(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンセンサス配列
(R2-16)PI[L,Y,E,W]T[R,K],IT[L,Y]E（SEQ ID NO: 19）
からなり、かつ前記配列が、YTRITLE（SEQ ID NO: 5）を含まないことを特徴とする、ｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドであって、
前記ｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドが、
（i）以下の配列：
0006574412.tif 000045
のうちの１つを含み；及び
（ii）任意にリンカー配列を介して、細胞透過性のペプチド（ＣＰＰ）に融合されており、かつ該ＣＰＰが、ポリアルギニンタグを含む、
前記ｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列：
(R2-16)PILTRITLE（SEQ ID NO: 19）
を含む、請求項１に記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列：
RRRRRRRRRRPILTRITLE（SEQ ID NO: 22）
を含む、請求項１に記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドを含む、異常な立体構造を有するｐ５３に起因する細胞の増殖を予防及び／または阻害するための薬学的組成物。
【請求項６】
有効量の請求項４に記載の薬学的組成物を含む、異常な立体構造を有するｐ５３に関連する癌を有する対象を治療するための医薬であって、前記対象における癌細胞の増殖を阻害すること、および／または前記対象の腫瘍を縮小させることを特徴とする、前記医薬。
【請求項７】
請求項４に記載の薬学的組成物を含む複数の用量を含む、癌を発症しやすくするｐ５３をコードする突然変異遺伝子を有する対象を治療するための医薬であって、前記複数の用量の合計が、請求項４に記載の薬学的組成物の有効量であり、かつ前記医薬が、前記対象における腫瘍の発症を予防することを特徴とする、前記医薬。
【請求項８】
容器内にパッケージ化された、請求項１〜３のいずれかに記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドを含む、異常な立体構造を有するｐ５３に起因する細胞の増殖を予防及び／または阻害するために使用されるキット。
【請求項９】
請求項１〜３のいずれかに記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドを作製する方法であって、それを化学的に合成するか、またはそれを組換えで生成することを含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドをコードする、発現ベクター。
【請求項１１】
前記ｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチドが、１〜７個のアミノ酸を含むペプチドリンカーにより前記ＣＰＰと結合している、請求項１に記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチド。
【請求項１２】
２〜１６個のアルギニン残基と結合している下記アミノ酸配列：
LTRITLE (SEQ ID NO: 4)
を含む、請求項１に記載のｐ５３の凝集を阻害するための細胞透過性ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１３年５月８日に出願された米国仮特許出願第６１／８２１，１５７号の恩典を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立科学財団より授与された助成金番号ＮＳＦ  ＭＣＢ−０９５８１１１のもと、政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。２０１４年５月８日に作成されたそのＡＳＣＩＩコピーは、５８０８６−３６４６６５＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、２４，６３６バイトの大きさである。
【背景技術】
【０００４】
腫瘍抑制因子ｐ５３における突然変異は、すべての報告されたヒトの癌の５０％に関連している（Ｓｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ｐ５３突然変異体の構造的不安定性は、部分的アンフォールディングを引き起こし（Ｂｕｌｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｅｒｓｈｔ，２００１）、それは次いで、ｐ５３にアルツハイマー病等のアミロイド疾患に見られるものと同様の凝集体を形成させることがある（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｊｕｃｋｅｒ，２０１２）。ｐ５３の誤った折り畳み及び凝集のプロセスは、タンパク質不活性化をもたらし、それにより、その保護機能から「ゲノムの守護者（ｇｕａｒｄｉａｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ）」を取り去る（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）。
【０００５】
過去数十年間に、いくつかの異なるｐ５３突然変異、特に「構造的突然変異」と見なされるものは、ｐ５３折り畳みに影響し、タンパク質の安定性を低下させ、部分的アンフォールディングを誘発することが示されている（Ｂｕｌｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｆｅｒｓｈｔ、２００１）。これらの異常なｐ５３立体構造は、誤った折り畳みのときにのみ溶媒曝露を受けるタンパク質コアに埋もれたエピトープを認識する突然変異体特異的抗体ＰＡｂ２４０を使用して、癌生検中で実証されている（Ｇａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９０）。加えて、いくつかの一連の証拠は、ｐ５３の断片（Ｉｓｈｉｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３、Ｓｉｌｖａ  ｅｔ  ａｌ，２０１０、Ｉｓｈｉｍａｒｕ  ｅｔ  ａｌ，２００９、Ｇａｌｅａ  ｅｔ  ａｌ，２００５、Ｒｉｇａｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８）、ならびに完全長突然変異体ｐ５３（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，２０１２）が、インビトロでアミロイド生成性凝集を経ることを示している。加えて、ｐ５３は、乳癌症例（Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）ならびに結腸癌腫（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）及び基底細胞癌腫（Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）に由来する生検において、誤って折り畳まれた凝集したアミロイド状態であることが報告された。
【０００６】
ｐ５３凝集体を特異的に不安定化できるか、またはそれらの形成を阻止することのできる薬剤、具体的には、異常に折り畳まれる及び／または凝集する（繊維形態において不活性であることが分かっている）という事実によりｐ５３が不活性化される癌の型の治療において使用するための、合理的な、構造に基づく手法において設計された薬剤が必要とされている。診断されるすべての腫瘍の約半分がｐ５３突然変異を示すため、このような標的治療薬の適用可能性は大きい。
【発明の概要】
【０００７】
[本発明1001]
コンセンサス配列
0006574412.tif 000002
によって表される阻害性ペプチド、またはその活性変異体。
[本発明1002]
コンセンサス配列
0006574412.tif 000003
によって表される本発明1001の阻害性ペプチド、またはその活性変異体。
[本発明1003]
コンセンサス配列
0006574412.tif 000004
で構成される、本発明1001の阻害性ペプチド。
[本発明1004]
コンセンサス配列
0006574412.tif 000005
で構成される、本発明1001の阻害性ペプチド。
[本発明1005]
以下の配列：
0006574412.tif 000006
のうちの1つを含む、本発明1001の阻害性ペプチド。
[本発明1006]
任意にリンカー配列を介して、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に融合される、本発明1001の阻害性ペプチドまたはその活性変異体を含むＣＰＰ阻害剤。
[本発明1007]
コンセンサス配列
0006574412.tif 000007
によって表される本発明1006のＣＰＰ、またはその活性変異体。
[本発明1008]
本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物。
[本発明1009]
ｐ53と、本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰとを含む、複合体。
[本発明1010]
異常な立体構造を有するｐ53タンパク質分子の立体構造を修復するための方法であって、
前記異常な立体構造を有する前記ｐ53分子を、有効量の本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させることを含み、
前記接触したｐ53が、修復された立体構造を有し、
前記修復された立体構造を有する前記ｐ53分子が、アポトーシスの誘発、細胞増殖の阻害、及び／または腫瘍縮小の誘発から選択される活性を呈する、前記方法。
[本発明1011]
異常な立体構造を有するｐ53に起因する細胞の増殖を予防及び／または阻害するための方法であって、前記細胞を、有効量の本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1012]
異常な立体構造を有するｐ53に関連する癌を有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、有効量の本発明1008の薬学的組成物を投与し、それにより、前記対象における癌細胞の増殖を阻害すること、および／または前記対象の腫瘍を縮小させることを含む、前記方法。
[本発明1013]
癌を発症しやすくするｐ53をコードする突然変異遺伝子を有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、合計で有効量の本発明1008の薬学的組成物を含む複数の用量を投与し、それにより、前記対象における腫瘍の発症を予防することを含む、前記方法。
[本発明1014]
ｐ53の凝集を低減または阻害するための方法であって、ｐ53アミロイドプロトフィラメントを、有効量の本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させることを含む、前記方法。
[本発明1015]
ｐ53の凝集を阻害する阻害性ペプチドを同定するためのコンピュータ実施方法であって、
標的ポリペプチド由来のｐ53セグメントＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：20）もしくはＬＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：21）のジッパー形成配列または前記ジッパー形成配列の鏡体を含む、鋳型ペプチド配列を同定するステップであって、前記ジッパー形成配列が凝集して立体ジッパーになる、前記ステップと、
コンピュータ上で、前記鋳型ペプチド配列と好ましい立体及びエネルギー分子間相互作用を形成する少なくとも1つの相補的ペプチド配列を設計するステップであって、前記相互作用が前記立体ジッパーの上端または下端の一方または両方で生じる、前記ステップと、
前記相補的配列、前記相補的配列の鏡体、前記相補的配列のペプチド模倣物、及び前記相補的配列の前記鏡体のペプチド模倣物から成る群から選択される、候補阻害性ペプチド化合物を同定するステップと
を含む、前記方法。
[本発明1016]
容器内にパッケージ化された、本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰを含むキット。
[本発明1017]
