(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光源から発せられた連続レーザ光を標本上で走査させる走査部と、
該走査部により走査された前記連続レーザ光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る戻り光を集光する対物レンズと、
該対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に開口し、前記対物レンズにより集光されて前記走査部によりディスキャンされた前記戻り光を部分的に通過させるピンホールと、
該ピンホールを通過した前記戻り光を同一波長のまま複数の光路に分割する光分割部と、
該光分割部により分割された各前記光路の戻り光をそれぞれ検出して該戻り光の輝度に相当する光強度信号を出力する複数の光検出部と、
これら光検出部ごとに、前記光強度信号に基づいて前記標本の画像データを取得する画像データ取得部と、
前記走査部により前記連続レーザ光が繰り返し走査されて該走査ごとに各前記光検出部により検出される前記標本の同一範囲からの戻り光の前記光強度信号に基づいて前記画像データ取得部により取得される、前記標本の同一範囲における複数の前記画像データを合成する画像データ合成部と、
該画像データ合成部により前記画像データが合成されて得られた最終合成画像データに対して高周波成分を強調する画像演算処理を施す演算処理部とを備える顕微鏡システム。
【請求項２】
光源から発せられた短パルスレーザ光を標本上で走査させる走査部と、
該走査部により走査された前記短パルスレーザ光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る戻り光を集光する対物レンズと、
該対物レンズと前記走査部との間に配され、前記標本からの前記戻り光を前記短パルスレーザ光の光路から分岐させる光分岐部と、
該光分岐部により分岐された前記戻り光を同一波長のまま複数の光路に分割する光分割部と、
該光分割部により分割された各前記光路の戻り光をそれぞれ検出して該戻り光の輝度に相当する光強度信号を出力する複数の光検出部と、
これら光検出部ごとに、前記光強度信号に基づいて前記標本の画像データを取得する画像データ取得部と、
前記走査部により前記短パルスレーザ光が繰り返し走査されて該走査ごとに各前記光検出部により検出される前記標本の同一範囲からの戻り光の前記光強度信号に基づいて前記画像データ取得部により取得される、前記標本の同一範囲における複数の前記画像データを合成する画像データ合成部と、
該画像データ合成部により前記画像データが合成されて得られた最終合成画像データに対して高周波成分を強調する画像演算処理を施す演算処理部とを備え顕微鏡システム。
【請求項３】
前記画像データ合成部が、前記光検出部ごとに取得された前記標本の同一範囲における複数の画像データを加算または加算平均することにより、前記標本の同一範囲における前記最終合成画像データを生成する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
【請求項４】
前記画像データ合成部が、前記光検出部ごとに取得された前記標本の同一範囲における複数の画像データを加算または加算平均することにより、前記光検出部ごとの光検出部合成画像データを生成し、前記光検出部ごとに生成された複数の前記光検出部合成画像データを加算または加算平均することにより、前記標本の同一範囲における前記最終合成画像データを生成する請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システム。
【請求項５】
前記複数の光検出部が、検出するフォトン数に対する感度特性が略同一になるように光検出部ゲインを調整する光検出部ゲイン調整制御部を備える請求項１から請求項４のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項６】
前記光検出部ゲイン調整制御部が、検出するフォトン数に対する前記複数の光検出部の感度特性が略同一になるように、最初に設定された１つの光検出部ゲインを基に、他の光検出部ゲインを求めて補正する請求項５に記載の顕微鏡システム。
【請求項７】
前記複数の光検出部と前記光分割部とを有する複数の検出ユニットと、
前記標本からの戻り光を同一波長のまま前記複数の検出ユニットに配分する光配分部とを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【請求項８】
前記複数の光検出部と前記光分割部とを有する複数の検出ユニットと、
前記標本からの戻り光を波長に応じて前記複数の検出ユニットに配分する光配分部とを備える請求項１から請求項６のいずれかに記載の顕微鏡システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡システムに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、共焦点顕微鏡により標本からの蛍光を検出して得られた標本の画像に対して、コンボリューション演算フィルタ処理を施して高周波数成分を強調することで、光学分解能以上の分解能を有する超解像画像を生成する顕微鏡システムが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−２００８３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ここで、光学分解能以上の分解能を得るには、高感度検出器（ＧａＡｓＰなど）により一定数以上のフォトンを検出してフォトンノイズを除去し、超解像画像を生成する元画像の高周波成分の比率を大きくする必要があるが、検出するフォトン数を増やすためにレーザ強度を上げたのでは、標本から発せられる蛍光の強度が強くなりすぎて高感度検出器が飽和してしまうことがある。そのため、レーザ光の強度を高感度検出器が飽和しない程度に抑え、標本の同一範囲においてレーザ光を複数回走査させるとともに、走査ごとに標本の同一範囲からの蛍光を検出することで、一定数以上のフォトンを検出する必要がある。
【０００５】
しかしながら、生細胞の観察では観察対象が動いてしまう可能性があり時間が分解能に影響するため、できるだけ短時間で一定数以上のフォトンを検出する必要があるところ、上記の方法では、標本の同一範囲の走査を繰り返す分だけ時間が掛かり、光学分解能以上の所望の分解能を得ることが困難という問題がある。
【０００６】
本発明は、より短時間で一定数以上のフォトンを検出して、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成することができる顕微鏡システムを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源から発せられた連続レーザ光を標本上で走査させる走査部と、該走査部により走査された前記連続レーザ光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に開口し、前記対物レンズにより集光されて前記走査部によりディスキャンされた前記戻り光を部分的に通過させるピンホールと、該ピンホールを通過した前記戻り光を同一波長のまま複数の光路に分割する光分割部と、該光分割部により分割された各前記光路の戻り光をそれぞれ検出して該戻り光の輝度に相当する光強度信号を出力する複数の光検出部と、これら光検出部ごとに、前記光強度信号に基づいて前記標本の画像データを取得する画像データ取得部と、前記走査部により前記連続レーザ光が繰り返し走査されて該走査ごとに各前記光検出部により検出される前記標本の同一範囲からの戻り光の前記光強度信号に基づいて前記画像データ取得部により取得される、前記標本の同一範囲における複数の前記画像データを合成する画像データ合成部と、該画像データ合成部により前記画像データが合成されて得られた最終合成画像データに対して高周波成分を強調する画像演算処理を施す演算処理部とを備える顕微鏡システムを提供する。
