(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の調節において使用するための、10〜22連続ヌクレオチド長の一本鎖LNAギャップマーアンチセンスオリゴマーに共有結合で結合した、2個または3個のN-アセチルガラクトサミンを有するガラクトースクラスタを含む、LNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項２】
ギャップマーが式X'-Y'-Z'であり、X'は1〜6個のLNA単位を含み、Y'は6〜10個のDNA単位からなり、Z'は1〜6個のLNA単位を含む、請求項1記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項３】
ガラクトースクラスタが、Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3またはL3G4またはコランベースのガラクトースクラスタではない、請求項1または2記載のLNAアンチセンスコンジュゲート。
【請求項４】
ガラクトースクラスタが、C8-C36飽和または不飽和脂肪酸、ステロール、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルからなる群より選択される薬物動態モジュレーターをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のLNAアンチセンスコンジュゲート。
【請求項５】
ガラクトースクラスタが、N-アセチルガラクトサミントリマーからなる、請求項1〜4のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマー。
【請求項６】
ガラクトースクラスタが、生理学的に切断可能なリンカーを介してオリゴマーに共有結合で連結されている、請求項1〜5のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項７】
生理学的に切断可能なリンカーが、ホスホジエステルによって連結されたヌクレオシドの領域（領域B）である、請求項6記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが、10〜16個の連続ヌクレオシドを有する、請求項1〜7のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項９】
LNAアンチセンスオリゴマーが、少なくとも90％のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を有する、請求項1〜8のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１０】
オリゴマーが、肝臓に発現するmRNAもしくはマイクロRNA、またはウイルス核酸を標的とする、請求項1〜9のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１１】
肝臓に発現するRNAが、（補体）第VII因子、補体因子C6、Bcl2、TTR、PCSK9、アポB、GCGR、CRP、DGAT2、GCCR、PTEN、PTP1B、SGLT2、およびSOD1、またはC型肝炎もしくはB型肝炎からなる群より選択されるmRNAである、請求項10記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１２】
オリゴマーが、肝臓に発現するmiR-122を標的とする、請求項10記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１３】
HBVのDNAおよび／またはRNAの配列を標的とする、請求項1〜12のいずれか一項記載のLNAオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１４】
医薬において使用するための請求項1〜13のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１５】
肝臓に発現するRNAの下方制御において使用するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１６】
代謝疾患または代謝障害の処置において使用するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１７】
B型肝炎またはC型肝炎の処置において使用するための、請求項12または13記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１８】
疾患または障害の処置のための医薬の製造において使用するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
【請求項１９】
請求項1〜13のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む薬学的組成物。
【請求項２０】
緩衝生理食塩水溶液とLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートとを含む、請求項19記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項1〜13のいずれか一項記載のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、細胞における標的遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で適切に、標的遺伝子を発現している細胞へ投与する工程を含む、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するインビトロの方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の領域
本発明は、LNA治療用一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートの領域に関する。本発明は、大幅に増強された効力、拡大された治療指数、および低下した毒性を有するLNA治療用オリゴヌクレオチド糖質コンジュゲートを提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、siRNAにおいて使用するために広範囲に評価されており、十分なインビボ効力を入手するために不可欠であると見なされている。例えば、RNA干渉経路を介して遺伝子発現を調節する修飾型オリゴマー化合物に言及しているWO2004/044141を参照されたい。オリゴマー化合物は、付着したオリゴマー化合物の薬物動態学的特性および薬力学的特性を修飾するかまたは増強することができる1種以上のコンジュゲート部分を含む。
【０００３】
WO2012/083046は、siRNAのためのガラクトースクラスタ-薬物動態モジュレーターターゲティング部分について報告している。
【０００４】
対照的に、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、コンジュゲーションまたは製剤化なしに治療的に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドの主な標的組織は、肝臓および腎臓であるが、リンパ節、脾臓、骨髄を含む広範囲のその他の組織も、アンチセンスモダリティによって到達可能である。
【０００５】
van Poelgeestら（American Journal of Kidney Disease,In Press）によると、ヒト臨床試験におけるLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの投与は、急性腎損傷をもたらす場合があった。Swayze et al,NAR,Dec.2006,advanced online publicationによると、ロックド核酸を含有しているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、効力を改善するが、動物において重大な肝毒性を引き起こす。
【０００６】
WO2004/087931は、酸によって切断可能な親水性ポリマー（PEG）コンジュゲートを含むオリゴヌクレオチドに言及している。
【０００７】
WO2005/086775は、治療用化学部分、切断可能リンカー、および標識ドメインを使用した、特定の器官への治療剤の標的特異的な送達に言及している。切断可能リンカーは、例えば、ジスルフィド基、ペプチド、または制限酵素によって切断可能なオリゴヌクレオチドドメインであり得る。
【０００８】
WO2011/126937は、小分子リガンドとのコンジュゲーションを介した、オリゴヌクレオチドの標的特異的な細胞内送達に言及している。
【０００９】
WO2009/025669は、ピリジルジスルフィド部分を含有しているポリマー（ポリエチレングリコール）リンカーに言及している。Zhao et al.,Bioconjugate Chem.2005 16 758-766も参照されたい。
【００１０】
Chaltin et al.,Bioconjugate Chem.2005 16 827-836は、デンドリマー送達系を作製するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドをカチオン性リポソームへ組み入れるために使用された、コレステロールによって修飾されたモノマー型、ダイマー型、およびテトラマー型のオリゴヌクレオチドについて報告している。コレステロールは、リジンリンカーを介して、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【００１１】
他の非切断可能コレステロールコンジュゲートは、siRNAおよびアンタゴmir（antagomirs）を肝臓へターゲティングするために使用されている。例えば、Soutscheck et al.,Nature 2004 vol.432 173-178およびKrutzfeldt et al.,Nature 2005 vol 438,685-689を参照されたい。部分的にホスホロチオエート化されたsiRNAおよびアンタゴmirについて、肝臓ターゲティングエンティティとしてのコレステロールの使用は、インビボ活性にとって不可欠であることが見出された。
【００１２】
Bhat et al.,AASLD November 7-11th 2013（ポスター）は、前臨床研究における、HCVの低下のための、miR-122を標的とするGalNacがコンジュゲートされた抗miR、RG-101の使用からのデータを開示した。
【００１３】
本発明は、糖質コンジュゲート、例えば、GalNAcコンジュゲートとのLNAオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションによって、一本鎖LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力、体内分布、および治療指数が大いに改善されるという発見に基づく。
【００１４】
関連出願
本願は、EP13153296.2（2013-01-30出願）、EP13157237.2（2013-02-28出願）、EP13174092.0（2013-06-27出願）、EP13192938.2（2013-11-14出願）、EP13192931.7（2013-11-14出願）、EP13192930.9（2013-11-14出願）、PCT/EP2013/073859（2013-11-14出願）、およびPCT/EP2013/073859（2013-11-14出願）に基づく優先権を主張する。これらの出願のこれらの内容は、参照によって本明細書に組み入れられる。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、アンチセンスオリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分とを含む、LNAアンチセンスオリゴマー（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）を提供する。
【００１６】
本発明は、アンチセンスオリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るGalNAc部分、例えば、3価GalNAc部分とを含む、LNAアンチセンスオリゴマー（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）を提供する。
【００１７】
本発明は、LNAアンチセンスギャップマー（gapmer）オリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分とを含む、（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）LNAアンチセンスオリゴマーギャップマーを提供する。LNAアンチセンスオリゴマーギャップマーは、例えば、mRNA標的またはウイルスRNA標的を標的とし得る。
【００１８】
本発明は、LNAアンチセンスミックスマー（mixmer）オリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分とを含む、（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）LNAアンチセンスオリゴマーミックスマーを提供する。LNAアンチセンスオリゴマーミックスマーは、例えば、mRNA標的、例えば、mRNAスプライス部位標的、またはマイクロRNA標的を標的とし得る。
【００１９】
本発明は、LNAアンチセンストータルマー（totalmer）オリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分とを含む、（本明細書において領域Aと呼ばれ得る）LNAアンチセンスオリゴマートータルマーを提供する。LNAアンチセンスオリゴマーミックスマーは、例えば、マイクロRNA標的を標的とし得る。
【００２０】
LNAアンチセンスオリゴマーは、7〜30ヌクレオシド長、例えば、8〜26ヌクレオシド長、または、いくつかの態様において、8〜18ヌクレオシド長であり得、少なくとも1個のLNA単位（ヌクレオシド）を含む。従って、本発明は、アンチセンスオリゴマーと、さらなる領域（領域Cと呼ばれる）の一部を形成し得るアシアロ糖タンパク質受容体ターゲティングコンジュゲート部分、例えば、GalNAc部分とを含むLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
【００２１】
本発明は、（非ヌクレオシド）糖質部分、例えば、糖質コンジュゲート部分に共有結合で接合された（例えば、連結された）LNAアンチセンスオリゴマーを提供する。いくつかの態様において、糖質部分は、直鎖状の糖質ポリマーではない。しかしながら、糖質部分は、多価、例えば、2価、3価、4価であってもよいし、または4個の同一のもしくは同一でない糖質部分が、任意でリンカーを介して、オリゴマーに共有結合で接合されていてもよい。
【００２２】
本発明は、アンチセンスオリゴマーと、糖質を含むコンジュゲート部分、例えば、糖質コンジュゲート部分とを含む、LNAアンチセンスオリゴマー（コンジュゲート）を提供する。
【００２３】
本発明は、本発明のLNAオリゴマー化合物と、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む、薬学的組成物を提供する。
【００２４】
本発明は、細胞における核酸標的の阻害において使用するための、本発明によるオリゴマー化合物を提供する。いくつかの態様において、使用はインビトロである。いくつかの態様において、使用はインビボである。
【００２５】
本発明は、医療において使用するための、例えば、医薬として使用するための、本発明のオリゴマー化合物を提供する。
【００２６】
本発明は、医学的な疾患または障害の処置において使用するための、本発明のオリゴマー化合物を提供する。
【００２７】
本発明は、疾患または障害、例えば、代謝疾患または代謝障害の処置のための医薬の調製のための、本発明のオリゴマー化合物の使用を提供する。
【００２８】
本発明は、8〜24個のホスホロチオエートによって連結されたヌクレオシドの連続領域を含み、LNAオリゴマーと連続している1〜6個のDNAヌクレオシドをさらに含むLNAオリゴマーも提供する。DNA間の、かつ／またはDNAヌクレオシドに隣接したヌクレオシド間連結は、生理学的に不安定なものであり、例えば、ホスホジエステル連結である。そのようなLNAオリゴマーは、本明細書に記載されるコンジュゲートの形態をとっていてもよい。コンジュゲートされる時、コンジュゲートは、例えば、糖質、例えば、GalNacコンジュゲート、例えば、GalNacクラスタ、例えば、トリGalNac、もしくは本明細書に記載される他のコンジュゲートであるかもしくはそれを含んでいてもよい。
[本発明1001]
LNAアンチセンスオリゴマーと、LNAアンチセンスオリゴマーに共有結合で結合した、例えば糖質コンジュゲート部分などの糖質を含むコンジュゲート部分とを含む、LNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1002]
糖質コンジュゲート部分が、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンからなる群より選択される、本発明1001のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1003]
糖質コンジュゲート部分が、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分である、本発明1001または1002のLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート。
[本発明1004]
コンジュゲート部分が、薬物動態モジュレーター、例えば、疎水基、例えば、C16-20疎水基、ステロール、コレステロールをさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかのLNAアンチセンスコンジュゲート。
[本発明1005]
糖質コンジュゲート部分が、ガラクトース、例えば、ガラクトースクラスタを含む、本発明1001〜1004のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1006]
ガラクトースクラスタが、N-アセチルガラクトサミントリマーからなる、本発明1005のLNAアンチセンスオリゴマー。
[本発明1007]
糖質コンジュゲート部分が、生理学的に切断可能なリンカーを介してオリゴマーに共有結合で連結されている、本発明1001〜1006のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1008]
生理学的に切断可能なリンカーが、酸不安定リンカー、ジルスフィドリンカー、ホスホジエステルリンカーヌクレオシドの領域（領域B）からなる群より選択される、本発明1007のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1009]
コンジュゲート部分が、リンカー、例えば、生理学的に切断可能なリンカーを介して糖質コンジュゲート部分に付着した薬物動態モジュレーターをさらに含む、本発明1001〜1008のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1010]
オリゴヌクレオチドが、7〜26個、例えば、7〜18個、7〜10個、10〜16個、12〜14個の連続ヌクレオシドを有する、本発明1001〜1009のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1011]
LNAアンチセンスオリゴマーが、LNAギャップマー（gapmer）、LNAミックスマー（mixmer）、LNAトータルマー（totalmer）、またはLNAタイニー（tiny）オリゴマーである、本発明1001〜1010のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1012]
LNAアンチセンスオリゴマーが、ホスホロチオエートリンカーオリゴマーである、本発明1001〜1010のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1013]
オリゴマーが、肝臓に発現する核酸、例えば、RNA、例えば、肝臓に発現するmRNAもしくはマイクロRNA、またはウイルス核酸を標的とする、本発明1001〜1012のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1014]
肝臓に発現するRNAが、（補体）第VII因子、補体因子C6、Bcl2、TTR、PCSK9、アポB、GCGR、CRP、DGAT2、GCCR、PTEN、PTP1B、SGLT2、およびSOD1からなる群より選択されるmRNA、またはウイルスRNA、例えば、C型肝炎もしくはB型肝炎である、本発明1013のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1015]
オリゴマーが、ギャップマーまたはショートマーオリゴマーである、本発明1013または1014のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1016]
オリゴマーが、肝臓に発現するマイクロRNA、例えば、miR-122を標的とする、本発明1013のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1017]
オリゴマーが、8〜18ヌクレオチド長である、本発明1013または1016のLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1018]
B型肝炎核酸、例えば、HBVのDNAおよび／またはRNAの配列を標的とする、前記本発明のいずれかのLNAオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1019]
医薬において使用するための前記本発明のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1020]
肝臓に発現するRNAの下方制御において使用するための、本発明1001〜1018のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1021]
代謝疾患または代謝障害、例えば、肝疾患または肝障害の処置において使用するための、本発明1001〜1018のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1022]
肝炎、例えば、B型肝炎またはC型肝炎の処置において使用するための、本発明1016〜1018のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1023]
疾患または障害、例えば、前記本発明のいずれかにおいて定義されたものの処置のための医薬の製造において使用するための、本発明1001〜1018のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲート。
[本発明1024]
前記本発明のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントとを含む薬学的組成物。
[本発明1025]
緩衝生理食塩水溶液とLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートとを含む、本発明1024の薬学的組成物。
[本発明1026]
前記本発明のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、細胞における標的遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で適切に、標的遺伝子を発現している細胞へ投与する工程を含む、細胞における標的遺伝子の発現を阻害するインビボまたはインビトロの方法。
[本発明1027]
前記本発明のいずれかのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを、対象の肝臓における標的遺伝子の発現を低下させるのに有効な量で適切に、対象へ投与する工程を含む、対象の肝臓におけるRNAの発現を阻害する方法。
[本発明1028]
本発明のオリゴマー化合物を含む薬学的組成物を、治療的に有効な量で、対象へ投与する工程を含む、処置を必要とする対象における疾患または障害の処置の方法。
[本発明1029]
5'末端または3'末端にアミノアルキル基を含むLNAオリゴマー。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】LNAオリゴヌクレオチドGalNAcのコンジュゲーション工程。
【図２】FVIIタンパク質レベル。
【図３】FVII mRNAレベル。
【図４ａ】実施例3 - 血清中のFVIIレベル。
【図４ｂ】実施例3 - 血清中のFVIIレベル。
【図４ｃ】実施例3 - 血清中のFVIIレベル。
【図４ｄ】実施例3 - 血清中のFVIIレベル。
【図５ａ】実施例3 - 肝臓中のFVII mRNAレベル。
【図５ｂ】実施例3 - 肝臓中のFVII mRNAレベル。
【図５ｃ】実施例3 - 肝臓中のFVII mRNAレベル。
【図５ｄ】実施例3 - 肝臓中のFVII mRNAレベル。
【図６】実施例3 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図７】図7Aおよび7Bは、異なるモノGalNAcコンジュゲートによるアポB mRNAのインビボサイレンシングを示す。生物切断性（biocleavable）リンカーを含まないか、ジチオリンカー（SS）を含むか、またはDNA/POリンカー（PO）を含む、異なるアポBモノGalNAcコンジュゲートによって、マウスを処置し（A）、DNA/POリンカーを含むモノGalNAcを、GalNAcクラスタと比較した（B）。肝臓試料（A）および腎臓試料（B）からRNAを単離し、アポB mRNAノックダウンについて分析した。データは生理食塩水（＝1）と比較して示される。
【図８】実施例5 - アポB mRNA発現。
【図９ａ】実施例5 - 血清中の総コレステロール。
【図９ｂ】実施例5 - 血清中の総コレステロール。
【図１０ａ】実施例5 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図１０ｂ】実施例5 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図１０ｃ】実施例5 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図１０ｄ】実施例5 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図１０ｅ】実施例5 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図１０ｆ】実施例5 - 肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量。
【図１１】実施例6 - 血清中のFVIIレベル。
【図１２】実施例6 - 肝臓中のFVII mRNAレベル。
【図１３−１】実施例において使用された化合物およびコンジュゲート部分の例。
【図１３−２】実施例において使用された化合物およびコンジュゲート部分の例。
【図１３−３】実施例において使用された化合物およびコンジュゲート部分の例。
【図１３−４】実施例において使用された化合物およびコンジュゲート部分の例。
【図１４−１】使用され得るトリGalNacコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNacコンジュゲート部分を例示しており、コンジュゲート1a〜4aは、コンジュゲートをオリゴマー（領域Aまたは生物切断性リンカー、例えば、領域B）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線はオリゴマーとの共有結合を表す。
【図１４−２】使用され得るトリGalNacコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNacコンジュゲート部分を例示しており、コンジュゲート1a〜4aは、コンジュゲートをオリゴマー（領域Aまたは生物切断性リンカー、例えば、領域B）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線はオリゴマーとの共有結合を表す。
【図１４−３】使用され得るトリGalNacコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNacコンジュゲート部分を例示しており、コンジュゲート1a〜4aは、コンジュゲートをオリゴマー（領域Aまたは生物切断性リンカー、例えば、領域B）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線はオリゴマーとの共有結合を表す。
【図１４−４】使用され得るトリGalNacコンジュゲートの例。コンジュゲート1〜4は、4種の適当なGalNacコンジュゲート部分を例示しており、コンジュゲート1a〜4aは、コンジュゲートをオリゴマー（領域Aまたは生物切断性リンカー、例えば、領域B）に連結するために使用される付加的なリンカー部分（Y）を含む同一のコンジュゲートをさす。波線はオリゴマーとの共有結合を表す。
【図１５】ラット安全性研究からのKim-1発現（実施例10を参照）。
【図１６】1mg/kgまたは2.5mg/kgのSEQ ID NO 32またはSEQ ID NO 17の単回投与によって処置されたマウスにおける血清中のアポBおよびLDL-Cのレベル。
【図１７】シード（seed）を標的とするタイニー（tiny）LNAによる、マウス肝臓におけるmiR-122のサイレンシング。（a）3回の静脈内投与での20mg/kgのタイニー抗miR-122、15塩基長の抗miR-122、もしくはLNAスクランブル対照、または生理食塩水による処置の後のマウス由来の肝臓RNAのRNAブロット分析。
【図１８】投薬前、4日目、および7日目の総コレステロール分析。コレステロールは、miR-122の減少のため、上方制御される。
【図１９】標準的なTaqMan Q-PCRアッセイによってAldo AおよびBckdkの発現を測定した。これらの遺伝子のmRNAレベルは、miR-122の減少のため、上方制御される。
【図２０】化合物の認容性を査定するため、最終血清（7日目）からALTを測定した。
【図２１】LNA化合物SEQ ID 55およびSEQ ID 56の抗ウイルス効果を決定するため、pAAV2/HBVの尾静脈へのハイドロダイナミックインジェクションの7日後に、Balb/Cマウスの肝臓におけるウイルス複製を測定した。ハイドロダイナミックインジェクションの24時間前に、示された用量レベルで、化合物を単回静脈内注射で与え、ハイドロダイナミックインジェクションの24時間後に開始された、毎日経口投与で与えられたエンテカビルと比較した。HBV DNAをqPCRによって定量し、肝臓DNA 100ng当たりのゲノム当量として報告した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の説明
本発明は、非ヌクレオチド糖質コンジュゲート基に共有結合で連結されたLNAオリゴマー化合物、例えば、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【００３１】
オリゴマー
本発明は、LNAアンチセンスオリゴマーと、LNAアンチセンスオリゴマーに共有結合で結合した、例えば糖質コンジュゲート部分などの糖質を含むコンジュゲート部分とを含むLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
【００３２】
本発明は、細胞における標的核酸の調節、例えば、阻害において使用するためにLNAオリゴマー化合物（本明細書においてLNAオリゴマーまたはLNAオリゴヌクレオチドとも呼ばれる）を利用する。LNAオリゴマーは、少なくとも1個の「ロックド核酸」（LNA）ヌクレオシド、例えば、2'位と4'位との間に（ラジカルとも呼ばれる）共有結合性のブリッジ（2'-4'ブリッジ）を含むヌクレオシドを含む。LNAヌクレオシドは、「二環式ヌクレオシド」とも呼ばれる。LNAオリゴマーは、典型的には、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３３】
いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、ギャップマーを含むかまたはギャップマーである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、ミックスマーを含むかまたはミックスマーである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、トータルマーを含むかまたはトータルマーである。
【００３４】
いくつかの態様において、オリゴマー内に存在するヌクレオシド類似体は全てLNAであり、オリゴマーは、任意で（例えば、ギャップマーまたはミックスマーにおいて）RNAヌクレオシドまたはDNAヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシドをさらに含んでいてもよい。
【００３５】
様々な態様において、本発明の化合物はRNA（単位）を含まない。いくつかの態様において、オリゴマーは、直鎖状分子であるかまたは直鎖状分子として合成される単一の連続配列を有する。従って、オリゴマーは、一本鎖分子であり得る。いくつかの態様において、オリゴマーは、同一オリゴマー内の等価な領域に相補的である短い領域、例えば、少なくとも3個、4個、または5個の連続ヌクレオチドの領域（即ち、二重鎖）を含まない。オリゴマーは、いくつかの態様において、（本質的に）二本鎖でなくてよい。オリゴマーは、本質的に、二本鎖でなく、例えば、siRNAでない。いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、（実質的に）相補的なオリゴヌクレオチドとの二重鎖の形態になく、例えば、siRNAでない。
【００３６】
長さ
本発明に関して「オリゴマー」という用語は、2個以上のヌクレオチドの共有結合によって形成された分子（即ち、オリゴヌクレオチド）をさす。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマーまたは単位とも呼ばれ得る。いくつかの態様において、「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」、「単位」、および「モノマー」という用語は、交換可能に使用される。ヌクレオチドまたはモノマーの配列に言及する時、言及されるのは、A、T、G、C、またはUのような塩基の配列であることが認識されるであろう。
【００３７】
オリゴマーは、7〜30ヌクレオチド長、例えば、7〜26ヌクレオチド長または8〜25ヌクレオチド長、例えば、9ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、例えば、10〜20ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、LNAオリゴマーの長さは、10〜16ヌクレオチド、例えば、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、または14ヌクレオチドである。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長、例えば、「タイニー」LNAである。
【００３８】
いくつかの態様において、オリゴマーは、全部で10〜22連続ヌクレオチド長、例えば、12〜18連続ヌクレオチド長、例えば、13〜17連続ヌクレオチド長または12〜16連続ヌクレオチド長、例えば、13連続ヌクレオチド長、14連続ヌクレオチド長、15連続ヌクレオチド長、16連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
【００３９】
いくつかの態様において、オリゴマーは、全部で10連続ヌクレオチド長、11連続ヌクレオチド長、12連続ヌクレオチド長、13連続ヌクレオチド長、または14連続ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
【００４０】
いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、22個以下のヌクレオチド、例えば、20個以下のヌクレオチド、例えば、18個以下のヌクレオチド、例えば、15個、16個、または17個のヌクレオチドからなる。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、20個未満のヌクレオチドを含む。オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列の長さについて範囲が与えられる時、それには、範囲内に提供された下限および上限の長さが含まれること、例えば、10〜30には、10および30の両方が含まれることが理解されるべきである。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明による糖質コンジュゲートの使用は、短いLNAオリゴマー、例えば、短いギャップマー、ミックスマー、またはトータルマー（タイニー）、例えば、20nt未満、例えば、18nt未満、例えば、16nt以下または15ntもしくは14nt以下のLNAオリゴマーのために特に適当であることが見出された。
【００４２】
ヌクレオシド間連結
いくつかの態様において、LNAオリゴマーのヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル以外のヌクレオシド間連結を少なくとも1個含み、例えば、領域A内のヌクレオシド間連結のうちの少なくとも1個、例えば、少なくとも50％、例えば、少なくとも75％、例えば、少なくとも90％、例えば、100％が、ホスホジエステル以外である。いくつかの態様において、ホスホジエステル以外のヌクレオシド間連結は、硫黄含有ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、例えば、ホスホロチオエートである。
【００４３】
LNAオリゴマーは、少なくとも1個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結、例えば、少なくとも2個、3個、または4個のホスホロチオエート連結を含み、いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結の少なくとも50％がホスホロチオエートであり得、例えば、少なくとも75％、少なくとも90％、または全てのヌクレオシド間連結（切断可能リンカー内に任意で存在するもの以外）が、ホスホロチオエートであり得る。いくつかの態様において、（存在する時、領域B以外の）5'末端、3'末端、または5'末端および3'末端の両方における2個の末端ヌクレオシドの間のヌクレオシド間連結は、硫黄含有ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートである。いくつかの態様において、オリゴマーは、DNAヌクレオシド間のヌクレオシド間連結が硫黄含有ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートである、連続DNAヌクレオシドの領域、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個の連続DNAヌクレオシドの領域を少なくとも1個含む。いくつかの態様において、典型的には、連続DNAヌクレオシドの領域を含むギャップマーの中央領域（Y）は、ヌクレオシド間、例えば、連続するDNAヌクレオシドの間および／またはDNAヌクレオシドと核酸類似体ヌクレオシド、例えば、本明細書において言及される糖修飾型ヌクレオシド、例えば、LNAとの間に、硫黄含有ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートを有する。
【００４４】
オリゴマーにおいて使用され得るヌクレオシド間連結の他の例には、メチルホスホネート（CH3P=O）およびメチルチオノホスフェート（methylthionophosphate）（CH3P=S）およびボラノホスフェートが含まれる。
【００４５】
ロックド核酸ヌクレオシド（LNA）
二環式ヌクレオシド類似体（LNAヌクレオシド）には、リボース環の第2炭素と第4炭素とを連結するブリッジ（またはビラジカル）（C4*-C2*ブリッジまたはビラジカル）を典型的に含むヌクレオシド類似体が含まれる。第2炭素と第4炭素との間のビラジカルの存在は、リボースを3'エンド（N型）立体構造へロックし、従って、C2*-C4*ビラジカルを有する二環式ヌクレオシド類似体は、しばしば、ロックド核酸（LNA）または二環式核酸（BNA）と呼ばれる。LNAおよびBNAという用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【００４６】
いくつかの態様において、LNAオリゴマーのヌクレオシドのうちのいくつかまたは全てが、本明細書においてヌクレオシド類似体とも呼ばれる修飾型ヌクレオシド、例えば、糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、二環式ヌクレオシド類似体（例えば、LNA）および／または2'置換ヌクレオシド類似体であり得る。いくつかの態様において、オリゴマー内に存在するヌクレオシド類似体は、全て、同一の糖修飾を含み、例えば、全て二環式ヌクレオシド類似体であり、例えば、それらは、β-D-X-LNAもしくはα-L-X-LNA（Xは、オキシ、アミノ、もしくはチオである）、または限定されないが、(R/S)cET、cMOE、もしくは5'-Me-LNAを含む、本明細書に開示されたその他のLNAからなる群より（任意で独立に）選択され得る。
【００４７】
いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも1個の二環式ヌクレオシド（LNA）と、少なくとも1個のさらなるヌクレオシド類似体、例えば、1個以上の2'置換ヌクレオシドとを含み得る。いくつかの態様において、オリゴマーのヌクレオシドのうちのいくつかまたは全部が、本明細書においてヌクレオシド類似体とも呼ばれる修飾型ヌクレオシドであり得る。
【００４８】
