(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の植物に乾燥ストレス耐性向上をもたらす方法であって、
（ａ）前記複数の植物を圃場で生育させるステップと、
（ｂ）乾燥ストレスが前記植物に影響を及ぼすかどうかを判定するステップと、
（ｃ）目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を前記植物の地上部に供給するステップであって、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると前記植物に乾燥ストレス抵抗性増加をもたらす上記ステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
前記植物に影響を及ぼす乾燥ストレスの存在又は不在が、次の基準：土壌の水分状態、植物の組織内の水分状態、植物水分ストレス指数、膨圧又は気孔コンダクタンス、及び土壌若しくは植物中の水ポテンシャルの１つ又は複数を用いて判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的の前記ヌクレオチド配列が、前記植物（単数又は複数）に前記乾燥ストレス耐性増加をもたらすことができるタンパク質をコードする、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、
ｉ．配列番号２、４、６、８、１２、１４、１８、２０、及び２２のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有する、又は
ｉｉ．配列番号２、４、６、８、１２、１４、１８、２０、及び２２のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、又は
ｉｉｉ．配列番号２、４、６、８、１２、１４、１８、及び２０のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも９０％の長さの、且つ、かかる長さにわたってそれぞれ配列番号２、４、６、８、１２、１４、１８、及び２０と少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を有する、又は
ｉｖ．配列番号２、４、６、８、１２、１４、１８、２０、及び２２のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して１〜１０のアミノ酸付加、置換若しくは欠失を有するアミノ酸配列を有する、
請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのＣｓｐＢである、請求項３又は４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記タンパク質が、配列番号８の植物転写因子ＬＡＳ又は請求項４の項目ｉｉ〜ｉｖで定義されたその変異体である、請求項３又は４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物（単数又は複数）が、双子葉植物である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸構築物が、Ｔ−ＤＮＡ内に存在し、両側にＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接しており、前記Ｔ−ＤＮＡが、前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物又は植物細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含有しない、請求項１から７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
目的の前記ヌクレオチド配列が、植物細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
目的の前記ヌクレオチド配列が、発現されると前記植物に乾燥ストレス抵抗性増加をもたらす遺伝子である、請求項１から９までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乾燥ストレスなどの非生物的ストレスに対する抵抗性増加を植物にもたらす方法に関する。本発明は、生育期に発生する非生物的ストレスに反応することを可能にする、農業作物又は植物生産システム及び方法にも関する。本発明は、かかる方法のための、アグロバクテリウム細胞を含む組成物、アグロバクテリウム株、及びアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液にも関する。本発明は、圃場で生育した複数の植物を非生物的ストレスから保護する方法をさらに提供する。さらに、前記組成物で処理され、処理前の植物と比較して増加した非生物的ストレス耐性を有する植物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
植物の種子、果実及びバイオマス生産は、植物期間に発生することがある乾燥又は他の非生物的ストレスによって大幅に損なわれることがあるので、植物の非生物的ストレス耐性は、過酷な環境条件下での農業にとって非常に重要である。生物工学的手段によって様々な非生物的ストレス（例えば、低温ストレス、熱ストレス、水分ストレス、塩ストレス、乾燥）に対する作物植物の耐性を増加させる試みは、既に着手されている。ＷＯ２００５／０３３３１８は、植物のストレス耐性を強化する方法に関し、この特許文献には枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などのグラム陽性菌からの低温ショックタンパク質をコードするＤＮＡで安定的に形質転換された遺伝子導入植物が記載されている。遺伝子導入植物についての非生物的ストレス耐性増加が報告されている。ＷＯ２００５／０３３３１８で述べられている１つの低温ショックタンパク質は、枯草菌ＣｓｐＢである。
【０００３】
Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４７（２００８）４４６〜４５５は、植物の非生物的ストレス耐性及びトウモロコシの水制限条件下で穀粒収量向上をもたらす細菌ＲＮＡシャペロンに関する。栄養生長期と生殖生長期両方でのストレス耐性が、水制限条件下でのトウモロコシの収量安定性向上とともに報告されている。また、この研究では、低温ショックタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子導入植物が使用された。
【０００４】
非生物的ストレスは環境条件に起因し、それ故、一般には植物全体に影響を及ぼす。これが、ストレス耐性を増加させるタンパク質を植物に備えさせるために先行技術で遺伝子導入植物が使用されてきた理由であるようである。しかし、遺伝子導入作物植物系統の産生は、何年もの開発を必要とする、時間のかかる方法である。その上、遺伝子導入作物の定植は、幾つかの国では許されないか、（例えば、動物の飼料としての使用に）厳しく制限されており、それによって先行技術に記載のアプローチをかかる国では使用することができない。さらに、遺伝子導入植物は、形質転換植物又はそれらの細胞を選択するために使用された選択可能マーカー遺伝子を一般に含有する。遺伝子導入植物におけるかかる選択可能マーカー遺伝子の使用は、抗生物質抵抗性遺伝子の拡散により医療における抗生物質の有用性が損なわれるかもしれず、除草剤抵抗性遺伝子の雑草への拡散により除草剤の有用性が損なわれるかもしれないので、遺伝子導入植物に対する批判者による大きな懸案事項である。それ故、ＷＯ２００５／０３３３１８及びＣａｓｔｉｇｌｉｏｎｉらの非生物的ストレス保護方法は、生態学的に問題がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、非生物的ストレス（特に、乾燥）抵抗性増加を植物にもたらす方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、環境安全性が向上したものである、及び／又は環境への抗生物質若しくは除草剤抵抗性遺伝子の拡散を必要としない、非生物的ストレス（特に、乾燥）抵抗性増加を植物にもたらす方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、遺伝子導入作物植物の定植が許されない国で使用することができる、非生物的ストレス（特に、乾燥）抵抗性増加を植物にもたらす方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明は、以下のものを提供する：
（１）植物に非生物的ストレス耐性向上をもたらす方法であって、目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を前記植物の地上部に供給することを含み、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらす上記方法。
【０００７】
（２）複数の植物に非生物的ストレス耐性向上をもたらす方法であって、
前記複数の植物を圃場で生育させるステップと、
非生物的ストレスが前記植物に影響を及ぼすかどうかを判定するステップと、
目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を前記植物の地上部に供給するステップであって、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらす上記ステップと
を含む上記方法。
【０００８】
（３）前記植物を所望の生育状態まで生育させるステップと、
前記アグロバクテリウム株の細胞を含有する前記懸濁液を前記植物の地上部に供給することを含む、前記植物に非生物的ストレス耐性増加をもたらす目的の前記ヌクレオチド配列を前記植物において発現させるステップと
を含む、項目（１）に記載の植物に非生物的ストレス耐性向上をもたらす方法。
【０００９】
（４）前記植物の地上部に前記懸濁液を供給する前記ステップの前に、前記植物又は前記複数の植物が、前記植物（単数又は複数）に前記非生物的ストレス耐性をもたらす遺伝子を含有しない、項目１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【００１０】
（５）前記非生物的ストレス耐性が、乾燥耐性である、項目１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【００１１】
（６）目的の前記ヌクレオチド配列が、前記植物（単数又は複数）に前記非生物的ストレス耐性増加をもたらすことができるタンパク質をコードする、項目１から５までのいずれか一項に記載の方法。
【００１２】
（７）前記タンパク質が、
−  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む若しくはから成る、又は
−  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む若しくはから成る、又は
−  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の長さの、且つ、かかる長さにわたってそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４と少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む若しくはから成る、又は
−  配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して１〜２０のアミノ酸付加、置換若しくは欠失を有するアミノ酸配列を含む若しくはから成る、
項目６に記載の方法。
【００１３】
（８）前記タンパク質が、低温ショックドメインを有し、好ましくは、前記タンパク質が、一本鎖ＲＮＡの結合部位を有するＲＮＡシャペロンである、項目６に記載の方法。
【００１４】
（９）前記タンパク質が、配列番号２の若しくは配列番号４のアミノ酸配列を含む、又は
前記タンパク質が、配列番号１若しくは配列番号２の全範囲にわたって少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
項目６から８までのいずれか一項に記載の方法。
【００１５】
