(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の増幅方法であって、
（ｉ）標的核酸を含有する細胞試料と接触させた溶解試薬を含有する含浸化学物質を含むセルロース系マトリックス固体支持体を反応容器に移す工程と、
（ｉｉ）固体支持体上の前記細胞試料を、該試料から核酸を溶出させるのに十分なｐＨが１３の溶液とインキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
（ｉｖ）増幅核酸を定量する工程と
を含み、
溶出方法が、増幅工程の前に、中和溶液を添加することをさらに含む、核酸の増幅方法。
【請求項２】
溶出した核酸が最小限の体積で含まれており、溶出した化学物質その他の細胞成分によって後段の分析手順が阻害されない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
インキュベートする前記工程（ｉｉ）を室温で行う、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
増幅方法が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
溶出した核酸がＤＮＡ種又はＲＮＡ種を含む、請求項３記載の方法。
【請求項６】
核酸が、ＲＮａｓｅ阻害剤及びα−シクロデキストリン存在下で増幅され、増幅が損失又は阻害を伴わずに効率的に起こる、請求項５記載の方法。
【請求項７】
核酸増幅試薬溶液は、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液及び１種以上のプライマーを含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
固体支持体の組成物は、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム、尿酸、ＥＤＴＡ又はＴｒｉｓ緩衝液を含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
工程（ｉ）の前に固体支持体が洗浄されない、請求項１乃至請求項８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
核酸がＤＮＡであって、当該方法が、さらに、
（ｖ）ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングを用いてＳＴＲプロファイルを作成することを含む、請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
核酸が、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであり、当該方法が、さらに、遺伝子発現分析を含む、請求項１乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅の分野に関し、特に、核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応の使用に関する。本発明は、核酸試料のワンステップ増幅のために、固体支持体（例えば、ＦＴＡ（商標）紙）とＰＣＲ試薬とを合わせることによる、核酸を増幅するために使用可能な方法及びキットを提供する。本発明は、長期間の保存及び簡単な核酸の処理における用途を有し、特に、遺伝子型判定、診断及び法医学に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、核酸を増幅するための分子生物学で一般的に使用されるツールである。米国特許第４６８３２０２号（Ｍｕｌｌｉｓ、Ｃｅｔｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、核酸又はその混合物に含まれる任意の望ましい特定の核酸配列を増幅させるプロセスを記載する。
【０００３】
濾紙又は化学的に改質されたマトリックスの上に核酸を長期間保存し、輸送し、保管することは、ＤＮＡ又はＲＮＡが抽出され、遺伝子分析（例えば、ＰＣＲ）に使用するための形態で単離される前に、遺伝子材料を保存するための周知の技術である。従って、欧州特許第１５６３０９１号（Ｓｍｉｔｈら、Ｗｈａｔｍａｎ）は、試料（例えば、細胞又は細胞溶解物）に由来する核酸を保存する方法に関する。核酸は、単離され、室温及び高湿度で、多種多様なフィルタ及び他の種類の固体支持体又は固相媒体の上で長期間保存される。さらに、本文書は、管、円筒形又は多層プレート中の広範囲の固体支持体上で核酸含有試料を保存するための方法を記載する。
【０００４】
国際公開第９０／０３９５９号（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）は、マトリックスに組み込まれるか、又はマトリックスに吸着されるＤＮＡが分解しないように保護する化合物又は組成物を含む固体マトリックスを含む、ＤＮＡ（血液ＤＮＡを含む）を保存するためのセルロース系固体支持体を記載する。本文書も、固体媒体を用いてＤＮＡを保存するための方法、また、ＤＮＡの回収又は系中での使用のための方法も開示する。
【０００５】
米国特許第５４９６５６２号（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）は、ＤＮＡ保存のためのセルロース系固体媒体及び方法を記載する。固体媒体の上でＤＮＡを保存し、輸送するための方法、及び（ａ）固体媒体からのＤＮＡの回収、又は（ｂ）固体媒体上でのＤＮＡの系中での使用（例えば、ＰＣＲによるＤＮＡ配列増幅）のいずれかを含む方法が開示される。残念なことに、記載されている方法は、固体媒体表面に界面活性剤又は洗剤が組み込まれているだけであり、従って、ＰＣＲを行う前に洗剤を除去するための別個の工程が必要となるという欠点がある。
【０００６】
欧州特許第２２９００９９号（Ｑｉａｇｅｎ）も、ＤＮＡを処理し、増幅する方法を記載する。この方法は、ＤＮＡを含有する試料を固体支持体に接触させる工程を含み、溶解試薬は、固体支持体に結合している。その後、ＤＮＡをＤＮＡ精製試薬で処理し、精製する。本出願は、固体支持体の上に封鎖剤を含まず、増幅前に溶解試薬を除去し、ＤＮＡを精製するために別個の工程が必要となる。
【０００７】
国際公開第９６／３９８１３号（Ｂｕｒｇｏｙｎｅ）は、遺伝子材料試料を保存し、その後に分析するための固体媒体を記載し、固体媒体は、タンパク質変性剤及びキレート化剤を含む。記載されている方法は、ＩＩ族及びＩＩＩ族の多価金属イオン及び遷移金属イオンを含む多価イオンを錯体化することができる任意の化合物であるキレート化剤についての方法である。この発明は、キレート化剤としてのシクロデキストリンを具体的に述べておらず、ＰＣＲ分析を１工程で行うことができることも示唆されていない。
【０００８】
米国特許第５７０５３４５号（Ｌｕｎｄｉｎら）は、試料を含有する細胞が溶解して核酸を放出し、抽出剤を中和するために試料がシクロデキストリンで処理される核酸調製方法を記載する。この系の利点は、従来の洗剤の除去が分離工程を必要とするが、洗剤を中和するためにシクロデキストリンを添加すると、分離工程の必要性がなくなり、汚染の機会が減るということである。
【０００９】
英国特許第２３４６３７０号（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ）は、核酸を含有する細胞を含む試料をフィルタに塗布し、細胞がフィルタに保持され、汚染物質は保持されないことを記載する。細胞はフィルタ上で溶解し、核酸は一緒に保持される。後の工程は、核酸を保持しつつ、細胞溶解物を濾別する。
【００１０】
国際公開第９６／１８７３１号（Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ）は、試料が固体支持体に結合し、試料を洗剤と接触させ、後の工程を実施して核酸を単離する、核酸を単離する方法を記載する。
【００１１】
国際公開第００／５３８０７号（Ｓｍｉｔｈ、Ｗｈａｔｍａｎ）は、遺伝子材料を含有する試料を保存し、溶解するための媒体を記載し、この遺伝子材料を溶出させ、分析することができる。この媒体は、溶解試薬でコーティングされている。これに加え、媒体を弱塩基、キレート化剤、界面活性剤、場合により尿酸でコーティングしてもよい。
【００１２】
国際公開第９９／３８９６２号（Ｈｅａｌｔｈ、Ｇｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）は、溶解試薬が結合した固体支持体を記載する。溶解試薬は、洗剤、キレート化剤、水、場合によりＲＮＡ消化酵素を含んでいてもよい。固体支持体は、シクロデキストリンを含まず、増幅分析のための核酸を精製するさらなる工程を必要とする。
【００１３】
ＤＮＡ増幅のための現行の方法は、ＤＮＡ精製手順を含み、この手順は、混入の機会を増やすいくつかの工程を含むことが多い。これは退屈なプロセスであり、従来の方法は、費用、複雑さ、特に、使用者の時間という観点で明らかな多くの欠点を有する。例えば、カラムに基づく核酸精製は、核酸を精製する典型的な固相抽出方法である。この方法は、緩衝液のｐＨ及び塩含有量に依存して、シリカ又は他の支持材に対する吸着による核酸の結合に左右される。適切な緩衝液の例としては、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液又はリン酸緩衝液（反応性アミンに起因して、ＤＮＡマイクロアレイ実験で用いられる）が挙げられる。このようなスピンカラムによる核酸の精製は、多くの複雑で煩わしい工程を含む。スピンカラムによる核酸精製は、典型的には、時間がかかる複雑な以下の３つの工程／段階を含む。
【００１４】
核酸を含有する試料をカラムに加え、核酸が、低いｐＨ（カラム上のシラノール基に対して）及び結合溶液の塩濃度に起因して結合し、緩衝液、変性剤（例えば、塩酸グアニジン）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、イソプロパノール及びｐＨ指示薬を含有していてもよい。
【００１５】
カラムを５ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ８．０）又は同様のもの、８０％ＥｔＯＨで洗浄する。
【００１６】
緩衝液又は水を用いてカラムを溶出させる。
【００１７】
代替法は、カオトロピック塩存在下、ＤＮＡがシリカ又はガラス粒子又はガラスビーズに結合するような核酸の結合を含む。この性質を使用し、ガラス粉末又はシリカビーズを用い、アルカリ性条件で核酸を精製した。典型的なカオトロピック塩としては、チオシアン酸グアニジニウム又は塩酸グアニジニウムが挙げられ、最近では、ガラスビーズが、ガラスを含有するミニカラムに置き換わっている。
【００１８】
法医学用途において、ＰＣＲ増幅を失敗しないようにする最良の防御は、妥当な試料取扱いと処理の技術を、効率的にＤＮＡを精製することがわかっている抽出系と合わせることである。
【００１９】
Ｓａｎｔｏｓ  Ｃ．Ｒ．ら、（Ｂｒａｚｉｌｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０１２、４３、３８９−３９２）は、核酸のＰＣＲ増幅前の溶出工程を省き、その混合物をＰＣＲ混合物に直接加える方法を記載する。このＰＣＲ増幅は、ＨＰＶ−ＤＮＡを検出するために行われ、増幅前に核酸を溶出させる標準的なＦＴＡ溶出カードプロトコルよりも効率がよかった。しかし、この方法は、ＨＰＶの存在を測定するための定性ＰＣＲのみを使用した。
【００２０】
Ｎｏｚａｗａ  Ｎ．ら、（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、４５、１３０５−１３０７）は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）を検出するためのリアルタイムＰＣＲを用いる方法を記載する。記載される方法は、精製されたＣＭＶを含む濾紙の使用を含み、これをＰＣＲ混合物に直接添加した。この論文は、光電子増倍管走査システムを備える装置のみが、フィルタディスクを含むリアルタイムＰＣＲアッセイのために使用可能であったことを注記していた。この論文は、濾紙が、電荷結合素子カメラを用いるときに装置に有害な影響を与え得ることを示唆しており、従って、ＡＢＩ７７００機のようなリアルタイムＰＣＲ機での濾紙の使用を除外するように教示している。
【００２１】
Ｑｉａｇｅｎ  Ｓａｍｐｌｅ＆Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ（２０１０年３月、１５）は、ＲＮＡ調製物の低いＡ260／Ａ230比が、下流にあるＰＣＲ処理に及ぼす影響を記載する。この新聞は、ＲＮＡ試料において、２３０ｎｍでの吸光度が増加しているのは、チオシアン酸グアニジン（ＦＴＡ溶出カードの一成分であり、ＲＮＡ精製手順で使用される）が混入しているためであることが非常に多いことを注記している。この実験は、チオシアン酸グアニジンが存在する場合には、ＲＮＡ試料のＡ260／Ａ230比が低くなるが、ＲＮＡ試料中のチオシアン酸グアニジンの濃度が１００ｍＭまでであれば、リアルタイムＰＣＲの信頼性に影響を与えなかったことを示す。
