(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための医薬組成物であって、前記動物に対する薬学的有効量の（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１，４−ジオン（環状グリシル−２−アリルプロリンまたはｃＧ−２−アリルＰともいう）または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を含む、医薬組成物。
【請求項２】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための医薬組成物であって、前記動物に対する薬学的有効量の（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１，４−ジオン（環状グリシル−２−アリルプロリンまたはｃＧ−２−アリルＰともいう）または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を含み、前記症状が、実行能力の欠損、または不安神経症、または異常な恐怖条件付け、または異常な社会的行動、または反復的行動である、医薬組成物。
【請求項３】
レット症候群の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための医薬組成物であって、前記動物に対する薬学的有効量の（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１，４−ジオン（環状グリシル−２−アリルプロリンまたはｃＧ−２−アリルＰともいう）または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を含む、医薬組成物。
【請求項４】
脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための医薬組成物であって、前記動物に対する薬学的有効量の（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１，４−ジオン（環状グリシル−２−アリルプロリンまたはｃＧ−２−アリルＰともいう）または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を含む、医薬組成物。
【請求項５】
フェラン−マクダーモット症候群（２２ｑ１３欠失症候群としても知られている）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための医薬組成物であって、前記動物に対する薬学的有効量の（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１，４−ジオン（環状グリシル−２−アリルプロリンまたはｃＧ−２−アリルＰともいう）または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を含む、医薬組成物。
【請求項６】
前記障害が、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）ならびに病理学的要求回避（ＰＤＡ）からなる群から選択される、請求項１から２までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記障害が、脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）、アンジェルマン症候群、フェラン−マクダーモット症候群（２２ｑ１３欠失症候群としても知られている）、結節性硬化症複合体、ＣＤＫＬ５変異およびＸ連鎖性乳児スパスム症候群及びレット症候群からなる群から選択される、請求項１から２までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ｃＧ−２−アリルＰが、水溶液および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、添加剤、担体またはアジュバントを含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
錠剤またはカプセル剤中に、賦形剤、担体、添加剤、アジュバントまたは結合剤の１つまたは複数をさらに含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記治療が、前記ｃＧ−２−アリルＰを、直接的または循環を介して間接的のいずれかで投与することを含む、請求項１から９までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記治療が、前記環状Ｇ−２−アリルＰを、経口、腹腔内、血管内、末梢循環、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、大槽内、局所、注入、移植片、エアロゾル、吸入、乱切、嚢内、筋肉内、鼻腔内、口腔、経皮、経肺、経直腸または経膣経路を介して投与することを含む、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記有効量が、前記動物のキログラム質量当たり約０．００１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の下限および約１００ｍｇ／ｋｇの上限を有する、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
有効性の評価が、前記動物のリンパ球におけるリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）またはリン酸化されたＡｋｔ（ｐＡｋｔ）の測定によるものであり、ここで、ｐＥＲＫまたはｐＡｋｔのいずれかにおける減少は、前記障害の重症度における低減を示す、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ＡＳＤの症状が、認知機能障害または認知機能不全、記憶喪失、空間位置感覚の喪失、学習能力の減少、短期または長期記憶を形成する能力の減少、エピソード記憶の減少、記憶を統合する能力の減少、空間記憶の減少、シナプス形成の減少、シナプス安定性の減少、実行能力の欠損、認知マッピングおよび場面記憶の欠損、発言および関係記憶の欠損、配置的または接続的な関係の迅速な習得の減少、具体的事象の文脈固有のコード化および想起の減少、エピソードおよび／またはエピソード様記憶の減少、不安神経症、異常な恐怖条件付け、異常な社会的行動、反復的行動、異常な夜行性行動、発作活動、異常な運動、ホスホ−ＥＲＫ１／２およびホスホ−Ａｋｔの異常発現ならびに徐脈の１つまたは複数の兆候または症状である、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの抗アポトーシス剤、抗壊死剤または神経保護剤をさらに含む、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
この国際特許出願は、２０１３年７月２５日に出願され、「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ａｕｔｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」と題された、発明者Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｉｒｗｉｎ  Ｇｌａｓｓ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｊｏｈｎ  Ｂｉｃｋｅｒｄｉｋｅ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｆｒｅｄｒｉｃｋ  ＳｎａｐｅおよびＰａｔｒｉｃｉａ  Ｐｅｒｅｚ  ｄｅ  Ｃｏｇｒａｍによる、米国仮特許出願第６１／９５８，３２９号の優先権を主張する。この仮出願は、参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ジケトピペラジンと構造的に関連している新規二環式化合物およびそれらの治療的使用のための方法に関する。特に、本発明は、そのような化合物の神経保護活性作用に関する。より詳細には、本発明は、自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）、および脆弱性Ｘ症候群（ＦＳＸ）等の神経発達障害（ＮＤＤ）の治療における、環状グリシル−２−アリルプロリン（「環状Ｇ−２−アリルＰ」または「ｃＧ−２−アリルＰ」または「ＮＮＺ２５９１」）およびその医薬組成物を含む環状グリシルプロリン（「ｃＰＧ」）およびその類似体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）の診断が増加しつつある。ＡＳＤは、社会的相互作用およびコミュニケーションにおける異常、限定的な興味、ならびに反復的行動を特徴とする、連鎖性発達障害の総称である。古典的な自閉症または自閉性障害に加えて、the American Psychiatric Association’s (APA) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5)の第５版は、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）をＡＳＤとして認識している。
神経発達障害（ＮＤＤ）は、脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、ＣＤＫＬ５変異（レット症候群およびＸ連鎖性乳児スパスム症候群とも関連している）等を含む。すべてではないが多くのＮＤＤは、遺伝子変異によって引き起こされ、そのため、時に単一遺伝子病と称される。一部のＮＤＤ患者は、自閉症の行動および症状を呈する。
【０００４】
ＮＤＤの例として、脆弱性Ｘ症候群は、罹患個体が様々な程度の知的障害者であり、種々の関連精神医学的症状を見せる、Ｘ連鎖性遺伝性疾患である。臨床的に、脆弱性Ｘ症候群は、知的障害、多動性および注意力の問題、自閉症スペクトラム症状、情緒不安定ならびにてんかんを特徴とする（Hagerman, 1997a）。脆弱性Ｘ症候群で見られるてんかんは、最も一般的には小児期において存在するが、その後、成人期に向かって次第に寛解する。多動性は、罹患男性のおよそ８０％において存在する（Hagerman, 1997b）。突き出た耳および顎ならびに関節の過伸展性等の身体的特色が高頻度で存在するが、診断に役立つものではない。知的障害は、表現型を定義する最も一般的な特色である。概して、男性は女性よりも重度に罹患する。女性が罹患しないという初期印象は、女性における特定の学習困難および他の神経精神医学的特色の存在の理解に取って代わられた。男性において存在する学習障害は年齢に伴ってより明確になるが、この経時的効果は、明示的な神経変性プロセスよりも発達曲線の平坦化の反映であると見られる。
脆弱性Ｘ症候群で見られる脳機能の損壊は、ヒトにおける脳構造の変化に匹敵する。ＭＲＩスキャン研究は、脆弱性Ｘ症候群が、適合対照において期待されるであろうよりも大きい脳体積に関連すること、およびこの変化がＦＭＲＰプロモーター領域におけるトリヌクレオチド拡張と相関することを明らかにする（Jakala et al, 1997）。顕微鏡レベルでは、脆弱性Ｘ症候群を持つヒトは、ニューロンの樹枝状構造の異常、特に、異常に多数の未熟な樹状突起棘を示す（Irwin et al., 2000）。
【０００５】
ＮＤＤの現在利用可能な治療は、症状の管理に焦点を当てれば対症的であり、かつ補助的であり、集学的アプローチを必要とする。教育的および社会的な技能訓練ならびに療法を早期に実施して、学習遅延および社会的機能障害の核心問題に対処する。特別な学問的、社会的、職業的、および支援サービスが多くの場合必要とされる。薬物療法、心理療法または行動療法が、共起する不安神経症、注意欠陥多動性障害（「ＡＤＨＤ」）、鬱病、攻撃性等の不適応な行動、および睡眠問題の管理に使用され得る。抗てんかん薬を使用して発作を制御してもよい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、以前に、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる、２００４年８月３１日に出願された特許出願公開第２００４／０２８３０号において、環状シクロペンチル−Ｇ−２−ＭｅＰおよび環状−Ｇ−２−アリルＰ（「ｃＧ−２−アリルＰ」）を含むがこれらに限定されない環状グリシルプロリン（「ｃＰＧ」）およびその類似体が、神経保護性および神経再生性であることを示した。ＡＳＤもＮＤＤも現在有効な治療はなく、患者ケアは、社会的および行動的介入を主に使用する症状の管理に限定される。本発明者らは、現在、環状Ｇ−２−アリルＰおよび本明細書で開示されている他の二環式化合物が、ＡＳＤおよびＮＤＤの治療において、特に、異常な社会的行動を正常化するために有効となり得ることを発見している。
【０００７】
本発明者らは、予想外にも、ｃＧ−２−アリルＰが、脆弱性Ｘ症候群（「ＦＸＳ」）または他のＡＳＤを有する動物における、不安神経症、多動性、記憶、学習ならびに種に典型的な異常な社会的行動および反復的行動に、着実な治療効果を有することを発見した。加えて、本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰで治療したｆｍｒ１−ノックアウト動物におけるＥＲＫ１／２およびＡｋｔリン酸化の変化が、ＡＳＤのｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断的評価を提供し、脆弱性Ｘ症候群の表現型が変性ｍＧＩｕＲ発現の結果であるという仮説を裏付けることを見出した。その上、ｃＧ−２−アリルＰの投与は、ｆｍｒ１−ノックアウトマウスにおけるニューロンの棘の数を有意に低減させた。
本明細書で開示されているｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用されるｆｍｒ１−ノックアウト動物は、脆弱性Ｘ症候群を持つヒトと同じ遺伝子変異を有するため、ｃＧ−２−アリルＰを含む本発明の環状グリシルプロリン（「ｃＧＰ」）化合物の投与は、ヒトにおける自閉症スペクトラム障害、神経発達障害および脆弱性Ｘ症候群の症状を治療するのに有用となり得る。加えて、本発明者らは予想外にも、本発明のｃＧＰが、ＡＳＤを持つ動物における有害な社会的行動および反復的行動を有効に治療し、故に、より正常な社会的相互作用を回復できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
故に、本発明の一態様は、後述する構造式および置換基を有する新規環式化合物を提供する。
【化１】
0006574769.tif 000002
式１
【０００９】
いくつかの態様では、式１の化合物は、
Ｘ1が、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｘ2が、ＣＨ2、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、またはＲ4およびＲ5は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であるか、またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であり、但し、Ｒ1＝メチルであり、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｈである場合、Ｒ5はベンジルではなく、Ｒ1＝Ｈである場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方はＨではない、置換基を含む。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2である式１の化合物（環状グリシル−２−アリルプロリン）または薬学的に許容されるその塩、立体異性体もしくは水和物を提供する。
また他の態様では、本発明は、薬学的に許容される賦形剤および治療有効量の環状Ｇ−２アリルＰを含む、医薬組成物を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、認知機能障害を有する動物を治療する方法であって、該動物に有効量の環状Ｇ−２−アリルＰを含む組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。またさらなる態様では、治療される動物はヒトである。
本発明を、その具体的な実施形態を参照して記述する。本発明の他の態様は、図面を参照して理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】スコポラミン処置後のモリス水迷路試験（ＭＷＭＴ：Ｍｏｒｒｉｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｍａｚｅ  Ｔｅｓｔ）の、習得期（１〜４日目）における動作に対する環状Ｇ−２−アリルＰによる処置の効果を示すグラフである。
【図１Ｂ】ＭＷＭＴのプローブ試験（５日目）におけるプラットフォーム象限潜時に対する環状Ｇ−２−アリルＰによる処置の効果を示すグラフである。
【図１Ｃ】３つの群：（１）ビヒクル処置、（２）スコポラミンおよびｃＧ−２−アリルＰ−処置ならびに（３）スコポラミン処置した動物の習得期の４日目に、プラットフォームを見つけるのに要した時間を示すグラフである。
【図２】処置後２５日目のプローブ試験中に、見慣れた物体を探索するのに費やした時間と新規物体を探索するのに費やした時間との差異を示すグラフである。見慣れた物体のデータ点は、３つの見慣れた物体の探索に費やした時間の平均を反映している。新規物体認識のデータ点は、新規物体を探索するのに費やした実時間である。
【図３】２４日目のＮＯＲＴの試験期における、海馬のＣＡ１領域のＡＭＰＡグルタミン酸受容体−１染色と、新規物体の調査に費やした時間と見慣れた物体の調査に費やした時間との比との間の相互関係を示すグラフである。
【図４】ビヒクル（ｖｅｈ）と比較した、６日目および２４日目のＣＡ１顆粒細胞層中におけるＡＭＰＡ  ＧｌｕＲｌの密度に対するｃＧ−２−アリルＰ（ｔ）の効果を示すグラフである。
【図５】処置後２４日目のＣＡ１多形細胞層中におけるＡＭＰＡ  ＧｌｕＲ１の密度に対するｃＧ−２−アリルＰ（ｔ）の効果を示すグラフである。
【図６】処置後２４日目の海馬のＣＡ３領域におけるシナプス前染色の密度を増大させる傾向に対するｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図７】処置後２４日目のＣＡ１領域の多形細胞層におけるシナプス前染色の密度を増大させる傾向に対するｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図８】処置後２４日目のＣＡ１領域の放線状層におけるシナプス前染色の密度を増大させるｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図９Ａ−９Ｃ】ＣＡ１およびＣＡ３におけるＮＭＤＡＲ−１の密度に対するｃＧ−２−アリルＰ処置の効果を示すグラフである。
【図１０】海馬のＣＡ１−２におけるＫｒｏｘ２４染色の密度に対するｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図１１】中齢期ラット（各群中ｎ＝２）の海馬の小領域ＣＡ３およびＣＡ１における、シナプス後密度を並置する２００ｎｍ2正方形内のビヒクルの数に対するｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図１２】興奮毒性酸化ストレス後の動物におけるニューロンの生存に対する環状Ｇ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図１３】興奮毒性酸化ストレス後の動物におけるニューロンの生存に対する環状シクロペンチルＧ−２−ＭｅＰの効果を示すグラフである。
【図１４】全脳虚血に供した動物における環状Ｇ−２−アリルＰの神経保護効果を示すグラフである。
【図１５】全脳虚血に供した動物における神経防護作用に対する異なる用量の環状Ｇ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【図１６Ａ】海馬ニューロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究に使用したチャンバーを描写する図である。
【図１６Ｂ】培養液中で１７日後の海馬ニューロンの写真を描写する図である。
【図１６Ｃ】ＧＦＰ標識Ｆｍｒ１ノックアウト海馬ニューロンを描写する図である。
【図１６Ｄ】ｃＧ−２−２アリルＰで処置したＦｍｒ１ノックアウトマウス由来の海馬ニューロンの写真を描写する図である。
【図１７】本発明のｃＧ−２−アリルＰの効果を試験するのに使用したオープンフィールド試験デバイスの写真を描写する図である。
【図１８】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１ノックアウト動物の、オープンフィールド試験に費やした時間Ｔ１のグラフを描写する図である。
【図１９】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物の、オープンフィールド試験における短期記憶（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｍ  ｍｅｍｏｒｙ）の結果のグラフを描写する図である。
【図２０】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物の、オープンフィールド試験における長期記憶（ｌｏｎｇ−ｔｅｍ  ｍｅｍｏｒｙ）の結果のグラフを描写する図である。
【図２１】ビヒクルで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における連続路地試験（Ｓｕｃｃｅｓｓｉｖｅ  Ａｌｌｅｙｓ  Ｔｅｓｔ）の結果のグラフを描写する図である。
【図２２】ｃＧ−２−アリルＰで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における連続路地試験の結果のグラフを描写する図である。
【図２３】野生型マウスおよびｆｍｒ１−ノックアウトマウスにおける本発明のｃＧ−２−アリルＰの効果の研究において使用した、高架式十字迷路の写真を描写する図である。
【図２４】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における高架式十字迷路の閉じたアーム試験の結果のグラフを描写する図である。
【図２５】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における高架式十字迷路の開いたアーム試験の結果のグラフを描写する図である。
【図２６】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における高架式十字迷路センター試験の結果のグラフを描写する図である。
【図２７】野生型およびｆｍｒ１−ノックアウトマウスにおける恐怖条件付けに対するｃＧ−２−アリルＰの効果を研究するのに使用したデバイスの写真を描写する図である。
【図２８】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における恐怖条件付け試験の結果のグラフを描写する図である。
【図２９Ａ−Ｅ】野生型マウスおよびｆｍｒ１−ノックアウトマウスにおける営巣行動に対するｃＧ−２−アリルＰの評価効果を研究するために使用した営巣スコアの写真を描写する図である。図２９Ａは１のスコアを描写し、図２９Ｂは２のスコアを描写し、図２９Ｃは３のスコアを描写し、図２０Ｄは４のスコアを描写し、図２９Ｅは５のスコアを描写している。
【図３０】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物における社交性試験の結果のグラフを描写する図である。
【図３１】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物におけるｐＥＲＫの発現レベルの結果のグラフを描写する図である。
【図３２】ビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型動物およびｆｍｒ１−ノックアウト動物におけるｐＡＫＴの発現レベルの結果のグラフを描写する図である。
【図３３Ａ−３３Ｆ】炎症性メディエーターインターロイキン１−ベータ（「ＩＬ１−ベータ」）およびインターロイキン６（「ＩＬ−６」）の発現に対するＰＢＢＩおよびｃＧ−２−アリルＰの効果の結果のグラフを描写する図である。図３３Ａ〜３３ＣはＩＬ１−ベータについての結果を描写し、図３３Ｄ〜３３ＦはＩＬ−６についての結果を描写している。
【図３４Ａ−３４Ｈ】ＢＡＸおよびＢＣＬ−２の発現に対するＰＢＢＩおよびｃＧ−２−アリルＰの効果の結果のグラフを描写する図である。図３４Ａ〜３４ＣはＢＡＸ発現についての結果を描写している。図３４Ｄ〜３４ＨはＢＣＬ２発現についての結果を描写している。
【図３５Ａ−３５Ｃ】３つの異なる時点におけるＡＴＦ３の発現に対するＰＢＢＩおよびｃＧ−２−アリルＰの効果の結果のグラフを描写する図である。
【図３６Ａ−３６Ｏ】神経可塑性に関連する数種の遺伝子マーカーの発現に対するＰＢＢＩおよびｃＧ−２−アリルＰの効果の結果のグラフを描写する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分枝鎖、直鎖または環状炭化水素ラジカルを指す。ラジカルは、二重結合の周囲でシスまたはトランス配座のいずれであってもよい。例示的なアルケニル基は、アリル、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル、シクロペンテニル等を含む。いくつかの実施形態では、アルケニル基は（Ｃ2−Ｃ6）アルケニルであり、他の実施形態では、アリルは特に有用となり得る。
【００１４】
「アルキル」は、飽和分枝鎖、直鎖または環状炭化水素ラジカルを指す。例示的なアルキル基は、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロプロピルメチル、ヘキシル等を含む。いくつかの実施形態では、アルキル基は（Ｃ1−Ｃ6）アルキルである。
「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分枝鎖、直鎖または環状炭化水素ラジカルを指す。例示的なアルキニル基は、エチニル、プロピニル、ブチニル、イソブチニル等を含む。いくつかの実施形態では、アルキニル基は（Ｃ2−Ｃ6）アルキニルである。
「アリール」は、コンジュゲートしたπ電子系を持つ不飽和環状炭化水素ラジカルを指す。例示的なアリール基は、フェニル、ナフチル等を含む。いくつかの実施形態では、アリール基は（Ｃ5−Ｃ20）アリールである。
【００１５】
「アリールアルキル」は、末端炭素と結合している水素原子の１個がアリール基で置きかえられている、直鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル基を指す。例示的なアリールアルキル基は、ベンジル、ナフチルメチル、ベンジリデン等を含む。
認知機能障害は、ＡＳＤ、ＮＤＤ、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体型認知症および他の障害を有する患者、ならびにヒトを含む老齢動物において観察され得る。
「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（Ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、記載されている要素を含むがこれらに限定されないことを意味する。
「増殖因子」は、細胞上の受容体と相互作用することによって細胞を刺激して成長または増殖させる、細胞外で活性なポリペプチドを指す。
「ヘテロアルキル」は、１個または複数の炭素原子が、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ等の別の原子で置きかえられている、アルキル部分を指す。例示的なヘテロアルキル基は、ピロリジン、モルホリン、ピペリジン、ピペラジン、イミダゾリジン、ピラゾリジン、テトラヒドロフラン、（Ｃ1−Ｃ10）置換アミン、（Ｃ2−Ｃ6）チオエーテル等を含む。
【００１６】
「ヘテロアリール」は、１個または複数の炭素原子が、Ｎ、Ｐ、Ｏ、Ｓ等の別の原子で置きかえられている、アリール部分を指す。例示的なヘテロアリール基は、カルバゾール、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、イソキノリン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピロール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール等を含む。
「傷害」は、神経系における細胞の変性、機能不全または死亡をもたらす、動物のあらゆる急性または慢性損傷を含む。そのような細胞は、神経細胞および非神経細胞を含む。傷害は、脳卒中、非出血性脳卒中、外傷性脳損傷；剥離、脊髄閉塞後等の胎児仮死に関連するまたは子宮内発育遅延に関連する周産期仮死；適正な蘇生または呼吸の失敗に関連する周産期仮死；ニアミスドローニング（ｎｅａｒ  ｍｉｓｓ  ｄｒｏｗｎｉｎｇ）、ニアミス乳幼児突然死、一酸化炭素吸入、アンモニアまたは他のガス中毒に関連する重篤なＣＮＳ外傷；心停止、昏睡、髄膜炎、低血糖、てんかん重積症；冠動脈バイパス形成手術、低血圧エピソードおよび高血圧性クリーゼに関連する脳の仮死のエピソード；ならびに脳外傷を含む。上記の例は単なる例証としてのものであり、本発明の化合物および方法によって治療できる傷害の完全な一覧であることを意図するものではないことを理解されたい。
【００１７】
「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全、非毒性かつ望ましい医薬組成物を調製するのに有用な賦形剤を指し、獣医学への使用およびヒトへの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合はガス状であってよい。
【００１８】
「薬学的に許容される塩」は、薬学的に許容され、所望の薬理学的特性を有する塩を指す。そのような塩は、化合物中に存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応することができる場合に形成され得る塩を含む。好適な無機塩は、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムならびにアルミニウムと形成されたものを含む。好適な有機塩は、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミン等の有機塩基と形成されたものを含む。そのような塩は、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸、ならびに、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸等のアルカン−およびアレーン−スルホン酸）と形成された酸付加塩も含む。２つの酸性基が存在する場合、薬学的に許容される塩は一酸一塩または二酸塩であってよく；同様に、２つを超える酸性基が存在する場合、そのような基のいくつかまたはすべては、塩として存在し得る。
【００１９】
「保護基」は、有機合成においてそれに慣例的に関連する意味を有する、すなわち、化学反応を別の保護されていない反応部位上で選択的に行うことができるように、かつ選択的反応が完了した後に基を容易に除去できるように、多官能化合物中の１つまたは複数の反応部位を選択的にブロックする基である。
「立体異性体」は、環状Ｇ−２−アリルプロリンの構造を有するが、キラル中心を有さない分子である。用語「環状Ｇ−２−アリルプロリン」は、すべての立体異性体を含む。
「置換されている」は、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリールまたはアリールアルキルラジカル上の水素原子の１個または複数が、別の置換基で独立に置きかえられている場合を指す。置換基は、−Ｒ’、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（ＮＲ’）−ＯＲ’、−ＮＲ’−Ｃ（ＮＲ’）−ＳＲ’、ＮＲ’−Ｃ（ＮＲ’）−ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチルおよびハロゲンを含み、ここで各Ｒ’は、独立に、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキルである。
【００２０】
「症状（Ｓｙｍｐｔｏｍ）」または「症状（ｓｙｍｐｔｏｍｓ）」は、認知機能障害または認知機能不全、記憶喪失の１つまたは複数の兆候または症状、空間位置感覚の喪失、学習能力の減少、短期または長期記憶を形成する能力の減少、エピソード記憶の減少、記憶を統合する能力の減少、空間記憶の減少、シナプス形成の減少、シナプス安定性の減少、実行能力の欠損、認知マッピングおよび場面記憶の欠損、発言および関係記憶の欠損、配置的または接続的な関係の迅速な習得の減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｒａｐｉｄ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｌ  ｏｒ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｖｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ）、具体的事象の文脈固有のコード化および想起の減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｎｔｅｘｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｖｅｎｔｓ）、エピソードおよび／またはエピソード様記憶の減少、不安神経症、異常な恐怖条件付け、異常な社会的行動、反復的行動、異常な夜行性行動、発作活動、異常な運動、ホスホ−ＥＲＫ１／２およびホスホ−Ａｋｔの異常発現ならびに徐脈の１つまたは複数を意味する。
【００２１】
「治療有効量」は、疾患を治療するために動物に投与された際に、疾患または傷害のための治療を達成するのに十分な量を意味する。「治療有効量」は、有害な症状もしくは所見を減少させ、望ましい症状もしくは所見を促進し、かつ／または根本となる障害を治療し、ならびに／あるいは治癒的である量を意味する。
「治療すること」または疾患の「治療」は、疾患にかかりやすいが疾患の症状を未だ経験しておらず呈してもいない動物において疾患が発生するのを予防すること（予防的治療）、疾患を阻害すること（その発症を減速させるまたは停止させること）、疾患の症状または副作用の軽減を提供すること（緩和的治療を含む）、および疾患を軽減させること（疾患の退行を引き起こすこと）を含む。
【００２２】
潜在的な水素原子（ピロール環上の水素等）は、明確化のために式から省略されているが、存在すると理解すべきである。
「ＡＴＦ３」は、活性化転写因子３を意味する。
「ＢＡＸ」は、ｂｃｌ−２様タンパク質としても公知のアポトーシス調節剤ＢＡＸを意味する。
「ＢＬＣ２アルファ」は、Ｂ−細胞リンパ腫−２を意味する。
「ＩＬ１−ベータ」は、インターロイキン１−ベータを意味する。
「ＩＬ−６」は、インターロイキン−６を意味する。
「ＢＤＮＦ」は、脳由来神経向性因子を意味する。
「Ｃｄｈ２」は、カドヘリン−２を意味する。
「Ｃｅｂｐｂ」は、ＣＣＡＡＴ／増強剤−結合タンパク質ベータを意味する。
「Ｃｒｅｍ」は、環状ＡＭＰ応答エレメント結合を意味する。
「Ｅｇｒ１」は、初期増殖応答タンパク質１を意味する。
「Ｇｒｉａ４」は、グルタミン酸受容体向イオン性ＡＭＰＡ４を意味する。
「Ｇｒｍ５」は、向代謝性グルタミン酸受容体５を意味する。
「Ｍａｐｋ１」は、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ１を意味する。
【００２３】
「ＭｅＣＰ２」は、メチルｃＰｇ結合タンパク質２を意味する。
「Ｎｒ４ａ１」は、神経成長因子１Ｂとしても公知の核内受容体サブファミリー４群Ａメンバー１を意味する。
「Ｎｔｆ３」は、ニューロトロフィン３を意味する。
「Ｎｔｆ４」は、ニューロトロフィン４を意味する。
「Ｐｃｄｈ８」は、プロトカドヘリン−８を意味する。
「Ｐｌｍ１」は、プレｍＲＮＡ漏出タンパク質１を意味する。
「Ｐｐｐ３ｃα」は、タンパク質ホスファターゼ３、触媒サブユニット、アルファを意味する。
「Ｔｎｆ」は、腫瘍壊死因子を意味する。
【００２４】
自閉症スペクトラム障害
自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）は、社会的相互作用およびコミュニケーションにおける異常、限定的な興味、ならびに反復的行動を特徴とする、連鎖性発達障害の総称である。古典的な自閉症または自閉性障害に加えて、the American Psychiatric Association's (APA) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (DSM-5)の第５版は、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）をＡＳＤとして認識している。
神経発達障害（ＮＤＤ）は、脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、ＣＤＫＬ５変異（レット症候群およびＸ連鎖性乳児スパスム症候群とも関連している）等を含む。すべてではないが多くのＮＤＤは、遺伝子変異によって引き起こされ、そのため、時に単一遺伝子病と称される。一部のＮＤＤ患者は、自閉症の行動および症状を呈する。
【００２５】
ＡＳＤおよびＮＤＤを評価するための臨床的ツール
ＡＳＤおよびＮＤＤは、１つまたは複数の臨床試験、例えば、レット症候群の自然歴／臨床的重症度尺度、異常行動チェックリスト地域版（ＡＢＣ）、異常行動チェックリスト（常同症）、バインランド、重症度の臨床全般印象（ＣＧＩ−Ｓ）、介護負担感アンケート（ＣＳＱ）、小児のエール・ブラウン強迫観念・強迫行為尺度（ＣＹＢＯＣＳ−ＰＤＤ）、小児自閉症評定尺度、反復的行動のインタビュー、ニソンガー小児行動評定尺度、広汎性発達障害行動一覧、常同行動尺度、反復的行動尺度、ロッサゴ尺度、反復的行動アンケート、および常同行動尺度、または脳波図（ＥＥＧ）スパイク頻度、ＥＥＧの周波数バンド内の総電力、手の動き、ＱＴｃおよび心拍変動（ＨＲＶ）、ならびに不規則呼吸からなる群から選択される１つまたは複数の生理学的試験を使用して、前記障害に罹患していない対照動物と比較して評価することができる。これらのツールのいくつかの信頼性および関連性を以下の表１に示す。
【００２６】
