(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における癌の治療のための医薬の製造のための、少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターおよび養子細胞治療組成物の使用であって、
前記養子細胞治療組成物と、少なくとも１種のサイトカインをコードする前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターとが、対象に別々に投与され、
前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、
ｉ）以下のものを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクター：
・５／３キメラ繊維ノブ、
・Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、
・アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、
・ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、および
・ウイルスＥ３プロモーター下で導入遺伝子発現の複製に関連する制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりの少なくともＴＮＦアルファまたはＩＬ−２の導入遺伝子をコードする核酸配列；または
ｉｉ）以下のものを含むアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）ベクター：
・Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのプロモーター、
・Ｅ３  ９ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａおよびＥ３  １５．３ｋＤａに影響を与える、Ｅ３領域における欠失、および
・Ｅ３の前記欠失領域の代わりの少なくともＣＤ４０Ｌの導入遺伝子の発現のための外因性または腫瘍特異的プロモーター
である、使用。
【請求項２】
前記養子細胞治療組成物が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体改変リンパ球およびキメラ抗原受容体改変リンパ球からなる群から選択される細胞型を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記養子細胞治療組成物が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、調節性Ｔ細胞および末梢血単核細胞からなる群から選択される細胞型を含む、請求項１〜２の何れか１項に記載の使用。
【請求項４】
前記養子細胞治療組成物がＴ細胞を含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛腫瘍、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群から選択される、請求項１〜４の何れか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記対象がヒトまたは動物である、請求項１〜５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの対象への投与を、同時にまたは任意の順序で連続して行う、請求項１〜６の何れか１項に記載の使用。
【請求項８】
養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの連続投与の間隔が、１分から４週間の期間である、ならびに／または養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性ウイルスベクターを複数回投与する、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記養子細胞治療組成物および／または少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの投与を、腫瘍内、動脈内、静脈内、胸膜内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射、または経口投与により行う、請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記腫瘍退縮性ウイルスベクターが、２種以上のサイトカインをコードする、請求項１〜９の何れか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍退縮性ウイルスベクターが、
ＩＬ−２、および
インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるサイトカイン群から選択される１種のサイトカインまたは複数種のサイトカイン
をコードする、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記アデノウイルスベクターが、２つの導入遺伝子の間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または任意にリボソームシャント部位２Ａを含む、請求項１０または１１に記載の使用。
【請求項１３】
少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを、１×１０10〜１×１０14ウイルス粒子の量で投与する、請求項１〜１２の何れか１項に記載の使用。
【請求項１４】
前記養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを、同時にまたは任意の順序で連続して対象に投与する、請求項１〜１３の何れか１項に記載の使用。
【請求項１５】
対象の腫瘍内における別個の養子細胞療法またはＴ細胞療法の効果を増加させるための医薬の製造のための腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの使用であって、
前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、
ｉ）以下のものを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクター：
・５／３キメラ繊維ノブ、
・Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、
・アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、
・ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、および
・ウイルスＥ３プロモーター下で導入遺伝子発現の複製に関連する制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりの少なくともＴＮＦアルファまたはＩＬ−２の導入遺伝子をコードする核酸配列；または
ｉｉ）以下のものを含むアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）ベクター：
・Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのプロモーター、
・Ｅ３  ９ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａおよびＥ３  １５．３ｋＤａに影響を与える、Ｅ３領域における欠失、および
・Ｅ３の前記欠失領域の代わりの少なくともＣＤ４０Ｌの導入遺伝子の発現のための外因性または腫瘍特異的プロモーター
である、使用。
【請求項１６】
養子細胞治療組成物、および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを含む医薬キットであって、
前記養子細胞治療組成物が第１の製剤に製剤化され、少なくとも１種のサイトカインをコードする前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが第２の製剤に製剤化され、
前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、
ｉ）以下のものを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクター：
・５／３キメラ繊維ノブ、
・Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、
・アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、
・ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、および
・ウイルスＥ３プロモーター下で導入遺伝子発現の複製に関連する制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりの少なくともＴＮＦアルファまたはＩＬ−２の導入遺伝子をコードする核酸配列；または
ｉｉ）以下のものを含むアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）ベクター：
・Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのプロモーター、
・Ｅ３  ９ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａおよびＥ３  １５．３ｋＤａに影響を与える、Ｅ３領域における欠失、および
・Ｅ３の前記欠失領域の代わりの少なくともＣＤ４０Ｌの導入遺伝子の発現のための外因性または腫瘍特異的プロモーター
である、医薬キット。
【請求項１７】
前記第１および第２の製剤が同時にまたは任意の順序で連続して対象に投与されるためのものである、請求項１６に記載の医薬キット。
【請求項１８】
１）５／３キメラ繊維ノブを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格、
２）Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、
３）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、
４）ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、ならび
に
５）ウイルスＥ３プロモーター下で導入遺伝子発現の複製に関連する制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりの少なくともＴＮＦアルファまたはＩＬ−２の導入遺伝子をコードする核酸配列
を含む、腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項１９】
Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのプロモーター、
Ｅ３  ９ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａおよびＥ３  １５．３ｋＤａに影響を与える、Ｅ３領域における欠失、および
Ｅ３の前記欠失領域の代わりの少なくともＣＤ４０Ｌの導入遺伝子を発現するための外因性または腫瘍特異的プロモーター
を含む、血清型３（Ａｄ３）腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２０】
前記導入遺伝子がＣＤ４０Ｌである、請求項１９に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２１】
前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが２種以上のサイトカインをコードする、請求項１８〜２０の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２２】
前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、ＩＬ−２と請求項１１に記載のサイトカイン群から選択される１種のサイトカインまたは複数種のサイトカインとをコードする、請求項２１に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２３】
前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、２つの導入遺伝子の間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または任意にリボソームシャント部位２Ａを含む、請求項２１または２２に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２４】
前記Ｅ３領域における導入遺伝子を発現するためのプロモーターが、ＣＭＶプロモーターまたはＥ２Ｆプロモーターである、請求項１９〜２３の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２５】
前記ベクターが、前記Ｅ３領域におけるＥ１Ａを発現するためのｈＴＥＲＴプロモーターおよびＣＤ４０Ｌを発現するためのＣＭＶプロモーターを含む、請求項１９〜２４の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
【請求項２６】
請求項１８〜２５の何れか１項に記載の腫瘍退縮性ベクターを含む、医薬組成物。
【請求項２７】
癌の治療のための医薬の製造のための請求項１８〜２５の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの使用。
【請求項２８】
前記使用が、同時もしくは連続する放射線療法、モノクローナル抗体、化学療法または他の抗癌薬もしくは介入の対象への適用をさらに含む、請求項１〜１３または２７の何れか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は生命科学および医薬の分野に関する。具体的には、本発明はヒトの癌治療に関する。より具体的には、本発明は、癌のための治療的使用および治療的方法のための、単独のまたは治療組成物と併用される腫瘍退縮性アデノウイルスベクターに関する。一側面において、本発明は、養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの個別投与に関する。さらに、本発明は医薬キットおよび医薬組成物に関し、両方とも腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを利用する。
【発明の背景】
【０００２】
新規療法が癌治療のために絶えず開発されている。養子細胞療法（ＡＣＴ）は癌を治療するための有力な手法であるが、他の疾患、たとえば感染および移植片対宿主疾患を治療するための有力な手法でもある。養子細胞移入は、ｅｘ  ｖｉｖｏで成長した細胞、最も一般的には免疫由来細胞の、免疫学的機能性および移植特性を移入する目的を有する宿主内への受動移入である。養子細胞移入は、養子Ｔ細胞療法において一般的であるような自己移植であってもよく、または感染もしくは移植片対宿主疾患の治療に典型的な同種異系であってもよい。臨床的に、この手法の一般的な態様は、ウイルスおよび癌に対する免疫を増強すること、または自己免疫疾患、たとえばＩ型糖尿病もしくは関節リウマチの状況における寛容性を促進することのいずれかのために、免疫促進または寛容原性細胞のいずれか、たとえばリンパ球の患者への移入を含む。
【０００３】
癌療法に関しては、ＡＣＴ手法が米国で研究している少数のグループによって１９８０年代に考え出され、その主要なグループの１つはＮＣＩのＳｔｅｖｅｎ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇおよび共同研究者であった。自己移植腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）または遺伝学的に再誘導される末梢血単核細胞の養子移入が、進行した固形腫瘍、たとえば黒色腫を有する患者およびＣＤ１９発現血液悪性腫瘍を有する患者を治療するために使用され、成功していた。ＡＣＴにおいて、最も一般的に使用されている細胞型は、時々ＣＤ８＋として分類されるＴ細胞であるが、他の変種には、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、調節性Ｔ細胞および末梢血単核細胞が含まれる。細胞は、たとえばＴＩＬ療法において改変されていなくてもよい、または遺伝子改変されていてもよい。腫瘍特異的標的に対するＴ細胞の遺伝子ターゲティングを達成するために、２つの一般的な手段が存在する。１つは、既知の特異性（ＴＣＲ療法）および一致したヒト白血球抗原（齧歯動物における主要組織適合性遺伝子複合体として知られているＨＬＡ）型を有するＴ細胞受容体の移入である。もう１つは、人工分子、たとえばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による細胞の改変である。この手法はＨＬＡに依存せず、ターゲティング分子に関して十分に柔軟性がある。たとえば、一本鎖抗体が使用されていてもよく、ＣＡＲも共刺激ドメインを組み込んでいてもよい。しかしながら、ＣＡＲ細胞の標的は標的細胞の膜上に存在することを必要とするのに対して、ＴＣＲ改変は細胞内標的を利用していてもよい。
【０００４】
ＡＣＴ開発の最初の１０年の間、ＴＩＬに焦点が当てられていた。ＴＩＬは腫瘍に見出されており、腫瘍が宿主内で免疫反応を誘発することを示唆している。このいわゆる腫瘍免疫原性は、腫瘍抗原によって媒介される。これらの抗原は正常細胞から腫瘍を識別し、それにより免疫刺激を提供する。
【０００５】
たとえば、米国特許出願公開第２００３１９４８０４（Ａ１）号は、ＴＩＬを利用することによって腫瘍細胞に対するＴ細胞の反応性を増強するための方法を記載している。米国特許出願公開第２００３１９４８０４（Ａ１）号において、Ｔ細胞は作用物質に曝露され、患者内に再び導入される。作用物質はＴ細胞における内因性ＮｏｔｃｈまたはＮｏｔｃｈリガンドの発現または相互作用を低減または阻止できる。
【０００６】
米国特許第５１２６１３２（Ａ）号は、有効量の自己移植ＴＩＬおよびサイトカインが使用される、癌を治療する方法を記載している。
【０００７】
Ｄｉａｚ  ＲＭら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００７  Ｍａｒ  １５；６７（６）：２８４０−８）は、水疱性口内炎ウイルス腫瘍内ウイルス療法と組み合わせて養子Ｔ細胞移入療法を使用することによる、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の循環レベルの増加を記載している。Ｄｉａｚらは、養子Ｔ細胞移入療法において、ＯＴ１細胞、すなわち人工モノクローナル細胞株を使用した。