本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰを作製する方法であって、それを化学的に合成するか、またはそれを組換えで生成することを含む、前記方法。
[本発明1018]
本発明1001〜1007のいずれかの阻害性ペプチドまたはＣＰＰをコードする、発現ベクター。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本特許または出願ファイルは、少なくとも１つの着色された図面を含む。
【図１】アミロイド凝集傾向のあるｐ５３のセグメントの２つの多形体、すなわち、ｐ５３残基２５３−２５８（配列：ＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０））及びｐ５３残基２５２−２５８（配列：ＬＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１））のＸ線高解像度構造を示す。両方の場合において、プロトフィラメントは、緊密な乾燥した接触面を有する２つの互いに噛み合うβシートから成る。シートの３つの層が示され、水分子は黄色の球として示される。上面図は、線維軸の下であり（赤色のダイヤモンドで示される）、底面図は、軸に対して垂直である（赤矢印）。
【図２】ｐ５３２５２−２５８結晶構造をモデルにしたＩＮＨ−１Ｒを示す。３つの隣接するシートが表される。シアンの球及び棒状の阻害剤は、ＬＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）構造に相補的な高い表面を有する。ＩＮＨ−１Ｒのアルギニン（黄色）は、反対のβシートと衝突し、さらなるフィラメント成長を阻害する。阻害剤は、立体ジッパー鋳型の上部及び／または下部（線維軸に沿って）と結合することができる。図は、線維軸の下方である。
【図３】ＩＮＨ−１Ｒによるｐ５３の凝集（セグメントｐ５３２５２−２５８）のインビトロ阻害を示す。ｐ５３の凝集は、色素が特異的に結合することができるアミロイドの量の増加により、チオフラビンＴ蛍光の増加が経時的に検出されるチオフラビンＴアッセイを介して監視される。ＩＮＨ−１Ｒは、異なる濃度で溶液に添加され、凝集の開始を遅らせ、濃度依存性様式で、存在する凝集体の総量を低下させることができる。このセグメントの配列ＬＴＩＩＴＬＥは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１である。
【図４】ＩＮＨ−１Ｒの細胞に透過するバージョン（１ＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰ）が、ヒト癌細胞に進入することが可能であることを示す。ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰをＦＩＴＣ蛍光標識に共有結合し、異なる癌細胞株または（本明細書に示される）卵巣癌患者から直接得られる初代細胞に添加した。Ａ．ペプチドは、細胞のサイトゾル及び核（緑色）に首尾よく透過し、ｐ５３と共局在化した。細胞核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青色）で染色し、ｐ５３を抗ｐ５３抗体により認識し、赤色で染色する。Ｂ．ペプチドは、同じ細胞内でタンパク質凝集体と共局在化する。タンパク質凝集体を、市販のＯＣ抗体（赤色）で染色する。これは、ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰが、これらの卵巣癌細胞において凝集したｐ５３に結合することを示す。
【図５】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰが、ｐ５３の再局在化を引き起こし、凝集を崩壊させることを示す。上部パネルにおいて、漿液の卵巣癌腫患者に由来する初代細胞のｐ５３染色は、点状のｐ５３サイトゾル染色を示す。１０μＭのＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰでの２４時間の処置後、すべての点は消え、ｐ５３は、ここで、核に拡散及び局在化され、下部パネルに見られるように転写因子及び腫瘍抑制因子の機能を発揮することができる。この場合もやはり、ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰは、ｐ５３と共局在化する（ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰは緑色、ｐ５３は赤色、核は青色）。
【図６】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰは、誤って折り畳まれたｐ５３に、野生型のような機能的折り畳みを獲得させる。卵巣癌腫瘍に由来する安定した細胞株を、あらゆるｐ５３をその構造状態に関らず認識する市販のＤＯ−１抗体で染色する。図５に示されるように、阻害剤での処置は、ｐ５３を核に再局在化させるが、スクランブルペプチドでの処置は再局在化させない。下部において、トランジションは、再折り畳みステップを伴う：ｐ５３が大量に存在するが、阻害剤での処置後、抗体ＰＡｂ２４０がこれらの細胞中でｐ５３には結合しない（上のＤＯ−１染色を参照されたい）。市販の抗体であるＰＡｂ２４０は、誤って折り畳まれたｐ５３を認識し、それにより、ＰＡｂ２４０抗原性の喪失は、ｐ５３集団における誤って折り畳まれたものから適切に折り畳まれた機能的に有効なタンパク質への変化を反映する。
【図７】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰで処置された細胞は、生理学的制御系に応答することができる機能的ｐ５３を有することを示す。０、１、５、または１０μＭのＩＮＨ−１Ｒで２４時間処置されたＯＶＣＡＲ−３細胞ライセートのｐ５３レベルをウェスタンブロットによって評定し、ＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。ｐ５３の総量は、１ＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰでの処置後、濃度依存的に減少する。ここで、適切に折り畳まれたｐ５３（図６を参照されたい）は、ＷＴｐ５３のように分解され得る。誤った折り畳み／凝集による超安定性は喪失し、タンパク質のターンオーバーは早くなる。
【図８】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰ  ＣＰＰは、誤って折り畳まれた／凝集傾向のある突然変異体ｐ５３を保有する腫瘍細胞における細胞死を効果的に誘発することを示す。Ａ．１０μＭのＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰで２４時間処置された細胞において、細胞生存能力の用量依存性低減を検出した。ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰ投薬量に上昇に伴う、アポトーシスの増加（Ｂ．）及び増殖の減少（Ｃ．）を観察した。Ｂ．及びＣ．は、卵巣癌からの初代細胞のある代表的なケースを示す。すべての感受性初代細胞ならびに細胞株で同様の結果を観察した。
【図９】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰが、癌細胞における細胞死を効果的に誘発することを示す。ＩＮＨ−１Ｒまたは対照ペプチドのいずれかで２４時間処置された細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳによって分析した。細胞死は、ビヒクルで処置された細胞（ＤＭＳＯ）と比較して、ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰで処置された細胞における、細胞の大きさの典型的な低減及び粒度の上昇を伴う。対照スクランブルペプチド配列で処置された癌細胞は、細胞の大きさまたは粒度においてあらゆる変化も示さなかった。
【図１０】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰで処置された癌細胞におけるアポトーシス及びネクローシスを示す。ＯＶＣＡＲ−３細胞を、ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰまたはスクランブル阻害剤配列のいずれかの示される濃度で２４時間処置した。Ｈｏｅｃｈｓｔ（青色）は、すべての核を染色し、ＹＯ−ＰＲＯ−１（緑色）は、アポトーシス細胞のみを染色し、プロピジウムヨウ化物（赤色）は、後期アポトーシス／ネクローシス細胞を染色する。阻害剤で処置された試料は、ほとんど死滅した細胞を含有する一方、スクランブルペプチドは効果を有さず、配列特異的効果を示す。
【図１１】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰは、ｐ５３標的遺伝子ｐ２１及びＭｄｍ２の上方制御を誘発することを示す。ｐ５３の誤った折り畳み／凝集突然変異を含有する腫瘍細胞のみにおけるｐ５３標的遺伝子の上方制御により、ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰの特異性及び有効性を確認した。
【図１２】ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰは、インビボでの腫瘍増殖を制限することを示す。Ａ．ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰ、スクランブルペプチド対照、またはビヒクルで１４日間処置されたマウス（各群においてｎ＝３、１匹のマウスは、２個の異種移植片を有する）からの異種移植片の画像。Ｂ．ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰで処置されたマウスの腫瘍は、重量で評価すると、対照と比較して６倍小さかった。Ｃ．腫瘍体積を日々推定した。Ｄ．ＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰで処置された動物からの残存腫瘍は、ｐ５３標的遺伝子ＭＤＭ２及びｐ２１の上方制御を示した。
【図１３】ＭＲＭ（多重反応モニタリング）質量分析によって測定されるＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰの血清濃度を示す。ヌードマウスにＯＶＣＡＲ−３細胞を側腹部に注射し、結果として得られる異種移植片を２週間成長させた。次いで、マウスを、１５ｍｇ／ｋｇのＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰペプチドまたはスクランブル対照ペプチドでＩＰを介して３日間処置した。それらを２つの群に分け、最終ペプチド注射後、１、２、４、８、１２、及び２４時間で屠殺した。２匹の未処理のマウスを治療の前に屠殺し、参照値を得た。注射後１時間でＩＮＨ−１Ｒ  ＣＰＰ（ならびに対照ペプチド）のピーク血清濃度を検出した。２匹のマウスの平均を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本出願は、例えば、異常な（例えば、病理学的）立体構造を有するｐ５３タンパク質分子に特異的に（優先的に）結合し、異常な立体構造を有するｐ５３分子の立体構造を修復するペプチドの設計、合成、及び機能的特徴付けに関する。異常な立体構造は、例えば、分子中の突然変異または他の要因に起因する分子の誤った折り畳み、または野生型もしくは突然変異ｐ５３分子のアミロイド凝集体の形成であり得る。立体構造の修復の結果、異常な立体構造によって喪失または阻害された生物学的または生化学的活性は、再活性化または修復される。例えば、阻害性ペプチドは、ｐ５３アミロイド凝集体のさらなる凝集を阻害する（遮断する）、及び／または、例えば、アポトーシスの誘発もしくは開始、細胞増殖の阻害、及び／または腫瘍縮小の誘発等のｐ５３の機能を修復する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、細胞へのそれらの送達を強化する細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に融合される。
【００１０】
