(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、ＴＮＦαと関連する医学的状態の経口治療における使用のための、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む医薬組成物であって、前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が、ＴＮＦαを特異的に結合しＴＮＦα活性を阻害する配列番号１０に記載のキメラポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２】
前記医学的状態が、肥満、メタボリックシンドローム、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記キメラポリペプチドが、Ｃ末端の小胞体保留シグナルをさらに含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記植物細胞が、追加のＮ末端の植物の小胞体シグナルペプチドを含む前記キメラポリペプチドを発現する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記植物シグナルペプチドが、配列番号４に示した通りである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記小胞体保留シグナルがＳＥＫＤＥＬ（配列番号１６）である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
追加のＮ−末端の植物の小胞体シグナルペプチドを含む前記キメラポリペプチドが、配列番号６に示した通りである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記キメラポリペプチドが、配列番号７に示した通りである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が、植物特異的グリカンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記植物細胞が懸濁液中で成長させられる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記植物細胞が、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物細胞である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ニコチアナ・タバカム植物細胞が、ブライトイエロー（ＢＹ−２）細胞である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記植物細胞が凍結乾燥されている、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記肝臓疾患または障害が、肝炎、肝硬変、肝臓がん、肝毒性、慢性肝臓疾患、脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記植物細胞が、経口栄養形態で提供される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記経口栄養形態が、完全食、溶解用粉末、バー、ベークド製品、シリアルバー、デイリーバー、スナック食品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー、チョコレートおよび乳製品である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物に、さらに薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野および背景】
【０００１】
本発明は、一部の態様において、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の、治療法における使用に関する。
【０００２】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、多様な炎症性、感染性および免疫関連プロセスおよび疾患の調節を媒介する、重要な炎症誘発性サイトカインであり、ＴＮＦαは、炎症性病態に関与する最も重要なメディエーターと考えられている。
【０００３】
ＴＮＦ−αは、分子量１７ｋＤのタンパク質であり、最初に、安定な三量体で配列された膜貫通タンパク質として合成され、次いで、メタロプロテアーゼ−ＴＮＦα変換酵素（ＴＡＣＥ）によって切断されて、遍在性に発現される、その同族受容体（ＴＮＦＲＩ、ｐ５５およびＴＮＦＲＩＩ、ｐ７５）に結合するホモ三量体の可溶性ＴＮＦ（ｓＴＮＦ）を形成する。遍在性ＴＮＦ受容体は、多種多様なＴＮＦ−α媒介細胞性応答の基礎を提供する。
【０００４】
ＴＮＦ−αは、多種多様な細胞性応答を誘導し、その多くは有害な結果、例えば、悪液質（がんおよびエイズ患者によく見られる、食欲不振を招く脂肪減少および全身タンパク質欠乏）および敗血症性ショックをもたらす。ＴＮＦ−α分泌の上昇は、糖尿病、同種移植片拒絶反応、敗血症、炎症性腸疾患、骨粗鬆症を含む種々のヒト疾患に、多くの自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、関節リウマチ、乾癬、乾癬性関節炎、過敏症、免疫複合体病に、さらにはマラリア、がんおよび肺線維症に関係している。
【０００５】
ＴＮＦαの生物学的作用は、２つの異なる受容体によって媒介される。ＴＮＦ−α受容体は、単核細胞から排出された場合に、「掃討を行い」かつ天然の阻害因子として作用することによって、ＴＮＦαレベルを低下させる。特異抗体およびデコイ受容体によるＴＮＦαの中和は、ＴＮＦαによって媒介される毒性の調節のための一般的な戦略となっている。
【０００６】
今日まで、５種のタンパク質系ＴＮＦαアンタゴニストが、米国ＦＤＡによって臨床的使用が承認されている：ＴＮＦｍＡｂ  Ｆａｂ’フラグメント−ＰＥＧコンジュゲートであるＣｉｍｚｉａ（セルトリズマブペゴル）；ＴＮＦｒｍＡＢであるＲｅｍｉｃａｄｅ（インフリキシマブ）；ＴＮＦｒｍＡＢであるＨｕｍｉｒａ（アダリムマブ）；抗ＴＮＦであるＳｉｍｐｏｎｉ（商標）（ゴリムマブ）；およびヒトＩｇＧのＦｃフラグメントと融合した可溶性の７５ｋＤａ  ＴＮＦα受容体の融合タンパク質であるエタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（商標）として登録されている）。
【０００７】
エタネルセプトは、関節リウマチ（ＲＡ）ならびに他の関節炎の適応症、例えば、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）、乾癬および強直性脊椎炎（ＡＳ）の治療に適応される。関節リウマチ（ＲＡ）は、世界中で約５００万人の人々を冒している慢性疾患である。適応症全体にわたって世界中でほぼ５０万人の患者が、Ｅｎｂｒｅｌで治療されている。２０１０年のＥｎｂｒｅｌ売上高は７８億ドルであり、抗ＴＮＦの全取引は２４０．４億ドルに上った。進行中または完了したＥｎｂｒｅｌ療法の臨床試験は、多様な適応症、例えば、その他の成人呼吸窮迫症候群、天疱瘡、アルツハイマー病、ベーチェット症候群、ＨＩＶ、心筋梗塞、膝関節滑膜炎、ループス腎炎、扁平苔癬、全身性アミロイドーシス、座骨神経痛、白斑、慢性疲労症候群、食欲不振、ＴＭＪ、喘息、気管支炎、糖尿病、骨髄異形成疾患などを含む。
【０００８】
しかし、生物薬剤は典型的には、これらの化合物を安全で有効な治療薬へと成功裏に開発するために薬物開発者が克服しなければならない多くの難題を提起する。例えば、タンパク質およびペプチドは、タンパク質分解酵素によって破壊される傾向があり、または比較的高分子量のタンパク質の場合には、中和抗体を生じる可能性がある。さらに、大きな複合分子は低い溶解性または不良な安定性を示し、保存寿命が短くなる可能性がある。その結果、生物薬剤治療薬は、急速にそれらの有効性を失うかまたは頻繁な投薬を必要とすることが多い。これらの要素は、治療法のコストだけでなく患者の承諾およびコンプライアンスにも影響を及ぼし、したがって治療有効性に影響する。
【０００９】
経口投与：
タンパク質およびペプチド系投与の最も一般的な方法は、侵襲的な薬物送達方法、例えば、注入および点滴による。これらは、全身性疾患のための高分子薬物の主な投与方法であるが、患者および開業医にとっては最も望ましくない方法でもある。この送達方法の明らかな否定的側面は、患者の承諾およびコンプライアンスであり、ほとんどの高分子の開発は、関連する費用または不都合が侵襲的な投与経路を使用する必要性を上回らない適応症に限定される。薬物を全身的に送達するための簡単で非侵襲的な方法として、経口投与は多くの利点を提供する：使用の容易さおよび簡便性、吸収面の広範囲な体積への接近、高い血管新生度、比較的長期にわたる滞留時間、不活性な非代謝成分の自然な除去など。
【００１０】
それでもなお、高分子医薬品の経口投与に関する研究は、この経路の潜在性に合致する満足なレベルの効率を示していない。これらの障壁の一部は、丸剤および他の固形製剤の摂取の難しさ、胃腸管中における生物活性高分子の不安定性、粘膜における生物活性剤の濃度、ならびに生物活性高分子に対する胃腸膜の透過性である。
【００１１】
生物活性物質の経口投与経路は、所期の標的組織に達する前に生物活性高分子を不活性化または破壊する可能性がある、胃における高い酸性度および酵素分解によって複雑化される。さらに、生物活性高分子の有効濃度は、胃腸管において見られる大きい体積では達成が困難である。したがって、有効であるためには、ほとんどの薬物は、上部消化管における吸収および／または環境から保護してから、腸または結腸中に急激に放出しなければならない。治療用高分子、例えば、タンパク質の経口または経腸投与と関連した問題を克服するために、製薬業界において種々の戦略が立てられている。これらの戦略としては、担体との共有結合、苛酷な条件、例えば、胃および上部消化管における活性成分の放出を減速するまたは防ぐように設計された、コーティングおよび製剤（ｐＨ感受性コーティング、ポリマーおよび多層コーティング、カプセル封入被包、徐放製剤、生体接着剤系、浸透圧制御送達系など）が挙げられる。しかし、このような製剤の形態での生物活性剤の調製は、複雑でコストのかかる方法を必要とする。粘膜で取り込みを増加させるための粘膜接着剤および浸透促進剤（サリチル酸塩、脂質−胆汁酸塩混合ミセル、グリセリド、アシルカルニチンなど）も用いられている。しかし、これらの一部は、深刻な局所毒性の問題、例えば、局所刺激、上皮層の剥脱および組織の炎症を引き起こすおそれがある。経口送達を改善するための他の戦略としては、生物活性剤をプロテアーゼ阻害薬、例えば、アプロチニン、大豆トリプシンインヒビターおよびアマスタチンと混合することが挙げられるが、酵素阻害薬は選択的でなく、また、内因性高分子を阻害して、望ましくない副作用を引き起こす。したがって、生物活性生物薬剤の現在の経口投与方法では、標的組織における所望の生物活性を確実に効率的に送達することができない。
【００１２】
ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ）を経口投与する試みは、循環に達する前に分子を不活性化または破壊する胃内の高い酸性度および酵素分解のために失敗に終わった。自動非経口投与のための装置を含む精巧で複雑な機構が、投与計画のコンプライアンスを確実にするように進化した。
【００１３】
さらなる背景技術としては以下が挙げられる：Ｆｉｎｃｋらの米国特許第７，９１５，２２５号、Ｆｉｎｃｋらの米国特許出願第１３／０２１５４５号および第１０／８５３，４７９号、Ｌｉらの米国特許出願第１１／９０６，６００号、Ｗａｒｒｅｎらの米国特許出願第１０／１１５，６２５号ならびにＧｏｍｂｏｔｚらの米国特許出願第１１／７８４，５３８号。
【発明の概要】
【００１４】
本発明の一部の態様の一側面によれば、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、ＴＮＦαと関連する医学的状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の治療有効量を経腸的に投与し、それによってＴＮＦαと関連する医学的状態を治療することを含む方法が提供される。
【００１５】
本発明の一部の態様の一側面によれば、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、ＴＮＦαと関連する医学的状態の経腸的治療のための、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の使用が提供される。
【００１６】
本発明の一部の態様によれば、経腸投与は経口投与である。
【００１７】
本発明の一部の態様によれば、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬は、抗ＴＮＦα抗体である。
【００１８】
本発明の一部の態様によれば、抗ＴＮＦα抗体は、インフリキシマブ、アダリムマブまたはゴリムマブである。
【００１９】
本発明の一部の態様によれば、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬は、
（ｉ）ＴＮＦ受容体のＴＮＦα結合ドメインを含む第１のドメインと、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＦｃドメインを含む第２のドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、第１のドメインと第２のドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがＴＮＦαに特異的に結合するキメラポリペプチドである。
【００２０】
本発明の一部の態様によれば、キメラポリペプチドは、小胞体保留シグナルを含む第３のドメインをさらに含み、第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に連続的翻訳によって融合されている。
【００２１】
本発明の一部の態様によれば、方法または使用は、第１のドメインのＮ末端に翻訳によって融合されている、小胞体シグナルペプチドをコードする追加のドメインを含む。
【００２２】
本発明の一部の態様によれば、シグナルペプチドは植物シグナルペプチドである。
【００２３】
本発明の一部の態様によれば、植物シグナルペプチドは、配列番号４に示した通りである。
【００２４】
本発明の一部の態様によれば、第１のドメインは、２００〜２５０アミノ酸長である。
【００２５】
本発明の一部の態様によれば、第１のドメインは、アミノ酸配列ＬＣＡＰ（配列番号１１）およびＶＦＣＴ（配列番号１２）を含む。
【００２６】
本発明の一部の態様によれば、第１のドメインは、アミノ酸配列ＬＰＡＱＶＡＦＸＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣ（配列番号１３）をさらに含む。
【００２７】
本発明の一部の態様によれば、第１のドメインは、配列番号２に示した通りである。
【００２８】
本発明の一部の態様によれば、免疫グロブリンはＩｇＧ1である。
【００２９】
本発明の一部の態様によれば、第２のドメインは、配列番号９に示した通りである。
【００３０】
本発明の一部の態様によれば、キメラポリペプチドは、配列番号６に示した通りである。
【００３１】
本発明の一部の態様によれば、キメラポリペプチドは、配列番号７、２０４または２０５に示した通りである。
【００３２】
本発明の一部の態様によれば、キメラポリペプチドは、ＴＮＦαによって誘導されるアポトーシスを阻害することができる。
【００３３】
本発明の一部の態様によれば、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬は、植物特異的グリカンを含む。
【００３４】
本発明の一部の態様によれば、植物特異的グリカンは、コアキシロースおよびコアα−（１，３）フコースからなる群から選択される。
【００３５】
本発明の一部の態様によれば、植物細胞は、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物細胞である。
【００３６】
本発明の一部の態様によれば、ニコチアナ・タバカム植物細胞は、ブライトイエロー（ＢＹ−２：Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ）細胞である。
【００３７】
本発明の一部の態様によれば、植物細胞は、凍結乾燥されている。
【００３８】
本発明の一部の態様によれば、植物細胞は、懸濁液中で成長させられる。
【００３９】
本発明の一部の態様によれば、肝臓疾患または障害は、肝炎、肝硬変、肝臓がん、肝毒性、慢性肝臓疾患、脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される。
【００４０】
本発明の一部の態様によれば、肝毒性は、アセトアミノフェン、ＮＴＨＥＳ、グルココルチコイド、イスニアゼド（isniazed）、ヒ素、四塩化炭素および塩化ビニルからなる群から選択される化学薬剤によって誘導される。
【００４１】
本発明の一部の態様によれば、糖尿病は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病およびＬＡＤＡ疾患からなる群から選択される。
【００４２】
本発明の一部の態様によれば、植物細胞は、経口栄養形態で提供される。
【００４３】
本発明の一部の態様によれば、経口栄養形態は、完全食（complete meal）、溶解用粉末、バー、ベークド製品、シリアルバー、デイリーバー（dairy bar）、スナック食品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー、チョコレートおよび乳製品である。
【００４４】
特に定義しない限り、ここで使用する全ての技術および／または科学用語は、本発明が関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここで記載するのと同様なまたは均等な方法および材料を、本発明の態様の実施または試験に使用できるが、例示的な方法および／または材料を以下に記載する。矛盾がある場合は、定義を含めて、特許明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法および実施例は、単に説明的なものであり、必ずしも限定的であることを意図しない。
【００４５】
ここで、本発明の一部の態様を、添付図面を参照して、単に一例として説明する。次に特に図面に詳細に言及するが、詳細は、一例として、本発明の態様の説明的な解説を目的として示すことを強調する。この点に関しては、この説明を図面と共に解釈すれば、当業者には、本発明の態様を実施できる方法が明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、植物によって発現される組換えヒト（ｐｒｈ）ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（ここでは、ＰＲＸ−１０６、配列番号６とも称する）のアミノ酸配列の略図である。ＢＹ２細胞における発現のためのｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ  ｃＤＮＡは、ＴＮＦ受容体のＴＮＦ結合部分およびＦＣタンパク質から構成される融合ポリペプチドを分泌経路に向けるシグナルペプチドと共に構築された。アミノ酸配列のカラーコード：黄色：シグナルペプチド；黒色：ＴＮＦ受容体部分；青色：ＩｇＧ１のＦｃ部分；赤色：ＥＲ保留シグナル。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣと市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）とのウエスタンブロットによる比較を示す。Ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（レーン１）および市販Ｅｎｂｒｅｌ（レーン２）を、還元条件下（図２Ａ）および非還元条件下（図２Ｂ）で、それぞれ１２％および８％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。膜に、抗ヒトＩｇＧ（抗ＦＣ）抗体（上部パネル）および抗ＴＮＦＲ２抗体（下部パネル）をブロットした。分子量マーカーが、右レーンに示されている。レーン１：ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣ；レーン２：市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）。
【図３】図３は、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃおよび市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）によるＴＮＦαの結合を、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ結合活性および分子完全性の定量的非放射性アッセイによって示すグラフである。ＴＮＦαに対する抗体でプレコートされたＥＬＩＳＡプレートを、ＴＮＦａと共にインキュベートし、続いて市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）およびｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現するＢＹ２細胞からの上清に曝露した。両調製物の段階希釈が、Ｘ軸に示されている。分子のＦｃ部分が、ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰで検出された。
【図４】図４は、抗ＩｇＧ（抗Ｆｃ）抗体を用いたウエスタンブロット分析による、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃの発現のための個々の植物細胞株のスクリーニングを示す画像である。
【図５−１】図５Ａ〜Ｆは、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）の存在下でのＡ３７５細胞におけるＴＮＦα細胞毒性を、ＭＴＴ生存能アッセイによって示す画像である。図５Ａ−未処理の培養Ａ３７５細胞；図５Ｂ−ＴＮＦαで処理；図５Ｃ−ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（３．１２５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞；図５Ｄ−市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（３．１２５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞；図５Ｅ−ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞；図５Ｆ−市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞。
【図５−２】図５Ｇは、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは市販Ｅｎｂｒｅｌの存在下でのＡ３７５細胞におけるＴＮＦα細胞毒性を、ＭＴＴ生存能アッセイによって示す棒グラフである。
【図６−１】図６Ａ〜Ｆは、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）の存在下でのＬ９２９細胞におけるＴＮＦα細胞毒性を、ＭＴＴ生存能アッセイによって示す画像である。図６Ａ−未処理の培養Ｌ９２９細胞；図６Ｂ−ＴＮＦαで処理；図６Ｃ−ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（３．１２５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞；図６Ｄ−市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（３．１２５ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞；図６Ｅ−ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＴＮＦα曝露細胞；図６Ｆ−市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理されたＮＦα曝露細胞。
【図６−２】図６Ｇは、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃまたは市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）の存在下でのＬ９２９細胞におけるＴＮＦα細胞毒性を、ＭＴＴ生存能アッセイによって示す棒グラフである。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｃは、マウスのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）免疫介在性肝炎モデルにおける肝毒性の血清マーカーに対する、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の有効な抗炎症活性を示す棒グラフである。マウスは、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃ（植物ＴＮＦＲ２：Ｆｃ）を発現する植物細胞、ステロイド抗炎症薬処置（デキサメタゾン）、宿主植物対照細胞（ＢＹ２）を与えるか、または未処置（生理食塩水）とし、６時間後にコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）をｉ．ｖ．投与した。ｃｏｎ  Ａ投与の１４時間後に、血清肝臓酵素（アラニンアミノトランフェラーゼ（aminotranferase）ＡＬＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＳＴ）をアッセイして、肝実質の損傷度を査定した。図７Ａおよび７Ｃ−カラム１−生理食塩水対照；カラム２−デキサメタゾン；カラム３−５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞；カラム４−相当する体積の宿主植物対照細胞（ＢＹ２）。図７Ｂ−カラム１−生理食塩水対照；カラム２−デキサメタゾン；カラム３−０．５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞；カラム４−５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞；カラム５−カラム３に相当する体積の宿主植物対照細胞（ＢＹ２）；カラム６−カラム４に相当する体積の宿主植物対照細胞（ＢＹ２）。図７Ａ−ｎ＝６、生理食塩水に対して*  ｐ＜０．０１；**  ｐ＜０．０００５；***  ｐ＜０．００００５、負の対照に対して＆  ｐ＜０．０５。図７Ｂ−ｎ＝６生理食塩水に対して、*  ｐ＜０．０２、負の対照に対して＆  ｐ＜０．０００５、負の対照に対して＃  ｐ＜０．０３。図７Ｃ−ｎ＝６、生理食塩水に対して*  ｐ＜０．０１；**  ｐ＜０．０００５；***  ｐ＜０．００００５、負の対照に対して＆  ｐ＜０．００００５。
【図７Ｂ】（図７Ａの続き）
【図７Ｃ】（図７Ｂの続き）
