(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ブロックコポリマーを含む水溶液に加水分解可能なシリカ源を加えることによってシリカ調合物を製造し、前記シリカ調合物を０℃から１５℃の温度に保持し、シリカ−ポリマー複合体ベシクルが形成するまで前記調合物をかき混ぜるステップであって、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）より前に行われるステップと；
（ｂ）前記シリカ−ポリマー複合体ベシクルを含有する前記シリカ調合物の温度を２５℃から１００℃の間となるように上げ、混合物をかき混ぜて球状構造を有するシリカ−ポリマー複合体ベシクルをベシクル壁内に形成させるステップと、
（ｃ）前記ベシクルを水熱処理にさらすステップと、
（ｄ）前記ベシクルを焼成し、それによってシリカベシクルを製造するステップと、
を含む、シリカベシクルを製造する方法。
【請求項２】
前記加水分解可能なシリカ源は、オルトケイ酸アルキルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブロックコポリマーは、オレフィントリブロックコポリマーである、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ブロックコポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（アルキレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）ブロックコポリマーである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）において前記温度は、３０℃から８５℃の間に上げられる、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）はステップ（ｂ）より前であり、ステップ（ｂ）はステップ（ｃ）より前であり、ステップ（ｃ）はステップ（ｄ）より前である、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記水熱処理は、９０℃から２００℃の間である温度で行われる、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記水熱処理は、０．７バールより大きく１０バール未満の高い圧力で行われる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）および／またはステップ（ｂ）における前記かき混ぜは、撹拌である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シリカベシクルの表面は、焼成後に疎水性修飾される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）３０ｎｍから７０ｎｍの間の粒径と；
（ｂ）球状の細孔によって穿孔された壁構造と；
（ｃ）前記壁の中に形成された４ｎｍから４０ｎｍの間の平均細孔入口サイズと
を有するシリカベシクル。
【請求項１２】
前記シリカベシクルの表面が修飾されている、請求項１１に記載のシリカベシクル。
【請求項１３】
前記シリカベシクルの表面は、元のシリカベシクル表面より疎水性にされている、請求項１２に記載のシリカベシクル。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法によって製造されたときの、下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有するシリカベシクル。
（ａ）３０ｎｍから７０ｎｍの間の粒径
（ｂ）球状の細孔によって穿孔された壁構造
（ｃ）壁の中に形成された４ｎｍから４０ｎｍの間の平均細孔入口サイズ
【請求項１５】
請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のシリカベシクルと、前記ベシクル内にカプセル化されたおよび／またはその外表面に結合された薬物および／または化学薬剤と、を含み、
前記シリカベシクルは下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有する、薬物または化学薬物送達システム。
（ａ）３０ｎｍから７０ｎｍの間の粒径
（ｂ）球状の細孔によって穿孔された壁構造
（ｃ）壁の中に形成された４ｎｍから４０ｎｍの間の平均細孔入口サイズ
【請求項１６】
１種または複数種の請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のシリカベシクルと、１種または複数種の免疫原と、を含み、
前記シリカベシクルは下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を有する、免疫原性組成物。
（ａ）３０ｎｍから７０ｎｍの間の粒径
（ｂ）球状の細孔によって穿孔された壁構造
（ｃ）壁の中に形成された４ｎｍから４０ｎｍの間の平均細孔入口サイズ
【請求項１７】
前記免疫原は、前記シリカベシクルの外周内にカプセル化されるかまたはその外表面に結合される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記免疫原は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の免疫原性断片である、請求項１６または請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記免疫原性組成物は、構造および／または機能の性格が互いに異なる複数の免疫原を提示またはカプセル化する、実質的に性格が同じである複数のシリカベシクルを含む、請求項１６から請求項１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記免疫原性組成物は、構造および／または機能の性格が実質的に同じである免疫原を提示またはカプセル化する、構造の性格が互いに異なる複数のシリカベシクルを含む、請求項１６から請求項１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
治療として有効な量のシリカベシクルを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、対象における免疫応答の誘発における使用のための、請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のシリカベシクル。
【請求項２２】
前記免疫応答は、細胞性免疫応答または抗体免疫応答である、請求項２１に記載のシリカベシクル。
【請求項２３】
治療として有効な量のシリカベシクルを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患または病態の予防または処置における使用のための、請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のシリカベシクル。
【請求項２４】
疾患または病態の処置のための医薬品の製造における請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のシリカベシクルと免疫原との使用。
【請求項２５】
前記免疫原は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の免疫原性断片である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
請求項１１から請求項１４のいずれか１項に記載のシリカベシクルのアジュバントとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学合成の分野に関する。より詳しくは、本発明は、中空シリカベシクルを合成する方法と、それによって製造されるシリカベシクルと、薬物送達における、および免疫原性組成物の一部としてのその使用と、に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書における背景技術へのいずれの参照も、そのような技術がオーストラリアまたは他の地域において普通の一般知識を構成することを認めるものと解釈するべきでない。
【０００３】
無機中空球は、独特の形態と広い範囲の用途における使用の可能性とによって大いに注目されている。無機中空球は、溶媒および体液中で良好な安定性を示し、優れた熱特性を有し、その有機対応物と比べて高い機械的強度も有する。これらの特性のおかげで無機中空球は、触媒反応、薬物／遺伝子送達、バイオイメージング、ナノ反応器、低誘電率材料および分離技術といった多彩な用途で用いられている。
【０００４】
所望の特性を作り出すために予め形成されたテンプレートを利用して無機中空球を合成する方法が開発されている。技法によってはミセル、エマルション、マイクロエマルション等を含むソフトテンプレート手法が関与する。この手法には、顕著な量の化学系有機溶媒または有機添加物が必要ということを含む複数の欠点がある。単結晶およびコロイド球を含むハードテンプレート手法も、続いてハードテンプレートを除去するエッチングステップとともに利用されて必要な細孔径を有する球を作り出している。そのような手法は、費用が高く、時間がかかり、環境非友好的であり、生成物の収率が比較的低いことが示されている。
【０００５】
シリカベシクルは、予め形成されたテンプレートを存在させずに超分子集合によって構築される中空球の一種である。小さな粒径（一般に２００ｎｍより小さい直径）を有するシリカベシクルは、その低い毒性と生分解性とによって細胞系および／または動物用途の可能性を有する。中空形態の内部の空の空間は、貨物分子の高容量貯蔵とその後の徐放のための貯蔵所として用いることができる。壁構造（壁厚および多孔性を含む）は、貨物分子の固定化と放出との両方にとって肝要である。しかし、シリカベシクルの壁の内部の細孔径および入口サイズの細かな制御は、困難な課題であることが証明されている。
【０００６】
これらの問題の１つ以上を克服または回避する、小分子もより大きな生体分子も送達するための制御された構造を有するシリカベシクル（ＳＶ）を提供すれば有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の側面によると、
（ａ）ブロックコポリマーを含む水溶液に加水分解可能なシリカ源を加えることによってシリカ調合物を製造し、シリカ調合物を２０℃未満の温度に保持し、シリカ−ポリマー複合体ベシクルが形成するまで調合物をかき混ぜるステップであって、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）より前に行われるステップと；
（ｂ）シリカ−ポリマー複合体ベシクルを含有するシリカ調合物の温度を２５℃から１００℃の間となるように上げ、混合物をかき混ぜて球状構造を有するシリカ−ポリマー複合体ベシクルをベシクル壁内に形成させるステップと；
（ｃ）ベシクルを水熱処理にさらすステップと；
（ｄ）ベシクルを焼成し、それによってシリカベシクルを製造するステップと
を含む、シリカベシクルを形成する方法が提供される。
【０００８】
本発明の第２の側面によると、
（ａ）３０ｎｍから７０ｎｍの間の粒径と；
（ｂ）球状の細孔によって穿孔された壁構造と；
（ｃ）壁の中に形成された４ｎｍから４０ｎｍの間の平均細孔入口サイズと、
を有するシリカベシクルが提供される。
【０００９】
好ましくは、粒径は、４０から６０ｎｍの間、より好ましくは約４５から５５ｎｍ、さらに好ましくは約５０ｎｍである。
【００１０】
本発明の第３の側面は、第１の側面の方法によって製造されたときのシリカベシクルにある。
【００１１】
本発明の第４の側面によると、第２または第３の側面のシリカベシクルと、ベシクル内にカプセル化されるかまたはその外表面に結合された薬物または化学薬剤と、を含む薬物または化学物質送達システムが提供される。
【００１２】
好ましくは、薬物は、有機薬物分子であり、化学薬剤は、農薬である。
【００１３】
本発明の第５の側面は、１種または複数種の第２または第３の側面のシリカベシクルと、１種または複数種の免疫原および／または抗原とを含む免疫原性組成物にある。
【００１４】
好ましくは、免疫原は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の免疫原性断片である。より好ましくは、免疫原および／または抗原は、ＢＶＤＶのＥ２タンパク質、またはその断片である。
【００１５】
本発明の第６の側面は、第５の側面の免疫原性組成物の治療として有効な量を投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法にある。
【００１６】
本発明の第７の側面は、第５の側面の免疫原性組成物の治療として有効な量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患または病態を予防または処置する方法にある。
【００１７】
一実施形態において、疾患または病態は、ウシウイルス性下痢である。
【００１８】
本発明の第８の側面は、疾患または病態の処置のための医薬品の製造における第２または第３の側面のシリカベシクルと免疫原との使用にある。
【００１９】
本発明の第９の側面は、第２の側面または第３の側面のシリカベシクルのアジュバントとしての使用にある。
【００２０】
上記の個々の側面において参照した本発明のさまざまな特徴および実施形態は、必要な変更を加えて他の側面に適切に適用される。したがって、１つの側面において特定される特徴を、他の側面において特定される特徴と適切に組み合わせることができる。
【００２１】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。
【００２２】
本発明が容易に理解され、効果を発揮することができるように、次に添付の図を参照して好ましい実施形態を例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】焼成後の新規シリカベシクル（Ａ）ＳＶ−１０−５０と（Ｂ）ＳＶ−１０−５０−１４０との一組のＦＥ−ＳＥＭ像である。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、焼成前の合成後ＳＶ−１０−ｘ−１００の一組のＴＥＭ像を示す。
【図３】３つの合成ステップによるシリカベシクルの形成を示す提案図式である。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、（Ａ，Ｂ）ＳＶ−１０−５０および（Ｃ，Ｄ）ＳＶ−１０−５０−１４０の焼成後の一連のＴＥＭ像を示す。
【図５】焼成後のＳＶ−１０−Ｔ２（Ａ）およびＳＶ−１０−ｘ−Ｔ３（Ｂ）の窒素収着等温線プロット、Ｎ２収着等温線から計算された細孔径分布プロットであり、（Ｃ）１〜３０ｎｍの範囲の吸着分岐からのＳＶ−１０−Ｔ２のＢｄＢ細孔径分布曲線、（Ｄ）脱着分岐からのＳＶ−１０−ｘ−Ｔ３のＢＪＨ細孔径分布曲線を示す。
【図６】１〜１８０ｎｍの範囲の吸着分岐からの焼成後のＳＶ−１０−Ｔ２（Ａ）およびＳＶ−１０−ｘ−Ｔ３（Ｂ）のＢｄＢ細孔径分布である。
【図７】（Ａ）ＳＶ−１０−７０、（Ｂ）ＳＶ−１０−ｘ−１００、（Ｃ）ＳＶ−１０−ｘ−１３０および（Ｄ）ＳＶ−１０−ｘ−１８０の焼成後の一連のＴＥＭ像である。
【図８】焼成後の（Ａ）ＳＶ−１０−ｘ−１００−ｌ（水層）、（Ｂ）ＳＶ−１０−ｘ−１００−ｕ（ＴＥＯＳ層）および（Ｅ）ＳＶ−２０−ｘ−１００のＴＥＭ像であり、（Ｃ，Ｄ）は、連続撹拌を行った場合（Ｃ）または１０分間だけ撹拌し、２４時間静止状態においた場合（Ｄ）のステップ１後の反応混合物の像である。
【図９】ＴＥＯＳを加える前の１０℃における反応溶液（Ａ）、（Ｂ〜Ｄ）ＴＥＯＳを加えたそれぞれ１２時間後、１５時間後および２４時間後の１０℃における反応溶液のクライオ（ｃｒｙｏ−）ＴＥＭ像である。
【図１０】ＳＶ−１０−７０反応系で、図１０Ａは、ステップ（ａ）においてＴＥＯＳを加えた後の１０℃における反応混合物の時間の関数としてのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルであり、図１０Ｂは、ステップ（ｂ）において次の７０℃処理の沈殿物の、時間の関数としてのＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルである。
【図１１】焼成後のシリカベシクル中のシトクロムｃの吸着量（Ｔ＝２５℃）の時間の関数としてのグラフ表示である。
【図１２】（Ａ）焼成後の純ＳＶ−１０−５０−１４０および（Ｂ〜Ｄ）シトクロムｃのＳＶ−１０−５０−１４０装荷のＴＥＭ像であり、チルトなし（Ｂ）、チルト角はそれぞれｘ軸単独で＋５０°（Ｃ）およびｘ軸単独で−５０°（Ｄ）である。
【図１３】シトクロムｃのＳＶ−１０−５０装荷のＴＥＭ像である。
【図１４】（Ａ）純液体ｎ−ＯＤＭＳ、焼成後（ＢおよびＤ）または疎水性修飾後（ＣおよびＥ）の（ＢおよびＣ）ＳＶ−１０−５０−１４０および（ＤおよびＥ）ＳＶ−１０−５０−１４０のそれぞれＦＴＩＲスペクトルである。
【図１５】疎水性修飾後の純ＳＶ−１０−５０の一組のＴＥＭ像であり、（Ａ）リボヌクレアーゼＡ装荷前および（Ｂ）リボヌクレアーゼＡ装荷後である。
【図１６】対照群である（Ａ〜Ｄ）か、２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識化ＳＶ−１０−５０（Ｅ〜Ｈ）または２５μｇ／ｍｌのＳＶ−１０−５０−１４０（Ｉ〜Ｌ）で２４時間処理されたＳＣＣ２５細胞の一連の共焦点顕微鏡法像である。
【図１７】１６μｇのリボヌクレアーゼＡ用量でのＳＣＣ２５細胞系統の２４時間および７２時間における細胞生存率のグラフ表示である。
【図１８】ＭＤＢＫ細胞のトリパンブルー染色（０．２％）を用いて中空シリカベシクルの細胞毒性を判定する半定量アッセイの結果を示す像である。（ａ）０．５ｍｇ／ｍｌ  ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ；（ｂ）０．１ｍｇ／ｍｌ  ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ；（ｃ）０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ；（ｄ）０．５ｍｇ／ｍｌ  ＳＶ−１０−ｘ−１４０；（ｅ）０．１ｍｇ／ｍｌ  ＳＶ−１０−ｘ−１４０；（ｆ）０．０１ｍｇ／ｍｌ  ＳＶ−１０−ｘ−１４０；（ｇ）０．５ｍｇ／ｍｌ  ＭＣＭ−４１合成後ベシクル（ｈ）ＭＤＢＫ細胞だけでシリカベシクルなし。
【図１９】シリカベシクルの吸着および脱着特性のゲル分析である。
【図２０】免疫原性組成物候補の注射に対するマウスの応答を示す一連のＥＬＩＳＡアッセイの結果のグラフ表示である。
【図２１】免疫化マウスからのマウス脾細胞の抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌のＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果のグラフ表示である。
【図２２】ＳＶ−１４０へのｏＥ２の吸着を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの像である。レーン１−マーカー、レーン２−ｏＥ２タンパク質、レーン３−ｏＥ２／ＳＶ−１４０上清、レーン４−ｏＥ２／ＳＶ−１４０ペレット。
【図２３】初回および２回目の免疫化後の８匹の動物について検査血清採血の終点力価データを示すグラフ表示である。すべてのマウスの尾の基部に１００μＬの投与分を３週間隔で投与した。個々の動物の血清を１：１００から１：６４００へ希釈した。チャートの個々のグラフ線は、各群の個々の動物（Ｍ１からＭ８）を表す。
【図２４】２回目の免疫化後に長期抗体応答のために保持される４匹の動物についての検査血清採血の終点力価データを示すグラフ表示である。個々の動物の血清を１：１００から１：６４００へ希釈した。チャートのグラフ線は、各群の４匹の個々の動物（Ｍ５からＭ８）を表す。
【図２５】免疫化マウスからのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌の検出を示すグラフ表示である。Ｍ１からＭ４は、各処置群の個々のマウスである。図の棒は、ｏＥ２抗原に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数を示す。
【図２６】免疫化マウスからのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌の検出を示すグラフ表示である。Ｍ５からＭ８は、各処置群の個々のマウスである。図の棒は、ｏＥ２抗原に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数を示す。
【図２７】免疫化動物の脾臓部分における全ＩｇＧの誘発を判定する免疫組織化学分析を示す一連の像である。ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ陽性処置群ａ）最終免疫化後３週、ｂ）最終免疫化後２５週；ｏＥ２／ＳＶ−１４０ナノワクチン処置群ｃ）最終免疫化後３週、ｄ）最終免疫化後２５週；非免疫化群ｅ）最終免疫化後３週、ｆ）最終免疫化後２５週。
【図２８】ナノワクチン免疫化の影響を判定する組織病理アッセイの結果を示す一連の像である。最終免疫化後３週で集めたｉ）心臓、ｉｉ）腎臓、ｉｉｉ）注射部位、ｉｖ）肝臓試料、ａ）ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ、ｃ）ｏＥ２／ＳＶ−１４０、ｅ）非免疫化、ならびに最終免疫化後２５週で集めた試料、ｂ）ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ、ｄ）ｏＥ２／ＳＶ−１４０、ｆ）非免疫化。
【図２９】４種類のＳＶ粒子に吸着したＶｉｒＢ９．２を示すゲル像である。吸着後の上清は、残留タンパク質をほとんど示さず、完全な吸着を指す。粒子レーンは、吸着したタンパク質を示す。Ｍ  シーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ）２マーカー。１：ＶｉｒＢ９．２タンパク質。２：ＳＶ１００吸着上清。３：ＳＶ１００粒子。４：ＳＶ１００ＮＨ２吸着上清。５：ＳＶ１００ＮＨ２粒子。６：ＳＶ１４０吸着上清。７：ＳＶ１４０粒子。８：ＳＶ１４０ＮＨ２吸着上清。９：ＳＶ１４０ＮＨ２粒子。
【図３０】０．１％ＳＬＳ中、一夜、３７℃におけるＳＶ粒子からのＶｉｒＢ９．２の脱着を示すグラフ表示である。ＳＶ１００およびＳＶ−１４０がもっとも良い脱着を示す。ＳＶ１００およびＳＶ１４０は、１００％脱着を示す。
【図３１】１：４０００の希釈における２回目の免疫化後２週のＶｉｒＢ９．１タンパク質に対する体液性免疫応答を示すグラフ表示である。ＶｉｒＢ９．１とＱｕｉｌ−ＡならびにＳＶ１００で免疫化した動物から良好な応答が見られる。２種類のタンパク質とＱｕｉｌ  Ａとの混合注射ならびに混合ナノ調合物は、ＶｉｒＢ９．１に特異的な高い抗体応答も示す。ＶｉｒＢ９．２タンパク質だけで免疫化した動物から交差反応は見られない。
【図３２】２回目の免疫化後のＶｉｒＢ９．２タンパク質に対する体液性免疫応答を示すグラフ表示である。ＶｉｒＢ９．２とＱｕｉｌ−ＡならびにＳＶ１００とで免疫化した動物から良好な応答が見られる。２種類のタンパク質とＱｕｉｌ  Ａとの混合注射ならびに混合ナノ調合物は、ＶｉｒＢ９．２に特異的な類似した高い抗体応答も示す。ＶｉｒＢ９．１タンパク質だけで免疫化した動物から交差反応は見られない。
【図３３】ＶｉｒＢ９．１タンパク質、１：４０００希釈に対する体液性応答を示すグラフ表示である。実験の経過期間にわたって検査群について相対免疫応答を示す５匹のマウスからの平均応答。免疫前検査採血は陰性であり、抗体応答は注射とともに増加傾向を示す。この傾向は、単一ナノ調合物と混合ナノ調合物との両方で観測された。
【図３４Ａ】ＶｉｒＢ９．１タンパク質に対する細胞性免疫応答を示すグラフ表示である。５匹のマウス個体からのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌。ＶｉｒＢ９．１＋Ｑｕｉｌ−Ａを注射したマウスは、ＶｉｒＢ９．１＋ＳＶ１００と同程度、多価注射ＶｉｒＢ９．１／９．２＋Ｑｕｉｌ−ＡおよびＶｉｒＢ９．１／９．２＋ＳＶ１００とも同程度、の結果を示す。ＣｏｎＡは、内部対照である。
【図３４Ｂ】ＶｉｒＢ９．１タンパク質に対する細胞性免疫応答を示すグラフ表示である。５匹のマウス個体からのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌。ＶｉｒＢ９．２＋Ｑｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）およびＶｉｒＢ９．２＋ＳＶ１００を注射した動物の最小限の応答があった。
【図３４Ｃ】ＶｉｒＢ９．１タンパク質に対する細胞性免疫応答を示すグラフ表示である。５匹のマウス個体からのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌。ＳＶ１００だけを注射した動物の非免疫化応答があった。
【図３５Ａ】ＶｉｒＢ９．２タンパク質に対する細胞性免疫応答を示すグラフ表示である。５匹のマウス個体からのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌。ＶｉｒＢ９．２＋Ｑｕｉｌ−Ａを注射したマウスは、ＶｉｒＢ９．２＋ＳＶ１００と同程度、多価注射ＶｉｒＢ９．１／９．２＋Ｑｕｉｌ−ＡおよびＶｉｒＢ９．１／９．２＋ＳＶ１００とも同程度、の結果を示す。ＣｏｎＡは、内部対照である。