【０００８】
ＡＣＴの初期試行においてさえも、治療有益性およびさらに治癒の劇的な例が存在したが、ほとんどの患者では有益ではなく、多くの患者は重度の副作用を経験した。養子細胞療法の最初の２０年の間、細胞移入自体の安全性は一般的に良好であったが、顕著な毒性およびさらに死亡率が、プレコンディショニング化学療法および放射線ならびに移入後に使用されるＩＬ−２を含む、療法を増強するために使用される併用療法と関連した。プレコンディショニングは、宿主内の抑制細胞、たとえば調節性Ｔ細胞および骨髄由来抑制因子を殺傷するため、腫瘍微小環境を調節するため、および移植のための「空間を作る（make room）」ために使用される。ＩＬ２は、移植のアネルギーを低減させるため、およびＩＬ２を増殖させるために移入後に使用される。
【０００９】
有効性に関して、改善の余地が残っている。一般には、細胞療法の増加した特異性および十分な腫瘍殺傷能力が保証される。特に、従来技術のＡＣＴにおいて、移入細胞は腫瘍に輸送できず、たとえできたとしても、それらの細胞は多くの場合、すぐにアネルギーになり、腫瘍細胞を殺傷できない、または増殖できず、その結果細胞数の急速な減少を生じる。さらに癌は、腫瘍細胞内で、動物における主要組織適合性遺伝子複合体として知られているヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を頻繁に下方制御し、それ故、ＨＬＡがＴ細胞受容体に対する腫瘍エピトープの提示に必要とされるので、Ｔ細胞を殺傷できなくなる。
【００１０】
本発明は養子細胞移入を利用する癌治療のための有効な手段および方法を提供する。
【発明の概要】
【００１１】
本発明の目的は、非効率で安全ではなく、予測不可能な癌療法に関する上記の問題を克服するための簡単な方法および手段を提供することである。より具体的には、本発明は細胞療法のための新規方法および手段を提供する。本発明の目的は、独立請求項に記載されていることを特徴とする、ウイルスベクター、方法および構成によって達成される。本発明の具体的な態様は従属請求項に開示されている。
【００１２】
本出願は、組換えウイルスベクターの構築、ウイルスベクターに関連する方法、ならびに腫瘍細胞株、動物モデルおよび癌患者におけるそれらの使用を記載している。
【００１３】
本発明は、新規および独創的なやり方で、サイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターを癌治療のための養子細胞治療と組み合わせる考えに基づく。本発明は、驚くべき効果、すなわち養子Ｔ細胞療法における以下の改善：ｉ）移入細胞の腫瘍への動員、ｉｉ）腫瘍における移入細胞の増殖、ｉｉｉ）腫瘍における移入細胞の増強した反応性（図２０）に基づく。実際に、ウイルスベクターおよびサイトカインと養子細胞治療との前記組合せは、想定され得るよりも広い標的に対してより効果的な結果を提供する。サイトカイン導入遺伝子を含むウイルスベクターと養子細胞移入との前記組合せの効果は、サイトカイン導入遺伝子を含むウイルスベクターのみの効果、または養子細胞移入のみの効果と比べて相乗的である。
【００１４】
さらに本発明の目的は、ヒトにおける悪性腫瘍を治療するために腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびトランスジェニック（ウイルスにより送達される導入遺伝子から産生される）インターロイキン−２（ＩＬ−２）の組合せを提供することである。本発明の上記および様々な他の目的および利点は、ヒトにおける悪性腫瘍を治療する方法であって、プレコンディショニング化学療法および／または放射線療法を用いて、または用いずに、癌の退縮または安定化を引き起こすように有効量のＴＩＬおよびＩＬ−２を癌に罹患している患者に投与することを含む、方法によって達成される。
【００１５】
本発明は、対象における癌を治療する方法であって、養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性（＝正常細胞ではなく、腫瘍において複製可能）アデノウイルスベクターの対象への個別投与を含む、方法に関する。
【００１６】
本発明はさらに、癌の治療に使用するための別個の養子細胞治療組成物と併用される少なくとも１種のサイトカインをコードする、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターに関する。
【００１７】
本発明はさらに、対象における癌を治療するための医薬の製造における別個の養子細胞治療組成物と併用される少なくとも１種のサイトカインをコードする、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの使用に関する。
【００１８】
本発明はまた、対象における養子細胞療法またはＴ細胞療法の効果を増加させる際に使用するための、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターに関する。
【００１９】
本発明はまた、対象におけるＴ細胞療法の効果を増加させるための医薬の製造における、退縮性アデノウイルスベクターの使用に関する。
【００２０】
本発明はまた、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを必要とする対象に投与することによって対象における養子細胞療法またはＴ細胞療法の効果を増加させる方法に関する。
【００２１】
本発明はまた、養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを含む医薬キットであって、養子細胞治療組成物が第１の製剤に製剤化され、少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが第２の製剤に製剤化される、医薬キットに関する。
【００２２】
さらに本発明は、
１）５／３キメラ繊維ノブを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格、
２）Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、
３）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、
４）ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、ならびに
５）ウイルスＥ３プロモーター下で導入遺伝子発現の複製に関連する制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりに少なくとも１種のサイトカイン導入遺伝子をコードする核酸配列であり、サイトカインは、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５（＝ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなる群から選択される、核酸配列を含む、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターに関する。
【００２３】
さらに本発明は、Ｅ３領域における欠失およびＥ３の欠失領域の代わりに導入遺伝子を発現するための腫瘍特異的プロモーターを含む、血清型３（Ａｄ３）腫瘍退縮性アデノウイルスベクターに関する。
【００２４】
さらに本発明は、本発明の腫瘍退縮性ベクターを含む医薬組成物に関する。
【００２５】
本発明はまた、対象における癌を治療する方法であって、本発明の腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを必要とする対象へ投与することを含む、方法に関する。また本発明は、癌の治療に使用するための本発明の腫瘍退縮性アデノウイルスベクターに関する。
【００２６】
本発明はまた、対象における癌を治療するための医薬の製造における本発明の腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの使用に関する。
【００２７】
本発明の構成の利点は、増強された治療効果および低減された副作用である。効果の増強および本発明者らの手法の抗抑制効果が、移入細胞のための「空間を作る」および腫瘍免疫抑制を低減させるために従来技術の方法で使用されるプレコンディショニング化学療法、および／または放射線療法の必要性を低減させることができるので、重度の有害事象、さらに死が阻止される。また、細胞を患者内へ移入した後、ウイルスが腫瘍内で複製している間にＩＬ２を産生する場合、移入細胞を増殖させ維持するための、従来技術の方法で使用されるＩＬ２の個別投与が必要とされないので、重度の有害事象、さらに死が阻止される。腫瘍における局所産生はまた、有害事象の原因である全身曝露を低減させながら、ＩＬ−２の求められている効果（移植の刺激および増殖）を増強し得る。本発明は、健常組織に対して低い毒性または低い損傷を伴う選択的治療を提供する。
【００２８】
本発明はまた、以下によって、驚くべき治療効果を提供する：ｉ）たとえば組換えサイトカインを含むウイルスベクターを腫瘍内に注射することによって腫瘍に輸送信号を提供すること。ウイルス注射の結果、この効果に関連するサイトカインの産生（病原体に関連する分子パターン認識受容体に対するウイルス結合に反応する）が生じるが、ウイルス由来の導入遺伝子としての大部分の関連サイトカインのさらなる産生によって、非常に高い効果が達成され得る。ｉｉ）危険信号を増加させることによって寛容性を低減させること。ウイルス注射自体は病原体に関連する分子パターン認識受容体に結合することによってこれを達成し得るが、効果はウイルス由来の導入遺伝子としてのサイトカインのさらなる産生によって増強され得る。ｉｉｉ）ＨＬＡ発現を誘導すること。細胞は抗ウイルスＴ細胞反応を開始するためにウイルスエピトープを提示しようとするので、ウイルス感染はＨＬＡ発現を増加させる。予想外にも、これは腫瘍エピトープに対するＴ細胞療法を増強するために使用でき、その腫瘍エピトープは作用するためにＨＬＡを必要とする。ＨＬＡに対するウイルスの効果はサイトカインによって部分的に媒介され、それ故、ウイルス由来の前記サイトカインの産生は、本発明の驚くべき態様において、近接する腫瘍細胞においてもＨＬＡ発現を誘導し得る。ｉｖ）免疫抑制を上昇させることによって細胞の増殖を誘導すること。免疫抑制はウイルス自体の存在（再び、病原体に関連する分子パターン認識受容体による）の両方によって媒介されるが、サイトカインの産生によって増強される（図４８）。それ故この手法は、現在養子細胞療法を妨げている臨床的障害を解決できる。
【００２９】
以下において、本発明を添付の図面を参照して特定の態様によって、より詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、Ａｄ５／３キメラ腫瘍退縮性アデノウイルスによる処置がＢ１６−ＯＶＡ腫瘍において、サイトカインおよびケモカイン分泌を増加させたことを示す。インターフェロン−γはＨＬＡ（＝ＭＨＣ）クラスＩの発現を上方制御できるので、ＴＩＬによって効果的に認識され得る腫瘍細胞表現型を生成する。様々なＩＦＮ−γ誘導性ケモカイン（たとえばＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１）は免疫細胞動員に関与し、それによりＴＩＬ活性化および増殖を促進できる。また、ＴＩＬの輸送はこれらのケモカインの上方制御によって増強され得る。
【図２】図２は、養子細胞移入を用いたまたは用いていない５／３キメラ腫瘍退縮性アデノウイルスの頻回注射後の腫瘍成長制御を示す。アデノウイルス処置単独（Ａ）は、ＰＢＳ処置と比較して、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍成長に対してほとんど効果を有さなかった。ウイルス注射と組み合わせた５０００００（Ｂ）または２００００００（Ｃ）腫瘍特異的ＯＴ−Ｉリンパ球の養子移入の結果、顕著な腫瘍成長制御が生じた。アデノウイルス単独またはＰＢＳと組み合わせたＯＴ−Ｉ細胞を使用した腫瘍成長に対する不十分な治療効果により、腫瘍退縮性ウイルスに関する、および単剤として使用した養子細胞移入療法に関する大きな欠点が目立ち、アデノウイルスを使用した養子細胞療法の効果を増強する本発明の目的を支持する。
【図３】図３は、アデノウイルス注射は腫瘍内へのＴ細胞輸送を誘導し、腫瘍内で養子移入Ｔ細胞の増殖を増加させることを示す。Ａ）養子移入ＣＤ８＋ＣＦＳＥ＋細胞の量は、リンパ球輸送に起因していると考えられ、処置後１日にＡｄ処置したマウスの腫瘍内で増加し、血液、流入領域リンパ節および脾臓内で減少する。全体のＣＤ８＋  Ｔ細胞数は実験の全体を通して、アデノウイルス処置した腫瘍において高いままであり、有害な腫瘍微小環境に対するこれらの細胞の耐性および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の増加した増殖を示唆している。Ｂ）６日および１４日に、ＯＴ−Ｉ細胞増殖はＰＢＳ群と比べてＡＤ処置した腫瘍において増強し、ＰＢＳ群においてより多くの割合で細胞分裂を受けている（Ｍ７に向かう）細胞が見られる。したがって、腫瘍退縮性アデノウイルスによる処置は養子移入ＴＩＬの輸送および増殖を誘導する。Ｃ）ＣＦＳＥ陽性細胞のゲーティングを行った方法についての例。Ｍ０は分裂していない細胞を示し、Ｍ７はＣＦＳＥを検出可能な限界（７倍超）未満に希釈するのに十分に分裂された細胞を示す。
【図４】図４は、矢印によって示される日に腫瘍退縮性アデノウイルスで処置したヒトから得たデータを表す。腫瘍内へのウイルス注射の結果、血液中のリンパ球の減少が生じ、腫瘍へのそれらの輸送を反映している。
【図５】図５は、ヒト癌患者の腫瘍内への腫瘍退縮性アデノウイルス注射により、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の流入が引き起こされたデータを表す。腫瘍退縮性アデノウイルスの腫瘍内注射の結果、処置の前後に針生検から評価した腫瘍においてＣＤ８＋  Ｔ細胞の蓄積が生じた。
【図６】図６は、Ｔ細胞の養子移入と組み合わせたアデノウイルス注射の結果を示す。皮下Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに５×１０5ＯＴ１リンパ球を腹腔内に養子移入し、腫瘍は未処置のままであったか、またはＰＢＳもしくはＡｄ５／３を注射した（例の材料および方法を参照のこと）。ヒト黒色腫と同様の免疫抑制Ｂ１６−Ｏｖａモデルにおいて、抗Ｏｖａ  ＯＴ１細胞の養子移入を少しだけ行う。ウイルス注射を加えることにより、有効性が劇的に増加する（ａ）。ＣＤ８＋  Ｔ細胞が増加する（ｂ）。これらの細胞は抗Ｏｖａ  Ｔ細胞ではない（ｃ）。
【図７】図７は、養子移入およびウイルス注射に起因する「天然」抗腫瘍Ｔ細胞の数の劇的な増加を表す。皮下Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに５×１０5ＯＴ１リンパ球を腹腔内に養子移入し、腫瘍は未処置のままであったか、またはＰＢＳもしくはＡｄ５／３を注射した（例の材料および方法を参照のこと）。養子移入＋ウイルス注射は、腫瘍および局所リンパ節における「他の」Ｔ細胞を増殖させるための触媒として作用する。（ａ）腫瘍部位におけるＴｒｐ２  ＣＤ８＋細胞。（ｂ）腫瘍部位における抗ｇｐ１００  ＣＤ８＋細胞。
【図８】図８は、１４日目の腫瘍内の活性化ＣＤ８＋細胞および腫瘍内のＴＩＭ−３発現を示す。皮下Ｂ１６−Ｏｖａ腫瘍を有するマウスに５×１０5ＯＴ１リンパ球を腹腔内に養子移入し、腫瘍は未処置のままであった、またはＰＢＳもしくはＡｄ５／３を注射した（例の材料および方法を参照のこと）。免疫療法における免疫抑制：免疫抑制が除去されない場合、Ｔ細胞数の増加は十分ではない。ウイルス処置した腫瘍において多くの活性化Ｔ細胞が存在し、免疫抑制は少ししかない。
【図９】図９は、抗腫瘍Ｔ細胞の増加および免疫抑制の減少の結果、腫瘍抗原に対する全身性免疫が生じることを示す。皮下Ｂ１６−ＯＶａ腫瘍を有するマウスに、５×１０5ＯＴ１（ａ）または２×１０6（ｂ）ＯＴ１リンパ球を腹腔内に養子移入し、腫瘍は未処置のままであった、またはＰＢＳもしくはＡｄ５／３を注射した（例の材料および方法を参照のこと）。抗原提示はウイルスにより増強される：Ｔ細胞は良好に作用する。いくつかの腫瘍エピトープに対する全身性免疫が生じる。（ａ）１４日目の腫瘍内の樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋  ＣＤ８０＋  ＣＤ８６＋）での共刺激分子の発現。（ｂ）１４日目の脾細胞でのＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ。
【図１０】図１０は、ウイルス注射後のＯＴＩ  Ｔ細胞の分布を示す：有効性を説明するのに十分ではないが、輸送する傾向がある。（ａ）図、（ｂ）動物モデル、（ｃ）腫瘍。
【図１１】図１１は、免疫抑制の上昇が細胞の増殖を誘導し得ることを表す。アデノウイルス処置した腫瘍は多くの腫瘍特異的リンパ球（ＯＴ−Ｉ細胞）を含有した。ＰＢＳ処置した腫瘍において、ＯＴＩ細胞はＭ５期において停止したが（左側の矢印）、Ａｄ群においてそれらは増殖し続けた（右側の矢印）。
【図１２】図１２は、ＯＴ１細胞と組み合わせた組換えサイトカイン（ウイルスなし）の有効性を示す。
【図１３】図１３は、養子Ｔ細胞移入と組み合わせたサイトカイン武装（armed）アデノウイルスの抗腫瘍効果を示す。皮下Ｂ１６−ＯＶＡ黒色腫を保有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、１日目に１．５×１０ｅ６ＣＤ８＋濃縮ＯＴ−１  Ｔ細胞により腹腔内（interaperitoneally）で処置した。サイトカインをコードするアデノウイルスまたは対照ウイルスＡｄ５−Ｌｕｃ１を、１日目およびその後１週間に１回、腫瘍内に注射した（１つの腫瘍当たり１×１０ｅ９ウイルス粒子）。腫瘍体積を以前に記載されているように計算し（Ｂｒａｍａｎｔｅら  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ＧＭ−ＣＳＦ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓａｒｃｏｍａ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１３  Ｄｅｃ  ２４）、腫瘍サイズは１日目を１００％と設定してそれぞれパーセンテージとして示す。リスクの数の図：所与の時点における各実験群に存在している動物の数。腫瘍が最大の許容可能なサイズを超えた場合、または疼痛もしくは苦痛の任意の兆候が明らかになった場合、動物を安楽死させた。
【図１４】図１４は、腫瘍サイズに対する異なるウイルスの効果を示す。
