(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を特定する方法であって、
（ａ）対象から得られた生体試料において、配列番号２および配列番号５を含む複数の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定すること、および
（ｂ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定することを含む、方法。
【請求項２】
前記バイオマーカーが配列番号１、３、６、７、１２および１７から選択される少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマーカーが配列番号１〜３、５〜７、１２および１７に記載の複数の核酸配列を含み、および前記対象が結腸直腸癌を有すると特定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオマーカーが配列番号１〜３、５〜７、１２および１７に記載の複数の核酸配列からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオマーカーが配列番号２および５に記載の核酸配列からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が血液、血漿、唾液、血清またはその組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が末梢血から抽出された血漿である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーが循環ｍＲＮＡに相当する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーの発現を測定することが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ、核酸配列決定技術、制限消化、特異的ハイブリダイゼーション、一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）および電気泳動分析から選択される少なくとも１種の核酸分析技法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーの発現を測定することが、血漿からｍＲＮＡを抽出すること、前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること、および前記ｃＤＮＡの発現レベルを、定量ＰＣＲを用いて測定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象の治療計画を決定するおよび／または管理するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の対象を特定する方法。
【請求項１２】
前記治療が化学療法薬を投与することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記化学療法薬が５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一部の実施形態によると、特異的ｍＲＮＡバイオマーカーの発現プロファイル（複数可）に基づいて前癌性の進行ポリープまたは結腸直腸癌を有する対象を特定する方法およびキットに関する。本発明は、結腸直腸癌の診断、予防、治療管理、モニタリングおよび素因の特定を行うための方法およびキットをさらに含む。
【背景技術】
【０００２】
結腸直腸癌（ＣＲＣ）は、最も一般的な癌の一種であり、全癌症例の約１０％、すべての癌死の約８％を占めている。固形癌は、通常、組織病理学的な組織評価に基づいて診断され、ＣＲＣの究極の判断基準は光ファイバー結腸内視鏡検査である。この技術は、多大な労力と時間を必要とし、費用が高く、および極めて浸潤的である。便潜血反応検査（ＦＯＢＴ）の代替法は、それほど浸潤的ではないが、低い感度に悩まされることが知られている。
【０００３】
スクリーニングアッセイおよびモニタリングアッセイは、癌の早期発見と治療管理に不可欠である。血液系試験により、臨床的に無症状の（健常と推定される）人の癌の診断、モニタリングおよび予測の大規模スクリーニングが可能になる。さらに、血液系試料採取は普及し、簡便であるので、無症状の集団においてコンプライアンスを向上させることができる。
【０００４】
Ｂｏｎｉｌｌａら（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２，７１９−７１４，２０１１）は、結腸直腸癌の進行期患者において予後不良に関連するｍＲＮＡバイオマーカーを開示している。
【０００５】
結腸直腸癌に関連している可能性のある数百の遺伝子の総覧が、例えば、Ｙｅら，Ｐｌｏｓ  ｏｎｅ，２０１３；８（５），ｅ６２８７０；およびＧａｒｃｉａら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍ．５３（１０）：１８６０−１８６３，２００７に開示された。Ｍａｒｓｈａｌｌら（Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１０；１２６：１１７７−１１８６）は、ＡＮＸＡ３、ＣＬＥＣ４Ｄ、ＬＭＮＢ１、ＰＲＲＧ４、ＴＮＦＡＩＰ６、ＶＮＮ１およびＩＬ２ＲＢの７遺伝子のパネルに対応する末梢血細胞から抽出されたＲＮＡに基づいてＣＲＣのバイオマーカーを開示している。
【０００６】
米国特許出願番号２０１０／０３３００７９号は、結腸直腸癌の初期診断および治療管理のためのタンパク質バイオマーカーを検出する方法を開示している。この方法は、末梢血中の５１の遺伝子の発現に関する定量的情報を得ることを含む。
【０００７】
国際公開第２０１１／０１２１３６号は、一群のｍｉＲＮＡの発現レベルに基づいてＣＲＣ試料と非癌性試料とを識別する方法を開示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
前癌性の進行ポリープおよび結腸直腸癌の早期発見および治療のための、感度と特異度が改善され、費用対効果が大きく、迅速で正確、かつ低侵襲の方法およびキットの必要性がいまだ満たされず存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、対象において結腸癌および前癌ポリープを特定する方法およびキットを提供する。有利には、本発明の方法およびキットは、非侵襲分子ベースの分析に基づき、前癌性の進行ポリープがある結腸を結腸直腸癌と識別する。さらに、本発明の方法およびキットは、高感度（少なくとも６０％）と高特異度（８５％を超える）を備えた診断用プラットフォームを提供する。
【００１０】
本発明は、顕性疾患が明らかになるよりはるか前に、血漿または他の体液中に疾患に関連したバイオマーカーが特定されることができるという発見を前提としている。本発明のバイオマーカーによって与えられる別の利点は、バイオマーカーが細胞外であり、それによってすべての身体組織から生じるという事実から生じる。さらに、これらのバイオマーカーは、免疫応答に影響を受けない。結腸直腸癌を患う患者の血漿フットプリントからこれらのバイオマーカーの有無は、本明細書では早期診断ツールとして提供され、そのために治療戦略は、腫瘍性結腸直腸細胞の形成を阻止する、遅延させるまたは逆転させるように考案および実施されることができる。本発明の疾患関連バイオマーカーの１つまたはいくつかからなる組み合わせは、前癌性の進行ポリープもしくは結腸直腸癌を患う対象を診断するのに有用であり、または直腸結腸癌に無症状の対象を診断するのに有利である。
【００１１】
驚くべきことに、本明細書に示すように、本発明の方法は、有限個の核酸配列バイオマーカーの発現プロファイルを用いて、健常な対象、結腸直腸癌を有する対象、および前癌性の進行ポリープを有する対象を特定する。さらに、本発明のバイオマーカーは、疾患の部位から離れた場所で、血漿試料中に特定される。病理学検査報告によると、予想外にも、前述の血漿ベースのバイオマーカーは、高特異度および高感度で相関する差次的に発現した遺伝子プロファイルをもたらす。
【００１２】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を特定する方法が提供され、該方法は
（ａ）対象からの生体試料を準備すること、
（ｂ）前記生体試料において配列番号１に記載の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定すること、および
（ｃ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行ポリープを有すると特定することを含む。
【００１３】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１を含み、ならびに配列番号２、３、５〜７、１２および１７から選択される少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００１４】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１〜３、５〜７、１２および１７に記載の核酸配列を含み、ならびに前記対象は結腸直腸癌を有すると特定される。
【００１５】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１〜３、５〜７、１２および１７に記載の核酸配列からなる。
【００１６】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および５に記載の核酸配列をさらに含み、および前記対象は前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定される。
【００１７】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および５に記載の核酸配列からなる。
【００１８】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１を含み、ならびに配列番号３、４、６および１４から選択される少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００１９】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および４、ならびに配列番号３、６および１４から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００２０】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、３および４を含む。
【００２１】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、４、６および１４を含む。
【００２２】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、３、４および１４を含む。
【００２３】