【図３５Ｂ】ＶｉｒＢ９．２タンパク質に対する細胞性免疫応答を示すグラフ表示である。５匹のマウス個体からのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌。ＶｉｒＢ９．１＋Ｑｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）およびＶｉｒＢ９．１＋ＳＶ１００を注射した動物の最小限の応答があった。
【図３５Ｃ】ＶｉｒＢ９．２タンパク質に対する細胞性免疫応答を示すグラフ表示である。５匹のマウス個体からのマウス脾細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイによる抗原特異的ＩＦＮ−γ分泌。ＳＶ１００だけを注射した動物の非免疫化応答があった。
【図３６】Ｔの関数としての焼成したシリカベシクルの壁厚（丸）、疎水性修飾の前（ひし形）および後（四角）の入口サイズ、未修飾シリカベシクルへのシトクロムｃ（逆三角）および修飾シリカベシクルへのリボヌクレアーゼＡ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａ）（下側の線、三角）吸着容量の相関を示すグラフ表示である。Ｔは、最終合成ステップの温度である。
【図３７】遊離ＲＮアーゼＡおよび１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液に溶解または分散された疎水性修飾シリカベシクルに装荷されたＲＮアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ  ０．５ｍｇ／ｍｌ）の示差走査熱量測定曲線を示すグラフ表示であり、加熱速度は６０℃／時間である。
【図３８】６５℃において０．０１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ２）で４０分間処理され、０．０１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に中和されたＲＮアーゼＡ／シリカベシクルの円偏光二色性スペクトルを示すグラフ表示である。最終ＲＮアーゼＡ濃度は、ｍｇ／ｍｌである。
【図３９】６μｇ／ｍｌの用量のＲＮアーゼＡで処理された（Ａ）ＳＣＣ２５細胞および（Ｂ）ＨＣＴ１１６細胞の２４、４８および７２時間後の細胞生存率を示すグラフ表示である。遊離ＲＮアーゼＡとシリカベシクルに装荷したＲＮアーゼＡとを６５℃において０．０１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ２）で４０分間処理し、０．０１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７に中和してから細胞に加えた。
【図４０】（Ａ）非修飾ＳＶ−１０−１２０および（Ｂ）トリプシン消化処理後に疎水性修飾したＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８に装荷したＲＮアーゼＡの質量分析法を示すグラフ表示である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、少なくとも部分的には、シリカ−ポリマー複合体の層状ベシクルを形成する低温における協同的な自己集合の第１ステップと；細孔壁構造を形成および整形する適温／中温における複合体壁内の制御された二次的な自己集合プロセスを含む第２ステップと；必要なとき細孔入口サイズのさらなる調節を可能にする高温における水熱処理プロセスである任意選択の第３ステップと、を含む手法によって、高い純度（＞９８％）および収率、固有の細孔壁構造ならびに制御可能な細孔入口サイズを有する比較的大きな細孔の中空シリカベシクルの形成の正確な制御が実現されるという知見にもとづくものである。提供される新規シリカベシクルは、高いタンパク質装荷容量、優れた細胞取込および薬物／化学薬剤送達システムとしておよびワクチンを目的とする免疫原性組成物の一部としての効力を含む、複数の望ましい特性を有することが見いだされている。
【００２５】
本特許明細書において、形容詞、たとえば第１および第２、左および右、前および後、上および下等は、１つの要素または方法ステップを別の要素または方法ステップから定義するためにだけ用いられ、特に断らない限り、それら形容詞によって記述される特定の相対位置または順番を必ずしも要求するものではない。
【００２６】
特に断らない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野において通常の知識を有する者によって普通に理解されると同じ意味を有する。
【００２７】
本明細書において用いられる用語「シリカベシクル」（ＳＶ）または「中空シリカベシクル」（ＨＳＶ）は、一般に内部の空洞を囲むシリカベースの壁を備えるベシクルを指す。詳しくは、本明細書に記載されるＳＶは、メソ多孔質の範囲（すなわち２から５０ｎｍの間）の空洞を有し、単層シリカ−空洞−シリカ壁を有し、１００ｎｍ未満の直径を有するので小型単層ベシクル（ＳＵＶ：ｓｍａｌｌ  ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ）と分類することができる。ベシクルの壁の中の多孔構造は、ベシクル壁の中の球状の穿孔によって提供される。これらの球状の細孔は、ベシクル壁の内表面と外表面とを橋渡しする連続した細孔の経路を形成するように相互につながってよい。球状の細孔がベシクルの壁の厚さと同様な直径を有する場合、単一の球状の細孔が壁の内表面と外表面とを橋渡しし、ベシクルの内部の空洞への大きな細孔入口を提供することができる。
【００２８】
本明細書において用いられる用語「かき混ぜ」は、それぞれの反応時に試薬の混合、動揺またはその他の動的な運動を引き起こすいずれの手段を指してもよい。撹拌は反応混合物をかき混ぜる好ましい手段であるが、超音波照射、振り混ぜおよび他の手段も許容されてよい。
【００２９】
本明細書において記載される実験操作において、一般に、合成されるシリカベシクルは、合成時に受けた処理温度ステップによって指定される。たとえば、ＳＶ−Ｔ１−Ｔ２−Ｔ３−ｎとし、Ｔ１、Ｔ２およびＴ３は、使用された３つの合成ステップのそれぞれの温度を示す。接尾辞ｎは、特定の試料を表わし、たとえば『ｃ』は焼成後を表わし、『ａ』は、試料に対して行われたアミノ修飾を表わし、『ｕ』または『ｌ』は、反応混合物が２つ以上の相を含む特定の事例において試料が上層から取られたかまたは下層から取られたかを知らせる。文字『ｘ』は、『ｘ』が表示のどこに置かれるかによって特定のステップがないことを示す。たとえばＳＶ−１０−ｘ−１４０は、１０℃における第１ステップによって合成され、第２ステップは行われなかったが、その代り第３ステップにおいてベシクルが本明細書に定義される１４０℃の水熱処理に付された、シリカベシクルを表す。
【００３０】
本発明の第１の側面において、
（ａ）ブロックコポリマーを含む水溶液に加水分解可能なシリカ源を加えることによってシリカ調合物を製造し、シリカ調合物を２０℃未満の温度に保持し、シリカ−ポリマー複合体ベシクルが形成するまで調合物をかき混ぜるステップであって、ステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）より前に行われるステップと；
（ｂ）シリカ−ポリマー複合体ベシクルを含有するシリカ調合物の温度を２５℃から１００℃の間になるように上げ、混合物をかき混ぜて球状構造を有するシリカ−ポリマー複合体ベシクルをベシクル壁内に形成させるステップと；
（ｃ）ベシクルを水熱処理にさらすステップと；
（ｄ）ベシクルを焼成し、それによってシリカベシクルを製造するステップと
を含む、中空シリカベシクルを製造する方法が提供される。
【００３１】
加水分解可能なシリカ源は、一般式［（Ｘ１）（Ｘ２）Ｓｉ（Ｘ３）（Ｘ４）］であると適切である。各Ｘ基は、少なくとも２つが加水分解可能であること以外は特に制限されない。好ましくは、４つのＸ基のうち３つが加水分解可能であり、より好ましくはＸ基のすべてが加水分解可能である。各Ｘは、異なってもよいが、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ置換もしくは非置換、アリールオキシ置換もしくは非置換、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル置換もしくは非置換またはアリール置換もしくは非置換、Ｃ１〜Ｃ１０アルケニル置換もしくは非置換からなる群から選ばれる有機基である。好ましくは、参照されるアルコキシ基、アルケニル基およびアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ８基であり、Ｃ２〜Ｃ８基、Ｃ３〜Ｃ８基、Ｃ４〜Ｃ８基、Ｃ５〜Ｃ８基、Ｃ６〜Ｃ８基およびＣ７またはＣ８基を含む。より好ましくは、アルコキシ基、アルケニル基およびアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ６基であり、Ｃ２〜Ｃ６基、Ｃ３〜Ｃ６基、Ｃ４〜Ｃ６基ならびにＣ５基およびＣ６基を含む。さらに好ましくは、アルコキシ基、アルケニル基およびアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ４基であり、Ｃ２〜Ｃ４基ならびにＣ３およびＣ４基を含む。さらに好ましくは、アルコキシ基、アルケニル基およびアルキル基は、Ｃ１〜Ｃ３基であり、Ｃ１基、Ｃ２基およびＣ３基を含んでよい。さらに好ましくは、アルコキシ基、アルケニル基およびアルキル基は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、ｓ−およびｔ−ブチル基からなる群から選ばれてよい。
【００３２】
１つの好ましい実施形態において、加水分解可能なシリカ源は、４つのＸ基すべてがＣ１〜Ｃ６アルコキシ基であり、Ｃ２〜Ｃ６、Ｃ３〜Ｃ６、Ｃ４〜Ｃ６ならびにＣ５およびＣ６を含み、Ｃ１〜Ｃ４、Ｃ２〜Ｃ４ならびにＣ３およびＣ４も含み、Ｃ１およびＣ２基も含む。好ましくは、加水分解可能なシリカ源は、オルトケイ酸アルキルであり、任意選択として置換されていてもよい。好ましくは、オルトケイ酸アルキルは、オルトケイ酸テトラメチル、オルトケイ酸テトラエチル（ｔｅｔｒｅｔｈｙｌｏｒｔｈｏｓｉｌｉｃａｔｅ）、オルトケイ酸テトラプロピルおよびオルトケイ酸テトラブチルからなる群から選ばれ、そのすべてが任意選択として置換されていてもよい。
【００３３】
用語「アルキル」は、任意選択として置換されている、１から１０の炭素原子を有する直鎖および分岐炭化水素基を指す。必要に応じて、アルキル基は、特定の数の炭素原子を有してよく、たとえば１、２、３、４、５または６の炭素原子を直鎖または分岐配置で有するアルキル基を含む、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ１〜Ｃ６アルキルである。非限定的なアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−およびｔ−ブチル、ペンチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ヘキシル、ヘプチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、２−エチルブチル、３−エチルブチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシルを含む。
【００３４】
用語「アルケニル」は、任意選択として置換されている、２から１０の炭素原子を有し、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和の直鎖または分岐炭化水素基を指す。必要に応じて、アルケニル基は、特定の数の炭素原子を有してよく、たとえば２、３、４、５または６の炭素原子を直鎖または分岐配置で有するアルケニル基を含む、Ｃ２〜Ｃ８アルケニルまたはＣ２〜Ｃ６アルケニルを有してよい。アルケニル基の非限定的な例は、エテニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニル、ｓ−およびｔ−ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプタ−１，３−ジエニル（ｈｅｐｔ−ｌ，３−ｄｉｅｎｅ）、ヘキサ−１，３−ジエニル（ｈｅｘ−ｌ，３−ｄｉｅｎｅ）、ノナ−１，３，５−トリエニル（ｎｏｎ−ｌ，３，５−ｔｒｉｅｎｅ）等を含む。
【００３５】
本明細書において用いられる用語「アルコキシ」は、酸素原子によってケイ素原子と結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（すなわち−Ｏ−アルキル）を意味し、アルキルは上記の通りである。本明細書において用いられる用語「アリールオキシ」は、同様な意味を有し、下記に定義されるアリール基がアルキル基に置き換わる。
【００３６】
本明細書において用いられる用語「アリール」は、各環が最大８員環の安定な単環、２環または３環炭素環を意味し、少なくとも１つの環はＨｕｅｃｋｅｌ  ４ｎ＋２則によって定義される芳香族である。
【００３７】
用語「任意選択として置換される」は、アルキル基、アルケニル基、アリール基、アミン、アミノ基、ハロゲン化物、チオ、ヒドロキシおよびカルボキシル基からなる群から選ばれる１つ以上の基による参照される基の置換を含むが、これらに限定されるものではない。置換のために他の基を用いてよいことは当業者に自明である。
【００３８】
非限定的な例にすぎないが、加水分解可能なシリカ源は、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、メチルトリ−イソ−プロポキシシラン、メチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、メチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、メチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、エチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、エチルトリ−イソ−プロポキシシラン、エチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、エチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、エチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｎ−プロピルトリメトキシシラン、ｎ−プロピルトリエトキシシラン、ｎ−プロピルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｎ−プロピルトリ−イソ−プロポキシシラン、ｎ−プロピルトリ−ｎ−ブトキシシラン（ｎ−ｐｒｏｐｙｌｔｉｎ−ｎ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ｎ−プロピルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｎ−プロピルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、イソプロピルトリメトキシシラン、イソプロピルトリエトキシシラン、イソプロピルトリ−ｎ−プロポキシシラン、イソプロピルトリイソプロポキシシラン、イソプロピルトリ−ｎ−ブトキシシラン、イソプロピルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、イソプロピルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｎ−ブチルトリメトキシシラン、ｎ−ブチルトリエトキシシラン、ｎ−ブチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｎ−ブチルトリイソプロポキシシラン、ｎ−ブチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ｎ−ブチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｎ−ブチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリメトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリエトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリイソプロポキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリメトキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリエトキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリイソプロポキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、イソブチルトリメトキシシラン、イソブチルトリエトキシシラン、イソブチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、イソブチルトリイソプロポキシシラン、イソブチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、イソブチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、イソブチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｎ−ペンチルトリメトキシシラン、ｎ−ペンチルトリエトキシシラン、ｎ−ペンチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｎ−ペンチルトリイソプロポキシシラン、ｎ−ペンチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ｎ−ペンチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｎ−ペンチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリメトキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリエトキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリイソプロポキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリメトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリエトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリイソプロポキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、イソペンチルトリメトキシシラン、イソペンチルトリエトキシシラン、イソペンチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、イソペンチルトリイソプロポキシシラン、イソペンチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、イソペンチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、イソペンチルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ネオ−ペンチルトリメトキシシラン、ネオ−ペンチルトリエトキシシラン、ネオ−ペンチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、ネオ−ペンチルトリイソプロポキシシラン、ネオ−ペンチルトリ−ｎ−ブトキシシラン、ネオ−ペンチルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ネオ−ペンチルトリ−ネオ−ブトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン、フェニルトリ−ｎ−プロポキシシラン、フェニルトリイソプロポキシシラン、フェニルトリ−ｎ−ブトキシシラン、フェニルトリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、フェニルトリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジメチルジイソプロポキシシラン、ジメチルジ−ｎ−ブトキシシラン、ジメチルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ジメチルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン（ｄｉｅｔｈｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジエチルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジエチルジイソプロポキシシラン、ジエチルジ−ｎ−ブトキシシラン、ジエチルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ジエチルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン（ｄｉｅｔｈｙｉｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｎ−プロピルジメトキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジメトキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジ−ｎ−プロポキシシラン（ｄｉ−ｎ−ｐｒｏｐｙｉｄｉ−ｎ−ｐｒｏｐｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｎ−プロピルジイソプロポキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジ−ｎ−ブトキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ジ−ｎ−プロピルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン（ｄｉ−ｎ−ｐｒｏｐｙｉｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジイソプロピルジメトキシシラン、ジイソプロピルジエトキシシラン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジイソプロピルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジイソプロピルジイソプロポキシシラン、ジイソプロピルジ−ｎ−ブトキシシラン、ジイソプロピルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ジイソプロピルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン（ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｉｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｎ−ブチルジメトキシシラン、ジ−ｎ−ブチルジエトキシシラン、ジ−ｎ−ブチルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジ−ｎ−ブチルジイソプロポキシシラン（ｄｉ−ｎ−ｂｕｔｙｉｄｉｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｎ−ブチルジ−ｎ−ブトキシシラン（ｄｉ−ｎ−ｂｕｔｙｉｄｉ−ｎ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｎ−ブチルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン（ｄｉ−ｎ−ｂｕｔｙｉｄｉ−ｓｅｃ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｎ−ブチルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ジ−ｓｅｃ−ブチルジメトキシシラン、ジ−ｓｅｃ−ブチルジエトキシシラン（ｄｉ−ｓｅｃ−ｂｕｔｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｓｅｃ−ブチルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジ−ｓｅｃ−ブチルジイソプロポキシシラン（ｄｉ−ｓｅｃ−ｂｕｔｙｉｄｉｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｓｅｃ−ブチルジ−ｎ−ブトキシシラン、ジ−ｓｅｃ−ブチルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ジ−ｓｅｃ−ブチルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン（ｄｉ−ｓｅｃ−ｂｕｔｙｉｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジメトキシシラン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジエトキシシラン（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジイソプロポキシシラン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジ−ｎ−ブトキシシラン（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｉｄｉ−ｎ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン（ｄｉ−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｉｄｉ−ｓｅｃ−ｂｕｔｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン（ｄｉｐｈｅｎｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ジフェニルジ−ｎ−プロポキシシラン、ジフェニルジイソプロポキシシラン、ジフェニルジ−ｎ−ブトキシシラン、ジフェニルジ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、ジフェニルジ−ｔｅｒｔ−ブトキシシラン、メチルネオペンチルジメトキシシラン（ｍｅｔｈｙｉｎｅｏｐｅｎｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、メチルネオペンチルジエトキシシラン、メチルジメトキシシラン、エチルジメトキシシラン、ｎ−プロピルジメトキシシラン、イソプロピルジメトキシシラン、ｎ−ブチルジメトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルジメトキシシラン、ｔｅｒｔ−ブチルジメトキシシラン（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、イソブチルジメトキシシラン（ｉｓｏｂｕｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ｎ−ペンチルジメトキシシラン（ｎ−ｐｅｎｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ｓｅｃ−ペンチルジメトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルジメトキシシラン（ｔｅｒｔ−ｐｅｎｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、イソペンチルジメトキシシラン（ｉｓｏｐｅｎｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ネオペンチルジメトキシシラン（ｎｅｏｐｅｎｔｙｉｄｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ネオヘキシルジメトキシシラン、シクロヘキシルジメトキシシラン、フェニルジメトキシシラン、メチルジエトキシシラン、エチルジエトキシシラン（ｅｔｈｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ｎ−プロピルジエトキシシラン、イソプロピルジエトキシシラン、ｎ−ブチルジエトキシシラン、ｓｅｃ−ブチルジエトキシシラン（ｓｅｃ−ｂｕｔｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、ｔｅｒｔ−ブチルジエトキシシラン（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、イソブチルジエトキシシラン、ｎ−ペンチルジエトキシシラン、ｓｅｃ−ペンチルジエトキシシラン、ｔｅｒｔ−ペンチルジエトキシシラン（ｔｅｒｔ−ｐｅｎｔｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、イソペンチルジエトキシシラン、ネオペンチルジエトキシシラン、ネオヘキシルジエトキシシラン、シクロヘキシルジエトキシシラン、フェニルジエトキシシラン（ｐｈｅｎｙｉｄｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、トリメトキシシラン、トリエトキシシラン、トリ−ｎ−プロポキシシラン、トリイソプロポキシシラン、トリ−ｎ−ブトキシシラン、トリ−ｓｅｃ−ブトキシシラン、トリ−ｔｅｒｔ−ブトキシシランのうち１種以上からなる群から選ばれてよい。上記化合物のうち好ましい化合物は、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリ−ｎ−プロポキシシラン、メチルトリイソプロポキシシラン（ｍｅｔｈｙｌｔｒｉｉｓｏｐｒｏｐｏｘｙｓｉｌａ−ｎｅ）、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジエチルジメトキシシランおよびジエチルジエトキシシランである。
【００３９】
加水分解可能なシリカ源は、上記式によって記述されるかまたは上記に挙げた１つ以上の型の単量体の反応によって形成されるオリゴマであってもよい。
【００４０】
好ましくは、水溶液は、緩衝水溶液である。
【００４１】
緩衝水溶液は、酸性緩衝液であると適切である。好ましい実施形態において、緩衝水溶液のｐＨは、３から６の間、または３から５の間、好ましくは４から５である。１つの好ましい実施形態において、緩衝水溶液は、酢酸ナトリウム／酢酸緩衝溶液である。
【００４２】
好ましくは、シリカ調合物中に無機塩も存在する。適当な無機塩は、ナトリウム塩およびカリウム塩を含む。硫酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムは、好ましい塩の２つの例である。調合物の高いイオン強度は、大型のベシクルの安定性を向上させ、均一性の維持を助けるとされている。これは、塩がないとベシクルが商品として依然有用ではあるが比較的小さく（３０ｎｍ）なり、均一性の低下を示すという実験的観測にもとづく。
【００４３】
好ましくは、ブロックコポリマーは、オレフィンブロックコポリマーである。広い範囲のオレフィンブロックコポリマーが市販されている。より好ましくは、ブロックコポリマーは、トリブロックコポリマー、すなわちＡ−Ｂ−Ａ配置のものである。一実施形態において、トリブロックコポリマーは、ポリ（アルキレン１オキシド）−ポリ（アルキレン２オキシド）−ポリ（アルキレン１オキシド）ブロックコポリマーであり、アルキレン１およびアルキレン２成分は、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンおよびそれらの誘導体、たとえばグリコール誘導体からなる基から独立に選ばれてよい。
【００４４】
さらに好ましくは、ブロックコポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（アルキレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）ブロックコポリマーであり、アルキレン基は、アルキレン１およびアルキレン２成分について上記に記載した通りである。好ましい実施形態において、ブロックコポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）またはポリ（エチレンオキシド）−ポリ（ブチレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）ブロックコポリマーである。
【００４５】
好ましくは、ステップ（ａ）において、シリカ調合物は、０℃から２０℃の間、好ましくは５℃から１５℃の間、より好ましくは約１０℃の温度に保持される。０℃から２０℃の間とは、０℃から１５℃、０℃から１２℃、５℃から２０℃、５℃から１５℃、７℃から１３℃の間の範囲を含んでよく、約０℃、１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃および２０℃の温度またはそれらの値のうちいずれか１つからそれらの値のうち他の１つへの範囲を含む。
【００４６】
適切には、ステップ（ａ）における混合物のかき混ぜは、撹拌である。好ましくは、シリカ−ポリマー複合体ベシクルの形成が起こるまでの撹拌は、第１の予め定められた時間の連続撹拌である。第１の予め定められた時間は、ＴＥＭなどの公知の技法によりシリカ−ポリマー複合体ベシクルの形成が観測されるまでの反応混合物の観察によって実験的に決定されてよい。調合物を連続的に撹拌することができないと２層への調合物の相分離が起こることがあり、これがベシクルの形成を混乱させる。
【００４７】
適切には、第１の予め定められた時間のかなりの部分、好ましくは大半、より好ましくはほとんど、さらに好ましくは実質的にすべてでシリカ調合物が撹拌される。
【００４８】
「かなりの部分」によって、第１の予め定められた時間の少なくとも最初の２０％の間は撹拌が連続しているものとする。「大半」によって、第１の予め定められた時間の少なくとも最初の５０％の間は撹拌が連続しているものとする。「ほとんど」によって、第１の予め定められた時間の少なくとも最初の７５％の間は撹拌が連続しているものとする。「実質的にすべて」によって、第１の予め定められた時間の少なくとも最初の８０％、好ましくは９０％の間は撹拌が連続しているものとする。
【００４９】
本発明者らは、驚くべきことに、連続撹拌が少なくとも第１ステップの肝要な側面であり、初期シリカ−ポリマー複合体ベシクルの大半が形成されるまで連続撹拌が保持されることが重要であることを見いだした。本発明者らは、反応が他の条件を同じに保って撹拌なしで行われると所望のベシクルが形成されず、結果として非晶質シリカが得られることを実験によって示した。これは、実験の部に記載される。
【００５０】
好ましくは、第１の予め定められた時間は、少なくとも５時間、より好ましくは少なくとも１０時間、さらに好ましくは少なくとも１５時間、さらに好ましくは少なくとも２０時間である。１つの好ましい実施形態において、第１の予め定められた時間は、約２４時間以上である。
【００５１】
適切には、ステップ（ｂ）において、３０℃から９０℃の間、好ましくは３０℃から８５℃の間、より好ましくは３５℃から８０℃の間となるように温度が上げられる。３０℃から９０℃の間とは、３０℃から８０℃、３０℃から７５℃、３０℃から７０℃、４０℃から９０℃、４０℃から８５℃、４０℃から８０℃、４０℃から７５℃、４０℃から７０℃の間の範囲を含んでよく、約３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃および９０℃またはそれらの値のいずれか１つからそれらの値の別の１つへの範囲の温度を含む。
【００５２】
適切には、ステップ（ｂ）における混合物のかき混ぜは、撹拌である。好ましくは、攪拌は、シリカ−ポリマー複合体ベシクルの壁の内部で球状構造の形成が発生するまで続けられる。この形成は、第２の予め定められた時間の連続撹拌後に起こってよい。
【００５３】
好ましくは、第２の予め定められた時間は、約０．１から約６．０時間の間、好ましくは約０．５から約５．０時間の間、より好ましくは約１．０から約４．０時間の間、さらに好ましくは約２．０から約３．０時間の間である。第２の予め定められた時間は、第１の予め定められた時間の場合と同じように、実験によって決定することもでき、壁の球状構造を有する適当な百分率のベシクル、たとえば９０％、９５％または９８％より多い前記ベシクルが形成されると終了すると考えることができる。
【００５４】
本発明者らは、適温／中温におけるステップ（ｂ）の加熱が、壁構造内で細孔壁構造の形成すなわち中空球状体の形成が起こる期間であり、ステップ（ａ）の加熱時の温度を超える高い温度が、所望のベシクル壁形態を実現するために肝要であることを見いだした。理論によって限界を設けたくはないが、本発明者らは、ステップ（ａ）の完了時点でシリカ−ポリマー複合体ベシクル中のシリカ化学種が完全には加水分解しておらず、シリカ前駆体有機基の一部、したがってある程度の疎水性をまだ保持している可能性があると考える。これらの条件においては、ブロックコポリマーの層状構造が有利である。しかし、ステップ（ｂ）では、シリカ前駆体の加水分解度が増加し、これによってシリカの表面は、シリカ表面に典型的なヒドロキシル末端基の方が優勢となり、したがって親水性が増す。壁の疎水性のこの減少とともに、界面活性剤の立体配座は、親水性条件において有利な球状ミセルなど曲面が増加した構造に変化することができる。結果としてこれが球状構造を有するベシクル壁細孔を形成させる。界面活性剤の選択、温度、含水率、シリカ前駆体加水分解度および他の要因に応じてステップ（ｂ）において球状ミセル以外の湾曲界面活性剤構造体が形成され、そのためベシクル壁の多孔性がこれらの湾曲界面活性剤構造体の形状に対応することは、当業者には当然である。球状ミセルに代って形成されることがある湾曲界面活性剤構造体は、六方晶ロッド相と、双連続立方晶相を含む立方晶相とを含むが、これらに限定されるものではない。形成される湾曲界面活性剤構造体の度合いは、界面活性剤液晶挙動における通常の知識を有する者に十分に理解される。
【００５５】
しかし、一実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）とそれに続くステップ（ｃ）とを含み、その後でベシクルを焼成する。この場合、ベシクルの壁の中により大きな球状の細孔を形成する上で重要なのは、ステップ（ｃ）の水熱ステップである。本発明の方法によって提供される範囲の上限にある細孔サイズだけが望まれる場合、ステップ（ｂ）（後の水熱ステップがないとより小さな細孔径を作り出す）は、本方法から省いてよい。
【００５６】
非常に好ましい一実施形態において、本方法は、ステップ（ａ）とそれに続くステップ（ｂ）とそれに続くステップ（ｃ）とを含み、その後でベシクルを焼成する。すなわち、ステップ（ａ）のシリカ調合物はステップ（ｂ）にさらされ、次にステップ（ｃ）にさらされるのは、ステップ（ｂ）の生成物としてのベシクル壁内に球状構造体を有するシリカ−ポリマー複合体ベシクルである。
【００５７】
好ましくは、すべての実施形態についてステップ（ｃ）の水熱処理は、９０℃より高く２００℃より低い、好ましくは９０℃より高く１８０℃より低い、より好ましくは９５℃より高く１６０℃より低い温度、たとえば約１００℃から約１６０℃で行われる。特定の実施形態において、水熱処理は、１００℃から２００℃の間、好ましくは１００℃から１８０℃の間、より好ましくは１００℃から１６０℃の間である温度で行われてよい。約１００℃、１０５℃、１１０℃、１１５℃、１２０℃、１２５℃、１３０℃、１３５℃、１４０℃、１４５℃、１５０℃、１５５℃および１６０℃の温度が有用とみなされる。
【００５８】
好ましくは、水熱処理ステップは、ケイ素質壁全体にわたって形成される入口を有するシリカ−ポリマー複合体ベシクルの形成まで、第３の予め定められた時間行われる。
【００５９】
好ましくは、第３の時間は、一般的に、第１の時間について記載の時間と同等である。
【００６０】
適切には、水熱ステップ（ｃ）は、高い圧力で行われる。好ましくは、高い圧力は、０．７バールより高く１５．５バールより低く、１．１バールから１５．０バール、１．５バールから１２．０バール、１．５バールから１０．０バール、１．５バールから８．０バール、１．５バールから６．０バールおよび１．５バールから５．０バールを含む。一実施形態において、高い圧力は、０．７バールより高く１０バールより低く、より好ましくは０．８バールより高く６バールより低く、たとえば約１バールから約６バールである。
【００６１】
図３に示されるように、ステップ（ｂ）を行って追加の水熱ステップを行わないと、結果としてベシクル壁の中に通常は４ｎｍより小さな直径を有する比較的小さな細孔が形成されることがある。これらの細孔は、大部分がベシクル壁の中の微小亀裂によって形成され、微小亀裂は、ベシクルの壁の中の小さな内部球状空洞と会合することがあり、これによってこれらの空洞はベシクルの内部空洞およびベシクルの外部とつながり、ベシクル壁を通して連続な細孔通路を形成する。ステップ（ｂ）を含めて、または含めないで（すなわちステップ（ａ）の後かまたはステップ（ｂ）の後に）水熱ステップを行うと、結果として図３に示されるようにベシクルの壁の中により大きな細孔が形成されることがある。したがって、ステップ（ａ）の直後にステップ（ｂ）またはステップ（ｃ）のどちらが行われ、その後に有用かつ商業的に価値ある生成物が作り出す焼成が行われてもよいが、ステップ（ａ）の後にステップ（ｂ）が行われ、ステップ（ｂ）自体の後にステップ（ｃ）が行われてから最後にシリカベシクルを製造する焼成が行われると、形態が微細に制御されて好ましい。
【００６２】
適切には、焼成は、コポリマーテンプレートを除去するのに適するいずれかの温度において行われ、通常は４００℃より高温で、好ましくは５００℃より高温で、さらに好ましくは約５５０℃で行われる。
【００６３】
本発明のプロセスのさまざまな段階で形成されるシリカを指して行われる参照は、焼成が行われるまでは近似的な組成ＳｉＯ２のシリカが完全に形成されるとは予測されないので、ケイ素−酸素ベースの化学種、たとえば部分的に縮合および水和した形のケイ素−酸素ベースの材料を指すことがあるのは、当業者に自明である。本発明のプロセスのさまざまな段階において形成されるケイ素−酸素ベースの材料は、公知の経路、たとえば加水分解および縮合を用いる本明細書に記載されるシリカ前駆体からのシリカの形成についての知識を有する者に周知である。
【００６４】
焼成ステップ後に、任意選択としてシリカベシクルの表面修飾が行われてよい。これは、通常、シリカベシクルの表面の疎水性の増加を含み、この増加は、特定のタンパク質および薬物化合物の装荷可能量を増加させることが見いだされている。表面修飾は、シリカベシクルの外表面または内表面、あるいは両方に適用されてよい。非常に好ましい一実施形態において、本方法は、シリカベシクルの焼成後に、適切な官能基でシリカベシクルを修飾するステップを含む。好ましくは、表面修飾は、疎水性修飾である。
【００６５】
シリカベシクル表面を修飾するために用いられる化学薬剤は、一般式［（Ｘ１）（Ｘ２）Ｓｉ（Ｘ３）（Ｘ４）］を有する加水分解可能なシリカ源であってよい。各Ｘ基は、少なくとも１つが加水分解可能であり、少なくとも１つが疎水性官能基であることを除いて特に限定されない。加水分解可能な各Ｘは、異なってよいが、置換または非置換のＣ１〜Ｃ４アルコキシ、およびハロゲン置換基からなる群から選ばれる有機基である。好ましくは、参照されるアルコキシ基は、メトキシル基およびエトキシル基である。より好ましくは、アルコキシ基は、メトキシル基である。好ましくは、参照されるハロゲン基は、クロリド基およびブロミド基である。より好ましくは、ハロゲン基は、クロリド基である。あるいは、各疎水性官能基Ｘは、異なってよいが、置換または非置換のＣ１〜Ｃ２０アルキルからなる群から選ばれる有機基である。シリカベシクルの表面修飾を付与するために用いられる加水分解可能なシリカ源は、以下の化合物すなわち、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、プロピルトリメトキシシラン、プロピルトリエトキシシラン、ブチルトリメトキシシラン、ブチルトリエトキシシラン、ペンチルトリメトキシシラン、ペンチルトリエトキシシラン、ヘキシルトリメトキシシラン、ヘキシルトリエトキシシラン、ヘプタニルトリメトキシシラン、ヘプタニルトリエトキシシラン、オクチルトリメトキシシラン、オクチルトリエトキシシラン、ノナニルトリメトキシシラン、ノナニルトリエトキシシラン、デカニルトリメトキシシラン、デカニルトリエトキシシラン、ウンデシルトリメトキシシラン、ウンデシルトリエトキシシラン、ドデシルトリメトキシシラン、ドデシルトリエトキシシラン、トリデシルトリメトキシシラン、トリデシルトリエトキシシラン、テトラデシルトリメトキシシラン、テトラデシルトリエトキシシラン、ペンタデシルトリメトキシシラン、ペンタデシルトリエトキシシラン、セチルトリメトキシシラン、セチルトリエトキシシラン、ヘプタデシルトリメトキシシラン、ヘプタデシルトリエトキシシラン、オクタデシルトリメトキシシラン、オクタデシルトリエトキシシラン、フェニルトリメトキシシラン、フェニルトリエトキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジプロピルジメトキシシラン、ジプロピルジエトキシシラン、ジブチルジメトキシシラン、ジブチルジエトキシシラン、ジペンチルジメトキシシラン、ジペンチルジエトキシシラン、ジヘキシルジメトキシシラン、ジヘキシルジエトキシシラン、ジヘプタニルジメトキシシラン、ジヘプタニルジエトキシシラン、ジオクチルジメトキシシラン、ジオクチルジエトキシシラン、ジノナニルジメトキシシラン、ジノナニルジエトキシシラン、ジデカニルジメトキシシラン、ジデカニルジエトキシシラン、ジウンデシルジメトキシシラン、ジウンデシルジエトキシシラン、ジドデシルジメトキシシラン、ジドデシルジエトキシシラン、ジトリデシルジメトキシシラン、ジトリデシルジエトキシシラン、ジテトラデシルジメトキシシラン、ジテトラデシルジエトキシシラン、ジペンタデシルジメトキシシラン、ジペンタデシルジエトキシシラン、ジセチルジメトキシシラン、ジセチルジエトキシシラン、ジヘプタデシルジメトキシシラン、ジヘプタデシルジエトキシシラン、ジオクタデシルジメトキシシラン、ジオクタデシルジエトキシシラン、ジフェニルジメトキシシラン、ジフェニルジエトキシシラン、エチルメチルジメトキシシラン、エチルメチルジエトキシシラン、プロピルメチルジメトキシシラン、プロピルメチルジエトキシシラン、ブチルメチルジメトキシシラン、ブチルメチルジエトキシシラン、ペンチルメチルジメトキシシラン、ペンチルメチルジエトキシシラン、ヘキシルメチルジメトキシシラン、ヘキシルメチルジエトキシシラン、ヘプタニルメチルジメトキシシラン、ヘプタニルメチルジエトキシシラン、オクチルメチルジメトキシシラン、オクチルメチルジエトキシシラン、ノナニルメチルジメトキシシラン、ノナニルメチルジエトキシシラン、デカニルメチルジメトキシシラン、デカニルメチルジエトキシシラン、ウンデシルメチルジメトキシシラン、ウンデシルメチルジエトキシシラン、ドデシルメチルジメトキシシラン、ドデシルメチルジエトキシシラン、トリデシルメチルジメトキシシラン、トリデシルメチルジエトキシシラン、テトラデシルメチルジメトキシシラン、テトラデシルメチルジエトキシシラン、ペンタデシルメチルジメトキシシラン、ペンタデシルメチルジエトキシシラン、セチルメチルジメトキシシラン、セチルメチルジエトキシシラン、ヘプタデシルメチルジメトキシシラン、ヘプタデシルメチルジエトキシシラン、オクタデシルメチルジメトキシシラン、オクタデシルメチルジエトキシシラン、フェニルメチルジメトキシシラン、フェニルメチルジエトキシシラン、トリメチルクロロシラン、エチルジメチルクロロシラン、プロピルジメチルクロロシラン、ブチルジメチルクロロシラン、ペンチルジメチルクロロシラン、ヘキシルジメチルクロロシラン、ヘプタニルジメチルクロロシラン、オクチルジメチルクロロシラン、ノナニルジメチルクロロシラン、デカニルジメチルクロロシラン、ウンデシルジメチルクロロシラン、ドデシルジメチルクロロシラン、トリデシルジメチルクロロシラン、テトラデシルジメチルクロロシラン、ペンタデシルジメチルクロロシラン、セチルジメチルクロロシラン、ヘプタデシルジメチルクロロシラン、オクタデシルジメチルクロロシラン、フェニルジメチルクロロシラン、フェネチルジメチルクロロシラン、ジメチルジクロロシラン、エチルメチルジクロロシラン、プロピルメチルジクロロシラン、ブチルメチルジクロロシラン、ペンチルメチルジクロロシラン、ヘキシルジメチルジクロロシラン、ヘプタニルメチルジクロロシラン、オクチルメチルジクロロシラン、ノナニルメチルジクロロシラン、デカニルメチルジクロロシラン、ウンデシルメチルジクロロシラン、ドデシルメチルジクロロシラン、トリデシルメチルジクロロシラン、テトラデシルメチルジクロロシラン、ペンタデシルメチルジクロロシラン、セチルメチルジクロロシラン、ヘプタデシルメチルジクロロシラン、オクタデシルメチルジクロロシラン、フェニルメチルジクロロシラン、フェネチルメチルジクロロシラン、メチルトリクロロシラン、エチルトリクロロシラン、プロピルトリクロロシラン、ブチルトリクロロシラン、ペンチルトリクロロシラン、ヘキシルトリクロロシラン、ヘプタニルトリクロロシラン、オクチルトリクロロシラン、ノナニルトリクロロシラン、デカニルトリクロロシラン、ウンデシルトリクロロシラン、ドデシルトリクロロシラン、トリデシルトリクロロシラン、テトラデシルトリクロロシラン、ペンタデシルトリクロロシラン、セチルトリクロロシラン、ヘプタデシルトリクロロシラン、オクタデシルトリクロロシラン、フェニルトリクロロシラン、フェネチルトリクロロシランのうち１種、あるいは２種以上の組み合わせを含んでよいが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
適切には、シリカベシクルの表面修飾は、気相反応または液相反応のどちらかを促進する適当な媒質中で、シリカベシクルを表面修飾のために用いられる加水分解可能な薬剤と組み合わせることによって行われる。表面修飾が液相媒質中で行われる場合、適切な溶媒（加水分解可能なシリカ源用の）にシリカベシクルが加えられ、表面修飾のために用いられる加水分解可能な薬剤の添加の前および／または後にシリカベシクルを含む混合物のかき混ぜが行われてよい。あるいは、疎水性修飾を行うために用いられる薬剤を既に含有している溶媒にシリカベシクルが加えられてもよい。好ましくは、表面修飾ステップにおける混合物のかき混ぜは、撹拌または超音波照射によって行われる。より好ましくは、表面修飾ステップにおける混合物のかき混ぜは、撹拌によって行われる。
