(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鶏冠をプロテアーゼおよびヒアルロニダーゼで分解した分解生成物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
【請求項２】
前記分解生成物が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸を含有することを特徴とする請求項１に記載の抗酸化剤。
【請求項３】
前記分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量が、抗酸化剤の全量に対して１０質量％以上であることを特徴とする請求項２に記載の抗酸化剤。
【請求項４】
分子量が１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることを特徴とする請求項２または３に記載の抗酸化剤。
【請求項５】
Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が、抗酸化剤の全量に対して０．０１質量％以下であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項６】
総遊離アミノ酸量が抗酸化剤の全量に対する質量比で２質量％以上であり、且つ、総蛋白質量が抗酸化剤の全量に対する質量比で２質量％以上であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項７】
前記遊離アミノ酸が、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチンおよびチロシンから選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする請求項６に記載の抗酸化剤。
【請求項８】
前記分解生成物の凍結乾燥物を粉砕して得た粉砕物を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項９】
前記分解生成物に水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行うことで得た水飽和１−ブタノール画分を含有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項１０】
ラジカルを捕捉する作用を有することを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項１１】
生体成分の酸化障害を抑制する作用を有することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【請求項１２】
鶏冠をプロテアーゼおよびヒアルロニダーゼで分解する酵素処理工程を含むことを特徴とする抗酸化剤の製造方法。
【請求項１３】
前記酵素処理工程の前に、前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程を有することを特徴とする請求項１２に記載の抗酸化剤の製造方法。
【請求項１４】
前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を、凍結乾燥した後、粉砕して粉砕物を得る工程を有することを特徴とする請求項１２または１３に記載の抗酸化剤の製造方法。
【請求項１５】
前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を精製する精製工程を有することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の抗酸化剤の製造方法。
【請求項１６】
前記精製工程が、前記分解生成物に水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行って水飽和１−ブタノール画分を得る分液工程を含むことを特徴とする請求項１５に記載の抗酸化剤の製造方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗酸化剤からなることを特徴とする内服剤。
【請求項１８】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗酸化剤からなることを特徴とする外用剤。
【請求項１９】
化粧品であることを特徴とする請求項１８に記載の外用剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒアルロン酸を含有する抗酸化剤に関する。特に安価に製造することができ、高い抗酸化活性が得られる抗酸化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸は、保湿効果や保水効果を高める働きがあることが知られており、従来からさまざまな化粧品や医薬品に配合されている。例えば、乾燥肌や荒れ肌に直接適用することにより保湿性を高めて肌のコンディションを調えたり、乾燥期に皮膚表面から水分が失われたりすることを防ぐために予防的に皮膚表面に適用することが通常行われている。また、ヒアルロン酸は、保湿効果から派生する機能や保湿効果以外の有用な特性の発現も期待され、その新たな利用法に関する研究も幾つか見受けられる。
【０００３】
例えば、特許文献１には、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を創傷治療剤に用いることが提案されている。この創傷治療剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているために安全性が高く、例えば経口投与や創傷部位への直接投与により創傷を迅速に治療することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００２−１４５８００号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上記のように、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物は、創傷治療剤として高い有用性を有する。しかし、この分解生成物は、創傷治療効果が確認されているだけで他の作用効果は殆ど知られておらず、応用範囲が限られていた。
【０００６】