【００２２】
典型的には、標準的なＦＴＡ溶出カードプロトコルに含まれる精製工程は、煩わしい場合があり、精製によってＤＮＡの品質が失われることがある。従って、核酸を増幅し、定量し、及び／又はプロファイリングするための改良され、単純化されたプロセスが必要であり、これにより、精製工程の必要性がなくなる。本発明は、この問題に対処し、固体支持体（特に、セルロースから誘導される支持体）から核酸を１工程で増幅するために使用することができる方法及びキットを提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０４１０９３号パンフレット
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、固体支持体と核酸とを接触させ、ＤＮＡ試料を簡単に増幅させるために、固体支持体存在下、核酸を増幅させることによる、核酸を増幅させるために使用することができる方法及びキットを提供する。
【００２５】
本発明の第１の態様では、核酸の増幅方法であって、
（ｉ）標的核酸を含有する細胞試料と接触させた含浸化学物質を含む固体支持体を反応容器に移す工程と、
（ｉｉ）固体支持体上の核酸を、試料から核酸を溶出させるのに十分な高ｐＨ溶液とインキュベートする工程と、
（ｉｉｉ）核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
（ｉｖ）増幅核酸を定量する工程と
を含む方法を提供する。
【００２６】
一実施形態では、本方法は、さらに、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングを用いてＳＴＲプロファイルを作成することを含む。
【００２７】
特定の実施形態では、高ｐＨ溶液は、ｐＨが約１０〜約１４の溶液である。好ましい実施形態では、高ｐＨ溶液は、ｐＨが約１１〜約１３．５の溶液である。最も好ましい実施形態では、高ｐＨ溶液は、ｐＨが約１２〜約１３の溶液である。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、溶出した核酸又は変性した核酸は、最小限の体積（例えば、５〜２００マイクロタイター）に含まれ、これより少ないと、溶出した化学物質及び他の細胞成分が、その後の分析手順を阻害する。
【００２９】
本発明の別の実施形態では、本発明の方法は、さらに、このようにして作られた最小限の体積が、その下流の分子生物学用途を可能にするような中和溶液の添加を含む。
【００３０】
本発明の別の実施形態では、溶出した核酸は、ＤＮＡ種又はＲＮＡ種を含む。特定の実施形態では、核酸は、増幅が効率的に起こり、損失又は阻害が起こらないように、ＲＮａｓｅ阻害剤及びα−シクロデキストリン存在下で増幅される。
【００３１】
本発明の別の実施形態では、溶出した核酸は、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡであり、本方法は、さらに、遺伝子発現分析を含む。
【００３２】
本発明のさらに別の実施形態では、提案される増幅方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００３３】
さらになお、本発明の方法では、核酸増幅試薬溶液は、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液及び１種以上のプライマーを含み、プライマーは、場合により、色素で標識される。
【００３４】
別の実施形態では、固体支持体の組成物は、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、塩酸グアニジン、ドデシル硫酸ナトリウム、尿酸、ＥＤＴＡ又はＴｒｉｓ緩衝液を含む。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、工程（ｉ）の前に固体支持体が水溶液で洗浄される。
【００３６】
さらになお、本発明の一実施形態は、ガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体、セルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、酸化シリカ、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ウール及び多孔質セラミックからなる群から選択される固体支持体を含む。
【００３７】
別の実施形態では、固体支持体は、セルロース系マトリックスである。
【００３８】
別の実施形態では、セルロース系マトリックスは、プレパンチ（prepunched）ディスクの形態である。
【００３９】
なおさらなる実施形態は、セルロース系マトリックスが、ＦＴＡ（商標）又はＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅカードの形態であるものを提供する。
【００４０】
別の実施形態では、核酸は、工程（ｉ）の前に固体支持体の上で保存される。
【００４１】
一実施形態では、核酸は、固体支持体の上で少なくとも３０分保存される。核酸を、固体支持体の上に長期間、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも７日間、少なくとも３０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも１年間、少なくとも１０年間固定してもよい。この様式で、核酸は、その後の分析に適切な乾燥した形態で保存されてもよい。典型的には、試料は、−２００℃〜４０℃の温度で保存される。それに加え、保存された試料は、場合により、乾燥した状態又は乾燥して粉状にした状態で、又は不活性雰囲気下で保存されてもよい。
【００４２】
本発明の別の態様では、核酸の増幅方法であって、
（ｉ）カオトロピック塩を含む固体支持体を、核酸を含有する細胞試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）固体支持体を反応容器に移す工程と、
（ｉｉｉ）固体支持体上の核酸を、核酸増幅試薬溶液とインキュベートする工程と、
（ｉｖ）核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
（ｖ）増幅核酸を定量する工程と、場合により、
（ｖｉ）ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）プロファイリングを用いてＳＴＲプロファイルを作成する工程と
を含んでいて、固体支持体存在下で、工程（ｉ）〜（ｖｉ）が実施される、方法が提供される。
【００４３】
固体支持体存在下で核酸を増幅させる利点は、核酸増幅に必要な工程の数を減らすことであり、それにより、操作時間の節約となり、操作者の使用が容易になる。別の利点は、特に、試料量が少ないときに、標的核酸の損失を避けることである。
【００４４】
本発明の一態様では、固体支持体は、細胞試料を加える前に、既に反応容器に入っている。
【００４５】
別の態様では、増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００４６】
別の態様では、増幅方法は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、等温増幅又は定量的ポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００４７】
さらなる態様では、核酸増幅試薬溶液は、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、反応緩衝液及び１種以上のプライマーを含み、プライマーは、場合により、色素で標識される。このような染料は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の蛍光染料ＦＡＭ（商標）又はＣｙＤｙｅ  ＤＩＧＥ  Ｆｌｕｏｒ（商標）を含んでいてもよい。核酸増幅試薬溶液は、乾燥した形態、例えば、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ（商標）（ＲＴＧ）フォーマットで存在していてもよい。ポリメラーゼ連鎖反応試薬の乾燥した配合物又は凍結乾燥した配合物の利点は、水を加えることによって簡単に可溶化させることができることであり、そのため、操作時間の節約となり、操作者の使用を容易にする。操作者の間違いを最小限にするために、乾燥した試薬混合物を反応容器（例えば、マルチウェルプレートのウェル）に前もって分注しておいてもよい。このようなＲＴＧ混合物の例としては、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能なＩｌｌｕｓｔｒａ  Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ  ＲＴ−ＰＣＲビーズが挙げられる。
【００４８】
さらなる態様では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。「核酸」という用語は、本明細書で、「ヌクレオチド」という用語と同義に用いられ、ＤＮＡ、例えば、プラスミドＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ；ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓＲＮＡ及びＲＮＡｉ；及びタンパク質核酸、ＰＮＡを含む。
【００４９】
一態様では、カオトロピック塩は、グアニジン塩である。
【００５０】
別の態様では、グアニジン塩は、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン及び塩酸グアニジンからなる群から選択される。
【００５１】
一態様では、カオトロピック塩は、ナトリウム塩、例えば、ヨウ化ナトリウムである。
【００５２】
別の態様では、固体支持体を工程（ｉ）の後、水溶液で洗浄する。
【００５３】
一態様では、固体支持体は、ガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体、セルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、酸化シリカ、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ウール及び多孔質セラミックからなる群から選択される。
【００５４】
さらなる態様では、セルロース系マトリックスは、プレパンチディスクの形態である。
【００５５】
別の態様では、セルロース系マトリックスは、ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅカードの形態である。
【００５６】
別の態様では、セルロース系マトリックスは、ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ（商標）Ｅｌｕｔｅ（ｉＦＴＡｅ）カードを示す形態であり、染料は、生体試料の存在を示す。
【００５７】
一態様では、増幅核酸は、ＰＣＲイメージングシステムで定量される。
【００５８】
一態様では、細胞試料は、真核細胞又は原核細胞、ウイルス、細菌、植物及び組織培養細胞からなる群から選択される。
【００５９】
別の態様では、細胞試料は、血液、血清、精液、脳脊髄液、滑液、リンパ液、唾液、口腔細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、尿、糞、毛髪、皮膚及び筋肉からなる群から選択される。細胞試料は、哺乳動物、鳥類、魚類、植物又はこれらの細胞培養物に由来していてもよい。好ましくは、細胞試料は、哺乳動物由来であり、最も好ましくは、ヒト由来である。核酸を含有する試料は、任意の供給源に由来していてもよい。この供給源としては、例えば、生理学的／病理学的体液（例えば、分泌物、排泄物、滲出液）又はヒト及び動物の細胞懸濁物；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁物；細菌、真菌、プラスミド、ウイルス、プリオンなどの液体生成物、抽出物又は懸濁物；ヒト又は動物の体組織（例えば、骨、肝臓、腎臓など）の液体抽出物又は均質物；ＤＮＡ合成又はＲＮＡ合成からの媒体、化学合成又は生物化学合成によるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；及びＤＮＡ又はＲＮＡが液体媒体中にあるか、又は液体媒体中であってもよい任意の多の供給源が挙げられる。
【００６０】
さらなる態様では、本方法は、分子診断ツール、ヒト同定ツール、法医学ツール、ＳＴＲプロファイリングツール及びＤＮＡプロファイリングからなる群から選択されるツールとして使用するためのものである。
