(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ殺虫性タンパク質であって、配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含む、前記キメラ殺虫性タンパク質。
【請求項２】
前記キメラ殺虫性タンパク質が、鱗翅目（Lepidoptera）の昆虫種に対する阻害活性を示す、請求項１に記載のキメラ殺虫性タンパク質。
【請求項３】
前記昆虫種が、ダイズヨガ（Anticarsia gemmatalis）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、モロコシカダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）、クリソデイキシス・インクルデンス（Chrysodeixis includens）、スポドプテラ・コスミオイデス（Spodoptera cosmioides）、スポドプテラ・エリダニア（Spodoptera eridania）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、シロイモジヨトウ（Spodoptera exigua）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、クサビオビリンガ（Earias vittella）、ヘリコベルパ・ゲロトペオン（Helicoverpa gelotopeon）、及びラキプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）からなる群から選択される、請求項２に記載のキメラ殺虫性タンパク質。
【請求項４】
キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、異種プロモータに作動可能に結合され、前記キメラ殺虫性タンパク質が、配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項５】
キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記ポリヌクレオチドが、配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含む前記キメラ殺虫性タンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を含む、前記ポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号20、9、27、6または3のいずれかに記載されている前記ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、前記宿主細胞が、細菌宿主細胞または植物宿主細胞からなる群から選択される、前記宿主細胞。
【請求項７】
前記細菌宿主細胞が、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、根粒菌属（Rhizobium）、バチルス属（Bacillus）、ブレビバチルス属（Brevibacillus）、大腸菌属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、クレビシエラ属（Klebsiella）、及びエルウィニア属（Erwinia）からなる群から選択され、前記バチルス種が、セレウス菌（バチルス・セレウス、Bacillus cereus）またはバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）であり、前記ブレビバチルス属が、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）あり、前記大腸菌属が、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記植物宿主細胞が、単子葉類及び双子葉類からなる植物の群から選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
昆虫阻害組成物であって、配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むキメラ殺虫性タンパク質を含む、前記昆虫阻害組成物。
【請求項１０】
前記キメラ殺虫性タンパク質とは異なる、少なくとも1つの昆虫阻害剤をさらに含む、請求項９に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの昆虫阻害剤が、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害dsRNA分子、及び昆虫阻害薬品からなる群から選択される、請求項１０に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも1つの他の殺虫剤が、鱗翅目、甲虫目（Coleoptera）、半翅目（Hemiptera）、同翅目（Homoptera）、またはアザミウマ目（Thysanoptera）の1つ以上の害虫種に対して活性を示す、請求項１０に記載の昆虫阻害組成物。
【請求項１３】
種子であって、
a．配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されている前記アミノ酸配列を含むキメラ殺虫性タンパク質か、あるいは
b．配列番号20、9、27、6または3のいずれかに記載されているポリヌクレオチドの昆虫阻害有効量を含む、前記種子。
【請求項１４】
鱗翅目害虫を防除する方法であって、前記方法が、前記鱗翅目害虫を請求項１に記載の前記キメラ殺虫性タンパク質の阻害量と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１５】
キメラ殺虫性タンパク質を含む遺伝子導入植物細胞、植物または植物部位であって、
a．前記キメラ殺虫性タンパク質が、配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されている任意のアミノ酸配列を含むか、あるいは
b．前記キメラ殺虫性タンパク質が、
i．配列番号21、10と少なくとも94％の同一性、
ii．配列番号28と少なくとも93％の同一性、
iii．配列番号7と少なくとも90％の同一性、または
iv．配列番号4と少なくとも90％の同一性
であるタンパク質を含む、前記遺伝子導入植物細胞、前記植物または前記植物部位。
【請求項１６】
鱗翅目害虫を防除する方法であって、前記害虫を、請求項１５に記載の前記遺伝子導入植物細胞、植物または植物部位に曝すことを含み、前記植物細胞、植物または植物部位が、前記キメラ殺虫性タンパク質の鱗翅目阻害量を発現する、前記方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の前記植物細胞、植物、または植物部位に由来する商品生産物であって、前記生産物が、前記キメラ殺虫性タンパク質の検出可能な量を含む、前記商品生産物。
【請求項１８】
前記生産物が、植物バイオマス、油、食物、動物飼料、穀粉、フレーク、ぬか、リント、殻、及び加工種子からなる群から選択される、請求項１７に記載の商品生産物。
【請求項１９】
請求項１に記載の前記キメラ殺虫性タンパク質を含む種子を生産する方法であって、
a．請求項１に記載の前記キメラ殺虫性タンパク質を含む少なくとも1つの種子を蒔くことと、
b．前記種子から植物を成長させることと、
c．前記植物から種子を収穫することであって、前記収穫された種子が、請求項１に記載の前記キメラ殺虫性タンパク質を含むことを含む、前記方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の前記キメラ殺虫性タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子であって、配列番号20、9、27、6または3からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、任意に、前記キメラ殺虫性タンパク質とは異なる昆虫阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列とを含む、前記組換えポリヌクレオチド分子。
【請求項２１】
キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントに作動可能に結合された異種プロモータを含む組換え核酸分子であって、
a．前記キメラ殺虫性タンパク質が、配列番号21、10、28、7または4のいずれかに記載されている任意のアミノ酸配列を含むか、あるいは
b．前記キメラ殺虫性タンパク質が、
i．配列番号21、10と少なくとも94％の同一性、
ii．配列番号28と少なくとも93％の同一性、
iii．配列番号7と少なくとも90％の同一性、または
iv．配列番号4と少なくとも90％の同一性
であるタンパク質を含むか、あるいは
c．前記ポリヌクレオチドセグメントが、配列番号20、9、27、6または3のいずれかに記載されているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである、前記組換え核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年10月16日出願の米国仮出願第62／064，989号（その全体が参考として本明細書に組み込まれる）の利益を主張するものである。
【０００２】
配列表の組み込み
配列表のコンピュータ可読フォームは、電子申請によって本出願と共に提出され、その全体が参考として本出願に組み込まれる。配列表は、ファイル名P34230WO00＿Seq＿PCTArt34．txtを有する、2016年8月23日に作成されたファイルに含まれ、これはサイズが898,229バイトである（MS−Windows（登録商標）オペレーティングシステムで計測）。
【０００３】
本発明は、全般的には、昆虫阻害タンパク質の分野に関する。作物及び種子の農業関連害虫に対して昆虫阻害活性を示すキメラ殺虫性タンパク質の新規部類が、本出願に開示される。特に、タンパク質の開示された部類は、鱗翅目（鱗翅目n）害虫に対して殺虫活性を示す。開示された毒素タンパク質のうちの1つ以上をコードする組換え核酸分子を含有する植物、植物部位、及び種子が提供される。
【背景技術】
【０００４】
農業上重要な植物、とりわけ、トウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、米、小麦、野菜、及び綿を含む植物から作物収量を向上させることは、ますます重要になってきている。増大する人口に対して食物を与え、衣服を支給し、かつエネルギーを提供するための農産物に対する増大するニーズに加えて、気候関連の影響及び農業生産のため以外に土地を使用することへの増大する人口からの圧迫は、農業のために利用可能な耕地の量を減らすと予測されている。これらの因子は、特に、植物バイオテクノロジー及び農耕法における大幅な改善の不在下での食料保障（food security）に関して、厳しい予想をもたらす。これらの圧迫を考慮すれば、技術、農業技術、及び有害生物管理における環境的に持続可能な改善は、農業のために利用可能な限られた量の耕地での作物の生産を拡大するために不可欠なツールである。
【０００５】
昆虫、特に鱗翅目内の昆虫は、農作物への損害の主要な原因と見なされ、その結果、生息地域において穀物収量を減少させる。農業に悪影響を及ぼす鱗翅目害虫種としては、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）、ビートアワヨトウ（Spodoptera exigua）、バーサアーミーワーム（bertha armyworm）（Mamestra configurata）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、キャベツシャクトリムシ（cabbage looper）（Trichoplusia ni）、ダイズシャクトリムシ（ダイズシャクトリムシ）（Chrysodeixis includens）、ヤガ科幼虫（ベルベットビーンキャタピラー）（Anticarsia gemmatalis）、グリーンクローバーワーム（green cloverworm）（Hypena scabra）、オオタバコガ（Heliothis virescens）、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）（Agrotis subterranea）、ヨトウムシ（Pseudaletia unipuncta）、ウェスタンカットワーム（western cutworm）（Agrotis orthogonia）、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）、ネーブルオレンジワーム（navel orangeworm）（Amyelois transitella）、コーンルートウェブワーム（corn root webworm）（Crambus caliginosellus）、ソッドウェブワーム（sod webworm）（Herpetogramma licarsisalis）、ヒマワリガ（Homoeosoma electellum）、マダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）、シンクイムシ（Cydia pomonella）、グレープベリーモス（grape berry moth）（Endopiza viteana）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）（Suleima helianthana）、コナガ（Plutella xylostella）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、ピンクステムボーラー（pink stem borer）（Sesamia inferens）、マイマイガ（Lymantria