一部の実施形態によれば、前記生体試料は、血液、血漿、唾液、血清またはその組み合わせからなる群から選択される。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００２４】
一部の実施形態によれば、前記生体試料は、末梢血から抽出された血漿である。
【００２５】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーは循環ｍＲＮＡである。
【００２６】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーの発現を測定することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量ＰＣＲ、核酸配列決定技術、制限消化、特異的ハイブリダイゼーション、一本鎖高次構造多型アッセイ（ＳＳＣＰ）および電気泳動分析から選択される少なくとも１種の核酸分析技法を含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００２７】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーの発現を測定することは、血漿からｍＲＮＡを抽出すること、前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写すること、および前記ｃＤＮＡの発現レベルを、定量ＰＣＲを用いて測定することを含む。
【００２８】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌または前癌性の進行直腸結腸ポリープを有する対象を特定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）対象からの生体試料を準備すること、
（ｂ）前記生体試料において配列番号２に記載の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定すること、および
（ｃ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定することを含む。
【００２９】
一部の実施形態によれば、前記マーカーは配列番号２を含み、ならびに配列番号１、３、５〜７、１２よび１７から選択される少なくとも１つの核酸配列をさらに含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００３０】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を特定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）対象からの生体試料を準備すること、
（ｂ）前記生体試料において、複数の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定することであって、前記複数の核酸配列が配列番号１と、配列番号２、３、５〜７、１２および１７から選択される少なくとも１つの核酸配列を含む、測定すること、および
（ｃ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定することを含む。
【００３１】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を特定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）対象からの生体試料を準備すること、
（ｂ）複数の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定することであって、前記複数の核酸配列が配列番号６、９および１４を含む、測定すること、および
（ｃ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定することを含む。
【００３２】
一部の実施形態によれば、該方法は、前記バイオマーカーにカットオフ値を提供することをさらに含む。一部の実施形態によれば、該方法は、バイオマーカーに対応する各核酸配列のカットオフ値を提供することをさらに含む。一部の実施形態によれば、該方法は、バイオマーカーに対応する複数の核酸配列のカットオフ値を提供することをさらに含む。
【００３３】
一部の実施形態によれば、該方法は、結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を治療することをさらに含む。
【００３４】
一部の実施形態によれば、治療することは、化学療法薬を投与すること、腸切除を行うこと、放射線療法を適用すること、およびその組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００３５】
一部の実施形態によれば、化学療法薬は、５−フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビンおよびその組み合わせからなる群から選択される。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００３６】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌を有する対象を特定するキットが提供され、該キットは、（ａ）対象から採取した生体試料において、配列番号１〜１７からなる群から選択される少なくとも１つの核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定するための手段、および（ｂ）前記少なくともバイオマーカーのカットオフ値、または前記少なくとも１つのバイオマーカーのカットオフ値に関する情報を決定するための手段を含み、前記カットオフ値を上回る少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルが、前記対象が結腸直腸癌を有すると特定する。
【００３７】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーの発現レベルを測定するための手段は、配列番号１〜１７からなる群から選択される少なくとも１つの核酸配列を増幅することができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、前記少なくとも１つの核酸配列にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、少なくとも１つの核酸配列に隣接するヌクレオチドプライマー対、およびその組み合わせである。
【００３８】
一部の実施形態によれば、前記少なくとも１つの核酸配列にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を含む。
【００３９】
一部の実施形態によれば、検出可能な標識は、前記少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルと相関する信号を生成する。
【００４０】
一部の実施形態によれば、検出可能な標識は、光信号を生成する。
【００４１】
一部の実施形態によれば、前記手段は、少なくとも１つの核酸配列に隣接するヌクレオチドプライマー対であり、およびそのヌクレオチドプライマー対は、検出可能な標識を含む。
【００４２】
一部の実施形態によれば、前記キットは、結腸直腸癌を有する対象を特定するために、その使用説明書をさらに含む。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態、特徴、利点および適用性の全範囲は、以下に示す発明を実施するための形態および図面から明らかになろう。しかし、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の趣旨および範囲内で種々の変更および修正が発明を実施するための形態から当業者には明らかになるので、この発明を実施するための形態は例としてのみ示されていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】下記の実施例に記載の実験手法の一実施形態を示す。
【図２Ａ】ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１（Ａ）およびＴＦＲＣ（Ｂ）それぞれのプライマーの濃度検量線を示す。
【図２Ｂ】ハウスキーピング遺伝子ＨＰＲＴ１（Ａ）およびＴＦＲＣ（Ｂ）それぞれのプライマーの濃度検量線を示す。
【図３Ａ】バイオマーカーＢＡＤ（配列番号２）について、結腸直腸癌（癌）を有する対象、前癌性の進行ポリープ（進行ポリープ）を有する対象の真陽性百分率（感度）、および健常（正常）亜集団の偽陽性百分率（１−特異度）のパイチャートを示す。
【図３Ｂ】バイオマーカーＢＡＭＢＩ（配列番号３）について、結腸直腸癌（癌）を有する対象、前癌性の進行ポリープ（進行ポリープ）を有する対象の真陽性百分率（感度）、および健常（正常）亜集団の偽陽性百分率（１−特異度）のパイチャートを示す。
【図３Ｃ】バイオマーカーＮＥＫ６（配列番号５）について、結腸直腸癌（癌）を有する対象、前癌性の進行ポリープ（進行ポリープ）を有する対象の真陽性百分率（感度）、および健常（正常）亜集団の偽陽性百分率（１−特異度）のパイチャートを示す。
【図３Ｄ】バイオマーカーＦＫＢＰ５（配列番号７）について、結腸直腸癌（癌）を有する対象、前癌性の進行ポリープ（進行ポリープ）を有する対象の真陽性百分率（感度）、および健常（正常）亜集団の偽陽性百分率（１−特異度）のパイチャートを示す。
【図３Ｅ】バイオマーカーＥＰＡＳ１（配列番号６）について、結腸直腸癌（癌）を有する対象、前癌性の進行ポリープ（進行ポリープ）を有する対象の真陽性百分率（感度）、および健常（正常）亜集団の偽陽性百分率（１−特異度）のパイチャートを示す。
【図３Ｆ】バイオマーカーＣＨＤ２（配列番号１）について、結腸直腸癌（癌）を有する対象、前癌性の進行ポリープ（進行ポリープ）を有する対象の真陽性百分率（感度）、および健常（正常）亜集団の偽陽性百分率（１−特異度）のパイチャートを示す。
【図４Ａ】健常な対象（正常−テクスチャグレイ）、前癌性の進行ポリープを有する対象（前癌性−ソリッドグレイ）および結腸直腸癌を有する対象（癌−ソリッドブラック）におけるバイオマーカーＣＯＸ１１、ＫＩＡＡ１１９９およびＢＡＤの組み合わせの正規化発現レベル（各カラムは単一の対象を指す）を示す。
【図４Ｂ】健常な対象（正常−テクスチャグレイ）、前癌性の進行ポリープを有する対象（前癌性−ソリッドグレイ）および結腸直腸癌を有する対象（癌−ソリッドブラック）におけるバイオマーカーＣＨＤ２とＥＰＡＳ１の組み合わせの正規化発現レベル（各カラムは単一の対象を指す）を示す。
【図５】バイオマーカーＢＡＤ、ＢＡＭＢＩ、ＣＨＤ２、ＦＫＢＰ５、ＳＡＳＨ３、ＮＥＫ６、ＥＰＡＳ１およびＫＬＦ９（それぞれ、配列番号２、３、１、７、１７、５、６および１２）の最大値のＲＯＣ分析であり、健常（対照）および癌（ＣＡ）におけるクラスターモデルのＡＵＣは７５％の感度と９３％の特異度を得ている。
【図６】図５のバイオマーカーに対応する、クラスターモデルの健常（対照）および癌（ＣＡ）の試料分布を示す。破線は８５％を上回る特異度と最大Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘポイント（０．８４）を示す。
