(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における免疫応答のプライミングに使用するための、シアル酸結合分子を含む医薬組成物であって、
前記シアル酸結合分子が、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）ＮａｎＨシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（ＶｃＣＢＭ）、および／または、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）ＮａｎＡシアリダーゼ由来のシアル酸結合ドメイン（ＳｐＣＢＭ）を含む、前記医薬組成物。
【請求項２】
シアル酸結合分子が、１つまたは複数の免疫調節性化合物の発現、機能および／または活性を増大させる、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
免疫調節性化合物が、ケモカイン、サイトカイン、ならびに／またはそれをコードするおよび／もしくはそれと関連する遺伝子／転写因子である、請求項２に記載の使用のための、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
免疫応答が、病原体によって引き起こされる感染または病原体が寄与する感染に対して保護する保護的免疫応答である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
病原体が、ウイルス、細菌および／または真菌の病原体である、請求項４に記載の使用のための、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
シアル酸結合分子が、インターロイキン１−β（ＩＬ１−β）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現増加を誘導する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
シアル酸結合分子が、免疫系細胞の動員、増殖および／または移動を誘導する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
シアル酸結合分子が、好中球の動員、増殖および／または移動を誘導する、請求項７に記載の使用のための、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
対象がヒトまたは動物対象である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
対象が病原体特異的抗体を産生する能力を維持する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
使用中に検出可能な病原体力価が存在する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
使用が予防的使用である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
対象が感染の症状であり、シアル酸結合分子が、感染の消散および／またはクリアランスを促進する免疫系を調節するために投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
シアル酸結合分子が、Ｎ置換もしくはＯ置換されたノイラミン酸、ならびにその合成形態、天然に存在する形態および／または修飾された形態に結合する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
シアル酸結合分子が、α−２，６連結したシアル酸および／またはα−２，３連結したシアル酸を含有する受容体に親和性を示す、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
シアル酸結合分子が、単一のシアル酸結合分子または２つ以上のシアル酸結合分子を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
シアル酸結合分子が、配列番号１、２、３もしくは４として示される配列の１つまたは複数を含むまたは該配列の１つまたは複数からなる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
免疫応答が、細菌、真菌および／またはウイルス感染に対して保護的である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
シアル酸結合分子が、オリゴマー化ドメイン（ＴＤ）をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
オリゴマー化ドメインが、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）シューダミニダーゼ由来である、請求項１９に記載の使用のための、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
オリゴマー化ドメインが、配列番号５または６として示される配列を含む、請求項１９または２０に記載の使用のための、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
シアル酸結合分子が、
（ｉ）ＶｃＣＢＭ；
（ｉｉ）Ｖｃ２ＣＢＭ；
（ｉｉｉ）Ｖｃ３ＣＢＭ；
（ｉｖ）ＶｃＣＢＭＴＤ；
（ｖ）ＳｐＣＢＭＴＤ；
（ｖｉ）Ｖｃ４ＣＢＭ；
（ｖｉｉ）Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ；および
（ｖｉｉｉ）Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ
からなる群から選択される１つまたは複数を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
免疫応答が保護的免疫応答であり、保護期間が約１日から約２、３、４、５、６、７または１４日まで持続する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
シアル酸結合分子が、経口、非経口、粘膜および／または鼻腔内投与用に製剤化される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
シアル酸結合分子が、期間全体で１回または複数回の投薬として投与される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
シアル酸結合分子が、感染または推定感染前に１回または複数回の投薬として投与される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
シアル酸結合分子が、対象における感染後に１回または複数回の投薬として投与される、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
シアル酸結合分子が、約０．１、１、１０または１００μｇのシアル酸結合分子／対象／日の投薬量で投与される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の使用のための、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
１つまたは複数のシアル酸結合分子を含むワクチン組成物であって、前記シアル酸結合分子が、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）ＮａｎＨシアリダーゼのシアル酸結合ドメイン（ＶｃＣＢＭ）、および／または、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）ＮａｎＡシアリダーゼ由来のシアル酸結合ドメイン（ＳｐＣＢＭ）を含む、前記ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節効果を発揮するシアル酸結合化合物を提供する。本明細書に記載される化合物は、上気道および／または下気道の病原体によって引き起こされる疾患を含む、ある範囲の疾患の治療および／または予防に用途を見出す。
【背景技術】
【０００２】
非常に多数のウイルス、細菌および真菌病原体は、ヒトの健康への脅威であり、健康サービスにおける負担であり続けている1。特に懸念されるのはインフルエンザウイルスであり、最も顕著には、高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスが出現し、また最近トリ起源のＨ７Ｎ９ウイルスが出現したことである2。これらのウイルスは、ヒト伝播性を獲得する能力を発揮しており、健康脅威の増加を示す3-5。
ワクチンは予防の礎として残されているが、これらの新たな病原体に対する有効なワクチンを開発するにはかなりの時間を要する。抗菌剤（抗ウイルス、特にインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤および抗生物質を含む）が利用可能であるが、それらの有効性は、病原体が変異し、薬物耐性となる能力によって損なわれる可能性がある6,7。新しい治療アプローチの必要性があるのは明らかである。
「Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＢＭ４０  ｍｏｄｕｌｅ  ｆｒｏｍ  Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  Ｓｉａｌｉｄａｓｅ」（２００８年５月１７日公開、http://www.biochem.emory.edu/conferences/glycot/Images/GlycoTProgram-Posters.pdfを参照）と題されるポスターは、多価性であることでシアル酸に対する親和性が増加した試薬の開発について記載している。しかしながら、そのポスターは、このような試薬が、病原体によって引き起こされる疾患および／または状態の治療に有用な免疫調節化合物として任意の用途を有することについては開示していない。
【０００３】
米国特許出願公開第２００２００５４８８０号（Ａｍｓｔｒｏｎｇら）は、末端に連結されたα−シアル酸（２→６）βＧａｌ−および／またはα−シアル酸（２→３）βＧａｌ−基に結合し得るペプチド、および哺乳動物における免疫応答または細胞間相互作用を阻害する方法におけるそれらの使用を記載する。シアル酸結合分子の免疫刺激効果は開示されていない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、シアル酸を結合することができるある種の化合物が、疾患−特に、微生物の病因を有する疾患、例えば、呼吸器疾患の治療および／または予防における用途を見出し得るという知見に基づく。
シアル酸に結合する能力を示す分子は、宿主細胞の表面上のシアル酸を含有する受容体の存在を利用する病原体による感染を中和または予防するために使用され得ることが知られている。例えば、オルトミクソウイルス科またはパラミクソウイルス科に属するウイルス、およびある種の連鎖球菌属（Streptococcus）細菌などの呼吸器病原体は、種々の哺乳動物組織における特定の細胞型に結合し、入り込むための細胞表面のシアル酸を含有する受容体を利用する。シアル酸部分および／またはそれを含む分子（例えば、細胞表面受容体）に結合する化合物、例えば、タンパク質およびペプチドは、細胞に結合または付着する手段として、細胞表面のシアル酸受容体を利用する病原体によって引き起こされるまたはそれに寄与される疾患の治療および／または予防に使用され得る。理論に束縛されるものではないが、シアル酸結合分子は、結合および／または付着から病原体を妨げるように、病原体と細胞表面のシアル酸受容体の間の相互作用を干渉し、および／または阻害し、妨げおよび／またはブロックすることができる。
本発明者らは、ここで、病原体と、例えば、シアル酸を含有する細胞表面受容体の間の相互作用を干渉またはブロックし、妨げおよび／もしくは阻害することに加えて（または、おそらくはその結果としてもしくはそれと組み合わせて）、ある種のシアル酸結合分子が免疫調節特性を有することを発見した。
したがって、第一の態様において、本発明は、対象における免疫応答の調節またはプライミングに使用するためのシアル酸結合分子を提供する。さらに、本発明は、対象における免疫応答を調節またはプライミングする方法において使用するためのシアル酸結合分子を提供する。
【０００５】
本発明は、宿主（すなわち、疾患もしくは感染を発症の危険にある対象またはそれを被っている（もしくは被っていることが疑われる）対象）の免疫応答を調節および／またはプライムすることによって、疾患（例えば、細菌、真菌および／またはウイルス病原体によって引き起こされる）を治療および／または予防するためのシアル酸結合分子を提供する。
さらに、本発明は、対象における免疫応答を調節する医薬を製造するためのシアル酸結合タンパク質の使用を提供することができる。また、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法を提供することができ、該方法は、必要とする対象に本発明のシアル酸結合タンパク質の免疫調節（または免疫刺激）の量（amount）または量（quantity）を投与することを含む。
【０００６】
本明細書を通して、用語「含む（comprise）」および／または「含んでいる（comprising）」は、本発明の態様および／または実施形態が、記述された特徴を「含む」ものであり、そのようなものとして、さらに他の特徴を含んでもよいことを意味するために使用されることに留意すべきである。しかしながら、本発明の文脈において、用語「含む」および／または「含んでいる」は、本発明が、関連する特徴「から本質的になる」または関連する特徴「から成る」実施形態を包含する。
【０００７】
本発明のシアル酸結合タンパク質−特に、本明細書に記載されている多価の炭水化物（carbonhydrate）結合モジュール、と関連する利点は（下記参照）、本明細書の記載されている種類の病原体によって引き起こされるまたはそれに寄与される感染および／または疾患により良好に対処し得るように、宿主免疫系をプライムすることである。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、本発明のシアル酸結合分子が、現在の感染および／または疾患だけでなく、将来の感染および／または疾患に対しても対象を保護する予防的治療として使用することができることを示唆する。加えてまたは代替的に、本発明のシアル酸結合分子は、感染後−例えば、既に病原体によって感染されている対象（このような対象は無症候性または症候性であってもよい）に投与され得る。本発明者らは、「感染後」投与する場合にも、本発明のシアル酸分子が、疾患、感染または病原体の消散および／またはクリアランス（除去（clearance））を容易にすることができることを示している。
【０００８】
用語「調節」または「免疫調節」（または「免疫刺激」）は、宿主の免疫応答に本発明の種々のシアル酸結合分子の観察された効果に適用されるように、免疫系の任意のプライミングおよび／または免疫系プロセス、経路およびもしくはそれらの任意の要素（単数または複数）の発現、機能および／または活性において／それらの（免疫）調節（すなわち、増加または減少）を包含する。用語「プライミング」は、免疫応答に適用されるように、免疫原、抗原、病原体、疾患または感染に対する免疫系の即応能力および／または反応性を増加させる現象を包含することができる。理論に束縛されるものではないが、本発明のシアル酸結合分子に関連する任意の免疫調節特性に加えて、シアル酸結合分子を投与されまたはそれと接触された対象が、感染／疾患の発症により良好に対処することができるようにさせ得る。
例えば、本発明は、例えば、ケモカインおよび／もしくはサイトカイン分子ならびに／またはそれらをコードするおよび／もしくはそれに関連する任意の遺伝子／転写因子を含む１つまたは複数の免疫調節化合物の発現、機能および／もしくは活性を増加または増強するシアル酸結合分子を提供し得る。
【０００９】
このようにして、本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、免疫系の１つまたは複数のサイトカインおよび／またはケモカイン分子の機能、発現および／または活性を調節することができる。具体的には、シアル酸結合分子は、病原体による感染に対する免疫応答に関連する１つまたは複数のサイトカインまたはケモカイン分子の機能発現および／または活性を調節することができる。以下により詳細に記載されるように、このような感染は、１つまたは複数のウイルス、細菌および／または真菌の病原体によって引き起こされるまたは寄与され得る。
【００１０】
サイトカインおよび／またはケモカインは、それらの機能、発現および／または活性は本明細書に記載されるシアル酸結合タンパク質によって調節されるが、総称して「感染に関連したサイトカイン／ケモカイン」と呼ぶことができる。用語「感染に関連したサイトカイン／ケモカイン」は、感染のクリアランスおよび／または消散を促進する免疫応答と通常関連しているそれらのサイトカイン／ケモカイン分子を含んでもよい。例えば、この用語は、炎症誘発性の抗ウイルスおよび／またはプロ食作用性サイトカイン／ケモカインを包含することができる。このようにして、本発明のシアル酸結合分子は、１つまたは複数の感染に関連したサイトカイン／ケモカイン、および／または１つまたは複数の炎症促進性、抗ウイルスおよび／もしくはプロ食作用性／細胞傷害性サイトカイン／ケモカインを調節する手段として利用することができる。
【００１１】
本発明者らは、本発明のシアル酸結合分子が、例えば、インターロイキン１−β（ＩＬ１−β）インターロイキン８（ＩＬ−８：研究は、マウスのＩＬ−８のホモログであるＭＩＰ−２発現の増加を同定した）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の発現の増加を誘導し得ることに留意した。当業者は、ＩＬ１−βの発現、機能および／または活性を調節し得る、例えば、増加し得る分子は、このサイトカインによって（少なくとも部分的に）制御される、例えば、炎症応答において効果を有することを認識する。同様に、ＩＬ−８が走化性および食作用に関与していることを考慮すると、このサイトカインの発現、機能および／または活性の任意の態様の調節は、対象における免疫応答を調節する可能性がある。インターフェロンγおよび腫瘍壊死因子αは、先天性および適応免疫応答の周知のメディエーターであり、したがって、これらのサイトカインの発現、機能および／または活性を調節する、（例えば）増加させる化合物は、免疫調節化合物とみなすことができる。
さらに、本発明のシアル酸結合分子は、感染部位への免疫細胞の動員、増殖および／または移動を調節する（例えば、誘導するまたは増加する）ことができる。例えば、本発明のシアル酸結合分子が投与された対象において、免疫細胞の動員、増殖および移動のプロセスは、ある程度および／またはより迅速に悪化され得る。
【００１２】
以上のことから、本発明は、対象における１つまたは複数のケモカインおよび／またはサイトカインの発現、機能および／または活性の刺激、増強または増加において使用するためのシアル酸結合分子を提供する。加えて、本発明は、対象における１つまたは複数のケモカインおよび／またはサイトカインの発現、機能および／または活性を刺激、増強または増加する方法において使用するためのシアル酸結合分子を提供する。
さらに、本発明は、対象における１つまたは複数のケモカインおよび／またはサイトカインの発現、機能および／または活性を刺激、増強または増加する医薬の製造においてシアル酸結合タンパク質の使用を提供することができる。さらに、本発明は、対象における１つまたは複数のケモカインおよび／またはサイトカインの発現、機能および／または活性を刺激、増強または増加する方法を提供することができ、該方法は、それを必要とする対象に本発明のシアル酸結合タンパク質の免疫調節量（amount）または量（quantity）を投与することを含む。
「対象」または「それを必要とする対象」は、例えば、任意のヒトまたは動物（哺乳動物）の対象であってもよい。したがって、本発明のシアル酸結合分子は、ヒトおよび／または動物の対象における免疫応答の調節にも適用することができる。
【００１３】
本発明の免疫調節化合物は、疾患または感染−特に、限定されないが、シアル酸を含有する細胞表面受容体に結合および／または付着することができる病原体によって引き起こされるまたはそれに寄与される疾患または感染の治療および／または予防における用途を見出すことができる。用語「病原体」は、例えば、ウイルス、細菌、原生動物および／または真菌の病原体を含むことができ、それらのいくつかは、宿主細胞のシアル酸を含有する受容体と相互作用しおよび／またはそれと会合しおよび／またはそれに結合する能力を有し得る。したがって、本発明は、ウイルス、細菌、原生動物および／または真菌の病原体によって引き起こされるまたは寄与される呼吸器の疾患／感染の治療および／または予防における用途を見出すことができ、それらのいくつかは、上気道および下気道の表面を裏打ちしている上皮細胞の表面上の、シアル酸を含有する受容体の存在を利用し得る。
【００１４】
したがって、「対象」（動物またはヒトのいずれか）は、感染または疾患、例えば、呼吸器の感染または疾患の症候性でありおよび／またはそれらを被っている（それを疑われる）ものであってもよい。あるいは、対象は、感染または疾患、例えば、呼吸器の感染または疾患に無症候性でありおよび／またはそれに罹り易く／感受性であり得る。全ての場合において、感染または疾患は、微生物（例えば、細菌、ウイルス、原生動物および／または真菌の病因）を有してもよい。
