(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養液を蓄えたリング状凹部と該リング状凹部の内側に貫通孔を備えた培養液容器と、
強磁性体を材料とし、該培養液容器の貫通孔を貫通するように配置された磁気コアと、
該磁気コアに巻設された励磁コイルと、
該磁気コアに巻設されたバイアスコイルと、
該励磁コイルに変動電流を供給する励磁コイル用電源と、
該バイアスコイルに直流電流を供給するバイアスコイル用直流電源より構成されていることを特徴とする培養液中の細胞の電気刺激装置。
【請求項２】
該バイアスコイルのインダクタンスを超えるインダクタンスを持つインダクターを介して該バイアスコイル用直流電源と該バイアスコイルが接続されていることを特徴とする請求項１に記載の培養液中の細胞の電気刺激装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養液中の細胞に電気刺激を行う装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、細胞へ電気的刺激を加えることにより、様々な細胞機能の制御が可能であることがわかってきている。現在までに報告されている効果として、「（１）特定遺伝子の発現やタンパク質産生」、「（２）細胞の分化誘導」、「（３）細胞の形態変化」、「（４）膜流動性の減少効果」、「（５）細胞増殖の遅延効果」、などが発見されている。
【０００３】
「（１）特定遺伝子の発現やたんぱく質の産生」の一例として、筋芽細胞の培養過程において培養液中に間歇的な電圧変化を加えることで、筋細胞の分化を促進するタンパク質（Ｃｘ４３）の発現が確認されている（非特許文献１）。また、一定方向の電気刺激下にて筋芽細胞を培養することにより、培養された細胞に収縮能を獲得させることができることも確認されている（非特許文献２）。
【０００４】
また、電気刺激による「（２）細胞の分化誘導」の一例として、ラット副腎髄質の好クロム性細胞腫ＰＣ１２に対する細胞分化誘導があげられる。このＰＣ１２細胞は、神経成長因子(ＮＧＦ)存在下で培養すると神経様細胞に分化し、神経突起をＮＧＦの分布する方向へ伸長させる。最近の研究では、ＮＧＦなしでも、矩形変動電圧を加えながら９６時間培養することによって、ＰＣ１２は神経様細胞に分化することが発見された(非特許文献３）。
【０００５】
上記のような電気刺激を用いた細胞培養方法については、特許出願もされており、特許文献１、２においては、培養液に浸漬された電極を用いて細胞に所定時間以上の電気刺激を与えることにより、細胞の分化を誘導する細胞分化誘導法が示されている。一方、電気ではなく磁場を用いて細胞機能制御を行う技術についても特許出願がなされている。特許文献３では、高周波交番磁界を印可することにより、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させ、神経栄養因子群の合成および細胞外への放出を促進させる装置について公開されている。
【０００６】
上記に示したように、電気刺激を用いた細胞制御方法は今後様々な医療分野への応用が期待されているが、いくつかの問題を抱えている。特に大きな問題は電極の問題である。培養液中に電気刺激を加えるためには、電極を培養液に接する（浸漬する）状態としその上で電圧を加えることになる。その際、培養液と電極の間では電子の授受が行われるが、その結果として、電極の金属はイオン化して培養液に溶出し、培養液中のイオンは電子を受け取り電極上に析出する。培養液の主体である水（Ｈ2Ｏ）は電気分解され、水素と酸素となって培養液中に放出される。その結果、培養液中のｐＨは変動し、加えて特定のイオンの濃度が変化してしまい、一定の培養環境を保持し続けることは難しい。そのため、培養液の化学的環境の定期的な調整が必要となってしまうという問題がある。培養液の化学的環境の変化は細胞の培養条件を固定できていないことを意味しており、研究の信頼性に関わる課題である。
【０００７】