また、本発明は、光源から発せられた短パルスレーザ光を標本上で走査させる走査部と、該走査部により走査された前記短パルスレーザ光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズと前記走査部との間に配され、前記標本からの前記戻り光を前記短パルスレーザ光の光路から分岐させる光分岐部と、該光分岐部により分岐された前記戻り光を同一波長のまま複数の光路に分割する光分割部と、該光分割部により分割された各前記光路の戻り光をそれぞれ検出して該戻り光の輝度に相当する光強度信号を出力する複数の光検出部と、これら光検出部ごとに、前記光強度信号に基づいて前記標本の画像データを取得する画像データ取得部と、前記走査部により前記短パルスレーザ光が繰り返し走査されて該走査ごとに各前記光検出部により検出される前記標本の同一範囲からの戻り光の前記光強度信号に基づいて前記画像データ取得部により取得される、前記標本の同一範囲における複数の前記画像データを合成する画像データ合成部と、該画像データ合成部により前記画像データが合成されて得られた最終合成画像データに対して高周波成分を強調する画像演算処理を施す演算処理部とを備える顕微鏡システムを提供する。
【０００８】
本発明によれば、光源からのレーザ光が走査部により標本の同一範囲において繰り返し走査されて、各光検出部によりレーザ光の走査ごとにその戻り光が検出されることで、レーザ光の強度を上げて強度が強い蛍光を１回で検出する場合のように光検出部を飽和させることなく一定数以上のフォトンを検出することができる。そして、各光検出部から出力される光強度信号に基づいて画像データ取得部により取得される標本の同一範囲における画像データを画像データ合成部により合成することで、フォトンノイズが除去された高周波数成分の比率が大きい最終合成画像データを生成することができる。したがって、この最終合成画像データに対して演算処理部により演算処理を施すことで、最終合成画像データの高周波成分を効率的に強調することができる。
【０００９】
この場合において、標本の同一範囲の走査を繰り返す分だけ時間が掛かるが、標本の同一範囲からの戻り光を同一波長のまま複数の光路に分割して各光検出部により検出することで、一定数以上のフォトンを検出する検出時間を短縮することができる。したがって、検出時間の影響によって分解能を低下させることなく、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成することができる。
【００１０】
上記発明においては、前記画像データ合成部が、前記光検出部ごとに取得された前記標本の同一範囲における複数の画像データを加算または加算平均することにより、前記標本の同一範囲における前記最終合成画像データを生成することとしてもよい。
【００１１】
このように構成することで、複数の画像データを加算する分だけ、画像データ取得部より取得される光検出部ごとの標本の同一範囲における画像データよりも、フォトンノイズが除去されて高周波数成分の比率が大きい最終合成画像データを生成することができる。
【００１２】
上記発明においては、前記画像データ合成部が、前記光検出部ごとに取得された前記標本の同一範囲における複数の画像データを加算または加算平均することにより、前記光検出部ごとの光検出部合成画像データを生成し、前記光検出部ごとに生成された複数の前記光検出部合成画像データを加算または加算平均することにより、前記標本の同一範囲における前記最終合成画像データを生成することとしてもよい。
【００１３】
このように構成することで、レーザ光を繰り返し走査させる分だけ、フォトンノイズが除去されて高周波数成分の比率が大きい光検出部合成画像データを光検出部ごとに生成し、さらに、光検出部の数だけ、フォトンノイズが除去されて高周波数成分の比率が大きい最終合成画像データを生成することができる。
【００１４】
上記発明においては、前記複数の光検出部が、検出するフォトン数に対する感度特性が略同一になるように光検出部ゲインを調整する光検出部ゲイン調整制御部を備えることとしてもよい。この場合、前記光検出部ゲイン調整制御部が、検出するフォトン数に対する前記複数の光検出部の感度特性が略同一になるように、最初に設定された１つの光検出部ゲインを基に、他の光検出部ゲインを求めて補正することとしてもよい。
このように構成することで、光分割部により強度が等分された戻り光を各光検出部により検出した場合に、光検出部ゲイン調整制御部による光検出部ゲインの調整により、各光検出部から略同一の光強度信号を出力させて、光検出部ごとに標本の同一範囲における略同一の画像データを取得することができる。
【００１５】
上記発明においては、前記複数の光検出部と前記光分割部とを有する複数の検出ユニットと、前記標本からの戻り光を同一波長のまま前記複数の検出ユニットに配分する光配分部とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、各検出ユニットにおいて、光配分部により同一波長のまま配分された標本からの戻り光が光分割部により同一波長のまま光路を分割されて各光検出部により検出される。したがって、これらの光検出部により、強度が強い蛍光のフォトンをより短時間で検出することができる。
【００１６】
上記発明においては、前記複数の光検出部と前記光分割部とを有する複数の検出ユニットと、前記標本からの戻り光を波長に応じて前記複数の検出ユニットに配分する光配分部とを備えることとしてもよい。
このように構成することで、各検出ユニットにおいて、光配分部により波長に応じて配分された標本からの戻り光が光分割部により同一波長のまま光路を分割されて各光検出部により検出される。したがって、これらの光検出部により、波長ごとに強度が強い蛍光のフォトンを短時間で検出することができる。
【００１７】
上記発明においては、前記光源から発せられる前記レーザ光が連続レーザ光であり、前記走査部により走査された前記連続レーザ光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る前記戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズの焦点位置と光学的に共役な位置に開口し、前記対物レンズにより集光されて前記走査部によりディスキャンされた前記戻り光を部分的に通過させるピンホールとを備え、前記光検出部が、前記ピンホールを通過して前記光分割部により光路が分割された前記戻り光を検出する。
【００１８】
このように構成することで、光源から発せられた連続レーザ光が対物レンズによって標本に照射されることにより標本から戻る戻り光の内、標本における対物レンズの焦点位置において発生した戻り光のみがピンホールを通過して、光分割部により分割された光路ごとに各光検出部により検出される。したがって、１光子励起観察により、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成して標本を観察することができる。