この項において使用される場合、用語「適切な」は、すべての関連カテゴリーについて利用可能な情報を用いて良好〜優れた信頼性および妥当性を伴う臨床的に意義のある転帰を測定するツールを意味する。用語「条件付きで適切な」は、「ある特定の下位尺度のみが関連する臨床的に意義のある転帰」を測定する、または「若年層にのみ意義がある」ものであってもいいツールを意味する。用語「有望な」および「潜在的に適切な」は、「新たに出現した、または一貫性のない信頼性および妥当性（例えば、良好〜優れた信頼性／妥当性）を有するが、データはすべてのカテゴリーにおいて利用可能なわけではなく、少なくとも２つがすべてのカテゴリーにおいて適正である、臨床的に意義のある転帰」を測定するツールを意味する。
【００２７】
【表１】
0006574769.tif 000003
【００２８】
不安神経症は、不安神経症、鬱病および気分尺度（ＡＤＡＭＳ）、小児および青年の症状一覧（ＣＡＳＩ）、小児行動チェックリスト（ＣＢＣＬ）、小児のための多次元不安神経症尺度（ＭＡＳＣ）、小児自閉症評定尺度（ＰＡＲＳ）、改訂小児不安神経症および鬱病尺度（ＲＣＡＤ）、小児不安神経症関連障害のスクリーニング（ＳＣＡＲＥＤ）、ニソンガー小児行動評定尺度および不安神経症診断インタビュー尺度（ＡＤＩＳ）を含む１つまたは複数の手段を使用して評価することができる。これらのツールのいくつかの信頼性および関連性を以下の表２に提示する。
【００２９】
【表２】
0006574769.tif 000004
【００３０】
ＡＳＤおよびＮＤＤにおける不安神経症を評価するための潜在的に適切な臨床的ツールを以下の表３に示す。
【表３】
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【００３１】
社会的コミュニケーションは、臨床的ツール、例えば、ＡＢＡＳ−ＩＩドメインスコア、異常行動チェックリスト（ＡＢＣ）−無気力／社会的離脱、ＡＤＩ−Ｒ、自閉症診断観察尺度−汎用版（ＡＤＯＳ−Ｇ）−新たな重症度スコア、自閉症衝撃測定（Ａｕｔｉｓｍ  Ｉｍｐａｃｔ  Ｍｅａｓｕｒｅ）、自閉症スペクトラム評定尺度、自閉症治療評価チェックリスト（ＡＴＥＣ）、ボールトスゲーム（Ｂａｌｌ  Ｔｏｓｓ  Ｇａｍｅ）、行動評価尺度（ＢＡＳ）、小児のための行動評価システム第２版ＢＡＳＣ−２（社会に関連する下位尺度）、実行能力の行動評定一覧、小児版カリフォルニア言語学習検査（ＶＬＴ−Ｃ）および修正されたＶＬＴ−Ｃ（ＭＶＬＴ−Ｃ）、介護者−小児の対話、Jahromi 2009、ＣＧＩ、小児自閉症評定尺度（ＣＡＲＳ）、小児の社会的行動アンケート、言語の基礎の臨床評価（ＣＥＬＦ−３および４）−語用論プロファイル、コミュニケーションおよび象徴的行動尺度（ＣＳＢＳ）、情動的発話タスクの理解、一般的信頼感尺度、ギリアム自閉症評定尺度（ＧＡＲＳ）、ＥＳＣＳからの共同注意測定（ＪＡＭＥＳ）、レッツフェイスイット（Ｌｅｔ’ｓ  Ｆａｃｅ  Ｉｔ！）、自発的表現言語の観測的評価（ＯＳＥＬ）、親アンケート、Nagaraj et al. 2006、親の評定アンケート、Chan et al, 2009、広汎性発達障害行動一覧（ＰＤＤ−ＢＩ）（利用可能な縮約版：ＰＤＤ−ＢＩ−スクリーニング版）、成人用の映像における読心術、小児用の映像における読心術、成人用の目から心を読むタスク改訂版（ＲＭＥＴ−Ｒ；Ｒｅａｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｉｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｙｅｓ  Ｔａｓｋ−Ｒｅｖｉｓｅｄ）、小児用の目から心を読むタスク改訂版（ＲＭＥＴ−Ｒ）、成人用の声における読心術、社会的コミュニケーションアンケート（ＳＣＱ）、社会的反応性尺度、社会的技能改善システム（ＳＳｉＳ）、心の理論試験、ならびにＶＡＢＳ−社会化およびコミュニケーションを使用して評価することができる。
【００３２】
社会的コミュニケーションを評価するために使用されるツールの中で、下記のものが「条件付きで適切な」ものとみなされる：異常行動チェックリスト（ＡＢＣ）：無気力／社会的離脱下位尺度、ＢＡＳＣ−２：社会的技能、離脱、機能的下位尺度、ＣＳＢＳ、ＥＳＣＳ、ＪＡＭＥＳ、ＳＳｉＳ、バインランド適応行動尺度社会化およびコミュニケーション下位尺度。「潜在的に適切な」ものであるとみなされるツールは、ＡＢＡＳ−ＩＩ：概念および社会的ドメイン、ＡＤＧＳ重症度スコア、自閉症スペクトラム評定尺度：社会的コミュニケーション、ＣＳＢＱ：理解下位尺度、ならびにＰＤＤ−ＢＩを含む。
【００３３】
自閉症
古典的な自閉症は、非常に多様性がある神経発達障害である。これは、典型的には乳児期または幼児期の間に診断され、明白な症状は多くの場合生後６か月から明らかになり、２〜３歳までに確立される。ＤＳＭ−５において定められた基準によれば、自閉症の診断は、（ａ）社会的相互作用における機能障害、（ｂ）コミュニケーションにおける機能障害ならびに（ｃ）限定的な興味および反復的興味および行動を含む、存在する３つの症状を必要とする。非常同摂食等の他の機能不全も一般的であるが、診断に必須ではない。これらの機能障害のうち、社会的相互作用機能障害が診断に特に重要であり、自閉症と診断するには下記の機能障害のうち２つが存在していなくてはならない：
（ｉ）社会的相互作用を調節するための複数の非言語行動（例えば、アイコンタクト）の使用における機能障害；
（ｉｉ）発達レベルに適切な仲間関係を発展させることの失敗；
（ｉｉｉ）楽しみ、興味または成就を共有しようと自発的に求めることの欠如；
（ｉｖ）社会的または感情的相互依存の欠如。
【００３４】
自閉症におけるコミュニケーション機能障害は、下記の方式の１つまたは複数で現れ得る：話し言葉の発達における遅延（その完全な欠如）；会話を開始するもしくは持続する能力における著しい機能障害；言語の常同および反復的使用；ならびに／または自発的な空想遊びの欠如。強度が異常とみなされる１つもしくは複数の興味への執着、日常行為または慣習行為の柔軟性のない順守、反復的運動マンネリズムおよび／または物体の部分に対する持続的な集中等、限定的、反復的および常同的な行動のパターンも診断に必要とされる。
最後に、自閉症と診断するには、３歳未満に、少なくとも１つの分野（すなわち、社会的相互作用、言語、または創作遊び）の機能における機能障害が発病することを要件とする。
【００３５】
アスペルガー症候群
アスペルガー症候群は自閉症と同様であり、ある特定の特色を共有する。自閉症のように、アスペルガー症候群も社会的相互作用における機能障害を特徴とし、これに、限定的な興味および反復的興味および行動が付随する。故に、アスペルガー症候群の診断は、自閉症と同じ３つの機能障害を特徴とする。しかしながら、これは、言語または認知発達において一般的遅延を有さず、対象の環境において興味の欠損を有さないことにより、他のＡＳＤとは異なる。その上、アスペルガー症候群は、典型的には、古典的な自閉症よりも症候学における重症度が低く、アスペルガー患者は自活が可能であり、比較的正常な生活を送ることができる。
【００３６】
小児期崩壊性障害
ヘラー症候群としても公知の小児期崩壊性障害（ＣＤＤ）は、小児が通常２〜４歳になるまでに発症するが（すなわち、自閉症およびレット症候群よりも遅い）、それに続き社会的、コミュニケーションおよび他の技能の重度の喪失を示す状態のことである。小児期崩壊性障害は自閉症によく似ており、いずれも、正常な発達、それに続き言語、社会的遊びおよび運動技能の有意な喪失を伴う。しかしながら、小児期崩壊性障害は、典型的には自閉症よりも遅く発生し、技能のより劇的な喪失を伴い、はるかにまれである。
ＣＤＤの診断は、下記の分野：言語、社会的技能、遊び、運動技能（歩く、登る、握る等の能力における劇的な降下等）、腸または膀胱の制御（以前にトイレトレーニングされているにもかかわらず）の２つ以上における以前に習得された技能の劇的な喪失によって決まる。発達性技能の喪失は、突然、数日〜数週間にわたって起こり得、またはより段階的であり得る。
【００３７】
特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）
特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）は、他の明確に定義されたＡＳＤに関連する症状のすべてではないがいくつかを呈する患者について表すＡＳＤである。ＡＳＤの診断の主要な基準は、他人と交流する困難、反復的行動、およびある特定の刺激に対する感受性の高まりを含む。これらはいずれも、上述したＡＳＤにおいて見られ得る。しかしながら、自閉症、アスペルガー症候群、レット症候群およびＣＤＤは、いずれもそれらの特異的診断を可能にする他の特色を有する。これらの４つの診断のうち１つの特異的診断を行うことができないが、ＡＳＤが明らかである場合、ＰＤＤ−ＮＯＳの診断が行われる。そのような診断は、スペクトラムにおける他の状態に適用可能であるよりも遅い年齢で開始する症状に起因し得る。
【００３８】
レット症候群
レット症候群（ＲＴＴ）は、ほぼ女性だけを侵す神経発達障害である（生児出生１００００人に１人）。最近まで、ＲＴＴは、自閉症スペクトラム障害として分類されていた（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition - Revised (DSM-IV-R)）。米国では、現在およそ１６，０００人の患者がＲＴＴに罹患している（Rett Syndrome Research Trust data）。レット症候群の診断では、下記の症状が特徴的である：生後６〜１８か月からの発達障害；生後３か月〜４歳の間に開始する頭部成長速度の減速；重度の言語障害；反復的および常同的な手の動き；ならびに歩行異常、例えば、つま先歩行または不安定な強直性歩行。加えて、レット症候群の診断に役立ち得る若干数の補助基準があるが、診断に必須ではない。これらは、呼吸困難、ＥＥＧ異常、発作、筋硬直および痙直、脊柱側彎症（脊椎の湾曲）、歯ぎしり、身長に比べ小さな手および足、発育遅延、体脂肪および筋肉量の減少、異常な睡眠パターン、短気または興奮、咀嚼および／または嚥下困難、循環不良ならびに便秘を含む。
ＲＴＴの発病は、通常、生後６〜８か月の間に始まり、発達および成長速度の減速を伴う。これに続いて、退行段階（１〜４歳の小児に典型的）、擬定常段階（２〜１０歳）およびその後の進行性末期運動悪化状態が起こる。ＲＴＴ症状は、言語、および常同的動きによって置きかえられる目的を持った手の動きを含む運動技能における成長の突然の減速および退行、自閉症の特色、パニック様発作、睡眠周期障害、振戦、発作、呼吸機能不全（エピソード性無呼吸、過呼吸）、失行、ジストニア、ジスキネジー、低血圧症、進行性後彎症または脊柱側彎症および重度の認知機能障害を含む。ほとんどのＲＴＴ患者は、重度の障害を伴って成人期まで生存し、２４時間のケアを必要とする。
【００３９】
ＲＴＴの８５％〜９５％の間の症例は、Ｍｅｃｐ２遺伝子（Amir et al. 1999. Nat Genet 23: 185-188; Rett Syndrome Research Trust）−メチル−ＣｐＧ−結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）をコードする遺伝子の変異によって引き起こされると報告されている。Ｍｅｃｐ２はＸ−染色体（位置Ｘｑ２８）に位置し、この理由で、男性の遺伝子への変異は通常致死的である。ＲＴＴは遺伝性疾患であるが、報告されている症例の１％未満が遺伝性であり、Ｍｅｃｐ２のほぼすべての変異はｄｅ  ｎｏｖｏで発生し、３分の２は、３番目および４番目のエクソン上にある８ＣｐＧジヌクレオチド（Ｒ１０６、Ｒ１３３、Ｔ１５８、Ｒ１６８、Ｒ２５５、Ｒ２７０、Ｒ２９４およびＲ３０６）における変異によって引き起こされる。
【００４０】
ＭｅＣＰ２は、メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを結合して、ＣＮＳにおいてＤＮＡの転写サイレンシングを発揮するタンパク質である。ＭｅＣＰ２の低減または非存在の主要な効果は、樹状突起棘発達の機能障害およびシナプスの形成であると思われる。ＭｅＣＰ２発現は、脳成熟と時間的に相関していると思われ、なぜ症状が典型的には生後１８か月前後で出現するかを説明している。
ＡＳＤに一般的な特色を提示する
ＡＳＤをまとめると、５つすべての形態の中で症状を提示する共通性があることは明瞭である。これらの一般的な特色は、正常な社会的能力における機能障害および反復的行動である。アスペルガー症候群を除くすべてにおいて、言語技能の不足として最も一般的に現れる知能発達遅延の一貫した提示もある。年齢の正常なパラメータに対する認知損失は、自閉症、レット症候群、ＣＤＤおよびＰＤＤ−ＮＯＳにおいて、多くの場合かなり著しい。
【００４１】
ＡＳＤの遺伝モデル
妥当性を提供するために、ＡＳＤの動物モデルは、臨床状態と同様の症状を実証し、それらの症状の病因に関して合理的な程度の表面的妥当性を有さなくてはならない。古典的な自閉症は、多くの異なる遺伝的機能障害によって引き起こされ得、自閉症症例の数パーセントを超えて占める単一の遺伝的欠陥はないと考えられていることが公知である。実際に、最近の研究は、まれな遺伝性の遺伝的欠陥に加えて、ＡＳＤの根本となると考えられる染色体位置の多数のｄｅ  ｎｏｖｏ構造の多様性を明らかにした（Marshall et al, 2008; Sebat et al, 2007）。故に、１ｐ、５ｑ、７ｑ、１５ｑ、１６ｐ、１７ｐおよびＸｑを含む２０以上の主要な部位における遺伝子配列のコピー数の多様性（ＣＮＶ）、転座および反転が、ＡＳＤ遺伝子座としてマッピングされている。
【００４２】
しかしながら、ＡＳＤの根本となる多起源のバックグラウンドおよび病因の複雑性にもかかわらず、ある特定の遺伝的欠陥はＡＳＤを生成できることが公知である。最もよく特徴付けられている欠陥のいくつかは、ニューロリジン−３（ＮＬＧＮ３）、ニューロリジン−４（ＮＬＧＮ４）、ニューレキシン−１α（ＮＲＸＮ１）およびシャンク３を含むシナプス後密度タンパク質のクラスターをコードする遺伝子の染色体異常から生じる（Sebat et al, 2007）。
【００４３】
ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４は、グルタミン酸作動性シナプス中に存在するシナプス後細胞接着分子である。これらは、シナプス後部位とのシナプス前接触を適合させるという役割を果たし、シナプス後足場タンパク質シャンク３とも相互作用する。ＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４への変異は、ＡＳＤ集団において観察されており、すべてのＡＳＤ症例のおそらく１％を占める（Lintas & Persico, 2008）。Ｊａｍａｉｎおよび共同研究者は、最初に、アスペルガー症候群および古典的な自閉症をそれぞれもたらす、２人の血縁関係がない対象におけるＮＬＧＮ３へのミスセンスおよびＮＬＧＮ４へのフレームシフトを報告した（Jamain et al, 2003）。ＡＳＤ集団におけるＮＬＧＮ３またはＮＬＧＮ４変異の発生率は確かに低いが（実際に、カナダでの研究における９６人のＡＳＤ患者の研究では、そのような変異は観察されなかった；Gauthier et al, 2005）、前臨床研究では、ニューロリジン変異が、自閉症の症状のモデルを実際に生成できることが確認された。故に、臨床的に報告されている、マウスへのＮＬＧＮ３に対する同じＲ４５１Ｃミスセンスの導入することは、社会的相互作用の低減および阻害シナプス伝達の増強を示す変異マウス株をもたらす（Tabuchi et al, 2007）。
【００４４】
このようにして得られたＲ４５１Ｃ変異マウスは、ＮＬＧＮ３変異に基づくＡＳＤのモデルの代表である。この事例では、ＮＬＧＮ３のＲ４５１位における変異は、「機能獲得」変異をもたらす。
対照的に、マウスにおけるＮＬＧＮ４の臨床変異をモデリングすることは、ＮＬＧＮ４の「機能喪失」変異によって実現される（古典的なノックアウトモデル）。このモデルでは、変異マウスは、社会的相互作用欠陥および超音波発声の低減を見せる（Jamain et al, 2008）。コミュニケーション欠陥は臨床的ＡＳＤの中核をなし、ＮＬＧＮ４ノックアウトマウスにおいて、野生型雌対応群に曝露した雄マウスの超音波発声における低減は、ＡＳＤのモデルとしての株の表面的妥当性を裏付ける。
【００４５】
シナプス前ニューレキシンタンパク質は、シナプス後ニューロリジン対応群との相互作用を介して、並置した樹状突起におけるシナプス後分化を誘導する。ニューレキシン−１α（ＮＲＸＮ１）遺伝子の変異は、多数の研究において報告されており（Sebat et al, 2007; Marshall et al, 2008; Kim et al, 2008; Yan et al, 2008）、これらは、コピー数のバリアントの形態で観察された。ＮＬＧＮ変異と同様に、ＮＲＸＮ１遺伝子の変異がマウスに（遺伝子ノックアウトの形態で）導入されると、ある特定のＡＳＤ様特色を持つ変異体株が生成される（Etherton et al, 2009）。これらのＮＲＸ１ノックアウトマウスは、海馬小型模型興奮性シナプス後電流（ｍＥＰＳＣ）周波数の減少および誘起電流の入力出力関係の減少を示す。これらの電気生理学的効果は、海馬における興奮性伝達の減少に関連する。興奮性神経伝達の減少に加えて、ＮＲＸＮ１ノックアウトマウスは、プレパルス抑制における減少を呈するが、社会的行動は影響を受けていないように思われる（Etherton et al, 2009）。
【００４６】
ニューレキシン−ＮＬＧＮトランス−シナプス構築物とある特定の特色を共有し、細胞接着分子１（ＣＡＤＭ１）は、シナプストランス−細胞接着活性にも関与するシナプス前および後の両方に存在する免疫グロブリンファミリータンパク質である（Biederer et al, 2002）。ＣＡＤＭ１遺伝子への変異は、ＡＳＤ患者において検出されており、これらの状態のさらなる考えられる原因を表すと思われる（Zhiling et al, 2008）。
ＣＡＤＭ１ノックアウトマウスの分析は、これらの動物が、不安神経症に関連する行動の増加、社会的相互作用の障害ならびに社会的記憶および認識の障害を示すことを明らかにする。加えて、ＣＡＤＭ１ノックアウトマウスは、より劣った運動技能を実証する（Takayanagi et al, 2010）。これらの機能不全は、ここでもＡＳＤ症候学と一致している。
【００４７】
２２ｑ１３欠失症候群（フェラン−マクダーモット症候群としても公知である）は、第２２染色体のｑ１３．３末端における微小欠失によって引き起こされるまれな遺伝性疾患である。この微小欠失は、典型的な遺伝的スクリーニングによって覆われていないことはまれであり、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション試験が診断を確認するために推奨される。最近の研究は、症候群が、正常なニューロンの機能のために重大なシナプス後密度タンパク質をコードする遺伝子シャンク３におけるエラーによって引き起こされることを示している。興味深いことに、この遺伝子におけるエラーはＡＳＤとも関連しており、２２ｑ１３欠失症候群は一般的にＡＳＤ診断につながり得る（Durand et al, 2007; Moessner et al, 2007; Sykes et al, 2009）。２２ｑ１３欠失症候群とＡＳＤの結果的診断との密接な関連を考慮して、この変異の変異マウスモデルが開発された。
【００４８】
シャンク３ノックアウトマウスは、超音波発声の低減（すなわち、社会的コミュニケーションの減退）およびマウス間での社会的相互作用時間の減少を含むＡＳＤ症状に酷似した数種の欠損を呈する。加えて、これらのマウスは、誘起電流と長期相乗作用（ＬＴＰ：ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の減少との入力出力関係によって測定された、海馬ＣＡ１興奮性伝達も減少している。ＬＴＰは、記憶形成および強化の根本となる生理学的プロセスであると考えられている。故にモデルは、ＡＳＤと一致する、ＮＬＧＮ４ノックアウトと同様の表現型を呈する。
言及したとおり、２２ｑ１３欠失症候群自体は非常にまれである。しかしながら、これは、特定の遺伝子の関与がＡＳＤの病因において決定的な役割を有し得るという重要な情報を提供する。シャンク３に加えて、この障害は、ＡＳＤにおけるさらなる考えられる遺伝子欠陥を明らかにする。５０のまたは記述されている２２ｑ１３欠失症候群のそのような症例のうち、１つを除いてすべてが、シャンク３を超えて伸びてＩｓｌｅｔ  Ｂｒａｉｎ−２遺伝子（ＩＢ２）として公知のさらなる遺伝子を含む、遺伝子欠失を有する（Sebat et al, 2007）。ＩＢ２タンパク質は、ＭＡＰキナーゼおよびアミロイド前駆体タンパク質を含む多くの他のタンパク質と相互作用し、神経突起におけるタンパク質輸送に影響を与えるように思われ、シナプス後密度において濃縮される（Giza et al, 2010）。タンパク質を欠いているマウス（ＩＢ２−／−ノックアウトマウス）は、社会的相互作用の減少（社会的臭い嗅ぎ行動および相互作用時間の低減）、探査行動の低減ならびに認知および運動欠損を呈する（Giza et al, 2010）。この行動的表現型は、小脳細胞における興奮性伝達の低減と関連していた。したがって、シャンク３ノックアウトと同様に、ＩＢ２変異の表現型もＡＳＤと一致する。
【００４９】
上述したシナプス後密度タンパク質欠損の動物モデルに加えて、ＡＳＤとともに自閉症につながり得る種々の特色を共有する他の単一遺伝子症候群が、ＡＳＤの薬物標的化のもう１つの手段を提供する。
最近、脆弱性Ｘ症候群は、神経発達障害（ＮＤＤ）と呼ばれる障害の別のファミリーに割り当てられている。本明細書における記述は、障害の公式分類に基づいて区別していない。将来、一方または他方のＡＳＤまたはＮＤＤが再分類されれば、この記述および本明細書における開示は、それらの名称にかかわらず、新たな分類に当てはまることになる。
【００５０】
脆弱性Ｘ症候群
脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、ｆｍｒ１遺伝子によってコードされたタンパク質を発現できないという結果をもたらす、Ｘ−染色体上での単一のトリヌクレオチド遺伝子配列（ＣＧＧ）の拡張によって引き起こされる。ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）は、正常な神経発達に必要とされるタンパク質である。脆弱性Ｘ症候群は、小児において自閉症を引き起こす可能性があり（Hagerman et al, 2010）、自閉症と診断されたすべての小児の２〜６％において、原因はＦＭＲ１遺伝子変異である。その上、ＦＸＳを持つ小児のおよそ３０％はある程度の自閉症を有し、さらに３０％はＰＤＤ−ＮＯＳと診断される（Hagerman et al, 2010）。実際に、脆弱性Ｘ症候群は、自閉症の最も一般的に公知の単一遺伝子原因である。ＦＭＲ１ノックアウトマウスは、ＦＸＳのモデルとして開発されたものであり、したがって、さらなるモデルとして、ｆｍｒ１遺伝子の変異は、異常な樹状突起棘発達および剪定（Comery et al, 1997）を、シナプス後密度における樹枝状足場タンパク質（シャンク１を含む）およびグルタミン酸受容体サブユニットの関連異常調節（Schutt et al, 2009）とともにもたらすことが示された。樹状突起形態学のこれらの効果は、大脳皮質およびへんとう体（Zhao et al, 2005）および海馬（Lauterbom et al, 2007）におけるＬＴＰの低下、ならびに認知障害（Kreuger et al, 2011）および社会不安神経症の増進（Spencer et al, 2005）をもたらす。
【００５１】
レット症候群
自閉症、アスペルガー、ＣＤＤおよびＰＤＤ−ＮＯＳのＡＳＤと比較して、レット症候群は、ほぼ単一遺伝子基盤を有するように思われ、マウスにおいて良好な表面的妥当性でモデル化され得る。レット症候群は、症例の最大９６％において、Ｍｅｃｐ２遺伝子の欠陥によって引き起こされると考えられている（Zoghbi, 2005）。結果として、ＭｅＣＰ２ノックアウト変異マウスは、臨床的レット症候群のすべての特質を持つ動物モデルを提供し、表現型はＡＳＤのＮＬＧＮ４、シャンク３およびＩＢ２ノックアウトモデルと若干の重複を示す。故に、ＭｅＣＰ２ノックアウトマウスは、海馬におけるＬＴＰの明瞭な機能障害を、社会的および空間記憶における対応する減少（Moretti et al, 2006）ならびに物体認識障害（Schaevitz et al, 2010）とともに示す。
故に、ヒトにおけるＡＳＤは、げっ歯類を含む動物における認知または発達障害の多くの特色を共有する。したがって、マウスおよびラット等のげっ歯類におけるＡＳＤの療法の研究は、ヒトにおいて取得される合理的に予測可能な結果である。
【００５２】
本発明の化合物
本発明のある特定の実施形態は、後述するとおりの構造を有する環状プロリル−グルタメート（「ｃＰＧ」）の新規誘導体を含む。
【化２】
0006574769.tif 000006
式１
【００５３】
ある特定の実施形態では、式１の化合物は、
Ｘ1が、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｘ2が、ＣＨ2、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ4およびＲ5は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であるか、
またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であり、
但し、Ｒ1＝メチルであり、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｈである場合、Ｒ5はベンジルではなく、
Ｒ1＝Ｈである場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方はＨではない、
置換基を含む。
【００５４】
さらなる実施形態では、式１の化合物は、
Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、Ｒ4＝Ｒ5＝メチル、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｒ2＝Ｒ3＝メチル、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2
置換基を含む。
本発明の他の実施形態では、式１の化合物は、
Ｒ4およびＲ5が一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、
Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、ｎ＝０、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、ｎ＝２、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、ｎ＝０、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、ｎ＝２、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2。
Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、ｎ＝３、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2；
Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、ｎ＝３、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2
置換基を含む。
【００５５】
本発明のまた他の実施形態では、式１の化合物は、Ｒ1＝メチルまたはアリルであり、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝ＨおよびＲ5が、アミノ酸：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、ノルバリン、ノルロイシン、シトルリン、オルニチン、ホモシステイン、ホモセリン、アロイソロイシン、イソバリン、サルコシン等の側鎖からなる群から選択される、置換基を含む。
【００５６】
本発明のまたさらなる実施形態では、式１の化合物は、
Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝メチル、Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｘ1＝ＮＨ、およびＸ2＝Ｓである置換基；
Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝メチル、Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｘ1＝ＮＨ、およびＸ2＝Ｓである置換基
を含む。
当業者ならば、上記の構造的表現がキラル中心を含有し得、その数は、異なる置換基によって決まることを理解するであろう。キラリティーは、各中心においてＲまたはＳのいずれであってもよい。構造図面は、考えられる互変異性、立体配座ジアステレオマーまたは鏡像異性形態の１つのみを表すことができ、本発明は任意の互変異性、立体配座異性体ジアステレオマーまたは鏡像異性形態を網羅し、これは本明細書において記述されているとおりの生物学的または薬理学的活性を呈することを理解すべきである。
【００５７】
薬理学および有用性
環状グリシル−２−アリルプロリン（ｃＧ−２−アリルＰ）は、２００６年４月７日に出願され、「Ｃｙｃｌｉｃ  Ｇ−２Ａｌｌｙｌ  Ｐｒｏｌｉｎｅ  ｉｎ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された、米国実用出願第１１／３９９，９７４号、現在は２０１０年８月１７日に発行された米国特許第７，７７６，８７６号、２００６年３月２日に出願され、「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」と題された米国実用出願第１０／５７０，３９５号、現在は米国特許第８，０６７，４２５号、「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」と題された、ＰＣＴ国際特許出願第２００４／０２８３０８号、２００３年９月３日に出願され、「Ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅ」と題された、米国仮特許出願第６０／４９９，９５６号、および２０１１年３月８日に出願され、「Ｃｙｃｌｉｃ  Ｇｌｙｃｙｌ−２−ＡｌｌｙｌＰｒｏｌｉｎｅ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ａｎｉｍａｌｓ」と題された、米国特許出願公開第１３／０４３，２１５号において記述されている。上記の特許出願および特許のそれぞれは、参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる。
【００５８】
本発明のある特定の態様は、神経変性状態を伴う老化に関連する認知機能障害の治療における、または明らかな神経変性がなく認知機能障害が見られる状況における、環状Ｇ−２−アリルＰの使用を含む。
スコポラミンは、アルツハイマー病に関連するコリン作用性機能低下の動物モデルにおいて一般的に使用される。スコポラミン処置後に観察される機能的欠損は、アルツハイマー病のヒト患者において見られるものを含む。故に、スコポラミン処置は、ヒト疾患において見られる認知機能障害を合理的に予測する。加えて、スコポラミン処置は、神経変性障害を有さないヒトにおける認知機能不全を模倣する。
【００５９】
スコポラミン誘導性認知機能不全で処置した動物に投与されたｃＧ−２−アリルＰは、それらの動物において、コリン作用性機能低下に罹患した人々に観察された治療的改善と同様の臨床的改善をもたらす。例えば、コリン作用性機能低下は、アルツハイマー病に関連する。故に、環状Ｇ−２−アリルＰスコポラミンで処置した動物の効果の研究は、コリン作用性機能不全に罹患しているヒトにおいて観察される効果を合理的に予測する。
【００６０】
他の作用物質を本発明の化合物とともに投与することができる。そのような他の作用物質は、例えば、増殖因子および関連誘導体、例えば、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、トリペプチドＧＰＥ、形質転換増殖因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ならびに／またはＩＧＦ−結合タンパク質からなる群から選択され得る。追加の化合物は、グリシル−２−メチルプロリルグルタメートおよび／または参照により完全に本明細書に明示的に組み込まれる、米国特許出願第１０／１５５，８６４号、現在は２００６年５月９日に発行された米国特許第７，０４１，３１４号において開示されている他の化合物を含む。
【００６１】
治療用途
本発明の組成物および方法は、認知機能障害ならびにＡＳＤおよびＮＤＤに関連する症状に罹患しているヒト患者等の動物の治療において使用を見出している。またさらに一般的には、本発明の組成物および方法は、記憶機能障害、知的障害、社会的相互作用の減少、コミュニケーションにおける機能障害、限定的な興味および反復的興味および行動ならびに発作に罹患しているヒト患者等の哺乳動物の治療において使用を見出している。
医薬組成物および投与
環状Ｇ−２−アリルＰは、医薬または医薬調製物の一部として投与することができる。これは、本発明の化合物を、任意の薬学的に適切な担体、アジュバントまたは賦形剤と合わせることを伴い得る。担体、アジュバントまたは賦形剤の選択は通常、当然ながら用いられる投与経路に依存することになる。
概して、本発明の化合物は、治療有効量で、当技術分野において公知の通常モードのいずれかにより、単独でまたは治療されている疾患の他の従来の治療剤と組み合わせてのいずれかで、投与されることになる。治療有効量は、疾患または傷害、その重症度、治療されている動物の年齢および相対的健康、化合物の効力ならびに他の要因に応じて広く変動し得る。抗アポトーシス剤、抗炎症剤および抗壊死剤として、環状Ｇ−２−アリルＰの治療有効量は、動物１キログラム質量当たり０．００１〜１００ミリグラムの範囲であってよく、０．００１〜０．１ｍｇ／ｋｇ等のより低用量は、脳室内投与等によって脳脊髄液を介する投与に適切であり、１〜１００ｍｇ／ｋｇ等のより高用量は、経口、全身（例えば、経皮）または非経口（例えば、静脈内）投与等の方法による投与に適切である。当業者であれば、必要以上の実験をすることなく、その技能および本開示を考慮して、所与の疾患または傷害のための本発明の化合物の治療有効量を決定することができるであろう。
【００６２】
環状Ｇ−２−アリルＰおよび他のｃＧＰ関連化合物は、当技術分野において公知である任意の末梢経路を介して末梢に投与され得る。これらは、非経口経路、例えば、末梢循環への注射、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、大槽内、局所、注入（例えば、浸透圧ポンプまたは皮膚パッチ剤等の緩徐放出デバイスまたはミニポンプを使用する）、移植片、エアロゾル、吸入、乱切（ｓｃａｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、腹腔内、嚢内、筋肉内、鼻腔内、経口、口腔、経皮、経肺、経直腸または経膣を含むことができる。組成物は、ヒトまたは他の哺乳動物への非経口投与用に、上述した神経疾患の療法を提供するための治療有効量（例えば、患者の病的状態を解消するまたは低減させる量）で、製剤化され得る。
【００６３】
望ましくは、可能ならば、抗アポトーシス剤、抗炎症剤および抗壊死剤として投与される場合、環状Ｇ−２−アリルＰは経口で投与することができる。組成物中における本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位投薬量の大きさ、賦形剤の種類、および当業者に周知である他の要因に応じて広く変動し得る。概して、最終組成物は、０．０００１質量パーセント（質量％）〜１０質量％、好ましくは０．００１質量％〜１質量％の本発明の化合物を含んでよく、残りは賦形剤である。
他の好都合な投与経路は、皮下注射（例えば、０．９％塩化ナトリウム等の生理的に適合性の担体に溶解したもの）またはＣＮＳへの直接投与を含む。定位デバイスおよび動物のＣＮＳの精密なマップを使用して、化合物は神経損傷部位に直接的に注射され得る。そのような投与経路は、その位置の灌流が、血流の減少によってまたはその領域への脳脊髄液（ＣＳＦ）流量の減少によってのいずれかで損なわれる状況においてとりわけ所望され得る。例としては、側脳室注射による、もしくは患者の脳の側脳室に外科的に挿入されたシャントを経由する投与、静脈内投与、所望の位置への直接注射による投与、直接的もしくは循環を介した間接的な投与、または他の経路による投与を含む。
【００６４】
「直接的にまたは循環を介して間接的に」により、本発明者らは、作用物質を循環に送達するために十分な血流量を有する任意の組織へのｃＧ−２−アリルＰの投与を意味する。非限定的な例は、皮膚、鼻、咽頭、消化管、または他のそのような組織を含む。そのような組織に投与されると、作用物質は組織によって吸収され、ここで作用物質は組織の間質液に入り、その後、小静脈、毛細管、細動脈またはリンパ管によって吸収される。次いで、作用物質は全身の体循環に運び込まれ、ここで脳を含む患部に送達され得る。作用物質が皮下にまたは腹膜に投与されると、作用物質は隣接組織によって吸収され、次いで、作用物質は局所的に循環に入り、その後、全身循環に送達され、ここで脳に輸送され得る。作用物質が血液脳関門に接近すると、次いで、作用物質は脳内の神経組織または脳脊髄液のいずれかに拡散することができ、ここで神経組織に送達され得る。
【００６５】
ＣＮＳにおける化合物の有効量は、本発明の化合物および担体を含むプロドラッグ形態の化合物の投与によって増加させてよく、ここで、担体は、患者体内での開裂または消化の影響を受けやすい連結によって本発明の化合物と接合している。投与後に開裂または消化される任意の好適な連結を用いてよい。
しかしながら、出願人側には、他の投与形態を除外する意図はない。
【００６６】
