(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
0006453855.tif 000021
（式中、Ｒ１および２が、それぞれＨである）の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
式：
【化２】
0006453855.tif 000022
の化合物であって、式中、Ｒ１およびＲ２が、それぞれＨである化合物、またはその薬学的に許容される塩；および任意選択的な薬学的に許容される賦形剤を含む、組成物。
【請求項３】
前記化合物が、前記化合物の細胞内取り込み及び／または安定性を増強する送達ビヒクルとともに製剤化され、場合により、前記送達ビヒクルが、脂質、二層間架橋多層状小胞、生分解性ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）［ＰＬＧＡ］系またはポリ無水物系ナノ粒子もしくは微粒子、及びナノ多孔性粒子支持脂質二重層からなる群から選択された１つ以上の薬剤を含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ、モノホスホリル脂質Ａ；及び／または樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを発現及び分泌する不活性化腫瘍細胞をさらに含む、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項５】
前記不活性化腫瘍細胞が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ３、ＩＬ−１２ｐ７０、またはＦＬＴ−３リガンドを発現及び分泌する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が個体に投与されたときに、抗原（複数を含む）に対する免疫応答を誘導する目的のために選択された１つ以上の抗原をさらに含む、請求項２または３に記載の組成物。
【請求項７】
請求項２〜６の一項に記載の組成物であって、
前記組成物が個体の治療の方法での使用のためであり、
前記治療が、以下の（ｉ）〜（ｖ）：
（ｉ）個体における免疫応答を誘導すること；
（ｉｉ）個体におけるＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を誘導すること；
（ｉｉｉ）癌抗原を発現する個体に前記組成物を、前記個体において前記癌抗原を発現する癌細胞を除去するか、または死滅させるために投与される一次療法の前または後に投与すること；
（ｉｖ）癌に罹患している個体に前記組成物を非経口投与すること；または
（ｖ）個体における抗体依存性細胞傷害性を刺激するために、抗体依存性細胞傷害性を誘導する１つ以上の治療抗体と一緒に、前記組成物を投与すること
の１つ以上を含む、組成物。
【請求項８】
前記組成物が、前記一次療法の後に投与される、請求項７に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記一次療法が、哺乳動物から前記癌細胞を除去するための外科手術、哺乳動物における前記癌細胞を死滅させるための放射線療法、または外科手術及び放射線療法の両方を含む、請求項８に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
前記投与が、皮下、筋肉内、または皮内であり、場合により、腫瘍塊への直接投与である、請求項２〜９の一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
前記方法が、哺乳動物に、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、または１つ以上の治療抗体のうちの１つ以上を投与することをさらに含む、請求項２〜１０の一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストが投与され、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストがイピリムマブまたはトレメリムマブである、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
ＰＤ−１経路アンタゴニストが投与され、ＰＤ−１経路アンタゴニストがＭＫ−３４７５、ＣＴ−０１１、ＡＭＰ−２２４、及びＭＤＸ−１１０６からなる群より選択される、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
ＰＤ−１経路アンタゴニストが投与され、ＰＤ−１経路アンタゴニストがＭＫ−３４７５、ＣＴ−０１１、ＡＭＰ−２２４、及びＭＤＸ−１１０６からなる群より選択される、請求項１２に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記化合物と、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストおよびＰＤ−１経路アンタゴニストの１つ又は両方とが別々の投与として投与される、請求項１１〜１４の一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記化合物と、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストおよびＰＤ−１経路アンタゴニストの１つ又は両方とが異なる時間で投与される、請求項１１〜１５の一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
前記化合物と、ＣＴＬＡ−４経路アンタゴニストおよびＰＤ−１経路アンタゴニストの１つ又は両方とが異なる投与経路で投与される、請求項１１〜１６の一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
癌の治療の方法での使用のためであり、前記癌が、結腸直腸癌、気道・消化器扁平上皮癌、肺癌、脳癌、肝臓癌、胃癌、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌、および腎臓癌からなる群より選択される、請求項２〜１７の一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月１８日に出願された米国仮出願第６１／８２５，００５号及び２０１３年１１月８日に出願された米国仮出願第６１／９０２，１２５号の優先権を主張し、これらの各々が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の背景
本発明の背景の以下の考察は、単に読者が本発明を理解するのを補助するために提供されるものであり、本発明の先行技術を記載または構成することが認められているものではない。
【０００３】
ヒト免疫系は、概して、「自然免疫」及び「適応免疫」と称される２つの部門に分けられ得る。免疫系の自然部門は、主に、補体系及びケモカイン／サイトカイン系を含む多数の可溶性因子ならびに肥満細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、及びナチュラルキラー細胞を含む多数の特殊化した細胞型を介した初期の炎症性応答が関与する。対照的に、適応免疫部門は、抗原に対する免疫記憶において重要な役割を担うＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞とともに遅延性のより長く持続する抗体応答が関与する。免疫系の第３の部門は、γδ  Ｔ細胞ならびに限られたＴ細胞受容体レパートリーを有するＮＫＴ細胞及びＭＡＩＴ細胞等のＴ細胞に関与するものであると見なされ得る。
【０００４】
抗原に対する効果的な免疫応答には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、適切なＭＨＣ背景で抗原を処理して、それをＴ細胞に提示し、次いで、細胞傷害性及びヘルパーＴ細胞のいずれかのＴ細胞刺激をもたらさなければならない。抗原提示後、ＡＰＣ及びＴ細胞の両方における共刺激分子の相互作用が成功しなければならず、そうでなければ、活性化が中断されるであろう。ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−１２は、多くの腫瘍モデルにおいて効果的な炎症誘発性分子としての役割を果たす。例えば、ＧＭ−ＣＳＦは、骨髄前駆細胞の増殖及び樹状細胞（ＤＣ）への分化を誘導するが、Ｔ細胞の活性化に必要な効果的な抗原提示細胞への成熟を活性化するためには、さらなるシグナルが必要である。効果的な免疫療法の障害には、適切な大きさ及び機能の細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞の誘導を制限し得る標的抗原への耐性、生じたＴ細胞の悪性細胞の部位への輸送不良、及び誘導されたＴ細胞応答の持続不良が挙げられる。
【０００５】
腫瘍細胞残屑を貪食するＤＣは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）提示の材料を処理し、共刺激分子の発現を上方調節し、所属リンパ節に移動して、腫瘍特異的リンパ細胞を刺激する。この経路は、腫瘍関連抗原に応答するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び活性化をもたらす。実際、患者の血液、リンパ組織、及び悪性病変において、そのような細胞が頻繁に検出される場合がある。
【０００６】
免疫回避の基礎となる機序についての新たな洞察が、免疫チェックポイント阻害剤または他の治療法との組み合わせを通して、直接的または間接的のいずれかで、治療ワクチン接種の効力を増強する併用治療レジメンとともに、効果的な抗腫瘍免疫を誘導するワクチン開発の基礎としての役割を果たしてきた。ＣＤＮの環状−ジ−ＡＭＰ（リステリアモノサイトゲネスにより産生された）及びその類似体の環状−ジ−ＧＭＰ（レジオネラニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）により産生された）は、ＳＴＩＮＧとして知られているＰＲＲ（病原体認識受容体）に結合するＰＡＭＰ（病原体関連分子パターン）として宿主細胞によって認識される。ＳＴＩＮＧは、ＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ１）−ＩＲＦ３シグナル伝達軸を活性化する宿主哺乳動物細胞の細胞質内のアダプタータンパク質であり、自然免疫を強力に活性化するＩＦＮ−β及び他のＩＲＦ−３依存性遺伝子産物の誘導をもたらす。ＳＴＩＮＧは、現在、細胞内病原体による感染を感知し、これに応答してＩＦＮ−βの産生を誘導して、病原体特異的抗体と同様に抗原特異的ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方からなる適応性のある防御的病原体特異的免疫応答を発生させる、宿主細胞質の監視経路の成分であると認識されている。環状プリンジヌクレオチドの例は、例えば、米国特許第７，７０９４５８号及び同第７，５９２，３２６号、ＷＯ２００７／０５４２７９、及びＹａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１８：５６３１（２００８）において多少詳細に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００７】
従来の治療的アプローチでは効果がない場合がある癌等の疾患を治療するための免疫学的戦略における改善された組成物及び方法が依然として必要とされている。
【０００８】
発明の概要
疾患への免疫応答を調節する組成物を提供することが本発明の目的である。
【０００９】
第１の態様において、本発明は、
インターフェロン遺伝子の刺激因子（「ＳＴＩＮＧ」）依存性Ｉ型インターフェロン産生を誘導する１つ以上の環状プリンジヌクレオチド（「ＣＤＮ」）を含む組成物を提供する。以下に記載されるように、多くのＣＤＮが本発明での使用を見出す。好ましい環状プリンジヌクレオチドとしては、ｃ−ジ−ＡＭＰ、ｃ−ジ−ＧＭＰ、ｃ−ジ−ＩＭＰ、ｃ−ＡＭＰ−ＧＭＰ、ｃ−ＡＭＰ−ＩＭＰ、ｃ−ＧＭＰ−ＩＭＰ、及びその類似体のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。この一覧は、限定するようには意図されていない。
【００１０】
本発明に従う環状プリンジヌクレオチドの一般構造は、以下の通りであり、
【化１】
0006453855.tif 000002
式中、Ｒ１及びＲ２の各々は、プリンであり、構造
【化２】
0006453855.tif 000003
は、リン酸結合がリボースの２’位または３’位のいずれかに対してであり得、かつ環状結合に関与しない２’位または３’位の他方が−ＯＨであることを反映させるよう意図される。本発明は、２’，５’，２’，５’ＣＤＮ及び２’，５’，３’，５’ＣＤＮを企図する。例として、２’−５’結合を有するｃ−ジ−ＧＭＰは、Ｒ１及びＲ２の各々がグアニンであり、各リン酸結合が２’−から−５’である、上に示された分子を指す。
【００１１】
本発明の目的ために、この一般構造は、ＳＴＩＮＧに結合し、ＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達カスケードを誘導（最も好ましくは、ヒトＳＴＩＮＧ依存性シグナル伝達カスケードを誘導）し、それによりＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生及び他の同時調節された遺伝子を誘導する能力を与える置換基を導入するためにさらに修飾される。例として、本発明は、以下の化合物：
【化３】
0006453855.tif 000004
を含む組成物を提供し、式中、各Ｘは独立して、ＯまたはＳであり、Ｒ３及びＲ４はそれぞれ独立して、Ｈであるか、または１〜１８個の炭素及び０〜３個のヘテロ原子の任意に置換された直鎖アルキル、１〜９個の炭素の任意に置換されたアルケニル、または任意に置換されたアリールであり、存在する場合、置換（複数を含む）が、Ｃ１−６アルキル直鎖もしくは分枝鎖、ベンジル、ハロゲン、トリハロメチル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、＝Ｏ、−ＣＯＯＲ’（式中、Ｒ’がＨもしくは低級アルキルである）、−ＣＨ２ＯＨ、及び−ＣＯＮＨ２からなる群から独立して選択され得、Ｒ３及びＲ４は、いずれもＨではない。
【００１２】
好ましい実施形態において、Ｒ３及びＲ４の一方または両方は独立して、細胞内エステラーゼによって除去されるプロドラッグ離脱基を含む。ある実施形態において、Ｒ３及びＲ４の一方または両方は、Ｃ６〜Ｃ１８脂肪酸エステルである。ある実施形態において、Ｒ３及びＲ４の一方または両方は、ミリストイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル等からなる群から選択される。
【００１３】
ある実施形態において、各Ｘは、Ｓである。各ＸがＳである場合の好ましい実施形態において、本組成物は、１つ以上の実質的に純粋なＳｐ，Ｓｐ、Ｒｐ，Ｒｐ、Ｓｐ，Ｒｐ、またはＲｐ，Ｓｐ立体異性体を含む。
【００１４】
ある実施形態において、Ｒ１及びＲ２の各々は、アデニン、グアニン、イノシン、及びキサンチン、またはその類似体からなる群から独立して選択される。好ましくは、Ｒ１及びＲ２の各々は独立して、アデニンまたはグアニンである。
【００１５】
以下に記載されるように、本発明に従って、環状プリンジヌクレオチドは、３’−５’結合を有するｃ−ジ−ＧＭＰと比較して、ＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を少なくとも２倍、より好ましくは５倍、または１０倍、もしくはそれ以上誘導することができる。ここに記述するように、最も好ましくは、ＳＴＩＮＧは、ヒトＳＴＩＮＧである。好ましい実施形態において、本発明に従って実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物は、ヒトＳＴＩＮＧを活性化するが、ビス−（３’，５’）結合のみを有する対応する環状プリンジヌクレオチドは、活性化しない。
【００１６】
アジュバントとしてのそれらの役割において、本組成物は、ワクチン（複数を含む）を採用する治療的または予防的戦略におけるアジュバントとして使用され得る。したがって、本発明の実質的に純粋なＣＤＮ、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩は、１つ以上の所定の抗原への免疫応答を刺激するように選択された１つ以上のワクチンと一緒に使用され得る。本発明の実質的に純粋なＣＤＮ、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩は、そのようなワクチンと一緒に、またはそれに加えて提供され得る。
【００１７】
そのようなワクチン（複数を含む）は、目的とする抗原、精製された抗原、抗原を発現及び／もしくは分泌するように組み換え技術によって作られた生ウイルスまたは細菌送達ベクター、抗原で負荷されるまたは抗原をコードする核酸を含む組成物でトランスフェクトされる細胞を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベクター、リポソーム抗原送達ビヒクル、または抗原をコードする裸の核酸ベクターを含む、不活性化もしくは弱毒化細菌もしくはウイルスを含むことができる。この一覧は、限定するようには意図されていない。例として、そのようなワクチン（複数を含む）は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ３、ＩＬ−１２ｐ７０、ＦＬＴ−３リガンドのうちの１つ以上を発現及び分泌する不活性化腫瘍細胞も含み得る。
【００１８】
本発明の実質的に純粋なＣＤＮ、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを含有する製剤中の様々な非経口及び非経口でない経路によって、それを必要とする個体に投与され得る。好ましい経路は、非経口であり、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、髄腔内、及び硬膜外投与のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。腫瘍内経路もまた、好ましい。具体的には、皮下投与による投与が好ましい。好ましい薬学的組成物は、水性または水中油型乳剤として製剤化される。
【００１９】
本発明の組成物は、例えば、アジュバント、脂質、二層間架橋した多重膜小胞、生分解性ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコール酸）［ＰＬＧＡ］系またはポリ無水物系ナノ粒子もしくは微粒子、及びナノ多孔性粒子に支持された脂質二重層、ＣＴＬＡ−４、及びＰＤ−１経路アンタゴニスト、ＰＤ−１経路遮断剤、先天性免疫を誘導する不活性化細菌（例えば、不活性化もしくは弱毒化リステリアモノサイトゲネス）、トール様受容体（ＴＬＲ）、（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、レチノイン酸誘導遺伝子系（ＲＩＧ）−Ｉ−様受容体（ＲＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、病原体関連分子パターン（「ＰＡＭＰ」）、化学療法剤等介して自然免疫活性化を介在する組成物等の１つ以上のさらなる薬学的に活性な成分を含み得るか、またはそれらと一緒に投与され得る。
【００２０】
関連態様において、本発明は、個体における免疫応答を誘導、刺激、またはアジュバントする方法に関する。これらの方法は、個体に、本発明の実質的に純粋なＣＤＮ、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩を投与することを含む。好ましい投与経路は、非経口である。上で述べたように、具体的には、そのような環状プリンジヌクレオチドのチオリン酸塩誘導体が特に好ましい。
【００２１】
ある実施形態において、本方法は、癌治療の方法である。例として、本発明の実質的に純粋なＣＤＮ、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩は、単独で、または当該技術分野で知られている１つ以上の癌ワクチン組成物とともに、またはそれに加えて提供され得る。そのような治療を受けている患者は、結腸直腸癌細胞からなる群から選択される癌、気道・消化器扁平上皮癌、肺癌、脳癌、肝臓癌、胃癌、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膵臓癌、及び腎臓癌に罹患し得る。他の実施形態において、本方法は、病原体への免疫応答を誘導、刺激、またはアジュバントする方法である。
【００２２】
癌に罹患している哺乳動物の治療に関して、本明細書に記載される方法は、任意に、癌抗原を発現する癌細胞を除去するか、または死滅させるための哺乳動物に投与される一次療法の前または後に、哺乳動物に、有効量の本発明の実質的に純粋なＣＤＮ、またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩を投与することを含むことができる。本発明の組成物は、ネオアジュバント療法として提供され得るが、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、一次療法後に投与される。様々な実施形態において、一次療法は、哺乳動物から癌細胞を除去するための外科手術、哺乳動物における癌細胞を死滅させるための放射線療法、または外科手術及び放射線療法の両方を含む。
【００２３】
他の実施形態において、本明細書に記載される方法は、Ｔｈ１からＴｈ２免疫への移動が臨床的利益をもたらす、疾患の治療のために、哺乳動物に、有効量の本発明の実質的に純粋なＣＤＮを投与することを含むことができる。細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）は、サイトカインＩＬ−２、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αを産生するＴＨ１  ＣＤ４＋Ｔリンパ球に関与する。対照に、体液性免疫は、ＩＬ−４、ＩＬ−６、及びＩＬ−１０を産生するＴＨ２  ＣＤ４＋Ｔリンパ球に関与する。ＴＨ１応答のための免疫偏向は、一般に、細胞傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、及び単球の活性化を引き起こす。概して、Ｔｈ１応答は、細胞内病原体（宿主細胞内にあるウイルス及び細菌）及び腫瘍に対してより効果的であるが、Ｔｈ２応答は、細胞外細菌、蠕虫を含む寄生虫、及び毒素に対してより効果的である。加えて、自然免疫の活性化は、Ｔヘルパー１型及び２型（Ｔｈ１／Ｔｈ２）免疫系のバランスを正常化し、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｅ依存性アレルギー及びアレルギー性喘息を引き起こすＴｈ２型応答の過度の反応を抑制することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】環状プリンジヌクレオチド（「ＣＤＮ」）媒介性シグナル伝達を示す。ＣＤＮ（例えば、ｃ−ジ−ＡＭＰまたはｃ−ジ−ＧＭＰ）が、細胞質受容体ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）に結合して、ＴＢＫ−１／ＩＲＦ−３経路を介したシグナル伝達を誘導し、ＩＦＮ受容体への結合とそれに続くシグナル伝達を介したＤＣのオートクリン及びパラクリン活性化の両方を引き起こすことにより、ＩＦＮ−βの産生を誘導する。
【図２Ａ】ｃ−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］及びジチオ誘導体の合成スキームを示す。
【図２Ｂ】ｃ−［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］及びジチオ誘導体の合成スキームを示す。
【図２Ｃ】化合物１０、２０、２１、２２、及び２３の構造を示す。
【図３Ａ】化合物９ａに対する１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す。
【図３Ｂ】化合物９ａに対するＣＯＳＹ（３．５〜６．０ｐｐｍ  １Ｈ−軸）の結果を示す。
【図３Ｃ】化合物９ａに対するＨＭＢＣ（３．０〜５．５ｐｐｍ  １Ｈ−軸）の結果を示す。
【図３Ｄ】化合物２１に対する１Ｈ−ＮＭＲの結果を示す。
【図３Ｅ】化合物２１に対するＣＯＳＹ（３．５〜６．０ｐｐｍ  １Ｈ−軸）の結果を示す。
【図３Ｆ】化合物２１に対するＨＭＢＣ（０〜９．５ｐｐｍ  １Ｈ−軸）の結果を示す。
【図３Ｇ】化合物２１に対するＨＭＢＣ（３．５〜５．５ｐｐｍ  １Ｈ−軸）の結果を示す。
【図３Ｈ】化合物１９ｂに対する分析ＨＰＬＣ（２〜２０％  ＡＣＮ／１０ｍＭ  ＴＥＡＡ緩衝液−２０分間）の結果を示す。
【図４】ｃ−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］及びジチオリボースのＯ置換誘導体を示す。
【図５】ｃ−［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］及びジチオリボースのＯ置換誘導体を示す。
【図６】ｃ−［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］及びジチオリボースのＯ置換誘導体を示す。
【図７】様々な環状ジヌクレオチド分子を用いた刺激後のＴＨＰ−１細胞における１型インターフェロン産生を示す。
【図８】様々な環状ジヌクレオチド分子を用いた刺激後の単独のドナーからのヒトＰＢＭＣにおける１型インターフェロン及びインターフェロンガンマの正規化されたＲＮＡ発現レベルを示す。
【図９（ａ）】（Ａ〜Ｃ）は、様々な環状ジヌクレオチド分子を用いた刺激後の単独のドナーからのヒトＰＢＭＣにおける１型インターフェロンアルファ及びデータタンパク質ならびにインターフェロンガンマタンパク質のレベルを示す。
【図９（ｂ）】上に記載の通り。
【図９（ｃ）】上に記載の通り。
【図１０】様々な環状ジヌクレオチド分子による処理後のアジュバント効力の特徴としてヒト細胞におけるＩＦＮ−β産生を示す。
【図１１Ａ】（ａ）〜（ｃ）は、様々な環状ジヌクレオチド分子による処理後の免疫活性化の測定として、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における表面ＣＤ６９発現の上方調節をそれぞれ示す。
【図１１Ｂ】上に記載の通り。
【図１１Ｃ】上に記載の通り。
【図１２】ホスホジエステラーゼ処理に対する様々なＣＤＮ誘導体の耐性を示す。
【図１３】様々な知られているＳＴＩＮＧ変異体を示す。
【図１４】ＩＦＮβ−ＬＵＣレポーターの誘導倍率を測定することによるヒトＳＴＩＮＧ変異型対立遺伝子をコードするＨＥＫ２９３細胞株の刺激を示す。
【図１５Ａ】刺激を受けたヒト樹状細胞によるＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の表面発現を示す。
【図１５Ｂ】ＬＰＳまたはＣＤＮ刺激後のヒトＤＣにおけるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）発現の代表的なヒストグラムである。
【図１６】環状ジヌクレオチドでアジュバント化したＯＶＡタンパク質によるワクチン接種から７日後のＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＰＢＭＣのＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を示す。
【図１７】環状ジヌクレオチドでアジュバント化したＯＶＡタンパク質によるワクチン接種から７日後のＣ５７ＢＬ／６またはｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｔ（ＳＴＩＮＧ−／−）マウスにおけるＰＢＭＣのＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞免疫を示す。
【図１８】様々な環状ジヌクレオチド分子による処理後のＢ１６黒色腫モデルにおける腫瘍体積を示す。
【図１９Ａ】様々な環状ジヌクレオチド分子による処理後のＣＴ２６腫瘍モデルにおける生存曲線を示す。
【図１９Ｂ】上に記載の通り。
【図１９Ｃ】上に記載の通り。
【図２０Ａ】ＨＢＳＳ及びＣｐＧジヌクレオチドを受容している対照マウスと比較した場合の、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ投与後の野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける腫瘍阻害を示す。
【図２０Ｂ】ＳＴＩＮＧ欠損マウスにおいて得られた結果を示す。
【図２１Ａ】ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ投与後の確立されたＣＴ２６結腸癌の拒絶を示す。
【図２１Ｂ】ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡにより処理されたマウスからのＩＦＮ−γ誘導を示す。
【図２１Ｃ】（記載なし。）
【図２２Ａ】ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ投与後の確立された４Ｔ１乳癌の拒絶を示す。
【図２２Ｂ】ＣＴ２６腫瘍細胞による再投与からの保護を示す。
【図２３Ａ】ＨＢＳＳビヒクル対照と比較した場合のＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ投与後のＣＴ２６（Ａ）及び４Ｔ１（Ｂ）担腫瘍動物の両方における処理された原発腫瘍の阻害を示す。
【図２３Ｂ】上に記載の通り。
【図２４Ａ】ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ投与後のＢ１６黒色腫における処理された原発腫瘍の阻害を示す。
【図２４Ｂ】Ｂ及びＣは、グラフ形式（Ｂ）及び写真形式（Ｃ）での肺組織自体のＨＢＳＳビヒクル対照と比較した場合のＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ投与後の遠位肺腫瘍結節の成長の阻害を示す。
【図２４Ｃ】上に記載の通り。
【００２５】
発明の詳細な記載
本発明は、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）として知られている最近発見された細胞質受容体を介してＤＣを活性化する新規の高活性環状−ジ−ヌクレオチド（ＣＤＮ）免疫刺激因子の使用に関する。具体的には、本発明のＣＤＮは、ＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を誘導する１つ以上の環状プリンジヌクレオチドを含む組成物の形態で提供され、この組成物中に存在する環状プリンジヌクレオチドは、実質的に純粋な２’，５’，２’，５’及び２’，５’，３’，５’ＣＤＮである。
【００２６】
