(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法であって、
（１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を直接混合し混合物を調製する工程；及び
（２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法。
【請求項２】
１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法において、
（１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を直接混合し混合物を調製する工程；及び
（２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造するための方法であって、従来方法よりも簡便に当該基質溶液を製造することができる方法に関するものである。  また、本発明は、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造するための方法において、当該基質溶液の製造を簡略化することができる方法に関するものである。【０００２】  本発明は、臨床検査などの生命科学分野、並びに分析化学などの化学分野等において有用なものである。
【背景技術】
【０００３】  血清又は血漿中のリパーゼ活性は、急性膵炎、慢性膵炎又は膵臓癌等の膵疾患において上昇することから、これらの膵炎等のマーカーとして有用なものである。  このリパーゼは、長鎖脂肪酸の３分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド（ＴＧ）のα位（１位、３位）のエステル結合を加水分解して、２分子の脂肪酸及び１分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する酵素である。  この１分子のβ−モノグリセライドは、α型に異性化され、これがリパーゼの作用を受けて加水分解されてグリセロールと脂肪酸とになる。【０００４】  血清又は血漿中のリパーゼ活性の測定方法としては、次のような方法が知られていた（非特許文献１及び非特許文献２参照。）。  例えば、オリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、３７℃で２４時間反応させた後、リパーゼによる加水分解反応により生成した脂肪酸をアルカリで滴定するＣｈｅｒｒｙ−Ｃｒａｎｄａｌｌの方法が知られていた。  しかし、この方法は反応時間が長く、測定しようとするリパーゼの不活性化や反応阻害が著しい方法であった。【０００５】  また、トリオレイン又はオリーブ油のエマルジョンをリパーゼの基質として用い、このトリオレイン又はオリーブ油のエマルジョンを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる乳化ミセルの加水分解反応にともなって起こる反応液の濁度の減少からリパーゼ活性を測定するＶｏｇｅｌ−Ｚｉｅｖｅ法及びこの変法が知られていた。  しかし、これらの方法は、血清蛋白による阻害やリウマチ因子による凝集塊の干渉を受け、均一かつ安定なエマルジョンを作るのが難しく、再現性に乏しいという短所を有する方法であった。【０００６】  また、ＢＡＬＢ（２，３−ジメルカプト−１−プロパノール  三酪酸）をリパーゼの基質として用い、このＢＡＬＢを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる加水分解反応により生成したＢＡＬ（２，３−ジメルカプト−１−プロパノール）をＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸）と反応させて、生じたＴＮＢアニオンの黄色の発色を４１２ｎｍで測定することによってリパーゼ活性を測定する方法が知られていた。  しかし、この方法は、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。【０００７】  また、天然型基質である１，２−ジリノレオイルグリセロールをリパーゼの基質として用い、この１，２−ジリノレオイルグリセロールを血清試料等と接触させ、反応させて、リパーゼによる加水分解反応により生成したリノール酸が、コエンザイムＡ、ＮＡＤ＋及びＡＴＰの存在下で、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ、エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ−３−ケトアシル−ＣｏＡチオラーゼ複合酵素の共同作用によってβ−酸化を受ける際に起こるＮＡＤＨの生成速度を測定することによってリパーゼ活性を測定する方法が知られていた。  しかし、この方法も、高濃度の肝エステラーゼの存在下でその干渉を受けてしまうため、他の測定項目の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入する肝エステラーゼの影響を受けて測定値に誤差が生じるという短所を有する方法であった。【０００８】  前記の各測定方法に加えて、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕をリパーゼの基質として用いる血清又は血漿中のリパーゼ活性の測定方法が開発された（特許文献１及び非特許文献２参照。）。  この方法では、この１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル［以下、「ＤＧＧＭＲ」ということがある］を血清試料等と接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。  このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。  この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。  このＤＧＧＭＲをリパーゼの基質として用いるリパーゼ活性の測定方法は、測定が一連の反応で進むシンプルなものであり、かつ他の測定試薬から反応セル又はノズル（プローブ）を介して混入するエステラーゼの影響を受けにくいという長所を有する方法である。【０００９】  ところで、血清又は血漿等に含まれるリパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている（非特許文献２参照。）。  このため、従来、リパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液）を製造するに当っては、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化（乳化）した基質溶液となるよう、種々の方法が考えられてきたが、基質を界面活性剤を含む水溶液に混合したり、基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、基質含有液を溶液に噴射注入したり、基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又は基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理が必要であったり、又は特別な装置若しくは器具などの物等が必要であった。【００１０】  例えば、リパーゼの基質となるトリグリセライド等の非水溶性物質を非イオン性界面活性剤を含む水溶液に加え、撹拌しながら加熱し、一度非イオン性界面活性剤の曇点より高い温度に上げ、更に撹拌を続けながら曇点以下に冷却することを特徴とする、非水溶性物質の透明な可溶化水溶液の製造方法が開示された（特許文献２参照。）。【００１１】  また、非イオン性界面活性剤を含む水溶液を当該非イオン性界面活性剤の曇点以上に加熱し、これにトリグリ���ライドを加え撹拌を続けながら溶解して、トリグリセライドの均一かつ可溶（透明）化水溶液を調製し、これをリパーゼの基質とし、必要に応じてこれにリパーゼ機能促進物質を含有することを特徴とする透明なリパーゼ測定用トリグリセライド基質溶液が開示された（特許文献３参照。）。【００１２】  また、検体中のリパーゼ活性の測定に用いるための基質溶液を製造するための方法であって、トリグリセライド等の基質とＨＬＢが１０〜１６の非イオン性界面活性剤等の界面活性剤を混合する際に、メタノール又はエタノール等の水溶性有機溶媒を同時に混合し、混合方法として超音波などの振動を与えることを特徴とする、基質溶液のミセル径の幾何平均径が０．１７μｍ〜０．３８μｍであり、かつ、ミセル径分布の幾何標準偏差が０．２５μｍ以下である基質溶液等を製造する方法が開示された（特許文献４参照。）。【００１３】  そして、前記のＤＧＧＭＲをリパーゼの基質として用いるリパーゼ活性の測定方法においても、その基質溶液の製造においては、「ｂ）蒸留水６０ｍｌ中に撹拌下にタウロデソキシコール酸ナトリウム０．９ｇ及びコリパーゼ（豚から）０．３ｇを撹拌下に溶解する。良好な撹拌下に、ｎ−プロパノール１．７ｍｌ中の１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６−メチル−レゾルフィン−）エステル７０ｍｇの溶液を前記溶液中に噴射注入する。」［特許文献１の例２９］、又は「試薬２：  ０．６ｇのリパーゼ発色基質（例えば、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）エステル）を、９ｍｌの適切なアルコール（例えば、エタノール）に溶解した。１ｇの乳化剤（ｅｍｕｌｇａｔｏｒ）（例えば、Ｂｒｉｊ  ３５またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）を溶液に添加した。得られた油相（ｏｅｌｉｃ  ｐｈａｓｅ）を注射針に吸い取り、高圧下で細いカニューレ（内径０．１５〜１．０ｍｍ）に通して撹拌中の水溶液中へ押出した。」［特許文献５の実施例３］と、有機溶媒であるアルコールを用い、かつ基質含有液を溶液に噴射注入（高圧下での注入）する処理を必要とするものであった。【００１４】  なお、また、ＤＧＧＭＲ等のリパーゼの基質と共に、陰イオン界面活性剤、レシチン及びコレステロールエステルから選ばれた少なくとも一種のリパーゼ基質可溶化剤を含むリパーゼ分析用基質溶液が、当該基質に対してその活性をほとんど低下させることなく、高度に可溶化することが可能であるとの効果を奏するものとして開示された（特許文献６参照。）。  そして、この文献には、前記のリパーゼ基質可溶化剤に替えて、０．１重量％の非イオン性界面活性剤を添加して用いた場合には、「濁りが有って、測定に支障あり」という結果になったことが記載されている。【００１５】  また、ＤＧＧＭＲ等のリパーゼの基質と、リパーゼ基質可溶化剤としての１，２−ジフタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンとを少なくとも含有することを特徴とする酵素活性測定用リパーゼ基質溶液が、溶液の透明度が高く、このため精度よくリパーゼ活性の測定が可能であり、かつ保存安定性が大きい等の効果を奏するものとして開示された（特許文献７参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】特開昭６１−２５４１９７号公報
【特許文献２】特開昭５８−１５６３３０号公報
【特許文献３】特開昭６３−１８８３９８号公報
【特許文献４】特開２００６−１８０７４１号公報
【特許文献５】特表平１１−５０４５２９号公報
【特許文献６】特開平９−２１５５００号公報
【特許文献７】特開平１１−３１８４９４号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】臨床検査法提要，第３０版，第６７０頁〜第６７４頁，金井正光編著，金原出版，１９９３年８月２０日発行
【非特許文献２】臨床検査法提要，第３３版，第５４５頁〜第５４７頁，金井正光監修，金原出版，２０１０年４月１日発行
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】  前記の通り、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造に当っては、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理が必要であったり、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とするものであった。【００１９】  これに対して、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法において、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要としない、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法を提供することである。  また、本発明の課題は、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を製造するための方法において、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要としない、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】  本発明者らは、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法について検討を重ねたところ、ＤＧＧＭＲと、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物［以下、「本重合体化合物」ということがある］とを混合し、その混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合することにより、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２１】  本発明の要旨は以下の通りである。〔１〕  １，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法であって、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法。〔２〕  １，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法において、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法。
【発明の効果】
【００２２】  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することができる方法である。  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法は、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液の製造を簡略化することができる方法である。【００２３】  従って、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法、及びリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法を用いた場合は、簡便、短時間、かつ低コストにより、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することが可能となった。【００２４】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法、及びリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法においては、煩雑な又は熟練を要する等の特別な処理が必要でなくなったため、製造したリパーゼ活性測定用基質溶液が規格を外れた不良品となる可能性が小さくなり、正確な測定結果（測定値）を得ることができるリパーゼ活性測定用基質溶液を低コストかつ確実に医療機関等に提供することができるようになった。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬による測定値と、対照市販試薬による測定値との相関を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】〔１〕リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法１．総論（Ａ）総論  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕をリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造するための方法であって、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とするものである。
【００２７】  そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、この（１）及び（２）の工程を含むものであることより、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することができる。
【００２８】（Ｂ）側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを用いる態様  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを用いる次の態様を含むものである。  「１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法であって、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法。」
【００２９】（Ｃ）ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を用いる態様  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を用いる次の態様を含むものである。  「１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法であって、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法。」
【００３０】２．リパーゼ  本発明において、リパーゼは、リパーゼとしての活性、すなわちリパーゼ活性を有するものであればよく、このリパーゼ活性を有するものであれば特に限定はない。
【００３１】  本発明において、リパーゼとしては、例えば、長鎖脂肪酸の３分子がそれぞれグリセロールにエステル結合したトリグリセライド（ＴＧ）のα位（１位、３位）のエステル結合を加水分解して、２分子の脂肪酸及び１分子のβ−モノグリセライドを生成する反応を触媒する膵リパーゼ［ＥＣ  ３．１．１．３］等を挙げることができる。
【００３２】  本発明は、体液、臓器又は組織に存在するリパーゼの活性測定にとって好適であり、体液に存在するリパーゼの活性測定にとってより好適であり、血液、血清又は血漿に存在するリパーゼの活性測定にとって更に好適であり、血清又は血漿に存在するリパーゼの活性測定にとって特に好適である。
【００３３】  また、本発明は、膵リパーゼの活性測定にとって好適である。
【００３４】３．試料  本発明において、リパーゼの活性を測定する試料は、前記のリパーゼを含む可能性がある試料であればよく、前記のリパーゼを含む可能性があるものであれば特に限定されない。  この試料としては、例えば、ヒト若しくは動物又は植物に由来する試料等を挙げることができる。
【００３５】  ヒト若しくは動物に由来する試料としては、特に限定されず、例えば、ヒト或いは動物の、血液、血清、血漿、尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、若しくは羊水などの体液；大便などの排泄物；膵臓、肝臓、若しくは胃などの臓器；毛髪、皮膚、爪、筋肉、若しくは神経などの組織；又は細胞等を挙げることができる。
【００３６】  本発明は、ヒト又は動物に由来する試料を試料とする場合に好適であり、ヒトに由来する試料を試料とする場合に特に好適である。
【００３７】  また、本発明は、体液、臓器又は組織を試料とする場合に好適であり、体液を試料とする場合により好適であり、血液、血清又は血漿を試料とする場合に更に好適であり、血清又は血漿を試料とする場合に特に好適である。
【００３８】  なお、本発明において、試料は、液体である場合に好適であるので、もし試料が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理等の前処理を既知の方法に従って行い、液体試料とすればよい。  また、試料は、必要に応じて、希釈又は濃縮処理等を行ってもよい。
【００３９】４．リパーゼ活性測定用基質  本発明において、試料中に含まれるリパーゼの活性の測定に使用するためのリパーゼの基質、すなわちリパーゼ活性測定用基質は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕である。
【００４０】  本発明においては、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲを試料と接触させ、試料中に含まれるリパーゼと反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、ＤＧＧＭＲより１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。  このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。  本発明においては、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めることができる。
【００４１】  なお、ＤＧＧＭＲは、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］、又はシグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社［日本国］等より市販されている。
【００４２】５．本重合体化合物（１）総論  前記の通り、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法においては、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物（本重合体化合物）を混合し混合物を調製する工程、及びこの混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含む。
【００４３】（２）側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル  本発明において用いる、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル［以下、「本変性シリコーンオイル」ということがある］について、以下説明する。
【００４４】  シリコーン化合物は、シロキサン結合〔−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−〕が主鎖であって、側鎖としてメチル基〔ＣＨ３−〕等の有機基がケイ素原子に結合した重合体化合物である。  そして、直鎖状のシリコーン化合物がシリコーンオイルである。
【００４５】  なお、変性シリコーンオイルは、直鎖状のジメチルシリコーン化合物〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕の一部のケイ素原子に有機基を導入した化合物である。  この変性シリコーンオイルとしては、ポリシロキサンの側鎖の一部、ポリシロキサンのどちらか片方の末端、ポリシロキサンの両方の末端、又はポリシロキサンの側鎖の一部と両方の末端に、各種の有機基を導入したシリコーンオイルが存在する。
【００４６】  この内、ポリシロキサンの側鎖の一部に各種の有機基を導入したシリコーンオイルが、側鎖型の変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕である。
【００４７】  なお、この導入する有機基の性質によって、変性シリコーンオイルは、反応性シリコーンオイルと非反応性シリコーンオイルに分類される。
【００４８】  この内、非反応性の変性シリコーンオイルとしては、その導入有機基により、ポリエーテル変性タイプ、アラルキル変性タイプ、フロロアルキル変性タイプ、長鎖アルキル変性タイプ、高級脂肪酸エステル変性タイプ、高級脂肪酸アミド変性タイプ、ポリエーテル・長鎖アルキル・アラルキル変性タイプ、長鎖アルキル・アラルキル変性タイプ、又はフェニル変性タイプ等を挙げることができる。
【００４９】  そして、側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕としては、その変性タイプが、例えば、ポリエーテル変性タイプのもの〔有機基：−Ｒ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲ’〕、ポリエーテル・長鎖アルキル・アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−Ｒ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲ’、−ＣａＨ２ａ＋１、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ６Ｈ５〕、アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ６Ｈ５〕、フロロアルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣＨ２ＣＨ２ＣＦ３〕、長鎖アルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣａＨ２ａ＋１〕、長鎖アルキル・アラルキル変性タイプのもの〔有機基：−ＣａＨ２ａ＋１、−ＣＨ２−ＣＨ（ＣＨ３）−Ｃ６Ｈ５〕、高級脂肪酸エステル変性タイプのもの〔有機基：−ＯＣＯＲ〕、高級脂肪酸アミド変性タイプのもの〔有機基：−ＲＮＨＣＯＲ’〕、又はフェニル変性タイプのもの〔有機基：−Ｃ６Ｈ５〕等を挙げることができる。
