(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性ハプテン被検体を含有すると推測される未知の試料であって干渉物質を含有すると推測される未知の試料中の被検体の実際の濃度を決定するための方法であって、下記のステップを含有する方法。
（ａ）未知の試料について第一のアッセイ方法を実行し、前記未知の試料中の前記疎水性ハプテン被検体の測定濃度を得、前記未知の試料について第二のアッセイ方法を実行して前記未知の試料中の前記干渉物質の濃度を得るステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記疎水性ハプテン被検体の前記測定された濃度及び前記干渉物質の前記測定された濃度を利用する所定の補正式を適用して、前記未知の試料中の前記疎水性ハプテン被検体の実際の濃度を決定するステップ。
ここで、前記補正式は、
（ｉ）前記第一のアッセイ方法を用いて、前記干渉物質を含有する少なくとも２つの異なる試料について、前記疎水性ハプテン被検体の濃度を測定し、被検体に特異的な特性を直接に測定する参照方法を用いて、前記少なくとも２つの異なる試料について、前記疎水性ハプテン被検体の濃度を測定するステップ；
（ｉｉ）前記第一のアッセイ方法と前記参照方法との間のバイアス（ここで、バイアスとは、異なる試料のそれぞれについて前記参照方法及び前記第一の方法によって決定された疎水性ハプテン被検体の濃度の間の相違である。）を決定するステップ；
（ｉｉｉ）前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて、前記干渉物質の濃度を測定するステップ；及び
（ｉｖ）前記バイアス及び前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれにおける干渉物質の濃度を用いて、回帰分析を行なうことにより、補正式を決定するステップ
を含む方法により、前以って決定される。
ここで、前記回帰分析は、回帰線を形成し該回帰線の傾き及び切片を使用して下記補正式を形成することを含む。
［Ａｎ］＝［ｍＡｎ］＋（ａ×［ｍＩＳ］＋ｂ）
（式中、［Ａｎ］は、前記未知の試料中の前記疎水性ハプテン被検体の実際の濃度、［ｍＡｎ］は、前記未知の試料中の前記疎水性ハプテン被検体の測定濃度、［ｍＩＳ］は、前記未知の試料中の前記干渉物質の測定濃度、ａは、前記回帰線の傾き、そして、ｂは、前記回帰線の切片である。）
【請求項２】
前記第一のアッセイ方法が下記のステップを含有する請求項１に記載の方法。
（ｉ）前記試料中の前記疎水性ハプテン被検体の測定濃度を決定するための試薬であって、疎水性ハプテン被検体の少なくとも１つの結合パートナーを含有する試薬を、前記試料を含有する媒体に添加するステップ、及び
（ｉｉ）前記疎水性ハプテン被検体が前記疎水性ハプテン被検体の前記結合パートナーに結合する条件下に、前記媒体をインキュベートするステップ。
【請求項３】
前記疎水性ハプテン被検体が、脂溶性ビタミン、ステロイドホルモン、治療薬物及び濫用薬物からなる群から選ばれる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性ハプテン被検体が、ビタミンＤである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一のアッセイ方法が下記のステップを含む請求項１に記載の方法。
アッセイ媒体中で、前記試料を、（ｉ）前記疎水性ハプテン被検体に結合して錯体を形成できる前記疎水性ハプテン被検体の抗体及び（ｉｉ）前記疎水性ハプテン被検体錯体又は前記抗体との結合に関して前記試料中の前記疎水性ハプテン被検体と競合する疎水性ハプテン被検体類似体の量に関連する信号を発生する信号発生システムの一員であって前記抗体に結合している信号発生システムの一員と、合一するステップ、
前記錯体を形成する条件下に前記アッセイ媒体をインキュベートするステップ、
前記錯体からの信号の量を測定するステップ、及び
信号の前記量を試料中の疎水性ハプテン被検体の測定濃度と関連付けるステップ。
【請求項６】
ビタミンＤ被検体を含有すると推測される未知の試料であって、コレステロールを含有すると推測される未知の試料中の前記ビタミンＤの実際の濃度を測定する方法であって、下記のステップを含む方法。
（ａ）未知の試料について第一のアッセイ方法を実行して前記未知の試料中の前記ビタミンＤの測定濃度を得、前記未知の試料について第二のアッセイ方法を実行してコレステロールの濃度を得るステップ；及び
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた前記ビタミンＤの測定濃度及びコレステロールの測定濃度を利用する所定の補正式を適用して、前記未知の試料中の前記ビタミンＤ被検体の実際の濃度を決定するステップ。
ここで、前記補正式は、下記のステップを含む方法により、前以って決定される。
（ｉ）少なくとも２つの異なる試料であって更にコレステロールを含有する試料について、前記第一のアッセイ方法を用いて、前記ビタミンＤ被検体の濃度を測定し、且つ、前記少なくとも２つの異なる試料について、被検体に特異的な特性を直接に測定する参照方法を用いて、前記ビタミンＤ被検体の濃度を測定するステップ；
（ｉｉ）前記第一のアッセイ方法と前記参照方法との間のバイアスを決定するステップ、ここで、バイアスとは、異なる試料のそれぞれについて前記参照方法及び前記第一のアッセイ方法によって決定されたビタミンＤ被検体の濃度の間の相違であり、
（ｉｉｉ）前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて、コレステロールの濃度を測定するステップ；及び
（ｉｖ）前記バイアス及び前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれにおけるコレステロールの濃度を用いて、回帰分析を行なうことにより、補正式を決定するステップ。
ここで、前記回帰分析は、回帰線を形成し該回帰線の傾き及び切片を使用して下記補正式を形成することを含む。
［ビタミンＤ］＝［ｍ  ビタミンＤ］＋（ａ×［ｍ  コレステロール］＋ｂ）
（式中、［ビタミンＤ］は、前記未知の試料中の前記ビタミンＤ被検体の実際の濃度、［ｍ  ビタミンＤ］は、前記未知の試料中の前記ビタミンＤ被検体の測定濃度、［ｍ  コレステロール］は、前記未知の試料中のコレステロールの測定濃度、ａは、前記回帰線の傾き、そして、ｂは、前記回帰線の切片である。）
【請求項７】
前記第一のアッセイ方法が下記のステップを含む請求項６に記載の方法。
（ｉ）前記試料中の前記ビタミンＤ被検体の前記測定濃度を決定するための試薬であって、前記ビタミンＤの少なくとも１つの結合パートナーを含有する試薬を、前記試料を含む媒体に添加するステップ、及び
（ｉｉ）前記ビタミンＤ被検体を前記ビタミンＤ被検体の前記結合パートナーに結合させる条件下に、前記媒体をインキュベートするステップ。
【請求項８】
前記第一のアッセイ方法がイムノアッセイである請求項１又は６に記載の方法。
【請求項９】
前記試料が体排出物、体吸引物、体切除物又は体抽出物である請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１０】
前記参照方法が質量分析法、液体クロマトグラフィ、電気泳動、マイクロ流体工学、顕微鏡検査法、分光学、化学的定量法及びイムノアッセイ並びにこれらの２以上の組合せからなる群から選ばれる請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１１】