いくつかの態様において、第1領域は、少なくとも1個、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個または25個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様において、ヌクレオシド類似体は、二環式ヌクレオシド類似体（例えば、LNA）および／または2'置換ヌクレオシド類似体からなる群より（任意で独立に）選択され、例えば、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-AP、2'-FANA、2'-(3-ヒドロキシ)プロピル、および2'-フルオロ-DNA単位、ならびに／またはその他の（任意での）糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、モルホリノ、ペプチド核酸（PNA）、CeNA、アンリンクト核酸（UNA）、ヘキシトール核酸（HNA）、ビシクロ-HNA（例えば、WO2009/100320を参照）からなる群より（任意で独立に）選択される。いくつかの態様において、さらなるヌクレオシド類似体は、その標的核酸（または相補的なDNA配列もしくはRNA配列）に対する第1領域の親和性を増加させる。様々なヌクレオシド類似体が、参照によって本明細書に組み入れられるFreier & Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213に開示されている。
【００４９】
いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、例えば、全てのヌクレオシド類似体（または、トータルマーにおいては、全てのヌクレオシド）、二環式ヌクレオシド類似体、例えば、LNA、例えば、β-D-X-LNAもしくはα-L-X-LNA（Xは、オキシ、アミノ、もしくはチオである）、または限定されないが、(R/S)cET、cMOE、もしくは5'-Me-LNAを含む、本明細書に開示されたその他のLNAを含む。いくつかの態様において、LNAオリゴマーは、DNA、ならびに糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、二環式ヌクレオシド類似体および／または2'置換ヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、DNAヌクレオシド単位およびLNAヌクレオシド単位を含む。
【００５０】
WO05/013901、WO07/027775、WO07027894は、完全2'-O-MOEのような完全2'置換オリゴマーに言及している。いくつかの態様において、オリゴマーの第1領域は、2'置換ヌクレオシドを含み得る。WO07/027775は、マイクロRNAを標的とするために使用するためのMOE、LNA、DNAミックスマーにも言及している。
【００５１】
標的
本発明のLNAオリゴマーコンジュゲートは、典型的には、本明細書において標的と呼ばれる核酸標的を標的とするために使用するためのものである。いくつかの態様において、非限定的な例として、本発明のオリゴマーは、mRNA、マイクロRNA、lncRNA（長鎖非コードRNA）、snRNA、snoRNA、およびウイルスRNAからなる群より選択される核酸（即ち、標的）を調節するために使用するためのものである。
【００５２】
いくつかの態様において、オリゴマーは、肝臓に発現するRNA、例えば、肝臓に発現するmRNAまたはマイクロRNAを標的とする。いくつかの態様において、LNAアンチセンスオリゴマーは、第VII因子、PCSK9、アポB、GCGR、CRP、DGAT2、GCCR、PTEN、PTP1B、SGLT2、およびSOD1からなる群より選択されるmRNAを標的とする（例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO2007/146511を参照）。本発明者らは、WO'511の42〜43頁の表1を具体的に組み入れる。いくつかの態様において、標的は、アポBヒトNM000384.1、アポBマウスXM137955.5、SGLT2ヒトNM003041.1、PCSK9ヒトNM174936.2、SODIヒトX02317、CRPヒトNM000567.1、GCCRマウスBC031885.1、GCGRヒトNM000160.1、DGAT2ヒトNM032564.2、PTPIBヒトNM002827.2、PTENマウスU92437.1、PTENヒトNM000314.4（参照はGENBANKアクセッション番号である）、補体第VII因子、補体因子C6、およびTTRからなる群より選択され得る。第VII因子をコードするヌクレオチド配列には、非限定的に、GENBANKアクセッション番号NM 000131.3、GENBANKアクセッション番号NM 019616.2、GENBANKアクセッション番号NT 027140.6のヌクレオチド1255000〜51273000、GENBANKアクセッションNM 010172.3、およびGENBANKアクセッション番号NT 039455.6のヌクレオチド10024000〜10037000が含まれる。補体因子C6ヌクレオチド配列には、BC035723.1、J05024.1 GI：187824、およびJ05064.1 GI：179703が含まれる。補体因子C6を標的とするLNAオリゴに言及しているEP 2320925 A2も参照されたい。TTR（トランスサイレチン）ヌクレオチド配列には、BC020791.1 GI：18089144、およびBC005310.1 GI：13529049が含まれる。
【００５３】
PCSK9を標的とするLNAオリゴマーの例は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2008/043753およびWO2001/009697に提供されている。
【００５４】
アポBを標的とするLNAオリゴマーの例は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2010014280およびWO2008/113830に提供されている。
【００５５】
標的は、いくつかの態様において、Bcl2 mRNAであり得る。Bcl2（例えば、M13994.1 GI：179366）を標的とするLNAオリゴマーを開示しているWO2005/061710を参照されたい。
【００５６】
標的は、肝臓において発現されるRNAであり得る。標的は、医学的な障害または疾患状態に関連している肝臓標的であり得る。多数の代謝疾患が、肝臓に関連しており、いくつかの態様において、本発明の化合物を使用して処置され得る。肝臓に関連した代謝疾患または代謝障害の標的には、例えば、アポ-B（高LDLコレステロール、ACS）、アポCIII（高血清トリグリセリド）、アポA（心血管疾患）、FGFR4（肥満）、GCCR（T2糖尿病）、GCGR（T2糖尿病）、PTP1B（T2糖尿病）、DGAT2（NASH）、PCSK9（高脂血症および関連障害）、MtGPAT、miR-122（高コレステロール）、ならびにmiR-33（代謝症候群、アテローム性動脈硬化症）が含まれる。
【００５７】
標的は、ウイルス核酸、例えば、ウイルスRNAであり得る。例には、肝炎ウイルス、例えば、B型肝炎およびC型肝炎（HCV）が含まれる。ウイルス性肝炎には、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、およびE型肝炎が含まれる。HCV LNAアンチセンスオリゴマーは、例えば、Laxton et al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy 2011 Vol 55 3105-3114に開示されている。
【００５８】
従って、オリゴマーは、代謝肝疾患と一般に呼ばれる、肝臓に関係した（または関連した）代謝疾患の処置において使用するためのものであり得る。肝臓関連代謝疾患には、例えば、代謝症候群、肥満、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性複合型高脂血症（FCHL）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、心血管疾患、冠動脈疾患（CAD）、ならびに冠動脈心疾患（CHD）、アテローム性動脈硬化症、心疾患、糖尿病（I型および／またはII型）、NASH、急性冠症候群（ACS）が含まれる。いくつかの態様において、肝臓に関係または関連した障害または疾患は、肝臓核酸標的の発現、例えば、過剰発現に関連している。
【００５９】
いくつかの態様において、例えば、標的がマイクロRNA-122である時、疾患は、ウイルス性疾患、例えば、肝炎、例えば、B型肝炎およびC型肝炎、またはコレステロール上昇に関係する代謝疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症および高脂血症ならびに関連障害であり得る。miR-122を標的とするオリゴマーは、肝機能の改善のため（例えば、PCT/EP2012/071934を参照）、壊死性炎症の処置のため、肝機能の血清バイオマーカーを改善するため、HCVに感染している可能性が有るまたは無いかつ肝機能の悪化の恐れが有るヒト対象における肝機能の損失を防止する（または損失の割合を低下させる）ため、HCVに感染しているまたは感染していないかつ肝機能の改善を必要とするヒト対象における肝機能を改善するためにも使用され得る。肝疾患は、非アルコール性脂肪肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎からなる群より選択される疾患もしくは障害；またはサイトメガロウイルス感染、住血吸虫感染、およびレプトスピローシス感染からなる群より選択される疾患もしくは障害であり得る。
【００６０】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、miR-122のような肝臓に発現するマイクロRNAを標的とする。miR-122を標的とするオリゴマーは、WO2007/112754、WO2007/112753、WO2009/043353に開示されており、ミックスマー、例えば、ミラビルセン（miravirsen）（配列
0006580993.tif 000002
［配列中、大文字は、β-D-オキシLNAであり、小文字はDNA、完全ホスホロチオエートであり、LNA Cは、5-メチルシトシンである］を有する）とも呼ばれるSPC3649、またはタイニーLNA、例えば、WO2009/043353に開示されたもの（例えば、
0006580993.tif 000003
［配列中、大文字は、（任意で、β-D_オキシ）LNA、完全ホスホロチオエートであり、LNA Cは、任意で、5-メチルシトシンである］）であり得る。いくつかの態様において、miR-122を標的とするオリゴマーは、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、または18ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、miR-122を標的とするオリゴマーは、オリゴマーの全長において測定されるようにmiR-122に完全に相補的な配列であり、好ましくは、配列5'-CACACTCC-3'を含む配列を有する。miRBaseによると、成熟マイクロRNA-122配列は
0006580993.tif 000004
である。いくつかの態様において、マイクロRNA、例えば、miR-122を標的とするオリゴマーは、オリゴマーの全長にわたってマイクロRNAの対応する領域に相補的であり、いくつかの態様において、オリゴマーの3'ヌクレオシドは、マイクロRNA、例えば、miR-122の1番目、2番目、3番目、または4番目の5'ヌクレオチド、例えば、マイクロRNA、例えば、miR-122の2番目の5'ヌクレオチドに相補的である（即ち、整列する）。
【００６１】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、肝臓に発現するマイクロRNA、例えば、miR-33（miR-33aおよび／またはmiR-33b）を標的とし、アテローム性動脈硬化症のような代謝障害の処置において使用され得る（例えば、WO2010/120508を参照）。miR-33a/bを標的とするオリゴマーは、
0006580993.tif 000005
からなる群より選択される核酸塩基配列を含み得、miR-33a/bを標的とする具体的なオリゴマーは、
0006580993.tif 000006
であり得る。配列中、大文字は、（任意で、β-D_オキシ）LNA、完全ホスホロチオエートであり、LNA Cは、任意で、5-メチルシトシンである。miRBaseによると、成熟マイクロRNA-33a配列は、
0006580993.tif 000007
であり、miR-33bは、
0006580993.tif 000008
である。
【００６２】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、肝臓に発現するマイクロRNA、例えば、miR-21を標的とし、肝線維症または肝細胞癌のような疾患の処置において使用され得る。miR-21を標的とするオリゴマーは、
0006580993.tif 000009
からなる群より選択される核酸塩基配列を含み得、miR-21を標的とする具体的なオリゴマーは、
0006580993.tif 000010
であり得る。配列中、大文字は、（任意で、β-D_オキシ）LNAであり、小文字はDNA、完全ホスホロチオエートであり、LNA Cは、任意で、5-メチルシトシンである。配列5'-GATAAGCT-3'（LNA Cは、5-メチルシトシンである）を有する完全LNAオリゴマーホスホロチオエート（例えば、β-D-オキシ-LNA）は、miR-21（SEQ ID NO 51）を阻害するためにインビボで広範囲に使用されている。miRBaseによると、成熟マイクロRNA-21配列は、
0006580993.tif 000011
である。
【００６３】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、肝臓に発現するマイクロRNA、例えば、miR-221を標的とし、例えば、肝細胞癌の処置において使用され得る。miR-221を標的とするオリゴマーは、
0006580993.tif 000012
からなる群より選択される核酸塩基配列を含み得、miR-221を標的とする具体的なオリゴマーには、
0006580993.tif 000013
が含まれる。配列中、大文字は、（任意で、β-D_オキシ）LNA、完全ホスホロチオエートであり、LNA Cは、任意で、5-メチルシトシンである。miRBaseによると、成熟マイクロRNA-221配列は、
0006580993.tif 000014
である。
【００６４】
他のマイクロRNA標的、およびそれらを標的とする、本発明のオリゴマーとして使用され得る化合物、またはそれらの連続ヌクレオチド配列、またはそれらの一部は、WO2007/112754に開示され、例えば、WO2007/112754の表2および実施例29に開示されており、これらは参照により本明細書に具体的に組み入れられる。他のマイクロRNA標的、およびそれらを標的とする、本発明のオリゴマーとして使用され得る化合物、またはそれらの連続ヌクレオチド配列、またはそれらの一部は、WO2009/043353に開示されており、例えば、WO2009/043353の表1に開示された化合物および標的であり、これらは参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
【００６５】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、標的（例えば、標的核酸）の発現を下方制御する（例えば、低下させるかまたは除去する）ことができる。この点に関して、本発明のオリゴマーは、標的の阻害に影響を与えることが可能である。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、標的核酸に結合し、正常発現レベル（例えば、オリゴマーまたはコンジュゲートの非存在下での発現レベル）と比較した、少なくとも10％または20％の発現の阻害、より好ましくは、正常発現レベルと比較した少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％の阻害に影響を与える。いくつかの態様において、そのような調節は、0.04〜25nM、例えば、0.8〜20nMの濃度の本発明の化合物を使用した時に見られる。同一のまたは異なる態様において、発現の阻害は、100％未満、例えば、98％未満の阻害、95％未満の阻害、90％未満の阻害、80％未満の阻害、例えば、70％未満の阻害である。発現レベルの調節は、例えば、SDS-PAGE後の標的タンパク質に対する適切な抗体を使用したウエスタンブロッティングのような方法により、タンパク質レベルを測定することによって、決定され得る。あるいは、発現レベルの調節は、例えば、ノーザンブロッティングまたは定量的RT-PCRにより、mRNAのレベルを測定することによって、決定され得る。mRNAレベルを介して測定する場合、適切な投薬量、例えば0.04〜25nM、例えば0.8〜20nMの濃度を使用した時の下方制御のレベルは、いくつかの態様において、典型的には、本発明の化合物、コンジュゲート、または組成物の非存在下での正常レベルの10〜20％のレベルとなる。
【００６６】
従って、本発明は、細胞における標的の発現を下方制御するかまたは阻害するため、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートを細胞へ投与する工程を含む、標的を発現している細胞における標的の発現を下方制御するかまたは阻害する方法を提供する。適切には、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。投与は、いくつかの態様において、インビトロで行われ得る。投与は、いくつかの態様において、インビボで行われ得る。本発明の化合物、例えば、オリゴマーおよびそれらのコンジュゲートは、種々の標的、例えば、肝臓において発現されるmRNAまたはマイクロRNAまたはその他の核酸標的へ標的指向化され得る（NCBI Genbank/遺伝子IDの参照は、本発明の化合物によって標的とされ得る配列の例として与えられ、Genbank/NCBI配列は、参照によって本明細書に組み入れられる）。
【００６７】
アポB
いくつかの態様において、第1領域（または第1領域および第2領域）は、アポB mRNA標的、例えば、アポB-100（参照によって本明細書に組み入れられるNCBI Genbank ID NM_000384.2 GI：105990531）の対応する領域に相補的である（即ち、それを標的とする）単一の連続核酸塩基配列を形成する。
【００６８】
アポBを標的とする本発明の化合物は、急性冠症候群の処置において使用され得る（WO20100076248を参照のこと）。従って、本発明は、急性冠症候群の処置において使用するための、アポB100を標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。本発明は、本発明のオリゴマーを、処置を必要とする対象へ投与する工程を含む、急性冠症候群の処置の方法をさらに提供する。
【００６９】
アポBを標的とする本発明の化合物は、アテローム性動脈硬化症の処置において使用され得る。従って、本発明は、アテローム性動脈硬化症の処置において使用するための、アポB100を標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。本発明は、本発明のオリゴマーを、処置を必要とする対象へ投与する工程を含む、アテローム性動脈硬化症の処置の方法をさらに提供する。アポBを標的とする本発明の化合物は、高コレステロール血症または高脂血症の処置において使用され得る。従って、本発明は、高コレステロール血症または高脂血症の処置において使用するための、アポB100を標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。本発明は、本発明のオリゴマーを、処置を必要とする対象へ投与する工程を含む、高コレステロール血症または高脂血症の処置の方法をさらに提供する。
【００７０】
本発明は、細胞におけるアポBを阻害するため、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物を細胞へ投与する工程を含む、アポBを発現している細胞におけるアポBの阻害のためのインビボまたはインビトロの方法を提供する。
【００７１】
本発明のオリゴマー／コンジュゲートにおいて第1領域として使用され得るLNAオリゴマーの例には、例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO2007/031081、WO2008/113830、WO2007131238、およびWO2010142805に開示されたものが含まれる。具体的な好ましい化合物には、以下のものが含まれる：
0006580993.tif 000015
配列中、大文字は、β-D-オキシLNA単位（ヌクレオシド）であり、小文字は、DNA単位であり、下付きのsは、ホスホロチオエート連結であり、大文字のCの前の上付きのmは、全てのLNAシトシンが5-メチルシトシンであることを示す。アポBを標的とする本発明の化合物は、本明細書に開示される、オリゴマーを肝臓へ標的指向化するコンジュゲート、例えば、糖質または親油性コンジュゲート、例えば、GalNacコンジュゲートまたはステロールコンジュゲート（例えば、コレステロールもしくはトコフェロール）に、コンジュゲートされていてもよい。コンジュゲートは、例えば、（いくつかの態様では領域Bを介して）オリゴマー化合物の5'末端または3'末端に在り得る。
【００７２】
アポBを標的とするその他のオリゴマーは、WO03/011887、WO04/044181、WO2006/020676、WO2007/131238、WO2007/031081、およびWO2010142805に開示されている。
【００７３】
PCSK9
いくつかの態様において、第1領域（または第1領域および第2領域）は、PCSK9 mRNA標的、例えば、ヒトPCSK9 mRNA（参照によって本明細書に組み入れられるNCBI Genbank ID NM_174936.3 GI：299523249）の対応する領域に相補的である（即ち、それを標的とする）単一の連続核酸塩基配列を形成する。
【００７４】
本発明は、医薬として使用するための、例えば、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置のための、PCSK9を標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。
【００７５】
本発明は、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得型変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈心疾患（CHD）からなる群より選択される障害の処置のための医薬の製造のための、PCSK9を標的とする本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００７６】
本発明は、PCSK9を標的とする有効量の本発明によるオリゴマーを高コレステロール血症または関連障害に罹患しているかまたは罹患する可能性が高い患者へ投与する工程を含む、高コレステロール血症または関連障害、例えば、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、例えば、PCSK9の機能獲得変異、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性高脂血症（FCHL）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈心疾患（CHD）からなる群より選択される障害を処置する方法を提供する。
【００７７】
本発明は、細胞におけるPCSK9を阻害するため、PCSK9を標的とする本発明によるオリゴマーを細胞へ投与する工程を含む、PCSK9を発現している細胞におけるPCSK9の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法を提供する。
【００７８】
以下は、ヒトPCSK9 mRNAを標的とし、本発明の化合物において領域Aとして使用され得るオリゴマーである。
0006580993.tif 000016
配列中、大文字は、β-D-オキシLNA単位（ヌクレオシド）であり、小文字は、DNA単位であり、下付きのsは、ホスホロチオエート結合であり、大文字のCの前の上付きのmは、全てのLNAシトシンが5-メチルシトシンであることを示す。PCSK9を標的とする本発明の化合物は、本明細書に開示される、オリゴマーを肝臓へ標的指向化するコンジュゲート、例えば、糖質または親油性コンジュゲート、例えば、GalNacコンジュゲートまたはステロールコンジュゲート（例えば、コレステロールもしくはトコフェロール）へコンジュゲートされていてもよい。コンジュゲートは、例えば、（いくつかの態様では領域Bを介して）オリゴマー化合物の5'末端または3'末端に在り得る。
【００７９】
PCSK9を標的とするその他のオリゴマーは、実施例ならびに参照によって本明細書に組み入れられるWO2008/043753、WO2011/009697、WO08/066776、WO07/090071、WO07/146511、WO0/143315、WO09/148605、WO11/123621、およびWO11133871に開示されている。PCSK9を標的とする本発明の化合物に使用されうる他の化合物は、実施例に例示されている。
【００８０】
miR-122
いくつかの態様において、第1領域（または第1領域および第2領域）は、マイクロRNA-122、例えば、miR-122a、例えば、has-miR-122配列（miRBaseリリース20：MI0000442）、例えば、
0006580993.tif 000017
の対応する領域に相補的である（即ち、それを標的とする）単一の連続核酸塩基配列を形成する。miR-122は、HCV感染において示されており、感染の維持のために必要とされる不可欠の宿主因子である。従って、miR-122の阻害剤は、C型肝炎感染の処置において使用され得る。
【００８１】
miR-122を標的とする本発明の化合物は、HCV感染の処置において使用され得る。従って、本発明は、HCV感染の処置において使用するための、miR-122を標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。本発明は、本発明のオリゴマーを、処置を必要とする対象へ投与する工程を含む、HCV感染の処置の方法をさらに提供する。
【００８２】
本発明は、HCV感染の処置のための医薬の製造のための、miR-122を標的とする本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００８３】
本発明は、miR-122を標的とする有効量の本発明によるオリゴマーをHCV感染に罹患している患者へ投与する工程を含む、HCV感染を処置する方法を提供する。
【００８４】
本発明は、細胞におけるmiR-122を阻害するため、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物を細胞へ投与する工程を含む、miR-122を発現している細胞、例えば、HCV感染細胞またはHCVレプリコン発現細胞におけるmiR-122の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法を提供する。
【００８５】
miR-122は、コレステロール代謝においても示されており、miR-122の阻害が、血漿コレステロールレベルを低下させる処置のために使用され得ることが示唆されている（Esau,Cell Metab.2006 Feb;3(2):87-98）。
【００８６】
従って、miR-122の阻害剤は、血漿コレステロールレベルを低下させるための処置において、またはコレステロールレベル上昇に関連した代謝疾患（関連障害）、例えば、脂肪肝（liver steatosis）、アテローム性動脈硬化症、高脂血症、高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、脂質異常症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈心疾患（CHD）からなる群より選択される適応症の処置において使用され得る。
【００８７】
miR-122を標的とする本発明の化合物は、コレステロールレベル上昇または関連障害の処置において使用され得る。従って、本発明は、コレステロールレベル上昇または関連障害の処置において使用するための、miR-122を標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。本発明は、本発明のオリゴマーを、処置を必要とする対象へ投与する工程を含む、コレステロールレベル上昇または関連障害の処置の方法をさらに提供する。
【００８８】
本発明は、コレステロールレベル上昇または関連障害の処置のための医薬の製造のための、miR-122を標的とする本発明のオリゴマーの使用を提供する。
【００８９】
本発明は、miR-122を標的とする有効量の本発明によるオリゴマーを障害に罹患している患者へ投与する工程を含む、コレステロールレベル上昇または関連障害を処置する方法を提供する。
【００９０】
本発明は、細胞におけるmiR-122を阻害するため、本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物を細胞へ投与する工程を含む、miR-122を発現している細胞、例えば、HCV感染細胞またはHCVレプリコン発現細胞におけるmiR-122の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法を提供する。
【００９１】
miR-122を標的とするオリゴマーは、WO2007/112754、WO2007/112753、WO2009/043353に開示されており、ミックスマー、例えばSPC3649（ミラビルセンとも呼ばれる。下記参照）、または小型LNA、例えばWO2009/043353に開示されたもの（例えば、
0006580993.tif 000018
配列中、大文字は、β-D_オキシLNA、完全ホスホロチオエートであり、LNA Cは5-メチルシトシンである）であり得る。いくつかの態様において、miR-122を標的とするオリゴマーは、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、15ヌクレオチド、16ヌクレオチド、17ヌクレオチド、もしくは18ヌクレオチド（または19ヌクレオチド、20ヌクレオチド、21ヌクレオチド、22ヌクレオチド、もしくは23ヌクレオチド）の長さを有する。いくつかの態様において、miR-122を標的とするオリゴマーは、オリゴマーの長さの全てにわたって測定してmiR-122に完全に相補的である配列を含み、好ましくは、配列5'-CACACTCC-3'を含む。いくつかの態様において、マイクロRNA、例えば、miR-122を標的とするオリゴマーは、オリゴマーの長さの全てにわたってマイクロRNAの対応する領域に相補的であり、いくつかの態様において、オリゴマーの3'ヌクレオシドは、マイクロRNA、例えばmiR-122の、最初の、2番目の、3番目の、または4番目の5'ヌクレオチド、例えば、マイクロRNA、例えばmiR-122の、2番目の5'ヌクレオチドに相補的（すなわちそれらに対し整列する）である。
【００９２】
以下は、has-miR-122（ヒトmiR-122）を標的とし、本発明の化合物において領域Aとして使用され得るオリゴマーである。
ミラビルセン：
0006580993.tif 000019
【００９３】
本発明（領域A）に関して使用され得る、その他のmiR-122を標的とする化合物は、WO2007/027894、WO2007/027775に開示されている。
【００９４】
MtGPAT：（NCBI遺伝子ID 57678 - 染色体：10；NC_000010.10（113907971..113975153、相補鎖）ミトコンドリアグリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ1（EC 2.3.1.15、GPAT1、mtGPAT1、GPAM、mtGPAMとしても公知）は、肝臓におけるトリグリセリド形成において主要な役割を果たし、高レベルのmtGPAT1活性は、脂肪肝（肝臓脂肪過多症）をもたらし、mtGPAT1の欠如は、低レベルの肝臓トリグリセリドおよび刺激された脂肪酸酸化をもたらす（mtGPATを標的とするオリゴマーを開示しているWO2010/000656を参照のこと）。MtGPATを標的とする本発明の化合物は、過体重、肥満、脂肪肝、肝臓脂肪過多症、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、インスリン抵抗性、糖尿病、例えば、インスリン非依存性糖尿病（NIDDM）のような状態を処置するために使用され得る。
【００９５】
以下のオリゴマー（SEQ ID NO 60）はヒトmTGPAtを標的とし、かつ本発明の化合物においてオリゴマー領域（第1領域）として使用され得、大文字はβ-D-オキシ-LNAなどのLNAであり、小文字はDNAであり、下付きのsはホスホロチオエート連結である。LNAシトシンは5-メチルシトシンであり得る。
0006580993.tif 000020
【００９６】
第VII因子（NCBI遺伝子ID 2155、NCBI J02933.1 GI：180333、またはEU557239.1 GI：182257998）。本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートは、第VII因子を標的とし、それによって、組織因子凝固経路の重大な成分である第VII因子の産生を阻害することができる。第VII因子を標的とする本発明の化合物は、（典型的には、出血を引き起こさずに）血栓性疾患、例えば、心発作、脳卒中、および血餅、または炎症性状態の処置または防止のために使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO2013/119979およびWO2012/174154は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、FVIIを標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【００９７】
第XI因子（NCBI Genbank BC122863.1 GI：114108211） - 肝臓において産生される凝固因子である第XI因子。高レベルの第XI因子は、心発作、脳卒中、および血餅に関連している。参照によって本明細書に組み入れられるWO2013/070771は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、XIを標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。第XI因子を標的とする本発明の化合物は、血栓性疾患、例えば、心発作、脳卒中、および血餅、または炎症性状態、例えば、関節炎および大腸炎の処置または防止のために使用され得る。
【００９８】
アポCIII（NCBI Genbank BC027977.1 GI：20379764）血中トリグリセリド代謝を制御するタンパク質。高レベルのアポC-IIIは、炎症、高トリグリセリド、アテローム性動脈硬化症、および代謝症候群に関連している。アポCIIIを標的とする本発明の化合物は、単一薬剤として、または他のトリグリセリド低下剤と組み合わせて、血清トリグリセリドレベルを低下させるため、または、例えば、家族性カイロミクロン血症症候群および重症高トリグリセリドの処置において使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO11085271は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、アポCIIIを標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【００９９】
アポ(a)（NCBI Genbank NM_005577.2 GI：116292749）は、肝臓におけるアポ(a)の産生を阻害し、心疾患の独立危険因子であるLp(a)を低下させるための直接アプローチを提示するため設計される。高レベルのLp(a)は、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、心発作、および脳卒中のリスク増加に関連している。Lp(a)は、動脈における早熟のプラーク発達またはアテローム性動脈硬化症を促進する。アポ(a)を標的とする本発明の化合物は、例えば、アテローム性動脈硬化症および冠動脈心疾患の処置において使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO05000201およびWO03014307は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、アポリポタンパク質(a)を標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【０１００】
B型肝炎（HBV）（例えば、全て参照によって本明細書に組み入れられるNCBI D23684.1 GI：560092；D23683.1 GI：560087；D23682.1 GI：560082；D23681.1 GI：560077；D23680.1 GI：560072；D23679.1 GI：560067；D23678.1 GI：560062；D23677.1 GI：560057を参照）
【０１０１】
HBVを標的とするオリゴマーは、当技術分野において周知である。例えば、WO96/03152、WO97/03211、WO2011/052911、WO2012/145674、WO2012/145697、WO2013/003520、およびWO2013/159109を参照されたい。
【０１０２】
HBVを標的とする本発明の化合物は、HBV感染の処置において使用され得る。従って、本発明は、HBVの処置において使用するための、HBVを標的とする本発明によるオリゴマーを提供する。本発明は、本発明のオリゴマーを、処置を必要とする対象へ投与する工程を含む、HBV感染の処置の方法をさらに提供する。
【０１０３】
本発明は、医薬として使用するための、例えば、B型肝炎感染または関連障害の処置のための、B型肝炎（HBV）を標的とする本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを提供する。
【０１０４】
本発明は、B型肝炎感染または関連障害の処置のための医薬の製造のための、B型肝炎（HBV）を標的とする本発明によるオリゴマーまたはコンジュゲートまたは薬学的組成物の使用を提供する。本発明は、HBVを標的とする有効量の本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートをB型肝炎ウイルスに感染した患者へ投与する工程を含む、B型肝炎感染または関連障害を処置する方法を提供する。本発明は、HBV複製を阻害するために、HBVを標的とする本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートを細胞へ投与する工程を含む、HBV感染細胞におけるHBV複製の阻害のためのインビボまたはインビトロの方法を提供する。本発明のオリゴマー（領域A）として使用され得る、（WO2011/47312に開示されたような）HBVを標的とするLNAオリゴマーの例は、
0006580993.tif 000021
である。さらなる化合物は、参照によって本明細書に組み入れられる、WO2011/47312の表1、ならびにWO2011/052911、WO2012/145674、WO2012/145697、WO2013/003520、およびWO2013/159109に開示されている。
【０１０５】
RG-101は、miR-122を標的とし、Galnacコンジュゲートを含み、Regulus TherapeuticsによってHCVの処置のために開発中の化合物である。
【０１０６】
ANGPTL3（例えば、NCBI BC007059.1 GI：14712025またはBC058287.1 GI：34849466）アンジオポエチン様3-脂質、グルコース、およびエネルギーの代謝を制御するタンパク質。ANGPTL3レベルの上昇を有するヒトは、早熟心発作のリスクの増加、動脈壁厚の増加に関連した高脂血症、および複数の代謝異常、例えば、インスリン抵抗性を有する。対照的に、より低いANGPTL3レベルを有するヒトは、より低いLDLCおよびトリグリセリドのレベル、ならびに心血管疾患のより低いリスクを有する。ANGPTL3を標的とする本発明の化合物は、例えば、高脂血症および関連障害、代謝異常、アテローム性動脈硬化症、冠動脈心疾患、またはインスリン抵抗性の処置において使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO11085271は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、ANGPTL3を標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【０１０７】
グルカゴン受容体またはGCGR（BC112041.1 GI：85567507；L20316.1 GI：405189）：グルカゴンは、特に、2型糖尿病において、インスリンの作用に対抗し、グルコースを産生するよう肝臓を刺激するホルモンである。進行糖尿病を有する患者において、調節されないグルカゴン作用は、血中グルコースレベルの有意な増加に至る。従って、グルカゴン作用の減弱は、重度糖尿病を有する患者において有意なグルコース低下効果を有し得る。さらに、GCGRの低下によって、膵機能を保存しインスリン分泌を増強するホルモンである活性型のグルカゴン様ペプチドまたはGLP-1がより多く産生される。GCGRを標的とする本発明の化合物は、例えば、インスリン抵抗性、高血糖、糖尿病、例えば、1型または2型糖尿病の処置において、膵機能の保存において、そして血中グルコースレベルを調節するため、使用され得る。WO2007/134014は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、GCGRを標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【０１０８】
線維芽細胞増殖因子受容体4またはFGFR4（NCBI遺伝子2264 - NC_000005.9（176513906..176525143））FGFR4は、肝臓および脂肪組織において発現され、脂肪を貯蔵する身体の能力を減少させると同時に、脂肪燃焼およびエネルギー消費を増加させることが示されている。多くの抗肥満薬が、食欲を抑制するよう脳に作用し、一般的に、CNS副作用をもたらす。FGFR4を標的とする本発明の化合物は、例えば、インスリン抵抗性、高血糖、糖尿病、例えば、1型または2型糖尿病の処置、肥満の保存（例えば、食欲抑制薬と組み合わせて使用された時）、体重の低下、およびインスリン感受性、糖尿病、例えば、1型糖尿病または2型糖尿病の改善、および血中グルコースレベルの調節において使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO09046141およびWO12174476は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、FGFR4を標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【０１０９】
