(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Methylobacterium属又はMethylophilus属に属するメチロトローフの組換え細胞であって、
導入された遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする第一遺伝子を有し、当該第一遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
導入された遺伝子として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする第二遺伝子をさらに有し、当該第二遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
前記メバロン酸経路で作用する酵素群は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼを含み、
前記第一遺伝子は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
をコードするものであり、
前記第二遺伝子は、下記（ｄ１）、（ｄ２）又は（ｄ３）：
（ｄ１）配列番号２３で表される塩基配列を有するＤＮＡ断片がコードする、Streptomyces griseolosporeusのメバロン酸経路酵素群、
（ｄ２）前記（ｄ１）のメバロン酸経路酵素群のアミノ酸配列の１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、メバロン酸経路酵素群としての活性を有するタンパク質、
（ｄ３）前記（ｄ１）のメバロン酸経路酵素群のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、メバロン酸経路酵素群としての酵素活性を有するタンパク質、
をコードするものであり、
メタノールからイソプレンを生産可能であり、
メタノールからイソプレンへの変換効率が２７％以上である組換え細胞。
【請求項２】
ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項１に記載の組換え細胞。
【請求項３】
導入された遺伝子として、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とをさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する請求項１又は２に記載の組換え細胞。
【請求項４】
大腸菌の組換え細胞であって、
導入された遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする第一遺伝子を有し、当該第一遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
導入された遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼをコードする第三遺伝子を有し、当該第三遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
導入された遺伝子として、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする第四遺伝子を有し、当該第四遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
導入された遺伝子として、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする第五遺伝子を有し、当該第五遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、
前記第一遺伝子は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
をコードするものであり、
前記第三遺伝子は、下記（ｅ１）、（ｅ２）又は（ｅ３）：
（ｅ１）配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｅ２）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつメタノールデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質、
（ｅ３）配列番号５で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつメタノールデヒドロゲナーゼの活性を有するタンパク質、
をコードするものであり、
前記第四遺伝子は、下記（ｆ１）、（ｆ２）又は（ｆ３）：
（ｆ１）配列番号９で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｆ２）配列番号９で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ３−ヘキスロース６リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｆ３）配列番号９で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ３−ヘキスロース６リン酸合成酵素の活性を有するタンパク質、
をコードするものであり、
前記第五遺伝子は、下記（ｇ１）又は（ｇ３）：
（ｇ１）配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｇ３）配列番号１３で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつ６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼの活性を有するタンパク質、
をコードするものであり、
メタノールからイソプレンを生産可能であり、
メタノールからイソプレンへの変換効率が１４％以上である組換え細胞。
【請求項５】
ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する請求項４に記載の組換え細胞。
【請求項６】
導入された遺伝子として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子、及び／又は、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する請求項４又は５に記載の組換え細胞。
【請求項７】
非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子は、大腸菌以外の由来のものである請求項６に記載の組換え細胞。
【請求項８】
導入された遺伝子として、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する請求項４〜７のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項９】
ゲラニル二リン酸合成酵素、ネリル二リン酸合成酵素、又はファルネシル二リン酸合成酵素の発現量を抑制する処理が行われたものである請求項１〜８のいずれかに記載の組換え細胞。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の組換え細胞を、メタノールを炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
【請求項１１】
請求項１〜９のいずれかに記載の組換え細胞にメタノールを接触させ、当該組換え細胞に前記メタノールからイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メタノール等からイソプレンを生産可能な組換え細胞、及び当該組換え細胞を用いるイソプレンの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
イソプレンは合成ポリイソプレンのモノマー原料であり、特にタイヤ業界において重要な素材である。近年、石油に依存した基幹化学品の生産プロセスから、植物資源等の再生可能資源からの生産プロセスへの転換技術の開発と実用化が、着実に進んでいる。イソプレンに関しても、例えば、糖を原料とした組換え大腸菌による生産技術が知られている（特許文献１，２、非特許文献１）。
【０００３】
一方、Ｃ１化合物の中でも、メタノールは、天然ガス、及びバイオマスや都市ゴミ等の廃棄物から得られる一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素の混合ガスである合成ガス等から安価に製造される。天然ガスは化石資源の中でも多量に存在し、かつＣＯ2の発生量が比較的少ないことから次世代エネルギー源として注目され、従来の石油から天然ガスへの移行が進んでいる。メタノールは、水に可溶であること等、取り扱いや貯蔵が容易である上、微生物培養の炭素源としても適している。
【０００４】
メチロトローフ（Methylotroph）とは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物の総称名である。メサノトローフ（Methanotroph）、メタン酸化細菌、メタノール資化性細菌、メタノール資化性酵母、メタノール資化性微生物等と呼ばれる微生物は、全てメチロトローフに属するものである。
【０００５】
メチロトローフは、メタノールをホルムアルデヒドに変換後、ホルムアルデヒドをＣ−Ｃ結合を有する有機物に変換する反応を中心代謝とする。図１に示されるように、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、及びキシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が知られている。細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、セリン回路又はＲｕＭＰ経路を保有している。一方、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、ＸｕＭＰ経路を保有している。
【０００６】
また、メチロトローフ細菌は、メタノール要求性の違いから、偏性メチロトローフ（obligate methylotroph）と、他の炭素化合物も利用できる通性メチロトローフ（facultative methylotroph）とに分類される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７６６７６号
【特許文献２】国際公開第２００９／１３２２２０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Yang J., et al., PLoSOne 2012, 7(4), e33509
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
再生可能資源からの生産プロセスについて、その従来技術のほとんどは、上記イソプレン生産技術を含めて、有機物、特に糖、グルセロールもしくは油成分等に依存した、微生物による生産法である。しかし、石油に由来する数多くの基幹化学品の世界的な生産量を賄うには、植物資源等に由来する現状使用可能な糖質、グリセリンや油成分の量では、微生物の炭素源として不足するのは必須である。すなわち、糖質や油成分に依存する微生物による基幹化学品の生産量は、将来に渡っても限定的である。また、このようなプロセスは、食との競合も懸念される。
【００１０】
上記メチロトローフの応用例としては、メタノールからのＳＣＰ（single cell protein）、生分解性プラスチック、アミノ酸等の生産技術が挙げられる。しかし、イソプレン等の、石油に由来する基幹化学品の製造に応用された例は見当たらない。前述のとおり、汎用高分子材料製品に利用されるモノマー化合物は現在全て石油に依存しているが、現在と同質の石油が永久に安価に供給される可能性は極めて低く、新たな効率的な代替プロセスの開発が急務である。なお、微生物による化学品生産のための炭素源を確保する目的で、セルロース、ヘミセルロース、及びリグニン等を含むハードバイオマスを糖化する技術も検討されているが、糖化のための酵素処理等が必要であり、コスト面で大きな問題がある。
