(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳がん腫瘍中のＨＥＲ２不均質性を評価することによりＨＥＲ２指向性療法に対する応答性を予測するための方法であって、
・  ＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する抗体と腫瘍の試料を接触させ、試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出すること、
・  ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと腫瘍の試料を接触させ、試料中のＨＥＲ２遺伝子増幅状態を検出すること、
・  ＨＥＲ２タンパク質（ＩＨＣ）及びＨＥＲ２遺伝子（ＤＩＳＨ）を、以下のように分類されるスコアにスコア化すること：
Ｏ  ＩＨＣ３＋かつＤＩＳＨ＋を示す試料についてはＡ群
Ｏ  ＩＨＣ３＋かつＤＩＳＨ−を示す試料についてはＢ群
Ｏ  ＩＨＣ２＋かつＤＩＳＨ＋を示す試料についてはＣ群
Ｏ  ＩＨＣ２＋かつＤＩＳＨ−を示す試料についてはＤ群
Ｏ  ＩＨＣ０、１＋かつＤＩＳＨ＋を示す試料についてはＥ群、及び
Ｏ  ＩＨＣ０、１＋かつＤＩＳＨ−を示す試料についてはＦ群
・  腫瘍がＦ群である第一のスコアを有する第一の病巣及びＡ群からＥ群より選択された第二のスコアを有する第二の病巣を示す場合、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測すること
を含む、方法。
【請求項２】
エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）について腫瘍の第二の試料をアッセイすることをさらに含む方法であって、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
・  エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と腫瘍の試料を接触させ、試料中のＥＲタンパク質を検出すること
・  プロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と腫瘍の試料を接触させ、試料中のＰＲタンパク質を検出すること
をさらに含む方法であって、
ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＨＥＲ２指向性療法がトラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、ネラチニブ、及びラパチニブからなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
乳がん腫瘍試料をスコア化する方法であって、
・  ＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する抗体と腫瘍試料を接触させ、試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出すること、
・  ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと腫瘍試料を接触させ、試料中のＨＥＲ２遺伝子増幅状態を検出すること、
・  ＨＥＲ２タンパク質（ＩＨＣ）及びＨＥＲ２遺伝子（ＤＩＳＨ）を以下のように分類されるスコアにスコア化し：
Ｏ  ＩＨＣ３＋かつＤＩＳＨ＋を示す試料についてはＡ群
Ｏ  ＩＨＣ３＋かつＤＩＳＨ−を示す試料についてはＢ群
Ｏ  ＩＨＣ２＋かつＤＩＳＨ＋を示す試料についてはＣ群
Ｏ  ＩＨＣ２＋かつＤＩＳＨ−を示す試料についてはＤ群
Ｏ  ＩＨＣ０、１＋かつＤＩＳＨ＋を示す試料についてはＥ群、及び
Ｏ  ＩＨＣ０、１＋かつＤＩＳＨ−を示す試料についてはＦ群
・  腫瘍がＦ群である第一のスコアを有する第一の病巣及びＡ群からＥ群より選択された第二のスコアを有する第二の病巣を示す場合、腫瘍試料を不均質としてスコア化すること
を含む、方法。
【請求項６】
腫瘍試料が不均質であるとスコア化される場合、５より高いハザード比を予測することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）について腫瘍の第二の試料をアッセイすることをさらに含む方法であって、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される、請求項に５に記載の方法。
【請求項８】
・  エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と腫瘍の試料を接触させ、試料中のＥＲタンパク質を検出すること、
・  プロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と腫瘍の試料を接触させ、試料中のＰＲタンパク質を検出すること
をさらに含む方法であって、
ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される、請求項に５に記載の方法。
【請求項９】
試料が不均質としてスコア化される場合、非不均質スコアと比較して有意に劣る生存スコア（ＲＦＳ：Ｐ＝０．０１７６；ＣＳＳ：Ｐ＝０．０１９９）を予測することをさらに含む、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、組織の不均質性を測定し、それを乳がんの診断及び治療における予後及び予測ツールとして使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳がんは世界中のすべてのがんの約２３％を占め、毎年何十万人もの死亡原因となっている。乳がんは、異なる治療に対する応答が異なり、患者ごとに適切な治療レジメンを選択することが重要である。受容体状態は、乳がん患者のための治療を選択するために使用される一般的な分類システムである。乳腺腫瘍は、エストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２としても知られている）タンパク質、及び／又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質を有する（陽性である）か、又は欠く（陰性である）。乳腺腫瘍はまた、ＨＥＲ２陽性か陰性かのもう一つの尺度として、ＨＥＲ２遺伝子増幅についても常套的にスクリーニングされる。いくつかの乳腺腫瘍は、三つすべてのマーカーについて陰性であり、「トリプルネガティブ」腫瘍と呼ばれる。
【０００３】
ＨＥＲ２陽性腫瘍はトラスツズマブ又はラパチニブなどのＨＥＲ２標的治療薬で治療されるが、エストロゲン受容体（ＥＲ）及び／又はプロゲステロン受容体（ＰＲ）陽性腫瘍は、通常はホルモン遮断療法（タモキシフェンなど）で治療される。現行の乳がん分類及び標的治療の方法は患者転帰を改善しているものの、多くのＨＥＲ２陽性腫瘍は、ＨＥＲ２標的療法に応答しないか又はＨＥＲ２標的療法に対する耐性を獲得する。現行のＨＥＲ２スクリーニング法は、一部には腫瘍の不均質性のために、偽陽性の結果を生じ得る。したがって、乳腺腫瘍を迅速かつ正確に分類し、臨床で適切な療法を選択するために、現行の分子スクリーニング法を改善する必要が依然としてある。
【０００４】
ＨＥＲ２（ＨＥＲ２遺伝子増幅又はＨＥＲ２タンパク質過剰発現のいずれか単独）のスコアリングは、ＨＥＲ２標的療法のガイドとして使用されている。これらのアッセイは乳がん患者に非常に有益であるが、療法に対する患者の応答をさらに層別化又は予測することができる新たなアッセイが絶えず求められている。
【発明の概要】
【０００５】
例示的な実施態様では、腫瘍におけるＨＥＲ２不均質性を評価することによるＨＥＲ２指向性療法に対する応答性を予測する方法が提供され、該方法は腫瘍の試料をＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させて試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出すること、腫瘍の試料をＨＥＲ２ゲノムＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと接触させて試料中のＨＥＲ２遺伝子増幅状態を検出すること、並びにＨＥＲ２タンパク質（ＩＨＣ）及びＨＥＲ２遺伝子（ＤＩＳＨ）をスコアリングすること含む。スコアリングは次のように分類される：ＩＨＣ３＋及びＤＩＳＨ＋を示す試料はＡ群、ＩＨＣ３＋及びＤＩＳＨ−を示す試料はＢ群、ＩＨＣ２＋及びＤＩＳＨ＋を示す試料はＣ群、ＩＨＣ２＋及びＤＩＳＨ−を示す試料はＤ群、ＩＨＣ０，１＋及びＤＩＳＨ＋を示す試料はＥ群、ＩＨＣ０，１＋及びＤＩＳＨ−を示す試料はＦ群。この方法は、腫瘍がＡ群からＦ群より選択される第一のスコアを有する第一の病巣及びＡ群からＦ群より選択される第二のスコアを有する第二の病巣を示す場合（ここで第一のスコアと第二のスコアは同じではない）、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測することをさらに含む。一実施態様では、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測する工程は、第一のスコアがＦ群であり、かつ第二のスコアがＡ群からＥ群より選択される場合に、腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測することを含む。腫瘍は、第一のスコアがＦ群であり、かつ第二のスコアがＡ群からＥ群より選択される場合に、ＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される。
【０００６】
別の実施態様では、本方法は、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）について腫瘍の第二の試料をアッセイすることをさらに含み、ここで腫瘍がＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測する工程は、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、腫瘍はＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測することを含む。言い換えれば、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がＴＮＢＣであると理解される場合でも、腫瘍はＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される。さらに別の実施態様では、この方法は、腫瘍の試料をエストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させて試料中のＥＲタンパク質を検出し、腫瘍の試料をプロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させて試料中のＰＲタンパク質を検出することをさらに含む。本方法は、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、腫瘍はＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測することをさらに含む。別の実施態様において、ＨＥＲ−２指向性療法は、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、ペルツズマブ、ネラチニブ、及びラパチニブからなる群より選択される。
【０００７】
例示的な実施態様では、腫瘍試料をスコアリングする方法が提供され、該方法は腫瘍試料をＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させて試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出すること、腫瘍試料をＨＥＲ２ゲノムＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと接触させて試料中のＨＥＲ２遺伝子増幅状態を検出すること、前述のＡ〜Ｆ群に従ってＨＥＲ２タンパク質（ＩＨＣ）及びＨＥＲ２遺伝子（ＤＩＳＨ）をスコアリングすること含む。この方法は、腫瘍がＡ群からＦ群より選択される第一のスコアを有する第一の病巣及びＡ群からＦ群より選択される第二のスコアを有する第二の病巣を示す場合（ここで第一のスコアと第二のスコアは同じではない）、腫瘍試料を不均質としてスコア化することをさらに含む。一実施態様において、腫瘍試料を不均質としてスコア化する工程は、第一のスコアがＦ群であり、かつ第二のスコアがＡ群からＥ群のうちの一つである場合に、該試料を不均質としてスコア化することを含む。腫瘍試料は、第一のスコアがＦ群であり、かつ第二のスコアがＡ群からＥ群のうちの一つである場合に、不均質としてスコア化される。
【０００８】
別の実施態様では、本方法は、試料が不均質であるとしてスコア化される場合、５より高いハザード比を予測することをさらに含む。さらに別の実施態様では、本方法は、エストロゲン受容体（ＥＲ）及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）について腫瘍の第二の試料をアッセイすることをさらに含み、ここで腫瘍は、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、ＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される。さらに別の実施態様では、この方法は、腫瘍の試料をエストロゲン受容体（ＥＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させて試料中のＥＲタンパク質を検出すること；腫瘍の試料をプロゲステロン受容体（ＰＲ）タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させて試料中のＰＲタンパク質を検出することを含み、ここで腫瘍は、ＥＲ及びＰＲが陰性で、腫瘍がトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）であると理解される場合、ＨＥＲ２指向性療法に応答性であると予測される。一実施態様では、この方法は、試料が不均質としてスコア化される場合、非不均質スコアと比較して有意に劣る（ＲＦＳ：Ｐ＝０．０１７６；ＣＳＳ：Ｐ＝０．０１９９）生存スコアを予測することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
