(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）または（Ｉ’）で表される化合物またはその塩：
【化１】
0006562517.tif 000087
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１０）Ｒ１１［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；そして
Ｘは酸素原子または硫黄原子であり、ただし、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９がともに水素原子である場合を除く）。
【請求項２】
前記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、Ｘが酸素原子である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
前記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、前記Ｂａｓｅが、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１または２に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
前記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、前記Ｂａｓｅが、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項３に記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
以下の式（ＩＩ）または（ＩＩ’）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
【化２】
0006562517.tif 000088
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１０）Ｒ１１［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；そして
Ｘは酸素原子または硫黄原子であり、ただし、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９がともに水素原子である場合を除く）。
【請求項６】
前記式（ＩＩ）または（ＩＩ’）において、Ｘが酸素原子である、請求項５に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。より詳細には、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対する高い結合親和性、ならびにヌクレアーゼに対する高い耐性を有する架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマー、ｓｉＲＮＡなどがある。このうち、アンチセンス法は、疾病に関わるｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより、病原ＲＮＡの翻訳過程を阻害し、疾病の治療や予防を行う手法である。ｓｉＲＮＡもこれに類似しており、生体に投与した二重鎖ＲＮＡによりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する。一方、アンチジーン法は、病原ＲＮＡを転写するＤＮＡ部位に対応する三重鎖形成オリゴヌクレオチドを外部から導入することによりＤＮＡからＲＮＡへの転写を抑制する。また、アプタマーは、短い核酸分子（オリゴヌクレオチド）であるため、疾病の原因となるタンパク質などの生体成分と結合することにより機能を発揮する。【０００３】
こうした核酸医薬の素材として、種々の人工核酸が開発されているが、未だ切札となるべき分子が存在しない。例えば、これまでに開発されてきた核酸医薬の素材として、Ｓ−オリゴ（ホスホロチオエート）、２’，４’−ＢＮＡ（bridged nucleic acid）／ＬＮＡ（locked nucleic acid）（特許文献１〜３および非特許文献１〜６参照）などがある。Ｓ−オリゴは、サイトメガロウイルスに対するアンチセンス医薬品として、既に米国で上市されている。これは、高いヌクレアーゼ耐性を有するものの、標的核酸鎖への結合親和性が低いという難点を有しており、改善が必要である。これまでに開発されている２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡはいずれも、２’，４’−架橋型人工ヌクレオシドとして標的核酸鎖への結合親和性が高く、これからの核酸医薬の素材として最も期待される分子である。しかし、ヌクレアーゼへの耐性が十分ではなく、生体内での安定性という点で改良の余地を残している。【０００４】
さらに、近年では、上記人工ヌクレオシドのうち、２’，４’−架橋構造内にヘテロ原子を導入して、例えば、標的核酸鎖への結合親和性をさらに向上させる開発が行われている。具体的には、以下の式（ａ）および式（ｂ）に示すようなヌクレオシド構造を有するオリゴヌクレオチド：【０００５】
【化１】
0006562517.tif 000002
【０００６】
が提案されている（非特許文献７および８）。【０００７】
しかし、上記式（ａ）に示すような構造をベースとするヌクレオシドは、例えば、その合成にあたり、非常に煩雑で多段階の工程を要し、ヌクレアーゼに対する耐性能に改善の余地があると考えられている点で未だ満足し得るものとは言えないものであった。また、式（ｂ）に示すような構造のベースとなるヌクレオシドは、大きな７員環架橋構造を有することにより標的核酸鎖との結合親和性が満足し得るものでないと考えられる点が指摘されていた。このため、このようなオリゴヌクレオチドと同等またはそれ以上の性能を有し、かつ工業的な生産効率が一層優れたオリゴヌクレオチドの開発が所望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９８／３９３５２号
【特許文献２】国際公開第２００５／０２１５７０号
【特許文献３】国際公開第２００３／０６８７９５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】C. Wahlestedtら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，2000年，97巻，10号，5633-5638頁
【非特許文献２】Y. Hariら、Bioorg. Med. Chem.，2006年，14巻，1029-1038頁
【非特許文献３】K. Miyashitaら、Chem. Commun.，2007年，3765-3767頁
【非特許文献４】S.M.A. Rahmanら、J. Am. Chem. Soc.，2008年，130巻，14号，4886-4896頁
【非特許文献５】M. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁
【非特許文献６】S. Obikaら、Bioorg. Med. Chem.，2001年，9巻，1001-1011頁
【非特許文献７】K. Morikaら、Bioorg. Med. Chem. Lett.，2002年，12巻，73-76頁
【非特許文献８】Y. Hariら、Org. Lett.，2013年，15巻，3702-3705頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、生体内でヌクレアーゼによる分解を受けにくく、標的のｍＲＮＡに対する高い結合親和性および特異性を有し、特定の遺伝子の発現を効率よく制御することのできるアンチセンス法や核酸医薬用の新規な分子であって、生産性に優れた当該分子を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の式（Ｉ）または（Ｉ’）で表される化合物またはその塩：【００１２】
【化２】
0006562517.tif 000003
【００１３】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１０）Ｒ１１［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；そして
Ｘは酸素原子または硫黄原子である）である。【００１４】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、Ｘは酸素原子である。【００１５】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、上記Ｂａｓｅは、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。【００１６】
さらなる実施形態では、上記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、上記Ｂａｓｅは、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。【００１７】
本発明はまた、以下の式（ＩＩ）または（ＩＩ’）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：【００１８】
【化３】
0006562517.tif 000004
【００１９】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１０）Ｒ１１［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；そして
Ｘは酸素原子または硫黄原子である）である。【００２０】
１つの実施形態では、上記式（ＩＩ）または（ＩＩ’）において、Ｘは酸素原子である。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、６’位にヘテロ原子を有する新規な２’，４’−架橋型６員環ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供される。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、従来の２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを匹敵する一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡに対する結合親和性を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸医薬への応用が期待される。本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、６員環架橋構造内の６’位にヘテロ原子を導入することができ、かつ従来と比較して、より簡便な反応プロセスを通じて製造することができる。このため、工業的な生産効率を一層高めることも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】実施例７で得られた各オリゴヌクレオチドの酵素耐性を示すグラフであって、実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、チミジン（天然体）、ＬＮＡおよびＥＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用いて合成した各オリゴヌクレオチドの酵素耐性を示すグラフである。
【図２】実施例１５で得られた各オリゴヌクレオチドの酵素耐性を示すグラフであって、実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）、チミジン（天然体）、およびＥＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用いて合成した各オリゴヌクレオチドの酵素耐性を示すグラフである。
【図３】実施例１７で得られた各オリゴヌクレオチド最終濃度１００ｎＭおよび４００ｎＭでの細胞培養系におけるアンチセンス効果を示すグラフであって、実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）、ＬＮＡおよびＥＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用いて合成した各オリゴヌクレオチドのアンチセンス効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００２４】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。
【００２５】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メチルオキシ基、エチルオキシ基、ｎ−プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブチルオキシ基、イソブチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられる。
【００２６】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基」は、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ｎ−ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基などが挙げられる。
【００２７】
本明細書において、用語「炭素数１から６のシアノアルコキシ基」は、上記炭素数１から６の直鎖アルコキシ基を構成する少なくとも１つの水素原子がシアノ基で置換された基をいう。