また、特に臨床応用を目的として行われる細胞培養は、その過程において無菌状態を維持することが極めて重要である。細胞培養容器自体は滅菌状態にて納品されるため、再利用しない限りは滅菌の手間暇が必要ではないが、電極は基本的に再利用が前提となるため、実験のたびに滅菌処理を行う必要があり、無菌状態の維持に困難さを伴う。
【０００８】
このような状況に鑑み出願人らは、鋭意研究を重ね、電極を用いない培養液中細胞の電気刺激装置およびその方法を開発し、特許出願をおこなった。具体的な発明の形態について図１０を用いて説明する。図１０に示す通り、開発された装置Ｂは、大きくわけて培養液容器３、磁気コア１、励磁コイル５、該励磁コイル５に電源供給する励磁コイル用電源８ａより構成される。培養液容器３は、リング状凹部７を持ちその内部に培養液２を蓄えることができる構造となっている。電気刺激時はこのリング状凹部７を電路として渦電流Ｕが発生する。培養液容器３のリング状凹部７の内部には貫通孔６が設けられており、その貫通孔６を強磁性体よりなる磁気コア１が貫通している。磁気コア１には励磁コイル５として導体が巻きまわされており、この励磁コイル５には、変動電流（パルス電流や交流電流）を供給するコイル用電源がケーブルにて接続されている。
【０００９】
具体的な発明の動作原理について説明する。励磁コイル用電源８ａよりケーブルを通して急峻に変化する励磁電流が励磁コイル５に供給されると、この励磁コイル５により発生した起磁力により、磁気コア１が励磁されその内部に磁束ｇが発生する。磁気コア１は強磁性体であるため、その磁束密度はかなり高密度となる。例えばケイ素鋼板を使用すれば最大２．０Ｔ程度、鉄系アモルファス材料を使用すれば１．５Ｔ程度の磁束密度を発生可能である。磁気コア内磁束は、励磁電流の急峻な変化と同期して急峻に変動する。この磁気コア１は培養液容器３を貫通しているため、培養液容器３をこの高密度な変動磁束が貫通することとなる。その結果、電磁誘導により、この変動磁束を打ち消そうとする電界および渦電流が培養液２内に発生し、培養液２内の細胞が刺激されることとなる。誘導電界パルスを発生させる場合の励磁コイル５の電流波形、コア内磁束波形、培養液中に誘導される誘導電界の一例を図８に示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】河原裕美，梅田知佳，吉元玲子，佐々木輝，呉樹亮，弓削類著「筋芽細胞への電気刺激効果」ＪＡＰＡＮＥＳＥＰＨＹＳＩＣＡＬＴＨＥＲＡＰＹＡＳＳＯＣＩＡＴＩＯＮ,２００５（０）、２００６年、Ａ０６１７−Ａ０６１７
【非特許文献２】ＨｉｄｅａｋｉＦｕｊｉｔａ,ＴａｋｕＮｅｄａｃｈｉ,ＭａｋｏｔｏＫａｎｚａｋｉ著「ＡｃｃｅｌｅｒａｔｅｄｄｅｎｏｖｏｓａｒｃｏｍｅｒｅａｓｓｅｍｂｌｙｂｙｅｌｅｃｔｒｉｃｐｕｌｓｅｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｉｎＣ２Ｃ１２ｍｙｏｔｕｂｅｓ」ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬＣＥＬＬＲＥＳＥＡＲＣＨ３１３，２００７年、ｐ.１８５３−１８６５
【非特許文献３】小山純弘，相澤益男著「電気刺激による細胞機能の制御」化学と生物Ｖｏｌ.３８，Ｎｏ.８、２０００年、ｐ.５０３−５０７
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００４−１２９６０３号公報
【特許文献２】特開２００５−０２７５０１号公報
【特許文献３】再表２００８−０５６４１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
前述のように、出願人らにより電極を用いない培養液内細胞電気刺激装置およびその方法が発明された。この発明（以降、本発明に先んずる発明として前発明と呼ぶ。）は、電極を用いない非常に画期的なものであるが、一方、強い刺激（高電流密度＋高電界）のパルスを長いパルス幅にて発生させることが難しいという欠点もある。
【００１３】