【図８Ａ】図８Ａ〜Ｃは、マウスのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）免疫介在性肝炎モデルにおける血清ＩＦＮ−γレベルに対する、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与の有効な抗炎症活性を示す棒グラフである。マウスに、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞、宿主植物対照細胞（ＢＹ２）、ステロイドまたは生理食塩水を経口投与によって与えた後に、図７Ａ〜７Ｃに記載した通りにＣｏｎ  Ａを投与した。ｃｏｎ  Ａ投与の１４時間後に、血清ＩＮＦ−γをＥＬＩＳＡによってアッセイした。図８Ａおよび８Ｃ−カラム１−生理食塩水対照；カラム２−デキサメタゾン；カラム３−５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞；カラム４−宿主植物対照細胞（ＢＹ２）相当体積。図８Ｂ−カラム１−生理食塩水対照；カラム２−デキサメタゾン；カラム３−０．５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞；カラム４−５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞；カラム５−カラム３に相当する宿主植物対照細胞（ＢＹ２）；カラム６−カラム４に相当する宿主植物対照細胞（ＢＹ２）。図８Ａ−ｎ＝６、生理食塩水に対して*  ｐ＜０．０５；**  ｐ＜０．００００１、負の対照に対しておよび＆  ｐ＜０．０００４。図８Ｂ−ｎ＝６、生理食塩水に対して*  ｐ＜０．０５；**  ｐ＜０．００００１、負の対照に対して＆  ｐ＜０．００４、負の対照に対して＃  ｐ＜０．０２。図８Ｃ−ｎ＝６、生理食塩水に対して*  ｐ＜０．０５、負の対照に対して＆  ｐ＜０．０９。
【図８Ｂ】（図８Ａの続き）
【図８Ｃ】（図８Ｂの続き）
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、マウスのコンカナバリンＡ（ｃｏｎ  Ａ）免疫介在性肝炎モデルにおける、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与による肝毒性の予防を示す、例示的な肝臓切片の顕微鏡写真である。マウスに、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞、宿主植物対照細胞（ＢＹ２）、または生理食塩水を与えた後に、図６Ａ〜６Ｃに記載した通りにＣｏｎ  Ａを投与した。ｃｏｎ  Ａ投与の14時間後に、肝臓を切除し、ホルムアルデヒド中で固定し、薄片を作り、ヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡によって評価した。図９Ａ−Ｃｏｎ  Ａ＋生理食塩水（対照）。図９Ｂ−Ｃｏｎ  Ａ＋０．５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質に相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞。図９Ｃ−Ｃｏｎ  Ａ＋図９Ｂに相当する宿主植物対照ＢＹ２細胞（ＢＹ２）の塊。
【図９Ｂ】（図９Ａの続き）
【図９Ｃ】（図９Ｂの続き）
【図１０Ａ】図１０Ａおよび１０Ｂは、マウスのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）免疫介在性肝炎モデルにおける肝毒性の血清マーカーに対する、経口投与された、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の有効な抗炎症活性を、哺乳類組換え細胞産生ＴＮＦＲ２：Ｆｃの抗炎症活性と比較して示す棒グラフである。マウスに、５μｇのＴＮＦＲ２：Ｆｃに相当する組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃ（植物ＴＮＦＲ２：Ｆｃ）を発現する植物細胞を経口投与によって（図１０Ａ、カラム２）与え、０．１ｍｇの哺乳類組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃ（エタネルセプト）を腹腔内投与によって（図９Ｂ、カラム２）与え、または対照処置（図１０Ａおよび１０Ｂ、カラム１）を行い、６時間後にコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）をｉ．ｖ．投与した。ｃｏｎ  Ａ投与の１４時間後に、血清肝臓生化学マーカーであるアラニンアミノトランフェラーゼ（aminotranferase）（ＡＬＴ）をアッセイして、肝実質の損傷度を査定した。図１０Ａ−ｎ＝６、生理食塩水に対して*  ｐ＜０．０１；**  ｐ＜０．０００５；***  ｐ＜０．００００５、負の対照に対して＆  ｐ＜０．０５。ここで留意すべきは、ｉ．ｐ．投与された０．１ｍｇの哺乳類組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃ融合タンパク質（エタネルセプト）の抗炎症効果に相当する、経口投与された、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の抗炎症効果である。
【図１０Ｂ】（図１０Ａの続き）
【図１１】図１１は、高脂肪食マウスモデルにおける血清レベルに対する、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果を示す棒グラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜Ｂは、高脂肪食マウスモデルにおける血清ＴＧに対する、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果を示す棒グラフである。生理食塩水と比較して、*  ｐ＜０．０００１；モックと比較して、＆  ｐ＜０．００２。
【図１２Ｂ】（図１２Ａの続き）
【図１３】図１３は、ＨＦＤマウスにおける体重増加を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＨＦＤマウスにおける肝臓Ｔｒｅｇに対する植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果を示す棒グラフである。生理食塩水と比較して、*  ｐ＜０．０５。
【図１５】図１５は、ＨＦＤマウスにおける肝臓ＮＫ細胞に対する、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果を示す棒グラフである。生理食塩水と比較して、*  ｐ＜０．０５。
【図１６】図１６は、脾臓／肝臓のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋比に対する、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果を示す棒グラフである。
【図１７】図１７は、脾臓／肝臓のＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋比に対する、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果を示す棒グラフである。
【発明の具体的な態様の説明】
【００４７】
本発明は、その一部の態様において、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の、治療法における使用に関する。
【００４８】
本発明の少なくとも１つの態様を詳細に説明する前に、本出願において、以下の説明において示すまたは実施例によって例示する詳細に本発明が必ずしも限定されないことを理解すべきである。本発明は、他の態様であることが可能であり、または種々の方法で実施するもしくは行うことが可能である。
【００４９】
生物薬剤の、それらの目標組織への正確な送達は、治療法のコストだけでなく患者の承諾およびコンプライアンスにも影響を及ぼし、したがってそれらの治療有効性に影響する難題を提起する。高分子生物薬剤の経口投与は、障壁、例えば、丸剤および他の固形製剤の摂取、胃腸管中における生物活性高分子の不安定性、粘膜における生物活性剤の濃度、ならびに生物活性高分子に対する胃腸膜の低い透過性を克服しなければならない。
【００５０】
ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））を経口投与する、以前の試みは、胃内の酸性度および酵素分解のために失敗に終わった。本発明者らは驚くべきことに、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞を与えることによって、生物活性ＴＮＦ結合性タンパク質（ＴＮＦＲ２：Ｆｃ）を効果的に経口投与できること、および組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与により、免疫介在性炎症性疾患からのかなり大きい保護が得られることを示した。
【００５１】
タバコＢＹ２細胞を、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃをコードする核酸構築物で形質転換させて培養すると、得られるＴＮＦ結合タンパク質が正確に発現され（例１を参照のこと）、市販の哺乳類細胞発現組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃ（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））と同様な電気泳動移動度、免疫学的交差反応性およびＴＮＦα結合特性を有していること（図２〜３を参照のこと）が示された。植物細胞発現組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの生物学的機能のインビトロアッセイは、２つの異なる型の標的細胞を用いて、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）に匹敵するＴＮＦ媒介アポトーシスからの細胞の保護のさらなる証拠を提供した（図５Ａ〜Ｆおよび６Ａ〜６Ｇを参照のこと）。
【００５２】
驚くべきことに、培養された、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞をマウスに与えてからコンカナバリンＡ免疫介在性肝毒性を誘導すると、肝損傷および炎症性サイトカインマーカーの血清レベルの有意で容量依存的な低下が観察された（例３、図７〜９）。組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与と、従来のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の腹腔内投与との比較は、血清肝酵素レベルのほぼ同一の低下を示した。これは、ｃｏｎ  Ａ肝毒性モデルの免疫関連炎症性傷害特性からの効果的な保護を示している。
【００５３】
本発明の一部の態様をさらに実施する間に、発明者らは、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与が、高脂肪食マウスによってモデル化された脂肪酸疾患（fatty acid disease）の特定の臨床症状を寛解させることを明らかにした（図１１〜１７を参照のこと）。したがって、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与は、脂肪肝疾患の動物モデルにおいて、血清酵素およびトリグリセリドの減少を引き起こした。この薬物はまた、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の種々の集団の脾臓および肝臓分布を変えた。これは、この薬物がＮＡＦＬＤの免疫調節薬としておよびメタボリックシンドロームにおいて役割を果たすことを示している。
【００５４】
したがって、本発明の一側面によれば、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、ＴＮＦαと関連する医学的状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の治療有効量を経腸的に投与し、それによってＴＮＦαと関連する医学的状態を治療することを含む方法が提供される。
【００５５】
あるいはまたはさらに、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病および肝臓疾患または障害と直接関連する、ＴＮＦαと関連する医学的状態の治療のための、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の使用が提供される。
【００５６】
用語「治療（処置）する」は、病態（疾患、障害または状態）の発現を阻害、予防もしくは抑止することおよび／または病態の低減、緩解もしくは退行を引き起こすことを指す。当業者ならば、種々の方法およびアッセイを使用して病態の発現を査定できること、ならびに同様に、種々の方法およびアッセイを使用して病態の低減、緩解または退行を査定できることが分かるであろう。
【００５７】
ここで使用する用語「予防する」は、疾患のリスクがあり得るが疾患があるとまだ診断されていない対象において、疾患、障害または状態が起こらないようにすることを指す。
【００５８】
ここで使用する用語「対象」は、病態を有するあらゆる年齢の哺乳類、例えば、ヒトを含む。具体的な一態様によれば、この用語は、病態を発現するリスクのある個体を包含する。
【００５９】
したがって、本教示は、肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病および肝臓疾患または障害と直接関連する医学的状態を治療または予防することを対象とする。本発明の一部の側面の一部の態様によれば、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む本発明の組成物は、肥満、メタボリックシンドロームおよび糖尿病を含む疾患および状態の予防、治療および制御に使用できる。一般に、用語「予防する」、「制御する」および「治療する」は、疾患または症状の素因を有する可能性があるがその疾患または症状を有するとまだ診断されていない患者からのその疾患またはその症状の発現の予防；疾患の症状の阻害、すなわち、その進行の阻害または遅延；ならびに疾患の症状の軽減、すなわち、疾患もしくは症状の退行、または症状の進行の逆転を包含する。
【００６０】
本発明によれば、内因性肥満、外因性肥満、過インスリン性肥満症、過形成性−肥大性肥満、肥大性満、甲状腺機能低下性肥満および病的肥満を含む全ての型の肥満を制御または治療することができる。また一方、本発明によれば、炎症介在性肥満を特に効果的に治療することができる。「予防する」、「制御する」または「治療する」とは、体重増加、特に体脂肪増加を減速、停止または逆行させて、体重の維持または減少をもたらすことを意味する。体重または体脂肪の減少は、血圧、総コレステロール、ＬＤＬコレステロールおよびトリグリセリドを低下させることによって、心血管疾患から保護することができ、慢性状態、例えば、高血圧症、冠状動脈性心疾患、２型糖尿病、高脂血症、変形性関節症、睡眠時無呼吸および変性関節疾患と関連する症状を軽減することができる。
【００６１】
メタボリックシンドロームまたはシンドロームＸは、高血圧症、高トリグリセリド血症、高血糖症、低レベルのＨＤＬＣおよび腹部肥満を含むいろいろな異常を伴う複雑な多因子性状態である。これらの特性を有する個体は代表的には、血栓形成促進性および炎症促進性状態を示す。入手可能なデータは、メタボリックシンドロームが真に症候群（リスク因子の分類）であることを示唆している。
【００６２】
世界保健機構（ＷＨＯ）ガイドラインによれば、個体が以下を示す場合に、メタボリックシンドロームが存在する：ａ）高血圧症（収縮期血圧＞１４０ｍｍＨｇまたは拡張期血圧＞９０ｍｍＨｇ）；（ｂ）高い血漿トリグリセリド（１５０ｍｇ／ｄＬ）および／または低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール（男性＜３５ｍｇ／ｄＬ、女性＜３９ｍｇ／ｄＬ）と定義される脂質異常症；３）高いボディマスインデックス（ＢＭＩ）（３０ｋｇ／ｍ２）および／または高いウエスト−ヒップ比（男性＞０．９０、女性＞０．８５）と定義される内蔵型肥満；ならびに４）ミクロアルブミン尿症（尿中アルブミン排泄率２０ｇ／分）。ＷＨＯ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．  Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．  １７：１５１〜１８３、１９９９を参照のこと。
【００６３】
全米コレステロール教育プログラム（ＮＣＥＰ  ＡＴＰ  ＩＩＩ研究）によれば、以下の５つのリスク因子のうち３つ以上が存在する場合に、メタボクックシンドロームと診断される：（１）腹囲が男性で＞１０２ｃｍ（４０ｉｎ）もしくは女性で＞８８ｃｍ（３７ｉｎ）；（２）トリグリセリドレベルが１５０ｍｇ／ｄＬ；（３）ＨＤＬコレステロール値が男性で＜４０ｍｇ／ｄＬもしくは女性で＜５０ｍｇ／ｄＬ；（４）血圧が＞１３０／８５ｍｍ  Ｈｇ；または（５）空腹時グルコースが＞１１０ｍｇ／ｄＬ。ＪＡＭＡ  ２８５：２４８６〜２４９７、２００１。
【００６４】
メタボリックシンドロームと関連する各障害は、それ自体がリスク因子であり、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、脳卒中および他の健康への悪影響を促進する可能性がある。また一方、これらの因子は、一緒に存在すると、心血管疾患および脳卒中のリスクの増加の前兆となる。
【００６５】
「制御する」または「治療（処置）する」とは、個体において示されるメタボリックシンドロームの症状の重症度および／または数を低減することを意味する。このような症状としては、高い血中グルコース、グルコース不耐性、インスリン耐性、高いトリグリセリド、高いＬＤＬコレステロール、低い高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロール、高い血圧、腹部肥満、炎症促進性状態および血栓形成促進性状態を挙げることができる。「予防する」「制御する」または「治療（処置）する」とは、さらにまたはあるいは、関連疾患を発現するリスクを低下させることおよび／またはこのような疾患の発症を遅延させることを意味する。このような関連疾患としては、心血管疾患、冠状動脈性心疾患ならびに動脈壁のプラーク形成および糖尿病性状態と関連する他の疾患が挙げられる。
【００６６】
糖尿病性状態としては、例えば、１型糖尿病、２型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病前症、遅発性自己免疫性１型糖尿病（ＬＡＤＡ）、高血糖症およびメタボリックシンドロームが挙げられる。治療の目的では、糖尿病は、顕性の診断された糖尿病、例えば、２型糖尿病、または前糖尿病性状態であり得る。
【００６７】
真性糖尿病（一般にここでは「糖尿病」と称する）は、グルコース調節異常を特徴とする疾患である。糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生できない場合または産生されたインスリンを体が効果的に使用できない場合に起こる、血中グルコースの濃度増加（高血糖）をもたらす慢性疾患である。糖尿病は、１型糖尿病（インスリン依存性糖尿病、若年性または小児期発症糖尿病）、２型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病または成人発症糖尿病）、ＬＡＤＡ糖尿病（成人潜在性自己免疫性糖尿病）または妊娠糖尿病に分類され得る。さらに、中間の状態、例えば、耐糖能異常および空腹時血糖異常も、２型糖尿病まで進行する高いリスクを示す状態と認識されている。
【００６８】
１型糖尿病においては、膵β細胞の自己免疫性破壊により、インスリン産生がない。この自己免疫性破壊のいくつかのマーカー、例えば、膵島細胞自己抗体、インスリン自己抗体、グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗体およびチロシンホスファターゼＩＣＡ５１２／ＩＡ−２自己抗体が、体液および組織中で検出可能である。全世界の糖尿病患者の９０％をなす２型糖尿病においては、インスリン分泌が不十分である場合もあるが、末梢のインスリン耐性が一次欠損であると考えられている。２型糖尿病は、必ずしもそうではないが、一般にインスリン耐性の原因である肥満と関連している。
【００６９】
２型糖尿病に先行して糖尿病前症が起こることが多い。糖尿病前症においては、血中グルコースレベルは正常より高いが、糖尿病と診断されるほどにはまだ高くない。ここで使用する用語「糖尿病前症」は、血中グルコースレベルの測定に使用される検査を指す用語である用語「耐糖能異常」または「空腹時血糖異常」と同義である。
【００７０】
糖尿病における慢性高血糖は、微小血管系および／または大血管系（macrovasculature）を冒す多発性の、主に血管の合併症と関連する。これらの長期的合併症としては、網膜症（限局性のボケ（focal blurring）、網膜剥離および視力の部分喪失または全喪失につながる）、ネフロパシー（腎不全につながる）、ニューロパシー（疼痛、しびれおよび四肢の感覚の喪失につながり、結果的に足潰瘍および／または足切断をもたらす可能性がある）、心筋症（心不全につながる）、および感染リスクの増加が挙げられる。２型または非インスリン非依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は、グルコース利用組織、例えば、脂肪組織、筋肉および肝臓の、インスリンの生理的作用に対する耐性と関連する。ＮＩＤＤＭと関連して慢性的に高い血中グルコースは、消耗性合併症、例えば、多くの場合透析または腎移植を余儀なくさせるネフロパシー；末梢性ニューロパシー；失明につながる網膜症；切断につながる下肢の潰瘍および壊死；肝硬変まで進行する可能性がある脂肪肝疾患；ならびに冠動脈疾患および心筋梗塞に対する感受性につながるおそれがある。「予防する」とは、糖尿病を発現するリスクを低減することまたは疾病の発症を遅延させることを意味する。「制御する」または「治療（処置）する」とは、関連合併症を発現するリスクを低減することおよび／またはこのような合併症の発症を遅延させることを意味する。
【００７１】
本発明の方法に従って組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞による治療を施される糖尿病状態は、当分野において公知の多数のアッセイのいずれかを使用して診断または監視することができる。個体を糖尿病もしくは糖尿病前症と診断またはカテゴリー化するためのまたは前記個体を監視するためのアッセイの例としては、これらに限定するものではないが、グリコシル化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）検査、結合ペプチド（Ｃ−ペプチド）検査、空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）検査、経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）および平常時血漿グルコース検査（casual plasma glucose test）が挙げられる。
【００７２】
ＨｂＡ１ｃは、血液中のグリコシル化ヘモグロビンの量を測定するバイオマーカーである。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンの安定な微小糖化細画分を示す。これは、最近６〜８週間の平均血中グルコースレベルを反映するものであり、総ヘモグロビンのパーセント（％）で表される。あるいは、糖尿病または糖尿病前症は、当分野において知られているいくつかの検査のいずれか、例えば、空腹時血漿グルコース検査または経口グルコース負荷試験を使用して血中グルコースレベルを測定することによって診断することもできる。空腹時血漿グルコース（ＦＰＧ）検査を使用する場合、患者が１２５ｍｇ／ｄｌを超える閾値ＦＰＧを有するならば、患者は糖尿病患者に分類され、本発明の方法に従って治療が施され、患者が１００ｍｇ／ｄｌを超えるが１２５ｍｇ／ｄｌ以下の閾値ＦＰＧを有するならば、患者は糖尿病前症患者に分類され、本発明の方法による治療が施される。経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）を使用する場合、患者が２００ｍｇ／ｄｌを超える閾値２時間ＯＧＴＴグルコースレベルを有するならば、患者は糖尿病患者に分類され、本発明の方法による治療が施される。患者が１４０ｍｇ／ｄｌを超えるが２００ｍｇ／ｄｌ未満の閾値２時間ＯＧＴＴグルコースレベルを有するならば、患者は糖尿病前症患者に分類され、本発明の方法による治療が施される。
【００７３】
プロインスリン分子から産生されたＣ−ペプチドは、膵島細胞から血流にインスリンと等モルの割合で分泌され、β細胞機能およびインスリン分泌のバイオマーカーとして使用される。２．０ｎｇ／ｍｌを超える空腹時Ｃ−ペプチド測定値は、高いインスリンレベルを示し、０．５ｎｇ／ｍｌ未満の空腹時Ｃ−ペプチド測定値は、不十分なインスリン産生を示す。
【００７４】
糖尿病状態を有すると分類されて、本発明の方法に従って組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞による治療が施される対象は、ここに記載するバイオマーカーおよび／または血中グルコース指標のいずれか、例えば、これらに限定するものではないが、グリコシル化ヘモグロビンレベル、Ｃ−ペプチドレベル、空腹時血漿グルコースレベルおよび経口グルコース負荷試験（ＯＧＴＴ）レベルを測定することによって、治療の有効性を監視することができる。ここに記載するバイオマーカーおよび／または血中グルコース指標に関しては、治療の有効性は、対象からの試料中のバイオマーカーまたは血中グルコース指標のレベルを定量して、バイオマーカーまたは血中グルコース指標のレベルが閾値レベルに達したかそれとも近づいているかを判定することによって判定できる。一部の態様において、閾値レベルは、当技術分野において公知の基準により「正常」値（すなわち、非糖尿病値）である、バイオマーカーもしくは血中グルコース指標のレベルに相当し得るか、または閾値レベルは、当技術分野において公知の基準により糖尿病前症もしくは糖尿病値である、バイオマーカーもしくは血中グルコース指標のレベルに相当し得る。
【００７５】
一部の態様において、治療の有効性は、治療開始前に対象においてバイオマーカーおよび／または血中グルコース指標のうちの１種以上の第１の測定値を取り、治療開始後の１つ以上の時点で対象において同じバイオマーカーおよび／または血中グルコース指標の第２の測定値と第１の測定値を比較することによって判定し、ここで、閾値に達したもしくは閾値を超えた（測定されているバイオマーカーによって、閾値より高いまたは低い）または第１の測定値よりも閾値に近い第２の測定値は、治療が有効であることを示す。
【００７６】
あるいはまたはさらに、治療の有効性は、糖尿病性状態と関連する二次的状態および症状の緩解があったか否かを判定することにより監視することができる。例えば、本発明の方法によって治療されている対象を、網膜症（例えば、視力の改善）、ネフロパシー（例えば、腎臓の構造または機能の改善）、ニューロパシー（例えば、神経機能の改善）および／または心血管疾患（例えば、血圧の低下またはより脂質レベルの低下）の症状の改善または低減について監視することができる。
【００７７】
高脂血症：
本発明の一部の側面の一部の態様によれば、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む本発明の組成物を使用して、血液中のいずれかのまたは全ての脂質および／またはリポタンパク質の異常に高いレベルを伴う高脂血症（高リポタンパク血症または高脂血症とも称する）を予防、治療および制御するために使用することができる。[1]これは、脂質異常症（いずれかの異常な脂質レベルを含む）の最も一般的な形態である。高脂血症はまた、どの型の脂質が上昇しているかによって、すなわち、高コレステロール血、高トリグリセリド血または複合型高脂血症においては両者であるかによって分類される。また、高いリポタンパク質（ａ）レベルもまた、高脂血症の一形態に分類される。この用語には、Ｉ型高リポタンパク血症、ＩＩ型高リポタンパク血症、ＩＩＩ型高リポタンパク血症、ＩＶ型高リポタンパク血症およびＶ型高リポタンパク血症、ならびに分類されていない家族型および獲得型の高脂血症も含まれる。
【００７８】
肝臓疾患：
本発明の一部の側面の一部の態様によれば、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞を含む本発明の組成物を使用して、肝炎、肝硬変、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（非アルコール性脂肪肝疾患−ＮＡＦＬＤとしても知られる）、肝毒性および慢性肝臓疾患を含む肝臓疾患および障害を予防、治療および制御することができる。一般に、用語「予防する」、「制御する」および「治療（処置）する」は、疾患または症状の素因を有する可能性があるがその疾患または症状を有するとまだ診断されていない患者からのその疾患またはその症状の発現の予防；疾患の症状の阻害、すなわち、その進行の阻害または遅延；ならびに疾患の症状の軽減、すなわち、疾患もしくは症状の退行または症状の進行の逆転を包含する。