【００２８】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の直鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基」は、アミノ基を構成する水素原子の１つまたは２つが、炭素数１から６の任意の直鎖または分岐鎖アルキル基で置換された基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、ジｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基などが挙げられる。
【００２９】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３から７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００３０】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３から７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２から７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００３１】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基」は、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基、および炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基を包含する。単に、「低級アルコキシ基」という場合もある。例えば、炭素数１から７の任意の直鎖アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、ｎ−ブチロキシ、ｎ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、およびｎ−ヘプチルオキシ基が挙げられ、炭素数３から７の任意の分岐鎖アルコキシ基としては、イソプロポキシ基、イソブチロキシ基、ｔｅｒｔ−ブチロキシ基、イソペンチルオキシ基などが挙げられ、そして炭素数３から７の任意の環状アルコキシ基としては、シクロブチロキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基などが挙げられる。
【００３２】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６から１２の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６から１２のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３から１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
【００３３】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。
【００３４】
本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４−アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
【００３５】
本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
【００３６】
本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
【００３７】
本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」などが挙げられる。
【００３８】
より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２−トリクロロエチル基などが挙げられる。１〜３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
【００３９】
「核酸合成の水酸基の保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、またはシリル基であり、さらに好適には、アセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基またはｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基である。「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、好適には、脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、または低級アルケニル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基または２−プロペニル基である。「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、好適には、アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、好適には、低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」または「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」であり、さらに好適には、２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基または４−クロロフェニル基である。「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」を構成する保護基は１つまたはそれ以上であり得る。「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、好適には、脂肪族アシル基または芳香族アシル基であり、さらに好適には、ベンゾイル基である。
【００４０】
本明細書において、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ４がＯＲ４ａそしてＲ５がＮＲ５ａとして表すことができる基は、「ホスホロアミダイト基」という。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
【００４１】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものをいう。
【００４２】
本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
【００４３】
本明細書において、用語「その塩」とは、本発明の式（Ｉ）または（Ｉ’）で表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
【００４４】
本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」としては、本発明の式（ＩＩ）または（ＩＩ’）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
【００４５】
以下、本発明について詳述する。
【００４６】
本発明の化合物はまたはその塩は、２’，４’−架橋型ヌクレオシドおよびヌクレオチドまたはその塩である。本発明の化合物またはその塩は、以下の式（Ｉ）または（Ｉ’）：
【００４７】
【化４】
0006562517.tif 000005
【００４８】
（式中、
「Ｂａｓｅ」は、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ１０）Ｒ１１［式中、Ｒ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基を表し；そして
Ｘは酸素原子または硫黄原子である）で表される構造を有する。
【００４９】
上記式（Ｉ）または（Ｉ’）において、「Ｂａｓｅ」は、プリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００５０】
上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。
【００５１】
中でも、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：
【００５２】
【化５】
0006562517.tif 000006
【００５３】
でそれぞれ表される、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（シトシニル基）、６−アミノプリン−９−イル基（アデニニル基）、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基（グアニニル基）、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（ウラシリル基）が好適であり、特に、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基（チミニル基）が好適である。また、オリゴヌクレオチドの合成の際には、水酸基およびアミノ基が保護基により保護されていることが好ましい。
【００５４】
本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、従来の２’，４’−の架橋構造の６’位に、酸素原子または硫黄原子のようなヘテロ原子が導入されていることにより、後述するオリゴヌクレオチドにおける酵素耐性能が向上する。また、このような２’，４’−の架橋構造内のヘテロ原子は、糖部のコンホメーションに直接的に影響を及ぼすものである。このため、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、得られたオリゴヌクレオチドに対し、当該影響による一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）との結合親和性をも一層向上させ得る。
【００５５】
さらに、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、その合成について、６’位へのヘテロ原子の導入を４’−エキソオレフィン体を利用することにより単工程で実現可能であり、さらに、ラジカル環化反応を利用することによって、６’位にヘテロ原子を有する架橋構造を極めて少ない工程を経て製造することができる。このため、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドは、従来より当該架橋構造内にヘテロ原子を導入したＥＮＡやＥｏＮＡと比較して、より少ない工程を通じて一層効率的に合成することができる。
【００５６】
これにより、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドとして、例えば、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）：
【００５７】
【化６】
0006562517.tif 000007
【００５８】
のようなエキソオレフィン体（ｉ）、ならびに立体化学が制御されたＲ体（ｉｉ）およびＳ体（ｉｉｉ）をそれぞれ別々に合成することができる
【００５９】
本発明において、オリゴヌクレオチド（２’，４’−架橋型人工ヌクレオチド）は、このような２’，４’−架橋型ヌクレオシドを用いて調製することができる。例えば、三リン酸化は、非特許文献５に記載の方法に従って容易に行われ得る。
【００６０】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩は、以下の式（ＩＩ）または（ＩＩ’）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含む：
【００６１】
【化７】
0006562517.tif 000008
【００６２】
（式中、「Ｂａｓｅ」、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ９は、上記式（Ｉ）または（Ｉ’）で定義されるものと同様である）。
【００６３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。
【００６４】
このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチド類縁体（アンチセンス分子）は、例えば、従来のＥｏＮＡを用いる場合と比較して、酵素耐性能が飛躍的に向上する。また、当該ＥｏＮＡを上回る一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）結合親和性を有する。
【００６５】
これらのことから、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドを用いて合成されたオリゴヌクレオチド類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子）としての有用性が期待される。
【００６６】
特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の２’，４’−架橋型ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。
【００６７】
本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製することができる。
【実施例】
【００６８】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００６９】
