(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞を単離する方法であって、
（ａ）子宮頸部の剥離によって得られた子宮頸部組織から細胞懸濁液を調整するステップと、
（ｂ）前記細胞懸濁液から細胞を回収するステップと
（ｃ）細胞を増殖させることが可能な条件のもとに、適切な細胞培養用培地において前記細胞をインキュベートするステップと、
（ｄ）幹細胞を選択するステップと、を含んでなり、
前記幹細胞は、
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ９０を発現し、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１を発現しないことを特徴とする幹細胞の単離方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）が、子宮頸管粘液を酵素的に脱凝集させることを含んでなることを特徴とする請求項１に記載の幹細胞の単離方法。
【請求項３】
単離された幹細胞は、さらに、
（ａ）ビメンチン、サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ−２の細胞マーカーを発現し、
（ｂ）デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、Ｅ−カドヘリンからなるグループから選択される少なくとも１つの細胞マーカーを発現しないことを特徴とする請求項１又は２に記載の幹細胞の単離方法。
【請求項４】
幹細胞がさらに、
（ａ）増殖培地において、２４時間あたり０．４〜２．１の倍加である増殖率と、
（ｂ）線維芽細胞様の形態と、
（ｃ）少なくとも１０細胞継代の間の安定した核型と、
（ｄ）単層で増殖し、基質に接着する能力と、
（ｅ）内胚葉系、外胚葉系、又は中胚葉系の細胞系統に分化する能力と、
（ｆ）非腫瘍形成能力と、
（ｇ）球体を形成する能力と、を示すことを特徴とする請求項３に記載の幹細胞の単離方法。
【請求項５】
子宮頸部の剥離によって得られた子宮頸部組織は、哺乳類の子宮頸部組織であることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の幹細胞の単離方法。
【請求項６】
前記哺乳類の子宮頸部組織は、ヒトの子宮頸部組織であることを特徴とする請求項５に記載の幹細胞の単離方法。
【請求項７】
子宮頸部組織が非癌性の組織であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の幹細胞の単離方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載された幹細胞の単離方法によって単離された子宮頸部幹細胞であって、当該細胞は、
（ａ）ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ビメンチン、サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ−２の細胞マーカーを発現し、
（ｂ）ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１の細胞マーカーを発現せず、また、デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、及びＥ−カドヘリンからなるグループから選択される少なくとも１つの細胞マーカーを発現しないことを特徴とする単離された子宮頸部幹細胞。
【請求項９】
請求項８に記載の単離された幹細胞であって、当該細胞がさらに、
（ａ）増殖培地において、２４時間あたり０．４〜２．１の倍加である増殖率と、
（ｂ）線維芽細胞様の形態と、
（ｃ）少なくとも１０代の細胞継代の間の安定した核型と、
（ｄ）単層で増殖し、基質に接着する能力と、
（ｅ）脂質生成系、骨形成系、神経系、又は筋細胞系の細胞系列に分化する能力と、
（ｆ）非腫瘍形成能力と、
（ｇ）球体を形成する能力と、を示すことを特徴とする単離された幹細胞。
【請求項１０】
請求項８又は９に記載の単離された幹細胞であって、当該細胞が哺乳動物由来であることを特徴とする単離された幹細胞。
【請求項１１】
請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞を含むことを特徴とする細胞集団。
【請求項１２】
（ａ）請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞又は請求項１１に記載の細胞集団をインキュベートするステップと、
（ｂ）培養培地から細胞を取り除くステップと、を含んでなる方法によって得られることを特徴とする馴化培地。
【請求項１３】
請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞、又は請求項１１に記載の細胞集団、又は請求項１２に記載の馴化培地と、薬学的に受容可能なキャリア及び／又はアジュバントと、を含んでなることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
薬剤としての使用のための、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞、請求項１１に記載の細胞集団、請求項１２に記載の馴化培地、請求項１３に記載の医薬組成物から選ばれる薬剤材料。
【請求項１５】
癌、前癌病変、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病態又は感染症、あるいは組織喪失に関連した疾患の処置又は予防における使用のための、又は受胎障害の診断、予後又は処置における使用のための、又は美容的処置においての使用のための、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞、請求項１１に記載の細胞集団、請求項１２に記載の馴化培地、請求項１３に記載の医薬組成物から選ばれる薬剤材料。
【請求項１６】
腫瘍細胞の増殖及び／又は転移、単球分化、末梢血単核細胞の増殖、又は病原性微生物の増殖及び／又は複製を抑制又は減少させるための、又は腫瘍細胞のアポトーシスを強化又は誘発するための、又は組織再生及び生殖細胞の選択を増強するための、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞、請求項１１に記載の細胞集団、請求項１２に記載の馴化培地、請求項１３に記載の医薬組成物から選ばれる薬剤材料。
【請求項１７】
請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の単離された子宮頸部幹細胞、又は請求項１１に記載の細胞集団、又は請求項１２に記載の馴化培地、又は請求項１３に記載の医薬組成物、を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
癌、前癌病変、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病態又は感染症、あるいは組織喪失に関連した疾患の処置又は予防のための、又は受胎障害の診断、予後又は処置における使用のための、又は美容的処置においての使用のための請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
腫瘍細胞の増殖及び／又は転移、単球分化、末梢血単核細胞の増殖を抑制又は減少させるための、又は腫瘍細胞のアポトーシスを強化又は誘発するための、又は組織再生を増強するための、又は生殖細胞の選択のための請求項１７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は子宮頸部組織から細胞懸濁液を作製するステップを備える幹細胞を単離する方法に関し、当該方法により単離された幹細胞に関し、さらに当該幹細胞の培養により得られた馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）に関する。本発明はまた、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患による慢性的病態、または感染症の治療または予防、さらには美容的処置のための当該幹細胞または馴化培地の使用を含む。故に、本発明は、幹細胞および幹細胞の、治療または美容のための使用の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生能力と多数の系譜経路に沿って分化する能力によって特徴づけられる。治療応用のために、成体幹細胞の特に期待のできるタイプは、いわゆる間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。ＭＳＣはまた、多能性間葉系間質細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ）として定義され、可塑性の接着性細胞としてインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で増殖するヘテロな細胞集団であり、線維芽細胞様の形態を有し、インビトロでコロニーを形成し、分化骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞のような中胚葉系細胞および他の胚性系譜の細胞に分化できる。
【０００３】
幹細胞はニッチ（ｎｉｃｈｅ）に在住するのではないかと考えられており、幹細胞の自己再生と組織再生との間のバランスを調整する。幹細胞ニッチの概念はもともと哺乳類の造血に関連して記述されており、ニッチは、造血幹細胞を収容し、その継続的存在を保証する特殊化した微小環境を表していた。ニッチ内の支持細胞がその分泌生成物とともに、幹細胞行動と相互作用し行動を管理するということが提案された。このモデルによれば、幹細胞の活動を支持するために、外部的な活動化のキューが存在しない場合に、ニッチ内の条件が幹細胞の静止状態を維持するように寄与し、必要性が生じた場合にその条件が前駆細胞の増殖と成熟を促進し、また幹細胞プールの自己再生を確実にする。
【０００４】
胚体中胚葉由来の軟組織における多能性成体細胞の異なる集団の存在は、何人かの著者によって報告されてきた。例えば、多能性細胞は、哺乳動物の骨格筋と他の結合組織から、ヒトの吸引脂肪組織から、または骨髄（いわゆる多能性成体前駆細胞（ＭＡＰＣ））から、取得され得ることが報告されてきた。原理的には、これらのすべての細胞集団は、骨髄のＭＳＣに似たやり方で、結合組織の修復と再生において使用され得る。しかしながら、これまでのところ、ＭＡＰＣ以外は、これらの集団のいずれも、表現型レベルでは十分に特徴づけられていない。故に、多能性成体細胞の存在は異なる結合組織において記述されてきたが、現在の技術水準においては、軟組織から得られた異なる多能性細胞型を同定し、明確に識別すること、すなわち十分に純粋な集団を得ることはできない。現在のところ、幹細胞の表現型の特徴づけは、とりわけ細胞表面レセプターのようなマーカーの決定およびインビトロ培養での細胞分化能の決定を含む。それぞれの細胞型は表面マーカーの一定の組合せを有しており、すなわちその特定の細胞型を特徴づけ、他の細胞型から区別することができる一定の発現プロフィールを有する。
【０００５】
成体幹細胞の理想的供給源は、そこから成体幹細胞が容易な非侵襲性の方法によって得ることができ、十分な数の細胞が単離可能となるものである。特に供給源は、生体から大きなリスクや不快感なしに容易に単離され得る幹細胞を提供でき、また単離と培養に過剰なコストを要せず、他の細胞型とのコンタミネーションが最少で高い収率を得ることを可能とすべきである。
【０００６】
骨髄（ＢＭ）は多能性ＭＳＣの単離のための主要な供給源であったが、脂肪組織が本細胞の別の供給源であり、しかしながら、ＢＭと脂肪組織の採収は非常に侵襲的な処置である。これに替わるもう一つの供給源は臍帯血であり、これは母または新生児に危害を加えることなしに、侵襲度のより低い方法で得ることが可能である。ＭＳＣの他の供給源は、胎盤、頭皮組織、腸幹細胞などの種々の他のヒト成体組織において見出された。ＢＭ、脂肪組織または臍帯血（ＵＣＢ）から単離されるすべての細胞は、線維芽細胞様組織、コロニー形成単位線維芽細胞（ＣＦＵ−Ｆ）の形成、多能性分化能などの典型的なＭＳＣ特性を示した。この３つの供給源由来のＭＳＣはＭＳＣマーカータンパク質を発現したが、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６の発現に関して顕著な相違が観察された。このようにして、ＭＳＣはその供給源によって異なる表現型を示すことができた。
【０００７】
骨髄を得るためのプロセスは苦痛を生じ、収率は非常に低く、臨床的に意義のある量を得るためには、エキソビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）での増大によって細胞の数を著しく増加させる必要がある。このステップはコストを増加させ、時間も必要となり、またコンタミネーションや材料損失のリスクも増加する。こうした理由のため、骨髄以外の間葉組織から多能性細胞を単離できれば非常に望ましいであろう。特に、手術上の利便性が与えられることから、これらに限定するものではないが、皮膚、脂肪組織、筋肉組織などの非骨軟骨性の中胚葉組織から細胞を単離できれば、都合がよいと思われる。
【０００８】
このように、現行技術において、非侵襲性の苦痛を与えない採収方法によって、幹細胞の別の供給源を提供することが求められている。この意味で、子宮（ｕｔｅｒｕｓ）は幹細胞の供給源となり得る。しかしながら、子宮はいろいろな部分に分割される複雑な器官である。具体的には、ヒトの子宮は上部の筋子宮体（ｕｐｐｅｒ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃｏｒｐｕｓ）と膣に延びる下方繊維状子宮頸部（ｌｏｗｅｒ  ｆｉｂｒｏｕｓ  ｃｅｒｖｉｘ）に分けることのできる線維筋性器官（ｆｉｂｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｏｒｇａｎ）である。子宮体部（ｃｏｒｐｕｓ  ｕｔｅｒｉ）は底部（ｆｕｎｄｕｓ）と子宮下部（または峡部）（ｌｏｗｅｒ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ（ｏｒ  ｉｓｔｈｍｕｓ））に分けられ、子宮下部は、ほぼ子宮動脈（ｕｔｅｒｉｎｅ  ａｒｔｅｒｙ）の位置に対応し子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）の内子宮口（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｏｓ）に達する。子宮頸部は狭い円筒形の通路であり、下端において膣に接続し、その上端において、子宮頸部は子宮下部（峡部）（ｌｏｗｅｒ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  （ｉｓｔｈｍｕｓ））を形成するように広くなる。子宮下部は、次いで、子宮底部（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｆｕｎｄｕｓ）に向かって広くなる（図１８）。子宮頸部の下端は婦人科の診察において膣の内部から見ることができ、子宮頸膣部（ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｘ）として知られる。子宮頸膣部の中心における開口部は子宮口（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｏｓ）として知られ、子宮と膣の間の通路となるように開いている。子宮頸管内膜（ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｘ）は、子宮口から子宮に達する、子宮頸部を貫くトンネルである子宮頸管（ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎａｌ）を取り囲む（図１９）。子宮頸管内膜と子宮頸膣部との間の重複境界部は、移行帯（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）と称される。本移行帯は、好ましくは、本発明の幹細胞が収集される部位である。
【０００９】
著名なカナダの組織学者であるアーサー  ワース  ハム（Ａｒｔｈｕｒ  Ｗｏｒｔｈ  Ｈａｍ）は、自身の著した教科書であって、多くの専門家によって必須の参考文献と認められている、“組織学（Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）”において、子宮体と子宮頸部の異なる組織層について記述している（Ｈａｍ，Ａ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｄ．Ｈ．  Ｈａｍ’ｓ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，９ｔｈ  ｅｄ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９８７）。ヒトの子宮体は、以下の３つの組織層からなる。１）子宮内膜（ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｕｍ）と称される内層は最も活動的な層で、周期的な卵巣ホルモンの変化に反応する。子宮内膜は高度に特殊化されており、月経および生殖のために必須の役割を果たす（本組織層由来の子宮内膜幹細胞）；２）中層すなわち子宮筋層（ｍｙｏｍｅｔｒｉｕｍ）は子宮体積のほとんどを構成する筋層であり、主として平滑筋細胞からなる（本組織層由来の子宮筋層幹細胞）；３）子宮の外層、すなわち漿膜（ｓｅｒｏｓａ）または子宮外膜（ｐｅｒｉｍｅｔｒｉｕｍ）は、子宮を覆う上皮細胞からなる組織の薄層である。しかしながら、子宮頸壁（ｃｅｒｖｉｘ  ｗａｌｌ）と子宮頸管に並んでいる膜組織は、子宮体とは異なる特徴を有する。実際、子宮頸壁は、主として結合組織によって構成される。子宮頸部は粘膜として知られる、扁平細胞と称される薄く、平で、鱗状の細胞からなる内壁と、漿膜（滑り皮膜）として知られる外膜によって構成される。さらに、子宮下部または峡部と称される子宮頸部に接合する子宮体の部分の壁は、主として平滑筋から構成される。故に、組織構造、そして子宮のこれらの２つの部分（子宮下部を含む子宮体と子宮頸部）の機能は異なる。
【００１０】
国際出願ＷＯ２０１１／０４２５４７は、子宮筋組織からの、特に、底部と子宮下部を含む子宮体（ｃｏｒｐｕｓ  ｕｔｅｒｉ）と称される子宮頸部の上の部分からの幹細胞を提供する方法を開示している。さらに、著者らは、子宮筋層のエクスプラント（ｅｘｐｌａｎｔｓ）は、子宮体の子宮下部から剥離によって取得されたと述べている。前述したように、子宮下部は子宮頸部の上端であり、解剖学的にまた組織学的に子宮頸部とは異なる子宮体の一部と考えられている。しかしながら、伝統的に、子宮体下部の壁は主として子宮筋組織により構成されていることが知られている、なぜなら子宮内膜層がこのレベルまで下がっているからである。それにもかかわらず子宮頸部の外壁は、主として結合組織によって構成されている。故に、表面細胞学的サンプリングによって子宮頸部から子宮筋組織を得ることはできない。故に、生体物質はバイオプシーのような侵襲的方法によって、子宮筋組織片、子宮筋層のエクスプラント、または子宮剥離物として得られるため、子宮筋層に到達するために高度の剥脱を必要とする。結果的に、子宮筋層前駆細胞を単離するために、組織サンプルからあらかじめ、子宮内膜、漿膜、脂肪、および線維性の組織を取り除く必要がある。国際出願ＷＯ２０１１／０４２５４７に記載の幹細胞集団は、造血系からの表面マーカーであるＣＤ３１、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＤＲなどの表面マーカーを発現する。これに対して、間葉系幹細胞は、造血系マーカーを発現しなかった。
【００１１】
バエゲ  アストリド  Ｃ（Ｂａｅｇｅ  Ａｓｔｒｉｄ  Ｃ）とその協力者は、間葉系幹細胞とは異なる上皮幹細胞と推定されるものの単離について開示している（Ｂａｅｇｅ  Ａｓｔｒｉｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ．  Ｖｏｌ４７，２００６：９３８）。ここで開示された細胞集団が、ヒトパピローマウイルスで誘発される子宮頸部発癌において潜在的役割を担っていたことに留意することが重要である。
【００１２】
さらに、マルヤマ  Ｔら（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ）は、子宮の生理学および病理学において、子宮内膜および子宮筋層の幹細胞／前駆細胞の役割を開示しているが、この文献は間葉系子宮頸部幹細胞について言及していない（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ；  ２０１０；  １４０：１１−２２）。前述したように、子宮筋層は子宮体の中層であり、子宮体積のほとんどを構成し、主として平滑筋細胞からなる筋層である。