本発明のさらなる実施形態では、動物における神経機能を回復させることは、治療量の環状Ｇ−２−アリルＰを、例えば、増殖因子および関連誘導体（インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様増殖因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）、形質転換増殖因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ−結合タンパク質（とりわけＩＧＦＢＰ−３）、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子産物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト増殖因子、アンドロゲン誘導性増殖因子から選択される別の神経保護剤と組み合わせて投与することを含み得る。ＦＧＦファミリーの追加のメンバーは、例えば、ｉｎｔ−２、線維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｆａｃｔｏｒ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−４、ケラチノサイト（ｋａｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）増殖因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ−２）、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン）、α−、β−、γ−またはコンセンサスインターフェロン、ならびにＴＮＦ−αを含む。他の形態の神経保護性治療剤は、例えば、クロメチアゾール；キヌレン酸、セマックス、タクロリムス、Ｌ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、副腎皮質刺激ホルモン−（４−９）類似体（ＯＲＧ  ２７６６）およびジゾシルピン（ｄｉｚｏｌｃｉｐｉｎｅ）（ＭＫ−８０１）、セレギリン；ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１、ＧＶ１５０５２６等のグルタメートアンタゴニスト；２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４等のＡＭＰＡアンタゴニスト；アドレシンＭＡｄＣＡＭ−１および／または抗ＭＡｄＣＡＭ−１ｍＡｂ  ＭＥＣＡ−３６７（ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ−９４７８）等のそのインテグリンα４受容体（α４β１およびα４β７）に対する抗炎症剤を含む。
【００６７】
環状Ｇ−２−アリルＰおよび他のｃＧＰ関連化合物は、持続放出系によって好適に投与される。持続放出組成物の好適な例は、造形品の形態の半透過性ポリマーマトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルを含む。持続放出マトリックスは、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Sidman et al, 1983, Biopolymers: 22: 547-56）、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res. : 15: 267）、エチレン酢酸ビニル（Langer et al, 1981, J. Biomed. Mater. Res.: 15; 267）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）を含む。持続放出組成物は、リポソームに封入された化合物も含む。化合物を含有するリポソームは、それ自体が公知の方法：ＤＥ  ３，２１８，１２１、ＥＰ  ５２，３２２、ＥＰ  ３６，６７６、ＥＰ  ８８，０４６、ＥＰ  １４３，９４９、ＥＰ  １４２，６４１、日本特許出願第８３−１１８００８号、米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５号、ならびにＥＰ  １０２，３２４によって調製される。通常は、リポソームは、脂質含有量が約３０ｍｏｌパーセントのコレステロールより大きい小型（約２００〜８００オングストローム）単層タイプのものであり、選択された割合は、最も効果的な療法に合わせて調整される。
【００６８】
非経口投与のために、一実施形態では、環状Ｇ−２−アリルＰは、概して、所望の純度のそれぞれを、単位投薬量注射剤形態（溶液、懸濁液またはエマルション）で薬学的にまたは非経口的に許容される担体、すなわち用いられる投薬量および濃度ではレシピエントに非毒性であり、製剤の他の原料と適合性であるものと混合することにより、製剤化され得る。
【００６９】
粘膜組織への本発明の化合物の送達のために、化合物をゲル製剤に組み込むことができる。粘膜（例えば、口腔、消化管、直腸）に送達されると、作用物質はゲルを出て拡散することができ、またはゲルが分解して、それにより作用物質を組織に放出することができ、ここで循環中に吸収され得る。例示的なゲル製剤は、カルボキシルメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、キチン、キトサン、デンプン、セルロース等のカルボキシ多糖、ヒアルロン酸等のタンパク質、またはポリビニルピロリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｙｒｏｌｌｉｄｉｎｅ）、ポリビニルアルコール等の他のポリマー、ならびに当技術分野において公知である他のゲル材料で作製されているものを含み得る。
【００７０】
概して、製剤は、環状Ｇ−２−アリルＰを、液体担体もしくは微粉化した固体担体または両方と接触させることによって調製される。次いで、必要ならば、生成物を所望の製剤に造形する。好ましくは、担体は、非経口担体、より好ましくはレシピエントの血液と等張の溶液である。そのような担体ビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル液、緩衝溶液およびデキストロース溶液を含む。固定油およびオレイン酸エチル等の非水性ビヒクルも本明細書において有用である。
【００７１】
担体は、好適には、等張性および化学的安定性を増強する物質等の少量の添加剤を含有する。そのような材料は、用いられる投薬量および濃度ではレシピエントに非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、および他の有機酸またはそれらの塩等の緩衝剤；アスコルビン酸等の酸化防止剤；低分子量（約１０個未満の残基）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジンまたはアルギニン等のアミノ酸；単糖、二糖、およびセルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロースまたはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトールまたはソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の対イオン；ポリソルベート、ポロキサマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤；および／または中性塩、例えば、ＮａＣｌ、Ｃｌ、ＭｇＣｌ2、ＣａＣｌ2等を含む。
環状Ｇ−２−アリルＰおよび他のｃＧＰ化合物は、典型的には、そのようなビヒクル中、約４．５〜８のｐＨで製剤化される。前述の賦形剤、担体または安定剤のいくつかの使用は、化合物の塩の形成をもたらすことが理解されるであろう。最終調製物は、安定な液体または凍結乾燥固体であってよい。
【００７２】
医薬組成物中の環状Ｇ−２−アリルＰの製剤は、アジュバントも含み得る。錠剤、カプセル剤等に組み込まれ得る典型的なアジュバントは、アカシア、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤；微結晶性セルロース等の賦形剤；コーンスターチまたはアルギン酸のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；スクロースまたはラクトース等の甘味剤；ペパーミント、冬緑またはサクランボ等の香味剤である。剤形が錠剤である場合、環状Ｇ−２−アリルＰ組成物は、結合剤を含み得、滑らかなコーティングを含んでもよい。剤形がカプセル剤である場合、上記の材料に加えて、脂肪油等の液体担体も含有し得る。種々のタイプの他の材料を、コーティングとして、または投薬量単位の物理的形態の修飾物質として使用してもよい。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、スクロース等の甘味料、プロピルパラベンのような保存料、着色剤、およびサクランボ等の香味剤を含有してもよい。注射用滅菌組成物は、従来の医薬実務に従って製剤化することができる。例えば、水、またはゴマ、ピーナッツもしくは綿実油のような自然発生の植物油、またはオレイン酸エチルのような合成脂肪ビヒクル等のビヒクル中の活性化合物の溶解または懸濁が望ましい場合があり、緩衝剤、保存料、酸化防止剤等を、許容されている医薬実務に従って組み込むことができる。
【００７３】
注射、心室内投与、および他の侵襲性投与経路では、環状Ｇ−２−アリルＰは無菌でなくてはならない。無菌状態は、当技術分野において公知である任意の方法、例えば、滅菌濾過膜（例えば、０．２μｍの膜）に通す濾過によって遂行され得る。治療用組成物は、概して、滅菌されたアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通することができるストッパーを有する静脈注射溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
環状Ｇ−２−アリルＰを含有する医薬製剤は、通常は、単回または複数回用量容器内に、例えば、密封したアンプルまたはバイアル内に、水溶液としてまたは再構成用の凍結乾燥製剤として貯蔵されることになる。凍結乾燥製剤の例として、１０ｍＬのバイアルに、５ｍＬの化合物の滅菌濾過した１％（ｗ／ｖ）水溶液を満たし、得られた混合物を凍結乾燥させる。輸液は、静菌性注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。他の剤形および種類の調製物を使用してよく、すべてが本発明の一部とみなされることが容易に理解され得る。
【００７４】
化合物の調製
環状Ｇ−２−アリルＰを調製するのに使用される出発材料および試薬は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）、Ｂａｃｈｅｍ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）等の商業的な供給業者から入手可能であるか、または、Fieser and Fieser’s Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; Rodd’s Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989; Organic Reactions, vols. 1-40, John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1991; March J; Advanced Organic Chemistry, 4th ed. John Wiley and Sons, New York, N.Y., 1992;およびLarock: Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, 1989等の参考文献に記述された手順に準拠し、当業者に周知の方法によって調製されるかのいずれかである。ほとんどの事例では、アミノ酸およびそれらのエステルまたはアミド、ならびに保護されたアミノ酸は、広く市販されており、修飾されたアミノ酸およびそれらのアミドまたはエステルの調製は、化学および生化学の文献において広範に記述されており、故に、当業者に周知である。
【００７５】
本発明の出発材料、中間体および最終生成物は、濾過、蒸留、結晶化、クロマトグラフィー等を含む従来の技術を使用して、単離および精製することができる。これらは、物理定数およびスペクトルデータを含む従来の方法を使用して特徴付けることができる。
環状Ｇ−２−アリルＰは環状ジペプチド（二環式２，５−ジケトピペラジン）であり、環状ＧＰｘ（「ｃＧＰ」）として公知である化合物のクラスのメンバーである。概して、ｃＧＰｓおよび環状Ｇ−２−アリルＰは、ペプチドおよび修飾されたペプチド合成の分野の当業者には既に周知であるような方法によって、本明細書の後の図に明記されている反応スキームに準拠して、またはペプチドおよび類似体の合成の分野の当業者に周知である他の方法に準拠することによって調製することができる。例えば、Bodanzsky: Principles of Peptide Synthesis, Berlin, New York: Springer-Verlag 1993を参照されたい。
【００７６】
本発明のジケトピペラジン化合物の合成は、例において論じられているとおりの液相合成による、またはMerrifield et al. 1963 J. Amer. Chem. Soc.: 85, 2149-2156によって例示されている固相合成法を介するものであってよい。固相合成は、機器のために確立されたプロトコールを使用するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル４３０Ａ等の市販のペプチド合成機を使用して実施され得る。
ジケトピペラジン合成の具体例は、下記の例において、ならびに例えばFischer, 2003, J. Peptide Science: 9: 9-35およびその中の参考文献において見ることができる。当業者であれば、本開示の利用可能な技能および知識を考慮すると、本発明の化合物のための１つまたは複数の好適な合成方法を開発することは難しくない。
【００７７】
選択された方法（固相または液相）に適切な保護基、および固相合成が使用されるならば適切な基質の選択は、当業者の技能の範囲内であろう。ペプチド合成に適切な保護基は、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、トシル（Ｔｏｓ）、ベンジルオキシカルボニル（ＺまたはＣｂｚ）、ｏ−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル（ＢｒＺ）等を含む。追加の保護基は、Goodman M. (ed.), "Synthesis of Peptides and Peptidomimetics" in Methods of organic chemistry (Houben-Weyl) (Workbench Edition, E22a,b,c,d,e; 2004; Georg Thieme Verlag, Stuttgart, New York)において同定されている。
【００７８】
選択された方法のためのカップリング剤の選択も、当業者の技能内となる。好適なカップリング剤は、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、Ｂｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＰｙＢｏｐ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）、ＢｏｐＣｌ（ビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸クロリド）、２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＩＰ）等を含む。ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）およびＨＯＡｔ（１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール）等の他の化合物を、合成において、例えばラセミ化を防止するために使用してもよい。
【００７９】
実施形態
以下で提示する具体的な実施形態は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、以下の一覧中の要素の１つまたは複数を、本明細書において具体的には明記されていない組合せに組み込むことにより、他の実施形態を作成することができる。すべてのそのような実施形態は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００８０】
実施形態１。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化３】
0006574769.tif 000007
を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｘ1は、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｘ2は、ＣＨ2、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ4およびＲ5は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であるか、
またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であり、
但し、Ｒ1＝メチルであり、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｈである場合、Ｒ5はベンジルではなく、
Ｒ1＝Ｈである場合、Ｒ2およびＲ3の少なくとも一方はＨではない）
【００８１】
実施形態２。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化４】
0006574769.tif 000008
を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｘ1は、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｘ2は、ＣＨ2、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であり、
但し、少なくとも１つのＲはＨではない）
【００８２】
実施形態３。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化５】
0006574769.tif 000009
を有する化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｘ1は、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｘ2は、ＣＨ2、ＮＲ’、ＯおよびＳからなる群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数である）
【００８３】
実施形態４。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化６】
0006574769.tif 000010
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｘ1、Ｘ3およびＸ4は、Ｓ、ＯおよびＮＨからなる群から独立に選択され、
Ｘ2は、Ｓ、Ｏ、ＣＨ2およびＮＨからなる群から選択され、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5は、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ4およびＲ5は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であるか、
またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数であり、
但し、少なくとも１つのＲはＨではなく、Ｘ3およびＸ4の両方はＯではない）
【００８４】
実施形態５。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化７】
0006574769.tif 000011
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｒ1およびＲ2は、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ1およびＲ2は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数である）
【００８５】
実施形態６。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化８】
0006574769.tif 000012
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｒ1、Ｒ2およびＲ3は、−Ｈ、−ＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＮＯ2、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’、−Ｃ（ＮＲ’）ＮＲ’Ｒ’、トリハロメチル、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択され、各Ｒ’は、−Ｈ、アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリールおよびヘテロアリールアルキルからなる群から独立に選択されるか、
またはＲ2およびＲ3は一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）n−ＣＨ2−であり、ここでｎは０〜６の整数である）
【００８６】
実施形態７。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、式：
【化９】
0006574769.tif 000013
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくは水和物を投与するステップを含む、方法。
（式中、
Ｒは、アルキル、置換アルキル、ヘテロアルキル、置換ヘテロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アリールアルキル、置換アリールアルキル、ヘテロアリールアルキルおよび置換ヘテロアリールアルキルからなる群から選択される）
【００８７】
実施形態８。Ｒ1＝メチルである、実施形態１〜４または６のいずれかの方法。
実施形態９。Ｒ1＝アリルである、実施形態１〜４または６のいずれかの方法。
実施形態１０。Ｒ2＝Ｒ3＝メチルであり、Ｘ＝Ｓである、実施形態１〜４のいずれかの方法。
実施形態１１。Ｒ1＝アリル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｒ4＝Ｒ5＝Ｈ、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2である、実施形態１の方法。
【００８８】
実施形態１２。Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、Ｒ4およびＲ5が一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）3−ＣＨ2−であり、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2である、実施形態１の方法。
実施形態１３。Ｒ1＝メチル、Ｒ2＝Ｒ3＝Ｈ、Ｒ4およびＲ5が一緒になって−ＣＨ2−（ＣＨ2）2−ＣＨ2−であり、Ｘ1＝ＮＨ、Ｘ2＝ＣＨ2である、実施形態１の方法。
実施形態１４。薬学的に許容される賦形剤を投与するステップをさらに含む、実施形態１〜１３のいずれかの方法。
実施形態１５。薬学的に許容される賦形剤および結合剤を投与するステップをさらに含む、実施形態１〜１３のいずれかの方法。
【００８９】
実施形態１６。薬学的に許容される賦形剤およびカプセル剤を投与するステップをさらに含む、実施形態１〜１３のいずれかの方法。
実施形態１７。少なくとも１つの他の抗アポトーシス剤、抗壊死剤または神経保護剤を投与するステップをさらに含む、実施形態１〜１３のいずれかの方法。
【００９０】
実施形態１８。他の抗アポトーシス剤または神経保護剤が、増殖因子および関連誘導体（インスリン様増殖因子−Ｉ［ＩＧＦ−Ｉ］、インスリン様増殖因子−ＩＩ［ＩＧＦ−ＩＩ］、形質転換増殖因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク質、ＩＧＦ−結合タンパク質［とりわけＩＧＦＢＰ−３］、塩基性線維芽細胞増殖因子、酸性線維芽細胞増殖因子、ｈｓｔ／Ｋｆｇｋ遺伝子産物、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−６、ケラチノサイト増殖因子、アンドロゲン誘導性増殖因子、ｉｎｔ−２、線維芽細胞増殖因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３およびＦＨＦ−４、ケラチノサイト増殖因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク質２［ＢＭＰ−２］、グリア細胞株由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、コンセンサスインターフェロン、ＴＮＦ−α、クロメチアゾール；キヌレン酸、セマックス、タクロリムス、Ｌ−トレオ−１−フェニル−２−デカノイルアミノ−３−モルホリノ−１−プロパノール、副腎皮質刺激ホルモン−（４−９）類似体［ＯＲＧ２７６６］、ジゾシルピン［ＭＫ−８０１］、セレギリン、グルタメートアンタゴニスト、ＡＭＰＡアンタゴニストおよび抗炎症剤から選択される、実施形態１７の方法。
【００９１】
実施形態１９。前記グルタメートアンタゴニストが、ＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１およびＧＶ１５０５２６からなる群から選択される、実施形態１８の方法。
実施形態２０。前記ＡＭＰＡアンタゴニストが、２，３−ジヒドロキシ−６−ニトロ−７−スルファモイルベンゾ（ｆ）キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０およびＬＹ３００１６４からなる群から選択される、実施形態１８の方法。
実施形態２１。前記抗炎症剤が、抗ＭＡｄＣＡＭ−１抗体ならびにインテグリン４β１受容体およびインテグリンα４β７受容体に対する抗体からなる群から選択される、実施形態１８の方法。
【００９２】
実施形態２２。前記抗ＭＡｄＣＡＭ−１抗体がＭＥＣＡ−３６７である、実施形態２１の方法。
実施形態２３。前記化合物が環状Ｇ−２−アリルＰである、実施形態１の方法。
実施形態２４。前記化合物が環状シクロヘキシル−Ｇ−２ＭｅＰである、実施形態１の方法。
実施形態２５。前記化合物が環状シクロペンチル−Ｇ−２ＭｅＰである、実施形態１の方法。
実施形態２６。自閉症スペクトラム障害（ＡＳＤ）または神経発達障害（ＮＤＤ）の症状を、そのような障害に罹患している動物において治療するための方法であって、動物に、哺乳動物に対する薬学的有効量の環状グリシル−２−アリルプロリン（ｃＧ−２−アリルＰ）を投与するステップを含む、方法。
【００９３】
実施形態２７。前記ｃＧ−２−アリルＰが、水溶液および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤、添加剤、担体またはアジュバントを含む、実施形態２６の方法。
実施形態２８。錠剤またはカプセル剤中に、１つまたは複数の賦形剤、担体、添加剤、アジュバントまたは結合剤をさらに含む、実施形態２６の方法。
実施形態２９。障害が、自閉性障害、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および特定不能の広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）ならびに病理学的要求回避（ＰＤＡ；Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｍａｎｄ  Ａｖｏｉｄａｎｃｅ）からなる群から選択される、実施形態１〜２８のいずれかの方法。
実施形態３０。障害が、脆弱性Ｘ症候群（ＦＸＳ）、アンジェルマン症候群、結節性硬化症複合体、フェラン−マクダーモット症候群、レット症候群、ＣＤＫＬ５変異およびＸ連鎖性乳児スパスム症候群からなる群から選択される、実施形態１〜２８のいずれかの方法。
【００９４】
実施形態３１。化合物が、直接的または循環を介して間接的のいずれかで投与される、実施形態１〜３０のいずれかの方法。
実施形態３２。前記化合物が、経口、腹腔内、血管内、末梢循環、皮下、眼窩内、点眼、髄腔内、大槽内、局所、注入、移植片、エアロゾル、吸入、乱切、腹腔内、嚢内、筋肉内、鼻腔内、口腔、経皮、経肺、経直腸または経膣経路を介して投与される、実施形態１〜３１のいずれかの方法。
実施形態３３。前記有効量が、動物のキログラム質量当たり約０．００１ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の下限および約１００ｍｇ／ｋｇの上限を有する、実施形態１〜３２のいずれかの方法。
実施形態３４。有効性の評価が、動物のリンパ球におけるリン酸化されたＥＲＫ（ｐＥＲＫ）またはリン酸化されたＡｋｔ（ｐＡｋｔ）の測定によるものであり、ここで、ｐＥＲＫまたはｐＡｋｔのいずれかにおける正常化は、前記障害の重症度における低減を示す、実施形態１〜３３のいずれかの方法。
【００９５】
実施形態３５。前記治療が、レット症候群の自然歴／臨床的重症度尺度、異常行動チェックリスト地域版（ＡＢＣ）、バインランド適応行動尺度、重症度の臨床全般印象（ＣＧＩ−Ｓ）、臨床全般印象改善（ＣＧＩ−Ｉ）、介護負担感アンケート（ＣＳＱ）からなる群から選択される１つもしくは複数の臨床試験、または脳波図（ＥＥＧ）スパイク頻度、ＥＥＧの周波数バンド内の総電力、ＥＥＧ周波数の大脳半球間コヒーレンス、常同的な手の動き、ＱＴｃおよび心拍変動（ＨＲＶ）、ホスホ−ＥＲＫ１／２およびホスホ−Ａｋｔの異常な細胞発現、増殖関連タンパク質−４３（ＧＡＰ−４３）の異常発現、シナプトフィジン（ＳＹＮ）の異常発現、不規則呼吸ならびに心臓および呼吸機能の連結からなる群から選択される１つもしくは複数の生理学的試験を使用して、前記障害に罹患していない対照動物と比較して評価されるようなＡＳＤもしくはＮＤＤの症状における改善をもたらす、実施形態１〜３３のいずれかの方法。
【００９６】
実施形態３６。前記ＡＳＤの症状が、認知機能障害または認知機能不全、記憶喪失の１つまたは複数の兆候または症状、空間位置感覚の喪失、学習能力の減少、短期または長期記憶を形成する能力の減少、エピソード記憶の減少、記憶を統合する能力の減少、空間記憶の減少、シナプス形成の減少、シナプス安定性の減少、実行能力の欠損、認知マッピングおよび場面記憶の欠損、発言および関係記憶の欠損、配置的または接続的な関係の迅速な習得の減少、具体的事象の文脈固有のコード化および想起の減少、エピソードおよび／またはエピソード様記憶の減少、不安神経症、異常な恐怖条件付け、異常な社会的行動、反復的行動、異常な夜行性行動、発作活動、異常な運動、ホスホ−ＥＲＫ１／２およびホスホ−Ａｋｔの異常発現ならびに徐脈である、実施形態１〜３５のいずれかの方法。
【００９７】
実施形態３７。実施形態１〜３６までのいずれかの、治療的有効性の存在、重症度または評価を検出するのための方法であって、ＡＳＤの対象の末梢リンパ球におけるホスホ−ＥＲＫ１／２またはホスホ−Ａｋｔの発現を、ＡＳＤを有さない対象の群の末梢リンパ球におけるホスホ−ＥＲＫ１／２またはホスホ−Ａｋｔの発現と、あるいは治療前の対象の末梢リンパ球におけるホスホ−ＥＲＫ１／２またはホスホ−Ａｋｔの発現と比較して測定するステップを含む、方法。
【実施例】
【００９８】
本発明は、次の例によってさらに例示される。これらの例は、例示によってのみ提供され、本発明の範囲を限定することを意図しない。
化合物の合成の一般的方法
フラッシュクロマトグラフィーをＳｃｈａｒｌａｕ  ６０（４０〜６０；ｍメッシュ）シリカゲルを使用して実施した。分析用薄層クロマトグラフィーを０．２０ｍｍプレコートシリカゲルプレート（ＡＬＵＧＲＡＭ（登録商標）ＳＩＬ  Ｇ／ＵＶ254）上で実行し、化合物を、ＵＶ蛍光を使用するまたはアルカリ性溶液中の過マンガン酸カリウムに漬けたプレートを加熱することによって可視化した。
摂氏度（℃）での融点をＥｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ（登録商標）融点装置で決定し、補正しない。
旋光度を２０℃で１０ｃｍパス長セルを使用してＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ３４１旋光計で測定し、１０-1ｄｅｇｃｍ2ｇ-1の単位で示す。試料を指示された溶媒に指定の濃度（ｇ／１００ｃｍ3で測定）で調製した。ＩＲスペクトルをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｏｎｅ  ＦＴ−ＩＲ分光計で記録した。試料を塩化ナトリウムディスク上の薄膜としてまたは臭化カリウムディスク中の固体として調製した。幅広なシグナルをｂｒによって示した。吸収極大の周波数（□）を波数（ｃｍ-1）で示す。
【００９９】
ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＤＲＸ４００（1Ｈ、４００ＭＨｚ；13Ｃ、１００ＭＨｚ）またはＢｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ３００（1Ｈ、３００ＭＨｚ；13Ｃ、７５ＭＨｚ）分光計で、周囲温度で記録した。1Ｈ  ＮＭＲデータについて化学シフトをＳｉＭｅ4から低磁場に１００万分の１（ｐｐｍ）で記載し、位置（δH）、相対積分、多重度（ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｄｄ＝二重線の二重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝幅広）、結合定数（Ｊ／Ｈｚ）および帰属として連続的に報告する。13Ｃ  ＮＭＲデータについて、化学シフトをＣＤＣｌ3と比較したｐｐｍで記載し、位置（δC）、ＤＥＰＴ実験によって決定されたハイブリダイゼーションの程度および帰属として連続的に報告する。1Ｈ  ＮＭＲスペクトルはＳｉＭｅ4（δ０．００）またはＣＤＣｌ3（δ７．２６）を使用して内部的に参照した。13Ｃ  ＮＭＲスペクトルはＣＤＣｌ3（δ７７．０）を使用して内部的に参照した。グリシン−プロリンアミド結合周辺の異なるコンホメーションのためにＮＭＲスペクトルに２セットのピークが生じる場合、少数のｃｉｓ立体構造異性体についての化学シフトにアスタリスク（*）で印を付ける。
【０１００】
正確な質量測定をＶＧ−７０ＳＥ質量分析計で記録した。
ヘキサンおよびジクロロメタンを使用前に蒸留した。メタノールをマグネシウムの削り屑とヨウ素を使用して乾燥させ、窒素下で蒸留した。トリエチルアミンを水素化カルシウムで乾燥させ、窒素下で蒸留した。
【０１０１】
（例１）
（８ａＳ）−メチル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１，４−ジオン（環状Ｇ−２ＭｅＰ）の合成
【０１０２】
【化１０】
0006574769.tif 000014
【０１０３】
スキーム１：試薬、条件および収量：（ｉ）ＬＤＡ、ＴＨＦ、−７８℃、ヨードメタン、−７８−＞−５０℃、２時間（６３％）；（ｉｉ）ＳＯＣｌ2、ＣＨ3ＯＨ、還流、Ｎ2、２．５時間（９８％）；（ｉｉｉ）Ｅｔ3Ｎ、ＢｏＰＣｌ2、ＣＨ2Ｃｌ2、ＲＴ、Ｎ2、２０．５時間（７８％）；（ｉｖ）１０％Ｐｄ／Ｃ、ＣＨ3ＯＨ、ＲＴ、１５時間（９８％）
【０１０４】
（２Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−２−トリクロロメチル−１−アザ−３−オキサビシクロ［３．３．０］オクタン−４−オン９
ｎ−ＢｕＬｉ（１．３１Ｍ、４．６８ｃｍ3、６．１４ｍｍｏｌ）を乾燥テトラヒドロフラン（１０ｃｍ3）中のジイソプロピルアミン（０．８６ｃｍ3、６．１４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に−７８℃窒素雰囲気下で、滴下で加えた。溶液を５分間撹拌し、０℃に温め、１５分間撹拌した。次いで溶液を乾燥テトラヒドロフラン（２０ｃｍ3）中のオキサゾリジノン８（１．００ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）溶液に−７８℃で２０分間かけて滴下で加え（暗茶色に変わった）、さらに３０分間撹拌し、次いでヨードメタン（０．７６ｃｍ3、１２．３ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下で加えた。溶液を２時間かけて−５０℃に温めた。水（１５ｃｍ3）を加え、溶液を室温に温め、クロロホルム（３×４０ｃｍ3）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥させ（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧中で乾燥まで蒸発させ、暗茶色半流動体を生じた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（１５％酢酸エチル−ヘキサン）による残渣の精製は淡黄色固体でのオキサゾリジノン９（０．６７ｇ、６３％）をもたらした：融点55-57℃ (文献、57-60℃); δH (300 MHz, CDCl3) 1.53 (3H, s, CH3), 1.72-2.02 (3H, m, Proβ-HおよびProγ-H2), 2.18-2.26 (1H, m, Proβ-H), 3.15-3.22 (1H, m, Proδ-H), 3.35-3.44 (1H, m, Proδ-H)および4.99 (1H, s, NCH).
【０１０５】
メチルＬ−２−メチルプロリネートハイドロクロリド１０
ａ）塩化アセチルの使用
オキサゾリジノン９（０．６０ｇ、２．３３ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール（１５ｃｍ3）中に窒素雰囲気下で溶解し、塩化アセチル（０．３３ｃｍ3、４．６６ｍｍｏｌ）を氷冷溶液に滴下で加えた。溶液を還流下で４．５時間加熱し、次いで溶媒を減圧下で除去し、茶色の油を生じ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（１０％ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2）で精製し、鱗状白色固体でのハイドロクロリド１０（０．２ｇ、４８％）をもたらした：融点107-109℃ (文献、106-108℃); δH (300 MHz, CDCl3) 1.81 (3H, s, CH3), 1.93-2.14 (3H, m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.33-2.39 (1H, m, Proβ-HAHB), 3.52-3.56 (2H, m, Proδ-H2)および3.82 (3H, s, CO2CH3).