（実施例１）２’，４’−架橋型ヌクレオシド（エキソメチレン体）の合成【００７０】
【化８】
0006562517.tif 000009
【００７１】
（実施例１．１）２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４’，５’−デヒドロ−５’−デオキシ−５−メチルウリジン（２ａ）および３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４’，５’−デヒドロ−５’−デオキシ−５−メチルウリジン（２ｂ）の合成【００７２】
【化９】
0006562517.tif 000010
【００７３】
窒素気流下にて、非特許文献８に記載の方法により５−メチルウリジンから合成した化合物１（９．３０ｇ，３８．７ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド溶液（１００ｍＬ）に、０℃にて１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン （２１．７ｇ，１９４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（７．００ｇ，４６．５ｍｍｏｌ）、硝酸銀（７．９０ｇ，４６．５ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、反応液をセライトで濾過した。ろ液に水を添加し、ジエチルエーテルで抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（１４．８ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１から３：２）で精製し、標題の化合物２ａ（５．９０ｇ，４３％）および化合物２ｂ（５．３５ｇ，３９％）をそれぞれ白色泡状固体として得た。【００７４】
次いで、得られた化合物２ａ（５．９０ｇ，１６．６ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（１００ｍＬ）に、窒素気流下にて、０℃で水素化ナトリウム（７９９ｍｇ，２０．０ｍｍｏｌ）を添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、０℃にて反応液に塩化アンモニウム水溶液を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で１回、かつ飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（５．６６ｇ）を得た。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１から３：２）で精製し、標題の化合物２ｂ（３．１９ｇ，５４％）を白色泡状固体として得た。【００７５】
得られた化合物２ａおよび２ｂの物性データをそれぞれ表１および表２に示す。【００７６】
【表１】
0006562517.tif 000011
【００７７】
【表２】
0006562517.tif 000012
【００７８】
（実施例１．２）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４’−（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）−５−メチルウリジン（３）の合成【００７９】
【化１０】
0006562517.tif 000013
【００８０】
窒素気流下、上記で得られた化合物２ｂ（２．０８ｇ，５．８６ｍｍｏｌ）の２−プロピン−１−オール溶液（５０ｍＬ）に、０℃で硫酸マグネシウム処理したｍ−クロロ過安息香酸（７５ｗ／ｗ％，１．２２ｇ，７．０３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和重曹水で中和し、水を添加して酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（３．０９ｇ）を得た。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン/酢酸エチル＝２：１から２：３）で精製し、標題の化合物３（１．００ｇ，４０％）を白色泡状固体として得た。【００８１】
得られた化合物３の物性データを表３に示す。【００８２】
【表３】
0006562517.tif 000014
【００８３】
（実施例１．３）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４’−（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）−５−メチルウリジン（４）の合成【００８４】
【化１１】
0006562517.tif 000015
【００８５】
窒素気流下、上記で得られた化合物３（１．００ｇ，２．３４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１７．５ｍＬ）に、２，６−ルチジン（０．５４ｍＬ，４．６８ｍｍｏｌ）を添加した後、０℃で４，４’−ジメトキシトリチルトリフルオロメタンスルホニルの無水ジクロロメタン溶液（１Ｍ，２．６ｍＬ，２．６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、０℃にてメタノールを添加してクエンチし、ジクロロメタンで希釈した。有機層を水で１回、かつ飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．７７ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から１：１）で精製し、標題の化合物４（１．３８ｇ，８１％）を白色泡状固体として得た。【００８６】
得られた化合物４の物性データを表４に示す。【００８７】
【表４】
0006562517.tif 000016
【００８８】
（実施例１．４）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（１−イミダゾリルチオカルボニル）−４’−（プロプ−２−イン−１−イルオキシ）−５−メチルウリジン（５）の合成【００８９】
【化１２】
0006562517.tif 000017
【００９０】
窒素気流下、上記で得られた化合物４（２．１２ｇ，２．９１ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（１５ｍＬ）に、１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（１．０４ｇ，５．８２ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を３時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（３．０９ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：２）で精製し、標題の化合物５（２．２０ｇ，９０％）を白色泡状固体として得た。【００９１】
得られた化合物５の物性データを表５に示す。【００９２】
【表５】
0006562517.tif 000018
【００９３】
（実施例１．５）１−［（１Ｒ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−８−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−４−メチレン−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（６）の合成【００９４】
【化１３】
0006562517.tif 000019
【００９５】
窒素気流下、上記で得られた化合物５（２．２０ｇ，２．６２ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（５０ｍＬ）に、９０℃にてトリストリメチルシリルシラン（２．４ｍＬ，７．８６ｍｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル（８６．１ｍｇ，０．５２４ｍｍｏｌ）とを添加し、同温度にて１時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（２．４１ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１から３：２）で精製し、標題の化合物６（１．０７ｇ，５７％）を白色泡状固体として得た。【００９６】
得られた化合物６の物性データを表６に示す。【００９７】
【表６】
0006562517.tif 000020
【００９８】
（実施例１．６）１−［（１Ｒ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−８−ヒドロキシ−４−メチレン−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（７）の合成【００９９】
【化１４】
0006562517.tif 000021
【０１００】
上記で得られた化合物６（３２１ｍｇ，０．４５０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．０ｍＬ）に室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，０．５０ｍＬ，０．５０ｍｍｏｌ）を添加し、１５時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（３８８ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：２）で精製し、標題の化合物７（２３４ｍｇ，８７％）を白色泡状固体として得た。【０１０１】
得られた化合物７の物性データを表７に示す。【０１０２】
【表７】
0006562517.tif 000022
【０１０３】
（実施例１．７）１−［（１Ｒ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−８−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ］−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−４−メチレン−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（８）（エキソメチレン体）の合成【０１０４】
【化１５】
0006562517.tif 000023
【０１０５】
窒素気流下、上記で得られた化合物７（２３０ｍｇ，０．３９３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍＬ，１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、０℃にて２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミジド（０．１１ｍＬ，０．４７２ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和重曹水を添加してクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で１回、かつ飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（３１２ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：２）で精製し、標題の化合物８（２５６ｍｇ，７８％；エキソメチレン体）を白色泡状固体として得た。【０１０６】
得られた化合物８の物性データを表８に示す。【０１０７】
【表８】
0006562517.tif 000024
【０１０８】
（実施例２）２’，４’−架橋型ヌクレオシド（（Ｒ）−メチル体）の合成【０１０９】
【化１６】
0006562517.tif 000025
【０１１０】
（実施例２．１）１−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−８−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−４−メチル−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（９）の合成【０１１１】
【化１７】
0006562517.tif 000026
【０１１２】
酸化白金（４１４ｍｇ，１．８２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン懸濁液（５．０ｍＬ）に、実施例１．５で得られた化合物６（１．３０ｇ，１．８２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）を添加し、水素気流下で、室温にて２４時間撹拌した。反応終了後、酸化白金をセライトろ過によって取り除き、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．３８ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から３：２）で精製し、標題の化合物９（１．１３ｇ，８７％）を白色泡状固体として得た。【０１１３】
得られた化合物９の物性データを表９に示す。【０１１４】
【表９】
0006562517.tif 000027
【０１１５】
（実施例２．２）１−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−８−ヒドロキシ−４−メチル−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（１０）の合成【０１１６】
