(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトタウ（ｐＳ４２２）に特異的に結合するヒト化抗体であって、該抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、１８及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１２、０５及び１５のＨＶＲ、又は
ｃ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ
を含む、ヒト化抗体。
【請求項２】
ａ）配列番号２０の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメイン及び配列番号１６の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号１９の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号２１の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン
を含む、請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
前記抗体が、エフェクター機能を示さない、請求項１〜２のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項４】
前記抗体が、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、
請求項１〜３のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項５】
前記抗体が、
ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下の、及び／又は
ｂ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下の、及び／又は
ｃ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下の、及び／又は
ｄ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下の
ＥＣ５０値を有する、請求項１〜４のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ヒトタウ（ｐＳ４２２）（配列番号０２）に特異的に結合し、ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、請求項１〜５のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項７】
前記抗体が、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体、又は
ｃ）突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを備えたヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、
ｄ）突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを備えたヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体、
ｅ）両重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ、並びに一方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを備えたヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、又は
ｆ）両重鎖に突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇ、並びに一方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを備えたヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体
である、請求項１〜６のいずれか一項記載のヒト化抗体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載のヒト化抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤。
【請求項９】
抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体又は抗Ａベータ抗体を更に含む、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
医薬の製造における、請求項１〜７のいずれか一項記載のヒト化抗体の使用。
【請求項１１】
前記医薬が、アルツハイマー病の処置用である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬が、前駆期アルツハイマー病の処置用である、請求項１０〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
前記医薬が、軽度アルツハイマー病の処置用である、請求項１０〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
前記医薬が、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減用である、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】
前記医薬が、認知及び機能の維持用である、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬が、認知的及び機能的減退の速度の緩徐化用である、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】
タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減のための、請求項１〜７のいずれか一項記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を含む請求項８又は９に記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号０３のリン酸化タウ（Ｔａｕ）フラグメントに特異的に結合するヒト化抗タウ（ｐＳ４２２）抗体、及び脳疾患の処置のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトタウ（微小管結合タンパク質タウ（神経原線維濃縮体タンパク質、対になったらせん状フィラメント−タウ、ＰＨＦ−タウ））は、主に軸索に認められる神経微小管結合タンパク質であって、チューブリン重合を促進するように、且つ、微小管を安定化するように機能する。８つのアイソフォーム（アイソフォームＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、胎児タウ）がヒト脳に認められ、最長アイソフォームは４４１個のアミノ酸（アイソフォームＦ、Uniprot P10636-8）を含む。タウ及びその特性は、Reynolds, C.H., et al., J. Neurochem. 69 (1997) 191-198にも記載されている。
【０００３】
タウは、その高リン酸化型にて、対になったらせん状フィラメント（ＰＨＦ）、すなわち、アルツハイマー病（ＡＤ）脳における神経原線維病変の構成要素の主要成分である。タウは、そのセリン又はトレオニン残基にて、ＧＳＫ３ベータ、ｃｄｋ５、ＭＡＲＫ及びＭＡＰキナーゼファミリーのメンバーを含む様々なキナーゼによってリン酸化され得る。
【０００４】
タウオパチーは、タウの異常な過剰リン酸化によって特徴付けられ、Iqbal, K., et al.（Biochim. Biophys. Acta 1739 (2005) 198-210)）によれば以下のものである。
・アルツハイマー病（同疾患の神経原線維型（tangle-only form）を含む）
・ダウン症候群、成人症例
・グアムパーキンソニズム認知症複合（Guam parkinsonism dementia complex）
・ボクサー認知症（Dementia pugilistica）
・ピック病
・嗜銀顆粒性認知症
・前頭側頭型認知症
・大脳皮質基底核変性症
・淡蒼球−橋−黒質変性症
・進行性核上性麻痺
・神経原線維変化型ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病。
【０００５】
アルツハイマー病の脳由来のタウに、今までのところおよそ４０個のセリン（Ｓ）／トレオニン（Ｔ）リン酸化部位が見出されている（Hanger, D.P., et al., J. Biol. Chem. 282 (2007) 23645-23654）。アルツハイマー病におけるタウ病変の発生は、そのリン酸化状態に関連している。しかしながら、前記４０個のリン酸化部位のほとんどが健康な胎児脳組織から抽出されたタウにも見出されるので、それらは疾患病変に関わるものではない。少数のリン酸化のみがその病状に一意的であり、おそらくは、アルツハイマーの脳のＰＨＦにおけるタウを定義する異常な凝集及び特徴的な不溶性の原因である（Morishima-Kawashima, M., et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 823-829）。Pei, J.J., et al.（J. Alzheimer's Disease 14 (2008) 385-392）によれば、現存する文献で提供されるのは、ＡＤ脳に特異的なこれらの部位に関する、限られていて不明確な情報である。Peiは、タウに対するリン酸化部位特異的抗体のリストを用い、２２名のＡＤ患者及び１０名の対照からの内側側頭葉のホモジネートにおけるそれらのレベルを測定した。
【０００６】
Bussiere, T., et al.（Acta Neuropathol. 97 (1999) 221-230）は、タウタンパク質のリン酸化セリン４２２は、神経原線維変性がある様々な疾患で見出される病態エピトープであることを記載した。Augustinack, J.C., et al.（Acta Neuropathol. 103 (2002) 26-35）は、ｐＳ４２２をアルツハイマー病における神経病変の重症度と相関しているものとして記載している。Guillozet-Bongaarts, A.（J. Neurochem. 97 (2006) 1005-1014）は、セリン４２２でのタウのリン酸化をＰＨＦの成熟プロセスの一部であるとして記載している。タウｐＳ４２２は、アルツハイマー病の種々のトランスジェニックマウスモデルにおいて発生している病変に関連して見出されてもいる。したがって、Deters, N., et al.は、Biochem. Biophys. Res. Commun. 379 (2009) 400-405において、二重トランスジェニックＤｏｍ５／ｐＲ５マウスで、病態Ｓ４２２エピトープが特異的にリン酸化されたタウを含む海馬のニューロン数が７倍の増加を示すと述べた。Goetz, J., et al.（Science 293 (2001) 1491-1495）は、Ａベータ４２原線維を注射したタウＰ３０１Ｌトランスジェニックマウスの脳における、Ｓ４２２でリン酸化されたタウの出現を報告した。
【０００７】
ＥＰ  ２００９１０４は、アルツハイマー病ＰＨＦ由来のタウタンパク質におけるリン酸化状態で生じるタウタンパク質のエピトープと、アルツハイマータウタンパク質を特異的に検出する抗体を生成するための、前記エピトープの使用とに関する。ＷＯ  ２００２／０６２８５１及びＵＳ  ７，４４６，１８０は、タウタンパク質の異常切断型に対する特異性がある抗体、並びにアルツハイマー病及び関連するタウオパチーに対しての、診断的及び治療的態様に関する。
【０００８】
ＷＯ  ９８／２２１２０は、アルツハイマー病の患者を処置する方法であって、アミノ酸約２０７〜約２２２、アミノ酸約２２４〜約２４０、及びアミノ酸約３９０〜約４０８のリン酸化タウフラグメントに対する抗体を、当該患者に投与する工程を含む方法に関する。リン酸化タウフラグメント３７９−４０８［Ｐ−Ｓｅｒ３９６、４０４］を用いてタウトランスジェニックマウスにワクチン接種する動物試験が、Asuni, A.A., et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129に述べられている。ＵＳ  ２００８／００５０３８３は、タウタンパク質フラグメントを投与することによる、被験者におけるアルツハイマー病又は他のタウオパチーを処置及び予防する方法に関する。
【０００９】
Hasegawa, M., et al.（FEBS Lett. 384 (1996) 25-30）は、微小管結合タンパク質タウ内のホスホセリン４２２に特異的なモノクローナル抗体（ＡＰ４２２）を報告している。
【００１０】
ＷＯ  ０１／５５７２５には、タウオパチーのin vivo診断用の方法、及び／又はタウオパチー 対 非タウオパチーのin vivo鑑別診断用の方法において使用するための、タウを特異的に認識する抗体、及びホスホ−タウ（１８１）を特異的に認識する抗体が報告されている。
【００１１】
ＷＯ  ０２／０２７０１７には、リン酸化セリンを有するポリペプチド免疫原から調製された抗体が報告されている。ＷＯ  ０２／０６２８５１は、タウタンパク質の異常切断型に対する特異性がある抗体、並びにアルツハイマー病及び関連するタウオパチーに関する診断及び治療の態様に関する。
【００１２】
ＷＯ  ２００４／０１６６５５には、中枢神経系（ＣＮＳ）タウタンパク質に特異的な抗体であって、当該抗体はＣＮＳタウタンパク質を特異的に認識するが末梢タウタンパク質を特異的に認識することはなく、及び当該抗体は、タウタンパク質をコード化する遺伝子のエクソン４によってコード化されるアミノ酸配列と、そのエクソン５によってコード化されるアミノ酸配列との間の結合部分のアミノ酸配列をエピトープとして特異的に認識するものが報告されている。
【００１３】
タウｐＳ４２２に対するモノクローナル抗体が、例えば、ＥＰ  １８７６１８５に記載されている。タウｐＳ４２２に対するポリクローナル抗体は市販されている（例えば、ProSci Inc. and Biosource International）。
【００１４】
ＷＯ  ２００６／０５５１７８には、Ｓｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５でタウタンパク質のリン酸化を阻害する方法であって、タウタンパク質を含有する試料を、アミロイドベータ由来の拡散性リガンドに結合する抗体又は抗原結合フラグメントに接触させ、これによりＳｅｒ２０２／Ｔｈｒ２０５でタウタンパク質のリン酸化を阻害することを含む方法が報告されている。
【００１５】
ｔｙｒ３９４及び／又はｔｙｒ３１０でリン酸化されたタウに特異的に結合する抗体調製物が、ＷＯ  ２００７／０１９２７３に報告されている。リン酸化タウフラグメント３７９−４０８［Ｐ−Ｓｅｒ３９６、４０４］を用いてタウトランスジェニックマウスにワクチン接種する動物試験が、Asuni, A.A. et al., J. Neuroscience 27 (2007) 9115-9129に述べられている。
【００１６】
ＥＰ  ２００９１０４は、アルツハイマー病ＰＨＦ由来のタウタンパク質におけるリン酸化状態で生じるタウタンパク質のエピトープと、アルツハイマータウタンパク質を特異的に検出する抗体を生成するための前記エピトープの使用とに関する。
【００１７】
ＵＳ  ２００８／００５０３８３は、タウタンパク質フラグメントを投与することによる、被験者におけるアルツハイマー病又は他のタウオパチーを処置及び予防する方法に関する。
【００１８】
ＷＯ  ２０１０／０３７１３５には、血液脳関門（ＢＢＢ）レセプター又は同等物に対するリガンドを含むか又はこれよりなる第１ドメインと、タンパク質凝集体の凝集速度を低下させる、タンパク質凝集体の形成を阻害する、又はタンパク質凝集体を逆転、消化若しくは溶解させる、酵素又は組成物を含むか又はこれよりなる第２ドメインとを含む、単離、合成又は組換えポリペプチド又はペプチドが報告されている。in vitro及び／又はin vivoでタウタンパク質を認識及びタウタンパク質に結合することができる抗体、特にモノクローナル抗体又はその機能的部分が、ＷＯ  ２０１０／１１５８４３に報告されている。
【００１９】
ＷＯ  ２０１１／０２６０３１に、タウオリゴマーに特異的に結合し、可溶性タウ又はタウ原線維に結合しない、タウオパチー、例えばアルツハイマー病、進行性核上性麻痺及び皮質基底核変性症を処置するために有用なモノクローナル抗体又はそのフラグメントが報告されている。ＷＯ  ２０１１／０５３５６５には、Ｓｅｒ（２３８）及びＴｈｒ（２４５）の１以上でリン酸化されたヒトタウタンパク質に特異的に結合する、単離された抗体が報告されている。
【００２０】
ＷＯ  ２０１２／０４５８８２には、哺乳類のタウタンパク質のホスホ−エピトープに特異的に結合し、タウオパチー等の神経変性障害を処置するために、及び認知障害を処置又は軽減するために有用な抗体が報告されている。ヒトモノクローナル抗タウ抗体又はそのタウ結合フラグメントは、ＷＯ  ２０１２／０４９５７０に報告されている。被験者におけるアルツハイマー病又は他のタウオパチーを予防又は処置する方法であって、アルツハイマー病又は他のタウオパチーの治療を必要とするヒトに抗体を投与することを含み、当該抗体はタウタンパク質の異常型に対する特異性を有し、前記抗体は正常なタウタンパク質に結合性及び／又は反応性を示さず、及びアルツハイマー病又は他のタウオパチーを予防又は処置するのに有効な条件下及びそれに有効な量で投与されるものである方法が、ＷＯ  ２０１２／１０６３６３に報告されている。
【００２１】
ＷＯ  ２０１２／１４９３６５には、凝集したタウとの反応性を示し、及び凝集していないタウとの反応性を実質的に示さない抗体であって、当該凝集したタウが、１以上のシステイン残基で、直接又はリンカーを介して、互いに架橋されている少なくとも２つのタウタンパク質を含むものが報告されている。
【００２２】
タウオパチー、例えばアルツハイマー病の処置に有用な組成物であって、タウに結合する抗体、特定のリン酸化タウ及びそのフラグメントに特異的に結合するリン酸化セリンの特定の位置で改変された化合物、並びに担体を含むものが、ＷＯ  ２０１０／１４２４２３に報告されている。
【００２３】
ＥＰ  １８７６１８５  Ａには、リン酸化ポリペプチドを認識する抗体が報告されている。ＷＯ  ２０１３／１５１７６２には、ヒト化タウ抗体が報告されている。ＷＯ  ２０１４／０１６７３７には、ヒトリン酸化タウに対する新規なニワトリモノクローナル抗体、及びその使用が報告されている。ＷＯ  ２０１４／０１６７３７に報告されているのは、ヒトリン酸化タウに対する新規なニワトリモノクローナル抗体、及びその使用である。病態タウ二量体及び前原線維病態タウオリゴマーに対して選択的な抗体、並びにタウオパチーの処置、診断及びモニタリングにおけるそれらの使用が、ＷＯ  ２０１２／１４９３６５に報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明は、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体、とりわけヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体、及びそれを使用する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本明細書に報告されるヒト化抗体は、標準的なヒト化方法によっては得られなかった。配列番号０７及び配列番号１１のアミノ酸配列を有する可変ドメインを含む親ウサギ抗体に匹敵する結合特性を備えたヒト化抗体を得るためには、アミノ酸配列に非標準的突然変異を導入する必要があった。これは、本明細書に報告される抗体が、ヒト血液脳関門を越えてヒト脳内で有効となることが意図されているのでとりわけ重要である。したがって、ヒト化抗体の選択のために一般的に適用される基準は、今回の場合に直接適用するには十分に厳密ではない。
【００２６】
本明細書に報告される一つの態様は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に特異的に結合する（ヒト化）抗体であって、当該抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに特異的に結合する。
【００２７】
本明細書に報告される抗体は、第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウに関する選択性、非リン酸化野生型ヒトタウ及びタウ突然変異体Ｓ４２２Ａに関する選択性を示す。非リン酸化野生型ヒトタウ及びタウ突然変異体Ｓ４２２Ａはそれぞれ、全く結合されないか、又は低親和性にて結合される。
【００２８】
本明細書に報告される一つの態様は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に特異的に結合する（ヒト化）抗体であって、当該抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインに、配列番号０８、１８及び１０のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインに、配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ
を含むことを特徴とする。
【００２９】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ａ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ、又は
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１２、０５及び１５のＨＶＲ
を含む。
【００３０】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、１８及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１２、０５及び１５のＨＶＲ、又は
ｃ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ
を含む。
【００３１】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ａ）配列番号２０の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメイン及び配列番号１６の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号１９の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号２１の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン
を含む。
【００３２】
一つの実施形態では、前記抗体は、アルツハイマー病の処置に使用するためのものである。
【００３３】
一つの実施形態では、前記抗体は、エフェクター機能を示さない。一つの実施形態では、前記抗体は、エフェクター機能を有していない。一つの実施形態では、前記抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、両重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを有する（ナンバリングはKabatのＥＵインデックスに従う）。
【００３４】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する。
【００３５】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下の、及び／又は
ｂ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下の、及び／又は
ｃ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下の、及び／又は
ｄ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下の
ＥＣ５０値を有する。
【００３６】
一つの実施形態では、前記抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）（配列番号０２）に特異的に結合し、ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない。
【００３７】
一つの実施形態では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。
【００３８】
一つの実施形態では、前記抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合する抗体フラグメントであって、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する。
【００３９】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体、又は
ｃ）突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを備えたヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、
ｄ）突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを備えたヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体、
ｅ）両重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ、並びに一方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを備えたヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、又は