磁気コア１がその内部に蓄えることができる磁束密度には限界があり、その限界の磁束密度を飽和磁束密度という。この飽和磁束密度を超える磁束ｇは、磁気コア１の内部にとどまることができず。磁気コア１の外側に溢れ出してしまう。その結果、磁気コア内磁束密度が飽和磁束密度を超える領域にて、前発明を使用しても、培養液２内部の渦電流Ｕおよび電界はわずかに生じるのみであり、非常に小さくなってしまう。よって、磁気コア１内部の磁束密度が飽和しない範囲で使用する必要がある。一方、培養液中に誘導される電界および渦電流密度の大きさは、磁気コア１内部の磁束密度変化の大きさ、すなわち磁束密度変化率にて決まる。磁束密度変化率が高ければ高いほどそれに比例して、誘導電界および渦電流Ｕの大きさは大きくなるが、コア内磁束密度は短い時間で飽和してしまう。逆に、磁束密度変化率が低ければ、コア内磁束密度が飽和するまでの時間は長くなるが、誘導される電界および渦電流密度の大きさは小さくなってしまう。即ち、前発明においては、強い刺激を長いパルスで実現することが難しいという問題がある。
【００１４】
この問題のひとつの解決手段としては、磁気コア１の断面積を拡大するという方法がある。刺激強度は、コア断面積の平方根にほぼ比例するため、コア断面積を４倍にして、磁束密度変化率を半減すれば、刺激強度を下げることなく２倍のパルス幅の電気刺激を行うことができる。しかし、コア断面積が４倍になるということは、コアの重量も４倍近くになることを意味しており、装置の重量化につながってしまう。
【００１５】
本発明の主たる課題は、非接触での培養液中細胞電気刺激における刺激パルスのパルス幅を最大２倍にまで拡大することであり、従たる課題は、細胞刺激のためのパルス幅を細かく制御すること、即ち、パルス幅を可変パラメータとした実験を容易に行うことができる装置の開発にある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
以上の課題に鑑み、本発明は、以下の技術を用いて上記の課題を解決した。請求項１に記載の発明（図１）は、
培養液２中の細胞に電気刺激を与える電気刺激装置Ａであって、
培養液２を蓄えたリング状凹部７と該リング状凹部７の内側に貫通孔６を備えた培養液容器３と、
強磁性体を材料とし、該培養液容器３の貫通孔６を貫通するように配置された磁気コア１と、
該磁気コア１に巻設された励磁コイル５と、
該磁気コア１に巻設されたバイアスコイル１０と、
該励磁コイル５に変動電流を供給する励磁コイル用電源８ａと、
該バイアスコイル１０に直流電流を供給するバイアスコイル用直流電源８ｂより構成されていることを特徴とする培養液中の細胞の電気刺激装置Ａである。
【００１７】
請求項１の発明によれば、バイアスコイル１０に一定の直流電流を供給することにより、磁気コア１を特定方向に磁化しておき、その状態にて該励磁コイル５に変動電流を供給することにより、磁気コア１内に変動する磁束を発生し、この変動する磁束により培養液容器３に蓄えられた培養液２中に渦電流Ｕを誘導し、この渦電流Ｕをもって培養液容器内細胞を電気刺激する。この時、バイアスコイル用直流電源８ｂの直流電流の供給方向と励磁コイル用電源８ａの変動電流の供給方向とを逆にすれば、刺激強度はそのままで、パルス幅を最大２倍程度まで延長することが可能となる。また、バイアスコイル１０に流す直流電流を調整することでパルス幅の制御をすることも可能となる。
【００１８】
請求項２に記載の発明は、該バイアスコイル１０のインダクタンスを超えるインダクタンスを持つインダクター１１を介して該バイアスコイル用直流電源８ｂと該バイアスコイル１０が接続されていることを特徴とする培養液中の細胞の電気刺激装置Ａである。
【００１９】