【図７】バイオマーカーＢＡＤとＮＥＫ６の最大値のＲＯＣ分析であり、健常（対照）および前癌性（ＡＤ）におけるクラスターモデルのＡＵＣは６０％の感度および８７％の特異度を得ている。
【図８】図７のバイオマーカーに対応する、クラスターモデルの健常（対照）および前癌性（ＡＤ）の試料分布を示す。破線は８５％を上回る特異度と最大Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘポイント（２）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本発明は、前癌性の進行ポリープおよび結腸直腸癌を特定するために使用されるバイオマーカーおよびその組み合わせを提供する。
【００４６】
したがって、本発明は、バイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせと、前癌性の進行ポリープおよび結腸直腸癌に関わる血漿バイオマーカーを分析する方法とに関する。本発明のバイオマーカーは、配列番号１〜１７に記載の遺伝子フラグメントを含む、配列番号７５〜９１に記載の１７の遺伝子に対応する１または複数のｍＲＮＡセグメントまたはそのフラグメントを含む。
【００４７】
本発明の開示の方法、キット、バイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせは、６０％以上の感度および８５％以上の特異度で、結腸直腸癌をスクリーニングし、特定するようにデザインされるのが好ましい。
【００４８】
一般に、本発明の方法は、血液試料中の前癌性の進行ポリープおよび結腸直腸癌についての早期診断を含む診断に関連している多くの異なる遺伝子の発現についてのバイオマーカープロファイルおよび定量的情報を得るのに有用である。
【００４９】
バイオマーカーのレベルは、電気泳動的にまたは免疫化学的に測定することができ、免疫化学的検出は、放射免疫測定法によって、免疫蛍光測定法または酵素結合免疫吸着測定法によって達成されることができる。一部の実施形態において、バイオマーカーのレベルは、ｑＰＣＲによって測定される。
【００５０】
現在のＣＲＣ分子診断は、前癌性の進行ポリープと結腸直腸癌を見分けられるほど感度が高くない。患者の約６０％は、最初、後期疾患と診断される。
その結果として、米国ではＣＲＣ患者の治療および治療管理に年間約１４０億ドルが費やされている。
【００５１】
したがって、本明細書に記載の診断プラットフォームは、高特異度および高感度であるが、コストを低くし、患者コンプライアスを改善し、現在のＣＲＣ診断の欠点を解決する。
【００５２】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌または前癌性の進行直腸結腸ポリープを有する患者を特定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）対象からの生体試料を準備すること、
（ｂ）前記生体試料において配列番号１に記載の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定すること、および
（ｃ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行ポリープを有すると特定することを含む。
【００５３】
一部の実施形態によれば、結腸直腸癌または前癌性の進行直腸結腸ポリープを有する対象を特定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）対象からの生体試料を準備すること、
（ｂ）前記生体試料において配列番号２に記載の核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定すること、および
（ｃ）前記バイオマーカーのカットオフ値を上回る前記バイオマーカーの発現レベルを特定し、それによって前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定することを含む。
【００５４】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号３に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号４に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号５に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号６に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号７に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号８に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号９に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１０に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１１に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１２に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１３に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１４に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１５に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１６に記載の核酸配列を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１７に記載の核酸配列を含む。
【００５５】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、配列番号１〜１７から選択される複数の核酸配列を含む。
一部の実施形態によれば、該方法は、バイオマーカーの発現レベルを測定すること、および配列番号１〜１７から選択される各核酸配列のカットオフ値を決定することを含み、前記カットオフ値を上回る複数の核酸配列のうちの少なくとも１つの発現レベルが、前記対象が結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸癌を有することを示す。
【００５６】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１に記載の核酸配列を含み、配列番号２〜３、５〜７、１２および１７のうちの少なくとも１つをさらに含み、ならびに前記対象は結腸直腸癌を有すると特定される。
【００５７】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１〜３、５〜７、１２および１７に記載の核酸配列を含み、ならびに前記対象は結腸直腸癌を有すると特定される。
【００５８】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１〜３、５〜７、１２および１７に記載の核酸配列からなる。
【００５９】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および配列番号５を含む。
【００６０】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および配列番号５からなる。
【００６１】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および配列番号３を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および配列番号４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および配列番号６を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号３および配列番号４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号３および配列番号６を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号３および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号３、配列番号６および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号４および配列番号６を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号４、配列番号６および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、配列番号６および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号６および配列番号９を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号６および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号９および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号６、配列番号９および配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、上述した組み合わせのうちのいずれかからなる。
【００６２】
一部の実施形態によれば、本発明は、前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を特定する方法を提供し、該方法は対象から生体試料を採取すること、前記生体試料において配列番号１〜１７（表１B）に記載の群から選択される少なくとも１つの核酸配列を含むバイオマーカーの発現レベルを測定すること、および前記少なくとも１つの核酸配列の発現レベルがそのカットオフ値を上回ることを決定し、それによって、対象が前癌性の進行結腸直腸ポリープまたは結腸癌を有すると特定することを含む。
【００６３】
一部の実施形態によれば、配列番号１のカットオフ値を下回る配列番号１の発現レベルと、前記少なくとも１つの第１のバイオマーカーのカットオフ値を下回る少なくとも１つの第１のバイオマーカーの発現レベルと、前記少なくとも１つの第２のバイオマーカーのカットオフ値を上回る少なくとも１つの第２のバイオマーカーの発現レベルとを決定することによって、対象が前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定され、前記第１のバイオマーカーは配列番号３〜８、１０〜１３および１５〜１７のうちの任意の1つまたは複数であり、ならびに前記第２のバイオマーカーは配列番号２、９および１４のうちの少なくとも１つを含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００６４】
