(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、ＧＬＵＴ４エンドサイトーシス抑制剤。
【請求項２】
ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスの抑制がＰＫＣα活性化抑制によるものである、請求項１記載の剤。
【請求項３】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、ＰＫＣα活性化抑制剤。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤を含む、糖尿病治療薬。
【請求項５】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、糖尿病治療薬。
【請求項６】
糖尿病が２型糖尿病である、請求項４又は５記載の治療薬。
【請求項７】
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンを有効成分として含有する、メタボリックシンドローム治療薬。
【請求項８】
研究用試薬である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病治療効果を有するリン脂質化合物、より詳細には１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を有効成分として含有する糖尿病治療薬等に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病は、インスリンの働きが悪くなり、血糖値が高くなり、尿にも糖が出る病気である。インスリンは、膵臓のβ細胞で産生、分泌され、肝臓や筋肉でグルコースからグリコーゲン（貯蔵型のグルコース）への合成を促進し、肝臓でのグリコーゲンからグルコースへの分解を抑えて、血糖値の上昇を抑える。
糖尿病は、過食、運動不足、肥満、ストレス、遺伝的素因が主たる理由で患者が増えている。
糖尿病はインスリンが絶対的に不足する１型糖尿病と相対的に不足する２型糖尿病に大別される。１型の治療にはインスリン注射が基本であり、２型の治療には食事、運動療法が基本であるが、血糖のコントロールが悪い場合には２型でも薬物療法が必要になる。薬物療法としては経口糖尿病治療薬あるいはインスリンが用いられるが、いずれも副作用の点、ＱＯＬの点等から改善が求められている。【０００３】
また、内臓脂肪の蓄積に起因して高血圧、高脂血症、糖尿病等の生活習慣病が発症した状態をメタボリックシンドロームと称し、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、脳梗塞等）の発症リスクを高めるものとして広く認知されるようになっている。従って糖尿病を予防・治療することができれば、必然的にメタボリックシンドロームの予防・治療に有効である。【０００４】
リン脂質は、種々の生物学的活性を有し、例えばある種のリン脂質は認知機能の改善や神経変性疾患に有効であることが報告されている。例えば、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンや１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリンが、スコポラミンによって誘導された空間学習障害及び記憶障害、あるいは軽度の認知障害や痴呆を改善することが報告されている（非特許文献１、２）。【０００５】
また、ホスファチジルエタノールアミンは、生体膜の主要成分の１つであるリン脂質であり、ホスファチジルセリン等とともに健康食品として市販されているが、ホスファチジルエタノールアミンの中でも、特にジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミン（脂肪酸として２つのリノール酸を含む）が、細胞死誘導抑制活性、特に小胞体ストレス抑制活性を有すること、当該活性により、ジリノレオイル・ホスファチジルエタノールアミンが医薬用途、特に神経変性疾患の予防および／または治療のために使用され得ることが報告されている（特許文献１）。
また、生体膜モデルやリポソーム調製等に用いられるリン脂質も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２４７７２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yaguchi T, Nagata T, Nishizaki T. Dilinoleoylphosphatidylcholine ameliorates scopolamine-induced impairment of spatial learning and memory by targeting alpha-7 nicotinic ACh receptors. Life Sci 2009;84:263-6
【非特許文献２】Yaguchi T, Nagata T, Nishizaki T. 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine improves cognitive decline by enhancing long-term depression. Behav Brain Res 2009;204:129-32
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、糖尿病治療効果において、新規な作用機序を有する化合物を見出し当該化合物の医薬用途を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は上記課題に鑑み鋭意検討を重ねた結果、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が糖尿病治療に有用な優れた薬理作用を有することを見出して本発明を完成するに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
［１］ＤＯＰＥを有効成分として含有する、ＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター４）エンドサイトーシス抑制剤。
［２］ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスの抑制がＰＫＣα活性化抑制によるものである、上記［１］記載の剤。
［３］ＤＯＰＥを有効成分として含有する、ＰＫＣα活性化抑制剤。
［４］上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤を含む、糖尿病治療薬。
［５］ＤＯＰＥを有効成分として含有する、糖尿病治療薬。
［６］糖尿病が２型糖尿病である、上記［４］又は［５］記載の治療薬。
［７］ＤＯＰＥを有効成分として含有する、メタボリックシンドローム治療薬。
［８］研究用試薬である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の剤。
