(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含むことを特徴とする、乳製品において異なる集団の量で存在する、既知の混合物中の乳酸菌またはビフィズス菌の株を互いに区別し、カウントする方法：
ａ）化学的に定義される寒天Ｍ１培地および異なる着色を生成する少なくとも２つの発色基質として６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（サーモンＧａｌ）及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−Ｇｌｕ）をそれぞれ含む一連の培養皿において、前記乳製品のアリコートを接種するステップであって、該基質のそれぞれが、少なくとも１つの該細菌株によって取り込まれ、少なくとも１つの他の該株によって取り込まれない上記ステップ；
ｂ）任意に、試験される製品中に存在する乳酸菌株の増殖を可能とする化学的に定義される寒天Ｍ２培地を含む一連の培養皿において、前記乳製品のアリコートを接種するステップであって、その株は、該Ｍ１培地、および少なくとも１つの該細菌株により取り込まれる少なくとも１つの発色基質上で増殖することができない上記ステップ；および
ｃ）細菌コロニーを形成するのに必要な時間の間、該皿をインキュベートし、各培養皿で観察される着色のそれぞれについてコロニーをカウントするステップ。
【請求項２】
培養皿の部分の寒天培地はまた、少なくとも１つの該細菌株の増殖を選択的に促進する少なくとも１つの添加剤を含み、および／または培養皿の部分の寒天培地はまた、少なくとも１つの該細菌株の増殖を選択的に阻害する少なくとも１つの添加剤を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培養皿の部分は、少なくとも１つの該細菌株の増殖に有利な選択的条件下でインキュベートされ、培養皿の別の部分は、少なくとも１つの他の該細菌株の増殖に有利な異なる選択的条件下でインキュベートされることを特徴とする、請求項１および２のうちの一項のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
試験される製品中に存在する少なくとも２つの細菌株は、同じ種および亜種に属することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
試験される製品中に存在する少なくとも１つの細菌株は、ラクトバチルス属に属し、および／または試験される製品中に存在する少なくとも１つの細菌株は、ストレプトコッカス属に属することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試験される製品は、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）の少なくとも１つの株、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の少なくとも１つの株、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の少なくとも１つの株を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試験される製品はまた、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の少なくとも１つの株を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６および７のうちの１つのいずれかに記載される方法であって、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の細菌をカウントするために、以下の組成を有するＭ１培地が使用されることを特徴とする、上記方法：寒天：１５ｇ／ｌ；トリプトン：２．５ｇ／ｌ；ペプシン消化肉ペプトン：２．５ｇ／ｌ；パパイン消化大豆ペプトン：５ｇ／ｌ；グリセロリン酸ナトリウム：１９ｇ／ｌ；ラクトース：５ｇ／ｌ；酵母抽出物：２．５ｇ／ｌ；肉抽出物：５ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム：０．２５ｇ／ｌ；アスコルビン酸：０．５ｇ／ｌ；６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（サーモンＧａｌ）：０．２ｇ／ｌ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−Ｇｌｕ）：０．１ｇ／ｌ。
【請求項９】
請求項７および８のうちの１つのいずれかに記載される方法であって、ラクトバチルス・デルブリュッキイ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の細菌をカウントするために、以下の組成を有するＭ２培地が使用されることを特徴とする、上記方法：ポリペプトン：１０ｇ／ｌ；酵母抽出物：５ｇ／ｌ；肉抽出物：１０ｇ／ｌ；リン酸二カリウム：２ｇ／ｌ；酢酸ナトリウム：５ｇ／ｌ；クエン酸アンモニウム：２ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム：０．２ｇ／ｌ；硫酸マンガン：０．０５ｇ／ｌ；寒天：１５ｇ／ｌ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）：０．１５ｇ／ｌ。
【請求項１０】
ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の細菌をカウントするために、Ｍ１培地を含む皿の第１の部分は、任意の添加剤を含まず、該皿の第２の部分は、添加剤としてバンコマイシンを含み、および該皿の第３の部分は、添加剤としてラムノースを含むことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の細菌をカウントするために、接種皿は、約４８時間、６〜１６％のＯ２および２〜１０％のＣＯ２を含む制御された雰囲気下でインキュベートされ、該皿の部分は、約３７℃でインキュベートされ、別の部分は約４４℃でインキュベートされることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ラクトバチルス・デルブリュッキイ・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の細菌をカウントするために、接種皿は、約４８時間、約４７℃で、１％未満のＯ２および少なくとも１３％のＣＯ２を含む制御された雰囲気下でインキュベートされることを特徴とする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品、特に乳製品中の混合物中に存在する関心のある細菌株の区別およびカウントに関する。
【０００２】
発酵食品、および特に乳製品の製造において、異なる属の細菌、および／または同じ属の細菌、および異なる種または亜種の細菌を含みうる細菌の混合物は、一般的に、発酵として使用される。特に、プロバイオティクス製品は通常、１つ以上のプロバイオティクス株に加えて、１つ以上の「技術」株を含むが、これはプロバイオティック特性を有する必要性はないが、例えば、改良されるプロバイオティクス株の増殖を可能にし、および／または最終製品で所望の特性（風味、食感等）を付与することを可能にする。
【０００３】
それらの製造中、発酵製品の品質を保証するために、それらの製造の終わりに、およびそれらの保管中に、それらの製品中に存在するプロバイオティクス株と技術細菌株を具体的に区別し、カウントすることができる必要があり、これは、製品中で使用される少なくとも２つの株が同じ属の近接種、または同じ種もしくは同じ亜種にさえ属する場合に、特に問題になることがある。
【０００４】
したがって、これらの株の差分カウントを可能にする信頼性が高く、迅速な分析技術を有することが望ましい。
発明者らは、現在、異なる発色基質の使用と組み合わせられる、選択的培地および／または選択的培地条件の使用に基づく方法を開発した。
【０００５】
したがって、本発明の主題は、以下のステップを含むことを特徴とする、乳酸菌またはビフィズス菌の株を使用して発酵される、食品、好ましくは乳製品において異なる集団の量で存在する、既知の混合物中の該乳酸菌またはビフィズス菌の株を互いに区別し、カウントする方法である：
ａ）化学的に定義される寒天Ｍ１培地および異なる着色を生成する少なくとも２つの発色基質を含む一連の培養皿において、任意に希釈される食品のアリコートを接種するステップであって、該基質のそれぞれは、少なくとも１つの該細菌株によって取り込まれ、少なくとも１つの他の該株によって取り込まれない上記ステップ；
ｂ）任意に、試験される製品中に存在する乳酸菌株の増殖を可能にする化学的に定義される寒天Ｍ２培地を含む一連の培養皿において、任意に希釈される食品のアリコートを接種するステップであって、その株は、該Ｍ１培地で増殖することができず、少なくとも１つの発色基質は該細菌株の少なくとも１つにより取り込まれる、上記ステップ；および
ｃ）細菌コロニーを形成するのに必要な時間の間、該皿をインキュベートし、各培養皿で観察される着色のそれぞれについてコロニーをカウントするステップ。
【０００６】
本発明の意味の範囲内で、表現「乳酸菌またはビフィズス菌」は、好ましくは一般的に芽胞を生成しない全ての嫌気性の、部分的に酸素耐性のグラム陽性菌を指し、その細菌は、桿菌または球菌の型であり、糖を乳酸に発酵することができる。より好ましくは、本発明の意味の範囲内の乳酸菌は、アエロコッカス科（Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、 カルノバクテリウム科（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、エンテロコッカス科（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）、乳酸桿菌科（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、ロイコノストック科（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ）、ストレプトコッカス科（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）またはビフィドバクテリア科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）の少なとも１つに属し、よりなお好ましくは、アエロコッカス属（Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス属（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペジオコックス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、テトラジェノコッカス属（Ｔｅｔｒａｇｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、バゴコッカス属（Ｖａｇｏｃｏｃｃｕｓ）、ワイセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）またはビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のうちの１つに属する。