前記回帰分析が回帰線を形成し該回帰線から補正式を展開することを含む請求項１又は６に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一のアッセイ方法が下記のステップを含む請求項６に記載の方法。
アッセイ媒体中で、前記試料を、（ｉ）前記ビタミンＤ被検体に結合して錯体を形成できる前記ビタミンＤ被検体の抗体及び（ｉｉ）前記ビタミンＤ被検体錯体又は前記抗体との結合に関して前記試料中の前記ビタミンＤ被検体と競合するビタミンＤ被検体類似体の量に関連する信号を発生する信号発生システムの一員であって前記抗体に結合している信号発生システムの一員と、合一するステップ、
前記アッセイ媒体を前記錯体を形成する条件下にインキュベートするステップ、
前記錯体からの信号の量を測定するステップ、及び
信号の前記量を試料中のビタミンＤ被検体の測定濃度と関連付けるステップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１４年１２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／０９３，１０５号の利益を請求する。上述の特許出願の全内容は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００２】
【特許文献１】Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎら、米国特許第３８１７８３７号明細書
【特許文献２】Ｕｌｌｍａｎら、米国特許第３９９６３４５号明細書
【特許文献３】Ｍａｇｇｉｏら、米国特許第４２３３４０２号明細書
【特許文献４】米国特許第５３５４６９３号明細書
【特許文献５】Ｄａｖａｌｉａｎら、米国特許第５０８９３９０号明細書
【特許文献６】米国特許第５５０８１７８号明細書
【特許文献７】米国特許第５３４０７１６号明細書
【特許文献８】米国特許第６２５１５８１号明細書
【特許文献９】米国特許第６１５３４４２号明細書
【特許文献１０】米国特許第７０２２５２９号明細書
【特許文献１１】米国特許第７２２９８４２号明細書
【特許文献１２】米国特許出願公開第２００５／０１１８７２７号明細書
【特許文献１３】米国特許第７１７９６６０号明細書
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３９：１１５７（１９６０）
【非特許文献２】Ｎｇｏ及びＬｅｎｈｏｆｆ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．（１９８０）１１６：２８５−２８８
【非特許文献３】Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）２２：８９５−９０４
【非特許文献４】Ｋｈａｎｎａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ａｃｔａ（１９８９）１８５：２３１−２４０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、被検体を含有すると推測される試料中の被検体の濃度を決定するための方法に関する。より具体的には、本発明は、試料中の被検体の濃度を決定するための上述の方法の間に行なわれる測定に対する干渉物質の影響の低減に関する。
【０００５】
例えば、薬物、ビタミンＤ及びビタミンＢ１２等のビタミン、並びにハプテンホルモン等の疎水性化合物は、リポタンパクの疎水性コア中に見出されることが多く、その代替被検体マーカーはコレステロールであり、このものは、低密度リポタンパク（ＬＤＬ）、超低密度リポタンパク（ＶＬＤＬ）、中間型リポタンパク（ＩＤＬ）、高密度リポタンパク（ＨＤＬ）及びカイロミクロンを始めとする全てのリポタンパク中に存在する。
【０００６】
上述のように、ビタミンＤは、そのような疎水性化合物の１つである。ビタミンＤは、紫外光により形成された後、リポタンパク及び血液中のビタミンＤ結合タンパク（ＶＤＢＰ）により輸送される。ビタミンＤが例えばアルコール等の有機溶媒で抽出されないビタミンＤのアッセイにおいて、ビタミンＤは、適切な試薬を用いてＶＤＢＰから遊離される。しかしながら、リポタンパクのコアの中のビタミンＤ分子は、リポタンパクのコアの中に残され、殆ど、影響を受けない。抽出アッセイは、骨が折れるものであり、上述のように、試料に対して有機溶媒を使用することが必要である。従って、例えばリポタンパクのコアのような干渉物質から遊離されないビタミンＤ分子は、イムノアッセイにおいて用いられる抗体に近づくことができないので、ビタミンＤ及び他の疎水性化合物のイムノアッセイの殆どは、例えば試料中のコレステロール及びリポタンパクのような１以上の干渉物質により負の影響を受ける。試料中のビタミンＤの実際の量は、正確に決定することができず、イムノアッセイで観察されるビタミンＤの量は、誤って高くなり或いは低くなる。
【０００７】
生物学的試料中のビタミンＤ量を評価することは、ビタミンＤ欠乏が哺乳動物の障害の多くに関連するので、重要である。患者から採取された試料中の疎水性ハプテン被検体の量を測定するための迅速且つ正確な診断方法を開発する必要が絶えず存在する。その方法は、全自動で、種々の干渉物質を含有する試料について実施されたときでも正確でなければならない。このアッセイ方法により、試料中の疎水性ハプテン被検体の量が正確に測定されなければならず、他方、試料中に存在する干渉物質に起因する不正確さを最小にするものでなければならない。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書に記述する原理に従う幾つかの例は、疎水性ハプテン被検体を含有すると推測される未知の試料であって、干渉物質を含有すると推測される未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の実際の濃度を測定する方法に向けられている。第一のアッセイ方法は、未知の試料について実施され、当該未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の濃度の測定値が得られる。第二のアッセイ方法は、当該未知の試料について実施され当該未知の試料中の干渉物質の濃度が得られる。ステップ（ａ）で得られた疎水性ハプテン被検体の測定濃度及び干渉物質の測定濃度を利用する所定の補正式が適用されて、未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の実際の濃度が決定される。補正式は、（ｉ）干渉物質を含有する少なくとも２つの異なる試料について、第一のアッセイ方法を用いて疎水性ハプテン被検体の濃度を測定し、この少なくとも２つの異なる試料について、参照方法を用いて疎水性ハプテン被検体の濃度を測定し、（ｉｉ）前記第一のアッセイ方法と前記参照方法との間のバイアスを決定し、ここで、バイアスとは、異なる試料のそれぞれについて前記参照方法及び前記第一の方法によって決定された疎水性ハプテン被検体の濃度の間の相違であり、（ｉｉｉ）前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて、干渉物質の濃度を測定し、そして、（ｉｖ）前記バイアス及び前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれにおける干渉物質の濃度を用いて、回帰分析を行なうことにより、補正式を決定することからなる方法により、前もって決定される。
