(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の式（Ｉ）で表される構造を有する分子であって、
【化１】
0006622079.tif 000021
式中、
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸を表し、Ｃ４およびＣ１２はそれぞれシステインを表し、Ｓ＊はＣ４およびＣ１２のシステインに由来する硫黄原子を表し、
Ｘ１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ２は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ９は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１４は任意のアミノ酸であるか、または存在せず、
Ｒ１は、下記の式（ＩＩ）〜（Ｖ）のいずれかで表される構造を有する基であり、
【化２】
0006622079.tif 000022
【化３】
0006622079.tif 000023
【化４】
0006622079.tif 000024
【化５】
0006622079.tif 000025
式中、
ｎは１〜４の整数であり、
Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素またはメチル基である、
分子。
【請求項２】
Ｘ２はトリプトファンであり、
Ｘ３はバリンであり、
Ｘ５はロイシンであり、
Ｘ８はトリプトファンであり、
Ｘ９はロイシンであり、
Ｘ１１はイソロイシンである、
請求項１に記載の分子。
【請求項３】
Ｘ７はプロリンである、請求項１または２に記載の分子。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ６、Ｘ１０、およびＸ１３は、それぞれ独立して、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される親水性アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の分子。
【請求項５】
Ｘ１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ１０はセリンまたはトレオニンであり、
Ｘ１３はアルギニンまたはリジンである、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の分子。
【請求項６】
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）で示されるペプチド鎖部分が、
ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ
というアミノ酸配列を有する、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の分子。
【請求項７】
Ｒ１において、ｎ＝２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の分子。
【請求項８】
Ｒ１は、下記の式（ＩＩ）で表される構造を有する基であり、
【化６】
0006622079.tif 000026
式中、ｎ＝２である、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の分子。
【請求項９】
下記式（ＶＩ）で表される構造を有する分子。
【化７】
0006622079.tif 000027
【請求項１０】
下記の配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃ１２−Ｘ１３−Ｘ１４
を有するペプチドを含む、ｈｓｐ９０結合剤製造用組成物であって、
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸を表し、Ｃ４およびＣ１２はそれぞれシステインを表し、
Ｘ１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ２は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ９は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１４は任意のアミノ酸であるか、または存在せず、
前記ペプチドは、Ｃ４およびＣ１２のシステインの側鎖を介してアザクラウンエーテルの２つの窒素原子に連結されてｈｓｐ９０結合剤を生じる、
組成物。
【請求項１１】
Ｘ２はトリプトファンであり、
Ｘ３はバリンであり、
Ｘ５はロイシンであり、
Ｘ８はトリプトファンであり、
Ｘ９はロイシンであり、
Ｘ１１はイソロイシンである、
請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｘ７はプロリンである、請求項１０または１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｘ１、Ｘ６、Ｘ１０、およびＸ１３は、それぞれ独立して、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される親水性アミノ酸である、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｘ１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ１０はセリンまたはトレオニンであり、
Ｘ１３はアルギニンまたはリジンである、
請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）で示されるペプチド鎖部分が、
ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ
というアミノ酸配列を有する、
請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