最も好ましくは、本発明の意味の範囲内で乳酸菌またはビフィズス菌は、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ブーフナー乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・クルヴァトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ）、 ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｃｋｅｉ）、特に ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌ. ｄｅｌｂｒｕｃｋｅｉ ｓｕｐｓｂ. Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）またはラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ディオリボランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｉｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・フルクティヴォランス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｒｕｃｔｉｖｏｒａｎｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・ヒルガルディー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｉｌｇａｒｄｉｉ）、イエンセン乳酸杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・クンケエイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｋｕｎｋｅｅｉ）、ラクトバチルス・マリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｌｉ）、ラクトバチルス・ナゲリィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｎａｇｅｌｉｉ）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、特にラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌ. ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. Ｐａｒａ��ａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ビニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、乳連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・ラフィノラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）、ストレプトコッカス・クレモリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ブレヴェ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｓ）またはビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）の種の少なくとも１つに属し；本発明の意味の範囲内でビフィズス菌は、ビフィドバクテリア科（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、特に、ビフィドロバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌を収集する。
【０００７】
「既知の混合物」は、細菌株の混合物を意味することが意図され、その定性的な組成、すなわち、それを構成する異なる株の本質および性質は知られている。それは、分析が基づく発酵製品の製造に使用される菌株の混合物により具体的に依存する。本発明に係る方法を実施する前に、各株に特異的な表現型プロファイルを確立するために、これらの株は、それらの生理学的および代謝特性の強調を目的とする表現型の分析に供されているであろう。この分析は特に、炭素、窒素、リンおよび硫黄源の異なるタイプの使用、所定の栄養添加物の使用、および／または異なるストレス剤（塩、ｐＨ、抗菌剤等）に対する耐性に関連しうる。
【０００８】
用語「化学的に定義される培地」は、本明細書中では、培地を示すために、その通常の意味で使用され、その全ての成分は、完全に知られており、定義される。本発明に係る化学的に定義される寒天培地は、好ましくは寒天細菌培地、より好ましくは乳酸菌またはビフィズス菌のための寒天培地である。
【０００９】