【００１１】
上記現状に鑑み、本発明は、メタノール等からイソプレンを生産するための一連の技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記した課題を解決するための１つの様相は、メチロトローフである宿主細胞にイソプレン合成酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【００１３】
イソプレン合成酵素（イソプレンシンターゼ、isoprene synthase）は、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）の異性体であるジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する作用を有する。イソペンテニル二リン酸とジメチルアリル二リン酸間の構造変換は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが触媒する。イソペンテニル二リン酸イソメラーゼは全ての生物に存在する。
そして本様相の組換え細胞は、メチロトローフである宿主細胞にイソプレン合成酵素をコードする遺伝子が導入されたものであり、宿主細胞内で当該遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である。本様相の組換え細胞は、細胞内で合成されたジメチルアリル二リン酸及びイソペンテニル二リン酸を、イソプレン合成酵素の作用によってイソプレンに変換することができる。すなわち、本様相の組換え細胞によれば、前記したＣ１化合物からイソプレンを生産することができる。
【００１４】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００１５】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００１６】
かかる構成により、リブロースモノリン酸経路によるホルムアルデヒド固定化能が付与又は増強される。
【００１７】
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌又は酵母である。
【００１８】
好ましくは、前記酵母は、Pichia属、Hansenula属、又はCandida属に属するものである。
【００１９】
本発明の１つの様相は、Pichia属、Methylobacterium属、又はMethylophilus属に属するメチロトローフの組換え細胞であって、導入された遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする第一遺伝子を有し、当該第一遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、導入された遺伝子として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする第二遺伝子をさらに有し、当該第二遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、前記メバロン酸経路で作用する酵素群は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼを含み、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能であり、メタノールからイソプレンへの変換効率が２７％以上である組換え細胞である。
【００２０】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００２１】
好ましくは、導入された遺伝子として、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とをさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する。
【００２２】
好ましくは、前記第二遺伝子は、放線菌由来のものである。
【００２３】
同様の課題を解決するための他の様相は、宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【００２４】
本様相の組換え細胞は、宿主細胞に「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」、「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」、及び「イソプレン合成酵素をコードする遺伝子」が導入されたものであり、宿主細胞内でこれらの遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である。
すなわち本様相の組換え細胞は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、「イソプレン合成酵素をコードする遺伝子」が導入されているので、細胞内でイソプレン合成酵素を発現することができる。その結果、細胞内で合成されたイソペンテニル二リン酸をイソプレンに変換することができる。すなわち、本様相の組換え細胞によっても、前記したＣ１化合物からイソプレンを生産することができる。
【００２５】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００２６】
同様の課題を解決するための他の様相は、リブロースモノリン酸経路を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【００２７】
本様相は、例えば、リブロースモノリン酸経路を有する非メチロトローフが宿主細胞である態様に相当するものである。
【００２８】
好ましくは、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００２９】
メタノールデヒドロゲナーゼ（methanol dehydrogenase）とアルコールデヒドロゲナーゼ（alcohol dehydrogenase）は、いずれもメタノールをホルムアルデヒドに変換する作用を有する。また、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ（formaldehyde dehydrogenase）はギ酸をホルムアルデヒドに変換する作用を有する。これらの酵素は、いずれも細菌に属するメチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。一方、酵母に属するメチロトローフはメタン酸化活性を有さず、アルコールオキシダーゼ（Alcohol oxidase）の働きによってメタノールをホルムアルデヒドへ変換する作用を有する。酵母もギ酸をホルムアルデヒドへ変換する酵素活性を有する。
【００３０】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００３１】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００３２】
メタンモノオキシゲナーゼ（methane monooxygenase）はメタンをメタノールに変換する作用を有する。メタンモノオキシゲナーゼも、メチロトローフにおけるメタン代謝酵素の１つである。
【００３３】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００３４】
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌又は酵母である。
【００３５】
好ましくは、宿主細胞がメバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有するものであり、メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子、及び／又は、非メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００３６】
かかる構成により、ＤＭＡＰＰの供給源となるＩＰＰの合成能が増強され、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの供給が効率的に行われる。その結果、本様相の組換え細胞は、イソプレン生産能がさらに高いものとなる。
【００３７】
好ましくは、メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子は、放線菌由来のものである。
【００３８】
好ましくは、宿主細胞が非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有するものであり、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子、及び／又は、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００３９】
かかる構成により、ＤＭＡＰＰの供給源となるＩＰＰの合成能が増強され、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰの供給が効率的に行われる。その結果、本様相の組換え細胞は、イソプレン生産能がさらに高いものとなる。
【００４０】
好ましくは、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子は、宿主細胞以外の由来のものである。
【００４１】
本発明の他の様相は、大腸菌の組換え細胞であって、導入された遺伝子として、イソプレン合成酵素をコードする第一遺伝子を有し、当該第一遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、導入された遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼをコードする第三遺伝子を有し、当該第三遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、導入された遺伝子として、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする第四遺伝子を有し、当該第四遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、導入された遺伝子として、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする第五遺伝子を有し、当該第五遺伝子が前記組換え細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能であり、メタノールからイソプレンへの変換効率が１４％以上である組換え細胞である。
【００４２】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００４３】
好ましくは、導入された遺伝子として、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する。
【００４４】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００４５】
好ましくは、導入された遺伝子として、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子、及び／又は、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子をさらに有し、当該遺伝子が前記組換え細胞内で発現する。
【００４６】
