(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
γリノレン酸誘導体を含み、γリノレン酸誘導体が６００ｍｇ〜９００ｍｇ／日で投与されることを特徴とする、血糖値低減効果を有する、血中および／または肝臓中のトリグリセド（ＴＧ）量を低減させるための、高脂血症および／または脂肪肝の改善剤であって、前記γリノレン酸誘導体が、γリノレン酸メチルエステルまたはγリノレン酸エチルエステルである、前記改善剤。
【請求項２】
少なくとも１０日間投与される、請求項１に記載の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低濃度のγリノレン酸（ＧＬＡ）またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）またはその誘導体を含む高脂血症および／または脂肪肝の改善剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
高脂血症および脂肪肝（アルコール性、非アルコール性）は予備軍も含め増加の一途にある。その治療薬としてはスタチン系薬剤や、フェノフィブラート等のフィブラート系薬剤が挙げられるが、効果が強いものは、肝機能障害、抹消神経障害、腎障害、横紋筋融解症等の副作用も多大なものが多い。特にフィブラート系薬剤は、肝機能障害、腎障害、横紋筋融解症や腫瘍惹起などの問題点がある。スタチン系薬剤は、副作用の弱いものは日本人には効果のないものが多い。
ＥＰＡ製剤やＥＰＡとドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の混和物は、副作用が比較的少ないが、作用点がSREBP1（sterol regulatory element binding protein 1）への働きかけによる肝臓での脂肪合成阻害であり、スタチン系薬剤に比し、その効果が微弱であった。
従って、高脂血症および脂肪肝の治療薬として、副作用が少なく、且つSREBP1以外の作用点に働きかける新たな薬剤の開発が望まれていた。
【０００３】
ＰＰＡＲ（peroxisome proliferator-activated receptors；ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体）は近年見つかった新たな核内受容体である。ＰＰＡＲは、核内に存在しており、α、β、γの３種類のサブタイプを有する。ＰＰＡＲαのリガンドは、主に肝臓のＰＰＡＲαを活性化し、脂質代謝を改善することから、脂質代謝改善、高脂血症治療効果を有することが知られている。ＰＰＡＲβのリガンドは、骨格筋における脂肪酸のβ酸化などを活性化し、インスリン抵抗性を改善し、肥満などを予防する効果を有していることが知られている。ＰＰＡＲγのリガンドは、インスリン抵抗性を改善することから、糖尿病治療効果を有することが知られている。
【０００４】
ＰＰＡＲαやＰＰＡＲγへのフルアゴニストは効果が強い反面、重篤な副作用を惹起することが知られている。近年、パーシャルアゴニストやバイアスドリガンドといった概念の薬剤の開発が望まれているが、有用なものはまだない。また、脂質代謝異常症と糖代謝異常症は合併して発症することも多く、どちらか一方の改善を促す薬剤はあるが、両方を改善する薬剤はない。さらに、脂質代謝異常症（例えば高脂血症）の治療薬は、肝機能障害（例えば脂肪肝）を患う患者には使えない等の制約を受ける。また、脂肪肝は、肝硬変、肝がんへ移行することが近年明らかになってきたことから、生活習慣のみならず、肝臓への障害を伴わない治療薬の開発が望まれていた。そして、糖尿病の治療薬は低血糖等の副作用が問題となり、医師による投薬の管理が必要となり、ＯＴＣでの購入、服用が困難であるという欠点があった。
【０００５】
特許文献１には、共役トリエン酸系油脂を含有する肥満を改善する機能を有する飲食品が記載されているが、γリノレン酸を含むものについては記載されていない。
特許文献２には、γリノレン酸を有効成分とするコレステロール低下剤が記載されているが、γリノレン酸の脂肪肝及び高脂血症の治療効果やＥＰＡとの併用効果については開示されていない。また、特許文献２には、低濃度のγリノレン酸が単独で肝脂肪及び高脂血症の治療に有効であることは記載されていない。
特許文献３には、ＰＰＡＲγ及び／またはＰＰＡＲαに作用する化合物が開示されているが、この化合物はγリノレン酸とは構造が異なる。また、特許文献３には、当該化合物とＥＰＡとの併用効果については開示されていない。
