(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する脂肪肝または脂肪性肝炎の治療剤。
【請求項２】
コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する脂肪肝または脂肪性肝炎の予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪肝および脂肪性肝炎治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪肝は、肝細胞に脂肪が異常に蓄積した状態のことであるが、脂肪の蓄積が進むと、肝臓内に白血球などの炎症細胞が浸潤したり、肝細胞の変性により風船化した肝細胞あるいはMallory-Denk小体と呼ばれる凝集体を有する肝細胞が生じたり、それらの肝細胞の周囲で線維化が見られるようになったりして、脂肪性肝炎に至る。さらに放置すると、肝硬変や肝臓がんの原因にもなりうることが知られている。脂肪性肝炎には、アルコールの過剰摂取によるアルコール性の病態と、発症原因がアルコールによらない非アルコール性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis：NASH）とが知られている。現在、その根本的な治療法は無く、治療は、食生活の改善と運動療法が基本となっている。
【０００３】
ところで、コノフィリンは、腫瘍細胞の増殖を抑制する作用、NF-κBの活性化を阻害する作用、抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の感受性を増強する作用、及び膵細胞に対してインスリン生成・放出細胞への分化を誘導する作用を有することが報告されている（特許文献１〜４、非特許文献１参照）が、その他の薬理学的作用は未だ十分に明らかにされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平７−２３３０７１号公報
【特許文献２】特開平１１−３２２６０２号公報
【特許文献３】国際公開第０４／０９９２１５号パンフレット
【特許文献４】特開2008-110972号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Mol. Cancer Res. 1(7): 508-518, 2003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、新規な脂肪肝治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らはコノフィリンをＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）モデルマウスに与え、肝硬変等の治療実験を行ったところ、モデルマウスで生じる肝臓の脂肪化がコノフィリンの経口投与により強く抑制されることが、予期せず見出され、本発明の完成に至った。
【０００８】
本発明の一実施態様は、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含有する脂肪肝及び脂肪性肝炎の治療剤である。本発明の他の実施態様は、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含有する脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬変または肝癌の予防剤である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、新規な脂肪肝治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施例において、ＭＣＳ群、ＭＣＤ群、ＭＣＤ＋conophylline群の間で、体重変化を比較した結果を示す図である。
【図２】本発明の一実施例において、ＭＣＳ群、ＭＣＤ群、ＭＣＤ＋conophylline群の各群で、肝臓における脂肪の蓄積を顕微鏡で観察した観察結果と、観察結果を分析した分析結果を示す図である。
【図３】本発明の一実施例において、ＭＣＳ群、ＭＣＤ群、ＭＣＤ＋conophylline群の各群で、血清中のＡＬＴ、肝臓の中性脂肪量、肝臓重量、肝臓重量／体重を計測した結果を示す図である。
【図４】本発明の一実施例において、ＭＣＳ群、ＭＣＤ群、ＭＣＤ＋conophylline群の各群で、ＦＡＢＰ、ＦＡＴＰ、ＡＣＯＸ１、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＭＴＴＰの各遺伝子の発現を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００１２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００１３】
本発明の脂肪肝及び脂肪性肝炎の治療剤、または脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌の予防剤は、コノフィリンまたはその薬理学的に許容される塩を含有する。コノフィリンの薬理学的に許容される塩としては、塩酸塩、硫酸塩を挙げることができるが、以下、本明細書では、「コノフィリン」という用語は、その薬理学的に許容される塩を含むものとする。
【００１４】
実施例に示すように、コノフィリンは、脂肪肝及び脂肪性肝炎の治療に有効である。従って、コノフィリンは、脂肪肝、脂肪性肝炎、肝硬変または肝臓癌の予防剤としても有効である。ここで、肝硬変および肝臓癌は、脂肪肝または脂肪性肝炎を経て生じたものである。脂肪肝及び脂肪性肝炎の原因は特に限定されず、食事性、アルコール性、非アルコール性、妊娠に伴うもの、のいずれであってもよい。