ｇｐ１０タンパク質のＣ末端に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の分子のペプチド部分が融合している、Ｔ７ファージ。
【請求項１７】
標的分子に結合することができる分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）４〜１０個のランダムアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含むペプチドがｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作されており、かつ、
アザクラウンエーテルの周上の相対する２つの窒素原子に連結された−ＣＯ−ＣＨ２−基が、前記２つのシステインの側鎖の硫黄原子にそれぞれ結合している構造を含む
修飾Ｔ７ファージのライブラリーを、
前記標的分子と混合する工程、
（ｂ）前記標的分子に結合した修飾Ｔ７ファージを分離する工程、
（ｃ）前記分離された修飾Ｔ７ファージを、ホスト細菌細胞に感染させ、対応するＴ７ファージを増殖させる工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）において増殖されたＴ７ファージと、前記アザクラウンエーテルの前記２つの窒素原子にハロアセチル基またはハロアセトアミド基が連結された構造を有するジハロゲン化合物とを反応させて、修飾Ｔ７ファージを新たに得る工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）で新たに得られた修飾Ｔ７ファージを、前記標的分子と混合する工程、および
（ｆ）前記標的分子に結合した修飾Ｔ７ファージを分離する工程、
を含む、方法。
【請求項１８】
前記工程（ｆ）の後に、
（ｇ）前記工程（ｃ）〜（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ｇ）において、前記工程（ｃ）〜（ｆ）が少なくとも４回繰り返される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記工程（ａ）の前に、前記修飾Ｔ７ファージのライブラリーを作製する初期工程をさらに含み、この初期工程は、
４〜１０個のランダムアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含むペプチドがｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作されたＴ７ファージのライブラリーを、
前記アザクラウンエーテルの前記２つの窒素原子にハロアセチル基またはハロアセトアミド基が連結された構造を有するジハロゲン化合物と反応させること
を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
４〜１０個のランダムアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含むペプチドがｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作されており、かつ、
アザクラウンエーテルの周上の相対する２つの窒素原子に連結された−ＣＯ−ＣＨ２−基が、前記２つのシステインの側鎖の硫黄原子にそれぞれ結合している構造を含む
修飾Ｔ７ファージのライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド部分およびクラウンエーテル部分を含んでクリプタンド構造をなすマクロ環分子、およびその同定方法に関する。本発明は特に、標的タンパク質のような標的分子に結合するマクロ環分子、およびそのようなマクロ環分子をスクリーニングにより同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工マクロ環分子は、例えば電気化学的材料および光物理学的材料など、幅広い応用可能性を有するために注目を集めている。人工マクロ環分子の中でも、クラウンエーテルおよびその類似体（クラウン類縁体）は、その親水性オリゴエチレン構造が水溶性を高めて凝集を防ぐため、生体適合性が優れている。
【０００３】
クラウンの潜在的有用性に関わらず、その生物学的アプリケーションに関する包括的な研究は最近になるまで報告されていなかった。本発明者らは、Ｔ７ファージを利用して、１０の９乗という非常に大きな分子多様性を提供するクラウンエーテル様分子ライブラリー（クラウンライブラリー）の構築を初めて報告し、そのライブラリーから、癌関連タンパク質（ヒートショックタンパク質９０；Ｈｓｐ９０）に特異的に結合する分子の同定・単離に成功した（特許文献１、非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−１２８２１１号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chem. Comm. (2014) Vol. 50, No. 30, pp. 3887-4012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、さらに多様な構造の人工マクロ環分子を得ることに対するニーズが存在する。特に、先行技術のクラウンライブラリーから得られたクラウンエーテル様分子では、標的タンパク質に対する結合親和性（解離定数ＫＤ）が１．７μＭ程度であったところ、それと同等あるいはそれより強い結合力を示す分子を得ることに対するニーズが存在する。
【０００７】
本発明は、新規マクロ環分子を提供することを課題とする。特に、タンパク質に対して結合することができるマクロ環分子を提供することを課題とする。本発明は特に、Ｈｓｐ９０に結合することができるマクロ環分子、およびそのようなマクロ環分子の製造用のペプチド組成物を提供することを課題とする。また、標的分子に結合することができるマクロ環分子の同定・単離を可能にするライブラリーおよびスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の側面を含む。
