(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソーム二重層を有する単層リポソームを含むアジュバント製剤であって、前記リポソーム二重層は、
（ａ）リン脂質として、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびジステアリルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つのホスファチジルコリン（ＰＣ）および／またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；
（ｂ）コレステロール；
（ｃ）モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）；および
（ｄ）サポニン
からなり、
コレステロール（ｂ）対リン脂質（ａ）のモル比は、５０：５０超であり、
単層リポソームは、光散乱分析によって検出される、マイクロメーター範囲の中央値直径サイズを有する、アジュバント製剤。
【請求項２】
前記サポニンが、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１またはそれらの混合物から選択される、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項３】
前記サポニンが、ＱＳ−２１である、請求項１または請求項２のいずれかに記載のアジュバント製剤。
【請求項４】
前記コレステロール（ｂ）対リン脂質（ａ）のモル比が、５５：４５〜７１：２９の範囲にある、請求項１から３のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
【請求項５】
前記コレステロール（ｂ）対リン脂質（ａ）のモル比が、５５：４５である、請求項１から４のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
【請求項６】
前記リン脂質が、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
【請求項７】
前記リン脂質が、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）をさらに含む、請求項６に記載のアジュバント製剤。
【請求項８】
前記リン脂質が、ＰＣおよびＰＧの両方を含み、前記ＰＣ対前記ＰＧ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比が、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１または約１５：１である、請求項１に記載のアジュバント製剤。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載のアジュバント製剤およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を含むリポソーム懸濁液であって、
（ｉ）１．２７２ｍＭ〜５０ｍＭのリン脂質（ａ）、および
（ｉｉ）約５ｍｇ／ｍｌ以下、約４ｍｇ／ｍｌ以下、約３ｍｇ／ｍｌ以下、約２ｍｇ／ｍｌ以下、約１ｍｇ／ｍｌ以下、約０．９ｍｇ／ｍｌ以下、約０．８ｍｇ／ｍｌ以下、約０．７ｍｇ／ｍｌ以下、約０．６ｍｇ／ｍｌ以下、約０．５ｍｇ／ｍｌ以下、約０．４ｍｇ／ｍｌ以下、約０．３ｍｇ／ｍｌ以下、約０．２ｍｇ／ｍｌ以下、約０．１ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０９ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０８ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０７ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０６ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０５ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０４／ｍｌｍｇ以下、約０．０３ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０２ｍｇ／ｍｌ以下または約０．０１ｍｇ／ｍｌ以下のＭＰＬＡ（ｃ）を含む、リポソーム懸濁液。
【請求項１０】
前記ＭＰＬＡ（ｃ）対リン脂質（ａ）のモル比が、約１：５．６〜約１：８８０または約１：８８〜約１：２２０である、請求項１から８のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
【請求項１１】
請求項１から８および１０のいずれか一項に記載のアジュバント製剤およびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を含むリポソーム懸濁液であって、
（ｉ）１．２７２ｍＭ〜５０ｍＭのリン脂質（ａ）、および
（ｉｉ）約１ｍｇ／ｍｌ以下、約０．９ｍｇ／ｍｌ以下、約０．８ｍｇ／ｍｌ以下、約０．７ｍｇ／ｍｌ以下、約０．６ｍｇ／ｍｌ以下、約０．５ｍｇ／ｍｌ以下、約０．４ｍｇ／ｍｌ以下、約０．３ｍｇ／ｍｌ以下、約０．２ｍｇ／ｍｌ以下、約０．１ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０９ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０８ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０７ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０６ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０５ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０４ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０３ｍｇ／ｍｌ以下、約０．０２ｍｇ／ｍｌ以下または約０．０１ｍｇ／ｍｌ以下のサポニン（ｄ）を含む、リポソーム懸濁液。
【請求項１２】
（ｉ）免疫原および
（ｉｉ）請求項１から８および１０のいずれか一項に記載のアジュバント製剤または請求項９または１１に記載のリポソーム懸濁液
を含む免疫原性組成物。
【請求項１３】
生理学的に許容される媒体をさらに含む、請求項１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記免疫原が、天然に存在するまたは人工的に創り出されるタンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、炭水化物、ハプテン、全ウイルス、細菌、原生動物およびウイルス様粒子からなる群から選択される、請求項１２または請求項１３のいずれかに記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記免疫原が、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である、請求項１４に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
動物を免疫するためのワクチンとして使用するための、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
アジュバントとしてのサポニンの毒性を低減する、またはアジュバント製剤を調製する方法であって、
モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム組成物を、前記サポニンに加えてリポソーム二重層を有する単層リポソームを形成する工程を含み、
前記リポソーム二重層は、
（ａ）リン脂質として、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびジステアリルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）からなる群から選択される少なくとも１つのホスファチジルコリン（ＰＣ）および／またはホスファチジルグリセロール（ＰＧ）；
（ｂ）コレステロール；
（ｃ）モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）；および
（ｄ）サポニン
からなり、
コレステロール（ｂ）対リン脂質（ａ）のモル比は、５０：５０超であり、
単層リポソームは、光散乱分析によって検出される、マイクロメーター範囲の中央値直径サイズを有する、方法。
【請求項１８】
前記サポニンが、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記サポニンが、ＱＳ−２１である、請求項１７または請求項１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記コレステロール（ｂ）対リン脂質（ａ）のモル比が、５５：４５〜７１：２９の範囲にある、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記コレステロール（ｂ）対リン脂質（ａ）のモル比が、５５：４５である、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その全体が本明細書に組み込まれる、２０１４年３月２５日に出願された米国仮出願第６１／９７０，１１８号の利益を主張する。
【０００２】
米国政府の権利
本開示の実施形態の開発中に行われた研究の一部は、米国国防総省付与番号Ｗ８１ＸＷＨ−０７−２−００６７による米国政府の資金を利用した。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
分野
本明細書に記載されているものは、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソームおよび少なくとも１種のサポニン、例えば、ＱＳ−２１を含む組成物に関する。リポソームは、ｉ）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質を含む脂質二重層（lipid bilayer comprising phospholipids）およびｉｉ）コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で含む。
【背景技術】
【０００４】
背景
現代の多くのワクチンが最適な有益効果をもたらすには、注射後に全身の安全性および最小限の副反応を維持しながら免疫応答を強化するワクチンアジュバントの使用を必要とする。リポ多糖類（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外膜の外葉の主要な表面分子であり、外葉にのみ存在している。ＬＰＳは、血清中の補体および食細胞による細菌の破壊を妨げ、コロニー形成のための付着に関与している。ＬＰＳは、リピッドＡを含有する、およそ１０、０００ダルトンの構造的に関連のある複合分子の１群であり、リピッドＡは、ＬＰＳの最も内側の領域にあり、疎水性のアンカーとしての役割を果たし、長鎖脂肪酸を有するリン酸化グルコサミン二糖単位を含む。
【０００５】
致死毒性、発熱原性およびアジュバント活性などの、ＬＰＳの生物学的活性は、リピッドＡ部分に関連していることが示されている。ＬＰＳおよびリピッドＡの両方は、それらの強力なアジュバント効果が昔から知られているが、これらの分子の高い毒性によって、ワクチン製剤における使用が制限されてきた。それらのアジュバント活性を維持しながら、ＬＰＳまたはリピッドＡの毒性を低減する方向に、かなりの科学的努力が行われてきた。