【図１５】図１５は、腫瘍サイズを低減させることに対する、ＯＴ１  Ｔ細胞と組み合わせたｍＴＮＦａ導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの優れた結果を示す。
【図１６】図１６は、腫瘍サイズを低減させることに対する、ＯＴ１  Ｔ細胞と組み合わせたｍＩＬ３導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターの優れた結果を示す。
【図１７】図１７は、Ｃ５ａまたはＴＮＦ−α発現腫瘍退縮性アデノウイルスの概略図を示す。導入遺伝子が挿入される部位を含む、ウイルスのいくつかの重要な特徴が示される。
【図１８】図１８は、Ａ５４９細胞における腫瘍退縮性アデノウイルスによるＴＮＦ−αの発現を示す。細胞を１０ＶＰ／細胞に感染させ、示した時点において培地を回収し、ＥＬＩＳＡを使用して培地中のＴＮＦ−αの量を評価した。ウイルスは感染細胞からのＴＮＦ−αの発現および分泌を誘導する。
【図１９】図１９は、腫瘍退縮性ＴＮＦ−アルファ武装腫瘍退縮性アデノウイルスによって産生されたＴＮＦ−アルファの生物活性を示す。このアッセイにおいて、感染細胞由来の上清を使用して、ＴＮＦ感受性ＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ細胞をチャレンジし、腫瘍退縮性アデノウイルスが機能的サイトカインの発現を駆動することを裏付けた。
【図２０】図２０は、腫瘍退縮性アデノウイルスによるヒト癌細胞の用量依存的殺傷を示す。予想されるように、ＴＮＦ−アルファ非感受性腫瘍退縮性許容ヒトＡ５４９またはＰＣ３腫瘍細胞において、腫瘍退縮性のみで細胞を殺傷するのに十分であったので、非武装（unarmed）対照ウイルスとＴＮＦ−アルファ発現腫瘍退縮性アデノウイルスとの間で相違は観察されなかった。しかしながら、ヒトＴＮＦ−アルファは、ヒトアデノウイルスによる腫瘍退縮性に許容可能ではないマウス細胞において部分的に活性であるために、ＴＮＦ−アルファは、非武装ウイルスと比較してＢ１６−ＯＶＡマウス細胞に見られるウイルスの、より強い細胞毒性の原因となった。複製欠損ウイルスはごくわずかな細胞殺傷能力を示す。
【図２１】図２１は、ＴＮＦ−アルファ発現ウイルスとの放射線療法の相乗作用を示す。Ａ）この実験における処置スケジュールの概略図。放射線（ＸＲＴ）は２×２Ｇｙの用量での全身照射であり、ウイルスは１×１０8ＶＰ／腫瘍であり、その各々のヌードマウスは２つのＡ５４９異種移植片を有した。Ｂ）ＴＮＦ−アルファウイルスは非武装親ウイルスより大きな抗腫瘍効果を保有する。複製欠損（ＲＤ）ウイルスは培地中でＡ５４９細胞を殺傷しなかったので（図２０）、ｉｎ  ｖｉｖｏでＲＤウイルスにより与えられる抗腫瘍効果は、ウイルス注射によって誘発されるサイトカイン、ＮＫ細胞およびマクロファージを含む、先天性免疫反応に起因する可能性がある。Ｃ）ＴＮＦ−アルファ発現ウイルスは、臨床的に関連する用量の外照射と組み合わせた場合、より大きな抗腫瘍効果を引き起こし、サイトカイン武装ウイルスの臨床的翻訳可能性を支持する。重要なことに、これらおよび以前の実験は、ＴＮＦ−アルファ発現腫瘍退縮性アデノウイルスが複製でき細胞を殺傷できることを示し、ＴＮＦ−アルファがアデノウイルスに対して抗ウイルス効果を与えないことの根拠となる。
【図２２】図２２は、Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍に対するｈＴＮＦ−アルファをコードするアデノウイルスの抗腫瘍効果を示す。この実験はＣ５ａウイルスを用いた図２６に示したものと類似しており、ＴＮＦ−アルファ発現が非武装ウイルスと比較してより大きな治療有益性を与えることを実証する。
【図２３】図２３は、サイトカイン武装ウイルス（ＩＩ）で処置した腫瘍内の腫瘍特異性ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増強された誘導／増殖を示す。図２０に示した実験における腫瘍は、実験１１と同様のフローサイトメトリー分析のために切除し、処理した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞のより大きな誘導／数を、非武装対照ウイルスと比較してＴＮＦをコードするウイルスで処置した腫瘍において検出し、ウイルス誘導性炎症と一緒に腫瘍退縮性アデノウイルスによって発現された、合理的に選択されたサイトカインが特有の腫瘍環境を生じることをＣ５ａデータと一緒に示唆し、これにより、図２Ｂ、Ｃに対する推測（inferral）および比較によって、養子移入Ｔ細胞でもある腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖および活性化を強く支持する。
【図２４】図２４は、Ａ５４９細胞におけるＣ５ａの発現を示す。細胞を１０ＶＰ／細胞に感染させ、示した時点において培地を回収し、ＥＬＩＳＡを使用して培地中のＣ５ａの量を評価した。２回の個々の実験の結果を示す。
【図２５】図２５は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性アッセイの結果を示す。試験上清中のケモカインによって引きつけられる、下側チャンバ内の半透過性膜を介して通過するＴＨＰ１ヒト単球の量を製造業者の指示書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＱＣＭキット）に従って定量化した。Ｃ５ａ発現ウイルスは、感染細胞から対照ウイルスより強い走化性因子を引き起こす。結果は、非武装ウイルスではなくサイトカイン武装ウイルスを使用することを支持する根拠となっている。
【図２６】図２６は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｄＤ２４−Ｃ５ａの抗腫瘍効果を示す。０日目、２日目および４日目に、樹立した皮下腫瘍に１×１０9ＶＰの各ウイルスまたは５０ｕｌのＰＢＳを注射し、腫瘍体積をカリパスによって測定した。Ｃ５ａ発現ウイルスは対照ウイルスと比較して優れた腫瘍制御を提供する。アデノウイルスはマウス細胞において複製しない、またはマウス細胞を殺傷しないので、すなわちアデノウイルスはこのモデルにおいて非細胞溶解性であるので（Ｙｏｕｎｇ  ＡＭら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２  Ｓｅｐ；２０（９）：１６７６−８８、ＰＭＩＤ：２２７３５３７９）、これらの結果は免疫学的抗腫瘍効果を増強するためのサイトカイン武装ウイルスの強力な能力を強調し、養子細胞療法の効果を増強するためにサイトカイン武装ウイルスを使用する概念を強く支持する。
【図２７】図２７は、サイトカイン武装ウイルス（Ｉ）で処置した腫瘍内の腫瘍特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増強された誘導／増殖を示す。図２６に示した実験における腫瘍を、フローサイトメトリー分析のために切除し、処理した。単一細胞の懸濁液をＣＤ８に対する抗体および抗ｏｖａ  ＴＣＲに対する五量体で染色した。非細胞溶解性アデノウイルスによるＣ５ａ発現は、対照ウイルス、非武装アデノウイルスまたはＣ５ａアンタゴニストを発現するウイルスと比較して腫瘍内でより多くのＯＶＡ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の数を誘導し、腫瘍内の養子移入Ｔ細胞の数を増加させるためにサイトカイン武装ウイルスの使用を支持する。実験１３も参照のこと。
【図２８】図２８は、適応（adaptive）Ｔ細胞反応の概略図を示す。
【図２９】図２９は、適応的（adaptively）に移入されたＴ細胞が既存のＴ細胞のための触媒（「スパーク」）として作用することを示す。
【図３０】図３０は、適応（adaptive）「スパーク」の結果、「天然」抗腫瘍Ｔ細胞が増加することを示す。
【図３１】図３１は、養子細胞移入の方法を示す。
【図３２】図３２は、本発明のＴＩＬＴ技術を用いて、毒性プレコンディショニング（化学療法＋放射線）およびポストコンディショニング（全身性ＩＬ２）が回避できることを示す。（ＴＩＬＴ技術の機構については図４８を参照のこと。）
【図３３】図３３は、単一のサイトカインを発現する新規ウイルス構築物の概略図を示す。ウイルス骨格は繊維ノブとは別のヒトアデノウイルス血清型５であり、この繊維ノブは血清型３由来である。単一導入遺伝子と二重導入遺伝子の両方はウイルスＥ３プロモーターの転写制御下にある。両方の導入遺伝子はｇｐ１９ｋおよび６．７ｋを欠失しているＥ３領域内に配置される。Ｅ１Ａタンパク質は定常領域２において２４アミノ酸（「Ｄ２４」）を欠失しており、Ｒｂ結合に欠陥を生じさせる。Ｅ１Ａ発現はＥ２Ｆプロモーターの調節下にある。いくつかのウイルス遺伝子領域が参照のために示される。
【図３４】図３４は、２つのサイトカインを発現する新規ウイルス構築物の概略図を示す。１つの型において、「リボソームシャント部位」／「リボソームスキッピング部位」／「ｃｉｓ作用ヒドロラーゼエレメント」（ＣＨＹＳＥＬ）が各サイトカインの間にインフレーム融合物として配置される。サイトカイン挿入物は両方のサイトカイン（sytokines）を産生するために共翻訳的に切断される単一ポリタンパク質として合成され、その結果、前者のサイトカインの３’末端においていくつかの追加のアミノ酸の付加を生じ、後者のサイトカイン、ＩＬ２の５’末端において単一のプロリンを生じる）。別の型において、ＩＲＥＳエレメントは２つのサイトカインを分離し、その結果、追加のアミノ酸を有さないサイトカインの合成を生じる。
【図３５】図３５は、２Ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図３６】図３６は、ＴＩＬＴ生物学的治療の静脈内アデノウイルス送達技術を示す。上記のＴＩＬＴアデノウイルスはＴ細胞療法を増強させるために、患者の腫瘍内に与えられる（４ａ、５ａの印をつけた）。しかしながら、全ての腫瘍が腫瘍内経路を介して到達できるとは限らない。それ故、本発明者らは静脈内経路を介して腫瘍に到達できるＡｄ３に基づいた送達ビヒクルを開発した（４ｂ、５ｂとして印をつけた）。
【図３７】図３７は、Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−ＣＭＶ−ＣＤ４０Ｌベクターの構造を示す。ウイルスベクターＡｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−ＣＭＶ−ＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列を配列番号３０に示す。
【図３８】図３８は、Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌベクターの構造を示す。ウイルスベクターＡｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌのヌクレオチド配列を配列番号３１に示す。
【図３９】図３９は、制限酵素によるｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−ＣＭＶ−ＣＤ４０Ｌベクター切断のアガロースゲルを示す。クローニングしたウイルスベクターの正確な制限分析は、ウイルスについての正確なＤＮＡ配列を示唆する。
【図４０】図４０は、制限酵素によるｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌベクター切断のアガロースゲルを示す。クローニングしたウイルスベクターの正確な制限分析は、ウイルスについての正確なＤＮＡ配列を示唆する。
【図４１】図４１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＥ２Ｆ−ＣＤ４０ＬおよびＣＭＶ−ＣＤ４０Ｌベクターの機能性を示す。垂直軸に相対的な視覚的力価ＴＣＩＤ50産生の対数（logarytmic）尺度（ＰＵＦ／ｍｌ）。水平軸に感染後の日数（ｄ）。これにより、ウイルスが機能的であり、少なくともいくつかの腫瘍細胞株に感染できることが示された。ウイルスの希釈物はＶＰ力価に従って作製しなかった。進行性ＴＣＩＤ50：新たに産生したウイルスを、それらが腫瘍退縮特性を有するかどうかを決定するために進行性ＴＣＩＤ50を用いて最初に試験した。インキュベーションの９日後、Ａ５４９細胞の全ての培養プレートにおいて感染が見え、これにより、全ての新規ウイルスが機能的であることが示された。それ以降の日の間、感染は１つの細胞当たりピペットで採取したウイルスの量に応じて拡散し続けた。細胞溶解の量および速度のわずかな相違を検出した。
【図４２】図４２は、全ての腫瘍退縮性血清型３ウイルスは、Ａ５４９肺癌細胞における非複製Ａｄ３ｅＧＦＰ対照ウイルスより有意に（ｐ＜０．０５）良好な細胞殺傷を示したことを表す。腫瘍退縮性Ａｄ３ウイルスの間で有意な相違を見ることはできず、全てのウイルス構築物は完全に機能的であり、Ｅ３領域欠失、挿入されたプロモーター（ＣＭＶまたはＥ２Ｆ）または挿入された導入遺伝子（ＣＤ４０Ｌ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍退縮性効果に影響を及ぼさないことを示唆している。
【図４３】図４３は、全ての腫瘍退縮性血清型３ウイルスは、ＰＣ３−ＭＭ２前立腺癌細胞における非複製Ａｄ３ｅＧＦＰ対照ウイルスより有意に（ｐ＜０．０５）良好な細胞殺傷を示したことを表す。腫瘍退縮性Ａｄ３ウイルスの間で有意な相違を見ることはできず、全てのウイルス構築物は完全に機能的であり、Ｅ３領域欠失、挿入されたプロモーター（ＣＭＶまたはＥ２Ｆ）または挿入された導入遺伝子（ＣＤ４０Ｌ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍退縮性効果に影響を及ぼさないことを示唆している。
【図４４】図４４は、全ての腫瘍退縮性血清型３ウイルスは、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞における非複製Ａｄ３ｅＧＦＰ対照ウイルスより有意に（ｐ＜０．０５）良好な細胞殺傷を示したことを表す。腫瘍退縮性Ａｄ３ウイルスの間で有意な相違を見ることはできず、全てのウイルス構築物は完全に機能的であり、Ｅ３領域欠失、挿入されたプロモーター（ＣＭＶまたはＥ２Ｆ）または挿入された導入遺伝子（ＣＤ４０Ｌ）がｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍退縮性効果に影響を及ぼさないことを示唆している。
【図４５】図４５は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＡｄ３に基づいたウイルス：同所性腹腔内卵巣癌モデルの抗腫瘍効果を示す。Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌは最適な抗腫瘍効果を有した。ＥＬＩＳＡにより、ＣＤ４０Ｌが血流中に放出していることが確認された。
【図４６】図４６は、免疫応答性マウスにおいてマウスＣＤ４０Ｌをコードする退縮性アデノウイルスの治療域を示す。用量５：１×１０11ＶＰ／マウス；用量４：３×１０10ＶＰ／マウス；用量３：１×１０10ＶＰ／マウス；用量２：１×１０9ＶＰ／マウス；用量１：１×１０8ＶＰ／マウス；陽性対照（用量２腫瘍内。）用量５に関して、マウスの６７％は肝臓毒性の兆候を有した。用量４は、ｉ．ｖ．送達後、肝臓毒性の兆候なしに良好な腫瘍導入を達成できた。
【図４７】図４７は、免疫応答性マウスにおいてマウスＣＤ４０Ｌをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスにより静脈内経路を介して処置したマウスにおける肝臓酵素放出を示す。任意の静脈内処置群（用量１〜５）において肝臓酵素放出によって測定した場合、肝臓毒性はあまりなかった。最後のバーは腫瘍内に与えられた用量２を示す。しかしながら、用量５において、目視検査において肝臓毒性が存在した−＞用量４は静脈内送達についての最大耐性用量である。（偽から用量２までの用量は左から右のバーとして表す）
【図４８】図４８は、二重サイトカイン発現ウイルスによる養子細胞療法の増強の機構を示す。ウイルス感染およびウイルス粒子の生得的検知は危険信号を誘発し、この危険信号は、癌細胞でのＨＬＡ／ＭＨＣクラスＩ分子の上方制御、抗原提示細胞の活性化および成熟、ならびに免疫細胞動員サイトカインの分泌を含む。危険信号は腫瘍退縮性ウイルスによる腫瘍細胞死によりさらに増幅され、この退縮性ウイルスはまた腫瘍抗原を放出し、免疫系による腫瘍組織の認識を増加させる。ウイルスは２種のサイトカインを発現する：Ｔ細胞動員サイトカインは養子移入Ｔ細胞を腫瘍内に引きつけ、特定の態様のインターロイキン２においてＴ細胞発現サイトカインはそれらの増殖を増加させ、維持する。
【図４９】図４９は、組換えマウスサイトカインを用いた輸送実験の概略図を示す。Ｂ１６−ＯＶＡ保有Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、０日目に２，０*１０6ＣＤ８ａ＋濃縮ＯＴ−Ｉリンパ球（四角）をｉ．ｐ．（腹腔内投与）で養子移入し、研究の日に組換えマウスサイトカイン（三角）の腫瘍内注射で処置する。腫瘍成長をモニターし、電子カリパスを使用することによって週に３回（丸）記録する。マウスを２つの異なる時点（ＳＡＣ１およびＳＡＣ２）で屠殺し（Ｘ）、腫瘍を採取し、ＯＴ−Ｉ  ｑＰＣＲおよびＴ細胞ＦＡＣＳ分析を使用して試料を分析する。
【図５０】図５０は、マウスサイトカインをコードするアデノウイルスによる輸送実験の概略図を示す。Ｂ１６−ＯＶＡ保有Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、０日目に２，０*１０6ＣＤ８ａ＋濃縮ＯＴ−Ｉリンパ球（四角）をｉ．ｐ．で養子移入し、研究の日に異なるマウスサイトカインで武装したアデノウイルス（赤色の三角）により腫瘍内で処置する。腫瘍成長をモニターし、電子カリパスを使用することによって週に３回（丸）記録する。マウスを２つの異なる時点（ＳＡＣ１およびＳＡＣ２）で屠殺し（Ｘ）、腫瘍を採取し、ＯＴ−Ｉ  ｑＰＣＲおよびＴ細胞ＦＡＣＳ分析を使用して試料を分析する。
【図５１】図５１は、１１１Ｉｎ放射線標識したＯＴ−Ｉ細胞およびＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化を使用した輸送実験の概略図を示す。Ｂ１６−ＯＶＡ保有Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスに、６連続日で１ｅ９ＶＰの５／３キメラウイルス（三角）を腫瘍内注射する。第１の群のマウスは、０日目に２，０*１０6ＣＤ８ａ＋濃縮、インジウムオキシン標識したＯＴ−Ｉリンパ球（四角）のｉ．ｖ．による養子移入を受け、他の群のマウスは７日目に受ける。ＯＴ−Ｉ細胞の腫瘍内での蓄積をＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化（丸）によって定量化する。マウスを２つの異なる時点（ＳＡＣ１およびＳＡＣ２）で屠殺し（Ｘ）、腫瘍を採取し、それらの最後の放射線を測定する。