次の図面はカラーで提出されている。
【図１Ａ−Ｂ】ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色）、及びＥＲタンパク質（赤色）について染色された乳腺腫瘍組織試料の、４倍拡大（図１Ａ）と６０倍拡大（図１Ｂ）の対画像である。この試料は、ＨＥＲ２遺伝子増幅、ＨＥＲ２タンパク質陽性、かつＥＲタンパク質陽性である。しかし、いくつかの細胞（丸で囲んだもの）は、ＥＲタンパク質陽性で、かつＨＥＲ２遺伝子増幅を有するが、ＨＥＲ２タンパク質については陰性である。
【図２Ａ−Ｂ】ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色）、及びＥＲタンパク質（赤色）について染色された乳腺腫瘍組織試料の、４倍拡大（図２Ａ）と６０倍拡大（図２Ｂ）の対画像である。この試料は、ＨＥＲ２遺伝子を増幅していて、ＥＲタンパク質陽性であるが、かすかな又はぼやけた褐色染色で明らかなように、ＨＥＲ２タンパク質陰性である。
【図３Ａ−Ｂ】ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色）、及びＥＲタンパク質（赤色）について染色された乳腺腫瘍組織試料の、４倍拡大（図３Ａ）及び６０倍拡大（図３Ｂ）対画像である。この試料は、ＨＥＲ２遺伝子増幅を示し、ＥＲタンパク質陽性であるが、赤色染色がないことで明らかなように、ＥＲ陰性である。図３の赤色染色は、試料中の正常な乳腺細胞におけるＥＲタンパク質染色である。
【図４Ａ−Ｃ】乳房組織試料中の、ｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ染色（図４Ａ）又はＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ染色（図４Ｂ）でのＥＲタンパク質ＩＨＣ、並びにＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ染色（図４Ｃ）でのＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質ＩＨＣ／ＩＳＨを示す、２０倍拡大の一連画像である。
【図５Ａ−Ｃ】乳房組織試料中の、ｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ染色（図５Ａ）又はＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ染色（図５Ｂ）でのＫｉ６７タンパク質ＩＨＣ、並びにＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＨＣ染色（図５Ｃ）でのＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質ＩＨＣ／ＩＳＨを示す、２０倍拡大の一連画像である。
【図６】乳房組織試料中のＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色）、及びＫｉ６７（赤色）の例示的な検出の画像である。
【図７Ａ−Ｄ】乳房組織試料中の、ＨＥＲ２タンパク質（褐色染色）、ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、及びＫｉ６７タンパク質（赤色染色）（図７Ａ及びＣ）又はＨＥＲ２タンパク質（褐色染色）、ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、及びＥＲタンパク質（赤色染色）（図７Ｂ及びＤ）の、２０倍拡大（図７Ａ及びＢ）又は６０倍拡大（図７Ｃ及びＤ）の一連画像である。
【図８Ａ−Ｃ】ＨＥＲ２不明瞭乳房組織試料中の、ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色染色）、及びＥＲタンパク質（赤色染色）を示す一連画像である。図８Ｂは、１０倍拡大の試料を示す。図８Ｂの四角で囲われている赤色の領域は、図８Ａで６０倍拡大で示されており、図８Ｂの四角で囲われている青色の領域は、図８Ｃで６０倍拡大で示されている。
【図９Ａ−Ｃ】ＨＥＲ２陽性乳房組織試料中の、ＨＥＲ２遺伝子（黒色点）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色染色）、及びＥＲタンパク質（赤色染色）を示す一連の画像である。図９Ｂは、１０倍拡大の試料を示す。図９Ｂの四角で囲われている赤色の領域は、図９Ａで６０倍拡大で示されており、図９Ｂの四角で囲われている青色の領域は、図９Ｃで６０倍拡大で示されている。
【図１０Ａ−Ｂ】例示的なＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性乳房組織試料におけるＨＥＲ２タンパク質（褐色）、ＥＲタンパク質（紫色）、ＨＥＲ２遺伝子（黒いスポット）、及び１７番染色体セントロメアＤＮＡ（赤いスポット）の染色を示す、２０倍拡大（図１０Ａ）と６０倍拡大（図１０Ｂ）の対画像である。
【図１１Ａ−Ｂ】例示的なＨＥＲ２陰性／ＥＲ陽性乳房組織試料におけるＨＥＲ２タンパク質（褐色）、ＥＲタンパク質（紫色）、ＨＥＲ２遺伝子（黒いスポット）、及び１７番染色体セントロメアＤＮＡ（赤いスポット）の染色を示す、２０倍拡大（図１１Ａ）と６０倍拡大（図１１Ｂ）の対画像である。
【図１２Ａ−Ｃ】１２Ａが６８℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１２Ｂが７２℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１２Ｃが７６℃のストリンジェンシー洗浄を用いる子宮頸部異形成症症例の顕微鏡写真３点である。
【図１３Ａ−Ｃ】１３Ａが６８℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１３Ｂが７２℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１３Ｃが７６℃のストリンジェンシー洗浄を用いるＺＲ−７５−１異種移植腫瘍の顕微鏡写真３点を示す。
【図１４Ａ−Ｂ】二重ストリンジェンシー洗浄法を用いるＨＥＲ２遺伝子−タンパク質アッセイの顕微鏡写真であり、図１４ＡはＺＲ−７５−１異種移植腫瘍を示し、図１４Ｂは子宮頸部異形成症症例を示す。
【図１５Ａ−Ｂ】二重ストリンジェンシー洗浄法を用いるＨＥＲ２遺伝子−タンパク質アッセイを示し、図１５Ａは対物レンズ４倍での乳がん腫瘍（breast cancer tumor）を示し、図１５Ｂは対物レンズ１００倍での同症例を示す。
【図１６Ａ−Ｂ】二重ストリンジェンシー洗浄法を用いるＨＥＲ２遺伝子−タンパク質アッセイを示し、図１６Ａは対物レンズ４倍での乳がん腫瘍を示し、図１６Ｂは対物レンズ１００倍での同症例を示す。
【図１７Ａ−Ｂ】遺伝子−タンパク質アッセイにより決定される臨床試験群別の無再発性生存期間（regression free survival）（ＲＦＳ）を示すグラフ（図１７Ａ）及び表（図１７Ｂ）である。
【図１８Ａ−Ｂ】遺伝子−タンパク質アッセイにより決定される臨床試験群別のがん特異的生存期間（cancer-specific survival）（ＣＳＳ）を示すグラフ（図１８Ａ）及び表（図１８Ｂ）である。
【図１９Ａ−Ｂ】臨床試験群での遺伝子タンパク質アッセイ状況における不均質性の影響を示す＜ＲＦＳ＞（図１９Ａ）及び＜ＣＳＳ＞（図１９Ｂ）のグラフである。
【図２０】図１９に示されたデータの亜母集団を示し、該集団は（ＥＲ、ＰＲについて、及びＦ群内で遺伝子タンパク質アッセイについて−ＴＮＢＣ）トリプルネガティブ乳がんであった。
【図２１Ａ−Ｂ】１０倍対物レンズ（図２１Ａ）及び６０倍（図２１Ｂ）の遺伝子−タンパク質アッセイによって染色された典型的な組織の顕微鏡写真であり、がん腫瘍不均質性の生物学的原因に関するエビデンスを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
標準乳腺腫瘍分類は、ＥＲ、ＰＲ、及びＨＥＲ２についての腫瘍状態の決定、並びに腫瘍がＥＲ陽性、ＨＥＲ２陽性又はトリプルネガティブであるかどうかに基づく療法の選択を含む。しかしながら、ＨＥＲ２陽性腫瘍の部分集合がＥＲ陽性であり、そのような腫瘍は抗エストロゲン療法と抗ＨＥＲ２療法との組み合わせに良好に応答する可能性があることが最近になって認められている（例えば、Rimawi et al., J. Clin. Oncol. 14:1726-1731, 2013; Montemurro et al., Ann. Oncol. doi: 10.1093/annonc/mdt287, 2013; Vaz-Luis et al., Ann. Oncol. 24:283-291, 2013）。したがって、ＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性腫瘍の正確な同定がますます重要になってきている。さらに、ＨＥＲ２タンパク質発現とＨＥＲ２遺伝子増幅結果との間の不一致への認識、及びそのような不一致における腫瘍不均質性の関与の可能性への認識が高まってきている（例えばNitta et al., Diagn. Pathol. 7:60, 2012）。したがって、ＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性腫瘍と同様にＨＥＲ２陽性腫瘍を正確に同定するための改善されたアッセイへのニーズが依然として存在する。
【００１１】
組織不均質性（例えば腫瘍不均質性）は、がん診断を混乱させる。不均質組織試料において、複数の単一マーカーの個々の分析結果を集めることは、単一試料での多重化法よりもいくつかの理由で劣る。第一に、多重化は、そのような単一マーカーを不均質に差次的に発現する細胞集団において、複数のマーカーを発現する試料内の細胞を同定することを可能にする。例えば、細胞集団全域でマーカーＡ及びＢを不均質に発現する試料に対する二つの単一マーカーアッセイは、両方のマーカーに関し、両方のマーカーについて陽性及び陰性の細胞が存在することを立証するであろう。二つの単一マーカーアッセイは、陽性及び陰性が細胞内で重なる範囲は示さないであろう。このように、細胞が不均質である範囲は、知ることができない。単一マーカーアッセイを使用して、細胞が両方のマーカーについて陰性である範囲、単一のマーカーについて陽性である範囲、又は両方のマーカーについて陽性である範囲は、定量化できない。この利点は二重アッセイフォーマットで実現されるが、より高レベルの多重化の場合に利点が組み合わされる。多重化がそのような明確な利点を提供しない均質な組織においてさえも、多重化は試料の保存などの他の利点を有する。
【００１２】
Ｉ．用語
特に説明がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、開示される発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を持つ。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、「又は」という語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「及び」を含むことが意図される。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」を意味する。したがって、「Ａ又はＢを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「Ａを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」か、又は「Ｂを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」か、又は「Ａ及びＢを含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味する。
【００１３】
本開示の実施態様の実施及び／又は試験のための適切な方法及び材料は、以下に記載される。そのような方法及び材料は、例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書に記載されたものと類似又は同等の他の方法及び材料を使用することもできる。例えば、本開示が関連する技術分野で周知の従来の方法は、様々な一般的及び特定の参考文献、例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (2000年まで増補); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 第4版, Wiley & Sons, 1999; Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990; 及びHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999に記載されている。
【００１４】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照により援用される。矛盾する場合、用語の説明を含めて本明細書が支配する。
【００１５】
開示された技術を実施又は試験するために、本明細書に記載された方法及び材料と類似又は同等のものを使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。材料、方法、及び実施例は例示的なものに過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００１６】
本開示の様々な実施態様の説明を容易にするために、以下の特定の用語の解釈を提供する。
【００１７】
抗体：少なくとも軽鎖又は重鎖の免疫グロブリン可変領域を含み、抗原（ＨＥＲ２タンパク質又はＥＲタンパク質など）のエピトープに特異的に結合するポリペプチド。抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は抗体断片を含む。抗体は、酵素、ハプテン又はフルオロフォアなどの検出可能な標識とコンジュゲートすることができるか、そうでなければそれらで標識化することができる。
【００１８】
