(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞における神経毒ポリペプチドの生物活性を直接決定する方法であって、
a)神経毒中毒に感受性のある細胞を神経毒ポリペプチドと共にある時間、神経毒ポリペプチドがその生物活性を発揮できる条件下でインキュベートするステップと、
b)細胞を固定するステップと、
c)細胞を、神経毒に切断されていない基質及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体、並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体と、前記捕捉抗体が前記基質に結合できる条件下で接触させるステップと、
d)細胞を、第1の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第1の検出抗体と、前記第1の検出抗体が前記第1の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第1の検出複合体を形成し、第2の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第2の検出抗体と、前記第2の検出抗体が前記第2の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第2の検出複合体を形成するステップであって、第1の検出抗体と第2の検出抗体は、異なる酵素にコンジュゲートされている、前記ステップと、
e)ステップd)の第1及び第2の検出複合体の量を決定するステップと、
f)第2の検出複合体を用いて、前記細胞において前記神経毒ポリペプチドによって切断された基質の量を算出し、それにより前記細胞における前記神経毒ポリペプチドの生物活性を決定するステップと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
蛍光法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
神経毒ポリペプチドが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G又はTeNTである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
基質が、VAMP/シナプトブレビン、SNAP-25又はシンタキシンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、初代神経細胞、神経芽細胞腫細胞などの、神経細胞に分化することができる腫瘍細胞、P19細胞若しくは人工多能性幹細胞(iPS)由来ニューロンからなる群から選択される神経細胞又は神経分化した細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞を固定するステップが、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド又はその混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって実行される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
神経毒に切断されていない基質及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体により、細胞における神経毒基質の全量を決定することが可能になる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
神経毒に切断されていない基質及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する前記第1の捕捉抗体が、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684、ウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19708(Pierce Antibodies)又はウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19701(Pierce Antibodies)である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第2の捕捉抗体が、配列番号２０〜２２に示されるCDRH1、CDRH2及びCDRH3並びに配列番号２３〜２５に示されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む抗体又はマウスモノクローナル抗体MC-6053(R&D Systems)である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第1及び/又は第2の捕捉抗体が固定されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第1の検出抗体が、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体又は蛍光色素にコンジュゲートされた抗体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第2の検出抗体が、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体、グルコースオキシダーゼコンジュゲート抗体、チロシナーゼコンジュゲート抗体又はβガラクトシダーゼ抗体である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
HRP基質が、Amplex(商標) UltraRed、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)又は3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(HPPA)である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
AP基質が、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸(DiFMUP)などの4-メチルウンベリフェリルリン酸誘導体又はフルオレセイン二リン酸(FDP)である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
a)第1の捕捉抗体、第2の捕捉抗体、第1の検出抗体及び第2の検出抗体の構成体であって、前記第2の捕捉抗体は、配列番号２０〜２２に示されるCDRH1、CDRH2及びCDRH3並びに配列番号２３〜２５に示されるCDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む抗体であり、且つ前記構成体は、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実行可能にするものである、前記構成体と、
b)a)による構成体によって決定された第1及び第2の検出複合体の量に基づいて前記神経毒によって切断された基質の量を算出する手段と、
c)前記方法を実行するための説明書と、
を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項１６】
ステップb)が細胞を固定し、且つ細胞を界面活性剤で透過処理することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞における神経毒ポリペプチドの生物活性を直接決定する方法であって、a)神経毒中毒に感受性のある細胞を神経毒ポリペプチドと共にある時間、神経毒ポリペプチドがその生物活性を発揮できる条件下でインキュベートするステップと、b)細胞を固定し、任意選択で、細胞を界面活性剤で透過処理するステップと、c)細胞を、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体、並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体と、前記捕捉抗体が前記基質に結合できる条件下で接触させるステップと、d)細胞を、第1の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第1の検出抗体と、前記第1の検出抗体が前記第1の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第1の検出複合体を形成し、第2の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第2の検出抗体と、前記第2の検出抗体が前記第2の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第2の検出複合体を形成するステップと、e)ステップd)の第1及び第2の検出複合体の量を決定するステップと、f)第2の検出複合体を用いて、前記細胞において前記神経毒ポリペプチドによって切断された基質の量を算出し、それにより前記細胞における前記神経毒ポリペプチドの生物活性を決定するステップとを含む方法に関する。本発明は、本発明の方法を実行するためのキットを更に提供する。
【背景技術】
【０００２】
ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)及び破傷風菌(Clostridium tetani)は、非常に強力な神経毒、即ちボツリヌス毒素(BoNT)及び破傷風毒素(TeNT)をそれぞれ産生する。これらのクロストリジウム神経毒(CNT)は、神経細胞に特異的に結合し、神経伝達物質の放出を混乱させる。各毒素は、不活性なプロセシングされていないおよそ150kDaの単鎖タンパク質として合成される。翻訳後プロセシングは、ジスルフィド架橋の形成及び細菌プロテアーゼによるタンパク質限定加水分解(ニッキング)に関係する。活性神経毒は、ジスルフィド結合により連結された2本の鎖、およそ50kDaのN末端軽鎖及びおよそ100kDaの重鎖からなる。CNTは、構造的及び機能的に3つのドメイン、即ち触媒的軽鎖、移行ドメイン(N末端半分)を包含する重鎖及び受容体結合ドメイン(C末端半分)からなり、例えば、Krieglstein 1990、Eur. J. Biochem. 188、39頁、Krieglstein 1991、Eur. J. Biochem. 202、41頁、Krieglstein 1994、J. Protein Chem. 13、49頁を参照のこと。ボツリヌス神経毒は、150kDaの神経毒タンパク質及び付随する非毒性タンパク質を含む分子複合体として合成される。複合体のサイズは、クロストリジウム株及び固有の神経毒血清型に基づいて300kDaから、500kDaより大きい及び900kDaの範囲で異なる。これらの複合体中にある非毒性タンパク質は、神経毒を安定化し、分解から保護している、Silberstein 2004、Pain Practice 4、S19〜S26を参照のこと。
【０００３】
ボツリヌス菌は、ボツリヌス神経毒(BoNT)A〜Gと称される7つの抗原的に固有の血清型を分泌する。破傷風菌によって分泌される関連する破傷風神経毒(TeNT)と共に、全ての血清型は、SNAREタンパク質を切断することによってシナプスエキソサイトーシスを遮断するZn2+エンドプロテアーゼである、Couesnon、2006、Microbiology、152、759頁を参照のこと。CNTは、ボツリヌス菌中毒及び破傷風に見られる弛緩性筋麻痺の原因になる、Fischer 2007、PNAS 104、10447頁を参照のこと。
【０００４】
その毒性作用にもかかわらず、ボツリヌス毒素複合体は、多くの疾患において治療薬として使用されてきた。ボツリヌス毒素血清型Aは、斜視、眼瞼痙攣及び他の障害の治療用として1989年に米国においてヒト用として承認された。それは、ボツリヌス毒素A(BoNT/A)タンパク質製剤として、例えば、商品名BOTOX(Allergan, Inc.)又は商品名DYSPORT/RELOXIN(Ipsen, Ltd)で市販されている。改良された、複合体を含まないボツリヌス毒素A製剤は、商品名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals, LLC)で市販されている。治療適用の場合、製剤は、治療しようとする筋肉に直接注射される。生理的pHで、毒素はタンパク質複合体から遊離し、所望の薬理効果が起こる。ボツリヌス毒素の効果は一時的でしかなく、それが、治療的な影響を維持するためにボツリヌス毒素の反復投与が必要とされ得る理由である。
【０００５】
クロストリジウム神経毒は、随意筋力を弱め、斜視、頸部ジストニアを含む局所性ジストニア及び良性特発性眼瞼痙攣に対して有効な治療である。それらは、片側顔面痙攣及び局所性痙直の緩和、更に胃腸障害、多汗症並びに美容上のしわ修正など広範な他の適応症に有効であることが更に示されてきた、Jost 2007、Drugs 67、669頁を参照のこと。
【０００６】
クロストリジウム神経毒の製造過程の間の、前記神経毒の定性的及び定量的な決定並びに生物活性がある神経毒ポリペプチドの品質管理は特に重要なものである。加えて、政府機関は、単純で、信頼性が高く、検証されたボツリヌス毒素活性アッセイしか受け入れない。現在のところ、致死率試験であるマウスLD50生物アッセイが、依然として製剤の効力を分析するために医薬品製造業者によって使用される「ゴールドスタンダード」である、Arnonら(2001)、JAMA 285、1059〜1070頁を参照のこと。しかしながら、近年、動物実験の必要性並びにこの種の動物に基づくアッセイに付随する全ての短所、経費及び倫理的問題を軽減するための代替手法を求めて多くの取り組みが行われてきた。加えて、管理機関は、製薬会社がボツリヌス神経毒の効力試験に3「R」の原則:「使用数削減、苦痛軽減、代替法利用」を適用することを約束している、Straughan、Altern. Lab. Anim. (2006)、34、305〜313頁を参照のこと。その結果、生きている動物を使用する方法の合理的な代替法を実現するために、細胞に基づく試験系が開発された。にもかかわらず、今のところ、神経毒ポリペプチドに対して十分な感応性があることが示された3つの細胞試験系だけが神経毒生物活性の決定に利用できる。これらの細胞に基づく試験系には、in vitroで分化させた齧歯類の胚から単離した初代ニューロン[Pellettら(2011)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 404、388〜392頁]、ニューロン分化した人工多能性幹細胞[Whitemarshら(2012)、Toxicol. Sci. 126、426〜35頁]、及びSiMa細胞系のサブクローン(WO2010/105234 A1)の使用がある。
【０００７】
しかしながら、初代ニューロンの単離には、動物の屠殺が必要であり、多くの労力を要し時間がかかる。更に、異なる初代ニューロンを使用する試験系は大きな変動を示す。同様に、ニューロン分化した人工多能性幹細胞の生成は困難であり、時間がかかる。加えて、そのような細胞の保存には大いに問題がある。腫瘍細胞系を使用するアッセイは、しばしばBoNTに対して十分な感応性がない。更に、大きな変動及び/又は高い失敗率をもたらす前記細胞系を使用するアッセイの前記腫瘍細胞系には複雑な分化手順が必要とされる。
【０００８】
当技術分野において記述されるクロストリジウム神経毒の生物活性を決定するアッセイには、細胞溶解物中の切断された神経毒基質の量によって神経毒活性が定量化されるウェスタンブロット解析がある。他のアッセイにおいて、クロストリジウム神経毒の活性は、電気化学発光(ECL)サンドイッチELISAによって測定される、WO2009/114748 A1を参照のこと。またこの場合、クロストリジウム神経毒の生物活性は、細胞溶解物から単離した後の、切断されたクロストリジウム神経毒基質の検出によって決定される。更に、両方のアッセイでは、神経毒基質を濃縮しなければならない。
【０００９】
上記を踏まえて、政府機関にとって許容可能であり及び/又は動物に基づく試験系の代替法を提供する神経毒ポリペプチド活性を決定する更なる試験系が大いに望まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、上述した必要性を満たす手段及び方法の提供とみなすことができる。技術的問題は、特許請求の範囲及び本明細書の以下で特徴づけられる実施形態によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第一の態様において、本発明は、細胞における神経毒ポリペプチドの生物活性を直接決定する方法であって、
a)神経毒中毒に感受性のある細胞を神経毒ポリペプチドと共にある時間、神経毒ポリペプチドがその生物活性を発揮できる条件下でインキュベートするステップと、
b)細胞を固定し、任意選択で、細胞を界面活性剤で透過処理するステップと、
c)細胞を、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体、並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体と、前記捕捉抗体が前記基質に結合できる条件下で接触させるステップと、
d)細胞を、第1の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第1の検出抗体と、前記第1の検出抗体が前記第1の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第1の検出複合体を形成し、第2の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第2の検出抗体と、前記第2の検出抗体が前記第2の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第2の検出複合体を形成するステップと、
e)ステップd)の第1及び第2の検出複合体の量を決定するステップと、