【００１９】
上記発明においては、前記光源から発せられる前記レーザ光が短パルスレーザ光であり、前記走査部により走査された前記短パルスレーザ光を前記標本に照射する一方、該標本から戻る前記戻り光を集光する対物レンズと、該対物レンズと前記走査部との間に配され、前記標本からの前記戻り光を前記短パルスレーザ光の光路から分岐させる光分岐部とを備え、前記光検出部が、前記光分岐部により分岐されて前記光分割部により光路が分割された前記戻り光を検出する。
【００２０】
このように構成することで、光源から発せられた短パルスレーザ光が対物レンズによって標本に照射されることにより、標本における対物レンズの焦点位置において発生した戻り光が走査部に戻らずに光分岐部により分岐され、光分割部により分割された光路ごとに各光検出部により検出される。したがって、多光子励起観察により、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成して標本を観察することができる。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、より短時間で一定数以上のフォトンを検出して、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。
【図２】図１の検出ユニットを示す概略構成図である。
【図３】ＰＭＴごとの光検出部合成画像データと、これらを加算平均した最終合成画像データを元画像として生成した超解像画像の一例を示す図である。
【図４】ＰＭＴごとの陽極感度値とＨＶ値の分布を示すマッピンググラフの一例を示す図である。
【図５】本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムの２つの検出ユニットを示す概略構成図である。
【図６】４つのＰＭＴの光検出部合成画像データと、これらを加算平均した最終合成画像データを元画像として生成した超解像画像の一例を示す図である。
【図７】検出ユニットごとに検出波長が異なる２つ１組のＰＭＴの光検出部合成画像データと、これらを検出波長ごとに加算平均した最終合成画像データを元画像として生成した超解像画像の一例を示す図である。
【図８】本発明の第３実施形態に係る顕微鏡システムを示す概略構成図である。
【図９】図８の検出ユニットを示す概略構成図である。
【図１０】本発明の各実施形態の変形例としてのＰＭＴごとの光検出部合成画像データと、これらを加算した最終合成画像データを元画像として生成した超解像画像の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る顕微鏡システムについて図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図１に示すように、１光子励起観察用の構成を有している。すなわち、顕微鏡システム１は、連続レーザ光（以下、レーザ光という。）を発生する連続レーザ光源（光源）３と、連続レーザ光源３から発せられたレーザ光を偏向するスキャナ（走査部）５と、スキャナ５により偏向されたレーザ光を生細胞のような標本Ｓに照射する一方、標本Ｓにおいて発生した蛍光（戻り光）を集光する対物レンズ７と、対物レンズ７により集光された蛍光をレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー９と、ダイクロイックミラー９により分岐された蛍光を集光する共焦点レンズ１１と、共焦点レンズ１１により集光された蛍光の通過を制限するピンホール１３と、ピンホール１３を通過した蛍光を平行光にするコリメートレンズ１５と、コリメートレンズ１５により平行光にされた蛍光を検出する検出ユニット１７とを備えている。
【００２４】
また、顕微鏡システム１には、スキャナ５を駆動する駆動装置１９と、検出ユニット１７および駆動装置１９を制御したり画像を生成したりするＰＣ（Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ、画像データ取得部、画像データ合成部、演算処理部）２１と、ＰＣ２１により生成された画像等を表示するモニタ２３と、ユーザが設定する観察条件等を記憶する記憶装置２５とが備えられている。
【００２５】
スキャナ５は、例えば、互いに近接配置された一対のガルバノミラー（図示略）を備え、これら一対のガルバノミラーによりダイクロイックミラー９からのレーザ光を偏向するようになっている。一対のガルバノミラーは、それぞれレーザ光の光軸に交差する軸回りに揺動角度を制御可能に設けられている。一方のガルバノミラーは、他方のガルバノミラーに対して揺動速度が十分に速く設定されている。高速側のガルバノミラーは標本Ｓ上でレーザ光を主走査方向（Ｘ軸方向）に走査し、低速側のガルバノミラーは標本Ｓ上における走査位置を副走査方向（Ｙ軸方向）に移動させるようなっている。
【００２６】
ダイクロイックミラー９は、連続レーザ光源３からのレーザ光をスキャナ５に向けて透過させる一方、標本Ｓから対物レンズ７およびスキャナ５を介してレーザ光の光路を戻る蛍光を共焦点レンズ１１に向けて反射するようになっている。
ピンホール１３は、対物レンズ７の瞳位置と共役な位置に開口しており、標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置において発生した蛍光のみを通過させることができるようになっている。このピンホール１３は、ＰＣ２１の制御により開口径を変更することができるようになっている。
【００２７】
検出ユニット１７は、図２に示すように、コリメートレンズ１５からの蛍光を反射する反射ミラー２７と、反射ミラー２７により反射された蛍光を２つの光路に分割するビームスプリッタ（光分割部）３１と、ビームスプリッタ３１により分割された一方の光路の蛍光を検出する検出部３３Ａ（１ｃｈ）と、他方の光路の蛍光を反射する反射ミラー３５と、反射ミラー３５により反射された蛍光を検出する検出部３３Ｂ（２ｃｈ）とを備えている。
【００２８】
反射ミラー２７は、所定の回転軸回りに回転可能なターレット３７により保持されている。ターレット３７は、反射ミラー２７と共に周方向に間隔をあけて配されたビームスプリッタ（光配分部）２８やダイクロイックミラー（光配分部）２９等を保持しており、回転軸回りに回転することにより、反射ミラー２７、ビームスプリッタ２８またはダイクロイックミラー２９等を蛍光の光路上に選択的に配置することができるようになっている。
【００２９】
ビームスプリッタ３１は、所定の回転軸回りに回転可能なターレット３９により保持されている。このビームスプリッタ３１は、反射ミラー２７からの蛍光を同一波長のまま強度を２等分し、一方の蛍光を検出部３３Ａに向けて反射する一方、他方の蛍光を反射ミラー３５に向けて透過させるようになっている。ターレット３９は、ビームスプリッタ３１と共に周方向に間隔をあけて配された反射ミラー３２等を保持しており、回転軸回りに回転することにより、ビームスプリッタ３１または反射ミラー３２等を蛍光の光路上に選択的に配置することができるようになっている。
【００３０】