【００１３】
一方、ロペス  Ｊら（Ｌｏｐｅｚ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ）及びシャオチャン  Ｓら（Ｘｉａｏｃｈｕｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ）は、ヒト子宮癌から単離され同定された幹細胞を開示する（Ｌｏｐｅｚ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．  ２０１２；  ６：  ２３２−２４０）、（Ｘｉａｏｃｈｕｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．  ２０１１；３５：１１９−１２３）。これらの幹細胞の不利な点は、腫瘍増殖に寄与することである。この意味で、間葉系幹細胞は癌幹細胞ニッチの構成要素であり、その結果、腫瘍細胞増殖を指示するうえで重要な役割を果たすことが述べられている（Ｒａｍａｓａｍｙ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２００７）。故に、癌組織から単離された幹細胞は、腫瘍特性および確かに他の特性において、正常組織から単離された幹細胞とは異なっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４２５４７号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】ハム，Ａ．Ｗ．（Ｈａｍ，Ａ．Ｗ．）及びコーマック，Ｄ．Ｈ．（Ｃｏｒｍａｃｋ，Ｄ．Ｈ．）、  Ｈａｍ’ｓ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ，第９版、フィラデルフィア：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，１９８７年．
【非特許文献２】バエゲ  アストリド  Ｃら（Ｂａｅｇｅ  Ａｓｔｒｉｄ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ  Ａｍｅｒ  Ａｓｓｏｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、ｌ４７巻，２００６年、ｐ．９３８．
【非特許文献３】（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、２０１０年、１４０巻、ｐ．１１−２２．
【非特許文献４】ロペス  Ｊら（Ｌｏｐｅｚ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．、２０１２年、６巻、ｐ．２３２−２４０．
【非特許文献５】シャオチャン  Ｓら（Ｘｉａｏｃｈｕｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｅｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．、２０１１年、３５巻、ｐ．１１９−１２３．
【発明の概要】
【００１６】
本発明の著者らは、子宮頸部組織が幹細胞の供給源として使用され得ることを見出した。この組織から単離された細胞は、子宮頸部幹細胞（ＵＣＥＳＣ）と称されるが、他の組織から単離された他の間葉系幹細胞よりも高い抗炎症活性、抗腫瘍能、抗菌活性、増殖率を示し、少なくとも１０代の細胞継代の間、その機能性と安定した核型を保持することができる。さらに、この新しい幹細胞の供給源は、非侵襲性の、苦痛のない方法によって間葉系幹細胞の単離を可能とするが、これは当該組織が、日常的な婦人科の診察の間に当該器官を剥離するだけで、得ることができるためである。
【００１７】
この新しい幹細胞の供給源とそこから得られる細胞に基づいて、本発明の著者らは、以下で詳細に開示される発明の諸態様を開発した。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】子宮頸部幹細胞は、成体間葉系幹細胞の免疫表現型を示す。子宮頚部のスメア（ｓｍｅａｒ）により得られ、９０日間培養された細胞は、特異的抗体により免疫標識され、タンパク質発現について評価された。デスミン、アクチンＨＨＦ３５、平滑筋アクチン、Ｐ６３、およびＥ−カドヘリン発現は、検出されなかったが、ＣＫＡＥ１ＡＥ３が局所的に発現され、ビメンチンは、強力な発現を示す。
【図１Ｂ】ｋｌｆ４、ｏｃｔ４、及びｓｏｘ２のような特定の幹細胞マーカーは、子宮頸部幹細胞において強力な免疫標識を示した。
【図１Ｃ】ヒト子宮頸部幹細胞（ｈＵＣＥＳＣ）のフローサイトメトリー分析は、高いパーセンテージでＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５タンパク質を示すが、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＴｒａ１−８１タンパク質の非発現を示す。
【図１Ｄ】単離されたｈＵＣＥＳＣは、特定の培地で培養されるとき、スフェロイド（ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ）を形成する。
【図２】ｈＵＣＥＳＣの増殖率。２，０００細胞／ウェルを播種した後の細胞の数として表わされるｈＵＣＥＳＣの増殖。
【図３】免疫原性アッセイ。図は２人のドナーの典型的なＭＬＲを示す。ＰＢＭＣの増殖は、刺激細胞の非存在下で、自己（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）マイトマイシンＣ処理されたＰＢＭＣの存在下で（陰性コントロール）、同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）マイトマイシンＣ処理されたＰＢＭＣの存在下で（陽性コントロール）、マイトマイシンＣ処理されたｈＵＣＥＳＣの存在下で、そしてＣｏｎ  Ａで刺激されたＰＢＭＣで（陽性コントロール）、測定された。刺激細胞は、１ウェルあたり２×１０４の密度で試験された。ｈＵＣＥＳＣの免疫原性を評価するために、一方向ＭＬＲアッセイが実施された。ＰＢＭＣの増殖は、マイトマイシンＣ処理された刺激細胞の存在下で、代謝的に活性な生体細胞の増加数に基づいて測定された。自己及び同種のＰＢＭＣは、それぞれ陰性及び陽性の刺激細胞制御としての役割を果たした。Ｃｏｎ  Ａの刺激を受けたＰＢＭＣは、別の陽性の刺激制御細胞としての役割を果たした。ｈＵＣＥＳＣは、ＭＬＲアッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を引き起こさなかった。
【図４】ｈＵＣＥＳＣ馴化培地の存在下における刺激を伴う単球分化の抑制。Ａでは、Ｕ９３７細胞の生存率は８０％を上回る。Ｂは、マクロファージ分化マーカーの発現に対するｈＵＣＥＳＣ馴化培地およびＡＳＣ馴化培地の効果である。Ｕ９３７、ＣＤ１１ｂの発現の基底レベルは、３４％である。ＰＭＡ処理されたコントロールＵ９３７細胞と比較すると、ＣＤ１１ｂに対して陽性の染色が見られる細胞のパーセンテージは、ＰＭＡ処理されたＵ９３７細胞における７３％からｈＵＣＥＳＣ馴化培地処理されたＵ９３７細胞における４８％に減少した。ＡＳＣ馴化培地で処理されたＵ９３７細胞に対するＣＤ１１ｂ発現のパーセンテージは、６７％である。
【図５】単球分化の抑制：２４時間の刺激とｈＵＣＥＳＣ馴化培地の添加。Ａでは、Ｕ９３７細胞の生存率は８０％を上回る。Ｂでは、Ｕ９３７、ＣＤ１１ｂ発現の基底レベルは３８％である。ＰＭＡ処理された制御Ｕ９３７細胞と比較すると、ＣＤ１１ｂに対して陽性の染色が見られる細胞のパーセンテージは、ＰＭＡ処理されたＵ９３７細胞におけるにおける８２％から、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地で処理され、２４時間で産生された（ＣＭ２４時間）Ｕ９３７細胞における４８％に減少し、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地で処理され、４８時間で産生された（ＣＭ４８時間）Ｕ９３７細胞における３４％に減少した。それにもかかわらず、ＡＳＣのＣＭで４８時間処理されたＵ９３７細胞におけるＣＤ１１ｂの発現は、７７％である。
【図６】馴化培地でのＰＢＭＣ増殖の抑制。馴化培地は、２４時間と４８時間の両方とも、ＰＢＭＣ増殖を抑制した。ＡＳＣ馴化培地よりもｈＵＣＥＳＣ馴化培地において、抑制はより効果的である。ｈＵＣＥＳＣ馴化培地による抑制の大きさはデキサメタゾンによるそれを上回った。
【図７Ａ】ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地は、ＨＴ２９細胞、ＡＧＳ細胞、およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における細胞増殖を減少させるが、ＭＣＦ−７細胞株における細胞増殖は減少させない。Ａ．完全培地（コントロール）、不完全培地（ＦＢＳなし）、２４時間または４８時間産生されたｈＵＣＥＳＣからの馴化培地および４８時間産生されたＡＳＣからの馴化培地で、４８時間処理された結腸直腸（ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ）（ＨＴ２９）および胃の（ＡＧＳ）腺癌細胞株の細胞増殖アッセイ。
【図７Ｂ】完全培地（＋ＦＢＳ）、不完全培地（−ＦＢＳ）で２４時間処理された、ＭＣＦ−７細胞からの馴化培地で２４時間産生された、またはｈＵＣＥＳＣからの馴化培地で２４時間産生された、ＭＣＦ−７細胞のＭＴＴアッセイ。
【図７Ｃ】完全培地（＋ＦＢＳ）、不完全培地（−ＦＢＳ）で４８時間処理された、ＭＣＦ−７細胞からの馴化培地で４８時間産生された、またはｈＵＣＥＳＣからの馴化培地で４８時間産生された、ＭＣＦ−７細胞のＭＴＴアッセイ。
【図７Ｄ】完全培地（＋ＦＢＳ）、不完全培地（−ＦＢＳ）、２４時間で産生されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの馴化培地、または２４時間で産生されたｈＵＣＥＳＣからの馴化培地、で２４時間処理された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセイ。
【図７Ｅ】完全培地（＋ＦＢＳ）、不完全培地（−ＦＢＳ）、４８時間で産生されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの馴化培地、または４８時間で産生されたｈＵＣＥＳＣからの馴化培地、で４８時間処理された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のＭＴＴアッセイ。
【図７Ｆ】ＭＣＦ−７細胞（１×１０５）は、細胞追跡用緑色色素で標識付けされ、６ウェルプレートで培養された。４時間後、細胞追跡用赤色色素で標識された１×１０５個のｈＵＣＥＳＣがＭＣＦ−７細胞に添加され、不完全培地（ＦＢＳなし）で７２時間共培養（共存培養）した。１２時間、４８時間、７２時間の時点で、画像が取得された。一番下の列は、不完全培地（−ＦＢＳ）におけるＭＣＦ−７細胞増殖の一例を示す。
【図７Ｇ】ＭＣＦ−７細胞に対する〔図７Ｆ〕において記載されているのと同じように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が標識され、ｈＵＣＥＳＣとともに共培養された。
【図８Ａ】ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地（ＣＭ）をＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に投与することは、細胞周期を遅らせ、アポトーシスを増加させる。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、４８時間、１０％ＦＢＳ（＋ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭと不完全培地（ＦＢＳ不含ＤＭＥＭ、−ＦＢＳ）で処理され、または４８時間、ｈＵＣＥＳＣからのＣＭで処理され、次いでヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用したフローサイトメトリーにかけられた。各フェーズにおける細胞のパーセンテージ（平均値±標準偏差）が、示されている。
【図８Ｂ】〔図８Ａ〕に記載のように４８時間処理された、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのタンパク質抽出物のサイクリンＡ、サイクリンＢ、サイクリンＥ、サイクリンＤ１、およびＧＡＰＤＨ（負荷コントロールとして使用される）のウェスタンブロット。
【図８Ｃ】アポトーシスは、完全培地（＋ＦＢＳ）、不完全培地（−ＦＢＳ）、またはｈＵＣＥＳＣからのＣＭで、４８時間培養されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、アネキシンＶ／ＰＩを使用したフローサイトメトリーによって測定された。アネキシンＶ＋／ＰＩ−およびアネキシンＶ＋／ＰＩ＋はそれぞれ、早いアポトーシス及び遅いアポトーシスを示す。
【図８Ｄ】〔図８Ｃ〕において示されるＭＤＡ−ＭＢ−２３１タンパク質抽出物のカスパーゼ８、−１２、−９、活性化カスパーゼ３、および切断されたＰＡＲＰのウェスタンブロット。
【図８Ｅ】〔図８Ｃ〕において処理されたような、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１抽出物における抗アポトーシスＢｉｄ、切断されたＢｉｄ、およびＢｉｍタンパク質のウェスタンブロット。ＧＡＰＤＨが、負荷コントロールとして使用された。
【図９Ａ】ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地（ＣＭ）は、異種移植マウスモデルにおいて、浸潤、３Ｄ増殖、および腫瘍体積を抑制する。ｈＵＣＥＳＣからの４８時間のＣＭは、不完全培地（−ＦＢＳ、コントロール）による細胞と比較して、マトリゲルマトリックスに対するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤を著しく減少させた。
【図９Ｂ】ｈＵＣＥＳＣ培養からの４８時間のＣＭの９日間の投与は、完全（＋ＦＢＳ）または不完全（−ＦＢＳ）培地で処理された細胞と比較すると、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の３Ｄ増殖を著しく減少させる。
【図９Ｃ】１３匹のＳＣＩＤマウスが、乳房脂肪パッドにＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞を注入された。１５日後に、７匹のマウスが、ｈＵＣＥＳＣ（ＣＭ処理された）からの馴化培地（ＣＭ）１５０μＬを、５日毎に腫瘍内に注入され、６匹のマウスが、不完全培地（−ＦＢＳ、コントロールグループ）を注入された。コントロールグループとＣＭ処理マウスの代表的画像が、１５日、２０日、２５日、３０日の時点で取得された。
【図９Ｄ】腫瘍体積は、ルミネセンスを測定して決定された。値は相対的ルミネセンスレベルの平均値±標準偏差として表現される。＊＊：コントロールグループに対しＰ＝０．０１１で有意。
【図９Ｅ】〔図９Ｃ〕に記載の、ＣＭおよびプラセボで処理されたＳＣＩＤマウスの代表的な腫瘍における、活性化カスパーゼ−３発現の免疫組織化学的検出。
【図９Ｆ】ＣＭ処理マウスとコントロールグループマウスの全生存（ｏｖｅｒａｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）カプラン−マイヤープロット（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  ｐｌｏｔｓ）。ＣＭで処理されたマウスは、コントロールグループマウスに比べ、長いＤＦＳを示した。その相違は統計的に有意であった（Ｐ＝０．０１９）。
【図１０Ａ】高い増殖率を有する乳房腫瘍（ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ）からの初代培養における細胞増殖は、ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地（ＣＭ）の投与後に著しく減少させられる。ヒト乳房腫瘍からの１０個の初代培養は、以下の培地により処理された：ａ）完全培地（＋ＦＢＳ）、ｂ）不完全培地（−ＦＢＳ）、ｃ）自身の細胞によって４８時間で産生される馴化培地（ＣＭ）、ｄ）組織脂肪由来ストローマ細胞（ＡＳＣ）によって４８時間で産生されるＣＭ、およびｅ）ｈＵＣＥＳＣによって４８時間で産生されるＣＭ。４８時間の培養の後、細胞増殖を評価するためにＭＴＴアッセイが実施された。高い増殖率を有する培養物（赤色の１１Ｂ５１２、１１Ｂ３２８５、１１Ｂ３１７１、および１１Ｂ７３５２）は、ｈＵＣＥＳＣからのＣＭによる処理後に、他の処理に比較して、有意な増殖の減少（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）を示した。
【図１０Ｂ】ｈＵＣＥＳＣからのＣＭで処理された、または不完全培地（−ＦＢＳ）で処理された高い増殖率を有する初代培養物からのタンパク質抽出物は、サイクリンＤ１、切断されたＰＡＲＰ、およびＧＡＰＤＨ（負荷コントロールとして使用される）抗体類でインキュベートされ、ウェスタンブロット法でアッセイされた。
【図１１】９６マイクロウェルプレートにおけるｈＵＣＥＳＣ馴化培地による病原微生物の増殖抑制の代表的な例。Ａでは、コントロール培地（Ｍ）は、大腸菌増殖を示し、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地（１）は、ウェル４（１／２０希釈）までの細菌増殖の抑制を示した。脂肪組織由来ＭＳＣ馴化培地は、すべてのウェルにおいて細菌増殖を示した。Ｂは、各条件のためにウェルに添加された容積の表。円は、細菌増殖の抑制を示すウェルを指す。
【図１２】ｈＵＣＥＳＣによる微生物の増殖抑制の代表的な例。ＣＦＵカウントとＯＤにより分析された、ｈＵＣＥＳＣによる微生物増殖の有意な抑制（ｐ＜０．００１）。培地のみと正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）は、大腸菌増殖の抑制を示さない。
【図１３】ｈＵＣＥＳＣ馴化培地による微生物の増殖抑制の代表的な例。ＣＦＵカウントとＯＤにより分析された、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地（ＣＭ）による微生物増殖の有意な抑制（ｐ＜０．００１）。培地のみと正常ヒト線維芽細胞馴化培地（ＣＭ  ＮＨＦ）は、大腸菌抑制を示さない。
【図１４】ラットにおけるドライアイのモデル。Ａは、切除前の眼窩外部の（ｅｘｔｒａｏｒｂｉｔａｌ）涙腺を示す写真。Ｂでは、涙液産生を測定するために、アレンジされたシルマー試験（ｓｃｈｉｒｍｅｒ  ｔｅｓｔ）が使用された。Ｃは、ドライアイにおける眼窩外部の涙腺の切除後７日目の正常な眼（ＮＥ）及びドライアイ（ＤＥ）における結果を示すシルマー試験。
【図１５】「インビボ」における上皮再生。Ａは、角膜のアルカリ熱傷の直後（Ｔ０ｈ）、１５時間後（Ｔ１５ｈ）、および５日後（Ｔ５ｄ）の、フルオレセイン染色の代表的な画像。Ｂ．アルカリ熱傷後１５時間後の上皮角膜再生のパーセントの統計的分析（＊ｐ＜０．００５）。Ｃは、アルカリ熱傷後５時間後の上皮角膜再生のパーセントの統計的分析（＊ｐ＝０．００５）。使用された処理は、馴化培地（ＣＭ）、以前に細胞と接触していない培地のみ（Ｍ）、ヒアルロン酸ナトリウム入り点眼薬（ＳＨ）、および非処理（ＮｏＴｒｅａｔ）であった。
【図１６】組織像。アルカリ熱傷後５日、馴化培地（ＣＭ）、以前に細胞と接触していない培地のみ（Ｍ）、ヒアルロン酸ナトリウム入り点眼薬（ＳＨ）で処理された角膜、および非処理（ＮｏＴｒｅａｔ）の角膜から得られた２０μスライド（ｓｌｉｄｅ）のヘマトキシリンエオジン染色の代表的な画像（倍率、×１０）。
【図１７】抗炎症効果。Ａは、アルカリ熱傷後５日目の角膜のＭＣＰ−１のリアルタイムＰＣＲ結果の統計的分析。Ｂは、アルカリ熱傷後５日目の角膜のＭＩＰ−１αのリアルタイムＰＣＲ結果の統計的分析。Ｃは、ＴＮＦ−αのリアルタイムＰＣＲ結果の統計的分析。分析された条件は、馴化培地（ＣＭ）で処理された角膜；以前に細胞と接触していない培地のみで処理された角膜（Ｍ）；ヒアルロン酸ナトリウム入り点眼薬（ＳＨ）で処理された角膜（ＳＨ）、ドライアイだが何ら病変（ＮｏＵｌｃ）のない目から得られた角膜、および何ら病変のない正常な目から得られた角膜（Ｎｏｒｍａｌ）、であった。
【図１８】ヒト子宮及びその周辺の区分概要図である。