好ましくは、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子は、大腸菌以外の由来のものである。
【００４７】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素は、植物由来のものである。
【００４８】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００４９】
好ましくは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００５０】
イソプレン合成酵素の直接の基質はジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）であることから、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を増強することによってもＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換が増強され、イソプレンの生産効率は向上する。
【００５１】
好ましくは、ゲラニル二リン酸合成酵素、ネリル二リン酸合成酵素、又はファルネシル二リン酸合成酵素の発現量を抑制する処理が行われたものである。
【００５２】
ＩＰＰは、ゲラニル二リン酸（ＧＰＰ）、ネリル二リン酸（ＮＰＰ）、又はファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）に変換され得る。そして本様相の組換え細胞は、ゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＰＰ合成酵素）、ネリル二リン酸合成酵素（ＮＰＰ合成酵素）、又はファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰ合成酵素）の発現量を抑制する処理が行われている。かかる構成により、ＤＭＡＰＰの供給源となるＩＰＰの浪費が抑えられ、イソプレン生産能がさらに高いものとなる。
【００５３】
同様の課題を解決するための他の様相は、イソプレン合成酵素を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【００５４】
本様相の組換え細胞は、イソプレン合成酵素を有する宿主細胞に、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」及び「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されたものであり、宿主細胞内で当該遺伝子が発現する。そして、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である。
すなわち本様相の組換え細胞は、「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」が導入されているので、メチロトローフと同様の特性を有している。そして、宿主細胞自身がイソプレン合成酵素を有するので、イソプレン合成酵素の作用によってジメチルアリル二リン酸及びイソペンテニル二リン酸をイソプレンに変換することができる。すなわち、本様相の組換え細胞によっても、前記したＣ１化合物からイソプレンを生産することができる。
【００５５】
好ましくは、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、メタノールデヒドロゲナーゼ又はアルコールオキシダーゼをコードする遺伝子であり、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子は、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００５６】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００５７】
好ましくは、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子は、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子である。
【００５８】
好ましくは、ホルムアルデヒドの固定化経路として、セリン経路、リブロースモノリン酸経路、及びキシルロースモノリン酸経路からなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１炭素同化経路を有する。
【００５９】
好ましくは、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼをコードする遺伝子とがさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００６０】
好ましくは、前記宿主細胞は、細菌又は酵母である。
【００６１】
好ましくは、宿主細胞がメバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有するものであり、メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子、及び／又は、非メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００６２】
好ましくは、メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子は、放線菌由来のものである。
【００６３】
好ましくは、宿主細胞が非メバロン酸経路によるイソペンテニル二リン酸合成能を有するものであり、メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子、及び／又は、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００６４】
好ましくは、非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子は、宿主細胞以外の由来のものである。
【００６５】
好ましくは、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００６６】
かかる構成により、宿主細胞内におけるイソプレン合成酵素の発現量が増強され、イソプレン生産能がさらに高いものとなる。
【００６７】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素は、植物由来のものである。
【００６８】
好ましくは、前記イソプレン合成酵素をコードする遺伝子は、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードするものである。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
【００６９】
好ましくは、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼをコードする遺伝子がさらに導入され、当該遺伝子が宿主細胞内で発現する。
【００７０】
好ましくは、ゲラニル二リン酸合成酵素、ネリル二リン酸合成酵素、又はファルネシル二リン酸合成酵素の発現量を抑制する処理が行われたものである。
【００７１】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法である。
【００７２】
本様相はイソプレンの生産方法に係るものである。本様相では、上記した組換え細胞をメタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として培養することにより、当該組換え細胞にイソプレンを生産させる。本様相によれば、メタノール等からイソプレンを生産することができる。
【００７３】
本発明の他の様相は、上記の組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソプレンを生産させるイソプレンの生産方法である。
【００７４】
本様相では、上記した組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該Ｃ１化合物からイソプレンを生産させる。本様相によっても、メタノール等からイソプレンを生産することができる。
【発明の効果】
【００７５】
本発明の組換え細胞によれば、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、又はホルムアミドからイソプレンを生産することができる。
【００７６】
本発明のイソプレンの生産方法についても同様であり、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、又はホルムアミドからイソプレンを生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路を表す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、本発明の実施形態について説明する。なお、本発明において「遺伝子」という用語は、全て「核酸」あるいは「ＤＮＡ」という用語に置き換えることができる。
【００７９】
本発明の１つの様相は、メチロトローフである宿主細胞にイソプレン合成酵素をコードする遺伝子が導入されてなり、当該遺伝子が前記宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【００８０】
また本発明の他の様相は、宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子と、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【００８１】
上述したように、メチロトローフとは、分子内にＣ−Ｃ結合を有さない炭素化合物、例えばメタン、メタノール、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン等を唯一の炭素源、エネルギー源として利用するＣ１化合物資化性微生物を指す。一般にメチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路、具体的には、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能（経路）とホルムアルデヒド固定化能（ホルムアルデヒドの固定化経路）とを、本来的に保有している。
【００８２】
ホルムアルデヒドの固定化経路としては、図１に示すセリン経路、リブロースモノリン酸経路（ＲｕＭＰ経路）、キシルロースモノリン酸経路（ＸｕＭＰ経路）が挙げられる。一般に、メチロトローフは、ホルムアルデヒドを介した炭素同化代謝経路として、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路を保有している。
【００８３】
ここで、各々のホルムアルデヒド固定化経路（図１）について説明する。
セリン経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（serine hydroxymethyltransferase）によるグリシンと５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸からのセリン生成反応である。５，１０−メチレン−テトラヒドロ葉酸は、ホルムアルデヒドとテトラヒドロ葉酸の結合によって生じる。セリン経路では、１分子のホルムアルデヒドから１分子のアセチルＣｏＡが直接生成する。
【００８４】
ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase、以下「ＨＰＳ」と略記することがある）によるリブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸の生成反応と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phosphate-3-hexuloisomerase、以下「ＰＨＩ」と略記することがある）によるＤ−アラビノ３ヘキスロース６リン酸からのフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）の生成反応である。