それが本明細書中で示されるように、表現「発色基質」は、好ましくは、基質を意味し、細菌によるその取り込みは、１つ以上の波長で光を吸収する物質、特に着色された物質を生成する。当業者がよく理解するように、生成される物質により吸収される波長（複数可）は、好ましくは、発色基質によって任意に吸収されるものと異なり、特に無色であってもよい。本発明を実施するために使用されうる発色基質は、それ自体知られている；それらは、特に、６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（サーモンＧａｌ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−Ｇｌｕ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）であってもよい。
【００１０】
培養皿の部分の寒天培地はまた、少なくとも１つの該細菌株の増殖を選択的に促進する少なくとも１つの添加剤を含むことができ、および／または培養皿の部分の寒天培地はまた、少なくとも１つの該細菌株の増殖を選択的に阻害する少なくとも１つの添加剤を含むことができる。
【００１１】
また、培養皿の部分は、少なくとも１つの該細菌株の増殖に有利な選択的条件下でインキュベートされることができ、培養皿の別の部分は、少なくとも１つの他の該細菌株の増殖に有利な異なる選択的条件下でインキュベートされることができる。
【００１２】
本発明に係る方法は、少なくとも２つの存在する細菌株が、同じ種および亜種に属する製品の分析に特に適する。
【００１３】
好ましくは、試験される製品中に存在する少なくとも１つの細菌株は、ラクトバチルス属に属し、および／または試験される製品中に存在する少なくとも１つの細菌株は、ストレプトコッカス属に属する。
【００１４】
本発明の特定の態様に従って、試験される製品は、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）の少なくとも１つの株、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の少なくとも１つの株、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の少なくとも１つの株を含む。有利には、それはまた、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）の少なくとも１つの株を含む。
【００１５】
この態様の文脈の範囲内で、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の細菌をカウントするために、以下の組成を有するＭ１培地が使用される：寒天：１５ｇ／ｌ；トリプトン：２．５ｇ／ｌ；ペプシン消化肉ペプトン：２．５ｇ／ｌ；パパイン消化大豆ペプトン：５ｇ／ｌ；グリセロリン酸ナトリウム：１９ｇ／ｌ；ラクトース：５ｇ／ｌ；酵母抽出物：２．５ｇ／ｌ；肉抽出物：５ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム：０．２５ｇ／ｌ；アスコルビン酸：０．５ｇ／ｌ；６−クロロ−３−インドキシル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（サーモンＧａｌ）：０．２ｇ／ｌ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルコピラノシド（Ｘ−Ｇｌｕ）：０．１ｇ／ｌ。
【００１６】
ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ. ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の細菌をカウントするために、以下の組成を有するＭ２培地が使用される：ポリペプトン：１０ｇ／ｌ；酵母抽出物：５ｇ／ｌ；肉抽出物：１０ｇ／ｌ；リン酸二カリウム：２ｇ／ｌ；酢酸ナトリウム：５ｇ／ｌ；クエン酸アンモニウム：２ｇ／ｌ；硫酸マグネシウム：０．２ｇ／ｌ；硫酸マンガン：０．０５ｇ／ｌ；寒天：１５ｇ／ｌ；５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）：０．１５ｇ／ｌ。
【００１７】
有利には、ラクトバチルス・パラカゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ ｓｕｂｓｐ. ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、およびストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）種の細菌をカウントするために：
Ｍ１培地を含む皿の第１の部分は、いかなる添加剤も含まず、該皿の第２の部分は、添加剤としてバンコマイシンを含み、および該皿の第３の部分は、添加剤としてラムノースを含み；および／または
接種皿は、約４８時間、６〜１６％のＯ２および２〜１０％のＣＯ２を含む制御された雰囲気下でインキュベートされ、該皿の部分は、約３７℃でインキュベートされ、別の部分は約４４℃でインキュベートされる。
【００１８】
好ましくは、ラクトバチルス・デルブリュッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ. Ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）種の細菌をカウントするために、Ｍ２培地の接種皿は、約４８時間、約４７℃で、１％未満のＯ２および少なくとも１３％のＣＯ２を含む制御された雰囲気下でインキュベートされる。