【０００９】
本明細書に記述する原理に従う幾つかの例は、ビタミンＤ被検体を含有すると推測される未知の試料であって、コレステロールを含有すると推測される未知の試料中のビタミンＤの実際の濃度を測定する方法に向けられている。未知の試料についての第一のアッセイ方法が実施され当該未知の試料中のビタミンＤ被検体の測定濃度が得られる。未知の試料についての第二のアッセイ方法が実施され未知の試料中のコレステロールの測定濃度が得られる。ステップ（ａ）で得られたビタミンＤ被検体の測定濃度及びコレステロールの測定濃度を利用する所定の補正式を適用して、未知の試料中のビタミンＤ被検体の実際の濃度を決定する。前記補正式は、（ｉ）第一のアッセイ方法を用いて少なくとも２つの異なる試料についてビタミンＤ被検体の濃度を測定し、参照方法を用いてコレステロールをも含有する前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについてビタミンＤ被検体の濃度を測定し、（ｉｉ）第一のアッセイ方法と参照方法との間のバイアスを決定し（ここで、バイアスとは、前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて、参照方法及びアッセイ方法によって測定されたビタミンＤ被検体の濃度の差をいう。）、（ｉｉｉ）前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれの中のコレステロールの濃度を測定し、そして、（ｉｖ）前記バイアスと前記少なくとも２つの異なる試料それぞれの中のコレステロールの濃度とを用いて回帰分析を行なうことによって補正式を決定することからなる方法によって予め決定される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
ここに提示する図面は、原寸に比例するものではなく、本明細書に記述する原理に従う例の理解を促進する目的で提供され、また、説明のために提供されるものであり、添付した請求項の範囲を限定するものではない。
【図１】図１は、１組の試料の各試料について、コレステロールの濃度に対してプロットしたバイアス（このバイアスは、１組の試料のビタミンＤについての液体クロマトグラフィ−質量分析法（ＬＣＭＳ）アッセイの結果を、同じ１組の試料についてのビタミンＤイムノアッセイの結果から差し引くことによって得られる。）を示すグラフである。
【図２】図２は、イムノアッセイによって測定されたビタミンＤの濃度を、前記１組の試料の各試料に対してプロットした図１のバイアス（補正式に基づいて補正している。）を示す。
【図３】図３は、イムノアッセイによって測定したビタミンＤの濃度（補正式を適用していない。）を、参照方法によって測定したビタミンＤの濃度に対してプロットした図である。
【図４】図４は、イムノアッセイによって測定したビタミンＤの濃度（補正式を適用している。）を、参照方法によって測定したビタミンＤの濃度に対してプロットした図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本明細書に記述する原理に従う方法の例によれば、ホストから採取された試料（この試料は、疎水性ハプテン被検体を正確に検出する能力に影響を与える１以上の干渉物質を含有する。）中の疎水性ハプテン被検体の正確な測定が提供される。本明細書に記述する原理に従う方法の例によれば、疎水性ハプテン被検体の測定濃度は、未知の試料の一部における疎水性ハプテン被検体の濃度をアッセイ方法により測定し、前記未知の試料の他の一部における干渉物質の濃度を、もう１つの、通常は別の、アッセイ方法により測定し、上記の両測定値を利用した所定の補正式を適用することによって補正して、未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の正確な測定値が得られる。幾つかの例では、干渉物資の濃度の測定は、疎水性ハプテン被検体の測定をも包含するテストパネルの一部として実施される。
【００１２】
補正式は、（ｉ）少なくとも２つの異なる試料であって干渉物質をも含有する試料について、第一のアッセイ方法を用いて、疎水性ハプテン被検体の濃度を測定し、前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて、参照方法を用いて、疎水性ハプテン被検体の濃度を測定し、（ｉｉ）前記第一のアッセイ方法と前記参照方法との間のバイアス（ここで、バイアスとは、前記２つの異なる試料について、前記参照方法及び前記第一のアッセイ方法により測定された疎水性ハプテン被検体の濃度の差をいう。）を測定し、（ｉｉｉ）前記２つの異なる試料における干渉物質の濃度を測定し、そして（ｉｖ）前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて、バイアス及び干渉物質の濃度を用いて回帰分析を行なうことにより補正式を決定することを含む方法により、予め決定される。
【００１３】
本発明者は、補正式なしでは、干渉物質によって、高すぎる又は低すぎるアッセイ測定値が得られるとしても、上述の補正式を用いれば、疎水性ハプテン被検体のより正確な測定ができることを見出した。
【００１４】
用語「疎水性ハプテン被検体」は、約２，５００未満の、又は約２，０００未満の、又は約１，５００未満の、又は約１，０００未満の、又は約５００未満の分子量を有し、例えば、約１００〜約２，５００の、又は約３００〜約２，５００の、又は約３００〜約２，０００の、又は約３００〜約１，５００の、又は約３００〜約１，０００の、又は約５００〜約２，５００の、又は約５００〜約２，０００の、又は約５００〜約１，５００の、又は約５００〜約１，０００の分子量範囲を有する被検体をいう。疎水性ハプテン被検体は、脂溶性であり、これは、疎水性ハプテン被検体が、例えば、１以上の脂肪、油、脂質に可溶であることを意味する。
【００１５】
幾つかの例では、疎水性ハプテン被検体には、これらに限定されるものではないが、例えば、ビタミン、濫用薬物、治療薬及びステロイドホルモンが含まれる。ビタミンには、これらに限定されないが、例えば、ビタミンＤ、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ及びビタミンＫが含まれる。ステロイドホルモンには、これは説明のためであって限定するものではないが、例えば、プロゲストゲン、エストロゲン、アンドロゲン、糖質ステロイド、鉱質コルチコイド及びセコステロイドが含まれる。本明細書に記述する原理に従う幾つかの例では、疎水性ハプテン被検体は、例えば、ビタミンＤである。
【００１６】
本明細書において、用語「ビタミンＤ」は、脂溶性セコステロイドのグループを指し、例えば、１以上の２５−ヒドロキシコレカルシフェロール（カルシジオール、カルシフェディオール、２５−ヒドロキシコレカルシフェロール又は２５−ヒドロキシビタミンＤ３及び２５−ヒドロキシビタミンＤ２を始めとする２５−ヒドロキシビタミンＤ（２５（ＯＨ）Ｄ）と略する。）；カルシジオール、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（カルシトリオール；１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ４；１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ５；及び１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ６；上述のもの全ての代謝体を含む。）を包含する。