検出部３３Ａおよび検出部３３Ｂは、互いに同一の構成を有している。具体的には、検出部３３Ａ，３３Ｂは、入射した蛍光を波長ごとに分光するグレーティング（分光素子）４１Ａ，４１Ｂと、グレーティング４１Ａ，４１Ｂにより分光された蛍光を反射する波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂと、波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂにより反射された蛍光を波長ごとに集光する結像レンズ４５Ａ，４５Ｂと、結像レンズ４５Ａ，４５Ｂにより集光された蛍光の内、一部の波長のみを通過させるスリット４７Ａ，４７Ｂと、スリット４７Ａ，４７Ｂを通過した蛍光を検出するＰＭＴ（Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ  Ｔｕｂｅ、光検出部）４９Ａ，４９Ｂとを備えている。
【００３１】
波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂは、ＰＣ２１により制御されて所定の揺動軸回りに揺動角度を変更されることで、グレーティング４１Ａ，４１Ｂにより波長ごとに分光された蛍光の内、スリット４７Ａ，４７Ｂを通過させる波長を切り替えることができるようになっている。
【００３２】
ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂは、例えば、ＧａＡｓＰ（Ｇａｌｌｉｕｍ  Ａｒｓｅｎｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｉｄｅ）型の高感度検出器であり、スリット４７Ａ，４７Ｂを通過した蛍光を検出して、その蛍光の輝度に相当する光強度信号をＰＣ２１に送るようになっている。
【００３３】
ＰＣ２１は、スキャナ５の各ガルバノミラーの揺動角度、波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂの揺動角度、ターレット３７，３９の回転動作およびピンホール１３の開口経等を制御するようになっている。また、ＰＣ２１は、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂから送られてくる光強度信号とスキャナ５の各ガルバノミラーの揺動角度に対応するレーザ光の走査位置に関する走査位置信号とに基づいて標本Ｓの画像データを生成するようになっている。
【００３４】
また、ＰＣ２１は、通常の蛍光画像データを生成する通常観察モードと、通常の蛍光画像データよりも解像度が高い超解像画像データを生成する超解像モードとを切り替えて実行することができるようになっている。超解像モードにおいては、ＰＣ２１は、スキャナ５の高速側のガルバノミラーにより標本Ｓ上で主走査方向における同一の走査ラインごとにレーザ光を複数回走査させてから、低速側のガルバノミラーによりレーザ光の走査位置を副走査方向に移動させていくとともに、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂによりその同一の走査ラインからの蛍光を走査ごとに検出させて、標本Ｓにおける同一範囲の画像データを複数取得するようになっている。
【００３５】
また、ＰＣ２１は、取得した標本Ｓの同一範囲における複数の画像データをＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとに加算平均してそれぞれ１枚の光検出部合成画像データを生成するようになっている。また、ＰＣ２１は、生成したＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとの光検出部合成画像データどうしを加算平均して１枚の最終合成画像データを生成するようになっている。さらに、ＰＣ２１は、生成した最終合成画像データを元画像として、この最終合成画像データに高周波成分を強調するコンボリューションフィルタを適用した画像演算処理を施して超解像画像を生成するようになっている。
【００３６】
また、ＰＣ２１は、超解像モードでは、光路条件自動設定および撮像条件自動設定を行うようになっている。ＰＣ２１は、光路条件自動設定として、例えば、蛍光の光路上にビームスプリッタ３１が配置されるようにターレット３９を制御するとともに、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂにより同一波長の蛍光が検出されるように波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂの揺動角度を制御するようになっている。また、ＰＣ２１は、撮像条件自動設定として、例えば、標本Ｓの同一範囲からの蛍光を繰り返し検出するサンプリングピッチの設定と、ピンホール１３の開口径の設定と、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとに加算する蛍光画像データの加算回数の設定と、コンボリューションフィルタの選定とを行うようになっている。
【００３７】
このように構成された顕微鏡システム１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１により標本Ｓの超解像画像を生成する場合は、まず、図示しないマウスやキーボード等により、ユーザが手動で対物レンズ７の倍率とＮＡ、レーザ光の波長、波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂによる選択波長情報および画像サイズ等の観察条件を設定し、記憶装置２５に記憶させる。
【００３８】
次いで、通常観察モードにより画像データの画質を調整する。
画質の調整は、ターレット３９により反射ミラー３２を蛍光の光路に配置し、光路長が短いＰＭＴ４９Ａを用いて行うこととすればよい。この場合、図１に示すように、連続レーザ光源３から発せられたレーザ光は、ダイクロイックミラー９を透過してスキャナ５により偏向された後、対物レンズ７により標本Ｓに照射される。これにより、スキャナ５の各ガルバノミラーの揺動動作に応じて、標本Ｓ上でレーザ光が２次元的に走査される。
【００３９】
レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生する蛍光は、対物レンズ７により集光されてレーザ光の光路を戻り、スキャナ５を介してダイクロイックミラー９によりレーザ光の光路から分岐される。そして、蛍光は、共焦点レンズ１１により集光されて一部がピンホール１３を通過した後、コリメートレンズ１５により平行光にされて検出ユニット１７に入射される。
【００４０】
検出ユニット１７に入射した蛍光は、反射ミラー２７および反射ミラー３２を介して検出部３３Ａに入射し、グレーティング４１Ａにより波長ごとに分光される。そして、蛍光は、波長選択ミラー４３Ａにより反射されて結像レンズ４５Ａにより集光され、スリット４７Ａを通過してＰＭＴ４９Ａにより検出される。
【００４１】
次いで、ＰＭＴ４９Ａにより、検出された蛍光の輝度に相当する光強度信号がＰＣ２１に送られる。そして、ＰＣ２１により、その光強度信号とレーザ光の走査位置信号とに基づいて標本Ｓの蛍光画像データが生成され、モニタ２３に表示される。ユーザはモニタ２３に表示された画像を見ながら画質を調整する。
【００４２】
次に、ユーザが超解像条件の取り込みをＰＣ２１に指示し、超解像モードに切り替える。
超解像モードでは、ＰＣ２１により、ターレット３９が制御されて蛍光の光路上にビームスプリッタ３１が配置されるとともに、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂにより同一波長の蛍光が検出されるよう波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂの揺動角度が制御される。また、ＰＣ２１により、ＰＭＴ４９Ｂが作動され、ＰＭＴ４９Ａと同一のＨＶ（Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ）がＰＭＴ４９Ｂに設定される。