【０００６】
一般的に使用されている他の非ヒトアジュバントは、キラヤ（Quillaja）サポニンであり、これは、キラヤ・サポナリア（Quillaja saponaria）の樹皮から抽出される、両親媒性のトリテルペン配糖体の混合物である。粗サポニンは、動物用のアジュバントとして用いられてきた。Ｑｕｉｌ−Ａは、キラヤ（Quillaja）サポニン原料の部分精製された水性抽出物であり、ＱＳ−２１は、Ｑｕｉｌ  ＡのＨＰＬＣ精製された画分である。ＱＳ−２１（ＱＡ２１と称される）を生成する方法は、米国特許第５，０５７，５４０号明細書に開示されている。しかし、使用するＱＳ−２１などのサポニンの主要な副作用の１つは、その細胞毒性である。具体的には、正確な細胞毒性機構は現在のところ知られていないが、サポニンは、赤血球の破壊または溶解である溶血を引き起こす。
【０００７】
必要とされているものは、免疫応答を強化するが関連した細胞毒性を有しないアジュバントを含む、ワクチン送達組成物である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
よって、当技術分野において、より強力であると同時により安全なアジュバント製剤を開発することが依然として必要とされている。本明細書において、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））組成物およびサポニンを含み、リピッドＡまたはサポニンの最小限の毒性を示すアジュバント製剤が提供される。
【０００９】
よって、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム組成物および少なくとも１種のサポニンを含むアジュバント製剤であって、リポソーム組成物は、ｉ）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質で構成された脂質二重層（lipid bilayer composing phospholipids）およびｉｉ）コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で含む、アジュバント製剤が提供される。サポニンは、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１またはそれらの混合物から選択され得る。好ましくは、サポニンは、ＱＳ−２１であり得る。
【００１０】
一態様では、アジュバント製剤のリポソーム組成物は、コレステロールを約５５％〜約７１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）または好ましくは約５５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含み得る。アジュバント製剤のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択されるホスファチジルコリン（ＰＣ）を含み得る。
【００１１】
あるいは、アジュバント製剤のリポソーム組成物は、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびジステアリルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）からなる群から選択されるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含み得る。アジュバント製剤のリポソーム組成物は、ＰＣ対ＰＧ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比が、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１または約１５：１であり得る。アジュバント製剤のリポソーム組成物は、多層小胞（ＭＬＶ）または小型単層小胞（ＳＵＶ）を含んでよく、小型単層小胞は、直径が約５０〜約１００ｎｍであり、多層小胞は、直径が約１〜約４μｍである。
【００１２】
別の態様では、アジュバント製剤のリポソーム組成物は、約５ｍｇ以下、約４ｍｇ以下、約３ｍｇ以下、約２ｍｇ以下、約１ｍｇ以下、約０．９ｍｇ以下、約０．８ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．６ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、約０．２ｍｇ以下、約０．１ｍｇ以下、約０．０９ｍｇ以下、約０．０８ｍｇ以下、約０．０７ｍｇ以下、約０．０６ｍｇ以下、約０．０５ｍｇ以下、約０．０４ｍｇ以下、約０．０３ｍｇ以下、約０．０２ｍｇ以下または約０．０１ｍｇ以下のＭＰＬＡ（リポソーム懸濁液１ｍｌ当たりの総重量）を含み得る。アジュバント製剤のリポソーム組成物は、約１：５．６〜約１：８８０または約１：８８〜約１：２２０のＭＰＬＡ：リン脂質モル比を有し得る。
【００１３】
さらなる態様では、アジュバント製剤は、約１ｍｇ以下、約０．９ｍｇ以下、約０．８ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．６ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、約０．２ｍｇ以下、約０．１ｍｇ以下、約０．０９ｍｇ以下、約０．０８ｍｇ以下、約０．０７ｍｇ以下、約０．０６ｍｇ以下、約０．０５ｍｇ以下、約０．０４ｍｇ以下、約０．０３ｍｇ以下、約０．０２ｍｇ以下または約０．０１ｍｇ以下の含量のサポニン（リポソーム懸濁液１ｍｌ当たりの総重量）を有し得る。
【００１４】
免疫原およびアジュバント製剤を含む免疫原性組成物も提供される。免疫原性組成物は、典型的には、生理学的に許容される媒体を含み得る。免疫原性組成物の免疫原は、天然に存在するまたは人工的に創り出されるタンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、炭水化物、ハプテン、全ウイルス（whole virus）、細菌、原生動物およびウイルス様粒子からなる群から選択され得る。好ましくは、免疫原性組成物の免疫原は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質であり得る。免疫原性組成物を投与する工程を含む、動物を免疫する方法も提供される。
【００１５】
アジュバントとしてのサポニンの毒性を低減する、またはアジュバント製剤を調製する方法であって、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム組成物を、サポニンに加える工程を含み、リポソーム組成物は、ｉ）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質を含む脂質二重層およびｉｉ）コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で含む、方法がさらに提供される。サポニンは、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。好ましくは、サポニンは、ＱＳ−２１であり得る。リポソーム組成物は、コレステロールを約５５％〜約７１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは、約５５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含み得る。
【００１６】
添付の図面は、本開示に組み込まれ、種々の実施形態の限定されない説明を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、実施例１に記載されているように、種々のＱＳ−２１濃度（図１Ａ：１０μｇ／ｍｌ  ＱＳ−２１；図１Ｂ：５０μｇ／ｍｌ  ＱＳ−２１）を有するリポソーム組成物の溶血活性を描くグラフである。
【図２】図２は、実施例１に記載されているように、リポソームとともに予備インキュベートされたＱＳ−２１による赤血球の溶血を描くグラフである。ＱＳ−２１は、総計５μｍｏｌのリン脂質を含有するＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソームと２２℃で混合した。リポソームは、３３．７、４３または５５ｍｏｌ％Ｃｈｏｌも含有した。
【図３】図３は、実施例１に記載されているように、リポソームとともに予備インキュベートされたサポニンによる赤血球の溶血を描くグラフである。
【図４】図４は、リポソーム中ＭＰＬＡ（liposomal MPLA）によるリポソーム中ＣｈｏｌへのＱＳ−２１の結合の阻害を描くグラフである。実験は、実施例２に記載されているように実施された。平均±Ｓ．Ｄ．は、Ｌを有する１４個の独立したリポソームバッチおよびＬ（ＭＰＬＡ）を有する４個の独立したバッチを用いて示されている。
【図５】図５は、リン脂質の脂肪酸アシル鎖長がＱＳ−２１の結合に対するリポソーム中Ｃｈｏｌの接近可能性に及ぼす影響を描くグラフである。実験は、実施例２に記載されているように実施された。図５Ａは、３３．７ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを有し、ＭＰＬＡを有さないリポソームの結果を説明するグラフである。図５Ｂは、５５ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを有し、ＭＰＬＡを有さないリポソームの結果を説明するグラフである。図５Ｃは、５５ｍｏｌ％ＣｈｏｌおよびＭＰＬＡを有するリポソームの結果を説明するグラフである。
【図６】図６は、ＭＰＬＡによるＤＭＰＣ／ＤＭＰＧリポソーム間のＣｈｏｌ移動の阻害を描くグラフである。ＭＰＬＡを含有しない（図６Ａ）またはＭＰＬＡを含有する（ＭＰＬＡ：リン脂質＝１：５．６）（図６Ｂ）リポソームへ結合するＱＳ−２１によって、Ｃｈｏｌ移動を検出した。
【図７】図７は、リポソーム中Ｃｈｏｌ含量の増加によるＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡリポソームのＬＡＬ陽性度（positivity）の抑制を描くグラフである。図７Ａは、３３．７ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを含有するリポソームへのＬＡＬ結合の結果を示すグラフであり、図７Ｂは、５５ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを含有するリポソームへのＬＡＬ結合の結果を示すグラフである。
【図８】図８は、ＱＳ−２１の非存在下（図８Ａ）および存在下（図８Ｂ）（ＡＬＦＱ）で、ＡＬＦ  ＳＵＶおよびＡＬＦ  ＭＬＶの光散乱によって測定された典型的なサイズ分布を描くグラフである。図８Ａにおいて、ＳＵＶの２つの曲線は、ＭＰＬＡ：リン脂質比が１：８８または１：５．６であるリポソームから構成された。ＭＬＶの２つの曲線は、（左から右に）ＭＰＬＡ：リン脂質比が１：２２０または１：８８であるリポソームから構成された。図８Ｂにおいて、曲線は、最初のＡＬＦが、（左から右に）それぞれ、ＭＰＬＡ：リン脂質比が１：２２０であるＭＬＶ；およびＭＰＬＡ：リン脂質比が１：８８および１：５．６であるＳＵＶから構成されたＡＬＦＱを表す。
【図９】図９は、ｇｐ１４０に対するＩｇＧの終点力価（endpoint titer）を描くグラフである。示されているＭＰＬＡ：リン脂質モル比を含有し、各製剤には２０μｇのＭＰＬＡが存在する、ＡＬＦ＋ＣＮ  ｇｐ１４０（図９Ａ）およびＡＬＦＱ＋ＣＮ  ｇｐ１４０（図９Ｂ）で、マウスを免疫した。血清は９週目由来のものであり、ＥＬＩＳＡによってアッセイした。値は、１群につき動物６匹の平均±標準偏差である。
