(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
成体脂肪由来幹細胞からＢＡＴ細胞を得るための方法であって、間葉系幹細胞成長培地において前記幹細胞を培養するステップと、ロシグリタゾン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、デキサメタゾン、ＩＢＭＸおよびＢＭＰ−７を含む培地に前記細胞を移すステップとを含む方法。
【請求項２】
前記細胞が、導入遺伝子をトランスフェクトされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記成体幹細胞の２０％以上が、ＢＡＴ細胞に分化する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記成体幹細胞の５０％以上が、ＢＡＴ細胞に分化する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記幹細胞を、以下の培地の組合せ：
（ｉ）ＭＳＣ  ＳＦＭ、
（ｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよびＩＢＭＸ、ならびに、任意選択的に、
（ｉｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾンおよびロシグリタゾン
に（ｉ）〜（ｉｉｉ）の順番に曝露するステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｉｉｉ）が、前記培地を交換することにより反復される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が、３日間隔で逐次的に前記培地に曝露される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記幹細胞を、以下の培地の組合せ：
（ｉ）ＭＳＣ  ＳＦＭ、
（ｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよびＩＢＭＸ、ならびに
（ｉｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、デキサメタゾンおよびロシグリタゾン
に（ｉ）〜（ｉｉｉ）の順番に曝露するステップを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）が、前記培地を交換することにより反復される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ロシグリタゾン、トリヨードチロニン（Ｔ３）、デキサメタゾン、ＩＢＭＸおよびＢＭＰ−７を含む、成体脂肪由来幹細胞からＢＡＴ細胞を得るためのキット。
【請求項１１】
ＢＭＰ、インスリンおよびトランスフェリンのうち１種または複数種をさらに含む、請求項１０に記載の成体脂肪由来幹細胞からＢＡＴ細胞を得るためのキット。
【請求項１２】
基礎培地および／または前脂肪細胞および／またはａｄＭＳＣおよび／または脂肪組織の抽出のための器具をさらに含む、請求項１０または請求項１１に記載の成体脂肪由来幹細胞からＢＡＴ細胞を得るためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞と、その産生のための方法に関する。特に、本発明は、ヒト成体幹細胞、例えば、脂肪由来幹細胞に由来するＢＡＴ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満のネガティブな健康効果に関しての理解が深まるにつれて、世界的に肥満の懸念が高まりつつある。理想体重を５０Ｋｇ以上上回る重度肥満は、特に、深刻な健康問題について顕著なリスクをもたらす。従って、肥満患者の処置には多大な注目が集まっている。
【０００３】
肥満は、エネルギー支出を上回る過剰なエネルギー摂取によるものと考えられているため、食欲抑制経路は、抗肥満薬開発の焦点であった。しかし、カロリー摂取の限定は、減量に抵抗する代償性の適応を誘導する。栄養知覚性ニューロン（ｎｕｔｒｉｅｎｔ−ｓｅｎｓｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｎ）は、認知および行動的要素とクロストークするため、食欲抑制薬は、容認できない精神医学的副作用を生じる傾向がある。しかし、脂肪生成の調節の複雑さのため、他の経路は殆ど調査されていない。
【０００４】
糖尿病は、相対的インスリン欠乏およびインスリン抵抗性と組み合わされた高血糖値によって特徴づけられた代謝性障害である。糖尿病患者の大部分は、遅発性糖尿病としても公知の２型糖尿病を患い、この型の糖尿病の発生率は、この数年間、肥満の増加と一致して悪循環に陥った。
【０００５】
ＢＡＴの機能は、食物から熱へとエネルギーを移動させることである。生理学的には、生じた熱およびその結果としての代謝効率減少の両方が重要となり得る。褐色脂肪組織からの熱生成は、生物が余分な熱を必要とするときはいつでも、例えば、出生後に、発熱状態への進行の際に、および冬眠からの覚醒の際に活性化され、熱発生の速度は、視床下部において開始される経路を介して中枢制御される。
【０００６】
ＢＡＴは、齧歯類およびヒトの新生児において豊富であるが、成人は、ＢＡＴを殆ど保有せず、量は加齢と共に減少する。ＢＡＴ生成および機能を促進する遺伝子が欠損した齧歯類が肥満する傾向があるように、また、ヒトにおいて、より若年のより痩せた個体においてより老齢の過体重対象よりも多量のＢＡＴが観察されるように、齧歯類およびヒトの両方におけるＢＡＴの量は、肥満と逆に相関する。従って、肥満個体においてＢＡＴ組織を活性化するため、あるいはＢＡＴ量を増加させるための方法は、減量および肥満関連罹患率に対する感受性にプラスの効果を有することが予想されるであろう。従って、肥満に対抗するための成人にＢＡＴを導入するために、多数の提案が為された。例えば、米国特許第６，６４５，２２９号は、「褐色脂肪組織（ＢＡＴ）」が、エネルギー支出の調節における役割を果たすこと、また、ＢＡＴの刺激が、患者の痩身をもたらし得ることを記述する。ＢＡＴ活性化は、交感神経系および他の生理学的影響、例えばホルモン性や代謝性の影響などによって調節される。活性化されると、ＢＡＴは、熱の生成のために血液供給から遊離脂肪酸（ＦＦＡ）および酸素を取り出す。新生児ＢＡＴおよび成人ＢＡＴは、ある特定の特徴が異なると思われる。例えば、新生児または古典的ＢＡＴは、Ｍｙｆ５を発現する筋肉様細胞系列に由来する。いわゆるベージュ脂肪またはブライト脂肪は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）内の異なる系列に由来する。近年、全成人ＢＡＴが、古典的ＢＡＴではなくベージュ／ブライトであると提唱された（Ｗｕら、２０１２  Ｃｅｌｌ  １５０：１〜１１）。
【０００７】