【００５０】  本発明においては、この側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル〔Ｓｉ（ＣＨ３）３−Ｏ−［Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｏ−］ｍ−［Ｓｉ（ＣＨ３）（有機基）−Ｏ−］ｎ−Ｓｉ（ＣＨ３）３〕［有機基：−Ｒ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂＲ’］を用いる。（又は、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を用いる。）
【００５１】  この側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルとしては、例えば、「ＫＦ−３５１Ａ」、「ＫＦ−３５４Ｌ」、「ＫＦ−３５５Ａ」、又は「ＫＦ−６０１１」［販売元はいずれの製品も信越化学工業株式会社（日本国）］等が市販されている。
【００５２】（３）ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物  本発明において用いる、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物［以下、「本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物」ということがある］について、以下説明する。
【００５３】  本発明においては、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物〔ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ−（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ−（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ｃＨ〕を用いる。（又は、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを用いる。）
【００５４】  このポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物（本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物）としては、例えば、ポリオキシエチレン（１６）ポリオキシプロピレングリコール（１７）〔医薬部外品原料規格名：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（１６Ｅ．Ｏ．）（１７Ｐ．Ｏ．）〕、又はポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレングリコール（２０）〔医薬部外品原料規格名：ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（２０Ｅ．Ｏ．）（２０Ｐ．Ｏ．）〕等を挙げることができる。
【００５５】  この本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物としては、例えば、ポリオキシエチレン（１６）ポリオキシプロピレングリコール（１７）［製品名：「プルロニック  Ｌ−３４」、販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ（日本国）］、又はポリオキシエチレン（２０）ポリオキシプロピレングリコール（２０）［製品名：「プルロニック  Ｌ−４４」、販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ（日本国）］等が市販されている。
【００５６】６．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程（１）総論  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物（本重合体化合物）を混合し混合物を調製する工程を含む。
【００５７】  なお、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕については、前記「４．リパーゼ活性測定用基質」において記載した通りである。  また、「側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物」（本重合体化合物）については、前記「５．本重合体化合物」において記載した通りである。
【００５８】（２）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程においては、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲと本重合体化合物を混合する。  すなわち、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と、本重合体化合物とを、直接混合する。
【００５９】  従来は、使用する界面活性剤を水又は水溶液と混合し、その後、これとリパーゼ活性測定用基質を混合していた。
【００６０】  しかしながら、本発明は、このような従来の方法とは異なり、リパーゼ活性測定用基質であるＤＧＧＭＲと本重合体化合物を直接混合するという特徴的な工程を有する方法である。
【００６１】  なお、本発明において、本重合体化合物は、１種類のものをリパーゼ活性測定用基質と混合してもよく、又は複数種類のものをリパーゼ活性測定用基質と混合してもよい。
【００６２】（３）リパーゼ活性測定用基質の混合量  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程において、このリパーゼ活性測定用基質を混合する量は、特に限定されない。  なお、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕は、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」における当該水又は水溶液との混合（以下、「第２混合」ということがある）の後に、その濃度が０．０５ｍＭ以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【００６３】  なお、第２混合の後（第２混合後）、このリパーゼ活性測定用基質の好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。
【００６４】  また、このリパーゼ活性測定用基質の濃度であるが、第２混合後、前記の目的の上から、２ｍＭ以下であることが好ましい。
【００６５】  なお、第２混合後、このリパーゼ活性測定用基質の好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１ｍＭ以下であり、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。
【００６６】  第２混合後の本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の好ましい濃度は、以上述べた通りである。  本発明においては、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と、本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程」における当該リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物との混合（以下、「第１混合」ということがある）の時の当該リパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物それぞれの混合量を、第２混合後にリパーゼ活性測定用基質の濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
【００６７】  なお、このリパーゼ活性測定用基質の混合量及び濃度であるが、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【００６８】（ａ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとした場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【００６９】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【００７０】  なお、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【００７１】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【００７２】  よって、この場合の第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量Ｗｓ［単位：グラム］は次のように表すことができる。
【００７３】    Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×ＭＷｓ）÷１０６
【００７４】    すなわち、Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×７５２．０５）÷１０６
【００７５】（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【００７６】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）×（Ａ÷１００）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【００７７】  なお、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【００７８】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【００７９】  よって、この場合の第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量Ｗｓ［単位：グラム］は次のように表すことができる。
【００８０】    Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×ＭＷｓ）÷（Ａ×１０４）
【００８１】    すなわち、Ｗｓ＝（Ｃｓ×Ｖｆ×７５２．０５）÷（Ａ×１０４）
【００８２】（４）本重合体化合物の混合量  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程において、この本重合体化合物を混合する量は、特に限定されない。  なお、本発明における本重合体化合物は、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程」における当該水又は水溶液との混合（第２混合）の後に、その濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）以上であることが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【００８３】  なお、第２混合の後（第２混合後）、この本重合体化合物の好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
【００８４】  また、この本重合体化合物の濃度であるが、第２混合後、前記の目的の上から、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。
【００８５】  なお、第２混合後、この本重合体化合物の好ましい濃度は、前記の目的の上から、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【００８６】  第２混合後の本発明における本重合体化合物の好ましい濃度は、以上述べた通りである。  本発明においては、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と、本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程」における当該リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物との混合（第１混合）の時の当該リパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物それぞれの混合量を、第２混合後に本重合体化合物の濃度が上記の通りになるように、考慮の上決めてもよく、このようにすることが、その製造手順の上から好ましい。
【００８７】  なお、この本重合体化合物の混合量及び濃度であるが、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【００８８】（ａ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させる本重合体化合物の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とした場合、第２混合後の本重合体化合物の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【００８９】    Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｖｆ
【００９０】  よって、この場合の第１混合時に混合させる本重合体化合物の混合量Ｗｐ［単位：グラム］は次のように表すことができる。
【００９１】    Ｗｐ＝（Ｃｐ×Ｖｆ）÷１００
【００９２】（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させる本重合体化合物の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後の本重合体化合物の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【００９３】    Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）×（Ａ÷１００）÷Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｖｆ
【００９４】  よって、この場合の第１混合時に混合させる本重合体化合物の混合量Ｗｐ（単位：グラム）は次のように表すことができる。
【００９５】    Ｗｐ＝（Ｃｐ×Ｖｆ）÷Ａ
【００９６】（５）混合の方法  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程において、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物とを混合する方法は、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
【００９７】  なお、本発明における当該混合においては、リパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等は必要なく、一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、通常の方法で混合すればよく、これによりリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物を調製することができる。
【００９８】（６）混合時の温度  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程において、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物とを混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる本重合体化合物の曇点付近の温度又はこの曇点付近の温度以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【００９９】  なお、曇点は、非イオン性の界面活性剤等の水溶液の温度を上げていった場合にその界面活性剤等のミセルが形成できなくなる温度であり、その水溶液が白濁する温度であって、その界面活性剤等毎に異なるものである。
【０１００】  また、本発明において、本重合体化合物の曇点付近の温度としては、その本重合体化合物の曇点の温度のプラスマイナス（±）２５℃の範囲を意味する。  この本重合体化合物の曇点付近の温度としては、その本重合体化合物の曇点の温度のプラスマイナス（±）１５℃の範囲が好ましく、プラスマイナス（±）１０℃の範囲がより好ましく、プラスマイナス（±）５℃の範囲が特に好ましい。
【０１０１】  そして、本発明においては、上記の本重合体化合物の曇点付近の温度以下の温度において、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程を行うことも好ましい。
【０１０２】  なお、例えば、本変性シリコーンオイルである、ＫＦ−３５１Ａの曇点は５２℃（自己実測値）であり、ＫＦ−３５５Ａの曇点は６７℃（自己実測値）であり、そして、ＫＦ−６０１１の曇点は６４℃（自己実測値）である  なお、ＫＦ−３５４Ｌは、曇点の測定に使用した恒温水槽の設定温度の上限の７７℃においても曇点に至らなかったので、これの曇点は７７℃超である。
【０１０３】  また、例えば、本ＰＯＥ・ＰＯＰ縮合物である、プルロニック  Ｌ−３４の曇点は６５℃（自己実測値）であり、そして、プルロニック  Ｌ−４４の曇点は６７℃（自己実測値）である。
【０１０４】  前記のリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程は、前記の目的の上から、用いる本重合体化合物の曇点の温度のプラスマイナス２５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが好ましく、用いる本重合体化合物の曇点の温度のプラスマイナス１５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことがより好ましく、用いる本重合体化合物の曇点の温度のプラスマイナス１０℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが更に好ましく、そして、用いる本重合体化合物の曇点の温度のプラスマイナス５℃の範囲の温度若しくはこの範囲の温度以下の温度で行うことが特に好ましい。
【０１０５】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程において、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物とを混合する時の温度であるが、この工程を、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕、及び用いる本重合体化合物それぞれの融点以上の温度において行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０１０６】  そして、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程は、前記の目的の上から、２℃以上で行うことがより好ましく、５℃以上で行うことが更に好ましく、１０℃以上で行うことが特に好ましい。
【０１０７】（７）混合の時間  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程において、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物とを混合する時間であるが、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物とが均質に混合されればよく、特に限定されない。  通常は、この混合を、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から、この混合を５分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、５分間で十分である。
【０１０８】  また、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物とを混合する時間は、特に上限はなく、例えば数時間混合しても構わないのであるが、時間もコストであるという観点から考えると、念入りに行うとしても通常は１０分間以内でよい。
【０１０９】７．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物を水又は水溶液と混合する工程（１）総論  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法は、「リパーゼ活性測定用基質（ＤＧＧＭＲ）と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物（本重合体化合物）を混合し混合物を調製する工程」において調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程を含む。
【０１１０】  なお、リパーゼ活性測定用基質については、前記「４．リパーゼ活性測定用基質」において記載した通りである。  また、本重合体化合物については、前記「５．本重合体化合物」において記載した通りである。  そして、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製することについては、前記「６．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程」において記載した通りである。
【０１１１】（２）水又は水溶液  本発明の、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、この水又は水溶液については、特に限定はない。
【０１１２】  この水としては、特に限定はないが、例えば、純水、蒸留水又は精製水等を挙げることができる。
【０１１３】  また、この水溶液としては、水を溶媒とするものであればよく、特に限定はないが、例えば、リパーゼ賦活化剤、リパーゼ活性化剤、コリパーゼ、及び緩衝剤からなる群から選ばれる少なくとも一つのもの等を含有する水溶液等を挙げることができる。
【０１１４】（ａ）リパーゼ賦活化剤  本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ賦活化剤としては、リパーゼを賦活化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、胆汁酸若しくはその塩等を挙げることができる。
【０１１５】  この胆汁酸としては、例えば、デオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、コール酸、リトコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、７−オキソリトコール酸、１２−オキソリトコール酸、１２−オキソケノデオキシコール酸、７−オキソデオキシコール酸、ヒオコール酸、ヒオデオキシコール酸、デヒドロコール酸、又はコール酸誘導体等を挙げることができる。
【０１１６】  また、この胆汁酸の塩としては、例えば、胆汁酸とアルカリ金属若しくはアルカリ土類金属との塩又はアンモニウム塩等を挙げることができる。  このアルカリ金属としては、例えば、カリウム、ナトリウム又はリチウム等を挙げることができ、また、このアルカリ土類金属としては、例えば、マグネシウム又はカルシウム等を挙げることができる。
【０１１７】  本発明において、リパーゼ賦活化剤としては、そのリパーゼ賦活化能、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面の形成能力、水溶性、及びコストの点から、胆汁酸又はその塩が好ましい。
【０１１８】  そして、胆汁酸としては、リパーゼ活性測定用基質が安定な酸性域において溶解可能な点でタウロデオキシコール酸が好ましく、また、コストの点からデオキシコール酸が好ましい。  この胆汁酸としては、タウロデオキシコール酸が特に好ましい。
【０１１９】  そして、胆汁酸の塩としては、胆汁酸とアルカリ金属の塩が好ましく、胆汁酸のカリウム塩又はナトリウム塩がより好ましく、胆汁酸のナトリウム塩が特に好ましい。
【０１２０】  よって、胆汁酸の塩としては、デオキシコール酸又はタウロデオキシコール酸のアルカリ金属（カリウム若しくはナトリウム等）の塩が好ましく、タウロデオキシコール酸のアルカリ金属（カリウム又はナトリウム等）の塩がより好ましく、タウロデオキシコール酸のナトリウム塩が特に好ましい。
【０１２１】  なお、本発明において、リパーゼ賦活化剤は、前記の「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部と、水又は水溶液との混合」（第２混合）の後、その濃度が０．２％（ｗ／ｖ）以上であることが好ましい。
【０１２２】  なお、第２混合後、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは０．４％（ｗ／ｖ）以上であり、特に好ましくは１％（ｗ／ｖ）以上である。
【０１２３】  また、このリパーゼ賦活化剤の濃度であるが、第２混合後、２０％（ｗ／ｖ）以下であることが好ましい。
【０１２４】  なお、第２混合後、このリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１２５】  本発明における、第２混合後のリパーゼ賦活化剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。  本発明においては、第２混合後のリパーゼ賦活化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「リパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ賦活化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０１２６】（ｂ）リパーゼ活性化剤  本発明において、前記の水溶液に含有させることができるリパーゼ活性化剤としては、リパーゼを活性化することができる物質であればよく、特に限定はないが、例えば、アルカリ土類金属イオン若しくはその塩等を挙げることができる。