アジュバントの設計及び開発への最近の洞察は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として知られている保存された微生物構造が、宿主パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって感知され、サイトカイン及びケモカインの誘導、及び特定の適応免疫応答の開始をもたらす下流のシグナル伝達カスケードを引き起こすという基本的な理解によって知らされている。いかに自然免疫応答系が微生物のＰＡＭＰ補体に関与するかにより、疾患を起こす侵入病原体と闘うのに適切である適応応答の発生を具体化する。アジュバント設計の目的は、所望の応答を開始するために、定義されたＰＡＭＰまたは指定されたＰＲＲに対して特異的な合成分子を選択することである。モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）及びＣｐＧ等のアジュバントは、ＭｙＤ８８及びＴｒｉｆアダプター分子を通してシグナルを送信し、ＮＦ−ｋＢ依存性炎症性サイトカインの誘導を媒介する、一連の膜貫通ＰＲＲであるトール様受容体（ＴＬＲ）によって認識されるＰＡＭＰである。ＭＰＬ（ＴＬＲ−４アゴニスト）及びＣｐＧ（ＴＬＲ−９アゴニスト）は、臨床的に進行したアジュバントであり、ＦＤＡにより認可されているか、または承認待ちであるワクチンの成分である。ＴＬＲは、細胞外及び液胞病原体を感知する細胞表面（例えば、ＴＬＲ−４）及びエンドソーム（例えば、ＣｐＧ）中に存在するが、ウイルス及び細胞内細菌を含む複数の病原体の生産的成長周期は、細胞質ゾル中で生じる。細胞外、液胞、及び細胞質ＰＲＲの区画化は、自然免疫系が、細胞質ゾルをモニタリングすることによって病原体微生物と非病原体微生物を区別する仮説をもたらす。細胞質の監視経路を含むＰＲＲに特異的なアゴニストが、細胞内病原体に対して防御免疫の発達を開始し、ワクチン設計に関連することを当業者には明らかであるはずである。これらの同一の標的リガンドはまた、腫瘍特異的なＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を必要とすることを知っている有効なワクチン標的悪性腫瘍の発達にも重要であろう。
【００２７】
細胞質の監視経路（ＣＳＰ）の活性化は、細胞内病原体への防御免疫の開発に不可欠である。ＣＳＰは、細菌、ウイルス、及び原生動物の病原体を検出し、ＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ−１）／ＩＲＦ−３シグナル伝達軸の活性化、ＩＦＮ−β及び他の共調節遺伝子の誘導をもたらす。ウイルス及び細菌の両方の核酸は、この経路を活性化し、ＩＦＮ−βの誘導は、ＭｙＤ８８及びＴｒｉｆ非依存性である。Ｉ型インターフェロンがしばしば、宿主抗ウイルス応答として主に考えられるが、ＩＦＮ−βの誘導が細胞内細菌、リステリアモノサイトゲネス（Ｌｍ）により感染したマクロファージ内の細胞質の成長の特徴である。マウスリステリア症モデルにおいて周知の両断論理は、野生型Ｌｍが細菌投与に対してマウスを保護する強力なＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞免疫を初回免疫するのに対して、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）欠損Ｌｍによるワクチン接種は、機能的なＴ細胞を引き出さないし、防御免疫も誘導しない。この違いは、機能的なＴ細胞媒介性防御免疫を引き出すための、宿主細胞遺伝子の発現及びＬｍによる細胞質アクセスの必要条件の証拠である。感染した宿主細胞中のＩＦＮ−βのレベルは、抗生物質を含む構造的に関係のない小分子を分泌するＬｍの多剤排出ポンプ（ＭＤＲ）によって調節される。ＩＦＮ−βは、ファゴリソソームに限定されるＬｍ  ＬＬＯ突然変異体により感染した宿主細胞中に誘導されない。ＩＦＮ−βの正常なレベルは、すべてのＴＬＲ媒介性シグナル伝達に欠損している感染したＭｙＤ８８−／−Ｔｒｉｆ−／−のマクロファージにおいて誘導される。これらのデータは、ＬｍがＴＬＲに関与するが、野生型Ｌｍによる感染に応答して、宿主細胞ＣＳＰがＩＦＮ−βの誘導と関連付けられる防御免疫の発生に必要であることを示す。
【００２８】
環状−ジ−ヌクレオチド（ＣＤＮ）は、細胞質ＰＲＲへのＳＴＩＮＧの直接結合を通して細胞質の監視経路を活性化する。Ｌｍ及び他の細胞内細胞による感染へのＩ型インターフェロン応答は、ｃ−ジ−ＡＭＰまたはその関連した環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、ｃ−ジ−ＧＭＰの分泌、ならびにＤＤＸ４１及びＤＥＡＤへの直接結合（アスパラギン酸塩−グルタミン酸塩−アラニン−アスパラギン酸塩）ボックスヘリカーゼ及びＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）、細胞質の監視経路の最近定義された受容体をもたらす。ＣＤＮは、ほとんどの細菌によって発現された第２のメッセンジャーであり、バイオフィルムの運動性及び形成を含む、様々なプロセスを調節する。ＴＢＫ−１／ＩＲＦ−３シグナル伝達経路を活性化するのに加えて、ＣＤＮの結合に応答して、ＳＴＩＮＧはまた、ＩｋＢキナーゼも活性化し、核へのＮＦ−ｋＢ転写因子の転座をもたらし、複数の炎症性遺伝子の発現を活性化する。
【００２９】
最近まで、いかにＳＴＩＮＧが細胞質ＤＮＡを感知するかは分かりにくいままであった。ｄｓＤＮＡと直接結合するＡＩＭ２とは異なり、ＳＴＩＮＧは、任意の明らかなＤＮＡ結合ドメインを欠いている。ＤＤＸ４１、ＤＮＡ−ＰＫ、及びＤＡＩキナーゼ等の他の候補ＤＮＡセンサーがＳＴＩＮＧを介したｄｓＤＮＡシグナル伝達の不可欠なメディエーターであるかどうかは、はっきりしないままであった。この謎は、環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）の発見により解明され、ｄｓＤＮＡとの結合に応答して、宿主細胞のヌクレオチジルトランスフェラーゼは、ＳＴＩＮＧに直接結合し、ＴＢＫ−１／ＩＲＦ−３軸を通してシグナル伝達カスケードを開始する第２のメッセンジャーである環状ジ−ＧＭＰ−ＡＭＰを合成し、これにより、ＩＦＮの誘導をもたらした。さらに、ｃＧＡＳ自然免疫ＤＮＡセンサーは、ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化する非標準的な環状ジヌクレオチドを生成する。細菌によって生成された第２のメッセンジャーである環状ジヌクレオチドとは異なり、ヌクレオチド間のリン酸塩架橋は、ビス−（３’，５’）結合によって連結され、ｃＧＡＳによって合成された環状−ＧＭＰ−ＡＭＰ中のヌクレオチド間のリン酸塩架橋は、ｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］と表される非標準的な２’，５’及び３’，５’結合によって連結される。したがって、ＳＴＩＮＧ（インターフェロン遺伝子の刺激因子）は、細胞内細菌６によって分泌された環状ジヌクレオチド（ＣＤＮ）、または細胞質病原体核酸との結合に応答して、宿主細胞の環状ＧＭＰ−ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）によって合成された第２のメッセンジャーであるｃ−ＧＭＰ−ＡＭＰの結合を介して、細胞質病原体核酸を感知するための中枢経路として現れる。
【００３０】
自然ＣＤＮ分子は、宿主細胞、例えば、抗原提示細胞中に存在し、当該自然ＣＤＮ分子を含有するワクチン製剤に取り込まれる、ホスホジエステラーゼによる崩壊に対して感受性がある。定義されたアジュバントの効力は、そのような崩壊によって、その定義されたＰＲＲ標的に結合し、活性化することができないアジュバントとして区別され得る。より低いアジュバントの効力は、例えば、測定された抗原特異的免疫応答の大きさによって定義されるように、より弱いワクチン効力と関連付けられ、自然免疫の特徴分子（例えば、ＩＦＮ−β）のより低い量の誘導された発現によって測定され得る。
【００３１】
本発明において、実質的に純粋な２’，５’，２’，５’及び２’，５’，３’，５’ＣＤＮ、及び特に、２’，５’，２’，５’及び２’，５’，３’，５’ｃ−ジ−ＡＭＰ及びｃ−ジ−ＧＭＰのジチオ−二リン酸塩誘導体が提供される。ｃ−ジ−ＡＭＰ及びｃ−ジ−ＧＭＰ分子の当該ジチオ−二リン酸塩誘導体のための合成プロセスは、ｃ−ジ−ＡＭＰ及びｃ−ジ−ＧＭＰ分子のＲｐ，Ｒｐ、Ｓｐ，Ｓｐ、ＳｐＲｐ、及びＲｐ，Ｓｐジチオ−二リン酸塩誘導体を含むジアステレオマーの混合物をもたらす。これらの個体種は、分離され得、それらの薬学的特性の実質的な差を示し得る。
【００３２】
定義
【００３３】
「投与」とは、ヒト、哺乳動物、哺乳動物対象、動物、獣医学的対象、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官、または生体液に関して本明細書で使用される場合、外因性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療薬、診断薬、または組成物を対象、細胞、組織、臓器、または生体液等に接触させることをいう、がこれらに限定されない。「投与」は、例えば、治療方法、予防方法、薬物動態的方法、診断方法、研究方法、プラセボ方法、及び実験的方法を指すことができる。細胞の処理は、試薬の細胞との接触、ならびに液体が細胞に接触している場合、試薬の液体との接触を包含する。また、「投与」は、試薬、診断、結合組成物による、または別の細胞による、例えば、細胞のインビトロ及びエクスビボ処理も包含する。「〜とともに投与する」は、２つ以上の薬剤を単一組成物として投与するようには意図されていない。単一組成物としての投与が本発明により企図されるが、そのような薬剤は、単一の対象に別々の投与として送達され得、同じまたは異なる時間に、同じ投与経路または異なる投与経路で投与され得る。
【００３４】
リガンド及び受容体と関係する「アゴニスト」は、受容体を刺激する分子、分子の組み合わせ、複合体、または試薬の組み合わせを含む。例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアゴニストは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦの突然変異タンパク質もしくは誘導体、ＧＭ−ＣＳＦのペプチド模倣薬、ＧＭ−ＣＳＦの生物学的機能を模倣する小分子、またはＧＭ−ＣＳＦ受容体を刺激する抗体を包含することができる。
【００３５】
リガンド及び受容体に関係する「アンタゴニスト」は、受容体を阻害、対抗、下方調節、及び／または除感作する分子、分子の組み合わせ、または複合体を含む。「アンタゴニスト」は、受容体の構成的活性を阻害する任意の試薬を包含する。構成的活性は、リガンド／受容体相互作用がない場合に現れるものである。また、「アンタゴニスト」は、受容体の刺激（または調節）による活性を阻害または阻止する任意の試薬も包含する。例として、ＧＭ−ＣＳＦ受容体のアンタゴニストには、いかなる限定も示唆するものではないが、リガンド（ＧＭ−ＣＳＦ）に結合し、それが受容体に結合することを阻止する抗体、または受容体に結合し、リガンドが受容体に結合することを阻止する抗体、あるいは抗体が不活性構造に受容体を固定する場合が含まれる。
【００３６】
本発明のＣＤＮに関して「実質的に純粋な」とは、特定の種が組成物中に存在するＣＤＮ活量の少なくとも５０重量％を占め、より多くの場合には少なくとも６０重量％を占め、典型的には少なくとも７０重量％を占め、より典型的には少なくとも７５重量％を占め、最も典型的には少なくとも８０重量％を占め、通常は少なくとも８５重量％を占め、より通常には少なくとも９０重量％を占め、最も通常には少なくとも９５重量％を占め、従来通りでは少なくとも９８重量％またはそれ以上を占めることを意味する。水、緩衝液、塩、洗浄剤、還元剤、プロテアーゼ阻害剤、安定剤（アルブミン等の添加タンパク質を含む）、及び賦形剤の重量は、一般に、純度の決定には使用されない。
【００３７】
リガンド／受容体、核酸／相補的核酸、抗体／抗原、または他の結合対（例えば、サイトカインとサイトカイン受容体）（本明細書では、それぞれ一般に、「標的生体分子」または「標的」と称される）を言及する場合、「特異的に」または「選択的に」結合するとは、タンパク質及び他の生物製剤の不均一集団における、標的の存在に関する結合応答を示す。特異結合とは、例えば、企図された方法の結合化合物、核酸リガンド、抗体、または抗体の抗原結合部位に由来する結合組成物が、非標的分子との親和性よりも、多くの場合、少なくとも２５％大きい、より多くの場合、少なくとも５０％大きい、最も多くの場合、少なくとも１００％（２倍）大きい、典型的には少なくとも１０倍大きい、より典型的には少なくとも２０倍大きい、最も典型的には少なくとも１００倍大きい親和性を有するその標的に結合することを意味し得る。
【００３８】
「リガンド」とは、標的生体分子に結合する小分子、核酸、ペプチド、ポリペプチド、単糖類、多糖類、グリカン、糖タンパク質、糖脂質、またはその組み合わせを指す。そのようなリガンドは、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストであり得るが、リガンドはまた、アゴニストでもアンタゴニストでもなく、アゴニスト特性もアンタゴニスト特性も有さない結合剤も包含する。リガンドのその関連標的に対する特異結合は、多くの場合、「親和性」という観点から表される。好ましい実施形態において、本発明のリガンドは、約１０４Ｍ−１〜約１０８Ｍ−１の親和性で結合する。親和性は、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（ｋｏｆｆは解離速度定数であり、Ｋｏｎは結合速度定数であり、Ｋｄは平衡定数である）として計算される。
【００３９】
様々な濃度（ｃ）における標識リガンドの結合画分（ｒ）を測定することにより、平衡状態での親和性が決定され得る。スキャッチャードの式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）（式中、ｒ＝平衡状態での結合リガンドのモル／受容体のモル；ｃ＝平衡状態での遊離リガンド濃度；Ｋ＝平衡結合定数；ｎ＝受容体分子当たりのリガンド結合部位数）を用いて、データがグラフ化される。グラフ解析により、ｒ／ｃは、Ｘ軸上のｒと対比して、Ｙ軸上にプロットされており、このようにしてスキャッチャードプロットを生成する。スキャッチャード分析による親和性測定は、当該技術分野で周知である。例えば、ｖａｎ  Ｅｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  １２：４２５−４３，１９９１、Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．２７：６５−８，１９８８を参照のこと。別法では、親和性は、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）により測定することができる。典型的なＩＴＣ実験では、リガンドの溶液をその関連標的の溶液に滴定する。それらの相互作用時に放出された熱（ΔＨ）を経時的にモニタリングする。逐次的な量のリガンドが、ＩＴＣ細胞に滴定されるにつれて、吸収または放出される熱の量が結合量と正比例するようになる。系が飽和に達すると、希釈熱のみが観察されるまで熱シグナルが減少する。次いで、細胞中におけるリガンドと結合パートナーの比に対する各注射からの熱のプロットから結合曲線が得られる。結合曲線は、適切な結合モデルを用いて解析されて、ＫＢ、ｎ、及びΔＨを決定する。ＫＢ＝１／Ｋｄであることに留意する。
【００４０】
本明細書で使用される「対象」は、ヒトまたは非ヒト生物体を指す。したがって、本明細書に記載される方法及び組成物は、ヒト疾患及び獣医学疾患の両方に適用可能である。ある実施形態において、対象は、「患者」、すなわち、疾患または状態に対する医療的ケアを受けている生存しているヒトである。これには、疾患が確定されていない、病理の徴候に対して調査されている者が含まれる。本発明の組成物及び方法により標的化されている特定の癌の診断が既に下されている対象が好ましい。本明細書に記載される組成物による治療に好ましい癌には、前立腺癌、腎臓癌、黒色腫、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、結腸癌、頭頸部癌、肺癌、及び乳癌が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
「治療有効量」は、患者利益を示す、すなわち、治療される状態の症状の軽減、予防、または改善をもたらすのに十分な試薬または薬学的組成物の量と定義される。薬剤または薬学的組成物が診断剤を含む場合、「診断有効量」は、シグナル、画像、または他の診断パラメータを生成するのに十分な量と定義される。薬学的製剤の有効量は、個体の感受性の度合い、個体の年齢、性別、及び体重、ならびに個体の特異体質反応等の因子によって異なるであろう。「有効量」は、医学的状態もしくは障害の症状もしくは徴候またはその原因過程を改善する、元の状態に戻す、緩和する、予防する、または診断することができる量を非限定的に包含する。別途に、明確に、または文脈により特に指定されない限り、「有効量」は、状態を改善するのに十分な最小量に限定されない。
【００４２】
（状態または疾患に関して）「治療」または「治療すること」は、好ましくは臨床的結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目邸として、疾患に関しての有益なまたは所望の結果は、疾患の防止、疾患に関連する状態の改善、疾患の治癒、疾患の重症度の軽減、疾患の進行の遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の緩和、疾患に苦しんでいる者の生活の質の向上、及び／または生存期間の延長、のうちの１つ以上を含むが、限定されない。同様に、本発明の目的として、状態に関して有益なまたは所望の結果は、状態の防止、状態の改善、状態の治癒、状態の重症度の軽減、状態の進行の遅延、状態に関連する１つ以上の症状の緩和、状態に苦しんでいる者の生活の質の向上、及び／または生存期間の延長、のうちの１つ以上を含むが、限定されない。例えば、本明細書に記載される組成物が癌の治療に使用される実施形態において、有益なまたは所望の結果には、新生または癌性細胞の蔓延の軽減（または破壊）、癌に見られる新生細胞の転移の軽減、腫瘍の大きさの縮小、癌による症状の減少、癌に苦しんでいる者の生活の質の向上、疾患を治療するのに必要とされる他の投薬量の減少、癌の進行の遅延、及び／または癌に罹患している患者の生存期間の延長、のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。文脈に応じて、例えば、対象が試薬の投与により改善されることが期待される障害を含む状況において、対象の「治療」は、対象が治療を必要とすることを示唆することができる。
【００４３】
「ワクチン」は、予防ワクチンを包含する。ワクチンはまた、治療ワクチン、例えば、ワクチンによって提供される抗原またはエピトープに関連する状態または障害を含む哺乳動物に投与されるワクチンも包含する。
【００４４】
環状プリンジヌクレオチド
【００４５】
原核細胞及び真核細胞は、細胞シグナル伝達ならびに細胞内及び細胞間通信のために様々な小分子を用いる。ｃＧＭＰ、ｃＡＭＰ等のような環状ヌクレオチドには、原核細胞及び真核細胞において調節活性及び開始活性があることが知られている。真核細胞とは異なり、原核細胞は、調節分子として環状プリンジヌクレオチドも用いる。原核生物では、２つのＧＴＰ分子の縮合が酵素ジグアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）により触媒されてｃ−ジＧＭＰが生じ、細菌の重要な調節因子を表す。
【００４６】
近年の研究は、環状ジＧＭＰまたはその類似体が、哺乳動物において、患者の免疫応答または炎症性応答も刺激または増強し得る、あるいはアジュバントとしての役割を果たすことによってワクチンに対する免疫応答を増強し得ることが示唆されている。病原体由来のＤＮＡの細胞質検出には、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）及びその下流の転写因子、ＩＦＮ−調節因子３（ＩＲＦ３）を介したシグナル伝達を必要とする。ＳＴＩＮＧ（ＩＦＮ遺伝子刺激因子；ＭＩＴＡ、ＥＲＩＳ、ＭＰＹＳ、及びＴＭＥＭ１７３としても知られている）と呼ばれる膜貫通タンパク質が、これらの環状プリンジヌクレオチドのシグナル伝達受容体として機能し、ＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナル伝達軸及びＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン応答の刺激を引き起こす。例えば、図１を参照のこと。Ｂｕｒｄｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４７８：５１５−１８，２０１１は、ＳＴＩＮＧが環状ジグアニル酸一リン酸とは直接結合するが、他の無関係なヌクレオチドまたは核酸とは結合しないことを示した。
【００４７】
本発明のＣＤＮに由来する前駆体として用いる環状プリンジヌクレオチドは、例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（２０１３）１５３：ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０４．０４６；米国特許第７，７０９４５８号及び同第７，５９２，３２６号；ＷＯ２００７／０５４２７９；ならびにＹａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ．１８：５６３１（２００８）において多少詳細に記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。これらのＣＤＮは、本発明のＣＤＮを生成するために標準的な有機化学技術を用いて改変され得る。
【００４８】
好ましいプリンには、アデニン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチン、イソグアニン等が含まれるが、これらに限定されない。本発明のＣＤＮは、好ましくはホスホロチオエート類似体、最も好ましくはその実質的に純粋なＳｐ，Ｓｐ、Ｒｐ，Ｒｐ、ＳｐＲｐ、またはＲｐ，Ｓｐ立体異性体である。
【００４９】
構造に表されるように、それぞれのリボースは、置換され得る２’または３’ヒドロキシルを含む。以下に記載されるように、本発明のＣＤＮは、プロドラッグの離脱基または活性、溶解性、バイオアベイラビリティ等に影響を及ぼす他の修飾を提供するこれらの２’または３’ヒドロキシル（環状結合の一部ではない）の一方または両方での置換を含むことができる。本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、企図された化合物の修飾を指し、薬理的活性をほとんど示さず（修飾化合物と比較した場合）、修飾化合物は、体内（例えば、標的細胞または標的器官内）で酵素または非酵素反応を通して非修飾形態に戻るように変換される。ある実施形態において、あるリボース上のヒドロキシルは、プロドラッグの離脱基を含む。プロドラッグは、薬物の物理化学的、生物薬剤学的、及び薬物動態学的特性を改変することができる。従来のプロドラッグは、インビボで転換を行うことによって活性化され、活性薬物を形成する薬物として分類される。プロドラッグ開発の理由は、典型的には不良な水溶解度、化学的不安定性、低経口バイオアベイラビリティ、血液脳関門透過性の不足、及び親薬物と関連する高い初回通過代謝である。好適なプロドラッグ部分は、例えば、“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｊ．Ｒａｕｔｉｃｏ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０１１において記載されている。
【００５０】
好ましい環状プリンジヌクレオチドは、ホスホロチオエート類似体であり、本明細書では「チオリン酸塩」と称される。ホスホロチオエートは、非架橋酸素のうちの一方が硫黄により置き換えられる標準ヌクレオチドの変異体である。ヌクレオチド間結合の硫化は、５’から３’及び３’から５’ＤＮＡ  ＰＯＬ  １エクソヌクレアーゼ、ヌクレアーゼＳ１及びＰ１、ＲＮａｓｅｓ、血清ヌクレアーゼ、ならびに蛇毒ホスホジエステラーゼを含む、エンドヌクレアーゼ及びエクソヌクレアーゼの作用を低減する。加えて、脂質二重層を交差する可能性が増大する。
【００５１】
本質的にキラルであるホスホロチオエート結合。当業者であれば、この構造中のリン酸塩がそれぞれ、Ｒ形態またはＳ形態で存在し得ることを認識するであろう。したがって、Ｒｐ，Ｒｐ、Ｓｐ，Ｓｐ、Ｓｐ，Ｒｐ、及びＲｐ，Ｓｐ形態が可能である。
【００５２】
上で述べたように、本発明の環状プリンジヌクレオチドは、ＣＤＮの２’−Ｏ−及び３’−Ｏ−置換基形態、具体的には、ＣＤＮチオリン酸塩を含む。さらなる安定性及びバイオアベイラビリティは、リボース部分の２’−ＯＨの置換によって提供することができる。本明細書で受け入れられる置換基には、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）０−Ｒａａ）、脂肪族基、脂環式基、アルコキシ、置換オキシ（−０−Ｒａａ）、アリール、アラルキル、複素環式ラジカル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ（−Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、イミノ（＝ＮＲｂｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（ＲｃＣ）もしくは−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−Ｎ０２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバアミド（−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ）もしくは−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、チオウレイド（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、グアニジニル（−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）（Ｒｃｃ））、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）（ＲｃＣ）もしくは−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｃ（＝ＮＲｂｂ）（Ｒａａ））、チオール（−ＳＲｂｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ）、及びスルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒｂｂ）（ＲｃＣ）もしくは−Ｎ（Ｒｂｂ）Ｓ（Ｏ）２Ｒｂｂ）が含まれるが、これらに限定されない。Ｒａａ、Ｒｂｂ、及びＲｃＣの各々は独立して、Ｈであるか、任意に結合された化学官能基、またはＨ、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環式、複素環式、及びヘテロアリールアルキルが含まれるが、これらに限定されない、好ましい一覧を用いたさらなる置換基である。本明細書に記載される化合物内で選択された置換基は、再帰的な度合いまで示される。
【００５３】
本明細書で使用される「アルキル」という用語は、２４個までの炭素原子を含有する飽和直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が含まれるが、これらに限定されない。アルキル基は、典型的には１〜約２４個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子を含み、より好ましくは１〜約６個の炭素原子を含む。本明細書で使用される「低級アルキル」という用語は、１〜約６個の炭素原子を含む。本明細書で使用されるアルキル基は、任意に、１つ以上のさらなる置換基を含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される「アルケニル」という用語は、２４個までの炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンのジエン等が含まれるが、これらに限定されない。アルケニル基は、典型的には２〜約２４個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、より好ましくは２〜約６個の炭素原子を含む。本明細書で使用されるアルケニル基は、任意に、１つ以上のさらなる置換基を含み得る。
【００５５】
本明細書で使用される「アルキニル」という用語は、２４個までの炭素原子を含有し、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指す。アルキニル基の例には、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル等が含まれるが、これらに限定されない。アルキニル基は、典型的には２〜約２４個の炭素原子、より典型的には２〜約１２個の炭素原子を含み、より好ましくは２〜約６個の炭素原子を含む。本明細書で使用されるアルキニル基は、任意に、１つ以上のさらなる置換基を含み得る。
【００５６】
本明細書で使用される「アシル」という用語は、有機酸からヒドロキシル基の除去により形成されたラジカルを指し、一般式−Ｃ（Ｏ）−Ｘを有し、式中、Ｘは、典型的には脂肪族、脂環式、または芳香族である。例には、脂肪族カルボニル、芳香族カルボニル、脂肪族スルホニル、芳香族スルホニル、脂肪族スルフィニル、芳香族リン酸塩、脂肪族リン酸塩等が含まれる。本明細書で使用されるアシル基は、任意に、さらなる置換基を含み得る。
【００５７】
「脂環式」という用語は、環が脂肪族である環状環系を指す。この環系は、少なくとも１つの環が脂肪族である１つ以上の環を含むことができる。好ましい脂環式化合物は、環中に約５〜約９個の炭素原子を有する環を含む。本明細書で使用される脂環式化合物は、任意に、さらなる置換基を含み得る。
【００５８】
本明細書で使用される「脂肪族化合物」は、２４個までの炭素原子を含有する直鎖または分枝鎖炭化水素ラジカルを指し、いかなる２つの炭素原子間の飽和は、一重、二重、または三重結合である。脂肪族基は、好ましくは、１〜約２４個の炭素原子、より典型的には１〜約１２個の炭素原子を含み、より好ましくは、１〜約６個の炭素原子を含む。脂肪族基の直鎖または分枝鎖は、窒素、酸素、硫黄、及びリンを含む１つ以上のヘテロ原子によって中断され得る。ヘテロ原子によって中断されるそのような脂肪族基には、ポリアルコキシ、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリアミン、及びポリイミンが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される脂肪族基は、任意に、さらなる置換基を含み得る。
【００５９】
本明細書で使用される「アルコキシ」という用語は、酸素原子がアルコキシ基を親分子に結合させるために使用されるアルキル基と酸素原子との間に形成されたラジカルを指す。アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるアルコキシ基は、任意に、さらなる置換基を含み得る。
【００６０】