【図１９】子宮頸管（ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎａｌ）、子宮頸管内膜（ｅｎｄｏｃｅｒｖｉｘ）、子宮口（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｏｓ）、子宮頸膣部（ｅｃｔｏｃｅｒｖｉｘ）などを含む子宮頸部（ｃｅｒｖｉｘ）及び内子宮口（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｏｓ）などを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
〔発明の方法〕
上述したように、本発明の著者らは、子宮頸部組織を幹細胞の供給源として使用することができ、好ましくは、非癌性の子宮頸部組織として使用できることを見出した。
【００２０】
このようにして、１つの態様において、本発明は幹細胞の単離方法に関し、以下において「本発明の方法」と称される方法は、
（ａ）子宮頸部組織から細胞懸濁液を調整するステップと、
（ｂ）当該細胞懸濁液から細胞を回収するステップと、
（ｃ）細胞を増殖させることが可能な条件のもとに、適切な細胞培養用培地において当該細胞をインキュベートするステップと、
（ｄ）幹細胞を選択するステップと、を含んでなる。
【００２１】
（ａ）〜（ｄ）のステップは、当業者において知られている従来の技術によって実施することができる。この新しい幹細胞の供給源のさらなる利点は、非侵襲性の、苦痛のない方法によって動物体から幹細胞を得ることを可能にすることである。
【００２２】
本発明に関連して、「非侵襲性の（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）」という用語は、皮膚が傷つけられることがなく、体腔が婦人科の検査のための通常の道具以上の道具を使用してプローブされる（ｐｒｏｂｅｄ）ことのないプロセスを指す。本発明に関連して、「苦痛のない」という用語は、身体的な痛みを生じさせないプロセスを指す。故に、本発明の方法は、当該幹細胞が単離されるその供給源が子宮頸部であるので、幹細胞を単離するための非侵襲性の苦痛のない方法である。
【００２３】
こうして、第１のステップ［ステップ（ａ）］において、本発明の方法は、子宮頸部組織から細胞懸濁液を調整するステップを含んでなる。
【００２４】
「子宮頸部組織」という用語は、子宮頸部、すなわち子宮の本体部と空洞部を膣から分離する器官から生じる組織を指す。子宮頸部は狭い円筒形の通路であり、下端において膣に接続し、その上端において、子宮頸部は子宮下部（峡部）を形成するように広くなる。子宮下部は、次いで、子宮底部に向かって広くなる（図１８）。子宮頸部の下端は婦人科の診察において膣の内部から見ることができ、子宮頸膣部として知られる。子宮頸膣部の中心における開口部は子宮口として知られ、子宮と膣の間の通路となるように開いている。子宮頸管内膜は、子宮口から子宮に達する、子宮頸部を貫くトンネルである子宮頸管を取り囲む（図１９）。子宮頸管内膜と子宮頸膣部との間の重複境界部は、移行帯（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｚｏｎｅ）と称される。本移行帯は、好ましくは、本発明の幹細胞が収集される部位である。
【００２５】
子宮頸部組織は、動物体から組織を取り除くための、バイオプシーのような侵襲的方法と、子宮頸部の剥離のような非侵襲性の方法など、当業者により知られている従来の方法によって得ることができる。好ましくは、子宮頸部組織は、幹細胞を得るための非侵襲性の苦痛のない方法と考えられる日常的な婦人科の診察の間に、子宮頸部を剥離することによって得られる。子宮頸部組織は、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、霊長類動物などの適切な哺乳類から、好ましくはヒトから得ることができる。
【００２６】
子宮頸部組織が得られると、組織は好ましくは、本発明の細胞を材料のその他の部分から分離する処理をおこなう前に洗浄される。プロトコールにおいて、子宮頸部組織は、生理学的に適合する食塩水（例えばリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ））又は無血清培地において維持される。子宮頸部組織の特性により、ある特定の実施形態においては、本発明の方法のステップ（ａ）は、子宮頸管粘液（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｕｃｕｓ）を酵素的に脱凝集させる（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ）ステップを含んでなる。子宮頸管粘液を脱凝集させることのできる酵素ならどんなものでも、本発明の方法において使用できる（例えばコラゲナーゼ、ディスパーゼ、トリプシンなど）。酵素処理のための量と継続時間は、投与される条件により異なるが、そのような酵素の使用は当業者において一般的に知られている。或いは、すなわちそのような酵素処理に伴って、子宮頸管粘液は、機械的攪拌、音響エネルギー、熱エネルギーなどの他の処理方法を使用して、分解させる（ｄｅｇｒａｄｅｄ）ことができる。分解が酵素法によって達成されるのであれば、細胞に対する悪影響を最小にするため、適切な期間の後に酵素を中和するのが望ましい。
【００２７】
分解ステップは、一般的には、凝集状態の細胞のスラリー又は懸濁液と通常は遊離した間質性（ストローマ：ｓｔｒｏｍａｌ）細胞（例えば赤血球、内皮細胞、線維芽細胞、幹細胞など）を含む流動性フラクションを産生する。本発明の方法における次の段階［ステップ（ｂ）］は、当該細胞懸濁液から細胞を回収することであり、これは凝集状態の細胞を残余の部分から分離することを意味する。これは遠心分離によって達成可能であり、遠心分離により細胞は上清に覆われた細胞塊（ペレット）となる。次いで上清は処分することができ、ペレットは生理学的に適合する流体中に懸濁される。さらに、懸濁した細胞は、一般的に赤血球を含み、ほとんどのプロトコールにおいて、赤血球を溶解（ｌｙｓｅ）することが望ましい。赤血球を選択的に溶解する方法は当業者において知られており、適切なプロトコールはどれでも使用可能である（例えば、塩化アンモニウムなどを使用した溶解によるハイパー又は低浸透圧性の培地中でのインキュベーション）。もちろん、赤血球が溶解されれば、残りの細胞は、例えば、濾過、沈降、遠心分離或いは密度分画によって溶解液（ライセート：ｌｙｓａｔｅ）から分離されるべきである。懸濁した細胞は、さらに純度を高めるために、１回以上連続して洗浄され、再遠心分離され、再懸濁され得る。或いは、細胞は、細胞表面マーカープロフィールに基づいて、或いは細胞サイズと粒状性に基づいて分離され得る。
【００２８】
細胞懸濁液からの細胞の回収に続いて、細胞を増殖させることが可能な条件のもとに、適切な細胞培養用培地において、細胞は培養される［ステップ（ｃ）］。好ましくは、細胞は、適切な細胞培養用培地を使用し、適当な細胞密度と培養条件で、分化することなく培養されるであろう。このようにして、細胞は、適切な細胞培養用培地［例えばＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２、ａｌｐｈａ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩなどに、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ウシ新生児血清、ウシ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウマ血清、ヒト血清又はヒト血清因子、アミノ酸などのような適切な血清を５〜２５％（例えば、２０％）追加した］の存在下で、固体表面上で分化なしに培養され、細胞を増殖させることが可能な条件のもとにインキュベートされる。培養条件、すなわちｐＨ、温度などは、当業者の通常の一般知識である。好ましくは、細胞は固体表面上の培養物であり、細胞が固体表面に接着して増殖可能となる条件下にある。
【００２９】
本明細書で使用される、「固体表面」という用語は、本発明の細胞を接着させることのできるあらゆる材料を指示する。例えば、当該材料は、ペトリ皿又は細胞培養フラスコのようなプラスチック材料で、その表面への哺乳類細胞の接着を促進するように処理され、例えばゼラチン、フィブロネクチン、ポリ−Ｄ−リジン又はその他の試薬で選択的にコートされる市販のポリスチレンプレートである。インキュベーションの後、非接着細胞と細胞断片を取り除くために、細胞は洗浄される。
【００３０】
細胞が増殖すると、これらは、適切なコンフルエンスに到達するまで、一般的には約８０％細胞コンフルエンスに達するまで、必要に応じて細胞培養用培地との置き換えが終わるまで、同じ培地の培養物中で、同じ条件下で維持され得る。望ましい細胞コンフルエンスに到達した後、細胞は、トリプシンのような脱離剤を使用し、適切な細胞密度（通常２，０００〜１０，０００細胞／ｃｍ２）のより大きな細胞培養表面に播種する、連続的継代によって増殖され得る。このようにして、細胞は、分化せずに、発生表現型を保持しながら、そのような培地で、少なくとも２回継代される。さらに好ましくは、細胞は、発生表現型を失わずに、少なくとも１０代（例えば、少なくとも１５代、又はさらに少なくとも２０代）継代され得る。一般的には、細胞は、約１００細胞／ｃｍ２〜約１００，０００細胞／ｃｍ２のような（例えば約５００細胞／ｃｍ２〜約５０，０００細胞／ｃｍ２、又はより具体的には約１，０００細胞／ｃｍ２〜約２０，０００細胞／ｃｍ２）望ましい密度で培養される。もっと低い密度で培養されるならば、（例えば約３００細胞／ｃｍ２）、細胞はより容易にクローンとして分離され得る。例えば数日後に、そのような密度で培養された細胞は、均質集団（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）に増殖する。
【００３１】
最後に、本発明の方法は、幹細胞を選択するステップ［ステップ（ｄ）］を含む。幹細胞は、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、フローサイトメトリーなどの従来の方法によって選択され得る。免疫細胞化学は、特異抗体の使用によって、細胞（培養細胞、細胞懸濁液）における特異的タンパク又は抗原の存在を推定するために使用される技術であり、特異抗体は特異的タンパク又は抗原に結びついて可視化し、顕微鏡による観察を可能とする。同業者において公知のように、染色される細胞は、以後の処置における取り扱いを容易にするため、固体支持体に接着され得るが、これはいくつかの方法で可能となる。接着性細胞は、顕微鏡スライド、カバーグラス、光学的に適切なプラスチック支持体などの上で発育し得る。一方、フローサイトメトリーはレーザーによる生物物理学的テクノロジーで、流体の流れの中に細胞を浮遊させ、電子検出装置を通過させて、細胞のカウント、ソーティング、バイオマーカー検出、プロテイン・エンジニアリングにおいて使用される。フローサイトメトリーの専門的なタイプとして、蛍光活性化細胞ソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）すなわちＦＡＣＳがある。これは生体細胞の不均一な混合物を、個々の細胞の特異的な光散乱と蛍光特性に基づき、１回に１個の細胞を、２つ以上のコンテナにソーティングする方法を提供する。これらの方法は、幹細胞を同定し選択するために検出される、例えば細胞表面マーカーなどの細胞マーカーとともに、当業者において広く知られている。
【００３２】
それが望ましいのであれば、幹細胞を単離するステップ及び手順は、手操作で実施可能である。或いは、そのような細胞を単離するプロセスは、１つ以上の適切な装置により、促進され、及び／又は自動化することができ、その具体例は当業者において公知である。実施例１は、ヒト子宮頸部組織から本発明の細胞を単離する方法を詳細に記載する。本発明の方法によりもたらされる結果として、子宮頸部幹細胞の均質な細胞集団が得られる。
【００３３】
このようにして、特定の実施態様において、単離された幹細胞は、
（ａ）細胞マーカー、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ビメンチン、サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ−２を発現し、
（ｂ）デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１からなるグループから選択される少なくとも１つの細胞マーカーを発現しない。
【００３４】
関心の対象となる表現型の確認は、従来の手段を使用して実施可能である。例えば、細胞表面マーカーなどの細胞マーカーは、通常、陽性／陰性選択に基づいた適切な従来の技術によって同定されることができ、例えば、細胞におけるその存在／非存在が確認されるべきである細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体が使用可能である。ただしその他の技術もまた、使用可能である。
【００３５】
ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ビメンチン、サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ−２細胞マーカーに対するモノクローナル抗体は、選択された細胞における当該マーカーの存在（又は当該マーカーの検出可能発現レベル）を確認するために使用され、デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１からなるグループから選択される細胞マーカーのうち少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、又は１２種の細胞マーカーに対するモノクローナル抗体は、それらの非存在を確認するために使用される。当該モノクローナル抗体は、公知の市販のものであり、或いは、従来の方法によって当業者により得られるものである。
【００３６】
別の特定の実施態様において、単離された幹細胞はさらに、
（ａ）増殖培地において、２４時間あたり０．４〜２．１倍加（ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）である増殖率と
（ｂ）線維芽細胞様の形態と、
（ｃ）少なくとも１０代の、好ましくは２０代の細胞継代の間の安定した核型と、
（ｄ）単層で増殖し、基質に接着する能力と、
（ｅ）内胚葉系（ｅｎｄｏｄｅｒｍａｌ）、外胚葉系（ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）、又は中胚葉系（ｍｅｓｏｄｅｒｍａｌ）に、好ましくは、脂質生成性（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ）、骨形成性（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ）、神経性（ｎｅｕｒａｌ）、又は筋細胞性（ｍｙｏｃｙｔｉｃ）の細胞系統（ｃｅｌｌ  ｌｉｎａｇｅ）に分化する能力と、
（ｆ）非腫瘍形成能力（ｎｏｎ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ）と、及び／又は
（ｇ）球体（ｓｐｈｅｒｅｓ）を形成する能力と、を示す。
【００３７】
別の特定の実施態様において、本明細書において開示される方法は、子宮頸部組織が非癌性の子宮頸部組織であり、好ましくは非癌性の哺乳類の子宮頸部組織であり、さらに好ましくは、ヒトの非癌性子宮頸部組織であることによって特徴づけられる。
【００３８】
「非癌性の子宮頸部組織」という用語は、癌又は悪性の組織のような子宮頸部組織とは異なる組織形態を有する正常な子宮頸部組織を指す。
【００３９】
本発明の方法により得られる幹細胞の詳細な開示は以下においてなされる。
【００４０】
以上の説明により、当業者は、単離された子宮頸部組織、好ましくは非癌性の単離された子宮頸部組織の使用、すなわち、子宮頸部幹細胞、好ましくは、非癌性の子宮頸部幹細胞を得るために、本来の環境（子宮頸部）から取り除かれて、その自然の状態から「ヒトの手によって」改変された組織の使用が、本発明の別の態様として考察されることを理解されよう。
【００４１】
〔本発明の細胞及び馴化培地〕
本発明の方法（上述された）を実地に移すことの帰結として、子宮頸部幹細胞が得られる。
【００４２】
このようにして、別の態様において、本発明は、以下において「本発明の細胞」と称される、単離された子宮頸部幹細胞に関し、当該細胞は、
（ａ）細胞マーカー、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ビメンチン、サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ−２を発現し、
（ｂ）デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１からなるグループから選択される少なくとも１つの細胞マーカーを発現しない。
【００４３】
本発明に関連して、「単離された」という用語は、人体又は動物体から単離された細胞について述べており、本細胞は、インビボ又はインビトロで、本細胞に結合した１つ以上の細胞を有さない。
【００４４】
本発明の方法により得られる幹細胞は、細胞マーカー、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ビメンチン、サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）、Ｋｌｆ４、Ｏｃｔ４、及びＳｏｘ−２を発現する。本発明に関連して、分析される細胞マーカーの「有意な発現」がある場合に、細胞が細胞マーカーを発現すると考えられる。本明細書で使用される「有意な発現」という表現は、本発明の細胞を含む細胞集団において、１０％より多くの、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より多くの、又はすべての細胞が、従来の方法及び装置（例えば当業者において公知の、市販の抗体及び標準プロトコールとともに使用されるベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム又はダコ（Ｄａｋｏ）  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓシステム）を使用して、フローサイトメトリー又は免疫細胞化学において、バックグラウンドシグナルを上回る、特定の細胞マーカーのためのシグナルを示すということを指示する。サイトケラチン（ＣＫＡＥ１ＡＥ３）にとって、「有意な発現」とは、巣状発現の存在を指示する。バックグラウンドシグナルは、従来のＦＡＣＳ分析において、個々の表面マーカーを検出するために使用される特異抗体と同じアイソタイプの非特異抗体によって与えられるシグナル強度によって定義される。このようにして、マーカーが細胞において「存在する」又は陽性であると考えられるためには、従来の方法及び装置（例えば当業者において公知の、市販の抗体及び標準プロトコールとともに使用されるベックマン・コールター  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム）を使用して、観察される特定のシグナルが、バックグラウンドシグナル強度より、１０％強く、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、５００％、１０００％、５０００％、１００００％、又はそれ以上に強い。
【００４５】
さらに、本発明の細胞は、デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１からなるグループから選択される少なくとも１つの細胞マーカーを発現しない。すなわち、細胞マーカーは、以下のマーカー、デスミン、アクチンＨＨＦ３５、β−カテニン、ｐ６３、Ｅ−カドヘリン、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＲＡ１−８１、ＣＤ４５、ＣＤ３４、及びＣＤ３１のうち少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、又は１２種に対し陰性である。
【００４６】
本明細書で使用される細胞マーカーに関して「陰性」とは、本発明の細胞を含む細胞集団において、１０％より少ない細胞、好ましくは９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又は少ない細胞が、従来の方法及び装置（例えば当業者において公知の、市販の抗体及び標準プロトコールとともに使用されるベックマン・コールター  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬ  ＦＡＣＳシステム又はダコ（Ｄａｋｏ）  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｐｌｕｓシステム）を使用して、フローサイトメトリー又は免疫細胞化学において、バックグラウンドシグナルを上回る、又はそうした細胞がないということを意味する。
