(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化基に共有結合したニューロテンシンポリペプチドからなり、
前記ニューロテンシンポリペプチドは、
配列番号２の配列からなるか、又は
ＮＴ（１−１３）、ＮＴ（２−１３）、ＮＴ（６−１３）、ＮＴ（８−１３）、Ｌｙｓ−ＮＴ（８−１３）、［Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、及び［Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）から選ばれ、
前記活性化基は、アミノ酸配列：Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ（ここで、ａａ１は、プロリン、又は、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）及びチアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）から選ばれるプロリン類似体である）からなるものである、化合物。
【請求項２】
前記活性化基は、配列番号５〜１１の配列のいずれか１つ、好ましくは配列番号９の配列又は配列番号１１の配列からなる、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記活性化基及びニューロテンシンポリペプチドは、リンカー基を介してコンジュゲートされている、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記リンカー基は、ポリエチレングリコール、ポリＧｌｙ、Ａｈｘスペーサー基、又はペプチド結合からなる、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
以下の化合物（Ｉ）〜（ＸＸ）から選ばれる、化合物：
【化１】
0006562948.tif 000019
【化２】
0006562948.tif 000020
Pr-cMPipRLRSarC-RRPYIL-OH (IX)、
Pr-cMPipRLRSarC-GGG-KPRRPYIL-OH (X)、
Pr-cMPipRLRSarC-Ahx-KPRRPYIL-OH (XI)、
Pr-cMPipRLRSarC-Ahx-RRPYIL-OH (XII)、
Pr-cMPipRLRSarC-PEG2-RRPYIL-OH (XIII)、
Pr-cMPipRLRSarC-PEG6-RRPYIL-OH (XIV)、
Pr-cMPipRLRSarC-RRPYTleL-OH (XV)、
Pr-cMPipRLRSarC-KRPYTleL-OH (XVI)、
Pr-cMPipRLRSarC-RKPYTleL-OH (XVII)、
Pr-cMPipRLRSarC-RRPWTleL-OH (XVIII)、
Pr-cMPipRLRSarC-KRPWTleL-OH (XIX)、及び
Pr-cMPipRLRSarPen-KRPYTleL-OH (XX)。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物、及び
医薬的に許容されるキャリアー又は賦形剤
からなる、医薬組成物。
【請求項７】
ニューロテンシンポリペプチドを、請求項１〜４のいずれか１つで定義された活性化基に共有結合させること
からなる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物の製造方法。
【請求項８】
哺乳動物対象において、体温を低下させるために使用される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項９】
突然の心停止後の、もしくは卒中、新生児虚血、心臓手術、外傷性頭部又は脊髄損傷、発作、疼痛、又は高熱を有する哺乳動物対象において、低体温を誘導するために使用される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１０】
哺乳動物対象において、脳損傷を保護、予防、又は軽減するために使用される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１１】
哺乳動物対象において、痙攣を軽減するために使用される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１２】
哺乳動物対象において、疼痛を軽減するために使用される、請求項１〜５のいずれか１つに記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロテンシン又は活性化基にコンジュゲートされたその類似体（「活性化ニューロテンシン」ともいう）からなる新規化合物、それからなる医薬組成物、及びその使用に関する。本発明の化合物及び組成物は、それを必要としている哺乳動物の体温を低下させるため（例えば、コントロールされた薬理的正常体温又は低体温を誘導するため）、特に、神経保護を誘導するために使用される。これらは特に、疼痛の処置は勿論のこと、例えば、虚血、外傷、又は発作と関連している中枢神経系（ＣＮＳ）の損傷を低減するために使用される。本発明の化合物及び組成物は、また、痙攣、高熱、又はニューロテンシンの生物活性からの恩恵がある何らかの病状の処置に使用される。
【背景技術】
【０００２】
体温を低下させること（低体温）は、例えば、卒中、心停止又は新生児虚血と関連している脳虚血、発作、深刻な外傷性脳及び脊髄損傷、もしくは心臓手術といった種々の状況で起こる傷害に対して効力のある神経保護的アプローチである。また、体温上昇を伴う病理的状況（例えば、頭蓋内圧亢進（ＩＣＨ）、虚血性又は出血性卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、敗血症、もしくは発熱に関連した何らかのウィルス、細菌又は寄生虫感染等）において、高熱から正常体温への還元は当然である。
【０００３】
従来、冷却材料又は処置といった外的方法（例えば、冷却布、氷浴等）、もしくは内的方法（例えば、冷却プローブ、低温流体の注入等）、もしくは双方を含む、体温を低下させるための物理的なアプローチが採用されている。しかしながら、これらの物理的なアプローチは、実行することが困難で、高額であり、作用及び／又は一時的効果の発現を遅延させ、麻痺性又は鎮静作用を有する薬剤を含む追加の処置剤の投与を必要とする、悪寒等の望ましくない副作用を誘導する。
【０００４】
物理的なアプローチにより、本質的にニューロテンシン又はその類似体を使用することが示唆されてきている。ニューロテンシン（ＮＴ）は、アミノ酸配列：ｐｙｒｏＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＯＨからなる線形トリデカペプチドである。哺乳動物において、内在性ＮＴは、主にＣＮＳにて発現され、ここで、ドーパミン作動系と相互作用する神経伝達物質及び神経調節物質として動作する。ＮＴは、また、末梢組織、主に消化管で発現し、ここで、消化管運動の一因となる。加えて、ＮＴ系の規制解除は、数種の癌と同様に、多くの精神神経疾患の病態生理に関与してきている。脳又は脊髄に直接投与したとき、ＮＴは、有力なμ−独立抗侵害受容効果及び低体温を齎す。ＮＴの臨床的な使用により、多くの病態生理学的疾患を処置するための、興味深く、革新的な手段が得られるが、これは、全身投与での血漿における非常に急速なタンパク質切断によって妨害される。さらに、不充分な血液脳関門（ＢＢＢ）浸透性により、脳又は脊髄に直接投与されない限り、その治療能力は妨害される。したがって、ニューロテンシンを基礎とする化合物の設計によって全身投与での中枢活性が引き出されるような医化学的な方法が必要とされている。抗体等の作用因子の配送（国際公開番号ＷＯ２０１１／１２７５８０号公報）又はペプチドの移送（国際公開番号ＷＯ２０１０／０６３１２２号公報）のために、ニューロテンシン類似体を設計すること及び／又はニューロテンシンあるいはその類似体をコンジュゲートすることが提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開番号ＷＯ２０１１／１２７５８０号公報
【特許文献２】国際公開番号ＷＯ２０１０／０６３１２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、従来技術において、ニューロテンシンを基礎とする薬剤には、疼痛の処置は勿論のこと、高熱、興奮毒性プロセス、神経炎症、痙攣といった異なる病態生理学的疾患における急速な作用の発現及び生物活性を含む、向上した効能及び安全性プロファイルが必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、向上した治療効果を有する新規ニューロテンシン化合物、及び哺乳動物、特にヒト対象におけるその使用を開示する。本発明は、活性化基（ｂ）に共有結合したＮＴ又はその類似体（ａ）からなる新規分子の設計に基づいている。本発明の「活性化ＮＴ」化合物により、ＢＢＢ浸透性及びタンパク質切断への耐性が高まっており、極めて向上した生物活性が実証されている。特に、全身投与で、本発明の活性化ＮＴ化合物は、種々の治療疾患での低体温、てんかん重積状態での抗痙攣効果、並びに神経保護及び抗神経炎症効果を含む、インビボにおける顕著な治療効果を齎した。重要なのは、本発明の化合物は、非常に急速に作用が発現し、強い生物活性を示すと共に、比較的作用の持続時間が短く、安全性プロファイルに非常に優れることである。これらの特性により、安全な治療介入を必要とする急性疾患における生化学的効果の細かい制御及び調律のための、非常に優れた薬力学的な安全性必要条件が得られる。さらに、本発明の化合物は、反復投与でいくらかの活性を維持しており、反復又は亜慢性処置に使用することができる。
【０００８】
本発明の目的は、したがって、活性化基に共有結合したニューロテンシンポリペプチドからなる化合物を提供することである。該活性化基は、アミノ酸配列：Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ（ここで、ａａ１はプロリン又はその類似体である）からなるものである。ＮＴポリペプチドへのカップリングは、直接的であってもよく、間接的、すなわちリンカー基を介したものであってもよい。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、上記定義された化合物、及び医薬的に許容されるキャリアー又は賦形剤からなる医薬組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、ニューロテンシンポリペプチドを、上記定義された活性化基に共有結合させること、好ましくはリンカー基を用いて間接的に共有結合させることからなる、上記定義された化合物の製造方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、上記定義された化合物又は組成物の、薬剤としての使用を提供することである。該化合物又は組成物は、疼痛の処置は勿論のこと、哺乳動物対象において、体温を低下させるため（例えば、低体温又は正常体温を誘導するため）に使用されてもよく、神経保護を誘導するため（例えば、脳損傷を低減するため）に使用されてもよい。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、上記定義された化合物又は組成物の、脳損傷を有する対象を処置するための使用を提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物対象において低体温を誘導する方法に関する。該方法は、上記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、脳損傷を有する対象を処置する方法を提供することである。該方法は、上記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００１５】
本発明は、ヒト患者等の何らかの哺乳動物対象における脳損傷の処置（例えば、脳損傷の影響に対する保護、予防、又は軽減）のために使用されてもよい。本発明は特に、脳虚血、発作、心停止又は新生児虚血、痙攣、深刻な外傷性頭部及び脊髄損傷、心臓手術、ＩＣＨ、敗血症、もしくは発熱に関連した何らかのウィルス、細菌又は寄生虫感染を有する対象の処置に適している。本発明はまた、標準的な抗痙攣剤に対する耐性がある痙攣を有する対象、もしくは、標準的な解熱薬剤に対する耐性又は該薬剤と患者の熱をより急速に冷ますための標準的な冷却技術との組合せに対する耐性がある高熱を有する対象の処置に適している。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、ＮＴモル当量８ｍｇ／ｋｇの投与量でＮＴを静脈内注射（急速）した後の、スイス（ＣＤ−１）マウスの直腸体温に対する、生理食塩水（ＮａＣｌ：０．９％）、ＮＴ、又は化合物Ｉの効果を示す。
【図２】図２は、ＮＴモル当量０．５〜８ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で化合物Ｉを静脈内注射（急速）されたスイス（ＣＤ−１）マウスにおける、低体温についての用量−反応関係性を示す。
【図３】図３は、スイス（ＣＤ−１）マウスにおける、化合物Ｉ、化合物ＩＩ、及び化合物ＩＶの低体温反応を示す。化合物Ｉ、化合物ＩＩ、及び化合物ＩＶを、ＮＴモル当量０．５ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルでマウスに静脈内注射（急速）した。
【図４】図４は、ＮＴモル当量０．０３〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量で化合物ＩＩを静脈内注射（急速）されたスイス（ＣＤ−１）マウスにおける、低体温についての用量−反応関係性を示す。最少有効量（ＭＥＤ）は、ＮＴモル当量０．３５ｍｇ／ｋｇで、最大効果は、ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇで観察された。
【図５】図５は、生体位での脳潅流を用いた、マウスにおける［３Ｈ−Ｔｙｒ３］−ＮＴ、［３Ｈ−Ｔｙｒ３］−化合物Ｉ、及び［３Ｈ−Ｔｙｒ３］−化合物ＸＩＶの、ＢＢＢ−並びに血液網膜関門（ＢＲＢ）−移送を示す。
【図６】図６は、ＮＴ、化合物Ｉ、化合物ＩＶ、及び化合物ＸＩＶの、インビトロでの血液安定性を示す。スイス（ＣＤ−１）マウスの新鮮な採取血液において、ペプチドを３７℃でインキュベートし、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分光（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析法によって、血漿蛋白分画における残存無傷ペプチドのパーセンテージを、表示された時点で定量化した。
【図７】図７は、スイス（ＣＤ−１）マウスにおける低体温反応の、化合物ＩＩと、ＮＴのより短い類似体からなる本発明の活性化ニューロテンシン化合物との比較を示す。化合物ＩＩ、化合物Ｖ、化合物ＶＩ、又は化合物ＶＩＩを、ＮＴモル当量０．５ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルでマウスに静脈内注射（急速）した。全てのコンジュゲートが同様の低体温効能を示した。
【図８】図８は、スイス（ＣＤ−１）マウスにおける化合物ＩＩ及びＶＩＩＩの低体温効果を示す。化合物ＩＩ又は化合物ＶＩＩＩを、ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルでマウスに静脈内注射（急速）した。
