(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アシル化されたヒトインスリン類似体であるインスリン誘導体であって、前記類似体は、
ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]
であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、式IIの基
[アシル]-[リンカー]-
[式中、リンカー基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜10個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸鎖であり、
gGluは、ガンマグルタミン酸残基を表し、
OEGは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸の残基(すなわち、式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-の基)を表し、
アミノ酸残基は、いずれの順序で存在してもよく、
アミノ酸鎖は、少なくとも1個のgGlu残基を含み、
アシル基は、
1,14-テトラデカン二酸、
1,15-ペンタデカン二酸、及び
1,16-ヘキサデカン二酸
から選択されるα,ω-ジ-カルボン酸の残基である]
でアシル化することにより誘導体化され、
アシル化された類似体は、A14E、及び/又はB3E若しくはB3Q置換を更に含んでもよい、インスリン誘導体。
【請求項２】
アシル化された類似体がB3E若しくはB3Q置換を更に含む、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項３】
アシル化された類似体がA14E置換を更に含む、請求項2に記載のインスリン誘導体。
【請求項４】
アシル化された類似体がA14E及びB3E置換を更に含む、請求項2に記載のインスリン誘導体。
【請求項５】
アシル化された類似体がB3E置換を更に含む、請求項2に記載のインスリン誘導体。
【請求項６】
アシル化された類似体がB3Q置換を更に含む、請求項2に記載のインスリン誘導体。
【請求項７】
類似体が、ヒトインスリンに対して、[A14E、A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]、[A14E、A22K、desB27、B29R、desB30]、[A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]、[A22K、B3Q、desB27、B29R、desB30]、又は[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、前記インスリン類似体が、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、請求項2に記載のインスリン誘導体。
【請求項８】
類似体が、ヒトインスリンに対して、[A14E、A22K、desB27、B29R、desB30]、[A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]、[A22K、B3Q、desB27、B29R、desB30]、又は[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、前記インスリン類似体が、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、請求項7に記載のインスリン誘導体。
【請求項９】
類似体が、ヒトインスリンに対して、[A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]であり、前記インスリン類似体が、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、請求項7に記載のインスリン誘導体。
【請求項１０】
リンカー基が、-gGlu-、-2×gGlu-、-3×gGlu-、-4×gGlu-、-gGlu-2×OEG-、-gGlu-3×(OEG-gGlu)-、-4×gGlu-2×OEG-、-2×OEG-、及び-2×OEG-gGlu-から選択される、請求項1から9のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１１】
リンカー基が、-gGlu-、-2×gGlu-、-4×gGlu-、-gGlu-2×OEG-、-gGlu-3×(OEG-gGlu)-、-2×OEG-、及び-2×OEG-gGlu-から選択される、請求項10に記載のインスリン誘導体。
【請求項１２】
リンカー基が、-4×gGlu-である、請求項10に記載のインスリン誘導体。
【請求項１３】
アシル基が、1,14-テトラデカン二酸、1,15-ペンタデカン二酸、又は1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される二酸基である、請求項1から12のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１４】
アシル基が、1,14-テトラデカン二酸である、請求項13に記載のインスリン誘導体。
【請求項１５】
式IIの基(すなわち、[アシル]-[リンカー]-)が、テトラデカンジオイル-gGlu-、テトラデカンジオイル-2×gGlu-、テトラデカンジオイル-3×gGlu-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG-、テトラデカンジオイル-2×OEG-、ペンタデカンジオイル-4×gGlu、ヘキサデカンジオイル-4×gGlu-、ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、又はヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu-である、請求項1から14のいずれか一項に記載のインスリン誘導体。
【請求項１６】
式IIの基(すなわち、[アシル]-[リンカー]-)が、テトラデカンジオイル-4×gGlu-である、請求項15に記載のインスリン誘導体。
【請求項１７】
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ペンタデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、又は
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-3×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
である、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項１８】
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリンである、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項１９】
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリンである、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項２０】
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリンである、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項２１】
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリンである、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項２２】
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリンである、請求項1に記載のインスリン誘導体。
【請求項２３】
請求項1から22のいずれか一項に記載のインスリン誘導体と、薬学的に許容される1種又は複数の担体又は希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項２４】
添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されており、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ペンタデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、及び
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-3×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
から選択されるアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、請求項23に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
6インスリン分子あたり0.2未満のZn2+イオンを含む、低亜鉛組成物として製剤化されている、請求項24又は25に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
界面活性剤が添加されていない、請求項24又は25に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ニコチン系化合物、詳細にはニコチンアミドを含む、請求項24又は25に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)、高血圧、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、消化不良、又は胃潰瘍を治療又は予防する医薬品を製造するための、請求項1から22のいずれか一項に記載のインスリン誘導体の使用。
【請求項３０】
糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)、高血圧、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、消化不良、又は胃潰瘍に関係する疾患、障害、又は状態を治療、予防、又は緩和するための、治療有効量の請求項1から22のいずれか一項に記載のインスリン誘導体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病に関係する医学的状態のための薬物という治療分野にある。より詳細には、本発明は、ヒトインスリン類似体の新規アシル化誘導体に関する。本発明はまた、そのようなインスリン誘導体を含む医薬組成物を提供し、糖尿病に関係する医学的状態を治療又は予防するためのそのような誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病治療のためのインスリン療法は、数十年にわたり使用されてきた。インスリン療法は、通常、毎日数回のインスリン注射を施すものである。このような療法は、1日1回又は2回の長時間作用型基礎注射、及び食事時(すなわち、食事前の使用)の即効型インスリン注射の投与を含むのが普通である。インスリン療法の重要な進歩の一つとなったのが、速効型インスリン類似体の導入である。しかし、速効型インスリン類似体を用いても、インスリンレベルは通常、注射後50〜70分まではピークに達しない。
【０００３】
したがって、インスリン注射によって、インスリンの自然な時間-作用プロファイルは再現されない。詳細には、糖尿病のない人における第一相インスリン放出の自然なスパイクでは、血中インスリンレベルは、食事からのグルコースが血中に入って数分以内に上昇する。対照的に、注射されたインスリンは、ゆっくりとしか血中に入らず、インスリンレベルは、レギュラーヒトインスリン注射の後80〜100分以内にピークに達する。
【０００４】
速効型インスリン類似体は、第一相インスリン放出を十分に模倣しないため、インスリン療法を使用する糖尿病患者は、食事開始時に存在するインスリンのレベルが不十分で、食事の間に存在するインスリンが多すぎるままとなる。インスリン送達におけるこの時間のずれは、食事開始後早々に高血糖を招きかねない。
【０００５】
インスリンは、自己会合特性を有し、その濃度が、自己会合の主要な要因である。高濃度、特に医薬製剤中において、インスリンは、自己会合して、二量体、六量体、十二量体、及び結晶となる。しかし、生理学的に活性のある形態のインスリンは、単量体であり、単量体が、インスリン受容体と結合し、生体応答を誘発する。
【０００６】
インスリン作用の迅速さは、インスリンが皮下組織にどれだけ速やかに吸収されるかに左右される。レギュラーヒトインスリンが皮下注射されるとき、製剤は、主として、2つの亜鉛イオンを含んだ六量体から構成される。六量体のインスリンは、その大きさのため、より小さい種より、拡散する速度が遅く、したがって、吸収速度が緩慢である。
【０００７】
六量体内には、化学的及び物理的な分解に対して分子を安定化させる2個の亜鉛原子が配置されている。注射後、皮下組織では、濃度を推進力とした動的平衡が起こり、六量体を二量体へ、次いで単量体へと解離させる。歴史的に、こうしたレギュラーヒトインスリン製剤では、最大血漿濃度レベルに達するのにおよそ120分を要する。レギュラーヒトインスリンより速やかに吸収される亜鉛-インスリン調製物、たとえば、インスリンアスパルト及びインスリンリスプロが商品化されている。
【０００８】
無亜鉛のインスリン製剤では、より急速な皮下吸収が可能になるはずであるが、インスリンについては、一般に、無亜鉛製剤の化学的及び物理的安定性が課題である。
【０００９】
様々なインスリン誘導体が、種々の用途に提唱されている。
【００１０】
WO1998042749は、経肺投与用の無亜鉛インスリン結晶を記載している。
【００１１】
US6960561は、安定性が向上している無亜鉛及び低亜鉛インスリン調製物を記載している。
【００１２】
WO2007/096431は、特に、A22位に、アシル化されたリシン残基を保持し、B29位においてアルギニン残基を保持し、desB30である類似体を始めとして、ある特定のヒトインスリン誘導体を記載しており、この類似体類は、生理的pH値で可溶性であり、作用プロファイルが長期であり、長時間作用型インスリンとして使用するためのものである。
【００１３】
WO2009/022013は、特に、A22に、アシル化されたリシン残基を保持し、B29位においてアルギニン残基を保持し、desB30である類似体を始めとして、より高いインスリン受容体結合親和性を有し、長時間作用型インスリンとして使用するためのものである、ある特定のアシル化インスリン類似体を記載している。
【００１４】
WO2009/112583は、A22位にリシン残基を保持し、B29位においてアルギニン残基を保持し、desB30である類似体を含めて、プロテアーゼ安定性の向上を示す、ある特定のインスリン類似体を記載している。
【００１５】
WO2011/161124は、特に、A22位にリシン残基を保持し、B29位においてアルギニン残基を保持し、desB30である類似体を含めて、安定性を向上させるために付加的なジスルフィド結合を含んだ、ある特定のアシル化インスリン類似体を記載している。
【００１６】
WO2012/171994は、特に、A22位に、アシル化されたリシン残基を保持し、B29位においてアルギニン残基を保持し、desB30である類似体を含めて、長期のin vivo活性のための、2つ以上の置換を含む、ある特定のインスリン誘導体を記載している。
【００１７】
WO2013063572は、場合によって亜鉛を含まない、超濃縮された速効型インスリン類似体製剤を記載している。
【００１８】
更に、アルブミン結合部分を用いたペプチド及びタンパク質のアシル化を使用して、ペプチド及びタンパク質の作用持続期間の延長がなされている。
【００１９】
しかし、本発明によるインスリン誘導体は報告されておらず、食事前に使用するための速効性インスリン誘導体としてのその使用はいまだかつて提唱されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】WO1998042749
【特許文献２】US6960561
【特許文献３】WO2007/096431
【特許文献４】WO2009/022013
【特許文献５】WO2009/112583
【特許文献６】WO2011/161124
【特許文献７】WO2012/171994
【特許文献８】WO2013063572
【特許文献９】US6500645
【特許文献１０】US5395922
【特許文献１１】EP765395
【特許文献１２】WO9828429
【特許文献１３】WO2009/115469
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern TJ & Manning MG、Plenum Press、New York 1992
【非特許文献２】Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995
【非特許文献３】Beaucageら(1981) Tetrahedron Letters 22 1859〜1869
【非特許文献４】Matthesら(1984) EMBO Journal 3 801〜805
【非特許文献５】Russell (1985) Gene 40 125〜130
【非特許文献６】Alberら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 419〜434
【非特許文献７】Kjeldsenら(1998) Prot. Expr. Pur. 14 309〜316
【非特許文献８】Kristensenら(1997) J. Biol. Chem. 20 12978〜12983
【非特許文献９】F.Z. Dorwald: Organic Synthesis on Solid Phase、Wiley-VCH 2000、ISBN 3-527-29950-5
【非特許文献１０】N. Sewald & H.D. Jakubke: Peptides: Chemistry and Biology、Wiley-VCH、2002、ISBN 3-527-30405-3
【非特許文献１１】The Combinatorial Cheemistry Catalog、1999、Novabiochem AG
【非特許文献１２】Glendorf Tら(2008) Biochemistry 47 4743〜4751
【非特許文献１３】Volund A (1978) Biometrics 34 357〜365
【非特許文献１４】Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177 244〜249
【非特許文献１５】LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309 274〜284
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
本発明の目的は、皮下投与後に食前プロファイルを有するインスリン類似体を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、製剤化された状態で化学的に安定しているインスリン類似体を提供することである。
【００２４】
本発明の3番目の目的は、亜鉛を加えなくとも、製剤化された状態で化学的に安定しているインスリン類似体を提供することである。
【００２５】
本発明の4番目の目的は、製剤化された状態で物理的に安定しているインスリン類似体を提供することである。
【００２６】
本発明の5番目の目的は、亜鉛を加えなくとも、製剤化された状態で物理的に安定しているインスリン類似体を提供することである。
【００２７】
本発明の6番目の目的は、製剤化された状態で化学的及び物理的に安定しているインスリン類似体を提供することである。
【００２８】
本発明の7番目の目的は、亜鉛を加えずに製剤化された状態で化学的及び物理的に安定しているインスリン類似体を提供することである。
【００２９】
本発明の8番目の目的は、皮下投与後、現在市販されている食前インスリンに比べて肝臓優先的である、インスリン類似体を提供することである。
【００３０】
本発明の9番目の目的は、皮下投与後、現在市販されている食前インスリンに比べて肝臓選択的である、インスリン類似体を提供することである。
【００３１】
本発明の10番目の目的は、現在市販されている食前インスリンに比べて、食事前の皮下投与後に低血糖を誘発しにくい、インスリン類似体を提供することである。
【００３２】
本発明の11番目の目的は、現在市販されている食前インスリンに比べて、食事前の皮下投与後に体重増加を誘発しにくい、インスリン類似体を提供することである。
【００３３】
本発明の12番目の目的は、現在市販されている食前インスリンに比べて、食事前の皮下投与後に低血糖及び体重増加を誘発しにくい、インスリン類似体を提供することである。
【００３４】
本発明のそれ以外の目的は、上で言及した目的、詳細には、皮下投与後に食前プロファイルを示す一方で、製剤化する際、特に亜鉛を加えずに製剤化する際、化学的に安定している、インスリン類似体の提供の1つ又は複数の組合せということになる。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
本発明者らは、本発明のA22Kアシル化インスリン誘導体が、先行技術の同様のインスリン誘導体に比べて著しく改善された特性を有することを発見した。詳細には、本発明者らは、本発明のインスリン誘導体が、添加された亜鉛イオンを含有しない製剤として、先行技術の同様の誘導体と比べたとき、より小さいサイズの分子凝集体と会合することを発見した。種が小さいほど、大きい種より迅速に拡散することが知られており、したがって、より急速な吸収が予想される。こうした分子凝集体のサイズは、たとえば、X線小角散乱(SAXS)によって、また実施例の部に記載するとおりのSEC-HPLC(サイズ排除HPLC)で連続希釈を行うことにより、本明細書に記載のとおりに測定することができる。
【００３６】
本発明者らは、本発明のインスリン誘導体が、添加された亜鉛イオンを含有しない製剤として、先行技術の同様の誘導体に比べて、ブタへの皮下投与後により迅速に吸収されることも発見しており、それによって、食事前に使用するインスリンとしての潜在的な臨床での有用性が示された。本発明者らは、本発明のインスリン誘導体が、添加された亜鉛イオンを含有しない製剤として、先行技術の同様の誘導体に比べて、ブタへの皮下投与後に、より少ない「テーリング」しか伴わないことを発見した。より少ないテーリングとは、注射されたインスリンの皮下貯留物が、先行技術の同様の類似体より迅速に吸収される結果、皮下投与後の平均滞留時間(MRT)が、本発明のインスリン誘導体について、先行技術の同様のアシル化誘導体と比べたとき、より短くなることを意味する。
【００３７】
無亜鉛の製剤は、より急速な皮下吸収を可能にするが、インスリンについては、一般に、無亜鉛製剤の化学的及び物理的安定性が課題であり、これまで、インスリングルリジン(Apidra(登録商標)、B3K、B29Eヒトインスリン)で、またバイアルに分注されるときは界面活性剤の存在下に限り、可能であるとしか示されていない。
【００３８】
本発明者らは今回、B3位における置換を有する、本発明のA22Kアシル化インスリン誘導体の亜集団が、非常に思いがけなく、またいまだかつてなく、添加された亜鉛イオン及び添加された界面活性剤を含まない製剤として、化学的にも物理的にも安定していることを発見した。
【００３９】
アシル化インスリン誘導体を食前インスリン療法として使用することによる利点は、インスリンアスパルト、インスリンリスプロ、又はインスリングルリジンのような、アシル化されていない食前インスリンによる治療で実現されるより高い血漿インスリン濃度が実現されることである。
【００４０】
本発明によるA22Kアシル化インスリン誘導体は、皮下投与後に、食事時様の時間-作用プロファイルを有する。
【００４１】
テトラデカン二酸、ペンタデカン二酸、又はヘキサデカン二酸を主体とする、本発明によるアルブミンバインダーを有するA22Kアシル化インスリン誘導体は、1.5%ヒト血清アルブミン(HSA)の存在下で低下するものである、インスリン受容体結合親和性を、非常に高度に付与することが示されている。
【００４２】
本発明によるA22Kアシル化インスリン誘導体は、生理学的塩濃度において溶解度が低下しない。
【００４３】