［９］有効量のＤＯＰＥをそれを必要とする対象に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
［１０］糖尿病が２型糖尿病である、上記［９］記載の方法。
［１１］ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスを抑制することを特徴とする、上記［９］記載の方法。
［１２］ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスの抑制がＰＫＣα活性化抑制によるものである、上記［１１］記載の方法。
［１３］糖尿病の治療に使用するためのＤＯＰＥ。
［１４］糖尿病が２型糖尿病である、上記［１３］記載のＤＯＰＥ。
［１５］ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスを抑制することを特徴とする、上記［１３］記載のＤＯＰＥ。
［１６］ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスの抑制がＰＫＣα活性化抑制によるものである、上記［１５］記載のＤＯＰＥ。
［１７］ＤＯＰＥで細胞を処理することを特徴とする、ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスを抑制する方法。
［１８］ＧＬＵＴ４エンドサイトーシスの抑制がＰＫＣα活性化抑制によるものである、上記［１７］記載の方法。
［１９］有効量のＤＯＰＥをそれを必要とする対象に投与することを含む、メタボリックシンドロームの治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
ＤＯＰＥは、糖尿病の治療に優れた薬理作用（タンパク質リン酸化酵素Ｃα（ＰＫＣα）活性化抑制作用、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のエンドサイトーシス抑制作用及び血糖値低下作用）を有し、従って糖尿病治療薬として有用である。またかかる薬理作用に基づいて種々の試薬としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、分化した３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞において、ＤＯＰＥがＧＬＵＴ４の細胞膜分布を増加させる作用を有することを示したグラフである。各種リン脂質誘導体で処理しない（Control）か、あるいは１μＭで処理して２０分後、細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、比：（細胞膜画分におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）／（全細胞におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）の平均値（±ＳＤ）を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、ANOVA (ボンフェローニ補正)。NS; not significant. DOPE; 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DAPE; 1,2-diarachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DPPE; 1,2-dipalmitoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine、DLPE; 1,2-dilinoleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine。
【図２】図２は、ＤＯＰＥのＧＬＵＴ４細胞膜分布増加作用が、ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシスを抑制することによるものであることを示したグラフである。３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞をインスリン（100 nM）で３０分間（-30 〜 0 min）処理し、次いで、洗い流してインスリンを除去し（0 min）、ＤＯＰＥ（10 mM）を細胞外溶液に添加した。１２０分間インキュベートした後、細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、比：（細胞膜画分におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）／（全細胞におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）の平均値（±ＳＤ）を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、ANOVA (ボンフェローニ補正)。NS; not significant.
【図３】図３は、ＰＫＣαをノックダウンすることにより、ＧＬＵＴ４細胞膜分布が増加することを示したグラフである。ネガティブコントロールであるＮＣ ｓｉＲＮＡ(NC)又はＰＫＣα ｓｉＲＮＡ（PKCα KD）をトランスフェクトした３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、比：（細胞膜画分におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）／（全細胞におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）の平均値（±ＳＤ）を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、unpaired t-test.
【図４】図４は、ＰＫＣαをノックダウンすることにより、ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシスが抑制され、ＧＬＵＴ４細胞膜分布が増加することを示したグラフである。ネガティブコントロールであるＮＣ ｓｉＲＮＡ（NC）又はＰＫＣα ｓｉＲＮＡ（PKCα KD）をトランスフェクトした３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞をインスリン（100 nM）で３０分間（-30 〜 0 min）処理し、次いで、洗い流してインスリンを除去した（0 min）。１２０分間インキュベートした後、細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった。グラフ中、各カラムは、比：（細胞膜画分におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）／（全細胞におけるｃ−ｍｙｃのシグナル強度）の平均値（±ＳＤ）を表している（各実験においてｎ＝４）。Ｐ値、ANOVA (ボンフェローニ補正)。NS; not significant.
