む配列を示す。例示的なタグドメインには、制限部位タグドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、アドレスタグドメイン、および転写プロモータドメインが含まれる。
【００７９】
一部の実施形態では、２つの異なるトランスポソームをin vitro転移反応で用い、該２つのトランスポソームはそれぞれ同一のトランスポザーゼを含むが、異なるトランスポゾン末端組成物も含む。一部の実施形態では、２つの異なるトランスポソームを用い、該２つの異なるトランスポソームはそれぞれ同一のトランスポザーゼを含み、トランスポゾン末端組成物は異なる移動鎖を含む。一部の実施形態では、２つの異なるトランスポソームを用い、該２つのトランスポソームはそれぞれ異なるトランスポザーゼ酵素と異なるトランスポゾン末端組成物を含み、これはそれぞれ、各トランスポザーゼと機能的複合体を形成する。
【００８０】
一部の実施形態では、in vitro転移反応で用いるトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物の量、またはトランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットルの反応当たり、５０ナノグラムの標的核酸につき約１ピコモル〜約２５ピコモルの間である。一部の実施形態では、in vitro転移反応で用いるトランスポザーゼおよびトランスポゾン末端組成物の量、またはトランスポソーム組成物の量は、５０マイクロリットルの反応当たり、５０ナノグラムの標的核酸につき約５ピコモル〜約５０ピコモルの間である。一部の実施形態では、トランスポザーゼの濃度は０．５〜１ｎＭである。一部の実施形態では、トランスポザーゼの濃度は２０μＬの反応当たり０．０１〜０．０２ピコモルである。
【００８１】
実施例２は、本明細書で提供する方法を用いたタグメンテーションステップのプロトコルを示す。単一細胞を用いてシークエンシングのためのライブラリを調製する実施形態では、存在するゲノムコピーが２つのみであるため、より小さい挿入サイズがライブラリの多様性を増加させる傾向がある。実施例８で示すように、カウント、ひいてはライブラリにより表される多様性は、挿入サイズが小さくなるにつれ増加する。そのため、一部の実施形態では、本明細書の方法はタグメンテーションステップにおいてより多くの量のトランスポザーゼを用いて断片化を増強し、タグ化核酸断片の挿入サイズを小さくする。示すように、１μＬのＴｎ５をタグメンテーション反応で用いる場合、平均断片サイズは約５５０ｂｐである一方、２μＬのＴｎ５をタグメンテーション反応で用いる場合、平均断片サイズは約４４０ｂｐである。より小さい挿入サイズと合致して、ライブラリの多様性は１μＬのＴｎ５で処置したものと比較し、２μＬのＴｎ５で処置した場合に増大する。Ｔｎ５を用いてトランスポザーゼの調整を示す。他のトランスポザーゼも本方法で用いることができ、本明細書で提供する方法および当業者に既知の方法を用いて、その量を調整し最適化することが可能である。
【００８２】
一部の実施形態では、in vitro転移反応の反応時間は２時間以下、１時間以下、３０分以下、１５分以下、または１０分以下である。一部の実施形態では、in vitro転移反応の反応時間は５分以下である。
【００８３】
一部の実施形態では、in vitro転移反応の反応温度は約４０℃〜約７０℃、約４５℃〜約６５℃、約５０℃〜約６０℃である。一部の実施形態では、in vitro転移反応の反応温度は約５５℃である。
【００８４】
一部の実施形態では、in vitro転移反応は、サンプルを例えば管において４℃で保持することにより終了させることが可能である。一部の実施形態では、タグメンテーション産物に対しタグメントバッファを中和させ、サンプルを室温で５分間インキュベーションする。
【００８５】
in vitro転移反応を介して、標的核酸断片を5'末端にタグ付けする。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はさらにステップを含み、3'末端タグを5'タグ化核酸断片に組み込んで、ジタグ化核酸断片のライブラリを作る。一部の実施形態では、単一の管において、任意の中断精製ステップを実行することなくジタグ化核酸断片のライブラリを5'タグ化標的核酸から生成する。3'末端タグの追加は種々の方法を介して、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ターミナルトランスフェラーゼ、および／または、国際公開第２０１０／０４８６０５号（この内容はその全体が組み込まれる）に記載のリガーゼを用いることにより、実行することが可能である。
【００８６】
したがって、一部の実施形態では、本明細書で提供する方法はさらに、（ｄ）ステップ（ｃ）による混合物を、3'タグが5'タグ化標的核酸断片に連結する条件下で、少なくとも１つの核酸修飾酵素とともに直接インキュベーションして、複数のジタグ化標的核酸断片を生成するステップを含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を単一の反応管において実行する。ジタグ化核酸断片ライブラリの生成を示す実施形態を以下に記載する。
【００８７】
一部の実施形態では、鎖置換活性または5'ヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化核酸断片を生成する。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、アニールした5'-タグ化核酸断片の集合を、熱サイクリングなく、前記アニールした5'-タグ化核酸断片が変性しないという条件下で、鎖置換活性または5'ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベーションするステップであって、前記ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型として相補的な鎖を用いて前記アニールした5'-タグ化核酸断片の各鎖の3'-末端を伸長し、そして、非移動鎖を置換または消化することによりジタグ化二本鎖ＤＮＡ断片のライブラリを生成する、ステップを含む。一実施形態では、伸長ステップは、鋳型として逆鎖上の5’タグを用い、７２℃で実行した。
【００８８】
一部の実施形態では、上記で提供した方法により生成したジタグ化二本鎖ＤＮＡ断片を変性させて、（例えば、９５℃まで加熱し急冷することにより）ジタグ化一本鎖ＤＮＡ断片を含むタグ化ＤＮＡ断片ライブラリを生成する。
【００８９】
他の実施形態では、ターミナルトランスフェラーゼを用いることによりジタグ化核酸断片を生成する。一部の実施形態では、5'-タグ化二本鎖核酸断片を変性させて5'-タグ化一本鎖核酸断片を生成する。5 '-タグ化一本鎖核酸断片を、ターミナルトランスフェラーゼと、該ターミナルトランスフェラーゼ用の少なくとも１つの基質とからなるＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベーションし、この間にターミナルトランスフェラーゼは第２タグを5'-タグ化核酸断片の3'-末端に連結することにより、ジタグ化核酸断片を含むタグ化核酸断片ライブラリを生成する。一部の実施形態では、トランスポゾン末端組成物を構成する非移動トランスポゾン末端の3'-末端を、（例えば、3'-終端ヌクレオチドとしてジデオキシヌクレオチドまたは3'-O-メチル-ヌクレオチドを有する、非移動トランスポゾン末端を用いることにより）ブロックし、これは、3'-ヌクレオチドをブロックし、ターミナルトランスフェラーゼによる追加を防ぐことにより、非移動トランスポゾン末端のバックグラウンドタグ付けを防ぐ。
【００９０】
他の実施形態では、5'-タグ化二本鎖核酸断片を変性させず、5'-タグ化一本鎖核酸断片を生成する。代わりに、5'-タグ化核酸断片を、変性ステップの前に、前記ターミナルトランスフェラーゼが第２タグを5'-タグ化核酸断片の3'-末端に連結する条件下およびそれに十分な時間で、ターミナルトランスフェラーゼと該ターミナルトランスフェラーゼ用の少なくとも１つの基質とからなるＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベーションすることにより、ジタグ化核酸断片のライブラリを生成する。一部の実施形態では、トランスポゾン末端組成物を構成する非移動トランスポゾン末端の3'-末端を、（例えば、3'-終端ヌクレオチドとして、ジデオキシヌクレオチドまたは3'-O-メチル-ヌクレオチドを有する、非移動トランスポゾン末端を用いることにより）ブロックする。
【００９１】
他の実施形態では、ジタグ化核酸断片をＤＮＡポリメラーゼと終端タグ付けオリゴヌクレオチドを用いることにより生成する。一部の実施形態では、5'-タグ化二本鎖核酸断片を変性して、（例えば、９５℃まで加熱し急冷することにより）5'-タグ化一本鎖核酸断片を生成し、第２タグを、ＤＮＡポリメラーゼと終端タグ付けオリゴヌクレオチドを用いて5'-タグ化一本鎖核酸断片の3'-末端に連結することにより、ジタグ化核酸断片ライブラリを生成する。一部の実施形態では、第２タグを、ＤＮＡポリメラーゼと終端タグ付けオリゴヌクレオチドを用いて5'-タグ化一本鎖核酸断片の3'-末端に連結するステップには、（１）5'-部分と3'-部分とを有する終端タグ付けオリゴヌクレオチドを提供するステップであって、前記5'-部分は、前記5'-タグ化一本鎖核酸断片の3'-終端に連結することが望ましい第２タグの配列に対し相補的な配列を示し、前記3'-部分は３〜８個のランダムなヌクレオチドを含むランダム配列を示し、このうち前記3'-終端ヌクレオチドはブロックされるため、その結果ＤＮＡポリメラーゼにより伸長することが不可能になる、ステップと、（２）前記終端タグ付けオリゴヌクレオチドを前記5'-タグ化一本鎖核酸断片にアニールする条件下およびそれに十分な時間で、5'-タグ化一本鎖核酸断片を前記終端タグ付けオリゴヌクレオチドと接触させるステップと、（３）前記終端タグ付けオリゴヌクレオチドを鋳型として用いて前記5'-タグ化一本鎖核酸断片の3'-終端を伸長するＤＮＡ重合条件下およびそれに十分な時間で、前記終端タグ付けオリゴヌクレオチドをアニールした前記5'-タグ化一本鎖核酸断片を反応混合物中でＤＮＡポリメラーゼと接触させ、それにより前記第２タグをその3'-終端に連結し、5'-および3'-をタグ化した一本鎖核酸断片を生成するステップが含まれる。
【００９２】