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ-2またはDGAT-2（NCBI遺伝子ID 84649）：トリグリセリドの合成における重大な成分。DGATの阻害は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）を有する患者において肝臓脂肪を低下させることができ、2型糖尿病およびインスリン抵抗性を処置するためにも使用され得る。DGAT-2を標的とする本発明の化合物は、NASHを処置するため、肝臓脂肪を低下させるため、糖尿病、例えば、2型糖尿病を処置するため、インスリン抵抗性を処置するため、使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO05019418およびWO2007136989は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、DGAT-2を標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【０１１０】
グルココルチコイド受容体またはGCCR（BC150257.1 GI：152013043）：グルココルチコイドホルモンは、身体中の多様な過程に影響を与え、過剰なレベルのグルココルチコイドホルモンは、体内の組織および器官の多くに有害な効果を及ぼし得る。クッシング症候群は、高レベルのグルココルチコイドへの長期曝露によって引き起こされる奇病である。未処置の場合、クッシング症候群を有する患者は、高血圧、糖尿病、および免疫機能障害を発症し、早期死亡の増加したリスクを有し得る。クッシング症候群のため認可された処置が存在するが、現在の医薬は、高血圧および糖尿病のような重大な副作用に関連しており、これらの患者のための新しい治療の高い満たされていない医学的必要性が残存している。GCCR-2を標的とする本発明の化合物は、クッシング症候群および関連状態（例えば、上にリストされたもの）を処置するために使用され得る。参照によって本明細書に組み入れられるWO07035759およびWO2007136988は、本発明のコンジュゲートへ組み入れられ得る、GCCRを標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。
【０１１１】
補体成分C5（M57729.1 GI：179982）：補体系は、宿主防御のための保護機序として免疫において中心的な役割を果たしているが、その制御異常は、とりわけ、発作性夜間血色素尿症（PNH）、非典型溶血性尿毒症症候群（aHUS）、重症筋無力症、視神経脊髄炎を含む広範囲のヒト疾患において、重篤な命にかかわる合併症をもたらす。補体成分C5を標的とする本発明の化合物は、これらの障害のうちの一つ以上を処置するために使用され得る。C5は、遺伝学的にも臨床的にもバリデートされた標的であり；機能喪失型ヒト変異が、ある種の感染に対する免疫防御の減弱と関連付けられており、抗C5モノクローナル抗体の静脈内投与による治療は、補体によって媒介される多数の疾患において臨床活性および認容性を示している。βサラセミアおよび鉄過剰障害の処置のための膜貫通セリンプロテアーゼ6（Tmprss6）。
【０１１２】
α-1アンチトリプシン（AAT）：（M11465.1 GI：177826）肝疾患に関連している。参照によって本明細書に組み入れられるWO13142514は、本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートへ組み入れられ得る、AATを標的とするオリゴヌクレオチド化合物を開示している。AATを標的とする本発明の化合物は、その必要のある個体において、AIAT mRNAおよびタンパク質の発現を減少させ、線維症、例えば、AIATD関連肝疾患、および肺疾患、例えば、AIATD関連肺疾患を処置するか、寛解させるか、防止するか、進行を遅くするか、または進行を止めるための方法において使用され得る。
【０１１３】
トランスサイレチン - TTR（BC005310.1 GI：13529049）：TTRを標的とする本発明のオリゴマーは、トランスサイレチンアミロイドーシスまたはTTRアミロイドーシス（組織に次第に蓄積するTTRの誤って折り畳まれた型を産生する変異遺伝子が、患者に遺伝する、重篤な希少な遺伝性疾患）を処置するために使用され得る。TTRアミロイドーシスを有する患者においては、TTRの変異型および正常型の両方が、心臓、末梢神経、および胃腸管を含む組織において小線維として発達し得る。TTR小線維の存在は、これらの組織の正常な機能に干渉し、TTRタンパク質小線維が拡大するにつれ、より多くの組織傷害が起こり疾患が悪化する。TTRは、血中の甲状腺ホルモンおよびレチノールを輸送する担体タンパク質である。TTRアミロイドーシスを有する患者においては、TTRの変異型および正常型の両方が、組織において小線維として発達し得る。本発明の化合物は、TTRアミロイドーシスを処置するために使用され得る。Benson et al.,Amyloid.2010 Jun;17(2):43-9およびAckermann et al.,Amyloid.2012 Jun;19 Suppl 1:43-4を参照されたい。本発明のオリゴマーまたはコンジュゲートにおいて使用され得る、TTRを標的とするアンチセンス化合物は、参照によって本明細書に組み入れられるUS8101743、WO11139917、およびWO10017509に開示されている。
【０１１４】
アミノレブリン酸合成酵素-1（ALAS-1）（BC011798.2 GI：33877783；AK312566.1 GI：164690365；NM_199166.2 GI：362999012；NM_000688.5 GI：362999011）。ALAS1は、ポルフィリン症の処置のための、例えば、急性間欠性ポルフィリン症（AIP）を含む肝性ポルフィリン症の処置のためのバリデートされた標的である。ALAS-1を標的とする本発明の化合物は、これらの障害の処置において使用され得る。
【０１１５】
血管内皮増殖因子またはVEGF（遺伝子ID 7422、ヒト配列：染色体：6；NC_000006.11（43737946..43754224））。VEGFは、癌において示されている。VEGFを標的とする本発明の化合物は、過剰増殖性障害、例えば、癌、例えば、肝臓癌の処置において使用され得る。
【０１１６】
表3は、本発明の化合物によって標的とされ得る肝臓標的の群、および（例えば、関連障害に罹患した者を）処置するためにそのような化合物が使用され得る医学的適応症／障害を提供する（Sehgal et al.,Liver as a target for oligonucleotide therapeutics,J.of Hepatology 2013,In Pressを参照）。
【０１１７】
【表３】
0006580993.tif 000022
【０１１８】
配列
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、標的核酸内に存在するヌクレオチド配列（即ち、オリゴマーが標的とする配列）の逆相補鎖に対応する連続ヌクレオチド配列を含む。表3は、関連適応症に対してオリゴヌクレオチド化合物を使用した前臨床開発または臨床開発の途中にあり、従って、本発明の化合物によって標的とするのに適したmRNA標的およびmiRNA標的の群を提供する。
【０１１９】
いくつかの態様において、標的は、miR-122、アポB-100、アポCIII、PCSK9、CRP、KSP、VEGF、PLK1、miR-34、FGFR4、第IXa因子、第XI因子、TTR、GCCR、PTP-1B、GCGR、AAT、ALDH2、HAMP経路、miR-33、アポ(a)、miR-7、miR-378、miR-21、Myc、miR-122、HCVゲノム、例えば、HCV 5'UTRまたはHCV NS5B RNAもしくはNS3 RNA、TMPRSS6、アンチトロンビンIII、アポCIII、ANGPLT3、MTP、DGAT2、ALAS1、アンチトロンビンIII、血清アミロイドA、および第VII因子からなる群より選択される。
【０１２０】
いくつかの態様において、連続ヌクレオチド配列は、標的配列とハイブリダイズする時、1個以下のミスマッチを含む。しかしながら領域Bは非相補的であり、任意で、その結果相補性の程度を決定する際には無視してもよい。
【０１２１】
本発明のオリゴマー（またはその領域）と、核酸の標的領域、例えば、本明細書に開示されたものとの間の「相補性」の程度の決定において、「相補性」（「相同性」または「同一性」とも）の程度は、オリゴマー（またはその領域）の配列と、最適にそれと整列する標的領域（または標的領域の逆相補鎖）の配列との間の同一性百分率（または相同性百分率）として表される。百分率は、2種の配列の間で同一である整列した塩基の数を計数し、オリゴマー内の連続モノマーの総数で割り、100を掛けることによって計算される。そのような比較において、ギャップが存在する場合、そのようなギャップは、ギャップ内のモノマーの数が本発明のオリゴマーと標的領域との間で異なる区域ではなく、単なるミスマッチであることが好ましい。
【０１２２】
本明細書において使用される、「相同の」および「相同性」という用語は、「同一性」および「同一の」という用語と交換可能である。
【０１２３】
「〜に対応する（corresponding to）」および「〜に対応する（corresponds to）」という用語は、オリゴマーのヌクレオチド配列（即ち、核酸塩基または塩基の配列）または連続ヌクレオチド配列（第1領域）と、（i）核酸標的の逆相補鎖の部分配列のいずれかより選択されるさらなる配列の等価な連続ヌクレオチド配列との間の比較をさす。ヌクレオチド類似体は、それらの等価なまたは対応するヌクレオチドと直接比較される。（i）または（ii）のさらなる配列に対応する第1配列は、典型的には、第1配列（例えば、連続ヌクレオチド配列）の全長にわたりその配列と同一であるか、または、本明細書に記載されるように、いくつかの態様において、対応する配列と少なくとも80％、例えば、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％相同、例えば、100％相同（同一）であり得る。
【０１２４】
「対応するヌクレオチド類似体」および「対応するヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチドにおけるヌクレオチドが同一であることを示すためのものである。例えば、ヌクレオチドの2-デオキシリボース単位がアデニンに連結されている時、「対応するヌクレオチド類似体」は、アデニンに連結された（2-デオキシリボースと異なる）ペントース単位を含有している。
【０１２５】
本明細書において使用される、「逆相補鎖」、「逆相補的」、および「逆相補性」という用語は、「相補鎖」、「相補的」、および「相補性」という用語と交換可能である。
【０１２６】
従って、オリゴマーの連続核酸塩基配列は、標的、例えば、本明細書において言及されたものに相補的であり得る。
【０１２７】
ヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体
本明細書において使用される、「ヌクレオチド」という用語は、糖部分（またはその類似体）と、塩基部分と、共有結合で連結された基（連結基）、例えば、ホスフェート型またはホスホロチオエート型のヌクレオチド間連結基とを含む配糖体をさし、天然に存在するヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNA、ならびに、本明細書において「ヌクレオチド類似体」とも呼ばれる、修飾型の糖および／または塩基部分を含む天然には存在しないヌクレオチドの両方を含む。本明細書において、単一のヌクレオチド（単位）は、モノマーまたは核酸単位とも呼ばれ得る。
【０１２８】
本発明に関して、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は、天然に存在するヌクレオチド／ヌクレオシド、例えば、DNAおよびRNA、ならびにヌクレオチド／ヌクレオシド類似体の両方をさすために使用されることが認識されるであろう。
【０１２９】
生化学の領域において、「ヌクレオシド」という用語は、糖部分と塩基部分とを含む配糖体をさすために一般的に使用され、従って、オリゴマーのヌクレオチドの間のヌクレオシド間連結によって共有結合で連結されたヌクレオチド単位をさす時に使用され得る。バイオテクノロジーの領域において、「ヌクレオチド」という用語は、核酸モノマーまたは単位をさすためにしばしば使用され、従って、オリゴヌクレオチドに関しては、塩基、例えば、「ヌクレオチド配列」をさすことができ、典型的には、核酸塩基配列をさす（即ち、糖骨格およびヌクレオシド間連結の存在は、潜在的である）。同様に、特に、ヌクレオシド間連結基のうちの1個以上が修飾されているオリゴヌクレオチドの場合、「ヌクレオチド」という用語は「ヌクレオシド」をさすことができ、例えば、ヌクレオシドの間の連結の存在または性質を特定する時ですら、「ヌクレオチド」という用語が使用され得る。
【０１３０】
当業者が認識するように、オリゴヌクレオチドの5'末端ヌクレオチドは、5'末端基を含んでいてもよいしまたは含んでいなくてもよいが、5'ヌクレオシド間連結基を含まない。天然には存在しないヌクレオチドには、修飾型糖部分を有するヌクレオチド、例えば、二環式ヌクレオチド、または2'修飾型ヌクレオチド、例えば、2'置換型ヌクレオチドが含まれる。
【０１３１】
「ヌクレオチド類似体」は、糖および／または塩基部分の修飾による、天然ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドのバリアントである。類似体は、原則として、「サイレント」であるに過ぎないか、またはオリゴヌクレオチドに関して、天然ヌクレオチドと「等価」であり、即ち、標的遺伝子発現を阻害するためにオリゴヌクレオチドが機能する方式に対して機能的な効果を及ぼさないものであり得る。しかしながら、そのような「等価な」類似体は、例えば、製造がより容易であるかもしくはより安価であるか、または保管もしくは製造の条件に対してより安定しているか、またはタグもしくは標識を表す場合、有用であり得る。しかしながら、好ましくは、類似体は、例えば、標的に対する結合親和性を増加させ、かつ／または細胞内ヌクレアーゼに対する抵抗性を増加させ、かつ／または細胞への輸送の容易さを増加させることによって、発現を阻害するためにオリゴマーが機能する方式に対して機能的な効果を及ぼすであろう。ヌクレオシド類似体の具体例は、例えば、Freier & Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213によって記載されており、スキーム1に記載される。
0006580993.tif 000023
スキーム1
【０１３２】
従って、オリゴマーは、天然に存在するヌクレオチド、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチド（本明細書において「DNA」と一般に呼ばれる）の単純な配列を含むかまたはそれからなっていてよいが、リボヌクレオチド（本明細書において「RNA」と一般に呼ばれる）、またはそのような天然に存在するヌクレオチドと1個以上の天然には存在しないヌクレオチド、即ち、ヌクレオチド類似体との組み合わせを含むかまたはそれからなることも可能である。そのようなヌクレオチド類似体は、適宜、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強し得る。
【０１３３】
適当な好ましいヌクレオチド類似体の例は、WO2007/031091によって提供されるか、またはその中で参照されている。本発明のオリゴマーにおいて使用され得るその他のヌクレオチド類似体には、三環式核酸が含まれ、例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO2013154798およびWO2013154798を参照されたい。
【０１３４】
オリゴマー化合物、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、本明細書において言及された化合物、例えば領域A、および、いくつかの任意の態様において、領域Bは、糖基が修飾されたヌクレオシドを1個以上含有していてもよい。そのような糖修飾型ヌクレオシド（ヌクレオシド類似体）は、増強されたヌクレアーゼ安定性、増加した結合親和性、または他の何らかの有益な生物学的特性を、アンチセンス化合物へ付与することができる。いくつかの態様において、ヌクレオシドは、化学的に修飾されたリボフラノース環部分を含む。
【０１３５】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、少なくとも1個、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、少なくとも19個、少なくとも20個、少なくとも21個、少なくとも22個、少なくとも23個、少なくとも24個、または25個のヌクレオシド類似体、例えば、糖修飾型ヌクレオシド類似体を含む。
【０１３６】
いくつかの態様において、ヌクレオシド類似体は、（任意で独立に）二環式ヌクレオシド類似体（例えば、LNA）および／または2'置換型ヌクレオシド類似体からなる群より選択され、例えば、（任意で独立に）2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-AP、2'-FANA、2'-(3-ヒドロキシ)プロピル、および2'-フルオロ-DNA単位、ならびに／またはその他の（任意での）糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、モルホリノ、ペプチド核酸（PNA）、CeNA、アンリンクト核酸（UNA）、ヘキシトール核酸（HNA）、ビシクロ-HNA（例えば、WO2009/100320を参照）からなる群より選択される。いくつかの態様において、ヌクレオシド類似体は、その標的核酸（または相補的なDNA配列もしくはRNA配列）に対する第1領域の親和性を増加させる。
【０１３７】
いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも1個の二環式ヌクレオチド類似体、例えば、LNAを含む。いくつかの態様において、第1領域は、少なくとも1個の二環式ヌクレオシド類似体（例えば、LNA）および／または2'置換型ヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマー内に存在するヌクレオシド類似体は、全て同一の糖修飾を含む。いくつかの態様において、第1領域内に存在する少なくとも1個のヌクレオシド類似体が、二環式ヌクレオシド類似体であり、例えば、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、例えば、全てのヌクレオシド類似体（領域BのDNAヌクレオシドおよびまたはRNAヌクレオシド以外）が、糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、二環式ヌクレオシド類似体、例えば、LNA、例えば、β-D-X-LNAもしくはα-L-X-LNA（Xはオキシ、アミノ、もしくはチオである）、または、限定されないが、(R/S)cET、cMOE、もしくは5'-Me-LNAを含む、本明細書に開示されたその他のLNAである。
【０１３８】
化学的に修飾されたリボフラノース環の例には、非限定的に、置換基（例えば、5'置換基および2'置換基）の付加；二環式核酸（BNA）を形成するための非ジェミナル環原子の架橋；リボシル環酸素原子のS、N(R)、またはC(R1)(R2)（R＝H、C1-C2アルキル、または保護基）への置換；ならびにそれらの組み合わせが含まれる。化学的に修飾された糖の例には、2'-F-5'-メチル置換型ヌクレオシド（他の開示された5',2'-ビス置換型ヌクレオシドについては、8/21/08に公開されたPCT国際出願WO2008/101157を参照）、リボシル環酸素原子のSへの置換および2'位でのさらなる置換（2005年6月16日に公開された、公開された米国特許出願US2005/0130923を参照）、あるいはBNAの5'置換（LNAが、例えば、5'-メチル基または5'-ビニル基によって置換された、11/22/07に公開されたPCT国際出願WO2007/134181を参照）が含まれる。
【０１３９】
修飾型糖部分を有するヌクレオシドの例には、非限定的に、5'-ビニル置換基、5'-メチル置換基（RまたはS）、4'-S置換基、2'-F置換基、2'-OCH3置換基、および2'-O(CH2)2OCH3置換基を含むヌクレオシドが含まれる。2'位の置換基は、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリル、O-C1-C10アルキル、OCF3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、およびO-CH2-C(=O)-N(Rm)（Rn）［RmおよびRnは、各々独立に、Hまたは置換型もしくは非置換型のC1-C10アルキルである］からも選択され得る。
【０１４０】
本明細書において使用される、「二環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分を含む修飾型ヌクレオシドをさす。二環式ヌクレオシドの例には、非限定的に、4'リボシル環原子と2'リボシル環原子との間に架橋を含むヌクレオシドが含まれる。いくつかの態様において、本明細書に提供される化合物には、架橋が4'〜2'二環式ヌクレオシドを含む、1種以上の二環式ヌクレオシドが含まれる。そのような4'〜2'二環式ヌクレオシドの例には、以下の式のうちのいずれかが含まれるが、これらに限定されない：4'-(CH2)-O-2'（LNA）；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'（ENA）；4'-CH(CH3)-O-2'、および4'-CH(CH2OCH3)-O-2*、ならびにそれらの類似体（2008年7月15日に発行された米国特許第7,399,845号を参照）；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'およびその類似体（2009年1月8日に公開された公開されたPCT国際出願WO2009/006478を参照）；4'-CH2-N(OCH3)-2'およびその類似体（2008年12月11日に公開された、公開されたPCT国際出願WO2008/150729を参照）；4'-CH2-O-N(CH3)-2'（2004年9月2日に公開された、公開された米国特許出願US2004/0171570を参照）；4'-CH2-N(R)-O-2'［Rは、H、C1-C10アルキル、または保護基である］（2008年9月23日に発行された米国特許第7,427,672号を参照）；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'（Chattopadhyaya,et al,J.Org.Chem.,2009,74,118-134を参照）；ならびに4'-CH2-C(=CH2)-2'およびその類似体（2008年12月8日に公開された、公開されたPCT国際出願WO2008/154401を参照）。例えば、Singh et al.,Chem.Commun.,1998,4,455-456；Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630；Wahlestedt et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,5633-5638；Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222；Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039；Srivastava et al.,J.Am.Chem.Soc,129(26)8362-8379(Jul.4,2007)；Elayadi et al.,Curr.Opinion Invens.Drugs,2001,2,558-561；Braasch et al.,Chem.Biol,2001,8,1-7；Oram et al,Curr.Opinion Mol.Ther.,2001,3,239-243；米国特許第6,670,461号、第7,053,207号、第6,268,490号、第6,770,748号、第6,794,499号、第7,034,133号、第6,525,191号、第7,399,845号；公開されたPCT国際出願WO2004/106356、WO94/14226、WO2005/021570、およびWO2007/134181；米国特許公開番号US2004/0171570、US2007/0287831、およびUS2008/0039618；ならびに米国特許出願番号12/129,154、60/989,574、61/026,995、61/026,998、61/056,564、61/086,231、61/097,787、および61/099,844；ならびにPCT国際出願番号PCT/US2008/064591、PCT/US2008/066154、およびPCT/US2008/068922も参照。上記二環式ヌクレオシドの各々は、1種以上の立体化学的糖配置、例えば、a-L-リボフラノースおよびβ-D-リボフラノースを有して、調製され得る（1999年3月25日にWO99/14226として公開されたPCT国際出願PCT DK98/00393を参照）。
【０１４１】
いくつかの態様において、BNAヌクレオシドの二環式糖部分には、ペントフラノシル糖部分の4'位と2'位との間に少なくとも1個の架橋を有する化合物が含まれるが、これらに限定されない。そのような架橋は、独立に、-[CiRaXRb)],,-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-C(=NRa)-、-C(=O)-、-C(=S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(=O)x-、および-N(Ra)-［式中、xは、0、1、または2であり；nは、1、2、3、または4であり；RaおよびRbは、各々独立に、H、保護基、ヒドロキシル、C1-C12アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-Ci2アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-Ci2アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C5-C20アリール、置換型C5-C20アリール、複素環ラジカル、置換型複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換型ヘテロアリール、C5-C7脂環式ラジカル、置換型C5-C7脂環式ラジカル、ハロゲン、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、アシル（C(=O)-H）、置換型アシル、CN、スルホニル（S(=O)2-J1）、またはスルホキシル（S(=O)-J1）であり；J1およびJ2は、各々独立に、H、C1-C6アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C5-C20アリール、置換型C5-C20アリール、アシル（C(=O)-H）、置換型アシル、複素環ラジカル、置換型複素環ラジカル、C1-C12アミノアルキル、置換型C1-C12アミノアルキル、または保護基である］より独立に選択される1個または2〜4個の連結された基を含む。
【０１４２】
いくつかの態様において、二環式糖部分の架橋は、-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-、または-C(RaRb)-O-N(R)-である。いくつかの態様において、架橋は、4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'、4*-(CH2)2-O-2'、4'-CH2-O-N(R)-2'、および4'-CH2-N(R)-O-2'-［式中、Rは、各々独立に、H、保護基、またはC1-C12アルキルである］である。
【０１４３】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、異性体配置によってさらに定義される。例えば、4'-2'メチレン-オキシ架橋を含むヌクレオシドは、a-L配置またはβ-D配置にあり得る。以前に、アンチセンス活性を示したアンチセンスオリゴヌクレオチドへ、a-L-メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNAが組み入れられた（Frieden et al,Nucleic Acids Research,2003,21,6365-6372）。
【０１４４】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドには、以下に図示されるような、（A）a-L-メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、（B）β-D-メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、（C）エチレンオキシ（4'-(CH2)2-O-2'）BNA、（D）アミノオキシ（4'-CH2-O-N(R)-2'）BNA、（E）オキシアミノ（4'-CH2-N(R)-O-2'）BNA、（F）メチル(メチレンオキシ)（4'-CH(CH3)-O-2'）BNA、（G）メチレン-チオ（4'-CH2-S-2'）BNA、（H）メチレン-アミノ（4'-CH2-N(R)-2'）BNA、（I）メチル炭素環式（4'-CH2-CH(CH3)-2'）BNA、および（J）プロピレン炭素環式（4'-(CH2)3-2'）BNAが含まれるが、これらに限定されない。
0006580993.tif 000024
式中、Bxは、塩基部分であり、Rは、独立に、H、保護基、またはC1-C2アルキルである。
【０１４５】
特定の態様において、二環式ヌクレオシドは、式Iを有する：
0006580993.tif 000025
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
-Qa-Qb-Qc-は、-CH2-N(Rc)-CH2-、-C(=O)-N(Rc)-CH2-、-CH2-O-N(Rc)-、-CH2-N(Rc)-O-、または-N(Rc)-O-CH2であり；
Rcは、C1-C12アルキルまたはアミノ保護基であり；かつ
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着である。
【０１４６】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式IIを有する：
0006580993.tif 000026
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；Zaは、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換型C1-C6アルキル、置換型C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルキニル、アシル、置換型アシル、置換型アミド、チオール、または置換型チオである。
【０１４７】
いくつかの態様において、置換型の基は、各々独立に、ハロゲン、オキソ、ヒドロキシル、OJc、NJd、SJc、N3、OC(=X)Jc、およびNJeC(=X)NJcJdより独立に選択される置換基によって一置換または多置換されている。Jc、Jd、およびJeは、各々独立に、H、C1-C6アルキル、または置換型C1-C6アルキルであり、Xは、OまたはNJCである。
【０１４８】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式IIIを有する：
0006580993.tif 000027
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；
Rdは、C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換型C1-C6アルキル、置換型C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルキニル、または置換型アシル（C(=O)-）である。
【０１４９】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式IVを有する：
0006580993.tif 000028
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；
Rdは、C1-C6アルキル、置換型C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、置換型C2-C6アルキニルであり；qb、qc、およびqdは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C6アルキル、置換型C1-C6アルキル、C2-Ceアルケニル、置換型C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、または置換型C2-C6アルキニル、C1-C6アルコキシル、置換型Q-C6アルコキシル、アシル、置換型アシル、C1-C6アミノアルキル、または置換型C1-C6アミノアルキルである。
【０１５０】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式Vを有する：
0006580993.tif 000029
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体への共有結合性の付着であり；qa、qb、qc、およびqfは、各々独立に、水素、ハロゲン、C1-C12アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシ、置換型C1-C12アルコキシ、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk、もしくはN(H)C(=S)NJjJkであるか；またはqeおよびqfは、共に、=C(qg)(qh)であり；qgおよびqhは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキル、または置換型C1-C12アルキルである。
【０１５１】
メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNAモノマー、アデニン、シトシン、グアニン、5-メチル-シトシン、チミン、およびウラシルの合成および調製は、それらのオリゴマー化および核酸認識特性と共に記載されている（例えば、Koshkin et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630を参照）。BNAおよびその調製は、WO98/39352およびWO99/4226にも記載されている。
【０１５２】
メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、メチレンオキシ（4'-CH2-O-2'）BNA、および2'-チオ-BNAの類似体も、調製されている（例えば、Kumar et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1998,8,2219-2222を参照）。核酸ポリメラーゼの基質としてのロックドヌクレオシド類似体を含むオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖の調製も記載されている（例えば、Wengel et al.,WO99/14226を参照）。さらに、新規の立体構造的に制限された高親和性オリゴヌクレオチド類似体である2'-アミノ-BNAの合成が、当技術分野において記載されている（例えば、Singh et al.,J.Org.Chem.,1998,63,10035-10039を参照）。さらに、2'-アミノ-BNAおよび2'-メチルアミノ-BNAが調製されており、相補的なRNA鎖およびDNA鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性が以前に報告されている。
【０１５３】
いくつかの態様において、二環式ヌクレオシドは、式VIを有する：
0006580993.tif 000030
式中、Bxは、複素環式塩基部分であり；
TaおよびTbは、各々独立に、H、ヒドロキシル保護基、コンジュゲート基、反応性リン基、リン部分、または支持媒体へ共有結合性の付着であり；qj、qj、qk、およびqlは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキル、置換型C1-C12アルキル、C2-C12アルケニル、置換型C2-C12アルケニル、C2-C12アルキニル、置換型C2-C12アルキニル、C1-C12アルコキシル、置換型C2-C12アルコキシル、OJj、SJj、SOJj、SO2Jj、NJjJk、N3、CN、C(=O)OJj、C(=O)NJjJk、C(=O)Jj、O-C(=O)NJjJk、N(H)C(=NH)NJjJk、N(H)C(=O)NJjJk、または(H)C(=S)NJjJkであり；かつqiおよびqjまたはqlおよびqkは、共に、=C(qg)(qh)［式中、qgおよびqhは、各々独立に、H、ハロゲン、C1-C12アルキル、または置換型C1-C6アルキルである］である。
【０１５４】
4'-(CH2)3-2'架橋およびアルケニル類似体、架橋4'-CH=CH-CH2-2'を有する、ある炭素環式二環式ヌクレオシドが、記載されている（例えば、Freier et al,Nucleic Acids Research,1997,25(22),4429-4443およびAlbaek et al,J.Org.Chem.,2006,71,7731-77'40を参照）。炭素環式二環式ヌクレオシドの合成および調製も、それらのオリゴマー化および生化学的研究と共に記載されている（例えば、Srivastava et al,J.Am.Chem.Soc.2007,129(26),8362-8379を参照）。
【０１５５】
本明細書において使用される、「4'〜2'（4'-2'）二環式ヌクレオシド」または「4'〜2'（4' to 2'）二環式ヌクレオシド」とは、2'炭素原子と4'炭素原子とを接続する架橋を含むフラノース環を含む二環式ヌクレオシドをさす。
【０１５６】
本明細書において使用される、「単環式ヌクレオシド」とは、二環式糖部分でない修飾型糖部分を含むヌクレオシドをさす。いくつかの態様において、ヌクレオシドの糖部分または糖部分類似体は、任意の位置で修飾または置換されていてよい。本明細書において使用される、「2'修飾型糖」とは、2'位において修飾されたフラノシル糖を意味する。いくつかの態様において、そのような修飾には、以下のものより選択される置換基が含まれる：限定されないが、置換型および非置換型のアルコキシ、置換型および非置換型のチオアルキル、置換型および非置換型のアミノアルキル、置換型および非置換型のアルキル、置換型および非置換型のアリル、ならびに置換型および非置換型のアルキニルを含む、ハロゲン化物。いくつかの態様において、2'修飾は、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2),,NH2、O(CH2),,CH3、O(CH2),,ONH2、OCH2C(=O)N(H)CH3、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3]2（式中、nおよびmは、1〜約10である）を含むが、これらに限定されない置換基より選択される。その他の2'置換基も、以下のものより選択され得る：C1-C12アルキル；置換型アルキル；アルケニル；アルキニル；アルカリル；アラルキル；O-アルカリルまたはO-アラルキル；SH；SCH3；OCN；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリル；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換型シリル；R；切断基；レポーター基；インターカレーター；薬物動態学的特性を改善するための基；およびアンチセンス化合物の薬力学的特性を改善するための基、ならびに類似の特性を有するその他の置換基。いくつかの態様において、修飾型ヌクレオシドは、2'-MOE側鎖を含む（例えば、Baker et al.,J.Biol.Chem.,1997,272,1 1944-12000を参照）。そのような2'-MOE置換は、未修飾ヌクレオシド、ならびに2'-O-メチル、O-プロピル、およびO-アミノプロピルのようなその他の修飾型ヌクレオシドと比較して改善された結合親和性を有することが記載されている。2-MOE置換基を有するオリゴヌクレオチドは、インビボで使用するための有望な特色を有する遺伝子発現のアンチセンス阻害剤であることも示されている（例えば、Martin,P.,He/v.Chim.Acta,1995,78,486-504；Altmann et al.,Chimia,1996,50,168-176；Altmann et al.,Biochem.Soc.Trans.,1996,24,630-637；およびAltmann et al.,Nucleosides Nucleotides,1997,16,917-926を参照）。
【０１５７】
本明細書において使用される、「修飾型テトラヒドロピランヌクレオシド」または「修飾型THPヌクレオシド」とは、通常のヌクレオシドにおけるペントフラノシル残基が6員テトラヒドロピラン「糖」（糖代替物）に置換されているヌクレオシドを意味する。修飾された?THPヌクレオシドには、ヘキシトール核酸（HNA）、アニトール核酸（ANA）、マニトール（manitol）核酸（MNA）（Leumann,CJ.Bioorg.and Med.Chem.(2002)10:841-854を参照）、フルオロHNA（F-HNA）と当技術分野において呼ばれているもの、または式Xを有する化合物が含まれるが、これらに限定されない：
式X
0006580993.tif 000031
式中、式Xの少なくとも1つの前記テトラヒドロピランヌクレオシド類似体のそれぞれについて独立に、
Bxは、複素環式塩基部分であり；
T3およびT4は、各々独立に、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物と連結しているヌクレオシド間連結基であるか、またはT3およびT4の一方が、テトラヒドロピランヌクレオシド類似体をアンチセンス化合物と連結しているヌクレオシド間連結基であり、かつT3およびT4の他方が、H、ヒドロキシル保護基、連結されたコンジュゲート基、または5'末端もしくは3'末端の基であり；q1、q2、q3、q4、q5、q6、およびq7は、各々独立に、H、C1-C6アルキル、置換型C1-C6アルキル、C2-C6アルケニル、置換型C2-C6アルケニル、C2-C6アルキニル、または置換型C2-C6アルキニルであり；かつR1およびR2の一方は、水素であり、かつ他方は、ハロゲン、置換型または非置換型のアルコキシ、NJ、J2、SJ、N3、OC(=X)J1、OC(=X)NJ1J2、NJ3C(=X)NJ1J2、およびCN［式中、Xは、O、S、またはNJ1であり、J1、J2、およびJ3は、各々独立に、HまたはC1-C6アルキルである］より選択される。