例えば、対象の免疫応答は、その対象の免疫系を（１つまたは複数のケモカインおよび／またはサイトカインの発現、機能および／または活性を誘導または刺激することによって）プライムするように、本発明の免疫調節（シアル酸結合）化合物により調節され得、その結果、本明細書に記載されている種類の病原体によって引き起こされるまたは寄与される感染および／または疾患により良好に対処することができる。
【００１５】
呼吸器の疾患および／または感染は、特定の細胞型に結合しおよび／または入り込むために細胞表面のシアル酸を含有する受容体を利用するオルトミクソウイルス科またはパラミクソウイルス科に属するウイルス、およびある種の連鎖球菌属細菌などの呼吸器病原体によって引き起こされるまたは寄与され得る。例えば、呼吸器疾患は、インフルエンザウイルスおよび／またはパラインフルエンザウイルスなどのウイルス性呼吸器病原体、ならびに、例えば、ヘモフィルス属（Haemophilus）種およびストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）などの細菌性病原体によって引き起こされるまたは寄与され得る。したがって、本発明は、ウイルス、細菌、原生動物および／または真菌の病因による呼吸器疾患のクリアランスおよび／または消散を促進する免疫応答を調節する（増強する、刺激するおよび／または増加する）ために使用され得るシアル酸結合分子を提供する。例えば、本発明は、例えば、オルトミクソウイルス科またはパラミクソウイルス科に属するウイルス、およびある種のヘモフィルス属細菌および／または連鎖球菌属細菌によって引き起こされるまたは寄与される疾患および／または状態の治療および／または予防に有益であるおよび／または促進する免疫応答を刺激し、増強および／または増加するように利用することができる。これらの疾患および／または状態としては、限定されないが、インフルエンザおよびウイルスおよび／または細菌の呼吸器疾患、例えば、クループ、肺炎および気管支炎が含まれ得る。
【００１６】
述べたように、本発明は、呼吸器の病原体によって引き起こされかまたは寄与される感染および／または疾患の治療および／または予防に限定されるとみなされるべきではなく；むしろ、本発明は、免疫応答を調節する化合物を提供し、その結果、様々な異なる病原体によって引き起こされるまたは寄与される疾患および／または感染をより良好に対処することができる。例えば、本発明は、細胞表面のシアル酸部分の存在を必ずしも利用しないが−しかし、宿主における感染および／または疾患をなおも引き起こし得る微生物病原体によって引き起こされるまたは寄与される疾患および／または感染の治療および／または予防における用途を見出すことができる。例えば、本発明者らは、本発明のシアル酸結合分子が、ヘルペスウイルス科に属するウイルスのクリアランス、および／またはそれによって引き起こされるまたは寄与される疾患の消散を促進する免疫応答を調節する（増強する、刺激するまたは改善する）ために使用され得ることを発見した。例えば、本発明は、例えば、ガンマヘルペスウイルスによって引き起こされるまたは寄与される感染または疾患の治療および／または予防に適用することができる。
【００１７】
さらに、本発明者らは、感染後の臨床的に重大な疾患の発症に対して保護するために免疫系をプライミングすることに加えて、ある程度の病原体（例えば、ウイルス）の複製が依然として宿主内で起こる可能性があることを発見した。病原体複製のこの「基準」レベルは、（投与が宿主の免疫応答を調節する）本発明のシアル酸結合タンパク質の投与後、宿主が、将来の病原体曝露に対する保護を提供することができる免疫応答を開始し得る状態であることを保証する。実際に、データは、ウイルス感染の場合、感染前のシアル酸結合分子の投与が、検出可能なウイルス力価が残存する（宿主の利益のために免疫系をプライムしおよび／または調節することによって）その後の感染を妨げるだけでなく、病原体に特異的な抗体が、その後感染に対して保護を与える宿主によって産生されることを示す。
このようにして、発生する任意の感染の前に対象に投与された場合、本発明の免疫調節化合物は、免疫系の調節および免疫系のプライミングを介して、病原体負荷の減少を促進し、順に、感染を取り除き、臨床症状を減少させる手助けをすることができる。
【００１８】
用語「シアル酸」は、本明細書で使用するとき、Ｎ−またはＯ−置換されたノイラミン酸の全ての形態を包含し、全てのその合成形態、天然に存在する形態および／または修飾された形態を含む。シアル酸は、細胞表面分子、糖タンパク質および糖脂質の成分として見出すことができる。ほとんどの場合、シアル酸は、細胞膜および／またはタンパク質に接続された糖鎖の末端（末端領域）に存在する。シアル酸ファミリーは、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９でアセチル化、グリコシル化、ラクトン化およびメチル化から生じる多数の（約５０個の）誘導体を包含する。全てのこのような誘導体は、用語「シアル酸」に包含されるべきである。
【００１９】
さらに、シアル酸は、ＧａｌおよびＧａｌＮＡｃにα（２，３）もしくはα（２，６）連結され、または別のシアル酸にα（２，８）もしくはα（２，９）連結されることが見出される。したがって、用語「シアル酸」は、本明細書を通して使用される一方で、全てのその誘導体、類似体または改変体（天然に存在するまたは合成的に生じさせたもののいずれか）、ならびにシアル酸を含むモノマー、二量体、三量体、オリゴマー、ポリマーまたはコンカタマーを包含することを理解することは重要である。
【００２０】
本発明のシアル酸結合分子は、上述したシアル酸、特に哺乳動物細胞の表面に存在するシアル酸、の全ての形態を含むシアル酸に対する親和性を示す。例えば、本発明の分子は、シアル酸を含む細胞膜受容体に対する親和性を示してもよい。この種の細胞受容体は、粘膜および気道の上皮細胞を含む、上皮細胞の表面上に存在してもよい。ウイルスおよび／または細菌の病原体を含む多数の病原体は、シアル酸に対する親和性を示す分子を発現することができる。この種の病原体は、宿主細胞に結合する手段として、細胞表面のシアル酸部分を利用するよう進化してきた。例えば、宿主細胞の表面に結合したシアル酸部分を介して細胞に結合されると、病原体は、細胞表面に定着しおよび／または細胞に感染し／細胞に入ることができる。
本発明のシアル酸結合分子は、主にヒト上気道の細胞に存在するα−２，６連結されたシアル酸受容体に対する親和性を示し得る。加えてまたは代替的に、シアル酸結合受容体は、上気道および下気道の細胞に存在するα−２，３連結されたシアル酸受容体に対して親和性を示すことができる。
シアル酸に対する親和性を示す分子は、シアル酸部分に結合し、または他にはそれにカップリングしもしくはそれと会合することを理解すべきである。したがって、用語「シアル酸結合分子」は、シアル酸部分に結合し、または他にはそれにカップリングしもしくはそれと会合する能力を保持する任意の断片を包含し得る。
【００２１】
本発明のシアル酸結合分子は、シアル酸に結合することができる単一の分子（例えば、単量体もしくは一価分子）、または、あるいは、２つ以上のシアル酸結合分子（例えば、全てが同一または異なっていてもよく−ポリマーまたは多価分子であってもよい）を含み得る。
【００２２】
本発明のシアル酸結合分子は、「炭水化物結合モジュール」（糖結合モジュール）（ＣＢＭ）として知られている１つまたは複数の分子を含んでもよい。適切なＣＢＭは、シアル酸に対する親和性を示すことができる。本発明において使用するための例示的な炭水化物結合モジュールは、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）ＮａｎＨシアリダーゼ（ＶｃＣＢＭ）のシアル酸結合ドメインおよび／またはストレプトコッカス・ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼ（ＳｐＣＢＭ）由来の同等の（もしくは相同な）ドメインを含んでもよい。当然に、他の生物に存在する類似または相同なシアル酸結合モジュールは、用語「ＣＢＭ」の範囲内に包含されるべきである。
【００２３】
例示的なビブリオ・コレラＮａｎＨシアリダーゼのアミノ酸配列は、アクセッション番号Ａ５Ｆ７Ａ４で寄託され、配列番号１（７８１アミノ酸）として以下に再現される。
MRFKNVKKTA LMLAMFGMAT SSNAALFDYN ATGDTEFDSP AKQGWMQDNT NNGSGVLTNA
DGMPAWLVQG IGGRAQWTYS LSTNQHAQAS SFGWRMTTEM KVLSGGMITN YYANGTQRVL
PIISLDSSGN LVVEFEGQTG RTVLATGTAA TEYHKFELVF LPGSNPSASF YFDGKLIRDN
IQPTASKQNM IVWGNGSSNT DGVAAYRDIK FEIQGDVIFR GPDRIPSIVA SSVTPGVVTA
FAEKRVGGGD PGALSNTNDI ITRTSRDGGI TWDTELNLTE QINVSDEFDF SDPRPIYDPS
SNTVLVSYAR WPTDAAQNGD RIKPWMPNGI FYSVYDVASG NWQAPIDVTD QVKERSFQIA
GWGGSELYRR NTSLNSQQDW QSNAKIRIVD GAANQIQVAD GSRKYVVTLS IDESGGLVAN
LNGVSAPIIL QSEHAKVHSF HDYELQYSAL NHTTTLFVDG QQITTWAGEV SQENNIQFGN
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N
配列番号１のＣＢＭ領域はアミノ酸残基２５から２１６である−この配列は配列番号２であり得る。
【００２４】
例示的なストレプトコッカス・ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼのアミノ酸配列は、アクセッション番号Ｐ６２５７５で寄託され、配列番号３（１０３５アミノ酸）として以下に再現される。
MSYFRNRDID IERNSMNRSV QERKCRYSIR KLSVGAVSMI VGAVVFGTSP VLAQEGASEQ
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AFFLGLFTLG KKREQ
配列番号３のＣＢＭ領域は、アミノ酸残基１２１から３０５である−この配列は配列番号４であり得る。
【００２５】
適切なＣＢＭは、Ｖ．コレラのｎａｎＨ遺伝子（シアリダーゼをコードする）、または別の生物に存在する同等もしくは相同な遺伝子（例えば、Ｓ．ニューモニエの同等／相同なｎａｎＡシアリダーゼ遺伝子）のシアル酸結合ドメインによってコードされるタンパク質性部分を含んでもよい。例えば、本発明のシアル酸結合分子は、Ｖ．コレラシアリダーゼの約１、５、１０、１５、２５または３０残基から（すなわち、１〜３０からまたはそれらの間の任意のアミノ酸残基から）約１５０、１７５、２００、２１０、２１６、２２０〜７８１残基まで（それらの間の任意の残基を含む１５０〜７８１の任意の残基まで）を含んでもよい。シアル酸結合ドメインは、約２５残基から約２１６残基までを含んでもよい。
【００２６】
さらなる適切なＣＢＭは、ストレプトコッカス・ニューモニエｎａｎＡ遺伝子（シアリダーゼをコードする）シアル酸結合ドメインによってコードされるタンパク質性部分を含むことができる。例えば、本発明のシアル酸結合分子は、Ｓ．ニューモニエシアリダーゼの約８０、９０、１００、１１０、１２０、１２１〜１３０残基から（すなわち、それらの間の任意の残基を含む約８０〜１３０残基のいずれかから）約２５０、２７５、３００、２０５、３１０、３２０〜１０３５残基まで（すなわち、約それらの間の任意の残基までを含む約２５０〜１０３５の任意の残基まで）を含んでもよい。シアル酸結合ドメインは、約１２１残基から約３０５残基までを含んでもよい。
【００２７】
本発明のシアル酸結合分子は、１つまたは複数のＣＢＭを含んでもよい。例えば、適切なシアル酸結合分子は、単一のＣＢＭ−例えば、単一のＶｃＣＢＭまたは単一のＳｐＣＢＭを含んでもよい。あるいは、シアル酸結合分子は、複数または多数（すなわち、２つ以上）のＣＢＭを含んでもよい。複数のＣＢＭを含むシアル酸結合分子は、「多価シアル酸結合分子」または「多価ＣＢＭ」と呼ぶことができる。多価ＣＢＭは、例えば、２つ以上のＶｃＣＢＭまたは２つ以上のＳｐＣＢＭｓを含んでもよい。多価（multivalient）ＣＢＭは、異なるＣＢＭの複合物、例えば、１つまたは複数のＳｐＣＢＭを有する１つまたは複数のＶｃＣＢＭを含んでもよい。
【００２８】
本発明の多価シアル酸結合分子は、オリゴマー化ドメインをさらに含むことができる。適切なオリゴマー化ドメインは、多量体構造、例えば、三量体に自己会合する能力を示し得る。例えば、１つまたは複数の（例えば、２つの）シアル酸結合分子（例えば、ＣＢＭ）は、オリゴマー化ドメインに結合され、カップリングされまたは融合されてもよい。オリゴマー化ドメインは、上記の特性を有する任意の分子またはその任意の機能的断片を含むことができる。
適切なオリゴマー化ドメインは、例えば、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）シューダミニダーゼに由来してもよい。例示的なシュードモナス・エルギノーサシューダミニダーゼ配列のアミノ酸配列は、アクセッション番号ＰＡＯ５７９で寄託され、配列番号５（４３８アミノ酸）として以下に再現される。
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RVVVEFARSS SPSTWNIVMP SYFNDGGHKG SGAQVEVGSL NIRLGTGAAV WGTGYFGGID
NSATTRFATG YYRVRAWI
【００２９】
配列番号５の三量体ドメインは、アミノ酸残基３３３から４３８である−この配列は配列番号６であり得る。
本発明において使用するためのオリゴマー化ドメインは、Ｐ．エルギノーサシューダミニダーゼ三量体ドメイン（ＰａＴＤ）の約２５０、２７５、３００、３１０、３２０、３３３、３４０〜３５０残基（すなわち、約それらの間の任意の残基からを含む約２５０から約３５０残基まで）から約４００、４１０、４２０、４３０または４３８残基まで（すなわち、約それらの間の任意の残基までを含む約４００から４３８残基までの約任意の残基まで）を含んでもよい。適切な三量化ドメインは、配列番号６の残基４３８〜３３３を含むことができる。
【００３０】
以上のことから、用語「シアル酸結合分子」または「炭水化物結合モジュール」は、図１ｄに示される多価分子のそれぞれを包含する。
理論に束縛されることを望まないが、本発明者らは、個々のシアル酸結合タンパク質がシアル酸に対して低い親和性を示す一方で、２つ以上のシアル酸結合分子（例えば、２つ以上のＣＢＭ）を含む多価分子は、結合力を介して改善された親和性を示すことを発見した。
したがって、本発明は、対象における免疫応答の調節（調節する方法）に使用するための、例えば、１つまたは複数のＶｃＣＢＭまたはＳｐＣＢＭを含む多価シアル酸結合分子を提供する。本発明は、図１に記載された多価シアル酸結合タンパク質の１つまたは複数を利用してもよい。
【００３１】
例えば、多価シアル酸結合分子は、対象における免疫応答の調節（調節する方法）に使用するための、場合によりオリゴマー化ドメイン（例えば、ＰａＴＤまたはその断片）に融合した、結合したまたはコンジュゲートした、２つ以上のＶｃＣＢＭを含んでもよい。対象における免疫応答の調節（調節する方法）に使用するための多価シアル酸分子は、２つの融合した（または結合した）、順にオリゴマー化ドメインに融合される、ＶｃＣＢＭ（例えば、図１に示される分子Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ参照）を含み、それからなりまたは本質的にそれからなっていてもよい。
【００３２】
さらに、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法において使用するための、場合によりオリゴマー化ドメイン（例えば、ＰａＴＤまたはその断片）に融合し、結合しまたはコンジュゲートする、２つ以上のＳｐＣＢＭを含む多価シアル酸分子を提供してもよい。免疫系の調節に使用するための多価シアル酸分子は、２つの融合した（または結合した）、順にオリゴマー化ドメインに融合されるＳｐＣＢＭ（例えば、図１に示される分子Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ参照）を含み、それからなりまたは本質的にそれからなってもよい。
様々な多価ＣＢＭ（図１に示されるＶｃ２ＣＢＭＴＤおよびＳｐ２ＣＢＭＴＤを含む）は、対象における免疫応答を調節する方法に用途を見出し得て、該方法は、免疫調節量の多価ＣＢＭを投与することを含むことを理解する必要がある。
本発明者らは、対象に少量を投与するときでさえ、本発明のシアル酸結合分子が、呼吸器の（例えば、ウイルスおよび／または細菌の）病原体によるその後のチャレンジからの感染に対して保護を誘導することを留意してきた。保護期間は、約１日〜約２１日の間のいずれかまで持続することができる−実際の期間は、シアル酸結合分子の形態および／または該分子が投与される（もしくは投与されることが意図される）投薬量に依存し得る。「保護期間」は、対象への本発明のシアル酸結合タンパク質の投与後の期間として定義することができ、感染後、その期間中、対象は疾患を発症せず、または実質的にその臨床症状を発症しない。保護期間は、約１４日間または約７日間、持続し得る。保護期間は、約１日から約２、３、４、５または６日まで持続し得る。
【００３３】
本発明は、組成物、例えば、本明細書に記載されるシアル酸結合分子のいずれかを含む医薬組成物を提供する。組成物は、本明細書に記載される免疫応答の調節において、または該免疫応答を調節する方法において使用するための医薬として用途を見出すことができる。
【００３４】
本発明のシアル酸結合タンパク質は、例えば、経口、非経口、局所および／または粘膜／吸入投与用に製剤化および／または調製されてもよい。例えば、本発明のシアル酸結合タンパク質は、対象への投与に適した無菌の医薬組成物として製剤化することができる。このような製剤は、医薬として許容される賦形剤、担体または希釈剤を含んでもよく、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール（polyethylene glycon）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン−ポリプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂などまたはそれらの組み合わせが含まれる。
局所投与用に製剤化された組成物は、軟膏、溶液または水性もしくは非水性液体中の懸濁液として、または水中油型液体エマルジョンとして提供されてもよい。
【００３５】
非経口投与用に（例えば、皮下、皮内、筋肉内および／または静脈内注射によって）製剤化または調製された組成物は、適切な分散剤、湿潤剤および／または懸濁剤を用いて、公知技術に従って製剤された水性または油性懸濁液を含むことができる。この点において、当業者は、許容される担体、希釈剤および／または賦形剤が、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液を含むことができることを認識する。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来使用されている。この目的のために、任意の無菌性固定油を使用してもよく、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドが含まれる。さらに、オレイン酸などの脂肪酸は、本発明による注射可能な組成物の調製における使用を見出すことができる。
【００３６】
粘膜投与用に適した（または処方された）組成物には、鼻腔内に投与されることが意図された組成物を含むことができる。このような組成物は、エアロゾル分散用に、投与されるべきシアル酸結合分子および／もしくは粒子（該シアル酸結合分子を含む）の溶液、または飲料水に分散された該シアル酸結合分子の溶液を含んでもよい。分散される場合、このような組成物は、望ましくは、例えば鼻腔内に、保持することができる１０〜２００ミクロンの範囲にある粒径を有するべきである；これは、必要に応じて、適切な粒子サイズの粉末の使用または適切な値の選択によって達成され得る。他の適切な組成物としては、鼻にかなり近づけて保持される容器から鼻孔を通して迅速な吸入による投与用に、２０〜５００ミクロンの範囲の粒径を有する粗粉末、および水性もしくは油性の溶液または懸濁液中０．２〜５ｗ／ｖ％の活性化合物を含む点鼻薬が含まれる。
当業者は、本発明のシアル酸結合タンパク質−特にＣＢＭ系（本発明の一価／多価分子）が、細胞に導入または発現させるためのベクターの形態で提供され得ることを認識する。
【００３７】
本発明の組成物（すなわち、シアル酸結合タンパク質を含む組成物）は、１つまたは複数の追加の成分をさらに含んでもよく−例えば、他の治療薬部分、ワクチン成分、アジュバント（すなわち、免疫された宿主の免疫応答を増強または促進する任意の薬剤）などが挙げられる。
本発明の組成物は、有効量の単回または複数回投薬量として投与されてもよい。例えば、２回以上の投薬が所定期間にわたって投与されてもよい。
一例として、初期投薬が投与され、続いて、初期投薬後、１、２、３、４、５、６、７、８、９および／または１０週間の間隔で与えられる１回または複数回の「追加免疫」投薬（二次投薬）が投与されてもよい。
【００３８】