【図１０−１】図１０は、実施例４ならびに原料および方法に記載されているように、抗−ｇｐ１４０抗血清のＩｇＧサブタイプのプロファイルを描くグラフである。マウスをＡＬＦ＋ｇｐ１４０（図１０Ａ）またはＡＬＦＱ＋ｇｐ１４０（図１０Ｂ）で免疫した。ＥＬＩＳＡプレートをｇｐ１４０でコーティングした。サブタイプ分析を実施し、値を標準曲線から算出した。各パネルは、９週目の免疫マウスからの１群由来の貯留血清を表す。
【図１０−２】図１０は、実施例４ならびに原料および方法に記載されているように、抗−ｇｐ１４０抗血清のＩｇＧサブタイプのプロファイルを描くグラフである。マウスをＡＬＦ＋ｇｐ１４０（図１０Ａ）またはＡＬＦＱ＋ｇｐ１４０（図１０Ｂ）で免疫した。ＥＬＩＳＡプレートをｇｐ１４０でコーティングした。サブタイプ分析を実施し、値を標準曲線から算出した。各パネルは、９週目の免疫マウスからの１群由来の貯留血清を表す。
【図１１】図１１は、一次免疫後９週目のマウス由来の脾細胞によるＩＦＮ−γ（図１１Ａ）およびＩＬ−４（図１１Ｂ）の産生を描くグラフである。脾細胞をプレーティングし、ｇｐ１４０  ＣＮ５４で１８時間刺激し、サイトカインを産生している細胞の数を、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。縦軸は、６動物／群の平均を表す（未処置：非免疫対照マウス）。
【図１２】図１２は、貯留抗血清によるＨＩＶの中和を描くグラフである。ワクチン製剤がＸ−軸上に示されている。ＩＤ５０値は、一次免疫後９週目のマウス由来の血清サンプルの示されている希釈での、偽ウイルスＭＷ９６５．２６ＰＶ（図１２Ａ）およびＧＳ０１５ＰＶ（図１２Ｂ）の５０％中和を表す。対照は、非免疫マウス由来の血清であった。２０未満のＩＤ５０値は、バックグラウンドとみなした。ＭｕＬＶ  ＰＶは、アッセイの陰性対照として使用した（データは示さず）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
１．定義および略語
１．１．略語および頭文字
ＡＢＴＳ        ２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）
ＡＬＦ          Ａｒｍｙリポソーム製剤
ＡＬＦＱ        ＡＬＦ＋ＱＳ−２１
ＢＣＩＰ        ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸
Ｃｈｏｌ        コレステロール
ｃＲＰＭＩ      完全ＲＰＭＩ  １６４０培地
ＤＭＥＭ        ダルベッコ変法イーグル培地
ＤＭＰＣ        ジミリストイルホスファチジルコリン
ＤＭＰＧ        ジミリストイルホスファチジルグリセロール
ＤＰＰＣ        ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＤＳＰＣ        ジステアロイルホスホコリン
ＥＬＩＳＡ      酵素結合免疫吸着アッセイ
ＥＬＩＳＰＯＴ  酵素結合免疫スポット
ＦＢＳ          ウシ胎仔血清
ＨＲＰ          ホースラディシュペルオキシダーゼ
ＩＤ５０        血清の５０％阻害希釈
ＩＦＮ−γ      インターフェロン−γ
ＩＬ−４        インターロイキン−４
Ｌ（ＭＰＬＡ）  モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム
ＬＡＬ          カブトガニ血球抽出成分
ＬＰＳ          リポ多糖類
ＭＬＶ          多層小胞
ＭＰＬＡ        モノホスホリルリピッドＡ
ＭｕＬＶ        マウス白血病ウイルス
ＮＢＴ          ニトロブルーテトラゾリウム
ＰＢＳ          リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣ            ホスファチジルコリン
ＰＧ            ホスファチジルグリセロール
ＰＨＡ          フィトヘマグルチニン
ＳＵＶ          小型単層小胞
【００１９】
１．２．定義
「免疫原」は、体液性および／または細胞性免疫応答を誘導することができる物質である。本明細書に記載されているような免疫原は、抗原、ハプテンまたは不活化病原体であり得る。本明細書に記載されているような免疫原性組成物は、例えば、ワクチン製剤であり得る。
【００２０】
本明細書において使用される「リポソーム」は、閉じ込められた水性容積を含有する閉じた二重膜を指す。リポソームはまた、単一膜二重層を有する単層小胞であり得るまたは多重膜二重層を有し、それぞれが水性層によって隣と分離されている多層小胞であり得る。得られた膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）の尾部が二重層の中央方向に配向され、親水性（極性）の頭部が水性相方向に配向しているものである。リポソームは、それらが通常使用される場合、スメクチック中間層からなり、リン脂質または非リン脂質のスメクチック中間層からなり得る。スメクチック中間層は、Small, HANDBOOK OF LIPID RESEARCH, Vol. 4, Plenum, NY, 1986, pp. 49-50によって、最も正確に記載されている。Ｓｍａｌｌによると、「与えられた分子が加熱されると、融解して直ちに等方性液体になる代わりに、むしろそれは中間層または液晶と呼ばれる中間状態を通過し得る。この状態は、いくつかの方向には秩序が残っているが、他の方向では秩序が失われていることを特徴とする・・・。一般に、液晶の分子は、幅広いというよりも幾分長く、分子の縦方向に沿ったある場所に、極性または芳香族部分を有する。分子の形および極性−極性または芳香族の相互作用によって、分子は、部分的に秩序を保った配置に整列することができる・・・。これらの構造は、一端に極性基を有する分子において特徴的に生じる。分子の長軸方向に長距離秩序を有する液晶は、スメクチック液晶、層状液晶またはラメラ液晶と呼ばれる・・・。スメクチック状態では、分子は単層または二重層の状態であり、層面に対して垂直または傾いており、凝固したまたは融解した脂肪族鎖を有し得る。」
【００２１】
リピッドＡは、一組の複雑な、大いにアシル化およびアミド化されたジグルコサミン二リン酸エステル分子であり、グラム陰性細菌由来のすべてのリポ多糖類（ＬＰＳ；エンドトキシンとしても知られている）に共通している脂質部分である。ＬＰＳは、すべてのグラム陰性細菌の外表面のほぼ全体を覆っており、リピッドＡは、ＬＰＳを細菌の脂質の外表面に繋ぎ留めている。野生型のスムース型細菌におけるＬＰＳのＯ−多糖部分は、ラフ型変異体に発現される比較的保存されたコアオリゴ糖に結合されており、これは次に、時には細菌の生存に必要とされ、ＬＰＳにおいてのみ見出される独特の化学構造である高度に保存された２−ケト−３−デオキシオクタン酸糖を介して、リピッドＡに結合されている。例えば、Alving et al., 2012, Expert Rev. Vaccines 11: 733-44を参照のこと。「モノホスホリルリピッドＡ」は、リピッドＡの類似物であり、頭部極性基上のグルコサミン−１−リン酸基が取り除かれている。ＭＰＬＡの類似物も多数存在する。
【００２２】
本明細書において使用されるリポソーム組成物の「コレステロールのモルパーセント濃度」は、リポソーム組成物の調製に最初に使用される、Ｃｈｏｌ：総リン脂質（すなわち、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロール）の比を指す。
【００２３】
本明細書において使用される「生理学的に許容される媒体」は、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与（例えば、経口、経皮または非経口投与）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用、すなわち、細胞培養に適した媒体を指す。例示的な生理学的に許容される媒体は、米国特許第４，１８６，１８３号明細書および同第４，３０２，４５９号明細書に開示されているような、リポソームの生理学的に許容される成分であることができる。
【００２４】
本明細書において使用される「好ましい」および「好ましくは」は、欧州のみにおける請求項の解釈のためのものと解釈されるべきである。この用語は、それらが米国の請求項の解釈のために現れる文およびパラグラフの解釈から、除外または削除されるべきである。
【００２５】
本明細書において使用される「約」は、言及されている値の±５％を指す。
【００２６】
他に特に定義されない限り、本明細書において使用される科学技術用語はすべて、当業者によって共通に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」および「ｔｈｅ」は、文脈が他に特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含むことが留意されなければならない。したがって、例えば、「抗体」への言及は、複数のそのような抗体を含み、「投与量（dosage）」への言及は、１回または複数の投与量および当業者に知られているその等価物などへの言及を含む。
【００２７】
２．サポニン
本実施形態に関して、適したサポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａ、その誘導体またはその精製された任意の成分（例えば、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１またはそれらの混合物）である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南米の樹木であるキラヤ・サポナリア・モリナ（Quillaja Saponaria Molina）から単離されるサポニン調製物であり、アジュバント活性を有することが最初に見出された。Dalsgaard et al., 1974, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, 44: 243-254。Ｑｕｉｌ  Ａの精製された断片は、ＨＰＬＣによって単離されており（欧州特許第０  ３６２  ２７８号明細書）、例えば、ＱＳ−７およびＱＳ−２１（それぞれＱＡ７およびＱＡ２１としても知られている）などを含む。ＱＳ−２１は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬｓ）、Ｔｈ１細胞および優れたＩｇＧ２ａ抗体応答を誘導することが示されている。
【００２８】
３．モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））
リポソームは、閉じ込められた水性容積を含有する閉じた二重膜である。リポソームはまた、単一膜二重層を有する単層小胞であり得るまたは多重膜二重層を有し、それぞれが水性層によって隣と分離されている多層小胞であり得る。得られた膜二重層の構造は、脂質の疎水性（非極性）の尾部が二重層の中央方向に配向され、親水性（極性）の頭部が水性相方向に配向しているものである。リポソームを囲むための適した親水性ポリマーは、限定されることなく、米国特許第６，３１６，０２４号明細書、同第６，１２６，９６６号明細書、同第６，０５６，９７３号明細書および同第６，０４３，０９４号明細書に記載されているような、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコール、ポリアスパルタミドおよび親水性ペプチド配列を含む。リポソームは、親水性ポリマーを用いずに作製することができる。それ故に、リポソーム製剤は、親水性ポリマーを含有しても、含有しなくてもよい。