【０１０６】
ｂ）塩化チオニルの使用
乾燥メタノール（１ｃｍ3）中オキサゾリジノン９（５３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の氷冷溶液を塩化チオニル（０．０４５ｃｍ3、０．６２ｍｍｏｌ）の滴下で処置した。溶液を還流下で２．５時間加熱し、冷却し、溶媒を減圧下で除去し、茶色の油を得た。油をトルエン（５ｃｍ3）に溶解し、残存塩化チオニルおよびメタノールを除去するために乾燥まで濃縮し、次いで鱗状白色固体でのハイドロクロリド１０（１６ｍｇ、４３％）をもたらすようにフラッシュカラムクロマトグラフィー（１０％ＣＨ3０Ｈ−ＣＨ2Ｃｌ2）で精製した。1Ｈ  ＮＭＲ帰属は上に報告したものと一致した。
【０１０７】
メチル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−２−メチルプロリネート１２
乾燥トリエチルアミン（０．２７ｃｍ3、１．９６ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（３５ｃｍ3）中ハイドロクロリド１０（０．１１ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）およびＮ−ベンジルオキシカルボニル−グリシン１１（９８．５％）（０．１７ｇ、０．７９ｍｍｏｌ）の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を１０分間撹拌した。Ｂｉｓ（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物（ＢｏＰＣｌ、９７％）（０．１９６ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）を加え、得られた無色溶液を２０．５時間撹拌した。溶液を１０％塩酸水（３０ｃｍ3）および飽和炭素水素ナトリウム水（３０ｃｍ3）で連続的に洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（５０〜８０％酢酸エチル−ヘキサン；グラジエント溶出）による生じた残渣の精製は、無色油でのジペプチド１２（０．１８ｇ、９２％）を生じた。アミド１２は、13Ｃ  ＮＭＲ分析によって、ｔｒａｎｓ：ｃｉｓが９８：２の立体構造異性体の混合物として存在することが示された（比は、少数および多数の立体構造異性体それぞれのプロγ−Ｃ原子に帰属されるδ２０．８および２３．５での共鳴の相対強度から推定した）：[α]D -33.0 (MeOH中c 1.0); νmax (フィルム)/cm-1 3406, 2952, 1732, 1651, 1521, 1434, 1373, 1329, 1310, 1284, 1257, 1220, 1195, 1172, 1135, 1107, 1082, 1052, 1029, 986, 965, 907, 876, 829, 775, 738および699; δH (300 MHz, CDCl3) 1.49 (3H, s, CH3), 1.77-2.11 (4H, m, Proβ-H2およびProγ-H2), 3.43-3.48 (2H, m, Proδ-H2), 3.61 (3H, s, OCH3), 3.85-3.89 (2H, m, Glyα-H2), 5.04 (2H, s, PhCH2), 5.76 (1H, br s, N-H)および7.21-7.28 (5H, s, ArH); δC (75 MHz, CDCl3) 13.8* (CH3, Proα-CH3), 21.1 (CH3, Proα-CH3), 20.8* (CH2, Proγ-C), 23.5 (CH2, Proγ-C), 38.0 (CH2, Proβ-C), 40.8* (CH2, Proβ-C), 43.3 (CH2, Glyα-C), 45.5* (CH2, Glyα-C), 46.6 (CH2, Proδ-C), 48.7* (CH2, Proδ-C), 51.9* (CH3, OCH3), 52.1 (CH3, OCH3), 60.0* (四重線, Proα-C), 66.0 (四重線, Proα-C), 66.3 (CH2, PhCH2), 68.6* (CH2, PhCH2), 127.5 (CH, Ph), 127.6 (CH, Ph), 127.9* (CH, Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.3* (CH, Ph), 136.2 (四重線, Ph), 155.9 (四重線, NCO2), 166.0 (四重線, Gly-CON), 169.4* (四重線, Gly-CON)および173.6 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 334.1535 (M+. C17H22N2O5の計算値334.1529).
【０１０８】
（８ａＳ）−メチル−ヘキサヒドロピロロ［１、２−ａ］ピラジン−１、４−ジオン（環状Ｇ−２ＭｅＰ）
メタノール（８．０ｃｍ3）中ジペプチド１２（０．１６７ｇ、０．５１ｍｍｏｌ）の溶液に活性炭（８．１ｍｇ、０．０７６ｍｍｏｌ）上で１０％Ｐｄを加え、容器に水素ガスを流した。得られた懸濁液を水素雰囲気下で１５時間勢いよく撹拌した。次いで混合物をセライトパッド、次いでショートプラグシリカゲルを通してメタノールで濾過し、溶媒を減圧下で除去し、黄色固体で環状Ｇ−２ＭｅＰ（８３ｍｇ、９８％）を産生した：融点133-135℃; [α]D -128.1 (MeOH中c 0.52); δH (300 MHz, CDCl3) 1.36 (3H, s, CH3), 1.87-2.01 (3H, m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.07-2.21 (1H, m, Proβ- HAHB), 3.45-3.64 (2H, m, Proδ-H2), 3.82 (1H, dd, J 17.1および4.1, CHAHBNH), 3.99 (1H, d, J 17.1, CHAHBNH)および7.66 (1H, br s, N-H); δC (75 MHz, CDCl3) 20.2 (CH2, Proγ-C), 23.2 (CH3, Proα-CH3), 35.0 (CH2, Proβ-C), 44.7 (CH2, Proδ-C), 45.9 (CH2, CH2NH), 63.8 (四重線, Proα-C), 163.3 (四重線, NCO)および173.3 (四重線, CONH); m/z (EI+) 168.08986 (M+. C8H12N2O2の計算値168.08988).
【０１０９】
（例２）
（８ａＳ）−メチル−スピロ［シクロヘキサン−１，３（４Ｈ）−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン｝−１，４（２Ｈ）−ジオン（環状シクロヘキシル−Ｇ−２−ＭｅＰ）の合成
【０１１０】
【化１１】
0006574769.tif 000015
【０１１１】
スキーム２：試薬、条件および収量：（ｉ）ＢｎＯ2ＣＣｌ、Ｎａ2ＣＯ3、Ｈ2Ｏ−ジオキサン（３：１）、１９時間、９６％；（ｉｉ）Ｅｔ3Ｎ、ＨＯＡｔ、ＣＩＰ、１，２−ジクロロエタン、還流、Ｎ2、１９時間（２３％）；（ｉｉｉ）１０％Ｐｄ／Ｃ、ＣＨ3ＯＨ、ＲＴ、１７時間（６５％）。
【０１１２】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−アミノシクロヘキサン−１−カルボン酸（１４）
水−ジオキサン（２１ｃｍ3、３：１）に溶解した１−アミノシクロヘキサンカルボン酸１３（０．７２ｇ、５．０２ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（１．６ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）の懸濁液に、ベンジルクロロホルメート（０．７９ｃｍ3、５．５２ｍｍｏｌ）を滴下で加え、溶液を室温で、１９．５時間撹拌した。水層をジエチルエーテル（６０ｃｍ3）で洗浄し、２Ｍ塩酸で酸性化し、酢酸エチル（２×６０ｃｍ3）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧下で蒸発させ、静置で白色固体での粗カルバメート１４（１．２３ｇ、８８％）に固化する無色油を産生した：融点152-154℃ (文献、148-150℃); δH (400 MHz, CDCl3) 1.27-1.56 (3H, m, 3 x シクロヘキシル-H), 1.59-1.73 (3H, m, 3 x シクロヘキシル-H), 1.85-1.91 (2H, m, 2 x シクロペンチル-H), 2.05-2.09 (2H, m, 2 x シクロペンチル-H), 5.02 (1H, br s, N-H), 5.12 (2H, s, OCH2Ph)および7.27-7.36 (5H, s, Ph); δC (100 MHz, CDCl3) 21.1 (CH2, 2 x シクロヘキシル-C), 25.1 (CH2, 2 x シクロヘキシル-C), 32.3 (CH2, シクロヘキシル-C), 59.0 (四重線,1-C), 67.1 (CH2, OCH2Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.2 (CH, Ph), 128.5 (CH, Ph), 136.1 (四重線, Ph), 155.7 (四重線, NCO2)および178.7 (四重線, CO2H).
【０１１３】
メチル−Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−シクロヘキシル−グリシル−Ｌ−２−メチルプロリネート（１５）
乾燥トリエチルアミン（０．２１ｃｍ3、１．５ｍｍｏｌ）を乾燥１，２−ジクロロエタン（２６ｃｍ3）中のハイドロクロリド１０（８４．０ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）、カルボン酸１４（０．１７ｇ、０．６１ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（１６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を１０分間撹拌した。２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート（０．１３ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を還流下で２１時間加熱し、次いで１０％塩酸水（３０ｃｍ3）および飽和炭素水素ナトリウム水（３０ｃｍ3）で連続的に洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（４０〜５０％酢酸エチル−ヘキサン；グラジエント溶出）による得られた残渣の精製は、白色固体でのアミド１５（１６ｍｇ、９％）を生じた。アミド１５は、13Ｃ  ＮＭＲ分析によって、ｔｒａｎｓ：ｃｉｓが１１：１の立体構造異性体の混合物として存在することが示された（比は、少数および多数の立体構造異性体それぞれのプロδ−Ｃ原子に帰属されるδ４１．３および４８．２での共鳴の相対強度から推定した）：融点219-222℃; [α]D -44.9 (CH2Cl2中c 1.31); νmax (フィルム)/cm-1 3239, 2927, 1736, 1707, 1617, 1530, 1450, 1403, 1371, 1281, 1241, 1208, 1194, 1165, 1150, 1132, 1089, 1071, 1028, 984, 912, 796, 749, 739および699; δH (400 MHz, CDCl3) 1.24-2.10 (17H, m, Proα-CH3, Proβ-H2, Proγ-H2および5 x シクロヘキシル-H2), 3.25-3.48 (1H, br m, Proδ-HAHB), 3.61-3.87 (4H, br m, OCH3およびProδ-HAHB), 4.92-5.19 (3H, m, N-HおよびOCH2Ph)および7.35-7.37 (5H, s, Ph); δC(100 MHz, CDCl3) 21.26 (CH2, シクロヘキシル-C), 21.33 (CH2, シクロヘキシル-C), 21.7 (CH3, Proα-CH3), 24.8 (CH2, シクロヘキシル-C), 25.0 (CH2, Proγ-C), 29.4* (CH2, シクロヘキシル-C), 29.7* (CH2, シクロヘキシル-C), 31.1 (CH2, シクロヘキシル-C), 31.6 (CH2, シクロヘキシル-C), 31.9* (CH2, シクロヘキシル-C), 32.2* (CH2, シクロヘキシル-C), 32.8* (CH2, シクロヘキシル-C), 37.3 (CH2, Proβ-C), 41.4* (CH2, Proδ-C), 48.2 (CH2, Proδ-C), 52.1 (CH3, OCH3), 59.1 (四重線, Glyα-C), 66.7 (CH2, OCH2Ph), 67.3* (CH2, OCH2Ph), 67.4 (四重線, Proα-C), 128.0* (CH, Ph), 128.1* (CH, Ph), 128.3 (CH, Ph), 128.5 (CH, Ph), 128.7 (CH, Ph), 136.6 (四重線, Ph), 153.7 (四重線, NCO2), 171.0 (四重線, Gly-CO)および174.8 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 402.2151 (M+. C22H30N2O5の計算値402.2155).
【０１１４】
（８ａＳ）−メチル−スピロ［シクロヘキサン−１、３（４Ｈ）−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン］−１、４（２Ｈ）−ジオン（環状シクロヘキシル−Ｇ−２ＭｅＰ）
メタノール（３．３ｃｍ3）中アミド１５（４０ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）の溶液に活性炭（１．６ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）上で１０％Ｐｄを加え、容器に水素ガスを流した。得られた懸濁液を水素雰囲気下で６１．５時間勢いよく撹拌し、次いでＣｅｌｉｔｅ（商標）パッドを通してメタノール（１５ｃｍ3）で濾過した。ろ液を減圧下で乾燥まで濃縮し、黄色半流動体を生じさせ、逆相Ｃ１８フラッシュカラムクロマトグラフィー（０〜１０％ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ；グラジエント溶出）によって精製し、白色固体での環状シクロヘキシル−Ｇ−２ＭｅＰ（１９ｍｇ、８１％）を産生した：融点174-177℃; [α]D -63.8 (CH2Cl2中c 1.13); νmax (フィルム)/cm-1 3215, 2925, 2854, 1667, 1646, 1463, 1427, 1276, 1232, 1171, 1085, 1014, 900, 868, 818, 783, 726および715; δH (400 MHz, CDCl3) 1.31-1.89 (12H, m, 9 x シクロヘキシル-Hおよび8a-CH3), 1.94-2.15 (4H, m, 7-H2および8-H2), 2.26 (1H, td, J 13.7および4.5, 1 x シクロヘキシル-H), 3.44-3.51 (1H, m, 6-HAHB), 3.79-3.86 (1H, m, 6-HAHB)および6.40 (1H, br s, N-H); δC (100 MHz, CDCl3) 19.5 (CH2, 7-C), 20.6 (CH2, シクロヘキシル-C), 20.8 (CH2, シクロヘキシル-C), 24.5 (CH2, シクロヘキシル-C), 25.0 (CH3, 8a-CH3), 33.7 (CH2, シクロヘキシル-C), 36.3 (CH2, 8-C), 36.5 (CH2, シクロヘキシル-C), 44.7 (CH2, 6-C), 59.5 (四重線, 8a-C), 64.0 (四重線, 3-C), 168.1 (四重線, 4-C)および171.6 (四重線, 1-C); m/z (EI+) 236.15246 (M+. C13H20N2O2の計算値236.15248).
【０１１５】
（例３）
（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン］−１、４−ジオン（環状Ｇ−２−アリルＰ）の合成
【０１１６】
【化１２】
0006574769.tif 000016
【０１１７】
スキーム３：試薬、条件および収量：（ｉ）ＬＤＡ、ＴＨＦ、−７８℃、臭化アリル、−７８−＞−３０℃、Ｎ2、４時間（６０％）；（ｉｉ）塩化アセチル、ＣＨ3ＯＨ、還流、Ｎ2、２４時間（６３％）；（ｉｉｉ）Ｅｔ3Ｎ、ＢｏＰＣｌ、ＣＨ2Ｃｌ2、ＲＴ、Ｎ2  １９．５時間（４５％）；（ｉｖ）ＴＦＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、１時間、次いでＥｔ3Ｎ、ＣＨ2Ｃｌ2、２３時間（３７％）。
【０１１８】
（２Ｒ，５Ｓ）−４−アリル−２−トリクロロメチル−１−アザ−３−オキサビシクロ［３．３．０］オクタン−４−オン１７
ｎ−ＢｕＬｉ（１．３１Ｍ、９．９３ｃｍ3、１３．０ｍｍｏｌ）を、乾燥テトラヒドロフラン（２０ｃｍ3）中のジイソプロピルアミン（１．８２ｃｍ3、１３．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に−７８℃窒素雰囲気下で、滴下で加えた。溶液を５分間撹拌し、０℃に温め、１５分間撹拌し、次いで乾燥テトラヒドロフラン（４０ｃｍ3）中プロオキサゾリジノン１６（２．１２ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）の溶液に−７８℃で２０分間かけて滴下で加え、反応混合物をさらに３０分間撹拌し、臭化アリル（２．２５ｃｍ3、２６．０ｍｍｏｌ）を５分間かけて滴下で加えた。溶液をゆっくり−３０℃に４時間かけて温め、Ｈ2Ｏ（３０ｃｍ3）でクエンチし、混合物を室温に温め、クロロホルム（３×８０ｃｍ3）で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧中で乾燥まで蒸発させ、暗茶色半流動体を産生し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（１０〜２０％酢酸エチル−ヘキサン；グラジエント溶出）によって精製し、０℃で固化するオレンジ色油でのオキサゾリジノン１７（１．４８ｇ、６０％）を産生し、それについてのｎｍｒデータは文献において報告されたものと一致した：δH (400 MHz, CDCl3) 1.58-1.92 (2H, m, Proγ-H2), 1.96-2.14 (2H, m, Proβ-H2), 2.50-2.63 (2H, m, Proδ-H2), 3.12-3.23 (2H, m, CH2-CH=CH2), 4.97 (1H, s, NCH), 5.13-5.18 (2H, m, CH=CH2)および5.82-5.92 (1H, m, CH=CH2); δC (100 MHz, CDCl3) 25.1 (CH2, Proγ-C), 35.1  (CH2, Proβ-C), 41.5 (CH2, Proδ-C), 58.3 (CH2, CH2CH=CH2), 71.2 (四重線, Proα-C), 100.4 (四重線, CCl3), 102.3 (CH, NCH), 119.8 (CH2, CH2CH=CH2), 131.9 (CH, CH2CH=CH2)および176.1 (四重線, C=O); m/z (CI+) 284.0009 [(M+H)+. C10H1335Cl3NO2の計算値284.0012], 285.9980 [(M+H)+. C10H1335Cl237ClNO2の計算値285.9982], 287.9951 [(M+H)+. C10H1335Cl37Cl2NO2の計算値287.9953]および289.9932 [(M+H)+. C10H1337Cl3NO2の計算値289.9923].
【０１１９】
メチルＬ−２−アリルプロリネートハイドロクロリド１８
乾燥メタノール（１５ｃｍ3）中のオキサゾリジノン１７（０．６４ｇ、２．２４ｍｍｏｌ）の氷冷溶液をメタノール（５ｃｍ3）中の塩化アセチル（０．３６ｃｍ3、５．０ｍｍｏｌ）の溶液で、滴下で処置した。溶液を還流下で２４時間加熱し、次いで冷却し、溶媒を減圧下で除去した。得られた茶色の油をトルエン（４０ｃｍ3）に溶解し、残存塩化チオニルおよびメタノールを除去するために乾燥まで濃縮し、次いでフラッシュカラムクロマトグラフィー（５〜１０％ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2；グラジエント溶出）によって精製し、緑色固体でのハイドロクロリド１８（０．２９ｇ、６３％）が得られ、それについてのＮＭＲデータは文献において報告されたものと一致した：δH (300 MHz, CDCl3) 1.72-2.25 (3H, m, Proβ-HAHBおよびProγ-H2), 2.32-2.52 (1H, m, Proβ-HAHB), 2.72-3.10 (2H, m, Proδ-H2), 3.31-3.78 (2H, m, CH2CH=CH2), 3.84 (3H, s, CO2CH3), 5.20-5.33 (2H, m, CH=CH2), 5.75-5.98 (1H, m, CH=CH2)および8.06 (1H, br s, N-H); m/z (CI+) 170.1183 [(M+H)+. C9H16NO2の計算値170.1181].
【０１２０】
メチル−Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−グリシル−Ｌ−２−アリルプロリネート２０
乾燥トリエチルアミン（０．２８ｃｍ3、２．０２ｍｍｏｌ）を乾燥ジクロロメタン（３５ｃｍ3）中のハイドロクロリド１８（０．１３ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）およびＮ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−グリシン１９（０．１４ｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を１０分間撹拌した。Ｂｉｓ（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィン酸塩化物（ＢｏＰＣｌ、９７％）（０．２０ｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１９．５時間撹拌した。次いで１０％塩酸水（３５ｃｍ3）および飽和炭素水素ナトリウム水（３５ｃｍ3）で連続的に洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（４０％酢酸エチル−ヘキサン）によって得られた残渣の精製は、淡黄色油でのジペプチド２０（０．０９ｇ、４５％）を生じた：[α]D +33.8 (CH2Cl2中c 0.83); νmax (フィルム)/cm-1 3419, 3075, 2977, 2930, 2874, 1739, 1715, 1656, 1499, 1434, 1392, 1366, 1332, 1268, 1248, 1212, 1168, 1122, 1051, 1026, 1003, 943, 919, 867, 830, 779, 739, 699および679; δH (300 MHz, CDCl3) 1.42 [9H, s, C(CH3)3], 1.93-2.08 (4H, m, Proβ-H2およびProγ-H2), 2.59-2.67 (1H, m, CHAHBCH=CH2), 3.09-3.16 (1H, m, CHAHBCH=CH2), 3.35-3.44 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.56-3.62 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.70 (3H, s, OCH3), 3.89 (2H, d, J 4.2, Glyα-H2), 5.06-5.11 (2H, m, CH=CH2), 5.42 (1H, br s, Gly-NH)および5.58-5.72 (1H, m, CH=CH2); δC (75 MHz, CDCl3) 23.7 (CH2, Proγ-C), 28.3 [CH3, C(CH3)3], 35.0 (CH2, Proβ-C), 37.6 (CH2, CH2CH=CH2), 43.3 (CH2, Glyα-C), 47.5 (CH2, Proδ-C), 52.5 (CH3, OCH3), 68.8 (四重線, Proα-C), 79.5 [四重線, C(CH3)3], 119.4 (CH2, CH=CH2), 132.9 (CH, CH=CH2), 155.7 (四重線, NCO2), 166.9 (四重線, Gly-CON)および173.8 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 326.1845 (M+. C16H26N2O5の計算値326.1842).
【０１２１】
（８ａＳ）−アリル−ヘキサヒドロピロロ［１、２−ａ］ピラジン−１、４−ジオン（環状Ｇ−２アリルＰ）
ジクロロメタン（９ｃｍ3）中のジペプチド２０（０．０９ｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の溶液に室温でトリフルオロ酢酸（１ｃｍ3、０．０１３ｍｍｏｌ）を滴下で加え、反応混合物を１時間、窒素雰囲気下で撹拌した。溶液を減圧下で蒸発させ、無色の油が生じ、ジクロロメタン（１０ｃｍ3）に溶解し、乾燥トリエチルアミン（０．０９６ｃｍ3、０．６９ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を４．５時間撹拌した、次にトリエチルアミン（０．０９６ｃｍ3、０．６９ｍｍｏｌ）をさらに加えた。反応混合物を一晩撹拌し、乾燥まで濃縮して緑色の油が生じ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（１０％ＣＨ3ＯＨ−ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、オフホワイト固体での環状Ｇ−２アリルＰ（２０ｍｇ、３７％）を生じた：融点106-109℃; [α]D -102.7 (CH2Cl2中c 0.95); νmax (CH2Cl2)/cm-1 3456, 3226, 2920, 1666, 1454, 1325, 1306, 1299, 1210, 1133, 1109, 1028, 1010, 949, 928, 882, 793, 761および733; δH (400 MHz, CDCl3) 1.92-2.01 (2H, m, Proγ-H2), 2.09-2.16 (2H, m, Proβ-H2), 2.39-2.56 (2H, m, CH2CH2=CH2), 3.46-3.53 (1H, m, Proδ-HAHB), 3.78-3.87 (2H, m, Proδ-HAHBおよびGlyα-HAHB), 4.09 (1H, d, J 17.2, Glyα-HAHB), 5.16-5.20 (2H, m, CH=CH2), 5.73-5.84 (1H, m, CH=CH2)および7.17 (1H, br s, N-H); δC (100 MHz, CDCl3) 20.1 (CH2, Proγ-C), 34.1 (CH2, Proβ-C), 41.7 (CH2, CH2CH2=CH2), 44.9 (CH2, Proδ-C), 46.4 (CH2, Glyα-C), 67.2 (四重線, Proα-C), 120.9 (CH2, CH=CH2), 131.0 (CH, CH=CH2), 163.4 (四重線, NCO)および171.7 (四重線, CONH); m/z (EI+) 195.1132 (M+. C10H15N2O2の計算値195.1134).
【０１２２】
（例４）
（８ａＳ）−メチル−スピロ［シクロペンタン−１，３（４Ｈ）−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジン］−１，４（２Ｈ）−ジオン（環状シクロペンチル−Ｇ−２−ＭｅＰ）の合成
【０１２３】
【化１３】
0006574769.tif 000017
【０１２４】
スキーム４：試薬、条件および収量：（ｉ）Ｅｔ3Ｎ、ＨＯＡｔ、ＣＩＰ、１，２−ジクロロエタン、８３℃、Ｎ2、１９時間（２３％）；（ｉｉ）１０％Ｐｄ／Ｃ、ＣＨ3ＯＨ、ＲＴ、１７時間（６５％）。
【０１２５】
Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−１−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸２１
ジオキサン（２．５ｃｍ3）中のベンジルクロロホルメート（０．２９０ｇ、１．１ｍｍｏｌ）の溶液に水（５ｃｍ3）中の１−アミノシクロペンタンカルボン酸（Ｆｌｕｋａ）（０．２ｇ、１．５４ｍｍｏｌ）および炭酸ナトリウム（０．４９０ｇ、４．６４ｍｍｏｌ）の溶液を０℃で、滴下で加えた。撹拌を室温で一晩継続し、反応混合物をエーテルで洗浄した。水層を２Ｍ塩酸で酸性化し、酢酸エチルで抽出し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、溶媒を除去し、静置で固化する油でカルバメート２１（０．２５３ｇ、６２％）をもたらした。カルバメート２１は1Ｈ  ＮＭＲ分析によって立体構造異性体の７０：３０混合物であることが示された（比は、多数および少数の立体構造異性体のＮ−Ｈプロトンにそれぞれ帰属されるδ５．３１および７．２９〜７．４０での共鳴の積分から推定した）：融点70-80℃ (文献1 82-86℃, エチルアセテート, 石油エーテル);  δH (400 MHz; CDCl3; Me4Si) 1.83 (4H, br s, 2 x シクロペンチル-H2), 2.04 (2H, br s, シクロペンチル-H2), 2.20-2.40 (2H, m, シクロペンチル-H2), 5.13 (2H, br s, OCH2Ph), 5.31 (0.7H, br s, N-H)および7.29-7.40 (5.3H, m, PhおよびN-H*); δC (100 MHz; CDCl3) 24.6 (CH2, シクロペンチル-C), 37.5 (CH2, シクロペンチル-C), 66.0 (四重線, シクロペンチル-C), 66.8 (CH2, OCH2Ph), 128.0 (CH, Ph), 128.1 (CH, Ph), 128.4 (CH, Ph), 136.1 (四重線, Ph), 155.8 (四重線, NCO2)および179.5 (四重線, CO2H).
【０１２６】
メチルＮ−ベンジルオキシカルボニルシクロペンチル−グリシル−Ｌ−２−メチルプロリネート２２
乾燥トリエチルアミン（０．１９ｃｍ3、１．４ｍｍｏｌ）を乾燥１，２−ジクロロエタン（２４ｃｍ3）中のハイドロクロリド１０（７８ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、カルボン酸２１（０．１５ｇ、０．５６ｍｍｏｌ）および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（Ａｃｒｏｓ）（１５ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の溶液に窒素雰囲気下、室温で、滴下で加え、反応混合物を１０分間撹拌した。２−クロロ−１，３−ジメチルイミダゾリジニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＩＰ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．１２ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を還流下で１９時間加熱し、１０％塩酸水（３０ｃｍ3）および飽和炭素水素ナトリウム水（３０ｃｍ3）で連続的に洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過し、減圧下で乾燥まで蒸発させた。フラッシュカラムクロマトグラフィー（６０％酢酸エチル−ヘキサン）による得られた残渣の精製は、白色固体でのアミド２２（３９ｍｇ、２３％）を生じた。アミド２２は、13Ｃ  ＮＭＲ分析によって、ｔｒａｎｓ：ｃｉｓが３：１のカルバメート立体構造異性体の混合物として存在することが示された（比は、多数および少数の立体構造異性体それぞれのカルバメートカルボニル−Ｃ原子に帰属されるδ１５４．１および１５５．７での共鳴の相対強度から推定した）：融点200-203℃; [α]D -54.5 (CH2Cl2中c 1.52); νmax (フィルム)/cm-1 3432, 3239, 3042, 2953, 1736, 1712, 1627, 1540, 1455, 1417, 1439, 1374, 1282, 1256, 1216, 1194, 1171, 1156, 1136, 1100, 1081, 1042, 1020, 107, 953, 917, 876, 756および701; δH (400 MHz, CDCl3) 1.33-1.53 (3H, br m, Proα-CH3), 1.62-2.20 (11H, m, Proβ-H2, Proγ-H2および7 x シクロペンチル-H), 2.59-2.71 (1H, br m, 1 x シクロペンチル-H), 3.31-3.42 (1H, br m, Proδ-HAHB), 3.58-3.79 (4H, br m, OCH3およびProδ-HAHB), 4.92-5.17 (3H, m, N-HおよびOCH2Ph)および7.27-7.42 (5H, s, Ph); δC (100 MHz, CDCl3) 21.7 (CH3, Proα-CH3), 24.1* (CH2, シクロペンチル-C), 24.2 (CH2, シクロペンチル-C), 24.4 (CH2, Proγ-C), 24.5 (CH2, シクロペンチル-C), 36.4 (CH2, シクロペンチル-C), 37.1 (CH2, シクロペンチル-C), 37.2* (CH2, シクロペンチル-C), 37.7 (CH2, Proβ-C), 38.2* (CH2, シクロペンチル-C), 48.5 (CH2, Proδ-C), 52.1 (CH3, OCH3), 66.6 (CH2, OCH2Ph), 66.9 (四重線, Proα-C), 67.2 (四重線, Glyα-C), 127.8 (CH, Ph), 128.2 (CH, Ph), 128.4 (CH, Ph), 136.6 (四重線, Ph), 154.1 (四重線, NCO2), 155.7* (四重線, NCO2), 170.5 (四重線, Gly-CO)および174.7 (四重線, CO2CH3); m/z (EI+) 388.1991 (M+. C21H28N2O5の計算値388.1998).
―――――――――――――
*は少数の立体構造異性体に割り当てられた共鳴を示す。
【０１２７】
（８ａＳ）−メチル−スピロ［シクロペンタン−１，３（４Ｈ）−テトラヒドロピロロ［１、２−ａ］ピラジン］−１，４（２Ｈ）−ジオン（環状シクロペンチル−Ｇ−２ＭｅＰ）
メタノール（４．６ｃｍ3）中のアミド２２（５４ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に活性炭（２．２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ）上で１０％Ｐｄを加え、容器に水素ガスを流した。得られた懸濁液を水素雰囲気下で１７時間勢いよく撹拌し、次いでＣｅｌｉｔｅ（商標）パッドを通してメタノール（１５ｃｍ3）で濾過した。ろ液を、減圧下で乾燥まで濃縮し、黄色半流動体を生じ、逆相Ｃ１８フラッシュカラムクロマトグラフィー（０〜１０％ＣＨ3ＣＮ／Ｈ2Ｏ；グラジエント溶出）によって精製し、黄色固体で環状シクロペンチル−Ｇ−２ＭｅＰ（２０ｍｇ、６５％）をもたらした：融点160-163℃; [α]D -97.9 (CH2Cl2中c 1.61); νmax (フィルム)/cm-1 3429, 2956, 2928, 2856, 1667, 1643, 1463, 1432, 1373, 1339, 1254, 1224, 1175, 1086, 1048, 976, 835, 774および730; δH (300 MHz, CDCl3) 1.47 (3H, br s, 8a-CH3), 1.56-2.19 (11H, m, 8-H2, 7-H2および7 x シクロペンチル), 2.58-2.67 (1H, br m, 1 x シクロペンチル), 3.48-3.56 (1H, m, 6-HAHB), 3.72-3.82 (1H, m, 6-HAHB)および6.56 (1H, br s, N-H); δC (75 MHz, CDCl3) 19.9 (CH2, 7-C), 24.6 (CH2, シクロペンチル), 24.92 (CH3, 8a-CH3), 24.93 (CH2, シクロペンチル), 36.0 (CH2, 8-C), 38.7 (CH2, シクロペンチル), 41.9 (CH2, シクロペンチル), 44.8 (CH2, 6-C), 64.3 (四重線, 8a-C), 66.8 (四重線, 3-C), 168.3 (四重線, 4-C)および172.2 (四重線, 1-C); m/z (EI+) 222.1369 (M+. C12H18N2O2の計算値222.1368).