本発明のシアル酸結合分子は、健常な対象に１回または複数回の投薬として（１回又は複数回分として）、それを必要とする対象に投与されてもよい（例えば、粘膜組織および／もしくは鼻腔内にまたはエアロゾルによって肺に投与されてもよい）。健常な対象は、例えば、微生物の呼吸器病原体などの微生物病原体によって引き起こされるまたは寄与される疾患または状態を被っていない対象である。感染前の最大約１０日に、例えば、１、２、３、４、５、６および／または７日に投与されたシアル酸分子は、その後の病原体チャレンジに対する保護を提供することが示されている。
本発明の種々のシアル酸結合タンパク質、ＣＢＭおよび／またはＳｐ２ＣＢＭＴＤは、約０．１、１、１０および１００μｇ／対象／日の投薬量で投与されてもよい。本発明のシアル酸結合タンパク質、ＣＢＭおよび／またはＳｐ２ＣＢＭＴＤは、感染またはおそらく感染前に１回または複数回、健常な対象に投与されてもよい。本発明のシアル酸結合タンパク質、ＣＢＭおよび／またはＳｐ２ＣＢＭＴＤは、非経口的、経口的および／または鼻腔内に投与されてもよい。
【００３９】
述べたように、本発明者らは、鼻腔内に投与した場合、本発明の単回の１μｇ投薬量の多価シアル酸結合タンパク質−特に、図１に記載されるＳｐ２ＣＢＭＴＤ分子は、免疫系をプライム（または刺激）し、病原体、例えば、呼吸器病原体を用いたチャレンジに対する保護を最大約７日間、１４日間または２１日間、提供することができることに留意した。さらに、インフルエンザＨ７Ｎ９感染前に投与された、０．１μｇ／対象／日投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤは、疾患およびその後の感染に対して完全な保護を提供するのに十分であった。
【００４０】
本発明は、対象における免疫応答の調節に使用するためのシアル酸結合分子を提供し、ここで、該シアル酸結合分子は、粘膜組織におよび／または鼻腔内に投与される。
さらに、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法に使用するためのシアル酸結合分子を提供し、ここで、該方法は、免疫調節量のシアル酸結合分子を粘膜組織におよび／または鼻腔内に投与することを含む。
以上のことから、本発明は、本明細書に記載されるシアル酸結合分子の１つまたは複数を含むワクチン組成物を提供することができる。本発明のワクチン組成物は、非経口、粘膜（エアロゾル／鼻腔内）および／または経口投与用に製剤化されてもよい。本発明のシアル酸結合分子は、ワクチンと別々にまたは同時に投与されてもよい。別々に投与する場合、シアル酸結合分子は、ワクチンの前および／または後に対象に投与され得る。したがって、本発明は、対象にワクチン接種する方法を提供し、ここで、対象は、本発明のシアル酸結合分子を用いて、一緒に（同時にまたは別々に）ワクチンを投与される。さらに、本発明は、ワクチン接種により疾患からの対象の保護に使用するためのシアル酸結合分子に関し得、ここで、シアル酸結合分子は、ワクチンと一緒に（同時にまたは別々に）投与される（投与されるべきである）。
【００４１】
本発明の組成物（すなわち、シアル酸結合タンパク質を含む組成物）は、１つまたは複数の追加の成分をさらに含んでもよく−例えば、他の治療薬部分、ワクチン成分、アジュバント（すなわち、免疫された宿主の免疫応答を増強または促進する任意の薬剤）などが挙げられる。
さらなる態様において、本発明は、例えば、本明細書に記載されているＣＢＭまたはシアル酸結合ＣＢＭ断片を含む本発明のシアル酸結合分子のいずれかをコードする核酸を提供する。さらに、本発明は、本発明のシアル酸結合分子をコードする遺伝子配列の部分に相補的である、オリゴヌクレオチドおよび／またはプライマー配列を提供する。当業者は、この種のオリゴヌクレオチドおよび／またはプライマーが、本発明における使用のためのシアル酸結合分子を組換え生成するための方法において有用であることを認識する。
【００４２】
加えて、本発明は、シアル酸結合分子をコードする配列を含む核酸を提供する。このような配列は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含むことができる。本発明の核酸配列は、組換え技術の使用に適しているベクターまたはプラスミドの形態、例えば、発現ベクターの形態をとることができる。本発明の核酸配列は、転写調節因子に作動可能に連結され、および／またはタグ部分をコードする配列に（直接的もしくは間接的に）融合されてもよい。本発明の核酸は、オリゴマー化ドメインをコードする配列をさらに含んでもよい。
当業者は、本発明のシアル酸結合分子のいずれかが、組換え技術を用いて調製することができ、ここで、例えば、宿主細胞が、シアル酸結合分子をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質転換されることを認識する。組換え的に生成されたシアル酸結合分子は、異種集団のタンパク質および他の材料からシアル酸結合分子の精製および／または単離を達成するための親和性精製技術において利用され得る「タグ」または「標識」を含んでもよい。
【００４３】
以上のことから、本発明は、本発明の核酸および／またはベクターを用いて形質転換された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、微生物細胞（例えば、細菌宿主細胞）または哺乳動物細胞であってもよい。
したがって、本発明は、異種タンパク質、例えば、検出可能な（おそらくは場合により検出可能な）部分および／または親和性精製部分（例えば、ＨｉｓもしくはＧＳＴタグ）に融合され、接続され、結合されまたはコンジュゲートされた、本発明のシアル酸結合分子を含む融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、ＣＢＭ（またはそのシアル酸結合断片）と、それに結合される、コンジュゲートされる、接続されるまたは融合されるオリゴマー化ドメインを含んでもよい。この種の融合タンパク質は、多価シアル酸結合分子（例えば、多価ＣＢＭ）の生成に用途を見出すことができる。
【００４４】
さらなる態様において、本発明は、例えば、本明細書に開示されている、シアル酸を利用しているウイルス、細菌、原生動物および／または真菌の病原体を含む、上述の病原体のいずれかによって引き起こされるまたは寄与される疾患および／または感染の治療または予防に使用するための本発明のシアル酸結合タンパク質のいずれかを提供することができる。例えば、本発明のシアル酸分子のいずれかは、医学における使用のためであってもよい。さらに、図１に開示されているＣＢＭ分子は、呼吸器疾患の治療もしくは予防において、または呼吸器疾患を治療する方法において使用するための医薬または組成物として用途を見出してもよい。
さらに、本発明は、本出願の明細書および図に記載されるシアル酸結合分子のいずれかを提供する。例えば、本発明は、図１に記載されるシアル酸結合分子の１つまたは複数を提供する。
【００４５】
本発明はまた、Ｈ７Ｎ９インフルエンザを含むインフルエンザの治療に使用するための、例えば、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを含む、本発明のシアル酸結合タンパク質のいずれかを提供する。また、Ｈ７Ｎ９インフルエンザを含むインフルエンザを治療する医薬を製造するための、例えば、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを含む、本発明のシアル酸結合タンパク質の使用を開示する。本発明はまた、Ｈ７Ｎ９インフルエンザを含むインフルエンザを治療するための方法を提供し、該方法は、治療的有効量の本発明のシアル酸結合タンパク質および／またはＳｐ２ＣＢＭＴＤを、それを必要とする対象に投与することを含む。理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの投与が、チャレンジ後の抗ＨＡ抗体の発生に影響を及ぼさず、免疫応答のレベルが、高投薬量のウイルスによる再感染を含む、Ｈ７Ｎ９ウイルス再感染に対して保護するには十分であったことを留意した。
【００４６】
ここで、本発明は、以下に示される発明を参照して説明され、下記に示す。
なお、本発明としては、以下の構成も好ましい。
〔１〕  対象における免疫応答の調節またはプライミングに使用するためのシアル酸結合分子。
〔２〕  シアル酸結合分子が、１つまたは複数の免疫調節性化合物の発現、機能および／または活性を調節する、〔１〕に記載の使用のための、〔１〕に記載のシアル酸結合分子。
〔３〕  免疫調節性化合物が、ケモカイン、サイトカイン、ならびに／またはそれをコードするおよび／もしくはそれと関連する遺伝子／転写因子である、〔２〕に記載の使用のための、〔２〕に記載のシアル酸結合分子。
〔４〕  免疫応答が、病原体によって引き起こされる感染または病原体が寄与する感染に対して保護する保護的免疫応答である、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔５〕  病原体が、ウイルス、細菌および／または真菌の病原体である、〔４〕に記載の使用のための、〔４〕に記載のシアル酸結合分子。
〔６〕  シアル酸結合分子が、インターロイキン１−β（ＩＬ１−β）、インターロイキン８（ＩＬ−８）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の発現増加を誘導する、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔７〕  シアル酸結合分子が、免疫系細胞の動員、増殖および／または移動を調節する、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔６〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔８〕  シアル酸結合分子が、好中球の動員、増殖および／または移動を調節する、〔７〕に記載の使用のための、〔７〕に記載のシアル酸結合分子。
〔９〕  対象における免疫応答の調節もしくはプライミングに使用するための、ならびに／あるいは対象における１つまたは複数のケモカインおよび／もしくはサイトカインの発現、機能および／または活性の刺激、増強もしくは増加に使用するためのシアル酸結合分子であって、前記対象は病原体を有するまたは病原体による感染の危険性がある、シアル酸結合分子。
〔１０〕  対象がヒトまたは動物対象である、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔９〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１１〕  対象が病原体特異的抗体を産生する能力を維持する、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１０〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１２〕  使用中に検出可能な病原体力価が存在する、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１１〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１３〕  使用が予防的使用である、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１２〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１４〕  対象が感染の症状であり、シアル酸結合分子が、感染の消散および／またはクリアランスを促進する免疫系を調節するために投与される、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１３〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１５〕  シアル酸結合分子が、Ｎ置換もしくはＯ置換されたノイラミン酸、ならびにその合成形態、天然に存在する形態および／または修飾された形態に結合する、〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１４〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１６〕  シアル酸結合分子が、α−２，６連結したシアル酸および／またはα−２，３連結したシアル酸を含有する受容体に親和性を示す、〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１５〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１７〕  シアル酸結合分子が、単一のシアル酸結合分子または２つ以上のシアル酸結合分子を含む、〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１６〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１８〕  シアル酸結合分子が、１つまたは複数の炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含む、〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔１７〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔１９〕  ＣＢＭが、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）ＮａｎＨシアリダーゼ（ＶｃＣＢＭ）のシアル酸結合ドメインおよび／またはストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）ＮａｎＡシアリダーゼ（ＳｐＣＢＭ）由来の同等ドメインを含む、〔１８〕に記載の使用のための、〔１８〕に記載のシアル酸結合分子。
〔２０〕  ＣＢＭが、配列番号１、２、３もしくは４として示される配列の１つまたは複数を含むまたは該配列の１つまたは複数からなる、〔１８〕または〔１９〕に記載の使用のための、〔１８〕または〔１９〕に記載のシアル酸結合分子。
〔２１〕  シアル酸結合分子が、
（ｉ）１つまたは複数のＣＢＭ；
（ｉｉ）複数もしくは多数のＣＢＭ；
（ｉｉｉ）多価ＣＢＭ；
（ｉｖ）２つ以上のＶｃＣＢＭ；
（ｖ）２つ以上のＳｐＣＢＭ；
（ｖｉ）異なるＣＢＭの組み合わせ；または
（ｖｉｉ）１つまたは複数のＳｐＣＢＭを伴う１つまたは複数のＶｃＣＢＭ
を含む、〔１〕〜〔２０〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２０〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔２２〕  免疫応答が、細菌、真菌および／またはウイルス感染に対して保護的である、〔２１〕に記載の使用のための、〔２１〕に記載のシアル酸結合分子。
〔２３〕  シアル酸結合分子が、オリゴマー化ドメイン（ＴＤ）をさらに含む、〔１〕〜〔２２〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２２〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔２４〕  オリゴマー化ドメインが、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）シューダミニダーゼ由来である、〔２３〕に記載の使用のための、〔２３〕に記載のシアル酸結合分子。
〔２５〕  オリゴマー化ドメインが、配列番号５または６として示される配列を含む、〔２３〕または〔２４〕に記載の使用のための、〔２３〕または〔２４〕に記載のシアル酸結合分子。
〔２６〕  シアル酸結合分子が、
（ｉ）ＶｃＣＢＭ；
（ｉｉ）Ｖｃ２ＣＢＭ；
（ｉｉｉ）Ｖｃ３ＣＢＭ；
（ｉｖ）ＶｃＣＢＭＴＤ；
（ｖ）ＳｐＣＢＭＴＤ；
（ｖｉ）Ｖｃ４ＣＢＭ；
（ｖｉｉ）Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ；および
（ｖｉｉｉ）Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ
からなる群から選択される１つまたは複数を含む、〔１〕〜〔２５〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２５〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔２７〕  調節された免疫応答が保護的免疫応答であり、保護期間が約１日から約２、３、４、５、６、７または１４日まで持続する、〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２６〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔２８〕  シアル酸結合分子が、医薬製剤として調製される、〔１〕〜〔２７〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２７〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔２９〕  シアル酸結合分子が、経口、非経口、粘膜および／または鼻腔内投与用に製剤化される、〔１〕〜〔２８〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２８〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔３０〕  シアル酸結合分子が、期間全体で１回または複数回の投薬として投与される、〔１〕〜〔２９〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔２９〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔３１〕  シアル酸結合分子が、感染または推定感染前に１回または複数回の投薬として投与される、〔１〕〜〔３０〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔３０〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔３２〕  シアル酸結合分子が、対象における感染後に１回または複数回の投薬として投与される、〔１〕〜〔３１〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔３１〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔３３〕  シアル酸結合分子が、約０．１、１、１０または１００μｇのシアル酸結合分子／対象／日の投薬量で投与される、〔１〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載の使用のための、〔１〕〜〔３２〕のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
〔３４〕  シアル酸結合分子が、粘膜組織におよび／または鼻腔内に投与される、対象における免疫応答の調節に使用するためのシアル酸結合分子。
〔３５〕  １つまたは複数のシアル酸結合分子を含むワクチン組成物。
〔３６〕  疾患の治療または予防に使用するためのシアル酸結合分子。
〔３７〕  インフルエンザの治療または予防に使用するための、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを含むシアル酸結合分子。
〔３８〕  必要とする対象にシアル酸結合タンパク質の免疫調節の量（amount）または量（quantity）を投与することを含む、対象における免疫応答を調節する方法。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】多価ＣＢＭ形態の構成要素およびシアル酸に対するそれらの親和性を示す図である。ａ、ＶｃＣＢＭ、球として描かれたα−２，３−シアリルラクトースを有するＶ．コレラシアリダーゼ（ＰＤＢ：１ｗ０ｐ）の残基２５〜２１６。ｂ、ＳｐＣＢＭ、α−２，３−シアリルラクトース（ＰＤＢ：４ｃ１ｗ）を有するＳ．ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼの残基１２１〜３０５。ｃ、ＴＤ、三量体ドメイン、レインボー色のＰ．エルギノーサシアリダーゼ（ＰＤＢ：２ｗ３８）の残基３３３〜４３８；単一色の他の２つのモノマー。ｄ、多価形態：２５℃で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定した場合のそれらの分子量、結合価およびα２，３−シアリルラクトースに対する結合親和性（ＶｃＣＢＭ、Ｖｃ２ＣＢＭおよびＶｃ３ＣＢＭについてのＫD値は以前に報告されている8）。タンデムリピートＣＢＭ、およびＴＤに融合したオリゴマーＣＢＭは、５−アミノリンカーによって連結される（全方法に詳述される）。