dispar）、コットンリーフワーム（cotton leaf worm）（Alabama argillacea）、フルーツツリーリーフローラー（fruit tree leaf roller）（Archips argyrospila）、ヨーロピアンリーフローラー（European leafroller）（Archips rosana）、アジアニカメイガもしくはニカメイガ（Chilo suppressalis）、コブノメイガ（Cnaphalocrocis medinalis）、コーンルートウェブワーム（corn root webworm）（Crambus caliginosellus）、ブルーグラスウェブワーム（bluegrass webworm）（Crambus teterrellus）、南西部アワノメイガ（Diatraea grandiosella）、シュガーケーンボーラー（surgarcane borer）（Diatraea saccharalis）、スピニーボールワーム（spiny bollworm）（Earias insulana）、スポッテドボールワーム（spotted bollworm）（Earias vittella）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、アメリカタバコガ（アメリカタバコガ）、マメヒメサヤムシガ（soy podworm）もしくはコットンボールワーム（cotton bollworm）（Helicoverpa zea）、ソッドウェブワーム（sod webworm）（Herpetogramma licarsisalis）、ヨーロピアングレープバインモス（European grape vine moth）（Lobesia botrana）、ミカンハモグリガ（Phyllocnistis citrella）、オオモンシロチョウ（Pieris brassicae）、ナノアオムシ（imported cabbageworm、もしくはモンシロチョウ（small white butterfly））（Pieris rapae）、ハスモンヨトウ（tobacco cutworm、もしくはcluster caterpillar）（Spodoptera litura）、及びトマトキバガ（Tuta absoluta）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００６】
歴史的に見ると、農業においては、合成化学殺虫剤の集中散布は、害虫防除剤に依存していた。耐性の出現の問題に加えて、環境及び人の健康への懸念が、生物殺虫剤の研究及び開発を促進した。この研究努力は、細菌を含む様々な昆虫病原性の微生物種の漸進的な発見及び使用をもたらした。
【０００７】
昆虫病原性細菌、特にバチルス属に属する細菌の、害虫防除剤としての可能性が発見かつ開発されたときに、生物防除パラダイムがシフトした。細菌バチルス・チューリンゲンシス（バチルス・チューリンゲンシス）（Bt）の菌株は、Bt株が、特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されたために、殺虫性タンパク質のための供給源として用いられてきた。Bt株は、胞子形成の開始時及び増殖定常期中に副胞子小体（parasporal）結晶封入体内に位置するデルタエンドトキシン（例えば、Cryタンパク質）を生成することが知られており、分泌殺虫性タンパク質を生成することも知られている。受容昆虫による摂取の際に、デルタエンドトキシンならびに分泌毒素は、それらの作用を、中腸上皮の表面で及ぼし、細胞膜を破壊し、細胞破壊及び細胞死をもたらす。殺虫性タンパク質をコードする遺伝子も、他のバチルス属及びブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）、リシニバチルス・スフェリカス（Lysinibacillus sphaericus）（「Ls」、以前はバチルス・スフェリカス（Bacillus sphaericusという名で知られていた）、ならびにパエニバチルス・ポペリエ（Paenibacillus popilliae）などの多様な他の細菌種を含むBt以外の細菌種で同定されている。
【０００８】
結晶性及び分泌された可溶性の殺虫性タンパク質毒素は、それらの宿主に対して高度に特異的であり、化学殺虫剤に対する代替物として世界的に受け入れられている。例えば、殺虫性毒素タンパク質は、農業上重要な植物を昆虫侵入から保護し、化学的農薬散布の必要性を低減し、かつ収量を増加させるために、様々な農業用途に使用されている。殺虫性毒素タンパク質は、様々な細菌株を含有する微生物処方物を植物表面に分散するための散布などの機械的な方法によって、及び殺虫性毒素タンパク質を発現する遺伝子導入植物ならびに種子を生産するために遺伝子形質転換技術を用いることによって、作物の農業上関連する害虫を防除するために用いられている。
【０００９】
殺虫性タンパク質を発現する遺伝子導入植物の使用は、地球規模で採用されている。例えば、2012年には、2610万ヘクタールに、Bt毒素を発現する遺伝子導入作物が作付けされている（James，C．，Global Status of Commercialized Biotech／GM Crops：2012．ISAAA Brief No．44）。遺伝子導入昆虫防除作物の地球規模の使用及びこれらの作物において使用される限られた数の殺虫性タンパク質は、現在利用されている殺虫性タンパク質に対して耐性を付与する既存の昆虫対立遺伝子に対する選択圧を生じさせた。
【００１０】
標的害虫における殺虫性タンパク質に対する耐性の発現は、殺虫性タンパク質を発現する遺伝子導入作物に対する昆虫の耐性の増加を管理するために有用である殺虫性タンパク質の新しい形態の発見及び開発への継続的な必要性を生み出している。改善された有効性を有する新しい殺虫性タンパク質で、より広範囲の感受性昆虫種にわたって防除を示すものは、抵抗性対立遺伝子を発現することができる生存昆虫の数を低減するであろう。加えて、同じ害虫に対する2つ以上の遺伝子導入殺虫性タンパク質毒素で異なる作用様式を表すタンパク質の1種の植物における使用は、あらゆる単一の標的昆虫種における耐性の確率を低減する。
【００１１】
その結果として、農業生産で現在用いられている毒素に比べて、より広範囲の標的害虫種に対する有効性の増加及び異なる作用様式などの改善された殺虫特性を有する追加の殺虫性タンパク質を同定することへの重要なニーズがある。このニーズに応えるために、本発明は、重要な標的の鱗翅目害虫種に対して活性を示す新規なCry1キメラ殺虫性タンパク質を開示する。
【００１２】
Cry1結晶タンパク質のファミリーのメンバーは、鱗翅目害虫に対して生理活性を示すことが当該技術分野において既知である。Cry1結晶タンパク質の前駆体型は、2つのほぼ等しいサイズのセグメントからなる。プロトキシンセグメントとして知られる前駆体タンパク質のカルボキシ末端部分は、結晶形成を安定化させ、殺虫活性を示さない。前駆体タンパク質のアミノ末端半分は、Cry1タンパク質の毒素セグメントを含み、Cry1ファミリーメンバー内の保存配列または実質的保存配列の並び順に基づいて、3つの構造ドメイン、ドメインI、ドメインII、及びドメインIIIにさらに細分され得る。ドメインIは、活性毒素セグメントの約3分の1を含み、チャネル形成に必須であることが示されている。ドメインII及びIIIは、検討される昆虫及び殺虫性タンパク質に応じて、受容体結合及び昆虫種特異性のどちらにも関与している。
【００１３】
当該技術分野において既知の多数の天然殺虫性タンパク質のドメイン構造の分類から増強した特性を有するキメラタンパク質を自由選択で作り出す可能性は、非常に僅かである。これは、殺虫性タンパク質セグメントを放出するために必要とされる、タンパク質構造の複雑な性質、オリゴマー化、及び活性化（キメラ前駆体の、このような形態で発現された場合の正確なタンパク質分解性プロセシングを含む）の結果である。キメラ構造の創製のための各親タンパク質内のプロトキシン及び特異的標的の注意深い選択によってのみ、そのキメラが由来する親タンパク質に比べて改善された殺虫活性を示す機能的キメラ殺虫性毒素と見なされ得る。プロトキシンと、互いに異なるいずれか2つ以上の毒素の毒素ドメインI、II及びIIIとの再組立てが、不完全な結晶形成または好ましい標的害虫種に向けられるあらゆる検出可能な殺虫活性の完全な欠如をしばしばもたらすことが当該技術分野において既知である。試行錯誤によってのみ、有効な殺虫性キメラが設計され、その時でさえも、当業者が、キメラの構成プロトキシンまたは毒素ドメインが由来し得るあらゆる単一の親毒素タンパク質と比べて同等なもしくは改善されている殺虫活性を示すキメラであると結論付けることは確実ではない。例えば、文献は、2つ以上の結晶タンパク質前駆体からのキメラタンパク質の構築または組立ての例を報告している。例えば、Jacqueline S．Knight，et al．“A Strategy for Shuffling Numerous バチルス・チューリンゲンシス Crystal Protein Domains．”J．Economic Entomology，97（6）（2004）：1805−1813；Bosch，et al．（米国特許第6，204，246号）；Malvar及びGilmer（米国特許第6，017，534号）を参照されたい。これらの例のそれぞれにおいて、得られたキメラの多くは、キメラの成分が由来する前駆体タンパク質と比べて、同等であるかまたは改善されている殺虫活性もしくは結晶形成特性を示すことに失敗した。
【発明の概要】
【００１４】
植物害虫の鱗翅目種に毒性のキメラ殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子が提供される。キメラ殺虫性タンパク質のそれぞれは、処方物中及び植物内で、単独で、または互いにまた他の殺虫性タンパク質及び昆虫阻害剤と組み合わされて使用することができ、したがって、農業システムにおいて現在使用中の殺虫性タンパク質及び殺虫薬品に対して代替品を提供する。
【００１５】
ある特定の実施形態において、配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むキメラ殺虫性タンパク質が本明細書に開示される。このキメラ殺虫性タンパク質は、ダイズヨガ（Anticarsia gemmatalis）、ジアトラエ・サッカラリス（Diatraea saccharalis）、モロコシカダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）、アメリカタバコガ（Helicoverpa zea）、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）、クリソデイキシス・インクルデンス（Chrysodeixis includens）、スポドプテラ・コスミオイデス（Spodoptera cosmioides）、スポドプテラ・エリダニア（Spodoptera eridania）、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）、シロイモジヨトウ（Spodoptera exigua）、オオタバコガ（Helicoverpa armigera）、ハスモンヨトウ（Spodoptera litura）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、ジアトラエア・グランジオセラ（Diatraea grandiosella）、クサビオビリンガ（Earias vitella）、ヘリコベルパ・ゲロトペオン（Helicoverpa gelotopeon）、及びラキプルシア・ヌ（Rachiplusia nu）などであるが、これらに限定されない鱗翅目の昆虫種に対して阻害活性を示す。
【００１６】
別の実施形態において、キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドが、異種プロモータに作動可能に連結され、キメラ殺虫性タンパク質が、配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含む、ポリヌクレオチドが開示される。キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、このポリヌクレオチドが、任意に、ストリンジェントな条件下で、配列番号1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51または52のいずれかに記載されているポリヌクレオチド配列の逆相補配列にハイブリダイズするか、あるいは配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むキメラ殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドも企図される。
【００１７】
他の実施形態において、配列番号1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51または52のいずれかに記載されているポリヌクレオチドを含む宿主細胞が本明細書に開示され、宿主細胞は、細菌宿主細胞または植物宿主細胞からなる群から選択される。企図される細菌宿主細胞としては、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、根粒菌属（Rhizobium）、バチルス属（Bacillus）、ブレビバチルス属（Brevibacillus）、大腸菌属（Escherichia）、シュードモナス属（Pseudomonas）、クレビシエラ属（Klebsiella）、及びエルウィニア属（Erwinia）が挙げられ、バチルス種は、セレウス菌（バチルス・セレウス、Bacillus cereus）またはバチルス・チューリンゲンシスであり、該ブレビバチルス属は、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）であり、該大腸菌属は、大腸菌（Escherichia coli）である。企図される植物細胞としては、単子葉植物及び双子葉植物が挙げられる。