【図５】図５は、ＤＯＰＥそれ自身はＰＫＣ活性化に関与しないが、ＴＰＡによって活性化されたＰＫＣαを抑制する作用を有することを示したグラフである。無細胞系で、ＰＫＣ活性をモニタリングした。（Ａ）ＤＯＰＥ非存在下あるいは存在下（100μM）で所定のＰＫＣアイソザイムを評価した。グラフ中、各カラムは、ＰＫＣ活性（pmol/min）の平均値（±SEM）を表している（ｎ＝４）。Ｐ値、ＤＯＰＥ非存在下での各ＰＫＣアイソザイム活性化と比べて、Dunnett’s test.（Ｂ）ＤＯＰＥの非存在下（コントロール）あるいは存在下（100μM）、ＴＰＡの非存在下あるいは存在下（1μM）でＰＫＣαの活性を評価した。グラフ中、各カラムは、ＰＫＣα活性（pmol/min）の平均値（±SEM）を表している（ｎ＝４）。Ｐ値、Dunnett’s test.TPA; 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate
【図６】図６は、ＤＯＰＥがＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｌｅｐｒｄｂ／ｌｅｐｒｄｂマウスにおいて血清グルコースレベルを低下させることを示すグラフである。マウスをグルコース飢餓の状態で１２時間置いた後、グルコース（2g/kg）を経口投与し、所定の時間に血液を回収して血清グルコースアッセイを行なった。グルコースを投与する３０分前に所定の濃度（0-10 mg/kg）でＤＯＰＥを経口投与した。グラフ中、各ポイントは血清グルコース濃度の平均値（±SEM）を表している（各実験においてｎ＝５）。Ｐ値、Fisher's PLSD（制約付最小有意差検定）
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明において有効成分として用いられる１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（本明細書中、必要に応じてＤＯＰＥと省略）は、以下の構造式を有する。ＤＯＰＥは生体膜モデルやリポソーム調製に用い得ることが知られているが、それ自体に特定の効能を有することは報告されていない。
【００１３】
【化１】
0006453245.tif 000002
【００１４】
ＤＯＰＥは、自体公知の方法によって製造することができる。また、ＤＯＰＥには光学異性体が存在するが、このような異性体及びそれらの混合物の全てが本発明の範囲に含まれる。ＤＯＰＥは商業的にも入手可能であり、例えばAvanti Polar Lipids (Alabaster, AL, USA)等から市販されている。
【００１５】
本発明においてＤＯＰＥはまた、その塩として用いられてもよい。かかる塩は、特に限定されないが、医薬又は食品として許容され得る塩が好ましく、例えば無機塩基（例、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属；カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属；アルミニウム、アンモニウム）、有機塩基（例、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン）、無機酸（例、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸）、有機酸（例、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸）、塩基性アミノ酸（例、アルギニン、リジン、オルニチン）又は酸性アミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）との塩などが挙げられる。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、被験体は哺乳動物であり得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル、チンパンジー）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット）、ペット（例、イヌ、ネコ、ウサギ）、使役動物又は家畜（例、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ）が挙げられるが、ヒトが好ましい。
【００１７】
ＤＯＰＥは、実施例にてデータで示されるように、（１）ＰＫＣα活性化抑制作用、（２）ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシス抑制作用、及び（３）血糖値低下作用を有する。
（１）ＰＫＣα活性化抑制作用
ＰＫＣは、レセプターではないセリン−トレオニンプロテインキナーゼの最大遺伝子ファミリーの一つとして同定された(Kikkawa et al., J. Biol. Chem., 257, 13341 (1982))。多数の生理的シグナリングメカニズムが、この酵素によるものであると考えられている。ＰＫＣ遺伝子ファミリーは、現在、４つのサブグラウンドに分類される以下の遺伝子から構成される：１）古典的なＰＫＣα、β１、β２およびγ、２）新規なＰＫＣδ、ε、ηおよびθ、３）異型のＰＫＣζ、λ、ηおよびι、並びに４）ＰＫＣμ。ＰＫＣαは２つのＣ１ドメイン（Ｃ１ａ，Ｃ１ｂ）とＣ２ドメイン及び触媒ドメインで構成されている。ＰＫＣαは癌等において他のＰＫＣと全く異なる挙動を取り、発癌に極めて重要なシグナルであることが報告されている。従って、ＰＫＣα活性化抑制剤は抗癌剤として使用できる可能性がある。