【０１２７】  このアルカリ土類金属イオン又はその塩としては、例えば、ベリリウムイオン若しくはベリリウム塩、マグネシウムイオン若しくはマグネシウム塩、又はカルシウムイオン若しくはカルシウム塩等を挙げることができる。
【０１２８】  このカルシウム塩としては、例えば、水溶性のカルシウム塩等を挙げることができ、より具体的には、１価又は２価以上の陰イオンとカルシウムイオンよりなる塩であって水溶性であるもの等を挙げることができる。
【０１２９】  なお、この陰イオンとしては、例えば、ハロゲンイオン、有機化合物よりなる酸基、又はその他の無機化合物よりなる酸基等を挙げることができる。
【０１３０】  そして、ハロゲンイオンとしては、例えば、フッ素イオン、又は塩素イオン等を挙げることができる。
【０１３１】  有機化合物よりなる酸基としては、例えば、酢酸イオン、クエン酸イオン、又はグルコン酸イオン等を挙げることができる。
【０１３２】  その他の無機化合物よりなる酸基としては、例えば、硫酸イオン、リン酸イオン、又は炭酸イオン、等を挙げることができる。
【０１３３】  本発明において、リパーゼ活性化剤としては、アルカリ土類金属イオン又はその塩が好ましい。
【０１３４】  なお、アルカリ土類金属イオン又はその塩としては、次の（ｉ）及び（ｉｉ）の点から、カルシウムイオン又はカルシウム塩が好ましい。  （ｉ）  リパーゼの活性化能  （ｉｉ）  リパーゼの触媒作用を受けることによりリパーゼ活性測定用基質から遊離した脂肪酸は、リパーゼ活性測定用基質よりなる界面を壊すが、カルシウムイオン又はカルシウム塩はこの遊離した脂肪酸を捕捉し、当該界面が壊れるのを抑制することができる。
【０１３５】  そして、このカルシウム塩としては、陰イオンとカルシウムイオンよりなる塩であって水溶性であるものが好ましい。
【０１３６】  そして、この陰イオンとしては、ハロゲンイオン又は有機化合物よりなる酸基が好ましい。より具体的には、塩素イオン又は酢酸イオンが特に好ましい。
【０１３７】  よって、カルシウム塩としては、ハロゲンイオンとのカルシウム塩又は有機化合物よりなる酸基のカルシウム塩が好ましく、より具体的には、塩化カルシウム又は酢酸カルシウムが特に好ましい。
【０１３８】  なお、本発明において、リパーゼ活性化剤は、前記の「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部と、水又は水溶液との混合」（第２混合）の後、その濃度が０．１ｍＭ以上であることが好ましい。
【０１３９】  なお、第２混合後、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは１ｍＭ以上であり、特に好ましくは５ｍＭ以上である。
【０１４０】  また、このリパーゼ活性化剤の濃度であるが、第２混合後、１００ｍＭ以下であることが好ましい。
【０１４１】  なお、第２混合後、このリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、より好ましくは５０ｍＭ以下であり、特に好ましくは２５ｍＭ以下である。
【０１４２】  本発明における、第２混合後のリパーゼ活性化剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。  本発明においては、第２混合後のリパーゼ活性化剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の「リパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にリパーゼ活性化剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０１４３】（ｃ）コリパーゼ  本発明において、水溶液に含有させることができるコリパーゼとしては、コリパーゼの作用、機能又は活性を有しているものであればよく、特に限定はないが、例えば、ヒト、若しくはブタなどの哺乳類由来のコリパーゼ又は遺伝子工学等を用いて調製、修飾若しくは改変されたコリパーゼ等を挙げることができる。
【０１４４】  本発明において、コリパーゼとしては、ブタなどの哺乳類由来のコリパーゼが好ましく、ブタなどの哺乳類の膵臓由来のコリパーゼがより好ましい。
【０１４５】  なお、本発明において、コリパーゼは、前記の「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部と、水又は水溶液との混合」（第２混合）の後、その活性値が１５Ｋ単位／Ｌ（１５Ｋ Ｕｎｉｔ／Ｌ）以上であることが好ましい。
【０１４６】  なお、第２混合後、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは１５０Ｋ単位／Ｌ以上であり、特に好ましくは７５０Ｋ単位／Ｌ以上である。
【０１４７】  また、このコリパーゼの活性値であるが、第２混合後、７，５００Ｋ単位／Ｌ以下であることが好ましい。
【０１４８】  なお、第２混合後、このコリパーゼの好ましい活性値は、より好ましくは３，７５０Ｋ単位／Ｌ以下であり、特に好ましくは２，２５０Ｋ単位／Ｌ以下である。
【０１４９】  本発明における、第２混合後のコリパーゼの好ましい活性値は、以上述べた通りである。  本発明においては、第２混合後のコリパーゼの活性値が上記の活性値となるよう、前記の「リパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物の混合物」と前記水溶液との混合比率等を勘案した上で、当該水溶液にコリパーゼを適当な活性値で含有させることが好ましい。
【０１５０】  なお、上記のコリパーゼの各活性値（単位／Ｌ）は、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］のブタ膵臓由来のコリパーゼの活性値の表示に基づくものである。［１ｍｇ／Ｌ＝７５Ｋ単位／Ｌ］
【０１５１】  なお、コリパーゼは、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］、又はシグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社［日本国］等より市販されている。
【０１５２】（ｄ）ｐＨ  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕は、ｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定である。  よって、前記の「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部と、水又は水溶液との混合」（第２混合）の後、そのｐＨはｐＨ４を中心とする一定の範囲内のものであることが好ましい。
【０１５３】  具体的には、第２混合後のｐＨは、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の安定性の点から、ｐＨ２〜ｐＨ７の範囲内にあることが好ましく、ｐＨ３〜ｐＨ５の範囲内にあることがより好ましく、そして、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５の範囲内にあることが特に好ましい。（前記のｐＨ値はいずれも２０℃での値である。）
【０１５４】  本発明における、第２混合後のｐＨは、以上述べた通りである。  本発明においては、第２混合後のｐＨが上記のｐＨとなるよう、前記水溶液のｐＨを適当なｐＨにすることが好ましい。
【０１５５】（ｅ）緩衝剤  本発明においては、前記の「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部と、水又は水溶液との混合」（第２混合）の後のｐＨを、前記（ｄ）に記載のｐＨ範囲に保つため、前記のｐＨ範囲に緩衝能を有する緩衝剤を前記水溶液に適宜含有させてもよい。
【０１５６】  本発明において、前記の水溶液に含有させることができる緩衝剤としては、特に限定はないが、例えば、酒石酸、コハク酸、マロン酸、若しくはクエン酸などの有機酸、又はグリシン、若しくはリン酸、或いはこれらの塩等を挙げることができる。
【０１５７】  そして、本発明において、この緩衝剤を含有する水溶液（すなわち、緩衝液）における緩衝剤の濃度は、特に限定はなく、設定するｐＨの範囲において緩衝能を発揮することができる濃度であればよい。
【０１５８】  例えば、第２混合後、この緩衝剤の濃度は、好ましくは５ｍＭ以上であり、より好ましくは１０ｍＭ以上であり、特に好ましくは３０ｍＭ以上である。
【０１５９】  また、この緩衝剤の濃度は、第２混合後、好ましくは５００ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であり、特に好ましくは５０ｍＭ以下である。
【０１６０】  本発明における、第２混合後の緩衝剤の好ましい濃度は、以上述べた通りである。  本発明においては、第２混合後の緩衝剤の濃度が上記の濃度となるよう、前記の水溶液に緩衝剤を適当な濃度で含有させることが好ましい。
【０１６１】（３）リパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物の混合物の水又は水溶液との混合  本発明における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程においては、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する。
【０１６２】  従来は、使用する界面活性剤を水又は水溶液と混合し、その後、これとリパーゼ活性測定用基質を混合していた。
【０１６３】  しかしながら、本発明は、このような従来の方法とは異なり、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を直接混合し、これにより調製したリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合するという特徴的な工程を有する方法である。
【０１６４】  ところで、本発明における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程であるが、特に限定はなく、例えば、「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物」の全部又は一部を「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は「水又は水溶液」を「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物」の全部又は一部へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。
【０１６５】  なお、本発明において、前記のリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物と、前記の水又は水溶液との混合の比率は、特に限定はなく適宜定めればよい。
【０１６６】  なお、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物と、水又は水溶液との混合については、例えば、次の（ｉ）及び（ｉｉ）のように考えることができる。
【０１６７】（ｉ）リパーゼ活性測定用基質の濃度の面から  前記の６の（３）に詳述した通り、第２混合後、リパーゼ活性測定用基質の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは０．０５ｍＭ以上であり、より好ましくは０．１ｍＭ以上であり、そして、特に好ましくは０．２ｍＭ以上である。  また、これも前記の６の（３）に詳述した通り、第２混合後、リパーゼ活性測定用基質の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは２ｍＭ以下であり、より好ましくは１ｍＭ以下であり、そして、特に好ましくは０．８ｍＭ以下である。
【０１６８】  そして、このリパーゼ活性測定用基質の好ましい濃度と、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量との関係は、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【０１６９】（ａ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そしてリパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとした場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【０１７０】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【０１７１】  なお、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【０１７２】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【０１７３】  よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０１７４】    Ｖｆ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｃｓ×ＭＷｓ）
【０１７５】    すなわち、Ｖｆ＝（Ｗｓ×１０６）÷（Ｃｓ×７５２．０５）
【０１７６】  従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望するリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０１７７】（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させるリパーゼ活性測定用基質の混合量をＷｓ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、リパーゼ活性測定用基質の分子量をＭＷｓとし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後のリパーゼ活性測定用基質の濃度Ｃｓ［単位：ｍＭ］は次の式で表すことができる。
【０１７８】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×１０６）×（Ａ÷１００）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×ＭＷｓ）
【０１７９】  なお、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の分子量ＭＷｓは７５２．０５であるので、上記の式は次のようになる。
【０１８０】    Ｃｓ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｖｆ×７５２．０５）
【０１８１】  よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０１８２】    Ｖｆ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｃｓ×ＭＷｓ）
【０１８３】    すなわち、Ｖｆ＝（Ｗｓ×Ａ×１０４）÷（Ｃｓ×７５２．０５）
【０１８４】  従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望するリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０１８５】（ｉｉ）本重合体化合物の濃度の面から  前記の６の（４）に詳述した通り、第２混合後、本重合体化合物の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは０．０１％（ｗ／ｖ）以上であり、より好ましくは０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、そして、特に好ましくは０．１％（ｗ／ｖ）以上である。
【０１８６】  また、これも前記の６の（４）に詳述した通り、第２混合後、本重合体化合物の好ましい濃度は、前記の目的の上から、好ましくは２０％（ｗ／ｖ）以下であり、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）以下であり、そして、特に好ましくは５％（ｗ／ｖ）以下である。
【０１８７】  そして、この本重合体化合物の好ましい濃度と、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量との関係は、例えば、次の（ａ）又は（ｂ）などのように考えることができる。
【０１８８】（ａ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させる本重合体化合物の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とした場合、第２混合後の本重合体化合物の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【０１８９】    Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｖｆ
【０１９０】  よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０１９１】    Ｖｆ＝（Ｗｐ×１００）÷Ｃｐ
【０１９２】  従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望する本重合体化合物の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０１９３】（ｂ）リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の一部を水又は水溶液と混合する場合  第１混合時に混合させる本重合体化合物の混合量をＷｐ［単位：グラム］とし、第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］とし、そして第１混合時の混合物のＡ％（重量又は容量）を第２混合時に水又は水溶液と混合した場合、第２混合後の本重合体化合物の濃度Ｃｐ［単位：％（ｗ／ｖ）］は次の式で表すことができる。
【０１９４】    Ｃｐ＝（Ｗｐ×１００）×（Ａ÷１００）÷Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｖｆ
【０１９５】  よって、この場合の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］は、次のように表すことができる。
【０１９６】    Ｖｆ＝（Ｗｐ×Ａ）÷Ｃｐ
【０１９７】  従って、上記の式により求めた容量Ｖｆ［単位：ｍＬ］になるよう、第２混合時に水又は水溶液を混合することにより、希望する本重合体化合物の濃度のリパーゼ活性測定用基質溶液を得ることができる。
【０１９８】  なお、本発明における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、二段階以上の複数の段階（ステップ）によって行ってもよい。  なお、このように、この工程を複数の段階（ステップ）によって行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０１９９】  この工程を複数の段階によって行う方法であるが、これは当該工程を複数の段階によって行うものであればよく、特に限定はないが、例えば、次の〔Ａ〕及び〔Ｂ〕の段階によって行うもの等を挙げることができる。
【０２００】〔Ａ〕  リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、一定量の水又は水溶液と混合する段階〔Ｂ〕  前記〔Ａ〕の段階における当該混合物（リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階
【０２０１】  なお、この場合、前記〔Ａ〕の段階において「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部」と混合する「水又は水溶液」の容量（一定量）をＶａ［単位：ｍＬ］とし、前記〔Ｂ〕の段階において当該混合液に「更に一定量の水又は水溶液」を混合した後の最終的な容量［すなわち、前記の第２混合時に水又は水溶液を混合した後の最終的な容量］（メスアップ後の容量等）をＶｆ［単位：ｍＬ］としたとき、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）は、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から、１〜５００の範囲にあることが好ましい。
【０２０２】  すなわち、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）が１〜５００の範囲内になるように、前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することが、前記の目的の上から好ましい。
【０２０３】  なお、同様に、前記の目的の上から、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）は、２〜２００の範囲にあることがより好ましく、５〜１００の範囲にあることが特に好ましい。
【０２０４】  すなわち、前記の目的の上から、ＶａによりＶｆを除した比の値（Ｖｆ／Ｖａ）が、２〜２００の範囲内になるように前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することがより好ましく、５〜１００の範囲内になるように前記のＶａ及びＶｆの値（容量）を選択することが特に好ましい。
【０２０５】  なお、前記〔Ａ〕の「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、一定量の水又は水溶液と混合する段階」であるが、特に限定はなく、例えば、「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物」の全部又は一部を一定量の「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は一定量の「水又は水溶液」を「リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物」の全部又は一部へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。
【０２０６】  また、前記〔Ｂ〕の「前記〔Ａ〕の段階における当該混合物（リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液に、更に一定量の水又は水溶液を混合する段階」であるが、特に限定はなく、例えば、「前記〔Ａ〕の段階における当該混合物（リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液」を一定量の「水又は水溶液」へ添加し、混合するという態様でもよく、又は一定量の「水又は水溶液」を「前記〔Ａ〕の段階における当該混合物（リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物との混合物）と水又は水溶液との混合後の混合液」へ添加し、混合するという態様でもよく、或いはその他の態様でもよい。
【０２０７】（４）混合の方法  本発明における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する方法は、当該混合物と、当該水又は水溶液が混合するのであればいずれの方法でもよく、特に限定はない。
【０２０８】  なお、本発明における当該混合においては、リパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等は必要なく、一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、通常の方法で混合すればよく、これにより、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合することができる。
【０２０９】（５）混合時の温度  本発明における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時の温度は、特に限定されないが、用いる本重合体化合物の曇点以下の温度においてこの工程を行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０２１０】  そして、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、前記の目的の上から、用いる本重合体化合物の曇点より１０℃低い温度以下で行うことがより好ましく、２５℃以下で行うことが特に好ましい。
【０２１１】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液とを混合する時の温度であるが、この工程を、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕、用いる本重合体化合物、及び使用する水又は水溶液それぞれの融点以上の温度において行うことが、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から好ましい。
【０２１２】  そして、このリパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程は、前記の目的の上から、１０℃以上で行うことがより好ましく、１５℃以上で行うことが特に好ましい。