【００４７】
有利には、実施例で示されるように、本発明の細胞は、他の有用な特徴を示す。こうして、特定の実施態様において、本発明の細胞はさらに、以下の特徴のうち、少なくとも１つ、好ましくは、全ての特徴を示す。
（ａ）増殖培地において、２４時間あたり０．４〜２．１の倍加（ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）である増殖率。
本発明の細胞の高い増殖速度は、幹細胞又は馴化培地の、素早い大量の生産を可能とする。これにより、以下が可能となる。（ｉ）これらの幹細胞のバイオロジーと使用方法を分析するために多数の実験を実施すること（これは、現在の技術で公知の低い増殖速度の間葉系幹細胞では面倒な作業である）；（ｉｉ）多量の幹細胞が短期間で得られることによる早い組織再生；（ｉｉｉ）抗炎症治療、抗腫瘍治療、及び抗感染治療における使用のために、素早く大量の幹細胞を得ること。
（ｂ）線維芽細胞様の形態。
（ｃ）少なくとも１０代の、好ましくは２０代の細胞継代の間の安定した核型、すなわち、細胞が、時間の経過において、細胞核における染色体の数と性状を維持する。
これにより、長期間において、幹細胞の機能性を確保することが可能となり、幹細胞の継代において再生可能で有効な薬剤が製造可能となる。
（ｄ）単層で増殖し、基質に接着する能力。
（ｅ）内胚葉系、外胚葉系、又は中胚葉系に、好ましくは、脂質生成系、骨形成系、神経系、又は筋細胞系に分化する能力。前記系の少なくとも１つに分化する選択された細胞の能力は、当業者に公知の従来の方法と通常のやり方で評価できる。
（ｆ）非腫瘍形成能力、すなわち腫瘍細胞を生じさせる変容行動又は増殖性表現型を呈しない。
（ｇ）球体を形成する能力、すなわち、懸濁培養において、細胞の塊り又はコロニーを形成する能力であり、マイトジェン因子（主として上皮成長因子（ＥＧＦ）及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ））の存在下で高い増殖性を示す。この能力は、インビトロで神経前駆細胞様を得るための潜在的な進路を表す。
【００４８】
特定の実施態様において、本発明の細胞は、ヒト由来であり、好ましくは月経期にないヒト由来である。
【００４９】
当業者は、本発明の細胞が細胞集団の一部であり得ることを理解されよう。故に、別の態様において、本発明は、以下において「本発明の細胞集団」と称される、本発明の細胞を含む単離された細胞集団に関する。
【００５０】
細胞集団に適用される「単離された」という用語は人体又は動物体から単離された細胞集団について述べており、当該細胞集団は、インビボ又はインビトロで、当該細胞集団に結合した１つ以上の細胞集団から、実質的にフリーである。
【００５１】
本発明によって提供される細胞及び細胞集団は、望ましければ、細胞集団のクローンを発生させる適切な方法を使用して、クローンとして増殖され得る。例えば、細胞の増殖させる集団を取出し、別のプレート（又はマルチウェルプレートのウェル）に播種され得る。或いは、細胞は、単一細胞を個々のウェルに配置するのを促進するための統計比率で、マルチウェルプレートにサブクローンされ得る。もちろん、細胞は、（例えばペトリ皿又は他の適切な基質において）低密度で培養し、クローニングリングのような装置を使用して他の細胞から単離することによってクローンとして増殖され得る。クローン集団の生産は、適切な培養培地での増殖でなされ得る。いずれにしても単離された細胞は、その発生表現型が評価され得る適切な時点に到るまで培養され得る。
【００５２】
さらに子宮頸部幹細胞に関して、本発明はまた、当該細胞の培養から得られる馴化培地を考察する。当業者が理解されるように、馴化培地は、本細胞自身の代わりに使用され得る、というのは、この馴化培地は本発明の細胞によって分泌される多くの化合物を提供するからである。
【００５３】
こうして別の態様において、本発明は、以下において「本発明の馴化培地」と称される馴化培地に関し、当該馴化培地は、
（ａ）本発明の単離された幹細胞又は本発明の細胞集団をインキュベートするステップと、
（ｂ）培養培地から細胞を取り除くステップと、を含む方法によって得られる。
【００５４】
本明細書で使用される「馴化培地」という用語は、培養細胞から、すなわち本発明の培養細胞（子宮頸部幹細胞）から採収される費やされた培地（ｓｐｅｎｔ  ｍｅｄｉａ）を意味する。馴化培地は、培養細胞によって培地中に分泌された代謝産物、成長因子、細胞外基質タンパク質を含む。個々の成分の例には、これに限定されるものではないが、グルコース、アミノ酸、ヌクレオシドなどの代謝産物、インターロイキン、ＥＧＦ（上皮成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）などの成長因子、コラーゲン、フィブロネクチン、種々のプロテオグリカンなどの基質タンパク質が含まれる。
【００５５】
本発明の馴化培地は、適切な条件の下に、細胞が活性化合物を培地に分泌するための十分な時間をかけて、本発明の単離された細胞を培養することによって生産される。本発明の細胞を培養するための、適切な細胞培養用培地は、例えばＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ−Ｆ１２又はａｌｐｈａ−ＭＥＭ、ＲＰＭＩなどに、ウシ胎仔血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ウシ新生児血清、ウシ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウマ血清、ヒト血清又はヒト血清因子、アミノ酸などのような適切な血清を５〜２５％（例えば、２０％）追加したものを含む。培養条件、すなわちｐＨ、温度などは、当業者の通常の一般知識である。一方、細胞の培養はバイオリアクターを使用して実施でき、バイオリアクターにより、大容量の培地と細胞に適した制御環境を管理できる。バイオリアクターは現行技術において広く知られており、その使用は当業者において日常的である。
【００５６】
培養後、培地は細胞を取り除くように処理される。これは、例えば、デカンテーション、遠心分離、濾過などの従来の方法で行ない得る。次いで、上清が馴化培地として収集され、４℃、−２０℃、−８０℃で、その機能性が維持され得る液体窒素又は別の条件で、例えばこれに限定されないが、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）、減圧下凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、或いはクリオデシケーション（ｃｒｙｏｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎ）で保存され、或いはただちに使用され得る。馴化培地は、濃縮又は希釈されるように、生産或いは処理され得る。さらに馴化培地の組成のすべて或いは一部は、合成され得る。
【００５７】
〔本発明の細胞の使用〕
本発明の細胞が単離されると、細胞及び細胞から得られた馴化培地は、医薬組成物を製造するために使用され得る。
【００５８】
こうして、別の態様において、本発明は、以下において「本発明の医薬組成物」と称される、本発明の単離された幹細胞、細胞集団、又は馴化培地、及び薬学的に受容可能なキャリア及び／又はアジュバントを含む医薬組成物に関する。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、予防的又は治療的に有効な量の本発明の細胞、細胞集団、又は本発明の馴化培地を含む。こうして、「予防的」又は「治療的に有効な量」という用語は、その薬理学的特性によって決定される治療効果を発揮させることのできる薬品の量を意味する。当該量は、望ましい効果をもたらすように計算され、一般的には、とりわけ、化合物の特性と患者の年齢・状態、障害又は疾患の重症度などの患者の特性、及び投与の経路と頻度を合わせて考慮したうえで決定されるであろう。
【００６０】
「薬学的に受容可能なキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、キャリアが、米国連邦政府又は各国政府の規制機関により承認されているか、或いは米国薬局方、ヨーロッパ薬局方、又は他の一般的に認められた薬局方において、動物において使用、そして特にヒトにおいて使用するものとして掲載されていることを意味する。「キャリア」という用語は、治療薬がこれらとともに投与される、希釈液、アジュバント、賦形剤、又はベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を意味する。組成物は、望ましければ、少量のｐＨ緩衝剤も含有できる。適切な薬剤キャリアの例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）に記載されている。そのような組成物は、患者への適切な投与の形態を提供するため、適切な量のキャリアとともに、好ましくは精製された形での本発明の細胞又は本発明の細胞集団、又は本発明の馴化培地の、予防的又は治療的に有効な量を含有する。調合は、投与方法に適合させるべきである。好ましくは、医薬組成物は無菌であり、対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）、好ましくは動物の対象、さらに好ましくは、哺乳類の対象、そして最も好ましくは、ヒトの対象への投与のための適切な形態である。
【００６１】
本発明の医薬組成物は種々の形態を取り得る。これらの形態には、例えば、凍結乾燥製剤、溶液又は懸濁液、注射剤などのような固形、半固形、液体投薬形態が含まれる。好ましい形態は、意図される投与方法と治療用途による。
【００６２】
本発明の細胞、細胞集団、又は馴化培地、或いはこれらを含む医薬組成物を、それらを必要とする対象に投与することは、従来の方法によって実施され得る。好ましくは、当該細胞又は細胞集団は、細胞を望ましい組織に、インビトロ又はインビボで、直接動物の組織に移行することを含む方法によって、対象に投与される。細胞又は馴化培地は、あらゆる適切な方法によって、望ましい組織に転移され得るが、その方法は、一般的に、組織型に応じて変化するであろう。例えば、細胞は、集団等を樹立するために、組織内の望ましい部位に播種され得る。細胞又は馴化培地は、カテーテル、トロカール、カニューレ、ステント、縫合糸（細胞とともに播種され、又は馴化培地に浸され得る）などのような器具を使用し、インビボで部位に移動され得る。
【００６３】
実施例で示されるように、本発明の細胞又は本発明の馴化培地は、患者の免疫系の調整が有益である疾患、例えばこれらに限定されないが、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植臓器及び移植組織の拒絶反応・慢性的病状・感染症などの免疫介在性疾患に関連した１つ以上の症状の予防、治療、改善のために使用され得る。さらに、抗腫瘍能のために、これらはまた、癌の治療又は予防のために使用され得る。さらに、これらの組織再生能力或いは組織再生を刺激する能力（再生医療）のために、これらは創傷治癒又は組織破壊に関連した他のプロセスにおいて使用され得る。
【００６４】
さらに、これらの組織再生能力或いは組織再生を刺激する能力（再生医療）のために、これらは創傷治癒又は組織破壊に関連した他のプロセスにおいて使用され得る。さらに、子宮頸管内粘液に物質を分泌する能力（精子が子宮頸管を通過して卵子に到達するのを援助する）ために、これらは受精過程において使用され得る。実施例に見られるように、本発明の細胞又は馴化培地は、新鮮な射精液で受精能を獲得した精子の特性を調整し、受精過程のため、適切な生殖細胞の選択を援助する。
【００６５】
こうして、別の態様において、本発明は、薬剤としての使用のための、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物に関する。
【００６６】
別の態様において、本発明は、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病態、感染症、組織喪失／破壊を伴う病気の治療又は予防における使用、又は受胎障害の診断、予後又は治療における使用のための、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物に関する。
【００６７】
本明細書で使用される「処置」（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）「処置する」（ｔｒｅａｔ）又は「処置すること」（ｔｒｅａｔｉｎｇ）は以下のことを意味する。（ａ）疾患又は病状に罹患しやすいと思われるがまだ疾患を有していると診断されていない対象において疾患又は病状が発生するのを防ぐこと；（ｂ）疾患又は病状を抑制する、すなわち、進展を阻止すること；（ｃ）疾患又は病状を和らげ及び／又は改善する、すなわち疾患又は病状を軽減させること；或いは（ｄ）疾患又は病状を治す、すなわち進展又は進行をストップすること。本発明の幹細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物によって処置される対象の集団には、望ましくない病状又は疾患を患っている患者とともに、病状又は疾患の発現のリスクをかかえている対象が含まれる。本発明において、処置されるべき疾患とは、癌、前癌病変、炎症性疾患、自己免疫疾患、移植臓器及び移植組織の拒絶反応・慢性的病状・感染症などの免疫介在性疾患、組織破壊又は組織喪失を伴う疾患及び受胎障害から選択される。
【００６８】
「疾病」（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）及び「疾患」（ｄｉｓｅａｓｅ）という用語は、対象の病状を言うために区別なく使用される。
【００６９】
「癌」という用語は、通常は細胞増殖、細胞分化、及び細胞生存を支配する統制手段の機能不全によって生じる疾患の種類を意味し、これによって悪性の転換を起こす細胞（癌細胞又は腫瘍細胞とも称される）を生じさせ、周囲組織に浸潤し（そして悪性腫瘍を形成し）、転移と称されるプロセスにおいて、最後には身体の他の部位に拡散し、二次性腫瘍を樹立する。さらに、本発明に関連して、「腫瘍」という用語は異常な組織塊を意味し、良性と悪性の両方の組織塊を含む。良性組織塊も、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物で処置されうる。
【００７０】
例示的な癌としては、これらに限定されないが、副腎皮質癌、エイズ関連癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、肛門直腸癌、肛門管癌、虫垂癌、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、胆管癌、肝外胆管癌、肝内胆管癌、膀胱癌、骨及び関節の癌、骨肉腫及び悪性線維性組織球腫、脳癌、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、天幕上未分化神経外胚葉性腫瘍、視経路及び視床下部膠腫、乳癌、気管支腺腫／カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化器癌、神経系の癌、神経系リンパ腫、中枢神経系の癌、中枢神経系リンパ腫、子宮頸癌、小児癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候グループ、子宮内膜癌、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、胆嚢癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍、頭頸部癌、肝細胞（肝臓）癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、眼癌、膵島腫瘍（内分泌膵臓）、カポジ肉腫、腎臓癌、腎癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓癌、喉頭癌、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリーセル白血病、口唇及び口腔癌、肝臓癌、肺癌、非小細性胞肺癌、肺小細胞癌、エイズ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、髄芽腫、眼内黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性扁平頸部上皮癌、口腔癌、舌癌、多発性内分泌腫瘍症候グループ、菌状息肉腫、骨髄異形成症候グループ、骨髄異形成／骨髄増多症、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性症候グループ、鼻咽腔癌、神経芽細胞腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔咽頭癌、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣低悪性度腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、膵臓癌、副鼻腔及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体芽腫及びテント上未分化神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎盂尿管移行上皮癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮癌、子宮肉腫、皮膚癌（非黒色）、皮膚癌（黒色腫）、メルケル皮膚細胞癌、小腸癌、軟部組織肉腫（ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｒｃｏｍａ）、扁平上皮癌、胃癌、テント上未分化神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫、胸腺腫と胸腺癌、甲状腺癌、腎盂・尿管・他の泌尿器の移行上皮癌、妊娠性絨毛腫瘍、尿道癌、子宮肉腫、子宮体癌、膣癌、外陰癌、及びウィルムス腫瘍が含まれる。
【００７１】
「前癌病変（ｐｒｅｃａｎｃｅｒｏｕｓ  ｌｅｓｉｏｎ）」という用語は、癌発生のリスク増加と関連する組織学的変化を示す病変を意味する。
【００７２】
「炎症性疾患」という用語は、例えば慢性炎症などの炎症によって特徴づけられる患者の状態を意味する。本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物によって処置され得る炎症性障害の、非限定的例としては、これらに限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、喘息、脳炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性骨溶解、アレルギー性疾患、敗血症性ショック、肺線維症（例えば、特発性肺線維症）、血管炎（例えば結節性多発動脈炎、ウェグナー肉芽腫、高安動脈炎、側頭動脈炎、及びリンパ腫様肉芽腫症）、外傷後血管形成（例えば血管形成後の再狭窄）、慢性ウイルス又は細菌感染から生じる未分化若年性脊椎関節症・未分化関節症・関節炎・炎症性骨溶解・慢性肝炎及び慢性炎症が含まれる。
【００７３】
「自己免疫疾患」という用語は、患者の自分自身の細胞、組織及び／又は器官に対する免疫反応によって生じる、細胞障害、組織障害及び／又は臓器障害によって特徴づけられる患者の状態を意味する。本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物によって処置され得る自己免疫疾患の非限定的例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎と精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労免疫機能障害症候グループ（ＣＦｌＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、クレスト症候群、寒冷凝集素症、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、原発性線維筋痛症、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー・橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫介在性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候グループ、サルコイドーシス、強皮症、全身性進行性硬化症、シェーグレン症候群、グッドパスチャー症候グループ、スティッフマン症候グループ、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎・白斑・ウェゲナー肉芽腫症などの血管炎が含まれる。
