(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップであって、前記生物学的試料は、肺組織、血液、血漿および血清から選択される、ステップ；
ｂ）前記生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
前記ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量における統計的に有意な増加が肺高血圧症を示している、方法。
【請求項２】
前記アッセイするステップが前記生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸がＣＣＬ２１リボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記アッセイするステップが前記生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アッセイするステップがノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイ、直接配列決定、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、キャピラリー電気泳動、サザンブロット、免疫測定法、免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析法から選択される技法を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定することにおける使用のためのキットであって、
ａ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在を検出する能力がある少なくとも１つのプローブ；および
ｂ）前記プローブを使用して、前記患者からの生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在に関してアッセイするための説明書であって、前記生物学的試料は、肺組織、血液、血漿および血清から選択される、説明書
を含む、キット。
【請求項７】
前記プローブが、ＣＣＬ２１発現の核酸配列の一領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＣＬ２１タンパク質もしくはその断片に結合する能力がある結合分子から選択される、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記結合分子が抗体またはその断片である、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、呼吸器疾患におけるバイオマーカーの分野におけるものであり、特に、肺高血圧症に関するバイオマーカーとしてのＣＣＬ２１発現の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
肺高血圧症は、予後不良と関連しており、右心不全をもたらす様々な起源の進行性疾患である。その全ての異型を含めると、この疾患は、世界中で最大一億人に影響すると推定されている１。２００８年の４ｔｈ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎで合意された肺高血圧症の現在の分類によれば、慢性肺高血圧症の５つのカテゴリーが存在する。
【０００３】
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺動脈圧の平均値上昇、安静時＞２５ｍｍＨｇ（運動後＞３０ｍｍＨｇ）と定義される。群１  ＰＨは、増加した肺血管抵抗が前毛細血管細小血管症（前毛細血管楔入圧＜１５ｍｍＨｇとして診断される）による疾患にさらに細分され得る。この群内に、突発性肺動脈高血圧症（ＩＰＡＨ）および家族性肺動脈高血圧症、随伴性肺動脈高血圧症、静脈／毛細管併発を有する肺動脈高血圧症、および新生児の持続性肺高血圧症が見出される。群２が左心疾患による肺高血圧症を含む一方、群３は、肺疾患／低酸素血症（例えばＣＯＰＤ）と関連している肺高血圧症を含み、群４は、慢性血栓塞栓性障害と関連している肺高血圧症を含む２。
【０００４】
肺高血圧症の根底にある病理の理解の進歩および診断におけるいくつかの改善および新規な治療の発達にもかかわらず、肺高血圧症の領域にわたる重要な未だ対処されていない医学的必要性ならびに容認できない罹患率および死亡率がなおある。
【０００５】
肺高血圧症のサブカテゴリーは、それらの根底にある原因において異なる。しかしながら、それらは全て、過剰な肺の血管収縮および異常な血管リモデリング、ユニークな叢状病変によって特徴付けられる。炎症および酸化ストレスと関連している内皮機能不全ならびに血管平滑筋細胞（ＳＭＣ）増殖は、肺動脈高血圧症の顕著な特色である３〜５。これらの構造的変化は、静止状態から増殖性、アポトーシス−抵抗性細胞表現型への切り換えを示唆している６、７。血管リモデリングは、肺血管抵抗の慢性的上昇、右心不全および死につながる。
【０００６】
いくつかの研究は、肺動脈高血圧症病態生理における免疫機構の役割も示唆した８。炎症細胞および著しいケモカイン産生がリモデリングされた肺動脈内で検出され、血管ストロマ細胞は、炎症性刺激に感受性であることが示された９。さらに、上昇した循環サイトカインレベルがＩＰＡＨにおいて測定された１０、１１。肺動脈高血圧症を有する患者の最大３分の１は、様々な血管自己抗原に対する循環自己抗体を有する１２、１３。これは、ＴおよびＢリンパ球からなる適応免疫系が関与していることを示唆しており、実際に、血管周囲ＴおよびＢリンパ球が肺血管肺動脈高血圧症病変において検出された１４。慢性炎症性障害および自己免疫疾患に関する研究は、病原性抗体およびＴ細胞が、局所的に標的器官においても、三次リンパ組織（ｔＬＴ）と通例称される高度に組織化された異所性リンパ濾胞で産生され得ることを示唆している１５。慢性肺疾患におけるｔＬＴの役割はその重要性が、特に、慢性閉塞性肺疾患において１６、突発性肺線維症１７において、および閉塞性細気管支炎１８、つい最近では、肺動脈高血圧症において１９増している。二次リンパ組織の異所性形成は、ナイーブＴおよびＢ細胞の局所的誘引によって開始される。したがって、恒常性ケモカイン、ならびに成熟ＤＣ、ナイーブＴ細胞、およびＢ細胞２０などのＣＣＲ７発現細胞を誘引する、ＣＣＬ２１などのリンパ球生存因子の局所的産生は、異所性リンパ組織の形成における決定的な事象である可能性がある。ＣＣＬ２１発現は、特に、ＩＰＡＨを有する患者からの外植された肺におけるｔＬＴにおいて最近検出された１９。
【０００７】
現在のガイドラインは、死亡リスク層別化に関するバイオマーカーとしての脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）またはプロＢＮＰのＮ末端断片（ＮＴ−プロＢＮＰ）の使用を推奨している。ナトリウム利尿ペプチドは、肺高血圧症の最初の血液由来マーカーであった。Nagaya et alは、ＢＮＰの血漿レベルが肺高血圧症における予後的重要性を有することを示した最初の人物である２１。ＢＮＰレベルは、症候性先天性心疾患を有する成人患者における死亡率を予測し２２、ＢＮＰはまた、療法応答の独立予測因子であった。肺動脈高血圧症を有する患者における遡及研究では、ＮＴ−プロＢＮＰ（ＢＮＰ合成の副産物）の連続的測定は、生存と関連していた２３。ＮＴ−プロＢＮＰ値のｌｏｇ変換は、９８％の特異性および６０％の感受性で有害事象のリスクがある肺動脈高血圧症を有する患者を同定した２４。
【０００８】
しかしながら、ＢＮＰまたはＮＴ−プロＢＮＰは、心筋ストレイン、心臓の過剰な伸張、および増加した心拍数のマーカーであり、肺高血圧症病態生理の駆動を司る、肺における末端肺動脈の変化を直接反映しない。心臓および右心室におけるリモデリング変化は、特に、肺動脈リモデリングに続くと考えられている。したがって、効果が疾患進行の結果として右心において可視化され得る前に、代替の非侵襲的循環バイオマーカーを使用して肺動脈リモデリングを評価しモニターすることに大きな関心が持たれる。
【０００９】
病態機構、疾患の重症度または処置応答を特異的に示すバイオマーカーは、肺高血圧症の管理のための理想的なツールであり、また、将来の臨床治験の遂行の成功を促進するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
ＣＣＬ２１は、肺高血圧症患者を対応対照（matched controls）から識別するための高度に特異的かつ感受性のバイオマーカーであることがここで見出された。
【００１１】
したがって、本発明は、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量（statistical significant increased amount）が肺高血圧症を示している、方法を提供する。
【００１２】
本発明は、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含む方法も提供する。
【００１３】
本発明は、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示している、方法も提供する。
【００１４】
これらの態様の一部の実施形態では、アッセイするステップは、生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み、例えば、核酸は、ＣＣＬ２１リボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択される。一部の他の実施形態では、アッセイするｔステップは、生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む。