（１０）配列番号２の全範囲にわたって少なくとも８０％の同一性を有する前記タンパク質が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からのＣｓｐＡのアミノ酸残基Ｗ１１、Ｆ１８、Ｆ２０、Ｆ３１、Ｈ３３及びＦ３４を大腸菌からのＣｓｐＡにおけるこれらの位置に対応する位置に少なくとも有する、項目９に記載の方法。
【００１６】
（１１）前記タンパク質が、枯草菌からのＣｓｐＢである、項目６から１０までのいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
（１２）水性であることもある前記懸濁液が、前記アグロバクテリウム株の前記細胞を前記懸濁液１ｍｌ当たり最大で２．２×１０７、好ましくは最大で１．１×１０７、さらに好ましくは最大で４．４×１０６、さらに好ましくは最大で１．１×１０６ｃｆｕの濃度で含有する、項目１から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【００１８】
（１３）前記懸濁液が、前記懸濁液に懸濁された研磨剤をさらに含有し、前記研磨剤が、好ましくは、水和剤の粒状無機担体、例えばシリカ又はカーボランダムである、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【００１９】
（１４）前記懸濁液が、前記研磨剤を前記懸濁液の０．０２重量％と２重量％の間、好ましくは０．０５重量％と１重量％の間、及びさらに好ましくは０．１重量％と０．５重量％の間の量で含有する、項目１３に記載の方法。
【００２０】
（１５）前記懸濁液が、農業用スプレーアジュバント、好ましくは非イオン性界面活性剤又は湿潤剤をさらに含み、好ましくは、前記スプレーアジュバントが、オルガノシリコーン湿潤剤、例えばシルウェット（Ｓｉｌｗｅｔ）Ｌ−７７である、項目１から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【００２１】
（１６）前記核酸構築物の少なくとも片側にＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接しており、それによって前記植物の細胞への前記核酸構築物の移入が可能になる、項目１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【００２２】
（１７）前記核酸構築物が、Ｔ−ＤＮＡ内に存在し、両側にＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接しており、前記Ｔ−ＤＮＡが、前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物又は植物細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含有しない、項目１から１６までのいずれか一項に記載の方法。
【００２３】
（１８）目的の前記ヌクレオチド配列が、植物細胞内で活性なプロモーターに作動可能に連結されている、項目１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【００２４】
（１９）前記核酸構築物が、前記タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡレプリコンをコードする、項目１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【００２５】
（２０）植物のアグロバクテリウム媒介形質転換のためのＤＮＡ分子又はベクターであって、プロモーターに作動可能に連結された目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物をＴ−ＤＮＡ内に含み、目的の前記ＤＮＡ配列が、非生物的ストレス耐性増加を植物にもたらすことができるタンパク質をコードし、前記Ｔ−ＤＮＡが、前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含有しない上記ＤＮＡ分子又はベクター。
【００２６】
（２１）項目２０に記載のＤＮＡ分子を含むアグロバクテリウム細胞。
【００２７】
（２２）プロモーターに作動可能に連結された目的の異種ＤＮＡ配列を含有する核酸構築物をＴ−ＤＮＡ内に含む異種ＤＮＡ分子を含むアグロバクテリウム株であって、目的の前記異種ＤＮＡ配列が、乾燥抵抗性増加を植物にもたらすことができるタンパク質をコードし、前記Ｔ−ＤＮＡが、前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物細胞の選択を可能にする選択可能マーカーを含有しない上記アグロバクテリウム株。
【００２８】
（２３）アグロバクテリウム株の細胞を含有する組成物であって、好ましくは非イオン性の湿潤剤、例えばオルガノシロキサン界面活性剤を場合によりさらに含み、前記アグロバクテリウム株が、プロモーターに作動可能に連結された目的の異種ＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含み、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらす上記組成物。
【００２９】
（２４）少なくとも１つの研磨剤をさらに含む、項目２３に記載の組成物。
【００３０】
（２５）前記組成物が懸濁液であり、前記懸濁液が、前記懸濁液に懸濁された前記アグロバクテリウム株の細胞と及び少なくとも１つの研磨剤を含有し、この場合、前記懸濁液が、前記アグロバクテリウム株の前記細胞を、前記懸濁液１ｍｌ当たり最大で４．４×１０７、好ましくは最大で１．１×１０７、好ましくは最大で４．４×１０６、さらに好ましくは最大で１．１×１０６ｃｆｕの濃度で含有する、項目２３又は２４に記載の組成物。
【００３１】
（２７）目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する組成物で処理された植物であって、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらし、前記植物がその細胞内に目的の前記ヌクレオチド配列を含有し、目的の前記ヌクレオチド配列を発現する上記植物。
【００３２】
（２８）植物に非生物的ストレス耐性を付与するための、項目２０のＤＮＡ分子、項目２１のアグロバクテリウム細胞、項目２２のアグロバクテリウム株又は項目２３から２５までのいずれか一項の組成物の使用。
【００３３】
（２９）植物に非生物的ストレス耐性を付与する方法であって、目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を調製するステップであって、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらす上記ステップと、前のステップで調製した懸濁液を前記植物の地上部に供給するステップとを含む上記方法。
【発明の効果】
【００３４】
本発明者らは、非生物的ストレスによる危険に曝される植物において、前記植物において発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらす目的のヌクレオチド配列を一過的に発現させることにより、植物の乾燥抵抗性などの非生物的ストレス抵抗性の増加を達成することが可能であることを、驚くべきことに発見した。１つの実施形態において、目的のヌクレオチド配列は、前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらすことができるタンパク質をコードする。本発明は、植物のための非生物的ストレス保護システム、キット及び方法であって、前記植物への外来遺伝子（例えば、目的のヌクレオチド配列）の供給を、乾燥などの非生物的ストレスが起こる又は起こると予期される環境条件に限定することができる上記システム、キット及び方法を提供する。非生物的ストレスが起こらない又は予期されない場合、例えば前記タンパク質をコードする、外来遺伝子又は導入遺伝子の植物への供給は、必要でなく、その供給を回避することができる。したがって、本発明の方法は、（染色体に安定的に及び遺伝的に組み込まれた外来遺伝子を含有する）遺伝子導入植物を利用する農業が許されない国にとっても有用である。
【００３５】
本発明は、本発明の方法に従って非生物的ストレス抵抗性増加がもたらされた植物を人間の食糧の生産への使用から除外するが、その代りに動物飼料の生産又はバイオ燃料の生産に使用することができる、作物管理システムを提供し、可能にする。しかし、生育期の好適な環境条件のため非生物的ストレス抵抗性増加がもたらされなかった植物を人間の食糧の生産に使用することができる。本発明は、ストレス耐性向上を必要としない生育期でさえ遺伝子導入植物が定植される先行技術非生物的ストレス改善方法（ＷＯ２００５／０３３３１８；Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４７（２００８）４４６〜４５５）と比較して大幅な改善を示す。
【００３６】
発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらすことができる目的のヌクレオチド配列を一過的に、すなわち、抗生物質抵抗性遺伝子又は除草剤抵抗性遺伝子などの選択可能マーカー遺伝子を必要とせずに、及びかかる抗生物質抵抗性遺伝子又は除草剤抵抗性遺伝子が組み込まれた植物細胞を選択することなく、前記植物に備えさせるので、抗生物質抵抗性遺伝子も除草剤抵抗性遺伝子も植物に挿入されず、これらの植物を有する環境でのかかる遺伝子の拡散を大幅に回避することができる。それ故、同じくこの理由で、本発明の方法は、遺伝子導入植物に依存する先行技術の非生物的ストレス保護システムと比較して向上した環境安全性を有する。非生物的ストレス条件下の植物に本発明の目的のヌクレオチド配列を一過的に備えさせることは、処理される植物に選択的利点をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】目的の遺伝子のクローニングに使用したプラスミドベクターを模式的に示す図である。ｐＮＭＤ２４９２は、転写・非複製型ベクターである。ＲＢ及びＬＢは、Ｔ−ＤＮＡの右左の境界を表す。Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；Ｏ：オメガ翻訳エンハンサー；Ｐ１９：トマトブッシースタントウイルスからのＰＴＧＳサプレッサーＰ１９；Ｔｎｏｓ：ノパリンシンターゼターミネーター；Ｔｏｃｓ：ｏｃｓターミネーター。ｐＮＭＤ０３５は、細胞間移行能力を有する、ＴＭＶに基づくウイルスベクターである。Ｐａｃｔ２：シロイヌナズナアクチン２遺伝子のプロモーター；ｏ：ＴＶＣＶ（カブ葉脈透化ウイルス）からの５’末端；ＲｄＲｐ：ｃｒ−ＴＭＶ（アブラナ科植物感染性トバモウイルス）からのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）；ＭＰ：ｃｒ−ＴＭＶからの移行タンパク質ＯＲＦ；Ｎ：ｃｒ−ＴＭＶからの３’非翻訳領域；Ｔｎｏｓ又はｎｏｓ：ノパリンシンターゼターミネーター；ＲｄＲｐ及びＭＭＰ  ＯＲＦ内の灰色区域に割り込んでいる白色区域は、植物細胞の細胞質におけるＲＮＡレプリコン形成の尤度を増すためにこれらのＯＲＦに挿入されたイントロンを示し、これは、ＷＯ２００５０４９８３９に詳細に記載されている。ｐＮＭＤ６６１は、細胞間移行能力がない、ＴＭＶに基づくベクターである。ＭＰ  ＯＲＦの点突然変異は、正しいＭＰ翻訳を妨げるフレームシフトにつながる。ｐＮＭＤ６７０は、細胞間移行能力を有する、ＰＶＸ（ジャガイモＸウイルス）に基づくベクターである。ＰＶＸ−ｐｏｌ：ＰＶＸからのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＣＰ：コートタンパク質ＯＲＦ；２５Ｋ、１２Ｋ及び８は共に、ＰＶＸからの２５ＫＤＡ、１２ｋＤａ及び８ｋＤａ三重遺伝子ブロックモジュールを示す；Ｎ：ＰＶＸからの３’非翻訳領域。ｐＮＭＤ６９４は、コートタンパク質コード配列が欠失している、全身移行も細胞間移行も不可能にされた、ＰＶＸに基づくベクターである。
【図２】シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）核転写因子ＹサブユニットＢ−１（ＮＦ−ＹＢ１）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１２９４４５．２）の発現のための転写ベクター（プラスミド構築物ｐＮＭＤ３４８６）及び枯草菌亜種スブチリスＪＨ６４２株からの低温ショックタンパク質ＣｓｐＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ０１３４６）のための転写ベクター（プラスミド構築物ｐＮＭＤ３４９３）を模式的に示す図である。