請求項２の発明によれば、励磁コイル５による磁気コア１内の磁束変化によってバイアスコイル１０の両端に生じる誘導電圧からバイアスコイル用直流電源８ｂを保護することが可能となる。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の電気刺激装置Ａを用いることにより、非接触での培養液中細胞電気刺激における刺激パルスのパルス幅を最大２倍にまで拡大することが可能となり、刺激が可能な対象範囲を拡大することができる。加えて、バイアスコイル１０の電流制御にて、刺激のパルス幅を細かく制御することも可能となるため、パルス幅を可変パラメータとした実験を容易に行うことが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明の第一の実施形態における使用状態の斜視図である。
【図２】図１における培養容器のセット又は交換時の斜視図である。
【図３】図１の断面図である。
【図４】図２の平面図である。
【図５】本発明で使用される培養容器の斜視図である。
【図６】図５の縦断面図である。
【図７】図１の装置の等価回路図である。
【図８】前発明のコイル電流に対するコア内磁束および培養液中電界の変化を示す図である。
【図９】前発明と本発明の磁気コア内磁束密度波形の比較図である。
【図１０】前発明装置の断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は上記のように、培養液内細胞の電気刺激を行うにあたって、刺激強度（誘導電界および電流密度）を低下させることなく、刺激のパルス幅を拡大することを主たる目的とし、本発明者らは鋭意研究を行った。
【００２３】
その結果、第１にバイアスコイル１０を用いて磁気コア１内部をあらかじめ逆方向に磁化させておき、その状態において励磁コイル５にて正方向に磁化を行うことにより、バイアスコイル１０を用いない場合に比較して最大２倍の大きさのパルス幅にて電気刺激を行うことが可能となった。
【００２４】
第２にバイアスコイル１０の電流値を制御することにより、電気刺激のパルス幅を精密に制御することが可能となった。
【００２５】
第３に、バイアスコイル１０とバイアスコイル用直流電源８ｂとを適当な大きさのインダクタンスを持つインダクター１１を介して接続することにより、バイアスコイル用直流電源８ｂをバイアスコイル１０に発生する起電力から保護することが可能となった。
【００２６】
以下、本発明を図１〜図７を用いて説明する。図１に示す通り、本装置Ａは、大きくわけて培養液容器３、磁気コア１、励磁コイル５、バイアスコイル１０、励磁コイル５に変動電流を供給する励磁コイル用電源８ａ（図３）、バイアスコイル１０に直流電流を供給するバイアスコイル用直流電源８ｂ（図３）、及び培養液容器３を載置するためのステージ４より構成される。
【００２７】
磁気コア１は、ロ字状の閉磁路タイプであるから、上下２分割されており、上部コア１ａと下部コア１ｂに分かれ、固定状態の下部コア１ｂに対して上部コア１ａは軸回転する。
【００２８】
また、ステージ４には下部コア１ｂが挿入される通孔４ａが穿設されている。
【００２９】
培養液容器３は、リング状凹部７を持ちその内部に培養液２を蓄えることができる構造となっている。電気刺激時はこのリング状凹部７を電路として渦電流Ｕが発生する。培養液容器３のリング状凹部７の内部には貫通孔６が設けられており、その貫通孔６を強磁性体よりなる磁気コア１が貫通している。磁気コア１には励磁コイル５、およびバイアスコイル１０として導体が巻設されている。この励磁コイル５には、パルス電流又は交流電流のような変動電流を供給する励磁コイル用電源８ａがケーブルにて接続されており、バイアスコイル１０には、直流電流を供給するバイアスコイル用直流電源８ｂがケーブルにて接続されている。
【００３０】
次に、本発明の動作原理について説明する。バイアスコイル用直流電源８ｂによって、バイアスコイル１０に所定の直流電流を流すことにより、磁気コア１内が磁化された状態となる。直流電流の供給方向は変動電流の反対方向である。
【００３１】
この状態で、励磁コイル用電源８ａよりケーブルを通して急峻に変化する励磁電流が励磁コイル５に供給されると、この励磁コイル５により発生した起磁力により、磁気コア１が励磁されその内部に磁束が発生する。
【００３２】