一方、近年、生体内で発生した活性酸素が与える生命体への悪影響が大きな問題になっている。活性酸素とは、普通の酸素分子よりも活性が高い酸素分子、およびその関連物質のことをいい、スーパーオキサイド（・Ｏ2-）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、過酸化水素（Ｈ2０2）、一重項酸素（1Ｏ2）といった狭義の活性酸素の他、ヒドロペルオキシルラジカル、アルコキシルラジカル、アルキルペルオキシルラジカル等のラジカル種、ペルオキシナイトライド、脂質ヒドロペルオキシド等のノンラジカル種も含まれる。狭義の活性酸素は、生命体が酸素（3Ｏ2）を消費する過程で発生するものであり、こうした活性酸素が過剰に発生すると、ＤＮＡ、脂質、酵素、タンパク質といった重要な生体成分が活性酸素により酸化され、他の活性酸素や酸化変性物等が生成される、いわゆる酸化障害が引き起こされる。こうした活性酸素による酸化障害は、老化現象を亢進することが知られており、糖尿病、高血圧、動脈硬化などの生活習慣病をはじめとする様々な疾患の発症に深く関わっていることが明らかになっている。
これらの活性酸素による生命体の酸化障害を抑制する方法としては、抗酸化物質を生命体に投与して活性酸素を消去する方法が従来から知られている。抗酸化物質には、フラボノイド、カテキン、ビタミンＣ（アスコルビン酸）等の水溶性抗酸化物質、ビタミンＥやβカロテン等の脂溶性抗酸化物質があるが、脂溶性抗酸化物質は体内に蓄積するため、投与量や投与方法の選定が難しいという問題がある。一方、水溶性抗酸化物質は、こうした体内蓄積の問題が生じないため、医薬品の他に、サプリメントとして多用されているが、生命体の酸化障害を十分に抑制する程の高い抗酸化活性は認められていない。
【０００７】
そこで本発明者らは、このような従来技術の課題を解決するために、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制することができる抗酸化剤およびその製造方法を提供することを課題として検討を進めた。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の課題を解決するために鋭意検討を行った結果、本発明者らは、上記の創傷治療作用があることが知られている組成物、すなわちヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物がラジカルを捕捉する作用も有し、抗酸化剤として極めて有用であることを初めて見出した。さらに、この分解生成物が、ラジカルによる赤血球溶血反応（酸化障害）を効果的に抑制する作用を有することの知見も得た。本発明は、これらの知見に基づいて提案されたものであり、具体的に以下の構成を有する。
【０００９】
［１］  ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を含有することを特徴とする抗酸化剤。
［２］  前記組成物が鶏冠であることを特徴とする［１］に記載の抗酸化剤。
［３］  前記分解生成物が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸を含有することを特徴とする［１］または［２］に記載の抗酸化剤。
［４］  前記分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量が、抗酸化剤の全量に対して１０質量％以上であることを特徴とする［１］〜［３］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［５］  分子量が１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が、分子量が３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることを特徴とする［３］または［４］に記載の抗酸化剤。
［６］  Ｎ−アセチルグルコサミンの含有量が、抗酸化剤の全量に対して０．０１質量％以下であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［７］  総遊離アミノ酸量が抗酸化剤の全量に対する質量比で２質量％以上であり、且つ、総蛋白質量が抗酸化剤の全量に対する質量比で２質量％以上であることを特徴とする［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［８］  前記遊離アミノ酸が、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチンおよびチロシンから選択される少なくとも１種を含有することを特徴とする［７］に記載の抗酸化剤。
［９］  前記分解生成物の凍結乾燥物を粉砕して得た粉砕物を含むことを特徴とする［１］〜［８］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［１０］  前記分解生成物に水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行うことで得た水飽和１−ブタノール画分を含有することを特徴とする［１］〜［９］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［１１］  ラジカルを捕捉する作用を有することを特徴とする［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
［１２］  生体成分の酸化障害を抑制する作用を有することを特徴とする［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の抗酸化剤。
【００１０】
［１３］  ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を含むことを特徴とする抗酸化剤の製造方法。
［１４］  前記組成物が鶏冠であり、前記酵素処理工程の前に、前記鶏冠を１辺０．５ｃｍ角以上に小片化する工程を有することを特徴とする［１３］に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１５］  前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を、凍結乾燥した後、粉砕して粉砕物を得る工程を有することを特徴とする［１３］または［１４］に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１６］  前記酵素処理工程の後に、前記酵素処理工程で得た分解生成物を精製する精製工程を有することを特徴とする［１３］〜［１５］のいずれか１項に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１７］  前記精製工程が、前記分解生成物に水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行って水飽和１−ブタノール画分を得る分液工程を含むことを特徴とする［１６］に記載の抗酸化剤の製造方法。