【００６１】
別の態様では、核酸は、工程（ｉｉ）の前に固体支持体の上で保存される。
【００６２】
一態様では、核酸は、固体支持体の上で少なくとも３０分保存される。核酸を、固体支持体の上に長期間、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも７日間、少なくとも３０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも１年間、少なくとも１０年間固定してもよい。この様式で、核酸は、その後の分析に適切な乾燥した形態で保存されてもよい。典型的には、試料は、−２００℃〜４０℃の温度で保存される。それに加え、保存された試料は、場合により、乾燥した状態又は乾燥して粉状にした状態で、又は不活性雰囲気下で保存されてもよい。
【００６３】
本発明の方法を、１本の管中で、又はＢａｒｏｎら、（２０１１、Ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、９３、ｅ５６０−ｅ５６１）に記載されるように自動化試料処理と組合せて高スループット９６ウェルフォーマットで使用してもよい。この手法は、最低限の数の工程を含み、試料のスループットが高い。この手順は、現在使用されている、もっと労働集約的なキット（例えば、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）に関連するプロトコルと比較して、操作の数が少ないため、操作者に誘発される誤りの危険性（例えば、相互混入）も減る。この手順に必要な操作が少ないため、試料を混ぜてしまう危険性も減る。重要なことに、本方法は、高スループットスクリーニングのためのマルチウェル形態に簡単に変換することができる。従って、本発明は、遺伝子を調べるのを補助するためにＰＣＲ反応を行うための試料処理を改良することができる。本発明は、９６ウェル／高スループットフォーマットで行うことができ、試料の取扱いが容易になるため、試料のバッチ処理の必要がない。
【００６４】
さらなる態様では、反応容器は、マルチウェルプレート中のウェルである。マルチウェルプレートは、６、１２、２４、９６、３８４ウェルを含め、種々のフォーマットで利用可能である。（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３８４ウェルマルチウェルプレート中、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００６５】
一態様では、固体支持体から円板をパンチによって抜くか、又は切断することによって、試料を反応容器に移す。固体支持体から一部又は円板をパンチによって抜くことは、例えば、Ｈａｒｒｉｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｎｃｈ（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）のようなパンチの使用によって行うことができる。
【００６６】
本発明の別の態様では、核酸の増幅方法であって、
（ｉ）溶解試薬を含む固体支持体を、核酸を含有する細胞試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）固体支持体を反応容器に移す工程と、
（ｉｉｉ）固体支持体上の核酸を、核酸増幅試薬溶液とインキュベートする工程と、
（ｉｖ）核酸を増幅して、増幅核酸を生じさせる工程と、
（ｖ）場合により、増幅核酸を定量する工程とを含み、
固体支持体存在下で、工程（ｉ）〜（ｖ）が実施される、方法が提供される。
【００６７】
一態様では、固体支持体は、細胞試料を加える前に、既に反応容器に入っている。
【００６８】
別の態様では、増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。
【００６９】
別の態様では、溶解試薬は、界面活性剤、洗剤及びカオトロピック塩からなる群から選択される。
【００７０】
別の態様では、溶解試薬は、ドデシル硫酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジン、塩化グアニジン、塩酸グアニジン及びナトリウムヨージドからなる群から選択される。
【００７１】
さらなる態様では、固体支持体は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び尿酸を含浸している。
【００７２】
一態様では、固体支持体は、予め孔があけられたＦＴＡ（商標）円板の形態である。
【００７３】
別の態様では、セルロース系マトリックスは、ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ（商標）（ｉＦＴＡ）カードを示す形態であり、染料は、生体試料の存在を示す。
【００７４】
別の態様では、固体支持体は、ガラス又はシリカ系固相媒体、プラスチック系固相媒体又はセルロース系固相媒体、ガラス繊維、ガラスマイクロファイバー、シリカゲル、酸化シリカ、ニトロセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリエステル、ポリアミド、炭水化物ポリマー、ポリプロピレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフッ化ビニリデン、ウール又は多孔質セラミックからなる群から選択される。
【００７５】
別の態様では、工程（ｉ）の後に固体支持体が水溶液で洗浄される。
【００７６】
一態様では、増幅核酸は、ＰＣＲイメージングシステムで定量される。
【００７７】
一態様では、細胞試料は、真核細胞又は原核細胞、ウイルス、細菌、植物及び組織培養細胞からなる群から選択される。
【００７８】
別の態様では、細胞試料は、血液、血清、精液、脳脊髄液、滑液、リンパ液、唾液、口腔細胞、子宮頸部細胞、膣細胞、尿、糞、毛髪、皮膚及び筋肉からなる群から選択される。細胞試料は、哺乳動物、鳥類、魚類、植物又はこれらの細胞培養物に由来していてもよい。好ましくは、細胞試料は、哺乳動物由来であり、最も好ましくは、ヒト由来である。核酸を含有する試料は、任意の供給源に由来していてもよい。この供給源としては、例えば、生理学的／病理学的体液（例えば、分泌物、排泄物、滲出液）又はヒト及び動物の細胞懸濁物；植物の生理学的／病理学的液体又は細胞懸濁物；細菌、真菌、プラスミド、ウイルス、プリオンなどの液体生成物、抽出物又は懸濁物；ヒト又は動物の体組織（例えば、骨、肝臓、腎臓など）の液体抽出物又は均質物；ＤＮＡ合成又はＲＮＡ合成からの媒体、化学合成又は生物化学合成によるＤＮＡ又はＲＮＡの混合物；及びＤＮＡ又はＲＮＡが液体媒体中にあるか、又は液体媒体中であってもよい任意の多の供給源が挙げられる。
【００７９】
さらなる態様では、本方法は、分子診断ツール、ヒト同定ツール、法医学ツール、ＳＴＲプロファイリングツール及びＤＮＡプロファイリングからなる群から選択されるツールとして使用するためのものである。
【００８０】
別の態様では、核酸は、工程（ｉｉ）の前に固体支持体の上で保存される。
【００８１】
一態様では、核酸は、固体支持体の上で少なくとも３０分保存される。核酸を、固体支持体の上に長期間、例えば、少なくとも２４時間、少なくとも７日間、少なくとも３０日間、少なくとも９０日間、少なくとも１８０日間、少なくとも１年間、少なくとも１０年間固定してもよい。この様式で、核酸は、その後の分析に適切な乾燥した形態で保存されてもよい。典型的には、試料は、−２００℃〜４０℃の温度で保存される。それに加え、保存された試料は、場合により、乾燥した状態又は乾燥して粉状にした状態で、又は不活性雰囲気下で保存されてもよい。
【００８２】
本発明の方法を、１本の管中で、又はＢａｒｏｎら、（２０１１、Ｆｏｒｅｎｓｉｃｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、９３、ｅ５６０−ｅ５６１）に記載されるように自動化試料処理と組合せて高スループット９６ウェルフォーマットで使用してもよい。この手法は、最低限の数の工程を含み、試料のスループットが高い。この手順は、現在使用されている、もっと労働集約的なキット（例えば、ＱＩＡｍｐ  ＤＮＡ血液ミニキット、Ｑｉａｇｅｎ）に関連するプロトコルと比較して、操作の数が少ないため、操作者に誘発される誤りの危険性（例えば、相互混入）も減る。この手順に必要な操作が少ないため、試料を混ぜてしまう危険性も減る。重要なことに、本方法は、高スループットスクリーニングのためのマルチウェル形態に簡単に変換することができる。従って、本発明は、遺伝子を調べるのを補助するためにＰＣＲ反応を行うための試料処理を改良することができる。本発明は、９６ウェル／高スループットフォーマットで行うことができ、試料の取扱いが容易になるため、試料のバッチ処理の必要がない。
【００８３】
さらなる態様では、反応容器は、マルチウェルプレート中のウェルである。マルチウェルプレートは、６、１２、２４、９６、３８４ウェルを含め、種々のフォーマットで利用可能である。（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３８４ウェルマルチウェルプレート中、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【００８４】
一態様では、固体支持体から円板をパンチによって抜くか、又は切断することによって、試料を反応容器に移す。固体支持体から一部又は円板をパンチによって抜くことは、例えば、Ｈａｒｒｉｓ  Ｍｉｃｒｏ  Ｐｕｎｃｈ（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｃ．；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）のようなパンチの使用によって行うことができる。
【００８５】
本発明の第３の態様では、本明細書で既に記載したような核酸を増幅するためのキットと、これに使用するための指示書が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅ（複製物１番）のＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイルを表す。
【図２】未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅ（複製物２番）のＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイルを表す。
【図３】未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅ（複製物３番）のＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイルを表す。
【図４】コントロールＤＮＡ試料のＰＣＲ増幅からのＳＴＲプロファイルを表す。
【図５】洗浄した血液をスポットしたｉＦＴＡｅを直接増幅させるｑＰＣＲ増幅からのＤＮＡ収率を表す。
【図６】未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅを直接増幅させるか、又は溶出させた後のｑＰＣＲ増幅からのＤＮＡ収率を表す。
【図７】最適化したＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用いてＦＴＡカードを周囲条件で保存するために適用される均質化した博物館試料からのＤＮＡ標的の増幅を表す。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
本発明の提案した方法の潜在的な用途としては、限定されないが、以下に示すものが挙げられる。
（ｉ）法医学的ワークフロー自動化