さらに他の実施形態では、鋳型依存性リガーゼおよびライゲーションタグ付けオリゴヌクレオチドを用いることによりジタグ化核酸断片を生成する。一部の実施形態では、アニールした5'-タグ化ＤＮＡ断片に第２タグを連結するという条件下およびそれに十分な時間で、5'-タグ化核酸断片を、鋳型依存性ＤＮＡリガーゼと、3'-部分および5'-部分を有するライゲーションタグ付けオリゴデオキシヌクレオチドとともにインキュベーションすることにより、アニールされたジタグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片ライブラリを生成し、ここにおいて前記3'-部分は前記5'-タグ化ＤＮＡ断片の3'-末端に連結することが望ましい任意の配列を示す第２タグを示し、前記5'-部分は5'-モノリン酸基を有し、そしてランダム配列を示す。一部の実施形態では、該方法はさらに、アニールされたジタグ化ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片ライブラリを、（例えば９５℃まで加熱し急冷することにより）変性させることで、ジタグ化一本鎖ＤＮＡ断片ライブラリを生成するステップを含む。
【００９３】
タグ化核酸断片のライブラリを生成した後、例えば限定サイクルポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてタグ化核酸断片を増幅して、クラスタ形成およびシークエンシングに必要な他の末端配列またはアダプター、例えば、インデックス、ユニバーサルプライマー、および他の配列を導入することが可能である。一部の実施形態では、このような増幅を5’タグ化核酸断片ライブラリに対して実行する。一部の実施形態では、このような増幅をジタグ化核酸断片ライブラリに対して実行する。一部の実施形態では、増幅を、タグ化核酸断片ライブラリを生成した同一の反応管において実行し、増幅用の薬剤を同一の反応管に直接加える。
【００９４】
したがって、本明細書で提供する方法は、（ｅ）１つまたは複数のジタグ化標的核酸断片を増幅して、該ジタグ化核酸断片の5’末端および／または3’末端において追加の配列を有するタグ化核酸断片ライブラリを生成するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を単一の反応管において実行する。例示的な増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅反応、ローリングサークル増幅反応、リガーゼ連鎖反応、転写介在増幅反応、およびループ介在増幅反応が含まれる。
【００９５】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ＰＣＲを用いてジタグ化一本鎖核酸断片ライブラリを増幅するステップを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ジタグ化ＤＮＡ断片ライブラリの単一プライマーＰＣＲ増幅を用いる。一部の実施形態では、ジタグ化ＤＮＡ断片を増幅するステップには、ＤＮＡポリメラーゼと、第２タグに対し相補的な少なくとも１つのプライマーとを用いることを含む。一部の実施形態では、ジタグ化ＤＮＡ断片ライブラリを増幅するステップは、移動鎖の少なくとも一部分の配列を示す１つのみのオリゴデオキシリボヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ジタグ化ＤＮＡ断片を鋳型として用いるＰＣＲにより、タグ化ＤＮＡ断片ライブラリを増幅することを含む。一部の実施形態では、プライマーは、追加の配列、例えばアダプター配列を含む5’部分を含む。
【００９６】
一部の実施形態では２つの異なるＰＣＲプライマーを用い、該ＰＣＲプライマーはそれぞれ、トランスポゾン末端組成物を構成する移動トランスポゾン末端の少なくとも一部分の配列を示す。一部の実施形態では、各ＰＣＲプライマーは3'-部分と5'-部分を含み、前記3'-部分は各移動トランスポゾン末端配列を示し、5'-部分は特定の目的のための各タグドメインまたはアダプター（例えば、次世代シークエンシングまたは増幅のための、シークエンシングタグドメイン／アダプターまたは増幅タグドメイン／アダプター、およびオプションとしてアドレスタグドメイン／アダプター）の配列を示す。例えば、単一トランスポゾン末端組成物をin vitro転移反応で用いて、鎖置換活性または5'ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いジタグ化ＤＮＡ断片ライブラリを生成する場合、ジタグ化ＤＮＡ断片は２つの異なるＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲにより増幅することが可能である。各ＰＣＲプライマーは3'-部分と5'-部分を含み、前記3'-部分は各移動トランスポゾン末端配列を示し、5'-部分は特定の目的のための各タグドメインまたはアダプター（例えば、次世代シークエンシングまたは増幅用の、シークエンシングタグドメイン／アダプターまたは増幅タグドメイン／アダプター、およびオプションとしてアドレスタグドメイン／アダプター）の配列を示す。一部の実施形態では、各ＰＣＲプライマーの5’部分は他のプライマーのそれとは異なり、したがってＰＣＲ産物の２つの末端の配列は異なる。例えば、一方の末端は一方のインデックスおよび／またはユニバーサルプライマー配列を含み、もう一方の末端は異なるインデックスおよび／またはユニバーサルプライマー配列を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、ジタグ化核酸断片の２つの末端は２つの異なる移動鎖配列から作り出される。例えば一部の実施形態では、２つの異なるトランスポソームをin vitro転移反応で用いることが可能であり、該２つのトランスポソームはそれぞれ同一のトランスポザーゼを含むが、異なるトランスポゾン末端組成物も含む。一部の実施形態では、２つの異なるトランスポソームを用い、該２つの異なるトランスポソームはそれぞれ同一のトランスポザーゼを含み、トランスポゾン末端組成物は異なる移動鎖を含む。一部の実施形態では、２つの異なるトランスポソームを用い、該２つのトランスポソームはそれぞれ異なるトランスポザーゼ酵素と異なるトランスポゾン末端組成物を含み、これはそれぞれ、各トランスポザーゼと機能的複合体を形成する。一部の実施形態では、２つの異なるトランスポゾン末端組成物をin vitro転移反応で用い、鎖置換活性または5'ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてジタグ化一本鎖核酸断片ライブラリを生成するが、該実施形態では、第１タグは一方のトランスポゾン末端組成物の移動鎖の配列を示し、第２タグはもう一方のトランスポゾン末端組成物の非移動鎖配列を示す。
【００９８】
２つの異なる移動鎖が二本鎖核酸の各逆鎖の5’末端に連結している上記実施形態および他の実施形態では、本明細書で提供する方法はさらに、２つの異なるＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲによりジタグ化核酸断片を増幅するステップを含み得る。一方のＰＣＲプライマーは、一方のトランスポゾン末端組成物を構成する一方の移動鎖の少なくとも一部分の配列を示し、もう一方のＰＣＲプライマーはもう一方のトランスポゾン末端組成物を構成するもう一方の移動鎖の少なくとも一部分の配列を示す。
【００９９】
２つのプライマーを用いる一部の実施形態では、各ＰＣＲプライマーは3'-部分と5'-部分を含み、前記3'-部分は各移動トランスポゾン末端配列を示し、前記5'-部分は特定の目的のための各タグドメイン／アダプター（例えば、次世代シークエンシングまたは増幅のための、シークエンシングタグドメインまたは増幅タグドメイン、およびオプションとしてアドレスタグドメイン）の配列を示す。一部の実施形態では、各ＰＣＲプライマーの5’部分はもう一方のプライマーのそれとは異なることから、異なる配列をＰＣＲ産物の２末端に導入することが可能である。一部の実施形態では、第１ＰＣＲプライマーの5'部分、または第２ＰＣＲプライマーの5'部分、または第１ＰＣＲプライマーおよび第２ＰＣＲプライマー両方の5'部分は、特定のシークエンシングプラットフォームの次世代シークエンシング用鋳型の発生のために、それぞれ第１シークエンシングタグ／アダプターまたは第２シークエンシングタグ／アダプター（例えば、Illumina Nexteraシークエンシングプラットフォーム用シークエンシングタグ）を含む。一部の実施形態では、第１ＰＣＲプライマーの5'部分または第２ＰＣＲプライマーの5'部分は、追加で、特定の目的のためのアドレスタグドメイン／アダプターまたは別のタグドメイン／アダプターを含む。
【０１００】
実施例３は、タグ化核酸断片の２つの末端に他の配列、例えば（カリフォルニア州サンディエゴのIllumina社による）インデックス１（ｉ７）およびインデックス２（ｉ５）を付加し、そして、他の目的、例えばクラスタ形成のために必要な配列を付加することが可能な限定サイクルＰＣＲ増幅を説明する。単一細胞シークエンシングではインプットＤＮＡが相対的に小さいため、ＰＣＲサイクル数を調整してより良好なシークエンシング結果を得ることが可能である。実施例９では、開始物質として単一細胞を用いてＰＣＲのサイクル数をテストし、最適化する。示すように、１６サイクルのＰＣＲをコピー数分析で用いる場合ノイズは大きく、１８サイクルまたは２０サイクルのＰＣＲを用いる場合ノイズは著しく減少する。従って、一部の実施形態では、ＰＣＲサイクル数は１８、１９、または２０である。
【０１０１】
幅広い種類の酵素およびキットを、当業者に既知のＰＣＲによる増幅反応を実行するために利用することができる。例えば、一部の実施形態では、ウィスコンシン州マディソンのEPICENTRE Biotechnologies社によるFAILSAFE（商標）PCR SystemまたはMASTERAMP（商標）Extra-Long PCR Systemのいずれかを、製造業者が記載するように用いてＰＣＲ増幅を実行する。しかしながら、本開示は増幅反応用の産物または条件の使用に限定されるわけではなく、標的配列にアニールするプライマーとトランスポゾンにアニールするプライマーの間の配列の増幅を可能にする、任意の適切な耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび反応混合物を用いることが可能である。
【０１０２】