本発明者らは、最近、成長する凝集体を特異的に「キャップする」ように設計された短いアミノ酸阻害剤を利用して、アルツハイマー病関連タンパク質Ｔａｕの凝集及びＨＩＶウイルス感染の精液由来のエンハンサー（ＳＥＶＩ）を効率的に抑止することができることを示した（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。したがって、癌の進行に対する大いなる効果を有すると思われるｐ５３生物学の完全に未開拓の態様、すなわち、凝集をもたらすｐ５３の誤った折り畳みを標的とする新たな治療ウィンドウが存在する。本発明者らは、突然変異、過剰発現、または他の細胞因子が、アミロイド凝集体の構成要素として提案される接着性の「立体ジッパー」セグメントを曝露するネイティブｐ５３構造を不安定化し得ることを仮定した（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００５、Ｓａｗａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００７）。本明細書に報告されるように、本発明者らはそのため、ｐ５３凝集体のアミロイドスパインの高解像度原子図を得て、それらを鋳型として使用して、その凝集体をキャップし、さらなるｐ５３凝集を阻害し、それにより、癌細胞を治療に対して感作させ、アポトーシスを誘発または開始することができる活性ｐ５３のプールを生成することができる構造に基づくペプチド阻害剤を開発した。これらの合理的な構造に基づくｐ５３凝集の阻害剤は、ｐ５３凝集状態に起因して、最も攻撃的であり、標準的治療に対して強いことが証明された腫瘍に対して有効な新たな化学療法を提供する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【００１１】
本発明は、例えば、そのような阻害性ペプチド；その中で本発明の阻害性ペプチドが細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）に融合される分子であって、その融合分子が、本明細書において「ＣＰＰ阻害剤」と称されることがある、分子；本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物；阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤を使用して、異常な立体構造を有するｐ５３分子の構造及び機能を修復し、例えば、（ａ）（例えば、凝集の開始を遅らせる、及び／またはｐ５３凝集体を含む癌もしくは腫瘍を有する溶液、細胞、または対象において、凝集の量を低下させるために）ｐ５３凝集を遮断もしくは阻害する、ならびに／または（ｂ）誤って折り畳まれたｐ５３の折り畳みを修復し、それにより、異常な立体構造によるｐ５３の生物学的もしくは生化学的活性を再活性化する、方法；対象に本発明の有効量のＣＰＰ阻害剤を投与すること、または、腫瘍を本発明の有効量のＣＰＰ阻害剤と接触させることを含む、凝集したｐ５３（例えば、野生型または突然変異体の凝集したｐ５３）を含む腫瘍を有する対象を治療するための方法；ならびに本明細書に記載の結晶構造の構造表現に基づく阻害性ペプチドまたは小分子を設計し、かつ得るための方法等のコンピュータ関連実施形態に関する。
【００１２】
本発明の阻害性ペプチド及びＣＰＰ阻害剤の利点には、（１）それらが、突然変異体もしくは野生型の凝集したｐ５３または誤って折り畳まれたｐ５３を含有する癌細胞上でのみ選択的に活性であること、（２）それらが、折り畳まれたまたは活性ｐ５３上で効果を示さない（正常な細胞中ではｐ５３濃度の過剰活性化または上昇がない）こと、（３）それらが、配列（例えば、突然変異）特異的ではなく、むしろ立体構造特異的であること；単一の阻害剤が、異なる凝集突然変異体に対して、ならびに野生型ｐ５３に対して作用するだろうこと、（４）それらが、相同体、ならびに例えば、タンパク質のｐ５３ファミリーの他のメンバーであるｐ６３及びｐ７３を含む他のタンパク質との野生型ｐ５３の共凝集ならびにｐ５３の凝集を遮断することができること（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１）、（５）それらの組成及び小さい大きさのおかげで細胞透過及びタンパク質安定性が困難な障害ではないこと、（６）それらが、予想外に安定していること：それらが、タンパク分解されず、インビボ（例えば、身体内）で機能するのに十分に長い半減期を呈すること、が挙げられる。
【００１３】
本発明の１つの態様は、コンセンサス配列
0006574412.tif 000008
によって表される阻害性ペプチド（例えば、単離されたペプチド）、またはその活性変異体である。１つの実施形態では、阻害性ペプチドは、コンセンサス配列
0006574412.tif 000009
によって表されるか、またはその活性変異体である。阻害性ペプチドは、コンセンサス配列
0006574412.tif 000010
で構成されてもよく、またはコンセンサス配列
0006574412.tif 000011
で構成されてもよい。本発明の実施形態では、阻害性ペプチドは、表１に列挙される阻害性ペプチド配列のうちのいずれかで構成され得るか、またはそれを含み得る。つまり、ペプチドは、
0006574412.tif 000012
であり得る。活性変異体を含む、先行の配列を有する阻害性ペプチドは、本明細書において「本発明の阻害性ペプチド」と称されることもある。
【００１４】
本発明の別の態様は、任意にリンカー配列を介して細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）と融合される（結合される、会合される、連結される）本発明の阻害性ペプチド（活性変異体を含む）を含むＣＰＰ阻害剤である。ペプチドは、様々な方法（例えば、化学的に連結される、またはペプチド結合を介して融合される、または他の従来の化学カップリング方法）のうちのいずれかでＣＰＰと融合され得る。
【００１５】
１つの実施形態では、ＣＰＰは、コンセンサス配列
0006574412.tif 000013
によって表されるか、またはその活性変異体である。このコンセンサス配列によって包含される配列を含むＣＰＰ阻害剤またはその活性変異体は、本明細書において「本発明のＣＰＰ阻害剤」と称されることもある。
【００１６】
本発明の別の態様は、本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰと、薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物である。そのような薬学的組成物は、本明細書において「本発明の薬学的組成物」と称されることもある。
【００１７】
本明細書で使用する、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに指示しない限り、複数の指示対象を含む。例えば、先行の事例では、薬学的組成物は、１つ以上の本発明の阻害性ペプチド分子またはＣＰＰを含み得、それは同じであってもよく、または異なってもよい。
【００１８】
本発明の別の態様は、ｐ５３タンパク質分子と、本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰとを含む複合体である。それらは、互いに結合され得るか、コンジュゲートされ得るか、他の方法で結びつけられ得る。ｐ５３及び阻害性ペプチドまたはＣＰＰは、共有結合されるか、または非共有結合され得る。
【００１９】
本発明の別の態様は、異常な立体構造（例えば、その異常な立体構造が、少なくとも部分的に、タンパク質の機能の喪失に関与する）を有するｐ５３タンパク質分子の立体構造を修復するための方法であり、
異常な立体構造を有するｐ５３分子を、有効量の本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させることを含み、
その接触したｐ５３が、修復された立体構造を有し、
修復された立体構造を有するｐ５３分子が、アポトーシスの誘発、細胞増殖の阻害、及び／または腫瘍縮小の誘発から選択される活性（例えば、修復された活性）を呈する。
【００２０】
本方法の１つの実施形態では、接触したｐ５３タンパク質分子は癌を有する対象中にあり、修復された立体構造を有するｐ５３分子は、対象における癌細胞の増殖を阻害するか、及び／または対象における腫瘍縮小を誘発する。
【００２１】
本発明の別の態様は、細胞を、有効量の本発明の阻害性ペプチドもしくはＣＰＰ阻害剤、または本発明の阻害性ペプチドもしくはＣＰＰ阻害剤を含む薬学的組成物と接触させることを含む、異常な立体構造を持つｐ５３に起因する（例えば、それにより引き起こされる）細胞増殖（例えば、癌細胞の増殖）を予防及び／または阻害するための方法である。
【００２２】
本発明の別の態様は、対象に、本発明の薬学的組成物を有効量投与し、それによって、対象において癌細胞の増殖を阻害するか、及び／または対象において腫瘍を縮小させることを含む、異常な立体構造を有するｐ５３に関連する（例えば、それにより媒介される）癌を有する対象を治療するための方法である。
【００２３】
本発明の別の態様は、対象に、合計で有効量の本発明の薬学的組成物を含む用量（例えば、複数の注射によるもの等の複数の用量）を投与し、それによって、対象における腫瘍の発症を低減または予防することを含む、ｐ５３をコードする突然変異遺伝子、それにより癌の発症し易さ（例えば、Ｌｉ−Ｆｒａｕｍｅｎｉ症候群）を有する対象を治療する方法である。
【００２４】
本発明の別の態様は、ｐ５３の凝集を阻害する阻害性ペプチドを同定するためのコンピュータ実施方法であり、
標的ポリペプチド由来のｐ５３セグメントＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）もしくはＬＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）のジッパー形成配列または当該ジッパー形成配列の鏡体を含む、鋳型ペプチド配列を同定するステップであって、当該ジッパー形成配列が凝集して立体ジッパーになる、ステップと、
コンピュータ上で、当該鋳型ペプチド配列を用いて好ましい立体及びエネルギー分子間相互作用を形成する少なくとも１つの相補的ペプチド配列を設計するステップであって、当該相互作用が当該立体ジッパーの上端または下端の一方または両方で生じる、設計するステップと、
当該相補的配列、当該相補的配列の鏡体、当該相補的配列のペプチド模倣物、及び当該相補的配列の当該鏡体のペプチド模倣物から成る群から選択される、候補阻害性ペプチド化合物を同定するステップと、を含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、任意に容器内にパッケージ化された本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤を含むキットである。
【００２６】
本発明の別の態様は、本発明の阻害性ペプチドを作製する方法であって、それを化学的に合成するか、またはそれを組換えで生成することを含む、その方法である。
【００２７】
本明細書の実施例に記載されるように、ｐ５３の線維形成セグメントの原子構造の決定に基づいて、本発明者らは、ｐ５３凝集を減退させる一連のペプチド阻害剤を設計した。本発明者らは、ｐ５３の成長する凝集体を特異的に「キャップする」ペプチド阻害剤を設計した。
【００２８】
ＺｉｐｐｅｒＤＢアルゴリズム（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）を使用して、本発明者らは、結晶化可能アミロイド形成セグメントを同定した。本発明者らは、ｐ５３２５２−２５８及びｐ５３２５３−２５８セグメントを化学的に合成し、それらを結晶化して、マイクロ結晶学によってそれらの三次元構造を決定した（図１）。構造は、「フェイストゥバック（ｆａｃｅ−ｔｏ−ｂａｃｋ）」（ｐ５３２５２−２５８に関して）及び「フェイストゥフェイス（ｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）」（ｐ５３２５３−２５８に関して）方向で疎水性側鎖を介して噛み合う平行整列（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）のβ鎖及びβシートを有する典型的な立体ジッパーアーキテクチャを示した（Ｓａｗａｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００７）。
【００２９】
本発明者らは、それらのＲｏｓｅｔｔａに基づく方法（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１）を適用し、ｐ５３２５２−２５８構造を鋳型として使用してｐ５３凝集を妨害する阻害剤を設計した。本発明の他の実施形態では、ｐ５３２５３−２５８構造を鋳型として使用して、阻害剤を設計する。
【００３０】
表１は、本方法で得られる１６個の代表的な阻害剤配列の一覧を示す。
【００３１】
（表１）ペプチド配列を含むアミロイド生成性ｐ５３凝集の設計された阻害剤の一覧。ＩＮＨ−１Ｒは、設計された最初の配列である。ＩＮＨ−１Ｒ及びすべての他の変異体を合成し、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）としてポリアルギニンタグと、及び内在性ｐ５３タンパク質配列に由来する短いリンカー（配列：ＲＰＩ）と融合した。阻害設計された配列は、太字で示し、ポリアルギニンタグ及びリンカーは、通常の文字で示す。