【図２】Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを用いた致死的チャレンジ後のＢＡＬＢ／ｃマウスの体重変化および肺ウイルス力価を示す図である。ａ、ウイルスチャレンジ直前の５００μｇのＶｃ４ＣＢＭまたはＢＳＡ（対照）の単回の鼻腔内投与後のマウスの体重変化（ｎ＝４）。ｂ、感染後の７日に測定されたマウスにおける肺ウイルス力価。ｃ、ウイルスチャレンジ直前の三量体（ＶｃＣＢＭＴＤ、ＳｐＣＢＭＴＤ、４００μｇ）もしくは六量体（Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ、１００μｇ）の生物製剤またはＰＢＳ（対照）の単回の鼻腔内投与後のマウスにおける体重変化（ｎ＝４）。ｄ、感染後の７日に測定されたマウスにおける肺のウイルス力価。破線は、ウイルス検出の限界を示す。バーは、各処理されたグループと対照グループについての平均±ｓ．ｄ．を表す。*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．００１、***ｐ＜０．０００１。
【図３】マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを用いた致死的チャレンジが与えられたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＣＢＭの予防的投与の効果を示す図である。ａ、ウイルスチャレンジ前の−１日に与えられた単回鼻腔内投薬量（５０、２５０もしくは５００μｇ）のＶｃ４ＣＢＭまたは（１０、５０もしくは２５０μｇ）のＶｃ２ＣＢＭＴＤもしくはＳｐ２ＣＢＭＴＤ後のマウス（ｎ＝５）の生存および体重変化。ｂ、ウイルスチャレンジ直前の０日に与えられた同じ単回鼻腔内投薬量の３つの生物製剤後のマウス（ｎ＝５）の生存および体重変化。各投与日について、生存曲線を上段パネルに示し、対応する体重減少曲線を下段パネルに示す。この場合、各値は、５匹のマウスについての平均体重±ｓ．ｄ．を表す。
【図４】マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを用いた致死的チャレンジ前にＳｐ２ＣＢＭＴＤとともに投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存および体重変化を示す図である。ａ、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）は、０日のウイルスチャレンジ前の−７日、−３日または−１日に単回、２回もしくは３回の鼻腔内投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤ（５０μｇ）を与えられた。また、マウスは、生物製剤の毒性を決定するために、３回の鼻腔内投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤ単独を与えられた（体重変化を青色で示す、最終パネル）。ｂ、ウイルスチャレンジ前の−７日、−３日または−１日に与えられた単回鼻腔内投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤ（１０、１もしくは０．１μｇ）後のマウス（ｎ＝５）の生存および体重変化。各投与日について、生存曲線を上段パネルに示し、対応する体重減少曲線を下段パネルに示す。全ての場合において、対照動物は、感染され、未処理であった。各値は、５匹のマウスについての平均体重±ｓ．ｄ．を表す。
【図５】末端シアル酸グリカンに対する特異性と乱雑性を示すＳｐＣＢＭについてのグリカンアレイスクリーニングを示す図である。５１１個のグリカン（機能性グライコミクスのためのコンソーシアム）からなるグリカンアレイｖ４．２を用いた、ＧＦＰ融合ＳｐＣＢＭのグリカン結合は、相対蛍光単位（ＲＦＵ）として表される。トップ４０ヒットは全てのシアロシドであり、そのうちの最初の２９個のグリカンのみをＲＦＵの減少順に列挙する。エラーバーは、４つの独立した反復についてのシグナルにおける平均の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。信頼値は、％ＣＶ＝１００×標準偏差／平均ＲＦＵ。
【図６】シアリダーゼによる前処理を伴うおよび伴わないＳｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤの細胞結合を示す図である。哺乳動物Ａ５４９およびＭＤＣＫ細胞は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＶｃ２ＣＢＭＴＤとのインキュベーション前にＳ．ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼの触媒ドメインとともに処理されまたは該触媒ドメインなしに処理され、続いて、それぞれウサギ抗ＳｐＣＢＭ抗体および抗ＶｃＣＢＭ抗体と一緒にインキュベーションされ、その後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識された抗ウサギＩｇＧ抗体と一緒にインキュベーションされた。ａ、シアリダーゼで前処理された細胞（右パネル）と比較して、細胞表面受容体へのｍＣＢＭ結合（緑色）を示すＡ５４９およびＭＤＣＫ細胞（左パネル）のライブ画像。核をＤＡＰＩ（青色）を用いて染色する。ｂ、シアリダーゼを用いてまたはシアリダーゼなしに処理された場合、細胞へのｍＣＢＭ結合の相対的蛍光単位（ＲＦＵ）。バーは、各処理されたグループと未処理のグループについての平均±ｓ．ｄ．を表す。
【図７】マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを用いたチャレンジの２４時間後にｍＣＢＭを用いて投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）は、ウイルスチャレンジの１日後に単回投薬量のＶｃ４ＣＢＭ（ａ）、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ（ｂ）またはＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ｃ）を用いて鼻腔内投与され、生存についてモニターされた。グラフは、異なる投薬量の各ｍＣＢＭの生存曲線を表す。
【図８】Ｖｃ４ＣＢＭ、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤまたはＳｐ２ＣＢＭＴＤを用いた投与後、マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスが接種されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける血清抗体応答を示す図である。ａ、−１日または０日に与えた場合、Ｖｃ４ＣＢＭ（５０、２５０または５００μｇ、左パネル）、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ（１０、５０または２５０μｇ、中パネル）およびＳｐ２ＣＢＭＴＤ（１０、５０または２５０μｇ、右パネル）の単回投与後の抗ＨＡ力価。ｂ、−７日、−３日もしくは−１日に１回、２回または３回与えた、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（５０μｇ）の投与後の抗ＨＡ力価。ｃ、−７日、−３日もしくは−１日に与えた、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（１または１０μｇ）の単回投与後の抗ＨＡ力価。バーは、各処理グループについての平均逆数ＨＩ力価（ｌｏｇ2）±ｓ．ｄ．を表す。
【図９】ヒト集団におけるＶｃＣＢＭまたはＳｐＣＢＭに対する既存の免疫性の欠如の実証を示す図である。ＥＬＩＳＡを用いた抗ＣＢＭ抗体の存在についてのヒト血液血清の分析。試料（ｎ＝５０）は、男性および女性（Ｓｅｒａｌａｂ，ＵＫ）の混ぜ合わさった年齢集団から得られた。Ａｄ８７およびＡｄ８８は、アデノウイルス抗体についての陽性対照である。エラーバーは、バッファーブロック（血清なし）に対して測定されたｓ．ｄ．を表す。*ｐ＜０．００１。
【図１０】マウスにおける処理後のＳｐ２ＣＢＭＴＤに対する血清ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体の検出を示す図である。マウスは、０日にマウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを用いたチャレンジ前の−７日、−３日または−１日に１０または１μｇ（５０μｌ）のＳｐ２ＣＢＭＴＤを鼻腔内投与された。血清は、全方法に記載されるように、ＥＬＩＳＡにより抗Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ抗体について分析するために＋２１日に採取された。バーは、それぞれ、グループあたり３匹のマウスからのＩｇＧ（ａ）、ＩｇＡ（ｂ）およびＩｇＭ（ｃ）についての平均吸光度変化±ｓ．ｄ．を示す。破線は、それぞれ、ＩｇＧ（Ａ450-620nm  ０．０７４）、ＩｇＡ（０．１１５）およびＩｇＭ（０．０４７）のアッセイの検出限界を示す。
【図１１】ケモカインおよびサイトカインの肺発現におけるｍＣＢＭの効果を示す図である。炎症性メディエーターのＭＩＰ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２は、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ（１００μｇ）、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（１００μｇ）、Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルス（５×１０3  ＰＦＵ）またはＰＢＳ（対照）のいずれかの経鼻投与後の２日および４日に、ＢＡＬＢ／ｃマウスから得られた肺ホモジネートを用いたＥＬＩＳＡによりアッセイされた。ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−２を除いて全て、肺ホモジネートにおいて検出された。バーは、５匹のマウスからの平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）±ｓ．ｄ．を示す。対照グループ（非感染、未処理）の結果と比較して*ｐ＜０．０５。
【図１２】マウスガンマヘルペスウイルスＭＨＶ−６８（４×１０5ＰＦＵ）またはＰＢＳ（対照）を用いたチャレンジ前に３回投薬量（５０μｇ、−７日、−３日、−１日）として投与された場合、肺ウイルス負荷（ａ）およびサイトカインレベル（ｂ）におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの六量体ｍＣＢＭの効果を示す図である。バーは、５匹からの平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）±ｓ．ｄ．を示す。マンホイットニー検定*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１。
【図１３】Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質の安定性を決定するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。ゲルは、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）において還元条件下で、ＰＢＳに溶解した濃度５．２５〜０．６６μｇ／チャネルで１０μｌ／チャネルを構成した。
【図１４】Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて致死的にチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存および体重変化におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの単回投与（ウイルスチャレンジ前）の効果を示す図である。
【図１５】Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて致死的にチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存および体重変化におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの単回投与（ウイルスチャレンジ後）の効果を示す図である。
【図１６】Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて致死的にチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存および体重変化におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの反復投与（ウイルスチャレンジ前）の効果を示す図である。
【図１７】致死的投薬量のＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて感染されたマウスの生存におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの単回および反復投与の効果を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）は、イソフルランで軽く麻酔され、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種の７、３もしくは１日前（Ａ）に、または接種の６時間もしくは２４時間後（Ｂ）に、単回投薬量（０．１、１、１０または１００μｇ／マウス）として鼻腔内投与された。２回および３回投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤは、それぞれ、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種前の３日および１日、または７日、３日および１日に投与された（Ｃ）。マウスは、５ＭＬＤ５０のＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて鼻腔内接種され、生存および体重減少について毎日モニターされた。対照の未処理動物は、７日、３日および１日に滅菌ＰＢＳを受けた。
【図１８】マウス肺切片におけるＨ７Ｎ９インフルエンザウイルスＮＰ陽性細胞の数におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果を示す図である。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種前の７日もしくは３日に単回投薬として、または２回（３日および１日）もしくは３回（７日、３日および１日）投薬としてＳｐ２ＣＢＭＴＤ（１０μｇ／マウス）を与えられた。各実験グループにおける３匹のマウスは、感染後の３日、６日および９日に屠殺された。マウス肺を取り出し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、抗インフルエンザＡ核タンパク質（ＮＰ）抗体を用いて免疫組織学的に染色された。マウスあたり全肺葉を含む１つのスライドが評価するために使用された。感染後の３日（Ａ）、６日（Ｂ）および９日（Ｃ）にＮＰ陽性細胞の数の定量的分析は、Ｉｍａｇｅ  Ｓｃｏｐｅ視覚ソフトウェアによって行われた。具体的には、染色された細胞は、核と細胞質内で暗褐色である。対照動物（Ｄ、Ｆ、Ｈ）の肺組織の画像は、感染後の９日（Ｈ）のいくつかの抗原陽性細胞と比較して、感染後の３日および６日（Ｄ、Ｆ）に細気管支および呼吸上皮細胞におけるＨ７Ｎ９インフルエンザ抗原陽性染色を示した。代表的なＳｐ２ＣＢＭＴＤ処理グループの画像（Ｈ７Ｎ９接種前の７日、３日および１日に３回投与）は、対照、および感染後の９日（Ｉ）のいくつかの陽性細胞と比較して、感染後の３日と６日（Ｅ、Ｇ）にマウスの肺において抗原陽性細胞の顕著な減少を示した。破線は、ウイルス感染され、ＰＢＳ処理された動物において決定されたＨ７Ｎ９インフルエンザ抗原陽性細胞を示し、１００％と考えられた。倍率、２０×。研究された感染後の各日の対照グループについての結果と比較して*Ｐ＜０．０１、**Ｐ＜０．０５；２方向ＡＮＯＶＡ。
【図１９】Ｓｐ２ＣＢＭＴＤで処理され、５ＭＬＤ５０のＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスで感染されたマウスの肺における組織学的変化を示す図である。図１８の凡例に記載されるように、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを投与した。マウス肺を１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。Ｈ７Ｎ９に感染させ、ＰＢＳ処理されたマウスの肺は、感染後の３日に気管支の上皮細胞に壊死があり（Ａ）、感染後の６日に炎症性細胞、浮腫、およびウイルス性肺炎を有する肺胞の崩壊と浸潤があった（Ｂ）。浮腫と炎症性細胞を伴う浸潤は、感染後の９日に観察されたが（Ｃ）、病変は、いくつかの領域に制限されていた。特徴的な病理学的変化は、感染後の３日に３回投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤを与えられたマウスの肺では観察されず（Ｄ）、感染後の６日および９日に最小の上皮壊死および炎症性細胞を伴う肺胞の浸潤があった（Ｅ、Ｆ）。倍率、２０×。実線の矢印は上皮壊死を示し、白抜きの矢じりは浮腫を示し、実線の矢じりはマクロファージおよび好中球を伴う細気管支周囲の肺胞の浸潤を示す。
【図２０】サイトカインおよびケモカインの肺発現におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤ投与の効果を示す図である。図１８の凡例に記載されるように、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを投与した。ＩＦＮ−γ（Ａ）、ＩＬ−１β（Ｂ）、Ｉｌ−６（Ｃ）、ＴＮＦ−α（Ｄ）、ＲＡＮＴＥＳ（Ｅ）、ＭＩＰ−１α（Ｆ）、ＭＣＰ−１（Ｇ）およびＩＰ−１０（Ｈ）の濃度は、Ｈ７Ｎ９ウイルス感染前の０日にＢＡＬＢ／ｃマウスの肺ホモジネートにおいて、ＭＹＣＴＯＭＡＧ−７０Ｋ−ＰＭＸ  ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）予備混合キットにより評価された。バーは、３匹のマウスからの平均濃度（ｐｇ／ｍＬ）±ＳＤを示す。黒色のバーは、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種され、ＰＢＳ処理されたマウス（対照）を表す。灰色のバーはＳｐ２ＣＢＭＴＤを用いて処理されたマウスを表す。*ｐ＜０．０５；**ｐ＜０．０５、対照群の結果と比較される、対応のないスチューデントｔ検定。
【図２１】Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの投与後の好中球を伴うマウス肺組織の浸潤。図１８の凡例に記載されるように、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを投与した。マウス肺を感染後の０日に得、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、好中球に特異的なマーカーであるミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）を用いて染色した。ＭＰＯ染色された切片を病理評価のために盲検化した。抗原の存在は、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全肺切片のデジタル画像を捕捉し、次に、著しく減少または不存在のＭＰＯ染色の場所と一緒に領域全体を手動で輪郭を描くことにより定量された。染色範囲が減少した肺領域の割合は、Ａｐｅｒｉｏ’ｓ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを用いて算出され、ウイルス感染され、ＰＢＳ処理された（対照）動物（Ａ）と比較して相対値として表された。対照動物（Ｂ）と、Ｈ７Ｎ９ウイルス感染前の単回（Ｃ）、２回（Ｄ）または３回（Ｅ）投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤが与えられた動物の代表的なＭＰＯ染色した肺画像。倍率、２０×。実線の矢じりは好中球を示す。対照グループの結果と比較した*ｐ＜０．０００１；一元配置ＡＮＯＶＡ。
【実施例】
【００４８】
（例１）
新規な遺伝子操作されたタンパク質を用いて宿主受容体を標的にすることによるインフルエンザの予防
方法
ウイルス。インビトロ研究に関して、以下のインフルエンザウイルスを使用した：Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（Ａ／ＰＲ／８／１９３４、Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ（ウドーン）／１９７２（Ｈ３Ｎ２）、およびＢ／香港／１９７３は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）中で増殖させた。ＭＤＣＫ細胞におけるウイルス感染性をプラークアッセイによって決定し、ｌｏｇ10ＰＦＵ／ｍｌとして表した。インビボ研究に関して、２つの菌株を使用した：マウスに適合されたＡ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）株はＭＤＣＫ細胞内で増殖し、マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルス30は発育鶏卵で増殖させた。Ａ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）について５０％マウス致死的投薬量（ＭＬＤ50）を決定するために、４匹の雌性６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）をイソフルランで軽く麻酔し、５０μＬの１０倍連続希釈した、ＰＢＳ中のウイルスを用いて鼻腔内接種した。ＭＬＤ50値は、２１日間の観察期間後に決定された。