特許文献４には、γリノレン酸のグリセリド体及びそのリパーゼ処理物が、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの両方の活性化能を有することが記載されているが、γリノレン酸が脂肪肝及び高脂血症を治療できることは示されていない。また、特許文献４では、γリノレン酸トリグリセリドとＥＰＡまたはその誘導体を組み合わせて、脂肪肝及び高脂血症を顕著に改善できることは記載されていない。
【０００６】
なお、ω３系列のＥＰＡやＤＨＡはω６系列のアラキドン酸代謝系と拮抗的に働くと一般的に考えられており、ω６系列のγリノレン酸をω３系列のＥＰＡと組み合わせることは行われていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００２−１８６４２４号公報
【特許文献２】特開平２−５３７２６号公報
【特許文献３】特開２００５−４７８７９号公報
【特許文献４】特開２００９−９６７９９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、副作用が少なく、脂質代謝に効果をもたらす、または脂質代謝と糖代謝の両方に効果をもたらす、治療薬および予防薬を提供することを課題とする。また、本発明は、現存する糖尿病治療薬、高脂血症治療薬と併用することにより、高脂血症および／または脂肪肝を改善する効果を有する、治療薬および予防薬を提供することを課題とする。また本発明は、現存する糖尿病治療薬、高脂血症治療薬と併用することにより、糖尿病および高脂血症の両方、糖尿病と肝脂肪の両方を改善する効果を有する、治療薬および予防薬を提供することを課題とする。さらに、本発明は、肝臓への障害が少なく、既存薬ＥＰＡよりも強い効果をもち、作用点が異なる薬剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、γリノレン酸が単独で、肝臓中の中性脂肪（トリグリセリド：ＴＧ）低減効果を有することに加えて、血糖値低減効果を有することを見出した。また、本発明者らは、γリノレン酸またはその誘導体とＥＰＡまたはその誘導体を組み合わせることにより、それぞれ単独の場合と比較して、脂肪肝、高脂血症を有意に改善できることを見出した。さらに、本発明者らは、γリノレン酸が、既存薬のＥＰＡよりも低濃度で高脂血症に効果があることを見出した。
本発明者らは、このようにして本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）γリノレン酸またはその誘導体を含み、γリノレン酸またはその誘導体が２５０ｍｇ〜１５００ｍｇ／日で投与されることを特徴とする、高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
（２）γリノレン酸またはその誘導体およびエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）またはその誘導体を含む、高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
（３）γリノレン酸またはその誘導体が、遊離型γリノレン酸、γリノレン酸トリグリセリド、γリノレン酸メチルエステルまたはγリノレン酸エチルエステルである、（１）または（２）に記載の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
（４）ＥＰＡの誘導体がＥＰＡメチルエステルまたはＥＰＡエチルエステルである、（２）または（３）に記載の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
（５）γリノレン酸またはその誘導体およびＥＰＡまたはその誘導体の合計量が１８００ｍｇ／日以下で投与される、（２）〜（４）のいずれかに記載の高脂血症および／または
脂肪肝の改善剤。
（６）少なくとも１０日間投与される、（１）〜（５）のいずれかに記載の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