【図３】噴霧１１日後、１１日渇水、のセイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）Ｎ９０−７４０植物を示す写真である。
【図４】噴霧１８日後、１１日渇水、７日再灌水、のセイヨウアブラナＮ９０−７４０植物を示す写真である。
【図５】噴霧２６日後、１１日渇水、７日再灌水、８日渇水、のセイヨウアブラナＮ９０−７４０植物を示す写真である。
【図６】噴霧２６日後、１１日渇水、７日再灌水、１３日渇水、１日再灌水、のセイヨウアブラナＮ９０−７４０植物を示す写真である。
【図７】トマト植物における目的の遺伝子の発現のために使用した、全身移行能力を有するＰＶＸウイルスベクターを模式的に示す図である。ＲＢ及びＬＢは、Ｔ−ＤＮＡの右左の境界を表す。Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター；ＰＶＸ−ＰＯＬ：ＰＶＸからのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＣＰ：コートタンパク質ＯＲＦ；２５Ｋ、１２Ｋ及び８は共に、ＰＶＸからの２５ＫＤＡ、１２ｋＤａ及び８ｋＤａ三重遺伝子ブロックモジュールを示す；Ｎ：ＰＶＸからの３’非翻訳領域；ＧｍＲＤ２２：大豆ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎ  ｍａｘ）からのＧｍＲＤ２２（アポプラスト局在ＢＵＲＰ−ドメインタンパク質）のコード配列；ＢｎＬＡＳ：菜種セイヨウアブラナからのＢｎＬＡＳ（ＧＲＡＳファミリー遺伝子）のコード配列；ＧＦＰ：クラゲからの緑色蛍光タンパク質のコード配列。ＶｉｒＧ  Ｎ５４Ｄは、Ｎ５４Ｄ突然変異を有する、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＧＶ３１０１からのＶｉｒＧタンパク質のコード配列を表す。
【図８】ＢｎＬＡＳ及びＧｍＲＤ２２遺伝子の発現のためのＰＶＸベクターを保有するアグロバクテリアを噴霧してから３週間後の渇水に曝されたトランスフェクトトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）栽培品種バルコニー・レッド（Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ）植物の表現型を示す写真である。渇水曝露を１４日間行った。
【図９】ＢｎＬＡＳ及びＧｍＲＤ２２遺伝子の発現のためのＰＶＸベクターを保有するアグロバクテリアを噴霧してから３週間後の渇水に曝されたトランスフェクトトマト栽培品種バルコニー・レッド植物の果実を示す写真である。渇水曝露を１４日間行った。噴霧１００日後に果実収量を評価した。番号１、２、３などは、個々の植物を表す。
【図１０】ＰＶＸベクターを保有するアグロバクテリアを噴霧してから３週間後の渇水に曝されたトランスフェクトトマト栽培品種バルコニー・レッド植物から収穫した果実のバイオマスを示す図である。渇水曝露を１４日間行った。果実収量を、噴霧１００日後に評価し、植物ごとに平均値として算出した。１：トランスフェクトされていない植物；２：ＢｎＬＡＳ遺伝子を発現する植物；３：ＧｍＲＤ２２遺伝子を発現する植物；４：ＧＦＰを発現する植物。
【図１１】ＰＥＧ６０００処理を受けたＧｍＲＤ２２、ＢｎＬＡＳ及びＧＦＰトランスフェクトトマトバルコニー・レッド苗の表現型を描写する写真である。
【図１２】１０日の注水抑止後、及び回復後（灌水２時間後）の、ＧＦＰ及びＢｎＬＡＳ発現ＰＶＸベクターがトランスフェクトされたトマト栽培品種バルコニー・レッドを示す写真である。播種１２日後に植物にアグロバクテリアを噴霧し、噴霧１２日後に植物を渇水に曝した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の方法は、農業に、すなわち大規模に、主として利用される。それ故、これらの方法は、一般に、複数の植物を用いて行われる。したがって、これらの方法は、例えば圃場に、播種又は定植される複数の植物に一般に利用される。本発明の方法を行う前、播種又は定植される植物は、本発明の方法でもたらされる非生物的ストレス耐性を植物にもたらす発現可能な遺伝子を含有しないことが好ましい。特に、植物は、そのような遺伝子の遺伝子導入植物でないことが好ましい。
【００３９】
植物を播種又は定植した後、典型的には農業従事者である使用者は、植物の生育及び植物の健康状態を観察することができる。さらに、使用者は、植物に対する非生物的ストレス条件が発生したかどうか、発生しているかどうか、又は発生するかもしれないかどうかを判定するために環境条件、例えば、天候及び／又は土壌の状態を観察することができる。非生物的ストレス条件が存在するかどうかの判定は、土壌からの試料の採取及び土壌の検査を含むことがある。或いは又は加えて、非生物的ストレス条件が存在するかどうかの判定は、植物からの又は前記植物の断片からの試料の採取及び植物の検査を含むこともある。
【００４０】
乾燥ストレス又は塩ストレスを判定するために、１つ又は複数の土壌試料を水分含有量又は塩分含有量についてそれぞれ検査することがある。好ましい実施形態において、本発明の方法は、乾燥に対する植物の耐性又は抵抗性（これらの用語を本明細書では交換可能に用いている）を向上させるために用いられる。それ故、乾燥ストレスの判定及びかかるストレスのさらなる発生の判定は、降水確率を見極めるための天気予報の追跡を含むことがある。
【００４１】
乾燥ストレス条件の判定は、当技術分野において公知である。例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ  ５８（第２号）１１９〜１３０、２００７；Ｉｄｓｏ、Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｍｅｔｅｏｒｏｌｏｇｙ  ２７、５９〜７０、１９８２；Ｓｈｉｍａｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｒｉｄ  Ｌａｎｄ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ２２−１  、２５１〜２５４、２０１２を参照されたい。植物に影響を及ぼす水分状態を判定する又は追跡するために土壌測定及び／又は植物測定を用いることがある。これらの公知の方法を直接法と間接法に分類することもできる。直接法の中では、土壌又は植物材料の相対含水率（ＲＷＣ）の測定、及び葉の水ポテンシャルの、例えば圧力室での又は樹液流動センサを使用する、直接測定を挙げることができる。間接法の中では、キャノピー温度の評価に基づく遠隔赤外技術、又はキャノピースペクトル反射率の測定に基づく遠隔分光法を挙げることができる。水が限られてくると、作物はそれら自体を低温に保つのに十分な水を蒸散することができないので、作物温度は上昇する。植物の葉は、それらの気孔を開放して、光合成のために二酸化炭素を入れ、同時に水蒸気を葉から流出させ、葉の表面を冷却する。土壌水が限られてくると蒸散は減少し、したがってその結果、葉冷却効果が低下し、作物温度の上昇が生じる。すべての物体はエネルギー又は放射線を放射し、これを物体の温度として測定する。作物キャノピーについては、通常は熱赤外放射温度計で温度を測定する。赤外放射温度計（ＩＲＴ）は、市販されている。Ｉｒｍａｋら、Ａｇｒｏｎｏｍｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ、９２、１２２１〜１２２７、２０００は、注水適時選択を目的とした、しかし本発明の植物の乾燥ストレスの判定にも使用することができる、作物水分ストレス指数（ＣＷＳＩ）の決定法を記載している。水分状態を追跡するための他の判断基準は、膨圧又は気孔コンダクタンス、及び土壌若しくは植物中の水ポテンシャルである。上に挙げた水分状態判断基準の絶対判定に依存しないように、乾燥ストレスの発生を容易に確認するために、水分状態を継続的に又は定期的に追跡することもある。
【００４２】
植物（単数若しくは複数）の所望の生育状態で、又は使用者が非生物的ストレスに対する植物の抵抗性を向上させるべきであると決意したとき、目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を植物又はそれらの部分に供給する。目的のヌクレオチド配列は、植物において発現されると、植物に非生物的ストレスに対する耐性増加をもたらすことができる。
【００４３】
本発明は、植物又は前記植物の部分を生産する方法であって、
（Ａ）複数の植物を圃場で生育させるステップと、
（Ｂ）乾燥ストレスが前記植物に影響を及ぼすかどうかを判定するステップと、
（Ｃ）乾燥ストレスが前記植物に影響を及ぼす又は影響を及ぼすことがあるとステップ（Ｂ）で判定された場合、目的のヌクレオチド配列を含有する核酸構築物を含む核酸分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を前記植物の地上部に供給するステップであって、目的の前記ヌクレオチド配列が前記植物において発現されると前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらす上記ステップと、
（Ｄ）前記植物又はそれらの所望の部分を収穫するステップと、
（Ｅ）ステップ（Ｃ）を行った場合、ステップ（Ｃ）を行ったことが許容される用途にステップ（Ｄ）の収穫物を使用するステップ、又はステップ（Ｃ）を行わなかった場合、ステップ（Ｃ）を行ったことが許容されない用途にステップ（Ｄ）の収穫物を使用するステップと
を含む上記方法も提供する。
【００４４】
ステップ（Ｃ）を行うことが許容されないことがある用途は、人間が摂取する食糧の生産である。ステップ（Ｃ）を行うことが許容されることがある用途は、動物の飼料の生産又はバイオ燃料の生産である。したがって、本発明は、総合効率を強力に向上させる、全生育期のための作物生産システム及び方法を提供する。一方で、乾燥に起因する作物又は植物材料の損失を低減させることができ、損失を免れた作物又はバイオマスを、遺伝子修飾が懸案事項でない用途に使用することができる。他方では、好適な天候条件のため乾燥耐性を増加させる対策を必要としない季節に生育する植物を遺伝子修飾せず、これは、一部の消費者に又は一部の国で好まれる。
【００４５】
本発明において、目的のヌクレオチドは、乾燥抵抗性などの非生物的ストレス抵抗性の増加を前記植物にもたらすことができるタンパク質をコードすることができる。或いは、目的のヌクレオチド配列は、発現されると、非生物的ストレス抵抗性増加を植物にもたらすことができるＲＮＡを生産することができる。
【００４６】
核酸分子は、一般にＤＮＡ分子である。この場合、その分子に含有される目的のヌクレオチド配列は、目的のＤＮＡ配列である。
【００４７】
本発明の方法では、目的の前記ヌクレオチド配列の一過性発現のために前記核酸分子（ベクター）を前記植物の部分に一過的にトランスフェクトする。これには、目的のヌクレオチド配列を植物においていつ発現させるべきか及び目的のどのヌクレオチド配列を発現させるべきかの決定を、トランスフェクション時点直前まで遅らせることができるという利点がある。用語「一過性の」は、いずれの選択方法も、例えば、選択可能薬剤とその選択可能薬剤を解毒することができる選択可能マーカー遺伝子とを使用して、核酸分子（ベクター）又はトランスフェクトされていない細胞若しくは植物からの核酸構築物がトランスフェクトされた細胞又は植物を選択するために用いられないことを意味する。結果として、トランスフェクトされた核酸は、一般に、植物染色体ＤＮＡに安定的に導入されない。その代りに、一過性発現方法は、トランスフェクトされたまさしくその植物細胞におけるトランスフェクションの効果を利用する。
【００４８】
目的の前記ヌクレオチド配列の可能な発現達成方法は、目的の前記ヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する自己複製（ウイルス）レプリコンの使用である。植物ウイルス発現系は、ＤＮＡウイルスベクターの使用についても、ＲＮＡウイルスベクターの使用についても、多くの出版物に、例えばＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ２００６０１２９０６、ＷＯ０２１０１００６又はＷＯ０２０６８６６４に記載されており、これらの文献にさらに多くの出版物が引用されている。