【００４９】
ｍＣＢＭｓの生成。Ｖ．コレラ由来のシアリダーゼをコードするｎａｎＨ遺伝子のファミリー４０31シアル酸結合ドメイン（ＣＢＭ）に基づいて、タンデムリピート多価タンパク質であるＶｃ４ＣＢＭは、以前に記載される8ように、ＰＣＲに基づくクローニング技術を用いて生成された。Ｖ．コレラｎａｎＨシアリダーゼ由来およびＳ．ニューモニエｎａｎＡシアリダーゼ由来のＣＢＭドメインのオリゴマー化は、シュードモナス・エルギノーサ由来のシューダミニダーゼタンパク質由来の三量体化ドメインを用いて、以下のように遺伝子操作された：それぞれ、Ｖ．コレラシアリダーゼのＣＢＭの残基２５〜２１６とＳ．ニューモニエｎａｎＡシアリダーゼのＣＢＭの残基１２１〜３０５をコードするＤＮＡ断片は、プライマー対（表３）を用いたＰＣＲ増幅によって５’および３’末端で修飾され、Ｐ．エルギノーサシューダミニダーゼ由来の三量体化ドメインの残基３３３〜４３８（ＰａＴＤ）をコードする遺伝子に対する続くライゲーションのために、タンデムにＣＢＭユニットの１または２コピーを連結させる異なる制限部位を導入した。得られた断片を、適切に消化されたｐＥＨＩＳＴＥＶベクター（ＶｃＣＢＭ断片用）またはｐＥＧＦＰ−ＨＩＳＴＥＶベクターｖ（ＳｐＣＢＭ断片用）のいずれかにクローニングし、それぞれＶｃＣＢＭＴＤ、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ、ＳｐＣＢＭＴＤおよびＳｐ２ＣＢＭＴＤとして指定された構築物を作製した（図１）。ＧＦＰ−ＳｐＣＢＭはまた、グリカンアレイ研究のためにｐＥＧＦＰ−ＨＩＳＴＥＶベクターを用いて作製された。全ての構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞中で増殖させ、構築物をＤＮＡ配列決定により確認し、その後、タンパク質産生用の発現宿主大腸菌ＢＬ２１ゴールド（ＤＥ３）を形質転換した。
【００５０】
ｍＣＢＭ発現、精製および特徴付け。遺伝子操作されたｍＣＢＭｓの発現は、いくつかの修正を伴うが、以前に記載される8ように実施された。簡単には、Ｈｉｓタグ化ＶｃＣＢＭまたはＧＦＰ−Ｈｉｓタグ化ＳｐＣＢＭのいずれかを含有する大腸菌細胞は、ＰＢＳ、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールを含有し、ＤＮＡａｓｅ（２０μｇ／ｍｌ）およびプロテアーゼ（マイナスＥＤＴＡ）インヒビタータブレット（Ｒｏｃｈｅ）を伴う緩衝液中で溶解された。清澄化された溶解物は、ニッケルを予め充填されたＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用され、その後、０．３Ｍ  ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールを含有するＰＢＳを用いてヒスチジンタグ化されたＣＢＭを溶出した。タグの除去は、特に明記しない限り、一晩、インサイチュでＴＥＶプロテアーゼを用いた消化により行われ、その後、ニッケルカラムに材料を再適用した。ｍＣＢＭタンパク質の全ては、ＰＢＳ中のＨｉＰｒｅｐ  １６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ２００ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によるサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、その後、エンドトキシンを除くために、Ｖｉｖａｐｕｒｅ  Ｓ  Ｍａｘｉ  Ｈ（ＶｃＣＢＭｓ）またはＱ  Ｍａｘｉ  Ｈ（ＳｐＣＢＭｓ）カラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）のいずれかを用いてさらに精製された。ＧＦＰタグ化タンパク質はまた、上記のようにアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーに供された。タンパク質収率は、ｍＣＢＭに応じて１５〜７０ｍｇ／ｌの間であると計算された。タンパク質は、−８０℃に保存した場合、数カ月間安定な状態であった。タンパク質の純度および大きさは、１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動および質量分析によって確認された。精製されたｍＣＢＭのシアル酸への結合は、多価のビオチン化α−２，３−シアリルラクトース−ＰＡＡ（Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈ）が固定化された、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサーチップを用いた表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ−１００、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）により確認された（表１）。
【００５１】
グリカンマイクロアレイ。ＧＦＰ−ＳｐＣＢＭのグリカン結合特異性は、グリカンスライドアレイＶ４．２（機能的グライコミクスのためのコンソーシアム）を用いて分析された。分析のためのＧＦＰ−ＳｐＣＢＭ（２００μｇ／ｍｌ）の調製は以前の記載8の通りであったが、抗ＧＦＰ抗体の使用が、結合の蛍光シグナルを増強し得るように修飾された。
【００５２】
細胞保護アッセイ。細胞保護アッセイについて、コンフルエントなＭＤＣＫ単層（ＤＭＥＭ中、０．５％ＦＣＳ）を３７℃にて１時間、ｍＣＢＭ（１０ｍｇ／ｍｌ、無血清（ＳＦ）ＤＭＥＭ中で適切に希釈された）とともにインキュベートした。単層をＳＦ−ＤＭＥＭで濯ぎ、その後、約１００〜２００ＰＦＵのインフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ（ウドーン）／１９７２（Ｈ３Ｎ２）およびＢ／香港／１９７３）を用いて１時間、３７℃で接種し、続いて洗浄した。細胞は、２μｇ／ｍｌのＮ−アセチル化トリプシンが補充されたＤＭＥＭ中の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の１．２％（ｗ／ｖ）Ａｖｉｃｅｌ（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ）で覆われた。プレートを３７℃で２〜３日間インキュベートした。プラークは、４％ホルムアルデヒドにおいて単層を固定し、０．１％クリスタルバイオレットで染色することによって可視化された。ウイルスから細胞の５０％を保護するｍＣＢＭｓのＥＣ50値は、用量−応答曲線から各ｍＣＢＭについて算出された。
【００５３】
ウイルス複製阻害アッセイ。コンフルエントのＭＤＣＫ細胞（９６ウェルフォーマット）を用いて、インフルエンザＡウイルス複製のｍＣＢＭによる阻害を評価した。細胞は、１時間、３７℃にて、異なるｍＣＢＭとともにインキュベートされ、その後、洗浄され、１時間、単層にインフルエンザＡウイルス（Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ（ウドーン）／１９７２（Ｈ３Ｎ２）、ＭＯＩ０．０１ＰＦＵ／細胞）を添加される。ウイルス接種を除き、Ｎ−アセチル化トリプシン（２．５μｇ／ｍｌ）を含有するＳＦ  ＤＭＥＭを細胞に添加し、さらに１６〜２４時間インキュベートした。細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００および２０ｍＭグリシンを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３０分間、透過させ、その後、１％ＢＳＡ、０．０２％アジ化ナトリウム（ＢＢ）を含有するＰＢＳで２〜３時間ブロックした。細胞を濯ぎ、ヤギ抗インフルエンザＡ（ＢＢ中で１：５００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を１〜２時間、２２℃で添加した。プレートを洗浄し、その後、ロバ抗ヤギＩｇＧ  ＨＲＰコンジュゲート抗体（１：５００希釈、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を添加した。発色のために、プレートをＴＭＢ（ＨＲＰ基質、Ｓｉｇｍａ）とともにインキュベートした。反応を１Ｍ  ＨＣｌの添加により停止させた。吸光度を４５０ｎｍの波長（参照として６２０ｎｍ）で測定した。ＥＣ50値は、用量−応答曲線から算出し、対照ウェル（未処理、感染）と比較して、ウイルス複製を５０％阻害するｍＣＢＭの濃度を決定した。
【００５４】
細胞傷害性アッセイ。２４時間の期間中に、哺乳動物の上皮細胞（ＭＤＣＫ）の生存率におけるｍＣＢＭの影響は、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により記載されるようにＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生存率アッセイを用いて評価された。ｍＣＢＭ（５ｍｇ／ｍｌストック濃度の希釈）をコンフルエントな細胞単層に添加し、対照（ＤＭＥＭのみ、未処理の対照、および陽性対照として２０％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム）と一緒に２４時間、３７℃でインキュベートした。ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ試薬を細胞に添加し、１時間インキュベートし、その後、５７０ｎｍの波長（参照として６２０ｎｍ）での吸光度を測定した。処理された細胞の相対的な吸光度は、ｍＣＢＭ濃度に対してプロットされた未処理細胞の割合として表された。細胞生存率を５０％に減少させるのに必要とされるｍＣＢＭの濃度（ＣＣ50）は、可変勾配とフィットさせた非線形回帰曲線を用いて、用量−応答曲線から決定された。
【００５５】
イメージング研究。ＭＤＣＫおよびヒト肺癌腫（Ａ５４９）細胞は、１０％ＦＣＳが補充されたＤＭＥＭ中で３×１０5細胞／ｍｌに希釈され、その後、９６ウェルのブラック平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに１００μｌを添加し、ＷｉｌｌＣｏディッシュ（３５×１０ｍｍガラス底、ＷｉｌｌＣｏ  Ｗｅｌｌｓ  Ｂ．Ｖ．）に１．５ｍｌを添加した。細胞を９０〜１００％コンフルエンスまで一晩インキュベートした。細胞は、暖めた滅菌ＰＢＳで３回濯がれ、Ｓ．ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼ32の触媒ドメイン（残基３１９〜８２２）は、ＳＦ−ＤＭＥＭ中、１５０μｇ／ｍｌの濃度で細胞に添加され、１時間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートされた。細胞をＰＢＳで広範囲に濯ぎ、その後、ｍＣＢＭ（ＳＦ−ＤＭＥＭ中、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ  ０．０５ｍｇ／ｍｌまたはＳｐ２ＣＢＭＴＤ  ０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、さらに１時間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。細胞を濯ぎ、その後、ウサギポリクローナル抗ｍＣＢＭ抗体（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を添加（ＤＭＥＭ−３％ＦＣＳ中、１：１０００）し、１時間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。この後、ＤＭＥＭ−３％ＦＣＳ中、２μｇ／ｍｌでヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ＩｇＧ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、さらに１時間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。次に、ＤＡＰＩを３０分間添加し、その後、ＰＢＳで細胞を最終洗浄した。プレートをＴＥＣＡＮ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｒｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅプレートリーダー（４８８ｎｍおよび５１８ｎｍの励起および発光波長を用いて）で読み取った。生細胞を、それぞれ、４８５ｎｍおよび５３１ｎｍの励起および発光波長を用いて、ＤｅｌｔａＶｉｓｉｏｎデコンボリューション顕微鏡（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を用いてイメージ化された。
【００５６】
マウス感染研究。インビボ研究は、Ｔｈｅ  Ｒｏｓｌｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，ＵＫおよびＳｔ  Ｊｕｄｅ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ，ＵＳＡで行われた。雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｈａｒｌａｎ  ＵＫ  Ｌｔｄ（５〜６週齢）またはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（６〜８週齢）、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡのいずれかから購入された。ＵＫにおいて、研究は、エジンバラにある感染症センターでインフルエンザ研究のための動物実験施設で行われ、Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６に従ったＵＫホームオフィスライセンスの下で実施された。マウスは、ハロタン（Ｒｈｏｎｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｌｔｄ，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）を用いて麻酔され、その後、４０μｌ  ＰＢＳ中の５×１０3または４×１０4ＰＦＵのインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスのいずれかを用いて致死的ウイルスチャレンジの２４時間前または当日に、様々な量のｍＣＢＭ（ＰＢＳ中、１００〜５００μｇ）を鼻腔内投与した。マウスを毎日計量し、臨床疾患の視覚的徴候について評価した。動物の元の体重の２５％が失われた動物をＣＯ2窒息により安楽死させた。感染後の４日および７日に、特に指示がない限り、肺を取り出し、ＰＢＳ中で均質化し、遠心分離により清澄化した。感染性ウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞上で標準的なプラークアッセイにより決定された。
【００５７】
マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを用いた実験は、米国の農務省によって使用を承認された動物バイオセーフティーレベル２＋（ＡＢＳＬ２＋）封じ込め施設で実施された。全ての研究は、適用される法律およびガイドラインの下、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ小児研究病院動物ケアおよび使用委員会からの承認後に実施された。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５）のグループは、特に断りのない限り、０．１〜５００μｇ／マウスの間の単回、２回または３回投薬量のいずれかで５０μｌのｍＣＢＭが鼻腔内で与えられた。ｍＣＢＭタンパク質を用いた処理は、ウイルスチャレンジの−７日から＋１日の間の異なる時点で開始された。動物は、マウスあたり１０ＭＬＤ50の投薬量でＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスを接種された。対照（感染、未処理）マウスは、ウイルス接種の１時間前に５０μｌの滅菌ＰＢＳを鼻腔内に受けた。ｍＣＢＭ毒性対照（非感染、未処理）も試験された。マウスは、感染の臨床兆候と生存について、感染後の２１日間、毎日観察され、体重は感染期間を通じて記録された。ウイルス肺力価は、ＭＤＣＫ細胞における組織培養感染量アッセイ（ＴＣＩＤ50）によって、マウス（ｎ＝３）のさらなるグループにおいて、感染後の３、６および９日に決定された。
【００５８】
サイトカイン分析。清澄化されたマウス肺ホモジネートのサイトカイン分析は、製造業者の指示書（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）に従って、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて行われた。
【００５９】
抗体分析。感染後の２１日に生存したマウスから回収した免疫血清は、抗ウイルスＨＡ抗体と抗ｍＣＢＭ抗体の存在の両方について試験された。ＨＩアッセイは、受容体−破壊酵素（ＲＤＥ  ＩＩ、１：１０希釈；Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて前処理され、５６℃にて３０分間、熱不活性化された血清について、０．５％充填したニワトリ赤血球を用いて行われた。標準的なＥＬＩＳＡは、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に固定化された、調製された抗体（１μｇ／ウェル）を用いて、感染マウスの血清試料から抗ＣＢＭ抗体を測定するために使用された。血清（ＢＢ中で１：１０００希釈）をウェルに添加し、続いて、ヤギ抗マウスＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭのＨＲＰコンジュゲート抗体（１：２５００希釈）を添加し、抗体の存在は、上述のようにＴＭＢを用いて検出された。ヒト集団におけるシアル酸結合ＣＢＭの既存の免疫性について試験するために、男性および女性の混合された年齢集団から得られたヒト血清試料（ｎ＝５０）（Ｓｅｒａｌａｂ，ＵＫ）を用いた。血清を１：１０００に希釈し、その後、ＨＲＰをコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ（１：２５００）を用いて、抗ＶｃＣＢＭ抗体および抗ＳｐＣＢＭ抗体について試験するために標準的なＥＬＩＳＡを適用した。
【００６０】
統計分析。生存研究について、カプラン・マイヤー法を用いて、未処理および処理グループの生存の確率を推定した。エラーバーを有する、プロットしたデータは、他に指示がなければ、平均±ｓ．ｄ．として表される。両グループ間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）は、ノンパラメトリックマンホイットニーＵ検定を用いて決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０パッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をすべての分析に使用した。
【００６１】
概要、結果および検討
インフルエンザウイルスは、表面の赤血球凝集素（ＨＡ）糖タンパク質を介して、気道上皮に存在するシアル酸受容体に結合し、そのイベントは、ウイルスのエンドサイトーシスを引き起こす12。２００９年のパンデミックＨ１Ｎ１ウイルスなどのヒトインフルエンザウイルスは、上気道に存在するα−２，６連結したシアル酸受容体を認識し、一方、Ｈ５Ｎ１などのトリインフルエンザウイルスは、α−２，３連結したシアル酸受容体を主に認識するが、このような受容体はまた、ヒトの下気道に存在する13,14。最近出現したヒトＨ７Ｎ９ウイルスは、受容体の両タイプを認識する点で異例であり、したがって、持続的なヒトからヒトへの伝染およびパンデミック能力の可能性がある15,16。本発明者らは、特定のタンパク質を用いて気道におけるこのような受容体をマスキングすることが、感染を妨げるための新規な治療経路を提供し得るという仮説を立てた。多数のシアル酸結合タンパク質が知られているが、ほとんどはシアル酸に対する親和性が低く、例えば、ＨＡモノマーはその受容体に対して約２．５ｍＭの親和性であるが、三量体であることを通じて、およびウイルス表面上に高コピー数で存在させることによって親和性を高める17。天然を模倣し、本発明者らは、ビブリオ・コレラＮａｎＨシアリダーゼ18由来のシアル酸結合ドメイン（ＶｃＣＢＭ、図１ａ）またはストレプトコッカス・ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼ由来の相同なドメイン（ＳｐＣＢＭ、図１ｂ）のいずれかを用いて多価形態を遺伝子操作した。多価は、タンデムリピート8を介して、またはシュードモナス・エルギノーサシアリダーゼ19由来のオリゴマー化ドメイン（ＴＤ）（図１ｃ）に１つもしくは２つのタンデムに連結されたＣＢＭドメインであって、三量体を形成するために自己会合するドメインを融合させることによって達成された。ＶｃＣＢＭとＳｐＣＢＭの多価形態は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定したとき、解離定数が１ｎＭ未満である結合力を介して親和性を上げる（図１ｄ、表１）。グリカンアレイスクリーニングは、ＶｃＣＢＭ8およびＳｐＣＢＭ（図５）がα−２，３またはα−２，６連結したシアル酸を認識することを示し、結晶学的分析は、両方のドメインがシアリルラクトースを用いた研究において末端シアル酸のみを認識することを明らかにする18。