【００１５】
これらの薬剤は、精製したコノフィリンを含有しても、コノフィリンを含有する植物やその乾燥物、またはその植物の抽出液や抽出物を含有してもよい。コノフィリンは、例えば、キョウチクトウ科の植物であるＥｒｖａｔａｍｉａ ｍｉｃｒｏｐｈｙｌｌａの葉に多量にふくまれているので（Ｕｍｅｚａｗａ，Ｋ．らＡｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４：２４１３−２４１８（１９９４））、その葉を用いることができるが、コノフィリンが含まれてさえすれば、どの植物のどの部位をも用いることができる。
【００１６】
コノフィリンを含有する植物の乾燥物は、コノフィリンを含有する植物を、そのままで又は粉砕した後、自然乾燥、凍結乾燥、温風乾燥などの方法によって乾燥することにより得ることができ、さらに乾燥物を粉砕し、粉末状にしてもよい。
【００１７】
コノフィリンを含有する植物の抽出液は、コノフィリンを含有する植物又はその乾燥物に溶媒を加え、コノフィリンを溶媒中に溶出させることにより得ることができる。溶媒としては、例えば、水、アルコール、酢酸エチル、クロロホルム、又は２種以上の混合溶媒を用いることができるが、水、エタノール、又はこれらの混合物を用いることが安全性の面から好ましい。なお、溶媒中への有効成分の溶出において、撹拌、粉砕、加熱などによって、コノフィリンの溶出量の増加及びコノフィリンの溶出時間の短縮を図ることができる。このようにして得られた抽出液は、葉の残渣を除去せず、薬剤の有効成分としてそのまま用いていることもできるが、抽出液中の葉の残渣を濾過法又は遠心分離法により除去した抽出液を用いてもよい。また、公知の方法によって、抽出液から溶媒を除去することにより、固形物である抽出物を得ることもできる。
【００１８】
なお、コノフィリンは、特開平７−２３３０７１号公報、国際公開第０４／０９９２１５号パンフレットなどに記載の方法に準じて製造することができるが、上述の抽出液や、抽出物の溶液を液体クロマトグラフィーなどにより分離精製することにより製造することもできる。
【００１９】
コノフィリンを含む薬剤は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などとして、脊椎動物に経口投与してもよいし、注射剤、坐剤などの製剤として、腹腔内や静脈内への注射により非経口投与することもできる。製剤中のコノフィリンの含有率は、１〜９０重量％の間で変動させることができる。例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤などの形態をとる場合には、有効成分を５〜８０重量％含有させるのが好ましい。シロップ剤などの液剤の場合には、有効成分を１〜３０重量％含有させるのが好ましい。さらに、非経口投与する注射剤の場合には、有効成分を１〜１０重量％含有させるのが好ましい。 コノフィリンの製剤化は、賦形剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトールなどの糖類、バレイショ、コムギ、トウモロコシなどのデンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムなどの無機物、結晶セルロースなど）、結合剤（デンプンのり液、アラビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースなど）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール、シリコーン油）、崩壊剤（デンプン、寒天、ゼラチン末、結晶セルロース、ＣＭＣ・Ｎａ、ＣＭＣ・Ｃａ、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど）、矯味矯臭剤（乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニトール、芳香性精油類など）、溶剤（注射用水、滅菌精製水、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、オリーブ油、綿実油など）、安定剤（窒素、二酸化炭素などの不活性ガス、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸などのキレート剤、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、Ｌ−アスコルビン酸、ロンガリットなどの還元物質など）、保存剤（パラオキシ安息香酸エステル、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェノール、塩化ベンザルコニウムなど）、界面活性剤（水素添加ヒマシ油、ポリソルベート８０、２０など）、緩衝剤（クエン酸、酢酸、リン酸のナトリウム塩、ホウ酸など）、希釈剤などの製剤添加物を用いて、公知の方法で行われる。
【００２０】
治療対象の脊椎動物としては特に限定されず、例えば、ほ乳類であってもよく、ヒトであってもよいが、ヒト以外のマウス、ラット、牛、ブタ、犬、猫、マーモセットなどの脊椎動物であってもよい。
【００２１】
例えば、コノフィリンをヒトに経口投与する場合には、１日あたり約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）の投与量で、１回または数回に分けて投与するとよいが、その投与量や投与回数は、症状、年齢、投与方法などにより適宜変更しうる。