【００４３】
次いで、ＰＣ２１により、スキャナ５のガルバノミラーの振り幅が調整され、スキャナズーム値が設定される（例えば、４０ｎｍ／Ｐｉｘｅｌ）。また、ＰＣ２１により、ピンホール１３の開口が１ＡｉｒｙＤｉｓｋよりも小さい径に設定される。また、ＰＣ２１により、蛍光画像データの加算処理が有効な状態に設定される。また、ＰＣ２１により、記憶装置２５に記憶されている対物レンズ７の情報、照射する励起光の波長情報および検出する蛍光の波長情報に基づき、演算処理用のコンボリューションフィルタが選定される。
【００４４】
この状態で、ＰＣ２１により画像データの取得が行われる。
超解像モードでは、通常の観察モードと同様に、連続レーザ光源３から発せられたレーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光が、検出ユニット１７に入射して反射ミラー２７により反射される。そして、蛍光はビームスプリッタ３１により同一波長のまま強度が等分されて２つの光路に分割され、一方の光路の蛍光が検出部３３Ａに入射され、他方の光路の蛍光が反射ミラー３５を介して検出部３３Ｂに入射される。
【００４５】
これら検出部３３Ａ，３３Ｂにおいては、入射した蛍光がそれぞれグレーティング４１Ａ，４１Ｂにより波長ごとに分光されて波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂにより反射された後、結像レンズ４５Ａ，４５Ｂにより集光されて、互いに同一波長の蛍光がスリット４７Ａ，４７Ｂを通過してＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂにより検出される。
【００４６】
超解像モードにおいては、ＰＣ２１によりスキャナ５が制御されて、主走査方向における同一の走査ラインごとにレーザ光が繰り返し走査され、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂにより、予め設定されたサンプリングピッチで同一の走査ラインごとに蛍光が繰り返し検出される。
【００４７】
この場合、ビームスプリッタ３１により同一波長のまま強度が等分された標本Ｓの同一範囲からの蛍光がＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂによりそれぞれ検出されるので、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂからの光強度信号に基づいて、ＰＣ２１によりＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ間で標本Ｓの略同一の蛍光画像データを複数取得することができる。
【００４８】
次いで、ＰＣ２１により、取得された標本Ｓの同一範囲の複数の画像データがＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとに加算平均されて、図３に示すような２枚の光検出部合成画像データが生成される。また、ＰＣ２１により、生成されたＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとの光検出部合成画像データどうしが加算平均されて、１枚の最終合成画像データが生成される。そして、ＰＣ２１により、生成された最終合成画像データを元画像として、この最終合成画像データに高周波成分を強調するコンボリューションフィルタを適用した画像演算処理が施される（Ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）。
【００４９】
ここで、スキャナ５により標本Ｓの同一範囲においてレーザ光が繰り返し走査されて、各ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂによりレーザ光の走査ごとに標本Ｓからの蛍光が検出されることで、レーザ光の強度をＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂが飽和しない程度に抑えつつ、一定数以上のフォトンを検出することができる。
【００５０】
そして、ＰＣ２１により、各ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂから出力される光強度信号に基づいて取得される標本Ｓの同一範囲における複数の蛍光画像データをＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとに加算平均するとともに、加算平均したＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとの光検出部合成画像データどうしをさらに加算平均することで、フォトンノイズが除去された高周波数成分の比率が大きい１枚の最終合成画像データを生成することができる。したがって、この最終合成画像データに対して画像演算処理を施すことで、最終合成画像データの高周波成分を効率的に強調することができる。
【００５１】
この場合において、生細胞のような標本Ｓを観察する場合は、観察対象が動いてしまう可能性があるため、時間を掛け過ぎると分解能に影響を与えてしまうが、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、標本Ｓの同一範囲を繰り返し走査しても、標本Ｓの同一範囲からの蛍光を同一波長のまま複数の光路に分割して各ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂにより同時に検出することで、一定数以上のフォトンを検出する検出時間を短縮することができる。したがって、検出時間の影響によって分解能を低下させることなく、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成することができる。
【００５２】
また、２つのＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂを用いることで、ＰＭＴが１つの場合よりもレーザ光の強度を上げて単位時間に取得するフォトン数を増加することができる。このようにすることで、より少ない加算回数で目標の分解能を得ることができる。また、各ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ当たりの単位時間に検出するフォトン数は変更しないため、印加するＨＶを下げ過ぎてＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂの負荷が増加するのを防ぐことができる。また、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとの光検出部合成画像データの合成処理時間は、顕微鏡システム１の撮像時間（例えば、５１２×５１２、１ｓｅｃ／ｆｒａｍｅ）と比較して小さい（１０−１００ｍｓオーダー）ため、単一のＰＭＴにより加算処理を繰り返して最終合成画像を生成するよりも時間的に優位となる。
【００５３】