【００６２】
ウイルス感染をブロックする多価ＣＢＭ（ｍＣＢＭｓ）の能力を最初にインビトロで試験した（表２）。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞、ならびに３つの異なるインフルエンザＡウイルス［Ａ／ＷＳＮ／１９３３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ＰＲ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｄｏｒｎ（ウドーン）／１９７２（Ｈ３Ｎ２）］およびインフルエンザＢウイルス（Ｂ／香港／１９７３）を用いた細胞保護およびウイルス複製阻害アッセイは、ｍＣＢＭがウイルス付着をブロックしたことを示し、ＥＣ50値は、一価の対応物を用いた場合の約３００μＭと比較して、３価〜６価を有するｍＣＢＭについて０．３９μＭ〜４．１μＭの範囲であった（データ示さず）。ｍＣＢＭは、ウイルス複製を阻害し、最大実行可能濃度で細胞傷害性を示さなかった（表２）。ｍＣＢＭの蛍光画像は、ｍＣＢＭが細胞表面に結合し、その結合は、細胞がシアル酸を除くために、無差別なシアリダーゼで前処理した後に、大幅に無効にされたことを示す（図６）。次に、本発明者らは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＡ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスの致死的感染をブロックするＶｃ４ＣＢＭの能力を検討した。Ｖｃ４ＣＢＭ（５００μｇ）は、ウイルスチャレンジの直前に、単回投薬として鼻腔内に投与された。Ｖｃ４ＣＢＭで処理されたマウスは生存し、僅かな初期の体重減少後に体重を再度増加し、未処理のマウスと比較して、感染後の７日に肺ウイルス力価が２対数減少した（図２ａ、ｂ）。この最初の有望な結果は、本発明者らに、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを用いた致死的チャレンジの１日前に鼻腔内に与えられた三量体（ＶｃＣＢＭＴＤ、ＳｐＣＢＭＴＤ、４００μｇ）形態と六量体（Ｖｃ２ＣＢＭＴＤ、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ、１００μｇ）形態の保護効果を調査するように促す（図２ｃ、ｄ）。４つのｍＣＢＭｓのうち、六量体形態は、感染後の７日に肺においてウイルスをほとんど検出することができなかったことを示し、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ処理されたマウスはごく僅かな体重減少を実証した（図２ｃ）。
【００６３】
続いて、本発明者らは、マウスに適合されたＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）パンデミックインフルエンザウイルスを用いた致死的チャレンジに対して、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける生物製剤を評価し、−１日、０日または＋１日に与えられた、単回鼻腔内投薬量（１０、５０、２５０、または５００μｇのいずれか）のＶｃ４ＣＢＭ、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤまたはＳｐ２ＣＢＭＴＤを調べた；０日は、ウイルスチャレンジの日であり、生存研究は＋２１日まで継続した。ウイルスチャレンジの２４時間後に与えた場合、ｍＣＢＭのいずれもマウスを保護しなかった（図７）。−１日に投与した場合、Ｖｃ４ＣＢＭ（５００μｇ）はたった４０％の生存率を与えた。０日に投与した場合、Ｖｃ４ＣＢＭ（５００μｇ）は、Ａ／ＷＳＮ／３３（Ｈ１Ｎ１）ウイルスチャレンジと一致して、１００％の生存率を与えたが、低投薬量ではたった４０％の生存率を与えた。対照的に、六量体形態は、−１日または０日に与えた場合、改善された保護を与えた。Ｖｃ２ＢＭＴＤは、１０または５０μｇの低投薬量で８０％の生存率を与えた。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは最良の保護を提供し、全てのマウスは−１日に投与された全ての投薬量で生存し、全てのマウスは、５０または２５０μｇ投薬量での０日における投与後に生存し、６０％が１０μｇ投薬量で生存した。ウイルスチャレンジに対して生存した全ての動物は体重が減少したが、最も有益な結果は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを０日に２５０μｇ投薬量で投与した場合に達成された（図３ｂ）。次に、本発明者らは、感染前にさらに投与されるＳｐ２ＣＢＭＴＤを用いた反復投薬の効果を検討した。単回の５０μｇ投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤは、０日にＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを用いた致死的チャレンジ前に、最大１週間、１回、２回または３回、ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内投与された。全ての投薬処方計画について１００％の生存率であり（データ示さず）、顕著には、２回または３回の投薬量が投与された場合、体重減少は僅かであるまたは全くなかった（図４ａ）。次に、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの最低有効投薬量を検討した。単回の１０、１または０．１μｇ投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤは、０日にＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを用いた致死的チャレンジ前の−７日、−３日または−１日に投与された。全てのマウスは、１０および１μｇの投薬処方計画で生存し、重要なことには、−７日に与えられた単回の１μｇ投薬量でさえ、感染後の８日に最大８％だけの体重減少が見られ、直ちに回復した（図４ｂ）。マウスは、＋２１日まで有害な臨床兆候なしに成長を続けた。対照的に、０．１μｇ投薬量で、−１日、−３日または−７日に投与した場合、それぞれ、８０％、２０％または０％のマウスが生存した（図４ｂ）。感染後の３日、６日および９日に測定されたウイルスの肺力価は、５０および１０μｇ投薬量について、ウイルスは、９日までに肺から取り除かれ、一方、１および０．１μｇ投薬量について、ウイルス力価は、対照（感染、未処理）のマウスと類似していたことを示した（結果を示さず）。重要なことに、血清抗ＨＡ抗体の高い力価は、全ての投薬処方計画を用いた処理後に存在しており、免疫応答��誘発するのに十分なウイルス複製が存在することを示している（図８）。
【００６４】
病原体由来の生物製剤を用いた一つの懸念は、反復投与の有効性を減少させ得る免疫原性の能力である。ＳｐＣＢＭおよびＶｃＣＢＭは、宿主とともに免疫寛容を進化させてきた可能性があるヒト病原体から選択され、本発明者らは、ヒト集団において、単一のＣＢＭドメインのいずれかに既存の免疫を見出さなかった（図９）。マウスにおけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの鼻腔内投与は血清のＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗体を誘発したが、用量依存的であり、１μｇのＳｐ２ＣＢＭＴＤは血清のＩｇＡおよびＩｇＭを無視できるレベルで誘発した（図１０）。ｍＣＢＭの免疫原性は、反復使用による問題があり得るが、しかしながら、タンパク質をより小さい免疫原性とする修飾は必要に応じて採用され得る20。
【００６５】
シアル酸は、全ての脊椎動物における全ての細胞の表面に広く発現され、免疫の発生を含む、複数の細胞機能の調節に関与する21。内因性および外因性のシアル酸を認識するタンパク質は、多くの場合、それ自体が多価であり、細胞の相互作用を媒介し、調節することが知られている22。生物製剤設計の元々の仮説は、シアル酸受容体のマスキングであるが、しかしながら、感染前の７日に与えた単回の低投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤの顕著な保護能力は、生物製剤が抗ウイルス状態に免疫系を付加的にプライミングしている場合があるという可能性を生じさせる。したがって、本発明者らは、マウスへのＶｃ２ＣＢＭＴＤまたはＳｐ２ＣＢＭＴＤの鼻腔内投与による炎症性サイトカイン／ケモカインの限定されたセットの誘導を検討し、２つの生物製剤間に有意な相違があり、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤまたはＰＢＳと比較して、ＩＬ−１β、ＭＩＰ−２（マウスのＩＬ−８のホモログ）、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αのより高いレベルを刺激することを見出した（図１１）。Ｓ．ニューモニエＣＢＭは、ヒトおよびマウスの脳細胞においてある種のサイトカインを刺激することが以前に報告されている23ＮａｎＡシアリダーゼの大きな領域の一部を形成するが、ＮａｎＡの他のセグメントはこの活性の原因であり得る。本発明者らの生物製剤は、サイトカイン誘導を含む細胞プロセスを調節している可能性があり、これはＳｐ２ＣＢＭＴＤの保護能力に寄与し得、その発見はさらなる過度の検討を必要とする。
【００６６】
インフルエンザを制御するための新たな治療アプローチが緊急に必要である。多大な努力は、インフルエンザへの新たなワクチンアプローチ24,25、ウイルス標的の新規な阻害剤26および宿主因子で標的化される新規な戦略27,28の開発に投入されている。本発明者らは、哺乳動物宿主に標的化された生物製剤が、さらなる検討に値するいくつかの利点を有することを実証している。本発明者らの生物製剤は、上気道および下気道に見出される異なるシアル酸受容体に結合し、マスクする能力を有し、したがって、適切な送達システムが使用される場合、ヒト気道全体に保護することができる。全ての処理されたマウスにおいて観察された血清抗ＨＡ抗体の産生は、保護を与え得ることに加えて、生物製剤が、ウイルスへの曝露の際に「ワクチン」を生じさせ、将来の曝露に対して潜在的に保護を提供することを示唆する。これらの生物製剤を臨床にもちこむには多数のチャレンジが行く手に存在しているが、本発明者らは、この新しい種類の治療薬が、インフルエンザの制御に対する強力な選択肢となる可能性を有すると考える。生物製剤は、多くの場合、インフルエンザに関連し、罹患率と致死率の増加に関与する二次細菌感染の主要な原因である、ストレプトコッカス・ニューモニエを含む病因においてシアル酸を利用する、他の呼吸器病原体のブロックにおいてより広範囲の可能な用途を有する。
【００６７】
【表１】
0006539289.tif 000002
【００６８】
【表２】
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【００６９】
【表３】
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0006539289.tif 000005
【００７０】
例１に関する参考文献
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【００７１】
（例２）
マウスガンマヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）を用いて感染させたマウスにおける遺伝子操作されたタンパク質Ｖｃ２ＣＢＭＴＤとＳｐ２ＣＢＭＴＤの予防効果
導入
マウスガンマヘルペスウイルス６８（ＭＨＶ−６８）は、ヒトに感染するカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）とエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）に密接に関連している2天然に存在するげっ歯類の呼吸器病原体1である。ガンマヘルペスウイルスは、それらのエンベロープ上に、ウイルスの細胞から細胞への伝達に関与している多数の表面タンパク質、糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）および糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）および糖タンパク質１５０（ｇｐ１５０）を提示する。ＥＢＶと同様に、ＭＨＶ−６８は、感染から後何ヶ月も後に発生し得る、リンパ増殖性疾患3と関連付けられる。しかしながら、ＥＢＶおよび他の多くのガンマヘルペスウイルスとは異なり、ＭＨＶ−６８は、インビトロで上皮細胞内で複製し、マウスの実験室系統に感染し、したがって、ガンマヘルペスウイルスの研究4のために優れたモデルを提供する。治療については、抗ウイルス剤は、通常、ほとんどのヘルペスウイルス感染の治療に提案されている。
【００７２】
マウスにおけるＭＨＶ−６８の鼻腔内投与は、肺胞上皮細胞の急性増殖性感染およびＢリンパ球における持続的な潜伏感染をもたらし、脾臓が潜伏ウイルスの主要なリザーバーである5,6。感染性ウイルスはまた、感染後の１０〜１３日間、ＢＡＬＢ／ｃマウスの肺から回収することができる5。ＭＨＶ−６８を用いたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの鼻腔内感染後のＢＡＬ液からのＭＨＶ−６８に対する炎症性サイトカイン応答の分析は、高レベルのＩＬ−６とＩＦＮ−γ、および低レベルのＩＬ−２とＩＬ−１０を示し、感染の１０日後あたりでサイトカイン産生はピークとなり、これは、肺からのウイルスクリアランスと相関するが、有意なレベルは、ウイルス投与から３日後と同程度に早期に観察される。対照的に、無視できるレベルのＩＬ−４またはＩＬ−５が検出される。さらに、精製された免疫Ｔ細胞はまた、ＭＨＶ−６８によるインビトロの再刺激後にＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γを産生することができ、これは、ウイルスが、後天性と先天性の宿主応答1の両方の成分を誘導することを示唆している。
【００７３】
呼吸器病原体に対する生物製剤として遺伝子操作されたシアル酸結合タンパク質を用いた、本発明者らの研究室における最近の証拠は、予め７日まで単回の低投薬量（１μｇ）を用いてマウスに鼻腔内投与したとき、完全な保護が、致死性のインフルエンザＡ／カリフォルニア／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスチャレンジに対して観察されることが示された（公開されていないデータ）。生物製剤は、Ｖ．コレラ（ＶＣ）とＳ．ニューモニエ（Ｓｐ）シアリダーゼ酵素から単離され、タンデムリピートまたはオリゴマー化ドメインアプローチのいずれかを使用して多価実体（ｍＣＢＭ）として遺伝子操作された炭水化物結合モジュールに基づく。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、低投薬量で予め多くの日数を与えられたときに、宿主を保護することが示されているため、これらのタンパク質は、細胞表面のシアル酸への結合からインフルエンザウイルスの付着をブロックすることができるだけでなく、免疫系を潜在的に「プライム」することもでき、免疫調節効果を介してウイルスに対する抗ウイルス応答を可能にすると考えられる。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるｍＣＢＭを用いた予備的研究は、感染なしに単回投薬として鼻腔内に投与した場合、免疫刺激効果が観察され、これは、２日後のＭＩＰ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１βなどの限定された一連のサイトカイン／ケモカインの産生を増強する能力を実証することを示した（公開されていないデータ）。
【００７４】
ここで、本発明者らは、ウイルス力価およびサイトカインレベルにおける、ＭＨＶ−６８感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて遺伝子操作されたｍＣＢＭの効果の予備的なデータを示す。感染マウスにおけるウイルス力価および特定のサイトカインレベルの減少は、ｍＣＢＭｓが、哺乳動物における感染を開始するために、シアル酸結合に依存しない他の呼吸器病原体による感染プロセスに影響を及ぼす可能性があることを実証する。
【００７５】
方法
インビボ研究。マウスの研究は、エジンバラにある感染症センターでインフルエンザ研究のための動物実験施設で行われ、Ａｎｉｍａｌｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  １９８６に従ったＵＫホームオフィスライセンスの下で実施された。マウスは、ハロタン（Ｒｈｏｎｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｌｔｄ，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅｓｓｅｘ，ＵＫ）を用いて麻酔され、その後、５０μｇのＶｃ２ＣＢＭＴＤまたはＳｐ２ＣＢＭＴＤのいずれかの鼻腔内投与が−７日、−３日および−１日に３回与えられ、続いて、４０μｌのＰＢＳ中の４×１０5個のＭＨＶ６８でチャレンジされた。感染の５日後、マウスを処分し、ウイルス力価の決定とサイトカイン分析のために死後にそれらの肺を回収した。
ウイルス力価。感染性ウイルス力価は、ＭＤＣＫ細胞において標準的なプラークアッセイによって決定された。マウスにおける肺ウイルス力価は、感染の５日後に決定された。
サイトカイン分析。清澄化されたマウス肺ホモジネート由来のＭＩＰ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−２のサイトカイン分析は、製造業者の指示書（ＲＤ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＫ）に従って、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキットを用いて行われた。
【００７６】
統計分析。プロットされたデータは、誤差バーを有し、他に指示がなければ、平均±ｓ．ｄ．として表される。２つの群間の統計的有意性（Ｐ＜０．０５）は、ノンパラメトリックなマンホイットニーＵ検定を用いて決定された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０パッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）をすべての分析について使用した。
【００７７】
結果と考察
本発明者らは、非シアル酸結合呼吸器病原体であるＭＨＶ−６８ウイルスを用いてチャレンジした場合、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける肺のウイルス負荷と免疫応答における六量体ｍＣＢＭ、Ｖｃ２ＣＢＭＴＤおよびＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果を検討した。生物製剤は、ウイルスチャレンジ前に、３回の投薬量（５０μｇ、−７、−３、−１日）として鼻腔内投与された。全ての処理されたマウスは、未処理の感染マウスと比較して、感染の５日後の肺ウイルス力価において一対数減少を示した（図１２ａ）。炎症性メディエーターＩＬ−１β、ＭＩＰ−２（ＩＬ−８のマウスホモログ）、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６およびＩＬ−２をモニターするためにＥＬＩＳＡを使用したマウスの肺ホモジネートのさらなる分析は、処理と未処理の感染マウス間において差異を示した。両方の生物製剤は、未処理の感染マウスと比較して、有意により低いレベルのＩＬ−６、ＭＩＰ−２およびＩＦＮ−γを示したが、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＬ−１βのレベルは感染マウスのみに類似していた（図１２ｂ）。このデータは、ｍＣＢＭｓの高度な予防的治療が、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γなどのＭＨＶ−６８感染によって刺激される特定の炎症性メディエーターのレベルの低下によって見られるように、免疫応答を調節することにより感染に応答する宿主を調製し得ることを示唆する。ｍＣＢＭｓは、潜在的に有害なケモカインの発現を妨げながら、ＭＨＶ−６８ウイルスチャレンジに対する免疫応答を増強するために、初期炎症プロセスを誘導する可能性がある。さらなる研究は、動物モデルに投与した場合、ｍＣＢＭの免疫応答プロファイルのタイプを理解する必要がある。
【００７８】
例２に関する参考文献
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J Gen Virol 73 ( Pt 9), 2347-2356 (1992).