一部の実施形態によれば、前記第２のバイオマーカーは、配列番号2を含む。一部の実施形態によれば、前記第２のバイオマーカーは、配列番号９を含む。一部の実施形態によれば、前記第２のバイオマーカーは、配列番号１４を含む。一部の実施形態によれば、前記第２のバイオマーカーは、配列番号2および９を含む。一部の実施形態によれば、前記第２のバイオマーカーは、配列番号2および１４を含む。一部の実施形態によれば、前記第２のバイオマーカーは、配列番号９および１４を含む。
【００６５】
一部の実施形態によれば、本明細書に使用する場合、「前癌性の進行ポリープ」、「前癌性」、「進行腺腫」、「ＡＤ」、「ＡＡ」および「ポリープ」という用語は、互換性があり、結腸直腸ポリープ、腫瘍性前癌病変、または悪性腫瘍もしくは腺腫性ポリープに発達しそうな他の異常組織増殖もしくは病変を指す。前癌性の進行ポリープを検出することによりＣＲＣ発生率および死亡率が低下することが明らかになった。実際に、ＣＲＣの約８５％は散発性であり、腺腫から発達したものだ。
【００６６】
一部の実施形態によれば、１ｃｍより大きい腺腫、または高度異形成もしくは絨毛構造を有する腺腫は、「進行腺腫」と呼ばれ、一般に、スクリーニングで検出するのに最適なサブセットであると考えられている。腺腫からＣＲＣへの発達は、５〜１０年かかると推定される。ほとんどのＣＲＣ症例は前癌病変から発達するので、患者にとってスクリーニングはかなりの臨床的有用性がある。
【００６７】
一部の実施形態によれば、「バイオマーカー」は、以下のうちの１つまたは複数を含むが、これに限定されない：特定の生物学的性質の分子指標；結腸直腸癌を検出するのに用いることができる生化学的な特徴または事実。一般に、「バイオマーカー」は、タンパク質、核酸、および代謝産物、それと共にそれらの多型、突然変異体、変異体、修飾物、サブユニット、フラグメント、タンパク質−リガンド複合体、および分解産物、タンパク質−リガンド複合体、元素、関連した代謝産物、電解質、元素および他の分析物または試料由来の測定物を包含するが、これに限定されない。バイオマーカーは、変異型タンパク質または変異型核酸も含むことができる。バイオマーカーは、これに限定されないが、年齢、民族性および癌の家族歴などの結腸直腸癌の他の臨床的特徴またはリスク因子を包含する健康状態の非分析物生理学的マーカーを指すこともある。
【００６８】
本明細書に使用する場合、「バイオマーカー」という用語は、遺伝子の核酸配列もしくはそのフラグメントを指し、その発現は結腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを意味している。バイオマーカーは、それに対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであり得、遺伝子またはそのフラグメントを表す。バイオマーカーは、配列番号１〜１７のうちの任意の１つまたは複数を含む。一部の実施形態によれば、バイオマーカーは、これに限定されないが配列番号１〜１７のうちの１つまたは複数を含む、配列番号７５〜９１またはそのフラグメントのうちの任意の１つまたは複数を含む。
【００６９】
一部の実施形態によれば、本明細書に使用する場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は互換的に使用され、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチド、またはその類似体のポリマー型を含む。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含むことがある。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されることもある。ポリヌクレオチドを、例えば、標識成分との結合によって重合の後さらに修飾してもよい。この用語は、二本鎖分子と一本鎖分子の両方も含む。
【００７０】
ＲＮＡは非常に不安定で、容易に分解可能であり、したがって、保護された細胞環境の外側ではおそらく不安定であり、または検出可能ではなさそうである。しかし、正常な状態で高度に調節されるＲＮＡ発現は、癌などの病的状態で、次第に調節不全になる。したがって、ＲＮＡ発現のプロファイリングは、癌の種類および病期を特定するのに有用である。
【００７１】
さらに、癌の分析のために血漿由来の循環ＲＮＡを使用することは、いくつかの理由で極めて魅力である：
（ａ）サンプリングは、低侵襲的方法（少量の血液の抽出）を必要とする、
（ｂ）サンプリングは、腫瘍進行の間、繰り返して、いつでも採取することができるので、治療への反応を分析することが可能になる、
（ｃ）全般的に容易であるため、無症状のリスク集団での使用に適する、および
（ｄ）結腸癌において循環腫瘍細胞と循環腫瘍ｍＲＮＡの間の相関が注目され、ｍＲＮＡは乳癌患者の血漿中のＤＮＡよりも感度が高いことが判明した。
【００７２】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーを表わす核酸配列は循環ｍＲＮＡである。
【００７３】
一部の実施形態によれば、「循環する」という用語は、血流中に見つけられる核酸のセグメントを指す。
【００７４】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーを表わす核酸配列は、循環ｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡである。
【００７５】
本明細書に使用する場合、「ｃＤＮＡ」という用語は、相補的ＤＮＡを指す。一部の実施形態によれば、ｃＤＮＡは、単離ポリヌクレオチド、核酸分子もしくはそのいずれかのフラグメントまたは補体を指す。一部の実施形態によれば、ｃＤＮＡは、組換え技術によって得られる、または合成的に合成され、二本鎖もしくは一本鎖であり得、コーディングおよび／または非コーディング５’配列と３’配列を表す。
【００７６】
一部の実施形態によれば、本明細書に使用する場合、「分析物」は、特定の疾患または障害を有する亜集団を特定するために測定され、および任意選択で使用される任意の物質を指す。それ以外を明記すると、バイオマーカー（分析物）の特性は、正常な生物学的過程、発病過程または治療介入への薬理反応の指標として客観的に測定および評価されることであり得る。
【００７７】
一部の実施形態によれば、「結腸癌」という用語は、結腸（大腸で最も長い部分）の組織内で形成される癌および／または腫瘍を指す。一般的に、結腸癌は腺癌（粘液および他の体液を産生し、放出する細胞内に発生する癌）である。  
【００７８】
一部の実施形態によれば、「直腸癌」という用語は、直腸（肛門までの大腸の最後の数インチ）の組織内で形成される癌および／または腫瘍を指す。
【００７９】
一部の実施形態によれば、本発明と関連して「結腸直腸癌」という用語は、結腸または直腸のいずれかに発生する癌を含むが、これに限定されない。
【００８０】
本発明は、液状（血液）試料中または対象からのいずれかの排泄物中の特徴的なバイオマーカーおよびバイオマーカーの特徴的なセットが、対象の癌性状態または前癌性状態を高特異度および高感度で特定するという予想外の発見に一部、基づいている。したがって、本発明による特定は、正確でかつ信頼性が高い。さらに、本発明のバイオマーカーは液状試料（例えば、血清、血漿もしくは血液）から、または排泄物（例えば、便もしくは尿）から採取されるので、本発明の方法は有利には非侵襲性である。
【００８１】
本明細書に使用する場合、「特定」、「〜として対象を特定すること」および「対象が有すると特定する」という用語は互換性があり、結腸直腸癌のスクリーニング；癌の存在または重篤度の検出；癌の予後；癌の早期診断；前癌性の進行ポリープの診断；癌の治効および／または再発；ならびに癌の療法および／または治療の選択、所定の癌療法の最適化、および／または特定の対象（例えば患者）もしくは亜集団のための療法の適合性の予測、または患者もしくは亜集団において治療用生成物の適切な投薬の決定を行うためのプラットフォームのうちの任意の１つまたは複数を包含する。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００８２】
一部の実施形態によれば、対象はヒト対象である。
【００８３】
一部の実施形態によれば、対象から採取される試料は、体液試料または排泄試料であり、例えば、精漿、血液、末梢血、血清、尿、前立腺液、精液、ザーメン、皮膚、気道、腸管と尿生殖路からの外分泌物、涙、脳脊髄液、痰、唾液、乳、腹腔液、胸膜液、腹腔液、嚢胞液、体腔洗浄液、気管支肺胞洗浄液、生殖系洗浄液および／または身体のいずれかの他の器官もしくは体内の系統の洗浄液および便が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【００８４】
一部の実施形態によれば、組織または体液を含む生体試料を採取することは、採血、採尿、採便、採痰、胸膜液もしくは腹腔液の吸引、細針生検、針生検、コア針生検と直視下生検、および洗浄の収集方法のうちの任意の１つまたは複数によって行われる。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。使用される手法に関係なく、生検／試料が採取されたら、バイオマーカーのレベルが決定され、したがって、診断を行うことができる。
【００８５】
一部の実施形態によれば、対象から採取される試料は、末梢血である。
【００８６】
一部の実施形態によれば、本明細書に使用する場合、「末梢血」という用語は、赤血球、白血球および小板を含む血液を指す。一般的には、試料は循環血液のプールである。一部の実施形態によれば、試料は、リンパ系、脾臓、肝臓または骨髄内に隔離されたものでない、末梢血液試料である。
【００８７】
一部の実施形態によれば、試料は血漿試料である。一部の実施形態によれば、試料は、末梢血に由来の血漿試料である。
【００８８】
一部の実施形態によれば、本明細書に記載の複数のバイオマーカーは任意選択で、任意の副組み合わせのバイオマーカーおよび／または少なくとも１つの他のバイオマーカー、例えば既知のバイオマーカーを特徴とする組み合わせを含む。
【００８９】
一部の実施形態によれば、本明細書に記載のように、複数のバイオマーカーは結腸直腸癌と相互関係がある。
【００９０】
一部の実施形態によれば、本明細書に使用する場合、「複数」という用語は、少なくとも２つを指す。一部の実施形態によれば、「複数」という用語は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７を指す。
【００９１】
一部の実施形態によれば、「発現レベルを測定すること」とは、臨床試料または対象由来の試料中の所定の物質、一般的にはｍＲＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかの物質の有無、量または相対量（「有効量」であり得る）を、例えば、そのような物質の定性もしくは定量濃度レベルを判定すること、またはさもなければ、対象の臨床パラメータの値もしくは分類を評価することを含む。
【００９２】
一部の実施形態によれば、「発現レベルを測定すること」とは、前記複数のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを決定すること、またはｍＲＮＡバイオマーカー（複数可）の発現レベルに対応するｃＤＮＡの量もしくは相対量を決定することを含む。