本実施形態においては、一変形例として、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂが、検出するフォトン数に対して略同一の感度特性（輝度値）となるように、ＰＣ（光検出部ゲイン調整制御部）２１が、これらＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂに印加するＨＶ（光検出部ゲイン）を調整することとしてもよい。この場合、画質調整用のＰＭＴ４９ＡのＨＶ（光検出部ゲイン）を基準にして、ＰＭＴ４９Ｂに印加するＨＶ（光検出部ゲイン）を補正することとしてもよい。
【００５４】
例えば、図４に示すような、ＧａＡｓＰ検出器の陽極感度値とＨＶ値との関係を示すマッピンググラフＡを、ＰＭＴ４９Ａ、４９Ｂごとに記憶装置２５に記憶させておく。図４において、縦軸は陽極感度を示し、横軸はＨＶを示している。
【００５５】
次に、基準となるｃｈ１のＰＭＴ４９Ａに印加するＨＶを調整して画像の明るさを最適化し、ＰＣ２１により、このときのＰＭＴ４９ＡのＨＶを読み込む。次いで、ＰＣ２１により、読み込んだｃｈ１のＰＭＴ４９ＡのＨＶに対応する陽極感度をマッピンググラフＡにおいて特定し、特定した陽極感度を補正対象であるｃｈ２のＰＭＴ４９Ｂにおいて実現するためのＰＭＴ４９ＢのＨＶをマッピンググラフＡにおいて特定する。そして、ＰＭＴ４９Ｂに印加するＨＶをマッピンググラフＡ上で特定したＰＭＴ４９ＢのＨＶとなるように調整する。
【００５６】
このようにすることで、ビームスプリッタ３１により同一波長のまま強度を等分された各蛍光をＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂによりそれぞれ検出した場合に、各ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂから略同一の光強度信号を出力させて、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ間で標本Ｓの同一範囲における同一の蛍光画像データを取得することができる。
ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとの光検出部合成画像データどうしを加算平均する場合は、輝度値の単位を合わせる必要があるため特に有効となる。
【００５７】
なお、上記ではＰＭＴ４９Ａと４９ＢのＨＶに対応する陽極感度のマッピンググラフＡを用いてＰＭＴ４９ＡのＨＶからＰＭＴ４９ＢのＨＶを求めたが、ＰＭＴ４９Ａ、ＰＭＴ４９Ｂ毎のＨＶに対する陽極感度の関係式を解くことにより、ＰＭＴ４９ＡのＨＶからＰＭＴ４９ＢのＨＶを算出してもよい。
【００５８】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る顕微鏡システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１は、図５に示すように、第１検出ユニット１７Ａ（検出ユニット１７）に加えて第２検出ユニット１７Ｂを備える点で第１実施形態と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡システム１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００５９】
第１検出ユニット１７Ａは、ビームスプリッタ２８により、標本Ｓからの蛍光を同一波長のまま強度を等分して第１検出ユニット１７Ａと第２検出ユニット１７Ｂとに配分することができるようになっている。
【００６０】
第２検出ユニット１７Ｂは、第１検出ユニット１７Ａのビームスプリッタ２８を透過してきた蛍光を反射する反射ミラー５１と、反射ミラー５１により反射された蛍光を２つの光路に分割するビームスプリッタ（光分割部）５３と、ビームスプリッタ５３により分割された一方の光路の蛍光を検出する検出部３３Ｃ（３ｃｈ）と、他方の光路の蛍光を反射する反射ミラー５５と、反射ミラー５５により反射された蛍光を検出する検出部３３Ｄ（４ｃｈ）とを備えている。
【００６１】
反射ミラー５１は、反射ミラー２７と同様に、所定の回転軸回りに回転可能なターレット５７により保持されており、ターレット５７を回転軸回りに回転することにより、蛍光の光路上に選択的に配置することができるようになっている。
【００６２】
ビームスプリッタ５３は、ビームスプリッタ３１と同様に、所定の回転軸回りに回転可能なターレット５９により保持されており、ターレット５９を回転軸回りに回転させることにより、蛍光の光路上に選択的に配置されるようになっている。このビームスプリッタ５３は、反射ミラー５１からの蛍光を同一波長のまま強度を２等分し、一方の蛍光を検出部３３Ｃに向けて反射する一方、他方の蛍光を反射ミラー５５に向けて透過させるようになっている。
【００６３】
検出部３３Ｃおよび検出部３３Ｄは、それぞれ検出部３３Ａおよび検出部３３Ｂと同一の構成を有している。具体的には、これら検出部３３Ｃ，３３Ｄは、グレーティング（分光素子）４１Ｃ，４１Ｄと、波長選択ミラー４３Ｃ，４３Ｄと、結像レンズ４５Ｃ，４５Ｄと、スリット４７Ｃ，４７Ｄと、ＰＭＴ（光検出部）４９Ｃ，４９Ｄとを備えている。
【００６４】
波長選択ミラー４３Ｃ，４３Ｄは、ＰＣ２１により制御されて所定の揺動軸回りに揺動角度を変更されることで、グレーティング４１Ｃ，４１Ｄにより波長ごとに分光された蛍光の内、スリット４７Ｃ，４７Ｄを通過させる波長を切り替えることができるようになっている。
ＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄは、例えば、ＧａＡｓＰ型の高感度検出器であり、スリット４７Ｃ，４７Ｄを通過した蛍光を検出して、その蛍光の輝度に相当する光強度信号をＰＣ２１に送るようになっている。
【００６５】
このように構成された顕微鏡システム１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム１により標本Ｓの超解像画像を生成する場合は、ユーザが手動で対物レンズ７の倍率とＮＡ、レーザ光の波長、波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂ，４３Ｃ，４３Ｄによる選択波長情報および画像サイズ等の観察条件を設定して、ＰＭＴ４９Ａを用いて画像を調整する。
【００６６】
次に、超解像モードでは、ＰＣ２１により、ターレット５９が制御されて蛍光の光路上にビームスプリッタ５３が配置されるとともに、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄにより同一波長の蛍光が検出されるように波長選択ミラー４３Ａ，４３Ｂ，４３Ｃ，４３Ｄの揺動角度が制御される。また、ＰＣ２１により、ＰＭＴ４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄがそれぞれ作動させられ、ＰＭＴ４９Ａと同一のＨＶがそれぞれに設定される。
【００６７】
この状態で、ＰＣ２１により画像データの取得が開始される。連続レーザ光源３から発せられたレーザ光が照射されることにより標本Ｓにおいて発生した蛍光は、第１検出ユニット１７Ａに入射して、ビームスプリッタ２８により同一波長のまま強度を等分されて２つの光路に分割される。一方の光路の蛍光は、ビームスプリッタ３１により同一波長のままさらに強度が等分されて２つの光路に分割され、第１実施形態と同様に、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂによりそれぞれ検出される。
【００６８】