ｆ）両重鎖に突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ、並びに一方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを備えたヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体
である。
【００４０】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号０８、配列番号１８及び配列番号１０のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４１】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号１０のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１２、配列番号０５及び配列番号１５のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４２】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号１０のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
i）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４３】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４４】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４５】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４６】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
ことを特徴とする。
【００４７】
全態様の一つの好ましい実施形態において、前記抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、抗体が重鎖可変ドメインの第４、２４及び７８位にバリン残基を有することを特徴とする。
【００４８】
全態様の一つの好ましい実施形態において、前記抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、抗体が重鎖可変ドメインの第７１位にアルギニン残基を有することを特徴とする。
【００４９】
本明細書に報告される一つの態様は、本明細書に報告される（ヒト化）抗体をコード化する、単離された核酸である。
【００５０】
本明細書に報告される一つの態様は、本明細書に報告される核酸を含む宿主細胞である。
【００５１】
本明細書に報告される一つの態様は、（ヒト化）抗体の製造方法であって、当該抗体が生成されるように、本明細書に報告される宿主細胞を培養する工程を含む方法である。
【００５２】
一つの実施形態では、前記方法は、細胞又は培養培地から前記抗体を回収する工程を更に含む。
【００５３】
本明細書に報告される一つの態様は、本明細書に報告される（ヒト化）抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤である。
【００５４】
一つの実施形態では、前記医薬製剤は、追加の治療剤を更に含む。
【００５５】
一つの実施形態では、前記追加の治療剤は抗アミロイド治療剤である。一つの実施形態では、前記抗アミロイド治療剤は、抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体又は抗Ａベータ抗体である。
【００５６】
本明細書に報告される一つの態様は、医薬として使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００５７】
本明細書に報告される一つの態様は、アルツハイマー病の処置に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００５８】
本明細書に報告される一つの態様は、前駆期アルツハイマー病の処置に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００５９】
本明細書に報告される一つの態様は、軽度アルツハイマー病の処置に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００６０】
本明細書に報告される一つの態様は、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００６１】
本明細書に報告される一つの態様は、認知及び機能の維持に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００６２】
本明細書に報告される一つの態様は、認知的及び機能的減退の速度の緩徐化に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００６３】
本明細書に報告される一つの態様は、神経原線維濃縮体蓄積の速度の低減に使用するための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体である。
【００６４】
如上の態様の一つの実施形態では、前記使用は、タウ（ｐＳ４２２）の消去によって神経原線維濃縮体負荷を低減することによる。
【００６５】
如上の態様の一つの実施形態では、前記使用は、神経原線維濃縮体ビルドアップを防止することによる。
【００６６】
如上の態様の一つの実施形態では、前記使用は、神経原線維濃縮体を除去／消去することによる。
【００６７】
一つの実施形態では、前記防止及び／又は除去は、タウ凝集体の細胞内クリアランスを促進することによる。
【００６８】
如上の態様の一つの実施形態では、前記使用は、神経原線維濃縮体の進展を阻害することによる。一つの実施形態では、前記阻害は、病態タウの型／種のニューロン間移送を防止することによる。
【００６９】
本発明の態様はまた、処置方法であって、アルツハイマー病を処置するため、前駆期アルツハイマー病を処置するため、軽度アルツハイマー病を処置するため、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性を低減するため、認知及び機能を維持するため、認知的及び機能的減退の速度を緩徐化するため、及び／又は神経原線維濃縮体蓄積の速度を低減するために、本明細書に報告される（ヒト化）抗体を投与することを含む方法である。
【００７０】
本明細書に報告される一つの態様は、医薬の製造における、本明細書に報告される（ヒト化）抗体の使用である。
【００７１】
一つの実施形態では、前記医薬は、アルツハイマー病の処置用である。
【００７２】
一つの実施形態では、前記医薬は、前駆期アルツハイマー病の処置用である。
【００７３】
一つの実施形態では、前記医薬は、軽度アルツハイマー病の処置用である。
【００７４】
一つの実施形態では、前記医薬は、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減用である。
【００７５】
一つの実施形態では、前記医薬は、認知及び機能の維持用である。
【００７６】
一つの実施形態では、前記医薬は、認知的及び機能的減退の速度の緩徐化用である。
【００７７】
本明細書に報告される一つの態様は、アルツハイマー病を有する個体の処置方法であって、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与することを含む方法である。
【００７８】
本明細書に報告される一つの態様は、個体における、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減方法であって、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与して、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性を低減することを含む方法である。
【００７９】
本明細書に報告される一つの態様は、個体における認知及び機能の維持方法であって、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与して、認知及び機能を維持することを含む方法である。
【００８０】
本明細書に報告される一つの態様は、個体における認知的及び機能的減退の速度の緩徐化方法であって、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与して、認知的及び機能的減退の速度を緩徐化することを含む方法である。
【００８１】
本明細書に報告される一つの態様は、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減における、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用である。
【００８２】
本明細書に報告される一つの態様は、認知及び機能の維持における、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用である。
【００８３】
本明細書に報告される一つの態様は、認知的及び機能的減退の速度の緩徐化における、本明細書に報告される（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用である。
【００８４】
本明細書に報告される抗体は、アルツハイマー病の処置において使用され得る。
【００８５】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体で、アルツハイマー病及び神経病変の進行の阻害／低減が実行され得る。
【００８６】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、アルツハイマー病の発症から保護するために使用され得るか、又はアルツハイマー病の進行を止めるためにも使用され得る。
【００８７】
一つの実施形態では、本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、ｉ）タウ（ｐＳ４２２）トランスジェニックマウス及びアルツハイマー病患者の脳切片のタウ（ｐＳ４２２）に結合し；及び／又はタウ（ｐＳ４２２）トランスジェニック細胞のタウ（ｐＳ４２２）をラベルする。
【００８８】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、アルツハイマー病の処置のために使用され得る。
【００８９】
本明細書に報告される一つの態様は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）の配列番号０３のアミノ酸配列に特異的に結合する（ヒト化）抗体である。
【００９０】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）の早期及び後期疾患関連型に特異的に結合／認識する。
【００９１】
本明細書に報告される一つの態様は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）関連アルツハイマー病進展の防止のための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体の使用である。
【００９２】
本明細書に報告される一つの態様は、リソソーム膜崩壊の低減のための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体の使用である。
【００９３】
本明細書に報告される一つの態様は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）で誘発された不安定化及び／又は崩壊に対する、リソソーム膜の安定化のための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体の使用である。
【００９４】
本明細書に報告される一つの態様は、アルツハイマー病進行の防止のための、本明細書に報告される（ヒト化）抗体の使用である。
【００９５】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）の播種及び細胞間進展の、抗体が媒介する阻害によって機能する。
【００９６】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合することによって、原線維の損傷からリソソームを保護する。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ウサギ及びヒト化軽鎖可変ドメインの配列アラインメントを示す図である；ＣＤＲに囲み枠を付記する。
【図２】ウサギ及びヒト化重鎖可変ドメインの配列アラインメントを示す図である；ＣＤＲに囲み枠を付記する。
【図３】ヒト化ＶＨとＶＬとの異なる組み合わせの、（Ａ）リン酸化タウペプチド、（Ｂ）リン酸化全長ヒトタウ、（Ｃ）非リン酸化タウペプチド、（Ｄ）非リン酸化全長ヒトタウへの生化学的結合を示す図である；（１）＝ＶＨ００／ＶＬ００、（２）＝ＶＨ３２／ＶＬ２１、（３）＝ＶＨ２０／ＶＬ２２、（４）＝ＶＨ３２／ＶＬ２２、（５）＝ＶＨ３３／ＶＬ２２；被覆濃度：リン酸化タウペプチド：５０ng/ml、他の全標的：１μg/ml；（リン酸化タウペプチドを１μg/mlで被覆すると、同等の結果が得られる（データ図示せず））。
【図４】ヒト化ＶＨとＶＬとの異なる組み合わせの、（Ａ）＝全長ヒトタウＳ４２２Ａ突然変異体、（Ｂ）＝凝集したヒトタウ（ｐＳ４２２）への生化学的結合を示す図である；（１）＝ＶＨ００／ＶＬ００、（２）＝ＶＨ３２／ＶＬ２１、（３）＝ＶＨ２０／ＶＬ２２、（４）＝ＶＨ３２／ＶＬ２２、（５）＝ＶＨ３３／ＶＬ２２；被覆濃度：リン酸化タウペプチド：５０ng/ml、他の全標的：１μg/ml；（リン酸化タウペプチドを１μg/mlで被覆すると、同等の結果が得られる（データ図示せず））。
【図５】選択されたヒト化ＶＨ／ＶＬの組み合わせの選択性を示すウエスタンブロットである；（１）＝ＶＨ００／ＶＬ００、（２）＝ＶＨ３２／ＶＬ２１、（３）＝ＶＨ２０／ＶＬ２２、（４）＝ＶＨ３２／ＶＬ２２、（５）＝ＶＨ３３／ＶＬ２２。
【図６】アルツハイマー病患者の脳抽出物中の高リン酸化タウへの結合を示す図である；（１）＝ＶＨ００／ＶＬ００、（２）＝ＶＨ３２／ＶＬ２１、（３）＝ＶＨ３２／ＶＬ２２。
【発明を実施するための形態】
【００９８】
配列の簡単な説明
配列番号０１：ヒトタウタンパク質アイソフォームＦ（４４１残基）
配列番号０２：第４２２位のセリン残基でリン酸化されたヒトタウタンパク質アイソフォームＦ（４４１残基）
配列番号０３：第７位（配列番号０１の第４２２位に対応）にリン酸化セリンを有するヒトタウタンパク質のフラグメント（配列番号０１の残基４１６〜４３０）：Ser-Ile-Asp-Met-Val-Asp-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-Asp
配列番号０４：ウサギ抗体０８６ ＣＤＲＬ１ − QSSQSVRTNKLA
配列番号０５：ウサギ抗体０８６ ＣＤＲＬ２ − SASTLDF
配列番号０６：ウサギ抗体０８６ ＣＤＲＬ３ − LGYFDCSIADCVA
配列番号０７：ウサギ抗体０８６ ＶＬ００
配列番号０８：ウサギ抗体０８６ ＣＤＲＨ１ − SNAIN
配列番号０９：ウサギ抗体０８６ ＣＤＲＨ２ − YIAVSGNTYYASWAKG
配列番号１０：ウサギ抗体０８６ ＣＤＲＨ３ − SNI
配列番号１１：ウサギ抗体０８６ ＶＨ００
配列番号１２：ヒト化ＣＤＲＬ１変異１ − RSSQSVRTNKLA
配列番号１３：ヒト化ＣＤＲＬ１変異２ − RSSQSVRTNRLA
配列番号１４：ヒト化ＣＤＲＬ２変異１ − SASTLDY
配列番号１５：ヒト化ＣＤＲＬ３変異１ − LGYFDSSADIVA
配列番号１６：ヒト化ＶＬ変異１ − ＶＬ２１
配列番号１７：ヒト化ＶＬ変異２ − ＶＬ２２
配列番号１８：ヒト化ＣＤＲＨ２ − YIAVSGNTYYADSVKG
配列番号１９：ヒト化ＶＨ変異１ − ＶＨ３２
配列番号２０：ヒト化ＶＨ変異２ − ＶＨ２０
配列番号２１：ヒト化ＶＨ変異３ − ＶＨ３３
配列番号２２：ヒト化ＣＤＲＬ２変異２ − SASTLQS
配列番号２３：ヒト化ＣＤＲＬ２変異３ − SASTLES
配列番号２４：ヒト化ＣＤＲＬ３変異２ − LGYFDSSIADSVA
配列番号２５：ヒト化ＣＤＲＬ３変異３ − LGYFDSSIADRVA
配列番号２６：ヒト化ＣＤＲＬ３変異４ − LGYFDPSIADPVA
配列番号２７：ヒト化ＣＤＲＬ３変異５ − LGYFDSSIADIVA
配列番号２８：ヒト化ＣＤＲＬ３変異６ − LGYFDPSADPIA
配列番号２９：ヒト化ＣＤＲＬ３変異７ − LGYFDPSADPVA
配列番号３０：ヒト化ＣＤＲＬ１変異３ − RASQGVRTNKLA
配列番号３１：ヒト化ＣＤＲＬ１変異４ − RASQSVRTNKLA
配列番号３２：ヒト化ＶＬ変異４ − ＶＬ０１
配列番号３３：ヒト化ＶＬ変異５ − ＶＬ０９
配列番号３４：ヒト化ＶＬ変異６ − ＶＬ１２
配列番号３５：ヒト化ＶＬ変異７ − ＶＬ１５
配列番号３６：ヒト化ＶＬ変異８ − ＶＬ１６
配列番号３７：ヒト化ＶＬ変異９ − ＶＬ１７
配列番号３８：ヒト化ＶＬ変異１０ − ＶＬ１９
配列番号３９：ヒト化ＶＬ変異１１ − ＶＬ２８
配列番号４０：ヒト化ＶＬ変異１２ − ＶＬ３３
配列番号４１：ヒト化ＶＬ変異１３ − ＶＬ３５
配列番号４２：ヒト化ＶＬ変異１４ − ＶＬ３９
配列番号４３：ヒト化ＶＬ変異１５ − ＶＬ４０
配列番号４４：ヒト化ＶＬ変異１６ − ＶＬ４１
配列番号４５：ヒト化ＶＬ変異１７ − ＶＬ４２
配列番号４６：ヒト化ＶＨ変異４ − ＶＨ０１
配列番号４７：ヒト化ＶＨ変異５ − ＶＨ０２
配列番号４８：ヒト化ＶＨ変異６ − ＶＨ０３
配列番号４９：ヒト化ＶＨ変異７ − ＶＨ０４
配列番号５０：ヒト化ＶＨ変異８ − ＶＨ１４
配列番号５１：ヒト化ＶＨ変異９ − ＶＨ１５
配列番号５２：ヒト化ＶＨ変異１０ − ＶＨ１８
配列番号５３：ヒト化ＶＨ変異１１ − ＶＨ１９
配列番号５４：ヒト化ＶＨ変異１２ − ＶＨ２２
配列番号５５：ヒト化ＶＨ変異１３ − ＶＨ２３
配列番号５６：ヒト化ＶＨ変異１４ − ＶＨ２４
配列番号５７：ヒト化ＶＨ変異１５ − ＶＨ３１
【００９９】
【表１】
0006608827.tif 000002
【０１００】
発明の実施形態の詳細な説明
Ｉ．定義
【０１０１】
本明細書での目的のための「アクセプタヒトフレームワーク」は、以下に定義するような、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプタヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでもよく、又はアミノ酸配列変化を含有してもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬアクセプタヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【０１０２】
「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総計の強度をいう。別途に示さない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性をいう。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般的に、解離定数（ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含め、当該技術分野で公知である通例の方法によって測定され得る。結合親和性を測定するための、具体的な実例となる典型的な実施形態を、以下に記載する。
【０１０３】
「親和性成熟」抗体とは、１以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１以上の改変を有する抗体であって、このような改変を有さない親抗体と比較して、かかる改変の結果、抗原に対する抗体の親和性の向上がもたらされるものをいう。
【０１０４】
用語「抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体」及び「ヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合する抗体」とは、その抗体がヒトタウ（ｐＳ４２２）をターゲティングする診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性をもってヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合することができる抗体をいう。一つの実施形態では、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の、関連性のない非ヒトタウ（ｐＳ４２２）タンパク質への結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定して、抗体のヒトタウ（ｐＳ４２２）への結合の約１０％未満である。
【０１０５】
本明細書で用語「抗体」は、最も広義に用いられ、所望の抗原−結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び抗体フラグメントを含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。
【０１０６】
「抗体フラグメント」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子をいう。抗体フラグメントの例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；二重特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する抗体をいい、及び逆に、競合アッセイにおいて、参照抗体は、当該抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する。一つの実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体のその抗原への結合を５０％以上阻止する。一つの実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体のその抗原への結合を８０％以上阻止する。一つの実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体のその抗原への結合を９０％以上阻止する。一つの実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体のその抗原への結合を９５％以上阻止する。一つの好ましい実施形態では、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、当該抗原に対し参照抗体と同じ残基で結合相互作用を有する。
【０１０８】
用語「キメラ」抗体とは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、一方、重鎖及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体をいう。
【０１０９】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が保持する定常ドメイン又は定常領域の型をいう。抗体の５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、更にサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２に分類し得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【０１１０】
「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域に起因し得るような生物活性であって、抗体クラスに応じて異なるものをいう。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプター）のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【０１１１】
ある薬剤、例えば医薬製剤の「有効量」とは、投薬量及び必要期間で、所望の治療的又は予防的結果を成し遂げるのに有効な量をいう。
【０１１２】
本明細書で用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、未変性の配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。一つの実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、重鎖のＣｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、カルボキシル末端までにわたる。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもしなくてもよい。本明細書に別途に記載がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242に記載の、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。
【０１１３】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基をいう。可変ドメインのＦＲは一般的に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４に現れる。
【０１１４】
用語「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書では互換的に使用され、未変性の抗体構造と実質的に同様の構造を有するか、又は本明細書で定義されるようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体をいう。用語「全長抗体」は、ジスルフィド結合により連結される２つの抗体軽鎖ポリペプチド及び２つの抗体重鎖ポリペプチドからなる多量体ポリペプチドを意味し、前記２つの抗体重鎖ポリペプチドにおいて、Ｃ末端リジン残基（Ｋ）は存在してもしなくてもよい。