【００１５】
これらの態様の一部の他の実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、糞便および組織試料から選択される。
【００１６】
これらの態様の一部の他の実施形態では、アッセイするステップは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイ、直接配列決定、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（dynamic allele-specific hybridization）、プライマー伸長法（primer extension assay）、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、キャピラリー電気泳動、サザンブロット、免疫測定法、免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析法から選択される技法を含む。
【００１７】
本発明は、対象が肺高血圧症予測（pulmonary hypertension predicting）を有するかどうかを決定することにおける使用のためのまたは肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測することにおける使用のためのキットであって、
ａ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在を検出する能力がある少なくとも１つのプローブ；および
ｂ）プローブを使用して、患者からの生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在に関してアッセイするための説明書
を含むキットも提供する。
【００１８】
本態様の一部の実施形態では、プローブは、ＣＣＬ２１発現の核酸配列の一領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＣＬ２１タンパク質もしくはその断片に結合する能力がある結合分子から選択される。
【００１９】
本態様の一部の実施形態では、結合分子は、抗体またはその断片である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】イマチニブでの処置後のＰＨのｈｙｐｏｘｉａ／ｓｕｇｅｎラットモデルにおける肺ｍＲＮＡ発現プロファイルからの候補バイオマーカーを示す図である。
【図１−２】イマチニブでの処置後のＰＨのｈｙｐｏｘｉａ／ｓｕｇｅｎラットモデルにおける肺ｍＲＮＡ発現プロファイルからの候補バイオマーカーを示す図である。
【図１−３】イマチニブでの処置後のＰＨのｈｙｐｏｘｉａ／ｓｕｇｅｎラットモデルにおける肺ｍＲＮＡ発現プロファイルからの候補バイオマーカーを示す図である。
【図１−４】イマチニブでの処置後のＰＨのｈｙｐｏｘｉａ／ｓｕｇｅｎラットモデルにおける肺ｍＲＮＡ発現プロファイルからの候補バイオマーカーを示す図である。
【図２】ＰＨ患者および対応対照（年齢、民族性、ジェンダー比が対応した）からの血清および血漿試料におけるヒトＣＣＬ２１タンパク質レベルを示す図である。
【図３】肺移植を受けているＰＨ患者からのヒト肺切片における免疫組織化学的検査によるＣＣＬ２１タンパク質発現および局在化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
定義
本明細書を解釈する目的で、以下の定義が当てはまることになり、適切な場合はいつでも、単数形で使用された用語は、複数形も含むことになり、逆の場合も同様である。追加の定義が詳細な説明にわたって記載される。
【００２２】
「ＣＣＬ２１」という用語は、他に規定されない限り、例えばＥＮＳＴ０００００２５９６０７（Ｅｎｓｅｍｂｌ）において定義されたアミノ酸配列を有するヒトＣＣＬ２１を表す。
【００２３】
「ＣＣＬ２１」という用語は、他に規定されない限り、例えばＥＮＳＰ０００００２５９６０７（Ｅｎｓｅｍｂｌ）において定義されたヌクレオチド配列を有するヒトＣＣＬ２１遺伝子を表す。
【００２４】
「ＣＣＬ２１」という用語は、ＳＣＹＡ２１；ＥＣＬ；ＳＬＣ；ＣＫｂ９；ＴＣＡ４；６Ｃｋｉｎｅ；６Ｃｋｉｎｅ；ｅｘｏｄｕｓ−２；「ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１［ホモ・サピエンス（Homo sapiens）（ヒト）］」；「Ｃ−Ｃモチーフケモカイン２１」；「ベータケモカインｅｘｏｄｕｓ−２」；「Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｆｏｒ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ」；ｅｘｏｄｕｓ−２；「二次リンパ組織ケモカイン」；「小誘導性サイトカインサブファミリーＡ（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）、メンバー２１」と同義語である。
【００２５】
本明細書では、「遺伝子」という用語は、遺伝子およびその全ての現在既知の変異体（バリアント）を意味する。
【００２６】
本明細書では、「レベル」という用語は、本発明によるバイオマーカーのＲＮＡおよび／またはＤＮＡおよび／またはタンパク質コピー数を表す。典型的には、療法下の患者から得られた生物学的試料におけるバイオマーカーのレベルは、健常な対象から得られた同様の試料における同じバイオマーカーのレベルとは異なっている（すなわち増加しているまたは減少している）。
【００２７】
「アッセイすること（assaying）」、「アッセイすること（to assay）」、「検出」、「検出すること（detecting）」および「検出すること（to detect）」という用語は、１つまたは複数のバイオマーカーの存在または非存在を同定することを表す。「測定」、「測定すること（measuring）」および「測定すること（to measure）」という用語は、１つまたは複数のバイオマーカーの存在、非存在または量を同定することを表す。
【００２８】
本明細書では、「ベースライン値」は、肺高血圧症を示さない「正常な」健常な対象からの比較可能な試料（例えば、試験された組織と同じ型の組織からの）におけるＣＣＬ２１発現（例えばｍＲＮＡ）またはＣＣＬ２１ポリペプチド（またはタンパク質）のレベル（量）を一般に表す。必要に応じて、正常な対象からの同じ組織のプールまたは集団が使用され得、ベースライン値は、測定値の平均値（average）または平均値（mean）とすることができる。適したベースライン値は、過度の実験なく当業者によって決定され得る。適したベースライン値は、値から編集されたデータベースにおいて入手可能であり得る、かつ／または公開されたデータ、もしくは患者の組織の遡及研究、および本発明の方法を実行する当業者に明らかであろう他の情報に基づいて決定され得る。適したベースライン値は、基準値の外にある測定されたレベルが診断上の見通しから異常であり、肺高血圧症を予測すると受け入れられ得るように、適切な信頼区間を提供する統計的ツールを使用して選択され得る。
【００２９】
本明細書では、値の「有意な」増加は、ランダム変動による変化の５パーセント未満の可能性の確率値を一般的に有する、適切であり、当技術分野で周知である統計的方法を使用して決定される、再現可能であるまたは統計的に有意である差異を表し得る。一般に、統計的に有意な値は、「正常な」健常な対照対象における値からの少なくとも２標準偏差である。適した統計的検定は、当業者に明白となる。例えば、ベースライン値と比較したタンパク質の量の有意な増加は、約５０％、２倍以上とすることができる。
【００３０】
本明細書では、「相同体」または「相同の」という用語は、共通の進化上の祖先を共有するまたは野生型との少なくとも５０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド変異体を表す。
【００３１】
本明細書では、「結合分子」という用語は、ＣＣＬ２１ポリペプチドに特異的に結合する任意のタンパク質またはペプチドを意味する。「結合分子」は、抗体および免疫学的に機能性の断片などのその断片を含むが、これらに限定されない。本明細書では、抗体または免疫グロブリン鎖の「免疫学的に機能性の断片」という用語は、その部分がどのように得られるかまたは合成されるかにかかわらず、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、なおＣＣＬ２１を特異的に結合する能力がある抗体の部分（抗原−結合部分）を含む結合タンパク質の種である。
【００３２】
「抗体」という用語は、インタクトな免疫グロブリンまたはその機能性の断片を表す。本明細書では、「抗体」という用語は、エピトープ、例えば、ヒトＣＣＬ２１上に見出されるエピトープを特異的に結合するかつ認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを意味する。「抗体」という用語は、単鎖抗体全体、およびその抗原−結合断片を含めた、抗体全体（モノクローナル、キメラ、ヒト化およびヒト抗体などの）を含む。「抗体」という用語は、可変領域を単独で、または以下のポリペプチドエレメント：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全てまたは部分と組み合わせて含み得る、抗原−結合抗体断片、単鎖抗体を含む。
【００３３】
本明細書では、「ＣＣＬ２１に結合する能力がある」結合分子は、１×１０−６Ｍ以下、または１×１０−７Ｍ以下、または１×１０−８Ｍ以下、または１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでＣＣＬ２１に結合する結合分子を表すことが意図されている。