［１８］  ［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の抗酸化剤からなることを特徴とする内服剤。
［１９］  ［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の抗酸化剤からなることを特徴とする外用剤。
［２０］  化粧品であることを特徴とする［１９］に記載の外用剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の抗酸化剤は、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制することができる。また、本発明の抗酸化剤の製造方法によれば、上記の有用な作用効果を奏する抗酸化剤を低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】プロテアーゼ分解物（抗酸化剤１）、アスコルビン酸およびアルブチンのＡＢＴＳラジカルカチオンに対する捕捉活性を示すグラフである。
【図２】プロテアーゼ分解物（抗酸化剤１）、アスコルビン酸について、ＯＲＡＣ法を用いて測定したアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルに対する抗酸化活性を示すグラフである。
【図３】プロテアーゼ分解物（抗酸化剤１）、アスコルビン酸について、酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験を行った結果を示すグラフである。
【図４】プロテアーゼ分解物への分液操作で得られた水飽和１−ブタノール画分、水画分、酢酸エチル画分のＡＢＴＳラジカルカチオンに対する捕捉活性を示すグラフである。
【図５】実施例で行ったプロテアーゼ分解物の精製工程を示すスキーム図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下において、本発明について詳細に説明する。以下に記載する構成要件の説明は、代表的な実施形態や具体例に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に限定されるものではない。なお、本明細書において「〜」を用いて表される数値範囲は「〜」前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
【００１４】
［抗酸化剤］
本発明の抗酸化剤は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解した分解生成物を含有する点に特徴がある。
【００１５】
上記組成物に含まれるヒアルロン酸は、化粧品や医薬品の成分として通常用いられているヒアルロン酸であれば特に制限なく使用することができる。ヒアルロン酸は、元来ウシの眼の硝子体から単離されたものであるが、これに限らず、動物の関節液やニワトリの鶏冠などから単離されたものであっても使用することができる。また、自然界から単離されたものでなく、合成や微生物発酵法により得られたものでもよい。
【００１６】
ヒアルロン酸は、アミノ酸とウロン酸からなる複雑な多糖類であるが、その構造の詳細は特に限定されない。例えば、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンからなるニ糖を繰り返し単位とする多糖を挙げることができる。組成物に含まれるヒアルロン酸の分子量は特に限定されないが、例えば鶏冠に含まれるヒアルロン酸は、分子量が６００万〜１０００万であり、鶏冠から抽出したヒアルロン酸は、抽出過程で分解されるため、平均分子量が数十万〜数百万である。本発明で使用するヒアルロン酸は抗酸化活性を過度に失わない限り、誘導化や熱変性を受けたものであっても構わない。いわゆるヒアルロン酸誘導体として知られている化合物は、本発明で有効に使用することができる。
【００１７】
上記組成物に含まれる蛋白質はその種類を問わないが、鶏冠に含まれる蛋白質が極めて好ましい。鶏冠の種類は特に制限されないが、ニワトリの鶏冠を用いるのが好ましい。ニワトリの鶏冠はヒアルロン酸を含有するため、本発明の抗酸化剤の製造に用いる組成物を提供するに際して、鶏冠にヒアルロン酸を別途添加しなくてもよいというメリットがある。このため、鶏冠を用いれば本発明の抗酸化剤の製造工程が簡略化でき、製造コストも下げることができる。
【００１８】
本発明で用いる組成物は、蛋白質とヒアルロン酸のみを含んでいてもよいし、その他の成分や溶媒、分散媒を含んでいてもよい。溶媒および分散媒としては、蛋白質やヒアルロン酸を溶解できるものであればよく、水や水性緩衝液を好適に用いることができる。また、組成物は、蛋白質とヒアルロン酸を含む天然物そのものであってもよい。組成物となる天然物としては、動物の関節液や鶏冠を挙げることができ、ヒアルロン酸を豊富に含むことからニワトリの鶏冠であることが好ましい。
【００１９】
本発明で用いる分解生成物は、上記の組成物をプロテアーゼで分解したものである。プロテアーゼの種類は特に制限されない。通常の蛋白質分解に用いられるプロテアーゼであればいずれも使用することができる。すなわち、エンドペプチダーゼであっても、エキソぺプチダーゼであっても使用することが可能であり、また活性部位はセリン、システイン、金属、アスパラギン酸等のいずれであってもよい。また、複数のプロテアーゼを混合して使用してもよい。好ましいプロテアーゼとして、例えばプロナーゼを使用することができる。
【００２０】
また、本発明で用いる分解生成物は、上記の組成物をプロテアーゼで分解したものであるため、少なくとも、プロテアーゼにより分解された蛋白質の分解物と、ヒアルロン酸を含有し、未分解の蛋白質（プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていた蛋白質）や組成物由来の他の成分を含有していてもよい。
分解生成物に含まれる蛋白質の分解物としては、未分解の蛋白質よりも低分子量の蛋白質、ペプチド、遊離アミノ酸を挙げることができ、これらが混在していてもよい。