本明細書で提供する方法は、タグ化核酸断片のライブラリを増幅するためのＰＣＲの使用に限定されるわけではない。同一配列を増幅し、意図した目的のために適切な組成および量の増幅産物を生成する任意の適切な増幅方法（例えば、ローリングサークル増幅、リボプライマー増幅（例えば、米国特許第７４１３８５７号明細書）、ＩＣＡＮ、ＵＣＡＮ、ｒｉｂｏｓｐｉａ、終端タグ付け（米国特許出願公開第２００５／０１５３３３３号明細書）、Eberwine-type aRNA増幅、または鎖置換増幅）を、本発明の実施形態で用いることが可能である。例えば、用いることが可能な一部の鎖置換法が、日本国京都の宝酒造株式会社の国際出願公開第０２／１６６３９号、同００／５６８７７号、およびオーストラリア国００／２９７４２号明細書、Becton Dickinson and Companyの米国特許第５５２３２０４号明細書、同５５３６６４９号明細書、同５６２４８２５号明細書、同５６３１１４７号明細書、同５６４８２１１号明細書、同５７３３７５２号明細書、同５７４４３１１号明細書、同５７５６７０２号明細書、および同５９１６７７９号明細書、Nanogen/ Becton Dickinson Partnershipの米国特許第６２３８８６８号明細書、同６３０９８３３号明細書、および同第６３２６１７３号明細書、Bio Merieuxの米国特許第５８４９５４７号明細書、同第５８７４２６０号明細書、および同第６２１８１５１号明細書、Gen-Probe社の米国特許第５７８６１８３号明細書、同第６０８７１３３号明細書、および同第６２１４５８７号明細書、Wickらの米国特許第６０６３６０４号明細書、Kurnの米国特許第６２５１６３９号明細書、日本国東京の栄研化学株式会社の米国特許第６４１０２７８号明細書および国際公開第００／２８０８２号、Auerbachの米国特許第５５９１６０９号明細書、同第５６１４３８９号明細書、同第５７７３７３３号明細書、同第５８３４２０２号明細書、および同第６４４８０１７号明細書、ならびに、Lizardiの米国特許第６１２４１２０および同第６２８０９４９号明細書に記載されている。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示の任意の方法により調製したタグ化核酸断片ライブラリは、その後、ライブラリ核酸を精製し、オプションとして、サイズ選択を提供するステップにかけることが可能である。これらのステップは、ＰＣＲ産物のクリーンアップと望ましくないサイズの核酸の除去に役立つ。当技術分野の種々の方法を用いて本方法で生成した核酸断片をクリーンにすることができ、該種々の方法には、断片をクリーンアップするコラムの使用、例えばQiagen QIAquick PCR精製キットの使用、および、ゲルサイズ選択の使用、例えばPippin Prep電気泳動プラットフォームの使用が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野で既知である、核酸断片のクリーンアップおよび／または核酸サイズ選択のための他の方法も、本明細書で提供する方法で用いることが可能である。
【０１０４】
例えば、一部の実施形態では、（Beckman Coulter Genomics社による）AMPure XPビーズを用いてタグ化核酸断片を精製する。核酸断片はＳＰＲＩ（solid-phase reversible immobilization）ビーズに結合させることが可能であり、異なる長さを有する核酸断片のビーズに対する親和性は、ＰＥＧ／ＮａＣｌ濃度を変えることにより制御することが可能である。したがって、ＰＥＧ／ＮａＣｌ濃度を変えることにより、異なるサイズの核酸を選択的に精製することが可能である。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、単一のAMPure XP処置を用いて、あるサイズ（例えば１５０〜２００ｂｐ）未満の核酸断片を取り除く。一部の実施形態では、２倍（上下）のサイズ選択は、２つの連続したAMPure XPステップにより実行することが可能である。第１選択ステップでは、低濃度のAMPure XPビーズをサンプルに加えてより大きいＤＮＡ断片を結合させる。このステップでは、より大きい断片を含むビーズを廃棄する。その後第２選択ステップにおいて、次に、より多くのビーズを上澄みに加える。この第２ステップでは、より小さい断片サイズに結合するように、ＰＥＧおよびＮａＣｌの量を増やす。次に、非常に短いライブラリ断片を含む上澄みを廃棄し、ビーズを洗浄して中位の断片を溶出する。当業者は、Bronner et al., 2009, Curr Protoc Hum Genet. 18:10で説明されるように、第１および最終のＳＰＩＲＩステップにおけるＰＥＧおよびＮａｃｌの濃度に応じて異なるサイズ幅が生成され得ることを理解しよう。
【０１０５】
AMPure XPビーズを用いて核酸断片ライブラリをクリーンアップする典型的な手順には、（１）AMPure XPビーズをボルテックスして、ビーズが確実に、均一に分散するようにするステップと、（２）ある量のAMPure XPビーズを生成した各ＰＣＲ産物に加え、室温でインキュベーションするステップと、（３）上澄みが澄むまで、管を磁気スタンド上の管ホルダーに置くステップと、（５）上澄みを取り除き廃棄するステップと、（６）管を磁気スタンドから外さずにビーズを１回または複数回洗浄するステップと、（７）管を磁気スタンドに置いたままビーズを自然乾燥させるステップと、（８）管を磁気スタンドから外し、再懸濁バッファを加え、室温でインキュベーションするステップと、（９）上澄みを新しい管に移すステップを含む。
【０１０６】
核酸断片ライブラリをクリーンアップしてサイズ選択した後、ライブラリ正規化ステップにさらにかけて各ライブラリの量を正規化し、プールした各サンプルにおいて概ね等しいそのライブラリの表示を確実にすることが可能である。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法において、ビーズに基づくライブラリ正規化プロセスを用いる。ビーズに基づくライブラリ正規化プロセスでは、概ね等しい量のビーズを、核酸断片サンプルを含む各ウェルに加える。各ウェルに加えたビーズの量は概ね等しいため、ビーズに連結した核酸断片の量も各ウェルで概ね等しい。従って、上澄みを取り除いた後、ビーズから溶出した核酸断片は概ね等しい量で各ウェルに存在し得る。
【０１０７】
典型的な、ビーズに基づくライブラリ正規化プロセスには、（１）（例えば、ビーズバッファにある）概ね等しい量のビーズを、上記で提供した方法で生成した核酸断片を含む各ウェルに加えるステップと、（２）インキュベーションして、および／または振り混ぜて、ビーズを核酸断片と結合させるステップと、（３）（プレート上に存在し得る）ウェルを磁気スタンドに置き、上澄みをクリアにするステップと、（４）ウェルを磁気スタンドに置いたまま、上澄みを注意深く取り除き廃棄するステップと、（５）ビーズを１回または複数回洗浄するステップと、（６）ビーズに連結した核酸断片を溶出するステップを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法により生成したタグ化核酸断片のライブラリを核酸シークエンシング用の鋳型として用いることが可能である。
【０１０９】
一部の実施形態では、シークエンシングの前に、ライブラリ中のタグ化核酸断片を増幅して、例えば合成によるシークエンシングでのシークエンシング中のノイズに対するシグナルを強化する。一部の実施形態では、タグ化核酸断片ライブラリを、増幅反応のための鋳型として用いる（例えば、タグ化核酸断片の末端配列に対し相補的なＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅反応）。一部の実施形態では、増幅したタグ化核酸断片のライブラリは、大部分またはほぼ全てが標的核酸によって示される配列を含む。標的核酸が有機体のゲノムＤＮＡを含む一部の実施形態では、増幅反応は全ゲノムの増幅反応である。
【０１１０】
一部の実施形態では、タグ化核酸断片を固体表面に固定することが可能である。例えば、固体表面は、タグ化核酸断片の末端配列に対し相補的なポリヌクレオチドに連結させることが可能であるため、タグ化核酸断片を固体表面に固定することが可能である。その後、固定化した核酸断片を表面上で増幅する。例えば、一部の実施形態では、固定化核酸断片は、米国特許第７９８５５６５号明細書および同第７１１５４００号明細書（これらそれぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の開示内容により例示されるクラスタ増幅技法を用いて増幅する。米国特許第７９８５５６５号明細書および同第７１１５４００号明細書に組み込まれた内容は固相核酸増幅法を記載し、これは、固定された核酸分子のクラスタまたは「コロニー」を含むアレイを形成するために、増幅産物を固体支持体に固定することを可能にする。このようなアレイ上の各クラスタまたはコロニーは、複数の同一の固定化ポリヌクレオチド鎖および複数の同一の固定化相補的ポリヌクレオチド鎖から形成される。そうして形成したアレイを、本明細書では通常「クラスタ化アレイ」をいう。米国特許第７９８５５６５号明細書および同第７１１５４００号明細書に記載されているような固相増幅反応の産物は、固定化ポリヌクレオチド鎖と固定化相補的鎖の対をアニールすることにより形成された、いわゆる「ブリッジされた」構造体であり、両鎖は、例えば共有結合的連結を介して5’末端で固体支持体に固定される。クラスタ増幅技法は、固定化核酸鋳型を用いて固定化アンプリコンを生成する方法の例である。当技術分野で既知の他の適切な技法を用いて、本明細書で提供する方法に従って生成した固定化タグ化核酸断片から固定化アンプリコンを生成することも可能である。
【０１１１】
本明細書に提供する方法に従って調製したタグ化核酸断片のライブラリは、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、およびナノポアシークエンシング等を含む、ダイレクトシークエンシングなどの任意の適切なシークエンシング技法に従いシークエンシングすることが可能である。一部の実施形態では、固定化ＤＮＡ断片を固体支持体上でシークエンシングする。一部の実施形態では、シークエンシングのための固体支持体は、増幅が起きる固体支持体と同じである。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書で提供する方法で用いるシークエンシング技法は合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）であり、ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば、標的核酸またはそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長をモニタリングして、鋳型のヌクレオチド配列を求める。基本となる化学プロセスは（例えば、ポリメラーゼ酵素により触媒される）重合とすることが可能である。ポリメラーゼに基づく特定のＳＢＳ実施形態では、プライマーに加えたヌクレオチドの並び順と型の検出を用いて鋳型配列を求めることが可能であるような鋳型依存的方法で、蛍光標識ヌクレオチドをプライマーに加える（それにより、プライマーを伸長する）。
【０１１３】