【発明の詳細な説明】
【００３１】
養子細胞療法
本発明の一般的手法は、癌と反応でき破壊できる免疫リンパ球の移入を使用する、癌を有する患者のための治療の開発である。単離された腫瘍浸潤リンパ球は培養液中で多くの数まで成長し、患者内へ注入される。本発明において、少なくとも１種のサイトカインをコードするアデノウイルスベクターがリンパ球の効果を増加させるために利用される。養子細胞治療組成物およびアデノウイルスベクターの個別投与に先立って、しばしば、骨髄破壊的（myeloablating）または非骨髄破壊的（non-myeloablating）プレコンディショニング化学療法および／または放射線療法が行われる。養子細胞療法処置は患者における癌を低減または排除することを意図する（図２１）。
【００３２】
本発明は、養子細胞治療組成物、たとえば腫瘍浸潤リンパ球、ＴＣＲ改変リンパ球またはＣＡＲ改変リンパ球を用いた療法に関する。本発明は、特にＴ細胞療法に関するが、他の養子療法、たとえばＮＫ細胞療法または他の細胞療法にも関する。実際に、本発明によれば、養子細胞治療組成物は、たとえばＴＩＬ療法において改変されていない細胞または遺伝子改変された細胞を含んでいてもよい。Ｔ細胞の腫瘍特異的標的への遺伝子ターゲティングを達成するための２つの一般的な手段が存在する。１つは、既知の特異性を有するＴ細胞受容体の移入（ＴＣＲ療法）および一致したヒト白血球抗原（齧歯動物における主要組織適合複合体として知られているＨＬＡ）型を有するＴ細胞受容体の移入である。もう１つは、人工分子、たとえばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）による細胞の改変である。この手法はＨＬＡに依存せず、ターゲティング分子に関して十分に柔軟性がある。たとえば、一本鎖抗体が使用されていてもよく、ＣＡＲも共刺激ドメインを組み込んでいてもよい。しかしながら、ＣＡＲ細胞の標的は標的細胞の膜上に存在することを必要とするのに対して、ＴＣＲ改変は細胞内標的を利用していてもよい。
【００３３】
ここに使用される場合、「養子細胞治療組成物」とは、養子細胞移入に適した細胞を含む任意の組成物を指す。本発明の一態様において、養子細胞治療組成物は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ＴＣＲ（すなわち異種Ｔ細胞受容体）改変リンパ球およびＣＡＲ（すなわちキメラ抗原受容体）改変リンパ球からなる群から選択される細胞型を含む。本発明の別の態様において、養子細胞治療組成物は、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、調節性Ｔ細胞および末梢血単核細胞からなる群から選択される細胞型を含む。別の態様において、ＴＩＬ、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、調節性Ｔ細胞または末梢血単核細胞は、養子細胞治療組成物を形成する。本発明の１つの特定の態様において、養子細胞治療組成物はＴ細胞を含む。ここに使用される場合、「腫瘍浸潤リンパ球」またはＴＩＬとは、血流から出て腫瘍内に移動する白血球を指す。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞を含む３つの群に分かれ得る。本発明の別の特定の態様において、養子細胞治療組成物は、標的特異的キメラ抗原受容体または特異的に選択されたＴ細胞受容体により改変されているＴ細胞を含む。ここに使用される場合、「Ｔ細胞」とは、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞およびγδＴ細胞を含む、ＣＤ３＋細胞を指す。
【００３４】
適切な細胞に加えて、本発明に使用される養子細胞治療組成物は任意の他の薬剤、たとえば薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤、アジュバント、添加剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／もしくは増粘剤、ならびに／または対応する製品に通常見出される任意の構成成分を含んでいてもよい。組成物を製剤化するための適切な成分および適切な製造方法の選択は当業者の一般的知識に属する。
【００３５】
養子細胞治療組成物は投与に適した任意の形態、たとえば固体、半固体または液体形態であってもよい。製剤は、これらに限定されないが、液剤、エマルション、懸濁剤、錠剤、ペレット剤およびカプセル剤からなる群から選択されていてもよい。組成物は特定の製剤に限定されず、代わりに組成物は任意の公知の薬学的に許容される製剤に製剤化されていてもよい。医薬組成物は当該技術分野において公知の任意の従来の方法によって製造されていてもよい。
ウイルスベクター
本発明に使用される腫瘍退縮性アデノウイルスベクターはヒトまたは動物を治療するのに適した任意のアデノウイルスベクターであってもよい。本発明の一態様において、アデノウイルスベクターはヒトウイルスのベクターであり、Ａｄ５、Ａｄ３およびＡｄ５／３ベクターからなる群から選択されていてもよい。別の態様において、ベクターはＡｄ５またはＡｄ５／３ベクターである。
【００３６】
ここに使用される場合、「腫瘍退縮性アデノウイルスベクター」とは、正常細胞に対する腫瘍細胞における選択的複製によって癌細胞に感染でき、殺傷できるアデノウイルスベクターを指す。
【００３７】
ベクターは、当該技術分野において公知の任意の手段において、たとえば任意のウイルス領域を欠失、挿入、変異または改変することによって改変されていてもよい。ベクターは複製に関して腫瘍特異的になる。たとえばアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｅ３および／またはＥ４における改変、たとえば腫瘍特異的プロモーターの挿入（たとえばＥ１を駆動するため）、領域（たとえば「Ｄ２４」、Ｅ３／ｇｐ１９Ｋ、Ｅ３／６．７ｋに使用されるようなＥ１の定常領域２）の欠失および導入遺伝子の挿入を含んでいてもよい。さらに、ベクターの繊維ノブ領域が改変されていてもよい。本発明の一態様において、アデノウイルスベクターは、Ａｄ５核酸骨格およびＡｄ３繊維ノブまたはＡｄ５／３キメラ繊維ノブを含むＡｄ５／３である。
【００３８】
ここに使用される場合、「アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格」という表現はＡｄ５のゲノムを指す。同様に、「アデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸骨格」はＡｄ３のゲノムを指す。「Ａｄ５／３ベクター」は、Ａｄ５とＡｄ３ベクターの両方の部分を有するキメラベクターを指す。本発明の特定の態様において、ベクターのカプシド改変はＡｄ５／３キメラ現象である。ここに使用される場合、「Ａｄ５／３キメラ繊維ノブ」は、繊維のノブ部分がＡｄ血清型３由来であり、繊維の残りがＡｄ血清型５由来である、キメラ現象を指す。具体的には、一態様において、構築物はＡｄ３由来の繊維ノブを有するのに対して、ゲノムの残りはＡｄ５由来である。（図１７、３３および３４を参照のこと）
腫瘍特異的腫瘍退縮性アデノウイルスを生成するための１つの手法は、Ｅ１の定常領域２（ＣＲ２）に影響を与える２４塩基対欠失（Ｄ２４）を操作することである。野生型において、アデノウイルスＣＲ２は、合成（Ｓ）期、すなわちＤＮＡ合成または複製期を誘導するための、細胞性Ｒｂ腫瘍抑制因子／細胞周期調節タンパク質を結合するのに関与している。ｐＲｂとＥ１Ａとの間の相互作用はＥ１Ａタンパク質保存領域の８アミノ酸１２１〜１２７を必要とし、このＥ１Ａタンパク質保存領域は本発明において欠失している。本発明のベクターは、Ｈｅｉｓｅ  Ｃ．ら（２０００、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ６、１１３４−１１３９）に従ってベクターのアミノ酸１２２〜１２９に対応するヌクレオチドの欠失を含む。Ｄ２４を有するウイルスは、Ｇ１−Ｓチェックポイントを克服することにおける低い能力を有し、この相互作用が必要でない細胞、たとえばＲｂ−ｐ１６経路において欠損のある腫瘍細胞においてのみ効果的に複製することが知られており、これは全てではないが大部分のヒト腫瘍を含む。（図１７、３３および３４を参照のこと）
たとえば腫瘍特異的プロモーターによってＥ１Ａ内因性ウイルスプロモーターを置きかえることも可能である。本発明の特定の態様において、ｈＴＥＲＴプロモーターがＥ１Ａ内因性ウイルスプロモーターの代わりに利用される。
【００３９】
Ｅ３領域はｉｎ  ｖｉｔｒｏでのウイルス複製に必須ではないが、Ｅ３タンパク質は宿主免疫反応の調節において、すなわち先天性と特異的免疫反応の両方の阻害において、重要な役割を有する。Ｅ３におけるｇｐ１９ｋ／６．７Ｋ欠失は、アデノウイルスＥ３Ａ領域由来の９６５塩基対の欠失を指す。得られたアデノウイルス構築物において、ｇｐ１９ｋと６．７Ｋ遺伝子の両方は欠失している（Ｋａｎｅｒｖａ  Ａら  ２００５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２、８７−９４）。ｇｐ１９ｋ遺伝子産物は、小胞体内の主要組織適合複合体Ｉ（ヒトにおいてＨＬＡ１として知られているＭＨＣ１）分子に結合し、隔離し、細胞毒性Ｔリンパ球による感染細胞の認識を阻止することが知られている。多くの腫瘍はＨＬＡ１／ＭＨＣ１を欠損しているので、ｇｐ１９ｋの欠失はウイルスの腫瘍選択性を増加させる（ウイルスは野生型ウイルスより速く正常細胞から除去されるが、腫瘍細胞内で相違は存在しない）。６．７Ｋタンパク質は細胞表面上で発現され、それらはＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体２を下方制御するのに関わる。（図１７、３３および３４を参照のこと）
これらの欠失の両方は本発明者らの発明に関して驚くべき利点を提供する。本発明者らは養子移入Ｔ細胞に対する腫瘍エピトープの提示のためのＨＬＡ／ＭＨＣの発現を回復しようと試みているので、ｇｐ１９ｋタンパク質の発現は非生産的であり、実際にＨＬＡ／ＭＨＣの上方制御はｇｐ１９ｋの欠失を必要とする。６．７ｋに関して、本発明者らの発明の態様はウイルス由来のＴＮＦアルファの産生であり、その抗腫瘍活性の１つは、（形質導入と非形質導入バイスタンダー細胞の両方で）直接的な抗腫瘍アポトーシス促進効果があるので、６．７ｋの存在は非生産的である。
【００４０】
本発明の一態様において、サイトカイン導入遺伝子または複数の導入遺伝子はＥ３プロモーターの下でｇｐ１９ｋ／６．７ｋ欠失Ｅ３領域内に配置される。これは、導入遺伝子発現を、ウイルスの複製、およびその後のＥ３プロモーターの活性化を可能にする腫瘍細胞に制限する。Ｅ３プロモーターは、当該技術分野において知られている任意の外因性（たとえばＣＭＶまたはＥ２Ｆプロモーター）または内因性プロモーター、具体的には内因性Ｅ３プロモーターであってもよい。Ｅ３プロモーターは複製によって主に活性化されるが、Ｅ１が発現される場合、いくつかの発現が生じる。Ｄ２４型ウイルスの選択性はＥ１発現後（Ｅ１がＲｂに結合できない場合）に生じるので、これらのウイルスは形質導入正常細胞においてもＥ１を発現する。それ故、Ｅ３プロモーター媒介性導入遺伝子発現を腫瘍細胞に制限するためにＥ１発現も調節することが非常に重要である。
【００４１】
本発明の別の態様において、Ｅ３ｇｐ１９ｋ／６．７ｋはベクター内に維持されるが、１つまたは多くの他のＥ３領域は欠失している（たとえばＥ３  ９−ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａおよび／またはＥ３  １５．３ｋＤａ）。
【００４２】
本発明の特定の態様において、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは、５／３キメラ繊維ノブを含み、以下：Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、欠失領域内への導入遺伝子挿入を伴う、ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、ならびにウイルスＥ３プロモーターの下で導入遺伝子発現の複製に関連した制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したアデノウイルス遺伝子ｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりに少なくとも１種のサイトカイン導入遺伝子をコードする核酸配列を含む、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格に基づく（図１７）。本発明の一態様において、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに基づく。（図１７、３３および３４を参照のこと）
本発明の別の特定の態様において、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターはアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸骨格に基づき、以下：Ｅ３領域における欠失、およびＥ３の欠失領域の代わりに導入遺伝子（たとえばＣＤ４０Ｌ）を発現するための腫瘍特異的プロモーター（たとえばＣＭＶまたはＥ２Ｆ）を含む。本発明の一態様において、アデノウイルスベクターはヒトアデノウイルスに基づく。（図３７および３８を参照のこと、ウイルスベクターＡｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬおよびＡｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌの対応するヌクレオチド配列は配列番号３０および３１に示される）
アデノウイルス３における早期領域（Ｅ３）タンパク質の正確な機能は知られていない。一般的にアデノウイルスにおいて、それらは、欠失した場合、複製を損なうようには見えず、それらはアデノウイルスに対する抗ウイルス宿主反応に影響を与えるように見える（Ｗｏｌｄら、１９９９）。ヒトアデノウイルスゲノムのＥ３はヒトに見出される６種（Ａ〜Ｆ）のアデノウイルスの間で最高レベルの遺伝的多様性を含有する。遺伝的内容のこの多様性は、遺伝子の種特異的アレイがコードされる、高度に保存されたＥ３−ｇｐ１９ＫとＥ３−ＲＩＤαオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）との間に主に位置する（Ｂｕｒｇｅｒｔ  ａｎｄ  Ｂｌｕｓｃｈ、２０００）。
【００４３】
ウイルス感染細胞の細胞毒性Ｔ細胞媒介性殺傷はＥ３−ｇｐ１９Ｋによって調節される。これは、細胞膜へのＭＨＣクラスＩの輸送を遮断し、ＴＡＰ−ＭＨＣクラスＩ複合体形成を阻害することによって達成される（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、１９８５；Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら、１９８７；Ｂｕｒｇｅｒｔ  ａｎｄ  Ｋｖｉｓｔ、２００２、Ｂｅｎｎｅｔら、１９９９）。
【００４４】
それ故、本発明の一側面において、重要な分子であるＥ３−ｇｐ１９Ｋは、十分に安定で（stealty）、十分な時間にわたって、腫瘍退縮およびその有益な効果を可能にするウイルス複製を行うために、アデノウイルスベクター内に含まれる。また、Ｅ３−ｇｐ１９Ｋを保持することにより、抗アデノウイルス細胞毒性Ｔ細胞の誘導が低減され、十分な抗腫瘍Ｔ細胞を生じることができる。
【００４５】
本発明の一態様において、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターはアデノウイルス血清型３（Ａｄ３）核酸骨格に基づき、以下：Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのプロモーター（たとえばｈＴＥＲＴ）、Ｅ３領域における欠失（たとえばＥ３  ９−ｋＤａ、Ｅ３  １０．２ｋＤａ、Ｅ３  １５．２ｋＤａおよびＥ３  １５．３ｋＤａに影響を与える欠失）、ならびにＥ３の欠失領域の代わりに導入遺伝子（たとえばＣＤ４０Ｌ）を発現するための腫瘍特異的プロモーター（たとえばＣＭＶまたはＥ２Ｆ）を含む。本発明の一態様において、ベクターの核酸骨格は完全にアデノウイルス血清型３である。本発明の一態様において、Ａｄ３  ｄｅｌＥ３ウイルスにおいて以下の特徴が欠失していた：Ｅ３  ９ｋ−Ｄａ、Ｅ３  １０．２−ｋＤａ、Ｅ３  １５．２−ｋＤａ、Ｅ３  １５．３−ｋＤａ、およびさらにプロモーター（ＣＭＶまたはＥ２Ｆ）がそれらの場所に挿入されているＣＤ４０Ｌ。これらのウイルスは腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、Ｔヘルパー型１（ＴＨ１）反応を含むいくつかの免疫機構を誘発し、このＴヘルパー型１（ＴＨ１）反応は細胞毒性Ｔ細胞の活性化および免疫抑制の低減を導く。
【００４６】
サイトカインは、腫瘍に対するＴ細胞の動員を含む、様々な機構を介して作用することによって免疫反応に関与する。サイトカイン導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、任意の動物、たとえばヒト、サル、ラット、マウス、ハムスター、イヌまたはネコ由来であってもよいが、具体的には、それはヒト配列によってコードされる。導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、その効果を改善するために改変されていてもよい、または改変されていない、すなわち野生型でもよい。
【００４７】
本発明の特定の態様は、少なくとも１種のサイトカインをコードするウイルスベクターを含む。本発明に使用されるサイトカインは当該技術分野において任意の公知のサイトカインから選択されていてもよい。本発明の一態様において、サイトカインは、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなる群から選択される。本発明の特定の態様において、サイトカインはＩＬ−２またはＴＮＦアルファである。本発明の別の態様において、サイトカインまたは複数のサイトカインは、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるケモカイン群から選択される。
【００４８】