（７）血糖値低減効果を有する（１）〜（６）のいずれかに記載の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、肝臓中のＴＧ量を低減させて肝臓中の脂肪を低減することができる。さらに肝臓中の脂肪低減効果に加えて、血糖値を低下させることができる。また、本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体に加えて、ＥＰＡまたはその誘導体を含む場合、肝臓中のＴＧの合成をさらに抑制することができる。さらに、本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、生体内にもともと存在するものに由来するため、毒性の心配が少ない。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】通常の濃度のγリノレン酸またはＥＰＡエチルを投与した場合のＴＧ分泌レシオ（ＴＧＳＲ）値を示す。縦軸はＴＧ濃度（mg/min）を示す。横軸はサンプルの種類を示す。
【図２】低濃度のγリノレン酸またはＥＰＡエチルを投与した場合のＴＧ分泌レシオ（ＴＧＳＲ）値を示す。縦軸はＴＧ濃度（mg/min）を示す。横軸はサンプルの種類を示す。
【図３】KK-Ay/TaJclマウスにおける体重の推移を示す。試験１群は、γリノレン酸投与群、試験２群は、ピオグリタゾン、フェノフィブレート投与群、試験３群は、無添加群である。
【図４】KK-Ay/TaJclマウスにおける血糖値の推移を示す。試験１群は、γリノレン酸投与群、試験２群は、ピオグリタゾン、フェノフィブレート投与群、試験３群は、無添加群である。
【図５】KK-Ay/TaJclマウスにおける長期投与後の血液中、肝臓中のＴＧの値を示す。ＮＣはＰＢＳ投与群、ＧＬＡはγリノレン酸投与群である。
【図６】SDT-Fattyにおける脂肪肝の抑制効果を示す（写真）。試験群１はＰＢＳ投与群、試験群２はγリノレン酸投与群、試験群３はＥＰＡ投与群、試験群４はＥＰＡ＋γリノレン酸投与群である。
【図７】種々の濃度のγリノレン酸のＰＰＡＲαとの反応性を示す。縦軸は活性（％）を示す。横軸は、サンプルの種類及びその濃度を示す。
【図８】種々の濃度のγリノレン酸誘導体のＰＰＡＲγとの反応性を示す。縦軸は活性（％）を示す。横軸は、サンプルの種類及びその濃度を示す。
【図９】ＰＰＡＲγ２のリン酸化阻害試験の結果を示す（写真）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体を単独で、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体の両方を含むことを特徴とする。本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体を単独で含む場合、γリノレン酸またはその誘導体が２５０ｍｇ〜１５００ｍｇ／日で投与されることを特徴とする。
【００１４】
本発明において、「高脂血症改善」とは、血中のＴＧ及び／またはコレステロールの量を低減させることをいう。本発明において、「高脂血症改善」とは、肝臓中のＴＧ濃度を低下させ、それにより、血中に分泌されるＴＧの量を低下させることが好ましい。「脂肪肝の改善」とは、γリノレン酸またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体を投与しないコントロールと比較して、肝臓中のＴＧ濃度が３０％以上低下することが好ましく、４０％以上低下することがより好ましく、４５％以上低下することがさらに好ましい。また、γリノレン酸またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体を投与しないコントロールと比較して、ＴＧ分泌レシオ（ＴＧＳＲ）として示される肝臓から血液への超低密度リポ蛋白質（ＶＬＤＬ）の分泌が３０％以上低下することが好ましく、４０％以上低下することがより好ましく、４５％以上低下することがさらに好ましい。
【００１５】
本発明で使用されるγリノレン酸またはその誘導体としては、遊離型γリノレン酸またはその誘導体、γリノレン酸のグリセリド体などのエステル体が挙げられる。
本発明で使用される「遊離型γリノレン酸」とは、γリノレン酸トリグリセリド、γリノレン酸ジグリセリド、γリノレン酸モノグリセリドのようなグリセリド体は含まない、グリセリンから遊離した、γリノレン酸単独を意味する。
本発明で使用される遊離型γリノレン酸は、市販のものを使用することができる。遊離型γリノレン酸は、CAYMAN CHEMICAL社などより販売されている。本発明で使用される遊離型γリノレン酸は、γリノレン酸トリグリセリドを酵素処理することによってグリセリンから遊離したγリノレン酸を使用してもよいし、月見草の種子などから抽出してもよい。月見草の種子などから抽出したものを酵素処理することによって、遊離したγリノレン酸を使用しても良い。
【００１６】