【図９】図９は、スイス（ＣＤ−１）マウスにおける低体温反応の、Ｎ末端配列番号９の配列を有する活性化基と、Ｃ末端ＮＴ（６−１３）又はＮＴ（８−１３）部分との間の別個のリンカーからなるニューロテンシンコンジュゲートの比較を示す。リンカー基なし（化合物ＩＸ）、ＧＧＧリンカー（化合物Ｘ）、Ａｈｘリンカー（化合物ＸＩＩ）、ＰＥＧ２リンカー（化合物ＸＩＩＩ）、又はＰＥＧ６リンカー（化合物ＸＩＶ）からなるコンジュゲートを、ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルでマウスに静脈内注射（急速）した。
【図１０】図１０は、ＮＴ（８−１３）類似体からなる、配列番号９のタンデム配列−ＮＴ（８−１３）又は配列番号１１のタンデム配列−ＮＴ（８−１３）コンジュゲートの、スプラーグドーリーラットにおける低体温反応の比較を示す。ＮＴ（８−１３）配列における、［Ｔｌｅ１２］（化合物ＸＶ）、［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］（化合物ＸＶＩ及び化合物ＸＸ）、［Ｌｙｓ９，Ｔｌｅ１２］（化合物ＸＶＩＩ）、［Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］（化合物ＸＶＩＩＩ）、又は［Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］（化合物ＸＩＸ）置換体からなるコンジュゲートを、ＮＴモル当量５ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルでラットに静脈内注射（急速）した。
【図１１】図１１は、化合物ＸＩＶの反復投与による、体温への効果を示す。ＮＴモル当量４ｍｇ／ｋｇの投与量で、４日間に渡って、化合物ＸＩＶをスイス（ＣＤ−１）マウスに毎日静脈内注射（急速）し、投与処置の後、各日３時間の間に、低体温反応を評価した。化合物ＸＩＶは、終始、大きくかつ安定した低体温効果を維持していた。
【図１２】図１２は、酵母誘発高熱（ｙｅａｓｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）のマウスモデルにおける、化合物ＸＩＶの解熱作用を示す。ＮＭＲＩマウスに酵母懸濁液を皮下注射すると、直腸温度が０．８℃上昇した（ベースライン２、高熱対ナイーブマウス）。化合物ＸＩＶを指示投与レベルで静脈内注射（急速）すると、解熱作用が示されただけでなく、中程度及び高い投与レベルで、強くかつ投与に依存した低体温が誘発された。
【図１３】図１３は、てんかん重積状態（ＳＥ）における体温及び発作強度への、化合物ＸＩＶの効果を示す。ＳＥの特性２時間後にステージ５又はステージ６の発作を誘発し、大抵は高熱と関連がある痙攣促進薬物カイナイト（ＫＡ）を、マウスに投与した。ＳＥ発現後３０分（ＳＥ３０）で、ＮＴモル当量２又は４ｍｇ／ｋｇの投与量で化合物ＸＩＶを投与すると、常に、少なくとも２時間存続する一過性低体温が誘導された（図１３（ａ））。化合物ＸＩＶに誘発された低体温は、ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶグループにおける発作の著しい減少と関連していた。発作モデルにおける抗痙攣効果の陽性コントロールとして用いられるジアゼパム（ＤＺＰ）を、高投与量で、一部の動物に腹腔内投与した。ＳＥ発現後３０分でニューロテンシン（ＮＴ８−１３）を投与した場合、ＳＥ動物と比較して、体温又は発作強度の重篤な変化は観察されなかった（図１３（ｂ））。
【図１４】図１４は、ＫＡに誘発されたＳＥ後の激しい興奮毒性損傷及び神経炎症を伴うマウスにおける、化合物ＸＩＶの神経保護及び抗神経炎症効果を示す。免疫組織化学的ラベリング（図１４（ａ））を用い、ＳＨＡＭ（Ａ，Ｄ，Ｇ）、ＳＥ（Ｂ，Ｅ，Ｈ）、及びＳＥ＋化合物ＸＩＶ（ＳＥ＋ＨＴ）（Ｃ，Ｆ，Ｉ）動物からの海馬体の冠状切片における脳損傷の規模を評価した。神経細胞を、神経細胞特定核タンパク質をラベルする抗ＮｅｕＮ抗体で、Ａ、Ｂ、及びＣとラベルした。歯状回（ＤＧ）の門部（Ｈ）と同様に、ＣＡ１及びＣＡ３錐体細胞層においても、神経細胞を矢印で示す。各々アストロサイト的及びミクログリア的反応性をモニタリングして、抗ＧＦＡＰ（Ｄ，Ｅ，Ｆ）及びＩｂａ１（Ｇ，Ｈ，Ｉ）抗体で神経炎症を評価した。小さい矢印は、反応性アストロサイト及びミクログリアを示す。スケールバーは５００μｍである。ＳＥ誘発グリオーシスは、ミクログリア及びアストログリア細胞型を引き起こした。ＳＨＡＭ動物において、ＧＦＡＰ及びＩｂａ１についての基本的なラベリングが、海馬中で検出された（図１４（ａ））。ＳＥ動物において、グリア細胞の非常に強力な活性が、全海馬層中で発生した。ＳＥ発現後３０分で化合物ＸＩＶ（ＳＥ＋ＨＴ）を投与した場合、該炎症反応は著しく低減した。ＮｅｕＮ及びＦｌｕｏｒｏ−ｊａｄｅ  Ｃラベリングを用い、神経細胞死及び化合物ＸＩＶの効果を定量化した（図１４（ｂ））。ＳＨＡＭ動物において、海馬中で神経細胞死は観察されなかった。ＳＥ動物において、ＣＡ１〜３錐体細胞層及びＤＧ中で多くの神経細胞死が観察された。ＳＥ動物で観察された神経変性は、ＳＥ発現後３０分で化合物ＸＩＶ又はＤＺＰを投与した場合には著しく低減したが、ＮＴ（８−１３）を投与した場合には変化が見られなかった（図１４（ｂ））。
【図１５】図１５は、ＳＥ後８週間に海馬中で、化合物ＸＩＶによって苔状線維新芽形成が軽減することを示す。苔状線維の異常な新芽形成又は歯状回顆粒細胞の軸索は、門細胞損失に応答して内部分子層（ＩＭＬ）において起こり、動物発作モデル及びヒトのてんかんにおいて充分に立証されている。化合物ＸＩＶによる新芽形成の効果は、ＳＥ発現後８週間で、亜鉛小胞輸送体３（ＺｎＴ３）に対する免疫組織化学的ラベリングで評価した。ＳＨＡＭ動物において、苔状線維末端は、ＣＡ３領域の門部及び淡明層に存在し、ＤＧのＩＭＬで末端は観察されなかった。ＳＥ動物において、苔状線維末端は、ＩＭＬ内部で観察された。ＳＥ動物と比較して、ＳＥ発現後３０分で化合物ＸＩＶ（ＳＥ＋ＨＴ、図１５（ａ））又はＤＺＰが投与された動物において、ＩＭＬを神経支配する末端の数は著しく減少したが、ＮＴ（８−１３）が投与された場合には、比較的変化がなかった（図１５（ａ）（ｂ））。
【図１６】図１６は、マウスにおけるライジング（悶え）試験での化合物ＸＩＶの抗侵害受容効果を示す。０．５％酢酸を１０ｍＬ／ｋｇで腹腔内注射する３０分前に、ＮＴモル当量０．５、１、及び５ｍｇ／ｋｇと投与レベルを増加させて、化合物ＸＩＶをマウスに静脈内注射（急速）した。酢酸の腹腔内注射後５分で開始した１０分間のピリオドにおいて、各マウスで発生する腹部ストレッチの数を測定した（ライジングカウント／１０分）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ニューロテンシンを基礎とする新規化合物、それからなる医薬組成物、及びその使用、例えば、コントロールされた体温の低下（例えば、低体温又は正常体温）、コントロールされた抗痙攣効果、もしくはそれを必要としている対象の鎮痛を誘導するための使用を提供する。
【００１８】
特に、本発明の目的は、活性化基に共有結合したニューロテンシンポリペプチドからなる化合物に属する。該活性化基は、アミノ酸配列：Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ（ここで、ａａ１はプロリン又はその類似体である）からなるものである。
【００１９】
実験例のセクションで図示しているように、本発明の活性化ニューロテンシン化合物は、生来のＮＴと比較したとき、強化したＢＢＢ浸透性及びタンパク質切断への高い耐性の双方を含む、高度に改善された生物学的特性を示す。該化合物は、高い耐性及び安全性プロファイルを有すると共に、非常に急速に作用が発現し、全身投与において低い投与レベルで強力な生物活性を示す。特に、本発明の化合物は、
i)生来のＮＴで得られたものよりも、最高８０倍優れた中枢低体温効果（ｃｅｎｔｒａｌ  ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を誘発し、
ｉｉ）低体温に関連した悪寒を誘発せず、
iii)潜在的で致命的に大きな低体温を防ぐ平坦効果を実証し、
iv)静脈内注射（急速）での最少有効量（ＭＥＤ）と最大耐量（ＭＴＤ）との間で非常に安全な余地を示し、
v)反復又は亜慢性処置を必要とする疾患に対する自身の適合性を実証する、反復静脈内投与で重要な生物活性を保持し、
vi)効力のある解熱活性を示し、
vii)運動発作を効果的に低減又は半減し、
viii)神経保護及び抗神経炎症活性を示し、
ix)発作に続いて及びてんかんにおいて、異常軸索新芽形成を効果的に軽減し、そして
x)明瞭な病態生理学的疾患における予想外の薬効及び効能を実証する、重要な鎮痛効果を誘発する。
【００２０】
本発明の化合物は、本質的に、活性化基に共有結合したニューロテンシンポリペプチドからなる。該活性化基は、ニューロテンシンポリペプチドと、直接的に、又は間接的に、すなわちリンカー基を介して、共有結合していればよい。該化合物は、また、以下の式（Ｉ）：
ＮＴ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＡＧ    （Ｉ）
（ここで、
ＮＴ：ニューロテンシン活性を有するいずれかのポリペプチド、
Ｌｉｎｋｅｒ：同一でも異なっていてもよい少なくとも２つの反応基を有する、架橋分子又はプラットフォーム、及び
ＡＧ：前記特定のアミノ酸配列からなる活性化基
である）
で表されてもよい。立体配置、リンク方法、及び構成成分の互いの固定点は、最適な活性が得られるように調整されるべきである。
【００２１】
＜ニューロテンシンポリペプチド＞
「ニューロテンシンポリペプチド」は、ニューロテンシン、ニューロテンシン類似体、又はニューロテンシンレセプターのポリペプチドアゴニスト等の、ニューロテンシン活性を有するいずれかのポリペプチドを示す。前記「類似体」には、低体温又は鎮痛を誘発する能力等のニューロテンシンの１種又は数種の生物活性を維持している、野生型ニューロテンシンのいずれかの変異体又はフラグメントが含まれる。より好ましくは、ニューロテンシンポリペプチドは、生来のニューロテンシン又はその類似体を示す。さらに好ましい実施形態において、「ニューロテンシンポリペプチド」には、ニューロテンシンの１種又は数種の生物活性を維持している、ヒトニューロテンシン、もしくはそのフラグメント又は変異体が含まれる。
【００２２】
ヒト野生型ニューロテンシンは、以下の配列：
ｐＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ−ＯＨ（配列番号１）
を有する１３のアミノ酸ペプチドである。
【００２３】
本発明のニューロテンシンポリペプチドには、したがって、好ましくは、以下の(i)〜(iv)からなるいずれかのポリペプチドが含まれる。
(i)配列番号１の配列
(ii)(i)の天然変異体
(iii)(i)又は(ii)のフラグメント、もしくは
(iv)(i)〜(iii)のいずれかの配列の類似体、好ましくは、１つ又はそれ以上のアミノ酸置換体もしくは修飾体からなるもの、より好ましくは、１、２、３、４、５、６、又は７つのアミノ酸残基、さらに好ましくは１、２、３、又は４つのアミノ酸残基の置換体もしくは修飾体からなるもの
（該ポリペプチドは、低体温又は鎮痛等の、ニューロテンシンの１種又は数種の生物活性を引き起こす能力を有する）
【００２４】
ここで用いられる配列のフラグメントは、該配列の、少なくとも４つ、より好ましくは少なくとも５つの連続したアミノ酸からなるいずれかのフラグメントを示す。この点において、本発明に係る好適なニューロテンシンポリペプチドには、ヒトニューロテンシンの少なくともアミノ酸８〜１３「ＮＴ（８−１３）」、ヒトニューロテンシンの少なくともアミノ酸６〜１３「ＮＴ（６−１３）」、又はヒトニューロテンシンの少なくともアミノ酸２〜１３「ＮＴ（２−１３）」からなるニューロテンシンフラグメントが含まれる。少なくともＣ末端ＮＴ（８−１３）フラグメントからなるこのようなフラグメントは、ニューロテンシンの生物活性の、全てではないが、殆どを引き起こすことが報告されている。以下に、対応するアミノ酸配列を示す。
ＮＴ（８−１３）：ＲＲＰＹＩＬ（配列番号２）
ＮＴ（６−１３）：ＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号３）
ＮＴ（２−１３）：ＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ（配列番号４）
【００２５】
特に好ましい実施形態において、本発明に係るニューロテンシンポリペプチドの配列は、野生型ニューロテンシンポリペプチド又はそのフラグメントに照らして、１、２、３、又は４つのアミノ酸修飾体（すなわち、置換体又は挿入体又は化学修飾体）からなる。この点において、以下のアミノ酸置換体又は修飾体は、独立して又は組み合わせて、ＮＴ又はそのフラグメントとなり、本発明で用いられるニューロテンシンの生物活性類似体が得られる。
【００２６】
・Ｎ末端アセチル化、すなわち、アセチルＮＴ（２−１３）、又はアセチルＮＴ（６−１３）、又はアセチルＮＴ（８−１３）の生成；
・（Ｄ）−Ａｒｇ、Ｌｙｓ、（Ｄ）−Ｌｙｓ、ＨＬｙｓ（ホモリジン）、Ｄａｂ（ジアミノブチル酸）、Ｏｒｎ（オルニチン）、（Ｄ）−Ｏｒｎ、又はα−デスアミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルホモリジンによるＡｒｇ８の置換、すなわち、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８］ＮＴ（８−１３）、又は［ＨＬｙｓ８］ＮＴ（８−１３）の生成；
・Ｌｙｓ、（Ｄ）−Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、（Ｄ）−Ｏｒｎ、Ｄａｂ、（Ｄ）−Ａｒｇ、ＨＬｙｓ（ホモリジン）、又はα−デスアミノ−Ｎ，Ｎ−ジメチルホモリジンによるＡｒｇ９の置換、すなわち、［Ｌｙｓ９］ＮＴ、［Ｌｙｓ９］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｏｒｎ９］ＮＴ、又は［（Ｄ）−Ｏｒｎ９］ＮＴ（８−１３）の生成；
・Ｔｒｐ、（Ｄ）−Ｔｒｐ、ｎｅｏＴｒｐ、（Ｄ）−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、（Ｄ）−Ｐｈｅ、Ｎａｌ（ナフチルアラニン）、又は（Ｄ）−３，１−ナフチルアラニンによるＴｙｒ１１の置換、すなわち、［Ｔｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｔｙｒ１１］ＮＴ（８−１３）、［Ｔｒｐ１１］ＮＴ、又は［（Ｄ）−Ｔｙｒ１１］ＮＴの生成；
・Ｔｌｅ（ｔｅｒｔ−ブチルロイシン）によるＩｌｅ１２の置換、すなわち、［Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、又は［Ｔｌｅ１２］ＮＴの生成；
・Ａｒｇ８、Ａｒｇ９、Ｔｙｒ１１、及びＩｌｅ１２の組み合わせ置換、すなわち、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、又は［ＨＬｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）の生成；
・８−９、９−１０、１０−１１、１１−１２、又は１２−１３位における、ＣＨ２ＮＨ（ｐｓｉ）還元結合でのペプチド結合の修飾；及び／又は
・前記可能なアミノ酸置換体又は修飾体のいずれかで、又はいずれもなしでの、ＮＴ（８−１３）のダイマーの環化
である。
【００２７】
好適な実施形態において、ニューロテンシンポリペプチドは、ヒトＮＴ、ＮＴ（２−１３）、ＮＴ（６−１３）又はＮＴ（８−１３）、もしくは１〜４のアミノ酸修飾体を有するその類似体から選ばれる。