【００７４】
「慢性病態」（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）という用語は、長期にわたって継続する疾患によって特徴づけられる患者の状態を意味し、病状は安定しているかゆっくり進行し、いつも症状を呈しているか小康状態にあり、繰り返し再発する。本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物によって処置され得る慢性疾患の非限定的例としては、循環器疾患、心臓疾患、脳卒中、癌、これらに限定されないが喘息又は慢性閉塞性肺疾患のような慢性呼吸器疾患、糖尿病、関節炎、肥満、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、虫歯、歯周病、慢性の耳の感染症、緑内障及び慢性のウイルス又は細菌による感染が含まれる。
【００７５】
「感染症」という用語は、細菌、ウイルス、寄生生物又は真菌類のような病原微生物の、生物体における存在によって特徴づけられる対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）の状態を意味する。本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物によって処置され得る感染症の非限定的例としては、インフルエンザ、鳥インフルエンザ、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、レジオネラ症、敗血症、結核、ブルーリ潰瘍、トリパノソーマ症、出血熱（例えばマールブルグ出血熱、エボラ出血発熱やデング出血熱）、肝炎（例えばＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎）、髄膜炎（例えば、髄膜炎菌性髄膜炎）、コレラ、黄熱病、マラリア、ハンセン病が含まれる。
【００７６】
前述の定義における「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」という用語は、これらに限定されないが、哺乳類、好ましくは、霊長類動物、さらに好ましくはヒトを含むすべての動物を意味する。こうして、本発明の単離された幹細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物は、前述の疾患を患ったすべての動物の処置に使用され得る。
【００７７】
「組織破壊」又は「組織喪失」という用語は、（ａ）組織塊のあるパーセンテージが取り除かれるか、又はｂ）当該組織を含む細胞の内部パターンと細胞の一定数が損傷を受けたり殺されたりして、一定の細胞数及び／又はパターンが残る疾患を意味する。組織破壊又は組織喪失を伴う疾患の例は以下から選択される。ドライアイ疾患のような眼表面疾患、角膜創傷；又は加齢黄斑変性症のような網膜疾患、網膜ジストロフィー変性；又は視神経症、緑内障、ブドウ膜炎；又は皮膚疾患、心臓疾患、腎疾患；又は中枢神経系、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症又は脊髄性筋萎縮症。
【００７８】
「受胎障害」という用語は、これらに限定されないが、卵子の質の悪さ、ホルモンの欠乏又は不均衡による排卵不全、不規則排卵、及び多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）などの排卵に関連する問題；又はこれらに限定されないが、異常な精子、不十分な精子、低運動性などの精子に関連する問題によって、子を妊娠するうえでの問題を意味する。故に、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物が、男性及び女性における受胎障害を治療するために、使用されうる。
【００７９】
「生殖細胞」（ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）という用語は、精母細胞又は卵母細胞のような生殖細胞（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）又は生殖細胞（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ）に発達する細胞を意味する。
【００８０】
「適切な生殖細胞」（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌｓ）という用語は、受精過程のあと接合体（ｚｙｇｏｔｅｓ）になる生殖体（ｇａｍｅｔｅｓ）を示す。生殖体が接合体になり得るかどうかを決定するためのアッセイは現行技術により公知の形態であり、当業者により通常実施されるものである。
【００８１】
本発明はまた、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物を、癌、前癌病変、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病状、感染症、組織喪失に関連した疾患の予防又は治療のため、或いは受胎障害の診断、予後、又は治療のため、併用療法において使用することついて考察する。
【００８２】
「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物を、これらに限定されないが、癌、前癌病変、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病状、感染症などの疾患、或いは移植された臓器及び組織の拒絶反応などの免疫介在性疾患、また組織喪失及び受胎障害に関連した疾患、に関連した１つ以上の症状の改善のため本発明の方法で、他の活性薬剤又は処置モダリティー（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ）と共に使用することを示す。これらの他の薬剤又は治療法には、そのような疾患の治療のための公知の薬物及び療法が含まれる。本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物はまた、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病状の治療に有用なコルチコステロイド、非ステロイド系抗炎症性化合物、又は他の薬剤と併用され得る。本発明の薬剤の他の療法又は処置モダリティーとの併用使用は、同時でも、逐次使用でも良く、すなわち、２つの治療法は分割されてもよく、本発明の細胞集団又は医薬組成物を含む細胞集団又は医薬組成物は、他の療法又は処置モダリティーの前又は後に使用され得る。担当医は、本発明の細胞集団又は医薬組成物を含む細胞集団又は医薬組成物が、他の薬剤、療法又は処置モダリティーと併用される場合において、その適切な投与順序を決定できる。
【００８３】
別の態様において、本発明はまた、美容的処置における使用のための、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物に関する。
【００８４】
本発明において、「美容的処置」という用語は、皮膚の外観の改善のための処置、例えば、特に老化した皮膚への投与、特に、しわ、ひだ、くぼみ（セルライト）のできた皮膚への投与により皮膚テクスチャーを改善する、或いはやけどによる外観を改善する、という処置を示す。この場合において、美容処置用調剤は、好ましくは、クリーム、ローション、ジェル又はワックスとして調合され、美容効果を高めるための化合物を含んでもよい。美容処置用調剤は、好ましくは皮膚に対し、皮下に、経皮的に投与され、局所的、経皮的、皮内、表皮内のいずれかで使用される。有利的には、本発明の幹細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物は、現行技術で公知の化粧品用フィラーと同じ程度の容易さで投与され得る。幹細胞調剤又は馴化培地は、皮膚テクスチャーを改善しなければならないエリアのいくつかのスポット、例えば、しわ、ひだ、くぼみのできた皮膚のまわり及び／又は下に、好ましくは、１スポット当たり２００μＬ〜２ｍＬ、最も好ましくは０．５ｍＬ〜２ｍＬを注入してもよい。
【００８５】
別の態様において、本発明は、腫瘍細胞の増殖及び／又は転移、単球分化、病原性微生物の増殖及び／又は複製、又は末梢血単核細胞の増殖を抑制又は減少させるため、或いは腫瘍細胞のアポトーシスを強化又は誘発するため、或いは組織再生（再生医療）を増強するため、或いは受胎障害の診断、予後、又は処置のため、或いは生殖細胞の選択における使用のための、本発明の単離された幹細胞、細胞集団、馴化培地又は医薬組成物に関する。
【００８６】
腫瘍細胞の増殖及び／又は転移を「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」又は「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」という用語は、腫瘍細胞の細胞分割をストップする、ブロックする、又は防ぐことのそれぞれ、又は１つの器官又は器官の一部から、別の隣接しない器官又は器官の一部へ、腫瘍細胞が広がるのをストップする、ブロックする、又は防ぐことのそれぞれを示す。類似的に、腫瘍細胞の増殖及び／又は転移を「減少させる」という用語は、腫瘍細胞の細胞分割を少なくすること、又は、１つの器官又は器官の一部から、別の隣接しない器官又は器官の一部へ、腫瘍細胞が広がるのを少なくすることをそれぞれ示す。
【００８７】
単球分化及び／又は末梢血単核細胞の増殖を「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」又は「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」という用語は、単球が分化してマクロファージになることをストップする、ブロックする、又は防ぐことのそれぞれ、或いは末梢血単核細胞の細胞分割をストップする、ブロックする、又は防ぐことのそれぞれを示す。類似的に、「単球分化及び／又は末梢血単核細胞の増殖を減少させる」という用語は、単球が分化してマクロファージになるのを少なくすること、或いは末梢血単核細胞の細胞分割を少なくすることそれぞれを示す。
【００８８】
病原微生物の増殖及び／又は複製を「抑制する（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」又は「抑制（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」という用語は、微生物の細胞分割をストップする、ブロックする、又は防ぐことを示す。結果として、微生物の数は減少するか、又は一定数を保つ。
【００８９】
「腫瘍細胞のアポトーシスを強化する」という表現は、「腫瘍細胞のアポトーシスを誘発する」という表現に類似しており、両方とも腫瘍細胞のプログラム細胞死のプロセスを増加させる又は誘発することを意味する。腫瘍細胞の増殖及び／又は転移の抑制又は減少、単球分化、病原微生物の増殖及び／又は複製又は末梢血単核細胞の増殖を測定する方法は、本明細書の実施例において示され、同時に、腫瘍細胞のアポトーシスが強化されているか或いは誘発されているかどうかをチェックするための方法も示される。これらの方法はすべて現行技術において広く知られており、当業者において、日常的に実施されるものである。
【００９０】
一方、本発明はまた、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物を含むキットについて、と同時に、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病状又は感染症、組織破壊又は組織喪失に関連した疾患、受胎障害の治療又は予防のために、そして腫瘍細胞の増殖及び／又は転移、単球分化、又は末梢血単核細胞の増殖を抑制する又は減少させるために、或いは腫瘍細胞のアポトーシスを強化し又は誘発するために、或いは組織再生を強化し又は誘発するために、或いは疾患の診断、予後又は治療における使用のために当該キットを使用することについて、考察をおこなう。本発明はまた、本発明のキットを美容目的のために使用することを含む。
【００９１】
さらに、本明細書で開示される、本発明の細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物の使用と同等の、対応する治療の方法も、本発明に関連して考察される。
【００９２】
この意味において、別の態様において、本発明は、治療的に有効な量の本発明の単離された幹細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物を被験対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することを含む処置又は予防を必要とする被験対象において、癌、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性的病態又は感染症、組織破壊又は組織喪失に関連した疾患、又は受胎障害の治療のための方法に関する。
【００９３】
さらに、本発明は、治療的に有効な量の本発明の単離された幹細胞、細胞集団、馴化培地、又は医薬組成物を対象に投与することを含む処置又は予防を必要とする対象において、腫瘍細胞の増殖及び／又は転移、単球分化、又は末梢血単核細胞の増殖を抑制する又は減少させるための、或いは腫瘍細胞のアポトーシスを強化し又は誘発するための、或いは組織再生を強化し又は誘発するための、或いは生殖細胞の選択の強化のための、或いは受胎障害の診断、予後、又は処置における使用のための、方法に関する。
【００９４】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する当業者のいずれかによって理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料は、本発明の実施において使用可能である。明細書及び特許請求の範囲を通じて、用語「含む又は含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその変形語は、他の技術的特徴、添加物、成分、又は工程を排除することを意図していない。本発明のさらなる目的、利点及び特徴は、明細書の検討により当業者に明らかになるか、又は本発明の実施によって当業者に知得され得る。以下の実施例、図面及び配列表は、例示のために提供され、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００９５】
〔実施例１：ヒト子宮頸部幹細胞の単離及び特性分析〕
［Ｉ−材料と方法］
〔ヒト子宮頸部幹細胞の単離と増殖〕
ヒト子宮頸部幹細胞（ｈＵＣＥＳＣ）は、日常的な婦人科の診察の間に、子宮頸部の剥離から得られた。簡単に述べるなら、子宮頸管粘液を構成要素に分解できるトリプシン、コラゲナーゼ、又は他の酵素で分解された。次いでサンプルは４００ｇで５分間遠心分離され、ペレットは集められて培養プレートに播種された。ウェルには、接着可能とするため、１％ゼラチン又はフィブロネクチン又は他の基質をあらかじめコートした。サンプルは、ダルベッコー改良イーグル培地（栄養成分混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ−Ｆ１２）、グルタミン、抗生物質の存在下又は不存在下、血清、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、インスリン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムを含んで）で培養された。細胞の植え継ぎ培養は、トリプシン又は組織・細胞分散化剤（ａｃｃｕｔａｓｅ）又は他の蛋白質分解酵素及び／又はコラーゲン溶解酵素とともに実施された。
【００９６】
〔フローサイトメトリー特性分析〕
ヒト子宮頸部幹細胞（ｈＵＣＥＳＣ）は、特定のモノクローナル抗体のパネル、すなわちＣＤ２９−ＰＥ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、ＣＤ９０−ＰＥ、ＣＤ１０５−ＰＥ、ＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ（ベックマン・コールター）、ＣＤ４４−ＰＥ、ＣＤ７３−ＰＥ、ＣＤ３１−ＰＥ、ＴＲＡ１−８１−ＦＩＴＣ（ベクトン・ディッキンソン、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ＣＤ３４−ＦＩＴＣ、ＣＤ１１７−ＰＥ及びＣＤ１３３−ＰＥ（ミルテニーバイオテク）で染色された。死滅細胞を識別するため、７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ）（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が付加された。免疫表現型検査が、異なるチューブに等量に分割された同じ細胞に対して実施された。染色された細胞は、ＰＢＳに再度懸濁され、ＣｙｔｏｍｉｃｓＦＣ５００  フローサイトメーター（ベックマン・コールター）を使用して分析された。計算されたデータは、ベックマン・コールター社が提供するＣＸＰソフトウェアを使用して分析された。
【００９７】
〔免疫細胞化学特性分析〕
ヒト子宮頸部幹細胞細胞（ｈＵＣＥＳＣ）は、上述したように培養された。免疫細胞化学のための処理をおこなう前に、３×１０４の細胞がスライドに播種され、９６％エタノールに１０分間固定された。マウスの腫瘍は１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間浸漬固定され、通常のとおりにパラフィンに包埋された。
【００９８】
厚さ４μｍの切片標本が、Ｆｌｅｘ  ＩＨＣ  顕微鏡スライド（ダコ（Ｄａｋｏ）、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に載置された。免疫組織化学的（ＩＨＣ）技術は、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ  ４８（ダコ）で自動的に実施された。ＦＬＥＸ  で、直ちに使用可能なＣＫ（クローンＡＥ１／ＡＥ３）、Ｅ−カドヘリン（クローンＮＣＨ−３８）、ビメンチン（クローンＶ９）、デスミン（クローンＤ３３）、アクチン（クローンＨＨＦ３５）、平滑筋アクチン（クローン１Ａ４）、及びβ−カテニン（クローンβ−カテニン−１）対するダコ社の一次抗体が使用された。Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）からのｐ６３（クローン４Ａ４）に対する直ちに使用可能なモノクローナル抗体も使用された。ＫＬＦ４、ＯＣＴ４、及びＳｏｘ２一次抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ及びＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈのそれぞれから得られた。エピトープ回復は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ標的回復（ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）溶液（ｐＨ９）を使用し、マイクロ波で２０分間実施された。ｐ６３以外のすべての抗体は、室温で２０分間インキュベートされ、ｐ６３は３０分間インキュベートされた。検出システムとして、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ／ＨＲＰ  ダコ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びアフィニティー単離されたヤギ抗マウス及び抗ウサギ免疫グロブリンと接合されたデキストランポリマー）を２０分間使用した。Ｅ−カドヘリンのために、マウスリンカー（ダコ）が加えられた。
【００９９】
〔増殖率〕
ｈＵＣＥＳＣの増殖率は、１２日間毎日、二つ組のウェルの細胞の総数を数えて測定された。最初に細胞は、６ウェルプレート培地にウェル当たり２，０００個播種された。
【０１００】
〔スフェロイド形成及び脂肪分化〕