【００１７】
分析対象の試料は、疎水性ハプテン被検体及び１以上の干渉物質を含有すると推測される試料である。試料は、生物学的試料であっても非生物学的試料であってもよい。生物学的試料は、哺乳動物被験体であっても非哺乳動物被験体であってもよい。哺乳動物被験体は、例えば、ヒト又は他の動物種であってよい。「非哺乳動物被験体」は、生物学的材料に関連しないものであって、これには、例えば、土壌試料、廃棄物流、水試料、空気試料、空気以外のガス試料及び鉱物試料が含まれる。用語「生物学的試料」は、例えば、体液、体組織、体化合物及び培養培地等のあらゆる生物学的材料をいう。試料は、あらゆる源からの固体、半固体又は流体（液体又は気体）であってよい。幾つかの実施態様では、試料は、体排出物、体吸引物、体切除物又は体抽出物であってよい。体とは、通常哺乳動物のそれであり、幾つかの実施態様では、体とは、人体である。体排出物は、例えば、尿、糞、便、膣粘液、精液、涙、息、汗、水疱液及び炎症性浸出液等の、体から排出される物質である（もっとも、これらは、切除又は抽出によっても得られる。）。体切除物とは、例えば、皮膚、毛髪並びに器官及び他の体部分からの生検材料を始めとする組織試料等の、体から採取された材料である。体吸引物とは、例えば、粘膜、唾液及び痰のような体から吸引された材料である。体抽出物とは、例えば、全血、血漿、血清、髄液、脳髄液、リンパ液、滑液及び腹水等の体から抽出された材料である。いくつかの例では、試料は、全血、血漿又は血清である。
【００１８】
用語「干渉物質」とは、疎水性ハプテン被検体と相互作用して疎水性ハプテン被検体を、疎水性ハプテン被検体の測定のためのアッセイに用いられる疎水性ハプテン被検体の抗体等の結合パートナーと、結合できなくする１以上の化合物をいう。そのような干渉物質には、これらに限られないが、例えば、ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ、ＨＤＬ及びカイロミクロンを始めとする全てのリポタンパク中に存在するコレステロールが含まれる。
【００１９】
（補正式の決定）
本明細書に記述する原理に従う例は、干渉物質が測定の正確さに影響する疎水性ハプテン被検体のアッセイに特別の適用を有する。上述のとおり、所定の補正式が、試験された試料中の１以上の干渉物質の存在に起因するアッセイ測定値の不正確な結果を補正するために採用される。本明細書に記述する原理に従う例では、補正式をあらかじめ決定する方法は、第一のアッセイ方法を用いて、少なくとも２つの異なる試料であって干渉物質をも含有する試料について疎水性ハプテン被検体の濃度を測定し、参照方法を用いて、前記少なくとも２つの異なる試料のそれぞれについて疎水性ハプテン被検体の濃度を測定することを含む。
【００２０】
所定の補正式は、例えば、生産者又は開発者によって、ホストからの未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の濃度を決定するために用いられるアッセイのために、決定される。一旦決定されれば、補正式は、例えば、アッセイの指示書に包含することによって、未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の濃度の決定に用いるために試験室等のユーザーに広められる。所定の補正式は、このユーザーによって、未知の試料の引き続く分析のために得られたアッセイの結果に容易に適用され、未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の正確な濃度が決定される。
【００２１】
補正式を決定するにあたり、第一のアッセイ方法に供される疎水性ハプテン被検体を含有する異なる試料の数は、少なくとも２、又は少なくとも３、又は少なくとも４、又は少なくとも５、又は少なくとも６である。幾つかの例では、採用される疎水性ハプテン被検体を含有する異なる試料の数は、例えば、２〜２０の間、又は２〜１５の間、又は２〜１４の間、又は２〜１３の間、又は２〜１２の間、又は２〜１１の間、又は２〜１０の間、又は３〜２０の間、又は３〜１５の間、又は３〜１４の間、又は３〜１３の間、又は３〜１２の間、又は３〜１１の間、又は３〜１０の間、又は４〜２０の間、又は４〜１５の間、又は４〜１２の間、又は４〜１０の間、又は５〜２０の間、又は５〜１５の間、又は５〜１２の間、又は５〜１０の間、又は６〜１５の間、又は６〜１４の間、又は６〜１３の間、又は６〜１２の間、又は７〜１５の間、又は７〜１４の間、又は７〜１３の間、又は７〜１２の間、又は８〜２０の間、８〜１５の間、又は８〜１２の間である。
【００２２】
幾つかの例では、採用される疎水性ハプテン被検体の濃度は、分析すべき未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の予期される濃度範囲に亘る。試験される疎水性ハプテン被検体の濃度は、一般に、例えば、約１０−５〜約１０−１７モル、又は約１０−６〜約１０−１４モル、又は約１０−８〜約１０−１０モルに及ぶ。各試料中の干渉物質の濃度は、例えば、約１０ｍｇ／ｄＬ〜約１，０００ｍｇ／ｄＬ、又は約５０ｍｇ／ｄＬ〜約１，０００ｍｇ／ｄＬ、又は約１００ｍｇ／ｄＬ〜約１，０００ｍｇ／ｄＬ、又は約２００ｍｇ／ｄＬ〜約１，０００ｍｇ／ｄＬ、又は約３００ｍｇ／ｄＬ〜約１，０００ｍｇ／ｄＬ、又は約５００ｍｇ／ｄＬ〜約１，０００ｍｇ／ｄＬ、又は約１０ｍｇ／ｄＬ〜約５００ｍｇ／ｄＬ、又は約５０ｍｇ／ｄＬ〜約５００ｍｇ／ｄＬ、又は約１００ｍｇ／ｄＬ〜約５００ｍｇ／ｄＬ、又は約２００ｍｇ／ｄＬ〜約５００ｍｇ／ｄＬ、又は約３００ｍｇ／ｄＬ〜約５００ｍｇ／ｄＬの間で変化する。
【００２３】
補正式の決定に当たって採用される第一のアッセイ方法は、疎水性ハプテン被検体を含有すると推測される試料、つまり未知の試料、を測定するために引き続いて用いられるアッセイ方法である。第一のアッセイ方法として如何なるアッセイ方法を採用してもよい。幾つかの例では、第一のアッセイ方法は、試料中の疎水性被検体の濃度を決定するための試薬であって疎水性被検体のための少なくとも１つの結合パートナーを含有する試薬を、試料を含有する媒体に、添加するステップ、及びこの媒体を、前記疎水性被検体のための結合パートナーに前記疎水性被検体を結合させる条件下で、インキュベートするステップを含む。結合により、前記被検体のための結合パートナーと前記被検体又は被検体類似体との錯体が生じる。そのような錯体の量が測定され、試料中の前記被検体の量に関連付けられる。
【００２４】
用語「結合パートナー」とは特定の結合対の一員である分子をいい、特異的に結合し、それにより他の分子の相補体と定義される２つの異なる分子の一方である。例えば、特定の結合対の一員は、表面上又は空洞に、該特定の結合対の他のメンバーの特別な空間的又は極性組織に特異的に結合する領域を有している。結合パートナーは、これは例示のためであって限定するものではないが、例えば、抗体又はアプタマー（例えば、核酸アプタマー又はペプチドアプタマー）である。
【００２５】
試薬として抗体を採用するアッセイは、イムノアッセイと呼ばれる。用語「被検体の抗体」とは、被検体に（そして、幾つかの例では、密接に関連する、被検体の代謝物としての、被検体の構造的類似体に）特異的に結合し、該被検体の分析を不正確にする他の物質とは影響を及ぼす程度には結合しない抗体をいう。従って、特異的結合には、２つの異なる分子の一方の他方に対する（その他の分子に対して認識が実質的に低いのに比較すると）特異的な認識が関与する。他方、非特異的結合には、特異的な表面構造の影響を相対的に受けない分子間の非共有結合が関与する。非特異的結合は、分子間の疎水性相互作用を始めとする幾つかの要因によって生じる。