最近の実験結果は、ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓと呼ばれる非洗浄最適化法によって、典型的な自動化ＨＩＤワークフローにおいて、効率的で損失がなく、減少がないプロセスが可能であることを示している。一般的に、当該産業は、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｌｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ又はＰｏｗｅｒｐｌｅｘ  １８Ｄワークフローのいずれかにおいて、１．２ｍｍ  ＦＴＡパンチを使用し、非洗浄ＦＴＡパンチに含まれる洗剤化学物質を克服するために、特殊な増幅反応混合物及び酵素を配合した。この洗剤の量でのポリメラーゼは、上のようにしなければ変性し、ＳＴＲ反応が非効率になる。典型的な方法は、特殊なＳＴＲ配合物を含有し、合計体積が１０〜２５μｌの１つの管又はウェルに１つの１．２ｍｍパンチを直接加えることに基づく。対照的に、本発明は、かなりの量のＤＮＡが一本鎖になる高ｐＨ溶出緩衝液に１つの１．２ｍｍパンチを加えることを提案し、溶液の体積全体に迅速に拡散する。約８〜１０分の短い時間中に、所定体積の中和剤を加え、合わせて合計で１００〜２００μｌの体積を得て、これには約０．０５〜０．２ｎｇ／μｌのゲノムＤＮＡが含まれている。次いで、このＤＮＡストック溶液を多段階ＳＴＲ反応に使用することができ（Ｐｏｗｅｒｐｌｅｘ  １６ＨＳを用いる例を開示する）、５〜１０μｌを複数回取り出し、並行反応に加えることができる。任意の分子生物学手順のための複製及びアンプリコンの適用のために、この溶液の一部をｑＰＣＲ反応又は一般的なＰＣＲ反応に加えることも可能である。特に関係があるのは、本発明が、１．２ｍｍパンチを利用せずに、おそらく２ｍｍ又は３ｍｍのパンチを使用し、自動化ワークフローを確立することができる能力であり、化学量論比率の高ｐＨ溶出緩衝液と中和剤を再び使用し、約１０分間の処理時間で、顕著に多くのＤＮＡを生じる。この特徴は、消耗品であるプラスチックワイヤによって生じる静電放電に起因して、自動化システムへのパンチの置き違えを確実に防ぐには、１．２ｍｍパンチの操作は困難であり、特別な注意が必要であることを認識するとき、重要になる。本明細書に記載したように、高体積溶出に基づく容易なシステムが開発されたため、特別に配合されたＰＣＲ試薬又はＳＴＲキット又は自動化された洗浄に頼ることなく、法医学で迅速なワークフローを利用することができ、非常に小さなパンチの静電放電による置き違えに起因するパンチの損失を避けることができる。ＦＴＡパンチの表面をこするための研磨棒をさらに使用し、高ｐＨ溶出溶液への直接的な置き換えによって、洗浄又は特別に配合された増幅反応物に頼ることなく、このプロセスの小型化が改良される。
【００８８】
現在、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、血中循環核酸（ＣＮＡ）、種々の種類の低分子ウイルスゲノム及びフラグメント化されたＤＮＡを含め、低分子量の核酸種を含む新しくスポットされた白血球の中に見出すことができる多くの種類の核酸が存在する。しかし、能動的な洗浄及び変性化学物質の除去を教示するか、又はこれに依存する従来法は、このような低分子量種をセルロースフィルタ及び他の膜に維持するのには適していない。結果として、このような洗浄工程が単純にこのような核酸種を洗い流してしまい、それによって、検出戦略を適用する前に核酸種の損失が生じる一定のおそれがある。本発明の特徴は、この損失をなくすことである。
【００８９】
能動的な洗浄及び変性化学物質に依存する従来の方法から生じる損失を修正することができる代表的な核酸種としては、ＣＮＡが挙げられる。ＣＮＡは、低分子量のヌクレオソームから誘導されるＤＮＡの集合であり、典型的には、２００ｂｐ未満であり、無細胞ＤＮＡであると記載される。胎児の循環血中に特異的な配列が検出され、この配列は、母体血漿の全ＤＮＡの一部を構成し、まだ生まれていない胎児から発生している可能性がある。このため、科学業界では、これを「胎児の遺伝子の変動（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｎ  ｆｅｔａｌ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」と考えるため、胎児の危険性にある程度関連する羊水穿刺をすることは困難である。この発見は、単純に母体の血液試料の分析に基づく非侵襲性の出産前診断手法を開発することに対する研究者の興味を損なわせるかもしれないが、種々の技術の課題は、スタンドアロン型の非侵襲性の診断技術の開発を妨げる。例えば、大きな問題は、母体の血漿において、同時に存在する母体ＤＮＡのバックグラウンドから胎児ＤＮＡを区別する能力であった。妊娠中、胎児ＤＮＡは、母体血漿中の全ＤＮＡの約３〜６％を占める。これらの条件は、分析に十分な量の胎児ＤＮＡを達成するのに、非常の多くの試料の処理及び濃縮を必要とする。胎児ＤＮＡに対する母体ＤＮＡの高い比率は、さらに、異数性のような複製物の数の変動を調べようとする場合には、この後の検出方法を混乱させる場合がある。検出方法及び配列決定に適用する場合、この濃縮は非常に顕著であり、現時点で入手可能なものよりも妊娠初期でもっと正確な試験結果を得ることができる。Ｐｅｔｅｒ  Ｂｒｉａｎ  Ｇａｈａｎ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ：ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ＥＰＭＡ  Ｊ．２０１０  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ；１（３）：５０３−５１２。
【００９０】
従来技術は、循環ＤＮＡの分析の診断上の信頼性は、標的配列の分画濃度、分析の感度及び特異性によって変わることもわかる。循環ＤＮＡ種間の１つのヌクレオチドの差を信頼性高く区別することは、技術的な課題であり、高感度の採用が必要となり、特異的な分析システムは、科学文献を詠めば非常に明確になる。例えば、ヒトの血漿及び血清中に存在する核酸の生物学的用途及び診断用途を記載する、Ａｎｋｅｒ、Ｐ．、Ｍｕｌｃａｈｙ、Ｈ．＆Ｓｔｒｏｕｎ、Ｍ．（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １０３、１４９−１５２．ｐｍｉｄ：１２４５５０２７、及びＬｏ、Ｙ．Ｍ．Ｄ．、Ｃｈｉｕ、Ｒ．Ｗ．Ｋ．＆Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｐ．Ｊ．、ｅｄｓ．（２００１）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ  ｏｒ  Ｓｅｒｕｍ  ＩＩ、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．９４５（Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。母体血漿での胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡのわずかな（例えば、１塩基の）違いを信頼性高く区別することは、今までは技術的な課題であり、Ｎａｓｉｓ、Ｏ．、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｓ．、Ｈｏｎｇ、Ｔ．、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ、Ｍ．、Ｒａｄｃｌｉｆｆｅ、Ｓ．、Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｌ．＆Ｏｔｅｖｒｅｌ、Ｔ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５０、６９４−７０１）から明らかである。ＰＮＡＳ  Ｊｕｌｙ  ２０、２００４  ｖｏｌ．１０１  ｎｏ．２９  １０７６２−１０７６７も参照。
【００９１】
当該技術は、種々の特性についての非侵襲性のＰＣＲに基づく出生前遺伝子検査の開発を示す種々の他の例とともに生み出される。しかし、このような試験に付随する問題は、ＰＣＲに基づくアッセイが、感度と特異性がトレードオフの関係にあり、特定の変異を同定することを難しくしていることである。さらに、ＰＣＲの統計的な性質に起因して、試料（例えば、母体組織又は体液から得た試料中の胎児の核酸）中に少量存在する分子集合が、多くは、過剰にみられる。実際に、最初の数回の増幅では、まれな核酸は増幅しない場合、徐々に、そのまれな事象でさえ検出されることは徐々にあり得なくなっていく。同様に、核酸の大きさが小さいため、母体試料中の胎児の核酸が変性し、ＰＣＲ増幅によって修正されない可能性もある。米国特許出願公開第２０１０／０２１６１５３号。
【００９２】
無細胞核酸は、癌、糖尿病、鎌状赤血球症、自己免疫疾患、心筋梗塞、多発性硬化症などによって例示される種々の疾患のバイオマーカー、特に、激しい運動、血液透析、妊娠のような生理学的状態のバイオマーカーとして提案されてきた。さらに、無細胞核酸の存在又は非存在は、例えば、外傷、日焼け、敗血症のようなある種の臨床状体にも関係がある。実際に、ＣＮＡは、多くの生体液、例えば、血液、尿、糞、母乳、気管支洗浄液及び腹水で検出されている。欧州特許出願公開第２４２６２１７号を参照。
【００９３】
胎児異数性（例えば、ダウン症候群、エドワーズ症候群及びパトー症候群）及び他の染色体異常は、１０００生児出生に９人発生している（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．９４２、２００２）。染色体異常は、一般的に、侵襲的手法（例えば、絨毛生検又は羊水穿刺）によって得られる胎児細胞の染色体分析によって診断される。これらの手法は、胎児にも母体にも大きなリスクを伴う可能性がある。母体血清マーカー又は超音波を用いる非侵襲的スクリーニングが利用可能であるが、信頼性が劣る（Ｆａｎら、ＰＮＡＳ、１０５（４２）：１６２６６−１６２７１、２００８）。今後、無細胞核酸（例えば、循環核酸、例えば、ＤＮＡ（ｃｉｒＤＮＡ）又はｃｉｒＲＮＡ）の検出が、既存の試験を補うものとして、特定の病理学的又は生理学的状態の診断、がんの予後及び経過観察、個々の患者の治療方針の選択、集団検診を可能とする非侵襲の画期的な技術となるだろう。
【００９４】
研究者らは、がんのときの壊死及びアポトーシスのプロセスによって、腫瘍から無細胞ＤＮＡが放出され、その結果、健康な個人では非常に少量しか存在しない無細胞ＤＮＡが顕著に増加し、この増加が、さらに精密な診断／治療介入が必要であるとのシグナルになり得るのではないかと考えている。Ｈｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒ  Ｓ、Ｂｕｒｇｅｓ  Ａ、Ｒｅｉｃｈ  Ｏら、ＤＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｎｄ  ｂｅｎｉｇｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．２００８；１１３７：１６２−７０．ｄｏｉ：１０．１１９６／ａｎｎａｌｓ．１４４８．０１３。乾燥した血液スポットに適用される従来のプロトコルを用いる洗浄手順では、これらの価値が高いバイオマーカーが失われてしまう場合がある。本発明の方法を使用すると、さらなる研究のために、これらの非常に小さな分子量のヌクレオソームから誘導されるＤＮＡを保存するのに役立つだろう。有望な事例として、胃腸がんにおいて、ヌクレオソームの量が、腫瘍のステージ及び転移の存在と相関関係にあるという例がある。Ｕｍｅｔａｎｉ  Ｎ、Ｋｉｍ  Ｊ、Ｈｉｒａｍａｔｓ  Ｓら、Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００６；５２：１０６２−９．ｄｏｉ：１０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ．２００６．０６８５７７。
【００９５】
さらに、ＣＮＡのような循環ヌクレオソームは、化学療法及び放射線療法の最中の進行性疾患と関係していると思われるが、一定して高い値であるか、又は値が増加しているところ、疾患が緩解した患者では、主に、値の大きな低下がみられるので、細胞障害性療法をモニタリングするときにも使用できそうである。実際に、前出のＨｏｌｄｅｎｒｉｅｄｅｒは、肺、膵臓及び結腸直腸のがん患者及び血液悪性腫瘍患者において、化学療法及び放射線療法の１週目のヌクレオソームの値によって治療の転帰を暗示することができることを報告している。
【００９６】
同様に、研究者らは、組織損傷又は炎症応答の結果として、血液中の遊離ＤＮＡ量の増加が、細胞死と相関関係にあることも観察している。実際に、遊離ＤＮＡ量を調べることが、自己免疫性疾患、卒中、癌及び心血管疾患を含む多くの疾患の有効な予後指標であると考えられる。しかし、循環ＤＮＡの量を定量的に評価する方法は、高価であり、時間がかかり、信頼性が低い。米国特許出願公開第２０１０／０２１６１４５号を参照。
（ｉｉ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ
まれに、ｍｉｃｒｏＲＮＡのように圧倒的な量の関心を得る新しい研究領域がある。実際に、過去２０年の間に、真核性遺伝子制御の分野は、一部にはＲＮＡが介在する遺伝子サイレンシングの発見によって、大きく様変わりした。真核生物での大部分の遺伝子制御は、ＲＮＡ分子レベルで起こる。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と呼ばれる内因性制御ＲＮＡ分子群は、全ヒト遺伝子の約３０％の制御に関与していると思われる。これらの「小さなＲＮＡ」分子（ｓＲＮＡ）は、がん、糖尿病又は神経性障害の進行にも、何らかの役割を果たす。
【００９７】