検出可能な標識：試料中の標的（タンパク質又は核酸など）の存在及び／又は量を示すシグナル（視覚的、電気的又はその他のシグナルなど）を生成することができる分子又は材料。特異的結合分子（例えば抗体又は核酸プローブ）にコンジュゲートさせる場合、検出可能な標識を使用して、特異的結合分子が向けられている標的の位置を特定し、かつ／又は標的を定量することができる。検出可能な標識は、直接的又は間接的に検出することができ、複数の異なる検出可能な標識を組み合わせて使用して、一又は複数の標的を検出することもできる。例えば、標的に特異的な抗体にコンジュゲートしたハプテンなどの第一の検出可能な標識は、第一の検出可能な標識に特異的に結合する分子にコンジュゲートしている第二の検出可能な標識を使用することにより間接的に検出することができる。さらに、別々に検出することができる複数の検出可能な標識を、異なる標的に特異的に結合する異なる特異的結合分子にコンジュゲートさせて、単一の試料中の複数の標的の検出を提供し得る多重アッセイを提供することができる。
【００１９】
検出可能な標識は、発色性、蛍光性、リン光性、及び／又は発光性の分子、ある物質を別の物質に変換して（例えば無色物質を着色物質に変換するか若しくはその逆により、又は沈殿物を生成させるか、又は試料の濁度を増加させることにより）検出可能なシグナルを提供する触媒（酵素など）、追加の検出可能な標識化抗体コンジュゲートを用いた抗体−ハプテン結合相互作用によって検出できるハプテン、並びに常磁性及び磁気分子又は材料を含む。検出可能な標識の特定の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、Ｂガラクトシダーゼ又はＢグルクロニダーゼ等の酵素；フルオロセイン、発光団、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ染料、レゾルフィン、及びローダミン等のフルオロフォア（蛍光分子の多くの追加例は、オレゴン州ユージーンのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅｓのThe Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesに見出すことができる）；量子ドット等のナノ粒子（それぞれが参照により本明細書に援用される米国特許第６８１５０６４号、第６６８２５９６号、及び第６６４９１３８号）；Ｇｄ３＋のような放射性又は常磁性金属イオンのＤＯＴＡ及びＤＰＴＡキレート等の金属キレート；並びに例えば捕捉蛍光分子を含有するリポソーム等のリポソームを含む。検出可能な標識が酵素を含む場合、色素原、蛍光性化合物又は発光性化合物などの検出可能な基質を酵素と組み合わせて使用し、検出可能なシグナルを生成する（多種多様な該化合物は、例えばカリフォルニア州カールズバッドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから商業的に入手できる）。
【００２０】
あるいは、酵素は金属組織学的検出スキームにおいて使用することができる。いくつかの例において、金属組織学的検出法は、アルカリホスファターゼなどの酵素を、水溶性金属イオン及び酵素の酸化還元不活性基質と組み合わせて使用することを含む。基質は酵素によって酸化還元活性剤に変換され、酸化還元活性剤は金属イオンを還元し、検出可能な沈殿物を形成する（例えば、それぞれが参照により本明細書に援用される米国特許第７６４２０６４号；第７６３２６５２号参照）。他の例では、金属組織学的検出方法は、水溶性金属イオン、酸化剤、及び還元剤とともに酸化還元酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼなど）を使用して検出可能な沈殿物を再形成することを含む（例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第６６７０１１３号参照）。ハプテンは抗体によって結合することができる小分子である。典型的なハプテンは、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）、及びフルオレセインを含む。さらなるハプテンは、本明細書に参照により援用される米国特許第７６９５９２９号に記載されているような、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリテルペン（triperpene）、尿素、チオ尿素、ロテノイド、クマリン、及びシクロリグナンハプテンを含む。
【００２１】
エストロゲン受容体（ＥＲ）：エストロゲン受容体１（ＥＳＲ１）、エストロゲン受容体アルファ（ＥＲアルファ）エストロゲン核内受容体アルファとしても知られている；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤアクセッション番号２０９９。ホルモン活性化転写因子。エストロゲン（又は他のＥＲアゴニスト）に結合すると、エストロゲン受容体は核に局在し、エストロゲン受容体２とのホモ二量体又はヘテロ二量体を形成し、様々な遺伝子の転写を活性化する。
【００２２】
ＥＲ核酸及びタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、ＥＲ遺伝子は染色体６ｑ２５．１に位置し、その配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００６．１１（１５２０１１６３１−１５２４２４４０９）として開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１２２７４２、ＮＭ＿００１１２２７４１、ＮＭ＿００１１２２７４０、ＮＭ＿０００１２５、ＸＭ＿００５２６６８５６、及びＸＭ＿００５２６６８５７はＥＲ核酸配列を開示し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１１６２１４、ＮＰ＿００１１１６２１３、ＮＰ＿００１１１６２１２、ＮＰ＿０００１１６、ＸＰ＿００５２６６９１３、及びＸＰ＿００５２６６９１４はＥＲタンパク質配列を開示しており、これらのすべては２０１３年１０月４日にＧｅｎＢａｎｋにより提供され、参照により援用される。
【００２３】
ＨＥＲ２：ｖ−ｅｒｂ−ｂ２鳥類赤芽球性白血病ウイルスがん遺伝子ホモログ２（ＥｒｂＢ２）、ヒト上皮増殖因子受容体２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ、及び神経芽細胞腫／膠芽細胞腫由来のがん遺伝子ホモログとしても知られている；ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤアクセッション番号２０６４。上皮増殖因子受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーとして、Ｈｅｒ２は、リガンド結合ドメインを欠き、リガンド自体に結合することができないが、他のリガンド結合ＥＧＦ受容体ファミリーメンバーとヘテロ二量体化する。Ｈｅｒ２の増幅及び／又は過剰発現は、乳がん及び卵巣がんを含むいくつかの種類のがんにおいて起こる。
【００２４】
Ｈｅｒ２核酸及びタンパク質配列は、公的に入手可能である。例えば、Ｈｅｒ２遺伝子は１７番染色体ｑ１２に位置し、その配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００００１７．１０（３７８４４１６７−３７８８４９１５）として開示されている。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１００５８６２、ＮＭ＿００４４４８、ＸＭ＿００５２５７１３９、及びＸＭ＿００５２５７１４０はＨｅｒ２核酸配列を開示し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００４４３９、ＸＰ＿００５２５７１９６、及びＸＰ＿００５２５７１９７はＨｅｒ２タンパク質配列を開示しており、これらのすべては２０１３年１０月４日にＧｅｎＢａｎｋにより提供され、参照により援用される。
【００２５】
免疫組織化学（ＩＨＣ）：抗体などの特異的結合剤と抗原との相互作用を検出することによって、試料中の抗原の存在又は分布を決定する方法。試料は、抗体にコンジュゲートした検出可能な標識（直接検出）によって、又は一次抗体に特異的に結合する二次抗体にコンジュゲートした検出可能な標識（例えば間接検出）によって検出された抗体と接触させる。
【００２６】
ＨＥＲ２タンパク質（ＩＨＣ）のスコアリング：次の免疫組織化学法（ＩＨＣ）のＦＤＡ基準を用いてＨＥＲ２タンパク質の試料をスコアリングする：スコア０（ＩＨＣ０）、スコア１＋（ＩＨＣ１）、スコア２＋（ＩＨＣ２＋）、スコア３＋（ＩＨＣ３＋）。
【００２７】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）：標識された核酸プローブのハイブリダイゼーションを用いて試料中の核酸の存在又は分布を決定し、組織（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の一部若しくは切片、又は組織が十分に小さい場合（例えば植物種子、ショウジョウバエ胚）には、組織全体（ホールマウントＩＳＨ）において特定のＤＮＡ又はＲＮＡ配列を局在化する方法。ＤＮＡ  ＩＳＨは、試料中の染色体の完全性を評価するため及び／又は遺伝子コピー数を決定するための医学的診断における使用など、染色体の構造を決定するために用いることができる。ＲＮＡ  ＩＳＨは組織切片又はホールマウント内でｍＲＮＡ及びその他の転写物を測定し、局在化する。
【００２８】
ＩＳＨの場合、通常、試料細胞及び組織を処理して標的核酸を固定し、標的分子へのプローブの接近を増加させる。検出可能に標識されたプローブは、高温で標的配列とハイブリダイズし、次いで過剰プローブが洗い流される。温度、塩及び／又は界面活性剤の濃度などの溶液パラメーターを操作して、あらゆる同一でない相互作用を取り除くことができる（例えば、正確な配列の一致のみが結合して残るほどに）。次に、標識されたプローブは組織中で局在化され、それぞれオートラジオグラフィー、蛍光顕微鏡法又は免疫組織化学法のいずれかを用いて定量化される可能性がある。ＩＳＨはまた、二以上の核酸を同時に検出するために、典型的には異なるように標識された二以上のプローブを用いることもできる。
【００２９】
二重ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＤＩＳＨ）：二の異なる標的配列を検出するために二のプローブを用いるｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）法。典型的には、これらの二のプローブは異なるように標識される。本明細書に提示される方法において、ＤＩＳＨは、腫瘍の試料をＨＥＲ２特異的プローブ及び１７番染色体のセントロメアプローブと接触させ、１７番染色体のセントロメアＤＮＡ対ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの比（例えば１７番染色体のセントロメアのコピー数に対ＨＥＲ２遺伝子のコピー数の比）を決定することによってＨＥＲ２遺伝子増幅状態を決定するアッセイであり得る。この方法は、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡ及び１７番染色体のセントロメアＤＮＡのそれぞれについて異なる検出可能な標識及び／又は検出システムを利用して、単一の試料中でそれぞれを個々に視覚的に検出できるようにすることを含む。
【００３０】
ＨＥＲ２遺伝子（ＤＩＳＨ）のスコアリング：ＤＩＳＨアッセイで決定された１７番染色体のセントロメアＤＮＡ対ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの比に基づき、次のＦＤＡ基準を用いてＨＥＲ２遺伝子の試料をスコアリングする：ＤＩＳＨ−（陰性：ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７＜２）ＤＩＳＨ＋（陽性：ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７≧２．０）。
【００３１】
プローブ：検出可能な標識又はレポーター分子に結合した単離核酸（単離合成オリゴヌクレオチドなど）。典型的な標識は、放射性同位体、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光又は蛍光剤、ハプテン（ＤＮＰを含むがこれに限定されない）、及び酵素を含む。種々の目的に適した標識化の方法及び標識の選択における指針が、例えばSambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSHL, New York, 1989)及びAusubelら(Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publ. Assoc. and Wiley-Intersciences, 1992）で議論されている。
【００３２】
プローブは、所望の特異性を提供するように選択することができ、標的核酸の少なくとも１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。特定の例において、プローブは、標的核酸の少なくとも１００、２５０、５００、６００、１０００又はそれ以上のヌクレオチドを含み得る。いくつかの例では、プローブは、ＨＥＲ２ゲノム核酸などの標的核酸の非連続部分からのヌクレオチドのセグメントを含む。
【００３３】
試料：用語「試料」は、標的が存在し得る任意の液体、半固体又は固体物質（若しくは材料）を指す。特に、試料は、生体試料又は生物物質から得られた試料であり得る。例示的な生体試料は、例えばヒト被験体などの動物被験体から得られる組織試料及び／又は細胞学的試料を含む。他の例では、生体試料は、例えば血液、血漿、血清、尿、胆汁、腹水、唾液、脳脊髄液、眼房水又は硝子体液、又は任意の体分泌液、漏出液、浸出液（例えば膿瘍又はその他任意の感染若しくは炎症部位から得られる体液）、又は関節（例えば正常な関節又は疾患に冒された関節）から得られる体液であり得る。生体試料はまた、任意の器官又は組織から得られる試料（腫瘍生検などの生検又は剖検標本を含む）であってもよく、細胞（一次細胞か培養細胞かを問わず）、又は任意の細胞、組織若しくは器官によりコンディショニングされた培地を含み得る。
【００３４】
特異的結合：規定の標的（例えば特定のタンパク質若しくは抗原に対する抗体又は特定の核酸配列に対する核酸プローブ）に優先的に結合する薬剤の結合を指す用語。標的タンパク質に関して、「特異的に結合する」とは、抗体又は他のリガンドの全体若しくは一部と特定のポリペプチドとの優先的結合を指す。「特異的に結合する」とは、標的核酸を指す場合、核酸プローブの全体又は一部と特定の核酸との優先的結合を指す。
【００３５】
特異的結合剤は、実質的に特定の標的にのみ結合する。特異的結合剤と非標的タンパク質又は核酸との間には、少量の非特異的相互作用が生じ得る。抗体の抗原に対する特異的結合は、典型的には、非標的タンパク質と比較して２倍超、例えば５倍超、１０倍超又は１００倍超の、標的タンパク質に結合された抗体又は他のリガンドの（単位時間当たりの）量の増加をもたらす。イムノアッセイ形式を使用して、特定のタンパク質（ＨＥＲ２タンパク質又はＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体など）と特異的に反応する抗体を選択することができる。イムノアッセイ形式及び条件の説明については、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)を参照のこと。
【００３６】
核酸プローブの標的核酸分子への特異的結合は、典型的には、非標的核酸と比較して２倍超、例えば５倍超、１０倍超又は１００倍超の、標的核酸に結合された核酸プローブの量の増加をもたらす。特定の核酸配列（ＨＥＲ２特異的プローブ又は１７番染色体のセントロメアプローブなど）と特異的に結合する核酸プローブを選択するのに適したＩＳＨ条件は様々である。
【００３７】
被験体：ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば獣医学的被験体）などの任意の多細胞性脊椎動物生物。
【００３８】
ＩＩ．いくつかの実施態様の概要
本明細書に開示されるのは、単一試料中の複数の標的分子（二以上のタンパク質及び／又は核酸など）を検出するための方法である。特定の実施態様では、本方法は、単一試料中のＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡ（ＨＥＲ２遺伝子コピー数など）の存在及び／又は量を検出することを含む。いくつかの実施態様では、本方法は、試料中の１７番染色体のセントロメアＤＮＡの存在及び／又は量を検出すること、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡ対１７番染色体のセントロメアＤＮＡの比（例えばＨＥＲ２遺伝子コピー数対１７番染色体のセントロメアコピー数の比）を決定することをさらに含む。これらの方法は、ＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡ、及び１７番染色体のセントロメアＤＮＡ（含まれる場合）のそれぞれについて、異なる検出可能な標識及び／又は検出システムを利用して、単一試料中でそれ覚的に検出できるようにすることを含む。
【００３９】
これらの方法のいくつかの実施態様では、試料をＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させてＨＥＲ２タンパク質を検出し、試料をＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体と接触させてＥＲタンパク質を検出し、また試料をＨＥＲ２ゲノムＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと接触させてＨＥＲ２ゲノムＤＮＡを検出する。ＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの検出は、同時に又は連続的に実施することができる。特定の一実施態様では、この方法は、連続的に、ＨＥＲ２タンパク質を検出すること（試料をＨＥＲ２特異的抗体と接触させ、試料中のＨＥＲ２タンパク質を検出すること）、続いてＥＲタンパク質を検出すること（試料をＥＲ特異的抗体と接触させ、試料中のＥＲタンパク質を検出すること）、さらに続いてＨＥＲ２ゲノムＤＮＡを検出すること（試料をＨＥＲ２ゲノムＤＮＡ特異的核酸プローブと接触させ、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡを検出すること）を含む。
【００４０】
一例として、ＨＥＲ２遺伝子（黒点核染色）、ＨＥＲ２タンパク質（褐色膜染色）、及びＥＲタンパク質（赤色細胞質染色）について染色された乳腺腫瘍組織試料の対画像を４倍（図１Ａ）及び６０倍（図１Ｂ）の倍率で示す図１Ａ−Ｂが参照される。この試料は、ＨＥＲ２遺伝子増幅、ＨＥＲ２タンパク質陽性、かつＥＲタンパク質陽性である。しかし、いくつかの細胞（丸で囲んだもの）は、ＥＲタンパク質陽性であり、かつＨＥＲ２遺伝子増幅を有するが、ＨＥＲ２タンパク質については陰性である。ＨＥＲ２標的療法はＨＥＲ２タンパク質を標的とするので、この不均質性は、ＨＥＲ２遺伝子が増幅されているがＨＥＲ２タンパク質を過剰発現していない腫瘍細胞に影響を及ぼす（例えば阻害又は死滅させる）治療の失敗をもたらす可能性がある。しかし、ＥＲ陽性である細胞は、なおＥＲ標的療法の影響を受けるであろう。
【００４１】
さらなる実施態様では、この方法は、試料をＨＥＲ２ゲノムＤＮＡ特異的核酸プローブ及び１７番染色体のセントロメアゲノムＤＮＡ特異的核酸プローブに同時に接触させ、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡを検出し、次いで１７番染色体のセントロメアゲノムＤＮＡを検出することを含む。
【００４２】
開示された方法のいくつかの例では、試料をＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する抗体と接触させる。ＨＥＲ２特異的抗体を構築する方法は、当該技術分野で知られている。さらに、そのような抗体は、市販されている可能性がある。一つの特定の例では、抗ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギモノクローナル抗体（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ.の、カタログ番号７９０−２９９１など）といった抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体と試料を接触させる。追加的なＨＥＲ２特異的抗体は、抗ｃ−ｅｒｂＢ２抗体Ａ０４８５（カリフォルニア州カーピンテリア（Carpinteria）のＤａｋｏ）を含む。いくつかの例において、ＨＥＲ２特異的抗体は検出可能に標識され、試料中のＨＥＲ２タンパク質の検出を可能にする。他の例では、試料を抗ＨＥＲ２抗体（一次抗体）と接触させた後、一次抗体に対して作られ、検出可能に標識された二次抗体、例えば酵素（例えばアルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））にコンジュゲートさせた二次抗体又は酵素にコンジュゲートさせたさらなる試薬で検出することができるハプテンにコンジュゲートさせた二次抗体と、試料を接触させる。ＨＥＲ２タンパク質の存在は、抗ＨＥＲ２抗体付近に着色沈殿物を生成する発色性及び／又は基質組成物と酵素を接触させることにより検出される。ＨＥＲ２タンパク質の存在及び／又は量は、試料中の染色強度を決定することにより検出される。いくつかの例では、０〜３のスケール（例えば０はバックグラウンドに比較して染色がないことを示し、１は弱い染色を示し、２は中程度の染色を示し、３は強い染色を示す）のような数値スケールでスライドリーダーにより評価される。
【００４３】
特定の一例において、この方法は、例えば試料中のＨＥＲ２タンパク質に抗ＨＥＲ２抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、ＨＥＲ２タンパク質に特異的に結合する一次抗体（例えば抗ＨＥＲ２  ４Ｂ５ウサギモノクローナル抗体）と試料を接触させることを含む。次いで、試料を、例えば二次抗体が一次抗体に特異的に結合するのに十分な条件下で、一次抗体に特異的に結合するビオチン化二次抗体と接触させる。次いで、例えばストレプトアビジン−ＨＲＰがビオチンに特異的に結合するのに十分な条件下で、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンと試料を接触させ、続いて試料を過酸化水素基質及び３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原と接触させ、これが抗ＨＥＲ２抗体（及びＨＥＲ２タンパク質）付近に、光学（明視野）顕微鏡で視覚的に検出することができる褐色の沈殿物を生じさせる。一例では、試薬（抗ＨＥＲ２抗体を除く）は、  ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号７６０−０９１）などのキットに含まれる。当業者であれば、ＨＥＲ２タンパク質の検出のための、異なる色の沈殿物が生じるものを含む代替の検出試薬（代替の二次抗体、酵素、基質及び／又は色素原など）を選択することができる。
【００４４】
開示された方法のいくつかの例では、ＥＲタンパク質に特異的に結合する抗体と試料を接触させる。ＥＲ特異的抗体を構築する方法は、当該技術分野で知られている。さらに、そのような抗体は、市販されている可能性がある。一つの特定の例では、抗ＥＲ（ＳＰ１）ウサギモノクローナル抗体（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．の、カタログ番号７９０−４３２４など）といった抗ＥＲウサギモノクローナル抗体と試料を接触させる。追加的なＥＲ特異的抗体は、抗ＥＲモノクローナル抗体１Ｄ５及びＥＲ−２−１２３（カリフォルニア州カーピンテリアのＤａｋｏ）を含む。いくつかの例において、ＥＲ特異的抗体は検出可能に標識され、試料中のＥＲタンパク質の検出を可能にする。他の例では、試料を抗ＥＲ抗体（一次抗体）と接触させた後、一次抗体に対して作られ、検出可能に標識された二次抗体、例えば酵素（例えばＡＰ又はＨＲＰ）にコンジュゲートさせた二次抗体又は酵素にコンジュゲートさせたさらなる試薬で検出することができるハプテンにコンジュゲートさせた二次抗体と、試料を接触させる。ＥＲタンパク質の存在は、抗ＥＲ抗体付近に着色沈殿物を生じさせる発色性及び／又は基質組成物と酵素を接触させることにより検出される。ＥＲタンパク質の存在及び／又は量は、試料中の染色強度を決定することにより検出される。いくつかの例では、ＥＲタンパク質について染色された試料中の腫瘍細胞のパーセンテージを決定することにより、スライドリーダーで染色をスコア化する。
【００４５】
特定の一例において、この方法は、例えば試料中のＥＲタンパク質に抗ＥＲ抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、ＥＲタンパク質に特異的に結合する一次抗体（例えば抗ＥＲ  ＳＰ１ウサギモノクローナル抗体）と試料を接触させることを含む。次いで、試料を、例えば二次抗体が一次抗体に特異的に結合するのに十分な条件下で、一次抗体に特異的に結合するＡＰコンジュゲート二次抗体と接触させる。次いで、光学顕微鏡で視覚的に検出することができる抗ＥＲ抗体（及びＥＲタンパク質）付近に赤色沈殿物を生じさせるナフトールホスフェート及びＦａｓｔ  Ｒｅｄ色素原と試料を接触させる。一例では、試薬（抗ＥＲ抗体を除く）は、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号７６０−５０１）などのキットに含まれる。当業者であれば、ＥＲタンパク質の検出のための、異なる色の沈殿物が生じるものを含む代替の検出試薬（代替の抗体、酵素、基質及び／又は色素原など）を選択することができる。
【００４６】
あるいは、この方法は、例えば試料中のＥＲタンパク質に抗ＥＲ抗体が特異的に結合するのに十分な条件下で、ＥＲタンパク質に特異的に結合する一次抗体（例えば抗ＥＲ  ＳＰ１ウサギモノクローナル抗体）と試料を接触させることを含む。次いで、試料を、例えば二次抗体が一次抗体に特異的に結合するのに十分な条件下で、一次抗体に特異的に結合するビオチン化二次抗体と接触させる。次いで、試料をストレプトアビジン−ＨＲＰと、続いて過酸化水素及びＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐｕｒｐｌｅ色素原（チラミド−ローダミンコンジュゲート；アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、パーツ番号７００−２２９）と接触させ、これが光学顕微鏡で視覚的に検出可能な抗ＥＲ抗体（及びＥＲタンパク質）付近の試料に結合した紫色の色素を生じさせる。
【００４７】
開示された方法のいくつかの例では、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと試料を接触させる。ＨＥＲ２特異的核酸プローブを構築する方法は、当業者に知られている。ＨＥＲ２特異的核酸プローブは、市販されている可能性もある。例えば、開示された方法における使用に適したＨＥＲ２プローブは、ＩＮＦＯＲＭ  ＨＥＲ２  Ｄｕａｌ  ＩＳＨ  Ｐｒｏｂｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号７８０−４４２２）に含まれるＨＥＲ２プローブを含む。一例では、例えば試料中のＨＥＲ２ゲノムＤＮＡと特異的に結合（ハイブリダイズ）するプローブに特化した条件下で、ハプテン標識ＨＥＲ２核酸プローブと試料を接触させる。次いで、試料を、例えば抗体がハプテンに特異的に結合するのに十分な条件下で、ハプテンに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体は、酵素（ＡＰ又はＨＲＰなど）にコンジュゲートしてもよく、あるいは抗ハプテン抗体に特異的に結合する第二の抗体と試料を接触させてもよく、この場合第二の抗体は酵素にコンジュゲートしている。ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの存在は、ＨＥＲ２核酸プローブ付近に着色沈殿物を生成する発色性及び／又は基質組成物と酵素を接触させることにより検出される。いくつかの例では、試料中のＨＥＲ２  ＤＮＡの遺伝子コピー数は、腫瘍細胞の核内の沈殿物の領域（「スポット」）の数を数えることによりスライドリーダーでスコア化される。
【００４８】