さらに、本願発明ではＰＫＣα活性化抑制がＧＬＵＴ４のエンドサイトーシスを抑制する作用を誘導することを明らかにした。従って、ＰＫＣα活性化抑制剤は糖尿病治療薬として使用できる可能性がある。
（２）ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシス抑制作用
脂肪細胞や骨格筋細胞に発現するＧＬＵＴ４は、インスリンの刺激がない場合は細胞膜上にはほとんど露出しておらず、細胞内の小胞群に組み込まれた状態で存在している。インスリンの刺激は、この細胞内小胞に存在するＧＬＵＴ４の細胞膜上への運搬を促進することにより、細胞膜表面に露出するＧＬＵＴ４の量を増加させ、グルコースを細胞内へ取り込むことにより血糖値を下げる。インスリンによって誘導される糖の取り込み亢進は生理的に重要であるが、糖尿病の場合にはこの生理現象に著しい障害が生じていることが知られている。インスリンの刺激がなくなるとＧＬＵＴ４は再び細胞膜上から細胞内の小胞群へと内部移行する（エンドサイトーシス）。
何らかの原因で膵臓のβ細胞が死滅することで、インスリン分泌障害をきたし糖尿病になる（１型糖尿病）。現在、１型糖尿病の治療は体外からインスリンを注射するしか手だてがない。一方、インスリン刺激に応答した糖取り込みが著しく減弱（インスリン抵抗性＝インスリン反応性の減弱）することも糖尿病発症の引き金となる（２型糖尿病）。２型糖尿病の治療には、インスリン分泌刺激剤、腸管での糖吸収阻害剤、２糖類分解抑制剤、ＤＰＰ−４阻害剤、ＰＰＡＲγ活性化剤等が用いられている。
糖の細胞内への取込みが、細胞膜上のＧＬＵＴ４を介することから、細胞膜上のＧＬＵＴ４の分布を増加する、あるいは減少を抑える作用を有する薬剤は、糖の細胞内取り込みを亢進することを可能とし、１型、２型糖尿病に関わらず糖尿病治療薬としてその効果が期待できる。
ここで、「細胞」とはグルコースを取込むことができる細胞であれば特に限定されないが、脂肪細胞、骨格筋細胞、肝細胞等が挙げられる。
（３）血糖値低下作用
ＤＯＰＥはインスリンを必要とせずに血糖値を低下させることができるので、２型糖尿病の治療に有用である。
これらの優れた薬理作用により、本発明は糖尿病の予防及び／又は治療薬として、またメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療薬として有用である（以下、本発明の医薬とも称する）。本明細書中で用いられる場合、「予防」とは、症状を示さない被験体において、該症状が顕在化するのを防ぐことを意味し、「治療」とは、症状を示す被験体において、該症状を軽減すること、あるいは該症状の悪化を防ぐこと又は遅延させることを意味する。
【００１８】
ＤＯＰＥのかかる薬理作用により、本発明はＰＫＣα活性化を抑制する方法、ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシスを抑制する方法、糖尿病の予防及び／又は治療方法、並びにメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療方法（以下、単に本発明の方法とも称する）を提供することができる。
【００１９】
本明細書中で用いられる場合、ＤＯＰＥで処理する対象となる細胞は、ＧＬＵＴ４を発現し、グルコースを取込むことができる細胞であれば特に限定されないが、脂肪細胞、骨格筋細胞、肝細胞等が挙げられる。これらの細胞は前駆細胞から自体公知の手法により分化誘導したものであってもよい。例えば脂肪細胞は３Ｔ３Ｌ１線維芽細胞から分化誘導され得る。
【００２０】
ここで「処理」とは、上記細胞とＤＯＰＥとを必要十分な時間接触させることであり、その時間は所望される効果や用いる細胞の種類によっても異なるが、通常、０．１〜３時間、好ましくは０．２〜２時間程度である。簡便には、ＤＯＰＥを含有する培養液中で当該細胞を培養することによって実施される。
【００２１】
本発明の医薬は、治療する各々の個別の患者の年齢及び状態に応じて変動するが、静脈内投与の場合には、ＤＯＰＥの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１００ｍｇ、筋肉内投与の場合には、ＤＯＰＥの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．００１〜１０ｍｇ、経口投与の場合には、ＤＯＰＥの１日用量としてヒト又は動物の体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇが、糖尿病の予防及び／又は治療のため、あるいはメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療のために一般的に与えられる。
【００２２】
本発明の医薬は、有効成分であるＤＯＰＥ以外に、任意の添加物、例えば医薬上許容され得る担体を含むことができる。医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【００２３】