［１］
下記の式（Ｉ）で表される構造を有する分子であって、
【化１】
0006622079.tif 000002
式中、
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸を表し、Ｃ４およびＣ１２はそれぞれシステインを表し、Ｓ＊はＣ４およびＣ１２のシステインに由来する硫黄原子を表し、
Ｘ１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ２は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ９は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１４は任意のアミノ酸であるか、または存在せず、
Ｒ１は、下記の式（ＩＩ）〜（Ｖ）のいずれかで表される構造を有する基であり、
【化２】
0006622079.tif 000003
【化３】
0006622079.tif 000004
【化４】
0006622079.tif 000005
【化５】
0006622079.tif 000006
式中、
ｎは１〜４の整数であり、
Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素またはメチル基である、
分子。
［２］
Ｘ２はトリプトファンであり、
Ｘ３はバリンであり、
Ｘ５はロイシンであり、
Ｘ８はトリプトファンであり、
Ｘ９はロイシンであり、
Ｘ１１はイソロイシンである、
［１］に記載の分子。
［３］
Ｘ７はプロリンである、［１］または［２］に記載の分子。
［４］
Ｘ１、Ｘ６、Ｘ１０、およびＸ１３は、それぞれ独立して、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される親水性アミノ酸である、［１］〜［３］のいずれかに記載の分子。
［５］
Ｘ１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ１０はセリンまたはトレオニンであり、
Ｘ１３はアルギニンまたはリジンである、
［１］〜［４］のいずれかに記載の分子。
［６］
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）で示されるペプチド鎖部分が、
ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ
というアミノ酸配列を有する、
［１］〜［５］のいずれかに記載の分子。
［７］
Ｒ１において、ｎ＝２である、［１］〜［６］のいずれかに記載の分子。
［８］
Ｒ１は、下記の式（ＩＩ）で表される構造を有する基であり、
【化６】
0006622079.tif 000007
式中、ｎ＝２である、
［１］〜［７］のいずれかに記載の分子。
［９］
下記式（ＶＩ）で表される構造を有する分子。
【化７】
0006622079.tif 000008
［１０］
下記の配列
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃ１２−Ｘ１３−Ｘ１４
を有するペプチドを含む、ｈｓｐ９０結合剤製造用組成物であって、
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸を表し、Ｃ４およびＣ１２はそれぞれシステインを表し、
Ｘ１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ２は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ９は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１４は任意のアミノ酸であるか、または存在せず、
前記ペプチドは、Ｃ４およびＣ１２のシステインの側鎖を介してアザクラウンエーテルの２つの窒素原子に連結されてｈｓｐ９０結合剤を生じる、
組成物。
［１１］
Ｘ２はトリプトファンであり、
Ｘ３はバリンであり、
Ｘ５はロイシンであり、
Ｘ８はトリプトファンであり、
Ｘ９はロイシンであり、
Ｘ１１はイソロイシンである、
［１０］に記載の組成物。
［１２］
Ｘ７はプロリンである、［１０］または［１１］に記載の組成物。
［１３］
Ｘ１、Ｘ６、Ｘ１０、およびＸ１３は、それぞれ独立して、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される親水性アミノ酸である、［１０］〜［１２］のいずれかに記載の組成物。
［１４］
Ｘ１はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、
Ｘ１０はセリンまたはトレオニンであり、
Ｘ１３はアルギニンまたはリジンである、
［１０］〜［１３］のいずれかに記載の組成物。
［１５］
Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）で示されるペプチド鎖部分が、
ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ
というアミノ酸配列を有する、
［１０］〜［１４］のいずれかに記載の組成物。
［１６］
ｇｐ１０タンパク質のＣ末端に、［１］〜［９］のいずれかに記載の分子のペプチド部分が融合している、Ｔ７ファージ。
［１７］
標的分子に結合することができる分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）４〜１０個のランダムアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含むペプチドがｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作されており、かつ、
アザクラウンエーテルの周上の相対する２つの窒素原子に連結された−ＣＯ−ＣＨ２−基が、前記２つのシステインの側鎖の硫黄原子にそれぞれ結合している構造を含む
修飾Ｔ７ファージのライブラリーを、