特定の一例では、この方法は、例えば試料中のＨＥＲ２ゲノムＤＮＡにＨＥＲ２プローブが特異的に結合するのに十分な条件下で、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）にコンジュゲートしたＨＥＲ２ゲノムＤＮＡプローブと試料を接触させることを含む。次いで、試料を、例えば抗ＤＮＰ抗体がＤＮＰに特異的に結合するのに十分な条件下で、ＤＮＰに特異的に結合する抗ハプテン抗体と接触させる。次いで、試料を、例えば二次抗体が抗ＤＮＰ抗体に特異的に結合するのに十分な条件下で、抗ＤＮＰ抗体に特異的に結合するＨＲＰコンジュゲート二次抗体と接触させる。次いで、試料を、発色性基質（chromogen and substrate）である酢酸銀、ヒドロキノン、及び過酸化水素と接触させる。銀イオンはヒドロキノンによって金属銀イオンに還元され、これは光学顕微鏡によって黒いスポットとして視覚的に検出することができる。一例では、試薬（ＨＥＲ２プローブを除く）は、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号７６０−０９８）などのキットに含まれる。当業者であれば、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの検出のための、異なる色の沈殿物が生じるものを含む代替の検出試薬（代替のハプテン、抗体、酵素、基質及び／又は色素原など）を選択することができる。
【００４９】
さらなる例において、開示された方法は、１７番染色体のセントロメアＤＮＡに特異的に結合するプローブと試料を接触させ、試料中の１７番染色体ＤＮＡ（１７番染色体コピー数など）を検出することをさらに含む。開示された方法のいくつかの例では、１７番染色体のセントロメアＤＮＡに特異的に結合する核酸プローブと試料を接触させる。１７番染色体特異的核酸プローブを構築する方法は、当業者に知られている。さらに、１７番染色体核酸プローブは、市販されている可能性もある。例えば、開示された方法における使用に適した１７番染色体のセントロメアプローブは、ＩＮＦＯＲＭ  ＨＥＲ２  Ｄｕａｌ  ＩＳＨ  Ｐｒｏｂｅ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号７８０−４４２２）に含まれる１７番染色体のセントロメアプローブを含む。一例では、例えば試料中の１７番染色体ゲノムＤＮＡと特異的に結合（ハイブリダイズ）するプローブに特化した条件下で、ハプテン標識１７番染色体セントロメア核酸プローブと試料を接触させる。次いで、試料を、例えば抗体がハプテンに特異的に結合するのに十分な条件下で、ハプテンに特異的に結合する抗体と接触させる。抗体は、酵素（ＡＰ又はＨＲＰなど）にコンジュゲートしてもよく、あるいは抗ハプテン抗体に特異的に結合する第二の抗体と試料を接触させてもよく、この場合第二の抗体は酵素にコンジュゲートしている。１７番染色体のセントロメアゲノムＤＮＡの存在は、１７番染色体のセントロメア核酸プローブ付近に着色沈殿物を生成する発色性及び／又は基質組成物と酵素を接触させることにより検出される。いくつかの例では、試料中の１７番染色体のセントロメアＤＮＡの遺伝子コピー数は、腫瘍細胞の核内の沈殿物の領域（「スポット」）の数を数えることによりスライドリーダーでスコア化される。
【００５０】
特定の例では、この方法は、例えば試料中の１７番染色体のセントロメアＤＮＡに１７番染色体のセントロメアプローブが特異的に結合するのに十分な条件下で、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）にコンジュゲートした１７番染色体のセントロメアＤＮＡプローブと試料を接触させることを含む。次いで、試料を、例えば抗ＤＩＧ抗体がＤＩＧに特異的に結合するのに十分な条件下で、ＤＩＧに特異的に結合する抗ハプテン抗体と接触させる。次いで、試料を、例えば二次抗体が抗ＤＩＧ抗体に特異的に結合するのに十分な条件下で、抗ＤＩＧ抗体に特異的に結合するＡＰコンジュゲート二次抗体と接触させる。次いで、試料を、ナフトールホスフェート及びＦａｓｔ  Ｒｅｄと接触させ、１７番染色体のセントロメアプローブ（及び１７番染色体のセントロメアＤＮＡ）付近の核に堆積し、赤いスポットとして光学顕微鏡により視覚的に検出可能な赤色の沈殿物を生じさせる。一例では、試薬（１７番染色体のセントロメアプローブを除く）は、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号７６０−５０５）などのキットに含まれる。当業者であれば、１７番染色体のセントロメアＤＮＡの検出のための、異なる色の沈殿物が生じるものを含む代替の検出試薬（代替のハプテン、抗体、酵素、基質及び／又は色素原など）を選択することができる。
【００５１】
開示された方法は、単一試料中の複数のタンパク質及び核酸標的の検出に関する。結果として、アッセイの各要素の検出可能なシグナルは、個別に識別可能でなければならない。したがって、いくつかの例では、アッセイの各要素の検出アッセイにより生成される視覚シグナルは、異なる色である。特定の一例において、この方法は、ＨＥＲ２タンパク質の褐色染色（例えば細胞膜での褐色染色）、ＥＲタンパク質の赤色染色（例えば核における赤色染色）、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの黒染色（例えば、個別に識別可能な黒いスポット又は黒いスポットの集まりなどの核における黒いスポット）をもたらす。別の特定の例において、この方法は、ＨＥＲ２タンパク質の褐色染色、ＥＲタンパク質の紫色染色、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの黒色染色をもたらす。当業者であれば、ＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡのそれぞれに対して異なる色の染色を提供するために、様々な組み合わせの検出試薬を選択することができる。さらなる例において、この方法は、１７番染色体のセントロメアＤＮＡに対する赤色染色（例えば、個別に識別可能な赤色スポット又は赤色スポットの集まりなどの核における赤色スポット）をさらにもたらす。特定の例において、この方法は、ＨＥＲ２タンパク質の褐色染色、ＥＲタンパク質の紫色染色、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの黒色染色、及び１７番染色体のセントロメアＤＮＡの赤色染色をもたらす。いくつかの実施態様では、ＤＡＢ（褐色）染色によるＨＥＲ２タンパク質染色が利用されるが、なぜならこれは現在受け入れられている検出システムであり、病理学者によく知られているためである。ただし、追加の色の組み合わせを用いることができる。
【００５２】
本明細書に開示される方法はまた、組織試料を、ＨＥＲ２特異的抗体及びＥＲ特異的抗体、ＨＥＲ２特異的核酸プローブ及び／又は１７番染色体のセントロメア特異的核酸プローブと接触させることを含む工程の前又は合間に試料の複数の前処理工程を含んでもよい。これらの工程は、当業者に知られており、試料（ＦＦＰＥ試料など）の脱パラフィン、細胞コンディショニング、洗浄などを含み得る。そのような前処理及び他の工程を含む例示的なプロトコールが実施例１に提供される。当業者であれば、これらの条件を調整することができる（例えばインキュベーションの時間及び／又は温度、洗浄工程などの細かい調整）。
【００５３】
開示された方法において使用可能な例示的な色素原は、表１に示すものを含む（ただしこれらに限定されない）。網羅的ではないが、表１は、現在利用可能な色素原の種類ついての洞察を提供する。さらなる例示的色素原は、２０１３年６月５日出願の米国仮特許出願第６１／８３１，５５２号及び米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号（これらはいずれもその全文が参照により本明細書に援用される）に記載されているものを含む。
0006626097.tif 000002
表１は、網羅的ではないが、現在利用可能な発色物質の種類についての洞察を提供する（†国際公開第２０１２／０２４１８５号、Kellyら、「Substrates for Chromogenic detection and methods of use in detection assays and kits」）。
【００５４】
いくつかの実施態様では、この方法は、試料がＨＥＲ２について陽性であるか陰性であるかを決定することを含む。いくつかの例では、試料は、ＨＥＲ２タンパク質について陽性又は陰性、ＨＥＲ２遺伝子増幅について陽性又は陰性、又はその両方であると決定される。当業者は、試料（乳腺腫瘍試料など）がＨＥＲ２タンパク質及び／又はＨＥＲ２遺伝子増幅について陽性又は陰性であるかどうかを決定することができる。いくつかの例では、試料は、０（陰性）、１＋（陰性）、２＋（不明瞭）又は３＋（陽性）など、ＨＥＲ２タンパク質について半定量的にスコア化される。いくつかの例では、試料は、例えば６コピー以上のＨＥＲ２（陽性）又は６コピー未満のＨＥＲ２（陰性）のように、ＨＥＲ２遺伝子コピー数に基づいてＨＥＲ２遺伝子増幅をスコア化される。他の例では、試料は、例えばＨＥＲ２／ＣＥＮ１７＜１．８（陰性）、１．８≧ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７≦２．２（不明確），ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７＞２．２（陽性）のように、ＨＥＲ２遺伝子コピー数対１７番染色体のセントロメアコピー数の比に基づいてＨＥＲ２遺伝子増幅をスコア化される。追加のＨＥＲ２試験ガイドラインが利用可能であり、それは、Wolffら., J. Clin. Oncol., doi:10.1200/JCO.2013.50.9984に記載されているものを含む。
【００５５】
いくつかの実施態様では、この方法は、試料がＥＲタンパク質について陽性であるか陰性であるかを決定することも含む。当業者は、試料（例えば乳腺腫瘍試料）がＥＲタンパク質について陽性であるか陰性であるかを決定することができる。いくつかの例では、試料中の腫瘍細胞の１％以上の核にＥＲタンパク質染色が存在する場合、試料はＥＲ陽性であると決定され、試料中の腫瘍細胞の１％未満の核にＥＲタンパク質染色が存在する場合、試料はＥＲ陰性であると決定される。さらなる例では、試料中の腫瘍細胞の１〜１０％にＥＲ染色が検出される場合、試料はＥＲ低発現を有すると決定され、試料中の腫瘍細胞の１０％超にＥＲ染色が検出される場合、試料はＥＲ高発現を有すると決定される。
【００５６】
本開示の方法は、自動化することができる（例えば実施例１に記載の通り）。自動ＩＨＣ及び／又はＩＳＨのためのシステム、例えばＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＵＬＴＲＡスライド染色システム、ＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴスライド染色システム、及びＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＸＴスライド染色システム（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ＢＯＮＤ−ＭＡＸ及びＢＯＮＤ−ＩＩＩスライド染色機（イリノイ州バッファローグローブのＬｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）並びにＩＱ  Ｋｉｎｅｔｉｃスライド染色機（カリフォルニア州コンコードのＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）などは、市販されている。Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．は、各々が参照により本明細書に援用される米国特許第５６５０３２７号、第５６５４２００号；第６２９６８０９号；第６３５２８６１号；第６５８２９６２号；第６８２７９０１号、及び第６９４３０２９号を含む自動分析を実施するためのシステム及び方法を開示する多数の米国特許の譲受人である。
【００５７】
ＩＩＩ．試料
例示的な試料は、限定されないが、血液塗抹標本、細胞遠心分離標本、細胞診塗抹標本、コア生検、及び／又は細針吸引液を含む。いくつかの例では、試料は、組織切片（例えばクライオスタット組織切片及び／又はパラフィン包埋組織切片）を含む。特定の実施態様では、試料は、乳腺腫瘍細胞又は卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞を含む。被験体から生体試料を得る方法は、当該技術分野で知られている。例えば、乳房組織又は乳房細胞を得る方法は常用されている。例示的な生体試料は、正常細胞若しくは組織から、又は新生細胞若しくは組織から単離することができる。特定の例では、生体試料は、乳腺腫瘍試料などの腫瘍試料を含む。
【００５８】
例えば、細胞材料を含む乳腺腫瘍からの試料は、腫瘍の全部又は一部の外科的切除により、腫瘍からの細針吸引液の採取により、及び当該技術分野で知られている他の方法により得ることができる。特定の例では、組織又は細胞試料を基質に適用し、ＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡを検出するために分析する。固体支持体は、生体試料を保持することができ、試料中の成分（例えばタンパク質及び／又は核酸分子）の簡便な検出を可能にする。例示的な支持体は、顕微鏡スライド（例えばガラス顕微鏡スライド又はプラスチック顕微鏡スライド）、カバースリップ（例えばガラスカバースリップ又はプラスチックカバースリップ）、組織培養皿、マルチウェルプレート、膜（例えばニトロセルロース又はフッ化ポリビニリデン（ＰＶＤＦ））又はＢＩＡＣＯＲＥTMチップを含む。
【００５９】
本明細書に記載の試料は、当該技術分野で現在知られているか又は今後開発される任意の方法を用いて調製することができる。一般に、組織試料は、培地中に組織を固定し、包埋することにより調製される。他の例では、試料は、例えば細胞を固体支持体（例えばガラススライド）上で塗抹又は遠心分離することにより固体支持体上に単層として調製される細胞懸濁液を含む。さらなる例では、新鮮な凍結（例えば非固定の）組織切片を本明細書に開示された方法で使用することができる。
【００６０】
試料を固定する方法は様々である。組織試料を固定することは、可能な限り生存状態に近いように細胞及び組織成分を保存し、有意な変化なしに、該成分に対し調製手順を行うことを可能にする。固定は、細胞死で始まる自己分解及び細菌分解プロセスを停止させ、ＩＳＨ又はＩＨＣなどの組織処理の後続段階に耐えるように細胞及び組織成分を安定化させる。
【００６１】