【００４９】
一過性発現のための植物又は植物部分へのＤＮＡ分子などの核酸分子の様々な導入方法が公知である。本発明では、核酸分子（ベクター）又は核酸構築物を、例えばアグロインフィルトレーションにより、植物にトランスフェクトするためにアグロバクテリアを好ましくは使用する。アグロバクテリアによる植物の大規模浸潤システム及び方法は、ＷＯ２００９０９５１８３に記載されている。別の実施形態では、多くの植物への、例えば圃場の植物への大規模散布によく適している、アグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を植物又は植物部分に噴霧する。かかるスプレートランスフェクション方法は、ＷＯ２０１２／０１９６６０に詳細に記載されている。
【００５０】
前記アグロバクテリウム株は、植物形質転換及びトランスフェクションに一般に使用され、並びに一般知識から当業者に公知である、アグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）種に属することがある。本発明の方法で使用されるアグロバクテリウム株は、目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＤＮＡ分子（Ｔｉ−プラスミド）を前記核酸分子として含む。目的のＤＮＡ配列は、植物において発現される１つ又は１つより多くのタンパク質をコードすることができる。核酸構築物は、アグロバクテリウム株の分泌系による植物細胞への核酸構築物の導入ためにＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ内に典型的に存在する。核酸構築物の少なくとも片側に又は両側に、前記植物（単数又は複数）のトランスフェクション及び前記核酸構築物の前記植物の細胞への導入を可能にするためにＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接している。好ましくは、前記核酸構築物は、Ｔ−ＤＮＡ内に存在し、両側にＴ−ＤＮＡ境界配列が隣接している。
【００５１】
最も好ましくは、核酸構築物は、アグロバクテリウム株のＴ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ内に存在する。Ｔｉ−プラスミドは、細菌におけるクローニング及び遺伝子改変を可能にするために前記Ｔ−ＤＮＡの外側に選択可能マーカーを含有することがある。しかし、前記植物の細胞に移入されるＴ−ＤＮＡは、存在する場合には前記Ｔ−ＤＮＡを含有する植物又は植物細胞の選択を可能にすることになる、選択可能マーカーを含有しないことが好ましい。この実施形態ではＴｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡ内に存在すべきでない選択可能マーカー遺伝子の例は、抗生物質抵抗性遺伝子又は除草剤抵抗性遺伝子である。本発明の方法は、目的の前記ヌクレオチド配列（又は前記タンパク質）の一過性トランスフェクション及び発現を用いるので、本方法は、本発明の核酸分子を組み込んだ植物細胞を、かかる抗生物質抵抗性遺伝子又は除草剤抵抗性遺伝子を使用することによって選択するステップを含まない。したがって、いずれの抗生物質抵抗性遺伝子も除草剤抵抗性遺伝子も前記植物に組み込む必要がなく、それにより、かかる遺伝子を環境に拡散させる確率が本発明の方法では低い。
【００５２】
核酸構築物は、目的のヌクレオチド配列を、そのヌクレオチド配列が植物細胞において発現できるように含む。このために、目的のヌクレオチド配列は、前記核酸構築物中で、植物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあることがある。好ましくは、目的のヌクレオチド配列は、非生物的ストレス耐性増加を植物にもたらすことができるタンパク質をコードする。目的のヌクレオチド配列の例は、ＤＮＡウイルスレプリコン若しくはＲＮＡウイルスレプリコン又は発現される遺伝子をコードする、ＤＮＡ配列である。前記遺伝子は、発現されると、植物に非生物的ストレス耐性増加をもたらす。好ましくは、前記遺伝子は、植物に非生物的ストレス耐性増加をもたらすことができるタンパク質をコードする。ウイルスレプリコンもまた、植物（単数又は複数）の細胞において発現されるかかるタンパク質をコードする。核酸構築物は、目的のヌクレオチド配列に加えて、他の配列、例えば、目的のヌクレオチド配列の発現の調節配列、例えば転写プロモーター及びターミネーターを含むことがある。核酸構築物は、発現されるさらなる遺伝子、例えば、Ｐ１９タンパク質などの遺伝子サイレンシングのサプレッサーをコードする遺伝子を含むことがある。かかるさらなる遺伝子の発現は、本発明のタンパク質を発現させるために使用されるプロモーターと同じプロモーターの制御下にあることもあり、又は異なるプロモーターの制御下にあることもある。アグロバクテリウム媒介遺伝子移入及びそのためのベクターは、例えば、上に列挙した参考文献から、又は植物生物工学に関する教科書、例えばＳｌａｔｅｒ、Ｓｃｏｔｔ及びＦｏｗｌｅｒ、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００８から、当業者には公知である。
【００５３】
本明細書において用いる場合、用語「植物細胞内で活性なプロモーター」は、植物細胞内で転写を制御（開始）することができるＤＮＡ配列を意味する。これは、植物由来の任意のプロモーターを含むが、植物細胞内で転写を指示することができる非植物由来の任意のプロモーター、すなわち、ウイルス又は細菌由来の特定のプロモーター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）（Ｈａｒｐｓｔｅｒら（１９８８）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ．２１２（１）：１８２〜９０）、サブタレニアンクローバーウイルスプロモーター４番若しくは７番（ＷＯ９６０６９３２）、又はＴ−ＤＮＡ遺伝子プロモーターも含み、組織特異的又は器官特異的プロモーターも含み、組織特異的又は器官特異的プロモーターとしては、種子特異的プロモーター（例えば、ＷＯ８９／０３８８７）、器官原基特異的プロモーター（Ａｎら（１９９６）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ８（１）：１５〜３０）、茎特異的プロモーター（Ｋｅｌｌｅｒら、（１９８８）ＥＭＢＯ  Ｊ．７（１２）：３６２５〜３６３３）、葉特異的プロモーター（Ｈｕｄｓｐｅｔｈら（１９８９）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１２：５７９〜５８９）、葉肉特異的プロモーター（例えば、光誘導性Ｒｕｂｉｓｃｏプロモーター）、根特異的プロモーター（Ｋｅｌｌｅｒら（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：１６３９〜１６４６）、塊茎特異的プロモーター（Ｋｅｉｌら（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８（５）：１３２３〜１３３０）、維管束組織特異的プロモーター（Ｐｅｌｅｍａｎら（１９８９）Ｇｅｎｅ  ８４：３５９〜３６９）、雄蕊選択的プロモーター（ＷＯ８９／１０３９６、ＷＯ９２／１３９５６）、裂開帯特異的プロモーター（ＷＯ９７／１３８６５）などが挙げられるが、これらに限定されない。一過性発現には、構成的プロモーター、すなわち、発生学的に調節されていないプロモーターを使用することが好ましい。しかし、構成的プロモーターは、組織特異的であることもあり、又は器官特異的であることもある。好ましいプロモーターは、下記の実施例で使用するものである。
【００５４】
本明細書において、用語「構築物」は、目的のヌクレオチド配列を含む組換え構築物を意味する。好ましくは、構築物は、前記植物に非生物的ストレス抵抗性増加をもたらすことができるタンパク質を少なくともコードする。
【００５５】
タンパク質の強い発現が所望される実施形態では、核酸構築物は、植物細胞内で複製してウイルスベクターのレプリコンを形成することができるウイルスベクターをコードすることがある。複製し続けるために、ウイルスベクター及びレプリコンは、植物細胞内に存在する核酸ポリメラーゼによって、例えば、そのレプリコンから発現されたウイルスポリメラーゼによって認識され得る複製起点を含有する。ＲＮＡウイルスベクター（「ＲＮＡレプリコン」とも呼ばれる）の場合、レプリコンは、後者が植物細胞核に導入された後のＤＮＡ構築物からの、植物細胞内で活性なプロモーターの制御下での転写によって、形成されることがある。ＤＮＡレプリコンの場合、レプリコンは、例えば、ＷＯ００／１７３６５及びＷＯ９９／２２００３に記載されているように、ＤＮＡ構築物中のウイルスレプリコンをコードする配列に隣接する２つの組換え部位間の組換えによって形成されることがある。レプリコンがＤＮＡ構築物によってコードされている場合、ＲＮＡレプリコンのことが好ましい。ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスベクター（ＤＮＡ又はＲＮＡレプリコン）の使用は、長年にわたって文献に広範に記載されている。一部の例は、次の特許公報である：ＷＯ２００８０２８６６１、ＷＯ２００７１３７７８８、ＷＯ２００６００３０１８、ＷＯ２００５０７１０９０、ＷＯ２００５０４９８３９、ＷＯ０２０９７０８０、ＷＯ０２０８８３６９、ＷＯ０２０６８６６４。ＤＮＡウイルスベクターの例は、ジェミニウイルスに基づくものである。本発明のために、植物ＲＮＡウイルスに基づくウイルスベクター又はレプリコン、特に、一本鎖プラスセンスＲＮＡウイルスに基づくものを用いることがある。したがって、ウイルスレプリコンは、一本鎖プラスセンスＲＮＡレプリコンであることがある。タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）及びポテックスウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づくかかるウイルスベクターの例。「に基づく」は、ウイルスベクターが、複製系、例えば、レプリカーゼ、及び／又はこれらのウイルスの複製に関与する他のタンパク質を用いることを意味する。ポテックスウイルスに基づくウイルスベクター及び発現系は、ＥＰ２０６１８９０又はＷＯ２００８／０２８６６１に記載されている。多くの他の植物ウイルスレプリコンが上述の特許公報に記載されている。
【００５６】
１つの実施形態において、本発明の方法は、前記タンパク質を好ましくはコードする目的のＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含むＤＮＡ分子を含むアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液を前記植物の地上部に噴霧することを含む。
【００５７】
前記植物の地上部に供給するために使用することができる懸濁液は、液体に懸濁されたアグロバクテリウム細胞を含む液体組成物である。懸濁液は一般に水性であり、これは、その液体が少なくとも５０、好ましくは少なくとも８０、さらに好ましくは少なくとも９０重量％水を含有することを意味する。液体中の他の成分は、生存可能な形態でのアグロバクテリウム細胞の維持に適合する他の液体成分であってもよく、これは、極性溶媒、例えば多価アルコール又はジメチルスルホキシドであってもよい。さらなる成分は、栄養素、ミネラル若しくは塩類、緩衝剤又はスプレーアジュバント（さらに下記参照）であってもよい。
【００５８】
本発明の方法で植物又は植物部分に噴霧するために使用される懸濁液は、最大で１．１×１０９ｃｆｕ／ｍｌのアグロバクテリウム細胞の濃度を有することができ、これは、６００ｎｍで１の光学密度のＬＢ培地中のアグロバクテリウム培養物にほぼ相当する。しかし、達成可能な高いトランスフェクション効率のため、特に、研磨剤及び／又は界面活性剤又は湿潤剤（下記参照）を使用して噴霧を行う場合は、はるかに低い濃度を用いることができ、これにより、アグロバクテリウム生産用の巨大発酵槽を必要とすることなく多くの植物、例えば圃場全体、の処理が可能になる。それ故、濃度は、最大で２．２×１０７ｃｆｕ／ｍｌ、好ましくは最大で１．１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ、さらに好ましくは最大で４．４×１０６ｃｆｕ／ｍｌであり得る。１つの実施形態において、濃度は、懸濁液１ｍｌ当たり最大で１．１×１０６ｃｆｕである。ｃｆｕ／ｍｌでの細胞濃度の決定を避けるために、分光光度計を使用して６００ｎｍでの見掛けの光学密度を測定することによりアグロバクテリア懸濁液の濃度を評定することが多い。本明細書において、１．１×１０７ｃｆｕ／ｍｌの濃度は、６００ｎｍで０．０１の算出光学密度に相当し、それに従って前記算出光学密度は、６００ｎｍで１．０の光学密度を有する懸濁液の水又は緩衝液での１００倍希釈によって定義される。同様に、４．４×１０６ｃｆｕ／ｍｌ及び１．１×１０６ｃｆｕ／ｍｌの濃度は、６００ｎｍで０．００４及び０．００１の算出光学密度にそれぞれ相当し、それに従って前記算出光学密度は、６００ｎｍで１．０の光学密度を有する懸濁液の水又は緩衝液でのそれぞれ２５０倍又は１０００倍希釈によって定義される。