また、分解生成物は、遊離アミノ酸を含有することが好ましい。分解生成物が含有する遊離アミノ酸は、蛋白質の分解物としての遊離アミノ酸であってもよいし、プロテアーゼ添加前の組成物に遊離アミノ酸として元々含まれていたものであってもよい。遊離アミノ酸の種類は、組成物の成分によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠である分解生成物では、比較的含有率が多いアミノ酸としてイソロイシン、β−アミノイソ酪酸、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等を挙げることができ、この他にも、多種類のアミノ酸を含む。
【００２１】
抗酸化剤における総蛋白質量は、抗酸化剤の全量に対する質量比で０．５〜１０質量％であることが好ましく、１〜７質量％であることがより好ましく、２〜５質量％であることがさらに好ましい。また、抗酸化剤における総遊離アミノ酸量は、抗酸化剤の全量に対する質量比で０．５〜１２質量％であることが好ましく、１〜８質量％であることがより好ましく、２〜６質量％であることがさらに好ましい。抗酸化剤における総蛋白質量および遊離アミノ酸量が上記の範囲であることにより、抗酸化剤が効果的に作用すると考えられ、ラジカルによる物質の酸化を顕著に抑制することができる。
本明細書中において「総蛋白質量」とは、Lowry法により求めた総蛋白質含量のことをいい、「総遊離アミノ酸量」とは、Ninhydrin法により求めた遊離アミノ酸の総量のことをいう。
【００２２】
上記の分解生成物に含まれるヒアルロン酸は、プロテアーゼ添加前の組成物に元々含まれていたヒアルロン酸がそのまま残存したもの（以下、「未分解のヒアルロン酸」という）であってもよいし、ヒアルロン酸の分解物（以下、「低分子ヒアルロン酸」という）であってもよいし、未分解のヒアルロン酸と低分子ヒアルロン酸とが混在したものであってもよいが、低分子ヒアルロン酸を含有することが好ましい。低分子ヒアルロン酸は生命体の深部に浸透し易く、生命体に対する作用を効果的に得ることができる。分解生成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であってもよいし、上記の組成物とは別の系でヒアルロン酸を加水分解し、得られた低分子ヒアルロン酸を分解生成物に添加したものであってもよいが、組成物中でヒアルロン酸を加水分解させて得た低分子ヒアルロン酸であることが好ましい。組成物中での低分子ヒアルロン酸の生成は、塩酸やヒアルロニダーゼ等の、ヒアルロン酸を加水分解する物質を組成物に添加することにより行うことができる。また、組成物が天然物である場合には、天然物に元々含まれる物質による自己消化を利用して低分子ヒアルロン酸を生成してもよい。ただし、ヒアルロン酸の生体に対する作用を有効に得る点から、ヒアルロン酸は構成単位を保持していること、すなわち、グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンまで分解が進行していないことが好ましい。具体的には、抗酸化剤におけるＮ−アセチルグルコサミンの含有量は、抗酸化剤の全量に対して０．０１質量％以下であることが好ましく、０質量％であることが最も好ましい。
本明細書中において「Ｎ−アセチルグルコサミン量」とはMorgan-Elson法により求めたＮ−アセチルグルコサミン含量のことをいう。
【００２３】
分解生成物が含有する低分子ヒアルロン酸は、分子量が３８０〜５０００であることが好ましい。分子量３８０〜５０００は、ヒアルロン酸の繰り返し単位数で約１〜１４に相当する。抗酸化剤における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有量は、抗酸化剤の全量に対して５質量％以上であることが好ましく、７質量％以上であることがより好ましく、１０質量％以上であることがさらに好ましい。また、低分子ヒアルロン酸のうちでは、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸が主成分であることが好ましく、分子量１５２０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の割合が分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸全量の６０質量％以上であることが好ましく、７０質量％以上であることがより好ましく、７５質量％以上であることがさらに好ましい。これにより、抗酸化剤が効果的に作用すると考えられ、ラジカルによる物質の酸化を顕著に抑制することができる。
低分子ヒアルロン酸の分子量と質量比率は、ポリエチレングリコールを分子量マーカーに用いる高速液体クロマトグラフィにより分析することができる。
【００２４】
分解生成物の性状は、用いる組成物の成分や組成比、プロテアーゼの種類によっても異なるが、通常は液状、さらには粘質性を帯びた液状である。分解生成物は、そのまま本発明の抗酸化剤としてもよいし、適宜精製して他の成分と組み合わせる等して本発明の抗酸化剤としてもよい。分解生成物を精製することにより、より抗酸化活性が高い抗酸化剤とすることができる。液状の抗酸化剤は、塗布や点眼のための外用剤、飲料タイプの内服剤等として用いることができる。また、分解生成物を凍結乾燥等により乾燥した後、粉砕した場合は、粉末状の抗酸化剤を提供することが可能である。粉末状の抗酸化剤は、そのまま、もしくは他の成分を含有させて内服剤に用いてもよいし、錠剤やカプセル剤に加工してもよいし、所望の溶媒または分散媒を添加して液状とし、塗布や点眼のための外用剤や飲料タイプの内服剤等として用いてもよい。
【００２５】
本発明の抗酸化剤には、上記分解生成物以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、抗酸化剤に賦形剤を含有させた場合には、分解生成物と賦形剤の配合率を制御して総蛋白質量や総遊離アミノ酸量、低分子ヒアルロン酸量等の成分量を調整することができる。また、保存し易い抗酸化剤の態様として、凍結乾燥させた分解生成物を粉砕して得た粉末を賦形剤で希釈した混合粉末を挙げることができる。賦形剤としては、特に限定されないが、デキストリンが好適である。賦形剤による希釈倍率は、質量比で２〜１０倍であることが好ましく、２〜７倍であることがより好ましく、３〜５倍であることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明の抗酸化剤は、ラジカルを捕捉する作用を有し、高い抗酸化活性を発揮する。