【０１２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験
次の薬理学的研究は、認知障害の減弱における環状Ｇ−２−アリルＰの有効性を実証している。それらは、限定されることを意図せず、本発明の他の組成物および方法は過度の実験を伴うことなく開発できる。これらの組成物および方法すべては、本発明の一部であるとみなされる。次のすべての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｕｃｋｌａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅまたは同等の規制機関によって承認された指針の下で開発されたプロトコールを使用して実行した。
【０１２９】
向知性薬の有効性は、コリン作動機能低下のモデルを使用して好都合に試験できる。コリン作動機能低下は、認知症関連認知機能低下に寄与することが示されており、アルツハイマー病に対する治療介入の標的であり続けている（Hunter 2004）。コリン作動機能低下モデルは、他の状態にも適用可能である。例えば、スコポラミン誘発コリン作動機能低下は、嫌悪感および怒りの顔面発現の認識精度を選択的に損ない、感情認識へのスコポラミンの効果をハンチントン病患者において見出されるものに類似のものにすることが示されている（Kamboy 2006）。スコポラミンは、コリン作動機能低下を誘発するために一般に使用されており、ヒトアルツハイマー病、加齢および認知機能の他の障害に対する十分周知のモデルである（Liskowsky et al, Int. J. Dev. Neurosci, 24(2-3):149-156 (2006)、Lindner et al., Psychopharmacology (Berl.) Sept 27 (2006)、Bouger et al., Eur. Neuropsychopharmacol 15(3):331-346 (2005)、Ebert et al, Eur. J. Clin. Invest., 28(11):944-949 (1998)、Barker et al, Int. J. Geriatr. Psychiatry, 13(4):244-247 (1998)、G. Smith, Brain Res. 471(2): 103-118 (1998)、Flood et al, Behav. Neural. Biol. 45(2): 169-184 (1986)）。
【０１３０】
（例５）
認知機能への環状Ｇ−２−アリルＰの効果を評価するために使用した学習および記憶のモリス水迷路（ＭＷＭ）モデル
研究の目的は、失認および感情状態（不安症）の様式において環状Ｇ−２アリルＰを調査することである。
方法
研究の最初の部分は、モリス水迷路記憶（ＭＷＭ）モデルにおけるｃＧ−２−アリルＰの急性試験を含んだ。ＭＷＭ試験は、ラットにおいて空間記憶を評価するために最も頻繁に使用される試験の１つであり、一般に空間記憶への疾患および処置の効果を正確に予測することが十分に認められている。したがってＭＷＭ試験は、ヒト対象における疾患および処置の効果を反映する。
【０１３１】
ＭＷＭのための標準的手順は次のとおりであった。本発明者らは、不透水を満たし、温度を２０℃に維持した環状水泳プール（深さ８０ｃｍ×直径１５０ｃｍ）を使用した。プラットフォームを水面の１ｃｍ下に隠し、視覚的手がかりのためにプラットフォームの２０ｃｍ上に、および空間的手がかりのために出発位置の３時の位置のどちらにも位置付けられた白色旗（１０ｃｍ×１０ｃｍ）を有した。実験の１〜４日目にラットは、各試験日に６回試行（各６０秒間）で記憶取得試行を受けた（馴化期）。プラットフォームに達するための待ち時間を記録し、平均待ち時間の日々の低減を隠されたプラットフォームがどこにあるかを学習するための能力の目安として使用した。
【０１３２】
実験５日目に正常、非加齢ウィスターラットを生理食塩水（ｎ＝２８）または記憶欠損を誘発するためのスコポラミン（０．５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｎ＝２７）のいずれかを受ける群に分けた。プローブ試験を開始する半時間前にスコポラミンを投与した。
スコポラミン処置の１０分後、環状Ｇ−２アリルＰを３０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３１）で経口投与し、ビヒクル処置動物には同一の処置プロトコールを使用する経口経管栄養によって希釈剤が投与された（ｎ＝２４）。
次いでｃＧ−２−アリルＰの急性の効果を記憶処理への任意の直接的薬理学的効果を判定するために、スコポラミン誘発記憶障害を有する動物および記憶障害を有さない同年齢の対照動物において試験した。実験群を下の表４に詳述する。
【０１３３】
【表４】
0006574769.tif 000018
【０１３４】
５日目に、プローブＭＷＭ試験を、プラットフォームを除去して実施した。６回試行を行い、それぞれの最大持続時間は６０秒間、試行間に少なくとも５分間の休息）。ラットがプラットフォーム近くを泳いだ時間の長さは、プラットフォームを位置付けるために彼らが非空間的戦略の使用するのではなく視覚的および空間的手がかりにどの程度頼っているかの目安を提供した。データを回収し、Ａｎｙ−ｍａｚｅ（ｖ４．２）ソフトウェアを使用して分析した。
行動試験から生成されたデータを年齢群間の差異を判定するために一元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析した。処置時点を依存因子として二元配置ＡＮＯＶＡを行動結果の進展を検討するために使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン３．０２をデータ分析のために使用した。
【０１３５】
結果
スコポラミンでの処置は、処置した動物において空間記憶の取得を顕著に損なった（プラットフォームへの時間は４日目に対照のおよそ２０８％）。環状Ｇ−２アリルＰ（３０ｍｇ／ｋｇ；毎日）は、スコポラミンによって誘導された認知障害を顕著に回復させた（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）。
【０１３６】
（例６）
ｃＧ−２−アリルＰは、シナプス可塑性および加齢関連記憶消失を改善する。
方法
加齢ラット（雄ウィスターラット、１８〜２０月齢）を４群に分けた：２群はビヒクル処置（群１および３）ならびに２群はＧ−２−アリルＰ処置（群２および４）（すべての群でｎ＝６〜８）。環状Ｇ−２−アリルＰをＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙによって合成し、処置前に通常の生理食塩水に溶解した。１日目に環状Ｇ−２−アリルＰの単一用量を群２および４の動物に中枢で与えた（２０ｎｇ／動物、ｉ．ｃ．ｖ．）；生理食塩水を群１および３に投与した。新規物体認知試験を使用する記憶試験を処置後３日目（群１および２）または２４日目（群３および４）のいずれかで開始した。ＮＯＲＴの完了時にラットを過剰量のペントバルビタールナトリウムで屠殺し、通常の生理食塩水に続いて、１０％ホルマリンで経心的に灌流した。群１および２においては７日目に、群３および４については２８日目に組織を回収した。脳は、標準的パラフィン包埋手順を使用する処理の前に最低でも２日間同じ固定剤中に保った。簡潔には、組織の小塊（１０×１０×３ｍｍ）を２４時間まで固定した。次いで塊をパラフィンに浸漬し、包埋し、紐状に切り、スライドに載せた。次いでスライドを、免疫染色を開始するまで保存した。脳組織におけるシナプス形成を、免疫組織化学的染色を使用して検討した。
【０１３７】
新規物体認知試験（ＮＯＲＴ）
探索的活動（ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）は、新たな環境においてヒトおよびラットを含む動物によって示される典型的な学習行動である。探索的活動は、新たなものが見慣れたものになる場合に経時的に減少し、馴化が生じる。見慣れた環境では探索的活動は、新規物体の導入によって再活性化できる。馴化後に環境が変化した場合の探索的行動（ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）の増加は、親密性についての記憶および新規性の認知についての目安を提供する。
この例において本発明者らは、２回のＮＯＲＴを実行した、１回は３〜６日目および他方は２４〜２７日目。ラットをＮＯＲＴの初日に試験活動領域（９０×６０×４０ｃｍ）に親しませるようにした。各試験の２日後に４個の新規物体を試験活動領域に置き、ラットは各日に２回の試行を受けた（各１５分間、２時間離す）。物体を探索することに費やした時間は、試験した動物が物体について学習すると低減した（訓練期）。最終日（各試験の４日目）に、１つの見慣れた物体を第２回の試行の前に新規物体で置きかえた（試験６、試験期）。３個の見慣れた物体を探索することに費やした平均時間および新規物体の探索に費やした時間を親密性の記憶および新規性の認知についての目安として使用した。
【０１３８】
海馬におけるＮＭＤＡ受容体、ＡＭＰＡ受容体、ｒＫｒｏｘ−２４およびシナプトフィジンｍＲＮＡの発現へのｃＧ−２−アリルＰの効果
ヒトおよび動物における海馬形成が多数の記憶型において重要な役割を演じていることは認められている（Morris et al. 2006 Europ. J. Neurosci. 23, 2829）。特異的機能は論争中であるが、海馬が、注意経験の自動コード化および初期保存（エピソード記憶形成）、記憶固定および新規性検出における鍵となる役割を演じていることは理解されている。第一の態様である記憶のコード化および短期保存は、シナプス可塑性およびシナプス伝達に依存しており、両者ともグルタミン酸神経伝達に関連している。
グルタミン酸神経伝達は、２種類のグルタミン酸受容体：Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＭＤＡＲ）およびａ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソキサロンプロピオン酸受容体ＡＭＰＡまたは非ＮＭＤＡ受容体によって促進される。
【０１３９】
ＡＰＭＡ受容体サブユニットＧｌｕＲ１は、シナプス後受容体であり、記憶測定のために一般に使用されている。ＧｌｕＲ１は、カルシウム流入を介在すると考えられており、学習に関連するシナプス可塑性に重要な機能を有している。シナプスへのＧｌｕＲ１の取り込みは、学習および記憶に不可欠である長期増強（ＬＴＰ）に対して重要である可能性があることが既に示唆されている（Hayashi et al, 2000）。
ＮＭＤＡ受容体サブユニットＮＲ１が空間記憶の形成のために不可欠であることが実証された。ＣＡ１領域の錐体細胞におけるＮＭＤＡ受容体のＲｌサブユニットが選択的にノックアウトされているノックアウトモデルでは、長期増強が消失することが示された（Tsien 1996）。
シナプトフィジンはシナプス前小胞タンパク質である。その定量的検出は、シナプス密度の分子マーカーとして確立されている。
【０１４０】
ニューロン転写因子Ｋｒｏｘ２４染色をニューロン可塑性についてのマーカーとして使用する。Ｋｒｏｘ２４ファミリー（および脳由来神経栄養因子、ＢＤＮＦ）のタンパク質産生物は、ＮＭＤＡ受容体介在海馬性ＬＴＰおよびＬＴＤの際に生じるシナプス修飾安定化に近年関連付けられている（Dragunow. 2006. Behaviour genetics. 23 ; 293）。
免疫組織化学的染色
従来の脱パラフィン化および再水和技術を使用して、水をベースとする緩衝液および抗体を組織切片に浸透させた。抗原の探索は、ＡＭＰＡ受容体（ＧｌｕＲ１）染色の前にだけ使用し、すなわちスライドを沸騰クエン酸緩衝液中に置き、冷却した。
【０１４１】
次の抗体を使用した：
ｉ）ＮＭＤＡ  ＮＲ１サブユニットに対する一次ウサギ抗体、緩衝液中１：２００濃度、４８時間インキュベート（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ−ＡＢ１５１６）、次いでＳｉｇｍａ蛍光二次抗体（ａｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４）、１：２００希釈、４０Ｃ、２４時間インキュベート。
ｉｉ）ＡＭＰＡ  ＧｌｕＲ１サブユニットに対する一次抗体、緩衝液中１：５０濃度、４８時間インキュベート（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ−ＡＢ１５０４）、次いで３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、１：２００希釈、４０Ｃ、２４時間インキュベート。
ｉｉｉ）ｍシナプトフィジンに対する一次抗体（Ｓｉｇｍａ−Ｓ５７６８）、緩衝液中１：２００濃度、次いでＤＡＢ、１：２００希釈、４０Ｃ、２４時間インキュベート）。
ｉｖ）ｒＫｒｏｘ−２４に対する一次抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ−カタログ番号ＳＣ−１８９）、緩衝液中１：２００濃度、次いで抗ウサギ二次抗体、１：２００希釈の濃度、４０Ｃ、２４時間インキュベート。
（ｅ）抗体を、光学顕微鏡を使用して検出した。
【０１４２】
結果
ＮＯＲＴ
ｃＧ−２−アリルＰで処置した群における新規性認知の改善傾向が２７日後に観察された（図２）が、処置６日後にはされなかった（図無し）。本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ処置が２７日目に薬物処置動物において新規性認知を改善したと結論付けている。
ＡＭＰＡグルタミン酸受容体−１染色
領域ＣＡ１（顆粒細胞層、多形細胞層および放線状層）およびＣＡ３（錐体細胞層）由来の海馬切片をＡＭＰＡ受容体ＧｌｕＲ１について染色した。
ＣＡ３では、７または２８日目のいずれでも各領域における受容体の数に変化はなかった。しかし２８日目にＣＡ１（顆粒細胞層）（図４）およびＣＡ１多形細胞層（図５）におけるＡＭＰＡ受容体の数に顕著な増加があった。
【０１４３】
この組織学的変化は、新規物体認知試験における成績の改善と相関した。記憶の改善（図２）は、ＡＭＰＡグルタミン酸受容体−１の上昇と相関した（図３）。本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがシナプス後レベルでグルタミン酸神経伝達（ＧｌｕＲ１）を改善したと結論付けた。
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ処置がシナプス後でのＧｌｕＲ１染色における長期増加およびシナプス前小胞の密度の増加を生じたことを観察した。海馬における小胞の大部分がグルタミン酸小胞であることから、本発明者らは、長期記憶改善がグルタミン酸神経伝達の増加と関連したと結論付けた。
【０１４４】
シナプトフィジン染色
本発明者らは、次に海馬のＣＡ３およびＣＡ１領域におけるシナプトフィジン染色のレベルへのｃＧ−２−アリルＰの効果を分析した。
試験したすべてのエリアにおいて、処置後２８日でのシナプトフィジン染色の密度における顕著な増加（ＣＡ３）または増加への明らかな傾向（ＣＡ１−多形細胞層および放線状層）があった。この増加は、増加したシナプス可塑性のマーカーであり、記憶試験を適用される処置群の成績における改善の最も可能性が高い原因であるシナプス形成の明らかな指標である。
【０１４５】
ＮＭＤＡ受容体−１染色
処置後のＡＭＰＡ受容体において顕著な改善がある一方で、ＮＭＤＡ受容体における変化はあまり明白ではない（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）。
Ｋｒｏｘ２４染色
本発明者らは、海馬のＣＡ１−２領域におけるＫｒｏｘ２４染色の密度を分析した。本発明者らは、ビヒクル処置群と比較して処置群における密度の増加傾向を観察した。本発明者らは、Ｋｒｏｘ２４染色結果が記憶機能の改善に正に相関すると結論付けている（図１０）。
【０１４６】
（例７）
ｃＧ−２−アリルＰは、ミドルエイジラットの海馬におけるシナプス前小胞の数を増加させる。
方法
４匹のミドルエイジウィスター雄ラット（１２月齢）を２群に分けた：１つはビヒクル処置（ｎ＝２）および１つはｃＧ−２−アリルＰ処置（ｎ＝２）。ラットを３ｍｇ／ｋｇ／日の生理食塩水またはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで皮下的に７日間処置した。実験２１日目に動物を屠殺し、海馬組織を回収した。組織の半薄セクションをＯｓＯ4で固定し、レジンに包埋した。ＣＡ１多形細胞層およびＣＡ３セクションを次いで超薄、８０ｎｍ切片に切片化し、ウラニルアセテートおよびクエン酸鉛で染色した。動物１匹当たりシナプスおよそ５０個を分析し、分類されたシナプス型および小胞密度を、ＡｎａｌｙＳＩＳ（登録商標）を使用して測定した。
【０１４７】
透過型電子顕微鏡をスライド上の小胞の総数を計数するために使用した。平均密度を、総面積を測定し（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎソフトウェアを使用）、小胞の数を使用することによって算出した。本発明者らは、シナプス後密度（ＰＳＤ）に並列して２００ｎｍ×２００ｎｍ四角における小胞密度を算出するためにYoshida et al. 97、Journal of Neurochemistryにおける手順に従った。
【０１４８】
結果
図６は、処置後２４日での海馬のＣＡ３領域におけるシナプス前染色の密度の増加傾向へのｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
図７は、処置後２４日でのＣＡ１領域の多形細胞層におけるシナプス前染色の密度の増加傾向へのｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
図８は、処置後２４日でのＣＡ１領域の放線状層におけるシナプス前染色の密度の増加傾向へのｃＧ−２−アリルＰの効果を示すグラフである。
【０１４９】
海馬のＣＡ１およびＣ３サブ領域におけるシナプス前小胞の数は、処置後２１日でビヒクル処置動物と比較してｃＧ−２−アリルＰ処置（３ｍｇ／ｋｇ／日×７日、皮下）後に増加した（図１１）。
本発明者らは、これらの研究からスコポラミン処置が動物において認知機能を減少させることができ、これらの変化が種々の神経学的状態の１つまたは複数を有するヒトにおける認知障害を模倣できると結論付けている。追加的に本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがスコポラミン処置動物および通常の加齢関連認知障害を有する動物において認知機能を改善できると結論付けている。さらに本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがシナプス形成を増加できる、ＡＭＰＡ受容体を増加できる、神経可塑性を増加できる、シナプス修飾を安定化できるおよび新規性認知を増加できると結論付けている。
【０１５０】
したがってこれらの研究は、アルツハイマー病、パーキンソン病および他の慢性神経障害、ならびに加齢に関連する認知障害を罹患しているヒトを含む動物における種々の認知障害を処置するための有効な薬理学的薬剤としてのｃＧ−２−アリルＰの使用を支持している。
【０１５１】
（例８）
小脳細胞外植への環状Ｇ−２−アリルＰおよび環状シクロペンチル−Ｇ−２ＭｅＰの効果
ｃＧ−２−アリルＰおよび環状シクロペンチル−Ｇ−２−ＭｅＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのニューロン細胞への効果を判定するために、成体ラット由来小脳外植を使用して一連の研究を実行した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系は、ニューロン増殖、神経突起増殖、神経束の形成、および神経細胞への毒素の影響、ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された並列効果を研究するために好適である。それによりｉｎ  ｖｉｔｒｏ小脳外植を使用する研究の結果は、ｉｎ  ｖｉｖｏ介入の効果を予測する。
【０１５２】
研究の第１シリーズでは、小脳外植へのグルタミン酸の効果を判定した。生理学的濃度でグルタミン酸は、ヒトを含む哺乳動物のＣＮＳにおける神経伝達物質である。しかし十分に高い濃度でグルタミン酸は、神経毒性であり、ニューロン細胞死を生じる。グルタミン酸がヒトを含む哺乳動物のＣＮＳにおける天然に存在する神経伝達物質であり、グルタミン酸神経毒性が当技術分野において細胞死および変性を含む一般的神経毒性を反映すると認識されていることから、それは神経変性および神経細胞死の処置において効果的な薬剤を同定および特徴付けるための価値のある有用なツールである。
材料および方法
カバーガラスを大きなペトリ皿に置き、７０％アルコールで５分間洗浄し、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈ2Ｏで洗浄した。カバーガラスを空気乾燥し、ポリ−Ｄ−リジン（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌストック溶液、９０〜１００μ１）で２時間、３４℃でコートした。
【０１５３】
小脳組織の抽出
出生後８日のウィスターラットを研究のために使用した。ラットを屠殺し、氷中に１分間置き、断頭し、小脳を取り、氷上に置いた。小脳組織を大きなペトリ皿で０．６５％グルコースを補充したＰＢＳ（ＰＢＳ１ｍｌ当たり１０μｌの６５％のストックＤ（＋）グルコース）１ｍｌに置き、さらに小さなセクションに刻み、２３Ｇ（０．４ｍｍ）針を介して１ｍｌインスリンシリンジで粉砕し、次いで大きなペトリ皿のグルコース溶液中に勢いよく戻した。組織を（１２５μｍポアサイズガーゼ）を通して篩いにかけ、培地を無血清ＢＳＡ補充−ＳＴＡＲＴ  Ｖ培地（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に交換するために２回遠心分離（６０ｇで２分間）した。２回目の遠心分離ステップは、ＳＴＡＲＴ  Ｖ培地１ｍｌで行った。マイクロ外植片をＳＴＡＲＴ  Ｖ培地５００μｌに再構成し、氷上に置いた。
【０１５４】
小脳細胞の培養
ＰＤＬ−コーティングの２時間後、スライドをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｈ2Ｏで洗浄し、空気乾燥した。各スライドを小さなペトリ皿（直径：３５ｍｍ）に置き、４０μｌ  ＳＴＡＲＴ  Ｖ／細胞懸濁液を加えた。組織を２時間、３４℃でインキュベートした（定着期）。次いでＳＴＡＲＴ  Ｖ培地（１ｍｌ）をペトリ皿に加え、３４℃、大気中５％ＣＯ2の存在下、湿度１００％で４８時間培養した。
【０１５５】
薬物適用
研究のために、特定の外植培養物をビヒクル（ＰＢＳ）だけに曝露した。第１の研究では（研究１）、毒素１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中１００ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸；最終濃度：１ｍＭ）１０μｌおよび毒素２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水中５０ｍＭ  ３−ニトロプロピオン酸−ｐＨ７、最終濃度：０．５ｍＭ）１０μｌを試験する薬物と同時に適用した（ＰＢＳ中に１０ｍＭストック溶液を調製し、最終濃度１〜１００ｎＭの間に希釈した）。それぞれの場合に薬物は、研究の期間中外植片に接触させたままにした。
【０１５６】
薬物の効果を判定するための方法
外植を研究期に薬物に曝露した後、細胞をＰＢＳ中でリンスし、次いで漸増する濃度のパラホルムアルデヒド（０．４％ＰＦＡ  ５００μｌを適用；次いで１．２％ＰＦＡ；次いで３％ＰＦＡおよび最終的に４％ＰＦＡ（各固定ステップ：２〜３分間）中で固定した。最終的にマイクロ外植片をＰＢＳ中でリンスした。
次いで外植片中のニューロンを形態（神経突起の存在）について評価し、顕微鏡視野当たりの生細胞として計数した。最も高い細胞密度を示した視野４個をカバーガラス当たりで計数し、データを平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として示した；ｎ＝各４。統計的有意性を独立スチューデントのｔ検定を使用して評価した。
【０１５７】
結果
環状Ｇ−２−アリルＰ
研究結果を図１２に示す。グルタミン酸処置（１ｍＭ；塗りつぶしたバー）は、ビヒクル処置対照（無地バー）と比較して神経突起を有する小脳ニューロンの約８５％消失を生じた。対照的にｃＧ−２−アリルＰは、グルタミン酸と同時に投与された場合（影を付けたバー）に用量依存的様式で．神経突起を有する細胞の数を顕著に増加させた。ｃＧ−２−アリルＰ（１００ｐｍから１０ｎｍ）の低用量での処置は、グルタミン酸誘発神経毒性における顕著な減少を示した。
環状シクロペンチル−Ｇ−２−ＭｅＰ
研究結果を図１３に示す。環状シクロペンチル−Ｇ−２ＭｅＰは、グルタミン酸と同時に投与された場合に神経突起を有する細胞の数を顕著に増加させた（薄い影を付けたバー）。環状シクロペンチル−Ｇ−２ＭｅＰの低用量での処置は、グルタミン酸誘発神経毒性における顕著な減少を示した。
【０１５８】
結論
ｃＧ−２−アリルＰおよび環状シクロペンチル−Ｇ−２−ＭｅＰの両方は、グルタミン酸誘発神経毒性を独立に減少または妨げ、両薬物が神経保護性であり、ニューロン変性または細胞死を阻害するために使用できることを示している。
【０１５９】
（例９）
低酸素性虚血障害ＩへのｃＧ−２−アリルＰの効果
材料および方法
ｃＧ−２−アリルＰが発作、心臓動脈バイパス移植術（ＣＡＢＧ）または他の低酸素侵襲への応答におけるニューロン損傷を予防できるかどうかを判定するために、一連の研究を低酸素性虚血障害（ＨＩ）に曝露したラットにおいて実行した。
【０１６０】
成体ラット（ウィスター、２８０〜３１０ｇ、雄）を使用した。改変Ｌｅｖｉｎｅモデル調製および実験手順を使用した（Rice et al, 1981, Ann. Neurol. : 9 : 131-141、Guan et al J., 1993, Cereb. Blood Flow Metab.: 13(4): 609- 16）。簡潔にこれらの手順は、一側性頸動脈結紮によって誘発されたＨＩ損傷に続く、留置された側脳室カニューレを有する動物における吸引性窒息からなる。ガイドカニューレを定位的に硬膜最上部、正中線１．５ｍｍ右、両耳間のゼロ面７．５ｍｍ前方にハロタン麻酔下で置いた。カニューレ挿入２日後に右頸動脈を二重結紮した。麻酔から１時間回復後、各ラットを湿度（９０±５％）および温度（３１°±０．５℃）を管理したインキュベーターにさらに１時間入れ、次いで低酸素（６％酸素）に１０分間曝露した。動物を処置前にさらに２時間インキュベーター内に保った。
【０１６１】
９対のラットをｃＧ−２−アリルＰ（２ｎｇ）またはそのビヒクル（通常の生理食塩水）のいずれかで低酸素虚血性侵襲２時間後に脳室内（ｉｃｖ）で処置した。各群のラットに、侵襲２時間後に浅麻酔（１．５％ハロタン）下でｃＧ−２−アリルＰまたはそのビヒクルを同時注入した。合計容量２０μｌをマイクロ注入ポンプによって２０分間かけて注入（ｉｃｖ）した。
組織学的試験を低酸素性虚血障害の５日後のラットに実施した。ラットをペントバルビタールナトリウムの過剰投与で屠殺し、通常の生理食塩水に続いて１０％ホルマリンで経心的に還流した。脳は、標準的パラフィン包埋手順を使用して処理する前に最低でも２日間同じ固定剤中に保った。
【０１６２】
冠状セクション厚さ８μｍを線条体から切り、大脳皮質および海馬をサイオニンおよび酸フクシンで染色した。組織学的結果を３種のレベルで評価した：（１）線条体の中央レベル、（２）完全な海馬が最初に出現した場所および（３）海馬の前角がちょうど出現した場所のレベル。組織傷害の重症度を線条体、皮質ならびに海馬のＣＡ１−２、ＣＡ３、ＣＡ４および歯状回でスコア化した。組織傷害をニューロン消失（好酸性（赤）細胞質および萎縮した核）、汎壊死（ｐａｎ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ）ならびに細胞反応として同定した。組織傷害を次のスコア系を使用してスコア化した：０：組織傷害を示していない、１：＜５％組織が傷害された、２：＜５０％組織が傷害された、３：＞５０％組織が傷害された、および４：＞９５％組織が傷害された。
結果および結論
この研究の結果を図１４に示す。図１４は、低酸素性虚血障害（各セットの左バー）が研究した脳の各エリアにおいて顕著な傷害スコアを生じたことを示している。図１４は比較的低用量のｃＧ−２−アリルＰ（各セットの右バー；２ｎｇ）の中心投与がビヒクル処置群と比較して検討した各脳領域において組織傷害を顕著に低減すること（ｐ＜０．００１）も示している。
【０１６３】
ｃＧ−２−アリルＰが低酸素性虚血障害によって生じる神経傷害に対して、低酸素性虚血障害後に投与された場合でも、神経保護性である可能性があることが見られる場合がある。この驚くべき発見は、ｃＧ−２−アリルＰが、神経変性または細胞死によって特徴付けられる種々の状態を処置するための有用な薬剤であることを示している。
【０１６４】
（例１０）
低酸素性虚血障害ＩＩへのｃＧ−２−アリルＰの効果
材料および方法
例９に記載の材料および方法を使用し、処置群の数を増加させた。ラットを５つの処置群に分け、４用量のｃＧ−２−アリルＰの１つまたはそのビヒクル（通常の生理食塩水）で低酸素虚血性侵襲２時間後に脳室内（ｉｃｖ）で処置した（１：ｎ＝１０、２ｎｇ；２：ｎ＝９、４ｎｇ；３：ｎ＝９、２０ｎｇ；４：ｎ＝１０、１００ｎｇ；および５：ｎ＝９、ビヒクル）。
【０１６５】
結果
図１５は、低酸素だけ（ビヒクル）が研究した脳のすべてのエリアにおいてニューロン傷害スコアをもたらしたことを示している。ｃＧ−２−アリルＰで処置した動物では、薬剤が低酸素／虚血性損傷後に投与されても低酸素はあまり影響を有さなかった。神経保護効果が線条体に投与された最も高い用量（１００ｎｇ）を除くｃＧ−２−アリルＰのすべての用量について観察された。しかし他のすべての部位および他のすべての用量で、ｃＧ−２−アリルＰは低酸素／虚血の神経傷害効果を和らげた。さらにｃＧ−２−アリルＰは、アポトーシスに関連するものなどの遅延型細胞死に関連する進行性の損傷を経験した脳領域において有効性の増加を有した。ＨＩ損傷にさらに耐性である歯状回および大脳皮質などの脳領域においては、線条体ならびに海馬のＣＡ１−２、ＣＡ３およびＣＡ４サブ領域などのＨＩ損傷にさらに感受性である脳領域においてよりも、損傷の進行がより遅く、より重度であることが周知である。この結果は、ｃＧ−２−アリルＰが慢性神経学的障害の処置において有益である可能性があることを示している。
【０１６６】
（例１１）
脆弱Ｘ症候群Ｉ一般的方法におけるｃＧ−２−アリルＰの効果
実験は、the United Kingdom Animals (Scientific Procedures) Act of 1986に従って実施した。Ｆｍｒ１−ＫＯ２マウスおよび野生型（ＷＴ）同腹仔をＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで生成し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドに８世代より多く繰り返し戻し交配し、Ｊａｃｋｓｏｎ’ｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙによってチリに送った。マウスを集団で飼い（ケージ当たり４〜６匹）、他に述べる場合を除いてすべての動物に餌および水を自由摂取させた。マウスを温度管理環境（２１±１℃）で１２時間明／暗周期（１９：００から７：００まで照明を切る）で維持した。
【０１６７】
課題を、１日当たり１つまで課題を実施して記載した順序で実施した。すべての実験は試験を実施する研究者およびマウスに注射する者に盲検であった。
パラメトリックデータを、二元配置ＡＮＯＶＡ（対象因子間の遺伝子型および性別）を使用して分析した。データが正規性の仮定または等分散性に違反する場合、変換（ｌｏｇ１０または平方根）を利用した。反復測定のＡＮＯＶＡについて、分散の等質性を真球度のマクリーの検定を使用して試験し、これに違反する場合、ヒューン・フェルト補正を使用した。非パラメトリックデータをマンホイットニーのＵ検定を使用して分析した。全体を通じてｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。
毒性の例は観察されなかった。動物を毛の外観における差異、立毛が存在するかどうか、眼の状態（涙眼またはポリフィア、眼瞼下垂）歩行外観、振戦、尾部緊張、操作への反応性などについて視診した。
【０１６８】
（例１２）
脆弱Ｘ症候群を有する動物由来の海馬ニューロンへのｃＧ−２−アリルＰの効果
ｃＧ−２−アリルＰがニューロンに効果を与えることができるかどうかを調べるために、本発明者らは野生型マウスまたはｆｍｒ１ノックアウトマウス由来のニューロンについてｉｎ  ｖｉｔｒｏで一連の研究を実行した。
方法
海馬細胞培養物を野生型およびｆｍｒ１ノックアウト胎仔マウス（妊娠１４〜１６日間）から調製した。簡潔には、マウスをクロロホルム麻酔下での頸椎脱臼によって屠殺し、分離した海馬細胞を１５ｍｍマルチウエル容器（Ｆａｌｃｏｎ  Ｐｒｉｍａｒｉａ）に置いた。１０％ウシ胎仔血清を補充したＭＥＭ−イーグル塩（補給グルタミン不含有）のプレーティング培地を使用した。培養物を３７℃、加湿した５％ＣＯ2雰囲気中に保持した。３日後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を、樹状突起棘形態形成を培養で経時的にモニターするために加えた（Ethell and Yamaguchi, 1999、Ethell et al., 2001、Henkemeyer et al, 2003）。樹状突起棘は、通常ｉｎ  ｖｉｔｒｏで７から１４日目（ＤＶＩ）の間に形成された。１４ＤＩＶまでに大部分の樹状突起は棘であった。平均（±ＳＤ）棘密度をμｍ当たりの棘の数として測定し、実験は三回行った。
【０１６９】
結果
これらの研究の結果を図１６Ａ〜１６Ｄに示す。図１６Ａは、ニューロン形態の測定のためのパーティション培養チャンバーを示す。図１６Ｂは、濃度０．５ｎＭでのｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）で処置した海馬ニューロンの顕微鏡写真を示す。本発明者らは、統計的に有意な変化を観察しなかった（平均±ＳＤ、ｎ＝３独立した実験：０．３６±０．０２）。
対照的に図１６Ｃは、５ｎＭ（０．２５±０．０３）の濃度でのｃＧ−２−アリルＰで処置した培養海馬ニューロンの顕微鏡写真を示す、本発明者らは、対照培養物と比較して統計的に有意な効果を観察した（０．２６±０．０４）。
【０１７０】
図１６Ｄは、ｃＧ−２−アリルＰで処置した培養海馬ニューロンの顕微鏡写真を示す。棘低減への顕著な効果が５０ｎＭ（０．２７±０．１０）の濃度でｃＧ−２−アリルＰで処置した培養物において観察された。本発明者らは、野生型動物との統計的有意差を観察しなかった（０．２６±０．０５）。