【化１８】
0006562517.tif 000028
【０１１７】
上記で得られた化合物９（１．１３ｇ，１．５９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に、室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，１．８ｍＬ，１．８０ｍｍｏｌ）を添加し、９時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．１８ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から２：３）で精製し、標題の化合物１０（９０７ｍｇ，９５％）を白色泡状固体として得た。【０１１８】
得られた化合物１０の物性データを表１０に示す。【０１１９】
【表１０】
0006562517.tif 000029
【０１２０】
（実施例２．３）１−［（１Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−８−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ］−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−４−メチル−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（１１）（（Ｒ）−メチル体）の合成【０１２１】
【化１９】
0006562517.tif 000030
【０１２２】
窒素気流下、上記で得られた化合物１０（２３０ｍｇ，０．３８３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（３．０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２１ｍＬ，１．１５ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミジド（０．１０ｍＬ，０．４６０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で６時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和重曹水を添加してクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で１回、かつ飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（３５８ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から２：３）で精製し、標題の化合物１１（１６６ｍｇ，５４％；（Ｒ）−メチル体）を白色泡状固体として得た。【０１２３】
得られた化合物１１の物性データを表１１に示す。【０１２４】
【表１１】
0006562517.tif 000031
【０１２５】
（実施例３）２’，４’−架橋型ヌクレオシド（（Ｓ）−メチル体）の合成【０１２６】
【化２０】
0006562517.tif 000032
【０１２７】
（実施例３．１）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４’−（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチルウリジン（１２）の合成【０１２８】
【化２１】
0006562517.tif 000033
【０１２９】
リンドラー触媒（５５５ｍｇ）の酢酸エチル懸濁液（３０ｍＬ）に、上記実施例１．３で得られた化合物４（９．５０ｇ，１３．０ｍｍｏｌ）の酢酸エチル溶液（１２０ｍＬ）を添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、セライトろ過によってパラジウム触媒を除き、溶媒を減圧留去して粗成績体（９．４０ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：２）で精製し、標題の化合物１２（８．５７ｇ，９０％）を白色泡状固体として得た。【０１３０】
得られた化合物１２の物性データを表１２に示す。【０１３１】
【表１２】
0006562517.tif 000034
【０１３２】
（実施例３．２）５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（１−イミダゾリルチオカルボニル）−４’−（プロプ−２−エン−１−イルオキシ）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５−メチルウリジン（１３）の合成【０１３３】
【化２２】
0006562517.tif 000035
【０１３４】
窒素気流下、上記で得られた化合物１２（２．００ｇ，２．７４ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（２０ｍＬ）に、１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（９２５ｍｇ，５．４７ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を３時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（２．９０ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：２）で精製し、標題の化合物１３（１．９２ｇ，８３％）を白色泡状固体として得た。【０１３５】
得られた化合物１３の物性データを表１３に示す。【０１３６】
【表１３】
0006562517.tif 000036
【０１３７】
（実施例３．３）１−［（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−８−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルオキシ−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−４−メチル−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（１４）の合成【０１３８】
【化２３】
0006562517.tif 000037
【０１３９】
窒素気流下、上記で得られた化合物１３（１．９２ｇ，２．２８ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（２０ｍＬ）に、９０℃にてトリストリメチルシリルシラン（１．１ｍＬ，３．４２ｍｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル（７５．０ｍｇ，０．４５７ｍｍｏｌ）とを添加し、同温度で１．５時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．９９ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１から３：２）で精製し、標題の化合物１４（１．０８ｇ，６６％）を白色泡状固体として得た。【０１４０】
得られた化合物１４の物性データを表１４に示す。【０１４１】
【表１４】
0006562517.tif 000038
【０１４２】
（実施例３．４）１−［（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−８−ヒドロキシ−４−メチル−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（１５）の合成【０１４３】
【化２４】
0006562517.tif 000039
【０１４４】
上記で得られた化合物１４（９００ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，１．４ｍＬ，１．４０ｍｍｏｌ）を添加し、９時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．０３ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：２）で精製し、標題の化合物１５（６１２ｍｇ，８１％）を白色泡状固体として得た。【０１４５】
得られた化合物１５の物性データを表１５に示す。【０１４６】
【表１５】
0006562517.tif 000040
【０１４７】
（実施例３．５）１−［（１Ｒ，４Ｓ，５Ｒ，６Ｒ，８Ｓ）−８−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノキシ］−１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシメチル）−４−メチル−２，７−ジオキサビシクロ［３．２．１］オクタン−６−イル］−チミン（１６）（（Ｓ）−メチル体）の合成【０１４８】
【化２５】
0006562517.tif 000041
【０１４９】
窒素気流下、上記で得られた化合物１５（３７２ｍｇ，０．６１９ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．５５ｍＬ，３．１０ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミジド（０．２１ｍＬ，０．９２９ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で４時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和重曹水を添加してクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で１回、かつ飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（５６０ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から２：３）で精製し、標題の化合物１６（２８７ｍｇ，５８％；（Ｓ）−メチル体）を白色泡状固体として得た。【０１５０】
得られた化合物１６の物性データを表１６に示す。【０１５１】
【表１６】
0006562517.tif 000042
【０１５２】
（比較例１）２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレンオキシ架橋した５−メチルウリジン（ＥｏＮＡ）の合成【０１５３】
【化２６】
0006562517.tif 000043
【０１５４】
非特許文献８に記載の方法にしたがって、標題の化合物（ＥｏＮＡ）を合成した。【０１５５】
（実施例４）オリゴヌクレオチドの合成および精製（１）
実施例１．７、実施例２．３および実施例３．５、ならびに比較例１で得られた化合物８（エキソメチレン体）、化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、化合物１６（（Ｓ）−メチル体）ならびにＥｏＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用い、これらとｄｍＣ（Ａｃ）およびＴのホスホロアミダイト（いずれもシグマ−アルドリッチ社製）との０．１Ｍの無水アセトニトリル溶液を調製し、ｎＳ−８  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（株式会社ジーンデザイン製オリゴヌクレオチド合成装置）を用いて、当該分野において公知のホスホロアミダイト法に従って、表１７に示す各オリゴヌクレオチドの合成を行った（ここで、Ｘは実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）に由来する構造に相当し、Ｙは実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）に由来する構造に相当し、Ｚは実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）に由来する構造に相当し、Ｗは比較例１で得られたＥｏＮＡに由来する構造に相当する）。【０１５６】
当該合成における合成スケールは０．２μｍｏｌであり、トリチルオン条件で行った。活性化剤には５−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ無水アセトニトリル溶液，Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ４２，Ｐｒｏｌｉｇｏ（登録商標））を使用した。縮合時間は、実施例１．７、実施例２．３および実施例３．５ならびに比較例１で得られたアミダイトブロックＸ、ＹおよびＺ、ならびにＥｏＮＡについては１０分間であり、天然体のアミダイトブロックでは３２秒間とした。合成完了後、２８％アンモニア水で室温下にて１．５時間処理して、カラム担体からの切り出しおよび塩基部、リン酸ジエステル部の脱保護を行った。次いで、簡易ゲルろ過カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。【０１５７】
なお、このＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
溶離液
・Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）
・Ｂ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液／アセトニトリル＝１：１
グラジエント
・Ｂ液濃度：  １６〜３２％（３０分間）
カラム
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ（１０×５０ｍｍ）(精製)