【００２８】
この点において、最も好適な実施形態において、ニューロテンシンポリペプチドは、［Ｌｙｓ８］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９］ＮＴ（８−１３）、［ＨＬｙｓ８］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｏｒｎ９］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８，Ｌｙｓ９］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｌｙｓ９］ＮＴ（８−１３）、［Ｔｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［ｎｅｏＴｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［ｎｅｏＴｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，ｎｅｏＴｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，ｎｅｏＴｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｌｙｓ９，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｌｙｓ８，Ｌｙｓ９，ｎｅｏＴｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，Ｔｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，ｎｅｏＴｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［Ｌｙｓ９，ｎｅｏＴｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［ＨＬｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［ＨＬｙｓ８，Ｔｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［ＨＬｙｓ８，ｎｅｏＴｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［ＨＬｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［ＨＬｙｓ８，ｎｅｏＴｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｏｒｎ９，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｏｒｎ９，Ｔｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｏｒｎ９，ｎｅｏＴｒｐ１１］ＮＴ（８−１３）、［（Ｄ）−Ｏｒｎ９，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、又は［（Ｄ）−Ｏｒｎ９，ｎｅｏＴｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）から選ばれる。
【００２９】
別の好適な実施形態において、本発明のニューロテンシンポリペプチドは、前記アミノ酸置換体のいずれかからなる、完全サイズのＮＴポリペプチド、又はＮＴ（２−１３）ポリペプチド、又はＮＴ（６−１３）ポリペプチドである。
【００３０】
最も好適な実施形態において、ニューロテンシンポリペプチドは、ＮＴ（８−１３）、又はニューロテンシンの１種又は数種の生物活性を維持しているその類似体である。
【００３１】
本発明での使用に好適なさらなるニューロテンシンポリペプチド又はニューロテンシン置換体は、例えば、Ｒｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９７７、Ｔｏｋｕｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）１９９０、Ｌａｂｂｅ−Ｊｕｌｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ  １９９４、Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９９８、Ｐｏｄｓｔａｗｋａ−Ｐｒｏｎｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２０１１、Ｋｉｔａｂｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．１８，１１−１９  １９８０、米国特許公開ＵＳ２００９／００６２２１２号公報、国際公開ＷＯ２００８／１３７７２０号公報、ＷＯ１９９９／０５２５３９号公報、ＷＯ２００７／０７０６７２号公報、ＷＯ２０１０／０６３１２２号公報、又はＷＯ２０１２／０００１１８号公報に記載されている。
【００３２】
＜活性化基＞
本発明の活性化ニューロテンシン化合物は、自身の活性を促進する活性化基からなる。一般的な態様において、該活性化基は、ＬＤＬレセプター（ＬＤＬＲ）をＢＢＢに結合させる、いずれかのペプチド配列からなる。ＮＴのＬＤＬＲ媒介経細胞輸送が認められることによって、驚くほどの生物活性を伴う活性化化合物が生成された。この点において、より好適な実施形態において、活性化基は、アミノ酸配列：Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ（ここで、ａａ１はプロリン残基（「Ｐ」）又はその類似体である）からなる。前記式において、Ｍはメチオニンを示し、Ｒはアルギニンを示し、Ｌはロイシンを示す。実験例のセクションで示しているように、このような活性化基は、本発明の活性化ニューロテンシン分子に、改善された生物活性及び薬理活性型を与える。特に、静脈内投与の場合、体温の低下について、内在性ＮＴよりも最高８０倍のより優れた効力のある活性化ニューロテンシン分子が、このような活性化基のグラフトにより生成される。このような顕著な低体温効果に加え、該化合物は、予想外の解熱活性を示す。これらはまた、興奮毒性に関連した神経細胞死及び神経炎症を阻害することによって、並びに、痙攣及びてんかんに関連した異常軸索新芽形成を軽減することによって、運動発作を軽減又は半減し、効力のある予想外の神経保護活性を実証する可能性を示す。加えて、本発明の活性化ニューロテンシン分子は、全身投与における急速な作用の発現、低い投与レベルでの強力な低体温活性、並びに、低体温に関連した悪寒がなく、潜在的で致命的に大きな低体温を防ぐ平坦効果、及びＭＥＤとＭＴＤとの間での４００倍の安全な余地を伴う非常に良好な安全性プロファイルと共に、非常に良好な薬物動態及び薬力学的プロファイルを示す。最終的に、該化合物は、静脈内投与により、重要な鎮痛効果を示した。
【００３３】
したがって、本発明は、活性化ニューロテンシン化合物に関する。該化合物は、アミノ酸配列：Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ（ここで、ａａ１は、プロリン残基「Ｐ」又はその類似体である）からなる活性化基を有する。好ましくは、プロリン類似体は、Ｐｉｐ及びＴｈｚから選ばれる。Ｐｉｐは、ピペコリン酸を表し、Ｔｈｚは、チアゾリジン−４−カルボン酸を表す。
【００３４】
好ましい実施形態では、前記活性化基は、以下のアミノ酸配列の１つからなる。
Ｍ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｒ（配列番号５）、
Ｍ−Ｐｉｐ−Ｒ−Ｌ−Ｒ（配列番号６）、又は
Ｍ−Ｔｈｚ−Ｒ−Ｌ−Ｒ（配列番号７）
【００３５】
さらに特別な実施形態では、活性化基におけるアミノ酸配列は、Ｌ型又はＤ型でのさらなるＮ末端システイン残基「Ｃ」を有する。すなわち、該アミノ酸配列は、アミノ酸配列：Ｃ−Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ又はｃ−Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ（ここで、ａａ１は、前記のとおりである）を含む。最も好ましい実施形態では、該Ｎ末端システイン残基「Ｃ」はＤ型である。
【００３６】
別の特別な実施形態では、活性化基におけるアミノ酸配列は、２つのさらなるＣ末端残基を有する。すなわち、該アミノ酸配列は、配列：Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ−ａａ２−ａａ３、好ましくは、配列：ｃ−Ｍ−ａａ１−Ｒ−Ｌ−Ｒ−ａａ２−ａａ３（ここで、ａａ１は、前記のとおり、ａａ２は、Ｇｌｙ又はその類似体Ｓａｒ（サルコシン）、及びａａ３は、Ｃｙｓ又はその類似体Ｐｅｎ（ペニシラミン）である）を含む。
【００３７】
特定の、かつ、最も好ましい活性化基は、以下のアミノ酸配列の１つからなる。
ｃ−Ｍ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｃ（配列番号８）
ｃ−Ｍ−Ｐｉｐ−Ｒ−Ｌ−Ｒ−Ｓａｒ−Ｃ（配列番号９）
ｃ−Ｍ−Ｔｈｚ−Ｒ−Ｌ−Ｒ−Ｇ−Ｐｅｎ（配列番号１０）
ｃ−Ｍ−Ｐｉｐ−Ｒ−Ｌ−Ｒ−Ｓａｒ−Ｐｅｎ（配列番号１１）
【００３８】
＜活性化ニューロテンシンの設計＞
本発明の好ましい活性化ニューロテンシン分子は、１つのニューロテンシンポリペプチドと、１つの活性化基とからなる。しかしながら、別の実施形態では、数個のＮＴ分子と１つの活性化基との組合せ、又はその逆の組合せが有利であるかもしれない。この点において、本発明の特別な化合物は、
式：（ＮＴ）ｌ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＡＧ、又は
式：ＮＴ−Ｌｉｎｋｅｒ−（ＡＧ）ｌ
（ここで、ｌは、２と５との間の整数、代表的には、２又は３である）
で表される。
【００３９】
活性化基は、好ましくはニューロテンシン分子に共有結合している。ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基が天然アミノ酸のみからなる場合、化学反応、生化学反応、又は酵素反応等の、技術分野においてそれ自体が周知ないずれかの反応もしくはプロセスによって、あるいは、遺伝子工学によって、カップリング（結合）が行われる。
【００４０】
カップリングは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＮＨ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＮ、−Ｎ３、−ＮＣＳ、マレイミドエステル、コハク酸イミドエステル、又は−ＰＯ２Ｈ等の反応要素が天然で存在するか、もしくは導入されている、活性化基及びニューロテンシンポリペプチドのいずれかの部位で行われる。このように、カップリングは、Ｎ末端、又はＣ末端、及び／又は側鎖により媒介される反応基にてなされ得る。活性化基は、共有結合によって、ニューロテンシンポリペプチドに直接的にカップリングし得る。一方、活性化基はまた、リンカー基によって非直接的にもカップリングし得る。共有化学カップリングには、好ましくは、エステル、アルデヒドもしくはアルキル又はアリール酸によるアルキル基、アリール基又はペプチド基；ケトン；アンヒドリド；スルフヒドリル又はヒドロキシル基；臭化又は塩化シアン由来の基；アジド；ニトリル；マレイミド；カルボニルジイミダゾール；コハク酸イミドエステル；あるいはスルホン酸ハロゲン化物を含有する二官能又は多官能剤の使用が含まれる。好ましい化学カップリング剤は、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイル−オキシスルホコハク酸イミドエステル）であり、これを、例えば、ニューロテンシンポリペプチドに添加し、次いで、活性化基と共有結合させる。
【００４１】
好適なリンカーの例には、例えばＬｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ポリＬｙｓ、Ｇｌｙ−Ｌｙｓ等のジペプチド、もしくはＧＧＧ又はＧ４Ｓ等のマルチアミノ酸からなる、モノ、ジ、トリ、もしくはマルチアミノ酸が含まれる。その他にも、該リンカーには、例えば、コハク酸、Ａｈｘ（アミノヘキサン酸）、又はＰＥＧ（ポリエチレングリコール）分子が含まれる。
【００４２】
好ましい実施形態において、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、ＰＥＧ分子から選ばれたリンカーを用いてカップリングされる。いずれかのＰＥＧ分子、特に、ＰＥＧ２（１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸）、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、又はＰＥＧ６（２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサヘンエイコサン酸）等が用いられる。より好ましくは、リンカーにはＰＥＧ２又はＰＥＧ６分子が含まれ、ＰＥＧ６がより一層好ましい。
【００４３】
別の好ましい実施形態では、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、ペプチド結合によって直接的にカップリングされる。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、ポリＧ分子、より好ましくは、Ｇアミノ酸又はＧＧＧトリペプチド、もしくは線形アミノヘキサン酸から選ばれた可動性リンカーを用いてカップリングされる。
【００４５】
別の好ましい実施形態では、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、切断可能なジスルフィド架橋を用いてカップリングされる。
【００４６】
別の好ましい実施形態では、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、ヘテロ二官能架橋剤、より好ましくは、スルホ−ＥＭＣＳ試薬を用いてカップリングされる。
【００４７】
本発明に係る、最も好ましい活性化ニューロテンシン分子のリストを、以下の表Ａに記載する。例えば配列番号１の配列を「配列番号１」とのみ表記する場合があり、他の配列も同様である。
【００４８】
【表１】
0006562948.tif 000002
【表２】
0006562948.tif 000003
【表３】
0006562948.tif 000004
【表４】
0006562948.tif 000005
【００４９】
本発明の活性化ニューロテンシン分子の詳細な製造方法は、実験例のセクションで記載する。この点において、本発明はまた、ニューロテンシンポリペプチドと前記定義された活性化基とを、（直接的に又は非直接的に）共有結合させるステップからなる、活性化ニューロテンシン分子の製造方法に関する。該方法は、活性化ニューロテンシンを収集する又は精製するさらなるステップ、及び／又は、活性化ニューロテンシンを修飾するさらなる任意のステップ、及び／又は、活性化ニューロテンシンを適用可能な賦形剤で処方するさらなる任意のステップを含んでいてもよい。
【００５０】
特別な実施形態では、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、まず、別々に合成され、その後、例えば、化学カップリング、酵素カップリング、又は生化学カップリングによって、共有結合される。前記のとおり、ニューロテンシン及び／又は活性化基に存在している、並びに／もしくは、挿入される、種々の反応性官能剤を介して、そして任意に適したリンカーを用いて、カップリングがなされる。