【０１５８】
いくつかの態様において、qm、qn、qp、qr、qs、qt、およびquが各々Hである、式Xの修飾型THPヌクレオシドが提供される。いくつかの態様において、qm、qn、qp、qr、qs、qt、およびquのうちの少なくとも1個は、H以外である。いくつかの態様において、qm、qn、qp、qr、qs、qt、およびquのうちの少なくとも1個は、メチルである。いくつかの態様において、R1およびR2のうちの一方がFである、式XのTHPヌクレオシドが提供される。いくつかの態様において、R1がフルオロであり、かつR2がHであり、R1がメトキシであり、かつR2がHであり、R1がメトキシエトキシであり、かつR2がHである。
【０１５９】
本明細書において使用される、「2'修飾型」または「2'置換型」とは、HまたはOH以外の置換基を2'位に含む糖を含むヌクレオシドをさす。2'修飾型ヌクレオシドには、非架橋2'置換基、例えば、アリル、アミノ、アジド、チオ、O-アリルおよびO-C1-C10アルキル、-OCF3、O-(CH2)2-O-CH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、またはO-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)［式中、RmおよびR,,は、各々独立に、Hまたは置換型もしくは非置換型のC1-C10アルキルである］を有するヌクレオシドが含まれるが、これらに限定されない。2'修飾型ヌクレオシドは、例えば、糖の他の位置および／または核酸塩基に、他の修飾をさらに含んでいてもよい。
【０１６０】
本明細書において使用される、「2'-F」とは2'位にフルオロ基を含む糖をさす。
【０１６１】
本明細書において使用される、「2'-OMe」または「2'-OCH3」または「2'-O-メチル」とは、各々、糖環の2'位に-OCH3基を含む糖を含むヌクレオシドをさす。
【０１６２】
本明細書において使用される、「オリゴヌクレオチド」とは、多数の連結されたヌクレオシドを含む化合物をさす。
【０１６３】
いくつかの態様において、多数のヌクレオシドのうちの1個以上が修飾型である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、1個以上のリボヌクレオシド（RNA）および／またはデオキシリボヌクレオシド（DNA）を含む。
【０１６４】
アンチセンス化合物へ組み入れるためのヌクレオシドを修飾するために使用され得るその他の多くのビシクロ糖代替環系およびトリシクロ糖代替環系も、当技術分野において公知である（例えば、概説論文：Leumann,J.C,Bioorganic and Medicinal Chemistry,2002,10,841-854を参照）。そのような環系は、活性を増強するために様々な付加的な置換を受けることができる。修飾型糖の調製の方法は、当業者に周知である。修飾型糖部分を有するヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分（天然、修飾型、またはそれらの組み合わせ）は、適切な核酸標的とのハイブリダイゼーションのため、維持される。
【０１６５】
いくつかの態様において、アンチセンス化合物は、修飾型糖部分を有するヌクレオチドを1個以上含む。いくつかの態様において、修飾型糖部分は2'-MOEである。いくつかの態様において、2'-MOE修飾型ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフに配置される。いくつかの態様において、修飾型糖部分は、cEtである。いくつかの態様において、cEt修飾型ヌクレオチドは、ギャップマーモチーフのウィング（wing）全体に配置される。
【０１６６】
いくつかの態様において、BNA（LNA）において、R4*およびR2*は、共に、R配置またはS配置のいずれかにあるビラジカル-O-CH(CH2OCH3)-を表す（2'O-メトキシエチル二環式核酸 - Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１６７】
いくつかの態様において、BNA（LNA）において、R4*およびR2*は、共に、R配置またはS配置のいずれかにあるビラジカル-O-CH-(CH2CH3)-を表す（2'O-エチル二環式核酸 - Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１６８】
いくつかの態様において、BNA（LNA）において、R4*およびR2*は、共に、R配置またはS配置のいずれかにあるビラジカル-O-CH-(CH3)-を表す。いくつかの態様において、R4*およびR2*は、共に、ビラジカル-O-CH2-O-CH2-を表す（Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１６９】
いくつかの態様において、BNA（LNA）において、R4*およびR2*は、共に、ビラジカル-O-NR-CH3-を表す（Seth at al.,2010,J.Org.Chem）。
【０１７０】
いくつかの態様において、LNA単位は、以下の群より選択される構造を有する。
0006580993.tif 000032
【０１７１】
本発明者らは、(S)-cETを使用したcET化合物（WO2009/12495の化合物ID 6/411847）および比較のためのβ-D-オキシLNA化合物（WO2009/12495の6/392063）の腎毒性を評価し、cET化合物が、β-D-オキシLNA対照と比較して、驚くほど高い腎毒性を誘発することを見出した。研究は単回投与研究であり、3日後に屠殺を行った（方法論についてはEP1984381、実施例41を参照されたい。ただし、本発明者らはNMRIマウスを使用した）。組織学的分析によって腎毒性を確認した。顕著に、血清ALTが認められる投薬量より低いcET化合物の投薬量で、腎毒性の兆候が見られ、このことから、cET化合物について、腎毒性が具体的に問題となり得ることが示された。従って、本発明のコンジュゲート、例えば、3価GalNAcコンジュゲートの使用は、cET化合物のようなLNA化合物の腎毒性を低下させるために高度に有用である。
【０１７２】
従って、オリゴマーは、天然に存在するヌクレオチド、好ましくは、2'-デオキシヌクレオチド（本明細書において「DNA」と一般に呼ばれる）の単純な配列を含むかまたはそれからなっていてもよいが、リボヌクレオチド（本明細書において「RNA」と一般に呼ばれる）、またはそのような天然に存在するヌクレオチドと1個以上の天然には存在しないヌクレオチド、即ち、ヌクレオチド類似体との組み合わせを含むかまたはそれからなることも可能である。そのようなヌクレオチド類似体は、適宜、標的配列に対するオリゴマーの親和性を増強し得る。
【０１７３】
親和性増強ヌクレオチド類似体、例えば、BNA（例えば、LNA）または2'置換型糖のオリゴマーへの組み入れは、特異的に結合するオリゴマーのサイズの低下を可能にすることができ、非特異的なまたは異常な結合が起こる前にオリゴマーのサイズに対する上限を低下させることもできる。
【０１７４】
いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも1個のヌクレオシド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、少なくとも2個のヌクレオチド類似体を含む。いくつかの態様において、オリゴマーは、3〜8個のヌクレオチド類似体、例えば、6個または7個のヌクレオチド類似体を含む。現在最も好ましい態様において、該ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個は、BNA、例えば、ロックド核酸（LNA）であり；例えば、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも3個または少なくとも4個または少なくとも5個または少なくとも6個または少なくとも7個または8個が、BNA、例えば、LNAであり得る。いくつかの態様において、全てのヌクレオチド類似体が、BNA、例えば、LNAであり得る。
【０１７５】
ヌクレオチドのみからなる好ましいヌクレオチド配列モチーフまたはヌクレオチド配列に言及する際、その配列によって定義される本発明のオリゴマーは、該配列に存在するヌクレオチドのうちの1個以上の代わりに、対応するヌクレオチド類似体、例えば、オリゴマー／標的二重鎖の二重鎖安定性／Tmを上昇させるBNA単位またはその他のヌクレオチド類似体（即ち、親和性増強ヌクレオチド類似体）を含んでいてもよいことが認識されるであろう。
【０１７６】
好ましいヌクレオチド類似体は、LNA、例えば、オキシ-LNA（例えば、β-D-オキシ-LNAおよびα-L-オキシ-LNA）ならびに／またはアミノ-LNA（例えば、β-D-アミノ-LNAおよびα-L-アミノ-LNA）ならびに／またはチオ-LNA（例えば、β-D-チオ-LNAおよびα-L-チオ-LNA）ならびに／またはENA（例えば、β-D-ENAおよびα-L-ENA）である。
【０１７７】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマー内に存在するさらなるヌクレオチド類似体は、例えば、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、BNA単位、例えば、LNA単位、アラビノ核酸（ANA）単位、2'-フルオロ-ANA単位、HNA単位、INA単位（インターカレーティング核酸 - 参照によって本明細書に組み入れられるChristensen,2002.Nucl.Acids.Res.2002 30:4918-4925）、および2'MOE単位より独立に選択される。いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体の上記のタイプのうちの一つのみが、本発明のオリゴマー、例えば、その第1領域または連続ヌクレオチド配列に存在する。
【０１７８】
いくつかの態様において、さらなるヌクレオチド類似体は、2'-O-メトキシエチル-RNA（2'MOE）、2'-フルオロ-DNAモノマー、またはLNAヌクレオチド類似体であり、従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、これらの三つのタイプの類似体より独立に選択されるヌクレオチド類似体を含んでいてもよいし、または三つのタイプより選択される一つのタイプの類似体のみを含んでいてもよい。いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個は、2'-MOE-RNAであり、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個が、2'-MOE-RNAヌクレオチド単位である。いくつかの態様において、ヌクレオチド類似体のうちの少なくとも1個は、2'-フルオロDNAであり、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個が、2'-フルオロ-DNAヌクレオチド単位である。
【０１７９】
本発明によるオリゴマーは、少なくとも1個のBNA、例えば、ロックド核酸（LNA）単位、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、もしくは8個のBNA/LNA単位、例えば、3〜7個もしくは4〜8個のBNA/LNA単位、または3個、4個、5個、6個、もしくは7個のBNA/LNA単位を含む。いくつかの態様において、全てのヌクレオチド類似体が、BNA、例えば、LNAである。いくつかの態様において、オリゴマーは、β-D-オキシ-LNA、および以下のLNA単位のうちの1種以上の両方を含み得る：β-D配置もしくはα-L配置のいずれかまたはそれらの組み合わせにあるチオ-LNA、アミノ-LNA、オキシ-LNA、および／またはENA。いくつかの態様において、全てのBNA、例えば、LNAシトシン単位が、5'-メチル-シトシンである。本発明のいくつかの態様において、オリゴマー（例えば、第1領域、任意で第2領域）は、BNA単位およびLNA単位ならびにDNA単位の両方を含み得る。いくつかの態様において、LNA単位およびDNA単位の合計は、10〜25、例えば、10〜24、好ましくは、10〜20、例えば、10〜18、例えば、12〜16である。本発明のいくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域のヌクレオチド配列、例えば、連続ヌクレオチド配列は、少なくとも1個のBNA、例えば、LNAからなり、残りのヌクレオチド単位はDNA単位である。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、BNA、例えば、LNA、ヌクレオチド類似体、および天然に存在するヌクレオチド（例えば、RNAヌクレオチドまたはDNAヌクレオチド、最も好ましくは、DNAヌクレオチド）のみを、任意で、修飾型ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエートと共に含む。
【０１８０】
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオチドの塩基部分をさし、天然に存在するバリアントおよび天然には存在しないバリアントの両方を含む。従って、「核酸塩基」は、公知のプリン複素環およびピリミジン複素環のみならず、それらの複素環式類似体および互変異性体も含む。領域BのDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドは、天然に存在する核酸塩基および／または天然には存在しない核酸塩基、例えば、A、C、T、およびGの群、またはC、T、およびGの群より独立に選択されるDNA核酸塩基を有し得ることが認識されるであろう。
【０１８１】
核酸塩基の例には、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、ヒポキサンチン、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、5-メチルシトシンからなる群より独立に選択され得る。いくつかの態様において、核酸塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、および5-メチルシトシンからなる群より独立に選択され得る。
【０１８２】
いくつかの態様において、オリゴマー内に存在する核酸塩基のうちの少なくとも1個は、5-メチルシトシン、イソシトシン、プソイドイソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンからなる群より選択される修飾型核酸塩基である。
【０１８３】
LNA
「LNA」という用語は、C2*-C4*ビラジカル（架橋）を含み、「ロックド核酸」として公知である二環式ヌクレオシド類似体をさす。それはLNAモノマーをさす場合もあるし、または「LNAオリゴヌクレオチド」に関して使用された時、LNAとは、1個以上のそのような二環式ヌクレオチド類似体を含有しているオリゴヌクレオチドをさす。いくつかの局面において、二環式ヌクレオシド類似体は、LNAヌクレオチドであり、従って、これらの用語は、交換可能に使用され得、そのような態様において、いずれも、リボース糖環のC2'とC4'との間のリンカー基（例えば、架橋）の存在を特徴とする。
【０１８４】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド化合物において使用されるLNAは、好ましくは、一般式IIの構造を有する：
0006580993.tif 000033
式中、Yは、-O-、-CH2O-、-S-、-NH-、N(Re)、および／または-CH2-からなる群より選択され；
0006580993.tif 000034
は、ヌクレオチド間連結、RH、末端基、または保護基の中から独立に選択され；Bは、天然または非天然のヌクレオチド塩基部分（核酸塩基）を構成し、RHは、水素およびC1-4-アルキルより選択され；Ra、Rb、Rc、Rd、およびReは、任意で独立に、水素、置換されていてもよいC1-12-アルキル、置換されていてもよいC2-12-アルケニル、置換されていてもよいC2-12-アルキニル、ヒドロキシ、C1-12-アルコキシ、C2-12-アルコキシアルキル、C2-12-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-12-アルコキシカルボニル、C1-12-アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ-カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロ-アリールオキシ-カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)-アミノ-カルボニル、アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、モノ-およびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキル-アミノカルボニル、C1-6-アルキル-カルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ（sulphono）、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、DNAインターカレーター、光化学的活性を有する基、熱化学的活性を有する基、キレート基、レポーター基、ならびにリガンドからなる群より選択され、ここで、アリールおよびヘテロアリールは、置換されていてもよく、2個のジェミナル置換基RaおよびRbは、共に、置換されていてもよいメチレン（=CH2）を表し得；RHは、水素およびC1-4-アルキルより選択される。いくつかの態様において、Ra、Rb、Rc、Rd、およびReは、任意で独立に、水素およびC1-6アルキル、例えば、メチルからなる群より選択される。全ての不斉中心について、非対称基はR方向またはS方向のいずれかで見出され得、例えば、2種の例示的な立体化学的異性体には、以下のように図示され得るβ-Dアイソフォームおよびα-Lアイソフォームが含まれる。
0006580993.tif 000035
【０１８５】
具体的な例示的LNA単位は以下に示される。
0006580993.tif 000036
【０１８６】
「チオ-LNA」という用語には、上記一般式中のYがSまたは-CH2-S-より選択される、ロックドヌクレオチドが含まれる。チオ-LNAは、β-D配置およびα-L配置の両方であり得る。
【０１８７】
「アミノ-LNA」という用語には、上記一般式中のYが-N(H)-、N(R)-、CH2-N(H)-、および-CH2-N(R)-（式中、Rは水素およびC1-4-アルキルより選択される）より選択される、ロックドヌクレオチドが含まれる。アミノ-LNAは、β-D配置およびα-L配置の両方であり得る。
【０１８８】
「オキシ-LNA」という用語には、上記一般式中のYが-O-を表す、ロックドヌクレオチドが含まれる。オキシ-LNAは、β-D配置およびα-L配置の両方であり得る。
【０１８９】
「ENA」という用語には、上記一般式中のYが-CH2-O-（式中、-CH2-O-の酸素原子は塩基Bに対して2'位に付着している）である、ロックドヌクレオチドが含まれる。Reは水素またはメチルである。
【０１９０】
いくつかの例示的な態様において、LNAは、β-D-オキシ-LNA、α-L-オキシ-LNA、β-D-アミノ-LNA、およびβ-D-チオ-LNAより選択され、具体的には、β-D-オキシ-LNAである。
【０１９１】
RNAseリクルートメント
オリゴマー化合物は、非RNase媒介型の標的mRNAの分解を介して、例えば、翻訳の立体的な障害またはその他の方法によって機能し得ることが認識される。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーは、エンドリボヌクレアーゼ（RNase）、例えば、RNaseHをリクルートすることができる。
【０１９２】
そのようなオリゴマー、例えば、領域Aまたは連続ヌクレオチド配列は、少なくとも6連続ヌクレオチド単位、例えば、少なくとも7連続ヌクレオチド単位、例えば、少なくとも8または少なくとも9連続ヌクレオチド単位（残基）の領域を含むことが好ましく、7連続ヌクレオチド、8連続ヌクレオチド、9連続ヌクレオチド、10連続ヌクレオチド、11連続ヌクレオチド、12連続ヌクレオチド、13連続ヌクレオチド、14連続ヌクレオチド、15連続ヌクレオチド、または16連続ヌクレオチドを含み、相補的な標的RNAとの二重鎖を形成した時に、RNaseをリクルートすることができる。RNAseをリクルートすることができる連続配列は、本明細書に記載されるギャップマーに関して言及される領域Y'であり得る。いくつかの態様において、RNAseをリクルートすることができる連続配列、例えば、領域Y'のサイズは、より大きく、例えば、10ヌクレオチド単位、11ヌクレオチド単位、12ヌクレオチド単位、13ヌクレオチド単位、14ヌクレオチド単位、15ヌクレオチド単位、16ヌクレオチド単位、17ヌクレオチド単位、18ヌクレオチド単位、19ヌクレオチド単位、または20ヌクレオチド単位であってもよい。
【０１９３】
EP 1 222 309は、RNaseHをリクルートする能力を決定するために使用され得る、RNaseH活性を決定するためのインビトロの方法を提供する。相補的なRNA標的と共に準備された時に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供された方法論を使用して、同一の塩基配列を有するが、DNAモノマーのみを含有しており、2'置換を有しておらず、オリゴヌクレオチド内の全てのモノマーの間にホスホロチオエート連結基を有するDNAのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定された初速度の少なくとも1％、例えば、少なくとも5％、例えば、少なくとも10％、または20％を超える、pmol/l/分で測定される初速度を有している場合、そのオリゴマーは、RNaseHをリクルートすることができると見なされる。
【０１９４】
いくつかの態様において、相補的なRNA標的およびRNaseHと共に準備された時に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法論を使用して、pmol/l/分で測定されるRNaseH初速度が、2'置換を有しておらず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定された初速度の1％未満、例えば、5％未満、例えば、10％未満、または20％未満である場合、そのオリゴマーはRNaseHをリクルートすることが本質的にできないと見なされる。
【０１９５】
他の態様において、相補的なRNA標的およびRNaseHと共に準備された時に、EP 1 222 309の実施例91〜95によって提供される方法論を使用して、pmol/l/分で測定されるRNaseH初速度が、2'置換を有しておらず、オリゴヌクレオチド内の全てのヌクレオチドの間にホスホロチオエート連結基を有する等価なDNAのみのオリゴヌクレオチドを使用して決定された初速度の少なくとも20％、例えば、少なくとも40％、例えば、少なくとも60％、例えば、少なくとも80％である場合、そのオリゴマーはRNaseHをリクルートすることができると見なされる。
【０１９６】
典型的には、相補的な標的RNAとの二重鎖を形成した時にRNaseをリクルートすることができる連続ヌクレオチド単位を形成するオリゴマーの領域は、RNA標的と共にDNA/RNA様二重鎖を形成するヌクレオチド単位からなる。本発明のオリゴマー、例えば、第1領域は、ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体の両方を含むヌクレオチド配列を含んでいてよく、例えば、ギャップマー、ヘッドマー（headmer）、またはミックスマーの形態にあり得る。
【０１９７】
「ヘッドマー」とは、領域Y'の最も5'のモノマーが、領域X'の最も3'のモノマーに連結されている、領域X'およびそれと連続している領域Y'を含むオリゴマーとして定義される。領域X'は、RNaseをリクルートしないヌクレオシド類似体の連続ストレッチを含み、領域Y'は、RNaseによって認識可能であり切断可能であるDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーの連続ストレッチ（例えば、少なくとも7連続モノマー）を含む。
【０１９８】
「テールマー（tailmer）」とは、領域Y'の最も5'のモノマーが領域X'の最も3'のモノマーに連結されている、領域X'およびそれと連続している領域Y'を含むオリゴマーとして定義される。領域X'は、RNaseによって認識可能であり切断可能であるDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーの連続ストレッチ（例えば、少なくとも7連続モノマー）を含み、領域X'は、RNaseをリクルートしないヌクレオシド類似体の連続ストレッチを含む。
【０１９９】
「ミックスマー」と呼ばれる他の「キメラ」オリゴマーは、（i）RNaseによって認識可能であり切断可能であるDNAモノマーまたはヌクレオシド類似体モノマーと、（ii）RNaseをリクルートしないヌクレオシド類似体モノマーとの交互の組成からなる。
【０２００】
いくつかの態様において、標的領域に対するオリゴマーの親和性の増強に加えて、いくつかのヌクレオシド類似体は、RNase（例えば、RNaseH）の結合および切断も媒介する。α-L-LNA（BNA）モノマーは、ある程度までRNaseH活性をリクルートするため、いくつかの態様において、α-L-LNAモノマーを含有しているオリゴマーのギャップ領域（例えば、本明細書において言及される領域Y'）は、RNaseHによって認識可能でありかつ切断可能である、より少ないモノマーからなり、ミックスマー構築に、より高いの柔軟性が導入される。
【０２０１】
ギャップマー設計
いくつかの態様において、本発明のオリゴマー、例えば、第1領域は、ギャップマーを含むかまたはギャップマーである。ギャップマーオリゴマーは、RNAse、例えば、RNAseHをリクルートすることができるヌクレオチドの連続ストレッチ、例えば、本明細書において領域Y'（Y'）と呼ばれる、少なくとも6 DNAヌクレオチドまたは7 DNAヌクレオチドの領域を含むオリゴマーであり、領域Y'の5'および3'の両方に、親和性増強ヌクレオチド類似体の領域が隣接している。例えば、RNAseをリクルートすることができるヌクレオチドの連続ストレッチの5'および3'に、1〜6個のヌクレオチド類似体が隣接している。これらの領域は、それぞれ領域X'（X'）および領域Z'（Z'）と呼ばれる。ギャップマーの例は、WO2004/046160、WO2008/113832、およびWO2007/146511に開示されている。
【０２０２】
いくつかの態様において、RNAseをリクルートすることができるモノマーは、DNAモノマー、α-L-LNAモノマー、C4'アルキル化DNAモノマー（参照によって本明細書に組み入れられるPCT/EP2009/050349およびVester et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)2296-2300を参照）、ならびにUNA（アンリンクト核酸）ヌクレオチド（参照によって本明細書に組み入れられるFluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039を参照）からなる群より選択される。UNAは、典型的には、リボースのC2-C3 C-C結合が除去され、ロックされていない「糖」残基が形成されている、ロックされていない核酸である。好ましくは、ギャップマーは、式（5'〜3'）X'-Y'-Z'の（ポリ）ヌクレオチド配列を含み；領域X'（X'）（5'領域）は、少なくとも1個のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1個のBNA（例えば、LNA）単位、例えば、1〜6個のヌクレオチド類似体、例えばBNA（例えば、LNA）単位からなるかまたはそれを含み；領域Y'（Y'）は、（相補的なRNA分子、例えば、mRNA標的との二重鎖を形成した時に）RNAseをリクルートすることができる少なくとも5個の連続ヌクレオチド、例えば、DNAヌクレオチドからなるかまたはそれを含み、かつ；領域Z'（Z'）（3'領域）は、少なくとも1個のヌクレオチド類似体、例えば少なくとも1個のBNA（例えば、LNA単位）、例えば、1〜6個のヌクレオチド類似体、例えばBNA（例えば、LNA）単位からなるかまたはそれを含む。
【０２０３】
いくつかの態様において、領域X'は、1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個のヌクレオチド類似体、例えばBNA（例えば、LNA）単位、例えば、2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば2〜5個のLNA単位、例えば、3個もしくは4個のヌクレオチド類似体、例えば3個もしくは4個のLNA単位からなり；かつ／または領域Z'は、1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個のヌクレオチド類似体、例えばBNA（例えば、LNA）単位、例えば、2〜5個のヌクレオチド類似体、例えば2〜5個のBNA（例えば、LNA単位）、例えば、3個もしくは4個のヌクレオチド類似体、例えば3個もしくは4個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。
【０２０４】
いくつかの態様において、Y'は、RNAseをリクルートすることができる5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、もしくは12個の連続ヌクレオチド、またはRNAseをリクルートすることができる6〜10個もしくは7〜9個、例えば、8個の連続ヌクレオチドからなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、領域Y'は、少なくとも1個のDNAヌクレオチド単位、例えば1〜12個のDNA単位、好ましくは、4〜12個のDNA単位、より好ましくは、6〜10個のDNA単位、例えば、7〜10個のDNA単位、最も好ましくは、8個、9個、または10個のDNA単位からなるかまたはそれを含む。
【０２０５】
いくつかの態様において、領域X'は、3個または4個のヌクレオチド類似体、例えばBNA（例えば、LNA）からなり、領域X'は、7個、8個、9個、または10個のDNA単位からなり、かつ領域Z'は、3個または4個のヌクレオチド類似体、例えばBNA（例えば、LNA）からなる。そのような設計には、（X'-Y'-Z'）3-10-3、3-10-4、4-10-3、3-9-3、3-9-4、4-9-3、3-8-3、3-8-4、4-8-3、3-7-3、3-7-4、4-7-3が含まれる。
【０２０６】
さらなるギャップマー設計は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2004/046160に開示されている。参照によって本明細書に組み入れられる米国仮出願第60/977,409号に基づく優先権を主張するWO2008/113832は、「ショートマー（shortmer）」ギャップマーオリゴマーに言及している。いくつかの態様において、本明細書に提示されたオリゴマーは、そのようなショートマーギャップマーであってもよい。
【０２０７】
いくつかの態様において、オリゴマー、例えば、領域X'は、式（5'〜3'）X'-Y'-Z'を含むかまたは該式である、全部で10ヌクレオチド単位、11ヌクレオチド単位、12ヌクレオチド単位、13ヌクレオチド単位、または14ヌクレオチド単位の連続ヌクレオチド配列からなっている。X'は、1個、2個、または3個のヌクレオチド類似体単位、例えばBNA（例えば、LNA）単位からなり；Y'は、相補的なRNA分子（例えば、mRNA標的）との二重鎖を形成した時にRNAseをリクルートすることができる7個、8個、または9個の連続ヌクレオチド単位からなり；かつZ'は、1個、2個、または3個のヌクレオチド類似体単位、例えばBNA（例えば、LNA）単位からなる。
【０２０８】
いくつかの態様において、X'は、1個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。いくつかの態様において、X'は、2個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。いくつかの態様において、X'は、3個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。いくつかの態様において、Z'は、1個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。いくつかの態様において、Z'は、2個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。いくつかの態様において、Z'は、3個のBNA（例えば、LNA）単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、7個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、8個のヌクレオチド単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、9個のヌクレオチド単位からなる。ある特定の態様において、領域Y'は、10個のヌクレオシドモノマーからなる。ある特定の態様において、領域Y'は、1〜10個のDNAモノマーからなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、Y'は、1〜9個のDNA単位、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個のDNA単位を含む。いくつかの態様において、Y'は、DNA単位からなる。いくつかの態様において、Y'は、α-L配置にある少なくとも1個のBNA単位、例えば、α-L配置にある2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、または9個のLNA単位を含む。いくつかの態様において、Y'は、少なくとも1個のα-L-オキシBNA/LNA単位を含むか、またはα-L配置の全てのLNA単位がα-L-オキシLNA単位である。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'内に存在するヌクレオチドの数は、次からなる群より選択される（ヌクレオチド類似体単位-領域Y'-ヌクレオチド類似体単位）：1-8-1、1-8-2、2-8-1、2-8-2、3-8-3、2-8-3、3-8-2、4-8-1、4-8-2、1-8-4、2-8-4、または；1-9-1、1-9-2、2-9-1、2-9-2、2-9-3、3-9-2、1-9-3、3-9-1、4-9-1、1-9-4、または；1-10-1、1-10-2、2-10-1、2-10-2、1-10-3、3-10-1。いくつかの態様において、X'-Y'-Z'内のヌクレオチドの数は、2-7-1、1-7-2、2-7-2、3-7-3、2-7-3、3-7-2、3-7-4、および4-7-3からなる群より選択される。ある特定の態様において、領域X'およびY'の各々は、3個のBNA（例えば、LNA）モノマーからなり、領域Y'は、8個または9個または10個のヌクレオシドモノマー、好ましくは、DNAモノマーからなる。いくつかの態様において、X'およびZ'の両方が、各々2個のBNA（例えば、LNA）単位からなり、Y'は、8個または9個のヌクレオチド単位、好ましくは、DNA単位からなる。様々な態様において、その他のギャップマー設計には、領域X'および／またはZ'が、3個、4個、5個、または6個のヌクレオシド類似体、例えば、2'-O-メトキシエチル-リボース糖（2'-MOE）を含有しているモノマーまたは2'-フルオロ-デオキシリボース糖を含有しているモノマー）からなり、領域Y'が、8個、9個、10個、11個、または12個のヌクレオシド、例えば、DNAモノマーからなり、ここで、領域X'-Y'-Z'が、3-9-3、3-10-3、5-10-5、または4-12-4のモノマーを有しているものが含まれる。さらなるギャップマー設計は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2007/146511A2に開示されている。
【０２０９】
BNAおよびLNAギャップマー：BNAおよびLNAという用語は、交換可能に用いられる。BNAギャップマーは、少なくとも1個のBNAヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域A）である。LNAギャップマーは、少なくとも1個のLNAヌクレオチドを含むギャップマーオリゴマー（領域A）である。
【０２１０】
スプライススイッチングオリゴマー
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライススイッチングオリゴマー、即ち、プレmRNAのオルタナティブスプライシングを引き起こす、プレmRNAを標的とするオリゴマーである。
【０２１１】
スプライススイッチングオリゴマーの標的には、TNF受容体が含まれ得、例えば、スプライススイッチングオリゴマー（SSO）は、参照によって本明細書に組み入れられるWO2007/058894、WO08051306 A1、およびPCT/EP2007/061211に開示されたTNFR SSOのうちの1種以上であり得る。
【０２１２】
スプライススイッチングオリゴマーは、典型的には（本質的には）RNaseHをリクルートすることができず、従って、ギャップマー設計、テールマー設計、またはヘッドマー設計は一般に望ましくない。しかしながら、ミックスマー設計およびトータルマー設計は、SSOに適した設計である。
【０２１３】
スプライススイッチングオリゴマーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーにおけるジストロフィン欠損を標的とするためにも使用されている。
【０２１４】
ミックスマー
大部分のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの意図された標的を分解するためにRNase酵素（例えば、RNaseH）をリクルートするよう設計されている化合物である。そのような化合物には、DNAホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、ならびにギャップマー、ヘッドマー、およびテールマーが含まれる。これらの化合物は、典型的には、少なくとも5 DNAヌクレオチドまたは6 DNAヌクレオチドの領域を含み、ギャップマーの場合には、親和性増強ヌクレオチド類似体が両側に隣接している。本発明のオリゴマーは、RNase(例えば、RNaseH）非依存性の機序を介して作動してもよい。非RNaseH（または非RNase）機序を介して作動するオリゴマーの例は、ミックスマーおよびトータルマーである。
【０２１５】
「ミックスマー」という用語は、ギャップマー、テールマー、およびヘッドマーとは対照的に、5個を超える隣接配列が存在しない、およびいくつかの態様において、4個を超える、例えば、3個を超える連続的な天然に存在するヌクレオチド、例えば、DNA単位が存在しない、天然に存在するヌクレオチドおよび天然には存在しないヌクレオチドの両方を含むオリゴマーをさす。いくつかの態様において、ミックスマーは、5個を超える連続ヌクレオシド類似体、例えば、BNA（LNA）を含まず、いくつかの態様において、4個を超える、例えば、3個を超える連続ヌクレオシド類似体、例えば、BNA（LNA）を含まない。そのようなミックスマーにおいて、残りのヌクレオシドは、例えば、DNAヌクレオシド、および／または非二環式ヌクレオシド類似体、例えば、本明細書において言及されたもの、例えば、2'置換型ヌクレオシド類似体、例えば、2'-O-MOEもしくは2'フルオロであり得る。
【０２１６】
本発明によるオリゴマーは、ミックスマーであり得、実際、オリゴマーもしくはその第1領域として（特に、次を標的とする時：マイクロRNA（抗miR）、mRNA上のマイクロRNA結合部位（Blockmir））、またはスプライススイッチングオリゴマー（SSO）として、様々なミックスマー設計が高度に効果的である。例えば、WO2007/112754（LNA-抗miR（商標））およびWO2008/131807（LNAスプライススイッチングオリゴ）を参照されたい。
【０２１７】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、任意で、DNAヌクレオシドと共に、BNAおよび2'置換型ヌクレオシド類似体を含み得る。例えば、参照によって本明細書に組み入れられるWO07027894およびWO2007/112754を参照されたい。具体例には、LNAと2'-O-MOEとDNA、LNAと2'フルオロと2'-O-MOE、2'-O-MOEと2'フルオロ、2'-O-MOEと2'フルオロとLNA、またはLNAと2'-O-MOEとLNAとDNAを含むオリゴマーまたは第1領域が含まれる。
【０２１８】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、ヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチド、またはあるタイプのヌクレオチド類似体および第2のタイプのヌクレオチド類似体の繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。繰り返しパターンは、例えば、2個毎または3個毎のヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体、例えば、BNA（LNA）であり、残りのヌクレオチドが、天然に存在するヌクレオチド、例えば、DNAであるか、または2'置換型ヌクレオチド類似体、例えば、本明細書において言及される2'MOE類似体もしくは2'フルオロ類似体であるか、または、いくつかの態様において、本明細書において言及されたヌクレオチド類似体の群より選択されるものであり得る。ヌクレオチド類似体、例えば、LNA単位の繰り返しパターンは、固定された位置、例えば、5'末端または3'末端のヌクレオチド類似体と組み合わせられてもよいことが認識される。
【０２１９】
いくつかの態様において、3'末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの最初のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えば、LNAヌクレオチドである。
【０２２０】
