(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオンの存在下でのエンドトキシン測定における反応阻害を低減する方法であって、
哺乳類細胞を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ組換えタンパク質と、イオンを含有する被験試料とを混合する工程を含み、
前記哺乳類細胞は、Ｃｏｓ−１細胞以外の哺乳類細胞であり、
前記ファクターＣ組換えタンパク質は、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣに比べて（α−２，３）結合の末端シアル酸を多く有する、方法。
【請求項２】
前記イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびマグネシウムイオンからなる群より選択される１種またはそれ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
エンドトキシン測定剤を製造する方法であって、
哺乳類細胞を宿主細胞として用いてカブトガニのファクターＣ組換えタンパク質を発現させること、および
前記哺乳類細胞の培養液または培養上清を前記エンドトキシン測定剤の成分として回収することを含み、
前記哺乳類細胞は、Ｃｏｓ−１細胞以外の哺乳類細胞であり、
前記培養液および前記培養上清は前記ファクターＣ組換えタンパク質を含み、
前記ファクターＣ組換えタンパク質は、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣに比べて（α−２，３）結合の末端シアル酸を多く有する、方法。
【請求項８】
前記エンドトキシン測定剤が、イオンの存在下で使用するためのものである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記イオンが、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびマグネシウムイオンからなる群より選択される１種またはそれ以上である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項７〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ファクターＣ組換えタンパク質が、１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣよりも高い残存活性を示す、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造されたエンドトキシン測定剤を用いて、被験試料中のエンドトキシンを測定することを含む、エンドトキシンの測定方法。
【請求項１５】
エンドトキシンが測定された医療用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器、医療器具、天然のタンパク質、組換えタンパク質、核酸または糖質の製造方法であって、
請求項７〜１３のいずれか１項に記載の方法により製造されたエンドトキシン測定剤を用いて、前記医療用水、前記医薬品、輸液、前記血液製剤、前記医療機器、前記医療器具、前記天然のタンパク質、前記組換えタンパク質、前記核酸、または前記糖質中のエンドトキシンを測定することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規組換えファクターＣ、その製造法、およびエンドトキシンの測定法に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンは、グラム陰性細菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖であり、強い発熱性物質として知られている。また、エンドトキシンは、発熱以外にも、マクロファージの活性化に伴う炎症性サイトカインの遊離やエンドトキシンショックの誘発等、微量でも細菌感染による様々な病態を惹き起こすことが知られている。このため、注射用医薬品を始めとする医薬品、水、医療器具等におけるエンドトキシンの検出は重要である。また、エンドトキシンはグラム陰性細菌感染症におけるショックの主な原因と考えられており、血液中のエンドトキシンを測定することで、感染の有無や治療効果を判定することができる。
【０００３】
また、アメリカカブトガニ（リムルス・ポリフェムス；Limulus polyphemus）にグラム陰性細菌が感染すると、血液凝固を引き起こすことが知られており、この現象はエンドトキシンの検出に利用されてきた。
【０００４】
すなわち、カブトガニ血球抽出液（カブトガニ・アメボサイト・ライセート。以下「ライセート」ともいう。）を使用して、エンドトキシンを測定する方法が知られている（例えば、非特許文献１）。この方法は、リムルステストと呼ばれ、エンドトキシンがライセートに接触することによって起きる、ライセート中に存在する種々のタンパク質のカスケード反応を利用するものである。カスケード反応の模式図を図１に示す。
【０００５】
エンドトキシンがライセートに接触すると、ライセート中に存在するセリンプロテアーゼ前駆体であるファクターＣが活性化されて活性型ファクターＣが生成する。この活性型ファクターＣによって、ライセート中に存在するファクターＢが活性化されて活性型ファクターＢが生成する。この活性型ファクターＢによって、ライセート中に存在するプロクロッティングエンザイムが活性化されてクロッティングエンザイムが生成する。
【０００６】
このクロッティングエンザイムは、ライセート中に存在するコアギュローゲンの分子中の特定の箇所を加水分解する。これによって、コアギュリンゲルが生成してライセートが凝固する。したがって、ライセートの凝固反応を測定することで、エンドトキシンを測定することができる。
【０００７】
また、クロッティングエンザイムを合成基質に作用させることで発色反応を進行させ、エンドトキシンを測定することもできる。例えば、クロッティングエンザイムは、合成基質であるｔ−ブトキシカルボニル−ロイシル−グリシル−アルギニル−ｐＮＡ（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）に作用し、そのアミド結合を加水分解してｐＮＡを遊離する。よって、前記合成基質を反応系に存在させておくことで、発色物質（ｐＮＡ）の吸光度（４０５ｎｍ）を測定することによりエンドトキシンを定量することができる。
【０００８】
また、日本産カブトガニのライセートから精製したファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを用いてカスケード反応系を再構成できることが知られている（非特許文献２）。
【０００９】
しかしながら、ライセート、またはそれから精製したファクターＣ、ファクターＢ、お
よびプロクロッティングエンザイムを利用するには、カブトガニを捕獲して血液を採取する必要があり、生物資源の保護の観点から、これらの成分を無尽蔵に供給することは困難である。そのため、遺伝子工学的にこれらの成分を生産し、カスケード反応系を再構成する技術が求められていた。
【００１０】
例えば、昆虫細胞を宿主細胞として用いてファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを発現させ、カスケード反応系を再構成した例が知られている（特許文献１、２）。しかしながら、当該再構成系においては、反応系に塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、または塩化カルシウムが存在することにより、カスケード反応が抑制されたと報告されている（特許文献１）。
【００１１】
一方、哺乳類細胞を宿主細胞として用いた例としては、アフリカミドリザルの腎細胞由来細胞株であるCOS-1を宿主細胞として用いて、シンガポール産カブトガニ（Carcinoscorpius rotundicauda）由来のファクターＣを発現させた例が知られている。しかしながら、COS-1を宿主細胞として用いた場合、発現したファクターＣは不溶性であったと報告されている（非特許文献３、４）。すなわち、哺乳類細胞を宿主細胞として用いて、機能的なファクターＣを生産した例は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第2008/004674号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2012/118226号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Iwanaga S., Curr. Opin. Immunol. Feb; 5(1): 74-82 (1993)
【非特許文献２】Nakamura T., et al., J. Biochem. Mar; 99(3): 847-57 (1986)
【非特許文献３】Roopashree S. Dwarakanath, et al., Biotechnology letters 19(4): 357-361 (1997)
【非特許文献４】Jing Wang, Bow Ho and Jeak L. Ding, Biotechnology letters 23: 71-76 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、カブトガニの新規組換えファクターＣ、およびこれを製造する方法を提供することを課題とする。
【００１５】
また、生体内に注射する注射剤の多くは、各種の塩（イオン）を含有している。一方で、これらの製造においては、エンドトキシンの確認が各国薬局方で義務付けられている。そこで、本発明は、その一態様において、塩（イオン）の存在下で反応阻害を受けにくいカスケード反応の再構成系を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は、ヒト細胞またはチャイニーズハムスター細胞を宿主細胞として用いることによりカブトガニの組換えファクターＣを製造できること、およびそのようにして製造された組換えファクターＣを用いることにより塩（イオン）の存在下で反応阻害を低減してエンドトキシンを測定できることを見出し、本発明を完成させた。
【００１７】
すなわち、本発明は以下の態様を包含する。
［１］
ファクターＣの活性を有する、カブトガニのファクターＣ。
［１．１．１］
シアル酸を有する、前記ファクターＣ。
［１．１．２］
（α−２，３）結合の末端シアル酸を有する、前記ファクターＣ。
［１．１．３］
天然ファクターＣに比べて（α−２，３）結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターＣ。
［１．１．４］
Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣに比べて（α−２，３）結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターＣ。
［１．１．５］
Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎでレクチンブロットした際に、天然ファクターＣに比べて高い反応性を示す、前記ファクターＣ。
［１．１．６］
Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎでレクチンブロットした際に、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣに比べて高い反応性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．１］
２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、１０％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．２］
２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、２０％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．３］
５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、２５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．４］
５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、３５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．５］
２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、２５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．６］
２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、３５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．７］
１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、１５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．８］
１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、２５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．９］
２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で、３５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．１０］
２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で、４５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．１１］
２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示
す、前記ファクターＣ。
［１．２．１２］
５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．１３］
２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．１４］
１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．２．１５］
２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［１．３．１］
下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、または（Ｄ）に示すタンパク質である、前記ファクターＣ：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質。
［１．３．２］
下記（Ａ）、または（Ｂ）に示すタンパク質である、前記ファクターＣ：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質。
［１．４］
組換えタンパク質である、前記ファクターＣ。