ｍｉｃｒｏＲＮＡは、小さな制御ＲＮＡ群であり、典型的には、２０〜３０ｎｔ長であり、制御された細胞分化又は制御不能の細胞分化を含め、健康及び疾患に関わっている。ｍｉｃｒｏＲＮＡは、一連のＲＮＡプロセシング工程の結果として、ｍｉＲＮＡ前駆体から細胞内で発生する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、翻訳の抑制及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の変性の両方によって、遺伝子発現を制御することが示されている。これらの小さなノンコーディングＲＮＡは、典型的には、複数の遺伝子を同時に標的とし、標的遺伝子の発現をわずかではあるが確実に誘発し、発現量を変える。これらの生物学的原理に関するいくつかの基本的な問題は、まだ答を探しているところであるが、ｍｉｃｒｏＲＮＡの多くの特異的な特徴は、圧倒的な治療効能データ、ヒト疾患への明らかな関与と組合せて、バイオテクノロジー業界がｍｉｃｒｏＲＮＡを治療の対象物であると考える可能性を探求し始めるきっかけとなっている。
【００９８】
その結果、１００程度のヌクレオチド、又は多くの生物のさまざまな細胞及び培養した細胞から得たもっと少ないヌクレオチドについて、小さなＲＮＡｓ−ＲＮＡ分子の研究は、現在非常に関心が高い分野であり、将来的にも間違いなく関心が高いままであろう。Ｂｒｅｎｎｅｃｋｅ、Ｊ．ら、ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌ．３（３）：Ｐ８５（２００５）。疾患に関連するｍｉＲＮＡ発現パターンの変化は、新しい予後判断及び診断の機会を与え、臨床マーカーの可能性も与えるだろう。
【００９９】
種々の疾患を治療するための治療薬剤としてのｍｉＲＮＡの有用性は、当該技術分野で、例えば国際公開第２００９／１２６６５０号に記載されており、血管形成を調整するためのｍｉ−１２６及びｍｉ−１２６阻害剤の使用が開示されている。国際公開第２００８／１３７８６７号（８６７号）は、がんを治療するためのｍｉＲ−３４治療薬剤を含む組成物を記載している。Ｃｏｇｓｗｅｌｌ  Ｊ．Ｐら、Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  ｄｉｓｅａｓｅ、１４、ｐ２７−４１、２００８は、アルツハイマー病の脳及びＣＳＦにおけるｍｉＲＮＡの変化を同定し、推定バイオマーカーを得て、疾患経路への洞察を記載している。国際公開第２００８／１３７８６７号は、ｍｉＲＮＡ発現が、アルツハイマーのＣＳＦを変え、正常な場合とアルツハイマー病の場合のＣＳＦ中のｍｉＲＮＡの変化を検出することができることを開示している。
【０１００】
同様に、国際公開第２００８／１５４３３３号は、遺伝子又は遺伝経路を調整するためのｍｉＲ−３４を用いて、ｍｉＲ−３４によって調整される遺伝子又は遺伝経路を同定し、患者の状態を評価し、及び／又は適切なｍｉＲＮＡを用いて患者を治療するときにこのプロファイルを用いるための方法及び組成物を詳細に記載している。
【０１０１】
近年、胎児診断に使用するために、血漿及び血清の中のｍｉｃｒｏＲＮＡが調べられている。Ｃｈｉｍ  ＳＳＣ、Ｓｈｉｎｇ  ＴＫＦ、Ｈｕｎｇ  ＥＣＷ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２００８；５４：４８２−９０．ｄｏｉ：１０．１３７３／ｃｌｉｎｃｈｅｍ．２００７．０９７９７；Ｈｕｎｇ  ＥＣＷ、Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ、Ｌｏ  ＹＭＤ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｆｅｔａｌ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈ．２００９；６２：３０８−１３．ｄｏｉ：１０．１１３６／ｊｃｐ．２００７．０４８４７０を参照。ＭｉｃｒｏＲＮＡは、がんの範囲にも関係があるとされている。Ｌｏｄｅｓ  ＭＪ、Ｃａｒａｂａｌｌｏ  Ｍ、Ｓｕｃｉｕ  Ｄ、ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｕｍ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｏｎ  ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．２００９；１４：ｅ６２２。
【０１０２】
しかし、ｍｉｃｒｏＲＮＡについて種々の提案されている研究の鍵は、１５〜１００ヌクレオチドの範囲の大きさのＲＮＡ分子を高効率で単離する必要があることである。この議論から明らかになるが、当該技術分野の現在の状態は、さらなる研究及び探求のために少量のｍｉｃｒｏＲＮＡを効率よく単離するための改良法については、よくわからないまま沈黙を保っている。
【０１０３】
手続的に、天然の供給源（組織試料、生物全体、細胞培養物、体液）からのＲＮＡの調製は、すべての他の生体分子の除去を必要とする。水を除けば、細胞の主要な要素は通常はタンパク質であり、多くは質量の４分の３を与える。主要な他の生体分子の中で、脂質、炭水化物、これら同士の組合せ、タンパク質、ＤＮＡは、他の主要な要素である。ＲＮＡ抽出の到達目標は、タンパク質とＤＮＡを除去することである。ＲＮＡを使用するときに、これらが最も大きな妨害となるからである。脂質や炭水化物といった部分は、通常は、洗剤の助けを借りれば溶解させて取り除くことができる。タンパク質は、洗剤及び変性剤の助けを借りれば、ＲＮＡ（及びＤＮＡ）から分けることができるが、一般的な溶液から除去されなければならない。米国特許出願公開第２００５／００５９０２４号（０２４号）を参照。
【０１０４】
米国特許出願公開第２００５／００５９０２４号に示されるように、現時点では、この目的を達成するために、２つの主要な方法が用いられる。第１の方法は、タンパク質を効果的に溶解又は沈殿させる、水に混和しない有機溶媒の使用を提案し、その後、除去の前に、タンパク質を含まない相を遠心分離によって除去する。一般的に、フェノール又はフェノール−クロロホルム混合物がこの目的のために用いられる。第２の方法（固相抽出）は、固体表面にＲＮＡを選択的に固定し、タンパク質を洗い流し、その後、ＲＮＡを水溶液中に放出させることを提案する。両方の手順が、ＤＮＡの混入量又はキャリーオーバーを下げることができるが、その効率は、使用される正確な条件によってさまざまである。
【０１０５】
フェノール及びフェノール−クロロホルムによる抽出は、タンパク質及び脂質がきわめて少ない核酸溶液を与えるが、炭水化物の多くは、この手順でも失われる。同様に、酸性フェノール−クロロホルムは、水溶液からＤＮＡの一部を抽出することが知られている。しかし、この用液は、塩酸グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム又は尿素のような変性剤の量が多く、これらはすべて、後で行われる酵素分析と適合しない。ＲＮＡは、通常は、エタノール又はイソプロパノールを用いた選択的な沈殿によってこれらの混合物から分離される。しかし、この手順を使用することは、小さな核酸分子（例えば、小さなＲＮＡ）にとっては非常に効率が悪いことを注記しておく。
【０１０６】
一方、固相抽出は、ＲＮＡの水への親和性を下げ、使用する固相への親和性を上げるために、高濃度の塩又は塩と、アルコールの使用に依存する。固体支持体としてガラス（シリカ）を使用し、変性を起こす高濃度の塩存在下（米国特許第５１５５０１８号；第５９９０３０２号；第６０４３３５４号；第６１１０３６３号；第５２３４８０９号）、又は低濃度の変性を起こす塩とエタノールを存在下（米国特許第６１８０７７８号）、大きなＲＮＡについて操作することが示されている。重要なことに、ガラスファイバー又はＲＮＡに対する結合のための通常の条件は、ｍｉｃｒｏＲＮＡにはうまく働かず、異なる組織では要求される事項が変わるため、溶解したままのものを使用することは問題がある。
【０１０７】
その結果、多くの従来のプロトコルは、ＤＮＡ又は大きいｍＲＮＡの単離に関するものであり、小さなＲＮＡ分子は、捕捉及び溶出の効率がよくないことが多いので、小さなＲＮＡ分子の単離には理想的とはいえない。米国特許出願公開第２００５／００５９０２４を参照。
【０１０８】
種々の生体試料からのｍｉＲＮＡの定量的及び定性的な単離は、限定されないが、労働集約的で時間のかかるプロトコルであること、ｍｉＲＮＡの大きさが小さいという性質から、抽出中に標的を簡単に損失しやすいこと、ｍｉＲＮＡは他のＲＮＡと異なり安定ではなく、処理及び保存の間に簡単に分解し得ること、実際の患者からのｍｉＲＮＡ検出率は通常は低く、又は検出不能であること（すなわち、定量できない）、さらに、抽出されたｍｉＲＮＡ標的は、通常は、関連する試験対象物との相関関係が低いことを含め、いくつかの理由によって妨げられている。
【０１０９】
同様に、従来技術では、ほとんどの場合に、ｍｉＲＮＡが試料中に低濃度で存在し、精製工程の間に使い果たされてしまいやすく、又はどこかにいってしまうことが明らかである。従来技術で知られている方法によって、全血及び細胞を含まない血液部分（血漿又は血清）などの体液から短いＲＮＡを精製することは可能ではあるが、比較的低収率でしか精製されないことも明らかである。さらに、米国特許出願公開第２０１２／０１７１６７５号に示されるように、現行の技術の状態では、遊離循環核酸（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ））を血漿又は血清から精製するのに有用な信頼性の高い方法がない。
【０１１０】
小さな核酸を単離し、保存するための改良法が依然として必要であることは、少量のｍｉｃｒｏＲＮＡを単離しようとする研究者が直面する課題を記載するいくつかの記載から明らかである。。この記述は、全ＲＮＡを含む目的の試料からｍｉＲＮＡを単離することに関する。著者らは、小さなＲＮＡフラクションを保持する単離方法はまったく存在せず、ｍｉＲＮＡは失われると結論づけている。
【０１１１】
生体試料からわずかな量のｍｉｃｒｏＲＮＡを単離するときの技術的な課題は、付随するさまざまな欠点を含め、以下の投稿の主題である。。
【０１１２】
入手可能な市販の単離試薬又はキット、例えば、ＱＩＡＧＥＮ−ＰＡＸＧＥＮＥ血液ＲＮＡキット、ＡＭＢＩＯＮ−ＬＥＵＫＯＬＯＣＫなどに関し、米国特許出願公開２０１２／２０８１８９号は、このような試薬／キットには、低い感度及び脱着性；低い収率；再現性がない；大体積の試料が必要；ｍｉｃｒｏＲＮＡ抽出が十分にスケールアップできない；低いスループットのうち、１つ以上の欠点があると議論している。
【０１１３】
まとめると、今日までのすべての方法に記載される標準的な洗浄の実践は、重要なバイオマーカー（例えば、ＣＮＡ及びｍｉｃｒｏＲＮＡ）を効率よく除去し、典型的には、ｍｉｃｒｏＲＮＡ分析の手段としてＦＴＡの使用を除外する。本明細書に記載し、請求する非洗浄手順を応用すれば、標的ｍｉｃｒｏＲＮＡ種を効果的に保存し、失うことなく、その後に分析することができる。この目的に従う本発明の一実施形態は、酸性溶出液を適用し、その後、高ｐＨの緩衝液で中和し、最初に高いｐＨにさらされることによってＲＮＡ種が受ける損傷を避けることを提案する。このように、本発明の方法によって、ｍｉＲＮＡのような非常に濃度が低い核酸を単離／精製することが可能となる。
（ｉｉｉ）多くの種類のウイルスは、ヒト及び他の種を感染させることが知られており、典型的には、血液循環中に見出され得る。これらの多くは低分子量の核酸であり、ＤＮＡ又はＲＮＡに由来していてもよく、環状又は直鎖の性質を有していてもよい。これらの大きさのため、典型的にすべての公開された方法で記載されているＦＴＡパンチで激しく洗浄すると、かなりの数のゲノム等価体が失われ、健康の指標として決定されるべき数のウイルス複製物を得ることができないだろう。このことは、特に、効果的な薬物治療計画のためにウイルス複写物の数のモニタリングが重要である、ＨＩＶ感染のような慢性疾患では重要である。ＦＴＡ又は同様の乾燥した血液スポットサンプリングを使用するプロセスは、ウイルス複写物の数を保存することを確保するには、是が非でも洗浄を避けるべきである。本願発明者らの新しい方法は、この分析に適しており、他の方法と比較して、単純な手法を与えるだろう。
（ｉｖ）古い血液試料：古い血液試料をＦＴＡに適用すると、試料中の全ＲＮＡ及びＤＮＡの分子一体性に関し、品質が悪くなることが多いことが知られている。しかし、近年の方法は、フラグメント化した核酸を探索し得る次世代の配列決定を開発した。本発明の方法は、さらに、攻撃的な洗浄工程をもたらす現行のＦＴＡ手順を用いると疑いようもなく起こる相当量の有益な核酸の損失を抑えることによって、次世代の配列決定方法で使用するための古い核酸の分子一体性を保護するのを助けることにより、これらの方法を補助するだろう。
【０１１４】