f)第2の検出複合体を用いて、前記細胞において前記神経毒ポリペプチドによって切断された基質の量を算出し、それにより前記細胞における前記神経毒ポリペプチドの生物活性を決定するステップと
を含む方法に関する。
【００１２】
本発明の方法は、細胞における神経毒ポリペプチドの生物活性の直接決定を可能にする。これは、当技術分野において記述される方法のような細胞の溶解及び細胞溶解物からの切断された神経毒基質の単離又は濃縮がもはや必要ないことを意味する。例えば、当技術分野のウェスタンブロット解析に基づくアッセイにおいて、神経毒基質は、SDSポリアクリルアミドゲル中のそれぞれのサンプル成分の分離及び濃縮によって濃縮される。当技術分野において記述される上述のECLサンドイッチELISAにおいて、神経毒基質の濃縮は、切断された神経毒基質に特異的に結合する抗体を使用することにより細胞溶解物が添加されたマイクロタイタープレート上で実行される。切断された神経毒基質は、前記切断されたクロストリジウム神経毒基質を濃縮する前述の抗体の結合によって溶解物から単離される。対照的に、SNAP-25について例示されるように、本発明の方法では、切断された神経毒基質を細胞内で直接検出することができる。この目的のために、本明細書の他の場所でより詳細に定義した神経毒中毒に感受性のある細胞を神経毒ポリペプチドと共にある時間、神経毒ポリペプチドが生物活性を発揮できる条件下でインキュベートする。次のステップにおいて、細胞を、例えばメタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド又は前述の固化剤の混合物などの固化剤の添加によって細胞を固定する。任意選択で、Triton X-100、Tween 20、サポニン、ジギトニン又はn-オクチル-β-グルコピラノシドなどの、本明細書の他の場所で定義される少なくとも1つの界面活性剤を使用することによって細胞を透過処理することができる。界面活性剤は、PBSなど適当な緩衝液に含めることができる。その後、細胞を、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体、並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体と、前記捕捉抗体が前記基質に結合できる条件下で接触させる。本明細書において、第1の捕捉抗体は、切断されていない及び神経毒に切断された神経毒基質の両方に存在する適当なエピトープに特異的に結合することにより、細胞内の神経毒基質の全含有量又は量を決定することができる。第2の捕捉抗体は、例えば、神経毒基質中の神経毒に切断された部位に特異的に結合することにより、切断された神経毒基質だけに存在するエピトープを認識し、それに特異的に結合する。別法として、細胞を前記第1及び第2捕捉抗体の混合物と接触させることができ、即ち、前述の条件下で、細胞を少なくとも第1の捕捉抗体及び少なくとも第2の捕捉抗体と同時に接触させる。次のステップにおいて、細胞を、第1の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第1の検出抗体と、前記第1の検出抗体が前記第1の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第1の検出複合体を形成する。その後のステップにおいて、細胞を、第2の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第2の検出抗体と、前記第2の検出抗体が前記第2の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第2の検出複合体を形成する。別法として、細胞を前記第1及び第2の検出抗体の混合物と接触させることができ、即ち、前述の条件下で、細胞を少なくとも第1の検出抗体及び少なくとも第2の検出��体と同時に接触させる。別法として、細胞の透過処理後に、前述の条件下で、細胞を前記第1及び第2の捕捉抗体並びに前記第1及び第2の検出抗体の混合物と同時に接触させることができる。次のステップにおいて、第1及び第2の検出複合体の量を決定する。最後に、第2の検出複合体を用いて、前記細胞において前記神経毒ポリペプチドによって切断された基質の量を算出する。それにより、前記神経毒ポリペプチドの生物活性を細胞において直接決定する。
【００１３】
図は以下の通り示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の細胞に基づくアッセイの作用機序を表す線図である。神経毒中毒に感受性のある細胞をマルチウェルプレートに播種し、その後、細胞を神経毒ポリペプチドで中毒にし、所与の中毒時間の後に細胞を固定する。神経毒切断されたSNAP-25に対する特異的抗体及び切断されていないSNAP-25に対する特異的抗体を、SNAP-25の特異的結合部位に結合させる。酵素結合抗宿主特異的二次抗体を使用し、これらの結合事象を使用して、神経毒に切断されたSNAP-25の濃度及びウェル内のSNAP-25の全量と相関する測定可能なシグナルを生成することができる。BoNT/A濃度を高めることで、測定される切断されたSNAP-25の量を増加させ、シグナルの利得を得られる。
【図２】実施例2によるiPS由来ニューロン及びSiMa細胞について得られたBoNT/A較正曲線を表す2つのグラフである。それらは、BoNT/Aの濃度と活性、及びHRP基質について決定された蛍光シグナル(RFU)とウェル内のSNAP-25の全量に対して標準化されたBoNT/Aに切断されたSNAP-25の含有量それぞれの依存関係を示す。BoNT/Aの濃度及び活性をそれぞれ増加させることにより、より多くのSNAP-25が神経毒によって変換され、切断されたSNAP-25の含有量が増加する。
【図３】実施例4によるiPS由来ニューロンについて得られたBoNT/A較正曲線を表すグラフである。それは、BoNT/Aの濃度と活性、並びにHRP基質について決定された蛍光シグナル(RFU)とウェル内のSNAP-25の全量に対して標準化されたBoNT/Aに切断されたSNAP-25の含有量及びBoNT/Aに切断されたSNAP-25の含有量それぞれの依存関係を示す。BoNT/Aの濃度及び活性をそれぞれ増加させることにより、より多くのSNAP-25が神経毒によって変換され、切断されたSNAP-25の含有量が増加する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下において、本発明の方法がより詳細に記述される。細胞培養の場合、神経細胞、SiMa細胞又はiPS由来ニューロンなど本明細書に定義される神経毒中毒に感受性のある細胞は、96ウェルマイクロタイタープレートに先ず播種される。SiMa細胞は、例えば、WO2010/105234に開示される手順によりニューロン表現型に分化され、iPS由来ニューロンは、例えば、WO2012/135621に記述されるアッセイによりニューロン表現型に分化される。次いで、細胞は、BoNT/Aなどの神経毒ポリペプチドで約72時間、中毒にする。その後のステップにおいて、ELISAアッセイの前に、細胞をマイクロタイタープレートに固定する。細胞を固定するために、例えば、氷冷メタノール(-20℃)を、-20℃で20分間細胞に添加することができる。
【００１６】
ELISAアッセイを実施する場合、細胞は先ず洗浄される。洗浄緩衝液として、例えば、10mM PBS緩衝液(pH7.4)中の0.1% Triton X-100を使用することができる。その後、内在性プロテアーゼが、10mM PBS(pH7.4)に0.6% H2O2などの失活緩衝液によって失活され、続いて別の洗浄ステップを行う。以下のステップにおいて、マイクロタイタープレート上の遊離の結合部位は、例えば、10mM PBS緩衝液(pH7.4)に2%BSA及び0.05% Triton X-100など適当なブロッキング緩衝液によってブロッキングされる。次いで、細胞は、適当な界面活性剤を使用することにより透過処理される。透過処理緩衝液として、例えば、10mM PBS緩衝液に0.5% Triton X-100を利用することができる。透過処理は、形成される孔を通じた細胞内の抗体の拡散を可能にする。その後、細胞は、上述の通り洗浄緩衝液によって洗浄される。
【００１７】
次のステップにおいて、透過処理された細胞は、例えば、異なる2つの抗体の混合物と共にインキュベートされる。混合物は、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体を含む。前記第1及び第2の捕捉抗体を連続して適用することもできる。例えば、第1の捕捉抗体は、切断されていない及び神経毒に切断されたSNAP-25の両方に特異的に結合することができ、それにより細胞内のSNAP-25の全量又は全含有量の定量化が可能になる。更に、本明細書に記載の評価の際には、この第1の捕捉抗体を使用して細胞内の切断されたSNAP-25の量を標準化することができる。第2の捕捉抗体は、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合し、したがってBoNT/Aに切断されたSNAP-25など切断された神経毒基質の決定及び検出が可能になる。
【００１８】
本発明の方法における全神経毒基質及び神経毒に切断された神経毒基質の以下の検出は、マイクロタイタープレート又は細胞培養皿上で、即ち細胞内で直接実行することができる。有利なことに、したがって、本発明の方法では、当技術分野において記述される方法のように細胞抽出物を調製し、細胞溶解物から神経毒基質を単離及び/又は濃縮する必要がない。その後、細胞を洗浄して、それぞれの抗原に結合していない過剰な抗体を除去する。その後のステップにおいて、透過処理された細胞を、少なくとも第1の検出抗体及び少なくとも第2の検出抗体と接触させる。前記抗体を、混合物として、即ち同時に又は連続して適用することができる。第1の検出抗体は、第1の捕捉抗体に特異的に結合する。それによって、第1の検出複合体が形成される。第1の検出抗体は、第1の捕捉抗体が由来する種に対して作ることができる。例えば、切断されていない及びBoNT/Aに切断された基質SNAP-25に特異的に結合する第1の捕捉抗体としてウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684(Sigma)が使用される場合、抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート抗体を第1の検出抗体として使用することができる。第2の検出抗体は、第2の捕捉抗体に特異的に結合する。それによって、第2の検出複合体が形成される。第2の検出抗体は、第2の捕捉抗体が由来する種に対して作ることができる。例えば、BoNT/Aに切断されたSNAP-25に特異的に結合する第2の捕捉抗体として本明細書の他の場所に記述される本発明のマウスモノクローナル抗体(mAb)20-2-5が使用される場合、抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体を、第2の検出抗体として使用することができる。本発明の方法で用いられるように、第1の検出抗体と第2の検出抗体を異なる酵素にコンジュゲートして、第1及び第2それぞれの捕捉抗体の特異的検出を可能にすることは当業者に明らかである。例えば、本明細書の他の場所で記述されるHRPに基づく検出はBoNT/Aに切断されたSNAP-25に、及びアルカリホスファターゼに基づく検出は全(BoNT/Aに切断された及び切断されていない)SNAP-25に使用することができる。その後、細胞は再び洗浄される。その後のステップにおいて、発蛍光性HRP基質が細胞に添加される。HRP基質として、例えば、540nmで励起され、600nmで放射するAmplex UltraRed(Invitrogen)を使用することができる。HRP基質とのインキュベーションは、ホースラディッシュペルオキシダーゼにより基質を充分に変換するのに充分な時間実行される。HRP基質とのインキュベーション後に、例えば、AP基質であるDiFMUP(6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸、励起360nm、放射450nm)を、HRP基質に添加することができ、細胞は、前記2つの基質の混合物と共にインキュベートされる。前記AP基質とのインキュベーションは、アルカリホスファターゼにより基質を充分に変換できる時間実行される。当技術分野において公知であるように、検出限界の定義により、基質は測定されるシグナルが、ブランクの平均値+3×平均の標準偏差、と少なくとも同程度に高いような充分な量に変換されなければならない。検出限界は、文献に記載の通り決定することができる、例えばArmbruster及びPry、Clinical Biochem. Rev. 2008、29(補足1):S49〜S52を参照のこと。アルカリホスファターゼのpH最適条件がアルカリ性領域にある��で、対応する基質緩衝液は、強アルカリ性である。アルカリホスファターゼ基質がHRP基質に添加される場合、ホースラディッシュペルオキシダーゼの反応はアルカリ性pHによって停止され、アルカリホスファターゼはDiFMUPを変換する。変換されたHRP基質は、アルカリ性pHに影響されない。最後に、2つの基質の蛍光が、以下の通りに測定される:
Amplex UltraRed:励起540nm、放射600nm
DiFMUP:励起360nm、放射450nm
【００１９】
当業技術者に理解されるように、使用される基質で異なる励起/放射波長を呈する発蛍光性基質だけが、本発明の方法における第1及び第2の捕捉抗体の検出に適している。この場合においてだけ、それらは各抗原、即ち全神経毒基質(切断されていない及び神経毒に切断されたSNAP-25など)並びに切断された神経毒基質(神経毒に切断されたSNAP-25など)の特異的検出を可能にする。それによって、あらゆるウェル又は細胞培養皿中にある神経毒基質の全含有量及び切断された神経毒基質の含有量を同時に定量化することが可能になる。これを踏まえて、有利なことに、本発明の方法を自動化することが可能である。本明細書の他の場所で述べられるように、本発明の方法に選ばれる発蛍光性基質は、それぞれの基質の特異的検出を可能にするために励起/放射スペクトル間で充分な変移を呈すると想定される。例えば、HRP基質Amplex及びその誘導体の場合並びにAP基質DiFMUPの場合、この要件は満たされる。最適な場合には、使用される発蛍光性基質の励起/放射スペクトル間に重りはないが、使用される発蛍光性基質の励起スペクトルのピーク領域において多くとも30%の重なりを許容できることが経験されてきた。
【００２０】
当業者によって更に認められるように、本発明の方法により、細胞において神経毒ポリペプチドによって切断された神経毒基質の直接検出及び定量化が可能になり、それにより前記細胞において前記神経毒ポリペプチドの生物活性を決定する。有利なことに、本発明の方法は、当技術分野において公知の方法に必要とされる、細胞溶解物若しくは抽出物の調製及び細胞溶解物/抽出物からの切断された神経毒基質の単離又は濃縮を必要としない。その結果として、サンプル材料を節約することができる。更に本発明の方法により、サンプル中の全神経毒基質の量並びに切断された神経毒基質の量を同時に決定することができるので、サンプル調製及び標本数を減らすことができる。当技術分野において記述されているアッセイでは、両方の抗原、即ち全神経毒基質と切断された神経毒基質を互いに別々に検出するには、サンプルを細分化しなければならない。本発明の方法により、サンプルの細分化が不要になる。それにより、サンプルの細分化に起因する不均質性を避けることができ、サンプル材料を節約することができる。更に、当技術分野において記述されているアッセイでは抗原が分解する可能性があり、そのアッセイは切断された神経毒基質の検出を偽る可能性がある。これは、当技術分野において記述されるアッセイにおいて、細胞は界面活性剤含有溶解緩衝液と共にインキュベートされるが神経毒ポリペプチド又は他の内在性プロテアーゼを不活性化することができないことにより、サンプルの長期保存に際して神経毒基質が分解されるためである。先行技術に記述されているECLサンドイッチELISAでは細胞溶解物を使用する必要があるため、前記アッセイにおいてより強力な溶解緩衝液を使用することはできない。これは、上述の抗原の凝集が、細胞培養皿又はマイクロタイタープレートのプラスチック表面に対する抗原の非特異的吸着をもたらし、適当な抗体による抗原の検出を妨げる可能性があるためである。抗原検出用の抗体も溶解物と接触するので、抗体が凝集することもあり得る。この場合、信頼性が高く、正確な抗原の検出はもはや不可能である。本発明者らは、当技術分野において記述される神経毒活性の生物活性の検出にウェスタンブロットアッセイを使用することによってそのような分解反応を経験した。新しい溶解物サンプルと比較して、-20℃で溶解物をより長期保存した場合、凍結中の分解過程により全SNAP-25の検出信号が強く減少することが判明し、切断されていない神経毒基質SNAP-25に対する切断された神経毒基質SNAP-25の比が変移した。細胞培養皿上での凝集により神経毒基質と神経毒若しくは他の内在性プロテアーゼの両方が直ちに不活性化されるので、細胞培養皿上に細胞を直接固定することにより神経毒基質の分解及び/又はサンプルの不安定性を避け得ることが、本発明者らによって見出された。これは、例えば、メタノール若しくは他の固定剤或いはエタノール、アセトン、ホルムアルデヒド若しくはその混合物など当技術分野において公知の固化剤又は本明細書に記述される他の固化剤による細胞の固定を使用することによって達成することができる。この固定方法を使用する、例えば、親のSiMa細胞(ヒト神経芽細胞腫細胞、DSMZ寄託番号164)及びiPS由来ニューロン[Whitemarshら(2012)、Toxicol. Sci. 126、426〜35頁]の安定性の分析は、新鮮な細胞培養皿と冷蔵庫中で7日間貯蔵したそれの間でいかなる差も見られなかった。
【００２１】
本明細書では、文脈に別段の明確な指図がない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は、単数と複数の両方への言及を含む。例として、「a cell」とは、1つ以上の細胞のことを指す。