γリノレン酸の誘導体としては、γリノレン酸トリグリセリド（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸）（GLA-TG）、γリノレン酸ジグリセリド、及びγリノレン酸モノグリセリドなどのγリノレン酸のエステルが挙げられる。
γリノレン酸トリグリセリドは、常法により合成できる。市販品として、NU-CHEK-PREP
Inc社、出光興産株式会社などにより販売されている。また、微生物によって製造されたものでもよい（特開昭63-283589号公報、特開平03-072892号公報、特開平8-214892号公報）。
また、本発明で使用されるγリノレン酸は、γリノレン酸トリグリセリド、γリノレン酸ジグリセリド、及びγリノレン酸モノグリセリドのグリセリド混合物であってもよい。
【００１７】
本発明で使用されるγリノレン酸のエステルの他の態様としては、γリノレン酸と直鎖又は分岐アルコール（グリセロール以外）のエステル体が挙げられ、好ましくは、γリノレン酸エチルエステル（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸エチル）及びγリノレン酸メチルエステル（all-cis-6,9,12-オクタデカトリエン酸メチル）である。
γリノレン酸の誘導体の他の態様としては、γリノレン酸エチル、γリノレン酸メチルなどのγリノレン酸の炭素数１〜４の低級アルキル化体も挙げられる。
これらのγリノレン酸のエステルやアルキル化体は、例えば、γリノレン酸をアルコールと脱水縮合させることにより、または、アルキル化剤で処理することにより得ることができる。
【００１８】
本発明で使用されるＥＰＡの誘導体は、ＳＲＥＢＰ１へ作用し、肝臓での脂肪合成を阻害できる限り限定されないが、ＥＰＡエチルエステルが好ましい。本発明で使用されるＥＰＡのエステルの他の態様としては、ＥＰＡと直鎖又は分岐アルコール（グリセロール以外）のエステル体が挙げられ、好ましくは、ＥＰＡエチルエステル（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-イコサ-5,8,11,14,17-ペンタエン酸エチル）及びＥＰＡメチルエステル（5Z,8Z,11Z,14Z,17Z)-イコサ-5,8,11,14,17-ペンタエン酸メチル）である。
ＥＰＡの誘導体の他の態様としては、ＥＰＡエチル、ＥＰＡメチルなどのＥＰＡの炭素数１〜４の低級アルキル化体も挙げられる。
これらのＥＰＡのエステルやアルキル化体は、例えば、ＥＰＡをアルコールと脱水縮合させることにより、または、アルキル化剤で処理することにより得ることができる。
また、ＥＰＡまたはその誘導体は、ＤＨＡと併用して使用してもよい。
【００１９】
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤の成分であるγリノレン酸またはその誘導体は、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの両方に結合し、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの標的遺伝子の転写を活性化することができる。ＰＰＡＲαの標的遺伝子としては、脂肪酸の酸化に関連する遺伝子である、AOX (Acyl-CoA oxidase)、及び、脂質の輸送などに関連した遺伝子である、FAT (Fatty Acid Transporter)、UCPs (Uncoupling Proteins) (Clapham J.C. et al, Nature 406: 415-418 (2000))、CPT1(Carnitine palmitoyl transferase 1)、ACS(Acetyl-coenzyme A synthetase)が挙げられる。ＰＰＡＲγの標的遺伝子としては、脂質代謝に関連した遺伝子である、レジスチン(Steppan M.C. et al, Nature 409: 307-312 (2001))、レプチンが挙げられる。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤の成分であるγリノレン酸またはその誘導体は、ＣＤＫ５によるＰＰＡＲのリン酸化修飾を阻害し、ＰＰＡＲγの転写を促進することができる。またＰＰＡＲγに直接結合することにより、ＰＰＡＲγの転写を促進することができる。以上よりγリノレン酸およびその誘導体は、ＰＰＡＲのパーシャルアゴニストとして使用することができる。γリノレン酸およびその誘導体は、フルアゴニストで起こる副作用を低減した糖尿病改善薬（インスリン感受性の改善）として使用することができる。