他方の光路の蛍光は、第２検出ユニット１７Ｂに入射して、反射ミラー５１により反射される。そして、蛍光は、ビームスプリッタ５３により同一波長のまま強度が等分されて２つの光路に分割され、一方の光路の蛍光が検出部３３Ｃに入射し、他方の光路の蛍光が反射ミラー５５を介して検出部３３Ｄに入射する。
【００６９】
これら検出部３３Ｃ，３３Ｄにおいては、入射した蛍光がそれぞれグレーティング４１Ｃ，４１Ｄにより波長ごとに分光されて波長選択ミラー４３Ｃ，４３Ｄにより反射された後、結像レンズ４５Ｃ，４５Ｄにより集光される。そして、互いに同一の波長の蛍光がスリット４７Ｃ，４７Ｄを通過してＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄにより検出される。
【００７０】
本実施形態においても、ＰＣ２１の制御により、標本Ｓにおける同一の走査ラインごとにレーザ光が繰り返し走査され、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄにより、予め設定されたサンプリングピッチで同一の走査ラインごとに蛍光が繰り返し検出される。
【００７１】
この場合、ビームスプリッタ２８，３１，５３により同一波長のまま強度が等分された標本Ｓの同一範囲からの蛍光がＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄによりそれぞれ検出されるので、これらＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄからの光強度信号に基づいて、ＰＣ２１によりＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄ間で標本Ｓの略同一の蛍光画像データを複数取得することができる。
【００７２】
次いで、ＰＣ２１により、取得された標本Ｓの同一範囲の複数の画像データがＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄごとに加算平均されて、図６に示すような４枚の光検出部合成画像データが生成される。また、ＰＣ２１により、生成されたＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄごとの光検出部合成画像データどうしが加算平均されて１枚の最終合成画像データが生成され、この最終合成画像データを元画像として超解像画像が生成される。
【００７３】
以上、本実施形態に係る顕微鏡システム１によれば、標本Ｓの同一範囲からの蛍光を同一波長のまま強度を等分して複数の光路に分割し、４つのＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄによりそれぞれ略同時に検出することで、強度が強い蛍光のフォトンをより短時間で検出することができる。
【００７４】
本実施形態は、ビームスプリッタ２８を採用してＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄにより同一波長の蛍光を検出することとした。これらに代えて、例えば、標本Ｓからの蛍光を波長に応じて各検出ユニット１７Ａ，１７Ｂに配分するダイクロイックミラー（光配分部、図５参照。）２９を採用し、第１検出ユニット１７Ａと第２検出ユニット１７Ｂとで異なる波長の蛍光を検出することとしてもよい。
【００７５】
この場合、同一波長の蛍光を検出するＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ間およびＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄ間でそれぞれ同一のＨＶ値を設定することとすればよい。また、ダイクロイックミラー２９を蛍光の光路上に配置し、標本Ｓからの蛍光を波長に応じて第１検出ユニット１７Ａと第２検出ユニット１７Ｂとに配分することとすればよい。そして、各検出ユニット１７Ａ，１７Ｂにおいて、異なる波長の蛍光をビームスプリッタ３１またはビームスプリッタ５３により、それぞれ同一波長のまま強度を等分して光路を２分割し、各ＰＭＴ４９Ａ，４９ＢまたはＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄによりそれぞれ検出することとすればよい。
【００７６】
本変形例においては、第１検出ユニット１７Ａにおいて、ビームスプリッタ３１により同一波長のまま強度を等分された一方の波長の蛍光がＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂによりそれぞれ検出され、第２検出ユニット１７Ｂにおいて、ビームスプリッタ５３により同一波長のまま強度を等分された他方の波長の蛍光がＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄによりそれぞれ検出されるので、ＰＣ２１において、これらＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄからの光強度信号に基づいて、ＰＭＴ４９Ａ，４９ＢごとおよびＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄごとにそれぞれ標本Ｓの略同一の蛍光画像データを取得することができる。
【００７７】
この場合、図７に示すように、ＰＣ２１により、取得した標本Ｓの同一範囲の画像データをＰＭＴ４９Ａ，４９ＢごとおよびＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄごとに加算平均してそれぞれ２枚の光検出部合成画像データを生成し、生成したＰＭＴ４９Ａ，４９ＢごとおよびＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄごとの光検出部合成画像データどうしを加算平均してそれぞれ１枚の最終合成画像データを生成することとすればよい。そして、ＰＣ２１により、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂの最終合成画像データとＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄの最終合成画像データとを元画像としてそれぞれ超解像画像を生成することとすればよい。
【００７８】
本変形例によれば、標本Ｓの同一範囲からの蛍光を波長に応じて複数の光路に分割し、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂ間で同一波長の蛍光を強度を等分して略同時に検出するとともに、ＰＭＴ４９Ｃ，４９Ｄ間で他の同一波長の蛍光を強度を当分して略同時に検出することで、波長ごとに強度が強い蛍光のフォトンを短時間で検出して、光学分解能以上の所望の分解能を有する異なる波長の超解像画像を生成することができる。
【００７９】
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る顕微鏡システムについて説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム６１は、図８に示すように、多光子励起観察を行う構成である点で、１光子励起観察を行う構成である第１実施形態に係る顕微鏡システム１と異なる。
以下、第１実施形態に係る顕微鏡システム１と構成を共通する箇所には、同一符号を付して説明を省略する。