ＢＡＴの活性化またはＢＡＴ量の増加は、ＢＡＴに関連する疾患、特に糖尿病にポジティブな効果を有することもできる（Ｖｅｇｉｏｐｏｕｌｏｓら、２０１０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８（１１５８〜６１）；Ｓｅａｌｅら、２００１、ＪＣＩ  １２１（９６〜１０５）；Ｂｏｓｔｒｏｍら、２０１２  Ｎａｔｕｒｅ  ４８１（４６３〜６８））。最も単純なシナリオにおいて、ＢＡＴは、肥満を減少させ、従ってＷＡＴ貯蔵物を低下させ、その結果そのインスリン抵抗性誘導を低下させることにより、ＩＩ型糖尿病を改善することができる。しかし、ＢＡＴは、肥満単独の低下によって予想される結果を超えて代謝性機能不全を改善することもできる。これは、ＢＡＴの増加が、減量しなかった場合であっても、過体重マウスにおけるインスリン感受性を改善したという事実によって証明される。ＢＡＴが、グルコースに応答した島細胞からのインスリン分泌にも直接的に影響を与え、グルコース恒常性を改善し得ることが示された（Ｇｕｅｒｒａら、ＪＣＩ、２００１、１０８（１２０５〜１２１３）。
【０００８】
加えて近年、マウスにおけるＢＡＴ移植が、肥満したインスリン抵抗性マウスの代謝状態を確実に改善し（Ｌｉｕら、（２０１３）Ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１〜４；Ｓｔａｎｆｏｒｄら、（２０１３）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、１２３（１）、２１５〜２２３）、ストレプトゾトシン誘導性糖尿病マウスにおける正常血糖および耐糖能を回復する（Ｇｕｎａｗａｒｄａｎａ＆Ｐｉｓｔｏｎ、２０１２、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、６１（３）、６７４〜８２）ことが示された。グルコースおよびエネルギーシンクとして作用することに加えて、褐色脂肪細胞は、ＩＬ−６等、グルコース代謝／インスリン感受性および全体的なエネルギー収支に有益な効果を有し得る因子を分泌する（局所的におよび／または循環において）可能性も高い（Ｓｔａｎｆｏｒｄら、２０１３）。
【０００９】
ＷＯ２００９１３７６１３は、１種または複数種の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）で処理した幹細胞抗原−１陽性（Ｓｃａ−１＋）前駆細胞が、ＢＡＴ細胞に分化またはそれに向けて分化するという発見に基づく、ＢＡＴを作製するための方法について記載する。これらのＢＡＴ細胞は、ＢＡＴ細胞熱発生プログラムをオンにすることによりカテコラミン刺激に応答する完全な能力を有する、真のＢＡＴ細胞として記載されている。
【００１０】
Ｎｉｓｈｉｏら、Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  １６：３９４、２０１２は、ヒト多能性幹細胞からのＢＡＴ細胞の作製について記載する。作製されたＢＡＴは、ブライトではなく古典的ＢＡＴ系列のものである。
【００１１】
さらに近年、ＷＯ２０１３／１２３２１４は、内胸動脈由来細胞（ｉＭＡＣ）を脂肪細胞分化誘導培地（ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）に曝露することによる、動脈由来細胞からのヒトＢＡＴの作製について記載した。
【発明の概要】
【００１２】
治療目的で設計されたＢＡＴは、患者に導入されることが企図されるため、患者自身の組織からＢＡＴを作製できる、即ち、自家療法を開発することは利点となろう。従って、ＢＡＴが乳児に豊富であり成体には少ないことからＢＡＴを作製するその潜在的効力にもかかわらず、ＥＳ細胞または胚性／胎児幹細胞の使用は適さない。成体脂肪組織は、脂肪吸引によってルーチンに除去されるため、ＷＡＴに由来する細胞からＢＡＴを作製できることは有利となろう。最後に、ＢＡＴは、ヒトに再導入されることが企図されるため、導入遺伝子の使用は、回避されるべきである。
【００１３】
従って、本発明の第１の態様において、脂肪由来成体幹細胞から作製された分化した褐色脂肪組織（ＢＡＴ）細胞が提供される。本出願人らは、ＷＡＴに存在する脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）から開始する、成体ＷＡＴからＢＡＴ細胞を作製するためのプロトコールを開発した。成体幹細胞は、トランスジェニックではない。
【００１４】
一実施形態において、成体幹細胞は、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）または脂肪前駆細胞、例えば、前脂肪細胞またはａｄＭＳＣ（脂肪組織由来間葉系幹細胞）である。
【００１５】
一実施形態において、ＵＣＰ１の基底発現は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）の少なくとも１０倍のレベルである。ＵＣＰ１の発現は、ＢＡＴ表現型の一般マーカーである。一実施形態において、ＵＣＰ１の基底発現は、ＷＡＴにおけるＵＣＰ１の基底発現の少なくとも２０倍である。ＵＣＰ１の発現は、ｃＡＭＰおよびそのアナログによってさらに誘導され得る。
【００１６】
一般に、遺伝子発現レベルは、本発明に従って成体幹細胞から得られた細胞の培養物において測定される。好ましくは、図面は、総細胞数に対して正規化され、従って、等しい細胞総数の培養物の間で相対的な比較が為される。例えば、培養物における細胞数にわたる結果を平均化することにより、１００細胞当たりまたは１細胞当たりの発現レベルを計算することができる。細胞数は、培養物におけるハウスキーピング遺伝子の発現レベルにより推測される。ハウスキーピング遺伝子は、全細胞において同じレベルで発現される。従って、各培養物におけるハウスキーピング遺伝子発現のレベルに対する遺伝子発現レベルの正規化は、異なる培養物にわたる比較を可能にする。
【００１７】
一実施形態において、ＢＡＴ培養物は、ＷＡＴと比較して増加した基底レベルでＰＤＲＭ１６を発現する。一部の例において、ＰＤＲＭ１６は、ＷＡＴにおける基底レベルよりも約２倍高いレベルで発現される。
【００１８】
一実施形態において、ＢＡＴ培養物は、ＷＡＴにおける基底発現レベルと比較して増加した基底レベルでＰＰＡＲＧＣ１ａを発現する。例えば、ＰＰＡＲＧＣ１ａは、ＷＡＴよりも約２０倍高いレベルで発現される。一部の例において、ＰＰＡＲＧＣ１ａは、ＷＡＴよりも約４０倍高いレベルで発現され得る。
【００１９】
一実施形態において、ＢＡＴ培養物は、白色脂肪組織（ＷＡＴ）と比較して増加したレベルではＣＩＤＥＡを発現しない。古典的ＢＡＴ遺伝子（Ｅｖａ１、ＦＢＸＯ３１、ＥＢＦ３、ＺＩＣ１）およびベージュ特異的遺伝子（ＴＭＥＭ２６、Ｔｂｘ１５、Ｓｈｏｘ２、ＨｏｘＣ９）の比較は、本発明のＢＡＴ細胞に関して、古典的ＢＡＴ系列よりも寧ろベージュを示唆する。一実施形態において、ベージュ脂肪においてより高いレベルで発現されるＣＤ１３７は、本発明の細胞において検出されない。
【００２０】