【００６７】
適切には、表面修飾ステップにおいて、温度は、８０℃から１２０℃の間、好ましくは１００℃から１２０℃の間、より好ましくは１０５℃から１１５℃の間となるように上げられてよい。
【００６８】
適切には、表面修飾ステップは、１種の有機溶媒または２種以上の有機溶媒の組み合わせ中で行われてよい。用いられてよい溶媒は、以下、すなわちペンタン、２−メチルブタン、ネオペンタン、ｎ−ヘキサン、２−メチルペンタン、３−メチルペンタン、２，２−ジメチルブタン、２，３−ジメチルブタン、ｎ−ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、２，２−ジメチルペンタン、２，３−ジメチルペンタン、２，４−ジメチルペンタン、３，３−ジメチルペンタン、３−エチルペンタン、２，２，３−トリメチルブタン、オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン、４−メチルヘプタン、３−エチルヘキサン（３−ｅｔｈｙｌｈｅｘａｎ）、２，２−ジメチルヘキサン、２，３−ジメチルヘキサン、２，４−ジメチルヘキサン、２，５−ジメチルヘキサン、３，３−ジメチルヘキサン、３，４−ジメチルヘキサン、３−エチル−２−メチルペンタン、３−エチル−３−メチルペンタン、２，２，３−トリメチルペンタン、２，２，４−トリメチルペンタン、２，３，３−トリメチルペンタン、２，３，４−トリメチルペンタン、テトラメチルブタン、ノナン、デカン、ウンデカン、ドデカン、エタノール、プロパン−１−オール、イソプロピルアルコール、ブチルアルコール、ペンタノール、ヘキサン−１−オール、ヘプタン−１−オール、オクタン−１−オール、ノナン−１−オール、デカン−１−オール、ウンデカン−１−オール、ドデカン−１−オール、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、１，２−ジメチルベンゼン、１、３−ジメチルベンゼン、１，４−ジメチルベンゼン、ｎ−プロピルベンゼン、１，２，３−トリメチルベンゼン、１，３，５−トリメチルベンゼン、１，２，４−トリメチルベンゼン、ベンジルアルコールのうち１種、または２種以上の組み合わせを含むが、これらに限定されるものではない。好ましくは、溶媒は、置換もしくは非置換Ｃ５〜Ｃ１６アルカン、Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、またはＣ１〜Ｃ３置換されているかもしくは置換されていない芳香族化合物である。より好ましくは、溶媒は、Ｃ２〜Ｃ８アルコール、またはＣ１〜Ｃ３置換されている芳香族化合物、さらに好ましくはＣ２〜Ｃ５アルコールまたはＣ１〜Ｃ３置換ベンゼンである。溶媒は、好ましくは、オクタン、エタノール、プロパン−１−オール、イソプロピルアルコールまたはトルエンあるいはこれらのうち１種以上の組み合わせである。
【００６９】
シリカベシクルの形成のために、実験の部に示される結果、特に図８に示される結果は、ベシクル構造の形成および高い収率にとってシリカ−ポリマーベシクルが形成されるまでの連続撹拌および低温が、２つの重要パラメータであることを明らかに示す。
【００７０】
界面活性剤の自己集合において、超分子凝集体の構造は、主として有機界面活性剤分子のｇ因子によって予測される。本発明者らは、ＰＥＯ−ＰＢＯ−ＰＥＯ型ブロックコポリマーテンプレート用システムにおいて、協同的に自己組織化したブロックコポリマー／ケイ酸塩複合体構造は、シリカ前駆体の疎水性／親水性の影響を受けることができることを示した。詳しくは、本発明者らは、温度、この事例では第１ステップの比較的低い温度が、ＴＥＯＳの加水分解速度に影響を及ぼし、それが今度は形成中のシリカオリゴマーの疎水性／親水性に影響を及ぼし、ベシクル構造体の自己集合にも影響を及ぼすとしている。合成ステップ（ａ）においては温度が高いほどＴＥＯＳの加水分解速度が速くなり、それが親水性シリカオリゴマー、ひいてはチューブ形および非晶質のシリカ構造体の望ましくない生成を生じさせるが、既に定義されたように、低い温度ほど所望のベシクル構造を作り出す（ｐｒｏｄｕｃｅｄ）ことができる。高温水熱処理は、細孔入口サイズを変化させることができるが、ステップ（ａ）後に直ちに水熱処理すると細孔壁構造内の球状体の形成を妨げ、それによって、商業的にはまだ有用であるがあまり好ましくないベシクル構造体を作り出す。ステップ（ｂ）におけるように適温または『中』温において、サンドイッチ状のシリカ／界面活性剤複合体構造は、界面活性剤層の両側にＴＥＯＳが堆積し、それによって後で焼成時にポリマーを除去するとシリカ−空洞−シリカ壁構造を生じるという直接的証拠を示す。
【００７１】
ＳＶ形成機構を視覚化するために、クライオＴＥＭを用いてこのプロセス全体にわたるさまざまな時間における形成中のベシクル構造体を検討した。図９Ａに示されるように、ブロックコポリマー界面活性剤は、シリカ源（ＴＥＯＳ）を加える前に１０ｎｍ未満の直径を有するミセル形である。これは、本方法が合成において予め形成されたベシクルテンプレートを用いず、シリカベシクルの形成は、界面活性剤とシリカオリゴマーとの協同的な自己集合であることを示す。ＴＥＯＳを加えた１５時間後、自己集合したシリカ−界面活性剤ベシクルを観測することができる（図９Ｃ）が、ステップ１の終了時点で細孔壁構造は観測されない（図９Ｄ）。細孔壁構造の中の球状体が適温における後処理、すなわちステップ（ｂ）またはＴ２（図３に表されている）においてのみ形成されることも明らかである。
【００７２】
本発明の第２の側面によれば、
（ａ）３０ｎｍから７０ｎｍの間の粒径と；
（ｂ）球状の細孔によって穿孔された壁構造と；
（ｃ）壁の中に形成された４ｎｍから４０ｎｍの間の平均細孔入口サイズと
を有するシリカベシクルが提供される。
【００７３】
好ましくは、粒径は、４０ｎｍから６０ｎｍ、より好ましくは約４５ｎｍから５５ｎｍの間、さらに好ましくは約５０ｎｍである。これは、エンドサイトーシスによるベシクルと随伴化学薬剤または生物薬剤との細胞取り込みを促進する理想的なサイズである。
【００７４】
適切には、平均細孔入口サイズは、５ｎｍから３８ｎｍの間、より好ましくは約６ｎｍから約３４ｎｍの間である。好ましい細孔入口サイズは、収容されるタンパク質あるいは他の薬物または生物分子のサイズに応じて決まる。たとえば、両方が大体３ｎｍのサイズを有するシトクロムＣおよびリボヌクレアーゼＡでは、約６ｎｍの平均細孔入口サイズを有するＳＶが好ましい。もっと大きな分子が収容されることが必要な用途なら、８、１２、１６、２４または３４ｎｍの平均細孔入口サイズを有するＳＶがより適切である。
【００７５】
シリカベシクルは、中空シリカベシクルである。
【００７６】
好ましくは、中空シリカベシクルは、４ｎｍから１５ｎｍの間、より好ましくは５ｎｍから１４ｎｍの間、さらに好ましくは７ｎｍから１３ｎｍの間の壁厚を有する。
【００７７】
本発明の第３の側面は、第１の側面の方法によって製造されたときのシリカベシクルにある。シリカベシクルは、第２の側面のシリカベシクルについて既に概要が示された物理特性を有する。
【００７８】
本発明の第４の側面によると、第２または第３の側面のシリカベシクルと、ベシクル内にカプセル化されるかまたはその外表面に結合された薬物または化学薬剤と、を含む薬物または化学物質送達システムが提供される。
【００７９】
好ましくは、薬物は有機分子であり、「生物学的薬剤」分子、たとえばタンパク質およびペプチドならびにそれらの断片を含んでよい。
【００８０】
好ましくは、化学薬剤は、農薬、たとえばシロアリ駆除剤である。
【００８１】
薬物または化学薬剤は、中空シリカベシクルの外表面に吸着または結合されるか、細孔内に捕集されるかあるいはベシクル空洞内にカプセル化されてよい。薬物または化学薬剤は、共有結合されてよいが、好ましくはたとえばイオン引力または静電相互作用によって放出可能に結合されるか、あるいは単に細孔構造内に物理的に捕集され、それによって持続放出特性を提供する。
【００８２】
本発明の第５の側面は、１種または複数種の第２または第３の側面のシリカベシクルと、１種または複数種の免疫原および／または抗原とを含む免疫原性組成物にある。
【００８３】
免疫原は、対象に投与されると対象中に免疫応答を誘発することができるいずれの分子、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、またはこれら化学種のいずれのものの断片であってもよい。実施形態によっては、免疫応答は、防御免疫応答であってよい。免疫原は、病原体、細胞、組織または器官から誘導されてよく、精製された抗原、細胞溶解物または培養濾液であってよく、あるいは組み換えまたは合成起源であってよい。
【００８４】
一実施形態において、免疫原または抗原は、免疫原同士または抗原同士の組み合わせであってよい。
【００８５】
一実施形態において、免疫原性組成物は、ワクチン組成物である。
【００８６】
一実施形態において、免疫原性ワクチン組成物は、多価ワクチン組成物である。
【００８７】
一実施形態において、免疫原は、病原ウイルス、細菌または他の生物から誘導される。適切には、免疫原が誘導される元の病原体は、一本鎖ＲＮＡウイルスである。好ましくは、ウイルスは、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパシウイルス（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）、ペギウイルス（Ｐｅｇｉｖｉｒｕｓ）、エフェメロウイルス（Ｅｐｈｅｍｅｒｏｖｉｒｕｓ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）およびペスチウイルス（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）からなる群から選ばれる。好ましい一実施形態において、ウイルスは、ペスチウイルスである。
【００８８】
ウイルスは、エフェメロウイルスまたはラブドウイルス科ウイルスであるとき、ウシ流行熱原因ウイルスであってよい。ウシ流行熱（ＢＥＦ）は、ウシの三日熱としても知られる。それは、媒介節足動物によって運ばれる牛の疾患である。ＢＥＦウイルスは、脂質エンベロープおよび５つの構造タンパク質を有するマイナス一本鎖ＲＮＡゲノムである。エンベロープ糖タンパク質Ｇは、型特異的抗原部位および中和抗原部位を有する。
【００８９】
特定の実施形態において、免疫原は、バベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）属の種から誘導されてよい。そのような寄生生物は、たとえばウシバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）またはフタゴバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｉｇｅｍｉｎａ）であってよい。
【００９０】
特定の実施形態において、免疫原は、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌｅｓ）目の種から誘導されてよい。これらの種は、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属、たとえばアナプラズマ・マージナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｍａｒｇｉｎａｌｅ）であってよい。牛がアナプラズマ・マージナーレに感染すると、一般にアナプラズマ病と呼ばれる疾患が生じる。
【００９１】
本発明の免疫原性組成物が、一緒に用いられてよい免疫原／抗原の型において限定されないことは当然である。ＨＳＶ薬物送達システムで用いられてよい抗原の例は、アデノウイルス４型および７型、炭疽熱、結核、ジフテリアおよび破傷風、百日咳、Ｂ型肝炎、ポリオウイルス、ヘモフィルス、髄膜炎菌疾患、Ａ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、日本脳炎、はしか、おたふくかぜおよび風疹、肺炎球菌疾患、狂犬病、ロタウイルス、痘瘡、腸チフス、みずぼうそう、黄熱病、豚サーコウイルス、ブタコレラウイルス、ウマインフルエンザウイルス、口蹄疫ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ＲＳウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ウマインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、イヌジステンパーウイルス、ブタ伝染性胸膜肺炎（アクチノバチルス・プルロニューモニアエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）によって引き起こされる）、イヌバベシア症およびイヌ内臓リーシュマニア症の処置または予防において用いられるものを含むがこれらに限定されるものではない。
【００９２】
本発明のシリカベシクルを用いた生成物のいずれかの１つの調合物、またはシリカベシクルの使用に関して本明細書に記載されているいずれかの組成物または側面において、２種以上の薬物分子または免疫原が存在してよい。ここで、単一調合物においてさまざまな免疫原の組み合わせ、さまざまな薬物分子の組み合わせ、または免疫原と薬物との組み合わせが用いられてよい。これは、多価ワクチン、複数薬物組み合わせおよび薬物ワクチン組み合わせの開発を可能にする。複数薬物組み合わせ、多価ワクチンおよび薬物ワクチン組み合わせは、薬学的に活性な分子（すなわち薬物分子、免疫原または他の分子）を一緒に混合してからこれらを個々のベシクルが２種以上の活性分子を含有するようにシリカベシクル中に装荷させるか、あるいは複数の単一型の活性分子が別々のロットのシリカベシクルに別々に吸着（装荷）されてから異なる活性分子を装荷したシリカベシクルが組み合わされて単一の調合物とされるか、のどちらによって構成されてもよい。この後の方の手法は、調合物中の各活性分子の放出が調合物中の他の活性分子の放出特性とは独立に調整できるように、異なる活性分子で異なるシリカベシクル設計が用いられることを可能にする。たとえば、単一調合物において、タンパク質などの大きな分子を装荷するために大きな細孔入口開口を有するシリカベシクルが用いられてよい一方で、同じ調合物において小さな有機薬物分子は、望むならこれらの小分子の徐放をよりよく調節するためにより小さな細孔入口開口を有するシリカベシクル内に収容されてよい。別の例として、強い疎水性特性を有するタンパク質免疫原の装荷量を最大にするために疎水性修飾シリカベシクルを用いて多価ワクチン調合物が構成されてよい一方で、同じ調合物においてより親水性の免疫原を収容するために非修飾ベシクルが用いられてよい。組み合わせ生成物の構成の代替戦略として、シリカベシクルに異なる活性分子を順に装荷してもよい。
【００９３】
一実施形態において、免疫原性組成物は、互いに異なる構造および／または機能性格の複数の免疫原を提示またはカプセル化している、実質的に同じ性格の複数のシリカベシクルを含む。
【００９４】
一実施形態において、免疫原性組成物は、実質的に同じ構造および／または機能性格の免疫原を提示またはカプセル化している、異なる構造性格の複数のシリカベシクルを含む。
【００９５】
さらに、本発明の免疫原性組成物がいずれの数の賦形剤材料または賦形剤材料の組み合わせを用いて調合されてよいことは当業者にとって当然である。これらの賦形剤材料は、安定な調合物を提供するため、流動性を向上させるため、ｐＨを調節するため、容易な再構成を可能にするため、抗原種を安定化するため、有害な毒性応答を最小限にするため、製造可能性を改善するため、安定性または寿命を増加させるためあるいはより容易な投与、貯蔵または輸送を可能にするため、を含むがこれらに限定されるものではない、いずれの数の当業者に周知の理由によって調合物中に含まれてもよい。本発明の免疫原性組成物を含有する医療品を調合するために用いることができる賦形剤は、アセトン、アルコール、無水ラクトース、ヒマシ油、酢酸フタル酸セルロース、デキストロース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、ＦＤ＆Ｃ黄色６号アルミニウムレーキ染料、ウシ胎児血清、ヒト血清アルブミン、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、プラスドンＣ、ポラクリリンカリウム、重炭酸ナトリウム、スクロース、水酸化アルミニウム、アミノ酸、塩化ベンゼトニウム、ホルムアルデヒド、無機塩および糖、ビタミン、アスパラギン、クエン酸、ラクトース、グリセリン、クエン酸鉄アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸アルミニウム、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、２−フェノキシエタノール、グルタルアルデヒド、ポリソルベート８０、硫酸カリウムアルミニウム、硫酸アンモニウム、ウシ抽出物、ゼラチン、ペプトン、リン酸ナトリウム、チメロサール、仔ウシ血清、グルタルアルデヒド、ラクトアルブミン加水分解物、硫酸ネオマイシン、ポリミキシンＢ、ラクトアルブミン加水分解物、イースト抽出物、ＭＲＣ−５細胞タンパク質、ネオマイシン、硫酸ポリミキシンＢ、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム、ヘミンクロリド、鉱物塩、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、硫酸アルミニウムカリウム、ホウ酸ナトリウム、大豆ペプトン、リン酸緩衝液、ポリソルベート２０、ホウ酸ナトリウム、脂質、リン酸二水素ナトリウム脱水物、炭水化物、Ｌ−ヒスチジン、β−プロピオラクトン、塩化カルシウム、リン酸水素ナトリウム、卵タンパク質、リン酸二水素カリウム、リン酸二水素ナトリウム、ポリミキシンＢ、塩化カリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｔａｕｒｏｄｅｏｘｙｃｈｏａｌａｔｅ）、硫酸ゲンタマイシン、ハイドロコーチゾン、オクトキシノール−１０、コハク酸水素α−トコフェリル、デオキシコール酸ナトリウム、オボアルブミン、ノニルフェノールエトキシレート、オクチルフェノールエトキシレート（トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００）、アルギニン、リン酸水素カリウム、卵タンパク質、エチレンジアミン四酢酸、硫酸ゲンタマイシン、加水分解された豚ゼラチン、リン酸二水素カリウムグルタミン酸ナトリウム（ｍｏｎｏｂａｓｉｃ  ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、硫酸プロタミン、メタ重亜硫酸ナトリウム、フェノール、カザミノ酸、クエン酸ナトリウム、リン酸一ナトリウム一水和物、水酸化ナトリウム、炭���カルシウム、デキストラン、ソルビトール、トレハロース、糖アルコール、多糖類、グルコサミン、マンニトール、ポリマーおよびキサンタンを含むがこれらに限定されるものではない。
【００９６】
好ましくは、免疫原は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）の免疫原性断片である。より好ましくは、免疫原は、ＢＶＤＶのＥ２タンパク質またはその断片である。構造エンベロープ糖タンパク質Ｅ２は、主免疫原決定基であり、Ｅ２による免疫化が中和抗体の産生を引き起こすので、サブユニットワクチンとして理想的な候補である。自然感染またはワクチン投与後にＥ２によって産生される中和抗体は、その後のＢＶＤＶ感染に対するもっとも重要な保護媒介体と考えられる。好ましくは、免疫原性組成物中に用いられるＥ２タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現を用いて発生させた可溶性無エンドトキシンＥ２である。こうして発現させたＥ２タンパク質は、マウスおよびヒツジにおいて免疫原性であることが示されており、いくつかのＢＶＤＶ−Ｅ２特異的抗体によって検出可能であった。このＥ２タンパク質は、本明細書においてはＯｐｔｉＥ２タンパク質と呼ばれる。
【００９７】
ウシウイルス性下痢（ＢＶＤ）は、重い粘膜損傷および臨床疾患、たとえば生殖欠陥、先天性欠陥および持続感染症を引き起こす流行性のウシ疾病である。普通はウシペスチウイルスとして知られるＢＶＤＶは、主に牛および一部の羊に感染する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ペスチウイルスに関する主な懸念は、受ける重大な経済的損失だけに限られず、これらのウイルスが宿主特異的でなく、家畜、たとえば羊、豚および山羊の間に容易に広がりうることを意味するという事実にもある。羊および山羊がＢＶＤＶに感染し、それからウイルスを牛に戻してうつすことができることが確立されている。ＢＶＤＶは、アメリカ野生および水牛の集団でも見いだされている。
【００９８】
現在、入手可能な生および不活性化型のＢＶＤＶワクチンは、急性感染症と関連する大多数の臨床疾患の予防に比較的効果があるが、これらのワクチンは、持続性感染した動物による伝染に対しては完全に保護することができない。これまで、ペスチガード（Ｐｅｓｔｉｇａｒｄ）（登録商標）（ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））がオーストラリアで使用を承認されている唯一のＢＶＤＶワクチンである。ペスチガードは、オーストラリア−トランジー（Ｔｒａｎｇｉｅ）およびベガ（Ｂｅｇａ）において単離されたＢＶＤＶの抗原性の（ａｎｔｉｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ）異なる２つの１型株による不活性化型ウイルスワクチンである。このワクチンは、６〜８週の間を置いて２回の投与分として投与される必要があり、その後は毎年のブースター注射が必要である。一度、開けるとこのワクチンは１ヶ月という短い貯蔵寿命しかなく、冷蔵が必要である。英国ではＢＶＤＶワクチンボビリス（Ｂｏｖｉｌｉｓ）ＢＶＤ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）が入手可能であり、Ｃ−８６株の不活性化型ＢＶＤＶ抗原を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）。ボビリスは、ＢＶＤＶの経胎盤感染から胎児を保護し、保護のために動物は毎年のブースター投与分を必要とする。ボビリスは、＋２℃から＋８℃で１８ヶ月の貯蔵寿命を有する。一度、開けるとこのワクチンの貯蔵寿命は、１０時間に低下する。
【００９９】
サブユニットワクチンは、高度に精製された組み換え抗原、たとえばタンパク質およびペプチドを含み、これらのワクチンは、通常のワクチンより安定であり、より良好な安全性プロフィールを有する。しかし、サブユニットワクチンは、低い免疫原性を有することがあり、代謝酵素による分解のために腸管粘膜組織を越えることができないことが多い。サブユニットワクチンの免疫原性を改善するために、調合物にアジュバントが加えられることが多い。アジュバントは、樹状細胞（ＤＣ）の活性化を増強し、強い抗原特異的免疫応答を生じさせるためにワクチン調合物に加えられる化合物と定義される。
【０１００】
本発明のシリカベシクルは、ＤＮＡワクチンとともに用いるのにも適する。ＤＮＡワクチンは、強い免疫応答および高い特異性を誘発することができる一方で、インビボでの低い細胞移入効率の問題を抱えることが多い。エンドサイトーシスによって細胞壁を効率的に通り抜け、生物的に活性な貨物を放出する能力によって、本発明の免疫原性組成物は、高い移入効率を有する効果的なＤＮＡワクチンを開発するために用いることができる。
【０１０１】
Ｑｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）サポニンベースのアジュバントは、抗原に対するＴｈ１免疫応答および細胞毒性Ｔリンパ球の産生を刺激することが知られているので、感染性疾患および癌免疫療法用のサブユニットワクチンでの使用に理想的である。しかし、注射部位における痛覚、重い局所反応および毒性プロフィールのような欠点のために、これらのアジュバントはヒトへの使用に適さない。
【０１０２】
実験の部において、ＭＤＢＫ細胞へのインビトロ細胞毒性を検査するための本中空シリカベシクルＳＶ−１０−ｘ−１４０（非修飾シリカベシクルである）およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ（アミノ修飾シリカベシクルである）の使用が、ナノワクチン調合物中の送達剤としてのそれらの使用の検査への前置きとして示される。細胞培養検査において、アミノ官能化ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａが０．５ｍｇ／ｍｌの濃度において非官能化ＳＶ−１０−ｘ−１４０と比較して毒性が強いことが見いだされた（図１８）。しかし、０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．０１ｍｇ／ｍｌというより低い濃度において、ＳＶ−１０−ｘ−１４０とＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａとの両方が低毒性であることが見いだされた。したがって、インビトロ細胞毒性結果にもとづいてさらなる検討のためにＳＶ−１０−ｘ−１４０とＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａとの両方が選ばれた。ＯｐｔｉＥ２タンパク質装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａの濃度は、一夜吸着後にタンパク質アッセイによって定量すると２００μｇタンパク質／ｍｇシリカベシクルであった。これは、優れたレベルの抗原成分の装荷を表し、本中空シリカベシクルの有利な特徴である。