【０１１５】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、その中に外来の核酸が導入されている細胞（このような細胞の後代を含む）をいう。宿主細胞は、初代形質転換細胞及び継代数に拘わらずそれに由来する後代を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。後代は、核酸含有量が親細胞と完全に同じでなくてよく、突然変異を含み得る。元の形質転換細胞についてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物活性を有する突然変異体後代は、本明細書に含まれる。
【０１１６】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択で最も通例に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般的に、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからなされる。一般的に、配列のサブグループは、Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Bethesda MD (1991), NIH Publication 91-3242, Vols. 1-3にあるようなサブグループである。一つの実施形態では、ＶＬについては、サブグループはKabat et al.（前記）にあるようなサブグループカッパＩである。一つの実施形態では、ＶＨについては、サブグループは、Kabat et al.（前記）にあるようなサブグループＩＩＩである。
【０１１７】
「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体をいう。ある実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含むことになり、ここですべて又は実質的にすべてのＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）は非ヒト抗体のものに対応し、そしてすべて又は実質的にすべてのＦＲはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」とは、ヒト化を受けている抗体をいう。
【０１１８】
用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、本明細書で使用する場合、順序通りに超可変であり（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）、及び構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成し、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触（antigen contact）」）を含有する、抗体可変ドメインの領域の各々をいう。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つはＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に、及び３つはＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。
【０１１９】
本明細書におけるＨＶＲは、以下のものを含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）に存在する超可変ループ（Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）に存在する抗原接触（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ（ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む）。
【０１２０】
別途に示さない限り、ＨＶＲ残基、及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書ではKabat et al.（前記）に従ってナンバリングされる。
【０１２１】
「イムノコンジュゲート」は、１以上の変異分子に接合された抗体である。
【０１２２】
「個体」又は「被験者」は、哺乳動物である。哺乳動物は、家畜化された動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサル等の非ヒト霊長類）、ウサギ、及び齧歯動物（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、個体又は被験者はヒトである。
【０１２３】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されているものである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定して９５％又は９９％を超える純度に精製される。抗体純度の評価のための方法のレビューについては、例えば、Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87を参照されたい。
【０１２４】
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離されている核酸分子をいう。単離された核酸は、通常核酸分子を含有する細胞に含有される当該核酸分子を含むが、かかる核酸分子は、染色体外に、又はその天然の染色体の位置とは異なる染色体の位置に存在する。
【０１２５】
「抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体をコード化する単離された核酸」とは、抗体重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコード化している１以上の核酸分子をいい、単一ベクター又は別個のベクター内のこのような核酸分子、及び宿主細胞内の１以上の位置に存在するこのような核酸分子を含む。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体をいい、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は可能な変異抗体を除いて同一及び／又は同じエピトープに結合するものであり、変異抗体とは例えば、天然に存在する突然変異を含むか、又はモノクローナル抗体調製物の生成中に生じるものであって、かかる変異は一般的に、微量しか存在していない。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対するものである。したがって、「モノクローナル」という修飾語句は、抗体の実質的に均一な集団から得られている抗体の特性を示し、何らかの特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座のすべて又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない、様々な技術によって作製され得るものであり、このような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法が本明細書に記載されている。
【０１２７】
「未変性の抗体」とは、天然に存在する様々な構造の免疫グロブリン分子をいう。例えば、未変性のＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同じ軽鎖及び２つの同じ重鎖からなる、約１５０、０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端にかけて、各重鎖は可変重ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後ろに３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端にかけて、各軽鎖は可変軽ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後ろに定常軽（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づきカッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つの型のうちの１つに割り当て得る。
【０１２８】
用語「添付文書」は、治療用製品の市販のパッケージに慣例的に含められる使用説明書を指すために使用され、それにはかかる治療用製品の使用に関する適応症、用途、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報が含まれる。
【０１２９】
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、最高のパーセント配列同一性を達成するように、必要に応じて配列のアラインメントを行い且つギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義され、ここで、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当該分野における技術内の種々のやり方で、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェア等の公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して成し遂げることができる。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書の目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータープログラムALIGN-2を使用して生成される。ALIGN-2配列比較コンピュータープログラムは、Genentech, Inc.,により創出され、そのソースコードはU.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559に利用者文書と共に提出されており、ここに米国著作権登録第ＴＸＵ５１００８７号で登録されている。ALIGN-2プログラムは、Genentech, Inc., South San Francisco, Californiaから公的に入手可能であり、又はソースコードからコンパイルされ得る。ALIGN-2プログラムは、digital UNIX（登録商標）V4.0Dを含むUNIX（登録商標）オペレーティングシステムにて使用するためにコンパイルされるべきである。すべての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムにより設定され、変動しない。
【０１３０】
ALIGN-2がアミノ酸配列比較のために使用される場合には、所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（「所与のアミノ酸配列Ｂへの、それとの、又はそれに対する特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａ」と、代わりに言及され得る）は、以下のとおりに計算される：
割合Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは、ＡとＢとのそのプログラムのアラインメントにおける配列アラインメントプログラムALIGN-2により完全一致としてスコア化されたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくならないということは分かるであろう。別途具体的に述べない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2コンピュータープログラムを使用して直上の段落に記載のとおりに得られる。
【０１３１】
用語「医薬製剤」とは、それに含有される有効成分の生物活性が有効となることを可能にするような型のものであって、その製剤が投与されることになるであろう被験者にとって容認し難いほど毒性の追加成分を含有しない調製物をいう。
【０１３２】
「薬学的に許容し得る担体」とは、有効成分以外の、被験者にとって無毒な、医薬製剤中の成分をいう。薬学的に許容し得る担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
用語「ヒトタウ（ｐＳ４２２）」とは、本明細書で使用する場合、未変性のヒトタウ（ｐＳ４２２）（UniProt P37840）をいう。この用語は、「全長」、未処理のヒトタウ（ｐＳ４２２）のみならず、細胞内での処理の結果生じるヒトタウ（ｐＳ４２２）の任意の型をも包含する。この用語はまた、天然に存在するヒトタウ（ｐＳ４２２）の変異、例えば、突然変異体、スプライス変異又は対立遺伝子変異も包含する。ヒトタウ（ｐＳ４２２）のアミノ酸配列を配列番号０２に示す。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「処置（treatment）」（及び「処置する（treat）」又は「処置すること（treating）」等のその文法的変異型は、処置を受ける個体の自然経過を変更する試みにおける臨床的介入をいい、予防のため、又は臨床病理の経過中のいずれかに実施され得る。処置の望ましい効果は、疾患の発症又は再発の予防、症候の軽減、疾患のなんらかの直接的又は間接的な病理的帰結の低減、転移の予防、疾患進行の速度の低下、病状の改善又は緩和、及び寛解又は予後の向上を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるため、又は疾患の進行を緩徐化するために使用される。
【０１３５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗原への抗体の結合に関わる、抗体重鎖又は軽鎖のドメインをいう。未変性の抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般的に類似の構造を有し、各ドメインは４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., N.Y. (2007), page 91を参照）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原−結合特異性を与えるのに十分であり得る。更に、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングするため、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを用いて、特定の抗原に結合する抗体を単離してもよい。例えば、Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628を参照されたい。
【０１３６】
用語「ベクター」は、本明細書で使用する場合、それに連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子をいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びそれが導入されている宿主細胞のゲノム内に組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらに動作可能に連結された核酸の発現を導くことができる。このようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
【０１３７】
ＩＩ．組成物及び方法
Ａ．例示的なヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体
本明細書に報告されるヒト化抗体は、標準的なヒト化方法によっては得られなかった。親ウサギ抗体に匹敵する結合特性を備えたヒト化抗体を得るためには、アミノ酸配列に非標準的突然変異を導入する必要があった。これは、本明細書に報告される抗体が、ヒト血液脳関門を越えてヒト脳内で有効となることが意図されているのでとりわけ重要である。したがって、ヒト化抗体の選択のために一般的に適用される基準は、今回の場合に直接適用するには十分に厳密ではない。
【０１３８】
好適で開発可能（developable）なヒト化抗体を得るためには、ＣＤＲＬ３（軽鎖ＣＤＲ３）においてジスルフィド架橋を形成している２つのシステインが、それぞれセリン及びイソロイシンで置換されなければならないことが見出されている。同じＣＤＲＬ３の正しい配向を確保することに加えて、ウサギＣＤＲＬ３の中央に存在するイソロイシン残基を欠失させ、その結果、親のウサギＣＤＲＬ３よりも１アミノ酸残基小さいヒト化ＣＤＲＬ３が得られた。
【０１３９】
更に、重鎖の第４、２４及び７８位の３つのバリンアミノ酸残基を維持することが有利であることが見出されている。これらの残基は、重鎖可変領域の抗原結合ループの正しい提示を確保するのに必要であると考えられるが、この理論に縛られることはない。加えて、第７１位にアルギニン残基が存在することが有利である。
【０１４０】
異なるヒト化軽鎖可変ドメインの配列アラインメントを、図１に示す。異なるヒト化重鎖可変ドメインの配列アラインメントを図２に示す。本明細書で使用する場合、ナンバリングは全て、Kabat可変ドメインナンバリングスキームに基づく。
【０１４１】
以下の表に、それぞれヒト化重鎖可変ドメインＶＨ１４及びＶＨ２０と組み合わせた、ウサギ軽鎖可変ドメインの異なるヒト化変異の特徴を示す。結合パートナーはヒトタウ（ｐＳ４２２）であった。
【０１４２】
【表２】
0006608827.tif 000003
【０１４３】
以下の表に、それぞれヒト化軽鎖可変ドメインＶＬ１７及びＶＬ１９と組み合わせた、ウサギ軽鎖可変ドメインの異なるヒト化変異の特徴を示す。
【０１４４】
【表３】
0006608827.tif 000004
【０１４５】
【表４】
0006608827.tif 000005
【０１４６】
以下の表に、異なるＶＨ／ＶＬの組み合わせに対する速度定数を示す。
【０１４７】
【表５】
0006608827.tif 000006
【０１４８】
ヒト化ＶＨとＶＬとの異なる組み合わせの生化学的結合を図３及び４に示す。
【０１４９】
以下の表に、異なるＶＨ／ＶＬの組み合わせに対する結合特異性を示す（[ng/ml]単位のＥＣ５０値）。
【０１５０】
【表６】
0006608827.tif 000007
【０１５１】
選択されたヒト化ＶＨ／ＶＬの組み合わせの、ヒトタウ突然変異体Ｓ４２２Ａに対する感受性は、図５に示されるウエスタンブロットに認めることができる。全てのヒト化変異は選択的に、Ｓ４２２でリン酸化されたヒトタウに結合する。親のウサギ抗体の非Ｓ４２２ホスホエピトープに対しては低レベルのｘ−反応性があるが、示されるヒト化変異は、親のウサギ抗体よりもこれに関して交差反応性が低い。
【０１５２】
図６に、アルツハイマー病患者の脳抽出物中のＰＨＦ-タウへの、親のウサギ抗体に対する、及び選択されたヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体に対する結合を示す。
【０１５３】
以下の表は、選択されたヒト化ＶＨ／ＶＬの組み合わせの生物学的特性を要約している。
【０１５４】
【表７】
0006608827.tif 000008
【０１５５】
一つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つのＨＶＲを含む（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を提供する。
【０１５６】
一つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つのＨＶＲを含む（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を提供する。
【０１５７】
一つの態様では、本発明は、（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３から選択される、少なくとも１つ、又は２つ、又は３つ、又は４つ、又は５つ、又は６つのＨＶＲを含む（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を提供する。
【０１５８】
一つの態様では、本発明は、
ｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全部で３つのＶＨ  ＨＶＲ配列を含む（ヒト化）抗体を提供する。
【０１５９】
一つの実施形態では、前記抗体は、
ｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３
を含む。
【０１６０】
別の実施形態では、前記抗体は、
ｉ）（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
から選択される、少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全部で３つのＶＬ ＨＶＲ配列を更に含む。
【０１６１】
更なる実施形態では、前記抗体は、
ｉ）（ａ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；又は
ｉｉ）（ａ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む。
【０１６２】
一つの態様では、本発明は、
ｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、又は
ｉｉｉ）（ａ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３
を含む（ヒト化）抗体を提供する。
【０１６３】
別の実施形態では、ＶＨ又はＶＬは、参照配列に比して置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、その配列を含む抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合する能力を保持している。
【０１６４】
本発明の更なる態様では、前記実施形態のいずれかに係る抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、キメラ、ヒト化又はヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一つの実施形態では、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである。別の実施形態では、抗体は全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１若しくはＩｇＧ４抗体又は本明細書で定義されるような他の抗体クラス若しくはアイソタイプである。
【０１６５】
本明細書に報告される（ヒト化）抗体は、トランスジェニックタウＰＳ２ＡＰＰマウスの脳におけるタウ（ｐＳ４２２）レベルを低減する。
【０１６６】
更なる態様では、前記実施形態のいずれかに係る（ヒト化）抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、以下の１〜７項目に記載の特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込み得る。
【０１６７】
１．抗体親和性
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体は、≦１００nM、≦５０nM、又は１nMと１００nMの間（例えば、１０−７M以下、例えば１０−７M〜１０−９M）の解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１６８】
一つの実施形態では、Ｋｄは放射性ラベル抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一つの実施形態では、ＲＩＡは、対象となる抗体のＦａｂバージョンとその抗原とで実施される。例えば、抗原に対するＦＡＢの溶液結合親和性は、一滴定系列の非ラベル抗原の存在下で、最低濃度の（１２５Ｉ）ラベル抗原を用いてＦａｂを平衡化し、次いで結合された抗原を抗Ｆａｂ抗体被覆プレートで捕獲することによって測定される（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照）。アッセイの条件を確立するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート（Thermo Scientific）を５０mM炭酸ナトリウム（ｐＨ９．６）中５μg/ml捕獲抗Ｆａｂ抗体（Cappel Labs）で一晩被覆し、その後ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンで２〜５時間、室温（およそ２３℃）にてブロッキングする。非吸着プレート（Nunc #269620）において、１００pM又は２６pM ［１２５Ｉ］−抗原を、対象となるＦａｂ（例えば、Presta, L.G. et al., Cancer Res.57 (1997) 4593-4599における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一致）の段階希釈と混合する。対象となるＦａｂは次いで、一晩インキュベーションされるが、インキュベーションは、平衡に達することを確実にするよう、更に長時間（例えば、約６５時間）続けてもよい。その後、混合物は室温で（例えば、１時間）インキュベーションするために捕獲プレートに移される。その溶液を次いで除去し、プレートはＰＢＳ中０．１％ポリソルベート２０（TWEEN-20（登録商標））で８回洗浄される。プレートが乾燥されたら、１５０μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）；Packard）が添加され、そのプレートはTOPCOUNT（商標）γカウンター（Packard）にて１０分間計数される。最高結合の２０％以下を与える各Ｆａｂの濃度が、競合結合アッセイにおいて使用するために選択される。
【０１６９】