本発明者らはこれらの研究から、ｃＧ−２−アリルＰが樹状突起棘をｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少させ、この結果はｃＧ−２−アリルＰがｉｎ  ｖｉｖｏで神経学的発達および機能を改善できることを示しており、それによりマウスにおいて脆弱Ｘ症候群を処置することに有用である可能性があると結論付けている。脆弱Ｘ症候群についてのネズミモデルが脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおいて見出されたのと同じ遺伝子変異を有することから、ｃＧ−２−アリルＰは、脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することにも有効である可能性がある。
【０１７１】
（例１３）
脆弱Ｘ症候群Ｉを有する動物における行動へのｃＧ−２−アリルＰの効果：
不安および記憶
ｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有する動物において有益な効果を有するかどうかを判定するために、本発明者らは、野生型およびｆｍｒ１ノックアウト動物でのｉｎ  ｖｉｖｏでの記憶または馴化について一連の研究を実行した。
【０１７２】
方法
動物
ｆｍｒ１ノックアウトマウス２匹（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を同じ遺伝子型の群で、温度および湿度を管理した部屋で、１２時間明暗周期（午前７から午後７まで照明）で飼った。試験は明期の間に実施した。餌および水は、自由摂取させた。試験をｆｍｒ１ノックアウトマウスおよびそれらの野生型同腹仔で実施した。実験はUK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986の必要事項に合致して実行した。
【０１７３】
研究群（ｎ＝各１０）を次のとおり作製した。
１．  ビヒクルで処置したｆｍｒノックアウト（ＫＯ）
２．  ビヒクルで処置した野生型（Ｗｔ）
３．  ｃＧ−２−アリルＰで処置したｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）（「ＮＮＺ−２５９１」）
４．  ｃＧ−２−アリルＰで処置した野生型（Ｗｔ）
不安についてのオープンフィールド試験
オープンフィールド（ＯＦ）試験は、不安／機能亢進、および学習の最も基本の形態の１つである新規環境への馴化を判定するために使用される複合試験であり、同じ環境への反復曝露に応じた探索の減少が記憶の指標として解釈される。これは、オープンフィールドへの曝露の２回セッション、１０分間および２４時間馴化セッションで通常研究される。
【０１７４】
図１７は、これらの研究に使用したデバイスの写真である。オープンフィールドは、移動を追跡できる曝露した空間である。
この研究に使用されたデバイスは、１０ｃｍ平方に区切られた活動領域５０×３０ｃｍを含む灰色ＰＶＣである。マウスを試験の５〜２０分前に実験室に入れる。マウスを角に面している角の四角に置き、３分間観察する。進入した（全身）四角の数および後ろ肢で立った回数（毛つくろいの一部ではなく、両前肢が地面から離れている）を計数する。最初に後ろ肢で立つまでの待ち時間も記録する。フィールド周辺のマウスの移動を、ビデオ追跡デバイスで３００秒間（ｖＮＴ４．０、Ｖｉｅｗｐｏｉｎｔ）記録した。マウスが最も明るい、フィールドの中央部に進入するまでの待ち時間、この中央領域で費やした総時間数、および総活性（センチメートルでのパス長を単位として）を記録した。
【０１７５】
オープンフィールド（ＯＦ）試験は、日常の操作に馴化された動物における、新規および見慣れた状態の下での探索的行動、不安およびまたは機能亢進を特徴付けるために使用される試験である。オープンフィールドへの曝露の際にマウスは、環境に馴化し、それにより経時的により少ない探索、移動量の減少を示す。
本実験では本発明者らは、初期曝露（Ｔ１）の際、１０分後の第２の曝露の際（Ｔ２）および２４時間後の第３の曝露の際（Ｔ３）に移動および立ち上がりを記録した。１０分および２４時間で自発運動または立ち上がりを低減しないことは、それぞれ短期および長期記憶における欠損を示している。
【０１７６】
結果
ｃＧ−２−アリルＰは、脆弱Ｘ症候群を有する動物において不安を減少させる。
図１８は、進入した四角の数（垂直軸）を各処置群についてプロットしたＯＦ試験の結果のグラフを示す。ビヒクル処置野生型動物（左バー）は、Ｔ１試験期間中に四角約８０個の合計距離を進んだ。同様にｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置野生型動物（左から３番目のバー）は、この試験期間中にほぼ同じ数の四角に進入した。
対照的に、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、同じ期間中により多い四角に進入した（ｐ＜０．００１）。この効果の規模は、これらの動物が試験期間Ｔ１中に四角約１５０個に進入しており、統計的に有意で実質的であった。しかし本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）がビヒクル処置およびｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物（左から３番目のバー）において見られるものに匹敵する結果で、ｆｍｒ１ノックアウト動物（右バー）の探索行動を顕著に低減したことを予想外に見出した。
【０１７７】
この結果から本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがｆｍｒ１ノックアウト動物における不安を減少させると結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおける不安を低減できると結論付けている。
ｃＧ−２−アリルＰは、脆弱Ｘ症候群を有する動物において短期記憶を改善する。
図１９は、期間Ｔ２（１０分間）でのＯＦ試験の結果のグラフを示し、進入した四角の数（垂直軸）を各処置群についてプロットしている。Ｔ１での結果と共に（図１８）、ビヒクル処置野生型動物（左バー）およびｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置野生型動物（左から３番目のバー）は、各群が期間Ｔ２中に四角約４５個に進入して通常の探索行動を実証した。Ｔ２試験期間に進んだ距離は、Ｔ１中に進んだ距離よりも少なく、この時点までに動物が少なくとも部分的にＯＦ試験に馴化したことを示している。
【０１７８】
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、動物の最初の２群のいずれよりも実質的に多い探索行動を示した（ｐ＜０．００１）。実際に増加の規模は約２倍、四角約１００個であった。
対照的に本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがｆｍｒ１ノックアウト動物（右バー）の探索行動を減少させ、実際にそれらの行動の大きさを野生型動物のものに正常化したことを驚くべきことに見出した。
本発明者らは、これらの結果から：（１）マウスでの脆弱Ｘ症候群が短期記憶または馴化を減少させた、および（２）ｃＧ−２−アリルＰがｆｍｒ１ノックアウト動物において短期記憶または馴化を改善したと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおける短期記憶を改善できると結論付けている。
【０１７９】
ｃＧ−２−アリルＰは、脆弱Ｘ症候群を有する動物における長期記憶を改善する。
図２０は、期間Ｔ３でのＯＦ試験の結果のグラフを示し、進入した四角の数（垂直軸）を各処置群に対してプロットしている。Ｔ１（図１８）およびＴ２（図１９）での結果と共に、ビヒクル処置野生型動物（左バー）およびｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置野生型動物（左から３番目のバー）は、各群が期間Ｔ３中に四角約２５〜３０個に進入して通常の探索行動を実証した。Ｔ３試験期間に進んだ距離は、Ｔ２中に進んだ距離よりも少なく、さらにＴ１で観察されたものと比較して減少しており、期間Ｔ３までに動物がＯＦ試験に進行的に馴化しており、より良い長期記憶を有したことを示している。
【０１８０】
対照的に、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、ビヒクル処置またはｃＧ−２−アリルＰ−処置群よりも実質的にさらに多い探索行動（ｐ＜０．００１）を示した。実際に増加の規模は、約２倍、四角約１００個であった。興味深いことにｆｍｒ１ノックアウト動物では、馴化は、時間およびＯＦデバイスへの曝露で増加しなかった。期間Ｔ３で進入した四角の数は、期間Ｔ２またはＴ１において見出されたものと同様であった。
本発明者らは、短期記憶と同様にｆｍｒ１ノックアウト動物において、ビヒクル処置Ｆｍｒ１ノックアウト動物と比較してｃＧ−２−アリルＰが実質的にＴ３での探索行動を減少させ（左から２番目のバー）、実際に正常化させ、長期記憶または馴化を正常に戻したことを示していることを予想外に見出した。
【０１８１】
結論
本発明者らは、これらの結果から：（１）ｆｍｒ１ノックアウトマウスが長期記憶または馴化の低下を示した、および（２）ｃＧ−２−アリルＰがｆｍｒ１ノックアウト動物において長期記憶または馴化を改善したと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおける長期記憶または馴化を正常化できると結論付けている。
【０１８２】
（例１４）
脆弱Ｘ症候群ＩＩを有する動物における行動へのｃＧ−２−アリルＰの効果：
機能亢進
ｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有する動物における機能亢進に有益な効果を有するかどうかを判定するために、本発明者らは、野生型およびｆｍｒ１ノックアウト動物でｉｎ  ｖｉｖｏでの一連の研究を実行した。
【０１８３】
方法
動物
ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ２）マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド）を同じ遺伝子型の群で、温度および湿度を管理した部屋で、１２時間明暗周期（午前７時から午後７時まで照明）で飼った。試験は明期の間に実施した。餌および水は、自由摂取させた。試験をｆｍｒ１ノックアウトマウスおよびそれらの野生型同腹仔で実施した。実験はUK Animals (Scientific Procedures) Act, 1986の必要事項に合致して実行した。動物を４群に分けた：
ビヒクル処置野生型
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト；
ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型；および
ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト
【０１８４】
連続路地試験
一研究において本発明者らは、「連続路地試験」デバイスを使用した。このデバイスは、４本の連続する線形に連結された次第に不安を惹起させる路地からなる。それぞれ続く路地は、それ以前の路地よりさらに薄い色で塗られ、より低い壁を有したおよび／またはより狭かった。路地１（Ａ１）の閉じた末端に動物を配置し、その末端の壁に向かせた。合計試験時間３００秒の間に、各路地（Ａ２、Ａ３、および／またはＡ４）に最初に進入するまでの待ち時間、各路地に費やした時間、および各路地に進入した回数を記録した。
連続路地試験について本発明者らは、上に記載の４群の動物それぞれについて、路地１（Ａ１）、路地２（Ａ２）、路地３（Ａ３）および路地４（Ａ４）に進入した数を測定した。
【０１８５】
結果
図２１および２２は、連続路地試験の結果を記す。図２１は、ビヒクル処置動物において得られた結果のグラフを記す。図２２は、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置動物において得られた結果のグラフを記す。進入の数（垂直軸）を各処置群に対して示し、各路地（Ａ１〜Ａ４）への進入を示す。図２１では、ビヒクル処置動物は、ｆｍｒ１ノックアウト動物が野生型動物よりも多い進入数を示して、探索行動を示した。ビヒクル処置野生型動物は、試験期間中にアームＡ１（ＷＴ−Ａ１）およびＡ２（ＷＴ−Ａ２）に約３〜４回進入したが、重要なことにアームＡ３（ＷＴ−Ａ３）またはＡ４（ＷＴ−Ａ４）に進入しなかった。
【０１８６】
対照的にビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、最初の開いた路地に進入するまでの待ち時間が有意に短く（ｐ＜０．００１）、開いた路地で有意に長い時間を費やした（ｐ＜０．００１）。これらの動物は、試験期間中にアームＡ１（ＫＯ−Ａ１）およびＡ２（ＫＯ−Ａ２）に約１０回進入した。ｆｍｒ１ノックアウト動物がアームＡ１およびＡ２に進入した回数は、野生型動物の回数の２倍より多く、ビヒクル処置野生型動物よりも有意に高いレベルの機能亢進を示している。ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物もアームＡ３（ＫＯ−Ａ３）およびＡ４（ＫＯ−Ａ４）への路地間でより多く交差した（ｐ＜０．０００１）。
本発明者らは、これらの結果からｆｍｒ１ノックアウトマウスが野生型動物よりも大きな不安を示したと結論付けている。
【０１８７】
図２２は、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置動物における連続路地試験の結果を示す。ｃＧ−２アリルＰ処置野生型動物は、試験期間中にアームＡ１（ＷＴ−Ａ１）に約２回進入し、試験期間中にアームＡ２（ＷＴ−Ａ２）に約４回進入した。これらの結果は、図２１に示すビヒクル処置野生型動物について得られた結果に匹敵する。
対照的に、ｃＧ−２−アリルＰで処置したｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物は、開いたアーム進入（ｐ＜０．００１）および中央で費やした時間（ｐ＜０．００５）において顕著な低減を示し、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物と比較して機能亢進における低減を示している。ｃＧ−２−アリルＰの効果の規模は、図２１に示すビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物についての約８回と比較して、アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物がアームＡ１（ＫＯ−Ａ１）に４回進入して、実質的であった。同様に図２１に示すビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物についての約１０回と比較して、ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物は、アームＡ２（ＫＯ−Ａ２）に約４回進入した。ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物は、図２１に示すビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物についての約９回と比較して、アームＡ３（ＫＯ−Ａ３）に約４回進入した。最後にｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物は、図２１に示すビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物についての約４回と比較して、アームＡ４（ＫＯ−Ａ４）に約３回進入した。
【０１８８】
結論
本発明者らは、この研究からｃＧ−２−アリルＰがこれらの条件下でｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて不安を減少させたと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが、脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
【０１８９】
高架十字迷路
別の研究では本発明者らは、「高架十字迷路」を使用した。高架十字迷路試験は、マウスにおける不安様機能亢進を測定するために最も広く使用されているものの１つである。試験は、開いた高架エリアに対するマウスの本来の嫌悪、および新規環境におけるそれらの本来の自発的探索行動に基づいている。図２３は、この研究で使用したデバイスの写真を示している。装置は、中央で互いに垂直に交わった２個の開いたアームおよび２個の閉じたアーム、ならびに中央エリアからなる。開いたアームは、より露出しており、それによりマウスにより多くの不安を作りだす。したがってマウスは、閉じたアームでより長い時間を費やし、より頻繁にそこを訪れる。マウスは、すべてのアームに接近でき、それらの間を自由に移動できるようにされた。開いたアームへの進入の数、開いたアームで費やした時間および中央で費やした時間を開いた空間が誘発する不安の指標として使用した。
【０１９０】
閉じたアームで費やした時間
図２４は、試験した動物の４群それぞれについてデバイスの閉じたアーム（垂直軸）において費やした時間量についての高架十字迷路を使用した研究の結果を示す。
図２４に示すとおり、ビヒクル処置野生型マウス（左バー）は、約２４０秒間を閉じたアームで費やし、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置野生型マウス（左から３番目のバー）は、同じ時間を閉じたアームで費やした。
対照的に、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、閉じたアームにおいて有意に少ない時間を費やし（約１６０秒間；ｐ＜０．００１）、ｆｍｒ１ノックアウト動物における機能亢進の状態を示している。ｃＧ−２−アリルＰは、ｆｍｒ１ノックアウト動物で閉じたアームにおいて費やした時間を正常化させた（右バー）。この機能亢進は、ビヒクル処置野生型およびｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物と比較してｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物において有意に低減していた。統計的に有意な差異がビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト群とｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト群との間で観察された（ｐ＜０．００１）。
【０１９１】
本発明者らは、この研究からｃＧ−２−アリルＰがこれらの条件下でｆｍｒ１ノックアウトマウスの機能亢進を減少させたと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することにも有効である可能性があると結論付けている。
高架十字迷路における開いたアームで費やした時間
図２５は、この研究の結果のグラフを示し、開いたアームで費やした時間（垂直軸）を試験した動物の４群それぞれについて示す。
【０１９２】
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、それらのビヒクル処置野生型同腹仔（左バー）と比較して有意に長い時間を開いたアームで費やした（ｐ＜０．００１）。対照的にｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）は、ｆｍｒ１ノックアウト動物が開いたアームで費やした時間を正常化した。ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物マウスが開いたアームで費やした時間は、ビヒクル処置野生型マウス（左バー）またはｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物（左から３番目のバー）について観察されたものと顕著に異ならなかった。
本発明者らは、これらの結果から：（１）ｆｍｒ１ノックアウト動物が野生型動物よりもさらに機能亢進した行動を示した、および（２）ｃＧ−２−アリルＰが機能亢進を正常化したと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
【０１９３】
高架十字迷路における中央での時間
図２６は、試験した動物の４群のそれぞれについてデバイスの中央で費やした時間（垂直軸）のグラフを示す。高架十字迷路の中央で費やした時間は、当技術分野において機能亢進の目安として認められている。
ビヒクル処置野生型マウス（左バー）は、約３０秒間を迷路の中央で費やした。ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置野生型マウス（左から３番目のバー）は、ビヒクル処置野生型動物よりもわずかに短い時間を中央で費やした。対照的に、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスは、ビヒクル処置野生型動物と比較して中央で顕著に長い時間を費やした（左から２番目のバー；ｐ＜０．００１）。
【０１９４】
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウトマウス（右バー）が、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）よりも有意に少ない時間を費やしたことを予想外に見出した。本発明者らは、ビヒクル処置野生型動物（左バー；ｐ＜０．００１）、ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物（左から３番目のバー；ｐ＜０．００１）またはｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（右バー；ｐ＜０．００１）と比較して．ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）が中央で費やした時間において統計的有意差を観察した。実際に本発明者らは、ビヒクル処置野生型群（左バー）、ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型群（左から３番目のバー）またはｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト群（右バー）のいずれも中央で費やした時間において統計的有意差を観察しなかった。
【０１９５】
本発明者らは、この研究からｃＧ−２−アリルＰがこれらの条件下でｆｍｒ１ノックアウトマウスの機能亢進を減少させたと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが、脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
【０１９６】
（例１５）
脆弱Ｘ症候群を有する動物における恐怖条件付けへのｃＧ−２−アリルＰの効果
療法（ｃｕｒｅ）または文脈いずれかの恐怖条件付けは、多数の種において十分に使用されている連合学習の形態を表す。文脈的（遅延）恐怖条件付けにおいて使用した依存測定は、条件付けられていない刺激（足ショク）、条件付けた刺激（ＣＳ）、具体的な文脈および／またはそのような合図（ｃｕｅ）の対に続いて生じる凍結応答である。条件付けの内容において音と対になる足ショクが与えられる場合、音だけに限らず文脈にも学習がある。
【０１９７】
文脈的恐怖条件付け（Ｃｏｎｔｅｘｔｕａｌ  ｆｅａｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ）は、基本的な条件付け手順である。それは、動物を取り、新規環境に置くことを含み、嫌悪的刺激を与え、次いでそれを除去する。動物を同じ環境に戻した場合、記憶しており、環境を嫌悪的刺激に関連付けた場合に一般に凍結応答を呈する。凍結は、恐怖への応答であり、「呼吸を除く移動の不在」として定義される。この凍結挙動は、嫌悪的刺激の強度、提示の回数および対象によって達成された学習の程度に応じて数秒間から数分間継続する場合がある。
【０１９８】
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおりこの研究のために野生型またはｆｍｒ１ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型；
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト；
ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型；および
ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト．
文脈的恐怖条件付けを評価するための装置
この研究で使用したデバイスを図２７に示す。条件付けられていない刺激（足への穏やかなショク）を適用し、条件付けた刺激は足へのショクに伴って適用された音であった。これらの条件下で動物は、条件付けられていない刺激を条件付けた刺激および刺激の文脈の両方と関連付ける。動物を五（５）分間試験した。
【０１９９】
結果
図２８は、試験した動物のそれぞれの群について「凍結挙動」に費やした時間のグラフを示す。この研究の急性ストレス状態下で、ビヒクル処置野生型動物（左バー）は、５分間の試験期間の平均約３０％を費やした（すなわち約１００秒間）。対照的に、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、実質的に少ない時間を凍結挙動に費やした（５分間の試験期間の約１８％すなわち約５４秒間）。本発明者らは、ｆｍｒ１ノックアウト動物がビヒクル処置野生型動物よりも少ない恐怖を示したと結論付けている。
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）がｆｍｒ１ノックアウト動物（右バー）において凍結挙動に費やした時間における実質的で統計的に有意な増加を産生したことを予想外に見出した。実際にｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト動物について観察された凍結挙動に費やした時間は、ビヒクル処置野生型動物（左バー）およびｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物（左から３番目のバー）によって費やされた時間に類似していた。
【０２００】
結論
本発明者らは、この研究からｆｍｒ１ノックアウト動物が野生型動物よりも低い恐怖条件付けを示したと結論付けている。これは、ｆｍｒ１ノックアウト動物が野生型動物と比較して生存状の不利益を有する可能性があることを示している。本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがこれらの条件下でｆｍｒ１ノックアウトマウスにおける恐怖条件付けを増加させたことも結論付けている。この効果は、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物において観察された生存不利益を軽減する可能性がある。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが、脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
【０２０１】
（例１６）
脆弱Ｘ症候群を有する動物におけるガラス玉覆い隠しおよび営巣行動へのｃＧ−２−アリルＰの効果
マウスは社会的な種であり、接近、追従、臭い嗅ぎ行動、アログルーミング、攻撃的遭遇、性的相互作用および親の行動、グループハドル（ｇｒｏｕｐ  ｈｕｄｄｌｅ）での巣作りおよび就寝を含む容易にスコア化される社会的行動を行い、マウスにおける社会的認識および社会的記憶は、親密さを誘導するために反復的に曝露される新たなマウスを臭い嗅ぎ行動に費やす時間の量および、新たな刺激動物が導入された場合の臭い嗅ぎ行動の高いレベルへの回復によって評価される。
【０２０２】
ガラス玉覆い隠し
マウスは、実験室の多くの基質を自発的に掘る。この行動は、自然での生息地で土または落ち葉に埋めた種子、穀物、昆虫および他の食糧を見つけるために探した野生でのそれらの祖先に由来する。これは、一般的な天然げっ歯類の行動を使い、管理された実験室条件下で定量的データを提供し、プリオン疾患、脆弱Ｘ症候群および脳病変に極めて高い感受性を証明した。「日常生活動作」（ＡＤＬ）を実施する能力の悪化は、アルツハイマー病（ＡＤ）および認知機能低下の初期徴候である（Deacon, 2012）。
ガラス玉覆い隠し行動へのｃＧ−２−アリルＰの効果を研究するために、本発明者らは野生型マウスおよびｆｍｒ１ノックアウトマウスでの一連の研究を実行した。
【０２０３】
方法
動物
本発明者らは、この研究のために上に記載のとおり野生型またはｆｍｒ１ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型；
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト；
ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型；および
ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト
マウスを木の削り屑のベッドを有する閉鎖環境に置いた。１０個のガラス玉を環境に入れ、埋められたガラス玉の数を目視観察によって判定した（中央値±四分位範囲（ＩＱＲ））。
【０２０４】
結果
本発明者らは、ビヒクル処置野生型マウスおよびｃＧ−２−アリルＰ処置野生型マウスが存在する１０個のガラス玉の内１０個（１００％）を埋めたことを観察した。対照的にｆｍｒ１ノックアウト動物は、ビヒクル処置野生型動物よりも有意に少ないガラス玉を埋めた（１０個の内平均３個すなわち３０％；（ｐ＜０．００１）。
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置ｆｍｒ１ノックアウト動物が１０個のガラス玉の内中央値８個を埋めた（８０％）ことを予想外に見出した。実際に、ｃＧ−２−アリルＰは、埋められたガラス玉の数をビヒクル処置野生型マウスまたはｃＧ−２−アリルＰ処置野生型マウスについて見出されたものに非常に近いレベルに正常化した。
【０２０５】
結論
本発明者らは、この研究からｆｍｒ１ノックアウトマウスが野生型動物よりも少ないガラス玉を埋め、ｃＧ−２−アリルＰがこの減少を救済し、実際に行動を標準化すると結論付けた。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが、脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
【０２０６】
営巣行動
雄および雌マウスは、巣を作り、目的が体温調節を含み、繁殖と関連することから、この試験を同等に実施する。この試験は、海馬病変および機能障害の指標としても使用される。
【０２０７】
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおり野生型またはｆｍｒ１ノックアウト動物のいずれかをこの研究のために使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型；
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト；
ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型；および
ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト
【０２０８】
営巣行動についての試験
マウスは、巣を作るために典型的には特定の材料を使用する。この研究では、本発明者らはワタ「ネストレッツ」を営巣ケージに導入した。それによりマウスは、ネストレッツのワタを引き裂いて使用でき、営巣ケージの寝床に巣を作るために使用できる。営巣は、マウスにおける典型的行動であり、通例の日常生活の態様を表す。したがってこの試験は、ヒトによって実行される日常生活課題を反映する。ｆｍｒ１ノックアウトマウスの営巣行動における変化は、したがって脆弱Ｘ症候群を有するヒトの行動の予測となる。さらにｆｍｒ１ノックアウトマウスへの薬物の効果は、脆弱Ｘ症候群を有するヒトへの薬物の効果の合理的な予測となる。
【０２０９】
マウスを明暗周期の暗期の約１時間前に個々に営巣ケージに置き、結果を翌朝評価した。ネストレッツの外観を下に記載のとおり５点満点制により評価し、裂かれていないネストレッツ材料の量も計量した。
１．ネストレッツは、大部分が裂かれていなかった（＞９０％未変化）。図２０Ａは、１のスコアを有するネストレッツの写真を示す。
２．ネストレッツは、部分的に裂かれていた（５０〜９０％未変化のまま）。図２０Ｂは、２のスコアを有するネストレッツの写真を示す。
３．ネストレッツは、大部分が切り刻まれていたが、しばしば同定可能な巣の場所がない：ネストレッツの＜５０％が未変化のままであるが、＜９０％がケージの床のエリアの四分の一以内にある、すなわちワタは巣に集められておらず、ケージ周辺に広がっていた。材料は、時折広く定義された巣エリアにある場合もあるが、決定的な定義は５０〜９０％が裂かれていることである。図２９Ｃは、３のスコアを有するネストレッツの写真を示す。
４．同定可能であるが、平らな巣：ネストレッツの＞９０％が裂かれており、材料はケージの床のエリアの四分の一以内の巣に集められているが、巣はその外周の５０％未満がマウス体長より高い壁（横で丸くなっている）を有して平らである。図２９Ｄは、４のスコアを有するネストレッツの写真をネストレッツの上のマウスと共に示す。
５．ほとんど完全な巣：＞９０％のネストレッツが裂かれており、巣は、その外周の５０％より多くにおいてマウス体長より高い壁を有するくぼみである。図２９Ｅは、５のスコアを有するネストレッツの写真をネストレッツの上のマウスと共に示す。
【０２１０】
結果および結論
本発明者らは、ビヒクル処置野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスが約４〜５個の間の巣の構築を達成したことを見出した。対照的にビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウトマウスについてスコア中央値はおよそ１〜２であった。
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置が営巣スコアをｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいて約４〜５増加させることを予想外に見出した。