したがって、本発明は、その第1の態様において、新規インスリン誘導体を提供し、このインスリン誘導体は、ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であるヒトインスリン類似体のアシル化誘導体であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、式IIの基
[アシル]-[リンカー]-
[式中、リンカー基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜10個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸鎖であり、gGluは、ガンマグルタミン酸残基を表し、OEGは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸の残基(すなわち、式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-の基)を表し、アミノ酸残基は、いずれの順序で存在してもよく、アミノ酸鎖は、少なくとも1個のgGlu残基を含み、
アシル基は、1,14-テトラデカン二酸、1,15-ペンタデカン二酸、及び1,16-ヘキサデカン二酸から選択されるα,ω-ジ-カルボン酸の残基である]
でアシル化することにより誘導体化されており、
アシル化類似体は、A14E、及び/又はB3E若しくはB3Q置換を更に含んでもよい。
【００４４】
別の第1の態様では、本発明は、本発明のインスリン誘導体と、薬学的に許容される1種又は複数の医薬添加剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、本発明のインスリン誘導体の医薬品としての使用に関する。
【００４６】
更に別の態様では、本発明は、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)、高血圧、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、消化不良、又は胃潰瘍に関係する疾患、障害、又は状態を治療、予防、又は緩和する方法であって、それを必要とする対象への、治療有効量の本発明のインスリン誘導体の投与を含む方法を提供する。
【００４７】
本発明の他の目的は、当業者には、以下の詳細な説明及び実施例から明白となろう。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
インスリン誘導体
本発明は、その第1の態様において、アシル化されたヒトインスリン類似体である、新規インスリン誘導体を提供する。
【００４９】
本発明のインスリン誘導体は、詳細には、アシル化されたヒトインスリン類似体として特徴付けることができ、この類似体は、ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、
インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、式IIの基
[アシル]-[リンカー]-
[式中、リンカー基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜10個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸鎖であり、gGluは、ガンマグルタミン酸残基を表し、OEGは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸の残基(すなわち、式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-の基)を表し、アミノ酸残基は、いずれの順序で存在してもよく、アミノ酸鎖は、少なくとも1個のgGlu残基を含み、
アシル基は、1,14-テトラデカン二酸、1,15-ペンタデカン二酸、及び1,16-ヘキサデカン二酸から選択されるα,ω-ジ-カルボン酸の残基である]
でアシル化することにより誘導体化される。
【００５０】
本発明のインスリン誘導体は、A14E、及び/又はB3E若しくはB3Q置換を更に含んでもよい。
【００５１】
一実施形態では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して、[A14E、A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]、[A14E、A22K、desB27、B29R、desB30]、[A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]、[A22K、B3Q、desB27、B29R、desB30]、又は[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている。
【００５２】
別の実施形態では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている。
【００５３】
第三の実施形態では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して[A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている。
【００５４】
第四の実施形態では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して[A22K、B3Q、desB27、B29R、desB30]であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている。
【００５５】
第五の実施形態では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して[A14E、A22K、desB27、B29R、desB30]であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている。
【００５６】
第六の実施形態では、ヒトインスリン類似体は、ヒトインスリンに対して[A14E、A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている。
【００５７】
上述のとおり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、上述のとおりの式IIの基、すなわち、連結基に結合したアシル基を保持する置換基でアシル化することにより誘導体化される。
【００５８】
本発明の状況では、式IIによる連結基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜10個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸鎖である。
【００５９】
一実施形態では、式IIによる連結基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜7個のアミノ酸残基から構成され、1から4個のgGlu残基と0〜3個のOEG残基とを含むアミノ酸鎖である。
【００６０】
別の実施形態では、式IIによる連結基は、-gGlu-、-2×gGlu-、-3×gGlu-、-4×gGlu-、-gGlu-2×OEG-、-gGlu-3×(OEG-gGlu)-、-4×gGlu-2×OEG-、-2×OEG-、及び-2×OEG-gGlu-から選択される。
【００６１】
第三の実施形態では、式IIによる連結基は、-gGlu-である。
【００６２】
第四の実施形態では、式IIによる連結基は、-2×gGlu-である。
【００６３】
第五の実施形態では、式IIによる連結基は、-3×gGlu-である。
【００６４】
第六の実施形態では、式IIによる連結基は、-4×gGlu-である。
【００６５】
第七の実施形態では、式IIによる連結基は、-gGlu-2×OEG-である。
【００６６】
第八の実施形態では、式IIによる連結基は、-gGlu-3×(OEG-gGlu)-である。
【００６７】
第九の実施形態では、式IIによる連結基は、-4×gGlu-2×OEG-である。
【００６８】
第10の実施形態では、式IIによる連結基は、-2×OEG-である。
【００６９】
第11の実施形態では、式IIによる連結基は、-2×OEG-gGlu-である。
【００７０】
本発明の状況では、式IIによるアシル基は、1,14-テトラデカン二酸、1,15-ペンタデカン二酸、又は1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される。
【００７１】
一実施形態では、式IIによるアシル基は、1,14-テトラデカン二酸から誘導される(すなわち、1,14-テトラデカンジオイル)。
【００７２】
別の実施形態では、式IIによるアシル基は、1,15-ペンタデカン二酸から誘導される(すなわち、1,15-ペンタデカンジオイル)。
【００７３】
第三の実施形態では、式IIによるアシル基は、1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される(すなわち、1,16-ヘキサデカンジオイル)。
【００７４】
別の実施形態では、上述のとおりの式IIの基は、テトラデカンジオイル-gGlu-、テトラデカンジオイル-2×gGlu-、テトラデカンジオイル-3×gGlu-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG-、テトラデカンジオイル-2×OEG-、ペンタデカンジオイル-4×gGlu、ヘキサデカンジオイル-4×gGlu-、ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、又はヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu-である。
【００７５】
別の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-gGlu-である。
【００７６】
第三の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-2×gGlu-である。
【００７７】
第四の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-3×gGlu-である。
【００７８】
第五の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-4×gGlu-である。
【００７９】
第六の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-である。
【００８０】
第七の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-2×OEG-である。
【００８１】
第八の実施形態では、式IIの基は、テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG-である。
【００８２】
第九の実施形態では、式IIの基は、ペンタデカンジオイル-4×gGlu-である。
【００８３】
第10の実施形態では、式IIの基は、ヘキサデカンジオイル-4×gGlu-である。
【００８４】
第11の実施形態では、式IIの基は、ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG-である。
【００８５】
第12の実施形態では、式IIの基は、ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu-である。
【００８６】
本発明のインスリン誘導体は、詳細には、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ペンタデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、及び
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-3×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
からなる群から選択されるものでよい。
【００８７】
本発明の化合物の好ましい特色
本発明は、以下の特色の1つ又は複数を参照することで、更に特徴付けることができる。
1. [A22K、desB27、B29R、desB30]であり、A14E、及び/又はB3E若しくはB3Qとして場合により置換されており、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、アシル化されたヒトインスリン類似体。
【００８８】
2. ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、B3E又はB3Qとして置換されており、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００８９】
3. ヒトインスリンに対して[A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]であり、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９０】
4. ヒトインスリンに対して[A22K、B3Q、desB27、B29R、desB30]であり、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９１】
5. ヒトインスリンに対して[A14E、A22K、desB27、B29R、desB30]であり、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９２】
6. ヒトインスリンに対して[A14E、A22K、desB27、B29R、desB30]であり、B3E又はB3Qとして置換されており、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９３】
7. ヒトインスリンに対して[A14E、A22K、B3E、desB27、B29R、desB30]であり、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基においてアシル化されている、条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９４】
8. ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、式IIの基
[アシル]-[リンカー]-
[式中、リンカー基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜10個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸鎖であり、
gGluは、ガンマグルタミン酸残基を表し、
OEGは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸の残基(すなわち、式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-の基)を表し、
アミノ酸残基は、いずれの順序で存在してもよく、
アミノ酸鎖は、少なくとも1個のgGlu残基を含み、
アシル基は、
1,14-テトラデカン二酸、
1,15-ペンタデカン二酸、及び
1,16-ヘキサデカン二酸、
から選択されるα,ω-ジ-カルボン酸の残基である]
でアシル化することにより誘導体化されており、
A14E、及び/又はB3E若しくはB3Q置換を更に含んでもよい、
条項1に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９５】
9. アシル基が、1,14-テトラデカン二酸、1,15-ペンタデカン二酸、又は1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される二酸基である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９６】
10. アシル基が、1,14-テトラデカン二酸又は1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される二酸基である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９７】
11. アシル基が、1,14-テトラデカン二酸から誘導される二酸基である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９８】
12. アシル基が、1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される二酸基である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【００９９】
13. アシル基が、1,15-ペンタデカン二酸から誘導される二酸基である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１００】
14. 連結基が1〜10個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０１】
15. 連結基が1〜8個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０２】
16. 連結基が1〜6個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０３】
17. 連結基が1〜4個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０４】
18. 連結基が1〜3個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０５】
19. 連結基が1〜2個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０６】
20. 連結基が1個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０７】
21. 連結基が2個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０８】
22. 連結基が3個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１０９】
23. 連結基が4個のgGlu残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１０】
24. 連結基が1〜6個のOEG残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１１】
25. 連結基が1〜4個のOEG残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１２】
26. 連結基が1〜3個のOEG残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１３】
27. 連結基が1個のOEG残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１４】
28. 連結基が2個のOEG残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１５】
29. 連結基が3個のOEG残基を含む、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１６】
30. 連結基がOEG残基を含まない、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１７】
31. 連結基が、-gGlu-、-2×gGlu-、-3×gGlu-、-gGlu-3×(OEG-Glu)-、-4×gGlu-、-2×OEG-、-4×gGlu-2×OEG-、-2×OEG-gGlu-、及び-gGlu-2×OEG-から選択される、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１８】
32. 連結基が、-gGlu、-gGlu-3×(OEG-gGlu)-、及び-gGlu-2×OEG-から選択される、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１１９】
33. 連結基が、-gGlu-、-2×gGlu-、及び-4×gGlu-から選択される、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１２０】
34. 式IIの基[アシル]-[リンカー]-が、テトラデカンジオイル-gGlu-、テトラデカンジオイル-2×gGlu-、テトラデカンジオイル-3×gGlu-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、テトラデカンジオイル-2×OEG-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG-、ヘキサデカンジオイル-4×gGlu-、ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、又はヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu-である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１２１】
35. 式IIの基[アシル]-[リンカー]-が、テトラデカンジオイル-gGlu-、テトラデカンジオイル-2×gGlu-、テトラデカンジオイル-4×gGlu-、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、テトラデカンジオイル-2×OEG-、ヘキサデカンジオイル-4×gGlu-、ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG-、又はヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu-である、条項7に記載のアシル化されたヒトインスリン類似体。
【０１２２】
定義
命名法
本明細書では、インスリンの命名は、以下の原則に従って行う。
用語「類似体」は、往々にして、さらなる化学修飾(誘導体化)、特にアシル化を受ける前の、当該インスリンタンパク質又はペプチドに対して使用される。そのような化学修飾(誘導体化)の結果として生じる生成物は、「誘導体」又は「アシルされた化類似体」と呼ぶのが普通である。しかし、本出願の状況では、用語「類似体」は、ヒトインスリンの類似体に加えて、そのようなヒトインスリン類似体の(アシル化された)誘導体も示す。
【０１２３】
名称は、ヒトインスリンに対する類似体、誘導体、及び修飾(アシル化)として割り当てる。アシル部分(すなわち、式IIの[アシル]-[リンカー]-基)の命名については、IUPAC命名法に従って命名を行う場合もあれば、ペプチド命名法のように命名を行う場合もある。
【０１２４】
一例として、次の構造(化学式1)のアシル部分:
【０１２５】
【化１】
0006580583.tif 000002
【０１２６】
は、「テトラデカンジオイル-4×gGlu」、「テトラデカンジオイル-4×ガンマGlu」、又は「1,14-テトラデカンジオイル-4×gGlu」等と命名する場合があり、γGlu(及びgGlu)は、アミノ酸であるL-立体配置のガンマグルタミン酸の省略表記であり、「4×」は、後に続く残基が4回繰り返されることを意味する。
【０１２７】
同様に、次の構造(化学式2)のアシル部分:
【０１２８】
【化２】
0006580583.tif 000003
【０１２９】
は、たとえば、「ヘキサデカンジオイル-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「ヘキサデカンジオイル-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)」、「1,16-ヘキサデカンジオイル-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「1,16-ヘキサデカンジオイル-(gGlu-OEG)3-gGlu)」、「1,16-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)」、「ヘキサデカンジオイル-(γGlu-OEG)3-γGlu)」、「ヘキサデカンジオイル-(γGlu-OEG)3-γGlu)」、又は「ヘキサデカンジオイル-3×(γGlu-OEG)-γGlu)」と命名することができ、