【００１８】
本明細書に開示される他の実施形態は、配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むキメラ殺虫性タンパク質を含む昆虫阻害組成物を含む。ある特定の実施形態において、昆虫阻害組成物は、キメラ殺虫性タンパク質とは異なる少なくとも1つの昆虫阻害剤をさらに含む。キメラ殺虫性タンパク質とは異なる企図される昆虫阻害剤としては、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害dsRNA分子、及び昆虫阻害薬品が挙げられる。キメラ殺虫性タンパク質とは異なるこれらの昆虫阻害剤は、鱗翅目、甲虫目（Coleoptera）、半翅目（Hemiptera）、同翅目（Homoptera）、またはアザミウマ目（Thysanoptera）のうちの1つ以上の害虫種に対して活性を示すことができる。
【００１９】
さらに別の実施形態において、配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むキメラ殺虫性タンパク質、もしくは配列番号1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51または52のいずれかに記載されているポリヌクレオチドの昆虫阻害有効量を含む種子が本明細書に開示される。
【００２０】
鱗翅目害虫を本発明のキメラ殺虫性タンパク質の阻害量と接触させることを含む鱗翅目害虫を防除する方法も企図される。
【００２１】
別の実施形態において、キメラ殺虫性タンパク質を含む遺伝子導入植物細胞、植物または植物部位が本明細書に開示され、このキメラ殺虫性タンパク質は、配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むか、あるいはキメラ殺虫性タンパク質は、配列番号21、10と少なくとも94％の同一性、配列番号28と少なくとも93％の同一性、配列番号7と少なくとも87％の同一性、配列番号4と少なくとも90％の同一性、配列番号13と少なくとも91％の同一性、配列番号16と少なくとも64％の同一性、配列番号19と少なくとも66％の同一性、配列番号23と少なくとも86％の同一性、配列番号25と少なくとも91％の同一性、配列番号30と少なくとも94％の同一性、配列番号33と少なくとも91％の同一性、配列番号36と少なくとも64％の同一性、配列番号39と少なくとも66％の同一性、配列番号41と少なくとも94％の同一性、配列番号43と少なくとも84％の同一性、配列番号45と少なくとも93％の同一性、配列番号47と少なくとも94％の同一性、配列番号50と少なくとも91％の同一性、または配列番号53と少なくとも93%の同一性を有するタンパク質を含む。害虫をこの遺伝子導入植物細胞、植物または植物部位に曝すことを含む鱗翅目を防除する方法であって、該植物細胞、植物または植物部位が、キメラ殺虫性タンパク質の鱗翅目阻害量を発現する、方法も企図される。
【００２２】
本明細書の他の実施形態において、植物細胞、植物、または植物部位に由来する商品産物であって、この産物がキメラ殺虫性タンパク質の検出可能な量を含む、商品産物が提供される。企図される商品産物としては、植物バイオマス、油、食物、動物試料、穀粉、フレーク、ぬか、リント、殻、及び加工種子が挙げられる。
【００２３】
本明細書に開示されるさらに別の方法は、キメラ殺虫性タンパク質を含む種子を生産する方法であり、方法は、キメラ殺虫性タンパク質を含む少なくとも1つの種子を蒔くこと、と、該種子から植物を成長させることと、該植物から種子を収穫することを含み、該収穫された種子は、キメラ殺虫性タンパク質を含む。
【００２４】
キメラ殺虫性タンパク質をコードする組換えポリヌクレオチド分子であって、配列番号1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51または52からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み、任意にキメラ殺虫性タンパク質とは異なる昆虫阻害剤をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換えポリヌクレオチド分子も、本明細書で企図される。
【００２５】
本明細書で企図される別の組換え核酸分子は、キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントに作動可能に連結された異種プロモータを含み、キメラ殺虫性タンパク質は、配列番号21、10、28、7、4、13、16、19、23、25、30、33、36、39、41、43、45、47、50または53のいずれかに記載されているアミノ酸配列を含むか、あるいはキメラ殺虫性タンパク質は、配列番号21、10と少なくとも94％の同一性、配列番号28と少なくとも93％の同一性、配列番号7と少なくとも87％の同一性、配列番号4と少なくとも91％の同一性、配列番号13と少なくとも91％の同一性、配列番号16と少なくとも64％の同一性、配列番号19と少なくとも66％の同一性、配列番号23と少なくとも86％の同一性、配列番号25と少なくとも91％の同一性、配列番号30と少なくとも94％の同一性、配列番号33と少なくとも91％の同一性、配列番号36と少なくとも64％の同一性、配列番号39と少なくとも66％の同一性、配列番号41と少なくとも94％の同一性、配列番号43と少なくとも84％の同一性、配列番号45と少なくとも93％の同一性、配列番号47と少なくとも94％の同一性、配列番号50と少なくとも91％の同一性、または配列番号53と少なくとも93％の同一性を有するタンパク質を含むか、あるいはポリヌクレオチドセグメントは、配列番号1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51または52のいずれかに記載されているヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【００２６】
本発明の他の実施形態、特徴、及び利点は、以下の発明を実施するための形態、実施例、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
［配列の簡単な説明］
【００２７】
配列番号1は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC1100をコードする組換えDNA配列である。
【００２８】
配列番号2は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC1100をコードする合成DNA配列である。
【００２９】
配列番号3は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC1100をコードする合成DNA配列である。
【００３０】
配列番号4は、TIC1100のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号5は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC860をコードする組換えDNA配列である。
【００３２】
配列番号6は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC860をコードする合成DNA配列である。
【００３３】
配列番号7は、TIC860のアミノ酸配列である。
【００３４】
配列番号8は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC867をコードする組換えDNA配列である。
【００３５】
配列番号9は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867をコードする合成DNA配列である。
【００３６】
配列番号10は、TIC867のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号11は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC867＿20をコードする組換えDNA配列である。
【００３８】
配列番号12は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867＿20をコードする合成DNA配列である。
【００３９】
配列番号13は、TIC867＿20のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号14は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC867＿21をコードする組換えDNA配列である。
【００４１】
配列番号15は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867＿21をコードする合成DNA配列である。
【００４２】
配列番号16は、TIC867＿21のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号17は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC867＿22をコードする組換えDNA配列である。
【００４４】
配列番号18は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867＿22をコードする合成DNA配列である。
【００４５】
配列番号19は、TIC867＿22のアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号20は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867＿23をコードする合成DNA配列である。
【００４７】
配列番号21は、TIC867＿23のアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号22は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867＿24をコードする合成DNA配列である。
【００４９】
配列番号23は、TIC867＿24のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号24は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC867＿24をコードする合成DNA配列である。
【００５１】
配列番号25は、TIC867＿25のアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号26は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC868をコードする組換えDNA配列である。
【００５３】
配列番号27は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868をコードする合成DNA配列である。
【００５４】
配列番号28は、TIC868のアミノ酸配列である。
【００５５】
配列番号29は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿9をコードする合成DNA配列である。
【００５６】
配列番号30は、TIC868＿9のアミノ酸配列である。
【００５７】
配列番号31は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC868＿10をコードする組換えDNA配列である。
【００５８】
配列番号32は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿10をコードする合成DNA配列である。
【００５９】
配列番号33は、TIC868＿10のアミノ酸配列である。
【００６０】
配列番号34は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC868＿11をコードする組換えDNA配列である。
【００６１】
配列番号35は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿11をコードする合成DNA配列である。
【００６２】
配列番号36は、TIC868＿11のアミノ酸配列である。
【００６３】
配列番号37は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC868＿12をコードする組換えDNA配列である。
【００６４】
配列番号38は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿12をコードする合成DNA配列である。
【００６５】
配列番号39は、TIC868＿12のアミノ酸配列である。
【００６６】
配列番号40は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿13をコードする合成DNA配列である。
【００６７】
配列番号41は、TIC868＿13のアミノ酸配列である。
【００６８】
配列番号42は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿14をコードする合成DNA配列である。
【００６９】
配列番号43は、TIC868＿14のアミノ酸配列である。
【００７０】
配列番号44は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿15をコードする合成DNA配列である。
【００７１】
配列番号45は、TIC868＿15のアミノ酸配列である。
【００７２】
配列番号46は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC868＿29をコードする合成DNA配列である。
【００７３】