【００２６】
一般に、本明細書に記述する原理に従う補正式の決定のための第一のアッセイ方法として採用されるアッセイは、アッセイ媒体中で疎水性ハプテン被検体を含有する試料と疎水性ハプテン被検体の抗体とを結合させることにより実施される。抗体は遊離で採用しても共役系で採用していてもよい。共役抗体は、例えば、支持体若しくは標識又は支持体と標識との結合体に結合している抗体である。採用される他の試薬の性質は、実行すべきアッセイの型による。媒体中での結合は、被検体又は被検体類似体を抗体と結合させて錯体を形成させる条件による。錯体の量は、錯体の量が媒体中で被検体の量に関連しているところで測定される。
【００２７】
「被検体類似体」とは、被検体の抗体のような受容体への結合に関して被検体と競合する変性された被検体をいう。変性により、被検体類似体を他の分子に結合させる手段が与えられる。被検体類似体は、通常、被検体類似体をハブ又は標識に連結する結合で水素を置換する以上に、被検体とは異なるが、そうでなくてもよい。被検体類似体は、例えば、例えば標識又は支持体のような他の分子に、例えば結合又は連結基を介して、共役した被検体であってもよい。
【００２８】
アッセイは、任意のアッセイ成分又は生成物を分離しないで（均質）行なってもよく分離して（非均質）行なってもよい。非均質アッセイは、通常、１以上の分離ステップが関与するが、競合的でも非競合的でもよい。イムノアッセイは、標識した又は標識しない試薬を用いてもよい。非標識化試薬を用いるイムノアッセイは、通常、本明細書に記述する原理に従う免疫コンジュゲートから準備された１以上の抗体が関与する相対的に大きな錯体の生成を含む。そのようなアッセイには、例えば、免疫沈降及び凝集法並びに対応する比濁法及び比ろう法のような抗体錯体の検知のための光散乱技法が含まれる。標識化イムノアッセイには、これらに限定されないが、例えば、化学発光イムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、蛍光偏光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、阻害アッセイ、誘起発光アッセイ、蛍光酸素チャネリングアッセイが含まれる。
【００２９】
イムノアッセイの一般的な群の１つには、試薬の１つの限定された濃度を用いるイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイのもう１つの群には、１以上の主な試薬の過剰の使用が関係する。イムノアッセイのもう１つの群は、分離のない均質なアッセイであり、ここでは、試料中の抗体への被検体又は被検体類似体の結合の際に、標識化試薬が標識信号を調整する。
【００３０】
上述のように、アッセイは、任意のアッセイ成分又は生成物を分離しないでも（均質）又は分離しても（非均質）実施することができる。均質アッセイとしては、特許文献１の第３欄第６行〜第６欄第６４行に開示されているＥＭＩＴ（登録商標）アッセイ（シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス社、イリノイ州ディアフィールド）；特許文献２第１７欄第５９行〜第２３欄第２５行に開示されているような免疫蛍光法；特許文献３第６欄第２５行〜第９欄第６３行に開示されているような酵素チャネリングイムノアッセイ（ＥＣＩＡ）；特許文献４例えば、中でも特許文献４に開示されている蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）；及びＹａｌｏｗら酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような酵素イムノアッセイが例示される。非均質アッセイの例は、特許文献５に開示されている。上述の開示の関連部分を、参照により、本明細書に取り入れる。
【００３１】
他の酵素イムノアッセイは、例えば、非特許文献２において議論された酵素調整媒介免疫測定法（「ＥＭＭＩＡ」）、非特許文献３において開示された基質標識蛍光免疫測定法（「ＳＬＦＩＡ」）、非特許文献４において開示された複合酵素ドナー免疫測定法（「ＣＥＤＩＡ」）、粒子強化比濁阻害免疫測定法（「ＰＥＴＩＮＩＡ」）等の均質粒子標識免疫測定法及び粒子強化比濁免疫測定法（「ＰＥＴＩＡ」）である。
【００３２】
その他のアッセイには、例えば、ゾル粒子免疫測定法（「ＳＰＩＡ」）、分散色素免疫測定法（「ＤＩＡ」）、メタロ免疫測定法（「ＭＩＡ」）、酵素膜免疫測定法（「ＥＭＩＡ」）及び蛍光免疫測定法（「ＬＩＡ」）が含まれる。他のタイプのアッセイには、抗体への結合の際の化合物の光学的、音響的及び電気的特性の変化のモニタリングを伴うイムノセンサーアッセイが含まれる。そのようなアッセイには、例えば光学イムノセンサーアッセイ、音響イムノセンサーアッセイ、半導体イムノセンサーアッセイ、電気化学的変換器イムノセンサーアッセイ、電位差測定イムノセンサーアッセイ及び電流測定電極アッセイが含まれる。
【００３３】
不均質アッセイは、通常、１つ以上の分離ステップを必要とし、競合的でも又は非競合的であってもよい。様々な競合的及び非競合的な不均質アッセイのフォーマットが、Ｄａｖａｌｉａｎらの特許文献５第１４欄第２５行〜第１５欄第９行に記載されており、その開示内容を参照により本発明に援用する。競合的な不均質アッセイの例では、被検体に対する抗体を結合した支持体を、被検体及び標識化被検体類縁体を含むと考えられる試料を含む媒体と接触させる。試料中の被検体は、被検体に対する抗体への結合に関して、検出可能な標識を有していてもよい被検体類縁体と競合する。支持体と媒体とを分離した後、支持体又は媒体の標識活性が、従来法により測定され、試料中の被検体の量と関係づけられる。
【００３４】
本明細書に記述する原理に従う補正式を予め決定するためのアッセイ方法で採用される媒体は、通常、最適のアッセイ感度を提供する中庸のｐＨの水性緩衝媒体である。前記水性媒体は、水のみでもよく、又は、０．１〜約４０体積％の共溶媒を含んでもいてよい。媒体のｐＨは、例えば、約４〜約１１の範囲、又は約５〜約１０の範囲、又は約６．５〜約９．５の範囲である。ｐＨは、通常、あらゆる特異的な結合対の結合メンバーの最適の結合や、信号生成システムの部材等の、アッセイに用いられる他の試薬のための最適ｐＨ、等々の妥協物である。様々な緩衝剤を用いて、望ましいｐＨを達成し、アッセイの間のｐＨを維持することができる。緩衝剤の例には、ホウ酸塩、リン酸塩、炭酸塩、ＴＲＩＳ、バルビタール、ＰＩＰＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＩＣＩＮＥ等が含まれる。使用される具体的な緩衝剤の種類は重要ではないが、個々のアッセイにおいて、或る緩衝剤又は他の緩衝剤の使用が好ましい場合もある。
【００３５】