【００３４】
本明細書では、「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００３５】
「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳類および非哺乳類を含む。
【００３６】
「患者」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。
【００３７】
「肺高血圧症アンタゴニスト」という用語は、肺高血圧症を阻害する、処置する、予防する、治癒させる任意の分子を意味する。
【００３８】
「処置する」、「処置すること」、「処置」、「予防する」、「予防すること」または「予防」という用語は、対象が障害または他のリスク因子を発達することになるリスクを低下させる治療的処置、予防的処置および適用を含む。処置および／または予防は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または根底にあるリスク因子の低下または少なくとも疾患の進行の減速を包含する。
【００３９】
「含むこと（comprising）」という用語は、「含むこと（including）」および「なること（consisting）」を意味し、例えば、Ｘを「含む（comprising）」組成物は、Ｘから排他的になり得るまたは例えば、Ｘ＋Ｙのように追加的な何かを含み得る。
【００４０】
数値ｘに関する「約」という用語は、例えば、ｘ＋１０％を意味する。２つのアミノ酸配列間の百分率配列同一性への言及は、整列した場合、アミノ酸のその百分率が２つの配列を比較することにおいて同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野で既知のソフトウェアプログラム、例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（F.M. Ausubel et al., eds., 1987）Supplement 30の節7.7.18に報告されているものを使用して決定され得る。好ましいアラインメントは、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを有するアフィンギャップ探索を使用したＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性探索アルゴリズムによって決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性探索アルゴリズムは、Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489に開示されている。
【００４１】
肺高血圧症に関するバイオマーカーとしてのＣＣＬ２１
ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）は、ＣＣケモカインファミリーに属する小型サイトカインである。ＣＣＬ２１は、免疫調節および炎症プロセスに関与するいくつかのＣＣサイトカイン遺伝子の１つである。ＣＣサイトカインは、２つの隣接するシステインによって特徴付けられるタンパク質である。他のケモカインと同様に、この遺伝子によってコードされるタンパク質は、造血を阻害し、走化性を刺激する。このタンパク質は、胸腺細胞およびＴ細胞、特にナイーブＴ細胞に関してｉｎ  ｖｉｔｒｏで走化性であるが、Ｂ細胞、マクロファージ、または好中球に関して走化性ではない。それは、ＴおよびＢリンパ球上で発現されるケモカイン受容体７に関する高親和性機能性リガンドである２５。ＣＣＬ２１は、二次リンパ器官へのリンパ球のホーミングを媒介することにおける役割を果たすと考えられている。つい最近、ＣＣＬ２１発現は、突発性肺動脈高血圧症を有する患者からの外植された肺におけるｔＬＴにおける二次リンパ組織の異所性形成において検出された１９。この研究では、ＣＣＬ２１は、ヒトとラット試料の両方において研究された。ラットおよびヒトＣＣＬ２１タンパク質配列は、６７％同一であり、これは、２つの種間の高度な相同性を示している。
【００４２】
診断および処置の方法
本発明は、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示している、方法を提供する。
【００４３】
本発明は、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示している、方法も提供する。
【００４４】
さらに、本発明は、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含む方法を提供する。
【００４５】
本発明の実施形態では、アッセイするステップは、生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸に関してアッセイすることを含む。
【００４６】
ＣＣＬ２１遺伝子発現の結果は、ポリヌクレオチド（または核酸）とすることができる。ポリヌクレオチドまたは核酸は、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシドおよびその任意の修飾ヌクレオシドであってよい少なくとも２つの核酸モノマーの鎖を含む分子である。ＤＮＡ分子ならびにゲノムおよびｃＤＮＡ配列、ｍＲＮＡおよびスプライシングされていないまたは部分的にスプライシングされた転写物およびスプライシング産物などのＲＮＡ分子が特に含まれる。
【００４７】
一実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み、核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００４８】
別の実施形態では、肺動脈高血圧症を有する患者が肺動脈高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み、核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００４９】
さらに別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み；
アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み、核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００５０】
本発明の他の実施形態では、アッセイするステップは、生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む。
【００５１】
本発明によるＣＣＬ２１タンパク質（またはポリペプチド）は、ヒトＣＣＬ２１遺伝子の（完全なまたは不完全な）転写および翻訳によって得られたポリペプチドを含む。
【００５２】
ポリペプチド変異体も本発明に含まれる。変異ポリペプチドは、野生型ヒトＣＣＬ２１遺伝子の転写および翻訳によってまたはその遺伝子の野生型ポリリボヌクレオチド転写物の翻訳によって得られた野生型ポリペプチドと比較して、１つまたは複数の欠失、挿入および／または置換を含有する分子を含む。
【００５３】
本発明によるバイオマーカーは、ＣＣＬ２１ポリペプチド（またはタンパク質）の断片または分解産物とすることができる。
【００５４】
一実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む、方法。
【００５５】
別の実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み；肺高血圧症が突発性肺動脈高血圧症である、方法。
【００５６】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む、方法。
【００５７】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み；肺高血圧症が突発性肺動脈高血圧症である、方法。
【００５８】
さらに別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み；
アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む、方法。
【００５９】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み；
アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み；肺高血圧症が突発性肺動脈高血圧症である、方法。
【００６０】
本発明の他の実施形態では、アッセイするステップは、生物学的試料をＣＣＬ２１発現の修飾核酸配列に関してまたは修飾ＣＣＬ２１タンパク質もしくはその断片に関してアッセイすることを含む。
【００６１】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの修飾は、当技術分野で周知である。修飾は、それぞれ、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの１つまたは複数のヌクレオシドまたはアミノ酸残基上で行われ得る。代わりに、または上記の化学修飾と組み合わせて、モノマー間の連結が、修飾され得る。さらなる既知の修飾は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドバイオマーカーへのタグまたは標識のコンジュゲーションを含む。
【００６２】