【００５１】
別の特別な実施形態では、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、単一分子として直接合成される。例えば、活性化ニューロテンシン分子は、唯一の分子実体として、ポリペプチド合成機で製造される。また、活性化ニューロテンシン分子は、遺伝子的融合及び組換え宿主細胞における発現によって製造される。このような方法は、両成分が天然アミノ酸からなる場合に適している。
【００５２】
この点において、本発明はまた、本発明の活性化ニューロテンシンをエンコードする核酸分子に関する。ここで、ニューロテンシンポリペプチド及び活性化基は、天然起源のアミノ酸からなり、アミノ酸結合又はリンカーによって結合している。
【００５３】
本発明のさらなる目的は、このような核酸分子からなるクローニング又は発現ベクター（例えば、プラスミド、ファージ、ウィルス、コスミド等）、及び、このような核酸又はベクターからなる組換え宿主細胞を提供することである。
【００５４】
本発明の活性化ニューロテンシン分子は、自身の活性をさらに上昇させるため、又は、薬物動態的特性を向上させるために、周知の技術を用いて修飾されてもよい。例えば、該分子をポリマー（ＰＥＧ、アルブミン）に結合させてもよく、親油性置換基の添加、又は化学的反応性基の添加によって修飾してもよい。また、天然起源のアミノ酸は、ペプチド模倣薬又はアミノ酸類似体によって取り換えられてもよく、及び／又は環状ポリペプチドが生成してもよい。
【００５５】
＜医薬組成物及び方法＞
本発明は、前記定義された活性化ニューロテンシン分子と、医薬的に許容される１つ又はそれ以上の賦形剤とからなる医薬組成物に関する。
【００５６】
活性化ニューロテンシンは、医薬的に許容されるいずれかの塩の形態で用いることができる。「医薬的に許容される塩」という表現は、限定されるものではないが、例えば、医薬的に許容される塩基又は酸付加塩、水和物、エステル、溶媒和物、前駆体、代謝物、もしくは立体異性体を示す。
【００５７】
「医薬的に許容される塩」という表現は、好ましくは、遊離塩基と適した有機又は無機酸とを反応させることによって一般に調製することができる非毒性塩を示す。これらの塩は、遊離塩基の生物学的効力及び特性を保持する。このような塩の代表例には、水溶性及び水不溶性塩、例えば、酢酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム、アムソナート（４，４−ジアミノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸塩）、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化水素酸塩、臭化物、酪酸塩、カンシラート、炭酸塩、塩酸塩、塩化物、クエン酸塩、クラブラン酸塩、ジクロルヒドラート、二リン酸塩、エデト酸塩、エデト酸カルシウム、エジシラート、エストラート、エシラート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキサフルオロリン酸塩、ヘキシルレゾルシン酸塩、ヒドラバミン、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨージド、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシラート、メチルブロミド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムカート、ナプシル酸塩、硝酸塩、３−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩（１，１−メチレン−ビス−２−ヒドロキシ−３−ナフトエ酸塩又はエンボン酸塩）、パントテン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、スルホサリチル酸塩、スラマート、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシラート、トリエチオジド、トリフルオロ酢酸塩、及び吉草酸塩が含まれる。
【００５８】
本発明はまた、前記定義した核酸、ベクター、又は宿主細胞と、医薬的に許容される１つ又はそれ以上の賦形剤とからなる医薬組成物に関する。
【００５９】
本発明の組成物は、例えば希釈剤、固体キャリアー、安定剤、防腐剤、界面活性剤等の医薬産業で古くから用いられている賦形剤から選ばれた医薬的に許容される賦形剤を含むことが有益である。該組成物は、固体、半固体、又は液体の形態で処方され得る。
【００６０】
液体組成物が好ましい。このような液体、特に注入可能なものは、例えば、医薬的に許容される溶媒、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール、オイル、及びこれらの類似体に、活性化ニューロテンシン分子を溶解又は分散させることによって調製することができる。
【００６１】
錠剤、ピル、粉末、又は顆粒等の固体組成物について、活性物質は、
a)希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、及び／又はグリシン；
b)滑沢剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムもしくはカルシウム塩、及び／又はポリエチレングリコール；
c)結合剤、例えば、ケイ酸マグネシウム及びケイ酸アルミニウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、及び／又はポリビニルピロリドン；
d)崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、又は発泡性混合物；及び／又は
e)吸着剤、色素、着香剤及び甘味料
と組み合わせることができる。賦形剤は、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウム、及び医薬的特質の類似体である。
【００６２】
坐薬等の半固体組成物について、賦形剤は、例えば、乳化剤又は油性懸濁剤、もしくは、ポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール基剤である。
【００６３】
本発明で好適に用いられるさらなる賦形剤は、国際公開番号ＷＯ２０１２／０９００７０号公報又は米国特許公開２０１２／０１７２４５４号明細書に記載の化合物である。
【００６４】
本発明はまた、前記定義された組成物と薬剤配送デバイス又はマニュアルとを含むコンテナーからなるキットに関する。該薬剤配送デバイスは、好ましくはシリンジである。
【００６５】
本発明の組成物は、特に限定がないが、例えば、非経口、経口、直腸内、局所、又は鼻腔内経路等のいずれかの適した経路によって投与することができる。
【００６６】
非経口投与は、例えば、腹腔内、皮下、静脈内、眼内、又は筋肉内注射等の注入によって、任意に延長又は遅延放出、もしくは徐放を伴って行えばよい。経口投与（又はｐｅｒ  ｏｓ）は、例えば、コーティング錠又は素錠、ゼラチンカプセル、粉末、ペレット、懸濁液、もしくは経口溶液の形態（１つのこのような経口投与形態は、即時放出を伴う場合もあり、延長又は遅延放出、もしくは徐放を伴ってもよい）を用いて行えばよい。直腸内経路は、例えば、坐剤の形態を用いて行えばよい。さらなる経路には、例えばパッチ、ポマード又はゲルの形態での局所経路、特に経皮経路、例えばエアロゾル及びスプレー形態での鼻腔内経路、経舌経路、眼内経路、もしくは腹腔内経路が含まれる。
【００６７】
前記医薬組成物は、典型的には、有効量の本発明の活性化ニューロテンシンを含む。本明細書に記載の「治療有効量」は、所定の条件及び投与スケジュールについて治療効果をもたらす用量を示す。典型的には、それは、疾病又は病的状態に伴う症状の一部の改善に責任があるか、もしくは貢献すると期待された生化学的効果が明確に達成されるように投与する際の、活性物質の平均用量である。例えば、ＣＮＳの障害又は異常を治療する際、前記疾患又は異常の原因もしくは症状の１つを減少させる、予防する、遅延させる、排除する又は停止させる用量は、治療に有効である。活性物質の「治療有効量」は、必ずしも疾患又は異常を治癒するとは限らないが、この疾患又は異常の発現が遅延される、妨げられる又は予防される、もしくはその症状が減弱される、もしくはその期間が変更される又は例えばあまり重症でなくなる、もしくは患者の回復が加速されるように、この疾患又は異常への治療が行われる。
【００６８】
特に人間に対する「治療有効量」は、患者の年齢、体重、全体的な健康状態、性別、及び／又は食事だけでなく、活性物質の活性／効力、その投与時間、その投与経路、その排出率及びその代謝、並びに予防又は治癒に基づいて処置された疾患（又は異常）の重症度を含む種々の要因に依存していると考えられる。このように、有効量は熟練の技術者によって調整される。しかしながら、一般に、有効量（ニューロテンシンに対するモル当量で表される）は、０．００１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇとの間、より好ましくは０．００２ｍｇ／ｋｇと５ｍｇ／ｋｇとの間である。有効量の適した範囲は、０．０１ｍｇ／ｋｇと２ｍｇ／ｋｇとの間である。このような用量範囲は、特に非経口注入、なかでも静脈内注射（急速）に適している。
【００６９】
本発明の分子及び組成物は、哺乳動物における薬理的低体温を誘発するために、及び低体温から恩恵を受けることができるいずれかの疾患又は病状を処置するために用いられる。
【００７０】
本発明は、特に、全体的な、局所的な、及び新生児のＣＮＳ虚血、ＣＮＳ外傷、心臓手術、疼痛、並びに高熱に関連したＣＮＳ疾患を処置するのに適している。より特別に、本発明は、心停止、卒中、新生児虚血、痙攣、深刻な外傷性頭部及び脊髄損傷、心臓手術によって対象のＣＮＳにおいて起こる興奮毒性神経細胞損傷及び神経炎症を、予防又は軽減又は最少化すること、ＩＣＨ、敗血症、もしくは発熱に関連した何らかのウィルス、細菌又は寄生虫感染による高熱を軽減すること、並びに、疼痛を軽減することに適している。
【００７１】
本発明の目的の１つは、哺乳動物対象における低体温を誘発するための、及び／又は、脳損傷を有する対象を処置するための、前記定義された化合物又は組成物の使用を提供することである。
【００７２】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物対象において低体温を誘発する方法に関するものであり、該方法は、前記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００７３】
本発明のさらなる態様は、哺乳動物対象において体温を低下させる方法に関するものであり、該方法は、前記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００７４】
本発明のさらなる目的は、脳損傷を有する対象を処置する方法を提供することであり、該方法は、前記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００７５】
本発明のさらなる目的は、対象における疼痛を軽減する方法を提供することであり、該方法は、前記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００７６】
本発明のさらなる目的は、対象における痙攣を軽減する方法を提供することであり、該方法は、前記定義された化合物又は組成物を、該対象に全身投与することからなる。
【００７７】
本発明は、ヒト患者等のいずれかの哺乳動物対象における脳損傷の影響を処置（例えば、保護、予防、又は低減）するために使用されてもよい。本発明は、特に、突然の心停止後の、卒中、新生児虚血、痙攣を有する、深刻な外傷性頭部及び脊髄損傷後の、心臓手術中の対象を処置し、ＩＣＨ、敗血症、もしくは発熱に関連した何らかのウィルス、細菌又は寄生虫感染による高熱を軽減するのに適している。
【００７８】
「処置」、「処置すること」、「処置する」という用語、並びに他の同様の表現は、例えば体温の低下といった薬理及び／又は生理的効果、並びに、患者の病状へのいずれかの間接的で有益な効果を達成することを示す。この効果は、病人における疾患又は症状の悪化、又は健常対象におけるその伝播を、完全にもしくはある程度予防するための、予防的効果もしくは予防効果となること、及び／又は、疾患及び／又はそれに関連した有害作用を、完全にもしくはある程度処置するための治療的効果となること、が可能である。本明細書に用いる用語「処置」は、哺乳動物、特にヒト対象における疾患のいずれかの処置を包含し、
(a)疾患の予防、もしくは、この病態又は障害の素因を有するが未だ陽性診断を受けていない人間において生じ得る状態の予防、
(b)例えばその進行を止めることによる、疾患の遅速、もしくは
(c)例えば疾患に伴う症状を低減させることによる、疾患からの解放
を含む。「処置」という用語はまた、個体または患者における状態を介護、治癒、解放、改善、軽減又は抑制するための活性物質のいずれかの投与を含む。
【００７９】
本発明はまた、対象の体温を低下させる方法に関するものであり、該方法は、それを必要とする対象に、前記定義された化合物又は組成物を、該対象の体温を低下させるのに充分な量で投与することからなる。該対象は、例えば、突然の心停止、卒中、新生児虚血、脳又は脊髄損傷、痙攣、高熱等を患っているか、又は最近患っていた状態でもよく、心臓手術を受けていてもよく、神経保護を必要としていてもよい。
【００８０】
本発明のさらなる態様及び利点は、以下の実施例を考慮することによって明らかになるであろう。これらの実施例は、実際は単なる例示であり、本出願の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００８１】
＜実施例１＞
ＮＴ−Ｌｙｓ６による活性化ＮＴ（１−１３）−ＡＧ薬剤の合成
第１ステップにおいて、完全サイズのニューロテンシン：ｐＥＬＹＥＮＫＰＲＲＰＹＩＬ−ＯＨ（ＮＴ）を、本発明者らが開発した種々の活性化基（ＡＧ）にカップリングさせた。目的は、ＡＧ／ＮＴの最適な組み合わせを選択することであった。このような分子を合成するために、ニューロテンシン配列中のリシン６側鎖のアミン反応性を利用した。市販のスルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイル−オキシスルホコハク酸イミドエステル）を、そのコハク酸イミドエステル部位を介してリシン６にカップリングさせた。精製後、官能化ニューロテンシン（ＮＴ−ＥＭＣＳ）を、異なるチオール化ＡＧにコンジュゲートした。
【００８２】
したがって、最終的に所望のコンジュゲートを達成するために、３つのステップ（２つの官能化成分、ＮＴ−ＥＭＣＳ及びチオール化ＡＧ、の合成、並びにこれらの結合）を行った。これらのステップを以下に図示する。
【００８３】
【化１】
0006562948.tif 000006
【００８４】
（分析及び精製方法）
反応の進行及び精製のモニタリングは、Ｃ１８  Ｋｉｎｅｔｅｘ（商標）カラム（５μｍ、１５０ｍｍ×４．６ｍｍ）を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００システムにて行った。検出は２１４ｎｍで行った。溶出系は、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ａ）及びＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ｂ）であった。流速は、４分間で溶液Ｂを０〜１００％の濃度勾配として、２ｍＬ／ｍｉｎであった。