【００２９】
リポソームは、当技術分野において知られている任意の脂質または脂質の組合せから構成され得る。例えば、小胞を形成する脂質は、米国特許第６，０５６，９７３号明細書および同第５，８７４，１０４号明細書に開示されているような、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトールおよびスフィンゴミエリンなどの、リン脂質を含む、天然に存在するまたは合成の脂質であり得る。
【００３０】
小胞を形成する脂質はまた、米国特許第６，０５６，９７３号明細書にも開示されているような、１，２−ジオレイルオキシ−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３，−ジテトラデシルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１［（２，３，−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＯＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、３［Ｎ−−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣＣｈｏｌ）またはジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）などの、糖脂質、セレブロシドまたは陽イオン性脂質であり得る。コレステロールはまた、米国特許第５，９１６，５８８号明細書および同第５，８７４，１０４号明細書に開示されているように、リポソーム小胞に安定性を付与する適切な範囲に存在し得る。追加的なリポソームの技術は、米国特許第６，７５９，０５７号明細書、同第６，４０６，７１３号明細書、同第６，３５２，７１６号明細書、同第６，３１６，０２４号明細書、同第６，２９４，１９１号明細書、同第６，１２６，９６６号明細書、同第６，０５６，９７３号明細書、同第６，０４３，０９４号明細書、同第５，９６５，１５６号明細書、同第５，９１６，５８８号明細書、同第５，８７４，１０４号明細書、同第５，２１５，６８０号明細書および同第４，６８４，４７９号明細書に記載されている。これらは、リポソームおよび脂質コーティングされた超微粒気泡ならびにそれらの製造方法を記載していた。したがって、当業者は、本開示およびこれらの他の特許の開示の両方を考慮して、本実施形態の目的のためのリポソームを生成することができた。本実施形態に関して、リポソーム組成物は、典型的には、約１ｍＭ〜約１５０ｍＭのリン脂質を含有する。
【００３１】
以上の例示的なリポソームはいずれも、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）を含むまたは他のリポソームおよびリピッドＡ（ＭＰＬＡ）と組み合わせることができる。ＭＰＬＡは単独で、ヒトおよび動物に対して毒性であり得る。しかし、リポソーム中に存在する場合、毒性は検出されない。例えば、Alving et al., 2012を参照のこと。本明細書に記載されているような、ＭＰＬＡを含むリポソームの調製のための例示的な手順は、少なくともAlving et al., 2012に教示されている。ＭＰＬＡは、強力なアジュバントとしての役割を果たし、リポソームおよびリポソームと関連するペプチド、タンパク質またはハプテンの免疫原性を高める役割を果たす。
【００３２】
本実施形態に関して、典型的なモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム（Ｌ（ＭＰＬＡ））は、もともとはＷａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄリポソームと称されるものであるが、今ではワクチンアジュバントとして、Ａｒｍｙリポソーム製剤（ＡＬＦ）として知られているものである。例えば、Alving et al., 2012を参照のこと。ＡＬＦアジュバントリポソームは、（１）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質、通常はジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）を含む脂質二重層；（２）安定化剤としてのコレステロール：および（３）免疫賦活物質としてのモノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）を含む。ヒトを対象とした臨床試験において、ＡＬＦ型リポソームアジュバントは、マラリア、ＨＩＶ−１およびがんに対するワクチン候補の中で、安全かつ強力であることが分かった。例えば、Fries et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 358-62；Alving, 2002, Vaccine, 20: S56-64を参照のこと。ＡＬＦにＱＳ−２１を加えてＡＬＦＱを形成するＡＬＦの特定の組成物は、コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で、好ましくは約５５％〜約７１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）またはより好ましくは約５５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含む。
【００３３】
本実施形態に関して、Ｌ（ＭＰＬＡ）は、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択されるホスファチジルコリン（ＰＣ）を含み得る。Ｌ（ＭＰＬＡ）は、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびジステアリルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）から選択されるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）も含み得る。リポソームのＰＣ対ＰＧ比（ｍｏｌ／ｍｏｌ）は、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１または約１５：１であり得る。リポソームは、約５ｍｇ以下、約４ｍｇ以下、約３ｍｇ以下、約２ｍｇ以下、約１ｍｇ以下、約０．９ｍｇ以下、約０．８ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．６ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、約０．２ｍｇ以下、約０．１ｍｇ以下、約０．０９ｍｇ以下、約０．０８ｍｇ以下、約０．０７ｍｇ以下、約０．０６ｍｇ以下、約０．０５ｍｇ以下、約０．０４ｍｇ以下、約０．０３ｍｇ以下、約０．０２ｍｇ以下または約０．０１ｍｇ以下の含量のＭＰＬＡ（リポソーム懸濁液１ｍｌ当たりの総重量）を有し得る。あるいは、リポソームは、約１：５．６〜約１：８８０、好ましくは約１：８８〜約１：２２０のＭＰＬＡ：リン脂質モル比を有し得る。リポソームは、多層小胞（ＭＬＶ）または小型単層小胞（ＳＵＶ）を含み得る。小型単層小胞は、直径が約５０〜約１００ｎｍであり得るが、多層小胞は、直径が約１〜約４μｍであり得る。
【００３４】
４．リポソームおよびサポニンを含むアジュバント製剤
ＡＳ０１として知られている（ＡＳ０１ＢまたはＡＳ０１Ｅとしても知られている）アジュバント製剤は、これまでにＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅによって売り出された。ＡＳ０１では、脂質二重層は、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロール、ＭＰＬＡおよびＱＳ−２１などの室温で「非結晶性」である中性脂肪から構成されていた。米国特許出願公開第２０１１／０２０６７５８号明細書を参照のこと。ＡＳ０１の製造中に、小型単層リポソーム小胞（ＳＵＶ）が最初に創り出され、次いで、精製されたＱＳ−２１がＳＵＶに加えられる。ＱＳ−２１は、それがリポソーム中コレステロールに結合し、その場所でそれが貫通（穴）をもたらすまたはリポソームに他の永久的な構造変化をもたらすという点において、独特の特性を付与する。例えば、Paepenmuller et al., 2014, Int. J. Pharm., 475: 138-46を参照のこと。遊離ＱＳ−２１の量が減少されると、遊離ＱＳ−２１によって頻繁に引き起こされる注射局所疼痛を恐らく軽減させることになる。例えば、Waite et al., 2001, Vaccine, 19: 3957-67；Mbawuike et al., 2007, Vaccine, 25: 3263-69を参照のこと。ＡＳ０１製剤は、「さらに強いＴ細胞媒介性免疫応答の誘導が必要とされる場合のワクチンのために」創り出された。Garcon et al., 2007, Expert. Rev. Vaccines, 6: 723-39を参照のこと。ＡＳ０１製剤は、種々のワクチンのためのアジュバントとして開発されている。Garcon & Mechelen, 2011, Expert. Rev. Vaccines, 10: 471-86を参照のこと。ＡＳ０１製剤は、米国特許出願公開第２０１１／０２０６７５８号明細書に記載されているように、コレステロール（ステロール）を１〜５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは２０〜２５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含有し得る。
【００３５】
本開示に記載されているように、ＱＳ−２１をＡＬＦリポソームに加えると（結果としてＡＬＦ＋ＱＳ−２１、または「ＡＬＦＱ」となり）、リポソーム膜の膜生化学および物理学的構造に複雑な変化をもたらすことになる。ＭＰＬＡ：リン脂質比ならびにＱＳ−２１、ＭＰＬＡおよびコレステロールの相対的なモル濃度およびモル比などの因子は、ＭＰＬＡおよびコレステロールの可視性に影響を及ぼした。これらの因子は、付近の赤血球の溶血によって決定されるように、加えられたＱＳ−２１の相対毒性に影響を及ぼした。
【００３６】
本実施形態に関して、アジュバント製剤は、モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム組成物および少なくとも１種のサポニンを含み、リポソーム組成物は、ｉ）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質（例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）および／またはジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ））を含む脂質二重層およびｉｉ）コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で、または好ましくは約５５％〜約７１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）またはより好ましくは約５５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含む。少なくとも、これらの２つの特徴は、以上に論じられているＡＳ０１のものとは異なる。サポニンは、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１もしくはそれらの混合物から選択され得る、またはサポニンは、好ましくはＱＳ−２１であり得る。アジュバント製剤は、リポソーム懸濁液１ｍｌ当たり、約１ｍｇ以下、約０．９ｍｇ以下、約０．８ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．６ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、約０．２ｍｇ以下、約０．１ｍｇ以下、約０．０９ｍｇ以下、約０．０８ｍｇ以下、約０．０７ｍｇ以下、約０．０６ｍｇ以下、約０．０５ｍｇ以下、約０．０４ｍｇ以下、約０．０３ｍｇ以下、約０．０２ｍｇ以下または約０．０１ｍｇ以下のサポニンを含有し得る。