ポリヌクレオチドの化学修飾は、アルキル、アシルまたはアミノ基による水素の置換、糖部分または糖間結合（すなわちホスホロチオエート）の改変、放射性ヌクレオチド（すなわち３２Ｐ）でのヌクレオチドの標識化、蛍光タグ（すなわちローダミン、フルオレセイン、Ｃｙ３および／またはＣｙ５、化学発光タグ、発色性タグまたは他の標識（すなわちジゴキシゲニンまたはビオチンおよび磁性粒子）などのタグまたは標識化分子とのコンジュゲーションを含むが、これらに限定されない。糖部分、プリンおよびピリミジン複素環の修飾ならびにその複素環類似体および互変異性体も本明細書に含まれる。例示的な例は、ジアミノプリン８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ６，Ｎ６−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５ブロモウラシル、２−ヒドロキシ−５メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンおよび米国特許第５，４３２，２７２号明細書；Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980；Freier and Altmann, Nucl. Acid Res., 1997, 25(22), 4429-43；Toulme’, J.J., Nature Biotechnology 19:17-18 (2001)；Manoharan M.; Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139 (1999)；Freier S.M., Nucleic acid Research, 25:4429-4443 (1997)；Uhlman E., Drug Discovery & Development, 3: 203-213 (2000)；Herdewin P., Antisense & Nucleic acid Drug Dev., 10:297-310 (2000)において報告された例である。
【００６３】
様々な標識化およびコンジュゲーション技法が当業者に既知である。ポリヌクレオチドまたは核酸標識化は、例えば、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化または標識プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって達成され得る。
【００６４】
本発明によるポリヌクレオチドバイオマーカーの化学修飾は、放射性同位体標識化および／または蛍光剤標識化を好ましくは含む。より好ましくは、本発明によるポリヌクレオチドバイオマーカーは、特に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってコピー数が増幅された場合、蛍光タグを含む（例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎアッセイは、一対の非標識ＰＣＲプライマーおよび５’末端のＦＡＭ（商標）またはＶＩＣ（登録商標）色素標識を有するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブおよび３’末端のマイナーグルーブバインダー（ＭＧＢ）非蛍光クエンチャー（ＮＦＱ）からなる。
【００６５】
生物学的試料
本発明の実施形態では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、尿、唾液、糞便および組織試料から選択される。
【００６６】
「提供」される試料は、アッセイを行う人物（または機械）によって得られ得る、またはそれは、別のものによって得られ、アッセイを実行する人物（または機械）に運ばれていても良い。
【００６７】
多くの適した試料型は、当業者に明白となろう。本発明の一実施形態では、試料は、全血、血漿、または血清（凝固因子が除去された血漿）などの血液試料である。例えば、末梢もしくは静脈血漿または血清が使用され得る。別の実施形態では、試料は、尿、汗、またはタンパク質が場合によって血流からその中に除去された別の体液である。尿の場合、例えば、タンパク質は、分解されている可能性があるので、本発明のタンパク質の診断上の断片は、スクリーニングされ得る。別の実施形態では、例えば、試料は、生検後に回収される肺組織である。試料を得、分析のためにそれらを調製するための方法は、通例であり、当技術分野で周知である。
【００６８】
一実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み；核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択され；生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００６９】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み；核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択され、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００７０】
さらに別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み；
アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み；核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片およびＣＣＬ２１リボ核酸（ＲＮＡ）相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択され、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００７１】
別の実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。
【００７２】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。
【００７３】
さらに別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み；
アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。
【００７４】
一部の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み、
肺高血圧症アンタゴニストがカルシウムチャネルブロッカー、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）５阻害剤、グアニル酸シクラーゼ（ｓＧＣ）刺激薬、エンドセリン受容体アンタゴニスト（ＥＲＡ）およびプロスタサイクリンアゴニストから選択される、方法が提供される。
【００７５】
検出（またはアッセイ）方法
当業者に既知のまたは明白ないろいろな方法が遺伝子またはタンパク質発現プロファイリングを実行するために用いられ得る。
【００７６】
一部の実施形態では、アッセイするステップは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイ、直接配列決定、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、キャピラリー電気泳動、サザンブロット、免疫測定法、免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析法から選択される技法を含む。
【００７７】
一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法は、２つの大きい群に分けられ得る：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、およびポリヌクレオチドの生化学的検出または配列決定に基づく他の方法。試料におけるｍＲＮＡ発現の定量化のための当技術分野で既知の最も通例使用される方法は、ノーザンブロッティングおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)）；ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ（Hod, Biotechniques 13:852-854 (1992)）；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）(Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992)）を含む。
【００７８】