【００８５】
粗生成物を、Ｃ１８  Ｌｕｎａ（商標）カラム（５μｍ、１００ｍｍ×２１．２ｍｍ）を備えたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ（登録商標）３０００システムのＲＰ−ＨＰＬＣにて精製した。検出は２１４ｎｍで行った。溶出系は、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ａ）及びＭｅＣＮ／０．１％ＴＦＡ（溶液Ｂ）であった。流速は２０ｍＬ／ｍｉｎであった。
【００８６】
１．ＮＴ−ＥＭＣＳの合成
完全サイズのＮＴをＢｉｏｃｈｅｍ  ＡＧ社から購入し、スルホ−ＥＭＣＳ（Ｎ−ε−マレイミドカプロイル−オキシスルホコハク酸イミドエステル）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から購入した。
【００８７】
スルホ−ＥＭＣＳの溶液（９．２ｍｇ、１５μｍｏｌ、１ｍＬのＰＢＳ（４倍）において１当量、ｐＨ＝７．４）を、ＮＴの溶液（２５ｍｇ、１５μｍｏｌ、１．２５ｍＬのＰＢＳ（４倍）において１当量、ｐＨ＝７．４）に加え、官能化ＮＴ−ＥＭＣＳを調製した。反応混合物を室温で撹拌した。反応のモニタリングは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣで行った。一晩撹拌した後、３０分間で溶液Ｂを２１〜３０％の濃度勾配として、粗混合物を調製ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。純度９５％を超えるフラクションを回収し、凍結乾燥して、精製白色粉末を得た（ｍ＝２１ｍｇ、収量＝７５％、純度＞９５％）。質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析で確認した（ｍ／ｚ  ［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値＝１８６５．９８、実測値＝１８６５．９７）。
【００８８】
２．チオール化ＡＧの合成
官能化ＮＴのマレイミド部位へのＡＧコンジュゲートのために、チオール反応基を、候補ＡＧ各々に導入した。
【００８９】
（ペプチド：Ｐｒ−ｃＭａａ１ＲＬＲａａ２ａａ３−Ｇ−ＯＨの合成）
ペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）法により、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）（ＣＥＭ）マイクロ波シンセサイザーで、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーと、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入したＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｗａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、ローディング０．７ｍｍｏｌ／ｇ）とを用いて、ペプチド：Ｐｒ−ｃＭａａ１ＲＬＲａａ２ａａ３−Ｇ−ＯＨを合成した。このような樹脂によって、その側鎖及びＣ末端において完全に脱保護されているペプチドが合成される。
【００９０】
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸を、標準的な直交側鎖保護で選択した。該Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−保護アミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｄ型又はＬ型）、Ｆｍｏｃ−Ｐｅｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ｄ型又はＬ型）、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｉｐ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｚ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨである。これらは全て、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。ピペリジン、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、エタンジチオール（ＥＤＴ）、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、及び１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−β］ピリジニウム−３−オキシドヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）も同様に、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）及びプロピオン酸無水物（Ｐｒ２Ｏ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００９１】
ａａ／ＤＩＥＡ／ＨＢＴＵ＝４／４／８（当量、樹脂に対して）を０．２５ｍｍｏｌスケール合成で、及び、ａａ／ＤＩＥＡ／ＨＢＴＵ＝５／５／１０（当量、樹脂に対して）を０．１ｍｍｏｌスケール合成で用い、ｎ＋１アミノ酸の酸官能のマイクロ波活性化によって、アミノ酸をカップリングさせた。カップリング時間は１０分間に調整した。ａａ１導入後のメチオニン及びシステインの組み込みには、ダブルカップリングが必要であった。このようにカップリングされた新規アミノ酸のＦｍｏｃ基の脱保護は、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて行った。ペプチド伸長の間にカップリングされた最終アミノ酸を、５０％プロピオン酸無水物又は酢酸無水物のＤＣＭ溶液を用いて、プロピオニル化又はアセチル化した。Ｎ末端カップリングの目的は、合成したネオペプチドを安定化させることであり、また、例えばＣ末端位置での共有結合の間の二次反応のリスクを軽減することである。トリチウム標識したプロピオニルコハク酸イミドエステルを用いてＮ末端アミノ基で時折標識されている、いくつかの放射能標識ペプチドのものと似たＮ末端化学構造を維持するために、アセチル部位よりもプロピオニル部位を選んだ。それから、ＴＦＡ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ＝９４／２／２／２の溶液を用い、少なくとも２時間に渡って室温（ＲＴ）で、樹脂結合ペプチドを切断した。樹脂１ｇにつき、最少１５ｍＬの切断溶液を用いた。次いで、粗ペプチドを、氷冷エーテルを用いて沈殿させ、３０００ｒｐｍで８分間遠心分離し、Ｈ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ中で凍結乾燥させた。得られた白色固体を、さらなる精製なしで次のステップに供した。
【００９２】
（ペプチド：Ｐｒ−ｃＭａａ１ＲＬＲａａ２ａａ３−Ｇ−ＯＨの環化）
２つの適した保護ＣｙｓもしくはＰｅｎ（Ｌ型又はＤ型）の２つのチオール官能からの分子内環化により、ジスルフィド架橋が得られた。ＡｃＯＨ、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、及び炭酸アンモニウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入した。粗Ｐｒ−ｃＭａａ１ＲＬＲａａ２ａａ３−Ｇ−ＯＨペプチドを、０．５％ＡｃＯＨに溶解させ、０．５ｍｇ／ｍＬの最終濃縮物を得た。炭酸アンモニウム（２Ｎ）をペプチド溶液に添加し、塩基性ｐＨ８〜９に到達させた。次いで、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］（０．０１Ｎ）を、明るい持続的な黄色となるまで反応混合物に添加した。反応のモニタリングは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにて行った。通常、反応は３０分未満で定量的であった。反応混合物を０．４５μｍの膜で濾過し、調製ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。純度９５％を超えるフラクションを回収し、凍結乾燥して、精製白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下の表に示す。
【００９３】
【表５】
0006562948.tif 000007
【００９４】
（環化Ｐｒ−ｃＭａａ１ＲＬＲａａ２ａａ３−Ｇ−ＯＨペプチド上でのシステアミンカップリング）
２−トリチルチオ−１−エチルアミンヒドロクロリド（Ｔｒｔ−システアミン）はＩｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。他の成分は前記のとおりである。Ｔｒｔ−システアミン（２当量）、ＤＩＥＡ（４当量）、及び遊離Ｃ末端（１当量）を含む環化ペプチドの溶液を、無水ＤＭＦ（ペプチドに対して０．０５Ｍ）中で調製した。ＰｙＢｏｐ（０．１３Ｍの無水ＤＭＦにおいて１．１当量）を最終的に混合物に添加した。出発ペプチドの完全な消失が示された２分後、ＨＰＬＣモニタリングと程なくして、反応の完了に到達した。ＤＭＦを真空下で蒸発させ、薄黄色油を得た。トリチルチオール保護を除去するために、ＤＣＭ／ＴＩＳ／ＴＦＡ＝３／１／１の溶液を添加した（出発ペプチドの約０．５ｍＬ／ｍｇ）。反応混合物を室温で撹拌した。反応のモニタリングは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにて行った。次いで、不活性ガスバブリングを用いてＤＣＭ及びＴＦＡを蒸発させ、Ｅｔ２Ｏにより粗ペプチド沈殿物を得た。３０００ｒｐｍで８分間遠心分離した後、粗ペプチドをＨ２Ｏ／０．１％ＴＦＡ中で凍結乾燥させ、調製ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。純度９５％を超えるフラクションを回収し、凍結乾燥して、精製白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下の表に示す。
【００９５】
【表６】
0006562948.tif 000008
【００９６】
３．チオール化ＡＧへのＮＴ−ＥＭＣＳコンジュゲートによるＮＴ（１−１３）−ＡＧの合成
チオール反応基を含むＡＧをＰＢＳ（１倍、１当量、０．００３Ｍ、ｐＨ７．４）中で可溶化させ、ＮＴ−ＥＭＣＳ（１当量）に添加した。反応混合物を室温で撹拌した。ＮＴ−ＥＭＣＳの可溶化は通常の超音波により進行した。反応のモニタリングは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣにて行った。反応が完了した後、粗生成物を調製ＲＰ−ＨＰＬＣにて精製した。純度９５％を超えるフラクションを回収し、凍結乾燥して、精製白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下の表に示す。
【００９７】
【表７】
0006562948.tif 000009
【００９８】
＜実施例２＞
インビトロでの本発明の活性化ＮＴ薬剤の結合親和性
ニューロテンシンの主要な低体温効果は、ＮＴＲ−１レセプターの活性化によって介在される。低体温効果等の生物活性を引き起こすために、ニューロテンシンコンジュゲートは、少なくとも生来のニューロテンシンのそれに似た親和性でＮＴＲ−１を結合するべきであり、これがすなわち、ＮＴ（１−１３）である。
【００９９】
ニューロテンシンコンジュゲートの結合親和性を、ヒト及びラット双方のニューロテンシンレセプタータイプ１（ｈＮＴＲ−１、ｒＮＴＲ−１）での競合結合アッセイを用いて評価した。ｈＮＴＲ−１用の強化細胞膜は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社から購入した。ラットＮＴＲ−１は、ＨＥＫ  ２９３細胞をラットＮＴＳＲ１プラスミドコンストラクト（Ｏｒｉｇｅｎｅ社製（ロックビル、アメリカ））に導入することによって得られた。
【０１００】
ｈＮＴＲ−１での活性化ＮＴ薬剤の結合親和性は、メーカー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）の指示を僅かに変更してなされた。詳細には、安定してヒトＮＴＲ−１を発現するＣＨＯ細胞から調製された膜ホモジネートを用いて、最終濃度０．５μｇ／ｗｅｌｌで、及び濃度３ｎＭの放射性リガンド［３Ｈ］−ニューロテンシン（比放射能９９．８Ｃｉ．ｍｍｏｌ−１、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）で、ＮＴＲ−１結合を測定した。放射性リガンドの特異結合を、０．８１ｎＭのＫＤ値と、膜たんぱく質１ｍｇあたり３４ｐｍｏｌのＢｍａｘとで判定した。５μＭのニューロテンシンの存在下、非特異結合が判定された。
【０１０１】
ラットニューロテンシンレセプタータイプ１（ｒＮＴＲ１）でのアッセイは、ｒＮＴＲ−１を発現するＨＥＫ  ２９３細胞からの膜ホモジネートを用いて、最終濃度０．７５μｇ／ｗｅｌｌで行った。これらホモジネートでの放射性リガンドの特異結合を、０．９３ｎＭのＫＤ値と、膜たんぱく質１ｍｇあたり２．５ｐｍｏｌのＢｍａｘとで判定した。
【０１０２】
結合バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１％ＢＳＡ）において、総反応容積１００μＬの９６ウェルプレートで、各アッセイを行った。続いてアッセイを室温で２４時間インキュベートした。各ウェルの内容物を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ−９６  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて、Ｕｎｉｆｌｉｔｅｒ（登録商標）−９６、ＧＦ／Ｃ（登録商標）フィルター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製、２５μＬの０．５％ポリエチレンイミンにて予浸）にて急速に濾過した。次いで、各ウェルを、洗浄バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．２）で５回濯いだ。各乾燥フィルターの放射活性（ｃｐｍ）を、２５μＬのＭｉｃｒｏＳｃｉｎｔ（商標）−Ｏ（Ｐｅｒｋｉｎ社製）を添加して測定し、ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ（商標）  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製）を用いて定量化した。典型的に、特異結合は総結合の９０％以上であった。投与−反応カーブを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈを用いてプロットし、ＩＣ５０値を決定した。アッセイは２回行った。チェン−プルソフ式を用いて、平均ＩＣ５０値からＫｉ値を決定した。
【０１０３】
【表８】
0006562948.tif 000010
【０１０４】
これらの結果から、本発明の活性化分子は、ナノモル範囲で又はそれよりも小さくとも、ＮＴＲ−１に対する非常に高い親和性を維持していることが分かる。実際、大抵の場合、ＡＧにより、ＮＴＲ−１に対する異なるＮＴ薬剤の親和性が大幅に増大した。コンジュゲートによって、どちらかと言えばレセプター結合を逆に妨げることが予期されるので、このような結果は、顕著で、かつ予期されないものである。