パイロシークエンシングなど、周期性反応を用いるほかのシークエンシング手順を用いることが可能である。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれる際の無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（Ronaghi, et al., 1996, Analytical Biochemistry 242(1), 84-9；Ronaghi, 2001, Genome Res.11(1), 3-11；Ronaghi et al., 1998, Science 281(5375), 363；米国特許第６２１０８９１号明細書；同第６２５８５６８号明細書、および同第６２７４３２０号明細書。これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）。パイロシークエンシングでは、放出されたＰＰｉを、ＡＴＰスルフリラーゼによりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即時に変換することにより検出することが可能であり、生成されたＡＴＰ量はルシフェラーゼ生成光子を介して検出することが可能である。従って、シークエンシング反応は発光検出系によりモニタリングすることが可能である。蛍光に基づく検出系で用いる励起放射線源は、パイロシークエンシングの手順には必要ではない。パイロシークエンシングを本開示内容に従って生成したアンプリコンに適用するために適応することが可能な検出器および手順は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８号明細書、米国特許第７５９５８８３号明細書、および同第７２４４５５９号明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを含む方法を利用することが可能である。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ-ホスフェート標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用を介して、またはzeromode waveguides（ＺＭＷ）法を用いて検出することが可能である。ＦＲＥＴに基づくシークエンシング用の技術および試薬は、例えば、Levene et al., 2003, Science 299, 682-686；Lundquist et al., 2008, Opt. Lett. 33, 1026-1028; Korlach et al., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181に記載されており、この開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１５】
一部のＳＢＳ実施形態には、ヌクレオチドが伸長産物に取り込まれる際に放出される光子の検出を含む。例えば、放出された光子の検出に基づくシークエンシングは、Ion Torrent社（コネチカット州ギルフォードのLife Technologies社の子会社）より商業的に入手可能な電気検出器および関連する技術、または、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書、同第２００９／０１２７５８９号明細書、同第２０１０／０１３７１４３号明細書、または同第２０１０／０２８２６１７号明細書（これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているシークエンシング法および系を用いることが可能である。結合平衡除外法（kinetic exclusion）を用いて標的核酸を増幅する本明細書に記載の方法は、光子の検出に用いる基質に容易に適用することが可能である。具体的には、本明細書に記載の方法を用いて、光子の検出に用いるアンプリコンのクローン集合を生成することが可能である。
【０１１６】
別の有用なシークエンシング技術はナノポアシークエンシングである（例えばDeamer et al., 2000, Trends Biotechnol., 18, 147-151; Deamer et al., 2002, Acc. Chem. Res. 35:817-825; Li et al., 2003, Nat. Mater. 2:611-615を参照。これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。一部のナノポアの実施形態では、標的核酸または標的核酸から取り除いた個々のヌクレオチドをナノポアに通過させる。核酸またはヌクレオチドがナノポアを通過する際、ポアの電気伝導度の変動を測定することにより各ヌクレオチドの型を特定することが可能である（米国特許第７００１７９２号明細書；Soni et al., 2007, Clin. Chem., 53, 1996-200; Healy, 2007, Nanomed. 2, 459-481; Cockroft et al., 2008, J. Am. Chem. Soc., 130, 818-820。これらの開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１１７】
本明細書で提供する方法はさらに、細胞のコピー数多型を分析するステップを含む。コピー数分析は、サンプルにおけるＤＮＡコピー数多型をテストする。このような分析は、種々のクリティカルな障害を引き起こし得る、またはそのリスクを増大し得る染色体コピー数多型を検出するのに役立つ。例えば、自閉症はコピー数の突然変異に関連することが報告されている（Sebat et al., 2007, Strong association of de novo copy number mutations with autism, Science 316 (5823): 445-9）。統合失調症もコピー数多型と関連することが報告されている（St Clair, 2008, Copy number variation 多型 and schizophrenia, Schizophr Bull 35 (1): 9-12）。コピー数多型を検出するために種々の方法が開発されてきた。しかしながら、開始物質が限定され、最小の細胞集合に由来する場合、ノイズが著しく結果が劣化する。本方法は、このような状況でコピー数多型を検出する方法を提供する。下記で提供する実施例は本方法を用いるコピー数多型分析を説明し、いくつかのパラメータをコピー数多型分析向けに最適化する。一部の実施形態では、コピー数多型分析で用いる最小の細胞集合には、１個、２個、３個、４個、５個の細胞が含まれる。典型的には、細胞数が増加するにつれ、より完全なリード分布を得ることが可能であり、そのため実施例１０に示すようにデータに存在するノイズは少なくなる。この例では、１個、３個、または５個の細胞を用いるリード分布を分析する。示すように、ゲノムカバレッジは細胞数が増加するにつれ増加し、１個の細胞はゲノムの約４０％をカバーでき、３個の細胞は５０％超のゲノムをカバーでき、５個の細胞は約６０％をカバーすることが可能である。１個、３個、および５個の細胞を用いた平均ライブラリ数は、それぞれ約５００万、１５００万、および２０００万である。この例で示すように、単一細胞を用いる場合、全体の成功率は相対的に高く９４％である（Ｎ＝１８７）。細胞アッセイの障害の一つは、細胞自体の質により、例えば、複製細胞、または、アポトーシスを起こした／壊死細胞の一つを選択することにより引き起こされる可能性がある。
【０１１８】
実施例１１は、本方法といくつかの現行の単一細胞調製法を比較する。QIAGEN社（カリフォルニア州サンディエゴ）が開発したREPLI-g Single Cell Kitを核酸の調整に用いると、コピー数多型データが単一細胞、３細胞、または５細胞に由来する場合、非常にノイズが多い。Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）が開発したSurePlex（PicoPlex）を核酸を調製するために用いた場合、それはREPLI-g Single Cell Kitと比較してノイズを減少させる。示すように、本方法（Nextera SC）はSurePlex Amplification Systemを用いた場合と比較し、ノイズをさらに減少させる。従って、本方法はコピー数多型を分析するのに進歩した方法を提供する。
【０１１９】
コピー数多型分析の一態様はモザイク現象を検出することである。モザイクまたはモザイク現象は、１ユニット体における２つ以上の遺伝子型の存在を意味する。モザイク現象には主に２つのタイプがあり、体細胞モザイク現象と生殖細胞モザイク現象である。体細胞モザイク現象は、体細胞が、例えば初期またはより後の切断時における有糸分裂のために１超の遺伝子型を含む場合に起きる。研究者らが、体細胞変異が一生を通じて次第に増え、多くの白血病、リンパ腫および固形腫瘍の原因であることを示した（Jacobs et al., 2012, Detectable Clonal Mosaicism and Its Relationship to Aging and Cancer, Nature Genetics 44 (6): 651-U668）。生殖細胞モザイク現象では、いくつかの配偶子（精子または卵母細胞）は突然変異するが他は正常であり、これも多くの疾病を招く。従って、モザイク現象の検出は貴重な診断情報を提供することが可能である。本開示内容はモザイク現象を検出する方法を提供する。実施例１２では、本明細書で提供するモザイク現象を検出する方法の使用を例示する。示すように、単一ＧＭ５０１２１細胞の１８番染色体のコピー数分析において、１５．４ＭＢのＤＮＡを表す集合を各単一細胞シークエンシングで検出する。同様に、単一のＧＭ２０９１６を用いた１５番染色体、Ｘ染色体、および１０番染色体のコピー数分析データと、単一のＧＭ１０２３９細胞を用いた１番染色体および１１番染色体のコピー数分析データは両方とも他の染色体を表す追加の集合を検出する。
【０１２０】