【０２１３】（６）混合の時間  本発明における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合して調製した混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程において、当該混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する時間であるが、このリパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物の混合物と、この水又は水溶液とが、均質に混合されればよく、特に限定されない。
【０２１４】  通常は、この混合を、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質の溶液を製造する目的の上から、この混合を５分間又はそれ以上行うことが好ましい。なお、一般的には、５分間で十分である。
【０２１５】  また、このリパーゼ活性測定用基質及び本重合体化合物の混合物と、水又は水溶液とを混合する時間は、特に上限はなく、例えば数時間混合しても構わないのであるが、時間もコストであるという観点から考えると、念入りに行うとしても通常は１０分間以内でよい。
【０２１６】８．リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径  先に記載した通り、リパーゼは、エマルジョン化したトリグリセライド基質の水と油との界面で最も効率よく作用し、このリパーゼの反応速度は分散した基質の表面積に関係するので、このリパーゼの活性測定には安定で均一なミセル粒子からなる基質の調製が重要であるとされている（非特許文献２参照。）。
【０２１７】  本発明において、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の溶液は、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）が６０〜１，５００ｎｍの範囲にあると、リパーゼとの反応の速度が高く、また、このエマルジョンが安定であり、このリパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できるので好ましい。
【０２１８】  この理由により、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質の溶液は、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）が７０〜１，０００ｎｍの範囲にあることがより好ましく、８０〜６００ｎｍの範囲にあることが更に好ましく、そして、１００〜２００ｎｍの範囲にあることが特に好ましい。
【０２１９】〔２〕リパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法１．総論（Ａ）総論  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法は、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル〔ＤＧＧＭＲ〕をリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法において、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物（本重合体化合物）を混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とするものである。
【０２２０】  そして、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法は、この（１）及び（２）の工程を含むものであることより、煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理、又は特別な装置若しくは器具などの物等を必要とせずに、ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含むリパーゼ活性測定用基質溶液の製造を簡略化することができる。
【０２２１】（Ｂ）側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを用いる態様  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法は、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを用いる次の態様を含むものである。  「１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法において、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイルを混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法。」
【０２２２】（Ｃ）ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を用いる態様  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法は、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を用いる次の態様を含むものである。  「１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルをリパーゼ活性測定用基質として含む、試料中のリパーゼ活性の測定に使用するための基質溶液を製造する方法であって、  （１）  当該リパーゼ活性測定用基質と、ポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物を混合し混合物を調製する工程；及び  （２）  前記（１）の混合物の全部又は一部を、水又は水溶液と混合する工程、を含むことを特徴とする、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法。」
【０２２３】２．リパーゼ  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、リパーゼについては、前記〔１〕の「２．リパーゼ」において記載した通りである。
【０２２４】３．試料  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、試料については、前記〔１〕の「３．試料」において記載した通りである。
【０２２５】４．リパーゼ活性測定用基質  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、リパーゼ活性測定用基質については、前記〔１〕の「４．リパーゼ活性測定用基質」において記載した通りである。
【０２２６】５．本重合体化合物  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、「側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル又はポリオキシエチレン・ポリオキシプロピレン縮合物」（本重合体化合物）については、前記〔１〕の「５．本重合体化合物」において記載した通りである。
【０２２７】６．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程については、前記〔１〕の「６．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物を混合し混合物を調製する工程」において記載した通りである。
【０２２８】７．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物を水又は水溶液と混合する工程  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物を、水又は水溶液と混合する工程については、前記〔１〕の「７．リパーゼ活性測定用基質と本重合体化合物の混合物を水又は水溶液と混合する工程」において記載した通りである。
【０２２９】８．リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法における、リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径については、前記〔１〕の「８．リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径」において記載した通りである。
【０２３０】〔３〕試料中のリパーゼ活性の測定試薬及び測定方法  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬、及び本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法等について、以下説明を行う。
【０２３１】１．試料中のリパーゼ活性測定試薬（１）試料中のリパーゼ活性測定試薬の構成等  試料中のリパーゼ活性測定試薬は、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液のみからなるものであってもよく、又は本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなるもの（試薬キット）であってもよい。
【０２３２】  なお、次の（ａ）及び（ｂ）の理由から、試料中のリパーゼ活性測定試薬としては、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなる試薬キットであることが好ましい。（ａ）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕はｐＨ４又はその付近のｐＨにおいて安定であるのに対して、リパーゼはｐＨ８又はその付近のｐＨにおいてその活性は至適であり、それぞれ適するｐＨ域が異なっている。（ｂ）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させると、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の安定性がよくなくなる。
【０２３３】  よって、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液と他の構成試薬からなる試薬キットであることが好ましく、この場合、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕を含む試薬のｐＨはｐＨ４又はその付近のｐＨとし、これと組み合わせる他の構成試薬のうち少なくとも一つの試薬のｐＨはｐＨ８又はそれ以上とすることが好ましく、また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩を、一つの試薬に共存させないことが好ましい。
【０２３４】  この試料中のリパーゼ活性測定試薬としては、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液と一つの他の構成試薬からなる２試薬系の試薬キットであることが好ましい。
【０２３５】  この場合、当該他の構成試薬を第１試薬とし、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を第２試薬として用いるものであることがより好ましい。
【０２３６】  そして、この場合に、当該他の構成試薬のｐＨはｐＨ８又はそれ以上とし、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液のｐＨはｐＨ４又はその付近のｐＨとすることが更に好ましい。
【０２３７】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液にコリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩の両方を含有させることはせず、コリパーゼ、及びリパーゼ賦活化剤としての胆汁酸又はその塩の少なくとも一方は当該他の構成試薬に含有させることが更に好ましい。
【０２３８】  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬は、終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法（レート法）によるものが好ましい。
【０２３９】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬においては、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と試料を接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成するが、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
【０２４０】  よって、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度等を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めればよい。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
【０２４１】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬において、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
【０２４２】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬において、測定反応の開始方法は、本発明のリパーゼ活性測定用基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。
【０２４３】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬において、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【０２４４】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬は、その構成試薬の全て又は一部が液状試薬であってよい。
【０２４５】  なお、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、そのもの単独にて、販売し、又は試料中のリパーゼ活性の測定に使用することができる。
【０２４６】  また、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液は、前記の他の構成試薬又はそれ以外の試薬と組み合わせて、販売し、又は試料中のリパーゼ活性の測定に使用することもできる。  前記の他の構成試薬、又はそれ以外の試薬としては、例えば、緩衝液、試料希釈液、試薬希釈液、校正（キャリブレーション）を行うための物質を含有する試薬、又は精度管理を行うための物質を含有する試薬等を挙げることができる。
【０２４７】（２）試料中のリパーゼ活性の測定試薬の具体例  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を含む試料中のリパーゼ活性の測定試薬の具体例を以下挙げる。
【０２４８】（Ｉ）例１（ａ）第１試薬  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ８．３（２０℃）］  デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）  塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ５ｍＭ  コリパーゼ  （ブタ膵臓由来；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ３７５Ｋ単位／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）  Ｂｉｃｉｎｅ  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ
【０２４９】（ｂ）第２試薬（本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液）  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ４．０（２０℃）］  １，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕  （ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ［リパーゼ活性測定用基質］  ０．３ｍＭ  側鎖型の非反応性のポリエーテル変性タイプの変性シリコーンオイル  ０．３％（ｗ／ｖ）  Ｌ−酒石酸  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ
【０２５０】（ＩＩ）例２（ａ）第１試薬  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液；ｐＨ８．４（２０℃）］  タウロデオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）  デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ０．２％（ｗ／ｖ）  塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ５ｍＭ  コリパーゼ  （ブタ膵臓由来；ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  １５０Ｋ単位／Ｌ（２ｍｇ／Ｌ）  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン  〔Ｔｒｉｓ〕  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ
【０２５１】（ｂ）第２試薬（本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液）  ［下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度で含む水溶液］  １，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕  （ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ［リパーゼ活性測定用基質］  ０．６ｍＭ  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物  ２％（ｗ／ｖ）  タウロデオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）
【０２５２】２．試料中のリパーゼ活性測定方法（１）試料中のリパーゼ活性の測定の方法  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法により測定を行う場合、当該測定は終点法（エンドポイント法）により測定を行うものであってもよく、又は反応速度法（レート法）により測定を行うものであってもよく、適宜選択すればよいが、反応速度法（レート法）によるものが好ましい。
【０２５３】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法により測定を行う場合、その測定は、一段階のステップにより行う１ステップ法、又は二段階若しくはそれ以上の多段階のステップにより行う多ステップ法を適宜選択して測定を行えばよい。
【０２５４】  なお、試料中のリパーゼ活性の測定に使用する測定試薬が、第１試薬、第２試薬、及び他の試薬（一つ又は二つ以上の試薬）よりなる場合、すなわち３以上の試薬よりなる場合は、これらの試薬を使用して測定を行うのに必要な数の段階（必要に応じ二段階又は三段階以上の段階）を経て測定反応を行わせ、試料中のリパーゼ活性の測定を行えばよい。
【０２５５】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法により測定を行う場合、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と試料を接触させ、反応させることにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成するが、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であって、容易に自然に加水分解されて６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
【０２５６】  よって、この生成する６’−メチルレゾルフィンの増加を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度等を測ることによって測定し、試料中に含まれていたリパーゼの活性値を求めればよい。なお、この場合、一波長法でもよく、又は二波長法でもよい。
【０２５７】  なお、測定した吸光度（若しくは透過率）又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出することは、６’−メチルレゾルフィンのモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又はリパーゼ活性値が分かっている標準物質（標準液、若しくは標準血清等）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行えばよい。
【０２５８】  また、試料を測定して得た吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出することが好ましい。
【０２５９】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法により測定を行う場合、測定反応時の温度は、３０℃又は３７℃等測定反応が進行しかつ測定反応に係わる酵素等の反応成分が熱により失活、変性又は変質しない範囲内の温度を設定すればよい。
【０２６０】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法により測定を行う場合、測定反応の開始方法は、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質等を加えることにより行う方法、又は試料を加えることにより行う方法等のいずれの方法のものでもよい。
【０２６１】  また、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法により測定を行う場合、その測定は、用手法により行うものであってもよく、又は自動分析装置等の装置を用いて行うものであってもよい。
【０２６２】（２）試料中のリパーゼ活性の測定方法の具体例  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液を用いる試料中のリパーゼ活性の測定方法の具体例を以下挙げる。
【０２６３】（ａ）測定試薬（ｉ）第１試薬  前記の１の（２）の（Ｉ）の（ａ）の第１試薬を、この測定方法の具体例における第１試薬として用いた。
【０２６４】（ｉｉ）第２試薬  前記の１の（２）の（Ｉ）の（ｂ）の第２試薬を、この測定方法の具体例における第２試薬として用いた。
【０２６５】（ｂ）試料  ヒトの血清を試料として用いた。
【０２６６】（ｃ）測定（ｉ）第１段階  前記の試料と前記の第１試薬を混合して、混合液を調製する。
【０２６７】  この混合する試料及び第１試薬それぞれの量は、第２試薬の量、試料に含まれるリパーゼの活性値、及び他の条件に応じて適宜決めればよい。  なお、一般的には、例えば、試料の量は０．５〜１００μＬ、第１試薬の量は２０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【０２６８】  この混合液の調製後、インキュベートを行う。  このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
【０２６９】  また、インキュベートする際の温度は、前記の混合液が凍結する温度より上の温度であればよい。  なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。  しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。  このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。  なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
【０２７０】  この試料と第１試薬の混合液の調製及びインキュベートにより、試料に含まれていたリパーゼと、第１試薬に含まれる試薬成分とが接触し、これらの成分によるリパーゼの賦活化や活性化等が行われる。
【０２７１】（ｉｉ）第２段階  前記の第１段階で調製した「試料と第１試薬の混合液」に、第２試薬を混合する。これを最終反応液とする。
【０２７２】  この混合する第２試薬の量は、試料の量、第１試薬の量、試料に含まれるリパーゼの活性値、使用する分析装置の仕様等、及び他の条件に応じて適宜決めればよい。  なお、一般的には、例えば、第２試薬の量は１０〜１，０００μＬの範囲のもの等とすることが好ましい。
【０２７３】  この最終反応液の調製後、インキュベートを行う。  このインキュベートの時間は、特に制限はないのであるが、通常は２０分以内であることが好ましく、１０分以内であることがより好ましく、５分以内であることが特に好ましい。
【０２７４】  また、インキュベートする際の温度は、前記の最終反応液が凍結する温度より上の温度であればよい。  なお、一般的に測定反応時の温度は、高い程、反応速度が高くなるので好ましい。  しかし、温度が高すぎると測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活してしまうので、インキュベートする際の温度は、測定反応に係わる酵素等の成分が変性、失活する温度未満の温度とする必要がある。  このインキュベートする際の温度は、通常は２〜７０℃であるが、２０〜３７℃が好ましく、３０〜３７℃がより好ましい。  なお、測定反応に係わる酵素等の成分が耐熱性酵素など耐熱性の成分であれば更に高温でもよい。