【００２０】
糖尿病の治療または予防効果を発揮し、副作用や細胞毒性を起こさないためには、溶媒（メタノール）対比で、ＰＰＡＲγの活性化能が、３〜６が好ましく、より好ましくは３〜５であり、ＰＰＡＲαの活性化能が、２〜４が好ましく、より好ましくは２〜３である。ＰＰＡＲの活性化は、レポーター・アッセイにより測定されるルシフェラーゼの発現系などのアッセイ系によって測定される。
Biochemical & Biophysical Research Communication 337 (2005) p.440-445のMaterial and methods Luciferase assaysの欄に記載されるように、ＰＰＡＲリガンド結合領域とＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域を有する融合タンパク質を発現するプラスミドと、ＧＡＬ４結合ＤＮＡ配列と連結したルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むプラスミドを、アフリカミドリザル腎細胞ＣＶ−１などの哺乳動物細胞に導入し、γリノレン酸またはその誘導体を入れて、ルシフェラーゼなどのレポーター活性を測定することにより、ＰＰＡＲの活性化を確認することができる。
【００２１】
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、高脂血症治療の他、糖尿病治療、脂肪肝治療、内臓脂肪蓄積抑制、及び脂質異常症治療などの脂質代謝異常症の治療または予防に効果を有する。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、医薬製剤の製造法で一般的に用いられている公知の手段に従って、γリノレン酸またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体を、そのまま、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して投与することができる。本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体を薬理学的に許容し得る担体に配合することによって製造することができる。
薬理学的に許容される担体としては、例えば固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤等が挙げられる。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤の製剤化には、通常製剤化に用いられる各種の成分が任意に使用されるが、その例としては、例えばデンプン、デキストリン、乳糖、コーンスターチ、無機塩類などが挙げられる。
【００２２】
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤の剤型としては、アンプル、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、輸液、ドリンク剤、混合剤等が挙げられるが、特定の剤型のものに限定されるものではない。
製剤中のγリノレン酸またはその誘導体は、製剤がＥＰＡまたはその誘導体を含まない場合、好ましい含有量は、製剤全量に対して１〜９０質量％であり、より好ましくは２０〜８０質量％である。
製剤中のγリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体の好ましい含有量は、製剤全量に対して５〜８５質量％であり、より好ましくは１０〜７０質量％である。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体と、ＥＰＡまたはその誘導体が別々に投与されてもよく、別々に投与される場合、製剤中のγリノレン酸またはその誘導体の好ましい含有量は、製剤全量に対して１０〜８０質量％であり、より好ましくは４０〜７０質量％であり、製剤中のＥＰＡまたはその誘導体の好ましい含有量は、製剤全量に対して１０〜８０質量％であり、より好ましくは４０〜７０質量％である。
【００２３】