本経路で生成するＦ６Ｐ等は解糖系へも供され、その後アセチルＣｏＡや、グリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）及びピルビン酸を生成する。Ｆ６Ｐの場合、１分子あたり、２分子のＧ３Ｐに変換され、次いで２分子のピルビン酸を経て２分子のアセチルＣｏＡが生成する。
【００８５】
ＸｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定に重要な反応は、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（dihydroxyacetone synthase）によるキシルロース５リン酸（Ｘｕ５Ｐ）とホルムアルデヒドからのジヒドロキシアセトン（ＤＨＡ）及びグリセルアルデヒド３リン酸（Ｇ３Ｐ）の生成反応である。本経路で生成したＧ３Ｐは解糖系にも供され、ピルビン酸とアセチルＣｏＡに変換される。ジヒドロキシアセトンもリン酸化によって解糖系へ供され、Ｇ３Ｐ、ピルビン酸、及びアセチルＣｏＡへと変換され得る。
【００８６】
本発明の組換え細胞は、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能なものである。例えば、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼを有する組換え細胞の場合には、メタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
【００８７】
また、メタノールデヒドロゲナーゼやアルコールオキシダーゼに加えてメタンモノオキシゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、メタンをメタノールに変換し、続いてメタノールをホルムアルデヒドに変換することができる。
【００８８】
さらに、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有する組換え細胞の場合には、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
【００８９】
一般に、細菌に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ細菌）は、メタンモノオキシゲナーゼとメタノールデヒドロゲナーゼを有しているので、メタン又はメタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、酵母に分類されるメチロトローフ（メチロトローフ酵母）は、アルコールオキシダーゼを有しているので、メタノールからホルムアルデヒドを合成することができる。また、メチロトローフはホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼを有しており、ギ酸をホルムアルデヒドに変換することができる。
【００９０】
上記メタノールデヒドロゲナーゼには、グラム陰性細菌のメチロトローフに見出されるピロロキノリンキノン（ＰＱＱ: pyrroloquinoline quinone）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＮＡＤ（Ｐ）依存型メタノールデヒドロゲナーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼ、グラム陽性細菌のメチロトローフに見出されるＤＭＮＡ（N,N'-dimethyl-4-nitrosoaniline）依存型メタノールオキシドリダクターゼ（Park H. et al., Microbiology 2010, 156, 463-471）が含まれ、酵母でのメタノールからホルムアルデヒドへの変換は、通常、酸素依存型であるアルコールオキシダーゼによって触媒される。
【００９１】
また、アミンオキシダーゼ（amine oxidase）やメチルアミンデヒドロゲナーゼ（methylamine dehydrogenase）を有する組換え細胞の場合には、メチルアミンをホルムアルデヒドに変換することができる。これらの酵素については、一部のメチロトローフやArthrobacter属細菌が有していることが知られている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
またホルムアミドをホルムアルデヒドに変換する酵素が、一部の微生物で見出されている（Anthony C., The Biochemistry of Methylotroph, 1982, Academic Press Inc.）。
【００９２】
そして、ホルムアルデヒドを経由してイソプレンを生産することができる。
【００９３】
宿主細胞として用いられるメチロトローフの種類としては、特に限定はないが、例えば細菌や酵母に分類されるものを採用することができる。
【００９４】
メチロトローフ細菌としては、例えば、Methylacidphilum属、Methylosinus属、Methylocystis属、Methylobacterium属、Methylocella属、Methylococcus属、Methylomonas属、Methylobacter属、Methylobacillus属、Methylophilus属、Methylotenera属、Methylovorus属、Methylomicrobium属、Methylophaga属、Methylophilaceae属、Methyloversatilis属、Mycobacterium属、Arthrobacter属、Bacillus属、Beggiatoa属、Burkholderia属、Granulibacter属、Hyphomicrobium属、Pseudomonas属、Achromobactor属、Paracoccus属、Crenothrix属、Clonothrix属、Rhodobacter属、Rhodocyclaceae属、Silicibacter属、Thiomicrospira属、Verrucomicrobia属、などに属する細菌が挙げられる。
【００９５】
メチロトローフ酵母としては、例えば、Pichia属、Candida属、Saccharomyces属、Hansenula属、Torulopsis属、Kloeckera属、などに属する酵母が挙げられる。Pichia属酵母の例としては、P. haplophila、P. pastoris、P. trehalophila、P. lindnerii、などが挙げられる。Candida属酵母の例としては、C. parapsilosis、C. methanolica、C. boidinii、C. alcomigas、などが挙げられる。Saccharomyces属酵母の例としては、Saccharomyces metha-nonfoams、などが挙げられる。Hansenula属酵母の例としては、H. wickerhamii、H. capsulata、H. glucozyma、H. henricii、H. minuta、H. nonfermentans、H. philodendra、H. polymorpha、などが挙げられる。Torulopsis属酵母の例としては、T. methanolovescens、T. glabrata、T. nemodendra、T. pinus、T. methanofloat、T. enokii、T. menthanophiles、T. methanosorbosa、T. methanodomercqii、などが挙げられる。
【００９６】
宿主細胞が非メチロトローフである場合には、メタノール等をホルムアルデヒドに変換する経路を有しているとは限らないので、少なくとも「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与する必要がある。さらに、「メタンをメタノールに変換する機能」を付与することが好ましい。これらの機能付与は、上記した酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、実現することができる。
【００９７】
例えば、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、メタノールデヒドロゲナーゼ(例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）をコードする遺伝子やアルコールオキシダーゼ（例えばEC1.13.13）をコードする遺伝子を用いることができる。また、ギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子として、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えばEC1.2.1.46）をコードする遺伝子を用いることができる。さらに、メタンをメタノールに変換する機能を付与する遺伝子として、メタンモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子を用いることができる。
【００９８】
また、メタノール資化性を付与するプラスミドが知られている。例えば、Bacillus methanolicusのメタノール資化性は、メタノール代謝に関わる酵素群をコードするプラスミドに依存している（Brautaset T. et al., J. Bacteriology 2004, 186(5), 1229-1238）。このようなプラスミドを近縁の非メチロトローフに導入することで、メタノール資化能を付与することが可能である。さらには、このようなプラスミドを改変することで、様々な非メチロトローフにメタノール資化性を付与することも可能である。
【００９９】
上記のようにして非メチロトローフに対して「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与し、さらに「ホルムアルデヒドの固定化能」を付与することにより、非メチロトローフをメチロトローフと同様に取り扱うことが可能となる。ホルムアルデヒド固定化能の付与は、例えば、上記したセリン経路、ＲｕＭＰ経路、又はＸｕＭＰ経路で作用する酵素をコードする遺伝子を非メチロトローフに導入することにより、実現することができる。
【０１００】
ＲｕＭＰ経路を付与する場合を例として、さらに説明する。ＲｕＭＰ経路の付与は、例えば、上記した３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）遺伝子を導入することにより、実現することができる。すなわち、ＨＰＳ／ＰＨＩによるホルムアルデヒド固定化反応の基質又は生成物である、リブロース５リン酸（Ｒｕ５Ｐ）とフルクトース６リン酸（Ｆ６Ｐ）は、ペントースリン酸経路、及びカルビン回路の代謝中間体として全ての生物に普遍的に存在する。したがって、ＨＰＳ／ＰＨＩの導入により、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、及び酵母等をはじめとする全ての生物にホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能である。
【０１０１】
元々ＲｕＭＰ経路を有している宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。これにより、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。例えば、枯草菌のように、元々ＲｕＭＰ経路もしくはこれと同質の経路を有する微生物に、例えばメタノールデヒドロゲナーゼ (例えば、EC1.1.1.244, EC1.1.2.7）等のアルコール脱水素酵素、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ；例えばEC4.1.2.43）、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ；例えばEC5.3.1.27）、等の酵素をコードする遺伝子を導入することで、メタノールをホルムアルデヒドに変換する機能（すなわちメタノール資化性）を付与すると共に、ホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。