【０１０３】
さまざまな緩衝液中の３７℃におけるＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶについてのインビトロ脱着測定は、本ＳＶに一度結合したタンパク質が容易に解離せず、さらに有利であることを示す。しかし、０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）およびクエン酸緩衝液ｐＨ  ４．０で実験が行われるとＯｐｔｉＥ２タンパク質が解離せず、０．１％ＳＬＳ中でタンパク質の最小限の脱着が起こった。
【０１０４】
非官能化ベシクルおよびアミノ官能化ベシクルに求められる最適な特性、たとえば細孔径、表面積および官能化を決定するために、インビボ動物検査において両方を検討した。ＯｐｔｉＥ２（５０μｇ）装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０（２５０μｇ）およびＯｐｔｉＥ２（５０μｇ）装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ（２５０μｇ）免疫原性組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を注射された処置群は、ＯｐｔｉＥ２（５０μｇ）プラスＱｕｉｌ  Ａ（１０μｇ）を投与された陽性対照群と同程度の優れた抗体応答を誘導した。しかし、従来型アジュバントＱｕｉｌ  Ａを共投与しても、Ｑｕｉｌ  ＡプラスＨＳＶナノワクチンを注射された処置群は、陽性対照群およびＯｐｔｉＥ２タンパク質装荷ＨＳＶ群と同じように見えたので、全ＩｇＧ力価およびＯｐｔｉＥ２へのＩＦＮ−γ応答を増強しなかった。アジュバントは、免疫賦活剤のようにまたは抗原送達ビヒクルとして作用し、Ｑｕｉｌ  Ａは、Ｔ細胞性免疫応答を開始することが知られており、本発明者らは、シリカベシクルが抗体媒介応答とＴ細胞性応答との両方を誘導する能力を有することを示している。アジュバントとナノ粒子との共投与が強い免疫応答を誘発するという仮定は、免疫賦活効果および抗原の『停車場効果』持続放出にもとづいていた。この場合、Ｑｕｉｌ  Ａは免疫応答を強化し、抗原装荷ナノ粒子は送達ビヒクルおよび免疫賦活剤として作用する。しかし、この実験から得られた結果は、シリカＨＳＶと従来型アジュバントＱｕｉｌ  Ａとの共投与が、強固な免疫応答を誘導しなかったことを示す。
【０１０５】
これは、優れた免疫賦活剤ならびに抗原送達ビヒクルとして作用するときの本シリカベシクルのアジュバント特性を浮き彫りにし、タンパク質プラスＳＶナノ調合物を投与された群は、陽性対照群より良好なＯｐｔｉＥ２エピトープへのＩＦＮ−γ応答を誘導した。抗原装荷したＳＶ−１０−ｘ−１４０とＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａとの両方が良好な抗体応答および細胞性免疫応答を誘発した。マウスは試行全体を通して健康なままであり、注射部位に眼に見える局所応答はなかった。タンパク質／ナノ粒子調合物への従来型アジュバントＱｕｉｌ  Ａの添加は、免疫応答を増強しなかった。これは、ＳＶ自体が優れたアジュバントとして作用し、したがってナノワクチンまたは免疫原性組成物の一部として使用されるとき複数の利点を示すことを示した。
【０１０６】
優れた結合特性、低い毒性、比較的高い細胞取込レベルおよび細孔壁構造は、結果として免疫原性組成物の一部として非常に有利な特性を有するＨＳＶを生じる。これらの特性、特に、ＨＳＶの大きな内部空洞と組み合わされた細孔壁構造によってこの送達システムは、単回投与ワクチン製品の開発および製造に特に適する。より詳しくは、ＨＳＶの大きな内部空洞は、大量の薬物がＨＳＶ中に装荷され、通常より大きな薬物の投与分が患者または対象へ送達されることを可能にする。ＨＳＶの細孔壁構造によってＨＳＶからの薬物の限られた放出速度が得られるので、この大きな投与分はすべてが一度に生物利用可能にならず、過剰投与が起こらないようにする。むしろ、薬物は、免疫応答が長い期間にわたって誘発されるように徐々に放出される。こうして、従来法では多回投与方式（たとえばプライム−ブースト方式）を用いて送達される薬物を、本明細書に記載される調合物中のＨＳＶを用いることによって、単回投与薬物となるように開発することができよう。多回投与から単回投与への薬物の投与方式の転換は、多回投与で送達される一部の薬物の実際の効力が多回投与方式の遵守されにくさのために限定されるので、低くなる投与コストおよび可能性として遵守しやすくなることを含む複数の利点を有する。
【０１０７】
さらに、ワクチン免疫原／抗原、より一般的にはタンパク質には、長い間低い熱安定性という弱点があり、ワクチン抗原またはタンパク質の分解および性能の低下を避けるために製造の時点から現場における使用まで冷蔵（コールドチェーン）を必要とする。医薬品研究における大きな目的は、熱安定性を向上させることであった。これが使いやすさを大いに向上させ、特に、遠隔地域、たとえば一部の農場および発展途上国においてワクチンおよびタンパク質治療薬のコストを下げるからである。本発明者らは、本発明のシリカベシクル内に含有されたタンパク質が熱安定性を大幅に向上させ、これによってシリカベシクル内に収容されたタンパク質は、タンパク質を顕著に変性させることおよびその生物活性に影響を及ぼすことなく室温より十分高い温度にさらされてよいことを見いだした。高温への曝露は、シリカベシクル／タンパク質の系が液体キャリア中にあるかまたは乾燥粉体の形である間に行われてよい。後者は、望むならタンパク質含有シリカベシクルをすっかり乾燥させ、液体キャリア中に再構成（再懸濁）することができるので、可能である。
【０１０８】
本発明者らは、本発明のシリカベシクル内にタンパク質をカプセル化すると、酸による分解に対するタンパク質の抵抗性が高くなることも見いだした。これは、タンパク質または他の酸に敏感な分子の経口送達経路による送達のためにシリカベシクルが用いられる状況にとって特に有用な特徴である。タンパク質は、通常は胃の中で高度に酸性の環境のために分解され、薬学的に効果が低下するので経口経路によって送達するのが難しい。驚くべきことに、本発明者らは、シリカベシクル内に収容されたタンパク質が、胃の環境を模した酸性条件へさらされてもあまり変性しないことを見いだした。よって、酸に敏感な分子、たとえばタンパク質が送達されることが望まれる経口剤形の開発においてシリカベシクルを用いることが実行可能なことがある。トリプシンおよび他の消化薬剤からの同様な保護も提供される。
【０１０９】
本発明の第６の側面は、治療として有効な量の第５の側面の免疫原性組成物を投与するステップを含む、対象において免疫応答を誘発する方法にある。
【０１１０】
本発明の免疫原性組成物は、予防するため（予防ワクチンの場合）または処置するために（処置のために用いられるワクチンの場合）用いられる相手の疾患の型において限定されないことは当然である。本発明の免疫原性組成物を用いて処置または予防することができる疾患の例は、アデノウイルス４型および７型、炭疽熱、結核、ジフテリアおよび破傷風、百日咳、Ｂ型肝炎、ポリオウイルス、ヘモフィルス、髄膜炎菌性髄膜炎、Ａ型肝炎、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、日本脳炎、はしか、おたふくかぜおよび風疹、肺炎球菌性疾患、狂犬病、ロタウイルス、痘瘡、腸チフス、みずぼうそうおよび黄熱病を含むがこれらに限定されるものではない。
【０１１１】
免疫応答は、細胞性免疫応答または抗体免疫応答であってよい。
【０１１２】
本発明の第７の側面は、治療として有効な量の第５の側面の免疫原性組成物を投与するステップを含む、対象における疾患または病態を予防または処置する方法にある。
【０１１３】
一実施形態において、疾患または病態は、ウシウイルス性下痢、ウシ流行熱、アナプラズマ症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、Ｂ型肝炎ウイルスおよびインフルエンザならびに上記で第５および第６の側面に関連して挙げられた疾患または病態であってよい。
【０１１４】
本明細書において用いられる用語「対象」または「個体」または「患者」は、治療または予防が望まれるいずれの対象、詳しくは脊椎動物の対象、およびさらに詳しくは哺乳類または魚の対象も指してよい。適当な脊椎動物は、霊長類、鳥、家畜動物（たとえば羊、牛、馬、ロバ、豚、魚）、検査動物（たとえばウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、伴侶動物（たとえば猫、犬）および捕獲野生動物（たとえば狐、鹿、ディンゴ）を含むがこれらに限定されるものではない。好ましい対象は、牛、羊、豚、魚または山羊からなる群から選ばれる家畜動物である。
【０１１５】
本発明の第８の側面は、疾患または病態の処置のための医薬品の製造における第２または第３の側面のシリカベシクルと、免疫原との使用にある。
【０１１６】
疾患または病態は、本発明の第５の側面から第７の側面に関連して上記に記載したもののいずれか１つ以上であってよい。
【０１１７】
本発明の第９の側面は、第２の側面または第３の側面のシリカベシクルのアジュバントとしての使用にある。
【０１１８】
免疫原、シリカベシクル、処置する疾患または病態などを含む第６の側面、第７の側面、第８の側面および第９の側面のすべての要素は、第１の側面から第５の側面のいずれかに既に記載されている通りであってよい。
【０１１９】
上記で考察したように、本明細書に記載されている方法によって合成されたシリカベシクルが優れた免疫賦活剤ならびに抗原送達ビヒクルとして作用することが実験によって示されている。ＳＶの存在でＯｐｔｉＥ２エピトープへのＩＦＮ−γ応答の改善が示されている。
【０１２０】
実験
材料
商品名Ｂ５０−６６００のブロックコポリマーＥＯ３９ＢＯ４７ＥＯ３９［ＥＯはポリ（エチレンオキシド）、ＢＯはポリ（ブチレンオキシド）である］は、ダウ・カンパニー（Ｄｏｗ  Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入した。オルトケイ酸テトラエチル（ＴＥＯＳ、≧９８％）、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）およびフルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）は、すべてシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入した。その他の試薬は、分析試薬グレードであった。
【０１２１】
分析
ＨＳＶの形態は、１．５ｋＶ動作のＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ７８００Ｆ電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ−ＳＥＭ）を用いて観察した。ＦＥ−ＳＥＭ測定のために、粉体化した試料をエタノール中に分散させ、その後でアルミニウム箔片上に滴下させ、ＳＥＭマウント上の導電性カーボンフィルムに取り付けることによって試料を調製した。
【０１２２】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）像は、２００ｋＶおよび１００ｋＶで動作のＪＥＯＬ  ２１００およびＪＥＯＬ  １０１０でそれぞれ得た。ＴＥＭ測定のために、粉体化した試料をＣｕグリッド上のカーボンフィルム上でエタノール中に分散させ、乾燥させることによって試料を調製した。
【０１２３】
窒素吸着／脱着等温線は、マイクロメリティクス（Ｍｉｃｒｏｍｅｒｉｔｉｃｓ）トライスター（Ｔｒｉｓｔａｒ）ＩＩシステムを用いて７７Ｋで測定した。試料は、真空ラインを用いて４５３Ｋで一夜脱気した。細孔容積および空洞サイズ分布曲線は、ブレクホフ（Ｂｒｏｅｋｈｏｆｆ）およびデ・ボア（ｄｅ  Ｂｏｅｒ）（ＢｄＢ）モデルを用いて等温線の吸着分岐から導いた。バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）−ジョイナー（Ｊｏｙｎｅｒ）−ハレンダ（Ｈａｌｅｎｄａ）（Ｈａｌａｎｄａ）（ＢＪＨ）法を利用して脱着分岐から入口サイズを計算し、ブリュナウアー（Ｂｒｕｎａｕｅｒ）−エメット（Ｅｍｍｅｔｔ）−テラー（Ｔｅｌｌｅｒ）（ＢＥＴ）法を利用して比表面積を計算した。全細孔容積は、０．９９の最大相対圧力（Ｐ／Ｐ０）において吸着した量から計算した。
【０１２４】
フーリエ（Ｆｏｕｒｉｅｒ）変換赤外（ＦＴＩＲ）スペクトルは、ダイヤモンド（Ｄｉａｍｏｎｄ）ＡＴＲ（減衰全反射）結晶を備えたサーモニコレー（ＴｈｅｒｍｏＮｉｃｏｌｅｔ）ネクサス（Ｎｅｘｕｓ）６７００  ＦＴＩＲ分光計を用いて取得した。スペクトルごとに４ｃｍ−１の分解能で４００ｃｍ−１〜４０００ｃｍ−１の範囲にわたり３２回のスキャンを取得した。
【０１２５】
シリカベシクルの形成のリアルタイムモニタリングを可能にするために、さまざまな反応時間において反応混合物のクライオＴＥＭおよびＡＴＲ−ＦＴＩＲを行った。クライオＴＥＭ試料調製のために、ブロックコポリマーを含有する緩衝溶液にＴＥＯＳを加える前後に、Ｃｕ  ＴＥＭグリッド上のカーボンフィルム上に１滴の反応混合物を落とし、その後は１５時間および２４時間の時点で試料を分析した。ＴＥＭグリッドは、液体窒素で１０分間処理し、次に少なくとも２日間凍結乾燥した。
【０１２６】
ＡＴＲ−ＦＴＩＲ検討のために、ステップ１における緩衝溶液へのＴＥＯＳの添加後のさまざまな反応時間（３、６、９、１２、１５および２４時間）において、一連のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを取得した。各スペクトルは、等量のＮａ２ＳＯ４を有する同じ緩衝溶液を用いて測定したバックグラウンドと対比して得た。７０℃において行ったステップ２の反応混合物についてさらに２回の分析を行った。分析は、３時間および６時間においてそれぞれ行った。
【０１２７】
中空シリカベシクルの調製
ステップ１：３０ｇのｐＨ＝４．７のＮａＡｃ−ＨＡｃ緩衝溶液（［ＮａＡｃ］＝［ＨＡｃ］＝０．４０Ｍ）に０．５ｇのＥＯ３９ＢＯ４７ＥＯ３９を溶解し、１０℃で撹拌しながら０．８５２ｇのＮａ２ＳＯ４（０．２０Ｍ）を加えて均一な溶液を形成させた。この溶液に、３．３３ｇのＴＥＯＳを加え、２４時間連続撹拌した。
【０１２８】
ステップ１における温度の影響を検討するために、他のすべてのパラメータを同じに保って２０℃において第２の実験を行った。
【０１２９】
ステップ１における撹拌の影響を検討するために、他のすべてのパラメータを同じに保ったが１０分間だけ撹拌を行い、その後は反応混合物を静止条件に２４時間置いてさらに別の実験を行った。撹拌しないと現れる反応混合物の別々の相を、次のステップに進ませるために別々の容器に分離する。
【０１３０】
ステップ２：ステップ２において、ステップ１からの反応混合物を適温（別々の実験において４０、５０、６０または７０℃をすべて試行した）に上げ、さらに２４時間連続撹拌した。
【０１３１】
ステップ３：ステップ２からの反応混合物を、さまざまな温度において別々に水熱処理（ＨＴ）にさらした。これを実現するために、適切な試料を反応容器から取り出し、オートクレーブに入れ、１、２、２．５、３．５、５、８および１０バールの圧力で、それぞれ１００℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、１７０℃または１８０℃のうち１つでさらに２４時間水熱処理した。この処理ステップ後に、沈殿物を濾別し、水で繰り返し洗浄して加えられた塩を除去し、次いで空気中で乾燥した（本明細書においては『合成後試料』と呼ばれる）。合成後試料の空気中５５０℃における５時間の焼成によって最終生成物を得た。ステップ２後に中空シリカベシクルが得られることを示すために、ステップ３に付すことなく複数のそれらの試料から沈殿物を濾過除去し、洗浄し、焼成し、分析できるようにした。
【０１３２】
ＨＳＶのアミノおよびＦＩＴＣ修飾
ＨＳＶアミノ修飾プロセスにおいては、１．５ｇの焼成されたＳＶ−１０−５０およびＳＶ−１０−５０−１４０を別々のフラスコに加えた。各フラスコの中に６０ｍｌのトルエンを加え、反応物を６時間撹拌してから１．０ｍｌのＡＰＴＥＳを加えた。１１０℃において１２時間撹拌した後に、ＨＳＶをトルエンおよびエタノールでよく洗浄してから換気フード中室温で乾燥した。アミノ修飾試料を相応にＳＶ−１０−５０−ＡまたはＳＶ−１０−５０−１４０−Ａと表記した。
【０１３３】
ＨＳＶをＦＩＴＣで修飾するために、ＦＩＴＣで標識化するための遊離−ＮＨ２部分を利用した。ＦＩＴＣの官能基チオシアネートは、アミノ反応性が高い。２０ｍｇの粉体化ＳＶ−Ａ、すなわちアミノ修飾シリカベシクルを３ｍｌの脱イオン水中に分散し、５ｍｌのＦＩＴＣエタノール溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ）と混合した。暗所において室温で６時間撹拌した後に、ＳＶを遠心分離し、上清が無色になるまでエタノールで３回洗浄した。ＦＩＴＣ標識化ＳＶは、ＳＣＣ２５細胞取込実験においた使用した後に共焦点顕微鏡法観察のために用いた。
【０１３４】
ＨＳＶの疎水性修飾
ＳＶの疎水性修飾を実現するために、２つの５０ｍｌ三つ口フラスコに４８ｍｇの焼成されたＳＶ−１０−５０およびＳＶ−１０−５０−１４０を別々に加えた。各試料を６ｍｌのトルエンで取込み、反応体混合物を６時間撹拌した後に０．１２ｍｌ（２％体積／体積）のｎ−オクタデシルトリメトキシルシラン（ｎ−ＯＤＭＳ）を加えた。１１０℃で１２時間撹拌した後に、疎水性修飾されたＳＶをトルエンおよびエタノールでよく洗浄してから換気フード中室温で乾燥した。疎水性修飾ＳＶ生成物を相応にＳＶ−１０−５０−Ｃ１８（Ｃ１８）またはＳＶ−１０−５０−１４０−Ｃ１８（Ｃ１８）と表記した。
【０１３５】
細胞培養および取込
ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の改変イーグル培地（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）中でＳＣＣ２５細胞を維持し、５％ＣＯ２中３７℃においてウシ胎児血清（１０％、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミズーリ州（ＭＯ））、Ｌ−グルタミン（１％）、ペニシリン（１％）およびストレプトマイシン（１％）を補った。定型として一日おきに培地を取替え、細胞は、飽和密度に達する前にトリプシン処理によって分離した。６−ウェルプレート中でスライドガラスにＳＣＣ２５細胞を接種（１ウェルあたり５×１０５細胞）し、２４時間インキュベーションした。ＰＢＳで２回洗浄した後に、２ｍｌの血清補助ＤＭＥＭ培地中で１μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識化ＳＶ−１０−５０またはＳＶ−１０−５０−１４０とともに細胞を２４時間インキュベーションした。その後で、細胞をＰＢＳで２回洗浄して残っているＳＶおよび死細胞を除去した。次に、４℃で２ｍｌの４％ＰＦＡ溶液中で細胞を３０分間固定し、核をＤＡＰＩで染色し、スライドガラスに載せた。最後に、共焦点顕微鏡（ＬＳＭツァイス（Ｚｅｉｓｓ）７１０）で細胞を観察し、像を記録した。
【０１３６】
シトクロムＣの装荷および染色
焼成後またはアミノ修飾に続いて１ｍｇのＳＶ−１０−５０またはＳＶ−１０−５０−１４０を含有する０．５ｍｌのＰＢＳ溶液を０．５ｍｌのシトクロムｃ−ＰＢＳ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）と混合した。２５℃である範囲の異なる時間（５分、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、８時間および１２時間）インキュベーションした後に、混合物を遠心分離した。シトクロムｃ装荷効率を評価するために、上清を集め、ＵＶ−２４５０（紫外可視分光光度計、島津）を用いて４８０ｎｍの波長で残留シトクロムｃ含有量を測定した。元のシトクロムｃ濃度および残留シトクロムｃ濃度と体積とにもとづいてシトクロムｃの装荷量を計算することができる。シトクロムｃ装荷ＳＶを１ｍｌに再分散させた。この懸濁液の１滴をＣｕ  ＴＥＭグリッド上のカーボンフィルム上へ滴下させ、空気中で乾燥させることができる。次に、ＴＥＭグリッドを６０℃において５０％エタノール溶液中の染色剤５％酢酸ウラニル（ＵＡＴ）で６分間処理した。染色されたＴＥＭグリッドを脱イオン水で洗浄し、空気中で乾燥させた。
【０１３７】
リボヌクレアーゼＡの装荷および染色
超音波浴を用いてＳＶ−１０−５０−Ｃ１８（Ｃ１８）またはＳＶ−１０−５０−１４０−Ｃ１８（Ｃ１８）のどちらかを１ｍｇ含有する０．５ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液を懸濁液として調製した。各懸濁液を０．５ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮアーゼＡ）−ＰＢＳ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）と混合した。２５℃のインキュベーター中、２００ｒｐｍで１８時間振盪した後に混合物を遠心分離した。ＲＮアーゼＡ装荷効率を評価するために、２００ｎｍフィルターを通して上清を集め、ＵＶ−２４５０（紫外可視分光光度計、島津）を用いて残留ＲＮアーゼＡ含有量を２７７．５ｎｍの波長で測定した。元のＲＮアーゼＡ濃度および残留ＲＮアーゼＡ濃度と体積とにもとづいてＲＮアーゼＡの装荷量を計算することができる。ＲＮアーゼＡ装荷ＳＶを１ｍｌに再分散させた。この懸濁液の１滴をＣｕ  ＴＥＭグリッド上のカーボンフィルム上へ滴下し、空気中で乾燥させた。次に、ＴＥＭグリッドを６０℃において５０％エタノール溶液中の染色剤５％酢酸ウラニル（ＵＡＴ）で６分間処理した。染色されたＴＥＭグリッドを脱イオン水で洗浄し、空気中で乾燥させた。
【０１３８】
細胞毒性およびＲＮアーゼＡ変性
ＳＣＣ２５細胞をウェルあたり２×１０４細胞の密度で９６−ウェルプレートに接種し、５％ＣＯ２中３７℃で２４時間培養した。次に、ＤＭＥＭ培地中の細胞に遊離ＲＮアーゼＡ、ＳＶ、ＲＮアーゼＡ装荷ＳＶおよび対応する変性試料を４〜１６μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ用量で加え、５％ＣＯ２中３７℃において細胞を２４時間および７２時間インキュベーションした。その後、各ウェルにＭＴＴ試薬（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌの溶液から１０μｌ／ウェル体積）を加え、１０秒間振盪してから３７℃において４時間インキュベーションした。上記細胞毒性実験のための遠心分離の後、上清の除去後に沈殿物（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｎｔｓ）を集めた。次に、各ウェルにＤＭＳＯ（１００μｌ）を加えてホルマザン結晶を溶解し、マイクロプレート読取装置（スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）Ｍ５、バイオ−ストラテジー・リミテッド（Ｂｉｏ−Ｓｔｒａｔｅｇｙ,  Ｌｔｄ））を用いて５７０ｎｍの光学密度（ＯＤ）を記録した。ＳＶおよびＲＮアーゼＡを存在させないでインキュベーションした細胞を対照として用いた。各群についてすべての実験を３回ずつ行った。
【０１３９】
遊離ＲＮアーゼＡとＲＮアーゼＡ装荷ＳＶとの両方を含むＲＮアーゼＡの熱および酸変性後に、別の系列の対照群を調製した。変性プロセスにおいて、１ｍｇの遊離ＲＮアーゼＡまたは６〜９ｍｇのＳＶ（１ｍｇのＲＮアーゼＡを装荷した）に５０μｌのＨＣｌ（０．０１Ｍ、ｐＨ２．０）溶液を加えた。この混合物を６５℃で４０分間インキュベーションし、冷却し、遠心分離した。混合物に正確なｐＨ試験紙によって示されるｐＨが約７に達するまでＮａＯＨ（０．０１Ｍ）溶液を滴下して加え、本実験において変性ＲＮアーゼＡ群として用いた。
【０１４０】
ワクチン送達システムとしての中空シリカベシクル
ＨＳＶ特性
『ナノワクチン』実験において用いられるＳＶは、下の表１に示される特性を有する非修飾『ＳＶ−１０−ｘ−１４０』とアミノ修飾『ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ』版との両方であった。
【０１４１】
【表１】
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【０１４２】
インビトロ細胞毒性アッセイのためのトリパンブルー染色
マディン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞（ＡＴＣＣ）を２４ウェルプレート中のスライドガラスに８０〜９０％飽和密度で接種し、５％ＣＯ２（ＣＯ２）中３７℃のインキュベーター中で一夜接着させた。細胞に対するナノ粒子濃度の影響を検討するために、希釈範囲（０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．０１ｍｇ／ｍｌ）のイーグル（Ｅａｒｌｅ’ｓ）最小必須培地（５％ウシ胎児血清（ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有する）中でＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ粒子を調製し、接着細胞に穏やかに滴下して加えた。非官能化ＳＶ−１０−ｘ−１４０、ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａおよび合成ナノ粒子としてＭＣＭ−４１（市販メソ多孔質シリカ）を存在させて５％ＣＯ２中３７℃で２０時間細胞をインキュベーションした。培地を注意深く除去し、ウェルをＰＢＳで穏やかに３回洗浄してＳＶ／ナノ粒子を除去した。細胞生存率を決定するために、０．２％トリパンブルー染色液（ライフ・テクノロジーズ）を２分間で加えた。トリパンブルー染色液を注意深く除去し、ウェルをＰＢＳで１回洗浄した。ｐＨ７．４の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で細胞を１５分間固定し、次にＰＢＳで３回洗浄した。スライドガラスに５μｌのＭＯＷＩＯＬ（シグマ）を載せた。ツァイスＨＡＬ  １００顕微鏡で明視野のイメージングによって細胞生存率を決定した。