次の構造(化学式3)の部分:
【０１３０】
【化３】
0006580583.tif 000004
【０１３１】
は、たとえば、テトラデカンジオイル、1,14-テトラデカンジオイル、又は(省略表記)C14二酸と命名することができる。15個及び16個の炭素原子を有する同様の残基についても、同様の表記、すなわち、それぞれペンタデカンジオイル、C15二酸、及びヘキサデカンジオイル、C16二酸が適用される。
【０１３２】
γGlu(及びgGlu)は、L-立体配置のアミノ酸ガンマグルタミン酸の省略表記である。
【０１３３】
OEGは、アミノ酸残基8-アミノ-3,6-ジオキサ-オクタン酸、すなわちNH2(CH2)2O(CH2)2OCH2CO2Hの省略表記である。
【０１３４】
「2×」及び「3×」は、後に続く残基が、それぞれ2回、3回繰り返されることを意味する。
【０１３５】
たとえば、実施例1のインスリン誘導体は、「A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン」と命名されて、ヒトインスリン中の、21個のアミノ酸残基を含んでいるA鎖が、1個アミノ酸(A22位)、すなわちリシン(K)で延長されており、更に、A22のリシン残基中の、Nε(又はN(eps))と示されるイプシロン窒素における、テトラデカンジオイル-4×gGlu部分でのアシル化によって修飾されていること、ヒトインスリンにおけるB27位のアミノ酸Tが欠失していること、ヒトインスリンにおけるB29位のアミノ酸KがアルギニンRで置換されていること、ヒトインスリンにおけるB30位のアミノ酸トレオニンTが欠失していることが示される。以下の式中のアステリスクは、当該残基がヒトインスリンと比べて異なっている(すなわち、置換されている)ことを示す。
【０１３６】
本出願では終始、本発明の好ましいインスリンの式及び名称の両方を示す。
【０１３７】
加えて、本発明のインスリンはまた、IUPAC命名法(OpenEye、IUPACスタイル)に従って命名される。この命名法によれば、実施例1のインスリン誘導体には、次の名称が割り当てられる: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド。
【０１３８】
式は、(アシル化によって修飾されている)リシン残基を伴って記される場合があり、伸長されたリシン残基と共に描かれる(たとえば、実施例23に示すとおり)か、又は短縮されたリシン残基と共に描かれる(たとえば、実施例1に示すとおり)ことを留意すべきである。すべての場合において、アシル基は、リシン残基のイプシロン窒素に結合している。
【０１３９】
完全を期して、B27位の残基が欠失(desB27)する結果、残存するアミノ酸残基がN末端の方へ(形式上)1残基ずれることに言及することができる。したがって、そのような類似体は、B28位の残基がプロリンであり、B29位の残基がアルギニンであるので、B27P、B28R、desB29〜30と命名することもできる(たとえば、実施例1の化合物を参照されたい)。これは、B27を欠失させることにより、配列中の次のアミノ酸が場所を変える、すなわち、B28位のアミノ酸(プロリン)がB27位に移るためである。
【０１４０】
物理的安定性
本明細書で使用する、インスリン調製物の「物理的安定性」という用語は、タンパク質が、熱機械的応力、及び/又は疎水性表面や界面等の不安定化する界面及び表面との相互作用に曝される結果として、生物学的に不活性及び/又は不溶性のタンパク質凝集体を形成する傾向を指す。水性タンパク質調製物の物理的安定性は、適切な容器(たとえば、カートリッジ又はバイアル)に詰めた調製物を異なる温度で様々な期間にかけて機械的/物理的応力(たとえば、撹拌)に曝した後の目視検査及び/又は濁り度測定によって評価される。調製物の目視検査は、背景を暗くして焦点を絞った光のもとで行われる。調製物は、昼光において目に見える濁りを示すとき、タンパク質凝集に関して、物理的に不安定であると分類される。別法として、調製物の濁り度は、当業者によく知られている簡単な濁り度測定によって評価することもできる。水性タンパク質調製物の物理的安定性は、高次構造状態のタンパク質の分光剤又はプローブを使用して評価することもできる。プローブは、タンパク質の非天然配座異性体に優先的に結合する小分子であることが好ましい。タンパク質構造の小分子分光プローブの一例は、Thioflavin Tである。Thioflavin Tは、アミロイド原線維の検出に広く使用されている蛍光色素である。原線維の存在下、ことによるとその上に他のタンパク質立体配置の存在下でも、Thioflavin Tは、原線維タンパク質形態に結合したとき、約450nmでの最大励起、及び約482nmでの発光増強を新たに生じる。未結合Thioflavin Tは、本質的に、これらの波長では蛍光性でない。
【０１４１】
化学的安定性
本明細書で使用する、タンパク質調製物の「化学的安定性」という用語は、未変性タンパク質構造に比べて生物学的効力が低下している可能性及び/又は免疫原性特性が増大している可能性を秘めた化学的分解生成物の生成をもたらす、共有結合性タンパク質構造の変化を指す。未変性タンパク質の種類及び性質並びにタンパク質が曝される環境に応じて、種々の化学的分解生成物が生成しうる。化学的分解生成物の量の漸増は、タンパク質調製物の貯蔵中及び使用中に認められることが多い。大部分のタンパク質は、グルタミニル又はアスパラギニル残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸が生成される、又はアスパラギニル残基ではisoAsp誘導体が生成される過程である、脱アミドに陥りがちである。他の分解経路には、高分子量生成物の生成が伴い、この場合では、2つ以上のタンパク質分子がアミド基転移及び/又はジスルフィド相互作用を経て互いに共有結合して、共有結合した二量体、オリゴマー、及びポリマー分解生成物の生成へとつながる(Stability of Protein Pharmaceuticals、Ahern TJ & Manning MG、Plenum Press、New York 1992)。(たとえば、メチオニン残基の)酸化は、別の種類の化学的分解として挙げることができる。タンパク質調製物の化学的安定性は、異なる環境条件に曝した後の種々の時点で化学的分解生成物の量を測定して評価することができる(分解生成物の生成は、多くの場合、たとえば、温度を上昇させて加速させることができる)。個々の各分解生成物の量は、往々にして、種々のクロマトグラフィー技術(たとえば、SEC-HPLC及び/又はRP-HPLC)を使用して、分解生成物を、分子サイズ、疎水性、及び/又は電荷に応じて分離することにより求められる。HMWP生成物は、免疫原性である可能性もあり、生物学的に活性がないため、HMWPのレベルが低いことが有利である。
【０１４２】
合成方法
本発明のインスリン誘導体は、インスリン、インスリン類似体、及びインスリン誘導体の従来の調製方法、特に、作業実施例に記載の方法によって取得することができる。
【０１４３】
一実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、テトラデカンジオイル-4×gGluである式IIの基でアシル化することにより得られる。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、高いpH、詳細には、9.5〜13の範囲のpHにおいて、テトラデカンジオイル-4×gGluである式IIの基でアシル化することにより得られる。
【０１４５】
より詳細には、本発明のインスリン誘導体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、(S)-2-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-ブチリルアミノ)-ペンタン二酸5-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル化合物(又は別法として、テトラデカンジオイル-4×gGlu-OSuと示される)(化学式4)でアシル化することにより得られる。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明のインスリン誘導体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、14-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソエトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソエトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソブチル]アミノ]-14-オキソテトラデカン酸化合物(又は別法として、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-OSuと示される)(化学式5)でアシル化することにより得られる。
【０１４７】
本発明の化合物の合成についての好ましい特色
本発明は、以下の特色の1つ又は複数を参照することで、更に特徴付けることができる。
1. 本発明のインスリン誘導体の合成における中間体としてアシル化方法で使用するための、(S)-2-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-ブチリルアミノ)-ペンタン二酸5-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル化合物(又は別法として、テトラデカンジオイル-4×gGlu-OSuと示される)(化学式4)。
【０１４８】
2. 本発明のインスリン誘導体の合成における中間体としてアシル化方法で使用するための、14-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソエトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソエトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソブチル]アミノ]-14-オキソテトラデカン酸化合物(又は別法として、テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-OSuと示される)(化学式5)。
【０１４９】
3. アシル化されたヒトインスリン類似体であり、この類似体は、ヒトインスリンに対してA22K突然変異を有しており、その位置に、条項1〜2のいずれか一つの化合物がアシル化される、インスリン誘導体の合成において、中間体化合物として使用するための、条項1〜2のいずれか一つに記載の化合物。
【０１５０】
4. アシル化されたヒトインスリン類似体であり、この類似体は、ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、A22K位において条項1〜2のいずれか一つの化合物でアシル化されている、インスリン誘導体の合成において、中間体化合物として使用するための、条項1〜2のいずれか一つに記載の化合物。
【０１５１】
5. アシル化されたヒトインスリン類似体であり、この類似体は、ヒトインスリンに対して[A22K、desB27、B29R、desB30]であり、アシル化された類似体は、A14E、及び/又はB3E若しくはB3Q置換を更に含んでもよく、A22K位において条項1〜2のいずれか一つの化合物でアシル化されている、インスリン誘導体の合成において、中間体化合物として使用するための、条項1〜2のいずれか一つに記載の化合物。
【０１５２】
6. A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、又は
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
の合成において、中間体化合物として使用するための、条項1に記載の化合物。
【０１５３】
生物学的活性
別の態様では、本発明は、医薬品として使用するため、又は医薬品若しくは医薬組成物の製造において使用するための、新規インスリン誘導体を提供する。
【０１５４】
本発明のインスリン誘導体は、食事前の使用に十分に適しているとみなされる、短時間で急速に作用するインスリン誘導体であることがわかっている。
【０１５５】
本発明のインスリン誘導体はすべて、インスリン受容体を活性化させて必要な血糖応答を得るのに妥当なインスリン受容体親和性を有する、すなわち、動物及びヒトにおいて血糖を低下させることができる。
【０１５６】
本発明のインスリン誘導体は、インスリン受容体(IR)のインスリン様成長因子1受容体(IGF-1R)に対する親和性の比(IR/IGF-1R)のバランスがとれていることがわかっている。
【０１５７】
一態様では、本発明のA22Kアシル化インスリンは、IR/IGF-1R比が、0.3より大きい、0.4より大きい、0.5より大きい、0.6より大きい、0.7より大きい、0.8より大きい、0.9より大きい、1より大きい、1.5より大きい、又は2より大きい。
【０１５８】
別の態様では、A22Kアシル化インスリン類似体は、式IIのアシル基が1,14-テトラデカン二酸から誘導される本発明の化合物であり、アシル化されたインスリン類似体は、1.6%(w/体積、概算)のグリセロール及び30mMのフェノール/m-クレゾール、pH7.4を含有する、本発明のアシル化インスリン類似体の600μM(概算)製剤をブタに皮下注射した後の平均滞留時間(MRT)が、250分未満、200分未満、175分未満、150分未満、125分未満である。
【０１５９】
別の実施形態では、A22Kアシル化インスリン類似体は、式IIのアシル基が1,16-ヘキサデカン二酸から誘導される本発明の化合物であり、アシル化されたインスリン類似体は、1.6%(w/体積、概算)のグリセロール及び30mMのフェノール/m-クレゾール、pH7.4を含有する、本発明のアシル化インスリン類似体の600μM(概算)製剤をブタに皮下注射した後の平均滞留時間(MRT)が、700分未満、600分未満、500分未満、400分未満、300分未満である。
【０１６０】
更なる態様では、本発明は、本発明のアシル化されたインスリン類似体の医学的使用、詳細には、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)、高血圧、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、消化不良、又は胃潰瘍に関係する疾患、障害、又は状態を治療、予防、又は緩和するための、このようなインスリン誘導体の使用であって、それを必要とする対象への、治療有効量の本発明のインスリン誘導体の投与を含む方法に関する。
【０１６１】
別の実施形態では、本発明は、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、又は耐糖能障害に関係する疾患、障害、又は状態を治療、予防、又は緩和するための、そのようなインスリン誘導体の使用であって、それを必要とする対象への、治療有効量の本発明のインスリン誘導体の投与を含む方法に関する。
【０１６２】
第三の実施形態では、本発明は、糖尿病、詳細には、1型糖尿病又は2型糖尿病に関係する疾患、障害、又は状態を治療、予防、又は緩和するための、そのようなインスリン誘導体の使用に関する。
【０１６３】
医薬組成物
本発明は、医薬品として有用な、アシル化されたインスリン類似体に関する。
【０１６４】
したがって、別の態様では、本発明は、治療有効量の本発明によるインスリン誘導体を含む新規医薬組成物を提供する。
【０１６５】
本発明による医薬組成物は、薬学的に許容される1種又は複数の担体及び/又は希釈剤を場合により含む。
【０１６６】
本発明の医薬組成物は、医薬組成物中に一般に使用される他の医薬添加剤、たとえば、保存剤、キレート剤、等張化剤、吸収促進剤、安定剤、酸化防止剤、ポリマー、界面活性剤、金属イオン、油脂性賦形剤、及びタンパク質(たとえば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、又はタンパク質)を更に含んでもよい。
【０１６７】
本発明の一実施形態では、本発明の医薬組成物は、水性調製物、すなわち、水を含む調製物である。このような調製物は通常、溶液又は懸濁液である。本発明の別の実施形態では、医薬組成物は、水溶液である。
【０１６８】
用語「水性調製物」とは、少なくとも50%w/wの水を含む調製物であると定義される。同様に、用語「水溶液」とは、少なくとも50%w/wの水を含む溶液であると定義され、用語「水性懸濁液」とは、少なくとも50%w/wの水を含む懸濁液であると定義される。水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適する賦形剤と混合された活性化合物を含有するものでよい。
【０１６９】
本発明の一実施形態では、インスリン調製物は、本発明のインスリン誘導体の水溶液を含み、前記インスリン化合物は、約0.1mM〜約20.0mM、より詳細には、約0.2mM〜約4.0mM、約0.3mM〜約2.5mM、約0.5mM〜約2.5mM、約0.6mM〜約2.0mM、又は約0.6mM〜約1.2mMの濃度で存在する。
【０１７０】
本発明の別の実施形態では、インスリン調製物は、本発明のインスリン誘導体の水溶液を含み、前記インスリン化合物は、約0.1mM、約0.3mM、約0.4mM、約0.6mM、約0.9mM、約1.2mM、約1.5mM、又は約1.8mMの濃度で存在する。
【０１７１】
本発明の医薬組成物は、緩衝剤系を更に含んでもよい。緩衝剤は、限定はしないが、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、グリシルグリシン、エチレンジアミン、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はこれらの混合物からなる群から選択することができる。こうした詳細な緩衝剤の一つ一つは、本発明の代替実施形態をなす。
【０１７２】
一実施形態では、緩衝剤は、リン酸緩衝剤である。更に別の実施形態では、前記リン酸緩衝剤の濃度は、約0.1mM〜20mMの範囲にある。更に別の実施形態では、前記リン酸緩衝剤の濃度は、0.1mM〜約10mM、約0.1mM〜約8mM、約1mM〜約8mM、約2mM〜約8mM、又は6mM〜8mMの範囲にある。
【０１７３】
本発明の注射用医薬組成物のpHは、3〜8.5の範囲にある。本発明の注射用医薬組成物は、pHが約6.8〜約7.8の範囲にあることが好ましい。
【０１７４】
一実施形態では、pHは、約7.0〜約7.8又は7.2〜7.6の範囲にある。
【０１７５】
本発明のインスリン調製物は、等張化剤を更に含んでもよい。等張化剤は、塩(たとえば、塩化ナトリウム)、糖若しくは糖アルコール、アミノ酸(たとえば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、トレオニン)、アルジトール(たとえば、グリセロール(グリセリン)、1,2-プロパンジオール(プロピレングリコール)、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール)  ポリエチレングリコール(たとえば、PEG400)、又はこれらの混合物からなる群から選択することができる。たとえば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロースNaを始めとする、単糖、二糖、若しくは多糖、又は水溶性グルカン等のいずれかの糖を使用することができる。一実施形態では、糖添加剤は、スクロースである。糖アルコールとしては、たとえば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールが挙げられる。一実施形態では、糖アルコール添加剤は、マンニトールである。上で言及した糖又は糖アルコールは、個々に、又は組み合わせて使用することができる。こうした詳細な等張化剤の一つ一つ又はその混合物は、本発明の代替実施形態をなす。
【０１７６】
本発明の一実施形態では、グリセロール及び/又はマンニトール及び/又は塩化ナトリウムは、0〜250mM、0〜200mM、又は0〜100mMの濃度に相当する量で存在してよい。
【０１７７】
本発明のインスリン調製物は、薬学的に許容される保存剤を更に含んでもよい。保存剤は、保存効果を得るのに十分な量で存在してよい。本発明の医薬組成物中の保存剤量は、たとえば、当分野の文献及び/又はたとえば市販製品中の既知の保存剤量から求めることができる。こうした詳細な保存剤の一つ一つ又はその混合物は、本発明の代替実施形態をなす。医薬調製物への保存剤の使用は、たとえば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995に記載されている。
【０１７８】
一実施形態では、注射用医薬組成物は、少なくとも1種のフェノール性化合物を保存剤として含む。
【０１７９】
別の実施形態では、本発明に従って使用されるフェノール性化合物は、最終注射用医薬組成物中に約6mg/mLまで、特に最終注射用医薬組成物中に約4mg/mLまで存在してよい。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明に従って使用されるフェノール性化合物は、最終注射用医薬組成物中に約4.0mg/mLまで、特に約0.5mg/mL〜約4.0mg/mL、又は約0.6mg/mL〜約4.0mg/mLの量で存在してよい。
【０１８１】
別の実施形態では、保存剤は、フェノールである。
【０１８２】
別の実施形態では、注射用医薬組成物は、フェノールとm-クレゾールの混合物を保存剤として含む。
【０１８３】
別の実施形態では、注射用医薬組成物は、約16mMのフェノール(1.5mg/mL)と約16mMのm-クレゾール(1.72mg/mL)とを含む。
【０１８４】
本発明の医薬組成物は、キレート剤を更に含んでもよい。医薬調製物へのキレート剤の使用は、当業者によく知られている。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995を参照文献として挙げておく。
【０１８５】
本発明の医薬組成物は、吸収促進剤を更に含んでもよい。吸収促進剤の仲間として、限定はしないが、ニコチン系化合物を挙げることができる。ニコチン系化合物という用語は、ニコチンアミド、ニコチン酸、ナイアシン、ナイアシンアミド、及びビタミンB3、及び/若しくはこれらの塩、及び/又はこれらのいずれかの組合せを包含する。
【０１８６】
一実施形態では、ニコチン系化合物は、ニコチンアミド、及び/若しくはニコチン酸、及び/又はこれらの塩である。別の実施形態では、ニコチン系化合物は、ニコチンアミドである。本発明に従って使用されるニコチン系化合物は、詳細には、N-メチルニコチンアミド、N,N-ジエチルニコチンアミド、N-エチルニコチンアミド、N,N-ジメチルニコチンアミド、N-プロピルニコチンアミド、又はN-ブチルニコチンアミドでよい。
【０１８７】
別の実施形態では、ニコチン系化合物は、約5mM〜約200mMの量、特に、約20mM〜約200mMの量、約100mM〜約170mMの量、又は約130mM〜約170mM、たとえば、約130mM、約140mM、約150mM、約160mM、約170mMの量で存在する。
【０１８８】
本発明の医薬組成物は、安定剤を更に含んでもよい。本明細書で使用する用語「安定剤」とは、ポリペプチドを含有する医薬調製物に加えられる、ペプチドを安定化する、すなわち、このような調製物の貯蔵寿命及び/又は使用期限を延長するための化学物質を指す。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995を参照文献として挙げておく。
【０１８９】
本発明の医薬組成物は、組成物を貯蔵する間のポリペプチド又はタンパク質による凝集体形成を軽減するのに十分な量のアミノ酸塩基を更に含んでもよい。用語「アミノ酸塩基」とは、所与のいずれかのアミノ酸がその遊離塩基形態又はその塩形態のどちらかで存在する、アミノ酸又はアミノ酸の組合せを指す。アミノ酸は、詳細には、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アミノグアニジン、オルニチン若しくはN-モノエチルL-アルギニン、エチオニン若しくはブチオニン、又はS-メチル-Lシステインでよい。本発明の一実施形態では、アミノ酸塩基は、1〜100mM、1〜50mM、又は1〜30mMの濃度に相当する量で存在してよい。