【０１０２】
なお、メチロトローフである宿主細胞に、ＨＰＳ遺伝子とＰＨＩ遺伝子を導入してもよい。すなわち、セリン経路、ＲｕＭＰ経路、あるいはＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへＨＰＳ／ＰＨＩを導入することで、ＲｕＭＰ経路によるホルムアルデヒド固定化能を増強することができる。その結果、組換え細胞のホルムアルデヒド耐性を高めることができ、結果的にメタノールやギ酸に対する耐性及び資化能を高めることが可能となる。これにより、組換え細胞の培養効率やイソプレンの生産効率を向上させることが可能となる。
【０１０３】
一方、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与する場合には、上記したセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（例えばEC2.1.2.1）遺伝子を用いることができる。例えば、非メチロトローフに、メタノールデヒドロゲナーゼ等のアルコール脱水素酵素遺伝子、５，１０-メチレンテトラヒドロ葉酸（5,10-methylenetetrahydrofolate）(CH2=H4F) 合成酵素遺伝子、及びセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ (例えばEC2.1.2.1）遺伝子等を導入することで、メタノール資化性と、セリン経路によるホルムアルデヒド固定化能を付与することが可能となる。
【０１０４】
続いて、イソプレン合成酵素について説明する。イソプレン合成酵素としては、組換え細胞内でその酵素活性を発揮できるものであれば特に限定はない。イソプレン合成酵素をコードする遺伝子についても同様であり、組換え細胞内で正常に転写・翻訳されるものであれば特に限定はない。
【０１０５】
イソプレン合成酵素は、多くの植物で見出されている。イソプレン合成酵素の具体例としては、ポプラ（Populus nigra）由来のもの（GenBank Accession No.: AM410988.1）が挙げられる。その他、Bacillus subtilis由来のもの（Sivy TL. et al., Biochem. Biophys. Res. Commu. 2002, 294(1), 71-5）が挙げられる。
配列番号１に上記ポプラ由来イソプレン合成酵素をコードする遺伝子（ＤＮＡ）の塩基配列と対応のアミノ酸配列、配列番号２にアミノ酸配列のみを示す。配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡは、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子の一例となる。
【０１０６】
さらに、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子には、少なくとも、下記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列と６０％以上の相同性（同一性）を示すアミノ酸配列を有し、かつイソプレン合成酵素の活性を有するタンパク質。
なお（ｃ）におけるアミノ酸配列の相同性（同一性）については、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上である。
【０１０７】
本発明の組換え細胞においては、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子等に加えて、他の遺伝子がさらに導入されていてもよい。導入する遺伝子としては、例えば、以下に説明するイソプレノイドの生合成経路で作用する酵素の遺伝子が挙げられる。
【０１０８】
本発明の組換え細胞を含めて全ての生物は、メバロン酸経路（ＭＶＡ経路ともいう）又は非メバロン酸経路（ＭＥＰ経路ともいう）からなるイソプレノイドの生合成経路を保有しており、イソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）を合成することができる。
メバロン酸経路は真核生物が備えているものであり、アセチルＣｏＡを出発物質としている。メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。
【０１０９】
一方、非メバロン酸経路は原核生物や葉緑体・色素体が備えているものであり、グリセルアルデヒド３−リン酸とピルビン酸を出発物質としている。非メバロン酸経路で作用する酵素としては、上流から順に、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼ、が挙げられる。
【０１１０】
１つの実施形態では、宿主細胞がメバロン酸経路によるＩＰＰ合成能を有するものである場合に、（i）メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子、及び／又は、（ii）非メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子、がさらに導入されている。（i）の遺伝子が導入されることにより、メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能が増強される。また（ii）の遺伝子が導入されることにより、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方からＩＰＰが合成されることとなり、ＩＰＰ合成能が増強される。そして、ＩＰＰ合成能が増強されることにより、結果としてイソプレン生産がより効率的に行われる。
【０１１１】
別の実施形態では、宿主細胞が非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能を有するものである場合に、（iii）メバロン酸経路で作用する酵素群をコードする遺伝子、及び／又は、（iv）非メバロン酸経路で作用する少なくとも１つの酵素をコードする遺伝子、がさらに導入されている。（iii）の遺伝子が導入されることにより、メバロン酸経路と非メバロン酸経路の両方からＩＰＰが合成されることとなり、ＩＰＰ合成能が増強される。また（iv）の遺伝子が導入されることにより、非メバロン酸経路によるＩＰＰ合成能が増強される。そして、ＩＰＰ合成能が増強されることにより、結果としてイソプレン生産がより効率的に行われる。
【０１１２】
上述したように、メバロン酸経路で作用する酵素群としては、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼが挙げられる。
（i）の遺伝子を導入する場合には、例えば、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼから選ばれた１又は２以上の酵素が宿主細胞内で発現するように、導入する遺伝子を選択すればよい。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
（iii）の遺伝子を導入する場合には、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、５−ホスホメバロン酸キナーゼ、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、及びイソペンテニル二リン酸イソメラーゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する遺伝子を選択すればよい。
【０１１３】
上述したように、非メバロン酸経路で作用する酵素群としては、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰレダクターゼが挙げられる。
（ii）の遺伝子を導入する場合には、例えば、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、及びＨＭＢ−ＰＰレダクターゼからなる酵素群が宿主細胞内で発現するように、導入する遺伝子を選択すればよい。
（iv）の遺伝子を導入する場合には、例えば、ＤＯＸＰシンターゼ、ＤＯＸＰレダクトイソメラーゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールシンターゼ、４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトールキナーゼ、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリトリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、ＨＭＢ−ＰＰシンターゼ、及びＨＭＢ−ＰＰレダクターゼから選ばれた１又は２以上の酵素が宿主細胞内で発現するように、導入する遺伝子を選択すればよい。例えば、これらの酵素群から１又は２以上の酵素を選択し、当該酵素をコードする遺伝子を宿主細胞に導入すればよい。
【０１１４】
なお、メバロン酸経路は全ての真核生物が保有しているが、真核生物以外でも見出されている。真核生物以外でメバロン酸経路を有するものとしては、放線菌であるStreptomyces sp. Strain CL190 (Takagi M. et al., J. Bacteriol. 2000, 182 (15), 4153-7)、Streptomyces griseolosporeus MF730-N6 (Hamano Y. et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001, 65(7), 1627-35）が挙げられる。細菌では、Lactobacillus helvecticus (Smeds A et al., DNA seq. 2001, 12(3), 187-190)、Corynebacterium amycolatum、Mycobacterium marinum、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Streptococuss agalactiae、Myxococcus xanthus等（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99)が挙げられる。アーキアでは、Aeropyrum属、Sulfolobus属、Desulfurococcus属、Thermoproteus属、Halobacterium属、Methanococcus属、Thermococcus属、Pyrococcus属、Methanopyrus属、Thermoplasma属等（Lombard J. et al., Mol. Biol. Evol. 2010, 28(1), 87-99）が挙げられる。例えば、上記（i）又は（iii）の遺伝子として、上記生物由来のものを用いることができる。
【０１１５】
また、細菌のＩＰＰ合成を強化するための例として、宿主の遺伝子発現制御を免れる目的で、細菌が本来有しないメバロン酸経路酵素群を導入する方が好ましい。
【０１１６】
また、（ii）又は（iv）の遺伝子がコードする非メバロン酸経路で作用する酵素は、宿主細胞以外の由来であることが好ましい。かかる構成により、反応生成物による反応抑制を避けることができる。
【０１１７】
セリン経路を有する宿主細胞の場合は、ホルムアルデヒド固定経路であるセリン経路から直接アセチルＣｏＡを生成するため、特にメバロン酸経路酵素群遺伝子を外来遺伝子として導入することが好ましい。
【０１１８】