本方法はまた、他の用途、例えば未着床遺伝子のスクリーニング、単一細胞研究、血中循環腫瘍細胞の分析、微細針吸引生検、バフィーコート、および羊膜細胞の分析に用いることが可能である。これらの用途では、開始する核酸物質は通常限られるため、本方法はこれらの用途向け分析を改善することが可能である。コピー数多型分析の他、本方法は、上記用途において最小の細胞集合に存在する単一ヌクレオチド変異体を検出するためにも用いることが可能である。単一ヌクレオチド変異体には、一塩基多型（ＳＮＰ）および点突然変異が含まれる。一塩基多型（ＳＮＰ）はよくある型の遺伝子多型であり、これには、人の集合において、測定可能な頻度（通常１％以上）で別の塩基が２つ以上発生するＤＮＡ位置での多型が含まれる。点突然変異は１％未満の頻度の塩基多型である。一塩基多型（ＳＮＰ）および点突然変異は、ヒト遺伝子の多様性の最も大きな原因を表す。これらの一塩基多型（ＳＮＰ）および点突然変異は通常、ある疾病と関連する遺伝子の近くに位置することから、ヒト遺伝子マップ上の疾病の位置を特定する生物学的マーカーとして機能し得る。従って、一塩基多型（ＳＮＰ）、点突然変異、および同様の突然変異の検出は、臨床活動、人の健康、および遺伝的疾患の制御にとって非常に重要である。本方法はゲノムＤＮＡに対する均一なアクセスという利点を提供し、標的核酸物質を保存するのに役立つ。従って、それは、最小の細胞集合を用いた単一ヌクレオチド多型検出を改善することが可能である。
【０１２１】
上記の種々の方法の一部の実施形態についての記載において、「反応管」または「管」を用いる。他の反応媒体および／または容器も本方法で用いることが可能であることは理解されるべきである。
【０１２２】
タグ化核酸断片ライブラリを調製するためのキット
別の態様では、本開示はタグ化核酸断片ライブラリを調製するキットを提供し、該キットは、（ａ）１つまたは複数のプロテアーゼを有する溶解試薬、および、（ｂ）少なくとも１つのトランスポザーゼと、移動鎖を含む少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを含む転移反応組成物を含む。
【０１２３】
一部の実施形態では、提供する溶解試薬は広範な特異性を有するプロテアーゼを１つのみ含むため、該プロテアーゼは種々のタンパク質およびポリペプチドを消化することが可能である。一部の他の実施形態では、本明細書で提供する溶解試薬は、種々のプロテアーゼの混合物を含み、種々のプロテアーゼの組み合わせは種々のタンパク質およびポリペプチドを消化することが可能である。本明細書で提供する例示的なプロテアーゼには、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、およびメタロプロテアーゼが含まれる。本明細書で用いる例示的なプロテアーゼには、組み換えバチルス株から単離したセリンプロテアーゼが含まれる。本明細書で用いる例示的なプロテアーゼには、サブチリシン、ならびに、サブチリシンカールスバーグ、アルカラーゼ、およびサブチリシンＳ４１などのその変異体が含まれる。サブチリシンおよびその変異体は当業者に既知であり、例えば、アウカラーゼ、アルカラーゼ０．６Ｌ、アルカラーゼ２．５Ｌ、ＡＬＫ−酵素、バシロペプチダーゼＡ、バシロペプチターゼＢ、バシラス・サチリスアルカリ性プロテイナーゼビオプラーゼ、ビオプラーゼＡＬ１５、ビオプラーゼＡＰＬ３０、コリスチナーゼ、サブチリシンＪ、サブチリシンＳ４１、サブチリシンセンダイ、サブチリシンＧＸ、サブチリシンＥ、サブチリシンＢＬ、ゲネナーゼＩ、エスペラーゼ、マキサターゼ、サモアーゼＰＣ１０、プロテアーゼＸＸＶＩＩ、サーモアーゼ、スーパーアーゼ、サブチリシンカールスバーグサブチリシンＤＹ、サブチロペプチダーゼ、ＳＰ２２６、サビナーゼ８．０Ｌ、サビナーゼ４．０Ｔ、カズサーゼ、プロテアーゼＶＩＩＩ、オプティクリーン（登録商標）、プロチンＡ ３Ｌ、サビナーゼ、サビナーゼ１６．０Ｌ、サビナーゼ３２．０Ｌ・ＥＸ、オリエンターゼ１０Ｂ、プロテアーゼＳ、セリンエンドペプチダーゼが含まれる。本明細書に示す方法および組成物の特定の実施形態では、Davail et al., 1994, J. Biol. Chem., 26:17448-17453（これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる）の例示的開示に示されるように、サブチリシンなどの易熱性プロテアーゼおよびサブチリシンの易熱性変異体を用いることが可能である。
【０１２４】
一部の実施形態では、溶解試薬は１つまたは複数の界面活性剤を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する界面活性剤は下流の酵素活性を妨げることはない。したがって、一部の実施形態では、溶解試薬は非イオン性界面活性剤を含む。典型的には、非イオン性界面活性剤は、非電荷で親水性の頭部基を含む。典型的な非イオン性界面活性剤はポリオキシエチレンまたはグリコシドを基盤とする。例示的な非イオン性界面活性剤には、Tween（登録商標）80、Tween（登録商標）20Tween、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-100-R、Triton（登録商標）X-114、NP-40、Genapol（登録商標）C-100、Genapol（登録商標）X-100、Igepal（登録商標）CA 630、Arlasolve（登録商標）200、Brij（登録商標）96/97Triton、Brij（登録商標）98、Brij（登録商標）58、Brij（登録商標）35Brijシリーズ、Pluronic（登録商標）L64、Pluronic（登録商標）P84、非界面活性型スルホベタイン（ＮＤＳＢ２０１）、amphipols（PMAL-C8）、CHAPS、オクチル-β-D-グルコピラノシド、サポニン、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル（C12E9、ポリドセノール（polidocenol））、ドデシル硫酸ナトリウム、N-ラウリルサルコシン、デオキシコール酸ナトリウム、胆汁塩、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、SB3-10、SB3-12、アミドスルホベタイン-14、オクチルチオグルコシド、マルトシド、HEGA、およびMEGAシリーズが含まれる。一部の実施形態では、溶解試薬は表１〜３で提供する成分を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、転移組成物は少なくとも１つのトランスポザーゼと、少なくとも１つのトランスポゾン末端組成物とを含み、該トランスポゾン末端組成物は（ｉ）移動トランスポゾン末端配列を示す3'-部分、および、次世代シークエンシングまたは増幅反応で用いるためのタグドメイン向け配列を示す5'-部分を有する移動鎖と、（ｉｉ）非移動トランスポゾン末端配列のみを示す5'-ホスフェート含有非移動鎖とを含み、ここで前記トランスポザーゼは、トランスポゾン末端配列とともにin vitro転移反応で活性な複合体を形成する。一部の実施形態では、キットはさらに、in vitro転移反応において最終濃度が１０％になる量のジメチルホルムアミドを含む反応バッファを含む。一部の実施形態では、タグドメインには1つまたは複数の制限部位ドメイン、捕捉タグドメイン、シークエンシングタグドメイン、増幅タグドメイン、検出タグドメイン、およびアドレスタグドメインが含まれる。
【０１２６】
一部の実施形態では、転移反応組成物は、2つ以上のトランスポゾン末端組成物を含み、該2つ以上のトランスポゾン末端組成物はそれぞれ、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる移動鎖を含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、トランスポザーゼはＴｎ５トランスポザーゼである。一部の実施形態では、トランスポゾン末端組成物はＴｎ５トランスポゾン末端を含む。キットの一実施形態では、トランスポソームは、in vitro転移反応におけるトランスポソームの最終濃度が少なくとも２５０ｎＭとなる濃度で提供される、野生型または高活性のＴｎ５トランスポザーゼまたはＭｕＡトランスポザーゼを含む。一部の他の実施形態では、野生型または高活性のＴｎ５トランスポザーゼまたはＭｕＡトランスポソームの最終濃度は少なくとも５００ｎＭである。
【０１２８】
一実施形態では、キットのトランスポザーゼは、１マイクロリットル当たり約５ユニット以上、１マイクロリットル当たり約１０〜２０ユニット以上、１マイクロリットル当たり約２０〜４０ユニット以上、１マイクロリットル当たり約４０〜６０ユニット以上、１マイクロリットル当たり約６０〜８０ユニット以上、または１マイクロリットル当たり約８０〜１００ユニット以上の濃度の、野生型または突然変異形のＴｎ５トランスポザーゼ（例えば、ＥＺ−Ｔｎ5（商標）トランスポザーゼ）である。一部の実施形態では、本明細書で提供するキットは表６で提供する成分を含む。
【０１２９】
一部の実施形態において、キットは修飾酵素を追加で含む。一部の実施形態において、該修飾酵素はポリメラーゼまたはリガーゼである。一部の実施形態において、キットは、5'ヌクレアーゼ活性または鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ活性を欠いたＤＮＡポリメラーゼ、鋳型依存性ＮＡＤリガーゼ、および鋳型非依存性リガーゼから選択される、少なくとも１つの他の酵素成分を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの他の酵素成分を、ＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＤＮＡポリメラーゼミックス、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆＩＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡリガーゼ、バクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ Ｒｎ １耐熱性ＲＮＡリガーゼ、およびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）耐熱性ｓｓＤＮＡリガーゼから選択する。
【０１３０】
キット中の少なくとも１つの酵素が鋳型依存性リガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ）である一部の実施形態では、高比率のリガーゼ分子がアデニル化され、ＡＴＰはキットで提供されない。キット中の少なくとも１つの酵素が鋳型依存性リガーゼ（例えば、大腸菌ＤＮＡリガーゼ）である一部の実施形態では、キットは、3'-部分と5'-部分とを含むライゲーションタグ付けオリゴヌクレオチドであって、前記3'-部分はタグドメイン配列を示し、前記5'-部分は約３〜約８個のヌクレオチドからなるランダムな配列を示す、ライゲーションタグ付けオリゴヌクレオチドを追加で含む。一部の実施形態では、ライゲーションタグ付けオリゴヌクレオチドは、４個のヌクレオチドからなるランダムな配列を示す5'-部分を含む。
【０１３１】