［１．５．１］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１１５ｋＤａ〜１４０ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．２］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１１５ｋＤａ〜１３０ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．３］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２０ｋＤａ〜１３０ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．４］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２０ｋＤａ〜１２８ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．５］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±５ｋＤａである、前記フ
ァクターＣ。
［１．５．６］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２８ｋＤａ±２ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．７］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±２ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．８］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２６ｋＤａ±２ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．５．９］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±１ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［１．６］
水溶性である、前記ファクターＣ。
［１．７］
ファクターＣを含む培養上清である、前記ファクターＣ。
［１．８］
下記（１）〜（３）に示す性質を有する、前記ファクターＣ：
（１）ファクターＣの活性を有する；
（２）非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１１５ｋＤａ〜１３０ｋＤａである；および
（３）２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、１０％以上の残存活性を示す。
［２］
カブトガニのファクターＣを製造する方法であって、哺乳類細胞を宿主細胞として用いてカブトガニのファクターＣを発現することを含む、方法。
［２．１．１］
前記哺乳類細胞が、ＣＯＳ−１以外の哺乳類細胞である、前記方法。
［２．１．２］
前記哺乳類細胞が、霊長類およびげっ歯類からなる群より選択される哺乳動物の細胞である、前記方法。
［２．１．３］
前記哺乳類細胞が、霊長類の細胞である、前記方法。
［２．１．４］
前記哺乳類細胞が、げっ歯類の細胞である、前記方法。
［２．１．５］
前記哺乳類細胞が、サルを除く霊長類およびげっ歯類からなる群より選択される哺乳動物の細胞である、前記方法。
［２．１．６］
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスターの細胞またはヒトの細胞である、前記方法。
［２．１．７］
前記哺乳類細胞が、チャイニーズハムスターの細胞である、前記方法。
［２．１．８］
前記哺乳類細胞が、ヒトの細胞である、前記方法。
［２．１．９］
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯまたはＨＥＫである、前記方法。
［２．１．１０］
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯである、前記方法。
［２．１．１１］
前記哺乳類細胞が、ＨＥＫである、前記方法。
［２．１．１２］
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ  ＤＧ４４またはＨＥＫ２９３である、前記方法。
［２．１．１３］
前記哺乳類細胞が、ＣＨＯ  ＤＧ４４である、前記方法。
［２．１．１４］
前記哺乳類細胞が、ＨＥＫ２９３である、前記方法。
［２．２．１］
前記ファクターＣが下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、または（Ｄ）に示すタンパク質である、前記方法：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質；
（Ｃ）配列番号４に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｄ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質。
［２．２．２］
前記ファクターＣが下記（Ａ）または（Ｂ）に示すタンパク質である、前記方法：
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質。
［３］
前記方法により製造され得る、カブトガニのファクターＣ。
［３．１］
ファクターＣの活性を有する、前記ファクターＣ。
［３．２．１］
シアル酸を有する、前記ファクターＣ。
［３．２．２］
（α−２，３）結合の末端シアル酸を有する、前記ファクターＣ。
［３．２．３］
天然ファクターＣに比べて（α−２，３）結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターＣ。
［３．２．４］
Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣに比べて（α−２，３）結合の末端シアル酸を多く有する、前記ファクターＣ。
［３．２．５］
Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎでレクチンブロットした際、天然ファクターＣに比べて高い反応性を示す、前記ファクターＣ。
［３．２．６］
Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎでレクチンブロットした際、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣに比べて高い反応性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１］
２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、１０％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．２］
２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、２０％以上の残存活性を示す、前記ファク
ターＣ。
［３．３．３］
５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、２５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．４］
５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、３５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．５］
２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、２５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．６］
２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、３５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．７］
１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、１５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．８］
１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、２５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．９］
２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で、３５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１０］
２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で、４５％以上の残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１１］
２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１２］
５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１３］
２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１４］
１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．３．１５］
２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で、Ｓｆ９を宿主細胞として用いて発現させたカブトガニのファクターＣ、および／または、天然ファクターＣよりも高い残存活性を示す、前記ファクターＣ。
［３．４］
組換えタンパク質である、前記ファクターＣ。
［３．５．１］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１１５ｋＤａ〜１４０ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．２］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１１５ｋＤａ〜１３０ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．３］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２０ｋＤａ〜１３０ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．４］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２０ｋＤａ〜１２８ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．５］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±５ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．６］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２８ｋＤａ±２ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．７］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±２ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．８］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２６ｋＤａ±２ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．５．９］
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±１ｋＤａである、前記ファクターＣ。
［３．６］
水溶性である、前記ファクターＣ。
［３．７］
ファクターＣを含む培養上清である、前記ファクターＣ。
［４］
前記ファクターＣを含む、エンドトキシン測定剤。
［４．１］
さらに、カブトガニのファクターＢおよびカブトガニのプロクロッティングエンザイムを含む、前記測定剤。
［４．２］
前記ファクターＢが下記（Ｅ）または（Ｆ）に示すタンパク質であり、前記プロクロッティングエンザイムが下記（Ｇ）または（Ｈ）に示すタンパク質である、前記測定剤：
（Ｅ）配列番号６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｆ）配列番号６に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、ファクターＢの活性を有するタンパク質；
（Ｇ）配列番号８に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｈ）配列番号８に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、又は付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、プロクロッティングエンザイムの活性を有するタンパク質。
［５］
前記測定剤を含む、エンドトキシン測定用キット。
［６］
前記測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシンを測定する方法。
［６．１．１］
前記被験試料が、イオンを含有する、前記方法。
［６．１．２］
前記被験試料が、カチオンを含有する、前記方法。
［６．１．３］
前記被験試料が、金属イオンを含有する、前記方法。
［６．１．４］
前記被験試料が、アルカリ金属イオンまたはアルカリ土類金属イオンを含有する、前記方法。
［６．１．５］
前記被験試料が、アルカリ金属イオンを含有する、前記方法。
［６．１．６］
前記被験試料が、アルカリ土類金属イオンを含有する、前記方法。
［６．２．１］
前記被験試料が、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、およびマグネシウムイオンからなる群より選択される１種またはそれ以上のイオンを含有する、前記方法。
［６．２．２］
前記被験試料が、ナトリウムイオンを含有する、前記方法。
［６．２．３］
前記被験試料が、カリウムイオンを含有する、前記方法。
［６．２．４］
前記被験試料が、カルシウムイオンを含有する、前記方法。
［６．２．５］
前記被験試料が、マグネシウムイオンを含有する、前記方法。
［６．３．１］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．３．２］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、２ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．３．３］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、５ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．３．４］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１０ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．３．５］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、２０ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．３．６］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、５０ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．３．７］