【実施例】
【００２２】
以下に本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２３】
［実施例１］
（１）コノフィリンの調製
実施例で用いたコノフィリンは、Fujiiらの論文（M. Fujii, I. Takei and K. Umezawa: Antidiabetic effect of plant extract containing conophylline by oral administration in streptozotocin-treated and Goto-Kakizaki rats. Biomedicine &. Pharmacotherapy 63: 710-716, 2009）に従って、調製したものである。具体的には、沖縄県宮古島で栽培したタベルネモンタナ・ディヴァリカタ（Tabernaemontana divaricata）の葉を６０℃の温風乾燥機により１６時間乾燥させて乾燥葉を得た。乾燥葉３００ｇを家庭用ミルで粉砕し、３Ｌの６０容量％のエタノールを加えてコノフィリン及びコノフィリジンを抽出した。遠心分離により上清を回収し、沈殿に再度６０容量％のエタノールを３Ｌ加えて再度抽出操作を行い、上清を回収した。回収した上清を混合し、エバポレーターでエタノールの除去と濃縮を行った後に凍結乾燥し、約５０ｇの乾燥物を得た。この乾燥物中、コノフィリンは２２ｍｇ／ｇの割合で含まれている。
【００２４】
（２）モデルマウスの作製とコノフィリンの効果
本実施例では、脂肪肝のモデルマウスとして、コリン・メチオニン欠乏食投与マウスを用いた。このマウスは、肝臓に著明な脂肪化を認めるとともに、肝臓細胞の繊維化を生じるため、ＮＡＳＨのモデルであると考えられている。
【００２５】
生後１０週齢のマウス（db/db、雄、６匹）に対し、８週間、（１）標準食（ＭＣＳ群）： L-Amino acids  175.7 g/kg, L-Methionine 2.0g/kg, Choline chloride 2.0g/kg, Sucrose 437.9 g/kg, Cornstarch 150g/kg, Dextromaltose 50g/kg, Cellulose 30g/kg, Corn oil 100g/kg, Sodium bicarbonate 7.4g/kg, Salt mix 35g/kg, Vitamin mix 10g/kg, total 1000g/kg（２）コリン・メチオニン欠乏食（ＭＣＤ群）L-Amino acids  175.7 g/kg, Sucrose 441.9 g/kg, Cornstarch 150g/kg, Dextromaltose 50g/kg, Cellulose 30g/kg, Corn oil 100g/kg, Sodium bicarbonate 7.4g/kg, Salt mix 35g/kg, Vitamin mix 10g/kg, total 1000g/kg（３）コノフィリン（１μｇ／体重ｇ）含有コリン・メチオニン欠乏食（ＭＣＤ＋conophylline群）を給餌した。毎週体重を測定し、各群で体重変化を比較したところ、ＭＣＤを与えた（２）（３）の群は、８週目まで同様に体重が減少し続けた（図１）。
【００２６】
８週目に肝臓を単離し、パラフィン切片を作成し、ＨＥ染色したところ、ＭＣＤ群では、他の２群より脂肪の蓄積が多く観察された（図２）。脂肪化を定量するため、顕微鏡１視野当たりの脂肪化している肝細胞を、各群において５視野ずつ計測したところ、ＭＣＳ群は２６．５％、ＭＣＤ群は４５．６％、ＭＣＤ＋conophylline群は２０．９％となり、ＭＣＤ群で肝臓の脂肪化の割合が有意に高かった（図２右下）。このように、コノフィリンは、肝臓細胞の脂肪化を抑制する効果がある。
【００２７】
次に、各群のマウスについて、肝障害のレベルの指標として知られる血清中のＡＬＴ及び肝臓の中性脂肪量をドライケミストリー法によって測定したところ、血清中のＡＬＴ、肝臓の中性脂肪量については、ＭＣＤ群が最も高く、肝障害が進んでいたが、コノフィリン投与によって肝障害が生じなくなった（図３上図）。また、肝臓重量を測定して肝臓重量／体重を算出したところ、肝臓重量は、ＭＣＤ＋conophylline群が最も少なく、これは脂肪肝が軽減していることを示している（図３下図）。
【００２８】
さらに、各群のマウスから得た肝臓において、脂質代謝関連遺伝子の発現をReal time PCR法で測定したところ、脂質輸送に関わるＦＡＢＰ、脂質排出に関わるＭＴＴＰ、β酸化に関わるＡＣＯＸ１の発現は、ＭＣＤ群で低下していたが、コノフィリン投与によって有意にまたは顕著に回復した（図４）。また、脂質取り込みに関わるＦＡＴＰの発現は、ＭＣＤ群で亢進していたが、コノフィリン投与によって顕著に回復した（図４）。このように、コノフィリンは、脂質代謝関連遺伝子の遺伝子発現の面からも、肝臓細胞の脂肪化に伴う脂質代謝異常を正常化する効果があることがわかる。一方、脂質合成に関わるＳＲＥＢＰ−１ｃは、各群で変化は認められなかった。
【００２９】
以上より、コノフィリンは、肝臓細胞の脂肪化を、脂質代謝異常を正常化することにより抑制する効果がある。従って、脂肪肝及び脂肪性肝炎の予防剤および治療剤として有効である。
【図１】
0006453636.tif 000002
【図２】
0006453636.tif 000003
【図３】
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【図４】
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