他の実施形態において、ＷＡＴと比較して次の遺伝子のうち１種または複数種の上昇した基底発現が観察される。ＴＢＸ１５、ＦＢＸＯ３１、ＥＢＦ３、ＳＨＯＸ２およびＴＭＥＭ２６。
【００２１】
本発明の第２の態様において、成体脂肪由来幹細胞からＢＡＴ細胞を得るための方法であって、間葉系幹細胞成長培地において幹細胞を培養するステップと、前記細胞を、Ｄｅｘ、ＩＢＭＸおよびＢＭＰ−７を含む培地に移すステップとを含む方法が提供される。
【００２２】
一実施形態において、細胞は、導入遺伝子をトランスフェクトされていない。
【００２３】
本発明に係る方法は、非常に効率的である。一実施形態において、ＵＣＰ−１等、ＢＡＴ関連遺伝子の発現に関する細胞培養物の抗体染色によって評価される通り、幹細胞の２０％以上が、ＢＡＴ細胞に分化する。好ましくは、幹細胞の２５％、３０％、４０％、５０％以上が、ＢＡＴに分化する。
【００２４】
本方法は、実施形態において、次の培地の組合せに幹細胞を曝露するステップを含む。
（ｉ）ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＢＭＰ−７；
（ｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｗ  Ｇｌｕｔａｍａｘ）、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、トリヨードチロニン（Ｔ３）、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよび３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）；ならびに
（ｉｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｗ  Ｇｌｕｔａｍａｘ）、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾンおよびロシグリタゾン。
【００２５】
上述のステップ（ｉｉｉ）は、培地を交換することにより反復することができる。
【００２６】
有利には、細胞は、３日間隔で逐次的に培地に曝露される。しかし、経験的解析により、特異的条件に対し異なるタイミングを決定することができる。
【００２７】
一実施形態において、成分を単一カクテルとして混合し、一段階手順においてＡＤＳＣの分化に用いることができる。これは、本明細書において「混合式」プロトコールと称される。
【００２８】
別の実施形態において、プロトコールは、次の通り３種の培地の組合せを含む。
（ｉ）ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＳＦＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；
（ｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよびＩＢＭＸ；ならびに
（ｉｉｉ）ＤＭＥＭ／Ｆ１２、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、デキサメタゾンおよびロシグリタゾン。
【００２９】
全培地において、抗生物質および／または抗真菌剤を用いて、感染を防止することができる。例えば、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを用いることができる。
【００３０】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様に係る方法によって得られる分化したＢＡＴ細胞を提供する。実施形態において、ＢＡＴ細胞は、本発明の第１の態様に係るＢＡＴ細胞となり得る。
【００３１】
第４の実施形態において、細胞が患者にインプラントされる、過剰な脂肪組織蓄積によって特徴づけられる疾患を患う患者の処置における使用のための、第１の実施形態に係る分化したＢＡＴ細胞が提供される。
【００３２】
第５の実施形態において、過剰な脂肪組織蓄積によって特徴づけられる疾患を患う患者を処置するための方法であって、前記処置を必要とする患者に、第１の実施形態に係る１個または複数個の細胞をインプラントするステップを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】１７日間分化させた脂肪由来幹細胞（Ｌｏｎｚａ）におけるＵＣＰ−１およびＰＲＤＭ１６発現の例を示す図である。Ａ）明視野；ｂ）抗ＰＤＭＲ１６  Ａｂ（緑色）Ｒ＆Ｄ、１：２０による染色；ｃ）抗ＵＣＰ１  Ａｂ（赤色）、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、１：１００；ｄ）ＰＤＲＭ１６（緑色）、ＵＣＰ−１（赤色）およびヘキスト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）（青色）の重ね合わせ。×２０拡大率。
【図２】１７日間分化させた脂肪由来幹細胞（Ｌｏｎｚａ）におけるＵＣＰ−１およびＰＲＤＭ１６発現の第２の例を示す図である。Ａ）明視野；ｂ）抗ＰＤＭＲ１６  Ａｂ（緑色）Ｒ＆Ｄ、１：２０による染色；ｃ）抗ＵＣＰ１  Ａｂ（赤色）、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、１：１００；ｄ）ＰＤＲＭ１６（緑色）、ＵＣＰ−１（赤色）およびヘキスト（青色）の重ね合わせ。×２０拡大率。
【図３】１７日間分化させた脂肪由来幹細胞（Ｌｏｎｚａ）におけるＵＣＰ−１およびチトクロムＣ酸化酵素発現の例を示す図である。Ａ）明視野；ｂ）抗ＵＣＰ−１  Ａｂ（緑色）、ＳａｎｔａＣｒｕｚ、１：１００による染色；ｃ）抗Ｃｙｔ  Ｃ  Ａｂ（赤色）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１：１００による染色。×１０拡大率。
【図４】１７日間分化させた脂肪由来幹細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における遺伝子発現のｑＰＣＲ解析を示す図である。ＡＤＳＣおよび分化したＢＡＴ細胞における発現レベルは、各遺伝子に対し１に設定した白色脂肪組織における発現の相対値である。
【図５】実施例２、３および４のプロトコールによって得られる細胞による、ＵＣＰ１タンパク質発現のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図６】実施例２、３および４に記載されている通りに得られるＢＡＴ細胞のｑＰＣＲ遺伝子発現解析を図解する図表である。
【図７】アドレナリン作動性シグナル伝達カスケードセカンドメッセンジャーであるｃＡＭＰで処理した、実施例２、３および４に記載されている通りに得られるＢＡＴ細胞のｑＰＣＲによるＵＣＰ１遺伝子発現解析を示す図である。ＢＡＴ活性は、アドレナリン作動性活性化（カテコラミン）によって増加する。アドレナリン作動薬またはセカンドメッセンジャー（ｃＡＭＰ）は、ＵＣＰ１発現を強力に活性化する。