本発明者らは、ｆｍｒ１ノックアウトマウスが巣を作ることに欠陥を実証し、ｃＧ−２−アリルＰが少なくとも部分的にこの欠陥を回復させたと結論付けている。この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが、脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトを処置することに有効である可能性があると結論付けている。
【０２１１】
（例１７）
社交性：社会認識、社会的新規性に対する嗜好
マウスは社会的な種であり、接近、追従、臭い嗅ぎ行動、アログルーミング、攻撃的遭遇、性的相互作用および親の行動、群れでの巣作りおよび就寝を含む容易にスコア化される社会的行動を行う。社交性を研究するために本発明者らは、野生型マウスおよびｆｍｒ１ノックアウト変異を有するマウスにおいて一連の研究を実行した。
【０２１２】
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおりこの研究のために野生型またはｆｍｒ１ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた。
ビヒクル処置野生型；
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト；
ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型；および
ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト．
【０２１３】
試験手順
マウスにおける社会的認識および社会的記憶は、親密さを誘導するために反復的に曝露される新たなマウスを臭い嗅ぎ行動に費やす時間の量および、新たな刺激動物が導入された場合の臭い嗅ぎ行動の高いレベルへの回復によって評価された。本発明者らは、動物の群それぞれで臭い嗅ぎ行為の数を測定した。
結果および結論
図３０は、研究したマウスの様々な群ごとの、臭い嗅ぎ行為の持続時間（垂直軸）のグラフを示す。本発明者らは、ビヒクル処置野生型動物（左バー）が試験期間中に約２３回の臭い嗅ぎ行為を示したことを見出した。対照的に、ｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）はあまり臭い嗅ぎ挙動を示さなかった（約６回）。
【０２１４】
しかし本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）処置ｆｍｒ１ノックアウト動物（右バー）において、臭い嗅ぎ挙動の量が約２１回に有意に増加した（ｐ＜０．００１）ことを驚くべきことに見出した。実際にｃＧ−２−アリルＰは、ビヒクル処置野生型（左バー）またはｃＧ−２−アリルＰ処置動物（左から３番目のバー）とほぼ同じレベルまでｆｍｒ１ノックアウト動物における臭い嗅ぎ挙動を増加させた。
本発明者らは、ｆｍｒ１ノックアウト動物が野生型動物と比較して社交性の欠損を示すと結論付けている。この結果は、脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおいて見出される十分周知の社交性における欠損と一致する。本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがｆｍｒ１ノックアウトマウスについて観察された社交性を増加させ、行動を正常化したことも結論付けている。
この研究で使用したｆｍｒ１ノックアウトマウスが、脆弱Ｘ症候群を有するヒトと同じ遺伝子変異を有することから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有するヒトにおける社会的相互作用を改善することにおいて有効である可能性があると結論付けている。
【０２１５】
（例１８）
ｃＧ−２−アリルＰは、脆弱Ｘ症候群を有する動物においてｐＥＲＫおよびｐＡＫＴの過剰発現を正常化する。
ニューロンは、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ−ＡｋｔおよびＲａｓ−ＥＲＫシグナル伝達カスケードを通じて局所樹状翻訳を制御し、ｍＧｌｕＲ５シグナル伝達カスケードを関連付ける脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質によって決定的に影響される。細胞内シグナル伝達分子、ＥＲＫおよびＡｋｔの過活性化は、シナプス可塑性において重要な役割を演じている。これらのタンパク質の発現のレベルは、脆弱Ｘ症候群の細胞病理学の特性であり、ＦＸＳの神経行動学的表現型に直接寄与すると考えられている。ＥＲＫは、古典的ＭＡＰＫシグナル伝達タンパク質であり、増殖因子伝達、増殖、ストレスへのサイトカイン応答およびアポトーシスに関与する。Ａｋｔは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達経路における鍵となる構成成分であり、核因子−κΒ（ＮｆκＢ）およびＢｃｌ−２ファミリータンパク質などの多数の下流エフェクターに結合および制御することによって細胞生存および代謝を制御している。これらのタンパク質の過剰活性化（リン酸化）は、自閉スペクトラム障害に関連付けられている。
【０２１６】
方法
動物
本発明者らは、上に記載のとおり、この研究のために野生型またはｆｍｒ１ノックアウト動物のいずれかを使用した。動物を次のとおり群に分けた（ｎ＝１群当たり動物４匹）。
ビヒクル処置野生型；
ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト；
ｃＧ−２−アリルＰ処置野生型；および
ｃＧ−２−アリルＰ処置ｆｍｒ１ノックアウト
【０２１７】
生化学試験
全脳可溶化物のＥＲＫ１／２およびＡｋｔのリン酸化レベルを、ウエスタンブロットを使用して評価した。マウスを屠殺し、脳を最終注射の１２日後、最終行動試験の直後に取った。他の研究は、ｐＥＲＫおよびｐＡｋｔを血液リンパ球中で測定した。ウエスタン分析の結果を各ブロットにおいて見られるＧＡＰＤＨタンパク質の量に標準化した。
【０２１８】
結果
リン酸化ＥＲＫ
図３１は、マウス由来の脳における研究の結果のグラフを示す。ビヒクル処置野生型マウスは、約０．９（ＵＡ単位）（左バー）の平均を有した。対照的にｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、約１．３（ＵＡ単位）（ｐ＜０．０５）へのリン酸化ＥＲＫのレベルの増加を有した。ｆｍｒ１ノックアウト動物のｃ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）での処置（左から３番目のバー）は、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物と比較してＥＲＫリン酸化を有意に低減した（ｐ＜０．０５）。ｆｍｒ１ノックアウト動物のｃＧ−２−アリルＰでの処置後に観察されたｐＥＲＫのレベルは、ビヒクル処置野生型動物（左バー）またはｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物（左から３番目のバー）のものと非常に類似していた。
同様の結果を動物の群から単離したリンパ球中のｐＥＲＫについて見出した。
【０２１９】
リン酸化ＡＫＴ
本発明者らは、動物の脳におけるＥＲＫについて本発明者らが観察したものと同様のパターンをリン酸化ＡＫＴにおいて観察した。図３２は、この研究の結果のグラフを示す。ビヒクル処置野生型マウスは、平均約０．９（ＵＡ単位）（左バー）を有した。対照的にｆｍｒ１ノックアウト動物（左から２番目のバー）は、約１．３（ＵＡ単位）のリン酸化ＡＫＴの増加したレベルを有した（ｐ＜０．０５）。ｆｍｒ１ノックアウト動物のｃ−２−アリルＰ（「ＮＮＺ２５９１」）での処置（左から３番目のバー）は、ビヒクル処置ｆｍｒ１ノックアウト動物と比較して、ＥＲＫリン酸化を約０．９（ＵＡ単位）に有意に（ｐ＜０．０５）低減した。ｆｍｒ１ノックアウト動物のｃＧ−２−アリルＰでの処置後に観察されたｐＡＫＴのレベルは、ビヒクル処置野生型動物（左バー）またはｃＧ−２−アリルＰ処置野生型動物（左から３番目のバー）のものに非常に類似していた。
同様の結果を動物の群から単離したリンパ球中のｐＡｋｔについて見出した。
【０２２０】
（例１９）
レット症候群の処置：レット症候群（ＲＴＴ）モデルにおけるｃＧ−２−アリルＰの寿命および長期増強への効果
ｃＧ−２−アリルＰ処置が、障害のネズミモデルにおいてレット症候群の発症および進行に影響を与えられるかどうかを判定するために、本発明者らはヘミ接合性ＭｅＣＰ２（１ｌｏｘ）雄マウスを使用する。ＭｅＣＰ２ノックアウト（ＭｅＣＰ２−ＫＯ）マウス系は、ヒト障害、レット症候群に特徴的な生理学的および神経学的異常性の範囲および重症度をよく模倣するとして当技術分野において広く認められている。
【０２２１】
すべての実験はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて実施され、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって、または他の機関による同様の承認によって承認された。ｃＧ−２−アリルＰはＡｌｂａｎｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ）によって合成され、Ｎｅｕｒｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって供給された。
【０２２２】
方法
処置
本発明者らは、ヘミ接合性ＭｅＣＰ２（１ｌｏｘ）雄マウスを２０ｍｇ／ｋｇ／日のｃＧ−２−アリルＰまたは生理食塩水で処置した（０．０１％ＢＳＡ、生存実験では１群当たりｎ＝１５およびＬＴＰ実験ではｎ＝２０）。処置は、誕生後４週間から腹腔内に投与する。生存実験のために処置を実験の経過を通じて維持する。切片調製のために使用する場合は、ＬＴＰ実験のためにマウスを９週まで処置する。
【０２２３】
生存
ＭｅＣＰ２欠損変異マウスは、ＲＴＴ症状を約４〜６週齢で発症し、１０〜１２週で死ぬ（Chen et al., 2001. Nat Genet 27: 327-331）。本発明者らは、野生型対照およびＭｅＣＰ２欠損動物の生存をビヒクルとｃＧ−２−アリルＰ−処置群とにおいて比較する。生存は、処置の開始から毎週測定し（４週間）、１週間隔（ｘ軸）で生存している（ｙ軸）マウスの割合を示すカプラン−マイヤー生存曲線を作成するために使用する。
長期増強（電気生理学）
ＭｅＣＰ２欠損マウスは、機能的および超微細構造的シナプス機能障害、海馬依存性記憶および海馬性長期増強（ＬＴＰ）の顕著な機能障害を罹患すると既に報告されている（Moretti et al. The Journal of Neuroscience. 2006. 26(1): 319-327）。ｃＧ−２−アリルＰ処置のシナプス機能への効果をＲＴＴモデルにおいて試験するために、本発明者らはビヒクルおよびｃＧ−２−アリルＰで処置した動物の両方において海馬性ＬＴＰを９週齢で比較する。それを行うために本発明者らは、生理食塩水またはＧ−２−ＭｅＰＥのいずれかで処置したＭｅＣＰ２欠損マウス由来の海馬の切片におけるニューロンでのベースライン電位の％としてｆＥＰＳＰのスロープを測定する。
【０２２４】
結果
結果は、ｃＧ−２−アリルＰ処置がＭｅＣＰ２欠損マウスの生存を増加させることを示している。野生型マウス（一番上の線）は対照動物であり、そのためそれらの生存は各時点で１００％である。生理食塩水で処置したＭｅＣＰ２欠損マウスだけが野生型マウスよりもずっと早く死に、約１１週までにＭｅＣＰ欠損マウスのほんの一部だけが生存している。しかし対照的に本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰで処置したＭｅＣＰ２欠損マウスは、生理食塩水処置マウスよりも実質的に長く生存することを見出している。ｍｅｃｐ２マウスのｃＧ−２−アリルＰ処置によって安全上の懸念は生じていない。
これらの結果は、ｃＧ−２−アリルＰがＭｅＣＰ２欠損マウスの生存を実質的に増加できることを実証している。ＭｅＣＰ２欠損マウスがレット症候群を有するヒトにおける病理学および治療有効性の予測であることから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰがレット症候群を有するヒトの寿命を増加できると結論付けている。
【０２２５】
結果は、ｃＧ−２−アリルＰ処置がＭｅＣＰ２欠損動物におけるｆＥＰＳＰスロープによって測定される海馬性長期増強（ＬＴＰ）を生理食塩水処置変異マウスと比較して増加させることも示す。本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰが、生理食塩水だけで処置した動物と比較してＭｅＣＰ２欠損マウスにおいてｆＥＳＰＳのスロープを増加させることを見出している。
【０２２６】
これらの結果は、ｃＧ−２−アリルＰがＭｅＣＰ２欠損マウスをｉｎ  ｖｉｖｏで処置することに有効である可能性があることを実証している。ＭｅＣＰ２欠損マウスがレット症候群を有するヒトにおける病理学および治療有効性の予測であることから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰがレット症候群を有するヒトのために有効な治療である可能性があると結論付けている。
【０２２７】
（例２０）
ｃＧ−２−アリルＰは樹状突起分枝を改善し、樹状突起棘長を増加させる
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ処置の樹状突起への効果を評価する。トランスジェニックｍｅｃｐ２ノックアウトマウス（ｎ＝１５から２０）にｃＧ−２−アリルＰを腹腔内２０ｍｇ／ｋｇの用量で、１日１回投与する。９週間後に屠殺に続いて樹状突起棘密度、棘長さおよび分枝を下の表５に従ってゴルジ染色後に検討する。
【０２２８】
【表５】
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【０２２９】
樹状の長さを生理食塩水（３匹の別々のマウスからニューロン３個を分析した、ｎ＝９）またはｃＧ−２−アリルＰ（２０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．１／日、４週から；３匹の別々のマウスからニューロン３個を分析した、ｎ＝９）のいずれかで処置した９週齢の雄ｍｅｃｐ２ヌル変異マウス由来の代表的な海馬ＣＡ１ニューロンの神経細胞体からの距離によって評価する。
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰが樹状の分枝を改善し、樹状突起棘長さを増加させることを観察している。μｍでの樹状の長さ（垂直軸）を細胞の神経細胞体からの距離（μｍで；水平軸）に対してプロットする。神経細胞体に近い樹状突起を有する細胞について、樹状突起は短い。しかし、神経細胞体からの距離が増加すると、生理食塩水処置は神経細胞体から最大約７０μｍの距離まで増加し、神経細胞体からさらに遠い距離で低下する樹状の長さを産生する。対照的に、ｃＧ−２−アリルＰ（塗りつぶした四角）での処置は、神経細胞体からの距離の範囲を超えるより長い樹状突起を産生する。
【０２３０】
（例２１）
マウスＩＩにおけるレット症候群の処置：マウス交配および遺伝子型判定
ＭｅＣＰ２生殖系列ヌル対立遺伝子マウスを使用する（Chen et al., 2001）。遺伝子型判定をＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（Chen et al., 2001）のとおり実施する。
ｃＧ−２−アリルＰ処置
生存測定、夜行性活性分析および免疫ブロット分析について、Ｎｅｕｒｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄによって供給されたｃＧ−２−アリルＰを腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ、ビヒクル＝生理食塩水、０．０１％ＢＳＡ）を介して投与する。処置をＰ１５に開始し、実験の経過中ずっと維持する。それらを急性切片調製のために使用する場合、細胞内生理学実験のためにマウスにｃＧ−２−アリルＰ（２０ｍｇ／ｋｇ体重、ビヒクル＝生理食塩水、０．０１％ＢＳＡ）を２週間毎日、Ｐ１５からＰ２８〜Ｐ３２注射する。光学的画像化実験のためにマウスの眼瞼縫合の日から画像化の日まで毎日ｃＧ−２−アリルＰ（２０ｍｇ／ｋｇ体重、ビヒクル＝生理食塩水、０．０１％ＢＳＡ）を注射する。
【０２３１】
切片生理学調製
感覚運動皮質のまたは近くの冠状セクション（厚さ３００μｍ）を、Ｖｉｂｒａｔｏｍｅを使用して＜４℃  ＡＣＳＦで切る。切片化後に切片を３７℃で２０分間インキュベートし、残りの実験は室温においてである。切片をＷａｒｎｅｒチャンバーに移し、記録を５層に位置付けられた目視同定した錐体ニューロンから取る。１２６ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ3、１ｍＭ  ＮａＨＰＯ4、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ4、２ｍＭ  ＣａＣｌ2および１４ｍＭブドウ糖を含有する人工脳脊髄液（ＡＣＳＦ）を、３１５〜３２０ｍＯｓｍおよびｐＨ７．４に調整し、９５％Ｏ２／５％ＣＯ2を通気する。細胞内ピペット溶液は、１００ｍＭグルコン酸カリウム、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、４ｍＭ  ＭｇＡＴＰ、０．３ｍＭ  ＮａＧＴＰおよび１０ｍＭ  Ｎａ−クレアチンリン酸を含有する。
【０２３２】
細胞内ホールセル記録
ホウケイ酸ピペット（３〜５ΜΩ、ＷＰＩ）をＳｕｔｔｅｒ  Ｐ−８０  ｐｕｌｌｅｒ（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して引く。細胞をアクロプラン（Ａｃｈｒｏｐｌａｎ）４０×水−液浸レンズを赤外線ＤＩＣ光学装置（Ｚｅｉｓｓ）で使用して視覚化し、ビデオモニターに映した赤外線カメラ（浜松）で検出する。ＢＮＣ−２１１０コネクターブロックおよびＭ−Ｓｅｒｉｅｓ  ｄｕａｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｃａｒｄ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）に繋いだＭｕｌｔｉｃｌａｍｐ  ７００Ｂ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、Ｍａｔｌａｂ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓ．）に書き込まれた特注の取得およびリアルタイム分析ソフトウェアによって実験を進めた。ギガシール（Ｇｉｇａｓｅａｌ）および破裂が達成され、ホールセル記録を低レベルのリークおよび直列抵抗について継続的に確認する。各記録について、５ｍＶ試験パルスを入力および直列抵抗を測定するために電圧固定で約１０回印加する。次いで電流固定で約１０パルス（５００ｍｓ、１０ｐＡ増大で４０〜１４０ｐＡ）を惹起された発火頻度および細胞易興奮性を定量するために印加する。アクセス抵抗、リークおよび細胞内在性易興奮性が群にわたって一致していることを確認する。最終的に、−６０ｍＶでの電圧一定下での自発的ＥＰＳＣを１０ｋＨｚおよび低域通過フィルターでの１ｋＨｚでサンプリングする。分析をＭａｔｌａｂに書かれたカスタムソフトウェアパッケージを使用して、すべての事象を自動化閾値により検出し、各事象を実験者によって個々に盲検的に確認して実施する。
【０２３３】
ゴルジ染色
Ｐ２８マウス由来の試料（＜１ｃｍ）を１０％ホルマリンおよび３％重クロム酸カリウム中で２４時間固定する。次いで組織を２％硝酸銀中、２日間、暗所、室温に移す。次いでこれらの試料からのセクションを蒸留水中に厚さ５０μｍに切る。運動皮質に対応するセクションをスライドにマウントし、１０分間空気乾燥し、次いで９５％アルコール、１００％アルコールおよびキシレンでの連続的リンスで脱水し、次いでカバーガラスでシールする。画像をｌ０倍（ホールセル）および１００倍（棘画像）でＺｅｉｓｓ  Ｐａｓｃａｌ  ５  Ｅｘｃｉｔｅｒ共焦点顕微鏡を使用して取得する。
【０２３４】
内在性シグナルの光学的画像化
成体（＞Ｐ６０）野生型（ＳＶＥＶまたはＢＬ６）およびＭｅＣＰ２（＋／−）変異雌（ＢＬ６）をこの実験のために使用する。野生型対照群は、ＭｅＣＰ２＋／−雌の野生型同腹仔または野生型同年齢のＳＶＥＶ雌の両方からなる。単眼除去のために、動物をアベルチン（０．０１６ｍｌ／ｇ）で麻酔し、一眼の眼瞼を４日間縫合する。画像化の前に縫合を除去し、遮断した眼を再び開ける。遮断縫合糸が未変化であり、遮断した眼の状態が健康であると考えられる動物だけを画像化セッションのために使用する。ｃＧ−２−アリルＰのシグナル伝達活性化について、ｃＧ−２−アリルＰを含有する溶液を遮断期の間ずっと毎日腹腔内に（ＩＰ）注射する。画像化セッションのためにマウスをウレタン（１．５ｇ／ｋｇ；全投与量の２０％を各２０〜３０分間で最終投与までＩＰで投与し、１％クロルプロチキセン（ｃｌｏｒｏｐｒｏｔｈｉｘｅｎｅ）０．０２ｍｌも初回投与と共に注射する）で麻酔する。頭蓋を露出させ、カスタムメイドプレートを、移動を最小化させるために頭に接着する。頭蓋をドレメルドリルで、Ｖ１で薄くし、生理食塩水（１．５％）中のアガロース溶液およびカバーガラスで覆う。画像化セッションの間、動物に常に酸素供給し、その体温は加温毛布で維持し、眼を定期的にシリコン油で処置し；生理的条件を常にモニターする。麻酔したマウスをいずれかの眼、単眼に示される定期的刺激を表示するモニターの前に置く；刺激は、大きさ９°ｘ７２°の垂直または水平に横滑りする白色バーからなり、均一に灰色のバックグラウンド上を９秒／周期で横滑りする。頭蓋表面を赤光（６３０ｎｍ）で照らし、輝度の変化を２５分間の各刺激セッション中にＣＣＤカメラ（Ｃａｓｃａｄｅ  ５１２Ｂ、Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって１５フレーム／秒の速度で捕捉する。経時的高域通過フィルター（１３５フレーム）を遅いシグナル雑音を除去するために用い、その後シグナルを、各ピクセルで刺激周波数に対応する経時的高フーリエ変換（ＦＦＴ）構成成分を抽出するためにコンピューター処理する。ＦＦＴ振幅を各眼に視覚的に惹起した応答の強度を測定するために使用する。眼球優位性指標は、ＯＤＩ＝（Ｒｃｏｎｔｒａ−Ｒｉｐｓｉ）／（Ｒｃｏｎｔｒａ＋Ｒｉｐｓｉ）として各ピクセルでの各眼の応答（Ｒ）に由来する。両眼帯は、画像化された半球に同側性の眼の刺激によって活性化される領域として定義される。
【０２３５】
心拍数測定
リアルタイム心臓脈拍数を尾クリップセンサー（Ｍｏｕｓｅ  ＯＸ  Ｏｘｉｍｅｔｅｒ−Ｏａｋｍｏｎｔ、ＰＡ）を使用して測定する。マウスは麻酔せず、フィットしたオープンプラスチックチューブに物理的に拘束する。記録セッションの前に、馴化させるために、チューブを、実験動物を飼っているケージに一晩置く。記録期を通じて体温を約８２〜８４°Ｆに維持する。本発明者らは、各マウスについて１５分間、３試行を記録する。マウスは、８週齢で、Ｐ１５からビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰで処置される。
【０２３６】
夜行性活性測定
自発的な運動活性を赤外線ビーム活性化移動モニタリングチャンバー（Ｏｐｔｏ−Ｖａｒｉｍａｘ−ＭｉｎｉＡ；Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｏｈｉｏ）を使用することによって測定する。各実験についてマウスをチャンバーに記録開始の少なくとも３時間前に置く。移動を通常の１２時間暗周期（午後７時から午前７時）の間モニターする。１時点当たり動物１匹当たり１暗周期を取得する。
【０２３７】
結果
ｃＧ−２−アリルＰ処置がＲＴＴ疾患の主要な特性の発達に影響を与えるかどうかを試験するために、２週齢の変異動物にそれらの一生にわたって毎日腹腔内注射する。次いでシナプス生理学、シナプス分子組成および皮質可塑性の測定を下に記載のとおり、心拍数、自発運動活性レベルおよび寿命などの健康関連測定と共に行う。
【０２３８】
ＭｅＣＰ２変異マウスのシナプス生理学におけるｃＧ−２−アリルＰの効果
近年の研究は、ＭｅＣＰ２−／ｙマウスの複数の脳領域にわたるニューロンが自発的活性における広範な低減を示し（Chang et al., 2006、Chao et al., 2007、Dani et al, 2005、Nelson et al, 2006）、表現型はＢＤＮＦの過発現によって救済される（Chang et al, 2006）ことを報告している。同様にＩＧＦ１誘導体の急性適用は、ラット海馬培養物において惹起された興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）振幅を４０％上昇させることが示されている（Ramsey et al., 2005、Xing et al., 2007）。ＭｅＣＰ２−／ｙ生理学的表現型を救済するｃＧ−２−アリルＰの有効性を試験するために、本発明者らは急性脳切片において細胞内ホールセル記録を取得し、５層皮質ニューロンにおいて興奮性シナプスドライブ（自発的ＥＰＳＣ振幅および周波数）を測定する。ここで−／ｙ動物から記録されたＥＰＳＣは、野生型動物において測定されたＥＰＳＣと比較して振幅において顕著に低減している。傾向は、ｃＧ−２−アリルＰで処置されたＭｅＣＰ２−／ｙ動物から記録されたＥＰＳＣにおいて部分的に逆転しており、ビヒクルで処置されたＭｅＣＰ２−／ｙマウスからのＥＰＳＣよりも振幅において顕著に大きい。これらの差異は、細胞にわたって平均化する場合にも見られる。これらの測定を通じて、アクセス抵抗、リーク、および細胞内在性易興奮性は、群にわたって一致していることも確認されている。ＥＰＳＣ間隔を定量することは、野生型とＭｅＣＰ２−／ｙ動物との間のＥＰＳＣ事象（ＥＰＳＣ周波数の低減）間の間隔においてわずかな増加を示している（Ｐ＝０．０４、コルモゴロフ−スミノフ検定）。本発明者らは、ＭｅＣＰ２−／ｙマウスの皮質細胞における興奮性シナプスドライブの低減、およびｃＧ−２−アリルＰ処置後のその部分的救済は、この領域におけるシナプス介在性興奮性伝達の強さにおける変化の結果としての、ＥＰＳＣ振幅における変化に部分的によることを見出している。
【０２３９】
ｃＧ−２−アリルＰ処置は皮質棘成熟を刺激する。
本発明者らは、ニューロンを低密度で明確に標識するためにゴルジ染色を使用し、標識細胞中の樹状突起棘密度および形態を測定するために高分解能共焦点画像化を適用し、分析を、臨界期マウス（Ｐ２８）由来の運動皮質のセクションにおける層状５錐体ニューロンに制限する。
低倍率画像が錐体細胞の樹状突起の程度を明らかに描写している一方で、本発明者らはシナプス接触を計数し、各棘の形態学的クラスを決定するために高倍率を使用する。本発明者らは、大きくて球状（「マッシュルーム」、Ｍ）、短くてずんぐりしている（「ずんぐりしている」、Ｓ）、短くて薄い（「薄い」、Ｔ）または糸状仮足（Ｆ）として棘を分類する。単位枝当たりの棘の密度の比較は、ノックアウトニューロンにおける棘密度の減少傾向を示しており、処置を受けたノックアウトでは大きく回復している。
【０２４０】
本発明者らは、続くＧ−２−ＭｅＰＥの投与で処置できる様式での興奮制伝達における機能性欠陥を支持する、ノックアウトにおける樹状接触の数および成熟状態における欠損の可能性を見出している。
成体ＭｅＣＰ２＋／−マウスにおける眼球優位性（ＯＤ）可塑性はｃＧ−２−アリルＰによって低減する。
ＯＤ可塑性における発育変動は、ＩＧＦ−１経路の活性化によって部分的に制御され、（１−３）ＩＧＦ−１の投与は野生型若年マウスにおいてＯＤ可塑性を低減できる（Tropea et al., 2006）。したがって本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰ処置が成体ＭｅＣＰ２変異体において観察されるＯＤ可塑性の延長を安定化できるかどうかを試験する。雌ＭｅＣＰ２＋／−マウス、年齢Ｐ６０以上で単眼を４日間遮断し、同時にｃＧ−２−アリルＰで処置する。ｃＧ−２−アリルＰ処置は、成体Ｍｅｃｐ２＋／−マウスにおいてＯＤ可塑性を低減し、確実にＧ−２−ＭｅＰＥがシナプス安定化または成熟化を急速に誘導できることを示している。
【０２４１】
ＭｅＣＰ２−／ｙマウスにおける徐脈はｃＧ−２−アリルＰによって処置される。
神経生理学的症状を回復させることにおけるｃＧ−２−アリルＰの有効性を検討することに加えて、本発明者らは生物の全体的な健康へのその効果を特徴付けることを目指している。臨床的および実験的証拠は、レット症候群患者における不安定な呼吸リズムおよびベースライン心臓の迷走神経緊張の低減などの自律神経系機能障害を示している（Julu et al., 2001）。交感神経系を通じて血圧恒常性を制御しているフィードバック機構の調節不良、例えば心拍数の過換気誘発減少は、レット症候群患者において一般的であり、重篤な不整脈を生じる場合がある（Acampa and Guideri, 2006、Julu et al., 2001）。
【０２４２】
心臓自律神経障害の病態形成は、十分に理解されていないが、脳幹での未成熟ニューロン連結が原因である可能性があることを示唆している。ＭｅＣＰ２−／ｙマウスにおける心拍数異常性およびｃＧ−２−アリルＰ処置の効果を検討するために、本発明者らはビヒクルまたはｃＧ−２−アリルＰで処置した非麻酔野生型およびＭｅＣＰ２−／ｙ動物においてリアルタイム心臓脈拍数をモニターする。野生型マウスは、１分間当たりおよそ７５０回を中心とする心拍数測定値の規則的分布を示している。対照的にＭｅＣＰ２−／ｙマウスは、さらに低い平均速度を示して、さらに不規則な心拍数を示し、その発生率は、ｃＧ−２−アリルＰでの処置後に顕著に低減する。
【０２４３】
ｃＧ−２−アリルＰ投与は自発運動活性および寿命を改善する。
ＭｅＣＰ２−／ｙマウスは、４〜６週齢でレット様症状を発症し、それらは進行性で嗜眠性になり、歩行失調を発症し、１０から１２週齢の間で死ぬ（Chen et al., 2001）。ベースライン自発運動活性も、ケージ内のエリアでの夜間の赤外線ビーム交差事象を計数することによって６週後のマウスで記録する。ＭｅＣＰ２ノックアウトマウス（ＫＯ）は、野生型マウス（ＷＴ）と比較して著しく低減した自発運動活性レベルを示すが、ｃＧ−２−アリルＰ（ＫＯ−Ｔ）での処置はこれらのレベルを上昇させる。
最終的に、ＭｅＣＰ２  ＫＯ同腹仔と比較して、ｃＧ−２−アリルＰで処置したＭｅＣＰ２−／ｙマウスも平均余命における増加を示す。
【０２４４】
本発明者らは、海馬におけるニューロン神経細胞体サイズへのｃＧ−２−アリルＰ処置の効果も測定する。マウスを上に記載のとおり自発運動活性についてｃＧ−２−アリルＰで処置する。海馬のＣＡ３領域におけるニューロンでの神経細胞体サイズは、野生型動物と比較してＭｅＣＰ２  ＫＯ動物において顕著に損なわれている。ｃＧ−２−アリルＰ処置は、ＫＯ動物において平均神経細胞体サイズを増加させるが、野生型動物における神経細胞体サイズにはほとんどまたは全く効果を有さない。
【０２４５】
（例２２）
マウスにおけるレット症候群での生存への経口ｃＧ−２−アリルＰの効果
レット症候群が慢性の運動技能の消失を含む衰弱障害であることから、容易に投与される調製物を使用してレット症候群を処置することは望ましい。この目的のために本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰおよび関連化合物の予測外に有益な治療的および薬物動態学的特性を利用できる（米国特許第７，７７６，８７６号および第８，０６７，４２５号）。
【０２４６】
したがって本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰを経口でＭｅＣＰ２欠損マウスに投与する。簡潔には、ｃＧ−２−アリルＰの薬学的有効量（動物１匹当たり２０または８０ｍｇ／ｋｇ）を含有する水性溶液または他の組成物を毎日投与する。対照ＭｅＣＰ２欠損動物には本発明者らは生理食塩水だけを投与し、野生型動物を設計に類似しているベースラインデータを得るために使用する。
野生型動物では、生存は各時点で１００％であると定義される。ＭｅＣＰ２欠損動物では生存は、実質的に減少している。しかしＭｅＣＰ２欠損マウスへのｃＧ−２−アリルＰの経口投与後、生存は実質的に増加する。
【０２４７】
（例２３）
マウスにおけるレット症候群での発作（Ｓｅｉｚｕｒｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ）へのｃＧ−２−アリルＰの効果
発作が顕著で、危険で治療困難なレット症候群の態様であることから、本発明者らはＭｅＣＰ２欠損動物における発作へのｃＧ−２−アリルＰの効果を判定する。
【０２４８】
生理食塩水またはｃＧ−２−アリルＰのいずれかで処置した野生型マウスおよびＭｅＣＰ２欠損マウスの脳波記録を、参照として全体を組み込む米国特許第７，７１４，０２０号に記載の方法を使用して得る。
本発明者らは、Ｇ−２ＭｅＰＥが運動発作および非けいれん性発作の両方を減少させることに有効である可能性があることを見出している。
【０２４９】
結論
ｃＧ−２−アリルＰは、レット症候群を有するヒトを処置するための効果的な治療法である可能性がある。さらに、ｃＧ−２−アリルＰが天然に存在する化合物（（１−３）ＩＧＦ−１；グリシルプロリルグルタミン酸またはＧＰＥ）よりも予測外に長い半減期を有することから、本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰの使用は、ＧＰＥを含む他の薬理学的薬剤を超える明確で実質的な有利点を有することを見出している。
【０２５０】
例えばｃＧ−２−アリルＰは、静脈内、皮下、脳室内、または非経口で送達される必要はない。実際に、マイクロ乳液、粗乳液、液体結晶調製物、ナノカプセルおよびハイドロゲルを含む経口製剤を、神経学的機能を改善でき、神経変性状態を処置できる錠剤、カプセルおよびゲルなどの経口で投与される調製物の製造において使用できる。本発明の化合物は、錠剤またはカプセルを飲むために必要である患者の運動機能が低い状況で使用できる。化合物の経口投与のための可溶性ゲルのいくつかの種類があり、これらは、本発明の化合物または組成物を患者に送達するために使用できる。ｃＧ−２−アリルＰが経口で容易に投与でき、レット症候群を含む神経変性障害を処置することに経口で有効であることから、本発明者らはｃＧ−２−アリルＰがレット症候群を有する患者の長期治療のために簡便で有益である可能性があると結論付けている。
【０２５１】
さらにレット症候群が鍵となる特性を他の自閉スペクトラム障害と共有していることから、本発明の化合物は、他のＡＳＤを有する動物から、ならびに自閉症、アスペルガー症候群、小児期崩壊性障害および他に規定されない広汎性発達障害（ＰＤＤ−ＮＯＳ）を有するヒトにおいて治療的有効性を提供することにおいて有用である可能性がある。
【０２５２】
（例２４）
ＡＳＤの処置
ＡＳＤにおける化合物の治療有効性を評価するために使用されているいくつかの動物系がある。
Ｓｈａｎｋ３−欠損マウスモデル