【００７９】
用語「肝臓疾患」は、肝臓を不適切に機能させるまたは肝臓を機能させなくする多くの疾患および障害に適用され、この肝機能喪失は肝臓疾患を示す。したがって、肝機能検査は、肝臓疾患を診断するために頻繁に使用される。このような検査の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定するものではない：
（１）血清酵素、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）のレベルを決定するためのアッセイであって、酵素レベルの増加が肝臓疾患を示すもの。当業者ならば、これらの酵素アッセイは、肝臓が損傷されていることのみを示すことが当然分かるであろう。これらは、肝臓の機能する能力を査定しない。肝臓の機能する能力をアッセイするためには他の検査を使用できる。
【００８０】
（２）血清ビリルビンレベルを決定するアッセイ。血清ビリルビンレベルは、総ビリルビンおよび直接ビリルビンとして報告される。総血清ビリルビンの正常値は、０．１〜１．０ｍｇｄｌ（例えば、約２〜１８ｍｍｏｌ／ｌ）である。直接ビリルビンの正常値は、０．０〜０．２ｍｇ／ｄｌ（０〜４ｍｍｏｌ／ｌ）である。血清ビリルビンの増加は、肝臓疾患を示す。
【００８１】
（３）血清タンパク質レベル、例えば、アルブミンおよびグロブリン（例えば、α、β、γ）を決定するアッセイ。総血清タンパク質の正常値は、６．０〜８．０ｇ／ｄｌ（６０〜８０ｇ／Ｌ）である。血清アルブミンの減少は、肝臓疾患を示す。グロブリンの増加は、肝臓疾患を示す。
【００８２】
他の検査としては、プロトロンビン時間の国際標準化比、活性凝固時間（ＡＣＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、プロトロンビン消費時間（ＰＣＴ）、フィブリノーゲン、凝固因子；αフェトプロテインおよびαフェトプロテイン−Ｌ３（パーセント）が挙げられる。
【００８３】
肝臓疾患の１つの臨床的に重要な型は、肝炎である。肝炎は、ウイルス（例えば、Ａ、ＢおよびＣ型肝炎ウイルス（それぞれ、ＨＡＶ、ＨＢＶおよびＨＣＶ）、化学製品、薬物、アルコール、遺伝性疾患または患者自身の免疫系（自己免疫性肝炎）によって引き起こされる可能性がある肝臓の炎症である。この炎症は、急性であって数週間〜数カ月間以内に回復し得るか、慢性であって長年にわたって持続し得る。慢性肝炎は、数十年間持続した後に、著しい症状、例えば、肝硬変（瘢痕および機能の喪失）、肝臓がんまたは死亡を引き起こす可能性がある。用語「肝臓疾患」によって包含され、本発明の組成物および方法を使用する治療または予防または制御に好適な種々の疾患および障害の他の重要な例としては、これらに限定するものではないが、アメーバ性肝膿瘍、胆道閉鎖症、線維症、肝硬変、コクシジオイド症、デルタ因子、肝細胞癌（ＨＣＣ）、アルコール性肝臓疾患、原発性胆汁性肝硬変、化膿性肝膿瘍、ライ症侯群、硬化性胆管炎およびウィルソン病が挙げられる。一部の態様において、ここに記載する組成物および方法は、肝実質細胞の喪失または損傷を特徴とする肝臓疾患の治療に好適である。一部の側面において、これの病因は、局所または全身炎症反応であり得る。
【００８４】
肝不全は、肝臓の大部分が損傷される場合に起き、肝臓は、その正常な生理機能をもはや果たすことができない。一部の側面において、肝不全は、肝機能の上記アッセイを使用してまたは対象の症状によって診断することができる。肝不全と関連する症状としては、例えば、以下：嘔気、食欲不振、疲労、下痢、黄疸、異常出血／過度の出血（例えば、凝固障害）、腹部膨隆、精神見当識障害または精神錯乱（例えば、肝性脳症）、眠気および昏睡の１つ以上が挙げられる
慢性肝不全は、数カ月から数年にわたって起き、最も一般的には、ウイルス（例えば、ＨＢＶおよびＨＣＶ）、長期の／過度の飲酒、肝硬変、血色素症および栄養失調症によって引き起こされる。急性肝不全は、肝臓疾患（例えば、黄疸）の最初の徴候後における重症合併症の出現であり、多くの状態を含み、その状態の全てが、重度の肝細胞傷害または壊死を伴う。一部の態様において、ここに記載する組成物および方法は、超急性、急性および亜急性の肝不全、劇症肝不全ならびに遅発性劇症肝炎（これらは全て、ここでは「急性肝不全」と称する）の治療に特に好適である。急性肝不全の一般的な原因としては、例えば、ウイルス性肝炎、特定の薬物および毒素（例えば、フッ素化炭化水素（例えば、トリクロルエチレンおよびテトラクロルエタン）、タマゴテングダケ（ａｍａｎｉｔａ  ｐｈａｌｌｏｉｄｅｓ）（例えば、一般に「デスカップマッシュルーム（death-cap mushroom）」に見られる）、アセトアミノフェン（パラセタモール）、ハロタン、スルホンアミド、ヘニトイン（henytoin））への曝露、心臓と関連する肝虚血（例えば、心筋梗塞、心停止、心筋症および肺塞栓症）、腎不全、肝静脈流出路閉塞（occlusion of hepatic venous outflow）（例えば、バッド−キアリ症候群）、ウィルソン病、妊娠性急性脂肪肝、アメーバ性膿瘍および播種性結核が挙げられる。
【００８５】
用語「肝炎」は、臓器の組織中に炎症細胞が存在することを特徴とする肝臓の傷害を暗示する肝臓状態を記載するのに使用する。この状態は自己制御され、自然治癒することがあり、または肝臓の瘢痕まで進歩することがある。肝炎は、持続期間が６カ月未満である場合には急性肝炎であり、持続期間が６カ月を超える場合には慢性肝炎である。肝炎ウイルスとして知られる１つの群のウイルスは、全世界において肝損傷の最も多くの症例の原因となっている。肝炎は、毒素（とりわけアルコール）、他の感染症に起因するか、または自己免疫プロセスの結果であることもある。肝炎としては、ウイルス感染、例えば、Ａ型〜Ｅ型肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型およびＥ型−−ウイルス性の原因の９５％超）、単純ヘルペス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、黄熱病ウイルス、アデノウイルス；非ウイルス感染、例えば、とりわけ、トキソプラズマ、レプトスピラ、Ｑ熱、ロッキー山紅斑熱；アルコール、毒素、キノコ中のアマニタトキシン、四塩化炭素、アサフェティダ、とりわけ、薬物、例えば、パラセタモール、アモキシシリン、抗結核薬、ミノサイクリンおよびここに記載する多数の他の薬物；虚血性肝炎（循環機能不全）；妊娠；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む自己免疫性状態；ならびに非アルコール性脂肪性肝炎に由来する肝炎が挙げられる。
【００８６】
「滅菌性炎症」は、原形質膜の完全性を失った瀕死の細胞から放出される細胞内分子が引き金となる肝臓の炎症を記載するのに使用する。この炎症は、原因物質、例えば、ウイルスまたは細菌およびアルコールの非存在下で起こる。他の細胞を刺激して炎症誘発性サイトカインおよびケモカインを産生し得る多くの細胞内分子が、特定されている。このような炎症誘発性細胞分子は、サイトカイン産生細胞上の受容体に結合することによって機能すると考えられている。治療せずに放置すると、滅菌性炎症は、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）または肝硬変（cyrrhosis）まで進行する可能性がある。
【００８７】
「非アルコール性脂肪性肝炎」または「ＮＡＳＨ」は、肝臓への脂肪の蓄積によって炎症が引き起こされる肝臓の状態である。ＮＡＳＨは、非アルコール性脂肪肝疾患として知られる１群の肝臓疾患の一部であり、脂肪が肝臓中に蓄積し、場合によっては、経時的に増悪する肝臓損傷（進行性肝損傷）を引き起こす。「非アルコール性脂肪肝疾患」（ＮＡＦＬＤ）は、過度のアルコール使用に起因しない肝臓の脂肪炎症である。これは、インスリン耐性、ならびにメタボリックシンドローム、肥満、高いコレステロールおよびトリグリセリドならびに糖尿病に関係し、最初は他のインスリン耐性状態（例えば、２型真性糖尿病）、例えば、体重減少のために開発された治療、メトホルミンおよびチアゾリジンジオンに応答し得る。非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、ＮＡＦＬＤの最も極端な形態であり、原因不明の肝臓の硬変の主な原因と考えられている。
【００８８】
ＮＡＳＨの一因となることが知られている他の要因としては、以下が挙げられる：腸、胃または両方を短縮する手術、例えば、空腸バイパス手術または胆膵路転換手術；栄養管または栄養を取る他の方法の長期使用；特定の薬物、例えば、アミオダロン、グルココルチコイド、合成エストロゲンおよびタモキシフェン。
【００８９】
ＮＡＳＨは、経時的に増悪し得る状態（進行性状態と称する）であり、肝硬変につながる肝臓の瘢痕（線維症）をもたらし得る。「肝硬変」は、肝細胞が瘢痕組織によって置きかえられた状態を記載する。「肝臓の硬変」または「肝硬変」という用語は、肝機能の進行性喪失につながる、線維性瘢痕組織による肝臓組織の置きかえならびに再生結節を特徴とする慢性肝臓疾患を記載するのに使用する。肝硬変は最も一般的には、ＮＡＳＨを含む脂肪肝疾患、ならびにアルコール依存症ならびにＢ型肝炎およびＣ型肝炎によって引き起こされるが、原因不明である場合もある。生命を脅かすおそれがある、肝硬変の合併症は、肝性脳症（錯乱および昏睡）および食道静脈瘤による出血である。肝硬変は歴史的には、いったん起こると概ね不可逆的であると考えられており、歴史的な治療は、進行および合併症の予防に重点が置かれた。肝硬変の進行期において、唯一の選択肢は肝移植である。本発明の、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞および方法は、病因に関係なく、肝臓の硬変を制限し、阻害し、肝臓の硬変の可能性を低減し、または肝臓の硬変を治療するのに使用できる。
【００９０】
本発明の、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞および方法は、肝臓の化学的外傷および肝毒性を治療、予防または制御するのに使用できる。「化学的外傷」または「急性の化学的外傷」は、薬物誘導性毒性または外傷を含む化学毒性の帰結として短期間にわたって患者に起こる重度の傷害を指す。アセトアミノフェン誘導性急性肝臓外傷を含む薬物誘導性急性肝臓外傷は、薬物への曝露（例えば、薬物過剰投与）、とりわけアセトアミノフェン毒性の結果または帰結として起こる急性肝臓外傷である。本発明による化合物は、とりわけ薬物誘導性（薬物過剰投与）およびアセトアミノフェン誘導性急性肝臓外傷を含む、物理的外傷および化学的外傷によって起こる肝臓の傷害を低減するのに有用である。
【００９１】
肝毒性（hepatotoxocity）は、肝毒性物質または肝毒性を誘導する生物活性剤によって生じる化学的肝臓外傷である。用語「肝毒性物質」および「肝毒性を誘導する生物活性剤」は、このような薬剤を投与された患者において多くの場合肝毒性が生じる化合物を記載するのに、文脈において同意語として使用する。肝毒性（hepatoxicity）物質の例としては、例えば、麻酔薬、抗ウイルス薬、抗レトロウイルス薬（ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬および非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬）、とりわけ抗ＨＩＶ薬、抗がん薬、臓器移植薬（シクロスポリン、タクロリムス、ＯＫＴ３）、抗菌薬（抗ＴＢ性抗生物質、抗真菌性抗生物質）、抗糖尿病薬、ビタミンＡ誘導体、ステロイド薬、とりわけ例えば、経口避妊薬、タンパク質同化ステロイド、アンドロゲン、非ステロイド性抗炎症薬、抗うつ薬（とりわけ三環系抗うつ薬）グルココルチコイド、天然物ならびにハーブ治療薬および代替治療薬、とりわけ例えば、セントジョーンズワートが挙げられる。
【００９２】
肝毒性は、小さい液滴（小滴性）のまたは大きい液滴（大滴性）の脂肪肝につながるトリグリセリド蓄積として顕在化し得る。リン脂質蓄積が遺伝性リン脂質代謝欠損を伴う疾患（例えば、テイ−サックス病）と同様なパターンにつながる別の型の脂肪変性もある。
【００９３】
具体的な一態様によれば、肝臓疾患は、脂肪肝疾患（例えば、非アルコール性）である。この場合、一部の態様によれば、ＴＮＦα阻害薬（例えば、経口投与される、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞）は、血清酵素（例えば、ＡＳＴもしくはＡＬＴまたは両方）および／またはトリグリセリドの低下を引き起こし、あるいはまたはさらに、同一病期の未治療の対象と比較して、肝臓および脾臓中のＴ細胞およびＮＫ細胞の分布を変える可能性がある。
【００９４】
本発明の、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞および方法は、慢性肝臓疾患を治療、予防または制御するために使用できる。慢性肝臓疾患は、経時的な肝臓組織の段階的破壊を特徴とする。肝硬変および線維症を含むいくつかの肝臓疾患は、このカテゴリーに分類され、線維症は、肝硬変の前兆であることが多い。肝硬変は、急性および慢性肝臓疾患の結果であり、肝機能の進行性喪失につながる、線維性瘢痕組織による肝臓組織の置きかえおよび再生結節を特徴とする。線維症および結節再生は、肝臓の正常な微視的小葉構築を喪失させる。線維症は、例えば、感染症、炎症、傷害およびさらには治癒によって生じる瘢痕組織の成長を示す。経時的に、線維性瘢痕組織が正常機能の肝臓組織とゆっくりと置きかわり、結果として肝臓への血流量を減少させて、血流中に見られる栄養素、ホルモン、薬物および毒物を十分に処理できない状態にする。肝硬変のより一般的な原因としては、アルコール依存症、Ｃ型肝炎ウイルス感染、毒素の摂取および脂肪肝が挙げられるが、多くの他の考えられる原因も存在する。慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）が、３００万〜５００万人を冒すと推定される、米国における慢性肝臓疾患の２つの主な原因である。高まる懸念は、約１０％が最終的にＮＡＳＨを発現する非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）を有する肥満およびメタボリックシンドロームを有する米国市民の数が連続的に増加し、現在３，０００万人を超える数に達していることである。他の肉体的な合併症は、肝機能の喪失の結果である。肝硬変で最も一般的な合併症は、腹腔内における体液の蓄積である、腹水症として知られている状態であり、特発性細菌性腹膜炎のリスクの増加につながり、場合によっては患者の早死という結果を招く可能性がある。
【００９５】
本発明の、組換えＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞および方法は、肝臓がんを制限し、阻害し、肝臓がんの可能性を低減し、または肝臓がんを治療するのに使用できる。肝臓がんのリスク因子としては、２型糖尿病（肥満によって悪化する）およびメタボリックシンドロームが挙げられる。２型糖尿病患者における肝臓がんのリスクは、糖尿病罹病期間および治療プロトコールによっては、より大きくなる（非糖尿病性患者のリスクの約３〜７倍）。メタボリックシンドロームは、炎症、脂肪変性、線維症、肝硬変、アポトーシス、遺伝子発現の変化を、最終的には肝臓がんさえももたらす。加えて、脂質代謝異常、高血圧症、高血糖症およびメタボリックシンドロームは、肝炎を悪化させ、肝炎を肝硬変へと進行させ、肝硬変は、例えば星細胞の活性化によってさらに肝臓がんに至る可能性がある。
【００９６】
種々の方法が、肝臓がんのスクリーニングおよび診断に使用可能であり、当技術分野において周知である。肝臓がんの指標としては、腫瘍マーカー、例えば、高いαフェトプロテイン（ＡＦＰ）またはデス−γ−カルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）が挙げられる。超音波、ＣＴスキャンおよびＭＲＩを含むスキャン技術およびイメージング技術も役立つ。巨視的には、肝臓がんは、結節性であり得る、またはびまん性および低限局性である浸潤性腫瘍であり得る。
【００９７】
使用する用語「ＴＮＦα」は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ、カケキシン（cachexin）またはカケクチン）を指し、これは、全身性炎症に関与するサイトカインであって、急性期反応を刺激するサイトカインの１つの群のメンバーである。ＴＮＦαは主に、活性化マクロファージ（Ｍ１）によって産生されるが、ＣＤ４＋リンパ球、ＮＫ細胞およびニューロンのような多くの他の細胞型によっても産生され得る。このタンパク質はＴＮＦＡ遺伝子によってコードされ、Ｒｅｆ＿ｓｅｑ番号：ＮＰ＿０００５８５を有する。このタンパク質は、炎症反応を刺激することが知られている（炎症促進性サイトカイン）。
【００９８】
ここで使用する「ＴＮＦαポリペプチド阻害薬」は、ＴＮＦαと結合して、以下のいずれかを含むＴＮＦα−受容体（ＴＮＦＲ）とのＴＮＦαの結合に反映されるＴＮＦα活性を阻害するおよび／または妨げるポリペプチドを指す：（ａ）ＴＮＦＲ、好ましくは内在性の（すなわち、個体または宿主に固有の）細胞膜結合型ＴＮＦＲ；（ｂ）ＴＮＦＲの細胞外ドメイン；および／または（ｃ）ＴＮＦＲのＴＮＦα結合ドメイン（細胞外ドメインの一部であり得る）。具体的な一態様によれば、受容体とのＴＮＦαの結合の阻害は、少なくとも５０％、例えば、５０〜１００％である。５０〜９５％、６０〜９０％またはさらには７０〜９０％。
【００９９】
ＴＮＦα阻害薬としては、ＴＮＦα受容体（またはここに記載するそれらの適当な部分）および抗ＴＮＦα抗体が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【０１００】
ここで使用するＴＮＦα阻害薬の「生物活性」は、ＴＮＦαと結合して、ＴＮＦαが以下のいずれかと結合するのを阻害しかつ／または妨げることである：（ａ）ＴＮＦＲ、好ましくは内在性の細胞膜結合型ＴＮＦＲ；（ｂ）ＴＮＦＲの細胞外ドメイン；および（ｃ）ＴＮＦＲのＴＮＦα結合ドメイン（細胞外ドメインの一部であり得る）。ＴＮＦα阻害薬は、ＴＮＦα活性およびその阻害を測定するための当技術分野で公知のアッセイを使用した場合に生物活性を示すことを、示すことができ、そのアッセイの一例はここに示されている。
【０１０１】
ここで使用する用語「ＴＮＦ受容体ポリペプチド」および「ＴＮＦＲ」は、ＴＮＦαと結合することができるＴＮＦＲ（任意の種、例えば、ヒトからの）に由来するポリペプチドを指す。２つの異なる細胞表面ＴＮＦＲが記載されている：ＩＩ型ＴＮＦＲ（またはｐ７５  ＴＮＦＲまたはＴＮＦＲＩＩ）およびＩ型ＴＮＦＲ（またはｐ５５  ＴＮＦＲまたはＴＮＦＲＩ）。成熟した全長ヒトｐ７５  ＴＮＦＲは、約７５〜８０キロダルトン（ｋＤ）の分子量を有する糖タンパク質である。成熟した全長ヒトｐ５５  ＴＮＦＲは、約５５〜６０ｋＤの分子量を有する糖タンパク質である。本発明の好ましいＴＮＦＲポリペプチドは、Ｉ型ＴＮＦＲおよび／またはＩＩ型ＴＮＦＲに由来する。受入番号の例は、以下に示す。具体的な一態様によれば、ＴＮＦＲは、ＴＮＦαと特異的に、例えば、１０-5Ｍ未満のＫｄで結合できる。
【０１０２】
具体的な一態様によれば、ＴＮＦα阻害薬は、キメラポリペプチドである。
【０１０３】
「キメラポリペプチド」または「融合ポリペプチド」は、天然で見出されるのとは異なる位置に領域を含むポリペプチドである。これらの領域は通常は別個のタンパク質中に存在し得、キメラもしくは融合ポリペプチドでは一緒にされるか、または通常は同一タンパク質中に存在し得るが、キメラもしくは融合ポリペプド中で新しい配列で配置される。キメラまたは融合ポリペプチドは、直鎖状か分枝かにかかわらず、ポリマーの形態のＴＮＦＲポリペプチドから生じることもできる。
【０１０４】
ここで使用するＴＮＦＲの「細胞外ドメイン」は、ＴＮＦＲのアミノ末端とＴＮＦＲ膜貫通領域のアミノ末端との間に見られるＴＮＦＲの部分を指す。ＴＮＦＲの細胞外ドメインは、ＴＮＦαと結合する。
【０１０５】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すのに同義で使用する。この用語はまた、修飾されているアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、または標識化成分とのコンジュゲーションが行われているアミノ酸ポリマーを包含する。
【０１０６】
ＴＮＦαポリペプチド阻害薬の具体例としては、これらに限定するものではないが、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ（商標））およびアダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ（商標））が挙げられ、これらはそれぞれ、キメラヒト−マウス抗ＴＮＦαモノクローナル抗体および全ヒト抗ＴＮＦαモノクローナル抗体からなる。本発明の教示に従って使用できる抗ＴＮＦα抗体の別の例としては、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ（商標））が挙げられる。
【０１０７】
この定義には、市販エタネルセプト（以下でさらに記載）およびＬｅｎｅｒｃｅｐｔ（ｐ５５ｓＴＮＦ−ＲＩ−ＩｇＧ１からなるキメラポリペプチド）をそれらの範囲に含むキメラポリペプチドも含まれる。このようなキメラポリペプチドについては、以下でさらに記載する。
【０１０８】
したがって、具体的な一態様によれば、
ＴＮＦαポリペプチド阻害薬は、
（ｉ）ＴＮＦ受容体のＴＮＦα結合ドメインを含む第１のドメインと、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＦｃドメインを含む第２のドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、第１のドメインと第２のドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に逐次連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがＴＮＦαに特異的に結合するキメラポリペプチドである。
【０１０９】
したがって、第１のドメインは、少なくともＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）のＴＮＦ結合ドメインから構成される。第１のドメインは、可溶性タンパク質である。したがって、具体的な一態様によれば、第１のドメインおよびさらにはキメラポリペプチド全体が、膜に固定されていない可溶性タンパク質である。
【０１１０】
可溶型ＴＮＦＲは、単量体、融合タンパク質（「キメラタンパク質」とも称する）、二量体、三量体またはより高次の多量体を含むことができる。本発明の特定の態様において、可溶性ＴＮＦＲ誘導体は、７５ｋＤａ  ＴＮＦＲまたは５５ｋＤａ  ＴＮＦＲを模倣し、インビボでＴＮＦαと結合するものである。本発明の可溶性ＴＮＦＲ模倣物は、ＴＮＦＲ  ｐ５５もしくはｐ７５またはそれらのフラグメントに由来し得る。ｐ５５およびｐ７５以外のＴＮＦＲ、例えば、ＷＯ９９／０４００１に記載されているＴＮＦＲなども、ここで記載する種々の医学的障害を治療するための可溶性ＴＮＦＲを得るのに有用である。ＴＮＦＲ模倣物を構築するのに使用する可溶性ＴＮＦＲ分子としては、例えば、ネイティブなＴＮＦＲの膜貫通領域を欠いており、ＴＮＦαと結合することができる、少なくとも２０アミノ酸を有するネイティブなＴＮＦＲの類似体またはセグメントが挙げられる。このような可溶型のＴＮＦＲは、細胞表面の受容体とＴＮＦαに対して競合し、したがってＴＮＦαが細胞に結合するのを阻害し、それによってＴＮＦαがその生物活性を顕在化するのを予防する。可溶性ＴＮＦＲのＴＮＦαへの結合は、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の簡便なアッセイを使用してアッセイすることができる。
【０１１１】
具体的な一態様によれば、第１のドメインはＴＮＦＲ２に由来する。（例えば、ＡＡＡ３６７５５）。
【０１１２】
本発明の一態様によれば、第１のドメインは、２００〜２５０アミノ酸長である。
【０１１３】
本発明の具体的な一態様によれば、第１のドメインは、アミノ酸配列ＬＣＡＰ（配列番号１１）およびＶＦＣＴ（配列番号１２）を含む。
【０１１４】
具体的な一態様によれば、第１のドメインは、アミノ酸配列ＬＰＡＱＶＡＦＸＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣ（配列番号１３）またはＬＰＡＱＶＡＦＴＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣ（配列番号１７）を含む。
【０１１５】
具体的な一態様によれば、第１のドメインは、配列番号２（配列番号１によってコードされる）に示した通りである。
【０１１６】
ここで使用する「免疫グロブリンのＦｃドメイン」は、重鎖の少なくとも２つの定常ドメイン（例えば、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、これらの用語は当技術分野において定義されている）を典型的に含む、抗体の１つの重鎖の領域を指す。Ｆｃドメインは、パパインによる抗体の消化によって、例えば、二量体の形態で得ることができる。ジスルフィド結合によって接続されたＦｃドメインポリペプチドの二量体は、抗体の「尾部」領域を形成する。当技術分野において知られている通り、抗体のいくつかの種類のＦｃドメインは、多量体の形態であり得る。したがって、Ｆｃドメインは、任意に単量体であり、任意に二量体および任意に多量体である。任意に、ここに記載するポリペプチドは、二量体の形態では、Ｆｃ二量体を含むポリペプチド、または多量体の形態では、Ｆｃ多量体を含むポリペプチドである。
【０１１７】
Ｆｃドメインは、ネイティブＦｃドメイン（すなわち、天然で抗体中に存在するドメイン）の修飾された形態、例えば、ネイティブＦｃドメインと少なくとも９０％の相同性、任意に少なくとも９５％の相同性、および任意に少なくとも９８％の相同性を有するポリペプチドを包含していてもよい。修飾Ｆｃドメインは、例えば、国際特許出願ＷＯ９７／３４６３１およびＷＯ９６／３２４７８に記載されている。
【０１１８】
任意に、ネイティブＦｃは、本発明の態様に必要でない構造的特性または生物活性をもたらす部位を除去するように修飾する。このような部位の例としては、ジスルフィド結合形成、選択された宿主細胞との不適合性、選択された宿主細胞中における発現時のＮ末端不均一性、グリコシル化、補体との相互作用、Ｆｃ受容体（新生児Ｆｃ受容体以外の）との結合、および／または抗体依存性細胞性細胞毒性（cellular cytotoxicity）に影響を及ぼすもしくは関与する残基が挙げられる。
【０１１９】
本発明の態様によるポリペプチドは、Ｆｃドメインのフラグメントも含み得る。任意に、上記で定義した通り、フラグメントは、少なくとも２０％、任意に少なくとも５０％、および任意に少なくとも８０％のＦｃドメインを含む。
【０１２０】
Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは任意に、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合部位を含む。経腸経路を経てキメラポリペプチドを投与する場合に、これは特に重要である。
【０１２１】
一態様によれば、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントの第１のドメインへの結合は、インビボで第１のドメイン自体よりも長い半減期を有するポリペプチドをもたらす。これは、Ｆｃドメインの血清半減期が長いこと（ＦｃＲｎとの結合によるＦｃのサルベージに起因する可能性がある）に起因する、および／または第１のドメイン自体と比較して大きいポリペプチドのサイズが糸球体濾過による血流からクリアランスを低減させることに起因する可能性がある。別の態様によれば、得られたポリペプチドは、第１のドメイン自体と比較して免疫原性を低下させた。
【０１２２】
任意の態様によれば、Ｆｃドメインまたはそのフラグメントは、ヒトＦｃドメイン（例えば、ヒト抗体に由来する）またはそのフラグメントである。
【０１２３】