【００３７】
本実施形態のアジュバント製剤は、免疫原と混合して、免疫原性組成物、例えば、ワクチン製剤を得るために使用され得る。免疫原性組成物は、生理学的に許容される媒体、例えば、米国特許第５，８８８，５１９号明細書に記載されているものの任意の１つを含み得る。免疫原性組成物は、天然に存在するもしくは人工的に創り出されるタンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、炭水化物、ハプテン、全ウイルス、細菌、原生動物またはウイルス様粒子を免疫原として含み得る。免疫原性組成物は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質、例えば、ｇｐ１４０であり得る。免疫原性製剤は、インフルエンザ、ＨＩＶ−１、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、ヒト乳頭腫ウイルス、Ａ型髄膜炎菌性髄膜炎、Ｂ型髄膜炎菌性髄膜炎、Ｃ型髄膜炎菌性髄膜炎、破傷風、ジフテリア、百日咳、ポリオ、Ｂ型インフルエンザ菌（Haemophilus influenza）、デング熱、手足口病、腸チフス、肺炎球菌（Pneumococcus）、日本脳炎ウイルス、炭疽、帯状疱疹、マラリア、ノロウイルスまたはがんのためのワクチンとして、適切に使用され得る。
【実施例】
【００３８】
以下の実施例は、本開示のある特定の代表的な実施形態および態様を実証し、さらに説明するために提供されるものであり、本明細書または特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００３９】
原料および方法
脂質、サポニンおよび他の試薬
ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）および合成モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）（ＰＨＡＤ（商標））を、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ、ＵＳＡ）から購入した。ＤＭＰＣおよびＣｈｏｌは、新たに蒸留されたクロロホルムに溶解し、ＤＭＰＧおよびＭＰＬＡは、クロロホルム：メタノール（９：１）に溶解した。精製されたＱＳ−２１（Ｄｅｓｅｒｔ  Ｋｉｎｇ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）は、ＰＢＳ中に１ｍｇ／ｍｌで溶解した。サポニンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。
【００４０】
ホースラディシュッペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヒツジ抗−マウスＩｇＧ  ＨＲＰを、Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅから購入した（カタログ番号ＡＰ２７２）。ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１（Ａ９０−１０５Ｐ）、ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ２ａ（Ａ９０−１０７Ｐ）、ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ２ｂ（Ａ９０−１０９Ｐ）、ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ３（Ａ９０−１１１Ｐ）ならびに精製されたマウスＩｇＧ１（ＭＩ１０−１０２）、ＩｇＧ２ａ（ＭＩ１０−１０３）、ＩｇＧ２ｂ（ＭＩ１０−１０４）およびＩｇＧ３（ＭＩ１０−１０５）は、Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ、ＴＸ、ＵＳＡ）から購入した。非コンジュゲートヤギ抗−マウスＩｇＧ  Ｆａｂ（１０１５−０１）は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、ＵＳＡ）からであった。精製された抗−マウスＩＦＮ−γ（５１−２５２５ＫＺ）、精製されたラット抗−マウスＩＬ−４（ＢＶＤ４−１Ｄ１１）、ビオチン−標識抗−マウスＩＦＮ−γ（５１−１８１８ＫＡ）およびビオチン−標識ラット抗−マウスＩＬ−４（ＢＶＤ６−２４Ｇ２）は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。
【００４１】
１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）は、ＴＺＭ．ｂｌ細胞を培養するためおよびＨＩＶ−１中和アッセイに使用した。１０％ＦＢＳ、１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する完全ＲＰＭＩ  １６４０培地（ｃＲＰＭＩ）は、マウス脾リンパ球を培養するためおよびＥＬＩＳＰＯＴ分析に使用した。
【００４２】
リポソームの調製
リポソームの調製を、Matyas et al., 2003, Methods Enzymol., 373: 34-50に既に記載されているように行った。実施例１〜３に関して、脂質を混合し、真空下で乾燥し、次いでｐＨ：７．４のＰＢＳ中に、総リン脂質が５０ｍＭまたは１．２７２ｍＭの最終濃度で、リポソームを形成した。リポソーム中のホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールは、９：１のモル比であった。リポソーム中Ｃｈｏｌは、示されているように変化させた。ＭＰＬＡを使用する場合には、ＭＰＬＡ：総リン脂質のモル比は、示されている箇所では４５：１または５．６：１であった。リポソーム中Ｃｈｏｌのモルパーセント濃度は、リポソームの調製に最初に使用される、Ｃｈｏｌ：全リン脂質（すなわち、ホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロール）のモル比に基づいている。
【００４３】
アジュバント効力を評価するために、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＣｈｏｌおよびＭＰＬＡを含有するＡｒｍｙリポソーム製剤（ＡＬＦ）を、Matyas et al., 2003に記載されている脂質沈着法（lipid deposition method）によって調製した。実施例４に関して、脂質を混合し、ロータリーエバポレーションによって乾燥した。ｐＨ：７．４のＰＢＳを、総リン脂質が５０ｍＭまたは２０ｍＭまたは２ｍＭの最終濃度で、水性リポソーム懸濁液中に加えることによって、多層小胞（ＭＬＶ）を形成した。総計２０μｇのＭＰＬＡを各リポソームの調製に使用し、ＭＰＬＡとリン脂質との間のモル比は、それぞれ１：２２０、１：８８および１：５．６であった。リポソーム中のホスファチジルコリンおよびホスファチジルグリセロールは、９：１のモル比であった。リポソーム中Ｃｈｏｌ濃度は、ＱＳ−２１を欠くすべてのＡＬＦ調製物において、４３ｍｏｌ％であった。Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ＬＶ１低容量高剪断マイクロ流動化装置（ＡＴＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、３０，０００ｐｓｉでリポソームをマイクロ流動し、ＳＵＶを形成した。リポソームの直径サイズ分布を、Ｈｏｒｉｂａ  ＬＢ−５５０粒径測定装置（Ｈｏｒｉｂａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、ＮＪ）によって測定した。Ａｒｍｙリポソーム製剤＋ＱＳ−２１（ＡＬＦＱ）は、Ｃｈｏｌ濃度が５５ｍｏｌ％であるＭＬＶまたはＳＵＶリポソームを、ＱＳ−２１と混合することによって作製した。ＱＳ−２１は、これらの条件下で、リポソーム中のＣｈｏｌに不可逆的に結合し、緩衝液中に存在する遊離のＱＳ−２１は検出されなかった。免疫に使用した各ＡＬＦＱ製剤中のＱＳ−２１の総量は、１０μｇであった。
【００４４】
ＨＩＶ−１  ｃｌａｄｅ  Ｃ  ＣＮ５４  ｇｐ１４０エンベロープ抗原（Ｐｏｌｙｍｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｋｌｏｓｔｅｒｎｅｕｂｅｒｇ、Ａｕｓｔｒｉａ）の総注射用量１０μｇを、ＰＢＳ中で、ＡＬＦまたはＡＬＦＱリポソームの各製剤と混合した。リポソーム中ＭＰＬＡ：リン脂質比が、ＭＬＶについては１：２２０または１：８８であり、ＳＵＶについては１：８８または１：５．６である、４つの異なるＡＬＦ−ｇｐ１４０製剤を作製した。ＭＰＬＡ：リン脂質比が、ＭＬＶは１：２２０または１：８８であり、ＡＬＦ  ＳＵＶは１：５．６であるＡＬＦ  ＳＵＶまたはＭＬＶに、ＱＳ−２１を加えることによって、３つの異なるＡＬＦＱ−ｇｐ１４０製剤を調製した。
【００４５】
コレステロール分析
リポソーム製剤のコレステロールおよびリン脂質濃度を間接的に確認するために、確立された方法によって、コレステロール含量を分析した。例えば、Zlatkis et al., 1953, J. Lab. Clin. Med., 41: 486-492を参照のこと。簡単に言えば、リポソーム５〜２００μｌを水に加え、最終容量を２００μｌにした。氷酢酸３ｍｌを加えた後、氷硫酸中０．１％塩化第二鉄２ｍｌを加えた。サンプルを混合し、次いで室温に平衡化した後、吸光度を５６０ｎｍで読み取った。リポソームのコレステロール濃度を、コレステロールの標準曲線から決定した。
【００４６】
溶血アッセイ
赤血球の溶血を、示されている実験条件下で、遊離ＱＳ−２１の相対量およびＱＳ−２１の毒性の両方の尺度として使用した。ヒト赤血球は、独立施設内審査委員会（ｔｈｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓによって再検討されたＷａｌｔｅｒ  Ｒｅｅｄ  Ａｒｍｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈのプロトコルの下で、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ＬＬＣ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。赤血球をＰＢＳで洗浄し、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒカウンターモデルＡＣＴ１０（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ、ＵＳＡ）によって定量化した。この試験の各アッセイでは、リポソームを用いてまたは用いずにインキュベートしたＱＳ−２１の溶血活性を２２０μｌ容量で決定し、アッセイの各ステップは室温（２２℃）で行った。１００マイクロリットルのＱＳ−２１の希釈液を、１００μｌのリポソームまたはＰＢＳのみを用いて、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｒｏｃｋｅｒ（Ｖｅｒｎｏｎ  Ｈｉｌｌｓ、ＩＬ、ＵＳＡ）上で１５分間インキュベートした。リポソームを混合した後、ＰＢＳ２０μｌ中の赤血球２×１０７個を混合物に加え、Ｄａｉｇｇｅｒ  Ｒｏｃｋｅｒ上で追加の３０分間インキュベートした。プレートを８００×ｇで６分間、遠心分離した。上清をポリスチレン製９６−ウェルプレートに移し、吸光度を５４１ｎｍで読み取った。ＱＳ−２１がリポソーム中Ｃｈｏｌへ結合することによる溶血を、遊離ＱＳ−２１による最大溶血率％として表した。