別の実施形態によれば、Ｋｄは、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを用いて測定される。例えば、BIACORE（登録商標）-2000又はBIACORE （登録商標）-3000（BIAcore, Inc., Piscataway, NJ）を使用し、２５℃にて固定化抗原CM5チップを〜１０応答単位（RU）で用いてアッセイを実施する。一つの実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5、BIACORE, Inc.）を供給者の使用説明書に従いＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０mM酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μg/ml（〜０．２μM）に希釈し、その後５μl／分の流量で注入して、およそ１０応答単位（RU）のカップリングしたタンパク質を得る。抗原の注入後、１Mエタノールアミンを注入して未反応の基をブロックする。反応速度測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈液（０．７８nM〜５００nM）を、０．０５％ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を含むＰＢＳ中で２５℃にておよそ２５μl／分の流量で注入する。単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)（BIACORE（登録商標）Evaluation Softwareバージョン3.2）を用い、会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィッティングさせることにより、会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）は、比ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出される（例えば、Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881を参照）。前記表面プラズモン共鳴アッセイによる会合速度が１０６M-1s-1を超える場合は、その会合速度は、分光計、例えば、ストップフローを備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophotometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中、２０nMの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の２５℃での蛍光放出強度(励起＝２９５nm；放出＝３４０nm、帯域通過１６nm)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて測定され得る。
【０１７０】
２．抗体フラグメント
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体は、抗体フラグメントである。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖフラグメント、及び下記その他のフラグメントを含むが、これらに限定されない。特定の抗体フラグメントのレビューについては、Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134を参照されたい。ｓｃＦｖフラグメントのレビューについては、例えば、Plueckthun, A., In; The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore (eds.), Springer-Verlag, New York (1994), pp. 269-315を参照、また、ＷＯ  ９３／１６１８５; ＵＳ  ５，５７１，８９４及びＵＳ  ５，５８７，４５８も参照されたい。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含み、in vivo半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２フラグメントの議論については、ＵＳ  ５，８６９，０４６を参照されたい。
【０１７１】
二重特異性抗体は、２つの抗原−結合部位を備えた、二価又は二特異的であり得る抗体フラグメントである。例えば、ＥＰ  ０４０４０９７；ＷＯ  １９９３／０１１６１；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134；及びHolliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照されたい。三重特異性抗体及び四重特異性抗体も、Hudson, P.J. et al., Nat. Med.9 (20039 129-134)に記載されている。
【０１７２】
単一ドメイン抗体は、ある抗体の重鎖可変ドメインの全て若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全て若しくは一部を含む抗体フラグメントである。ある実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、ＵＳ  ６，２４８，５１６を参照）。
【０１７３】
抗体フラグメントは、本明細書に記載のような、インタクトな抗体のタンパク質分解性消化、及び組換え宿主細胞（例えば、E. coli又はファージ）による生成を含むがこれらに限定されない、種々の技術によって作製され得る。
【０１７４】
３．ヒト化抗体
典型的には、非ヒト抗体は、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持しつつ、ヒトに対する免疫原性を低減するようにヒト化される。一般的にヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体由来であり、またＦＲ（又はその一部）がヒト抗体配列由来である、１以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は場合により、ヒト定常領域の少なくとも一部又は全長も含むこととなろう。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば抗体特異性又は親和性を回復又は改良するよう、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基の由来元である抗体）からの対応する残基で置換される。
【０１７５】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633に概説されており、更に、例えば、Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329；Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; ＵＳ  ５，８２１，３３７、ＵＳ  ７，５２７，７９１、ＵＳ  ６，９８２，３２１、及びＵＳ  ７，０８７，４０９；Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34（特異性決定領域（ＳＤＲ）接合を記載）；Padlan, E.A., Mol. Immunol.28 (1991) 489-498（「リサーフェシング」を記載）；Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60（「ＦＲシャフリング」を記載）；並びにOsbourn, J. et al., Methods36 (2005) 61-68 and Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260（ＦＲシャフリングへの「誘導選択（guided selection）」アプローチを記載）に記載されている。
【０１７６】
ヒト化のために使用され得るヒトフレームワーク領域は、「最良適合」法を用いて選択されたフレームワーク領域（例えば、Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308を参照）；軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列由来のフレームワーク領域（例えば、Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289；及びPresta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632を参照）；ヒト成熟（体細胞性突然変異）フレームワーク領域又はヒト生殖系列フレームワーク領域（例えば、Almagro, J.C. and Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633を参照）；及びスクリーニングＦＲライブラリー由来のフレームワーク領域（例えば、Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684及びRosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618)を 参照）を含むが、これらに限定されない。
【０１７７】
４．多重特異性抗体
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある実施形態では、結合特異性の１つは、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対し、そして他のものは任意の他の抗原に対する。ある実施形態では、二重特異性抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製され得る。
【０１７８】
多重特異性抗体を作製するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え共発現（Milstein, C. and Cuello, A.C., Nature 305 (1983)537-540、ＷＯ  ９３／０８８２９、及びTraunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659を参照）、及び「ノブ・イン・ホール（knob-in-hole）」操作（例えば、ＵＳ  ５，７３１，１６８を参照）を含むが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、抗体ＦＣヘテロ二量体分子を作製するために静電的なステアリング効果を操作すること（ＷＯ  ２００９／０８９００４）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、ＵＳ  ４，６７６，９８０及びBrennan, M. et al., Science229 (1985) 81-83を参照）；ロイシンジッパーを用いて二重特異性抗体を生成すること（例えば、Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553を参照）；二重特異性抗体フラグメントを作製するために「二重特異性抗体」技術を用いること（例えば、Holliger, P. et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448を参照）;及び単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374を参照）;及び例えば、Tutt, A. et al., J. Immunol.147 (1991) 60-69に記載されているように三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。
【０１７９】
「オクトパス（Octopus）抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を備えた操作（engineered）抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ  ２００６／００２５５７６を参照）。
【０１８０】
本明細書における抗体又はフラグメントには、ヒトタウ（ｐＳ４２２）及び、別の異なる抗原に結合する抗原結合部位を含む「二重作用(Dual Acting)Ｆａｂ」すなわち「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ  ２００８／００６９８２０を参照）。
【０１８１】
本明細書における抗体又はフラグメントには、ＷＯ  ２００９／０８０２５１、ＷＯ  ２００９／０８０２５２、ＷＯ  ２００９／０８０２５３、ＷＯ  ２００９／０８０２５４、ＷＯ  ２０１０／１１２１９３、ＷＯ  ２０１０／１１５５８９、ＷＯ  ２０１０／１３６１７２、ＷＯ  ２０１０／１４５７９２、及びＷＯ  ２０１０／１４５７９３に記載の多重特異性抗体も含まれる。
【０１８２】
５．抗体変異
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体のアミノ酸配列変異が意図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を改良することが望ましい場合がある。ある抗体のアミノ酸配列変異は、その抗体をコード化するヌクレオチド配列に適切な改変を導入することにより、又はペプチド合成により調製され得る。このような改変には、例えば、その抗体のアミノ酸配列からの欠失、及び／又はその抗体のアミノ酸配列への挿入及び／又はその抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が含まれる。最終構築体が所望の特徴、例えば、抗原結合性を保持する限り、欠失、挿入、及び置換を任意に組み合わせて最終構築体に到達することができる。
【０１８３】
ａ）置換、挿入及び欠失変異
ある実施形態では、１以上のアミノ酸置換を有する抗体変異が提供される。置換的突然変異誘発の対象となる部位には、ＨＶＲ及びＦＲが含まれる。保存的置換を、「好ましい置換」という見出しの下に以下の表に示す。より実質的な変化は、以下の表で「例示的置換」という見出しの下に提供されており、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下に更に説明するとおりである。アミノ酸置換を対象となる抗体に導入し、生成物を所望の活性について、例えば保持／改良された抗原結合、減少した免疫原性、又は改良されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣについてスクリーニングし得る。
【０１８４】
【表８】
0006608827.tif 000009
【０１８５】
アミノ酸は、共通する側鎖特性に従って分類され得る。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１８６】
非保存的置換は、これらのクラスの一つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うであろう。
【０１８７】
置換的変異の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化抗体）の１以上の超可変領域残基の置換を伴う。一般に、結果的に得られ、更なる研究のために選択される変異には、親抗体に比して特定の生物学的特性の改変（例えば、改良）（例えば、親和性増大、免疫原性低減）があり、及び／又は親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換的変異は、親和性成熟抗体であって、これは例えば本明細書に記載されるもののようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技法を使って、好都合に生成され得る。簡単に言うと、１以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、変異抗体をファージ上に表示させて、特定の生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１８８】
改変（例えば、置換）を、例えば抗体親和性を改良するためにＨＶＲに施してもよい。このような改変は、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち体細胞での成熟プロセス中に高頻度に突然変異を受けるコドンによってコード化される残基（例えば、Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196）及び／又は抗原に接触する残基に施すことができ、その結果得られる変異ＶＨ又はＶＬは結合親和性について試験される。二次ライブラリーを構築し、それから再選択することによる親和性成熟は、例えばHoogenboom, H.R. et al.が、Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37に記載している。親和性成熟のいくつかの実施形態では、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャフリング、又はオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性が導入される。その後、二次ライブラリーを作成する。次いで、所望の親和性を有する任意の抗体変異を同定するために、ライブラリーをスクリーニングする。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化するＨＶＲ指向的アプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発又はモデリングを使用して、特異的に同定することができる。特にＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は標的とされることが多い。
【０１８９】
ある実施形態では、そのような改変が抗原と結合する抗体の能力を実質的に低減しない限り、置換、挿入、又は欠失が、１以上のＨＶＲ内に存在してもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的改変（例えば、本明細書に提供されるとおりの保存的置換）をＨＶＲに施すことができる。このような改変は例えば、ＨＶＲにおける抗原接触残基外であり得る。前記の変異ＶＨ及びＶＬ配列のある実施形態では、各ＨＶＲは無改変であるか、１つ、２つ又は３つ以下のアミノ酸置換を含有する。
【０１９０】
突然変異誘発の標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な一方法は、Cunningham, B.C. and Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085に記載されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基群（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕ等の荷電残基）を同定し、それを中性アミノ酸又は負荷電アミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）で置き換えて、抗体の抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、更なる置換を導入してもよい。これに代えて、又はこれに加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造は、抗体と抗原の間の接触点を同定する。このような接触残基及び近隣残基は、置換の候補として標的にするか、又は除外することができる。変異をスクリーニングして、それらが所望の特性を有する否かが決定され得る。
【０１９１】
アミノ酸配列挿入には、１残基から、１００残基以上を含有するポリペプチドまでにわたる長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端融合、並びに、単一アミノ酸残基又は複数アミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入的変異には、抗体のＮ末端又はＣ末端の、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）又は抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドへの融合が含まれる。
【０１９２】
ｂ）グリコシル化変異
ある実施形態では、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させるために、本明細書に提供される抗体は改変される。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、１以上のグリコシル化部位が作出又は除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって、好都合に達成され得る。
【０１９３】
抗体がＦｃ領域を含む場合は、そこに付着する炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって生成される未変性抗体は、典型的には、分岐した二分岐のオリゴ糖を含み、これは一般的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合によって付着される（例えば、Wright, A. and Morrison, S.L., TIBTECH 15 (1997) 26-32を参照されたい）。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えばマンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに、二分岐のオリゴ糖構造の「ステム」中のＧｌｃＮＡｃに付着したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、特定の改良された特性を有する抗体変異を作出するために、本発明の抗体中のオリゴ糖の改変を施してもよい。
【０１９４】
ｃ）Ｆｃ領域変異
ある実施形態では、本明細書に提供される抗体のＦｃ領域に１以上のアミノ酸改変を導入し、これによりＦｃ領域変異を生成してもよい。Ｆｃ領域変異は、１以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１９５】
ある実施形態において、本発明は、全部ではなく一部のエフェクター機能を持つ抗体変異を意図し、これは当該抗体変異を、in vivoの抗体の半減期は重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣ等）は不必要又は有害であるような応用に対して望ましい候補にする。ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認するために、in vitro及び／又はin vivo細胞毒性アッセイを行うことができる。例えば、抗体がＦｃγＲ結合を欠く（それゆえにおそらくＡＤＣＣ活性を欠いている）が、ＦｃＲｎ結合能は保持していることを確実にするために、Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）結合アッセイを行うことができる。ＡＤＣＣを媒介するための主要細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲ発現は、Ravetch, J.V. and Kinet, J.P., Annu. Rev. Immunol. 9 (1991) 457-492の464ページの表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのin vitroアッセイの非限定的な例は、ＵＳ  ５，５００，３６２（例えば、Hellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986) 7059-7063；及びHellstrom, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985) 1499-1502を参照）；ＵＳ  ５，８２１，３３７（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361を参照）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を採用してもよい（例えば、フローサイトメトリー用のACTI（商標）非放射性細胞毒性アッセイ（CellTechnology, Inc. Mountain View, CA）；及びCytoTox 96（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Promega, Madison, WI）を参照）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞として、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。これらに代えて、又はこれらに加えて、対象となる分子のＡＤＣＣ活性は、in vivoで、例えば、Clynes, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998) 652-656に開示されているような動物モデルで、評価され得る。抗体がＣ１ｑに結合することができず、したがってＣＤＣ活性を欠くことを確認するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを行ってもよい。例えば、ＷＯ  ２００６／０２９８７９及びＷＯ  ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro, H. et al., J. Immunol. Methods 202 (1996) 163-171；Cragg, M.S. et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103 (2004) 2738-2743を参照）。ＦｃＲｎ結合及びin vivoクリアランス／半減期決定も、当技術分野で公知の方法を使用して実施され得る（例えば、Petkova, S.B. et al., Int. Immunol. 18 (2006) 1759-1769を参照）。
【０１９６】