【００２２】
本明細書では、用語「約」とは、記載された項目、数、パーセンテージ又は期間の値を制限する場合、記載された項目、数、パーセンテージ又は期間の値の±10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%若しくは1%の範囲のことを指す。±10パーセントの範囲が、好ましい。
【００２３】
本明細書では用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「から構成される(comprised of)」は、「含む(including)」、「含む(includes)」若しくは「含有する(containing)」、「含有する(contains)」と同義語であり、更に包括的又は無制限であり、追加の記載されていないメンバー、要素若しくは方法ステップを除外しない。明らかに、用語「含む(comprising)」は、用語「からなる(consisting of)」を包含する。より具体的には、本明細書では用語「含む(comprise)」は、請求が、挙げられた要素若しくは方法ステップの全てを包含するが、追加の、名前の付いていない要素又は方法ステップも含み得ることを意味する。例えば、ステップa)、b)並びにc)を含む方法とは、狭義には、ステップa)、b)及びc)からなる方法を包含する。句「からなる(consisting of)」は、組成(又は装置、又は方法)が、記載された要素(又はステップ)を有し、それ以上を有さないことを意味する。それに対し、用語「含む(comprises)」は、ステップa)、b)及びc)に加えて、更なるステップ、例えばステップd)並びにe)を含む方法も包含することができる。
【００２４】
「1〜5μMの濃度」などの数値の範囲が、本明細書において使用される場合、その範囲は1及び5μMだけでなく1〜5μMの間の任意の数値、例えば、2、3及び4μMも含む。
【００２５】
本明細書では用語「in vitro」とは、動物又は人体に対して外側又は外部を意味する。本明細書では用語「in vitro」は、「ex vivo」を含むものと理解されるべきである。用語「ex vivo」とは、動物又は人体から取り出され、体外、例えば、培養容器中で維持又は増殖される組織若しくは細胞のことを一般に指す。本明細書では用語「in vivo」は、動物又は人体に対して内側若しくは内部を意味する。
【００２６】
本明細書では用語「神経毒ポリペプチド」は、ボツリヌス菌及び破傷風菌神経毒、即ちボツリヌス毒素(BoNT)及び破傷風毒素(TeNT)を意味する。より具体的には、前記用語は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G及び破傷風神経毒(TeNT)を包含する。神経毒ポリペプチド、特にその軽鎖及び重鎖は、上に示されるボツリヌス神経毒の抗原的に異なる血清型の1つから得られる。一態様において、神経毒ポリペプチドの前記軽及び重鎖は、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G又はTeNTからなる群から選択される神経毒の軽及び重鎖である。別の態様において、前記神経毒ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1(BoNT/A)、配列番号3(BoNT/B)、配列番号5(BoNT/C1)、配列番号7(BoNT/D)、配列番号9(BoNT/E)、配列番号11(BoNT/F)、配列番号13(BoNT/G)又は配列番号15(TeNT)に示される核酸配列を含む。更に、一態様において、配列番号2(BoNT/A)、配列番号4(BoNT/B)、配列番号6(BoNT/C1)、配列番号8(BoNT/D)、配列番号10(BoNT/E)、配列番号12(BoNT/F)、配列番号14(BoNT/G)又は配列番号16(TeNT)のいずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドが包含される。本発明の手段並びに方法の一態様において、配列番号2(BoNT/A)、配列番号4(BoNT/B)、配列番号6(BoNT/C1)、配列番号8(BoNT/D)、配列番号10(BoNT/E)、配列番号12(BoNT/F)、配列番号14(BoNT/G)及び配列番号16(TeNT)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む又はからなる神経毒ポリペプチドが更に包含される。
【００２７】
別の態様において、前記ポリヌクレオチドは、1つ以上のヌクレオチド置換、欠失及び/又は付加を含む上述したポリヌクレオチドのバリアントであり、更に別の態様において1つ以上のアミノ酸置換、欠失及び/又は付加を有するポリペプチドを生ずる場合がある。更に、別の態様において本発明のバリアントポリヌクレオチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、13若しくは15のいずれか1つに示される核酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%同一である核酸配列バリアント、又は配列番号2、4、6、8、10、12、14若しくは16のいずれか1つに示されるアミノ酸配列と少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%同一であるアミノ酸配列をコードする核酸配列バリアントを含むものとする。本明細書では用語「同一」とは、2つの核酸配列間又は2つのアミノ酸配列間で同一のアミノ酸の数を決定することによって特徴づけられる配列同一性のことを指し、配列は、最高の整列の一致が得られるように整列される。それは、例えばBLASTP、BLASTN又はFASTA(Altschul 1990、J Mol Biol 215、403頁)などコンピュータプログラムに体系化された公開されている技術又は方法を使用して算出することができる。一態様において、パーセント同一性値は、全アミノ酸配列にわたって算出される。異なる配列を比較するために、様々なアルゴリズムに基づく一連のプログラムが、熟練者に利用可能である。この文脈において、Needleman及びWunsch又はSmith及びWatermanのアルゴリズムが、特に信頼性の高い結果を与える。配列の整列化を実行するために、プログラムPileUp(Higgins 1989、CABIOS 5、151頁)又はプログラムGap及びBestFit(Needleman 1970、J Mol Biol 48、443頁、Smith 1981、Adv Appl Math 2、482頁)を使用することができ、それらは、GCGソフトウェアパケット(Genetics Computer Group 1991、575 Science Drive、Madison、Wisconsin、USA 53711)の一部である。本発明の別の態様において、パーセント(%)で上に記載される配列同一性値は、全配列領域にわたって以下の設定:Gap加重:50、長さ加重:3、平均一致:10.000及び平均不一致:0.000を用いてプログラムGAPを使用して決定され、特に明記しない限り、その設定は配列整列化のための標準設定として常に使用されるものとする。一態様において、上述したバリアントポリヌクレオチドのそれぞれは、神経毒ポリペプチド、即ちBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G又は破傷風神経毒(TeNT)それぞれの生物学的特性のうち1つ以上、別の態様において、全てを保持するポリペプチドをコードする。プロセッシングされていない前駆体が一部の生物学的機能に影響を及ぼし得る又は部分的に活性であり得ると考えられる場合であっても、完全な生物活性はタンパク質分解性活性化の後にしか維持されないことは当業者によって理解されよう。本明細書では「生物学的特性」とは、(a)受容体結合、(b)内部移行、(c)エンドソーム膜を横断する細胞質ゾルへの移行及び/又は(d)シナプス小胞膜融合に関係するタンパク質の細胞内タンパク質分解性切断のことを指す。生物活性を評価するためのin vivoアッセイには、Pearceら(Pearce 1994、Toxicol. Appl. Pharmacol. 128:69〜77頁)及びDresslerら(Dressler 2005、Mov. Disord. 20:1617〜1619頁、Keller 2006、Neuroscience 139:629〜637頁)によって記述されるマウスLD50アッセイ及びex vivoマウス半横隔膜アッセイがある。生物活性は、マウスユニット(MU)で一般に表される。本明細書では、1MUとは、腹腔内注射後に、指定されたマウス集団の50%を殺す神経毒成分の量、即ちマウスi. p. LD50である。更なる態様において、バリアントポリヌクレオチドは、生物学的特性を改善若しくは改変された神経毒をコードすることができ、例えば、酵素認識のために改善された切断部位を含んでもよく、又は受容体結合若しくは上で指定した他の任意の特性について改善されてもよい。
【００２８】
したがって、本明細書では用語「神経毒ポリペプチドの生物活性」は、神経毒ポリペプチドに特徴的な生物学的特性、即ち(a)受容体結合、(b)内部移行、(c)エンドソーム膜を横断して細胞質ゾルへの移行及び/又は(d)シナプス小胞膜融合に関係するタンパク質の細胞内タンパク質分解性切断を意味する。本明細書では、神経毒ポリペプチドは、上記の特性a)〜d)の少なくとも1つ、好ましくはシナプス小胞膜融合に関係するタンパク質の細胞内タンパク質分解性切断、又はa)〜d)に挙げた生物学的特性の2つ若しくは3つ若しくは4つ全てを呈すると想定される。
【００２９】
本開示の態様は、一部に、樹立細胞系由来の細胞を含む。本明細書では、用語「細胞」とは、例えば、BoNT/Aなどの神経毒による神経毒中毒に感受性のある任意の真核細胞、又は神経毒を取り込むことができる任意の真核細胞のことを指す。用語細胞は、例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、霊長類及びヒト細胞など様々な生物由来の、例えば、ニューロン及び非ニューロンなど様々な細胞型由来の細胞を包含し、不均一な細胞集団、組織又は生物から単離できる又はその一部であることができる。本明細書では、用語「樹立細胞系」は「不死化細胞系」若しくは「形質転換細胞系」と同義であり、生物、組織又は器官供給源から得られる細胞集団の無限増殖に対して選択される細胞の細胞培養のことを指す。定義により、樹立細胞系は、初代細胞の細胞培養を除外する。本明細書では、用語「初代細胞」は、新しい組織又は器官から直接採取される細胞であり、無制限に増殖する潜在性を有さない。例えば、初代神経細胞を、本発明の方法に使用することができる。樹立細胞系は、細胞の不均一な集団又は細胞の均一な集団を含むことができる。単一細胞から得られる樹立細胞系は、クローン細胞系と称される。樹立細胞系は、細胞が細胞機構の全部を行うのに必要な全ての成分を内生的に発現し、それによりBoNT/Aなどの神経毒が、SNAP-25などの基質をタンパク質分解性に切断し、BoNT/A受容体に対するBoNT/Aなど神経毒受容体に対する神経毒の結合、神経毒/受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質への神経毒軽鎖の移行及び神経毒基質のタンパク質分解性切断を包含する細胞であることができる。別法として、樹立細胞系は、細胞が細胞機構の全部を行うのに必要な成分の少なくとも1つを外来の供給源から導入し、それによりBoNT/Aなどの神経毒が、SNAP-25などの基質をタンパク質分解性に切断し、BoNT/A受容体に対するBoNT/Aなど受容体に対する神経毒の結合、神経毒/受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質への神経毒軽鎖の移行及び神経毒基質のタンパク質分解性切断を包含する細胞であることができる。そのような樹立細胞系由来の細胞は遺伝子操作された細胞系とも称され、例えば、外来のFGFR2、外来のFGFR3、外来のSV2、SNAP-25など外来の神経毒基質、又はその任意の組合せを発現することができる。
【００３０】
本明細書に意味される用語「神経毒中毒に感受性のある細胞」は、細胞機構の全部を行うことができ、それにより、神経毒ポリペプチド(例えば、BoNT/A)が神経毒基質(例えば、BoNT/A基質SNAP-25)を切断し、またその対応する受容体に対する神経毒の結合(例えば、BoNT/A受容体に対するBoNT/Aの結合)、神経毒/受容体複合体の内部移行、細胞内小胞から細胞質への神経毒軽鎖の移行及び神経毒基質のタンパク質分解性切断を包含する細胞を意味する。神経毒ポリペプチドの生物活性を決定するためのアッセイは、当技術分野において周知であり、本明細書の他の場所にも記述されている、例えば、Pellettら(2011)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 404、388〜392頁、Whitemarshら(2012)、Toxicol. Sci. 126、426〜35頁を参照のこと。したがって、本明細書では「神経毒中毒に感受性のある細胞」は、神経毒感応性細胞を意味する。前述の用語は、細胞又は細胞系、例えば、単離された初代細胞若しくはその細胞系又は樹立細胞系の細胞若しくは樹立細胞系、例えば、本明細書の他の場所で定義されるような神経細胞に分化することができる神経芽細胞腫細胞又は神経芽細胞腫細胞系などの腫瘍細胞又は腫瘍細胞系を含む。例えば、前記神経芽細胞腫細胞系は、DSMZ(寄託番号164)から市販されているSiMa細胞系であることができる。細胞系SiMaの特異的クローンについて、WO2010/105234に更に開示されている。本発明の方法に使用することができる他の神経芽細胞腫細胞系は、以下のATCC又はDSMZ番号の下にATCC又はDSMZから入手することができる:CRL-2263の下に細胞系N1E-115、CCL-131の下に細胞系Neuro2a、CRL-2266の下に細胞系SH-SY5Y、CRL-1721の下に細胞系PC12、ACC157(DSMZ)の下にMHH-NB-11細胞系及びCRL-2271の下に細胞系SK-N-BE(2)。神経毒中毒に感受性のある他の腫瘍細胞は、P-19細胞(マウス胎児性癌細胞系)(DSMZ寄託番号316)である。人工多能性幹細胞(iPS)-由来ニューロン、好ましくはヒト人工多能性幹細胞(iPS)-由来ニューロンが、神経毒中毒に感受性のある細胞に更に包含される、例えば、上に引用した、Whitemarshら(2012)を参照のこと。そのようなヒトiPS由来ニューロンも、例えば、Cellular Dynamicsから市販されている。iPS細胞を生成する方法は、例えば、Yuら[Science 2009年5月8日、324(5928):797〜801頁、Epub 2009]、WO2011/056971及びWO2011/025852に記述されている。いくつかの態様において、iPSは、適切な方法、例えば、WO2012/135621並びに米国特許出願第2010/0279403号及び第2010/0216181号に記述される方法を使用してニューロンに分化される。
【００３１】
用語「細胞を固定する」は、当技術分野において記述される方法を使用して細胞を固定することを意味する。一般に、固定とは、生物組織を腐食から守り、それによって自己分解を妨げる化学工程である。固定は、進行中のあらゆる生化学反応を停止し、処理した組織の機械的強度又は安定性を高めることもできる。固定は、検査又は分析のために、組織又は細胞などの生物材料のサンプルを前記組織又は細胞を準備する過程においてできるだけその天然に近い状態に保つ。このために、固定剤は、内在性生体分子、特にタンパク質分解酵素を無効にするように通常作用し、さもなければその分解酵素はサンプルを消化又は損傷する。更に、固定剤は、外的な損傷からサンプルを一般に保護する。固定剤は、組織又は細胞培養内に存在する可能性があるか、さもなければ固定した組織又は細胞培養にコロニーを形成する可能性がある細菌を含む最も一般的な微生物に対して有毒である。加えて、多くの固定剤により、固定された物質は化学的に改変され、日和見微生物が消化できないか又は有毒かいずれか好ましくなくなる。最終的に、固定剤は、分子レベルで細胞又は組織をしばしば改変して、その機械的強度又は安定性を高める。この強度及び剛性の増加は、更なる分析用として加工される際にサンプルの形状及び構造などの形態を保つのに役立ち得る。固定剤及び固定手順の選択が、追加の加工ステップ及び予定される最終的な分析によって決まり得ることは当業技術者に明らかである。例えば、免疫組織化学は、特異的タンパク質標的である抗原に特異的に結合する抗体を使用する。長時間にわたる固定は、これらの標的を化学的にマスキングし、抗体結合を妨げる可能性がある。これらの場合、例えば、冷ホルマリンを使用する迅速固定方法を使用することができる。別法として、細胞は、氷冷メタノール(-20℃)を添加することによって固定することができる。そのほか、ホルムアルデヒド若しくはグルタルアルデヒドなどのアルデヒド、及びエタノール若しくはメタノールなどのアルコール、酸化剤、HEPESグルタミン酸緩衝液媒介有機溶剤保護効果(Hepes-glutamic acid buffer-mediated organic solvent protection effect)(HOPE)固定剤、アセトン、又はメタノールとアセトン、メタノールとエタノール、パラホルムアルデヒドとTriton X-100若しくはパラホルムアルデヒドとメタノールの混合物などその混合物を固定手順に使用することができる。本発明の方法の一態様において、細胞を固定するステップは、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド又はその混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって実行される。抗原に対する抗体の自由な接近を確実にする及び/又は支援するために、任意選択で、Triton X-100など少なくとも1つの界面活性剤を含む適当な透過処理緩衝液を使用することによって細胞を透過処理することができる。本発明の方法に使用することができる透過処理緩衝液は、例えば、10mM PBS緩衝液に0.5% Triton X-100である。本発明の方法の他の態様において、細胞は、Tween 20、サポニン、ジギトニン又はn-オクチル-β-グルコピラノシドから選択される少なくとも1つの界面活性剤を含むPBSなどの透過処理緩衝液を使用することによって透過処理することができる。他の態様において、本明細書に言及される界面活性剤の2つ以上の混合物を、前記透過処理緩衝液に使用することができる。一般に、細胞の場合、固定強度及び時間は、より厚く、構造的に複雑な組織切片よりかなり短い。免疫細胞化学の場合、サンプル調製は、標的細胞をスライド、細胞培養皿又はマイクロタイタープレートに固定するステップを基本的に伴う。完全な固定により、抗原が固定され、一方で忠実な細胞内及び亜細胞内構造が保持され、全ての細胞及び亜細胞内区画への抗体の制約のない接近が可能になる。上で例示した広範な固定剤が一般的に使用され、方法の正しい選択は、検査される抗原の性質及び使用される抗体の特性によって決まることになる。固定方法は、一般に:有機溶剤及び架橋試薬の2種類に分類される。アルコール及びアセトンなどの有機溶剤は、脂質を除去し、細胞を脱水し、一方でタンパク質を細胞構造に凝結させる。パラホルムアルデヒドなどの架橋試薬は、通常遊離アミノ基による分子間橋を形成し、したがって連結された抗原の網目を構築する。架橋剤は、有機溶剤より細胞構造を保つのに優れるが、一部の細胞成分の抗原性を減少させ、しばしば上に示される透過処理ステップを追加して試料への抗体の接近を可能にする必要がある場合がある。両方の方法による固定は、タンパク質抗原を変性させることがあり、そのため、変性タンパク質に対して調製した抗体が、細胞染色に一層有用になる場合がある。適切な固定方法は、該当する用途に従って選択されるべきである。細胞の固定方法は、当技術分野においてよく記述されている(例えば、Methods in cell biology、第37巻:Antibodies in cell biology、David J. Asai編、1993、Academic Press Inc.を参照のこと)。