【００５９】
植物又は植物の部分に噴霧するために使用されるアグロバクテリウム株の細胞を含有する懸濁液は、トランスフェクション効率を向上させるために、前記懸濁液に懸濁された少なくとも１つの研磨剤を含有することがある。使用することができる研磨剤は、アグロバクテリウム細胞の水性懸濁液に本質的に不溶性である粒状材料である。研磨剤は、特に湿潤剤とともに使用すると、葉などの植物組織の表面を脆弱にすると、及びその結果、植物組織の細胞間隙へのアグロバクテリウム細胞の浸透を助長すると考えられる。結果として、トランスフェクション効率は高い。
【００６０】
本発明の研磨剤として使用される粒状材料は、農薬製剤の水和剤（ＷＰ）において担体として一般に使用されるような担体材料であり得る。水和剤に関連して、これらの担体は、農薬製剤分野では「増量剤」又は「不活性増量剤」とも呼ばれる。水和剤製剤は、植物保護分野における一般知識の一部である。ハンドブックＰＥＳＴＩＣＩＤＥ  ＳＰＥＣＩＦＩＣＡＴＩＯＮＳ、「Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＦＡＯ  ａｎｄ  ＷＨＯ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ」、世界保健機関（ＷＨＯ）及び国際連合食糧農業機関編、ローマ、２００２、ＩＳＢＮ  ９２−５−１０４８５７−６を参照されたい。植物保護のための水和剤製剤は、例えばＥＰ１８１０５６９、ＥＰ１４８８６９７、ＥＰ１９０８３４８及びＥＰ０７８９５１０に記載されている。研磨剤は、ミネラル材料、典型的には無機材料であり得る。かかる担体材料の例は、珪藻土、タルク、粘土、炭酸カルシウム、ベントナイト、酸性白土、アタパルジャイト、ゼオライト、絹雲母、海泡石又はケイ酸カルシウムである。石英粉末、例えば、ＷＯ０２／０８７３２４に記載されている高純度石英粉末を使用することも可能である。好ましい例は、シリカ、例えば親水性沈降及びヒュームドシリカ、並びにカーボランダムである。水和剤に使用される希釈剤又は増量剤、例えばシリカの研磨特性は公知である（Ｇ．Ａ．Ｍａｔｔｈｅｗｓによる「Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００の５２頁を参照されたい）。
【００６１】
研磨剤として使用するための粒状無機材料の市販品としては、Ｅｖｏｎｉｃ  Ｄｅｇｕｓｓａ製の親水性シリカＳｉｐｅｒｎａｔ（商標）２２Ｓ及びＳｉｐｅｒｎａｔ（商標）５０Ｓを挙げることができる。他の製品は、ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｔａｉｗａｎ  Ｌｔｄ．製の合成非晶質水和シリカ「Ｈｉ−Ｓｉｌ（商標）２５７」又はＨｕｂｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の合成ケイ酸カルシウム「Ｈｕｂｅｒｓｏｒｂ  ６００（商標）」である。市販のサブミクロンサイズのシリカは、約０．０２μｍの平均粒径を有するＨｉ−Ｓｉｌ（商標）２３３（ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）である。
【００６２】
研磨剤は、０．０１μｍと４０μｍの間、好ましくは０．０１５μｍと３０μｍの間、さらに好ましくは０．０５μｍと３０μｍの間、さらにいっそう好ましくは０．１μｍと３０μｍの間、さらにいっそう好ましくは０．１μｍと２０μｍの間、さらにいっそう好ましくは０．５μｍと２０μｍの間、及び最も好ましくは１．０μｍと１６μｍの間の中位粒径を有することができる。１つの実施形態において、中位粒径は、０．０１５μｍと１μｍの間、又は０．０２μｍと０．５μｍの間である。中位粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬｔｄからのＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ（商標）を使用してレーザー回折により測定することができる体積中位粒径である。噴霧ノズルの目詰まりを避けるために、研磨剤に含有される最も大きい粒子の最大粒径は、最大で４５μｍ、好ましくは最大で４０μｍであるべきであり、この粒径は、篩分析によって判定することができる。この条件は、（ＩＳＯ３２６２−１９に従って）篩い残分が１．５重量％未満である場合に満たされると考えられる。研磨剤は、上記のレーザー回折によって測定して、最大で４０μｍの、好ましくは最大で３０μｍのＤ９０値を有することができる。典型的に、上記粒径は、一次粒径に関する。本発明の水性懸濁液中の研磨剤の含量は、前記懸濁液の０．０１重量％と３重量％の間、好ましくは０．０２重量％と２重量％の間、さらに好ましくは０．０５重量％と１重量％の間、及びさらにいっそう好ましくは０．１重量％と０．５重量％の間であり得る。
【００６３】
植物の部分への噴霧に使用可能な懸濁液は、農業用スプレーアジュバントを含有することが好ましい。スプレーアジュバントは、界面活性剤又は湿潤剤であることもある。本発明において界面活性剤又は湿潤剤には複数の利点がある。界面活性剤又は湿潤剤は、水性懸濁液の水の表面張力を低下させ、アグロバクテリアが植物の葉の表面により浸透できるようにする。さらに、界面活性剤又は湿潤剤は、懸濁液の安定性を向上させ、懸濁液中の研磨剤の沈降を低減させる。本発明において使用される界面活性剤は、特に限定されない。しかし、非イオン性界面活性剤のことが好ましい。界面活性剤を説明するために用いられることが多い測定法は、ＨＬＢ（親水性／親油性バランス）である。ＨＬＢによって親水性及び親油性化合物と会合する界面活性剤の能力が説明される。高いＨＬＢバランスを有する界面活性剤は、油溶性化合物より水溶性化合物とよく会合する。本明細書において、ＨＬＢ値は、１２以上、好ましくは少なくとも１３であるべきである。非イオン性界面活性剤としては、オルガノシリコーン界面活性剤、例えばポリアルキレンオキシド変性ヘプタメチルトリシロキサンが、本発明において最も好ましい。市販品は、ＧＥ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＭａｔｅｒｉａｌｓからのＳｉｌｗｅｔ  Ｌ７７（商標）スプレーアジュバントである。
【００６４】
本発明において使用可能なアグロバクテリウム株は、当技術分野において植物のトランスフェクション又は形質転換に一般に使用されているものである。一般に、バイナリーベクター系及びバイナリー株が使用される、すなわち、一方で植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移入に必要なｖｉｒ遺伝子及び他方でＴ−ＤＮＡが別々のプラスミド上にある。使用可能なアグロバクテリウム株の例は、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５（２０００）４４６〜４５１のバイナリーアグロバクテリウム株及びベクター系に関するＨｅｌｌｅｎｓらの論文に与えられている。バイナリーアグロバクテリウム株に関連して、ｖｉｒ遺伝子を含有するプラスミドは、「ｖｉｒプラスミド」又は「ｖｉｒヘルパープラスミド」と呼ばれる。トランスフェクトされるＴ−ＤＮＡを含有するプラスミドがいわゆるバイナリーベクターであり、これを本明細書では「ＤＮＡ分子」又は「ベクター」とも呼ぶ。用語「株」又は「アグロバクテリウム株」は、バイナリーベクター以外のアグロバクテリウムの成分に関する。したがって、本明細書では、バイナリーベクターを含有しないバイナリーアグロバクテリウム株とバイナリーベクター導入後のバイナリーアグロバクテリウム株を、同じ株名で呼ぶ。
【００６５】
アグロバクテリアの懸濁液は、次のように生成することができる。核酸構築物を含有するＤＮＡ分子又はベクターをアグロバクテリウム株に形質転換することができ、形質転換されたアグロバクテリウム培養物を、前記ＤＮＡ分子の維持のために場合により選択圧をかけながら増殖させる。１つの方法では、その後、本発明の方法で使用するアグロバクテリウム株を培養培地に接種し、高い細胞濃度まで増殖させる。大量の培養培地を得るために、小容量の高濃度培養培地をより多数の培養物に接種してもよい。一般に、アグロバクテリアを６００ｎｍで少なくとも１、典型的には約１．５のＯＤに相当する細胞濃度まで増殖させる。その後、かかる高濃度アグロバクテリア懸濁液を希釈して所望の細胞濃度を達成する。高濃度アグロバクテリア懸濁液の希釈には水を使用する。この水は、緩衝剤又は塩類を含有することもある。水は、上述の界面活性剤をさらに含有することもある。或いは、濃厚アグロバクテリア懸濁液を水で希釈してもよく、その希釈工程後又は中に任意の添加剤、例えば界面活性剤及び任意選択の緩衝物質を添加する。研磨剤を希釈前、中又は後に添加してもよい。しかし、アグロバクテリア懸濁液に研磨剤を均一に分散させるために研磨剤の添加中に懸濁液を撹拌することが好ましい。濃厚アグロバクテリア懸濁液を希釈するステップを、希釈した懸濁液を噴霧するために使用される噴霧器の噴霧タンクの中で行ってもよい。
【００６６】
本発明の方法において植物又は植物部分のトランスフェクションに使用される噴霧器は、植物の数又は噴霧する面積に主として依存する。１つ又は少数の植物に噴霧するために、家庭及びガーデニングに広く使用されているようなポンプ噴霧器を使用することができる。これらは、０．５リットルと２リットルの間の噴霧タンク容量を有することができる。中規模の散布には、手動操作型液体噴霧器、例えば、レバー操作型ナップサック噴霧器又は手動操作型圧縮噴霧器を使用することができる。しかし、本発明で達成される高いトランスフェクション効率は、圃場又は温室で生育する植物などの多くの植物のトランスフェクションにその最大の可能性がある。このために、電動式液体噴霧器、例えば、噴霧ブームを装備したトラクター搭載液体噴霧器を使用することができる。広い畑にはヘリコプター又は飛行機を使用する空中散布技術も可能である。これらすべてのタイプの噴霧器が当技術分野において公知であり、例えばＧ．Ａ．Ｍａｔｔｈｅｗｓによる書籍「Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、第３版、Ｂｌａｃｋｗｅｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００に記載されている。噴霧器の噴霧タンク内での均質な懸濁を確保するために、小又は中型噴霧器を噴霧中、一定の間隔で又は継続的に振ってもよい。トラクター搭載噴霧器などの大きい噴霧器には噴霧タンク内に攪拌機を装備すべきである。
【００６７】
噴霧する懸濁液中のアグロバクテリア細胞及び場合により研磨剤を考慮して、本発明で使用する噴霧器は、少なくとも微粒噴霧液滴サイズの噴霧を生じさせるべきである。また、Ｇ．Ａ．Ｍａｔｔｈｅｗｓによる上述の書籍、７４頁において使用されている噴霧の分類の中粒噴霧又は粗粒噴霧を用いてもよい。本発明の噴霧の主な目的は、懸濁液での植物組織の湿潤である。したがって、正確な液滴サイズは重要でない。しかし、圧力を上昇させて植物表面に噴霧を施すことにより、トランスフェクション効率をさらに向上させることができる。
【００６８】
本発明の方法でもたらされる非生物的ストレス抵抗性向上以外の任意の所望の形質を植物にもたらす遺伝子を含有する遺伝子導入植物に本発明の方法を適用することが可能である。
【００６９】