本発明のウイルスベクターは、１種、２種、３種、４種、５種またはそれ以上のサイトカインをコードしていてもよい。本発明の一態様において、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは２種以上のサイトカイン、最も具体的には２種をコードする。これらの２種のサイトカインはたとえば、これらに限定されないが、ＧＭＣＳＦの付加を有する、上記に挙げたものを含む任意の公知のサイトカインであってもよい。２種のサイトカインは異なるサイトカインであってもよい。本発明の一態様において、腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるサイトカイン群から選択される任意の２種以上のサイトカインをコードする、または腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは、ＩＬ−２ならびにインターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるサイトカイン群から選択される１種のサイトカインまたは複数種のサイトカインをコードする。本発明の特定の態様において、サイトカインはＩＬ−２およびＴＮＦアルファである。他のサイトカインは、Ｔ細胞を引きつけ、活性化し、腫瘍免疫抑制を低減することによって機能するのに対して、ＩＬ−２はＴ細胞移植片の増殖を誘導する。それ故、ＩＬ−２は、Ｔ細胞療法において典型的に行われるような全身注射の代わりに、それを必要とする腫瘍において局所的に産生され、このＴ細胞療法は副作用を引き起こし得るので、従来技術の療法の主要な問題（すなわち全身性ＩＬ−２の毒性）がこの態様によって阻止され得る。
【００４９】
導入遺伝子の作用と一緒に、腫瘍退縮性ウイルスの複製およびウイルスＤＮＡによる病原体に関連した分子パターン認識受容体の活性化によって提供される危険信号は、腫瘍免疫抑制をプレコンディショニング療法を省略できるような程度まで低減させることができる。その結果として、従来技術における主要な問題であるプレコンディショニング化学療法、および放射線に起因する毒性が回避され得る。
【００５０】
本発明の一態様において、ウイルスベクターは、２つの導入遺伝子の間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または任意にリボソームシャント部位２Ａを含む。それ故、ＩＲＥＳまたはリボソームシャント部位２Ａは、任意のサイトカイン、たとえばＩＬ−２と上記に挙げたサイトカイン群から選択される任意のサイトカインとの間にあってもよい。ここに使用される場合、「ＩＲＥＳ」は、タンパク質合成においてメッセンジャーＲＮＡ配列の中間における翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を指す。ＩＲＥＳは任意のウイルス由来であってもよいが、本発明の一態様において、ＩＲＥＳは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来である。ここに使用される場合、「リボソームシャント部位２Ａ」は、リボソームが開始コドンに到達するように５’非翻訳領域の部分を物理的に迂回する翻訳開始部位を指す。ＩＲＥＳとＡ２の両方は、ウイルスに１つのプロモーター（Ｅ３プロモーター）由来の２つの導入遺伝子を産生させることができる。
【００５１】
本発明に使用されていてもよいウイルスゲノムの一般的な設計の概略図は、図１７、３３、３４、３７および３８に示される。導入遺伝子Ｃ５ａ、ｈＣＤ４０Ｌ、ｈＩＦＮａ２、ｈＩＦＮｂ１、ｈＩＦＮｇ１、ｈＩＬ２またはＴＮＦアルファを含むウイルスベクターのヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１〜７（Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４−導入遺伝子）に示される。ＣＤ４０Ｌを含むウイルスベクターのヌクレオチド配列はまた、配列番号３０および３１（Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬおよびＡｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌ）に示される。さらに、一方がＩＬ−２であり、他方がＣ５ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮａ２、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＧＭＣＳＦまたはＴＮＦアルファである、２つの導入遺伝子を含むウイルスベクターのヌクレオチド配列は、配列番号８〜２１（配列番号８  Ｃ５ａ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号９  ＩＦＮａ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１０  ＴＮＦアルファ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１１  ＣＤ４０Ｌ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１２  ＩＦＮｂ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１３  ＧＭＣＳＦ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１４  ＩＦＮｇ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１５  Ｃ５ａ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１６  ＩＦＮａ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１７  ＴＮＦアルファ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１８  ＣＤ４０Ｌ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１９  ＩＦＮｂ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号２０  ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号２１  ＩＦＮｇ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２）（Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４−導入遺伝子−ＩＲＥＳ／２Ａ−導入遺伝子）に示される。
【００５２】
まとめると、少なくとも１種のサイトカイン導入遺伝子を含むウイルスベクターを利用する本発明の重要な利点は、ｉ）サイトカインおよびウイルス自体がＴ細胞および他の免疫細胞を腫瘍に動員する危険信号を引き起こし、ｉｉ）サイトカインが腫瘍と局所リンパ器官の両方においてＴ細胞増殖を誘導し、ｉｉｉ）サイトカインおよびウイルス自体が腫瘍において増殖するためにＴ細胞（養子Ｔ細胞移植片と天然の先天性抗腫瘍Ｔ細胞の両方）を誘導でき、ｉｖ）サイトカインおよび／またはウイルスが癌細胞上の抗原提示分子（ＨＬＡ）の上方制御を誘導し、それらをＴ細胞による認識および殺傷に対して感受性にし、ｖ）サイトカインおよびウイルス複製が免疫抑制および細胞アネルギーを低減させることによって腫瘍微小環境を有利に変えることである。
【００５３】
本発明に利用されるウイルスベクターはまた、上記以外の他の改変を含んでいてもよい。任意のさらなる構成成分または改変が任意に使用されていてもよいが、本発明に必須ではない。
【００５４】
外因性エレメントの挿入は標的細胞においてベクターの効果を増強できる。外因性組織または腫瘍特異的プロモーターの使用は組換えベクターにおいて一般的であり、それらもまた本発明に利用されていてもよい。
【００５５】
まとめると、本発明は、腫瘍退縮性ウイルスの複製がＴ細胞を動員でき、腫瘍において危険信号を誘導でき、免疫抑制および細胞アネルギーを低減することを明らかにする。これらの効果は、免疫を誘導するための進化的に保存された機構である、病原体に関連した分子パターン認識受容体を介して媒介され、寛容性に依存しない。本発明はまた、正常細胞ではなく腫瘍内で複製できる腫瘍退縮性プラットフォームの付与される利点が腫瘍における自己増幅であることを明らかにする。加えて、腫瘍退縮性効果自体がヒトにおける全抗腫瘍効果に付与されてもよい。
癌
本発明の組換えベクターは腫瘍細胞内で複製可能である。本発明の一態様において、ベクターは細胞内で複製可能であり、その細胞はＲｂ経路、具体的にはＲｂ−ｐ１６経路を欠損している。これらの欠損細胞には動物およびヒトにおける全ての腫瘍細胞が含まれる。ここに使用される場合、「Ｒｂ経路の欠損」は、経路のいずれかの遺伝子またはタンパク質における変異および／または後成的変化を指す。これらの欠損に起因して腫瘍細胞はＥ２Ｆを過剰発現するので、通常、有効な複製に必要とされるＥ１Ａ  ＣＲ２によるＲｂの結合は不要である。さらに選択性はＥ２Ｆプロモーターによって媒介され、そのＥ２Ｆプロモーターは、Ｒｂ／ｐ１６経路欠損細胞において見られるように、遊離Ｅ２Ｆの存在下でのみ活性化する。遊離Ｅ２Ｆの非存在下ではＥ１Ａの転写は生じず、ウイルスは複製しない。Ｅ２Ｆプロモーターの包含は正常組織内でＥ１Ａの発現を阻止するのに重要であり、その正常組織は、Ｅ３プロモーターから導入遺伝子発現を可能にすることにより、直接と間接の両方で毒性を引き起こし得る。
【００５６】
本発明は対象における癌を治療するための手法に関する。本発明の一態様において、対象はヒトまたは動物、具体的には動物またはヒト患者、より具体的には癌を患っているヒトまたは動物である。
【００５７】
手法は悪性腫瘍と良性腫瘍の両方を含む、任意の癌または腫瘍を治療するために使用でき、原発腫瘍と転移癌の両方が手法の標的であってもよい。本発明の一態様において、癌は腫瘍浸潤リンパ球を特徴付ける。本発明の手段は腫瘍浸潤リンパ球を特徴付ける転移性固形腫瘍の治療に特に魅力的である。別の態様において、Ｔ細胞移植片はキメラ抗原受容体の腫瘍または組織特異的Ｔ細胞受容体によって改変されている。
【００５８】
ここに使用される場合、「治療」または「治療する」という用語は、癌または腫瘍に関連する障害または症状の完全な治癒だけでなく、予防、改善または緩和を含む目的のために、対象、好ましくは哺乳動物またはヒト対象への、少なくとも腫瘍退縮性アデノウイルスベクターまたは少なくとも腫瘍退縮性アデノウイルスベクターおよび養子細胞治療組成物の投与を指す。治療効果は、患者の症状、血液中の腫瘍マーカー、またはたとえば腫瘍のサイズ、もしくは患者の生存期間をモニターすることによって評価されていてもよい。
【００５９】
本発明の別の態様において、癌は、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌（oral cancer）、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛腫瘍、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌（oral cancer）、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌（mouth cancer）、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群から選択される。
【００６０】
本発明の療法に適するようにヒトまたは動物患者を分類する前に、臨床医は患者を検査していてもよい。正常から外れて腫瘍または癌を明らかにしている結果に基づいて、臨床医は患者のために本発明の治療を提案してもよい。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は本発明の少なくとも１種類のウイルスベクターを含む。さらに組成物は、少なくとも２種、３種または４種の異なるベクターを含んでいてもよい。ベクターに加えて、医薬組成物はまた、他の治療的に有効な薬剤、任意の他の薬剤、たとえば薬学的に許容される担体、緩衝剤、賦形剤、アジュバント、添加剤、防腐剤、充填剤、安定剤および／もしくは増粘剤、ならびに／または対応する製品に通常見出される任意の構成成分を含んでいてもよい。組成物を製剤化するための好適な成分および適切な製造方法の選択は当業者の一般的知識に属する。
【００６１】
医薬組成物は投与に適した任意の形態、たとえば固体、半固体または液体形態であってもよい。製剤は、これらに限定されないが、液剤、エマルション、懸濁剤、錠剤、ペレット剤およびカプセル剤からなる群から選択されていてもよい。本発明の組成物は特定の製剤に限定されず、代わりに組成物は任意の公知の薬学的に許容される製剤に製剤化されていてもよい。医薬組成物は当該技術分野において公知の任意の従来の方法によって製造されていてもよい。
【００６２】
本発明の一態様において、ウイルスベクターまたは医薬組成物はＴ細胞を動員するためのインサイチュービヒクルとして作用し、それらの治療効果を増強し、腫瘍におけるそれらの増殖を可能にする。
【００６３】
本発明の医薬キットは、養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを含む。養子細胞治療組成物は第１の製剤に製剤化され、少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは第２の製剤に製剤化される。本発明の別の態様において、第１および第２の製剤は同時にまたは任意の順序で連続して対象へ投与するためのものである。
投与
本発明のベクターまたは医薬組成物は、植物、動物およびヒトからなる群から選択される任意の真核生物対象に投与されていてもよい。本発明の特定の態様において、対象はヒトまたは動物である。動物は、ペット、家畜および生産動物からなる群から選択されていてもよい。
【００６４】
任意の従来の方法がベクターまたは組成物を投与するために対象に使用されていてもよい。投与経路は、製剤または組成物の形態、疾患、腫瘍の位置、患者、共存症および他の要因に依存する。
【００６５】
本発明の一態様において、対象への養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの個別投与は同時にまたは任意の順序で連続して行われる。ここに使用される場合、「個別投与」または「個別」は、養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、互いに別個の２つの異なる製品または組成物である状況を指す。
【００６６】
養子細胞治療組成物および本発明の少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの１回の投与のみ、または腫瘍退縮性もしくは非細胞溶解性ウイルスベクターのみの投与が治療効果を有していてもよい。たとえば患者および癌の種類、程度または位置に応じて投与の間隔は任意の期間であってもよい。本発明の一態様において、養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの連続投与の間隔は、１分〜４週間、具体的には１〜１０日、より具体的には１〜５日の期間である、ならびに／または養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが複数回投与される。養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスの投与回数はまた、治療期間の間、異なっていてもよい。腫瘍退縮性アデノウイルスベクターまたは医薬もしくは養子細胞組成物は、たとえば最初の２週間、４週間、１カ月または治療期間の間に１〜１０回投与されていてもよい。本発明の一態様において、ベクターまたは任意の組成物の投与は、最初の２週間、次いで４週間、次いで１カ月に３〜７回行われる。本発明の特定の態様において、投与は、最初の２週間、次いで４週間、次いで１カ月に４回行われる。治療期間の長さは変化させていてもよく、たとえば２〜１２カ月以上続けていてもよい。
【００６７】
本発明の特定の態様において、養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは同日に投与され、その後腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは、たとえば１〜６または１２カ月以上続けていてもよい治療期間の間、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回または１カ月に１回投与される。
【００６８】
本発明の一態様において、腫瘍退縮性ウイルスの投与は、腫瘍内、動脈内、静脈内、胸膜内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射、または経口投与により行われる。投与の任意の組合せも可能である。手法は局所注射にも関わらず全身効果を与えることができる。養子細胞治療組成物は静脈内または腫瘍内に投与されていてもよい。一態様において、養子細胞治療組成物および／または少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの投与は、腫瘍内、動脈内、静脈内、胸膜内、膀胱内、腔内もしくは胸膜注射、または経口投与により行われる。本発明の特定の態様において、ＴＩＬまたはＴ細胞は静脈内に投与され、ウイルスベクターは腫瘍内および／または静脈内に投与される。注目すべきことに、ウイルスはＴ細胞の投与とは別に腫瘍に送達され、ウイルスはｅｘ  ｖｉｖｏでＴ細胞移植片を改善するために使用されない。本質的に、Ｔ細胞移植片が良好に作用できるようにウイルスは腫瘍を改善する。
【００６９】
ベクターの有効量は、治療を必要とする対象、腫瘍の種類、腫瘍の位置および腫瘍の段階に少なくとも依存する。用量はたとえば約１×１０8ウイルス粒子（ＶＰ）〜約１×１０14ＶＰ、具体的には約５×１０9ＶＰ〜約１×１０13ＶＰ、より具体的には約８×１０9ＶＰ〜約１×１０12ＶＰで変化させていてもよい。一態様において、少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターは、１×１０10〜１×１０14ウイルス粒子の量で投与される。本発明の別の態様において、用量は約５×１０10〜５×１０11ＶＰの範囲である。
【００７０】
移入される細胞の量もまた患者に依存するが、典型的な量は１回の注射につき１×１０9〜１×１０12細胞の範囲である。注射の回数も変わるが、典型的な態様は、数週間（たとえば２〜４週間）の間隔を空けた１または２ラウンドの治療を含む。
【００７１】
任意の他の治療または治療の組合せが本発明の療法に加えて使用されていてもよい。特定の態様において、本発明の方法または使用は、対象への放射線療法、モノクローナル抗体、化学療法、または他の抗癌薬、もしくは介入（手術を含む）の同時または連続適用をさらに含む。
【００７２】
ここに使用される場合、「治療する」または「増加する」という用語、およびそれらからの語幹の単語は、必ずしも１００％または完全な治療または増加を示すとは限らない。むしろ、当業者が潜在的利点または治療効果を有すると認識する様々な程度が存在する。これに関して、本発明の方法は、Ｔ細胞療法の効果または疾患の治療もしくは予防の任意の程度の任意の量の増加を提供できる。