【０１４３】
ＳＶおよびＳＶ−Ａナノ粒子へのＯｐｔｉＥ２吸着
吸着反応は、１．５ｍｇのＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ粒子と２．５ｍｇ／ｍｌの無菌トリス緩衝液中の３００μｇのＯｐｔｉＥ２とを２ｍｌの最終体積で用いた。この粒子−タンパク質スラリーを室温（ＲＴ）において振盪機にかけ、２４時間後に粒子−タンパク質スラリーの試料（５０μｌ）を取り出し、１６．２ｇで１分間遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の上清の電気泳動によって結合していないＯｐｔｉＥ２タンパク質の量を推定した。
【０１４４】
脱着測定
ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａナノ粒子ペレットを１０００μｌのＰＢＳプラス０．１％ＳＬＳ（ラウレス硫酸ナトリウム）または０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）またはｐＨ  ４．０のクエン酸緩衝液中に再懸濁し、試料を室温で１２０分間２００ｒｐｍの振盪機にかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の上清の電気泳動によって脱着タンパク質を推定した。
【０１４５】
タンパク質アッセイ
タンパク質アッセイ（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＤＣキット）によって、製造者の指示に従い、吸着試料の上清を定量した。
【０１４６】
ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙａｌａｍｉｄｅ）ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）
シリカベシクル／ナノ粒子試料を１５μｌのＰＢＳおよび５μｌのＳＲＢ（６２．５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１１７ｍＭ  ＤＴＴ、１０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルーからなるＳＤＳ還元性緩衝液）中に再懸濁し、８５℃で２分間インキュベーションし、次に１０％トリス−グリシンゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上で電気泳動に付した。ゲルを５０％メタノール、１０％酢酸、０．２５％クーマシーブルーＲ２５０中で３０分間染色することによって可視化し、続いて３０％メタノール、１０％酢酸中で３０分間の洗浄を３回行って脱色した。
【０１４７】
マウスで行われる免疫化測定
バイオロジカル・リソース・ファシリティー（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、クイーンズランド大学（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄ）、ブリスベーン（Ｂｒｉｓｂａｎｅ）、オーストラリアからＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入し、同所において特定病原体感染防止条件で収容した。８週齢雌マウスをＨＥＡＰフィルター付きケージ内で１群あたり４匹の動物で１２時間明と１２時間暗とのサイクルの環境制御区域に収容した。食餌および水を随時与えた。すべての手順は、クイーンズランド大学倫理委員会の承認を得た。研究全体にわたって動物を綿密に監視した。すべての動物が研究期間を通じて良好な健康状態にとどまり、眼に見える有害な健康影響はなかった。ヘパリン被覆ヘマトクリット管（ヒルシュマン・ラボールゲレーテ（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ  Ｌａｂｏｒｇｅｒａｅｔｅ）、ハイルブロン（Ｈｅｉｌｂｒｏｎｎ）、ドイツ）を用いる後眼窩静脈叢採血によって免疫化前血液試料を採取した。最初の免疫化の前に採取した免疫化前血液試料を免疫前（ＰＩ）試料と呼んだ。下の表２は、本研究における種々の処置群を示す。吸着反応物を上記のように無菌的に調製した。Ｑｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）（スーパーフォス・バイオセクター（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）、ベドバック（Ｖｅｄｂａｃｋ）、デンマーク）を無菌注射水（ファイザー、ブルックリン（Ｂｒｏｏｋｌｙｎ）、米国）中に２ｍｇ／ｍｌで再懸濁した。ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０、ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０プラスＱｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）、ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−ＡおよびＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−ＡプラスＱｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）によって生じる免疫応答の間の差異を検討するために、注射可能な投与分を４回の皮下注射によって尾の基部に投与した。マウスの陽性対照群は、５０μｇのＯｐｔｉＥ２タンパク質および１０μｇのＱｕｉｌ  Ａ（ＱｕｉｌＡ）を受けた。陰性対照群は、ＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ（２５０μｇ）ベシクルプラスＱｕｉｌ  Ａ（１０μｇ）の注射を受けた。無菌２７ゲージ針（テルモ（Ｔｅｒｕｍｏ）、東京、日本）を用いる尾の基部における皮下注射によって１００μｌの投与量（ファイザーの０．９％食塩水中）を投与した。非免疫化群を除くすべての処置群に２週間隔で３回の注射を投与し、最終免疫化の１４日後にマウスを屠殺した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを用いてＯｐｔｉＥ２特異的抗体応答を調べ、ＥＬＩＳＯＰＴアッセイを用いて細胞性応答を調べた。
【０１４８】
【表２】
0006622203.tif 000003
【０１４９】
ＥＬＩＳＡプロトコル
ＯｐｔｉＥ２特異的抗体応答の検出：マイクロタイタープレート（９６ウェル、ヌンク（Ｎｕｎｃ）、マキシソーブ（Ｍａｘｉｓｏｒｂ）、ロスキルデ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）をＰＢＳ中のＯｐｔｉＥ２抗原溶液（２ｎｇ・μＬ−１（μＬ−１）、５０μＬ）で４℃において一夜コーティングすることによってＯｐｔｉＥ２特異的抗体の検出のための酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。コーティング用溶液を取去り、プレートをＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ（１×）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（０．１％）、シグマ−アルドリッチ）で１回洗浄し、ＲＴで穏やかに振盪しながらＰＢＳ（２００μＬ）中のウシ血清アルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）（ＢＳＡ、５％、シグマ−アルドリッチ）および脱脂乳（５％、フォンテッラ（Ｆｏｎｔｅｒｒａ）、オークランド（Ａｕｃｋｌａｎｄ）、ニュージーランド）で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。マウス血清試料をＰＢＳ（５０μＬ）中１：１００から１：６４００に希釈し、各希釈物をブロックされたプレートのウェルに加えた後にＲＴで２時間インキュベーションした。マウス抗体を検出するために、ＰＢＳ中１：１０００に希釈したＨＲＰ共役ポリクローナル羊抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコン・オーストラリア（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ）、メルボルン（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）、ビクトリア州（ＶＩＣ）、オーストラリア）を各ウェルに加え、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した。各ウェルにＴＭＢ基質（１００μＬ、シグマ−アルドリッチ）を加え、室温で１５分間インキュベーションした。発色反応を止めるためにＨＣｌ（１Ｎ、１００μＬ）をウェルに加えた。ラブシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）マルチスキャン（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ）ＲＣプレートスキャナーを用いて４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０１５０】
マウス脾細胞の単離およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
安楽死後に無菌的に脾臓を取出し、ウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％）、Ｈｅｐｅｓ（２０ｍＭ、ｐＨ７．３）、ピルビン酸ナトリウム（１Ｍ）、グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）（１Ｍ）、ペニシリンＧ、ストレプトマイシン、ファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）（それぞれ計算最終量）を補った氷冷ＤＭＥＭ培地（５ｍＬ）中に置いた。脾臓を穏やかにすり潰し、注射器プランジャーを用いてナイロンメッシュ（１００ｍｍ、ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、フラクリン・レークス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ）、ニュージャージー（ＮＪ））を通過させた。細胞をＤＭＥＭ（５ｍＬ）で洗浄し、遠心分離し（８００ｇ、５分、４℃）、次に室温で５分間、溶菌緩衝液（ＮＨ４Ｃｌ（０．１５Ｍ）、ＫＨＣＯ３（１０ｍＭ）、Ｎａ２−ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）、１ｍＬ）中に再懸濁させた。洗浄ステップを２回、それぞれＤＭＥＭ（９ｍＬおよび５ｍＬ）で繰り返す。細胞ペレットをＤＭＥＭ（２ｍＬ）中に再懸濁させ、トリパンブルー（０．２％）で染色することによって細胞数を決定した。各マウス脾臓からの細胞をモノクローナルインターフェロン−ｇ（ＩＦＮ−γ）（マブテック（Ｍａｂｔｅｃｈ）捕集抗体をプレコートしたポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）のＥＬＩＳＰＯＴプレートに１．０〜１．５×１０５細胞／ウェル、１回に３点で接種した。陽性対照としてのＯｐｔｉＥ２抗原（１ｍｇ／ｍＬ、ＳＩＩＮＦＥＫＬ、オースペプ（Ａｕｓｐｅｐ）、パークビル（Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ）、ビクトリア州（ＶＩＣ）、オーストラリア）またはポリクローナル賦活因子コンカバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ、１ｍｇ／ｍＬ、シグマ−アルドリッチ）を存在させるかまたは存在させないで、細胞を３７℃、５％ＣＯ２中の完全ＤＭＥＭ培地中で４０時間インキュベーションした。製造者の仕様書に従ってＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（アウトイムン・ディアグノスティカ（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）、ストラスブルク（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ）、ドイツ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴプレートを読取った。
【０１５１】
結果
ＳＶの特性
図１は、ＳＶ−１０−５０（像Ａ）とＳＶ−１０−５０−１４０（像Ｂ）との両方が１００ｎｍ未満の均一な粒径を有する球状の形態を備えることを示す２つの電界放出型ＳＥＭ像（ＡおよびＢ）を示す。図２を見ると合成後ＳＶ−１０−ｘ−１００のＴＥＭ像は、大体５０ｎｍの直径と約５ｎｍの壁厚とを有する単層ベシクルを示す（図２Ａ）。倍率を上げたＴＥＭ像（図２Ｂ）から、ベシクル壁の中にシリカ−空洞−シリカのサンドイッチ状単層構造が形成され、図３に表されるシリカ−界面活性剤複合体の存在を示すことが分る。焼成後、ＳＶ−１０−５０は、図４Ａに見られるように単層ベシクル構造を維持し、ベシクル壁の内部で明らかに球状体を観測することができる。これは、シリカベシクルが、ケイ素質の壁の中の気泡状空洞であって互いに別々のものであってもよくまたは相互接続してＳＶの外部から内部空洞への通路を形成してもよい、これらの球状体からできた多孔壁構造を有することを示している。このことは図４Ｂにおいてもっともよく分る。ＳＶ−１０−５０−１４０は、単層ベシクル構造（図４Ｃ）を維持し、図４Ｄに示されるように壁において約１５ｎｍの入口サイズを観測することができる。
【０１５２】
シリカベシクル壁の中の空洞の存在は、Ｎ２収着分析によってさらに確認される。図５Ａは、ステップ（ｂ）の４０〜７０℃熱処理におけるＳＶ試料の窒素吸着−脱着等温線を例示する。等温線はすべてＨ２型ヒステリシスループを有するＩＶ型等温線を示し、これら４つの試料が第２ステップにおいて『中』温処理にさらされ、同様な細孔構造を有することを示す。Ｎ２収着結果からのさらなる構造情報を表１に示す。図５Ｂは、２バール、２．５バール、３．５バール、５バール、８バールおよび１０バールの圧力において１２０、１３０、１４０、１５０、１７０および１８０℃の水熱処理温度にさらされたＳＶ試料の窒素吸着等温線を示す。これらは、水熱処理温度が増すにつれて高い相対圧力へシフトする脱着分岐を有する典型的なＩＶ型等温線であることが分る。ＢｄＢ法を用いて窒素吸着等温線の吸着分岐から空洞サイズを計算し、ＢＪＨ法を用いて脱着分岐から入口サイズを計算する。図５ＣのＢｄＢ細孔径分布曲線は、４０〜７０℃で行ったステップ（ｂ）ＳＶ試料において大体２ｎｍから１５ｎｍを中心とするピークを示し、１〜１０バールの圧力で１００〜１８０℃の水熱処理温度を受けたＳＶ試料では、脱着分岐から計算したＢＪＨ細孔径分布曲線は、図５Ｄに見られるように、温度の増加とともに右側へシフトして入口サイズの増加を示唆するピークを示す。
【０１５３】
なお、すべてのＳＶ試料は、４０〜５０ｎｍのＢｄＢ計算内部空洞サイズを示す（図６）。これは、すべてのＳＶ試料がこの範囲の同様な空洞サイズを有することを示す。下の表３にまとめるように、ＳＶの細孔入口サイズは、６ｎｍ〜１６ｎｍの範囲で調節することができた。
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
焼成後のＳＶ−１０−７０のＴＥＭ像（図７Ａ）は、ＳＶ−１０−５０の場合に既に観測されたものと一致する細孔壁構造を有する同様なベシクル構造を示す。これに対して、焼成後のＳＶ−１０−ｘ−１００、ＳＶ−１０−ｘ−１３０およびＳＶ−ｘ−１８０のＴＥＭ像（図７Ｂ〜Ｄ）においては細孔壁構造を観測することはできず、適切な細孔壁構造形成にとって適温または中温における第２ステップの処理が必須であることを示す。Ｎ２収着結果と一致する大体１０および３０ｎｍのサイズを有する細孔入口もそれぞれ観測することができる（図７ＣおよびＤ）。
【０１５６】
比較として、１０分だけ撹拌し、その後は２４時間静置処理して生成したＳＶ試料のＴＥＭ像は、ベシクル構造を示さない。その代り、図８ＡおよびＢに示されるように短い管状構造体および非晶質シリカ構造体がそれぞれ観測される。図８Ｃに示す連続撹拌で実現した均一な白色の反応混合物と比較すると連続撹拌しなかった反応混合物は、図８Ｄに示す透明な下相と白色ゲル状の上相とに分離する。ＳＶ−２０−ｘ−１００のＴＥＭ像は、図８Ｅのベシクル構造体と管状構造体との混合物を示す。この結果から所望のベシクル形態の形成にとって何らかの形のかき混ぜが決定的であることが明らかである。
【０１５７】
クライオＴＥＭおよびＡＴＲ−ＦＴＩＲ観測
ＳＶ形成機構を理解するために、クライオＴＥＭを利用してステップ（ａ）（図３のＴ１）のさまざまな時点における成長中のベシクル構造を検討した。図９Ａに示すように、シリカ源（ＴＥＯＳ）の添加前に、ブロックコポリマーＢ５０−６６００界面活性剤は、２０ｎｍ未満の直径を有するミセルの形をしている。これは、予め形成されたベシクルテンプレートは合成において１２時間の時点で用いられず（図９Ｂ）、ＳＶの形成は、界面活性剤とシリカオリゴマーとの協同的な自己集合であることを示す。ＴＥＯＳ添加の１５時間後、自己集合したシリカ−界面活性剤ベシクルを観測することができる（図９Ｃ）が、ステップ１の終了時点で細孔壁構造を観測することはできない（図９Ｄ）。したがって、細孔壁構造が適温における後処理においてのみ形成されることが明らかである。
【０１５８】
上記で考察したクライオＴＥＭに加えて、ＡＴＲ−ＦＴＩＲ分光法を用いて反応混合物中で生成する化学種を観測した。図３に示したステップ（ａ）すなわちＴ１のさまざまな反応時間（３時間、６時間、９時間、１２時間、１５時間および２４時間）における反応混合物のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルを測定した。図１０Ａは、ＥｔＯＨ（ν（Ｃ−Ｏ）＋ν（Ｃ−Ｃ））および（ρ'（ＣＨ３）＋ρ（ＣＨ２））にそれぞれ帰属することができる８７７、１０４５および１２７２ｃｍ−１に表れる３つの特性ピークを示す。９６４ｃｍ−１に観測される弱く幅の広いバンドは、Ｓｉ−ＯＨ基のＳｉ−Ｏ伸縮と関連している。縮合したシリカ中のＳｉ−Ｏ−Ｓｉの振動は、１０５０〜１２００ｃｍ−１の領域に帰属が複雑な広いピークを示す。ステップ１からのすべてのスペクトルは、−Ｓｉ−ＯＣＨ２ＣＨ３基に帰属することができる同じ特性バンドを７８３ｃｍ−１、９６０ｃｍ−１（ρ（ＣＨ３））、１０８４ｃｍ−１（ν（Ｃ−Ｏ）／（Ｃ−Ｏ）＋（Ｃ−Ｃ））、１１０５ｃｍ−１ｃｍ−１（ρ′（ＣＨ３））、１１６７ｃｍ−１（ρ（ＣＨ３））、１２７２ｃｍ−１（τ（ＣＨ２））、１３９６ｃｍ−１（δｓ（ＣＨ３））に示す。
【０１５９】
図３に示したステップ（ａ）すなわちＴ１の２４時間の反応時間全体にわたる−Ｓｉ−ＯＣＨ２ＣＨ３基の存在は、ＴＥＯＳの加水分解速度が遅いことを示す。これは、アルコキシ基の立体効果によると考えることができる。８７８および１０４５ｃｍ−１のバンド（両方がエタノールに帰属される）の強度は、反応時間とともにゆっくり増加し、ＴＥＯＳの加水分解速度が遅く、ステップ（ａ）すなわちＴ１の時間窓の中でエトキシ基の加水分解反応が続行することを示す。なお、エトキシ（ｅｔｈｘｏｙ）基の加水分解から誘導されるシラノール基も９６０ｃｍ−１（Ｓｉ−Ｏ伸縮）近辺に特性バンドを示すはずである。しかし、放出されるエタノールの限られた量と、したがって生成する少量のシラノールとを考慮すると、シラノールのピークは、ＳｉＯＣＨ２ＣＨ３と関連するバンドと重なりうるので観測されないかもしれない。さらに、１０５０〜１２００ｃｍ−１の範囲の特性ピークを比較することによって、ＴＥＯＳ系におけるこの領域のバンドの明らかな広幅化（−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉの形成を示す）は観測されず、すなわちＴＥＯＳの縮合速度も遅い。その結果、ステップ（ａ）すなわちＴ１における支配的なケイ素化学種は、部分的に加水分解したシラノールと未反応の疎水性エトキシ基との両方である。ステップ（ａ）すなわちＴ１における疎水性シリカオリゴマーは、シリカ／界面活性剤複合体のｇ因子を高くする。ベシクルの形成は、界面活性剤ベシクルの形成と同様な複合体層の曲がりおよび閉じによると考えられる。
【０１６０】
図３に示したステップ（ｂ）すなわちＴ２の３時間および６時間における反応生成物のＡＴＲ−ＦＴＩＲスペクトルも測定し、図１０Ｂに示す。すべての特性ピーク（８７６ｃｍ−１、１０４５ｃｍ−１、１０８６ｃｍ−１、１２７７ｃｍ−１、１３４８ｃｍ−１、１４１３ｃｍ−１および１４５２ｃｍ−１）は、ＥｔＯＨ（ν（Ｃ−Ｏ）＋ν（Ｃ−Ｃ））および（ρ′（ＣＨ３）＋ρ（ＣＨ２））にそれぞれ帰属することができる。−Ｓｉ−ＯＣＨ２ＣＨ３基に帰属することができるピークはなく、ＴＥＯＳがこのステップにおいてはるかに速い加水分解速度と、ステップ（ｂ）における適温でのシリカベシクル−界面活性剤複合体中の−Ｓｉ−ＯＣＨ２ＣＨ３基からシラノールへの低い縮合速度と、を有することを示す。ステップ（ｂ）のこの親水性シリカオリゴマーは、シリカ／界面活性剤複合体のｇ因子を低下させ、それがベシクル骨格を変化させないでシリカ／界面活性剤複合体の高い曲率変化を生じさせてケイ素壁内に細孔壁構造を形成させる。これらのシリカベシクルについて提案された形成機構を図３に記載する。
【０１６１】
シトクロムＣの装荷および染色
図１１は、試験した中空シリカベシクル中のシトクロムｃの５分における高い吸着量を示す。これは、焼成後のＳＶ−１０−５０とＳＶ−１０−５０−１４０との両方の非常に速い吸着を示す。吸着レベルは、５分後に比較的定常のままであり、この短い時間間隔で既に最大吸着量に達していることを示す。装荷されたシトクロムｃの量は、ＳＶ−１０−５０、ＳＶ−１０−５０−１４０でそれぞれ６２０ｍｇ／ｇ、６４２ｍｇ／ｇであった。
【０１６２】
ＨＳＶに装荷されたシトクロムｃ用の染色剤として５０％エタノール溶液中の５％ＵＡＴを利用した。同じ染色法を純ＳＶ−１０−５０−１４０−Ｃ、すなわち焼成後に対照として適用し、図１２Ａに示したＴＥＭ像は染色していないＨＳＶのものと同様であり、このケイ素材がＵＡＴによって染色されないことを示した。図１２Ｂは、染色されたシトクロムｃである、コントラストが高くなった空洞（白の矢印によって示される暗くなった空洞）を有するいくつかのシリカベシクルを示す。空洞の高いコントラストは、図１２ＣおよびＤに見られるようにチルト角が高いと平均的なままである。これは、シトクロムｃがＨＳＶによって均一に吸着されることを示す。この染色法をＳＶ−１０−５０ベシクルにも適用した（図１３）。
【０１６３】
リボヌクレアーゼＡの装荷および染色
図１４に見られるＦＴＩＲスペクトルは、疎水性修飾後のベシクルのオクタデシル基の特性ピークを示し、シリカベシクルへの疎水性基のグラフト化の成功を示す。疎水性修飾後のＳＶ−１０−５０およびＳＶ−１０−５０−１４０について１８時間でのＲＮアーゼＡの吸着量は、それぞれ２０６±６ｍｇ／ｇおよび２７６±８ｍｇ／ｇである。ＳＶに装荷したシトクロムｃ用染色剤として５０％エタノール溶液中の５％ＵＡＴを利用した。疎水性修飾後の純ＳＶ−１０−５０に同じ方法を適用し、ＴＥＭ像（１５図）は、染色していないＳＶのものと同様であり、ケイ素材がＵＡＴによって染色されないことを示す。図１５Ｂは、染色されたＲＮアーゼＡを表すと考えられるコントラストが高くなった空洞（暗くなった空洞）を有する１個のシリカベシクルを示す。ＲＮアーゼＡは、ＳＶによって均一に吸着されることが示されている。
【０１６４】
細胞培養および取込
上記で説明したようにＦＩＴＣで標識化しておいたシリカベシクルを共焦点顕微鏡法によって調べて細胞取込を視覚化した。図１６に示すように、細胞をＦＩＴＣ標識化ＳＶ−１０−５０およびＳＶ−１０−５０−１４０とともにインキュベーションすると、細胞の内部でＦＩＴＣに由来する強い緑色の蛍光シグナルが検出され、ＨＳＶがＳＣＣ２５癌細胞によって容易に取込まれることを示す（図１６ＨおよびＬ）。ＦＩＴＣ標識化ＳＶ−１０−５０−１４０の方が、ＳＣＣ２５細胞によって内包化されるＳＶ−１０−５０−１４０の量の増加を示唆する強い信号を示す。
【０１６５】
細胞毒性
ＲＮアーゼＡは、ｍＲＮＡおよびｔＲＮＡを分解して細胞生存性に影響を及ぼすことができる強い蛋白合成撹乱因子とみなされる。ＲＮアーゼＡの熱変性はＭＣＦ−７細胞系統における細胞毒性を低下させ、この場合ＲＮアーゼＡは高密度シリカナノ粒子の外表面に共役したと報告されている。ヒト皮膚癌ＳＣＣ２５細胞における遊離ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＡ装荷ＳＶ、ＳＶおよび対応する変性試料の抗癌効果を検討した。同じＲＮアーゼＡ濃度の遊離ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＡ−ＳＶ、変性ＲＮアーゼＡまたは変性ＲＮアーゼＡ−ＳＶで細胞を処理した。ＳＶ中のＲＮアーゼＡの吸着量からＳＶ濃度を計算した。