【図８】ＢＡＴプロトコールにより分化した細胞が、公表されているＷＡＴプロトコールにより分化した細胞と比較してより高い呼吸能力を示すことを示す、ＸＦ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｔｏ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｅｓｔキット（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により測定される酸素消費解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、他に断りがなければ、分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの従来技法を当業者の技能範囲内で利用する。そのような技法は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、ブック１〜３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（１９９５年および定期的な補冊；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９、１３および１６章、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅｅ  ａｎｄ  Ａ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩｒＩ  Ｐｒｅｓｓ；ならびにＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００３５】
［定義］
分化した：本発明において、分化した組織または細胞とは、単能性、多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性または全能性細胞に由来する、規定の組織型（本発明の場合は褐色脂肪組織またはＢＡＴである）の細胞になった細胞である。
【００３６】
ＢＡＴ：褐色脂肪組織は、本明細書または例えばＳｖｅｎｓｓｏｎら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１１年２月；２７（２）：２２７〜３２に記載されている通り、褐色脂肪に関連する遺伝子発現プロファイルに代表される褐色脂肪、好ましくは、ヒト褐色脂肪の特徴を有し、褐色脂肪のエネルギー利用プロファイルを有する組織である。ＢＡＴは、典型的に、白色脂肪組織およびＡＤＳＣ  ＢＡＴ前駆体細胞よりも優れたレベルでＵＣＰ１遺伝子を発現する。ＢＡＴは、古典的またはブライト（ベージュ）系列のものとなり得る。古典的系列は、筋肉様系列のものであるＭｙｆ５発現細胞に由来し、一方、ブライトまたはベージュ系列は、ＷＡＴにおける細胞に由来する。実施形態において、本発明のＢＡＴ細胞は、ブライト／ベージュ系列のものである。
【００３７】
ＷＡＴ：白色脂肪組織は、成体白色脂肪の特徴を有する組織である。好ましくは、これはヒトＷＡＴである。
【００３８】
細胞：本明細書に言及されている通り、細胞は、全て半透性細胞膜または細胞壁に包まれた１個または複数個の核、細胞質および様々な細胞小器官からなる、独立的に機能することのできる生物の最小の構造単位または単細胞生物として定義されている。
【００３９】
本発明に係るＢＡＴ細胞が由来する出発細胞は、成体ヒト幹細胞または前駆細胞、好ましくは、脂肪組織に由来する幹細胞または前駆細胞に由来する。本発明の実施形態において、細胞は、遺伝子操作されていない。一実施形態において、それらは、間葉系幹細胞である。幹細胞は、より詳細に下に定義されており、全能性、２種以上の分化細胞型を生じることのできる多能性または多分化能性細胞である。幹細胞は、インビトロで分化させて、それ自身が多分化能性であっても終分化していてもよい分化細胞を生じることができる。インビトロで分化した細胞は、細胞分化を促進する１種または複数種の薬剤に幹細胞を曝露することにより人為的に作製された細胞である。
【００４０】
成体：本発明の文脈において、境界線は、胚性、新生児および新生児期後の組織の間に引かれる。新生児期後組織は、成体と称される。例えば、新生児期後は、誕生から１カ月後の（ヒト）乳児を指す。
【００４１】
トランスジェニック：本明細書に言及されている通り、トランスジェニック細胞は、外来性遺伝子をトランスフェクトまたは形質転換された細胞である。
【００４２】
全能性：全能性細胞は、生物および胚体外組織に存在するいかなる種類の体細胞または生殖細胞にも分化する潜在力を有する細胞である。よって、いかなる所望の細胞も、何らかの手段により、全能性細胞から派生させることができる。
【００４３】
多能性：多能性細胞は、発生中の胚および成体生物のあらゆる細胞型に分化し得るが、胚体外組織には分化しない細胞である。
【００４４】
体細胞：本明細書において、用語「体細胞」は、本技術分野で理解されているものと同じ意義を有する、即ち、生殖系列細胞を除く生物の身体を構成するいずれかの細胞である。哺乳類において、生殖系列細胞（配偶子としても公知）は、受精の際に融合して接合子と呼ばれる細胞を産生する精子および卵子であり、接合子から哺乳類胚全体が発生する。
【００４５】
培養培地：本発明に係るＢＡＴ細胞は、特定の薬剤の存在下における培養培地において脂肪由来幹細胞を培養することにより得ることができる。培地は、細胞の増殖および／または継代に用いられる培養培地となり得る。場合によっては、培地は、典型的に未知組成の血清を含むことがあるため、培養培地の組成は未知のものとなるであろう。しかし、好ましい実施形態において、培養培地の成分のそれぞれは、その量または濃度の観点から公知のものとなるであろう。一実施形態において、培養培地は、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＤＭＥＭ／Ｆ１２等、幹細胞の培養に適した無血清培地となり得る。
【００４６】
脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）：本明細書に言及されている通り、脂肪由来幹細胞またはＡＤＳＣは、脂肪組織に由来する幹細胞である。そのような細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄＭＳＣ）と、一般的に、脂肪起源の他の多分化能性細胞を含む。ＡＤＳＣは、Ｌｏｎｚａ（カタログ番号ＰＴ−５００６）およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＳｔｅｍＰｒｏ  ＡＤＳＣキット）から市販されている。ａｄＭＳＣは、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（カタログ番号Ｃ−１２９７８）から入手できる。ＡＤＳＣは、例えば、本明細書に表記されている通り、ＷＡＴから単離することができる。