例示的態様によれば、Ｆｃドメイン（またはそのフラグメント）は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）Ｆｃドメイン（またはそのフラグメント）である。
【０１２４】
具体的な一態様によれば、第２のドメインは、配列番号９（配列番号８によってコードされる）に示した通りである。
【０１２５】
したがって、キメラポリペプチドの第２のドメインは、免疫グロブリン定常ドメインの少なくとも一部、例えば、免疫グロブリン重鎖定常ドメインまたは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインを含む。好ましくは、第２のドメインは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインの少なくとも一部を含む。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは好ましくは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびに任意にヒンジ領域の少なくとも一部を含むＦｃフラグメントである。免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤもしくはＩｇＥ免疫グロブリンドメインまたはそれに由来する修飾免疫グロブリンドメインであり得る。好ましくは、第２のドメインは、ＩｇＧ免疫グロブリン定常ドメインの少なくとも一部を含む。ＩｇＧ免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４ドメインから、または米国特許第５，９２５，７３４号に記載されているような修飾ドメインから選択され得る。免疫グロブリンドメインは、エフェクター機能を示し得る。しかし、一部の態様において、修飾された、例えば、部分的に欠失したエフェクター機能を有する修飾免疫グロブリンを使用できる。したがって、例えば、受容体。
【０１２６】
本発明の一態様によれば、第１のドメインと第２のドメインのキメラ融合は、配列番号１０を有するエタネルセプト（Ｉｍｍｕｎｅｘ）を形成する。
【０１２７】
第１のドメインおよび第２のドメインの種起源は、治療される対象に応じて選択されることは理解されるであろう。したがって、具体的な一態様によれば、第１のドメインおよび第２のドメインは、ヒト起源のものであるか、またはヒト対象に投与される場合に免疫原性反応を招かないように修飾されている。
【０１２８】
ここで使用する「エタネルセプト」および「Ｅｎｂｒｅｌ（商標）」は、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによる商業的に入手可能なＴＮＦＲ２：Ｆｃを示すのに同義で使用する。エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に連結されたヒト７５キロダルトン（ｐ７５）腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外リガンド結合部分からなる二量体の融合ポリペプチドである。エタネルセプトのＦｃ成分は、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）およびヒンジ領域を含有するが、重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）は含有しない。ＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞は、ＰＲＸ−１０６とも称する。
【０１２９】
別の態様によれば、キメラポリペプチドは、
（ｉ）ＴＮＦ受容体のＴＮＦα結合ドメインを含む第１のドメインと、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＦｃドメインを含む第２のドメインと、
（ｉｉｉ）小胞体保留シグナルを含む第３のドメインと
を含み、第１のドメインと第２のドメインと第３のドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがＴＮＦαに特異的に結合する。
【０１３０】
したがって、本発明のこの側面によれば、キメラタンパク質は、小胞体中に保留されるように発現される。具体的な一態様によれば、細胞中のＴＮＦＲ２：Ｆｃ分子の少なくとも一部（例えば、少なくとも２０％）は、ＥＲ中に保留される。
【０１３１】
ここで使用される用語「小胞体保留シグナルペプチド」は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在する場合に、ポリペプチドをゴルジ装置から回収させて小胞体に保留させるペプチド配列を指す（Ｒａｙｏｎら  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ、Ｖｏｌ．４９、Ｎｏ．３２６、ｐｐ．１４６３〜１４７２、１９９８；およびＮｅｕｍａｎｎら  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ、２００３；９２：１６７〜１８０を参照のこと）。一態様において、小胞体保留シグナルペプチドは、ＨＤＥＬ（配列番号１４）、ＫＤＥＬ（配列番号１５）またはＳＥＫＤＥＬ（配列番号１６）である。
【０１３２】
上述のように、第１のドメイン、第２のドメイン（および第３のドメインが存在する場合には、第３のドメイン）がそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に連続的翻訳によって融合されている。これは、第１のドメインが第２のドメインのＮ末端に位置する（第１のドメインのカルボキシ末端が、第２のドメインのＮ末端に翻訳によって融合されている）こと、および第２のドメインが第３のドメインのＮ末端に位置する（第２のドメインのカルボキシ末端が、第３のドメインのＮ末端に翻訳によって融合されている）ことを意味する。したがって、第２のドメインは実際には、Ｎ末端の第１のドメインとＣ末端の第３のドメインによって挟まれている（sandwitched）。概要を提示すると、以下の通りである：第１のドメイン＞第２のドメイン（＞第３のドメイン）が、Ｎ末端からＣ末端まで順序正しく方向付けられている（図１を参照のこと）。ドメイン間の連結は、直接的であるか、またはリンカー、例えばペプチドリンカーを使用して間接的であり得る。
【０１３３】
分子は、第１のドメインの上流（Ｎ末端）に方向付けられかつ翻訳によってそれと融合されている小胞体シグナル配列をコードする追加のドメインをさらに含むことができる。
【０１３４】
ここで使用する「小胞体（ＥＲ）シグナルペプチド」は、シグナル配列、リーダー配列、または分泌経路に向かうように運命づけられた、新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（例えば、５〜３０アミノ酸長の）リーダーペプチドを指す。
【０１３５】
具体的な一態様によれば、ＥＲシグナルペプチドは、植物タンパク質に由来する（植物タンパク質から採取される、トランケートされる）。
【０１３６】
具体的な一態様によれば、小胞体シグナルペプチドは、Ｎ．プルムバギニフォリア（Ｎ．ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）のカルレティキュリンタンパク質に由来する。
【０１３７】
さらなる具体的な一態様によれば、Ｎ．プルムバギニフォリアのカルレティキュリンタンパク質のシグナルペプチドは、配列番号４に示した通りであり、配列番号３の核酸配列によってコードされる。
【０１３８】
ここで使用する用語「翻訳によってＮ末端に融合される」または「翻訳によってＣ末端に融合される」は、代表的には組換え発現の結果としての、各ドメインのＮ末端またはＣ末端アミノ酸への、ペプチド結合を介した示されたペプチドの共有結合を指す。
【０１３９】
具体的な一態様によれば、キメラポリペプチドは、配列番号６に示した通りである。
【０１４０】
具体的な一態様によれば、キメラポリペプチドは、配列番号７、２０４または２０５に示した通りである。
【０１４１】
上述の通り、本発明の組換えキメラタンパク質は、植物細胞中で産生される。
【０１４２】
ポリペプチドを発現するために、ここで記載する、キメラポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドは、「植物核酸発現構築物」にライゲートされる。
【０１４３】
ここで使用する用語「植物核酸発現構築物」は、本発明の一部の態様の核酸と、宿主植物細胞において核酸の転写を導くための少なくとも１つのプロモーターとを含む核酸構築物を指す。好適な形質転換手法のさらなる詳細を、以下に示す。
【０１４４】
本発明の一部の態様によれば、本発明の核酸配列と、植物宿主細胞において核酸配列の転写を導くための１つのプロモーターとを含む核酸発現構築物が提供される。
【０１４５】
ここで使用する用語「核酸配列」は、単離されて、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で提供される一本鎖または二本鎖核酸配列を指す。
【０１４６】
ここで使用する表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られる配列を指す。このような配列は、続いてインビボまたはインビトロでＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して増幅され得る。
【０１４７】
ここで使用する表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離された）配列を指し、したがって、染色体の連続部分に相当する。
【０１４８】
ここで使用する表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも部分的に相補的でありかつ少なくとも部分的にゲノムである配列を指す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするのに必要ないくつかのエクソン配列（exonal sequences）と、その間に介在するいくつかのイントロン配列とを含み得る。イントロン配列は、他の遺伝子を含む、いかなる供給源のものであってもよく、典型的には、保存スプライシングシグナル配列を含むものとする。このようなイントロン配列は、シス作用性発現調節エレメントをさらに含み得る。
【０１４９】
本発明の一部の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、植物における発現に対して最適化される。このような配列修飾の例としては、対象の植物種において典型的に見られるＧ／Ｃ含量に、より密接に近づくように変更されたＧ／Ｃ含量、および一般にはコドン最適化と称する、植物種中に変則的に見られるコドンの除去が挙げられるが、これらに限定するものではない。一態様において、キメラポリペプチドをコードする核酸配列のコドン使用頻度は、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacuum）またはニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）に対して最適化される。
【０１５０】
表現「コドン最適化」は、対象の植物内におけるコドン使用頻度に近い構造遺伝子またはそのフラグメント内における使用に適当なＤＮＡヌクレオチドの選択を指す。したがって、最適化遺伝子または核酸配列は、ネイティブなまたは天然の遺伝子のヌクレオチド配列が、植物内で統計学的に好ましいまたは統計的に有利なコドンを利用するように修飾されている遺伝子を指す。ヌクレオチド配列を典型的には、ＤＮＡレベルで調べ、植物種における発現に対して最適化されたコード領域を任意の好適な方法を用いて、例えば、Ｓａｒｄａｎａら（１９９６、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  １５：６７７〜６８１）に記載されるようにして決定する。この方法において、コドン使用頻度バイアスの尺度であるコドン使用頻度の標準偏差は、高発現植物遺伝子と比較したネイティブ遺伝子の各コドンの使用頻度の平方比例偏差（squared proportional deviation）を最初に出し、続いて平均平方偏差（average squared deviation）を算出することによって、算出することができる。使用した式は、１ＳＤＣＵ＝ｎ＝１Ｎ［（Ｘｎ−Ｙｎ）／Ｙｎ］２／Ｎ（式中、Ｘｎは、高発現植物遺伝子中のコドンｎの使用頻度を指し、Ｙｎは、対象の遺伝子中のコドンｎの使用頻度を指し、Ｎは、対象の遺伝子中のコドンの総数を指す）である。双子葉植物の高発現遺伝子のコドン使用頻度の表は、Ｍｕｒｒａｙら（１９８９、Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：４７７〜４９８）のデータを使用して編集したものである。
【０１５１】
特定の植物細胞型に好ましいコドン使用頻度に従って核酸配列を最適化するための１つの方法は、余分な統計的計算を行わずに、コドン最適化表、例えば、日本のＮＩＡＳ（独立行政法人農業生物資源研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））のＤＮＡバンクからＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅでオンライン提供されるものを直接使用することに基づく（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ（ｄｏｔ）  ｋａｚｕｓａ（ｄｏｔ）ｏｒ（ｄｏｔ）  ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）。Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅは、多数の異なる種のコドン使用頻度表を含み、各コドン使用頻度表は、Ｇｅｎｂａｎｋに存在するデータに基づいて統計的に決定されている。
【０１５２】
このようなコドン最適化表を使用して、特定の種（例えば、イネ）の各アミノ酸に最も好ましいまたは最も有利なコドンを決定することによって、対象のタンパク質をコードする、天然のヌクレオチド配列を、その特定の植物種にコドン最適化することができる。これは、アミノ酸に関して、特定の種のゲノムにおいて統計的発生頻度が低い可能性があるコドンを、統計的により有利なコドンと置きかえることによって行う。また一方、１種以上のより有利でないコドンを選択して、既存の制限部位を欠失させ、潜在的に有用な接合部に新しいものを作製し（５’および３’末端に、シグナルペプチドまたは終結カセット、セグメントを切断およびスプライシングして正しい全長配列を産生するために使用され得る内部部位を付加し）、またはｍＲＮＡの安定性もしくは発現に悪影響を及ぼし得るヌクレオチド配列を排除することができる。
【０１５３】
所望のコードヌクレオチド配列は、あらゆる修飾に先立って、既に、特定の植物種において統計的に有利なコドンに相当する多数のコドンを含有している可能性がある。したがって、ネイティブヌクレオチド配列のコドン最適化は、所望のヌクレオチド配列内のどのコドンが、特定の植物に関して統計的に有利でないかを決定すること、およびこれらのコドンを特定の植物のコドン使用頻度表に従って修飾して、コドン最適化された誘導体を産生することを含むことができる。修飾ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質が、対応する天然またはネイティブな遺伝子によってコードされるタンパク質よりも高いレベルで産生されるならば、修飾ヌクレオチド配列は、植物コドン使用頻度に関して完全にまたは部分的に最適化されている可能性がある。コドン使用頻度を変えることによる合成遺伝子の構築については、例えば、ＰＣＴ特許出願第９３／０７２７８号に記載されている。
【０１５４】
したがって、具体的な一態様によれば、配列番号５に示した、ニコチニア・タバカム（Nicotinia tobaccum）に対して最適化された配列が提供される。
【０１５５】
本発明の一部の態様によれば、キメラポリペプチド（cimeric polypeptide）をコードする核酸配列を、植物細胞において活性なシス作用性調節配列、例えば、植物プロモーター配列に作動可能に連結させる。
【０１５６】
調節配列がそれに連結されたコード配列（の発現）に対して調節効果を及ぼすことができるならば、コード核酸配列は調節配列（例えば、プロモーター）に「作動可能に連結されている」。
【０１５７】
任意の好適なプロモーター配列が、本発明の核酸構築物によって使用され得る。好ましくは、プロモーターは、構成型プロモーター、組織特異的プロモーターまたは誘導性プロモーターである。
【０１５８】
ここで使用する表現「植物発現性」は、プロモーター配列に付加されたまたはプロモーター配列に含有される任意の追加の調節エレメントを含むプロモーター配列を指し、植物細胞、組織または器官、好ましくは単子葉または双子葉植物の細胞、組織または器官において発現を少なくとも誘導し、もたらし、活性化しまたは増強できる。このようなプロモーターは、構成的プロモーター（すなわち、多数の組織において高レベルの遺伝子発現を導くことができる）、組織特異的プロモーター（すなわち、特定の１種以上の組織において遺伝子発現を導くことができる）、誘導性プロモーター（すなわち、刺激下で遺伝子発現を導くことができる）、またはキメラプロモーター（すなわち、少なくとも２種の異なるプロモーターの部分から形成されている）であることができる。
【０１５９】
本発明の一部の態様の方法に有用な好ましいプロモーターの例を、表Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶに示す。
【表Ｉ】
0006622591.tif 000002
【表ＩＩ】
0006622591.tif 000003
【表ＩＩＩ】
0006622591.tif 000004
【表ＩＶ−１】
0006622591.tif 000005
【表ＩＶ−２】
0006622591.tif 000006
【０１６０】
本発明の一部の態様の核酸構築物は、適当な選択可能なマーカーおよび／または複製起点をさらに含むことができる。本発明の一部の態様によれば、利用する核酸構築物は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で増殖することもでき（構築物は適当な選択可能なマーカーおよび複製起点を含む）、細胞中での増殖と適合性であることもできる、シャトルベクターである。本発明による構築物は、例えば、プラスミド、バクミド、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であることができる。
【０１６１】
本発明の一部の態様の核酸構築物は、植物細胞を安定的にまたは一過性に形質転換するために利用できる。安定な形質転換においては、核酸は植物ゲノムに組み込まれ、したがって、安定な遺伝形質を表す。一過性形質変換においては、外来性ポリヌクレオチドが、形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムには組み込まれず、したがって、一過性の形質を表す。
【０１６２】
したがって、本発明の一部の態様によれば、本発明の核酸構築物を含む単離細胞が提供される。
【０１６３】
ここで使用する用語「単離細胞」は、天然の環境から、例えば、植物から少なくとも部分的に分離された細胞を指す。一部の態様において、単離細胞は全植物の植物細胞である。一部の態様において、単離細胞は植物細胞、例えば、培養中の植物細胞である。
【０１６４】
ここで使用する用語「植物」は、全植物、植物の祖先および後代ならびに植物の部分、例えば、種子、シュート、茎、根（塊茎を含む）、ならびに植物細胞、組織および器官を包含する。植物は、懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む任意の形態であることができる。本発明の方法において特に有用な植物としては、上科緑色植物、特に単子葉および双子葉類植物に属する全ての植物、例えば、以下を含むリストから選択される、餌または飼料用マメ科植物、観賞植物、食用作物、木、または潅木が挙げられる：アカシア属（Ａｃａｃｉａ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、マタタビ属（Ａｃｔｉｎｉｄｉａ）、トチノキ属（Ａｅｓｃｕｌｕｓ）、アガチス・アウストラリス（Ａｇａｔｈｉｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、アルビジア・アマラ（Ａｌｂｉｚｉａ  ａｍａｒａ）、アルソフィラ・トリコロール（Ａｌｓｏｐｈｉｌａ  ｔｒｉｃｏｌｏｒ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ラッカセイ属（Ａｒａｃｈｉｓ）、ビンロウ（Ａｒｅｃａ  ｃａｔｅｃｈｕ）、アステリア・フラグランス（Ａｓｔｅｌｉａ  ｆｒａｇｒａｎｓ）、アストラガルス・キケル（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ  ｃｉｃｅｒ）、バイキアエア・プルリユガ（Ｂａｉｋｉａｅａ  ｐｌｕｒｉｊｕｇａ）、カバノキ属（Ｂｅｔｕｌａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ブルグイエラ・ジムノルヒザ（Ｂｒｕｇｕｉｅｒａ  ｇｙｍｎｏｒｒｈｉｚａ）、ブルケア・アフリカナ（Ｂｕｒｋｅａ  ａｆｒｉｃａｎａ）、ブテア・フロンドーサ（Ｂｕｔｅａ  ｆｒｏｎｄｏｓａ）、カダバ・ファリノサ（Ｃａｄａｂａ  ｆａｒｉｎｏｓａ）、カリアンドラ属（Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ）、カメリア・シネンシス（Ｃａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、カンナ・インディカ（Ｃａｎｎａ  ｉｎｄｉｃａ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、センナ属（Ｃａｓｓｉａ）、セントロエマ・プベスケンス（Ｃｅｎｔｒｏｅｍａ  ｐｕｂｅｓｃｅｎｓ）、ボケ属（Chacoomeles）、キンナモムム・カシア（Ｃｉｎｎａｍｏｍｕｍ  ｃａｓｓｉａ）、コフィア・アラビカ（Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ）、コロフォスペルムム・モパネ（Ｃｏｌｏｐｈｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｍｏｐａｎｅ）、コロニリア・バリア（Ｃｏｒｏｎｉｌｌｉａ  ｖａｒｉａ）、コトネアスター・セロティナ（Ｃｏｔｏｎｅａｓｔｅｒ  ｓｅｒｏｔｉｎａ）、サンザシ属（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、イトスギ属（Ｃｕｐｒｅｓｓｕｓ）、シアテア・デアルバタ（Ｃｙａｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、クリプトメリア・ジャポニカ（Ｃｒｙｐｔｏｍｅｒｉａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、オルガヤ属（Ｃｙｍｂｏｐｏｇｏｎ）、シンテア・ディアルバタ（Ｃｙｎｔｈｅａ  ｄｅａｌｂａｔａ）、マルメロ（Ｃｙｄｏｎｉａ  ｏｂｌｏｎｇａ）、ダルベルジア・モネタリア（Ｄａｌｂｅｒｇｉａ  ｍｏｎｅｔａｒｉａ）、ダバリア・ディバリカータ（Ｄａｖａｌｌｉａ  ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）、ヌスビトハギ属（Ｄｅｓｍｏｄｉｕｍ）、ジクソニア・スクアロサ（Ｄｉｃｋｓｏｎｉａ  ｓｑｕａｒｏｓａ）、ジベテロポゴン・アンプレクテンス（Ｄｉｂｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ａｍｐｌｅｃｔｅｎｓ）、��オクレア属（Ｄｉｏｃｌｅａ）、ドリコス属（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ）、ドリクニウム・レクツム（Ｄｏｒｙｃｎｉｕｍ  ｒｅｃｔｕｍ）、エキノクロア・ピラミダリス（Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ  ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ）、エーラフィア属（Ｅｈｒａｆｆｉａ）、シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ  ｃｏｒａｃａｎａ）、スズメガヤ属（Ｅｒａｇｒｅｓｔｉｓ）、エリスリナ属（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ）、ユーカリ属（Eucalypfus）、ユークレア・シンペリ（Ｅｕｃｌｅａ  ｓｃｈｉｍｐｅｒｉ）、ユーラリア・ビロサ（Eulalia vi/losa）、パゴピルム属（Ｐａｇｏｐｙｒｕｍ）、フェイジョア・セロウィアナ（Ｆｅｉｊｏａ  ｓｅｌｌｏｗｉａｎａ）、フラガリア属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、フレミンギア属（Ｆｌｅｍｉｎｇｉａ）、フレイシネチア・バンクスリ（Ｆｒｅｙｃｉｎｅｔｉａ  ｂａｎｋｓｌｉ）、ゲンノウショウコ（Ｇｅｒａｎｉｕｍ  ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、イチョウ（GinAgo biloba）、グリシネ・ジャバニカ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｊａｖａｎｉｃａ）、グリリシジア属（Ｇｌｉｒｉｃｉｄｉａ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、グレビレア属（Ｇｒｅｖｉｌｌｅａ）、グイボウルチア・コレオスペルマ（Ｇｕｉｂｏｕｒｔｉａ  ｃｏｌｅｏｓｐｅｒｍａ）、イワオウギ属（Ｈｅｄｙｓａｒｕｍ）、ヘマフィア・アルチシマ（Ｈｅｍａｆｆｈｉａ  ａｌｔｉｓｓｉｍａ）、ヘテロポゴン・コントフス（Ｈｅｔｅｒｏｐｏｇｏｎ  ｃｏｎｔｏｆｆｕｓ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、ヒパレニア・ルファ（Ｈｙｐａｒｒｈｅｎｉａ  ｒｕｆａ）、オトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ  ｅｒｅｃｔｕｍ）、ヒペフェリア・ジソルテ（Ｈｙｐｅｆｆｈｅｌｉａ  ｄｉｓｓｏｌｕｔｅ）、インジゴ・インカルナタ（Indigo incamata）、アヤメ属（Ｉｒｉｓ）、レプタレナ・ピロリホリア（Ｌｅｐｔａｒｒｈｅｎａ  ｐｙｒｏｌｉｆｏｌｉａ）、ハギ属（Ｌｅｓｐｅｄｉｚａ）、レツカ属（Lettuca）、ギンネム（Ｌｅｕｃａｅｎａ  ｌｅｕｃｏｃｅｐｈａｌａ）、ロウデチア・シンプレクス（Ｌｏｕｄｅｔｉａ  ｓｉｍｐｌｅｘ）、ロトヌス・バイネスリ（Lotonus bainesli）、ミヤコグサ属（Ｌｏｔｕｓ）、マクロチロマ・アクシラレ（Ｍａｃｒｏｔｙｌｏｍａ  ａｘｉｌｌａｒｅ）、リンゴ属（Ｍａｌｕｓ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、メジカゴ・サリバ（Medicago saliva）、メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ  ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）、ムサ・サピエンタム（Ｍｕｓａ  ｓａｐｉｅｎｔｕｍ）、ニコチアヌム属（Nicotianum）、オノブリキス属（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、オルニトプス属（Ｏｒｎｉｔｈｏｐｕｓ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、ペルトホルム・アフリカヌム（Ｐｅｌｔｏｐｈｏｒｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペルセア・グラチシマ（Ｐｅｒｓｅａ  