【００４７】
カブトガニ血球抽出成分アッセイ
リン脂質鎖長およびＣｈｏｌのモル分率がＭＰＬＡのリポソーム表面発現に及ぼす役割を調べるために、カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）アッセイをプローブとして使用した。凝固タンパク質を含有するリムルス・ポリフェムス（Limulus polyphemus）（アメリカカブトガニ）の血液由来の血球抽出成分は、ＬＰＳまたはリピッドＡのエンドトキシン活性を検出するための代用プローブとして、幅広く使用されている。例えば、Brandenburg et al., 2009, Curr. Med. Chem., 16: 2653-2660を参照のこと。リムルスタンパク質が結合するリピッドＡ（またはＭＰＬＡ）の正確な分子のエピトープまたは構造は、まだ完全には明らかになっていないが、リピッドＡのリポソーム二重層への組み込みは、エンドトキシン活性およびＬＡＬ活性の両方を大いに遮蔽する。例えば、Harmon et al., 1997, Anal. Biochem., 250: 139-146を参照のこと。ＬＡＬ活性の遮蔽は、リポソームの脂質二重層におけるリピッドＡの「リムルス−反応性」基を捕捉することで、リムルスタンパク質のリピッドＡへの結合を阻害することによると考えられている。しかし、「リムルス−陽性」（すなわち、反応性）および「リムルス−陰性」（すなわち、非反応性）リポソームは、リポソーム中リピッドＡの濃度を、それぞれ、より高い量またはより低い量に変化させることによって創り出すことができる。Richardson et al., 1983, Infect. Immun., 39: 1385-1391を参照のこと。他のリポソーム中脂質と同様に、リピッドＡは、自己会合して、リピッドＡが豊富なドメインを形成することができ、これらは層状または非層状であり得る。例えば、Kubiak et al., 2011, Biophys. J., 100: 978-986；Brandenburg et al., 1998, Chem. Phys. Lipids, 91: 53-69を参照のこと。高濃度のリポソーム中リピッドＡは、恐らく自己会合または相分離し、リピッドＡのリムルス−反応基の表面可視性が高まることになる。
【００４８】
カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）動的−ＱＣＬアッセイを、Ｌｏｎｚａ（Ａｌｌｅｎｄａｌｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）から購入した。アッセイは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）プラットホーム上で、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬプロトコルを使用し、３７℃にて、以下のパラメータ：Δｔ＝１５０秒、測定フィルター＝４０５ｎｍ、ΔＯＤ＝０．２、読み取り数＝４０を使用して行った。結果は、ＥＵ／ｍｌ単位で提示された。
【００４９】
マウスの免疫
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）（５〜６週齢；６匹／群）を、ワクチン０．０５ｍｌで、注射によって、大腿後部のどちらかに、０、３および６週に筋肉内（ＩＭ）免疫した。４つのマウス群を、以上に掲載されているＡＬＦ＋ｇｐ１４０製剤で免疫し、３群をＡＬＦＱ＋ｇｐ１４０製剤で免疫した。１つのマウス群は免疫せずに、免疫学的試験のための陰性対照として使用した。最初の免疫前および一次免疫後３週および６週に、動物から採血した。９週目に、動物を放血致死させ、脾臓を採取した。
【００５０】
ワクチン接種後の抗体応答のＥＬＩＳＡによる検出
ＩｇＧ抗体の終点力価を決定するために、ｇｐ１４０タンパク質（ＰＢＳ中０．１μｇ／０．１ｍｌ／ウェル）を、Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ平底プレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）に加えた。４℃で一晩インキュベートした後、さらなるすべてのステップを室温で行った。プレートを、ＰＢＳ中０．５％乳／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ブロッキング緩衝液）２５０μｌで、２時間ブロックした。サンプルを１：４００希釈から始めて連続的に２倍希釈し、希釈した血清サンプル１００μｌをプレートに加えた。プレートを１時間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＨＲＰ結合ヒツジ抗−マウスＩｇＧ（１００μｌブロッキング緩衝液中０．１μｇ）を各ウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした後、洗浄した。１００μｌのＡＢＴＳ  ２−成分基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ、ＵＳＡ）を各ウェルに加え、プレートを１時間インキュベートした。１％ＳＤＳを１ウェルにつき１００μｌ加えることによって、発色を停止させた。吸光度を４０５ｎｍで読み取った。終点力価を、吸光度がバックグラウンドの２倍であった希釈度と定義した。
【００５１】
ＩｇＧサブタイプの決定を、Glenn et al., 1995, Immunol. Let. 47: 73-78から改変した。非コンジュゲートヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｆａｂ）を使用して、標準曲線を作製した。Ｆａｂ（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）１００μｌを９６−ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ平底プレートのウェルに加え、プレートを４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）で３回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％脱脂乳（ブロッキング緩衝液）を１ウェルにつき２５０μｌ加えてブロックし、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。洗浄後、ブロッキング緩衝液１００μｌを、各ウェルに加えた。精製されたマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を、２００ｎｇ／ｍｌのブロッキング緩衝液から始めて２倍希釈した。各希釈液１００μｌをプレートに加えた。プレートを、室温で２時間インキュベートし、３回洗浄した。１００μｌのＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３（ブロッキング緩衝液中１：１０００希釈）を対応するウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＡＢＴＳを加えた。１％ＳＤＳを１ウェルにつき１００μｌ加えることによって、発色を停止させた。吸光度を４０５ｎｍで読み取った。サブクラスの分析に関して、標準ＥＬＩＳＡについては、各群において貯留しておいたマウス血清を、ｇｐ１４０コーティングプレートに加えた。ＨＲＰ結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３を加え、ＥＬＩＳＡを標準曲線と一緒に実施した。各群の貯留血清の免疫グロブリンサブクラスの濃度を、標準曲線を使用して算出した。
【００５２】
ＩＮＦ−γおよびＩＬ−４のための酵素結合免疫スポットアッセイ
安楽死させたマウスからの脾臓を、１００−μｍナイロン製細胞ストレーナー（Ｔｈｏｍａｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓｗｅｄｅｓｂｏｒｏ、ＮＪ、ＵＳＡ、カタログ番号４６２０Ｆ０５）に通し、シリンジのプランジャーを用いて押し出した。脾細胞の懸濁液を、ｃＲＰＭＩ培地中に収集し、同培地で３回洗浄した。ＥＬＩＳＰＯＴを、Rao et al., 2002, J. Virol., 76: 9176-85に記載されているように実施した。脾臓を採取する前に、ｍｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ９６−ウェルマイクロタイタープレート（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、７０％エタノールで前処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中に希釈した５μｇ／ｍｌのキャプチャーＩＮＦ−γ−特異的ＩｇＧまたはＰＢＳ中に希釈した２μｇ／ｍｌのキャプチャーＩＬ−４−特異的ＩｇＧを、１００μｌ／ウェルでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートし、次いでｃＲＰＭＩで２回洗浄し、２００μｌ／ウェルのｃＲＭＰＩを用いて、ＲＴで２時間ブロックした。５０μｌのマウス細胞懸濁液（８×１０６細胞／ｍｌ）を、各サイトカインアッセイのために、二連でプレーティングした。非賦活細胞については５０μｌのｃＲＰＭＩをもしくは賦活細胞については１０μｇ／ｍｌ  ｇｐ１４０  ＣＮ５４を、または陽性対照として５０μｌの１０μｇ／ｍｌＣｏｎ−Ａをまたは陰性対照として５０μｌの２μｇ／ｍｌ  ＰＨＡを、対応するウェルに加えた。プレートをＣＯ２インキュベーター中で、３７℃にて１８時間インキュベートした。０．００２％Ｔｗｅｅｎ２０（洗浄緩衝液）を含有するＰＢＳで、プレートを３回洗浄した。ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌビオチン−標識検出ＩＮＦ−γまたはＩＬ−４抗体１００μｌを、各ウェルに加えた。プレートを、室温で３時間インキュベートし、次いで３回洗浄した。１００μｌのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ溶液（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号７１００−０４）、ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／０．００１％Ｔｗｅｅｎ中１：１０００に希釈したもの）を各ウェルに加え、プレートを暗所で室温にて１時間インキュベーションした。プレートを３回洗浄し、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ色原体基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ，カタログ番号５０−８１−０７）を１ウェルにつき１００μｌ加えた。スポットが現れた後、プレートを蒸留水で完全に洗い流した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４−産生細胞の頻度を、ＢｉｏＲｅａｄｅｒ  ３０００  Ｅｌｉｓｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ−Ｓｙｓ  ＧｍｂＨ、Ｋａｒｂｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。データは、スポットの平均数として表される。