配列番号47は、TIC868＿29のアミノ酸配列である。
【００７４】
配列番号48は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC869をコードする組換えDNA配列である。
【００７５】
配列番号49は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC869をコードする合成DNA配列である。
【００７６】
配列番号50は、TIC869のアミノ酸配列である。
【００７７】
配列番号51は、細菌細胞中の発現に用いられる、TIC836をコードする組換えDNA配列である。
【００７８】
配列番号52は、植物細胞中の発現に用いられる、TIC836をコードする合成DNA配列である。
【００７９】
配列番号53は、TIC836のアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００８０】
農業害虫防除の当該技術分野における問題は、標的害虫に対して有効であり、標的害虫種に対して広範囲の毒性を示し、望ましくない農学的問題を起こすことなく植物中で発現されることが可能であり、また植物において商業的に使用されている現行の毒素と比べて、作用の代替モードを提供する新しい殺虫性タンパク質に対するニーズと特徴付けられ得る。新規なキメラ殺虫性タンパク質が本明細書に開示され、特に広範囲の鱗翅目有害虫に対して、これらのニーズのそれぞれに対処する。
【００８１】
現在使用されている殺虫性タンパク質に対する昆虫の耐性の発現を回避するために、または逃れるために、異なる作用様式（MOA）、ならびに広域スペクトル及び有効性を有する新しい殺虫性タンパク質が、鱗翅目防除に必要とされる。このニーズに対処するための1つの方法は、異なる生物源から、好ましくは、細菌、真菌または植物から新しい殺虫性タンパク質を発見することである。別のアプローチは、構造的類似性を呈する様々なBtタンパク質間のセグメントを置き換えて、昆虫阻害特性を有する新しいキメラBtタンパク質を作り出すことである。当該技術分野において既知の多数の天然殺虫性結晶タンパク質のドメイン構造の再組み合わせから増強された特性を有するキメラタンパク質を創製する可能性は、非常に僅かであることが当該技術分野において知られている。例えば、Jacqueline S．Knight，et al．“A Strategy for Shuffling Numerous バチルス・チューリンゲンシス Crystal Protein Domains．”J．Economic Entomology，97（6）（2004）：1805−1813を参照されたい。
【００８２】
新規なキメラ殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子配列が本明細書に開示される。これらの殺虫性タンパク質は、より広範囲にわたる標的害虫に対する増加した有効性及び異なる作用様式などの改善された殺虫特性を有するさらなる毒性の殺虫性タンパク質を設計するための当該技術分野における継続するニーズに対処する。本明細書に開示される例示のタンパク質を含む、このタンパク質のグループのメンバーは、鱗翅目有害虫種に対して殺虫活性を示す。
【００８３】
「セグメント」または「断片」は、開示されたキメラ殺虫性タンパク質を記述する完全アミノ酸または核酸配列よりも短い連続アミノ酸または核酸配列を記述するために本出願で使用される。昆虫阻害活性を示すセグメントまたは断片も、このようなセグメントまたは断片のキメラ殺虫性タンパク質の対応するセクションとの整合性が、セグメントまたは断片とキメラ殺虫性タンパク質の対応するセクションとの間で約65〜約100％のいずれかの全体に占める割合のアミノ酸配列同一性をもたらす場合に、本出願において開示される。
【００８４】
本出願において、用語「活性な（active）」または「活性（activity）」、「殺虫（pesticidal）活性」もしくは「殺虫性」、あるいは「殺虫（insecticidal）活性」、「昆虫阻害性」もしくは「殺虫性」への言及は、害虫を阻害し（成長、摂食、繁殖力、または生存能力を阻害すること）、抑制し（成長、摂食、または生存能力を抑制すること）、防除する（殺虫性タンパク質の有効量を含有する特定の作物に対する害虫の侵入を防除し、害虫の摂食活動を防除すること）もしくは殺滅する（病的状態にさせ、致死させ、または繁殖力を低下させる）ことでの殺虫性タンパク質などの毒性薬剤の有効性を指す。これらの用語は、殺虫性タンパク質の殺虫的有効量を害虫に提供する結果を含むよう意図され、害虫の殺虫性タンパク質への暴露は、病的状態、致死、繁殖力低下、または発育阻害をもたらす。これらの用語は、殺虫性タンパク質の差中的有効量の植物中もしくは植物上へ提供する結果としての、植物、植物の組織、植物の部分、種子、植物細胞からの、または植物が生育することができる特定の地理的位置からの害虫の撃退も含む。一般的に、殺虫活性とは、鱗翅目の昆虫が挙げられるがこれらに限定されない特定の標的害虫のこの殺虫性タンパク質、タンパク質断片、タンパク質セグメントまたはポリペプチドに対する昆虫摂食によって引き起こされる成長、発達、生存能力、摂食行動、交尾行動、繁殖力を阻害する上で、または有害作用におけるあらゆる計測可能な減少において有効である殺虫性タンパク質の能力を指す。殺虫性タンパク質は、植物によって産生されることが可能であるか、または植物にもしくは植物が生息する場所の範囲内の環境に散布されることも可能である。用語「生理活性」、「有効な（effective）」、「効力がある（efficacious）」またはそれらの変型もまた、本発明のキメラ殺虫性タンパク質の標的有害虫に及ぼす効果を記述するために、本出願においてほぼ同じ意味で利用される用語である。
【００８５】
毒性薬剤の殺虫的に有効量は、標的害虫の食事で提供される場合、毒性薬剤が害虫と接触するとき、殺虫活性を示す。毒性薬剤は、殺虫性タンパク質または当該技術分野で既知の1つ以上の化学薬剤であり得る。殺虫性化学薬剤及び殺虫性タンパク質剤は、単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。化学薬剤としては、標的害虫の抑制のために特定の遺伝子を標的化するdsRNA分子、有機塩化物、有機リン剤、カルバメート、ピレトロイド、ネオニコチノイド、及びリアノイドが挙げられるが、これらに限定されない。殺虫性タンパク質剤としては、本出願において記載されているキメラ殺虫性タンパク質、ならびに鱗翅目の有害虫種を標的とするモノを含む他のタンパク質性毒性薬剤、加えて甲虫目、アザミウマ目、半翅目及び同翅目種を防除することで使用するために当該技術分野において利用可能なCryタンパク質などの、他の植物害虫を防除するために使用されているタンパク質毒素が挙げられる。
【００８６】
害虫、特に作物植物の害虫への言及は、作物植物の有害虫、特に開示されたキメラ殺虫性タンパク質に依って防除されるこれらの鱗翅目の有害虫を意味する。しかしながら、害虫への言及は、植物の甲虫目、半翅目及び同翅目の有害虫、ならびに線虫及び真菌（これらの害虫を標的化する毒性薬剤が共存するか、またはキメラ殺虫性タンパク質と、もしくはキメラ殺虫性タンパク質と65〜約100パーセント同一であるタンパク質と共に存在するとき）含むこともできる。
【００８７】
本明細書に開示されるキメラ殺虫性タンパク質は、成虫、蛹、幼虫、及び新生虫を含む鱗翅目昆虫種、ならびに成虫及び蛹を含む半翅目昆虫種からの有害虫に対する殺虫活性を示す。鱗翅目の昆虫としては、ヤガ科に属するヨトウムシ、ネキリムシ、シャクトリムシ、及びタバコガ、例えば、ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）、ビートアワヨトウ（Spodoptera exigua）、バーサアーミーワーム（bertha armyworm（Mamestra configurata）、タマナヤガ（Agrotis ipsilon）、キャベツシャクトリムシ（cabbage looper）（Trichoplusia ni）、ダイズシャクトリムシ（ダイズシャクトリムシ）（Pseudoplusia includens）、ヤガ科幼虫（ベルベットビーンキャタピラー）（Anticarsia gemmatalis）、グリーンクローバーワーム（green cloverworm）（Hypena scabra）、オオタバコガ（Heliothis virescens）、グラニュレートカットワーム（granulate cutworm）（Agrotis subterranea）、ヨトウムシ（Pseudaletia unipuncta）、ウェスタンカットワーム（western cutworm）（Agrotis orthogonia）；メイガ科の穿孔虫、保護繭を作る幼虫、クモの巣状の巣を作る幼虫、コーンワーム（coneworm）、アオムシ及び葉を食い荒らす幼虫、例えば、アワノメイガ（Ostrinia nubilalis）、ネーブルオレンジワーム（navel orangeworm）（Amyelois transitella）、コーンルートウェブワーム（corn root webworm）（Crambus caliginosellus）、ソッドウェブワーム（sod webworm）（Herpetogramma licarsisalis）、ヒマワリガ（Homoeosoma electellum）、マダラメイガ（Elasmopalpus lignosellus）；ハマキガ科に属するハマキムシ、芽を食い荒らす幼虫、シードワーム（seed worm）、及びフルーツワーム（fruit worm）、例えば、シンクイムシ（Cydia pomonella）、グレープベリーモス（grape berry moth）（Endopiza viteana）、ナシヒメシンクイ（Grapholita molesta）、サンフラワーバッドモス（sunflower bud moth）（Suleima helianthana）；ならびに多くの他の経済的に重要な鱗翅目類、例えば、コナガ（Plutella xylostella）、ワタアカミムシ（Pectinophora gossypiella）、及びマイマイガ（Lymantria dispar）が挙げられるが、これらに限定されない。鱗翅目の他の害虫としては、例えば、Alabama argillacea（コットンリーフワーム（cotton leaf worm））、Archips argyrospila（フルーツツリーリーフローラー（fruit tree leaf roller））、Archips rosana（ヨーロピアンリーフローラー（European leafroller））及び他のハマキガ種、Chilo suppressalis（アジアニカメイガ、またはライスステムボーラー）、Cnaphalocrocis medinalis（コブノメイガ）、Crambus caliginosellus（コーンルートウェブワーム（corn root webworm））、Crambus teterrellus（ブルーグラスウェブワーム（bluegrass webworm））、Diatraea grandiosella（南西部アワノメイガ）、Diatraea saccharalis（シュガーケーンボーラー（surgarcane borer））、Earias insulana（スピニーボールワーム（spiny bollworm））、Earias vittella（スポッテドボールワーム（spotted bollworm））、Helicoverpa armigera（オオタバコガ）、Helicoverpa zea（アメリカタバコガ（アメリカタバコガ）またはコットンボールワーム（cotton bollworm））、Heliothis virescens（オオタバコガ）、Herpetogramma licarsisalis（ソッドウェブワーム（sod webworm））、Lobesia botrana（ヨーロピアングレープバインモス（European grape vine moth））、Phyllocnistis citrella（ミカンハモグリガ）、Pieris brassicae（オオモンシロチョウ）、Pieris rapae（ナノアオムシ（imported cabbageworm）、もしくはモンシロチョウ（small white butterfly））、Plutella xylostella（コナガ）、Spodoptera exigua（シロイチモジヨトウ）、Spodoptera litura（ハスモンヨトウ（tobacco cutworm、cluster caterpillar））、及びTuta absoluta（トマトキバガ）が挙げられる。
【００８８】
本出願において、「単離DNA分子」、または等価な用語もしくはフレーズへの言及は、DNA分子が、単独でまたは他の組成物と組み合わせて存在するが、その天然環境内には存在しない分子であることを意味する。例として、例えば、生物のゲノムのDNA内に天然に見出されるコード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモータ配列、転写末端配列等の核酸要素が、その要素が生物のゲノム内にまたそれが天然に見出されるゲノム内の位置にある限りにおいて「単離されている」とは見なされない。しかしながら、これらの要素のそれぞれ、及びこれらの要素の下位部分は、その要素が生物のゲノム内にまたそれが天然に見出されるゲノム内の位置にはない限りにおいて、本開示の範囲内で「単離されている」ことになるであろう。同様に、殺虫性タンパク質またはそのタンパク質の任意の天然起源の殺虫性変異体をコードするヌクレオチド配列は、そのタンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌からのDNA内にそのヌクレオチド配列がない限りにおいて、単離されたヌクレオチド配列となるであろう。天然起源の殺虫性タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的のために単離されていると見なされるであろう。本開示の目的のために、任意の遺伝子導入ヌクレオチド配列、すなわち、植物または細菌の細胞のゲノムに挿入されるか、もしくは染色体外ベクター中に存在するDNAのヌクレオチド配列は、それが植物または細菌のゲノム内で、細胞を形質転換するために用いられるプラスミドまたは同様な構造内に存在していようが、あるいは植物または細菌に由来する組織、子孫、生体サンプルまたは商品生産物中に検出可能な量で存在していようが、単離されたヌクレオチド配列と見なされるであろう。