一つの実施態様において、本発明の医薬は経口投与に好適な製剤として処方され得る。経口投与に好適な製剤は、水、生理食塩水のような希釈液に有効量の物質を溶解させた液剤、有効量の物質を固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、顆粒剤、散剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の物質を懸濁させた懸濁液剤、有効量の物質を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤等である。
【００２４】
別の実施態様において、本発明の医薬は非経口的な投与に好適な製剤として処方され得る。非経口的な投与（例、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、局所注入など）に好適な製剤としては、水性および非水性の等張無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性および非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分および医薬上許容され得る担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００２５】
ＤＯＰＥは、食品として提供することができる。有効成分であるＤＯＰＥは、上述の通り、哺乳動物（例、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）に対して（１）ＰＫＣα活性化抑制作用、（２）ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシス抑制作用、及び（３）血糖値低下作用を有し、糖尿病の予防・治療、あるいはメタボリックシンドロームの予防・治療に効果的な機能性食品として提供することができる。
【００２６】
本発明において「食品」とは、医薬品及び医薬部外品以外の全ての飲食物を意味する。例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、及びいわゆるサプリメントを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
本発明の医薬あるいは食品は、該医薬あるいは該食品の単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填されたもの、あるいは多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填されたものであり得る。
本発明の医薬あるいは食品が、単一の製剤あるいは食品として提供される場合には、該医薬あるいは食品の単位摂取量又はその分割量は、ＤＯＰＥの単位摂取量又はその分割量である。
【００２８】
単位摂取量又はその分割量が個別に包装又は充填された医薬あるいは食品としては、例えば、単位摂取量又はその分割量を、通常の包装物（例えば、ＰＴＰ（press through packing）シート、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に別々に包装又は充填したものが挙げられる。このように個別に包装又は充填された医薬あるいは食品は、さらに組み合わされて、１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に一緒に包装又は充填されていてもよい。多数の単位摂取量又はその分割量が包括的に包装又は充填された医薬あるいは食品としては、例えば、多数の錠剤又はカプセル剤が区分されることなく１つの容器（例えば、紙容器、フィルム（例、プラスチックフィルム）容器、ガラス容器、プラスチック容器）中に包装又は充填されたものが挙げられる。本発明の医薬あるいは食品はまた、単位摂取量又はその分割量を、長期間の摂取に十分な数で含み得るが、例えば食品の場合であれば３日以上、好ましくは７日、１０日、１４日又は２１日以上あるいは１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月以上の摂取に十分な数で含み得る。
【００２９】
さらに、ＤＯＰＥは、上述の通り、（１）ＰＫＣα活性化抑制作用、（２）ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシス抑制作用、及び（３）血糖値低下作用を有し、従って各種試薬としても提供され得る。当該試薬としては、具体的には、ＰＫＣα活性抑制剤、ＧＬＵＴ４エンドサイトーシス抑制剤等が挙げられる。当該試薬は、従来にない新しい作用メカニズムを有する、副作用の軽減された、及び／又はより効果が増強された、糖尿病やメタボリックシンドロームの予防及び／又は治療薬を開発する有用なツールとなる。
【００３０】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【００３１】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例に何ら制限されるものではない。
【実施例】
【００３２】
実施例１：ＤＯＰＥが有するＧＬＵＴ４のエンドサイトーシス抑制作用の検証
（材料と方法）
１．細胞培養