キット中の少なくとも１つの酵素が、バクテリオファージＴＳ２１２６耐熱性ＲＮＡリガーゼ、Ｍｔｈ Ｒｎ１耐熱性ＲＮＡリガーゼ、およびＣＩＲＣＬＩＧＡＳＥ（商標）耐熱性ｓｓＤＮＡリガーゼから選択した鋳型非依存性リガーゼである一部の実施形態では、該鋳型非依存性リガーゼは高アデニル化形態で提供され、ＡＴＰはキットで提供されない。ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼおよび鋳型非依存性核酸リガーゼを含むキットの一実施形態では、ＥＺ−Ｔｎ５ｐＭＥＤＳトランスポゾン末端組成物は、5'-モノリン酸基を有するＥＺ−Ｔｎ５ＭＥＴＳ移動鎖および5'-モノリン酸基を有するＥＺ−Ｔｎ５ｐＭＥＮＴＳの両方を含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、キットは増幅反応用試薬をさらに含む。一部の実施形態では、増幅反応用試薬はＰＣＲ用試薬である。一部の実施形態では、増幅反応用試薬は少なくとも１つのプライマーを含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプライマーは、移動鎖の少なくとも一部分の配列を示す3’部分を含む。一部の実施形態では、前記少なくとも１つのプライマーは、ユニバーサル配列を含む5’部分を含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、キットは２つのプライマーを含み、各ＰＣＲプライマーは3'-部分と5'-部分を含み、前記3'-は各移動ランスポゾン末端配列を示し、前記5'-部分は特定の目的のための各タグドメイ／アダプター（例えば、次世代シークエンシングまたは増幅用の、シークエンシングタグドメインまたは増幅タグドメイン、およびオプションとしてアドレスタグドメイン）を示す。一部の実施形態では、各ＰＣＲプライマーの5'-部分はもう一方のプライマーのそれとは異なる。一部の実施形態では、第１ＰＣＲプライマーの5'-部分もしくは第２ＰＣＲプライマーの5'-部分、または、第１ＰＣＲプライマーおよび第２ＰＣＲプライマー両方の5'-部分は、それぞれ、第１または第２のシークエンシングタグ／アダプターを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供するキットは、表７で提供する成分を含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、キットはさらに、サイズ選択試薬を含む。一部の実施形態では、サイズ選択試薬は（Beckman Coulter Genomics社による）ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを含む。核酸断片はＳＰＲＩ（solid-phase reversible immobilization）ビーズに結合することが可能である。一部の実施形態では、サイズ選択試薬はさらにＰＥＧおよびＮａＣｌを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、本明細書で提供するキットはさらにライブラリ正規化試薬を含む。一部の実施形態においてライブラリ正規化試薬は、Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）により提供されるライブラリ正規化添加物（Library Normalization Additives）（Part No. 15025391）と、Illumina社により提供されるライブラリ正規化ビーズ（Library Normalization Beads）（Part No.15022566）を含む。一部の実施形態において、ライブラリ正規化試薬はさらにIllumina社により提供されるライブラリ正規化洗浄剤（Library Normalization Wash）（Part No. 15022565）を含む。一部の実施形態では、ライブラリ正規化試薬はさらに、Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）により提供されるライブラリ正規化保存バッファ（Part No.15025139）を含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、キットはさらに、固体表面を有する装置を含む。一部の実施形態では、固体表面にはオリゴヌクレオチドの集合が連結している。一部の実施形態において、装置はフローセル装置である。一部の実施形態において、固体表面は、分子を規則正しいパターンで固定するのに適したパターン付き表面を含む。
【０１３７】
上記の記載から、変形および修飾を本明細書に記載の発明に対して施して、それを種々の用法および条件に採用することが可能であることが明白であろう。このような実施形態もまた、以下の請求項の範囲内にある。
【０１３８】
本明細書の変数の任意の定義における要素の列記の記載は、列記された要素のうち任意の単一の要素または組み合わせ（もしくはサブコンビネーション（subcombination））としてその変数の定義を含む。本明細書の実施形態の記載は、任意の単一の実施形態として、または、任意の他の実施形態もしくはその一部との組み合わせにおいて、該実施形態を含む。
【０１３９】
本明細書で言及した全ての特許および刊行物は、各個別の特許および刊行物が参照により組み込まれることを具体的および個別に意味するのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
以下の例を限定ではなく実例として提供する。
【実施例】
【０１４１】
（実施例１）
標的核酸を含む細胞溶解物の生成
一部の実施形態では、細胞溶解物を生成するステップの間、細胞膜を界面活性剤により破壊し、この間にタンパク質−脂質会合および脂質−脂質会合を壊すことにより可溶形の細胞内物質を解放する。広範な特性を有するプロテアーゼの主な機能は、ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質をＤＮＡから取り除き、トランスポザーゼがＤＮＡに均一にアクセスできるようにすることである。一部の実施形態では、本例に示すように、提供する界面活性剤とプロテアーゼは単一の溶解試薬混合物中にある。該混合物は、標的核酸を含む細胞溶解物を生成するために、細胞に直接適用する。上記のように、一部の実施形態において、熱を用いてプロテアーゼを不活性化させる場合、熱は二本鎖核酸を変性せず、確実にタグメント化ステップが妨げられないようにすることが重要である。
【０１４２】
この例では、プロテアーゼは７０℃で熱不活性化させることが可能であり、この温度でＤＮＡの二本鎖立体構造は保存される。標的核酸を含む細胞溶解物の生成についてのプロトコルは、以下のように実施例１において説明する。
【０１４３】
（１）管を３〜５回、ゆっくりと逆にして軽くはじき、続いて微量遠心機で短時間回転させたことにより、十分に混ざった試薬。
【０１４４】
クリーンな微量遠心管において、表１の成分を組み合わせて５Ｘの溶解マスター混合物を作る。溶解マスター混合物はサンプル数に従って増やすことが可能であり、例えば、ピペット中の減少を補うために１０％の追加を含めることが可能である。
【０１４５】
【表１】
0006626848.tif 000002
【０１４６】
上記表１中の５Ｘ溶解バッファは、以下の表２に従って調製することが可能である。
【０１４７】
【表２】
0006626848.tif 000003
【０１４８】
全ての試薬は、管を数回ゆっくりとボルテックスし、続いて微量遠心機で短時間回転させることにより、十分に混合することが可能である。このステップは３〜５回繰り返すことが可能である。５Ｘ溶解バッファを室温で保存して、界面活性剤の沈殿を防ぐことが可能である。
【０１４９】
５Ｘプロテアーゼ保存溶液は以下のように調製することが可能である：（ｉ）プロテアーゼ、例えばQIAGEN社のプロテアーゼを、２．３８ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｑ Ｈ２Ｏを最終濃度が３１５０ｍＡＵ／ｍＬになるまで加えることによりガラスバイアル内で直接再懸濁して、使い捨ての保存アリコットを調製する。バイアルを数回ゆっくりとボルテックスすることにより、プロテアーゼを確実に十分に溶解する。溶液を２５μＬのアリコットに等分し、−８０℃で急速凍結させ、（ｉｉ）使い捨て保存アリコットをフリーザーから取り出し解凍し、以下の表３に従って５Ｘプロテアーゼ保存溶液を調製する。
【０１５０】
【表３】
0006626848.tif 000004
【０１５１】
従って、５Ｘプロテアーゼ保存溶液の最終濃度は４５０ｍＡＵ／ｍＬである。
【０１５２】
（３）上記で調製した溶解マスター混合物を２μＬ、細胞、陽性対照ゲノムＤＮＡまたは陰性対照を含む各管に加える。サンプルをサーマルサイクラーにおいて以下のプログラムに従ってインキュベーションする：５０℃３０分、７０℃２０分、および４℃で維持。
【０１５３】
一部の実施形態では、陽性対照ゲノムＤＮＡを各実験に含める（約３０ｐｇ）。陽性対照ゲノムＤＮＡは、以下の表４および５で調製するように、１０ｎｇ／μＬの保存溶液から２ステップの連続希釈で調製することが可能である。
【０１５４】
【表４】
0006626848.tif 000005
【０１５５】
その後、上記表に従って調製した中間ＤＮＡ希釈液を次に、以下の表５に従って希釈することが可能である。
【０１５６】
【表５】
0006626848.tif 000006
【０１５７】
上記表において調製した３μＬの最終希釈液を、陽性対照ゲノムＤＮＡのインプットとして用いることが可能である。これは、３０ｐｇの５細胞またはそのゲノム的同等物に相当する。より多くまたはより少ないゲノムＤＮＡも本明細書に記載の方法に従って用いることが可能である。
【０１５８】
（実施例２）
細胞溶解物における標的核酸の直接的タグメント化
一部の実施形態では、例えば実施例１で調製した細胞溶解物におけるゲノムＤＮＡは、Nexteraトランスポソーム（カリフォルニア州サンディエゴのIllumina社より入手可能）によりタグメント化（タグ化および断片化）することが可能である。NexteraトランスポソームはインプットＤＮＡを同時に断片化し、末端にタグ／アダプター配列を加えることが可能である。タグメンテーションマスター混合物は、任意の事前ＤＮＡ精製ステップまたは増幅ステップなしに、実施例１で調製した細胞溶解物に直接加えることが可能である。タグメンテーションマスター混合物は、以下の表６に示すように調製することが可能であり、マスター混合物はサンプル数に従って増やす、例えば、ピペット中の減少を補うために１０％の追加を含めることが可能である。
【０１５９】
【表６】
0006626848.tif 000007
【０１６０】