組織は、灌流を含む任意の適切な方法により、又は固定剤への浸漬により固定することができる。固定剤は、架橋剤（アルデヒドなど、例えばホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、及びグルタルアルデヒド、並びに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば金属イオン及び錯体、例えば四酸化オスミウム及びクロム酸）、タンパク質変性剤（例えば酢酸、メタノール、及びエタノール）、未知のメカニズムの固定剤（例えば塩化第二水銀、アセトン、及びピクリン酸）、組み合わせ試薬（例えばカルノア固定液、メタカーン（methacarn）、ブアン液  Ｂ５固定液、ロスマン液、及びジャンドル液）、マイクロ波、及びその他の固定剤（例えば排除体積固定及び蒸気固定）に分類することができる。緩衝剤、洗浄剤、タンニン酸、フェノール、金属塩（例えば塩化亜鉛、硫酸亜鉛、及びリチウム塩）及びランタンなどの添加剤もまた、固定剤に含まれ得る。
【００６２】
試料を調製する際に最もよく使用される固定剤はホルムアルデヒドであり、一般にホルマリン溶液（１０％緩衝化ホルマリンと呼ばれる４％ホルムアルデヒド緩衝溶液）の形態である。一例では、固定剤は１０％中性緩衝化ホルマリンである。
【００６３】
いくつかの例では、包埋剤が使用される。包埋剤は、先々の分析のため、保存に役立つように組織及び／又は細胞を埋め込ませる不活性材料である。埋め込みは、組織試料を薄切片にスライスすることも可能にする。包埋剤は、パラフィン、セロイジン、ＯＣＴTM化合物、寒天、プラスチック又はアクリルを含む。多くの包埋剤は疎水性である。それゆえ、主に親水性試薬を利用する組織学的又は細胞学的分析の前に、不活性材料を除去する必要がある。脱パラフィン化又は脱ろうという用語は、生体試料からの任意の種類の包埋剤の部分的又は完全な除去を指すために本明細書では広く使用される。例えば、パラフィン包埋組織切片は、トルエン、キシレン、リモネン又は他の適切な溶媒などの有機溶媒を通過させることによって脱ろうされる。
【００６４】
ＩＶ．治療の方法
開示された方法は、被験体に対する治療を選択及び／又は施すことをさらに含み得る。いくつかの例では、治療は、被験体の腫瘍のＨＥＲ２及び／又はＥＲ状態に基づいて選択され、施される。例えば、ＥＲ陽性／ＨＥＲ２陰性腫瘍を有する被験体は、タモキシフェン、レトロゾール、トレミフェン、フルベストラント、アナストロゾール、及び／又はエキセメスタンなどの一又は複数の抗エストロゲン治療薬を投与される。ＨＥＲ２陽性／ＥＲ陰性腫瘍を有する被験体は、トラスツズマブ、ラパチニブ、ペルツズマブ、及び／又はトラスツズマブエムタンシンなどの一又は複数のＨＥＲ２標的療法が施される。ＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性腫瘍を有する被験体は、一又は複数の抗エストロゲン治療薬及び一又は複数のＨＥＲ２標的療法の両方が施される。一例では、ＨＥＲ２陽性／ＥＲ陽性腫瘍を有する被験体は、トラスツズマブ及びレトロゾール；トラスツズマブ及びアナストロゾール；又はトラスツズマブ、ラパチニブ、及びレトロゾールを投与される。さらなる例において、被験体は、ＥＲ又はＨＥＲ２状態にかかわらず、ネオアジュバント化学療法も施される。例えば、被験体は、タキサン（パクリタキセル又はドセタキセルなど）、アントラサイクリン（ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン又はミトキサントロンなど）、シクロホスファミド、カペシタビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート又はそれらの組み合わせで治療することができる。当業者は、被験体のＨＥＲ２及びＥＲ状態、並びに被験体の年齢、状態、以前の治療歴、及びその他の要因に基づいて、被験体にとって適切な治療レジメンを選択することができる。
【実施例】
【００６５】
以下の実施例は、実施態様及び一般的なプロトコールのうちのある特定の特徴を説明するために提供される。本開示の範囲は、以下の実施例により例示される特徴に限定されない。
【００６６】
実施例１
ＨＥＲ２及びＥＲ遺伝子タンパク質アッセイ
本実施例は、試料中のＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、及びＨＥＲ２遺伝子コピー数の検出のための多重遺伝子−タンパク質アッセイを記載する。
【００６７】
単一試料中のＨＥＲ２及びＥＲタンパク質並びにＨＥＲ２遺伝子コピー数の検出のための多重アッセイが開発された。最初に、ＨＥＲ２タンパク質が、ｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＰＡＴＨＷＡＹ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギモノクローナル抗体（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＩＨＣにより検出された。次に、ＥＲタンパク質が、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＣＯＮＦＩＲＭ抗エストロゲン受容体（ＳＰ１）ウサギモノクローナル抗体（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＩＨＣにより検出された。最後に、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡが、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出され、ＤＮＰ標識ＨＥＲ２プローブを用いるＩＳＨで検出された。すべての工程は、ＮｅｘＥＳ  Ｖ１０．６を用いるＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴ自動ＩＨＣ／ＩＳＨ染色装置（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号：Ｎ７５０−ＢＭＫＸＴ−ＦＳ）で以下の通り実施された。
（１）  ベーキング：６０℃で４分間、すすぎ；
（２）  ＥＺ  Ｐｒｅｐ（ＶＭＳＩ  カタログ番号：９５０−１０２）を用いて試薬浸透のために脱パラフィンを実施し、ろうを除去した：７２℃で２ｘ８分、すすぎ；
（３）  細胞コンディショニングは、使用済みＣＣ１（ＶＭＳＩ  カタログ番号：９５０−１２４）を用いて、９５℃で２ｘ１６分及び１ｘ８分間行い、反応緩衝液でスライドをすすぐ；
（４）  ３７℃で４分間、ＩＶＩＥＷ阻害剤（ＶＭＳＩ  カタログ番号：２５３−２１８７）で処理し、反応緩衝液でスライドをすすぐ；
（５）  一次抗体の適用：ＰＡＴＨＷＡＹ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ４Ｂ５抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号７９０−２９９１）を３７℃で３２分間インキュベートし、反応緩衝液でスライドをすすぐ；
（６）  ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出システムでの検出：Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２０３０）３７℃で４分間、すすぎ、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｂ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２０３１）３７℃で４分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ビオチン  Ｉｇ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１８８）３７℃で８分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ＳＡ−ＨＲＰ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１８９）３７℃で８分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１９０）及びＩＶＩＥＷ  過酸化水素（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１９１）３７℃で８分間、すすぎ、並びにＩＶＩＥＷ  Ｃｏｐｐｅｒ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１９２）３７℃で４分間、すすぎ（すすぎはすべて反応緩衝液を用いる）；
（７）  反応緩衝液を適用し、試料を９５℃で８分間インキュベートし、加熱せずに４分間インキュベートし、反応緩衝液ですすいだ。
（８）  一次抗体適用：ＣＯＮＦＩＲＭ抗ＥＲ（ＳＰ１）抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号７９０−４３２４）を３７℃で１６分間インキュベートし、スライドを反応緩衝液ですすいだ；
（９）  検出は、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｒｅｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４３２７）３７℃で１６分間、すすぎ、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄエンハンサー（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４３２６）３７℃で４分間、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄナフトール（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４３２８）３７℃で４分間、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ａ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４２９）及びＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  Ｂ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４３３０）３７℃で１６分間、すすぎ（すすぎはすべて反応緩衝液を用いる）；
（１０）  ３７℃で４分間リンス緩衝液９００μｌ、９０℃で８分間の３サイクル細胞コンディショニング：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  ２（ＶＭＳＩ  カタログ番号９５０−１２３）を適用し、すすぎ；  
（１１）  プロテアーゼ処理：ＩＳＨ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ２（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４１４８）３７℃で１２分間、すすぎ；
（１２）  清澄化：ＨｙｂＣｌｅａｒ溶液（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４５７２）５２℃で４分間；
（１３）  プローブ：ＨＥＲ２  ＤＮＰプローブ（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４４２２）５２℃で４分間、８０℃で４分間、及び４４℃で６時間、すすぎ；
（１４）  リンス緩衝液でストリンジェンシー洗浄７２℃で４ｘ８分、すすぎ
（１５）  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステムでの検出：銀染色ＩＳＨ  抗ＤＮＰ抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１４）３７℃で２０分間、すすぎ、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ  ＨＲＰ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１３）３７℃で２４分間、すすぎ、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ  色素原Ａ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１０）室温で４分間、すすぎ、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ａ  室温で４分間、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ｂ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１１）室温で４分間、及び銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ｃ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１２）室温で８分間、すすぎ；
（１６）  対比染色＆ポスト対比染色：Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ（ＶＭＳＩ  カタログ番号：７９０−２２０８）で８分間、すすぎ、Ｂｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ  カタログ番号：７６０−２０３７）で４分間ポスト対比染色。
【００６８】
この染色プロトコールは、ＨＥＲ２タンパク質の褐色染色、ＥＲタンパク質の赤色染色、及びＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの黒色染色をもたらす。増幅されたＨＥＲ２遺伝子を有し、ＨＥＲ２タンパク質陽性及びＥＲタンパク質陽性である試料（図１Ａ及びＢ）、増幅されたＨＥＲ２遺伝子を有し、ＨＥＲ２タンパク質陰性及びＥＲタンパク質陽性である試料（図２Ａ及びＢ）、並びに増幅されたＨＥＲ２遺伝子を有し、ＨＥＲ２タンパク質陽性及びＥＲタンパク質陰性である試料（図３Ａ及びＢ）を示す、典型的な複数の乳腺腫瘍試料が提供される。試料内で不均質性が観察された。例えば、ＨＥＲ２タンパク質陽性試料（図１）においても、いくつかの細胞はＨＥＲ２遺伝子増幅ありでＥＲタンパク質陽性であったが、ＨＥＲ２タンパク質は欠いていた（図１Ｂの丸で囲った細胞）。