【０１０５】
＜実施例３＞
インビボでの本発明の活性化ＮＴ薬剤の評価
ニューロテンシンの主要な薬理活性での本発明の活性化ＮＴ薬剤の薬効を、スイス（ＣＤ−１）マウスにおける低体温反応のモニタリングによって調べた（図１）。８ｍｇ／ｋｇのＮＴを静脈内注射（急速）した後、マウスは、直腸体温において、注射後１５分で基準から−１℃の最大効果という、僅かではあるが重要な低下を示した。この効果は２４ｍｇ／ｋｇで増大し、注射後３０分で−２．６℃の最大効果に到達した。これに反して、８ｍｇ／ｋｇモル当量の投与量（ＮＴモル当量８ｍｇ／ｋｇ）で、化合物Ｉ（活性化基として配列番号８の配列を含む、本発明の活性化ＮＴ薬剤）を静脈内注射すると、注射後１５分で重要な効果を示し、注射後３０分から６０分の間で−３．７℃の最大効果に到達するといった、急速かつ大きな体温の低下が誘発された。その後、注射後３時間以内で基準温度に戻るまで、この薬理低体温は次第に減少した。実験中、これらのマウスにおいて悪寒は観察されなかった。
【０１０６】
化合物Ｉについての低投与レベルでの評価により、ＮＴモル当量８ｍｇ／ｋｇでのより強い効果はなく、ＮＴモル当量０．５ｍｇ／ｋｇの最少有効量（ＭＥＤ）、ＮＴモル当量１．２１ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０、及びＮＴモル当量４ｍｇ／ｋｇで観測された約−４℃の最大効果という、投与量依存低体温効果が示された（図２）。低投与レベルでの注射後１５分から高投与レベルでの注射後３０〜６０分へと投与レベルが高くなるにつれて、最大効果に到達する時間が増大した。８ｍｇ／ｋｇのＭＥＤを示すＮＴ単独と比較したとき、この活性化ＮＴ薬剤は、主要な低体温効果において１６倍の増大を示した。
【０１０７】
次いで、本発明に係る別の活性化基（ＡＧ）を試験した。ＮＴモル当量０．５ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルでの化合物Ｉと比較したとき、例えば、活性化基として配列番号９の配列又は配列番号１１の配列を含む活性化ＮＴ薬剤、すなわち、化合物ＩＩ（ＮＴ−配列番号９）及び化合物ＩＶ（ＮＴ−配列番号１１）は、マウスにおいて、注射後３０分で各々−４．１℃及び−３．４℃の最大効果という、より一層大きな低体温反応を引き起こした（図３）。化合物ＩＩをさらなる調査に用いた。
【０１０８】
化合物ＩＩの投与−反応関係性の評価により、ＮＴ単独の場合よりも８０倍低い、ＮＴモル当量０．１ｍｇ／ｋｇのＭＥＤ、及びＮＴモル当量１．２５ｍｇ／ｋｇのＥＤ５０が示された（図４）。高投与レベルで、化合物ＩＩは、注射後６０分で、ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇで−７℃の最大効果に到達するといった、より一層強い体温低下を引き起こした。この高投与レベルで、マウスは、低体温効果に適時に匹敵する、低減した自発運動活性を示したが、異種の刺激に対する充分な反応能力を維持していた。また、３０℃前後の体温を示すマウスであっても、悪寒は観察されなかった。
【０１０９】
＜実施例４＞
本発明の活性化ＮＴ薬剤のＢＢＢ移送
本発明の活性化ニューロテンシン薬剤のＢＢＢ浸透性及びインビトロでの血液安定性を評価した。
【０１１０】
成体オスＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける原位置脳潅流技術（ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｂｒａｉｎ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を用いて、本発明のコンジュゲートのＢＢＢ及び血液網膜関門（ＢＲＢ）での移送運動を評価した。［３Ｈ］Ｔｙｒ３−ＮＴとＡＧとのカップリング又はトリチウム標識されたＡＧのＮＴ分子へのカップリングにより、放射能標識された活性化ＮＴ化合物を得た。ＮＴの放射能標識は、トリチウムガスを用いて、ヨードＴｙｒ３−ＮＴを触媒脱ハロゲン化することによって行い、一方ＡＧの放射能標識は、トリチウム標識されたプロピオニルコハク酸イミドエステルをＡＧのＮ末端にカップリングさせることによって行った。比放射能（ＳＲＡ）は、典型的には、５０Ｃｉ／ｍｍｏｌの範囲であった。各合成のための放射能の総量は、通常、１００μＣｉと１０００μＣｉとの間であった。
【０１１１】
動物において、通常の生理学的及び解剖学的状態のもとで、全身分布のかく乱因子なしで、脳の細胞及び血管新生を維持するために、原位置脳潅流技術によって、人工潅流液の組成の総合的な管理が可能となる。原位置脳潅流は、Ｄａｇｅｎａｉｓらによって、最初にラットにおいて開発され、マウスに適用された（Ｄａｇｅｎａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．，２０（２），３８１−６）。これにより、目的のレセプター、酵素、もしくは異種の流入又は流出移送体について、遺伝子組み換え並びにＫＯ変異マウスにおいて、ＢＢＢ及びＢＲＢを渡る化合物の移送運動が評価される。
【０１１２】
放射能標識された本発明の化合物の原位置脳潅流を、２ｍＬ／ｍｉｎの潅流液の流速で１２０秒間行った。初期移送を、移送係数Ｋｉｎ（試験化合物の分布容積（血管容積に換算）と脳潅流時間との関係）として表した。試験化合物の急性毒性がないゆえに、放射能標識されたスクロースと通常はＢＢＢを渡らない化合物との共同潅流により、また、ＢＢＢの物理的な完全性の評価がなされた。
【０１１３】
文献に記載のデータと一致して、ＮＴにより、脳における、〜０．４×１０−４ｍＬ／ｓ／（脳組織）ｇのＫｉｎ値という非常に低い初期移送が実証された。眼におけるＮＴ移送はより一層低かった（図５、白色棒グラフ）。重要であるのは、放射能標識された本発明の活性化ＮＴ薬剤で得られた結果により、一致して、脳及び眼への非常に高い移送運動が示されたうえに、本発明の活性化基を備えたＮＴの活性により、これらの他の非浸透性器官への移送が特に強化されたことが実証されていることである。特に、化合物ＸＩＶは、脳において、〜３．６５×１０−４ｍＬ／ｓ／ｇのＫｉｎ値を示し、これは遊離ＮＴと比較して９倍増であり、また、眼において、〜３２．０×１０−４ｍＬ／ｓ／ｇのＫｉｎ値を示した（図５、黒灰色棒グラフ）。さらに、スクロースの脳分布容積がコントロール値と似ているので、化合物Ｉにより、ＢＢＢの完全性は変わらなかった。
【０１１４】
＜実施例５＞
インビトロでの本発明の活性化ＮＴ薬剤の安定性
本発明の薬剤のインビトロでの血液安定性（半減期ｔ１／２）を評価し、ＮＴ単独の場合と比較した。すなわち、スイス（ＣＤ−１）マウスの新鮮な採取血液において、２μＭの通常濃度で、各ペプチドを３７℃で３時間以下インキュベートした。液体クロマトグラフィー−タンデム質量分光（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）分析法によって、数回の時点で、血漿蛋白分画において検体を定量化した。インビトロでの半減期（ｔ１／２）を、各運動プロファイル（一時反応運動：Ｃ（ｔ）＝Ｃ０ｅ−ｋｔ）の対数回帰から推量し、ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋとした。
【０１１５】
結果より、血漿分解に対して生来のＮＴは、インビトロでの半減期がほんの７分間という、非常に低い耐性を有することが確認された。これは、内因性ペプチド及び天然アミノ酸のみを含む通常の小さな線形ペプチドの急速な酵素タンパク質分解と一致する（Ｆｏｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ  Ｎｕｔｒ．，Ｊａｎ；１４０（１）：１１７−８）。著しく対照的に、本発明の全ての活性化ＮＴ薬剤では、マウス血液におけるｔ１／２が大きく増長し、典型的には１時間を超えた。
【０１１６】
【表９】
0006562948.tif 000011
【０１１７】
纏めると、ＢＢＢ移送運動、インビトロでの血液安定性、及び増強した中枢低体温効果により、本発明の活性化ＮＴ薬剤の、顕著で、かつ予期されない有益な効果が実証される。
【０１１８】
＜実施例６＞
ＮＴ（ｘ−１３）を基礎とする活性化ニューロテンシン分子の合成
実施例１〜５において、配列番号９の配列が、完全サイズのＮＴの活性化において特に効果的であることが示された。これらの実施例及び後の実施例において、配列番号９の配列について、ＮＴフラグメントに基づく効果的な活性化ニューロテンシン分子を生成する能力を試験した。
【０１１９】
数種の切断されたニューロテンシン類似体は、特にアミノ酸８−１３に相当する最小配列が存在するとき、完全サイズの内因性ニューロペプチドと同様に効果的であることが、文献で報告されている。これに基づき、製造コストを最小限に抑え、ＮＴのＮ末端部位でタンデムコンジュゲートさせながら、さらに効果的な薬剤の生成を目的として、サイズを小さくしたＮＴ類似体を用いて新規活性化ＮＴ薬剤を調製した。
【０１２０】
完全サイズのニューロテンシンからなるコンジュゲートのために採用されるいくつかのコンジュゲート方法（実施例１参照）によって、３つのニューロテンシンフラグメント：ＮＴ（２−１３）（ピログルタミン酸のみが欠損）；ＮＴ（６−１３）（最小活性配列からなる）；及びＬｙｓ−ＮＴ（８−１３）（最小活性配列からなり、さらにＡＧへのカップリングに用いられるリシン６を少なくとも含む）に重点を置いて、コンジュゲートを合成した。分析及び精製は、実施例１と同様の方法で行った。
【０１２１】
１．ＮＴ（ｘ−１３）ペプチド合成
ペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）法により、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）（ＣＥＭ）マイクロ波シンセサイザーで、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーを用いて、切断されたニューロテンシン類似体を合成した。アミノ酸カップリングは、手動でプレローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ）から行った。このような樹脂によって、その側鎖及びＣ末端において完全に脱保護されているペプチドが合成される。
【０１２２】
Ｗａｎｇ樹脂（ローディング０．２ｍｍｏｌ／ｇ）は、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社から購入した。その他の原料は、先に記載したとおりである。
【０１２３】
樹脂のプレローディングについて、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ／ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（６当量／６当量／６当量）のＤＭＦ（０．０５５Ｍ、アミノ酸に対して）溶液を樹脂に添加した。次いで、ＤＭＡＰ（１当量）を添加した。一晩機械的に撹拌した後、樹脂を洗浄し、そのローディングを評価した。通常のローディングは、０．１ｍｍｏｌ／ｇと０．１６ｍｍｏｌ／ｇとの間である。
【０１２４】
ペプチド伸長は、先に記載したとおりに行った。５０％酢酸無水物のＤＣＭ溶液を用いてペプチドＮ末端をアセチル化し、内因性ペプチド中で発見されたペプチド結合を再現して、代謝安定性を向上させた。樹脂結合ペプチドを前記と同様にして切断し、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製した。純度９５％を超えるフラクションを回収し、凍結乾燥して、精製白色粉末を得た（最終純度＞９５％）。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下に示す。
【０１２５】
【表１０】
0006562948.tif 000012
【０１２６】
２．ＮＴ（ｘ−１３）−ＥＭＣＳ合成
ＮＴ（ｘ−１３）官能化を、実施例１に記載の完全サイズＮＴと同様の方法で行った。生成したペプチドは、純度が少なくとも９５％の精製白色粉末であった。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下に示す。
【０１２７】
【表１１】
0006562948.tif 000013
【０１２８】
３．チオール化配列番号９の合成
チオール化配列番号９を、実施例１に記載の方法で合成した。
【０１２９】
４．コンジュゲートＮＴ（ｘ−１３）−配列番号９の合成
配列番号９の配列へのＮＴ（ｘ−１３）−ＥＭＣＳのカップリングは、実施例１に記載のＮＴ（１−１３）−ＡＧ合成と同じ方法で行った。生成したコンジュゲートは、純度が少なくとも９５％の精製白色粉末であった。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下に示す。
【０１３０】
【表１２】
0006562948.tif 000014
【０１３１】
＜実施例７＞
本発明の活性化ＮＴ（ｘ−１３）薬剤の低体温反応
ＮＴモル当量０．５ｍｇ／ｋｇの同じ投与レベルで、各コンジュゲートをスイス（ＣＤ−１）マウスに静脈内注射（急速）し、活性化薬剤の低体温反応を評価した。
【０１３２】
全ての切断されたＮＴを基礎とする薬剤により、注射後３０分で体温低下が最大約−２．５℃という、マウスにおいて同程度の低体温が引き起こされた（図７）。これらの結果より、最短Ｃ末端ＮＴ（８−１３）フラグメントは、本発明の活性化薬剤と関連して強い生物活性を引き起こすのに充分であることが示される。
【０１３３】
＜実施例８＞
ジスルフィド架橋を用いた活性化ＮＴ薬剤コンジュゲートの合成
ＥＭＣＳリンカー及びＮＴ配列において天然に存在するか又は導入されるリシン残基を用いて、実施例１〜４に記載の本発明の活性化ＮＴ薬剤コンジュゲートを合成した。新しくリンクしているストラテジーを評価する目的で、ＮＴ（８−１３）及び配列番号９の配列を、ジスルフィド架橋を介してコンジュゲートした。このような切断可能なリンカーは、脳実質における充分に活性なＮＴ（８−１３）の放出を引き起こす可能性があるいくつかの細胞内区画の還元性環境（特にＢＢＢの内皮細胞）において切断され得る一方、体循環において良好な安定性を示す。さらに、リンカーの変更により、別の潜在的に有益なＰＫ、気質、及び代謝特性を備える新しい薬剤が齎される。
【０１３４】
ジスルフィド架橋は、コンジュゲートされる両成分に天然に存在するか又は導入される２つのチオール基から形成される。本発明と関連して、コンジュゲートされる二成分は、遊離システインを提示せず、それゆえに２つのチオール官能は、ＡＧ及びＮＴに化学的に導入された。このために、チオール活性Ｎｐｙｓによって保護されたシステイン残基は、ＮＴ（８−１３）のＮ末端で導入された。Ｎｐｙｓ誘導体化Ｃｙｓは、遊離チオールに対して特異的に反応性が高く、それゆえにヘテロジスルフィド架橋の形成を好む。ＮＴ−ＥＭＣＳへのコンジュゲートと同様の方法にて、システアミンでのＣ末端官能化により、チオール化された配列番号９の配列を生成した。両成分を個々に製造した後、最終ステップで互いにコンジュゲートさせた。カップリングステップを以下に図示する。分析及び精製方法は実施例１に記載のとおりである。
【０１３５】
【化２】
0006562948.tif 000015
【０１３６】
１．ペプチドＣ（Ｎｐｙｓ）−ＮＴ（８−１３）の合成
Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ及びＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）は、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。
