(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーを含有する間葉系幹細胞の未分化性維持培養材料。
【請求項２】
３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気の培養条件下での使用において、１日間乃至３０日間培養後の間葉系幹細胞の未分化性及び多分化能を、該幹細胞の採取直後のそれと同等の活性度で保つことができる、請求項１に記載の未分化性維持培養材料。
【請求項３】
前記培養条件下で間葉系幹細胞の培養を為したとき、酵素処理により間葉系幹細胞の回収が可能である、請求項２に記載の未分化性維持培養材料。
【請求項４】
前記セルロースナノファイバーが、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均繊維径（Ｄ）を有するナノファイバーの形態にある、請求項１乃至請求項３のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料。
【請求項５】
前記セルロースナノファイバーが、０．０１μｍ乃至１０μｍの平均粒子径（ｄ）を有するナノファイバーの形態にある、請求項１乃至請求項４のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料。
【請求項６】
前記セルロースナノファイバーが、平均繊維径（Ｄ）に対する平均繊維長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が２乃至５００であるナノファイバーの形態にある、請求項４に記載の未分化性維持培養材料。
【請求項７】
請求項１乃至請求項６のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料が液中に溶解又は分散されてなる、培養液。
【請求項８】
前記未分化性維持培養材料が、前記培養液の全体積量に対して０．０００１％（ｗ／ｖ）乃至２％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解又は分散されてなる、請求項７に記載の培養液。
【請求項９】
間葉系幹細胞が請求項７又は請求項８に記載の培養液の液中を漂ってなる、間葉系幹細胞含有培養液。
【請求項１０】
前記未分化性維持培養材料が、単位体積（１ｍＬ）当たり１．０×１０３〜１．０×１０６の間葉系幹細胞を含む前記培養液の全体積量に対して０．０００１％（ｗ／ｖ）乃至２％（ｗ／ｖ）の濃度で培養液中を漂ってなる、請求項９に記載の間葉系幹細胞含有培養液。
【請求項１１】
結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの存在下、間葉系幹細胞を生体外で培養することにより、１日間乃至３０日間培養後の該間葉系幹細胞の未分化性及び多分化能を該幹細胞の採取直後と同等の活性度で保つことを特徴とする、間葉系幹細胞の培養方法。
【請求項１２】
前記セルロースナノファイバーが、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均繊維径（Ｄ）を有するナノファイバーの形態にある、請求項１１に記載の培養方法。
【請求項１３】
前記セルロースナノファイバーが、０．０１μｍ乃至１０μｍの平均粒子径（ｄ）を有するナノファイバーの形態にある、請求項１１又は請求項１２に記載の培養方法。
【請求項１４】
前記セルロースナノファイバーが、平均繊維径（Ｄ）に対する平均繊維長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が２乃至５００であるナノファイバーの形態にある、請求項１２に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、体性幹細胞の未分化性を維持しつつ該細胞を培養する材料に関し、詳細には、間葉系幹細胞などの体性幹細胞を生体外で、例えば治療に必要とされる一定期間、その分化を抑制し、体性幹細胞の増殖・分化活動を停止させた状態（休眠状態）に保つことができる、天然物由来の多糖類を含有する培養材料に関する。
【背景技術】
【０００２】  間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨芽細胞、脂肪細胞、筋細胞、軟骨細胞、神経細胞や肝細胞など、間葉系に属する細胞への分化能をもつとされる体性幹細胞（生体幹細胞、組織幹細胞とも称する）の一種であり、組織の再構築や修復をする再生医療への応用、例えば、炎症・免疫抑制や組織修復、血管新生による血流の改善、抗老化（アンチエイジング）等の治療の他、従来治療法がなかった疾患への応用が期待されている。  分化多能性の間葉系幹細胞は、患者自身の骨髄、脂肪組織、滑膜、歯槽骨、歯根膜等の組織からだけでなく、胎盤、臍帯血、臍帯の種々の細胞等から単離することができることから、間葉系幹細胞の利用は生命倫理上のハードルが低い。また間葉系幹細胞は、ＥＳ細胞やｉＰＳ細胞に比べ癌化リスクが低いとされ、早期の臨床応用が期待される。  間葉系幹細胞を細胞組織医薬品や細胞組織医療機器として臨床用途に利用するとき、例えば自家移植を想定すると、患者の体内より細胞を取り出し、生体外で培養して増殖させ、患者へ自家移植するという工程を経ることになる。このとき、培養期間やその後の保管期間中に、目的以外の形質を持った細胞に変化することなく、患者に戻される細胞の有効性及び安全性を確保することが重要となる。しかしながら、間葉系幹細胞は分化や細胞老化を起こし易いため、その品質コントロールが難しいことが挙げられ、細胞の品質管理に大きな課題が残されている。【０００３】  間葉系幹細胞を生体外で培養するにあたり、その増幅促進に関して、様々な増幅ペプチドが研究されている（特許文献１及び特許文献２）。また、特定の増殖因子群と脂肪酸複合物とを基礎培地に添加することにより、無血清条件下であっても血清培地の場合と同等以上の細胞増殖を導くことが報告されている（特許文献３）。一方、間葉系幹細胞の分裂回数には限度があり、分裂回数に依存して細胞の老化が進むことが知られている。間葉系幹細胞の有効性、すなわち臨床応用における品質が、どの程度の分裂増殖を経た細胞まで保証されるかについては、現在も確立された知見は得られていない。【０００４】  そこで、患者から採取した間葉系幹細胞はまずはその品質を劣化させることなく、治療に用いるまでの期間にわたって、高品質に保存することが強く求められる。間葉系幹細胞に限らず、細胞の保存方法として、一般に液体窒素温度にて凍結保存する方法が用いられている。凍結及び解凍は細胞の活性及び機能損失を伴うため、凍結及び解凍プロセス中に細胞を保護する目的でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の化学薬品を凍結媒体に添加する。ＤＭＳＯは高い膜透過性を有しており、細胞が凍結される過程において氷晶の形成を低下させ、膜損傷や細胞小器官の脱水などを最小化している（特許文献４）。【０００５】  間葉系幹細胞の凍結法以外の保存のためのアプローチとしては、凍結をせずに通常の培養をしつつ保存する方法も考えられる。しかし、ここで問題となるのは、培養環境により生じうる間葉系幹細胞の性質・形質の変化である。  一般に、生体内において細胞の周囲環境を構成する細胞外マトリクスは、結合組織細胞の分化状態に化学的及び物理的に影響を与えることが知られており、間葉系幹細胞の分化の系統決定にも影響すること���報告されている。  例えば弾性をｉｎ  ｖｉｖｏの生物環境に類似するようにコントロールされたハイドロゲル上において間葉系幹細胞を培養することによる、神経性、筋原性、骨原性の細胞への分化誘導が研究されている（非特許文献１）。この知見は、間葉系幹細胞を１ｋＰａ以上の弾性率を持つハイドロゲル基材上で培養するだけで、培養環境の弾性特性等に依存した系統へと分化し、すなわち未分化状態が崩れ、品質が劣化することを意味する。  これに対して、間葉系幹細胞を、２５０Ｐａの弾性を有するＩ型コラーゲン及びフィブロネクチンによりコーティングされたアクリルアミドゲル上で培養することにより、幹細胞の細胞周期を静止状態へと誘導又は維持し、生物活性を持続させる方法が提案されている（非特許文献２、特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００８／０２６６３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１１／０４０５００号パンフレット
【特許文献３】特許第４３８５０７６号明細書
【特許文献４】特表２０１２−５１７８２３号公報
【特許文献５】特表２０１０−５３２１６７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  １２６、６７７、２００６
【非特許文献２】Ｔｉｓｓｕ  Ｅｎｇ  ＰａｒｔＡ  １５，１４７，２００９、
【非特許文献３】ＲＥＧＥＮＥＲＡＴＩＶＥ  ＭＥＤＩＣＩＮＥ  ＡＮＤ  ＴＩＳＳＵＥ  ＥＮＧＩＮＥＥＲＩＮＧ  −  ＣＥＬＬＳ  ＡＮＤ  ＢＩＯＭＡＴＥＲＩＡＬＳ、Ｄａｎｉｅｌ  Ｅｂｅｒｌｉ、２０１１  ＩｎＴｅｃｈ