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）(純度確認)
流速
・３．０ｍＬ／分（精製）
・１．０ｍＬ／分（純度確認）
カラム温度
・５０℃
検出
・ＵＶ（２６０ｎｍ）【０１５８】
（実施例５）融解温度（Ｔｍ）の測定（１）
終濃度をカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍＭ、塩化カリウム１４０ｍＭ、実施例４で得られたオリゴヌクレオチド４μＭ、および表１７に示される一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水中に浴し、室温までゆっくりと冷ました後、各サンプル溶液を１５℃まで冷却して融解温度（Ｔｍ）の測定を開始した。毎分０．５℃の割合で９５℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１８００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、プロットした。Ｔｍ値は全て中線法で算出し、３回の独立した測定結果の平均値とした。【０１５９】
一本鎖ＲＮＡを標的鎖とした場合の結果と、一本鎖ＤＮＡを標的鎖とした場合の結果をそれぞれ表１７に示す。【０１６０】
【表１７】
0006562517.tif 000044
【０１６１】
表１７から明らかなように、実施例１．７、実施例２．３および実施例３．５で得られた化合物８（エキソメチレン体）、化合物１１（（Ｒ）−メチル体）および化合物１６（（Ｓ）−メチル体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、コントロールのオリゴヌクレオチドと比較して、一本鎖オリゴＲＮＡに対してＴｍ値が高く、より高い結合親和性を示していたことがわかる。また、これらの実施例１．７、実施例２．３および実施例３．５で得られた化合物をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、ＥｏＮＡをアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドを比較しても、一本鎖オリゴＲＮＡに対してＴｍ値が高く、より高い結合親和性を示していたことがわかる。【０１６２】
（実施例６）融解温度（Ｔｍ）の測定（２）（三重鎖形成能評価）
終濃度をカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍＭ、塩化カリウム１４０ｍＭ、塩化マグネシウム５ｍＭ、実施例４で得られたオリゴヌクレオチド１．５μＭ、および表１８に示される二本鎖ＤＮＡ１．５μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水中に浴し、室温までゆっくりと冷ました後、各サンプル溶液を１５℃まで冷却して融解温度（Ｔｍ）の測定を開始した。毎分０．５℃の割合で９０℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１８００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、プロットした。Ｔｍ値は全て中線法で算出し、３回の独立した測定結果の平均値とした。【０１６３】
二本鎖ＤＮＡを標的鎖とした場合の結果を表１８に示す。【０１６４】
【表１８】
0006562517.tif 000045
【０１６５】
表１８から明らかなように、実施例１．７、実施例２．３および実施例３．５で得られた化合物８（エキソメチレン体）、および化合物１６（（Ｓ）−メチル体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、ＥｏＮＡをアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドと比較しても、二本鎖ＤＮＡに対するＴｍ値が遜色なく、より高い結合親和性を示していたことがわかる。【０１６６】
（実施例７）オリゴヌクレオチドの合成および精製（２）
実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、チミジン（天然体）、ＬＮＡおよびＥＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用いたこと以外は、実施例４と同様にして当該分野において公知のホスホロアミダイト法に従って、以下に示すオリゴヌクレオチドの合成を行った。【０１６７】
【化２７】
0006562517.tif 000046
【０１６８】
（実施例８）酵素耐性実験（１）
終濃度をそれぞれＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、実施例７で得られた各オリゴヌクレオチド７．５μＭ、３’−エキソヌクレアーゼ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  Ａｄｍａｎｔｅｕｓ  Ｖｅｎｏｍ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ：ＣＡＶＰ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）１．５μｇ／ｍＬとしたサンプル溶液（１００μＬ）を、３７℃に保ち反応を行った。経時的に反応液の一部（２０μＬ）を採取し、９０℃で２分間加熱して酵素を失活させ、オリゴヌクレオチドの残量を、ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＬＣ−２０ＡＴ、ＳＰＤ−２０Ａ、ＣＴＯ−２０Ａ、ＣＢＭ−２０Ａ）により定量した。【０１６９】
なお、このＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
溶離液
・Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）
・Ｂ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液／アセトニトリル＝１：１
グラジエント
・Ｂ液濃度：  １２〜２４％（１５分間）  （天然体、ＬＮＡ）
１２〜２４％（３０分間）  （ＥＮＡ）
１４〜２６％（１５分間）  （エキソメチレン体、（Ｒ）−メチル体、（Ｓ）−メチル体）
カラム
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（４．６×５０ｍｍ）（天然体、ＬＮＡ、エキソメチレン体、（Ｒ）−メチル体、（Ｓ）−メチル体）
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（４．６×５０ｍｍ）を２本連結（ＥＮＡのみ）
流速
・１．０ｍＬ／分
カラム温度
・５０℃
検出
・ＵＶ（２６０ｎｍ）【０１７０】
得られた結果を図１に示す。【０１７１】
図１に示すように、実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、または実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、天然体のチミジンまたはＬＮＡを用いたものと比較して、未反応のオリゴヌクレオチドの残存量が著しく高い結果を示していたことがわかる。さらに、ＥＮＡを用いたオリゴヌクレオチドと比較しても、当該エキソメチレン体、（Ｒ）−メチル体、または（Ｓ）−メチル体を用いたオリゴヌクレオチドは、経時的に未反応のオリゴヌクレオチドの残存量が低下するものでもなく、より優れた酵素耐性を有していたことがわかる。【０１７２】
（実施例９）ホスホロアミダイト化された２’，４’−架橋型ヌクレオシド（無置換体）の合成【０１７３】
【化２８】
0006562517.tif 000047
【０１７４】
（実施例９．１）（２’Ｒ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−（１−オキソ−エチレンオキシ）チミジン（１７）の合成【０１７５】
【化２９】
0006562517.tif 000048
【０１７６】
実施例１．６で得られた化合物７（１．１７ｇ，１．９５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２０ｍＬ）に、アセトン（１０ｍＬ）および飽和重層水（４００ｍＬ）を添加し、０℃でオキソン（登録商標）（１８．０ｇ，２９．３ｍｍｏｌ）の水溶液（１００ｍＬ）を滴下して、室温で２４時間撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．１０ｇ）を得た。【０１７７】
次いで、この粗成績体のジオキサン溶液（２０ｍＬ）に１Ｍ水酸化カリウム水溶液（２０ｍＬ，２０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を添加することによりクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で１回、飽和食塩水で１回それぞれ洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．４８ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール＝２５：１から７．１)で精製し、化合物７（５８０ｍｇ，５０％）と、トリオール（４２２ｍｇ）とをそれぞれ白色泡状固体として得た。【０１７８】
次いで、得られたトリオールのテトラヒドロフラン／水溶液（３：１，１０ｍＬ）に０℃にて過ヨウ素酸ナトリウム（２８５ｍｇ，１．３３ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を添加してクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で１回、飽和食塩水で１回それぞれ洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（５６０ｍｇ）を得た。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：２）で精製し、標題の化合物１７（３４６ｍｇ，３０％，３工程）を白色泡状固体として得た。【０１７９】
得られた化合物１７の物性データを表１９に示す。【０１８０】
【表１９】
0006562517.tif 000049
【０１８１】
（実施例９．２）（２’Ｒ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−（１−ヨード−ビニレンオキシ）チミジン（１８）の合成【０１８２】
【化３０】
0006562517.tif 000050
【０１８３】
上記で得られた化合物１７（５０．０ｍｇ，０．０８３２ｍｍｏｌ）のエタノール溶液（２．０ｍＬ）に、トリエチルアミン（５８μＬ，０．４１６ｍｍｏｌ）およびヒドラジン一水和物（８．０μＬ，０．１６６ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で４時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（５３．２ｍｇ）を得た。【０１８４】
次いで、窒素気流下にて、得られた粗成績体の無水テトラヒドロフラン溶液（２．０ｍＬ）に１，８−ジアザビシクロウンデセン（６２μＬ，０．４１６ｍｍｏｌ）を滴下し、０℃でヨウ素（４３．７ｍｇ，０．１６６ｍｍｏｌ）を添加し、室温で２時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を添加してクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で１回、飽和食塩水で１回それぞれ洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（７０．０ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から２：３）で精製し、標題の化合物１８（３７．８ｍｇ，６４％，２工程）を白色泡状固体として得た。【０１８５】
得られた化合物１８の物性データを表２０に示す。【０１８６】
【表２０】
0006562517.tif 000051
【０１８７】
（実施例９．３）（２’Ｒ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−（エチレンオキシ）チミジン（１９）の合成【０１８８】
【化３１】
0006562517.tif 000052
【０１８９】
酸化白金（５１．６ｍｇ，０．２２８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン懸濁液（１．０ｍＬ）に、上記で得られた化合物１８（３２３ｍｇ，０．４５５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（４．０ｍＬ）および１，８−ジアザビシクロウンデセン（０．２０ｍＬ，１．３６ｍｍｏｌ）を添加し、水素気流下にて、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、酸化白金をセライトろ過によって取り除き、水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（２６８ｍｇ）を得た。得られた粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：４）で精製し、標題の化合物１９（２５１ｍｇ，９４％）を白色泡状固体として得た。【０１９０】
得られた化合物１９の物性データを表２１に示す。【０１９１】
【表２１】
0006562517.tif 000053
【０１９２】