上記アッセイ方法において、様々な補助的材料を使用してもよい。例えば、緩衝剤に加えて、媒体は、媒体の安定化剤及び使用される試薬の安定化剤を含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、これらの添加物に加えて、アルブミン等のタンパク質；ホルムアミド等の有機溶媒；第四級アンモニウム塩；例えば硫酸デキストラン等のポリアニオン；結合促進物質、例えばポリアルキレングリコール；例えばデキストラン又はトレハロース等の多糖類を添加してもよい。前記媒体は、血餅形成の防止剤を含有していてもよい。かかる試薬は当技術分野で公知であり、例えばＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸塩、ヘパリン等を含む。前記媒体は、例えばアジ化ナトリウム、硫酸ネオマイシン、ＰＲＯＣＬＩＮ（登録商標）３００、ストレプトマイシン等の当技術分野で公知の１つ以上の保存剤を含有してもよい。上記の材料のいずれであっても、それを使用する場合は、それは、所望の効果又は機能を発揮させるのに十分な濃度又は量で存在する。
【００３６】
採用するアッセイの性質によって、媒体は、例えば、標識がその一部を形成している信号生成システムの他のメンバーのような１以上の成分を含有していてもよい。
【００３７】
信号生成システムは、１つ以上の成分を有していてもよいが、少なくとも１つの成分は、標識である。信号生成システムは、試料中の疎水性ハプテン被検体の存在に関連する信号を発生する。信号生成システムは、測定可能な芯がオウを生成するのに必要な全ての試薬を含有する。信号生成システムの他の成分は、デヴェロッパー溶液中に含まれていてもよく、これらに限らないが、例えば、基質、強化剤、活性化剤、化学発光化合物、コファクター、禁止剤、捕捉剤、金属イオン、及び信号生成物質の結合に必要な特異的な結合物質を含有していてもよい。信号生成システムの他の成分は、例えば、補酵素、酵素生成物と反応する物質、その他の酵素及び触媒である。信号生成システムは、外部手段によって、電磁放射の使用によって、望ましくは視覚的検査によって、検知可能な信号を与える。信号生成システムの例は、特許文献６に記載されているが、その関連する開示を参照により、ここに援用する。
【００３８】
用語「標識」は、ポリ（アミノ酸）標識及び非ポリ（アミノ酸）標識を包含する。用語「ポリ（アミノ酸）標識部分」は、例えば、これらに限定されるわけではないが、酵素、抗体、ペプチド及び免疫原のようなタンパクを包含する。用語「非ポリ（アミノ酸）標識」は、タンパクではない標識を包含する。非ポリ（アミノ酸）標識は、直接に検知可能であるか又は検知可能な信号を生成する反応を通して検知することができる。非ポリ（アミノ酸）標識は、等方性でも非等方性でもよく、これは説明のためであって限定するものではないが、例えば、放射性同位体、発光化合物（これには、限定するものではないが、例えば、アクリジニウムエステル、蛍光化合物及び化学発光化合物が含まれる。）、触媒をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、染料、補酵素、酵素基質、放射性基、及び増幅可能なポリヌクレオチド配列であってよい。幾つかの例においては、非ポリ（アミノ酸）標識は、例えば、放射性同位体であり、（例えば、アクリジニウムエステルのように）発光性であり、（例えば、混濁度又は比濁法により、結合していないラテックス粒子から結合して分離できる磁性粒子のような）微粒子及び化学発光ビーズであってよい。
【００３９】
幾つかの既知のアッセイは、信号生成システム（ｓｐｓ）を使用し、そこでは、第一及び第二のｓｐｓメンバーを採用する。ｓｐｓメンバーは、ｓｐｓの一員の活性化が、例えば光等の、生成物を生じ、これがｓｐｓのもう１つのメンバーの活性化をするという点で、関連している。
【００４０】
既知のアッセイの幾つかの実施態様では、ｓｐｓメンバーは、例えば感光剤のような増感剤と、増感剤の活性化により生成される生成物によって活性化される化学発光組成物とを、含有する。第二のｓｐｓメンバーは、通常、結合した又は結合していないｓｐｓメンバーの量、即ち、検出すべき被検体に又は検出すべき被検体の量を反映する薬剤に結合し又は結合していないｓｐｓメンバーの量、に関連する検知可能な信号を生成する。本明細書に記述する原理に従う幾つかの例では、増感剤試薬又は化学発光試薬のどちらかは、本明細書に記述する原理に従って調製されたコンジュゲート（接合）試薬である。利用可能な光増感剤及び化学発光試薬の例は、特許文献７及び８に記載されたものである。これらの特許文献の関連する記載を参照により本明細書に援用する。
【００４１】
これは説明のためであって限定するものではないが、特別な例において、誘起発光イムノアッセイを採用してもよい。誘起発光イムノアッセイは、特許文献７（Ｕｌｌｍａｎ）において言及されている。その開示を参照により本明細書に援用する。このアッセイでは、光増感剤試薬と化学発光試薬とを使用する。１つのアプローチでは、このアッセイは、光増感剤試薬として、粒子接合体の標識が光増感剤である標識−粒子接合体を使用する。化学発光試薬は、被検体の抗体からなる。被検体は、被検体の抗体に関して、被検体の類縁体を含有する粒子接合体と競合する。被検体が存在すると、化学発光化合物に近接してくる標識された粒子接合体分子の数がより少なくなる。従って、アッセイ信号が減少する。光増感剤は、一重項酸素を発生し、２つの標識が近接したときに、化学発光試薬を活性化する。活性化された化学発光試薬は、次いで、光を発生する。生成された光の量は、形成された錯体の量に関連し、それは、次いで、試料中に存在する被検体の量に関連する。
【００４２】
アッセイ媒体中の種々の試薬の濃度は、一般に、被検体の対象の濃度範囲、アッセイの性質等により決定される。しかしながら、各試薬の最終濃度は、通常、対象の範囲に亘ってアッセイ感度を最適化するように、経験的に決定される。つまり、重要な被検体の濃度の変化から、正確に測定可能な信号の差異が提供されなければならない。通常は、信号生成システムや被検体の性質等を考慮して、種々の試薬の濃度が決定される。
【００４３】
上述のように、試料と試薬とは媒体中に配合して提供される。媒体の添加の順序は、変わりうるが、ここで記述するアッセイフォーマットの幾つかの実施態様においては、或る優先順位が存在する。勿論、最も簡単な添加の順序は、全ての材料を同時に添加し、均質アッセイにおけるように、アッセイ媒体が信号に対して及ぼす影響を決定することである。代替法として、試薬のそれぞれ又は試薬の群を逐次的に合一してもよい。いくつかの実施態様では、以下に述べるように、各添加に引き続いてインキュベーションステップを行なってもよい。非均質アッセイでは、１つ以上のインキュベーションステップの後に洗浄ステップを採用してもよい。
【００４４】
１以上のインキュベーション期間を、上述の種々の試薬の添加の間の間隔をも含めて、１以上の間隔をあけて、媒体に適用してもよい。試薬は、通常、試薬の種々の成分の結合が起きるのに十分な温度で十分な時間、インキュベートされる。アッセイを実行するのに、通常、中庸の温度が採用され、それは、通常、測定の間、一定温度好ましくは室温である。インキュベーション温度は、通常、例えば、約５℃〜約９９℃、又は約１５℃〜約７０℃、又は約２０℃〜約４５℃である。インキュベーション時間は、例えば、約０．２秒〜２４時間、又は約１秒〜約６時間、又は約２秒〜約１時間、又は約１分〜約１５分である。時間の長さは、媒体の温度及び種々の試薬の結合速度による。測定の間の温度は、一般に、例えば、約１０℃〜約５０℃又は約１５℃〜約４０℃の範囲である。
【００４５】
アッセイ方法の次のステップで、媒体について、被検体及びこの被検体の抗体を含有する錯体の存在について検査する。錯体の量は、試料中の被検体の量を示す。多くの実施態様において、媒体の試験には、媒体からの信号の検知が関与する。信号の量は、試料中の被検体の存在及び／又は量に関連する。検出の特別なモードは、ｓｐｓの性質による。上記で議論したように、ｓｐｓの標識が外部手段で検知可能な信号を生成する多くの方法がある。信号生成システムの活性化は、信号生成システムのメンバーの性質による。