【０１９０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、界面活性剤を更に含んでもよい。本明細書で使用する用語「界面活性剤」とは、水溶性(親水性)部である頭部と、脂溶性(親油性)セグメントとから構成される任意の分子又はイオンを指す。界面活性剤は、好ましくは界面に蓄積し、親水性部が水(親水性相)に向かって、親油性部が油相又は疎水性相(すなわち、ガラス、空気、油等)に向かって配向している。界面活性剤がミセルを形成し始める濃度は、臨界ミセル濃度又はCMCとして知られている。更に、界面活性剤は、液体の表面張力を低下させる。界面活性剤は、両親媒性化合物としても知られている。医薬調製物への界面活性剤の使用は、当業者によく知られている。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版、1995を参照文献として挙げておく。
【０１９１】
本発明は更に、そのようなインスリン調製物の調製方法に関する。本発明のインスリン調製物は、一般に認められているいくつかの方法のいずれかを使用して調製することができる。たとえば、調製物は、医薬添加剤の水溶液をインスリン誘導体の水溶液と混合し、その後pHを所望のレベルに調整し、混合物に水を足して最終体積とした後、滅菌濾過にかけることにより調製できる。
【０１９２】
無亜鉛医薬組成物
インスリン調製物は、伝統的に、医薬調製物において許容される安定性を実現するために、たとえば塩化物又は酢酸塩として加えられた亜鉛を含む。しかし、本発明のある特定のインスリン誘導体が、十分な化学的及び物理的安定性を維持しながら、亜鉛を加えずに医薬組成物に製剤化され、その結果、十分な化学的及び物理的安定性の維持にZn2+イオンを必要とする、同等なインスリン類似体よりも急速な作用の発現を実現できることが、思いがけなく見出された。無亜鉛製剤は、皮下組織により急速に吸収され、したがって食事前の使用が可能になる。
【０１９３】
これに関して、亜鉛の痕跡は、多かれ少なかれ、医薬組成物の製造に従来使用される医薬添加剤中に、特に、医療容器に使用されるゴム材料中に存在することもあるため、無亜鉛インスリン医薬組成物は、実に手にしがたいということに触れる必要がある。
【０１９４】
したがって、一態様では、本発明は、低亜鉛組成物として製剤化された、すなわち、調製物に別途亜鉛を加えていない、本発明のインスリン誘導体を含む医薬組成物を提供する。このような医薬組成物は、実際には「低亜鉛組成物」とみなすことができるとはいえ、「無亜鉛組成物」と呼ぶのが普通である。
【０１９５】
しかし、無亜鉛医薬添加剤を供給することができるなら、本発明のインスリン誘導体において、無亜鉛医薬組成物の調製が実際に見込まれる。したがって、別の態様では、本発明は、本発明のインスリン誘導体と、亜鉛を含まない、薬学的に許容される1種又は複数の担体若しくは希釈剤とを含む、無亜鉛医薬組成物を提供する。
【０１９６】
本発明者らは、B3位における置換を有する、本発明のA22Kアシル化インスリン誘導体の亜集団が、亜鉛イオンを加えずに製剤化され、添加された界面活性剤を含まない医薬組成物の化学的及び物理的安定性の一助となることを更に発見した。したがって、別の態様では、本発明は、B3位における追加の置換(すなわち、B3E又はB3Q)を含む本発明のインスリン誘導体と、薬学的に許容される1種又は複数の担体又は希釈剤とを含み、しかし、界面活性剤が添加されていない、上述のとおりの低亜鉛又は無亜鉛医薬組成物を提供する。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、亜鉛イオンが添加されていない、低亜鉛組成物として製剤化された医薬組成物であって、インスリン誘導体と、薬学的に許容される1種又は複数の担体又は希釈剤とを含み、インスリン誘導体は、アシル化されたヒトインスリン類似体であり、この類似体は、
ヒトインスリンに対して[A22K、B3E又はB3Q、desB27、B29R、desB30]
であり、インスリン類似体は、A22位のリシン残基のイプシロンアミノ基を、式IIの基
[アシル]-[リンカー]-
[式中、リンカー基は、-gGlu-及び-OEG-から選択される1〜10個のアミノ酸残基から構成されるアミノ酸鎖であり、
gGluは、ガンマグルタミン酸残基を表し、
OEGは、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸の残基(すなわち、式-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-の基)を表し、
アミノ酸残基は、いずれの順序で存在してもよく、
アミノ酸鎖は、少なくとも1個のgGlu残基を含み、
アシル基は、
1,14-テトラデカン二酸、
1,15-ペンタデカン二酸、及び
1,16-ヘキサデカン二酸
から選択されるα,ω-ジ-カルボン酸の残基である]
でアシル化することにより誘導体化されており、
アシル化類似体は、A14E置換を更に含んでもよい、
医薬組成物を提供する。
【０１９８】
別の実施形態では、B3位における追加の置換は、B3Eである。
【０１９９】
第三の実施形態では、B3位における追加の置換は、B3Qである。
【０２００】
第四の実施形態では、本発明は、亜鉛イオンが添加されていない、低亜鉛組成物として製剤化された医薬組成物であって、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ペンタデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-3×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、及び
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
から選択されるアシル化されたヒトインスリン類似体を含む医薬組成物を提供する。
【０２０１】
更に別の実施形態では、本発明は、6インスリン分子あたり0.2未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.15未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.12未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.1のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.09未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.08未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.07未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.06未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.05未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.04未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.03未満のZn2+イオン、6インスリン分子あたり0.02未満のZn2+イオン、又は6インスリン分子あたり0.01未満のZn2+イオンの濃度に相当する量で亜鉛イオンが存在してよい、上述のとおりの低亜鉛医薬組成物を提供する。
【０２０２】
更なる実施形態では、本発明は、注射用組成物として製剤化された、上述のとおりの低亜鉛又は無亜鉛医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、当業界で知られている従来の方法を使用して取得することができる。たとえば、諸成分を水溶液の形で混ぜ合わせ、その後pHを所望のレベルに調整することができ、混合物に水を足して最終体積とした後、滅菌濾過にかける。
【０２０３】
非経口投与は、注射器、場合に応じてペン型注射器による、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射によって行うことができる。別法として、非経口投与は、注入ポンプによって行ってもよい。別の選択肢として、本発明のインスリン化合物を含有するインスリン調製物は、たとえば、無針注射による、若しくは微細針パッチ、場合に応じてイオン導入パッチからの経皮投与、又は経粘膜、たとえば頬側投与に適合させることもできる。
【０２０４】
本発明によるインスリン調製物は、このような治療を必要とする患者に、いくつかの部位、たとえば、局所部位、たとえば、皮膚及び粘膜部位において、吸収の迂回路となる部位(たとえば、動脈内、静脈内、心臓内の投与)において、また吸収に関与する部位(たとえば、皮内、皮下、筋肉内、若しくは腹部内の投与)において投与することができる。
【０２０５】
一実施形態では、本発明のインスリン調製物は、注射によるインスリン療法に使用されるペン型装置での適用に好適である。
【０２０６】
本発明の医薬組成物は、非経口投与による糖尿病の治療において使用することができる。
【０２０７】
別の実施形態では、本発明のインスリン調製物は、ポンプの使用による継続的な皮下インスリン注入療法を始めとする、インスリン投与に通常使用される種々の医療用具での使用、及び/又は基礎インスリン療法での適用向けに調製することもできる。
【０２０８】
患者に投与される本発明のインスリン調製物の投与量は、医師によって選択されることが推奨される。現在、本発明によるインスリン誘導体は、最終医薬組成物中に、約0.1mM〜約20.0mM、より特段には約0.2mM〜約4.0mM、約0.3mM〜約2.5mM、約0.5mM〜約2.5mM、約0.6mM〜約2.0mM、又は約0.6mM〜約1.2mMの量で存在するように企図されている。
【０２０９】
本発明の医薬組成物の好ましい特色
本発明は、以下の特色の1つ又は複数を参照することで、更に特徴付けることができる。
1. 本発明のアシル化されたヒトインスリン類似体と、薬学的に許容される1種又は複数の医薬添加剤とを含む医薬組成物。
【０２１０】
2. 添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１１】
3. B3位における置換を有するアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１２】
4. B3E又はB3Q置換を有するアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１３】
5. B3E置換を有するアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１４】
6. B3Q置換を有するアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１５】
7. A22K(N(eps)テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ペンタデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、及び
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-3×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
から選択されるアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１６】
8. A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン、及び
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン
から選択されるアシル化されたヒトインスリン類似体を含む、添加された亜鉛イオンを含まない低亜鉛組成物として製剤化されている、条項1に記載の医薬組成物。
【０２１７】
9. 6インスリン分子あたり0.2未満のZn2+イオンを含む、条項7〜8のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０２１８】
10. 界面活性剤が添加されていない、条項7〜8のいずれか一つに記載の低亜鉛医薬組成物。
【０２１９】
11. ニコチン系化合物を含む、条項7〜8のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０２２０】
12. 合計濃度約20mM〜約170mMのニコチン系化合物、フェニルアラニン、及び/又はその塩を含む、条項7〜8のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０２２１】
13. 合計濃度約130mM〜約170mMのニコチン系化合物、フェニルアラニン、及び/又はその塩を含む、条項7〜8のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０２２２】
14. 薬学的に許容される医薬添加剤、希釈剤、及び/又は佐剤を含む、条項7〜8のいずれか一つに記載の医薬組成物。
【０２２３】
治療方法
本発明は、治療用途のための薬物に関する。より詳細には、本発明は、糖尿病に関係する医学的状態を治療又は予防するための、本発明のヒトインスリン類似体のアシル化誘導体の使用に関する。
【０２２４】
したがって、別の態様では、本発明は、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)、高血圧、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、消化不良、又は胃潰瘍に関係する疾患、障害、又は状態から選択されるものでよい、ヒトを含めた生きている動物体の疾患、障害、又は状態を治療又は緩和する方法であって、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明のアシル化されたヒトインスリン類似体を投与する工程を含む方法を提供する。
【０２２５】
別の実施形態では、本発明は、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)、高血圧、認知障害、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、卒中、心血管障害、冠動脈心疾患、炎症性腸症候群、消化不良、又は胃潰瘍に関係する疾患、障害、又は状態から選択されるものでよい、ヒトを含めた生きている動物体の疾患、障害、又は状態を治療又は緩和する方法であって、それを必要とする対象への、治療有効量の本発明のアシル化されたヒトインスリン類似体の投与を含む方法を提供する。
【０２２６】
第三の実施形態では、本発明は、糖尿病、1型糖尿病、2型糖尿病、耐糖能障害、高血糖、異脂肪症、肥満、メタボリック症候群(メタボリック症候群X、インスリン抵抗性症候群)に関係する疾患、障害、又は状態から選択されるものでよい、ヒトを含めた生きている動物体の疾患、障害、又は状態を治療又は緩和する方法を提供する。
【０２２７】
第四の実施形態では、本発明は、糖尿病、詳細には、1型糖尿病又は2型糖尿病に関係する疾患、障害、又は状態から選択されるものでよい、ヒトを含めた生きている動物体の疾患、障害、又は状態を治療又は緩和する方法を提供する。
【０２２８】
本発明は、添付の図面を参照することで更に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０２２９】
【図１】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例1のインスリン誘導体(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)を、NovoRapid(登録商標)/NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト、市販の製剤、6インスリン分子あたり亜鉛3(0.5及び1nmol/kg)のプロファイルと比較して示すグラフである。
【図２】最初の2時間だけを示す、図1にあるのと同じデータを示すグラフである。
【図３ａ】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例1のインスリン(1nmol/kg)についてのデータを、NovoRapid(登録商標)/NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト、市販の製剤、6インスリン分子あたり亜鉛3(1nmol/kg)のプロファイルだけと比較した、図1にあるのと同じデータを示すグラフである。
【図３ｂ】図3aのインスリンプロファイルの結果として生じる血漿グルコースの変化を示すグラフである。
【図４ａ】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例2のインスリン(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)を、NovoRapid(登録商標)/NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト、市販の製剤、6インスリン分子あたり亜鉛3(0.5及び1nmol/kg)のプロファイルと比較して示すグラフである。
【図４ｂ】結果として生じる、血漿グルコースの変化を示すグラフである。
【図５ａ】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例2のインスリン(1nmol/kg)についてのデータを、NovoRapid(登録商標)/NovoLog(登録商標)(インスリンアスパルト、市販の製剤、6インスリン分子あたり亜鉛3(1nmol/kg)のプロファイルだけと比較した、図4a及び図4bにあるのと同じデータを示すグラフである。
【図５ｂ】結果として生じる、血漿グルコースの変化を示すグラフである。
【図６】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例11のインスリン(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)を示すグラフである。
【図７】結果として生じる、血漿グルコースの変化を示すグラフである。
【図８】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例44のインスリン(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)を示すグラフである。
【図９】結果として生じる、血漿グルコースの変化(1nmol/kg)を示すグラフである。
【図１０】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された先行技術のインスリンA22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013、実施例45)(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)を示すグラフである。
【図１１】結果として生じる、血漿グルコースの変化(1nmol/kg)を示すグラフである。
【図１２】6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された先行技術を代表するテトラデカン二酸類似体(WO2009/022013、実施例45、図10及び図11に示したもの)(72nmol/動物)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)を示すグラフである。
【図１３】結果として生じる、血漿グルコースの変化を示すグラフである。
【図１４Ａ】蛍光対時間のプロットを示すグラフであり、これから、ずれ区間と細動区間の線形近似の切片として、ずれ時間を推定することができる。
【図１４Ｂ】蛍光対時間のプロットを示すグラフであり、これから、ずれ区間と細動区間の線形近似の切片として、ずれ時間を推定することができる。
【図１４Ｃ】蛍光対時間のプロットを示すグラフであり、これから、ずれ区間と細動区間の線形近似の切片として、ずれ時間を推定することができる。
【図１５】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例2のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【図１６】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例7のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【図１７】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例7のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【図１８】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例7のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【図１９】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例7のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【図２０】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例4のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【図２１】肥満Zuckerラットにおける皮下注射後の、実施例4のインスリン誘導体の、170mMのニコチンアミド非存在下/存在下でのPK/PDプロファイルを示すグラフである。
【実施例】
【０２３０】
以下の実施例に即して本発明を更に例示するが、実施例は、請求項に記載の本発明の範囲を一切限定しないものとする。
【０２３１】
インスリン類似体の発現及び精製
インスリン類似体の発現
本発明に従って使用される、インスリン類似体、すなわち、2本の鎖の、アシル化されていないインスリン類似体は、たとえばUS6500645で開示されているような、よく知られている技術によって、適切な宿主細胞中で、当該インスリン類似体をコードするDNA配列を発現させることにより、組換え産生される。インスリン類似体は、直接に、又はB鎖におけるN末端延長部及び/若しくはB鎖とA鎖の間の連結ペプチド(Cペプチド)を有していてもよい前駆体分子として発現される。このN末端延長部及びCペプチドは、適切なプロテアーゼ、たとえば、アクロモバクター・リティカス(Achromobactor lyticus)プロテアーゼ(ALP)又はトリプシンによってin vitroで切り離され、したがって、それぞれB1位及びA1位の隣に切断部位を有することになる。本発明に従う使用に適する種類のN末端延長部及びCペプチドは、たとえば、US5395922、EP765395、及びWO9828429で開示されている。
【０２３２】
本発明に従って使用されるインスリン類似体前駆体をコードするポリヌクレオチド配列は、確立された方法、たとえば、Beaucageら(1981) Tetrahedron Letters 22 1859〜1869に記載されている亜リン酸アミダイト法、又はMatthesら(1984) EMBO Journal 3 801〜805に記載の方法によって合成して調製することができる。亜リン酸アミダイト法によれば、たとえば自動DNA合成装置でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、二重にし、核酸連結して、合成DNA構築物を生成する。DNA構築物の現在のところ好ましい調製手段は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるものである。
【０２３３】
組換え法では通常、選択された微生物又は宿主細胞中での複製が可能であり、また本発明に従って使用されるインスリン類似体前駆体をコードするヌクレオチド配列を運搬するベクターが利用される。組換えベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の存在物として存在し、その複製が染色体の複製と無関係であるベクター、たとえば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でよい。ベクターは、自己複製を確実にするいずれかの手段を収容してよい。別法として、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み込まれ、これが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものでもよい。更に、単一のベクター若しくはプラスミド、又は宿主細胞のゲノムに導入される全DNAを合わせて収容する2種以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを使用してもよい。ベクターは、線状又は閉環状のプラスミドでよく、ベクターが宿主細胞ゲノムに安定して組み込まれ、又はベクターが細胞中でゲノムと無関係に自立的に複製されるのを可能にする、エレメントを収容することが好ましい。