本発明は、アグロバクテリウム株の細胞を含有する組成物であって、前記アグロバクテリウム株が、プロモーターに作動可能に連結された目的の異種ＤＮＡ配列を含有する核酸構築物を含み、目的の前記ヌクレオチド配列が、植物に非生物的ストレス抵抗性増加を、前記植物において発現されると、もたらす上記組成物も提供する。この組成物は、液体であることもあり、又は固体であることもある。固体組成物の例は、前記アグロバクテリウム株の細胞を含有する乾燥又は凍結乾燥組成物である。液体組成物の例は、下で述べる懸濁液である。凍結乾燥組成物は、アグロバクテリウム細胞を含有する懸濁液を、好ましくは、グリセロールなどの凍結防止剤の存在下で冷凍乾燥させることによって調製することができる。前記組成物は、スプレーアジュバント又は上述の好ましくは非イオン性の湿潤剤、例えばオルガノシリコーン界面活性剤をさらに含むことがある。例えば水又は水性溶媒での希釈により、噴霧用の懸濁液を生成するために、前記組成物を使用することができる。
【００７０】
本発明の方法では、非生物的ストレス抵抗性増加を前記植物にもたらすことができる目的の前記ヌクレオチド配列又は前記タンパク質を多細胞植物、特に高等植物において発現させることができる。農業に使用される作物植物が好ましい。単子葉植物と双子葉（作物）植物の両方を使用することができる。本発明での使用のための一般的な作物植物としては、アルファルファ、オオムギ、マメ、キャノーラ、ササゲ、ワタ、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ハウチワマメ、キビ、オートムギ、エンドウマメ、ピーナッツ、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、カラスノエンドウ、コムギ、フジ及び堅果植物が挙げられる。本発明の実施に好ましい植物種としては、イネ科、キク科、ナス科及びバラ科の代表物が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい植物は、植物連鎖に通常は入らない植物、例えば、タバコ属種、例えばタバコ（Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ）及びベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）であり、使用することができる。
【００７１】
一般に、前記タンパク質を前記植物又は植物部分の細胞のサイトゾルにおいて発現させる。この場合、特定の区画にタンパク質を指向させるいずれのシグナルペプチドも酵素に加えない。
【００７２】
本発明において発現及び使用される、非生物的ストレス抵抗性増加を前記植物にもたらすことができるタンパク質は、一般に、本発明においてそのタンパク質を発現させることができる植物又は植物部分とは異種のタンパク質であり、すなわち、前記植物又はその部分は、そのタンパク質を天然に生産しない。これらの酵素をコードする遺伝子の植物における発現への、特にそれらの発現に用いられる植物における発現へのコドン使用頻度を最適化することが可能である。コドン最適化は、発現収率を増加させる標準的方法である。コドン最適化遺伝子及び核酸を商業的供給源、例えば、ドイツ、レーゲンスブルクのＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎ  ＧｍｂＨに発注することができる。
【００７３】
植物の非生物的ストレス抵抗性増加は、本発明の懸濁液での植物の処理、及び対照又はリファレンスとして、前記アグロバクテリウム株の前記細胞を含有しない懸濁液での同じタイプの植物の他の点では同一の条件下での処理によって判定することができる。その後、両方の植物を同一の条件の非生物的ストレスに付す。本発明に従って処理した植物の非生物的ストレス抵抗性増加を、より元気な生育又はより良好な健康状態によって検出することができる。
【００７４】
本発明に従って増加させることができる非生物的ストレス抵抗性の例は、以下である：乾燥抵抗性、塩抵抗性、浸透圧ストレス抵抗性、低温抵抗性、凍結抵抗性、熱抵抗性、重金属に対する抵抗性、低酸素に対する抵抗性又は酸化ストレス抵抗性。
【００７５】
植物の乾燥ストレス耐性を向上させるための目的のヌクレオチド配列及びタンパク質の例を以下に与える。遺伝子及びタンパク質の参照先も与える。
【００７６】
ＪＨ６４２などの枯草菌亜種スブチリス株からのＣｓｐＢ（ＡＡＢ０１３４６）。Ｃａｓｔｉｇｌｉｏｎｉら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １４７（２００８）４４６〜４５５及びＨｕｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８（２００６）２４０〜２４８。植物における発現のためにコドン最適化されたＣｓｐＢのコード配列を配列番号１に与える。アミノ酸配列を配列番号２に与える。
【００７７】
大腸菌低温ショックタンパク質７．４（ｃｓｐＡ）遺伝子。植物における発現に適したＣｓｐＡタンパク質のコード配列を配列番号３に与える。アミノ酸配列を配列番号４に与える。
【００７８】
シロイヌナズナ核転写因子ＹサブユニットＢ−１（ＮＦ−ＹＢ１）（ＮＭ＿１２９４４５．２）は、遺伝子導入植物の乾燥抵抗性を増加させる；Ｎｅｌｓｏｎら、ＰＮＡＳ  １０４（２００７）１６４５０〜１６４５５を参照されたい。コード配列を配列番号５に与える。アミノ酸配列を配列番号６に与える。
【００７９】
ＢｎＬＡＳ−ＧＲＡＳファミリー遺伝子。植物におけるそれらの異所発現は、生育を阻害し、開花を遅らせ、葉の老化を遅らせ、乾燥抵抗性を増加させる；Ｙａｎｇら（２０１１）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  ３０（３）：３７３〜８８を参照されたい。コード配列を配列番号７に与える。アミノ酸配列を配列番号８に与える。
【００８０】
ＩＰＴ（イソペンテニルトランスフェラーゼ）発現は、渇水中、光合成タンパク質複合体の分解を防止する；Ｒｉｖｅｒｏら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１（２０１０）１９２９〜１９４１、及びＯｒｉら、Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１（１９９９）１０７３〜１０８０を参照されたい。ＩＰＴコード配列を配列番号２１に与える。アミノ酸配列を配列番号２２に与える。
【００８１】
ＢｃＷＲＫＹ４６−ＴＦ、ＷＲＫＹタンパク質ファミリーのメンバー、は、タバコの低温、塩及び脱水ストレス耐性を強化することが報告された；Ｗａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ  ３９（２０１２）４５５３〜４５６４を参照されたい。ＢｃＷＲＫＹ４６のコード配列を配列番号１１に与える。アミノ酸配列を配列番号１２に与える。
【００８２】
ヒマワリからのＨａＨＢ１、ＡｔＨＢ１３、ＡｔＰＲ２、ＡｔＰＲ４及びＡｔＧＬＵ−ホメオドメイン・ロイシンジッパー転写因子は、乾燥及び塩分ストレスに対する耐性を付与する；Ｃａｂｅｌｌｏ及びＣｈａｎ（２０１２）Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．１０（２０１２）８１５〜８２５を参照されたい。スプライス部位を除去した完全コード配列を配列番号１３に与える。アミノ酸配列を配列番号１４に与える。
【００８３】
グラム陰性植物病原菌からのハーピン−過敏細胞死（ＨＣＤ）、病原体防御を刺激し、植物の生育を増進し、乾燥耐性を強化する；Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．６２（２０１１）４２２９〜４２３８を参照されたい。
【００８４】
ＡＶＰ１  Ｈ＋ポンプ（液胞Ｈ１−ピロホスファターゼ）−液胞Ｈ１−ピロホスファターゼを過剰発現する植物は、同質遺伝子野生型株より高ＮａＣｌ濃度及び水分欠乏に対する抵抗性がはるかに高い；Ｇａｘｉｏｌａら、２００１  ＰＮＡＳ  ９８（２０）１１４４４〜１１４４９；Ｐａｒｋら、ＰＮＡＳ  １０２（２００５）１８８３０〜１８８３５；Ｚｈａｎｇら（２０１１）Ｐｌａｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ６：６、８６１〜８６３を参照されたい。コード配列を配列番号１７に与える。アミノ酸配列を配列番号１８に与える。
【００８５】
イネからのストレス応答性遺伝子ＳＮＡＣ１（ストレス応答性ＮＡＣ１）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３９４７０２）−ＳＮＡＣ１（ストレス応答性ＮＡＣ１）は、過酷な乾燥ストレス条件下の圃場で生殖生長期の遺伝子導入イネの乾燥抵抗性を有意に強化し、その上、表現型の不利益も収量損失も示さない；Ｈｕら（２００６）ＰＮＡＳ  １０３：１２９８７〜１２９９２を参照されたい。コード配列を配列番号１９に示す。アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【００８６】
以下のタンパク質を植物において発現させることによって塩耐性を増加させることができる：
ＧｍＲＤ２２（ダイズからのアポプラスト局在ＢＵＲＰ−ドメインタンパク質）は、遺伝子導入シロイヌナズナ及びイネの塩分及び浸透圧ストレス耐性を増加させ、リグニン生産を増加させる；Ｗａｎｇら（２０１２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．３５（２０１２）１９３２〜１９４７を参照されたい。ＧｍＲＤ２２のコード配列を配列番号９に与える。アミノ酸配列を配列番号１０に与える。
【００８７】
ヒマワリからのＨａＨＢ１、ＡｔＨＢ１３、ＡｔＰＲ２、ＡｔＰＲ４及びＡｔＧＬＵ−上述のホメオドメイン・ロイシンジッパー転写因子を、植物の塩耐性を増加させるために使用することができる。
【００８８】
アポプラストのアスコルビン酸オキシダーゼ遺伝子の発現抑制は、植物の塩耐性を増加させる；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｅｘｐ  Ｂｏｔａｎｙ  ５６（２００５）１７８５〜１７９６を参照されたい。タバコからの遺伝子のコード配列を配列番号１５に与える。アミノ酸配列を配列番号１６に与える。当技術分野において公知であるようにＲＮＡ干渉を用いることによってアスコルビン酸オキシダーゼの発現を抑制することができる。
【００８９】
ＡＶＰ１  Ｈ＋ポンプ（液胞Ｈ１−ピロホスファターゼ）−液胞Ｈ１−ピロホスファターゼを過剰発現する遺伝子導入植物は、同質遺伝子野生型株より高ＮａＣｌ濃度及び水分欠乏に対する抵抗性がはるかに高い；Ｇａｘｉｏｌａら、２００１  ＰＮＡＳ  ９８（２０）１１４４４〜１１４４９；Ｚｈａｎｇら（２０１１）Ｐｌａｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ６：６、８６１〜８６３を参照されたい；配列については上を参照されたい。
【００９０】
イネからのストレス応答性遺伝子ＳＮＡＣ１（ストレス応答性ＮＡＣ１）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３９４７０２）−ＳＮＡＣ１（ストレス応答性ＮＡＣ１）は、過酷な乾燥ストレス条件下の圃場で遺伝子導入イネの乾燥塩抵抗性を強化する；Ｈｕら（２００６）ＰＮＡＳ  １０３：１２９８７〜１２９９２を参照されたい。コード配列を配列番号１９に示す。アミノ酸配列を配列番号２０に示す。
【００９１】
以下のタンパク質を植物において発現させることによって低温耐性を増加させることができる：
ＢｃＷＲＫＹ４６−ＴＦ、ＷＲＫＹタンパク質ファミリーのメンバー。遺伝子導入タバコにおける構成的発現は、低温、ＡＢＡ、塩及び脱水ストレスに対する感受性を低減させた。Ｗａｎｇら（２０１２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ。
【００９２】
ＳＮＡＣ１標的遺伝子ＯｓＳＲＯ１ｃは、イネにおいて過酸化水素を調節することにより酸化ストレス耐性を修飾する；Ｙｏｕら、Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ（２０１３）を参照されたい。
【００９３】
ＬｅＣＹＰ１−トマトシクロフィリン。コード配列を配列番号２３に与える。アミノ酸配列を配列番号２４に与える。根形成向上により乾燥抵抗性；Ｏｈら（２００６）Ｐｌａｎｔａ  ２２４：１３３〜１４４を参照されたい。
【００９４】