ここで、本明細書中において「抗酸化活性」とは、酸化を防ぐ性質のことをいい、生体成分（ＤＮＡ、脂質、酵素、タンパク質等）の酸化障害を抑制する機能の他、食品等の酸化による劣化を防ぐ機能等も含む。本発明の抗酸化剤は、これら機能の両方を奏するが、有用性が特に高いことから、生体成分の酸化障害を抑制する機能を利用することが好ましい。
本発明の抗酸化剤に捕捉させるラジカルは特に限定されず、活性酸素としてのラジカルであってもよいし、活性酸素以外のラジカルであってもよい。ラジカルの具体例として、スーパーオキサイド（・Ｏ2-）、ヒドロキシルラジカル（ＨＯ・）、ヒドロペルオキシルラジカル（ＨＯＯ・）、アルコキシルラジカル（ＲＯ・）、アルキルペルオキシルラジカル（ＲＯＯ・）等を挙げることができる。
このように、本発明の抗酸化剤は高い抗酸化活性を有するため、経口で摂取され、その成分が腸管から吸収された場合には、生体内で発生した活性酸素を捕捉し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制しうる。その結果、老化の進行が抑えられるとともに、生活習慣病やがん等の酸化ストレスが起因する各種疾患の発症を抑制することができる。
ここで、本発明の抗酸化剤は、生体成分であるヒアルロン酸や蛋白質、反応が緩和な酵素を用いているため安全性が高く、経口で摂取する内服剤として使用し易いという利点がある。
また、本発明の抗酸化剤は、皮膚に適用することも可能である。皮膚から内部に吸収された成分は、表皮や真皮、皮下組織で発生した活性酸素を捕捉して、皮膚の老化や炎症、色素沈着等の障害を効果的に抑制することができる。また、皮膚から生体内に吸収されず、皮膚表面に残った成分は、皮膚の表面や表面付近で発生した活性酸素を捕捉して、活性酸素による皮膚の老化や炎症、色素沈着等の障害を効果的に抑制することができる。本発明の抗酸化剤は、プロテアーゼによる分解を経ているため、その条件の変更により、皮膚からの吸収性を制御することができ、これにより、特定の部位（例えば皮膚表面、皮膚の表面付近または皮膚の深部等）に優先的に作用させることも可能である。
【００２７】
本発明の抗酸化剤の使用量は、対象とする障害によっても異なるが、例えば本発明の抗酸化剤を内服薬として経口投与する場合、その投与量は８０〜２０００ｍｇ／成人標準体重／日であることが好ましく、１日に２〜３回に分けて投与することが適当である。
また、本発明の抗酸化剤を化粧品または外用薬として、皮膚に塗布する場合、その塗布量は０．５ｇ〜５．０ｇ／１０ｃｍ2であることが好ましく、使用回数は１〜４回／日程度が適当である。
【００２８】
［抗酸化剤の製造方法］
次に、本発明の抗酸化剤の製造方法について説明する。
本発明の抗酸化剤の製造方法は、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を含むことを特徴とする。
本発明の抗酸化剤の製造方法は、さらに必要に応じて、この他の工程を有していてもよい。例えば、組成物が鶏冠である場合には、酵素処理工程の前に、鶏冠を小片化する小片化工程を有していてもよい。また、酵素処理工程の後に、分解生成物を濾過する濾過工程、濾過した分解生成物を乾燥した後、粉砕する製粉工程、濾過した分解生成物を精製する精製工程を有していてよい。以下において、本発明の抗酸化剤の製造方法を詳細に説明する。
【００２９】
まず、ヒアルロン酸と蛋白質とを含有する組成物を準備する。組成物としてニワトリの鶏冠を利用する場合には、性別、年令を問わず使用し得る。ただし、採取後なるべく時間を置かずにプロテアーゼ分解に供することが好ましい。また、時間を置いてプロテアーゼ分解するときには、冷凍保存した後に解凍して使用することが好ましい。
【００３０】
鶏冠をプロテアーゼ分解するときには、まず鶏冠を小片化する小片化工程を行ってから、該鶏冠の小片をプロテアーゼ含有溶液に接触させることが好ましい。鶏冠は、好ましくは０．５ｃｍ角以上、より好ましくは０．７ｃｍ角以上、さらに好ましくは０．９ｃｍ角以上の小片にする。過度に細片化してしまったり、ミンチ状にしてしまったりすると、水分が過度に流れ出てしまうため好ましくない。
【００３１】
次に、組成物をプロテアーゼで分解する酵素処理工程を行う。本発明の製造方法で用いるプロテアーゼの説明については、上記の［抗酸化剤］の欄のプロテアーゼの説明を参照することができる。酵素処理は、組成物やプロテアーゼの種類によっても異なるが、例えば組成物が鶏冠等の固形物や粉末である場合には、プロテアーゼを溶解した水溶液等の溶液（酵素液）を組成物に添加した後、一定時間放置することで行うことが好ましい。ここで、酵素液のｐＨは５．０〜１０．０であることが好ましく、処理温度は４０〜６０℃であることが好ましく、処理時間は０．５〜３．０時間であることが好ましい。また、酵素処理は、酵素液を添加した組成物を振とうしながら行うことが好ましい。
【００３２】
以上のようにして得られた分解生成物は、ろ過などの方法により鶏冠等の固形分を除去して、液状の分解生成物として用いることができる。また、凍結乾燥等により乾燥してさらに粉砕する製粉工程を行うことにより、粉末状の分解生成物として用いることもできる。これらの分解生成物は、そのまま本発明の抗酸化剤としてもよいし、適宜精製し、賦形剤等の他の成分と組み合わせる等して本発明の抗酸化剤としてもよい。
【００３３】
本発明の抗酸化剤は、このように、極めて簡単な工程で製造することができる。このため、本発明の抗酸化剤の製造方法を用いることにより、有用性が高い抗酸化剤を低いコストで提供することができる。
また、濾過した分解生成物や粉末状の分解生成物を精製することにより、抗酸化活性がより高い抗酸化剤とすることができる。分解生成物の精製方法の詳細については、後掲の実施例の＜プロテアーゼ分解物の精製＞の欄を参照することができる。分解生成物を精製するに当たっては、分解生成物に、水と水飽和１−ブタノールによる分液操作を行うことが好ましい。この分液操作により得られる水飽和１−ブタノール画分は、抗酸化活性が高い成分を含んでおり、さらにカラムクロマトグラフィ等の他の精製操作を行うことにより、抗酸化活性が極めて高い抗酸化剤を得ることができる。
【００３４】
［抗酸化剤の用途］
上記のように、本発明の抗酸化剤は、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制することができる。このため、本発明の抗酸化剤は、ヒト等の動物に投与する内服剤や外用剤として効果的に用いることができる。本発明の抗酸化剤が外用剤である場合、外用医薬であってもよいし、化粧品であってもよい。化粧品である場合、例えば乳液、クリーム、ローション、エッセンスなどの基礎化粧料、口紅、ファンデーション、リキッドファンデーション、メイクアッププレスドパウダー、おしろい、アイシャドーなどのメイクアップ化粧料等の態様で好適に用いることができる。