前記被験試料におけるイオンの含有量が、該被験試料に由来するカチオンの濃度が、該
被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１００ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．４］
前記被験試料が、注射剤である、前記方法。
［６．５．１］
前記被験試料が、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、イオタラム酸ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、およびリン酸二水素ナトリウムからなる群より選択される１種またはそれ以上の塩を含有する、前記方法。
［６．５．２］
前記被験試料が、塩化ナトリウムを含有する、前記方法。
［６．５．３］
前記被験試料が、硫酸マグネシウムを含有する、前記方法。
［６．５．４］
前記被験試料が、炭酸水素ナトリウムを含有する、前記方法。
［６．５．５］
前記被験試料が、クエン酸ナトリウムを含有する、前記方法。
［６．５．６］
前記被験試料が、塩化カルシウムを含有する、前記方法。
［６．５．７］
前記被験試料が、塩化カリウムを含有する、前記方法。
［６．５．８］
前記被験試料が、イオタラム酸ナトリウムを含有する、前記方法。
［６．５．９］
前記被験試料が、エデト酸カルシウム二ナトリウムを含有する、前記方法。
［６．５．１０］
前記被験試料が、リン酸二水素ナトリウムを含有する、前記方法。
［６．６．１］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．６．２］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、２ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．６．３］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、５ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．６．４］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１０ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．６．５］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、２０ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．６．６］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、５０ｍＭ以上となるような量
である、前記方法。
［６．６．７］
前記被験試料における塩の含有量が、該被験試料に由来する塩の濃度が、該被験試料と前記測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１００ｍＭ以上となるような量である、前記方法。
［６．７］
カスケード反応の進行を検出するための基質を反応系に添加する工程を含む、前記方法。
［６．８］
さらに、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】リムルステストのカスケード反応系を示す図。
【図２】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類のファクターＣ（Sf9、CHO、HEK、TAL）の非還元条件下ウエスタンブロッティングの結果を示す写真。
【図３】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の天然ファクターＣ（TAL）および組換えファクターＣ（CHO）の分子量を示す写真（SDS-PAGE）。
【図４】ファクターＣの活性測定のスキームを示す図。
【図５】再構成カスケード反応系を示す図。
【図６】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類のファクターＣ（Sf9、CHO、HEK、TAL）の活性を示す図。
【図７】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類のファクターＣ（Sf9、CHO、HEK、TAL）の、各種注射剤による活性阻害を示す図。
【図８】タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣ（TtFC）とカルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターＣ（834CrID4）のアラインメントを示す図（図９に続く）。下線は、N型糖鎖修飾の起こり得るコンセンサス配列を示す。
【図９】タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣ（TtFC）とカルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターＣ（834CrID4）のアラインメントを示す図（図８の続き）。下線は、N型糖鎖修飾の起こり得るコンセンサス配列を示す。
【図１０】還元条件下および非還元条件下でのファクターＣと特異的抗体との反応部位を示す模式図。
【図１１】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類の精製ファクターＣの分子量を示す写真（SDS-PAGE）。
【図１２】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類の精製ファクターＣの分子量を示す写真（ウエスタンブロット）。
【図１３】日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類の精製ファクターＣのグライコペプチダーゼFによるN型糖鎖の除去の結果を示す写真（ウエスタンブロット）。
【図１４】（ａ）日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類の精製ファクターＣのレクチンブロットによるN型糖鎖の検出結果を示す写真；（ｂ）レクチンの結合特異性を示す図；（ｃ）実験結果と文献報告から予想される組換えファクターＣのN型糖鎖の構造を示す模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
（１）本発明のファクターＣ
本発明のファクターＣは、カブトガニ由来のファクターＣである。本発明のファクターＣは、組換えタンパク質である。「組換えタンパク質」とは、タンパク質をコードする遺伝子を宿主細胞に導入し異種発現させることにより得られたタンパク質をいう。本発明のファクターＣは、ファクターＣの活性を有する。
【００２０】
カブトガニとしては、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、アメリカ産カブトガニであるリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、東南アジア産（シンガポール産）カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）、東南アジア産カブトガニであるタキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）が挙げられる。これらの中では、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス、または東南アジア産（シンガポール産）カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ由来であるのが好ましい。また、これらの中では、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス由来であるのがより好ましい。タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。カルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターＣのアミノ酸配列を配列番号４に示す。また、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターＣをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示す。
【００２１】
本発明のファクターＣは、N型糖鎖修飾されていてよい。N型糖鎖とは、タンパク質のアスパラギン残基に結合した糖鎖をいう。タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣとカルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターＣとでは、N型糖鎖修飾の起こり得るアミノ酸残基が保存されている。両ファクターＣのアラインメントとN型糖鎖修飾の起こり得るコンセンサス配列（Asn-Xaa-Ser/Thr（Xaaは任意のアミノ酸残基を示す））を図８、９に示す。よって、特に、カルシノスコルピウス・ロツンディカウダのファクターＣは、タキプレウス・トリデンタツスのファクターＣと同様に好適なファクターＣであると考えられる。
【００２２】
本発明のファクターＣは、シアル酸を有していてよい。シアル酸としては、例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（Neu5Ac）やＮ−グリコリルノイラミン酸（Neu5Gc）が挙げられる。「シアル酸を有する」とは、本発明のファクターＣにシアル酸が結合していることをいう。シアル酸は、ファクターＣに直接結合していてもよく、間接的に結合していてもよい。例えば、シアル酸は、シアル酸を含む糖鎖がファクターＣに結合することにより、間接的にファクターＣに結合していてよい。シアル酸は、例えば、（α-2,3）結合のシアル酸であってよく、より具体的には（α-2,3）結合の末端シアル酸であってよい。「（α-2,3）結合のシアル酸」とは、（α-2,3）グリコシド結合で糖に結合したシアル酸をいう。「（α-2,3）結合の末端シアル酸」とは、（α-2,3）グリコシド結合で糖に結合し、且つ、糖鎖の末端に位置するシアル酸をいう。糖鎖としては、例えば、N型糖鎖が挙げられる。シアル酸は、例えば、翻訳後修飾によりシアル酸を含む糖鎖をタンパク質に付加できる宿主細胞でファクターＣを発現することにより、ファクターＣに付加することができる。そのような宿主細胞としては、哺乳類細胞が挙げられる。シアル酸は、例えば、糖鎖解析により検出することができる。糖鎖解析は、公知の手法により行うことができる。例えば、レクチンや糖鎖抗体を利用して糖鎖解析を行うことができる。具体的には、例えば、Maackia amurensis Agglutinin（MAM）を利用してレクチンブロットを行うことにより、（α-2,3）結合の末端シアル酸を特異的に検出することができる。
【００２３】
本発明のファクターＣは、対照のファクターＣと比較して、シアル酸を多く有していてよい。「対照のファクターＣと比較して、シアル酸を多く有する」とは、本発明のファクターＣに結合したシアル酸の量が、ファクターＣの分子当たりのシアル酸の分子数に換算して、対照のファクターＣに結合したシアル酸の量よりも大きいことをいう。例えば、本発明のファクターＣに結合したシアル酸の量は、ファクターＣの分子当たりのシアル酸の分子数に換算して、対照のファクターＣに結合したシアル酸の量の、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、または３．０倍以上であってよい。
【００２４】
対照のファクターＣとしては、昆虫細胞Ｓｆ９で発現させた組換えファクターＣや天然のファクターＣが挙げられる。「Ｓｆ９を宿主細胞として発現させたファクターＣ」とは、本発明のファクターＣと同一のアミノ酸配列からなるファクターＣをコードする遺伝子をＳｆ９を宿主細胞として発現させることにより得られるファクターＣをいう。「天然のファクターＣ」とは、カブトガニのライセートから分離精製されたファクターＣをいう。天然のファクターＣは、本発明のファクターＣが由来するカブトガニのライセートから分離精製されたファクターＣであってよい。すなわち、具体的には、例えば、本発明のファクターＣがタキプレウス・トリデンタツスの組換えファクターＣまたはそのバリアントである場合、天然のファクターＣはタキプレウス・トリデンタツスのライセートから分離精製されたファクターＣであってよい。
【００２５】
「対照のファクターＣと比較して、シアル酸を多く有する」かどうかは、本発明のファクターＣと対照のファクターＣとでシアル酸の量を比較することにより確認できる。シアル酸の量は、例えば、糖鎖解析により決定することができる。糖鎖解析は、公知の手法により行うことができる。例えば、レクチンや糖鎖抗体を利用して糖鎖解析を行うことができる。具体的には、例えば、Maackia amurensis Agglutinin（MAM）を利用してレクチンブロットを行うことにより、（α-2,3）結合の末端シアル酸を特異的に定量することができる。MAMでレクチンブロットを行った際に高い反応性を示す程、（α-2,3）結合の末端シアル酸の量が大きい、すなわち、（α-2,3）結合の末端シアル酸を多く有する、と決定できる。すなわち、本発明のファクターＣは、対照のファクターＣと比較して、MAMでレクチンブロットを行った際に高い反応性を示してよい。「対照のファクターＣと比較して、MAMでレクチンブロットを行った際に高い反応性を示す」とは、等量の本発明のファクターＣと対照のファクターＣに対してそれぞれMAMでレクチンブロットを行った際に、本発明のファクターＣのスポットの検出強度（発色の程度等）が、対照のファクターＣのスポットの検出強度よりも高いことをいう。
【００２６】
本発明のファクターＣは、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されていないものであってよい。また、本発明のファクターＣは、Ｃ末端にＶ５タグが付加されていないものであってよい。また、本発明のファクターＣは、Ｃ末端にペプチドが一切付加されていないものであってよい。また、本発明のファクターＣは、Ｎ末端にペプチドが一切付加されていないものであってよい。また、本発明のファクターＣは、両末端とも、ペプチドが一切付加されていないものであってよい。
【００２７】
本発明のファクターＣは、ファクターＣの活性を有する限り、上記各種カブトガニのファクターＣ、例えば配列番号２または４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、のバリアントであってもよい。バリアントには、例えば、上記ファクターＣのホモログや人為的な改変体が含まれる。なお、バリアントのアミノ酸配列は、実際にカブトガニにおいて見出されることを要しない。すなわち、「カブトガニの／カブトガニ由来の」ファクターＣには、カブトガニにおいて見出されるファクターＣのバリアントであって、カブトガニにおいては見出されないアミノ酸配列を有するものも含まれる。
【００２８】
ファクターＣの活性とは、エンドトキシンの存在下で活性型となり、ファクターＢを活性型に変化させる活性をいう。「ファクターＣの活性を有する」ことは、例えば、本発明のファクターＣを、好適なファクターＢおよび好適なプロクロッティングエンザイムと組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。具体的には、例えば、好適なファクターＢとして配列番号６のタンパク質を、好適なプロクロッティングエンザイムとして配列番号８のタンパク質を使用できる。カスケード反応の進行は、後述する検出用基質を用いて測定できる。