【００８９】
実施例にさらに記載されるように、キメラ形成の努力を通して、キメラ殺虫性タンパク質をコードする約844個のヌクレオチド配列が既知の殺虫性毒素（本明細書では「親タンパク質」と称される）のプロトキシン及び毒素ドメインから構築され、発現され、鱗翅目活性についてのバイオアッセイで試験を行った。構築された殺虫性タンパク質のうちの少数が、その毒素成分が由来する親タンパク質と比べて、改善された鱗翅目活性または増強された鱗翅目スペクトルを示した。
【００９０】
改善された鱗翅目活性または増強された鱗翅目スペクトルを有するこれらの新規なキメラ殺虫性タンパク質は、以下の殺虫性親タンパク質のプロトキシン及び毒素ドメインから構築された：Cry1Ah（ドメインI）、Cry1Bb1（ドメインI及びII）、Cry1Be2（ドメインI及びII）、Cry1Ja1（ドメインI及びII）、Cry1Fa1（ドメインI及びII）、Cry1Ac（ドメインII及びプロトキシン）、Cry1Ca（ドメインIII及びプロトキシン）、Cry1Ka（ドメインIII及びプロトキシン）、Cry1Jx（ドメインIII）、Cry1Ab（ドメインIII）、Cry1Ab3（プロトキシン）、Cry1Da1（プロトキシン）、Cry4（プロトキシン）、Cry9（プロトキシン）、Cry1Be（プロトキシン）、及びCry1Ka（プロトキシン）。
【００９１】
具体的には、改善された鱗翅目活性または増強された鱗翅目スペクトルを有する本発明の新規なキメラ殺虫性タンパク質は、以下のプロトキシン及びドメインの組み合わせを含む：TIC1100／配列番号4（ドメインI−Cry1Ah、ドメインII−Cry1Ac、ドメインIII−Cry1Ca、プロトキシン−Cry1Ac）、TIC860／配列番号7（ドメインI−Cry1Bb1、ドメインII−Cry1BB1、ドメインIII−Cry1Ca、プロトキシン−Cry1Ac）、TIC867／配列番号10（ドメインI−Cry1Be2、ドメインII−Cry1Be2、ドメインIII−Cry1Ka、プロトキシン−Cry1Ab3）、TIC868／配列番号28（ドメインI−Cry1Be2、ドメインII−Cry1Be2、及びドメインIII−Cry1Ca、プロトキシン−Cry1Ab3）、TIC869／配列番号50（ドメインI−Cry1Ja1、ドメインII−Cry1Ja1、ドメインIII−Cry1Jx、プロトキシン−Cry1Ab3）ならびにTIC836／配列番号53（ドメインI−Cry1Fa1、ドメインII−Cry1Fa1、ドメインIII−Cry1Ab、プロトキシン−Cry1Ac）。
【００９２】
アミノ酸置換または別のプロトキシンドメインが導入された変異体もまた、キメラ殺虫性タンパク質TIC867及びTIC868に対して構築された。具体的には、これらのTIC867及びTIC868の変異体は、以下のアミノ酸置換または別のプロトキシンドメインを含む：TIC867＿20／配列番号13（別のプロトキシンドメインCry1Da1）、TIC867＿21／配列番号16（別のプロトキシンドメインCry4）、TIC867＿22／配列番号19（別のプロトキシンドメインCry9）、TIC867＿23／配列番号21（別のプロトキシンドメインCry1Be）、TIC867＿24／配列番号23（別のプロトキシンドメインCry1Ka）、TIC867＿25／配列番号25（別のプロトキシンドメインCry1Ka）、TIC868＿9／配列番号30（アミノ酸修飾N240S＿Y343Q＿N349T）、TIC868＿10／配列番号33（別のプロトキシンドメインCry1Da1）、TIC868＿11／配列番号36（別のプロトキシンドメインCry4）、TIC868＿12／配列番号39（別のプロトキシンドメインCry9）、TIC868＿13／配列番号41（別のプロトキシンドメインCry1Be）、TIC868＿14／配列番号43（別のプロトキシンドメインCry1Ka）、TIC868＿15／配列番号45（別のプロトキシンドメインCry1Ca）、及びTIC868＿29／配列番号47（アミノ酸修飾Q136Y＿Y343Q＿N349T）。
【００９３】
実施例で裏付けられるように、これらのTIC867及びTIC868変異体は、親キメラ殺虫性タンパク質の鱗翅目活性を変化させ、及び／または鱗翅目活性スペクトルを低減し、したがって、別のプロトキシンドメイン及びアミノ酸置換が、キメラ殺虫性タンパク質TIC867及びTIC868の殺虫活性及びスペクトルに及ぼす直接的な影響を有することを示唆した。
【００９４】
キメラ殺虫性タンパク質の多くは、複数の鱗翅目害虫種に対して殺虫活性を示している。具体的には、本出願において開示される新規なキメラ殺虫性タンパク質は、以下鱗翅目害虫のうちの1つ以上に対して活性を示した：ベルベットビーンキャタピラー（VBC、Anticarsia gemmatalis）、シュガーケーンボーラー（SCB、Diatraea saccharalis）、マダラメイガ（LSCB、Elasmopalpus lignosellus）、アメリカタバコガ（CEW、Helicoverpa zea）、ソイビーンポッドワーム（SPW、Helicoverpa zea）、コットンボールワーム（CBW、Helicoverpa zea）、タバコバッドワーム（TBW、Heliothis virescens）、ダイズシャクトリムシ（SBL、Chrysodeixis includens）、ブラックアーミーワーム（BLAW、Spodoptera cosmioides）、サザンアーミーワーム（SAW、Spodoptera eridania）、ツマジロクサヨトウ（FAW、Spodoptera frugiperda）、ビートアワヨトウ（BAW、Spodoptera exigua）、オオタバコガ（OBW、Helicoverpa armigera）、ハスモンヨトウ（OLW、Spodoptera litura）、ピンクボールワーム（PBW、Pectinophora gossypiella）、南西部アワノメイガ（SWCB、Diatraea grandiosella）、スポッテドボールワーム（SBW、Earias vittella）、アメリカボールワーム（SABW、Helicoverpa gelotopeon、及びヒマワリシャクトリムシ（SFL、Rachiplusia nu）。したがって、本出願に記載される例示的なタンパク質は、共通機能によって関連付けられ、成虫、蛹及び幼虫を含む鱗翅目昆虫種からの害虫に対して殺虫活性を示す。
【００９５】
キメラ殺虫性タンパク質に類似しているタンパク質は、当該技術分野において既知の様々なコンピュータベースのアルゴリズムを用いて、互いに比較することによって同定することができる。例えば、キメラ殺虫性タンパク質に関連するタンパク質のアミノ酸配列同一性は、これらのパラメータ：重み付け行列（Weight matrix）：blosum、ギャップ開始（opening）ペナルティ：10．0、ギャップ伸張ペナルティ：0．05、親水性ギャップ：オン、親水性残基：GPSNDQERK、残基特異的ギャップペナルティ：オンを使用して、Clustal Wアライメントを用いることによって解析することができる（Thompson，et al（1994）Nucleic Acids Research、22：4673−4680）。アミノ酸同一性パーセントは、（アミノ酸同一性／対象のタンパク質の長さ）に100％を乗じた積によってさらに算出される。Clustal Wアライメントを用いて得られ、かつ本出願において企図されるものと結果が同様であるという条件で、他のアライメントアルゴリズムも当該技術分野において利用可能である。
【００９６】
昆虫阻害活性を示す問い合わせ（query）タンパク質は、このような問い合わせタンパク質の配列番号4、7、10、13、16、19、23、25、28、30、33、36、39、41、43、45、47、50および53に記載されている対象のキメラ殺虫性タンパク質とのアライメントが、問い合わせのタンパク質と対照タンパク質との間の少なくとも約64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または約100％のアミノ酸配列同一性（もしくはこの範囲内のいずれかの少数パーセント）をもたらす場合、本出願で開示されることが意図されている。
【００９７】
本出願の実施形態にさらに記載されるように、キメラ殺虫性タンパク質をコードする合成または人工配列を、植物において使用するために設計した。植物において使用するために設計された例示の合成ヌクレオチド配列を、配列番号2及び3（TIC1100）、配列番号6（TIC860）、配列番号9（TIC867）、配列番号12（TIC867＿20）、配列番号15（TIC867＿21）、配列番号18（TIC867＿22）、配列番号20（TIC867＿23）、配列番号22（TIC867＿24）、配列番号24（TIC867＿25）、配列番号27（TIC868）、配列番号29（TIC868＿9）、配列番号32（TIC868＿10）、配列番号35（TIC868＿11）、配列番号38（TIC868＿12）、配列番号40（TIC868＿13）、配列番号42（TIC868＿14）、配列番号44（TIC868＿15）、配列番号46（TIC868＿29）、配列番号49（TIC869）ならびに配列番号52（TIC836）に記載する。
【００９８】
植物細胞中の発現については、キメラ殺虫性タンパク質は、植物細胞のサイトゾル中に内在するようにまたは植物細胞の様々な細胞小器官を標的化するように発現することができる。例えば、タンパク質を葉緑体に標的化させることは、オフ表現型が発生することを防止しながら、遺伝子導入植物中の発現されるタンパク質のレベルの増加をもたらす。標的化はまた、遺伝子導入事象における害虫抵抗性効果における増加ももたらし得る。標的ペプチドまたは輸送ペプチドは、核、ミトコンドリア、小胞体（ER）、葉緑体、アポプラスト、ペルオキソーム及び原形質膜を含む細胞の特定領域へのタンパク質の輸送を指示する短い（3〜70個のアミノ酸の長さ）のペプチド鎖である。一部の標的ペプチドは、タンパク質が輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。葉緑体への標的化については、タンパク質は、ほぼ40〜50個のアミノ酸である輸送ペプチドを含有する。葉緑体輸送ペプチドの使用の説明については、米国特許第5，188，642号及び同第5，728，925号を参照されたい。多くの葉緑体局在型タンパク質は、各遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体輸送ペプチド（CTP）によって葉緑体を標的化する。このような単離された葉緑体タンパク質の例としては、リブロ―ス−1，5−二リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット（SSU）に関連するもの、フェレドキシン、フェレドキシン酸化還元酵素、集光性タンパク質複合体I及びタンパク質II、チオレドキシンF、エノイルピルビニルシキミ酸シンターゼ（EPSPS）、ならびに米国特許第7，193，133号に記載されている輸送ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。非葉緑体タンパク質は、異種CTPとのタンパク質融合を用いることによって、葉緑体を標的化することができること、及びこのCTPが、タンパク質を葉緑体に向けるのに十分であることをインビボ及びインビトロで立証されている。シロイヌナズナ（アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana））EPSPS CTP（CTP2）（Klee et al．，Mol．Gen．Genet．210：437−442，1987を参照）またはペチュニア（ペチュニア・ヒブリダ（Petunia hybrida））EPSPS CTP（CTP4）（della−Cioppa et al．，Proc．Natl，Acad．Sci．USA  83：6873−6877，1986を参照）などの好適な葉緑体輸送ペプチドの組み込みが、遺伝子導入植物において、異種EPSPSタンパク質を葉緑体に向かせることが示されている（米国特許第5，627，061号、同第5，633，435号、及び同第5，312，910号、ならびに欧州特許第0218571号、同第189707号、同第508909号、及び同第924299号を参照）。キメラ殺虫性タンパク質が葉緑体を標的化するために、葉緑体輸送ペプチドをコードする配列が、植物細胞中で最適な発現をするように設計されたキメラ殺虫性タンパク質をコードする合成コード配列に対する作動可能な結合中及びフレーム中の5’に配置される。
【００９９】
これらの合成または人工ヌクレオチド配列を含有する発現カセット及びベクターを構築し、当該技術分野において既知の形質転換法及び技術に従って、トウモロコシ、綿、及びダイズ植物細胞中に導入した。形質転換細胞を、キメラ殺虫性タンパク質を発現することが観察されている形質転換植物中で再生させた。殺虫活性をテストするために、形質転換植物から得た植物の葉片を用いて、鱗翅目害虫の幼虫の存在下でバイオアッセイを行った。キメラ殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子組成物が企図される。例えば、キメラ殺虫性タンパク質は、キメラ殺虫性タンパク質をコードするORFを有するポリヌクレオチド分子が、プロモータ及び構築物が向けられる系における発現に必要な任意の他の調節要素などの遺伝子発現要素に作動可能に結合されている組換えDNA構築物を用いて発現することができる。非限定的な例としては、植物中のキメラ殺虫性タンパク質の発現のための合成キメラ殺虫性タンパク質をコードする配列に作動可能に結合された植物機能的プロモータまたはBt細菌もしくは他のバチルス種中でのタンパク質の発現のためのキメラ殺虫性タンパク質をコードする配列に作動可能に結合されたBt機能的プロモータが挙げられる。他の要素もキメラ殺虫性タンパク質をコードする配列に作動可能に結合することができ、例えば、エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー、コード化タンパク質固定化タグ（HIS−タグ）、翻訳ペプチド（すなわち、色素体輸送ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのポリペプチド配列、リボソーム結合部位、及びRNAi標的部位が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