【０１３７】
Ｎ末端を制限しなかったほかは実施例６と同様にして、Ｈ−ＮＴ（８−１３）を調製した。Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）−ＯＨ（５当量）及び無水ＤＭＦ（０．３３Ｍ）におけるＤＩＣ（５当量）の溶液を１０分間室温で前活性化させ、樹脂に添加した。一晩機械的に撹拌した後、樹脂をＤＭＦ及びＤＣＭで洗浄し、樹脂結合ペプチドを切断して、先の実施例と同様の方法で処置した。３０分間で溶液Ｂを１７〜２６％の濃度勾配として粗ペプチドを精製し、精製薄黄色粉末を得た（ｍ＝２５．９ｍｇ、収量＝２４％、純度＞９５％）。質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析で確認した（ｍ／ｚ  ［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値＝１０７４．４９、実測値＝１０７４．４７）。分析の間にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにおいてＮｐｙｓ保護が切断されたとき、この基を有さない生成物も観察された（Ｍ  −Ｎｐｙｓ＋Ｈ＋Ｈ］＋、計算値＝９２０．５１、実測値＝９２０．４７５）。
【０１３８】
２．チオール化配列番号９の合成
チオール化配列番号９を、実施例１に記載の方法で製造した。
【０１３９】
３．活性化ＮＴコンジュゲートＮＴ（８−１３）−ＳＳ−配列番号９（化合物ＶＩＩＩ）の合成
不活性雰囲気（０．０２Ｍ）下、脱ガスした１０％酢酸溶液にＣ（Ｎｐｙｓ）−ＮＴ（８−１３）（１．３当量）を溶解させた。不活性雰囲気（０．０１５Ｍ）下、脱ガスした１０％酢酸溶液にチオール化された配列番号９の配列（１当量）を溶解させ、すぐにＣ（Ｎｐｙｓ）−ＮＴ（８−１３）溶液に添加した。不活性雰囲気下、反応混合物を室温で撹拌した。反応のモニタリングは、分析ＲＰ−ＨＰＬＣで行った。４８時間撹拌後、反応混合物にＣ（Ｎｐｙｓ）−ＮＴ（８−１３）（０．４５当量）を再度添加した。反応の完了後、３０分間で溶液Ｂを１７〜２７％の濃度勾配として、粗混合物を調製ＲＰ−ＨＰＬＣにて精製し、精製白色粉末を得た（ｍ＝７．８ｍｇ、収量＝５２％、純度＞９５％）。質量を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析で確認した（ｍ／ｚ  ［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値＝２０５０．００、実測値＝２０５１．０８）。
【０１４０】
＜実施例９＞
ＮＴ（８−１３）−ＳＳ−配列番号９活性化薬剤コンジュゲートの低体温反応
ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇの投与レベルでスイス（ＣＤ−１）マウスに静脈内注射（急速）し、ＮＴ（８−１３）−ＳＳ−配列番号９（化合物ＶＩＩＩ）の低体温反応を評価して、システアミン−ＥＭＣＳリンカーを用いて得られた薬剤、すなわち化合物ＩＩと比較した。
【０１４１】
化合物ＶＩＩＩは、化合物ＩＩと同程度に、マウスにおいて有効な低体温を引き起こした。両化合物は、各々、注射後４５分で体温低下が最大−５．８℃、及び注射後１時間で体温低下が最大−６．７℃という低体温を引き起こした（図８）。このように、ジスルフィドリンカーを用いたＮＴ（８−１３）のカップリングにより、ＮＴを活性化するのに適したストラテジーが発現され、一方、脳毛細血管内皮細胞等の還元性環境において、ＮＴがおそらく放出される。
【０１４２】
＜実施例１０＞
タンデムＡＧ−ＮＴ活性化薬剤の合成
ＮＴ及びＡＧ成分を個々に調製し、官能化させ、次いでこれらをカップリングさせることにより、先の実施例で開示した活性化ＮＴ薬剤を合成した。本実施例において、タンデム合成及びＳＰＰＳ適合スペーサーを用い、活性化ＮＴ薬剤の新シリーズを製造した。一方、ペプチド結合により、ＮＴ及びＡＧ成分を直接カップリングさせた。これらの薬剤の合成は、タンデムにおいて２つのステップのみで行うことができる。２つのステップとは、支持体上でのペプチドの伸長、及びＡＧジスルフィド結合形成である。このストラテジーを用い、最適なＮＴ（８−１３）フラグメント及びその類似体に基づく活性化ＮＴ薬剤を、３５％以下の全収量で調製した。さらに、タンデム合成により、ＡＧ成分とＮＴポリペプチドとの間のスペーサーとして、多数のリンカーの使用が可能となる。重要なのは、遊離カルボキシル末端は、ＮＴレセプターへの結合のために必須であるので、ＮＴポリペプチドは、コンジュゲートのＣ末端で導入されたことである。これらの中で、一般的なリンカーは、トリグリシン等のアミノ酸を基礎とするリンカーである。また、アミノヘキサン酸も選択された。この非天然アミノ酸は、ペプチドと他の成分との間の距離を増大させるために用いられる、一般的な疎水性リンカーである。最終的には、２つのＰＥＧスペーサーがまた、コンジュゲートに、より親水性を付与し、それゆえにより水溶性かつ生物学的な耐性を付与するかを評価した。２つのＰＥＧ分子を試験し、その生物活性に対する、ＡＧとＮＴポリペプチドとの間の距離の影響を評価した。薬剤コンジュゲートに導入された全てのリンカー／スペーサーにより、ＮＴポリペプチドによるターゲット−レセプターの最適認識にとって重要な適応性が、薬剤に付与された。分析及び精製は、実施例１に記載の方法で行った。
【０１４３】
１．配列番号９−ＮＴ（８−１３）、配列番号９−ＧＧＧ−ＮＴ（６−１３）、配列番号９−Ａｈｘ−ＮＴ（６−１３）、及び配列番号９−Ａｈｘ−ＮＴ（８−１３）の合成
ペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）法により、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）（ＣＥＭ）マイクロ波シンセサイザーで、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーと、前記方法にて手動でプレローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、ローディング０．０９ｍｍｏｌ／ｇ）とを用いて、化合物ＩＸ（配列番号９−ＮＴ（８−１３））、化合物Ｘ（配列番号９−ＧＧＧ−ＮＴ（６−１３））、化合物ＸＩ（配列番号９−Ａｈｘ−ＮＴ（６−１３））、及び化合物ＸＩＩ（配列番号９−Ａｈｘ−ＮＴ（８−１３））を合成した。
【０１４４】
Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨは、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。他の原料については、前記のとおりである。
【０１４５】
ペプチド伸長、切断、及び処置は、先の実施例に記載のものと同じ方法で行った。Ｄ−Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、及びＮＴ−Ａｒｇ９アミノ酸について、ダブルカップリングを行った。５０％プロピオン酸無水物のＤＣＭ溶液を用い、ペプチドＮ末端をプロピオニル化した。３０分間で溶液Ｂを１５〜２５％の濃度勾配として、調製ＲＰ−ＨＰＬＣにて粗ペプチドである配列番号９−ＧＧＧ−ＮＴ（６−１３）を精製した。スペーサーなし（ペプチド結合のみ）か、又はＡｈｘスペーサーを含む粗ペプチドを、さらに精製することなく、次の環化ステップに用いた。
【０１４６】
実施例１で詳細に説明したものと同じプロトコルを用い、ＡＧに含まれる２つのシステイン（１及び８位）からの分子内環化により、ジスルフィド架橋を得た。白色粉末の精製薬剤を得た（最終純度＞９５％）。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下に示す。
【０１４７】
【表１３】
0006562948.tif 000016
【０１４８】
２．配列番号９−ＰＥＧ２−ＮＴ（８−１３）及び配列番号９−ＰＥＧ６−ＮＴ（８−１３）の合成
ＰＥＧスペーサーを手動で導入した以外は、ペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）法により、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）（ＣＥＭ）マイクロ波シンセサイザーで、化合物ＸＩＩＩ（配列番号９−ＰＥＧ２−ＮＴ（８−１３））及び化合物ＸＩＶ（配列番号９−ＰＥＧ６−ＮＴ（８−１３））を合成した。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーと、前記方法にて手動でプレローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、ローディング０．０９ｍｍｏｌ／ｇ）とを用いた。
【０１４９】
Ｆｍｏｃ−１２−アミノ−４，７，１０−トリオキサドデカン酸（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ２−ＯＨ）及びＦｍｏｃ−２１−アミノ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサオキサヘンエイコサン酸（Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ６−ＯＨ）は、ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。他の原料については、前記のとおりである。
【０１５０】
ペプチド伸長は、先の記載と同じ方法で、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）マイクロ波シンセサイザーにて、ＰＥＧ導入まで、及びその手動導入後に行った。Ｄ−Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、及びＮＴ−Ａｒｇ９アミノ酸について、ダブルカップリングを行った。手動カップリングとして、ＰＥＧアミノ酸（２当量）を、ＣＯＭＵ（２当量）及び無水ＤＭＦ（ＰＥＧに対して０．２Ｍ）におけるＤＩＥＡ（４当量）にて、５分間前活性化させた。次いで、活性化ＰＥＧを樹脂に添加し、混合物を一晩、室温で機械的に撹拌した。５０％プロピオン酸無水物のＤＣＭ溶液を用い、ペプチドＮ末端をプロピオニル化した。通常の切断及び処置の後、粗ペプチドを、さらに精製することなく、次の環化ステップに用いた。
【０１５１】
実施例１で説明したものと同じプロトコルを用い、ＡＧに含まれる２つのシステイン（１及び８位）からの分子内環化により、ジスルフィド架橋を得た。白色粉末の精製コンジュゲートを得た（最終純度＞９５％）。詳細な濃度勾配、収量、及び質量分析を以下に示す。
【０１５２】
【表１４】
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【０１５３】
３．配列番号９−［Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、配列番号９−［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、配列番号９−［Ｌｙｓ９，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、配列番号９−［Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、配列番号９−［Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）、及び配列番号１１−［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３）の合成
ペプチド固相合成（ＳＰＰＳ）法により、Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）（ＣＥＭ）マイクロ波シンセサイザーで、化合物ＸＶ（配列番号９−［Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３））、化合物ＸＶＩ（配列番号９−［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３））、化合物ＸＶＩＩ（配列番号９−［Ｌｙｓ９，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３））、化合物ＸＶＩＩＩ（配列番号９−［Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３））、化合物ＸＩＸ（配列番号９−［Ｌｙｓ８，Ｔｒｐ１１，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３））、及び化合物ＸＸ（配列番号１１−［Ｌｙｓ８，Ｔｌｅ１２］ＮＴ（８−１３））を合成した。Ｆｍｏｃ／ｔＢｕストラテジーと、前記方法にて手動でプレローディングしたＦｍｏｃ−Ｌｅｕ−Ｗａｎｇ樹脂（１００〜２００メッシュ、１％ＤＶＢ、ローディング０．０９ｍｍｏｌ／ｇ）とを用いた。
【０１５４】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ−ＯＨ、及びＦｍｏｃ−Ｔｌｅ−ＯＨは、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。他の原料については、前記のとおりである。
【０１５５】
ペプチド伸長、切断、及び処置は、先の実施例に記載のものと同じ方法で行った。Ｄ−Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、及びＮＴ−Ａｒｇ９アミノ酸について、ダブルカップリングを行った。５０％プロピオン酸無水物のＤＣＭ溶液を用い、ペプチドＮ末端をプロピオニル化した。通常の切断及び処置の後、粗ペプチドを、さらに精製することなく、次の環化ステップに用いた。
【０１５６】
【表１５】
0006562948.tif 000018
【０１５７】
＜実施例１１＞
タンデムＡＧ−ＮＴ活性化薬剤の低体温反応
タンデム合成手段を用いて得られた活性化ＮＴ薬剤の低体温効果を実証するために、各薬剤を、化合物ＩＩと同様に、ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇの投与レベルでスイス（ＣＤ−１）マウスに静脈内注射（急速）し、注射後３時間に渡って直腸体温をモニタリングした。
【０１５８】
試験した全ての薬剤は、マウスにおいて有効な同程度の低体温反応を引き起こした。全ての薬剤は、注射後６０分で約−６／−７℃に到達し、同じように体温及び動態が最も低下した（図９）。
【０１５９】
化合物ＸＩＶは、注射後６０分で−６．７℃に到達し、この投与レベルで大きな低体温効果を示す一方、最も良好な耐性プロファイルを提示した。化合物ＸＩＶのＥＤ５０は、ＮＴモル当量１．５３ｍｇ／ｋｇであり、これは、化合物Ｉ及び化合物ＩＩについての測定値と似ている。化合物Ｉと比較すると、化合物ＸＩＶは、脳及び眼におけるＫｉｎが、各々３．６５×１０−４ｍＬ／ｓ／ｇ及び３．３０×１０−４ｍＬ／ｓ／ｇと増大しており（図５、黒色棒グラフ）、高い血液安定性を示し、推定半減期が９６分であった（図６）。ＮＴモル当量２０ｍｇ／ｋｇでマウスに注射したとき、化合物ＸＩＶは、さらなる安全性の懸念なしで、まだ充分に耐性があった。この投与レベルで、さらなる体温の低下は観察されず、ＮＴモル当量１０ｍｇ／ｋｇで薬理的低体温反応の飽和状態であることが示された。最大耐量（ＭＴＤ）はＮＴモル当量４０ｍｇ／ｋｇであり、ＬＤ５０（致死量、５０％）には到達しなかった（＞ＮＴモル当量４０ｍｇ／ｋｇ）。ＭＥＤは、ＮＴモル当量約０．１ｍｇ／ｋｇであり、この薬力学／毒性プロファイルは、