【００９３】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーのカットオフ値は、健常対象の集団を非健常対象の集団と見分ける発現レベルを指す。一部の実施形態によれば、配列番号１〜１７に記載の各バイオマーカーのレベルは、健常対象の集団において前記バイオマーカーのそれぞれのカットオフ値を下回っている。
【００９４】
一部の実施形態によれば、カットオフ値は統計的に有意な値である。一部の実施形態によれば、カットオフ値のｐ値は、多くても０．０５である。一部の実施形態によれば、前記少なくともバイオマーカーの前記カットオフ値を上回るまたは下回る少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルは、対象のＣＲＣ状態を決定する。
【００９５】
一部の実施形態によれば、各バイオマーカーのカットオフ値を決定することは、健常な対象、前癌性の進行ポリープを有する対象もしくは結腸直腸癌を有する対象からなる大きな集団において、前記少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルを測定することを含む。
【００９６】
一部の実施形態によれば、本発明の方法は、ｍＲＮＡバイオマーカーのそれぞれを逆転写すること、および対応する相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を得ることをさらに含む。一部の実施形態によれば、各ｃＤＮＡの量を計量することは、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）によって行われる。
【００９７】
一部の実施形態によれば、発現レベルは、定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定される。
【００９８】
一部の実施形態によれば、オリゴヌクレオチドの対は、適合する融解温度（Ｔｍ）、例えば、それより７℃未満、好ましくは５℃未満、より好ましくは４℃未満、最も好ましくは３℃未満、理想的には３℃と０℃の間で異なる融解温度を有するように選択されるのが好ましい。
【００９９】
本明細書に使用する場合、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）は、蛍光プローブを用いて、ＤＮＡの増幅を定量的に測定する方法である。この技術は、５’末端に結合された蛍光プローブおよび３’末端に結合されたクエンチャーを有するオリゴヌクレオチドプローブを利用する。ＰＣＲ増幅の間、これらのプローブは、増幅産物内に位置する標的配列にハイブリダイズし、およびポリメラーゼは結合されたプローブによって鋳型を複製すると、さらにポリメラ−ゼ５’−ヌクレアーゼ活性によって蛍光プローブを切断する。クエンチ分子と蛍光プローブの間の近接近のために、通常、蛍光は検出されないが、この分離によって、プローブ切断サイクル数に比例して蛍光強度の増加がもたらされる。
【０１００】
一部の実施形態によれば、所望の標的配列のセグメントの長さは、互いに対するプライマーの相対的位置によって決定され、したがってこの長さは制御可能なパラメータである。標的配列の所望のセグメントは、混合物において主要な配列（濃度に関して）になるので、このセグメントは「ＰＣＲ増幅された」と言われる。ほんの数例を挙げれば、多くの可変部分は、ＰＣＲの平均効率に影響を及ぼすことがあり、例えば、標的ＤＮＡの長さと二次構造、プライマーの長さと設計、プライマーとｄＮＴＰの濃度、および緩衝液組成がある。外来性ＤＮＡ（例えば、研究室面上にこぼされたＤＮＡ）との反応の混入または相互汚染も重要な検討対象である。これらの反応条件は、各異なるプライマー対および標的配列について慎重に最適化されなければならない。
【０１０１】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーの発現レベルを決定することは、当技術分野で既知のいずれかの手段によっておよび本明細書に記載のように特定の核酸配列の発現または発現レベルの検出を含み得る。
【０１０２】
一部の実施形態によれば、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの量および／または濃度を測定することは、少なくとも１つのプローブまたは少なくとも１つのプライマー、好ましくはプライマー対を使用することによって行われる。一般的に、核酸プローブまたはプライマーは、本発明の特定のバイオマーカーの発現または発現レベルを検出するのに好適である。
【０１０３】
本明細書に使用する場合、「プライマー」は、標的配列にアニーリング（ハイブリダイズ）することができ、それによって、好適な条件下でＤＮＡ合成の開始点として役立つことができる二本鎖領域を作るオリゴヌクレオチドを定義する。
【０１０４】
一部の実施形態によれば、「プライマー対」という用語は、本明細書では、本発明の少なくとも一部の実施形態によるオリゴヌクレオチド（オリゴ）の対を指し、選択された核酸配列を、いくつかの種類の増幅過程の１つによって、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する際に共に使用するように選択される。以下にさらに詳細に説明するように、他の種類の増幅過程としては、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅または核酸配列ベース増幅が挙げられる。一般的に当技術分野で知られているように、オリゴは、選択された条件下で相補配列に結合するように設計されている。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態によれば、使用される特定のアッセイ形式と特定の必要性および標的ゲノムに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは任意の好適な長さとすることができる。任意選択で、オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１２ヌクレオチドの長さ、好ましくは１５と２４の分子の間であり、および選択された核酸増幅システムに特に適するように適合させることができる。一般的に当技術分野で知られているように、オリゴヌクレオチドプライマーは、その標的配列とハイブリッド形成する融点を考慮に入れることによって設計されることができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，ＣＳＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０１０６】
一部の実施形態によれば、本発明のバイオマーカーの発現レベルは、表２に収載のプライマーを使用して決定される。
【０１０７】
一部の実施形態によれば、診断アッセイの「感度」は、陽性反応を示す病人の百分率（「真陽性」のパーセント）である。診断アッセイによって検出されない病人は、「偽陰性」である。病気にかかっていなく、かつ診断アッセイで陰性反応を示す対象は、「真陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１−偽陽性率であり、「偽陽性」率は陽性反応を示し、疾患が認められない対象の割合として定義される。特定の診断方法によって病態の確定診断が得られないこともあるが、その方法が診断を支援する陽性指示をもたらすならば、十分である。
【０１０８】
一部の実施形態によれば、正常対象（例えば、癌に悩んでいない健常な人）と比較すると、本明細書に開示する方法は、少なくとも９７％の特異度で少なくとも１９％の感度で、疾患または病態（具体的には結腸直腸癌）を識別する。一部の実施形態によれば、正常対象と比較すると、本方法は、少なくとも９２％の特異度で少なくとも４４％の感度で、疾患または病態を識別する。一部の実施形態によれば、正常対象と比較すると、本方法は、少なくとも７９％の特異度で少なくとも５６．５％の感度で、疾患または病態を識別する。一部の実施形態によれば、疾患または症状を模倣する症候を示す対象と比較すると、本方法は、少なくとも９２％の特異度で少なくとも５８％の感度で、疾患または病態を識別する。一部の実施形態によれば、正常対象と比較すると、本方法は、少なくとも７８％の特異度で少なくとも６６％の感度で、疾患または病態を識別する。一部の実施形態によれば、正常対象と比較すると、本方法は、少なくとも８５％の特異度で少なくとも１００％の感度で、疾患または病態を識別する。一部の実施形態によれば、正常対象と比較すると、本方法は、少なくとも７９％の特異度で少なくとも５６．５％の感度で、疾患または病態を識別する。一部の実施形態によれば、正常対象と比較すると、本方法は、少なくとも８１％の特異度で少なくとも５３％の感度で前癌性の進行ポリープを、および少なくとも８７．５％の感度で結腸直腸癌を識別する。
【０１０９】
一部の実施形態によれば、バイオマーカーの「相対量」という用語は、特定の疾患または病態の診断と一致している対象の試料中のバイオマーカーの量を指す。相対量は、絶対量（例えば、マイクログラム／ｍｌ）または相対量（例えば、信号の相対強度）のどちらかであり得る。
【０１１０】
一部の実施形態によれば、個々のバイオマーカーおよび／またはバイオマーカーの組み合わせは、疾患または病態の発症時期の診断のために、任意選択で用いられてよい。そのような診断は、任意選択で、突発性の病態を含む非常に多様な病態の場合、役に立つことがある。
【０１１１】
当業者は、指標を有害転帰への素因と関連させることはパフォーマンス（感度および特異度）分析であると理解する。例えば、プリセットカットオフ値を上回るＲＮＡバイオマーカー発現レベルは、患者がＣＲＣを有することを示すこともあるのに対して、プリセットカットオフ値以下のＲＮＡバイオマーカー発現レベルは対象が健常で、ＣＲＣではないことを示すことができる。
【０１１２】
さらに、バイオマーカー濃度のベースラインレベルからの変化は、疾患またはその進行（経時的モニタリングが関わっている場合）の状態、または処置の治療効果を反映することもあり得るが、バイオマーカー発現レベルの変化の程度は、ＣＲＣの重篤度に関連することもある。統計的有意性は、2つ以上の集団を比較し、信頼区間（ＣＩ）および／またはｐ値を決定することによって決定されることが多い。
【０１１３】
一部の実施形態によれば、本発明の信頼区間（ＣＩ）は、９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％であり、一方好ましいｐ値は、０．１未満、０．０５未満、０．０２５未満、０．０２未満、０．０１未満、０．００５未満、０．００１未満、または０．０００１未満である。ＣＲＣおよび前癌性の進行ポリープを特定するための例示的な統計的検定は、以下に記載する。
【０１１４】