本明細書で提供される例示の組換えポリヌクレオチド分子としては、配列番号4（TIC1100）、7（TIC860）、10（TIC867）、13（TIC867＿20）、16（TIC867＿21）、19（TIC867＿22）、21（TIC867＿23）、23（TIC867＿24）、25（TIC867＿25）、28（TIC868）、30（TIC868＿9）、33（TIC868＿10）、36（TIC868＿11）、39（TIC867＿12）、41（TIC867＿13）、43（TIC867＿14）、45（TIC867＿15）、47（TIC867＿29）、50（TIC869）および53（TIC836）に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号1、2、3、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、22、24、26、27、29、31、32、34、35、37、38、40、42、44、46、48、49、51および52などのポリヌクレオチドに作動可能に結合した異種プロモータが挙げられるが、これらに限定されない。異種プロモータはまた、色素標的化キメラ殺虫性タンパク質及び非標的化キメラ殺虫性タンパク質をコードする合成DNAコード配列に作動可能に結合することも可能である。本明細書に開示されるキメラ殺虫性タンパク質をコードする組換え核酸分子のコドンが、同義コドンによって置換され得ることも企図される（当該技術分野においてサイレント置換として知られる）。
【０１０１】
キメラ殺虫性タンパク質コード化配列を含む組換えDNA分子または構築物は、キメラ殺虫性タンパク質、キメラ殺虫性タンパク質とは異なるタンパク質、昆虫阻害性dsRNA分子、または補助的タンパク質をコードするDNA配列と共に同時発現するかまたは共発現するように構成され得る1つ以上の毒性剤DNAの領域をさらに含むことができる。補助的タンパク質としては、補因子、酵素、結合パートナー、または、例えば、その発現を補助し、植物中でのその安定性に影響を与え、オリゴマー化のための自由エネルギーを最適化し、その毒性を増強させ、またその活性のスペクトルを増加させることによって、昆虫阻害剤の効果を補助するように機能する他の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。補助的タンパク質は、例えば、1つ以上の昆虫阻害剤の取り込みを容易にしてもよく、または毒性剤の毒性作用を増強させてもよい。
【０１０２】
組換えDNA分子または構築物は、全てのタンパク質またはdsRNA分子が1つのプロモータから発現されるように、あるいは各タンパク質またはdsRNA分子が別々のプロモータ制御下もしくはこれらのいくつかの組み合わせの制御下にあるように組み立てることができる。本発明のタンパク質は、選択される発現系の種類に応じて、キメラ殺虫性タンパク質が、他のオープンリーディングフレーム及びプロモータも含有する共通のヌクレオチドセグメントから発現される多重遺伝子発現系から発現されてもよい。例えば、細菌多重遺伝子発現系は、単一オペロン内で多重結合／タンデムのオープンリーディングの発現（すなわち、ポリシストロニック発現）を駆動するために、単一のプロモータを利用することができる。別の例では、植物多重遺伝子発現系は、それぞれが、異なるタンパク質または1つ以上のdsRNA分子などの他の毒性剤を発現する、多重非結合発現カセットを利用する。
【０１０３】
キメラ殺虫性タンパク質をコードする配列を含む組換え核酸分子または組換えDNA構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクターによって、宿主細胞に送達され得る。このようなベクターは、宿主細胞中のキメラ殺虫性タンパク質をコードする配列の安定もしくは一過性の発現、またはコード化ポリペプチドのその後の発現を達成するために使用することができる。キメラ殺虫性タンパク質をコードする配列を含む外因性組換えポリヌクレオチドまたは組換えDNA構築物で、宿主細胞に導入されるものは、本明細書では「導入遺伝子」と称される。
【０１０４】
キメラ殺虫性タンパク質のいずれか1つ以上をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子導入細菌、遺伝子導入植物細胞、遺伝子導入植物、及び遺伝子導入植物部位が本明細書に提供される。用語「細菌細胞」または「細菌」としては、アグロバクテリウム属、バチルス属、サルモネラ属（Salmonella）、シュードモナス属、または根粒菌属の細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。用語「植物細胞」または「植物」としては、双子葉類細胞または単子葉類細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。考えられる植物及び植物細胞としては、アルファルファ、バナナ、大麦、豆、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ属、人参、キャッサバ、トウゴマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、白菜、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、カボチャ属、キュウリ、ダグラスファー、ナス、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、ホップ、セイヨウネギ、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ナッツ、燕麦、オリーブ、タマネギ、花き、パーム、牧草、エンドウ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、馬鈴薯、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、大根、菜種、米、根茎、ライ麦、ベニバナ、低木、ソルガム、サウザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、トウナス、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、スイートガム、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝草、スイカ、及び小麦の植物細胞または植物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、遺伝子導入植物細胞から再生された遺伝子導入植物及び遺伝子導入植物部位が提供される。ある特定の実施形態において、植物部位は、種子、鞘、葉、花、茎、根、またはその任意の部分、もしくは遺伝子導入植物部位の非再生可能な部分とすることができる。この文脈において使用される、遺伝子導入植物部位の「非再生可能な」部分は、植物全体を形成するよう誘導され得ないか、または有性生殖及び／もしくは無性生殖が可能である植物全体を形成するよう誘導され得ない部分である。ある特定の実施形態において、植物部位の非再生可能な部分は、遺伝子導入種子、鞘、葉、花、幹、または根の一部である。
【０１０５】
鱗翅目阻害量のキメラ殺虫性タンパク質を含む遺伝子導入植物の作製方法が提供される。このような植物は、本出願で提供されるキメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞中に導入し、昆虫または鱗翅目阻害量のキメラ殺虫性タンパク質を発現する該植物細胞に由来する植物を選択することによって作製することができる。植物は、再生、種子、花粉、または分裂組織形質転換技術によって、植物細胞から生じることができる。植物を形質転換するための方法は、当該技術分野において既知である。例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換が、米国特許出願公開第2009／0138985A1（ダイズ）、同第2008／0280361A1（ダイズ）、同第2009／0142837A1（トウモロコシ）、同第2008／0282432号（綿）、及び同第2008／0256667号（綿）に記載されている。
【０１０６】
キメラ殺虫性タンパク質を発現する植物は、他の殺虫性タンパク質を発現する、及び／または、例えば他の昆虫防除形質、除草剤耐性遺伝子、収量もしくはストレス耐性形質を付与する遺伝子などの他の遺伝子導入形質を発現する遺伝子導入事象を用いて繁殖させることによって交配させることが可能であり、あるいはこのような形質は、これら形質が全て結合されるように単一ベクター中に組み合され得る。
【０１０７】
加工理産物が、検出可能な量のキメラ殺虫性タンパク質、その昆虫阻害セグメントまたは断片、もしくはその任意の特徴的な部分を含む加工植物性産物もまた、本出願に開示される。ある特定の実施形態において、処理産物は、植物部位、植物バイオマス、油、食物、糖、動物飼料、穀粉、フレーク、ぬか、リント、殻、加工種子、及び種子からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、加工産物は、再生不能である。植物生産物は、遺伝子導入植物または遺伝子導入植物部位に由来する商品または他の商取引の製品を含むことができ、これらの商品または他の製品は、キメラ殺虫性タンパク質の特徴的な部分をコードするかまたは含むヌクレオチドセグメントまたは発現されたRNAもしくはタンパク質を検出することによって商取引を通して追跡され得る。
【０１０８】
キメラ殺虫性タンパク質を用いて、昆虫、特に作物の鱗翅目の侵入を防除する方法も、本出願に開示される。このような方法は、昆虫−または鱗翅目阻害量のキメラ殺虫性タンパク質を含む植物を成長させることを含むことができる。ある特定の実施形態において、このような方法は、次のいずれか1つ以上をさらに含むことができる：（i）キメラ殺虫性タンパク質を含むかまたはコードする任意の組成物を、植物または植物を生じさせる種子に塗布すること、及び（ii）植物または植物を生じさせる種子を、キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することである。一般に、キメラ殺虫性タンパク質は、鱗翅目昆虫に対して昆虫阻害活性を付与するために、組成物で提供され、微生物で提供され、または遺伝子導入植物で提供される。
【０１０９】
ある特定の実施形態において、キメラ殺虫性タンパク質は、発現に好適な条件下でキメラ殺虫性タンパク質を発現するように形質転換された組換えバチルス属または任意の他の組換え細菌細胞を培養することによって調製された昆虫阻害組成物の殺虫活性成分である。このような組成物は、キメラ殺虫性タンパク質を発現／産生するこのような組換え細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈降、または濃縮によって調製することができる。このようなプロセスは、バチルス属または他の昆虫病原性細菌の細胞抽出物、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解物、細胞上清、細胞濾液、もしくは細胞ペレットをもたらすことができる。このように産生されたキメラ殺虫性タンパク質を得ることによって、キメラ殺虫性タンパク質を含む組成物は、細菌細胞、細菌胞子、及び副胞子封入体を含むことができ、農業用の昆虫阻害スプレー製品としての使用、または食餌バイオアッセイにおける昆虫阻害処方物としての使用を含む様々な用途に処方することができる。
【０１１０】
前述の化合物または処方物は、餌、粉末、ダスト、ペレット、顆粒、スプレー、エマルジョン、コロイド懸濁液、水性溶液、バチルス属胞子または結晶調製物もしくは種子処理物などの農業上許容し得る担体をさらに含むことができる。化合物または処方物は、タンパク質の1つ以上を発現するように形質転換された組換え植物細胞、植物組織、種子または植物；もしくはタンパク質の1つ以上を発現するように形質転換された細菌をさらに含むことも可能である。組換えポリペプチドに固有の昆虫阻害または殺虫性阻害のレベル及び植物または食餌アッセイに適用される化合物または処方物のレベルに応じて、化合物または処方物は、様々な重量％の組換えポリペプチド、例えば、0．0001重量％から0．001重量％まで、0．01重量％まで、1％重量まで、99重量％までの組換えポリペプチドを含むことができる。
【０１１１】