本発明に従って非生物的ストレス抵抗性増加を植物にもたらすために、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のタンパク質のいずれかを植物において発現させてもよい。同じ目的が、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４の配列のいずれかと１００％未満の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を前記植物において発現させることによって達成されることもある。発現されるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列全体と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する変異体タンパク質であることもある。前記アミノ酸配列同一性は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％及びさらにいっそう好ましくは少なくとも９７％であることもある。アミノ酸配列同一性パーセントを算出する場合、２つの配列を最適にアラインメントし、それら２配列間のヌクレオチド又はアミノ酸残基の完全一致数を決定する。その完全一致数をアラインメントした領域（すなわち、アラインメントしたアミノ酸残基の数）で割り、１００をかけて、配列同一性パーセント値に到達する。ギャップ、すなわち、残基が一方の配列には存在するが他方には存在しないアラインメント内の位置は、非同一残基がある位置と考えられる。アミノ酸配列同一性は、標準設定を用いてＢＬＡＳＴＸ２．２．１４を使用して決定することができる。標準設置は、例えば、アラインメント内の配列ギャップを可能にする。
【００９５】
アラインメントする領域の長さは、好ましくは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のそれぞれのタンパク質の全長にわたる。
【００９６】
別の実施形態において、発現されるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の、且つ、かかる長さにわたってそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４と少なくとも９０％の配列同一性のアミノ酸配列を含む又はから成る。別の実施形態において、発現されるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の、且つ、かかる長さにわたってそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４と少なくとも９５％の配列同一性のアミノ酸配列を含む又はから成る。これらの実施形態において、変異体タンパク質は、好ましくは、植物に配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２又は２４のそれぞれのタンパク質の非生物的ストレス抵抗性増加をそれぞれもたらすことが尚できる。
【００９７】
或いは、変異体タンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列と比較して１〜数個のアミノ酸付加、置換又は欠失を有するアミノ酸配列を有する、又はから成り、前記変異体タンパク質は、好ましくは、非生物的ストレス抵抗性増加を前記植物にもたらすことが尚できる。アミノ酸付加、置換又は欠失の最大数は、最大で２０、好ましくは最大で１５、さらに好ましくは最大で１０、及びさらにいっそう好ましくは最大で５であり得、それに従って、付加、置換及び付加の合計数により「アミノ酸付加、置換又は欠失」の数が決まる。
【００９８】
他の実施形態において、発現されるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸配列とこれらの配列番号の全長にわたって比較して少なくとも９０％のアミノ酸配列類似性を有する。好ましくは、配列同一性は、これらの配列番号の全長にわたって少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％である。別の実施形態において、発現されるタンパク質は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つのアミノ酸残基数の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の、且つ、かかる全長にわたってそれぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２及び２４のいずれか１つと少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％の配列類似性の、アミノ酸配列を含む又はから成る。
【００９９】
タンパク質配列の配列類似性は、あるアミノ酸と別のアミノ酸のすべての可能な交換についてのスコアに関する置換行列を用いる。タンパク質配列間の類似度は、例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２置換行列（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５）で評価することができる。
【０１００】
前記植物に乾燥ストレス抵抗性増加をもたらすことができるタンパク質は、低温ショックドメインを有することがあり、好ましくは、前記タンパク質は、一本鎖ＲＮＡの結合部位を有するＲＮＡシャペロンである。低温ショックタンパク質などのＲＮＡシャペロンは、ミスフォールドしたＲＮＡ分子を、ＲＮＡ二本鎖の不安定化又は一本鎖核酸への結合によって回復させると考えられる（例えば、Ｈｕｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８８（２００６）２４０〜２４８を参照されたい）。好ましくは、前記タンパク質は、配列番号２の枯草菌ＣｓｐＢであるか、又は配列番号２の枯草菌ＣｓｐＢの（上で定義したとおりの）変異体である。１つの実施形態において、前記タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
【０１０１】
タンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列によって定義されるタンパク質の変異体である場合、前記タンパク質は、大腸菌からのＣｓｐＡのアミノ酸残基Ｗ１１、Ｆ１８、Ｆ２０，Ｆ３１、Ｈ３３及びＦ３４を、大腸菌からのＣｓｐＡ中のこれらの位置に対応する位置に、少なくとも有する。大腸菌からのＣｓｐＡ中の位置に対応する位置は、アラインメントによって決定することができ、前記タンパク質配列の最適アラインメントに対応する。
【０１０２】
１つの実施形態において、非生物的ストレス耐性は、乾燥耐性であり、前記タンパク質は、配列番号８の植物転写因子ＬＡＳ、又は配列番号１０のＧｍＲＥ２２２、又は上で定義したとおりのその変異体である。かかる実施形態において、植物は、双子葉植物、好ましくはナス科植物、及びさらに好ましくはトマト植物である。
【実施例】
【０１０３】
（参照例１）
コロニー形成単位（ｃｆｕ）での液体培地中のアグロバクテリウム細胞濃度の決定
液体懸濁液１ｍｌ当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍｌ）での液体懸濁液中のアグロバクテリウム細胞の濃度を、次のプロトコルを用いて決定することができる。構築物ｐＮＭＤ６２０で形質転換したアグロバクテリウム・ツメファシエンスＩＣＦ３２０株の細胞を、２５ｍｇ／Ｌ  カナマイシン（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、Ａ１４９３）と５０ｍｇ／Ｌ  リファンピシン（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、４１６３．２）とを含有する７．５ｍｌの液体ＬＢＳ培地中で増殖させた。細菌培養物を継続的に振盪しながら２８℃でインキュベートした。分光光度計を使用して、６００ｎｍ波長で、吸光度単位（ＡＵ）で表される細菌培養物の吸光度又は光学密度（ＯＤ６００）を培養物の１ｍｌアリコートでモニターした。液体培養物１ミリリットル当たりのコロニー形成単位数（ｃｆｕ／ｍｌ）として概算される細胞濃度をＯＤ６００値１、１．３、１．５、１．７及び１．８で分析することができる。このために、液体培養物の２５０μｌアリコートをＬＢＳ培地で希釈して、２５ｍｌの最終体積を達成した（希釈１：１００）。２．５ｍｌのかかる１：１００希釈物を２２．５ｍｌのＬＢＳと混合して、希釈１：１０００を達成した。液体培養希釈物１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：１００，０００、１：１，０００，０００、１：１０，０００，０００及び１：１００，０００，０００を同様に調製した。２５ｍｇ／Ｌ  カナマイシンと５０ｍｇ／Ｌ  リファンピシンとを補足した寒天凝固ＬＢＳ培地に少なくとも３種の希釈物のアリコート（直径９０ｍｍのプレート１枚当たり２５０μｌの細菌培養物）を塗布した。各希釈物のアリコートのプレーティングを三重反復で行った。２８℃で２日のインキュベーション後、細菌コロニーをプレートごとに計数した。１：１，０００，０００及び１：１０，０００，０００希釈物のプレーティングにより、それぞれ、プレート１枚当たり数百及び数十のコロニーを得た。プレート１枚当たりほんの少数のコロニーしかもたらさない希釈１：１００，０００に関しては、この希釈を細胞濃度の算出に用いなかった。細胞濃度を次の式に従って概算した：ｃｆｕ／ｍｌ＝４×コロニー数毎プレート×希釈係数。
【０１０４】
６００ｎｍ（ＬＢ培地中）での及び細胞形成単位での吸光度測定により測定する場合の形質転換細胞濃度について、本明細書では次の関係を用いる：１．０のＯＤ６００は、１．１×１０９ｃｆｕ／ｍｌに相当する。
【０１０５】
ＬＢＳ培地（液体）
１％大豆ペプトン（大豆粕のパパイン水解物；Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｓ１３３０）
０．５％酵母エキス（Ｄｕｃｈｅｆａ、Ｙ１３３３）
１％塩化ナトリウム（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、９２６５．２）
を水に溶解し、それを１Ｍ  ＮａＯＨ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、６７７１．２）でｐＨ７．５に調整する。
【０１０６】
固体ＬＢＳ培地を調製するために、液体ＬＢＳ培地に１．５％寒天（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ、２２６６．２）を補足した。培地を１２１℃で２０分間、オートクレーブで処理した。
【０１０７】
（例１）
後続の例で使用するベクター
本研究において、本発明者らは、３５Ｓ  ＣａＭＶプロモーターと細胞間移行能力を有する又は有さない、ＴＭＶに及びＰＶＸに基づくウイルスレプリコンとに基づく標準的な転写ベクターを使用した。５つすべてのタイプのクローニングベクターについてのプラスミドマップを図１に示す。すべての場合、ｃａｔｇ及びｇａｔｃ（ｔａａｇ）５’及び３’オーバーハングをそれぞれ有するＢｓａｌクローニング部位を用いて目的の遺伝子を挿入した。ｐＮＭＤ２４９２転写ベクターは、ｐｌＣＢＶ１０、ｐＢＩＮ１９由来バイナリーベクター（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔら、２００４、２００６）に基づいて作成した。このベクターは、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界の間に挿入された２個の発現カセットを含有する。右の境界に隣接する発現カセットは、ＣＡＭＶ  ３５Ｓプロモーターと、オメガ翻訳エンハンサーと、目的の遺伝子の挿入のためのＢｓａｌクローン部位と、ｎｏｓターミネーターとを含んだ（配列順に記載）。左の境界に隣接する発現カセットは、３５Ｓプロモーター、続いてオメガ翻訳エンハンサー、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）からのサイレンシングのＰ１９サプレッサーのコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＢ５６４８３．１）及びｏｃｓターミネーターを含有した。
【０１０８】
細胞間移行能力を有する、ＴＭＶに基づくベクターｐＮＭＤ０３５、細胞間移行能力がない、ＴＭＶに基づくベクターｐＮＭＤ６６１、細胞間及び全身移行能力を有する、ＰＶＸに基づくベクターｐＮＭＤ６７０、並びに全身移行も細胞間移行も不可能にされた、ＰＶＸに基づくベクターｐＮＭＤ６９４は、特許「植物をトランスフェクトする方法（Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ  ｐｌａｎｔｓ）」に既に記載されている。