一部の実施形態によれば、生体試料中の関心の核酸の検出は、当技術分野で既知の任意の方法によって実施することができる。任意選択で、関心の核酸の検出は、オリゴヌクレオチドプローブを用いたハイブリダイゼーションベースアッセイによって達成される。従来のハイブリダイゼーションアッセイとしては、ＰＣＲ、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、定量ＰＣＲ、定量リアルタイムＰＣＲ、リボヌクレア−ゼプロテクション、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、プライマー伸長、ドットブロットまたはスロットブロット（ＲＮＡ）、およびノーザンブロット（すなわち、ＲＮＡ検出について）が挙げられる。他の検出方法には、ディップスティックセットアップ上にプローブを含んでいるキットなどがある。
【０１１５】
一部の実施形態によれば、プローブは多数の周知の方法によって標識されてもよい。検出可能なマーカーの非限定例としては、リガンド、フルオロフォア、化学発光剤、酵素および抗体が挙げられる。本発明の方法の感度の増加を可能にすることができるプローブと共に使用する他の検出可能なマーカーには、例えばビオチンおよび放射性ヌクレオチドがある。特定のラベルを選択すると、それがプローブに結合される方法が指示されることは、当業者には明らかになろう。
【０１１６】
一部の実施形態によれば、プローブは、表２に収載のプローブから選択される。
【０１１７】
一部の実施形態によれば、プローブオリゴヌクレオチドは、合成に続いて、ビオチン化ｄＮＴＰもしくはｒＮＴＰを組み込むことによって、または同様の方法（例えば、ビオチンのソラレン誘導体をＲＮＡに光架橋する）によって標識され、続いて標識ストレプトアビジン（例えば、フィコエリトリン結合ストレプトアビジン）または均等物を添加してもよい。あるいは、蛍光標識したオリゴヌクレオチドプローブを用いる場合、フルオレセイン、ＦＡＭ、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸおよび他をオリゴヌクレオチドに結合させることができる。好ましくは、本発明のバイオマーカーの検出は、ＴａｑＭａｎアッセイを用いることによって、好ましくはレポーター分子とクエンチャー分子の組み合わせ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）を用いることによって達成される。
【０１１８】
一部の実施形態によれば、生体試料において関心の核酸を検出することは、任意選択でＮＡＴベースアッセイによって達成されることもでき、該アッセイは例えばＰＣＲ（またはそのバリエーション、例えばｑＰＣＲ）の核酸増幅技術を含む。
【０１１９】
選択された核酸配列または標的核酸配列の増幅は、いくつかの好適な方法によって実施されてもよい。多数の増幅技術が記述されており、当業者の特定の必要性を満たすように容易に適合させることができる。増幅技術の非限定例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写ベース増幅、ｑβレプリカーゼ系およびＮＡＳＢＡが挙げられる。
【０１２０】
一部の実施形態によれば、対象からの核酸試料は、最も大量の差次的に発現する核酸の増幅に好都合な条件下で増幅される。一部の実施形態によれば、ｃＤＮＡへの逆転写は、患者からｍＲＮＡ試料上で実施される。一部の実施形態によれば、差次的に発現する核酸の増幅は、同時に実施される。そのような方法は、差次的に発現した核酸配列の代わりに、差次的に発現したタンパク質を検出するように適合させ得ることを当業者は理解するであろう。
【０１２１】
一部の実施形態によれば、本発明を実施するための核酸（例えば、ｍＲＮＡ）は、周知の方法に従って得ることができる。
【０１２２】
一部の実施形態によれば、検出は任意選択で、チップまたは他のそのようなデバイスで行われてもよい。分析される候補領域を含む核酸試料は、任意選択で分離され、増幅され、レポーター基で標識される。このレポーター基は、フィコエリトリンなどの蛍光群であってもよい。次いで、標識核酸は、流体ステーションを用いて、チップ上に固定されたプローブと共にインキュベートさせる。反応が完了したら、チップをスキャナに挿入し、ハイブリダイゼーションのパタ−ンを検出する。ハイブリダイゼーションデータは、ここでチップに結合されたプローブに結合する、すでに核酸に組み込まれているレポーター基から発される信号として収集される。チップ上に固定されている各プローブの配列および位置はわかっているので、所定のプローブにハイブリダイズされた核酸の同一性を決定することができる。
【０１２３】
自動化装置と共に利用する場合、上述の検出方法を用いて、疾患および／または病状のために複数の試料を迅速かつ簡単にスクリーニングすることができることを理解されたい。
【０１２４】
一部の実施形態によれば、生体試料において結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを特定するキットが提供され、該キットは、配列番号１に記載の核酸配列を含むバイオマーカーに隣接するヌクレオチドプライマー対を充填した１つまたは複数の容器を含み、前記ヌクレオチドプライマー対はバイオマーカーを含む前記試料において個人のゲノムのフラグメントを選択的に増幅するように設計されている。
【０１２５】
一部の実施形態によれば、ヌクレオチドプライマー対は、表２に収載のヌクレオチドプライマー対から選択される。
【０１２６】
一部の実施形態によれば、前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０および４１を含む。
【０１２７】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号２、３、５〜７、１２および１７から選択される少なくとも１つの核酸配列をさらに含み、ならびに前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号３０と３１、配列番号３４と３５、配列番号６７と６８、配列番号４９と５０、配列番号５２と５３、配列番号６４と６５、および配列番号７３と７４のうちの少なくとも1対を含む。
【０１２８】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号1〜３、５〜７、１２および１７に記載の核酸配列を含み、前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１、配列番号３０と３１、配列番号３４と３５、配列番号６７と６８、配列番号４９と５０、配列番号５２と５３、配列番号６４と６５、および配列番号７３と７４を含み、ならびに前記キットは、結腸直腸癌を特定するためのものである。
【０１２９】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号1〜３、５〜７、１２および１７に記載の核酸配列からなり、前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１、配列番号３０と３１、配列番号３４と３５、配列番号６７と６８、配列番号４９と５０、配列番号５２と５３、配列番号６４と６５、および配列番号７３と７４を含み、ならびに前記キットは、結腸直腸癌を特定するためのものである。
【０１３０】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および５に記載の核酸配列を含み、前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号９５と９６および配列番号６７と６８を含み、ならびに前記対象は、前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定される。
【０１３１】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および５に記載の核酸配列からなり、前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１および配列番号６７と６８を含み、ならびに前記対象は、前癌性の進行結腸直腸ポリープを有すると特定される。
【０１３２】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１と、配列番号３、４、６および１４から選択される少なくとも１つの核酸配列とを含み、ならびに前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１に加えて、配列番号３４と３５、配列番号５５と５６、配列番号４９と５０、配列番号６１と６２のうちの少なくとも1対を含む。
【０１３３】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１および４と、配列番号３、６および１４から選択される少なくとも１つの核酸配列とを含み、ならびに前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１および配列番号５５と５６に加えて、配列番号３４と３５、配列番号４９と５０、配列番号６１と６２のうちの少なくとも1対を含む。
【０１３４】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、３および４を含み、ならびに前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１、配列番号３４と３５および配列番号５５と５６を含む。
【０１３５】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、４、６および１４を含み、ならびに前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１、配列番号５５と５６、配列番号４９と５０、および配列番号６１と６２を含む。
【０１３６】
一部の実施形態によれば、前記バイオマーカーは、配列番号１、３、４および１４を含み、ならびに前記ヌクレオチドプライマー対は、配列番号４０と４１、配列番号３４と３５、配列番号５５と５６、および配列番号６１と６２を含む。
【０１３７】
一部の実施形態によれば、「癌」および「結腸直腸癌」という用語は互換性である。
【０１３８】
一部の実施形態によれば、癌は侵襲性である。他の実施形態によれば、癌は非侵襲性である。さらに他の実施形態によれば、癌は非転移性である。一部の実施形態によれば、癌は転移性である。一部の実施形態によれば、癌は転移性の結腸直腸癌である。
【０１３９】
一部の実施形態によれば、本発明のキットおよび方法は、結腸直腸癌のリスクの高い人、例えば、これまでに局所性結腸直腸癌、転移性結腸直腸癌と診断された人、または結腸直腸癌と遺伝的に関係がある人、またはこれまでに癌と診断された第一度血縁者および第二度血縁者がいる人のモニタリングで用いられる。潰瘍性大腸炎または結腸クローン病などの結腸の炎症症状の既往歴のある人も、結腸直腸癌に対する高リスク群に入る人と考えられ得る。結腸直腸癌が排除されたかどうかを決定するために、本発明による分子診断は、結腸直腸癌の治療中または治療をうけていた人のモニタリングで用いることができる。本発明によるスクリーニングと診断のキットおよび方法は、例えば、遺伝子スクリーニングおよび／または家族歴によって遺伝的にかかりやすいと特定された人のモニタリングで用いることができる。本発明によるスクリーニングと診断のキットおよび方法は、遺伝的にかかりやすいと特定されたか否かにかかわらず無症状の人のモニタリングで用いることができる。