代わりに、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含めた特定の二本鎖を認識し得る抗体が用いられ得る。ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定するための様々な方法は、遺伝子発現プロファイリング、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を含めたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐテクノロジー、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）（Velculescu et al., Science 270:484-487 (1995)；およびVelculescu et al., Cell 88:243-51 (1997)）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、大規模並列シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現解析(Brenner et al., Nature Biotechnology 18:630-634 (2000)）を使用することによってなど、製造者のプロトコールに従って市販の機器によって行われ得るマイクロアレイ解析、プロテオミクス、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）などを含むが、これらに限定されない。好ましくは、ｍＲＮＡが定量化される。かかるｍＲＮＡ分析は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技法を使用して、またはマイクロアレイ解析によって好ましくは行われる。ＰＣＲが用いられる場合、ＰＣＲの好ましい形は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）である。
【００７９】
免疫組織化学的検査方法も本発明のバイオマーカーの発現レベルを検出するのに適している。したがって、各マーカーに特異的な抗体または抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体が発現を検出するために使用される。抗体は、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンなどのハプテン標識、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼなどの酵素で抗体自体を直接標識化することによって検出され得る。代わりに、非標識一次抗体が、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清またはモノクローナル抗体を含む標識二次抗体と組み合わせて使用される。免疫組織化学的検査プロトコールおよびキットは、当技術分野で周知であり、市販されている。
【００８０】
発現レベルは、例えば、免疫測定法またはプロテオミクス技法の様々な型を使用してタンパク質レベルでも決定され得る。
【００８１】
免疫測定法では、標的の診断上のタンパク質マーカーは、マーカーに特異的に結合する抗体を使用することによって検出される。抗体は、典型的には、検出可能な部分で標識化されることになる。以下のカテゴリー：３５Ｓ、１４Ｃ、１２５１、３Ｈ、および１３１１などのラジオアイソトープに一般に分類され得る多数の標識が利用可能である。抗体は、例えば、Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al. (1991) Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubsに報告されている技法を使用して、放射性同位体で標識化され得、放射能は、シンチレーション測定を使用して測定され得る。
【００８２】
希土類キレート（ユウロピウムキレート）またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリトリンおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄなどの蛍光標識が利用可能である。蛍光標識は、例えば、上記の「Current Protocols in Immunology」において開示された技法を使用して、抗体にコンジュゲートされ得る。蛍光は、蛍光計を使用して定量化され得る。
【００８３】
様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号明細書は、これらのいくつかの総説を提供している。酵素は、様々な技法を使用して測定され得る発色性基質の化学的改変を一般に触媒する。例えば、酵素は、基質の色変化を触媒し得、これは、分光光度的に測定され得る。代わりに、酵素は、基質の蛍光または化学発光を改変し得る。蛍光の変化を定量化するための技法が上に記載されている。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起状態になり、次いで、（例えば、ケミルミノメーターを使用して）測定され得る光を放射し得るまたは蛍光アクセプターにエネルギーを供与する。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号明細書）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン（dihydrophthalazinedion）、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、およびグルコース−６−リン酸脱水素酵素）、複素環オキシダーゼ（ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどを含む。酵素を抗体にコンジュゲートするための技法は、O’Sullivan et al. (1981) Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York 73: 147-166に報告されている。
【００８４】
酵素−基質組合せの例は、例えば：水素ペルオキシダーゼが色素前駆体（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン塩酸塩（ＴＭＢ））を酸化する、基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）；発色性基質としてパラニトロフェニルリン酸を有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；および発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）または蛍光発生基質４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼを有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）を含む。
【００８５】
多数の他の酵素−基質組合せは、当業者に入手可能である。これらの一般的な総説に関して、米国特許第４，２７５，１４９号明細書および米国特許第４，３１８，９８０号明細書を参照されたい。
【００８６】
免疫測定技法の他のバージョンでは、抗体は、標識化される必要はなく、その存在は、抗体に結合する標識抗体を使用して検出され得る。血漿および血清試料中のヒトＣＣＬ２１タンパク質の検出に関して、Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（登録商標）（ＭＳＤ）プラットフォーム上での特別仕様の免疫測定法が使用された。ＭＳＤの電気化学発光検出テクノロジーは、ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹおよびＭＵＬＴＩ−ＳＰＯＴ（登録商標）マイクロプレートの電極表面で惹起された電気化学的刺激で光を放射するＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）標識を使用する。
【００８７】
したがって、診断上の免疫測定法は、本明細書では、例えば、競合的結合アッセイ、ＥＬＩＳＡなどの直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイを含めた任意のアッセイフォーマットであってよい。
【００８８】
一実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによってＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み；核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択され；生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００８９】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによってＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み；核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択され；生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００９０】
さらに別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み、
アッセイするステップが生物学的試料をＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲによってＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含み；核酸がリボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択され；生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。好ましくは、核酸は、ＣＣＬ２１  ｍＲＮＡから増幅されたｃＤＮＡである。
【００９１】