タグメンテーションＤＮＡバッファ（Tagmentation DNA Buffer）およびNexteraアンプリコンタグメント混合物（Nextera Amplicon Tagment Mixture）はIllumina社（カリフォルニア州サンディエゴ；Part No.15027866および15031561）より入手可能である。タグメンテーションＤＮＡバッファは、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＭｇＣｌ２、およびジメチルホルムアミドを含む。Nexteraアンプリコンタグメント混合物は、トランスポソーム酵素を含む。１５μＬのタグメンテーションマスター混合物をその後、例えば実施例１により生成したような各細胞溶解物に加え、該細胞溶解物とともに５５℃で５分間、その後４℃でインキュベーションして反応を終わらせることが可能である。その後、ＳＤＳを含む中和タグメントバッファ（カリフォルニア州サンディエゴのIllumina社から入手可能）を管に加えて、室温で５分間インキュベーションすることが可能である。
【０１６１】
（実施例３）
限定サイクルＰＣＲ増幅
例えば実施例２で調製したようなタグメント化ＤＮＡ断片は、限定サイクルＰＣＲプログラムにより増幅することが可能である。このＰＣＲステップはまた、タグ化核酸断片の２つの末端に他の配列を加えることが可能であり、該配列には、例えば、インデックス１（ｉ７）およびインデックス２（カリフォルニア州サンディエゴのIllumina社から入手可能）ならびにクラスタ形成など他の目的に必要な配列が挙げられる。例えば、表７中の以下の成分（カリフォルニア州サンディエゴのIllumina社から入手可能）を、実施例３により生成した中和タグメンテーションに加えることが可能である。
【０１６２】
【表７】
0006626848.tif 000008
【０１６３】
表７中のＰＣＲマスター混合物は以下の表８のように調製することが可能である。
【０１６４】
【表８】
0006626848.tif 000009
【０１６５】
例示的なＰＣＲプログラムは以下である：７２℃で３分、９８℃で３０秒、次に、９８℃１０秒、６０℃３０秒、および７２℃３０秒を２０サイクル、最後に、サンプルを４℃で保持する。
【０１６６】
（実施例４）
プロテアーゼ活性はＤＮＡへの均一なアクセスに有用である
プロテアーゼ活性が持つ、ＤＮＡへの均一なアクセスに対する効果を本例では分析する。特に、０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ（４．５ｍＡＵ／ｍＬ）、０．５ｍｇ／ｍＬ（２２．５ｍＡＵ／ｍＬ）、または２．５ｍｇ／ｍＬ（１１２．５ｍＡＵ／ｍＬ）のプロテアーゼを用いて、全細胞および核を処置する。ユニークにマッピングされたリードの比率を各シークエンシングについて分析する。図１は、０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、または２．５ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼで処置した全細胞または全核を用いたシークエンシングにおける、ユニークにマッピングされたリードの比率を示すヒストグラムである。示すように、ユニークにマッピングされたリードの比率は、プロテアーゼの濃度が上昇するにつれ高くなり、これは、開始物質として全細胞および核の両方を用いても当てはまる。０．５ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼを用いたユニークにマッピングされたリードの比率は、２．５ｍｇ／ｍＬを用いた場合と同様であることも注目される。
【０１６７】
プロテアーゼ活性が持つ、ＤＮＡへの均一なアクセスに対する効果を、Nextera XTライブラリ調製とともにバルクゲノムＤＮＡ対照を用いた場合と、十分なプロテアーゼ活性を有する単一細胞を用いた場合と、不十分なプロテアーゼ活性を有する単一細胞を用いた場合で、カウントおよびコピー数の分析結果を比較することによりさらに分析する。図２は、バルクＤＮＡ、十分なプロテアーゼ活性で処置した単一細胞、および不十分なプロテアーゼ活性で処置した単一細胞を用いた、カウントおよびコピー数分析結果のヒストグラムである。示すように、比較的多量のゲノムＤＮＡを現行のNextera XTライブラリ調製方法とともに用いた場合、図２の上部パネルで示すように、比較的クリーンなコピー数分析結果を低ノイズで得ることが可能である。単一細胞のみをシークエンシングに用いた場合、ノイズは大きく、コピー数分析データは図２の下部パネルで示すようにばらついた分散パターンを示す。驚くべきことに、単一細胞を十分なプロテアーゼ（０．５ｍｇ／ｍＬ）で処置した場合、コピー数分析結果は図２の中央パネルに示すようにバルクゲノムＤＮＡを用いた結果と同等まで回復し、低ノイズのクリーンなデータを示す。これは、ＤＮＡ結合タンパク質が均一に取り除かれることにより、プロテアーゼがトランスポザーゼによりゲノムＤＮＡのアクセス可能性を高めることが可能であることを示す。
【０１６８】
これらの結果は、プロテアーゼ活性がシークエンシングにおいて、ＤＮＡへの均一なアクセスに有用であることを示す。
【０１６９】
（実施例５）
プロテアーゼ濃度の最適化
本例では、本方法で用いるプロテアーゼ濃度を分析する。図３Ａは、０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、または２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼで処置した単一細胞におけるコピー数分析結果のヒストグラムを示す。示すように、単一細胞を０．５ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼで処置する場合、図３Ａの上２つのヒストグラムに示すように、クリーンなコピー数分析結果が同様に得られた。対照的に、７０℃で前加熱不活性化させたプロテアーゼで反応を行った場合、図３Ａの一番下のヒストグラムに示すようにクリーンなコピー数分析結果を得ることはできない。この結果は、０．５ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬの両方の濃度のプロテアーゼが効果的かつ十分であることを示す。
【０１７０】
０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼ、または２ｍｇ／ｍＬの（７０℃で）前加熱不活性化させたプロテアーゼで処置した単一細胞のシークエンシングにおいて、ユニークにマッピングされたリードの比率も分析する。図３Ｂは、０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、または２ｍｇ／ｍＬの前加熱不活性化プロテアーゼで処置した単一細胞、および細胞なしの対照サンプルのシークエンシングにおける、ユニークにマッピングされたリードの比率のヒストグラムを示す。示すように、０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼで処置した単一細胞を用いたシークエンシングにおけるユニークにマッピングされたリードの比率は、わずかなばらつきがありつつ全て約６５％である。対照的に、プロテアーゼを７０℃下で不活性化させた場合、より多くの量のプロテアーゼを用いたとしてもユニークにマッピングされたリードの比率はずっと低く、ばらつきも大きい。
【０１７１】
加えて、コピー数データにおけるノイズを、隣接するビンカウント間のカウント差を分析することにより分析する。図３Ｃは、０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、または２ｍｇ／ｍＬの前加熱不活性化プロテアーゼで処置した単一細胞、および細胞なしの対照サンプルのシークエンシングにおける、隣接するビン間のリードカウント差（隣接するビン間のリードカウント差の四分位区間）のヒストグラムを示す。示すように、０．５ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、１ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼ、および２ｍｇ／ｍＬの活性プロテアーゼで処置した単一細胞を用いたシークエンシングにおける隣接するビンカウントのカウント差は全て相対的に小さく（約２０％）、ばらつきも小さい。対照的に、プロテアーゼを７０℃下で不活性化させた場合、より多くの量のプロテアーゼ（２ｍｇ／ｍＬ）を用いたとしても、隣接するビンカウント間のカウント差はずっと大きく、ばらつきも大きい。
【０１７２】
まとめると、これらの結果は、０．５ｍｇ／ｍＬ〜２．０ｍｇ／ｍＬ（２２．５ｍＡＵ／ｍＬ〜９０ｍＡＵ／ｍＬ）の範囲の濃度のプロテアーゼが、本明細書で提供する方法で十分かつ効率的であることを示す。
【０１７３】
（実施例６）
プロテアーゼ消化反応のｐＨ条件の最適化
本例では、プロテアーゼ消化反応のｐＨ条件を最適化し、プロテアーゼ活性とシークエンシング結果のバランスをとる。
【０１７４】
プロテアーゼ活性を異なるｐＨ条件下で分析する。結果を図４Ａに示す。図４Ａは、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ８．５、ｐＨ９．０、またはｐＨ１０．０でのプロテアーゼの（ｐＨ８．０でのプロテアーゼ活性と比較した）比較活性を示すヒストグラムである。示すように、プロテアーゼの活性はｐＨ値が上昇するにつれ高くなり、ｐＨ７．０で活性は最も低く、ｐＨ１０．０で活性は最も高い。
【０１７５】
その後、ユニークにマッピングされたリードの比率を種々のｐＨ条件下で分析する。図４Ｂは、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、またはｐＨ１０．０の下、プロテアーゼで処置した単一細胞のシークエンシングにおける、ユニークにマッピングされたリードの比率のヒストグラムである。示すように、ｐＨが７、８、または９である場合、約７０％のクリーンなユニークにマッピングされたリードを得ることが可能である。しかしながら、ｐＨが１０である場合、得ることが可能なユニークにマッピングされたリードの比率は下がり、データのばらつきは著しく増加する。
【０１７６】
隣接するビン間のカウント差を比較することによりコピー数データにおけるノイズも分析する。図４Ｃは、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０、またはｐＨ１０．０の下、０．５ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼで処置した単一細胞についてのシークエンシングにおける、隣接するビン間のリードカウント差（隣接するビン間のリードカウント差の四分位区間）のヒストグラムを示す。示すように、ユニークにマッピングされたリード結果と一致して、隣接するビン間のカウント差は相対的に小さく（約２０％）、ばらつきも小さい一方、ｐＨ１０．０では隣接するビン間のカウント数は著しく大きく、ばらつきも大きい。