本明細書で使用される「アミノアルキル」という用語は、アミノ置換Ｃ＼−Ｃｎアルキルラジカルを指す。ラジカルのアルキル部分は、親分子で共有結合を形成する。アミノ基は、いかなる位置で位置づけられ得、アミノアルキル基は、アルキル及び／またはアミノ部分でさらなる置換基により置換することができる。
【００６１】
本明細書で使用される「アラルキル」及び「アリールアルキル」という用語は、Ｃ＼−Ｃｎアルキルラジカルに共有結合される芳香族基を指す。得られるアラルキル（またはアリールアルキル）基のアルキルラジカル部分は、親分子で共有結合を形成する。例には、ベンジル、フェネチル等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるアラルキル基は、任意に、ラジカル基を形成するアルキル、アリール、または両方の基に結合される、さらなる置換基を含み得る。
【００６２】
本明細書で使用される「アリール」及び「芳香族」という用語は、１つ以上の芳香環を有する単環式または多環式炭素環式環系を指す。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニル等が含まれるが、これらに限定されない。好ましいアリール環系は、１つ以上の環中に約５〜約２０個の炭素原子を有する。本明細書で使用されるアリール基は、任意に、さらなる置換基を含み得る。
【００６３】
本明細書で使用される「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「ヘテロアリール」及び「複素環式」という用語は、環の少なくとも１つが芳香族であり、１つ以上のヘテロ原子を含む、単環式または多環式の芳香環、環系または縮合環系を含むラジカルを指す。ヘテロアリールはまた、縮合環の１つ以上がヘテロ原子を含有しない系を含めた縮合環系を含むことを意味する。ヘテロアリール基は、典型的には、硫黄、窒素、または酸素から選択される１つの環原子を含む。ヘテロアリール基の例には、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、キノオキサリニル等が含まれるが、これらに限定されない。ヘテロアリールラジカルは、直接または連結部分、例えば、脂肪族基もしくはヘテロ原子を介して親原子に結合され得る。本明細書で使用されるヘテロアリール基は、任意に、さらなる置換基を含み得る。
【００６５】
本明細書で使用される「ヘテロアリールアルキル」という用語は、共有結合したＣ１−Ｃ１２アルキルラジカルをさらに含む前記で定義した通りのヘテロアリール基を指す。得られるヘテロアリールアルキル基のアルキルラジカル部分は、親分子で共有結合を形成することができる。例には、ピリジニルメチル、ピリミジニルエチル、ナフチリジニルプロピル等が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用されるヘテロアリールアルキル基は、任意に、ヘテロアリールまたはアルキル部分の１つまたは両方にさらなる置換基を含み得る。
【００６６】
上で述べたように、好ましい環状プリンジヌクレオチドはまた、ＣＤＮのプロドラッグ形態、具体的には、ＣＤＮのチオリン酸塩を含む。プロドラッグは、薬物の物理化学的、生物薬剤学的、及び薬物動態学的特性を改変することができる。従来のプロドラッグは、インビボで転換を行うことによって活性化され、活性薬物を形成する薬物として分類される。プロドラッグ開発の理由は、典型的には不良な水溶解度、化学的不安定性、低経口バイオアベイラビリティ、血液脳関門透過性の不足、及び親薬物と関連する高い初回通過代謝である。好適なプロドラッグ部分は、例えば、“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｊ．Ｒａｕｔｉｃｏ，Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０１１において記載されている。
【００６７】
環状プリンジヌクレオチドに関して本明細書で使用される「実質的に純粋な」という用語は、上の図で示されるキラル中心で他の可能な立体化学に対して少なくとも７５％純粋であるＲｐ，ＲｐまたはＲｐ，Ｓｐ形態を指す。例として、「実質的に純粋なＲｐ，Ｒｐ  ｃ−ジ−ＧＭＰチオリン酸塩」は、ｃ−ジ−ＧＭＰチオリン酸塩のＲｐ，Ｓｐ及びＳｐ，Ｓｐ形態に関して少なくとも７５％純粋であり得る。好ましい実施形態において、実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチドは、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９７％純粋、及び少なくとも９９％純粋である。本発明の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチドの調製は「立体化学的に純粋」であるが、これは、これらのキラル中心で特定の立体化学を有する調製内のすべてのＣＤＮが同一であることを示すことを意味しない。例えば、実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチドの調製は、Ｒｐ，Ｒｐ  ｃ−ジ−ＧＭＰチオリン酸塩及びＲｐ，Ｒｐ  ｃ−ジ−ＡＭＰチオリン酸塩の組み合わせを含有し、さらに、実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド調製であり得る。そのような調製はまた、患者の治療において好都合である以下に記載される他の成分を含み得るが、但し、調製物内のすべてのＣＤＮがこれらのキラル中心で特定の立体化学を有するものとする。
【００６８】
本明細書に記載されるＣＤＮ組成物は、宿主に、単独で、または薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて、適切な免疫応答を誘導、修飾、または刺激するのに十分な量で投与することができる。免疫応答は、特異的免疫応答、非特異的免疫応答、特異的及び非特異的免疫応答、生得的応答、一次免疫応答、適応的免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、ならびにサイトカイン発現が含まれ得るが、これらに限定されない。ある実施形態において、ＣＤＮ組成物は、１つ以上の所定の抗原への免疫応答を刺激することを目的とするワクチン；アジュバント；ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１経路アンタゴニスト、脂質、リポソーム、化学療法剤、免疫調節細胞株等を含む、１つ以上のさらなる組成物と併せて投与される。
【００６９】
ＣＤＮ組成物は、さらなる治療もしくは予防のための組成物またはモダリティの前、後、及び／またはそれとともに投与され得る。これらには、Ｂ７共刺激分子、インターロイキン−２、インターフェロン−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＯＸ−４０／ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド、サルグラモスチム、レバミゾール、ワクシニアウイルス、バシラスカルメットゲラン桿菌（ＢＣＧ）、リポソーム、ミョウバン、完全または不完全フロインドアジュバント、解毒エンドトキシン、鉱油、リポレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、及び油乳剤もしくは炭化水素乳剤等の界面活性物質が含まれるが、これらに限定されない。細胞傷害性Ｔ細胞応答に対して抗体応答を優先的に刺激するＴ細胞免疫応答を誘導するための担体が好ましいが、両方の種類の応答を刺激するものも、同様に使用することができる。薬剤がポリペプチドである場合、ポリペプチド自体またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを投与することができる。担体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）または樹状細胞等の細胞であり得る。抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞、及びＢ細胞等の細胞型を含む。他のプロフェッショナル抗原提示細胞は、単球、辺縁帯クッパー細胞、ミクログリア、ランゲルハンス細胞、相互に入り込んだ樹状細胞、濾胞樹状細胞、及びＴ細胞を含む。また、通性抗原提示細胞も使用することができる。通性抗原提示細胞の例は、星状膠細胞、濾胞上皮細胞、内皮、及び線維芽細胞を含む。担体は、ポリペプチドを発現するため、または後にワクチンを接種した個体の細胞に発現するポリヌクレオチドを送達するために変換される細菌細胞であり得る。水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム等のアジュバントは、免疫応答を誘発、増強、または延長するために、ワクチンの能力を増加するために追加され得る。サイトカイン、ケモカイン、及びＣｐＧのような細菌核酸配列、トール様受容体（ＴＬＲ）９アゴニスト、ならびにリポタンパク質、ＬＰＳ、モノホスホリル脂質Ａ、リポタイコ酸、イミキモド、レシキモド、ならびにさらに別々に使用されるまたは記載される組成物と併用されるポリＩ：Ｃ等のレチノイン酸誘導遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）アゴニストを含むＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９のためのさらなるアゴニスト等のさらなる材料も、潜在的なアジュバントである。アジュバントの他の代表例は、キラヤサポナリア及びコリネバクテリウムパルバムの皮から精製された均質サポニンを含む合成アジュバントＱＳ−２１を含む（ＭｃＣｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，１９７９；４３：１６１９）。アジュバントが、最適化の対象であることを理解されるであろう。つまり、当業者は、使用するための最高のアジュバントを決定するために日常の実験に従事することができる。
【００７０】
さらなる治療剤との同時投与のための方法は、当該技術分野で周知である（Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ、Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ）。
【００７１】
本発明の化合物のアジュバント特性のため、それらの使用はまた、他のワクチン、アジュバント、抗原、抗体、及び免疫調節成分を含む他の治療法と組み合わせられ得る。例を以下に提供する。
【００７２】
アジュバント
【００７３】
上記の環状プリンジヌクレオチド（複数を含む）に加えて、本発明の組成物は、それらの性質のため、不活性化腫瘍細胞（複数を含む）中に存在する癌抗原に応答する免疫系を刺激するように作用し得る１つ以上のさらなる物質をさらに含み得るか、またはそうでなければそれを使用することができる。そのようなアジュバントには、脂質、リポソーム、自然免疫を誘導する不活性化細菌（例えば、不活性化または弱毒化リステリアモノサイトゲネス）、トール様受容体（ＴＬＲ）を介して自然免疫活性化を仲介する組成物、（ＮＯＤ）様受容体（ＮＬＲ）、レチノイン酸誘導遺伝子に基づく（ＲＩＧ）−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）、及び／またはＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）が含まれるが、これらに限定されない。ＰＡＭＰの例には、リポタンパク質、リポポリペプチド、ペプチドグリカン、ザイモサン、リポ多糖類、ナイセリアポリン、フラジェリン、プロフィリン、ガラクトセラミド、ムラミルジペプチドが含まれる。ペプチドグリカン、リポタンパク質、及びリポテイコ酸は、グラム陽性の細胞壁成分である。リポ多糖類は、ほとんどの細菌によって発現され、ＭＰＬがその一例である。フラジェリンは、病原性細菌及び共生細菌によって分泌される細菌鞭毛抗原の構造成分を指す。α−ガラクトシルセラミド（α−ＧａｌＣｅｒ）は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞の活性化因子である。ムラミルジペプチドは、全細胞に共通する生物活性ペプチドグリカンモチーフである。この一覧は、限定するようには意図されていない。好ましいアジュバント組成物を以下に記載する。
【００７４】
ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１経路アンタゴニスト
【００７５】
ＣＴＬＡ−４は、適応免疫応答の重要な負の調節因子であると考えられている。活性化Ｔ細胞がＣＴＬＡ−４を上方調節し、ＣＤ２８よりも高い親和性を有する抗原提示細胞上のＣＤ８０及びＣＤ８６に結合することにより、Ｔ細胞刺激、ＩＬ−２遺伝子発現、及びＴ細胞増殖を阻害する。ＣＴＬＡ４遮断の抗腫瘍効果は、結腸癌、転移性前立腺癌、及び黒色腫のマウスモデルで観察されている。
【００７６】
イピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（商標））及びトレメリムマブは、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、ＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を阻害するヒト化モノクローナル抗体である。イピリムマブ及びトレメリムマブを用いた第Ｉ相及び第ＩＩ相試験は、癌患者における臨床活性を示した。同様の戦略により標的とされ得る他の負の免疫調節因子には、プログラム細胞死１、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター、形質転換成長因子ベータβ、インターロイキン−１０、及び血管内皮増殖因子が含まれる。
【００７７】
ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞上に発現する適応免疫応答のもう一つの負の調節因子である。ＰＤ−１は、Ｂ７−Ｈ１及びＢ７−ＤＣに結合し、ＰＤ−１の結合は、Ｔ細胞活性化を抑制する。ＰＤ−１経路遮断には抗腫瘍効果がある。ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＫ３４７５、ＣＴ−０１１、ＡＭＰ−２２４、及びＭＤＸ−１１０６が文献に報告されており、これらは本発明に使用し得るＰＤ−１経路遮断剤の例である。
【００７８】
ＴＬＲアゴニスト
【００７９】
本明細書で使用される「トール様受容体」（または「ＴＬＲ」）という用語は、微生物生成物を感知し、かつ／または適応免疫応答を開始させる、タンパク質のトール様受容体ファミリーのメンバーまたはその断片を指す。一実施形態において、ＴＬＲは、樹状細胞（ＤＣ）を活性化する。トール様受容体（ＴＬＲ）は、最初は微生物病原体を認識する自然免疫系のセンサーとして特定されたパターン認識受容体のファミリーである。ＴＬＲは、ロイシンリッチリピートの外部ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ＴＩＲ（Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１Ｒ）ドメインを含む保存された膜貫通分子のファミリーを含む。ＴＬＲは、多くの場合「ＰＡＭＰ」（病原体関連分子パターン）と称される、微生物の異なる構造を認識する。ＴＬＲに結合するリガンドは、炎症及び免疫に関与する因子の産生を誘導する細胞内シグナル伝達経路のカスケードを起動させる。
【００８０】
ヒトでは、１０のＴＬＲが特定されている。細胞表面に発現するＴＬＲには、ＴＬＲ−１、−２、−４、−５、及び−６が含まれるが、ＴＬＲ−３、−７／８、及び−９は、ＥＲ区画に発現する。異なるＴＬＲ発現パターンに基づいてヒト樹状細胞サブセットを特定することができる。例として、骨髄系または「従来の」ＤＣ（ｍＤＣ）サブセットが刺激を受けると、ＴＬＲ１〜８を発現し、活性化マーカー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ、ＣＣＲ７）のカスケード、炎症性サイトカイン及びケモカインが産生される。この刺激及び得られた発現の結果が、抗原特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の初回免疫となる。これらのＤＣは、抗原を取り込む能力が増強され、それらを適切な形でＴ細胞に提示する。対照的に、形質細胞様ＤＣ（ｐＤＣ）サブセットが活性化されると、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９のみを発現し、その結果として、ＮＫ細胞及びＴ細胞が活性化される。死滅しつつある腫瘍細胞がＤＣの機能に悪影響を及ぼすことがあるため、癌治療に対する免疫療法的アプローチでは、抗腫瘍免疫の初回刺激にＴＬＲアゴニストによるＤＣの活性化が有益であり得ることが示唆されている。また、放射線照射及び化学療法を用いる乳癌の治療が成功を収めるには、ＴＬＲ４の活性化が必要であることも示唆されている。
【００８１】
当該技術分野で公知であり、本発明に使用されるＴＬＲアゴニストには、限定されないが、以下のものが挙げられる：
Ｐａｍ３Ｃｙｓ、ＴＬＲ−１／２アゴニスト；
ＣＦＡ、ＴＬＲ−２アゴニスト；
ＭＡＬＰ２、ＴＬＲ−２アゴニスト；
Ｐａｍ２Ｃｙｓ、ＴＬＲ−２アゴニスト；
ＦＳＬ−１、ＴＬＲ−２アゴニスト；
Ｈｉｂ−ＯＭＰＣ、ＴＬＲ−２アゴニスト；
ポリリボシン酸：ポリリボシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）、ＴＬＲ−３アゴニスト；
ポリアデノシン−ポリウリジル酸（ポリＡＵ）、ＴＬＲ−３アゴニスト；
ポリ−Ｌ−リジン及びカルボキシメチルセルロースで安定化したポリイノシン−ポリシチジル酸（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、ＴＬＲ−３アゴニスト；
モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ＴＬＲ−４アゴニスト；
ＬＰＳ、ＴＬＲ−４アゴニスト；
細菌フラジェリン、ＴＬＲ−５アゴニスト；
シアリル−Ｔｎ（ＳＴｎ）、多数のヒト癌細胞上のＭＵＣ１ムチンに付随する炭水化物、ＴＬＲ−４アゴニスト；
イミキモド、ＴＬＲ−７アゴニスト；
レシキモド、ＴＬＲ−７／８アゴニスト；
ロキソリビン、ＴＬＲ−７／８アゴニスト；及び
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）、ＴＬＲ−９アゴニスト。
【００８２】
ＴＬＲアゴニストは、それらのアジュバント性から、他のワクチン、アジュバント、及び／または免疫調節成分と組み合わせて使用されるのが好ましく、様々な組み合わせで組み合わせられ得る。したがって、ある実施形態において、本明細書に記載される、ＳＴＩＮＧに結合し、ＳＴＩＮＧ依存性ＴＢＫ１活性化を誘導する環状プリンジヌクレオチドならびに樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを発現及び分泌する不活性化腫瘍細胞を、治療目的で１つ以上のＴＬＲアゴニストとともに投与することができる。
【００８３】
抗体治療法
【００８４】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、細胞に媒介される免疫防御の機序であり、これにより、免疫系のエフェクター細胞は標的細胞を活発に溶解し、この膜表面抗原は特異的抗体により結合されている。体液性免疫応答の一部として抗体が感染を制限し、かつ抑えるように作用することができる機序のうちの１つである。古典的ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞により媒介され、マクロファージ、好中球、及び好酸球もＡＤＣＣを媒介することができる。ＡＤＣＣは、腫瘍に対してトラスツズマブ及びリツキシマブを含む治療モノクローナル抗体の作用の重要な機序である。本発明の化合物は、ＡＤＣＣを強化するように作用し得る。
【００８５】
以下のものは、本発明の化合物とともに使用され得る抗体の例示的な一覧である。
【００８６】
ムロモナブ−ＣＤ３：臓器、例えば、腎臓、移植の急性拒絶反応を防ぐために使用される。ヒト化バージョンは、１型真性糖尿病におけるベータ細胞の自己免疫性破壊の阻害に有望である。
【００８７】
インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））及びアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（登録商標））：腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）に結合する。リウマチ性関節炎、乾癬、クローン病等の一部の炎症性疾患に使用される。
【００８８】
オマリズマブ（Ｘｏｌａｉｒ（登録商標））。ＩｇＥに結合し、それ故にＩｇＥが肥満細胞に結合するのを防ぐ。アレルギー性喘息に対して使用される。
【００８９】
ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））。活性化Ｔ細胞の表面で曝露されたＩＬ−２受容体の一部に結合する。移植された腎臓の急性拒絶反応を防ぐために使用される。
【００９０】
リツキシマブ（商標名＝Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））。ほとんどのＢ細胞に見られるＣＤ２０分子に結合し、Ｂ細胞リンパ腫を治療するために使用される。
【００９１】
イブリツモマブ（商標名＝Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））。これは、同位体に共役されるＢ細胞（及びリンパ腫）上のＣＤ２０分子に対するモノクローナル抗体である。Ｒｉｔｕｘａｎとともに補完されるリンパ腫患者に与えられる。
【００９２】
トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））。これは、ＣＤ２０に対するモノクローナル抗体の複合体であり、放射性同位体ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）である。
【００９３】
セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））。一部の腫瘍細胞（一部の乳癌、リンパ腫）に見られる上皮成長因子（ＥＧＦ）の受容体であるＨＥＲ１を遮断する。
【００９４】
トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））。乳癌のおよそ２０％において過剰発現した成長因子受容体であるＨＥＲ２を遮断する。
【００９５】
Ａｄｃｅｔｒｉｓ（登録商標）。ＣＤ３０に結合するモノクローナル抗体の複合体であり、細胞表面分子が一部のリンパ腫の細胞により発現されたが、骨髄を再配置させる必要がある正常幹細胞には見られなかった。
【００９６】
アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ（登録商標））。リンパ球に見られる分子であるＣＤ５２に結合し、Ｔ細胞及びＢ細胞の両方を枯渇させる。慢性リンパ性白血病の完全寛解をもたらし、腎臓移植の拒絶反応を防ぐのに有望である。
【００９７】
Ｌｙｍ−１（Ｏｎｃｏｌｙｍ（登録商標））。リンパ腫細胞上に高レベルで発現され得るＨＬＡ−ＤＲでコードした組織適合性抗原に結合する。
【００９８】
腫瘍に対して体自体の免疫応答を増強するように作用するイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標））。
【００９９】
ビタキシン。腫瘍の血管に見られるが、正常組織を供給する血管には見られない血管インテグリン（アルファ−ｖ／ベータ−３）に結合する。第ＩＩ相臨床試験では、ビタキシンは、有害な副作用なく、固形腫瘍を収縮させるのに有望であることを示している。
【０１００】
ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））。血管内皮成長分子（ＶＥＧＦ）に結合し、その受容体に結合するのを防ぐ。結腸直腸癌の治療のために使用される。
【０１０１】
アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（登録商標））。通常、受容体をフィブリノゲンによって結合されるそれらの表面上で結合することによって血小板の凝集を抑制する。血管形成術を行う患者における冠状動脈の再び塞がれるのを防ぐのに有用である。
【０１０２】
送達剤
【０１０３】
リポソームは、リン脂質の１つ（「単層」）またはそれ以上（「多重層」）の層から形成された小胞である。リン脂質の構成要素の両親媒性の性質から、リポソームは、一般に、親水性外面を示し、親水性コアを包んでいる親水性層を含む。親水性／疎水性成分の組み込み、それらの非毒素性、生分解性、生体適合性、アジュバント性、細胞性免疫の誘導、持続放出の特性、及びマクロファージによる取り込み亢進におけるリポソームの多様性は、抗原の送達においてそれらを魅力的な候補にする。
【０１０４】
ＷＯ２０１０／１０４８３３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）は、好適なリポソーム調製を記載する。本明細書ではＶｅｓｉＶａｘ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）と称される、上記「免疫原性ポリペプチド（複数を含む）または炭水化物（複数を含む）」を含むまたは含まないそのようなリポソーム製剤は、１つ以上の追加の成分、例えば、ペプチドグリカン、リポペプチド、リポ多糖類、モノホスホリル脂質Ａ、リポテイコ酸、レシキモド、イミキモド、フラジェリン、非メチル化ＣｐＧモチーフ、ベータ−ガラクトシルセラミド、ムラミルジペプチド、全トランス型レチノイン酸、二本鎖ウイルスＲＮＡ、熱ショックタンパク質、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド、カチオン性界面活性剤、トール様受容体アゴニスト、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン及びｎｏｄ様受容体アゴニスト等を含有し得る。有利には、これらのリポソーム製剤は、本発明に従って１つ以上の環状プリンジヌクレオチドを送達するために使用することができる。
【０１０５】
さらに、上述のリポソーム製剤では、免疫原性ポリペプチドまたは炭水化物をリポソームに結合させるアンカーとして「ステロイド誘導体」が用いられるのに対して、ステロイドは、単にコレステロール等の非共役ステロイドとして与えられる場合がある。
【０１０６】
脂質混合物からリポソームを調製するのに適する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｂａｓｕ  ＆  Ｂａｓｕ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，２００２、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｉｎｆｏｒｍａ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，２００６を参照のこと。好ましい方法には、そこに記載されている押出法、ホモジナイゼーション法、及び超音波処理法が含まれる。本発明に使用するリポソームを調製するための例示的な方法は、脂質混合物を乾燥させた後、水性媒体中での水和及び超音波処理を実施して、リポソームを形成することを含み、ＷＯ２０１０／１０４８３３に記載されている。
【０１０７】
ある実施形態において、リポソームは、特定の平均サイズの範囲内になるように提供される。リポソームのサイズは、例えば、予め選択された細孔径を有する膜からリポソームを含む水性媒体を押し出し、膜を通過する材料を収集することによって選択することができる。好ましい実施形態において、実質的に直径が５０〜５００ｎｍ、より好ましくは実質的に直径が５０〜２００ｎｍ、最も好ましくは実質的に直径が５０〜１５０ｎｍになるようにリポソームを選択する。本明細書でこの文脈で使用される「実質的に」という用語は、リポソームの少なくとも７５％、より好ましくは８０％、最も好ましくは少なくとも９０％が指定された範囲内になることを意味する。
【０１０８】
本発明に使用し得る他の脂質及び脂質様アジュバントには、水中油型（ｏ／ｗ）乳剤（例えば、Ｍｕｄｅｒｈｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．８８：１３３２−９，１９９９）を参照のこと）、ＶｅｓｉＶａｘ（登録商標）ＴＬＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ジギトニン（例えば、米国特許第５，６９８，４３２号を参照のこと）、及びグルコピラノシル脂質（例えば、米国特許出願公開第２０１００３１０６０２号を参照のこと）が含まれる。
【０１０９】
ナノ粒子はまた、ほとんどの経口経路に適している薬物送達系を表す。長年にわたって、様々な自然及び合成ポリマーが、ナノ粒子の調製において探索されており、その中で、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、及びそれらのコポリマー（ＰＬＧＡ）は、それらの成体適合性及び生分解性から、広範囲にわたって調査されてきた。ナノ粒子及び他のナノ担体は、いくつかの種類の薬剤、例えば、抗癌剤、抗高血圧剤、免疫賦活剤、及びホルモン、ならびに巨大分子、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、及び抗体に対する潜在的作用として作用する。例えば、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．２１：３８７−４２２，２００４、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １：２２−３０，２００５を参照のこと。
【０１１０】
化学療法剤
【０１１１】
さらなる実施形態において、本方法は、対象に、追加の治療として有効量の１つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む。ある実施形態において、１つ以上の化学療法剤は、酢酸アビラテロン、アルトレタミン、アンヒドロビンンブラスチン、アウリスタチン、ベキサロテン、ビカルタミド、ＢＭＳ  １８４４７６、２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−（３−フルオロ−４−メトキシフェニル）ベンゼンスルホンアミド、ブレオマイシン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−プロリ−１−Ｌプロリン−ｔ−ブチルアミド、カケクチン、セマドチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、３’，４’−ジデヒドロ−４’−デオキシ−８’−ノルビン−カロイコブラスチン、ドセタキソル、ドキセタキセル、シクロホスファミド、カルボプラチン、カルムスチン、シスプラチン、クリプトフィシン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン  ドラスタチン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、エトポシド、５−フルオロウラシル、フィナステリド、フルタミド、ヒドロキシウレア及びヒドロキシウレアタキサン、イホスファミド、リアロゾール、ロニダミン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ＭＤＶ３１００、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、イセチオン酸ミボブリン、リゾキシン、セルテネフ、ストレプトゾシン、マイトマイシン、メトトレキサート、タキサン、ニルタミド、オナプリストン、パクリタキセル、プレドニムスチン、プロカルバジン、ＲＰＲ１０９８８１、リン酸ストラムスチン、タモキシフェン、タソネルミン、タキソール、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、ならびにビンフルニンから選択される。