【００４６】
測定の間の温度は、一般に、約１０℃〜約７０℃、又は約２０℃〜約４５℃、又は約２０℃〜約２５℃である。１つのアプローチでは、被検体の既知の濃度を用いて標準曲線が形成される。調整器及び他の制御機器を使用してもよい。
【００４７】
あらゆる標識から生成される発光又は光は、視覚的に、写真的に、化学光量的に、分光学的に、例えば、光電子増倍管やフォトダイオードを用いて又はその量を測定するのに便利な手段を用いて測定され、それが媒体中の被検体の量に関連付けられる。信号の存在及び／又は量の試験には、信号の検知をも含むが、これは、一般に、信号を読み取るステップにすぎない。信号は、通常、機器を用いて読み取られ、機器の性質は、信号の性質による。機器は、これらに限定されないが、例えば、分光光度計、蛍光光度計、吸収分光計、ルミノメーター及び化学発光計である。
【００４８】
上述のように、補正ファクターを前以って決定するには、試料の一部について第一のアッセイ方法により、また、同じ試料の一部について参照方法により、試料中の疎水性ハプテン被検体の濃度の測定を行なう。これらの測定は、本明細書に記述する原理に従う補正式を前以って決定するのに使用した試料のそれぞれについて実施する。参照方法は、上述した異なる試料のそれぞれにおける疎水性ハプテン被検体の濃度の測定に採用された第一のアッセイ方法とは異なる、被検体の測定方法である。参照方法は、被検体又はその誘導体に特異的な特性、例えば質量分析法により測定されたＭ／Ｚ比、を直接に測定する方法でなければならない。採用可能な参照方法には、これは説明のためであって限定するものではないが、質量分析法、例えば高速液体クロマトグラフィを始めとする液体クロマトグラフィ、電気泳動、顕微鏡検査法、マイクロ流体工学、分光学、化学的定量法、イムノアッセイ、及びこれらの２以上の組合せが包含される。
【００４９】
少なくとも第一のアッセイ方法及び参照方法により、使用された異なる試料のそれぞれについて、疎水性ハプテン被検体の濃度が測定されると、第一のアッセイ方法及び参照方法の間のバイアスが決定される。このバイアスは、疎水性ハプテン被検体を含有する異なる試料のそれぞれについて、参照方法及び第一のアッセイ方法によって測定された疎水性ハプテン被検体の濃度の差異である。
【００５０】
異なる試料のそれぞれにおける第一のアッセイ方法及び参照方法を用いた疎水性ハプテン被検体の濃度の測定に加えて、異なる試料のそれぞれにおける干渉物質の濃度についても測定が行なわれる。異なる試料中の干渉物質の濃度の測定は、干渉物質の測定のためのアッセイ方法を用いて実施することができる。アッセイ方法は、上述の第一のアッセイ方法及び参照方法のいずれから選んでもよい。分析される異なる試料は、本発明書に記載の原理に従って生成された補正式を、後々、大きな患者集団について遭遇する広範囲の干渉物質の分析に用いることができるように、干渉物質の広い濃度範囲に及ばなければならない。これは、例えば、補正式を生成するのに必要な数よりも多い数の試料を分析し、試料の中から、干渉物質の広範囲の濃度を提供する試料を選定することによって達成することができる。
【００５１】
補正式は、異なる試料のそれぞれにおけるバイアス及び干渉物質の濃度を用いて回帰分析を行なうことにより決定される。回帰分析は、独立変数と１以上の従属変数との間の関係に焦点を当てるものである。回帰分析は、例えば、これらに限定されないが、線形回帰分析、多項式回帰分析、通常の最小二乗回帰分析、パッシング−バブロック回帰及びデミング回帰（重み付き又は非重み付き）等のいずれであっても、適切なものを、採用することができる。
【００５２】
これは説明のためであって、限定するものではないが、或る例では、回帰分析は、直線回帰におけるように回帰線を形成し、回帰線の傾き及び切片から補正式を展開する。この例では、個々の異なる試料について、上述のようにして得られたバイアスを上述のようにして得られた干渉物質の濃度に対してプロットする。以下の関係式、即ち補正式、が導かれる。［Ａｎ］＝［ｍＡｎ］＋（ａ×［ｍＩＳ］＋ｂ）。ここで、［Ａｎ］は、未知の試料における疎水性被検体の実際の濃度であり、［ｍＡｎ］は、未知の試料における疎水性被検体の測定濃度であり、［ｍＩＳ］は、未知の試料中の干渉物質の測定濃度であり、ａは、回帰線の傾きであり、ｂは、回帰線の切片である。従って、試験室等のユーザーは、補正式が既に定められているアッセイを用いて、上記の補正式により疎水性ハプテン被検体の濃度を正確に決定することができる。アッセイを実施した後、未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の測定濃度及び干渉物質の測定濃度を前記式に代入して、未知の試料中の疎水性ハプテン被検体の正確な濃度を得る。例えば、特定の疎水性ハプテン被検体の特定のアッセイについて、所定の補正式が、［Ａｎ］＝［ｍＡｎ］＋（０．２２×［ｍＩＳ］＋（−０．２８））と決定された。従って、［ｍＡｎ］の値が３６ｎｇ／ｍＬであり、［ｍＩＳ］の値が１３０ｎｇ／ｍＬであれば、式は、［Ａｎ］＝３６＋（０．２２×１３０＋（−０．２８））、即ち、［Ａｎ］＝３６＋２８．６−２８＝３６．６ｎｇ／ｍＬとなる。
【００５３】
（アッセイを実施するためのキット）
疎水性ハプテン被検体の測定のためのアッセイを簡便に実施するために有用なキット中には、特定のアッセイを実施するための試薬が存在する。一例では、キットは、被検体を分析するための試薬のパッケージされた組合せを含むが、その性質は、特定のアッセイフォーマットに依る。試薬は、例えば、非検体の結合パートナーを含んでいてもよい。試薬は、それぞれ個別の容器に入れられていてもよく、種々の試薬が、その交差反応性及び安定性に応じて、１以上の容器中に合一されていてもよい。キットは、更に、追加結合メンバーや補助試薬等の、アッセイを実施するためのパッケージされた、他の個別の試薬を含んでいてもよい。
【００５４】
キットにおける種々の試薬の相対量は、本発明の方法中に起きなければならない反応を実質的に最適化する試薬の濃度を得、アッセイの感度を実質的に最適化するために、広範囲に変化させることができる。適切な条件下では、キット中の１以上の試薬は、通常凍結乾燥され賦形剤を含んだ乾燥粉末として提供することができ、この乾燥粉末は、溶解により、方法又はアッセイを実行するのに適切な濃度を有する試薬溶液となる。キットは、更に、方法又はアッセイについての説明文書及び上述した本発明の実施態様に従った補正式を含んでいてもよい。
【００５５】
本明細書において、用語「少なくとも」は、特定の項目の数がそこで述べられた数と同じかそれより多いことを意味する。本明細書において、用語「約」は、そこで述べられた数がプラスマイナス１０％異なり得ることを意味する。例えば、「約５」は、４．５〜５．５の範囲を意味する。
【００５６】
用語「第一の」及び「第二の」は、全く任意のものであり、認定された項目の間の順序や順位付け、それらの項目の添加の順序を示唆することを何ら意図していない。本明細書において、第一の及び第二の使用の例には、例えば、第一のアッセイ方法及び第二のアッセイ方法並びに第一のｓｐｓメンバー及び第二のｓｐｓメンバーが挙げられる。
【００５７】
以下の実施例は、限定のためではなく説明のために、本発明の具体的な実施態様を記載したものであり、本発明の範囲を記述することを意図するものであって限定することを意図していない。本明細書に記載された部及び百分率は、特に指定がなければ、容量に基づく。
【実施例】
【００５８】