本発明の抗酸化剤は、その用途に応じて、上記分解生成物や賦形剤以外にも、さまざまな成分を含有させることができる。例えば、ビタミン、野菜粉末、ミネラル、酵母エキス、着色剤、増粘剤などを必要に応じて含有させることができる。これらの成分の種類は特に制限されず、含有量は目的とする機能を十分に発揮させることができる範囲内で適宜調節することができる。
また、抗酸化剤である化粧品には、化粧品に通常用いられる配合成分、例えば油性成分、界面活性剤、保湿剤、増粘剤、防腐・殺菌剤、粉体成分、紫外線吸収剤、色素、香料等を必要に応じて適宜配合することもできる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、割合、操作等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。
【００３６】
本実施例で製造した抗酸化剤の成分分析は下記の方法により行った。
（１）水分含有量の測定
水分含有量は、抗酸化剤の１ｇを１０５℃で３時問加熱乾燥し、精密天秤で恒量を求め定量した。
【００３７】
（２）全窒素の定食
全窒素はＡＯＡＣ法に基づくセミミクロケルダール法によって定量した。
【００３８】
（３）遊離アミノ酸の定量およびアミノ酸組成の分析
総遊離アミノ酸量はNinhydrin法によって定量した。定量には標準アミノ酸としてロイシンの検量線を作成し使用した。また、遊離アミノ酸の組成は、生体分析用カラムを装着したアミノ酸自動分析機（日立社製、L-8500型）を用いて分析した。この分析には、抗酸化剤の５０ｍｇを蒸留水に溶解し、ロータリーエバポレーダー（６０℃）で減圧乾固させた後、０．０２Ｎ塩酸５ｍＬで溶出し、ろ紙でろ過したのち、滅菌フィルターでろ過したろ液５０μＬを分析試料として使用した。
【００３９】
（４）タンパク質の定量
総タンバク質量はLawry法によって決定した。標準検量線の作成には牛血清アルブミンを使用した。
【００４０】
（５）Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの定量
Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン含有量はMorgan-Elson法で定量した。
【００４１】
（６）グルコサミノグリカンの定量
２−ニトロフェニルヒドラジンカップリング法による比色定量法で分析した。標準検量の作成には鶏冠由来ヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＲＣ）およびstreptococcus zooepidemicus由来のヒアルロン酸ナトリウム（和光純薬社製、ＨＡＳＺ）を用いた。
【００４２】
（７）低分子ヒアルロン酸の分子量測定
示差屈折計（Shimazu社製、RID-10A型）を装着した高速液体クロマトグラフィー（Shimazu社製）によってヒアルロン酸の分子量を推定した。カラムとしてTSKgel G-2,500PWXL（7.8mmID×30cm）を用い、水を移動相として流速１ｍｌ／ｍｉｎで分析を行った。分子量マーカーには分子量４００、１０００、２０００、６０００の４種のポリエチレングリコール（Aldrich社製）を用いた。また、各低分子ヒアルロン酸の構成重量比は、抗酸化剤とデキストリンのみのサンプルを高速液体クラマトグラフィにより分析し、抗酸化剤で現れたピークのピーク面積からデキストリンのピーク面積を差し引くことにより求めた。
【００４３】
［製造例］
採取したてのニワトリの鶏冠１ｋｇを約１ｃｍ角に切断して小片化し、１００℃で蒸きょうを行うことにより加熱殺菌した。この小片状の鶏冠にプロテアーゼを中心とした食物由来の酵素類を添加して４５℃で１．５時間反応させた後、攪拌して均質化した。その後、濾過して粗大な固形成分を除去し、液状の分解生成物（以下、「プロテアーゼ分解物」という）を得た。このプロテアーゼ分解物は、ｐＨ６．５、Ｂｒｉｘ値６．２０、固形分濃度５．９１質量％であった。このプロテアーゼ分解物を凍結乾燥して粉砕し、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末（抗酸化剤１）を得た。また、このプロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末に３倍等量（質量比）のデキストリンを添加することにより、デキストリン添加凍結乾燥粉末（抗酸化剤１’）を製造した。
【００４４】
［抗酸化剤の成分分析］
製造した抗酸化剤１’について、上記の方法により成分分析を行った。測定された一般成分の含有率を表１に示し、遊離アミノ酸の組成を表２に示し、低分子ヒアルロン酸の分子量の分析結果を表３に示す。なお、表１〜３中の「％」は「質量％」を表す。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
【表２】
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【００４７】
【表３】
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【００４８】
表２に示すように、抗酸化剤１’に含まれる遊離アミノ酸の中では、イソロイシン、β−アミノイソ酪酸の含有量が多く、ついで、アラニン、タウリン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、シスチン、チロシン等が多く含まれていた。
また、表３に示すように、抗酸化剤１’に含まれる低分子ヒアルロン酸は、推定分子量５０００、１５２０、１１４０、７６０および３８０の５種類からなることがわかった。また、ヒアルロン酸の繰り返し単位１つの分子量を約４００とすると、各低分子ヒアルロン酸の繰り返し単位数は、分子量の大きい順に、１３〜１４、４、３、２および１であり、質量比率は、３３％、４７％、１０％、６％および４％であった。よって、低分子ヒアルロン酸の主要成分は、分子量１５２０程度の４分子成分と分子量５０００程度の１３〜１４分子成分の２成分であることがわかった。なお、抗酸化剤１’における、分子量３８０〜５０００の低分子ヒアルロン酸の含有率は、抗酸化剤１’の全量に対して１３．４質量％であった。
【００４９】
［抗酸化活性評価］
（ａ）ラジカル捕捉試験