【００１９】
本発明は、乳酸菌の異なる株を区別し、発酵乳製品中のこれらの株のそれぞれの細菌をカウントするために、本発明による方法を実施することを例示する非限定的な例を参照する以下の追加の説明によって、より良く理解されるだろう。
【００２０】
実施例：発酵乳製品中の乳酸菌の差別的計数
材料および方法
試験される製品の組成
製品１：
製品１は、３つの種に属する５つの細菌株を含む発酵製品であり、すなわち：
−Ｌ．カゼイ亜種パラカゼイ（以下、ラクトバチルス・パラカゼイ株１と呼ぶ）の１つのプロバイオティクス株；
−Ｓ．サーモフィルスの３つの技術株；
−Ｌ．デルブリュッキイ亜種ブルガリクスの１つの技術株。
製品の製品寿命の開始時（Ｄ４）および製品寿命の終わり（Ｄ３５）に期待される理論的な細菌負荷を以下の表Ｉに示す。
【００２１】
【表１】
0006580569.tif 000002
【００２２】
製品２
製品２は、３つの種に属する７つの細菌株を含む発酵製品であり、すなわち：
−Ｌ．カゼイ亜種パラカゼイ（ラクトバチルス・パラカゼイ株１およびラクトバチルス・パラカゼイ株２）の２つのプロバイオティクス株；
−Ｌ．ラムノサスの１つのプロバイオティクス株；
−Ｓ．サーモフィルスの３つの技術株；
−Ｌ．デルブリュッキイ亜種ブルガリクスの１つの技術株。
製品の製品寿命の開始時（Ｄ４）および製品寿命の終わり（Ｄ３５）に期待される理論的な細菌の負荷を以下の表ＩＩに示す。
【００２３】
【表２】
0006580569.tif 000003
【００２４】
株の酵素活性：
異なる株は、β−グルコシダーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性に対して試験された。
その結果を以下の表ＩＩＩに示す：
【００２５】
【表３】
0006580569.tif 000004
【００２６】
製品１および２における細菌カウント
培養条件および培地
製品１および２に存在する細菌株をカウントするために現在使用される培地条件および培地をそれぞれ以下の表ＩＶおよびＶにまとめる。
これらの参考培養条件および培地が対照として使用された。
【００２７】
【表４】
0006580569.tif 000005
【００２８】
【表５】
0006580569.tif 000006
【００２９】
ＭＲＳ、酸ＭＲＳおよびＭ１７培地は、従来の市販の培地（ＡＥＳ ＣＨＥＭＵＮＥＸ）である。
制御された雰囲気下の培地について、ＧＡＳＰＡＫ（登録商標）ガス生成システムは、以下の条件を得るために使用された：
−嫌気的条件：％Ｏ２＜１％；％ＣＯ２≧１３％
−ＣＯ２:％ＣＯ２>２．５％
微好気条件：６％＜％Ｏ２＜１６％；２％＜％ＣＯ２＜１０％
好気性条件：周囲の空気
【００３０】
以下、Ｍ１およびＭ２として記載される２つの発色培地を調製した：これらの培地の組成をそれぞれ、以下の表ＶＩおよびＶＩＩに示す：
【００３１】
【表６】
0006580569.tif 000007
【００３２】
【表７】
0006580569.tif 000008
【００３３】
試験は、Ｍ１およびＭ２培地のそれぞれの３つの異なるバッチを用いて実施された。
製品１および２のために使用された培地条件をそれぞれ、以下の表ＶＩＩＩおよびＩＸに示す：
【００３４】
【表８】
0006580569.tif 000009
【００３５】
【表９】
0006580569.tif 000010
【００３６】
操作手順：
サンプルを製品の２つの製品寿命段階で採取した：寿命の開始および寿命の終わり。
製品１について、製品寿命の開始、サンプルを発酵製品の製造後、４、５および６日に採取、製品寿命の終わり、サンプルを製造後３１、３２および３３日に採取した：製品２
について、製品寿命の開始、サンプルを製造後７、８および９日に採取し、製品寿命の終わり、サンプルを製造後２８、２９および３０日に採取した。
【００３７】
各試験断片について、１／１０までの希釈の範囲は、トリプトン塩チューブ中で実施された。理論集団（参照、表ＩおよびＩＩ）の関数として選択される３つの希釈は、使用される培地のそれぞれの上に接種された。各希釈について、希釈される製品の１ｍｌを１つのペトリ皿に接種し、使用される培地の１５ｍｌをその皿に注いだ。
皿を条件下でインキュベートし、そして継続時間について、表ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩおよびＩＸに示した。
【００３８】
結果
株の同定：
Ｍ１培地上：
４４℃で、ラクトバチルス・ラムノサス株は、青色コロニーを生成し、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、マゼンタ色のコロニーを生成する：ラクトバチルス・パラカゼイ株１および２、およびラクトバチルス・ブルガリクス株は増殖しない；
ラムノースの添加を有する３７℃、ラクトバチルス・ラムノサス株およびラクトバチルス・パラカゼイ株２は、無色のコロニーを生成する；ラクトバチルス・パラカゼイ株１は、ターコイズ色のコロニーを生成し、ストレプトコッカス・サーモフィルス株は、マゼンタ色のコロニーを生成する。ラクトバチルス・ブルガリクス株は、増殖しない；
バンコマイシンの添加を有する３７℃、ラクトバチルス・ラムノサス株は、青色コロニーを生成する；ラクトバチルス・パラカゼイ株１は、ターコイズ色のコロニーを生成し、ラクトバチルス・パラカゼイ株２は、無色のコロニーを生成する；ストレプトコッカス・サーモフィルス株およびラクトバチルス・ブルガリクス株は、増殖しない。
【００３９】
Ｍ２培地上：