上述の議論から明らかなことは、小さな核酸（例えば、ＣＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、古い血液試料など）を単離し、保存する現行の方法は、非常に信頼性が低く、多くの欠点を伴っていることである。また、その他の幅広い欠陥は、ここに記載したような方法を追い求める動機付けにならないだろう。どちらかといえば、このようなその他の幅広い欠陥は、競争的で費用に気を遣う市場では特に、当業者は、小さな核酸分子を単離する方法のさらなる研究を追い求めることを必然的にあきらめていくだろう。上述の内容にもかかわらず、本明細書には、従来のワークフロー／方法に付随する欠点を効果的に克服し、保護しつつ、小さな核酸分子の単離／精製を初めて可能にした新しい方法を提示している。
【０１１５】
実験結果
使用する化学物質及び材料
化学物質及びその供給源のリストを以下に与える。
【０１１６】
Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ（商標）ｅｌｕｔｅ  ｍｉｃｒｏ（ＷＢ１２０２１８及びＷＢ１２０４１１）；
Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ（商標）ｅｌｕｔｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＷＢ１２０２３０）；
ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃカード（ＷＢ１２０２０５）
正常なヒト血液（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ）；
ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ  ｐｒｏｄｕｃｔ  コードＧ１５２Ａ）；
Ｈａｒｒｉｓ  Ｕｎｉ−ｃｏｒｅパンチ、１．２ｍｍ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｚ７０８８６０−２５ｅａ、ロット３１１０）；
ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＡｍｐＥｒａｓｅ  ＵＮＧなし（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  部品番号４３２４０１８）；
ＴａｑＭａｎ  ＲＮａｓｅ  Ｐ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  部品番号４３１６８３１）−ＲＮａｓｅ  Ｐプライマーを含有する；
Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  ｑＰＣＲキット、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐａｒｔ：４３４３８９５
ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １８Ｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ  コードＤＣ１８０２）−プライマーを含有する；
ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １６  ＨＳ（Ｐｒｏｍｅｇａ  コード：ＤＣ２１０１−プライマーを含有する；
滅菌水（Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  コードＷ４５０２）；
Ｈｕｍａ子宮頸部上皮細胞（ＨｅＬａ）（ＡＴＣＣコードＣＣＬ−２）及び
Ｈｉ−ＤＩホルムアミド（ＡＢＩ  ｃｏｄｅ  ４３１１３２０）。
【０１１７】
（ＨｅＬａ細胞をスポットしたＥｌｕｔｅ  ＦＴＡカードからのＳＴＲプロファイル）
２．５×１０6細胞／ｍｌの濃度で培養したＨｅＬａ細胞を、ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅ（ｉＦＴＡｅ）カードの上にスポットした。細胞をスポットしたＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカードから１．２ｍｍのパンチ片を採取し、最終体積２５μｌで、直接的なＳＴＲキットＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １８Ｄ反応混合物と合わせた。増幅前に、２５μｌの試料混合物を、９６ウェルＰＣＲプレートのそれぞれのウェルに加えた。１０秒間の試料注入を用い、３１３０ｘ１キャピラリー電気泳動で試料を分析した。
【０１１８】
ＰＣＲ反応は、以下のように設定された。
【０１１９】
標準及び試料を適切なウェルに加えた。プレートを密封し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離処理した。以下の熱サイクル条件の下で、Ｇｅｎｅａｍｐ／ＡＢＩ  ９７００  Ｔｈｅｒｍｏ  ＣｙｃｌｅｒでＰＣＲを行った。
【０１２０】
９６℃で２分間、その後、以下を２８サイクル：９４℃で１０秒間、６０℃で１分間、その後、６０℃で２０分間、その後、４℃。増幅後、キャピラリー電気泳動を用い、ＰＣＲ産物の視覚化を達成した。結果を図１〜４にグラフとして示す。
【０１２１】
【表１】
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【０１２２】
【表２】
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【０１２３】
【表３】
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図１は、ＳＴＲ  ＰＣＲ試薬と合わせた、未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカード（複製物１番）のＳＴＲプロファイルを表す。平均ピーク高さは、２３１３ＲＦＵであった。
【０１２４】
図２は、ＳＴＲ  ＰＣＲ試薬と合わせた、未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカード（複製物２番）のＳＴＲプロファイルを表す。平均ピーク高さは、２２６０ＲＦＵであった。
【０１２５】
図３は、ＳＴＲ  ＰＣＲ試薬と合わせた、未洗浄ＨｅＬａ細胞をスポットしたｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカード（複製物３番）のＳＴＲプロファイルを表す。平均ピーク高さは、５３８６ＲＦＵであった。
【０１２６】
図４は、ＳＴＲ  ＰＣＲ試薬を用い、精製されたゲノムＤＮＡのＳＴＲプロファイルを示す。平均ピーク高さは、１９０４ＲＦＵであった。
【０１２７】
ｑＰＣＲを用い、ＨｅＬａ細胞をスポットし、血液をスポットしたＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカードからのＤＮＡの定量（表５）
１×１０7細胞／ｍｌの濃度で培養したＨｅＬａ細胞又は白血球を、ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカードの上にスポットした。細胞をスポットしたＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカードから３ｍｍ又は１．２ｍｍのパンチ片を採取し、ｉＦＴＡｅ高スループット溶出プロトコルを用いて溶出させるか、又は１ｍｌの溶出緩衝液を用いて洗浄するか、又は洗浄せずにおく。試料、ＦＴＡカード又は５μｌの溶出液のいずれかを、ＴａｑＭａｎ  Ｒｎａｓｅ  Ｐ検出試薬及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ混合物を含むｑＰＣＲ反応物に加えた。このＰＣＲ試料混合物を、増幅前に、９６ウェルＰＣＲプレートの個々のウェルに加えた。
【０１２８】
Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅの高スループット溶出プロトコルは、以下の通りであった。
【０１２９】
３ｍｍのパンチ片を９６ウェルプレートに加え、それぞれのウェルに２００μｌの滅菌水を加え、プレートを密封し、ボルテックスによって断続的に３回回転させた（それぞれ５秒間）。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離した。水を吸引し、捨て、それぞれのウェルに６０μｌの滅菌水を加え、プレートを再び密封した。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、プレートをサーマルサイクラーに９８℃で３０分置いた。次いで、プレートを、最大速度に設定したボルテックスミキサーを用いて６０回（１パルス／秒）断続的に回転させた。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ピペットを用い、壁面から溶出物を除去し、定量のために別のプレート／ウェルに移した。
【０１３０】
ＰＣＲ反応は、以下のように設定された。
【０１３１】
標準及び試料を適切なウェルに加えた。プレートを密封し、１０００ｒｐｍで１分間遠心分離処理した。以下の熱サイクル条件の下で、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ＳｙｓｔｅｍでＰＣＲを行った。
【０１３２】
５０℃で２分間、その後、９５℃で１０分間、その後、４０サイクル：９５℃で１５秒間、６０℃で１分間。使用した検出器は、ＦＡＭ（商標）プローブであった。結果を表５に示す。
【０１３３】
【表４】
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表５は、洗浄した血液と、未洗浄の血液をスポットしたか、又は細胞をスポットしたｉＦＴＡｅカードのｑＰＣＲの結果を示す。この表は、ｎｇ／μｌでの３つのｑＰＣＲ反応からのＤＮＡの平均収率を示す。最初の３つの試料は、ｉＦＴＡｅカードの２つの３ｍｍパンチ片から溶出したＤＮＡの複製物であり、４番目の試料は、１ｍｌの溶出緩衝液で洗浄し、次いで、リアルタイムＰＣＲを用いて増幅させた、血液をスポットしたｉＦＴＡｅカードの１．２ｍｍパンチ片である（データは、３つの別個の試料の平均である）。試料５〜７は、Ｈｅｌａ細胞を用いてスポットしたｉＦＴＡｅカードの２つの３ｍｍパンチ片から溶出したＤＮＡの複製物であり、８番目の試料は、１ｍｌの溶出緩衝液で洗浄し、次いで、リアルタイムＰＣＲ機を用いて増幅させた、ＨｅｌａをスポットしたｉＦＴＡｅカードの３ｍｍパンチ片である。最後の試料は、洗浄せず、直接的にリアルタイムＰＣＲ機を使用した、ＨｅｌａをスポットしたｉＦＴＡｅカードの１．２ｍｍパンチ片である（データは、３つの別個の試料の平均である）。スポットしていないネガティブパンチ片は、検出可能なＤＮＡを生じなかった。
【０１３４】
【表５】
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ｑＰＣＲを用い、ＨｅＬａ細胞をスポットし、血液をスポットしたＦＴＡ  ｅｌｕｔｅカードからのＤＮＡの定量（図５及び図６）
７．５４×１０6細胞／ｍｌの濃度で培養したＨｅＬａ細胞又は白血球を、ｉＦＴＡｅカードの上にスポットした。１．２ｍｍ（ＨｅＬａ及び血液試料）パンチ片をｉＦＴＡｅカードから採取し、１ｍｌの滅菌水で洗浄し、ボルテックスで回転させ、水を除去し、又は、試料を洗浄せずにおく。３ｍｍ（ＨｅＬａ及び血液試料）パンチ片をｉＦＴＡｅカードから採取し、ｉＦＴＡｅ高スループット溶出プロトコルを用いて溶出させた。試料をスポットしたｉＦＴＡｅカード、又は２μｌ又は５μｌの溶出液のいずれかを、ＴａｑＭａｎ  Ｒｎａｓｅ  Ｐ検出試薬及びＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ混合物を含むｑＰＣＲ反応物に加えた。このＰＣＲ試料混合物を、増幅前に、９６ウェルＰＣＲプレートの個々のウェルに加えた。
【０１３５】
Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  ｅｌｕｔｅの高スループット溶出プロトコルは、以下の通りであった。
【０１３６】
処理すべきそれぞれの試料について、１×３ｍｍパンチ（ＨｅＬａ試料）片を１．５ｍｌの管に入れた。この管に１ｍｌの滅菌水を加え、ボルテックスによって断続的に３回回転させた（それぞれ５秒間）。水を吸引し、捨て、パンチ片を９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに移した。それぞれのウェルに６０μｌの滅菌水を加え、プレートを再び密封した。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、プレートをサーマルサイクラーに９８℃で３０分置いた。次いで、プレートを、最大速度に設定したボルテックスミキサーを用いて６０回（１パルス／秒）断続的に回転させた。プレートを１２００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ピペットを用い、壁面から溶出物を除去し、定量のために別のプレート／ウェルに移した。定量するまでプレートを４℃で保存した。