別の実施形態では、対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示しており；アッセイするステップが生物学的試料を免疫測定法またはＥＬＩＳＡによってＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。
【００９２】
別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、患者から得られた生物学的試料を免疫測定法またはＥＬＩＳＡによってＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示しており；アッセイするステップが生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。
【００９３】
さらに別の実施形態では、肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含み；
アッセイするステップが生物学的試料を免疫測定法またはＥＬＩＳＡによってＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含み、生物学的試料が血液または血漿または血清から選択される、方法。
【００９４】
本発明のキット
本発明は、対象が肺高血圧症予測を有するかどうかを決定することにおける使用のためのまたは肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測することにおける使用のためのキットであって、
ａ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在を検出する能力がある少なくとも１つのプローブ；および
ｂ）プローブを使用して、患者からの生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在に関してアッセイするための説明書
を含むキットを提供する。
【００９５】
一実施形態では、プローブは、ＣＣＬ２１の発現を定量化するための、遺伝子特異的もしくは遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーなどの、ＣＣＬ２１発現の核酸配列の一領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドから選択される。
【００９６】
キットは、試料、特に固定パラフィン包埋組織試料からのＲＮＡの抽出のための試薬および／またはＲＮＡ増幅のための試薬を任意選択でさらに含み得る。キットは、様々な試薬（典型的には濃縮された形での）、例えば、既製のマイクロアレイ、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ；またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼのうちの１つまたは複数をそれぞれ有する容器（方法の自動実行における使用に適したマイクロタイタープレートを含めた）を含み得る。
【００９７】
別の実施形態では、プローブは、ＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に結合する能力がある結合分子である。好ましくは、結合分子は、抗体またはその断片である。
【００９８】
他の結合分子は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに基づく足場（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型の１０番目のモジュール（１０Ｆｎ３ドメイン））を有する分子、アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標））、アンキリン由来反復モジュールを含む分子、Ａｆｆｉｂｏｄｙ（登録商標）分子、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）分子、Ａｆｆｉｌｉｎ（登録商標）分子およびタンパク質エピトープミメティックとすることができる。
【実施例】
【００９９】
本発明は、限定的であると解釈されるべきではない以下の例によってさらに例証される。
【０１００】
１．Ｈｙｐｏｘｉａ／Ｓｕｇｅｎラットモデル遺伝子チッププロファイリング
ＰＨのラットＨｙｐｏｘｉａ／Ｓｕｇｅｎモデルを使用して、実験ＰＨおよび未処置ラット肺を用いたラット肺試料間の比較トランスクリプトームプロファイリングを実行した。
【０１０１】
全ての動物手順をＢｒｉｔｉｓｈ  Ｈｏｍｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ  ｏｆ  １９８６，ＵＫに従って行った。
【０１０２】
Ｓｕｇｅｎ（２５０ｍｇ；ＳＵ５４１６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））をビヒクル（脱イオン水中の１２．５ｍｌ；０．５％（ｗｔ／ｖｏｌ）カルボキシルメチルセルロースナトリウム、０．９％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＮａＣｌ、０．４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ポリソルベート、０．９％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ベンジルアルコール）に溶解し、１５分間超音波処理し、次いでボルテックスした。第０日に、動物を麻酔し、秤量し、皮下注入によってＳｕｇｅｎ  ２０ｍｇ／ｋｇを与えた。動物を低酸素チャンバーに置き、Ｏ２レベルをゆっくりと１０％まで減少させた。対照動物は、大気（２１％Ｏ２）中に残し、研究のための正常酸素圧対照として役立たせた。２週間後、全ての動物を低酸素チャンバーから移動した。第４週後、動物をセボフルラン麻酔下で心エコー測定に供し、完全に回復するまで密接にモニターした。動物は、ケタミンおよびメデトミジン麻酔の混合物下で右心室圧（ＲＶＰ）の測定のためにＲＶカテーテル処置を受けた。スケジュール１による安楽死後、肺の左葉を除去し、膨張させ、１０％ホルマリン中で固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋した。右肺の葉を転写プロファイリングのためにスナップ凍結した。
【０１０３】
ＴＴ２組織バッグ（Ｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標）Ｃａｔ＃５２００２１）に採取した、凍結したラット肺試料をＣｏｖａｒｉｓ  ＣｒｙｏＰｒｅｐ  ＣＰ０２を使用して粉砕した。粉砕された肺試料からの全ＲＮＡを製造者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ（商標））に従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキットによって抽出した。ゲノムＤＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ  ｋｉｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での処置によって除去した。ＲＮＡの正確な定量化をＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計で決定した。ＲＮＡの質を、２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）上でのマイクロフルイディクスに基づく電気泳動によって１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡを分析することによって評価した。
【０１０４】
マイクロアレイ調製および分析に関して、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｏｎｅ−Ｒｏｕｎｄ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキットを使用して、１μｇの全ＲＮＡを増幅した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）をオリゴ（ｄＴ）およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含有するプライマーで合成した。次いで、二本鎖ｃＤＮＡを精製し、ビオチン化ｃＲＮＡを得るための鋳型として使用した。増幅されたｃＲＮＡの量および質をＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用して評価した。ビオチン化ｃＲＮＡを断片化し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｒａｔ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ２３０＿２にハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、ＧｅｎｅＣｈｉｐアレイを洗浄し、染色し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００  ７Ｇを使用してスキャンした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを画像取得のために使用した。分析をＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ＧＸ  １１．５．１ソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）を使用して行った。データ標準化を、Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉｃｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＲＭＡ）アルゴリズムおよび全ての試料の中央値へのベースライン変換を使用して達成した。