【０１１２】
免疫調節細胞株
【０１１３】
「不活性化腫瘍細胞」とは、細胞分裂を防ぐように処理されている腫瘍細胞（患者への「自己」または「同種」のいずれか）を意味する。本発明の目的のために、そのような細胞は、それらの免疫原性及びそれらの代謝活性を維持させる。癌治療の一部として、そのような腫瘍細胞は、患者内で発現される導入遺伝子を発現するように遺伝的に改変される。したがって、本発明の組成物またはワクチンは、治療を受けている患者に対して自己または同種である新生（例えば、腫瘍）細胞を含み、最も好ましくは患者を冒している腫瘍細胞と同じ一般型の腫瘍細胞である。例えば、黒色腫に罹患している患者には、一般的に、黒色腫由来の遺伝的に改変された細胞を投与するであろう。本発明に使用する腫瘍細胞を不活性化する方法、例えば、放射線照射の使用等は、当該技術分野で周知である。
【０１１４】
本発明の不活性化腫瘍細胞は、１つ以上の共刺激分子または共刺激薬剤とともに患者に投与する。好ましい共刺激薬剤は、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを含む。そのような共刺激薬剤を評価するための方法は、文献において周知である。ＤＣの誘導及び成熟は、一般に、刺激後のＣＤ８０及びＣＤ８６等の特定の膜分子の発現増加、ならびに／またはＩＬ−１２及びＩ型インターフェロン等の炎症性サイトカインの分泌によって評価される。
【０１１５】
好ましい実施形態において、不活性化腫瘍細胞自体は、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを発現及び分泌するように改変される。本発明は、例示的な意味でＧＭ−ＣＳＦの使用に関して記載されている。したがって、例として、腫瘍細胞は、米国特許第５，６３７，４８３号、同第５，９０４，９２０号、同第６，２７７，３６８号、同第６，３５０，４４５号、ならびに米国特許出願公開第２０１００１５０９４６号（これらの各々は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）において記載されるように、ＧＭ−ＣＳＦをコードする導入遺伝子を発現し得る。膵臓癌の治療のためのＧＭ−ＣＳＦを発現する遺伝的に改変される癌細胞または「サイトカインを発現する細胞ワクチン」が、米国特許第６，０３３，６７４号及び同第５，９８５，２９０号に記載されており、これらの両方が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１１６】
そのような不活性化腫瘍細胞及び／またはバイスタンダー細胞によってＧＭ−ＣＳＦの代わりにまたはそれとともに発現され得る他の適切なサイトカインには、ＣＤ４０リガンド、ＩＬ−１２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２０、及びＣＣＬ２１のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。この一覧は、限定するようには意図されていない。
【０１１７】
対象に投与する不活性化腫瘍細胞が１つ以上の目的とするサイトカインを発現するのが好ましいが、腫瘍細胞株は、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを発現及び分泌する不活性化バイスタンダー細胞株が伴ってもよい。バイスタンダー細胞株は、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激するサイトカインをすべて供給するものであっても、あるいは不活性化腫瘍細胞によって発現及び分泌される、樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激するサイトカインを補うものであってもよい。例として、免疫調節サイトカインを発現するバイスタンダー細胞株は、米国特許第６，４６４，９７３号及び同第８，０１２，４６９号、Ｄｅｓｓｕｒｅａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１４：８６９−８４，２００７、及びＥａｇｅｒ  ａｎｄ  Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：１８−２７，２００５において記載されており、これらの各々は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【０１１８】
「顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）ポリペプチド」とは、免疫調節活性を有し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５２１２２．１と少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有するサイトカインまたはその断片を意味する。
【０１１９】
ワクチン
【０１２０】
ある実施形態において、ＣＤＮ組成物は、１つ以上の所定の抗原への免疫応答を刺激することを目的としている１つ以上のワクチンと併せて投与される。本発明での使用を見出し得る標的抗原の例を以下の表に列挙する。標的抗原はまた、表に列挙される抗原の免疫学的に活性な部分を含む断片または縮合ポリペプチドであり得る。この一覧は、限定するようには意図されていない。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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好適な抗原が当該技術分野で公知である他の有機体には、クラミジアトラコマチス、化膿連鎖球菌（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコッカスアガラクチア（Ｂ群連鎖球菌）、肺炎連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌、インフルエンザ菌、髄膜炎菌、淋菌、コレラ菌、サルモネラ種（チフス菌、ネズミチフス菌を含む）、エンテリカ（ヘリコバクターピロリ  赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、及び他のＤ群赤痢菌種を含む）、鼻疽菌、類鼻疽菌、肺炎かん菌、クロストリジウム種（クロストリジウムディフィシルを含む）、腸炎ビブリオ、及びビブリオバルニフィカスが含まれるが、これらに限定されない。この一覧は、限定するようには意図されていない。
【０１２１】
薬学的組成物
【０１２２】
本明細書で使用される「薬学的」という用語は、疾患の治癒、治療、または予防に使用することを目的とし、処方または市販の製剤として米国食品医薬品局（または米国以外のこれに相当する機関）による承認手続きを必要とする化学物質を指す。そのような組成物の製剤化及び投与の技術に関する詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）及びＮｉｅｌｌｏｕｄ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉ−Ｍｅｓｔｒｅｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ：２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に見出され得る。
【０１２３】
本開示の目的のために、薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、アジュバント、及びビヒクルを含有する製剤において、経口、非経口、吸入スプレーによる、局所的、または直腸内を含む様々な手段によって投与され得る。ここで使用される非経口という用語には、様々な注入技術による皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、真皮内、髄腔内、及び硬膜外注射が含まれる。本明細書で使用される動脈内及び静脈内注射には、カテーテルを介した投与が含まれる。また、冠動脈ステント及び冠動脈リザーバーを介した投与も企図される。本発明の化合物の腫瘍内投与は、局所的に浸潤するＤＣを直接活性化し得る、腫瘍細胞のアポトーシスを直接促進し得るか、または細胞毒性剤への腫瘍細胞を感作させ得る。本明細書で使用される経口という用語には、経口摂取、または舌下もしくは口腔経路による送達が含まれる。経口投与には、液体飲料、エネルギーバー、及び丸剤が含まれる。
【０１２４】
薬学的組成物は、目的とする投与方法に適した任意の形態であり得る。経口使用に用いる場合、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性散剤もしくは顆粒剤、乳剤、硬もしくは軟カプセル剤、シロップ剤、またはエリキシル剤が調製され得る。経口使用を目的とする組成物は、薬学的組成物の製造のための当該技術分野で公知の任意の方法に従って調製され得、そのような組成物は、味の良い調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、及び保存剤を含む１つ以上の薬剤を含有し得る。錠剤の製造に適している非毒性の薬学的に許容される賦形剤と混合した薬物化合物を含有する錠剤が許容される。これらの賦形剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウム等の不活性希釈剤；トウモロコシデンプンまたはアルギン酸等の造粒剤及び崩壊剤；デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム等の結合剤；及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の滑沢剤であり得る。錠剤は、コーティングしなくてもよく、または消化管での崩壊及び吸収を遅延させ、かつ／または長期間にわたって持続作用を提供する腸溶性コーティング、結腸溶性コーティング、またはマイクロカプセル化を含む既知の技術によってコーティングしてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリル等の時間遅延物質を単独でまたはロウとともに使用し得る。
【０１２５】
経口使用のための製剤はまた、薬物化合物を不活性固体希釈剤、例えば、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合した硬ゼラチンカプセル剤、あるいは有効成分を水またはラッカセイ油、流動パラフィン、もしくはオリーブ油等の油性媒体と混合した軟ゼラチンカプセル剤として提供してもよい。
【０１２６】
薬学的組成物を水性懸濁液の製造に適している賦形剤と混合した水性懸濁液として製剤化してもよい。そのような賦形剤には、懸濁液、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルプロリドン、トラガントゴム、及びアラビアゴム、ならびに分散剤または湿潤剤、例えば、天然に存在するリン脂質（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート）が含まれる。水性懸濁液はまた、ｐ−ヒドロキシ−安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ−安息香酸ｎ−プロピル等の１つ以上の保存剤、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、及び１つ以上の甘味剤、例えば、スクロースまたはサッカリンも含有し得る。
【０１２７】
油性懸濁液は、有効成分をラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、もしくはヤシ油等の植物油または流動パラフィン等の鉱油に懸濁させることによって製剤化され得る。経口懸濁液は、蜜ロウ、固形パラフィン、またはセチルアルコール等の増粘剤を含有し得る。上に記載したような甘味剤及び香味剤は、味の良い経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を添加することによって保存され得る。
【０１２８】
水の添加による水性懸濁液の調製に適している本開示の分散性散剤及び顆粒剤は、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤、及び１つ以上の保存剤と混合して有効成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤は、上に開示したものによって例示されている。さらなる賦形剤、例えば、甘味剤、香味剤、及び着色剤も存在し得る。
【０１２９】
本開示の薬学的組成物はまた、水中油型乳剤であってもよい。油相は、オリーブ油またはラッカセイ油等の植物油、流動パラフィン等の鉱油、またはその混合物であり得る。適切な乳化剤には、アラビアゴム及びトラガントゴム等の天然に存在するゴム、ダイズレシチン等の天然に存在するリン脂質、脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導されるソルビタンモノオレアート等のエステルまたは部分エステル、ならびにこれらの部分エステルとエチレンオキシドとの縮合物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート等が含まれる。乳化剤はまた、甘味剤及び香味剤も含有し得る。
【０１３０】
グリセロール、ソルビトール、またはスクロース等の甘味剤とともにシロップ剤及びエリキシル剤を製剤化してもよい。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、香味剤、または着色剤も含有し得る。
【０１３１】
本開示の薬学的組成物は、無菌注射用水性懸濁液または油性懸濁液等の無菌注射用調製物の形態であってもよい。この懸濁液は、既知の技術に従って、上に言及された適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁化剤を用いて製剤化され得る。無菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒の無菌注射用溶液または懸濁液、例えば、１，３−ブタン−ジオールの溶液であってもよく、または凍結乾燥粉末として調製してもよい。使用し得る許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンガー溶液、及び等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌固定油を従来通りに溶媒または懸濁媒として使用し得る。この目的のため、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性の固定油を使用し得る。さらに、オレイン酸等の脂肪酸も同様に、注射用液の調製に使用し得る。
【０１３２】
担体物質と組みわせて単一剤形を作製し得る有効成分の量は、治療する宿主及び具体的な投与形式によって異なる。例えば、ヒトへの経口投与を目的とする持続放出製剤は、全組成物の約５〜約９５％で変化し得る適切かつ好都合な量の担体物質と組み合わせた約２０〜５００ｍｇの活性物質を含有し得る。投与のために容易に測定できる量を提供する薬学的組成物を調製することが好ましい。一般に、全身投与される有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇであり、例えば、対象（例えば、ヒト等の哺乳動物）の年齢及び体重、治療が必要な正確な状態及びその重症度、投与経路を含む多数の因子によって異なり、最終的には担当医または獣医の判断により決定される。しかしながら、任意の特定の患者に対する具体的な投与レベルは、当業者に十分理解される通り、使用する具体的な化合物の活性、治療する個体の年齢、体重、全般的健康状態、性別、及び食事、投与時間及び経路、排泄速度、これまでに投与した他の薬物、ならびに治療を受ける具体的な状態の重症度を含む様々な因子によって決まることが理解されよう。
【０１３３】
上述の通り、経口投与に適している本開示の製剤は、それぞれが所定量の有効成分を粉末もしくは顆粒剤として、水性もしくは非水性液体の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型乳液もしくは油中水型乳液として含有するカプセル剤、カシェ剤、または錠剤等の個別の単位として提供することができる。薬学的組成物はまた、ボーラス、舐剤、またはペースト剤としても投与され得る。
【０１３４】
錠剤は、任意に、１つ以上の補助成分とともに、圧縮または成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械で有効成分を、任意に、結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルエチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）界面活性剤または分散剤と混合した粉末または顆粒剤等の自由流動性の形成に圧縮することによって調製され得る。成形錠剤は、適切な機械で、不活性液体希釈剤で湿潤させた粉末化合物の混合物を用いて作製され得る。錠剤は、任意に、コーティングまたは刻み目を施してもよく、また錠剤中の有効成分の緩徐な放出または制御された放出がもたらされるように、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロースを所望の放出プロファイルが得られる様々な割合で用いて製剤化してもよい。錠剤は、任意に、胃以外の消化管の部分で放出がもたらされるように、腸溶性または直腸溶性コーティングを施してもよい。これは、特に、式１の化合物が酸加水分解を受けやすい場合、この化合物に有利である。
【０１３５】
口腔内への局所投与に適している製剤には、風味付けされた基剤、通常は、スクロース及びアラビアゴムまたはトラガント中に有効成分を含むトローチ剤；ゼラチンとグリセリンまたはスクロースとアラビアゴム等の不活性な基剤中に有効成分を含む芳香錠；及び適切な液体担体中に有効成分を含む口腔洗浄剤が含まれる。
【０１３６】
直腸投与用の製剤は、例えば、カカオ脂またはサリチル酸塩を含む適切な基剤を用いた坐剤として提供され得る。
【０１３７】
膣内投与に適している製剤は、有効成分に加えて当該技術分野で適切であることが知られている担体等を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡状剤、またはスプレー製剤として提供され得る。
【０１３８】
非経口投与に適している製剤は、抗酸化剤、緩衡剤、静菌剤、及び製剤を目的とする受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性等張無菌注射溶液、ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性また非水性無菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量または複数用量の密閉容器、例えば、アンプル及びバイアル中に提供され得、仕様直前に無菌液体担体、例えば、注射用水の添加のみが必要なフリーズドライの（凍結乾燥した）状態で保管することができる。注射溶液及び懸濁液は、既に記載されているような無菌の粉末剤、顆粒剤、及び錠剤から調製され得る。
【０１３９】
本明細書で使用される薬学的に許容される塩としては、酢酸塩、ピリジン、アンモニウム、ピペラジン、ニコチンアミド、ギ酸塩、尿素、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、リチウム、桂皮塩、メチルアミノ、メタンスルホン酸塩、ピクリン酸、酒石酸、トリエチルアミノ、ジメチルアミノ、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる薬学的に許容される塩は、当業者に公知である。
【０１４０】
特定の患者に対する有効量は、治療する状態、患者の全般的な健康状態、投与経路及び投与用量ならびに副作用の程度等の因子によって異なり得る。治療及び診断方法の指針が利用可能である（例えば、Ｍａｙｎａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ；Ｄｅｎｔ（２００１）Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫを参照のこと）。
【０１４１】
有効量は、１回の投与で投与され得るが、１回の投与に限定されない。したがって、投与は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回またはそれ以上の薬学的組成物の投与であり得る。本発明の方法で薬学的組成物を２回以上投与する場合、投与に１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分またはそれ以上の時間間隔、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間等の間隔を空け得る。時間数という文脈では、「約」という用語は、プラスマイナス３０分以内の任意の時間間隔を意味する。投与はまた、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、及びその組み合わせの時間間隔を空け得る。本発明は、等しい時間を空ける投与間隔に限定されるのではなく、等しくない間隔での投与を包含する。
【０１４２】
例えば、１回／週、２回／週、３回／週、４回／週、５回／週、６回／週、７回／週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎のような投与スケジュールを本発明に用いることができる。投与スケジュールは、例えば、合計１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、７か月、８か月、９か月、１０か月、１１か月、及び１２か月の期間にわたる投与を包含する。
【０１４３】
上記の投与スケジュールの周期が提供される。周期は、例えば、約７日毎、１４日毎、２１日毎、２８日毎、３５日毎、４２日毎、４９日毎、５６日毎、６３日毎、７０日毎等で反復され得る。周期の間に無投与期間を設けてもよく、その期間は、例えば、約７日、１４日、２１日、２８日、３５日、４２日、４９日、５６日、６３日、７０日等であり得る。この関連では、「約」という用語は、プラスマイナス１日、プラスマイナス２日、プラスマイナス３日、プラスマイナス４日、プラスマイナス５日、プラスマイナス６日、またはプラスマイナス７日を意味する。
【０１４４】
追加の治療剤との共投与の方法は、当該技術分野で周知である（Ｈａｒｄｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ  ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、Ｐｏｏｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ、Ｃｈａｂｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｏｎｇｏ（ｅｄｓ．）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａ．，ＰＡ）。
【０１４５】
上述の通り、本発明の組成物は、非経口または経腸送達用の薬学的組成物として製剤化するのが好ましい。動物に投与するための一般的な薬学的組成物は、水溶液等の薬学的に許容されるビヒクル、塩、保存剤、緩衝剤等を含む非毒性賦形剤を含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｅａｓｔｏｎ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ｐｐ１４０５−１４１２  ａｎｄ  １４６１−１４８７（１９７５）、Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ  ＸＩＶ，１４ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９７５）を参照のこと。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、及びオレイン酸エチル等の注射用有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、生理食塩水、非経口ビヒクル、例えば塩化ナトリウム、リンゲルブドウ糖等が含まれる。静脈内ビヒクルには、流動性付与剤及び栄養補充液が含まれる。保存剤は、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスを含む。薬学的組成物のｐＨ及び様々な成分の正確な濃度は、当該技術分野のルーチンの技術に従って調整する。
【０１４６】
特定のワクチンの反復投与（同種追加免疫）には、体液性応答を強化する効果があることが証明されている。そのようなアプローチは、ベクターに対する事前の免疫が堅固な抗原提示及び適切な炎症性シグナルの発生を損なうことがあるため、細胞性免疫を強化するのに効果的ではない場合がある。この問題を回避する１つのアプローチが、異なる抗原送達システム（異種追加免疫）を用いるワクチンの連続投与である。異種追加免疫レジメンでは、少なくとも１回の初回免疫または追加免疫の送達は、本明細書に記載される不活性化腫瘍細胞／環状プリンジヌクレオチド組成物の送達を含む。このレジメンの異種部門は、以下の戦略のうちの１つ以上を用いる抗原の送達を含み得る：
目的とする抗原を含み、何らかの変性条件で処理して病原性の侵入力を備えるのに無効または非効率的にされた粒子の不活性化または弱毒化細菌またはウイルス；
一般に、病原体もしくは病原体を含む組織試料またはその組換え型の細胞培養から精製された天然に産生される抗原である精製抗原；
対象の宿主細胞で抗原を発現及び／または分泌するように組換え操作された生ウイルスまたは細菌送達ベクター。これらの戦略は、ウイルスまたは細菌ベクターを非病原性及び非毒性に弱毒化する（例えば、遺伝子工学により）依存するものである。
抗原を負荷した細胞または抗原をコードする核酸を含む組成物をトランスフェクトした細胞を含む、樹状細胞（ＤＣ）ベクター（例えば、去勢抵抗性転移性前立腺癌の治療のためのＰｒｏｖｅｎｇｅ（登録商標）（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベクター；
リポソーム抗原送達ビヒクル；ならびに
遺伝子銃、エレクトロポレーション、細菌ゴースト、マイクロスフェア、微粒子、リポソーム、ポリカチオンナノ粒子等により投与され得る裸のＤＮＡ及び裸のＲＮＡベクター。
【０１４７】
初回免疫ワクチン及び追加免疫ワクチンは、以下の経路のいずれか１つまたはその組み合わせによって投与することができる。一態様において、初回免疫ワクチン及び追加免疫ワクチンは、同じ経路によって投与される。別の態様において、初回免疫ワクチン及び追加免疫ワクチンは、異なる経路によって投与される。「異なる経路」という用語は、体の異なる部位、例えば、口腔、非口腔、腸内、非経口、直腸、節間（リンパ節）、静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、腫瘍内、腫瘍周辺、腫瘍内、点滴、粘膜、鼻腔、脳脊髄腔または脳脊髄液等、ならびに異なる様式によって、例えば、経口、静脈内、及び筋肉内が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４８】
有効量の初回免疫ワクチンまたは追加免疫ワクチンは、一用量で与えられてもよいが、一用量に限定されない。したがって、投与は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のワクチン投与であり得る。ワクチンを複数回投与する場合、投与は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分またはそれ以上の時間間隔を空けて、約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間等の間隔を空けることができる。時間の関連で、「約」という用語は、任意の時間間隔±３０分以内を意味する。投与はまた、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、及びその組み合わせの時間間隔で空けることも可能である。本発明は、時間を均等に空ける投与間隔に限定されるものではなく、非限定例だけを示すと、１日目、４日目、７日目、及び２５日目での投与からなる初回スケジュール等の非等間隔での投与を包含する。
【実施例】
【０１４９】
以下の実施例は、本発明を説明する役割を果たすものである。これらの実施例は、本発明の範囲を限定することを一切意図するものではない。
【０１５０】
実施例１．一般的方法
【０１５１】
オリゴヌクレオチドの溶液相合成に適している無水溶媒及び試薬が購入され、無水技術を用いて乾燥アルゴンまたは窒素下で処理された。乾燥アルゴンまたは窒素下で無水アセトニトリルまたはピリジン中でアミダイトカップリング反応及び環化が行われた。乾燥ピリジン中のすべての反応に対する出発材料を、ピリジンからの濃縮（３回）によって乾燥させた。ジクロロメタン中のメタノールの勾配を用い、Ｆｌｕｋａ  ６０Ａ高精製グレードまたはＭｅｒｃｋ  Ｇｒａｄｅ  ９３８５シリカを用いて、分取シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを行った。Ｖａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  １０ミクロンＣ１８  ２５０×４．６ｍｍまたはＶａｒｉａｎ  ３ミクロンＣ１８  １００×４．６ｍｍカラムのいずれかならびに１０ｍＭのＴＥＡＡ及びアセトニトリルの勾配を用いて２５４ｎｍでモニタリングするＰｒｏＳｔａｒ  ３３０フォトダイオードアレイ検出器を用いたＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ２１０  ＨＰＬＣシステムにおいて分析ＨＰＬＣを行った。ＳＰＤ−２０Ａ  ５０ｍｌ／分の流量で１０ｍＭのＴＥＡＡ及びアセトニトリルの勾配を用いたＶａｒｉａｎ  Ｍｉｃｒｏｓｏｒｂ  ６０−８  Ｃ−１８  ４１．６×２５０ｍｍカラムにおいて、２５４ｎｍでモニタリングするＵＶ／Ｖｉｓ検出器を装備したＳｈｉｍａｄｚｕ分取ＬＣ２０−ＡＰ  ＨＰＬＣシステムにおいて分取ＨＰＬＣを行った。３％（ｗｔ／ｗｔ）の負荷でＣ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて固相抽出を行った。Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ２０Ｄ分析ＨＰＬＣを用いて、ＰＤＡ、ＭＳ、及びＥＬＳＤの検出によるシングル四重極型Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ２０１０ＥＶ装置においてＬＣ／ＭＳ（ＥＳＩ／ＡＰＣＩ）を得た。Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）のＷＭ  Ｋｅｃｋ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ及びＵＣ  ＢｅｒｋｅｌｅｙのＱＢ３／Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔ  Ｌａｂの両方から高解像度ＦＴ−ＩＣＲの質量スペクトルを得た。