【０１６６】
図１７の結果は、ＳＶ−１０−５０とＳＶ−１０−５０−１４０との両方が２４時間においてそれぞれ７８μｇ／ｍｌおよび５８μｇ／ｍｌの濃度でＳＣＣ２５細胞にほとんど毒性を示さないことを明らかにする。ＳＶ−１０−５０−１４０は、７２時間において低い毒性（１７％阻害）を示し、両方のＳＶ化学種が生体適合性のナノキャリアであることを示す。遊離ＲＮアーゼＡおよび変性後の遊離ＲＮアーゼＡは、ＳＣＣ２５細胞に細胞毒性を示さない。遊離ＲＮアーゼＡと比較すると、ＲＮアーゼＡ装荷ＳＶ−１０−５０および疎水性修飾後のＳＶ−１０−５０−１４０は、長い時間範囲にわたってもっとも高い細胞毒性（それぞれ２４時間において１７％、２６％、７２時間において５４％、４３％の阻害）を示した。興味深いことに、熱変性および強酸変性後のＲＮアーゼＡ装荷ＳＶは、遊離ＲＮアーゼＡより高いＳＣＣ２５細胞への細胞毒性を示し、ＳＶ−１０−５０およびＳＶ−１０−１４０についてそれぞれ２４時間で１４％、２２％、７２時間で４８％、３８％の阻害であった。変性後のＲＮアーゼＡ−ＳＶは、変性しなかったＲＮアーゼＡ−ＳＶより若干低い細胞毒性を示す。これらの結果は、本ＳＶが、シリカベシクル内に吸着されることが証明されるＲＮアーゼＡに苛酷な条件からの保護を提供することができることを示す。ＳＶ−１０−５０−１４０中に装荷したＲＮアーゼＡは、細胞取込の効率が高くなることに起因して高くなる細胞毒性を示した。
【０１６７】
ワクチン送達システム関連結果
インビトロ細胞毒性測定
ＭＤＢＫ細胞のトリパンブルー色素排除染色法によってＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルのインビトロ細胞毒性を判定した。さまざまな濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．０１ｍｇ／ｍｌ）のＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルで細胞を処理した。死細胞は透過性となった細胞膜を介する染料の取込によって青色を示したが、生細胞には変化がなく、染色液を取込まない。０．１ｍｇ／ｍｌおよび０．０１ｍｇ／ｍｌにおいてＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａは細胞生存率に対して毒性効果をまったく示さなかった（図１８、ｂ、ｃ、ｅおよびｆ）。しかし、０．５ｍｇ／ｍｌにおいてＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａは２０時間のインキュベーション後にＭＤＢＫ細胞に対して毒性効果があった（図１８ａ）。より低い濃度のＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルとともにインキュベーションした細胞は、ベシクルなしで単独でインキュベーションした細胞と同等に見え、したがってすべてのその後の実験検討は、ＳＶ−１０−ｘ−１４０ベシクルとＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルとの両方を用いて行った。
【０１６８】
吸着および脱着分析
ＯｐｔｉＥ２タンパク質を上記のようにＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルに装荷した。ＯｐｔｉＥ２の分子量は、４２ｋＤａである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて粒子への吸着があるかどうかを決定した。結合上清のタンパク質アッセイおよび物質収支式の適用を用いてＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−ＡベシクルへのＯｐｔｉＥ２吸着量を決定した。２００μｇのＯｐｔｉＥ２が、タンパク質アッセイによって定量すると１ｍｇのＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルに結合した。ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａについて脱着測定を行った。
【０１６９】
脱着を検討するために、ＯｐｔｉＥ２装荷ベシクルペレットを０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）、０．１％ＳＬＳおよびｐＨ４．０のクエン酸緩衝液を含むさまざまな緩衝液中に再懸濁させた。振盪機を用いて試料を３７℃で１２０分間インキュベーションした。脱着した上清および粒子部分についてのゲル分析は、０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）およびｐＨ４．０のクエン酸緩衝液を存在させるとタンパク質はベシクルと強く結合したままであり、ＳＶ−１０−ｘ−１４０とＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａとの両方から脱着しないことを示した（図１９）。
【０１７０】
図１９に示した分析結果の詳細は、以下の通りである。（ａ）ＯｐｔｉＥ２装荷ナノ粒子の評価、レーン１：ＯｐｔｉＥ２タンパク質；レーン２：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ上清；レーン３：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａナノ粒子ペレット；レーン４：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０上清；レーン５：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０ナノ粒子ペレット；（ｂ）ＯｐｔｉＥ２装荷ナノ粒子の脱着測定、レーン１：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ上清、０.１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）中脱着；レーン２：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａナノ粒子ペレット、０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）中脱着；レーン３：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ上清、０．１％ＳＬＳ中脱着（ｄｅｓｏｒｂｅｄ  ０．１％  ＳＬＳ）；レーン４：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａナノ粒子ペレット、０．１％ＳＬＳ中脱着；レーン５：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ上清、クエン酸緩衝液液（ｐＨ〜４．０）中脱着；レーン６：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａナノ粒子ペレット、クエン酸緩衝液（ｐＨ〜４．０）中脱着；レーン７：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０上清、０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）中脱着；レーン８：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０ナノ粒子ペレット、０．１Ｎ  ＨＣｌ（ＨＣＬ）中脱着；レーン９：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０上清、０．１％ＳＬＳ中脱着（ｄｅｓｏｒｂｅｄ  ０．１％  ＳＬＳ）；レーン１０：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０ナノ粒子ペレット、０．１％ＳＬＳ中脱着；レーン１１：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０上清、クエン酸緩衝液（ｐＨ〜４．０）中脱着；レーン１２：ＯｐｔｉＥ２装荷ＳＶ−１０−ｘ−１４０ナノ粒子ペレット、クエン酸緩衝液（ｐＨ〜４．０）中脱着。
【０１７１】
０．１％ＳＬＳを存在させると非常に低い量のベシクルからのタンパク質脱着が観測された。ＳＶ−１０−ｘ−１４０とＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａとは、同様な吸着および脱着特性を示した。ＳＶ−１０−ｘ−１４０とＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａとは、異なる細孔径を有し、したがって、ＯｐｔｉＥ２タンパク質がこれらの粒子に異なる方法で（内部または外部）結合し、従来型アジュバントＱｕｉｌ  Ａとともに共投与すると免疫応答の誘発に対して影響を及ぼすことができるかどうかを検討するために、ＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａベシクルでインビボ実験を行った。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡデータ
表２に記載したワクチン調合物でマウスを免疫化した。３回の皮下ワクチン注射後の抗ＯｐｔｉＥ２特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって免疫化マウスの全ＩｇＧ応答を分析した。注射前にＯｐｔｉＥ２装荷ＨＳＶワクチン調合物を新たに調製した。試行の開始時点でマウスからのＰＩ血清試料を採取し、６週の期間にわたって各注射後２週間隔で後続の血清試料を採取した。すべてのマウスは、実験全体を通じて正常な体重範囲のままであった。最終採血からのＥＬＩＳＡ結果（図２０）は、免疫原性組成物処置群（ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１４０、ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１４０＋Ｑｕｉｌ  Ａ、ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ、ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ＋Ｑｕｉｌ  Ａ）および陽性対照群（ＯｐｔｉＥ２＋Ｑｕｉｌ  Ａ）が１：６４００の希釈まで優れた抗体力価と１．２０の平均ＯＤ４５０ｎｍとを示すことを示唆する。従来型アジュバントをまったく用いないでＯｐｔｉＥ２プラスＨＳＶ（ＳＶ）を投与した処置群は、陽性対照群について見られるものと同等な抗体応答を誘発した。ＢＶＤＶ  ＯｐｔｉＥ２装荷非修飾または官能化ＨＳＶプラスＱｕｉｌ  Ａを注射したマウスの群は、ほとんど同様な応答を示した。ＨＳＶと従来型アジュバントとの共投与は、ワクチン調合物中にＱｕｉｌ  Ａを存在させても応答が劇的に増加しなかったので、強固な免疫応答を生じる結果とならなかった。ＯｐｔｉＥ２プラスＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａナノ調合物を受けた４匹のマウスの間で抗体応答の変動が観測された。ＳＶ−１０−ｘ−１４０およびＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ  ＨＳＶプラスＱｕｉｌ  Ａを受けた陰性対照群は、ＯｐｔｉＥ２エピトープに対して低いバックグラウンド抗体応答を示した。
【０１７３】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＯｐｔｉＥ２抗原に対するＴ細胞性ＩＦＮ−γ応答を定量するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いた。最終免疫化の２週後に、屠殺したマウスから脾臓を回収し、細胞化処理して脾細胞の集合を得た。ナノワクチン調合物ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１４０、ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１４０＋Ｑｕｉｌ  Ａ、ＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１００−ＡおよびＯｐｔｉＥ２＋ＳＶ−１０−ｘ−１００−Ａ＋Ｑｕｉｌ  Ａを受けたマウスは、ＯｐｔｉＥ２エピトープに対して優れた細胞性免疫応答を示した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（図２１、Ｍ１からＭ４は各群のマウス個体であり、黒い棒はＯｐｔｉＥ２抗原に応答してＩＦＮ−γを産生する細胞の数を示す）の結果は、抗原プラス中空シリカベシクルを受けた群は、抗原装荷ＨＳＶプラス従来型アジュバントを投与した群と多かれ少なかれ同様のようであることを示す。しかし、ナノワクチン調合物を受けた群は、陽性対照群（ＯｐｔｉＥ２＋Ｑｕｉｌ  Ａ）より良好なＩＦＮ−γ応答を示し、それ自体優れたアジュバントとしてのシリカベシクルの効率を浮き彫りにした。さらに、抗原装荷ＨＳＶで処置した群は、抗原装荷ＨＳＶプラス従来型アジュバントで処置した群より良好なＴ細胞性応答を誘発した。ＳＶプラス従来型アジュバントの共投与は、抗体応答ならびにＩＦＮ−γ応答をあまり増加させなかった。陰性対照群、ＳＶ−１０−ｘ−１４０プラスＱｕｉｌ  Ａ、ＳＶ−１０−ｘ−１００−ＡプラスＱｕｉｌ  Ａおよび免疫化群は、ＩＦＮ−γ応答を発生させた。しかし、この応答は、非免疫化群もＯｐｔｉＥ２エピトープに対してＩＦＮ−γ応答を発生させたので、ＯｐｔｉＥ２抗原に対して特異的でなかった。
【０１７４】
追加のナノワクチン実験
上記実験は、薄いシェル壁、大きな空洞および入口サイズを有する本発明のシリカベシクルがＯｐｔｉＥ２タンパク質吸着および放出を改善することを明らかに示した。さらに、ＯｐｔｉＥ２（５０μｇ）／ＳＶ−１４０（２５０μｇ）調合物は、陽性対照群ＯｐｔｉＥ２（５０μｇ）プラスＱｕｉｌ  Ａ（１０μｇ）より高い抗ＯｐｔｉＥ２  ＩｇＧならびにＩＦＮ−γ応答を誘導し、自己アジュバントとして作用した。商業的に有用な効力を示しながら、良好なレベルの抗体および細胞性免疫応答を得るために、動物は３回のナノワクチン注射の投与を受けた点に注意する。この成功に導かれて本発明者らは、ＢＶＤＶ  Ｅ２をモデルウイルス抗原として用いて長期免疫応答を発生させることができる有効なナノワクチンを開発するに至った。
【０１７５】
総論
全体として、陽性対照群にＯｐｔｉＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ（１００μｇのＯｐｔｉＥ２プラス１０μｇのＱｕｉｌ  Ａ）、ナノワクチン処置群にＯｐｔｉＥ２／ＳＶ−１４０（５００μｇのＳＶ−１４０に吸着した１００μｇのＯｐｔｉＥ２）を投与することによって、マウスモデルにおいてＯｐｔｉＥ２装荷シリカベシクル（ＳＶ）−１４０の長期インビボ機能を検証した。２回の注射でマウスを免疫化し、６ヶ月の間に８つの異なる時点で血液試料を採取して抗体応答を分析した。最終免疫化後３週（４匹のマウス）および２５週（４匹のマウス）の２つの異なる時点で屠殺したマウスから脾臓を集めてＩＦＮ−γ応答を定量した。ナノワクチン処置群ＯｐｔｉＥ２／ＳＶ−１４０は、８つの時点すべてで従来型アジュバントＱｕｉｌ  Ａと同程度のＢＶＤＶ特異的抗体応答を発生させた。さらに、２５週において、ＯｐｔｉＥ２／ＳＶ−１４０で免疫化した４匹のマウスすべてで、侵入病原体を認識し、排除するために必須である細胞性応答［１５００スポット形成単位（ＳＦＵ）／１００万細胞］がＯｐｔｉＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ（４７３〜１５００ＳＦＵ／１００万細胞）より高かった。これらの実験は、長期体液性ならびに細胞性免疫応答を誘発するＳＶの能力を示す。免疫組織化学検査も、ＢＶＤＶ  Ｅ２  ＳＶ調合物を注射したマウスにおいてＢＶＤＶ  Ｅ２  Ｑｕｉｌ  Ａより高い応答を示した。さらに、動物の主要器官すべてについて３週と２５週との両方の時点で組織検査を行ってＳＶ（Ｔｈｅｙ  ＳＶ）が悪影響を及ぼさないことを確かめた。検査に用いたすべての動物は、実験期間全体を通じて健康なままであった。
【０１７６】
実験
ＳＶ−１４０へのＯｐｔｉＥ２の吸着
吸着反応は、２ｍｇのＳＶ−１４０と、０．２％イゲパール（Ｉｇｅｐａｌ）ＣＡ６３０を含有する無菌５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．０）中の５００μｇのＯｐｔｉＥ２とを、２ｍＬの最終容積で用いた。この粒子−タンパク質スラリーを室温（ＲＴ）で２００ｒｐｍの振盪機にかけた。２４時間後、粒子−タンパク質スラリーの試料（５０μＬ）を取出し、１６．２ｇで１分間遠心分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の上清および粒子の電気泳動によって非結合ＯｐｔｉＥ２タンパク質の量を推定した。
【０１７７】
マウスで行った免疫化測定
バイオロジカル・リソース・ファシリティー、クイーンズランド大学、ブリスベーン、オーストラリアからＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入し、同所において特定病原体感染防止条件で収容した。８週齢雌マウスをＨＥＡＰフィルター付きケージ内で１群あたり８匹の動物で１２時間明と１２時間暗とのサイクルの環境制御区域に収容した。食餌および水を随時与えた。研究全体にわたって動物を綿密に監視した。すべての動物が研究期間を通じて良好な健康状態にとどまり、眼に見える有害な健康影響はなかった。
【０１７８】
ヘパリン被覆ヘマトクリット管（ヒルシュマン・ラボールゲレーテ、ハイルブロン、ドイツ）を用いる後眼窩静脈叢採血によって免疫化前血液試料を採取した。最初の免疫化の前に採取した免疫化前血液試料を免疫前（ＰＩ）試料と呼んだ。吸着反応物を上記のように無菌的に調製し、吸着したＯｐｔｉＥ２／ＳＶペレットを最終的な注射可能投与分の調製の前に１ｍＬの食塩水中で洗浄した。Ｑｕｉｌ  Ａ（スーパーフォス・バイオセクター、ベドバック、デンマーク）を無菌注射水（ファイザー、ブルックリン、米国）中に２ｍｇ／ｍＬで再懸濁した。ＯｐｔｉＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ、ＯｐｔｉＥ２／ＳＶ−１４０および非免疫化群によって発生する免疫応答の間の差異を検討するために、注射可能投与分を投与した。マウスの陽性対照群は、１００μｇのＯｐｔｉＥ２タンパク質および１０μｇのＱｕｉｌ  Ａを受けた。処置群は、ＯｐｔｉＥ２（１００μｇ）装荷ＳＶ−１４０（５００μｇ）の注射を受けた（下表３）。無菌２７ゲージ針（テルモ、東京、日本）を用いる尾の基部における皮下注射によって１００μＬの投与量（ファイザーの０．９％食塩水中）を投与した。非免疫化群を除くすべての処置群に３週間隔で２回の注射を投与した。最終免疫化の２１日後に各群から４匹のマウスを屠殺した。残りの４匹のマウスから血液試料を４週毎に２５週まで採取し、試行期間の終了時点で動物を屠殺した。週に１回、動物の体重を測定し、健康状態を調べた。さらに、動物の臨床徴候も観察し、いずれかの疾患の兆候を以下のように数値評点に変換した。０＝正常、１〜４＝軽い変化、動物を毎日観察する必要がある、５〜１０＝顕著な変化：１日２回観察し、動物施設において主任獣医と相談する、＞１０＝安楽死させる。
【０１７９】
【表４】
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【０１８０】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）プロトコル
ＯｐｔｉＥ２特異的抗体応答の検出：マイクロタイタープレート（９６ウェル、ヌンク、マキシソーブ、ロスキルデ、デンマーク）をＰＢＳ中のＯｐｔｉＥ２抗原溶液（２ｎｇ／μＬ、５０μＬ）で４℃において一夜コーティングすることによってＯｐｔｉＥ２特異的抗体の検出のためのＥＬＩＳＡを行った。コーティング用溶液を取去り、プレートをＰＢＳ−Ｔ（１×ＰＢＳ、０．１％ツイーン−２０、シグマ−アルドリッチ）で１回洗浄し、ＲＴで穏やかに振盪しながら２００μＬ  ＰＢＳ中のウシ血清アルブミン（５％、シグマ−アルドリッチ）および脱脂乳（５％、フォンテッラ、オークランド、ニュージーランド）で１時間ブロックした。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。
【０１８１】
マウス血清試料を５０μＬのＰＢＳ中で１：１００から１：６４００に希釈し、各希釈物をブロックされたプレート中のウェルに加えた後にＲＴで２時間インキュベーションした。マウス抗体を検出するために、ＰＢＳ中１：５００００に希釈したＨＲＰ共役ポリクローナル羊抗マウスＩｇＧ抗体（ケミコン・オーストラリア、メルボルン、ビクトリア州、オーストラリア）を各ウェルに加え、穏やかに振盪しながらＲＴで１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳ−Ｔ中で３回洗浄した。各ウェルにＴＭＢ基質（１００μＬ、ライフ・テクノロジーズ）を加え、ＲＴで１０分間インキュベーションした。発色反応を止めるために１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌをウェルに加えた。バイオテック（ＢｉｏＴｅｋ）マイクロプレート・リーダー（ウィヌースキ（Ｗｉｎｏｏｓｋｉ）、米国）を用いて４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０１８２】
マウス脾細胞の単離および酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイ
３週時に屠殺した４匹の動物と、最終免疫化後２５週時の他の４匹とから安楽死後に無菌的に脾臓を取り出し、集めた脾臓を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ライフ・テクノロジーズ）、２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）、１Ｍピルビン酸ナトリウム、１Ｍグルタマックス、１００単位／ｍＬペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬファンギゾンを補った５ｍＬ氷冷ＤＭＥＭ培地（ライフ・テクノロジーズ）中に置いた。脾臓を穏やかにすり潰し、注射器プランジャーを用いて１００μｍナイロンメッシュ（ベクトン・ディッキンソン）を通過させた。細胞を５ｍＬ  ＤＭＥＭで洗浄し、４℃において８００ｇで５分間遠心分離してからＲＴで１ｍＬ溶菌緩衝液（０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ）中に５分間再懸濁した。洗浄ステップを各回ＤＭＥＭ（９ｍＬおよび５ｍＬ）で２回繰り返す。細胞ペレットを２ｍＬ  ＤＭＥＭに再懸濁し、０．２％トリパンブルーでの染色によって細胞数を決定した。各マウス脾臓からの細胞を、モノクローナルインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）（マブテック、スウェーデン）捕集抗体をプレコートしたポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）ＥＬＩＳＰＯＴプレートに１．０〜１．５×１０５細胞／ウェル、１回３組で接種した。陽性対照としての１μｇ／ｍＬ  ＯｐｔｉＥ２抗原またはポリクローナル賦活因子コンカバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ、１μｇ／ｍＬ、シグマアルドリッチ）を存在させてまたは存在させないで、５％ＣＯ２中３７℃において完全ＤＭＥＭ培地中で細胞を４０時間インキュベーションした。製造者の仕様書に従ってＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（アウトイムン・ディアグノスティカ、ストラスブルク、ドイツ）を用いてＥＬＩＳＰＯＴプレートを読み取った。
【０１８３】
免疫組織化学
３週および２５週の時点で、屠殺したマウスから脾臓部分を集めた。脾臓の一部を切開し、ＯＣＴ中で凍結させ、ハイラックス（Ｈｙｒａｘ）Ｃ６０クライオスタットを用いて５μｍの切片を切り取った。凍結切片を有するスライドを、冷エタノール中で氷の上に８分間固定してからＲＴで２０分間乾燥させた。次にスライドをＰＢＳ中で３×５分間洗浄し、ＲＴで２０分間乾燥させ、ダコ（Ｄａｋｏ）ペンを用いて切片の周りに円形のしるしを付けた。次にブロック用緩衝液（１％ＢＳＡ＋５％ＦＢＳ＋ＰＢＳ）を用いて切片を４℃で一夜インキュベーションした。次の日、ブロックを除去するためにスライドをＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。次に切片を１：５００のアレクサ（Ａｌｅｘａ）フルオール（Ｆｌｕｏｒ）４８８山羊抗マウスＩｇＧとともに暗所においてＲＴで１時間インキュベーションし、次にスライドをＰＢＳ中で３×５分間洗浄した。核を染色するために、次に切片をＤＡＰＩとともに５分間インキュベーションし、ＰＢＳ中で素早く洗浄した。切片をプロロング（ＰｒｏＬｏｎｇ）（登録商標）ゴールド・アンチフェイド（Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ）封入剤でマウントし、顕微鏡で調べた。