【０１０５】
分泌タンパク質（血液試料中で検出される可能性がある）をコードし、リモデリングプロセスと関連している差次的に発現される遺伝子（＞１．５倍、ｐ値≦０．０５、Ｔ検定）をさらなる検証のために最終候補リストに載せた（表１）。リモデリングと関連している遺伝子を以下の情報源から照合した：ＭｅｔａＣｏｒｅ  ｐａｔｈｗａｙデータベース（http://thomsonreuters.com/metacore formerly GeneGO）、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓデータベース（ＩＰＡ）（http://www.ingenuity.com/products/ipa）、Ｇｅｎｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ  ｔｏｏｌ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｎａｖｉａｇａｔｏｒ（http://hugenavigator.net/HuGENavigator）。血液中で分泌されるまたは検出されるとアノテートされた遺伝子を以下の情報源を使用して見出した：Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓデータベース（ＩＰＡ）（http://www.ingenuity.com/products/ipa）および専売のデータセット（ＳＥＣＴＲＡＮＳ）。
【０１０６】
【表１】
0006622722.tif 000002
0006622722.tif 000003
【０１０７】
２．イマチニブでの処置後の突発性肺動脈高血圧症のＨｙｐｏｘｉａ  Ｓｕｇｅｎラットモデルにおける候補バイオマーカーｍＲＮＡレベルの評価
全ての動物手順を上記のように行った。
【０１０８】
この研究では、第０日のＳｕｇｅｎの初回用量の投与、およびその後の低酸素チャンバーでの１４日の期間後、ラットにさらなる２週間毎日、１００ｍｇ／ｋｇのイマチニブまたはビヒクル対照を投与した。
【０１０９】
スケジュール１による安楽死後、組織学的分析のために肺の左葉を除去し、気道膨張によって、膨張させ、１０％ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋した。組織切片（３μｍ）をフォンビルブランド因子（ｖＷＦ）およびα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）に対する抗体で染色した。スライドをＤＭＬＢおよび共焦点顕微鏡、デジタルカメラ、およびＩＭ５０イメージングソフトウェア（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）を使用して調べた。肺小血管（ｖＷＦ染色によって示された１０〜１００μｍ直径）を、筋肉化を示している周囲のα−ＳＭＡ陽性染色の程度に関して評価した。右肺の葉を候補バイオマーカーｍＲＮＡ発現測定のためにスナップ凍結した。全ＲＮＡを抽出し、上の節で述べた品質制御を行った。
【０１１０】
ｃＤＮＡをキット製造者のプロトコールに従ってＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して合成した。ＱＰＣＲを、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）上で行った。ＴａｑＭａｎアッセイをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）から購入した。相対的発現を１０の異なるハウスキーピング遺伝子の組合せに標準化した。データをＳＤＳ  ＲＱ  Ｍａｎａｇｅｒ、ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、バージョン２．４）を使用して分析した。各遺伝子に関する標準化された遺伝子発現値（２−Δｃｔ）をプロットし、ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｉｎ  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０２を使用して分析した。
【０１１１】
表１に列挙された全ての転写物の発現をビヒクルまたはイマチニブで処置された動物からの肺試料において評価した。以下の６つの遺伝子転写物がラットＨｙ／Ｓｕ肺において上方制御され、イマチニブでの処置で下方制御されることが見出された：Ｃｃｌ２１、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ１３、Ｄｍｐ１、Ｆｒｚｂ（図１）。さらに、第２８日にイマチニブまたはビヒクルで処置された群および対照未処置動物からの肺試料におけるＣＣＬ２１  ｍＲＮＡ発現レベルを測定し、未処置対照と比較したビヒクル処置動物の肺におけるＣＣＬ２１  ｍＲＮＡレベルの増加およびイマチニブでの処置後の減少を観察した（図３、上のグラフ）。これらの群からの肺試料におけるＣＣＬ２１発現レベルは、右心室圧と動脈筋肉化の両方と有意に相関した（Ｐ＜０．０００１）
【０１１２】
したがって、上記の遺伝子の転写物レベルが、治療薬投与の結果として肺高血圧症を有する動物の肺において抗リモデリング剤に応答して下方制御されると結論づけた。
【０１１３】
３．長期的なラットＨｙｐｏｘｉａ／Ｓｕｇｅｎにおける血管リモデリング読取りとの候補バイオマーカーｍＲＮＡ相関の評価
全ての動物手順を上記のように行った。この研究では、第０日のＳｕｇｅｎの初回用量の投与および低酸素チャンバーにおける２１日の期間後、ラットは、上昇した右心室圧および動脈筋肉化を発達した。スケジュール１による安楽死後、肺の左葉を組織学的分析のために、右葉をｍＲＮＡ分析のために除去した。以下の研究時点からの肺試料における６つ全ての候補バイオマーカーｍＲＮＡ発現レベルを測定した：第３週、第５週、第８週および第１４週ならびに未処置動物（各群においてｎ＝６）。ピアソン相関を使用して、候補バイオマーカーｍＲＮＡ発現と筋肉化の百分率、右心室圧（ＲＶＰ）と閉塞血管の数間の相関の有意性を評価した。これらの群からの肺試料において評価された全てのマーカーの転写物発現は、３つの血管リモデリング読取りのうちの少なくとも２つと有意に相関した：動脈筋肉化の百分率、閉塞血管の百分率および右心室圧（表２）。したがって、評価された候補バイオマーカーの転写物が血管リモデリングの程度を示していると結論づけた。
【０１１４】
【表２】
0006622722.tif 000004
【０１１５】
４．ＰＨ患者および対応対照の血清および血漿試料における候補バイオマーカータンパク質レベルの評価
候補バイオマーカーの循環タンパク質レベルが対応対照と比較して血清および血漿ＰＨ患者試料において上昇しているかどうかを決定するために、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３およびＣｏｌ１８１ａに関する免疫測定法を開発し、３０人のＰＨ患者ならびに２５人の年齢、民族性およびジェンダー比対応対照におけるこれらの循環レベルを測定した。
【０１１６】
ヒト末梢血試料を承認された倫理審査委員会適用に従って入手し、取り扱った。３０人の肺高血圧症患者からの対応血清および血漿試料を収集した。世界保健機関（ＷＨＯ）分類システム（Ｄａｎａ  Ｐｏｉｎｔ  ２００８）２に従って、３０人のＰＨ患者のうち、２４．８％は、群１に属し、２８．４％は、群２に属し、１０％は、群２および３に属し、３３．３％は、群３に属し、３．５％は、群４に属した。
【０１１７】
ＭＳＤ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃｕｓｔｏｍプレートを使用した免疫測定法を製造者の推奨に従って実行した。簡潔に述べると、プレートを２５μｌ／ウェルで専売のＤｉｌｕｅｎｔ２でインキュベートし、粘着性のカバーフィルムで密封し、プレート振盪機（３００〜１０００ｒｐｍ）上で室温において３０分間インキュベートした。ＣＣＬ２１  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔタンパク質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ｃａｔ＃  ＤＹ３６６、Ｐａｒｔ  ８４１７０９）を１％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１５２６０−０３７）／ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１４１９０）中で復元し、１０，０００ｐｇ／ｍｌで加え、１：５連続希釈をゼロ標準（０ｐｇ／ｍｌ）としての第８ポイントで、Ｄｉｌｕｅｎｔ２で行った。
【０１１８】
標準、試料、およびアッセイ対照をＤｉｌｕｅｎｔ２を有するＭＳＤプレートに２５μｌ／ウェルで加えた。プレートを密封し、プレート振盪機（３００〜１０００ｒｐｍ）上で２時間室温においてインキュベートした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ（商標）、ｃａｔ＃  Ｐ３５６３−１０ＰＡＫ）で３回洗浄した。
【０１１９】