Ｓｈａｎｋ３−欠損マウスを研究においてＡＳＤに関連する２２ｑ１３欠失症候群のモデルとして使用する。
【０２５３】
２２ｑ１３欠失症候群は、Ｓｈａｎｋ３遺伝子における欠失または変異に関連する（Bonaglia et al, 2006）。Ｓｈａｎｋ３遺伝子は、グルタミン酸シナプスにおいてフレームワークを形成するマスタースキャホールディングタンパク質をコードしている（Boeckers et al, 2006）。Ｓｈａｎｋ３は、シナプス後密度（ＰＳＤ）のコアの欠かせない部分であり、α−アミノ−３−ヒドロキシル−５−メチル−４−イソキサゾル−プロピオン酸（ＡＭＰＡ）、代謝型グルタミン酸（ｍＧｌｕ）およびＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）グルタミン酸受容体の構成成分ならびに細胞骨格系構成成分を含むＰＳＤへおよびシナプスへ多数の鍵となる機能性構成要素を動員する。２２ｑ１３欠失／Ｓｈａｎｋ３変異の割合を探索する近年の研究は、Ｓｈａｎｋ３のハプロ不全がＡＳＤ症例の０．５％から１％の頻度でＡＳＤの一遺伝子性形態を生じる場合があることを示唆している（Durand et al, 2007、Moessner et al, 2007、Gauthier et al, 2008）。
【０２５４】
全長Ｓｈａｎｋ３の発現の破壊を有するマウスモデルの生成は、当技術分野において既に記載されている（Bozdagi et al., Molecular Autism 2010, 1 :15, p4）。簡潔には、Ｂｒｕｃｅ４  Ｃ５７ＢＬ／６胚性幹細胞をエクソン４およびエクソン９の前に挿入されたｌｏｘＰ部位を有するマウス系統を生成するために使用した。ｌｏｘＰが導入された対立遺伝子を切り出し、エクソン４から９の欠失、すなわちＳｈａｎｋ３のアンキリン反復ドメインの完全な欠失を伴って系統を維持した。野生型（＋／＋）ヘテロ接合性（＋／−）およびノックアウト（−／−）マウスをヘテロ接合体−ヘテロ接合体交雑からメンデルの頻度で産生した。全長Ｓｈａｎｋ３  ｍＲＮＡの５０％低減をヘテロ接合体（ｑＰＣＲ）において、およびＳｈａｎｋ３タンパク質の発現の低減を確認した（Ｓｈａｎｋ３抗体Ｎ６９／４６での免疫ブロット法による）。
ヘテロ接合体を有する野生型マウスとの交雑によって生成されたヘテロ接合性マウスを２２ｑ１３欠失症候群の原因となるＳｈａｎｋ３のハプロ不全のモデルを最良としてこの例において使用する。
【０２５５】
方法
薬物処置
１から３月齢野生型およびヘテロ接合性Ｓｈａｎｋ３欠損マウスを４処置群：プラセボ処置野生型、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３欠損群および２つのＳｈａｎｋ３欠損ｃＧ−２−アリルＰ処置群に分ける。動物にプラセボ（水）または水中に製剤化したｃＧ−２−アリルＰを経口投与で、１４日間にわたり１日２回与える。ｃＧ−２−アリルＰを２用量：１５または６０ｍｇ／ｋｇ投与する。
方法論
方法論の詳細な記載はBozdagi et al. (Molecular Autism 2010, 1: 15）において見出すことができる。
【０２５６】
行動分析
行動評価は、いくつかの時点で行われ、Ｂｏｚｄａｇｉ  ｅｔ  ａｌによって記載された方法論による社会的相互作用および超音波の社会的コミュニケーションの分析を含む。簡潔には、各処置群における雄雌間の社会的相互作用を評価する。対象雄は集団で飼育し、清潔なわらを有する清潔なケージにおいて個々に試験される。各試験セッションは５分間継続する。対象マウスそれぞれを様々な見慣れない発情Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌と組み合わせる。デジタル閉回路テレビカメラ（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、Ｓｅｃａｕｃｕｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）をケージから水平に３０ｃｍに位置付ける。超音波マイクロフォン（Ａｖｉｓｏｆｔ  ＵｌｔｒａＳｏｕｎｄＧａｔｅコンデンサーマイクロフォンカプセルＣＭ１５；Ａｖｉｓｏｆｔ  Ｂｉｏａｃｏｕｓｔｉｃｓ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）をケージの上２０ｃｍに置く。マイクロフォンのサンプリング周波数は２５０ｋＨｚであり、分解能は１６ビットである。使用した装置は、雄対象と雌パートナーとによって発せられる鳴き声を区別できないが、マウスでの雄雌間の相互作用の際の鳴き声の圧倒的多数は、通常雄によって発せられる。装置全体は、単一の２５ワット赤光源によって照らされる減音環境チャンバー（ｓｏｕｎｄ−ａｔｔｅｎｕａｔｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｃｈａｍｂｅｒ）（ＥＮＶ−０１８Ｖ；Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ  Ａｌｂａｎｓ、ＶＴ、ＵＳＡ）に含まれる。次に雄対象からのビデオは、対象の遺伝子型および処置群を知らされていない調査者によって、Ｎｏｌｄｕｓ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｌｅｅｓｂｕｒｇ、ＶＡ、ＵＳＡ）を使用して、鼻をつきあわせる臭い嗅ぎ行動、鼻で肛門性器部の臭いを嗅ぎ行動および他の身体領域の臭いを嗅ぐ行動の測定についてスコア化される。超音波発声を、遺伝子型／処置群情報に盲検の２名の高度に訓練された調査者によって手作業で同定し、略式の統計をＡｖｉｓｏｆｔパッケージを使用して算出する。評定者間信頼性は９５％である。データを独立スチューデントのｔ検定を使用して分析する。
【０２５７】
嗅覚馴化／脱馴化試験を各群について雄および雌マウスにおいて実施する。方法は既に記載されている（Silverman et al 2010、Yang et al 2009およびSilverman et al 2010）。非社会的および社会的臭いは、次の順で、すなわち水、水、水（蒸留水）；アーモンド、アーモンド、アーモンド（１：１００希釈のアーモンド抽出物）；バナナ、バナナ、バナナ（１：１００希釈の人工バナナ香料）；社会的１、社会的１、社会的１（見慣れない性別が一致するＢ６マウスを飼っているケージの底から拭った）；および社会的２、社会的２、社会的２（見慣れない性別が一致する１２９／ＳｖＩｍＪマウスの異なる群を飼っている第２のケージの底から拭った）で、ホームケージに連続的にそれぞれ２分間挿入された一連の綿棒によって提示される。一元配置反復測定ＡＮＯＶＡを馴化事象の各セットおよび各脱馴化事象について各処置群内で実施し、チューキーの事後検定が続く。
【０２５８】
海馬切片電気生理学
死後に、急性海馬切片（３５０μｍ）を、組織チョッパーを使用してマウスから調製する。切片を維持し、実験を３２℃で実行する。切片を：ＮａＣｌ、１２５．０；ＫＣｌ、２．５；ＭｇＳＯ4、１．３；ＮａＨ2ＰＯ4、１．０；ＮａＨＣＯ3、２６．２；ＣａＣｌ2、２．５；グルコース、１１．０を（ｍＭで）含有するリンゲル溶液で灌流する。リンゲル溶液を９５％Ｏ２／５％ＣＯ２、３２℃で、細胞外記録の際に通気する（電極溶液：３Ｍ  ＮａＣｌ）。切片を奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）のベースラインの確立の１時間前に維持し、エリアＣＡ１における放射状層から記録し、シェファー側枝交連求心神経（Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ−ｃｏｍｍｉｓｓｕｒａｌ  ａｆｆｅｒｅｎｔｓ）のエリアＣＡ３に置かれた双極性タングステン電極での刺激（３０秒ごとに１００μｓパルス）によって惹起する。試験刺激強度は、ｆＥＰＳＰを最大応答の半分である振幅で得られるように調整する。ＥＰＳＰ初期スロープ（ｍＶ／ｍｓ）を４個の連続する応答の平均波形から決定する。入出力（Ｉ／Ｏ）曲線を低Ｍｇ2+（０．１ｍＭ）溶液中のｆＥＰＳＰスロープ対線維斉射振幅をプロットすることによって生成する。ＡＭＰＡ受容体介在およびＮＭＤＡ受容体介在Ｉ／Ｏ関連をイオンチャネル型グルタミン酸受容体アンタゴニスト：２−アミノ−２−ホスホノペンタン酸ＡＰＶ（５０μΜ）および６−シアノ−７−ニトロキノキサリン−２，３−ジオンＣＮＱＸ（１００μΜ）の存在下で測定する。二連発刺激応答を１０から２００ｍｓの刺激間間隔で測定し、第２の刺激パルスの第１の刺激パルスに対する平均応答の比として表す。
【０２５９】
ＬＴＰは、対照および遺伝子改変マウスに対して、高周波刺激によって（４回の１００Ｈｚ、１秒刺激は５分間離された）、またはシータバースト刺激（ＴＢＳ）（２００ｍｓ離された１００Ｈｚでの４回のパルスの１０回バースト）によって、または単一の１００Ｈｚ刺激によってのいずれかによって誘導される。長期抑うつ（ＬＴＤ）を誘導するために、シェファー側枝を低周波または二連発低周波刺激（１Ｈｚでの９００パルス、１５分間）で刺激し、ｍＧｌｕ受容体依存性ＬＴＤを誘導する。データを平均±ＳＤとして表し、統計解析を０．０５のαレベルでの有意設定で分散の分析（ＡＮＯＶＡ）またはスチューデントのｔ検定を使用して実施する。
【０２６０】
結果
行動的
雄試験対象による社会的臭い嗅ぎ行動合計の累積的持続時間は、プラセボ処置野生型群においてよりもプラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群において低下している。付加的に、雄雌間の社会的相互作用の際により少ない超音波発声が野生型対照よりもプラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群によって発せられる。
【０２６１】
２匹のＳｈａｎｋ３−欠損群におけるｃＧ−２−アリルＰ処置は、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群と比較して、社会的臭い嗅ぎ行動の合計の累積的持続時間における顕著な増加を生じる。さらにｃＧ−２−アリルＰ処置群は、プラセボ処置変異群よりも増加した超音波発声の回数を示している。
嗅覚馴化／脱馴化研究は、マウスが社会的誘引物質を検出でき、４群すべてが正常レベルの馴化（連続して３回の同じ臭いを嗅ぐ行動に費やした時間の減少によって示される）および予測される脱馴化（異なる臭いを嗅ぐ行動に費やした時間の増加によって示される）を示すことを確認することを意図した。
【０２６２】
電気生理学
興奮性シナプス後場電位（ｆＥＰＳＰ）スロープ対刺激強度をプロットすることは、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群対対照群でのＩ／Ｏ曲線における低下を実証している。ヘテロ接合性プラセボ処置群において本発明者らは、ＡＭＰＡ受容体介在場電位における減少も観察し、野生型対照群と比較してＩ／Ｏ関数の平均スロープにおける５０％減少を反映している。対照的にシナプスＮＭＤＡ受容体機能を測定するために競合的ＡＭＰＡ／カイニン酸（ｋｉａｎａｔｅ）受容体アンタゴニストＣＮＱＸの存在下でＩ／Ｏ関連を分析する場合、野生型とプラセボ処置ヘテロ接合性群の間に差異はない。これらの結果は、Ｓｈａｎｋ３ヘテロ接合性マウスでのＡＭＰＡ受容体介在基底伝達における特異的低減を示している。
【０２６３】
ｃＧ−２−アリルＰ処置は、両方のヘテロ接合性群においてＡＭＰＡ受容体介在場電位を標準化し、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群と比較してＩ／Ｏ関数の平均スロープにおける増加を生じる。
プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群におけるＬＴＰの維持は、野生型対照と比較して明白に損なわれている。ＴＢＳ  ＬＴＰ試験（２００ｍｓ離された１００Ｈｚでの４回のパルスの１０回バースト）もプラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群におけるＴＢＳ後６０分での増強において顕著な減少を示している。ＬＴＰで観察された変化したシナプス可塑性とは対照的に、長期抑うつ（ＬＴＤ）は、変異群において顕著に変化していなかった。ｃＧ−２−アリルＰ処置は、プラセボ処置Ｓｈａｎｋ３−欠損群と比較して、海馬性長期増強（ＬＴＰ）およびその維持を両方のＳｈａｎｋ３−欠損群において増加させる。
【０２６４】
考察および結論
社会的適応力の乏しさおよび反復行動は、ＡＳＤのすべての形態の一般的特性および鍵となる診断目安である。知能発達遅延および言語技能の未発達もアスペルガー症候群を除くすべてのＡＳＤにおいて存在する一般的特性である。
上に記載の動物モデルは、臨床的ヒト状態に類似の症状を提示するとして当技術分野において認められている。上に記載のすべての変異モデル（ＮＬＧＮ３、ＮＬＧＮ４、ＣＡＤＭ１、ＮＲＸＮ１、ＦＭＲ１、ｓｈａｎｋ３）は、社会的技能の障害または社会的不安の増加を表す。海馬への興奮性伝達の減少は、ＮＲＸＮ１、ｓｈａｎｋ３、ＭｅＣＰ２およびＦＭＲ１変異動物モデルにおいて同定されている。現在、ＡＳＤの多起源または他因子性モデルは、記載されていない。上に記載の動物モデルは、ヒト集団においてＡＳＤを生じることが周知である遺伝子欠陥に基づいており、ＡＳＤ治療の有効性を試験する最良の機会を提供する。
【０２６５】
したがってＡＳＤの動物モデルにおけるｃＧ−２−アリルＰの有効性は、ＡＳＤを罹患しているヒト対象におけるその有効性の合理的な予測である。
【０２６６】
（例２５）
ＦＸＳマウスリンパ球のリン酸フローサイトメトリー分析によるシグナル伝達タンパク質リン酸−ＥＲＫ１／２およびリン酸−Ａｋｔの測定
シグナル伝達経路は外部刺激を細胞応答に関連付け、通常、細胞増殖、死および分化を制御する。本発明者らは、ＥＲＫ１／２およびＡｋｔに対する、それらがリン酸化された場合にだけこれらのタンパク質を認識するリン酸特異的抗体を使用する。フローサイトメトリーの１つの独特の特性は、標準的生化学技術によって得られたのではないリン酸化状態の測定を実施するその能力であり、これは薬物処置効果を研究するために広い可能性を明らかに有している。
【０２６７】
方法
リンパ球を５匹のｆｍｒ１ノックアウトおよび５匹の野生型同腹仔対照マウスからｃＧ−２−アリルＰの注射後に研究時ごとに単離する。リンパ球を２個のシグナル伝達エフェクター、ｐ−ＥＲＫ１／２およびｐ−Ａｋｔの活性化について、フローサイトメトリー（リン酸フロー）による活性化の目安としてリン酸化状態を使用して検討する。
取った測定値は：
１．リンパ球での総フローサイトメトリー合計およびリン酸化ＥＲＫ
２．リンパ球での総フローサイトメトリー合計およびリン酸化ＡＫＴ
結果
本発明者らは、ｆｍｒ１ノックアウトマウスから単離されたリンパ球がＥＲＫ１／２およびＡｋｔリン酸−エピトープの活性化を示すことを見出している。ｃＧ−２−アリルＰで処置したｆｍｒ１ノックアウトマウスにおけるｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２についての平均蛍光強度（ＭＦＩ）レベルは、すべての時点において減少している：単回処置１５、３０、６０および２４０分後。本発明者らは、ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいてｃＧ−２−アリルＰ処置の５日後および連続する日でＭＦＩの同様の低減を見出している。
【０２６８】
要約すると、ｃＧ−２−アリルＰは、ｆｍｒ１ノックアウトマウスにおいてＥＲＫ１／２およびＡｋｔのリン酸活性化における顕著な低減を産生する。この結果は、ｐ−ＥＲＫおよびｐ−ＡｋｔがＡＳＤまたはＮＤＤを有するヒトを処置することにおける治療有効性を評価するために有用な生物学的マーカーであることを示している。ｐＥＲＫおよびｐＡｋｔのリンパ球における発現がｆｍｒ１ノックアウトマウスの脳におけるこれらのリン酸化タンパク質の発現に類似していることから、リンパ球における治療効果の観察は、ヒトを含む罹患した動物の脳におけるｃＧ−２−アリルＰの効果の合理的な予測である。
【０２６９】
（例２６）
Ｇ−２−アリルＰを使用する脆弱Ｘ症候群を有するヒトの処置
ｃＧ−２−アリルＰが脆弱Ｘ症候群を有する患者を処置することに有効であるかどうかを判定するために、本発明者らは二重盲検、プラセボ対照研究を実行する。
【０２７０】
方法
患者
脆弱Ｘ症候群を有する男性患者は、全ｆｍｒ１変異を実証する遺伝子解析によって診断される。本明細書で上述の１つまたは複数の臨床評価ツールを使用して症状を評価する。各患者を１つまたは複数の臨床評価ツールによって１つまたは複数の反復行動（ＲＢＢ）、不安および社交性についてスコア化する。４以上の臨床全般印象−重症度（ＣＧＩ−Ｓ）スコア、または３０以上のＡＢＣ合計スコアを登録する。
【０２７１】
薬物送達
登録患者を群に分ける。すべての登録者は、２週間にわたり１日２回、単回盲検投与プラセボで試験を開始する。次いでｃＧ−２−アリルＰを、経口で３５ｍｇ／ｋｇを１日２回（ｎ＝２０）または７０ｍｇ／ｋｇを１日２回（ｎ＝２０）の用量で２８日間投与し、続いて２８日間のプラセボ、またはプラセボに無作為化された場合は、ｃＧ−２−アリルＰを７０ｍｇ／ｋｇを１日２回の用量で４２日目に開始して投与し、７０日目に停止する。研究投薬を調剤する前に、ｃＧ−２−アリルＰを経口投与のための液体を提供するためにイチゴ風味を付けた希釈剤で再構成する。プラセボ（ｎ＝２０）は、イチゴ希釈剤および水である。
【０２７２】
評価
薬物動態学
各群のすべての対象から血液試料を４２日目および７０日目に採取する。四個の（４）試料を開始４２日目に（投与前および投与後２〜４時間）および７０日目（投与前および投与後２〜４時間）に回収する。各時点での予備試料も回収する。
【０２７３】
有効性
有効性を、重症度の臨床全般印象（ＣＧＩ−Ｓ）、改善の臨床全般印象（ＣＧＩ−Ｉ）、脆弱Ｘ症候群評価尺度、臨床医完全脆弱Ｘドメイン特異的懸念（視覚的アナログ尺度）、介護者上位３位懸念（Ｃａｒｅｇｉｖｅｒ  Ｔｏｐ  Ｔｈｒｅｅ  Ｃｏｎｃｅｒｎｓ）（視覚的類似尺度）、異常行動チェックリスト、バインランド適合行動尺度、ＣＡＳＩ−１６、ＣＹＢＯＣＳ−ＰＤＤ、発作日誌、コンピューター化指標追跡、ＫｉＴａｐを使用する認知のコンピューター化測定、および表出言語試料採取課題を使用して判定する。
有効性結果測定
以下の４群の有効性結果測定を、単独および組み合わせたｃＧ−２−アリルＰの２種の投与レベルをプラセボと比較して評価する。
【０２７４】
包括的機能的帰結測定
次の測定をベースラインで、処置の際にならびに活性およびプラセボ群の間で比較した変化で評価する。
脆弱Ｘ症候群評価尺度における変化を各対象について、ベースライン（処置前）１４日目ならびに処置の終了時（４２日目および７０日目）の間で算出する。
包括的結果は、臨床全般印象−重症度および改善尺度（ＣＧＩ−ＳおよびＣＧＩ−Ｉ）によって各来院時に、ベースライン以降から（例えば１４、２８、４２、５６、７０および８４日目測定する。
【０２７５】
臨床医−完全脆弱Ｘドメイン特異的懸念における変化は、視覚的アナログ尺度（ＶＡＳ）を介して捕捉され、各対象についてベースライン（処置前）、１４日目および処置終了時（４２および７０日目）間で算出する。
視覚的類似尺度（ＶＡＳ）を介して捕捉される介護者上位３位懸念（対象の脆弱Ｘ症候群に関する）における変化をベースライン（処置前）、１４日目および処置終了時（４２および７０日目）間で対象において算出する。
ＣＡＳＩ−１６、ＣＹＢＯＣＳ−ＰＤＤ、異常行動チェックリスト（ＡＢＣ）、表出言語試料採取課題およびバインランド適合行動尺度（ＶＡＢＳ）における変化を各対象についてベースライン、１４日目および４２日目および７０日目の間で算出する。
生理学的結果測定
血清レベルならびに標準的血液学および化学パラメータ（甲状腺機能を含む）の変化を７０日目までベースラインから算出する。眼底試験および扁桃腺サイズをベースライン、ならびに１４、２８、４２、５６、７０および８４日目に記載する。フローサイトメトリーを、１４、２８、４２、５６および７０日目に得た血液試料での抹消リンパ球中の酵素ＡｋｔおよびＥＲＫのリン酸化状態を評価するために使用する。ＥＣＧをスクリーニング、ベースライン、２８、４２、５６および７０日目に評価する。
【０２７６】
認知／自動化結果測定
次の測定値をベースライン、薬物投与研究時および研究後に評価する。ＫｉＴａｐを使用する認知のコンピューター化測定を、ベースライン、１４日目、４２日目、７０日目および８４日目に評価する。コンピューター化指標追跡評価をベースライン、１４日目、２８、４２、５６および７０日目に測定する。
薬物動態学的−薬力学的関連
適合した薬物動態学的（ＰＫ）および有効性（ＰＤ）測定値は、無作為に３５ｍｇ／ｋｇまたは７０ｍｇ／ｋｇのｃＧ−２−アリルＰいずれかを経口で１日に２回受けているすべての患者から回収する。薬力学的マーカーは、包括的機能的、生理学的および認知／自動化結果を含む。手法は、研究の経過にわたる有効性測定における変化を評価するためおよびこれらを測定されたまたは算出された薬物動態学的評価項目と相関させるためである。付加的にＰＫ／ＰＤモデルを、必要に応じてｃＧ−２−アリルＰの血液濃度と効果との間の関連を確立するために使用する。
【０２７７】
統計的方法
有効性
ＡＮＯＶＡ、ＡＮＣＯＶＡおよびカイ二乗検定を有効性測定レベルと処置群間の変化を比較するために使用する。各投与群を同時のプラセボ群と比較し、併用投与群を併用プラセボ群と比較する。両側ｐ値＜０．０５を、統計的有意性を示すとみなす。
６０個（４０：２０）の合計試料サイズは、脆弱Ｘ症候群評価尺度などの鍵となる結果測定において８０％検出力を有して統計的に有意（両側α＝０．０５）として検出される、活性とプラセボとの間のエフェクトサイズ＞０．８０を可能にする。各用量群内での比較（すなわち評価時期の比較）のために、活性およびプラセボ内でのエフェクトサイズ＞０．７は、８０％検出力を有して統計的に有意（両側α＝０．０５）として検出される。
【０２７８】
薬物動態学
定常状態での最大濃度（Ｃｍａｘ；ピーク）、最小濃度（Ｃｍｉｎ；トラフ）、Ｃ０−４および曲線下面積（ＡＵＣ）パラメータをｃＧ−２−アリルＰ濃度データから直接算出し、平均、中央値、幾何平均、標準偏差、範囲および９５％信頼区間を含む標準的記述統計学を使用して各時点で要約する。
ＰＫパラメータと有効性測定の間に関連があるかどうかを判定するために、研究の経過にわたる有効性測定における変化を様々な時点で推定されたＰＫパラメータと相関させる。これらの関連を、相関係数および一般的線形モデルを使用して統計的に試験する。
【０２７９】
結果および結論
本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰが患者によって良好な耐用性を示されることを見出している。本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰが本明細書に記載の１つまたは複数の評価ツールを使用して測定される臨床転帰を改善する臨床的に関連する顕著な効果を有することをさらに見出している。本発明者らはｃＧ−２−アリルＰがｐＥＲＫおよびｐＡｋｔレベルを標準化することも見出している。
本研究は、ｃＧ−２−アリルＰがヒトにおける脆弱Ｘ症候群の有害症状を処置することに効果的であることを実証している。
【０２８０】
（例２６）
ラットにおける貫通性弾道様脳損傷後のシナプス可塑性へのｃＧ−２−アリルＰの効果Ｉ：
この例では本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰが貫通性弾道様脳損傷（ＰＢＢＩ）後に抗炎症および抗アポトーシス活性を有するかどうかを調査した。ｃＧ−２−アリルＰに類似する分子構造が、記憶増強効果を有し、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの受動的回避学習を改善し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経突起増殖を促進することを示している。これは、ｃ（ＧＰ）類似物での処置が神経可塑性およびシナプス形成を増強することを示唆している。したがって本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがＰＢＢＩ後にシナプス可塑性を決定する遺伝子およびコードされたタンパク質を制御するかどうかを調査した。
【０２８１】
方法
貫通性弾道様脳損傷（ＰＢＢＩ）
頭部への弾丸または断片創傷傷の弾道学動態を模倣する一側性前頭ＰＢＢＩモデル（Williams, 2005、Williams, 2006）は、右前皮質を通じたカスタムプローブの定位挿入によって誘導された。一時的な腔が、プローブの末端に装着された弾性バルーンの急速な膨張／収縮（すなわち＜４０ｍ秒間）によって形成された。ＰＢＢＩ装置は、コンピューター制御水圧発生装置（Ｍｉｔｒｅ  Ｃｏｒｐ  ＭｃＬｅａｎ、ＶＡ）、ＰＢＢＩプローブおよび、既に記載のカスタム設計プローブホルダーを備えた定位フレームからなる（Lu, 2009、Williams, 2005）。損傷重症度をコンピューター制御の水圧下でのバルーンのサイズによって決定した。０．６３ｃｍ拡大に較正されたバルーン直径は、ラット総脳容積の１０％を表す、すなわち１０％ＰＢＢＩを表す。すべての手術は麻酔下で行った。試験した群は：疑似＋ビヒクル、ＰＢＢＩ＋ビヒクル、ＰＢＢＩ＋ｃＧ−２−アリルＰ（経口経管栄養による３０ｍｇ／ｋｇ、損傷後３０分、および収量まで毎日１回）。すべての手順は、ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ＷＲＡＩＲによって承認された。動物はＡＡＡＬＡＣによって公認された施設で飼った。
【０２８２】
ｃＧ−２−アリルＰの経口投与
ｃＧ−２−アリルＰ（またはビヒクル）を３０ｍｇ／ｋｇの用量で動物に経口経管栄養を介して投与した。
ＥＬＩＳＡ
標的タンパク質をインターロイキン１ベータ（「ＩＬ−１ベータ」）（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧＷＢ−ＳＫＲ１０７）およびインターロイキン−６（「ＩＬ−６」）（ＧｅｎＷａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧＷＢ−ＺＺＤ１００）ＥＬＩＳＡで製造者の説明書に従って定量した。レベルを算出し、ＢＣＡアッセイによって決定した全タンパク質濃度に標準化した（１群当たりｎ＝９〜１０）。
【０２８３】
ウエスタンブロット
試料をすべての群（疑似＋ビヒクル、ＰＢＢＩ＋ビヒクル、ＰＢＢＩ＋ｃＧ−２−アリルＰ）について損傷後２４時間ならびに３および７日で分析した。組織を、ＨＡＬＴプロテアーゼ阻害剤を含有するＲＩＰＡ緩衝液中で均質化した。総タンパク質は、ＢＣＡアッセイに基づいた。ブロットを５％ミルクでブロックし、抗ＡＴＦ３、抗ＢＡＸ、または抗ＢＣＬ２で探索した。ブロットを、タンパク質添加を調節するために抗ベータアクチン抗体で再探索した。バンド強度の分析をＬＡＳ４０００およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔＴＬソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して行った（１群当たりｎ＝９〜１０）。
【０２８４】
神経可塑性ｍＲＮＡアレイ
ｃＤＮＡを生成した。個々の動物由来の総ＲＮＡからランダムプライマーを使用する。ｃＤＮＡをＳＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓによって産生された標的化ＰＣＲアレイに置き、産生物を、ＳｙＢｒ緑色蛍光を使用して検出した。Ｃｔレベルをベータアクチンに標準化した。損傷結果を、相対量（ＲＱ）を評価するために疑似と比較した（１群当たりｎ＝６）。
【０２８５】
結果
ＰＢＢＩ損傷単独では、炎症性およびアポトーシス性測定研究における急性（ＰＢＢＩ後２４時間）増加を導いた。図３３Ａ〜３３Ｆは、これらの結果を示す。ＰＢＢＩは、ＩＬ−１ベータ（図３３Ａ）およびＩＬ−６（図３３Ｄ）の量を増加させた。ｃＧ−２−アリルＰは、炎症誘発性サイトカインＩＬ１−ベータ（図３３Ｃ）およびＩＬ−６（図３３Ｄおよび３３Ｆ）を減少させた。ＡＮＯＶＡ：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１；エラーバー：ＳＥＭ。ｃＧ−２−アリルＰは、ＩＬ−ベータレベルをＰＢＢＩ後３日目に増加させ、その下流標的ＩＬ−６について代償性である可能性がある。ｃＧ−２−アリルＰでの処置は、ＰＢＢＩ後７日目にＩＬ１−ベータのレベルを減少させた（図３３Ｃ）。ｃＧ−２−アリルＰ処置は、ＩＬ−６レベルをＰＢＢＩ後２４時間（図３３Ｄ）および７日目の両方で減少させた（図３３Ｅ）が、３日目（図３３Ｂ）ではあまり効果を有さなかった。これらの結果は、ｃＧ−２−アリルＰがこれらの炎症性サイトカインを減少させたことを示している。
【０２８６】
図３４は、ＰＢＢＩがＢＡＸ（図３４Ａ、３４Ｂおよび３４Ｃ）ならびにＢＣＬ２（図３４Ｄ、３４Ｅ、３４Ｆ、３４Ｇおよび３４Ｈ）の発現を顕著におよび実質的に増加させたことを示している。ｃＧ−２−アリルＰは、ＢＡＸ（図３４Ａ〜３４Ｃ）またはＢＣＬ２（図３４Ｄ〜３４Ｈ）レベルを顕著に変化させなかった。
図３５は、ＰＢＢＩがすべての時点でＡＴＦ３の発現を増加させたことを示している（図３５Ａ〜３５Ｃ）。驚くべきことに本発明者らは、ｃＧ−２−アリルＰがウエスタンブロットによって包括的に測定されたとおり、ＰＢＢＩ後２４時間でＡＴＦ３を減少させることを見出した（図３５Ａ）。
【０２８７】
図３６は、ＰＢＢＩ後に、ｃＧ−２−アリルＰ処置がグリア４（ＡＭＰＡ受容体；図３６Ｆ）を２４時間時点で顕著に増加させたことを示している。付加的に本発明者らは：クレム（Ｃｒｅｍ）（ＣＲＥＢ阻害物質；図３６Ｄ）の減少、ＮＴＦ３（図３６Ｊ）の減少、ＮＴＦ４（図３６Ｋ）の減少、Ｐｃｄｈ８（腫瘍抑制因子遺伝子；図３６Ｌ）の減少、ＢＤＮＦ（図３６Ａ）の減少、Ｐｉｍ１；図３６Ｍ）の減少およびＰｐｐ３ｃａ（図３６Ｎ）の増加を含む傾向を観察した。
結論
ＲＮＡ発現におけるこれらの傾向、具体的にはグリア４の増加、クレムの減少およびＰｃｄｈ８発現の減少は神経可塑性を促進する。ＮＴＦ３およびＮＴＦ４の減少は、シナプス形成を可能にする。
【０２８８】
全体としてこれらの結果は、ｃＧ−２−アリルＰが重度のＰＢＢＩ後に抗炎症性効果を有し、神経可塑性を増強したことを示している。この実験系で得られた結果がヒトにおいて見られる効果の合理的な予測であることから、ｃＧ−２−アリルＰおよび類似の環状ＧＰ化合物は、軽度、中程度および重度の外傷性脳損傷の症状を処置することに有効である可能性がある。
【０２８９】
（例２７）
ラットにおける貫通性弾道様脳損傷後のシナプス可塑性へのｃＧ−２−アリルＰの効果ＩＩ：
増殖関連タンパク質４３およびシナプトフィジン
この例において本発明者らは、ラットにおける貫通性弾道様脳損傷（ＰＢＢＩ；１０％損傷重症度）後の神経可塑性に関与する遺伝子およびタンパク質の発現へのｃＧ−２−アリルＰの役割を検討した。
【０２９０】
方法
この例においてＰＢＢＩを産生するための方法は、例２６のための上の記載と同じである。成体スプラーグドーリーラットを３群に無作為に帰属させた：疑似（開頭術のみ）、ＰＢＢＩ＋ビヒクル（すなわちＨ2Ｏ）、およびＰＢＢＩ＋ｃＧ−２−アリルＰ。ｃＧ−２−アリルＰ（またはビヒクル）を損傷後３０分、３０ｍｇ／ｋｇで経口経管栄養を介して投与し、その後７、１４および２８日間１日１回継続した。各処置終点で、ラットを灌流し、脳を組織学的分析のために処理した（ｎ＝５〜６／群／時点）。軸索新芽形成の検出のために、増殖関連タンパク質−４３（ＧＡＰ−４３）の免疫組織化学的検出を用いた。シナプス形成をシナプトフィジン（ＳＹＮ）についての免疫組織化学によって判定した。組織学的定量のために、海馬領域における積分した密度をＮＩＨ  ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して判定した。
【０２９１】
結果
ビヒクル処置群ではＰＢＢＩは、同側性海馬において損傷後７日、１４日および２８日で、ならびに対側性海馬において損傷後７日および１４日でＧＡＰ−４３発現を有意に減少させた（ｐ＜０．０５対疑似）。ＳＹＮ染色における有意な低減がＰＢＢＩ＋ビヒクル群において、損傷後１４日および２８日に同側性海馬において、および損傷後１４日に対側性海馬において検出された（ｐ＜０．０５対疑似）。ｃＧ−２−アリルＰでの継続的処置は、ＰＢＢＩ後７日または１４日でＧＡＰ−４３またはＳＹＮ発現における損傷誘発低減に効果を示さなかった。しかし損傷後２８日でｃＧ−２−アリルＰ処置は、ＧＡＰ−４３およびＳＹＮの両方の発現においてＰＢＢＩ−誘発低減を中等度の処置効果の指標である疑似対照と有意に異ならないレベルに減弱した。
【０２９２】
結論
組織学的分析は、ＰＢＢＩが損傷後の亜急性から慢性期の際の軸索新芽形成およびシナプス形成の有意な低減を誘発したことを示している。これらの結果は、神経可塑性を促進するｃＧ−２−アリルＰの傾向を示している。使用した動物系がヒトにおける神経可塑性の予測であることから、これらの結果は、ｃＧ−２−アリルＰが脳損傷の有害作用を回復させることにおいて有効である可能性があることを示している。
【０２９３】
本明細書で提供する記載および例は、例示の目的のみのためである。本発明の範囲は、記載された実施形態に限定されることを意図しない。本発明の要素を組み込んでいる他の実施形態は、当業者による過度の実験を伴うことなく実施できる。したがってすべてのそのような実施形態は、本発明の一部であるとみなされる。
【０２９４】
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The following references, and all patents, patent applications and other publications cited herein are incorporated fully by reference as if separately so incorporated.
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図２７】
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【図２９Ａ】
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【図３３Ａ】
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【図３６Ｊ】
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【図３６Ｌ】
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【図３６Ｍ】
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【図３６Ｎ】
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【図３６Ｏ】
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