【００７９】
（例３）
Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルス感染に対する炭水化物結合モジュール：前臨床試験における有効性。ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルス感染に対する糖（Carboxydrate）結合モジュール（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ）の六量体形態の効果。
材料および方法
ウイルス。インフルエンザＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ウイルスは、世界保健機関の監視ネットワークを介して得られた。Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ウイルスは、１０日齢の発育鶏卵（卵）の尿膜腔に臨床試料を培養することにより、患者から単離され、実験に使用したウイルスのストックは卵中に調製された（継代歴：Ｅ２／Ｅ２）。動物の５０％が死亡したマウス致死的投薬量（ＭＬＤ50）は、２１日後、６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて決定された（体重、１８〜２０ｇ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）。重篤な疾患を示し、最初の体重の＞２５％を失った動物を安楽死させた。
【００８０】
ヒトＨ７Ｎ９インフルエンザウイルスを用いた実験は、米国農務省によって承認された動物のバイオセーフティーレベル３＋封じ込め施設で実施された。全ての研究は、適用される法律およびガイドラインの下、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ小児研究病院動物ケアおよび使用委員会からの承認後に実施された。
【００８１】
化合物。炭水化物結合モジュール（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ）の六量体形態は、Ｈｅｌｅｎ  Ｃｏｎｎａｒｉｓ博士（Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｔ．Ａｎｄｒｅｗｓ，ＵＫ）により１０．５ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳにて提供された。６ＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ）タンパク質は、使用するまで−８０℃で保存された。マウス動物モデルにおける６ＣＢＭ（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ）タンパク質の有効性を評価するために、タンパク質試料を１３Ｋ  ｒｐｍで５分間、遠心分離し、新たなバイアルに移し、所望の濃度まで滅菌ＰＢＳに溶解させた。
【００８２】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。タンパク質の安定性は、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で還元条件下、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質（ＰＢＳに溶解させた５．２５〜０．６６μｇ／チャネル濃度で１０μｌ／チャネル）の電気泳動移動度の決定により確認された。主なタンパク質バンドは、約５０ｋＤａで同定され、いくつかの追加のマイナーなバンドが同定された（図１３）。２１ｋＤａでバンドは検出されなかった。したがって、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質は解離されなかった。
【００８３】
マウスにおけるＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスによる致死的感染におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの有効性。雌性６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（体重、１８〜２０ｇ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、イソフルランの吸入により軽く麻酔され、５０μｌの感染性Ｈ７Ｎ９ウイルスを鼻腔内接種された。全体的に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの３２グループ（１グループあたり５匹のマウス）をこの実験に使用した（表１ａ）。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、異なる処方計画で鼻腔内に５０μｌのＳｐ２ＣＢＭＴＤを与えられた。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質の単回投薬量（０．１、１、１０および１００μｇ／マウス／日）は、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの７日前（−７日：グループ１〜４）、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの３日前（−３日：グループ５〜８）、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの１日前（−１日：グループ９〜１２）、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの６時間後（＋６時間：グループ１３〜１６）、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの２４時間後（＋１日：グループ１７〜２０）のいずれかで投与された。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質の反復投与は、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの３日前および１日前（−３日、−１日：グループ２１〜２４）に２回の投薬として投与され、またはウイルスチャレンジの７日前、３日前および１日前（−７日、−３日、−１日：グループ２５〜２８）に３回の投薬として投与されて行われた。毒性対照として、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質は、３つの処方計画で１００μｇ／マウス／日の投薬量にて投与された（毒性：グループ２９〜３１）。動物は、マウスあたり５ＭＬＤ50の投薬量でＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスで接種された。対照（感染、未処理）マウスは、ウイルス接種の１時間前に５０μｌの滅菌ＰＢＳを鼻腔内に受けた。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、感染の臨床徴候および生存について、感染後の２１日間、毎日観察された。死亡までの平均日数は、ログハザードスケールを用いて算出された。マウスは、感染後の０日、２日、４日、６日、８日、１０日、１２日、１４日、１９日および２１日に計量され、体重の減少または増加は、ウイルス接種前の０日の各マウスの体重の割合として各マウスについて算出された。
【００８４】
抗ＨＡ抗体応答。血清試料を感染後の２１日に生存マウスから回収し、１：１０に希釈した受容体−破壊酵素（Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ  Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）を用いて一晩３７℃にて処理し、５６℃にて３０分間、熱不活性化し、滅菌ＰＢＳで１：１０に希釈し、０．５％充填したニワトリ赤血球（ＣＲＢＣ）を用いた血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによって試験した。
Ｈ７Ｎ９ウイルス高投薬量による再感染。Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスによる致死的感染から生存した全ての動物は、感染後の２１日に２５ＭＬＤ50のウイルスを用いて再感染させた。マウスは、感染の臨床徴候と生存について毎日観察され、体重変化は、指定された日にモニターされた。
【００８５】
結果
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスで致死的にチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスの生存におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質の効力。本発明者らは、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスで致死的にチャレンジされたマウスの生存および臨床兆候における、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質の単回または反復投与の効果を評価した（表２ａ）。単回投薬量、２回および３回投薬量（１００μｇ／マウス／日）として投与した場合に、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、未感染マウスの体重変化と死亡を引き起こさなかった。本発明者らは、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤがこれらの実験で使用した最高投薬量でマウスに対して非毒性であると結論付けた。
【００８６】
未処理のＨ７Ｎ９ウイルス接種された対照マウスは、進行性の体重減少を示し、死に至るまでの平均日数は７．８±１．１であった（表２ａおよび図１４〜１６）。本発明者らは、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジに対するマウスの保護におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの用量依存効果を観察し、より有益な保護が１００μｇ／マウス／日という高投薬量で達成された（図１４）。Ｄ−７、Ｄ−３、Ｄ−１に投与した場合、１００μｇ／マウス／日の投薬量が１００％保護を与えた。試験された全ての処方計画で単回投与として適用された場合、０．１μｇ／マウス／日の投薬量が最少の有効な投薬量であった。
【００８７】
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）で致死的チャレンジ後に投与された場合、単回のＳｐ２ＣＢＭＴＤ投薬量の効果を評価するために、本発明者らは、ウイルス接種の６時間または２４時間後に処理を開始した（図１５）。これらの実験において使用された最大投薬量（１００μｇ／マウス／日）は、＋６時間で適用された場合には１００％生存を与え、＋２４時間（＋１日）で適用された場合にはたった４０％の動物の生存を与えた。
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）ウイルスによるマウスの致死的チャレンジに対するＳｐ２ＣＢＭＴＤを用いた反復投薬の有効性を評価するために、タンパク質の２回投薬がＤ−３とＤ−１に投与され、３回投薬がＤ−７、Ｄ−３、Ｄ１に投与された（図１６）。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤを２回および３回適用した場合、全ての投薬処方計画について１００％生存であった。
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスで致死的にチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスの体重変化におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質の効力。１００μｇ／マウス／日の最大Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投薬量を動物に投与した場合に、体重変化はほとんどないまたは全くなかった。一方、０．１μｇ／マウス／日の投薬量は、体重減少に最小の効果を与え、この投薬量で処理された動物は、最も顕著な体重減少を経験した（表３ａ）。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの投与時期は、生存および体重減少に最も有益な効果の提供に重要である。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質による処理がウイルス接種の２４時間後に開始された場合、動物は、最も顕著な重量変化を示した。全体的に、観察された体重変化は、Ｈ７Ｎ９感染後に観察された生存転帰と相関した。
【００８８】
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスによるマウスの感染を血清学的に確認し、抗ＨＡ抗体の産生におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質処方計画の効果を比較するために、本発明者らは、ＨＩアッセイのために感染後の２１日に血清を回収した。相同なＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスに対する抗ＨＡ抗体は、全ての生存マウスにおいて観察され、逆数ＨＩ力価は４０〜８０の間の範囲であった（表４ａ）。
【００８９】
高投薬量のＨ７Ｎ９ウイルスによる生存マウスの再感染。２５ＭＬＤ50のＨ７Ｎ９ウイルスによる再感染から動物を完全に保護した；動物は、疾患兆候を示さず、死亡しなかった（表５ａ）。
【００９０】
結論
・Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスによる致死的チャレンジ前のＳｐ２ＣＢＭＴＤの反復投与は、最も有益な結果を与え、使用された最低投薬量（０．１μｇ／マウス／日）でさえ、ＢＡＬＢ／ｃマウスの１００％の生存をもたらした。これは、使用された投薬量の減少の可能性を示す。
・投与時期は、致死的マウスモデルにおけるＳｐ２ＣＢＭＴＤタンパク質処理の有効性と関連する：タンパク質をＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルス接種前に投与した場合に、完全な保護（１００％生存率）が達成された。
・Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの用量依存的効果は、Ｈ７Ｎ９致死的マウスモデルにおいて観察され、したがって、インフルエンザウイルスに対するこのタンパク質の特異性を示す。
・Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの投与は、抗ＨＡ抗体の発生に影響を及ぼさず、免疫応答のレベルは、Ｈ７Ｎ９ウイルスの再感染に対して保護するには十分であった。
【００９１】
【表４】
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【００９２】
【表５】
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【００９３】
【表６】
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【００９４】
【表７】
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【００９５】
【表８】
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【００９６】
【表９】
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【００９７】
（例４）
出現Ａ（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いた致死的チャレンジに対してマウスを保護するシアル酸結合タンパク質Ｓｐ２ＣＢＭＴＤに関するさらなる研究
概要
例３に示されたデータによって示されるように、インフルエンザウイルス複製に必須の細胞因子を標的とする化合物は、抗ウイルス療法に対する魅力的なアプローチを表す。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、インフルエンザウイルスによって認識される気道上皮上のシアル酸を含有する細胞受容体をマスクする遺伝子操作された多価タンパク質である。出現ヒトＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いたマウスの致死的感染に対するＳｐ２ＣＢＭＴＤの抗ウイルス能力は、インビボでのその活性のメカニズムの基礎があったように調査された。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種の前（７日、３日もしくは１日）または後（６時間もしくは２４時間）に単回投薬量または反復投薬量（０．１、１、１０もしくは１００μｇ）として鼻腔内にマウスに投与された。Ｈ７Ｎ９の致死的チャレンジ前の７日に投与された場合、単回Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投薬量（１０または１００μｇ）は８０％から１００％のマウスを保護した。反復Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投与は最大保護を与え、試験された最低投薬量（０．１μｇ）でさえ、マウスの１００％生存をもたらした。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの投与は、炎症誘発性メディエーター（ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１、Ｉｌ−１β、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＩＰ−１０）の肺発現を誘導し、Ｈ７Ｎ９ウイルス感染前に気道に好中球を動員した。これは、より少ない顕著な炎症およびマウス肺からの迅速なウイルスクリアランスをもたらした。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投与は、ウイルス特異的な適応免疫応答に影響を及ぼさず、相同Ｈ７Ｎ９ウイルスまたは異種Ｈ５Ｎ１ウイルスのより高い投与量を用いた再感染に対して保護するのに十分であった。したがって、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、致死的マウスモデルにおけるＨ７Ｎ９感染の予防に効果的であり、人畜共通のインフルエンザウイルスに対する予防オプションとして期待される。
【００９８】
材料および方法
ウイルス、細胞および生物製剤
インフルエンザＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）およびＡ／トルコ／１５／２００６（Ｈ５Ｎ１）ウイルスは、世界保健機関のネットワークを介して取得され、３５℃で４８時間、発育鶏卵で増殖させた。以前に記載されるように（２２）、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから取得され、維持した。ストレプトコッカス・ニューモニエＮａｎＡシアリダーゼ由来の炭水化物結合モジュール４０（ＣＢＭ４０）ドメインをコードする遺伝子とシュードモナス・エルギノーサのシューダミニダーゼ由来の三量体化ドメインをコードする遺伝子を用いて、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤをＰＣＲに基づくクローニング技術により生成させた（２１）。Ｈ７Ｎ９とＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスを用いた実験は、米国の農務省によって承認された動物バイオセーフティーレベル３＋封じ込め施設で実施された。
【００９９】
マウスにおけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効力
６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重、１８〜２０ｇ；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、イソフルラン吸入により軽く麻酔し、５０μＬのＰＢＳ中の５０％マウス致死的投薬量（ＭＬＤ５０）のＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを５回用いて鼻腔内接種された。第一の研究について、グループあたり５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種前の７日、３日もしくは１日、またはＨ７Ｎ９ウイルス接種の６時間もしくは２４時間後に鼻腔内に単回投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤ（０．１、１、１０もしくは１００μｇ／マウス）を与えられた。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの反復投薬は、Ｈ７Ｎ９接種前に２回（３日および１日）投薬量または３回（７日、３日および１日）投薬量のいずれかとして与えられた。マウスの生存は、感染後（ｐ．ｉ．）の２１日間、毎日モニターされた；重症疾患の兆候および２５％の体重減少を示した動物を屠殺した。対照マウスは、７日、３日および１日に滅菌ＰＢＳを受けた。
【０１００】
第二の研究について、１０μｇ投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤを評価した。グループあたり１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスは、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルス接種前に単回（７日もしくは３日）、２回（３日および１日）、または３回（７日、３日および１日）の投薬量のＳｐ２ＣＢＭＴＤを与えられた。体重の減少または増加は、接種前のその重量の割合として各マウスについて算出された。感染後の３日、６日および９日に、各群からの３匹のマウスは、肺ホモジネートにおけるウイルス肺力価およびサイトカイン／ケモカイン応答のレベルを決定するために屠殺された。各群からの追加の３匹のマウスは、肺の組織病理学的検査のために屠殺された。肺を取り出し、滅菌ＰＢＳで十分にリンスし、均質化し、１ｍＬの氷冷ＰＢＳに懸濁した。細胞残屑を１０分間、２０００ｇで遠心分離によって除去し、その後、上清をＭＤＣＫ細胞における５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）アッセイに使用した。マウスの生存を感染後の２１日間、モニターした。すべての研究は、適用される法律およびガイドラインの下で実施され、Ｓｔ．Ｊｕｄｅ小児研究病院動物ケアおよび使用委員会から承認された。
【０１０１】
Ｈ７Ｎ９およびＨ５Ｎ１ウイルスを用いた再感染
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いた接種から３週間後、生存マウスは、２５ＭＬＤ５０の相同なウイルスを用いて再感染された。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＨ７Ｎ９ウイルス接種による初期処理で生存した他のマウスは、３週間後にＳｐ２ＣＢＭＴＤの第二の投与を受け、次に、２０ＭＬＤ５０のＡ／トルコ／１５／２０１６（Ｈ５Ｎ１）ウイルスを感染された。