【０１５２】
１Ｈに対して５００ＭＨｚ及び３１Ｐに対して２０２ＭＨｚで行われるＶａｒｉａｎ  ＩＮＯＶＡ−５００  ＮＭＲスペクトロメーターにおいて、４５℃で１０ｕＬのＤ２Ｏ（Ｄ２Ｏ添加後、１６時間の遅延）を用いたｄ６−ＤＭＳＯ中に、１Ｈ、３１Ｐ、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（２Ｄ  ＮＭＲ相関分光法）、１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ（異核多重結合相関分光法）スペクトルを得た。得られたＦＩＤをＰＣに移し、Ａｃｏｒｎ  ＮＭＲ  Ｉｎｃ．からのＮＵＴＳ  ＮＭＲ処理相とウェアを用いて処理した。化学シフトは、１Ｈに対しては、ＤＭＳＯ溶媒、２．５０ｐｐｍを参照された。ＮＭＲスペクトルの参照に対するＩＵＰＡＣ推奨によって、３１Ｐの化学シフトは、０ｐｐｍの絶対値の１Ｈ周波数に対して「統一スケール」を用いて参照された。１Ｈに対しては４００ＭＨｚで、３１Ｐに対しては１６２ＭＨｚで行われるＪＥＯＬ  ＥＣＸ−４００  ＮＭＲスペクトロメーターにおいて、１Ｈ及び３１Ｐスペクトルのいくつかを得た。
【０１５３】
直接次元では２０４８データ点、間接次元では２５６の時点を用いて絶対値モードにおいて、勾配ＣＯＳＹスペクトルを得た。正弦ベル平方関数を用いて、両方の次元をアポタイズした。直接次元は、ゼロを入れて、両方の次元については、２０４８×２０４８ポイントの最終マトリクスサイズ及び３．９１Ｈｚの解像度／データ点を得た。
【０１５４】
ホスホジエステル結合での位置化学の割り当て：１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣと組み合わせた１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ（及び場合によっては、リンの脱カップリング）実験は、ホスホジエステル結合の位置化学が２’，５’−３’，５’であることを直接証明するために使用された（９ａ及び図３Ａ〜Ｇにおける実験の考察を参照のこと）。同様の１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ実験は、最終シリル脱保護またはイオン交換後、すべての合成した環状ジヌクレオチドのホスホジエステル結合で非標準的な位置化学（２’，５’−３’，５’）を確認した。
【０１５５】
ＲＲ−及びＲＳ−ジアステレオマー（合成配列の主なＣＤＮ生成物）の割り当ては、文献の方法（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ２８９：３５２−３７８，２００９）に従った。
【０１５６】
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ分析（２５４ｎｍで紫外線検出）によって示されるように、すべてのＣＤＮ生成物（図２Ａ〜２Ｃ）は、９５％以上の純度であった。
【０１５７】
略語及び頭字語：グアニン＝Ｇ。イソブチリルグアニン＝Ｇｉｂ。４，４−ジメトキシトリチル＝ＤＭＴ。ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ＝ＣＥＯ。ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル＝ＴＢＳ。アデニン＝Ａ。ベンゾイルアデニン＝ＡＢｚ。環状−［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＣＤＡ＝１９ａ（ＴＥＡ塩）。ジチオ−［ＲＰ，ＲＰ］−環状−［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡ＝１９ｂ（ＴＥＡ塩）；２１（ナトリウム塩）；２２（アンモニウム塩）。ジチオ−［ＲＰ，ＳＰ］−環状−［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＲＳ−ＣＤＡ＝１９ｃ（ＴＥＡ塩）。環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＣＤＧ＝９ａ（ＴＥＡ塩）。ジチオ−［ＲＰ，ＲＰ］−環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＧ＝９ｂ（ＴＥＡ塩）。ジチオ−［ＲＰ，ＳＰ］−環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＲＳ−ＣＤＧ＝９ｃ（ＴＥＡ塩）。環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ｃＧＡＭＰ。ジチオ−［ＲＰ，ＲＰ］−環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］＝ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰ＝２０（ＴＥＡ塩）。モノチオ−環状−［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）Ｒｐ］＝ＭＬ−３’，５’−Ｒ−ＣＤＡ＝１９ｄ（ＴＥＡ塩）。２’−Ｏ−ミリストイル−環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］＝Ｃ１４−ＭＬ−ＣＤＧ＝１０（ＴＥＡ塩）。ＭＬ−ｃＧＡＭＰ＝２’，３’−ｃＧＡＭＰ＝環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］＝２３（ＴＥＡ塩）
【０１５８】
ＭＬ−ｃＧＡＭＰ（図２ｃ中構造２３）は、細胞ｃＧＡＳから酵素的に調製され、分取ＨＰＬＣによって精製された。
【０１５９】
実施例２．ＭＬ−ＣＤＧシリーズに対する一般的実験（図２ａ）：環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］９ａの合成。
【０１６０】
１）３の調製。２５ｍｌのアセトニトリル中４．８７ｇ（５．０ｍｍｏｌ）のＮ２−イソブチリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノフィニル］グアノシン（１）の溶液に、０．１８ｍｌ（１０ｍｍｏｌｅ）の水及び１．２３ｇ（６ｍｍｏｌｅ）のピリジウムトリフルオロアセタートを添加した。室温で５分間撹拌した後、２５ｍｌのｔ−ブチルアミンを添加し、反応物を室温で１５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、発泡体として２を得、次いで、アセトニトリル（２×５０ｍｌ）で同時蒸発させた。６０ｍｌのジクロロメタン中の２の溶液に、０．９ｍｌ（５０ｍｍｏｌｅ）の水及びジクロロメタン（４４ｍｍｏｌ）中の６０ｍｌの６％（ｖ／ｖ）ジクロロ酢酸を添加した。室温で１０分後、この反応物をピリジン（７．０ｍｌ、８７ｍｍｏｌ）の添加によって反応停止処理した。反応混合物を油になるまで濃縮し、４０ｍｌの無水アセトニトリルで３回同時蒸発させることによって乾燥させ、最後に、１２ｍｌの体積で３を得た。
【０１６１】
２）４の乾燥溶液の調製。Ｎ２−イソブチリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノフィニル］グアノシン（４、６．３３ｇ、６．５ｍｍｏｌｅ）を、４０ｍｌの無水アセトニトリル中に溶解し、４０ｍｌの無水アセトニトリルで３回同時蒸発させることによって乾燥させ、最後に２０ｍｌを得た。１０の３Å分子篩を添加し、溶液を使用するまでアルゴン下で保存した。
【０１６２】
３）酸化及び脱トリチル化後に２’，５’直鎖ダイマー６ａを得るための３及び４のカップリング。２０ｍｌのアセトニトリル中の共沸乾燥させた４（６．５ｍｍｏｌｅ）を、シリンジを介して３（５．０ｍｍｏｌｅ）に添加した。室温で５分間撹拌した後、デカン中の２．３７ｍｌ（１５ｍｍｏｌｅ）の５．５Ｍ  ｔ−ブチルヒドロペルオキシドを添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。次いで、反応物を０℃に冷却し、２．５ｍｌの水中で１．２５ｇのＮａＨＳＯ３を添加し、氷槽を取り外し、反応物を５分間撹拌した。反応物を発泡体になるまで濃縮し、８０ｍｌのジクロロメタン中に取り込んだ。ジクロロメタン中で０．９ｍｌの水及び８０ｍｌの６％（ｖ／ｖ）のジクロロ酢酸を添加し、反応物を室温で１０分間撹拌した。５０ｍｌのピリジンを添加して、ジクロロ酢酸を反応停止処理した。溶媒を減圧下で除去して、固体として粗６ａを得た。
【０１６３】
４）７ａを得るための６ａの環化。６ａを５０ｍｌの乾燥ピリジン中に溶解し、５ｍｌ（全反応の１／１０ｔｈ、約０．５ｍｍｏｌｅ）を、シリンジを介して１５０ｍｌの乾燥ピリジンに移した。これを約１００ｍｌの体積になるまで濃縮した。次いで、２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−２−オキシド（ＤＭＯＣＰ、０．３５ｇ、１．８ｍｍｏｌｅ）を添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。０．３２ｍｌの水を添加し、その直後に０．１６ｇのヨウ素を添加し、反応物を室温で５分間撹拌した。次いで、反応混合物を０．１ｇのＮａＨＳＯ３を含有する３５０ｍｌの水に注ぎ入れ、室温で５分間撹拌した。２ｇのＮａＨＣＯ３を撹拌しながらゆっくり添加し、次いで、分液漏斗中に注ぎ入れ、４００ｍｌの１：１  酢酸エチル：ジエチルエーテルで抽出した。水層を、４００ｍｌの１：１  酢酸エチル：ジエチルエーテルで再抽出し、有機層を合わせて、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、０．７５ｇの、７ａを含有する混合物である完全保護された環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］を得た。
【０１６４】
５）粗８ａを得るためのメチルアミンを用いた粗７ａの脱保護。７５０ｍｇの７ａに、無水エタノール（３３重量％）中で１８ｍｌのメチルアミンを９０分間撹拌し、この時点でＨＰＬＣによる分析は反応が完了したことを示した。反応混合物を濃縮して、油を得、１０ｍｌのヘキサン／酢酸エチル（５０：５０）による処理後、オフホワイト色の固体を得た。粉砕／洗浄溶媒をデカントし、残留溶媒を減圧下で除去して、２４０ｍｇのオフホワイト色の固体を得た。
【０１６５】
６）粗８ａの分取ＨＰＬＣ。粗８ａの１２０ｍｇの分量を５ｍｌのＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（２０／８０）中に取り込んだ。０．４５ミクロンのＰＴＦＥ濾過後、注射サンプルをＣ−１８  Ｄｙｎａｍａｘカラム（４０×２５０ｍｍ）に適用した。アセトニトリル及び１０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液の勾配で溶出を行った（５０ｍｌ／分の流量で２０分間にわたって２０％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ）。純粋な８ａを含有する２つのＨＰＬＣ実行からのＨＰＬＣ画分をプールし、蒸発させ、ＣＨ３ＣＮを除去し、凍結乾燥させて、残りの水及び揮発性緩衝液のほとんどを除去して、アセトニトリル（３×４ｍｌ）で共沸乾燥させた後、ビス−トリエチルアンモニウム塩として４２ｍｇの純粋な８ａを得た（最終ステップ後まで分取ＨＰＬＣ精製を延期することも可能である）。Ｃ３２Ｈ５１Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２Ｓｉ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ：［Ｍ−Ｈ］−の計算値９１７．２６０６；実測値９１７．２６２２。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＋微量Ｄ２Ｏ）４５℃  δ８．２２（１Ｈ，ｓ），７．８５（１Ｈ，ｓ），５．７６−５．７９（２Ｈ，ｄｄ），５．２１（１Ｈ，ｍ），４．８５（１Ｈ，ｍ），４．５８（１Ｈ，ｔ），４．４９（１Ｈ，ｄ），４．３１（１Ｈ，ｍ），４．２１（１Ｈ，ｍ），３．９７（１Ｈ，ｄ），３．８３（３Ｈ，ｍ），２．９４（１２Ｈ，ｍ），１．１２（１８Ｈ，ｔ），０．９０（９Ｈ，ｓ），０．７２（９Ｈ，ｓ），０．１４（６Ｈ，ｄ），０．０９（３Ｈ，ｓ），−０．０２（３Ｈ，ｓ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＋微量Ｄ２Ｏ）４５℃。δ−１．２６，−２．０２（図３ａ〜３ｃ）。
【０１６６】
７）トリエチルアミントリヒドロフルオリドを用いた８ａのＴＢＳ基の脱保護、ＴＥＡＢを用いた中和反応、ビス−トリエチルアンモニウム塩として純粋な９ａを得るためのＣ−ｌ８  Ｓｅｐ−Ｐａｋを用いた固相抽出。４０ｍｇの８ａに、１．０ｍｌのトリエチルアミントリヒドロフルオリドを添加した。混合物を室温で３０時間撹拌した。分析ＨＰＬＣによって反応の完了を確認した後、サンプルを、１２ｍｌの冷却した１Ｍ  トリエチルアンモニウム重炭酸塩中への滴加によって中和した。中和した溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｃ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ上で脱塩し、生成物をＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（１：１）で溶出した。ＣＨ３ＣＮを減圧下で蒸発させ、残りの水溶液を冷凍し、一晩凍結乾燥させた。メタノール（３×３ｍｌ）からの複数回の蒸発及びメタノール（１×３ｍｌ）中の５０％アセトニトリルからの最終の蒸発により、ビス−トリエチルアンモニウム塩として２９．３ｍｇの環状−［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（９ａ）を得た。Ｃ２０Ｈ２３Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ：［Ｍ−Ｈ］−の計算値６８９．０８７６；実測値６８９．０８７４。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６＋微量Ｄ２Ｏ）４５℃  δ７．９２（１Ｈ，ｓ），７．９０（１Ｈ，ｓ），５．８２（１Ｈ，ｄ），５．８０（１Ｈ，ｄ），４．９７（１Ｈ，ｍ），４．８５（１Ｈ，ｍ），４．６８（１Ｈ，ｍ），４．３１（１Ｈ，ｄ），４．２１（１Ｈ，ｔ），４．１０（２Ｈ，ｍ），３．７９（３Ｈ，ｍ），２．９１（１４Ｈ，ｍ），１．１３（２２Ｈ，ｔ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）４５℃。δ１．８０，−１．０５。
【０１６７】
９ａのＨＰＬＣ保持時間は、Ｃ−１８カラム（３ミクロン、１００×４．６ｍｍ、０．６ｍｌ／分）上で２０分間にわたる、１０ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム中の２〜２０％  ＣＨ３ＣＮの勾配を用いたｃ−ジ−ＧＭＰに対する９．３分間と比較して、７．２５分間である。ＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）は、予測された元素式：Ｃ２０Ｈ２３Ｎ１０Ｏ１４Ｐ２に対する［Ｍ−Ｈ］−の計算値６８９．０８７６；実測値６８９．０８７４を確認した。９ａの３１−Ｐ  ＮＭＲは、２’，５’／３’，５’の混合結合と一致する２．０３及び−０．９５ｐｐｍで２つのピーク（集積１：１）を示した（ｃ［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］及びｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（２’，５’）ｐ］の両方は、例えば、対称により１つのみの３１−Ｐ  ＮＭＲシグナルを得た）。ホスホジエステル結合の位置化学に対する直接的な証拠は、リンの脱カップリング実験と組み合わせた１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、及び１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ二次元ＮＭＲによって得られた（図３ｂ及び３ｃ）。アノマー（Ｈ−１）プロトンは、５．８２ｐｐｍで二重項（または三重項）の重複として現れる。「Ａ」指定は、ダウンフィールドのアノマー性（Ｈ−１）プロトンに与えられ、「Ｂ」は、そのわずかにアップフィールドであるアノマー性プロトンに与えられた。「Ａ」及び「Ｂ」リボースの両方においてアノマー性プロトンから開始して、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ実験（図３ｂ）は、Ｈ−２Ａ（４．９６ｐｐｍ）、Ｈ−３Ａ（４．３１ｐｐｍ）、ならびにＨ−２Ｂ（４．６７ｐｐｍ）及びＨ−３Ｂ（４．８４ｐｐｍ）の割り当てを可能にした。ダウンフィールドのリン（２．０３ｐｐｍ）への照射により、Ｈ−３Ｂ多重項を二重項に変換し、一方、アップフィールドのリン（−０．９５ｐｐｍ）の照射により、Ｈ−２Ａの複合多重項の単純化をもたらした。両方の脱カップリング実験において、５’リボースメチレン多重項の単純化も観測された。二次元の１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣは、脱カップリング実験の結果を確認した。したがって、リンの脱カップリング及び１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ実験と組み合わせた１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹの結果は、ホスホジエステル結合の位置化学が２’，５’／３’，５’であり、９ａが環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］であるという直接的な証拠を提供する。
【０１６８】
実施例３．ＭＬ−ＣＤＡシリーズ（図２ｂ）：環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］Ｎａ塩２１の合成のための一般的実験（図２ｃの化合物を参照のこと）。
【０１６９】
１）１３の調製。
【０１７０】
２５ｍｌのアセトニトリル中の５ｇ（５．１５ｍｍｏｌ）のＮ６−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノフィニル］アデノシン（１１）の溶液に、０．１８ｍｌ（１０ｍｍｏｌｅ）の水及び１．２０ｇ（６．２ｍｍｏｌｅ）のピリジニウムトリフルオロアセタートを添加した。室温で５分間撹拌した後、２５ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルアミンを添加し、反応物を室温で１５分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、発泡体として１２を得、次いで、アセトニトリル（２×５０ｍｌ）で同時蒸発させ、６０ｍｌのジクロロメタン中に溶解した。この溶液に、水（０．９ｍｌ、５０ｍｍｏｌｅ）及び６０ｍｌのジクロロメタン中６％（ｖ／ｖ）ジクロロ酢酸（４４ｍｍｏｌ）を添加した。室温で１０分後、反応物をピリジン（７．０ｍｌ、８７ｍｍｏｌ）の添加によって反応停止処理し、油になるまで濃縮し、これを４０ｍｌの無水アセトニトリルで３回同時蒸発させることによって乾燥させ、最後に１２ｍｌの体積で１３を得た。
【０１７１】
２）１４の乾燥溶液の調製。
【０１７２】
Ｎ６−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−Ｏ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノフィニル］アデノシン（１４、６．４ｇ、６．６ｍｍｏｌｅ）を、４０ｍｌの無水アセトニトリル中に溶解し、４０ｍｌの無水アセトニトリルで回同時蒸発させることによって乾燥させ、最後に２０ｍｌを得た。１０の３Å分子篩を添加し、溶液を使用するまでアルゴン下で保存した。
【０１７３】
３）２’，５’−モノチオ−直鎖ダイマー１６の調製。
【０１７４】
２０ｍｌのアセトニトリル中の共沸乾燥させた１４（６．４ｇ、６．６ｍｍｏｌｅ）を、シリンジを介して１２ｍｌの無水アセトニトリル中の１３（５．１５ｍｍｏｌ）の溶液に添加した。室温で５分間撹拌した後、１．１４ｇ（５．６ｍｍｏｌ）の３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＤＤＴＴ）を添加し、反応物を室温で３０分間撹拌した。反応物を濃縮し、残渣油を８０ｍｌのジクロロメタン中に溶解した。ジクロロメタン中で水（０．９ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）及び８０ｍｌの６％（ｖ／ｖ）ジクロロ酢酸（５８ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で１０分間撹拌した。５０ｍｌのピリジンを添加して、ジクロロ酢酸を反応停止処理した。溶媒を減圧下で除去して、固体として粗１６ｂを得た。
【０１７５】
４）保護された環状−ジチオジアステレオ異性体１７ｂ及び１７ｃを得るための１６ｂの環化及び硫化。
【０１７６】
１６ｂを１５０ｍｌの乾燥ピリジン中に溶解し、これを約１００ｍｌの体積になるまで濃縮した。次いで、２−クロロ−５，５−ジメチル−１，３，２−ジオキサホスホリナン−２−オキシド（ＤＭＯＣＰ、３．４４ｇ、１８ｍｍｏｌｅ）を添加し、反応物を室温で５分間撹拌した。３．２ｍｌの水を添加し、その直後に３−Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン（１．３ｇ、７．７ｍｍｏｌｅ）を添加し、反応物を室温で５分間撹拌した。次いで、反応混合物を、２０ｇのＮａＨＣＯ３を含有する７００ｍｌの水中に注ぎ入れ、室温で５分間撹拌し、次いで、分液漏斗中に注ぎ入れ、８００ｍｌの１：１  酢酸エチル：ジエチルエーテルで抽出した。水層を６００ｍｌの１：１  酢酸エチル：ジエチルエーテルで再抽出した。有機層を合わせて、減圧下で濃縮し、ジアステレオ異性体１７ｂ及び１７ｃを含有する約１１ｇの油を得た。
【０１７７】
５）１７ｂ及び１７ｃを含有する粗混合物のシリカゲルカラムクロマトグラフィー
【０１７８】
上の粗混合物をジクロロメタン中に溶解し、２５０ｇのシリカカラムに適用した。所望のジアステレオ異性体を、ジクロロメタン（０〜１０％）中のメタノールの勾配を用いたカラムから溶出した。所望のジアステレオ異性体１７ｂ及び１７ｃを含有する画分を合わせて、濃縮し、２．２６ｇの約５０％  １７ｂ及び５０％  １７ｃを得た。
【０１７９】
６）粗１８ｂ及び１８ｃへの完全に保護された環状ジアステレオ異性体１７ｂ及び１７ｃの脱保護。
【０１８０】
シリカゲルカラムからの２．２６ｇの粗１７ｂ及び１７ｃを、厚壁ガラス加圧管に移した。６０ｍｌのメタノール及び６０ｍｌの濃縮アンモニア水を添加し、管を油槽中で、５０℃で１６時間撹拌しながら加熱した（出発材料がこの時点で消費されるため、最近の実行は、１２時間であった）。反応混合物をほぼ周囲温度まで冷却し、窒素ガス流で３０分間拡散させ、大型の丸底フラスコに移した。発泡及び突沸を避けるために、揮発性物質のほとんどを慎重に減圧下で除去した。水がまだ存在する場合、残渣物を冷凍し、乾燥するまで凍結乾燥させた。
【０１８１】
７）純粋な１８ｂを得るための粗１８ｂ及び１８ｃの分取ＨＰＬＣ精製。
【０１８２】
１８ｂ及び１８ｃを含有する凍結乾燥させた粗混合物を、約５０ｍｌのＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（６０／４０）中に取り込んだ。０．４５ミクロンのＰＴＦＥ濾過後、４〜５ｍｌのサンプル分量をＣ−１８  Ｄｙｎａｍａｘカラム（４０×２５０ｍｍ）に適用した。アセトニトリル及び１０ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液の勾配で溶出を行った（５０ｍｌ／分の流量で２０分間にわたって３０％〜５０％  ＣＨ３ＣＮ）。純粋な１８ｂを含有する分取ＨＰＬＣ実行からの画分をプールし、蒸発させ、ＣＨ３ＣＮを除去し、凍結乾燥させて、ビス−トリエチルアンモニウム塩として３６０ｍｇの純粋な１８ｂ（ＲＰＲＰ−ジアステレオ異性体）を得た。
【０１８３】
８）トリエチルアミントリヒドロフルオリドを用いた１８ｂの２つのＴＢＳ基の脱保護、ＴＥＡＢを用いた中和反応、ビス−トリエチルアンモニウム塩として純粋な１９ｂを得るためのＣ−ｌ８  Ｓｅｐ−Ｐａｋを用いた固相抽出及び凍結乾燥
【０１８４】
８ａ）２７０ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の１８ｂに、５．０ｍｌの純トリエチルアミントリヒドロフルオリドを添加した。混合物を室温で約４０時間撹拌した。分析ＨＰＬＣによって反応の完了を確認した後、サンプルを、４５ｍｌの冷却し、撹拌した１Ｍ  トリエチルアンモニウム重炭酸塩中への滴加によって中和した。中和した溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｃ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ上で脱塩し、生成物をＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（５：１）で溶出した。ＣＨ３ＣＮを減圧下で蒸発させ、残りの水溶液を冷凍し、凍結乾燥させた。水からの複数回の凍結乾燥により、ビス−トリエチルアンモニウム塩として１２２ｍｇ（５７％）のジチオ−（Ｒｐ，Ｒｐ）−［環状−Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（１９ｂ）を得た。
【０１８５】
８ｂ）９０ｍｇ（０．０８ｍｍｏｌ）の１８ｂを、１０ｍｌの乾燥アセトニトリルとともに３回同時蒸発させた。乾燥させた残渣物を０．４ｍｌの無水ピリジン中に取り込んだ。通気針付きフラスコを５０℃の油浴中に置き、０．６２ｍｌのトリエチルアミントリヒドロフルオリド及び１．０ｍｌのトリエチルアミンを撹拌混合物に同時に添加した。混合物を５０℃で２時間撹拌した。分析ＨＰＬＣによって反応の完了を確認した後、サンプルを、２５ｍｌの冷却し、撹拌した１Ｍ  トリエチルアンモニウム重炭酸塩中への滴加によって中和した。中和した溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｃ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ上で脱塩し、生成物をＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（１：４）で溶出した。ＣＨ３ＣＮを減圧下で蒸発させ、残りの水溶液を冷凍し、凍結乾燥させた。水からの複数回の凍結乾燥により、ビス−トリエチルアンモニウム塩として５４ｍｇ（７６％）のジチオ−（Ｒｐ，Ｒｐ）−［環状−Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（１９ｂ）を得た。
【０１８６】
８ｃ）４５℃で純ＴＥＡ−ＨＦの加熱による様々なＴＥＡ−ＨＦの脱保護、続いて、ＴＥＡＢの中和、Ｓｅｐ−Ｐａｋの脱塩、及び凍結乾燥。
【０１８７】
通気針を装備したフラスコ中でＴＥＡ・３ＨＦ（１ｍＬ、６．１ｍｍｏｌ）を１８ｂ（４１ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）に添加し、混合物を４５℃で撹拌した。反応進行をＬＣによりモニタリングし、出発材料及びモノ−ＴＢＳ類似体（約２時間）が消費すると、混合物を室温まで冷却した。混合物を、０℃で１Ｍ  ＴＥＡＢ（４．９ｍＬ）及びＴＥＡ（１．６ｍＬ）の溶液にゆっくりピペットで吸い取り、弱塩基性ｐＨをｐＨ紙によって確認した。中和溶液をＷａｔｅｒｓ  Ｃ−１８  Ｓｅｐ−Ｐａｋ（１０ｇ）上で脱塩し、生成物を１５％  ＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭ  酢酸トリエチルアンモニウム水溶液で溶出した。凍結乾燥により、白色固体として２１ｍｇ（６４％）の１９ｂ（ビス−トリエチルアンモニウム塩）を得た。分析ＨＰＬＣ（２〜２０％  アセトニトリル／１０ｎＭ  ＴＥＡＡ緩衝液−２０分間）による分析は、９５％超の純度を示した（図３ｈ）。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．５８（ｓ，１Ｈ），８．４１（ｓ，１Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝７．０，１Ｈ），５．３０（ｔｄ，Ｊ＝８．５，４．０，１Ｈ），５．２４−５．２１（ｍ，１Ｈ），５．０３（ｄｄ，Ｊ＝７．５，４．５，１Ｈ），４．３９（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，４．０，１Ｈ），４．１８（ｓ，１Ｈ），４．１４−４．０８（ｍ，２Ｈ），３．８５−３．８３（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｄ，Ｊ＝１２．０，１Ｈ），３．０６（ｑ，Ｊ＝７．５，１２Ｈ），１．１５（ｔ，Ｊ＝７．５，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５８．８１，５２．５４；Ｃ２０Ｈ２４Ｏ１０Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値６８９．０５２１，実測値６８９．０５１４。
【０１８８】
８ｄ）Ｇａｆｆｎｅｙらの２０１０に記載されるアセトン沈殿を介したＴＥＡ−ＨＦ反応の後処理もまた可能であるが、上の８ａ〜８ｃの項に記載される改変を用いてより清浄な生成物をいくらか得た。
【０１８９】
１０）ナトリウム塩への変換
【０１９０】
以下に記載されるように、イオン交換によって、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡのビス−ＴＥＡ塩（１９ｂ）を、薬学的に許容されるナトリウム塩（２１）に容易に変換する。
【０１９１】
ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡ・２Ｎａ＋（２１）。ＢＴ  ＡＧ（登録商標）５０Ｗ−Ｘ２  Ｒｅｓｉｎ  １００〜２００メッシュ、水素型（１００ｍｇ）を、Ｂｉｏ−ｓｐｉｎ（登録商標）カラムに脱イオン水とともにスラリーで充填した。過剰な脱イオン水は、重力によって排水した。３床体積の１Ｍ  ＮａＯＨ（１ｍＬ）は、重力によってカラムを通過させ、続いて、５床体積の脱イオン水（２ｍＬ）が通過した。重力によって過剰な脱イオン水を排水した後、脱イオン水（１ｍＬ）中のＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡ・２ＴＥＡ（１９ｂ、１０ｍｇ）の溶液をカラムに負荷した。カラムを５床体積の脱イオン水（２ｍＬ）で溶出し、画分を収集し、ＴＬＣプレート及びＵＶランプによってＵＶ活性について確認した。目的とする画分をプールし、冷凍し、一晩凍結乾燥させて、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡ・２Ｎａ＋を定量的に得た。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−３０μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．５４（ｓ，１Ｈ），８．４０（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．１６７（ｓ，１Ｈ），６．０９（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），５．９２（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），５．２６（ｔｄ，Ｊ＝８．５，４．５，１Ｈ），５．２１−５．１９（ｍ，１Ｈ），５．０１（ｄｄ，Ｊ＝７．５，４．５，１Ｈ），４．４２（ｄ，Ｊ＝４，１Ｈ），４．２３（ｄｄ，Ｊ＝１０．５，５．０，１Ｈ），４．１７（ｓ，１Ｈ），４．１５−４．００（ｍ，２Ｈ），３．９０−３．８２（ｍ，１Ｈ），３．７３−３．７０（ｍ，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−３０μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５８．８５，５１．５３（図３ｄ〜３ｇ）；Ｃ２０Ｈ２３Ｏ１０Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値６８９．０５２１，実測値６８９．０５０３。
【０１９２】
ホスホジエステル結合の位置化学に対する直接的な証拠は、ＭＬ−ＣＤＧシリーズ実験（［段落１９］）と同様に、１Ｈ−３１Ｐ  ＨＭＢＣ二次元ＮＭＲと組み合わせた１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹによって得られた（図３ｅ〜３ｇ）。
【０１９３】
ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＧ（９ｂ）。修正（図２ａ）：ｅ）ＤＤＴＴ；ｈ）３−Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン；ｎ）ＴＥＡ塩として得、イオン交換を必要としなかった、を用いてＭＬ−ＣＤＧシリーズ実験（段落［００１１］）の手順後、ＭＬ−ＣＤＧと同様に化合物９ｂを合成した。
【０１９４】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ７．９８（ｓ，１Ｈ），７．９４（ｓ，１Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝９．０，１Ｈ），５．８０（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．２５−５．２３（ｍ，１Ｈ），５．１２（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．５，１Ｈ），４．７３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，４．５，１Ｈ），４．４２（ｄ，Ｊ＝４．０，１Ｈ），４．２２（ｔ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），４．１４−４．１０（ｍ，２Ｈ），３．９４−３．９０（ｍ，２Ｈ），３．７７−３．７３（ｍ，１Ｈ），３．０５（ｑ，Ｊ＝７．０，１２Ｈ），１．１６０（ｔ，Ｊ＝７．０，１Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５９．０９，５０．３７；Ｃ２０Ｈ２３Ｏ１２Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値７２１．０４１９，実測値７２１．０４１０。
【０１９５】
ＭＬ−ＲＳ−ＣＤＧ（９ｃ）。修正（図２ａ）：ｅ）ＤＤＴＴ；ｈ）３−Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン；ｋ）［Ｒｐ，Ｓｐ］ジアステレオマー８ｃを収集した；ｎ）ＴＥＡ塩として得、イオン交換を必要としなかった、を用いてＭＬ−ＣＤＧシリーズ実験（段落［００１１］）の手順後、ＭＬ−ＣＤＧと同様に化合物９ｃを合成した。
【０１９６】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．０１（ｓ，１Ｈ），７．９８（ｓ，１Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），５．７９（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．０，１Ｈ），５．２０−５．１９（ｍ，１Ｈ），４．６８（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．０，１Ｈ），４．２１−４．１８（ｍ，２Ｈ），４．１０−４．０５（ｍ，３Ｈ），３．７１−３．６８（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｑ，Ｊ＝７．０，１２Ｈ），１．１３（ｔ，Ｊ＝７．０，１８Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５９．８９，５７．１７；Ｃ２０Ｈ２４Ｏ１２Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値７２１．０４１９０４，実測値７２１．０４１４３。
【０１９７】
Ｃ１４−ＭＬ−ＣＤＧ（１０）：修正（図２ａ）：ｎ）ミリスチン酸無水物、ＤＭＦを用いてＭＬ−ＣＤＧシリーズ実験（段落［００１１］）の手順後、ＭＬ−ＣＤＧと同様に化合物１０（図２ｃ）を合成した。
【０１９８】
９ａのビス−トリエチルアミン塩（０．２６０ｇ、０．２９１ｍｍｏｌ）に、３．７ｍｌのＤＭＦ、０．３ｍｌのピリジン、及び１２８ｍｇ（０．２９２ｍｍｏｌ）のミリスチン酸無水物を添加した。反応混合物を６０℃で合計５時間加熱し、室温まで冷却し、１００ｕｌのＭｅＯＨで反応停止処理した。ＬＣ痕跡は、出発材料の保持時間範囲内で現れる質量の残りを用いた主な新たな生成物への２５％の変換を示した。主な生成物の質量は、負モードでＬＣ／ＭＳによるＣ１４−アシル化生成物として確認され、ｍ／ｚ（Ｍ−１）が８９９（Ｃ３４Ｈ４９Ｎ１０Ｏ１５Ｐ２−に対する計算値：８８９．３）であった。蒸発後、残渣物は、２ｍｌのＣＨ３ＣＮ、３ｍｌの０．１Ｍ  ＴＥＡＡ、及び十分なＭｅＯＨ中で取り込まれ、材料のほとんどを溶液にした。少量の微粒子物質を除去するために遠心分離を介して短時間沈降させた後、２０分間にわたって１０ｍＭ  ＴＥＡＡ中の２５％〜５０％超のＣＨ３ＣＮの勾配を用いて、Ｃ１８−分取ＨＰＬＣを介して溶液を精製した。所望の生成物を含有する画分を合わせて、乾燥するまで凍結乾燥させて、白色固体として３６ｍｇのＣ１４−ＭＬ−ＣＤＧ  １０（トリエチルアンモニウム塩）を得た。
【０１９９】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．００（ｓ，１Ｈ），７．９０（ｓ，１Ｈ），５．９８（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．８３（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），５．７６（ｄｄ，Ｊ＝７．５，４．５，１Ｈ），５．１５−５．１０（ｍ，１Ｈ），４．９０−４．８５（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｄ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），４．３０−４．２７（ｍ，１Ｈ），４．０７（ｓ，１Ｈ），３．９４−３．９０（ｍ，３Ｈ），３．８２−３．７８（ｍ，１Ｈ），３．０４（ｑ，Ｊ＝７．０，１２Ｈ），２．３７−２．２３（ｍ，２Ｈ），１．５１−１．４３（ｍ，２Ｈ），１．２８−１．１４（ｍ，３８Ｈ）。０．８５（ｔ，Ｊ＝７．０，３Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ−１．３６，−２．１２；Ｃ３４Ｈ４９Ｏ１５Ｎ１０Ｐ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値８９９．２８６０，実測値８９９．２８３４。
【０２００】
ＭＬ−ＣＤＡ（１９ａ）。修正（図２ｂ）：ｅ）ｔ−ＢｕＯＯＨ；ｈ）Ｉ２／Ｈ２Ｏ；ｎ）ＴＥＡ塩として得、イオン交換を必要としなかった、を用いてＭＬ−ＣＤＡシリーズ実験（段落［００２０］）の手順後、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡと同様に化合物１９ａを合成した。
【０２０１】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．４４（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），６．０８（ｄ，Ｊ＝８．０，１Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．１０−５．０（ｍ，３Ｈ），４．３０（ｄ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），４．３−４．１９（ｍ，１Ｈ），４．１４（ｄ，Ｊ＝１．５，１Ｈ），４．０５（ｑ，Ｊ＝１１．５，２Ｈ），３．７８−３．７５（ｍ，２Ｈ），２．９０（ｑ，Ｊ＝７．５，１８Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．０，２７Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ１．６７，−０．４７；Ｃ２０Ｈ２４Ｏ１２Ｎ１０Ｐ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値６５７．０９７７６３，実測値６５７．０９６８０。
【０２０２】
ＭＬ−ＲＳ−ＣＤＡ（１９ｃ）。修正（図２ｂ）：ｋ）［Ｒｐ，Ｓｐ］ジアステレオマー１８ｃを収集した；ｎ）ＴＥＡ塩として得、イオン交換を必要としなかった、を用いてＭＬ−ＣＤＡシリーズ実験（段落［００２０］）の手順後、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡと同様に化合物１９ｃを合成した。
【０２０３】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．５２（ｓ，１Ｈ），８．３７（ｓ，１Ｈ），８．１６（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），６．１０（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．４５（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．５，１Ｈ），５．３１−５．２６（ｍ，１Ｈ），５．００（ｄｄ，Ｊ＝８．５，４．５，１Ｈ），４．４１−４．３６（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｄ，Ｊ＝５．０，１Ｈ），４．１４−４．０７（ｍ，３Ｈ），３．７０−３．６７（ｍ，３Ｈ），２．８４（ｑ，Ｊ＝７．０，１９Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．５，２９Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５９．９８，５７．３５；Ｃ２０Ｈ２４Ｏ１０Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−２Ｈ＋Ｎａ）−の計算値７１１．０３４０，実測値７１１．０３１６。
【０２０４】
ＭＬ−３’−５’−Ｒ−ＣＤＡ（１９ｅ）。修正（図２ｂ）：ｅ）ｔ−ＢｕＯＯＨ；ｈ）３−Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン；ｎ）ＴＥＡ塩として得、イオン交換を必要としなかった、を用いてＭＬ−ＣＤＡシリーズ実験（段落［００２０］）の手順後、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡと同様に化合物１９ｅを合成した。
【０２０５】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．４９（ｓ，１Ｈ），８．３８（ｓ，１Ｈ），８．１７（ｓ，１Ｈ），８．１４（ｓ，１Ｈ），６．０９（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），５．９０（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．２３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，５．０，１Ｈ），５．１２−５．０４（ｍ，２Ｈ），４．３１（ｄ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），４．２１−４．１４（ｍ，３Ｈ），４．１０（ｑ，Ｊ＝１１．０，１Ｈ），３．８０−３．７１（ｍ，２Ｈ），２．８５（ｑ，Ｊ＝７．０，１８Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．５，２７Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−１５μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５９．３２，−０．３７；Ｃ２０Ｈ２３Ｏ１１Ｎ１０Ｐ２Ｓに対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値６７３．０７４９，実測値６７３．０７２９。
【０２０６】
アンモニア塩としてのＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡ（２２）。修正（図２ｂ）：ｎ）ＢＴ  ＡＧ（登録商標）５０Ｗ−Ｘ２  Ｒｅｓｉｎ  １００〜２００メッシュ、水素型、１Ｍ  ＮＨ４ＯＨ、を用いてＭＬ−ＣＤＡシリーズ実験（段落［００２０］）の手順後、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡと同様に化合物２２を合成した。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−３０μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．８０（ｓ，１Ｈ），８．４４（ｓ，１Ｈ），８．３９（ｓ，２Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝１０．０，１Ｈ），６．３４（ｓ，１Ｈ），５．５０（ｔｄ，Ｊ＝１０．５，４．５，１Ｈ），５．２１−５．１５（ｍ，１Ｈ），５．０２（ｄ，Ｊ＝４．０，１Ｈ），４．９２（ｄ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），４．６１−４．４９（ｍ，２Ｈ），４．３０−４．２７（ｍ，２Ｈ）；Ｃ２０Ｈ２３Ｏ１０Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対する１ＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値６８９．０５２１，実測値６８９．０５０４。
【０２０７】
ＭＬ−ＲＲ−ｃＧＡＭＰ（２０）。修正（図２ｂ）：ｄ）ｐｙｒ、４；ｎ）ＴＥＡ塩として得、イオン交換を必要としなかった、を用いてＭＬ−ＣＤＡシリーズ実験（段落［００２０］）の手順後、ＭＬ−ＲＲ−ＣＤＡと同様に化合物２０（図２ｃ）を合成した。
【０２０８】
１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−３０μＬ  Ｄ２Ｏ）δ８．３４（ｓ，１Ｈ），８．１５（ｓ，１Ｈ），８．０１（ｓ，１Ｈ），５．９１（ｄ，Ｊ＝７．５，１Ｈ），５．８６（ｄ，Ｊ＝８．５，１Ｈ），５．２９−５．２３（ｍ，１Ｈ），５．１７−５．１４（ｍ，１Ｈ），５．０２（ｄｄ，Ｊ＝７．５，４．０，１Ｈ），４．４１（ｄ，Ｊ＝４．５，１Ｈ），４．２５（ｄｄ，Ｊ＝５．０，１０．５，１Ｈ），４．１３−４．０３（ｍ，３Ｈ），３．９５−３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７８−３．７４（ｍ，１Ｈ），２．８４（ｑ，Ｊ＝７．５，１８Ｈ），１．０８（ｔ，Ｊ＝７．５，２８Ｈ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（２００ＭＨｚ，４５℃，（ＣＤ３）２ＳＯ−３０μＬ  Ｄ２Ｏ）δ５８．８１，５０．９１；Ｃ２０Ｈ２３Ｏ１１Ｎ１０Ｐ２Ｓ２に対するＨＲＭＳ（ＦＴ−ＩＣＲ）ｍ／ｚ（Ｍ−Ｈ）−の計算値７０５．０４７０，実測値７０５．０４５１。
【０２０９】
実施例４．リボース２’−及び３−置換誘導体
【０２１０】
本発明に使用される誘導体の例を図４〜６に示す。
【０２１１】
実施例５．ＣＤＮ誘導されたＩ型インターフェロン発現
【０２１２】
アジュバント効力の特徴として自然分子及び誘導分子の各々によってヒト細胞中に誘導されたＩ型インターフェロンの相対的レベルを決定するために、プロモーターの制御下で５つのＩＦＮ刺激性応答成分からなるアルカリホスファターゼを発現するＩＲＦ誘導性分泌型胎児アルカリホスファターゼレポーター遺伝子（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた４×１０５個のＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞（ヒト単球細胞株）を、１００μＭの環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＧ）、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（混合結合、またはＭＬ−ＣＤＧ）、またはＨＢＳＳとともに、３７℃、５％  ＣＯ２で３０分間インキュベートした。３０分後、細胞を洗浄し、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で９６ウェルプレート中に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。一晩インキュベーション後、それぞれのサンプルから細胞培養上清を収集し、２０μＬの細胞培養上清を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に添加し、４５分間インキュベートし、Ｉ型インターフェロンのタンパク質レベルを評価した。Ｖｅｒｓａ  Ｍａｘ動的分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、吸光度６５５ｎｍでの読み込みを３分毎に行った。
【０２１３】
図７に示されるように、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）は、広範囲の時点にわたって環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］よりも著しく高いレベルのＩＦＮ−βを誘導した。これらの結果は、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］の精製された調製物が、ヒト単球細胞株中において環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］が活性化するよりもより高度に自然免疫応答を活性化することを示す。
【０２１４】
環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］と比較して、自然免疫を活性化するための効力の特徴として環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）によって誘導されるＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、及びＩＦＮ−γのレベルを決定するために、４つの独立したヒトドナーから単離した１×１０６個の初代ヒトＰＢＭＣを、９６ウェルＵ字底プレート中、３７℃、５％  ＣＯ２で３０分間、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５または０．５μＭの環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＧ）または環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）、１μｇ／ｍＬのインターフェロン刺激性ＤＮＡ（ＩＳＤ）、または４μｇ／ｍＬのポリ（Ｉ：Ｃ）とともにインキュベートし、分子をＰＢＭＣに移入した。ＩＳＤ（インターフェロン刺激性ＤＮＡ）は、ＴＬＲ非依存性（Ｓｔｅｔｓｔｏｎ，Ｄ．Ｂ．ｅｔ．ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２４，９３−１０３，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６）であり、ｃＧＡＳを介してシグナルを伝達するため、ＳＴＩＮＧ依存性であるのに対して、ポリ（Ｉ：Ｃ）は、ＴＬＲ３経路及びＲＩＧ−Ｉ経路の両方を介してシグナルを電たすることができるため、ＳＴＩＮＧ非依存性である。３０分後、細胞を洗浄し、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地に交換し、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。６時間のインキュベーション後、一部の細胞を採取し、Ｉ型サイトカインインターフェロンアルファ２（ＩＦＮＡ２）及びインターフェロンベータ１（ＩＦＮＢ１）、ならびにＩＩ型サイトカイン遺伝子インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）の遺伝子発現におけるリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。遺伝子発現は、ＰｒｉｍｅＰＣＲ  ＲＮＡ精製及びｃＤＮＡ分析系を用いてリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲによって決定し、ＣＦＸ９６遺伝子サイクラー上で実行した（すべて、ＢｉｏＲａｄ）。標的（Ｅ標的）及び参照（Ｅ参照）におけるＰＣＲ増幅の異なる効率性からなるそれぞれについて正規化発現を決定し、対数スケールした生データユニットのサイクル閾値（ＣＴ）を正規化発現の線形ユニットに変換する。使用された参照遺伝子はＧＵＳＢ及びＰＧＫ１であり、遺伝子は、０．５を下回る係数変数（ＣＶ）及び１を下回るＭ値を有することが確認され、それ故に異なる処理条件によって変化しなかった。これらのサイトカインの相関する分泌タンパク質レベルを評価するために、２４時間のインキュベーション後、残りの細胞から上清を採取し、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によつてＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γレベルを決定する一方、ＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）によってＩＦＮ−βレベルを決定した。
【０２１５】
図８に示されるように、インターフェロンアルファ２（ＩＦＮＡ２）の遺伝子発現は、４人のドナーすべてにわたって、５μＭでの環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対してよりも５μＭでの環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対して著しく高かった。同様に、インターフェロンベータ１（ＩＦＮＢ１）の遺伝子発現は、４人のドナーすべてにわたって、５μＭでの環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対してよりも５μＭでの環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対して著しく高かった。インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）の遺伝子発現は、４人のドナーすべてにわたって、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対してよりも５μＭでの環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対して著しく高いレベルに誘導された。これらのデータは、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］と比較して環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］の効力の増加が様々なヒトドナーにおいて重要な自然免疫サイトカインの遺伝子発現を誘導することを示す。
【０２１６】
図９（ａ）に示されるように、５μＭでの環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］による初代ヒトＰＢＭＣにおいて誘導された分泌型ＩＦＮ−αのレベルは、４人のドナーすべてにわたって、同じまたは低い用量で環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］よりも高い。図９（ｂ）では、ＥＬＩＳＡによって評価されるように、５μＭでの環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］に対するＩＦＮ−βのレベルもまた、４人のドナーすべてにおいて、ＩＳＤ及びポリＩ：Ｃ対照に対しても、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］を誘導したレベルで用いるものよりも高かった。図９（ｃ）は、ＣＢＡによって評価されるように、ＩＦＮ−γの分泌について同様の見解を示す。５μＭ及び０．５μＭの両方で、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］は、同じ用量で、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］よりも高いレベルのＩＦＮ−γを誘導し、４人のドナーすべてにわたって、ＩＳＤ及びポリＩ：Ｃ対照よりも高いレベルを誘導した。これらのデータは、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］と比較して環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］の効力の増加が、広範囲のサンプリングのヒトドナーにおいて、Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮ産生を刺激するために、自然免疫の誘導には極めて重要であることを示す。
【０２１７】
アジュバント効力の特徴として自然分子及び誘導分子の各々によってヒト細胞中に誘導されたＩＦＮ−βの相対的レベルを決定するために、ＩＲＦ誘導性分泌型胎児アルカリホスファターゼレポーター遺伝子（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた４×１０５個のＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ細胞、ヒト単球細胞株を、［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）、環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（混合結合またはＭＬ−ＣＤＡ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）、または培地対照と比較して、５０μＭの環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＧ）、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（混合結合またはＭＬ−ＣＤＧ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）とともに、３７℃、５％  ＣＯ２で３０分間インキュベートした。３０分後、細胞を洗浄し、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で９６ウェルプレート中に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。一晩インキュベーション後、それぞれのサンプルから細胞培養上清を収集し、２０μＬの細胞培養上清を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に添加し、４５分間インキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、吸光度６５５ｎｍでの読み込みを１５分で行った。
【０２１８】
図１０に示されるように、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］
（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）誘導体は、非修飾環状ｃ−ジ−ＧＭＰ（ＣＤＧ）または修飾ＣＤＧ分子よりも著しく高いレベルのＩＦＮ−βを誘導した。同様に、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］
（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）分子は、非修飾ＣＤＡまたはＭＬ  ＣＤＡ分子のいずれかよりも著しく高いＩＦＮ−βレベルを誘導した。これらの結果は、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ誘導体の精製された調製物が、ヒト単球細胞株中において親ＣＤＮ分子よりもより高度に自然免疫応答を活性化することを示す。
【０２１９】