【００３２】
本発明の方法に従って使用される用語「接触させる」は、物理的及び/又は化学的相互作用が可能になるように、細胞及びそれぞれの抗体を物理的に近接させることを意味する。特異的相互作用を可能にする適切な条件は、当技術に熟達した者に周知である。明らかに、前記条件は、本発明の方法において適用される抗体及び細胞によって決まることになり、当技術に熟達した者によって常法通り適合させることができる。更に、相互作用を可能にするのに十分な時間も、熟練者によってすぐに決定することができる。細胞と本発明の方法において詳述されるそれぞれの抗体とを接触させる個々のステップの間に洗浄ステップを実施して、接触に適した条件を得ることができることを理解されたい。例えば、本発明の方法のステップc)において、細胞を、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体と接触させた後に洗浄ステップを組み込んで残りの溶液並びに/又は過剰な第1及び第2の捕捉抗体を除去し、その後に第1の検出抗体及び/若しくは第2の検出抗体を適用することができる。同様に、細胞を本発明の方法における第1及び/又は第2の検出抗体と接触させた後に、洗浄ステップを含めることができる。適当な洗浄緩衝液は、例えば、10mM PBS緩衝液(pH7.4)に0.1% Triton X-100である。より具体的には、本明細書では用語「接触させる」とは、本発明の方法のステップc)において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体が前記基質に結合できる条件下で、細胞を前記捕捉抗体と接触させることを指す。第1及び第2の捕捉抗体を、例えば混合物として同時に又は連続して細胞に適用することができる。「接触させる」とは、本発明の方法のステップd)において、第1の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第1の検出抗体が前記第1の捕捉抗体に結合できる条件下で細胞を前記第1の検出抗体と、及び第2の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第2の検出抗体が前記第2の捕捉抗体に結合できる条件下で細胞を前記第2の検出抗体と接触させることを更に指す。それによって、第1及び第2検出複合体が形成される。別法として、第1及び第2の検出抗体を連続して適用することもできる。
【００３３】
本明細書では、用語「抗体」とは、特定の抗原に応答して作られた、その抗原に特異的に結合する、免疫系によって生成される分子のことを指し、天然に存在する抗体と天然に存在しない抗体の両方を含む。本明細書では「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、二量体若しくは多量体、キメラ化抗体、二重特異的抗体、二重特異的一本鎖抗体、多重特異的抗体、合成抗体、ヒト化抗体、二官能性抗体、Ig受容体のような細胞結合性抗体、直鎖抗体、ダイアボディ、ミニボディ又は前記抗体のいずれかのフラグメントを包含する。前記抗体のフラグメントには、例えば、Fab、Fv若しくはscFvフラグメント、又はこれらフラグメントのいずれかの化学的に修飾された誘導体がある。抗体は、当技術分野において記述される方法を使用することによって製造することができる、例えば、Harlow及びLane「Antiboy, A Laboratory Manual」、CSH Press、Cold Spring Harbor、1988を参照のこと。モノクローナル抗体は、Kohler 1975、Nature 256、495頁及びGalfre 1981、Meth. Enzymol. 73、3頁に最初に記述された技術によって調製することができる。前記技術は、マウス骨髄腫細胞と免疫化した哺乳動物から得られる脾臓細胞との融合を含む。抗体は、当技術分野において周知の技術によって更に改善することができる。例えば、Biacoreシステムで利用される表面プラスモン共鳴を使用して、エピトープに結合するファージ抗体の有効性を高めることができる、例えば、Schier 1996、Human Antibodies Hybridomas 7、97頁、Malmborg 1995、J. Immunol. Methods 183、7頁を参照のこと。本明細書では抗体は、抗体の機能的等価物、即ち神経毒基質の所望のエピトープ又は部分に特異的に結合することができる薬剤も含む。一態様において、前記特異的結合を媒介することができるそのような機能的等価物は、神経毒基質又はそのドメインに特異的に結合する結合タンパク質を含む。本明細書では抗体は、VH及びVLドメイン並びに軽鎖定常ドメイン(CL)及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含む完全長免疫グロブリン分子、又は完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、例えばFabフラグメント、F(ab')2フラグメント、Fcフラグメント、Fdフラグメント若しくはFvフラグメントなどであることができる。抗体は、任意の脊椎動物種(例えば、ヒト、ヤギ、ウマ、ロバ、マウス、ラット、ウサギ又はニワトリ)から得ることができ、任意の型(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD若しくはIgA)、クラス(例えば、IgA、IgD、IgE、IgG若しくはIgM)又はサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1若しくはIgA2)であることができる。天然に存在する抗体、天然に存在しない抗体及びその抗原性化合物結合フラグメントの構造に関する全般的な開示については、例えばPlueckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、Rosenburg及びMoore編、Springer-Verlag、New York、269〜315頁(1994)、Borrabeck、Antibody Engineering 第2版(Oxford University Press)を参照のこと。天然に存在する抗体は、通常約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、2つの同一の軽鎖(L)及び2つの同一の重鎖(H)から構成される。各軽鎖は、1つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で異なる。各重及び軽鎖は、規則的な間隔がある鎖内ジスルフィド架橋も有する。各重��は一方の末端に、いくつかの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン(VL)及び他方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1定常ドメインと整列しており、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。
【００３４】
完全な抗原認識及び抗原結合部位は、抗体の可変ドメイン、即ち、Fvフラグメントに含有される。このフラグメントは、隙間なく非共有結合性会合している1つの重鎖可変ドメイン(VH)と1つの軽鎖可変ドメイン(VL)との二量体を含む。各ドメインは、4つのフレームワーク領域(FR)を含み、それらの領域は3つの超可変領域によって接続されたβシート構成を主にとり、その可変領域はβシート構造を接続するループを形成し、いくつかの場合にはβシート構造の一部を形成する。各超可変領域は、相補性決定領域(CDR)に対応するアミノ酸配列を含む。全体で、抗原結合特異性を与える、VH-VL二量体の表面において抗原結合部位を定義する6つのCDR領域からなる3次元構成をとる。例えば、Cyrus Chothia、ら、Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions、Nature 342(6252):877〜883頁(1989)、Elvin A. Kabat、らSequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、国立衛生研究所、公衆衛生局、Bethesda、Md. (1991)を参照のこと。抗体の定常ドメインは、抗体が抗原に結合するのに直接関係しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与など様々なエフェクター機能を呈する。
【００３５】
本明細書では「選択的な結合」又は「特異的結合」は、例えば、結合親和性、結合特異性及び結合力などの結合特性を含む、例えばDavid J. King、Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies、240頁(1998)を参照のこと。結合親和性とは、抗体がそのエピトープ結合部位に存在する時間の長さのことを指し、抗体がそのエピトープを結合する強度と見ることができる。結合親和性は、抗体の平衡解離定数(KD)で記述することができ、KDは平衡でのKd/Ka比と定義される。Kaは抗体の結合速度定数であり、Kdは抗体の解離速度定数である。結合親和性は、結合と解離の両方によって決定され、高い結合又は低い解離のいずれも単独では高い親和性を確実にすることができない。結合速度定数(Ka)又は会合速度定数(Kon)は、単位時間当たりの結合事象の回数、又は抗体及び抗原がその抗体-抗原複合体へと可逆的に結合する傾向を測定する。結合速度定数は、M-1s-1で表され、以下の通りに記号化される:[Ab] × [Ag] × Kon。結合速度定数が大きい程、抗体はより速やかに抗原に結合する、又は抗体と抗原との結合親和性がより高い。解離速度定数(Kd)又は分離速度定数(Koff)は、単位時間当たりの解離事象の回数又は抗体-抗原複合体がその成分分子、即ち抗体及び抗原へと可逆的に分かれる(解離する)傾向を測定する。解離速度定数は、s-1で表され、以下の通りに記号化される:[Ab + Ag] × Koff。解離速度定数が小さい程、抗体はその抗原に対してより密接に結合する、又は抗体と抗原との結合親和性がより高い。平衡解離定数(KD)は、平衡において新たな抗体-抗原複合体が形成される速度が、抗体-抗原複合体が解離する速度に等しいことを測定する。平衡解離定数はMで表され、Koff/Kon = [Ab] × [Ag] / [Ab+Ag]と定義され、[Ab]は抗体のモル濃度であり、[Ag]は抗原のモル濃度であり、[Ab+Ag]は抗体-抗原複合体のモル濃度であり、系が平衡である場合、全ての濃度がそのような成分のものである。平衡解離定数が小さい程、抗体はその抗原に対してより密接に結合する、又は抗体と抗原との間の結合親和性がより高い。したがって、本発明の方法の一態様において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体は、例えば、1×105M-1 s-1未満、1×106 M-1 s-1未満、1×107 M-1 s-1未満又は1×108 M-1 s-1未満の結合速度定数を有することができる。別の態様において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体は、例えば、1×105M-1 s-1より大きい、1×106 M-1 s-1より大きい、1×107 M-1 s-1より大きい又は1×108 M-1 s-1より大きい結合速度定数を有することができる。更なる態様において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体は、例えば1×10-3M-1 s-1未満、1×10-4 M-1 s-1未満、1×10-5 M-1 s-1未満又は1×10-6 M-1 s-1未満の分離速度定数を有することができる。なお更なる態様において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体は、例えば、1×10-3M-1 s-1より大きい、1×10-4 M-1 s-1より大きい、1×10-5 M-1 s-1より大きい又は1×10-6 M-1 s-1より大きい分離速度定数を有することができる。更なる態様において、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体は、例えば、1×105M-1 s-1未満、1×106 M-1 s-1未満、1×107 M-1 s-1未満又は1×108 M-1 s-1未満の結合速度定数を有することができる。別の態様において、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体は、例えば、1×105M-1 s-1より大きい、1×106 M-1 s-1より大きい、1×107 M-1 s-1より大きい又は1×108 M-1 s-1より大きい結合速度定数を有することができる。更なる態様において、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体は、例えば、1×10-3M-1 s-1未満、1×10-4 M-1 s-1未満、1×10-5 M-1 s-1未満又は1×10-6 M-1 s-1未満の分離速度定数を有することができる。なお更なる態様において、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体は、例えば、1×10-3M-1 s-1より大きい、1×10-4 M-1 s-1より大きい、1×10-5 M-1 s-1より大きい又は1×10-6 M-1 s-1より大きい分離速度定数を有することができる。
【００３６】
神経毒に切断された又は切断されていない神経毒基質であるSNAP-25、VAMP/シナプトブレビン又はシンタキシンなどの標的抗原は一般に、エピトープとも呼ばれる結合部位を1つ以上有し、そのエピトープは抗体のCDR形成抗原結合部位によって認識される。本明細書では「エピトープ」は、「抗原決定基」と同義であり、免疫グロブリン又はT細胞受容体に特異的結合できるか、さもなければ分子と相互作用できる例えばペプチド、ポリペプチド、多糖又は脂質含有分子など標的抗原上の部位のことを指す。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は、異なる構造を有する。したがって、1つの抗原は、対応する抗体を複数有することができる。本明細書に称される「特異的結合」は、例えば、競合実験及びウェスタンブロットを含む様々な周知の技術で試験することができる。本発明によって使用されるエピトープは、抗体によって認識される神経毒基質、例えばSNAP-25、VAMP/シナプトブレビン又はシンタキシンにある抗原決定基に関する。本明細書では用語「特異的」は、選択的を意味し、固有の効果若しくは影響を有する又は一方向だけに若しくは1つのものだけと反応することを指す。抗体又は結合タンパク質若しく結合ドメインに言及する場合、本明細書では用語「特異的に結合する」又は「選択的に結合する」とは、抗体又は結合タンパク質/ドメインが標的外エピトープと実質的に交差反応しないような、指示された標的エピトープに対する抗体又は結合タンパク質/ドメインの差別的な結合のことを指す。本明細書に定義されるように、ペプチドエピトープの最小のサイズは、約5アミノ酸残基であり、ペプチドエピトープは、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24、少なくとも25又は少なくとも30アミノ酸残基を一般に含む。ペプチドエピトープは、直鎖又は不連続なエピトープでもよい。不連続なエピトープは、ペプチドの一次構造において隣接していないが、ペプチドの二次、三次又は四次構造によりエピトープへと作られるアミノ酸残基を含む。更に、エピトープが、例えば炭水化物部分、糖脂質若しくはリポタンパク質のような脂質部分、又はリン酸化アミノ酸のような化学修飾アミノ酸部分などのアミノ酸配列以外の分子の一部を含み得ることにも留意されたい。
【００３７】