【０２７５】  この最終反応液の調製及びインキュベートにより、前記の第１段階におけるリパーゼの賦活化や活性化等に引き続き、この第２段階における測定反応が開始し、試料に含まれていたリパーゼの活性測定反応が進められる。
【０２７６】  すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法により、安定で均一なミセル粒子からなるエマルジョン化した基質溶液となっている第２試薬（本発明におけるリパーゼ活性測定用基質溶液）が、この第２段階において試料に含まれていたリパーゼと接触することにより、リパーゼが触媒する加水分解反応によって、本発明におけるリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕より１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロール及びグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルが生成する。  そして、このグルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステルは不安定であるので、容易に自然に加水分解されて、６’−メチルレゾルフィン（λｍａｘ：５８０ｎｍ）を生成する。
【０２７７】  この生成した６’−メチルレゾルフィンは、その極大吸収波長（λｍａｘ）が５８０ｎｍであるので、この６’−メチルレゾルフィンに由来する最終反応液の吸光度（又は透過率）を５８０ｎｍ又はその近辺の波長の吸光度（又は透過率）を測ることによって測定する。
【０２７８】  次に、測定した吸光度（若しくは透過率）又は吸光度（若しくは透過率）の変化量より、試料に含まれていたリパーゼの活性値を算出する。
【０２７９】  なお、これは、６’−メチルレゾルフィンのモル吸光係数を基に測定した吸光度（若しくは透過率）より算出する方法、又はリパーゼ活性値が分かっている標準物質（標準液、若しくは標準血清等）の吸光度（若しくは透過率）と対比して算出する方法等の方法を適宜選択して行う。
【０２８０】  なお、上記の試料に含まれていたリパーゼの活性値の算出は、試料を測定して得た最終反応液の吸光度（若しくは透過率）より試薬盲検（試薬ブランク）を差し引いて求めた吸光度差（ΔＡｂｓ．）を用いて行うことが好ましい。
【実施例】
【０２８１】  以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【０２８２】〔実施例１〕（リパーゼ活性測定用基質溶液の製造−１）  本重合体化合物の曇点の測定、本発明の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造、及び当該リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定を行った。【０２８３】１．曇点の測定（１）本重合体化合物水溶液の調製  下記の（ａ）〜（ｄ）の４種類の側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）、及び下記の（ｅ）〜（ｆ）の２種類のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物について、それぞれ０．１％（ｗ／ｖ）となるよう純水と混合し、本重合体化合物水溶液を調製した。【０２８４】  （ａ）  ＫＦ−３５１Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｂ）  ＫＦ−３５４Ｌ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｃ）  ＫＦ−３５５Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｄ）  ＫＦ−６０１１  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｅ）  プルロニック  Ｌ−３４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）  （ｆ）  プルロニック  Ｌ−４４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）【０２８５】（２）本重合体化合物の曇点の測定（ｉ）  前記（１）で調製した前記（ａ）〜（ｆ）の６種類の本重合体化合物水溶液［濃度：０．１％（ｗ／ｖ）］それぞれの１ｍＬを各々別個の試験管に入れた。【０２８６】（ｉｉ）  次に、これらの試験管を恒温水槽（型式：ＢＫ−３３、販売元：ヤマト科学株式会社［日本国］）に入れ、水槽の温度を１℃ずつ上昇させた。なお、水槽の温度は水銀温度計で測定を行った。【０２８７】（ｉｉｉ）  そして、前記の恒温水槽に入れた試験管内の本重合体化合物水溶液を観察して、この水溶液が白く濁った時の温度をその本重合体化合物の曇点として記録した。  なお、この曇点の測定に使用した恒温水槽（ＢＫ−３３）は、加温した水槽の温度の上限が７７℃であるので、水槽の温度を７７℃まで上昇させても白濁せず曇点に至らなかった場合は、「７７℃超」と記録した。【０２８８】（３）測定結果  前記（２）において測定し、記録したそれぞれの本重合体化合物の曇点を、以下に示した。  （ａ）  ＫＦ−３５１Ａ：５２℃  （ｂ）  ＫＦ−３５４Ｌ：７７℃超  （ｃ）  ＫＦ−３５５Ａ：６７℃  （ｄ）  ＫＦ−６０１１：６４℃  （ｅ）  プルロニック  Ｌ−３４：６５℃  （ｆ）  プルロニック  Ｌ−４４：６７℃【０２８９】２．本発明によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び当該基質溶液の製造の簡略化方法により、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を行った。【０２９０】（１）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、６個のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。【０２９１】（２）  次に、下記の（ａ）〜（ｄ）の４種類の側鎖型の非反応性の変性シリ���ーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）、及び下記の（ｅ）〜（ｆ）の２種類のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。【０２９２】  （ａ）  ＫＦ−３５１Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｂ）  ＫＦ−３５４Ｌ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｃ）  ＫＦ−３５５Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｄ）  ＫＦ−６０１１  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｅ）  プルロニック  Ｌ−３４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）  （ｆ）  プルロニック  Ｌ−４４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）【０２９３】（３）  前記（２）の添加後、各々のビーカーを、６７℃の温度に設定した恒温水槽（型式：ＢＫ−３３、販売元：ヤマト科学株式会社［日本国］）に入れ、これを撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を６７℃で混合した。なお、水槽の温度は水銀温度計で測定し、確認した。【０２９４】  この６７℃での混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」を調製した。【０２９５】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーを前記の６７℃の温度の水槽中でスターラー（リモートドライブ電磁スターラー、型式：ＨＰ４０１０７、販売元：株式会社三商［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのスターラーのコントロールユニットの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０２９６】（４）  次に、前記（３）の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」の全部をビーカー内よりマイクロピペットにより吸い取り、別のビーカー（容量：１０ｍＬ）中で予め２０℃としておいた「一定量（４．０ｍＬ）の純水」に、撹拌しながら当該混合物の全部（全量）をこのマイクロピペットより添加した。【０２９７】  そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」との混合を行った。【０２９８】  なお、この撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０２９９】  また、前記のビーカー中の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」の温度は水銀温度計で測定することにより２０℃であることを確認しておいた。【０３００】（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物）と一定量の純水との混合後の混合液」に、更に一定量の純水を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３０１】（６）  以上の操作により、下記の（ａ）〜（ｆ）の計６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液を、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法によって製造した。  なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計６種類）において、いずれも、リパーゼ活性���定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、本重合体化合物の濃度は２．０％（ｗ／ｖ）である。  また、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計６種類）のいずれにも、濃度勾配や強い濁り等は見られず、それぞれ均質に混合されていることを目視にて確認した。【０３０２】  （ａ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ａ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５１Ａ）  （ｂ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｂ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５４Ｌ）  （ｃ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｃ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５５Ａ）  （ｄ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｄ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−６０１１）  （ｅ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｅ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−３４）  （ｆ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｆ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−４４）【０３０３】３．リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定  前記２において製造したリパーゼ活性測定用基質溶液（計６種類）のエマルジョンのミセル径を測定した。【０３０４】（１）エマルジョンのミセル径の測定（ｉ）  前記２で製造した前記２の（７）の（ａ）〜（ｆ）の６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液［いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕濃度：０．６ｍＭ、本重合体化合物濃度：２．０％（ｗ／ｖ）］それぞれの２．５ｍＬを各々別個のプラスチックセルに入れた。【０３０５】（ｉｉ）  次に、これらのプラスチックセルを順に動的光散乱式粒径分布測定装置（型式：ＬＢ−５５０、販売元：株式会社堀場製作所［日本国］）に入れ、それぞれのプラスチックセル中の各リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の測定を行った。なお、この測定は室温（２５℃）にて行った。【０３０６】（２）測定結果  前記（１）において測定した前記の６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）を表１に示した。【０３０７】  なお、この表１において、この６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の値は平均値の値を示す。【０３０８】  また、この表１には、この６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液の目視での観察結果も示した。更に、この表１には、この６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液で用いた本重合体化合物の曇点についての前記１における測定結果も示した。【０３０９】  なお、この表の「観察結果」の欄において、「○」は「濃度勾配、強い濁り及び発色のいずれも見られなかったもの」を示す。【０３１０】  また、この表の「用いた本重合体化合物の曇点」の欄には、リパーゼ活性測定用基質溶液で用いた本重合体化合物の曇点の測定値を示すが、水槽の温度を７７℃まで上昇させても白濁せず曇点に至らなかったものについては「７７℃超」と表した。【０３１１】
【表１】
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【０３１２】（３）考察  表１より、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法に従って製造した６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液−ａ〜リパーゼ活性測定用基質溶液−ｆ）においては、いずれもそのエマルジョンのミセル径（粒子径）が１００ｎｍ〜１，１００ｎｍの範囲にあることが分かる。【０３１３】  すなわち、前記の通り、ミセル径（粒子径）が測定されたことより、これらの６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液はいずれも、ミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質溶液を形成していることが分かる。【０３１４】  そして、これらの６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液はいずれも、リパーゼとの反応の速度が高く、エマルジョンが安定であり、リパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できる６０ｎｍ〜１，５００ｎｍの範囲にそのエマルジョンのミセル径（粒子径）があることが分かる。【０３１５】  また、この表１より、これらの６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のいずれにおいても、濃度勾配や強い濁りや発色は見られず、このような問題のないことが分かる。【０３１６】  以上のことより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及びリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法、並びにこれらの方法に従って製造したリパーゼ活性測定用基質溶液は、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有するものであることが確かめられた。【０３１７】（ｉ）  従来の方法のようにリパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等が必要ないものであること。【０３１８】（ｉｉ）  一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、簡便、短時間、かつ低コストにより、リパーゼ活性測定用基質溶液を製造することが可能であり、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を簡略化することができるものであること。【０３１９】（ｉｉｉ）  製造されるリパーゼ活性測定用基質溶液が、試料中のリパーゼ活性の測定に適したものであること。【０３２０】〔実施例２〕（リパーゼ活性測定用基質溶液の製造−２）  本発明の方法及び対照例の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造、並びに当該リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定を行った。【０３２１】１．リパーゼ活性測定用基質溶液の製造  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び当該基質溶液の製造の簡略化方法により、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を行った。  また、対照例の方法により、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を行った。【０３２２】〔１〕本発明の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造（１）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、５���のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。【０３２３】（２）  次に、下記の（ａ）〜（ｃ）の３種類の側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）、及び下記の（ｄ）〜（ｅ）の２種類のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。【０３２４】  （ａ）  ＫＦ−３５１Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｂ）  ＫＦ−３５５Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｃ）  ＫＦ−６０１１  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｄ）  プルロニック  Ｌ−３４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）  （ｅ）  プルロニック  Ｌ−４４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）【０３２５】（３）  前記（２）の添加後、各々のビーカーを室温（２５℃）において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合した。【０３２６】  この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」を調製した。【０３２７】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３２８】（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）の濃度のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３２９】  そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」との混合を行った。【０３３０】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３３１】（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物）と一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液との混合後の混合液」に、更に一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３３２】（６）  以上の操作により、下記の（Ａ）〜（Ｅ）の計５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液を、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法によって製造した。  なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計５種類）において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、本重合体化合物の濃度は２．０％（ｗ／ｖ）である。  また、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計５種類）のいずれ��も、濃度勾配や強い濁り等は見られず、それぞれ均質に混合されていることを目視にて確認した。【０３３３】（Ａ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５１Ａ）（Ｂ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｂ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５５Ａ）（Ｃ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｃ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−６０１１）（Ｄ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｄ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−３４）（Ｅ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｅ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−４４）【０３３４】〔２〕対照例の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、５個のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。【０３３５】（２）  次に、下記の（ｆ）〜（ｊ）の界面活性剤（いずれも非イオン性界面活性剤）をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。【０３３６】  （ｆ）  Ｔｗｅｅｎ８０  ［ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート］  （販売元：東京化成工業株式会社［日本国］）  （ｇ）  ＮＩＫＫＯＬ  ＧＯ−４６０Ｖ  ［テトラオレイン酸ポリオキシエチレン（６０）ソルビット］  （販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）  （ｈ）  ＮＩＫＫＯＬ  ＴＬ−１０  ［モノヤシ油脂肪酸ポリオキシエチレン（２０）ソルビタン］  （販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）  （ｉ）  サンニックス  ＧＰ−１０００  ［ポリオキシプロピレングリセリルエーテル］  （販売元：三洋化成工業株式会社［日本国］）  （ｊ）  ＮＩＫＫＯＬ  ＴＭＧＯ−１５  ［モノオレイン酸ポリオキシエチレン（１５）グリセリル］  （販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）【０３３７】（３）  前記（２）の添加後、各々のビーカーを室温（２５℃）において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と前記の各界面活性剤を混合した。【０３３８】  この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０３３９】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３４０】（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）の濃度のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３４１】  そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより��前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の２％（ｗ／ｖ）のタウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液」との混合を行った。