【０２３４】
組換え発現ベクターは、酵母中で複製しうるものでもよい。酵母中でのベクターの複製を可能にする配列の例は、酵母プラスミド2μm複製遺伝子REP1-3及び複製起点である。
【０２３５】
ベクターは、形質転換された細胞の容易な選択を可能にする、1つ又は複数の選択マーカーを収容してもよい。選択マーカーは、殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性等をもたらす遺伝子産物である。細菌用選択マーカーの例は、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)若しくはバチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)のdal遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、若しくはテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を付与するマーカーである。糸状菌宿主細胞で使用される選択マーカーとしては、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイル転移酵素)、pyrG(オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼ)、及びtrpC(アントラニル酸合成酵素)が挙げられる。酵母宿主細胞に適するマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3である。酵母に好適な選択マーカーは、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)TPI遺伝子(Russell (1985) Gene 40 125〜130)である。
【０２３６】
ベクターにおいて、ポリヌクレオチド配列は、適切なプロモーター配列に動作可能に連結される。プロモーターは、突然変異型、切断型、及びハイブリッドプロモーターを含めて、最適な宿主細胞において転写活性を示すいずれの核酸配列でもよく、宿主細胞と相同又は異種である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から取得することができる。
【０２３７】
細菌宿主細胞において転写を導くのに適するプロモーターの例は、大腸菌(E. coli)lacオペロン、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)アガラーゼ遺伝子(dagA)、Bacillus subtilisレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、Bacillus licheniformisアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)マルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)アルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、及びBacillus licheniformisペニシリナーゼ遺伝子(penP)から取得されるプロモーターである。糸状菌宿主細胞において転写を導くのに適するプロモーターの例は、コウジカビ(Aspergillus oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミーヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ(Aspergillus niger)中性アルファ-アミラーゼ、及びAspergillus niger酸安定性アルファ-アミラーゼの遺伝子から取得されるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ma1、TPI、ADH、TDH3、又はPGKプロモーターである。
【０２３８】
本発明に従って使用されるインスリンペプチド主鎖をコードするポリヌクレオチド配列は、通常、適切なターミネーターにも動作可能に連結される。酵母では、適切なターミネーターは、TPIターミネーターである(Alberら(1982) J. Mol. Appl. Genet. 1 419〜434)。
【０２３９】
本発明に従って使用されるインスリン類似体をコードするポリヌクレオチド配列、プロモーター、及びターミネーターをそれぞれ組み合わせ、選択された宿主中での複製に必要な情報を収容する適切なベクターにこれらを挿入する手順は、当業者によく知られている。本発明に従って使用されるインスリン主鎖をコードするDNA配列全体を収容するDNA構築物をまず調製し、引き続いてこの断片を適切な発現ベクターに挿入するか、又は個々のエレメント(シグナル及びプロペプチド(B鎖のN末端延長部)、Cペプチド、A鎖及びB鎖等)の遺伝子情報を収容するDNA断片を順次挿入した後、核酸連結するかのどちらかによってベクターを構築できることは理解されよう。
【０２４０】
本発明に従って使用されるインスリン類似体をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが宿主細胞に導入される結果、ベクターは、染色体の組込体として、又は自己複製する染色体外ベクターとして保たれる。用語「宿主細胞」は、複製の間に生じる突然変異により親細胞と同一でない、親細胞の子孫を包含する。宿主細胞は、単細胞微生物、たとえば原核生物でも、又は非単細胞微生物、たとえば真核生物でもよい。有用な単細胞の細胞は、細菌細胞、たとえば、限定はしないがバチルス属(Bacillus)の細胞、ストレプトマイセス属(Streptomyces)の細胞を始めとするグラム陽性細菌、又は大腸菌やシュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)等のグラム陰性細菌である。真核生物細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞でよい。
【０２４１】
宿主細胞は、特に、酵母細胞とすることができる。酵母生物は、培養されて、培地にインスリンペプチド主鎖又はその前駆体を分泌する、いかなる適切な酵母生物でもよい。適切な酵母生物の例としては、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、シゾサッカスミセル・プロべ(Schizosaccharomyces pombe)、サッカロミセス・ウバルム(Sacchoromyces uvarum)、クルイベロミセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、ハンゼヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、ピキア・メタノリカ(Pichia methanolica)、ピキア・クルイベリ(Pichia kluyveri)、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、カンジダ属の種(Candida sp.)、トルラ酵母(Candida utilis)、カンジダ・カカオイ(Candida cacaoi)、ゲオトリクム属の種(Geotrichum sp.)、及びゲオトリクム・ファーメンタンス(Geotrichum fermentans)から選択される株が挙げられる。
【０２４２】
酵母細胞の形質転換は、たとえば、プロトプラストを生成してから、既知の方法によって形質転換して行うことができる。細胞の培養に使用する培地は、酵母生物の成長に適する従来のどんな培地でもよい。
【０２４３】
インスリン類似体の精製
分泌されたインスリン類似体又はその前駆体は、遠心分離する、濾過する、インスリン類似体若しくはその前駆体をイオン交換マトリックス若しくは逆相吸収マトリックスに捕らえる若しくは吸着させる、又は塩による濾過によって、たとえば硫酸アンモニウムによって上清のタンパク質性成分を沈殿させることにより酵母細胞を培地から分離した後、様々なクロマトグラフィー手順、たとえばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等によって精製することを含めた従来の手順によって、培地から回収することができる。
【０２４４】
本発明のインスリンペプチド主鎖の精製及び消化は、次のように実施される。
B鎖のN末端延長部、及びB鎖とA鎖の間の修飾によるCペプチドを含んでいてもよい、単鎖インスリン類似体前駆体は、陽イオン交換によって、酵母培養上清から精製及び濃縮される(Kjeldsenら(1998) Prot. Expr. Pur. 14 309〜316)。
【０２４５】
単鎖インスリン類似体前駆体は、リシンに特異的な固定化されたALPでの消化(Kristensenら(1997) J. Biol. Chem. 20 12978〜12983)又はトリプシンの使用によって、存在すればB鎖N末端延長部、及びCペプチドを切り離すことにより、2本の鎖のインスリンペプチド主鎖に仕上げられる。
【０２４６】
トリプシン消化
インスリン類似体前駆体を含有する、陽イオン交換クロマトグラフィーステップからの溶出液を、水で希釈して、エタノール濃度を15〜20%とする。グリシンを加えて濃度を50mMとし、NaOHでpHを9.0〜9.5に調整する。トリプシンを1:300(w:w)の割合で加え、4度で消化を進行させる。消化は、消化が完了するまで20分毎に分析してモニターする。消化は、1Mのクエン酸を3:100(体積:体積)の割合で加えて終結させる。
【０２４７】
消化反応は、C18カラムを使用するWaters Acquity Ultra-Performance Liquid Chromatographyシステムでの分析LCによって分析し、分子量は、MALDI-TOF MS(Bruker Daltonics Autoflex II TOF/TOF)によって確認した。
【０２４８】
2本の鎖のインスリン類似体は、アセトニトリル勾配を使用するC18カラムでの逆相HPLC(Waters 600システム)によって精製される。所望のインスリン類似体、たとえば、A22K、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;A22K、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;又はA22K、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリンは、凍結乾燥によって回収される。
【０２４９】
純度は、C18カラムを使用するWaters Acquity Ultra-Performance Liquid Chromatographyシステムでの分析LCによって求め、分子量は、MALDI-TOF MSによって確認した。
【０２５０】
略語
ALP - アクロモバクター・リティカスプロテアーゼ
Cペプチド - 連結ペプチド
HPLC - 高速液体クロマトグラフィー
IR - インスリン受容体
IGF-1R インスリン様成長因子1受容体
LC - 液体クロマトグラフィー
MALDI-TOF - マトリックス支援レーザー脱離イオン化  飛行時間型
MS - 質量分析
PCR - ポリメラーゼ連鎖反応
PD - 薬力学(血中/血漿グルコース低下効果)
PG - 血漿グルコース
PK - 薬力学(血中/血漿インスリン濃度対時間プロファイル)
tBuは、tert-ブチルであり、
DCMは、ジクロロメタンであり、
DICは、ジイソプロピルカルボジイミドであり、
DIPEA=DIEAは、N,N-ジイソプロピルエチルアミンであり、
DMFは、N,N-ジメチルホルムアミドであり、
DMSOは、ジメチルスルホキシドであり、
EtOAcは、酢酸エチルであり、
Fmocは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニルであり、
γGlu(gGlu)は、ガンマL-グルタミルであり、
HClは、塩酸であり、
HOBtは、1-ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、
NMPは、N-メチルピロリドンであり、
MeCNは、アセトニトリルであり、
OEGは、[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]エチルカルボニルであり、
Suは、スクシンイミジル-1-イル=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルであり、
OSuは、スクシンイミジル-1-イルオキシ=2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシであり、
RPCは、逆相クロマトグラフィーであり、
RTは、室温であり、
TCTUは、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートであり、
TFAは、トリフルオロ酢酸であり、
THFは、テトラヒドロフランであり、
TNBSは、2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸であり、
TRISは、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンであり、
TSTUは、O-(N-スクシンイミジル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレートである。
【０２５１】
概論
以下の実施例及び一般手順では、本明細書及び合成スキームにおいて明らかにした中間体化合物及び最終生成物に言及する。本発明の化合物の調製について、以下の実施例を使用して詳述するが、記載する化学反応は、本発明の化合物を調製することへの、その一般的な適用可能性に関して開示する。
【０２５２】
反応は、時として、本発明の開示範囲内に含まれる各化合物に、記載のとおりに適用可能でないこともある。これが起こる化合物を、当業者は難なく察知されよう。こうした場合では、当業者に知られている慣例的な微調整によって、すなわち、妨げとなる基を適切に保護する、従来の他の試薬に変更する、又は反応条件を型通りに加減することによって、反応を首尾よく実施することができる。
【０２５３】
別法として、本明細書で開示する、又はそうではないが慣例的な、他の反応が、該当する本発明の化合物の調製に適用可能となる。すべての調製方法において、出発材料はすべて、知られており、又は既知の出発材料から容易に調製することができる。温度はすべて、セ氏温度で記載し、別段指摘しない限り、収率を指すとき、部及び百分率はすべて、質量であり、溶媒及び溶離液を指すとき、部はすべて、体積部である。
【０２５４】
本発明の化合物は、当業界内で典型的である以下の手順の1つ又は複数を用いて精製することができる。必要なら、こうした手順を、勾配、pH、塩、濃度、流量、カラム等について微調整してもよい。不純物プロファイル、当該インスリンの溶解性等の要素に応じて、当業者なら、こうした微調整を容易に察知し、実行することができる。
【０２５５】
酸性HPLC又は脱塩の後、純粋な画分を凍結乾燥することで、化合物が単離される。
【０２５６】
中性HPLC又は陰イオン交換クロマトグラフィーの後は、化合物を脱塩し、等電pHで沈殿させ、又は酸性HPLCによって精製する。
【０２５７】
典型的な精製手順
RP-HPLC系:
次のものからなるGilson系:リキッドハンドラーModel 215、ポンプModel 322-H2、及びUV検出器Model 155(UV215nm及び280nm)
【０２５８】
陰イオン交換及び脱塩系:
Akta Explorer系は、次のものからなる。ポンプModel P-900、UV検出器Model UV-900(UV214、254、及び280nm)、pH及び伝導率検出器Model pH/C-900、画分収集装置Model Frac-950
【０２５９】
酸性RP-HPLC:
カラム:Phenomenex Gemini、5μM 5u C18 110Å、30×250mm
流量:20mL/min
緩衝液A:水中0.1%TFA
緩衝液B:アセトニトリル中0.1%TFA
【０２６０】
中性RP-HPLC:
カラム:Phenomenex Gemini、5μM 5u C18 110Å、30×250mm
流量:20mL/min
緩衝液A:10mMトリス、15mM(NH4)2SO4、pH=7.3、milliQ中20%アセトニトリル
緩衝液B:アセトニトリル中20% milliQ
【０２６１】
陰イオン交換クロマトグラフィー:
カラム材料:Poros50HQ又はSource30Q
流量:カラム次第
緩衝液A:15mMトリス、25mM NH4OAc、50%EtOH、pH=7.5
緩衝液B:15mMトリス、500mM NH4OAc、50%EtOH、pH=7.5
【０２６２】
脱塩:
カラム:HiPrep 26/10
流量:20mL/min
緩衝液A:水中0.1%TFA
緩衝液B:アセトニトリル中0.1%TFA
【０２６３】
アシル化試薬は、溶液中(以下を参照のこと)、又はたとえばWO2009/115469に記載されているような固相上のいずれかで合成した。
【０２６４】
一般式IIIのアシル化試薬の固相合成についての一般手順
[アシル]-[リンカー]-Act
式中、アシル及びリンカー基は、上で規定したとおりであり、Actは、N-ヒドロキシスクシンイミド(OSu)や1-ヒドロキシベンゾトリアゾール等の、活性エステルの脱離基であり、
アシル部分のアシル及びリンカー部分内のカルボン酸は、tert-ブチルエステルとして保護されている。
【０２６５】
一般式IIIの化合物は、当業者に知られている固相ペプチド合成の分野の手順を使用して、固体支持体上に合成することができる。
【０２６６】
そうした一手順は、Fmoc保護されたアミノ酸のポリスチレン2-クロロトリチルクロリド樹脂への付着を含む。付着は、トリエチルアミンやN,N-ジイソプロピルエチルアミンのような第三級アミンの存在下で、遊離のN保護されたアミノ酸を使用して実現することができる(以下の参照文献を参照されたい)。このアミノ酸のC末端(樹脂に結合している)は、本発明の親インスリンに結合される合成配列の末端になる。
【０２６７】
Fmocアミノ酸を樹脂に付着させた後、たとえば、ピペリジンやジエチルアミンのような第二級アミンを使用してFmoc基を脱保護してから、別の(又は同じ)Fmoc保護されたアミノ酸を結合させ、脱保護する。合成配列は、ヘキサデカン二酸、ペンタデカン二酸、又はテトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステルのような、tert-ブチルで単一保護された脂肪(α、ω)二酸を結合させて終端させる。
【０２６８】
樹脂からの化合物の切断は、0.5〜5%TFA/DCM(ジクロロメタン中トリフルオロ酢酸)、酢酸(たとえば、DCM中10%、又はHOAc/トリフルオロエタノール/DCM 1:1:8)、DCM中ヘキサフルオロイソプロパノールのような希酸を使用して実現される(たとえば、F.Z. Dorwald: Organic Synthesis on Solid Phase、Wiley-VCH 2000、ISBN 3-527-29950-5; N. Sewald & H.D. Jakubke: Peptides: Chemistry and Biology、Wiley-VCH、2002、ISBN 3-527-30405-3;又はThe Combinatorial Cheemistry Catalog、1999、Novabiochem AG、及びこれらの中で引用されている参照文献を参照されたい)。これにより、化合物中にカルボン酸保護基として存在するtert-ブチルエステルは、確実に脱保護されない。
【０２６９】
最後に、(樹脂から遊離した)C末端カルボキシ基を、たとえば、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として活性化させる。この活性化エステルを、たとえば、無希釈TFAを使用して脱保護し、そのまま、又は精製(結晶化)後に、本発明の親インスリンに取り付ける際の結合試薬として使用する。この手順を以下で説明する。
【０２７０】
固相上でアシル化試薬を合成する一般手順の実例:
テトラデカンジオイル-4×gGlu-OSu(化学式4)の合成
【０２７１】
【化４】
0006580583.tif 000005
【０２７２】
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.5mmol/g(15.79g、23.69mmol)を、無水ジクロロメタン(150mL)中に20分間放置して膨潤させた。Fmoc-Glu-OtBu(6.72g、15.79mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(10.46mL、60.01mmol)を無水ジクロロメタン(120mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を16時間振盪した。樹脂を濾別し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.5mL、31.59mmol)のメタノール/ジクロロメタン混合物(9:1、150mL、5min)溶液で処理した。次いで、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。
【０２７３】
N,N-ジメチルホルムアミド中20%ピペリジンで処理して(2×150mL、1×5min、1×20min)、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。Fmoc-Glu-OtBu(10.08g、23.69mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、8.42g、23.69mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.43mL、42.64mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(120mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を16時間振盪した。樹脂を濾別し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.5mL、31.59mmol)のメタノール/ジクロロメタン混合物(9:1、150mL、5min)溶液で処理した。次いで、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。
【０２７４】
N,N-ジメチル-ホルムアミド中20%ピペリジンで処理して(2×150mL、1×5min、1×20min)、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチル-ホルムアミド(2×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。Fmoc-Glu-OtBu(10.08g、23.69mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、8.42g、23.69mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.43mL、42.64mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(120mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を16時間振盪した。樹脂を濾別し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.5mL、31.59mmol)のメタノール/ジクロロメタン混合物(9:1、150mL、5min)溶液で処理した。次いで、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。
【０２７５】