同一であってもよいしまたは異なっていてもよいいくつかの態様において、3'末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの2番目のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えば、LNAヌクレオチドである。
【０２２１】
同一であってもよいしまたは異なっていてもよいいくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーの7番目および／または8番目のヌクレオチド、同一であってもよいしまたは異なっていてもよいいくつかの態様において、3'末端から数えて、オリゴマーまたはミックスマーの9番目および／または10番目のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えば、LNAヌクレオチドである。
【０２２２】
同一であってもよいしまたは異なっていてもよいいくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーの5'末端は、ヌクレオチド類似体、例えば、LNAヌクレオチドである。
【０２２３】
上記の設計特色は、いくつかの態様において、ミックスマー設計、例えば、抗miRミックスマーへ組み入れられ得る。
【０２２４】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、4個を超える連続DNAヌクレオチド単位または3個を超える連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。いくつかの態様において、ミックスマーは、2個を超える連続DNAヌクレオチド単位の領域を含まない。
【０２２５】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、少なくとも2個の連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、少なくとも2個の連続LNA単位からなる領域を少なくとも含む。
【０２２６】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはミックスマーは、少なくとも3個の連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、少なくとも3個の連続LNA単位からなる領域を少なくとも含む。
【０２２７】
いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、7個を超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、LNA単位の領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、6個を超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、LNA単位の領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、5個を超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、LNA単位の領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、4個を超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、LNA単位の領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、3個を超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、LNA単位の領域を含まない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーまたはミックスマーは、2個を超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えば、LNA単位の領域を含まない。
【０２２８】
以下の態様が、（例えば、領域Aとしての）ミックスマーまたはトータルマーオリゴマーに当てはまり得る：本発明のオリゴマー（例えば、領域A）は、いくつかの態様において、LNAヌクレオチドおよび非LNAヌクレオチド（例えば、DNAまたは2'置換型ヌクレオチド類似体）の少なくとも2個の交互の領域を含み得る。
【０２２９】
本発明のオリゴマーは、いくつかの態様において、式：5'([LNAヌクレオチド]1-5および[非LNAヌクレオチド]1-4)2-12.3'の連続配列を含み得る。
【０２３０】
いくつかの態様において、連続ヌクレオチド配列（またはオリゴマー）の5'ヌクレオチドは、LNAヌクレオチドである。
【０２３１】
いくつかの態様において、連続ヌクレオチド配列の3'ヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体、例えばLNAであるか、または、2個、3個、4個、5個の3'ヌクレオチドが、ヌクレオチド類似体、例えばLNAヌクレオチド、もしくは増強された血清安定性をオリゴマーに付与するその他のヌクレオチド類似体である。
【０２３２】
いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、式5'([LNAヌクレオチド]1-5-[非LNAヌクレオチド]1-4)2-11-[LNAヌクレオチド]1-5 3'を有する。
【０２３３】
いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドおよび非LNAヌクレオチドの連続領域を2個、3個、または4個有し、例えば、式5'([LNAヌクレオチド]1-5および[非LNAヌクレオチド]1-4)2-3を含み、任意で、さらなる3'LNA領域[LNAヌクレオチド]1-5を含む。
【０２３４】
いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、5'([LNAヌクレオチド]1-3および[非LNAヌクレオチド]1-3)2-5を含み、任意で、さらなる3'LNA領域[LNAヌクレオチド]1-3を含む。
【０２３５】
いくつかの態様において、オリゴマーの連続ヌクレオチド配列は、5'([LNAヌクレオチド]1-3および[非LNAヌクレオチド]1-3)3を含み、任意で、さらなる3'LNA領域[LNAヌクレオチド]1-3を含む。
【０２３６】
いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドは全てDNAヌクレオチドである。
【０２３７】
いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドは、DNA単位、RNA単位、2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、および2'-フルオロ-DNA単位からなる群より独立にまたは依存的に選択される。
【０２３８】
いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドは（任意で独立に）2'置換型ヌクレオシド類似体からなる群より選択され、例えば、（任意で独立に）2'-O-アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-AP、2'-FANA、2'-(3-ヒドロキシ)プロピル、および2'-フルオロ-DNA単位、ならびに／またはその他の（任意での）糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、モルホリノ、ペプチド核酸（PNA）、CeNA、アンリンクト核酸（UNA）、ヘキシトール核酸（HNA）、ビシクロ-HNA（例えば、WO2009/100320を参照）からなる群より選択される。いくつかの態様において、ヌクレオシド類似体は、その標的核酸（または相補的なDNA配列またはRNA配列）に対する第1領域の親和性を増加させる。様々なヌクレオシド類似体が、参照によって本明細書に組み入れられるFreier & Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213に開示されている。
【０２３９】
いくつかの態様において、非LNAヌクレオチドはDNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドを含み、任意で、親和性増強ヌクレオチド類似体および／または血清安定性増強ヌクレオチド類似体であり得るその他のヌクレオチド類似体（例えば、非LNAヌクレオチドについてリストされたヌクレオチド類似体）を含む。
【０２４０】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド類似体の連続ヌクレオチド配列からなる。
【０２４１】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなる。
【０２４２】
いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、8〜12nt長、例えば、8〜10nt長または10〜20nt長、例えば、12〜18nt長または14〜16nt長である。
【０２４３】
いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、ホスホジエステルヌクレオシド間連結を有する相補的な一本鎖RNA核酸分子と共に、少なくとも約60℃、例えば、少なくとも65℃のTmを有する二重鎖を形成することができる。
【０２４４】
Tmアッセイの例：オリゴヌクレオチド：オリゴヌクレオチドとRNA標的（PO）との二重鎖を、500mlのRNase不含水で3mMに希釈し、500mlの2×Tm緩衝液（200mM NaCl、0.2mM EDTA、20mMリン酸Na、pH7.0）と混合する。その溶液を3分間95℃に加熱し、次いで、30分間室温でアニールさせる。二重鎖融解温度（Tm）を、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を使用して、Peltier温度プログラマPTP6が装備されたLambda 40 UV/VIS分光光度計で測定する。温度を20℃から95℃まで上昇させ、次いで、25℃まで降下させ、260nmでの吸光を記録する。融解およびアニーリングの両方の一次導関数および極大を、二重鎖Tmを査定するために使用する。
【０２４５】
トータルマー
トータルマーは、天然には存在しないヌクレオシド、例えば、糖修飾型ヌクレオシド類似体のみを含む一本鎖オリゴマーである。
【０２４６】
本発明による第1領域はトータルマーであり得、実際、オリゴマーまたはその第1領域として（例えば、特に、マイクロRNAを標的とする時（抗miR））、またはスプライススイッチングオリゴマー（SSO）として、様々なトータルマー設計が高度に効果的である。いくつかの態様において、トータルマーは、少なくとも1個のXYX配列モチーフまたはYXY配列モチーフ、例えば、配列XYXまたはYXY（配列中、Xは、LNAであり、Yは、代替的な（即ち、非LNA）ヌクレオチド類似体、例えば、2'-O-MOE RNA単位および2'-フルオロDNA単位である）の反復を含むかまたはそれからなる。上記配列モチーフは、いくつかの態様において、例えば、XXY、XYX、YXY、またはYYXであり得る。
【０２４７】
いくつかの態様において、トータルマーは、7〜16ヌクレオチド、例えば、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、12ヌクレオチド、13ヌクレオチド、14ヌクレオチド、または15ヌクレオチド、例えば、7〜12ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなり得る。
【０２４８】
いくつかの態様において、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも30％、例えば、少なくとも40％、例えば、少なくとも50％、例えば、少なくとも60％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、例えば、95％、例えば、100％、BNA（LNA）単位を含む。残りの単位は、本明細書において言及された非LNAヌクレオチド類似体より選択され得、例えば、2'-O_アルキル-RNA単位、2'-OMe-RNA単位、2'-アミノ-DNA単位、2'-フルオロ-DNA単位、LNA単位、PNA単位、HNA単位、INA単位、および2'MOE RNA単位からなる群、または2'-OMe RNA単位および2'-フルオロDNA単位からなる群より選択され得る。
【０２４９】
いくつかの態様において、トータルマーは、LNA単位のみからなる連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、トータルマー、例えば、LNAトータルマーは、7〜12ヌクレオシド単位長である。いくつかの態様において、（オリゴマーまたはその第1領域としての）トータルマーは、参照によって本明細書に組み入れられるWO2009/043353において言及されたように、マイクロRNAに対して標的指向化され得る（即ち、抗miRである）。
【０２５０】
いくつかの態様において、オリゴマーまたは連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドを含み、任意で、親和性増強ヌクレオチド類似体および／または血清安定性増強ヌクレオチド類似体であり得るその他のヌクレオチド類似体を含む。
【０２５１】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド類似体の連続ヌクレオチド配列からなる。
【０２５２】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはそれらの連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列からなる。
【０２５３】
本発明のオリゴマーを介したマイクロRNAの調節
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、マイクロRNA配列、例えば、成熟マイクロRNAまたはそれらの一部に対応するかまたは完全に相補的である連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなるオリゴマー、例えば、LNA-antimiR（登録商標）（LNAミックスマーまたはトータルマー）である。マイクロRNAのインビボ活性を調節するための本発明の使用は、マイクロRNAが典型的には対象における多数のmRNAを制御するという事実のため、最重要と考えられる。従って、治療用の抗miRを不活化する能力は、極めて望ましい。
【０２５４】
多数のマイクロRNAが、多数の疾患に関係している（例えば、WO2009/043353を参照）。オリゴマーは、いくつかの態様において、マイクロRNA（の対応する領域）を標的とする（即ち、完全に相補的な連続ヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる）。マイクロRNAは、マイクロRNA-21、マイクロRNA-221、miR-122、またはmiR-33（miR33a＆miR-33b）のような肝臓に発現するマイクロRNAであり得る。
【０２５５】
従って、本発明のいくつかの局面は、マイクロRNAの発現に関連した疾患の処置に関する。いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーまたはその第1領域は、マイクロRNA配列、例えば、成熟マイクロRNA配列、例えば、miRBase（http://microrna.sanger.ac.uk/cgi-bin/sequences/mirna_summary.pl?org=hsa）に発表されたヒトマイクロRNAに対応するかまたは完全に相補的である連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、マイクロRNAは、ウイルスマイクロRNAである。本明細書作成の時点で、miRbase 19では、1600の前駆体および2042の成熟ヒトmiRNA配列がmiRBase内に存在しており、それらは、各ヒトマイクロRNAの成熟マイクロRNA配列を含め、全て、参照によって本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、hsa-miR122（NR_029667.1 GI：262205241）、例えば、成熟has-miR122に対応するかまたは完全に相補的である連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、本発明によるオリゴマーは、オリゴマーの全長にわたって、hsa-miR122（NR_029667.1 GI：262205241）、例えば、成熟has-miR122に対応するかまたは完全に相補的である連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含む。
【０２５６】
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域がmiR-122を標的とする時、オリゴマーは、C型肝炎感染の処置において使用するためのものである。
【０２５７】
いくつかの態様において、オリゴマーがhas-miR-33、例えば、
0006580993.tif 000037
を標的とする時、それは、代謝疾患、例えば、代謝症候群、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、および関連障害の処置において使用するためのものである。Najafi-Shoushtar et al,Science 328 1566-1569、Rayner et al.,Science 328(1570-1573)、Horie et al.,J Am Heart Assoc.2012,Dec 1(6)を参照されたい。代謝疾患において示される他の肝臓に発現するマイクロRNAには、コレステロール流出を直接調節することが公知であるmiR-758、miR-10b、miR-26、およびmiR-106bが含まれる（Davalos & Fernandez-Hernando,Pharmacol Res.2013 Febを参照）。従って、標的は、miR-122（MIMAT0004590）、miR-33（MIMAT0000091、MIMAT0003301）、miR-758（MIMAT0003879）、miR-10b（MIPF0000033）、miR-26a（MIMAT0000082）、およびmiR-106b（MIMAT0004672）からなる群より選択されるマイクロRNAであり得る。マイクロRNAの参照は、miRBaseリリース19である。
【０２５８】
抗miRオリゴマー
好ましいオリゴマーまたはその第1領域の「抗miR」設計およびオリゴマーは、WO2007/112754、WO2007/112753、PCT/DK2008/000344、ならびに米国仮出願第60/979217号および第61/028062号に開示されており、それらは、全て、参照によって本明細書に組み入れられる。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、ミックスマーまたはトータルマーである抗miRである。したがって抗miRという用語はオリゴマーという用語に置き換えられる。
【０２５９】
抗miRオリゴマーは、マイクロRNA配列またはその対応する部分配列に完全に相補的であるかまたは本質的に相補的である（即ち、1個もしくは2個のミスマッチを含んでいてもよい）連続ヌクレオチド配列からなるかまたはそれを含むオリゴマーである。この点に関して、抗miRは、成熟マイクロRNA全体に相補的であるかもしくは本質的に相補的である連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよいし、または抗miRは、成熟マイクロRNAもしくはプレマイクロRNAの部分配列に相補的であるかもしくは本質的に相補的である連続ヌクレオチド配列を含んでいてもよいと考えられ、そのような部分配列（従って、対応する連続ヌクレオチド配列）は、典型的には、少なくとも8ヌクレオチド長、例えば、8〜25ヌクレオチド、例えば、9ヌクレオチド長、10ヌクレオチド長、11ヌクレオチド長、12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、例えば、10〜17ヌクレオチドまたは10〜16ヌクレオチド、例えば、12〜15ヌクレオチドである。
【０２６０】
抗miRの多数の設計が提唱されており、典型的には、治療的に使用するための抗miR、例えば、その連続ヌクレオチド配列は、1個以上のヌクレオチド類似体単位を含む。
【０２６１】
いくつかの態様において、抗miRは、本明細書に記載されるギャップマー構造を有し得る。しかしながら、WO2007/112754およびWO2007/112753に説明されるように、その他の設計、例えば、ミックスマーまたはトータルマーも、好ましい場合がある。
【０２６２】
いずれも参照によって本明細書に組み入れられるWO2007/112754およびWO2007/112753は、成熟マイクロRNAに相補的な抗miRオリゴマーおよび抗miRオリゴマー設計を提供している。
【０２６３】
いくつかの態様において、抗miRの部分配列はmiRNAシード（seed）領域に対応する。いくつかの態様において、オリゴマーの1番目または2番目の3'核酸塩基は、マイクロRNA配列の2番目の5'ヌクレオチドに対応する。
【０２６４】
いくつかの抗miR態様において、オリゴマーの領域の3'末端から測定されるオリゴマーの核酸塩基単位1〜6（両端を含む）は、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。
【０２６５】
いくつかの抗miR態様において、オリゴマーの領域の3'末端から測定されるオリゴマーの核酸塩基単位1〜7（両端を含む）は、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。
【０２６６】
いくつかの抗miR態様において、オリゴマーの領域の3'末端から測定されるオリゴマーの核酸塩基単位2〜7（両端を含む）は、マイクロRNAシード領域配列に相補的である。
【０２６７】
いくつかの態様において、抗miRオリゴマーは、miRNAシード領域に相補的な領域内の位置に、少なくとも1個のヌクレオチド類似体単位、例えば、少なくとも1個のLNA単位を含む。抗miRオリゴマーは、いくつかの態様において、miRNAシード領域に相補的な領域内の位置に、1〜6個または1〜7個のヌクレオチド類似体単位、例えば、1〜6個および1〜7個のLNA単位を含み得る。
【０２６８】
いくつかの態様において、本発明の抗miRは、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、または9ヌクレオチド長であり、ヒトまたはウイルスのマイクロRNAのシード領域に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの少なくとも80％、例えば85％、例えば90％、例えば95％、例えば100％が、LNAである。
【０２６９】
いくつかの態様において、本発明の抗miRは、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、または9ヌクレオチド長であり、ヒトまたはウイルスのマイクロRNAのシード領域に相補的な連続ヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチドの少なくとも80％がLNAであり、ヌクレオチド間結合の少なくとも80％、例えば85％、例えば90％、例えば95％、例えば100％がホスホロチオエート結合である。
【０２７０】
いくつかの態様において、抗miRは、3'末端から数えて、3〜8位に1個または2個のLNA単位を含む。これは、RNA:RNA二重鎖と構造が類似している二重鎖であるオリゴ:マイクロRNA二重鎖によって形成されるAヘリックスの安定性に有利であると考えられる。
【０２７１】
WO2007/112754の48頁15行目〜51頁9行目までの表は、抗マイクロRNAオリゴマー（即ち、オリゴマーまたはその第1領域であり得る抗miR）の例を提供しており、参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。
【０２７２】
マイクロRNA模倣物
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、1種以上のmRNA標的の発現を抑制するために細胞へ導入され得るmiRNA模倣物の形態にある。miRNA模倣物は、典型的には、全長miRNA配列に完全に相補的である。miRNA模倣物は、本明細書において提供されたまたは参照されたmiRNA配列のうちの1種以上の対応する領域に相同である連続ヌクレオチド配列を含む化合物である。miRNA模倣物または抗miRの使用は、（任意で）さらにmRNA標的を抑制するため、またはmiRNAをサイレンシング（下方制御）し、それによって、内在性miRNAの機能を阻害し、mRNA標的の抑制解除を引き起こし、発現を増加させるために使用され得る。
【０２７３】
アプタマー
いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、治療用アプタマー、スピーゲルマー（spiegelmer）であり得る。アプタマーは、リガンド、例えば、受容体リガンドであってもよく、従って、ターゲティング部分（即ち、さらなるコンジュゲート）として使用され得ることに注意されたい。本発明に関するアプタマー（例えばスピーゲルマー）は、ヌクレオチドの配列ではなく、立体構造に基づいて選択された、20〜50ヌクレオチド長の核酸であり、インビボで直接、標的タンパク質に結合することによって治療効果を顕現させ、従って、標的の逆相補鎖を含まない。実際、それらの標的は、核酸ではなくタンパク質である。オリゴマーまたはその第1領域であり得る具体的なアプタマーには、Macugen（OSI Pharmaceuticals）またはARC1779（Archemix,Cambridge,MA）が含まれる。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、アプタマーではない。いくつかの態様において、オリゴマーまたはその第1領域は、アプタマーでもスピーゲルマーでもない。
【０２７４】
ヌクレオチド間連結
本明細書に記載されたオリゴマー（例えば、第1領域および第2領域）のヌクレオシドモノマーは、［ヌクレオシド間］連結基を介して、共に結合されている。適宜、各モノマーは、連結基を介して、3'隣接モノマーに連結されている。
【０２７５】
本発明に関して、オリゴマーの末端の5'モノマーは、5'末端基を含んでいてもよいしまたは含んでいなくてもよいが、5'連結基を含まないことを、当業者は理解するであろう。
【０２７６】
「連結基」または「ヌクレオチド間連結」という用語は、2個のヌクレオチドを共有結合で共に結合することができる基を意味するものである。具体的な好ましい例には、ホスフェート基およびホスホロチオエート基が含まれる。
【０２７７】
本発明のオリゴマーのヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、連結基を介して、共に結合されている。適宜、各ヌクレオチドは、連結基を介して、3'隣接ヌクレオチドに連結されている。
【０２７８】
適したヌクレオチド間連結には、WO2007/031091にリストされたもの、例えば、（参照によって本明細書に組み入れられる）WO2007/031091の34頁の第1段落にリストされたヌクレオチド間連結が含まれる。
【０２７９】
いくつかの態様において、ホスホジエステル連結または領域B以外のヌクレオチド間連結を、通常のホスホジエステルから、ヌクレアーゼによる攻撃に対してより抵抗性のもの、例えば、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートへ修飾することが好ましい。これらの2種は、RNaseHによって切断可能であり、標的遺伝子の発現の低下におけるアンチセンス阻害の経路も可能にする。
【０２８０】
本明細書に提供される適切な硫黄（S）含有ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエートまたはホスホジチオエートが、好ましい場合がある。ホスホロチオエートヌクレオチド間連結は、特に、第1領域のため、例えば、ギャップマー、ミックスマー、抗mir、スプライススイッチングオリゴマー、およびトータルマーにおいても好ましい。
【０２８１】
ギャップマーについて、オリゴマー内のヌクレオチド間連結は、例えば、標的とされたRNAのRNaseHによる切断を可能にするため、ホスホロチオエートまたはボラノホスフェートであり得る。ホスホロチオエートは、改善されたヌクレアーゼ抵抗性およびその他の理由、例えば、製造の容易さのため、好ましい。
【０２８２】
一つの局面において、第1領域と第2領域との間のホスホジエステル連結を除き、および任意で、領域B内のホスホジエステル連結を除き、本発明のオリゴマーの残りのヌクレオシド間連結、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート基によって相互に連結されている。いくつかの態様において、第1領域内のヌクレオシド間の少なくとも50％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、例えば、全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル（ホスフェート）以外であり、例えば、ホスホロチオエート、ホスホジチオエート、またはボラノホスフェートからなる群より選択される。いくつかの態様において、第1領域内のヌクレオシド間の少なくとも50％、例えば、少なくとも70％、例えば、少なくとも80％、例えば、少なくとも90％、例えば、全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートである。
【０２８３】
WO09124238は、中性ヌクレオシド間連結によって3'末端または5'末端に付着した少なくとも1個の二環式ヌクレオシドを有するオリゴマー化合物に言及している。従って、本発明のオリゴマーは、中性ヌクレオシド間連結、例えば、1個以上のホスホトリエステル、メチルホスホネート、MMI、アミド-3、ホルムアセタール（formacetal）、またはチオホルムアセタールによって3'末端または5'末端に付着した少なくとも1個の二環式ヌクレオシドを有し得る。残りの結合は、ホスホロチオエートであり得る。
【０２８４】
コンジュゲート、ターゲティング部分、およびブロッキング基
「コンジュゲート」という用語は、1個以上の非ヌクレオチド部分または非ポリヌクレオチド部分がコンジュゲートした、本明細書に記載されるオリゴマーの共有結合性の付着（「コンジュゲーション」）によって形成された不均質の分子を示すことが意図される。
【０２８５】
糖質コンジュゲート
いくつかの態様において、コンジュゲート基は、糖質部分である。
【０２８６】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、糖質であるかもしくは糖質を含んでいてもよく、または糖質基を含む。いくつかの態様において、糖質は、ガラクトース、ラクトース、n-アセチルガラクトサミン、マンノース、およびマンノース-6-リン酸からなる群より選択される。いくつかの態様において、コンジュゲート基は、マンノースもしくはマンノース-6-リン酸であるかまたはそれを含んでいてもよい。糖質コンジュゲートは、ある範囲の組織、例えば、肝臓および／または筋肉における送達または活性を増強するために使用され得る。例えば、EP1495769、WO99/65925、Yang et al.,Bioconjug Chem(2009)20(2):213-21、Zatsepin & Oretskaya Chem Biodivers.(2004)1(10):1401-17を参照されたい。
【０２８７】
さらに、オリゴマーは、1個以上の付加的なコンジュゲート部分をさらに含んでいてもよく、それらのうち、親油性部分または疎水性部分が特に関心対象である。これらは、例えば、薬物動態モジュレーターとして作用することができ、任意で、リンカー、例えば、生物切断性リンカーを介して、糖質コンジュゲート、糖質コンジュゲートをオリゴマーに連結するリンカー、または複数の糖質コンジュゲート（多価コンジュゲート）をオリゴマーに連結するリンカーに、または共有結合で連結され得る。
【０２８８】
薬物動態モジュレーター
本発明の化合物は、1個以上の付加的なコンジュゲート部分をさらに含むことができ、その中で、例えば、コンジュゲート基が糖質部分である場合、親油性または疎水性の部分が特に関心対象である。そのような親油性または疎水性の部分は、薬物動態モジュレーターとして作用することができ、任意で、リンカー、例えば、生物切断性リンカーを介して、糖質コンジュゲート、糖質コンジュゲートをオリゴマーに連結するリンカー、または複数の糖質コンジュゲート（多価コンジュゲート）をオリゴマーに連結するリンカーに、共有結合で連結され得る。
【０２８９】
従って、オリゴマーまたはコンジュゲート部分は、薬物動態モジュレーター、例えば、親油性または疎水性の部分を含み得る。そのような部分は、WO2012/082046においてsiRNAコンジュゲートに関して開示されている。疎水性部分には、飽和または不飽和であり得るC8〜C36脂肪酸が含まれ得る。いくつかの態様において、C10、C12、C14、C16、C18、C20、C22、C24、C26、C28、C30、C32、およびC34脂肪酸が使用され得る。疎水基は、16個以上の炭素原子を有し得る。例示的な適当な疎水基は、ステロール、コレステロール、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルからなる群より選択され得る。WO'346号によると、16個未満の炭素原子を有する疎水基は、ポリヌクレオチドのターゲティングを増強する効果が劣っているが、複数コピー（例えば、2×、例えば、2×C8、C10、C12、C14）で使用して、効力が増強され得る。ポリヌクレオチドターゲティング部分として有用な薬物動態モジュレーターは、コレステロール、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基からなる群より選択され得、それらは、各々、直鎖状、分岐状、または環状であり得る。薬物動態モジュレーターは、好ましくは、炭素原子および水素原子のみを含有している炭化水素である。しかしながら、疎水性を維持する置換またはヘテロ原子、例えば、フッ素は、許容され得る。
【０２９０】
驚くべきことに、本発明者らは、LNAオリゴマーと共に使用するためのGalNacコンジュゲートが、薬物動態モジュレーターを必要としないことを見出し、従って、いくつかの態様において、GalNacコンジュゲートは、親油性または疎水性の部分、例えば、本明細書に記載されたものに共有結合で連結されていない、例えば、C8-C36脂肪酸またはステロールを含まない。従って、本発明は、親油性または疎水性の薬物動態モジュレーターまたはコンジュゲート部分／基を含まないLNAオリゴマーGalNacコンジュゲートも提供する。
【０２９１】
GalNAcコンジュゲート
本発明は、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分にコンジュゲートされたLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、コンジュゲート部分（例えば、第3領域または領域C）は、アシアロ糖タンパク質受容体ターゲティング部分、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、Nアセチルガラクトサミン、N-プロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、およびN-イソブタノイルガラクトサミンを含む。いくつかの態様において、コンジュゲートは、ガラクトースクラスタ、例えば、N-アセチルガラクトサミン三量体を含む。いくつかの態様において、コンジュゲート部分は、GalNAc（N-アセチルガラクトサミン）、例えば、一価、二価、三価、または四価のGalNAcを含む。3価GalNAcコンジュゲートは、化合物を肝臓へ標的指向化するために使用され得る。GalNAcコンジュゲートは、メチルホスホネートおよびPNAアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、US 5,994517およびHangeland et al.,Bioconjug Chem.1995 Nov-Dec;6(6):695-701）ならびにsiRNA（例えば、WO2009/126933、WO2012/089352＆WO2012/083046）と共に使用されている。GalNAcの参照およびそこで使用された具体的なコンジュゲートは、参照によって本明細書に組み入れられる。その他のGalNAcコンジュゲート部分には、例えば、オリゴ糖および糖質クラスタ、例えば、Tyr-Glu-Glu-(アミノヘキシルGalNAc)3(YEE(ahGalNAc)3；ヘパトサイト上のGal/GalNAc受容体に結合するグリコトリペプチド、例えば、Duff,et al.,Methods Enzymol,2000,313,297を参照）；リジンベースのガラクトースクラスタ（例えば、L3G4；Biessen,et al.,Cardovasc.Med.,1999,214）；ならびにコランベースのガラクトースクラスタ（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体の糖質認識モチーフ）が含まれ得る。さらなる適当なコンジュゲートには、アシアロ糖タンパク質受容体（ASGP-R）上に見出される糖質認識ドメイン（CRD）に結合することができるオリゴ糖が含まれ得る。オリゴ糖および／または糖質複合体を含有しているコンジュゲート部分の例は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第6,525,031号に提供されている。
【０２９２】
WO2012/083046は、本発明において使用するために適当である切断可能な薬物動態モジュレーターを含むGalNAcコンジュゲート部分を有するsiRNAを開示しており、好ましい薬物動態モジュレーターは、C16疎水基、例えば、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシルである。'046号の切断可能な薬物動態モジュレーターは、コレステロールでもあり得る。
【０２９３】
ターゲティング部分（コンジュゲート部分）は、ガラクトース、ガラクトサミン、N-ホルミル-ガラクトサミン、N-アセチルガラクトサミン、Nプロピオニル-ガラクトサミン、N-n-ブタノイル-ガラクトサミン、N-イソ-ブタノイルガラクトサミン、ガラクトースクラスタ、およびN-アセチルガラクトサミン三量体からなる群より選択され得、16個以上の炭素原子を有する疎水基、16〜20個の炭素原子を有する疎水基、パルミトイル、ヘキサデカ-8-エノイル、オレイル、(9E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル、ジオクタノイル、およびC16-C20アシル、およびコレステロールからなる群より選択される薬物動態モジュレーターを有し得る。'046号に開示されたある特定のGalNacクラスタには、(E)-ヘキサデカ-8-エノイル（C16）、オレイル（C18）、(9,E,12E)-オクタデカ-9,12-ジエノイル（C18）、オクタノイル（C8）、ドデカノイル（C12）、C-20アシル、C24アシル、ジオクタノイル（2×C8）が含まれる。ターゲティング部分-薬物動態モジュレーターターゲティング部分は、生理学的に不安定な結合、または、例えば、ジスルフィド結合、またはPEGリンカーを介して、ポリヌクレオチドに連結され得る。本発明は、オリゴマーとコンジュゲート基との間の、DNAホスホジエステルリンカーなどのホスホジエステルリンカーの使用にも関する（これらは本明細書において領域Bと呼ばれ、適宜、LNAオリゴマーと糖質コンジュゲート基との間に位置する）。
【０２９４】
肝臓のヘパトサイトを標的とするため、好ましいターゲティングリガンドは、ガラクトースクラスタである。ガラクトースクラスタには、2〜4個の末端ガラクトース誘導体を有する、例えば、それを含む、分子が含まれる。本明細書において使用される、ガラクトース誘導体という用語には、ガラクトース、およびガラクトースと同等以上のアシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトースの誘導体の両方が含まれる。末端ガラクトース誘導体は、そのC-l炭素を通して分子に付着する。アシアロ糖タンパク質受容体（ASGPr）は、ヘパトサイトに特有であり、枝分かれした末端にガラクトースを有する糖タンパク質に結合する。好ましいガラクトースクラスタは、各々アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するガラクトサミンまたはガラクトサミン誘導体を、3個、末端に有する。より好ましいガラクトースクラスタは、3個のN-アセチルガラクトサミンを末端に有する。当技術分野において一般的な他の用語には、三分岐型ガラクトース、三価ガラクトース、およびガラクトース三量体が含まれる。三分岐型ガラクトース誘導体クラスタは、二分岐型または単分岐型のガラクトース誘導体構造より大きい親和性で、ASGPrに結合することが公知である（Baenziger and Fiete,1980,Cell,22,611-620；Connolly et al.,1982,1.Biol.Chern.,257,939-945）。nMレベルの親和性を達成するためには多価が必要とされる。WO2012/083046によると、アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有する単一のガラクトース誘導体の付着は、送達ポリマーと共に同時投与された時、インビボでRNAiポリヌクレオチドのヘパトサイトへの機能的送達を可能にしない。
【０２９５】
ガラクトースクラスタは、各々中心分岐点に連結された2個、または好ましくは3個のガラクトース誘導体を含み得る。ガラクトース誘導体は、糖類のC-l炭素を通して中心分岐点に付着する。ガラクトース誘導体は、好ましくは、リンカーまたはスペーサーを介して分岐点に連結される。好ましいスペーサーは、フレキシブル親水性スペーサー（米国特許第5885968号；Biessen et al.J.Med.Chern.1995 Vol.39 p.1538-1546）である。好ましいフレキシブル親水性スペーサーは、PEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーは、PEG3スペーサーである。分岐点は、3個のガラクトース誘導体の付着を可能にし、さらにオリゴマーへの分岐点の付着を可能にする任意の小分子であり得る。例示的な分岐点基はジリジンである。ジリジン分子は、3個のガラクトース誘導体が付着し得る3個のアミン基、およびジリジンがオリゴマーに付着し得るカルボキシル反応基を含有している。分岐点のオリゴマーへの付着は、リンカーまたはスペーサーを通して起こり得る。好ましいスペーサーは、フレキシブル親水性スペーサーである。好ましいフレキシブル親水性スペーサーは、PEGスペーサーである。好ましいPEGスペーサーは、PEG3スペーサー（3個のエチレン単位）である。ガラクトースクラスタは、当技術分野において公知の方法を使用して、オリゴマーの3'末端または5'末端に付着させられ得る。