前記標的分子と混合する工程、
（ｂ）前記標的分子に結合した修飾Ｔ７ファージを分離する工程、
（ｃ）前記分離された修飾Ｔ７ファージを、ホスト細菌細胞に感染させ、対応するＴ７ファージを増殖させる工程、
（ｄ）前記工程（ｃ）において増殖されたＴ７ファージと、前記アザクラウンエーテルの前記２つの窒素原子にハロアセチル基またはハロアセトアミド基が連結された構造を有するジハロゲン化合物とを反応させて、修飾Ｔ７ファージを新たに得る工程、
（ｅ）前記工程（ｄ）で新たに得られた修飾Ｔ７ファージを、前記標的分子と混合する工程、および
（ｆ）前記標的分子に結合した修飾Ｔ７ファージを分離する工程、
を含む、方法。
［１８］
前記工程（ｆ）の後に、
（ｇ）前記工程（ｃ）〜（ｆ）を繰り返す工程
をさらに含む、［１７］に記載の方法。
［１９］
前記工程（ｇ）において、前記工程（ｃ）〜（ｆ）が少なくとも４回繰り返される、［１８］に記載の方法。
［２０］
前記工程（ａ）の前に、前記修飾Ｔ７ファージのライブラリーを作製する初期工程をさらに含み、この初期工程は、
４〜１０個のランダムアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含むペプチドがｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作されたＴ７ファージのライブラリーを、
前記アザクラウンエーテルの前記２つの窒素原子にハロアセチル基またはハロアセトアミド基が連結された構造を有するジハロゲン化合物と反応させること
を含む、［１７］〜［１９］のいずれかに記載の方法。
［２１］
４〜１０個のランダムアミノ酸で隔てられた２つのシステインを含むペプチドがｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作されており、かつ、
アザクラウンエーテルの周上の相対する２つの窒素原子に連結された−ＣＯ−ＣＨ２−基が、前記２つのシステインの側鎖の硫黄原子にそれぞれ結合している構造を含む
修飾Ｔ７ファージのライブラリー。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、標的分子に対して様々な結合力を有するマクロ環分子を効率よく得ることができる。特に、抗体の代替物となり得るような、ｎＭ域のＫＤを有する強い結合分子を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、スキーム１により合成された1,1’-(1,4,10,13-テトラオキサ-7,16-ジアザシクロオクタデカン-7,16-ジイル)ビス(2-ブロモエタノン)の（Ａ）ＬＣ−ＭＳスペクトル（実測ｍ／ｚ値＝５０３．３、５０５．２、５０７．２；理論ｍ／ｚ値＝５０３．０、５０５．０、５０７．０）および（Ｂ）１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）を示す。
【図２】図２は、クラウンエーテル修飾化したモデルペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって解析した結果を示す。
【図３】図３は、（Ａ）モデルペプチドを異なる濃度のクラウンエーテルで修飾した後にさらにＦＬ−ＩＡ（フルオレセインヨードアセトアミド）で修飾した場合に観察された蛍光の強さ、および（Ｂ）Ａにおける蛍光強度を定量化したグラフを示す。
【図４】図４は、本発明の一実施態様によるスクリーニングの概略を示す。
【図５】図５は、ポジティブセレクションの各ラウンド後のファージ群（ポリクローン）について、標的タンパク質または対照タンパク質（ＢＳＡ）に対する結合をＥＬＩＳＡによって定量化した結果を示す。
【図６】図６は、スクリーニング後に単離した２２個のファージクローンについて、標的タンパク質または対照タンパク質（ＢＳＡ）に対する結合をＥＬＩＳＡによって定量化した結果を示す。
【図７】図７は、合成ペプチドを用いて製造した本発明の一実施態様によるクリプタンド分子のＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【図８】図８は、合成ペプチドリンカー（上）および対応するクリプタンド分子（下）のＣＤスペクトルを示す。
【図９】図９は、本発明の一実施態様によるクリプタンド分子にＧＳＴ−Ｈｓｐ９０ＮＴＤ（左）またはＧＳＴ（右）を滴下したＩＴＣ実験の結果を示す。Ｎ：結合部位数、ＫＤ：解離定数、ΔＨ：エンタルピー変化、ΔＳ：エントロピー変化、ΔＧ：自由エネルギー変化。
【図１０】図１０は、本発明の一実施態様によるクリプタンド分子の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（上）および標的タンパク質と結合させた際のＳＴＤ−ＮＭＲ測定結果（下）を示す。左上に、このクリプタンド分子の構造および疎水性アミノ酸の配置を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の第１の側面は、Ｈｓｐ９０タンパク質に結合することができる分子を提供する。Ｈｓｐ９０は、当業者に知られているように、細胞においてタンパク質の品質管理を行ういわゆる分子シャペロンとして機能する、進化的に保存されたタンパク質である。Ｈｓｐ９０は、タンパク質のホメオスタシス、細胞シグナル伝達、ストレス応答等の様々な生体機能において重要な役割を果たす。Ｈｓｐ９０はまた、癌の病理に関与することが知られており、薬剤療法における重要なターゲットであると考えられている（J. Med. Chem., 2010, 53, 3-17；Nat. Rev. Cancer, 2010, 10, 537-549）。従って、Ｈｓｐ９０に結合する分子は、Ｈｓｐ９０結合剤の成分として、例えば医薬成分として、あるいは結合に基づいた阻害、検出、精製等を行うための研究ツール等として有用となり得る。
【００１２】
本発明者らは先に、Ｔ７ファージのｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されたシステイン含有ペプチドに選択的に化合物をチオエーテル結合させる方法（10BASEd-T）を開発した（特許文献１、非特許文献１）。