0006574412.tif 000014
表１の阻害剤配列は、表の２列目の上から下へ向かってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７、１０、及び１８である。ＣＰＰ阻害剤配列は、表の３列目の上から下に向かってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、２８、及び３６である。
【００３２】
本発明のペプチド阻害剤は、本明細書に示されるｐ５３が媒介する機能のうちの１つ以上を呈する凝集していないまたは折り畳まれたｐ５３分子等の他のタンパク質標的（意図しない標的）との結合と比較して、異常な立体構造（例えば、アミロイド原線維もしくは線維として凝集するか、あるいは部分的にもしくは完全に折り畳まれていないかまたは誤って折り畳まれた）を有するｐ５３に特異的（選択的、優先的）に結合する。実際に、本発明のペプチド阻害剤と凝集していないまたは折り畳まれたｐ５３分子との間の結合は検出することができない。
【００３３】
他の好適なペプチド変異体には、例えば、Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）及びＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）が挙げられる。
【００３４】
この構造分析に基づき、１つのコンセンサス配列は、表１に示される１６個の配列を考慮して、
0006574412.tif 000015
である。別の実施形態では、コンセンサス配列は、
0006574412.tif 000016
である。残基番号１、６、及びより少ない程度に番号３は、鋳型構造との最も少ない接触を有し、このため、７個の残基のうち最も可変である。
【００３５】
上述の配列の活性変異体もまた含まれる。これらは、本明細書に示される阻害性ペプチドの特性（例えば、立体構造依存的であり、配列非依存的に凝集したｐ５３に特異的に結合する能力、ｐ５３のｐ５３または他のタンパク質との線維形成を阻害する能力、例えば、溶液もしくは細胞、培養物、または対象における癌細胞を含む細胞の増殖を阻害する能力、アポトーシスを誘発または開始する能力、あるいは、腫瘍を縮小させる能力）を保持する変異体である。本明細書で使用される場合、線維形成は、線維またはアミロイド原線維等の原線維の形成を指す。
【００３６】
好適な活性変異体には、ペプチド模倣物化合物を含む（例えば、本明細書に開示される方法に従って、ペプチドの構造及び／または結合活性（例えば、水素結合及び疎水性パッキング相互作用等）を模倣するように設計されたものを含む、天然の模倣されたペプチドの生化学的及び／または生物学的作用（複数可）を模倣することができる非ペプチド構造要素を含有する任意の化合物）。本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤（それらの活性変異体を含む）は、本明細書において「ペプチド化合物」または「化合物」と称されることもある。
【００３７】
１つの実施形態では、阻害性ペプチドの活性変異体は、開始阻害性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端のいずれか、またはその両方で、１〜３（例えば、１、２、または３）個のアミノ酸分、短縮される。別の実施形態では、活性変異体は、開始阻害性ペプチドのＣ末端で１、２、３、または４個のアミノ酸分、伸ばされる（延長される）。
【００３８】
様々な他の種類の活性変異体が包含される。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列において上述されたもの以外のアミノ酸が置換される。これらのアミノ酸は、タンパク質分解に対するペプチド阻害剤の保護、または他の方法でペプチドの安定化を補助することができ、及び／または、他の方法における望ましい薬動力学特性に寄与することができる。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、阻害剤をより緊密に標的に結合させ、これは、側鎖が、それとの水素結合及び／または無極性相互作用を最適化するためである。加えて、非天然アミノ酸は、例えば、阻害定数等の値を測定するために使用され得る強い蛍光マーカー等の検出可能なマーカーを導入する機会を提供する。例えば、ペプトイド、βアミノ酸、Ｎエチル化アミノ酸、及び小分子模倣物等のペプチド模倣物も含まれる。
【００３９】
１つの実施形態では、非天然アミノ酸は、配列中でアミノ酸と置換される。１００個を超える非天然アミノ酸が、市販されている。これらには、例えば、以下のものが挙げられる。
ＬＥＵを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−Ｌ−シクロヘキシルグリシン            １６１３２１−３６−４
Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルグリシン                  １０２４１０−６５−１
Ｆｍｏｃ−４−ヒドロキシ−Ｄ−フェニルグリシン  １７８１１９−９３−２
Ｆｍｏｃ−Ｌ−α−ｔ−ブチルグリシン            １３２６８４−６０−７
Ｆｍｏｃ−シクロペンチル−Ｇｌｙ−ＯＨ          ２２０４９７−６１−０
Ｆｍｏｃ−Ｌ−２−インダニルグリシン            ２０５５２６−３９−２
ＴＨＲを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ            ７１９８９−３５−０
Ｆｍｏｃ−（ＲＳ）−２−アミノ−３−
ヒドロキシ−３−メチルブタン酸              １０５５０４−７２−１
ＩＬＥを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−アロ−Ｉｌｅ−ＯＨ            ２５１３１６−９８−０
Ｂｏｃ−Ｎ−Ｍｅ−アロ−Ｉｌｅ−ＯＨ    １３６０９２−８０−３
Ｆｍｏｃ−Ｈｏｍｏｌｅｕ−ＯＨ          １８０４１４−９４−２
ＧＬＵを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−γ−カルボキシ−Ｌ−グルタミン酸        １１１６６２−６４−７
Ｆｍｏｃ−Ｌ−α−アミノスベリン酸                ２１８４５７−７６−２
ＡＲＧを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン            ５８１１１−９４−７
Ｆｍｏｃ−Ｌ−シトルリン                          １３３１７４−１５−９
ＴＹＲを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−３−アミノ−Ｌ−チロシン            ７２６１８１−７０−０
Ｆｍｏｃ−３−ニトロ−Ｌ−チロシン            １３６５９０−０９−５
Ｆｍｏｃ−３−メトキシ−Ｌ−チロシン
Ｆｍｏｃ−３−ヨード−Ｌ−チロシン            １３４４８６−００−３
Ｆｍｏｃ−３−クロロ−Ｌ−チロシン            ４７８１８３−５８−３
Ｆｍｏｃ−３，５−ジブリモ−Ｌ−チロシン      ２０１４８４−２６−６
ＬＹＳを置換し得る非天然アミノ酸：
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（レトロ−Ａｂｚ−Ｂｏｃ）−ＯＨ        １５９３２２−５９−５
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｃａ）−ＯＨ                        ３８６２１３−３２−７
Ｆｍｏｃ−（Ｎδ−４−メチルトリチル）−Ｌ−オルニチン  ３４３７７０−２３−０
Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−Ｎ−ε−（ｄ−ビオチン）−Ｌ−リジン  １４６９８７−１０−２
【００４０】
別の実施形態では、Ｌ−アミノ酸のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、または７個）が、Ｄアミノ酸で置換される。
【００４１】
別の実施形態では、Ｎ−メチル化残基のうちの１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、または７個）が、ペプチドに含まれる。代表的なそのようなペプチドには、例えば、以下のものが挙げられる。
0006574412.tif 000017
【００４２】
本発明の阻害性ペプチドは、例えば、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００４３】
１つの実施形態では、阻害剤は、阻害剤を設計するための基礎として、本明細書に示されるｐ５３の線維形成セグメントのうちの１つの原子構造を使用して、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅＬｉｆｅ  ２０１３（これは、特に本方法に関して、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載される方法によって設計された小分子である。Ｊｉａｎｇらの方法によって同定され得る好適な小分子は、当業者には明らかだろう。
【００４４】
本発明の１つの実施形態では、本発明のペプチドは、そのアミノ酸の１、２、または３個が、上述の非天然アミノ酸等の天然に生じない側鎖を有するアミノ酸で、または、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅＬｉｆｅ  ２０１３によって設計された小分子の架橋（例えば、Ｌｙｓ残基のエプシロンアミノ基を介して）によって修飾された側鎖を有するアミノ酸で置換されるように、修飾される。いくつかの代表的な線維結合分子が、以下に示される。これらの活性変異体は、ｐ５３の成長する凝集体をキャップするだけでなく、修飾側鎖を介して、立体ジッパーの側面に結合し（に対してクランプし）、それによって、ペプチドの阻害性活性を強化する。
【００４５】
Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅＬｉｆｅ  ２０１３によって設計される線維結合化合物には、以下のものを含む。
0006574412.tif 000018
0006574412.tif 000019
【００４６】
本発明の阻害性ペプチドの細胞透過性を強化するために、それらは、様々な細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）のうちのいずれかに融合され得る。ＣＰＰは、典型的には、リジンもしくはアルギニン等の正荷電アミノ酸の高い相対存在量を含むか、または極性／荷電アミノ酸及び非極性疎水性アミノ酸の交互のパターンを含む配列を有するアミノ酸組成物を有する。これら２つの種類の構造は、それぞれ、ポリカチオン性または両親媒性と称される。ＣＰＰの第３のクラスは、低い正味荷電を有するか、または細胞取り込みに欠かせない疎水性アミノ酸基を有する無極性残基のみを含有する疎水性ペプチドである。本発明の阻害性ペプチドと融合され得るいくつかの典型的なＣＰＰを表２に示す。
【００４７】
（表２）
・  名称        配列
参照−原本または再考
0006574412.tif 000020
0006574412.tif 000021
0006574412.tif 000022
0006574412.tif 000023
【００４８】
別の実施形態では、ＣＰＰは、ポリＤ（１−１６）である。
【００４９】
一般的に、ＣＰＰの長さは、分子が細胞に進入した後の安定性及び薬動力学特性を改善するために、例えば、約３０個未満のアミノ酸のように、やや短いことが望ましい。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、本発明のペプチドに直接結合される（融合される）。他の実施形態では、高荷電のＣＰＰは、阻害剤がその活性を保持することを可能にするために、リンカーを用いて阻害剤ペプチドから分離することが望ましい。様々なリンカーのうちのいずれかが使用され得る。リンカーの大きさは、例えば、１〜７個、またはさらに多くのアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、もしくは７個のアミノ酸）の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、内在性ｐ５３配列に由来する配列を有する。例えば、リンカーは、ＧＧＭＮＲＲＰＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）、またはＲＰＩのＮ末端側の１、２、３、４、または５個の連続するアミノ酸が阻害性ペプチドに融合されるその切頭型バージョンであってもよい。本明細書に示される実験で使用されるＲＰＩリンカーは、そのようなリンカーの１つである。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態では、ＣＰＰ阻害剤は、特異的に特定の癌型を標的とするためにさらに改変される。例えば、