【００７３】
図２８〜３２、３６および４８は、本発明の方法および機構を示す。
【００７４】
技術が進歩するにつれて、本発明の概念は様々な方法で実施され得ることは当業者に自明である。本発明およびその態様は上記の例に限定されないが、特許請求の範囲内で変更していてもよい。
【００７５】
［実施例］
材料および方法
Ｂ１６−ＯＶＡ動物モデル：オボアルブミンを発現するＢ１６細胞（Ｂ１６−ＯＶＡ）を、ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、２０ｍＭのＬ−グルタミン、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液（ＧＩＢＣＯ）中に維持した。４〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６免疫応答性メスマウスに、５０ｕｌのＲＰＭＩ、０％ＦＢＳ中の２．５×１０5Ｂ１６−ＯＶＡ細胞を、一匹のマウスにつき１つの腫瘍で右脇腹に皮下移植した。腫瘍生着のおおよそ１０日後（腫瘍が注射可能、約３ｍｍの最小直径になったとき）、マウスを群に分け、いくつかの実験において、５０ｕｌのＰＢＳまたは５０ｕｌのＰＢＳ中の腫瘍退縮性アデノウイルスの１×１０9ウイルス粒子（ＶＰ）のいずれかの腫瘍内注射により６連続日で処置した。他の実験において、０、２および４日目に３回注射を与えた。マウス細胞はヒトアデノウイルスに対して非許容性であるので、ウイルス複製により誘導される炎症を模倣するために複数の腫瘍内ウイルス注射を使用した（Ｂｌａｉｒら、１９８９）。
【００７６】
養子移入：ｉ．ｔ．処置の最初の日に、マウスはまた、養子移入によって腹腔内空洞において、１００ｕｌのＲＰＭＩ、０％ＦＢＳ中の５×１０5〜２×１０6の一晩置いたＣＤ８ａを濃縮し、増殖させた脾細胞を受け、その脾細胞は、オボアルブミン（ＯＶＡ）特異的ＣＤ８  Ｔ細胞受容体のみを有するように遺伝子操作された４〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）１１００Ｍｊｂ／Ｊ（ＯＴ−１）マウス由来であった。ＣＤ８ａ濃縮は、製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ、ｃａｔ．ｎｏ  １３０−０４９−４０１）に従って移入の５日前にマウスＣＤ８ａ（Ｌｙ−２）Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓによって実施した。濃縮細胞は、組換えマウスＩＬ−２（１６０ｎｇ／ｍｌ）および可溶性抗マウスＣＤ３ε抗体（０，３ｕｇ／ｍｌ、Ａｂｃａｍ、クローン１４５−２Ｃ１１）の存在下でリンパ球培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ、２０ｍＭのＬ−グルタミン、１×Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液、１５ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭのピルビン酸Ｎａ）中で合計５日間増殖させた。
【００７７】
フローサイトメトリーのための組織処理：マウスを安楽死させ、脾臓、流入領域リンパ節および腫瘍を１〜１０ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中で採取し、末端心臓出血によって血液を胸腔内に回収し、使い捨てシリンジによってＥＤＴＡ含有微小遠心管内に移し、分析のために処理した：固形腫瘍を外科用メスによって大まかに解離し、５〜１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ3、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）入りの１０ｍｌの使い捨て滅菌ピペットチップ中で粉砕し、室温（ＲＴ）にて約２０分間インキュベートし、そのときに細胞を１２００ｒｐｍ、５分、＋４℃にてペレット化し、その後、細胞の推定量に応じて、細胞を１〜１０ｍｌのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ中に再懸濁し、４０μｍの無菌フィルターを通過させ、単一の細胞溶液を作製した。いくつかの態様において、代わりに腫瘍組織を、３７℃、５％ＣＯ2にて１〜２時間、全体積１ｍｌのプロテアーゼカクテル（１ｍｇ／ｍｌのＡ、ＨまたはＰ型コラゲナーゼ、Ｒｏｃｈｅおよびベンゾナーゼ、最終濃度１２５単位／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ、Ｅ１０１４−２５ＫＵを補足したＲＰＭＩ）中で外科用メスで切断した後（ＡＣＫを加える前）に直接処理し、その後、１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液を加え、細胞を上記のように処理した。２００μｌの全血を５ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液中にピペットで採取し、上記のように処理した。細胞を３７℃、５％ＣＯ2にて一晩インキュベートした、または免疫染色およびフローサイトメトリーによって直接分析した。
【００７８】
サイトカイン分析のための組織処理：マウスを安楽死させ、約２〜１０ｍｍ3の腫瘍部分をドライアイス上の２ｍｌの微小遠心管内で凍結し、−８０℃に保存した。腫瘍部分を秤量し、２００μｌの氷冷ＰＢＳを加えた。部分をＴｉｓｓｕｅ  Ｍａｓｔｅｒ  １２５ローターによりホモジナイズし、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）および０．１％ＢＳＡ最終濃度を加え、管を氷上に維持した。腫瘍ホモジネートを２０００ｒｐｍ、１０分、＋４℃にて回転させ、製造業者の指示書に従って、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｒａｙ上でＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔサイトカインビーズ（ＢＤ、ＵＳＡ）を用いて上清を分析した。
本発明を支持する実験
実験１（腫瘍内アデノウイルス注射によって誘導されるサイトカインおよびケモカイン）：
アデノウイルス注射がサイトカインおよびケモカイン発現を生じ得るかどうかを調べるために、本発明者らは、皮下Ｂ１６−ＯＶＡ腫瘍を保有するマウスに、０、１、２、３、４および５日目に、ＰＢＳまたは５／３キメラ腫瘍退縮性アデノウイルスのいずれかを腫瘍内に注射した。１つの治療群につき３匹のマウスから腫瘍を抽出し、０日目（ウイルス注射の前＝ベースライン対照）にサイトカイン分析のために処理し、６、１０、１４および１８日目の時点ごとに３匹の他のマウス由来の腫瘍を処理した。
【００７９】
注目すべきことに、結果は、ウイルスにより誘導されるＩＦＮ−γの分泌の増加、およびその後の、１０日目のＩＦＮ−γ誘導性ケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよびＭＣＰ−１の上方制御を示した（図１）。
【００８０】
養子細胞療法の治療効果を増強させるために、これらの知見は重要である。
【００８１】
このデータによれば、腫瘍退縮性サイトカイン武装アデノウイルスによる処置の結果、腫瘍微小環境の有益な変化が生じ、養子移入免疫細胞の走化性を増加させ、細胞毒性ＣＤ８＋  Ｔ細胞による腫瘍細胞認識を増強させた。
実験２（養子Ｔ細胞療法のアデノウイルスにより媒介される増強）：
養子Ｔ細胞療法のアデノウイルス処置の影響を調べるために、マウスＢ１６−ＯＶＡ黒色腫を、５／３キメラ腫瘍退縮性アデノウイルス単独、または腫瘍特異的ＯＴ−Ｉ細胞の養子移入との組合せで処置し、腫瘍内ＰＢＳ注射を受けているマウスと比較した。図２にまとめた３回の独立した実験の結果は、一方で、ウイルス注射それ自体で（ヒトアデノウイルスはマウス細胞において生産的に複製しないことに留意されたい）、小さい腫瘍の成長制御を生じ、処置後１４日まで続き、その後減少したことを表す（図２Ａ）。他方で、処置したマウスに５×１０5または２×１０6ＯＴ−Ｉ細胞を養子移入した場合、ＰＢＳとＡｄ群との間に統計的に有意な相違が２つの別の実験において観察された（それぞれ図２Ｂおよび２Ｃ）。
【００８２】
それ故、腫瘍内のウイルスの存在は養子細胞療法に対する効果を非常に増強させた。Ｂ１６．ＯＶＡ黒色腫モデル（Ｓｏｎｇ  ＸＴら  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１１  Ｊａｎ；１９（１）：２１１−７、ＰＭＩＤ：２０９５９８１４）において、Ａ２０特異的ショートヘアピンＲＮＡおよびトール様受容体５を刺激するフラジェリンの分泌型（Ａｄ−ｓｈＡＦ）を同時発現する等量のアデノウイルスと混合したＯＶＡを発現する複製欠損アデノウイルス（Ａｄ−ＯＶＡ）の１×１０10ＶＰの単回筋肉内注射のために、各々１×１０9ＶＰの６回の腫瘍内ウイルス注射を、Ｓｏｎｇら（２０１１、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ）によって報告されているものと比較してＯＴ−Ｉ細胞が等しいまたは優れた抗腫瘍効果の養子移入と組み合わせて本発明者らの手で行った。これらの結果を考慮すると、本発明の新規側面は腫瘍内へのウイルス注射を標的とすることであり、これにより、非武装ウイルスを用いてでさえ、筋肉内に投与される複数の免疫機能武装ウイルスよりも優れた腫瘍制御を本発明者らは達成できる。
実験３（ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫細胞集団の質および量のアデノウイルスにより媒介される変化）：
実験２の養子移入細胞の輸送および増殖を調べるために、ＯＴ−Ｉ細胞を、５μＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで染色した。この蛍光細胞染色色素を全ての細胞分裂に伴って希釈し、したがって本発明者らは、各細胞分裂（最大７回の分裂、ここでＭ０−７と標識した）における蛍光信号強度の約１／２のわずかな減少を分析することにより、フローサイトメトリーによってリンパ球増殖を追跡できる。移入の１日後、結果は、腫瘍内で移入ＯＴ−Ｉ細胞（ＣＤ８＋  ＣＦＳＥ＋二重陽性集団）のウイルスにより誘導される蓄積を示し、血液中のこれらの細胞の低減が同時に起こった（図３Ａ）。その後、また、全ＣＤ８＋  Ｔ細胞数が、ＰＢＳ注射した腫瘍と比べてウイルス処置した腫瘍において多いように見え、１４日目に全ＣＤ８＋  Ｔ細胞数はウイルス処置したマウスのリンパ器官において増加した。
【００８３】
異なる時点におけるＯＴ−Ｉ細胞分裂の量を図３Ｂに示す。ＯＴ−Ｉ細胞の増殖状態は１日目において両方の群の間で同じであったので、様々な器官内のＣＤ８＋細胞数の相違はアデノウイルスにより誘導される免疫細胞輸送に起因した。しかしながらその後、この状況は変化し、アデノウイルス処置した腫瘍におけるＯＴ−Ｉ細胞の増加は、増加したリンパ球増殖に起因した。６日目に、ＰＢＳ処置した腫瘍内のＯＴ−Ｉ細胞の大部分はＭ５期において停止したのに対して、アデノウイルス群における移入細胞は増殖し続けた（分裂Ｍ６−Ｍ７）。このデータにより、腫瘍退縮性ウイルス療法または非細胞溶解性ウイルス注射の結果、腫瘍内の免疫抑制を遮断し、ＣＤ８＋細胞活性化の原因となる免疫細胞を引きつけることによって、および／またはＴ細胞アネルギーを克服するのに役立ついくつかの他の重要な機構によって、養子移入リンパ球の増強された輸送および増殖が生じることが示唆される。
【００８４】
動物モデルにおける本発明者らの知見に対する支持として、本発明者らは、進行癌を有する患者への腫瘍退縮性ウイルス投与後の最初の日の間、血中リンパ球数の一時的な低下を観察した（図４）が、これは、腫瘍内の急性アデノウイルス感染に反応して循環Ｔ細胞が動員されたことを示唆する。
【００８５】
さらに、腫瘍内にＴ細胞を動員するアデノウイルス感染の支持として、本発明者らは、治療前より治療後、腫瘍生検組織切片内に増加した数のＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した（図５）。
【００８６】
図６は、Ｔ細胞の養子移入と組み合わせたアデノウイルス注射の結果を示す。
【００８７】
図７は、養子移入およびウイルス注射に起因した「天然」抗腫瘍Ｔ細胞の数の劇的な増加を表す。
【００８８】
図８は、１４日目の腫瘍内の活性化ＣＤ８＋細胞および腫瘍内のＴＩＭ−３発現を示す。
【００８９】
図９は、抗腫瘍Ｔ細胞の増加および免疫抑制の低減の結果、腫瘍抗原に対して全身性免疫が生じることを示す。
【００９０】
図１０は、ウイルス注射後のＯＴＩ  Ｔ細胞の分布を示す。
【００９１】
図１１は、上昇した免疫抑制が細胞の増殖を誘導できることを表す。
【００９２】
図１２は、ＯＴ１細胞と組み合わせた組換えサイトカイン（ウイルスなし）の効果を示す。
実験４（養子移入Ｔ細胞＋マウスサイトカイン武装Ａｄ５アデノウイルス）：
モデル：
Ｂ１６−ＯＶＡ（１匹の動物につき０，２５×１０ｅ６細胞）を有するＣ５７ＢＬ／６
群：
注射なし
Ａｄ５−Ｌｕｃ
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦａ
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＦＮｇ
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＦＮｂ１
注射なし＋ＯＴ１
Ａｄ５−Ｌｕｃ＋ＯＴ１
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦａ＋ＯＴ１
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＦＮｇ＋ＯＴ１
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２＋ＯＴ１
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＦＮｂ１＋ＯＴ１
Ａｄ５ベクターはマウス導入遺伝子をコードする非複製ヒトアデノウイルスのベクターである。構築物はＡｄＥａｓｙ技術（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ）を用いて作製し、導入遺伝子カセット（ＣＭＶプロモーターによって駆動される）はＥ１領域を欠失している（たとえばＤｉａｃｏｎｕ  Ｉら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ  １；７２（９）：２３２７−３８を参照のこと）。
【００９３】
群のサイズ：
ｎ＝７、１２×７＝８４（＋追加２０％＝１００）
処置スケジュール：
ＯＴ１細胞：１日目に１匹の動物につき２×１０ｅ６腹腔内投与（ｉ．ｐ．）
ウイルス注射：１日目およびその後１週間に１回で１×１０ｅ９ウイルス粒子（ＯＤ２６０）
エンドポイント：
腫瘍体積（最初の週の間２日ごと、次いで３日ごとに測定した）
ＦＡＣＳおよび／またはＥＬＩＳＰＯＴ（Ｓｉｒｉデータに従って最も関連するアッセイに焦点を当てる）のために、マウスが死んだまたはマウスを殺傷した場合の、腫瘍および脾臓の採取。
【００９４】
Ｔ細胞療法と組み合わせた最適な導入遺伝子はＴＮＦアルファｊａ  ＩＬ２であった（図１３）。データを増加させると、同じサイトカインがウイルスなしの実験において関係した。
【００９５】
図１４は、腫瘍サイズに対する異なるウイルス（Ｔ細胞療法なし）の結果を示す（図１４）。
【００９６】
図１５は、Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦアルファ−ベクターと組み合わせたＴ細胞療法の優れた結果を示す。
【００９７】
図１６は、Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２−ベクターと組み合わせたＴ細胞療法の優れた結果を示す。
新規ウイルス構築物
以下の新規ウイルス構築物を本発明者らの提案した技術の例として提示する：
Ｃ５ａおよびＴＮＦ−α発現腫瘍退縮性ウイルス
本発明者らは、６．７Ｋ／ｇｐ１９遺伝子領域の代わりに導入遺伝子として相補体構成成分Ｃ５ａまたはヒトＴＮＦ−αの活性部分を有する新規腫瘍退縮性Ａｄ５／３アデノウイルスを生成した（図１７）。
実験５（Ｃ５ａコードアデノウイルスベクターからの導入遺伝子発現）：
概念の実証として、腫瘍退縮性アデノウイルスが、養子細胞療法を増強させるために提案されている選択されたサイトカインを発現できるかどうかを確認するために、本発明者らは、Ｃ５ａをコードするアデノウイルスの１０ＶＰ／細胞にて培地中でヒトＡ５４９細胞を感染させ（図２４）、感染後の異なる時点にて細胞培養上清中でＣ５ａレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。実際に結果は、所有しているアデノウイルス構築物が選択されたサイトカインを保有しているという仮定を実証し、支持している。
実験６（新規アデノウイルスベクターによる単球移動に対する効果）：
本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ走化性アッセイを使用して単球を動員するＣ５ａの能力を試験した：Ａ５４９細胞を、Ｃ５ａを発現するアデノウイルスもしくは非武装対照ウイルス（１０ＶＰ／細胞−同様のウイルス間の感染単位）のいずれかで感染させた、またはＰＢＳで処置し、感染の４８時間後に培地を採取し、製造業者の指示書（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＱＣＭ、ｃａｔ．ｎｏ．ＥＣＭ５１２）に従ってトランスウェル走化性アッセイにおいてヒト単球細胞株ＴＨＰ１を動員するために使用した。結果は、非感染細胞または非武装対照ウイルスに感染した細胞由来の培地による以上に、Ｃ５ａ発現ウイルスに感染した細胞由来の上清によって、有意に多い単球の誘引を表す（図２５）。
実験７（Ｃ５ａ武装アデノウイルスの抗腫瘍効果）：
非細胞溶解性腫瘍感染の状況においてＣ５ａの抗腫瘍有効性を評価するために、本発明者らは、ＰＢＳ、Ｃ５ａ発現または非武装対照ウイルスのいずれかを用いて、０、２および４日目にＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて樹立されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍を処置した。結果はＣ５ａ発現ウイルスによる強力な抗腫瘍効果を表す（図２６）。
実験８（Ｃ５ａウイルスによる増加した抗腫瘍Ｔ細胞増殖）：