磁気コア１は強磁性体であるため、その磁束密度はかなり高密度となる。例えば、磁気コア１に電磁鋼板としての積層ケイ素鋼板９を使用すれば、最大２．０Ｔ程度、鉄系アモルファス材料を使用すれば１．５Ｔ程度の磁束密度を発生させることが可能である。磁気コア内磁束は、励磁電流の急峻な変化と同期して急峻に変動する。
【００３３】
この磁気コア１は培養液容器３を貫通しているため、培養液容器３をこの高密度な変動磁束が貫通することとなる。その結果、電磁誘導により、この変動磁束を打ち消そうとする電界および渦電流Ｕが培養液２内に発生し、培養液２内の細胞が刺激されることとなる。
【００３４】
上記動作原理において、バイアスコイル１０により、磁気コア１内が上記のように逆方向の飽和点−Ｂｓ近くまで磁化されていた場合（これを０-で示す。図９）、励磁コイル５が発生するパルス磁界による磁気コア１内部の正方向の磁束変化はコア内磁化が正方向に飽和するまで続く、結果としてバイアスがない場合に比較して２倍程度まで刺激パルスのパルス幅を拡大することが可能となる。これを図９において破線で示す。
【００３５】
これに対して、前発明の場合には、バイアスが掛かっていないので、飽和点Ｂｓ・−Ｂｓの中間点に位置し、この位置を０で示す。この場合のコア磁束密度の変化は実線で示される。
【００３６】
一方、バイアスコイル１０により、磁気コア１内が正方向の飽和点Ｂｓの近くまで磁化されていた場合（これを０＋で示す。）、コア内部のパルス磁界による磁束変化はきわめて小さくなり、ほとんど刺激が起こらない。バイアスコイル１０が発生する磁界強度、即ち、バイアスコイル１０の電流量によって、磁気コア１内部の磁化状態を制御することによって、刺激パルスのパルス幅を制御することが可能となる。なお、図９では、飽和点をＢｓ、−Ｂｓで示す。
【００３７】
なお、このバイアスコイル１０によるパルス幅の拡大・制御方法にはひとつの問題がある。それは、励磁コイル５により磁気コア１内部の磁束が急速変化した際に、バイアスコイル１０の両端に生じる誘導電圧である。即ち、励磁コイル５による磁束変化を、打ち消そうとする方向にバイアスコイル１０の両端に非常に高い電圧が生じてしまうという問題である。この電圧は場合によっては数千ボルト程度の大きさになるため、バイアスコイル１０と直接バイアスコイル用直流電源８ｂが繋がっている場合、バイアスコイル用直流電源８ｂの出力部にしっかりとした保護回路が設けられていない限りバイアスコイル用直流電源８ｂを破損してしまうことになる。
【００３８】
これを防ぐためには、直流電流は通過できるが急変電流は通過できないような素子を用いればよい。具体的には、磁気コア１に巻設されている状態におけるバイアスコイル１０のインダクタンスを超えるインダクタンスを持ったインダクター１１をバイアスコイル１０とバイアスコイル用直流電源８ｂの間に挿入することが有効である。
【００３９】
磁気コア１内部の磁束変化によってバイアスコイル１０の両端に高電圧が発生したとしても、発生源より高いインダクタンスには、急変電流はほとんど流れ込むことができないため、バイアスコイル用直流電源８ｂとインダクター１１の間には、誘導起電力の影響は非常に軽微となる。一方、インダクター１１は、直流電流を素通しする特性を持つため、バイアスコイル１０によるバイアス磁界の大きさにもほとんど影響が出ない。
【実施例】
【００４０】
次に、本発明の詳細を実施例に基づいて説明する。なお、この実施例は当業者の理解を容易にするためのものである。すなわち、本願発明は明細書の全体に記載される技術思想によってのみ限定されるものであり、本実施例によってのみ限定されるものでないことは理解されるべきことである。
【００４１】