ＧＬＵＴ４ｍｙｃを発現する３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ線維芽細胞株を用いた。当該細胞は、ヒトｃ−ＭＹＣエピトープ（１４アミノ酸）を第１エクトドメインに挿入して構築される。細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウシ血清、ペニシリン(最終濃度,100 U/ml)及びストレプトマイシン(最終濃度, 0.1 mg/ml)を添加したDulbecco’s Modified Eagles Medium(DMEM)中、５％ＣＯ２及び９５％空気の湿気のある環境で３７℃で培養した。細胞がコンフルエントな状態に到達したら（０日目）、線維芽細胞から脂肪細胞へと分化させるために、培地を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清(FBS)，１μＭデキサメサゾン，０．５ｍＭ  ３−イソブチル−メチル−キサンチン及び０．１ｍｇ／ｍｌインスリンを添加したＤＭＥＭに交換した。３日目、７日目及び１１日目で、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを添加したＤＭＥＭに培地交換した。１４日目で、脂肪細胞へと分化した細胞を実験に使用した。【００３３】
２．ＧＬＵＴ４動員のモニタリング
３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有し、１０ｍＭグルコースを添加したKrebs-Ringer-HEPES buffer[136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 1.25 mM MgSO4及び20 mM HEPES, pH 7.5]中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテル(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)を含む氷冷したミトコンドリアバッファー[210 mM マンニトール, 70mM シュクロース, 及び1 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA), 10 mM HEPES, pH 7.5]中、ソニケーションによりホモジナイズした。続いて、ホモジネートを４℃で５分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清をさらに４℃で１５分間、１１，０００ｒｐｍで遠心分離した。回収した上清を４℃で６０分間、１００，０００ｇで超遠心分離し、細胞質画分と細胞膜画分に分離した。上清を細胞質画分として、ペレットを細胞膜画分としてそれぞれ用いた。細胞質成分及び細胞膜成分が首尾よく分離できたかどうかは細胞質成分のマーカーであるＬＤＨに対する抗体と、細胞膜成分のマーカーであるカドヘリンに対する抗体とを用いたウェスタンブロット解析によって確認した。
各画分の蛋白質濃度はＢＣＡ蛋白質アッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて測定した。細胞膜画分の蛋白質を１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含有するミトコンドリアバッファーに再懸濁した。各画分の蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって分離し、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)膜に転写した。ブロッティング膜は５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ[150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween20及び20 mM Tris, pH7.5]でブロッキングし、抗ｃ−ｍｙｃ抗体(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)と反応させ、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。免疫反応性は、ＥＣＬキット(Invitrogen)を用いて検出し、化学発光検出システム(chemiluminescence detection system; GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)を用いて可視化した。シグナル密度は画像解析ソフト(Image Gauge software; GE Healthcare)を用いて測定した。【００３４】
３．ｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）の構築とトランスフェクション
Ａｋｔ１／２  ｓｉＲＮＡはSanta Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA)から購入した。ＰＫＣα  ｓｉＲＮＡ（PKCα KD)及びネガティブコントロールであるｓｉＲＮＡ（ＮＣ）はAmbion (Carlsbad, CA, USA)から購入した。
ＰＫＣα用のｓｉＲＮＡの配列としては、5'-GAACGUGCAUGAGGUGAAAtt-3' （配列番号１）及び5'-UUUCACCUCAUGCACGUUCtt-3' （配列番号２）を用いた。