ｈＵＣＥＳＣは、スフェロイドが写真に撮られた後、６０ｍｍディッシュで５〜７日間、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ｖｏｌ／ｖｏｌ）  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ＥＧＦ）及び５ｎｇ／ｍＬ線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンにおいて、培養された。脂肪分化をひき起こすため、ｈＵＣＥＳＣは、６０ｍｍディッシュで１２日間、ｈＭＳＣ分化培地キット−脂肪生成培地（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）において培養され、次いでオイルレッド  Ｏ染色（Ｓｉｇｍａ）のため、ホルムアルデヒド固定された。
【０１０１】
〔馴化培地製造〕
細胞は、３×１０４細胞／ｃｍ２の密度で、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳと抗生物質を伴うＦ１２培地）において、プレート培養された。４８時間後、細胞はリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄され、次いで、ＤＭＥＭ（ＦＢＳ不存在のＦ１２）で２４時間又は４８時間培養された。次いで、培地は馴化培地（ＣＭ）として集められ、１０分間３００ｇで遠心分離され、直ちに使用され、又は−２０℃で保存された。
【０１０２】
［ＩＩ−結果］
子宮頸部の剥離から得られたヒト子宮頸部幹細胞（ｈＵＣＥＳＣ）は、免疫細胞化学とフローサイトメトリーを使用して、免疫表現型のために検査された。図１Ａに示されるように、ｈＵＣＥＳＣは、β−カテニンとビメンチン抗体で陽性に免疫標識され、いくつかのびまん性の巣状細胞もまた、パン−サイトケラチン（ｐａｎ−ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）抗体に対し陽性である。さらに、ｈＵＣＥＳＣは、胚性幹細胞に特有の３転写因子、すなわちＯＣＴ４、ＫＬＦ４、及びＳｏｘ２の強い発現を示す（図１Ｂ）。ｈＵＣＥＳＣ表現型はまた、フローサイトメトリーによって測定された。われわれは、これらの細胞が、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、及びＣＤ９０に対し陽性であり、一方それらがＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１３３（造血マーカー）、ＣＤ１１７、ＣＤ３１、ＴＲＡ−１−８１（胚性幹細胞表面マーカー）、及びＨＬＡ−ＤＲ（図１Ｃ）に対し陰性であることを見出した。
【０１０３】
ｈＵＣＥＳＣ細胞の特性をさらに評価するために、それらはスフェロイドを形成するように誘発された。７日間培養した後で、個々の細胞は、血清を含まない馴化培地における懸濁培養で維持された。７日後、細胞は、クローンのスフェロイド構造を形成した（図１Ｄ）。
【０１０４】
また、ｈＵＣＥＳＣの増殖率は、１２日の間毎日、二つ組（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）のウェルの細胞の総数を数えて測定された。ｈＵＣＥＳＣは、２４時間当たり０．４〜２．１倍加（ｄｕｂｌｉｎｇｓ）の増殖率を示している（図２）。
【０１０５】
〔実施例２：炎症関連の実験〕
［Ｉ−材料と方法］
〔免疫原性アッセイ〕
一方向混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイが、ヒト子宮頸部幹細胞（ｈＵＣＥＳＣ）の免疫原性を測定するために使用された。ＭＬＲは、９６−ウェル微量定量プレートで、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ１６４０培地を使用して実施された。２人の異なるドナー由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、１人のドナーから１ウェル当たり、細胞２×１０５個がプレート培養された。少なくともＰＢＭＣの一つがｈＵＣＥＳＣ試験細胞に対し大きなミスマッチである可能性を最大化するために、異なるドナーが使用された。アッセイで使用される刺激細胞は、自己ＰＢＭＣ（ベースライン反応）、同種異系ＰＢＭＣ（正の制御反応）、及びｈＵＣＥＳＣ細胞集団を含んでいた。刺激細胞は、培養ウェル（ウェル当たり２×１０４細胞、１０％刺激細胞）に添加される前に、マイトマイシンＣ処理が施された。追加的なコントロールは培地のみでプレート培養されたＰＢＭＣ（刺激細胞含まず）、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激されたＰＢＭＣ、及びマイトマイシンＣのみで処理されたｈＵＣＥＳＣから成る培養である。各処理のため、三つ組（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）培養が実施された。増殖は、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）  ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって評価された。生きている（代謝的に活性な）細胞は、テトラゾリウム塩を色のついたホルマザン化合物に還元したが、死滅細胞はこうしたことはおこなわない。こうして、テトラゾリウム塩ベースの比色アッセイは、増殖できる細胞のみを検出する。サンプルの吸光度は、微量定量プレートリーダーを使用した、ブランクとしてのバックグラウンドコントロールに対する測定であった。ホルマザン生成物の吸光度を測定するための波長は、４２０〜４８０ｎｍ（約４４０ｎｍで吸収最大化）である。参照波長は、６００ｎｍを上回るべきである。
【０１０６】
〔単球分化の抑制〕
この試験のためにＵ９３７細胞株が使用された。細胞は、２４ウェルプレートにおいて１ウェル当たり細胞１．５×１０５個の密度で、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳと抗生物質を含むＦ１２）でプレート培養された。２ｎｇ／ｍＬのホルボール１２−ミリスチン酸１３−酢酸（ＰＭＡ：ｐｈｏｒｂｏｌ  １２−  ｍｙｒｉｓｔａｔｅ  １３−ａｃｅｔａｔｅ）が添加され、タンパク質キナーゼＣを活性化するＰＭＡ処理は、マクロファージの分化と関連した接着の増大と表面マーカーの発現によって反映される、Ｕ９３７細胞におけるより大きな分化をひき起こす。コントロールウェルにおいて、ＰＭＡ溶液は付加されなかった。２４時間後、培地は、ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地、又はヒト組織脂肪由来の幹細胞（ＡＳＣ，ＳｔｅｍＰｒｏ（Ｒ），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの馴化培地に変更され、試験ウェルでさらに２４時間培養された。追加的試験は、馴化培地の存在下でＰＭＡを有する刺激されたＵ９３７細胞株から成った。上清は集められ、接着性細胞は洗浄され、トリプシン処理され、対応するチューブに集められた。細胞は、５分間、２００ｇで遠心分離され、ＰＢＳ１００μＬ中に再懸濁された。マクロファージへの分化は、フローサイトメトリー分析により、単球分化マーカーＣＤ１１ｂの発現によってモニターされた。細胞は、細胞生存率を評価するため、ＰＥ−ＣＤ１１ｂモノクローナル抗体と７−ＡＡＤで染色された。Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ）抗原は、もともとは、マクロファージのための細胞表面マーカーとして記述されていた。Ｍａｃ−１抗原は、Ｃ３ｂｌでコートされた粒子の接着及び食作用を、顆粒球とマクロファージによって媒介する。さらに、Ｍａｃ−１は、顆粒球走化性、表面接着性、凝集性などの広範な接着に依拠した機能を媒介すると思われる。
【０１０７】
〔馴化培地を有するＰＢＭＣ増殖の抑制〕
健康なボランティアからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）密度勾配遠心分離によって、２０ｍＬのヘパリン加末梢血から単離された。界面より回収された細胞は、ＰＢＳで２回洗浄され、追加されたＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁された。ＰＢＭＣ生存率はトリパンブルー排除によって測定された。単離されたＰＢＭＣの一定分量が冷凍され、次に使用するまで−８０°で冷凍された。実験のため、ＰＢＭＣの冷凍された一定分量が、８人の血縁でないドナーからランダムに選ばれ、解凍されて使用された。
【０１０８】
ＰＢＭＣ増殖のアッセイのために、単離されたＰＢＭＣは、（１ウェルあたり細胞２×１０５個で）、４日間、９６−ウェル平底微量定量プレートで、ＤＭＥＭ（ＦＢＳを含まず、馴化培地（ｈＵＣＥＳＣ又はＡＳＣからの）を有し、１μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）で刺激されたＦ１２）中で、培養された。ＰＢＭＣのみ、及びデキサメタゾン１０−６Ｍを含むＣｏｎＡ刺激を受けたＰＢＭＣは、それぞれ基底の増殖コントロール及び抑制コントロールとして機能した。増殖は、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１によって評価された。このアッセイは、増殖できる細胞のみを検出する。サンプルの吸光度は、微量定量プレートリーダーを使用した、ブランクとしてのバックグラウンドコントロールに対して測定された。
【０１０９】
［ＩＩ−結果］
一方向ＭＬＲアッセイは、ｈＵＣＥＳＣの免疫原性を評価するために実施された。ＰＢＭＣの増殖は、マイトマイシンＣ処理された刺激細胞の存在下、代謝的に活性な生体細胞の増加数に基づいて測定された。自己及び同種異系のＰＢＭＣは、それぞれ陰性及び陽性の刺激細胞コントロールとして機能した。ＣｏｎＡ刺激を受けたＰＢＭＣは、他の陽性刺激コントロール細胞として機能した。図３に示されるように、ｈＵＣＥＳＣは、ＭＬＲアッセイにおいて、Ｔ細胞増殖を誘導しなかった。
【０１１０】
さらに、マクロファージへの分化は、フローサイトメトリー分析により、単球分化マーカーＣＤ１１ｂの発現によってモニターされた。図４において、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地の存在下において、刺激された単球分化の抑制が示された。Ｕ９３７  ＣＤ１１ｂ  発現の基底レベルは３４％であり、ＰＭＡ処理されたコントロールＵ９３７細胞と比較すると、ＣＤ１１ｂに対し陽性と染色された細胞のパーセンテージは、ＰＭＡ処理されたＵ９３７細胞における７３％から、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地処理されたＵ９３７細胞における４８％に減少した。ＡＳＣ馴化培地で処理されたＵ９３７細胞に対するＣＤ１１ｂ発現のパーセンテージは６７％であった。Ｕ９３７細胞の生存率が、あらゆる条件において、８０％より高かったことは注目に値する。これらのデータは、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地の存在下における単球分化の抑制又は保護を示す。図５において、２４時間の刺激及びｈＵＣＥＳＣ馴化培地の添加において、単球分化の抑制が示されている。Ｕ９３７  ＣＤ１１ｂ発現の基底レベルは３８％であり、ＰＭＡ処理されたコントロールＵ９３７細胞と比較すると、ＣＤ１１ｂに対し陽性と染色された細胞のパーセンテージは、ＰＭＡ処理されたＵ９３７細胞における８２％から、２４時間（ＣＭ  ２４時間）産生されたｈＵＣＥＳＣ馴化培地で処理されたＵ９３７細胞における４８％、及び、４８時間（ＣＭ  ４８時間）産生された馴化培地で処理されたＵ９３７細胞における３４％に、減少した。それにもかかわらず、ＡＳＣ  ＣＭで４８時間処理されたＵ９３７細胞におけるＣＤ１１ｂの発現は７７％であった。Ｕ９３７細胞の生存率が、あらゆる条件において、８０％より高かったことは注目に値する。これらのデータは、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地の存在下でかつ４８時間の馴化培地の場合においての単球分化の抑制を示し、ＣＤ１１ｂ陽性細胞のパーセンテージは明らかにＵ９３７基底レベルと同じである。
【０１１１】
図６において、馴化培地をともなうＰＢＭＣ増殖の抑制が示される。ｈＵＣＥＳＣ馴化培地は、２４時間と４８時間の両方とも、ＰＢＭＣ増殖を抑制した。ＡＳＣ馴化培地をともなう場合よりもｈＵＣＥＳＣ馴化培地をともなう場合において、抑制はより効果的であった。ｈＵＣＥＳＣ馴化培地による抑制の大きさは、デキサメタゾンによる抑制の大きさを上回った。デキサメタゾンは、かなり強力な抗炎症薬であり、これらのデータは、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地の高い抗炎症ポテンシャルを示唆する。
【０１１２】
〔実施例３：癌関連実験〕
［Ｉ．−材料及び方法］
〔細胞培養〕
ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（ヒト乳腺癌細胞株）は、細胞培養ヨーロッパコレクション（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓ．，ＵＫ）から入手し、ＨＴ２９（結腸直腸腺癌細胞株）及びＡＧＳ（胃腺癌細胞株）は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。これらの細胞株は、９０−ｍｍ  ペトリ皿で、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補給されたＤＭＥＭにおいて、空気−ＣＯ２（９５：５）雰囲気で、３７°Ｃにおいて増殖された。コンフルエントな細胞は、リン酸塩緩衝食塩水で２回洗浄され、ＰＢＳにおいて、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）での簡単なインキュベーションによって採収された。ヒト子宮頸部幹細胞（上記のように得られたｈＵＣＥＳＣ）、ヒト乳腺腫瘍からの初代培養、及びヒト組織脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ，ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、９０−ｍｍペトリ皿で、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補給されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）において、空気−ＣＯ２（９５：５）雰囲気で、３７°Ｃにおいて増殖された。
【０１１３】
ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地（ＣＭ）、ＡＳＣ、ＭＣＦ−７、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１が、ＤＭＥＭ−Ｆ１２（１０％ＦＢＳ）において細胞を７０％コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで培養することによって得られた。次いで、細胞はＰＢＳにおいて３回洗浄され、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２において、再度培養された。２４時間又は４８時間後、培地は、１０分間、３００ｇで遠心分離され、上清は集められて直ちに使用された。
【０１１４】
三次元細胞培養が実施された。簡略には、培養スライドが６０μＬの氷冷マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコートされ、３７°Ｃで２０分間インキュベートされてマトリゲルを凝固させた。細胞は、５分間、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（トリプシン２．５ｇ／Ｌ、ＥＤＴＡ０．３８ｇ／Ｌ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理された。２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のマトリゲルを補給された、培地の容積１００μＬ当たり５×１０３個の細胞を含む単一細胞の懸濁液は、凝固したマトリゲルの上に注意深く置かれた。細胞をマトリゲルに接着させるために、インキュベーションが３７°Ｃで３０分間実施された。培養スライドは次いで、６−ウェルプレートに置かれ、１ウェル当たり５００μＬの培地が追加され、細胞は１０日間培養された。ｈＵＣＥＳＣは次いで、１週間、異なる培地（１０％ＦＢＳを含む（＋ＦＢＳ）ＤＭＥＭ−Ｆ１２、ＦＢＳを含まない（−ＦＢＳ）ＤＭＥＭ−Ｆ１２、又はｈＵＣＥＳＣからの４８時間馴化培地）で処理された。単層としての、又は三次元培養における細胞の位相差写真が、オリンパスＤＰ７２カメラで撮影された。球体の直径の計量は、球体の直径を直線により手でトレースし、任意の長さの単位でその値を測ることにより実施された。
【０１１５】
〔共培養（Ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅｓ）〕
細胞は、上述のように培養された。培地は７０％コンフルエンスで取り除かれ、細胞は、製造者の使用説明書に従って、予め加温したＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ溶液（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  ＧＲＥＥＮ  ＣＭＦＤＡによるＭＣＦ−７とＭＤＡ−ＭＢ−２３１、及びＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ  ＲＥＤ  ＣＭＰＴＸによるｈＵＣＥＳＣ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ、ＵＳＡ）で標識された。次いで、１ウェル当たり１×１０５個のＭＣＦ−７又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が６−ウェルプレートでプレート培養され、４時間後に１×１０５個のｈＵＣＥＳＣ細胞がＭＣＦ−７又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に添加され、７２時間、共培養（共存培養）された。画像は、１２時間、４８時間、７２時間において、高解像度デジタルカメラ（オリンパスＤＰ７２；Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）により、ランダムに撮影された。カウント用フレーム（１０２μｍ２）が撮影画像上に重ね合わせられ、はっきり視認可能な細胞のみが、顕微鏡写真上の少なくとも３つの異なる視野において、ＩｍａｇｅＪ  ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用してカウントされた。
【０１１６】
〔結腸直腸及び胃腺癌細胞株の増殖〕
ＨＴ２９及びＡＧＳの増殖は、細胞増殖試薬  ＷＳＴ−１（ロシュ）を使用して評価された。ＨＴ２９及びＡＧＳ細胞株は、９６−ウェル平底微量定量組織培養プレートで、１ウェル当たり２×１０４個の細胞がプレート培養された。２４時間後、細胞は、等量（１５０μＬ）の、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（コントロール）、ＦＢＳを含まない（ｗ／ｏ  ＦＢＳ）ＤＭＥＭ−Ｆ１２、及びｈＵＣＥＳＣからの２４時間又は４８時間馴化培地、ＡＳＣで、２４時間又は４８時間処理された。ＷＳＴ−１試薬（１５μＬ）が各ウェルに添加され、混合物は１時間インキュベートされた。吸光度は、微量定量プレートリーダーを使用し、ブランクとしてのバックグラウンドコントロールに対して測定された。
【０１１７】
〔ＭＴＴ代謝〕