【００４７】
成体幹細胞：本明細書に定義されている通り、成体に由来するいずれかの幹細胞である。好ましくは、成体幹細胞はＡＤＳＣである。
【００４８】
薬剤：用語「薬剤」は、ａｄＭＳＣ等の細胞が含有されている培地に添加される（例えば、外来的に添加または補充される）要素を指す。薬剤は、通常、細胞または細胞が含有されている培地に存在しなくてよい。薬剤は、単一薬剤であっても、２種以上の異なる薬剤の組合せ等、薬剤の組合せであってもよい。
【００４９】
本開示は、成体細胞からＢＡＴ細胞を得るための方法と、そのような方法によって得ることができるＢＡＴ細胞を提供する。本発明のＢＡＴ細胞は、本明細書に記載されている適用において有利な特定の特徴を有する。これらの方法は、幹または前駆細胞からＢＡＴ細胞系列への分化を促進するステップを含む。より具体的には、本開示は、少なくとも部分的に、ＷＡＴ由来の幹または前駆細胞を分化させて、規定の条件を用いてＢＡＴを産生することができるという発見に基づく。
【００５０】
＜細胞＞
＜幹細胞＞
幹細胞は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、２００１年６月、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｈ．ｇｏｖｌｎｅｗｓ／ｓｔｅｍｃｅｌｌ／ｓｃｉｒｅｐｏｒｔ．ｈｔｍに詳細に記載されている。幹細胞は、分化して、少なくとも１種、場合によっては多くの特殊化した細胞型を形成することのできる細胞である。
【００５１】
現在までに、３種類の哺乳類多能性幹細胞が単離されており、あるいは人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を含めるのであれば、４種類の哺乳類多能性幹細胞が単離されている。これらの細胞は、通常、胚の全３胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）に由来する細胞型を生じることができる。３種類の幹細胞は、精巣腫瘍に由来する胚性癌腫（ＥＣ）細胞、着床前胚（通常、胚盤胞）に由来する胚性幹（ＥＳ）細胞、および着床後胚（通常、生殖腺の一部となることが運命づけられた胎児の細胞）に由来する胚性生殖（ＥＧ）細胞である。これらの細胞は、真に多能性であるため、分化を方向づける試みにおいて特に注目を集める。しかし、これらは本発明の焦点ではない。
【００５２】
幹細胞は、成体生物にも存在する。成体幹細胞は、分化した（特殊化した）組織において生じ、自身を再生し、分化してより特殊化した細胞を生じることができる未分化細胞である。従って、これは、患者の組織から得てＢＡＴの作製に用いることができるため、本発明における使用に理想的である。成体幹細胞に加えて、多くの種類の前駆細胞または前駆体細胞が存在する。これらは、その分化潜在力が部分的に制限され、恐らく身体のあらゆる組織において生じる細胞であり、分化することができるが、そのレパートリーが幹細胞ほど広範ではなく、定義によると、自己再生できないと言う点において幹細胞とは異なる。これらの細胞も、本発明の文脈において有用である。
【００５３】
様々な組織から試料を得るための方法と、初代細胞株を樹立するための方法は、本技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ＧＥ、Ｗｉｓｅ  ＣＪ．、「Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ，  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ．１９９７；７５：１３〜２１を参照）。体細胞株は、例えば、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物・細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）またはＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｓｉｃｋｉｎｇｅｎｓｔｒ．６３／６５、Ｄ−６９１２６  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ等、多数のサプライヤーから購入することができる。
【００５４】
＜半分化（ｓｅｍｉ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）細胞＞
この細胞は、機能的ＢＡＴ細胞を生じることができる多分化能性前駆細胞等、前駆細胞となり得る。幹細胞と同様に、前駆細胞は、特異的な種類の細胞型に分化する能力を有する。しかし、幹細胞とは対照的に、これは、既にはるかに特異的になっており、その「標的」細胞に分化するよう押し進められている。幹細胞および前駆細胞の間の最も重要な差異は、幹細胞が、無制限に複製することができる一方、前駆細胞は、限られた回数しか分裂できないことである。大部分の前駆細胞は、単能性または多分化能性として記載されている。この観点において、これは、成体幹細胞と比較することができる。しかし、前駆細胞は、細胞分化のより進んだステージにあると考えられる。これは、幹細胞と完全に分化した細胞との間の「中央」に位置する。これが有する効力の種類は、その「親」幹細胞の種類と、また、そのニッチに依存する。幹細胞と同様に、これは、大部分において、これが成長しその標的組織に分化するための正しい条件により、コロニーにおいて形成および発生される。前駆細胞は、成体生物に存在し、身体の修復系として作用する。これは、特殊な細胞を補充するが、同様に、血液、皮膚および腸管組織を維持する。これは、発生中の胚性膵臓組織に見出すこともできる。
【００５５】
ヒト脂肪由来幹細胞は、例えば、Ｌｉら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２、２３７：８４５〜８５２およびＵＳ２０１２２０８２７４に表記されている手順により、脂肪組織から単離することができる。
【００５６】
＜細胞培養技法＞
細胞培養は、いずれかの適した技法によって行うことができる。ＡＤＳＣまたはａｄＭＳＣを含む、成体幹または前駆細胞からＢＡＴを分化させるために用いることのできる本明細書に開示されている薬剤は、順次または同時期に添加することができる。
【００５７】
本出願人らは、例えば、ＥＰ１９１７３４９、ＷＯ２００４０３１３６９、ＥＰ２４９１３８６およびＥＰ２４６４７２０において、種々の培地における細胞の逐次的培養のための技法およびツールを以前に開示した。そのような技法は、本発明の文脈において用いることができるが、これは必須ではなく、よって、本願は、脂肪前駆体をＢＡＴに分化させるために必要な条件を提供する。
【００５８】
従って、細胞培養は、本明細書に記載されている薬剤に細胞を曝露するための標準培養技法を用いて、標準細胞培養プレートにおいて行うことができる。
【００５９】