ＣＣＬ２１検出および捕獲抗体（ＭＳＤ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｐｌａｔｅと共に供給された、Ｈｕｍａｎ  ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ  ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）、ｃａｔ＃  ＤＹ３６６、Ｐａｒｔｓ  ８４１７０７および８４１７０８）を１μｇ／ｍｌの最終濃度でＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ＤｕｏＳｅｔプロトコールに従って、復元した。検出抗体溶液を洗浄されたプレートに加えた。プレートを密封し、室温で振盪しながら２時間インキュベートした。最終洗浄ステップ後、リバースピペッティングを使用して、１５０μｌの２×Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（等体積のＨ２Ｏで希釈された）を加え、プレートをＭＳＤ機器ＳＥＣＴＯＲ  Ｉｍａｇｅｒ  ６０００を使用して読んだ。
【０１２０】
統計的分析のために、対応のないｔ検定をＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍ  ６を使用して行った。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して行った。ソフトウェアによって得られた曲線下面積（ＡＵＣ）は、バイオマーカー／の特異性および選択性を反映している。１のＡＵＣは、２つの集団を識別することにおいて１００％感受性かつ特異的なバイオマーカーを示す。
【０１２１】
ＣＣＬ２１が血清と血漿試料の両方において対応対照と比較してＰＨ患者において上方制御されたが、Ｃｏｌ１８ａ１、ＣＸＣＬ１２または１３（データは示さず）は上方制御されなかったことを見出した（図２）。データセットの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析は、ＣＣＬ２１循環レベルが、血清試料において０．９１および血漿試料において０．８９の曲線下面積（ＡＵＣ）で（図２）、高感受性および特異性で患者を対照から識別することができることを示した。したがって、ＣＣＬ２１が対応対照と比較してＰＨ患者の血清および血漿試料において上方制御され、高感受性／特異性で患者を対照から識別することができると結論づけた。
【０１２２】
５．ＰＨ患者からのヒトＩＨＣ  ＣＣＬ２１タンパク質データ
ＰＨからのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片を、承認されたインフォームドコンセントおよび機関の合意の下で肺移植を受けている患者からＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅから入手した。
【０１２３】
ＣＣＬ２１を以下のプロトコールを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＸＴ上での免疫組織化学的検査によって検出した。簡潔に述べると、切片を、ＥＺｐｒｅｐ溶液を使用して脱ろうし、高ｐＨ８抗原回復をＶｅｎｔａｎａ  ｃｃ１試薬を使用して行った。ＣＣＬ２１をヤギ抗ヒトＣＣＬ２１抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）ＡＦ３６６、３．３３ｕｇ／ｍｌ）を使用して検出した−抗体を室温で１２時間インキュベートした。二次抗体は、３７℃で２０分インキュベートした、１／２００に希釈されたビオチン化ウサギ抗ヤギ（ＤＡＫＯ  Ｅ０４６６）であった。ビオチン化二次抗体を、ＤＡＢＭａｐキットを使用して検出した。（Ｖｅｎｔａｎａ  ６５０−０１０）。切片を、Ｈａｒｒｉｓヘマトキシリンを使用して対比染色し、カバーガラスをかけた。画像をＡｐｅｒｉｏ  ＸＴスライドスキャナーを使用してスキャンし、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｔｕｄｉｏを使用して分析した。
【０１２４】
ＣＣＬ２１タンパク質を上皮下／上皮および肺胞マクロファージならびにリンパ管を有する領域における進行型ＰＨ患者からのＰＡＨ病変（図３（Ａ〜Ｄ））において検出した。したがって、ＣＣＬ２１が疾患病変の部位で発現されると結論づけた。
【０１２５】
【表３】
0006622722.tif 000005
0006622722.tif 000006
0006622722.tif 000007
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
対象が肺高血圧症を有するかどうかを決定するための方法であって、
ａ）肺高血圧症を有すると疑われる対象から得られた生物学的試料を用意するステップ；
ｂ）前記生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｃ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値と比較するステップ
を含み；
前記ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量が肺高血圧症を示している、方法。
［２］
肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測する方法であって、前記患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップを含み、ベースライン値と比較したＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の増加したレベルが、前記患者が前記肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる増加した見込みを示している、方法。
［３］
肺高血圧症を有する患者を処置する方法であって、
ａ）前記患者から得られた生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質のレベルに関してアッセイするステップ；および
ｂ）前記患者が、肺高血圧症を有さない対象におけるＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量を示しているベースライン値に対するＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の量と比較して、ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の統計的に有意な増加した量を有する場合、治療有効量の肺高血圧症アンタゴニストを投与するステップ
を含む、方法。
［４］
前記アッセイするステップが前記生物学的試料をＣＣＬ２１発現の核酸配列に関してアッセイすることを含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］
前記核酸がＣＣＬ２１リボ核酸（ＲＮＡ）またはその断片および相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）またはその断片から選択される、上記［４］に記載の方法。
［６］
前記アッセイするステップが前記生物学的試料をＣＣＬ２１タンパク質またはその断片に関してアッセイすることを含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載の方法。
［７］
前記生物学的試料が血液、血清、血漿、尿、唾液、糞便および組織試料から選択される、上記［１］から［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］
前記アッセイするステップがノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイ、直接配列決定、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高解像度融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、キャピラリー電気泳動、サザンブロット、免疫測定法、免疫組織化学的検査、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析法から選択される技法を含む、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］
対象が肺高血圧症予測を有するかどうかを決定することにおける使用のためのまたは肺高血圧症を有する患者が肺高血圧症アンタゴニストでの処置に応答することになる見込みを予測することにおける使用のためのキットであって、
ａ）ＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在を検出する能力がある少なくとも１つのプローブ；および
ｂ）前記プローブを使用して、前記患者からの生物学的試料をＣＣＬ２１発現および／またはＣＣＬ２１タンパク質の存在に関してアッセイするための説明書
を含む、キット。
［１０］
前記プローブが、ＣＣＬ２１発現の核酸配列の一領域に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはＣＣＬ２１タンパク質もしくはその断片に結合する能力がある結合分子から選択される、上記［９］に記載のキット。
［１１］
前記結合分子が抗体またはその断片である、上記［９］に記載のキット。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３】
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