本発明の方法によると、「第1の捕捉抗体」は、切断されていない及び神経毒に切断された基質に含まれるエピトープに特異的に結合する。前記神経毒基質は、例えば、SNAP-25、VAMP/シナプトブレビン又はシンタキシンであることができる。例えば、SNAP-25は、BoNT/A、BoNT/C1及びBoNT/Eの公知の基質である。VAMP/シナプトブレビンは、BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G及びTeNTの基質であるが、シンタキシンは、BoNT/C1の基質である。前記第1の捕捉抗体により、細胞内のそれぞれの神経毒基質の全量、即ち完全含有量を決定することが可能になる。例えば、全長205アミノ酸残基を有するSNAP-25において、BoNT/Aの切断部位は、アミノ酸残基Gln197とArg198の間に限局される。したがって、BoNT/A切断部位に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちSNAP-25のアミノ酸残基1〜198に限局されるエピトープに特異的に結合する抗体は、第1の捕捉抗体として使用することができる。例えば、前記抗体は、SNAP-25のN末端エピトープ又は中央部に位置するエピトープに特異的に結合することができる。BoNT/C1の場合、BoNT/C1切断部位(Arg198〜Ala199)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちSNAP-25のアミノ酸残基1〜199は、第1の捕捉抗体として使用することができる。BoNT/Eの場合、BoNT/E切断部位(Arg180〜Ile181)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちSNAP-25のアミノ酸残基1〜181は、第1の捕捉抗体として使用することができる。VAMPが神経毒基質として使用される場合、BoNT/B切断部位(Gln76〜Phe77)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちVAMPのアミノ酸残基1〜77は、第1の捕捉抗体として使用することができる。BoNT/D切断部位(Lys59〜Leu60)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちVAMP2のアミノ酸残基1〜60は、第1の捕捉抗体として使用することができる。BoNT/F切断部位(Gln58〜Lys59)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちVAMP2のアミノ酸残基1〜59は、第1の捕捉抗体として使用することができる。BoN/G切断部位(Ala81〜Ala82)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちVAMP2のアミノ酸残基1〜82は、第1の捕捉抗体として使用することができる。シンタキシンが基質として使用される場合、BoN/C1切断部位(Lys253〜Ala254)に対してN末端側に位置するエピトープ、即ちシンタキシン1aのアミノ酸残基1〜254は、第1の捕捉抗体として使用することができる。
【００３８】
本発明の態様において、BoNT/Aプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、BoNT/Aによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒトSNAP-25A若しくはSNAP-25B又はラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、エゾバフンウニ、ヤリイカ、モノアラガイ若しくはアメフラシのホモログ、パラログ若しくはオルソログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、例えば、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００３９】
本発明の態様において、BoNT/Bプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、BoNT/Bによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、エゾバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、若しくはsyn、チスイビルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP、又はカエノルハブディティス属SNB1様、或いはその任意のオルソログ、パラログ又はホモログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４０】
本発明の態様において、BoNT/C1プロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、BoNT/C1による切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒト及びマウスシンタキシン1A、シンタキシン1B1、シンタキシン2-1、シンタキシン2-2、シンタキシン2-3、シンタキシン3A若しくはシンタキシン1B2、ウシ若しくはラットシンタキシン1A、シンタキシン1B1若しくはシンタキシン1B2、ラットシンタキシン2若しくはラットシンタキシン3、マウスシンタキシン1A、シンタキシン1B1、シンタキシン1B2、シンタキシン2、シンタキシン3A、シンタキシン3B若しくシンタキシン3C、ニワトリシンタキシン1A若しくシンタキシン2、アフリカツメガエルシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ダニオシンタキシン1A、シンタキシン1B若しくはシンタキシン3、シビレエイシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、エゾバフンウニシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ショウジョウバエシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、チスイビルシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、ヤリイカシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B、モノアラガイシンタキシン1A若しくはシンタキシン1B又はその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４１】
BoNT/Dプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、本発明の態様において、BoNT/Dによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、エゾバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、若しくはsyn、チスイビルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP、又はカエノルハブディティス属SNB1様、或いはその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４２】
BoNT/Eプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、本発明の態様において、BoNT/Eによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒトSNAP-25A若しくはB又はラット、マウス、ウシ、ダニオ、フナ、アフリカツメガエル、シビレエイ、エゾバフンウニ、ヤリイカ、モノアラガイ若しくはアメフラシのホモログ、パラログ若しくはオルソログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４３】
BoNT/Fプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、本発明の態様において、BoNT/Fによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、エゾバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、若しくはsyn、チスイビルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP、又はカエノルハブディティス属SNB1様、或いはその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４４】
BoNT/Gプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、本発明の態様において、BoNT/Gによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、エゾバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、若しくはsyn、チスイビルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP、又はカエノルハブディティス属SNB1様、或いはその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４５】
TeNTプロテアーゼに認識され、切断される神経毒切断部位は、本発明の態様において、TeNTによる切断に感応性のタンパク質から得られる。一態様において、そのようなタンパク質は、ヒト若しくはマウスVAMP-1、VAMP-2及びVAMP-3/セルブレビン、ウシVAMP-2、ラットVAMP-2若しくはVAMP-3、ニワトリVAMP-1、VAMP-2若しくはVAMP-3、シビレエイVAMP-1、エゾバフンウニVAMP、ショウジョウバエsybA、synB、synC、synD、若しくはsyn、チスイビルVAMP、アフリカツメガエルVAMP-2若しくはVAMP-3、ダニオVAMP-1若しくはVAMP-2、ヤリイカVAMP、モノアラガイVAMP、アメフラシVAMP、又はカエノルハブディティス属SNB1様、或いはその任意のオルソログ、パラログ若しくはホモログである。前記タンパク質から得られる適切な切断部位は、欧州特許第1926744号B1に開示されている。
【００４６】
本発明の方法において第1の捕捉抗体として使用できる適当な抗体の例には、例えば、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684(Sigma)[Fernandez-Salas E、Wang J、Molina Y、Nelson JB、Jacky BPS、ら(2012) Botulinum Neurotoxin Serotype a Specific Cell-Based Potency Assay to Replace the Mouse Bioassay、PLoS ONE 7(11):e49516.doi:10.1371/journal.pone.0049516]、ウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19708(Pierce Antibodies)、ウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19701(Pierce Antibodies)、VAMP/シナプトブレビン抗体sc-13992(Santa Cruz Biotechnology)若しくは＃104 203(Synaptic Systems)、又はシンタキシン抗体ADI-VAM-SV013(Enzo Life Sciences)がある。
【００４７】
一態様において、細胞内の神経毒基質の全量を決定するために切断されていない及び神経毒に切断された基質を認識する第1の捕捉抗体は、以下の実施例で示すように、標準化に使用される。
【００４８】
本明細書では「第2の捕捉抗体」は、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する。したがって、前記第2の捕捉抗体は、神経毒に切断された神経毒基質、例えば、BoNT/A SNAP-25切断生成物を選択的に認識する。対照的に、前記第2の捕捉抗体は、例えば、切断されていないSNAP-25など切断されていない神経毒基質に結合できない。本発明の方法において第2の捕捉抗体として使用できる適当な抗体の例には、例えば、以下に示すような本発明のマウスモノクローナル抗体、即ちBoNT/Aに切断されたSNAP-25(Baldwin及びBarbieri 2007、Biochemistry 46、3200〜3210頁)を認識するマウスモノクローナル抗体MC-6053(R&D Systems)及びマウスモノクローナル抗体DMAB4345(Creative Diagnostics)がある。
【００４９】
更なる態様において本発明は、神経毒に切断されたSNAP-25の切断部位、即ち神経毒に切断されたSNAP-25にだけ特異的に結合するが、切断されていないSNAP-25には結合しない新規のモノクローナル抗体を提供する。以下の実施例に記載の通り、前記モノクローナル抗体が生成され、特徴づけられ、神経毒に切断されたSNAP-25に対するその高い親和性及び特異性のため、本発明の方法の第2の捕捉抗体として特に適していると判明した。好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号74に示されるエピトープSNAP-25190-197「TRIDEANQ」及び/又はSNAP-25197、即ち神経毒(例えば、BoNT/A)に切断されたSNAP-25を認識し、特異的に結合する。より好ましくは、本発明のモノクローナル抗体は、配列番号75に示されるエピトープSNAP-25191-197「RIDEANQ」及び/若しくはSNAP-25197、配列番号76に示される配列のエピトープSNAP-25192-197「IDEANQ」及び/若しくはSNAP-25197に、又は配列番号77に示されるエピトープSNAP-25193-197「DEANQ」及び/若しくはSNAP-25197を認識し、特異的に結合する。
【００５０】
一態様において、本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号18に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号19に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントに関する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号20〜22にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号23〜25にそれぞれ示される。以下の実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体20-2-5に対応する。加えて、本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号26に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号27に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントに関係する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号28〜30にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号31〜33にそれぞれ示される。以下の実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体5-10-5に対応する。更に本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号34に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号35に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントに関する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号36〜38にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号39〜41にそれぞれ示される。以下の実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体1-10-4に対応する。本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号42に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号43に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントにも関係する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号44〜46にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号47〜49にそれぞれ示される。以下の実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体16-5-4に対応する。加えて、本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号50に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号51に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントに関する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号52〜54にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号55〜57にそれぞれ示される。以下���実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体6-3-8に対応する。本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号58に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号59に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントに更に関係する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号60〜62にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号63〜65にそれぞれ示される。以下の実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体18-3-3に対応する。更に、本発明は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合し、配列番号66に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)及び/又は配列番号67に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)を含む抗体若しくはそのフラグメントに関する。前記重鎖及び/若しくは軽鎖可変領域の相補性決定領域(CDR)を1、2若しくは3つ含む抗体又はそのフラグメントが、本発明に更に包含される。対応するCDRH1、CDRH2及びCDRH3配列は、配列番号68〜70にそれぞれ示され、一方で対応するCDRL1、CDRL2及びCDRL3配列は、配列番号71〜73にそれぞれ示される。以下の実施例で示すように、前述の配列は、マウスモノクローナル抗体14-12-1に対応する。