一実施形態において、耐性の発現の蛍光性を低減するために、キメラ殺虫性タンパク質を含む昆虫阻害組成物または遺伝子導入植物は、一部の鱗翅目昆虫種に対して昆虫阻害活性を示すが、キメラ殺虫性タンパク質とは異なるものである少なくとも1つの追加の毒性剤をさらに含むことができる。このような組成物のための可能な追加の毒性剤としては、昆虫阻害タンパク質及び昆虫阻害dsRNA分子が挙げられる。このようなリボヌクレオチド配列の害虫を防除するための使用についての一例は、Baumら（米国特許出願公開第2006／0021087  A1号）に記載されている。鱗翅目害虫の防除のためのこのような追加のポリペプチド（複数可）は、例えば、Cry1A（米国特許第5，880，275号）、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A．105、Cry1Ae、Cry1B（米国特許出願公開第10／525，318号）、Cry1C（米国特許第6，033，874号）、Cry1D、Cry1E、Cry1F、及びCry1A／Fキメラ（米国特許第7，070，982号；同第6，962，705号；及び同第6，713，063号）、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab（米国特許第7，064，249号）、Cry2Ae、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET66、TIC400、TIC800、TIC834、TIC1415、Vip3A、VIP3Ab、VIP3B、AXMI−001、AXMI−002、AXMI−030、AXMI−035、及びAXMI−045（米国特許出願公開第2013−0117884  A1号）、AXMI−52、AXMI−58、AXMI−88、AXMI−97、AXMI−102、AXMI−112、AXMI−117、AXMI−100（米国特許出願公開第2013−0310543  A1号）、AXMI−115、AXMI−113、AXMI−005（米国特許出願公開第2013−0104259  A1号）、AXMI−134（米国特許出願公開第2013−0167264  A1号）、AXMI−150（米国特許出願公開第2010−0160231  A1号）、AXMI−184（米国特許出願公開第2010−0004176  A1号）、AXMI−196、AXMI−204、AXMI−207、AXMI−209（米国特許出願公開第2011−0030096  A1号）、AXMI−218、AXMI−220（米国特許出願公開第2014−0245491  A1号）、AXMI−221z、  AXMI−222z、AXMI−223z、AXMI−224z、AXMI−225z（米国特許出願公開第2014−0196175  A1号）、AXMI−238（米国特許出願公開第2014−0033363  A1号）、AXMI−270（米国特許出願公開第2014−0223598  A1号）、AXMI−345（米国特許出願公開第2014−0373195  A1号）、DIG−3（米国特許出願公開第2013−0219570  A1号）、DIG−5（米国特許出願公開第2010−0317569  A1号）、DIG−11（米国特許出願公開第2010−0319093  A1号）、AfIP−1A及びその誘導体（米国特許出願公開第2014−0033361  A1号）、AfIP−1B及びその誘導体（米国特許出願公開第2014−0033361  A1号）、PIP−1APIP−1B（米国特許出願公開第2014−0007292  A1号）、PSEEN3174（米国特許出願公開第2014−0007292  A1号）、AECFG−592740（米国特許出願公開第2014−0007292  A1号）、Pput＿1063（米国特許出願公開第2014−0007292  A1号）、Pput＿1064（米国特許出願公開第2014−0007292  A1号）、GS−135及びその誘導体（米国特許出願公開第2012−0233726  A1）、GS153及びその誘導体（米国特許出願公開第2012−0192310  A1号）、GS154及びその誘導体（米国特許出願公開第2012−0192310  A1号）、GS155及びその誘導体（米国特許出願公開第2012−0192310  A1号）、米国特許出願公開第2012−0167259  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2012−0047606  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2011−0154536  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2011−0112013  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2010−0192256  A1号に記載される配列番号2及び4ならびにその誘導体、米国特許出願公開第2010−0077507  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2010−0077508  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2009−0313721  A1号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許出願公開第2010−0269221  A1号に記載される配列番号2または4ならびにその誘導体、米国特許第7，772，465（B2）号に記載される配列番号2及びその誘導体、WO2014／008054  A2号に記載されるCF161＿0085及びその誘導体、米国特許出願公開第US2008−0172762  A1号、同第US2011−0055968  A1号、及び同第US2012−0117690  A1号に記載される鱗翅目毒性タンパク質及びそれらの誘導体；US7510878（B2）号に記載される配列番号2及びその誘導体、米国特許第7812129（B1）号に記載される配列番号2及びその誘導体などであるが、これらに限定されない、昆虫阻害タンパク質からなる群から選択されてもよい。
【０１１２】
他の実施形態において、昆虫阻害組成物または遺伝子導入植物は、得られる昆虫阻害の範囲を拡大するために、本発明のキメラ殺虫性タンパク質によって阻害されない害虫（甲虫目、半翅目、及び同翅目など）に対して昆虫阻害活性を示す少なくとも1つの毒性剤をさらに含むことができる。
【０１１３】
甲虫目害虫の防除のためのこのような追加の毒性剤は、例えば、Cry3Bb（米国特許第6，501，009号）、Cry1C変異体、Cry3A変異体、Cry3、Cry3B、Cry34／35、5307、AXMI134（米国特許出願公開第2013−0167264  A1号）、AXMI−184（米国特許出願公開第2010−0004176  A1号）、AXMI−205（米国特許出願公開第2014−0298538  A1号）、axmi207（米国特許出願公開第2013−0303440  A1号）、AXMI−218、AXMI−220（米国特許出願公開第20140245491A1号)、AXMI−221z、AXMI−223z  （米国特許出願公開第2014−0196175  A1号)、AXMI−279（米国特許出願公開第2014−0223599  A1号）、AXMI−R1及びその変異体（米国特許出願公開第2010−0197592  A1）、TIC407、TIC417、TIC431、TIC807、TIC853、TIC901、TIC1201、TIC3131、DIG−10（米国特許出願公開第2010−0319092  A1号）、eHIP（米国特許出願公開第2010／0017914号）、IP3及びその変異体（米国特許出願公開第2012−0210462  A1号)、ならびにω−ヘキサトキシン−Hv1a（米国特許出願公開第US2014−0366227  A1号）であるが、これらに限定されない昆虫阻害タンパク質からなる群から選択されてもよい。
【０１１４】
半翅目害虫の防除のためのこのような追加の毒性剤は、例えば、TIC1415（米国特許出願公開第2013−0097735  A1号）、TIC807（米国特許第8609936号）、TIC834（米国特許出願公開第2013−0269060  A1号）、AXMI−036（米国特許出願公開第2010−0137216  A1号）、及びAXMI−171（米国特許出願公開第2013−0055469  A1号）であるが、これらに限定されない、半翅目活性タンパク質からなる群から選択されてもよい。高注目、鱗翅目、及び半翅目害虫の防除のための追加のポリペプチドは、Neil Crickmore（btnomenclature．infoでの世界規模のウェブ）によって維持されるバチルス・チューリンゲンシス毒素命名法ウェブサイトで見ることができる。
【０１１５】
キメラ殺虫性タンパク質をコードする配列及びキメラ殺虫性タンパク質と実質的な同一率を有する配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、熱増幅及びハイブリダイゼーションなどの当業者に既知の方法を用いて同定することができる。例えば、キメラ殺虫性タンパク質は、関連するタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するために使用することができ、また密接に関連する他のタンパク質をスクリーニングし、それらを見つけ出すために使用することができる。
【０１１６】
さらに、キメラ殺虫性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、熱サイクルまたは等温増幅及びハイブリダイゼーション法を用いて、この部類の他のメンバーを同定するためのスクリーニングにプローブ及びプライマーとして使用することも可能である。例えば、配列番号2に記載されている配列に由来するオリゴヌクレオチドは、商品生産物に由来するデオキシリボ核酸サンプルにおけるキメラ殺虫性導入遺伝子の存在または不在を決定するために使用することができる。オリゴヌクレオチドを使用する特定の核酸検出法の感度であるならば、配列番号2のいずれかに記載されている配列に由来するオリゴヌクレオチドは、商品生産物の一部のみが、配列番号2のいずれかを含有する遺伝子導入植物に由来する場合に、プールされた供給源に由来する商品生産物中の対応のキメラ殺虫性タンパク質を検出するために使用され得ることが期待される。
【実施例】
【０１１７】
前述の内容を考慮して、以下に開示される実施形態は、単に本発明の代表にすぎず、様々な形態で具体化され得ることが、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書に開示される特定の構造的及び機能的詳細は、限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１８】
実施例1：鱗翅目活性新規キメラ殺虫性タンパク質コード配列の創製及びクローニング
本実施例は、新規キメラ殺虫性タンパク質の作成及びキメラ殺虫性タンパク質のクローンビングならびに発現を例示する。
【０１１９】
組換え核酸配列を、既知のCryタンパク質遺伝子から構築し、新規キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を生成した。得られたポリヌクレオチド配列をバチルス・チューリンゲンシス（Bt）発現プラスミドベクター中にクローンした。ポリヌクレオチド配列の確認後に、発現プラスミドをBt中に形質転換し、発現させた。発現された新規キメラ殺虫性タンパク質の調製物を、様々な鱗翅目害虫に対する活性についてアッセイした。
【０１２０】
キメラ殺虫性タンパク質をコードする多くのポリヌクレオチド配列を生成し、バイオアッセイで試験した。キメラ殺虫性タンパク質の全てが、活性を示したわけではなかった。キメラ殺虫性タンパク質の数個のみを、バイオアッセイにおいて示された鱗翅目に特異的なそれらの活性に基づいて選択した。アミノ酸置換、または別のプロトキシンドメインが導入されたアミノ酸変異体も、元々のキメラ殺虫性タンパク質TIC867及びTIC868に基づいて生成した。本発明のキメラ殺虫性タンパク質の成分（ドメインI、II及びIIIならびにプロトキシン）を表1に提示する。元々のTIC868タンパク質配列に対するTIC868変異体中のアミノ酸置換も提示している。
【表１】
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【０１２１】
実施例2：新規キメラ殺虫性タンパク質は、鱗翅目害虫に対して活性を示す
本実施例は、実施例1に記載されたキメラ殺虫性タンパク質の試験及びキメラ殺虫性タンパク質について観察された鱗翅目活性を例示する。
【０１２２】
キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を、Bt中で発現させた。次いで、発現されたキメラ殺虫性タンパク質を、トウモロコシ、サトウキビ、ダイズ及び綿、ならびに他の作物の害虫として知られている様々な鱗翅目に対してアッセイを行った。具体的には、殺虫性タンパク質を、ベルベットビーンキャタピラー（VBC、Anticarsia gemmatalis）、シュガーケーンボーラー（SCB、Diatraea saccharalis）、マダラメイガ（LSCB、Elasmopalpus lignosellus）、アメリカタバコガ（CEW、Helicoverpa zea）、タバコバッドワーム（TBW、Heliothis virescens）、ダイズシャクトリムシ（SBL、Chrysodeixis includens）、ブラックアーミーワーム（BLAW、Spodoptera cosmioides）、サザンアーミーワーム（SAW、Spodoptera eridania）、ツマジロクサヨトウ（FAW、Spodoptera frugiperda）、ビートアワヨトウ（BAW、Spodoptera exigua）、オオタバコガ（OBW、Helicoverpa armigera）、ハスモンヨトウ（OLW、Spodoptera litura）、ピンクボールワーム（PBW、Pectinophora gossypiella）、タマナヤガ（BCW、Agrotis ipsilon）、南西部アワノメイガ（SWCB、Diatraea grandiosella）、スポッテドボールワーム（SBW、Earias vittella）、及びアワノメイガ（ECB、Ostrinia nubilalis）。アメリカタバコガ（CEW、Helicoverpa zea）は、ソイビーンポッドワーム（SPW）及びコットンボールワーム（CBW）とも呼ばれる。活性は、死亡及び発育阻害スコアならびにMIC50スコアの組み合わせを通して判定された。MIC50は、死亡した幼虫及びL1幼虫（二齢への脱皮に失敗した幼虫）のどちらも考慮にいれられた脱皮抑制濃度を指す。表2は、各キメラ殺虫性タンパク質の活性を示す。『＋』記号は、特定の有害虫に対して観察された活性を示す。
【表２】