【００２９】
本発明のファクターＣは、ファクターＣの活性を有する限り、上記のようなファクター
Ｃのアミノ酸配列、例えば配列番号２または４に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含む配列を有するタンパク質であってもよい。前記「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、例えば、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加等には、遺伝子が由来するカブトガニの個体差、株、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異も含まれる。
【００３０】
また、本発明のファクターＣは、上記のようなファクターＣのアミノ酸配列全体、例えば配列番号２または４に示すアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性または同一性を有し、かつ、ファクターＣの活性を有するタンパク質であってもよい。
【００３１】
本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、上記のような本発明のファクターＣをコードする限り特に制限されない。本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、公知の遺伝子配列から調製され得るプローブ、例えば配列番号１または３に示す塩基配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、ファクターＣの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、好ましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、さらに好ましくは、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。
【００３２】
また、本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせを哺乳類細胞での発現に最適化するよう変更してもよい。最適化は、例えば一般の受託サービスを利用して行うことができる。なお、本発明のファクターＣをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせが哺乳類細胞での発現に最適化されたＤＮＡ
のバリアントであってもよい。
【００３３】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、ファクターＢおよびプロクロッティングエンザイム、並びにそれらをコードする遺伝子に準用できる。
【００３４】
本発明のファクターＣは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１１５ｋＤａ〜１４０ｋＤａ、１１５ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、１２０ｋＤａ〜１３０ｋＤａ、または１２０ｋＤａ〜１２８ｋＤａであってよい。また、本発明のファクターＣは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２７ｋＤａ±５ｋＤａ、１２８ｋＤａ±２ｋＤａ、１２７ｋＤａ±２ｋＤａ、１２６ｋＤａ±２ｋＤａ、または１２７ｋＤａ±１ｋＤａであってよい。また、本発明のファクターＣは、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される分子量が１２８ｋＤａまたは１２６ｋＤａであってよい。
【００３５】
また、本発明のファクターＣは、イオンによる活性阻害を受けにくい性質を有していてもよい。「イオンによる活性阻害を受けにくい性質を有する」とは、本発明のファクターＣが、対照のファクターＣと比較して、イオンの存在下で高い残存活性を示すことをいう。対照のファクターＣとしては、昆虫細胞Ｓｆ９で発現させた組換えファクターＣや天然のファクターＣが挙げられる。「高い残存活性を示す」とは、本発明のファクターＣの残存活性が対照のファクターＣの残存活性より高い限り特に制限されないが、例えば、本発明のファクターＣの残存活性が対照のファクターＣの残存活性の１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、２．０倍以上、２．５倍以上、または３．０倍以上であることを意味してよい。「イオンによる活性阻害を受けにくい性質」として、具体的には、例えば、対照のファクターＣと比較して、２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で高い残存活性を示す性質、５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で高い残存活性を示す性質、２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で高い残存活性を示す性質、１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で高い残存活性を示す性質、２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で高い残存活性を示す性質が挙げられる。また、「イオンによる活性阻害を受けにくい性質」として、具体的には、例えば、２１ｍＭのクエン酸ナトリウムの存在下で１０％以上または２０％以上の残存活性を示す性質、５２ｍＭの炭酸水素ナトリウムの存在下で２５％以上または３５％以上の残存活性を示す性質、２１４ｍＭの塩化ナトリウムの存在下で２５％以上または３５％以上の残存活性を示す性質、１６ｍＭの硫酸マグネシウムの存在下で１５％以上または２５％以上の残存活性を示す性質、２．５ｍＭの塩化カルシウムの存在下で３５％以上または４５％以上の残存活性を示す性質も挙げられる。本発明のファクターＣは、これらの性質の１つを有していてもよく、これらの性質の２つまたはそれ以上を有していてもよい。なお、「残存活性」は、図４に示すアッセイ系において、注射用水にエンドトキシンを添加したもの（エンドトキシン濃度0.05EU/mL）を測定検体とした際の反応性を100%とした場合の、イオンを含む被験試料にエンドトキシンを添加したもの（エンドトキシン濃度0.05EU/mL）を測定検体とした際の反応性の相対値（%）として示される。
【００３６】
また、本発明のファクターＣは、水溶性であってよい。ここでいう「水溶性」とは、本発明のファクターＣを適当な宿主細胞で発現させた際に、発現したファクターＣが可溶性画分に検出されるこという。「可溶性画分に検出される」とは、発現したファクターＣの２０％以上、５０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上が可溶性画分に検出されることであってよい。
【００３７】
（２）本発明のファクターＣの製造法
本発明のファクターＣは、例えば、哺乳類細胞を宿主細胞として用いて発現させることにより製造できる。すなわち、本発明は、哺乳類細胞を宿主細胞として用いてカブトガニのファクターＣを発現することを含む、カブトガニのファクターＣを製造する方法、を提
供する。同方法を、「本発明の製造法」ともいう。本発明の製造法により製造され得るファクターＣは、本発明のファクターＣの一態様である。
【００３８】
哺乳類細胞は、カブトガニのファクターＣを機能的に（functionally）発現することができる限り、特に制限されない。「機能的に発現する」とは、発現されたファクターＣが、ファクターＣの活性を示すことをいう。具体的には、哺乳類細胞は、ＣＯＳ−１細胞以外の哺乳類細胞であってよい。哺乳類細胞は、げっ歯類および霊長類からなる群より選択される哺乳動物の細胞であるのが好ましい。げっ歯類としては、特に制限されないが、チャイニーズハムスター、ハムスター、マウス、ラット、モルモットが挙げられる。これらの中では、チャイニーズハムスターが好ましい。チャイニーズハムスターの細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株（ＣＨＯ）が挙げられる。ＣＨＯとしては、ＣＨＯ  ＤＧ４４やＣＨＯ  Ｋ１が挙げられる。霊長類としては、特に制限されないが、ヒト、サル、チンパンジーが挙げられる。霊長類は、サル以外の霊長類であってもよい。これらの中では、ヒトが好ましい。ヒトの細胞としては、ヒト胎児腎細胞由来細胞株（ＨＥＫ）が挙げられる。ＨＥＫとしては、ＨＥＫ２９３が挙げられる。
【００３９】
哺乳類細胞は、ファクターＣをコードする遺伝子を保持することにより、ファクターＣを発現できる。哺乳類細胞において、ファクターＣをコードする遺伝子は、同細胞で機能するプロモーターの制御下で発現可能に保持されていればよい。哺乳類細胞において、ファクターＣをコードする遺伝子は、例えば、プラスミドのように染色体外で自律複製するベクター上に存在していてもよく、染色体上に導入されていてもよい。ファクターＣをコードする遺伝子を哺乳類細胞に導入する手法は特に制限されない。染色体外で自律複製するベクターとしては、例えば、pCA7 (Makoto Takeda, et al., J. Viol. 79(22): 14346-54 (2005)) が挙げられる。また、例えば、pCI-neoベクター（Promega社）を用いて、ファクターＣをコードする遺伝子を哺乳類細胞の染色体上に導入できる。哺乳類細胞は、ファクターＣをコードする遺伝子を、１コピーのみ有していてもよく、２コピーまたはそれ以上有していてもよい。
【００４０】
哺乳類細胞を培養する際の培養条件は、哺乳類細胞が増殖できる限り特に制限されず、哺乳類細胞の培養に通常用いられる条件を、必要により適宜修正して用いることができる。培地としては、例えば、哺乳類細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。具体的には、例えば、RPMI1640培地（Sigma社）やDMEM培地（Sigma社）を用いることができる。培養は、例えば、３６℃〜３８℃で、５％ＣＯ２供給下で静置培養により行うことができる。
【００４１】
機能的なファクターＣが発現したことは、ファクターＣの活性を測定することにより確認できる。また、ファクターＣが発現したことは、ファクターＣをコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することや、抗体を用いてウエスタンブロットによりファクターＣを検出することでも確認できる。
【００４２】
発現したファクターＣは、ファクターＣを含有する溶液として回収し、本発明のエンドトキシン測定剤の成分として利用できる。ファクターＣを含有する溶液とは、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等でありうる。ファクターＣは、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずに用いてもよい。本発明では、ファクターＣを精製することなく、発現されたファクターＣを含有する細胞培養上清液をそのまま用いても、十分なエンドトキシン測定能が得られる。ファクターＣの精製は、例えばタンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。また、ファクターＣに、Ｈｉｓタグ等のタグを付加している場合には、当該タグ
に対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーによりファクターＣを精製することもできる。また、ファクターＣを含有する溶液は、例えば、フィルターろ過して用いてもよい。フィルターとしては、例えば、0.22μmのフィルターを用いることができる。
【００４３】
（３）本発明のエンドトキシン測定剤
本発明のファクターＣは、エンドトキシンの測定に利用できる。すなわち、本発明は、本発明のファクターＣを含むエンドトキシン測定剤を提供する。同エンドトキシン測定剤を、「本発明のエンドトキシン測定剤」ともいう。本発明のエンドトキシン測定剤は、エンドトキシンの測定態様に応じて、さらに、ファクターＣ以外の因子を含んでいてもよい。
【００４４】
例えば、本発明のファクターＣは、ファクターＢおよびプロクロッティングエンザイムと組み合わせて、エンドトキシンの測定に利用できる。すなわち、本発明のエンドトキシン測定剤の一態様は、本発明のファクターＣ、ファクターＢ、およびプロクロッティングエンザイムを含む、エンドトキシン測定剤である。この場合、カスケード反応の最終産物であるクロッティングエンザイムを検出することにより、エンドトキシンを測定できる。本発明のエンドトキシン測定剤の一態様に含まれるファクターＢおよびプロクロッティングエンザイムを、それぞれ本発明のファクターＢおよび本発明のプロクロッティングエンザイムともいう。
【００４５】
一方、カスケード反応の途中段階を検出することにより、エンドトキシンを測定することもできる。この場合、本発明のエンドトキシン測定剤は、当該途中段階までに関与する因子を含んでいればよい。具体的には、例えば、カスケード反応の中間産物である活性型ファクターＣを検出することによりエンドトキシンを測定する場合、本発明のエンドトキシン測定剤は、ファクターＣを含んでいればよい。
【００４６】
本発明のファクターＢは、カブトガニ由来のファクターＢである。また、本発明のプロクロッティングエンザイムは、カブトガニ由来のプロクロッティングエンザイムである。カブトガニとしては、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス（Tachypleus tridentatus）、アメリカ産カブトガニであるリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）、東南アジア産（シンガポール産）カブトガニであるカルシノスコルピウス・ロツンディカウダ（Carcinoscorpius rotundicauda）、東南アジア産カブトガニであるタキプレウス・ギガス（Tachypleus gigas）が挙げられる。これらの中では、日本産カブトガニであるタキプレウス・トリデンタツス由来であるのが好ましい。
【００４７】
タキプレウス・トリデンタツスのファクターＢ、プロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号６、８に示す。また、タキプレウス・トリデンタツスのファクターＢ、プロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子の塩基配列をそれぞれ配列番号５、７に示す。
【００４８】
本発明のファクターＢは、ファクターＢの活性を有する限り、上記各種カブトガニのファクターＢ、例えば配列番号６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。バリアントには、例えば、上記ファクターＢのホモログや人為的な改変体が含まれる。また、本発明のファクターＢをコードする遺伝子は、上記のような本発明のファクターＢをコードする限り特に制限されない。ファクターＢやそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述のファクターＣやそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
【００４９】
ファクターＢの活性とは、活性型ファクターＣの存在下で活性型となり、プロクロッテ