（補正式の決定）
各試料がそれぞれ異なる個人から得られた１１の異なる血清試料からなるセットを使用した。各試料の一部について、シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社（ニューアーク）から入手したイムノアッセイを用いて、２５（ＯＨ）ビタミンＤの濃度を分析した。イムノアッセイは、ＤＩＭＥＮＳＩＯＮ（登録商標）クリニカルケミストリシステム（シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社）により実施した。ＤＩＭＥＮＳＩＯＮ（登録商標）ＥＸＬ（登録商標）２５（ＯＨ）ビタミンＤトータルアッセイ（ＶｉｔＤ）は、発光酸素チャネリングイムノアッセイ法（ＬＯＣＩ）に基づく均質競合化学発光イムノアッセイである。このアッセイは、血清及び血漿の両方における全２５（ＯＨ）濃度（２５（ＯＨ）Ｄ２及び２５（ＯＨ）Ｄ３）を測定する。ＬＯＣＩ  ＶｉｔＤ構成要素には、遊離試薬、２つの合成ビーズ試薬及びビオチン化モノクローナル抗体が含まれる。第一のビーズ試薬（センシビーズ）は、特許文献９〜１２に記載された方法に類似の方法を用いて調製されたもので、ストレプトアヴィジンで被覆され、感光性染料を含有していた。感光剤は、ビス（トリヘキシル）−シリコン−ｔ−ブチルフタロシアニンであった。第二のビーズ試薬（ケミビーズ）は、特許文献１３に記載された手順に類似の手順を用いて調製されたもので、２５（ＯＨ）ビタミンＤ３類似体で被覆され、化学発光染料を含有していた。化学発光化合物は、ユーロピウムでキレートした２−（４−（Ｎ，Ｎ−ジ−テトラデシル）アニリノ−３−フェニルチオキセンであった。試料を遊離試薬（アニリノナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ））でインキュベートして、それらの結合タンパクからビタミンＤ分子を遊離させた。次いで、反応混合物をビオチン化抗体でインキュベートして、２５（ＯＨ）ビタミンＤ／ビオチン化抗体錯体を形成させた。ケミビーズを添加して過剰の遊離のビオチン化抗体を除去し、次いで、センシビーズを添加して、ケミビーズ類似体／抗体−ビオチン／ストレプトアヴィジン−センシビーズ錯体を形成させた。反応混合物に６８０ｎｍで照射するとセンシビーズから一重項酸素が発生し、このものは、ケミビーズ中に拡散して、化学発光反応を引き起こした。その結果生じた信号を６１２ｎｍで測定したところ、試料中の全２５（ＯＨ）ビタミンの濃度に反比例していた。
【００５９】
各試料の他の部分について、参照方法として、ＩＤ−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ（同位体希釈液体クロマトグラフィ／質量分析／質量分析）を用いてビタミンＤ濃度を測定した。
【００６０】
各試料の他の部分について、シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッド社からの全コレステロール濃度アッセイ（Ｎｏ．ＤＦ２７）により、製造者のプロトコルに従って、コレステロール濃度を分析した。アッセイにおいて、コレステロールエステラーゼ（ＣＥ）がコレステロールエステルの加水分解を触媒して遊離のコレステロールを生成し、このものは、前以って存在していた遊離のコレステロールと共に、コレステロールオキシダーゼによって触媒される反応において酸化され、コレスト−４−エン−３−オン及び過酸化水素を形成した。このようにして形成された過酸化水素は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＰＯ）の存在下で、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリンーＨＣｌ／４−アミノアンチピリン（ＤＥＡ−ＨＣｌ／ＡＡＰ）を酸化するのに使用され、５４０ｎｍで吸収を示す発色団を生成する。酸化されたＤＥＡ−ＨＣｌ／ＡＡＰによる吸収は、全コレステロール濃度に正比例し、ポリクロマチック（４５２ｎｍ、５４０ｎｍ、７００ｎｍ。ｎｍは、ナノメーターを表わす。）終点法を用いて測定される。
【００６１】
イムノアッセイ法を用いて異なる各試料から得られたビタミンＤ濃度を、参照方法を用いて異なる各試料から得られたビタミンＤ濃度から差し引いて、異なる各試料についてのバイアスが得られる。異なる各試料についてのバイアスを異なる各試料についてのコレステロール濃度に対してプロットした。結果を図１に示す。ここで、［ｖｉｔＤ］は、ビタミンＤの濃度、ＬＣＭＳは、参照方法を用いて測定されたビタミンＤの濃度、ＤＭ  ＥＸＬは、イムノアッセイを用いて測定されたビタミンＤの濃度、ｍｇはミリグラム、ｄＬはデシリットル、ｙは目的変数、ｘは、説明変数であり、Ｒ２は、相関係数の平方である。
【００６２】
上述の結果から、以下の補正式が導かれる。
［Ａｎ］＝［ｍＡｎ］＋（ａ×［ｍＩＳ］＋ｂ）
式中、［Ａｎ］は、未知の試料中の実際のビタミンＤ濃度、［ｍＡｎ］は、未知の試料中の測定ビタミンＤ濃度、［ｍＩＳ］は、未知の試料中の測定コレステロール濃度、ａは、回帰線の傾きで、この例では０．２２１３、ｂは、回帰線の切片で、この例では−２７．９６６である。従って、補正式は、
［実際のビタミンＤ］＝［測定ビタミンＤ］+（０．２２１３×［コレステロール］−２７．９６６）となる。
【００６３】
（補正式の証明）
上記決定された補正式の証明は、ビタミンＤの測定濃度及び上述の補正式を用いて、実際のビタミンＤ濃度について、バイアスを計算することによって実行される。異なる試料のそれぞれについて、コレステロールに対してバイアスをプロットする。結果を図２に示す。ここで、３Ｅ−５は、３×１０−５を意味する。これから分かるとおり、試料中の実際のビタミンＤ濃度の決定のために補正式を適用した後では、バイアスとコレステロールの濃度との間の相関は、もはや存在しない。
【００６４】
図３及び図４を参照して分かるように、補正式の適用後は、相関係数（イムノアッセイを用いて測定されたビタミンＤ濃度とＩＤ−ＬＣＭＳ／ＭＳ法を用いて測定されたビタミンＤ濃度との間の相関におけるデータのばらつき）が改善される。図３及び図４において、Ｒは相関係数、ｎｇはナノグラム、ｍＬはミリリットルである。
【００６５】
本明細書で引用された全ての刊行物及び特許出願は、参照により、各刊行物及び特許出願が参照により援用されると明確に個別に指示されていたように、本明細書に援用される。
【００６６】
上述の発明は、図示及び例示により、理解を明快にするために、幾分詳細に記述したけれども、本発明の教示に照らせば、添付された請求項の精神及び範囲から逸脱することなく、変更及び修飾をなし得ることは、当業者にとって、明らかである。更に、上述の記載においては、本発明を完全に理解するために、説明上、特定の命名を使用した。しかしながら、本発明を実行するために、その特定の詳細が必要ではないことは、当業者に明らかである。従って、本発明の特定の実施態様についての上記記述は、図示及び説明のために提供されたものである。それらは、網羅的なものではなく、開示された厳密な形態に発明を限定するものでもない。上述の教示に鑑みて、多くの修飾及び変更が可能である。実施態様は、本発明の原理及びその現実の適用を説明し、それにより当業者が本発明を実施できるようにするために選択され記載されたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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