エフェクター機能が低減している抗体には、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９の１つ以上の置換を有するものが含まれる（ＵＳ  ６，７３７，０５６）。このようなＦｃ領域突然変異体には、第２６５位、２６９位、２７０位、２９７位及び３２７位のアミノ酸の２つ以上に置換を有するＦｃ領域突然変異体（残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ領域突然変異体（ＵＳ  ７，３３２，５８１）を含む）が含まれる。
【０１９７】
ＦｃＲへの結合が改良又は減縮されている特定の抗体変異が記載されている（例えば、ＵＳ  ６，７３７，０５６、ＷＯ  ２００４／０５６３１２、及びShields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604を参照）。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、例えばＵＳ  ６，１９４，５５１、ＷＯ  ９９／５１６４２、及びIdusogie, E.E. et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184に記載されているように、Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の改変（すなわち、減縮）をもたらす改変が、Ｆｃ領域に施される。
【０１９９】
半減期が増加し、胎児への母体ＩｇＧの移行を担う新生児型Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）（Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593、及びKim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434）への結合が改良されている抗体が、ＵＳ  ２００５／００１４９３４に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改良する１以上の置換がそこに含まれているＦｃ領域を含む。このようなＦｃ領域変異には、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４又は４３４の１以上に置換を有するもの、例えばＦｃ領域残基４３４に置換を有するものが含まれる（ＵＳ  ７，３７１，８２６）。
【０２００】
Ｆｃ領域変異の他の例に関しては、Duncan, A.R. and Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740；ＵＳ  ５，６４８，２６０；ＵＳ  ５，６２４，８２１；及びＷＯ  ９４／２９３５１も参照されたい。
【０２０１】
ｄ）システイン操作抗体変異
ある実施形態では、システイン操作抗体（cysteine engineered antibody）、例えば、抗体の１以上の残基がシステイン残基で置換されている「チオＭＡｂ」を作出することが望ましいかもしれない。特定の実施形態では、置換残基は抗体の接近可能部位に存在する。それらの残基をシステインで置換することによって抗体の接近可能部位に反応性のチオール基が位置することになり、本明細書において更に説明するように、それを用いて、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分に接合することで、イムノコンジュゲートを作出することができる。ある実施形態では、次に挙げる残基の任意の１以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＶ２０５（Kabatナンバリング）、重鎖のＡ１１８（ＥＵナンバリング）、及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵナンバリング）。システイン操作抗体は、例えばＵＳ  ７，５２１，５４１に記載されているように生成され得る。
【０２０２】
ｅ）抗体誘導体
ある実施形態では、当技術分野において公知であり容易に入手することができる追加の非タンパク質部分を含有するように、本明細書に提供される抗体を更に改変し得る。抗体の誘導体化に好適な部分として水溶性ポリマーが挙げられるが、それらに限定されない。水溶性ポリマーの非限定的な例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性ゆえに、製造時に有利であり得る。ポリマーは任意の分子量であってよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。抗体に付着されるポリマーの数は様々であってよく、複数のポリマーが付着される場合、それらは同じ分子又は異なる分子であることができる。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、改良しようとする抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が所定の条件下で治療に使用されるかどうか等を含むがこれらに限定されない考慮事項に基づいて決定され得る。
【０２０３】
別の実施形態では、抗体と、照射への曝露によって選択的に加熱され得る非タンパク質部分との接合体が提供される。一つの実施形態では、非タンパク質部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605）。照射は任意の波長のものであってよく、通常の細胞を傷つけることはないが、非タンパク質部分を、抗体−非タンパク質部分に近接する細胞が死滅する温度まで加熱する波長が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０４】
Ｂ．組換え方法及び組成物
抗体は、例えばＵＳ  ４，８１６，５６７に記載されているように、組換え法及び組換え組成物を使用して生成され得る。一つの実施形態では、本明細書に記載の抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体をコード化する単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコード化し得る。更なる実施形態では、このような核酸を含む１以上のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる実施形態では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような実施形態の一つでは、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列と抗体のＶＨを含むアミノ酸配列とをコード化する核酸を含むベクターを含むか、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含む第１ベクターと抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコード化する核酸を含む第２ベクターとを含む（例えば、前記ベクターで形質転換されている）。一つの実施形態では、宿主細胞は、真核生物、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ球系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一つの実施形態では、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を作製する方法であって、上に提供される抗体をコード化する核酸を含む宿主細胞を抗体の発現に好適な条件下で培養すること、及び場合により、その宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む方法が提供される。
【０２０５】
抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の組換え生成のために、抗体をコード化する核酸、例えば上記のとおりのものを単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために１以上のベクターに挿入する。このような核酸は、従来の手法を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコード化する遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離し、配列決定され得る。
【０２０６】
抗体をコード化するベクターのクローニング又は発現に好適な宿主細胞として、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が挙げられる。例えば、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合は、抗体は細菌中で生成され得る。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、ＵＳ  ５，６４８，２３７、ＵＳ  ５，７８９，１９９、及びＵＳ  ５，８４０，５２３を参照されたい（E.coliにおける抗体フラグメントの発現を記載しているCharlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254も参照されたい）。発現後に、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性画分中に単離され得、更に精製され得る。
【０２０７】
原核生物だけでなく、糸状菌又は酵母等の真核微生物も、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されていて部分的又は完全にヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の生成をもたらす真菌株及び酵母株を含めて、抗体をコード化するベクターのための好適なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照されたい。
【０２０８】
グリコシル化抗体発現用の好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎生物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎生物細胞の例として、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と一緒に使用され得る、特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションに使用され得る、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０２０９】
植物細胞培養も宿主として利用され得る。例えば、ＵＳ  ５，９５９，１７７、ＵＳ  ６，０４０，４９８、ＵＳ  ６，４２０，５４８、ＵＳ  ７，１２５，９７８、及びＵＳ  ６，４１７，４２９（トランスジェニック植物中で抗体を生成するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照されたい。
【０２１０】
脊椎動物細胞も宿主として使用され得る。例えば、懸濁での生育に適応させた哺乳動物細胞株が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74に記載の２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えばMather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68に記載のＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞が挙げられる。他の有用な哺乳動物宿主細胞株として、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０等の骨髄腫細胞株が挙げられる。抗体生成に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株のレビューについては、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照されたい。
【０２１１】
Ｃ．アッセイ
本明細書に提供される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体は、当技術分野で公知の種々のアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、同定し、スクリーニングし、又は特徴付けられ得る。
【０２１２】
１．結合アッセイ及び他のアッセイ
一つの態様では、本発明の抗体は、例えばＥＬＩＳＡ、アルファＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、抗体又は逆相アレイ等の公知の方法によって、その抗原結合活性について試験される。
【０２１３】
例示的なＥＬＩＳＡ又はアルファＬＩＳＡアッセイにおいて、溶液（細胞上清、細胞又は組織溶解液、体液等）中のタウ（ｐＳ４２２）は、タウ（ｐＳ４２２）の第１エピトープ、すなわち特定のコンフォメーションにあるタウ（ｐＳ４２２）に特異的に結合する捕獲抗体、及び、第２エピトープ、すなわちタウ（ｐＳ４２２）のコンフォメーションに特異的に結合する、検出実体（detection entity）にカップリングされた検出抗体により結合される。読み取りは、その検出実体（化学発光、蛍光、エネルギー移動誘発発光等）に基づく。いくつかの例では、同じアッセイで捕獲及び検出抗体と同じ抗体を使用し、タウ（ｐＳ４２２）の凝集体型を検出することができる（例えば、Tokuda, T. et al., Neurology 75 (2010) 1766-1772を参照）。
【０２１４】
抗体アレイの場合、抗体はガラス又はニトロセルロースチップにスポットされる。スライドはブロックされて、タウ（ｐＳ４２２）含有溶液と共にインキュベーションされ、洗浄されて未結合抗体を除去し、そして結合抗体は、蛍光でラベルされた対応する二次抗体により検出される。蛍光シグナルは蛍光スライドスキャナーにより測定される。同様に逆相アレイの場合、組換えタウ（ｐＳ４２２）、細胞上清、細胞又は組織溶解液、体液等が、ガラス又はニトロセルロースチップにスポットされる。スライドはブロックされて、個々のアレイはタウ（ｐＳ４２２）の特異的エピトープに対する抗体と共にインキュベーションされる。未結合抗体は洗い流され、結合抗体は、蛍光でラベルされた対応する二次抗体で検出される。蛍光シグナルは蛍光スライドスキャナーにより測定される（Dernick, G., et al., J. Lipid Res. 52 (2011) 2323-2331）。
【０２１５】
ウエスタンブロットの例では、凝集した組換えタウ（ｐＳ４２２）又は細胞上清、細胞又は組織溶解液、体液等に由来するタウ（ｐＳ４２２）は、ＳＤＳ ＰＡＧＥ又は未変性のゲル状態において分子量により分離され、ニトロセルロース又はＰＶＤＦ膜へとブロッティングされる。ブロッキング後、膜は、タウ（ｐＳ４２２）のアミノ酸配列又はコンフォメーションに特異的な抗体と共にインキュベーションされる。その後、膜は洗浄されて未結合抗体を除去する。結合抗体は、化学発光若しくは蛍光又は他の検出手段のための検出実体にカップリングされた、対応する二次抗体により検出される。タウ（ｐＳ４２２）のアミノ酸配列に特異的な抗体は、そのエピトープが凝集によりマスキングされていない限り、種々の凝集体型、よって種々の分子量のタウ（ｐＳ４２２）に結合することになる。他方、コンフォメーション特異的な抗体は、タウ（ｐＳ４２２）の特定の凝集体型のみを検出することになり、固有の分子量のバンドのみが現れる（例えば、Towbin, H., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350-4353；Burnette, W.N., Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203を参照）。
【０２１６】
別の態様では、ヒトタウ（ｐＳ４２２）への結合に関して、本明細書に報告される（ヒト化）抗体と競合する抗体を同定するために、競合アッセイを使用してもよい。ある実施形態では、このような競合抗体は、本明細書に報告される（ヒト化）抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば、線状又はコンフォメーショナルエピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な例示的方法は、Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, In: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996)に提供されている。
【０２１７】
例示的な競合アッセイでは、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合する第１ラベル抗体と、ヒトタウ（ｐＳ４２２）への結合に関して第１抗体と競合するその能力について試験しようとする第２無ラベル抗体とを含む溶液中で、固定化ヒトタウ（ｐＳ４２２）がインキュベーションされる。対照として、第１ラベル抗体を含むが、第２無ラベル抗体を含まない溶液中で、固定化ヒトタウ（ｐＳ４２２）がインキュベーションされる。ヒトタウ（ｐＳ４２２）への第１抗体の結合を許容する条件下でのインキュベーション後に、過剰な未結合抗体を取り除き、固定化ヒトタウ（ｐＳ４２２）と会合しているラベルの量を測定する。対照試料と比較して試験試料中で、固定化ヒトタウ（ｐＳ４２２）と会合しているラベルの量が実質的に低減していれば、それは、第２抗体がヒトタウ（ｐＳ４２２）への結合に関して第１抗体と競合していることを示唆する（例えば、Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照）。
【０２１８】
２．活性アッセイ
一つの態様では、生物活性を有するその抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物活性として例えば、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性からの保護／その低減／その阻害、及び／又はオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播からの保護／その低減／その阻害、及び／又はＬＵＨＭＥＳ細胞におけるタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性の低減を挙げることができる。in vivo及び／又はin vitroでこのような生物活性を有する抗体もまた提供される。
【０２１９】
ある実施形態では、本発明の抗体は、このような生物活性について試験される。
【０２２０】
分泌されたタウ（ｐＳ４２２）で、レシピエント神経細胞に細胞死を引き起こすものを含有する馴化培地を添加することにより、保護的な生物活性を評価することができる。この毒性は、本明細書に記載される保護抗体を添加することによって逆転させることができる。分泌されたタウ（ｐＳ４２２）の毒性の性質は、これまでに確立されている（Emmanouilidou, E., et al., J. Neurosci., 30 (2010) 6838-6851）。
【０２２１】
Ｄ．診断及び検出のための方法及び組成物
ある実施形態では、本明細書に提供される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体はいずれも、生物試料におけるヒトタウ（ｐＳ４２２）の存在を検出するために有用である。本明細書で使用する場合、用語「検出する」は、定量的検出又は定性的検出を包含する。ある実施形態では、生物試料としては、細胞、又は脳組織等の組織が挙げられる。
【０２２２】
一つの実施形態では、診断又は検出の方法に使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体が提供される。更なる態様では、生物試料におけるヒトタウ（ｐＳ４２２）の存在を検出する方法が提供される。ある実施形態では、前記方法は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）への抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の結合を許容する条件下に、生物試料を本明細書に記載される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体と接触させることと、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体とヒトタウ（ｐＳ４２２）との間で複合体が形成されるか否かを検出することとを含む。このような方法は、in vitro法又はin vivo法であり得る。一つの実施形態では、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を用いて、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を用いた治療に適格な被験者を選択し、例えばヒトタウ（ｐＳ４２２）は患者の選択のためのバイオマーカーとなる。
【０２２３】
本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害として、１型脳内鉄沈着神経変性（ＮＢＩＡ１）、純粋自律神経不全、ダウン症候群、グアム−パーキンソン痴呆複合（complex of Guam）、及びびまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、アルツハイマー病のレビー小体変種（ＬＢＶＡＤ）等のいくつかのレビー小体障害、特定の型のゴーシェ病、及びパーキンソン病認知症（ＰＤＤ）が挙げられる。
【０２２４】
ある実施形態では、ラベルされた抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体が提供される。ラベルとして、直接検出されるラベル又は部分（例えば蛍光ラベル、発色団ラベル、高電子密度ラベル、化学発光ラベル、及び放射性ラベル）、並びに例えば酵素反応又は分子相互作用によって間接的に検出される部分、例えば酵素又はリガンドが挙げられるが、それらに限定されない。例示的なラベルとして、放射性同位体３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ（luceriferases）、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（ＵＳ  ４，７３７，４５６）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖質オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、過酸化水素を使って色素前駆体を酸化する酵素（例えば、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ）とカップリングした複素環オキシダーゼ（例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定フリーラジカル等が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２２５】
Ｅ．医薬製剤
本明細書に記載の抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の医薬製剤は、所望の純度を有するこのような抗体を１以上の場合による薬学的に許容し得る担体（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)）と混合することにより、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容し得る担体は、使用される投薬量及び濃度においてレシピエントにとって一般に無毒性であり、これには、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等の緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリ（ビニルピロリドン）；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、又はデキストリン；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン界面活性剤、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）があるが、それらに限定されない。本明細書における、例示的な薬学的に許容し得る担体として更に、間質薬物分散剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒｈｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.）が挙げられる。ｒｈｕＰＨ２０を含む特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ＵＳ  ２００５／０２６０１８６及びＵＳ  ２００６／０１０４９６８に記載されている。一つの態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ、例えばコンドロイチナーゼと併用される。
【０２２６】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、ＵＳ  ６，２６７，９５８に記載されている。水性抗体製剤としては、ＵＳ  ６，１７１，５８６及びＷＯ  ２００６／０４４９０８に記載されているものが挙げられ、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０２２７】
本明細書における製剤は、処置される特定適応症の必要に応じて、２つ以上の有効成分、好ましくは互いに有害な影響を及ぼさない相補的活性を有するものも含有し得る。例えば、更に［［抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体と組み合わせ得る薬物リスト］］を提供することが望ましい。このような有効成分は、適宜、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。
【０２２８】