（実施例９．４）（２’Ｒ）−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−（エチレンオキシ）チミジン（２０）（無置換体）（ホスホロアミダイト化された２’，４’−架橋型ヌクレオシド）の合成【０１９３】
【化３２】
0006562517.tif 000054
【０１９４】
窒素気流下にて、上記で得られた化合物１９（２５１ｍｇ，０．４２８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（５．０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．２３ｍＬ，１．２８ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミジド（０．１１ｍＬ，０．５１３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和重曹水を添加してクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で１回、飽和食塩水で１回それぞれ洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（３５０ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から１：２）で精製し、標題の化合物２０（無置換体）（２８３ｍｇ，８４％）を白色泡状固体として得た。【０１９５】
得られた化合物２０の物性データを表２２に示す。【０１９６】
【表２２】
0006562517.tif 000055
【０１９７】
（実施例１０）２’，４’−架橋型ヌクレオシド（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）の合成【０１９８】
【化３３】
0006562517.tif 000056
【０１９９】
（実施例１０．１）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４’−Ｃ−［（１Ｒ）−メチル−２−プロピン−１−イルオキシ］−５−メチルウリジン（２１）の合成【０２００】
【化３４】
0006562517.tif 000057
【０２０１】
実施例１．１で得られた化合物２ｂ（２．５３ｇ，７．１３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）にアセトン（５０ｍＬ）と飽和重層水（５０ｍＬ）とを添加し、０℃でオキソン（登録商標）（１３．１ｇ，２１．４ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（２．６６ｇ）を得た。【０２０２】
次いで、アルゴン気流下にて、この粗成績体の無水ジエチルエーテル溶液（１０ｍＬ）に、−４０℃で（Ｒ）−３−ブチン−２−オール（４．５ｇ，６４．２ｍｍｏｌ）、塩化亜鉛（１Ｍジエチルエーテル溶液の７．１ｍＬ，７．１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で1時間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和重曹水でクエンチし、セライトでろ過した。ろ液から酢酸エチルで抽出し、有機層を水で１回、および飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（２．８８ｇ）を得た。その後、この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から１：２）で精製し、標題の化合物２１（１．８６ｇ，５９％，２工程）を白色泡状固体として得た。【０２０３】
得られた化合物２１の物性データを表２３に示す。【０２０４】
【表２３】
0006562517.tif 000058
【０２０５】
（実施例１０．２）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４’−Ｃ−［（１Ｒ）−メチル−２−プロピン−１−イルオキシ］−５−メチルウリジン（２２）の合成【０２０６】
【化３５】
0006562517.tif 000059
【０２０７】
アルゴン気流下にて、実施例１０．１で得られた化合物２１（１．８２ｇ，４．１３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２５ｍＬ）に、２，６−ルチジン（０．９６ｍＬ，８．２６ｍｍｏｌ）を添加した後、０℃にて４，４’−ジメトキシトリチルトリフルオロメタンスルホニルの無水ジクロロメタン溶液（１Ｍ，４．５ｍＬ，４．５ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、０℃でメタノールを添加してクエンチし、ジクロロメタンで希釈した。有機層を水で１回、および飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（３．４９ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１から１：１）で精製し、標題の化合物２２（２．９６ｇ，９６％）を淡黄色泡状固体として得た。【０２０８】
得られた化合物２２の物性データを表２４に示す。【０２０９】
【表２４】
0006562517.tif 000060
【０２１０】
（実施例１０．３）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（１−イミダゾリルチオカルボニル）−４’−Ｃ−［（１Ｒ）−メチル−２−プロピン−１−イルオキシ］−５−メチルウリジン（２３）の合成【０２１１】
【化３６】
0006562517.tif 000061
【０２１２】
アルゴン気流下にて、実施例１０．２で得られた化合物２２（２．９２ｇ，３．９３ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（３０ｍＬ）に、１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（１．４０ｇ，７．８６ｍｍｏｌ）を添加し、得られた反応液を３時間加熱下にて還流した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（４．４１ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：２から２：３）で精製し、標題の化合物２３（２．６８ｇ，８０％）を白色泡状固体として得た。【０２１３】
得られた化合物２３の物性データを表２５に示す。【０２１４】
【表２５】
0006562517.tif 000062
【０２１５】
（実施例１０．４）（２’Ｒ）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−［（２Ｒ）−メチル−１−メチレン−エチレンオキシ］チミジン（２４）の合成【０２１６】
【化３７】
0006562517.tif 000063
【０２１７】
アルゴン気流下にて、実施例１０．３で得られた化合物２３（２．６４ｇ，３．０９ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（３０ｍＬ）に、９０℃にてトリストリメチルシリルシラン（１．９ｍＬ，６．１８ｍｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル（１０２ｍｇ，０．６１９ｍｍｏｌ）とを添加し、同温度で１時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（４．０１ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５：１から２：１）で精製し、標題の化合物２４（１．２３ｇ，５５％）を白色泡状固体として得た。【０２１８】
得られた化合物２４の物性データを表２６に示す。【０２１９】
【表２６】
0006562517.tif 000064
【０２２０】
（実施例１０．５）（２’Ｒ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−［（２Ｒ）−メチル−１−メチレン−エチレンオキシ］チミジン（２５）の合成【０２２１】
【化３８】
0006562517.tif 000065
【０２２２】
実施例１０．４で得られた化合物２４（１．１８ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に、室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，１．８ｍＬ，１．８ｍｍｏｌ）を添加し、１２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．９５ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：２）で精製し、標題の化合物２５（８８９ｍｇ，８９％）を白色泡状固体として得た。【０２２３】
得られた化合物２５の物性データを表２７に示す。【０２２４】
【表２７】
0006562517.tif 000066
【０２２５】
（実施例１０．６）（２’Ｒ）−３’−Ｏ−[２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ]−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−［（２Ｒ）−メチル−１−メチレン−エチレンオキシ］チミジン（２６）（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）の合成【０２２６】
【化３９】
0006562517.tif 000067
【０２２７】
アルゴン気流下にて、実施例１０．５で得られた化合物２５（７００ｍｇ，１．１４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．６１ｍＬ，３．４２ｍｍｏｌ）を添加し、０℃にて２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミジド（０．３１ｍＬ，１．３７ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和重曹水を添加してクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で１回、および飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（８１５ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から２：３）で精製し、標題の化合物２６（６５６ｍｇ，７１％）を白色泡状固体として得た。【０２２８】
得られた化合物２６の物性データを表２８に示す。【０２２９】
【表２８】
0006562517.tif 000068
【０２３０】
（実施例１１）２’，４’−架橋型ヌクレオシド（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）の合成【０２３１】
【化４０】
0006562517.tif 000069
【０２３２】
（実施例１１．１）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−４’−Ｃ−[（１Ｓ）−メチル−２−プロピン−１−イルオキシ]−５−メチルウリジン（２７）の合成【０２３３】
【化４１】
0006562517.tif 000070
【０２３４】
実施例１．１で得られた化合物２ｂ（２．５３ｇ，７１３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（５０ｍＬ）に、アセトン（５０ｍＬ）と飽和重層水（５００ｍＬ）とを添加し、０℃にてオキソン（登録商標）（１３．１ｇ，２１．４ｍｍｏｌ）の水溶液（５０ｍＬ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、ジクロロメタンで抽出し、有機層を飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（２．６６ｇ）を得た。【０２３５】
次いで、アルゴン気流下にて、この粗成績体の無水ジエチルエーテル溶液（１０ｍＬ）に、−４０℃にて（Ｓ）−３−ブチン−２−オール（４．５ｇ，６４．２ｍｍｏｌ）、塩化亜鉛（１Ｍジエチルエーテル溶液、７．１ｍＬ，７．１ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を飽和重曹水でクエンチし、セライトでろ過した。ろ液から酢酸エチルで抽出し、有機層を水で１回、および飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（３．２５ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から２：３）で精製し、標題の化合物２７（２．４２ｇ，７７％，２工程）を白色泡状固体として得た。【０２３６】
得られた化合物２７の物性データを表２９に示す。【０２３７】
【表２９】
0006562517.tif 000071
【０２３８】
（実施例１１．２）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４’−Ｃ−[（１Ｓ）−メチル−２−プロピン−１−イルオキシ]−５−メチルウリジン（２８）の合成【０２３９】
【化４２】
0006562517.tif 000072
【０２４０】