【００５１】
本明細書では用語「第1の検出抗体」とは、第1の捕捉抗体に特異的に結合する抗体である。前記第1の検出抗体により、第1の捕捉抗体の特異的検出が可能になる。第1の検出複合体中にある結合している第1の検出抗体の量が、第1の検出複合体に含まれる第1の捕捉抗体の量(したがって全量、即ち切断された及び切断されていない神経毒基質)と相関するので、結合している第1の検出抗体の量を測定することにより第1の検出複合体の量を決定することができる。例えば、適当な種特異的な抗体を、第1の検出抗体として使用することができる:第1の捕捉抗体としてマウス抗体が使用される場合、前記第1の検出抗体は、マウス抗体に特異的に結合する抗マウス抗体であることができる。第1の検出抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体又は蛍光色素にコンジュゲートされた抗体であることができる。例えば、グルタルアルデヒドを使用することによる抗体への酵素のコンジュゲーションは、当技術分野において周知である。
【００５２】
ほぼ40年間、酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)を使用して、広範な化合物及び病原体が定量化されてきた。当初は、放射活性を使用してアッセイを定量化したが、放射免疫測定法(RIA)は、比色結果を得るために酵素を利用するアッセイに置き換わった。最近、蛍光及び発光生成物を生じるための新たな基質が開発された。新たなアッセイの基本的な原理は、比色アッセイと同じままである。基質は、特異性を与える抗体にコンジュゲートされたタンパク質の酵素活性によって測定可能な化合物に変換される。
【００５３】
ELISAにおいて一般に使用される酵素コンジュゲートは、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼである。したがって、一態様において、第1の検出抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートすることができる。本発明の方法において第1の検出抗体として使用することができる酵素コンジュゲートの更なる例には、基質としてグルコースを使用するグルコースオキシダーゼ、基質1-(4-メチル-クマリン-7-イル)-3-(4-ヒドロキシフェニル)尿素(PAP-AMC)を変換するチロシナーゼ(Stratis Avrameas、Immunochemistry、第6巻、第1号、1969年1月、43〜48頁、IN9〜IN11頁、49〜52頁)又は基質6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルβ-d-ガラクトピラノシド(DiFMUG)を変換するβガラクトシダーゼ(Geeら、Analytical Biochemistry、第273巻、第1号、1999年8月、41〜48頁)がある。基質を添加すると同時に、酵素によって前記基質は検出可能な形態に変換される。例えば、アルカリホスファターゼは、リン酸のエステルの切断を触媒する。アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体が、第1の検出抗体として使用される場合、4-メチルウンベリフェリルリン酸誘導体、例えば、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸(DiFMUP)又はフルオレセイン2リン酸(FDP)など適当な基質が使用される。6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸(DiFMUP)は、APによって検出可能な形態、即ち発蛍光性生成物6,8-ジフルオロ-4-メチルウムベリフェロンに変換される。前記基質は、例えば、Molecular Probesから提供されている。DiFMUPのこの反応生成物の蛍光強度は、約358/450nmの最大励起/放射を使用して測定することができる。この目的で使用することができる更なる基質は、9H-(1,3-ジクロロ-9,9-ジメチルアクリジン-2-オン-7-イル)リン酸(DDAOリン酸、Invitrogen)、フルオレセイン二リン酸(FDP、Sigma Aldrich)又は4-メチルウンベリフェリルリン酸(MUP、Invitrogen)である。DDAOリン酸は、APによって約646/659nmの最大励起/放射を有する発蛍光性生成物ジメチルアクリジノン(DDAO)に変換される。APの基質としてFDPが使用される場合、反応生成物は、約490/514nmの最大励起/放射を有するフルオレセインである。MUPの場合、対応する反応生成物は、約360/449nmの最大励起/放射を有する4-メチルウムベリフェロン(7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン)である。また、これらの基質は、例えばMolecular Probesから市販されている。別法として、本発明の方法の第1の検出抗体における酵素コンジュゲートとしてホースラディッシュペルオキシダーゼを使用することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)は、過酸化水素(H2O2)から水(H2O)への還元を触媒する。水素供与体として作用する特異的基質の存在下で、HRPの作用は、無色又は非蛍光性分子を発色した及び/又は蛍光部分にそれぞれ変換する。例えば、Amplex(商標) Red(Life Technologies)は、HRP含有アッセイで使用する基質である。Amplex Redは、ペルオキシダーゼ酵素の存在下で、1:1の化学量論でH2O2と反応して、563nm及び587nmの最大吸収及び蛍光放射をそれぞれ有する赤色蛍光化合物であるレゾルフィンを生じる。HRP基質の別の例は、Amplex(商標) UltraRed(Life Technologies)である。Amplex(商標) UltraRed試薬(約570/585nmの励起/放射)は、Amplex(商標) Red試薬の能力を改善し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ結合酵素アッセイにおいてより明るい蛍光を提供し、モルベース当たりの感度を向上させることが報告されている。酸化型Amplex(商標) UltraRed試薬(Amplex(商標) UltroxRed試薬)の蛍光は、pHにも不感応性であり、基質及びその酸化生成物は、過酸化水素(H2O2)又はジチオスレイトール(DTT)などのチオールの存在下でAmplex(商標) Red試薬より高い安定性を呈する。本発明の方法に使用することができる更に適当なHRP基質には、例えば、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP、AnaSpec)又は3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(HPPA、AnaSpec)(Tuuminenら1991、J. Immunoassay 12、29〜46頁)がある。
【００５４】
別法として、第1の検出抗体は、第1の捕捉抗体の検出を可能にする適当な、検出可能な標識を持つことができる。標識は、直接的又は間接的な方法によって行うことができる。直接標識は、第1の検出抗体に標識を直接結合させる(共有結合的又は非共有結合的)ことを含む。間接標識は、第1の検出抗体に特異的に結合し、検出可能な標識を持つ薬剤の結合(共有結合的又は非共有結合的)を含む。そのような薬剤は、例えば、第1の検出抗体に特異的に結合する二次(より高次の)抗体であることができる。そのような場合において、二次抗体は、検出可能な標識に結合されることになる。加えて、第1の検出複合体の検出のために更により高次の抗体を使用できることは理解されよう。しばしばより高次の抗体を使用して、シグナルが増強される。適切な高次の抗体には、周知のストレプトアビジンビオチン系(Vector Laboratories, Inc.)、並びに周知のDako LSAB(登録商標)2及びLSAB(登録商標)+(標識ストレプトアビジンビオチン)、又はDako PAP(ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ)もあり得る。更なる態様において、第1の検出抗体の前記標識は蛍光色素であり、即ち第1の抗体は蛍光色素にコンジュゲートされる。この場合、蛍光は、蛍光リーダーによって直接測定することができる。典型的な蛍光標識には、GFP及びその誘導体などの蛍光タンパク質、Cy3又はCy5などのCy色素、Texas Red、フルオレセイン並びにAlexa色素、例えばAlexa 568がある。
【００５５】
本明細書では「第2の検出抗体」とは、第2の捕捉抗体に特異的に結合する抗体である。第2の検出抗体は、例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ又はチロシナーゼなどの酵素にコンジュゲートすることができる。したがって、一態様において、第2の検出抗体は、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体、グルコースオキシダーゼコンジュゲート抗体又はチロシナーゼコンジュゲート抗体である。前記第2の検出抗体により、第2の捕捉抗体の特異的検出が可能になる。第2の検出複合体中にある結合している第2の検出抗体の量が、第1の検出複合体に含まれる第2の捕捉抗体の量(したがって切断された神経毒基質の量)と相関するので、結合している第2の検出抗体の量を測定することにより第2の検出複合体の量を決定することができる。例えば、第2の捕捉抗体としてウサギ抗体が使用された場合、抗ウサギ抗体を第2の検出抗体として使用することができる。第1の検出抗体に関して本明細書の他の場所で言及されるように、第2の検出抗体は、上記の酵素又は蛍光色素などの標識を持つ(即ち、第2の検出抗体は、蛍光色素にコンジュゲートされる)ことができる。本発明の方法の一態様において、本発明の方法において第1及び第2それぞれの捕捉抗体の特異的検出を可能にするには、第1の検出抗体にコンジュゲートされる酵素は、第2の検出抗体にコンジュゲートされる酵素と異なる。例えば、第1の検出抗体がAPコンジュゲート抗体である場合、第2の検出抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体であり、又はその逆であることができる。更に、AP及びHRPの発蛍光性基質の励起/放射スペクトルは、実質的に重ならないが、互いに異なり、即ちそのスペクトルは、それぞれの生成物によって生成される蛍光強度の識別が可能になるように明らかな変移を示す。例えば、DiFMUPは約358/450nmで励起/放射を呈するが、Amplex UltraRedは約570/585nmの励起/放射を呈し、それにより、それぞれの酵素による前記発蛍光性基質の変換によって生成される蛍光強度の正確な測定が可能になる。更なる態様において、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体は、細胞内に過剰に存在する抗原に対する、即ち、細胞内の全SNAP-25など(切断されていない及び切断された)神経毒基質の全量を測定するための第1の検出抗体として使用される。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体は、細胞内により少量で存在する抗原のための、即ち、細胞内のBoNT/Aに切断されたSNAP-25など切断された神経毒基質の量を測定するための第2の検出抗体として使用される。当技術分野において公知の通り、HRP基質がAP基質より感応性が高いことは、より少量の分析物を検出できることを意味している。HRP抗体が、切断されたSNAP-25の検出用二次抗体として使用される場合、より少量の切断されたSNAP-25を検出可能である。同じく、より少量のBoNT/Aを決定することができ、それによりアッセイの感度が高まる。AP抗体は細胞内のSNAP-25の全量を測定するので、分析物が過剰にあるため、高感度の基質は必要でない。
【００５６】
例えば、「少なくとも第1の捕捉抗体」など、本明細書では用語「少なくとも」は、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する抗体に加えて、前述の特異性を持つ1つ以上の更なる抗体を本発明の方法に使用できることを意味する。同様に、「少なくとも第2の捕捉抗体」は、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する抗体に加えて、前述の特異性を持つ1つ以上の更なる抗体を本発明の方法に使用できることを意味する。更に、第1の検出抗体(単数)[又は第1の検出抗体(複数)]に特異的に結合する1つ以上の第1の検出抗体を、本発明の方法に使用することができる。同様に、第2の検出抗体(単数)[又は第2の検出抗体(複数)]に特異的に結合する1つ以上の第2の検出抗体を、本発明の方法に使用することができる。
【００５７】
用語「第1の検出複合体」とは、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合し、それにより細胞内の神経毒基質の全含有量の決定が可能になる第1の捕捉抗体及び第1の検出抗体を含む複合体のことを指す。第1の検出複合体の量は、特異的に結合している第1の検出抗体の量の決定によって測定することができる。これは、酵素の性質又は第1の検出抗体の標識に応じて、例えば蛍光の強度を測定することにより実現することができる。
【００５８】
用語「第2の検出複合体」とは、神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合し、それにより細胞内の切断された神経毒基質の含有量の決定が可能になる第2の捕捉抗体及び第2の検出抗体を含む複合体のことを指す。第2の検出複合体の量は、特異的に結合している第2の検出抗体の量の決定によって測定することができる。これは、酵素の性質又は第2の検出抗体の標識に応じて、例えば蛍光の強度を測定することにより実現することができる。
【００５９】
信号対雑音比が、形成された抗体-抗原複合体からのシグナルとバックグラウンドシグナルとを統計的に有意な程度に区別できるという規定付きで、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)の代わりに、任意の検出系を使用して本発明の方法の態様を実践することができると想像される。免疫に基づく検出系の非限定的な例には、ウェスタンブロッティング及びドットブロッティングのような免疫ブロット分析、免疫沈降分析並びにサンドイッチELISAがある。シグナルの検出は、画像化若しくは蛍光体画像化(AU)を伴うオートラジオグラフィー、生物発光(BL)、蛍光、共鳴エネルギー移動、平面偏光、比色又はフローサイトメトリー(FC)を使用して実現することができる。免疫に基づく検出系の説明は、例えば、Commonly Used Techniques in Molecular Cloning、A8.1-A8-55(Sambrook及びRussell、編、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第3巻、第3版、2001)、Detection Systems、A9.1-A9-49(Sambrook及びRussell、編、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第3巻、第3版、2001)に開示されている。
【００６０】
更なる態様において、本明細書で言及される細胞、抗体、神経毒ポリペプチド及び神経毒基質又は他の任意の生成物は、それぞれ単離された細胞、抗体、神経毒ポリペプチド、神経毒基質若しくは生成物である。単離された抗体など、本明細書では用語「単離された」とは、ヒトが介在して自然環境から分離された分子のことを指す。
【００６１】
本発明の方法の1つ態様において、方法は蛍光法である。
【００６２】