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤の投与方法としては特に制限されないが、経口投与が好ましい。好ましい投与量は、投与対象、年齢、性別、体重、対象臓器、症状、投与方法などにより異なり特に制限されないが、γリノレン酸またはその誘導体が単独で投与される場合、例えば、患者に対して、γリノレン酸またはその誘導体の量が、好ましくは２５０ｍｇ／日〜１５００ｍｇ／日であり、より好ましくは２５０ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日であり、例えば、１５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、または４５０ｍｇ／回を１日３回である。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体およびＥＰＡまたはその誘導体の両方が投与される場合、例えば、患者に対して、γリノレン酸またはその誘導体の量とＥＰＡまたはその誘導体の量の合計が、好ましくは５００ｍｇ／日〜３０００ｍｇ／日であり、より好ましくは５００ｍｇ／日〜１５００ｍｇ／日であり、例えば、３００ｍｇ／回、６００ｍｇ／回、または９００ｍｇ／回を１日３回である。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体と、ＥＰＡまたはその誘導体が別々に投与されてもよく、別々に投与される場合、例えば、患者に対して、γリノレン酸またはその誘導体の量およびＥＰＡまたはその誘導体の量が、それぞれ、好ましくは２５０ｍｇ／日〜１５００ｍｇ／日であり、より好ましくは２５０ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日であり、例えば、１５０ｍｇ／回、３００ｍｇ／回、または４５０ｍｇ／回を１日３回である。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体を含む場合、γリノレン酸またはその誘導体の投与量と、ＥＰＡまたはその誘導体の投与量との合計を上記範囲内とすればよく、γリノレン酸またはその誘導体の投与量と、ＥＰＡまたはその誘導体の投与量は、好ましくは２：１〜１：２、より好ましくは等量である。
本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、γリノレン酸またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体およびＥＰＡまたはその誘導体が少なくとも１０日、好ましくは１０〜２０日間投与されることを特徴とする。
【００２４】
本発明のγリノレン酸またはその誘導体、あるいは、γリノレン酸またはその誘導体及びＥＰＡまたはその誘導体を含む高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、医薬品、医薬部外品等の皮膚外用剤に含有させることができる。医薬品または医薬部外品としては、軟膏剤、クリーム剤、外用液剤等の医薬品等が挙げられる。
また、本発明の皮膚外用剤には前記生理活性組成物のほか本発明の効果を損なわない範囲で医薬部外品などの皮膚外用剤に配合される成分、油分、高級アルコール、脂肪酸、紫外線吸収剤、粉体、顔料、界面活性剤、多価アルコール・糖、高分子、生理活性物質、溶媒、酸化防止剤、香料、防腐剤等を配合することができる。
【実施例】
【００２５】
以下に、実施例を挙げて、本発明について更に詳細に説明を加えるが、本発明が、これら実施例にのみ、限定を受けないことは言うまでもない。
【００２６】
実施例１．高脂肪食と薬剤を経口投与した後のトライトンを用いたＴＧＳＲ試験（通常の濃度のGLAの高脂血症改善効果）
SDラット（１０週令、雄、日本クレアより購入）を高脂肪食（ＨＦＤ３２：日本クレアより購入）の自由摂取、ＳＰＦ条件下で１週間飼育し、一群５匹で５群に分け、次の一週間は高脂肪食を自由摂取させながら、毎日GLA（1000mg/kg体重/日）、EPAエチル（1000mg/kg体重/日）、NC（0.5%CMC（カルボキシメチルセルロース）溶液３５０μｌ/日）をゾンデにて経口投与した。
最終投与後、尾静脈よりＴＲＩＴＯＮ（ＷＲ１３３９：シグマアルドリッチより購入）を400mg/kgを投与し、経時的に（投与前、投与後１時間、２時間、３時間）採血し、ＴＧＳＲを算出した。さらに、採血終了後、イソフルラン吸入麻酔下において腹部大動脈より血液採取し、血漿を分離した。さらに肝臓を摘出し、ＴＧの測定に供した。