（１）１つの実施形態は、癌特異的プロテアーゼによるタンパク質分解切断後のみ細胞に進入することができる活性化可能なＣＰＰであるＡＣＰＰを使用する、Ｒｏｇｅｒ  Ｔｓｉｅｎ及び共同作業者によって説明される手法（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１０）の修正である。この実施形態では、阻害剤は、目的とする癌によって主に発現されるプロテアーゼに特異的な配列を利用して特定の癌型を標的とする。
（２）別の実施形態は、Ｈａｔａｋｅｙａｍａ及び共同作業者によって提唱される戦略（Ｈａｔａｋｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ  ２０１１）の修正である。これらの著者は、癌血管系マーカーであるアネキシン１に結合する炭水化物模倣ペプチドＩＦ７（配列ＩＦＬＬＷＱＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２））を使用して、標的化癌細胞送達を得た。この実施形態では、好適な腫瘍血管系マーカー結合ペプチドは、本発明のＣＰＰ阻害剤に融合される。
（３）別の実施形態では、阻害剤は、ナノ粒子とコンジュゲートされる。様々な好適なナノ粒子のうちのいずれかは、当業者には明らかだろう。これらには、例えば、空のボールトシェル、リポソーム、高分子ナノ粒子、デンドリマー等が挙げられる。
【００５２】
本発明の１つの実施形態では、本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤は、本明細書に示される方法等の従来の技法を使用して単離または精製される。「単離される」とは、通常、それに関連付けられる成分、例えば、ペプチドが合成された後に存在する成分から分離されることを意味する。単離されたペプチドは、ペプチド配列を含有するタンパク質の切断生成物であってもよい。「精製された」阻害性ペプチドは、例えば、９０％、９５％、９８％、または９９％超純粋であり得る。
【００５３】
本発明の実施形態では、阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤は、検出可能に標識される。標識されたペプチドは、例えば、阻害性ペプチドの作用機序及び／または細胞部位をより良く理解するために使用することができる。検出を可能にする（例えば、検出可能なシグナルを提供する、または検出され得る）好適な標識は、従来型であり、当業者に周知である。好適な検出可能な標識には、例えば、放射性活性剤、蛍光標識等が挙げられる。そのような標識をタンパク質に付着するための方法またはそれらの存在及び／もしくは量を検出するためのアッセイは、従来型であり、周知である。
【００５４】
本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤は、様々な当該技術分野において認識されている方法のうちのいずれかによって合成することができる（例えば、化学的に、または好適な宿主細胞中での組換え発現によって）。本発明の方法で使用するための阻害性ペプチドの十分な量を生成するために、実践者は、例えば、従来の技法を使用して、ペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成し、発現ベクター中に挿入することができ、その中で、配列は、プロモーターまたはエンハンサー等の発現制御配列の制御下にあり、次いで、ペプチドの合成を命令することができる。例えば、（ａ）末端に好適なリンカーを有するＤＮＡを新たに合成し、ベクター中にクローニングすることができる、（ｂ）全ＤＮＡ配列をベクター中にクローニングすることができる、または（ｃ）重複オリゴヌクレオチドから開始し、それらを従来のＰＣＲで作られる遺伝子合成方法によって結合し、結果として得られるＤＮＡをベクター中に挿入することができる。好適な発現ベクター（例えば、プラスミドベクター、ファージを含むウイルス性ベクター、人工ベクター、酵母ベクター、真核性ベクター等）が、ベクターを作製する、目的とする配列を挿入する、その核酸でコードされたタンパク質を発現する、及び発現されたタンパク質を単離または精製するための方法と同様に、当業者には明らかだろう。
【００５５】
本発明の別の態様は、阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤のうちの１つ以上と、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的組成物である。薬学的組成物の成分は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標識で、またはポジトロン放出分光法（ＰＥＴ）による検出のために好適な標識で、検出可能に標識されてもよい。いくつかの実施形態では、阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤は、所望の目的に対する有効量で存在する。
【００５６】
「薬学的に許容される」とは、薬学的組成物の調製において有用であることが、一般的に安全で、無毒性であり、生物学的に望ましくないことはなく、それ以外でも望ましくなくないことはないことを意味し、獣医学的ならびにヒトの薬学的使用に許容されることを含む。例えば、化合物の「薬学的に許容される塩」は、本明細書に定義されるように薬学的に許容される塩及び親化合物の所望の薬理作用のある活性を保有する塩を意味する。
【００５７】
本発明の他の態様は、任意に、好適なリンカーによって阻害性ペプチドから任意に分離されるＣＰＰ配列に結合される、本発明の阻害性ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の実施形態では、ポリヌクレオチドは、（例えば、トランスフェクションによる）好適な細胞への導入後にコードされたタンパク質の生成を促進するように、調整制御配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に作動可能に連結され、細胞は発現ベクターを含み、本発明の阻害性ペプチドを作製する方法は、細胞を培養すること及び結果として生成されたポリペプチドを回収することを含む。
【００５８】
本出願の全体を通して使用される、「約」とは、値のプラスまたはマイナス５％を意味する。
【００５９】
本発明の別の態様は、本明細書に示される方法のうちのいずれかを行うためのキットである。キットは、好適な量の本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤、ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤を生成するための試薬、それらの機能もしくは活性を測定するためのアッセイのための試薬等を含むことができる。本発明のキットは、方法を実施する為の使用説明書を含んでもよい。本発明のキットの他の任意の要素には、好適な緩衝液、媒質成分等、本明細書に示される結晶構造のうちの１つの構造表現を提供するコンピュータもしくはコンピュータ可読媒体、容器、またはパッケージ材料が挙げられる。好適な制御を実施するための試薬も含まれ得る。キットの試薬は、例えば、凍結乾燥形態または安定化液体で、その中で試薬が安定する容器内にあってもよい。試薬はまた、単一使用形態、例えば、対象に投与するための単一反応形態であってもよい。
【００６０】
本発明の１つの態様は、本明細書に示される方法を使用して、ｐ５３の凝集を阻害する阻害性ペプチドを設計するためのコンピュータ実施方法である。例えば、方法は、ｐ５３セグメントＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）もしくはＬＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）のジッパー形成配列またはジッパー形成配列の鏡体（ここでジッパー形成配列は凝集して立体ジッパーになる）を含む鋳型ペプチド配列を（例えば、コンピュータを用いて）同定することと、コンピュータ上で、鋳型ペプチド配列を用いて好ましい立体及びエネルギー分子間相互作用を形成する少なくとも１つの相補的ペプチド配列を設計することであって、相互作用が当該立体ジッパーの上端または下端の一方または両方で生じる、設計することと、補的配列、相補的配列の鏡体、相補的配列のペプチド模倣物、及び相補的配列の鏡体のペプチド模倣物から成る群から選択される、候補阻害性ペプチド化合物を（例えば、コンピュータを用いて）同定することと、を含み得る。この種類の方法の詳細は、特に、目的とするアミロイドを形成する標的ポリペプチドの凝集を阻害する阻害性ペプチド化合物を設計する方法に関して、参照により本明細書にその全体が組み込まれる米国特許第１２／７０２，１７５号で出願された特許において記載される。
【００６１】
本発明の実施形態では、この方法によって設計される阻害性化合物（例えば、ペプチド化合物）は、合成され、例えば、本明細書に示される方法のうちの１つを使用して、ｐ５３の凝集に結合する、及び／またはそれを阻害する能力に関してスクリーニングされる。
【００６２】
本発明の候補の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤の特徴付けは、様々な従来の方法のうちのいずれかによって行うことができる。例えば、ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤は、ｐ５３凝集を低減させるか、もしくは阻害する、またはｐ５３を再活性化する能力に関してアッセイすることができる。次いで、機能性ｐ５３は、例えば、細胞中でアポトーシスをもたらすことができる。アッセイは、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【００６３】
１つの代表的なインビトロアッセイは、図３に示されるチオフラビンＴアッセイである（Ｎａｉｋｉ，Ｈ．，Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｔａｋｅｄａ，Ｔ．（１９８９）  Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ，ｔｈｉｏｆｌａｖｉｎｅ  Ｔ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７，２４４−２４９）。アッセイは、ＬＴＩＩＴＬＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）等の標的配列ペプチドを使用して実施することができ、または完全長ｐ５３（組換えｐ５３等）を使用して実施することができる。両方の場合において、ペプチド（例えば、ＬＴＩＩＴＬＥ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）またはｐ５３は、チオフラビンＴ及び濃度の上昇した阻害剤を有する溶液中に配置される。アッセイは、マルチウォールプレート（例えば、３８４ウェルプレート）で実施される。この色素は、アミロイド特異的であり、アミロイド凝集体に結合した時にのみ蛍光を発する。蛍光は、例えば、プレートリーダーを用いて経時的に測定される。阻害は、凝集の開始の遅延及び／または形成された凝集体のより少ない総量として検出される。
【００６４】
以下のアッセイは、細胞中で実施することができる従来の機能的アッセイのである。
【００６５】
１．ｐ５３凝集の低減
ｐ５３凝集は、ｐ５３不活性化の指標として癌細胞中で測定される（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。スクリーニングは、例えば、以下の従来の方法のうちの１つを使用して、阻害剤の有無に関係なく存在する凝集体の総量の変化に対して実施される。
・  市販のアミロイド立体構造特異的抗体、例えば、Ａ１１及びＯＣを使用する細胞の免疫染色
・  チオフラビンＴ及びＣｏｎｇｏ  Ｒｅｄ等のアミロイド特異的色素による細胞の染色
・  ＯＣまたはＡ１１抗体を使用する細胞ライセート上でのドットブロット