【０１８４】
組織検査
屠殺したマウスからの心臓、腎臓、肝臓および注射部位を集め、１０％ホルマリン中で４８時間固定した。器官をさらに処理し、パラフィンに埋め込み、ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＲＭ２２４５ロータリー・ミクロトーム（Ｒｏｔａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて８μｍ切片を切り取った。次に以下のヘマトキシリンおよびエオシン染色手順を用いて切片を染色した。最初に切片をキシレン（２分毎に３回取り替える）中で脱ワックスし、次に無水アルコール（２分毎に２回取り替える）、９０％中で２分、７０％中で２分、再水和させた。次に、水道水中で２分間洗浄し、ヘマトキシリン中で３分間染色し、再び水道水で２分間洗浄した。次に切片を７０％アルコール中で２分間洗浄し、エオシン中で３分間染色した。次に切片を９５％アルコール中で２分間、次に無水アルコール（２分毎に３回取り替える）中で洗浄した。最後に、切片を素早く乾操させ、キシレン（２分毎に３回取り替える）中で固定し、デペックス（ＤｅＰｅｘ）中でマウントした。次に切片を顕微鏡で観察した。
【０１８５】
結果
吸着
５００μｇのＯｐｔｉＥ２タンパク質を２ｍｇのＳＶ−１４０とともに２４時間インキュベーションすることによって吸着試験を行った。発現されたＯｐｔｉＥ２（以下ＯｐｔｉＥ２またはｏＥ２と呼び、これらの用語は区別なく用いられる）の分子量は、４２ｋＤａである。タンパク質および粒子スラリーを集め、上清試料と粒子試料とに分け、タンパク質の吸着を判定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ゲル分析は、結合の２４時間後に上清（図２２−レーン３）中にタンパク質が検出されず、粒子ペレット中でＯｐｔｉＥ２のＳＶ−１４０との完全な結合が観測される（図２２−レーン４）ことを示す。
【０１８６】
ＥＬＩＳＡデータ
２回の皮下ワクチン注射を用いてマウスをｏＥ２プラスＱｕｉｌ  ＡおよびｏＥ２／ＳＶ−１４０ワクチン調合物（表３に示される）で免疫化し、２５週の期間にわたって各注射後３週間隔で血清試料を採取した。すべての処置群の動物は、試行期間全体を通じて健康なままであり、正常な体重範囲にあった。抗ｏＥ２特異的ＥＬＩＳＡアッセイによって免疫化マウスの全ＩｇＧ応答を分析した。３週および２５週の２つの時点における最終採血からのＥＬＩＳＡ結果（図２３および図２４に示した）は、ｏＥ２／ＳＶ−１４０を注射したナノワクチン処置群と陽性対照群ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａとの両方が抗体応答で予測される同様な低下の傾向を有することを示した。免疫化を受けなかった陰性対照群は、ｏＥ２エピトープに特異的な抗体応答を示さなかった。
【０１８７】
細胞性免疫応答の発生
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを用いてｏＥ２抗原に対するＴヘルパー１型（Ｔｈ１）細胞性インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）応答を判定した。最終免疫化後３週および２５週に、屠殺された各群のマウスから脾臓を回収し、細胞化処理して脾細胞の細胞集合を得た。ナノワクチン調合物ｏＥ２／ＳＶ−１４０を受けたマウスは、スポット形成単位（ＳＦＵ）を産生する細胞の数で示すように、最終免疫化後２５週でもｏＥ２抗原に対する優れた細胞性免疫応答を示した。３週時において、屠殺された４匹のマウス（３つの投与群から）から脾臓試料を集めた。６週データは、各投与群の２匹のマウスが低い応答を示し、他の２匹が高い応答を示した（図２５）ので、ｏＥ２／ＳＶ−１４０によって誘導される細胞性応答（５９９〜１５００ＳＦＵ／１００万細胞）がｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａ（５５１〜１５００ＳＦＵ／１００万細胞）と同程度であることを示した。
【０１８８】
２５週時に屠殺された４匹のマウスは、ｏＥ２／ＳＶ−１４０が陽性対照群（４７３〜１５００ＳＦＵ／１００万細胞）より強い細胞性応答（１５００ＳＦＵ／１００万細胞）を誘導することを示した（図２６）。３週後ならびに２５週後に抗体媒介応答と細胞性応答との両方を誘導するＳＶ−１４０ベシクルの能力は、優れた自己アジュバントおよびワクチン送達ビヒクルとしてのその可能性を浮き彫りにする。
【０１８９】
免疫組織化学データ
マウス脾臓切片について免疫組織化学観察を行った。アレクサフルオール４８８ヤギ抗マウスＩｇＧで切片を、ＤＡＰＩで核を染色した。脾臓切片中の緑色は、抗体応答の存在を表す。ｏＥ２／ＳＶ−１４０（図２７ｃおよびｄ）は、最終免疫化の３週後だけでなく最終免疫化の２５週後にも抗体応答を発生させる。ＩｇＧ応答は、両方の時点（３週および２５週）で強くなったようであり、ｏＥ２／ＳＶ−１４０は陽性対照ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａと同程度であった。免疫化しなかった処置群の切片において緑色がないことが、陰性対照群のマウスは抗体応答を発生させないことを確認する。
【０１９０】
組織検査データ
屠殺されたマウスから心臓、腎臓、肝臓および注射部位を集め、１０％ホルマリン中で固定し、さらに処理し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって染色した。組織検査結果は、ｏＥ２／ＳＶ−１４０を注射したマウスの切片が陰性処置群（免疫化されていない）と同様に見えた（図２８のｉ、ｉｉ、ｉｉｉ（ｃおよびｄをｅおよびｆと比較する））ので、ｏＥ２／ＳＶ−１４０ナノワクチンの投与が最終免疫化後３週と２５週との両方の時点において心臓、腎臓、肝臓および注射部位に対して悪影響を及ぼさなかったことを示す。ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａで処置した動物の切片も、非免疫化群と同様に見えた。これは、５００μｇの５０ｎｍ  ＳＶ−１４０の投与が、動物の体内で非常によく許容され、動物の主要器官に対して悪影響をまったく及ぼさなかったことを示す。
【０１９１】
ＢＶＤＶ  Ｅ２を用いたナノワクチン（Ｎａｎｏｖａｃｃｉｂｅ）実験についての結論
合理的に設計したＳＶ−１４０に吸着したｏＥ２は、最終免疫化後２５週でも抗ｏＥ２  ＩｇＧならびにＩＦＮ−γ応答を両方誘導し、効率的なワクチン送達ビヒクルと強力なアジュバントとの両方としてのＳＶの潜在力を示した。動物に３週間隔で２つのワクチン投与分を投与し、ｏＥ２（１００μｇ）プラスＱｕｉｌ  Ａ（１０μｇ）とｏＥ２（１００μｇ）／ＳＶ−１４０（５００μｇ）とは、同様な抗体応答の低下傾向を示した。ｏＥ２／ＳＶ−１４０は、陽性対照ｏＥ２プラスＱｕｉｌ  Ａより強固な長期細胞性応答を生み出した。免疫組織化学の結果は、ｏＥ２／ＳＶ−１４０で処置した動物が強固な全ＩｇＧ応答を生み出すことを確認し、組織検査は、高い投与分のナノワクチン（５００μｇ）の注射が動物の主要器官に対して衰弱化影響を及ぼさないことを明らかにした。これらの結果は、長期体液性ならびに細胞性応答を誘導する能力を有するより安全かつ有効なサブユニットワクチンのための新しい基盤技術の開発へ向けたＳＶの有用性を示す。
【０１９２】
アナプラズマについてのナノワクチン実験
シリカベシクル（ＳＶ）、詳しくは２００μｇ／ｍｇ粒子の高い吸着率を有するＳＶ−１４０へのＢＶＤＶ−Ｅ２の吸着に関する実験に続いて、ウシダニ熱の原因生物アナプラズマ・マージナーレ由来の２つの異なるタンパク質、ＶｉｒＢ９．１（５６ｋＤａ）およびＶｉｒＢ９．２（４４ｋＤａ）で同じ手法を用いることが決定された。これらのタンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の系で発現させた。ＶｉｒＢ９．１は、０．２ｍＭ  ＩＰＴＧによって１５℃で１７時間誘導したロゼッタ（Ｒｏｓｅｔｔａ）（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中でＧＳＴタグを用いて発現させた。得られた可溶性タンパク質を、ＧＳＴアフィニティーカラムとスーパーデックス（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ）２００  １０／３００  ＧＬサイズ排除カラムとをそれぞれ用いるクロマトグラフィーによって細菌細胞溶解物から精製した。精製後、ＶｉｒＢ９．１画分を集め、濃縮し、その後の作業のためにＰＢＳ中に透析した。ＶｉｒＢ９．２は、１ｍＭ  ＩＰＴＧによって３７℃で５時間誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中でｐＥＴ−ＳＵＭＯを用いて発現させた。得られたタンパク質を不溶性封入体画分から精製した。可溶化後、ＶｉｒＢ９．２をその後の作業のためにＰＢＳ中に透析した。
【０１９３】
１×ＰＢＳ緩衝液中４℃および室温でＶｉｒＢ９．１およびＶｉｒＢ９．２の吸着をそれぞれ行った。ＳＶ１００粒子への吸着率は、ＶｉｒＢ９．１では２００μｇ／ｍｇ、ＶｉｒＢ９．２では４００μｇ／ｍｇであった。ＳＶ１００−ＮＨ２、ＳＶ１４０およびＳＶ１４０−ＮＨ２へのＶｉｒＢ９．１の吸着比も、大体２００μｇ／ｍｇであった。ＶｉｒＢ９．２は、ＳＶ１００−ＮＨ２、ＳＶ１４０およびＳＶ１４０−ＮＨ２へ同様な吸着を示す（図２９）。このデータは、ＢＶＤＶ  Ｅ２以外の抗原的に重要なタンパク質のキャリアとして作用するＳＶ粒子の能力を確認する。ＳＶ１００およびＳＶ１４０からのＶｉｒＢ９．２の脱着は、アミノ官能化粒子より良好であることが見いだされた（図３０）。これらの観察結果にもとづき、ＶｉｒＢタンパク質を装荷したＳＶ１００をマウス試行実験において用いた。マウス試行において用いるためのＳＶ１００粒子にＶｉｒＢ９．１とＶｉｒＢ９．２との両方を吸着させて免疫応答を誘発する能力をチェックした。これらのタンパク質を別々に粒子に吸着させ、それぞれ個別のタンパク質および組み合せた両方のタンパク質を含有するナノ調合物を調製した（表４）。
【０１９４】
【表５】
0006622203.tif 000006
【０１９５】
ＶｉｒＢ９．１およびＶｉｒＢ９．２は連関タンパク質であり、連関タンパク質を免疫化するとＴ−細胞依存性ＩｇＧ応答を増加させる（連関認識）ことができるとともに２種以上の免疫原性タンパク質を提示することが示されている（モース（Ｍｏｒｓｅ）ら、２０１２年）。この実験のための予備的なデータは、ＳＶ１００粒子へ吸着したＶｉｒＢ９．１およびＶｉｒＢ９．２が体液性免疫を誘導することに成功したことを示している（図３１および３２）。
【０１９６】
ＶｉｒＢ９．１についての最終血清（最終注射後３週）からのＥＬＩＳＡ結果も、良好な抗体応答を示す（図３３）。ＶｉｒＢ９．２についての最終血清のＥＬＩＳＡ結果は、ＶｉｒＢ９．１についてと同様な傾向に従う。３回の注射後に得られた優れた細胞性免疫応答（図３４および３５）も、ＳＶ  １００とともに注射したＶｉｒＢ９．１およびＶｉｒＢ９．２が従来型アジュバントとしてのＱｕｉｌ−Ａと同程度の確実な応答を生み出すことを示した。
【０１９７】
この試行において、２群のマウスにＶｉｒＢ９．１とＶｉｒＢ９．２との両方の組み合わせも注射した（表４）。群３（表４）は、従来型アジュバントＱｕｉｌ−Ａを用い、群６は、別々に吸着して吸着後に混合ナノ調合物として一緒にしたＶｉｒＢ９．１／ＶｉｒＢ９．２を含有する調合物の注射を含んだ。組み合わされたＶｉｒＢ９．１およびＶｉｒＢ９．２ナノ調合物で免疫化した動物は、個別のＶｉｒＢ／ＳＶ調合物を注射したマウスの免疫応答と同程度の良好な体液性（図３１から３３）および細胞性（図３４および３５）免疫応答を示した。より重要な点として、ＶｉｒＢ９．１／ＳＶで個別に免疫化した動物は、ＥＬＩＳＡアッセイ（体液性応答、図３１から３３）とＥＬＩＳＰＯＴアッセイ（細胞性応答、図３４ｂおよび３５ｂ）との両方においてＶｉｒＢ９．２タンパク質との反応性をほとんど示さず、逆の場合も同じであった。
【０１９８】
インビボでアジュバントおよびタンパク質キャリアとして作用するＳＶの能力の確認に加えて、組合せ免疫化による免疫応答は、個々のタンパク質が免疫系によって独立に処理されることを示し、単回投与で複数の疾患を標的とすることができるような多価ワクチンを製造するためにＳＶを用いることができることを示した。
【０１９９】
シリカベシクルおよびタンパク質安定性試験によるモデル治療タンパク質の吸着容量
シリカベシクルのタンパク質装荷量と入口サイズとの相関
本発明者らは、壁厚を約６ｎｍに維持したまま（図３６の丸）で本シリカベシクル（ＳＶ）の入口サイズを＜３．９から３４ｎｍ（図３６のひし形）まで調節することができることを見いだした。−Ｃ１８鎖による疎水性修飾後、ＳＶの入口サイズはすべての場合に１〜２ｎｍ減少する（図３６の四角）。これら両方の系列のＳＶを用いて治療タンパク質の装荷量とＳＶの入口サイズとの関係を検討した。シトクロムｃ（図３６の逆三角）およびリボヌクレアーゼＡ（三角で示したＲＮアーゼＡ）をモデル治療タンパク質として用い、結果は既に考察した。
【０２００】
図３６に示したように、両方の系列のＳＶは、入口サイズが増加するにつれて２つのモデルタンパク質への吸着容量の同様な傾向を示す。ＳＶの入口サイズが壁厚と等しいとき装荷量は極大値（疎水性修飾ＳＶ上のＲＮアーゼＡでは５６３ｍｇ／ｇ、非修飾ＳＶ上のＣｙｔｏ  Ｃでは８４０ｍｇ／ｇ）に達する。
【０２０１】
官能化ＳＶ試料に吸着したＲＮアーゼＡの位置をさらに予測するために、タンパク質吸着に使用不可能な微細孔区域を除いたＢＥＴ表面積で吸着容量を除することによって単位表面積あたりのＲＮアーゼＡ吸着容量（ｍｇ／ｍ２）を計算した（表５）。同じ疎水性修飾および約５０ｎｍの粒径を有する中実シュテーバー（Ｓｔｏｅｂｅｒ）球もＲＮアーゼＡ吸着に用い、１８時間後に８９ｍｇ／ｇのＲＮアーゼＡ装荷量を示したＳＶと比較した。修飾シュテーバー球の場合、ＲＮアーゼＡの吸着が外表面において単分子層吸着挙動で起こることは明らかである。５０ｎｍ中実シュテーバー球と比較すると、ＳＶ−１０−５０−Ｃ１８は同じサイズを有するが、シュテーバー球の吸着容量（１．１３ｍｇ／ｍ２）の半分の０．６４ｍｇ／ｍ２という弱い吸着容量を有する。中実シュテーバー球の場合のように、ＲＮアーゼＡは、ＳＶ−１０−５０−Ｃ１８の外表面にしか吸着することができない。入口サイズがタンパク質サイズより小さいからである。しかし、微細孔区域を除くそのＢＥＴ表面積は、窒素収着によって測定される中空ＳＶ−１０−５０−Ｃ１８の内表面積と外表面積との両方からなり、中実シュテーバー球のＢＥＴ表面積の２倍であり、吸着容量を低くする原因となる。ＳＶ−１０−１００−Ｃ１８は、中実シュテーバー球の容量よりわずかに高い１．５１ｍｇ／ｍ２の容量を示す。疎水性修飾後のＳＶ−１０−１００−Ｃ１８の入口サイズは、＜３．９ｎｍである。窒素吸着技法から正確な入口サイズを決定することはできないが、ＳＶ−１０−１００が６ｎｍの入口サイズを有し、修飾後の入口サイズ減少が１〜２ｎｍの範囲であると考えると、入口サイズは３．９ｎｍに近いと推論することができる。この入口サイズは、タンパク質サイズに近く、したがってＲＮアーゼＡを空洞中に装荷することができ、吸着容量が比較的高くなる。ＲＮアーゼＡのサイズよりはるかに大きな入口サイズを有するＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８およびＳＶ−１０−１４０−Ｃ１８は、シュテーバー球の吸着容量の２倍の単位面積あたり吸着容量を示し、ＲＮアーゼＡがシリカシェルの表面だけでなく空洞の内部にも多層吸着によって吸着することを示す。
【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
疎水性修飾ＳＶ中に装荷したＲＮアーゼＡの熱安定性
示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）によって１０〜１３０℃の範囲でＲＮアーゼＡの熱アンフォールディングを測定した。ＶＰ  ＤＳＣ微量熱量計（マイクロカル・カンパニー（ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、米国）を用いて６０℃／時の昇温速度でＤＳＣを行った。通常の手順においては、ＲＮアーゼＡ／ＳＶを１０ｍＭ  ＰＢＳ溶液に０．５ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ濃度で懸濁させた。同じ濃度のＳＶだけを用いる参照懸濁液も調製した。参照懸濁液および試料懸濁液を、ＤＳＣ測定のために対応するセルに注入した。遊離ＲＮアーゼＡのＤＳＣ曲線も得た。図３７は、一連のＤＳＣ曲線を示し、ＲＮアーゼＡ／ＳＶ懸濁液の温度をｘ軸、見かけのモル熱容量（Ｃｐ）をｙ軸とし、ｙ軸は、ベースライン補正し、ＲＮアーゼＡの濃度で正規化してある。遊離ＲＮアーゼＡのＤＳＣ曲線は、ＲＮアーゼＡの熱アンフォールディングを示唆する吸熱ピークを示す。ＲＮアーゼＡ熱アンフォールディングの中点温度（Ｔｍ）も測定し、文献報告と一致する６３．６℃を中心としていた。ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８に装荷したＲＮアーゼＡのＴｍは、ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−５０−Ｃ１８（７１．９℃）およびＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１４０−Ｃ１８（７４．９℃、１１８℃）よりはるかに高い約１１９℃に増加する。ＤＳＣの結果は、約６ｎｍの入口サイズを有する疎水性修飾ＳＶに装荷したＲＮアーゼＡが、ＲＮアーゼＡを外表面に吸着するＳＶ−１０−５０−Ｃ１８および大きな入口サイズを備えるＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１４０−Ｃ１８と比較して、ＰＢＳ中でもっとも高い熱安定性を有することを示す。
【０２０４】
疎水性修飾ＳＶに装荷したＲＮアーゼＡの酸および熱処理後の活性
疎水性修飾ＳＶに装荷したＲＮアーゼＡの安定性および活性を酸および熱処理によってさらに検討した。処理手順において、ＳＶに装荷した約１ｍｇのＲＮアーゼＡに５０μｌの０．０１Ｍ  ＨＣｌ（ｐＨ２）を加えた。混合物を６５℃に４０分間保持し、次に０．０１Ｍ  ＮａＯＨ溶液（ｐＨ１２）でｐＨが７に達するまで中和した。次に最終ＲＮアーゼＡ濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに希釈した。遊離ＲＮアーゼＡも対照群として相応に処理した。処理後のＲＮアーゼＡの二次構造変化を検討するために、ＳＶ懸濁液を参照物としてＲＮアーゼＡ／ＳＶ懸濁液の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを測定した。図３８は、２００〜２３０ｎｍの波長範囲のＣＤスペクトルの強度が、ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８＞ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１４０−Ｃ１８＞ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−５０−Ｃ１８＞ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０であることを示す。強度が高いほど、処理後に多くの二次構造が維持されていることを示す。したがって、ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８に装荷したＲＮアーゼＡが酸および熱処理後にもっとも高い二次構造の含有量を示す。
【０２０５】
次に酸および熱処理後のＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８を細胞送達のために用いてＲＮアーゼＡの活性をさらに試験した。前に記載した手順を使用した。図３９に示すように、ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８は、７２時間後でもＳＣＣ２５とＨＣＴ１１６との両方の細胞に対して最小限の細胞毒性を示し、官能化ＳＶ試料の優れた生体適合性を実証する。ＳＣＣ２５およびＨＣＴ１１６細胞を遊離ＲＮアーゼＡで処理すると、裸のタンパク質が細胞中に入ることができないので、阻害を見ることができない。ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８によって送達したＲＮアーゼＡは、１６μｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ濃度から増加し、曝露時間とともに細胞阻害能力が増加する、時間依存性細胞毒性を示す（図３９Ａ）。同じ傾向をＨＣＴ１１６細胞において観測することができ、細胞阻害は、２４時間の３３％から４８時間の４８％、最後に７２時間の６９％である。ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８の細胞阻害能力は、酸および熱処理後のＲＮアーゼＡの安定性および活性保持を確認する。
【０２０６】
大部分の治療タンパク質は、変性またはプロテアーゼによる消化を容易に受けるもろい構造を有する。たとえば、タンパク質は、経口送達時のペプシンまたはトリプシン消化および静脈内注射におけるプラスミンに耐える必要がある。本実験においては、ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８をトリプシンで消化させ、残る無傷のＲＮアーゼの量を質量分析法（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍａｔｒｙ）（ＭＳ）によって定量検出した。最初に、ＳＶに装荷した１ｍｇのＲＮアーゼＡを６０℃においてジチオスレイトールで３０分間処理した。このプロセスは、遊離ＲＮアーゼＡ中のジスルフィド結合を分解するためである。第２に、３７℃においてＰＢＳ溶液（１：５０）中の１ｍｇ／ｍｌのトリプシンにＲＮアーゼＡ／ＳＶを加え、約１２時間振盪した。次に混合物を遠心分離し（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｅｄ）、上清を沈殿物から除去した。沈殿物をＭＡＬＤＩ  ＭＰＴ  ３８４プレートにスポットし、試験前に１μｌ  ＣＨＣＡ溶液と混合した。ブルーカー（Ｂｒｕｋｅｒ）オートフレックス（Ａｕｔｏｆｌｅｘ）ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＩＩＩスマート（Ｓｍａｒｔ）ビームで試料を分析した。データ収集のための３９％のレーザー強度で１０箇所の異なる部位における２００回のレーザーショットの累計によってＬＰ−ＰｅｐＭｉｘモードで質量スペクトルを取得し、較正した。較正を目的として３種の標準ペプチド、アンギオテンシンＩＩ（Ｍｗ＝１０４６．５Ｄａ）、ＡＣＴＨ−Ｃｌｉｐ（Ｍｗ＝２４６５．２Ｄａ）およびソマトスタチン２８（Ｍｗ  ３１４７．５Ｄａ）を用いてばらつきを低下させた。図４０Ａは、ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０のＭＳを示し、質量対電荷比で１０００〜５０００の範囲にある一連のピークを示す。これらのピークはすべて、無傷のＲＮアーゼＡからトリプシンによって消化されたペプチドに帰属することができる。比較として、ＲＮアーゼＡ／ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８のＭＳは、無傷のＲＮアーゼＡの質量である１３．７ｋの質量対電荷比に小さなピークを示す。その結果、疎水性修飾ＳＶによって吸着されたときトリプシン消化プロセス後にある量のＲＮアーゼＡが残るが、修飾しないと装荷されたＲＮアーゼＡは完全に消化される。
【０２０７】
本明細書に示した結果によると、タンパク質サイズに近い入口サイズを有するＳＶは、もっとも高いモデル治療タンパク質の装荷量を示す。一例としてＲＮアーゼＡを用いると、ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８中に装荷したＲＮアーゼＡの位置は、外表面だけでなくＳＶ空洞の中にもあると予測される。さらに、これらの実験は、約６ｎｍの入口サイズおよび疎水性修飾を有するＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８が、熱あるいは潜在的な酸またはトリプシン消化という苛酷な条件からの保護をＲＮアーゼＡに対して示すことを示唆する。ＳＶ−１０−１２０−Ｃ１８中に装荷したＲＮアーゼＡは、加熱および強酸による処理後でも依然として癌細胞に対して良好な阻害を示す。この発見は、驚くべきものであり、治療タンパク質送達のための有効な保護ナノキャリアの設計にとって肝要となる、当分野においてこれまで見いだされなかった重要な理解をもたらす。
【０２０８】
添付の請求項および本発明の上記記載において、明白な文言または必然の含意によって明らかに断らない限り、語「含む」、または「含む（３人称単数）」または「含む（現在分詞）」を含むその変化形は、包含する意味で、すなわち明示された整数の存在を指定するために用いられるが、本発明の１つ以上の実施形態におけるさらなる整数の存在または追加を妨げるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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