ｇｒａｔｉｓｓｉｍａ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、インゲンマメ属（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）、カナリーヤシ（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｃａｎａｒｉｅｎｓｉｓ）、ホルミウム・クーキアヌム（Ｐｈｏｒｍｉｕｍ  ｃｏｏｋｉａｎｕｍ）、カナメモチ属（Ｐｈｏｔｉｎｉａ）、カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ  ｇｌａｕｃａ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、エンドウ（Pisum sativam）、ポドカルプス・トタラ（Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ  ｔｏｔａｒａ）、ポゴナルトリア・フレキイ（Ｐｏｇｏｎａｒｔｈｒｉａ  ｆｌｅｃｋｉｉ）、ポゴナフリア・スクアロサ（Ｐｏｇｏｎａｆｆｈｒｉａ  ｓｑｕａｒｒｏｓａ）、ヤマナラシ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）、プロソピス・シネラリア（Ｐｒｏｓｏｐｉｓ  ｃｉｎｅｒａｒｉａ）、ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ  ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ）、プテロロビウム・ステラツム（Ｐｔｅｒｏｌｏｂｉｕｍ  ｓｔｅｌｌａｔｕｍ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コナラ属（Ｑｕｅｒｃｕｓ）、シャリンバイ（Rhaphiolepsis umbellata）、ロパロスチリス・サピダ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｔｙｌｉｓ  ｓａｐｉｄａ）、ルス・ナタレンシス（Ｒｈｕｓ  ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ）、リベス・グロッスラリア（Ｒｉｂｅｓ  ｇｒｏｓｓｕｌａｒｉａ）、スグリ属（Ｒｉｂｅｓ）、ニセアカシア（Ｒｏｂｉｎｉａ  ｐｓｅｕｄｏａｃａｃｉａ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、キイチゴ属（Ｒｕｂｕｓ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、シザキリウム・サングイネウム（Schyzachyrium sanguineum）、シアドピチス・ベフィシラタ（Ｓｃｉａｄｏｐｉｔｙｓ  ｖｅｆｆｉｃｉｌｌａｔａ）、セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ  ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ  ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）、スポロボルス・フィムブリアツス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｕｓ  ｆｉｍｂｒｉａｔｕｓ）、スチブルス・アロペクロイデス（Ｓｔｉｂｕｒｕｓ  ａｌｏｐｅｃｕｒｏｉｄｅｓ）、スチロサントス・フミリス（Stylosanthos humilis）、タデハギ属（Ｔａｄｅｈａｇｉ）、ラクウショウ（Ｔａｘｏｄｉｕｍ  ｄｉｓｔｉｃｈｕｍ）、メガルカヤ（Ｔｈｅｍｅｄａ  ｔｒｉａｎｄｒａ）、シャジクソウ属（Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ  ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ）、スノキ属（Ｖａｃｃｉｎｉｕｍ）、ソラマメ属（Ｖｉｃｉａ）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ）、ワトソニア・ピラミダタ（Ｗａｔｓｏｎｉａ  ｐｙｒａｍｉｄａｔａ）、オランダカイウ（Ｚａｎｔｅｄｅｓｃｈｉａ  ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、アマランス、アーティチョーク、アスパラガス、ブロッコリー、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、コラードグリーン、亜麻、ケール、レンチル、アブラナ、オクラ、タマネギ、ジャガイモ、イネ、大豆、わら、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、トマト、スカッシュティー（squash tea）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、オオムギ、ライ麦、オートムギ、ピーナッツ、エンドウ、レンチルおよびアルファルファ、ワタ、ナタネ、キャノーラ、ペッパー、ヒマワリ、タバコ、ナス、ユーカリ、木、観賞植物、多年生牧草および飼料作物。あるいは、藻類および他の非緑色植物も、本発明の方法に使用することができる。
【０１６５】
本発明の一部の態様によれば、植物または植物細胞は、ウキクサ科の植物、細胞または根粒である。ウキクサ科（単子葉植物の科であるウキクサ科（Ｌｅｍｎａｃｅａｅ）のメンバー、またはアオウキクサ属（Ｌｅｍｎａ））の植物またはウキクサ科根粒培養物は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介遺伝子移入、弾道衝撃（ballistic bombardment）または電気穿孔法を含む多数の方法のいずれか１つによって、対象のヌクレオチド配列を含有する発現カセットで効率的に形質転換することができる。ポリペプチドの商業生産に有用な、ウキクサ科細胞の分子操作のための方法およびウキクサ科発現系の詳細な説明は、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｔｏｍｐらの米国特許第６，０４０，４９８号および第６，８１５，１８４号、ならびにＤｉｃｋｅｙらの米国特許第８，０２２，２７０号（これら全てを、参照することによってここに完全に組み込む）を参照のこと）。
【０１６６】
本発明の一部の態様によれば、本発明の方法によって使用する植物または植物細胞は、栽培植物または栽培植物の細胞、例えば、イネ、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、オオムギ、ピーナッツ、ジャガイモ、ゴマ、オリーブの木、パームオイル、バナナ、大豆、ヒマワリ、キャノーラ、サトウキビ、アルファルファ、雑穀、マメ科植物（マメ（ｂｅａｎ）、エンドウ）、亜麻、ルピナス、ナタネ、タバコ、ポプラおよびワタである。
【０１６７】
さらなる態様によれば、植物細胞は、タバコ細胞、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）で形質転換され根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、セイヨウワサビ細胞およびニンジン細胞を含む。一態様において、タバコ細胞は、タバコ細胞株、例えば、これに限定するものではないが、ニコチアナ・タバカムＬ．ｃｖブライトイエロー（ＢＹ−２）細胞に由来する。植物細胞は、任意の型の好適な培養方法、例えば、これに限定するものではないが、固体表面（例えば、プラスチック培養容器またはプレートなどの）上または懸濁液中での培養によって成長させることができる。一部の細胞、例えば、ＢＹ−２およびニンジン細胞は懸濁液中で培養および成長させ得ることが認められるであろう。懸濁液中で植物細胞を培養するのに好適な装置および方法は、当技術分野で公知であり、例えば、国際特許出願ＰＣＴ  ＩＬ２００８／０００６１４に記載されている。さらに別の態様において、細胞は、ニコチアナ・ベンサミアナを含むがこれに限定されない、タバコ植物全体または植物組織の細胞である。さらに別の態様によれば、植物細胞は、ニンジン細胞である。
【０１６８】
単子葉植物および双子葉類植物の両方に外来遺伝子を導入する種々の方法がある（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ｉ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１）４２：２０５−２２５；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３３８：２７４〜２７６）。
【０１６９】
外来性ＤＮＡを植物ゲノムＤＮＡに安定に組み込む本質的方法には、２つの主な手法がある。
【０１７０】
（ｉ）アグロバクテリウム媒介遺伝子移入：Ｋｌｅｅら（１９８７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．３８：４６７〜４８６；ＫｌｅｅおよびＲｏｇｅｒｓ、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ、Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．２〜２５；Ｇａｔｅｎｂｙ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｋｕｎｇ，Ｓ．およびＡｒｎｔｚｅｎ，Ｃ．Ｊ．編、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．（１９８９）ｐ．９３〜１１２。
【０１７１】
（ｉｉ）直接ＤＮＡ取り込み：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｖｏｌ．６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｇｅｎｅｓ  Ｓｃｈｅｌｌ，Ｊ．およびＶａｓｉｌ，Ｌ．Ｋ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９８９）ｐ．５２〜６８；例えば、プロトプラストへのＤＮＡの直接取り込みのための方法、Ｔｏｒｉｙａｍａ，Ｋ．ら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１０７２〜１０７４。植物細胞の短時間の電気ショックによって誘導されるＤＮＡ取り込み：Ｚｈａｎｇら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．（１９８８）７：３７９〜３８４。Ｆｒｏｍｍら  Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１９：７９１〜７９３。以下の手段による、植物細胞または組織へのＤＮＡ注入：粒子銃による（Ｋｌｅｉｎら  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：５５９〜５６３；ＭｃＣａｂｅら  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８８）６：９２３〜９２６；Ｓａｎｆｏｒｄ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２０６〜２０９）；マイクロピペットシステムの使用による（Ｎｅｕｈａｕｓら、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８７）７５：３０〜３６；ＮｅｕｈａｕｓおよびＳｐａｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．（１９９０）７９：２１３〜２１７）；細胞培養物、胚またはカルス組織のガラス繊維またはシリコンカーバイドウィスカーによる形質転換（米国特許第５，４６４，７６５号）；またはＤＮＡと発芽花粉との直接インキュベーションによる（ＤｅＷｅｔら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｖｕｌｅ  Ｔｉｓｓｕｅ、Ｃｈａｐｍａｎ，Ｇ．Ｐ．およびＭａｎｔｅｌｌ、Ｓ．Ｈ．およびＤａｎｉｅｌｓ編、Ｗ．Ｌｏｎｇｍａｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、（１９８５）ｐ．１９７〜２０９；ならびにＯｈｔａ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：７１５〜７１９）。
【０１７２】
アグロバクテリウム系は、植物ゲノムＤＮＡに組み込まれる規定されたＤＮＡセグメントを含有するプラスミドベクターの使用を含む。植物組織の接種方法は、植物種およびアグロバクテリウム送達系によって異なる。広範に使用される手法は、全植物分化の開始のための良好な供給源を提供する任意の組織外植片を用いて行うことができるリーフディスク法である。例えば、Ｈｏｒｓｃｈら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ａ５、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ（１９８８）ｐ．１〜９を参照のこと。補助的手法は、アグロバクテリウム送達系を真空浸潤と組み合わせて用いる。アグロバクテリウム系は、トランスジェニック双子葉植物の作製においてとりわけ生存可能である。
【０１７３】
植物細胞への直接ＤＮＡ移入には種々の方法がある。電気穿孔法においては、プロトプラストが強力な電場に短期間曝露される。微量注入法においては、ＤＮＡが、非常に小さいマイクロピペットを使用して直接、細胞に機械的に注入される。微粒子銃においては、ＤＮＡがミクロ発射体（microprojectile）、例えば、硫酸マグネシウム結晶またはタングステン粒子上に吸着され、ミクロ発射体が物理的に加速されて、細胞または植物組織に入る。
【０１７４】
安定した形質転換の後、植物の繁殖を行う。最も一般的な植物繁殖方法は、種子によるものである。しかし、植物はメンデルの法則によって支配される遺伝的分散に従って種をつけるので、種子繁殖による再生には、ヘテロ接合性のために収穫物の均一性が欠如しているという欠陥がある。基本的に、各種子は遺伝的に異なり、各々がそれ自体の特異的な形質を持ちながら成長することとなる。したがって、形質転換植物は、再生植物が親のトランジェニック植物と同一の形質および特徴を有するように作製することが好ましい。したがって、形質転換植物は、形質転換植物の迅速で一貫した複製を実現する微細繁殖（micropropagation）によって再生することが好ましい。
【０１７５】
微細繁殖は、選択された親植物または栽培品種から切除された単一の組織片から新世代の植物を成長させる方法である。この方法は、融合タンパク質を発現する好ましい組織を有する植物の大量複製を可能にする。作製される新世代の植物は、元の植物と遺伝的に同一であり、元の植物の特徴を全て有する。微細繁殖によれば、短期間で高品質の植物材料を大量生産することができ、元のトランジェニックまたは形質転換植物の特徴が保存された状態での、選択された栽培品種の迅速な増殖が提供される。植物のクローニングの利点は、植物の増殖速度ならびに作製される植物の品質および均一性である。
【０１７６】
微細繁殖は、段階間で培地および成長条件の変更が必要な多段階法である。したがって、微細繁殖法は、４つの基本的な段階：段階１、最初の組織培養；段階２、組織培養物の増殖；段階３、分化および植物形成；ならびに段階４、温室培養およびハードニングを含む。段階１の最初の組織培養において、組織培養物を確立し、汚染菌がないことを証明する。段階２において、最初の組織培養物を、十分な数の組織試料が作製されて作製目標を達成するまで、増殖させる。段階３において、段階２において成長させた組織試料を分割して、個別の小植物に成長させる。段階４において、形質転換された小植物をハードニングのために温室に移して、自然環境で成長できるように、光に対する植物の耐性を徐々に増加させる。
【０１７７】
本発明の一部の態様によれば、トランスジェニック植物を、葉細胞、成長点細胞または全植物の一過性形質転換によって作製する。
【０１７８】
一過性形質転換は、上述した直接ＤＮＡ移入法のいずれかによって、または修飾植物ウイルスを使用してウイルス感染によって行うことができる。
【０１７９】
植物宿主の形質転換に有用であることが示されているウイルスとしては、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）およびビーンコモンモザイクウイルス（ＢＶまたはＢＣＭＶ：Bean Common Mosaic Virus）が挙げられる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特許第４，８５５，２３７号（ビーンゴールデンモザイクウイルス；ＢＧＶ：bean golden mosaic virus）、ＥＰＡ６７，５５３（ＴＭＶ）、特開昭６３−０１４６９３号公報（ＴＭＶ）、ＥＰＡ１９４，８０９（ＢＶ）、ＥＰＡ  ２７８，６６７（ＢＶ）；およびＧｌｕｚｍａｎ，Ｙら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．１７２〜１８９（１９８８）に記載されている。植物を含む多くの宿主において外来ＤＮＡの発現に使用するための偽ウイルス粒子が、ＷＯ８７／０６２６１に記載されている。
【０１８０】
本発明の一部の態様によれば、一過性形質転換に使用するウイルスは、非病原性であり、重症症状、例えば、成長速度の低減、モザイク、輪紋、葉巻、黄変、条斑形成（streaking）、ポックス形成、腫瘍形成および壁孔をもたらす能力に欠けるものである。好適な非病原性ウイルスは、天然の非病原性ウイルスまたは人工的に弱毒化したウイルスであり得る。ウイルスの弱毒化は、亜致死性加熱、化学処理を含むがこれに限定されない、当技術分野において周知の方法を使用することによって、または例えば、ＫｕｒｉｈａｒａおよびＷａｔａｎａｂｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４：２５９〜２６９、２００３）、Ｇａｌ−ｏｎら（１９９２）、Ａｔｒｅｙａら（１９９２）ならびにＨｕｅｔら（１９９４）によって記載されたような特異的（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）突然変異誘発技術によって、行うことができる。
【０１８１】
好適なウイルス株は、利用可能な供給源から、例えば、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）などから、または感染植物からの単離によって得ることができる。感染植物組織からのウイルスの単離は、当技術分野において周知の技術、例えば、例えば、ＦｏｓｔｅｒおよびＴａｔｌｏｒ編  「Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ）、Ｖｏｌ  ８１）」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８に記載されているような技術によって行うことができる。簡潔に言えば、好適なウイルスを高濃度で含有すると考えられる感染植物の組織、好ましくは若い葉および花の花弁を、緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）中で粉砕して、その後の接種で使用できるウイルス感染汁液を生成する。
【０１８２】
植物における非ウイルス性核酸配列の導入および発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記参考文献によって、ならびにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２：２８５〜２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕら  ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）６：３０７〜３１１；Ｆｒｅｎｃｈら  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）２３１：１２９４〜１２９７；Ｔａｋａｍａｔｓｕら  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）２６９：７３〜７６；および米国特許第５，３１６，９３１号によって実証されている。
【０１８３】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、好適な修飾はウイルス自体に行うことができる。あるいは、外来ＤＮＡを用いた所望のウイルスベクターの構築を容易にするために、ウイルスを最初に、細菌プラスミドにクローニングすることができる。次に、ウイルスをプラスミドから切除することができる。ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、細菌の複製起点を、ウイルスＤＮＡに結合させることができ、次にそれを細菌によって複製する。このＤＮＡの転写および翻訳により、ウイルスＤＮＡをカプシド形成するコートタンパク質が産生される。ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ウイルスは一般に、ｃＤＮＡとしてクローニングし、プラスミドに挿入する。次に、プラスミドを使用して、構築物の全てを作製する。次いで、プラスミドのウイルス配列を転写しかつウイルス遺伝子を翻訳して、ウイルスＲＮＡをカプシド形成するコートタンパク質を産生することによって、ＲＮＡウイルスを産生する。
【０１８４】
一態様において、ネイティブコートタンパク質コード配列がウイルスポリヌクレオチドから欠失されている植物ウイルスポリヌクレオチドであって、ノンネイティブ植物ウイルスコートタンパク質コード配列、および植物宿主において発現し、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドをパッケージングしかつ組換え植物ウイルスポリヌクレオチドによる宿主の全身感染を確実にできるノンネイティブコートタンパク質コード配列のノンネイティブプロモーター、好ましくはサブゲノムプロモーターが挿入されている植物ウイルスポリヌクレオチドが提供される。あるいは、タンパク質が産生されるように、コートタンパク質遺伝子を、その内部のノンネイティブポリヌクレオチド配列の挿入によって不活性化することもできる。組換え植物ウイルスポリヌクレオチドは、１つ以上の追加のノンネイティブサブゲノムプロモーターを含有することができる。各ノンネイティブサブゲノムプロモーターは、植物宿主中の隣接遺伝子またはポリヌクレオチド配列を転写または発現することができるが、相互の組み換えおよびネイティブサブゲノムプロモーターとの組み換えはできない。２つ以上のポリヌクレオチド配列が含まれる場合には、ノンネイティブ（外来）ポリヌクレオチド配列を、ネイティブ植物ウイルスサブゲノムプロモーターまたはネイティブおよびノンネイティブ植物ウイルスサブゲノムプロモーターと隣接して挿入することができる。ノンネイティブポリヌクレオチド配列を、宿主植物においてサブゲノムプロモーターの制御の下で転写または発現させて、所望の産物を産生することができる。
【０１８５】
第２の態様において、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドは、ノンネイティブコートタンパク質コード配列ではなくネイティブコートタンパク質コード配列をノンネイティブコートタンパク質サブゲノムプロモーターの１つに隣接して配置する以外は、第１の態様の場合と同様にして提供される。
【０１８６】
第３の態様において、ネイティブコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しておりかつ１つ以上のノンネイティブサブゲノムプロモーターがウイルスポリヌクレオチドに挿入されている組換え植物ウイルスポリヌクレオチドが、提供される。挿入されているノンネイティブサブゲノムプロモーターは、植物宿主において隣接遺伝子を転写および発現することができるが、相互の組み換えおよびネイティブサブゲノムプロモーターとの組み換えはできない。ノンネイティブなポリヌクレオチド配列は、配列が宿主植物においてサブゲノムプロモーターの制御下で転写または発現されて所望の産物が産生されるように、ノンネイティブサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入することができる。
【０１８７】
第４の態様において、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドは、ネイティブコートタンパク質コード配列をノンネイティブコートタンパク質コード配列によって置き換える以外は第３の態様の場合と同様にして提供される。
【０１８８】
ウイルスベクターを、組換え植物ウイルスポリヌクレオチドによってコードされるコートタンパク質によってカプシド形成して、組換え植物ウイルスを産生する。組換え植物ウイルスポリヌクレオチドまたは組換え植物ウイルスを使用して、適当な宿主植物を感染させる。組換え植物ウイルスポリヌクレオチドは、宿主における複製、宿主における全身性拡散、および宿主における外来遺伝子（外来性ポリヌクレオチド）の転写または発現による所望のタンパク質の産生が可能である。
【０１８９】
植物にウイルスを接種するための技術は、ＦｏｓｔｅｒおよびＴａｙｌｏｒ編  「Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｆｒｏｍ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒ）、Ｖｏｌ８１）」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、１９９８；  ＭａｒａｍｏｒｏｓｈおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ編  「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」  ７  ｖｏｌｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９６７〜１９８４；Ｈｉｌｌ，Ｓ．Ａ．  「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８４；Ｗａｌｋｅｙ，Ｄ．Ｇ．Ａ．  「Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８５；ならびにＫａｄｏおよびＡｇｒａｗａ編  「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ」、Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｅｉｎｈｏｌｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに見ることができる。
【０１９０】
上記に加えて、本発明のポリヌクレオチドをクロロプラストゲノムに導入し、それによってクロロプラスト発現を可能にすることもできる。
【０１９１】
クロロプラストのゲノムに外来性核酸配列を導入するための技術は、公知である。この技術は、以下の手順を含む。最初に、細胞１個当たりのクロロプラストの数が約１まで低減するように、植物細胞を化学的に処理する。次いで、少なくとも１つの外来性ポリヌクレオチド分子をクロロプラストに導入することを目的として、外来性ポリヌクレオチドを粒子銃によって細胞に導入する。外来性ポリヌクレオチドは、クロロプラストに固有の酵素によって容易に行われる相同組換えによってクロロプラストのゲノムに組み込み可能なように、選択する。このために、核酸配列は、対象の遺伝子に加えて、クロロプラストのゲノムに由来する少なくとも１つのポリヌクレオチドストレッチ（polynucleotide stretch）を含む。加えて、外来性ポリヌクレオチドは、逐次選択手順によって、このような選択後にクロロプラストゲノムのコピーの全てまたは実質的に全てが外来性ポリヌクレオチドを含むことを確実にする働きをする選択可能なマーカーを含む。この技術に関するさらなる詳細は、米国特許第４，９４５，０５０号および第５，６９３，５０７号に見られ、これらの特許を参照することによってここに組み込む。こうして、ポリペプチドをクロロプラストのタンパク質発現系によって産生し、クロロプラストの内膜に組み込むことができる。
【０１９２】