細胞生存率／増殖実験は、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物（ＭＴＴ）アッセイを使用して実施された。ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、又はヒト乳房腫瘍（Ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｕｒｓ）からの初代培養は、１ウェル当たり３×１０４個の細胞で、２４−ウェルプレートでプレート培養された。２４時間後、細胞は、等量（５００μＬ）の、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−Ｆ１２（コントロール）、ＦＢＳ  を含まない（ｗ／ｏ  ＦＢＳ）ＤＭＥＭ−Ｆ１２、及びＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ｈＵＣＥＳＣからの２４時間又は４８時間馴化培地、ＡＳＣ、又は乳房癌腫瘍（Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｕｍｏｕｒｓ）からの初代培養で、２４時間又は４８時間処理された。ＭＴＴ（０．５μｇ／μＬ）が各ウェルに追加され、混合物は１時間インキュベートされた。培地は次いで取り除かれ、ＤＭＳＯ（５００μＬ）が各ウェルに追加された。サンプルの吸光度は、５７０ｎｍで、マルチウェル  プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＵＬＴＲＡ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，ＭＡａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において測定された。結果は、少なくとも２つの独立した実験からの４つ組（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅｓ）の平均±標準偏差値としてプロットされた。
【０１１８】
〔ウェスタンブロット分析〕
ヒト乳房腫瘍からのＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、及び初代培養は、４℃で、３００μＬの溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；５ｍＭ  ＥＧＴＡ；１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２；１％ＳＤＳ；１０％グリセロール；１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；１０ｍＭ  オルトバナジウム酸ナトリウム；４ｍＭ  ＰＭＳＦ、及び５０μｇ／ｍＬアプロチニン）中で分離された。細胞溶解液（ｌｙｓａｔｅ）は次いで、１４，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離され、生じた上清は集められ、タンパク濃度がブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）によって測定された。ウェスタンブロッティングが実施された。簡略的に、６０μｇの総タンパク質が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけられた。タンパク質はニトロセルロース膜に移され、ブロックされ、一晩中、４℃で、一次抗体により免疫標識され（表１参照）、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄され、適切なニ次抗体により、１時間インキュベートされた。シグナルは、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  ウェスタンブロッティング基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により検出され、製造者の使用説明書に従って標準的なＸ線フィルムにブロットを置き、視覚化した。
【０１１９】
【表１】
0006453771.tif 000002
【０１２０】
〔細胞周期及びアポトーシスアッセイ〕
細胞周期及びアポトーシスアッセイは、Ｇｕａｖａ  フローサイトメーター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して実施された。簡略に言えば、細胞周期評価のため、１ウェル当たり２×１０５個の細胞が、ａ）１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）、ｂ）ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２（１：１）及びｃ）馴化培地で、４８時間培養され、採収され、７０％低温エタノールで３０分間固定され、ＰＢＳで洗浄され、リボヌクレアーゼ（１００μｇ／ｍＬ）とヨウ化プロピジウム（ＰＩ，５０μｇ／ｍＬ）で３０分間、暗所でインキュベートされた。アポトーシス分析は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣを使用して実施された。細胞は採収され、ＰＢＳで２回洗浄され、１×結合緩衝液（０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１．４Ｍ  ＮａＣｌ、及び２５ｍＭ  ＣａＣｌ２）中に再懸濁された。５μＬのＦＩＴＣ−アネキシンＶが添加され、暗所で、１５分間、室温でインキュベートされた。最後に、４００μＬの１×結合緩衝液が各チューブに添加され、分析された。アネキシンＶ陽性及びＰＩ陰性は初期のアポトーシスを示すが、アネキシンＶ陰性及びＰＩ陽性は後期のアポトーシスを示す。
【０１２１】
〔細胞浸潤アッセイ〕
アッセイは、製造者の使用説明書に従って、ＢＤ  ＢｉｏＣｏａｔマトリゲル浸潤チャンバー（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施された。マトリゲルであらかじめコートされたフィルターが、細胞浸潤を調べるために使用された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、上部チャンバーに、０．５ｍＬのＤＭＥＭ無血清培地（１フィルター当たり５×１０４個の細胞）中に、置かれた。４８時間培養のｈＵＣＥＳＣの馴化培地が、２０％ＦＢＳとして下部チャンバーに置かれた。２２時間のインキュベーション後、フィルターの下面に移動した細胞は、室温で２分間、メタノールに固定され、クリスタルバイオレットを使用して２分間染色され、視覚化されて、カウントされた。細胞移動又は細胞浸潤のための値は、二つ組実験のため１フィルター当たり４視野で、顕微鏡視野当たりの細胞の平均数として表現された。実験は３回繰り返された。
【０１２２】
〔動物実験〕
重度複合免疫不全症自然突然変異（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｍｕｔａｔｉｏｎ）のためのホモ接合性の６〜８週間の年齢適合雌マウス（ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ，  ｎａｍｅｄ  ＳＣＩＤ，Ｐａｒｃ  Ｒｅｃｅｒｃａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）が、異種移植実験のために使用された。１３匹のＳＣＩＤマウス（６匹がコントロールで７匹が処理）は、ｐｃＤＮＡ３−ルシフェラーゼベクター（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−ｌｕｃ細胞）で安定的にトランスフェクションされた３×１０６個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、左側と右側の腹部の皮下に注入された。細胞注入の１５日後に、マウスは腫瘍内に、５日毎に４７日目まで、４８時間−ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地（ＣＭ）又はプラセボを、１５０μＬ注入された。ルシフェリン注入（１５０ｍｇ／ｋｇ）後、腫瘍増殖は、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＶＩＳ，Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ルミネセンスにより外部からモニターされた。強度マップが、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ソフトウェア（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して取得された。本ソフトウェアは、各ピクセルの強度を表す色彩ベースのスケールを使用する（低位を表す青から高位を表す赤に及ぶ）。１匹のコントロールマウスと１匹のＣＭ処理されたマウスが３１日目に殺され、腫瘍は切除され、１０％中性緩衝ホルマリンに２４時間固定され、組織学的及び免疫組織化学的研究のため、パラフィンに包埋された。残りのすべてのマウスは、生存率分析のためにモニターされた。
【０１２３】
〔免疫組織化学〕
マウス腫瘍は、１０％中性緩衝ホルマリンに２４時間浸漬固定され、ルーチン的にパラフィンに包埋された。厚さ４μｍの切片標本を、Ｆｌｅｘ  ＩＨＣ顕微鏡スライド（ダコ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）に載せた。免疫組織化学的（ＩＨＣ）技術は、ＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒＬｉｎｋ  ４８（ダコ）で自動的に実施された。活性化カスパーゼ３  抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）が使用された。エピトープ回復は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ標的回復溶液（ｐＨ９）を使用し、マイクロ波で２０分間実施された。すべての抗体は、室温で２０分間インキュベートされた。検出システムとして、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ／ＨＲＰ  ダコ（西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアフィニティー単離されたヤギ抗マウス及び抗ウサギ免疫グロブリンと接合されたデキストランポリマー）を２０分間使用した。
【０１２４】
［ＩＩ−結果］
〔ヒト癌細胞の増殖に対するｈＵＣＥＳＣの効果〕
癌細胞株に対するｈＵＣＥＳＣの効果の可能性を探求するため、細胞増殖アッセイは、完全培地（コントロール）、不完全培地（ＦＢＳを含まない）、２４時間又は４８時間産生されたｈＵＣＥＳＣからの馴化培地、及び４８時間産生されたＡＳＣからの馴化培地で、４８時間処理された結腸直腸（ＨＴ２９）及び胃の（ＡＧＳ）腺癌細胞株について評価された。結腸直腸及び胃腺癌細胞増殖に対するｈＵＣＥＳＣ馴化培地の効果は、ＡＳＣからの馴化培地の効果よりはるかに強力であった（図７Ａ）。
【０１２５】
ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地（ＣＭ）を投与後の乳癌に対するｈＵＣＥＳＣの効果の可能性を探索するため、非浸潤性のヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７と浸潤性の高いヒト乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において、増殖／細胞毒性が評価された。図７Ｂ−Ｃに示されるように、（２４時間又は４８時間の）ＨＵＣＥＳＣからのＣＭをＭＣＦ−７細胞に投与した２４時間及び４８時間後、ＦＢＳを含まない培地、又はＭＣＦ−７細胞によって２４時間又は４８時間で産生されたＣＭで処理された細胞に比べ、ＨＵＣＥＳＣからのＣＭには、ＭＴＴ代謝の有意な減少は観察されなかった。しかしながら、同じＨＵＣＥＳＣからのＣＭがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株に投与されると、細胞増殖の有意な減少が、２４時間（４８時間培養されたＨＵＣＥＳＣからのＣＭ、Ｐ＜０．０１）及び４８時間（２４時間及び４８時間培養されたＨＵＣＥＳＣからのＣＭ、それぞれＰ＜０．０１及びＰ＜０．００１）において見られる（図７Ｄ−Ｅ）。ＨＵＣＥＳＣからのＣＭの細胞増殖に対する効果が、ＭＣＦ−７又はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞とｈＵＣＥＳＣとの共培養によって維持され得るか、或いはＣＭにのみ依拠しているのか、を評価するため、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、緑色色素で標識され、ｈＵＣＥＳＣは、赤色色素で標識された。ｈＵＣＥＳＣと共培養されたＭＣＦ−７細胞はＭＣＦ−７のみで培養されたＭＣＦ−７細胞と同様に増殖したが（図７Ｆ）、ｈＵＣＥＳＣとＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の共培養は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のみによる増殖に比較して、有意に（Ｐ＜０．０１）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の数を減少させる（図７Ｇ）ことが見出された。
【０１２６】
〔ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地は細胞周期を遅らせ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株におけるアポトーシスを誘発する〕
ＨＵＣＥＳＣからのＣＭがＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を有意に減少させたことをふまえ、この減少を媒介する可能性のあるものとして、細胞周期とアポトーシスが評価された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、１０％ＦＢＳ（＋ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭ、ＦＢＳを含まない（−ＦＢＳ）ＤＭＥＭ、又はｈＵＣＥＳＣからの４８時間のＣＭで、４８時間培養され、次いで我々は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（細胞周期を評価するため）とアネキシンＶ／ＰＩ（アポトーシスを評価するため）とを使用して、フローサイトメトリーを実施した。さらに、細胞周期とアポトーシスの両方に伴うタンパク質の発現を評価するために、ウェスタンブロットが実施された。この結果は、ＣＭ処理された細胞は、完全培地（＋ＦＢＳ）又は不完全培地（−ＦＢＳ）で処理された細胞に関して、Ｇ０−Ｇ１フェーズで有意に増加する（図８Ａ）。故に、サイクリンＡ、サイクリンＢ、及びサイクリンＤ１タンパク質発現における視覚的減少がＣＭ処理細胞において観察された（図８Ｂ）。ＣＭによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の処理は、ＦＢＳを含まずに培養された細胞に比較して、アネキシン＋／ＰＩ−及びアネキシン＋／ＰＩ＋細胞の著しい増加を誘発し、これは、ＣＭが初期と後期のアポトーシスを、それぞれ誘発することを示す（図８Ｃ）。ＣＭで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのタンパク質抽出物の免疫ブロットは、カスパーゼ−８、−１２、−９、活性化カスパーゼ−３、及び切断されたＰＡＲＰにおける増加を示し（図８Ｄ）、完全培地（＋ＦＢＳ）及び不完全培地（−ＦＢＳ）で処理された細胞に関して、Ｂｉｄ及びＢｉｍの減少を示した（図８Ｅ）。
【０１２７】
〔浸潤、三次元培養形成、腫瘍増殖、及び生存率は、ｈＵＣＥＳＣからの馴化培地によって変更される〕
ＨＵＣＥＳＣからのＣＭが、マトリゲルマトリックスによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤に、影響を及ぼすかどうかが探索された。図９Ａは、不完全培地（−ＦＢＳ）の存在下における細胞と比較して、ＣＭの存在下におけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の浸潤能力の有意な減少（Ｐ＜０．００１）を示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の三次元増殖もまた探索された。これらの実験のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、その中で球体構造を形成する非常に粘性の大きい培地であるマトリゲルにおいて培養された。ＣＭによる処理は球体の直径の相当な減少を示し、細胞が不完全培地で処理された場合は、この点は認知されなかった（ＣＭにおける平均直径＝２．８±１．０対−ＦＢＳにおける平均直径＝５．７±１．６、任意のユニット、Ｐ＝０．０２３）（図９Ｂ）。
【０１２８】
重篤な免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス腫瘍異種移植モデルを使用したインビボでのＣＭの腫瘍内投与の効果が次に評価された。マウスは、ルシフェラーゼベクターで安定的にトランスフェクションされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を乳房脂肪パッドに注入され、１５日後に、腫瘍が見えるようになったとき、マウスは５日毎に、不完全培地（コントロール）又はｈＨＵＣＥＳＣからのＣＭ（１５０μＬ）を腫瘍内に注入され、ルミネセンスにより外部からモニターされた（図９Ｃ）。ＣＭによる治療の１５日後に（３０日目）、腫瘍体積の有意な減少（Ｐ＝０．０１１）が観察された（図９Ｄ）。３３日目に、２匹の動物が（１匹はコントロールで、１匹はＣＭ処理されたマウス）屠殺され、腫瘍は取り除かれ、活性化カスパーゼ−３（アポトーシスの指標として）に対し、免疫組織化学による分析がおこなわれた。図９Ｅは、ＣＭ処理されたマウスにおける活性化カスパーゼ−３発現の顕著な増加を示す。マウスの生存率を評価するために、残りのマウスは、５日毎にＣＭ又はプラセボが注入され、４７日目まで観察された。図９Ｆに示されるように、カプランマイヤー生存プロットは、ＣＭで処理されたマウスは、コントロールマウスと比較して、全体としてより長い生存率を有したことを示す（Ｐ＝０．０１９）。
【０１２９】
〔馴化培地は、高い増殖率を有する腫瘍の増殖を減少させる〕
乳房腫瘍を有する患者からの初代培養に、ｈＵＣＥＳＣからのＣＭを投与する効果が、次に評価された。こうして、１０個の乳癌の初代培養物が、ＭＴＴ  アッセイを使用して細胞増殖のために評価された。低増殖率の乳房腫瘍細胞（１１Ｂ３１８６，１１Ｂ２４４５，１１Ｂ５３０，１１Ｂ５４５，１１Ｂ９８０，及び１１Ｂ２１２７）においては、ｈＵＣＥＳＣからのＣＭの投与は、不完全培地（−ＦＢＳ）、腫瘍細胞自身からのＣＭ、又は組織脂肪由来間質性細胞（ＡＳＣ）によって産生されたＣＭ、の投与による効果と比較して、細胞増殖に対し有意な効果は示さなかったが、高い増殖率を有する乳房腫瘍（１１Ｂ５１２，１１Ｂ３２８５，１１Ｂ３１７１，及び１１Ｂ７３５２）からの初代培養において、ｈＵＣＥＳＣからのＣＭの投与は、他の処理と比較して、細胞増殖における有意な減少（Ｐ＜０．００１）をひき起こした（図１０Ａ）。高い増殖率を有するこれらの初発腫瘍からのタンパク質抽出物におけるサイクリンＤ１及び切断されたＰＡＲＰの発現もまた評価された。その結果は、図１０Ｂに示される。ｈＵＣＥＳＣからのＣＭが投与された場合に、サイクリンＤ１及びＰＡＲＰ切断の発現における明らかな減少が観察されたが、不完全培地（ＦＢＳを含まない）により処理された初代培養においては、観察されなかった。
【０１３０】
〔実施例４：ｈＵＣＥＳＣによる病原微生物の増殖抑制〕
［Ｉ−材料及び方法］
使用された細菌株は、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ  ２５９９２）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ  ２９２１３）、及び腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  ５１２９９）であった。
【０１３１】
〔階段希釈によるマルチウェルプレート培養における増殖抑制〕
抗菌活性を有する培地の最高希釈倍率を決定するために、９６マイクロウェルプレート培養において、病原微生物の増殖抑制が評価された。簡略には、コントロール（ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ−Ｆ１２培地）及び馴化培地（ｈＵＣＥＳＣ又は脂肪組織由来ＭＳＣ）の１００μＬの段階１：２希釈液と、７５μＬの段階１：２希釈液が、９６ウェルプレートに置かれた（ｐｌａｃｅｄ）。次いで、ブレインハートブロス（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｂｒｏｔｈ）（０．５マックファーランドの懸濁液の１：３００希釈）における細菌懸濁液が各ウェルに添加された。プレートは、３７°で２４時間から４８時間インキュベートされた。細菌増殖抑制は、コントロールウェルとｈＵＣＥＳＣ又は脂肪組織由来ＭＳＣ馴化培地を含むウェルとを比較して測定された。
【０１３２】
〔ｈＵＣＥＳＣ及びその馴化培地による細菌増殖の抑制〕