【００６９】
実施例２
検出方法の比較とＫｉ６７の使用
本実施例は、ＥＲタンパク質ＩＨＣの検出方法の比較及びＥＲ  ＩＨＣとＫｉ６７  ＩＨＣの比較を記載する。
【００７０】
ｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ試薬又はＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ試薬でのＥＲタンパク質ＩＨＣの染色を、乳腺腫瘍試料（図４Ａ及びＢ）で試験し、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄで染色したＨＥＲ２  ＩＨＣ／ＩＳＨと比較した（図４Ｃ）。ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ染色（図４Ｃ）をアッセイに含めるために選択した（実施例１に記載）。ＥＲ  ＩＨＣの代わりにＫｉ６７タンパク質ＩＨＣを用いて同様の実験を実施した（図５Ａ〜Ｃ）。図６は、ＨＥＲ２遺伝子、ＨＥＲ２タンパク質、及びＫｉ６７タンパク質について染色された試料を示す。ＨＥＲ２陽性試料中のＫｉ６７又はＥＲ  ＩＨＣでのＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質染色の例を図７Ａ〜Ｄに示す。ＨＥＲ２不明瞭な場合のＫｉ６７又はＥＲ  ＩＨＣでのＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質染色の例をそれぞれ図８及び９に示す。
【００７１】
実施例３
四重ＨＥＲ２及びＥＲ遺伝子−タンパク質アッセイ
本実施例は、試料中のＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、ＨＥＲ２遺伝子コピー数、及び１７番染色体コピー数の検出のための多重遺伝子−タンパク質アッセイを記載する。
【００７２】
単一試料中のＨＥＲ２及びＥＲタンパク質、ＨＥＲ２遺伝子コピー数、１７番染色体のセントロメアＤＮＡ遺伝子コピー数の検出のための多重アッセイが開発された。最初に、ＨＥＲ２タンパク質が、ｉＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＰＡＴＨＷＡＹ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ（４Ｂ５）ウサギモノクローナル抗体（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＩＨＣにより検出された。次に、ＥＲタンパク質が、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐｕｒｐｌｅ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、ＣＯＮＦＩＲＭ抗エストロゲン受容体（ＳＰ１）ウサギモノクローナル抗体（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いるＩＨＣにより検出された。最後に、ＨＥＲ２核酸ゲノムＤＮＡ及び１７番染色体のセントロメアＤＮＡが、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出されるＤＮＰ標識ＨＥＲ２プローブ及びＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ検出（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出されるＤＩＧ標識１７番染色体のセントロメアプローブを用いる二重ＩＳＨにより検出された。すべての工程は、ＮｅｘＥＳ  Ｖ１０．６を用いるＢＥＮＣＨＭＡＲＫ  ＸＴ自動ＩＨＣ／ＩＳＨ染色装置（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  カタログ番号：Ｎ７５０−ＢＭＫＸＴ−ＦＳ）で以下の通り実施された。
（１）  ベーキング：６０℃で４分間、すすぎ；
（２）  ＥＺ  Ｐｒｅｐ（ＶＭＳＩ  カタログ番号：９５０−１０２）を用いて試薬浸透のために脱パラフィンを実施し、ろうを除去した：７２℃で２ｘ８分、すすぎ；
（３）  細胞コンディショニングは、使用済みＣＣ１（ＶＭＳＩ  カタログ番号：９５０−１２４）を用いて、９５℃で２ｘ１６分及び１ｘ８分間行い、反応緩衝液でスライドをすすぐ；
（４）  ３７℃で４分間、ＩＶＩＥＷ阻害剤（ＶＭＳＩ  カタログ番号：２５３−２１８７）で処理し、反応緩衝液でスライドをすすぐ；
（５）  一次抗体の適用：ＰＡＴＨＷＡＹ抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ４Ｂ５抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号７９０−２９９１）を３７℃で３２分間インキュベートし、反応緩衝液でスライドをすすぐ；
（６）  ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ検出システムでの検出：Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２０３０）３７℃で４分間、すすぎ、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ｂ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２０３１）３７℃で４分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ビオチン  Ｉｇ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１８８）３７℃で８分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ＳＡ−ＨＲＰ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１８９）３７℃で８分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ＤＡＢ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１９０）及びＩＶＩＥＷ過酸化水素（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１９１）３７℃で８分間、すすぎ、並びにＩＶＩＥＷ  Ｃｏｐｐｅｒ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１９２）３７℃で４分間、すすぎ（すすぎはすべて反応緩衝液を用いる）；
（７）  反応緩衝液を適用し、試料を９５℃で８分間インキュベートし、加熱せずに４分間インキュベートし、反応緩衝液ですすいだ；
（８）  一次抗体適用：ＣＯＮＦＩＲＭ抗ＥＲ（ＳＰ１）抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号７９０−４３２４）を３７℃で１６分間インキュベートし、スライドを反応緩衝液ですすいだ；
（９）  検出：ＶＩＥＷビオチンＩｇ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１８８）３７℃で８分間、すすぎ、ＩＶＩＥＷ  ＳＡ−ＨＲＰ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−２１８９）３７℃で８分間、すすぎ、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｐｕｒｐｌｅ（ＶＭＳＩ  カタログ番号７００−２２９）及び過酸化水素３７℃で３２分間、すすぎ（すすぎはすべて反応緩衝液を用いる）；
（１０）  ３７℃で４分間リンス緩衝液９００μｌ、９０℃で８分間の３サイクル細胞コンディショニング：Ｃｅｌｌ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒ  ２（ＶＭＳＩ  カタログ番号９５０−１２３）を適用し、すすぎ；
（１１）  プロテアーゼ処理：ＩＳＨ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ２（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４１４８）３７℃で８分間、すすぎ；
（１２）  清澄化：ＨｙｂＣｌｅａｒ溶液（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４５７２）５２℃で４分間；
（１３）プローブ：ＨＥＲ２  ＤＮＰ及びＣｈｒ１７  ＤＩＧプローブカクテル（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４４２２）５２℃で４分間、８０℃で４分間、及び４４℃で６時間、すすぎ；
（１４）  リンス緩衝液でストリンジェンシー洗浄７２℃で４ｘ８分、すすぎ；
（１５）  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  ＳＩＳＨ  ＤＮＰ  ＤｅｔｅｃｔｉｏｎシステムでのＨＥＲ２検出：銀染色ＩＳＨ  抗ＤＮＰ抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１４）３７℃で２０分間、すすぎ、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ  ＨＲＰ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１３）３７℃で２４分間、すすぎ、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ａ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１０）室温で４分間、すすぎ、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ａ室温で４分間、銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ｂ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１１）室温で４分間、及び銀染色ＩＳＨ  ＤＮＰ色素原Ｃ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１２）室温で８分間、すすぎ（すすぎはすべて反応緩衝液を用いる）；
（１６）  ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ検出システでのＣｈｒ１７検出：ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧマウス抗ＤＩＧ抗体（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１５）３７℃で２０分間、すすぎ、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ  ＡＰ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１９）３７℃で３２分間、すすぎ、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ  ｐＨ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１８）３７℃で８分間、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧナフトール（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１７）３７℃で４分間、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ（ＶＭＳＩ  カタログ番号２５３−４４１６）４分間、ＵＬＴＲＡＶＩＥＷ  Ｒｅｄ  ＩＳＨ  ＤＩＧ  Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ３７℃で１２分間、すすぎ（すすぎはすべて反応緩衝液を用いる）；
（１７）  対比染色＆ポスト対比染色：Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ  ＩＩ（ＶＭＳＩ  カタログ番号：７９０−２２０８）を用い３７℃で８分間、すすぎ、Ｂｌｕｉｎｇ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＶＭＳＩ  カタログ番号：７６０−２０３７）を用い３７℃で４分間ポスト対比染色。
【００７３】
この染色プロトコールは、ＨＥＲ２タンパク質の褐色染色、ＥＲタンパク質の紫色染色、ＨＥＲ２ゲノムＤＮＡの黒色染色、及び１７番染色体のセントロメアＤＮＡの赤色染色をもたらす。増幅したＨＥＲ２遺伝子を有し、ＨＥＲ２タンパク質陽性であり、かつＥＲタンパク質陽性である典型的な試料を図１０Ａ及びＢに示す。ＨＥＲ２陰性（タンパク質及び遺伝子）かつＥＲ陽性と考えられる試料を図１１Ａ及びＢに示す。
【００７４】
実施例４
四重ＨＥＲ２及びＥＲ遺伝子−タンパク質アッセイ
本実施例は、ＨＥＲ２及び１７番染色体コピー数分析のために一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを用いる、試料中のＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、ＨＥＲ２遺伝子コピー数及び１７番染色体コピー数の検出のための多重遺伝子−タンパク質アッセイを記載する。オリゴヌクレオチドプローブに関する開示のために参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第６１／９４３１９６号が参照される。一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの使用は、該プローブが前述のＤＮＡプローブ（ＨＥＲ２  ＤＮＰ及びＣｈｒ１７  ＤＩＧプローブカクテル（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４４２２）よりもずっと迅速にハイブリダイズするので、アッセイに必要な時間を短縮する。特に、ハイブリダイゼーション時間は６時間から１時間に短縮された。さらに、ＨｙｂＣｌｅａｒ溶液（ＶＭＳＩ  カタログ番号７８０−４５７２）が一本鎖オリゴヌクレオチドプローブには必要ないことが発見された。