Ｃ５ａ発現ウイルスの抗腫瘍効果の観察された増加（図２４）がＴ細胞に関連しているかどうかを評価するために、免疫優勢オボアルブミンペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、ＵＳＡ）が負荷されたＭＨＣ  Ｉを認識するＴＣＲに特異的なＡＰＣがコンジュゲートした五量体で染色することによって検出された、オボアルブミン特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞についてフローサイトメトリーによって腫瘍を分析した。実際に、Ｃ５ａウイルス群における腫瘍は、対照ウイルスまたはＰＢＳを注射した腫瘍より有意に多い割合の腫瘍特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を含有した（図２７）。
実験９（ＴＮＦ−αコードアデノウイルスからの導入遺伝子発現）：
Ｃ５ａウイルス（図２４および実験５）と同様に、本発明者らは、最適な導入遺伝子の分泌を媒介する、ｈＴＮＦ−αを発現する腫瘍退縮性アデノウイルスの能力を試験した。結果により、発現が確認される（図１８）。
実験１０（発現された導入遺伝子の生物学的効果は腫瘍退縮性アデノウイルスにおいて保持される）：
アデノウイルス発現導入遺伝子がその生物学的効果を維持するかどうかを評価するために、対照非武装ウイルスまたはＴＮＦ−アルファ発現ウイルス（様々なＶＰ／細胞、７２時間  ｐ．ｉ．）に感染させたＡ５４９細胞由来のウイルスを含まない（１００ｋＤ濾過した）上清を、ＴＮＦ−アルファに対して感受性があるＷＥＨＩ−１３ＶＡＲ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２１４８）細胞上に適用し、これらの細胞を上清への曝露の７２時間後に生存について評価した。（たとえばＥｓｐｅｖｉｋ  Ｔら  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９８６；９５（１）：９９−１０５が方法を記載している。）結果は、腫瘍退縮性アデノウイルスから発現したＴＮＦ−アルファが効力のある生物学的効果を保持することを表す（図１９）。
実験１１（腫瘍退縮性サイトカイン発現ウイルスはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞殺傷能力を保持する）：
ＴＮＦ−アルファは抗ウイルス効果を有する可能性があるので、ＴＮＦ−アルファを発現するアデノウイルスの腫瘍退縮効果が、癌細胞に感染し、殺傷する、その能力を保持することを確認することは重要であった。培養物中のいくつかの癌細胞株をＴＮＦ−アルファ発現または対照ウイルスに感染させ、製造業者の指示書（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）に従って、ＣｅｌｌｔｉｔｅｒＧｌｏ  ＡＱ  ＭＴＳアッセイによって生存について評価した。結果は、ウイルスがｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍退縮性であることを示す（図１９〜２０）。
実験１２（放射線療法とＴＮＦアルファを発現する腫瘍退縮性ウイルスとの間の相乗効果）：
本発明者らは、付随する焦点外部ビーム放射線（ＸＲＴ）を用いて、または用いずに皮下Ａ５４９異種移植片を有するヌードマウスを腫瘍内においてウイルス処置した（図２１）。ＲＤは複製欠損ウイルスを示し、非武装ウイルスはＴＮＦアルファを有さない腫瘍退縮性ウイルスである。
実験１３（免疫応答性宿主内のＴＮＦ−アルファ発現アデノウイルスの増加した抗腫瘍効果）：
マウス細胞内で複製しない腫瘍退縮性アデノウイルスが依然として、免疫応答性マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍効果を引き起こすことができるかどうかを試験するために、樹立したＢ１６．ＯＶＡ腫瘍を有するマウスに、図２６と同様にＴＮＦ−アルファ発現もしくは非武装対照ウイルスまたはＰＢＳを腫瘍内に注射した。結果は、対照と比較してＴＮＦ−アルファ発現ウイルスにより強力な全体の腫瘍制御を示し（図２２）、ヒトＴＮＦアルファがマウスにおいて部分的に活性であることを示唆し、強力な抗腫瘍効果を達成する武装ウイルスの考えを支持する。
実験１４（ＴＮＦα−ウイルスによる増加した抗腫瘍Ｔ細胞増殖）：
実験１１と同様に、本発明者らは、ＴＮＦ−アルファ発現ウイルスの観察された抗腫瘍効果が、腫瘍特異的細胞溶解性Ｔ細胞反応の誘導に関連するかどうかを試験することを望んだ。本発明者らは腫瘍を抽出し、それらを実験１１のようにフローサイトメトリー分析のために処理した。結果（図２３）により実際に、同様にＴＮＦ−アルファ発現が腫瘍部位における腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖を促進することが確認され、提案された技術を支持する強力な根拠が示される。
【００９８】
図２８〜３２、３６および４８は、本発明の方法および機構を例示する。
実験１５（２つの異なるアデノウイルスベクターおよびＯＴ１（Ａｄ−ｍＴＮＦａ／Ａｄ−ｍＩＬ２＋ＯＴ１）を用いた組合せ実験）：
モデル：
Ｂ１６−ＯＶＡ（１匹の動物につき０．２５×１０ｅ６細胞）を有するＣ５７ＢＬ／６
群：
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦａ（１×１０ｅ９のＶＰ）
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２（１×１０ｅ９のＶＰ）
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦａ＋Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２（０．５＋０．５×１０ｅ９個のＶＰ）
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦａ＋ＯＴ１
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２＋ＯＴ１
Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＴＮＦａ＋Ａｄ５−ＣＭＶ−ｍＩＬ２＋ＯＴ１
Ａｄ５Ｌｕｃ１＋ＯＴ１
注射なし（偽−偽）
Ａｄ５ベクターはマウス導入遺伝子をコードする非複製ヒトアデノウイルスのベクターである。構築物はＡｄＥａｓｙ技術（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｉｎｃ）により作製した；導入遺伝子カセット（ＣＭＶプロモーターにより駆動される）は欠失したＥ１領域にある（たとえばＤｉａｃｏｎｕ  Ｉら  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２  Ｍａｙ  １；７２（９）：２３２７−３８を参照のこと）。
【００９９】
群サイズ：
ｎ＝９
１００匹を順序付けた
処置スケジュール：
ＯＴ１細胞：１日目に１匹の動物当たり１．５×１０ｅ６腹腔内投与（ｉ．ｐ．）（以前の実験と同じ量、２×１０ｅ６ではない）
ウイルス注射：単一の薬剤について：１日目、その後１週間に１回で１×１０ｅ９ウイルス粒子（ＯＤ２６０）；組合せについて：１日目、その後１週間に１回で０．５×１０ｅ９ＶＰ＋０．５×１０ｅ９ＶＰ
エンドポイント：腫瘍体積（最初の週の間２日ごと、次いで３日ごとに測定した）
さらに本発明を支持する実験
いくつかの動物実験は本発明を支持する。最初に本発明者らは、サイトカインの組換えマウス型を使用して養子Ｔ細胞移入と組み合わせるための最適なサイトカイン候補をスクリーニングした（図４９）。サイトカインは以下の群：インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２から選択される。サイトカイン導入遺伝子または２つの導入遺伝子を含むウイルスゲノムの一般的設計の概略図は図３３および３４に示される。図３５は２Ａのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。導入遺伝子Ｃ５ａ、ｈＣＤ４０Ｌ、ｈＩＦＮａ２、ｈＩＦＮｂ１、ｈＩＦＮｇ１、ｈＩＬ２またはＴＮＦａを含むウイルスベクターのヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１〜７に示される（Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４−導入遺伝子）。さらに、一方がＩＬ−２であり、他方がＣ５ａ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦ−Ｎａ２、ＩＦＮｂ、ＩＦＮｇ、ＧＭＣＳＦまたはＴＮＦａである、２つの導入遺伝子を含むウイルスベクターのヌクレオチド配列は配列番号８〜２１（配列番号８  Ｃ５ａ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号９  ＩＦＮａ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１０  ＴＮＦａ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１１  ＣＤ４０Ｌ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１２  ＩＦＮｂ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１３  ＧＭＣＳＦ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１４  ＩＦＮｇ−２Ａ−ＩＬ２、配列番号１５  Ｃ５ａ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１６  ＩＦＮａ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１７  ＴＮＦａ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１８  ＣＤ４０Ｌ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号１９  ＩＦＮｂ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号２０  ＧＭＣＳＦ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２、配列番号２１  ＩＦＮｇ−ＩＲＥＳ−ＩＬ２）（Ａｄ５／３−Ｅ２Ｆ−Ｄ２４−導入遺伝子−ＩＲＥＳ／２Ａ−導入遺伝子）に示される。
【０１００】
最適な候補のいくつかをサイトカイン／ウイルス組合せ実験のために選択し、それらのレジメンはおおよそ同じであり、全てのマウスはＣＤ８ａ＋濃縮ＯＴ−Ｉリンパ球の腹腔内注射およびアデノウイルスと混合した、選択したサイトカインの腫瘍内処置を受けた。加えて、マウスにおいて活性が証明されているマウスサイトカインまたはヒトサイトカインのいずれかをコードする本発明者らの既存の複製欠損アデノウイルスを使用して、別の輸送実験を行った（図５０）。ＲＤは複製欠損ウイルスを示す。これらの実験に基づいて、最終的なサイトカイン候補または複数の候補が選択され得、さらに臨床においても分析され得る。
【０１０１】
実験の結果は、ａ）腫瘍内のウイルス注射の結果、腫瘍へのＴ細胞の輸送が増強され、ｂ）ウイルス注射の結果、腫瘍内のＭＨＣ１発現が増強され、ｃ）低い寛容性および免疫抑制を生じる危険信号が活性化され、ｄ）ウイルス注射後、Ｔ細胞が腫瘍において増殖することを示す。重要なことに、導入遺伝子としてサイトカインを加えることにより、これらの効果の各々が増強された。注目すべきことに、二重導入遺伝子は効果をさらに増強させた。それ故、サイトカイン武装腫瘍退縮性アデノウイルスの腫瘍内注射は、ウイルスベクターまたは養子細胞移入単独のいずれかで達成され得るものよりも、相乗的に養子細胞移入の効果を増強させた。
【０１０２】
養子移入後のＴ細胞輸送および生体内分布を調べるために、ＳＰＥＣＴ／ＣＴ画像化実験を行った（図５１）。ＣＤ８ａ＋濃縮ＯＴ−Ｉリンパ球を１１１Ｉｎで放射線標識し、レシピエントマウス内に養子移入した。
【０１０３】
インジウムオキシンの半減期は比較的短い（２，８３日）ので、画像化の最大監視期間を７日に制限した。この制限のために、細胞を２つのバッチにおいて標識し、２つの異なる時点でマウスに移入した。第１のバッチからの画像化データが０〜７日の輸送事象に及ぶのに対して、第２のバッチは、本発明者らがウイルス後８〜１４日の間、腫瘍内の事象を観察することを可能にする。
腫瘍退縮性Ａｄ３ウイルス（図３７〜４０、配列番号３０および３１（Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬおよびＡｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ３ｄｅｌ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌ））
クローニング手順：
１．対応する発現カセットを含有するＡｄ３  ３’末端プラスミドの構築、このプラスミドはＡｄ３ゲノムの３’ＩＴＲを含有し、Ａｄ３ゲノムの２９，８９２〜３０，９４７のＥ３領域を発現カセットと置きかえた。（注記：本発明者らは、３’末端に近接するＡｄ３ゲノムにおけるＥｃｏＲＩ制限部位を利用する）
２．Ａｄ３  ５’末端プラスミドの構築、このプラスミドは５’ＩＴＲおよびｈＴＥＲＴ−Ｅ１を含有する。（注記：本発明者らは、Ａｄ３ゲノムにおける特有の制限部位ＮｏｔＩおよび５’末端に近接するＮｈｅＩ制限部位を利用する）
３．ｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬおよびｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌの構築（注記：本発明者らは、ファージパッキングシステムを利用する）
対応する発現カセットを含有するＡｄ３  ３’末端プラスミドの構築：
１．ＰＣＲによりＥ２Ｆプロモーターを増幅する、フォワードプライマー：５’ＡＡＡｔｔａａｔｔａａｔｇｇｔａｃｃａｔｃｃｇｇａｃａａａｇｃ３’（配列番号２２）、リバースプライマー５’ＴＴＴｇｃｔａｇｃｇｇｃｇａｇｇｇｃｔｃｇａｔｃｃ３’（配列番号２３）。ＴＡベクターｐＧＥＭ−Ｔ（ｐｒｏｍｅｇａ）→ｐＧｅｍＴ−Ｅ２Ｆ内にクローニングした。
【０１０４】
２．ＰＣＲによりＣＤ４０Ｌフラグメントを増幅する、フォワードプライマー：５’ＴＡＧＣＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣ３’（配列番号２６）、リバースプライマー：５’ＧＴＣＡＡＴＴＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＴＴＧＡＧＴＡＡＧＣＣＡＡ３’（配列番号２７）。ｐＧＥＭ−Ｔ→ｐＧｅｍＴ−ＣＤ４０Ｌ内にクローニングした。
【０１０５】
３．ＣＭＶ−ＧＦＰ（ｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−ＣＭＶＧＦＰ）を含有する本発明者らのＡｄ３  ３’末端プラスミドはＧＦＰを除去するためにＮｈｅＩ／ＡｐａＩを用いて消化され、ｐＧｅｍＴ−ＣＤ４０ＬはＮｈｅＩ／ＡｐａＩを用いて消化された→ｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−ＣＭＶ−ＣＤ４０Ｌ。
【０１０６】
４．ｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬにおけるＣＭＶプロモーターを、Ｅ２Ｆプロモーター（ｐＧｅｍＴ−Ｅ２ＦはＰａｃＩ／ＮｈｅＩを用いて消化した）→ｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌと置きかえた。
【０１０７】
ｈＴＥＲＴ−Ｅ１を含有するＡｄ３  ５’末端プラスミドの構築物：
１．ＰＣＲにより、ｐＫＢＳ２−ｈＴＥＲＴ（Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ１Ａペーパー由来のプラスミド）由来のＡｄ３ゲノムの５’末端を増幅する、フォワードプライマー５’ｇｔｃａｇｔｔｔａａａｃｔｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｃｔａｔｃｔａｔａｔａａｔａｔａｃｃｔｔａｔａｇａｔｇｇａａｔｇｇ３’（配列番号２８）、リバースプライマー５’ＣＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＣＡＧＣＡＴＡＧＡＡＴＣＡＧ３’（配列番号２９）。ｐＧｅｍ−Ｔ→ｐＧｅｍＴ−Ａｄ３−５’末端−ｈＴＥＲＴ内にクローニングした。
【０１０８】
２．プラスミドｐＷＥＡ−Ａｄ３（これは全ａｄ３ゲノムを含有する）はＦｓｅＩ／ＮｏｔＩを用いて消化し、Ａｄ３ゲノムの５’末端を含有する１３．２ｋｂ断片を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ（−）から改変した（ＳａｃＩとＸｂａＩとの間の制限部位はＳａｃＩ−ＰｍｅＩ−ＭｌｕＩ−ＦｓｅＩ−ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ−ＸｂａＩとして改変した）ベクター→ｐＢＳ−Ａｄ３−５’末端内にクローニングした。
【０１０９】
３．プラスミドｐＢＳ−Ａｄ３−５’末端はＰｍｅＩ／ＮｈｅＩを用いて消化し、５’ＩＴＲを含有する約８００ｂｐ断片を、ｐＧｅｍＴ−Ａｄ３−５’末端−ｈＴＥＲＴ→ｐＢＳ−Ａｄ３−５’末端−ｈＴＥＲＴ由来の対応するＰｍｅＩ／ＮｈｅＩ断片と置きかえた。
【０１１０】
ｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬおよびｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌ：
１．プラスミドｐＷＥＡ−Ａｄ３−ｈＴＥＲＴ−Ｅ２Ｆ−は３’末端ゲノムを除去するためにＥｃｏＲＩを用いて消化し、ｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−ＣＭＶ−、ｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−ＣＭＶ−ＣＤ４０ＬおよびｐＷＥＡ−Ａｄ３−３’末端−Ｅ２Ｆ−ＣＤ４０Ｌ由来の発現カセットを含有する対応する断片とライゲーションする。
【０１１１】
２．ライゲーションは、Ｇｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩプラスパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）を使用してファージ内にパッケージングし、増殖させた（Ｘｌ１青色染色）
Ａｄ３ウイルスの機能性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、その結果を図４１に示す。全ての新規ウイルスは機能的であり、腫瘍細胞株に感染できる。
【０１１２】