・  高分子量ｐ５３凝集体の存在／不在を確認するための、ｐ５３特異的抗体を使用する、細胞ライセート上でのウェスタンブロットと連結したネイティブページゲル
・  異常にまたは正常に折り畳まれたｐ５３の間を識別することができる異なる市販のｐ５３抗体を使用する細胞の免疫染色
【００６６】
２．ｐ５３機能の再活性化
記載されたように、ｐ５３機能は、典型的には、凝集によって阻害される（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１１；Ｌａｓａｇｎａ−Ｒｅｅｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。ｐ５３不活性化及び再活性化は、以下の従来の手法を用いて、異なる濃度の阻害剤の存在下で試験される。
・  ＲＴ−ＰＣＲまたはＲＮＡｓｅｑによるいくつかのｐ５３標的の転写物を定量化することによって測定されるｐ５３の転写活性の修復
・  タンパク質レベルでいくつかのｐ５３標的をウェスタンブロットを介して検出することによって、測定されるｐ５３の転写活性の修復
・  軟寒天培養コロニー形成アッセイによる、細胞増殖スクリーニングを抑止する阻害剤の能力
・  ＢｒｄＵ取り込みまたはＫｉ６７染色の低減による、細胞増殖スクリーニングを抑止する阻害剤の能力
・  ＭＴＴまたはＭＴＳアッセイにより測定される、細胞死を誘発する阻害剤の能力
・  カスパーゼアポトーシスキットまたはＦＡＣＳと組み合わされたアネキシンＶ染色により測定される、アポトーシスを誘発する阻害剤の能力
【００６７】
細胞は、阻害剤単独で、またはキナーゼに対する他の標的剤等の従来の化学療法ならびに他の化学療法分子もしくは他の分子と組み合わせて処置される。先行する方法のうちのいずれかは、候補の阻害性ペプチドを、例えば、ｐ５３に結合する、ｐ５３線維形成を阻害する、または、インビトロもしくはインビボで癌細胞を化学療法に対して感作させるそれらの能力に関して試験することをさらに含んでもよい。
【００６８】
本発明の１つの態様は、ｐ５３アミロイドプロトフィラメントを有効量の本発明のＣＰＰ阻害剤の阻害性ペプチドのうちの１つ以上と接触させることを含む、ｐ５３凝集を低減させるか、またはそれを阻害するための方法である。そのような方法は、インビトロ（溶液中で）またはインビボ（例えば、培養中の細胞もしくは対象中で）で行われ得る。
【００６９】
本発明の別の態様は、異常な立体構造を有するｐ５３タンパク質分子の立体構造を修復するための方法である。本明細書で使用される場合、「異常な立体構造」は、野生型立体構造とは異なり、分子の機能の喪失をもたらす、立体構造を指す。例えば、異常な立体構造を有するｐ５３は、（例えば、癌細胞の）細胞増殖を阻害する、アポトーシスを誘発もしくは開始する、または腫瘍を縮小させる能力を喪失し得る。そのような異常な立体構造は、本明細書において、病理学的立体構造と称されることもある。異常な立体構造は、他のｐ５３分子または他のタンパク質と、ｐ５３分子のアミロイド凝集体または線維（原線維）の形態をとることもできる。あるいは、異常な立体構造は、突然変異または他の要因に起因するｐ５３タンパク質の誤った折り畳み（例えば、部分的もしくは完全なアンフォールディング）の形態をとることができる。あらゆる特定の機序に束縛されるものではないが、誤った折り畳みを促進する突然変異は、ネイティブｐ５３構造を不安定化して、疎水性接着セグメントｐ５３２５２−２５８に、溶媒曝露を受けさせることが示唆される。セグメントは、急速に、他のｐ５３分子と相互作用し、タンパク質凝集及び不活性化をもたらす。これらのセグメントが互いに相互作用することを遮断する凝集阻害剤を生成することによって、凝集プロセスが停止され、及び／または、阻害剤はまた、誤って折り畳まれたｐ５３を活性立体構造になるよう介添えし、それにより、細胞死応答を駆動することができる機能的及び可溶性ｐ５３のプールを修復する可能性が示唆される。
【００７０】
異常な立体構造を有するｐ５３タンパクの立体構造を修復するためのこの方法では、異常な立体構造を有するｐ５３分子を、有効量の本発明の阻害性ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させる。接触されたｐ５３分子は、修復された立体構造を有し、例えば、アポトーシスの誘発もしくは開始、細胞増殖の阻害、及び／または腫瘍縮小から選択される修復もしくは再活性化された生物学的または生化学的活性を呈する。
【００７１】
本発明の別の態様は、ｐ５３タンパク質の異常な立体構造に由来するｐ５３タンパク質の生物学的または生化学的活性（機能）を再活性化または修復するための方法である。本方法は、異常な立体構造を有するｐ５３タンパク質分子を、有効量の本発明の阻害剤ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させることを含み、ここで、ｐ５３分子の生物学的または生化学的活性は、アポトーシスの誘発もしくは開始、及び／または細胞増殖の阻害、及び／または腫瘍縮小の誘発である。異常な立体構造を有するｐ５３タンパク質の接触の結果として、ｐ５３分子の喪失した生物学的または生化学的活性が再活性化または修復される。
【００７２】
本発明の別の態様は、ｐ５３タンパク質の異常な立体構造に由来するｐ５３タンパク質の生物学的または生化学的活性（機能）の喪失を阻害または予防するための方法である。本方法は、異常な立体構造を有するｐ５３タンパク質分子を、有効量の本発明の阻害剤ペプチドまたはＣＰＰ阻害剤と接触させることを含み、ここで、ｐ５３分子の生物学的または生化学的活性は、アポトーシスの誘発もしくは開始、及び／または細胞増殖の阻害、及び／または腫瘍縮小の誘発である。異常な立体構造を有するｐ５３タンパク質の接触の結果として、ｐ５３分子の活性の喪失が、阻害または予防される。
【００７３】
本発明の別の態様は、ｐ５３が異常な立体構造（例えば、凝集したまたは誤って折り畳まれた）を有する癌または腫瘍等のｐ５３の機能の喪失によって媒介される疾患または病状を有する対象を治療するための方法である。つまり、癌は、異常な立体構造を有するｐ５３と関連する。本方法は、対象に、有効量の１つ以上の本発明のＣＰＰを投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＣＰＰ阻害剤のうちの１つ以上のカクテルが使用される。いくつかの実施形態では、ＣＰＰ阻害剤は、対象の化学療法薬またはレジメンへの応答を強化するために、従来の化学療法薬またはレジメンと併せて使用される。典型的なそのような化学療法薬またはレジメンには、例えば、パクリタキセル、タキソール、ゲムシタビン、シスプラチン、カルボプラチン、ラパマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、トラスツズマブ、イマチニブ、ソラフェニブ、ベムラフェニブ、ダサチニブ、クリゾチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、カルフィルゾミブ、ＰＲＩＭＡ１−ＭＥＴ、ＭＩ−７７３、ヌトリン、及び１７ＡＡＧが挙げられる。
【００７４】
本発明の化合物または薬学的組成物の「有効量」は、測定可能な量の所望の結果、例えば、ｐ５３凝集の阻害を引き出すことができる量、診断的アッセイについて、ｐ５３凝集等の関心対象の標的を検出することができる量、または治療方法において、治療される疾患もしくは病状の症状を、測定可能な量で低減もしくは回復させることができる量である。
【００７５】
「対象」とは、病状または疾患が本発明の方法によって治療され得る、異常な立体構造を持つｐ５３（例えば、ｐ５３が、凝集した、または誤って折り畳まれた）を有する任意の対象（患者）であり得る。本発明の１つの実施形態では、対象は、突然変異体ｐ５３に関連する、Ｓｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６に記載の癌のうちの１つ等の癌を有する。典型的な対象には、実験動物、イヌ、ネコ、非ヒト霊長動物、及びヒトを含む哺乳動物等の脊椎動物が挙げられる。
【００７６】
本発明の阻害剤は、例えば、経口、経鼻、腹腔内、もしくは非経口的、静脈内、筋肉内、局所、もしくは皮下経路による、または組織への注射による選択された投薬経路に適応する様々な形状の薬学的組成物として製剤化され得る。
【００７７】
化合物の投与に好適な経口形状には、ロゼンジ、トローチ、錠剤、カプセル、発泡錠、経口崩壊錠、胃での保持時間を増加するように設計される浮遊錠（ｆｌｏａｔｉｎｇ  ｔａｂｌｅｔ）、頬パッチ、及び舌下錠が挙げられる。
【００７８】
本発明の化合物は、例えば、経口で、不活性希釈剤もしくは吸収可能な食用担体等の薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、または吸入もしくは吹送によって全身的に投与されてもよい。それらは、コーティングされた、もしくはコーティングされていない硬または軟シェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、錠剤に押し固められてもよく、または患者の食事の食糧に直接組み込まれてもよい。経口治療投与に関して、化合物は、１つ以上の賦形剤と合わされてもよく、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、水等の形状で使用されてもよい。ヒトへの投与に適した組成物に関して、「賦形剤」という用語は、限定されないが、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２１ｓｔ  ｅｄ．（２００６）（以下、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ）に記載の成分を含むことを意味する。
【００７９】
化合物は、微細な不活性粉末担体と合わされてもよく、対象によって吸入もしくは吹送されてもよい。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の化合物を含むべきである。組成物及び調製物のパーセンテージは、当然のことながら、変化してもよく、好都合には、所与の単位剤形の重量の約２％〜約６０％であり得る。
【００８０】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル等は、次のものも含み得る：タラカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチン等の結合剤、リン酸二カルシウム等の賦形剤、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤、ならびにスクロース、フルクトース、ラクトース、もしくはアスパルテーム等の甘味料またはペパーミント、ウィンターグリーンの油、もしくはチェリー香料等の着香料が添加されてもよい。単位剤形がカプセルの場合、上記種類の材料に加えて、植物油またはポリエチレングリコール等の液体担体を含有してもよい。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物、甘味料としてスクロースまたはフルクトース、防腐剤としてメチル及びプロピルパラベン、チェリー風味またはオレンジ風味等の色素及び香料を含有してもよい。
【００８１】
種々の他の材料は、コーティングとして、または他の方法で固形単位剤形の物理的形状を改変するために、存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、ゼラチン、蝋、セラック、または糖等でコーティングされ得る。当然のことながら、任意の単位剤形の調製において使用される任意の材料は、薬学的に許容され、用いられる量で実質的に無毒性であるべきである。
【００８２】
加えて、化合物は、持続放出調製物及び装置に組み込まれてもよい。例えば、化合物は、持効性放出カプセル、持効性放出錠剤、及び持効性放出丸剤に組み込まれてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、発泡錠、経口崩壊錠、胃での保持時間を増加するように設計される浮遊錠、頬パッチ、及び舌下錠から成る群から選択される剤形を使用して投与される。
【００８３】
化合物はまた、注入もしくは注射によって静脈内に、または腹腔内に投与されてもよい。化合物の溶液は、水中で、任意に無毒性界面活性剤と混合して調製され得る。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中で、ならびに油中で調製され得る。通常の貯蔵及び使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を予防するための防腐剤を含有することができる。
【００８４】