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入するか、コロイド薬物送達系（例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）に封入するか、又はマクロエマルションに封入することができる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. (ed.) (1980)に開示されている。
【０２２９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の好適な例として、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透過性マトリックスであって、マトリックスがフィルム又はマイクロカプセル等の造形品の形態にあるものが挙げられる。
【０２３０】
in vivo投与に使用される製剤は一般に滅菌状態にある。滅菌性は例えば滅菌濾過膜による濾過等によって容易に達成され得る。
【０２３１】
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書に提供される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体はいずれも、治療方法で使用され得る。
【０２３２】
一つの態様では、医薬として使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体が提供される。更なる態様では、アルツハイマー病の処置に使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体が提供される。ある実施形態では、処置方法において使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体が提供される。ある実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を有する個体の処置方法において使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を提供し、当該処置方法は、前記個体に抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を投与すること含む。一つのこのような実施形態において、前記方法は更に、例えば、後述するような、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を前記個体に投与することを含む。更なる実施形態では、本発明は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害すること、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害すること、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させることにおいて使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を提供する。ある実施形態では、本発明は、個体において、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害する、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させる方法において使用するための抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体を提供し、当該方法は、前記個体に抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を投与して、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害するか、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害するか、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させることを含む。前記実施形態のいずれかに係る「個体」は、好ましくはヒトである。
【０２３３】
更なる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用を提供する。一つの実施形態では、前記医薬は、アルツハイマー病の処置用である。さらなる実施形態では、前記医薬は、アルツハイマー病の処置方法において使用するためのものであり、当該方法は、前記医薬の有効量をアルツハイマー病を有する個体に投与することを含む。一つのこのような実施形態では、前記方法は更に、例えば、後述するような、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を前記個体に投与することを含む。更なる実施形態では、前記医薬は、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性の阻害用、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播の阻害用、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性の低下用である。更なる実施形態では、前記医薬は、個体において、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害する、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害する、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させる方法において使用するためのものであり、当該方法は、前記個体に前記医薬の有効量を投与して、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害するか、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害するか、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させることを含む。前記実施形態のいずれかに係る「個体」は、ヒトであってよい。
【０２３４】
更なる態様では、本発明は、アルツハイマー病を処置するための方法を提供する。一つの実施形態では、前記方法は、このようなアルツハイマー病を有する個体に抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を投与することを含む。一つのこのような実施形態では、前記方法は更に、後述するような、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量を前記個体に投与することを含む。前記実施形態のいずれかに係る「個体」は、ヒトであってよい。
【０２３５】
更なる態様では、本発明は、個体において、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害するか、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害するか、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させるための方法を提供する。一つの実施形態では、前記方法は、前記個体に抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を投与して、ヒトニューロン及びグリア細胞においてタウ（ｐＳ４２２）で誘発された細胞毒性を阻害するか、又はニューロンとグリア細胞との間でのオリゴマーヒトタウ（ｐＳ４２２）の細胞間伝播を阻害するか、又はタウ（ｐＳ４２２）で誘発されたカスパーゼ活性を低下させることを含む。一つの実施形態では、「個体」はヒトである。
【０２３６】
更なる態様では、本発明は、例えば前記治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体のいずれかを含む医薬製剤を提供する。一つの実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体のいずれかと、薬学的に許容し得る担体とを含む。別の実施形態では、医薬製剤は、本明細書に提供される抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体のいずれかと、例えば、後述するような、少なくとも１つの追加の治療剤とを含む。
【０２３７】
本発明の抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と同時投与され得る。
【０２３８】
上述の併用療法には、併用投与（この場合、２つ以上の治療剤が同じ製剤又は別々の製剤に含まれる）、及び個別投与（この場合、本発明の抗体の投与を、追加の治療剤（１種又は複数種）の投与の前に、同時に、及び／又は後に、行うことができる）が包含される。一つの実施形態では、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の投与と、追加の治療剤の投与は、互いに約１カ月以内、又は約１、２若しくは３週間以内、又は約１、２、３、４、５、若しくは６日以内に行なわれる。
【０２３９】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、及び鼻腔内投与、並びに局所処置が所望される場合には、病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。投薬は、投与が短期間であるか慢性的であるかにも一部依存して、任意の好適な経路、例えば静脈内注射又は皮下注射等の注射によることができる。単回投与、又は様々な時点にわたる複数投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定されない種々の投薬計画が、本明細書では意図される。
【０２４０】
本発明の抗体は、適正な医療行為（good medical practice）に合致する方法で、製剤化され、投薬され、投与されるであろう。これに関して考慮すべき要因には、処置される特定の障害、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与の計画、及び医療従事者に公知の他の要因が含まれる。抗体は、問題の障害を予防又は処置するために現在使用されている１以上の薬剤と共に場合により製剤化されるが、必ずしもその必要はない。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害又は処置のタイプ、及び上で述べた他の要因に依存する。これらは一般に、本明細書に記載されるものと同じ投薬量及び投与経路で使用されるか、又は本明細書に記載の投薬量の約１〜９９％、若しくは任意の投薬量で、実験的／臨床的に適切であると決定された任意の経路によって使用される。
【０２４１】
疾患の予防又は処置に関して、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で使用する場合、又は１つ以上の他の追加の治療剤と併用する場合）は、処置すべき疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体が予防のために投与されるか治療のために投与されるか、治療歴、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに担当医の裁量に依存するであろう。抗体は、１回で、又は一連の処置に渡って、患者に好適に投与される。疾患のタイプ及び重症度に依存して、例えば１回若しくは複数回の別個の投与によるか、又は持続注入によるかを問わず、約１μg/kg〜１５mg/kg（例えば０．５mg/kg〜１０mg/kg）の抗体を、患者への投与のための初回候補投薬量とすることができる。典型的な１日投薬量は、上述の要因に依存して約１μg/kgから１００mg/kgまで又はそれ以上に及ぶことがある。数日又はそれ以上にわたる反復投与の場合、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が起こるまで維持されるであろう。抗体の例示的投薬量は約０．０５mg/kg〜約１０mg/kgの範囲にあるであろう。したがって、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１以上の用量が患者に投与され得る。このような用量は、（例えば、患者が抗体の投与を約２回から約２０回、例えば約６回受けるように）間欠的に、例えば毎週又は３週間ごとに投与してもよい。最初に高用量の負荷量を投与した後、１以上の低用量を投与してもよい。しかしながら、他の投薬治療方式が有用であり得る。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【０２４２】
上記の製剤化又は治療方法はいずれも、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の代わりに、又は抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて行うことができることが理解される。
【０２４３】
ＩＩＩ．製造品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器、及び容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器としては、例えばビン、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成され得る。容器は、単独であるか、又はその状態を処置、予防及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は静脈内溶液バッグであるか、皮下注射針で穿孔可能な栓を有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、その組成物が選択された状態の処置に使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が入っている第１容器と、（ｂ）更なる細胞毒性物質又は他の治療剤を含む組成物が入っている第２容器とを含み得る。本発明のこの実施形態の製造品は、特定の状態を処置するためにその組成物を使用できることを示す添付文書を更に含んでもよい。これに代えて、又はこれに加えて、製造品は、薬学的に許容し得る緩衝剤、例えば静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器を更に含み得る。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを、更に含み得る。
【０２４４】
前記製造品はいずれも、抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の代わりに、又は抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体に加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含み得ることが理解される。
【０２４５】
ＩＶ．具体的な実施形態
１．  ヒトタウ（ｐＳ４２２）に特異的に結合するヒト化抗体であって、当該抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに特異的に結合する抗体。
【０２４６】
２．  ヒトタウ（ｐＳ４２２）に特異的に結合するヒト化抗体であって、当該抗体は、
ａ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、１８及び１０のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ
を含む抗体。
【０２４７】
３．  項目２に記載のヒト化抗体であって
ａ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ、又は
ｂ）軽鎖可変ドメインに、配列番号１２、０５及び１５のＨＶＲ
を更に含む抗体。
【０２４８】
４．  項目２〜３のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、
ａ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、１８及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ、又は
ｂ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１２、０５及び１５のＨＶＲ、又は
ｃ）重鎖可変ドメインに配列番号０８、０９及び１０のＨＶＲ、並びに軽鎖可変ドメインに配列番号１３、１４及び１５のＨＶＲ
を含む抗体。
【０２４９】
５．  項目２〜４のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、
ａ）配列番号２０の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｂ）配列番号１９の重鎖可変ドメイン及び配列番号１６の軽鎖可変ドメイン、又は
ｃ）配列番号１９の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン、又は
ｄ）配列番号２１の重鎖可変ドメイン及び配列番号１７の軽鎖可変ドメイン
を含む抗体。
【０２５０】
６．  項目２〜５のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、アルツハイマー病の処置に使用するためのものである抗体。
【０２５１】
７．  項目２〜６のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、エフェクター機能を示さない抗体。
【０２５２】
８．  項目２〜７のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、エフェクター機能を有していない抗体。
【０２５３】
９．  項目２〜８のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する抗体。
【０２５４】
１０．  項目２〜９のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、
ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下の、及び／又は
ｂ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下の、及び／又は
ｃ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下の、及び／又は
ｄ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下の
ＥＣ５０値を有する抗体。
【０２５５】
１１．  項目２〜１０のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）（配列番号０２）に特異的に結合し、ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない抗体。
【０２５６】
１２．  項目１〜１１のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、重鎖可変ドメインの第４、２４及び７８位にバリン残基を有する抗体。
【０２５７】
１３．項目１〜１２のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、重鎖可変ドメインの第７１位にアルギニン残基を有する抗体。
【０２５８】
１４．  項目２〜１３のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体はモノクローナル抗体である抗体。
【０２５９】
１５．  項目２〜１０のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）に結合する抗体フラグメントであって、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６０】
１６．  項目２〜１４のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、又は
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体、又は
ｃ）突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを備えたヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、
ｄ）突然変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを備えたヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体、
ｅ）両重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ、並びに一方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを備えたヒトサブクラスＩｇＧ１の全長抗体、又は
ｆ）両重鎖に突然変異Ｓ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ、並びに一方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ並びにそれぞれ他方の重鎖に突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃを備えたヒトサブクラスＩｇＧ４の全長抗体
である抗体。
【０２６１】
１７．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号０８、配列番号１８及び配列番号１０のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６２】
１８．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号１０のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１２、配列番号０５及び配列番号１５のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６３】
１９．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号０８、配列番号０９及び配列番号１０のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５のＨＶＲを含み、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６４】
２０．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号２０のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６５】
２１．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６６】
２２．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１９のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６７】
２３．  ヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体であって、
ａ）前記抗体は２つの抗体重鎖を含み、各々が重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域を含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号２１のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトＩｇＧ１定常領域であって、そのＣ末端リジン残基は存在してもしなくてもよく、並びに
ｉｉｉ）前記定常領域は、アミノ酸変化Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含むものであり、
ｂ）前記抗体は２つの抗体軽鎖を含み、各々が軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常ドメインを含んでおり、
ｉ）前記可変ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有し、
ｉｉ）前記定常領域は、ヒトカッパ軽鎖定常領域又はヒトラムダ軽鎖定常領域であり、
並びに
ｃ）前記抗体は、
ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的に結合する、及び／又は
ｉｉ）１μg/mLで全長ヒトタウ（配列番号０１）に結合しない、及び／又は
ｉｉｉ）第４２２位のセリンでリン酸化された全長ヒトタウ（配列番号０２）に特異的に結合する、及び／又は
ｉｖ）第４２２位のセリンでリン酸化されたヒトタウ（配列番号０２）の凝集体に特異的に結合する、及び／又は
ｖ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有する全長ヒトタウに特異的に結合する、及び／又は
ｖｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）フラグメントに対して６ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有する全長ヒトタウ（ｐＳ４２２）に対して４．５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｖｉｉｉ）配列番号０２のアミノ酸配列を有するヒトタウ（ｐＳ４２２）の凝集体に対して３０ng/mL以下のＥＣ５０値を有する、及び／又は
ｉｘ）配列番号０１のアミノ酸配列を有し、アミノ酸突然変異Ｓ４２２Ａを有するヒトタウに対して１２５ng/mL以下のＥＣ５０値を有する
抗体。
【０２６８】