【００５３】
中和アッセイ
２つのｔｉｅｒ１  ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ偽ウイルスに対する中和抗体応答を、ルシフェラーゼに基づいたウイルス中和アッセイを使用し、既に記載されているようなＴＺＭ．ｂｌ細胞を用いることによって測定した。例えば、Brown et al., 2007, J. Virol., 81: 2087-91を参照のこと。血清の５０％阻害希釈（ＩＤ５０）の算出は、細胞対照の相対発光単位を差し引いた後、ウイルス対照ウェルと比較して、相対発光単位の５０％減少に帰着する血清希釈として行った。簡単に言えば、血清サンプルを２５μｌで４倍連続希釈したものを、９６−ウェル平底プレート中、二連で、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中でアッセイした。ＨＩＶ  ｃｌａｄｅ  Ｃ、ＧＳ０１５  ＰＶおよびＭＷ９６５．２６  ＰＶ（２５μｌ）を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。次いで、Brown et al., 2008.に既に記載されているように、ＴＺＭ．ｂｌ細胞を、ＤＥＡＥ−デキストランを含有する１０％ＤＭＥＭ中、５０μｌ容量で加え（１０４細胞／ウェル）、中和抗体力価を決定した。ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）陰性対照を、すべてのアッセイに含めた。
【００５４】
統計解析
統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して行った。抗体サブタイプの定量化に関して、シグモイド型４パラメータ非線形回帰曲線フィッティングを使用した。複数の群間における統計的比較は、一元配置ＡＮＯＶＡ法、ダンの補正を用いたクラスカル−ウォリス検定を使用して行った。カラム比較分析は、対応のないｔ−検定（マンホイットニー検定）を使用して行った。
【００５５】
実施例１    リポソーム中Ｃｈｏｌが共インキュベートしたＱＳ−２１の溶血活性に及ぼす影響の特性決定
ＱＳ−２１を有するリポソーム組成物の溶血活性を、ＱＳ−２１の濃度を変化させることによって、最初に特性決定した。簡単に言えば、３３．７％、４３％および５５％コレステロールを含有するリン脂質リポソーム５０ミリモルを、１０μｇ／ｍｌおよび５０μｇ／ｍｌのＱＳ−２１と混合し、室温で２０分間インキュベートした。赤血球をリポソーム−ＱＳ−２１の混合物に加え、３０分間インキュベートした。遊離ＱＳ−２１は、陽性対照としての役割を果たした。細胞を遠心分離し、上清の光学密度を５４１ｎｍで測定して、溶血のレベルを反映した。結果は、図１に提示されているように、ＱＳ−２１を有するリポソーム組成物による溶血のレベルは、リポソーム中のコレステロールの濃度によって決まることを示唆している。
【００５６】
ＱＳ−２１を有するリポソーム組成物の溶血活性を、リポソーム中Ｃｈｏｌのｍｏｌ％を変化させることによって、さらに特性決定した。ＱＳ−２１によって引き起こされる赤血球の損傷度は、ＱＳ−２１とともに予備インキュベートされたリポソーム中Ｃｈｏｌのｍｏｌ％に逆相関することが見出された（図２）。遊離ＱＳ−２１は、およそ２μｇで最大溶血を引き起こしたが、ＱＳ−２１を、３３．７または４３ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを含有するリポソームとともに予備インキュベートした場合には、最大溶血は、およそ４μｇのＱＳ−２１で起こった（図２）。５５ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを有するリポソームは、ＱＳ−２１の溶血の影響を２００μｇまで完全にブロックした（図２）。同様の結果が、濃度を変化させたサポニンを含有するリポソーム組成物について観察された（図３）。リポソームが５５ｍｏｌ％コレステロールを含有した場合には、５００μｇ／ｍｌまでのサポニンについて、溶血は全く検出されなかった。
【００５７】
実施例２    ＱＳ−２１とリポソーム中Ｃｈｏｌとの間の相互作用の特性決定
０．１２７μｍｏｌ総リン脂質および５０ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを含有するＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／ＣｈｏｌリポソームへのＱＳ−２１の結合を、０．０２５μｍｏｌのＭＰＬＡ（ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡ）も含有する同リポソームと比較した。簡単に言えば、総計０．１２７μｍｏｌのリン脂質（ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ、９／１）、５０ｍｏｌ％ＣｈｏｌからなるリポソームおよびＭＰＬＡ，（Ｌ）またはＬ（ＭＰＬＡ）（ＭＰＬＡ：リン脂質＝１：５．６）を欠いているまたは含有するリポソームとともに、ＱＳ−２１を予備インキュベートした。次いで、溶血活性を測定した。図４に示されているように、ＭＰＬＡ（Ｌ）を含まない５０ｍｏｌ％Ｃｈｏｌリポソームは、２５μｇのＱＳ−２１の濃度でようやく１００％の溶血に到達した。リポソームがＭＰＬＡ（Ｌ（ＭＰＬＡ））を有すると、溶血は５μｇのＱＳ−２１で最大レベルに到達し、これは遊離ＱＳ−２１の溶血曲線に類似していた。したがって、５０％Ｃｈｏｌは、ＭＰＬＡを欠いているものと比較すると、ＭＰＬＡを含有するリポソーム中のＱＳ−２１に対して可視性がより少ないことは明らかである。
【００５８】
０．１１４μｍｏｌのホスファチジルコリンを含有し、それぞれＤＭＰＣ、ＤＰＰＣおよびＤＳＰＣからなり、０．０１２７μｍｏｌのＤＭＰＧと一緒に、３３．７％または５５％Ｃｈｏｌを含有し、２．８５ｎｍｏｌのＭＰＬＡを含むまたは含まない３種のリポソーム組成物を、ＱＳ−２１とともに予備インキュベートした（図５）。次いで、溶血活性を評価した。図５Ａに示されているように、１０μｇまでのＱＳ−２１について、３３．７ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを有するＤＭＰＣ、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣリポソームに結合されたＱＳ−２１は、ほとんどまたは全くなかった。しかし、リポソーム中Ｃｈｏｌを５５％に増加させると（図５Ｂ）、ＤＳＰＣリポソームにおいておよび顕著にはＤＭＰＣリポソームにおいて、ＣｈｏｌへのＱＳ−２１の結合が増加した。これとは対照的に、５５％Ｃｈｏｌを有するＤＰＰＣリポソームは、ＤＭＰＣまたはＤＳＰＣリポソームに比べて、ＱＳ−２１への結合が非常に少なかった（図５Ｂ）。ＭＰＬＡの存在は、５５％Ｃｈｏｌを有するＤＭＰＣリポソームへのＱＳ−２１の結合を阻害したが、ＤＰＰＣまたはＤＳＰＣリポソームへの結合を阻害しなかった（図５Ｃ）。
【００５９】
さらに、６６％Ｃｈｏｌを含有するリポソームから、Ｃｈｏｌを欠いているリポソームへのＣｈｏｌの移動を、ＱＳ−２１をプローブとして使用することによって検出した（図６）。ＱＳ−２１を［Ｌ（０％Ｃｈｏｌ）＋Ｌ（６６％Ｃｈｏｌ）］とともに予備インキュベートしたところ、ＱＳ−２１をＬ（０％Ｃｈｏｌ）またはＬ（６６％Ｃｈｏｌ）と別々に予備インキュベートした後に観察されたものの中間に位置する、ＱＳ−２１の溶血活性をもたらした（図６Ａ）。ＱＳ−２１を、ＭＰＬＡを含有し、Ｃｈｏｌを含有するまたは欠いているリポソームの同等の混合物［Ｌ（０％Ｃｈｏｌ＋ＭＰＬＡ）＋Ｌ（６６％Ｃｈｏｌ＋ＭＰＬＡ）］とともに予備インキュベートしたところ、同様にＱＳ−２１による中間のレベルの溶血をもたらした（図６Ｂ）。しかし、図６Ｂに示されている［Ｌ（０％Ｃｈｏｌ＋ＭＰＬＡ）＋Ｌ（６６％Ｃｈｏｌ＋ＭＰＬＡ）］の曲線は、ＭＰＬＡを欠いているリポソーム［Ｌ（０％Ｃｈｏｌ）＋Ｌ（６６％Ｃｈｏｌ）］（図６Ａ）と比較すると、より大きな溶血活性の方向へシフトされた。したがって、リポソーム中のＭＰＬＡの存在が、リポソーム間のＣｈｏｌ移動を阻害したまたはリポソームの混合物中のＣｈｏｌの可視性を遮蔽したことは明らかである。
【００６０】
実施例３    リポソーム中Ｃｈｏｌの量を増加させることによる、ＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡリポソームのカブトガニ血球抽出成分の認識抑制
カブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）アッセイを、Ｃｈｏｌの種々の量を含有するＤＭＰＣ／ＤＭＰＧ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡリポソームについて実施した。図７Ａは、３３．７ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを含有するＤＭＰＣ／ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡ、ＤＰＰＣ／ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡまたはＤＳＰＣ／ＤＭＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＭＰＬＡリポソーム中のＭＰＬＡが、ＬＡＬアッセイによって検出されたことを示している。３３．７ｍｏｌ％Ｃｈｏｌを含有するリポソームにおける、ＭＰＬＡのＬＡＬによる認識は、ホスファチジルコリンの飽和脂肪酸アシル鎖の長さに比例し、ＬＡＬが、ＤＳＰＣ＞ＤＰＰＣ＞ＤＭＰＣの順に結合した。しかし、５５ｍｏｌ％Ｃｈｏｌでは、各リポソームにおいて、ＬＡＬがＭＰＬＡを検出する能力が劇的に減少した（図７Ｂ）。
【００６１】
実施例４    Ｌ（ＭＰＬＡ）およびサポニンを含む製剤のアジュバント効力の特性決定
リポソームサイズがアジュバント効力に及ぼす影響を試験するために、それぞれがＡＬＦリポソーム（すなわち、ＭＰＬＡを含有する）のタイプである、大型ＭＬＶおよびＳＵＶを構築した。図８に示されているように、光散乱分析に基づいて、ＡＬＦ  ＳＵＶ粒子の直径サイズ範囲は、５０から１００ｎｍの間であり、ＡＬＦ  ＭＬＶは、１から４μｍの間であった。この後者のＭＬＶでの結果は、光散乱分析が多くの大型粒子を検出したことを示しているが、電子的粒径分析によって示されている双曲的な分布において、ＭＬＶは多数の小型粒子も含有している。例えば、Alving et al., 1975, Biochim. Biophys. Acta., 394: 157-65を参照のこと。したがって、光散乱分析を用いた場合、ＭＬＶ中に存在した小型粒子が、大型粒子の影に隠れた。いずれにせよ、それぞれ測定した粒子集団の分布は狭く、中央値ピークを１つのみ有した。ＡＬＦ  ＳＵＶの場合には、これは同種の集団の存在を示した。高ＭＰＬＡ：リン脂質比でさえも、ＡＬＦ  ＳＵＶは、小型粒子の単一分布を形成した。しかし、ＱＳ−２１を欠いているリポソームとは対照的に、ＱＳ−２１を含有するすべてのＡＬＦリポソーム（ＡＬＦＱ）の中央値サイズは、最初のＡＬＦ粒子がＳＵＶであるかＭＬＶであるかにかかわらず、マイクロメーターの値域で測定された（図８Ｂ）。以上に示されているように、このことは小型粒子が同時に発生している集団の可能性の余地を与えない。ＡＬＦＱ粒子の全体的なサイズの範囲内で、明確なわずかに異なる中央値サイズを有する大型ＡＬＦＱの個々の小集団が、ＭＰＬＡ：リン脂質比に応じて発生した（図８Ｂ）。