（i）〜（iv）の遺伝子がコードするメバロン酸経路あるいは非メバロン酸経路で作用するこれらの酵素については、天然に存在するものの他、各酵素の改変体でもよい。例えば、各酵素のアミノ酸置換変異体や、各酵素の部分断片であって同様の酵素活性を有するポリペプチドでもよい。
【０１１９】
イソプレン合成酵素の直接の基質はジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）であることから、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ活性を増強することによってもＩＰＰからＤＭＡＰＰへの変換が増強され、イソプレンの生産効率は向上する。したがって、外来遺伝子としてイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子をさらに導入してもよい。この場合のイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ遺伝子の由来としては、宿主生物と同一もしくは近縁種由来のものが好ましい。
【０１２０】
組換え体に対して、ゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＰＰ合成酵素）、ネリル二リン酸合成酵素（ＮＰＰ合成酵素）、又はファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰ合成酵素）の発現量を抑制する処理を行うことにより、イソプレン生産能をさらに高めることができる。すなわち、当該処理によって、ＩＰＰからＧＰＰ、ＮＰＰ、又はＦＰＰへの変換が抑えられ、ＤＭＡＰＰの供給源であるＩＰＰの浪費が抑えられる。
当該処理としては、ＧＰＰ合成酵素、ＮＰＰ合成酵素、又はＦＰＰ合成酵素をコードする遺伝子に対する各種処理、例えば、遺伝子への変異導入（コドンの改変、ノックアウト等）、プロモーターの改変、ＳＤ配列の改変、などが挙げられる。
【０１２１】
本発明のさらに他の様相は、イソプレン合成酵素を有する宿主細胞に、メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能を付与する遺伝子と、ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子とが導入されてなり、当該遺伝子が宿主細胞内で発現し、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物からイソプレンを生産可能である組換え細胞である。
【０１２２】
本様相に採用できるイソプレン合成酵素を有する宿主細胞としては、例えば、米国特許第５８４９９７０号に記載されているBacillus属、Acinetobacter属、Agrobacterium属、Erwinia属、Pseudomonas属、等に属する細菌が挙げられる。
【０１２３】
本様相においても、上記した全ての実施形態をそのまま適用することができる。例えば、本様相において「メタノール及び／又はギ酸をホルムアルデヒドに変換する機能」を付与する遺伝子」と「ホルムアルデヒド固定化能を付与する遺伝子」については、上述した例をそのまま適用することができる。すなわち、メタノールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、メタンモノオキシゲナーゼ等をコードする各遺伝子を、宿主細胞に導入することができる。
【０１２４】
また、本様相においても、３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ）をコードする遺伝子と、６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ）をコードする遺伝子をさらに導入してもよい。
【０１２５】
さらに、本様相においても、宿主細胞にイソプレノイドの生合成経路で作用する酵素の遺伝子を導入してもよい。例えば、上記した（i）〜（iv）の遺伝子を用いた実施形態を、本様相にも適用することができる。
【０１２６】
本様相においては、宿主細胞に、イソプレン合成酵素をコードする遺伝子をさらに導入してもよい。本実施形態によれば、宿主細胞が本来有しているイソプレン合成酵素に加えて、外来のイソプレン合成酵素が合成されるので、イソプレン生産能がさらに高くなる。導入されるイソプレン合成酵素遺伝子としては特に限定はなく、例えば、上記したポプラ由来のイソプレン合成酵素遺伝子を用いることができる。もちろん、宿主由来のイソプレン合成酵素遺伝子をさらに導入してもよい。
【０１２７】
またさらに、本様相においても、組換え体に対して、ゲラニル二リン酸合成酵素（ＧＰＰ合成酵素）、ネリル二リン酸合成酵素（ＮＰＰ合成酵素）、又はファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＰＰ合成酵素）の発現量を抑制する処理を行ってもよい。
【０１２８】
宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては特に限定はなく、宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。例えば、宿主細胞に導入可能でかつ組み込まれた遺伝子を発現可能なベクターを用いることができる。
例えば、宿主細胞が細菌等の原核生物の場合には、当該ベクターとして、宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組み込みが可能で、挿入された上記遺伝子を転写できる位置にプロモーターを含有しているものを用いることができる。例えば、当該ベクターを用いて、プロモーター、リボソーム結合配列、上記遺伝子、および転写終結配列からなる一連の構成を宿主細胞内で構築することが好ましい。
【０１２９】
例えば、メチロトローフ細菌の染色体への組み込み方法としては、リブロースモノリン酸経路を有するMethylobacillus flagellatusや、セリン経路を有するMethylobacterium extorquencsで、目的遺伝子の破壊操作によって例が示されている（Chistoserdova L. et al., Microbiology 2000, 146, 233-238; Chistoserdov AY., et al., J. Bacteriol 1994, 176, 4052-4065）。これらは環状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法であるが、Methylophilus属細菌等では、直鎖状ＤＮＡを用いたゲノムへの遺伝子導入法も開発されている（特開２００４−２２９６６２号公報）。一般に、宿主細胞による分解を受けにくい場合は、直鎖状ＤＮＡによるゲノム組換えの方が、環状ＤＮＡによるよりも効率的である。また通常、相同組換え法は、inverted-repeat sequence等のように、ゲノム上に多コピー存在する遺伝子を標的することが好ましい。また、ゲノムに多コピー導入する手法としては、相同組換え以外に、トランスポゾンに搭載する方法もある。メチロトローフ細菌へのプラスミドによる遺伝子導入法としては、例えば、広宿主域ベクターであるpAYC32 (Chistoserdov AY., et al., Plasmid 1986, 16, 161-167)、pRP301 (Lane M., et al., Arch. Microbiol. 1986, 144(1), 29-34)、pBBR1、pBHR1 (Antoine R. et al., Molecular Microbiology 1992, 6, 1785-1799)、pCM80 (Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）、等がある。
【０１３０】
メチロトローフ酵母における遺伝子導入方法としては、主にPichia pastorisで確立されており、pPIC3.5K、pPIC6、pGAPZ、pFLD（インビトロジェン社）等のベクターが市販されている。
【０１３１】
Bacillus属細菌への遺伝子導入にできる使用プラスミドとしては、Bacillus subtilisには、pMTLBS72 (Nquyen HD. Et al., Plasmid 2005, 54(3), 241-248)、pHT01（フナコシ社）、pHT43（フナコシ社）等が、Bacillus megateriumには、p3STOP1623hp （フナコシ社）、pSPYocHhp（フナコシ社）等が、Bacillus brevisには、pNI DNA（タカラバイオ社）等がある。
【０１３２】
またベクターを用いて複数種の遺伝子を宿主細胞に導入する場合、各遺伝子を１つのベクターに組み込んでもよいし、別々のベクターに組み込んでもよい。さらに１つのベクターに複数の遺伝子を組み込む場合には、各遺伝子を共通のプロモーターの下で発現させてもよいし、別々のプロモーターの下で発現させてもよい。複数種の遺伝子を導入する例としては、宿主細胞がメチロトローフである場合に、「イソプレン合成酵素をコードする遺伝子」に加えて、上記（i）〜（iv）の遺伝子やＨＰＳ／ＰＨＩ遺伝子を導入する態様が挙げられる。
【０１３３】
以上のようにメチロトローフ等で使用できる既知のベクターを示したが、プロモーター、ターミネーター等の転写制御、複製領域等に関わる領域を、目的に応じて改変することができる。改変方法としては各宿主細胞、もしくはその近縁種における天然の他の遺伝子配列に変更してもよく、また人工の遺伝子配列に変更してもよい。
【０１３４】
また、以上の遺伝子導入による改変に加え、突然変異、ゲノムシャッフリング等の変異手法をも組み合わせることで、さらにイソプレンの生産性を向上させることが可能となる。
【０１３５】
本発明のイソプレンの生産方法の１つの様相では、上記した組換え細胞を、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を炭素源として用いて培養し、当該組換え細胞にイソプレンを生産させる。炭素原として用いるこれらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。また、これらのＣ１化合物は、主たる炭素原として用いることが好ましく、唯一の炭素原であることがより好ましい。
【０１３６】
なお、偏性メチロトローフの場合は、Ｃ１化合物を唯一の炭素源とする合成培地を用いることが基本であるが、これに酵母エキス、コーンスティープリカー、肉エキス等の天然培地やビタミン類を少量加えることによっても菌の増殖は促進される。通性メチロトローフである場合は、菌体増殖ステージでは糖質、脂質等のＣ１化合物以外の物質を炭素源としてもよく、イソプレン生産ステージで炭素源を上記Ｃ１化合物に変更すればよい。微生物の培養法としては、目的に応じて好気、微好気、もしくは嫌気条件で培養可能である。またバッチ培養、流加培養、連続培養のいずれの方法でもよい。
炭素源として例えばメタノールを用いる場合は、通常、細菌の場合は１．０％(ｖ/ｖ)濃度、酵母の場合は３．０％（v/v）濃度以下で用いるが、人為的にこれらに対する耐性を改良した場合は、それ以上の濃度でも培養可能である。
【０１３７】
本発明のイソプレンの生産方法の別の様相では、上記した組換え細胞に、メタン、メタノール、メチルアミン、ギ酸、ホルムアルデヒド、及びホルムアミドからなる群より選ばれた少なくとも１つのＣ１化合物を接触させ、当該組換え細胞に前記Ｃ１化合物からイソプレンを生産させる。すなわち、細胞分裂（細胞増殖）を伴うか否かにかかわらず、組換え細胞に前記したＣ１化合物を接触させて、イソプレンを生産させることができる。例えば、固定化した組換え細胞に前記したＣ１化合物を連続的に供給し、イソプレンを連続的に生産させることができる。
本様相においても、これらのＣ１化合物については、１つのみを用いてもよいし、２つ以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１３８】
生産されたイソプレンは、細胞内に蓄積されるか、細胞外に放出される。例えば、細胞外に放出されたイソプレンを回収し、単離精製することにより、純化されたイソプレンを取得することができる。