【００７５】
一本鎖オリゴヌクレオチドＨＥＲ２プローブ（ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブ）は、ＨＥＲ２遺伝子領域を特異的に標的とするジニトロフェニル（ＤＮＰ）標識、非繰り返し（repeat-free）ゲノムプローブである。ＩＮＦＯＲＭ  ＨＥＲ２  ＤＵＡＬ  ＩＳＨ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅと同様に、ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブは、ＨＥＲ２標的領域を包含するヒト１７番染色体由来のゲノムＤＮＡの３２７０００ヌクレオチド（ｎｔ）超（３５０２７９７９〜３５３５５５１６）にわたる（ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｙ  ２００４  （ＮＣＢＩ３５／ｈｇ１７）  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチド配列は、ＩＮＦＯＲＭ  ＨＥＲ２  ＤＵＡＬ  ＩＳＨ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅの配列から設計された。各ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドは８０ｍｅｒ長で設計された。したがって、非標的結合のストリンジェンシーレベルは、上記のオリゴヌクレオチドプローブ設計基準によって高められた。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブの特異性は、試験したＩＳＨアッセイ条件下で中期スプレッドで実験的に確認された。
【００７６】
バイオインフォマティクス検索を用いて、ＨＥＲ２標的領域周辺のＨＥＲ２特異的核酸配列を同定した。選択されたゲノム標的核酸配列は、連続した非重複８０ｎｔセグメントに分離される。２０ｎｔの間隔を空けた脱塩基性ホスホラミダイト上に５個のＤＮＰハプテンをそれぞれ有する１１９６〜８０ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドをアフィニティー精製し、質量分析及びゲル電気泳動により分析した。ＨＥＲ２オリゴヌクレオチドプローブを、ヒトブロッキングＤＮＡを含まないホルムアミドベースの緩衝液中で塊状にした。最初のスクリーニングプロセスにおいて、オリゴヌクレオチドの数、ＤＮＰハプテンの数及び間隔は、ＨＥＲ２遺伝子に対する感受性及び特異性のために、ヒトブロッキングＤＮＡを含まないホルムアミドベースの緩衝液中で機能的に試験された。
【００７７】
一本鎖オリゴヌクレオチドＣｈｒ１７プローブ（Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブ）を、５８ｂｐ〜８７ｂｐの長さを有する１４オリゴヌクレオチドのプールで作製した。各オリゴヌクレオチドを、その５’末端に配列ＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴを有する非結合尾部上の二のＤＩＧハプテン分子で標識した。これらのオリゴヌクレオチドをＰＡＧＥ精製し、質量分析法で分析した。Ｃｈｒ１７オリゴヌクレオチドプローブを、ヒトブロッキングＤＮＡを含まないホルムアミドベースの緩衝液中で調製した。例示的な実施態様では、Ｃｈｒ１７は、表２に列挙した配列の一又は複数を含む。
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【００７８】
本発明の一態様は、Ｃｈｒ１７遺伝子検出とＨＥＲ２遺伝子検出の間のシグナルを平衡させるために、異なるストリンジェンシー洗浄が必要なことである。特にそれは、遺伝子シグナル（例えばＨＥＲ２）とセントロメアシグナル（例えばＣｈｒ１７）が等しいサイズであり、両方が不連続で丸く、容易に識別できるシグナルを有するような遺伝子タンパク質アッセイを読み取る場合に重要である。大きい、奇形、異種又は弱いシグナルは、遺伝子タンパク質アッセイの読み取りを混乱させる。この問題は、より高レベルの多重化（すなわち四重以上）によってさらに混乱する。したがって、図１２Ａ〜Ｃは、１２Ａが６８℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１２Ｂが７２℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１２Ｃが７６℃のストリンジェンシー洗浄を用いる子宮頸部異形成症症例の顕微鏡写真３点を示す。種々のストリンジェンシーでのこれらの試験は、６８℃のストリンジェンシー洗浄がＨＥＲ２の最良のシグナル（黒色、ＳＩＳＨで検出）を生成することを示した図１３Ａ−Ｃは、１３Ａが６８℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１３Ｂが７２℃のストリンジェンシー洗浄を用い、１３Ｃが７６℃のストリンジェンシー洗浄を用いるＺＲ−７５−１異種移植腫瘍の顕微鏡写真３点を示す。７６℃のストリンジェンシー洗浄がＣｈｒ１７の最良のシグナル（赤色で検出）を生成することが判定された。このように、ＨＥＲ２を６８℃でストリンジェンシー洗浄し、ＨＥＲ２を検出し、Ｃｈｒ１７を７６℃でストリンジェンシー洗浄し、次いで検出した場合（「二重ストリンジェンシー洗浄法（dual stringency wash approach）」）、四重遺伝子タンパク質アッセイが最も明瞭であることが発見された。
【００７９】
ここで図１４Ａ〜Ｂを参照すると、この二重ストリンジェンシー洗浄法を用いるＨＥＲ２遺伝子−タンパク質アッセイの顕微鏡写真が示されており、図１４ＡはＺＲ−７５−１異種移植腫瘍を示し、図１４Ｂは子宮頸部異形成症症例を示す。同様に、図１５Ａ〜Ｂは、この二重ストリンジェンシー洗浄法を用いるＨＥＲ２遺伝子−タンパク質アッセイを示し、この場合図１５Ａは対物レンズ４倍での乳がん腫瘍を示し、図１５Ｂは対物レンズ１００倍での同じ症例を示す。図１５Ｂにおいて、ＨＥＲ２タンパク質はＤＡＢで検出され（褐色）、ＥＲは赤で検出され、ＨＥＲ２遺伝子はＳＩＳＨ（黒色）で検出され、Ｃｈｒ１７は青色で検出される。同様に、図１６Ａ−Ｂは、二重ストリンジェンシー洗浄法を用いるＨＥＲ２遺伝子−タンパク質アッセイを示し、この場合図１６Ａは対物レンズ４倍での乳がん腫瘍を示し、図１６Ｂは対物レンズ１００倍での同じ症例を示す。種々のマーカーが、図１５の記載のように検出される。特に重要なのは、図１６ＡがＨＥＲ２発現に関して有意な腫瘍不均質性を示すことである。特に、視野の左半分は低いＨＥＲ２発現を示し、一方、右半分は強いＨＥＲ２発現を示す。図１６Ｂは、腫瘍のこれらの不均質部分間の境界面の１００倍の視野を示しているため、右側にＨＥＲ２高発現を有し、左側に低発現を有するいくつかの細胞を見ることが可能である。特に興味深いのは、図１６Ｂの左側のこれらの細胞がＨＥＲ２遺伝子増幅を示すものの、増幅されたＨＥＲ２タンパク質発現は示さないことである。本開示の一態様は、ＨＥＲ２タンパク質、ＥＲタンパク質、ＨＥＲ２遺伝子、Ｃｈｒ１７遺伝子の多重読み取りが可能なことがこれまで不可能であった腫瘍の不均質性の理解を可能にすることである。このように、現在記載されているアッセイは、病理学者に診断のための非常に貴重なツールを提供する。
【００８０】
実施例５
不均質性試験
背景：
乳がん患者のＨＥＲ２標的療法の適格性は、ＨＥＲ２遺伝子増幅及びＨＥＲ２タンパク質過剰発現の評価により決定される。遺伝子−タンパク質アッセイ（ＧＰＡ、米国Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）は、単一組織切片を用いるＨＥＲ２免疫組織化学（ＩＨＣ）と二重ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＤＩＳＨ）の同時評価のための新規の方法である。本試験では、本発明者らは、ＧＰＡにより評価されたＨＥＲ２  ＩＨＣとＤＩＳＨの結果間の関係を調べた。さらに、本発明者らは、浸潤性乳がん患者のＨＥＲ２状態と予後との相関を分析した。
【００８１】
患者及び方法：
本試験では、２０００年〜２００１年に埼玉県立がんセンターで治療を受けた２８０名の継続患者（追跡中央値：１３０ヵ月）の浸潤癌組織を調べた。ＨＥＲ２陽性患者では、アジュバントトラスツズマブ療法を受けた患者はいなかった。しかし、ＨＥＲ２陽性再発患者の７６％が再発後にトラスツズマブ療法を受けた。ＧＰＡは、常套的に処理された原発腫瘍の切片で実施され、ＨＥＲ遺伝子及びタンパク質の状態は、次のようなＦＤＡ基準、すなわちＤＩＳＨ（陰性：ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７＜２、陽性：ＨＥＲ２／ＣＥＮ１７≧２．０）及びＩＨＣ（スコア０からスコア３＋）を用いて腫瘍切片の全領域において別々に評価された。ＩＨＣスコア２＋患者群では、ＡＳＣＯ／ＣＡＰ  ２０１３ガイドラインの基準を用い、ＤＩＳＨの結果に従って最終ＨＥＲ２陽性を決定した。ＩＨＣ及びＤＩＳＨの結果によって階層化された無再発生存期間（ＲＦＳ）及びがん特異的生存期間（ＣＳＳ）を分析した。さらに、不均質性のパターンを、次の４つの表現型及び遺伝子型：Ａ）ＩＨＣ２＋／ＤＩＳＨ＋；Ｂ）ＩＨＣ２＋／ＤＩＳＨ−；Ｃ）ＩＨＣ１＋又は０／ＤＩＳＨ＋；及びＤ）ＩＨＣ１＋＆０／ＤＩＳＨ−の共存により分類した。ＩＨＣ０＆１＋群では、不均質性の存在及び予後が分析された。
【００８２】
結果：
ＨＥＲ２  ＩＨＣ３＋群（２７．５％）は、ＨＥＲ２  ＩＨＣ１＋＆０群よりも有意に劣る生存期間を有し（ＲＦＳ：Ｐ＝０．００３９；ＣＳＳ：Ｐ＝０．０３６２）、ＨＥＲ２  ＤＩＳＨ＋群（２７．５％）は、ＨＥＲ２  ＤＩＳＨ−群よりも有意に劣る生存期間を有した（ＲＦＳ：Ｐ＝０．００５６；ＣＳＳ：Ｐ＝０．０４９７）。ＡＳＣＯ／ＣＡＰ基準で定義したＨＥＲ２陽性群は、ＨＥＲ２陰性群よりも有意に劣るＲＦＳを有した（Ｐ＝０．０２１１）。ＨＥＲ２  ＩＨＣ１＋＆０／ＤＩＳＨ＋群は、ＩＨＣ１＋＆０／ＤＩＳＨ−群よりも有意に劣るＲＦＳを有した（Ｐ＝０．０２０８）。ＨＥＲ２  ＩＨＣ１＋＆０／ＤＩＳＨ−群では、不均質性を有する患者（３３例）は不均質性を伴わない患者よりも有意に劣る生存期間を有した（ＲＦＳ：Ｐ＝０．０１７６；ＣＳＳ：Ｐ＝０．０１９９）。ここで図１７Ａ〜Ｂを参照すると、グラフ（１７Ａ）及び表（１７Ｂ）は、遺伝子−タンパク質アッセイにより決定された群別の無再発性生存期間（ＲＦＳ）を示す。ここで図１８Ａ及び１８Ｂを参照すると、グラフ及び表は、遺伝子−タンパク質アッセイにより決定された群別のがん特異的生存期間（ＣＳＳ）を示す。ここで図１９Ａ及び１９Ｂを参照すると、遺伝子タンパク質アッセイ状況において不均質性を評価する有用性が示されている。図２０は、図１９に示されたデータの亜集団を示し、該集団は（ＥＲ、ＰＲについて、及びＦ群内で遺伝子タンパク質アッセイについて−ＴＮＢＣ）トリプルネガティブ乳がんであった。この群において不均質性（ｎ＝３１、非不均質；ｎ＝８、不均質）は、より有意であった（ｐ＝０．０１６  ＨＲ：５．８５）。
【００８３】
ＨＥＲ２  ＧＰＡ技術は、単一細胞レベルでのＨＥＲ２  ＩＨＣ及びＤＩＳＨの結果の不一致及び不均質性を同時に評価するのに有用であり得、ＨＥＲ２腫瘍細胞不均質性の存在は、ＨＥＲ２陰性乳がん患者において強力な予後因子であり得る。ＨＥＲ２腫瘍内不均質性の存在とＨＥＲ２標的療法の有効性との関係に関するさらなる臨床研究を実施しなければならない。ここで図２１Ａ〜Ｂを参照すると、ＨＥＲ２遺伝子及びＨＥＲ２タンパク質の両方で染色された典型的な組織が示されている（図２１Ａは１０倍対物レンズで、図２１Ｂは６０倍対物レンズで示されている）。この特定の乳がん症例を考慮すると、不均質性でスコアを取っているＦ群が臨床研究結果に基づく予後不良を有した理由を説明し得る。いくつかの腫瘍細胞はＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質陽性を有したが、他の領域はＨＥＲ２タンパク質を発現せず、ＨＥＲ２遺伝子増幅を示した。不均質性は、Ｆ群腫瘍症例（ＨＥＲ２  ＩＨＣ陰性＆ＤＩＳＨ陰性）においてＤ群（ＨＥＲ２  ＩＨＣ陰性＆ＤＩＳＨ陽性）細胞に主に起因する。まずＨＥＲ２遺伝子増幅が起こり、ＨＥＲ２タンパク質陽性は後にしか観察されないという推定がされている。図２１Ａにおいて、画像は、ＨＥＲ２  ＩＨＣ及びＤＩＳＨ陽性腫瘍細胞の複数の層並びにＨＥＲ２  ＩＨＣ陰性＆ＤＩＳＨ陽性細胞の単一細胞層を示す。現在の乳房ＨＥＲ２遺伝子及びタンパク質アッセイは、ＨＥＲ２  ＩＨＣアッセイ及びＩＳＨアッセイの両方が乳がん症例の予後の判断及び予測結果の診断能力を強化することを示唆している。
【００８４】
本開示の原理が適用され得る多くの可能な実施態様を考慮して、図示された実施態様は単なる例であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを認識すべきである。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲により既定される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲及び精神の内に入るすべてを本発明者らの発明として請求する。
【図１Ａ−Ｂ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｂ】
0006626097.tif 000011
【図７Ｃ−Ｄ】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図９Ａ−Ｃ】
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【図１０Ａ−Ｂ】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１３Ａ−Ｃ】
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【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６Ａ−Ｂ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【配列表】
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