誘導体分子の免疫応答を活性化する相対的能力を決定するために、ＣＤＮ化合物を、尾の基底部への皮下注射によって、５０、５、及び０．５μＭの用量で、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＨＢＳＳ中の全体積１００μＬにおいて）に投与した。ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞における表面ＣＤ６９発現の上方調節に対する蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によるリンパ球免疫細胞活性化について、マウスを２４時間後に評価した。
【０２２０】
図１１（ａ〜ｃ）に示されるように、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）分子は、用量依存的な様式で、ＮＫ及びＴ細胞の強力な免疫活性化を誘導した。Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）分子はまた、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ分子よりもより少ない程度ではあるが、ＮＫ及びＴ細胞の活性化も誘導した。ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ分子は両方とも、すべての用量で、ＭＬ  ＣＤＮ分子よりも免疫細胞の活性化を誘導した。これらのデータは、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ分子の増加した免疫活性化の特性が、ＭＬ  ＣＤＮ分子と比較して、具体的には、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ分子の強力な免疫細胞の活性化を誘導する能力を強調することを示す。
【０２２１】
実施例６．ホスホジエステラーゼに対するＲｐ，ＲｐジチオＣＤＮの耐性の強化
【０２２２】
ヒト細胞におけるＩ型インターフェロンの誘導は、未処理及びホスホジエステラーゼで処理されたオキソ、Ｒｐモノチオ、及びＲｐ，Ｒｐジチオ誘導体の効力を評価するために測定された。５つの化合物（環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）、環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＡ）、Ｒｐモノチオ（Ｒｐ、モノチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  Ｒ−ＣＤＡ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ（Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＲＲ−ＣＤＡ）、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）は、クロタラスアダマンテウス（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）（Ｓｉｇｍａ）からの１６０μｇのヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ）、ペニシリウムシトリヌム（Ｓｉｇｍａ）からの２．５ｍＵのヌクレアーゼＰ１（ＮＰ１）、または処理された偽物のいずれかで処理した。７μｇの各々の化合物を、ＳＶＰＤ緩衝液（１×ＰＢＳ及び０．６ｍＭのＭｇＣｌ２）、ＮＰ１緩衝液（３０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．３、２ｍＭのＺｎＣｌ２）のいずれかで希釈するか、または未処理のままにし、次いで、３７℃で２時間インキュベートし、続いて、ヌクレアーゼを不活性化するために１０分間沸騰した。４ｘ１０５個のＴＨＰ１−Ｂｌｕｅ（商標）ＩＳＧ細胞（プロモーターの制御下で５つのＩＦＮ刺激性応答成分からなるアルカリホスファターゼを発現するＩＲＦ誘導性分泌型胎児アルカリホスファターゼレポーター遺伝子（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）でトランスフェクトされたヒト単球細胞株）を、５０μＭの処理された偽物、ＳＶＰＤで処理された、またはＮＰ１で処理された分子とともに、インキュベートした。３０分後、細胞を洗浄し、１０％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ培地中で９６ウェルプレート中に播種し、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。１６時間のインキュベーション後、それぞれのサンプルから細胞培養上清を収集し、２０μＬの細胞培養上清を１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）に添加し、２５分間インキュベートし、Ｉ型インターフェロンのタンパク質レベルを評価した。Ｖｅｒｓａ  Ｍａｘ分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、吸光度６５５ｎｍでの読み込みを測定した。
【０２２３】
図１２に示されるように、未処理Ｒｐ，Ｒｐジチオ化合物、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＲＲ−ＣＤＡ）、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）は、オキソ（環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）及び環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＡ）及びＲｐモノチオ（Ｒｐ、モノチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  Ｒ−ＣＤＡ）ＣＤＮ誘導体分子よりもより強力な誘導因子のＩ型インターフェロンである。２’−５’及び３’−５’ホスホジエステル結合の両方を開裂するホスホジエステラーゼＳＶＰＤ、または３’−５’ホスホジエステル結合を選択的に消化するＮＰ１のいずれかによる処理後のＣＤＮ誘導体の活性を評価した（Ｐｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ，（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｉｍｉｓｔｒｙ，２８３，３６４９４−３６５０３）。図１２は、Ｒｐ，Ｒｐジチオ化合物、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＲＲ−ＣＤＡ）、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）が、ＳＶＰＤ及びＮＰ１処理後、それらの効力を保持するのに対して、オキソ（環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）及び環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＡ）は、ＳＶＰＤ及びＮＰ１の両方による消化後、活性を失ったことを示す。３’−５ホスホジエステル結合で単一のチオ置換を含むＲｐモノチオ誘導体（Ｒｐ、モノチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  Ｒ−ＣＤＡ）は、ＮＰ１消化後、活性を保持したが、２’−５’ホスホジエステル結合を開裂するＳＶＰＤ処理に影響を受けやすかった。ＳＶＰＤまたはＮＰ１消化に対するオキソ、Ｒｐモノチオ、及びＲｐ，Ｒｐジチオ誘導体の微分磁化率は、Ｒｐモノチオ及びＲｐ，Ｒｐジチオ誘導体の構造を確認する。これらの結果はまた、Ｒｐ，Ｒｐジチオ誘導体の効用が、ホスホジエステラーゼによる消化への耐性のため、血清中及び／または宿主細胞中に存在し、それ故に本明細書で示されるように、自然免疫シグナル伝達のより強力な活性化、インビボでの増加した治療上の抗腫瘍効果をもたらすことを示す。
【０２２４】
実施例７．合成ＣＤＮ誘導体分子は、すべてのヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子のシグナル伝達を強力に活性化する
【０２２５】
自然及び誘導分子への５つの知られている天然ヒトＳＴＩＮＧ変異体（ＷＴ、ＲＥＦ、ＨＡＱ、ＡＱ、及びＱとも称される）の応答性を決定するために、ヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を発現したヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞株の一団を生成した。親ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞株は、内因性ＳＴＩＮＧを発現しないため、外部に発現したＳＴＩＮＧ対立遺伝子の応答性を評価することができる。ｈＳＴＩＮＧ（ＲＥＦ）−ＧＦＰ、ｈＳＴＩＮＧ（ＷＴ）−ＧＦＰ、ｈＳＴＩＮＧ（ＨＡＱ）−ＧＦＰ、ｈＳＴＩＮＧ（Ｑ）−ＧＦＰ、及びｍＳＴＩＮＧ（ＷＴ）−ＧＦＰをコードするＭＳＣＶ２．２プラスミドは、ＵＣ  ＢｅｒｋｅｌｅｙのＶａｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得られた。ｈＳＴＩＮＧ（ＡＱ）−ＧＦＰは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、ｈＳＴＩＮＧ（Ｑ）−ＧＦＰから得られた。ｈＳＴＩＮＧ（ＲＥＦ）対立遺伝子の配列はまた、Ｂａｒｂｅｒ対立遺伝子としても知られており（Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂａｒｂｅｒ，Ｇ．Ｎ．（２００８）．Ｎａｔｕｒｅ  ４５５，６７４−６７８）、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿９３８０２３．１を有する。ｈＳＴＩＮＧ（ＲＥＦ）と、その他のＷＴ、ＨＡＱ、ＡＱ、及びＱヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子との間のアミノ酸差を、出典Ｙｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ８：ｅ７７８４６（２０１３）である、図１３に示す。個々のヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子の各々を発現する安定したＨＥＫ  ２９３Ｔ由来細胞株は、ＵＣ  ＢｅｒｋｅｌｅｙのＣａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ＦａｃｉｌｉｔｙでのＭｏ  Ｆｌｏ細胞選別機を用いて、ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳ選別によって生成された。１×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ  ＳＴＩＮＧ細胞を、９６ウェルプレート中に播種し、正規化のために、ルシフェラーゼレポーターのヒトＩＦＮ−βプロモーターの上流を発現する５０ｎｇのヒトＩＦＮ−βレポータープラスミド（ｐＬｕｃ−ＩＦＮ−β）及び１０ｎｇのＴＫ−ｒｅｎｉｌｌで一過性にトランスフェクトされた（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を用いて）。２４時間後、均一の摂取を確実にするために、ジギトニン透過性を用いて自然及び合成ＣＤＮ誘導体分子を用いて、細胞を刺激した。２５ｕｌのジギトニン緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＫＣＬ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、８５ｍＭ  スクロース、０．２％  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＡＴＰ、０．１ｍＭ  ＧＴＰ、１０ｕｇ／ｍｌのジギトニン）中で１０μＭの環状［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ｃＧＡＭＰ）、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ｃＧＡＭＰ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ｃＧＡＭＰ）、環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＲＲ−ＣＤＡ）、環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＡ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＧ）、Ｒ���，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＲＲ−ＣＤＧ）、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）、またはＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）を用いて、それぞれのＳＴＩＮＧ細胞株を刺激した。２０分後、刺激混合物を除去し、２００ｕｌの標準的なＲＰＭＩ培地を添加した。６時間刺激後、細胞溶解物を調製し、レポーター遺伝子活性を、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ３照度計上でデュアルルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。
【０２２６】
図１４は、ＩＦＮβ−ＬＵＣレポーター（ｙ軸上に記されたＲＬＵ）の誘導倍率を測定することによってヒトＳＴＩＮＧ変異型対立遺伝子をコードするＨＥＫ２９３細胞株の刺激を示す。図１４に示されるように、Ｒｐ，Ｒｐジチオ混合結合化合物、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ｃＧＡＭＰ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）は、すべてのヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子によってＩＦＮβレポーター活性を強力に誘導する。耐火性ヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子、ｈＳＴＩＮＧ（ＲＥＦ）、及びｈＳＴＩＮＧ（Ｑ）は、正準ヌクレオチド間リン酸塩橋結合：環状［Ｇ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ｃＧＡＭＰ）、環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）、及び環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＧ）を有する自然分子による刺激に対して不良に応答する。著しく対照的に、耐火性ヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を発現する細胞株は、合成Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）：ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ、及びＭＬ  ＲＲ−ｃＧＡＭＰによる刺激に応答した。マウスＳＴＩＮＧを発現する細胞は、試験した分子のすべてに応答し、修飾した合成ＣＤＮ誘導体分子がヒトＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性化に対して関連があることを示す。これらの結果は、Ｒｐ，Ｒｐジチオ混合結合化合物、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ｃＧＡＭＰ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）が試験したすべてのヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子を強力に活性化することを示し、これらの分子が、広範囲のヒト集団にわたって、自然免疫を効率よく誘導することを示す。
【０２２７】
合成ＣＤＮ誘導体分子がヒト樹状細胞（ＤＣ）の成熟を誘導したことを示すために、ヒトＰＢＭＣからのＣＤ１４＋単球を、５０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ及び２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を用いて６日間処理した。７日後、単球由来のＤＣを、培地に直接添加したＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）またはＣＤＮ（５０μＭ）のいずれかで刺激した。４８時間後、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６の表面発現は、ＣＤ１１ｃ＋  ＤＣ集団にゲートを設定したＦＡＣＳによって決定された。図１５Ａは、図に示されたＣＤＮ分子による刺激後の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の平均を示す棒グラフを示す。また、ヒトＤＣにおけるＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、及びＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）発現の代表的なヒストグラムを図１５Ｂに示す。塗りつぶしたヒストグラムは、非刺激細胞に相当し、点線は、ＬＰＳ刺激を表し、実線は、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）刺激を表す。これらの結果は、２’−５、３’−５’非標準または混合結合（ＭＬ）リン酸塩架橋構造と組み合わせてヌクレオチド間のリン酸塩架橋の非架橋酸素原子のＲｐ，Ｒｐジチオ置換を含む構造を有する合成ＣＤＮ分子がすべてのヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子においてシグナル伝達を活性化し、ヒトＤＣの成熟を強力に活性化することを示す。
【０２２８】
実施例８．ＣＤＮ誘導性抗原特異Ｔ細胞応答
【０２２９】
異なる環状ジヌクレオチド分子によって誘導されるＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５）に、１０μｇのオブアルブミンタンパク質を含む２％スクアレンと水で製剤化された０μｇ（ＣＤＮなし）または５μｇまたは２５μｇの［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（混合結合またはＭＬ−ＣＤＧ）で皮下に予防接種を行った。予防接種から７日後に、それぞれの動物から血液を採血し、ＰＢＭＣを調製した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、支持細胞として１×１０５個のナイーブ脾細胞の存在下で、培地のみ（非刺激）または１μＭのＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを用いて、５×１０４個のＰＢＭＣを一晩刺激した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔを作成し、ＣＴＬプレートリーダー及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用いて定量化した。
【０２３０】
図１６に示されるように、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）の両方の用量は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ＯＶＡ特異的ＣＤ８免疫応答を誘導する。これらの応答は、非刺激の対照及びＣＤＮのない対照群によって誘導された応答よりも著しく高い。これらの結果は、抗原を用いた環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）の製剤がインビボで抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を刺激し得ることを示す。
【０２３１】
ＳＴＩＮＧシグナル伝達がＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導するためにｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）を必要とするかどうかを判定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝３または５）及びｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔマウス（ｎ＝３）に、１０μｇのオブアルブミンタンパク質を含む２％スクアレンと水で製剤化された０μｇ（ＣＤＮなし）または５μｇまたは２５μｇの［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）のいずれかで皮下に予防接種を行った。予防接種から７日後に、それぞれの動物から血液を採血し、ＰＢＭＣを調製した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、支持細胞として１×１０５個のナイーブ脾細胞の存在下で、培地のみ（非刺激）または１μＭのＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを用いて、５×１０４個のＰＢＭＣを一晩刺激した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔを作成し、ＣＴＬプレートリーダー及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用いて定量化した。
【０２３２】
図１７は、ｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）が機能的ＳＴＩＮＧ分子の存在によって異なるＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞応答を誘導することを示す。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、機能的ＳＴＩＮＧ分子を用いた、ｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）及びオブアルブミンタンパク質の製剤は、非刺激対照及びＣＤＮのない対照と比較して、有意なＯＶＡ２５７−２６４免疫応答を誘導する。機能的ＳＴＩＮＧ分子（Ｓａｕｅｒ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０１１）を発現しないｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔマウスにおいて、ｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ−ＣＤＧ）によって誘導されたＯＶＡ特異的応答は、ＣＤＮを含まない（ＣＤＮなし）対照製剤によって誘導されたＯＶＡ特異的応答とはあまり異ならない。これらの結果は、ｃ［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］
（ＭＬ−ＣＤＧ）によって誘導された免疫応答が機能的ＳＴＩＮＧ分子を必要とすることを示す。
【０２３３】
実施例９．様々なＣＤＮ誘導体を用いた比較データ
【０２３４】
誘導体分子の抗腫瘍免疫を促進する能力を評価するために、Ｂ１６黒色腫細胞（１００μＬのＰＢＳ中の５×１０４個の細胞）を、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり８匹のマウス）の腰部に皮下移植した。腫瘍移植後の１４日目に、腫瘍が約７５ｍｍ３の体積に達したときに、処理を開始した。ＣＤＮ化合物（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中２５μｇ）を、２７ゲージ針を用いて、腫瘍の中央に皮下注射により投与した。合計３回の腫瘍内注射については、３日毎に注射を繰り返した。試験したＣＤＮは、環状［Ｇ（３’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＧ）、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（混合結合、またはＭＬ  ＣＤＧ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）、環状［Ａ（３’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＣＤＡ）、環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（混合結合、またはＭＬ  ＣＤＡ）、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）であった。
【０２３５】
図１８に示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ及びＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ誘導体は、環状ＭＬ  ＣＤＧ及び環状ＭＬ  ＣＤＡ環状ジヌクレオチド分子と比較して、強力な抗腫瘍効果を誘導した。ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ分子は、ＭＬ  ＣＤＡ誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｃｅ）（Ｐ＝０．０００４、スチューデントｔ検定）よりも著しく多くの腫瘍拒絶を誘導し、マウスは、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ腫瘍群においては、腫瘍移植後４４日目までにほぼ腫瘍がなかった。これらのデータは、ＭＬ  ＣＤＮ誘導体分子と比較して、Ｂ１６黒色腫マウスモデルにおいてＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ誘導体の効力の強化及びＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ分子の有意な抗腫瘍効果を示す。
【０２３６】
誘導体分子の抗腫瘍免疫を促進する能力をさらに評価するために、ＣＴ２６結腸癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中２×１０５個の細胞）を、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射により移植し、全生存について評価した。ＣＤＮ化合物（１００μＬのＨＢＳＳの全体積中２５μｇ）を、尾の基底部への皮下注射によって腫瘍移植から１日後に投与した。マウスは、合計２回のワクチン接種のために、１週間後に、さらなる注射で追加免疫した。
【０２３７】
図１９Ａに示されるように、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）は、環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＣＤＧ）分子（Ｐ＝０．００１８、ログランク検定）と比較して、著しく高い生存率を誘導し、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）は、環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＣＤＡ）分子（Ｐ＝０．０００５、ログランク検定）と比較して、著しく高い生存率を誘導した。これは、ＣＴ２６肺転移生存モデルにおいて、ＭＬ  ＣＤＮ誘導体分子と比較して、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ誘導体の有意な抗腫瘍効果を示す。これらの結果は、ＣＤＮ誘導体分子が、首尾よく皮下に投与することができることを示す。
【０２３８】
腫瘍開始Ｔ細胞の初回免疫の活性化及びＣＤＮ誘導体分子によって誘導された抗腫瘍効果が単一の腫瘍型及びマウス遺伝的背景に限定されなかったことを示すために、他の腫瘍モデルにおいて合成ＣＤＮの抗腫瘍免疫を促進する能力を試験した。ＣＴ２６結腸癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）または４Ｔ１乳癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）のいずれかを、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）の脇腹上に皮下移植した。腫瘍移植後の約１４日目である、腫瘍が約７５ｍｍ３の体積に達したときに、処理を開始した。化合物Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）またはＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）化合物（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中２５μｇ）、またはＨＢＳＳビヒクル対照、及びＲｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）またはＨＢＳＳビヒクル対照を、２７ゲージ針を用いて、腫瘍の中央に皮下注射により投与した。合計３回の腫瘍内注射については、３日毎に注射を繰り返した。
【０２３９】
図１９Ｂに示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧは、８匹のマウスのうちの７匹のマウスにおいて腫瘍成長を完全に抑制したが、一方、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡは、すべての確立されたＣＴ２６腫瘍の腫瘍成長を完全に抑制した。図１９Ｃに示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ誘導体は、すべての確立された４Ｔ１乳腺腫瘍の腫瘍成長を完全に抑制した。これらのデータは、複数の腫瘍モデルにおいて、合成混合結合ＲｐＲｐジチオ環状ジヌクレオチド（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮ）誘導体の特筆すべき効力及び永続的な抗腫瘍効果を示す。
【０２４０】
実施例１０．ＣＤＮ誘導性抗腫瘍効果は、ＳＴＩＮＧ依存性である
【０２４１】