ィングエンザイムを活性型であるクロッティングエンザイムに変化させる活性をいう。「ファクターＢの活性を有する」ことは、例えば、本発明のファクターＢを、好適なファクターＣおよび好適なプロクロッティングエンザイムと組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。具体的には、好適なファクターＣとして配列番号２のタンパク質を、好適なプロクロッティングエンザイムとして配列番号８のタンパク質を使用できる。カスケード反応の進行は、後述する検出用基質を用いて測定できる。
【００５０】
本発明のプロクロッティングエンザイムは、プロクロッティングエンザイムの活性を有する限り、上記各種カブトガニのプロクロッティングエンザイム、例えば配列番号８に示すアミノ酸配列を有するタンパク質のバリアントであってもよい。バリアントには、例えば、上記プロクロッティングエンザイムのホモログや人為的な改変体が含まれる。また、本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、上記のような本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする限り特に制限されない。プロクロッティングエンザイムやそれをコードする遺伝子のバリアントについては、上述のファクターＣやそれをコードする遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
【００５１】
プロクロッティングエンザイムの活性とは、活性型ファクターＢの存在下で活性型であるクロッティングエンザイムとなり、後述する検出用基質と反応する活性をいう。検出用基質と反応する活性とは、例えば、コアギュローゲンと反応し凝固を引き起こす活性や、後述する一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは保護基、Ｙはペプチド、ＺはＹとアミド結合した色素である）で表される基質と反応し色素Ｚを遊離させる活性（例えば、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐＮＡと反応しｐＮＡを遊離させる活性）をいう。「プロクロッティングエンザイムの活性を有する」ことは、例えば、本発明のプロクロッティングエンザイムを、好適なファクターＣおよび好適なファクターＢと組み合わせた際に、エンドトキシンの存在下でカスケード反応の進行を検出することにより確認できる。具体的には、好適なファクターＣとして配列番号２のタンパク質を、好適なファクターＢとして配列番号６のタンパク質を使用できる。カスケード反応の進行は、後述する検出用基質を用いて測定できる。
【００５２】
本発明のファクターＢおよび／または本発明のプロクロッティングエンザイムは、それぞれファクターＢの活性、プロクロッティングエンザイムの活性を有する限り、任意のペプチド等が付加されていてもよい。そのようなペプチドとしては、ＨｉｓタグやＶ５タグ等のタグ配列が挙げられる。また、本発明のファクターＢおよび／または本発明のプロクロッティングエンザイムは、本発明のファクターＣと同様に、Ｃ末端にＨｉｓタグが付加されていないもの、Ｃ末端にＶ５タグが付加されていないもの、Ｃ末端にペプチドが一切付加されていないもの、Ｎ末端にペプチドが一切付加されていないもの、または両末端ともペプチドが一切付加されていないものであってもよい。
【００５３】
また、本発明のファクターＢをコードする遺伝子および／または本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。例えば、本発明のファクターＢをコードする遺伝子および／または本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせを宿主細胞での発現に最適化するよう変更してもよい。配列番号６のファクターＢをコードし、且つコドンの組み合わせが昆虫細胞での発現に最適化されたＤＮＡとしては、配列番号９のＤＮＡが挙げられる。なお、本発明のファクターＢをコードする遺伝子および／または本発明のプロクロッティングエンザイムをコードする遺伝子は、コドンの組み合わせが宿主細胞での発現に最適化されたＤＮＡのバリアントであってもよい。
【００５４】
本発明のファクターＢおよび本発明のプロクロッティングエンザイムは、それぞれ、天
然に得られるものであってもよく、組換えタンパク質であってもよい。
【００５５】
天然のファクターＢおよび天然のプロクロッティングエンザイムは、それぞれ、上記各種カブトガニの血球抽出液から取得することができる。これらの因子は、所望の程度に精製して用いることができる。精製は、例えば、公知の手法（Nakamura T. et al., J Biochem. 1986 Mar; 99(3): 847-57.）により行うことができる。
【００５６】
また、組換えファクターＢおよび組換えプロクロッティングエンザイムは、それぞれ、宿主細胞に発現させることで取得できる。宿主細胞は、各因子を発現できる限り特に制限されない。宿主細胞としては、例えば、異種タンパク質の発現に通常用いられるものを利用できる。宿主細胞としては、例えば、昆虫細胞、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞が挙げられる。これらの中では、翻訳後修飾の観点から真核細胞が好ましく、具体的には、昆虫細胞や動物細胞がより好ましい。
【００５７】
動物細胞としては、例えば、哺乳類細胞が挙げられる。哺乳類細胞等の動物細胞を用いる場合、上述した本発明のファクターＣの製造についての記載を、ファクターＢおよびプロクロッティングエンザイムの製造にも準用できる。
【００５８】
昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21、SF+、High-Fiveが挙げられる。昆虫細胞としては、Sf9が好ましい。
【００５９】
昆虫細胞を宿主細胞として用いて各因子を発現する手法は、各因子を発現できる限り特に制限されず、異種タンパク質の発現に通常用いられる手法を好適に利用できる。例えば、各因子をコードする遺伝子を組み込んだウイルスを昆虫細胞に感染させることで各因子を発現させることができる（「ウイルス法」ともいう）。また、各因子をコードする遺伝子を組み込んだベクターを昆虫細胞に導入し、宿主細胞の染色体上に当該遺伝子を組み込むことで各因子を発現させることができる（「安定発現細胞株法」ともいう）。
【００６０】
＜ウイルス法＞
ウイルス法に用いるウイルスは、昆虫細胞に感染し各因子を発現させることができる限り特に制限されず、昆虫細胞でのタンパク質の発現に通常用いられるものを好適に利用できる。そのようなウイルスとしては、バキュロウイルス（Baculovirus）が挙げられる。バキュロウイルスとしては、核多角体病ウイルス（Nucleopolyhedrovirus；NPV）が好ましい。ＮＰＶとしては、ＡｃＮＰＶ（Autographa californica NPV）、ＢｍＮＰＶ（Bombyx mori NPV）が挙げられる。ＮＰＶとしては、ＡｃＮＰＶが好ましい。
【００６１】
ウイルスへの核酸の導入は常法により行うことができ、例えば、トランスファーベクターを用いた相同的組換えにより行うことができる。トランスファーベクターとしては、pPSC8（プロテインサイエンス（Protein Sciences）社）、pFastBac（Life technologies corporation）、pVL1393（ファーミンジェン（Pharmingen）社）が挙げられる。トランスファーベクターとしては、pPSC8が好ましい。
【００６２】
各因子をコードする遺伝子を組み込んだウイルスを常法により昆虫細胞に感染させることで、当該ウイルスを保持し、各因子を発現する昆虫細胞が得られる。
【００６３】
＜安定発現細胞株法＞
各因子をコードする遺伝子を昆虫細胞の染色体上に組み込むことで、各因子を安定に発現する安定発現細胞株が得られる。安定発現細胞株の構築手法は、特に制限されず、常法により行うことができる。例えば、pIZ-V5（Life Technologies Corporation）を用いて、マニュアルに従って安定発現細胞株を構築することができる。
【００６４】
昆虫細胞を培養する際の培養条件は、昆虫細胞が増殖できる限り特に制限されず、昆虫細胞の培養に通常用いられる条件を、必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培地としては昆虫細胞の培養に通常用いられる培地を用いることができる。そのような培地としては、例えば市販の昆虫細胞用の無血清培地が挙げられる。具体的には、Sf900III無血清培地（Life Technologies Corporation）等を好適に用いることができる。培養は、例えば、２７℃〜２８℃で、振とう培養により行うことができる。
【００６５】
各因子が発現しているかどうかは、各因子の活性を測定することにより確認できる。また、各因子が発現しているかどうかは、各因子をコードする遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量を測定することや、抗体を用いてウエスタンブロットにより各因子を検出することでも確認できる。
【００６６】
発現した各因子は、当該各因子を含有する溶液として回収し、本発明のエンドトキシン測定剤の成分として利用できる。各因子を含有する溶液とは、例えば、培養液、培養上清、細胞破砕抽出物、またはそれらの混合物等でありうる。各因子は、所望の程度に精製して用いてもよく、精製せずに用いてもよい。本発明では、各因子を精製することなく、発現された各因子を含有する細胞培養上清液をそのまま用いても、十分なエンドトキシン測定能が得られる。各因子を精製する場合には、各因子の精製は、例えばタンパク質の精製に用いられる公知の方法により行うことができる。そのような方法としては、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等が挙げられる。また、各因子に、Ｈｉｓタグ等のタグを付加している場合には、当該タグに対する親和性を利用したアフィニティークロマトグラフィーにより各因子を精製することもできる。また、各因子を含有する溶液は、例えば、フィルターろ過して用いてもよい。フィルターとしては、例えば、0.22μmのフィルターを用いることができる。
【００６７】
なお、各因子がウイルス法により製造された場合には、ウイルスの除去を行うことが好ましい。ウイルスを除去する手法は特に制限されず常法により行うことができる。例えば、ポアサイズ５００ｋＤａの中空糸濾過膜によりウイルスを除去することができる。
【００６８】
本発明において、本発明のファクターＣ、本発明のファクターＢ、および本発明のプロクロッティングエンザイムは、因子毎に発現細胞を構築しそれぞれ別個に発現させてよい。
【００６９】
本発明のエンドトキシン測定剤は、例えば、本発明のファクターＣのみを含有していてもよく、本発明のファクターＣ、本発明のファクターＢ、および本発明のプロクロッティングエンザイムのみを含有していてもよい。
【００７０】
本発明のエンドトキシン測定剤は、カスケード反応の進行を検出するための基質を含有してもよい。本発明において、そのような基質を検出用基質という場合がある。
【００７１】
検出用基質としては、コアギュローゲンが挙げられる。コアギュローゲンは、カスケード反応の最終産物であるクロッティングエンザイムの検出基質である。コアギュローゲンとクロッティングエンザイムが接触することで、コアギュリンとして凝固する。凝固反応の進行は反応液の濁度を測定することで測定することができる。コアギュローゲンはカブトガニ血球抽出液（ライセート）から回収することができる。また、コアギュローゲンをコードする遺伝子の塩基配列は明らかになっており（宮田ら、蛋白質  核酸  酵素  別冊
No.29; P30-43; 1986）、常法に従い遺伝子工学的に生産することもできる。
【００７２】
また、検出用基質としては、合成基質を用いてもよい。合成基質は、カスケード反応の検出に好適な性質を有する限り特に制限されない。「カスケード反応の検出に好適な性質」としては、クロッティングエンザイムの存在を検出するための性質や、カスケード反応の途中段階を検出するための性質が挙げられる。「クロッティングエンザイムの存在を検出するための性質」としては、クロッティングエンザイムの触媒反応により発色する性質や、クロッティングエンザイムの触媒反応により蛍光を発する性質が挙げられる。「カスケード反応の途中段階を検出するための性質」としては、活性型ファクターＣ等のカスケード反応の中間産物の触媒反応により発色する性質や、活性型ファクターＣ等のカスケード反応の中間産物の触媒反応により蛍光を発する性質が挙げられる。合成基質としては、例えば、一般式Ｘ−Ｙ−Ｚ（式中、Ｘは保護基、Ｙはペプチド、ＺはＹとアミド結合した色素である）で表される基質が挙げられる。反応系にエンドトキシンが存在する場合には、カスケード反応の結果として生ずるクロッティングエンザイムまたは中間産物の触媒反応によりＹ−Ｚ間のアミド結合が切断され、色素Ｚが遊離して発色する、あるいは蛍光を発する。保護基Ｘとしては、特に制限されず、ペプチドの公知の保護基を好適に用いることができる。そのような保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基が挙げられる。色素Ｚは、特に制限されず、例えば、可視光下で検出される色素であってもよく、蛍光色素であってもよい。色素Ｚとしては、ｐＮＡ（パラニトロアニリン）、ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）、ＤＮＰ（２，４−ジニトロアニリン）、Ｄａｎｓｙｌ（ダンシル）系色素が挙げられる。ペプチドＹとしては、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＬＧＲ）、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（ＩＥＧＲ）（配列番号１０）、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＶＰＲ）、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＤＰＲ）が挙げられる。合成基質としては、エンドトキシンの測定態様に応じて、クロッティングエンザイムまたは中間産物と反応するものを適宜選択して利用することができる。例えば、基質特異性の点からは、ペプチドＹとしてＬＧＲを含む基質はクロッティングエンザイムの検出に好適に用いることができ、ペプチドＹとしてＶＰＲまたはＤＰＲを含む基質は活性型ファクターＣの検出に好適に用いることができる。遊離した色素Ｚは、色素の性質に応じた手法により測定すればよい。
【００７３】
また、本発明のエンドトキシン測定剤は、エンドトキシンの測定に用いることができる限り、各因子や検出用基質以外の成分を含有していてもよい。そのような成分は、保存性、取扱い易さ、各因子や検出用基質の安定性などを考慮して選定すればよく、特に限定されるものではない。
【００７４】
また、本発明のエンドトキシン測定剤は、固体状、液体状、ゲル状等の任意の形態で製剤化されていてもよい。製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、希釈剤、又は溶剤等の添加剤などを使用することができる。本発明のエンドトキシン測定剤は、そのまま、あるいは水、生理食塩水、または緩衝液等を用いて希釈、分散、又は溶解し、エンドトキシンの測定に利用できる。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明のエンドトキシン測定剤の範囲に含まれることは言うまでもない。
【００７５】
本発明のエンドトキシン測定剤において、各因子やその他の成分は、混合して存在していてもよく、それぞれ別個に存在していてもよい。例えば、各因子は、任意の比率で混合され製剤化されていてもよく、それぞれ別個に製剤化されていてもよい。