【非特許文献４】Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３２２  （３），  ７５９〜７６５  （２００４）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】  前述の凍結媒体にＤＭＳＯ等の化学薬品を用いた凍結保存法は、融解過程において、細胞に対して著しいダメージを与えることや（非特許文献３）、間葉系幹細胞の分化に影響を与える可能性（非特許文献４）が報告されている。  また、前述の細胞外マトリクスとしてハイドロゲルを使用した分化誘導にあっては、検討がなされている培養基材の弾性が高い数値範囲にあることから、細胞が静止状態となることや細胞の保存性能について見出されていない。  さらに培養基材として提案されているアクリルアミドゲルを構成するアクリルアミドモノマーについては、神経毒性や肝毒性があることが指摘されている。一般に、生体適合性を示す水溶性ポリマーやヒドロゲルを構成する重合性モノマーは細胞毒性を示すことが多く、これらモノマーから得られる高分子ゲルから未反応モノマーを完全に除去することは事実上困難といえ、こうした高分子ゲルを生体安全性が求められる細胞培養基材等として採用するには課題が残る。【０００９】  このように、これまでにも間葉系幹細胞の多能性を維持したまま保存時の生存率改善を図るための様々な提案がなされているが、ＤＭＳＯなどの化学薬品を用いた凍結保存方法に代えて、所望の細胞の保存性を満足し、しかも細胞毒性のおそれのない、間葉系幹細胞の保存方法の提案は未だなされていない。【００１０】  本発明は、斯かる従来技術の状況に鑑みてなされたものであり、体性幹細胞の分化機能へ影響を与えるようなＤＭＳＯなどの化学薬品を用いることなく、従来実施されてきた凍結保存方法に代わる、分化機能や細胞機能の劣化や生存率への影響が極めて低い体性幹細胞の培養方法（保存方法）を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  本発明者らは上記の課題を解決する為に鋭意検討を重ねた結果、体性幹細胞を培養する培養液の中に増粘又はゲル化剤としての機能をもつ天然物由来の多糖類、例えば増粘性多糖類やナノファイバー状多糖類を溶解又は分散させたところ、当該多糖類が幹細胞の分化にかかる系統決定に関してほぼ不活性な休眠状態での幹細胞の培養を可能とする足場材料となることを見出した。即ち、間葉系幹細胞を天然物由来の多糖類が溶解又は分散されてなる細胞培養液の中に液中を漂うように溶解又は分散させることにより、培養液を凍結させることなく、培養条件下で間葉系幹細胞の分化を抑制し、そして望みの一定期間、初期状態を維持し保存する（休眠状態として培養する）ことができることを見出した。ここで初期状態とは、間葉系幹細胞がいずれの分化系統への未だ分化を開始していない、未分化の状態を指す。しかも、上記増粘性多糖類やナノファイバーの形態にある多糖類といった天然物由来の多糖類を用いることにより、プロテアーゼ等を用いる一般的な細胞回収方法により、培養液からの間葉系幹細胞の回収が可能であり、間葉系幹細胞の再利用が可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】  すなわち本発明は、天然物由来の多糖類を用いた細胞培養法に属し、特にこの培養系が間葉系幹細胞の未分化性維持培養を可能とするものであることの独自の発見に基づく。このような培養を可能とする当該多糖類の構造並びにその溶解液又は分散液の最適条件を見出すことで本発明が完成したものである。  本発明における間葉系幹細胞の未分化性維持培養の原理は、間葉系幹細胞の細胞周期を静止期に止め休眠状態での培養を実現することにより、細胞分裂及び増殖に伴う細胞寿命の短縮並びに老化の進行を抑制するだけでなく、望まぬ表現型への分化に伴う細胞変化の可能性を排除することにある。このような培養状態は、間葉系幹細胞が生体において、幹細胞ニッシェと呼ばれる天然の細胞外環境に置かれているときの生存状況に近いものであり、本発明に従う培養法は、生体模倣的手段により課題を解決するものである。  さらに本発明は、休眠培養による間葉系幹細胞の品質劣化の回避、休眠状態を解除して用いる際の回収方法の確立、及び回収された間葉系幹細胞の品質保持の確認を含む。高品質な間葉系幹細胞を保存し活用するために必須となる品質保持及び回収のために、天然物由来の多糖類を用いることで、これらの課題を解決する。【００１３】  具体的には、本発明は、第１観点として、天然物由来の多糖類を含有する体性幹細胞の未分化性維持培養材料に関する。  第２観点として、前記多糖類がナノファイバー形状の多糖類である、第１観点に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第３観点として、前記多糖類が増粘性多糖類である、第１観点に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第４観点として、前記増粘性多糖類がメチルセルロース又はダイユータンガムである、第３観点に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第５観点として、前記体性幹細胞が間葉系幹細胞である、第１観点乃至第４観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第６観点として、３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気の培養条件下での使用において、１日���乃至３０日間培養後の体性幹細胞の未分化性及び多分化能を、該幹細胞の採取直後のそれと同等の活性度で保つことができる、第１観点乃至第５観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第７観点として、前記培養条件下で体性幹細胞の培養を為したとき、酵素処理により体性幹細胞の回収が可能である、第１観点乃至第６観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第８観点として、前記多糖類が、１ｎｍ乃至１００ｎｍの平均繊維径（Ｄ）を有するナノファイバーの形態にある、第２観点及び第５観点乃至第７観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第９観点として、前記多糖類が、０．０１μｍ乃至１０μｍの平均粒子径（ｄ）を有するナノファイバーの形態にある、第２観点及び第５観点乃至第８観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第１０観点として、前記多糖類が、平均繊維径（Ｄ）に対する平均繊維長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が２乃至５００であるナノファイバーの形態にある、第８観点に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第１１観点として、前記未分化性維持培養材料が、セルロース由来の天然物ナノファイバーである、第２観点及び第５観点乃至第１０観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料に関する。  第１２観点として、第１観点乃至第１１観点のうち何れか一項に記載の未分化性維持培養材料が液中に溶解又は分散されてなる、培養液に関する。  第１３観点として、前記未分化性維持培養材料が、前記培養液の全体積量に対して０．０００１％（ｗ／ｖ）乃至２％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解又は分散されてなる、第１２観点に記載の培養液に関する。  第１４観点として、体性幹細胞が第１２観点又は第１３観点に記載の培養液の液中を漂ってなる、体性幹細胞含有培養液に関する。  第１５観点として、前記未分化性維持培養材料が、単位体積（１ｍＬ）当たり１．０×１０３〜１．０×１０６の幹細胞を含む前記体性幹細胞含有培養液の全体積量に対して０．０００１％（ｗ／ｖ）乃至２％（ｗ／ｖ）の濃度で培養液中を漂ってなる、第１４観点に記載の体性幹細胞含有培養液に関する。  第１６観点として、更に血清を含む、第１４観点又は第１５観点に記載の体性幹細胞含有培養液に関する。  第１７観点として、前記血清が、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清及びニワトリ血清からなる群から選択される、第１６観点に記載の体性幹細胞含有培養液に関する。  第１８観点として、前記血清が、前記体性幹細胞含有培養液の全体積に対して０．１体積％乃至５０体積％の濃度で含まれる、第１６観点又は第１７観点に記載の体性幹細胞含有培養液に関する。  第１９観点として、更に細胞機能調節因子を含む、第１４観点乃至第１８観点のうち何れか一項に記載の体性幹細胞含有培養液に関する。  第２０観点として、天然物由来の多糖類の存在下、間葉系幹細胞を生体外で培養することにより、１日間乃至３０日間培養後の該間葉系幹細胞の未分化性及び多分化能を該幹細胞の採取直後と同等の活性度で保つことを特徴とする、間葉系幹細胞の培養方法に関する。