（実施例１）幅９０ｍｍ厚み０．２７ｍｍのケイ素鋼板を１００ｍｍ×８０ｍｍの巻き芯に２３０回程度巻回し、磁路断面積９０ｍｍ×６５ｍｍ、磁路長５６０ｍｍの巻コアを作成し、これを２分割して磁気コアとした。また、幅１６ｍｍx深さ１８ｍｍリング長４００ｍｍのリング状凹部を持つ培養液容器をガラスにて製作した。ガラスの厚みは２ｍｍ、容器の大きさは、幅１０８ｍｍ×奥行１３４ｍｍ×高さ２０ｍｍであり、リング状凹部の内部に６８ｍｍ×９４ｍｍの貫通孔を設けた。また、１ｍｍ×１１ｍｍの平角線を磁気コアに４回巻まわし、これをパルスコイルとした（パルスコイルは励磁コイルと同義で、以下、パルス電流を励磁電流として使用するため、パルスコイルという。同様に励磁コイル用電源もパルスコイル用パルス電源という。）。パルスコイル用パルス電源としては、最大充電電圧７２０Ｖ、内部コンデンサ１０μＦ、モノフェーズ式パルス電源を用いて、パルスコイルとパルス電源を８ｍｍｓｑのケーブルで接続した。また、バイアスコイルとして２ｍｍｓｑの銅線を磁気コアに４０回巻きまわした。バイアスコイル用直流電源としては、市販の３０Ｖ−３Ａの直流電源を用いて、バイアスコイルと直流電源との間を２ｍｍｓｑのケーブルで接続した。また磁気コアの側面にガラスエポキシの板を接着しステージとした。製作した磁気コアがこの貫通孔を貫通するようにステージ上に培養液容器を配置した。その後培養液容器に０．９％食塩水を深さ１５ｍｍまで注いだ。その結果、図１と同様の構成が完成した。
【００４２】
図１と同様の構成が完成したところで、パルス電源から１００Ｖのパルス電圧をパルスコイルに印加したところ、直流電源のヒューズが切れた。これはバイアスコイルの起電力の影響によるものと予想される。
【００４３】
次に、バイアスコイルと直流電源を直結せず、４Ｈのインダクタンスを持つインダクターを挿入した。この状態で、パルス電圧から１００Ｖのパルス電圧を発生した場合、直流電源はヒューズが切れずに動作し続け、バイアスコイルと直流電源間ケーブルの電流を測定したところ、出力電流の変動はほぼ０Ａであった。その後パルス電圧を７２０Ｖまであげても、同様に直流電源に流れ込む変動電流はほぼ０Ａであった。なお、バイアスコイルのインダクタンスは５００ｍＨであった。
【００４４】
バイアスコイルの電流を０Ａに設定し、パルス電源から７２０Ｖのパルスを発生したところ、発生電界のパルス幅は５６μｓであり、その強度は４３７．５Ｖ／ｍであった。その後、バイアスコイルによる磁束変化方向と逆方向に磁気コア内の磁束が飽和するように、バイアスコイルに１.５Ａの電流を通電した状態にて、同様にパルス電源より７２０Ｖのパルスを発生したところ、発生電界のパルス幅は１２０μｓとなり、その強度は４３７．５Ｖ／ｍであった。よって、あらかじめバイアスコイルにて磁気コア内の磁束密度を逆向きに飽和させておくことによって、パルス幅が最大２倍にまで拡大できることが確認できた。
【００４５】
同様に、バイアスコイルの電流を０.５Ａに設定すると、発生電界のパルス幅は８０μｓ、強度は４３７．５Ｖ／ｍでとなり、バイアスコイルの電流を１.０Ａとすると、発生電界のパルス幅は１０４μｓ、強度は４３７．５Ｖ／ｍでとなった。また、バイアスコイルと直流電源の接続を逆にして、バイアスコイルに正電流を流すことによって、磁束が正方向（パルスコイルに正電流を通電した際に生じる磁束変化方向）に向かうような接続をすると、バイアスコイルの電流を１．５Ａにしたあたりで、発生電界のパルス幅が０になりパルスが出なくなった。すなわち、バイアスコイルに流す電流の大きさの制御により、刺激パルスのパルス幅の制御が可能であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
iＰＳ細胞、ＥＳ細胞等の多能性幹細胞の研究をはじめ、各種細胞制御の研究および細胞を用いた製品の製造において、本発明による機器は非常に重要な機器となりうると考える。
【符号の説明】
【００４７】
Ａ・Ｂ：電気刺激装置、Ｕ：渦電流、ｇ・−ｇ：磁束、Ｂｓ・−Ｂｓ：飽和点、１：磁気コア、１ａ：上部コア、１ｂ：下部コア、２：培養液、３：培養液容器、４：ステージ、４ａ：通孔、５：励磁コイル、６：貫通孔、７：リング状凹部、８ａ：励磁コイル用電源、８ｂ：バイアスコイル用直流電源、９：積層ケイ素鋼板、１０：バイアスコイル、１１：インダクター
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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