各実験のために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ，ＡＴＣＣ  ２５９９２）コロニーは、冷凍ストックから播種され、一晩中、３７℃で、液状ルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地（Ｄｉｆｃｏ  ＢＤ，ＵＳＡ）において、僅かに撹拌しながら増殖された。各実験の前に、細菌細胞は１回洗浄され、ＰＢＳに再懸濁され、懸濁液の光学密度（λ＝６００ｎｍにおけるＯＤ）が測定された。ＣＦＵの数が、次の等式により計算された。ＯＤ６００＝１．０が大腸菌に対する４×１０８ＣＦＵ／ｍＬに対応する。ｈＵＣＥＳＣ又はその馴化培地（ＣＭ）による細菌増殖の直接的抑制の評価は、ＣＦＵの計算とＯＤの読取りによってなされた。
【０１３３】
簡略には、２４−ウェルプレートにおいて、３００ＣＦＵ大腸菌が以下のものに対し添加された。ａ）１０％ＦＢＳを補充されたＤＭＥＭ／Ｆ−１２−ＨＡＭ（１：１）における２×１０５個のｈＵＣＥＳＣ、ｂ）同じ培養培地における２×１０５個の正常のヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）、ｃ）培養培地のみ。次いで、培養物は、ＣＯ２加湿インキュベーターで６時間インキュベートされた。光学密度は、ＬＢにおいて３７℃で寄生された培養物を、２時間増殖させた後で測定された。ＣＦＵの数量化は、ＬＢ−寒天培地プレートで３７°Ｃで一晩、インキュベーションした後におこなわれた。残りの感染された培地は、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離され、−２０℃で（残余の細菌体を除去するため）冷凍された。サンプルは氷上で融解され、一定分量が９６−ウェルプレートに転移され、１００ＣＦＵの大腸菌が播種され、３７℃で１６時間インキュベートされた。次いで、ＯＤ及びＣＦＵが、上述のようにカウントされた。
【０１３４】
［ＩＩ−結果］
〔階段希釈によるマルチウェルプレートにおける増殖抑制〕
コントロール培地のすべての希釈液は、細菌の増殖を示した。脂肪組織由来ＭＳＣ馴化培地は、何らの抗菌活性も示さなかったが、ｈＵＣＥＳＣ馴化培地は、１／２０希釈液まで、細菌増殖の抑制を示した（図１１）。
【０１３５】
〔ｈＵＣＥＳＣとその馴化培地による細菌増殖の抑制〕
ヒトｈＵＣＥＳＣは、コントロール培地及びコントロールＮＨＦ細胞の両方に比べて、有意に大腸菌の細菌増殖を抑制した（ｐ＜０．００１）。ＣＦＵ及びＯＤによる数量化において、いずれにおいても、コロニー数（図１２）と吸光度（図１３）のそれぞれで、コントロール（培地のみとＮＨＦ）と比べ、約５０％の減少を示した。ｈＵＣＥＳＣ由来の感染された培地は、ｈＵＣＥＳＣと同じ効果を大腸菌に対して示した。これらの結果は、ｈＵＣＥＳＣにより分泌される何らかの可溶性因子が、抗菌性の効果を生じさせていることを示唆する。
【０１３６】
〔実施例５：組織再生関連実験：ｈＵＣＥＳＣ馴化培地によるドライアイのラットモデルにおけるアルカリ熱傷角膜上皮の創傷治癒〕
［Ｉ−材料及び方法］
１５匹のメスの、体重２００〜２５０ｇの、スプラーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットが、この実験をおこなうために使用された。全ての動物は、ＮａＯＨ（０．３７５ｍＬ）に浸されたケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）（０．４２５ｍＬ）とキシラジン（ｘｉｌａｃｉｎｅ）（０．２ｍＬ）の混合物を腹腔内に注入することにより、麻酔をかけられた。実験の最後において、すべてのラットは、ＣＯ２吸入によって屠殺された。
【０１３７】
〔ドライアイモデル〕
１５匹のラットのうち３匹は、健康な目の状態にしておき、残りの１２匹のラットは麻酔をかけられ、ドライアイを作製するため外眼性涙腺（ｅｘｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｌａｃｒｉｍａｌ  ｇｌａｎｄ）が両側で切除された。外眼性涙腺は、ラットの３つの涙腺の１つである。この腺は、涙液産生のための主要腺であり、アクセスが容易である（図１４Ａ）。手術の１週間後に、涙液産生は、シルマー試験（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｓ  Ｃｕｓｉ  ＳＡ，  Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）で測定された。ペーパーストリップが、使用のため２ｍｍ幅に切られた。ストリップの先端が、１ｍｍの長さのところで折りたたまれ、まぶたの下に５分間導入された。この後、折りたたみマークからの湿ったストリップの長さが測定された（図１４Ｂ、Ｃ）。１２匹のラット全部が、ドライアイを示した。
【０１３８】
〔角膜アルカリ創傷と検査〕
中心部角膜のアルカリ創傷は、両眼に、２μＬのＮａＯＨ（１モル／Ｌ）に６０秒間浸された１枚のワットマン濾紙（２×２ｍｍ）を当てることによって、作られた。角膜は次いで生理食塩水で、３０秒間リンスされた。全部のラットは、上述したように、前もって麻酔をかけられていた。傷のついた上皮は、麻酔をかけられたラットの角膜の表面をフルオレセイン（Ｃｏｌｉｒｃｕｓｉ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａ，Ａｌｃｏｎ  Ｃｕｓｉ，Ｓ．Ａ．，Ｅｌ  Ｍａｓｎｏｕ−Ｂａｒｃｅｌｏｎａ）染色した後に、視認できるようになった。角膜は、手術顕微鏡（Ｔａｋａｇｉ  ＯＭ−５  ２２０−２，Ｔｏｋｉｏ，Ｊａｐｏｎ）に取り付けられたデジタルカメラ（Ｎｉｋｏｎ  Ｄ２００，Ｔｏｋｉｏ，Ｊａｐｏｎ）で、青色光の下で写真撮影された。角膜損傷の定量的測定は、無料の市販ソフトウェアＩｍａｇｅＪ（Ｓｏｆｔｏｎｉｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，ＳＬ）によりオフラインで、目の表面のピクセルの総数に関して、フルオレセインで染色されたピクセルの数をカウントすることにより、写真上でおこなわれた。
【０１３９】
〔グループと処理〕
１５匹のラットは、３匹ずつ５つのグループに分けられた。健康な目で角膜損傷のないグループ（正常グループ）が１グループと、ドライアイで、両眼の角膜にアルカリ熱傷のあるグループ（ＣＭグループ、Ｍグループ、ＳＨグループ、及び非処理グループ）が４グループであった。処理は、以下のように、１日４回、点眼液を局所適用することでなされた。
ＣＭグループ：馴化培地  Ｍグループ：細胞と以前に接触していない培養培地（ＤＭＥＭ−Ｆ１２；Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）
ＳＨグループ：ヒアルロン酸ナトリウム（０．０１５ｇ／１０ｍＬ）点眼薬
非処理グループ：処理なし。
【０１４０】
〔馴化培地（ＣＭ）〕
ヒト子宮頸部間葉系幹細胞（本発明の細胞：Ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）は、５ｍＬのＤＭＥＭ−Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）培養培地により、７０％コンフルエンスの９０ｍｍペトリ皿で、空気−ＣＯ２（９５：５）雰囲気で、３７℃において４８時間、培養された。この後、上清は集められ、−８０℃で冷凍され凍結乾燥されて、−８０℃で使用されるまで貯蔵された。凍結乾燥された粉末は、ｄｄＨ２Ｏで使用される直前に再懸濁された。
【０１４１】
〔組織学的検査〕
実験の最後に、角膜アルカリ熱傷後の５日目に、各グループからランダムに選択された１匹のラットが屠殺され、眼球が切除され、１０％中性緩衝ホルマリン中に浸漬固定された。２４時間後、角膜が眼球から切り取られ、エタノール（７０％）に浸された。角膜は次いでパラフィンに包埋され、２０μｍ切片標本がスライドに載置されて、組織学的評価のためにヘマトキシリン・エオシン二重染色法（Ｈ−Ｅ）で染色された。
【０１４２】
〔ｍＲＮＡ発現分析〕
実験の最後に、角膜損傷後の５日目に、各グループの残りの２匹のラットが屠殺され、角膜が切り取られた。角膜におけるマクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、及び腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）のｍＲＮＡ発現レベルが、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（リアルタイムＰＣＲ）を使用して評価された。全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して角膜から単離された。ｃＤＮＡは、トランスクリプターファーストストランドｃＤＮＡ合成キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）による３０μＬの反応において、ＲＮＡ（１μｇ）から合成された。定量的リアルタイムＰＣＲの反応は、ｉＣｙｃｌｅｒ装置（７５００  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で、ｉＱ  ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、２０μＬの容積において、２μｇのｃＤＮＡでおこなわれた。サンプルは、合計３５サイクルのために、９４℃で１０秒間変性され、５８℃で１０秒間アニールされ、７２℃で１０秒間増幅される。サンプルは、β−アクチンを内因性コントロールとして、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  １．４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して定量化された。オリゴヌクレオチド配列は、表２に記載される。
【０１４３】
【表２】
0006453771.tif 000003
【０１４４】
〔データ解析〕
値は、平均値±標準偏差で表された。平均値は、ポストホック比較のためのＴｕｋｅｙの範囲検定とともに、一元配置分散分析を使用して比較された。０．０５を下回るＰ値が、統計的に有意であるとみなされた。ＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２０１１ａ  Ｖｅｒｓｉｏｎ７．１（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ，Ｉｎｃ）ソフトウェアが、すべての計算のために使用された。
上皮再生のパーセンテージ（％ＥＲ）は、次の式、％ＥＲ＝１００（ｍｉ−ｍｆ）／ｍｉにより計算された。
ここで、ｍｉは角膜損傷の第１測定値（アルカリ熱傷の直後）であり、ｍｆは、４８時間後の最終測定値である。両方の測定値とも、角膜の総面積に対する損傷面積のパーセンテージを表す。
【０１４５】
［ＩＩ−結果］
〔上皮の回復効果〕
角膜上皮のフルオレセインによる染色は、上皮の欠損を示すものである（図１５Ａ）。各グループに対する上皮の再生のパーセンテージ（％ＥＲ）は、方法のセクションにおいて記載したように計算された。角膜表面の回復は、アルカリ熱傷の１５時間後で、ＣＭで処理されたグループが、他のグループに比べ有意に速かった（ｐ＜０．００５，一元配置分散分析；図１５Ｂ）。上皮再生（ＥＲ）の平均値は、ＣＭグループが６２±５％；Ｍグループが３４±１５％；ＳＨグループが３２±１５％；非処理グループが３６±１３％であった。アルカリ熱傷後の５日目で、角膜表面の回復はすべての処理を受けたグループにおいてほぼ完全であった（＞７５％）が、処理を受けたグループは処理を受けないグループに比べ、回復はなお有意に速かった（ｐ＝０．００５、一元配置分散分析；図１５Ｃ）。ＥＲの平均値は、ＣＭグループが９２±４％；Ｍグループが７７±１５％；ＳＨグループが７４±１５％、非処理グループが６２±１６％であった。
【０１４６】
５日目のアルカリ熱傷による角膜上皮の創傷閉鎖は、角膜切片標本のＨ−Ｅ染色の後に比較され、角膜上皮の再生は、ＣＭで処理されたグループが他のグループに比べて速かった（図１６）。
【０１４７】
〔抗炎症効果〕
ＣＭが炎症を和らげる潜在的メカニズムを探求するため、走化性因子ＭＩＰ−１α  と  ＭＣＰ−１、及び免疫促進性サイトカイン  ＴＮＦ−α、の産生を評価した。われわれは、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦ−αすべてのレベルが、非処理グループ（損傷があるが処理がない）を含む残りのグループに比べＭグループ（培養培地で処理されたグループ、幹細胞との接触なし）において非常に高いことを見出した（ｐ＜０．０５；一元配置分散分析；図１７）。しかしながら、同じ培養培地で処理されたが幹細胞と以前に接触していたグループ（ＣＭグループ）は、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−１、及びＴＮＦ−αのすべてのレベルが、Ｍグループと比べ低かった（ｐ＜０．０５；一元配置分散分析；図４）。この結果は、使用された培養培地（ＤＭＥＭ−Ｆ−１２）が、このタイプの損傷に対し炎症誘発効果を有し、これらの効果が培養される幹細胞によって分泌される因子のいくつかによって打ち消されたことを示すと思われる。さらに、ＣＭグループにおけるＭＩＰ−１αのレベルは、Ｎｏ  Ｌｅｓグループ（角膜損傷なし）のレベルと類似しており、他の処理グループ（Ｍ及びＳＨ）及び非処理グループに比べ低い（ｐ＜０．０５；一元配置分散分析；図１７Ｂ）。この結果は、損傷を受けた角膜に対するＣＭの抗炎症効果を示している。
【０１４８】
〔実施例６：生殖細胞選択に関連した実験：精子に対するｈＵＣＥＳＣ馴化培地の効果〕
［Ｉ−材料及び方法］
馴化培地（ＣＭ）は、凍結乾燥され、３つの濃度０．５：１、１：１、及び４：１で元に戻された。実験は、新鮮精液及び／又は受精能を獲得した精子に対し、０時間（Ｔ０）、３時間（Ｔ３）及び２４時間（Ｔ２４）において、実施された。
【０１４９】
〔精液分析〕
精液分析は、２０１０年世界保健機関（ＷＨＯ）ガイドラインに従って、光学顕微鏡を使用して実施された。液化の後、５μＬの精液がノイバウエル計算板（Ｓｅｆｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈａｉｆａ，Ｉｓｒａｅｌ）に載置された。全精子数（×１０６／ｍＬ）及びパーセンテージ運動性（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ）が、手で測定された。５μＬの滴量当たり最低２００個の細胞がカウントされ、サンプル当たり少なくとも２滴が調べられた。精子生命力が、やはりＷＨＯガイドラインに従い、エオシンレッド及びニグロシン（ｎｉｇｒｏｓｉｎ）を使用して、色素排除法によって調べられた。
【０１５０】
〔酸化ストレスの評価〕
ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）は、酸化されると５１０ｎｍで励起されたとき赤色核蛍光を生成するＤＮＡに反応する蛍光色素を産生する、エチジウム（Ｅｔ＋）の弱い蛍光を発する二電子還元生成物である。このプローブで得られた結果は、スーパーオキサイドアニオンの決定的な同定を含む、ＲＯＳ（活性酸素種）を生成するヒトの精子の能力の測度として有効とされてきた。細胞内ＲＯＳ酸性アッセイのために、ＤＨＥ（３μＭ）は、ＰＢＳ緩衝剤中で希釈され、最終容積５００μＬ中の０．５×１０６個の新鮮精子に添加された。細胞は、次いで４５分間、室温で、暗所でインキュベートされ、２回洗浄され（２０００ｒｐｍ、５分間）、結果として生じた赤色（ＨＥ）蛍光発光は、ＦＡＣＳｃａｎアナライザーを使用してフローサイトメトリーにより分析された。データは、蛍光性精子のパーセンテージとして表現された。
【０１５１】
〔原形質膜の完全性の評価〕
ミトコンドリアの原形質膜の完全性は、精子の運動性と生命力に相関してポジティブであり、細胞アポトーシスに相関してネガティブである。酸化的リン酸化のプロセスの間、プロトンが、ミトコンドリアの内部から外部にポンピングされ（ｐｕｍｐｅｄ）、ミトコンドリア内膜電位（ＭＭＰ）と称される電気化学的勾配を生成する。高いＭＭＰを示すミトコンドリアを、低いＭＭＰを示すミトコンドリアから区別する能力は、ミトコンドリアの代謝機能と膜組織の完全性の厳密な推定を提供する。精子についてのＭＭＰの評価は、臭化３，３′‐ジヘキシルオキサカルボシアニン（ＤｉＯＣ６：３，３′−ｄｉｈｅｘｙｌｏｘａｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ  ｉｏｄｉｄｅ）蛍光性色素を使用して、フローサイトメトリーにより実施された。簡略には、各新鮮サンプルからの精子（０．５×１０６）は、ＤｉＯＣ６（ＨＴＦ培地で０．１ｎＭに希釈された）により、３７℃のウォーターバスで４５分間、５００μＬの最終容積においてインキュベートされた。次いで細胞は、ＰＢＳで２回（２０００ｒｐｍ、５分間）洗浄され、５００μＬのＰＢＳ緩衝液に再懸濁されフローサイトメトリーによって分析された。陰性コントロールとして、精子サンプルはまた、１ｍＭの脱共役カルバモイルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＩＰ：ｕｎｃｏｕｐｌｅｒ  ｃａｒｂａｍｏｙｌ  ｃｙａｎｉｄｅ  ｍ−ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｈｙｄｒａｚｏｎｅ）によりインキュベートされた。
【０１５２】
［ＩＩ−結果］
ｈＵＣＥＳＣ馴化培地（ＣＭ）は、濃度と時間に依拠する精子特性に対する効果を示す（表３）。コントロール（ＣＭを含まず）と比較すると、ＣＭ４：１は、Ｔ３及びＴ２４で、精子特性のすべてのパーセンテージの減少を示し、一方ＣＭ１：１は、Ｔ２４で、運動性、生命力、酸化ストレス、及び膜電位に対するより高い効果を示す。
【０１５３】
【表３】
0006453771.tif 000004
【０１５４】
表４は、ｈＵＣＥＳＣ  ＣＭ  １：１は、ｈＵＣＥＳＣ  ＣＭ  ０．５：１に比べ、新鮮射精液及び受精能獲得精子の精子特性に対し、高い効果を生じることを示す。ｈＵＣＥＳＣ  ＣＭは、受精能獲得精子よりも新鮮精子に対し高い効果を示し、このことは、良質な精子の選択に対する助けとなる。
【０１５５】
【表４】
0006453771.tif 000005
【図１Ａ】
0006453771.tif 000006
【図１Ｂ】
0006453771.tif 000007
【図１Ｃ】
0006453771.tif 000008
【図１Ｄ】
0006453771.tif 000009
【図２】
0006453771.tif 000010
【図３】
0006453771.tif 000011
【図４】
0006453771.tif 000012
【図５】
0006453771.tif 000013
【図６】
0006453771.tif 000014
【図７Ａ】
0006453771.tif 000015
【図７Ｂ】
0006453771.tif 000016
【図７Ｃ】
0006453771.tif 000017
【図７Ｄ】
0006453771.tif 000018
【図７Ｅ】
0006453771.tif 000019
【図７Ｆ】
0006453771.tif 000020
【図７Ｇ】
0006453771.tif 000021
【図８Ａ】
0006453771.tif 000022
【図８Ｂ】
0006453771.tif 000023
【図８Ｃ】
0006453771.tif 000024
【図８Ｄ】
0006453771.tif 000025
【図８Ｅ】
0006453771.tif 000026
【図９Ａ】
0006453771.tif 000027
【図９Ｂ】
0006453771.tif 000028
【図９Ｃ】
0006453771.tif 000029
【図９Ｄ】
0006453771.tif 000030
【図９Ｅ】
0006453771.tif 000031
【図９Ｆ】
0006453771.tif 000032
【図１０Ａ】
0006453771.tif 000033
【図１０Ｂ】
0006453771.tif 000034
【図１１】
0006453771.tif 000035
【図１２】
0006453771.tif 000036
【図１３】
0006453771.tif 000037
【図１４】
0006453771.tif 000038
【図１５】
0006453771.tif 000039
【図１６】
0006453771.tif 000040
【図１７】
0006453771.tif 000041
【図１８】
0006453771.tif 000042
【図１９】
0006453771.tif 000043
【配列表】
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