細胞培養における１種または複数種の薬剤の量（例えば、濃度または用量）および曝露時間は、脂肪細胞前駆体の集団におけるＢＡＴ細胞または成熟ＢＡＴ細胞の特徴を有する細胞の数を増加させるのに十分なものとなろう。濃度および曝露時間の両方は、当業者によって経験的に決定することができる。
【００６０】
典型的には、細胞は、最大３日間、例えば１日間、２日間または３日間の期間、薬剤に曝露される。より長いインキュベーション時間を用いてもよい。
【００６１】
ＢＡＴは、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）、細胞死誘導性ＤＦＦ４５様エフェクターＡ（ＣＩＤＥＡ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、コアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ）−１アルファ、および／またはＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ｃａｍｐ）−１ベータおよび／またはＰＲＤＭ−１６等、１種または複数種のＢＡＴ特異的マーカーを測定することにより同定することができる。ＢＡＴを同定するための代替方法は、ＢＡＴ形態（例えば、視覚による、例えば、細胞の顕微鏡検査）；またはＢＡＴ熱力学、例えば、チトクロム酸化酵素活性、Ｎａ＋−Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ酵素単位の測定またはＢＡＴ熱発生に関与する他の酵素のアッセイおよび動物移植後の機能解析を含む。
【００６２】
＜薬剤＞
本発明における細胞培養において用いられる薬剤は、いずれかの従来の様式で、例えば、細胞集団への投与のための担体系において製剤化することができる。担体は、リポソーム等、コロイド系となり得る。担体は、ポリマー、例えば、生分解性、生体適合性ポリマーマトリックスとなることもできる。一部の実施形態において、タンパク質は、タンパク質統合性を維持しつつポリマーマトリックスに包埋することができる。ポリマーは、ポリペプチド、タンパク質または多糖等、天然のものであっても、ポリ（アルファ−ヒドロキシ）酸等、合成のものであってもよい。例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチンおよびこれらの組合せで作製された担体が挙げられる。一部の実施形態において、ポリマーは、ポリ−乳酸（ＰＬＡ）またはｃｏ−ポリ乳酸／グリコール酸（ＰＧＬＡ）である。ポリマーマトリックスは、マイクロスフェアおよびナノスフェアを含む、種々の形態およびサイズで調製および単離することができる。ポリマー製剤は、治療効果の持続時間の延長をもたらすことができる。
【００６３】
しかし、一般に、薬剤は、細胞培養培地に直接的に添加することができ、細胞に取り込まれる。
【００６４】
一部の実施形態において、薬剤は、ＢＭＰ、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよびＩＢＭＸのうち１種または複数種を含むことができる。
【００６５】
＜ＢＡＴの派生＞
ＢＡＴ細胞は、本明細書に表記されている方法に従って、脂肪組織幹または前駆細胞から得ることができる。例えば、上述の通りに単離されたＡＤＳＣは、ＭＳＣ培養に適した基礎培地において培養することにより、薬剤に曝露することができる。
【００６６】
ａｄＭＳＣを含む脂肪由来幹または前駆細胞は、１種の薬剤、または組み合わせたおよび／または連続した１種または複数種の薬剤により、ＢＡＴに分化させることができる。上に明示されている通り、薬剤は、インスリン、トランスフェリン、Ｔ３、デキサメタゾン、ＢＭＰ−７、ＩＢＭＸおよびロシグリタゾンのうち１種または複数種を含むことができる。細胞培養培地において用いられるＴ３の濃度は、０．１〜２ｎＭに及ぶことができ；デキサメタゾンの濃度は、１ｕＭ〜５００ｎＭに及ぶことができ；ＩＢＭＸの濃度は、１００ｕＭ〜１ｍＭに及ぶことができ；ＢＭＰ−７の濃度は、１０ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌに及ぶことができ；ロシグリタゾンの濃度は、１０ｎＭ〜１ｍＭの間に及ぶことができる。培養培地は、細胞培養に適したいずれかの培地となり得る。培養培地の例として、ＬＤＭＥＭ（低グルコースＤＭＥＭ）、ＨＤＭＥＭ（高グルコースＤＭＥＭ）およびＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。培養培地は、血清または血清タンパク質を補充することができる。あるいは、細胞は、血清または血清タンパク質を添加しない培養培地において成長させることができる。適した培地の例として、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ＭＳＣ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）無血清培地、Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＭｅｓｅｎｃｕｌｔ（登録商標）幹細胞基礎培地および細胞培養のための他の市販の培地が挙げられる。培地は、最適な分化のために３日毎に換えることができる。分化は、本技術分野において公知の種々の方法によってモニターすることができる。幹細胞および分化処理した細胞の間のパラメータの変化は、処理細胞が分化したことを示すことができる。顕微鏡を用いて、分化における細胞の形態を直接的にモニターすることができる。例として、分化している脂肪細胞は、ＢＡＴ脂肪細胞に典型的な多胞性（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒ）細胞高次構造を採ることができ、この構造において、脂肪の液滴が細胞質中に分散している。細胞は典型的に、多角形の形状も採る。細胞は、本技術分野において周知の方法を用いて免疫染色することができる。特に、ＵＣＰ１は、ＢＡＴのマーカーである。例えば、ＵＣＰ１に特異的な一次抗体は、直接検出のためにフルオロフォアまたは発色団で標識することができる。あるいは、一次抗体は、フルオロフォアもしくは発色団で標識されたまたは酵素に連結された二次抗体により検出することができる。フルオロフォアは、フルオレセイン、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、Ｃｙ−５．５、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ５２５、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ５６５またはＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ６５３となり得る。二次抗体に連結された酵素は、ＨＲＰ、Ｂ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼとなり得る。