【０２９６】
好ましいガラクトース誘導体は、N-アセチル-ガラクトサミン（GalNAc）である。アシアロ糖タンパク質受容体に対する親和性を有するその他の糖類は、ガラクトサミン、N-n-ブタノイルガラクトサミン、およびN-イソ-ブタノイルガラクトサミンを含むリストより選択され得る。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されており（例えば、Jobst,S.T.and Drickamer,K.JB.C.1996,271,6686を参照）、または当技術分野において典型的な方法を使用して、容易に決定される。
0006580993.tif 000038
【０２９７】
GalNacコンジュゲートは図1に図示される。本発明のコンジュゲートのさらなる例は、以下に図示される。
0006580993.tif 000039
0006580993.tif 000040
0006580993.tif 000041
【０２９８】
糖質コンジュゲート（例えばGalNAc）はしたがって、（ポリ）エチレングリコールリンカー（PEG）、例えばジエチレングリコールリンカー、トリエチレングリコールリンカー、テトラエチレングリコールリンカー、ペンタエチレングリコールリンカー、ヘキサエチレングリコールリンカーなどのリンカーを介してオリゴマーに連結され得る。
【０２９９】
従って、本明細書に記載されるように、糖質コンジュゲート（例えば、GalNAc）は、生物切断性リンカー、例えば、本明細書において定義される領域Bを介して、任意で、上記図中にジリジンとして図示された領域Yを介して、オリゴマーに連結され得る。
【０３００】
ここで、上記GalNacクラスタコンジュゲート内の疎水性または親油性の部分（またはさらなるコンジュゲート部分）（即ち、薬物動態モジュレーター）は、BNAオリゴマーまたはLNAオリゴマー、例えば、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する時には、任意である。
【０３０１】
本研究において使用された具体的なGalnacクラスタ、コンジュゲート1、2、3、4、ならびにコンジュゲート1a、2a、3a、および4a（GalNacクラスタをオリゴマーに接合する任意でのC6リンカーと共に示されている）については、図面を参照されたい。
【０３０２】
従って、GalNAcクラスタの各糖質部分（例えば、GalNAc）は、スペーサー、例えば、(ポリ)エチレングリコールリンカー（PEG）、例えば、ジエチレングリコールリンカー、トリエチレングリコールリンカー、テトラエチレングリコールリンカー、ペンタエチレングリコールリンカー、ヘキサエチレングリコールリンカーを介して、オリゴマーに接合され得る。上に示されるように、PEG部分は、ガラクトース糖部分とペプチド（トリリジンが示されている）リンカーとの間のスペーサーを形成する。
【０３０３】
糖質コンジュゲート（例えば、GalNAc）または糖質-リンカー部分（例えば、糖質-PEG部分）は、分岐点基、例えば、アミノ酸または適宜2個以上（例えば、3個、4個、または5個）のアミノ基を含むペプチド、例えば、リジン、ジリジンまたはトリリジンまたはテトラリジンを介して、オリゴマーに共有結合で接合（連結）され得る。トリリジン分子は、3個の糖質コンジュゲート基、例えば、ガラクトース＆誘導体（例えば、GalNAc）およびさらなるコンジュゲート、例えば、疎水性または親油性の部分／基が付着し得るように介在する4個のアミン基、ならびにトリリジンがオリゴマーに付着し得るように介在するカルボキシル反応基を含有している。さらなるコンジュゲート部分、例えば、親油性／疎水性部分は、オリゴマーに付着しているリジン残基に付着し得る。
【０３０４】
いくつかの態様において、GalNacクラスタは、ビラジカルリンカーを介してオリゴマー（または領域Yもしくは領域B）に付着するペプチドリンカー、例えば、Tyr-Asp(Asp)トリペプチドまたはAsp(Asp)ジペプチドを含み、例えば、GalNacクラスタは、以下のビラジカルリンカーを含み得る：
0006580993.tif 000042
R1は、-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-シクロヘキシル（-C6H10-）、1,4-フェニル（-C6H4-）、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-、または-C2H4(OC2H4)3-、C(O)CH2-、-C(O)C2H4-、-C(O)C3H6-、-C(O)C4H8-、-C(O)C5H10-、-C(O)C6H12-、1,4-シクロヘキシル（-C(O)C6H10-）、1,4-フェニル（-C(O)C6H4-）、-C(O)C2H4OC2H4-、-C(O)C2H4(OC2H4)2-、または-C(O)C2H4(OC2H4)3-より好ましくは選択されるビラジカルである。いくつかの態様において、R1は、-C2H4-、-C3H6-、-C4H8-、-C5H10-、-C6H12-、1,4-シクロヘキシル（-C6H10-）、1,4-フェニル（-C6H4-）、-C2H4OC2H4-、-C2H4(OC2H4)2-、または-C2H4(OC2H4)3-より好ましくは選択されるビラジカルである。
【０３０５】
アミノアルキル中間体
本発明は、アミノアルキル、例えば、C2-C36アミノアルキル基、例えば、C6アミノアルキル基およびC12アミノアルキル基を（例えば、5'末端または3'末端に）含むアンチセンスLNAオリゴマーを含むLNAオリゴマー中間体をさらに提供する。アミノアルキル基は、例えば、（例えば、保護された）アミノアルキルホスホラミダイトを使用した標準的なオリゴヌクレオチド合成の一部としてLNAオリゴマーに付加され得る。アミノアルキルとLNAオリゴマーとの間の連結基は、例えば、ホスホロチオエートもしくはホスホジエステル、または、例えば、本明細書において言及されたその他のヌクレオシド連結基のうちの1種であり得る。アミノアルキル基は、例えば、ヌクレオシド連結基、例えば、ホスホロチオエート連結またはホスホジエステル連結によって、例えば、LNAオリゴマーの5'または3'に共有結合で連結され得る。
【０３０６】
本発明は、例えば、オリゴヌクレオチド合成の最初または最後のラウンドにおいて、アミノアルキル基をオリゴマーに付加する工程を含む、LNAオリゴマーの逐次合成、例えば、固相オリゴヌクレオチド合成を含む、LNAオリゴマーの合成の方法も提供する。合成の方法は、糖質コンジュゲートをアミノアルキル-LNAオリゴマーと反応させる工程（コンジュゲーション工程）をさらに含み得る。糖質コンジュゲートは、適当なリンカーおよび／または分岐点基を含んでいてよく、本明細書に記載されるさらなるコンジュゲート基、例えば、疎水基または親油基を任意で含んでいてもよい。コンジュゲーション工程は、オリゴマーが固体支持体に結合している間（例えば、オリゴヌクレオチド合成の後、固体支持体からのオリゴマーの溶出の前）に実施されてもよいし、またはその後（即ち、溶出の後）に実施されてもよい。本発明は、本発明のオリゴマーの合成におけるアミノアルキルリンカーの使用を提供する。本発明は、第1領域（A）および（任意で、存在する場合）第2領域（B）の[逐次]オリゴヌクレオチド合成の工程を含み、合成工程に続いて、本明細書に記載される糖質コンジュゲート基（X、またはリンカーを含むX-Y）、例えば、GalNAcコンジュゲート、例えば、3価GalNAc（例えば、コンジュゲート1、コンジュゲート2、コンジュゲート3、コンジュゲート4、コンジュゲート1a、コンジュゲート2a、コンジュゲート3a、およびコンジュゲート4aからなる群より選択されるコンジュゲート、またはその他の3価GalNAcコンジュゲート部分、例えば、本明細書に開示されたもの）を含む第3領域［ホスホラミダイトを含む］を付加する工程、続いて、[固相]支持体からオリゴマー化合物の切断を含む、オリゴマー化合物、例えば、本発明のオリゴマー化合物の合成（または製造）の方法を提供する。
【０３０７】
しかしながら、コンジュゲート領域（例えば、XまたはX-Y）は、固体支持体からの切断の後に付加されてもよいことが認識される。あるいは、合成の方法は、第1領域（A）および任意での第2の領域（B）を合成し、続いて、支持体からオリゴマーを切断し、その後、第3領域、例えば、X基またはX-Y基をオリゴマーに付加する工程を含んでいてもよい。第3領域の付加は、例えば、（支持体上の）オリゴマー合成の最終工程においてアミノホスホラミダイト単位を添加することによって達成され得る。それは、支持体からの切断の後、任意で、X基上またはY基上（存在する時）の活性化基を介して、X基またはX-Y基と接合するために使用される。切断可能リンカーがヌクレオチド領域でない態様において、領域Bは、非ヌクレオチド切断可能リンカー、例えば、ペプチドリンカーであってもよく、それは、領域X（領域Cとも呼ばれる）の一部を形成していてもよいし、または領域Y（もしくはその一部）であってもよい。
【０３０８】
方法のいくつかの態様において、領域X（例えば、C）または（X-Y）、例えば、コンジュゲート（例えば、GalNAcコンジュゲート）は、活性化基（活性化された官能基）を含み、合成の方法において、活性化されたコンジュゲート（または領域xもしくはX-Y）は、第1領域および第2領域、例えば、アミノ連結オリゴマーに付加される。アミノ基は、例えば、（典型的には、オリゴマーの5'末端にアミノ基をもたらすであろう）オリゴマー合成の最終工程として、標準的なホスホラミダイト化学によって、オリゴマーに付加され得る。例えば、オリゴヌクレオチド合成の最終工程において、保護されたアミノ-アルキルホスホラミダイト、例えば、TFA-アミノC6ホスホラミダイト（6-(トリフルオロアセチルアミノ)-ヘキシル-(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)-ホスホラミダイト)が使用される。アミノ基は、例えば、例としてN-(6-(O-(4,4'-ジメトキシトリチル))-ヘキシル)-(2-カルボキサミド)-フタリミジルと共に固体支持体を使用することによって、例えばオリゴマー合成の最初の工程として、オリゴマーに付加されてもよい（これは典型的には、オリゴマーの3'末端にアミノ基をもたらす）。
【０３０９】
領域X（または本明細書において言及される領域C）、例えば、コンジュゲート（例えば、GalNacコンジュゲート）は、NHSエステル法を介して活性化されてもよく、次いで、アミノ連結オリゴマーが付加される。例えば、N-ヒドロキシサクシニミド（NHS）が、領域X（または領域C）、例えば、コンジュゲート、例えば、GalNacコンジュゲート部分のための活性化基として使用され得る。
【０３１０】
親油性コンジュゲート
オリゴマーはさらに、親油性コンジュゲートなどの別のコンジュゲートを含み得る（例えば薬物動態モジュレーターとして）。代表的なコンジュゲート部分には、ステロイド分子を含む親油性分子（芳香族および非芳香族）；タンパク質（例えば、抗体、酵素、血清タンパク質）；ペプチド；ビタミン（水溶性または脂溶性）；ポリマー（水溶性または脂溶性）；薬物、毒素、レポーター分子、および受容体リガンドを含む小分子；糖質複合体；核酸切断複合体；金属キレート剤（例えば、ポルフィリン、テキサフィリン、クラウンエーテル等）；ハイブリッドフォトヌクレアーゼ（photonuclease）／インターカレーターを含むインターカレーター；架橋剤（例えば、光活性、酸化還元活性）、ならびにそれらの組み合わせおよび誘導体が含まれ得る。多数の適当なコンジュゲート部分、それらの調製およびオリゴマー化合物との連結は、例えば、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられるWO93/07883および米国特許第6,395,492号に提供されている。オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成は、各々参照によってその全体が本明細書に組み入れられるManoharan in Antisense Drug Technology,Principles,Strategies,and Applications,S.T.Crooke,ed.,Ch.16,Marcel Dekker,Inc.,2001、およびManoharan,Antisense and Nucleic Acid Drug Development,2002,12,103による包括的な概説においても報告されている。親油性コンジュゲート部分は、例えば、オリゴマー化合物の親水性に対抗するため、および細胞侵入を増強するために使用され得る。親油性部分には、例えば、ステロイドおよび関連化合物、例えば、コレステロール（米国特許第4,958,013号およびLetsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553）、チオコレステロール（Oberhauser et al,Nucl Acids Res.,1992,20,533）、ラノステロール、コプロスタノール、スチグマステロール、エルゴステロール、カルシフェロール、コール酸、デオキシコール酸、エストロン、エストラジオール、エストラトリオール、プロゲステロン、スチルベストロール、テストステロン、アンドロステロン、デオキシコルチコステロン、コルチゾン、17-ヒドロキシコルチコステロン、それらの誘導体等が含まれる。
【０３１１】
その他の親油性コンジュゲート部分には、脂肪族基、例えば、直鎖状、分岐状、および環状のアルキル、アルケニル、およびアルキニルが含まれる。脂肪族基は、例えば、5〜約50個、6〜約50個、8〜約50個、または10〜約50個の炭素原子を有し得る。脂肪族基の例には、ウンデシル、ドデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、テルペン、ボルニル、アダマンチル、それらの誘導体等が含まれる。いくつかの態様において、脂肪族基内の1個以上の炭素原子が、ヘテロ原子、例えば、O、S、またはNに置換されていてもよい（例えば、ゲラニルオキシヘキシル）。さらなる適当な親油性コンジュゲート部分には、グリセロールの脂肪族誘導体、例えば、アルキルグリセロール、ビス(アルキル)グリセロール、トリス(アルキル)グリセロール、モノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドが含まれる。いくつかの態様において、親油性コンジュゲートは、ジ-ヘキシルデシル-rac-グリセロールもしくは1,2-ジ-O-ヘキシルデシル-rac-グリセロール（Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651；Shea,et al.,Nuc.Acids Res.,1990,18,3777）、またはそれらのホスホネートである。飽和および不飽和の脂肪族官能性、例えば、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、および脂肪族アミンも、親油性コンジュゲート部分として役立ち得る。いくつかの態様において、脂肪族官能性は、約6〜約30個または約8〜約22個の炭素を含有し得る。脂肪酸の例には、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサン酸等が含まれる。
【０３１２】
さらなる態様において、親油性コンジュゲート基は、6〜約50個、10〜約50個、または14〜約40個の炭素原子を有する多環芳香族基であり得る。多環芳香族基の例には、ピレン、プリン、アクリジン、キサンテン、フルオレン、フェナントレン、アントラセン、キノリン、イソキノリン、ナフタレン、それらの誘導体等が含まれる。その他の適当な親油性コンジュゲート部分には、メントール、トリチル（例えば、ジメトキシトリチル（DMT））、フェノキサジン、リポ酸、リン脂質、エーテル、チオエーテル（例えば、ヘキシル-S-トリチルチオール）、それらの誘導体等が含まれる。オリゴマー化合物の親油性コンジュゲートの調製は、当技術分野において、例えば、Saison-Behmoaras et al,EMBO J.,1991,10,1111；Kabanov et al.,FEBSLett.,1990,259,327；Svinarchuk et al,Biochimie,1993,75,49；Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229、およびManoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651に十分に記載されている。
【０３１３】
低密度リポタンパク質（LDL）に対する親和性を有するコンジュゲート部分を含有しているオリゴマー化合物は、効果的な標的特異的送達系の提供を支援することができる。腫瘍細胞上における、LDLの受容体の高い発現レベルから、LDLは、これらの細胞に対する薬物の選択的送達のための、魅力的な担体である（Rump,et al.,Bioconjugate Chem.,1998,9,341；Firestone,Bioconjugate Chem.,1994,5,105；Mishra,et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229）。LDLに対する親和性を有する部分には、多くの親油基、例えば、ステロイド（例えば、コレステロール）、脂肪酸、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、LDL親和性を有するコンジュゲート部分は、コール酸、例えば、ケノデオキシコール酸およびリトコール酸のジオレイルエステルであり得る。
【０３１４】
いくつかの態様において、コンジュゲート基は、親油性部分、例えば、ステロール（例えば、コレステロール、コレステリル、コレスタノール、スチグマステロール、コラン酸、およびエルゴステロール）であるかまたはそれを含み得る。いくつかの態様において、コンジュゲートは、コレステロールであるかまたはそれを含み得る。例えば、Soutschek et al.,Nature(2004)432,173；Krutzfeldt Nature 2005,NAR 2007を参照されたい。
【０３１５】
いくつかの態様において、コンジュゲートは、脂質、リン脂質、または親油性アルコール、例えば、カチオン性脂質、中性脂質、スフィンゴ脂質、ならびに脂肪酸、例えば、ステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノールエライジン酸、リノレン酸、およびミリスチン酸であるかまたはそれを含み得る。いくつかの態様において、脂肪酸には、飽和または不飽和のC4〜C30アルキル鎖が含まれる。アルキル鎖は、直鎖状であってもよいしまたは分岐状であってもよい。
【０３１６】
いくつかの態様において、親油性コンジュゲートは、ビオチンであってもよいしまたはビオチンを含んでいてもよい。いくつかの態様において、親油性コンジュゲートは、グリセリドもしくはグリセリドエステルであってもよいしまたはグリセリドもしくはグリセリドエステルを含んでいてもよい。
【０３１７】
親油性コンジュゲート、例えば、コレステロールまたは本明細書に開示されるものは、オリゴヌクレオチドの、例えば、肝臓（典型的には、ヘパトサイト）への送達を増強するために使用され得る。
【０３１８】
以下の参照が、親油性コンジュゲートの使用に言及している：Kobylanska et al.,Acta Biochim Pol.(1999);46(3):679-91；Felber et al,.Biomaterials(2012)33(25):599-65；Grijalvo et al.,J Org Chem(2010)75(20):6806-13；Koufaki et al.,Curr Med Chem(2009)16(35):4728-42；Godeau et al J.Med.Chem.(2008)51(15):4374-6。
【０３１９】
いくつかの態様において、コンジュゲート部分は親水性である。いくつかの態様において、コンジュゲート基は、親油性置換基、例えば、脂肪酸置換基、例えば、C8-C26、例えば、パルミトイル置換基を含まず、ステロール、例えば、コレステロール置換基も含まない。この点に関して、本発明の一部は、LNAオリゴマーGalNACコンジュゲートが、薬物動態モジュレーター、例えば、脂肪酸置換基（例えば、＞C8または＞C16脂肪酸基）を使用しない場合でも、著しい薬物動態学的特性を有するという驚くべき発見に基づく。
【０３２０】
リンカー
連結またはリンカーは、1個以上の共有結合を介して、ある関心対象の化学基またはセグメントを、もう一つの関心対象の化学基またはセグメントに連結する、2個の原子の間の接続である。コンジュゲート部分（またはターゲティング部分またはブロッキング部分）は、直接、または連結部分（リンカーもしくはテザー）を通して、オリゴマー化合物に付着し得る。リンカーは、第3領域、例えば、コンジュゲート部分を、オリゴマー化合物（例えば、領域B）に、共有結合で接続するために役立つ二官能性部分である。いくつかの態様において、リンカーは、反復単位、例えば、エチレングリコール単位またはアミノ酸単位の鎖構造またはオリゴマーを含む。リンカーは、少なくとも2種類の官能性を有することができ、一つは、オリゴマー化合物に対する付着のためのものであり、他方は、コンジュゲート部分に対する付着のためのものである。リンカーの官能性の例は、オリゴマー上もしくはコンジュゲート部分上の求核基と反応するため求電子性であるか、または求電子基と反応するため求核性であり得る。いくつかの態様において、リンカーの官能性には、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、ホスホルアミダート、ホスフェート、ホスファイト、不飽和（例えば、二重結合または三重結合）等が含まれる。リンカーのいくつかの例には、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（ADO）、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート（SMCC）、6-アミノヘキサン酸（AHEXまたはAHA）、6-アミノヘキシルオキシ、4-アミノ酪酸、4-アミノシクロヘキシルカルボン酸、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシ-(6-アミド-カプロエート)（LCSMCC）、サクシニミジルm-マレイミド-ベンゾイレート（MBS）、サクシニミジルN-e-マレイミド-カプロイレート（EMCS）、サクシニミジル6-(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート（SMPH）、サクシニミジルN-(a-マレイミドアセテート)（AMAS）、サクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）、β-アラニン（β-ALA）、フェニルグリシン（PHG）、4-アミノシクロヘキサン酸（ACHC）、β-(シクロプロピル)アラニン（β-CYPR）、アミノドデカン酸（ADC）、アルキレンジオール、ポリエチレングリコール、アミノ酸等が含まれる。
【０３２１】
コンジュゲート部分のオリゴマー化合物への付着において有用であり得る多様なさらなるリンカー基が、当技術分野において公知である。有用なリンカー基の多くの概説が、例えば、Antisense Research and Applications,S.T.Crooke and B.Lebleu,Eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,p.303-350に見出され得る。ジスルフィド連結は、オリゴヌクレオチドの3'末端を、ペプチドに連結するために使用されている（Corey,et al.,Science 1987,238,1401；Zuckermann,et al,J Am.Chem.Soc.1988,110,1614；およびCorey,et al.,J Am.Chem.Soc.1989,111,8524）。Nelson,et al.,Nuc.Acids Res.1989,17,7187は、オリゴヌクレオチドの3'末端にビオチンを付着させるための連結試薬を記載している。この試薬、N-Fmoc-O-DMT-3-アミノ-1,2-プロパンジオールは、3'-Amineの名称でClontech Laboratories（Palo Alto,Calif.）から市販されている。それは、Glen Research Corporation（Sterling,Va.）からも3'-Amino-Modifier試薬の名称で市販されている。この試薬は、Judy,et al.,Tetrahedron Letters 1991,32,879によって報告されたように、ペプチドをオリゴヌクレオチドに連結するためにも利用された。オリゴヌクレオチドの5'末端に連結するための類似の市販の試薬は、5'-Amino-Modifier C6である。これらの試薬は、Glen Research Corporation（Sterling,Va.）から入手可能である。これらの化合物または類似のものは、フルオレセインをオリゴヌクレオチドの5'末端に連結するため、Krieg,et al,Antisense Research and Development 1991,1,161によって利用された。他の化合物、例えば、アクリジンは、ポリメチレン連結を介して、オリゴヌクレオチドの3'末端ホスフェート基に付着させられた（Asseline,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81,3297）。上記の基のいずれかは、単一のリンカーとして、または1種以上のさらなるリンカーと組み合わせて使用され得る。
【０３２２】
リンカー、およびオリゴマー化合物のコンジュゲートの調製におけるそれらの使用は、当技術分野において、例えば、各々参照によってその全体が組み入れられる、WO96/11205およびWO98/52614ならびに米国特許第4,948,882号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,580,731号；第5,486,603号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,667,025号；第5,254,469号；第5,245,022号；第5,112,963号；第5,391,723号；第5,510475号；第5,512,667号；第5,574,142号；第5,684,142号；第5,770,716号；第6,096,875号；第6,335,432号；および第6,335,437号、WO2012/083046に提供されている。
【０３２３】
本明細書において使用されるように、生理学的に不安定な結合とは、哺乳動物体内に通常見られる条件またはそれに類似している条件の下で切断可能である不安定結合である（切断可能リンカーとも呼ばれる）。生理学的に不安定な連結基は、ある特定の生理学的条件に存在する時に化学的変換（例えば、切断）を受けるよう選択される。哺乳動物細胞内条件には、哺乳動物細胞内で生じるものにおいて見られるまたはそれに類似する化学的条件、例えば、pH、温度、酸化性または還元性の条件または作用物質、および塩濃度が含まれる。哺乳動物細胞内条件には、哺乳動物細胞に通常存在する、例えば、タンパク質分解酵素または加水分解酵素からの酵素活性の存在も含まれる。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、例えば、標的細胞において発現され得るヌクレアーゼに対して感受性であり、従って、本明細書に詳述されるように、リンカーは、ホスホジエステルによって連結されたヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシドの短い領域（例えば、1〜10個）であり得る。
【０３２４】
化学的変換（不安定結合の切断）は、薬学的に許容される薬剤の細胞への添加によって開始されるか、または不安定結合を含有している分子が、適切な細胞内および／もしくは細胞外の環境に到達した時に自然に起こり得る。例えば、pH不安定結合は、分子が酸性化されたエンドソームに進入する時に切断され得る。従って、pH不安定結合は、エンドソーム切断可能結合であると見なしてもよい。酵素切断可能結合は、酵素、例えば、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものに曝された時に切断され得る。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に進入した時に切断され得る。従って、ジスルフィドは、細胞質切断可能結合であると見なしてもよい。本明細書において使用される、pH不安定結合とは、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定結合である。細胞のエンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合は、エンドソーム不安定結合とも名付けられ得る。
【０３２５】
リンカー（例えば、領域Y）
連結またはリンカーとは、1個以上の共有結合を介して、ある関心対象の化学基またはセグメントを、別の関心対象の化学基またはセグメントに連結する、2個の原子間の接続である。コンジュゲート部分（またはターゲティング部分またはブロッキング部分）は、直接、または連結部分（リンカーもしくはテザー）を通して、オリゴマー化合物に付着していてよい。リンカーは、第3領域、例えば、コンジュゲート部分を、オリゴマー化合物（例えば、領域B）に共有結合で接続するために役立つ二官能性部分である。いくつかの態様において、リンカーは、反復単位、例えば、エチレングリコール単位またはアミノ酸単位の鎖構造またはオリゴマーを含む。リンカーは、少なくとも2個の官能性を有することができ、1個は、オリゴマー化合物への付着のためのものであり、もう1個は、コンジュゲート部分への付着のためのものである。リンカーの官能性の例は、オリゴマー上もしくはコンジュゲート部分上の求核基と反応するため求電子性であるか、または求電子基と反応するため求核性であり得る。いくつかの態様において、リンカーの官能性には、アミノ、ヒドロキシル、カルボン酸、チオール、ホスホロアミデート（phosphoramidate）、ホスホロチオエート、ホスフェート、ホスファイト、不飽和（例えば、二重結合または三重結合）等が含まれる。リンカーのいくつかの例には、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸（ADO）、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシレート（SMCC）、6-アミノヘキサン酸（AHEXまたはAHA）、6-アミノヘキシルオキシ、4-アミノ酪酸、4-アミノシクロヘキシルカルボン酸、サクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-l-カルボキシ-(6-アミド-カプロエート)（LCSMCC）、サクシニミジルm-マレイミド-ベンゾイレート（MBS）、サクシニミジルN-e-マレイミド-カプロイレート（EMCS）、サクシニミジル6-(β-マレイミド-プロピオンアミド)ヘキサノエート（SMPH）、サクシニミジルN-(a-マレイミドアセテート)（AMAS）、サクシニミジル4-(p-マレイミドフェニル)ブチレート（SMPB）、β-アラニン（β-ALA）、フェニルグリシン（PHG）、4-アミノシクロヘキサン酸（ACHC）、β-(シクロプロピル)アラニン（β-CYPR）、アミノドデカン酸（ADC）、アルキレンジオール、ポリエチレングリコール、アミノ酸等が含まれる。
【０３２６】
コンジュゲート部分のオリゴマー化合物への付着において有用であり得る多様なさらなるリンカー基が、当技術分野において公知である。有用なリンカー基の多くの概説が、例えば、Antisense Research and Applications,S.T.Crooke and B.Lebleu,Eds.,CRC Press,Boca Raton,Fla.,1993,p.303-350に見出され得る。ジスルフィド連結は、オリゴヌクレオチドの3'末端を、ペプチドに連結するために使用されている（Corey,et al.,Science 1987,238,1401；Zuckermann,et al,J Am.Chem.Soc.1988,110,1614；およびCorey,et al.,J Am.Chem.Soc.1989,111,8524）。Nelson,et al.,Nuc.Acids Res.1989,17,7187は、オリゴヌクレオチドの3'末端にビオチンを付着させるための連結試薬を記載している。この試薬、N-Fmoc-O-DMT-3-アミノ-1,2-プロパンジオールは、3'-Amineの名称でClontech Laboratories（Palo Alto,Calif.）から市販されている。それは、Glen Research Corporation（Sterling,Va.）からも3'-Amino-Modifier試薬の名称で市販されている。この試薬は、Judy,et al.,Tetrahedron Letters 1991,32,879によって報告されたように、ペプチドをオリゴヌクレオチドに連結するためにも利用された。オリゴヌクレオチドの5'末端への連結のための類似の市販の試薬は、5'-Amino-Modifier C6である。これらの試薬は、Glen Research Corporation（Sterling,Va.）から入手可能である。これらの化合物または類似のものは、フルオレセインをオリゴヌクレオチドの5'末端に連結するため、Krieg,et al,Antisense Research and Development 1991,1,161によって利用された。他の化合物、例えば、アクリジンは、ポリメチレン連結を介して、オリゴヌクレオチドの3'末端ホスフェート基に付着させられた（Asseline,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1984,81,3297）。上記の基のいずれかは、単一のリンカーとして、または1種以上のさらなるリンカーと組み合わせて使用され得る。
【０３２７】
リンカー、およびオリゴマー化合物のコンジュゲートの調製におけるそれらの使用は、当技術分野において、例えば、各々参照によってその全体が組み入れられる、WO96/11205およびWO98/52614、ならびに米国特許第4,948,882号；第5,525,465号；第5,541,313号；第5,545,730号；第5,552,538号；第5,580,731号；第5,486,603号；第5,608,046号；第4,587,044号；第4,667,025号；第5,254,469号；第5,245,022号；第5,112,963号；第5,391,723号；第5,510475号；第5,512,667号；第5,574,142号；第5,684,142号；第5,770,716号；第6,096,875号；第6,335,432号；および第6,335,437号、Wo2012/083046に提供されている。
【０３２８】
本明細書において使用されるように、生理学的に不安定な結合とは、哺乳動物体内に通常見られる条件またはそれに類似している条件の下で切断可能である不安定結合である（切断可能リンカーとも呼ばれる）。生理学的に不安定な連結基は、ある特定の生理学的条件に存在する時に化学的変換（例えば、切断）を受けるよう選択される。哺乳動物細胞内条件には、哺乳動物細胞内で生じるものにおいて見られるまたはそれに類似する化学的条件、例えば、pH、温度、酸化性または還元性の条件または作用物質、および塩濃度が含まれる。哺乳動物細胞内条件には、哺乳動物細胞に通常存在する、例えば、タンパク質分解酵素または加水分解酵素からの酵素活性の存在も含まれる。いくつかの態様において、切断可能リンカーは、例えば、標的細胞において発現され得るヌクレアーゼに対して感受性であり、従って、本明細書に詳述されるように、リンカーは、ホスホジエステルによって連結されたヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシドの短い領域（例えば、1〜10個）であり得る。
【０３２９】
化学的変換（不安定結合の切断）は、薬学的に許容される薬剤の細胞への添加によって開始されるか、または不安定結合を含有している分子が、適切な細胞内および／もしくは細胞外の環境に到達した時に自然に起こり得る。例えば、pH不安定結合は、分子が酸性化されたエンドソームに進入する時に切断され得る。従って、pH不安定結合は、エンドソーム切断可能結合であると見なしてもよい。酵素切断可能結合は、酵素、例えば、エンドソームもしくはリソソームまたは細胞質に存在するものに曝された時に切断され得る。ジスルフィド結合は、分子が細胞質のより還元性の環境に進入した時に切断され得る。従って、ジスルフィドは、細胞質切断可能結合であると見なしてもよい。本明細書において使用される、pH不安定結合とは、酸性条件（pH＜7）下で選択的に分解される不安定結合である。細胞のエンドソームおよびリソソームは7未満のpHを有するため、そのような結合は、エンドソーム不安定結合とも名付けられ得る。
【０３３０】
オリゴマーと連結された生物切断性コンジュゲート
オリゴマー化合物は、任意で、オリゴマー（領域Aと呼ばれる）とコンジュゲート（領域Cと呼ばれる）との間に位置する第2領域（領域B）を含み得る。領域Bは、リンカー、例えば、切断可能なリンカー（生理学的に不安定な連結とも呼ばれる）であり得る。
【０３３１】
実施例9に示すアッセイにおける、切断に対する感受性は、リンカーが生物切断性であるかまたは生理学的に不安定であるかどうかの判定に使用され得る。
【０３３２】
本発明による生物切断性リンカーとは、標的組織、例えば、肝臓および／または腎臓において、切断に対して感受性（即ち、生理学的に不安定）であるリンカーをさす。標的組織において見られる切断速度は、血清において見られるものより大きいことが好ましい。組織（例えば、肝臓または腎臓）および血清における切断のレベル（％）を決定するための適当な方法は、実施例9に見出される。いくつかの態様において、本発明の化合物における生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカーまたはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、領域Bは、実施例9の肝臓または腎臓のホモジネートアッセイにおいて、少なくとも約20％切断され、例えば、少なくとも約30％切断され、例えば、少なくとも約40％切断され、例えば、少なくとも約50％切断され、例えば、少なくとも約60％切断され、例えば、少なくとも約70％切断され、例えば、少なくとも約75％切断される。いくつかの態様において、実施例9におけるアッセイにおいて使用される血清における切断（％）は、約30％未満であり、約20％未満、例えば、約10％未満、例えば、5％未満、例えば、約1％未満である。
【０３３３】
同一であってもよいしまたは異なっていてもよいいくつかの態様において、本発明の化合物における生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカーまたはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、領域Bは、S1ヌクレアーゼ切断に対して感受性である。S1切断に対する感受性は、実施例9において示されるS1ヌクレアーゼアッセイを使用して評価され得る。いくつかの態様において、本発明の化合物における生物切断性リンカー（生理学的に不安定なリンカーまたはヌクレアーゼ感受性リンカーとも呼ばれる）、例えば、領域Bは、実施例9において使用されるアッセイによるS1ヌクレアーゼとの120分のインキュベーションの後に、少なくとも約30％切断され、例えば、少なくとも約40％切断され、例えば、少なくとも約50％切断され、例えば、少なくとも約60％切断され、例えば、少なくとも約70％切断され、例えば、少なくとも約80％切断され、例えば、少なくとも約90％切断され、例えば、少なくとも95％切断される。
【０３３４】
ヌクレアーゼ感受性の生理学的に不安定な連結
オリゴマー化合物は、任意で、LNAオリゴマー（領域Aと呼ばれる）と糖質コンジュゲート（領域Cと呼ばれる）との間に位置する第2領域を含み得る。領域Bは、リンカー、例えば切断可能なリンカー（生理学的に不安定な連結とも呼ばれる）であり得る。
【０３３５】
いくつかの態様において、領域Bは1〜10個のヌクレオチドを含み、例えば、ヌクレオシド間連結基、例えば、ホスホジエステル連結を介して、第1領域の5'ヌクレオチドまたは3'ヌクレオチドに共有結合で連結され、ここで、
（a）第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結であり、第1領域に［例えば、直接］隣接している第2領域のヌクレオシドは、DNAもしくはRNAのいずれかであり；かつ／または
（b）第2領域の少なくとも1個のヌクレオシドは、ホスホジエステルによって連結されたDNAヌクレオシドもしくはRNAヌクレオシドである。
【０３３６】
いくつかの態様において、領域Aおよび領域Bは、8〜35ヌクレオチド長の単一の連続ヌクレオチド配列を形成する。いくつかの局面において、第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結は、第2領域の一部と見なされ得る。
【０３３７】
いくつかの態様において、第2領域と第3領域との間にリン含有連結基が存在する。リン連結基は、例えば、ホスフェート（ホスホジエステル）基、ホスホロチオエート基、ホスホロジチオエート基、またはボラノホスフェート基であり得る。いくつかの態様において、このリン含有連結基は、第2領域と、第3領域に付着しているリンカー領域との間に位置する。いくつかの態様において、ホスフェート基はホスホジエステルである。
【０３３８】
従って、いくつかの局面において、オリゴマー化合物は、少なくとも2個のホスホジエステル基を含み、少なくとも1個は、本発明の上記の通りであり、その他は、第2領域と第3領域との間、任意で、リンカー基と第2領域との間に位置する。
【０３３９】
いくつかの態様において、第3領域は、活性化基、例えばコンジュゲーションにおいて使用するための活性化基である。この点で、本発明は、領域Aおよび領域Bならびに活性化基を含む活性化されたオリゴマー、例えば、その後の第3領域との連結に適した、例えばコンジュゲーションに適した中間体も提供する。
【０３４０】
いくつかの態様において、第3領域は、反応基、例えばコンジュゲーションにおいて使用するための反応基である。この点で、本発明は、領域Aおよび領域Bならびに反応基を含むオリゴマー、例えば、その後の第3領域との連結に適した、例えばコンジュゲーションに適した中間体も提供する。反応基は、いくつかの態様において、アミン基またはアルコール基、例えば、アミン基を含み得る。
【０３４１】