【発明の効果】
【００１４】  本発明の未分化性維持培養材料によれば、再生医療において特に有用性の高い間葉系幹細胞を、化学薬品やタンパク、調製因子等の培地への添加や、増殖因子の除去を必要とせず、未分化の状態を維持（休眠状態）したまま長期間にわたって保存することを可能にする。  また本発明の未分化性維持培養材料を使用することにより、生体から採取し、選別し、そして純化した間葉系幹細胞を、実際の治療に用いる時点まで高品質にて保つことが可能となる。ここで“高品質にて保つ”とは、幹細胞を定義する上での性質となる未分化性及び多分化能を維持すること指す。また本発明の間葉系幹細胞の培養方法によれば、一定期間の間葉系幹細胞の保存培養後には、特殊な操作を必要とせず、細胞培養の技術分野において一般的に用いられている方法、例えばトリプシンなどのプロテアーゼを作用させる方法により、高い細胞回収率を達成することができる。  このように、本発明の未分化性維持培養材料は、間葉系幹細胞の高品質にての保存培養と、利用に際しての回収及び調製の容易さという二つの主要な効果を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１及び実施例２のｈＭＳＣ培養におけるカルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による生死判定結果を示す図である。
【図２】図２は、実施例３乃至実施例７のｈＭＳＣ培養におけるカルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による生死判定結果を示す図である。
【図３】図３は、実施例１乃至実施例３のｈＭＳＣの４週間培養後のポジティブマーカー染色結果を示す図である。
【図４】図４は、実施例１乃至実施例３のｈＭＳＣの４週間培養後のネガティブマーカー染色結果を示す図である。
【図５】図５は、対照試験のｈＭＳＣ培養（１週間）におけるカルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による生死判定結果を示す図である。
【図６】図６は、実施例１２のｈＭＳＣの４週間培養後のポジティブマーカー染色結果を示す図である。
【図７】図７は、実施例１２のｈＭＳＣの４週間培養後のネガティブマーカー染色結果を示す図である。
【図８】図８は、実施例８で培養したｈＭＳＣの脂肪細胞分化誘導試験後の抗ＦＡＢＰ４抗体による免疫染色試験の結果を示す図である。
【図９】図９は、実施例８で培養したｈＭＳＣの脂肪細胞分化誘導試験後オイルレッドＯ染色の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、実施例８で培養したｈＭＳＣの骨細胞分化誘導試験後のアザリンレッドＳ染色試験の結果を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例８で培養したｈＭＳＣの３週間の軟骨細胞分化誘導試験後の抗アグリカン抗体による細胞の免疫染色試験の結果を示す図である。
【図１２】図１２は、実施例８で培養したｈＭＳＣの４週間の軟骨細胞分化誘導試験後の抗アグリカン抗体による細胞の免疫染色試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】  以下、本発明の未分化性維持培養材料について詳細に説明する。  なお本明細書において「休眠培養」とは、幹細胞が生体内に存在している際の特徴である、幹細胞の細胞周期が静止期にある状態にて維持され、未だ分化せずに待機してなる状態を、生体外培養条件下においても実現すること、すなわち幹細胞を未分化の状態（初期状態）にて維持する（細胞を休眠状態とする）培養を指す。【００１７】＜未分化性維持培養材料＞  本発明の未分化性維持培養材料は、天然物由来の多糖類を含有するものであり、前記多糖類がナノファイバー形状の多糖類（以下、単に“ナノファイバー”と称する）であるか、或いは増粘性多糖類であることが好ましい。【００１８】［ナノファイバー（セルロース）原料］  本発明の未分化性維持培養材料に使用される天然物由来のナノファイバーとしては、微細化されたセルロースナノファイバーが挙げられる。  上記セルロースナノファイバーの原料は、例えば、木材、竹、麻、ジュート、ケナフ、コットン、農作物又は食物残渣など植物由来のセルロース、又はバクテリアセルロース、シオグサ（クラドフォラ）、灰色植物（グラウコキスチス）、バロニア、ホヤセルロースなど、微生物産生若しくは動物産生のセルロースを使用することができる。  上記植物由来のセルロースはミクロフィブリルと呼ばれる非常に細い繊維がさらに束になりフィブリル、ラメラ、繊維細胞と段階的に高次構造を形成しているものであり、バクテリアセルロースは菌細胞から分泌されたセルロースのミクロフィブリルが、そのままの太さで微細な網目構造を形成しているものである。【００１９】  本発明の未分化性維持培養材料に使用されるセルロースナノファイバーの原料としては、好ましくは、上述の農作物又は食物残渣など植物由来のセルロース、又は微生物産生若しくは動物産生のセルロースをクラフトパルプ法又はサルファイトパルプ法で処理したセルロース、並びにそれらを高圧ホモジナイザーやミル等で粉砕した粉末セルロースが挙げられる。更に好ましくは非結晶部分を酸加水分解処理で除去した後、粉砕及び篩い分けすることで得られる結晶セルロースが挙げられる。【００２０】［セルロース原料の微細化（粉砕）方法］  本発明において、上述したようにこれらセルロース原料を粉砕して得られる微細化したセルロースナノファイバーを用いることが好ましい。セルロース原料の粉砕方法は限定されないが、本発明の目的に合う後述する繊維径及び繊維長にまで微細化するには、高圧ホモジナイザー、グラインダー（石臼）、あるいはビーズミルなどの媒体撹拌ミルといった、強いせん断力が得られる方法が好ましい。【００２１】  これら粉砕方法の中でも、特に高圧ホモジナイザーを用いて微細化することが好ましく、例えば特開２００５−２７０８９１号公報や特許第５２３２９７６号明細書に開示されるような湿式粉砕法を用いて微細化（粉砕化）することが望ましい。具体的には、セルロース原料を分散させた分散液（水分散液）を、一対のノズルから高圧でそれぞれ噴射して衝突させることにより、セルロース原料を粉砕するものであって、例えばスターバースト（登録商標）システム（（株）スギノマシン製の高圧粉砕装置）やナノヴェイタ（登録商標）（吉田機械興業（株）の高圧粉砕装置）を用いることにより実施できる。【００２２】  前述の高圧ホモジナイザーを用いてセルロース原料を微細化（粉砕化）する際、微細化や均質化の程度は、高圧ホモジナイザーの超高圧チャンバーへ圧送する圧力と、超高圧チャンバーに通過させる回数（処理回数）、及び水分散液中のセルロース濃度に依存することとなる。  圧送圧力（処理圧力）は、通常、５０〜２５０ＭＰａであり、好ましくは１５０〜２４５ＭＰａである。圧送圧力が５０ＭＰａ未満の場合には、セルロースの微細化が不充分となり、微細化により期待される効果が得られない。  また、微細化処理時の水分散液中のセルロース濃度は０．１質量％〜３０質量％、好ましくは１質量％〜１０質量％である。水分散液中のセルロース濃度が０．１質量％未満だと生産性が著しく低く、３０質量％より高い濃度だと粉砕効率が低く、所望のセルロースナノファイバーが得られない。  微細化（粉砕化）の処理回数は、特に限定されず、前記水分散液中のセルロース濃度にもよるが、例えば、セルロース濃度が０．１〜１質量％の場合には処理回数は１〜１００回程度であり、１〜１０質量％では１〜１０００回であり、好ましくは１０〜２００回である。また、分散液のセルロース濃度が３０質量％を超える高濃度な場合は、微細化するのに数千回以上の処理回数が必要となることや、取扱いに支障をきたす程度まで分散液の高粘度化が進むため、工業的観点から非現実的である。【００２３】  本発明に用いるセルロースナノファイバーの平均粒子径（ｄ）は、０．０１μｍ乃至１０μｍ、好ましくは０．０５μｍ乃至５μｍである。なお本発明において、セルロースナノファイバーの“平均粒子径”とは、希薄条件で水中に分散したランダムコイルの状態にあるセルロースナノファイバーの流体力学的直径の径を表している。平均粒子径が０．０１μｍ未満であると、セルロースナノファイバーが微細すぎることにより添加効果が得られず、すなわち、それを含有する未分化性維持培養材料の細胞浮遊作用及び細胞回収率が低下する。また平均繊維径が１０μｍより大きいと、未分化性維持培養材料の透明性や細胞分散効果が失われ、細胞同士が凝集塊を形成したり、細胞とともに未分化維持培養材料が沈降することにより期待した効果が得られない。【００２４】  本発明に用いるセルロースナノファイバーの平均繊維径（Ｄ）は、１ｎｍ乃至１００ｎｍ、好ましくは５ｎｍ乃至７０ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ乃至５０ｎｍである。平均繊維径が１ｎｍ未満であると、セルロースナノファイバーが微細すぎることにより添加効果が得られず、すなわち、それを含有する未分化性維持培養材料からの細胞回収率が低下する。