N,N-ジメチルホルムアミド中20%ピペリジンで処理して(2×150mL、1×5min、1×20min)、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。Fmoc-Glu-OtBu(10.08g、23.69mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、8.42g、23.69mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.43mL、42.64mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(120mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を16時間振盪した。樹脂を濾別し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(5.5mL、31.59mmol)のメタノール/ジクロロメタン混合物(9:1、150mL、5min)溶液で処理した。次いで、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。
【０２７６】
N,N-ジメチルホルムアミド中20%ピペリジンで処理して(2×150mL、1×5min、1×20min)、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、2-プロパノール(2×150mL)、ジクロロメタン(2×150mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)で洗浄した。テトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(7.45g、23.69mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、8.42g、23.69mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(7.43mL、42.64mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(40mL)とジクロロメタン(80mL)の混合物に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を16時間振盪した。樹脂を濾別し、ジクロロメタン(2×150mL)、N,N-ジメチルホルムアミド(2×150mL)、メタノール(2×150mL)、及びジクロロメタン(10×150mL)で洗浄した。
【０２７７】
トリフルオロエタノール(150mL)で終夜処理することにより、樹脂から生成物を切断した。樹脂を濾別し、ジクロロメタン(3×100mL)で洗浄した。減圧下で溶媒を除去した。残渣をシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー(勾配溶離  ジクロロメタン/メタノール  100:0〜95:5)によって精製して、表題化合物を白色の固体として得た。
【０２７８】
生成物を真空乾燥して、(S)-2-((S)-4-tert-ブトキシカルボニル-4-{(S)-4-tert-ブトキシカルボニル-4-[(S)-4-tert-ブトキシカルボニル-4-(13-tert-ブトキシカルボニル-トリデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-ブチリルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステルを得た。
収率:14.77g(89%)。
【０２７９】
【数１】
0006580583.tif 000006
【０２８０】
得られた、tert-ブチル保護されたテトラデカンジオイル-4×gGlu-OH((S)-2-((S)-4-tert-ブトキシカルボニル-4-{(S)-4-tert-ブトキシカルボニル-4-[(S)-4-tert-ブトキシカルボニル-4-(13-tert-ブトキシカルボニル-トリデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-ブチリルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル)を、テトラヒドロフランに溶解させた。DIPEAを加えた後、アセトニトリルに溶解させたTSTUを加えた。反応混合物を3時間撹拌し、次いで真空中で蒸発にかけ、酢酸エチルに溶解し直し、0.1M HCl(水溶液)で洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発にかけた。LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1174.7(M+Na+)。計算値:1175.4。
【０２８１】
保護し、OSuとして活性化させた化合物を、10mLのTFAに溶解させ、室温で終夜撹拌した。ジエチルエーテルを加え、精製した沈殿を濾別し、終夜真空乾燥して、(S)-2-((S)-4-カルボキシ-4-{(S)-4-カルボキシ-4-[(S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシ-トリデカノイルアミノ)-ブチリルアミノ]-ブチリルアミノ}-ブチリルアミノ)-ペンタン二酸5-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イル)エステル(テトラデカンジオイル-4×gGlu-OSu)を得た。LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=872.2(M+H+)。計算値:871.9。
【０２８２】
固相上でアシル化試薬を合成する一般手順の実例:
テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-OSu(化学式5)の合成
【０２８３】
【化５】
0006580583.tif 000007
【０２８４】
13-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-トリデカン酸tert-ブチルエステル
2-クロロトリチル樹脂100〜200メッシュ1.7mmol/g(79.8g、135.6mmol)を、無水ジクロロメタン(450mL)中に20分間放置して膨潤させた。{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、34.9g、90.4mmol)及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(59.9mL、343,6mmol)を無水ジクロロメタン(100mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を4時間振盪した。樹脂を濾別し、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(31.5mL、180.8mmol)のメタノール/ジクロロメタン混合物(4:1、150mL、2×5min)溶液で処理した。次いで、樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(2×300mL)、ジクロロメタン(2×300mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×300mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド中20%ピペリジンで処理(1×5min、1×30min、2×300mL)して、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×300mL)、2-プロパノール(2×300mL)、及びジクロロメタン(350mL、2×300mL)で洗浄した。
【０２８５】
{2-[2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-エトキシ]-エトキシ}-酢酸(Fmoc-OEG-OH、52.3g、135.6mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、48.2g、135.6mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(42.5mL、244.1mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(250mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を2時間振盪した。ニンヒドリン試験が依然として陽性であったため、樹脂を濾過し、同量の試薬でもう30分間処理した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×300mL)、ジクロロメタン(2×300mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(3×300mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド中20%ピペリジンで処理(1×5min、1×30min、2×300mL)して、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×300mL)、2-プロパノール(2×300mL)、及びジクロロメタン(350mL、2×300mL)で洗浄した。
【０２８６】
(S)-2-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニルアミノ)-ペンタン二酸1-tert-ブチルエステル(Fmoc-LGlu-OtBu、57.7g、135.6mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、48.2g、135.6mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(42.5mL、244.1mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(250mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を1時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(2×300mL)、ジクロロメタン(2×300mL)、及びN,N-ジメチルホルムアミド(2×300mL)で洗浄した。ジメチルホルムアミド中20%ピペリジンで処理(1×5min、1×30min、2×300mL)して、Fmoc基を除去した。樹脂をN,N-ジメチルホルムアミド(3×300mL)、2-プロパノール(2×300mL)、及びジクロロメタン(350mL、2×300mL)で洗浄した。
【０２８７】
テトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル(C14(OtBu)-OH、42.7g、135.6mmol)、O-(6-クロロ-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(TCTU、48.2g、135.6mmol)、及びN,N-ジイソプロピルエチルアミン(42.5mL、244.1mmol)をジクロロメタン/N,N-ジメチルホルムアミド混合物(4:1、300mL)に溶かした溶液を樹脂に加え、混合物を1.5時間振盪した。樹脂を濾過し、N,N-ジメチルホルムアミド(6×300mL)、ジクロロメタン(4×300mL)、メタノール(4×300mL)、及びジクロロメタン(7×600mL)で洗浄した。2,2,2-トリフルオロエタノール(600mL)で18時間処理することにより、樹脂から生成物を切断した。樹脂を濾別し、ジクロロメタン(4×300mL)、ジクロロメタン/2-プロパノール混合物(1:1、4×300mL)、2-プロパノール(2×300mL)、及びジクロロメタン(6×300mL)で洗浄した。溶液を合わせ、溶媒を蒸発させ、粗生成物をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル60A、0.060〜0.200mm、溶離液:ジクロロメタン/メタノール  1:0〜9:1)によって精製した。
【０２８８】
純粋な13-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-トリデカン酸tert-ブチルエステルが、真空乾燥され、橙色の油状物として得られた。
収率:55.2g(77%)。
RF(SiO2、ジクロロメタン/メタノール  9:1):0.35。
【０２８９】
【数２】
0006580583.tif 000008
【０２９０】
13-{(S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-[2-(2-{[2-(2-カルボキシメトキシ-エトキシ)-エチルカルバモイル]-メトキシ}-エトキシ)-エチルカルバモイル]-プロピルカルバモイル}-トリデカン酸tert-ブチルエステル(テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-OH、8.89g、11,3mmol))を、100mLのアセトニトリルに溶解させ、撹拌した溶液にTSTU(4.07g、13.5mmol)及びDIPEA(2.35mL、13.5mmol)を加え、混合物を室温で1時間撹拌した。溶媒を蒸発にかけ、残渣をジクロロメタンに溶解させ、0.05M HClで2回洗浄した。
【０２９１】
有機相を乾燥させ(MgSO4)、真空中で蒸発させた。これによって、9.98g(100%)の13-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-トリデカン酸tert-ブチルエステルが油状物として得られた。
【０２９２】
13-((S)-1-tert-ブトキシカルボニル-3-{2-[2-({2-[2-(2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルオキシカルボニルメトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-メトキシ)-エトキシ]-エチルカルバモイル}-プロピルカルバモイル)-トリデカン酸tert-ブチルエステル(4g)をトリフルオロ酢酸(10mL)に溶解させ、混合物を室温で1時間撹拌し、真空中で蒸発にかけた。残渣をジクロロメタン(10mL)に溶解させ、真空中で蒸発にかけた。冷ジエチルエーテル(10mL)を加えると、油脂状の白色固体が沈殿した。デカントしてこれを単離し、真空乾燥した。これによって、3.4g(定量的)の14-[[(1S)-1-カルボキシ-4-[2-[2-[2-[2-[2-[2-(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ-2-オキソエトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-2-オキソエトキシ]エトキシ]エチルアミノ]-4-オキソブチル]アミノ]-14-オキソテトラデカン酸(テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG-OSu)が得られ、これを-18℃で保管した。
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=775,33、計算値:774,8。
【０２９３】
インスリン誘導体のアシル化及び精製
本発明のインスリン誘導体のアシル化及び精製の一般手順(A)を以下の実施例1に記載する。この手順は、以下の実施例2〜25化合物の合成にも適用されている。こうした誘導体の一部については、他の方法を使用する精製(上述のとおり)も行っている。
【０２９４】
(実施例1)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０２９５】
【化６】
0006580583.tif 000009
【０２９６】
A22K、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン(2.0g)を40mLの0.1M Na2CO3(水溶液)に溶解させ、1M NaOH(水溶液)でpHを11.2に調整した。テトラデカンジオイル-4×gGlu-OSu(0.454g)を2mLのDMFに溶解させ、1M NaOH(水溶液)でpHを絶えず11.2に保ちながら、インスリン溶液に滴下した。反応混合物を室温で30分間撹拌し、次いで、0.1M HCl(水溶液)を使用してpH=7.5に中和し、1:1のEtOH/milliQ水で希釈した。
【０２９７】
得られるインスリンを、15mMトリス中25〜500mMの酢酸アンモニウム、50v/v%エタノール、pH7.5(酢酸)を溶離液とするPoros50HQ 74mLカラムでの陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製した。純粋画分の脱塩は、勾配をかけた0.1%トリフルオロ酢酸含有milliQ水中アセトニトリルを溶離液として逆相カラムで行った。得られる純粋なインスリンを凍結乾燥した。LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1629.98(M+4)/4。計算値:1630.65。
【０２９８】
アシル化試薬であるテトラデカンジオイル-4×gGlu-OSuは、上述のとおりに合成した。
【０２９９】
(実施例2)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３００】
【化７】
0006580583.tif 000010
【０３０１】
この類似体は、実施例1に記載の方法に従って調製した。LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1633.9(M+4H+)。計算値:1634.4
【０３０２】
(実施例3)
一般手順(A)
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluA14,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)-ブタノイル]-アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３０３】
【化８】
0006580583.tif 000011
【０３０４】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1622.2(M+4)/4。計算値:1622.1
【０３０５】
(実施例4)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-Lys,(B)-ペプチド
【０３０６】
【化９】
0006580583.tif 000012
【０３０７】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1641.2(M+4H+)。計算値:1641.4。
【０３０８】
(実施例5)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３０９】
【化１０】
0006580583.tif 000013
【０３１０】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1616.6(M+4)/4。計算値:1617.1
【０３１１】
(実施例6)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３１２】
【化１１】
0006580583.tif 000014
【０３１３】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1749.9(M+4)/4。計算値:1750.3
【０３１４】
(実施例7)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GlnB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３１５】
【化１２】
0006580583.tif 000015
【０３１６】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1634.2(M+4)/4。計算値:1633.1
【０３１７】
(実施例8)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GlnB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３１８】
【化１３】
0006580583.tif 000016
【０３１９】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1616.6(M+4)/4。計算値:1615.8.
【０３２０】
(実施例9)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GlnB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３２１】
【化１４】
0006580583.tif 000017
【０３２２】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1749.8(M+4)/4。計算値:1748.5
【０３２３】
(実施例10)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３２４】
【化１５】
0006580583.tif 000018
【０３２５】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1565.6(M+4)/4。計算値:1566.1
【０３２６】
(実施例11)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-Lys,(B)-ペプチド
【０３２７】
【化１６】
0006580583.tif 000019
【０３２８】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1637.4(M+4)/4。計算値:1636.6
【０３２９】
(実施例12)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３３０】
【化１７】
0006580583.tif 000020
【０３３１】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1613.2(M+4)/4。計算値:1613.4
【０３３２】
(実施例13)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-3×(gGlu-OEG)-gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３３３】
【化１８】
0006580583.tif 000021
【０３３４】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1746.4(M+4)/4。計算値:1746.5。
【０３３５】
(実施例14)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３３６】
【化１９】
0006580583.tif 000022
【０３３７】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1533.2(M+4)/4。計算値:1533.8
【０３３８】
(実施例15)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３３９】
【化２０】
0006580583.tif 000023
【０３４０】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1610.7(M+4)/4。計算値:1610.1
【０３４１】
(実施例16)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GlnB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３４２】
【化２１】
0006580583.tif 000024