２５．  項目１〜２４のいずれか１つに記載のヒト化抗体をコード化する、単離された核酸。
【０２６９】
２６．  項目２５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【０２７０】
２７．  項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体を製造する方法であって、当該ヒト化抗体が生成されるように、本明細書に報告される宿主細胞を培養する工程を含む方法。
【０２７１】
２８．  細胞又は培養培地から前記ヒト化抗体を回収する工程を更に含む、項目２７に記載の方法。
【０２７２】
２９．  項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体と、薬学的に許容し得る担体とを含む医薬製剤。
【０２７３】
３０．  追加の治療剤を更に含む、項目２９に記載の医薬製剤。
【０２７４】
３１．  前記追加の治療剤が抗アミロイド治療剤である、項目３０に記載の医薬製剤。
【０２７５】
３２．  前記抗アミロイド治療剤が抗ヒトアルファ−シヌクレイン抗体又は抗Ａベータ抗体である、項目３１に記載の医薬製剤。
【０２７６】
３３．  医薬として使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２７７】
３４．  アルツハイマー病の処置に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２７８】
３５．  前駆期アルツハイマー病の処置に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２７９】
３６．  軽度アルツハイマー病の処置に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２８０】
３７．  タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２８１】
３８．  認知及び機能の維持に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２８２】
３９．  認知的及び機能的減退の速度の緩徐化に使用するための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体。
【０２８３】
４０．  医薬の製造における、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体の使用。
【０２８４】
４１．  前記医薬が、アルツハイマー病の処置用である、項目３３及び４０のいずれか１つに記載の使用
【０２８５】
４２．  前記医薬が、前駆期アルツハイマー病の処置用である、項目３３及び４０〜４１のいずれか１つに記載の使用。
【０２８６】
４３．  前記医薬が、軽度アルツハイマー病の処置用である、項目３３及び４０〜４２のいずれか１つに記載の使用。
【０２８７】
４４．  前記医薬が、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減用である、項目３３及び４０〜４３のいずれか１つに記載の使用。
【０２８８】
４５．  前記医薬が、認知及び機能の維持用である、項目３３及び４０〜４４のいずれか１つに記載の使用。
【０２８９】
４６．  前記医薬が、認知的及び機能的減退の速度の緩徐化用である、項目３３及び４０〜４５のいずれか１つに記載の使用。
【０２９０】
４７．  アルツハイマー病を有する個体の処置方法であって、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与することを含む方法。
【０２９１】
４８．  個体におけるタウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減方法であって、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与して、タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性を低減することを含む方法。
【０２９２】
４９．  個体における認知及び機能の維持方法であって、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与して、認知及び機能を維持することを含む方法。
【０２９３】
５０．  個体における認知的及び機能的減退の速度の緩徐化方法であって、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の有効量を前記個体に投与して、認知的及び機能的減退の速度を緩徐化することを含む方法。
【０２９４】
５１．  タウ（ｐＳ４２２）で誘発された神経変性の低減における、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用。
【０２９５】
５２．  認知及び機能の維持における、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用。
【０２９６】
５３．  認知的及び機能的減退の速度の緩徐化における、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の使用。
【０２９７】
５４．  項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、ｉ）タウ（ｐＳ４２２）トランスジェニックマウス及びアルツハイマー病患者の脳切片のタウ（ｐＳ４２２）に結合し；及び／又はタウ（ｐＳ４２２）トランスジェニック細胞のタウ（ｐＳ４２２）をラベルする抗体。
【０２９８】
５５．  項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体であって、当該抗体は、ヒトタウ（ｐＳ４２２）の早期及び後期疾患関連型に特異的に結合／認識する抗体。
【０２９９】
５６．  ヒトタウ（ｐＳ４２２）関連アルツハイマー病進展の防止のための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体の使用。
【０３００】
５７．  リソソーム膜崩壊の低減のための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体の使用。
【０３０１】
５８．  ヒトタウ（ｐＳ４２２）で誘発された不安定化及び／又は崩壊に対する、リソソーム膜の安定化のための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体の使用。
【０３０２】
５９．  アルツハイマー病進行の防止のための、項目１〜２３のいずれか１つに記載のヒト化抗体の使用。
【０３０３】
Ｖ．実施例
以下は本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明をふまえて、他に種々の実施形態を行い得ることが理解される。
【０３０４】
材料及び方法
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を用いて、Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載のようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の使用説明書に従って使用した。
【０３０５】
遺伝子及びオリゴヌクレオチド合成 
所望の遺伝子セグメントを、化学合成によりGeneart GmbH（Regensburg, Germany）で調製した。合成された遺伝子フラグメントを、増殖／増幅のためにE.coliプラスミドにクローニングした。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって検証した。あるいは、短い合成ＤＮＡフラグメントを、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、又はＰＣＲを介して組立てた。それぞれのオリゴヌクレオチドを、metabion GmbH（Planegg-Martinsried, Germany）により調製した。
【０３０６】
試薬
市販の化学物質、抗体及びキットは全て、別途に述べない限り製造業者のプロトコルに従い提供されるとおりに使用した。
【０３０７】
実施例１
ウサギ抗体の調製及び精製
【０３０８】
免疫化
Charles River Laboratories International, Inc.からのＮＺＷウサギを、免疫化のために使用した。ＫＬＨにカップリングされたリン酸化ペプチドタウ（４１６−４３０）［ｐＳ４２２］をＫ３ＰＯ４緩衝液（puffer）ｐＨ７．０中に１mg/mlの濃度で溶解させ（solved）、安定なエマルションの生成まで完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）と混合させた（１：１）。３羽のウサギに２mlのエマルションを皮内（i.d.）注射し、その後第２回目の筋肉内（i.m.）注射及び第３回目の皮下（s.c.）注射を、各々１mlづつ、１週間の間隔で行った。２週間後に１mlの第４回目の筋肉内注射を実施し、その後４週間の間隔で２回、更に１mlの皮下注射を行った。各動物の末梢全血試料１０mlを、第３、４、５及び６回目の注射後４〜６日に採取して、ＦＡＣＳにおける単一細胞選別に用いた。各動物の追加の０．５ml血清を同じ時間に採取して、タウ（４１６−４６３）［ｐＳ４２２]特異性抗体応答の決定に用いた。
【０３０９】
抗体応答
免疫化に対する抗体応答を、血清の段階希釈により、ＥＬＩＳＡを用いて決定した。ＥＬＩＳＡでは、ビオチン化タウ（４１６−４３０）［ｐＳ４２２］のウェル当たり３０ngを、１×ＰＢＳ中で４℃にて一晩、ストレプトアビジンが予め被覆された９６ウェルマイクロタイタープレート（MC1347, Micro Coat Biotechnologie GmbH, Bernried, Germany）上でインキュベーションした。検出のため、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ（The Jackson laboratory）を１：１６０００の希釈で用いた。Roche Diagnostics GmbHのBM Blue POD Substrate、沈降テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、使用準備済溶液を、可視化のために使用した。１N ＨＣｌで反応を停止させて、４５０／６９０nmによりTecan Infiniteで測定した。
【０３１０】
Ｂ細胞クローニング
プレートの被覆
【０３１１】
滅菌の、ストレプトアビジンが被覆された６−ウェルプレート（細胞培養等級）を、３種のビオチン化対照ペプチド（非リン酸化タウ（４１６−４３０）、ＭＣＡＫ＿Ｈｕｍａｎ（８８−１０２）［９５−ｐＳｅｒ］及びＭＡＰ２＿Ｈｕｍａｎ（１８０２−１８１６）［ｐＳｅｒ−１８０２］）の混合物か、又はビオチン化されたリン酸化ペプチドタウ（４１６−４３０）［ｐＳ４２２］と、各々ＰＢＳ中０．５〜１μg/mlの濃度で室温にて１時間インキュベーションした。プレートを使用前に３回滅菌ＰＢＳで洗浄した。細胞培養６−ウェルプレートを、カーボネート緩衝液（０．１M 炭酸水素ナトリウム、３４mM 炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ９．５５）中２μg/ml ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）で４℃にて一晩被覆した。プレートを使用前に３回滅菌ＰＢＳで洗浄した。
【０３１２】
ウサギ末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の単離
ＥＤＴＡ含有全血を１×ＰＢＳで２倍に希釈し、その後ウサギＰＢＭＣを単離するためにlympholyte mammal（Cedarlane Laboratories）で密度遠心分離を実施した。ＰＢＭＣは、抗体で染色する前に２回洗浄された。
【０３１３】
ＥＬ−４ Ｂ５培地
１０％ＦＣＳ（Hyclone, Logan, UT, USA）、２mM グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（PAA, Pasching, Austria）、２mM ピルビン酸ナトリウ、１０mM ＨＥＰＥＳ（PAN Biotech, Aidenbach, Germany）及び０．０５mM β−メルカプトエタノール（Gibco, Paisley, Scotland）を追加したRPMI 1640（Pan Biotech, Aidenbach, Germany）。
【０３１４】
マクロファージ／単球の枯渇
滅菌６−ウェルプレート（細胞培養等級）を用いて、非特異的接着によりマクロファージ及び単球を枯渇させた。ウェルは、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）か、又はストレプトアビジン及び前記対照ペプチドかのいずれかで被覆された。最大４mlの培地及び免疫されたウサギからの最大６×１０６個の末梢血単核球で各ウェルを満たし、３７℃で１時間、インキュベーターにて結合させた。上清中の細胞の５０％をパニング工程のために用い、細胞の残りの５０％を直接、免疫蛍光染色及び単一細胞選別に供した。
【０３１５】
ペプチドでのＢ細胞のパニング
ストレプトアビジン及びビオチン化ペプチドタウ（４１６−４３０）[ｐＳ４２２] で被覆された６−ウェル組織培養プレートに、４ml培地当たり最大６×１０６個の細胞を播種し、３７℃で１時間、インキュベーターにて結合させた。ウェルを注意深く１×ＰＢＳで１〜２回洗浄することにより、非接着性細胞を除去した。残存する粘質細胞は、インキュベーターにおいて３７℃で１０分、トリプシンによって剥離させて、その後培地で２回洗浄した。免疫蛍光染色まで、細胞を氷上で保持した。
【０３１６】
免疫蛍光染色及び単一細胞選別
単一細胞選別のために使用する抗ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣは、AbD Serotec（STAR121F, Dusseldorf, Germany）より入手した。表面染色のため、枯渇及びパニング工程から得られた細胞を、ＰＢＳ中の抗ウサギＩｇＧ ＦＩＴＣ抗体と、冷却室内、暗所で４℃にて３０分、回転させながらインキュベーションした。遠心分離の後、上清を吸引により除去した。ＰＢＭＣは、２サイクルの遠心分離及び氷冷ＰＢＳでの洗浄に供した。最後にＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳに再懸濁させて、直ちにＦＡＣＳ分析に供した。5μg/mlの濃度のヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen, San Diego, CA, USA）を、ＦＡＣＳ分析の前に添加し、死細胞と生細胞とを識別した。ＦＡＣＳは、FACSDiva ソフトウェアを備えたBecton Dickinson FACSAria（BD Biosciences, USA）を用いて実施し、単一のＦＩＴＣラベル生細胞が、９６−ウェルプレート内に沈殿した。
【０３１７】
Ｂ細胞培養
Ｂ細胞培養物は、Zubler, R.H. et al., J. Immunol. 134 (1985) 3662-3668に記載のものと類似の方法によって調製された。簡単に言うと、単一選別されたＢ細胞を９６−ウェルプレートにおいて、Pansorbin細胞（１：２００００）（Calbiochem (Merck), Darmstadt, Deutschland）、５％ウサギ胸腺細胞上清及びガンマ照射されたＥＬ−４−Ｂ５マウス胸腺腫細胞（２×１０４／ウェル）を含む２１０μl／ウェルのＥＬ−４ Ｂ５培地と共に３７℃で７日間、５％ＣＯ２の雰囲気内でインキュベーターにて培養した。Ｂ細胞培養上清をスクリーニング用に除去し、細胞は直ちに可変領域遺伝子クローニング用に回収するか、又は１００μl ＲＬＴ緩衝液（Qiagen, Hilden, Germany）中で−８０℃で凍結させた。
【０３１８】
Ｂ細胞クローンスクリーニング
Ｂ細胞培養上清は、ビオチン化タウ（４１６−４３０）[ｐＳ４２２]への結合につき、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングされた。非リン酸化タウ（４１６−４３０）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシニアン）及び関連性のないリン酸化ペプチドＭＣＡＫ＿Ｈｕｍａｎ（８８−１０２）［９５−ｐＳｅｒ］を対照抗原として使用した。ＥＬＩＳＡプレートの調製のため、ストレプトアビジンが予め被覆されたマイクロタイタープレートを５０ng/mｌのビオチン化タウ（４１５−４３０）[ｐＳ４２２]と共に室温で１時間インキュベーションした。ＫＬＨ又は対照ペプチドの被覆は、１μg/mlで行った。Ｂ細胞上清を、１：５〜１：１０に希釈し、抗原が被覆されたマイクロタイタープレートにおいて６０分間インキュベーションした。念入りに洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニン接合検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用してウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢとインキュベーションした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ビオチン化タウ（４１６−４３０）[ｐＳ４２２]でバックグラウンドを超えるシグナルを生じるが、ＫＬＨ及びＭＣＡＫ＿Ｈｕｍａｎ（８８−１０２）［９５−ｐＳｅｒ］では生じないＢ細胞クローンを更に検討し、可変領域遺伝子クローニングに供した。
【０３１９】
Ｖ−ドメインのＰＣＲ増幅及び配列決定
全ＲＮＡを、NucleoSpin（登録商標）8/96 RNAキット（Macherey&Nagel；740709.4, 740698）を用い、製造業者のプロトコールに従って調製した。全工程を、epMotion 5075液体取扱いシステム（liquid handling system）（Eppendorf）で行った。ＲＮＡは、６０μlのＲＮＡｓｅ不含水で溶出させた。６μlのＲＮＡを用いて、Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix（Invitrogen 18080-400）及びオリゴｄＴ−プライマーを使用し、製造業者の使用説明書に従って逆転写酵素反応によりｃＤＮＡを生成した。４μlのｃＤＮＡを用いて、重鎖用にプライマーrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、並びに軽鎖用にrbLCfinal.up及びrbLCfinal.do（以下の表を参照）を使用し、AccuPrime SuperMix（Invitrogen 12344-040）で５０μlの最終体積にて免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域（ＶＨ及びＶＬ）を増殖した。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：９４℃で５分間（高温開始）；９４℃で２０秒、７０℃で２０秒、６８℃で４５秒の３５サイクル、及び６８℃で７分（最終的な伸長）。
【０３２０】
【表９】
0006608827.tif 000010
【０３２１】
５０μlのＰＣＲ溶液のうち８μlを、48 E-Gel 2%（Invitrogen G8008-02）にロードした。陽性ＰＣＲ反応物を、NucleoSpin（登録商標）Extract II キット（Macherey&Nagel；740609250）を用い、製造業者のプロトコールに従って純化（clean）し、５０μlの溶出緩衝液にて溶出した。精製されたＰＣＲ生成物１２μlを、重鎖用にrbHCfinal.up及びrbHCfinal.do、並びに軽鎖用にrbLCfinal.up及びrbLCfinal.do（上記表を参照）を用いて双方向に直接配列決定した。
【０３２２】
ウサギモノクローナル抗体及びウサギ／マウスキメラ抗体の組換え発現
ウサギモノクローナル抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコード化するＰＣＲ生成物を、オーバーハングクローニング方法（Haun, R.S. et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518；Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256）により、発現ベクターへとｃＤＮＡとしてクローニングした。重複するプライマーを使用するＰＣＲによって、ＶＨ挿入物のウサギのカッパ又はガンマ定常領域及びＶＬをコード化する線形化された発現プラスミドを増幅させた。一本鎖オーバーハングを生成するＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと共に精製されたＰＣＲ生成物をインキュベーションした。ｄＣＴＰを添加することにより反応を停止させた。次の工程で、プラスミド及び挿入物を合わせ、部位特異的組換えを誘導するＲｅｃＡと共にインキュベーションした。組換えられたプラスミドをE.coliに形質転換した。翌日、増殖したコロニーを取り、プラスミド調製、制限解析及びＤＮＡ配列決定によって正確に組換えられたプラスミドについて試験した。抗体発現については、単離されたＨＣ及びＬＣプラスミドを一過的にＨＥＫ２９３細胞へコトランスフェクトし、１週間後に上清を回収した。ウサギマウスキメラ抗体のクローニング及び発現については、ＰＣＲによってＶＨ及びＶＬ領域を増幅し、マウス定常カッパ又はマウス定常ガンマ１領域を含む発現ベクターへサブクローニングした。ウサギ／マウスキメラＨＣ及びＬＣプラスミドを単離し、正確な挿入について制限解析及びＤＮＡ配列決定によって試験し、一過的にＨＥＫ２９３細胞へコトランスフェクトした。トランスフェクションの１週間後に上清を回収した。
【０３２３】
抗体精製
組換え発現したウサギ抗体をMabSelectSuRe（商標）カラム(GE Healthcare)で細胞培養上清から精製した。試料をロードする前に、２５mmol/L Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２５mmol/L ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。５０mmol/L 酢酸塩（ｐＨ３．１４）で抗体を溶出した。溶出された試料を直ちに脱塩カラム（Sephadex G25, GE Healthcare）にロードし、２０mmol/L Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０mmol/L ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に溶出した。精製抗体の保存にもこの緩衝液を使用した。一般的な保存温度は４℃であり、精製工程中は室温、分取後は−８０℃であった。細胞培養上清から得られた組換え発現ウサギ／マウスキメラ抗体をMabSelectSuRe（商標）カラム(GE Healthcare)で精製した。試料をロードする前に、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）でカラムを平衡化した。１００mmol/L クエン酸塩（ｐＨ３．０）で抗体を溶出した。溶出された試料を直ちに２mol/L Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。その後、サイズ排除カラム(Superdex 200, GE Healthcare)に抗体をロードし、２０mmol/L Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０mmol/L ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）に溶出した。精製抗体の保存にも、この緩衝液を使用した。一般的な保存温度は４℃であり、精製工程中は室温、分取後は−８０℃であった。
【０３２４】
実施例２
抗タウｐＳ４２２モノクローナルウサギ抗体は、ｐＳ４２２でリン酸化されたタウに対して高度に選択的であり、タウｐＳ４２２の原線維状凝集体に結合する
【０３２５】
ＥＬＩＳＡ
ＨＥＫ２９３細胞においてウサギモノクローナル抗体を組換え発現させた。ＥＬＩＳＡにより、ビオチン化タウ（４１６−４３０）［ｐＳ４２２］、非リン酸化タウ（４１６−４３０）、ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）及び関係性のないリン酸化ペプチドＭＣＡＫ＿Ｈｕｍａｎ（８８−１０２）［９５−ｐＳｅｒ］に対する結合について、細胞培養上清又は精製されたウサギ抗体を試験した。ＥＬＩＳＡプレートの調製については、室温で１時間５０ng/mLのビオチン化タウ（４１５−４３０）［ｐＳ４２２］と共に、ストレプトアビジンで予め被覆されたマイクロタイタープレートをインキュベーションした。ＫＬＨ又は対照ペプチドによる被覆は、１μｇ／ｍＬで行った。抗原でラベルされたマイクロタイタープレートにおいて、様々な濃度で６０分間、ウサギ抗タウｐＳ４２２抗体（Abcam AB51071）又は上清を含有しているウサギ抗体をインキュベーションした。念入りに洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニン接合検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用して、ウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢと共にインキュベーションした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ＥＣ５０値によって抗体結合を特徴付けた。ビオチン化タウ（４１６−４３０）［ｐＳ４２２］及び非リン酸化タウ（４１６−４３０）ペプチドに対する抗体結合を、そのＥＣ５０値によって特徴付けた。高濃度、即ち、１：５で希釈された細胞培養上清における一点測定によって、ＫＬＨ又はＭＣＡＫリン酸化ペプチドの交差反応性を推定した。結果を以下の表に示す。タウリン酸化ペプチドに対する結合のＥＣ５０値は、タウペプチドに対する結合のＥＣ５０値の１００分の１未満であることが見出され、これは、非リン酸化タウペプチドに比べてリン酸化タウフラグメントに対する選択性が少なくとも１００倍であることを示唆する。ＫＬＨ及びＭＣＡＫ対照リン酸化ペプチドに対する結合は、全ての抗体でバックグラウンドレベルであり、これは、タウリン酸化ペプチドの最大値測定の約１＜３％である。