また平均繊維径が１００ｎｍより大きいと、未分化性維持培養材料の細胞分散効果が失われ、細胞同士が凝集塊を形成することにより期待した効果が得られない。  また本発明に用いるセルロースナノファイバーの平均繊維長（Ｌ）は、０．０１μｍ乃１００μｍ、好ましくは０．０５μｍ乃至１０μｍである。【００２５】  本発明に用いるセルロースナノファイバーのアスペクト比（Ｌ／Ｄ）は、平均繊維長／平均繊維径より得られ、通常２〜５００であり、好ましくは３〜３００であり、より好ましくは４〜２５０である。アスペクト比が２未満の場合には、未分化性維持培養材料として液中での分散性安定性が充分に得られず、細胞の分散性が保てない。またアスペクト比が５００を超える場合には、繊維長が極めて大きくなることを意味することから、培養液の粘度増大などを誘発し、取扱性の著しい低下を誘発する。【００２６】  なお本発明において、セルロースナノファイバーの平均粒子径（ｄ）、平均繊維径（Ｄ）及び平均繊維長（Ｌ）は以下のようにして求めたものである。・平均粒子径（ｄ）：後述する製造例において作製したセルロース分散液を０．０１〜０．１質量％となるように超純水にて希釈し、超音波洗浄機にて３０分間分散させて、大塚電子（株）製動的光散乱測定器（ＦＤＬＳ−３０００、キュムラント法）、又はマルバーン社製レーザー回折式粒度分布測定装置（マスターサイザー２０００、累積体積５０％通過径（Ｄ５０））を用いて平均粒子径（ｄ）を測定した。  なお平均粒子径（ｄ）は下記アインシュタイン・ストークスの式を用いて、拡散係数Ｄから流体力学的直径として求められる。  ｄ＝ｋＴ／３πη０Ｄ  ｄ：粒子径（流体力学的直径）、ｋ：ボルツマン定数、Ｔ：絶対温度、η０：溶媒の粘度・平均繊維径（Ｄ）：応研商事（株）製コロジオン支持膜を日本電子（株）製イオンクリーナ（ＪＩＣ−４１０）で３分間親水化処理を施した。この支持膜に、後述する製造例において作製したセルロース分散液（超純水にて希釈）を数滴滴下し、室温乾燥させ、試料とした。この試料を（株）日立製作所製透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ−８０００）（１０，０００倍）にて加速電圧２００ｋＶで観察した。得られた画像を用いて、標本数：２００〜２５０本のセルロースナノファイバーについて各々の繊維径を計測し、その数平均値を平均繊維径（Ｄ）とした。・平均繊維長（Ｌ）：後述する製造例において作製したセルロース分散液を、セルロース濃度が０．００１質量％となるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）により希釈し、セルロースを分散させた。これを予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃にて１時間乾燥させて試料とした。得られた試料の日本電子（株）製走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＳＭ−７４００Ｆ）（２，０００倍）で観察した画像を用いて、標本数：１５０〜２５０本のセルロースナノファイバーについて各々の繊維長を計測し、その数平均値を平均繊維長（Ｌ）とした。【００２７】［増粘性多糖類］  天然物由来のメチルセルロースやダイユータンガム等の増粘性多糖類は、高濃度領域では増粘剤として作用する。一方１％以下といった低濃度領域では細胞などに対して分散剤として作用する。そしてこれら増粘性多糖類をこうした低濃度にて細胞培養に使用すると、培養操作等のハンドリングに大きな影響を与えることなく、細胞増殖を安定化させることができることが知られている。これは、増粘性多糖類を低粘度にて（謂わば分散剤として）添加することで、細胞の培養容器への接着や細胞同士が接着し合うことによる細胞塊形成などを、抑制する作用によるものである。そしてこの作用により、細胞接着による細胞機能喪失や増殖阻害、及び細胞塊中心部の栄養不足や酸欠によるネクローシ��を抑制することができる。  本発明の未分化性維持培養材料に使用される天然物由来の増粘性多糖類としては、例えばヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸及びそれらの塩、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸プロピレングリコールエステル等アルギン酸誘導体、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそのナトリウム等の塩、メチルヒドロキシプロピルセルロース、セルロース硫酸ナトリウム、ジアルキルジメチルアンモニウム硫酸セルロース等のセルロース誘導体、キトサン、ポリクオタニウム−１０等のカチオン化セルロース、カチオン化デキストラン及びグアーヒドロキシプロピルトリモニウムクロリド等のカチオン化多糖等が好ましいものとして挙げられる。  中でも、本発明の未分化性維持培養材料として、メチルセルロース又はダイユータンガムを好適に使用できる。【００２８】＜体性幹細胞＞［間葉系幹細胞］  本発明の未分化性維持培養材料が培養対象とする体性幹細胞には間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、臍帯血幹細胞、神経幹細胞などがあるが、特に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を対象とする。  いろいろな型の細胞に分化可能で、治療に活用され得る間葉系幹細胞は通常、成体から採取し、選別し、そして純化したものを用いる。本発明の未分化性維持培養材料を適用できる間葉系幹細胞としては、患者から直接採取される臨床用の初代ヒト間葉系幹細胞ばかりでなく、試験研究用に用い得る細胞バンクより入手できる間葉系幹細胞や、不死化された間葉系幹細胞株も挙げられる。  当業者であれば既知の通り、これら間葉系幹細胞は、臨床上の適用の観点から捉えると、自家ソース由来、同種異系ソース由来又は異種間ソース由来の何れの細胞であってもよい。また採取源は、ドナー骨髄、組織生検、胚性ソース、出生後ソース等の何れの採取源であってもよい。具体的には腸骨稜の骨髄、大腿頸骨、脊椎、肋骨又は他の骨髄腔由来、或いは胚性卵黄嚢、胎盤、臍帯、骨膜、胎児及び青年期の皮膚及び血液を含む組織生検由来などの採取源が挙げられる。【００２９】＜培養液＞  本発明は、前記未分化性維持培養材料が液中に分散されてなる培養液にも関する。  前記培養液は、緩衝液及び／又は液体培地を含む。  上記液体培地としては、天然培地、半合成培地、合成培地などのうち、動物細胞の培養に用いられる培地を好適に使用できる。このような培地としては、例えばウィリアム培地Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地）、ハムＦ１０培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１０）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ１２）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、アルファ改変イーグル培地（α-Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅｓ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ；α-ＭＥＭ）などが挙げられる。  また該液体培地は、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを含有してもよい。また液体培地には目的に応じてその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもでき、例えばウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、ニワトリ血清インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種増殖因子、細胞機能調節因子などを添加できる。  前記培養液は、前記未分化性維持培養材料が、該培養液の全体積量に対して０．０００１％（ｗ／ｖ）乃至２％（ｗ／ｖ）の濃度、好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）乃至１％（ｗ／ｖ）の濃度で分散されてなるものが望ましい。【００３０】＜体性幹細胞含有培養液＞  さらに本発明は、体性幹細胞が前記培養液の浴中を漂ってなる体性幹細胞含有培養液にも関する。  前記体性幹細胞含有培養液は、単位体積（１ｍＬ）当たり１．０×１０３〜１．０×１０６の幹細胞を含む前記体性幹細胞含有培養液の全体積量に対して、前記未分化性維持培養材料が０．０００１％（ｗ／ｖ）乃至２％（ｗ／ｖ）の濃度、好ましくは０．０００５％（ｗ／ｖ）乃至１％（ｗ／ｖ）の濃度で培養液中を漂ってなるものが望ましい。【００３１】  該体性幹細胞含有培養液には、前述の液体培地に添加可能なその他の化学成分又は生体成分、すなわちナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを添加してもよい。例えばウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、ニワトリ血清インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２−メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロースの他、各種細胞機能調節因子、線維芽細胞増殖因子、上皮増殖因子、血管内皮増殖因子、血小板由来増殖因子、肝細胞増殖因子などを更に添加できる。  例えばウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、ニワトリ血清などの血清の場合、体性幹細胞含有培養液の全体積に対して０．１体積％乃至５０体積％、好ましくは０．５体積％乃至２０体積％の濃度で添加することが望ましい。【００３２】［培養方法］  本発明の未分化性維持培養材料を用いた体性幹細胞の培養方法（休眠培養）の一例を以下に記す。  まず、上述の本発明の未分化性維持培養材料を、前述の培養液（緩衝液及び／又は上記液体培地、またこれら培地に牛胎児血清やヒト血清等を添加した液体培地）に添加し、該未分化性維持培養材料を培養液中に溶解又は分散させ、��解液又は分散液の状態とする。  こうして準備した本発明の未分化性維持培養材料を含有する培養液を、動物細胞の培養に一般的に用いられる培養器：シャーレ、フラスコ、ウェルプレート、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バックなどの適当な容器中に準備し、ここに適切な緩衝液等に懸濁させた間葉系幹細胞を、単位体積（１ｍＬ）当たりの培地に幹細胞数が１．０×１０３〜１．０×１０６となるように播種する。このとき、血清や細胞機能調節因子等を培養液に更に添加してもよい。  未分化性維持培養材料の分散培養液に播種された間葉系幹細胞は、通常１０℃乃至４０℃、好ましくは３５℃乃至３８℃、例えば３７℃にて、０体積乃至１０体積％、好ましくは３体積乃至７体積％、例えば５体積％の二酸化炭素雰囲気にて、細胞培養用インキュベーター内において培養することができる。  細胞培養中は必要に応じて、培養液を交換し、培養環境を新鮮に保つこともできる。培養液交換に際しては、例えば未分化性維持培養材料としてナノファイバーを用いた場合、所定の遠心力条件にて遠心分離し、細胞培養液中に分散しているナノファイバーと細胞との両者を沈降回収し、新鮮な培養液に再分散することにより行うことができる。  例えば上述の手順にて、３７℃、５体積％二酸化炭素雰囲気の培養条件下で本発明の未分化性維持材料を使用し間葉系幹細胞等の体性幹細胞を培養することにより、１日間乃至３０日間培養後の体性幹細胞の未分化性及び多分化能を、該幹細胞の採取直後と同等の活性度で保つことができる。【００３３】［回収方法］  本発明の未分化性維持材料を使用した培養条件下で体性幹細胞の培養を為したとき、トリプシン処理により体性幹細胞の回収が可能である。【００３４】  本発明の未分化性維持培養材料を使用することにより、休眠培養の実施後２週間以上、例えば３０日を経た後においても間葉系幹細胞等の体性幹細胞の未分化性を維持し、分化能を保持するとともに、細胞老化を抑制することができる。
【実施例】
【００３５】  以下に実施例を挙げて本発明の特徴をより具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容及び処理手順は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。【００３６】［平均粒子径ｄの測定］  前述の［００２６］に記載の手順に従い、動的光散乱測定より下記製造例１乃至製造例３で得られたセルロースナノファイバーの平均粒子径ｄを求めた。［平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌの測定］  前述の［００２６］に記載の手順に従い、ＴＥＭ画像及びＳＥＭ画像より下記製造例１乃至製造例３で得られたセルロースナノファイバーの平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌを求め、これらの値よりアスペクト比Ｌ／Ｄを求めた。【００３７】［製造例１：微結晶セルロース由来セルロースナノファイバー（ＭＣ１）の製造］  市販の微結晶セルロース（フナコシ（株）製  カラムクロマトグラフィー用  フナセル粉末ＩＩ）１．５質量部に純水１，０００質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２４５ＭＰａにて５０回粉砕処理を行い、微結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＣ１）を得た。【００３８】［製造例２：微結晶セルロース由来セルロースナノファイバー（ＭＣ２）の製造］  市販の微結晶セルロース（フナコシ（株）製  カラムクロマトグラフィー用  フナセル粉末ＩＩ）１５質量部に純水１，０００質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２４５ＭＰａにて１５０回粉砕処理を行い、微結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＣ２）を得た。【００３９】［製造例３：微結晶セルロース由来セルロースナノファイバー（ＭＣ３）の製造］  市販の微結晶セルロース（フナコシ（株）製  カラムクロマトグラフィー用  フナセル粉末ＩＩ）１５質量部に純水１，０００質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２４５ＭＰａにて３００回粉砕処理を行い、微結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＣ３）を得た。【００４０】［製造例４：パルプ由来セルロースナノファイバー（ＰＣ）の製造］  市販のクラフトパルプ（国際紙パルプ商事（株）製  ＬＢＫＰ  Ｄ−８、固形分４６質量％）２２質量部に純水９７８質量部を加えて分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２４５ＭＰａにて２００回粉砕処理を行い、パルプ由来セルロースナノファイバーの水分散液を得た。得られた分散液をシャーレに測りとり、１１０℃にて１時間乾燥を行い、水分を除去して残渣の量を測定し、濃度を測定した。その結果、水中のセルロース濃度（固形分濃度）は、１．０質量％であった。この分散液を純水にて１０質量倍となるように希釈し、０．１質量％水分散液（ＰＣ）を得た。【００４１】［製造例５：バクテリアセルロース由来セルロースナノファイバー（ＢＣ）の製造］  市販のバクテリアセルロース（ＵＴＡＭＡ社製  ＰＴ．ＮＩＲＡＭＡＳ、酢酸水溶液中セルロース固形��約０．５質量％）２００質量部を家庭用ミキサーにて５分間解砕した。得られたスラリーをろ過し、純水へ分散させた後にｐＨを測定し、ｐＨが中性（６〜７）となるまで同様の水洗を繰り返した。全量を１０００質量部となるように純水を加えた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２００ＭＰａにて３００回粉砕処理を行い、バクテリアセルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＢＣ）を得た。【００４２】  製造例１乃至製造例５で得られたセルロースナノファイバーについて、平均粒子径ｄ、平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌを前述の手順に従い測定した。得られた結果並びに平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌより求めたアスペクト比（Ｌ／Ｄ）を示す。【００４３】
【表１】
0006512662.tif 000002