【０１０２】
肺サイトカインおよびケモカイン分析
４つのサイトカイン［ガンマインターフェロン（ＩＦＮ−γ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、活性化調節された発現および分泌正常Ｔ細胞（ＲＮＴＥＳ）、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）］の濃度、および４つのケモカイン［インターロイキン−１β（Ｉｌ−１β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、マクロファージ炎症性タンパク質−１α（ＭＩＰ−１α）、誘導タンパク質（ＩＰ−１０）］の濃度は、製造業者の指示に従ってマウスＭＹＣＴＯＭＡＧ−７０Ｋ−ＰＭＸ  ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ（登録商標）予備混合キット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定された。各サイトカインについて、標準曲線は、３．２〜１０，０００ｐｇ／ｍＬの範囲であった。サイトカインは、感染後の０日、３日、６日および９日に２５μＬの肺ホモジネート試料において測定された。マルチプレックスプレートは、ｘＰｏｎｅｎｔデータ収集および分析ソフトウェアを用いて、ルミネックス１００／２００アナライザーで読み取った。
【０１０３】
組織病理学および免疫組織化学
第二の研究の各実験グループ（ｎ＝３）におけるマウスの肺を１０％中性緩衝ホルマリン（ＮＢＦ）を用いて全身灌流後に回収した。マウス肺を気管注入を介して膨張させ、包埋、切片化、インフルエンザＡウイルス［核タンパク質（ＮＰ）；ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ］および好中球［ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｈａｎｄｏｎ］についてヘマトキシリンおよびエオシンまたは免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を用いた従来の組織病理学について染色する前の少なくとも７日間、１０％ＮＢＦ中に維持する。インフルエンザＡウイルスＮＰ染色およびＭＰＯ染色した切片を病理評価のために盲検化した。抗原の存在は、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて全肺切片のデジタル画像を捕捉し、次に、著しく減少または不存在のＮＰおよびＭＰＯ染色の場所と一緒に領域全体を手動で輪郭を描くことにより定量された。染色範囲が減少した肺領域の割合は、Ａｐｅｒｉｏ’ｓ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを用いて算出された。
【０１０４】
血清学
血清試料をＨ７Ｎ９またはＨ５Ｎ１ウイルス感染の２１日後に得、受容体−破壊酵素（Ｄｅｎｋａ  Ｓｅｉｋｅｎ  Ｃｏ）を用いて処理し、５６℃で１時間、熱不活性化し、０．５％シチメンチョウ赤血球（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いた赤血球凝集素（ＨＡ）阻害アッセイにより抗ＨＡ抗体の存在について試験した。血清試料中の抗ＳｐＣＢＭ抗体の存在は、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に固定化された精製タンパク質（１μｇ／ウェル）を用いて、ＥＬＩＳＡにおいて測定された（２１）。
統計分析
ウイルス肺力価は、サイトカインおよびケモカインの濃度、ならびに抗ＳｐＣＢＭ抗体力価は、対応のないスチューデントｔ検定によって分析された。ＮＰ染色およびＭＰＯ染色された肺細胞数は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５．０ソフトウェアを用いて分散分析（ＡＮＯＶＡ）により比較された。累積生存率は、カプラン・マイヤーログランク検定により算出された。
【０１０５】
結果
Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルスを用いて致死的にチャレンジされたマウスの生存におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効力。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤが、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて致死的にチャレンジされたマウスの生存率を改善したかどうかを決定するために、生物製剤が、ウイルスチャレンジ前の７日、３日または１日に０．１、１、１０または１００μｇの投薬量で１回投与された。ウイルス接種され、ＰＢＳ処理された対照動物は、進行性の体重減少を示し、感染後の８日と１０日の間に全て死亡した（図１７）。Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジ前のＳｐ２ＣＢＭＴＤの単回の鼻腔内投与は、マウスの用量依存的な保護をもたらした。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの最大単回投薬量（１００μｇ）は最大保護を提供し、生物製剤をウイルス接種前の７日、３日または１日に投与した場合に、１００％のマウスが感染に対して生存した（図１７Ａ）。１０μｇの単回投薬量は、ウイルス接種前の１日または７日もしくは３日に投与した場合に、それぞれ１００％、８０％および８０％のマウスを保護した。しかしながら、ウイルスチャレンジ前の３日または１日に１μｇ投薬量を投与した場合に、たった６０％および４０％のマウスが生存した（図１７Ａ）。試験した最低投薬量（０．１μｇ）は、少なくとも効果的であり、たった２０％のマウスが保護された。
【０１０６】
次に、マウスの生存におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤを用いた早期の曝露処理後の効果を評価した。Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジの６時間後に与えられたＳｐ２ＣＢＭＴＤは、１０および１００μｇの投薬量で１００％のマウスを保護し、１μｇで４０％のマウスを保護した（図１７Ｂ）。保護の効力は、治療の開始が２４時間遅れた場合に減少した：１００μｇで処理されたマウスの４０％だけがＨ７Ｎ９接種に対して生存した；０．１および１μｇは生存効果を与えなかった。
Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスを用いて感染させたマウスの致死的チャレンジ前に２回または３回処方計画として与えられたＳｐ２ＣＢＭＴＤの反復投与は、試験された生物製剤の全ての投薬量で完全な保護を与えた（図１７Ｃ）。これらの結果は、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種前のＳｐ２ＣＢＭＴＤの反復投与がマウスの生存および体重減少の最小化に最も効果的であることを示した（表１ｂ）。
【０１０７】
マウス肺におけるＨ７Ｎ９インフルエンザウイルス複製におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果。第二の実験において、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの抗ウイルス活性のメカニズムの基礎は、保護が第一の実験において与えられた１０μｇ投薬量で調べられた。Ｈ７Ｎ９ウイルス負荷の動力学は、感染マウスの肺において決定された。試験された全ての生物製剤処方計画で処理されたマウスの肺におけるウイルス力価は、感染後の３日または６日で対照のウイルス力価とは異なっていなかった（表１ｂ）。注目すべきは、感染後の９日に、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの２回および３回投与が、感染マウスの肺におけるウイルス負荷を有意に減少させたが（Ｐ＜０．００５）、試験された両方の単回投薬処方計画は、ウイルス力価を減少させなかった（表１ｂ）。
【０１０８】
ＰＢＳ（対照）または生物製剤の異なる処方計画のいずれかが与えられた感染マウスの下気道におけるＡ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルス複製を比較するために、ウイルス陽性細胞を感染後の３日、６日および９日に肺切片において定量した（図１８）。対照動物において、ＮＰ陽性細胞（インフルエンザ感染細胞の尺度）は、感染後の３日および６日に全肺切片を通じて検出され、具体的には気管支、細気管支および細気管支周囲肺胞の上皮細胞において検出され（図１８Ｄ、Ｆ）、抗原陽性細胞数は、感染後の９日に減少した（図１８Ｈ）。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの単回投与は、感染後の３日、６日または９日に対照動物と比較して、マウス肺におけるＮＰ陽性細胞数を有意に変化させなかった。対照的に、生物製剤の２回または３回の投与は、ＮＰ陽性細胞数の有意な減少（それぞれ、Ｐ＜０．０１およびＰ＜０．０５）をもたらし、細胞数は、感染後の３日で８０％から７０％に減少し（図１８Ａ）、感染後の９日で５０％に減少した（図１８Ｃ）。
【０１０９】
これらの知見は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投与が、感染マウスの肺においてＨ７Ｎ９ウイルス複製を制御することを示した。肺切片アッセイは細胞内ウイルスだけを検出することができるが、ＴＣＩＤ５０アッセイは細胞内と細胞外の両方のウイルスを検出することができるため、感染性ウイルス力価における観察された差異および感染マウスの肺におけるウイルス陽性細胞数とすることができる。
【０１１０】
肺組織の組織学的変化におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果。肺における変化の程度を決定するために、感染後の３日、６日および９日に異なるＳｐ２ＣＢＭＴＤ処方計画グループから得られた組織を組織学的に調べた（図１９）。Ｈ７Ｎ９に感染したＰＢＳ処理されたマウスの肺は、感染後の３日に気管支の上皮細胞の壊死を示し（図１９Ａ）、感染後の６日に炎症性細胞（好中球およびマクロファージ）による肺胞崩壊と浸潤、浮腫およびウイルス性肺炎を示した（図１９Ｂ）。炎症性細胞による浮腫および浸潤は、感染後の９日まで継続したが、病変がいくつかの領域に制限されていた（図１９Ｃ）。３回の投薬処方計画を受けたＳｐ２ＣＢＭＴＤ処理されたマウスにおいて、感染後の３日目に特徴的な病理学的変化はなく、炎症性細胞による肺胞の上皮壊死および浸潤が最小であった（図１９Ｄ）。肺実質における炎症性細胞の蓄積およびウイルス伝播の進行は、感染後の６日に観察され、感染後の９日に消散した（図１９Ｅ、Ｆ）。これらの知見は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投与が、致死的Ｈ７Ｎ９ウイルス感染に関連している肺組織損傷を減少させることを支持する。
【０１１１】
肺のサイトカインおよびケモカイン産生におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投与に関連した炎症性および自然免疫応答を決定するために、サイトカインおよびケモカインの肺発現におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果を検討した。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、Ｈ７Ｎ９ウイルス接種前の炎症誘発性応答を刺激し、サイトカイン（ＩＬ−６、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１）およびケモカイン（Ｉｌ−１β、ＴＮＦα、ＭＩＰ−１α、ＩＰ−１０）などの特定の炎症誘発性メディエーターのレベルが増加し、有意差（Ｐ＜０．０１またはＰ＜０．０５）は、特に反復投薬を用いて、感染後の０日でＳｐ２ＣＢＭＴＤ処理された動物と対照動物の間に観察された（図２０）。これらの効果は、肺における活性化された肺胞マクロファージに起因する可能性がある。サイトカインおよびケモカインの肺発現は、感染後の３日、６日および９日に実験群間で変動し、発現の明確なパターンはなかった（データ示さず）。これらの結果は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、迫り来るインフルエンザウイルス感染により良好に対抗するために、宿主を「プライミング」することによって免疫応答を調節する場合があることを示唆する。
【０１１２】
好中球動員におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの効果。ウイルス接種前に決定されたサイトカインレベルの上昇が、肺における免疫細胞集団の増加と関連していることを確認するために、好中球数を測定した（図２１）。感染後の０日目に、好中球数は、対照よりも、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ処理されたマウスからの試料において有意に高く（Ｐ＜０．０００１）、最大増加が、反復Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投薬を与えられたマウスから得られた試料において見られた（図２１）。本発明者らの結果は、ウイルス複製部位への免疫細胞の動員が、致死的Ｈ７Ｎ９ウイルス感染からの急速な回復と生存に寄与されるＳｐ２ＣＢＭＴＤ投与によって引き起こされたことを示す。
Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルスを用いたマウスの再感染。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ処理が適応免疫の誘導と干渉するかどうかを調べるために、Ａ／Ａｎｈｕｉ／１／２０１３（Ｈ７Ｎ９）インフルエンザウイルスに対する血清抗ＨＡ抗体の力価を決定した。全ての生存マウスは、使用された処方計画に関係なく、抗ＨＡ抗体の中程度の力価（１：４０〜１：１６０）を有した（表２ｂ）。抗ＨＡ抗体力価は、２５ＭＬＤ５０投薬量の相同Ｈ７Ｎ９ウイルス再感染に対して、生存動物を１００％を保護するのに十分であった（データ示さず）。
【０１１３】
反復投与とＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスによる再感染後の抗ＳｐＣＢＭ抗体の誘導。生物製剤を反復して使用した場合、抗生物製剤抗体の発生は、潜在的に保護を無効にする可能性があった。本発明者らは、生物製剤の２つの使用後にマウス血清中の抗ＳｐＣＢＭ抗体のレベルを評価した（表２ｂ）。無傷なマウスと比較して、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの第一の使用後に最も顕著な増加が、急性抗体のプールを示すＩｇＭについて観察され、ＩｇＡについて最も少ない増加が示された。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの第二の使用後、ＩｇＧおよびＩｇＭのレベルは、それぞれ、全ての処理群において、１．３〜１．７倍および１．４〜４．４倍増加した（表２ｂ）。反復Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ使用が、インフルエンザウイルス感染に対する保護に影響を与えることができるかどうかという問題に対処するために、本発明者らは、高病原性Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いてマウスに再感染させた。重要なことには、生物製剤を２回受容したグループの動物は、Ｈ５Ｎ１ウイルスを用いた致死的チャレンジから完全に保護された（データ示さず）。
【０１１４】
検討。インフルエンザＨ７Ｎ９ウイルス誘発による急性呼吸窮迫症候群（２３）の先に開発された致死的マウスモデルにおいて、本発明者らは、新たな出現ヒト病原体による致死的な感染の予防における新規な宿主標的化された生物製剤Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの高い効力を実証した。最大効力とマウスの１００％保護は、Ｈ７Ｎ９ウイルスチャレンジ前のＳｐ２ＣＢＭＴＤの反復投与によって達成されたが、２０％〜１００％の動物は、時期と投薬量に応じて、ウイルスチャレンジ後のＳｐ２ＣＢＭＴＤの単回投薬により保護された。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの反復投与は、Ｈ７Ｎ９ウイルス感染前にいくつかの主要な炎症誘発性サイトカインを誘導し、肺上皮に免疫細胞を動員し、それほど顕著ではない炎症とマウス肺から迅速なウイルスクリアランスをもたらした。
【０１１５】
トリインフルエンザウイルスによって引き起こされるヒト感染は、人畜共通感染症を制御するための最適な治療法について懸念を提起し、新規な抗インフルエンザ薬を開発する必要性を強調する。近年、新規薬物の標的が広がり、インフルエンザウイルス特異的なタンパク質だけでなく、ウイルス複製に本質的な宿主因子に着目している。宿主標的化薬物の主要な利点は、異なるインフルエンザウイルスサブタイプに対するそれらの広範囲の活性と効力であり、薬物耐性改変体（２４）の出現の低リスクである。薬物開発のための魅力的な戦略は、宿主細胞へのインフルエンザウイルスの侵入を阻害することである。したがって、ＳＡを含有する宿主細胞受容体をマスクするために設計されたＳｐ２ＣＢＭＴＤは有望な候補である。治験抗ウイルス生物製剤ＤＡＳ１８１とは異なり、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、細胞受容体を除かないが、それらをマスクし、ウイルス付着を妨げる（２１）。グリカンアレイスクリーニングは、ＳｐＣＢＭが、グリカンを含有する末端α２，３またはα２，６連結ＳＡを認識する（２０）ことを示し、ヒトの上気道および下気道内の受容体に結合することができる生物製剤の実施可能性を強調する。多価を介して達成されるＳｐ２ＣＢＭＴＤの高親和性は、それが長期間、ＳＡ受容体をマスクすることを可能にする。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは単回投与後の最大８日間マウス肺において検出され（２１）、これによりウイルス感染に先立っての投与が可能となり、予防対策の貴重な成分が作られる。対照的に、Ｈ７Ｎ９に感染させたマウスにおけるＤＡＳ１８１の抗ウイルス活性の最近の研究は、毎日の投薬が、体重減少を減らし、致死性からマウスを完全に保護するために、感染の開始時に必要とされることを示す（２５）。標的（細胞表面シアログリココンジュゲート）が両方の薬物にとって同じであるにもかかわらず、処方計画は異なる。
本発明者らのデータは、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの抗ウイルス作用のメカニズムは複雑であり、２つの主要な要因：１）ＳＡを含有する細胞受容体へのウイルス結合を妨げ（２１）、２）宿主免疫応答を調節することによって駆動されることを示唆する。インフルエンザウイルス感染に対する保護におけるＳｐ２ＣＢＭＴＤの多機能的役割は、先天性免疫応答の刺激、およびインフルエンザウイルス感染部位への免疫細胞の動員によって実証され、したがって、Ｈ７Ｎ９ウイルスによって誘導される免疫病理の重症度を低減する。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、ＳＡに加えて、まだ未知の受容体（単数または複数）に結合し、したがって、免疫応答を調節する能力を獲得することが可能である。
【０１１６】
重要なことは、Ｈ７Ｎ９ウイルス感染に対して生存した、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ処理されたマウスから回収された血清は、特異的な抗ＨＡ抗体に陽性であり、それにより適応免疫応答の発生が生じた。免疫応答のレベルは、高投薬量の相同なウイルスを用いたＨ７Ｎ９ウイルスの再感染に対して保護するのに十分であった。
【０１１７】
この新規な治療薬の長期使用に関する主要な関心事は、それに対する特異的抗体の開発である。本発明者らの結果は、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ抗ＳｐＣＢＭ抗体の血清レベルが、第一投与の３週間後のＳｐ２ＣＢＭＴＤの第二投与後に増加するが、保護は影響を受けず、全ての動物は、高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスを用いた異種チャレンジに対して生存することを実証した。新たな出現Ｈ７Ｎ９インフルエンザウイルスと高病原性Ｈ５Ｎ１の内部遺伝子セグメントの全ては類似し、トリＨ９Ｎ２ウイルス由来のものと密接に関連している（１６、２６）。したがって、初期Ｈ７Ｎ９ウイルス感染によって確立される交差反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の免疫応答は、Ｈ５Ｎ１再感染に対する保護に寄与している可能性がある。高病原性Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスの異なるＨＡクレードに対するＳｐ２ＣＢＭＴＤの効力を決定するために、さらなる研究が必要とされる。本発明者らの結果は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの反復使用が短期間内でさえも可能であることを確認する。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ投与間の期間がより長い場合、抗ＳｐＣＢＭ抗体を除去することができ、保護レベルにおけるそれらの可能な効果を減少させる場合がある。免疫原性の可能な懸念を低減させるために、生物製剤のヒト化が可能である。
【０１１８】
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、インフルエンザの潜在的なパンデミック株によって引き起こされる疾患の予防のための将来性を示すインフルエンザ感染症のための治療薬の新規な宿主向けの種類を表す。以前の研究は、この生物製剤は、パンデミックＨ１Ｎ１ｐｄｍ０９ウイルスに対して効果的であることを示唆する（２１）。まとめると、これらのデータは、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤが、出現インフルエンザウイルスに対する有望な予防オプションであるという見解を支持する。パラインフルエンザウイルス、いくつかのコロナウイルス、およびＳ．ニューモニエなどの他の呼吸器病原体はまた、将来的にＳｐ２ＣＢＭＴＤのより広範な応用を実行することができる、病因のためのＳＡ受容体を使用する。マウスでの本発明者らの知見は、反復低投薬量の処方計画が最も高い生存率をもたらし、マウス肺における組織損傷を最小化することを確認した。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの免疫調節特性は、さらなる調査を必要とするが、本研究の知見は、ＳＡ受容体を使用していない病原体によって引き起こされる呼吸器疾患の予防においてこのアプローチのより広い適用可能性を提唱する。
【表１０】
0006539289.tif 000015
【表１１】
0006539289.tif 000016
【０１１９】
例４に関する参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【配列表】
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