【０３４３】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1609.7(M+4)/4。計算値:1609.9
【０３４４】
(実施例17)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３４５】
【化２２】
0006580583.tif 000025
【０３４６】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1606.3(M+4)/4。計算値:1606.4
【０３４７】
(実施例18)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-4×gGlu)、B3Q、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GlnB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(15-カルボキシペンタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３４８】
【化２３】
0006580583.tif 000026
【０３４９】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1640.9(M+4)/4。計算値:1641.1
【０３５０】
(実施例19)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-ペンタデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(14-カルボキシテトラデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３５１】
【化２４】
0006580583.tif 000027
【０３５２】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1637.63(M+4)/4。計算値:1636.76
【０３５３】
(実施例20)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３５４】
【化２５】
0006580583.tif 000028
【０３５５】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1703.0(M+4)/4。計算値:1703.2
【０３５６】
(実施例21)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]Lys,(B)-ペプチド
【０３５７】
【化２６】
0006580583.tif 000029
【０３５８】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1706.6(M+4)/4。計算値:1707.0
【０３５９】
(実施例22)
一般手順(A)
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluA14,GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-Lys,(B)-ペプチド
【０３６０】
【化２７】
0006580583.tif 000030
【０３６１】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1601.9(M+4)/4。計算値:1601.6
【０３６２】
(実施例23)
一般手順(A)
A14E、A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-4×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluA14,GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３６３】
【化２８】
0006580583.tif 000031
【０３６４】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1625.9(M+4)/4。計算値:1625.8
【０３６５】
(実施例24)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-2×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３６６】
【化２９】
0006580583.tif 000032
【０３６７】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1537.7(M+4)/4。計算値:1537.5
【０３６８】
(実施例25)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３６９】
【化３０】
0006580583.tif 000033
【０３７０】
LC-MS(エレクトロスプレー):m/z=1537.7(M+4)/4。計算値:1537.5
【０３７１】
(実施例26)
一般手順(A)
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-3×gGlu)、B3E、desB27、B29R、desB30ヒトインスリン;
IUPAC(OpenEye社、IUPAC style)名: N{アルファ}([GluB3,ArgB29],desThrB27,ThrB30-インスリン(ヒト)-(A)-ペプチジル)-N{イプシロン}[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(13-カルボキシトリデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]Lys,(B)-ペプチド
【０３７２】
【化３１】
0006580583.tif 000034
【０３７３】
この類似体は、実施例1に記載の方法に従って調製することができる。
【０３７４】
(実施例27)
可溶化された受容体で測定した、選択された本発明のインスリン誘導体のインスリン受容体親和性
本発明のインスリン類似体のヒトインスリン受容体(IR)に対する相対的な結合親和性を、シンチレーション近接検定(SPA)における競合結合によって明らかにする(Glendorf Tら(2008) Biochemistry 47 4743〜4751に従う)。
【０３７５】
簡潔に述べると、96ウェルOptiplates(Perkin-Elmer Life Sciences社)においてヒトインスリン標準物質及び試験されるインスリン類似体の連続希釈を行った後、[125I-A14Y]-ヒトインスリン、抗IRマウス抗体83-7、可溶化されたヒトIR-A(IR-Aホロ受容体を過剰発現するベビーハムスター腎臓(BHK)細胞から、コムギ胚芽凝集素クロマトグラフィーによって半精製したもの)、及びSPAビーズ(抗マウスポリビニルトルエンSPAビーズ、GE Healthcare社)を含んだ、100mMのHEPES(pH7.8)、100mMのNaCl、10mMのMgSO4、及び0.025%(v/v)のTween 20からなる結合緩衝液を加える。プレートを穏やかに振盪しながら22℃で22〜24時間インキュベートし、2000rpmで2分間遠心分離し、TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences社)で計数する。
【０３７６】
SPAからのデータを、4パラメータロジスティックモデルに従って分析し(Volund A (1978) Biometrics 34 357〜365)、類似体の結合親和性を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準物質の結合親和性を基準として算出した。
【０３７７】
より生理的な条件を模倣するために、結合緩衝液が1.5%のHSA(w/v)(Sigma A1887)を含有する同類のアッセイも使用した。
【０３７８】
選択された本発明のインスリン類似体のインスリン受容体親和性及び他のin vitroデータを、以下のTable 1(表1)に示す。
【０３７９】
(実施例28)
膜結合型受容体で測定した、選択された本発明のインスリン誘導体のインスリン受容体及びインスリン様成長因子1受容体親和性
ヒトIR-A、IR-B、又はIGF-IRいずれかの挿入断片を収容するpZem219Bベクターを堅固に形質移入したBHK細胞から、膜結合型ヒトIR及びIGF-1Rを精製する。BHK細胞を収穫し、氷冷緩衝液(25mMのHEPES pH7.4、25mMのCaCl2、及び1mMのMgCl2、250mg/Lのバシトラシン、0.1mMのPefablock)中でホモジナイズする。ホモジネートを41%(w/v)スクロースクッションに層状に重ね、4℃で75分間、95000gで遠心分離する。形質膜を集め、緩衝液(上記のとおり)で1:5希釈し、4℃で45分間、40000gで再び遠心分離する。ペレットを最小体積の緩衝液に再懸濁し、針(サイズ23)で3回抜き差ししてから、使用するまで-80℃で保管する。
【０３８０】
膜結合型ヒトIR-A、IR-B、又はIGF-1Rに対する相対的な結合親和性を、SPA設定における競合結合によって明らかにする。IR検定は、96ウェルOptiplates(Perkin-Elmer Life Sciences社)において二通りに実施する。50pMの[125I-A14Y]-ヒトインスリンを含有する総体積200μLの検定緩衝液(50mMのHEPES、150mMのNaCl、5mMのMgSO4、0.01%のTriton X-100、0.1%(w/v)のHSA(Sigma A1887)、完全無EDTAプロテアーゼ阻害剤)、50μgのコムギ胚芽凝集素(WGA)コートされたPVTマイクロスフェア(GE Healthcare社)、及び漸増する濃度のリガンドと共に、膜タンパク質を、穏やかに撹拌しながら25℃で150分間インキュベートする。プレートを2000rpmで2分間遠心分離して検定を終了させ、TopCount NXT(Perkin-Elmer Life Sciences社)での計数によって結合放射活性を定量化する。
【０３８１】
IGF-1R検定は、膜結合型IGF-1R及び50pMの[125I-Tyr31]-ヒトIGF-1を用いたことを除き、本質的にIR結合検定についてのとおりに実施する。SPAからのデータを、4パラメータロジスティックモデルに従って分析し(Volund A (1978) Biometrics 34 357〜365)、試験される類似体の結合親和性を、同じプレート内で測定したヒトインスリン標準物質の結合親和性を基準として算出する。
【０３８２】
選択された本発明のインスリン類似体のIR(Aイソ型)及びIGF-1R結合データを以下のTable 1(表1)に示す。
【０３８３】
【表１Ａ】
0006580583.tif 000035
【０３８４】
【表１Ｂ】
0006580583.tif 000036
【０３８５】
(実施例29)
SEC-HPLC希釈によって分析した単量体-二量体平衡
SEC-HPLC(サイズ排除HPLC)を用いた一続きの希釈を行って、無亜鉛インスリンの単量体-二量体平衡を評価した。0.6mMの試験されるインスリン類似体を様々な体積(2.5〜80μL)でSuperose 12 10/300 GLカラムに注入し、140mMのNaCl、10mMのTris pH7.7を用い、0.8mL/minの流量で溶離させることにより、サンプルは、事実上注入体積に比例して希釈される。希釈に応じた保持時間の変化に基づき、2つのパラメータ、すなわち、分子量の増加(Mw増加)及びR傾斜を算出した。
【０３８６】
R傾斜は、log(注入体積)に対する保持時間のプロットの傾きとして導き、Mw増加は、基準サンプル一式を用い、最低注入体積と最高注入体積の間の見かけの分子量増加として算出した。どちらのパラメータにも、インスリン類似体が希釈に応じて解離する傾向、すなわち、皮下注射後に単量体への急速な解離が実現される潜在的可能性が反映されている。
【０３８７】
こうした判定及び先行技術のインスリン類似体の判定の結果を、以下のTables 2(表2)〜4(表4)に示す。
【０３８８】
【表２】
0006580583.tif 000037
【０３８９】
【表３】
0006580583.tif 000038
【０３９０】
示されている実施例番号は、既知で、先行技術(たとえば、WO2007/096431)に記載されている、B27Thr残基の欠失(desB27)のないA22Kアシル化類似体である。
【０３９１】
【表４】
0006580583.tif 000039
【０３９２】
示されている実施例番号は、既知で、先行技術(たとえば、WO2007/096431)に記載されている、B27Thr残基の欠失(desB27)のないA22Kアシル化類似体である。
【０３９３】
結論
desB27類似体である、本発明のA22Kアシル化インスリンは、先行技術の(B27Thr残基の欠失のない)同様のA22Kアシル化類似体より、希釈に応じて解離する傾向がはるかに強く、したがって、食前のボーラス投与にはるかに有用であると結論付けることができる。更に、この検定における本発明のインスリンは、ヒトインスリン(食前インスリンとして使用されるが、作用プロファイルがインスリンアスパルトより緩慢である)より、インスリンアスパルト(NovoRapid(登録商標)又はNovoLog(登録商標)(Novo Nordisk社)として市販され、食前インスリンとして使用される)に似ていると結論付けることもでき、本発明の誘導体の特性が先行技術のものに比べて改善されていることが強調される。
【０３９４】
本発明の類似体はすべて、ヒトインスリン(R傾斜-0.65、Table 3(表3)を参照のこと)よりはるかに小さい負のR傾斜-0.13〜-0.02を有し(Table 2(表2))、したがってインスリンアスパルト(R傾斜-0.04、Table 3(表3))に似ている。対照的に、試験した先行技術の同様の類似体はすべて、ヒトインスリン(-0.52〜-0.78、Tables 3(表3)及び4(表4))に似通っているR傾斜を有する。その結果、本発明の類似体はすべて、先行技術の類似体より小さいMw増加を示した(それぞれ、10.7%以下対53〜83%(Tables 2(表2)、3(表3)、及び4(表4)を参照のこと)。
【０３９５】
これらのデータは、本発明の化合物が、先行技術の同様の類似体より単量体性であることを示している。この点において、本発明の化合物は、インスリンアスパルトに似ているのに対し、先行技術の類似体は、ヒトインスリンに似ている。
【０３９６】
(実施例30)
X線小角散乱(SAXS)によって測定した自己会合
SAXSデータを使用して、試験されるインスリン類似体の皮下注射後の自己会合状態を推定した。SAXSデータは、0.6mMの試験されるインスリン類似体及び140mMのNaClを含有するpH7.4の無Zn製剤から収集した。各類似体について、SAXS散乱プロファイルの強度に、多成分混合物中の個々の成分すべてが寄与するということを使用して、単量体、二量体、及びより大きい種の相対量を推定した。各成分からの強度(形状因子)を使用することにより、混合物中の各成分の体積分率寄与を推定することが可能である。非負又は制約なし最小二乗のアルゴリズムを使用する線形方程式の系を使用して、実験と計算による散乱曲線の相違を最小限に抑える。形状因子は、単量体、二量体、六量体等の結晶構造から計算する。体積分率は、百分率(%)で示す。
【０３９７】
平均分子量は、濃度がわかっている参照サンプルを使用し、分子質量の比が、測定された濃度に対して正規化された、零角での散乱強度I(0)の比と同一であることを想定して、見積もられる。
【０３９８】
本発明の誘導体及び先行技術の誘導体から得られた結果を、以下のTables 5(表5)、6(表6)、及び7(表7)に示す。
【０３９９】
【表５】
0006580583.tif 000040
【０４００】
【表６】
0006580583.tif 000041
【０４０１】
【表７】
0006580583.tif 000042
【０４０２】
これらの研究から、本発明の誘導体は、注射後の皮下組織の条件を模倣する条件において、先行技術の類似体より、単量体へと解離する傾向がはるかに強く、したがって、皮下注射後にはるかに速やかに吸収されると結論付けることができる。単量体含有量は、本発明の類似体では63〜83%の範囲であるのに対し、先行技術の類似体では0〜48%である。更に、先行技術の類似体については、観察される最も大きい分子種が、両方とも、大きさ(Rg及びDmax)がより大きいだけでなく、より多い量(本発明の類似体の1〜22%に対して42〜62%)で見出されると結論付けることもできる。これにより、先行技術の類似体に比べて、食前の使用についての本類似体の有用性が強調される。
【０４０３】
(実施例31)
医薬調製物の調製
本発明の医薬調製物は、水溶液として製剤することができる。水溶液は、たとえば、塩化ナトリウム及び/又はグリセロールを用いて等張性にすることができる。更に、水性媒質が、緩衝液及び保存剤を含有してもよい。調製物のpH値は、所望の値に調整され、当該インスリン類似体の等電点pIに応じて、約3〜約8.5の間、約3〜約5の間、又は約6.5、約7.4、若しくは約7.5とすることができる。
【０４０４】
無亜鉛インスリン製剤の調製
最終製剤中0.6mMのインスリン類似体、16mMのm-クレゾール、16mMのフェノール、7mMのリン酸二ナトリウム、適量のニコチンアミド及びグリセロールを含有する水溶液に、無亜鉛インスリン類似体を溶解させ、1N塩酸/1N NaOHを使用してpHを7.3〜7.5(室温で測定)に調整した。水を加えて最終体積とし、溶液を0.2μmフィルターで滅菌濾過した。製剤を2mlバイアルに充填し、クリンプキャップを使用して密封した。
【０４０５】
【表８】
0006580583.tif 000043
【０４０６】
(実施例32)
タンパク質製剤の物理的安定性を評価するためのThT原線維形成検定
ペプチドの物理的安定性が低いと、サンプル中に秩序だった糸状の高分子構造として認められ、最終的にはゲル形成をもたらす、アミロイド原線維の形成につながりかねない。Thioflavin T(ThT)は、原線維に結合すると、明瞭な蛍光サインを伴う[Naikiら(1989) Anal. Biochem. 177 244〜249、LeVine (1999) Methods. Enzymol. 309 274〜284]。
【０４０７】
部分的に折り畳まれたペプチド中間体の生成が、原線維形成の一般的な開始機序として提唱されている。ほんの少数のこうした中間体が核となって鋳型を形成し、それにさらなる中間体が寄り集まることもあり、原線維形成が進行する。ずれ時間は、臨界質量の核が構築される間の期間に相当し、見かけの速度定数は、原線維それ自体が形成される速度である(図1)。
【０４０８】
サンプル調製
サンプルは、各検定前に新たに調製した。各組成物のサンプルを、990:10の体積比でThT水溶液(0.1mM ThT)と混合し、96ウェルマイクロタイタープレート(Packard Opti-Plate(商標)-96、白色ポリスチレン)に移した。普通は、各サンプルの(1つの試験条件に対応する)4つ又は8つの複製を、1列のウェルに配置した。プレートをScotch 15 Pad(Qiagen社)で密閉した。
【０４０９】
インキュベーション及び蛍光測定
所与の温度でのインキュベーション、振盪、及びThT蛍光発光の測定を、Fluoroskan Ascent FL蛍光プレートリーダー又はVarioskanプレートリーダー(Thermo Labsystems社)において行った。温度は、37℃に調整した。オービタル振盪は、示した全データにおいて1mmの振幅で960rpmに調整した。蛍光測定は、444nmフィルターを介した励起及び485nmフィルターを介した発光測定を使用して行った。各行程を、プレートを検定温度で10分間インキュベートすることにより開始した。プレートを45時間まで20分毎に測定した。各測定の間に、プレートを記載したとおりに振盪及び加熱した。
【０４１０】
データ処理
蛍光対時間のプロットをMicrosoft Excelで作成し、図14A、図14B、及び図14C(それぞれ、実例1A、実例1B、及び実例1C)に例示するとおり、ずれ区間と細動区間の線形近似の切片として、ずれ時間を推定した。ずれ時間の増大は、物理的安定性の増大に相当する。データ点は、通常、4つ又は8つのサンプルの平均である。
【０４１１】
本発明のA22Kアシル化類似体について得られた結果、及びB27Thr残基の欠失(desB27)のない先行技術の同様のA22Kアシル化類似体の結果を、以下でTable 8(表9)に示す。
【０４１２】
【表９】
0006580583.tif 000044
【０４１３】
本発明のA22Kアシル化インスリン類似体は、ニコチンアミド添加と添加なしのどちらの無亜鉛製剤でも、原線維形成に対して、先行技術の同様の類似体より良好又は同様の安定性を示す(すなわち、物理的安定性が向上している)と結論付けられる。SAXS及びSEC-HPLC希釈データからは、本発明のインスリン類似体は、大きさがより小さい(すなわち、単量体及び二量体から構成される)ことが示唆され、当業者なら、物理的安定性がより低くなると予想することになるので、これは、非常に意外である。
【０４１４】
(実施例33)
インスリンの化学的安定性の分析
サイズ排除クロマトグラフィー
使用した製剤:実施例31を参照されたい。
高分子量タンパク質(HMWP)及び単量体インスリン類似体の定量を、Waters Acquity BEH200 SECカラム(150×2.4mm、部品番号186005225)において、55%(v/v)のアセトニトリル、0.05%のTFAを含有する溶離液を用い、0.2ml/minの流量及び40℃のカラム温度で行った。検出は、調整可能な吸光度検出器(Waters Acquity TUV)によって215nmで行った。注入体積は、600μMのインスリン類似体製剤と600μMのヒトインスリン標準物質のどちらも、1.5μlとした。各類似体調製物は、2mlバイアルにおいて、5、25、及び37℃でインキュベートした。所定の時間に、調製物のHMWP含有量を測定した。結果を以下の表9(表10)に示す。
【０４１５】
【表１０】
0006580583.tif 000045
【０４１６】
37℃での無亜鉛製剤としての保管による高分子量タンパク質(HMWP)の生成は、本発明のインスリン誘導体でははるかに少ない(実施例2、4、及び7のインスリンについて、それぞれ、8週間保管後に6.8%以下のHMWPの生成)のに対し、先行技術の同様のインスリン誘導体では、HMWP生成が29.1%になると結論付けられる。更に、本発明のインスリン誘導体は、37℃で保管したとき、無亜鉛製剤として、ニコチンアミド存在下でも、HMWPの生成が低レベルであると結論付けられる。
【０４１７】
逆相クロマトグラフィー(UPLC)
インスリン関連不純物の定量を、Phenomenex Kinetex C18カラム、サイズ2.1×150mm、粒径1.7μm、及び孔径100Å(Phenomenex社部品番号00F-4475-AN)を使用するUPLC系において、0.3ml/minの流量、50℃で、215nmでのUV検出を用いて行った。溶離は、A:10%(v/v)のアセトニトリル、0.09Mのリン酸水素二アンモニウム、pH3.6、及びB:80%(v/v)のアセトニトリルからなる移動相、0〜7分は15%のBから26%のBへの線形変化、7〜34分は40%のBへの線形変化、34〜36分は80%のBへと線形変化してカラム洗浄の後、39分に15%のBの初期条件に復帰という勾配を用いて行った。不純物の量は、測定された吸光度域として、保存剤が溶離された後に求められた総吸光度域に対するパーセントにして求めた。各類似体調製物は、2mlバイアルにおいて、5、25、及び37℃でインキュベートした。所定の時間に、調製物のインスリン関連不純物を測定した。結果を以下の表10(表11)に示す。
【０４１８】
【表１１】
0006580583.tif 000046
【０４１９】
本発明のインスリン誘導体は、亜鉛なしの製剤中で、先行技術の同様のA22Kアシル化類似体よりはるかに安定していると結論付けられる。先行技術の類似体は、不安定である結果、37℃で8週間の保管後、5%未満(84%ポイントの純度損失に相当する)の誘導体しか無傷でない。(実施例2、4、及び7の化合物に代表される)本発明のインスリン類似体は、37℃で8週間保管後の純度損失が、それぞれ、7.7、5.5、及び15%ポイント未満である。更に、本発明のインスリン誘導体は、ニコチンアミドが添加された無亜鉛製剤中でも安定していると結論付けられる。
【０４２０】
(実施例34)
LYDブタにおける皮下PK/PDプロファイル