アルゴン気流下にて、実施例１１．１で得られた化合物２７（２．４０ｇ，５．４５ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（２５ｍＬ）に、２，６−ルチジン（１．３ｍＬ，１０．９ｍｍｏｌ）を添加した後、０℃で４，４’−ジメトキシトリチルトリフルオロメタンスルホニルの無水ジクロロメタン溶液（１Ｍ，６．０ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、０℃にてメタノールを添加してクエンチし、ジクロロメタンで希釈した。有機層を水で１回、および飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（４．０８ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：１から３：２）で精製し、標題の化合物２８（３．４５ｇ，８５％）を淡黄色泡状固体として得た。【０２４１】
得られた化合物２８の物性データを表３０に示す。【０２４２】
【表３０】
0006562517.tif 000073
【０２４３】
（実施例１１．３）３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−（１−イミダゾリルチオカルボニル）−４’−Ｃ−[（１Ｓ）−メチル−２−プロピン−１−イルオキシ]−５−メチルウリジン（２９）の合成【０２４４】
【化４３】
0006562517.tif 000074
【０２４５】
アルゴン気流下にて、実施例１１．２で得られた化合物２８（３．４０ｇ，４．５８ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（３０ｍＬ）に、１，１’−チオカルボニルジイミダゾール（１．６３ｇ，９．１５ｍｍｏｌ）を添加し、反応液を３時間加熱還流した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（５．０１ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝３：２から２：３）で精製し、標題の化合物２９（３．０６ｇ，７８％）を白色泡状固体として得た。【０２４６】
得られた化合物２９の物性データを表３１に示す。【０２４７】
【表３１】
0006562517.tif 000075
【０２４８】
（実施例１１．４）（２’Ｒ）−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−[（２Ｓ）−メチル−１−メチレン−エチレンオキシ]チミジン（３０）の合成【０２４９】
【化４４】
0006562517.tif 000076
【０２５０】
アルゴン気流下にて、実施例１１．３で得られた化合物２９（３．００ｇ，３．５２ｍｍｏｌ）の無水トルエン溶液（３０ｍＬ）に、９０℃でトリストリメチルシリルシラン（２．２ｍＬ，７．０４ｍｍｏｌ）とアゾビスイソブチロニトリル（１１５ｍｇ，０．７０３ｍｍｏｌ）とを添加し、同温度で２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（４．４８ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝５：１から２：１）で精製し、標題の化合物３０（１．０５ｇ，４１％）を白色泡状固体として得た。【０２５１】
得られた化合物３０の物性データを表３２に示す。【０２５２】
【表３２】
0006562517.tif 000077
【０２５３】
（実施例１１．５）（２’Ｒ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−[（２Ｓ）−メチル−１−メチレン−エチレンオキシ]チミジン（３１）の合成【０２５４】
【化４５】
0006562517.tif 000078
【０２５５】
実施例１１．４で得られた化合物３０（１．００ｇ，１．３８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に、室温でテトラブチルアンモニウムフルオリド（１Ｍテトラヒドロフラン溶液，１．５ｍＬ，１．５ｍｍｏｌ）を添加し、１２時間撹拌した。反応終了後、溶媒を減圧留去して粗成績体（１．８０ｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝１：１から１：２）で精製し、標題の化合物３１（４８５ｍｇ，５８％）を白色泡状固体として得た。【０２５６】
得られた化合物３１の物性データを表３３に示す。【０２５７】
【表３３】
0006562517.tif 000079
【０２５８】
（実施例１１．６）（２’Ｒ）−３’−Ｏ−［２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ］−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，４’−[（２Ｓ）−メチル−１−メチレン−エチレンオキシ]チミジン（３２）（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）の合成【０２５９】
【化４６】
0006562517.tif 000080
【０２６０】
アルゴン気流下にて、実施例１１．５で得られた化合物３１（４００ｍｇ，０．６５３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１０ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．３５ｍＬ，１．９６ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミジド（０．１７ｍＬ，０．７８３ｍｍｏｌ）を滴下し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、０℃で反応液に飽和重曹水を添加してクエンチし、ジクロロメタンで抽出した。有機層を水で１回、および飽和食塩水で１回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去して粗成績体（５２８ｍｇ）を得た。この粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ−ヘキサン／酢酸エチル＝２：１から２：３）で精製し、標題の化合物３２（３３２ｍｇ，６３％）を白色泡状固体として得た。【０２６１】
得られた化合物３２の物性データを表３４に示す。【０２６２】
【表３４】
0006562517.tif 000081
【０２６３】
（実施例１２）オリゴヌクレオチドの合成および精製（３）
実施例９．４、実施例１０．６および実施例１１．６で得られた化合物２０（無置換体）、化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、および化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）を、それぞれアミダイトブロックとして用い、これらとｄｍＣ（Ａｃ）およびＴのホスホロアミダイト（いずれもシグマ−アルドリッチ社製）との０．１Ｍの無水アセトニトリル溶液を調製し、ｎＳ−８  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（株式会社ジーンデザイン製オリゴヌクレオチド合成装置）を用いて、当該分野において公知のホスホロアミダイト法に従って、表３５に示す各オリゴヌクレオチドの合成を行った（ここで、Ｑは実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）に由来する構造に相当し、Ｒは実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）に由来する構造に相当し、Ｓは実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）に由来する構造に相当する）。【０２６４】
当該合成における合成スケールは０．２μｍｏｌであり、トリチルオン条件で行った。活性化剤には５−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ無水アセトニトリル溶液，Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ４２，Ｐｒｏｌｉｇｏ（登録商標））を使用した。縮合時間は、実施例９．４、実施例１０．６および実施例１１．６で得られたアミダイトブロックＱ、ＲおよびＳについて１０分間であり、天然体のアミダイトブロックでは３２秒間とした。合成完了後、２８％アンモニア水で室温下にて１．５時間処理して、カラム担体からの切り出しおよび塩基部、リン酸ジエステル部の脱保護を行った。次いで、簡易ゲルろ過カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。【０２６５】
なお、このＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
溶離液
・Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）
・Ｂ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液／アセトニトリル＝１：１
グラジエント
・Ｂ液濃度：  １６〜３２％（３０分間）
カラム
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ（１０×５０ｍｍ）(精製)
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８  ２．５μｍ（４．６×５０ｍｍ）(純度確認)
流速
・３．０ｍＬ／分（精製）
・１．０ｍＬ／分（純度確認）
カラム温度
・５０℃
検出
・ＵＶ（２６０ｎｍ）【０２６６】
（実施例１３）融解温度（Ｔｍ）の測定（３）
終濃度をカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍＭ、塩化カリウム１４０ｍＭ、実施例１２で得られたオリゴヌクレオチド４μＭ、および表３５に示される一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水中に浴し、室温までゆっくりと冷ました後、各サンプル溶液を１５℃まで冷却して融解温度（Ｔｍ）の測定を開始した。毎分０．５℃の割合で９５℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１８００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、プロットした。Ｔｍ値は全て中線法で算出し、３回の独立した測定結果の平均値とした。【０２６７】
一本鎖ＲＮＡを標的鎖とした場合の結果と、一本鎖ＤＮＡを標的鎖とした場合の結果をそれぞれ表３５に示す。【０２６８】
【表３５】
0006562517.tif 000082
【０２６９】
表３５から明らかなように、実施例９．４、実施例１０．６および実施例１１．６で得られた化合物２０（無置換体）、化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）および化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、コントロールのオリゴヌクレオチドと比較して、いずれも一本鎖オリゴＲＮＡに対してＴｍ値が高く、より高い結合親和性を示していたことがわかる。【０２７０】
（実施例１４）融解温度（Ｔｍ）の測定（４）（三重鎖形成能評価）
終濃度をカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍＭ、塩化カリウム１４０ｍＭ、塩化マグネシウム５ｍＭ、実施例１２で得られたオリゴヌクレオチド１．５μＭ、および表３６に示されるヘアピン二本鎖ＤＮＡ１．５μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水中に浴し、室温までゆっくりと冷ました後、各サンプル溶液を１５℃まで冷却して融解温度（Ｔｍ）の測定を開始した。毎分０．５℃の割合で９０℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１８００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、プロットした。Ｔｍ値は全て中線法で算出し、３回の独立した測定結果の平均値とした。【０２７１】
二本鎖ＤＮＡを標的鎖とした場合の結果を表３６に示す。【０２７２】
【表３６】
0006562517.tif 000083
【０２７３】
表３６から明らかなように、実施例９．４、実施例１０．６および実施例１１．６で得られた化合物２０（無置換体）、化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）および化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、コントロールのオリゴヌクレオチドと比較して、その多くが二本鎖ＤＮＡに対してＴｍ値が高く、より高い結合親和性を示していたことがわかる。【０２７４】
（実施例１５）オリゴヌクレオチドの合成および精製（４）
実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）、チミジン（天然体）、およびＥＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用いたこと以外は、実施例４と同様にして当該分野において公知のホスホロアミダイト法に従って、以下に示すオリゴヌクレオチドの合成を行った。【０２７５】
【化４７】
0006562517.tif 000084
【０２７６】
（実施例１６）酵素耐性実験（２）