i)それは、激化した薬理的低体温による潜在的致死過量投与を阻止する、かつ、
ii)静脈内（急速）投与モードを用い、ＭＥＤとＭＴＤとの間の増加倍率として表される治療ウィンドウが、最大低体温反応を誘発する投与レベルと軽度／無致死毒性を引き起こす投与レベルとの間が４倍の安全保障で、約４００である
ので、優れた安全性の前提条件を構成する。
【０１６０】
＜実施例１２＞
置換ＮＴからなるタンデム活性化薬剤の低体温反応
タンデム合成手段を用いて得られたＮＴ（８−１３）の置換体を含む活性化ＮＴ薬剤の低体温効果を実証するために、各薬剤を、非置換化合物ＩＸと同様に、ＮＴモル当量５ｍｇ／ｋｇでスプラーグドーリーラットに静脈内注射（急速）し、注射後３時間に渡って直腸体温をモニタリングした。
【０１６１】
ＮＴ（８−１３）配列における安定置換体を含む全ての薬剤は、非置換化合物ＩＸと比較して、ラットにおいてより高い低体温反応を引き起こした（図１０）。ＮＴモル当量５ｍｇ／ｋｇでの体温の最大低下は、化合物ＩＸについて、注射後３０分で−１．２℃であり、化合物ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ及びＸＸについて、注射後６０〜９０分で−２℃前後であり、化合物ＸＶＩＩＩ及びＸＩＸについて、注射後９０分で−２．８℃前後であった。
【０１６２】
＜実施例１３＞
本発明の活性化ＮＴ薬剤の反復投与
本発明の活性化ＮＴをマウスに反復投与した際の低体温反応性を実証するために、ＮＴモル当量４ｍｇ／ｋｇで、化合物ＸＩＶを、スイス（ＣＤ−１）マウスに４日間毎日静脈内注射（急速）することを試みた。各日注射後３時間の間に、直腸体温をモニタリングした。
【０１６３】
１日目に、マウスは典型的に、注射後４５分で−５．５℃という体温の最大低下を示した（図１１）。２日目に低体温反応は僅かに低くなったが、その後、注射後３０分で−３℃という平均した体温低下で、効果は有意にかつ安定して維持された（２日目〜４日目）。
【０１６４】
３日間の反復投与で効果を示さない安定ＮＴ類似体（Ｂｏｕｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，９８７（１）：３９−４８）に反して、これらの結果によって、本発明の活性化ＮＴ薬剤は、効果的かつ安全な投与レベルでの反復又は亜慢性投与が可能であり、限られた耐性で固有の薬力学的特性を提示することが実証される。
【０１６５】
＜実施例１４＞
本発明の活性化ＮＴ薬剤の解熱効果
ナイーブマウスに静脈内注射したときに有意な低体温効果を誘発することに加えて、酵母誘発高熱を伴うマウスにおける本発明の活性化ＮＴ薬剤の解熱効果を評価した。つまり、まず、オスＮＭＲＩマウスの直腸温度を、直腸プローブを用いて試験の１４時間前に測定した（ベースライン１、最低５分間のインターバルで２回独立して測定）。次いで、高熱反応を誘発する酵母懸濁液（５１２ｍｇ／ｋｇ）又はヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）の０．９％生理食塩水液を、マウスに皮下注射した。ベースライン温度での酵母又はＨＰＭＣ注射の効果を評価するために、１４時間後、再度マウスの直腸温度を測定した（ベースライン２、最低５分間のインターバルで２回独立して測定）。次いで、マウスを無作為に選出して、活性化ニューロテンシン分子（化合物ＸＩＶ）又はコントロール（０．９％生理食塩水）を静脈内注射し、１５、３０、４５、６０、１２０、及び１８０分後に再度直腸温度を測定した。
【０１６６】
酵母懸濁液を注射し、生理食塩水を与えたコントロールマウスは、典型的な０．６〜１℃の高熱を示した。本発明の活性化ＮＴ分子の解熱効果を、誘発された高熱を覆す自身の能力として評価した。結果により、化合物ＸＩＶは、注射後１５分で同じ動物のベースライン２と比較した場合、又は生理食塩水で処置しており、注射後の時間が一致した動物と比較した場合、−２．２℃という最大効果を示して、ＮＴモル当量２ｍｇ／ｋｇのマウスにおいて急激に、高熱を大きく覆すことが示された（図１２）。化合物ＸＩＶの解熱効果は、ＮＴモル当量６ｍｇ／ｋｇの投与レベルで、４．７℃へと体温をさらに低下させる可能性を伴って、投与−反応関係性を示した。この顕著な結果により、コントロールされた正常体温、又は本発明の活性化ＮＴ分子によって誘発された穏やかな治療的低体温でさえも、局所的脳虚血、深刻な外傷性脳損傷、ＩＣＨ、ウィルス、細菌又は寄生虫感染、及び局所的炎症反応が高熱を誘発するかもしれない何らかの急性疾患等の、高熱に起因した急性疾患における神経保護に対して、使用可能であることが示された。
【０１６７】
＜実施例１５＞
てんかん及び興奮毒性神経細胞死のマウスモデルにおける、活性化ＮＴ薬剤の抗痙攣、神経保護並びに抗神経刺激効果
本実施例において、本発明の活性化ＮＴ薬剤の、痙攣及び発作に起因した興奮毒性の後の神経保護を促進する能力を評価した。その他の細胞よりもさらに、神経細胞は特に、酸素及びグルコース除去、グルタミン酸塩の大量放出を誘発する状況、神経細胞の主な興奮性神経伝達物質に対して敏感である。神経細胞による過剰のグルタミン酸塩放出により、次に、過剰の神経細胞活性が誘発され、これは急速な神経細胞死及び有害な神経炎症を起こす。この興奮毒性のプロセスは、脳虚血の全ての形態、すなわち、次の突然の心停止（全体的な脳虚血）、次の卒中（局所的虚血）、及び新生児虚血にとって一般的である。興奮毒性はまた、発作の間、並びにてんかん、次の脳及び脊髄外傷において起こる。全てのケースで、興奮毒性に対して神経細胞が特に敏感な、海馬等の神経系の領域において観察される急速な神経細胞死により、しばしば重篤なハンディキャップ又は死を伴うような元の状態に戻せない神経細胞損傷が導かれる。発作はまた、異常軸索新芽形成、特に、発作の始まりから数週間における海馬の苔状線維のそれに起因する。
【０１６８】
本ケースにおいて、興奮毒性は、てんかん重積状態（ＳＥ）を誘発すると知られている副駆虫剤であるカイニン酸（ＫＡ）の皮下（ｓ．ｃ．）注射によって誘発された。該てんかん重積状態は、ＫＡ投与後３〜７日で観察される興奮毒性、神経炎症、及び海馬における重篤な神経細胞損傷、並びにＫＡ投与後７〜８週間で観察される歯状回苔状線維の異常軸索新芽形成を伴って誘発される。化合物ＸＩＶについて
i)てんかん活性（反復性発作の持続性）
ii)神経変性、神経炎症、及び結果として生じた脳組織損傷、並びに
iii)歯状回苔状線維の異常軸索新芽形成
の効果を試験した。
【０１６９】
ＦＶＢ／Ｎ成長オスマウスに、ＫＡを単回投与（４０〜４５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）で注射し、ＳＥの保証として自然再発する発作を伴うマウスを得た。マウスのネガティブコントロール群に、ＫＡの代わりに０．９％生理食塩水を投与し、さらなる処置は何も行わなかった（「ＳＨＡＭ」、ｎ＝５）。ＳＥ発現後３０分で、ＮＴモル当量４ｍｇ／ｋｇの投与量で化合物ＸＩＶを（処置グループ「ＳＥ＋ＨＴ」、ｎ＝５）、又は０．９％生理食塩水を（グループ「ＳＥ」、ｎ＝５）、又は１５ｍｇ／ｋｇの高投与量で有効抗痙攣及び抗てんかん薬剤のジアゼパム（ＤＺＰ）を（ポジティブコントロールグループ「ＳＥ＋ＤＺＰ」）、マウスに急速静脈内（尾血管）注射した。直腸プローブを用い、ＫＡ注射の前、及びその後６時間の間に１５分ごとに、体温をモニタリングした。この期間中、運動発作の発生及び重症度についてマウスを評価した。１週間後、この興奮毒性のモデルにおいて、脳内の主要構成である海馬体が組織損傷を示しており、これらの動物について、冠状切片上の神経細胞死の組織学的評価を断念した。同じ処置を行った別の動物グループについては、８週間で歯状回苔状線維の異常軸索新芽形成の組織学的評価を断念した。
【０１７０】
１）てんかん重積状態における体温及び発作強度に対する活性化ＮＴ薬剤の効果：抗痙攣特性を有する化合物ＸＩＶ
ＫＡの投与（４０〜４５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）により特徴的な連続的行動の変化が引き起こされた。注射直後、すべての動物において不動症が発現した（ステージ１）。ＫＡ注射後３０分以内で、点頭痙攣での自動症、前肢クローヌス、及び循環行動が観察された（ステージ２〜３）。次いで、ほとんどの動物について進展が一時中断し（ステージ４）、前肢クローヌス及び落下行動を伴う継続した飼育が続いた（ステージ５）。何匹かのマウスでは、激しい全身強直性間代性発作があった（ステージ６）。少なくともラシーヌステージ５発作に到達した動物のみが、研究に含まれた。ＫＡ注射後２時間前後で発生したＳＥは、ステージ５〜６発作によって特徴づけられ、しばしば高熱に起因した（図１３（ａ））。ＳＥ発現後３０分（ＳＥ３０）で投与された化合物ＸＩＶにより、常に、少なくとも２時間は持続する一時的な低体温へと導かれた（図１３（ａ））。ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶ動物について、ＳＥ動物と比較して、体温（ＢＴ）の平均低下度として、−２．５℃及び−３．６℃が各々記録された（Ｆ＝５２．３４、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。この低体温は、ＳＥグループと比較して、ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶグループにおける発作の大きな減少に起因していた（Ｆ＝８２３．９６、＊＊＊Ｐ＜０．００１、図１３（ｂ））。ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶ動物により、実験の休止期間に、ステージ２発作の平均又はそれ未満が提示された。動物のサブセットに、高投与量のジアゼパム（ＤＺＰ）を腹腔内投与した。ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶ動物についてのように、実験の休止期間に、ＤＺＰ処置動物は急速なステージ１〜２発作を示し、これらの動物において、低体温もまた観察された（Ｆ＝８２３．９６、＊＊＊Ｐ＜０．００１、図１３（ａ）（ｂ））。ＳＥが始まった３０分後にニューロテンシンＮＴ（８−１３）を投与した場合、ＳＥ動物と比較して、ＢＴ又は発作強度の重要な変化は観察されなかった。このように、ＳＥ動物（ＳＥ＋ＨＴグループ）においてＮＴモル当量４ｍｇ／ｋｇの投与量で化合物ＸＩＶを投与することにより、薬剤の有効な抗痙攣効果が実証され、運動発作の明確な減少又は穏やかな抑制が誘発された。この効果は、２．５時間の間に体温が−３〜−６℃低下したことと関連があった。
【０１７１】
２）てんかん重積状態後の海馬における、活性化ＮＴ薬剤による神経保護の促進
各々神経細胞特定核タンパク質及び神経細胞死をラベルする抗ＮｅｕＮ抗体及びＦｌｕｏｒｏ−ｊａｄｅ  Ｃを用い、ＳＨＡＭ動物と比較すると（図１４（ａ）−パネルＡ）、コントロールＳＥ動物の海馬におけるいくらかの歯状門神経細胞だけでなく、ＣＡ１及びＣＡ３錐体細胞の広範囲な損失が観察された（図１４（ａ）−パネルＢ）。ＳＥ発現後３０分で化合物ＸＩＶ又はＤＺＰを投与した際には、ＳＥ動物で観察された神経変性はかなり減少したが（図１４（ａ）（ｂ））、ＮＴ（８−１３）を投与した際には、変化がなかった。ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶ動物について得られた結果は、ＳＥ３０＋ＮＴ（８−１３）グループで観察された結果と大きく異なっていたが、ＳＥ３０＋ＤＺＰマウスで観察された結果とは差異がなかった。
【０１７２】
３）てんかん重積状態後の海馬における、活性化ＮＴ薬剤によるグリア介在性炎症反応の軽減
ＳＥ誘発グリオーシスは、ミクログリア及びアストログリア細胞型を引き起こした。ＧＦＡＰ及びＩｂａ１免疫ラベリングを用い、神経炎症に対する化合物ＸＩＶの効果を評価した。ＳＨＡＭ動物において、ＧＦＡＰ及びＩｂａ１についての基本的なラベリングがＨＦ中で検出された（図１４（ａ）−パネルＤ）。ＳＥ動物において、グリア細胞の非常に強力な活性が、全海馬層中で発生した（図１４−パネルＥ、Ｈ）。ＳＥ発現後３０分で化合物ＸＩＶ又はＤＺＰを投与した際には、この炎症反応は著しく低減したが（図１４−パネルＦ、Ｉ）、ＮＴ（８−１３）を投与した際には、変化がなかった。ＳＥ３０＋化合物ＸＩＶ動物について得られた結果は、ＳＥ３０＋ＮＴ（８−１３）グループで観察された結果と大きく異なっていたが、ＳＥ３０＋ＤＺＰマウスで観察された結果とは差異がなかった。
【０１７３】
４）てんかん重積状態後の海馬における、活性化ＮＴ薬剤による苔状線維発芽の低減
一般に、ＫＡ処置マウス及びてんかんにおいて、苔状線維（歯状回顆粒細胞の軸索）の発芽は、充分に証明されている。この異常軸索は、門細胞損失に応答して内部分子層（ＩＭＬ）において起こることが提議されてきている。化合物ＸＩＶの神経保護効果をさらに研究するために、ＳＥ後８週間で苔状線維発芽の程度を評価した。亜鉛イオンにおいて、苔状線維末端は非常に強化されており、図１５に示すように、亜鉛小胞輸送体３（ＺｎＴ３）に対する免疫組織化学的ラベリングを用い、苔状線維の発芽を検出した。全てのＳＨＡＭ動物において、苔状線維末端は、ＣＡ３領域の門部及び淡明層に存在し、ＤＧのＩＭＬで末端は観察されなかった（図１５（ａ）−パネルＡ、Ｂ、図１５（ｂ））。ＳＥ動物において、苔状線維末端は、ＳＨＡＭマウスのように肺門及びＣＡ３領域で観察されただけでなく、ＩＭＬ内部でも観察された（図１５（ａ）−パネルＣ、Ｄ、図１５（ｂ））。ＳＥ動物と比較して、ＳＥ発現後３０分で化合物ＸＩＶ又はＤＺＰを投与した動物において、ＩＭＬを神経支配する末端の数は著しく減少したが（図１５（ａ）−パネルＥ、Ｆ、図１５（ｂ））、ＮＴ（８−１３）を投与した場合には、著しい変化はなかった（図１５（ｂ））。
【０１７４】
本発明の活性化ＮＴ分子は、興奮毒性神経細胞死及び神経炎症による脳組織損傷を阻害する魅力的なアプローチを表すだけでなく、恐らく、低体温によって神経細胞活性を低減して運動発作を抑制する効力を有することが、これら全ての結果によって明確に実証されている。
【０１７５】
＜実施例１６＞
タンデム活性化ＮＴ薬剤の抗侵害受容効果
活性化ＮＴ薬剤の抗侵害受容性効力を評価するために、化合物ＸＩＶについて、マウスにおける実験疼痛モデルで試験を行った。急性内臓疼痛のモデルとしてライジング試験を用い、静脈内投与後の化合物ＸＩＶの効果を評価した。化合物ＸＩＶを投与されたマウスにおいて、体温が最も低下する時間が注射後４５分前後であることを考えると、この疼痛モデルにおいて、類似した薬力学的動力学が仮定された。マウスにまず、投与レベルを増加させて化合物ＸＩＶを静脈内注射（急速）し、その後３０分で、続いて０．７％酢酸を腹腔内注射した（１０ｍＬ／ｋｇ）。コントロールマウスにおいて、酢酸の腹腔内注射により、早くも注射後２〜３分で、特徴的かつ定量化可能な腹部ストレッチ（体の伸長及び前肢の拡張）を得て、注射後５〜１５分の間でピークに到達した。したがって、ＮＴモル当量０．５、１、又は５ｍｇ／ｋｇで生理食塩水もしくは化合物ＸＩＶを投与したマウスにおける腹部ストレッチの数（１０分間を超える観察でのライジングカウント）の評価に、この時間ウィンドウを用いた。
【０１７６】
このモデルにおいて、化合物ＸＩＶにより、ＮＴモル当量０．５ｍｇ／ｋｇでは効果がなく、ＮＴモル当量１及び５ｍｇ／ｋｇでは、ライジングカウントが各々５０％及び６４％低減するという、重大であり、かつ投与量に依存した抗侵害受容効果が得られた（図１６）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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