誘導体分子の効果がＳＴＩＮＧ依存性であるかどうかを判定するために、Ｂ１６黒色腫細胞（１００μＬのＰＢＳ中５×１０４個の細胞）を、６〜８週齢の雌ｇｏｌｄｅｎｔｉｃｋｅｔ  ＳＴＩＮＧ−／−マウスまたは野生型Ｃ５７ＢＬ／６対照マウス（１群当たり５匹のマウス）の右脇腹に移植した。腫瘍移植後の１４日目に、腫瘍が約７５ｍｍ３の体積に達したときに、処理を開始した。投与した化合物は、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ｇ（２’，５’）ｐＧ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧ）（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中２５μｇ）、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ  １６６８（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）、またはＨＢＳＳビヒクル対照であった。マウスは、２７ゲージ針を用いて、腫瘍の中央のみへの皮下注射により処理した。合計３回の腫瘍内注射については、３日毎に注射を繰り返した。
【０２４２】
図２０Ａに示されるように、誘導体ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＮは、ＨＢＳＳ対照と比較して野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて劇的な腫瘍阻害を生じ、ＴＬＲ９アゴニストＣｐＧ  １６６８（Ｐ＝０．０３、スチューデントｔ検定）よりも有意な腫瘍阻害であった。図２０Ｂでは、腫瘍成長は、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＧまたはＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡのいずれによっても阻害されず、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（図２０Ａ）において観察された抗腫瘍効果が機能的なＳＴＩＮＧシグナル伝達経路に完全に依存していたことを示す。対照的に、ＣｐＧ  １６６８の腫瘍成長は、ＨＢＳＳ対照（Ｐ＝０．０３、スチューデントｔ検定）と比較して、野生型及びＳＴＩＮＧ−／−マウスの両方に類似しており、この化合物の作用がＳＴＩＮＧ非依存性であることを示す。
【０２４３】
実施例１１．ＣＤＮ誘導体は、持続的かつ効果的な抗腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を誘導する
【０２４４】
合成誘導体ＣＤＮ分子が持続的かつ有効な抗腫瘍Ｔ細胞免疫を生じるかどうかを判定するために、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）に、ＣＴ２６結腸癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）を移植した。マウスは、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）化合物（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）またはＨＢＳＳビヒクル対照により処理し、腫瘍成長は、上述の実施例のようにモニタリングした。マウスは、腫瘍移植後１８日目に出血し、ＰＢＭＣをＦｉｃｏｌｌ勾配（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって単離した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、支持細胞として１×１０５個のナイーブ脾細胞の存在下で、培地のみ（非刺激）または１μＭの内因性Ｈ−２  Ｌｄ制限された腫瘍拒絶抗原ＡＨ１ペプチドを用いて、５×１０４個のＰＢＭＣを一晩刺激した。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔプレートを作成し、ＣＴＬプレートリーダー及びＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔソフトウェアを用いて定量化した。腫瘍移植後５５日目に、生存マウス及び年齢をマッチさせたナイーブ対照マウスに、ＣＴ２６または４Ｔ１のいずれか（両方とも、１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）の腫瘍細胞（１群当たり４匹のマウス）とともに、対側側腹に移植した。
【０２４５】
図２１Ａに示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡにより処理されたすべてのマウスは、確立されたＣＴ２６結腸癌の成長を拒絶した。この効果が適応Ｔ細胞免疫応答のＣＤＮ媒介性誘導によって媒介されたことを決定するために、ＰＢＭＣは、腫瘍誘導後１８日目に、内因性腫瘍抗原ＡＨ１による刺激に応答した、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＩＦＮ−γ誘導について評価した。図２１Ｂに示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡにより処理されたマウスから単離したＰＢＭＣは、ＨＢＳＳで処理された対照群（Ｐ＝０．００３、スチューデントｔ検定）と比較して、ＡＨ１ペプチド刺激に応答して、有意に高いＩＦＮ−γを生じた。さらに、図２１Ｃでは、対側腫瘍により再投与された生存マウスは、同じＣＴ２６腫瘍型に対して完全な保護を示し、一方、４Ｔ１腫瘍型の成長を阻害しなかったことを示した。これらのデータは、処理された腫瘍と、腫瘍投与を拒否し得る安定的な腫瘍抗原特異的メモリＴ細胞集団の両方の拒否をもたらす、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡの持続的かつ効果的な腫瘍特異的Ｔ細胞媒介性抗腫瘍免疫を生じる能力を示す。
【０２４６】
ＣＤＮ誘導体分子が代替の腫瘍モデルにおいて効果的かつ持続的な抗腫瘍免疫を生じるかどうかを判定するために、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）に、４Ｔ１乳癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）を移植した。マウスは、上述の実験のように、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）化合物（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）またはＨＢＳＳビヒクル対照により処理した。腫瘍移植後３５日目に、生存マウス及び年齢をマッチさせたナイーブ対照マウスに、ＣＴ２６または４Ｔ１のいずれか（両方とも、１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）の腫瘍細胞（１群当たり４匹のマウス）とともに、対側側腹に移植した。
【０２４７】
図２２Ａに示され、上に示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡによる処理は、確立された４Ｔ１乳癌の腫瘍成長を完全に阻害した。さらに、図２２Ｂでは、対側側腹への４Ｔ１腫瘍細胞による再投与は、完全な保護を誘導した。さらに免疫原性ＣＴ２６腫瘍による再投与はまた、完全な保護を生じ、これらの腫瘍が同様の腫瘍抗原を共有することを示し、合成ＣＤＮ誘導体分子の効力のさらなる証拠を提供した。
【０２４８】
実施例１２．ＣＤＮ合成誘導体を用いた腫瘍内投与による腫瘍開始Ｔ細胞の初回免疫の活性化は、未照射部位への腫瘍阻害を誘導する。
【０２４９】
本明細書に示される実施例は、合成ＣＤＮ誘導体の腫瘍内（ＩＴ）注射が、炎症性サイトカインのＳＴＩＮＧ依存性活性化により、特筆すべき持続的な腫瘍の崩壊をもたらし、効果的な腫瘍特異的Ｔ細胞免疫の発達を促進することを示す。腫瘍特異的Ｔ細胞免疫のＳＴＩＮＧ依存性誘導は、自己腫瘍によるその後の投与から動物を保護する。当業者には、進行癌が転移性であり、効果的であり、治療法が遠位の塊の増殖を阻害しなければならないことを明らかとなるであろう。遠位の未処理の腫瘍塊の腫瘍増殖を阻害するものまたは選択された病変の処理は、未照射部位への効果として知られている。合成ＣＤＮ誘導体分子を含む選択された腫瘍のＩＴ注射が遠位の未処理腫瘍の腫瘍増殖を阻害したかどうかを試験するために、（Ａ）ＣＴ２６結腸癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）及び（Ｂ）４Ｔ１乳癌細胞（１００μＬのＰＢＳ中１×１０５個の細胞）を、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）の対側側腹に皮下移植した。腫瘍移植後１３日目に、腫瘍が約７５ｍｍ３の体積に達したときに、処理を開始した。Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）化合物（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）またはＨＢＳＳビヒクル対照を、２７ゲージ針を用いて、原発（右側）腫瘍の中央のみに皮下注射により投与した。合計３回の腫瘍内注射については、３日毎に注射を繰り返した。
【０２５０】
図２３に示されるように、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）化合物は、ＨＢＳＳビヒクル対照と比較して、ＣＴ２６（図２３Ａ）及び４Ｔ１（図２３Ｂ）担腫瘍動物の両方における処理された原発腫瘍の完全阻害を誘導した。さらに、腫瘍モデルの両方において対側（未処理）腫瘍の増殖はまた、ＨＢＳＳ対照（図２３Ａ  Ｐ＝０．００１１、図２３Ｂ  Ｐ＝０．００１９、スチューデントｔ検定）と比較して、有意に阻害した。これらのデータは、原発腫瘍に注射されたとき、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ誘導体の有意な抗腫瘍効果、ならびにその有意な未照射部位への抗腫瘍免疫効果を示す。
【０２５１】
合成ＣＤＮ誘導体分子が代替の腫瘍モデル及びマウス遺伝的背景において未照射部位への抗腫瘍免疫を促進するかどうかを判定するために、６〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり８匹のマウス）の右脇腹に、Ｂ１６黒色腫細胞（１００μＬのＰＢＳ中５×１０４個の細胞）を移植した。１週間後、年齢をマッチさせたナイーブ対照マウスの一群とともに、肺を移植するために、マウスに、１×１０５個のＢ１６黒色腫細胞を皮下移植した。１３日目に、皮下の脇腹腫瘍が約７５ｍｍ３に達したとき、マウスは、上述のプロトコルのように、３回の注射については、Ｒｐ，Ｒｐジチオ環状［Ａ（２’，５’）ｐＡ（３’，５’）ｐ］（ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡ）（４０μＬのＨＢＳＳの全体積中５０μｇ）またはＨＢＳＳビヒクル対照を用いて腫瘍内処理した。皮下腫瘍移植後２８日目（静脈注射後２１日目）に、マウスを殺処分し、肺を採取し、固定し（１０％  中性緩衝ホルマリン）、腫瘍結節の数を、解剖顕微鏡を用いて計数した。
【０２５２】
図２４Ａ及び上述の実験に示されるように、ＭＬ  ＲＲ−ＣＤＡによる処理は、ＨＢＳＳ対照群（Ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定）と比較して、原発性脇腹腫瘍の腫瘍成長を有意に阻害した。さらに、図２４Ｂ中及び図２４Ｃ中に示されるように、ＣＤＮ誘導体による処理は、ＨＢＳＳ及びナイーブ（静脈注射のみ）の腫瘍群と比較して、遠位肺腫瘍結節の成長を有意に阻害した。本明細書に示される結果は、処理した腫瘍の崩壊によって示されるように、炎症性サイトカインのＳＴＩＮＧ依存性活性化及び未処理の遠位腫瘍の増殖を阻害する効果的な腫瘍特異的Ｔ細胞免疫の発現により、合成ＣＤＮ誘導体の腫瘍内（ＩＴ）注射が未照射部位への抗腫瘍効果をもたらすことを示す。
【０２５３】
当業者であれば、本発明が、目的を達成して、記載される結果及び利点ならびに本発明に内在する結果及び利点を得るために十分に適応していることを容易に理解する。本明細書に提供される実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、典型的なものであって、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０２５４】
本発明は、その適用が以下の説明に記載されるまたは図面に図示される構成の詳細及び構成要素の配置に限定されないことを理解するべきである。本発明は、記載されるものに加えて、実施形態が可能であり、かつ様々な方法で実践及び実施することが可能である。また、本明細書で使用される表現及び用語ならびに要約は、説明を目的とするものであり、限定するものとして見なされるべきではないことを理解するすべきである。
【０２５５】
したがって、当業者であれば、本開示が基づく概念を、本発明のいくつかの目的を実施するための他の構造、方法、及びシステムを設計するための基礎として容易に用い得ることが理解されよう。したがって、特許請求の範囲は、本発明の精神及び範囲を逸脱しない限り、このような同等の構成を含むものと見なされることが重要である。
【０２５６】
本発明は、当業者がこれを作製し、使用するのに十分詳細に説明及び例示されているが、様々な代替、修正、及び改善が本発明の範囲及び範囲から逸脱することなく明らかになるはずである。本明細書に提供される実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。その中の修飾及び他の用途が当業者には思い浮かぶであろう。これらの修正は、本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲によって定義される。
【０２５７】
当業者には、様々な置換及び修正を、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して行い得ることが、容易に明らかとなるであろう。
【０２５８】
本明細書で言及されたすべての特許及び刊行物は、本発明に関する当業者の水準を示す。すべての特許及び刊行物は、それぞれ個々の刊行物が、参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５９】
本明細書で図示的に説明された本発明は、本明細書に具体的に開示されていないいかなる要素または複数の要素、限定または複数の限定がない場合にも好適に実践することができる。したがって、例えば、本明細書の各事例において、「含む」、「本質的になる」、及び「からなる」という表現のいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。採用されている用語及び表現は、限定ではなく説明のための用語として使用され、そのような用語及び表現の使用において、示され、記載された特定のいずれの同等物またはその一部を除くことを意図するものではなく、様々な修正が、特許請求される本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特性によって具体的に開示されたが、当業者であれば、本明細書に開示された概念の修正及び変形を用いることが可能であり、そのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０２６０】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に記載される。
本願は、以下の態様を包含し得る。
［１］  組成物であって、
ＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を誘導する１つ以上の環状プリンジヌクレオチドであって、前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドが、以下の構造：
【化４】
0006453855.tif 000019
（ａ）であって、
【化５】
0006453855.tif 000020
（ｂ）に共有結合される、（ａ）を有し、
式中、
Ｒ３が、（ｂ）の５’炭素への共有結合であり、
Ｒ４が、（ｂ）の２’または３’炭素への共有結合であり、
Ｒ１が、プリンであって、そのＮ９窒素を介して（ａ）のリボース環に結合された、プリンであり、
Ｒ５が、プリンであって、そのＮ９窒素を介して（ｂ）のリボース環に結合された、プリンであり、
Ｘ１及びＸ２の各々が独立して、ＯまたはＳであり、
Ｒ２が、Ｈであるか、または１〜１８個の炭素及び０〜３個のヘテロ原子の任意に置換された直鎖アルキル、１〜９個の炭素の任意に置換されたアルケニル、１〜９個の炭素の任意に置換されたアルキニル、もしくは任意に置換されたアリールであり、存在する場合、置換基（複数を含む）が独立して、Ｃ１−６アルキル直鎖もしくは分枝鎖、ベンジル、ハロゲン、トリハロメチル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、＝Ｏ、−ＣＯＯＲ’からなる群から選択され得、式中、Ｒ’がＨであるか、または低級アルキル、−ＣＨ２ＯＨ、及び−ＣＯＮＨ２であり、
（ａ）と共有結合していない（ｂ）の２’または３’炭素が−Ｏ−Ｒ６であり、式中、Ｒ６が、Ｈであるか、または１〜１８個の炭素及び０〜３個のヘテロ原子の任意に置換された直鎖アルキル、１〜９個の炭素の任意に置換されたアルケニル、１〜９個の炭素の任意に置換されたアルキニル、もしくは任意に置換されたアリールであり、存在する場合、置換基（複数を含む）が独立して、Ｃ１−６アルキル直鎖もしくは分枝鎖、ベンジル、ハロゲン、トリハロメチル、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＯＨ、＝Ｏ、−ＣＯＯＲ’からなる群から選択され得、式中、Ｒ’がＨであるか、または低級アルキル、−ＣＨ２ＯＨ、及び−ＣＯＮＨ２である、１つ以上の環状プリンジヌクレオチド、
またはそのプロドラッグもしくは薬学的に許容される塩を含む、組成物。
［２］  Ｒ４が（ｂ）の２’炭素への共有結合である、上記［１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［３］  Ｒ４が（ｂ）の３’炭素への共有結合である、上記［１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［４］  Ｒ２及びＲ６がいずれもＨではない、上記［１］〜［３］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［５］  Ｒ２及びＲ６の一方または両方が、細胞内エステラーゼによって除去されるプロドラッグ離脱基を含む、上記［４］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［６］  前記プロドラッグ離脱基が、Ｃ６〜Ｃ１８脂肪酸エステルである、上記［５］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［７］  Ｒ２及びＲ６の一方または両方がミリストイルである、上記［５］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［８］  Ｒ２及びＲ６の一方または両方がペンタノイルである、上記［５］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［９］  Ｒ２及びＲ６の一方または両方がヘキサノイルである、上記［５］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１０］  Ｒ２及びＲ６の一方または両方がヘプタノイルである、上記［５］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１１］  Ｘ１及びＸ２が両方ともにＳである、上記［１］〜［１０］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１２］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドが、１つ以上の実質的に純粋なＳｐ，Ｓｐ、Ｒｐ，Ｒｐ、ＳｐＲｐ、またはＲｐ，Ｓｐ立体異性体を含む、上記［１４］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１３］  Ｒ１及びＲ５が独立して、アデニン、グアニン、イノシン、及びキサンチンからなる群から選択される、上記［１］〜［１２］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１４］  Ｒ１及びＲ５の一方または両方がアデニンである、上記［１３］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１５］  Ｒ１及びＲ５の一方または両方がグアニンである、上記［１３］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１６］  Ｒ１がアデニンであり、Ｒ５がグアニンである、上記［１３］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１７］  前記組成物が、３’−５’結合を有するｃ−ジ−ＧＭＰと比較して、ＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を少なくとも２倍、より好ましくは５倍、または１０倍誘導する、上記［１］〜［１６］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１８］  前記環状プリンジヌクレオチドが、前記環状プリンジヌクレオチドの細胞内取り込み及び／または安定性を増強する送達ビヒクルとともに製剤化される、上記［１］〜［２０］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［１９］  前記送達ビヒクルが、脂質、二層間架橋多層状小胞、生分解性ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）［ＰＬＧＡ］系またはポリ無水物系ナノ粒子もしくは微粒子、及びナノ多孔性粒子支持脂質二重層からなる群から選択された１つ以上の薬剤を含む、上記［１８］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２０］  ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＴＬＲアゴニスト、ＣｐＧ、及び／またはモノホスホリル脂質Ａをさらに含む、上記［１］〜［１９］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２１］  樹状細胞の誘導、動員、及び／または成熟を刺激する１つ以上のサイトカインを発現及び分泌する不活性化腫瘍細胞をさらに含む、上記［１］〜［２０］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２２］  前記不活性化腫瘍細胞が、ＧＭ−ＣＳＦを発現及び分泌する、上記［２１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２３］  前記不活性化腫瘍細胞が、ＣＣＬ２０を発現及び分泌する、上記［２１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２４］  前記不活性化腫瘍細胞が、ＣＣＬ３を発現及び分泌する、上記［２１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２５］  前記不活性化腫瘍細胞が、ＩＬ−１２ｐ７０を発現及び分泌する、上記［２１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２６］  前記不活性化腫瘍細胞が、ＦＬＴ−３リガンドを発現及び分泌する、上記［２１］に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２７］  前記腫瘍細胞が、放射線での治療によって不活性化される、上記［２１］〜［２６］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２８］  前記組成物が個体に投与されたときに、抗原（複数を含む）に対する免疫応答を誘導する目的のために選択された１つ以上の抗原をさらに含む、上記［１］〜［２６］の一項に記載の実質的に純粋な環状プリンジヌクレオチド組成物。
［２９］  個体における免疫応答を誘導する方法であって、
前記個体に、上記［１］〜［２８］の一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
［３０］  個体におけるＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を誘導する方法であって、
前記個体に、上記［１］〜［２８］の一項に記載の組成物を、ＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン産生を誘導するのに十分な量で投与することを含む、前記方法。
［３１］  癌に罹患している哺乳動物の治療のための方法であって、
前記癌抗原を発現する癌細胞を除去するか、または死滅させるための前記哺乳動物に投与される一次療法の前または後に、前記哺乳動物に、有効量の上記［１］〜［２８］の一項に記載の組成物を前記個体に投与することを含む、前記方法。
［３２］  前記組成物が、前記一次療法の後に投与される、上記［３１］に記載の方法。
［３３］  前記一次療法が、前記哺乳動物から前記癌細胞を除去するための外科手術、前記哺乳動物における前記癌細胞を死滅させるための放射線療法、または外科手術及び放射線療法の両方を含む、上記［３１］または［３２］に記載の方法。
［３４］  癌に罹患している哺乳動物の治療のための方法であって、
前記哺乳動物に、有効量の上記［１］〜［２８］の一項に記載の組成物を非経口投与することを含む、方法。
［３５］  前記非経口投与が、皮下、筋肉内、または皮内である、上記［３４］に記載の方法。
［３６］  前記非経口投与が、腫瘍塊への直接投与である、上記［３４］に記載の方法。
［３７］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドのＸ１及びＸ２が、両方ともにＳである、上記［２９］〜［３６］の一項に記載の方法。
［３８］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドが、１つ以上の実質的に純粋なＳｐ，Ｓｐ、Ｒｐ，Ｒｐ、ＳｐＲｐ、またはＲｐ，Ｓｐ立体異性体を含む、上記［３７］に記載の方法。
［３９］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドが、実質的に純粋なＲｐ，Ｒｐ立体異性体を含む、上記［３８］に記載の方法。
［４０］  前記方法が、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＰＤ−１経路アンタゴニスト、またはＴＬＲアゴニストのうちの１つ以上を投与することをさらに含む、上記［２９］〜［３９］の一項に記載の方法。
［４１］  前記方法が、前記哺乳動物に、１つ以上の治療抗体を投与することをさらに含む、上記［２９］〜［３９］の一項に記載の方法。
［４２］  個体における抗体依存性細胞傷害性を刺激する方法であって、前記個体に、抗体依存性細胞傷害性を誘導する１つ以上の治療抗体と一緒に、上記［１］〜［２８］の一項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
［４３］  前記投与が非経口である、上記［４２］に記載の方法。
［４４］  前記投与が、皮下、筋肉内、または皮内である、上記［４３］に記載の方法。
［４５］  前記非経口投与が、腫瘍塊への直接投与である、上記［４４］に記載の方法。
［４６］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドのＸ１及びＸ２が、両方ともにＳである、上記［４２］〜［４５］の一項に記載の方法。
［４７］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドが、１つ以上の実質的に純粋なＳｐ，Ｓｐ、Ｒｐ，Ｒｐ、ＳｐＲｐ、またはＲｐ，Ｓｐ立体異性体を含む、上記［４６］に記載の方法。
［４８］  前記組成物中に存在する前記環状プリンジヌクレオチドが、実質的に純粋なＲｐ，Ｒｐ立体異性体を含む、上記［４７］に記載の方法。
【図１】
0006453855.tif 000023
【図２Ａ】
0006453855.tif 000024
【図２Ｂ】
0006453855.tif 000025
【図２Ｃ】
0006453855.tif 000026
【図３Ａ】
0006453855.tif 000027
【図３Ｂ】
0006453855.tif 000028
【図３Ｃ】
0006453855.tif 000029
【図３Ｄ】
0006453855.tif 000030
【図３Ｅ】
0006453855.tif 000031
【図３Ｆ】
0006453855.tif 000032
【図３Ｇ】
0006453855.tif 000033
【図３Ｈ】
0006453855.tif 000034
【図４】
0006453855.tif 000035
【図５】
0006453855.tif 000036
【図６】
0006453855.tif 000037
【図７】
0006453855.tif 000038
【図８】
0006453855.tif 000039
【図９（ａ）】
0006453855.tif 000040
【図９（ｂ）】
0006453855.tif 000041
【図９（ｃ）】
0006453855.tif 000042
【図１０】
0006453855.tif 000043
【図１１Ａ】
0006453855.tif 000044
【図１１Ｂ】
0006453855.tif 000045
【図１１Ｃ】
0006453855.tif 000046
【図１２】
0006453855.tif 000047
【図１３】
0006453855.tif 000048
【図１４】
0006453855.tif 000049
【図１５Ａ】
0006453855.tif 000050
【図１５Ｂ】
0006453855.tif 000051
【図１６】
0006453855.tif 000052
【図１７】
0006453855.tif 000053
【図１８】
0006453855.tif 000054
【図１９Ａ】
0006453855.tif 000055
【図１９Ｂ】
0006453855.tif 000056
【図１９Ｃ】
0006453855.tif 000057
【図２０Ａ】
0006453855.tif 000058
【図２０Ｂ】
0006453855.tif 000059
【図２１Ａ】
0006453855.tif 000060
【図２１Ｂ】
0006453855.tif 000061
【図２１Ｃ】
0006453855.tif 000062
【図２２Ａ】
0006453855.tif 000063
【図２２Ｂ】
0006453855.tif 000064
【図２３Ａ】
0006453855.tif 000065
【図２３Ｂ】
0006453855.tif 000066
【図２４Ａ】
0006453855.tif 000067
【図２４Ｂ】
0006453855.tif 000068
【図２４Ｃ】
0006453855.tif 000069