【００８０】
顕微鏡システム６１は、連続レーザ光源３と、ダイクロイックミラー９と、検出ユニット１７とに代えて、短パルスレーザ光（以下、レーザ光という。）を発生する超短パルスレーザ光源（光源）６３と、標本Ｓからの蛍光をスキャナ５に戻さずにレーザ光の光路から分岐させるダイクロイックミラー（光分岐部）６５と、検出ユニット６７とを備えている。
【００８１】
ダイクロイックミラー６５は、スキャナ５と対物レンズ７との間に配されており、スキャナ５からのレーザ光を対物レンズ７に向けて透過する一方、対物レンズ７により集光された標本Ｓからの蛍光を検出ユニット６７に向けて反射するようになっている。
【００８２】
検出ユニット６７は、図９に示すように、反射ミラー２７と、ビームスプリッタ３１と、反射ミラー３５と、検出部６９Ａ（１ｃｈ）と、検出部６９Ｂ（２ｃｈ）とを備えている。
【００８３】
検出部６９Ａおよび検出部６９Ｂは、互いに同一の構成を有している。具体的には、これら検出部６９Ａ，６９Ｂは、同一の波長選択特性を有する波長選択フィルタ７１Ａ，７１Ｂと、これら波長選択フィルタ７１Ａ，７１Ｂを保持するターレット７３Ａ，７３Ｂと、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂとを備えている。
【００８４】
ターレット７３Ａ，７３Ｂは、所定の回転軸回りに回転可能に設けられ、回転軸回りに回転することにより、蛍光の光路に波長選択フィルタ７１Ａ，７１Ｂを配置することができるようになっている。
【００８５】
このように構成された顕微鏡システム６１の作用について説明する。
本実施形態に係る顕微鏡システム６１により標本の超解像画像を生成する場合は、ＰＣ２１により、ターレット７３Ａ，７３Ｂが制御されて蛍光の光路上に波長選択フィルタ７１Ａ，７１Ｂが配置される。
【００８６】
この状態で、超短パルスレーザ光源６３から発せられたレーザ光は、スキャナ５により偏向されてダイクロイックミラー６５を透過した後、対物レンズ７により標本に照射される。また、レーザ光が照射されることにより標本Ｓにおける対物レンズ７の焦点位置において発生した蛍光は、対物レンズ７により集光された後、スキャナ５に戻らずにダイクロイックミラー６５によりレーザ光の光路から分岐されて検出ユニット６７に入射される。
【００８７】
検出ユニット６７に入射した蛍光は、反射ミラー２７により反射されてビームスプリッタ３１により同一波長のまま強度を等分されて２つの光路に分割される。そして、ビームスプリッタ３１により反射された一方の光路の蛍光の内、波長選択フィルタ―７１Ａを透過した蛍光がＰＭＴ４９Ａにより検出され、ビームスプリッタ３１を透過して反射ミラー３５により反射された他方の光路の蛍光の内、波長選択フィルタ７１Ｂを透過した蛍光がＰＭＴ４９Ｂにより検出される。
【００８８】
以下、第１実施形態と同様に、ＰＣ２１により、各ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂから出力される光強度信号に基づいて標本Ｓにおける同一範囲の複数の蛍光画像データが取得され、これらの蛍光画像データがＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとに加算平均される。また、ＰＭＴ４９Ａ，４９Ｂごとの光検出部合成画像データどうしが加算平均されて１枚の最終合成画像データが生成され、この最終合成画像データを元画像として超解像画像が生成される。
【００８９】
以上説明したように、本実施形態に係る顕微鏡システム６１によれば、多光子励起観察により、光学分解能以上の所望の分解能を有する超解像画像を生成して標本Ｓを観察することができる。
【００９０】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本実施形態においては、光分割部として、蛍光を同一波長のまま強度を等分するビームスプリッタ３１，２８，５３を例示して説明したが、これに代えて、蛍光を異なる割合の強度に分割するビームスプリッタを採用することとしてもよい。また、検出ユニットとして、２つの検出ユニット１７Ａ，１７Ｂを例示して説明したが、３つ以上の検出ユニットを採用して、光配分部により標本からの蛍光を各検出ユニットに配分し、これらの検出ユニットにより同一波長または異なる波長の蛍光を略同時に検出することとしてもよい。
【００９１】
本発明の実施形態におけるビームスプリッタ（光分割部）として、例えば、全ての蛍光波長域において入射光の波長に依存せず透過率および反射率が５０％のハーフミラーを採用してもよい。また、領域により反射方向が異なるミラーを用いて、それぞれの領域におけるそれぞれの反射光を各検出器に入射させてもよい。また、反射領域と透過領域が設定されたミラーを用いて、それぞれの領域における反射光、透過光を各検出器に入射させてもよい。
【００９２】
上記各実施形態において、ＰＣが、取得された標本Ｓの同一範囲の複数の画像データをＰＭＴ（光検出部）ごとに加算平均して、光検出部合成画像データを生成し、生成されたＰＭＴ（光検出部）ごとの光検出部合成画像データどうしをさらに加算平均して最終合成画像データを生成することとしたが、ＰＣ２１が、各ＰＭＴ（光検出部）で取得された標本Ｓの同一範囲の複数の画像データを加算平均して最終合成画像データを生成することとしてよい。
【００９３】
上記各実施形態において、ＰＣが、取得された標本の同一範囲の複数の画像データをＰＭＴ（光検出部）ごとに加算平均して光検出部合成画像データを生成したり、生成されたＰＭＴ（光検出部）ごとの光検出部合成画像データ同士を加算平均して最終合成画像データを生成したりすることとしたが、加算平均することに代えて、例えば図１０に示すように、取得された標本の同一範囲の複数の画像データをＰＭＴ（光検出部）ごとに加算して光検出部合成画像データを生成したり、生成されたＰＭＴ（光検出部）ごとの光検出部合成画像データ同士を加算して最終合成画像データを生成したりすることとしてもよい。
【００９４】
このようにした場合も、ＰＣより取得されるＰＭＴ（光検出部）ごとの標本の同一範囲における各蛍光画像データよりも、高周波数成分の比率が大きい最終合成画像データを生成することができる。
なお、加算する場合の光検出部合成画像データ、および、光検出部合成画像データどうしを加算してつくる最終合成画像データは、ＰＭＴ（光検出部）で取得される１つの画像データの持つビット長よりも大きいビット長を持つ合成画像データとなる。
【符号の説明】
【００９５】
１，６１    顕微鏡システム
３    連続レーザ光源（光源）
５    スキャナ（走査部）
７    対物レンズ
１３    ピンホール
１７，６７    検出ユニット
１７Ａ    第１検出ユニット（検出ユニット）
１７Ｂ    第２検出ユニット（検出ユニット）
２１    ＰＣ（画像データ取得部、画像データ合成部、演算処理部、光検出部ゲイン調整制御部）
２８    ビームスプリッタ（光配分部）
２９    ダイクロイックミラー（光配分部）
３１    ビームスプリッタ（光分割部）
４９Ａ，４９Ｂ，４９Ｃ，４９Ｄ    ＰＭＴ（光検出部）
５３    ビームスプリッタ（光分割部）
６３    超短パルスレーザ光源（光源）
Ｓ    標本
【図１】
0006539508.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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