【００７６】
本発明のエンドトキシン測定剤における各因子やその他の成分の濃度は特に制限されないが、エンドトキシンを測定する際に、後述する好ましい濃度範囲に収まるよう調整されるのが好ましい。本発明のエンドトキシン測定剤（被験試料に接触させる前に溶液にしたもの）における各因子の濃度は、例えば、５〜２００μg／mLであってよく、２０〜１００μg／mLであるのが好ましく、４０〜８０μg／mLであるのがより好ましく、約６０μg
／mLであるのが特に好ましい。また、各因子の製造方法に応じて、本発明のエンドトキシン測定剤における各因子の濃度を設定してもよい。例えば、本発明のエンドトキシン測定剤（被験試料に接触させる前に溶液にしたもの）における、げっ歯類の細胞を宿主細胞として用いて製造したファクターＣの濃度は、例えば、５〜２００μg／mL、１０〜５０μg／mL、または１５〜４０μg／mLであってもよい。また、例えば、本発明のエンドトキシン測定剤（被験試料に接触させる前に溶液にしたもの）における、霊長類の細胞を宿主細胞として用いて製造したファクターＣの濃度は、例えば、５〜２００μg／mL、５０〜１５０μg／mL、または８０〜１２０μg／mLであってもよい。なお、上記例示した濃度は、例えば、上記例示したような手法により各因子を発現させて得られた培養上清をフィルター濾過して得られたろ液中のタンパク質が全て目的の因子であると仮定して算出したものであってもよい。
【００７７】
本発明のエンドトキシン測定剤は、エンドトキシン測定用キットとして提供することができる。エンドトキシン測定用キットは、本発明のエンドトキシン測定剤を含む限り特に制限されない。エンドトキシン測定用キットは、例えば、エンドトキシン標品、反応用容器（例えば、チューブやマイクロプレート）、マニュアル等から選択される１またはそれ以上の構成要素を含んでいてよい。
【００７８】
（４）本発明のエンドトキシン測定法
本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合することにより、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にはカスケード反応が進行する。カスケード反応の進行を測定することにより、被験試料中のエンドトキシンを測定することができる。すなわち、本発明は、本発明のエンドトキシン測定剤と被験試料とを混合する工程、およびカスケード反応の進行を測定する工程を含む、被験試料中のエンドトキシンを測定する方法を提供する。同方法を、「本発明のエンドトキシン測定法」ともいう。
【００７９】
本発明のエンドトキシン測定法の一態様（以下、「第１の態様」ともいう）においては、全ての因子が被験試料と混合される。第１の態様において、本発明のエンドトキシン測定剤に含まれる各因子は、本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程の当初から反応系に含まれていてもよく、逐次反応系に添加されてもよい。
【００８０】
例えば、本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程は、以下の工程（Ａ）〜（Ｃ）を含んでいてもよい。
（Ａ）本発明のファクターＣを反応系に添加する工程。
（Ｂ）本発明のファクターＢを反応系に添加する工程。
（Ｃ）本発明のプロクロッティングエンザイムを反応系に添加する工程。
【００８１】
工程（Ａ）〜（Ｃ）は別個に行われてもよく、一部同時に行われてもよく、全て同時に行われてもよい。工程（Ａ）〜（Ｃ）は任意の順番で行われてよい。例えば、工程（Ａ）の後に工程（Ｂ）が行われ、工程（Ｂ）の後に工程（Ｃ）が行われてもよい。
【００８２】
第１の態様において、カスケード反応の進行は、検出用基質を反応系に添加し、当該基質の反応（発色や凝固等）を測定することで測定できる。検出用基質は、本発明のエンドトキシン測定剤を被験試料と混合する工程の当初から反応系に含まれていてもよく、当該工程の進行中または完了後に反応系に添加されてもよい。本発明のエンドトキシン測定剤として、検出用基質を予め含有しているものを用いる場合も、当然、第１の態様に包含される。
【００８３】
なお、本発明のエンドトキシン測定法において、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り、本発明のファクターＢおよびプロクロッティング
エンザイム自体は、被験試料と接触しなくともよい。すなわち、本発明のエンドトキシン測定法の別の態様（以下、第２の態様ともいう）は、以下の工程（Ａ）〜（Ｄ）を含む被験試料中のエンドトキシン測定法である。
（Ａ）本発明のファクターＣと被験試料とを混合する工程。
（Ｂ）本発明のファクターＢと、工程Ａの混合後のファクターＣとを混合する工程。
（Ｃ）本発明のプロクロッティングエンザイムと、工程Ｂの混合後のファクターＢとを混合する工程。
（Ｄ）カスケード反応の進行を測定する工程。
【００８４】
第２の態様において、工程（Ａ）〜（Ｄ）は別個に進行してもよく、一部同時に進行してもよく、全て同時に進行してもよい。例えば、工程Ａを開始し、当該工程の進行中または完了後にファクターＢやプロクロッティングエンザイムを反応系に添加してもよい。また、工程Ｂを開始し、当該工程の進行中または完了後にプロクロッティングエンザイムを反応系に添加してもよい。また、工程Ａの当初から３種の因子全てが反応系に含まれていてもよい。また、例えば、工程Ａの接触後のファクターＣを回収して工程Ｂに用いてもよく、工程Ｂの接触後のファクターＢを回収して工程Ｃに用いてもよい。
【００８５】
第２の態様において、カスケード反応の進行は、検出用基質を反応系に添加し、当該基質の反応（発色や凝固等）を測定することで測定できる。検出用基質は、工程Ａの当初から反応系に含まれていてもよく、各工程の進行中または完了後に反応系に添加されてもよい。
【００８６】
また、カスケード反応の途中段階を検出することにより、エンドトキシンを測定することもできる。具体的には、例えば、カスケード反応の中間産物である活性型ファクターＣを検出することにより、エンドトキシンを測定することができる。すなわち、本発明のエンドトキシン測定法の別の態様（以下、第３の態様ともいう）は、例えば、本発明のファクターＣと被験試料とを混合する工程、および活性型ファクターＣを検出する工程を含む、被験試料中のエンドトキシン測定法であってよい。第３の態様において、活性型ファクターＣの検出は、検出用基質を反応系に添加し、当該基質の反応（発色等）を測定することで行うことができる。検出用基質は、本発明のファクターＣを被験試料と混合する工程の当初から反応系に含まれていてもよく、当該工程の進行中または完了後に反応系に添加されてもよい。
【００８７】
本発明のエンドトキシン測定法は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り、その他の任意の工程を含んでいてよい。例えば、本発明のエンドトキシン測定法は、反応系に検出用基質を添加する工程、あるいは、カスケード反応により生じたクロッティングエンザイムまたは中間産物と検出用基質とを混合する工程を含んでいてもよい。また、例えば、本発明のエンドトキシン測定法は、検出用基質の反応に基づき、被験試料中のエンドトキシン量を算出する工程を含んでいてもよい。
【００８８】
本発明のエンドトキシン測定法において、反応は水あるいは緩衝液等の水性溶媒中で行われるのが好ましい。
【００８９】
本発明のエンドトキシン測定法において、反応液中での各因子の濃度は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、各因子の性質等に応じて適宜設定することができる。例えば、各因子の濃度は、終濃度で、例えば、２．５〜１００μg／mLであってよく、１０〜５０μg／mLであるのが好ましく、２０〜４０μg／mLであるのがより好ましく、約３０μg／mLであるのが特に好ましい。また、各因子の製造方法に応じて、反応液中での各因子の濃度を設定してもよい。例えば、げっ歯類の細胞を宿主細胞として用いて製造したファクターＣの濃度は、終濃度で、例えば、２
．５〜１００μg／mL、５〜２５μg／mL、または７．５〜２０μg／mLであってもよい。また、例えば、霊長類の細胞を宿主細胞として用いて製造したファクターＣの濃度は、終濃度で、例えば、２．５〜１００μg／mL、２５〜７５μg／mL、または４０〜６０μg／mLであってもよい。なお、上記例示した濃度は、例えば、上記例示したような手法により各因子を発現させて得られた培養上清をフィルター濾過して得られたろ液中のタンパク質が全て目的の因子であると仮定して算出したものであってもよい。
【００９０】
本発明のエンドトキシン測定法において、反応液中での検出用基質の濃度は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、検出用基質の性質等に応じて適宜設定することができる。例えば、検出用基質が合成基質である場合には、検出用基質の濃度は、終濃度で、例えば通常０．００１ｍＭ〜１００ｍＭであり、０．０１ｍＭ〜１０ｍＭであるのが好ましい。
【００９１】
いずれの態様においても、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り、反応系には、各因子、検出用基質、および被験試料以外に、任意の成分が含まれていてもよい。
【００９２】
反応液のｐＨは、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、各因子の性質に応じて適宜設定することができる。反応液のｐＨは、例えば、通常ｐＨ５〜１０であり、好ましくは７〜８．５である。
【００９３】
反応温度は、被験試料にエンドトキシンが含まれる場合にカスケード反応が進行する限り特に限定されず、各因子の性質に応じて適宜設定することができる。反応温度は例えば通常１０℃〜８０℃であり、好ましくは２０℃〜５０℃である。例えば、反応温度は３７℃であってもよい。
【００９４】
反応時間は特に限定されず、各因子の性質や反応温度等の諸条件に応じて適宜設定すればよい。反応時間は例えば通常５分〜２時間であり、好ましくは１５分〜９０分である。例えば、反応時間は３０分〜４０分であってもよい。
【００９５】
いずれの態様においても、反応の過程において、被験試料、各因子、およびその他の成分を単独で、あるいは任意の組み合わせで追加的に反応系に添加してもよい。これらの成分は１回または複数回添加されてもよく、連続的に添加されてもよい。また、反応開始から反応終了まで均一の条件を用いてもよく、反応の過程において条件を変化させてもよい。
【００９６】
検出用基質の反応（発色や凝固等）を測定することで、エンドトキシンの存在に基づくカスケード反応の進行を測定することができ、被験試料中のエンドトキシンを測定することができる。検出用基質の反応（発色や凝固等）は、用いた検出用基質に応じた手法により測定すればよい。
【００９７】
エンドトキシンの測定を定量的に行う場合には、濃度既知のエンドトキシン標準試料を用いてエンドトキシン量と検出用基質の反応の程度（発色や凝固等の程度）との間の相関データを取得し、当該相関データに基づき被験試料に存在するエンドトキシンを定量すればよい。相関データとは、例えば検量線である。定量はカイネティック法により行ってもよく、エンドポイント法によって行ってもよい。
【００９８】
エンドトキシンの測定を行うことのできる被験試料としては、特に制限されず、医療用水、医薬品、輸液、血液製剤、医療機器、医療器具、化粧品、飲食品、環境試料（例えば、空気、河川、土壌）、生体成分（例えば、血液、体液、組織）、天然のタンパク質、組
換えタンパク質、核酸、糖質等が挙げられる。被験試料は、例えば、注射剤であってよい。注射剤とは、生体内に注射によって投与され得るものをいう。注射剤は、市場流通時に液体である必要はなく、凍結乾燥品であってもよい。被験試料は、それ自体を、あるいはその抽出物や洗浄液を反応系に混合、分散、又は溶解し、エンドトキシンの測定に供することができる。
【００９９】
また、上述の通り、本発明のファクターＣは、イオンによる活性阻害を受けにくい性質を有していてもよい。よって、本発明の一態様においては、イオンを含有する被験試料中のエンドトキシンの測定を好適に行うことができる。
【０１００】
すなわち、被験試料は、イオンを含有する被験試料であってよい。「イオンを含有する」とは、被験試料が、エンドトキシンの測定時にイオンとして存在する物質を含有していることをいう。すなわち、ここでいう「イオン」とは、もともとイオン化した状態で被験試料中に含有されているものであってもよく、もともとは塩の状態で被験試料中に含有されているがエンドトキシンの測定時にはイオン化しているものであってもよい。イオンの種類は特に制限されない。イオンとしては、例えば、カチオンが挙げられる。カチオンとしては、例えば、金属イオンが挙げられる。金属イオンとしては、例えば、アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンが挙げられる。アルカリ金属イオンおよびアルカリ土類金属イオンとして、具体的には、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオンが挙げられる。被験試料におけるイオンの含有量は、例えば、被験試料に由来するカチオンの濃度が、被験試料とエンドトキシン測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上となるような量であってよい。塩として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム、塩化カルシウム、塩化カリウム、イオタラム酸ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムが挙げられる。被験試料における塩の含有量は、例えば、被験試料に由来する塩の濃度が、被験試料とエンドトキシン測定剤とを混合した後の反応系における終濃度として、１ｍＭ以上、２ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、または１００ｍＭ以上となるような量であってよい。被験試料は、１種のイオン（または塩）を含有していてもよく、２種またはそれ以上のイオン（または塩）を含有していてもよい。
【実施例】
【０１０１】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の例示であり、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。
【０１０２】
１．ファクターＣタンパク質の調製
（１）昆虫細胞（Sf9）によるファクターＣの発現
本項では、昆虫細胞であるSf9を宿主細胞として用いて、以下の手順により、ファクターＣを調製した。
【０１０３】
日本産カブトガニTachypleus tridentatusのファクターＣをコードするDNAを、昆虫細胞用の発現ベクターであるpIZ-V5（Life Technologies Corporation）のEcoRVとMluI認識部位の間に挿入し、ファクターＣ発現プラスミドを作製した。同ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に、同ＤＮＡにコードされるファクターＣのアミノ酸配列を配列番号２に示す（以下、本実施例において同じ）。
【０１０４】
ファクターＣ発現プラスミドを、セルフェクチン試薬（Life Technologies Corporation）を使ったトランスフェクションにより、Sf9培養細胞に導入した。Sf9を、300-600 μg/mLのZeocin（Life Technologies Corporation）を含むSf900III無血清培地（Life Techn
ologies Corporation）で、28℃で静置培養し、発現プラスミドがゲノム上に導入されたSf9を選択した。
【０１０５】