【０１０９】
Ｂｓａｌクローニング部位を用いてｐＮＭＤ１４２６クローニングベクターにシロイヌナズナ核転写因子ＹサブユニットＢ−１（ＮＦ−ＹＢ１）のコード配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１２９４４５．２）を直接挿入することにより、プラスミド構築物ｐＮＭＤ３４８６を作成した。同様に、同じクローニングベクターに枯草菌亜種スブチリスＪＨ６４２株からの低温ショックタンパク質のコドン最適化コード配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ０１３４６）を挿入して、プラスミド構築物ｐＮＭＤ３４９３を得た（図２）。
【０１１０】
（例２）
ナタネ植物の乾燥抵抗性に対するＮＦ−ＹＢ１及びＣｓｐＢ遺伝子の一過性発現の影響
７週齢セイヨウアブラナ植物に、ｐＮＭＤ３４８６及びｐＮＭＤ３４９３構築物（それぞれ、３５Ｓプロモーターの制御下にあるＮＦ−ＹＢ１及びＣｓｐＢコード配列を含有する転写ベクター）（図２）を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣｒｙＸ株を噴霧した。Ａ．ツメファシエンスＣｒｙＸ株は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１３／０００９９４に記載されている。噴霧当日、植物の灌水を停止した。１１日の渇水後、その後７日、植物に灌水した。その後、植物を１３日の渇水に付し、再び１日灌水した。第１の渇水処理（１１日）の終了までは、ＮＦ−ＹＢ１、ＣｓｐＢ及び未処理対照植物すべてが、一切の群間有意差なくしおれて見えた（図３）。その後７日の灌水中にすべての植物は、渇水処理前に有した形状を回復し、植物は健康且つ元気に見えた（図４）。第２の渇水処理（８日）の終了までは、ＣｓｐＢ植物は、ＮＦ−ＹＢ１植物と比較した場合、わずかにしおれが少なかった（図５）。１日の再灌水後、ＣｓｐＢ植物は、他の２群よりはるかに元気であった（図６）。
【０１１１】
（例３）
トマト植物の乾燥耐性に対するＢｎＬＡＳ及びＧｍＲＤ２２遺伝子の一過性発現の影響
３週齢トマト栽培品種バルコニー・レッド植物に、ｐＮＭＤ７５７０、ｐＮＭＤ７６００及びｐＮＭＤ６００構築物（それぞれ、ＢｎＬＡＳ、ＧｍＲＤ２２及びＧＦＰコード配列を含有する全身移行能力を有する、ＰＶＸに基づくベクター）（図７）を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスＩＣＦ３２０株を噴霧した。植物の灌水を噴霧３週間後に停止した。渇水曝露は１４日間続いた。渇水処理の終了までは、ＢｎＬＡＳ及びＧｍＲＤ２２トランスフェクト植物のほうがトランスフェクトされていない対照植物よりしおれが少なかった（図８）。１４日の渇水（土壌の水飽和率おおよそ３４％）後、果実を収穫するまで植物に再び灌水した。渇水に曝されたトマト植物の果実収量を、アグロバクテリアを噴霧してから１００日後に評価した。この実験に含めた個々の植物について収穫された果実を図９に示す。渇水曝露後、ＧｍＲＤ２２トランスフェクト植物は、トランスフェクトされていない植物及びＢｎＬＡＳがトランスフェクトされた植物及びＧＦＰ植物と比較した場合、高い果実バイオマスを示した（図１０）。
【０１１２】
稚苗の乾燥抵抗性に対するＢｎＬＡＳの一過性発現の効果を評価するために、土壌で生育した１２日齢トマト（栽培品種バルコニー・レッド）小植物に、ＰＶＸベクターｐＮＭＤ７５８０（ＢｎＬＡＳ挿入）及びｐＮＭＤ５８００（ＧＦＰ挿入、トランスフェクション対照）を保有するアグロバクテリアの懸濁液を噴霧した。噴霧１３日後、苗を１０日の渇水に曝し、その後、再び灌水した。１０日の渇水処理後、トランスフェクトされていない苗及びＧＦＰベクターがトランスフェクトされた苗と比較して、ＢｎＬＡＳトランスフェクト植物のほうが元気であり、しおれが少なかった（図１１、上のパネル）。その差は、２時間の水回復後、よりいっそう明らかである（図１１、下のパネル）。
【０１１３】
（例４）
トマト植物の浸透圧ストレス抵抗性に対するＢｎＬＡＳ及びＧｍＲＤ２２遺伝子の一過性発現の影響
土壌で生育した１２日齢トマト（栽培品種バルコニー・レッド）苗に、ＰＶＸベクターｐＮＭＤ７５８０（ＢｎＬＡＳ挿入）、ｐＮＭＤ７６１０（ＧｍＲＤ２２挿入）及びｐＮＭＤ５８００（ＧＦＰ挿入、トランスフェクション対照）を保有するアグロバクテリアの懸濁液を噴霧した。噴霧１３日後、ＰＥＧ６０００の２０％溶液が入っているビーカーに苗を移し、そこで２０時間インキュベートした。図１２に描写されているように、トランスフェクトされていない植物及びＧＦＰベクターがトランスフェクトされた植物と比較して、ＢｎＬＡＳ及びＧｍＲＤ２２トランスフェクト植物のほうが生育可能であり、しおれが少なかった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１４】
本明細書において言及する核酸及びアミノ酸配列
ＣｓｐＢ−枯草菌からの低温ショックタンパク質
配列番号１：Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎによって合成された、セイヨウアブラナのコドン最適化された完全ＣＤＳ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ０１３４６
【化１】
0006453315.tif 000002
配列番号２：アミノ酸配列：
【化２】
0006453315.tif 000003
大腸菌低温ショックタンパク質７．４（ｃｓｐＡ）遺伝子、完全ｃｄｓ
ＧｅｎＢａｎｋ：Ｍ３０１３９．１
配列番号３：ＣＤＳ：
【化３】
0006453315.tif 000004
配列番号４：タンパク質：
【化４】
0006453315.tif 000005
ＭＦ−ＹＢ１−シロイヌナズナ核転写因子ＹサブユニットＢ−１
配列番号５：Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎによって合成されたＯＲＦ原配列
ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿１２９４４５．２
【化５】
0006453315.tif 000006
配列番号６：アミノ酸配列
【化６】
0006453315.tif 000007
ＢｎＬＡＳ−セイヨウアブラナ栽培品種ホワ・シュワーン（Ｈｕａ  ｓｈｕａｎｇ）５番転写因子ＬＡＳ
配列番号７：Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された完全ＣＤＳ
スプライス部位を除去：４５４−４５６：ＡＧ→ＴＣ、Ｃ６５１Ｔ
ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＱ３２４２３３．１
【化７】
0006453315.tif 000008
配列番号８：アミノ酸配列
【化８】
0006453315.tif 000009
ＧｍＲＤ２２−ダイズからのアポプラスト局在ＢＵＲＰ−ドメインタンパク質
配列番号９：Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された完全ＣＤＳ（ＢｓａＩ部位除去のためにＣ８４３Ｇサイレント突然変異）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＴ０９７２９９．１
【化９】
0006453315.tif 000010
配列番号１０：アミノ酸配列
【化１０】
0006453315.tif 000011
ＢｃＷＲＫＹ４６−チンゲンサイ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ  ｓｕｂｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）転写因子ＷＲＫＹ４６
配列番号１１：Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された完全ＣＤＳ。
ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＭ５８５２８４
【化１１】
0006453315.tif 000012
配列番号１２：アミノ酸配列
【化１２】
0006453315.tif 000013
ＨａＨＢ１−ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）ＨＤ−ＺｉｐサブファミリーＩ転写因子
配列番号１３：Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された完全ＣＤＳ；スプライス部位を除去  Ｇ５６１Ａ、Ｇ７５０Ａ
ＧｅｎＢａｎｋ：ＨＱ２８７８０２．１
【化１３】
0006453315.tif 000014
配列番号１４：アミノ酸配列
【化１４】
0006453315.tif 000015
ＮｔＡＡＯ−タバコアスコルビン酸オキシダーゼ前駆体
配列番号１５：Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された完全ＣＤＳ。
ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ４３６２４
【化１５】
0006453315.tif 000016
配列番号１６：アミノ酸配列
【化１６】
0006453315.tif 000017
ＡＶＰ１＿ＡＲＡＴＨ：シロイヌナズナ液胞Ｈ＋−ピロホスファターゼ（ＡＶＰ−３）
配列番号１７：Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成された完全ＣＤＳ；（Ｅ２２９Ｄ突然変異を有する；スプライス部位を除去：Ａ２６１Ｇ、Ｃ２００４Ｇ、Ａ２１９０Ｔ）
ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＥ２９３４９．１
【化１７】
0006453315.tif 000018
配列番号１８：アミノ酸配列
【化１８】
0006453315.tif 000019
ＳＮＡＣ１−イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）（日本型栽培品種群）ストレス誘導転写因子ＮＡＣ１（ＳＮＡＣ１）
配列番号１９：Ｅｎｔｌｅｃｈｏｎによって合成された、ベンサミアナタバコのコドン最適化された完全ＣＤＳ
ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＱ３９４７０２．１
【化１９】
0006453315.tif 000020
配列番号２０：アミノ酸配列
【化２０】
0006453315.tif 000021
アグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８からのＩＰＴイソペンテニルトランスフェラーゼＩＰＴ（Ｅ８８Ｇ）
配列番号２１：ＣＤＳ、Ｅ８８Ｇ突然変異  ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０２５１０９．１
【化２１】
0006453315.tif 000022
配列番号２２：アミノ酸配列
【化２２】
0006453315.tif 000023
ＬｅＣＹＰ−トマトシクロフィリン
配列番号２３：ＣＤＳ
【化２３】
0006453315.tif 000024
配列番号２４：アミノ酸配列
【化２４】
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配列番号２５：ｐＮＭＤ２４９２のＴ−ＤＮＡ領域
配列番号２６：ｐＮＭＤ０３５のＴ−ＤＮＡ領域
配列番号２７：ｐＮＭＤ６６１のＴ−ＤＮＡ領域
配列番号２８：ｐＮＭＤ６７０のＴ−ＤＮＡ領域
配列番号２９：ｐＮＭＤ６９４のＴ−ＤＮＡ領域
配列番号３０：ｐＮＭＤ３４８６のＴ−ＤＮＡ領域
配列番号３１：ｐＮＭＤ３４９３のＴ−ＤＮＡ領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
0006453315.tif 000036
【図１２】
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【配列表】
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