いくつかの態様において、領域Aは、ホスホジエステル以外のヌクレオシド間連結、例えば、（任意で独立に）ホスホロチオエート、ホスホジチオエート、およびボラノホスフェート、およびメチルホスホネートからなる群より選択されるヌクレオシド間連結、例えば、ホスホロチオエートを、少なくとも1個、例えば、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、または24個、含む。いくつかの態様において、領域Aは、少なくとも1個のホスホロチオエート連結を含む。いくつかの態様において、ヌクレオシド間連結の少なくとも50％、例えば少なくとも75％、例えば少なくとも90％、例えば、領域A内の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル以外であり、例えば、ホスホロチオエート連結である。いくつかの態様において、領域A内の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル以外である。
【０３４２】
いくつかの態様において、オリゴマー化合物は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第1領域、任意で、第1領域および第2領域であってもよいしまたはそれを含んでいてもよい。この点で、いくつかの態様において、領域Bは、（核酸）標的に相補的な連続核酸塩基配列の一部を形成し得る。他の態様において、領域Bは、標的との相補性を欠いていてもよい。
【０３４３】
換言すると、いくつかの態様において、本発明は、ホスホジエステル連結を介してオリゴヌクレオチドの隣接ヌクレオシドに連結された少なくとも1個の末端（5'および／または3'）のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを有する、非ホスホジエステルによって連結された、例えば、ホスホロチオエートによって連結されたオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）を提供する。末端のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドは、任意でリンカー部分を介して、コンジュゲート部分、ターゲティング部分、またはブロッキング部分にさらに共有結合で連結されている。
【０３４４】
第1領域は、例えば、5'末端または3'末端のヌクレオシド間連結、例えば、ホスホジエステル連結を介して、第2領域に共有結合で連結される。従って、ホスホジエステル連結は、領域Aの最も5'に在るヌクレオシドと領域Bの最も3'に在るヌクレオシドとの間、および／または領域Aの最も3'に在るヌクレオシドと領域Bの最も5'に在るヌクレオシドとの間に位置し得る。この点で、いくつかの態様において、領域Aに共有結合で接合された2個の領域Bが、1個は領域Aの5'末端に、1個は領域Aの3'末端に、存在してもよい。2個の領域Bは、同一であってもよいしまたは異なっていてもよく、任意で独立に、リンカー（Y）を介して、同一のまたは異なる第3領域に共有結合で連結されてもよい。
【０３４５】
オリゴマーは、8〜35個の連続するヌクレオチドの長さを有してもよく、例えば7〜25個の連続するヌクレオチドの第1領域、および1〜10個の連続するヌクレオチドの第2領域を含み、例えば、第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結が、第2領域の最初の（または唯一の）DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドにホスホジエステルによって連結されているか、または領域Bが、少なくとも1個のホスホジエステルによって連結されたDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを含む。
【０３４６】
第2領域は、いくつかの態様において、ホスホジエステルによって連結され得るさらなるDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを含み得る。第2領域は、例えば、コンジュゲート部分であり得るかまたはそれを含み得る第3領域に、さらに共有結合で連結されている。
【０３４７】
第2領域は、ホスホジエステル連結を介して第1領域に連結された少なくとも1個のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを含むかまたはそれからなっていてよい。いくつかの局面において、第1領域と第2領域との間のヌクレオシド間連結は、領域Bの一部と見なされる。
【０３４８】
いくつかの態様において、第2領域は、少なくとも1〜10個の連結されたヌクレオシド、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の連結されたDNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。DNA/RNAホスホジエステルの領域は、切断可能リンカーの提供において重要であると考えられるが、領域Bも、糖修飾型ヌクレオシド類似体、例えば、上記の第1領域について言及されたものを含むことが可能である。しかしながら、いくつかの態様において、領域Bのヌクレオシドは、（任意で独立に）DNAおよびRNAからなる群より選択される。領域Bのヌクレオシドは、天然に存在する核酸塩基または天然には存在しない核酸塩基を含み得ることが、認識されるであろう。領域Bは、（いくつかの態様において、領域Aに隣接している最初のヌクレオシドであってもよい）少なくとも1個のホスホジエステルによって連結されたDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドを含む。領域Bが他のヌクレオシドを含む場合、領域Bは、ホスホジエステル以外の他のヌクレオシド結合、例えば、（任意で独立に）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、またはメチルホスホネートも含み得る。しかしながら、他の態様において、領域B内の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートである。いくつかの態様において、領域Bの全てのヌクレオシドが、（任意で独立に）2'-OHリボース糖（RNA）または2'-H糖のいずれかを含む（即ち、RNAまたはDNA）。
【０３４９】
いくつかの態様において、第2領域は、少なくとも1〜10個の（例えば、ホスホジエステルによって）連結されたDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシド、例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個の（例えば、ホスホジエステルによって）連結されたDNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドを含むかまたはそれからなる。
【０３５０】
いくつかの態様において、領域Bは、3個以下または4個以下の連続するDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシドを含む。従って、領域Bは、RNAseHをリクルートしないよう短くてよく、この局面は、領域Bが、標的に相補的な単一の連続核酸塩基配列の一部を形成しない時、重要であり得る。より短い領域B、例えば、1〜4nt長の領域Bは、配列特異的な制限酵素の標的となる可能性が低いことからも、いくつかの態様において、好ましい可能性がある。従って、エンドヌクレアーゼ切断に対する領域Bの感受性を変動させ、それによって、インビボまたは細胞内での活性オリゴマーの活性化の速度を微調整することが可能である。極めて急速な活性化が必要とされる場合には、適宜、より長い領域B、および／または（例えば、細胞もしくは組織に特異的なまたは差次的に発現される）制限酵素の認識部位を含む領域Bが利用され得る。
【０３５１】
実施例において例示されるように、領域Bは、例えば、ホスホジエステル連結、および／または任意での適切なリンカー基、例えば、本明細書に提供されたもの、例えば、ホスフェートヌクレオシド連結（例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ボラノホスフェート、もしくはメチルホスホネート）、もしくはトリアゾール基を含み得るリンカー基を介して、コンジュゲート基、ターゲティング基、反応基、活性化基、またはブロッキング基などの官能基（X）にコンジュゲートされ得る。いくつかの局面において、連結基は、領域Aと領域Bとの間の連結基と同一であり、従って、ホスホジエステル連結であり得る。いくつかの局面において、連結基はホスホロチオエート連結である。
【０３５２】
いくつかの態様において、第2領域のDNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドより独立に選択される。いくつかの態様において、第2領域のDNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドである。いくつかの態様において、第2領域のDNAヌクレオチドまたはRNAヌクレオチドは、RNAヌクレオチドである。
【０３５３】
第2領域に関して、DNAヌクレオシドおよびRNAヌクレオシドという用語には、天然に存在する塩基、または天然には存在しない塩基（塩基類似体もしくは修飾型塩基とも呼ばれる）が含まれ得る。
【０３５４】
いくつかの態様において、第2領域は、他のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体をさらに含んでいてもよいことが認識されるであろう。いくつかの態様において、第2領域は、DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドのみを含む。いくつかの態様において、第2領域が複数個のヌクレオシドを含む時、第2領域内のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結を含む。いくつかの態様において、第2領域が複数個のヌクレオシドを含む時、第2領域内の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホジエステル連結を含む。
【０３５５】
いくつかの態様において、第2領域の少なくとも2個の連続ヌクレオシドは、DNAヌクレオシド（例えば、少なくとも3個または4個または5個の連続DNAヌクレオチド）である。いくつかの態様において、第2領域の少なくとも2個の連続ヌクレオシドは、RNAヌクレオシド（例えば、少なくとも3個または4個または5個の連続RNAヌクレオチド）である。いくつかの態様において、第2領域の少なくとも2個の連続ヌクレオシドは、少なくとも1個のDNAおよび少なくとも1個のRNAヌクレオシドである。領域Aと領域Bとの間のヌクレオシド間連結はホスホジエステル連結である。いくつかの態様において、領域Bが複数個のヌクレオシドを含む時、少なくとも1個のさらなるヌクレオシド間連結、例えば、領域Aに隣接している2個（または3個または4個または5個）のヌクレオシドの間の連結基は、ホスホジエステルである。
【０３５６】
第2領域の片側（5'または3'のいずれか）には、第1領域、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが隣接しており、反対側（それぞれ3'または5'のいずれか）には、任意で（即ち、第2領域とコンジュゲート／ブロッキング基等の部分との間の）リンカー基を介して、コンジュゲート部分または類似した基（例えば、ブロッキング部分／基、ターゲティング部分／基、もしくは治療用小分子部分）が隣接している。
【０３５７】
そのような態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって説明され得る：
5'-A-PO-B[Y]X-3'  または  3'-A-PO-B[Y]X-5'
式中、Aは、領域Aであり、POは、ホスホジエステル連結であり、Bは、領域Bであり、Yは、任意の連結基であり、Xは、コンジュゲート基、ターゲティング基、ブロッキング基、または反応基もしくは活性化基である。
【０３５８】
いくつかの態様において、領域Bは、3'〜5'または5'〜3'に：（i）領域Aの5'ヌクレオシドとのホスホジエステル連結、（ii）DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシド、および（iii）さらなるホスホジエステル連結を含む。
5'-A-PO-B-PO-3'  または  3'-A-PO-B-PO-5'
【０３５９】
さらなるホスホジエステル連結は、領域Bのヌクレオシドを、1個以上のさらなるヌクレオシド、例えば、1個以上のDNAヌクレオシドもしくはRNAヌクレオシドに連結するか、または、任意で連結基（Y）を介して、X（コンジュゲート基、ターゲティング基、もしくはブロッキング基、もしくは反応基もしくは活性化基）に連結することができる。
【０３６０】
いくつかの態様において、領域Bは、3'〜5'または5'〜3'に：（i）領域Aの5'ヌクレオシドまたは3'ヌクレオシドとのホスホジエステル連結、（ii）2〜10個の、ホスホジエステルによって連結されたDNAまたはRNAヌクレオシド、例えば、DNAヌクレオシド、および任意で（iii）さらなるホスホジエステル連結を含む：
5'-A-[PO-B]n-[Y]-X 3'  または  3'-A-[PO-B]n-[Y]-X 5'
5'-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 3'  または  3'-A-[PO-B]n-PO-[Y]-X 5'
式中、Aは、領域Aを表し、[PO-B]nは、領域Bを表し、nは、1〜10、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10であり、POは、領域BとX（または存在する場合、Y）との間の任意でのホスホジエステル連結基である。
【０３６１】
いくつかの態様において、本発明は、以下の式のうちの一つによる（またはそれを含む）化合物を提供する。
5' [領域A]-PO-[領域B] 3'-Y-X
5' [領域A]-PO-[領域B]-PO 3'-Y-X
5' [領域A]-PO-[領域B] 3'-X
5' [領域A]-PO-[領域B]-PO 3'-X
3' [領域A]-PO-[領域B] 5'-Y-X
3' [領域A]-PO-[領域B]-PO 5'-Y-X
3' [領域A]-PO-[領域B] 5'-X
3' [領域A]-PO-[領域B]-PO 5'-X
【０３６２】
領域Bは、例えば、以下のものを含むかまたはそれからなる。
5' DNA 3'
3' DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-3'
3' DNA-PO-DNA-5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
5' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 3'
3' DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA-PO-DNA 5'
【０３６３】
第2領域における配列選択：
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド領域AおよびBを、相補的な標的配列と整列させた時、領域Bは相補的な配列を形成しない。
【０３６４】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチド領域AおよびBを、相補的な標的配列と整列させた時、領域Bは相補的な配列を形成する。この点で、領域Aおよび領域Bは、共に、標的配列に相補的である単一の連続配列を形成し得る。
【０３６５】
いくつかの態様において、領域B内の塩基の配列は、標的の組織または細胞または細胞内コンパートメントに存在する優勢なエンドヌクレアーゼ切断酵素に基づき、最適のエンドヌクレアーゼ切断部位を提供するよう選択される。この点で、標的組織および非標的組織から細胞抽出物を単離することによって、非標的細胞（例えば、腎臓）と比較して、所望の標的細胞（例えば、肝臓／ヘパトサイト）において優先的な切断活性に基づき、領域Bにおいて使用するためのエンドヌクレアーゼ切断配列が、選択され得る。この点で、標的下方制御のための化合物の効力は、所望の組織／細胞のために最適化され得る。
【０３６６】
いくつかの態様において、領域Bは、配列AA、AT、AC、AG、TA、TT、TC、TG、CA、CT、CC、CG、GA、GT、GC、またはGG（Cは5-メチルシトシンであってもよくかつ／またはTはUに交換されてもよい）のジヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、領域Bは、配列
0006580993.tif 000043
（Cは5-メチルシトシンであってもよくかつ／またはTはUに交換されてもよい）のトリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、領域Bは、配列
0006580993.tif 000044
（Xは、A、T、U、G、C、およびそれらの類似体からなる群より選択され得、Cは5-メチルシトシンであってもよく、かつ／またはTはUに交換されてもよい）のトリヌクレオチドを含む。（天然に存在する）核酸塩基A、T、U、G、Cに言及する時、これらは、等価な天然核酸塩基として機能する（例えば、相補的なヌクレオシドと塩基対形成する）核酸塩基類似体に置換されてもよいことが認識されるであろう。
【０３６７】
いくつかの態様において、本発明の化合物は、複数個のコンジュゲート基（または複数個の官能基X - 例えば、コンジュゲート基、ターゲティング基、ブロッキング基、または活性化された基、または反応基もしくは活性化基）、例えば、2個または3個のそのような基を含み得る。いくつかの態様において、領域Bは、任意で[例えば、非ヌクレオチド]リンカー基を介して、少なくとも1個の官能基、例えば、2個または3個の官能基に共有結合で連結されている。いくつかの態様において、第1領域は、2個の領域B（例えば、1個は第1領域の5'、1個は3'）に、共有結合で連結されていてもよく（例えば、ヌクレオシド間連結、例えば、ホスホジエステル連結を介する）、各領域Bは、（任意で独立に）本明細書に記載された領域Bより選択され得る。この点で、1個の領域Bは、1個以上の官能基を有していてよく、第2の領域Bも、1個以上の官能基を有していてよく、各領域Bの官能基は、独立に、コンジュゲート、ターゲティング基、ブロッキング基、または反応性／活性化基より選択され得る。
【０３６８】
上記の領域B、例えば、「PO DNAリンカー」を、オリゴマーとコンジュゲート部分（XまたはX-Y）との間に使用することは、オリゴマーが標的細胞（例えば、ヘパトサイト）へ送達された後の、オリゴマー配列からのコンジュゲート部分の均一な切断を確実にするため、特に有利である。均一な切断は、親化合物の最大の細胞内効力を保持するためにも、オリゴマーコンジュゲートの安全性プロファイルを増強するためにも有用であり得る。
【０３６９】
ポリオリゴマー化合物
本発明は、第1領域（領域A）、（任意で第2領域（領域B））、および第3領域（領域C）を含んでいてよく、第1領域が、少なくとも1個のさらなるオリゴマー化合物（領域A'）に共有結合で連結されており、第1領域（領域A）と領域A'とが、例えば、本明細書に開示される第2領域（領域B）のものと同様であり得る生物切断性リンカー（領域B'）、例えば、少なくとも1個のホスホジエステルによって連結されたDNAまたはRNA（例えば、DNA）、例えば、2個、3個、4個、または5個のホスホジエステルによって連結されたDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシド（例えば、DNAヌクレオシド）の領域を介して共有結合で連結されている、ポリオリゴマー化合物を提供する。領域Bを含む態様において、領域BおよびB'は、いくつかの態様において、同一の構造、例えば、同数のDNA/RNAヌクレオシドおよびホスホジエステル連結ならびに／または同一の核酸塩基配列を有し得る。他の態様において、領域BおよびB'は、異なっていてもよい。例えば、そのようなポリオリゴマー化合物は、（5'〜3'または3'〜5'）コンジュゲート-PO-ON-PO'-ON'（コンジュゲートは、領域Cであり、POは、領域Bであり、PO'は、領域B'であり、ON 1は、領域Aであり、ON'は、領域A'である）のような構造を有する。
【０３７０】
オリゴマー領域A'は、いくつかの態様において、生物切断性リンカーを介して一列に（または平行に）連結された複数個のさらなるオリゴマー化合物（例えば、2個または3個のさらなるオリゴマー化合物）、例えば、コンジュゲート-PO-ON-PO-ON'-PO''-ON''またはコンジュゲート-PO-ON-[PO-ON']n（nは、例えば、1、2、または3であり得、各ON'は、同一であってもよいしまたは異なっていてもよく、異なる場合、同一の標的を有していてもよいしまたは異なる標的を有していてもよい）を含み得ることが理解されるべきである。
【０３７１】
本発明は、式[LNAs]7-18-[DNA]1-5-[LNAs]7-18の連続ヌクレオチド配列と、非核酸塩基コンジュゲート、例えば、GalNAcコンジュゲート部分、例えば、3価GalNAcコンジュゲートコンジュゲート、例えば、コンジュゲート1、2、3、4、1a、2a、3a、4aのいずれか一つからなる群より選択されるコンジュゲート部分、またはその他の3価GalNAcコンジュゲート、例えば、本明細書に開示されたものとを含むオリゴマー化合物を提供する。下付きのsは、ホスホロチオエート連結をさす。-[DNA]1-5-領域内のまたは-[DNA]1-5-領域に隣接する少なくとも1個のヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル連結である。いくつかの態様において、-[DNA]1-5-領域内のまたは-[DNA]1-5-領域に隣接する全てのヌクレオシド間結合が、ホスホジエステル結合である。いくつかの態様において、-[DNA]1-5-領域は、ホスホジエステル連結によって接合された2個、3個、4個、または5個の連続DNAヌクレオシドを有する。そのような態様において、-[DNA]2-5-の間のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結であり、任意で、領域-[DNA]1-5とLNA領域[LNAs]7-18との間のヌクレオシド間連結は、独立に、ホスホロチオエート連結またはホスホジエステル連結であり、例えば、両方ともホスホジエステルであるか、または両方ともホスホロチオエートであるか、または一方がホスホジエステル、他方がホスホロチオエートである。DNA領域が単一のDNAヌクレオシドである態様において、DNA領域に隣接しているヌクレオシド間連結の少なくとも一方または両方が、ホスホジエステルであり、一方のみがホスホジエステルである場合、他方はホスホロチオエートであり得る。領域-[DNA]1-5は、本明細書において領域Bについて記載されたように定義され得、即ち、生理学的に切断可能なヌクレオシドリンカー領域であり得る。各[LNAs]7-18は、LNAホスホロチオエートオリゴマーであり、例えば、LNAギャップマー、LNAミックスマー、またはLNAトータルマーからなる群より独立に選択され得る。GalNAcコンジュゲートは、例えば、連続ヌクレオチド配列の5'または3'に位置し得る。好ましい態様において、LNAオリゴマーの少なくとも一方、または両方のポリオリゴマーコンジュゲートが、7〜12ヌクレオチド長、例えば、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長、または10ヌクレオチド長のLNAトータルマーである。いくつかの態様において、LNAトータルマーは、ホスホロチオエート連結によって連結されたLNAヌクレオチド、例えば、β-D-オキシLNAヌクレオシドのみを含み得る。例えば、ポリオリゴマーコンジュゲートは、連続ヌクレオチド配列[LNAs]7-10-[DNA]1-5-[LNAs]7-10、例えば、[LNAs]7-10-[DNA]2-[LNAs]7-10または[LNAs]7-10-[DNA]3-[LNAs]7-10または[LNAs]7-10-[DNA]4-[LNAs]7-10を含み得る。一つの態様において、連続ヌクレオチド配列は、[LNAs]8-[DNA]1-5-[LNAs]8、例えば、[LNAs]8-[DNA]2-[LNAs]8、[LNAs]8-[DNA]3-[LNAs]8、または[LNAs]8-[DNA]4-[LNAs]8を含む。そのようなポリオリゴマー複合体は、マイクロRNA、例えば、成熟マイクロRNAを標的とするのに特に有用である。第1の標的（例えば、mRNA、マイクロRNA、またはウイルス配列）を標的とする第1のLNAオリゴマー領域、および第2の標的（例えば、mRNA、マイクロRNA、またはウイルス配列）を標的とする第2のLNAオリゴマー領域を利用することによって、2種の別個の標的を標的とする単一の化合物を作製することができ、例えば、第1のオリゴ���ー領域は、アポBを標的とし、第2のオリゴマー領域は、別のmRNA、例えば、mtGPAT mRNAを標的とし得る。例えば：
領域C-5'[SEQ ID No 50]-[領域B]-[SEQ ID No 59]3'
0006580993.tif 000045
領域Cは、3価GalNAcコンジュゲート、例えば、コンジュゲート2a、または本明細書に開示されたその他のGalNAcコンジュゲートであり得る。領域Bは、DNAジヌクレオチドの間のヌクレオチド間連結およびジヌクレオチドに隣接しているヌクレオチド間連結がホスホジエステルである、DNAジヌクレオチド「ca」であり得る。
【０３７２】
あるマイクロRNAを標的とする第1のLNAオリゴマー領域（例えば、[LNAs]7-10）および第2のマイクロRNAを標的とする第2のLNAオリゴマー領域を利用することによって、2種の異なるマイクロRNA標的、例えば、両方とも肝細胞癌において示されているmiR-21およびmiR-221を標的とする単一の化合物を作製することができる。あるいは、この第1および第2の領域は、同一のマイクロRNA、例えば、miR-122、miR-21、miR-155、miR-33、miR-221を標的としてもよく、それは、単一のコンジュゲート部分について、2種のオリゴマーが標的細胞へ送達されることを可能にする。
【０３７３】
例えば受容体によって媒介されるGalNAcがコンジュゲートされたオリゴマーの取り込みが標的細胞の表面上の遊離の受容体の利用可能性によって限定される、例えばアシアロ糖タンパク質受容体コンジュゲートによる受容体媒介コンジュゲートターゲティングにとって、これは、特に重要であり、ポリオリゴマーコンジュゲートの使用は、標的細胞への増強された送達を可能にする。重要な生物学的機能を果たす細胞表面受容体の完全飽和を回避することも重要であり、従って、ポリオリゴマー戦略の使用は、コンジュゲート部分による受容体飽和／競合による副作用のリスクを低下させながら関連する薬理を確実にするために、十分な化合物の効果的な送達を可能にする。従って、ポリオリゴマーコンジュゲートの使用は、治療指数を増強する（望ましくない副作用を低下させると共に、オリゴマーの送達および活性を増加させる）ための有効な解決策を提供する。
【０３７４】
組成物
本発明のオリゴマーは、薬学的な製剤および組成物において使用され得る。適宜、そのような組成物は、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩、またはアジュバントを含む。WO2007/031091は、適当な好ましい薬学的に許容される希釈剤、担体、およびアジュバントを提供しており、それらは、参照によって本明細書に組み入れられる。適当な投薬量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤も、WO2007/031091に提供されており、それらも、参照によって本明細書に組み入れられる。
【０３７５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的組成物または製剤の調製のため、薬学的に許容される活性物質または不活性物質と混合され得る。薬学的組成物の製剤化のための組成物および方法は、投与経路、疾患の程度、または投与すべき用量を含むが、これらに限定されない、多数の基準に依る。
【０３７６】
アンチセンス化合物は、適当な薬学的に許容される希釈剤または担体とアンチセンス化合物を組み合わせることによって、薬学的組成物において利用され得る。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）が含まれる。PBSは、非経口送達される組成物において使用するために適当な希釈剤である。
【０３７７】
アンチセンス化合物を含む薬学的組成物は、薬学的に許容される塩、エステル、またはそのようなエステルの塩、またはヒトを含む動物への投与によって生物学的活性を有する代謝物質もしくはその残基を（直接もしくは間接的に）提供することができる他のオリゴヌクレオチドを包含する。従って、例えば、本開示は、アンチセンス化合物の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、そのようなプロドラッグの薬学的に許容される塩、およびその他の生物学的等価物にも関する。適当な薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、本発明のオリゴマーはプロドラッグである。
【０３７８】
適用
本発明のオリゴマーは、例えば、診断、治療、および予防のための研究試薬として利用され得る。
【０３７９】
研究において、いくつかの態様において、そのようなオリゴマーは、細胞および実験動物において（典型的には、mRNAを分解するかまたは阻害し、それによって、タンパク質形成を防止することによって）タンパク質の合成を特異的に阻害し、それによって、標的の機能的分析、または治療的介入のための標的としての有用性の評価を容易にするために使用され得る。
【０３８０】
治療のため、標的の発現を調節することによって処置され得る疾患または障害を有すると推測される動物またはヒトが、本発明によるオリゴマー化合物を投与することによって処置される。本発明のオリゴマーまたは組成物のうちの1種以上を、治療的にまたは予防的に有効な量で投与することによって、哺乳動物を処置する方法、例えば、標的の発現に関連した疾患または状態を有するかまたはその素因を有すると推測されるヒトを処置する方法が、さらに提供される。本発明によるオリゴマー、コンジュゲート、または薬学的組成物は、典型的には、有効量で投与される。
【０３８１】
本発明は、本明細書において言及される障害の処置のための医薬の製造のための、または本明細書において言及される障害の処置の方法のための、記載される本発明の化合物またはコンジュゲートの使用も提供する。いくつかの態様において、疾患または障害は肝臓関連の、または肝臓に関連する疾患または障害、例えば以下から選択される疾患または障害である。
【０３８２】
本発明は、本明細書に記載される本発明による化合物、および／または本発明によるコンジュゲート、および／または本発明による薬学的組成物を、その必要のある患者へ投与する工程を含む、本明細書において言及される障害を処置する方法も提供する。
【０３８３】
医学的適応症
本発明は、医薬において使用するためのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。本発明は、肝臓に発現するRNAの下方制御において使用するための、LNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。本発明は、代謝疾患または代謝障害、例えば、肝疾患または肝障害の処置において使用するためのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。本発明は、肝炎、例えば、B型肝炎またはC型肝炎の処置において使用するためのLNAアンチセンスオリゴマーコンジュゲートを提供する。
【０３８４】
いくつかの態様において、疾患は、肝疾患または肝障害である。いくつかの態様において、疾患または障害は、肝線維症であるか、または肝線維症をもたらすか、または肝線維症に関連している。いくつかの態様において、疾患または障害は、血液凝固障害、例えば、血栓塞栓性合併症、例えば、血栓症、塞栓症、および血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中である。第VII因子を標的とするオリゴマーは、血液凝固障害の処置のため、または対象における血液凝固を調節するために使用され得る。第VII因子アンチセンスオリゴヌクレオチドの例については、US2010/0298417およびWO2012/174154を参照されたい。第VII因子を標的とするオリゴマーは、炎症性疾患／障害、癌、慢性関節リウマチ、および繊維症の処置のためにも使用され得る（US2010/0298417およびWO2012/174154を参照）。従って、いくつかの態様において、上記の疾患および障害も、本発明の化合物によって処置され得る。従って、いくつかの態様において、本発明は、炎症性疾患／障害、癌、慢性関節リウマチ、および繊維症；または血液凝固障害、例えば、血栓塞栓性合併症、例えば、血栓症、塞栓症、血栓塞栓症、深部静脈血栓症、肺塞栓症、心筋梗塞、および脳卒中からなる群より選択される疾患もしくは障害の処置において使用するためのオリゴマーを提供する。
【０３８５】
いくつかの態様において、疾患または障害は、肝疾患または肝障害である。
【０３８６】
いくつかの態様において、疾患または障害は、例えば、肝疾患もしくは肝障害、および／または、いくつかの局面において、心血管疾患もしくは心血管障害であり得る代謝障害である。
【０３８７】
心血管／代謝疾患には、例えば、代謝症候群、肥満、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性複合型高脂血症（FCHL）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈心疾患（CHD）、アテローム性動脈硬化症、心疾患、糖尿病（I型および／またはII型）、NASH、急性冠症候群（ACS）、NASH、慢性心不全、心疾患、心代謝疾患、高脂血症および関連障害、代謝症候群、アテローム性動脈硬化症、慢性心不全、血管疾患、末梢動脈障害、心疾患、虚血、2型糖尿病、および／または1型糖尿病が含まれる。
【０３８８】
いくつかの態様において、疾患または障害は、代謝症候群、肥満、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、HDL/LDLコレステロール不均衡、脂質異常症、例えば、家族性複合型高脂血症（FCHL）、後天性高脂血症、スタチン抵抗性高コレステロール血症、冠動脈疾患（CAD）、および冠動脈心疾患（CHD）からなる群より選択される。
【０３８９】
いくつかの態様において、疾患または障害は、慢性心不全、心血管疾患、心代謝疾患、慢性心不全、血管疾患、末梢動脈障害、心疾患、虚血、急性冠症候群（ACS）からなる群より選択される。
【０３９０】
いくつかの態様において、疾患または障害は、2型糖尿病、および／または1型糖尿病である。
【０３９１】
いくつかの態様において、疾患または障害は、ウイルス性疾患、例えば、C型肝炎、B型肝炎などのウイルス性肝炎である。いくつかの態様において、肝疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患および非アルコール性脂肪性肝炎からなる群より選択される疾患または障害であり得る。
【０３９２】
本発明は、疾患、障害、または状態、例えば、本明細書において言及されたものの処置のための医薬の製造における、本発明の化合物の使用をさらに提供する。
【０３９３】
一般的に述べると、本発明のいくつかの局面は、1個以上のLNA単位を含む標的へ標的指向化されたオリゴマーを、治療的に有効な量で哺乳動物へ投与する工程を含む、標的の異常なレベルに関連した状態に罹患しているかまたは罹患し易い哺乳動物を処置する方法に関する。本発明によるオリゴマー、コンジュゲート、または薬学的組成物は、典型的には、有効量で投与される。
【０３９４】
本発明の関心対象の局面は、本明細書において言及される疾患、障害、または状態の処置のための医薬の調製のための、本明細書において定義される化合物の使用に関する。
【０３９５】
さらに、本発明は、疾患または状態、例えば、本明細書において言及されたものに罹患している対象、例えばヒトなどの哺乳動物を処置する方法に関する。
【０３９６】
処置を必要とする患者は、疾患もしくは障害に罹患しているかまたは罹患する可能性が高い患者である。
【０３９７】
いくつかの態様において、本明細書において使用される、「処置」という用語は、既存の疾患（例えば、本明細書において言及される疾患もしくは障害）の処置、または疾患の防止、即ち、予防の両方をさす。従って、本明細書において言及される処置とは、いくつかの態様において、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【実施例】
【０３９８】
マウス試験:
特別の定めのない限り、マウス実験は以下のように行われうる。
【０３９９】
用量投与およびサンプリング:
7〜10週齢のC57Bl6-Nマウスを用い、動物を年齢および性別について適合させた(試験1、2および4の場合には雌性、試験3においては雄性)。化合物を尾静脈へ静脈内注射した。中間の血清サンプリングの場合、顔面静脈の穿刺によって2〜3滴の血液を集め、下大静脈から最後の採血をした。血清は、ゲルを含んだ血清分離管(Greiner)に集め、分析まで凍結保存した。
【０４００】
C57BL6マウスに、示した情報にしたがって生理食塩水中に処方された1 mg/kgのASOの単回用量(もしくは示した量)または生理食塩水のみを静脈内に投薬した。動物を、例えば投薬後4日目もしくは7日目(または示した時)に殺処理し、肝臓および腎臓をサンプリングした。
【０４０１】
RNA単離およびmRNA分析:
Qantigene mRNA定量化キット(「bDNA-アッセイ法」, Panomics/Affimetrix)を、製造元のプロトコルにしたがって用い、組織由来のmRNA分析を行った。組織溶解物の場合、プロテイナーゼKを含有する溶解用緩衝液1 ml中での超音波処理により組織50〜80 mgを溶解させた。RNA抽出なしに溶解物をbDNA-アッセイ法に直接用いた。標的およびGAPDHに対するプローブセットは、特注デザインしてPanomicsから入手した。分析のため、標的遺伝子に対して得られた発光単位をハウスキーパーGAPDHに対して正規化した。
【０４０２】
ALT、ASTおよびコレステロールの血清分析は、血清10 μlを用い、「Cobas INTEGRA 400 plus」臨床化学プラットフォーム(Roche Diagnostics)にて行った。
【０４０３】
第VII因子の血清中レベルの定量化の場合、BIOPHEN FVII酵素活性キット(#221304, Hyphen BioMed)を製造元のプロトコルにしたがって用いた。
【０４０４】
オリゴヌクレオチド定量化の場合、蛍光標識されたPNAプローブを組織溶解物中の関心対象のオリゴとハイブリダイズさせる。bDNA-アッセイ法に関しては、正確に秤量した量の組織だけで、同じ溶解物を用いる。AEX-HPLCおよび蛍光検出を用いてヘテロ二本鎖を定量化する。
【０４０５】
実施例1：オリゴヌクレオチド合成
同一の13塩基長マウス第VII因子配列に基づき、以下のLNAギャップマーオリゴヌクレオチドを調製した。
0006580993.tif 000046
略語：大文字のL：β-D-オキシLNA；s：ホスホロチオエート；大文字のD：DNA；（NH2C6）：アミノリンカー；（Chol1）：コレステロール；（C6SSC6）：生物切断性ジスルフィドリンカー。
0006580993.tif 000047
【０４０６】
GalNacコンジュゲート以外の化合物は、市販のホスホラミダイトを使用した固相合成を介して合成し、IEX HPLCを介して精製した。3価GalNAcクラスタは、参照によって本明細書に組み入れられるUS2012/0157509に従って調製した（図1を参照）。
【０４０７】
実施例2：GalNacコンジュゲートおよびコレステロールコンジュゲートを比較するFVIIのインビボ阻害
全部で9群のマウス（n03）を使用して、GalNacコンジュゲートおよびコレステロールコンジュゲートを並行して試験するインビボマウス研究を準備した。各マウスに、1mg/kgまたは4mg/kgのいずれかのLNA化合物を単回静脈内投与した。生理食塩水対照群が含まれていた。投与の1日前にマウスから予め採血し、その後、6時間目、24時間目、48時間目に血液を採取し、3日後に、マウスを屠殺し、肝臓、腎臓、および血液の試料を採取した。
【０４０８】
第VII因子の血清レベルおよびmRNAレベルを、標準的なアッセイ技術を使用して測定した（図2および3を参照）。FVII GalNacおよびコレステロール（ホスホロチオエート化合物）の両方が、血清におけるFVIIノックダウンを改善し、GalNacは、コレステロールより効果的であった（図2、1mg/kgを参照）。
【０４０９】
実施例3：FVIIのインビボ阻害  GalNacコンジュゲートおよびコレステロールコンジュゲート  用量漸増研究
化合物
0006580993.tif 000048
大文字のLは、LNAヌクレオシド（例えば、β-D-オキシLNA）であり、小文字のdは、DNAヌクレオシドである。下付きのsは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表す（領域A）。2POリンカー（領域B）は、配列領域Aの5'にあり、ホスホジエステル連結によって連結された2個のDNAヌクレオシドを含み、領域Aの3'DNAヌクレオシドと領域Aの5'LNAヌクレオシドとの間のヌクレオシド間連結もホスホジエステルである。連結基（Y）が、存在する時、コンジュゲート基を領域BまたはAへ連結するために使用される（例えば、SEQ ID NO 3）。
【０４１０】
全部で16群のマウス（n＝3）を使用してインビボマウス研究を準備した。各マウスに、1g/kg、0.5g/kg、0.25g/kg、0.1g/kg、または0.05mg/kgのいずれかで、LNA化合物を単回静脈内投与した。生理食塩水対照群が含まれていた。投与の1日前にマウスから予め採血し、その後、研究中の様々な時点で血液を採取した。マウスを、4日目、14日目、または24日目に屠殺し、肝臓、腎臓、および血液の試料を採取した。研究構成については、下記表を参照されたい。第VII因子の血清レベル（図4）、mRNAレベル（図5）、およびオリゴヌクレオチド組織中含量（図6）を、標準的なアッセイ技術を使用して測定した。
【０４１１】