【０３４２】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３４３】（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液との混合後の混合液」に、更に一定量の２％（ｗ／ｖ）タウロデオキシコール酸ナトリウム水溶液を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３４４】（６）  以上の操作により、下記の（Ｆ）〜（Ｊ）の計５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液を、対照例の方法によって製造した。  なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計５種類）において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、各界面活性剤の濃度は２．０％（ｗ／ｖ）である。【０３４５】（Ｆ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｆ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｗｅｅｎ８０）（Ｇ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｇ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＧＯ−４６０Ｖ）（Ｈ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｈ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＴＬ−１０）（Ｉ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｉ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：サンニックス  ＧＰ−１０００）（Ｊ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｊ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＴＭＧＯ−１５）【０３４６】  なお、上記の「（Ｆ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｆ」、「（Ｇ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｇ」及び「（Ｈ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｈ」については、これらのいずれにも、濃度勾配や強い濁り等は見られず、それぞれ均質に混合されていることを目視にて確認した。【０３４７】  しかしながら、上記の「（Ｉ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｉ」は強度の濁りが生じていた。また、上記の「（Ｊ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｊ」は発色が生じてしまっていた。【０３４８】２．リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定  本発明の方法により製造した前記１の〔１〕の（７）の（Ａ）〜（Ｅ）の５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液、及び対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の（Ｆ）〜（Ｉ）の４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液について、それぞれのエマルジョンのミセル径を測定した。（なお、「（Ｊ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｊ」は発色が生じてしまった為、そのエマルジョンのミセル径の測定は行わなかった。）【０３４９】（１）エマルジョンのミセル径の測定（ｉ）  前記１の〔１〕で製造した前記１の〔１〕の（７）の（Ａ）〜（Ｅ）の５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液［いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕濃度：０．６ｍＭ、本重合体化合物濃度：２．０％（ｗ／ｖ）］、及び前記１の〔２〕で製造した前記１の〔２〕の（７）の（Ｆ）〜（Ｉ）の４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液［いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕濃度：０．６ｍＭ、界面活性剤濃度：２．０％（ｗ／ｖ）］それぞれの２ｍＬを各々別個のプラスチックセルに入れた。【０３５０】（ｉｉ）  次に、これらのプラスチックセルについて順に動的光散乱式粒子径分布測定装置（型式：Ｎａｎｏｔｒａｃ  ＵＰＡ−ＥＸ２５０、販売元：日機装株式会社［日本国］）の光学プローブ（光ファイバー）を中に入れ、それぞれのプラスチックセル中の各リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の測定を行った。なお、この測定は室温（２５℃）にて行った。【０３５１】（２）測定結果  前記（１）において測定した前記の計９種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）を表２に示した。【０３５２】  なお、この表２において、これらの計９種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の値は平均値の値を示す。【０３５３】  また、この表２には、本発明の方法により前記１の〔１〕で製造したリパーゼ活性測定用基質溶液［計５種類］、及び対照例の方法により前記１の〔２〕で製造したリパーゼ活性測定用基質溶液［計５種類］の目視での観察結果も示した。【０３５４】  なお、この表の「観察結果」の欄において、「○」は「濃度勾配、強い濁り及び発色のいずれも見られなかったもの」を示し、「×（※１）」は「強度の濁りが生じたもの」そして、「×（※２）」は「発色が生じたもの」を示す。【０３５５】
【表２】
0006603961.tif 000003
【０３５６】（３）考察（Ｉ）本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液  表２より、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法に従って製造した５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液−Ａ〜リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｅ）においては、いずれもそのエマルジョンのミセル径（粒子径）が８０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にあることが分かる。【０３５７】  すなわち、前記の通り、ミセル径（粒子径）が測定されたことより、これらの６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液はいずれも、ミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質溶液を形成していることが分かる。【０３５８】  そして、これらの５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液はいずれも、リパーゼとの反応の速度が高く、エマルジョンが安定であり、リパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できる６０ｎｍ〜１，５００ｎｍの範囲にそのエマルジョンのミセル径（粒子径）があることが分かる。【０３５９】  また、この表２より、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法に従って製造した５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のいずれにおいても、濃度勾配や強い濁りや発色は見られず、このような問題のないことが分かる。【０３６０】  以上のことからも、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及びリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法、並びにこれらの方法に従って製造したリパーゼ活性測定用基質溶液は、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有するものであることが確かめられた。【０３６１】（ｉ）  従来の方法のようにリパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等が必要ないものであること。【０３６２】（ｉｉ）  一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、簡便、短時間、かつ低コストにより、リパーゼ活性測定用基質溶液を製造することが可能であり、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を簡略化することができるものであること。【０３６３】（ｉｉｉ）  製造されるリパーゼ活性測定用基質溶液が、試料中のリパーゼ活性の測定に適したものであること。【０３６４】（ＩＩ）対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液（ａ）  表２より、対照例の方法により製造した「（Ｆ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｆ」、「（Ｇ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｇ」及び「（Ｈ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｈ」は、いずれもそのエマルジョンのミセル径（粒子径）が、６０ｎｍ未満であることが分かる。【０３６５】  すなわち、これらの対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液［計３種類］はいずれも、ミセル径（粒子径）が測定されたことより、いずれもミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質溶液を形成していることが分かる。【０３６６】  しかしながら、これらの対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基���溶液［計３種類］はいずれも、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）が、リパーゼとの反応の速度が高く、エマルジョンが安定であり、リパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できる６０ｎｍ〜１，５００ｎｍの範囲にはないことが分かる。【０３６７】  つまり、これらの対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液［計３種類］はいずれも、試料中のリパーゼ活性の測定に適したものでないことが分かる。【０３６８】（ｂ）  また、表２に記載されている通り、対照例の方法により製造した「（Ｉ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｉ」は強度の濁りが生じ、「（Ｊ）リパーゼ活性測定用基質溶液−Ｊ」は発色が生じた。【０３６９】  すなわち、これらの対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液［計２種類］はいずれも、試料中のリパーゼ活性の測定に適したものでないことが分かる。【０３７０】〔実施例３〕（リパーゼ活性測定用基質溶液の製造−３）  本発明の方法及び対照例の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造、並びに当該リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定を行った。【０３７１】１．リパーゼ活性測定用基質溶液の製造  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び当該基質溶液の製造の簡略化方法により、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を行った。  また、対照例の方法により、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を行った。【０３７２】〔１〕本発明の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造（１）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、４個のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。【０３７３】（２）  次に、下記の（ａ）〜（ｂ）の２種類の側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）をそれぞれ２．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。また、下記の（ａ）〜（ｂ）の２種類の側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。（すなわち、本重合体化合物の種類毎に、２．０グラム量り取り添加したビーカー１個と４．０グラム量り取り添加したビーカー１個を用意した。）【０３７４】  （ａ）  ＫＦ−３５１Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｂ）  ＫＦ−６０１１  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）【０３７５】（３）  前記（２）の添加後、各々のビーカーを室温（２５℃）において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と前記の本重合体化合物を混合した。【０３７６】  この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」を調製した。【０３７７】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子���このマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３７８】（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の純水」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３７９】  そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」との混合を行った。【０３８０】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３８１】（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物）と一定量の純水との混合後の混合液」に、更に一定量の純水を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３８２】（６）  以上の操作により、下記の［１］〜［４］の計４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液を、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法に従って製造した。  なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計４種類）において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭである。  また、本重合体化合物の濃度は、前記（２）において本重合体化合物を２．０グラム量り取ってビーカーに添加したもののリパーゼ活性測定用基質溶液においては１．０％（ｗ／ｖ）であり、そして、本重合体化合物を４．０グラム量り取ってビーカーに添加したもののリパーゼ活性測定用基質溶液においては２．０％（ｗ／ｖ）である。【０３８３】［１］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５１Ａ〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［２］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５１Ａ〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［３］  リパーゼ活性測定用基質溶液−３（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−６０１１〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［４］  リパーゼ活性測定用基質溶液−４（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−６０１１〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）【０３８４】〔２〕対照例の方法によるリパーゼ活性測定用基質溶液の製造（１）  リパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、２４個のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。【０３８５】（２）  次に、下記の（ｃ）〜（ｎ）の１２種類の界面活性剤（いずれも非イオン性界面活性剤）をそれぞれ２．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。また、下記の（ｃ）〜（ｎ）の１２種類の界面活性剤（いずれも非イオン性界面活性剤）をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。【０３８６】  （ｃ）  ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−７  ［ポリオキシエチレン（７）２級アルキルエーテル］  （販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）  （ｄ）  ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−７．５  ［ポリオキシエチレン（７．５）ノニルフェニルエーテル］  （販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）  （ｅ）  エマルゲン  １１０８  ［ポリオキシエチレン（８）アルキルエーテル］  （販売元：花王株式会社［日本国］）  （ｆ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ［ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル］  （販売元：和光純薬工業株式会社［日本国］）  （ｇ）  Ｂｒｉｊ３５  ［ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテル］  （販売元：和光純薬工業株式会社［日本国］）  （ｈ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５  ［ポリオキシエチレン（４０）イソオクチルフェニルエーテル］  （販売元：シグマ  アルドリッチ  ジャパン合同会社［日本国］）  （ｉ）  Ｔｗｅｅｎ２０  ［ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート］  （販売元：和光純薬工業株式会社［日本国］）  （ｊ）  ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１５  ［ポリオキシエチレン（１５）ノニルフェニルエーテル］  （販売元：日光ケミカルズ株式会社［日本国］）  （ｋ）  エマルゲン  Ｂ−６６  ［ポリオキシエチレントリベンジルフェニルエーテル］  （販売元：花王株式会社［日本国］）  （ｌ）  エマルゲン  Ａ−６０  ［ポリオキシエチレンジスチレン化フェニルエーテル］  （販売元：花王株式会社［日本国］）  （ｍ）  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４  ［ポリオキシエチレン（８）オクチルフェニルエーテル］  （販売元：和光純薬工業株式会社［日本国］）  （ｎ）  サンニックス  ＧＰ−４４０  ［ポリオキシプロピレングリセリルエーテル］  （製造元：三洋化成工業株式会社［日本国］）【０３８７】（３）  前記（２）の添加後、各々のビーカーを室温（２５℃）において撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と前記の各界面活性剤を混合した。【０３８８】  この混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」を調製した。【０３８９】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３９０】（４）  次に、前記（３）のビーカー内の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物」（全部）に、撹拌しながら「一定量（４．０ｍＬ）の純水」を室温（２５℃）においてマイクロピペットより添加した。【０３９１】  そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」との混合を行った。【０３９２】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０３９３】（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と界面活性剤の混合物）と一定量の純水との混合後の混合液」に、更に一定量の純水を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０３９４】（６）  以上の操作により、下記の［５］〜［２８］の計２４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液を、対照例の方法によって製造した。  なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計２４種類）において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭである。  また、各界面活性剤の濃度は、前記（２）において界面活性剤を２．０グラム量り取ってビーカーに添加したもののリパーゼ活性測定用基質溶液においては１．０％（ｗ／ｖ）であり、そして、界面活性剤を４．０グラム量り取ってビーカーに添加したもののリパーゼ活性測定用基質溶液においては２．０％（ｗ／ｖ）である。【０３９５】［５］  リパーゼ活性測定用基質溶液−５（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−７〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［６］  リパーゼ活性測定用基質溶液−６（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＢＴ−７〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［７］  リパーゼ活性測定用基質溶液−７（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−７．５〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［８］  リパーゼ活性測定用基質溶液−８（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−７．５〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［９］  リパーゼ活性測定用基質溶液−９（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：エマルゲン  １１０８〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［１０］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１０（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：エマルゲン  １１０８〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［１１］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１１（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［１２］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１２（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［１３］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１３（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｂｒｉｊ３５〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［１４］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１４（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｂｒｉｊ３５〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［１５］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１５（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［１６］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１６（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［１７］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１７（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｗｅｅｎ２０〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［１８］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１８（リパー���活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｗｅｅｎ２０〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［１９］  リパーゼ活性測定用基質溶液−１９（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１５〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［２０］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２０（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：ＮＩＫＫＯＬ  ＮＰ−１５〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［２１］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２１（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：エマルゲン  Ｂ−６６〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［２２］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２２（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：エマルゲン  Ｂ−６６〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［２３］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２３（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：エマルゲン  Ａ−６０〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［２４］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２４（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：エマルゲン  Ａ−６０〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［２５］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２５（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［２６］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２６（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）［２７］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２７（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：サンニックス  ＧＰ−４４０〔濃度：１．０％［ｗ／ｖ］〕）［２８］  リパーゼ活性測定用基質溶液−２８（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、界面活性剤：サンニックス  ＧＰ−４４０〔濃度：２．０％［ｗ／ｖ］〕）【０３９６】２．リパーゼ活性測定用基質溶液の観察及びエマルジョンのミセル径の測定〔１〕リパーゼ活性測定用基質溶液の観察（１）観察  本発明の方法により製造した前記１の〔１〕の（７）の［１］〜［４］の４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液、及び対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の［５］〜［２８］の２４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液について、それぞれ目視で観察を行った。【０３９７】（２）観察結果  前記（１）において目視により観察を行ったリパーゼ活性測定用基質溶液の観察結果を表３に示した。【０３９８】  なお、この表の「観察結果」の欄において、「○」は「濃度勾配、強い濁り及び発色のいずれも見られなかったもの」を示し、そして、「×（※３）」は「均質でないもの（リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤が分離してしまっている、又は油層と水層とに分離してしまっている）」を示す。【０３９９】
【表３】
0006603961.tif 000004
【０４００】〔２〕リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径の測定  本発明の方法により製造した前記１の〔１〕の（７）の［１］〜［４］の４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液、並びに対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の［５］〜［１４］、［１７］〜［２０］及び［２３］〜［２６］の１８種類のリパーゼ活性測定用基質溶液について、それぞれのエマルジョンのミセル径を測定した。【０４０１】  なお、対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の［１５］、［１６］、［２１］、［２２］、［２７］及び［２８］の６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液は、観察結果を示した表３より分かるように、いずれも、「均質でないもの（リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤が分離してしまっている、又は油層と水層とに分離してしまっている）」であり、リパーゼ活性の測定に適さないことが明白であるので、エマルジョンのミセル径の測定は行わなかった。【０４０２】（１）エマルジョンのミセル径の測定  本発明の方法により製造した前記１の〔１〕の（７）の［１］〜［４］の４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液、並びに対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の［５］〜［１４］、［１７］〜［２０］及び［２３］〜［２６］の１８種類のリパーゼ活性測定用基質溶液について、前記実施例２の２の（１）の（ｉ）〜（ｉｉ）の記載の通りに操作を行い、各リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の測定を行った。【０４０３】（２）測定結果  前記（１）において測定した各リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）も前記の表３に示した。【０４０４】  なお、この表３において、これらの各リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の値は平均値の値を示す。【０４０５】  また、この表の「エマルジョンのミセル径（粒子径）」の欄には、リパーゼ活性測定用基質溶液のエマルジョンのミセル径（粒子径）の測定値を示すが、測定に使用した前記の動的光散乱式粒子径分布測定装置（型式：Ｎａｎｏｔｒａｃ  ＵＰＡ−ＥＸ２５０）におけるミセル径（粒子径）の測定下限が１０ｎｍであるので、測定の結果この測定下限未満であることが表示されたものについては「１０ｎｍ未満」と示した。【０４０６】３．考察〔１〕本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液  表３より、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法に従って製造した４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液−１〜リパーゼ活性測定用基質溶液−４）のいずれにおいても、濃度勾配や強い濁りや発色は見られず、このような問題のないことが分かる。【０４０７】  また、この表３より、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法に従って製造した４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液−１〜リパーゼ活性測定用基質溶液−４）においては、いずれもそのエマルジョンのミセル径（粒子径）が１００ｎｍ〜２００ｎｍの範囲にあることが分かる。【０４０８】  すなわち、前記の通り、ミセル径（粒子径）が測定されたことより、これらの４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液はいずれも、ミセル粒子からなるエマルジョン化したリ���ーゼ活性測定用基質溶液を形成していることが分かる。【０４０９】  そして、これらの４種類のリパーゼ活性測定用基質溶液はいずれも、リパーゼとの反応の速度が高く、エマルジョンが安定であり、リパーゼ活性測定用基質溶液を長期間保存・使用できる６０ｎｍ〜１，５００ｎｍの範囲にそのエマルジョンのミセル径（粒子径）があることが分かる。【０４１０】  以上のことからも、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及びリパーゼ活性測定用基質溶液の製造の簡略化方法、並びにこれらの方法に従って製造したリパーゼ活性測定用基質溶液は、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特徴を有するものであることが再度確かめられた。【０４１１】（ｉ）  従来の方法のようにリパーゼ活性測定用基質をアルコールなどの有機溶媒を含む溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を滴々と滴下して溶液に混合したり、リパーゼ活性測定用基質含有液を溶液に噴射注入したり、リパーゼ活性測定用基質溶液を強力なミキサーで高速に撹拌したり、又はリパーゼ活性測定用基質溶液に超音波を掛ける処理を行ったり等の煩雑な若しくは熟練を要する等の特別な処理や特別な装置等が必要ないものであること。【０４１２】（ｉｉ）  一般的なミキサーを用いて一般的な速度で撹拌する等、簡便、短時間、かつ低コストにより、リパーゼ活性測定用基質溶液を製造することが可能であり、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を簡略化することができるものであること。【０４１３】（ｉｉｉ）  製造されるリパーゼ活性測定用基質溶液が、試料中のリパーゼ活性の測定に適したものであること。【０４１４】〔２〕対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液  表３より、対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の［１５］、［１６］、［２１］、［２２］、［２７］及び［２８］の６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液は、いずれも、「均質でないもの（リパーゼ活性測定用基質と界面活性剤が分離してしまっている、又は油層と水層とに分離してしまっている）」であり、リパーゼ活性の測定に不適であることが分かる。【０４１５】  また、この表３より、対照例の方法により製造した前記１の〔２〕の（７）の［５］〜［１４］、［１７］〜［２０］及び［２３］〜［２６］の１８種類のリパーゼ活性測定用基質溶液は、いずれも、そのエマルジョンのミセル径（粒子径）の測定結果が測定下限未満、すなわち「１０ｎｍ未満」であったので、ミセル粒子からなるエマルジョン化したリパーゼ活性測定用基質溶液を形成していないことが分かる。【０４１６】  よって、これらの対照例の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液［計２４種類］はいずれも、試料中のリパーゼ活性の測定に適したものでないことが分かる。【０４１７】〔実施例４〕（試料中のリパーゼ活性の測定）  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して、試料中のリパーゼ活性の測定を行った。【０４１８】１．測定試薬〔１〕本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び当該基質溶液の製造の簡略化方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液からなる第２試薬、及び当該第２試薬に対応す��第１試薬よりなるリパーゼ活性測定試薬（リパーゼ活性測定試薬キット）を製造した。【０４１９】（１）第１試薬  下記の試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、ｐＨをｐＨ８．４（２０℃）に調整して、第１試薬を調製した。【０４２０】  デオキシコール酸ナトリウム  ［リパーゼ賦活化剤］  ２％（ｗ／ｖ）  塩化カルシウム  ［リパーゼ活性化剤］  ５ｍＭ  コリパーゼ  （ブタ膵臓由来、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）  ３７５Ｋ単位／Ｌ（５ｍｇ／Ｌ）  Ｂｉｃｉｎｅ  ［緩衝剤］  ４０ｍＭ【０４２１】（２）第２試薬  本発明の方法により製造した、前記の実施例１の２の（７）の（ａ）〜（ｆ）の６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液［いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕濃度：０．６ｍＭ、本重合体化合物濃度：２．０％（ｗ／ｖ）］（下に記載）を、それぞれ第２試薬として使用した。【０４２２】  （ａ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ａ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５１Ａ）  （ｂ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｂ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５４Ｌ）  （ｃ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｃ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５５Ａ）  （ｄ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｄ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−６０１１）  （ｅ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｅ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−３４）  （ｆ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｆ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−４４）【０４２３】〔２〕対照市販試薬  市販のリパーゼ活性測定試薬（リパーゼ活性測定試薬キット）である「リキテック  リパーゼ  カラー  ＩＩ」（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、対照として用いた。  なお、この「リキテック  リパーゼ  カラー  ＩＩ」［以下、「対照市販試薬」ということがある］は、第１試薬である「緩衝液」、及び第２試薬である「基質液」（ＤＧＧＭＲをリパーゼ活性測定用基質として含む）よりなるものである。【０４２４】２．試料  下の「（１）標準物質」、「（２）管理血清−１」、「（３）管理血清−２」及び「（４）管理血清−３」をそれぞれ試料として用いた。【０４２５】（１）標準物質  市販の標準物質である「常用参照標準物質  ＪＳＣＣ常用酵素  （ＪＣＣＬＳ  ＣＲＭ−００１）」（製造番号：００１ｂ、販売元：一般社団法人検査医学標準物質機構［日本国］）を、「標準物質」として用いた。【０４２６】（２）管理血清−１  市販の精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉ  Ｇ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−１」として用いた。【０４２７】（３）管理血清−２  精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩＩ」の「試作品」（株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−２」として用いた。【０４２８】（４）管理血清−３  市販の精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＣＲＰＩＩ  Ｕ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−３」として用いた。【０４２９】３．試料中のリパーゼ活性の測定  前記２の各試料のリパーゼ活性の測定を、それぞれ下記の通り行った。【０４３０】〔１〕本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬による測定  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液からなる第２試薬、及び当該第２試薬に対応する第１試薬よりなるリパーゼ活性測定試薬（リパーゼ活性測定試薬キット）を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記２の各試料のリパーゼ活性の測定を行った。【０４３１】（１）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ａを用いた場合（ａ）  前記の７１８０形汎用自動分析装置において、前記２のそれぞれの試料（「（１）標準物質」、「（２）管理血清−１」、「（３）管理血清−２」及び「（４）管理血清−３」）について、これらの試料の２．６μＬに、それぞれ前記１の〔１〕の（１）の「第１試薬」の１６０μＬを第１試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０４３２】（ｂ）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の〔１〕の（２）の（ａ）の「リパーゼ活性測定用基質溶液−ａ」の９６μＬを第２試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０４３３】（ｃ）  次に、３０ポイント（第１試薬添加後５１６．０４９秒）から３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長５７０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて測定した。（試料中に含まれていたリパーゼの活性値に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）【０４３４】（ｄ）  なお、較正（キャリブレーション）のための較正物質（キャリブレーター）として、「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」（製造番号：１５８６８８、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を用いた。  この「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」を試料とすること以外は、前記（ａ）〜（ｃ）の記載の通りに操作を行い、較正物質である「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」を測定したときの吸光度変化量を測定した。（当該較正物質に含まれているリパーゼの活性値［既知値］に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）【０４３５】（ｅ）  また、試薬盲検（試薬ブランク）の測定のため、生理食塩水を用いた。  この生理食塩水を試料とすること以外は、前記（ａ）〜（ｃ）の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。（試薬盲検の吸光度変化量の測定）【０４３６】（ｆ）  次に、前記（ｃ）において求めた前記２のそれぞれの試料についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（ｅ）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「試料の吸光度変化量差の値」を求めた。【０４３７】  また、前記（ｄ）において求めた較正物質（リパーゼ活性値が既知）についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（ｅ）において求めた当該��イント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「較正物質の吸光度変化量差の値」を求めた。【０４３８】  次に、前記の「試料の吸光度変化量差の値」と、「較正物質の吸光度変化量差の値」と、既知である「較正物質のリパーゼ活性値」とを対比し、比例計算を行うことにより、前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４３９】（２）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｂを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ａからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｂ［前記１の〔１〕の（２）の（ｂ）］に替えること、及び前記（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「２４ポイント（第１試薬添加後４１１．８８７秒）から２８ポイント（第１試薬添加後４８０．３６０秒）」に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｂを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４４０】（３）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｃを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ａからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｃ［前記１の〔１〕の（２）の（ｃ）］に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｃを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４４１】（４）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｄを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ａからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｄ［前記１の〔１〕の（２）の（ｄ）］に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｄを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４４２】（５）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｅを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ａからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｅ［前記１の〔１〕の（２）の（ｅ）］に替えること、及び前記（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「２３ポイント（第１試薬添加後３９４．０４３秒）から２７ポイント（第１試薬添加後４６２．５１６秒）」に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｅを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４４３】（６）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｆを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ａからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｆ［前記１の〔１〕の（２）の（ｆ）］に替えること、及び前記（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「１９ポイント（第１試薬添加後３２２．６６５秒）から２３ポイント（第１試薬添加後３９４．０４３秒）」に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操��を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｆを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４４４】〔２〕対照市販試薬による測定  対照市販試薬を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記２の各試料のリパーゼ活性の測定を行った。【０４４５】  すなわち、前記〔１〕の（１）の（ａ）における第１試薬を「第１試薬」から「対照市販試薬」の「緩衝液」［前記１の〔２〕］に替えること、前記〔１〕の（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ａから「対照市販試薬」の「基質液」［前記１の〔２〕］に替えること、及び前記〔１〕の（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「２１ポイント（第１試薬添加後３５８．３５４秒）から２５ポイント（第１試薬添加後４２９．７３２秒）」に替えること以外は、前記〔１〕の（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、対照市販試薬を使用した場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４４６】４．測定結果  前記３の〔１〕及び〔２〕において測定し、求めた前記２の各試料のリパーゼ活性値を表４に示した。【０４４７】  なお、この表４において示した各試料のリパーゼ活性値の単位は、単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）である。【０４４８】