【０１３９】
以下、実施例をもって本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１４０】
ＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフへのイソプレン合成酵素遺伝子の導入と、組換え体を用いたメタノールからのイソプレンの生産
【０１４１】
本実施例では、ＸｕＭＰ経路を有するメチロトローフとして、メタノール資化性酵母Pichia pastolis GS115株（インビトロジェン社）を使用した。
ポプラ（Populus nigra）の葉由来の全ＲＮＡを鋳型とし、配列番号３と配列番号４で表されるプライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、ポプラ由来イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）をコードする遺伝子（ポプラ由来ＩｓｐＳ遺伝子、配列番号１、GenBank Accession No.: AM410988.1）を増幅した。得られた増幅ＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクター（タカラバイオ社）へクローニングし、ｐＴ７ＩＳを構築した。ｐＴ７ＩＳをＢａｍＨＩで切断してＩｓｐＳ遺伝子を回収した。回収したＩｓｐＳ遺伝子を、ｐＰＩＣ３．５Ｋ（インビトロジェン社）のＢａｍＨＩ切断部位へ導入し、イソプレン合成酵素遺伝子が導入されたベクターｐＰＣＩＰＳを構築した。
【０１４２】
Pichia pastoris GS115株へのｐＰＣＩＰＳによるイソプレン合成酵素遺伝子の導入は、インビトロジェン社マニュアル「Version D 032002/25-0156」に従って行った。マルチコピーの遺伝子導入体を得るために、１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticin（インビトロジェン社）耐性株を取得した。これによって、外来のイソプレン合成酵素遺伝子を複数コピー保持するメタノール資化性酵母GS115IPS株を構築した。またコントロール株として１．５ｍｇ／ｍＬ濃度のGeneticinに耐性のある、ｐＰＩＣ３．５Ｋのみが導入されたGS11535K株も得た。
【０１４３】
GS115IPS株及びGS11535K株を、それぞれ、メタノールを唯一の炭素源とする２０ｍＬの合成Ａ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール２０ｍＬを含む。）にて、好気的に、３０℃で６４時間培養した。菌体を回収した後、それぞれの回収された菌体を、ブチルゴム栓で封をされた１２５ｍＬ容量のバイアル瓶中で、４５ｍＬの合成Ａ培地にて、さらに、３０℃で１６時間振とう培養した。培養終了後、気相成分をＧＣ／ＭＳによって分析した。その結果、GS11535K株ではイソプレンは検出されなかったが、GS115IPS株ではイソプレンが検出された。以上のことから、本実施例によって、メタノール資化経路の１種であるＸｕＭＰ経路を介した、真核微生物（酵母）によるイソプレン生産が可能であることがわかった。
【実施例２】
【０１４４】
非メチロトローフへのメタノールデヒドロゲナーゼ、ＨＰＳ遺伝子、ＰＳＩ遺伝子、及びイソプレン合成酵素遺伝子の導入と、組換え体によるメタノールからのイソプレン生産
【０１４５】
本実施例では、非メチロトローフとしてBacillus subtilisを使用した。
【０１４６】
（各種遺伝子調製）
配列番号５のＮＡＤＰ依存型メタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子を、Bacillus methanolicus (NCIMB 13114)のゲノムＤＮＡより、配列番号７及び配列番号８のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をpT7 Blue-Tベクターへクローニングし、ｐＴ７ＢＭｍｄｈを構築した。
【０１４７】
配列番号９の３−ヘキスロース６リン酸合成酵素（ＨＰＳ）遺伝子を、Methylomonas aminofaciensのゲノムＤＮＡより、配列番号１１及び配列番号１２のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をpT7 Blue-T ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＭＡｈｐｓを構築した。
【０１４８】
配列番号１３の６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（ＰＨＩ）遺伝子を、Methylomonoas aminofaciensのゲノムＤＮＡより、配列番号１５及び配列番号１６のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をpT7 Blue-T ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＭＡｐｈｉを構築した。
【０１４９】
実施例１で作製したイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）遺伝子を保持するｐＴ７ＩＳを鋳型とし、配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを用いてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡ断片をpT7 Blue-Tベクターへクローニングし、ｐＴ７ＩＳ２を構築した。
【０１５０】
（各種発現ベクターの構築）
クローニングベクターｐＴ７ＭＡｈｐｓをＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断することによってｈｐｓ遺伝子を切り出した。該ｈｐｓ遺伝子をBacillus subtilis用発現ベクターpHT01(MoBiTec社）のＢａｍＨＩサイトへ導入し、ｐＨＴｈを作製した。
クローニングベクターｐＴ７ＭＡｐｈｉをＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断することによってＰＨＩ遺伝子を切り出した。該ＰＨＩ遺伝子をｐＨＴｈのＢａｍＨＩサイトへ導入し、ｐＨＴｈｐを作製した。
クローニングベクターｐＴ７ＢＭｍｄｈをＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断することによってＭＤＨ遺伝子を切り出した。該ＭＤＨ遺伝子をｐＨＴｈｐのＢａｍＨＩサイトへ導入し、ｐＨＴｈｐｍを作製した。
さらに、ｐＴ７ＩＳ２をＢａｍＨＩ及びＳｍａＩで切断することによってＩｓｐＳ遺伝子を切り出した。該ＩｓｐＳ遺伝子をｐＨＴｈｐｍのＢａｍＨＩ／ＳｍａＩサイトへ導入し、ｐＨＴｈｐｍＩＳを構築した。発現ベクターｐＨＴｈｐｍＩＳは、ｐＨＴ０１のプロモーター下流にＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子、及びＩｓｐＳ遺伝子がこの順番に配置されたオペロンを保持する。
【０１５１】
コントロールとして、上記と同様にして、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及びＩｓｐＳ遺伝子のみを有する発現ベクターｐＨＴｈｐＩＳを作製した。同様に、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及びＭＤＨ遺伝子のみを有する発現ベクターｐＨＴｈｐｍを作製した。
【０１５２】
MoBiTec社マニュアル「Bacillus subtilis Expression Vectors」に従って、各発現ベクターをBacillus subtilisに導入し、組換え体（組換え細胞）を作製した。これにより、発現ベクターｐＨＴｈｐｍＩＳを保持するＢＳｈｐｍＩＳ株、発現ベクターｐＨＴｈｐＩＳを保持するＢＳｈｐＩＳ株、及び、発現ベクターｐＨＴｈｐｍを保持するＢＳｈｐｍ株を、それぞれ作製した。
【０１５３】
各組換え体を、２０ｍＬのメタノール資化誘導培地（メタノール１０ｍＬ、リン酸アンモニウム３ｇ、塩化カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、０．０１ｍＭ ＩＰＴＧ、及びクロラムフェニコール５ｍｇを、１Ｌの水道水中に含む。）にて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．２の時点で、菌体を回収した。回収した全菌体を、上記同様のメタノール資化誘導培地４５ｍＬ（但しＩＰＴＧ濃度を０．１ｍＭとした。）に加え、ブチルゴム栓によって封をされた１２５ｍＬ容量のバイアル瓶中にて、３７℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、気相成分をＧＣ／ＭＳによって分析した。
【０１５４】
まず培養の結果、ＢＳｈｐｍＩＳ株とＢＳｈｐｍ株は十分に生育したが、ＭＤＨを有しないＢＳｈｐＩＳ株はほとんど生育しなかった。
イソプレン生産に関して、ＢＳｈｐｍＩＳ株についてイソプレンが検出された。ＢＳｈｐｍＩＳ株における、資化されたメタノールからイソプレンへの変換効率は、１４％であった。ＢＳｈｐｍ株では、イソプレンが僅かに検出されたものの、資化されたメタノールからイソプレンへの変換効率は０．３％程度であった。
【０１５５】
以上のことから、非メチロトローフであるBacillus subtilisにＭＤＨ遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、及びＰＨＩ遺伝子を導入することで、メタノールを主要炭素源する培地で効率良く生育させることが可能であり、かつＩｓｐＳ遺伝子を導入することで、効率的にイソプレンが生成することがわかった。
【実施例３】
【０１５６】
ＭＶＡ経路遺伝子及びイソプレン合成酵素遺伝子が導入された、セリン経路を有するメチロトローフの作製と、組換え体によるメタノールからのイソプレン生産
【０１５７】
本実施例では、セリン経路を有するメチロトローフとして、Methylobacterium extorquens (ATCC 55366)を使用し、本株へＩｓｐＳ遺伝子及び放線菌由来のメバロン酸経路遺伝子クラスタを導入することで、イソプレン生産株を作製した。
【０１５８】
実施例１で作製したｐＴ７ＩＳを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２０で表されるプライマーを使用して、ポプラ由来ＩｓｐＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＩＳ３を構築した。
放線菌Streptomyces griseolosporeus (Kitasatospora griseola)のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号２１と配列番号２２で表されるプライマーを使用したＰＣＲによって、S. griseolosporeusのメバロン酸経路酵素群をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片（配列番号２３）を増幅した。このＤＮＡ断片には、Mevalonate kinase、Mevalonate diphosphate decarboxylase、Phosphomevalonate kinase、IPP isomerase、HMG-CoA (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A) reductase (HMGR)、及びHMG-CoA synthaseをコードする遺伝子クラスタが含まれている。得られた増幅ＤＮＡ断片をpT7-Blue T ベクターへクローニングし、ｐＴ７ＳＭＶを構築した。
【０１５９】