ＮＣ  ｓｉＲＮＡは、同じＧＣ含量及び核酸組成を有するスクランブル配列を用いた。
各ｓｉＲＮＡの細胞へのトランスフェクションにはリポフェクトアミン試薬(Invitrogen)を用いた。トランスフェクション４８時間後の細胞を実験に用いた。【００３５】
４．ウェスタンブロッティング
３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンを含有し、１０ｍＭグルコースを添加したKrebs-Ringer-HEPES buffer[136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.25 mM CaCl2, 1.25 mM MgSO4及び20 mM HEPES, pH 7.5]中、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を各種ホスホエタノールアミンの存在下又は非存在下で１０分間インキュベートした。次いで、細胞を１％（ｖ／ｖ）プロテアーゼインヒビターカクテルを含む溶解バッファー[150 mM NaCl, 20 mM エチレンジアミン四酢酸, 0.5% (v/v) Nonidet P-40 及び 50 mM Tris, pH 7.4]で溶解し、４℃で５分間、３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を全細胞溶解物として用いた。
ウェスタンブロッティングのために、蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、ポリビニリデンジフルオライド膜に転写した。ブロッティング膜は５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むＴＢＳ−Ｔ[150 mM NaCl, 0.1% (v/v) Tween20及び 20 mM Tris, pH7.5]でブロッキングし、続いて、それぞれphospho-Thr308-Akt1/2［pT308］、phospho-Ser-Akt1/2［pS473］、Ａｋｔ１/２に対する抗体(Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA)、あるいはβ−アクチンに対する抗体(Sigma, St. Louis, MO, USA)と反応させた。洗浄後、膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させた。免疫反応性は、ＥＣＬキット(GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)を用いて検出し、化学発光検出システム(chemiluminescence detection system;GE Healthcare)を用いて可視化した。各サンプルの蛋白質濃度はＢＣＡプロテインアッセイキット(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)を用いて測定した。【００３６】
５．ＧＬＵＴ４内部移行（取込み）アッセイ
３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有し、１０ｍＭグルコースを添加したKrebs-Ringer-HEPES buffer中、３７℃で３時間インキュベートし、次いで細胞を１００ｎＭのインスリンと３７℃で３０分間インキュベートした。氷冷したKrebs-Ringer-HEPES bufferで３回洗浄した後、細胞を予め温めておいたKrebs-Ringer-HEPES buffer中、ＤＯＰＥの存在下又は非存在下、３７℃で１２０分間培養した。【００３７】
（結果）
各種リン脂質誘導体で処理しない（Control）か、あるいは処理した細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった結果を図１に示す。ＤＯＰＥで処理した場合のみ有意に細胞膜におけるＧＬＵＴ４の分布を増加させた。この結果は、ＤＯＰＥがＧＬＵＴ４の細胞膜分布を増加させる作用があり、他のリン脂質誘導体にはその作用がないことを示している。
インスリンで前処理（洗い流して除去）した後にＤＯＰＥ処理した（あるいは未処理の）細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった結果を図２に示す。ＤＯＰＥ非存在下では、インスリン刺激でＧＬＵＴ４は細胞膜上に輸送されるが、１２０分後にはエンドサイトーシスにより細胞内へ取込まれた。これに対して、ＤＯＰＥ存在下では、インスリン刺激で輸送された細胞膜上ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシスが抑制されていた。
ネガティブコントロールであるＮＣ ｓｉＲＮＡ(NC)又はＰＫＣα ｓｉＲＮＡ（PKCα KD）をトランスフェクトした３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった結果を図３に示す。ＰＫＣα ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞の細胞膜におけるＧＬＵＴ４分布が有意に増加していた。この結果は、ＰＫＣαノックダウンにより細胞膜上ＧＬＵＴ４分布が増加することを示している。換言すると、ＰＫＣαは細胞膜上ＧＬＵＴ４分布を減少させることを示唆している。