終濃度をそれぞれＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍＭ、塩化マグネシウム１０ｍＭ、実施例１５で得られた各オリゴヌクレオチド７．５μＭ、３’−エキソヌクレアーゼ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ  Ａｄｍａｎｔｅｕｓ  Ｖｅｎｏｍ  Ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ：ＣＡＶＰ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）２．５μｇ／ｍＬとしたサンプル溶液（１００μＬ）を、３７℃に保ち反応を行った。経時的に反応液の一部（２０μＬ）を採取し、９０℃で２分間加熱して酵素を失活させ、オリゴヌクレオチドの残量を、ＨＰＬＣ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製ＬＣ−２０ＡＴ、ＳＰＤ−２０Ａ、ＣＴＯ−２０Ａ、ＣＢＭ−２０Ａ）により定量した。【０２７７】
なお、このＨＰＬＣの条件は以下の通りであった。
溶離液
・Ａ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０）
・Ｂ液：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液／アセトニトリル＝１：１
グラジエント
・Ｂ液濃度：  １２〜２４％（１５分間）  （天然体、無置換体）
１２〜２４％（３０分間）  （ＥＮＡ）
１４〜２６％（１５分間）  （エキソメチレン体、（Ｒ）−メチル体、（Ｓ）−メチル体、（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体、（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）
カラム
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（４．６×５０ｍｍ）（天然体、エキソメチレン体、（Ｒ）−メチル体、（Ｓ）−メチル体、（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体、（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）
・Ｗａｔｅｒｓ社製ＸＢｒｉｄｇｅＴＭ  Ｓｈｉｅｌｄ  ＲＰ１８（４．６×５０ｍｍ）を２本連結（ＥＮＡのみ）
流速
・１．０ｍＬ／分
カラム温度
・５０℃
検出
・ＵＶ（２６０ｎｍ）【０２７８】
得られた結果を図２に示す。【０２７９】
図２に示すように、実施例８に記載の実験系よりも３’−エキソヌクレアーゼの濃度を高めた系において、実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、または実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、天然体のチミジンおよび残存量が経時的に低下したＥＮＡと比較して、未反応のオリゴヌクレオチドの残存量が著しく高い結果を示していたことがわかる。特に当該酵素および／または濃度においては、（Ｒ）−メチル体または（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体を用いたオリゴヌクレオチドの未反応のオリゴヌクレオチドの残存量の経時的な低下が少ないものであり、より優れた酵素耐性を有していたことがわかる。【０２８０】
（実施例１７）オリゴヌクレオチドの合成および精製（５）
本実施例では、４種の塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）で構成されるオリゴヌクレオチドにおいて、以下の人工核酸のいずれかを取り込ませた。実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、実施例３．５で得られた化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）、チミジン（天然体）、ＬＮＡおよびＥＮＡを、それぞれアミダイトブロックとして用いたこと以外は、実施例４と同様にして当該分野において公知のホスホロアミダイト法に従って、以下に示すオリゴヌクレオチドの合成を行った。天然体の場合、オリゴヌクレオチドの配列は、５’−d(TTCAGCATTGGTATTC)−３’（配列番号５）である。【０２８１】
【化４８】
0006562517.tif 000085
【０２８２】
（実施例１８）融解温度（Ｔｍ）の測定（４）
本実施例では、実施例１７で得られた各オリゴヌクレオチドについて、標的鎖として５’−ｒ（ＧＡＡＵＡＣＣＡＡＵＧＣＵＧＡＡ）−３’（配列番号６）の一本鎖オリゴＲＮＡと二重鎖形成させ、当該ＲＮＡとの融解温度を測定した。【０２８３】
終濃度をリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍＭ、塩化ナトリウム１００ｍＭ、実施例１７で得られたオリゴヌクレオチド４μＭ、および上記一本鎖オリゴＲＮＡ４μＭを含むサンプル溶液（１３０μＬ）を沸騰水中に浴し、室温までゆっくりと冷ました後、各サンプル溶液を１５℃まで冷却して融解温度（Ｔｍ）の測定を開始した。毎分０．５℃の割合で９５℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１６５０ＰＣ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１８００  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｓ（株式会社島津製作所製）を用いて測定し、プロットした。Ｔｍ値は全て中線法で算出し、３回の独立した測定結果の平均値とした。結果を表３７に示す。【０２８４】
【表３７】
0006562517.tif 000086
【０２８５】
表３７から明らかなように、化合物８（エキソメチレン体）、化合物１１（（Ｒ）−メチル体）、化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、化合物２０（無置換体）、化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、および化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）のいずれをアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、コントロールの天然体を用いたオリゴヌクレオチドと比較して、標的鎖の一本鎖オリゴＲＮＡに対してＴｍ値が高く、より高い結合親和性を示していたことがわかる。化合物８（エキソメチレン体）、化合物１６（（Ｓ）−メチル体）、化合物２０（無置換体）、化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）、および化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）については、ＬＮＡおよびＥＮＡと同程度のＴｍ値を示し、よって、これらに匹敵する高い結合親和性を示していたことがわかる。【０２８６】
よって、４種の塩基（Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）で構成されるオリゴヌクレオチドの場合であっても、いずれの人工オリゴ核酸も標的一本鎖ＲＮＡに対して十分な結合能を持つことが示された。【０２８７】
（実施例１９）細胞培養系におけるアンチセンス評価
４．５１×１０５細胞／ｍＬに調製したＨｕｈ−７（ヒト肝癌細胞株：ＰＳ２０）を９６ウェル平底マイクロプレート（ＩＷＡＫＩ）に播種し、３７℃にて５％ＣＯ２下で２４時間培養した。各アンチセンス核酸分子が最終濃度１００ｎＭもしくは４００ｎＭとなるように、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をさらに添加して混合し、室温にて１５分間静置した後、各ウェルに添加した。実施例１７で得られた各オリゴヌクレオチドを添加し、２４時間後に細胞を回収した。なお、コントロールとして、オリゴヌクレオチド無添加で同じ処理を行った。細胞の回収は、ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ＆  ＲＴ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（東洋紡績株式会社製）を用いて行った。また、このキットを用いてトータルＲＮＡの回収を行った。【０２８８】
ＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  ＆  ＲＴ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  ｑＰＣＲ（東洋紡績株式会社製）を用いて、回収したトータルＲＮＡよりｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡを適宜希釈した後、リアルタイムＰＣＲを行い、ＡｐｏＢのｍＲＮＡ量を定量した。リアルタイムＰＣＲでは、ハウスキーピング遺伝子のＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量も同時に定量した。これにより、ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ量に対するＡｐｏＢのｍＲＮＡ量を定量的に評価した。リアルタイムＰＣＲにはＦａｓｔ  ＳＹＢＲ（登録商標）  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。【０２８９】
以下に使用したプライマーのシーケンスを示す：
Ｈｓ＿ＡｐｏＢ＿Ｆｗ  ：ＧＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＧＡＡＧＴＧ（配列番号８）
Ｈｓ＿ＡｐｏＢ＿Ｒｖ  ：ＧＣＴＧＣＴＴＴＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＡＣ（配列番号８）
Ｈｓ＿ＧＡＰＤＨ＿Ｆｗ：ＧＧＣＣＴＣＣＡＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＣＣ（配列番号９）
Ｈｓ＿ＧＡＰＤＨ＿Ｒｖ：ＡＧＧＧＧＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＡＡＣＴＧ（配列番号１０）【０２９０】
得られた結果を図３に示す。図３において、「ＥｏＤＮＡ構造」は、実施例１７で合成されたオリゴヌクレオチドのうち、実施例９．４で得られた化合物２０（無置換体）に由来する構造を含むオリゴヌクレオチド；「Ｒ−ＭｅＥｏＤＮＡ構造」は、実施例１７で合成されたオリゴヌクレオチドのうち、実施例２．３で得られた化合物１１（（Ｒ）−メチル体）に由来する構造を含むオリゴヌクレオチド；「Ｓ−ＭｅＥｏＤＮＡ構造」は、実施例１７で合成されたオリゴヌクレオチドのうち、実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）に由来する構造を含むオリゴヌクレオチド；「メチレンＥｏＤＮＡ構造」は、実施例１７で合成されたオリゴヌクレオチドのうち、実施例１．７で得られた化合物８（エキソメチレン体）に由来する構造を含むオリゴヌクレオチド；「Ｒ−Ｍｅ−メチレン構造」は、実施例１７で合成されたオリゴヌクレオチドのうち、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）に由来する構造を含むオリゴヌクレオチド；そして「Ｓ−Ｍｅ−メチレン構造」は、実施例１７で合成されたオリゴヌクレオチドのうち、実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）に由来する構造を含むオリゴヌクレオチドを表す。【０２９１】
図３に示すように、最終濃度が１００ｎＭの場合、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）をアミダイトブロックとして用いて合成したオリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを用いたものよりも強いＡｐｏＢ遺伝子発現抑制効果（アンチセンス効果）を示し、その他の新規架橋型核酸においてもＥＮＡまたはＬＮＡを用いたものと同様のアンチセンス効果を示した。最終濃度が４００ｎＭの場合、実施例１０．６で得られた化合物２６（（Ｒ）−メチル−エキソメチレン体）および実施例１１．６で得られた化合物３２（（Ｓ）−メチル−エキソメチレン体）を用いた各オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡを用いたものよりも強いアンチセンス効果を示し、その他の新規架橋型核酸においてもＥＮＡまたはＬＮＡを用いたものと同様のアンチセンス効果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０２９２】
本発明によれば、６’位にヘテロ原子を有する新規な２’，４’−架橋型６員環ヌクレオシドおよびヌクレオチドが提供される。この２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、従来の２’，４’−架橋型人工ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを匹敵する一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対する結合親和性を有する。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸医薬への素材として有用である。
【図１】
0006562517.tif 000089
【図２】
0006562517.tif 000090
【図３】
0006562517.tif 000091
【配列表】
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