本発明の方法の別の態様において、本明細書の他の場所で詳細に定義されるように、神経毒ポリペプチドは、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F若しくはBoNT/Gポリペプチド又は破傷風(TeNT)神経毒ポリペプチドである。
【００６３】
本発明の方法の更なる態様において、神経毒基質は、VAMP/シナプトブレビン、SNAP-25又はシンタキシンである。
【００６４】
以下において、本発明の方法に使用できるそれぞれの神経毒基質の対応する受託番号は、ヒトSNAP-25 P60880、ヒトシンタキシン-1A Q16623、シンタキシン-1B P61266、シンタキシン-2 P32856、シンタキシン-3 Q13277、シンタキシン-4 Q12846、シンタキシン-5 Q13190、シンタキシン-6 O43752、シンタキシン-7 O15400、シンタキシン-8 Q9UNK0、シンタキシン-10 O60499、シンタキシン-11 O75558、シンタキシン-12 Q86Y82、シンタキシン-16 O14662、シンタキシン-17 P56962、シンタキシン-18 Q9P2W9、シンタキシン-19 Q8N4C7、ヒトシナプトブレビン-1 P23763、シナプトブレビン-2 P63027、シナプトブレビン-3 Q15836、ヒトシナプトタグミン:シナプトタグミン-1 P21579、シナプトタグミン-2 Q8N9I0、シナプトタグミン-3 Q9BQG1、シナプトタグミン-4 Q9H2B2、シナプトタグミン-5 O00445、シナプトタグミン-6 Q5T7P8、シナプトタグミン-8 Q8NBV8、シナプトタグミン-9 Q86SS6、シナプトタグミン-10 Q6XYQ8、シナプトタグミン-11 Q9BT88、シナプトタグミン-12 Q8IV01、シナプトタグミン-13 Q7L8C5、シナプトタグミン-14 Q8NB59、シナプトタグミン-15 Q9BQS2、シナプトタグミン-16 Q17RD7、シナプトタグミン-17 Q9BSW7、ヒト小胞結合膜タンパク質(VAMP):小胞結合膜タンパク質1 P23763、小胞結合膜タンパク質2 P63027、小胞結合膜タンパク質3 Q15836、小胞結合膜タンパク質4 O75379、小胞結合膜タンパク質5 O95183、小胞結合膜タンパク質7 P51809、小胞結合膜タンパク質8 Q9BV40、又はシナプス小胞糖タンパク質(SV2):シナプス小胞糖タンパク質2A Q7L0J3、シナプス小胞糖タンパク質2B Q7L1I2、シナプス小胞糖タンパク質2Cで示される。
【００６５】
本発明の別の態様において、細胞は、初代神経細胞、本明細書の他の場所で定義される神経芽細胞腫細胞若しくは細胞系などの、神経細胞に分化することができる腫瘍細胞、P19細胞又は人工多能性幹細胞(iPS)由来ニューロン、好ましくはヒト人工多能性幹細胞(iPS)由来ニューロンからなる群から選択される神経細胞又は神経分化細胞である。
【００６６】
本発明の方法の更なる態様において、細胞を固定するステップは、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド又はその混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって実行される。好ましくは、細胞を固定するステップは、氷冷メタノール(-20℃)の添加及び-20℃で約20分間のインキュベーションによって実行される。
【００６７】
本発明の方法の一態様において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体により、細胞内の神経毒基質の全量を決定することが可能になる。それぞれの神経毒基質の中にある第1の捕捉抗体の適切な結合領域及びエピトープは、本明細書の他の場所に定義されている。
【００６８】
本発明の方法の特定の態様において、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体は、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684、ウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19708(Pierce Antibodies)又はウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19701(Pierce Antibodies)である。
【００６９】
本発明の方法の更なる態様において、第2の捕捉抗体は、本発明のマウスモノクローナル抗体20-2-5、5-10-5、1-10-4、16-5-4、6-3-8、18-3-3若しくは14-12-1、又はマウスモノクローナル抗体クローンMC-6053(R&D Systems)である。好ましくは、第2の捕捉抗体は、マウスモノクローナル抗体20-2-5である。本発明のマウスモノクローナル抗体の可変領域及びCDRの対応する配列は、本明細書の他の場所に記述されている。
【００７０】
本発明の方法の特定の態様において、第1及び/又は第2の捕捉抗体は、固定されている。例えば、前記第1及び/又は第2の捕捉抗体は、固相支持体に連結されている。本明細書では用語「固相支持体」は、「固相」と同義であり、本明細書に開示される第1及び/又は第2の捕捉抗体を固定するために使用できる任意の基材のことを指す。固相支持体の非限定的な例には、例えば、管、板、カラム、ピン若しくは「計量棒」、磁気粒子、ビーズ又は例えば、アガロース、セファロース、二酸化ケイ素及びプラスチックなど他の球面若しくは繊維性クロマトグラフィー媒体、並びに例えば、ニトロセルロース及びポリフッ化ビニリデン(PVDF)などのシート又は膜がある。固相支持体は、例えばガラス、炭素、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、ジアゾセルロース又は澱粉など様々な物質を使用して構築することができる。選択される固相支持体は、それを可溶性又は結合していない物質から容易に分離できるようにし、例えば過剰な試薬、反応副産物又は溶媒など結合していない物質を固相支持体結合アッセイ成分から(例えば、洗浄、濾過、遠心分離などによって)分離する、さもなければ除去することを一般に可能にする物理的特性を有することができる。固相支持体を作製及び使用する方法の非限定的な例は、例えば、Molecular Cloning, A Laboratory Manual上記(2001)及びCurrent Protocols in Molecular Biology、上記(2004)に記述されており、それぞれはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。一態様において、第1及び/又は第2の捕捉抗体は、ビーズにコンジュゲートされる。抗体-ビーズコンジュゲートは、前記細胞の透過処理によって得られる孔を通じて細胞に入ることができるのに十分小さいと想定される。
【００７１】
本発明の方法の特定の態様において、第1の検出抗体は、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体又は蛍光色素にコンジュゲートされた抗体である。
【００７２】
本発明の方法の更なる特定の態様において、第2の検出抗体は、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体、グルコースオキシダーゼコンジュゲート抗体、チロシナーゼコンジュゲート抗体又はβガラクトシダーゼコンジュゲート抗体である。
【００７３】
好ましくは、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体が、細胞内の全SNAP-25など(切断されていない及び切断された)神経毒基質の全量を測定するための第1の検出抗体として使用され、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体が、細胞内のBoNT/Aに切断されたSNAP-25など切断された神経毒基質の量を測定するための第2の検出抗体として使用される。
【００７４】
本発明の方法の特定の態様において、AP基質は、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸(DiFMUP)などの4-メチルウンベリフェリルリン酸誘導体又はフルオレセイン二リン酸(FDP)である。
【００７５】
本発明の方法の特定の態様において、HRP基質は、Amplex UltraRed、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)又は3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(HPPA)である。
【００７６】
本発明の方法のより特定の態様において、本方法は、図1に例示される通りに実行される。
【００７７】
更なる態様において、本発明は、
a)第1の捕捉抗体、第2の捕捉抗体、第1の検出抗体及び第2の検出抗体の構成体であって、本発明の方法を実行可能にする構成体と、
b)a)による構成体によって決定された第1及び第2の検出複合体の量に基づいて前記神経毒によって切断された基質の量を算出する手段と、
c)前記方法を実行するための説明書と
を含む、本発明の方法を実行するためのキットに関する。
【００７８】
本明細書では用語「キット」とは、上述した手段又は一緒に梱包されてもされなくてもよい本発明の試薬の集まりのことを指す。キットの成分は、別々のバイアルに(即ち別々の部品のキットとして)含まれてもよく又は単一バイアルで提供されてもよい。更に、本発明のキットは、本明細書において上で言及される方法の実施に使用されることを理解されたい。一態様において、全ての成分が、本明細書に記される方法を実施するのにすぐに利用可能な方式で提供されると想定される。更なる態様において、キットは、前記方法を実行するための説明書を含有する。説明書は、紙又は電子形態のユーザーマニュアルによって提供され得る。例えば、マニュアルは、本発明のキットを使用して上述した方法を実行した場合に得られる結果を解釈するための説明書を含むことができる。
【００７９】
最終的に、別の態様において本発明は、(i)本発明の方法によって神経毒産物の生物活性を決定するステップと、(ii)医薬品若しく化粧品用途に使用する神経毒産物を製剤化するステップとを含む、医薬品又は化粧品用途に使用する製剤化された神経毒産物を製造する方法に関する。神経毒産物は、当技術分野において公知の所望の用途目的によって決まる様々な技術によって製剤化することができる。例えば、(生物学的に活性な)神経毒産物は、1つ以上の薬学的に許容できる担体と組み合わせて医薬組成物として使用することができる。薬学的に許容できる担体は、製剤の他の要素に適合しており、その投与患者に有害でないという意味で許容可能でなければならない。利用される医薬用担体には、固体、ゲル又は液体があり得る。固体担体の典型例は、ラクトース、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などである。液状担体の典型例は、グリセロール、リン酸緩衝生理食塩水、水、乳剤、各種湿潤剤などである。適切な担体は、上記の及び当技術分野において周知の他の担体を含む、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pennsylvaniaを参照のこと。一態様において、医薬組成物は、投与の前に希釈剤に溶解することができる。また希釈剤も、神経毒産物の生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水又は生理的食塩水である。加えて、医薬組成物又は製剤は、他の担体又は非毒性、非治療的、非免疫原性安定剤などを含むこともできる。したがって、一態様において、製剤化された神経毒産物は、液体又は凍結乾燥形態で存在することができる。一態様において、それは、グリセロール、タンパク質安定剤(HSA)又はポリビニルピロリドン(PVP)、ヒアルロン酸若しくは遊離アミノ酸などの非タンパク質安定剤と一緒に存在することができる。一態様において、適切な非タンパク質安定剤は、WO2005/007185又はWO2006/020208に開示されている。一態様において、本発明の方法によるステップ(i)によって決定される生物活性は、25、50、75、100、125、150又は200U(マウスLD50単位)のボツリヌス毒素活性に相当する。製剤化された神経毒産物は、治療上有効な用量で様々な疾患若しくは障害のヒト若しくは動物療法に又は美容上の目的に使用することができる。
【００８０】
本明細書で言及される疾患又は障害は、随意筋力、頸部、頭蓋ジストニアを含む局所性ジストニア及び良性特発性眼瞼痙攣、片側顔面痙攣、及び局所性痙直、胃腸障害、多汗症、並びに美容上のしわ修正、眼瞼痙攣、顎開口型及び顎閉口型口下顎ジストニア、歯ぎしり、メージュ症候群、舌ジストニア、眼瞼失行、開口頸部ジストニア、頸部前屈、頸部後屈、頸部側屈、斜頸、咽頭ジストニア、喉頭ジストニア、痙攣性発声障害/内転筋型痙攣性呼吸困難、四肢ジストニア、腕ジストニア、動作特異性ジストニア、書痙、音楽家痙攣、ゴルファー痙攣、脚ジストニア、腿部内転、腿部外転、膝屈曲、膝伸展、足首屈曲、足首伸展、内反尖足、奇形足ジストニア、母指の過伸展、足指屈曲、足指伸展、軸性ジストニア、ピサ症候群、ベリーダンサージストニア、分節性ジストニア、片側性ジストニア、全身性ジストニア、lubag病におけるジストニア、大脳皮質基底核変性症におけるジストニア、lubag病におけるジストニア、遅発性ジストニア、脊髄小脳失調におけるジストニア、パーキンソン病におけるジストニア、ハンチントン舞踏病におけるジストニア、ハレルフォルデンスパッツ病におけるジストニア、ドーパ誘発性ジスキネジア/ドーパ誘発性ジストニア、遅発性ジスキネジア/遅発性ジストニー、発作性ジスキネジア/ジストニア、運動性、非運動性、動作誘発性口蓋ミオクローヌス、ミオクローヌス、ミオキミア、筋波動症、硬直、良性筋痙攣、遺伝性顎振戦、奇異性顎筋活動、片側咀嚼筋痙攣、肥大性鰓弓ミオパチー、咬筋肥大、前脛骨筋肥大、眼振、動揺視、核上性注視麻痺、持続性部分てんかん、痙性斜頸手術の計画、声帯外転筋麻痺、難治性変異性発生障害、上部食道括約筋機能障害、声帯肉芽腫、吃音、ジルドラトゥレット症候群、中耳ミオクローヌス、防御性喉頭閉鎖、喉頭切除後言語障害、防御性眼瞼下垂、眼瞼内反、オッディ括約筋機能不全、偽アカラシア及び非アカラシア食道運動障害、腟痙、術後固定、振戦、膀胱機能障害、排尿筋括約筋共同運動障害、膀胱括約筋痙攣、片側顔面痙攣、神経再生ジスキネジア、オトガイのくぼみ、スティッフパーソン症候群、強縮、前立腺肥大、肥満症、脳性小児麻痺性斜視治療、網膜剥離手術後、白内障手術後の混合性随伴麻痺、無水晶体筋炎斜視、筋障害性斜視における斜視手術に合併する交代性上斜位、内斜視、外斜視、アカラシア、裂肛、外分泌腺機能亢進、フレイ症候群、ワニの涙症候群、腋窩、手掌、足底多汗症、鼻漏、脳卒中における、パーキンソン病における、筋萎縮性側索硬化症、痙攣症状における、脳炎及び脊髄炎、自己免疫過程、多発性硬化症、横断性脊髄炎、デビック症候群、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、真菌感染における、遺伝性痙性対麻痺、卒中後症候群、大脳半球梗塞、脳幹梗塞、脊髄梗塞における、中枢神経系外傷、大脳半球病変、脳幹病変、脊髄病変における、中枢神経系出血、脳出血、クモ膜下出血、硬膜下出血、脊椎内出血における、腫瘍形成、大脳半球腫瘍、脳幹腫瘍、脊髄腫瘍及び膣痙における関連唾液分泌過多からなる群から選択される。美容上の用途は、目じりのしわの治療若しくは低減又はGFL、渋面、顔面非対称から選択される。
【００８１】
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）細胞における神経毒ポリペプチドの生物活性を直接決定する方法であって、
a)神経毒中毒に感受性のある細胞を神経毒ポリペプチドと共にある時間、神経毒ポリペプチドがその生物活性を発揮できる条件下でインキュベートするステップと、
b)細胞を固定し、任意選択で、細胞を界面活性剤で透過処理するステップと、
c)細胞を、切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する少なくとも第1の捕捉抗体、並びに神経毒に切断された基質の切断部位に特異的に結合する少なくとも第2の捕捉抗体と、前記捕捉抗体が前記基質に結合できる条件下で接触させるステップと、
d)細胞を、第1の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第1の検出抗体と、前記第1の検出抗体が前記第1の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第1の検出複合体を形成し、第2の捕捉抗体に特異的に結合する少なくとも第2の検出抗体と、前記第2の検出抗体が前記第2の捕捉抗体に結合できる条件下で接触させ、それにより第2の検出複合体を形成するステップと、
e)ステップd)の第1及び第2の検出複合体の量を決定するステップと、
f)第2の検出複合体を用いて、前記細胞において前記神経毒ポリペプチドによって切断された基質の量を算出し、それにより前記細胞における前記神経毒ポリペプチドの生物活性を決定するステップと、
を含む、前記方法。
（２）蛍光法である、（１）に記載の方法。
（３）神経毒ポリペプチドが、BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/F又はTeNTである、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）基質が、VAMP/シナプトブレビン、SNAP-25又はシンタキシンである、（１）〜（３）のいずれか１に記載の方法。
（５）細胞が、初代神経細胞、神経芽細胞腫細胞などの、神経細胞に分化することができる腫瘍細胞、P19細胞若しくは人工多能性幹細胞(iPS)由来ニューロンからなる群から選択される神経細胞又は神経分化した細胞である、（１）〜（４）のいずれか１に記載の方法。