標識された細胞は、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡下で検査することができる。細胞または細胞培地の蛍光または吸光度は、蛍光光度計または分光光度計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｒ）において測定することができる。遺伝子発現の変化は、ＲＴ−ＰＣＲまたは定量的リアルタイムＰＣＲを用いて、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のレベルでモ���ターすることもできる。ＢＡＴのいかなるマーカーを用いてもよい。例えば、ＵＣＰ１発現をモニターすることができる。本技術分野において公知の方法を用いて細胞からＲＮＡを単離することができ、本技術分野において周知のＰＣＲ条件およびパラメータを用いて所望の遺伝子産物を増幅することができる。増幅することができる遺伝子産物は、脱共役タンパク質（ＵＣＰ１）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ、コアクチベーター１アルファ（ＰＧＣ）−１アルファ、および／またはＰＰＡＲガンマコアクチベーター（ＰＧＣ）−１ベータおよび／またはＰＲＤＭ−１６を含む。
【００６７】
＜ＢＡＴの増殖＞
ＢＡＴ細胞は、Ｃｏｓｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌｔｄ．製の褐色脂肪細胞維持培地等、市販の培地を用いた培養において増殖させることができる。あるいは、ＤＭＥＭ等、一般に入手できる培養培地を用いて、脂肪細胞を増殖させることができる。
【００６８】
＜キット＞
本発明は、脂肪組織由来幹または前駆細胞からＢＡＴ細胞を作製するためのキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、脂肪由来幹または前駆細胞；１種または複数種の幹細胞または前駆細胞からＢＡＴ細胞系列への分化を促進させることができる１種または複数種の薬剤；必要に応じて、対象に細胞を投与するための装置および／または投与のための説明書を含むことができる。キットの異なる成分は、別々の容器に包装し、使用直前に混合することができる。２種以上の薬剤が特定のキットに含まれる場合、薬剤は、別々に包装し、使用前に別々に混合することができる、あるいはその結果得られる混合物の成分が組み合わせたときに安定的であるならば、一体に包装することができる。一実施形態において、本発明に係るキットは、Ｄｅｘ、ＩＢＭＸおよびＢＭＰ−７のうち２種以上を含む。一実施形態において、キットは、上に表記されている薬剤、ＢＭＰ、インスリン、トランスフェリン、ＢＭＰ−７、Ｔ３、デキサメタゾン、ロシグリタゾンおよびＩＢＭＸのうち２、３、４、５または６種以上を含むことができる。
【００６９】
キットは、ＳｔｅｍＰｒｏ  ＳＦＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２および／またはＤＭＥＭ等、基礎培地をさらに含むことができる。
【００７０】
必要に応じて、キットは、ＢＡＴ細胞を派生させることができる前脂肪細胞またはａｄＭＳＣ等の細胞、ならびに脂肪組織の抽出およびそれから幹細胞を派生させるための器具、説明書および薬剤を含むことができる。
【００７１】
＜治療適用＞
本発明によって得られるＢＡＴは、患者への導入または再導入のための治療目的に用いて、個体における褐色脂肪含有量を増加させることができる。
【００７２】
脂肪組織の送達のための方法は、本技術分野において公知のものである。方法は、処置すべき対象にＢＡＴ細胞をインプラントするステップを含むことができる。そのような方法は、患者における肥満およびインスリン抵抗性の処置に、あるいは肥満に関連する疾患、例えば、糖尿病、がん、神経変性および加齢の処置に有用である。ＢＡＴ細胞をインプラントするための方法は、本技術分野において公知のものであり、例えば、針を備えるシリンジまたは他の送達装置等、対象への細胞の導入を可能にするよう構成された送達系を用いるステップを含む。典型的には、ＢＡＴ細胞は、細胞が付着することができる足場、マトリックスまたは他のインプラント式装置ありまたはなしで、薬学的に許容される培地または担体中に存在するであろう（例として、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチンおよびこれらの組合せで作製された担体が挙げられる）。
【００７３】
様々な投与経路および様々な投与部位は、当業者にとって明らかであり、腎臓被膜下、皮下、中枢神経系（くも膜下腔内を含む）、血管内、肝内、臓器内（ｉｎｔｒａｓｐｌａｎｃｈｎｉｃ）、腹腔内（網内（ｉｎｔｒａｏｍｅｎｔａｌ）を含む）および筋肉内部位を含む、脂肪細胞が存在するいずれかの部位を含む。例えば、ＢＡＴ細胞は、患者の皮下にインプラントすることができる。
【００７４】
インプラントされた細胞が、患者自身の細胞に由来することができ、従って、免疫学的に適合性となるであろうことは、本発明の利点である。免疫学的に適合性でない細胞が用いられる場合、免疫抑制化合物を投与することができる。
【実施例１】
【００７５】
＜ヒトａｄＭＳＣの単離＞
待機的外科手術手技を受けている若年ドナーから得た皮下脂肪組織からヒトａｄＭＳＣを単離した。およそ１．５ｇの脂肪組織をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、細かく刻み、続いて３７℃で３０分間、ウォーターバス振盪機（２００ｒｐｍ）において０．１５％コラゲナーゼＩ型（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）で消化した。１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｙｍｃｉｎ）（５０ｍｇ／ｍＬ）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）の添加により、コラゲナーゼを不活性化した。ａｄＭＳＣ含有細胞懸濁液を６００ｇで５分間、遠心分離した。単離した細胞を、２５ｃｍ２細胞培養フラスコに２．５×１０４細胞の密度で蒔き、標準培養培地において３７℃、５％ＣＯ２で培養した。４８時間後に培養物をＰＢＳで洗浄して、付着していない細胞を除去し、新鮮な培地を再供給した。ａｄＭＳＣを増やし、脂肪生成分化によって特徴づけた。脂肪生成キット（Ｃｙａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、培養１４日後に、脂質液滴のオイルレッドＯ（Ｓｉｇｍａ）染色によりＡＤＭＳＣの脂肪生成分化を確認した（図１ｃ）。適切な量の滅菌ＨＣｌ（１ｍｏｌ／Ｌ）およびＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）をＤＭＥＭに添加し、市販のｐＨ微小電極（Ｌａｚａｒｌａｂ、米国カリフォルニア州ロサンゼルス）（０．０１のｐＨ単位に感受性）を用いてモニターすることにより、異なるｐＨ値を有する培養培地を調製した。７．４（標準条件）、７．１（正常ＩＶＤ）、６．８（軽度変性ＩＶＤ）および６．５（重度変性ＩＶＤ）を含む、４種のｐＨ値を有する培地を得た。培養培地を３７℃、５％ＣＯ２で３日間維持して、ｐＨを平衡化した（ＣＯ２依存性）。細胞増殖アッセイのための２４ウェルプレート、あるいは細胞生存率ならびに遺伝子およびタンパク質発現解析のための２５ｃｍ２細胞培養フラスコのいずれかにおいて、継代２におけるａｄＭＳＣを培養した。３日目に細胞に新鮮な培地を再供給し、６日目に解析のために収集した。