【００４４】［実施例１：ＭＣ１を用いたｈＭＳＣ培養］［培養液の調製］  製造例１で得られたセルロースナノファイバー（ＭＣ１）の０．１質量％水分散液１００ｍＬに、市販の高圧蒸気滅菌可能な粉末培地（日水製薬（株）製  ダルベッコ変法イーグル培地２）１００ｍＬ分を添加した。これを３０分程マグネチックスターラーで撹拌して該粉末培地を水分散液に溶解させた後、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した。この溶液を室温まで冷却したのち、この溶液に市販のＬ−グルタミン溶液（和光純薬工業（株）製  ２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（×１００））を終濃度２ｍＭとなるように添加し、さらに滅菌した１０質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加えた。溶液から少量を取りだし、ｐＨ試験紙を使用して溶液のｐＨがおよそｐＨ７．０〜８．０であることを確認した。この溶液に、使用前に１０体積％となるようにウシ胎児血清（以下本明細書中ではＦＢＳと記載する）を加え、０．１％（ｗ／ｖ）ＭＣ１培養液とした。また、目的に応じて１０体積％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）ＤＭＥＭ、Ｐｏｗｄｅｒ、Ｌｏｗ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｐｙｒｕｖａｔｅ３１６００−０３４）をＭＣ１培養液に追加混合することで、培養液中のセルロースナノファイバー濃度を調節した（表２及び図１乃至図４におけるＮＦ濃度参照）。【００４５】［間葉系幹細胞ＭＳＣの播種］  親水性処理をしていないポリスチレンシャーレである直径１０ｃｍの低接着性アズノール滅菌シャーレ（アズワン（株）製  ＧＤ９０−１５）に、培地として０．０２５〜０．１％（ｗ／ｖ）ＭＣ１培養液を１０ｍＬ入れ、ヒト間葉系幹細胞（Ｌｏｎｚａ  ＰＴ−２５０１；以下本明細中ではｈＭＳＣと記載する）を５．０×１０５個／ｄｉｓｈで播種した。この播種した細胞を５体積％二酸化炭素中、３７℃で１日間培養したのち、シャーレに接着した細胞を取り除くため、培養液を新しいアズノール滅菌シャーレに移し、さらに４週間培養を続けた。途中、１週間おきに培地交換のため培養液を遠心管に回収して１０℃で３００ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去したのち１０体積％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地１０ｍＬに再懸濁させて新しいアズノール滅菌シャーレに移した。  培養後１〜４週間の各時点で培養液を回収し、以下の手順に従い、カルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による細胞の生死判定、トリプシン処理による細胞の回収、未分化マーカーによる免疫染色を行った。【００４６】＜カルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による生死判定＞  １〜４週間の培養後に回収した各培養液から０．５ｍＬを取り出し、１０℃で３００ｇ、５分間遠心分離して上清を除去し、ナノファイバー（以下、ＮＦと称する）沈殿物を１ｍＬのリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳと称する）で洗浄した。２回洗浄を繰り返したのちＮＦ沈殿物にカルセイン−ＡＭ／ＰＩ液を０．５ｍＬ加えて混合し、５体積％二酸化炭素中、３７℃で３０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳ洗浄を２回行い、ＮＦ沈殿物に０．５ｍＬのＤＭＥＭ培地を加えて懸濁させ、その懸濁液を２４ウェルプレートに移して位相差顕微鏡観察及び蛍光顕微鏡下で緑蛍光（生細胞）・赤蛍光（死細胞）を確認した。得られた結果を図１及び図２に示す。【００４７】＜トリプシン処理による細胞の回収＞  １〜４週間の培養後に回収した各培養液１ディッシュ分を遠心管に移し、１０℃で３００ｇ、５分間遠心分離して上清と沈殿物に分けた。沈殿物を１０ｍＬのＰＢＳで２回洗浄し、この上清も回収し、すべての上清を１０℃で４３０ｇ、３分間遠心し、沈殿物を得た。得られたすべての沈殿物を一つにまとめ、ここに沈殿物とおよそ等量のトリプシン液（和光純約工業（株）製、０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｓｉｎ−１ｍｍｏｌ／ｌ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ）を加え、３７℃で５分間インキュベートした。その後、１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地をトリプシン液の倍量加え、混合したのち１０℃で３００ｇ、５分間遠心して上清と沈殿物に分けた。上清をさらに１０℃で４３０ｇ、３分間遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物と先に分けた沈殿物をともに、新しい１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地１０ｍＬに懸濁させ、直径１０ｃｍの親水処理された細胞培養用ポリスチレンディッシュ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ、以下本明細書中ではＴＣＰＳと記載する）に再播種した。この再播種した細胞を５体積％二酸化炭素中、３７℃で一晩インキュベートしたところ、ディッシュに生着した細胞が確認された。この生着した細胞を上記と同じトリプシン液にて処理し、３７℃で５分間インキュベートしたのち、１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地をトリプシン液の倍量以上〜最大さらに１０ｍＬ程度加え、混合し、１０℃で４３０ｇ、３分間遠心分離し、そして、得られた沈殿細胞を新しい１０体積％ＦＢＳを含む数ｍＬのＤＭＥＭ培地に懸濁させた。この懸濁物をヘマトサイトメーターを用いて計測した。  また細胞播種時に、比較対象として、ｈＭＳＣを直径１０ｃｍのＴＣＰＳに１０体積％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に５．０×１０５個／ｄｉｓｈ播種し、播種翌日に細胞を回収及びカウントした。この時の細胞数を回収率１００％として、前述の培養に供した細胞の回収率を算出した。得られた結果を下記表２に示す。ここで未分化性維持材料への細胞の付着率は、ナノファイバー分散液で培養した翌日の時点で、分散ナノファイバーへ付着せずに培養ディッシュに沈降付着した細胞数を上述のトリプシン処理による回収を行って計測した細胞数を、比較対象の細胞数から差し引くことで求めた。これは浮遊した細胞の数を直接に計測することの困難性のためである。【００４８】［休眠性の確認］  間葉系幹細胞の性質を維持した休眠状態での培養が行われたかどうかについて、間葉系幹細胞を特徴づける各種マーカータンパク質の発現状態を観察し、評価した。  １〜４週間の培養後、トリプシン処理によって実施例１のＭＣ１から回収した細胞を２４ウェルプレートに５．０×１０３個／ｃｍ２（９．５×１０３個／ウェル）で播種し、播種した細胞を５体積％二酸化炭素中、３７℃で一晩インキュベートした。  この細胞に、ヒト間葉系幹細胞のマーカー抗体（ポジティブマーカー：６種、ネガティブマーカー：５種）を用いて免疫蛍光染色を行い、細胞の休眠性を評価した。免疫蛍光染色は以下の方法で行った。細胞をＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド・リン酸緩衝液で固定し、洗浄後に１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン及び１０体積％ロバ血清を含むＰＢＳ（ブロッキングバッファー）でブロッキング処理した。この処理した細胞を適宜の濃度に希釈したマウスモノクローナル抗体と４℃で一晩反応させ、１次抗体を洗浄除去後、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウス抗体と室温で１時間反応させた。洗浄後、標識された細胞が蛍光顕微鏡下で緑蛍光（陽性及び発現強度）を発するか否かを確認した。４週間培養後の免疫染色結果を図３及び図４に示す。  なお対照試験として、実施例１乃至実施例３において使用したものと同等の継代数６のｈＭＳＣを実施例で行ったのと同様の播種条件にて培養し、マーカー抗体に対する免疫蛍光染色を行った。【００４９】［実施例２：ＭＣ２を用いたｈＭＳＣ培養］  製造例２で得られたセルロースナノファイバー（ＭＣ２）の０．１質量％水分散液を用いて、実施例１と同様の方法で培地調製を行い、０．１％（ｗ／ｖ）ＭＣ２培養液を調製した。これを用いて実施例１と同様の方法でｈＭＳＣの播種及び培養を行い、１〜４週間の培養の後、カルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による生死判定、トリプシンによる細胞の回収及び休眠性の確認について行った。【００５０】［実施例３：ＭＣ３を用いたｈＭＳＣ培養］  製造例３で得られたセルロースナノファイバー（ＭＣ３）の０．１質量％水分散液を用いて、実施例１と同様の方法で培地調製を行い、０．１％（ｗ／ｖ）ＭＣ３培養液を調製した。これを用いて実施例１と同様の方法でｈＭＳＣの長期培養、カルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による生死判定、細胞の回収及び休眠性の確認を行った。【００５１】［実施例４：ＰＣを用いたｈＭＳＣ培養］  製造例４で得られたセルロースナノファイバー（ＰＣ）の０．１質量％水分散液を用いて、実施例１と同様の方法で培地調製を行い、０．１％（ｗ／ｖ）ＰＣ培養液を調製した。なお、ｈＭＳＣの培養にはＴＣＰＳを用い、細胞の生死判定、及びトリプシンによる細胞の回収を行った。また本実施例では、培養翌日の時点についても細胞の回収を行った。【００５２】［実施例５：ＢＣを用いたｈＭＳＣ培養］  製造例５で得られたセルロースナノファイバー（ＢＣ）の０．１質量％水分散液を用いて、実施例１と同様の方法で培地調製を行い、０．