【０１４０】
本発明は、少なくとも１つの癌の症状または特徴、例えば結腸内のポリープの存在を示す人を特定するのに有用である。
【０１４１】
一部の実施形態によれば、本発明は、結腸直腸癌を患ったことがある近親者を含む、家族歴を有すると特定された人のモニタリングで用いる。同様に、本発明は、具体的には、治療を受けた人、および腫瘍を除去した人、または寛解傾向にある人をモニターするのに有用である。
【０１４２】
一部の実施形態によれば、本発明は、結腸直腸癌を有する対象を治療する方法をさらに提供し、該方法は、結腸直腸癌または前癌性の進行結腸直腸ポリープを有する対象を特定すること、および前記対象を治療することを含み、治療することは化学療法薬を投与すること、腸切除を行うこと、放射線療法を適用すること、およびその組み合わせのうちの少なくとも１つを含む。
【０１４３】
一部の実施形態によれば、化学療法薬としては、５−フルオロウラシル、ロイコボリンもしくはオキサリプラチンもしくはカペシタビンおよび／またはモノクローナル抗体、例えばベバシズマブ、セツキシマブもしくはパニツムマブもしくは代替のモノクローナル抗体またはその組み合わせが挙げられるが、これに限定されない。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【０１４４】
一部の実施形態によれば、前癌性の進行ポリープの対象を治療することは、前記前癌性の進行ポリープの除去を含む。
【０１４５】
一部の実施形態によれば、前記前癌性の進行ポリープの除去は、結腸内視鏡検査、軟性Ｓ状結腸鏡検査および直視下手術のうちの１つまたは複数を行うことを含む。本発明の別々の実施形態は、各可能性である。
【０１４６】
一部の実施形態によれば、本発明による前記対象の特定、診断、早期診断および／または予後は、当業者（すなわち、臨床医または内科医）が対象の治療計画を決定する、および／または管理することを可能にする。対象の治療を管理することは、癌性状態（例えば、癌状態）の重篤度の判定を含む。例えば、癌性状態の重篤度が、手術が適当なことを示す場合、医師は手術のために患者を予定に入れることもある。同様に、癌性状態の重篤度が末期癌を示す場合、または癌状態が急性である場合、さらなる処置は是認されないこともある。さらに、治療が成功したことを結果が示す場合、さらなる治療管理または治療が必要でない場合もある。あるいは、本発明の方法の結果が確定的でない場合、または状態の確認が必要な理由がある場合、医師がさらに診断検査の指示を出すこともある。したがって、少なくとも１つのバイオマーカーが、結腸直腸癌を有すると特定されるカットオフ値を上回る発現レベルを示すことが認められる患者は、さらなる診断法を受けることもある。
【０１４７】
本明細書に使用する場合、「対象」とは、通常、哺乳類の対象を指す。哺乳類の対象は、ヒトまたは非ヒトであり得、ヒトが好ましい。
【０１４８】
一部の実施形態によれば、健常な対象は、従来の診断方法によって決定される検出可能な結腸直腸の疾患もしくは症状、結腸直腸関連疾患または前癌性の進行ポリープのない対象と定義される。
【０１４９】
上で詳細に述べたように、および添付の特許請求の範囲で請求するように、本発明の種々の実施形態および態様は、以下の実施例においてその実験的支持が明らかになる。
【０１５０】
実施例
実施例１−試験対象母集団および試料の調製
本試験には５０歳以上の結腸内視鏡検査を予定している対象が参加した。平均的リスクの人だけを確実に登録するために、本試験から以下を除外した：ＣＲＣもしくは腺腫の既往症；６ヵ月以内に鉄欠乏性貧血もしくは血便排泄（血便）；または家族歴が該疾患のリスクの増加を示している（第一度近親者２人以上がＣＲＣを罹患、もしくは５０歳以下で１人または複数がＣＲＣを罹患；またはリンチ症候群もしくは家族性大腸腺腫症であることが判明している）。
【０１５１】
ポリープ切除術および生検を含む結腸内視鏡検査手法は、鎮静、モニタリング、画像診断および機器に関するスクリーニング基準値および施設基準値を用いて認定内視鏡医によって行われた。病理組織診断、診断法および生検と摘出標本の進行度分類は、常法を用いた。健常対象５５名、進行腺腫の対象４７名およびＣＲＣ患者の対象３５名を含む、対象１３７名からの試料が検査室分析への選択に使用可能であった。本試験群の臨床パラメータならびに組織パラメータを表１Ａに示す。
【０１５２】
【表１】
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【０１５３】
本試験に登録された患者の同意を得た後、手術または結腸内視鏡検査の前に、採血管（バキュテーナー）を用いて約１０ｍｌの血液を採取した。採取した血液は、さらなる処理過程まで、採取後最高４時間まで冷蔵保存した。
【０１５４】
遠心分離によって血球から血漿を分離させた。この血漿をＴＲＩｚｏｌ(登録商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で均質化した。各量の血漿を３．５量のＴＲＩｚｏｌ試薬と混合させた。この混合液を保管マイクロチューブに分配し、次いでさらなる精製まで−８０℃で保管した。
【０１５５】
全ＲＮＡ抽出を以下のプロトコルに従って行った：同じ人のＴＲＩｚｏｌ（商標）−血漿混合液を含有する４つのマイクロチューブの各々にクロロホルム３００μｌ（１１９．３８ｇ／モル）を添加した。この溶液を勢いよく混合させ、次いで室温で１０分間インキュベートした。その後、この混合液を４℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。水相を新しいマイクロチューブに移し、次いで同量のクロロホルムと勢いよく混合させ、室温で３分間インキュベートし、４℃、１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。遠心分離後、上相を新しいマイクロチューブに移し、次にＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）からのＲＬＴ緩衝液全１．４ｍｌを添加し、チューブを混ぜた。その後、各分離した上相当たり１．５倍量の１００％ＥｔＯＨを添加した。この溶液をよく混合し、−２０℃で、終夜インキュベートした。インキュベーション後、溶液を解凍し、この混合液７００μｌをＲＮｅａｓｙ（商標）スピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に充填し、２３℃、１０，０００ｇで３０秒間、微量遠心分離し、フロースルーを廃棄した。解凍した試料の残りを充填し、この溶液のすべてがＲＮｅａｓｙ（商標）スピンカラムを通して濾過されるまで、上述のようにスピンカラムを遠心分離した。さらなるＲＮＡ精製は、ＲＮｅａｓｙ(商標）ミニキットプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って完了した。手短に言うと、試料をスピンカラムに充填し、次いでＲＰＥ緩衝液５００μｌで２回洗浄した。最終的に、ＲＮａｓｅを含まない水を３５μｌ加えることによってＲＮＡを溶出した。ＲＮＡを完全に再懸濁させるために、溶出したＲＮＡを最初にヒートブロック内で６５℃で５分間インキュベートし、続いて氷上で５分間インキュベートし、遠心沈殿した。ＲＮＡ量をＮａｎｏＤｒｏｐ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）装置を使用して測定した。
【０１５６】
遺伝子発現チップアレイを用いて遺伝子発現プロファイルを検査するために、同じ人のＴＲＩｚｏｌ−血漿混合液を用いて、全ＲＮＡを精製し、氷上で解凍し、線状アクリルアミド１５ｍｇとクロロホルム２００μｌを各ＴＲＩｚｏｌ１ｍｌ当たり加え、次いで勢いよく混合した。室温で１０分間インキュベーションした後、この混合液を４℃、１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。水相を分離し、さらにｑＰＣＲ用のＲＮＡ試料の調製のために上述のようにＲＮＡ精製ステップを実行した。
【０１５７】
ｑＰＣＲによって遺伝子発現レベルを検査するために、１０マイクロリットルの血漿ＲＮＡを各ｃＤＮＡ反応で用いた。逆転写酵素反応は、ｑＳｃｒｉｐｔ緩衝混合液とＲＴ酵素を用いて行った。生成されたｃＤＮＡを−２０℃で保管した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現マイクロアレイを用いる遺伝子発現プロファイルのために、ｃＤＮＡを合成、精製し、次いでフラグメンテーションとビオチン標識にかけた。
【０１５８】
実施例２−発現レベルの定量化
初めに、７２遺伝子を、異なる亜集団においてその発現レベルについて検査し、そのうち１７遺伝子（表１Ｂ）を結腸直腸癌の検出のバイオマーカーのパネルに選択した。
【０１５９】
【表２】
0006608424.tif 000003
0006608424.tif 000004
0006608424.tif 000005
【０１６０】
その後、必要量のｃＤＮＡを４倍に希釈し、そのうち２μｌをｑＰＣＲで用いた。一般的なｑＰＣＲ反応の場合、ＰｅｒｆｅＣＴａ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（カタログ番号９５０６５、Ｑｕａｎｔａ）を、各遺伝子に特異的な順方向プライマーと逆方向プライマー（表２）のセット、加水分解プローブと共に使用し、ｃＤＮＡを２０μｌの最終量で希釈した。ｑＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７９００システムを用い、９６ウェルＰＣＲプレート中で、Ｑｕａｎｔａの特定条件下で５２サイクル行った。表２に収載の蛍光標識したプローブは、５’末端でＦＡＭ（別名５６−ＦＡＭ）、３’末端でＩＡＢｋＦＱの標識のうちの１種または複数種を含み、およびＮ，Ｎ−ジエチル−４−（４−ニトロナフタレン−１−イルアゾ）−フェニルアミン（別名「ＺＥＮ」）をさらに含んでもよい。ＺＥＮは、任意の位置で組み込むことができる。例えば、ＺＥＮは、３’末端から９位、３’末端から１０位、またはプローブの真ん中で（ＺＥＮの位置から数えて、およそ同じ数のヌクレオチドが３’および５’方向で伸びるように）組み込むことができる。正規化のための参照遺伝子は、ヒトＨＰＲＴ１およびヒトＴＦＲＣであった。各遺伝子のデルタ−デルタＣｔおよび相対定量は、ＤａｔａＡｓｓｉｓｔ  ｖ３．０で算出した。参照遺伝子プライマーおよびプローブ配列は以下の通りである：ｈＨＰＲＴ１遺伝子、順方向プライマー−ＴＡＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＡＡＡＧＧ（配列番号１８）、逆方向プライマー−ＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＧ（配列番号１９；最終濃度３００ｎＭ）４つのＬＮＡを追加したプローブ−ＦＡＭ−ＴＡＴＧＧＡＣＡＧＧＡＣＴＧＡＡＣＧ−３’ＩＡＢｋＦＱ（配列番号２０）（最終濃度２００ｎＭ）。ｈＴＦＲＣ順方向プライマー−ＴＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＣＣＡ（配列番号２１）、逆方向プライマー−ＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＡＴＡＧＧＴＧＴＣＣＡＴＧ (配列番号２２、最終濃度５００ｎＭ）、５つのＬＮＡを追加したプローブ−ＦＡＭ−ＴＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＡＡＡ−３’ＩＡＢｋＦＱ(配列番号２３)（最終濃度２５０ｎＭ）。方法の代表的なフローチャートを図１に示す。