【０１３７】
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ］を用い、上に記載したように設定した。
【０１３８】
図５は、ｑＰＣＲ反応に直接使用される、洗浄した血液をスポットしたｉＦＴＡｅカードのＤＮＡ収率を示す。ｉＦＴＡｅカードの３種類の異なるバッチを実験（Ａ、Ｂ及びＣ）で使用した。
【０１３９】
図６は、ｑＰＣＲ反応に直接使用されるか、又は最初に溶出し、次いで、ｑＰＣＲ反応にに使用される、未洗浄のＨｅｌａ細胞をスポットしたｉＦＴＡｅカードのＤＮＡ収率を示す。ｉＦＴＡｅカードの３種類の異なるバッチを実験（Ａ、Ｂ及びＣ）で使用した。
【０１４０】
ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用い、血液をスポットしたＦＴＡカードから溶出したＤＮＡのＳＴＲプロファイル及びｑＰＣＲ（表６、７及び８）
ＤＮＡ溶出
４枚の１．２ｍｍパンチ片をＦＴＡ血液スポットから採取し、別個の管に入れた。２枚のパンチ片に、前もってパンチ片を洗浄することなく、以下の方法を行った。
【０１４１】
１．３５μｌの溶液１（０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１３．０）をパンチ片に加える。
【０１４２】
２．室温で５分間インキュベートする。
【０１４３】
３．６５μｌの溶液２（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、ボルテックスで５回洗浄し、混合する。
【０１４４】
４．室温で１０分間インキュベートする。
【０１４５】
５．ボルテックスを１０回動かす。
【０１４６】
６．パンチ片を取り出し、絞り、最大体積のＤＮＡ溶液を回収する。
【０１４７】
残りの２パンチ片も同じ方法であるが、上の溶液１及び２の量を２倍にして行った。次いで、ｑＰＣＲ又はＳＴＲプロファイリングのいずれかが必要になるまで、ＤＮＡ溶液を４℃で保存する。
【０１４８】
ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １６ＨＳ  ＳＴＲプロファイリング
溶出した全体積（１００又は２００μｌ）の両方のスケールから得た２個ずつの試料の５μｌ及び１０μｌの小分け分を用い、ＳＴＲ  ＰＣＲを行った。次いで、装置のマニュアルの標準条件を用い、試料をＧｅｎｅａｍｐ  ９７００  Ｔｈｅｒｍａｌサイクラーにおいた。３１３０×１  Ｇｅｎｅｔｉｃ分析機を用いてすべてのＳＴＲ試料を分離し、Ｇｅｎｅｍａｐｐｅｒ  ＩＤソフトウエアを用い、結果を分析した。
【０１４９】
【表６】
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承認基準
合格基準−ＳＴＲ対立遺伝子ピークは、ヘテロ接合体ピークについて７５ＲＦＵより高いと予想され、ホモ接合体ピークについて１５０ＲＦＵより高いと予想される。ネガティブコントロールは、プロファイルをまったく生成しないと予想される（すなわち、５０ＲＦＵを超えるピークなし）。ポジティブコントロールは、ヘテロ接合体ピークについて７５ＲＦＵより高いと予想され、ホモ接合体ピークについて１５０ＲＦＵより高いと予想される。
【０１５０】
【表７】
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Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒ  ｑＰＣＲ
すべてのｑＰＣＲを、７９００ＨＴ  Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ機で行い、ＳＤＳ  ２．３ソフトウエアを用いて分析した。
【０１５１】
Ｑｕａｎｔｉｆｉｌｅｒのユーザーガイドに記載されている標準的な反応混合物の体積及び装置プロトコルを使用した。それぞれの溶出体積について４つの複製物を試験した。
【０１５２】
ｑＰＣＲアッセイのためのすべての標準は、予想通りに合格しており、両方の溶出体積についてのすべての試料も、以下の表８にまとめたように、定量値も戻している。
【０１５３】
【表８】
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ｑＰＣＲ及びＳＴＲプロファイリングアッセイから、ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ高ｐＨ方法は、Ｗｈａｔｍａｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｔｅ（Ｅｌｕｔｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ＦＴＡ（登録商標）カードを室温でｐＨ処理）に公開された標準に記載されるものと、高ｐＨ溶出の前に阻害化学物質を除去するために広範囲にわたる洗浄を必要とするすべての他の公知のプロトコルと同等であることをを示唆する結果を得た。洗浄手順を省くことによって、自動化されたパンチ形成及び洗浄のシステムを合わせることによって行われた小さなパンチ片をなくす機会がなくなり、スループットが向上し、費用が安くなる。
【０１５４】
保存された魚組織の古くなった博物館試料を用いたＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法の使用
１００％エタノール中で２００３年から保存されたＭａｃｋｅｒｅｌ（Ｓｏｍｂｅｒ  Ｓｕｍｂｒｕｓ）試料を、１８０μｌのＰＢＳあたり約５ｍｍ3の組織を用い、Ｑｉａｇｅｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｕｐｔｏｒ  Ｐｒｏｂｅを用い、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で均質化した。１０μｌずつの小分け分をピペットでＦＴＡカードに置き、一晩乾燥させた。パンチ加工されたＦＴＡ円板からの試料ＤＮＡの高ｐＨ溶出前に、最小限の洗浄の有効性を評価するために、３つずつの円板を得て、以下のように処理した。
【０１５５】
１．標準的なＷｈａｔｍａｎのパンチ洗浄方法に従って、標準的に洗浄する。
【０１５６】
２．ＴＥ-1緩衝液を用いて１回洗浄する。
【０１５７】
３．洗浄はしないが、α−シクロデキストリンを、ＰＣＲ中の最終濃度が２％（ｗ／ｖ）になるまで添加する。
【０１５８】
４．高ｐＨ溶出雨溶出の前に、まったく洗浄をしない。
【０１５９】
次いで、処理された３個ずつのパンチ片を以下の溶出プロトコルにさらした。
【０１６０】
溶液１：０．１Ｎ  ＮａＯＨ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１３．０
溶液２：０．１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．０
時間スキーム：高ｐＨで１０分間、５分間中和。
【０１６１】
１．２０μｌの溶液１に３ｍｍのパンチ片を加える（通常のプロトコルによって洗浄）
２．氷上で１０分間インキュベートする。
【０１６２】
３．４０μｌの溶液２を加え、ボルテックスで５回混合する。
【０１６３】
４．室温で５分間インキュベートし、ボルテックスを１０回動かす。
【０１６４】
合計体積６０μｌ中の３ｍｍパンチ片を３個ずつの管にサンプリングし、３μｌのＤＮＡ溶液を加え、それぞれの異なる処理をされた試料からアセンブルしたＰＣＲに加えた（最終体積２５μｌ）。独立した増幅反応に３種類の異なるプラマー対を使用した。Ｓｓｃｏｘ１−１／Ｓｓｃｏｘ１−２（予想される産生物の大きさ１３８ｂｐ）；Ｓｓｃｏｘ１−１／Ｓｓｃｏｘ１−３（予想される産生物の大きさ２６５ｂｐ）；Ｓｓｃｏｘ１−１／Ｓｓｃｏｘ１−４（予想される産生物の大きさ４５１ｂｐ）。ポジティブ及びネガティブのコントロール増幅試料も、ＤＮＡインターカレーション染料を含有する分析用の１％アガロースゲルで実施したことも注記しておく。しかし、ネガティブコントロールがネガティブであったことが示された場合、準備段階での洗浄を行わない高ｐＨでのＤＮＡを溶出する最適化されたワークフローを用いると、古い保存された組織試料でも同等にうまくいくことがわかった（図７）。
【０１６５】
図７は、最適化されたＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用い、周囲状態で保存したＦＴＡカードに適用される均質化された博物館試料からのＤＮＡ標的の増幅結果を示す。増幅した試料のアガロースゲルは、排他的な洗浄によって含浸した化学物質を除去していないＦＴＡパンチ片からＤＮＡを溶出する手法によって、成功するＰＣＲに適したＤＮＡ溶液を与えることを示す（レーン１−３、１５−１７及び２９−３１：標準的な洗浄；レーン４−６、１８−２０及び３２−３４：１回洗浄；レーン７：洗浄なし＋２％中和剤、すべてＳｓｃｏｘ１−１／１−２；レーン２１：洗浄なし＋２％中和剤、すべてＳｓｃｏｘ１−１／１−３；レーン３５：洗浄なし＋２％中和剤、すべてＳｓｃｏｘ１−１／１−４；レーン８：洗浄なし＋２％中和産物１３８ｂｐ；レーン２２：洗浄なし＋２％中和産物２６５ｂｐ；レーン３６：洗浄なし＋２％中和産物４５１ｂｐ；レーン９、２３及び３７：洗浄なし＋２％中和剤；レーン１０−１２、２４−２６及び３８−４０：洗浄なし；レーン１４、２８及び４２：ネガティブコントロール；レーン２７及び４１：ポジティブコントロール）。
【０１６６】
ＦＴＡカードからのｍｉＲＮＡ検出のためのＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法の検証
ｍｉＲＮＡに似た特定のＲＮＡ種は、天然で小さく（約２２ヌクレオチド）、従って、従来の抽出及び精製の工程中に容易に失われる。当業者は、アルカリｐＨ溶液が、ＤＮＡではなくＲＮＡの２’−ヒドロキシルエステル交換反応を触媒することを理解すると思われるが、ＲＮＡの変性及び損失も悪化するだろう。ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法とＲＮＡ種との適合性を評価するために、ＦＴＡカードに合成ｍｉＲＮＡをスポットし、以下のようなＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用い、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。
【０１６７】
材料：
（１）Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃカード（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＷＢ１２０２０６、ロット番号ＦＴ６９０２０１１）
（２）ｍｉＲ２１−５ｐ（５’−ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ−３’（配列番号１）、ＩＤＴによって合成された）
（３）Ｌｅｔ７ｉ−５ｐ（５’−ＵＧＡＧＧＵＡＧＵＡＧＵＵＵＧＵＧＣＵＧＵＵ−３’（配列番号２）、ＩＤＴによって合成された）
（４）溶液１（０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１３．０）
（５）溶液２（０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）
（６）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８１６１）
（７）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｓ＿ｍｉＲ２１＿２、カタログ番号ＭＳ００００９０７９）ロット番号１１８３４６８５８）
（８）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｓ＿Ｌｅｔ７ｉ＿１、カタログ番号ＭＳ００００３１５７）ロット番号１６８３３１８６２）
（９）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８０７３）
（１０）α−シクロデキストリン（ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ４６８０−１Ｇ）、ヌクレアーゼを含まない水で８％（ｗ／ｖ）を作成。
【０１６８】
（１１）ＰＣＲプレート（ＡＢＩ、バーコード付きのＭｉｃｒｏＡＭＰ  Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート、参照番号４３４６９０６）
試料の調製：