注射または注入に適した薬学的剤形には、任意にリポソームに封入される、無菌の注射可能もしくは注入可能な溶液または分散液の即時調製に適応する化合物を含む、無菌水溶液もしくは分散液または無菌粉末が挙げられる。すべての場合において、最終的な剤形は、無菌の流体であり、製造及び貯蔵の条件下において安定すべきである。液体担体またはビヒクルは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、無毒性グリセリルエステル、及びそれらの好適な混合物を含む、溶媒または液体分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散液の場合、必要とされる粒径の維持によって、または界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【００８５】
無菌注射可能溶液は、必要量の化合物を、必要に応じて上に列挙される種々の他の成分を含む適切な溶媒に組み込み、その後、濾過滅菌することによって調製される。無菌注射可能溶液の調製のための無菌粉末の場合では、調製の好ましい方法は、所望の成分活性成分に追加して事前に滅菌濾過された溶液中に存在する任意の追加の粉末を得る真空乾燥及び凍結乾燥技法である。
【００８６】
局所投与に関して、化合物は、純粋な形態で適用されてもよい。しかしながら、固体または液体であり得る皮膚科学的に許容可能な担体と組み合わせて、それらを組成物または製剤として皮膚へ投与することが一般的に望ましいだろう。
【００８７】
有用な固体担体には、タルク、粘土、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉化した固体を含む。他の固体担体は、従来の無毒性ポリマーナノ粒子またはマイクロ粒子が挙げられる。有用な液体担体には、化合物が、任意に無毒性界面活性剤を用いて有効なレベルで溶解または分散され得る水、アルコール、もしくはグリコール、または水／アルコール／グリコールブレンドを含む。香料及び追加の抗微生物剤等のアジュバントが、所与の用途のための特性を最適化するために添加されてもよい。結果として得られる液体組成物は、含浸性包帯及び他の包帯材に使用される吸収性パッドから適用されてもよく、またはポンプ型もしくはエアロゾル噴霧器を使用して患部上に噴霧されてもよい。
【００８８】
式１の化合物の有用な投薬量は、それらのインビトロ活性、及び動物モデルにおけるインビボ活性と比較することによって決定することができる。マウス及び他の動物からヒトまでの有効な投薬量を推定するための方法は、当該技術分野で既知である。
【００８９】
例えば、ローション等の液体組成物における化合物の濃度は、約０．１〜２５重量％または約０．５〜１０重量％であり得る。ゲルもしくは粉末等の半固体または固体組成物における濃度は、約０．１〜５重量％または約０．５〜２．５重量％であり得る。
【００９０】
本発明の薬剤の有効な投薬量及び投与経路は、従来のものである。薬剤の正確な量（有効用量）は、例えば、対象の種属、年齢、体重、及び全身状態または臨床状態、治療される任意の障害の重症度または機序、使用される特定の薬剤またはビヒクル、投与の方法及びスケジュール等によって、対象によって異なるだろう。治療的有効用量は、経験的に、当業者に既知の従来の手順によって決定することができる。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，ｅｄｓ．，Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。例えば、有効用量は、細胞培養アッセイにおいて、または好適な動物モデルにおいてのいずれかで、最初に推定することができる。また、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。治療的用量はまた、比較可能な治療薬の投薬量に対する類似性から選択することもできる。
【００９１】
特定の投与様式及び投薬レジメンは、症例の特徴（例えば、対象、疾患、関与する疾患状態、及び治療が予防的であるかどうか）を考慮して、担当臨床医によって選択されるだろう。治療は、数日間、数ヶ月間、またはさらに数年間の期間にわたって、化合物（複数可）の１日用量または数日用量を含み得る。
【００９２】
しかしながら、一般的に、好適な用量は、約０．００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば、キログラム当たり約０．１ｍｇ超といった１日当たり体重の約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または１日当たりレシピエントの体重のキログラム当たり約１〜約１０ｍｇの範囲であるだろう。例えば、好適な用量は、１日当たり体重の約１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
【００９３】
化合物は、好都合に、例えば、単位剤形１つ当たり０．０５〜１００００ｍｇ、０．５〜１００００ｍｇ、５〜１０００ｍｇ、または約１００ｍｇの活性成分を含有する単位剤形で投与される。いくつかの実施形態では、投薬単位は、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約２５ｍｇ、約５０ｍｇ、約７５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約７５０ｍｇ、または約１０００ｍｇの活性成分を含有する。
【００９４】
本発明はまた、本明細書に示される結晶構造のうちの１つの構造表現を提供するか、または本明細書に示されるアッセイ結果を記憶及び／もしくは評価するコンピュータ可読媒体等のコンピュータに関係する実施形態も含む。
【００９５】
ｐ５３構造表現を含む記憶媒体（コンピュータ可読媒体）は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ、例えば、ＣＤＲＯＭ）、ディスケット、磁気記憶媒体、これらのカテゴリーの混合物等であり得る。記憶媒体は、コンピュータに局在化していてもよく、または遠隔（例えば、インターネットを含む、ネットワークされた記憶媒体）であってもよい。本発明はまた、本発明の３Ｄ構造の座標を含むコンピュータ可読データベース、本発明の３Ｄ構造に関する情報が組み込まれているかまたはそれを含むコンピュータ可読媒体、（例えば、ｐ５３セグメントの構造の特徴付けるための、またはペプチド阻害剤を設計及び／もしくは選択するための）本発明の方法を行うようにプログラムされたコンピュータ、ならびに本明細書に示される方法を行うためのプログラムがその上に保存されたデータキャリアを生成する方法も提供する。
【００９６】
任意の好適なコンピュータを本発明において使用することができる。
【００９７】
本明細書で考察される計算装置または任意の他のコンピュータシステムもしくはその計算装置構成要素のうちのいずれかを実装するために使用され得る１つ以上の実施形態に従う計算装置を実装するための例示的アーキテクチャが以下に記載される。クライアントまたはサーバー等の本計算装置とともに使用することができる他の装置が、同様に構成され得ることが理解されるだろう。計算装置は、バス、プロセッサ、メモリ、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、記憶装置、入力装置、出力装置、及び通信インタフェースを含み得る。
【００９８】
バスは、計算装置の構成要素間の通信を可能にする１つ以上の相互接続を含み得る。プロセッサは、任意の種類のプロセッサ、マイクロプロセッサ、または命令を解釈及び実行することができる処理論理回路（例えば、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ））を含み得る。プロセッサは、単一装置（例えば、シングルコア）及び／または装置の群（例えば、マルチコア）を含み得る。メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、またはプロセッサによって実行するための情報及び命令を記憶することができる別の種類の動的記憶装置を含み得る。メモリはまた、プロセッサによる命令を実行中に一時的数値変数または他の中間情報を記憶するために使用することもできる。
【００９９】
ＲＯＭは、ＲＯＭ装置、及び／またはプロセッサの静的情報及び命令を記憶することができる別の種類の静的記憶装置を含み得る。記憶装置は、情報及び／または命令を記憶するための磁気ディスク及び／または光ディスクならびにその対応するドライブを含み得る。記憶装置は、単一記憶装置、または並行して動作する複数の記憶装置等の複数の記憶装置を含み得る。さらに、記憶装置は、計算装置上に局在的に常駐してもよく、ならびに／またはサーバーに対して遠隔であってもよく、ネットワーク及び／または専用通信もしくはチャネル等の別の種類の接続を介してそこに接続されてもよい。
【０１００】
入力装置は、キーボード、マウス、接触感応ディスプレイ装置、マイクロホン、ペンベースのポインティング装置、ならびに／または音声認識装置及び／もしくは指紋走査装置等の生体識別入力装置等の操作者が情報を計算装置に入力することを可能にする任意の機構もしくは機構の組み合わせを含み得る。出力装置は、ディスプレイ、プリンター、スピーカーを含む、情報を操作者に出力することを可能にする任意の機構もしくは機構の組み合わせを含み得る。
【０１０１】
通信インタフェースは、計算装置がクライアント、サーバー、ライセンス管理、ベンダー等の他の装置及び／またはシステムと通信することを可能にする任意のトランシーバーのような機構を含み得る。例えば、通信インタフェースは、ネットワークに連結される第１のインタフェース及び／またはライセンス管理に連結される第２のインタフェース等の１つ以上のインタフェースを含み得る。あるいは、通信インタフェースは、無線ネットワーク等のネットワークを介する通信のための他の機構（例えば、無線インタフェース）を含み得る。１つの実装において、通信インタフェースは、汎用ハードウェア（例えば、パーソナルコンピュータフォームファクタ）、専用ハードウェア（例えば、モデルもしくはモデルの一部のコンパイル版を実行するように適応するデジタルシグナル処理（ＤＳＰ）装置）等を含み得る標的となる装置等の目的地装置にコードを送信するための論理回路を含み得る。
【０１０２】
計算装置は、メモリ等のコンピュータ可読媒体に含まれるソフトウェア命令を実行するプロセッサに応答して、ある特定の機能を実施することができる。代替となる実施形態では、本開示の原理と一致する特性を実装するために、ソフトウェア命令の代わりに、またはそれと組み合わせて配線接続された回路が使用されてもよい。このため、本開示の原理と一致する実装は、ハードウェア回路及びソフトウェアの任意の特定の組み合わせに限定されない。
【０１０３】
例示的実施形態は、ソフトウェア構成要素として、多くの異なる方法で具体化され得る。例えば、独立型ソフトウェアパッケージ、ソフトウェアパッケージの組み合わせであってもよく、またはより大きいソフトウェア製品において「ツール」として組み込まれるソフトウェアパッケージであってもよい。それは、既存のソフトウェアアプリケーションにインストールするための独立型製品として、または拡張パッケージとして、ネットワーク、例えば、ウェブサイトからダウンロードされ得る。またそれは、クライアント−サーバーソフトウェアアプリケーションとして、またはウェブ対応ソフトウェアアプリケーションとしても利用可能である。またそれは、ハードウェア装置上にインストールされるソフトウェアパッケージとして具体化されてもよい。
【実施例】
【０１０４】
実施例Ｉ−阻害性ペプチド及びＣＰＰ阻害剤の設計及び特徴付け
ｐ５３の線維形成セグメントの原子構造の特定に基づいて、本発明者らは、合理的に、インビトロでの凝集を減退させる一連の阻害剤を設計した。本発明者らは、ｐ５３の成長する凝集体を「キャップする」ペプチド阻害剤を設計した。ＺｉｐｐｅｒＤＢアルゴリズム（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）を使用して、本発明者らは、配列ＩＬＴＩＩＴＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を同定したＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１によって突然変異体ｐ５３凝集に重要であるとも報告された領域における、結晶化可能アミロイド形成セグメントを同定した。本発明者らは、ｐ５３２５２−２５８及びｐ５３２５３−２５８セグメントを化学的に合成し、それらを結晶化して、マイクロ結晶学によってそれらの三次元構造を決定した（図１）。構造は、「フェイストゥバック（ｆａｃｅ−ｔｏ−ｂａｃｋ）」（ｐ５３２５２−２５８に関して）及び「フェイストゥフェイス（ｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ）」（ｐ５３２５３−２５８に関して）方向で疎水性側鎖を介して噛み合う平行整列（ｐａｒａｌｌｅｌ  ｉｎ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）のβ鎖及びβシートを有する典型的な立体ジッパーアーキテクチャを示した（Ｓａｗａｙａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００７）。