【表４】
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【０４４９】５．考察  表４より、本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して求めた試料中のリパーゼ活性値の測定結果（測定値）は、６種類のリパーゼ活性測定用基質溶液（リパーゼ活性測定用基質溶液−ａ〜リパーゼ活性測定用基質溶液−ｆ）のいずれを用いた場合であっても、対照市販試薬を使用して求めたリパーゼ活性値の測定結果（測定値）とほぼ同様の値であることが分かる。【０４５０】  このことより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び製造の簡略化方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液は、試料中のリパーゼ活性を正確に測定することができるものであることが確かめられた。【０４５１】  すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び製造の簡略化方法においては、簡便、短時間かつ低コストによりリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することが可能になるとともに、当該基質溶液により試料中のリパーゼ活性の正確な測定結果（測定値）を提供することができることが確かめられた。【０４５２】〔実施例５〕（試料中のリパーゼ活性の測定の相関）  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して試料中のリパーゼ活性の測定を行い、また、対照市販試薬を使用して同一試料のリパーゼ活性の測定を行い、これらの相関を確認した。【０４５３】１．測定試薬〔１〕本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び当該基質溶液の製造の簡略化方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液からなる第２試薬、及び当該第２試薬に対応する第１試薬よりなるリパーゼ活性測定試薬（リパーゼ活性測定試薬キット）を使用した。【０４５４】［１］第１試薬  第１試薬として、前記の実施例４の１の〔１〕の（１）の「第１試薬」を使用した。【０４５５】［２］第２試薬  本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び当該基質溶液の製造の簡略化方法により、リパーゼ活性測定用基質溶液の製造を行った。【０４５６】（１）  本発明におけるリパーゼ活性測定用基質である、１，２−ｏ−ジラウリル−ｒａｃ−グリセロ−３−グルタル酸−（６’−メチルレゾルフィン）−エステル  〔ＤＧＧＭＲ〕（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を、５個のビーカー（容量：１０ｍＬ）のそれぞれに、０．０９グラム［ｇ］ずつ量り取った。【０４５７】（２）  次に、下記の（ａ）〜（ｃ）の３種類の側鎖型の非反応性の変性シリコーンオイル（ポリエーテル変性タイプ）、及び下記の（ｄ）〜（ｅ）の２種類のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン縮合物をそれぞれ４．０グラム［ｇ］ずつ量り取り、これを１種類ごとにそれぞれ異なる前記（１）のビーカーに添加した。【０４５８】  （ａ）  ＫＦ−３５１Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｂ）  ＫＦ−３５４Ｌ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｃ）  ＫＦ−３５５Ａ  （販売元：信越化学工業株式会社［日本国］）  （ｄ）  プルロニック  Ｌ−３４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）  （ｅ）  プルロニック  Ｌ−４４  （販売元：株式会社ＡＤＥＫＡ［日本国］）【０４５９】（３）  前記���２）の添加後、各々のビーカーを、６７℃の温度に設定した恒温水槽（型式：ＢＫ−３３、販売元：ヤマト科学株式会社［日本国］）に入れ、これを撹拌して、ビーカー内のリパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を６７℃で混合した。なお、水槽の温度は水銀温度計で測定し、確認した。【０４６０】  この６７℃での混合（撹拌）を５分間行い、「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」を調製した。【０４６１】  なお、当該撹拌は、前記のビーカーを前記の６７℃の温度の水槽中でスターラー（リモートドライブ電磁スターラー、型式：ＨＰ４０１０７、販売元：株式会社三商［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのスターラーのコントロールユニットの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４６２】（４）  次に、前記（３）の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物」の全部をビーカー内よりマイクロピペットにより吸い取り、別のビーカー（容量：１０ｍＬ）中で予め２０℃としておいた「一定量（４．０ｍＬ）の純水」に、撹拌しながら当該混合物の全部（全量）をこのマイクロピペットより添加した。【０４６３】  そして、当該添加後、この撹拌を室温（２５℃）にて５分間継続して行うことにより、前記の「リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物を混合して調製した混合物」（全部）と、前記の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」との混合を行った。【０４６４】  なお、この撹拌は、前記のビーカーをマルチスターラー（型式：Ｍ−３、販売元：アズワン株式会社［日本国］）の上に載せ、このビーカー内の回転子をこのマルチスターラーの目盛り「３」で回転させることにより行った。【０４６５】  また、前記のビーカー中の「一定量（４．０ｍＬ）の純水」の温度は水銀温度計で測定することにより２０℃であることを確認しておいた。【０４６６】（５）  次に、前記（４）の「当該混合物（リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕と本重合体化合物の混合物）と一定量の純水との混合後の混合液」に、更に一定量の純水を混合して、最終的な容量を２００ｍＬとした。【０４６７】（６）  以上の操作により、下記の（ｉ）〜（ｖ）の計５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液を、本発明の製造方法及び製造の簡略化方法によって製造した。  なお、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計５種類）において、いずれも、リパーゼ活性測定用基質〔ＤＧＧＭＲ〕の濃度は０．６ｍＭであり、本重合体化合物の濃度は２．０％（ｗ／ｖ）である。  また、これらのリパーゼ活性測定用基質溶液（計５種類）のいずれにも、濃度勾配や強い濁り等は見られず、それぞれ均質に混合されていることを目視にて確認した。【０４６８】  （ｉ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５１Ａ）  （ｉｉ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５４Ｌ）  （ｉｉｉ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉｉ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：ＫＦ−３５５Ａ）  （ｉｖ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｖ（リパーゼ活性測定用基質：���ＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−３４）  （ｖ）  リパーゼ活性測定用基質溶液−ｖ（リパーゼ活性測定用基質：ＤＧＧＭＲ、本重合体化合物：プルロニック  Ｌ−４４）【０４６９】〔２〕対照市販試薬  対照市販試薬として、前記の実施例４の１の〔２〕における市販のリパーゼ活性測定試薬「リキテック  リパーゼ  カラー  ＩＩ」（販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を使用した。【０４７０】２．試料  下の「（１）標準物質」、「（２）管理血清−１」、「（３）管理血清−２」、「（４）管理血清−３」、「（５）プール血清」、及び「（６）ヒト血清」をそれぞれ試料として用いた。【０４７１】（１）標準物質  市販の標準物質である「常用参照標準物質  ＪＳＣＣ常用酵素  （ＪＣＣＬＳ  ＣＲＭ−００１）」（製造番号：００１ｂ、販売元：一般社団法人検査医学標準物質機構［日本国］）を、「標準物質」として用いた。【０４７２】（２）管理血清−１  市販の精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｉ  Ｇ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−１」として用いた。【０４７３】（３）管理血清−２  精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＩＩ」の「試作品」（株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−２」として用いた。【０４７４】（４）管理血清−３  市販の精度管理用管理血清である「Ａａｌｔｏ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＣＲＰＩＩ  Ｕ」（販売元：株式会社シノテスト［日本国］）を、「管理血清−３」として用いた。【０４７５】（５）プール血清  複数のヒト血清を混合したものを、「プール血清」として用いた。【０４７６】（６）ヒト血清  ヒト血清（計５０検体）を、「ヒト血清」として用いた。【０４７７】３．試料中のリパーゼ活性の測定  前記２の各試料のリパーゼ活性の測定を、それぞれ下記の通り行った。【０４７８】〔１〕本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬による測定  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液からなる第２試薬、及び当該第２試薬に対応する第１試薬よりなるリパーゼ活性測定試薬（リパーゼ活性測定試薬キット）を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記２の各試料のリパーゼ活性の測定を行った。【０４７９】（１）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉを用いた場合（ａ）  前記の７１８０形汎用自動分析装置において、前記２のそれぞれの試料（「（１）標準物質」、「（２）管理血清−１」、「（３）管理血清−２」、「（４）管理血清−３」、「（５）プール血清」、及び「（６）ヒト血清」）について、これらの試料の２．６μＬに、それぞれ前記１の〔１〕の［１］の「第１試薬」の１６０μＬを第１試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０４８０】（ｂ）  次に、１６ポイント（第１試薬添加後２７０．０９３秒）から１７ポイント（第１試薬添加後２８６．９７７秒）の間に、前記１の〔１〕の［２］の（７）の（ｉ）の「リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉ」の９６μＬを第２試薬として添加し、３７℃で反応させた。【０４８１】（ｃ）  次に、３０ポイント（第１試薬添加後５１６．０４��秒）から３４ポイント（第１試薬添加後５８７．４２６秒）に掛けての吸光度変化量を主波長５７０ｎｍ、副波長７００ｎｍにて測定した。（試料中に含まれていたリパーゼの活性値に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）【０４８２】（ｄ）  なお、較正（キャリブレーション）のための較正物質（キャリブレーター）として、「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」（製造番号：１５８６８８、販売元：ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社［日本国］）を用いた。  この「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」を試料とすること以外は、前記（ａ）〜（ｃ）の記載の通りに操作を行い、較正物質である「自動分析用キャリブレーターＩＩ（Ｃ．ｆ．ａ．ｓ．ＩＩ）」を測定したときの吸光度変化量を測定した。（当該較正物質に含まれているリパーゼの活性値［既知値］に応じて生成する６’−メチルレゾルフィンの濃度増加に基づく吸光度変化量の測定）【０４８３】（ｅ）  また、試薬盲検（試薬ブランク）の測定のため、生理食塩水を用いた。  この生理食塩水を試料とすること以外は、前記（ａ）〜（ｃ）の記載の通りに操作を行い、生理食塩水を測定したときの吸光度変化量を測定した。（試薬盲検の吸光度変化量の測定）【０４８４】（ｆ）  次に、前記（ｃ）において求めた前記２のそれぞれの試料についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（ｅ）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「試料の吸光度変化量差の値」を求めた。【０４８５】  また、前記（ｄ）において求めた較正物質（リパーゼ活性値が既知）についての当該ポイント間の吸光度変化量から、前記（ｅ）において求めた当該ポイント間の試薬盲検の吸光度変化量を差し引いて、「較正物質の吸光度変化量差の値」を求めた。【０４８６】  次に、前記の「試料の吸光度変化量差の値」と、「較正物質の吸光度変化量差の値」と、既知である「較正物質のリパーゼ活性値」とを対比し、比例計算を行うことにより、前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４８７】（２）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉ［前記１の〔１〕の［２］の（７）の（ｉｉ）］に替えること、及び前記（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「２４ポイント（第１試薬添加後４１１．８８７秒）から２８ポイント（第１試薬添加後４８０．３６０秒）」に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４８８】（３）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉｉを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉｉ［前記１の〔１〕の［２］の（７）の（ｉｉｉ）］に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用��質溶液−ｉｉｉを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４８９】（４）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｖを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｖ［前記１の〔１〕の［２］の（７）の（ｉｖ）］に替えること、及び前記（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「２３ポイント（第１試薬添加後３９４．０４３秒）から２７ポイント（第１試薬添加後４６２．５１６秒）」に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｖを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４９０】（５）第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｖを用いた場合  前記（１）の（ｂ）における第２試薬をリパーゼ活性測定用基質溶液−ｉからリパーゼ活性測定用基質溶液−ｖ［前記１の〔１〕の［２］の（７）の（ｖ）］に替えること、及び前記（１）の（ｃ）における吸光度変化量を測定するポイント（ポイント間）を「３０ポイントから３４ポイント」より「１９ポイント（第１試薬添加後３２２．６６５秒）から２３ポイント（第１試薬添加後３９４．０４３秒）」に替えること以外は、前記（１）の（ａ）〜（ｆ）の記載の通りに操作を行い、第２試薬にリパーゼ活性測定用基質溶液−ｖを用いた場合の前記２の各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４９１】〔２〕対照市販試薬による測定  対照市販試薬を使用して、７１８０形汎用自動分析装置（販売元：株式会社日立ハイテクノロジーズ［日本国］）により、前記２の各試料のリパーゼ活性の測定を行った。【０４９２】  すなわち、前記２の（１）〜（６）の各試料のリパーゼ活性の測定を、前記１の〔２〕の「対照市販試薬」の「緩衝液」（第１試薬）及び「基質液」（第２試薬）を使用して、前記の実施例４の３の〔２〕に記載の方法に従って操作を行い、当該各試料のリパーゼ活性値を求めた。【０４９３】４．測定結果（１）相関の図  前記３の〔１〕における各試料のリパーゼ活性値の測定結果（測定値）と、前記３の〔２〕における各試料のリパーゼ活性値の測定結果（測定値）とを、これらの相関の図として図１に示した。【０４９４】  なお、本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉを用いた場合の相関の図を図１の［１］として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉを用いた場合の相関の図を図１の［２］として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉｉを用いた場合の相関の図を図１の［３］として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｖを用いた場合の相関の図を図１の［４］として、そして、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｖを用いた場合の相関の図を図１の［５］として示した。【０４９５】  なお、これらの図１の［１］〜［５］において、横軸（ｘ）は前記３の〔２〕における対照市販試薬による各試料のリパーゼ活性値の測定結果（測定値）を表す。この測定値の単位は、単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）である。【０４９６】  また、これらの図１の［１］〜［５］において、縦軸（ｙ）は前記３の〔１〕に���ける「本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬」による各試料のリパーゼ活性値の測定結果（測定値）を表す。この測定値の単位は、単位／Ｌ（Ｕｎｉｔ／Ｌ）である。【０４９７】  そして、これらの図１の［１］〜［５］において、「標準物質」の試料を「△」で示し、「管理血清−１」の試料を「○」で示し、「管理血清−２」の試料を「□」で示し、「管理血清−３」の試料を「●」で示し、「プール血清」の試料を「◇」で示し、そして、「ヒト血清」（計５０検体）の試料をそれぞれ「◆」で示した。【０４９８】（２）相関の回帰式  前記３の〔１〕における「本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を含む測定試薬」による測定結果（測定値）と、前記３の〔２〕における対照市販試薬による測定結果（測定値）との相関の回帰式及び相関係数を以下に示す。［なお、これらの相関の回帰式における「ｘ」及び「ｙ」は前記（１）に記載した通りである。］【０４９９】［１］  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉを用いた場合  相関の回帰式：ｙ＝１．２０５ｘ−７．９９９、相関係数Ｒ２：０．９７９５【０５００】［２］  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉを用いた場合  相関の回帰式：ｙ＝１．１３６ｘ−１０．０４、相関係数Ｒ２：０．９８９２【０５０１】［３］  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｉｉを用いた場合  相関の回帰式：ｙ＝１．０４１ｘ＋１．７５６、相関係数Ｒ２：０．９９５３【０５０２】［４］  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｉｖを用いた場合  相関の回帰式：ｙ＝１．１７３９ｘ−１１．９３、相関係数Ｒ２：０．９８６１【０５０３】［５］  本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液として、リパーゼ活性測定用基質溶液−ｖを用いた場合  相関の回帰式：ｙ＝１．１０６５ｘ−５．７６０、相関係数Ｒ２：０．９９８０【０５０４】５．考察  図１の［１］〜［５］、並びに前記４の（２）に記載した相関の回帰式及び相関係数の値より、本発明の方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液を使用して求めた試料中のリパーゼ活性値の測定結果（測定値）は、５種類のリパーゼ活性測定用基質溶液のいずれを用いた場合であっても、対照市販試薬を使用して求めたリパーゼ活性値の測定結果（測定値）と良好な相関性を示すことが分かる。【０５０５】  このことより、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び製造の簡略化方法により製造したリパーゼ活性測定用基質溶液は、試料中のリパーゼ活性を正確に測定することができるものであることが確かめられた。【０５０６】  すなわち、本発明のリパーゼ活性測定用基質溶液の製造方法及び製造の簡略化方法においては、簡便、短時間かつ低コストによりリパーゼ活性測定用基質溶液を製造することが可能になるとともに、当該基質溶液により試料中のリパーゼ活性の正確な測定結果（測定値）を提供することができることが確かめられた。
【図１】
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