１．２ｍｍ  ＵｎｉＣｏｒｅパンチャーを用いてＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃのパンチ片を調製し、２１０ｎｇの合成ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ２１−５ｐ又はＬｅｔ７ｉ−５ｐ）をそれぞれのパンチ片の上に１μｌずつスポットした。試料を室温で一晩乾燥させた。
【０１６９】
ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法による試料調製方法：
それぞれの１．２ｍｍパンチ片を３５μＬの溶液１（０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  １３．０）に懸濁させ、室温で５分間インキュベートし、ボルテックスで混合しつつ、６５μｌの溶液２（０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で中和した。試料をさらに室温で５分間インキュベートし、ボルテックスで混合し、溶液からパンチ片を取り出し、圧縮し、ＲＮＡ溶液の最大体積（約１００μｌ）を回復した。
【０１７０】
逆転写（ＲＴ）：
ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８１６１）を用い、ＲＴ反応混合物を調製した。簡単にいうと、４μｌの５倍ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＨｉＳｐｅｃ緩衝液、２μｌの１０倍ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  Ｍｉｘ、２μｌのｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍｉｘ、４μｌの８％α−シクロデキストリン（ｗ／ｖ）、６μｌのヌクレアーゼを含まない水及び２μｌのＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ溶出液（上で抽出した合計体積の約２％）を、０．２ｍｌ管の中で合わせた。合成ｍｉＲＮＡを当量の入力で用い、コントロール反応を並行して調製した。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、９５℃で５分間インキュベートし、酵素を不活化した。
【０１７１】
ｃＤＮＡテンプレートの調製：
２０μｌの上述のＲＴ反応物それぞれに１８０μｌのヌクレアーゼを含まない水を加えることによって、ｃＤＮＡの１：１０希釈液を調製した。ヌクレアーゼを含まない水を用い、このｃＤＮＡストックを１：１００及び１：４００まで順次希釈した。
【０１７２】
定量的ＰＣＲによる検出（ｑＰＣＲ）：
ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８０７３）を用い、ｑＰＣＲ反応物を調製した。簡単にいうと、１２．５μｌの２倍ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ混合物、２．５μｌの１０倍ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマー、５．５μｌのヌクレアーゼを含まない水及び２．５μｌの１０倍ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマー（Ｈｓ＿ｍｉＲ２１＿２、カタログ番号ＭＳ００００９０７９又はＨｓ＿Ｌｅｔ７ｉ＿１、カタログ番号ＭＳ００００３１５７）を、マスター混合物として合わせた。希釈したｃＤＮＡテンプレート（１：１００及び１：４００ストック）を、９６ウェルＰＣＲプレートに２μｌずつ加え、その後、２３μｌのマスター混合物をウェルごとに混合した。それぞれの試料及び希釈物をこの様式で３個ずつ調製し、ｑＰＣＲ反応を７５００Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置で、以下のパラメータに従ってインキュベートした。９５℃／１５分、（９５℃／１５秒、５５℃／３０秒、７０℃／３０秒）×４０サイクル。
【０１７３】
表９に示される結果は、ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用い、ＦＴＡパンチ片からの合成ｍｉＲＮＡの信頼性が高い定量的な検出を示す。溶液コントロール反応に対し、これらのｑＰＣＲの結果は、ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用い、ＦＴＡパンチ片からｍｉＲＮＡの約５０％の機能回収を示唆している。
【０１７４】
【表９】
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生理学的ＲＮＡのこの能力を拡張するために、本願発明者らは、ＭＣＦ−７細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＭ７８４６）及びｍｉＲ２１を高いレベルで発現することが理解されている乳腺癌細胞株から精製された全ＲＮＡについてこれらの実験を繰り返した。ＦＴＡカードに、ＭＣＦ−７全ＲＮＡをスポットし、以下のようなＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用いて分析した。
【０１７５】
材料：
（１）Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃカード（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＷＢ１２０２０６、ロット番号ＦＴ６９０２０１１）
（２）ＭＣＦ−７全ＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号ＡＭ７８４６）
（３）溶液１（０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ１３．０）
（４）溶液２（０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）
（５）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８１６１）
（６）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  プライマーＡｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｓ＿ｍｉＲ２１＿２、カタログ番号ＭＳ００００９０７９）ロット番号１１８３４６８５８）
（７）ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマーＡｓｓａｙ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｓ＿Ｌｅｔ７ｉ＿１、カタログ番号ＭＳ００００３１５７）  ロット番号１６８３３１８６２）
（８）ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８０７３）
（９）α−シクロデキストリン（ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ４６８０−１Ｇ）、ヌクレアーゼを含まない水で８％（ｗ／ｖ）を作成。
【０１７６】
（１０）ＰＣＲプレート（ＡＢＩ、バーコード付きのＭｉｃｒｏＡＭＰ  Ｆａｓｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  ９６ウェル反応プレート、参照番号４３４６９０６）
試料の調製：
１．２ｍｍ  ＵｎｉＣｏｒｅパンチャーを用いてＦＴＡ  Ｃｌａｓｓｉｃのパンチ片を調製し、ＭＣＦ−７細胞からの１ｍｇ／ｍｌの全ＲＮＡ（１μｇ）をそれぞれのパンチ片の上に１μｌずつスポットした。試料を室温で一晩乾燥させた。
【０１７７】
ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法による試料調製方法：
それぞれの１．２ｍｍパンチ片を３５μＬの溶液１（０．１Ｍ  ＮａＯＨ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  １３．０）に懸濁させ、室温で５分間インキュベートし、ボルテックスで混合しつつ、６５μｌの溶液２（０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で中和した。試料をさらに室温で５分間インキュベートし、ボルテックスで混合し、溶液からパンチ片を取り出し、圧縮し、ＲＮＡ溶液の最大体積（約１００μｌ）を回復した。
【０１７８】
逆転写（ＲＴ）：
ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８１６１）を用い、ＲＴ反応混合物を調製した。簡単にいうと、４μｌの５倍ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＨｉＳｐｅｃ緩衝液、２μｌの１０倍ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃｓ  Ｍｉｘ、２μｌのｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍｉｘ、４μｌの８％α−シクロデキストリン（ｗ／ｖ）、６μｌのヌクレアーゼを含まない水及び２μｌのＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ溶出液（上で抽出した合計体積の約２％）を、０．２ｍｌ管の中で合わせた。反応物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、９５℃で５分間インキュベートし、酵素を不活化した。
【０１７９】
ｃＤＮＡテンプレートの調製：
２０μｌの上述のＲＴ反応物それぞれに１８０μｌのヌクレアーゼを含まない水を加えることによって、ｃＤＮＡの１：１０希釈液を調製した。ヌクレアーゼを含まない水を用い、このｃＤＮＡストックを１：１００及び１：４００まで順次希釈した。
【０１８０】
定量的ＰＣＲによる検出（ｑＰＣＲ）：
ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号２１８０７３）を用い、ｑＰＣＲ反応物を調製した。簡単にいうと、１２．５μｌの２倍ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ混合物、２．５μｌの１０倍ｍｉＳｃｒｉｐｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌプライマー、５．５μｌのヌクレアーゼを含まない水及び２．５μｌの１０倍ｍｉＳｃｒｉｐｔプライマー（Ｈｓ＿ｍｉＲ２１＿２、カタログ番号ＭＳ００００９０７９又はＨｓ＿Ｌｅｔ７ｉ＿１、カタログ番号ＭＳ００００３１５７）を、マスター混合物として合わせた。希釈したｃＤＮＡテンプレート（１：１０、１：１００及び１：４００ストック）を、９６ウェルＰＣＲプレートに２μｌずつ加え、その後、２３μｌのマスター混合物をウェルごとに混合した。それぞれの試料及び希釈物をこの様式で３個ずつ調製し、ｑＰＣＲ反応を７５００Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置で、以下のパラメータに従ってインキュベートした。９５℃／１５分、（９５℃／１５秒、５５℃／３０秒、７０℃／３０秒）×４０サイクル。
【０１８１】
表１０に示される結果は、ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ方法を用い、ＦＴＡパンチ片からの生理学的ｍｉＲＮＡの信頼性が高い定量的な検出を示す。Ｌｅｔ７ｉに対し、すべての試験したｃＤＮＡ希釈物について、比例的に高いＣＴ値がｍｉｒ２１について検出され、このことはＭＣＦ−７乳腺癌細胞におけるｍｉｒ２１の公知の過剰発現と一致している。従って、ＦＴＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ法は、相対的なＲＮＡ発現方法に適している。
【０１８２】
【表１０】
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本明細書で述べられるあらゆる特許、特許明細書、及び他の公開された参考文献は、それぞれが個々に、かつ具体的に本明細書に参考として組み込まれているかのように、その全体が本明細書に参考として組み込まれる。本発明の好ましい例示的な実施形態が記載されるが、当業者は、本発明を記載した実施形態以外の方法で実施することができることを理解し、実施形態は、単なる説明のために提示され、限定するためのものではない。本発明は、以下に示す特許請求の範囲のみによって限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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