本発明の一部の態様によれば、方法は、核酸を発現する植物細胞を成長させることをさらに含む。植物細胞は、望ましい任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養された細胞、培養組織もしくは培養器官中の細胞、または植物中の細胞であり得る。一部の態様において、植物細胞は、培養細胞、または培養組織または培養器官中の細胞である。さらに他の態様において、植物細胞は、遺伝子移動（gene transference）に使用される任意の型の植物である。植物細胞は、全植物の一部として、あるいは植物細胞培養において成長させることができる。
【０１９３】
本発明の一部の態様によれば、植物細胞は、植物細胞懸濁培養において成長させる。ここで使用する用語「懸濁培養」は、生物体から分離した細胞の成長を指す。懸濁培養は、液体培地（「懸濁培地」）の使用によって促進することができる。懸濁培養は、液体栄養培地中における細胞の成長を指すことができる。植物細胞の懸濁培養において本発明の植物細胞を成長させるのに好適な方法および装置は、例えば、ＰＣＴ  ＷＯ２００８／１３５９９１、米国特許第６，３９１，６８３号、米国特許出願第１０／７８４，２９５号；国際特許公開公報ＰＣＴ  ＷＯ２００４／０９１４７５、ＷＯ２００５／０８０５４４およびＷＯ２００６／０４０７６１に詳述されており、これらの特許文献を参照することによって、ここに完全に記載されているかのようにここに組み入れる。
【０１９４】
したがって、本発明は、核酸配列を発現することによって本発明のＴＮＦαポリペプチド阻害薬を産生する植物または植物培養物を包含する。植物細胞または全植物内で発現させたら、核酸配列によってコードされるＴＮＦα阻害薬のレベルを、当技術分野において周知の方法、例えば、活性アッセイ、ＴＮＦα阻害薬、例えば、キメラポリペプチド（抗ＴＮＦＲ２および抗Ｆｃ、以下の実施例部分を参照のこと）に特異的に結合できる抗体を使用するウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学検査、免疫細胞化学検査、免疫蛍光検査などによって決定することができる。
【０１９５】
核酸配列から転写されるＲＮＡの、植物中レベルを決定する方法は、当技術分野において周知であり、それには、例えば、ノザンブロット分析、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析（定量的、半定量的またはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを含む）およびＲＮＡ−インサイチューハイブリダイゼーションが含まれる。
【０１９６】
本発明の一部の態様によれば、本発明の、発現された組換えキメラポリペプチドを、植物細胞においてグリコシル化して、植物特異的グリカン残基を有する１つもしくは２つもしくは３つまたはそれ以上のグリカン構造を有するキメラポリペプチドが得られる。したがって、本発明の一部の態様によれば、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、１つ、２つ、３つまたはそれ以上のアンテナに配列された種々の量のグリカン構造を有するキメラポリペプチドを産生する。全ての構造は、コアα（１，３）フコース、β（１，２）キシロースおよび／またはＧｌｃＮＡｃ残基に加えて、２つのＧｌｃＮＡｃおよび１つのマンノースのコア構造、ならびに種々の量のマンノースのバリエーションを含有し得る。構造は、コア構造に加えて、少なくとも１つ、任意に少なくとも２つ、任意に少なくとも３つもしくは任意に少なくとも４つまたはそれ以上のマンノース残基を有する高マンノース型のものである；あるいは各グリカン上にマンノース型と他のグリカン型の両方を有する複合型のものである、または高マンノースおよび複合アンテナの両方を有するハイブリット型のものであることができる。他の態様において、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、任意に少なくとも２つ、任意に少なくとも３つもしくは任意に少なくとも４つまたはそれ以上のコアキシロース残基を有するＴＮＦα阻害薬を産生する。さらに他の態様において、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、任意に少なくとも２つ、任意に少なくとも３つもしくは任意に少なくとも４つまたはそれ以上のコアα−（１，３）フコース残基を有するＴＮＦα阻害薬を産生する。一態様において、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つの露出したマンノース残基、少なくとも１つのコアキシロース残基および少なくとも１つのα−（１，３）フコース残基を有するＴＮＦα阻害タンパク質（inhibitor protein）を産生する。さらに他の態様において、本発明の発現ベクターを発現する細胞は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つまたはそれ以上の末端Ｎ−アセチルグルコサミン置換を外側マンノース糖上に有するＴＮＦα阻害薬を産生する。
【０１９７】
具体的な一態様によれば、ＴＮＦα阻害薬、例えば、キメラポリペプチドは、シアル酸残基を欠いている。さらに、具体的な一態様によれば、ＴＮＦα阻害薬、例えば、キメラポリペプチドは、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％またはそれ以上の複合グリカンを含む。具体的な一態様によれば、キメラポリペプチドは、４０〜７０％の複合グリカンを含む。
【０１９８】
本発明のＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞は、ＴＮＦαと関連する医学的状態を治療するのに利用される。
【０１９９】
実施例部分の例２には、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬（例えば、キメラポリペプチド）を発現する植物細胞は、対象への経腸投与のために提供される場合、効果的な全身送達系として使用できることが示されている（ＷＯ２００７／０１０５３３を参照のこと）。したがって、一部の態様において、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬は、キメラポリペプチドを発現する形質転換植物細胞と薬学的に許容される担体とを含む、経口または経腸送達用の医薬組成物中に配合することができる。一部の態様において、医薬組成物の形質転換植物細胞は、凍結乾燥された植物細胞であるが、新鮮な（凍結乾燥されていない細胞）、植物組織、植物の部分または全植物の使用も、ここで企図される。
【０２００】
凍結乾燥の前に、細胞は洗浄して、成長培地中に存在する可能性があるあらゆる細胞片を除去することができる。
【０２０１】
細胞を凍結乾燥のために調製しているときは、細胞を維持培地中でインキュベートして細胞の代謝プロセスを低減させることが場合によっては望ましい。
【０２０２】
前処理（必ずしも必要でないが）は、室温でまたは植物細胞が典型的に培養される温度で行うことができる。取扱いの容易さのため、およびほとんどの植物細胞が室温でかなり安定であるという理由から、前処理は、約室温（２０℃）で行う。安定剤は、直接培地に加えること、および前処理プロセスの間に必要に応じて補充することが可能である。
【０２０３】
前処理は、１種以上の浸透圧剤の存在下で細胞をインキュベートすることを含むこともできる。有用な浸透圧剤の例としては、糖、例えば、サッカライドおよびサッカライド誘導体、アミノ酸もしくはイミノ酸、例えば、プロリンおよびプロリン誘導体、またはこれらの薬剤の組合せが挙げられる。一部の比較的有用な糖および糖誘導体は、フルクトース、グルコース、マルトース、マンニトール、ソルビトール、スクロースおよびトレハロースである。浸透圧剤は、その後に凍結乾燥できるよう細胞を調製する濃度で利用する。
【０２０４】
凍結乾燥は、真空蒸着によって細胞の水分含量を低減することを目的とする。真空蒸着は、気圧が減圧された環境に細胞を配置することを伴う。望ましい水分除去速度に応じて、約−３０℃〜５０℃の温度で動作する減圧周囲圧力は、１００トル、１トル、０．０１トルまたはそれ以下である。具体的な一態様によれば、細胞の凍結乾燥は、−４０℃まで凍結し、次いで一晩にわたって０．１ｍｂａｒの圧力まで真空を適用することによって行う。次いで、細胞を−１０℃まで加熱すると、結果として氷分が全て、昇華および蒸発するであろう。減圧条件下で、細胞中の水の６０〜９５％まで除去できるように、水分蒸発速度を増加させる。
【０２０５】
具体的な一態様によれば、凍結乾燥は、細胞から水の６０％超、７０％超、８０％超、または具体的には９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超または９８％超を除去する。具体的な一態様によれば、最終的な水分含量は、約５〜１０％、５〜８％または６〜７％である。
【０２０６】
ここで使用する表現「経腸投与」は、胃腸管の任意の部分からの投与、例えば、直腸内投与、結腸内投与、腸内投与（近位または遠位）および胃内投与を指す。一部の態様において、経腸投与は、経口投与に意味する。本発明の教示が粘膜投与も目的とすることは、認識されるであろう。
【０２０７】
細胞は、固体として配合してもよく、液体として配合してもよく、または粉末として配合してもよい。一部の態様において、細胞は、再懸濁された凍結乾燥細胞である。
【０２０８】
したがって、経口剤形は、経口栄養形態として（例えば、３７℃を超える温度への加熱および圧縮を含む変性条件に、タンパク質が曝露されないならば）、完全食として、溶解用の、例えば、健康飲料用の粉末として、溶液として、任意に低カロリーである既製飲料、例えば、ソフトドリンク、例えば、ジュース、ミルクセーキ、ヨーグルト飲料、スムージーもしくは大豆系飲料として、バーの形態で提供することもできるし、またはあらゆる種類の食品、例えば、ベークド製品、シリアルバー、デイリーバー、スナック食品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー（例えば、ライスクラッカー）、チョコレートおよび乳製品中に分散させることもできる。
【０２０９】
細胞自体を対象に投与することもできるし、あるいは本発明の細胞を、それらが好適な担体もしくは賦形剤と混合されている医薬組成物の形態で対象に投与することもできる。
【０２１０】
ここで使用する「医薬組成物」は、他の化学成分、例えば、生理的に好適な担体および賦形剤を含む、ＴＮＦα阻害薬を発現する細胞の製剤を指す。医薬組成物の目的は、生物体への化合物の投与を容易にすることである。
【０２１１】
ここで使用する用語「活性成分」は、所期の生物学的作用を担うことができるＴＮＦα阻害薬を発現する細胞を指す。
【０２１２】
以下において、表現「生理的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」は、同義で使用でき、生物体にほとんど刺激をもたらさずかつ投与された化合物の生物活性および性質を抑制しない担体または希釈剤を指す。補助剤は、これらの表現の下に含まれる。好ましくは、使用する担体は、非免疫原性の担体であり、さらに好ましくは、腸関連リンパ組織を刺激しない。
【０２１３】
ここで、用語「賦形剤」は、活性成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖および種々の型のデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油ならびにポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２１４】
薬物の製剤化および投与のための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡの最新版に見ることができ、これを参照することによってここに完全に組み込む。
【０２１５】
したがって、本発明に従って使用する医薬組成物は、医薬として使用できる製剤中への活性成分の加工を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１種以上の生理的に許容される担体を用いて、従来の方法で製剤化することができる。
【０２１６】
経口投与のためには、医薬組成物は、活性化合物を、当技術分野において周知の医薬として許容される担体と合わせることによって、容易に製剤化することができる。このような担体により、医薬組成物は、患者による経口摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化することが可能になる。経口使用のための医薬製剤は、固体賦形剤を使用して、得られた混合物を任意に粉砕し、所望により好適な補助剤を添加後に顆粒の混合物を加工して、錠剤または糖衣錠のコアを得ることによって、作製することができる。好適な賦形剤は特に、フィラー、例えば、糖、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはソルビトール；セルロース製品（cellulose preparation）、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、米デンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびナトリウムカルボキシメチルセルロースなど；ならびに／または生理的に許容されるポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）である。必要ならば、崩壊剤、例えば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えば、アルギン酸ナトリウムを添加してもよい。
【０２１７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングを施す。この目的のために、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を任意に含有していてもよい濃縮糖溶液を、使用し得る。識別のために、または異なる活性化合物用量の組合せを特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加してもよい。
【０２１８】
経口的に使用できる医薬組成物には、ゼラチンから作られる押し込み型カプセル剤、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールから作られる密封軟カプセル剤が含まれる。押し込み型カプセル剤は、活性成分を、フィラー、例えば、ラクトース、結合剤、例えば、デンプン、滑沢剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、および任意に安定剤と混合して含有してもよい。軟質カプセル剤においては、活性成分は、好適な液体、例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール中に溶解または懸濁させてもよい。加えて、安定剤を添加してもよい。
【０２１９】
剤形は、添加剤、例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、リン、ビタミンＤおよびビタミンＫのうちの１種以上を含んでいてもよい。好適な１日の量は、カルシウムでは０．１ｍｇ〜３．６ｇ、好ましくは３２０〜５３０ｍｇである。一般に、本発明の栄養製剤または医薬中のビタミンおよび無機質の１日投与量は、保健機関によって推奨される投与量の２５〜１００重量％である。食物繊維もまた、本発明の組成物の成分であってもよい。サプリメントのさらなる成分としては、健康上の利益を有することが知られている、とりわけ身体能力を改善するための生物活性化合物またはエキスを挙げることができる。
【０２２０】
一般に、単位剤形は、酸化防止剤をさらに含んでいてもよい（例示的実施例は、上記で提供される−。別の態様において、酸化防止剤は薬学的に許容される酸化防止剤である。別の態様において、酸化防止剤は、ビタミンＥ、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ω−３およびβ−カロテンからなる群から選択される。
【０２２１】
別の態様において、単位剤形は生物活性タンパク質またはペプチドのエンハンサーをさらに含む。別の態様において、単位剤形は、生物活性タンパク質またはペプチドの補因子をさらに含む。
【０２２２】
別の態様において、本発明の単位剤形は、医薬品等級の界面活性剤をさらに含む。界面活性剤は、当技術分野において周知であり、とりわけ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｃ  Ｒｏｗｅ、Ｐａｕｌ  Ｊ  ＳｈｅｓｋｅｙおよびＳｉａｎ  Ｃ  Ｏｗｅｎ編、ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２００５）に記載されているものである。別の態様において、界面活性剤は、当技術分野において公知の任意の他の界面活性剤である。
【０２２３】
別の態様において、本発明の単位剤形は、医薬品等級の乳化剤またはエマルゲーター（emulgator）（皮膚軟化剤）をさらに含む。乳化剤およびエマルゲーターは、当技術分野において周知であり、とりわけ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（前書）に記載されているものである。乳化剤およびエマルゲーターの非限定的な例は、ユームルジン（eumulgin）、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ  Ｂ１  ＰＨ、Ｅｕｍｕｌｇｉｎ  Ｂ２  ＰＨ、硬化ヒマシ油セトステアリルアルコールおよびセチルアルコールである。別の態様において、乳化剤またはエマルゲーターは、当技術分野において公知である任意の他の乳化剤またはエマルゲーターである。
【０２２４】
別の態様において、本発明の単位剤形は、医薬品等級の安定剤をさらに含む。安定剤は、当技術分野において周知であり、とりわけ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（前書）に記載されているものである。別の態様において、安定剤は、当技術分野において公知の任意の他の安定剤である。
【０２２５】
別の態様において、本発明の単位剤形は、アルギニン、リシン、アスパルテート、グルタメートおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸をさらに含む。別の態様において、アルギニン、リシン、アスパルテート、グルタメートおよびヒスチジンの類似体および修飾型（modified version）はそれぞれ、用語「アルギニン」、「リシン」、「アスパルテート」、「グルタメート」および「ヒスチジン」に含まれる。別の態様において、アミノ酸は、リボヌクレアーゼまたは他の活性分子のさらなる保護を提供する。別の態様において、アミノ酸は、生物活性タンパク質またはペプチドと標的細胞との相互作用を促進する。別の態様において、アミノ酸は、単位剤形の油成分に含有されている。
【０２２６】
別の態様において、本発明の単位剤形は、マトリックス担体単位剤形が混合される１種以上の医薬として許容される剤をさらに含む。別の態様において、賦形剤は、１種以上の追加のポリサッカライドを含む。別の態様において、賦形剤は、１種以上のワックスを含む。別の態様において、賦形剤は単位剤形に所望の風味を提供する。別の態様において、賦形剤は、薬物の堅牢性および最終剤形、例えば、ゲルカプセル剤または硬ゼラチンカプセル剤に影響を与える。
【０２２７】
賦形剤の非限定的な例としては、以下が挙げられる：消泡剤（ジメチコン、シメチコン）；抗菌性保存剤（塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム（benzelthonium chloride）、ブチルパラベン、塩化セチルピリジニウム、クロロブタノール、クロロクレゾール、クレゾール、エチルパラベン、メチルパラベン、メチルパラベンナトリウム、フェノール、フェニルエチルアルコール、酢酸フェニル水銀、硝酸フェニル水銀、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、プロピルパラベン、プロピルパラベンナトリウム、安息香酸ナトリウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、ソルビン酸、チメロサール、チモール）；キレート化剤（エデト酸塩二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸および塩、エデト酸）；コーティング剤（カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロースアセテート、セルロースアセテートフタレート、エチルセルロース、ゼラチン、医薬用グレーズ、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸コポリマー、メチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリビニルアセテートフタレート、セラック、スクロース、二酸化チタン、カルナウバワックス、マイクロクリスタリンワックス、ゼイン）；着色剤（カラメル、赤色酸化鉄、黄色酸化鉄、黒色酸化鉄または酸化鉄ブレンド）；錯化剤（エチレンジアミン四酢酸および塩（ＥＤＴＡ）、エデト酸、ゲンチシン酸エタノールアミド（ethanolmaide）、硫酸オキシキノリン）；乾燥剤（塩化カルシウム、硫酸カルシウム、二酸化ケイ素）；乳化および／または可溶化剤（アカシア、コレステロール、ジエタノールアミン（補助剤）、モノステアリン酸グリセリン、ラノリンアルコール、レシチン、モノグリセリドおよびジグリセリド、モノエタノールアミン（補助剤）、オレイン酸（補助剤）、オレイルアルコール（安定剤）、ポロキサマー、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシル３５ヒマシ油、ポリオキシル４０硬化ヒマシ油、ポリオキシル１０オレイルエーテル、ポリオキシル２０セトステアリルエーテル、ポリオキシル４０ステアレート、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、プロピレングリコールジアセテート、プロピレングリコールモノステアレート、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ステアリン酸、トロラミン、乳化ワックス）；香味料および香料（アネトール、ベンズアルデヒド、エチルバニリン、メントール、サリチル酸メチル、グルタミン酸一ナトリウム、橙花油、ペパーミント、ペパーミント油、ハッカ精、ローズオイル、ストロンガーローズウォーター（stronger rose water）、チモール、トルーバルサムチンキ、バニラ、バニラチンキ、バニリン）；保湿剤（グリセリン、ヘキシレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール）；ポリマー（例えば、セルロースアセテート、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、アクリルポリマーおよびコポリマー）；懸濁および／または増粘剤（アカシア、寒天、ア���ギン酸、モノステアリン酸アルミニウム、ベントナイト、精製ベントナイト、ベントナイトマグマ、カルボマー９３４ｐ、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロース（carboxymethycellulose）ナトリウム１２、カラギーナン、マイクロクリスタリンおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムセルロース、デキストリン、ゼラチン、グアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ケイ酸アルミウニムマグネシウム、メチルセルロース、ペクチン、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポビドン、アルギン酸プロピレングリコール、二酸化ケイ素、コロイド状二酸化ケイ素、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、キサンタンガム）；甘味剤（アスパルテーム、デキストレート、デキストロース、賦形剤デキストロース、フルクトース、マンニトール、サッカリン、サッカリンカルシウム、サッカリンナトリウム、ソルビトール、ソルビトール液、スクロース、圧縮性糖、粉砂糖、シロップ）；このリストは、排他的なものとして記載するのではなく、本発明の経口投与単位剤形に使用し得る賦形剤の種類および特定の賦形剤を単に代表するものである。
【０２２８】
保存剤、キレート化剤、起泡剤、天然または人工甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤、矯味剤、酸味料、乳化剤、増粘剤、沈殿防止剤、分散剤または湿潤剤、酸化防止剤などから選択されるもののいずれかを含む従来の添加剤を、本発明の組成物に含めてもよい。矯味矯臭剤は、投与計画のコンプライアンスを助けるために本発明の組成物に加えることができる。典型的な矯味矯臭剤としては、これらに限定するものではないが、天然または合成エッセンス、パイナップル、オレンジ、レモン、ミント、ベリー、チョコレート、バニラおよびメロンのオイルおよび／またはエキスが挙げられる。
【０２２９】
投与する組成物の量は、言うまでもなく、治療される対象、苦痛の重症度、投与方法、処方医師の判断などによって異なるであろう。
【０２３０】
別の態様において、成人用量範囲当たりのキメラポリペプチド有効量は、約０．０００２ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、約０．００２〜２ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜２ｍｇ／ｋｇ、約０．２〜２ｍｇ／ｋｇ、約０．００２〜０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．０００２〜１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２〜０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．００２〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．００２〜０．００８ｍｇ／ｋｇ、約０．０２〜０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．００１〜０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜１５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５〜１ｍｇ／ｋｇ、約０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、約０．００５〜０．０１ｍｇ／ｋｇまたは約０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇである。具体的な一態様によれば、成人用量当たりのキメラポリペプチド有効量は、０．００２〜０．２ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【０２３１】
具体的な一態様によれば、０．０１〜１００ｍｇ、０．１〜１００ｍｇ、０．１〜５０ｍｇ、０．１〜２０ｍｇ、０．１〜１０ｍｇ、０．１〜５ｍｇの均一の用量を投与する。
【０２３２】
具体的な一態様によれば、均一の用量は、約０．１〜１０ｍｇである。
【０２３３】
具体的な一態様によれば、経口用量を、毎日投与する。用量は、日中の複数回の投与のために分割してもよい（１日約２〜４回）。用量はまた、２日毎に、１週に２回、１週に３回、隔週、毎週投与することができ、または数週間（例えば、２〜８週間）隔てることができる。
【０２３４】
ここで使用する用語「約」は±１０％を指す。
【０２３５】
用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する」およびそれらの同根語は、「〜を含むがそれに限定されない」を意味する。
【０２３６】
用語「〜からなる」は、「〜を含み、それに限定される」を意味する。