本発明のインスリン誘導体は、たとえば、市販製剤としてのインスリンアスパルト(NovoRapid)と比較する、又はこのプロトコールに従う先行技術の同様のA22Kアシル化インスリン類似体と比較する、ブタへの皮下投与によって試験することができる。誘導体は、薬動学的及び/又は薬力学的パラメータについて試験することができる。
【０４２１】
使用した一般法
超音波検査及び注射場所の作製
永久静脈カテーテルを設置するための麻酔の間、Esaote社の超音波走査装置モデル「MyLabFive」及び線形プローブ型「LA435 6-18 MHz」を用い、超音波によってブタを検査する。右側又は左側(カテーテルの反対側)の耳と肩甲骨の中間の頸部、すなわち、下に筋肉のない(皮下注射に適する)2×2cmの範囲を特定し、入れ墨で印を付ける。
【０４２２】
給餌スケジュール
ブタは、実験前に絶食させる(朝食なし)。
【０４２３】
ブタは、全実験の間、その通常の畜舎に入れ、麻酔をしない。12時間の血液サンプルを収集するまで、ブタを絶食させるが、水は自由に与える。12時間の血液サンプルの後、ブタに食物及びリンゴを与える。
【０４２４】
投薬
PenfillをNovoPen(登録商標)4に取り付ける。それぞれのブタに新しい針を使用する。針ストッパーを使用して、表皮の5mm下への最大皮下貫通を確実にする。用量体積(IU体積)を計算し、それぞれのブタについて書き留める。
用量体積(U)=((体重×用量nmol/kg)/濃度nmol/mL)×100U/mL
ブタには、頸部の右側又は左側(カテーテルの反対側)において、横から皮下組織に投薬を行い、注射した後最低10秒間は針を皮下組織に入れたままにして、化合物の沈着を確実にする。
【０４２５】
低血糖の治療
皮下投与後、低血糖を予防するために、グルコース溶液の静脈内注射の準備ができているべきであり、すなわち、4〜5本の注射器(20mL)に、使用できる状態の滅菌20%グルコースが充填される。低血糖の診断は、臨床症状及び糖測定器(Glucocard X-meter)での血中グルコース測定に基づく。
【０４２６】
治療は、50〜100mlの20%グルコース(10〜20gのグルコース)の緩慢な静脈内注射からなる。グルコースは、効くまで5〜10分かけて少量ずつ与える。
【０４２７】
血液サンプル採取
実験前に、10IU/mLのヘパリン添加なしの滅菌0.9%NaClで、頸静脈カテーテルの開通性を点検する。
【０４２８】
投薬の前後に、畜舎において、次の時点で、血液サンプルを中心静脈カテーテルから採取する:
投薬前(-10、0)、3、6、9、12、15、20、30、45、60、90、120、150、180、240、300、360、420、480、540、600、720分
【０４２９】
サンプルは、3方ストップコックで採取する。4〜5mlの廃棄血液を抜き取り、廃棄した後、サンプルを採取する。
【０４３０】
グルコース及びインスリン分析用に、0.8mlの血液サンプルを、EDTAコートされたチューブに収集する。
【０４３１】
各血液サンプル採取後に、10IU/mLのヘパリン添加なしの滅菌0.9%NaCl 5mlをカテーテルに流す。
【０４３２】
チューブを最低でも10回穏やかに傾けて、血液と抗凝血剤(EDTA)の十分な混合を確実にし、1分後に湿氷上に置く。サンプル採取後1時間以内に、チューブを4℃で10分間、3000rpmで回転させる。サンプルは、ピペットで移すまで、湿氷上で保管する。
【０４３３】
凝固のリスクの増大を伴うカテーテル中での細菌生育を回避するために、無菌技術が必要とされる。
【０４３４】
実験後のカテーテルの閉鎖
無菌技術を使用して血液サンプル採取を行っていなかった場合、10kgあたり1mlのPentrexyl(登録商標)(1gのアンピシリンが10mlの0.9%NaClに溶解したもの)での1回の静脈内処置を、血液サンプル採取に使用していたカテーテルからゆっくりと静脈内投与することができる。この処置に続いて、カテーテルに10mlの0.9%NaClを流す。
【０４３５】
カテーテルに、ヘパリン(10IU/mL)が添加された5mlの滅菌0.9%NaClを流す。ラテックス注入膜を備えた新しいルアーロックを用いてカテーテルを閉じ、1.0mlのTauroLockHep500をカテーテルの止め具として膜から注入する。
【０４３６】
血液サンプルの分析
血漿グルコース:10ulの血漿を500ulの緩衝溶液にピペットで移して、BIOSEN自動分析装置で血漿中のグルコース濃度を測定する。
【０４３７】
血漿インスリン:1×50μlの血漿を0.65mlのMicronic(登録商標)チューブ(ELISA/LOCI/SPA装備)にピペットで移して、ELISA又はLC-MSを使用して分析する。
【０４３８】
血漿は、-20℃で凍結させて保管する。
【０４３９】
(実施例35)
LYDブタにおける実施例1のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル
上記一般手順に従って、実施例1のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４４０】
使用した製剤
実施例1のインスリン誘導体、pH=7.4、609μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;30mMのフェノール(無Zn/六量体)
【０４４１】
インスリンアスパルト、市販の製剤、600μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;7mMのリン酸塩;10mMの塩化ナトリウム;300μMの酢酸亜鉛;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール
【０４４２】
これらの測定の結果を、添付の図1〜図4、及び以下のTable 11(表12)に示す。
【０４４３】
【表１２】
0006580583.tif 000047
【０４４４】
結論
亜鉛なしの製剤にした実施例1のインスリン誘導体は、PK/PDプロファイルがインスリンアスパルト(NovoRapid(登録商標))市販製剤と非常に似通っていると結論付けられる。更に、このインスリン誘導体の平均滞留時間は、165分であった。実施例1のインスリン誘導体は、速効型(食前)インスリンとして有用であると結論付けることができる。
【０４４５】
(実施例36)
LYDブタにおける実施例2のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル
上記一般手順に従って、実施例2のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４４６】
使用した製剤
実施例2のインスリン誘導体、pH=7.367、607μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;30mMのフェノール(0 Zn/六量体)
【０４４７】
インスリンアスパルト、市販の製剤、600μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;7mMのリン酸塩;10mMの塩化ナトリウム;300μMの酢酸亜鉛;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール
【０４４８】
これらの測定の結果を、添付の図4〜図5、及び以下のTable 12(表13)に示す。
【０４４９】
【表１３】
0006580583.tif 000048
【０４５０】
結論
亜鉛なしの製剤にした実施例2のインスリン誘導体は、PK/PDプロファイルがインスリンアスパルトと非常に似通っていると結論付けられる。更に、このインスリン誘導体の平均滞留時間は、NovoRapid(登録商標)(インスリンアスパルト)と実質的に違わない111分であった。実施例2のインスリン誘導体は、速効型(食前)インスリンとして有用であると結論付けることができる。
【０４５１】
(実施例37)
LYDブタにおける実施例11のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル
上記一般手順に従って、実施例11のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４５２】
使用した製剤
実施例11のインスリン誘導体、pH=7.44、689μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;30mMのフェノール(無Zn/六量体)
【０４５３】
これらの測定の結果を、添付の図6〜図7、及び以下のTable 13(表14)に示す。
【０４５４】
図6及び図7には、6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された実施例11のインスリン(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)、及び結果として生じる血漿グルコースの変化をそれぞれ示す。1nmol/kg
【０４５５】
【表１４】
0006580583.tif 000049
【０４５６】
亜鉛なしの製剤にした実施例11のインスリン誘導体は、食前インスリンとして適格であるPKプロファイルを有すると結論付けられる。更に、このインスリン誘導体の平均滞留時間は、同様の(同じく)1,16-ヘキサデカン二酸を含有する先行技術のインスリン誘導体、A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013、実施例45、MRT=1287分)について得られたプロファイルより実質的に短い、334分であった。以下を参照されたい。実施例11のインスリン誘導体は、速効型(食前)インスリンとして有用であると結論付けることができる。
【０４５７】
(実施例38)
LYDブタにおける実施例4のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル
上記一般手順に従って、実施例4のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４５８】
使用した製剤
実施例4のインスリン誘導体、pH=7.43、621μM;1.8%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;10mMの塩化ナトリウム(無Zn/六量体)
【０４５９】
これらの測定の結果を、添付の図8〜図9、及び以下のTable 14(表15)に示す。
【０４６０】
【表１５】
0006580583.tif 000050
【０４６１】
亜鉛なしの製剤にした実施例4のインスリン誘導体は、食前インスリンとして適格であるPKプロファイルを有すると結論付けられる。更に、このインスリン誘導体の平均滞留時間は、同様の1,16-ヘキサデカン二酸を含有する先行技術のインスリン誘導体、A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013、実施例45、MRT=1287分)について得られたプロファイルより実質的に短い、160分であった。以下を参照されたい。実施例4のインスリン誘導体は、速効型(食前)インスリンとして有用であると結論付けることができる。
【０４６２】
(実施例39)
LYDブタにおける先行技術のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル
上記一般手順に従って、先行技術のインスリン誘導体、A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013、実施例45)について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４６３】
使用した製剤
WO2009/022013実施例45の化合物、588μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;30mMのフェノール;7mMのトリス、pH=7.4(無Zn/六量体)、1nmol/kg
【０４６４】
これらの測定の結果を、添付の図10〜図11、及び以下のTable 15(表16)に示す。
【０４６５】
図10及び図11には、6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された、先行技術のインスリン誘導体、すなわち、A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013、実施例45)(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)、及び結果として生じる血漿グルコースの変化をそれぞれ示す(1nmol/kg)。
【０４６６】
【表１６】
0006580583.tif 000051
【０４６７】
亜鉛なしの製剤にした、先行技術WO2009/022013実施例45のインスリン誘導体は、可能性として、皮下貯留物の一部の吸収が遅れたことに起因する、長引くテーリングを伴うと結論付けられる。24時間(1440分)の時点でのこのインスリンの血漿濃度は、98pMである。更に、血中グルコース低下効果が延長されて、少なくとも8時間(480分)持続する。平均滞留時間は、ほぼ1日である1287分であった。このため、先行技術のこのインスリンは、食事前の使用に不適当となる。
【０４６８】
(実施例40)
LYDブタにおける先行技術のインスリン誘導体の近縁類似体の皮下PK/PDプロファイル
上記一般手順に従って、WO2009/022013に記載のとおりの先行技術(詳細には、実施例45(A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリンを参照されたい)を代表する、C14二酸類似体のA22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリンについて、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４６９】
使用した製剤
A22K(N(eps)-テトラデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013実施例45の1,16-ヘキサデカンジオイル(C16二酸)類似体の1,14-テトラデカンジオイル(C14二酸)類似体)、588μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;30mMのフェノール;7mMのトリス、pH=7.4(無Zn/六量体)
【０４７０】
これらの測定の結果を、添付の図9、及び以下のTable 16(表17)に示す。
【０４７１】
図12及び図13には、6インスリン分子あたり亜鉛0で製剤化された、先行技術を代表するインスリン誘導体、すなわち、A22K(N(eps)-ヘキサデカンジオイル-gGlu-2×OEG)、B29R、desB30ヒトインスリン(WO2009/022013実施例45)のC14二酸類似体(1nmol/kg)のPK(薬動学的)プロファイル(インスリン濃度対時間)、及び結果として生じる血漿グルコースの変化をそれぞれ示す(72nmol/動物)。
【０４７２】
【表１７】
0006580583.tif 000052
【０４７３】
結論
亜鉛なしの製剤にした、先行技術WO2009/022013実施例45のインスリン誘導体のC14二酸版は、可能性として、皮下貯留物の一部の吸収が遅れたことに起因する、長引くテーリングを伴うと結論付けられる。10時間(600分)の時点でのこのインスリンの血漿濃度は、24pMである。先行技術のこのC14二酸類似体の平均滞留時間(MRT)は、271分であることがわかった。本発明の実施例1及び2のC14二酸類似体で得られた、対応する結果は、それぞれ、165分及び111分であった。更に、血中グルコース低下効果が延長されて、少なくとも11時間(660分)持続する。
【０４７４】
このため、先行技術のこのインスリンは、食事前の使用に不適当となる。
【０４７５】
(実施例41)
肥満Zuckerラットにおける実施例2のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル、製剤への170mMのニコチンアミドの使用と不使用によるプロファイルの比較
上記一般手順に従って、実施例2のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４７６】
使用した製剤
実施例2のインスリン誘導体、pH=7.43、621μM;1.8%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;10mMの塩化ナトリウム(無Zn/六量体);170mMのニコチンアミド使用及び不使用
【０４７７】
ラットには40nmol/kgを投薬した。
【０４７８】
これらの測定の結果を、添付の図15に示す。
【０４７９】
実施例2のインスリンの無亜鉛製剤に170mMのニコチンアミドを含め、Zuckerラットに皮下投与すると、Tmaxのより早い、より一層速効型であるPKプロファイルが得られると結論付けられる。すなわち、本発明の実施例2のインスリン製剤にニコチンアミドを含めると、食事前の使用により一層適したインスリン製剤になることが示される。
【０４８０】
(実施例42)
肥満Zuckerラットにおける実施例7のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル、製剤への170mMのニコチンアミドの使用と不使用によるプロファイルの比較
上記一般手順に従って、実施例7のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４８１】
使用した製剤:
実施例7のインスリン誘導体、pH=7.39、604μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;7mMのリン酸ナトリウム;10mMの塩化ナトリウム(無Zn/六量体);170mMのニコチンアミド
【０４８２】
実施例7のインスリン誘導体、pH=7.39、599μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;7mMのリン酸ナトリウム;10mMの塩化ナトリウム(無Zn/六量体)
【０４８３】
ラットには40nmol/kgを投薬した。
【０４８４】
これらの測定の結果を、添付の図16〜図17に示す。
【０４８５】
実施例7のインスリンの無亜鉛製剤に170mMのニコチンアミドを含め、Zuckerラットに皮下投与すると、Tmaxのより早い、より一層速効型であるPKプロファイルが得られると結論付けられる。すなわち、本発明の実施例7のインスリン製剤にニコチンアミドを含めると、食事前の使用により一層適したインスリン製剤になることが示される。
【０４８６】
(実施例43)
肥満Zuckerラットにおける実施例16のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル、製剤への170mMのニコチンアミドの使用と不使用によるプロファイルの比較
上記一般手順に従って、実施例16のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４８７】
使用した製剤
実施例16のインスリン誘導体、pH=7.44、599μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;7mMのリン酸ナトリウム;10mMの塩化ナトリウム(無Zn/六量体);170mMのニコチンアミド
【０４８８】
実施例16のインスリン誘導体、pH=7.40、581μM;1.6%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;7mMのリン酸ナトリウム;10mMの塩化ナトリウム(無Zn/六量体)
【０４８９】
ラットには40nmol/kgを投薬した。
【０４９０】
これらの測定の結果を、添付の図18〜図19に示す。
【０４９１】
実施例16のインスリンの無亜鉛製剤に170mMのニコチンアミドを含め、Zuckerラットに皮下投与すると、Tmaxのより早い、より一層速効型であるPKプロファイルが得られると結論付けられる。すなわち、本発明の実施例16のインスリン製剤にニコチンアミドを含めると、食事前の使用により一層適したインスリン製剤になることが示される。
【０４９２】
(実施例44)
LYDブタにおける実施例4のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル、製剤への170μMのニコチンアミドの使用と不使用によるプロファイルの比較
上記一般手順に従って、実施例4のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４９３】
使用した製剤
実施例4のインスリン誘導体、pH=7.42;0.604mMのインスリン誘導体;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;2%(w/vol)のグリセロール;7mMのリン酸塩(無Zn/六量体)
【０４９４】
実施例4のインスリン誘導体、pH=7.43;0.605mMのインスリン誘導体;170mMのニコチンアミド;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;0.6%(w/vol)のグリセロール;7mMのリン酸塩
【０４９５】
ブタには1nmol/kgを投薬した。
【０４９６】
これらの測定の結果を、添付の図20に示す。
【０４９７】
実施例4のインスリンの無亜鉛製剤に170μMのニコチンアミドを含め、ブタに皮下投与すると、Tmaxのより早い、より一層速効型であるPKプロファイルが得られると結論付けられる。すなわち、本発明の実施例4のインスリン製剤にニコチンアミドを含めると、食事前の使用により一層適したインスリン製剤になることが示される。
【０４９８】
(実施例45)
LYDブタにおける実施例2のインスリン誘導体の皮下PK/PDプロファイル、製剤への170μMのニコチンアミドの使用と不使用によるプロファイルの比較
上記一般手順に従って、実施例2のインスリン誘導体について、以下のPK及びPDプロファイルを取得した。
【０４９９】
使用した製剤
実施例2のインスリン誘導体、pH=7.4、608μM;2%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;7mMのリン酸ナトリウム(無Zn/六量体)
【０５００】
実施例2のインスリン誘導体、pH=7.4、614μM;170μMのニコチンアミド;0.6%(w/vol)のグリセロール;16mMのフェノール;16mMのm-クレゾール;7mMのリン酸ナトリウム(無Zn/六量体)
【０５０１】
ブタには1nmol/kgを投薬した。
【０５０２】
これらの測定の結果を、添付の図21に示す。
【０５０３】
実施例2のインスリンの無亜鉛製剤に170μMのニコチンアミドを含め、ブタに皮下投与すると、Tmaxのより早い、より一層速効型であるPKプロファイルが得られると結論付けられる。すなわち、本発明の実施例2のインスリン製剤にニコチンアミドを含めると、食事前の使用により一層適したインスリン製剤になることが示される。
【図１】
0006580583.tif 000053
【図２】
0006580583.tif 000054
【図３ａ】
0006580583.tif 000055
【図３ｂ】
0006580583.tif 000056
【図４ａ】
0006580583.tif 000057
【図４ｂ】
0006580583.tif 000058
【図５ａ】
0006580583.tif 000059
【図５ｂ】
0006580583.tif 000060
【図６】
0006580583.tif 000061
【図７】
0006580583.tif 000062
【図８】
0006580583.tif 000063
【図９】
0006580583.tif 000064
【図１０】
0006580583.tif 000065
【図１１】
0006580583.tif 000066
【図１２】
0006580583.tif 000067
【図１３】
0006580583.tif 000068
【図１４Ａ】
0006580583.tif 000069
【図１４Ｂ】
0006580583.tif 000070
【図１４Ｃ】
0006580583.tif 000071
【図１５】
0006580583.tif 000072
【図１６】
0006580583.tif 000073
【図１７】
0006580583.tif 000074
【図１８】
0006580583.tif 000075
【図１９】
0006580583.tif 000076
【図２０】
0006580583.tif 000077
【図２１】
0006580583.tif 000078
【配列表】
0006580583000001.app