0006626102.tif 000003
【０１２３】
上の表2でわかるように、キメラ殺虫性タンパク質のほとんどが、1つ以上の鱗翅目害虫種に対して活性を示した。
【０１２４】
実施例3：キメラ殺虫性タンパク質をコードし、植物中で発現するための遺伝子の合成
本実施例は、植物中での発現のためのキメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの合成を例示する。
【０１２５】
合成コード配列を、植物中でのキメラ殺虫性タンパク質の発現で使用するために構築した。合成配列は、キメラ殺虫性タンパク質のアミノ酸配列を保存すると同時に、ATTTAなどの特定の好ましくない問題の配列及びA／Tに富んだ植物ポリアデニルか配列を回避しつつ、米国特許第5，500，365号に一般的に記載されている方法に従って設計し、合成した。植物中での発現のためのキメラ殺虫性タンパク質をコードするこれらの遺伝子についてのヌクレオチド配列を表3に列記する。
【表３】
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【０１２６】
実施例4：植物中でのキメラ殺虫性タンパク質の発現のための発現カセット
本実施例は、キメラ殺虫性タンパク質をコードする植物中で使用するよう設計されたポリヌクレオチド配列を含む発現カセットの構築を例示する。
【０１２７】
様々な植物発現カセットを、表3に提示された植物発現のために設計された、キメラ殺虫性タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を用いて構築した。このような発現カセットは、植物プロトプラストにおける一過性発現または植物細胞の形質転換に有用である。典型的な発現カセットを、細胞内のタンパク質の最終的な配置に関して設計した。発現カセットの1つのセットを、タンパク質が翻訳され、細胞質ゾルに留まらせるように設計した。発現カセットの別のセットは、毒素タンパク質に隣接する輸送ペプチドを有し、葉緑体または色素体などの細胞の細胞内小器官を標的化させるよう設計した。全ての発現カセットを、プロモータを有する5’末端で開始するように設計し、プロモータは、複数のプロモータ要素、エンハンサー要素、または導入遺伝子の発現を促進するために作動可能に結合された、当業者に既知の他の発現要素からなることができる。プロモータ配列は、通常、プロモータに対して3’の1つ以上のリーダー配列に連続して続いた。イントロン配列は、通常、導入遺伝子の発現を改善するために、リーダー配列に対して3’に提供された。毒素または輸送ペプチドについてのコード配列及び毒素についてのコード配列は、通常、作動可能に結合されたプロモータ、リーダー及びイントロン配置の3’に位置した。3’UTR配列は、通常、転写の終了を容易にするために、また得られた転写物のポリアデニルかに対して重要な配列を提供するために、コード配列の3’に位置した。上述の要素の全てを、発現カセットの構築のために提供された追加の配列と共に、作動可能に結合させ、順次配置させた。
【０１２８】
実施例5：安定して形質転換されたトウモロコシにおけるキメラ殺虫性タンパク質の鱗翅目活性
本実施例は、トウモロコシ植物中で発現され、対応のトウモロコシ有害虫への食餌として提供される場合のキメラ殺虫性タンパク質によって示された鱗翅目に対する阻害活性を例示する。
【０１２９】
トウモロコシ品種LH244を、アグロバクテリウム媒介形質転換法を用いて、実施例4に記載されたバイナリー形質転換ベクターで形質転換した。形質転換細胞を、当該技術分野において既知の方法によって、植物を形成するよう誘導した。植物の葉片を用いるバイオアッセイを、米国特許第8，344，207号に記載されるものと同様に実施した。非形質転換LH244植物を用いて、陰性対照として用いられる組織を得た。各バイナリーベクターからの複数の形質転換事象を、アメリカタバコガ（CEW、Helicoverpa zea）、ツマジロクサヨトウ（FAW、Spodoptera frugiperda）、タマナヤガ（BCW、Agrotis ipsilon）、及び南西部アワノメイガ（SWCB、Diatraea grandiosella）に対して評価した。
【０１３０】
葉片バイオアッセイを、R0及びF1世代の遺伝子導入植物で実施した。加えて、葉の損傷速度を、鱗翅目有害虫が侵入したキメラ殺虫性タンパク質を発現する遺伝子導入F1植物の全体について評価した。TIC860及びTIC868を発現するF1遺伝子導入事象もFAW、CEW、及びSWCBに対して畑で活性について評価した。アッセイ結果を表4に示す。『＋』の記号は、特定の有害虫に対して観察された活性を示す。表4に示すように、キメラ殺虫性タンパク質の大部分及びキメラ殺虫性タンパク質変異体の多くが、1つ以上の鱗翅目害虫種に対する活性を示した。
【表４】
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【０１３１】
実施例6：安定に形質転換されたダイズにおけるキメラ殺虫性タンパク質の鱗翅目活性
本実施例は、ダイズ植物中で発現され、対応の有害虫に食餌として提供される場合の、キメラ殺虫性タンパク質によって示される鱗翅目に対する阻害活性を例示する。
【０１３２】
選択されたキメラ殺虫性タンパク質についてのコード配列を、植物発現用に再設計し、バイナリー植物形質転換ベクター中にクローンし、ダイズ植物細胞を形質転換するために用いた。植物形質転換ベクターは、実施例4に記載されるように、キメラ殺虫性タンパク質の発現用の第1の導入遺伝子カセット及びスペクチノマイシン選択を用いる形質転換植物細胞第2の導入遺伝子カセットを含んだ。TIC1100、TIC860及びTIC836の場合などのいくつかの例において、葉緑体輸送ペプチドコード配列を、キメラ殺虫性コード配列に作動可能に結合させた。色素体標的化及び非標的化TIC1100、TIC860及びTIC836を用いてアッセイを行った。下表5は、キメラ殺虫性タンパク質及びTIC867変異体キメラ殺虫性タンパク質ならびに安定して形質転換されたダイズにおける発現に使用するための関連するコード配列を示す。
【０１３３】
ダイズ植物細胞を、アグロバクテリウム媒介形質転換によって、上述したバイナリー形質転換ベクターを用いて形質転換した。得られた形質転換植物細胞を、ダイズ植物全体を形成するように誘導した。葉組織を採取し、実施例5に記載されたバイオアッセイで用いるか、あるいは凍結乾燥組織をバイオアッセイのための昆虫用食餌で用いた。バイオアッセイを、FAW、サザンアーミーワーム（SAW、Spodoptera eridania）、ダイズシャクトリムシ（SBL、Chrysodeixis includens）、ソイビーンポッドワーム（SPW、Helicoverpa zea）、ベルベットビーンキャタピラー（VBC、Anticarsia gemmatalis）、タバコバッドワーム（TBW、Heliothis virescens）、ブラックアーミーワーム（BLAW、Spodoptera cosmioides）、マダラメイガ（LSCB、Elasmopalpus lignosellus）、及びオオタバコガ（OBW、Helicoverpa armigera）に対して行った。
【０１３４】
表5は、R0世代の植物における各殺虫性タンパク質についての鱗翅目の選択された種に対する活性を示し、表中の『＋』は活性を示す。表5で分かるように、安定して形質転換されたダイズにおいて発現されたキメラ殺虫性タンパク質のそれぞれは、複数の鱗翅目種に対する活性を示した。特に注目すべき点は、TIC867変異体のTIC867＿23が、SPWに対して活性を示したことである。
【表５】
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【０１３５】
選択された形質転換事象を、自家受粉させ、得られた種子を成長させた。葉組織をR1世代植物から採取し、摂食バイオアッセイで用いた。TIC1100、TIC860、TIC867、TIC868、TIC869及びTIC836を発現するR1植物を、SAW、SBL、SPW及びVBCについてアッセイした。表6は、これらの試験で観察された活性を示す。『＋』記号は、特定の有害虫に対して観察された活性を示す。表6で立証されるように、R1世代の植物から発現されたキメラ殺虫性タンパク質の大部分が、1つ以上の鱗翅目種に対して活性を示した。
【表６】
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【０１３６】
表7は、TIC1100、TIC860、及びTIC836を発現する安定して形質転換されたR1世代のダイズ植物を用いてスクリーンハウスで行われた実地試験の結果を示す。スクリーンハウス内で植物に侵入させるために用いられた種としては、SAW、SBL及びSPWが含まれた。耐性は、ダイズ植物における15％以下の落葉として定義された。これらのケージ試験において観察された耐性は、表6に提示されたR1世代のダイズ葉組織において観察された耐性と一致している。『＋』の記号は、特定の有害虫に対して観察された活性を示す。
【表７】
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【０１３７】
TIC867及びTIC869を発現する安定して形質転換されたR1世代のダイズ植物を用いてのスクリーンハウス内での実地試験も、アルゼンチンの2つの異なる地点、アセベド及びフォンテズエラ（Fontezuela）で行った。スクリーンハウス内で植物に侵入させるために用いられた種は、南米ボールワーム（SABW、Helicoverpa gelotopeon）、VBC、BLAW、及びヒマワリシャクトリムシ（SFL、Rachiplusia nu）を含む。耐性は、ダイズ植物における15％以下の落葉として定義された。下表8は、観察された耐性を示す。『＋』の記号は、特定の有害虫に対して観察された活性を示す。表8で立証されるように、TIC867を発現する遺伝子導入ダイズ植物は、BLAW及びVBCに対する耐性を示した。TIC869を発現する遺伝子導入ダイズ植物は、SABW、SFL、BLAW、及びVBCに対する耐性を示した。
【表８】
0006626102.tif 000009
【０１３８】
実施例7：安定して形質転換された綿におけるキメラ殺虫性タンパク質の鱗翅目活性
本実施例は、綿植物において発現され、対応の有害虫に対して食餌として提供される場合の、キメラ殺虫性タンパク質によって示される鱗翅目害虫に対する阻害活性を例示する。
【０１３９】
選択されたキメラ殺虫性タンパク質についてのコード配列を、植物発現用に再設計し、バイナリー植物形質転換ベクター中にクローンし、綿植物細胞を形質転換するために用いた。得られたバイナリーベクターは実施例4に記載されたものと同様であり、色素体標的化及び非標的化TIC860（コード配列：配列番号6；タンパク質配列：配列番号7）、TIC867（コード配列：配列番号9；タンパク質配列：配列番号10）、TIC868（コード配列：配列番号27；タンパク質配列：配列番号28）、TIC867＿23（コード配列：配列番号20；タンパク質配列：配列番号23）を発現するために用いた。
【０１４０】
綿植物細胞を、アグロバクテリウム媒介形質転換法によって形質転換した。形質転換綿細胞を、植物全体を形成するよう誘導した。綿の葉組織を、コットンボールワーム（CBW、Helicoverpa zea）、FAW、TBW及びSBLに対する、実施例5に記載されたようなバイオアッセイで用いた。表9は、安定して形質転換されたR0世代の綿において、TIC860、TIC867、及びTIC868に関してこれら鱗翅目種に対して観察された活性を示し、ここで『＋』の記号は活性を示す。表9で分かるように、TIC860、TIC867、及びTIC868は、安定して形質転換されたR0世代の綿において、2つ以上の鱗翅目害虫種に対して活性を示した。
【表９】
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【０１４１】
選択された形質転換事象を用いて、R1種子を生成した。TIC860、TIC867、及びTIC868を発現するR1植物を、CBW、FAW、TBW、及びSBLに対する耐性についてアッセイした。葉、蕾（square）及び鞘（boll）組織をアッセイで用いた。表10は、これらの試験で観察された活性を示す。『＋』記号は、特定の有害虫に対して観察された活性を示す。表10で立証されるように、TIC860は、葉組織においてFAWに対する活性を示した。さらに、キメラ殺虫性タンパク質TIC867は、葉、蕾及び鞘組織におけるCBW及びFAWに対する活性、ならびに葉におけるTBW及びSBLに対する活性を示した。キメラ殺虫性タンパク質TIC868は、葉、蕾及び鞘組織においてFAWに対する、ならびに葉においてTBW及びSBLに対する活性を示した。
【表１０】
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【０１４２】
本明細書で開示されかつ主張された組成物の全ては、本開示の観点から過度の実験を行うことなく作製かつ実行され得る。本発明の組成物は、前述の例示的な実施形態に関して記載されてきたが、本発明の真の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、変形、変化、修正、及び変更が本明細書に記載される組成物に適用されてもよいことが当業者には明らかであるだろう。より具体的には、化学的及び生理学的のどちらにも関連するある特定の薬剤が、同様なまたは類似する結果が得られる限り、本明細書に記載される薬剤に取って代わってもよいことは明らかであろう。当業者には明らかであるこのような類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあると見なされる。
【０１４３】
本明細書に引用された全ての刊行物及び公開された特許文献は、各個々の刊行物または特許出願が参考として組み込まれることを具体的かつ個別的に示されているのと同程度に参考として本明細書に組み込まれる。
【配列表】
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