製造した抗酸化剤１（プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末）について、ＡＢＴＳラジカルカチオン（非天然のモデルラジカル）に対するラジカル捕捉活性を、Biol. Pharm. Bull., 29, 766-771(2006)に記載された分光光度法を用いて評価した。具体的には、ＡＢＴＳラジカルカチオンを含む反応溶液３ｍＬに、終濃度が３００μｇ／ｍＬとなるように抗酸化剤１を加え、５分、１５分、３０分、６０分および１２０分を経過した時点でＡＢＴＳラジカルカチオンの残存率を調べた。また、比較として抗酸化剤１の代わりにアスコルビン酸またはアルブチンを各２０μＭずつ添加した系と、抗酸化剤１と同量の水を添加した系（コントロール）についても同様の試験を行った。それらの結果を図１に示す。
【００５０】
【化１】
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【００５１】
図１を見ると、抗酸化剤１を添加した系は、コントロールやアスコルビン酸を添加した系に比べてＡＢＴＳラジカルカチオンの残存率が大きく低減しており、抗酸化剤１が優れたラジカル捕捉活性を示すことを確認することができた。また、アスコルビン酸やアルブチンを添加した系では、一旦、ラジカル残存率が低くなると、それ以上時間が経過してもラジカル残存率が変化しないのに対して、抗酸化剤１を添加した系では、一旦、ラジカル残存率が大きく低減した後に、時間の経過に伴ってラジカル残存率が徐々に低くなる。このことから、抗酸化剤１のラジカル捕捉活性は持続的であり、抗酸化剤として有利な特長が認められた。
【００５２】
（ｂ）ＯＲＡＣ法
製造した抗酸化剤１（プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末）について、２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）から発生するアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルに対する抗酸化活性を、Biosci. Biotechnol. Biochem., 72, 1558-1563(2008)に記載されたＯＲＡＣ（Oxygen Radical Absorbance Capacity）法を用い、反応溶液を生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）に調整して評価した。試験に用いた抗酸化剤１の量は３０μｇ／ｍＬである。また、比較として抗酸化剤１の代わりにアスコルビン酸各３μＭずつ添加した系と、抗酸化剤１と同量の水を添加した系（コントロール）についても同様の試験を行った。それらの結果を図２に示す。
ＯＲＡＣ法は、蛍光プローブであるフルオレセインがラジカルにより酸化、分解されて蛍光強度が減少する現象を利用するものであり、蛍光強度の減少を遅延させる（グラフを右にシフトさせる）もの程、抗酸化活性が高いと評価することができる。また、この評価で使用しているアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルは、生体成分の過酸化反応に関与する脂質アルコキシラジカル、脂質ペルオキシラジカルを模したラジカル種である。したがって、ここで評価される抗酸化活性は生体での抗酸化活性に近似したものとして見ることができる。
以上の点から図２を見ると、抗酸化剤１を添加した系のグラフは、コントロールやアスコルビン酸を添加した系のグラフに比べて大きく右側にシフトしており、蛍光強度の減少がより遅延していることを示している。このことから、抗酸化剤１は、生体成分の過酸化反応において、アスコルビン酸を遥かに上回る高い抗酸化活性を発揮しうることが示唆された。
【００５３】
（Ｃ）酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験
製造した抗酸化剤１（プロテアーゼ分解物の凍結乾燥粉末）について、２，２’−アゾビス（２−アミノプロパン）二塩酸塩（ＡＡＰＨ）から発生するアルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルに対する抗酸化活性を、Food Chem., 134, 606-610(2012)に記載された酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験を用いて評価した。試験に用いた抗酸化剤１の量は３００μｇ／ｍＬである。また、比較として抗酸化剤１の代わりにアスコルビン酸を各５０μＭずつ添加した系と、抗酸化剤１と同量の水を添加した系（コントロール）についても同様の試験を行った。同じ条件で３回試験を行い、その平均値と標準偏差を求めた結果を図３に示す。
酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験は、アルコキシラジカルおよびペルオキシラジカルにより赤血球膜の脂質やタンパク質が酸化されて生じる溶血反応（酸化障害）により、赤血球の残存率が減少する現象を利用するものであり、溶血反応を遅延させる（グラフを右側にシフトさせる）もの程、抗酸化活性が高いと評価することができる。
図３を見ると、抗酸化剤１を添加した系のグラフは、コントロールやアスコルビン酸を添加した系のグラフに比べて右側にシフトしており、赤血球の溶血反応がより遅延していることを示している。このことから、抗酸化剤１は、生体成分の酸化障害を効果的に抑制する作用を有し、その作用はアスコルビン酸を大きく上回ることを確認することができた。
【００５４】
＜プロテアーゼ分解物の精製＞
上記の製造例で調製したプロテアーゼ分解物の凍結乾燥物粉末を以下のようにして精製した。
まず、プロテアーゼ分解物の凍結乾燥物粉末３２．０ｇに超純水を加えてろ過し、そのろ液に、全量が１．５Ｌになるように超純水を加えて希釈した。このろ液の希釈液について、１．５Ｌの酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）による分液操作を２回行い、さらに、得られた水画分に７５０ｍｌの水飽和１−ブタノールによる分液操作を２回行った。分液操作で得られた水飽和１−ブタノール画分、酢酸エチル画分、水画分について、上記のＡＢＴＳラジカルカチオンを用いたラジカル捕捉試験を行った。その結果を図４に示す。図４に示すように、水飽和１−ブタノール画分と水画分に高い抗酸化活性が認められ、特に水飽和１−ブタノール画分に強い抗酸化活性が認められた。また、各分液操作で得られた水飽和１−ブタノール画分（固形分：４０３．３ｍｇ）、水画分（固形分：３７．３ｇ）について、以下のようにしてカラムクロマトグラフィによる精製を行った。その精製スキームを図５に示す。なお、図５に示すカラムのうち、カラム１、５以外のカラムに注入したサンプルは、その直前のカラムから溶出したフラクションのうち、ＡＢＴＳラジカルカチオンを用いたラジカル捕捉試験で比較的高い活性が認められたフラクションまたはそれらのフラクションの混合液である。