ｐＴ７ＩＳ３をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩによって切断して、ＩｓｐＳ遺伝子を得た。該ＩｓｐＳ遺伝子を広宿主域ベクターであるｐＣＭ８０(Marx CJ. et al., Microbiology 2001, 147, 2065-2075）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＩＳを作製した。ｐＴ７ＳＭＶをＫｐｎＩで切断して、放線菌ＭＶＡ経路遺伝子及びターミネーター配列を含む断片を得た。該断片をｐＣ８０ＩＳのＫｐｎＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＩＳＭＶを構築した。発現ベクターｐＣ８０ＩＳＭＶは、プロモーター下流にＩｓｐＳ遺伝子及び放線菌ＭＶＡ経路酵素遺伝子群を有する。
発現ベクターｐＣ８０ＩＳをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＩＳ株を得た。発現ベクターｐＣ８０ＩＳＭＶをエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＩＳＭＶ株を得た。コントロールとして、発現ベクターｐＣＭ８０をエレクトロポレーションによってM. extorquensへ導入し、ＭＥ−ＣＭ８０株を得た。
【０１６０】
ＭＥ−ＩＳ株、ＭＥ−ＩＳＭＶ株、又はＭＥ−ＣＭ８０株を、メタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン ０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、及びテトラサイクリン１０ｍｇを含む。）２０ｍＬにて、好気的に３０℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．２の時点で、菌体を回収した。回収した全菌体を上記同一の合成Ｂ培地４５ｍＬに加え、ブチルゴム栓によって封をされた１２５ｍＬ容量のバイアル瓶中にて３０℃で１６時間振とう培養した。培養終了後、気相成分をＧＣ／ＭＳによって分析した。
【０１６１】
その結果、ＭＥ−ＩＳ株とＭＥ−ＩＳＭＶ株でイソプレンが検出された。資化されたメタノールからイソプレンへの変換効率は、ＭＥ−ＩＳ株では８％、ＭＥ−ＩＳＭＶ株では２７％であった。なお、ＭＥ−ＣＭ８０株ではイソプレンは検出されなかった。
以上のことから、セリン経路を有するメチロトローフへ、ＭＶＡ経路遺伝子及び、イソプレン合成酵素遺伝子を導入することによって、メタノールからの効率的なイソプレンの生産が可能であることが示された。
【実施例４】
【０１６２】
ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフへのイソプレン合成酵素遺伝子の導入と、組換え体を用いるメタノールからのイソプレン生産
【０１６３】
本実施例では、ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフとして、Methylophilus methylotrophus (ATCC 53528)を使用し、本株へＩｓｐＳ遺伝子を導入することで、イソプレン生産株を作製した。
【０１６４】
実施例１で作製したｐＴ７ＩＳを鋳型とし、配列番号１９と配列番号２４のプライマーを用いるＰＣＲによって、ＩｓｐＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。このＤＮＡ断片をpT7 Blue-Tベクターへクローニングし、ｐＴ７ＩｓｐＳ４を作製した。ｐＴ７ＩｓｐＳ４をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで切断することによって、ＩｓｐＳ遺伝子及びターミネーター配列を含むＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片をｐＣＭ８０（実施例３）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトへ導入し、ＩｓｐＳの発現ベクターｐＭ８０ＩＳを構築した。ｐＭ８０ＩＳをエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ−８０ＩＳ株を得た。
また、大腸菌ＩＤＩ（イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ）遺伝子とポプラＩｓｐＳ遺伝子とを含む遺伝子クラスター（配列番号２５）を、ｐＣＭ８０のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩサイトへ導入し、ｐＣ８０ＩＤＩＳを構築した。ｐＣ８０ＩＤＩＳをエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ−８０ＩＤＩＳ株を得た。
コントロールとして、ｐＣＭ８０をエレクトロポレーションによってM. methylotrophusへ導入し、ＭＭ−８０株を得た。
【０１６５】
ＭＭ−８０ＩＳ株、ＭＭ−８０ＩＤＩＳ株、又はＭＭ−８０株を、実施例３で使用したメタノールを唯一の炭素源とする合成Ｂ培地（但し、メタノール濃度は１%(v/v)とした）２０ｍＬにて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．２の時点で、菌体を回収した。回収した全菌体を上記同一の合成Ｂ培地４５ｍＬに加え、ブチルゴム栓によって封をされた１２５ｍＬ容量のバイアル瓶中にて、３７℃で１６時間振とう培養した。培養終了後、気相成分をＧＣ／ＭＳによって分析した。
【０１６６】
その結果、ＭＭ−８０ＩＳ株とＭＭ−８０ＩＤＩＳ株でイソプレンが検出された。資化されたメタノールからイソプレンへの変換効率は、ＭＭ−８０ＩＳ株では１２％、ＭＭ−８０ＩＤＩＳ株では１９％であった。一方、ＭＭ−８０株ではイソプレンは検出されなかった。
以上のことから、ＲｕＭＰ経路を有するメチロトローフへ、イソプレン合成酵素遺伝子を導入することによって、メタノールからの効率的なイソプレンの生産が可能であることが示された。また、ＩＤＩ遺伝子を導入することによってイソプレン合成が促進されることがわかった。
【実施例５】
【０１６７】
大腸菌へのメタノールデヒドロゲナーゼ（ＭＤＨ）遺伝子、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及びＩｓｐＳ遺伝子の導入と、組換え体によるメタノールからイソプレンの生産
【０１６８】
実施例２で作製した発現ベクターｐＨＴｈｐｍＩＳを鋳型とし、配列番号２６及び２７のプライマーを用いるＰＣＲによって、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子及びＩｓｐＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片（hpmIS）を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片をpT7Blue-Tベクターへクローニングし、ｐＴ７ｈｐｍＩＳを作製した。ｐＴ７ｈｐｍＩＳをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、hpmIS遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をpET23d (Novagen社)のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトへ導入し、大腸菌での発現ベクターｐＴｈｐｍＩＳを構築した。発現ベクターｐＴｈｐｍＩＳを大腸菌Rosetta(DE3) (Novagen社)へ導入し、大腸菌ＲＨＰＭＩ株を得た。
【０１６９】
実施例２で作製した発現ベクターｐＨＴｈｐＩＳを鋳型とし、配列番号２６及び２７のプライマーを用いるＰＣＲによって、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及びＩｓｐＳ遺伝子を含むＤＮＡ断片（hpIS）を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片をpT7Blue-Tベクターへクローニングし、ｐＴ７ｈｐＩＳを作製した。ｐＴ７ｈｐＩＳをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、hpIS遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をpET23d (Novagen社)のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトへ導入し、大腸菌での発現ベクターｐＴｈｐＩＳを構築した。発現ベクターｐＴｈｐＩＳを大腸菌Rosetta(DE3)へ導入し、大腸菌ＲＨＰＩ株を得た。
【０１７０】
実施例２で作製した発現ベクターｐＨＴｈｐｍを鋳型とし、配列番号２６及び２８のプライマーを用いるＰＣＲによって、ＨＰＳ遺伝子、ＰＨＩ遺伝子、及びＭＤＨ遺伝子を含むＤＮＡ断片（hpm）を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片をpT7Blue-Tベクターへクローニングし、ｐＴ７ｈｐｍを作製した。ｐＴ７ｈｐｍをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで切断し、hpm遺伝子を含むＤＮＡ断片を回収した。このＤＮＡ断片をpET23d (Novagen社)のＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩサイトへ導入し、大腸菌での発現ベクターｐＴｈｐｍを構築した。発現ベクターｐＴｈｐｍを大腸菌Rosetta(DE3)へ導入し、大腸菌ＲＨＰＭ株を得た。
【０１７１】
各々の組換え大腸菌を、０．０５ｍＭ濃度のＩＰＴＧを含有するメタノール資化合成Ｃ培地（１ＬあたりＨ3ＰＯ4 １８ｇ、Ｋ2ＳＯ4 １４．２８ｇ、ＫＯＨ ３．９ｇ、ＣａＳＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．９ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １１．７ｇ、ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ ８．４ｍｇ、ＫＩ １．１ｍｇ、ＭｎＳＯ4Ｈ2Ｏ ４．２ｍｇ、ＮａＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０．３ｍｇ、Ｈ3ＢＯ3 ０．０３ｍｇ、ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０．７ｍｇ、ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ２８ｍｇ、ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ９１ｍｇ、ビオチン０．２８ｍｇ、メタノール５ｍＬ、クロラムフェニコール３４ｍｇ、及びアンピシリン１００ｍｇを含む。）２０ｍＬにて、好気的に３７℃で培養した。培養液のＯＤ６００が１．０−１．２の時点で、菌体を回収した。回収した全菌体を上記同一組成の合成Ｃ培地に４５ｍＬに加え、ブチルゴム栓によって封をされた１２５ｍＬ容量のバイアル瓶中にて、３７℃で２４時間振とう培養した。培養終了後、気相成分をＧＣ／ＭＳによって分析した。
【０１７２】
その結果、ＲＨＰＭＩ株のみでイソプレンが検出された。ＲＨＰＭＩ株における、資化されたメタノールからイソプレンの変換効率は、１４％であった。なお、ＲＨＰＩ株は全く生育できなかった。ＲＨＰＭ株は、生育はしたものの、イソプレンの生成は検出できなかった。
【図１】
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【配列表】
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