１％（ｗ／ｖ）ＢＣ培養液を調製した。なお、ｈＭＳＣの培養にはＴＣＰＳを用い、細胞の生死判定、及びトリプシンによる細胞の回収を行った。【００５３】［実施例６：メチルセルロースを用いたｈＭＳＣ培養］  メチルセルロース（Ｍ０３８７、Ａｌｄｒｉｃｈ社製：ＭＥ）を用いて１．０質量％水分散液を調製し、これを用いて実施例１と同様の方法で培地調製を行い、１．０％（ｗ／ｖ）メチルセルロース培養液を調製した。なお、ｈＭＳＣの培養にはアズノール滅菌シャーレを用い、細胞の生死判定、及びトリプシンによる細胞の回収を行った。また本実施例では、培養３日後の時点についても細胞の回収を行った。【００５４】［実施例７：ダイユータンガムを用いたｈＭＳＣ培養］  ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ  ＣＲＥＴＥ  ＤＧ−Ｆ、三晶株式会社製：ＤＵ）の１．０質量％水分散液を用いて、実施例１と同様の方法で培地調製を行い、１．０％（ｗ／ｖ）ダイユータンガム培養液を調製した。なお、ｈＭＳＣの培養にはアズノール滅菌シャーレを用い、生死判定、及びトリプシンによる細胞の回収を行った。また本実施例では、培養３日後の時点についても細胞の回収を行った。【００５５】［結果：細胞生死判定］  図１及び図２に示すように、実施例１乃至実施例３のいずれの系においても、生細胞（緑蛍光）を示すカルセイン−ＡＭ染色像は４週間後も観察されるのに対し、死細胞（赤蛍光）を示すＰＩ染色細胞はごく低頻度の観察にとどまった。すなわち、この観察結果より、ＭＣ１〜ＭＣ３のナノファイバー分散培養液によって、ｈＭＳＣを４週間以上培養可能であることが示された。また実施例４及び実施例５においても、１週間後にカルセイン−ＡＭ染色像が観察され、ＰＣ及びＢＣのナノファイバー分散培養液によってもｈＭＳＣを培養可能であることが示された。  また実施例１及び実施例２では培養中に細胞同士が数個から十個程度凝集している様子が顕著であるが、実施例３では４週間後の生細胞の分散状態がよいことから、ＭＣ３のナノファイバー分散培養液が特に個々の幹細胞に対して均質な培養環境を提供しているものと理解される。【００５６】［結果：細胞の回収率］  表２に示すように、実施例１乃至実施例５のいずれにおいても、播種翌日に未分化性維持培養材料が細胞に付着していることが確認でき、特に実施例１乃至実施例３及び実施例５では８０％を超える細胞付着率が確認できた。なお実施例６（メチルセルロース）及び実施例７（ダイユータンガム）においても、後述するように一定の培養期間後において細胞を回収できていることから、これら実施例においても播種翌日に未分化性維持培養材料が細胞に付着しているといえる。  また実施例１乃至実施例３では、４週間後において約４０〜６０％の細胞を回収できるとする結果が得られた。特に実施例１のＭＣ１を用いた培養において、最も高い回収率が得られ、４週間の長期培養後において６１．２％の細胞が回収できた。  また実施例４、実施例６及び実施例７においても、一定の培養期間後に細胞を回収できることが確認された。  これらの結果より、ナノファイバー分散培養液及び増粘性多糖類分散培養液のいずれも、ｈＭＳＣの回収・再播種の再生着に有効であると理解される。特に同じ微結晶セルロース由来ナノファイバーの水分散液（ＭＣ１乃至ＭＣ３）を使用した実施例１乃至実施例３においては、使用したナノファイバーの長さが長い条件において細胞回収率が上昇し、とりわけ微結晶セルロース由来ナノファイバーのナノファイバー分散溶液にあっては、ｈＭＳＣの回収・再播種後の再生着に有効であると理解される。【００５７】
【表２】
0006512662.tif 000003
【００５８】［結果：休眠性確認］  図３に示すように、ナノファイバー分散培養液を用いた培養後４週間の時点で、ポジティブマーカーであるＳＴＲＯ−１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５に対して、実施例１−３のいずれの細胞においても対照試験と同程度の正常な発現を示した。  また図４に示すように、ネガティブマーカーであるＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５に関しても、対照試験と同程度の免疫染色蛍光強度を示し、ｈＭＳＣの性質を４週間培養後においてもほぼ正常に保持していることが確認できた。【００５９】［実施例８乃至実施例１０：ＭＣ１を用いた細胞無接着培養シャーレ上でのＭＳＣ培養］［培養液の調整］  実施例１と同様の条件及び手順に従って培養液を調製した。［間葉系幹細胞ＭＳＣの播種］  直径１０ｃｍの細胞無接着培養シャーレ（グライナー製  ＣｅｌｌＳｔａｒ６６４９７０）に、培地として０．０２質量％、０．０１７質量％、０．０１２５質量％のＭＣ１培養液を１０ｍＬ入れ、ｈＭＳＣを５．０×１０５個／ｄｉｓｈで播種した。１週間おきに培地交換のため培養液を遠心管に回収して１０℃で３００ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去したのち沈殿物を１０質量％ＦＢＳを含む新しいＤＭＥＭ培地１０ｍＬに再懸濁させて、もとの細胞無接着培養シャーレに戻した。培養後１〜４週間の各時点で培養液を回収し、段落［００４６］［００４７］［００４８］に記載の手順に従い、カルセイン−ＡＭ／ＰＩ法による細胞の生死判定、トリプシン処理による細胞の回収及び未分化マーカーによる細胞の免疫染色を行った。【００６０】［多分化能保持の確認］  回収された細胞に対して、多分化能を保持した休眠状態での培養が行われたかどうかを確認するため、市販の分化誘導培地（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製  ヒト間葉系幹細胞  分化誘導キット  ｓｃ００６）を用いて脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞への分化誘導を夫々行った。この分化させた細胞をマーカー抗体を用いて免疫染色し、これら細胞がそれぞれの細胞系への分化能を有しているか確認した。〈ＭＣ１培地での培養と細胞の回収〉  ｈＭＳＣを０．０２％ＭＣ１培養液で２週間培養後、段落[００４７]に記載の手順と同様にトリプシン処理によって回収した。【００６１】〈脂肪細胞への分化誘導〉  ＭＣ１培地から回収したｈＭＳＣをαＭＥＭ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製  ＭＥＭα  １２５６０−０５６）に１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン、グルタミンを添加した基本培地に再懸濁し、滅菌したカバーガラスの入った２４ウェルプレートに２．１×１０４個／ｃｍ2で再播種した。１００％コンフルエントになるまで培養した後、基本培地に脂肪細胞の分化誘導剤を添加したものへ培地を交換した。３、４日おきに分化誘導剤入り培地を新鮮なものに交換し、３週間培養を続けた。１〜３週間目にカバーガラスを取り出し、培養したｈＭＳＣのオイルレッドＯ染色及び抗ＦＡＢＰ４抗体による免疫染色を行った。【００６２】〈骨細胞への分化誘導〉  骨細胞への分化誘導中の細胞の剥がれを防ぐため、１μｇ／ｍＬのフィブロネクチン溶液を滅菌したカバーガラスの入った２４ウェルプレートに加え、３７度で３〜３０時間処理した。ＭＣ１培地から回収したｈＭＳＣを、αＭＥＭ（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製  ＭＥＭα  １２５６０−０５６）に１０％ＦＢＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン及びグルタミンを添加した基本培地に再懸濁し、そして準備しておいた２４ウェルプレートに４．２×１０３個／ｃｍ2で再播種した。一晩培養後、基本培地に骨細胞の分化誘導剤を添加したものへ培地を交換をした。３、４日おきに分化誘導剤入り培地を新鮮なものに交換し、４週間培養を続けた。２〜４週間目にカバーガラスを取り出し、培養細胞のアリザリンレッドＳ染色を行った。【００６３】〈軟骨細胞への分化誘導〉  ＭＣ１培地から回収したｈＭＳＣをＤＭＥＭ（ＦＢＳ−）で１．０×１０６個／ｍＬに調整し、それを、細胞凝集塊を形成するため、ＴＣＰＳに適量入れた３％メチルセルロース／ＤＭＥＭ中に１０μＬ（１０，０００個）ずつ注入した。一晩培養後、火炎滅菌した薬匙で細胞塊を掬い出し、ＰＢＳで洗ってチェンバースライドシステム（Ｎｕｎｃ製  ラブテック  チェンバースライドシステム  １７８５９９ＪＰ）の各ウェルに１個ずつ移した。ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２  １１３２０−０３３）にＩＴＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ｓｃ００６付属品）、ペニシリン・ストレプトマイシン及びグルタミンを加えた基本培地にさらに軟骨分化誘導剤を加えたものを各ウェルに１００μＬずつ加えた。２〜３日おきに培地交換をして４週間培養を続けた。３、４週間目に抗アグリカン抗体による細胞の免疫染色を行った。