【実施例２】
【００７６】
＜ＢＡＴの分化＞
標準成長培地（ＳｔｅｍＰｒｏ  ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において３０，０００細胞／ｃｍ２（０日目）で脂肪由来幹細胞を播種する。３日後および下に示すその後の日数において、次の培地処方を細胞に添加する。細胞培養成分は市販されている。ＢＭＰ７は、骨形成タンパク質７ｂである。培養培地は、感染を防止するためにペニシリンおよびストレプトマイシン（１％）を含む。
【００７７】
【表１】
0006453753.tif 000002
【００７８】
１７日目に細胞を固定し、ＢＡＴ遺伝子発現および形態に関して解析する。
【００７９】
＜結果＞
図１および図２は、ＡＤＳＣ（Ｌｏｎｚａ）に由来する細胞におけるＵＣＰ１およびＰＲＭＤ１発現を示す。細胞は、ＢＡＴの特徴を全て示す。
【００８０】
図３は、上に表記されている通りに得られた細胞におけるＵＣＰ１およびチトクロムＣ酸化酵素染色の結果を示す。再度、細胞は、ＢＡＴの特徴を示す。
【００８１】
図４は、上述の通りに得られたＢＡＴ細胞のｑＰＣＲ遺伝子発現解析の結果を示す。これらの結果は、ＢＡＴ表現型の存在を確認する。興味深いことに、ＣＩＤＥＡは、ＷＡＴと比較して過剰発現されていない。本発明に従って得られるＢＡＴ細胞において発現される遺伝子と、その関連する系列を下表２に表記する。
【００８２】
【表２】
0006453753.tif 000003
【実施例３】
【００８３】
＜一段階プロトコール＞
逐次培養プロトコールを一段階（「混合式」）プロトコールに置き換えて、実施例１に概要を述べた手順を反復した。本実験において、ＭＳＣ  ＳＦＭ培地においてＡＤＳＣをインキュベートし、続いて分化期間の持続時間（１５〜１６日間）、分化培地に直接的に移した。
【００８４】
【表３】
0006453753.tif 000004
【００８５】
ＩＴＳＥは、トランスフェリンおよびインスリンを含有する市販の細胞培養培地サプリメントであるが、残りの成分は、実施例２において用いられる試薬と同一である。
【００８６】
図５〜図８に結果を表記し、これについて実施例４でさらに説明する。
【実施例４】
【００８７】
＜第２のプロトコールを用いたＢＡＴの分化＞
ＳｔｅｍＰｒｏ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において５０，０００細胞／ｃｍ２（０日目）で脂肪由来幹細胞を播種し、２日後に、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンを再度含有する、次の処方に従った分化培地に培地を置き換える。６日目の後には、分化１４または１５日目まで２〜３日毎に培地を交換する。
【００８８】
【表４】
0006453753.tif 000005
【００８９】
ＢＡＴの作製をモニターするために、ＢＡＴ細胞型に関連する様々な遺伝子の発現に関して細胞を解析した。図５は、実施例２、３および４のプロトコールに従って単離された組織のＵＣＰ−１発現のウエスタンブロットを図解する。本実施例４のプロトコールは、「ＭＲ」と称される。
【００９０】
図６は、ｑＰＣＲによって評価される、３種のプロトコールにより得られる遺伝子発現の変化を示す。各事例において、ＵＣＰ−１発現は、細胞がＢＡＴに分化するにつれて有意に増加する。他のマーカーの発現の増加は、用いたプロトコールに応じて変動する。
【００９１】
ＢＡＴにおけるＵＣＰ−１発現は、典型的にｃＡＭＰ誘導性である。従って、ｃＡＭＰにより誘導された場合の、３種のプロトコールによって得られた細胞におけるＵＣＰ−１の誘導を解析した。結果を図７に示す。全３種のプロトコールは、ｃＡＭＰ誘導性遺伝子発現を示す細胞の作製をもたらし、ＭＲプロトコールが、最も優れた程度の誘導能を生じた。
【００９２】
ＢＡＴ細胞の特徴の最終アッセイは、天然に得られるＢＡＴと比較した、細胞の酸素消費の解析に関与した。褐色脂肪細胞は、白色脂肪細胞よりも高いミトコンドリア含有量を有し、より高レベルのＵＣＰ１を発現する。ＵＣＰ１タンパク質は、ミトコンドリア内膜を通してＨ＋を流し、熱を生じることにより、酸化的リン酸化からＡＴＰ産生を脱共役し、よって、ＢＡＴ細胞は、白色脂肪細胞よりも高い呼吸数を示す。呼吸能力を評価する最良の仕方の１つは、インタクト細胞における酸素消費を直接的に測定することによるものである。この理由により、Ｓｅａｈｏｒｓｅ技術を用いた。Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ノース・ビレリカ）製のＸＦ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｔｏ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｔｅｓｔキットを用いて、マイクロプレートにおいてミトコンドリア機能の４種の重要なパラメータを測定した（基礎呼吸、ＡＴＰターンオーバー、プロトンリークおよび最大呼吸）。これらのパラメータは全て、先に言及した通り、より多数のミトコンドリアおよびより高いＵＣＰ１タンパク質発現のため、通常、ＷＡＴ細胞と比較してＢＡＴ細胞においてより高い（Ａｈｆｅｌｄｔら、（２０１２）、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１４（２）、２０９〜２１９）。結果を図８に示す。
【００９３】
他に記述がなければ、本明細書に用いられているあらゆる技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意義を有する。本発明の実施または検査において、本明細書に記載されているものと類似または均等ないかなる方法および材料を用いてもよい。そのような使用に適した方法、装置および材料は、上に記載されている。本明細書に引用されているあらゆる刊行物は、本発明に関連して用いることのできる刊行物において報告されている方法論、試薬およびツールを説明および開示する目的のため、ここに本明細書の一部を構成するものとしてその内容全体を援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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