ラクトバチルス・ラムノサス株は、無色のコロニーを生成し、ラクトバチルス・ブルガリクス株は、青色コロニーを生成する。ストレプトコッカス・サーモフィルス株およびラクトバチルス・パラカゼイ株１および２は、増殖しない。
これらの結果を以下の表Ｘにまとめる：
【００４０】
【表１０】
0006580569.tif 000011
【００４１】
製品１：
したがって、Ｍ１培地は、ラクトバチルス・パラカゼイおよびストレプトコッカス・サーモフィルスをカウントすることを可能にし、Ｍ２培地は、ラクトバチルス・ブルガリクスをカウントすることを可能にする。
【００４２】
製品２：
したがって、Ｍ１培地は、以下をカウントすることを可能にする：
４４℃：ラクトバチルス・ラムノサスおよびストレプトコッカス・サーモフィルス
３７℃でラムノースの添加：ラクトバチルス・パラカゼイ株１；
３７℃でバンコマイシンの添加：ラクトバチルス・パラカゼイ株２。
Ｍ２培地は、ラクトバチルス・ブルガリクスをカウントすることを可能にする。
【００４３】
細菌をカウントする細菌：
製品１：
製品寿命の初期：
結果を表ＸＩに示す：
【００４４】
【表１１】
0006580569.tif 000012
【００４５】
カウント方法のばらつきは、以下の通りである：
Ｍ１培地上：Ｌ．パラカゼイ１について、５．７ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜６．２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ、Ｓ．サーモフィルスについて、５．３ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜６．８ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ、
Ｍ２培地上：Ｌ．ブルガリクスについて、２．８ｘ１０６ＣＦＵ/ｍｌ〜３ｘ１０６ＣＦＵ/ｍｌ。
【００４６】
参照培地上、酸ＭＲＳのＬ．ブルガリクスをカウントする難しさは、以下を留意すべきである：
５日：Ｍ２培地に対する１つのｌｏｇの違いおよびＤ４からのカウント、
６日：増殖なし。
【００４７】
製品寿命の終わり：
結果を表ＸＩＩに示す：
【００４８】
【表１２】
0006580569.tif 000013
【００４９】
Ｍ１培地は、製品中に存在するラクトバチルス・パラカゼイとストレプトコッカス・サーモフィルスの間を効果的に区別することができる。Ｌ．パラカゼイに対するカウントは、３つのバッチに渡って４ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜４．５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌの間で、分析の３日間に渡って変動する。Ｓ．サーモフィルスの負荷は、１．９ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜２．２ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌの間で変動する。
これらの試験はまた、参照培地上またはＭ２培地上であるかどうかにかかわらず、この生存期間のステージでの製品中のＬ．ブルガリクスの不存在を示している。
【００５０】
製品２：
製品寿命の初期：
結果を表ＸＩＩＩに示す。
【００５１】
【表１３】
0006580569.tif 000014
【００５２】
カウント方法のばらつきは、次のとおりである：
Ｍ１培地上：Ｌ．パラカゼイ１について、１．６ｘ１０８ＣＦＵ／ｍ１〜１．８ｘ１０８ＣＦＵ／ｍ１の間、Ｌ．パラカゼイ２について、２．３ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ〜３ｘ１０７ＣＦＵ／ｍ１の間、Ｓ．サーモフィルスについて、８．７ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜９．８ｘ１０８ＣＦＵ／ｍ１の間、Ｌ．ラムノサスの３つのバッチについて、２．３ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ
Ｍ２培地上：Ｌ．ブルガリクスについて、２．６ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ〜５ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌの間。
【００５３】
製品寿命の終わり：
結果を表ＸＩＶに示す。
【００５４】
【表１４】
0006580569.tif 000015
【００５５】
Ｍ１培地の３つのバッチに渡るカウントは、Ｌ．パラカゼイ１について、１．５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍ１〜１．６ｘ１０８ＣＦＵ／ｍ１の間、Ｌ．パラカゼイ２について、１．４ｘ１０７ＣＦＵ／ｍｌ〜２．２ｘ１０７ＣＦＵ／ｍ１の間、Ｓ．サーモフィルスについて、６．６ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌ〜７．５ｘ１０８ＣＦＵ／ｍ１の間、Ｌ．ラムノサスの３つのバッチについて２．０ｘ１０８ＣＦＵ／ｍｌで変動する。
【００５６】
試験はまた、参照培地上またはＭ２培地上であるかどうかにかかわらず、この生存期間のステージでの製品中のＬ．ブルガリクスの不存在を示している。
上記の方法の使用はまた、製品１中に存在する３つの細菌種と製品２中に存在する４つの細菌種の間を区別することを可能にする。