【０１０５】
ｐ５３２５３−２５８（ＴＩＩＴＬＥ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）及びｐ５３２５２−２５８（ＬＴＩＩＴＬＥ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）構造の原子座標を、それぞれ、表３及び４に示す。
【０１０６】
（表３）
0006574412.tif 000024
0006574412.tif 000025
0006574412.tif 000026
0006574412.tif 000027
0006574412.tif 000028
0006574412.tif 000029
0006574412.tif 000030
0006574412.tif 000031
【０１０７】
（表４）
0006574412.tif 000032
0006574412.tif 000033
0006574412.tif 000034
0006574412.tif 000035
0006574412.tif 000036
0006574412.tif 000037
0006574412.tif 000038
0006574412.tif 000039
【０１０８】
表５は、ｐ５３セグメントの結晶構造に対するＸ線データ収集及び精密化の統計を示す。表５は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１の「ＬＴＩＩＴＬＥ」及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０の「ＴＩＩＴＬＥ」を開示する。
【０１０９】
（表５）
0006574412.tif 000040
ａ．  括弧内の値は、最高解像度シェルに対応する
ｂ．  Ｒｍｅｒｇｅ＝Σ｜／−＜／＞｜／Σ／
ｃ．  Ｒｗｏｒｋ＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜／ΣＦｏ
ｄ．  Ｒｆｒｅｅ＝Σ｜Ｆｏ−Ｆｃ｜／ΣＦｏ、構造精密化を通して含まれなかった反射を含有するランダム集合を使用して計算される
【０１１０】
本発明者らは、それらのＲｏｓｅｔｔａに基づく方法（Ｓｉｅｖｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１）を適用し、ｐ５３２５２−２５８構造を鋳型として使用してｐ５３凝集を妨害する阻害剤を設計した。本発明の他の実施形態では、ｐ５３２５３−２５８構造を鋳型として使用して、阻害剤を設計する。
【０１１１】
本出願で先に示された表１は、本方法で得られる１６個の代表的な配列の一覧を示す。
【０１１２】
表６は、阻害剤の選択の計算特性を示す。
【０１１３】
（表６）設計された阻害剤の凝集傾向及びキャッピングエネルギー。
0006574412.tif 000041
【０１１４】
表６のペプチドは、上から下に向かって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、４、７、５、８、６、１２、１４、及び１３によって表される。
【０１１５】
図２は、ｐ５３２５２−２５８構造をモデルにしたＩＮＨ−１Ｒ阻害剤を示す。明らかであるように、ＡＲＧ置換は、隣接するシートと衝突して、新たなモノマーが自由な線維末端に付着することを効率的に阻害し、さらなる成長を予防する。
【０１１６】
設計された阻害剤を合成し、インビトロチオフラビンＴ凝集アッセイにおいて試験した（図３）。最も有効な設計であるＩＮＨ−１Ｒは、凝集の開始を遅らせ、阻害剤１対ｐ５３分子１０のモル比であっても、試験したすべての濃度で存在する凝集体の量を低下させた（図３）。
【０１１７】
阻害剤を細胞透過性にするために、本発明者らは、内在性ｐ５３配列に由来する配列ＲＰＩの３残基のリンカーを介してペプチド−阻害剤パネルを９残基のポリアルギニンタグに融合した。細胞に進入するそれらの能力を確認するため、蛍光顕微鏡検査によってプローブの細胞内局在化を検出するために細胞透過性ＩＮＨ−１Ｒ阻害剤をＦＩＴＣ部分に結合した（図４）。本発明者は、ＯＶＣＡＲ−３、ＣＡＯＶ−３、ＷｉＤｒ、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２、ならびに癌患者に由来する初代細胞を含むが、これらに限定されない異なる癌細胞株を、ＦＩＴＣで標識された阻害剤で２４時間処置した。結合していない阻害剤を除去するための徹底的な洗浄後、細胞をホルムアルデヒドに固定し、ｐ５３を市販のｐ５３抗体を使用して染色した。図４Ａに見られるように、阻害剤は、細胞膜を透過することができるだけでなく、実際に核に進入し、その標的であるｐ５３と共局在化することができた。さらに、阻害剤は、立体構造特異的抗体ＯＣによって染色されるタンパク質凝集体と共局在化することが分かった（Ｋａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ，２００７、図４Ｂ）。
【０１１８】
構造誘導型の合理的に設計された本発明のｐ５３アミロイド阻害剤は、異常な立体構造を有するｐ５３分子（例えば、凝集したまたは誤って折り畳まれたｐ５３）を持つ癌細胞を特異的に標的とする。本発明者は、インビトロでの凝集進行を停止する阻害剤の能力を実証した（図３）。本発明者は、次いで、本発明者の発見の臨床的関連性を確認するために、確立された癌細胞株上で、ならびに漿液性卵巣癌患者に由来する初代細胞上で、阻害剤を試験した。本発明者の阻害剤は、変更された誤って折り畳まれた形態のｐ５３を発現する腫瘍細胞を特異的に標的とするように設計され、機能性であり適切に折り畳まれたｐ５３または凝集機能のないｐ５３突然変異体をもつ細胞では効果を有するべきではない。これを確認するために、本発明者は、いくつかの対照を含めた。１つはＷＴｐ５３（ＭＣＦ−７）を持ち、２つはｐ５３凝集状態に関して事前に特徴付けられた（一方は凝集していない突然変異（ＷｉＤｒ）を有し、他方はｐ５３凝集傾向のある突然変異（Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２）を有する）、３つの確立された細胞株を、陰性対象及び陽性対照として使用した。阻害剤の効果のうちの１つは、サイトゾル区画から核へのｐ５３の再局在化を引き起こすことであった（図５）。この効果は、細胞ＭＣＦ７を持つＷＴ  ｐ５３の場合には観察されず（図２ａ）、ｐ５３が構造の整合性を喪失するときにのみ、ＩＮＨ−１Ｒが活性であることを示唆する。
【０１１９】
阻害剤の別の効果は、誤って折り畳まれたｐ５３をＷＴのような機能的立体構造に再び折り畳むことであった。ＰＡ４０細胞においてＩＮＨ−１Ｒで処置されたｐ５３は、部分的に折り畳まれていない突然変異体ｐ５３を特異的に標的とする抗体ＰＡｂ２４０によって認識されず（図６）、再局在化がタンパク質の再折り畳みを伴ったことを示す。生理学的な折り畳みを維持するｐ５３の結果として、処置された細胞中のｐ５３タンパク質のレベルは、用量依存的に減少した。適切に折り畳まれたｐ５３は、制御機構として細胞中で急速に分解される。誤って折り畳まれた／凝集したｐ５３は、分解に対して効率的に標的とされることができず、そのため、阻害剤の不在下ではタンパク質レベルは高い。これは、折り畳まれたｐ５３の集団を生成するＩＮＨ−１Ｒの能力のさらなる証拠である。あらゆる特定の機序に束縛されるものではないが、これが、既存のｐ５３凝集体を除去する（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ  ｏｕｔ）阻害剤が、曝露される凝集傾向のあるセグメントに介添えするか、またはそれをマスクすることによる、凝集した／誤って折り畳まれた／折り畳まれたｐ５３の間の平衡を変化させることによるものであることが示唆される。
【０１２０】
ＩＮＨ−１Ｒは、標準ＭＴＳアッセイによって検出されるように、２Ｄ培養系において１０μＭの用量での処置のたった２４時間後に癌細胞生存の５０％未満で用量依存的に細胞死を引き起こした（図７Ａ）。ＩＮＨ−１Ｒの効果は、ポリ−ＡＲＧ単独またはスクランブル阻害剤配列がいかなる効果も引き出さなかったことから、特異的である。３Ｄ培養系で成長した癌細胞または初代細胞の両方から同様の結果が得られた。この場合、細胞を１：１のＰｒＥＧＭ：マトリゲルの混合物に播種した。細胞層が固体化した後、０．１〜１０μＭの濃度で阻害剤またはスクランブル対照ペプチドのいずれかを含有する温かいＰｒＥＧＭ培地を、５〜７日間細胞に重層した。
【０１２１】
阻害剤は、アネキシンＶ染色の増加及びＫｉ６７染色の減少によって証明されるように、用量依存的なアポトーシスの増加及び細胞増殖の減少の両方を引き起こした（図７Ｂ及び７Ｃ）。スクランブルペプチド配列とは対照的に、また、組み合わせたＨｏｅｃｈｓｔ／ＰＩ／ＹＯ−ＰＲＯ−１染色によっても証明されるように、ＩＮＨ−１Ｒでの処置によりアポトーシスならびにネクローシスが特異的に誘発された（図８）。細胞死は、図９に見られるようにＦＡＣＳ法によっても監視することができ、１０μＭの阻害剤で２４時間処置されたＯＶＣＡＲ−３細胞は、細胞死の典型的な兆候である、細胞の大きさの減少及び粒度の上昇を示した。
【０１２２】
ＱＰＣＲ（図８）またはＲＮＡｓｅｑ法によって試験されるように、凝集傾向のある突然変異を持つ腫瘍細胞のみにおけるｐ５３標的遺伝子の上方制御によって、ＩＮＨ−１Ｒの特異性及び有効性を確認した。
【０１２３】
本発明者のインビボ研究において、本発明者は、微小残存腫瘍量を有する患者が化学療法を施される、減量手術後の状況を模倣することを試みた。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、凝集傾向のあるｐ５３  Ｒ２４８Ｑ突然変異を持つＯＶＣＡＲ−３細胞を皮下に注射し、単独治療薬としてＩＮＨ−１Ｒ、対照スクランブルペプチド、またはビヒクルのいずれか（１５ｍｇ／ｋｇ）で１４日間にわたって毎日腹腔内に処置した（図９）。ＩＮＨ−１Ｒで処置されたマウスは、７５重量％低減した異種移植片質量を有する減退した腫瘍増殖を示した（図９Ｂ及び９Ｃ）。残存する腫瘍組織は、ｐ５３活性化を示す明白なｐ２１及びＭＤＭ２の活性化を示した（図９Ｄ）。また、阻害剤を、同様の効果で既存の腫瘍を保有するマウスにおいてインビボで試験した。
【０１２４】
腹腔内に注入されたペプチドの薬物動態プロファイルは、注射の１時間後に約１．２μＭの血清ピーク濃度を示した。ペプチド濃度は、注入の２時間後に約０．３μＭまで低下し、最大１２時間安定したままであった（図１０）。血清中のペプチドが相対的に安定性であれば、ＩＶ投与は、許容される代替となる投薬経路である。
【０１２５】
前述の説明から、当業者であれば、本発明の不可欠な特徴を容易に確認することができ、その趣旨と範囲から逸脱することなく、本発明の変更及び修正を行い、それを種々の用法及び条件に適用し、本発明を最大限に利用することができる。先行の好ましい特定の実施形態は、単なる例示として解釈され、どのような形であっても本発明の範囲を制限するものではない。２０１３年５月８日出願の米国仮特許出願第６１／８２１，１５７号及びその図面を含む、本明細書に引用されるすべての出願、特許、及び刊行物の全開示は、特にそれらが引用される情報に関して、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２６】
参考文献
0006574412.tif 000042
0006574412.tif 000043
0006574412.tif 000044
【図１】
0006574412.tif 000046
【図２】
0006574412.tif 000047
【図３】
0006574412.tif 000048
【図４】
0006574412.tif 000049
【図５】
0006574412.tif 000050
【図６】
0006574412.tif 000051
【図７】
0006574412.tif 000052
【図８】
0006574412.tif 000053
【図９】
0006574412.tif 000054
【図１０】
0006574412.tif 000055
【図１１】
0006574412.tif 000056
【図１２】
0006574412.tif 000057
【図１３】
0006574412.tif 000058
【配列表】
0006574412000001.app