算出は、J. D. Bagdade et al, Metabolism, vol 25, No.5, p533-542 (1976)に記載の方法に従った。具体的には、トライトン投与直後の血中ＴＧ値（ＴＧ０）、一時間後、二時間後の血中ＴＧ値（ＴＧ１，ＴＧ２）を測定し、ＴＧ０→ＴＧ１、ＴＧ０→ＴＧ２の血中ＴＧ値の１分当たりの増加を算出平均し、体重から換算した血清量（ＰＶＳＥ）で補正して算出した。
その結果、コントロール群に比べ、ＧＬＡ投与群、ＥＰＡエチル群で減少し、ともに効果を確認したが、ＧＬＡとＥＰＡに効果の大きな差は確認できなかった（図１）。
【００２７】
実施例２．高脂肪食と薬剤を経口投与した後のトライトンを用いたＴＧＳＲ試験（低濃度のGLAの高脂血症改善効果）
ウイスターラット（１０週令、雄、日本クレアより購入）を高脂肪食（ＨＦＤ３２：日本クレアより購入）の自由摂取、ＳＰＦ条件下で３日間飼育し、一群６匹で３群に分け、次の一週間は高脂肪食を自由摂取させながら、毎日ＧＬＡ（500mg/kg体重/日）、ＥＰＡエチル（500mg/kg体重/日）、NC（0.5%CMC(カルボキシメチルセルロース）溶液７００μｌ/kg/日）を経口投与（ゾンデ）した。最終投与後、尾静脈よりＴＲＩＴＯＮ（ＷＲ１３３９：シグマアルドリッチより購入）を400mg/kgを投与し、経時的に（投与前、投与後１時間、２時間、３時間）採血し、ＴＧＳＲを算出した。
経時的に採取した血液中の総コレステロール値と血中ＴＧ量を東京貿易メディシス社製ビオリス２４Ｉプレミアムにて測定した。算出はJ. D. Bagdade et al, Metabolism, vol
25, No.5, p533-542 (1976)に記載の方法に従った。結果を図２に示す。
ＴＧＳＲはコントロール群、ＥＰＡ投与群に比べ、ＧＬＡ投与群で有意に減少した。
実施例１，２のＴＧＳＲ試験の結果より、ＥＰＡエチル（エパデール）が通常投与される濃度（1000mg/kg体重/日）の半分の濃度（500mg/kg体重/日）であっても、ＧＬＡ（500mg/kg体重/日）はラットにおいて効果が見られたことから、ＥＰＡエチル（エパデール）のヒトへの通常投与量（６００ｍｇ×３回／日＝１８００ｍｇ／日）の１／３〜１／２程度の投与量（６００ｍｇ〜９００ｍｇ／日）のＧＬＡはヒトに対して効果を有すると考えられる。
【００２８】
実施例３．薬剤を経口投与したKK-Ay/TaJclマウスの血糖値の推移試験（GLAの血糖値改善効果）、および血中ＴＧ、肝臓中ＴＧ低減効果試験
KK-Ay/Tajcl７週令雄マウスを１群７匹で３群準備し、ＳＰＦグレードでバイオバブル内にて飼育した（一匹ずつ飼育）。給水は高圧蒸気滅菌したものを給水ボトルで給水、餌はＣＥ−２（放射線滅菌）を自由摂取させた。
経口投与する薬剤は、滅菌生理食塩水を７０ｍｌ×３本準備し、（１）発酵ＧＬＡ油（全脂肪酸中ＧＬＡ−ＴＧ体を３０％含有）を２ｍｌ添加、（２）ピオグリタゾン６０ｍｇ、フェノフィブレート６００ｍｇ、ＣＭセルロース０．３５ｇを加え、溶解する、（３）
無添加を準備し、毎日０．５ｍｌ／匹／日をゾンデにて経口投与（土曜、日曜は投与無し）、週一回体重測定した（図３）。体重に有意な差は見られず、投与する薬剤による問題は見られなかった。
２０日間（４週間）摂餌量は週２回測定し、血糖値は毎週一回食事後に測定した（アキュチェックアビバ：ロシュダイアグノスティックス社製で測定。）。その結果、試験（１）群は試験（３）群に比べて、血糖値の上昇を抑制した（図４）。
さらに長期投与終了後に血中および肝臓中のＴＧを、リオリス２４Ｉプレミアム（東京貿易社製）を用いて測定した。その結果、試験（１）群で肝臓中ＴＧの著減を確認した（図５）。
【００２９】
実施例４．SDT-FattyへのＧＬＡ、ＥＰＡの長期投与による脂肪肝の抑制効果
SDT-Fatty(Homo) ５週令雌マウス４匹は日本クレアより購入した。ＳＰＦ条件下で一匹ずつケージにて飼育した。
給水は高圧蒸気滅菌した１％ＮａＣｌ溶液を用い、自由摂取とした。給餌はＣＥ−２（放射線滅菌）を用い、自由摂取とした。４匹を４群にわけ、（１）ＰＢＳ、（２）ＧＬＡ（遊離型９８％純度）を０．２ｃｃ／匹／日、１０日間、０．４ｃｃ／匹／日、１０日間投与（ゾンデにて経口投与）、（３）ＥＰＡ（遊離型９８％純度）のＧＬＡと同様の投与、または、（４）ＧＬＡ、ＥＰＡを上記（２）、（３）の半量ずつ経口投与した。投与後、イソフルランにて吸入麻酔後、腹部大動脈より血液採取したのち、開腹、肝臓を摘出後、肝組織標本を作製し、オイルレッドにて肝脂肪を染色した。結果を図６に示す。
試験群（１）〜試験群（３）において、小葉中心〜中間帯にオイルレッド０陽性の脂肪滴が観察されたが、試験群（４）ではオイルレッド０陽性がほとんど観察されなかった。すなわち、ＧＬＡ、ＥＰＡの併用群にてＰＢＳ投与群（対照群）である（１）群に比べ著しい肝臓脂肪の低減を確認した（図６）。