結論：FVIIを標的とするLNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたGalNAc（SEQ ID NO 3および6）は、コンジュゲートされていないLNAオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO 1）と比較して、血清中のFVIIタンパク質（図4）および肝臓中のmRNA（図5）に対する極めて高い活性を示す。極めて低い用量ですら、活性は顕著である。さらに、GalNAcクラスタが、コレステロールコンジュゲート（SEQ ID NO 4および7）と比較して、FVIIのタンパク質およびmRNAについてより高活性であることが理解される（図4dおよび図5d）。肝臓および腎臓における組織中含量は、図6に示され、GalNAcクラスタ（SEQ ID NO 3および6）が、コンジュゲートされていないFVIIを標的とするLNAオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO 1）と比較して、肝臓への取り込みを増強し、腎臓への取り込みを低下させることが理解される。GalNAcにコンジュゲートされたLNAオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO 3および6）を、コレステロールにコンジュゲートされたLNAオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO 4および7）と比較すると、肝臓において到達されたレベルは類似しているが、GalNAcにコンジュゲートされたLNAオリゴヌクレオチドは、より高い活性を示したため、これらはコレステロールにコンジュゲートされたLNAオリゴヌクレオチドよりも優れた比活性をもたらすようであることが理解される。POリンカーは、組織への取り込みを増強し（図6）、より高い効力ももたらし得る（図4）と考えられる。
【０４１２】
材料および方法：
実験設計：
0006580993.tif 000049
全て上記のスキームに従って、雌マウスに静脈内投与し、屠殺時に肝臓、腎臓、および血液の試料を採取した。
【０４１３】
実施例4：異なるモノGalNAcコンジュゲートによるアポB mRNAのインビボサイレンシング
化合物
4μmolスケールで、Expedite 8900/MOSS合成装置（多重オリゴヌクレオチド合成システム）で、ホスホラミダイトアプローチを使用して、ウリジンユニバーサルサポート（uridine universal supports）において、オリゴヌクレオチドを合成した。合成の完了後、室温で1〜2時間アンモニア水を使用して固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、65℃で16時間さらに脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC（RP-HPLC）によって精製し、UPLCによって特徴決定し、分子量をESI-MSによってさらに確認した。さらなる詳細については、下記を参照されたい。
【０４１４】
オリゴヌクレオチドの伸長
β-シアノエチル-ホスホラミダイト（DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-メチル-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T、またはC6-S-Sリンカー）のカップリングを、アセトニトリル中の0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイトおよびアセトニトリル中のDCI（4,5-ジシアノイミダゾール）（0.25M）の溶液を活性化剤として使用することによって実施する。最終サイクルでは、市販のC6連結コレステロールホスホラミダイトを、DCM中0.1Mで使用した。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を、キサンタンヒドリド（アセトニトリル／ピリジン9:1中0.01M）を使用することによって実施する。ホスホジエステル連結を、THF／ピリジン／水7:2:1中0.02Mのヨウ素を使用して導入する。他の試薬は、オリゴヌクレオチド合成のために典型的に使用されるものである。固相合成後のコンジュゲーションのため、市販のC6アミノリンカーホスホラミダイトを、固相合成の最後のサイクルにおいて使用し、脱保護および固体支持体からの切断の後、アミノ連結脱保護オリゴヌクレオチドを単離した。コンジュゲートを、標準的な合成法を使用して、官能基の活性化を介して導入した。
0006580993.tif 000050
大文字は、LNAヌクレオシド（例えば、β-D-オキシLNA）であり、小文字は、DNAヌクレオシドである。下付きのsは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表す（領域A）。LNAシトシンは、任意で、5-メチルシトシンである。2POリンカー（領域B）は、配列領域Aの5'にあり、ホスホジエステル結合によって連結された2個のDNAヌクレオシドを含み、領域Aの3'DNAヌクレオシドと領域Aの5'LNAヌクレオシドとの間のヌクレオシド間連結もホスホジエステルである。連結基（Y）は、存在する場合、コンジュゲート基を領域BまたはAへ連結するために使用され得る（SEQ ID NO 8および11）。異なるリンカーを含むモノGalNAcコンジュゲートおよびGalNAcクラスタを比較するため、生理食塩水対照、または生物切断性リンカーを含まないか、ジチオリンカー（SS）を含むか、もしくはDNA/POリンカー（PO）を含むモノGalNAcにコンジュゲートされた1mg/kg ASO（図7a）、またはモノGalNAcもしくはGalNAcクラスタにコンジュゲートされた0.25mg/kg ASO（図7b）の単回投与によって、C57BL6マウスを静注処置した。7日後に、動物を屠殺し、肝臓および腎臓の試料からRNAを単離し、アポB mRNA発現について分析した。
【０４１５】
結論：
コンジュゲートされていない化合物（＃12）と比較して、生物切断性リンカー（＃8）を含まないか、またはDNA/POリンカー（＃10）を含むモノGalNAcのコンジュゲーションは、明白に改善された肝臓における活性を示す（図7a）。異なるGalNAcコンジュゲート、例えば、モノGalNAcPO（＃10）およびGalNAcクラスタ（＃11）のコンジュゲーションは、肝臓または腎臓のいずれかへの集中による化合物活性の微調整も可能にする（図7b）。
【０４１６】
材料および方法：
実験設計：
0006580993.tif 000051
【０４１７】
投薬および試料採取
上記の表に従って、C57BL6マウスに、生理食塩水で製剤化された1mg/kgもしくは0.25mg/kgのASO、または生理食塩水単独を単回静脈内投与した。投与後7日目に動物を屠殺し、肝臓および腎臓の試料を採取した。
【０４１８】
RNA単離およびmRNA分析
肝臓および腎臓の試料から全RNAを抽出し、アポB mRNAレベルを分岐DNAアッセイを使用して分析した。
【０４１９】
実施例5：インビボのGalNAcコンジュゲートによるアポB mRNAのノックダウン、組織中含量、および総コレステロール
化合物
0006580993.tif 000052
大文字は、LNAヌクレオシド（例えば、β-D-オキシLNA）であり、小文字は、DNAヌクレオシドである。下付きのsは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表す（領域A）。LNAシトシンは、任意で、5-メチルシトシンである。2POリンカー（領域B）は、配列領域Aの5'にあり、ホスホジエステル結合によって連結された2個のDNAヌクレオシドを含み、領域Aの3'DNAヌクレオシドと領域Aの5'LNAヌクレオシドとの間のヌクレオシド間連結もホスホジエステルである。連結基（Y）が、存在する場合、コンジュゲート基を領域BまたはAへ連結するために使用され得る（SEQ ID NO 13および11）。
【０４２０】
下記表（実験設計）に従って、C57BL6/Jマウスに、生理食塩水、または0.25mg/kgの非コンジュゲートLNAアンチセンスオリゴヌクレオチド（SEQ ID NO12）もしくは等モル量のGalNAc1、GalNAc2、もしくはコレステロール（2PO）にコンジュゲートされたLNAアンチセンスオリゴヌクレオチドを、静脈内または皮下のいずれかで単回注射し、1〜7日目に屠殺した。
【０４２１】
肝臓および腎臓からRNAを単離し、アポB mRNAノックダウンについて分析するため、アポBに特異的なプライマーおよびプローブを用いたqPCRに供した。オリゴヌクレオチド容量をELISA法を使用して測定し、血清中の総コレステロールを測定した。
【０４２２】
結論：
アポB LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたGalNAc1およびGalNAc2（SEQ ID NO 11および13）は、非コンジュゲートアポB LNAより良好にアポB mRNAのノックダウンを示した（図8）。GalNAc1コンジュゲート（SEQ ID NO 13）については、静脈内投薬が皮下投薬より良好であるようであったが、このことは、別のGalNAcクラスタについて反対のことが報告されているため、驚くべきことである（Alnylam,9th Annual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society）。総コレステロールデータは、GalNAcクラスタコンジュゲート（SEQ ID NO 11および13）が、静脈内投与および皮下投与の両方で、非コンジュゲート化合物およびコレステロールコンジュゲート化合物（SEQ ID NO 12および14）より良好な効果をもたらす様子を示している（図9aおよびb）。オリゴヌクレオチドの組織中含量（図10a〜f）は、コンジュゲートが、親化合物と比較して、肝臓への取り込みを増強し、腎臓への取り込みを低下させる様子を示している。このことは、静脈内投与および皮下投与の両方に当てはまる。静脈内投薬した時、GalNAc1（SEQ ID NO 13）は、GalNAc2（SEQ ID NO 11）と比較して、極めて多い肝臓への取り込みをもたらすが、活性は両方の化合物について高いため、GalNAc2コンジュゲートは、GalNAc1コンジュゲートより高い比活性を誘導すると考えられ、このことは、LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、薬物動態モジュレーターを含まないGalNAcコンジュゲートが、特に有用であり得ることを示している。
【０４２３】
材料および方法：
実験設計：
0006580993.tif 000053
【０４２４】
用量投与
上記表に従って、到着時およそ20gのC57BL/6JBom雌動物に、生理食塩水で製剤化された化合物または生理食塩水単独を、（0日目の体重による）体重1kg当たり10ml、静脈内または皮下で投薬した。
【０４２５】
肝臓および腎臓の組織採取
70％CO2〜30％O2によって動物を麻酔下に置き、上記表に従って、頚部脱臼によって屠殺した。肝臓の右葉の半分および1個の腎臓を刻み、RNAlaterに浸した。肝臓の他方の半分および他方の腎臓を、凍結させ、組織分析のために使用した。
【０４２６】
全RNA単離および第一鎖合成
製造業者の説明に従って、Qiagen RNeasyキット（Qiagenカタログ番号74106）を使用して、RLT溶解緩衝液の存在下でビーズ粉砕によって均質化された最大30mgの組織から、全RNAを抽出した。製造業者の説明に従って、Ambionからの逆転写酵素試薬を使用して、第一鎖合成を実施した。
【０４２７】
各試料について、0.5μgの全RNAをRNase不含H2Oで（10.8μl）に調整し、2μlのランダムデカマー（50μM）および4μlのdNTPミックス（2.5mM各dNTP）と混合し、3分間70℃に加熱した後、試料を氷上で急速に冷却した。2μlの10×緩衝液RT、1μlのMMLV逆転写酵素（100U/μl）、および0.25μlのRNase阻害剤（10U/μl）を、各試料に添加し、続いて、60分間42℃でインキュベートし、10分間95℃で酵素を熱不活化し、次いで、試料を4℃に冷却した。cDNA試料を1:5希釈し、製造業者のプロトコルに従って、Taqman Fast Universal PCR Master Mix 2x（Applied Biosystemsカタログ番号4364103）を使用したRT-QPCRおよびTaqman遺伝子発現アッセイ（mアポB、Mn01545150_m1およびmGAPDH #4352339E）に供し、ファーストモードでApplied Biosystems RT-qPCR装置（7500/7900またはViiA7）で処理した。肝臓中および腎臓中のオリゴヌクレオチド含量を、サンドイッチELISA法によって測定した。
【０４２８】
血清コレステロール分析：
屠殺の直前に、血清調製のため、S-monovette Serum-Gelバイアル（Sarstedt,Numbrecht,Germany）を使用して、後眼窩静脈叢血液を収集した。血清を、製造業者の指示に従って、ABX Pentra Cholesterol CP（Triolab,Brondby,Denmark）を使用して、総コレステロールについて分析した。
【０４２９】
実施例6：FVIIのインビボ阻害（低用量、24日）
使用された化合物 - 実施例1を参照。
【０４３０】
全部で7群のマウス（n＝3）を使用してインビボマウス研究を準備した。各マウスに、0.25mg/kgまたは0.1mg/kgのいずれかで、LNA化合物を単回静脈内投与した。生理食塩水対照群が含まれていた。投与の1日前にマウスから予め採血し、その後、研究中の4日目、7日目、11日目、14日目、18日目、および24日目に血液を採取した。マウスを24日目に屠殺し、肝臓、腎臓、および血液の試料を採取した。研究構成については、下記表（実験設計）を参照されたい。第VII因子血清レベルおよびmRNAレベルを、標準的なアッセイ技術を使用して測定した。
【０４３１】
結論：
FVIIを標的とするLNAオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされたGalNAc（SEQ ID NO 3および6）は、わずか0.1mg/kgの単回投与の後、24日間の血清中のFVIIタンパク質（図11）および肝臓中の24日目のmRNA（図12）に対して極めて高い活性を示す。GalNAcクラスタ（SEQ ID NO 3および6）が、コレステロールコンジュゲート（SEQ ID NO 4および7）と比較して、FVIIタンパク質およびmRNAについてより高活性であることが理解される。
【０４３２】
材料および方法：
全て以下のスキームに従って、雄マウスに静脈内投与し、屠殺時に肝臓、腎臓、および血液の試料を採取した。
【０４３３】
実験設計：
0006580993.tif 000054
【０４３４】
実施例7：非ヒト霊長類研究 - GalNacコンジュゲート研究 - PCSK9およびアポB
化合物：
0006580993.tif 000055
大文字は、LNAヌクレオシド（例えば、β-D-オキシLNA）であり、小文字は、DNAヌクレオシドである。下付きのsは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表す。LNAシトシンは、任意で、5-メチルシトシンである。
【０４３５】
この試験の主な目的は、カニクイザルに対する、GalNacクラスタにコンジュゲートした抗PCSK9および抗アポB LNA（Conj2a）の単回の低速静脈内ボーラス後に7週にわたって選択された脂質マーカーを調べることと、サルにおける化合物の潜在毒性を評価することである。化合物は、0.625および2.5 mg/mlの初期濃度にて無菌生理食塩水(0.9%)中で調製された。
【０４３６】
少なくとも24ヶ月齢の雄性(PCSK9)または雌性(ApoB)サルを用い、それらが水道水を自由に利用できるようにし、動物1頭あたりMWM(E) SQC SHORT過剰餌(Dietex France, SDS, Saint Gratien, France) 180 gが毎日分配されるものとする。各檻に分配される飼料の総量は、その日の檻の中の動物の数によって算出される。加えて、果実または野菜を各動物に毎日与える。処置期間の開始前に少なくとも14日の間、動物を試験条件に慣らす。この期間中に、前処置調査を行う。動物に、例えば、0.25 mg/kgまたは1 mg/kgの場合、1用量で静脈内投与する。用量は0.4 mL/kgである。1群あたり動物2頭を用いる。3週後、データを分析し、より高用量またはより低用量の計画を用いて第2の動物群で着手することができる - 予備的な用量設定は0.5 mg/kgおよび1 mg/kgであるか、または最初のデータセットに基づいたものよりも低い。
【０４３７】
用量処方物を1日目に1回投与する。動物を処置後7週の間にわたって観察し、51日目に試験から解放する。1日目は処置期間の初日に当たる。臨床観察および体重および食物摂取(1群あたり)を試験の前および間に記録する。
【０４３８】
血液をサンプリングし、以下の時点で分析する。
0006580993.tif 000056
RCP 0 日常的な臨床病理学、LSB = 肝臓安全性の生化学、PK = 薬物動態学、OA = 他の分析、L = 脂質。
【０４３９】
血液生化学
以下のパラメータを、下記の際に、生存している全ての動物について判定する:
●  完全な生化学パネル(下記の完全なリスト) - -8、15、および50日目、
●  肝臓安全性(ASAT、ALP、ALAT、TBILおよびGGTのみ) - 4、8、22、および36日目、
●  脂質プロファイル(総コレステロール、HDL-C、LDL-C、およびトリグリセリド)ならびにアポ-Bのみ - -1、4、8、22、29、36、および43日目。
【０４４０】
血液(およそ1.0 mL)をリチウムヘパリン管へ採る(ADVIA 1650血液生化学分析器を用いる): アポ-B、ナトリウム、カリウム、塩化物、カルシウム、無機リン、グルコース、HDL-C、LDL-C、尿素、クレアチニン、総ビリルビン(TBIL)、総コレステロール、トリグリセリド、アルカリホスファターゼ(ALP)、アラニンアミノトランスフェラーゼ(ALAT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(ASAT)、クレアチンキナーゼ、γ-グルタミルトランスフェラーゼ(GGT)、乳酸脱水素酵素、総タンパク質、アルブミン、アルブミン/グロブリン比。
【０４４１】
血液の分析:
血液サンプルを、-8、-1、4、8、15、22、29、36、43、および50日目に第16群の動物のみから集める。
【０４４２】
静脈血(およそ2 mL)を各動物における適切な静脈から血清分離管(SST)へ集め、室温で少なくとも60 ± 30分の間、凝固させる。血液を冷蔵条件(+4℃を維持するように設定した)の下で10分間、1000 gで遠心分離する。血清を3本の別個の管へ移し、ELISA法(Circulex Human PCSK9 ELISAキット、CY-8079、カニクイザル由来の血清に対して確証された)を用いCitoxLAB Franceにて分析されるまで-80℃で貯蔵した。
【０４４３】
他の分析:
WO2011009697およびWO2010142805は、以下の分析のための方法を提供している: qPCR、PCSK9/ApoB mRNA分析。他の分析には、PCSK9/アポBタンパク質ELISA、ELISAによる血清Lp(a)分析(Mercodia番号10-1106-01)、組織および血漿オリゴヌクレオチド分析(薬物含量)、サンプルの抽出、標準サンプルおよびQCサンプル、ELISAによるオリゴヌクレオチド含量判定が含まれる。アポBコンジュゲートについてのデータは、図16に示される。同一のオリゴヌクレオチド配列を保持する化合物11および14は、使用された用量で有意な薬理を示さなかったが、やはり同一のオリゴ配列を共有する化合物SEQ ID NO 17および32は、有効であり、GalNacコンジュゲート化合物（SEQ ID NO 17）が、コレステロールコンジュゲート化合物よりも大幅に強力であった。アポBを標的とする化合物による肝毒性または腎毒性の徴候は、存在しなかった。
【０４４４】
PCSK9を標的とする化合物についてのデータは、下記表に示される。
0006580993.tif 000057
＊ 投薬前ベースラインレベルとの比較
【０４４５】
PCSKを標的とする化合物による肝毒性または腎毒性の徴候は、存在しなかった。顕著に、PCSK9-GalNac化合物は、PCSK9の急速な高度に効果的な下方制御をもたらし、それは、長期（研究の全期間）にわたり維持された。このことは、GalNacコンジュゲート化合物が、迅速な初期ノックダウンに関しても、長期的にも、より有効であることを例証しており、非コンジュゲート親化合物と比較しても、代替コンジュゲーションテクノロジー、例えば、コレステロールコンジュゲーションを使用した化合物と比較しても、比較的低い頻度で、より低い投薬量で投薬され得ることを示している。類似した結果が、アポBを標的とする化合物のうちの一つについて見られ（図16を参照）、GalNac化合物が、コレステロールコンジュゲート化合物より著しく強力であることが見出され、より長い期間にわたり作用をもたらした。SEQ ID NO 28は、研究の期間を通じてPCSK9およびLDL-Cの急速で一貫した下方制御をもたらし（2.5mg/kg用量で34日目に見られた）、顕著なPCSK9下方制御が、2.5mg/kgの単回投与の48日後に見られた。
【０４４６】
実施例8: ラットにおける肝臓および腎臓毒性評価
本発明の化合物は、マウスまたはラットでのような、げっ歯類でのその毒性プロファイルについて評価することができる。例として、以下のプロトコルが用いられうる: Wistar Han Crl:WI(Han)をおよそ8週齢の年齢で用いる。この年齢で、雄はおよそ250 gの重さがあるはずである。全ての動物がSSNIFF R/M-Hペレット維持食(SSNIFF Spezialdiaten GmbH, Soest, Germany)を、およびボトルに含有された水道水(0.22 μmのフィルタでろ過された)を自由に利用できるようにする。10および40 mg/kg/用量の用量レベルを用い(皮下投与)、1日目および8日目に投与する。動物を15日目に安楽死させる。尿および血液サンプルを7日目および14日目に集める。臨床病理学評価を14日目に行う。体重を試験の前に、投与の初日に、および剖検の1週間前に判定する。1群あたりの飼料消費を毎日評価する。血液サンプルを絶食6時間後に尾静脈から採取する。以下の血清分析を行う: 赤血球数 平均細胞容積 血中血球容積 ヘモグロビン 平均細胞ヘモグロビン濃度 平均細胞ヘモグロビン 血小板数 白血球数 細胞形態とともに白血球分画 網状赤血球数、ナトリウム カリウム 塩化物 カルシウム 無機リン グルコース 尿素 クレアチニン 総ビリルビン 総コレステロール トリグリセリド アルカリホスファターゼ アラニンアミノトランスフェラーゼ アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ 総タンパク質 アルブミン アルブミン/グロブリン比。α-GST、β-2ミクログロブリン、カルビンジン、クラステリン、シスタチンC、KIM-1、オステオポンチン、TIMP-1、VEGF、およびNGALについて検尿を行う。7つの被分析物(カルビンジン、クラステリン、GST-α、KIM-1、オステオポンチン、TIMP-1、VEGF)は、パネル1 (MILLIPLEX(登録商標) MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 1, RKTX1 MAG-37K)の下で定量化される。3つの被分析物(β-2ミクログロブリン、シスタチンC、リポカリン-2/NGAL)は、パネル2 (MILLIPLEX(登録商標) MAP Rat Kidney Toxicity Magnetic Bead Panel 2, RKTX2MAG-37K)の下で定量化される。ラット尿中のこれらのバイオマーカーの濃度の判定のためのアッセイ法は、Luminex xMAP(登録商標)技術に基づく。抗α-GST/β-2ミクログロブリン/カルビンジン/クラステリン/シスタチンC/KIM-1/オステオポンチン/TIMP-1/VEGF/NGAL抗体でコーティングされたミクロスフェアを2種類の異なる蛍光色素で色分けする。以下のパラメータを判定する(尿 ADVIA 1650を用いて): 尿中タンパク質、尿中クレアチニン。定量的パラメータ: 容積、pH (10-Multistix SG試験ストリップ/Clinitek 500尿分析器を用いて)、比重(屈折計を用いて)。半定量的パラメータ(10-Multistix SG試験ストリップ/Clinitek 500尿分析器を用いて): タンパク質、グルコース、ケトン、ビリルビン、亜硝酸塩、血液、ウロビリノーゲン、沈降細胞診断(顕微鏡検査による)。定性的パラメータ: 外観、色。殺処理後、体重ならびに腎臓、肝臓および脾臓の重量を測定し、臓器の対体重比を算出する。腎臓および肝臓サンプルを採取し、凍結させるかまたはホルマリン中で貯蔵する。顕微分析を行う。
【０４４７】
実施例9：FAM標識コンジュゲートを有する、アポBを標的とする化合物
0006580993.tif 000058
大文字は、LNAヌクレオシド（例えば、β-D-オキシLNA）であり、小文字は、DNAヌクレオシドである。下付きのsは、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表す。LNAシトシンは、任意で、5-メチルシトシンである。
【０４４８】
異なるDNA/POリンカーを有するFAM標識ASOを、S1ヌクレアーゼ抽出物（下記表を参照）、肝臓もしくは腎臓のホモジネート、または血清（下記表）のいずれかにおけるインビトロ切断に供した。
【０４４９】
異なるDNA/POリンカーを有するFAM標識ASO（100μM）を、ヌクレアーゼ緩衝液中のS1ヌクレアーゼ（100μL当たり60U）によるインビトロ切断に20分間および120分間供した。緩衝溶液にEDTAを添加することによって酵素活性を停止させた。次いで、溶液を、Dionex DNApac p-100カラムおよび10mM〜1M範囲の勾配の過塩素酸ナトリウム（pH7.5）を使用したDionex Ultimate 3000におけるAIE HPLC分析に供した。切断されたオリゴヌクレオチドおよび未切断のオリゴヌクレオチドの含量を、615nmでの蛍光検出器および260nmでのuv検出器の両方を使用して、標準物に対して決定した。
0006580993.tif 000059
【０４５０】
結論：POリンカー（または本明細書において言及される領域B）は、コンジュゲート（または基C）の切断除去をもたらし、リンカーの長さおよび／または配列組成の両方を、領域Bの核酸分解切断に対する感受性を調節するために使用することができる。DNA/POリンカーの配列は、ヌクレアーゼS1抽出物において20分後に見られる切断速度を調節することができる（上記表）。従って、血清および標的組織の細胞における切断のレベルを調節するためにも、領域B（例えば、DNA/POリンカー）のための配列選択を使用することができる。
【０４５１】
肝臓、腎臓、および血清（下記表を参照）に、組織1g当たり200μgの濃度でオリゴヌクレオチドSEQ ID NO 21を添加した。NMRIマウスから収集された肝臓および腎臓の試料を、均質化緩衝液（0.5％Igepal CA-630、25mMトリスpH8.0、100mM NaCl、pH8.0（1N NaOHによって調整））において均質化した。ホモジネートを37℃で24時間インキュベートし、その後、ホモジネートをフェノール-クロロホルムによって抽出した。肝臓および腎臓からの抽出物ならびに血清における切断されたオリゴヌクレオチドおよび未切断オリゴヌクレオチドの含量を、上記HPLC法を使用して、標準物に対して決定した。
0006580993.tif 000060
【０４５２】
結論：POリンカー（または本明細書において言及される領域B）は、肝臓または腎臓のホモジネートにおいては、オリゴヌクレオチドからのコンジュゲート（または基C）の切断をもたらすが、血清においてはもたらさない（上記表）。注：上記アッセイにおける切断とは、切断可能なリンカーの切断をさし、オリゴマーまたは領域Aは、機能的に完全なままであるべきである。実施例9において示されたアッセイにおける切断に対する感受性は、リンカーが生物学的に切断可能または生理学的に不安定であるか否かを決定するために使用することができる。
【０４５３】
実施例10：GalNacコンジュゲート：ラット毒性研究
方法論：
実施例8を参照。
【０４５４】
ラット安全性研究は、CiToxLabs（France）で実施された。使用された研究構成（用量範囲および時間的経過）において、ウィスターHanラットは、ヒトにおける腎毒性（そしてある程度肝毒性）を予測することが以前に証明されているため、雄ウィスターラット（n＝4/群）を研究のために選択した。1日目および8日目に、動物に、コンジュゲートLNA化合物（10mg/kg）または対応する非コンジュゲート「親化合物」（40mg/kg）を皮下注射した。7日目および14日目に尿を収集し、分析まで氷上で維持した。尿試料を、遠心分離し（およそ380g、5分、＋4℃）、Luminex xMAP（登録商標）テクノロジーに基づく多重アッセイによって、尿中損傷マーカーのパネルを分析した。研究における尿中腎損傷マーカーのパネルのうち、KIM-1（腎損傷マーカー1）が、尿中腎損傷マーカーのメタ分析においてKIM-1について最近記載されたように（Vlasakova et al,Evaluation of the Relative Performance of Twelve Urinary Biomarkers for Renal Safety across Twenty Two Rat Sensitivity and Specificity Studies Toxicol.Sci.December 21,2013）、最大のダイナミックレンジおよび最も明白なシグナルを示した。
【０４５５】
使用された化合物：
SEQ ID NO 11および17（標的アポB）ならびに以下のPCSK9を標的とする化合物のSEQ ID：
0006580993.tif 000061
【０４５６】
結果は、Galnacコンジュゲートの使用によって、親LNA化合物の腎毒性プロファイルが大きく改善され得ることを例証している図15に示される。従って、GalNacコンジュゲートLNA化合物は、親化合物よりも大幅に強力であるのみならず、腎毒性のリスクの著しい低下にも関連している。
【０４５７】
実施例11：LNA抗miR GalNacコンジュゲート
化合物
大文字は、LNA、例えば、β-D-オキシLNAである。小文字は、DNAである。下付きのsは、ホスホロチオエート連結である。他のヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル（ホスフェート）連結である。Cの前の上付きのmは、LNA 5-メチルシトシン（任意）を表す。いくつかの態様において、化合物はLNAシトシンを用いて作製されてもよい。いくつかの態様において、コンジュゲート1a基は、別のGalNAcコンジュゲート基、例えば、本明細書に開示されたもの、例えば、コンジュゲート2aであってもよい。
0006580993.tif 000062
【０４５８】
全部で9群のマウス（n＝5）を使用してインビボマウス研究を実施した。各マウスに、0.5mg/kgまたは2mg/kgまたは親LNA化合物と比較して等モル用量のGalNAcコンジュゲートLNAを、0日目、2日目、および4日目に静脈内投薬した。生理食塩水対照群が含まれていた（表1の研究構成を参照）。投与の4日前、途中の4日目、終了点の7日目に血清試料を採取した。肝臓および腎臓の試料をRNAlater中に保管した。Obad Nat Genet.2011 Mar 20;43(4):371-8に記載されるように、miR122ノックダウンのバリデーションを行った（図17）。血清中のコレステロールレベルを、Elmen J,et al.LNA-mediated microRNA silencing in non-human primates.Nature.2008;452:896-899に記載されるように分析した（図18）。2種のmiR122によって下方制御される遺伝子（Aldo AおよびBckdk）のmRNAレベルを、標準的なQPCRアッセイ技術を使用して分析した（図19）。化合物の認容性を査定するため、ALTを測定した（図20）。
【０４５９】
研究構成
0006580993.tif 000063
【０４６０】
結論：
GalNAcの抗miR122（SEQ ID 52および54）へのコンジュゲーションは、低用量群（図3、3×0.5mg/kg）において既に、総コレステロールレベルの減少（図2）ならびにAldo AおよびBckdk mRNAの上方制御によって示される、肝臓におけるmiR122ノックダウンの著しい改善を示した。抗miR122オリゴヌクレオチドの効果は、腎臓においては見られなかった。ALTの増加が、SEQID 52について測定され、それは、2個のオリゴヌクレオチドの1個のGalNAcへのコンジュゲーション（SEQID54）によって改善する傾向を示した。
【０４６１】
実施例12：HBVを標的とするオリゴヌクレオチドのためのGalNacコンジュゲート
4μmolスケールで、Expedite 8900/MOSS合成装置（多重オリゴヌクレオチド合成システム）でホスホラミダイトアプローチを使用して、ウリジンユニバーサルサポートにおいてオリゴヌクレオチドを合成した。合成の完了後、室温で1〜2時間アンモニア水を使用して、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、65℃で16時間さらに脱保護した。オリゴヌクレオチドを逆相HPLC（RP-HPLC）によって精製し、UPLCによって特徴決定し、分子量をESI-MSによってさらに確認した。さらなる詳細については、下記を参照されたい。
【０４６２】
オリゴヌクレオチドの伸長
β-シアノエチル-ホスホラミダイト（DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-メチル-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、LNA-T、またはC6-S-Sリンカー）のカップリングを、アセトニトリル中0.1Mの5'-O-DMT-保護アミダイトおよびアセトニトリル中DCI（4,5-ジシアノイミダゾール）（0.25M）の溶液を活性化剤として使用することによって実施した。最終サイクルのため、市販のC6連結コレステロールホスホラミダイトを、DCM中0.1Mで使用した。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化を、キサンタンヒドリド（アセトニトリル／ピリジン9:1中0.01M）を使用することによって実施する。ホスホジエステル連結を、THF／ピリジン／水7:2:1中0.02Mのヨウ素を使用して導入する。その他の試薬は、オリゴヌクレオチド合成のために典型的に使用されるものである。固相合成後のコンジュゲーションのため、市販のC6アミノリンカーホスホラミダイトを、固相合成の最後のサイクルにおいて使用し、脱保護および固体支持体からの切断の後、アミノ連結脱保護オリゴヌクレオチドを単離した。コンジュゲートを、標準的な合成法を使用して、官能基の活性化を介して導入した。
【０４６３】
RP-HPLCによる精製：
粗化合物を、Phenomenex Jupiter C18 10μ 150×10mmカラムでの調製用RP-HPLCによって精製した。0.1M酢酸アンモニウム（pH8）およびアセトニトリルを、5mL/分の流速で、緩衝液として使用した。収集された画分を凍結乾燥させ、典型的には、白色固体として精製された化合物を得た。
【０４６４】
略語：
DCI：4,5-ジシアノイミダゾール
DCM：ジクロロメタン
DMF：ジメチルホルムアミド
DMT：4,4'-ジメトキシトリチル
THF：テトラヒドロフラン
Bz：ベンゾイル
Ibu：イソブチリル
RP-HPLC：逆相高速液体クロマトグラフィ
【０４６５】
LNAギャップマーは、以下の通りであった。
0006580993.tif 000064
上記ギャップマー化合物（非コンジュゲートバージョン）は、HBVに対して特に有効であるとして、既に当技術分野において注目されている（WO2011/47312）。
【０４６６】
大文字は、LNAヌクレオシド、例えば、β-D-オキシ-LNAであり、小文字は、DNAヌクレオシドであり、下付きのsは、ホスホロチオエート連結である。LNAシトシンは、5-メチルシトシンであってもよい。
【０４６７】
部分的に繰り返されたHBVのプレゲノムRNAを発現するプラスミド、例えば、pAAV/HBV1.3（J Virol.1995 Oct;69(10):6158-69）またはその誘導体pAAV2/HBV1.3（WuxiAppTech,Wuxi,China）の尾静脈へのハイドロダイナミックインジェクションによってHBV複製を確立することができるマウス系統、例えば、BALB/cまたはC57B/6において、LNAオリゴマーを、インビボの抗ウイルス効果について査定することができる。マウスの体重の8〜12％に等しい大量の生理食塩水でのプラスミドの注射は、肝臓におけるウイルスプレゲノムRNAの蓄積および発現をもたらし、その後、急性HBV感染の確立に至る。プラスミドの注射の1日以上前またはプラスミドの注射の1日後に、LNAオリゴマーによる動物の処置を開始することができる。静脈内注射または皮下注射によって、生理食塩水中のLNAオリゴマーの送達を行うことができる。
【０４６８】
研究構成
0006580993.tif 000065
【０４６９】
インビボ実験を、SEQ ID 55およびSEQ ID 56に対して実施した。後者は、前者のGalNACコンジュゲート（コンジュゲート1a）である。Balb/Cマウス系統を使用したマウス尾静脈ハイドロダイナミックインジェクションモデルにおいて、HBVに対する効力について、LNA化合物を試験した。等モル用量；2mg/kgおよび10mg/kg（単回注射）（SEQ ID 55）ならびに2.7mg/kgおよび13.5mg/kg（単回注射）（SEQ ID 56）で、LNA化合物を試験した。LNA抗HBV化合物を、生理食塩水およびHBV逆転写酵素の阻害剤であるエンテカビルと比較した。エンテカビルは、経口的に毎日0.1mg/kgで投薬された。適用可能な場合には、動物を、ハイドロダイナミックインジェクションの24時間前にLNA化合物によって処置した。エンテカビルは、ハイドロダイナミックインジェクションの24時間後に開始て、記載されたような1日用量で与えられた。インビボでHBV複製を開始させるため、全ての動物に、尾静脈を介して、生理食塩水中20μgのpAAV2/HBVプラスミドDNAを注射した。注射は、マウスの体重の8％に等しい生理食塩水溶液で行われ、全用量が5秒以内に与えられた。ハイドロダイナミックショックからの回復を確実にするため、動物を少なくとも2時間観察した。全ての動物を、インビボ研究の期間中、体重変化および臨床的症状について毎日モニタリングした。ハイドロダイナミックインジェクション後1日目、3日目、5日目、および7日目、エンテカビルの投与の4時間後に、顎下出血によって、全ての動物から血液試料を収集した。7日目、エンテカビルの最後の投与の4時間後に、全ての動物を安楽死させ、心穿刺を介して採血した。肝臓を採集し、試料を急速凍結させた。全ての血液試料を、ヘパリンナトリウムを含有しているチューブに収集した。
【０４７０】
全HBV DNAレベルの量からpAAV2/HBV DNAレベルを差し引いた肝臓の単位重量当たりのコピーとして、qPCRによってHBV DNA複製のレベルを決定するため、各肝臓の左葉の一部を使用した。7日目に収集された血漿試料を、サンドイッチelisaアッセイ（Cusabio；カタログ番号CSB-E16539m）を使用して、ALTレベルについて試験した。LNAコンジュゲートオリゴマーは、認容性が高く、ALTの有意な上昇は観察されなかった。
【０４７１】
結論：
HBVに対して特に有効であるとして以前に当技術分野において注目されたSEQ ID 55（WO2011/47312）は、この研究において使用された用量レベルにおいては、肝臓におけるHBVの複製に対する効果をほとんど有しないことが見出された。対照的に、同一のオリゴヌクレオチドからなり、GalNACコンジュゲートのみが付着したSEQ ID 56は、肝臓におけるHBV DNAレベルに対する優れた用量依存性の抗ウイルス効果を有することが観察され（図22）、単回送達の8日後、および感染の開始の7日後に、肝臓におけるウイルス力価は90％低下した。化合物は、認容性が高く、いずれの化合物でもALTレベルの用量依存的な増加の証拠はなかった。LNAアンチセンスオリゴヌクレオチドは、コンジュゲーションの非存在下で肝臓へ効率的にターゲティングされることが公知であり、親化合物の相対的な無効性およびコンジュゲート化合物の高度に強力な効果は注目に値する。
【図１】
0006580993.tif 000066
【図２】
0006580993.tif 000067
【図３】
0006580993.tif 000068
【図４ａ】
0006580993.tif 000069
【図４ｂ】
0006580993.tif 000070
【図４ｃ】
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【図４ｄ】
0006580993.tif 000072
【図５ａ】
0006580993.tif 000073
【図５ｂ】
0006580993.tif 000074
【図５ｃ】
0006580993.tif 000075
【図５ｄ】
0006580993.tif 000076
【図６】
0006580993.tif 000077
【図７Ａ】
0006580993.tif 000078
【図７Ｂ】
0006580993.tif 000079
【図８】
0006580993.tif 000080
【図９ａ】
0006580993.tif 000081
【図９ｂ】
0006580993.tif 000082
【図１０ａ】
0006580993.tif 000083
【図１０ｂ】
0006580993.tif 000084
【図１０ｃ】
0006580993.tif 000085
【図１０ｄ】
0006580993.tif 000086
【図１０ｅ】
0006580993.tif 000087
【図１０ｆ】
0006580993.tif 000088
【図１１】
0006580993.tif 000089
【図１２】
0006580993.tif 000090
【図１３−１】
0006580993.tif 000091
【図１３−２】
0006580993.tif 000092
【図１３−３】
0006580993.tif 000093
【図１３−４】
0006580993.tif 000094
【図１４−１】
0006580993.tif 000095
【図１４−２】
0006580993.tif 000096
【図１４−３】
0006580993.tif 000097
【図１４−４】
0006580993.tif 000098
【図１５】
0006580993.tif 000099
【図１６】
0006580993.tif 000100
【図１７】
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【図１８】
0006580993.tif 000102
【図１９】
0006580993.tif 000103
【図２０】
0006580993.tif 000104
【図２１】
0006580993.tif 000105
【配列表】
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