ファクターＣ遺伝子を安定発現しているSf9の候補をクローニングシリンダー法で単離し、複数のSf9細胞株をクローン化した。得られたクローンをそれぞれ培養し、培養上清を得た。培養上清中への組換えファクターＣタンパク質の分泌を、抗ファクターＣ抗体（2C12抗体；Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481 (1992)）を用いたウエスタンブロット法により確認した。また、培養上清のファクターＣ活性（エンドトキシンによる活性化能）を合成基質Boc-LGR-pNAを用いた活性測定により確認した。なお、活性測定の手順は、「４．活性測定」に後述する通りである（以下、本実施例において同じ）。ウエスタンブロット及び活性測定の結果に基づき、ファクターＣ高発現Sf9細胞株を選抜した。
【０１０６】
ファクターＣ高発現Sf9細胞株を、1xペニシリン/ストレプトマイシン（Life Technologies Corporation）と50μg/mLゼオシンを含んだSf900III培地で対数増殖期後半（6-8x10^6 cells/mL）まで浮遊培養（28℃）し、遠心分離（3,000xg、30分、4℃）により培養上清を得た。培養上清を0.22μmのフィルターでろ過し、得られた画分（ろ液）を組換えファクターＣ（Sf9）とした。
【０１０７】
（２）哺乳類細胞（CHO DG44）によるファクターＣの発現
本項では、チャイニーズハムスター卵巣由来細胞株であるCHO DG44を宿主細胞として用いて、以下の手順により、ファクターＣを調製した。
【０１０８】
日本産カブトガニTachypleus tridentatusのファクターＣをコードするDNAを、哺乳類細胞用の発現ベクターであるpCI-neo (Promega) のEcoRIとXbaI認識部位の間に挿入し、ファクターＣ発現プラスミドを作製した。この際、ファクターＣの開始コドンの直前にkozak配列（GCCACC）を付加した。
【０１０９】
ファクターＣ発現プラスミドとdhfr発現プラスミドを、リポフェクション試薬（Lipofectamine LTX）（Life Technologies Corporation）を使った同時トランスフェクションにより、CHO DG44培養細胞に導入した。CHO DG44を1mg/mL Geneticin（Life Technologies Corporation）を加えたRPMI1640培地（5% 透析血清、1xペニシリン/ストレプトマイシンを含む）（Sigma）で、37℃、5% CO2供給下で静置培養し、発現プラスミドがゲノム上に導入されたCHO DG44を選択した。
【０１１０】
同時トランスフェクション15日後から、培地にMTX（メトトレキセート）（和光純薬工業）を添加し、50nMから5,000nMまで3ヶ月かけて段階的にMTX濃度を上げて、ファクターＣ高発現CHO DG44細胞株をポリクローンで取得した。導入したファクターＣ遺伝子がMTXの効果で増幅されていることは、2C12抗体を用いたウエスタンブロット法による培養上清中のファクターＣの検出とリアルタイムPCRによるファクターＣのmRNA転写量の定量を行うことにより確認した。
【０１１１】
ポリクローンのファクターＣ高発現CHO DG44細胞群を、0.5 cell/wellになるように培地で希釈し、96 wellプレートに播種した。播種後10-20日頃より、形成された細胞コロニーを順次、拡大培養し、ファクターＣ高発現CHO DG44細胞株のクローン化をおこなった。ファクターＣのmRNA転写量をリアルタイムPCRで、ファクターＣタンパク質の培地への分泌量を2C12抗体を用いたウエスタンブロット法で、培養上清のファクターＣ活性（エンドトキシンによる活性化能）を合成基質Boc-LGR-pNAを用いた活性測定で、それぞれ確認し、モノクローンのファクターＣ高発現CHO DG44細胞株を選抜した。
【０１１２】
ファクターＣ高発現CHO DG44細胞株（モノクローン）を、5μM MTXを含む無血清完全合成培地への馴化を経て浮遊化させた。同株を、37℃、5%CO2供給下、対数増殖後期まで生育させ、浮遊培養液を遠心分離（3,000xｇ、30分、4℃）して培養上清を得た。培養上清を0.22μmのフィルターでろ過し、得られた画分（ろ液）を組換えファクターＣ（CHO）とした。
【０１１３】
（３）哺乳類細胞（HEK293）によるファクターＣの発現
本項では、ヒト胎児腎細胞由来細胞株であるHEK293を宿主細胞として用いて、以下の手順により、ファクターＣを調製した。
【０１１４】
日本産カブトガニTachypleus tridentatusのファクターＣをコードするDNAを、哺乳類細胞用の発現ベクターであるpCA7 (Makoto Takeda, et al., J. Viol. 79(22): 14346-54
(2005)) のEcoRIとXhoI認識部位に挿入し、ファクターＣ発現プラスミドを得た。この際、ファクターＣの開始コドンの直前にkozak配列（GCCACC）を付加した。
【０１１５】
ファクターＣ発現プラスミドを、ポリエチレンイミン（Sigma）を使ったトランスフェクション法（橋口ら, ヒト培養細胞を用いた組換え蛋白質の発現 -293系統細胞によるスタンダードプロトコール-, 蛋白質科学会アーカイブ, 1, e017 (2008), http://www.pssj.jp/archives/Protocol/Expression/293_01/293_01_01.html）により、HEK293培養細胞に導入した。HEK293を、DMEM培地（10% 牛胎児血清、2mM L-グルタミンを含む）（Sigma）で、培地交換せずに、37℃、5%CO2供給下で静置培養した。トランスフェクションから4日後、培養液を回収し、遠心分離（3,300xg、30分、4℃）により培養上清を得た。培養上清を0.22μmのフィルターでろ過し、得られた画分（ろ液）を組換えファクターＣ（HEK）とした。
【０１１６】
（４）天然ファクターＣ（Tachypleus tridentatus血球細胞由来）の調製
日本産カブトガニTachypleus tridentatusの血球細胞抽出液から、ファクターＢとファクターＣを含む画分を、デキストランサルフェート樹脂によるカラムクロマトグラフィー（Takanori Nakamura, et al., Eur. J. Biochem. 154: 511-521 (1986)）により得た。この画分5 mLを、Sepharose CL6Bゲル（GEヘルスケア）を充填したカラム（φ2.2 cmｘ 97ｃｍ）を用いてゲルろ過に供した。ゲルろ過は、公知の手法（Jeak Ling Ding and Bow Ho, US5,712,144; Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156）とほぼ同一の条件で行った。流速は15 mL/時間とし、溶媒には154 mM NaCl、1 mM EDTA、5%
DMSOを含む50 mM Trisバッファー（pH8.0）を使用した。
【０１１７】
ゲルろ過の溶出画分（3.7mL/本、150本）を、SDS-PAGEとCBB染色、2C12抗体を用いたウエスタンブロット法、及び合成基質Boc-LGR-pNAを用いた活性測定に供し、ファクターＣタンパク質を含む画分を同定した。この精製ファクターＣタンパク質を含む画分を天然ファクターＣ（TAL）とした。
【０１１８】
２．組換えファクターＢと組換えプロクロッティングエンザイムの調製
日本産カブトガニTachypleus tridentatusのファクターＢをコードするDNAを、昆虫細胞用の発現ベクターであるpIZ-V5（Life Technologies Corporation）のEcoRVとMluI認識部位の間に挿入し、ファクターＢ発現プラスミドを作製した。同ＤＮＡの塩基配列を配列番号９に、同ＤＮＡにコードされるファクターＢのアミノ酸配列を配列番号６に示す。なお、配列番号９に示す塩基配列は、昆虫細胞での発現に最適化された塩基配列である。
【０１１９】
日本産カブトガニTachypleus tridentatusのプロクロッティングエンザイムをコードするDNAを、昆虫細胞用の発現ベクターであるpIZ-V5（Life Technologies Corporation）のEcoRVとMluI認識部位の間に挿入し、プロクロッティングエンザイム発現プラスミドを作
製した。同ＤＮＡの塩基配列を配列番号７に、同ＤＮＡにコードされるプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列を配列番号８に示す。
【０１２０】
ファクターＣの場合と同様の方法で、発現プラスミドをそれぞれSf9細胞に導入、高発現クローンを選択し、培養上清を調製した。各培養上清を0.22μmのフィルターでろ過し、得られた画分（ろ液）をそれぞれ組換えファクターＢおよび組換えプロクロッティングエンザイムとした。各因子が得られたことは、各因子に対する特異的な抗体を用いたウエスタンブロット法と活性測定によりそれぞれ確認した。
【０１２１】
３．ファクターＣタンパク質の分子量の比較（１）
上記で調製した4種類のファクターＣタンパク質について、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により分子量を比較した。
【０１２２】
まず、それぞれ図２に示す量のファクターＣを、5-20%グラジエントゲルを用いた非還元SDS-PAGEに供した。図中、Sf9、CHO、HEKは、それぞれSf9、CHO DG44、HEK293に発現させたファクターＣを意味し、TALは、天然ファクターＣを意味する（以下、同じ）。なお、ファクターＣは還元条件下でH鎖とL鎖に切断および分離される。本実施例では、インタクト（intact）なファクターＣの分子量を比較するため、非還元条件でSDS-PAGEをおこなった。
【０１２３】
SDS-PAGEの後、PVDF膜（Bio RAD）へセミドライブロッターでタンパク質を転写した。PVDF膜を回収し、5%スキムミルクでブロッキングした後、一次抗体（2C12抗体）、二次抗体（HRP-標識抗マウス-ヤギ抗体）（Dako）の順で処理した。次いで、検出試薬 SuperSignal West Dura（Thermo Scientific）でファクターＣのバンドを発光させ、CCDカメラで記録した。
【０１２４】
4種類のファクターＣはそれぞれ分子量が異なり、CHO、TAL、HEK、Sf9の順に大きかった（図２）。
【０１２５】
シンガポール産カブトガニ（Carcinoscorpius rotundicauda）について、血球細胞抽出液から精製した天然ファクターＣタンパク質、昆虫細胞であるSf9、S2、およびアフリカミドリザルの腎細胞由来細胞株であるCOS-1のそれぞれを宿主細胞として用いて作製した組換えファクターＣタンパク質の分子量は、全て132 kDaであると報告されている（天然ファクターＣタンパク質についてJeak Ling Ding and Bow Ho, US5,712,144; Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156 (1993)、Sf9およびS2についてJing
Wang, et al., J. Biol. Chem. 277(39): 36363-72 (2002)、COS-1についてRoopashree S. Dwarakanath, et al., Biotechnology letters 19(4): 357-361 (1997)）。
【０１２６】
そこで、上記で調製した4種類のファクターＣの内、CHOおよびTALについて、分子量の正確な測定を行った。まず、天然ファクターＣ（TAL）と同じ手法で、組換えファクターＣ（CHO）を精製した。次いで、公知の手法（Jeak Ling Ding and Bow Ho, US5,712,144;
Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156）と同一の条件で電気泳動（15%ゲル、LMW Marker kit（GEヘルスケア））を行い、Ferguson plotにより各ファクターＣの分子量を決定した。その結果、組換えファクターＣ（CHO）の分子量は126 kDa、天然ファクターＣ（TAL）の分子量は123 kDaであった（図３）。すなわち、日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の天然ファクターＣ（TAL）および組換えファクターＣ（CHO）の分子量は、いずれも、シンガポール産カブトガニCarcinoscorpius rotundicauda由来のファクターＣの分子量（132 kDa）よりも小さいことが判明した。
【０１２７】
なお、上記で調製した4種類のファクターＣの分子量の違いは、宿主細胞の種類に応じ
た翻訳後修飾（糖鎖修飾）の差によるものと考えられる。例えば、哺乳類細胞では翻訳後のN型糖鎖にシアル酸が結合するため、哺乳類細胞で作製した組換えタンパク質は、昆虫細胞で作製した組換えタンパク質よりもサイズが大きくなることが知られており（Robert
L. Harrison and Donald L. Jarvis, Methods in Molecular Biology 338: 341-356 (2007)）、このことは本実施例の結果（図２）と一致する。
【０１２８】
４．活性測定
上記で調製した4種類のファクターＣのそれぞれを、他の因子と組み合わせて、以下の手順で活性測定を行った。活性測定のスキームを図４に示す。
【０１２９】
図４に示すように、ファクターＣ以外の共通材料（組換えファクターＢ、組換えプロクロッティングエンザイム、合成基質Boc-LGR-pNA、トリスバッファー）を混合し、共通混液を調製した。共通混液にそれぞれ図６に示す量のファクターＣを加えて50μLとして、検体50μL（米国薬局方標準エンドトキシン（USP-RSE）（生化学工業）を含む水）と混合し、37℃で30分間加温した。このアッセイ系では、エンドトキシンによりファクターＣが活性化されて活性型ファクターＣが生成し、活性型ファクターＣによりファクターＢが活性化されて活性型ファクターＢが生成し、活性型ファクターＢによりプロクロッティングエンザイムが活性化されてクロッティングエンザイムが生成し、クロッティングエンザイムが合成基質Boc-LGR-pNAを切断して、パラニトロアニリンが遊離する（図５）。パラニトロアニリンの生成に基づく吸光度（A405nm）変化を経時的に測定し、単位時間当たりの吸光度変化率（mAbs/min）としてファクターＣ活性を算出した。測定はn=3で行った。
【０１３０】
なお、上記アッセイ系における各因子の終濃度は以下の通りであった。組換えファクターＢ：３０μg／mL、組換えプロクロッティングエンザイム：３０μg／mL、組換えファクターＣ（Sf9）：１１．３μg／mL、組換えファクターＣ（CHO）：１２μg／mL、組換えファクターＣ（HEK）：５１．５μg／mL、ファクターＣ（TAL）：０．２５μg／mL。なお、上記濃度（TAL以外）は、各因子を発現させて調製したサンプル（ろ液）中のタンパク質が全て目的の因子であると仮定して算出したものである。また、ファクターＣ（TAL）濃度は、精製後のファクターＣ（TAL）の濃度である。
【０１３１】
上記で調製した4種類のファクターＣのそれぞれについて同等の活性を示す再構成系を構築することができた（図６）。また、いずれの再構成系も、検体中に含まれるエンドトキシン濃度（0.05及び0.1EU/mL）の増大に応じて活性が増大した。
【０１３２】