【００３０】
実施例５．レポータージーンアッセイによるPPAR受容体への作用確認
ＰＰＡＲの活性化能の測定は、Tsuyoshi Gotoら、Biochemical & Biophysical Research Communication 337 (2005) p.440-445、「Phytol directly activates proliferator-activated receptor α (PPARα) and regulates gene expression involved in lipid metabolism in PPARα-expressing HepG2 hepatocytes」のMaterial and methods Luciferase assaysの欄を参照して行った。詳細には、ＰＰＡＲリガンド活性は、ＰＰＡＲリガンド結合領域とＧＡＬ４  ＤＮＡ結合領域との融合タンパクに対する結合および標的遺伝子活性化をルシフェラーゼの発現で評価するレポーター・アッセイにより測定した。このアッセイにおいて、サンプルの活性は、溶媒対照と比較し、溶媒対照よりも有意に高い活性を示した。ルシフェラーゼ活性の検出は、FEBS Letters 514 (2002) 315-322に記載されるような、レポータージーンアッセイ法を用いた。
具体的には、アフリカミドリザル腎細胞ＣＶ−１（宿主細胞）に、ＰＰＡＲリガンド結合領域とＧＡＬ４ ＤＮＡ結合領域の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むプラスミドと、ＧＡＬ４結合ＤＮＡ配列にルシフェラーゼをつないだレポータープラスミドを導入し、この細胞に、サンプルを添加して、インキュベートした後にルシフェラーゼ活性の検出を行った。ブランクはＤＭＳＯで実施した。
【００３１】
ＰＰＡＲリガンド活性化率の計算方法は以下の通りとした。測定はｎ＝５で行い、ウミホタルルシフェラーゼ化学発光強度にウミシイタケルシフェラーゼ化学発光強度を除すことによって各々の比率を求めた。ブランクにおける比率を１００％とし、その他のサンプルについてＰＰＡＲ活性を％で示した。図７にＧＬＡのＰＰＡＲαへの作用性を示す。また図８にＧＬＡメチルエステルとＧＬＡエチルエステルのＰＰＡＲγへの作用性を示す。
サンプルはＧＬＡ、ＧＬＡメチルエステル、ＧＬＡ-エチルエステルの３種でＰＰＡＲαを使用した結果、γへの作用性を試験した結果、ＰＰＡＲαではＧＬＡが、ＰＰＡＲγではＧＬＡメチルエステルおよびＧＬＡエチルエステルが、濃度依存的にＰＰＡＲ活性が
増加した。
さらに、ＧＬＡによるＰＰＡＲγ２のリン酸化阻害に関しても試験した。リコンビナントで作製したＰＰＡＲγ２受容体蛋白質１μｇと種々の濃度のＧＬＡ、ＣＤＫ（リン酸化酵素：ミリポア社製）、リン酸化基質、緩衝液（セルシグナリング社製）を加え、３０℃にて３０分反応させたのち、SDS-PAGE2×サンプルバッファーを10μL添加、95℃、5分間熱処理を行い、SDS-PAGE用のサンプルとした。SDS-PAGEには10μLをアプライした。SDS-PAGE後、バイオラッドウエスタンブロッティング装置を用いPVDF膜に100V、1時間転写を行った。
ブロッティングしたPVDF膜をブロッキング剤（ナカライテスク社ブロッキングワン）で4℃、一晩ブロッキングを実施した。ブロッキング後、１次抗体（Phospho-(Ser) CDKs Substrate (P-S2-100) Rabbit mAb、Cell Signaling Technology社、4℃、一晩）、２次抗体（抗ウサギIgG抗体HRP標識、ナカライテスク社、室温１時間反応後ECL plusを用いてリン酸化Serを検出した。検出には、Image Quant LAS4000を用いた。結果を図９に示す。ＧＬＡの濃度に依存してリン酸化の阻害が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００３２】
本発明により、高脂血症および／または脂肪肝の改善剤を提供することができる。本発明の高脂血症および／または脂肪肝の改善剤は、様々な生理効果（高脂血症治療、糖尿病治療、脂肪肝治療、内臓脂肪蓄積抑制、または脂質異常症治療等）を奏し、医薬用途に展開可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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