【０２３７】
用語「〜から本質的になる」は、追加の成分、工程および／または部分が、特許請求の範囲に記載した組成物、方法または構造の基本的および新規特徴を実質的に変えない場合に限って、組成物、方法または構造が追加の成分、工程および／または部分を含むことを意味する。
【０２３８】
ここで使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈からそうでないことが明白に指示される場合を除き、複数の指示対象を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１種の化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含んでいてもよい。
【０２３９】
この出願全体を通じて、本発明の種々の態様は、範囲の形式で示す場合がある。範囲形式での記載は、単に簡便かつ簡潔にするためであり、本発明の範囲に対する変更できない限定と解するべきではない。したがって、範囲の記載は、その範囲内の考えられる部分範囲および個々の数値を全て、具体的に開示していると考えるべきである。例えば、１つの範囲、例えば、１〜６の記載は、部分範囲、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５および６を具体的に開示していると考えるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０２４０】
ここで数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内の任意の挙げられた数字（分数または整数）を含むことが意味される。第１の指示数と第２の指示数の「の間の範囲」と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」とは、ここでは同義で使用し、第１の指示数および第２の指示数ならびにその間の分数および整数の全てを含むことを意味する。
【０２４１】
ここで使用する用語「方法」は、所与の課題を達成するためのやり方、手段、技術および手順であって、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の分野における当業者にとって公知であるまたはそのような当業者によって公知のやり方、手段、技術および手順から容易に発展させることができる、やり方、手段、技術および手順を含むがこれらに限定されないものを指す。
【０２４２】
ここで使用する用語「治療（処置）する」は、状態の進行を抑制する、実質的に阻害する、遅延させるもしくは逆行させること、状態の臨床症状もしくは審美的症状を実質的に緩解させること、または状態の臨床症状もしくは審美的症状の出現を実質的に予防することを含む。
【０２４３】
明確にするために別個の態様との関連で記載される本発明の特定の特徴は、単一の態様と組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔にするために単一の態様との関連で記載される本発明の種々の特徴は、別個に、または任意の好適な部分的組合せとして、または本発明の任意の他の記載した態様において好適なように提供することもできる。種々の態様との関連で記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその態様が機能しない場合を除いて、それらの態様に不可欠な特徴と考えるべきではない。
【０２４４】
上記で記載しかつ以下の特許請求の範囲において特許請求する、本発明の種々の態様および側面は、以下の実施例において実験による裏付けを得る。
【０２４５】
［実施例］
次に、以下の実施例に言及するが、これらの実施例は、上記記載と共に本発明の一部の態様を非限定的に説明するものである。
【０２４６】
一般に、ここで使用する用語体系および本発明において利用する実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、以下を参照のこと：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」  Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ〜ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、Ｖｏｌｓ．１〜４、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）；以下に記載されている方法体系：米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号；第４，８０１，５３１号；第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ〜ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ〜ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されており、例えば、以下を参照のこと：米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」  Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」  Ｖｏｌ．１，２，３１７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）（これらの文献を全て、参照することによって、ここに完全に記載されているかのようにここに組み入れる）。他の一般的な参考文献も、本文献全体を通じて提供する。ここでの手順は、当技術分野において周知であると考えられるものであり、読む人の便宜のために示す。ここに含まれる全ての情報は、参照することによってここに組み込む。
【０２４７】
例１
材料および実験手順
発現構築物および発現
ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：ＦｃをコードするｃＤＮＡは、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、ドイツ）によって最適化および合成されたものである。コドン使用頻度は、ニコチアナ・タバカム遺伝子のコドンバイアスに適合させた。ＩｇＧ１部分は、Ｆｃ  ＩｇＧ１重鎖定常領域［ホモサピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）］ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  ＡＥＶ４３３２３からクローニングした。
【０２４８】
最適化プロセスにおいて、以下のシス作用性配列モチーフを回避した：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム侵入部位（ribosomal entry site）、ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチ、ＲＮＡ不安定性エレメント（「キラーモチーフ」）、反復配列およびＲＮＡ二次構造、スプライスドナー（潜在性）およびアクセプター部位、分岐点。加えて、ＧＣ含量が非常に高い（８０％超）または非常に低い（３０％未満）領域を回避した。結果として得られるＤＮＡ配列は、配列番号１に示した通りである。コードされるポリペプチドは、配列番号２に示した通りである。ネイティブｃＤＮＡ配列に対して、Ｎ．プルムバギニフォリアのカルレティキュリンタンパク質からのシグナルペプチド（例えば、小胞体標的シグナルペプチド）を遺伝子のＮ’末端に加えて、分泌経路へのＰｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃの効率的な標的指向化を可能にし、次に、タンパク質が小胞体中に移動したら、これをシグナルペプチダーゼによってポリペプチドから切断する（配列番号３、配列番号４；それぞれ、ＥＲシグナルペプチドのＤＮＡおよびペプチド配列を表す）。さらに、ＥＲ保留シグナルＳＥＫＤＥＬを、遺伝子のＣ’末端に加えた。このシグナルは、ゴルジ装置からＥＲへのタンパク質の回収およびＥＲにおける局在化を可能にする。全コード配列（シグナルペプチド−ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ−ＳＥＫＤＥＬ）は配列番号５によってコードされ、コードされるポリペプチドは、配列番号６に示した通りである。Ｎ末端シグナルペプチドの切断後に得られるタンパク質は、配列番号７、２０４または２０５に示した通りである（ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ−ＳＥＫＤＥＬ）。
【０２４９】
Ｎ．タバカムＢＹ２細胞における安定発現
アグロバクテリウム媒介形質転換は、外来遺伝子を植物細胞ゲノムに導入するために広範に使用されている。この手法を用いて、外来遺伝子およびその調節エレメントからなるＴ−ＤＮＡ分子を、植物ゲノム中にランダムに導入する。組込み部位および遺伝子挿入物のコピー数は制御できないので、形質転換プロセスは、種々の導入遺伝子発現レベルを有する細胞から構成される非常に不均一なトランスジェニック「プール」をもたらす。トランスジェニック「プール」を、続いてクローン単離に使用する。形質転換プロセスにより、それぞれが個別の形質転換イベントを示す多数の単細胞株が確立され、それから外来遺伝子の発現レベルが最も高いクローンを選択する。ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ（ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣ）に関して、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃカセットを有するプラスミドを用いて、形質転換を行った（図１  配列番号７および８）。その結果、組換えタンパク質は、細胞の小胞体（ER）を標的にする。ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣ−ＥＲ発現ベクターによるＢＹ２細胞の形質転換を、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介植物形質転換手順によって以下のようにして行った：ＢＹ２（ブライトイエロー２）懸濁培養物を、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：ＦＣ−遺伝子およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）選択遺伝子を内包しているベクターを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（tumefactiens）株と共に４８時間共培養した。続いて、５０ｍｇ／Ｌカナマイシン（Kanamaycin）および２５０ｍｇ／Ｌセフォタキシムが補充された培地中に、細胞を維持した。ＮＰＴＩＩ遺伝子は、カナマイシンに対する耐性を与え、したがって、ＮＰＴＩＩ陽性ＢＹ２細胞のみが、この選択培地中で生き残る。セフォタキシムは、アグロバクテリウムを選択的に死滅させるのに使用した。植物細胞は、この抗生物質に対して耐性を示す。
【０２５０】
最適発現クローンのスクリーニング
個々の細胞株を選択するために、高希釈細胞懸濁液のアリコートを固形ＢＹ−２培地上に広げた（Ｔｏｓｈｉｙｕｋｉ  ＮａｇａｔａおよびＦｕｍｉ  Ｋｕｍａｇａｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１：１２３〜１２７、１９９９）。次いで、小さいカルスが発生するまで、細胞を成長させた。次に、各カルスを培養液中に再懸濁させた。それから、細胞をサンプリングし、ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣについて評価した。約５００種の細胞株を、変性条件下でウエスタンブロットによってスクリーニングした（図４）。高発現レベルを有する細胞株を、同一方法でさらに再分析して、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：ＦＣ産生クローンの最高発現クローンを選択した。
【０２５１】
ゲル電気泳動：
ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、電場上でタンパク質をそのサイズによって分離する。タンパク質は、界面活性剤ＳＤＳの存在下で、それらの分子量の対数の一次関数として泳動する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上におけるＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣの泳動パターンおよび同定を、市販の分子量標準タンパク質（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ；ｃａｔ  Ｎｏ．Ｐ７７０８Ｓ）および商業的に入手可能な、ＣＨＯ細胞で発現される哺乳類細胞由来のＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エンタネルセプト（Entanercept）；Ｗｙｅｔｈ）と比較した。ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣを、β−メルカプトエタノールを含有する還元試料緩衝液によってまたはネイティブ抽出緩衝液によって、細胞から抽出した。ネイティブな抽出上清を、分析の前に非還元試料緩衝液と混合した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ（商標）細胞垂直電気泳動装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂ．）を使用して、予備混合された電気泳動用のＴｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、電気泳動を行った。電気泳動後、タンパク質を、ポリアクリルアミドゲルからタンパク結合ニトロセルロース膜（ｉＢｌｏｔ（商標））に移した。膜を、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有す５％のミルク緩衝液でＲＴにおいて１時間ブロッキングした。分子のＦｃ部分の同定には、ＨＲＰにコンジュゲートされたヤギ抗ヒトＩｇＧ（ｃａｔ＃１０９−０３５−０９８、Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用した。ＴＮＦＲ２の検出には、ウサギ抗ＴＮＦＲＩＩ（ＩＤ：ａｂ１０９８５３、Ａｂｃａｍ）、続いてヤギ抗ウサギＨＲＰ（ｃａｔ＃１１１−０３５−００３、Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。検出は、ＥＣＬ検出キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて行った。ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣの免疫反応性を、市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エンタネルセプト（Entanercept）；Ｗｙｅｔｈ）の免疫反応性と比較した。バンドを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して検出した。
【０２５２】
質量分析によるアミノ酸配列決定
ｐｒｈＴＮＦＲ２：ＦＣは、Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙのＳｍｏｌｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｈａｉｆａ、イスラエル）で配列解析する。タンパク質をゲルから抽出し、２．８ｍＭ  ＤＴＴで還元し（６０℃で３０分間）、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム中８．８ｍＭヨードアセトアミドを用いて変性させ（暗所において室温で３０分間）、１０％ＡＣＮおよび１０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中で変性トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）またはキモトリプシンにより１：５０の酵素対基質比で３７℃において一晩消化させる。得られたペプチドの３％を、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ逆相材料（Ｄｒ  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツ）が充填された０．０７５×２００ｍｍ溶融シリカ毛細管（Ｊ＆Ｗ）上での逆相クロマトグラフィーによって分離する。ペプチドは、０．１％ギ酸水溶液を含む５から４５％のアセトニトリルの直線勾配で６０分間および０．１％ギ酸水溶液を含む９５％アセトニトリルで１５分間、流速０．２５μｌ／分で溶離させる。イオントラップ質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｔｈｅｒｍｏ）によってポジティブモードでＭＳフルスキャンと、それに続く、１回目のＭＳスキャンから選択された７つの最もドミナントなイオンの衝突誘起解離（collision induces dissociation）（ＣＩＤ）を繰り返し使用して、オンライン質量分析を行う。
【０２５３】
質量分析データを、Ｓｅｑｕｅｓｔ  ３．３１ソフトウェア（Ｊ．ＥｎｇおよびＪ．Ｙａｔｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）を使用して特定配列に対比して分析する。
【０２５４】
グリコシル化分析
Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞と植物細胞系において産生される糖タンパク質の間の大きな違いは、グリコシル化プロファイルおよびグリカン構造である。タンパク質に結合した種々のＮ−結合型グリカン構造を特性決定するために、予備分析を行った。これらの結果を、市販Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）で見られるＮ−グリコシル化プロファイルの結果と比較する。Ｏ−結合型グリカンの存在およびグリカン部位分析を判定する。
【０２５５】
ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣおよび市販Ｅｎｂｒｅｌの試料を、還元し、アルキル化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離する。約７５ＫＤａのタンパク質バンド（タンパク質合計約２００μｇ）を採取してグリカン分析を行う。グリカン分析には、ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣについては、トリプシン消化とそれに続くＰＮＧａｓｅ  ＡまたはＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化（合計タンパク質それぞれ、約８０％および約２０％）を、市販Ｅｎｂｒｅｌについては、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ消化のみを使用する。トリプシンとそれに続くＰＮＧａｓｅ  Ａによる消化では、Ｎ−結合型グリカンが全て遊離され、ＰＮＧａｓｅ  Ｆによる消化では、α１−３コアフコースを含有するもの（植物中に見られる）を除く全てのグリカンが遊離される。遊離されたグリカンを抽出し、清浄にし、次いで蛍光試薬アントラニルアミド（２−アミノベンズアミド、２ＡＢ）で標識し、続いて過剰の２ＡＢを除去する。分析方法は、蛍光検出器（励起３３０ｎｍ、発光４２０ｎｍ）と一体化された順相アミド系カラム（Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ  Ａｍｉｄｅ−８０カラム）を備えるＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣ系上におけるグリカンの分離を含む。標識したグリカンプールの配列決定を、種々のエキソグリコシダーゼによる連続消化とそれに続くさらなるＨＰＬＣ分析によって達成した。種々のエキソグリコシダーゼによる連続消化を使用すると、グリカン構造のプロファイルおよびそれらの相対量についてさらなる情報が得られる。ＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣから遊離されたグリカンに関して行うエキソグリコシダーゼ消化には、β１−２、３、４および６Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）を除去するＪＢＨ（タチナタマメ（Ｊａｃｋ  ｂｅａｎ）β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）、マンノースα１−２、６＞３マンノースを除去するＪＢＭ（タチナタマメマンノシダーゼ）、およびα１−６およびα１−３コアフコースを除去するＢＫＦ（ウシ精巣フコシダーゼ）を用いる。蛍光標識により、総消化グリカンプール中の種々のグリカン構造の分布の半定量分析が可能となる。次に、ギ酸アンモニウムおよびアセトニトリルからなる勾配溶媒流を使用して、特有のグリカン結合に従ってサイズの低い方から順にグリカンを分離する。個々のグリカンの保持時間を、グルコース単位（ＧＵ）のラダーを示す部分加水分解デキストランフラグメントの標準ミックスの保持時間と比較する。グリカンを、標準および外部データベース（ｇｌｙｃｏｂａｓｅ  ｗｅｂｓｉｔｅ  ８０８０）との比較に基づき、それらのＧＵ値に従って、ピークに割り当てる。最終割当および相対ピーク面積を、ＰＮＧａｓｅ  Ａ消化のクロマトグラムから算出する。
【０２５６】
酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）
結合ＥＬＩＳＡ：  ＴＮＦα結合ＥＬＩＳＡは、市販ＴＮＦα検出ＥＬＩＳＡキット（ヒトＴＮＦ−α；Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．＃ＨＫ３０７）と市販抗ヒトＩｇＧ抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＦＣ特異的ＨＲＰ；Ｓｉｇｍａ）の組合せである。このアッセイは、ｐｒｈＴＮＦＲ２：ＦＣ結合活性の定量的非放射性アッセイである。この結合ＥＬＩＳＡは、ＴＮＦＲとＩｇＧドメインの両方を含む機能性（ＴＮＦαと結合することができる）分子の検出を可能にする。
【０２５７】
ＴＮＦαに対する抗体をプレコートしたＥＬＩＳＡプレートを、ＴＮＦα（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）と共に室温で１時間インキュベートした。各ＥＬＩＳＡ工程の間で、プレートを市販洗浄緩衝液で３回洗浄した。市販ＥｎｂｒｅｌおよびＰＲＨ  ＴＮＦＲ２：ＦＣを発現するＢＹ２細胞からの上清（段階希釈物）を、ＥＬＩＳＡプレート上でＲＴにおいて２時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＨＲＰを１：１０，０００で希釈し、プレート上でＲＴにおいて１時間インキュベートした。ＴＭＢを、ＨＲＰに対する基質として使用した。比色反応を、１０％ＨＣＬで停止させ、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０２５８】
Ａ３７５細胞におけるＴＮＦα誘導アポトーシスの予防
Ａ３７５細胞（ヒトメラノーマ細胞）を、培地（ＡＴＣＣ、＃３０−２００２、１０％ＦＢＳを補充）中に懸濁させて成長させた。１０4個／ウェルの細胞を、９６ウェルアッセイプレート中に蒔き、アッセイ培地（ＡＴＣＣ、＃３０−２００２、５％ＦＢＳを補充）中で一晩インキュベートした。組換えＴＮＦα（２ｎｇ／ｍｌ、ＰｒｏＳｐｅｃ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を、種々の濃度（１．５６２〜１００ｎｇ／ｍｌ）のｐｒｈＴＮＦＲ２：ＦＣまたは市販Ｅｎｂｒｅｌ（エンタネルセプト（Entanercept）；Ｗｙｅｔｈ）の存在下で３７℃において２時間インキュベートした。インキュベート後、混合溶液を、アクチノマイシンＤ（０．８μｇ／ｍｌ）の存在下でＡ３７５細胞に加え、加湿インキュベーター中で３７℃、ＣＯ2  ５％においてさらに２４時間インキュベートし、ＭＴＴアッセイ（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｍ５６５５）によってアポトーシスの定量化を判定した。プレートを５７０〜６５０ｎｍで読み取り、ＴＮＦ−α誘導細胞毒性の阻害（％）を算出した。
【０２５９】
例２
タンパク質分析
ｐｒｈＴＮＦＲ２：ＦＣを、還元条件（図２Ａ）および非還元条件（図２Ｂのネイティブ抽出）下で分析した。ｐｒｈＴＮＦＲ２：ＦＣ（レーン１）および市販Ｅｎｂｒｅｌ（レーン２）を、抗Ｆｃ抗体（上部パネル）および抗ＴＮＦＲ２抗体（下部パネル）を用いて検出した。２つのタンパク質は、おそらく植物細胞発現酵素と哺乳類細胞発現酵素とのグリコシル化パターンにおける差のため、移動特性にわずかな差を示している。
【０２６０】
市販Ｅｎｂｒｅｌとｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：ＦＣの両方によるＴＮＴα結合を、ｐｒｈＴＮＦＲ２：Ｆｃ（ＰＲＸ-１０６）発現ＢＹ２細胞の可溶化液の段階希釈物を市販Ｅｎｂｒｅｌと比較することによって調べた。ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：ＦＣ段階希釈物は、市販タンパク質と同様な用量反応結合パターンを示している（図３を参照のこと）。タンパク質発現によるトランスジェニック細胞株の選択は、ウエスタンブロット法によって行った。したがって、個々の細胞株の選択を可能にするために、高希釈細胞懸濁液のアリコートを、固形ＢＹ−２培地上に広げた。次いで、小さいカルスが発生するまで、細胞を成長させた。次に、各カルスを培養液中に再懸濁させた。それから、細胞をサンプリングし、産生された標的タンパク質の還元条件下での抽出とそれに続くウエスタンブロット同定（抗ＦＣ抗体）によって、ｐｒｈ  ＴＮＦＲ２：Ｆｃ発現レベルについて評価した（図４）。発現タンパク質の機能性を、ＴＮＦα誘導アポトーシスを予防するその能力によって確かめた。具体的には、ＴＮＦα活性は、転写阻害剤、アクチノマイシンＤの存在下で特定の細胞株の細胞死を誘導するその能力によって測定することができる。ＴＮＦαの中和タンパク質によるプレインキュベーションは、受容体（ＴＮＦ−Ｒ１およびＴＮＦ−Ｒ２）との結合を予防し、それによってサイトカイン作用を阻害しかつＴＮＦα誘導細胞死を予防する。ＭＴＴアッセイによる細胞生存度の定量化は、ＴＮＦα細胞毒性のインセル活性アッセイを提供する。結果を、メラノーマ細胞Ａ３７５については図５Ａ〜Ｇに、Ｌ９２９線維芽細胞については図６Ａ〜Ｇに示す。
【０２６１】
例３
組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与は、Ｃｏｎ  Ａ免疫介在性肝炎（hepatatis）モデルにおいて肝毒性を効果的に低減する
コンカナバリンＡ（Ｃｏｎ  Ａ）モデルは、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞（ＮＫＴ）およびマクロファージ依存性肝傷害を研究するための確立した動物モデルであり、免疫介在性肝炎に特有の病態形成および病理学的変化に近い模倣をする。この免疫介在性肝炎モデルにおける、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与による肝毒性の寛解は、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の有効な抗炎症能力の証拠を提供する。
【０２６２】
材料および方法
動物：  全実験で、Ｃ５７Ｂｌ／６マウス雄、１１〜１２週齢を使用した。各実験群に５〜８匹のマウスを含めた。
【０２６３】