【０３２６】
【表１０】
0006608827.tif 000011
【０３２７】
可溶性であって、凝集した全長タウｐＳ４２２に対する特異性も試験した。室温で一晩、タウｐＳ４２２（３００μg/mL）の原線維状凝集体をポリスチレン系Maxisorbマイクロタイタープレート（Nunc）に被覆した。同様の方法で、Maxisorbマイクロタイタープレートに可溶性の全長タウ及びタウｐＳ４２２を被覆した。ウサギ抗タウｐＳ４２２抗体対照（Abcam AB51071）又は精製されたウサギ抗体を添加して、最大１０００ng/mLの濃度で６０分間インキュベーションした。念入りに洗浄した後、ヒツジ抗ウサギＩｇＧジゴキシゲニン接合検出抗体（Chemicon AQ301D）を使用してウサギ抗体の結合を検出した。室温でＴＭＢとインキュベーションした後、３７０nm〜４９２nmで吸光度を測定した。ＥＣ５０値によって抗体結合を特徴付けた。結果を以下の表に示す。
【０３２８】
【表１１】
0006608827.tif 000012
【０３２９】
ウサギモノクローナル抗体は、１ng/mL未満のＥＣ５０値でタウ−ｐＳ４２２タンパク質に結合した。０．４ng/mL〜１４ng/mLのＥＣ５０値で原線維状タウｐＳ４２２を検出した。非リン酸化全長タウタンパク質に対する結合のシグナルは、バックグラウンドレベルと識別できなかった。したがって、タウと比較して少なくとも１００倍の選択性で、それら抗体の各々がタウｐＳ４２２及び原線維状タウｐＳ４２２に結合すると推定された。
【０３３０】
BIAcore（商標）
BIAcore（商標）分析によって、原線維状タウｐＳ４２２凝集体に対する結合につき、更に調査及び確認した。３７℃でBIAcore 3000機器を使用して測定を行った。システム及び試料の緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（１０mM ＨＥＰＥＳ、１５０mM ＮａＣｌ、３．４mM ＥＤＴＡ、０．００５％ポリソルベート２０(v/v)）であった。BIAcore（商標）CM5センサーチップをプレコンディショニング手順に供した。連続して、フローセルＦＣ１、ＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４上に３０秒間、０．１％ＳＤＳ、５０mM ＮａＯＨ、１０mM ＨＣｌ及び１００mM Ｈ３ＰＯ４を注入した。アミンカップリング手順を、BIAcore 3000（商標）wizard v. 4.1を使用して、製造業者の使用説明書に従って行った。センサー表面をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化した後、センサーのフローセルＦＣ２、ＦＣ３及びＦＣ４上に非リン酸化部位選択性抗タウ抗体ｍＡｂ＜ＴＡＵ＞Ｍ−４／５３−ＩｇＧを固定化した。対照として、関連性のない抗原を認識するＣＫ−ＭＭ（クレアチンキナーゼアイソタイプ）に対する抗体をＦＣ１上に捕捉した。１０mM ＮａＡｃ（ｐＨ５．０）中３０μg/mLになるようにｍＡｂ＜ＴＡＵ＞Ｍ−４／５３−ＩｇＧ及びＣＫ−ＭＭに対する抗体を希釈し、１０．０００RUの抗体捕捉系を固定化するために、７分間の接触時間で１０μL／分にて注入した。１Mエタノールアミンで飽和させることによって表面を不活化した。１０μL／分にて２分間、溶液中の検体としてリン酸化線維状タウタンパク質（原液０．３mg/mLをＨＢＳ−ＥＰで１：１００に希釈）を用いて５サイクル、センサーをコンディショニングした。３０μL／分にて３分間、１０mMグリシン（ｐＨ２．５）で再生を行った。ｍＡｂ ４／５３からのｐタウ線維の解離を観察することができなかったので、ｍＡｂ ４／５３に対する検体の結合はｐタウ線維を解離させないと想定される。全ての更なる測定サイクルで、０．３mg/mLのｐタウ線維をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１：１００に希釈し、不均一なサンドイッチ法において各抗体検体にｐタウを呈示するために、１分間、１０μL／分で注入した。抗体検体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で１００nMの濃度に希釈し、３分間２０μL／分で系に注入した。３分間の解離後、１００μL／分で１分間、１０mM グリシン（ｐＨ２．５）を２回注入し、次いで、１００μL／分で１５秒間ＨＢＳで洗浄することによってセンサー表面を再生した。相互作用の会合及び解離相をモニターした。溶液中の抗体検体が二価であるので、アビディティに重み付けした（avidity-burdened）抗体―ｐタウカイネティックスを、速やかな親和性に基づく早期解離工程と、後半の錯体解離におけるアビディティは安定化しているが、律速であるカイネティック工程からなる二相解離モデルによって特徴付けた。検体注入が終了した１０秒後（早期）及び５０秒後（後期）、可能な場合ｋｄ及びｔ／２（ｄｉｓｓ）を定量した。二重参照手順を使用して、カイネティック測定値を評価した。先ず、ＦＣ１参照からのシグナルを減じて、緩衝液のバルク効果及び非特異的結合を補正した。次に、０nM 検体注入を減じて、それぞれの捕捉系から一次抗体の解離を補正した。BIAcore（商標）評価ソフトウェアv.4.1に従ってラングミュア1.1解離適合モデルを使用して、反応速度を評価した。式：ｌｎ（２）／６０×ｋｄに従って抗原／抗体複合体安定半減期（分）を計算した。
【０３３１】
結果を以下の表に要約する。
【０３３２】
【表１２】
0006608827.tif 000013
【０３３３】
実施例３
アルツハイマー病患者の脳切片における細胞内ｐタウに対する抗タウｐＳ４２２モノクローナルウサギ抗体の結合
ＡＤ患者からのヒト脳組織の低温切片を用いる免疫蛍光染色実験によって、モノクローナルウサギ抗タウｐＳ４２２抗体によるアルツハイマー病脳組織のｐタウ病変の免疫組織化学的検出の特異性及び感受性について調べた。この手順は基本的に実施例Ｘ（マウス抗体）に記載されているのと同じ手順であった。ヤギ抗ウサギAlexa Fluor488（登録商標）接合二次抗体（Invitrogen/Molecular Probes A11034）によってウサギＩｇＧを検出した。ｐタウ沈着物及び線維は、クローンＭａｂ００５、Ｍａｂ０１９、Ｍａｂ０２０、Ｍａｂ０８５、Ｍａｂ０８６及びＭａｂ０９７について特異的且つ高感度に染色されていることが明らかである。大きな神経原線維濃縮体及び細長い糸屑状構造物のような、細胞内のｐタウ沈着が顕著である。調査したクローン全てについて最小有効濃度は０．０８〜０．０１６μg/mLであると測定され、これは、純粋なヒトｐタウ沈着物に対して高感度で結合することを示唆する。
【０３３４】
実施例４
ウサギ抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体のヒト化
本明細書で使用する場合「可変ドメイン」（軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）の可変ドメイン）は、抗体がタウ（ｐＳ４２２）抗原に結合する際に直接的に関係する、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの対の各々を意味する。可変軽鎖及び重鎖ドメインは同じ一般構造を有し、各ドメインは４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は広く保存されていて３つの「超可変領域」により連結されている。
【０３３５】
ウサギ抗体ｍＡｂ０８６のＶＨ及びＶＬドメインの構造をコンピューター内で（in silico）分析して、ヒトＶＨ及びＶＬドメイン（ＩＭＧＴ）の構造データベースと比較した。選択されたヒトＶＨ及びＶＬドメインへウサギ抗体のＣＤＲをグラフティングするために、構造的に最も類似したＶドメインのパネルを選択した。加えて、一次配列の類似性を考慮して、ウサギ抗体のＶＨ及びＶＬドメインの一次配列をヒトＶドメインレパートリーとアラインメントすることにより、ヒトＶドメインの選択幅を狭めた。ウサギ親残基への、ヒトフレームワーク領域内での復帰突然変異をいくつかのヒト化変異に導入した。同様に、適切な場合にはＣＤＲにおける突然変異をいくつかの変異に導入することで、抗原への親和性を潜在的に増加させ、ＣＤＲ三次構造（立体構造）を維持し、そしてシステイン残基又は抗体精製後に改変を受ける可能性がある残基のような望ましくない特徴のものを除去した。
【０３３６】
ヒト化変異の各々を含有する重鎖及び軽鎖ベクターを、マトリックス状にマイクロタイター培養プレート中にＨＥＫ２９３懸濁細胞へコトランスフェクトして、あらゆる可能な軽鎖／重鎖組み合わせの、完全サイズのＩｇＧを発現している細胞培養物を得た。３７℃で５日間培養した後、上清を回収し、マイクロタイタースケールにてプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０３３７】
実施例５
組換え発現ベクターの生成
ａ）ヒトＩｇＧ１定常領域を用いた、免疫グロブリン重鎖の発現用ベクターの生成
ヒトＩｇＧ１定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３）と、ウサギ抗体Ｍａｂ０８６由来のヒト化抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体ＶＨドメインとを含む、ヒト化重鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）−特異抗体ＶＨドメインをコード化するＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇＧ１定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。
【０３３８】
ヒトＩｇＧ１定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する。
【表１３】
0006608827.tif 000014
【０３３９】
発現ベクターは、ベクターｐＵＣ１８からの複製の起点（このプラスミドのE.coliにおける複製を可能とする）、及びベータ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coliにおけるアンピシリン耐性を与える）も含む。
【０３４０】
抗体重鎖の転写単位は、５’から３’の方向に、以下の機能性エレメントを含む：
−  イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−  マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコード化する核酸、
−  ヒトＩｇＧ１定常領域をコード化する核酸、及び
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
【０３４１】
ｂ）ヒトＩｇ−カッパ定常領域を用いた、免疫グロブリン軽鎖の発現用ベクターの生成
ヒトＩｇ−カッパ定常領域（ＣＬ−カッパ）と、ウサギ抗体Ｍａｂ０８６由来の抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体ＶＬ（カッパ）ドメインとを含む、ヒト化カッパ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体ＶＬ（カッパ）ドメインをコード化するＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇ−カッパ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。
【０３４２】
ヒトＩｇ−カッパ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する。
【表１４】
0006608827.tif 000015
【０３４３】
発現ベクターは、ベクターｐＵＣ１８からの複製の起点（このプラスミドのE.coliにおける複製を可能とする）、及びベータ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coliにおけるアンピシリン耐性を与える）も含む。
【０３４４】
抗体カッパ軽鎖の転写単位は、５’から３’の方向に、以下の機能性エレメントを含む：
−  イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−  マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをコード化する核酸、
−  ヒトＩｇ−カッパ定常領域をコード化する核酸、及び
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
【０３４５】
ｃ）ヒトＩｇ−ラムダ定常領域を用いた、免疫グロブリン軽鎖の発現用ベクターの生成
ヒトＩｇ−ラムダ定常領域（ＣＬ−ラムダ）と、ウサギ抗体Ｍａｂ０８６由来の抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインとを含む、ヒト化ラムダ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインをコード化するＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇ−ラムダ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。
【０３４６】
ヒトＩｇ−ラムダ定常領域は、以下のアミノ酸配列を有する。
【表１５】
0006608827.tif 000016
【０３４７】
発現ベクターは、ベクターｐＵＣ１８からの複製の起点（このプラスミドのE.coliにおける複製を可能とする）、及びベータ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coliにおけるアンピシリン耐性を与える）も含む。
【０３４８】
抗体ラムダ軽鎖の転写単位は、５’から３’の方向に、以下の機能性エレメントを含む：
−  イントロンＡを含むヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター、
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−  マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  可変軽鎖（ＶＬ）ドメインをコード化する核酸、
−  ヒトＩｇ−ラムダ定常領域をコード化する核酸、及び
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
【０３４９】
ｄ）ヒトＩｇ−カッパ定常領域を用いた、免疫グロブリンカッパ軽鎖の発現用ベクターの生成
ヒトＩｇ−カッパ定常領域（ＣＬ−カッパ）と、ウサギ抗体Ｍａｂ０８６由来の抗ヒトタウ（Ｓ４２２）抗体ＶＬ（カッパ）ドメインとを含む、ヒトＩｇ−カッパ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）−抗体ＶＬ（カッパ）ドメインをコード化するＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇ−カッパ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。構築体はゲノム編成となっており、すなわち、イントロンがシグナルペプチド内、及びＶＬ（カッパ）ドメインとＣＬ−カッパドメインとの間に存在していた。
【０３５０】
発現ベクターは、ベクターｐＵＣ１８からの複製の起点（このプラスミドのE.coliにおける複製を可能とする）、及びベータ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coliにおけるアンピシリン耐性を与える）も含む。
【０３５１】
抗体カッパ軽鎖の転写単位は、５’から３’の方向に、以下の機能性エレメントを含む：
−  ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−  マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをコード化する核酸、
−  ヒトＩｇＧカッパ定常領域、及び
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
【０３５２】
ｅ）ヒトＩｇ−ラムダ定常領域を用いた、免疫グロブリンラムダ軽鎖の発現用のベクターの生成
【０３５３】
ヒトＩｇ−ラムダ定常領域（ＣＬ−ラムダ）と、ウサギ抗体Ｍａｂ０８６由来の抗ヒトタウ（Ｓ４２２）抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインとを含む、ヒトＩｇ−ラムダ軽鎖をコード化する融合遺伝子は、それぞれの抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）−抗体ＶＬ（ラムダ）ドメインをコード化するＤＮＡフラグメントを、ヒトＩｇ−ラムダ定常領域をコード化する配列エレメントに融合することにより組立てられた。構築体はゲノム編成となっており、すなわち、イントロンがシグナルペプチド内、及びＶＬ（ラムダ）ドメインとＣＬ−ラムダドメインとの間に存在していた。
【０３５４】
発現ベクターは、ベクターｐＵＣ１８からの複製の起点（このプラスミドのE.coliにおける複製を可能とする）、及びベータ−ラクタマーゼ遺伝子（E.coliにおけるアンピシリン耐性を与える）も含む。
【０３５５】
抗体ラムダ軽鎖の転写単位は、５’から３’の方向に、以下の機能性エレメントを含む：
−  ヒトサイトメガロウイルス（Ｐ−ＣＭＶ）からの最初期エンハンサー及びプロモーター
−  ヒト重鎖免疫グロブリン５’−非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
−  マウスの免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
−  軽鎖可変（ＶＬ）ドメインをコード化する核酸、
−  ヒトＩｇＧラムダ定常領域、及び
−  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨ ｐＡ）。
【０３５６】
実施例６
抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の組換え生成
Ｆ１７培地（Invitrogen Corp.）中で培養された、一過的にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ヒト胎児腎臓細胞株２９３由来）において抗体を生成した。実施例５に記載のようなそれぞれのベクターのトランスフェクションには、「293-Free」トランスフェクション試薬（Novagen）を使用した。抗体は、個々の発現プラスミドから発現された。トランスフェクションを、製造業者の使用説明書に明記されるとおりに実施した。組換え抗体含有細胞培養上清は、トランスフェクションの３〜７日後に回収された。上清は、精製するまで低温（例えば、−８０℃）で保存された。
【０３５７】
例えばＨＥＫ２９３細胞におけるヒト免疫グロブリンの組換え発現に関する一般的な情報は、Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203に示されている。
【０３５８】
実施例７
組換え抗ヒトタウ（ｐＳ４２２）抗体の精製
抗体含有培養上清は、２種のクロマトグラフィー工程によって濾過及び精製された。
【０３５９】
抗体は、ＰＢＳ（１mM ＫＨ２ＰＯ４、１０mM Ｎａ２ＨＰＯ４、１３７mM ＮａＣｌ、２．７mM ＫＣｌ）、ｐＨ７．４で平衡化されたHiTrap MabSelectSuRe（GE Healthcare）を用い、アフィニティークロマトグラフィーによって捕獲された。未結合のタンパク質は、平衡化緩衝液で洗浄することにより除去され、抗体は２５mMクエン酸塩緩衝液、ｐＨ３．１を用いて回収され、溶出後直ちに１M Ｔｒｉｓ−塩基、ｐＨ９．０を用いてｐＨ６．０に調整された。
【０３６０】
Superdex 200（商標）（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーを、第２精製工程として使用した。サイズ排除クロマトグラフィーは、２０mMヒスチジン緩衝液、０．１４M ＮａＣｌ、ｐＨ６．０において実施された。Biomax-SK膜を備えたUltrafree-CL遠心式濾過ユニット（Millipore, Billerica, MA, USA）を用いて抗体含有溶液を濃縮し、−８０℃で保存した。
【０３６１】
実施例８
カイネティックスクリーニング
カイネティックスクリーニングは、Schraeml et al.（Schraeml, M. and M. Biehl, Methods Mol. Biol. 901 (2012) 171-181）に従い、BIAcore CM5センサーを備えたBIAcore 4000機器にて実施された。BIAcore 4000機器は、ソフトウェアバージョンV1.1の制御下にあった。BIAcore CM5シリーズSチップを機器に実装させ、製造業者の使用説明書に従って水力学的に扱い、プレコンディショニングした。機器緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０mM ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＥＤＴＡ、０．０５％（w/v）Ｐ２０）であった。抗体捕獲システムを、センサー表面に準備した。ＮＨＳ／ＥＤＣ化学を使用し、１０，０００RUにて機器のフローセル１、２、３及び４内で、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ特異性を有するポリクローナルヤギ抗ヒト抗体（Jackson Lab.）を、１０mM酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５）中３０μg/mlでスポット１、２、４及び５に固定化した。各フローセルにおいて、抗体はスポット１及びスポット５で捕獲された。スポット２及びスポット４は、参照スポットとして使用された。センサーは、１M エタノールアミン溶液で不活化された。ヒト化抗体誘導体を、１mg/ml ＣＭＤ（カルボキシメチルデキストラン）を追加した機器緩衝液中、４４nMと７０nMとの間の濃度で適用した。抗体は、３０μl／分の流量で２分間注入された。表面呈示抗体の捕獲レベル（ＣＬ）を、rel.応答単位（RU）で測定した。溶液中の検体、リン酸化ヒトタウタンパク質、非リン酸化ヒトタウタンパク質及びリン酸化ヒトタウ突然変異体タンパク質Ｔ４２２Ｓは、３００nMで３分間、３０μl／分の流量で注入された。解離を、５分間モニタリングした。捕獲システムは、１０mMグリシン緩衝液、ｐＨ１．７を３０μL／分で１分間、全フローセルにわたって注入することにより再生された。２つの報告ポイント、すなわち、検体の注入終了の直前の記録シグナル（結合後期（binding late）（ＢＬ）と示す）と、解離時間の終了直前の記録シグナル（安定性後期（stability late）（ＳＬ））とを、カイネティックスクリーニング性能を特徴付けるために使用した。更に、解離速度定数ｋｄ（１／ｓ）をラングミュアモデルに従って計算し、抗体／抗原複合体半減期を式：ｌｎ（２）／（６０×ｋｄ）に従って分単位で計算した。モル比（ＭＲ）を、式：ＭＲ＝（結合後期（RU））／（捕獲レベル（RU））×（ＭＷ（抗体）／（ＭＷ（抗原））に従って計算した。センサーが好適な量の抗体リガンド捕獲レベルで構成されている場合、各抗体は溶液中の少なくとも１つの検体に機能的に結合することができるはずであり、ＭＲ＝１．０のモル比によって表される。それから、当該モル比は、検体結合の価数モードに対する指標でもある。最高価数は、２種の検体を結合する抗体に対してＭＲ＝２であることができ、１種が各Ｆａｂ価数を有する。
【０３６２】
別の実施形態では、反応速度を同じ実験装備を用いたが、０nM（緩衝液）、１．２nM、３．７nM、１１．１nM、３３．３nM、１００nM及び３００nMの、溶液中各検体の複数種濃度系列を使用して、２５℃及び３７℃で決定した。BIAcore評価ソフトウェアを用い、製造業者の使用説明書及びRMAX globalでラングミュア1.1モデルに従って、濃度依存的結合挙動からカイネティックデータを計算した。
【０３６３】
実施例９
ＥＬＩＳＡ
非被覆Maxisorbプレートに、非ビオチン化ペプチド／タンパク質／凝集体を、そしてストレプトアビジン被覆Maxisorbプレートに、ＰＢＳ中ビオチン化ペプチド／タンパク質／凝集体を添加して一晩インキュベーションした。上清を破棄して、ウェルを９０μlの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ／０．１％Tween 20）で３回洗浄した。残存する反応性スポットを、ブロッキング緩衝液（１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミンFraction V、脂肪酸不含、Roche, Cat. No.：10735078001）／０．０５％Tween 20）で１時間インキュベーションすることによりブロックした。上清を破棄して、ウェルを９０μlの洗浄緩衝液で３回洗浄した。試料及び対照抗体は、ＥＬＩＳＡ緩衝液（１×ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミンFraction V、脂肪酸不含、Roche, Cat. No.：10735078001）／０．０５％Tween 20）中５００ng/mLの開始濃度で、１２の希釈液（１：２）に調製された。インキュベーション時間は、振盪機上、室温にて６０分間であった。上清を破棄して、ウェルを９０μlの洗浄緩衝液で３回洗浄した。二次抗体の溶液を、ＥＬＩＳＡ緩衝液にて調製した。合計で２５μlの抗体混合液を、アッセイプレートの全ウェル内に移し、このプレートをその後振盪機上、室温にて６０分間インキュベーションした。上清を破棄して、ウェルを９０μlの洗浄緩衝液で３回洗浄した。全てのウェルにＡＢＴＳ溶液２５μlを添加した。吸光度を、４０５nm〜４９２nmで読み取った。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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