【０１７７】
一部の実施形態では、消化反応のｐＨ値はｐＨ７．０〜ｐＨ９．０の間である。
【０１７８】
（実施例７）
プロテアーゼの熱不活性化のテスト
一部の実施形態では、本明細書で提供するプロテアーゼを熱不活性化させることが可能である。上記で論じたように、調製した実施形態では、プロテアーゼを比較的低温下（例えば、７０℃）で不活性化させることが可能であり、その結果、二本鎖ＤＮＡ立体構造をタグメンテーション反応のために保存することが可能である。本例では、（QIAGEN社からの）プロテアーゼを、熱不活性化およびシークエンシング結果に対するその影響について分析する。
【０１７９】
プロテアーゼは異なる温度で前加熱し、該プロテアーゼの活性をテストした。結果を図５Ａに示し、これは、室温、５０℃、６０℃、または７０℃で前加熱した場合の比較プロテアーゼ活性についてのヒストグラムを示す。示すように、プロテアーゼ活性は温度が上昇するにつれ次第に低減し、７０℃で完全に不活性化させる。この結果は上記の実施例５で示した結果と一致する。
【０１８０】
単一細胞、３細胞、および１５ｐｇのゲノムＤＮＡを種々の温度でシークエンシングした際の、ユニークにマッピングされたリードの比率を分析する。図５Ｂは、室温、５０℃、６０℃、または７０℃において２．０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼで処置した単一細胞、３細胞、および１５ｐｇのゲノムＤＮＡのシークエンシングにおける、ユニークにマッピングされたリードの比率についてのヒストグラムを示す。示すように、ユニークにマッピングされたリードの比率は温度が上昇するにつれ低下する。しかしながら、実験では相対的により高い濃度のプロテアーゼ（２．０ｍｇ／ｍＬ）を用いることから、７０℃で低減したプロテアーゼ活性での許容範囲はより大きい。したがって、７０℃においてユニークにマッピングされたリードの比率は、より低い温度で処置したものよりは小さいものの、まだ相対的に高い。
【０１８１】
単一細胞、３細胞、および１５ｐｇのゲノムＤＮＡを種々の温度でシークエンシングした際の、隣接するビン間のカウント差も分析する。図５Ｃは、室温、５０℃、６０℃、または７０℃において２．０ｍｇ／ｍＬのプロテアーゼで処置した単一細胞、３細胞、および１５ｐｇのゲノムＤＮＡについてのシークエンシングにおける、隣接するビン間のリードカウント差（隣接するビン間のリードカウント差の四分位区間）についてのヒストグラムを示す。示すように、より低温（例えば、室温および５０〜６０℃）では隣接するビン間のカウント差は比較的小さく、ばらつきも小さい一方、７０℃では、隣接するビン間のカウント差は著しく大きく、ばらつきもより大きい。
【０１８２】
（実施例８）
ライブラリの多様性は挿入サイズが小さくなるにつれ増加する
単一細胞シークエンシングではゲノムのコピーが２つあるのみであることから、より小さい挿入サイズはライブラリ多様性を増す傾向がある。図６Ａに示すように、カウントひいてはライブラリにより代表される多様性は、挿入サイズが小さくなるにつれ増す。そのため、一部の実施形態では、本明細書の方法はより多量のトランスポザーゼをタグメンテーションステップにおいて用いて断片化を強化し、タグ化核酸断片の挿入サイズを小さくする。図６Ｂは、１μＬのＴｎ５または２μＬのＴｎ５で処置したライブラリの挿入サイズを示す。示すように、１μＬのＴｎ５をタグメント化反応で用いた場合、平均断片サイズは約５５０ｂｐである一方、２μＬのＴｎ５をタグメント化反応で用いた場合、平均断片サイズは約４００ｂｐである。図６Ｃに示すように、より小さい挿入サイズと一致し、１μＬのＴｎ５で処置したものと比較し２μＬのＴｎ５で処置した場合にライブラリの多様性は向上する。
【０１８３】
（実施例９）
ＰＣＲサイクルの最適化
最小の細胞集合を用いるシークエンシングにおいて、インプットＤＮＡは相対的に小さいため、ＰＣＲのサイクル数を調整してより良好なシークエンシング結果を得ることが可能である。本例では、開始物質として単一細胞を使用して、ＰＣＲのサイクル数をテストし、最適化する。図７は、１６サイクル、１８サイクル、または２０サイクルのＰＣＲを用い、本明細書で提供する方法に従った単一細胞のシークエンシングにおけるカウントおよびコピー数についての分析結果のヒストグラムを示す。示すように、１６サイクルのＰＣＲを用いた場合ノイズは大きく、１８サイクルまたは２０サイクルのＰＣＲを用いた場合ノイズは著しく減少する。
【０１８４】
（実施例１０）
１細胞、３細胞、または５細胞を用いたリード分布
１細胞、３細胞、または５細胞を用いたリード分布を本例では分析する。図８Ａは、単一細胞シークエンシングのリード分布を３つ示す。示すように、リード領域は３つの単一細胞シークエンシング間で完全に重複しているわけではない。そのため、細胞数の増加はより広いカバレッジに役立ち得る。図８Ｂは単一細胞のシークエンシング、３細胞のシークエンシング、または５細胞のシークエンシングのリード分布を示す。示すように、細胞数が増えるにつれゲノムカバレッジは拡大する。図８Ｃは、１細胞、３細胞、または５細胞を用いた平均的なライブラリの多様性および推定ゲノムカバレッジのヒストグラムを示す。示すように、１細胞は約４０％のゲノムをカバーすることが可能であり、３細胞は５０％超のゲノムをカバーすることが可能であり、５細胞は約６０％のゲノムをカバーすることが可能である。１細胞、３細胞、および５細胞を用いた平均ライブラリ数は、それぞれ約５００万、１５００万、および２０００万である。
【０１８５】
図８Ｄは、全体の成功率を示す。示すように、１個超の細胞を用いる場合、全体の成功率は９９％（Ｎ＝８１）である。単一細胞を用いる場合、全体の成功率も比較的高く、９４％（Ｎ＝１８７）である。
【０１８６】
（実施例１１）
異なるライブラリ調製方法間でのカウントおよびコピー数のデータ比較
本例では、本明細書で提供する方法を、いくつかの現行の単一細胞調製方法と比較する。
【０１８７】
図９Ａは、Nexteral XT Library PrepとともにREPLIg Single Cell（ＭＤＡ）を用いたコピー数分析を示す。QIAGEN社が開発したREPLIg Single Cell Kitは、単一細胞（１〜＜１０００細胞）に由来するゲノムＤＮＡまたはゲノムカバレッジを有する精製ゲノムＤＮＡを増幅するために特異的に設計されている。QIAGEN社により開発されたREPLIg Single Cell Kitは、ＭＤＡ（Multiple Displacement Amplification）技術を用いる。Spits et al., 2006, Whole-genome multiple displacement amplification from single cells, Nature protocols 1 (4): 1965-70を参照のこと。しかしながら、図９Ａに示すように、コピー数多型データを単一細胞、３細胞、または５細胞より得た場合、該データはＭＤＡにより生じる過増幅のため非常にノイズが多い
【０１８８】
図９Ｂは、Nexteral XT Library PrepとともにSurePlex（PicoPlex）を用いたコピー数分析を示す。Illumina社（カリフォルニア州サンディエゴ）が開発したSurePlex Amplification Systemは、単一細胞または数個の単一細胞からＤＮＡを抽出し、増幅するための一つの解である。示すように、SurePlex Amplification SystemはＭＤＡと比較し著しくノイズを減少させる。
【０１８９】
図９Ｃは、本明細書で提供する方法（Nextera SC）を用いたコピー数分析を示す。示すように、SurePlex Amplification Systemを用いた場合と比較し、ノイズはさらに減少する。
【０１９０】
実施例１２．モザイク現象の検出
本例では、本明細書で提供する、モザイク現象を検出するための方法の使用を例証する。図１０Ａは、単一ＧＭ５０１２１細胞を用いた１８番染色体のコピー数分析データを示す。３つの単一細胞シークエンシングからのコピー数データを示す。１５．４ＭＢのＤＮＡを表す集合を、各単一細胞シークエンシングにおいて検出する。図１０Ｂは、単一ＧＭ２０９１６細胞を用いたカウント数データを示す。示すように、矢印はモザイク現象から生じたカウントを示す。図１０Ｃは、単一ＧＭ２０９１６細胞を用いた、１５番染色体、Ｘ染色体、および１０番染色体についてのコピー数分析データを示す。分析した各染色体についてのコピー数データは、別の染色体を表す追加の集合を検出する。同様に図１０Ｄは、単一ＧＭ１０２３９細胞を用いた、１番および１１番の染色体についてのコピー数分析データを示す。これらの図で示すように、図１０Ｄで分析した各染色体についてのコピー数データも、別の染色体を表す追加の集合を検出する。
【０１９１】
多くの実施形態を記載してきた。しかしながら、種々の変更を行うことができることが理解されよう。従って、他の実施形態も以下の請求項の範囲内にある。
【図１】
0006626848.tif 000010
【図２】
0006626848.tif 000011
【図３Ａ】
0006626848.tif 000012
【図３Ｂ】
0006626848.tif 000013
【図３Ｃ】
0006626848.tif 000014
【図４Ａ】
0006626848.tif 000015
【図４Ｂ】
0006626848.tif 000016
【図４Ｃ】
0006626848.tif 000017
【図５Ａ】
0006626848.tif 000018
【図５Ｂ】
0006626848.tif 000019
【図５Ｃ】
0006626848.tif 000020
【図６Ａ】
0006626848.tif 000021
【図６Ｂ】
0006626848.tif 000022
【図６Ｃ】
0006626848.tif 000023
【図７】
0006626848.tif 000024
【図８Ａ】
0006626848.tif 000025
【図８Ｂ】
0006626848.tif 000026
【図８Ｃ】
0006626848.tif 000027
【図８Ｄ】
0006626848.tif 000028
【図９Ａ】
0006626848.tif 000029
【図９Ｂ】
0006626848.tif 000030
【図９Ｃ】
0006626848.tif 000031
【図１０Ａ】
0006626848.tif 000032
【図１０Ｂ】
0006626848.tif 000033
【図１０Ｃ】
0006626848.tif 000034
【図１０Ｄ】
0006626848.tif 000035
【配列表】
0006626848000001.app