ネガティブコントロールであるＮＣ ｓｉＲＮＡ（NC）又はＰＫＣα ｓｉＲＮＡ（PKCα KD）をトランスフェクトした３Ｔ３Ｌ１−ＧＬＵＴ４ｍｙｃ脂肪細胞を用い、インスリンで前処理（洗い流して除去）した後にＤＯＰＥ処理した（あるいは未処理の）細胞を溶解し細胞質（Ｃ）画分と細胞膜（Ｍ）画分に分離し、次いで抗ｃ−ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行なった結果を図４に示す。
インスリン刺激でＧＬＵＴ４は細胞膜上に輸送され、その後、エンドサイトーシスにより細胞内へ取込まれ、細胞膜上のＧＬＵＴ４が減少するが、ＰＫＣα ｓｉＲＮＡをトランスフェクションした細胞では当該減少が抑制された。この結果は、インスリン刺激で輸送された細胞膜上ＧＬＵＴ４のエンドサイトーシスがＰＫＣαノックダウンで抑制されることを示している。換言すれば、ＰＫＣαはＧＬＵＴ４エンドサイトーシスを刺激することを示唆している。【００３８】
実施例２：ＤＯＰＥが有するＰＫＣα活性化抑制作用の検証
（材料と方法）
セルフリーＰＫＣアッセイ
無細胞系でのＰＫＣ活性は、既報(Kanno T et al. J Lipid Res 2006;47:1146-1156)に記載された方法によって定量した。要すれば、合成ＰＫＣ基質ペプチド(10μM)を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(pH 7.5)，５ｍＭ酢酸マグネシウム，１０μＭ  ＡＴＰを含むメディウム中、ＤＯＰＥ（100μＭ）の存在下又は非存在下、1μＭのＴＰＡ（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）の存在下又は非存在下で、３０℃、５分間種々のＰＫＣアイソザイムと反応させた。ＰＫＣ−δや−ε等の新規なＰＫＣに対してはＣａ２＋−ｆｒｅｅのメディウムを用い、それ以外のＰＫＣアイソザイムに対しては１００μＭ  ＣａＣｌ２を含むメディウムを用いた。逆相ＨＰＬＣ(LC-10ATvp, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)に負荷し、基質ペプチドのピークと新しい生成物のピークを２１４ｎｍの吸光度で測定した。リン酸化されていないＰＫＣ基質ペプチドとリン酸化されているＰＫＣ基質ペプチドの面積を測定し（総面積は本実施例で用いたＰＫＣ基質ペプチドの濃度に相当する）、リン酸化された基質ペプチドの量を算出した。１分間当たりにリン酸化された基質ペプチドの量(pmol/1 min) をＰＫＣ活性の指標として用いた。【００３９】
（結果）
結果を図５に示す。この結果は、ＤＯＰＥそれ自身はＰＫＣ活性化に関与しないが、ＴＰＡによって活性化されたＰＫＣαを抑制する作用があることを示している。【００４０】
実施例３：ＤＯＰＥが有する血糖値低下作用の検証
（材料と方法）
グルコース耐性テスト
Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｌｅｐｒｄｂ／ｌｅｐｒｄｂマウス（雌性、８週齢）(CLEA Japan; Tokyo, Japan)を用いた。グルコース耐性テストは１２時間飢餓状態のマウスで行なった。グルコース(2 g/ml/kg body weight)を強制経口投与し、その時点を０ｈとした。グルコースを投与する３０分前に、ＤＯＰＥ(0, 0.1, 1, 10mg/kg)を経口投与した。ＤＯＰＥ(0mg/kg)には食塩水を用いた。３０、６０、及び９０分の時点で尾静脈から血液(10μl)を回収し、得られた血液から血漿サンプルを調製しｐ−アミノベンジルエチルエステル(ABEE)で標識した、各血漿サンプルを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システム(LC-10ATvp; Shimadzu Co., Kyoto, Japan)に負荷した。グルコース濃度は、標準グルコース溶液を用いて作成されたピーク面積／濃度の検量線から算出した。
（結果）
結果を図６に示す。この結果は、ＤＯＰＥが２型糖尿病モデルマウスに対して用量依存性に血糖値を下げる作用があることを示している。【００４１】
以上の結果より、ＰＫＣα活性化を抑制→ＧＬＵＴ４の細胞内輸送（エンドサイトーシス）の抑制→細胞膜上のＧＬＵＴ４分布の増加→細胞外から細胞内への糖取込み増加→糖尿病治療への適用、というＤＯＰＥの有する糖尿病やメタボリックシンドローム治療における有用性が明らかになった。
【配列表フリーテキスト】
【００４２】
配列番号１：ｓｉＲＮＡ
配列番号２：ｓｉＲＮＡ
【産業上の利用可能性】
【００４３】
ＤＯＰＥは、糖尿病の治療に優れた薬理作用（タンパク質リン酸化酵素Ｃα（ＰＫＣα）活性化抑制作用、グルコーストランスポーター４（ＧＬＵＴ４）のエンドサイトーシス抑制作用及び血糖値低下作用）を有し、従って糖尿病治療薬として有用である。またかかる薬理作用に基づいて種々の試薬としても有用である。【００４４】
本出願は、日本で出願された特願２０１４−００７２３２（出願日２０１４年１月１７日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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