ウイルスをまたＣＨＯ−Ｋ７で試験したが、それらはＴＣＩＤ50の間、それらの細胞の生存に対して効果を示さなかった。これは恐らく、これらのハムスター細胞の表面上のヒト様デスモグレイン−２の欠失に起因した。
ＡＤ３ベクターのｉｎ  ｖｉｖｏでの結果
全ての動物実験は、ヘルシンキ大学および南フィンランド州政府の動物実験委員会により承認された。マウスをそれらの健康状態について頻繁にモニターし、疼痛または苦痛の兆候に気付くとすぐに安楽死させた。メスのｆｏｘ  ｃｈａｓｅ重症複合免疫不全マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を使用した。
【０１１３】
腹膜に広がった卵巣癌の同所性モデルを、３００ｍｌの純粋なダルベッコ改変イーグル培地中の５×１０ｅ６  ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞を、重症複合免疫不全マウス（ｎ＝５／群）の腹腔内に注射することによって開発した。３日後、マウスを非侵襲的に画像化し、一匹のマウスにつきＰＢＳまたはＰＢＳ中の１０９ＶＰを腹腔内に注射することによって処置した。ＩＶＩＳ１００（Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）を使用して３、７、１４、２１および２５日目にマウスを画像化して、マウスにおける腫瘍細胞の数を推定した。生物発光画像化のために、１５０ｍｇ／ｋｇのＤ−ルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を腹腔内に注射し、１０秒の曝露時間、１ｆ／停止、中間ビニングおよびオープンフィルターで１０分後にキャプチャーした。画像化の間、マウスをイソフルランガスで麻酔した。Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ２．５０（Ｘｅｎｏｇｅｎ）を用いて画像を重ね合わせた。マウスの腹膜領域周囲の目的の領域を描くことによって全光束（光子／ｓ）を測定した。バックグラウンドは減算した。
【０１１４】
図４５はｉｎ  ｖｉｖｏでのウイルスに基づいたＡｄ３の抗腫瘍効果を示す。
ＭＴＳ細胞増殖アッセイ（図４２〜４４）
１日目に、１０５細胞／ウェル（Ａ５４９、ＰＣ３−ＭＭ２またはＳＫＯＶ３−ｌｕｃ）を、５％のＦＢＳを含有した１００μｌの成長培地（ＧＭ）入りの９６ウェルプレート内に播種した。２日目に、５％のＦＢＳを含有するＧＭを用いて単層を１回洗浄した。次いで細胞を、１００、１０、１、０．１および０ウイルス粒子／細胞の用量にて異なるウイルスに感染させた。その後、細胞を振盪機械上で１時間インキュベートし、次いでＧＭで洗浄した。新たに５％ＧＭを加えた後、細胞をインキュベータに残し、ＧＭを４日ごとに置きかえた。試験したウイルスの１つの細胞変性効果が最高濃度で１００％に到達した後、ｍｔｓ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えることによって試験を終了した。インキュベーションの２時間後、吸光度を４９０ｎｍフィルターにて測定した。次いでバックグラウンドを減算し、結果を分析した。
免疫応答性マウスにおいてマウスＣＤ４０Ｌをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスの治療域
免疫応答性動物において、ウイルスゲノムは、静脈注射後、腫瘍内に存在する（図４６）。アルビノＣ５７マウスにマウスＢ１６−ｏｖａ細胞を皮下接種し、マウスＣＤ４０Ｌをコードする５つの異なるウイルス用量のＡｄ５に基づいたウイルスを用いて静脈内で処置した（実験４および１５を参照のこと）。１群当たり３匹の動物の腫瘍を採取し、−８０℃にて保存した。全ＤＮＡを抽出し、ウイルスＤＮＡ負荷を定量的ＰＣＲを用いて調べた。ウイルスＥ４コピー数を、マウスＢ−アクチンプライマーを用いてゲノムＤＮＡに正規化した。図４６において、各記号は１つの腫瘍を表し、水平線は群の中央値を示す。偽：ｎ＝５；用量５：ｎ＝４；用量４：ｎ＝４；用量３：ｎ＝４；用量２：ｎ＝６；用量１：ｎ＝２；用量２  ｉ．ｔ．：ｎ＝４。用量５：１×１０11ＶＰ／マウス；用量４：３×１０10ＶＰ／マウス；用量３：１×１０10ＶＰ／マウス；用量２：１×１０9ＶＰ／マウス；用量１：１×１０8ＶＰ／マウス；陽性対照（用量２腫瘍内。）
用量５に関して、マウスの６７％は肝臓毒性の兆候を有した。用量４は、静脈送達後、肝臓毒性の兆候なしに良好な腫瘍形質導入を達成できた。
【０１１５】
肝臓酵素放出実験の結果を図４７に示す。肝臓酵素放出実験は以下のように実施した。全ての動物プロトコールは、ヘルシンキ大学および南フィンランド州政府の動物実験委員会により調査され、承認された。３〜４週齢のメスアルビノＣ５７マウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、オランダ）に２．５×１０5Ｂ１６−ｏｖａ細胞を両脇腹の皮下に注射し、７群（３匹のマウス／群）に無作為化した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に希釈したＡｄ５／３ＣＭＶ−ｍＣＤ４０Ｌウイルスを１０8〜１０11ウイルス粒子（ＶＰ）／マウス（用量１〜用量５）にて静脈内に注射した。１つの処置群は用量２（１０9ＶＰ／細胞）を陽性対照として腫瘍内に受けた。全ての手段の前に動物に麻酔をし、健康状態を毎日モニターした。ウイルス注射の４８時間後、マウスを屠殺し、心穿刺によって血液を採取した。５０００ｒｐｍにて１０分間、血液試料を遠心分離することによって血清を分離した。血清試料中のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル（単位／リットル）を、Ｓｉｍｅｎｓ  ＡＤＶＩＡ  １６５０臨床化学分析器を使用してＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃｏｒｅにて定量化した。血清溶血はアッセイを妨げる可能性があるので（誤った高いＡＬＴおよびＡＳＴレベル）、溶血試料を分析から排除した。バーは平均＋ＳＥＭを示す。
以下に、本願の出願当初の請求項を実施の態様として付記する。
［１］  対象における癌を治療する方法であって、養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターの対象への個別投与を含む、方法。
［２］  癌の治療に使用するための別個の養子細胞治療組成物と併用される少なくとも１種のサイトカインをコードする、腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［３］  前記養子細胞治療組成物が、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、Ｔ細胞受容体改変リンパ球およびキメラ抗原受容体改変リンパ球からなる群から選択される細胞型を含む、［１］〜［２］の何れか１項に記載の方法または使用。
［４］  前記養子細胞治療組成物が、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、デルタ−ガンマＴ細胞、調節性Ｔ細胞および末梢血単核細胞からなる群から選択される細胞型を含む、［１］〜［３］の何れか１項に記載の方法または使用。
［５］  前記養子細胞治療組成物がＴ細胞を含む、［１］〜［４］の何れか１項に記載の方法または使用。
［６］  前記癌が、上咽頭癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽喉癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛腫瘍、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞白血病／リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、乏突起膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、消化管カルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、絨毛癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉症、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉癌、心臓癌、口唇癌、髄膜癌、口腔癌、神経癌、口蓋癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃腺癌からなる群から選択される、［１］〜［５］の何れか１項に記載の方法または使用。
［７］  前記対象がヒトまたは動物である、［１］〜［６］の何れか１項に記載の方法または使用。
［８］  養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの対象への投与を、同時にまたは任意の順序で連続して行う、［１］〜［７］の何れか１項に記載の方法または使用。
［９］  養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの連続投与の間隔が、１分から４週間の期間である、ならびに／または養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性ウイルスベクターを複数回投与する、［８］に記載の方法または使用。
［１０］  前記養子細胞治療組成物および／または少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性ウイルスベクターの投与を、腫瘍内、動脈内、静脈内、胸膜内、膀胱内、腔内もしくは腹膜注射、または経口投与により行う、［１］〜［９］の何れか１項に記載の方法または使用。
［１１］  前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ５、Ａｄ３またはＡｄ５／３から選択される、［１］〜［１０］の何れか１項に記載の方法または使用。
［１２］  前記アデノウイルスベクターが、Ａｄ５核酸骨格およびＡｄ３繊維ノブまたはＡｄ５／３キメラ繊維ノブを含むＡｄ５／３である、［１１］に記載の方法または使用。
［１３］  前記サイトカインが、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５（＝ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなる群から選択される、［１］〜［１２］の何れか１項に記載の方法または使用。
［１４］  前記腫瘍退縮性ウイルスベクターが、２種以上のサイトカインをコードする、［１］〜［１３］の何れか１項に記載の方法または使用。
［１５］  前記腫瘍退縮性ウイルスベクターが、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５（＝ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるサイトカイン群から選択される任意の２種以上のサイトカインをコードする、または前記腫瘍退縮性ウイルスベクターが、ＩＬ−２、およびインターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＧＭＣＳＦ、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなるサイトカイン群から選択される１種のサイトカインまたは複数種のサイトカインをコードする、［１３］に記載の方法または使用。
［１６］  前記アデノウイルスベクターが、２つの導入遺伝子の間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または任意にリボソームシャント部位２Ａを含む、［１４］または［１５］に記載の方法または使用。
［１７］  少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを、１×１０10〜１×１０14ウイルス粒子の量で投与する、［１］〜［１６］の何れか１項に記載の方法または使用。
［１８］  前記養子細胞治療組成物および腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを、同時にまたは任意の順序で連続して対象に投与する、［１］〜［１７］の何れか１項に記載の方法または使用。
［１９］  対象における養子細胞療法またはＴ細胞療法の効果を増加させる際に使用するための腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２０］  腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを、それを必要とする対象に投与することによって、対象における養子細胞療法またはＴ細胞療法の効果を増加させる方法。
［２１］  養子細胞治療組成物および少なくとも１種のサイトカインをコードする腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを含む医薬キットであって、前記養子細胞治療組成物が第１の製剤に製剤化され、少なくとも１種のサイトカインをコードする前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが第２の製剤に製剤化される、医薬キット。
［２２］  前記第１および第２の製剤が同時にまたは任意の順序で連続して対象に投与されるためのものである、［２１］に記載の医薬キット。
［２３］  １）５／３キメラ繊維ノブを含むアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸骨格、
２）Ｅ１Ａの腫瘍特異的発現のためのＥ２Ｆ１プロモーター、
３）アデノウイルスＥ１のＲｂ結合定常領域２における２４ｂｐ欠失（Ｄ２４）、
４）ウイルスｇｐ１９ｋおよび６．７ｋリーディングフレームの核酸配列欠失、ならびに
５）ウイルスＥ３プロモーター下で導入遺伝子発現の複製に関連する制御を生じる、Ｅ３領域において欠失したｇｐ１９ｋ／６．７Ｋの代わりの少なくとも１種のサイトカイン導入遺伝子をコードする核酸配列であり、前記サイトカインが、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、相補体Ｃ５ａ、ＩＬ−２、ＴＮＦアルファ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ１２、ＩＬ−２３、ＩＬ１５、ＩＬ１７、ＣＣＬ１、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４−１、ＣＣＬ１４−２、ＣＣＬ１４−３、ＣＣＬ１５−１、ＣＣＬ１５−２、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３−１、ＣＣＬ２３−２、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５−１、ＣＣＬ２５−２、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ３Ｌ１、ＣＣＬ４、ＣＣＬ４Ｌ１、ＣＣＬ５（＝ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ２、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲＬ１、ＣＣＲＬ２、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＸ３ＣＲ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１５、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸＣＲ７およびＸＣＬ２からなる群から選択される、核酸配列
を含む、腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２４］  Ｅ３領域における欠失およびＥ３の欠失領域の代わりに導入遺伝子を発現するための腫瘍特異的プロモーターを含む、血清型３（Ａｄ３）腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２５］  前記サイトカインが［１３］に記載のサイトカイン群から選択される、［２４］に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２６］  前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが２種以上のサイトカインをコードする、［２３］〜［２５］の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２７］  前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、［１５］に記載の第１のサイトカイン群から選択される任意の２種以上のサイトカインをコードする、または前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、ＩＬ−２と［１５］に記載の第２のサイトカイン群から選択される１種のサイトカインまたは複数種のサイトカインとをコードする、［２６］に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２８］  前記腫瘍退縮性アデノウイルスベクターが、２つの導入遺伝子の間に内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）または任意にリボソームシャント部位２Ａを含む、［２６］または［２７］に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［２９］  ［２３］〜［２８］の何れか１項に記載の腫瘍退縮性ベクターを含む、医薬組成物。
［３０］  対象における癌を治療する方法であって、［２３］〜［２８］の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクターを、それを必要とする対象へ投与することを含む、方法。
［３１］  癌の治療に使用するための［２３］〜［２８］の何れか１項に記載の腫瘍退縮性アデノウイルスベクター。
［３２］  前記方法または使用が、同時もしくは連続する放射線療法、モノクローナル抗体、化学療法または他の抗癌薬もしくは介入の対象への適用をさらに含む、［１］〜［１７］、［２０］または［３０］〜［３１］の何れか１項に記載の方法または使用。
【０１１６】
参考文献
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ウイルス構築物についての参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【配列表】
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