（６）前記細胞を固定するステップが、メタノール、エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド又はその混合物からなる群から選択される固化剤の添加によって実行される、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する第1の捕捉抗体により、細胞における神経毒基質の全量を決定することが可能になる、（１）〜（６）のいずれか１に記載の方法。
（８）切断されていない及び神経毒に切断された基質に特異的に結合する前記第1の捕捉抗体が、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684、ウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19708(Pierce Antibodies)又はウサギポリクローナル抗SNAP25抗体PA5-19701(Pierce Antibodies)である、（７）に記載の方法。
（９）第2の捕捉抗体が、マウスモノクローナル抗体クローン20-2-5又はマウスモノクローナル抗体MC-6053(R&D Systems)である、（１）〜（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）第1及び/又は第2の捕捉抗体が固定されている、（１）〜（９）のいずれか１に記載の方法。
（１１）第1の検出抗体が、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体又は蛍光色素にコンジュゲートされた抗体である、（１）〜（１０）のいずれか１に記載の方法。
（１２）第2の検出抗体が、アルカリホスファターゼ(AP)コンジュゲート抗体、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート抗体、グルコースオキシダーゼコンジュゲート抗体、チロシナーゼコンジュゲート抗体又はβガラクトシダーゼ抗体である、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。
（１３）HRP基質が、Amplex UltraRed、10-アセチル-3,7-ジヒドロキシフェノキサジン(ADHP)又は3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸(HPPA)である、（１）〜（１２）のいずれか１に記載の方法。
（１４）AP基質が、6,8-ジフルオロ-4-メチルウンベリフェリルリン酸(DiFMUP)などの4-メチルウンベリフェリルリン酸誘導体又はフルオレセイン二リン酸(FDP)である、（１）〜（１３）のいずれか１に記載の方法。
（１５）a)第1の捕捉抗体、第2の捕捉抗体、第1の検出抗体及び第2の検出抗体の構成体であって、（１）〜（１４）のいずれか１に記載の方法を実行可能にする、前記構成体と、
b)a)による構成体によって決定された第1及び第2の検出複合体の量に基づいて前記神経毒によって切断された基質の量を算出する手段と、
c)前記方法を実行するための説明書と、
を含む、（１）〜（１４）のいずれか１に記載の方法を実行するためのキット。
この明細書で引用される全ての参照は、その全体の開示内容及びこの明細書において特に言及される開示内容に関してここに参照により組み込まれる。
【実施例】
【００８２】
次に本発明は、以下の実施例によって例示することになるが、本発明の範囲を制限するものとして解釈されないものとする。
【００８３】
[実施例1]
神経毒に切断された基質SNAP-25の切断部位に特異的に結合するモノクローナル抗体の生成
神経毒に切断された基質SNAP-25の切断部位に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術を使用して生成した。この目的のために、Balb/cマウス(雌、8週齢)を、N末端にシステイン残基を持つSNAP-25190-197「C-TRIDEANQ」(配列番号17)で免疫化した。前記N末端システイン残基は、SNAP-25アミノ酸配列に由来しないが、SNAP-25190-197ペプチド(配列番号74)をキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に連結するために導入された。ハイブリドーマ細胞を、マウス脾臓細胞とドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ GmbH、Braunschweig、寄託番号146)から購入した骨髄腫細胞系SP2/0-Ag14(SP2/0)との融合によって得た、Hemmerleinら、Molecular Cancer 2006、5、41頁も参照のこと。神経毒に切断された基質SNAP-25の切断部位に特異的に結合する抗体を、ELISAでスクリーニングした。得られたクローンは、BoNT/Aに切断されたSNAP-25に対する特異性及び親和性に関して選択された。陰性対照として、クローンを、切断されていないSNAP-25206に結合しないことについて試験した。その結果、マウスモノクローナル抗体20-2-5、5-10-5、1-10-4、16-5-4、6-3-8、18-3-3及び14-12-1は、BoNT/Aに切断されたSNAP-25197に対して非常に特異的であり、ELISA及びウェスタンブロットにおいてSNAP25206に対して検出可能な交差反応性がないことが判明した。前記モノクローナル抗体のアイソタイプ判定は、マウスモノクローナル抗体アイソタイプ判定試験キット(Serotec)を使用して実行された。その結果、mAb 18-3-3、16-5-4及び1-10-4が、IgG2a抗体であるのに対して、mAb 20-2-5、14-12-1、6-3-8及び5-10-5は、IgG1抗体であることが判明した。
【００８４】
VH及びVL鎖の対応するアミノ酸配列並びに前述のマウスモノクローナル抗体の対応するCDR(相補性決定領域)配列を配列表に示す。
【００８５】
[実施例2]
二重蛍光CB-BoNT/A活性ELISA
細胞の固定
1.培地/毒素溶液を除去する。氷冷メタノール(-20℃)100μl/ウェルを添加し、-20℃で20分間インキュベートする。
注:その後の全てのステップを室温で行う。
【００８６】
細胞固定後:
1.メタノール溶液を除去し、PBS緩衝液100μl/ウェルを添加する。長期保存(>1日)のためには、PBS緩衝液300μl/ウェルを添加し、パラフィルムでプレートを封入するべきである。プレートは、冷蔵庫に保管すべきである。
2. PBS緩衝液を除去し、洗浄緩衝液200μl/ウェルで細胞を3回洗浄する。各ステップは、穏やかに振盪しながら1分間実施されるべきである。
3.洗浄緩衝液を除去し、失活緩衝液100μl/ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら20分間インキュベートする。
4.失活緩衝液を除去し、洗浄緩衝液300μl/ウェルで穏やかに振盪しながら細胞を5分間1回洗浄する。
5.洗浄緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液200μl/ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートする。
6.ブロッキング緩衝液を除去し、透過処理緩衝液100μl/ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら15分間インキュベートする。
7.透過処理緩衝液を除去し、PBS緩衝液300μl/ウェルで細胞を1回洗浄する。このステップは、穏やかに振盪しながら1分間実施されるべきである。
8.PBS緩衝液を除去し、各ウェルに一次抗体混合物(ブロッキング緩衝液中の抗体希釈)100μlを添加する。穏やかに振盪しながら終夜(16〜18時間)インキュベートする。細胞を、同時に2つの一次抗体と共にインキュベートする:BoNT/Aに切断されたSNAP-25に特異的なマウス抗体及びSNAP-25を認識するポリクローナルウサギ抗体(標準化のためにSNAP-25の全量を決定するための抗体)。
9.一次抗体混合物を除去し、洗浄緩衝液200μlで細胞を4回洗浄する。各ステップは、穏やかに振盪しながら5分間実施されるべきである。
10.洗浄緩衝液を除去し、各ウェルに二次抗体混合物:HRPコンジュゲート抗マウス及びAPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(ブロッキング緩衝液中の希釈抗体)100μlを添加し、穏やかに振盪しながら2.5〜3時間インキュベートする。
11.二次抗体混合物を除去し、洗浄緩衝液200μl/ウェルで細胞を5回洗浄し、その後HEPES緩衝液300μl/ウェルで洗浄ステップを1回行う。各洗浄ステップは、穏やかに振盪しながら5分間実施されるべきである。
12.プレートからPBS緩衝液を除去し、各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ用の発蛍光性基質(HRP基質)75μlを添加する。穏やかに振盪しながら50分間インキュベートする。直射光からプレートを保護する。
13.各ウェルにアルカリホスファターゼ用の発蛍光性基質(AP基質)75μlを添加し、穏やかに振盪しながら更に50分間インキュベートする。直射光からプレートを保護する。
14.蛍光プレートリーダーを使用してプレートを読み込む:
540nmで励起、600nmで放射。
360nmで励起、450nmで放射。
15.算出
標準化のために、切断されたSNAP-25のRFU値(600nmでの蛍光)を、各ウェルの全SNAP-25のRFU(450nm)に対して標準化する。線図においてRFUをより良く図示するために、以下の式を使用して全ての値を係数1000で掛け算する:
【００８７】
【数１】
0006608357.tif 000002
その後、各標準又はサンプルについて得られたRFU値を平均する。
【００８８】
試薬調製
洗浄緩衝液:
10mM PBS緩衝液(pH7.4)に0.1% Triton X-100
PBS緩衝液(10mM):
リン酸緩衝食塩水(Sigma、#P5368)(pH7.4)
失活緩衝液:
10mM PBS緩衝液(pH7.4)に0.6% H2O2
ブロッキング緩衝液:
10mM PBS緩衝液(pH7.4)に2% BSA + 0.05% TritonX-100
透過処理緩衝液:
10mM PBS緩衝液に0.5% TritonX-100
HEPES緩衝液:
50mM HEPES(pH7.4)
HRP基質:
50mM HEPES(pH7.4)
0.007% H2O2
150pM Amplex UltraRed
AP基質:
25mMジエタノールアミン(pH9.8)
2mM MgCl2
100μL M DiFMUP
【００８９】
[実施例3]
本発明の実施例2によるCBA-ELISAのBoNT/A較正曲線の実例
親SiMa細胞の細胞培養及びBoNT/Aによる中毒を、供給元のマニュアルに従って実行した。同様に、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来ニューロン(Cellular Dynamics)の細胞培養及びBoNT/Aによる中毒を、製造者による手順に従って実行した。
【００９０】
実施例2に従ってELISAを実行した。切断されていない及びBoNT/Aに切断されたSNAP-25に特異的に結合する第1の捕捉抗体として、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684(Sigma)が使用された。この抗体は、細胞内のSNAP-25の全量の検出を可能にする。BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体として、本発明のモノクローナル抗体クローン20-2-5(実施例1を参照のこと)を利用した。
【００９１】
図2の2つのグラフは、得られたBoNT/A較正曲線を示す。それらは、BoNT/Aの濃度と活性、及びHRP基質について決定された蛍光シグナル(RFU)とBoNT/Aに切断されたSNAP-25の含有量(単一のBoNT/A標準のエラーを例示するためにRFU値はブランク補正されない)それぞれの依存関係を実証する。BoNT/Aの濃度及び活性をそれぞれ増加させることにより、より多くのSNAP-25が神経毒によって変換され、切断されたSNAP-25の含有量が増加する。BoNT/AのBoNT/A濃度/活性のシグナルの依存関係は、4引数方程式を使用して例示される。
【００９２】
[実施例4]
二重蛍光CB-BoNT/A活性ELISA
細胞の固定
1.培地/毒素溶液を除去する。氷冷メタノール(-20℃)100μl/ウェルを添加し、-20℃で20分間インキュベートする。
注:その後の全てのステップを室温で行う。
【００９３】
細胞固定後:
1.メタノール溶液を除去し、PBS緩衝液100μl/ウェルを添加する。長期保存(>1日)のためには、PBS緩衝液300μl/ウェルを添加し、パラフィルムでプレートを封入するべきである。プレートは、冷蔵庫に保管すべきである。
2. PBS緩衝液を除去し、PBS緩衝液200μl/ウェルで細胞を3回洗浄する。各ステップは、穏やかに振盪しながら1分間実施されるべきである。
3.PBS緩衝液を除去し、失活緩衝液100μl/ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら20分間インキュベートする。
4.失活緩衝液を除去し、PBS緩衝液300μl/ウェルで穏やかに振盪しながら細胞を3分間1回洗浄する。
5.PBS緩衝液を除去し、ブロッキング緩衝液200μl/ウェルを添加し、穏やかに振盪しながら1時間インキュベートする。
6.ブロッキング緩衝液を除去し、各ウェルに一次抗体混合物(ブロッキング緩衝液中の希釈抗体)100μlを添加する。穏やかに振盪しながら終夜(16〜18時間)インキュベートする。細胞を、同時に2つの一次抗体と共にインキュベートする:BoNT/Aに切断されたSNAP-25に特異的なマウス抗体及びSNAP-25を認識するポリクローナルウサギ抗体(標準化のためにSNAP-25の全量を決定するための抗体)。
7.一次抗体混合物を除去し、PBS緩衝液200μlで細胞を4回洗浄する。各ステップは、穏やかに振盪しながら3分間実施されるべきである。
8.PBS緩衝液を除去し、各ウェルに二次抗体混合物:HRPコンジュゲート抗マウス及びAPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(ブロッキング緩衝液中の希釈抗体)100μlを添加し、穏やかに振盪しながら2.5〜3時間インキュベートする。
9.二次抗体混合物を除去し、PBS緩衝液200μl/ウェルで細胞を5回洗浄し、その後HEPES緩衝液300μl/ウェルで洗浄ステップを1回行う。各洗浄ステップは、穏やかに振盪しながら3分間実施されるべきである。
10.プレートからHEPES緩衝液を除去し、各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼ用の発蛍光性基質(HRP基質)75μlを添加する。穏やかに振盪しながら50分間インキュベートする。直射光からプレートを保護する。
11.各ウェルにアルカリホスファターゼ用の発蛍光性基質(AP基質)75μlを添加し、穏やかに振盪しながら更に50分間インキュベートする。直射光からプレートを保護する。
12.蛍光プレートリーダーを使用してプレートを読み込む:
540nmで励起、600nmで放射。
360nmで励起、450nmで放射。
13.算出
標準化のために、切断されたSNAP-25のRFU値(600nmでの蛍光)を、各ウェルの全SNAP-25のRFU(450nm)に対して標準化する。線図においてRFUをより良く図示するために、以下の式を使用して全ての値を係数1000で掛け算する:
【００９４】
【数２】
0006608357.tif 000003
その後、各標準又はサンプルについて得られたRFU値を平均する。
【００９５】
試薬調製
PBS緩衝液(10mM):
リン酸緩衝食塩水(Sigma、#P5368)(pH7.4)
失活緩衝液:
10mM PBS緩衝液(pH7.4)に0.6% H2O2
ブロッキング緩衝液:
10mM PBS緩衝液(pH7.4)に2% BSA + 0.05% TritonX-100
HEPES緩衝液:
50mM HEPES(pH7.4)
HRP基質:
50mM HEPES(pH7.4)
0.007% H2O2
150pM Amplex UltraRed
AP基質:
25mMジエタノールアミン(pH9.8)
2mM MgCl2
100μL M DiFMUP
【００９６】
[実施例5]
本発明の実施例4によるCBA-ELISAのBoNT/A較正曲線の実例
ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来ニューロン(Cellular Dynamics)の細胞培養及びBoNT/Aによる中毒を、製造者による手順に従って実行した。
【００９７】
実施例4に従ってELISAを実行した。切断されていない及びBoNT/Aに切断されたSNAP-25に特異的に結合する第1の捕捉抗体として、ウサギポリクローナル抗SNAP-25抗体S9684(Sigma)が使用された。この抗体は、細胞内のSNAP-25の全量の検出を可能にする。BoNT/Aに切断されたSNAP-25の切断部位に特異的に結合する第2の捕捉抗体として、本発明のモノクローナル抗体クローン20-2-5(実施例1を参照のこと)を利用した。
【００９８】
図3に示されるグラフは、得られたBoNT/A較正曲線を示す。それらは、BoNT/Aの濃度と活性、及びHRP基質について決定された蛍光シグナル(RFU)とBoNT/Aに切断されたSNAP-25の含有量それぞれの依存関係を示す。BoNT/Aの濃度及び活性をそれぞれ増加させることにより、より多くのSNAP-25が神経毒によって変換され、切断されたSNAP-25の含有量が増加する。BoNT/AのBoNT/A濃度/活性のシグナルの依存関係は、4引数方程式を使用して例示される。
【図１】
0006608357.tif 000004
【図２】
0006608357.tif 000005
【図３】
0006608357.tif 000006
【配列表】
0006608357000001.app