【００５５】
［水飽和１−ブタノール画分の精製］
まず、水飽和１−ブタノール画分を下記条件のカラム１に注入し、７０％メタノール１Ｌを流して溶出を行った。
（カラム１の条件）
カラム１    ：TOYOPEARL HW-40C（直径４．０ｃｍｘ３９．０ｃｍ、４８９．８ｃｍ3）
サンプル    ：水飽和１ブタノール画分（固形分：３９３．３ｍｇ）
フラクションサイズ  :フラクション１；１００ｍＬ、フラクション２〜１９；５０ｍＬ
溶出液      : ７０％メタノール（１Ｌ）
【００５６】
カラム１から溶出したフラクション４を下記条件のカラム２に注入し、５０％メタノール４００ｍＬを流して溶出を行った。
（カラム２の条件）
カラム２    ：TOYOPEARL HW-40F（直径２．５ｃｍ×長さ３５．０ｃｍ、１７１．７ｃｍ3）
サンプル    ：カラム１のフラクション４（１２７．０ｍｇ）
流速        ：１．２ｍＬ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：１０ｍＬ
溶出液      ：５０％メタノール（４００ｍＬ）
【００５７】
カラム２から溶出したフラクション１３〜１４の混合液を下記条件のカラム３に注入し、４０％メタノール４００ｍＬを流して溶出を行った。
（カラム３の条件）
カラム３    ：TOYOPEARL HW-40F（直径２．５ｃｍ×長さ３４．５ｃｍ、１７０．０ｃｍ3）
サンプル    ：カラム２のフラクション１３〜１４の混合液（固形分：４７．８ｍｇ）
流速        ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：１０ｍｌ
溶出液      ：４０％メタノール（４００ｍＬ）
【００５８】
カラム３から溶出したフラクション１３を下記条件のカラム４に注入し、５０％メタノール８０ｍＬを流して溶出を行った。
（カラム４の条件）
カラム４    ：Sephadex LH-20（直径１．０ｃｍ×長さ２６．０ｃｍ、２０．４１ｃｍ3）
サンプル    ：カラム３のフラクション１３（固形分：１４．２ｍｇ）
流速        ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
フラクションサイズ：２．０ｍＬ
溶出液      ：５０％メタノール（８０ｍＬ）
カラム４から溶出したフラクション７〜１１の混合液を抗酸化剤２とした。
【００５９】
［水画分の精製］
水画分を下記条件のカラム５に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１００、５／９５、１０／９０、２０／８０、４０／６０の順に変化させて５．０Ｌずつカラムに流して溶出を行った。
（カラム５の条件）
カラム５  ：DIAION HP20（直径１２．０ｃｍ×長さ４０．５ｃｍ、４５７８ｃｍ3）
サンプル    ：水画分（固形分：３７．３ｇ）
フラクションサイズ：２．５Ｌ
溶出液      ：水、メタノールと水の混合液
【００６０】
カラム５から溶出したフラクション７〜１２の混合液を下記条件のカラム６に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１０、１／９、２／８、４／６、６／４、８／２の順に変化させて４．０Ｌずつカラムに流して溶出を行った。
（カラム６の条件）
カラム６  ：DIAION HP20（直径１２．０ｃｍ×長さ４０．５ｃｍ、４５７８ｃｍ3）
サンプル    ：カラム５のフラクション７〜１２の混合液（固形分：１２．５８ｇ）
フラクションサイズ：２．０Ｌ
溶出液      ：水、メタノールと水の混合液
【００６１】
カラム６から溶出したフラクション８〜９の混合液を下記条件のカラム７に注入し、メタノールと水を、混合比率（メタノール／水）を０／１０、１／９、２／８、３／７、４／６、５／５、６／４の順に変化させて２．０Ｌずつカラムに流して溶出を行った。
（カラム７の条件）
カラム７  ：DlAION HP20（直径７．０ｃｍ×長さ３６．５ｃｍ、１４０４ｃｍ3）
サンプル    ：カラム６のフラクション８〜９の混合液（固形分：６．５７ｇ）
フラクションサイズ：５００ｍＬ
溶出液      ：水、水とメタノールの混合液
【００６２】
カラム７から溶出したフラクション２１〜２６の混合液を下記条件のカラム８に注入し、５０％メタノール１．０Ｌを流して溶出を行った。
（カラム８の条件）
カラム８    ：TOYOPEAL HW-40C（直径４．０ｃｍ×長さ４３ｃｍ、５４０．０ｃｍ3）
サンプル      ：カラム７のフラクション２１〜２６の混合液（固形分：２．０ｇ）
フラクションサイズ：３０ｍＬ
溶出液        ：５０％メタノール（１．０Ｌ）
カラム８から溶出したフラクション１３〜１４の混合液を抗酸化剤３とした。
【００６３】
以上の工程で精製した抗酸化剤２、３について、上記のラジカル捕捉試験、ＯＲＡＣ法による試験、酸化ストレス誘導性赤血球溶血阻害試験を行ったところ、抗酸化剤２、３は、抗酸化剤１よりも高い抗酸化活性を示すことを確認することができた。また、分液操作により得た各画分の中では、水飽和１−ブタノール画分が高い抗酸化活性を有しており、さらに水飽和１−ブタノール画分を精製して得た抗酸化剤２が極めて高い抗酸化活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明によれば、高い抗酸化活性を有し、生体成分の酸化障害を効果的に抑制する抗酸化剤を低コストで提供することができる。このため、本発明の抗酸化剤を用いれば、活性酸素が起因する老化現象の亢進、生活習慣病をはじめとする各種疾患の発症を抑制することが可能になり、さらに、こうした抗酸化活性が高く、しかも安価な内服剤や外用剤を提供することができる。このため、本発明は産業上の利用可能性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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