哺乳類細胞COS-1で作製したCarcinoscorpius rotundicauda由来の組換えファクターＣ（132 kDa）は不溶性画分に回収されることが報告されている（Roopashree S. Dwarakanath, et al., Biotechnology letters 19(4): 357-361 (1997); Jing Wang, Bow Ho and Jeak L. Ding, Biotechnology letters 23: 71-76 (2001)）。また、昆虫細胞S2で作製したCarcinoscorpius rotundicauda由来の組換えファクターＣ（132 kDa）は、エンドトキシンに依存したプロテアーゼの活性を示さないと報告されている（Jing Wang, et al., J. Biol. Chem. 277(39): 36363-72 (2002)）。後者（S2で作製したファクターＣ）については、レクチンへの反応性の違いから、糖鎖構造がCarcinoscorpius rotundicauda由来の天然ファクターＣや昆虫細胞Sf9で作製した組換えファクターＣと異なるので活性がない、と推測されている。
【０１３３】
一方、本実施例の結果より、Tachypleus tridentatus由来の組換えファクターＣ（Sf9、CHO、HEK）は、分子量が天然のファクターＣ（TAL）と異なっていても、すなわち糖鎖構造が天然のファクターＣ（TAL）と異なっていても、エンドトキシンに依存した活性を示すことが明らかとなった。
【０１３４】
５．注射剤による活性阻害
エンドトキシンは強力な免疫反応誘起物質であるため、エンドトキシンに汚染された注射剤を体内に入れた場合には、重大な副作用が起こる。そのため、注射剤の製造においては、カブトガニ・アメボサイト・ライセート試薬を用いたエンドトキシン試験を行い、エンドトキシン汚染がないことを確認するよう、各国薬局方で義務付けられている。
【０１３５】
そこで、上記で調製した4種類のファクターＣについて、各種注射剤中のエンドトキシンへの反応性を比較した。
【０１３６】
対照検体としては、注射用水にエンドトキシンを添加したもの（エンドトキシン濃度0.05EU/mL）を使用した。測定検体としては、１０ｗ／ｖ％塩化ナトリウム注射液（１０％塩化ナトリウム注射液：大塚製薬株式会社）の４倍希釈液、０．５Ｍ硫酸マグネシウム注射液（硫酸Ｍｇ補正液１ｍＥｑ／ｍＬ：大塚製薬株式会社）の１６倍希釈液、生理食塩液（大塚生食注：大塚製薬株式会社）の原液、７ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム注射液（メイロン静注７％：大塚製薬株式会社）の８倍希釈液、１０ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム注射液（輸液用 クエン酸ナトリウム静注液：扶桑薬品工業株式会社）の８倍希釈液、０．５Ｍ塩化カルシウム注射液（塩化Ｃａ補正液１ｍＥｑ／ｍＬ：大塚製薬株式会社）の１００倍希釈液、リンゲル液（リンゲル液「フソー」：扶桑薬品工業株式会社）の原液、およびイオタラム酸ナトリウム注射液（コンレイ４００注：第一三共株式会社）の１６倍希釈液にエンドトキシンを添加したもの（エンドトキシン濃度0.05EU/mL）を使用した。なお、１０ｗ／ｖ％クエン酸ナトリウム注射液の８倍希釈液を測定検体とした場合、クエン酸ナトリウムの終濃度は約２１ｍＭである。７ｗ／ｖ％炭酸水素ナトリウム注射液の８倍希釈液を測定検体とした場合、炭酸水素ナトリウムの終濃度は約５２ｍＭである。１０ｗ／ｖ％塩化ナトリウム注射液の４倍希釈液を測定検体とした場合、塩化ナトリウムの終濃度は約２１４ｍＭである。生理食塩液の原液を測定検体とした場合、塩化ナトリウムの終濃度は約７７ｍＭである。０．５Ｍ硫酸マグネシウム注射液の１６倍希釈液を測定検体とした場合、硫酸マグネシウムの終濃度は約１６ｍＭである。０．５Ｍ塩化カルシウム注射液の１００倍希釈液を測定検体とした場合、塩化カルシウムの終濃度は約２．５ｍＭである。図４に示す手順でファクターＣの活性測定を行い、対照検体中のエンドトキシンに対する反応性を100%として、各種注射剤中のエンドトキシンに対する反応性の相対値（%）を残存活性とした。測定はn=４で行った。
【０１３７】
結果を図７に示す。代表的な注射剤を測定検体とした場合、注射用水を用いた場合と比較して、エンドトキシンへの反応性が阻害された。また、反応阻害の程度は、注射剤の種類とファクターＣを発現する宿主細胞の種類に応じて異なっていた。組換えファクターＣ（CHO）と組換えファクターＣ（HEK）は、天然ファクターＣ（TAL）に比べ、すべての注射剤に対して、反応阻害を受けにくい傾向を示した。特に、組換えファクターＣ（CHO）は、多くの場合、最も高い残存活性を示した。一方、組換えファクターＣ（Sf9）は、多くの注射剤（サンプルNo.6以外の7種類）について、最も反応阻害を受けやすかった。
【０１３８】
これらの結果から、哺乳類細胞で発現したファクターＣは、イオンによる活性阻害を受けにくい性質を有し得ると考えられる。このような性質は、注射剤の製造におけるエンドトキシン汚染の検出に特に有用である。
【０１３９】
６．L鎖特異的なファクターＣタンパク質抗体の作製
ファクターＣタンパク質は、非還元状態では1本鎖(Full)で存在し、還元状態ではH鎖とL鎖の2本に解離することが知られている。抗ファクターＣモノクローナル抗体（2C12抗体）は、FullとH鎖を認識することが報告されている（Yoshiki Miura, et al., J. Biochem. 112: 476-481（1992））。そこで、L鎖中に存在するペプチド抗原を作製し、常法によりウサギに免疫して、L鎖とFullを認識するポリクローナル抗体（FCL抗体）を製造した（
図１０）。
【０１４０】
７．組換えファクターＣタンパク質の精製
上記「１．ファクターＣタンパク質の調製」の「（４）天然ファクターＣ（Tachypleus
tridentatus）の調製」に記述した方法に準じて、哺乳類細胞（CHO DG44、HEK293）と昆虫細胞（Sf9）の培養上清から3種類の組換えファクターＣタンパク質を精製した。方法の概要としては、培養上清（100〜300mL）をデキストランサルフェート樹脂によるカラムクロマトグラフィーにかけ、組換えファクターＣを含む溶出画分を更にゲルろ過で分離した。各組換えファクターＣタンパク質が精製されたことは、SDS-PAGEとCBB染色、2C12抗体を用いたウエスタンブロット法、および活性測定により確認した。
【０１４１】
８．ファクターＣタンパク質の分子量の比較（２）
4種類の精製ファクターＣタンパク質について、SDS-PAGEおよびウエスタンブロット法により改めて分子量を比較した。
【０１４２】
天然カブトガニ由来（TAL）、CHO DG44の培養上清由来（CHO）、HEK293の培養上清由来（HEK）、Sf9の培養上清由来（Sf9）の4種類の精製ファクターＣタンパク質を同一のゲル（15%ゲル）上でSDS-PAGEに供し、CBB染色をおこなった（図１１）。4種類の精製ファクターＣタンパク質は、いずれも、非還元状態では一本鎖（Full）であり、還元状態ではH鎖とL鎖の2本に解離した。また、PVDF膜に転写後、2C12抗体とFCL抗体によるウエスタンブロットをおこなった（図１２）。抗体の認識部位（図１０）に対応して、2C12抗体はFullとH鎖を、FCL抗体はFullとL鎖を、それぞれ特異的に認識した。これにより、図１１にみられたCBBのバンドはファクターＣ由来のバンドであることが確認された。また、ファクターＣの分子量は、非還元状態でのFull、還元状態でのH鎖およびL鎖のすべてについて、CHOが一番大きく、TALとHEKがほぼ同じ、Sf9が一番小さいことが確認された。
【０１４３】
より詳細に4種類の精製ファクターＣの分子量を比較するために、公知の手法（Jeak Ling Ding and Bow Ho, US5,712,144; Jeak L. Ding, et al., Biochem. Biophys. Acta 1202: 149-156）と同じ条件で電気泳動（15%ゲル、LMWマーカー(GEヘルスケア)）を行い、CBB染色後、Ferguson plotで分子量を決定した。
【０１４４】
結果を表１に示す。非還元条件下において、TALは124 kDaであり、文献報告の123 kDaとよく似た結果になった。一方、CHOはそれよりも大きい128 kDaであり、HEKはTALと同じく124 kDaであった。一方、Sf9は109 kDaであり、TALよりも小さい分子量であった。以上の結果より、昆虫細胞（Sf9）で発現した場合は天然のファクターＣ（TAL）よりも分子量の小さい組換えファクターＣタンパク質が生産され、哺乳類細胞（CHO、HEK）で発現した場合は天然のファクターＣ（TAL）よりも分子量の大きいまたは同等の組換えファクターＣタンパク質が生産されることが判明した。この傾向は還元条件下のH鎖とL鎖においても同様であった。
【０１４５】
シンガポール産カブトガニCarcinoscorpius rotundicauda由来の天然ファクターＣとその遺伝子を昆虫細胞で発現して得られた組換えファクターＣの非還元下での分子量はいずれも132 kDaと報告されているが、本実施例で得られた日本産カブトガニTachypleus tridentatus由来の4種類の精製ファクターＣは、いずれも、それよりも分子量が小さいことが判明した（表１）。
【０１４６】
【表１】
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【０１４７】
９．N型糖鎖修飾の確認
本実施例で組換えファクターＣを発現する際に使用した遺伝子は全てTachypleus tridentatus由来の配列で、末端にタグが付加されないように発現プラスミドを設計している。このため、本実施例で得られた4種類のファクターＣの翻訳アミノ酸配列は同一と考えられる。更に、組換えファクターＣ（HEK、Sf9）のN末端アミノ酸の部分配列を決定した所、文献報告にあるTachypleus tridentatusの天然ファクターＣの配列と同一であることが確認された（データ示さず）。
【０１４８】
一般に、翻訳後修飾はタンパク質の分子量に大きく影響するといわれている。更に、昆虫細胞と哺乳類細胞の間では、翻訳後修飾によりタンパク質に付加されるN型糖鎖の構造に違いがあることが報告されている。本実施例で観察された精製ファクターＣの分子量の差がN型糖鎖の違いに由来するのか確かめるために、ファクターＣタンパク質をグライコペプチダーゼFで処理した。本酵素はタンパク質に結合したN型糖鎖を切断除去することが知られている。よって、本酵素処理により精製ファクターＣが均一の分子量になれば、N型糖鎖がファクターＣ間の分子量の差の原因であることが示唆される。
【０１４９】
添付の説明書に従い、精製ファクターＣタンパク質1μgを、SDSと還元剤の存在する変性条件下で、1mUのグライコペプチダーゼF（TaKaRa）で処理した。処理後のサンプルをSDS-PAGEで分離後、ウエスタンブロット法で解析した。結果を図１３に示す。H鎖については、4種類のいずれも、グライコペプチダーゼ処理により分子量が減少し、その分子量は均一になることが確認された。一方、L鎖については、4種類のいずれも、グライコペプチダーゼ処理により分子量が減少したが、均一な分子量となったのはCHO、HEK、TALの3種類のみであった。すなわち、4種類のL鎖の内、Sf9由来のファクターＣのL鎖は、グライコペプチダーゼ処理後の分子量が他の3つに比べ大きいことが判明した。このことから、Sf9由来のファクターＣのL鎖では、N型糖鎖修飾以外に何らかの翻訳後修飾がなされていると考えられた。
【０１５０】
以上の解析より、翻訳後のN型糖鎖修飾の差がファクターＣの分子量の差の主要因であることが示された。
【０１５１】
１０．ファクターＣのN型糖鎖の解析
タンパク質のN型糖鎖修飾において、哺乳類細胞では、タンパク質のアスパラギン残基上で段階的に糖が付加され、最終的に末端にシアル酸を含む「コンプレックス（COMPLEX）型」の糖鎖が生成する。一方、昆虫細胞では、多くの場合シアル酸は付加されず、末端がマンノースの「パウチマンノース（PAUCIMANNOSE）型」の糖鎖が生成する（Robert L. Harrison and Donald L. Jarvis, Methods in Molecular Biology 338:341-356(2007)）。4種類の精製ファクターＣタンパク質のN型糖鎖の差を確認する目的で、末端シアル酸特異的レクチン（Maackia amurensis Agglutinin (MAM)、Sambucus sieboldiana Agglutinin (SSA)）等の各種レクチンを用いてレクチンブロットを行った。
【０１５２】
4種類の精製ファクターＣと陽性コントロールの牛Fetuinタンパク質の希釈系列（100、25、6ng）をニトロセルロース膜にドットブロット後、3%BSAでブロッキングした。ビオチン標識したレクチン（（株）J-オイルミルズ）、ストレプトアビジン標識したHRP（Thermo Scientific）を順に反応させ、HRP基質（Thermo Scientific）の分解による発光を検出した。コントロールとして、レクチンの代わりに2C12抗ファクターＣ抗体を使い、4種類のファクターＣが同量ブロットされていることを確認した。
【０１５３】
レクチンブロットの結果を図１４（ａ）に、用いたレクチンの結合特異性を図１４（ｂ）に示す。フコース特異的レクチンであるLens culinaris Agglutinin (LCA)とバイアンテナ型、高マンノース型、およびコンプレックス型の糖鎖特異的レクチンであるCanavalia ensiformis Agglutinin (ConA)は、4種類のファクターＣとFetuinの全サンプルに結合した。一方、（α-2,3）結合の末端シアル酸特異的レクチンであるMAMを使用した場合、CHO、HEKの順に強く反応し、TALとFetuinでは同程度の弱い反応がみられたが、Sf9では反応がみられなかった。（α-2,6）結合の末端シアル酸特異的レクチンであるSSAを使用した場合、HEK、TAL、Fetuinでは反応がみられたが、CHOとSf9では反応がみられなかった。
【０１５４】
以上の結果、組換えファクターＣのN型糖鎖は、哺乳類細胞（CHO、HEK）で発現した場合には（α-2,3）結合の末端シアル酸を含むのに対し、昆虫細胞（Sf9）で発現した場合には（α-2,3）結合の末端シアル酸を含まないことが示唆された。本実験結果と文献報告から予想される組換えファクターＣのN型糖鎖の構造模式図を図１４（ｃ）に示す。本実験結果も、翻訳後のN型糖鎖修飾の差がファクターＣの分子量の差の主要因であることを支持するものである。
【産業上の利用可能性】
【０１５５】
本発明によれば、カブトガニの組換えファクターＣを効率的に製造できる。また、本発明の一態様においては、イオンを含有する被験試料中のエンドトキシンを、反応阻害を低減して測定することができる。
【０１５６】
配列表の説明
配列番号１：日本産カブトガニのファクターＣ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号２：日本産カブトガニのファクターＣのアミノ酸配列
配列番号３：東南アジア産（シンガポール産）カブトガニのファクターＣ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号４：東南アジア産（シンガポール産）カブトガニのファクターＣのアミノ酸配列配列番号５：日本産カブトガニのファクターＢ遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号６：日本産カブトガニのファクターＢのアミノ酸配列
配列番号７：日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイム遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号８：日本産カブトガニのプロクロッティングエンザイムのアミノ酸配列
配列番号９：昆虫細胞での発現にコドンを最適化した、日本産カブトガニのファクターＢ
遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号１０：ペプチド配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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