【００６２】
原料および方法に記載されているように、種々の組成物を使用して、抗体産生を免疫マウスから測定し、結果を図９にまとめた。図９Ａに示されているように、ＭＰＬＡ：リン脂質が１：８８の比で含有するＡＬＦ  ＳＵＶは、同一のＭＰＬＡ：リン脂質比を有するＡＬＦ  ＭＬＶに比べて、統計学的に有意的に、より高いＩｇＧ抗−ｇｐ１４０結合抗体の産生をマウスにおいて誘導した。ＭＰＬＡ：リン脂質比が１：５．６であるＡＬＦ  ＳＵＶは、結合抗体の最も高い力価を誘導した。図９Ｂは、すべてのＡＬＦＱ−アジュバント化製剤が、ＡＬＦ  ＭＬＶ−アジュバント化製剤のいずれよりも有意に高い、ｇｐ１４０に対する結合抗体を誘導したことを示している。すべてのＡＬＦＱ−アジュバント化群における総計のｇｐ１４０−特異的ＩｇＧ結合抗体レベルは、リポソームのサイズまたは相対リン脂質濃度とは無関係であるように思われる。
【００６３】
ＩｇＧサブタイプの決定は、抗体産生をさらに特性決定するために実施した。ＡＬＦ＋ｇｐ１４０で免疫したすべてのマウス群は、ｇｐ１４０に対するＩｇＧ１結合抗体の中等度または高度の力価を明らかにした（図１０Ａ）。ＡＬＦ  ＭＬＶは、ＩｇＧ１サブクラスを優位に誘導したが、一方、ＡＬＦ  ＳＵＶは、ＩｇＧ１とＩｇＧ２ａとの間のバランスのとれた産生を誘導し、またＩｇＧ２ｂ産生も誘導した。ＭＰＬＡ：リン脂質比を増加させると、すべてのサブクラスの抗体応答がより高くなった（図１０Ａ）。図１０Ｂに示されているように、ＡＬＦＱ群において、ＩｇＧ１の血清中濃度は常に高く、すべてのサブタイプが誘導されたが、これらは、ＡＬＦＱの創作に最初に利用した、ＡＬＦ  ＳＵＶまたはＡＬＦ  ＭＬＶのＭＰＬＡ：リン脂質比とは無関係であった。
【００６４】
Ｔｈ１対Ｔｈ２の免疫応答を比較するために、アジュバント化ｇｐ１４０で免疫したマウスから新たに単離した脾リンパ球について、ＥＬＩＳＰＯＴ分析を行った。図１１に示されているように、ＡＬＦ−アジュバント化製剤のすべてがＩＮＦ−γを産生する脾リンパ球の増殖を誘導し、これは未処置対照で観察されたよりも高かった。ＡＬＦＱ製剤は、ＡＬＦより多数のＩＮＦ−γ−陽性細胞を誘導した（図１１Ａ）。免疫マウスのすべてが高ＩＬ−４産生を示し、これは未処置マウスに比べて有意に（ｐ＜０．０００１）高かった（図１１Ｂ）。ＩＬ−４を産生する細胞数の有意差は、免疫群間で観察されなかった。以上の結果を考慮すると、ＡＬＦＱリポソームが、ＭＰＬＡ：リン脂質比に関係なく、ＩＮＦ−γ分泌の顕著な誘導を引き起こしたように思われる。したがって、ＡＬＦＱリポソームは、Ｔｈ１型免疫を誘導するための有用なアジュバントになり得る可能性を秘めている。
【００６５】
ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質に対する非中和結合抗体は、第３相有効性試験において、予防に相関することが報告されたが、中和抗体は、ＨＩＶ−１に対する予防的ワクチンにとって重要であると広く考えられている。このために、ＡＬＦおよびＡＬＦＱがアジュバントとしての役割を果たし、モデルｇｐ１４０エンベロープタンパク質に対する中和抗体を誘導する能力を試験した。マウス群の貯留血清サンプルを、２つのｔｉｅｒ  １、ｃｌａｄｅ  Ｃ  ＨＩＶ初代分離株に対して試験した。図１２に示されているように、１つのＡＬＦ−アジュバント化および２つのＡＬＦＱ−アジュバント化ワクチン群は、ＭＷ９６５．２６ＰＶ（図１２Ａ）およびＧＳ０１５ＰＶ（図１２Ｂ）の両方を、高ＩＤ５０で中和する抗−ｇｐ１４０抗血清を誘導した。ＭＰＬＡ：リン脂質比が１：５．６であるＡＬＦは、最も高い中和力価を誘導し、一方、ＭＰＬＡ：リン脂質比が１：８８および１：２２０であるＡＬＦＱも、中和抗体を誘導したが、それは幾分低い力価であった。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム組成物および少なくとも１種のサポニンを含むアジュバント製剤であって、前記リポソーム組成物は、ｉ）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質で構成された脂質二重層およびｉｉ）コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で含む、アジュバント製剤。
［２］
前記サポニンが、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１またはそれらの混合物から選択される、上記［１］に記載のアジュバント製剤。
［３］
前記サポニンが、ＱＳ−２１である、上記［１］または上記［２］のいずれかに記載のアジュバント製剤。
［４］
前記リポソーム組成物が、コレステロールを約５５％〜約７１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含む、上記［１］から［３］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［５］
前記リポソーム組成物が、コレステロールを約５５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含む、上記［１］から［４］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［６］
リポソームが、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジステアリルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）からなる群から選択されるホスファチジルコリン（ＰＣ）を含む、上記［１］から［５］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［７］
前記リポソーム組成物が、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）およびジステアリルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）からなる群から選択されるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）をさらに含む、上記［６］に記載のアジュバント製剤。
［８］
前記ＰＣ対前記ＰＧ（ｍｏｌ／ｍｏｌ）の比が、約０．５：１、約１：１、約２：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１または約１５：１である、上記［７］に記載のアジュバント製剤。
［９］
前記リポソーム組成物が、約５ｍｇ以下、約４ｍｇ以下、約３ｍｇ以下、約２ｍｇ以下、約１ｍｇ以下、約０．９ｍｇ以下、約０．８ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．６ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、約０．２ｍｇ以下、約０．１ｍｇ以下、約０．０９ｍｇ以下、約０．０８ｍｇ以下、約０．０７ｍｇ以下、約０．０６ｍｇ以下、約０．０５ｍｇ以下、約０．０４ｍｇ以下、約０．０３ｍｇ以下、約０．０２ｍｇ以下または約０．０１ｍｇ以下のＭＰＬＡ（リポソーム懸濁液１ｍｌ当たりの総重量）を含む、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［１０］
前記リポソーム組成物が、約１：５．６〜約１：８８０または約１：８８〜約１：２２０のＭＰＬＡ：リン脂質モル比を有する、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［１１］
サポニンの含量（リポソーム懸濁液１ｍｌ当たりの総重量）が、約１ｍｇ以下、約０．９ｍｇ以下、約０．８ｍｇ以下、約０．７ｍｇ以下、約０．６ｍｇ以下、約０．５ｍｇ以下、約０．４ｍｇ以下、約０．３ｍｇ以下、約０．２ｍｇ以下、約０．１ｍｇ以下、約０．０９ｍｇ以下、約０．０８ｍｇ以下、約０．０７ｍｇ以下、約０．０６ｍｇ以下、約０．０５ｍｇ以下、約０．０４ｍｇ以下、約０．０３ｍｇ以下、約０．０２ｍｇ以下または約０．０１ｍｇ以下である、上記［１］から［１０］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［１２］
前記リポソーム組成物が、多層小胞（ＭＬＶ）または小型単層小胞（ＳＵＶ）を含み、小型単層小胞は、直径が約５０〜約１００ｎｍであり、多層小胞は、直径が約１〜約４μｍである、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤。
［１３］
免疫原および上記［１］から［１２］のいずれか一項に記載のアジュバント製剤を含む免疫原性組成物。
［１４］
生理学的に許容される媒体をさらに含む、上記［１３］に記載の免疫原性組成物。
［１５］
前記免疫原が、天然に存在するまたは人工的に創り出されるタンパク質、組換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、炭水化物、ハプテン、全ウイルス、細菌、原生動物およびウイルス様粒子からなる群から選択される、上記［１３］または上記［１４］のいずれかに記載の免疫原性組成物。
［１６］
前記免疫原が、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質である、上記［１５］に記載の免疫原性組成物。
［１７］
上記［１３］から［１６］のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を投与する工程を含む、動物を免疫する方法。
［１８］
アジュバントとしてのサポニンの毒性を低減する、またはアジュバント製剤を調製する方法であって、
モノホスホリルリピッドＡ（ＭＰＬＡ）含有リポソーム組成物を、前記サポニンに加える工程を含み、前記リポソーム組成物は、ｉ）炭化水素鎖が２３℃以上の水中融解温度を有するリン脂質を含む脂質二重層およびｉｉ）コレステロールを約５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）を超えるモルパーセント濃度で含む、方法。
［１９］
前記サポニンが、ＱＳ−７、ＱＳ−１８、ＱＳ−２１およびそれらの混合物からなる群から選択される、上記［１８］に記載の方法。
［２０］
前記サポニンが、ＱＳ−２１である、上記［１８］または上記［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］
前記リポソーム組成物が、コレステロールを約５５％〜約７１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含む、上記［１８］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
［２２］
前記リポソーム組成物が、コレステロールを約５５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）のモルパーセント濃度で含む、上記［１８］から［２１］のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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