【００６４】［製造例６：微結晶セルロース由来セルロースナノファイバー（ＭＣ４）の製造］  市販の微結晶セルロース（セオラス、ＰＨ−１０１、旭化成ケミカルズ社製））１．５質量部に純水１，０００質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２２０ＭＰａにて５０回粉砕処理を行い、微結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＣ４）を得た。【００６５】［製造例７：微結晶セルロース由来セルロースナノファイバー（ＭＣ５）の製造］  市販の微結晶セルロース（セオラス、ＰＨ−１０１、旭化成ケミカルズ社製））１．５質量部に純水１，０００質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２２０ＭＰａにて１００回粉砕処理を行い、微結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＣ５）を得た。【００６６】［製造例８：微結晶セルロース由来セルロースナノファイバー（ＭＣ６）の製造］  市販の微結晶セルロース（セオラス、ＰＨ−１０１、旭化成ケミカルズ社製））１．５質量部に純水１，０００質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２２０ＭＰａにて１５０回粉砕処理を行い、微結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＣ６）を得た。【００６７】  製造例６乃至製造例８で得られたセルロースナノファイバーについて、平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌを前述の手順に従い測定した。得られた結果並びに平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌより求めたアスペクト比（Ｌ／Ｄ）を示す。【表３】
0006512662.tif 000004
【００６８】［２倍濃度ＤＭＥＭ培養液の調製］  超純水５０ｍＬへ市販の高圧蒸気滅菌可能な粉末培地（日水製薬（株）製  ダルベッコ変法イーグル培地２）１００ｍＬ分を添加した。これを３０分程マグネチックスターラーを用いて撹拌して該粉末培地を水分散液に溶解させた後、１２１℃で１５分間高圧蒸気滅菌した。この溶液を室温まで冷却したのち、この溶液に市販のＬ−グルタミン溶液（和光純薬工業（株）製  ２００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｌ−グルタミン溶液（×１００））を終濃度４ｍＭとなるように添加し、さらに滅菌した１０質量％炭酸水素ナトリウム水溶液を１ｍＬ加えて２倍濃度ＤＭＥＭを調製した。この溶液から少量を取りだし、ｐＨ試験紙を使用して溶液のｐＨがおよそｐＨ７．０〜８．０であることを確認した。【００６９】［実施例１１：ＭＣ４を用いたｈＭＳＣの培養］  製造例６で得られたセルロースナノファイバー（ＭＣ４）の蒸気滅菌済み０．１質量％水分散液に、滅菌済みの２倍濃度ＤＭＥＭ（ペニシリン・ストレプトマイシンも２倍濃度）を等量混合して０．０５％の培養液を調整した。この培養液に１０％ＦＢＳとなるようにＦＢＳを加え、実施例１と同様の方法で低接着性アズノールディッシュ（アズワン社製）にｈＭＳＣの播種して培養を行い、細胞を回収し、そして未分化マーカーによる細胞の免疫染色を行った。【００７０】［実施例１２：ＭＣ５を用いたｈＭＳＣの培養］  製造例７で得られたセルロースナノファイバー（ＭＣ５）の蒸気滅菌済み０．１質量％水分散液に、滅菌済みの２倍濃度ＤＭＥＭ（ペニシリン・ストレプトマイシンも２倍濃度）を等量混合して０．０５％の培養液を調整した。この培養液に１０％ＦＢＳとなるようにＦＢＳを加え、実施例１と同様の方法で低接着性アズノールディッシュにｈＭＳＣを播種して培養を行い、細胞を回収し、そして未分化マーカーによる細胞の免疫染色を行った。【００７１】［実施例１３：ＭＣ６を用いたｈＭＳＣの培養］  製造例８で得られたセルロースナノファイバー（ＭＣ６）の蒸気滅菌済み０．１質量％水分散液に、滅菌済みの２倍濃度ＤＭＥＭ（ペニシリン・ストレプトマイシンも２倍濃度）を等量混合して０．０５％の培養液を調整した。この培養液に１０％ＦＢＳとなるようにＦＢＳを加え、実施例１と同様の方法で低接着性アズノールディッシュにｈＭＳＣを播種して培養を行い、細胞を回収し、そして未分化マーカーによる細胞の免疫染色を行った。【００７２】［対照試験：ＤＭＥＭを用いたｈＭＳＣ培養］  対照試験として、ｈＭＳＣをＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含む）で低接着性アズノールディッシュに播種したものを培養し、細胞の生死判定、培地の遠心分離による細胞の回収を行った。【００７３】［結果：細胞の回収率］  表４に実施例８乃至実施例１３及びＤＭＥＭ（ＮＦなし）を用いたｈＭＳＣ培養（対照試験）の細胞付着率及び細胞回収率を示す。  表４に示すように実施例８の０．０２質量％のＭＣ１を用いた培養では細胞無接着シャーレを用いた場合、４週間後で８３．４％の細胞を回収できるとする結果が得られた。実施例９及び実施例１０では、ＭＣ１の濃度をそれぞれ０．０１７％及び０．０１２５％と希薄な条件で培養を行ったが、いずれも６０〜８０％と高い細胞回収率が得��れた。  一方、工業スケール品ＭＣ４乃至ＭＣ６のシリーズにおいては、実施例１１のＭＣ４を用いた培養と実施例１３のＭＣ６を用いた培養では２週間後までの細胞回収率が４０％程度に止まったが、実施例１２のＭＣ５を用いた培養ではこれらのシリーズのうちで最も高い細胞回収率が得られ、２週間後で７２％、４週間後で５３％の細胞を回収できた。  これらの結果より、実施例１乃至実施例３及び実施例８乃至実施例１３の微結晶セルロース由来のナノファイバー分散溶液は特にｈＭＳＣの回収及び再播種の再生着に有効であることが理解できる。【表４】
0006512662.tif 000005
【００７４】［結果：休眠性確認］  図６に示すように、実施例１２の工業スケールＭＣ５を用いた分散培養後、４週間の時点でポジティブマーカーであるＳＴＲＯ−１、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５は対照試験と同程度の正常な発現を示した。  また図７に示すように、ネガティブマーカーであるＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５に関しても、対照試験と同程度の免疫染色蛍光強度を示し、ｈＭＳＣの性質を４週間培養後においてほぼ正常に保持していることが確認できた。【００７５】［結果：分化誘導能の確認］  最も高い細胞回収率を示した実施例８について、分散培養後に回収されたｈＭＳＣが多分化能を保持しているかどうかを確かめるため、段落［００６１］乃至［００６３］に記載の方法と同様に、ＭＳＣの幹細胞性保持の基準とされている脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞の３方向性分化能の有無を夫々調べた。  実施例８で培養したｈＭＳＣの脂肪細胞分化試験後、抗ＦＡＢＰ４抗体によるｈＭＳＣの免疫染色試験の結果（図８参照）及びオイルレッドＯ染色の結果（図９参照）を示す。  その結果、図８に示すように回収後、脂肪分化誘導を行ったｈＭＳＣではＦＡＢＰ４の顕著な発現を示すとともに、図９に示すように脂肪滴の蓄積が認められた（オイルレッドＯ染色）。これらより分散培養したｈＭＳＣの脂肪細胞分化能の保持が確認できた。  また、実施例８で培養したｈＭＳＣの骨細胞分化試験後のアザリンレッドＳ染色試験の結果（図１０参照）を示す。  図１０に示すように骨細胞分化誘導を行ったｈＭＳＣはアリザリンレッドにより強く染色されたことから、分散培養したｈＭＳＣの骨細胞分化誘導能の保持が確認できた。  さらに、実施例８で培養したｈＭＳＣの骨細胞分化試験３週間後及び４週間後の抗アグリカン抗体による免疫染色を行った（図１１及び図１２参照）。  図１１、１２に示すように３週間及び４週間の軟骨細胞分化誘導を行ったｈＭＳＣのではアグリカンの顕著な発現が認められ、軟骨細胞分化能の保持が確認できた。  以上により実施例８において回収されたｈＭＳＣは脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞の三方向性分化能を保持していることが確かめられた。
【図１】
0006512662.tif 000006
【図２】
0006512662.tif 000007
【図３】
0006512662.tif 000008
【図４】
0006512662.tif 000009
【図５】
0006512662.tif 000010
【図６】
0006512662.tif 000011
【図７】
0006512662.tif 000012
【図８】
0006512662.tif 000013
【図９】
0006512662.tif 000014
【図１０】
0006512662.tif 000015
【図１１】
0006512662.tif 000016
【図１２】
0006512662.tif 000017