Ｃｏｎ  Ａモデル：  ５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、４ｍＭＣａＣｌ2に溶解したコンカナバリンＡ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＯＨ、米国）を、２０ｍｇ／Ｋｇ体重の用量で、尾静脈に静脈内投与した。Ｃｏｎ  Ａ投与の１４時間後にマウスを屠殺し、心臓穿刺によって血液試料を収集し、凝固させ、血清肝臓酵素（アラニンアミノトランフェラーゼ（aminotranferase）、ＡＬＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））レベルおよびサイトカイン（ＩＦＮ−γ）レベルの決定のために血清を除去した。組織病理学的評価（下記参照）のために肝臓を切除し、準備した。
【０２６４】
組換え植物細胞の経口投与：  組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与を、Ｃｏｎ  Ａ投与の６時間前に開始した。マウスには、０．５μｇ（Ｘ１）または５μｇ（Ｘ１０）のＴＮＦＲ２：Ｆｃ  タンパク質に相当する、生理食塩水中での乳化によって新たに調製した組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞を投与した。ネイティブ対照には、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の代わりに、同一経口投与容量の宿主ＢＹ２（−）植物細胞を投与した。経口投与は、３５０μｌの容量で胃強制投与によって行った。
【０２６５】
ステロイド制御：Ｃｏｎ  Ａ投与の６時間前に、マウス１匹当たり０３５ｍｇのデキサメタゾン（Ｔｅｖａ、イスラエル）の経口投与によって、ステロイド処置を行った。
【０２６６】
肝毒性：肝実質の損傷のマーカーである、肝臓酵素（アラニンアミノトランフェラーゼ（aminotranferase）、ＡＬＴおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ））を、血清中で、Ｒｅｆｌｏｖｅｔ  Ｐｌｕｓ臨床化学分析システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ドイツ）を使用して評価した。サイトカイン（ＩＦＮ−γ）レベルを、処置マウスおよび対照マウスの血清中で、ＥＬＩＳＡによってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ、米国）を使用して評価した。
【０２６７】
病理診断：  光学顕微鏡による形態学的および組織学検査のために組織を１０％ホルムアルデヒド中で固定し、室温で保存し、パラフィン包埋し、薄片を作り、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した後、個々の肝臓において病理組織診断を決定した。
【０２６８】
結果：
３つの別個の一連の実験において、低用量（ＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質０．５μｇ「Ｘ１」に相当する）およびより高用量（ＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質５μｇ「Ｘ１０」に相当する）での、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与はいずれも、Ｃｏｎ  Ａの肝毒性作用を有意に低減した。肝損傷の血清酵素マーカー（ＡＳＴ、ＡＬＴ）の上昇は、３つの実験全てにおいてほとんど予防され（図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃを参照のこと）、有効性は、経口ステロイド処置に近かった（例えば、図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃ、Ｄｅｘ．）。
【０２６９】
Ｃｏｎ  Ａ投与の１４時間後におけるマウス血清中のサイトカインＩＦＮ−γの測定（図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃを参照のこと）もまた、低用量（ＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質「Ｘ１」０．５μｇに相当する）およびより高用量（ＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質「Ｘ１０」５μｇに相当する）の用量での、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与を受けているいずれの群においても、血清ＩＦＮ−γの有意な低下を示した。
【０２７０】
処置マウスおよび対照マウスの肝臓の組織病理学的評価（ヘマトキシリンおよびエオシン）（図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃ）は、対照肝臓（図９Ａ）においては、重症の肝壊死を示したが、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞で処置したマウスの肝臓においては、肝臓構造の保存および正常な肝臓組織像を示した（図９Ｂ）。
【０２７１】
組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞（低用量、ＴＮＦＲ２：Ｆｃタンパク質０．５μｇに相当する）の経口投与と、市販の、哺乳類細胞で発現されたＴＮＦＲ２：Ｆｃエタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）１００μｇの腹腔内投与を、Ｃｏｎ  Ａ免疫介在性肝炎モデルにおける肝毒性に対するそれらの効果について比較した。処置マウスにおける血清肝臓損傷マーカーＡＳＴとＡＬＴのレベルを、未処置対照に対して比較すると、Ｃｏｎ  Ａ誘導した免疫介在性肝炎に応答した肝臓損傷マーカーの上昇の予防において、経口投与した、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞は低用量であっても、腹腔内投与したエタネルセプト１００μｇと同程度に効果的である（８７〜８５％、図１０Ａおよび１０Ｂ）ことが明らかであった。
【０２７２】
例４
組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与は、高脂肪食（ＨＦＤ）によってモデル化された脂肪肝疾患において免疫原性を効果的に寛解させる
広く受け入れられている脂肪肝疾患の動物モデルを、高脂肪食（ＨＦＤ）によって誘導する。食餌性肥満を有するマウスは、高い血清脂質プロファイル、増加した肝臓トリグリセリドおよび免疫系変化を特徴とする。
【０２７３】
ＨＦＤを与えられたマウスに対する、経口投与された組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の効果を、判定した。分析には、疾患の臨床症状に対するおよび免疫調節薬としての、処置の効果を含めた。
【０２７４】
材料および方法
動物：  全実験で、Ｃ５７ｂｌ／６マウス雄、６〜７週齢を使用した。各実験群に１０匹のマウスを含めた。マウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエルから購入した。全てのマウスに、０日から２４週間後の屠殺まで、ＨＦＤ（Ｈａｒｌａｎ、ＴＤ８８１３７、カロリーの４２％が脂肪由来）を与えた。
【表１】
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【０２７５】
組換え植物細胞の経口投与：  組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞（バッチＬｙ０１３＋）の週に３回の経口投与を開始した。負の対照には、同一経口投与用量のモック細胞（ＢＹ−）を投与した。マウスに対する全ての経口投与は、総容量が３５μｌであった。各投与の前に、新たな製剤を作製した。
【０２７６】
週ベースで測定した評価項目
１．体重
月１回ベースで測定した評価項目
１．空腹時血中グルコースレベル
２．血清ＡＬＴ、ＡＳＴレベル*
３．血清トリグリセリドレベル*
*血清肝臓酵素およびトリグリセリドの監視は、Ｒｅｆｌｏｖｅｔ  Ｐｌｕｓ臨床化学分析システム（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）の測定によって行った。
【０２７７】
追加評価項目：
１．１日目および２４週目における空腹時血清インスリンレベル（ＥＬＩＳＡ）。
【０２７８】
２．８週目および２４週目におけるグルコース負荷試験（ＧＴＴ）
３．肝臓脂肪含有量（トリグリセリド）；屠殺後
４．肝臓組織像、屠殺後
５．血清サイトカインレベル（ＴＮＦ−α）、屠殺後（ＥＬＩＳＡ）。
【０２７９】
６．Ｔ細胞およびＴｒｅｇ（脾臓および肝臓）のサブセットのフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）。
【０２８０】
７．ＣＤ８−ＡＰＣ／ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ２５−ＰＥ／Ｆｏｘｐ３−ＰＥ−Ｃｙ７
８．ＣＤ３−ＦＩＴＣ／ＮＫ  １．１−ＡＰＣ
マウス屠殺（２４週目）の後：
サイトカイン分泌：  サイトカイン（ＴＮＦ−α）レベルを、処置マウスおよび対照マウスの血清中で、ＥＬＩＳＡによってＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ、米国）を使用して測定した。
【０２８１】
病理組織診断：  肝臓を切除し、次いで１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、薄片を作り、Ｈ＆Ｅおよびマソントリコーム（Mason trichome）（線維症の）で染色した。盲検化された病理学者が、ＮＡＳＨに特徴的な形態学的および組織病理学的変化について、光学顕微鏡によってＨ＆Ｅ組織を調べて、スコア化した。
【０２８２】
トリグリセリドの決定：  Ｆｏｌｃｈ方法の変法を使用して肝臓内における細胞内トリグリセリド（ＴＧ）の蓄積を定量化した。ＴＧを、瞬間凍結された肝臓のアリコートから抽出し、次いでＧＰＯ−Ｔｒｉｎｄｅｒキット（Ｓｉｇｍａ、Ｒｅｈｏｖｏｔ、イスラエル）を使用して分光光度法によってアッセイし、ホモジェネート中のタンパク質含有量に対して正規化した。
【０２８３】
ＦＡＣＳ分析を、脾臓から採取したＴ細胞およびＴｒｅｇのサブセットについて行った。
【０２８４】
結果
経口投与した、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の、血清酵素に対する効果を試験した。図１１において分かるように、阻害薬を発現する細胞の経口投与は、屠殺日（２４週目）において測定された場合、処置マウスにおいてＡＳＴレベルの減少をもたらした。ＡＬＴレベルの減少の傾向も、明白であった（データは示さず）。
【０２８５】
経口投与した、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の、血清トリグリセリド（ＴＧ）に対する効果を試験した。図１２において分かるように、阻害薬を発現する細胞の経口投与は、屠殺日（２４週目）において測定された場合、処置マウスにおいてＴＧレベルの有意な減少をもたらした。重要なことに、試験した全ての群において、体重増加の持続にもかかわらず、血清酵素およびＴＧに対する効果は明白であった（図１３）ので、得られた結果はＴＮＦＲ２：Ｆｃの治療有効性を裏付けている。
【０２８６】
次に、モデルマウスの肝臓および脾臓におけるＴ細胞亜集団の分布を、病理組織診断およびＦＡＣＳによって試験した。図１４は、肝臓Ｔｒｅｇの結果を示す。図から分かる通り、肝臓内Ｔｒｅｇは、高用量処置マウスにおいて有意に減少した。
【０２８７】
図１５は、肝臓ＮＫ細胞の結果を示す。図から分かる通り、肝臓内ＮＫ細胞は、高用量処置マウスにおいて有意に増加した。
【０２８８】
図１６は、脾臓／肝臓のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋比に対する、組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する植物細胞の経口投与の効果の結果を示している。図から分かる通り、Ｔｒｅｇ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋）に関する肝臓対脾臓の比の増加が認められた。生理食塩水処置マウスと比較して、０．５μｇのＰＲＸ−１０６はこの比を１０％増加させ、１０μｇのＰＲＸ−１０６はこの比を２２％増加させた。
【０２８９】
図１７は、脾臓／肝臓のＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋比に対する、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与の効果の結果を示す。図から分かる通り、脾臓対肝臓の比の相当な増加が、細胞の別のサブセット：ＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋細胞でも認められた。０．５ｇの低用量の薬物は、生理食塩水処置マウスと比較して、この比を７４％増加させた。
【０２９０】
これらの結果から、植物細胞中の組換えＴＮＦＲ２：Ｆｃの経口投与が、脂肪肝疾患のモデルとなるＨＦＤマウスにおいて、Ｔ細胞分布を変え、肝臓内対末梢（脾臓）のＴ細胞機能に影響を及ぼすことが示唆される。
【０２９１】
例５
マウスにおける毒性研究
方法
動物
試験開始時に８週の雄および雌のＳＤラット（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、イスラエル）を、標準実験室条件下で飼育した。試験開始時の平均体重はおおよそ、雄で６．８ｇ、雌で６．３ｇであった。動物は、市販のげっ歯類用飼料（Ｔｅｋｌａｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｇｌｏｂａｌ  １８％  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｅｔ  ｃａｔ＃：２０１８ＳＣ）を摂餌させ、加圧滅菌して酸性化した飲料水（ｐＨ２．５〜３．５）を自由に利用できるようにした。
【０２９２】
研究計画
１群当たり１２匹のラット（雄６匹および雌６匹）を含む３つの投薬群および１群当たり６匹のラット（雄３匹および雌３匹）を含む対照群の４つの群に割り当てた。各性において、対照群には希釈緩衝液（０．２Ｍマンニトール）を、３つの処置群にはＴＮＦＲ２：Ｆｃを発現する細胞をＴＮＦＲ２：Ｆｃ  ０．１、０．５および１ｍｇ／Ｋｇ体重の用量レベルで投与した。細胞を、要求される発現タンパク質の量に応じてアリコートとして分取した。各アリコートを、３０ｇの市販のげっ歯類用飼料粉末および希釈緩衝液と混合して、ペレットを作製した。対照ペレットは、希釈緩衝液および市販のげっ歯類用飼料粉末のみで作製した。全ての動物に、１４日間にわたって毎日、ペレットを経口的に摂餌させた。研究中に、死亡率および一般的な臨床観察を行い、体重を毎日監視した。研究終了時（１５日目）に、二酸化炭素吸入による浅麻酔の後、全ての動物の後眼窩洞全体から３つの血液試料を抜き取った。その後に、動物を屠殺し、病理診断を行い、選択された器官を収集した。
【０２９３】
結果
１４日間の安全性研究全体を通じて、有害な臨床症状は記録されなかった。全ての血液パラメーターは、正常な範囲内であって、有意な偏差はなかった。体重増加は、持続し、正常であり、群間（処置群または対照群）に有意差はなかった。細胞の発現は、安全であり、忍容性が良好であり、有害作用がないことが分かった。生化学パラメーターまたは臨床症状に対する影響は、認められなかった。肉眼的剖検観察により、病理所見は認められなかった。瀕死状態または重度の窮迫状態にある動物は、認められなかった。激痛または体重減少を示す動物は、観察されなかった。
【０２９４】
例６
ＰＲＸ−１０６の配列決定
Ｅｄｍａｎ分解によるＮ末端配列決定
分析は、Ａｌｐｈａｌｙｓｅ（デンマーク）ｕａｉｎｆ、ＡＢＩ  Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９４配列決定装置で行った。この手順は、エドマン分解化学反応によってタンパク質およびペプチドのＮ末端アミノ酸配列を決定するものである。エドマン分解は、アミノ酸残基を１つずつ切断してクロマトグラフィーによって同定する周期的な手順である。ここでは周期的手順の工程は３つである。工程１において、ＰＩＴＣ試薬を、アルカリ性条件下でＮ末端アミノ基にカップリングさせる。工程２において、Ｎ末端残基を、酸性媒体中で切断する。工程３において、ＰＩＴＣとカップリングした残基をフラスコに移し、ＰＴＨ残基に変換し、ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって同定する。次いで、次の周期を、次のＮ末端残基の同定のために開始する。
【０２９５】
結果：
配列は、ＬＰＡＱＶ（配列番号１８）と決定された。
【０２９６】
質量分析検出器に連結された逆相ＨＰＬＣによるアミノ酸配列の検証。
【０２９７】
配列決定は、Ｓｍｏｌｅｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−  Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｈａｉｆａ、イスラエル）で行われた。分析は、質量分析検出器に連結された逆相ＨＰＬＣを使用して行った。
【０２９８】
方法
タンパク質分解
分析試料を８Ｍ尿素、１００ｍＭ炭酸水素アンモニウム（ＡＢＣ）中に再懸濁させ、続いて２．８ｍＭ  ＤＤＴで還元し（６０℃で３０分間）、暗所で周囲温度においてさらに３０分間、１００ｍＭ  ＡＢＣ中８．８ｍＭヨードアセトアミドを用いて変性させた。２Ｍ尿素、２５ｍＭ  ＡＢＣ中で変性トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を１：５０の酵素対基質比で使用して、タンパク質を３７℃において一晩消化させた。
【０２９９】
質量分析による分析
トリプシンまたはキモトリプシンペプチドを、ステージチップ（手製Ｃ１８）を使用して脱塩し、残留緩衝液を蒸発させ、ペレットを０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸に再懸濁させた。得られたペプチド２０ｎｇを、Ｒｅｐｒｏｓｉｌ逆相材料（Ｄｒ  Ｍａｉｓｃｈ  ＧｍｂＨ、ドイツ）が充填された０．０７５×２００ｍｍ溶融シリカ毛細管（Ｊ  ａｎｄ  Ｗ）上での逆相クロマトグラフィーによって分離した。ペプチドを０．１％ギ酸水溶液を含む５から４５％のアセトニトリルの直線勾配で６０分間、続いて０．１％ギ酸水溶液を含む９５％アセトニトリルで１５分間、流速０．２５μｌ／分で溶離させた。イオントラップ質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｔｈｅｒｍｏ）においてポジティブモードでＭＳフルスキャンとそれに続く、１回目のＭＳスキャンから選択された７つの最もドミナントなイオンの衝突誘起解離（ＣＩＤ）を繰り返し使用して、オンライン質量分析を行った。質量分析データは、特異タンパク質由来データベースを使用するＤｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアバージョン１．３ソフトウェアを使用して分析した。
【０３００】
結果
配列を、エタネルセプト配列のペプチド配列と比較した。特定された配列を、以下の表Ｖに示す。参照配列の８４．８％のカバレッジが提示される（図２０、緑色を参照のこと）。
【表Ｖ−１】
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【表Ｖ−２】
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【表Ｖ−３】
0006622591.tif 000010
【表Ｖ−４】
0006622591.tif 000011
【表Ｖ−５】
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【表Ｖ−６】
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【０３０１】
本発明をその具体的な態様と関連して記載したが、多くの代替形態、変更形態および変形形態が当業者に明らかであることは、明白である。したがって、添付した特許請求の範囲の精神および広範な範囲に含まれるこのような全ての代替形態、変更形態および変形形態を包含することが意図される。
【０３０２】
本明細書中に記載した全ての出版物、特許および特許出願は、個々の出版物、特許または特許出願が参照によって具体的かつ個別に組み込まれていることが示された場合と同程度に、参照によって本明細書中に組み込む。加えて、本出願中のいずれの参考文献の引用または確認も、このような参考文献が本発明に対する先行技術として利用可能であると認めるものとはみなされない。セクションの表題が使用される限りでは、それらは必ずしも限定的であると解釈すべきではない。
以下に、出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、ＴＮＦαと関連する医学的状態を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の治療有効量を経腸的に投与し、それによってＴＮＦαと関連する前記医学的状態を治療することを含む方法。
［２］  肥満、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症および肝臓疾患または障害からなる群から選択される、ＴＮＦαと関連する医学的状態の経腸的治療のための、ＴＮＦαポリペプチド阻害薬を発現する植物細胞の使用。
［３］  前記経腸投与が経口投与である、［１］に記載の方法または［２］に記載の使用。
［４］  前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が抗ＴＮＦα抗体である、［１］に記載の方法または［２］に記載の使用。
［５］  前記抗ＴＮＦα抗体が、インフリキシマブ、アダリムマブまたはゴリムマブである、［４］に記載の方法または使用。
［６］  前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が、
（ｉ）ＴＮＦ受容体のＴＮＦα結合ドメインを含む第１のドメインと、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＦｃドメインを含む第２のドメインと
を含むキメラポリペプチドであって、前記第１のドメインと前記第２のドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に連続的翻訳によって融合されており、キメラポリペプチドがＴＮＦαに特異的に結合するキメラポリペプチドである、［１］に記載の方法または［２］に記載の使用。
［７］  前記キメラポリペプチドが、小胞体保留シグナルを含む第３のドメインをさらに含み、前記第１のドメイン、第２のドメインおよび第３のドメインがそれぞれ、Ｎ末端からＣ末端に連続的翻訳によって融合されている、［６］に記載の方法または使用。
［８］  前記第１のドメインのＮ末端に翻訳によって融合されている、小胞体シグナルペプチドをコードする追加のドメインを含む、［６］または［７］に記載の方法または使用。
［９］  前記シグナルペプチドが植物シグナルペプチドである、［８］に記載の方法または使用。
［１０］  前記植物シグナルペプチドが、配列番号４に示した通りである、［９］に記載の方法または使用。
［１１］  前記第１のドメインが、２００〜２５０アミノ酸長である、［６］または［７］に記載の方法または使用。
［１２］  前記第１のドメインが、アミノ酸配列ＬＣＡＰ（配列番号１１）およびＶＦＣＴ（配列番号１２）を含む、［１１］に記載の方法または使用。
［１３］  前記第１のドメインが、アミノ酸配列ＬＰＡＱＶＡＦＸＰＹＡＰＥＰＧＳＴＣ（配列番号１３）をさらに含む、［１２］に記載の方法または使用。
［１４］  前記第１のドメインが、配列番号２に示した通りである、［１３］に記載の方法または使用。
［１５］  前記免疫グロブリンがＩｇＧ1である、［６］または［７］に記載の方法または使用。
［１６］  前記第２のドメインが、配列番号９に示した通りである、［６］または［７］に記載の方法または使用。
［１７］  前記キメラポリペプチドが、配列番号６に示した通りである、［６］または［７］に記載の方法または使用。
［１８］  前記キメラポリペプチドが、配列番号７、２０４または２０５に示した通りである、［７］に記載の方法または使用。
［１９］  前記キメラポリペプチドが、ＴＮＦαによって誘導されるアポトーシスを阻害することができる、［６］または［７］に記載の方法または使用。
［２０］  前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が、植物特異的グリカンを含む、［１］または［２］に記載の方法または使用。
［２１］  前記植物特異的グリカンが、コアキシロースおよびコアα−（１，３）フコースからなる群から選択される、［２０］に記載の方法または使用。
［２２］  前記植物細胞が、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）植物細胞である、［１］または［２］に記載の方法または使用。
［２３］  前記ニコチアナ・タバカム植物細胞が、ブライトイエロー（ＢＹ−２）細胞である、［２２］に記載の方法または使用。
［２４］  前記植物細胞が凍結乾燥されている、［１］または［２］に記載の方法または使用。
［２５］  前記植物細胞が懸濁液中で成長させられる、［１］または［２］に記載の方法または使用。
［２６］  前記肝臓疾患または障害が、肝炎、肝硬変、肝臓がん、肝毒性、慢性肝臓疾患、脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からなる群から選択される、［１］または［２］に記載の方法または使用。
［２７］  前記肝毒性が、アセトアミノフェン、ＮＳＡＩＤＳ、グルココルチコイド、イスニアゼド（isniazed）、ヒ素、四塩化炭素および塩化ビニルからなる群から選択される化学薬剤によって誘導される、［２６］に記載の方法または使用。
［２８］  前記糖尿病が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病およびＬＡＤＡ疾患からなる群から選択される、［２６］に記載の方法または使用。
［２９］  前記植物細胞が、経口栄養形態で提供される、［１］または［２］に記載の方法または使用。
［３０］  前記経口栄養形態が、完全食、溶解用粉末、バー、ベークド製品、シリアルバー、デイリーバー、スナック食品、朝食用シリアル、ミューズリー、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー、チョコレートおよび乳製品である、［２９］に記載の方法または使用。
［３１］  前記肝臓疾患または障害が脂肪肝疾患である、［１］〜［２７］、［２９］または［３０］の何れか一項に記載の方法または使用。
［３２］  前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が、肝臓および脾臓のＴ細胞分布を変える、［３０］に記載の方法または使用。
［３３］  前記ＴＮＦαポリペプチド阻害薬が、血清酵素または代謝産物を低減する、［３０］に記載の方法または使用。
［３４］  前記血清酵素が、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）またはアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）である、［３０］に記載の方法または使用。
［３５］  前記代謝産物がトリグリセリドである、［３０］に記載の方法または使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
0006622591.tif 000020
【図６−２】
0006622591.tif 000021
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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