【０１６１】
ｃＤＮＡのためのプライマーおよびプローブ最終濃度の決定は、６ｃＤＮＡ希釈において１００倍の範囲検量線を用いて行った。
Ｒ２＞０．９５の精度で検量線の最適傾斜（−３．３）を示したプライマーおよびプローブ濃度を各遺伝子の最適濃度として選択した（図２）。
【０１６２】
【表３】
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【０１６３】
実施例３−データ分析
全結腸内視鏡検査による前癌性ポリープ、結腸の腺癌または正常な結腸の存在は、図２に模式的に例示するように、特異的分子マーカーおよびその組み合わせの存在または非存在に基づいて特定した。すべての統計的分析ＳＰＳＳパッケージについては、バージョン２１（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ統計）を使用した。
【０１６４】
最初に、結腸内視鏡検査を受けた対象から血液を採取した。それによって、結腸内視鏡検査の結果および生検試料を採取した症例の病理報告または癌腫症例の病理報告を試験群の状態の参考として用いた。また、方法論を用いて、進行腺腫および癌疾患の状態の最適なバイオマーカーを提供することができる遺伝子組み合わせを特定した。上で詳述したように、試験コーホート（表１Ａ）は、健常対象（ｎ＝５５）、進行腺癌（ＡＡ；ｎ＝４７）および結腸直腸癌（ＣＲＣ；ｎ＝３５）の３つの対象群からなるようにデザインした。
【０１６５】
ｑＰＣＲによる遺伝子発現の正規化は、血漿中で安定して発現する２つの参照遺伝子、ＨＰＲＴ１とヒトＴＦＲＣの発現に基づいていた。プライマー−プローブ比率は、低ＲＮＡの量を校正し、ｃＤＮＡ濃度の３桁の大きさで最適なＰＣＲ効率を得る（リニアダイナミックレンジ）。
【０１６６】
ＰＣＲ結果のすべては、式：ＲＱ＝２＾（−デルタＣｔ）によって算出した相対量（ＲＱ）として記録した。デルタＣｔは、候補検出器遺伝子マーカーの測定Ｃｔと、ｈＨＰＲＲ１およびＴＦＲＣの参照ハウスキーピング遺伝子との間の差である。カットオフ値を決定して、すべての健常対象（正常）が確実にその値以下になるようにした。代表的なバイオマーカーのカットオフ値を表３に収載する。
【０１６７】
【表４】
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【０１６８】
いくつかの分析方法は、健常対象、前癌性の進行ポリープの対象および結腸直腸癌の対象から採取した試料から得たデータに基づいて、疾患の状態を決定するために適用した。
【０１６９】
バイオマーカーの組み合わせを用いることによって、結腸直腸癌の特定の感度は改善され、一方、特異度は損なわれないことがさらに確定された。組み合わせ中の各バイオマーカーの発現レベルの範囲に対応する、異なる値間を比較するために、組み合わせデータ分析アルゴリズムを使用した。バイオマーカーの組み合わせを選択すると、組み合わせ中のバイオマーカーのそれぞれ発現レベルをそのカットオフ値と比較した。代表的なバイオマーカーのカットオフ値を表３に収載する。このアルゴリズムを使用して、組み合わせ中の各バイオマーカーの発現レベルがその所定のカットオフ値を下回った場合、１の値をそのバイオマーカーの組み合わせに割り当てた。前述の組み合わせ中の少なくとも１つのバイオマーカーの発現レベルがその所定のカットオフ値を上回った場合、２の値をそのバイオマーカーの組み合わせに割り当てた。割り当てられた値（１または２）も、本明細書では正規化発現レベルと呼ぶ。ＣＯＸ１１、ＫＩＡ１１９９およびＢＡＤ(配列番号９、１４および２；表４Ａ）ならびにＣＨＤ２およびＥＰＡＳ１（配列番号１および６；表４Ｂ）の組み合わせの健常（Ｎ）、前癌性（ＡＤ）および癌（ＣＡ）の集団における正規化発現レベルをそれぞれ図４Ａと４Ｂに示し、カットオフ値を上回る発現レベルは太字で示す（表４Ａおよび４Ｂ）。
【０１７０】
【表５】
0006608424.tif 000009
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【０１７１】
【表６】
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【０１７２】
実施例４−結腸直腸癌の特定
結腸直腸癌を少なくとも１つのバイオマーカーによって特定するために、癌に対するバイオマーカーの感度および特異度を最も高いものに選び、前癌性の進行ポリープへの感度を最小にする。所定のカットオフを上回る発現レベルとバイオマーカーを検討し、単一バイオマーカー分析の結果を以下の表５に示す。表５に示すように、例えば、ＣＨＤ２（配列番号１）は、結腸直腸癌の検出において９７％の特異度と１９％の感度を示す。
【０１７３】
組み合わせデータ分析アルゴリズムを使用することによって、バイオマーカーの組み合わせまたは亜群を用いて、対象が結腸直腸癌を有すると特定することができるが、特異度を損なうことはない。
【０１７４】
表６に示すように、単独のバイオマーカーそれぞれの感度と比べると、組み合わせデータ分析は、ＢＡＭＢＩ(配列番号３）とＨＮＲＮＨＰ３（配列番号４）の２つのバイオマーカーの特定の感度を増加させることができる。
【０１７５】
表７において、バイオマーカーそれぞれの感度と比べると、組み合わせデータ分析は、ＣＨＤ２(配列番号１）とＥＰＡＳ１（配列番号６）の２つのバイオマーカーの特定の感度を増加させることができることを示している。
【０１７６】
表８において、バイオマーカーそれぞれの感度と比べると、組み合わせデータ分析は、ＢＡＭＢＩ(配列番号３）、ＨＮＲＮＨＰ３（配列番号４）およびＣＨＤ２(配列番号１）の３つのバイオマーカーの特定の感度を増加させることを示している。
【０１７７】
【表７】
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【０１７８】
【表８】
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【０１７９】
【表９】
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【０１８０】
【表１０】
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【０１８１】
表９において、バイオマーカーそれぞれの感度と比べると、組み合わせデータ分析は、ＣＨＤ２(配列番号１）、ＥＰＡＳ１（配列番号６）、ＨＮＲＮＨＰ３（配列番号４）およびＫＩＡＡ１１９９(配列番号１３）の４つのバイオマーカーの特定の感度を増加させることを示している。
【０１８２】
【表１１】
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【０１８３】
別の分析方法において、ｑＰＣＲデルタＣｔ結果の２つのデータセットは、癌−健常とＡＤ−健常を明確にしている。ケース−健常群の中で遺伝子間、ならびに遺伝子の分散測定値間の関係を算出した。
【０１８４】
癌−健常のデータセットにおいて、表３に収載した８つの遺伝子間の相関性は、互いに高度に関連した２つの遺伝子クラスターを明らかにした。クラスター１は、遺伝子ＣＨＤ２、ＢＡＤおよびＢＡＭＢＩ（それぞれ配列番号１〜３）を含み、クラスター２は、遺伝子ＮＥＫ６、ＦＫＢＰ５およびＳＡＳＨ３（それぞれ配列番号５、７および１７）を含む。これらの所見によって、以下の特徴が明らかになった：
１．Ｍａｘ＿ＢＡＤ＿ＢＡＭＢＩ＿ＣＨＤ２−この特徴は、ＣＨＤ２、ＢＡＤおよびＢＡＭＢＩ（それぞれ配列番号１〜３）の３つの遺伝子からの最大値に相当する；
２．Ｍａｘ＿ＦＫＢＰ５＿ＳＡＳＨ３＿ＮＥＫ６−この特徴は、ＮＥＫ６、ＦＫＢＰ５およびＳＡＳＨ３（それぞれ配列番号５、７および１７）の３つの遺伝子からの最大値に相当する。
【０１８５】
ロジスティック回帰を用いて、以下の４つの特徴を用いて癌−健常の分類モデルを開発した。
ａ）Ｍａｘ＿ＢＡＤ＿ＢＡＭＢＩ＿ＣＨＤ２；
ｂ）Ｍａｘ＿ＦＫＢＰ５＿ＳＡＳＨ３＿ＮＥＫ６；
ｃ）ＥＰＡＳ１；および
ｄ）ＫＬＦ９。
【０１８６】
この分析は、以下のモデル方程式によってもたらされた：
Ｙ〜ｍａｘ＿ＢＡＤ＿ＢＡＭＢＩ＿ＣＨＤ２＋５ｘｍａｘ＿ＦＫＢＰ５＿ＮＥＫ６＿ＳＡＳＨ３＋２３ｘＥＰＡＳ１−３ｘＫＬＦ９−２５。
【０１８７】
受診者操作特性（ＲＯＣ）曲線分析法を用いて、モデルの分離能力を評価し(図５）、および（８４．３％ＡＵＣ、９５％漸近信頼区間：７４．８％〜９３．９％、Ｐ値＜０．００１）を得た。８５％ポイントを上回る特異度および最大Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘポイント（感度＋特異度−１）は７５％の実行感度および９３％の特異度でポイント０．８４で交わる（図６）。
【０１８８】
ケース処理要約は、表１０に示す。
【０１８９】
【表１２】
0006608424.tif 000018
【０１９０】
健常−ＡＤデータベースについては、ｔ検定および／またはステップワイズ回帰モデルを用いて、モデル構築に関与した特徴を選択した。ＢＡＤおよびＮＥＫ６（それぞれ配列番号２および５）を選択し、およびこのモデルの方程式は以下の通りであった。
Ｙ〜ＢＡＤ＋１１ｘＮＥＫ６−４８ 
【０１９１】
ＲＯＣ分析法を用いて、健常−ＡＤのモデルの分離能力を評価し(図７）、７０．５％ＡＵＣ（９５％漸近信頼区間：５８．５％〜８２．５％、Ｐ値＜０．００１）を得た。８５％ポイントを上回る特異度および最大Ｙｏｕｄｅｎ  ｉｎｄｅｘポイントは６０％の実行感度および８７％の特異度でポイント２で交わる（図８）。
【０１９２】
ケース処理要約を表１１に示す。
【０１９３】
【表１３】
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【０１９４】
これらの分析は、精製された血漿ＲＮＡの質がよくなくても、進行腺腫または結腸直腸癌の検出と関連付けて遺伝子を特定することがやはり可能であることを強く示した。
【０１９５】
特定の実施形態についての前述の説明は、本発明の一般的性質を十分に明らかにしており、当業者は現在の知識を用いることによって、過度の実験を行うことなく、および類概念から逸脱することなく、種々の用途のためにそのような特定の実施形態を容易に修正し、および／または適合させることができる。したがって、そのような適合および修正は、開示された実施形態の趣旨の範囲内でおよび均等物の範囲内で理解されるように意図されるべきであり、意図される。本明細書で用いた語法または用語は説明を目的とし、限定を目的としていないことを理解すべきである。種々の開示された機能を実施する手段、材料および工程は、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態を取ることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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