【００１３】
本発明において、発明者らは、この10BASEd-T法を利用して、ランダムペプチド（すなわち、２つのシステイン以外はランダムなアミノ酸を含むペプチド）にクラウンエーテルを連結させた構造を有するクリプタンド分子のライブラリーを構築し、Ｈｓｐ９０に結合する分子のスクリーニングを行ったところ、強い親和性をもってＨｓｐ９０に結合するクリプタンド分子を同定し取得することに成功した。
【００１４】
本明細書における「クリプタンド」という用語は、一般的に、３つ以上の弧が結合したかたちをとるクラウンエーテル様環状分子を包含する。本発明の一実施態様による分子は、クラウンエーテルの環を二分するようにしてペプチド性の弧が結合して、結果として３つの弧を含む環状分子となっているため、クリプタンドである。
【００１５】
本明細書において「クラウンエーテル」という場合、エーテルの酸素の代わりに窒素が配置されたアザクラウンエーテルも包含される。事実、本発明の実施態様のクリプタンドを構成するのは、クラウンの周上の第１の酸素原子と、クラウンの周上で第１の酸素原子から最も離れた（すなわち、第１の酸素原子と相対する）第２の酸素原子とがそれぞれ窒素原子に置き換わったアザクラウンエーテル（ジアザクラウンエーテル）、または、クラウンの周上のその他の酸素も窒素になっているアザクラウンエーテルである。クラウンの周上で相対するこれら２つの窒素原子が、−ＣＯ−ＣＨ２−基等を含むリンカー（例えば−ＣＯ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−等）を介して、上記ペプチドの２つのシステインの側鎖硫黄原子にそれぞれ連結される（例えば下記式（Ｉ）〜（Ｖ）参照）。
【００１６】
上記分子は、抗体に匹敵するほどの高い親和性によってＨｓｐ９０タンパク質に結合し得ることが見出された。これは、先行技術のクラウン類縁体（非特許文献１）をはるかに上回る強い結合力である。
【００１７】
本発明の一実施態様による分子は、下記一般式（Ｉ）で表される構造に属する。
【化８】
0006622079.tif 000009
この式中、Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を含む）は、ペプチド結合で連結されたアミノ酸を表し、Ｃ４およびＣ１２はそれぞれシステインを表し、Ｓ＊はＣ４およびＣ１２のシステインの側鎖に由来する硫黄原子を表し、Ｒ１はクラウンエーテル構造を含む基を表す。上記ペプチド結合で連結された複数のアミノ酸からなる部分、すなわちペプチドの部分は、Ｘ１がＮ末端側、Ｘ１４がＣ末端側である。
【００１８】
本発明の実施態様による分子の物理化学的解析により、クリプタンド中のペプチド部分はＨｓｐ９０との結合において主要な役割を果たすとみられる疎水性アミノ酸の配置を提供し、またクラウンエーテル部分は、水溶性向上に貢献し水素結合に寄与することに加えて、分子全体に適度な剛直性を与え、これらの特徴の結果として上述した強い結合力が得られることが示唆された。
【００１９】
すなわち、本発明の一実施態様による分子は、上記一般式（Ｉ）で表される構造を含み、式中、  
Ｘ１は任意のアミノ酸であり、
Ｘ２は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ３は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ５は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ６は任意のアミノ酸であり、
Ｘ７は任意のアミノ酸であり、
Ｘ８は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ９は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１１は疎水性アミノ酸であり、
Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、
Ｘ１４は任意のアミノ酸であるか、またはＸ１４は存在せずにＸ１３が末端アミノ酸である。
【００２０】
上記Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を除く）は、システインではないことが好ましい。
【００２１】
上記疎水性アミノ酸は、好ましくは、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択され、より好ましくは、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、およびフェニルアラニンからなる群から選択され、さらに好ましくは、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびトリプトファンからなる群から選択される。これらの疎水性アミノ酸は、ペプチド間の疎水性結合に関与するものであり、進化の過程でこれらの疎水性アミノ酸がこれらのうちの別の疎水性アミノ酸にしばしば置き換わることは当業者に知られている。すなわち、これらの疎水性アミノ酸は一定の互換性を有することが理解される。
【００２２】
上記一般式（Ｉ）中、Ｘ２はトリプトファン、Ｘ３はバリン、Ｘ５はロイシン、Ｘ８はトリプトファン、Ｘ９はロイシン、Ｘ１１はイソロイシンであることが特に好ましい。
【００２３】
一般式（Ｉ）中、Ｘ７は任意のアミノ酸であるが、プロリンであることが好ましい。
【００２４】
一般式（Ｉ）中、Ｘ１、Ｘ６、Ｘ１０、およびＸ１３は任意のアミノ酸であるが、それぞれ親水性アミノ酸であることが好ましい。これら親水性アミノ酸の存在は、クラウンエーテル部分の酸素原子または窒素原子により提供される水溶性および／または水素結合をさらに補完すると考えられるからである。
【００２５】
上記親水性アミノ酸は、好ましくは、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択され、より好ましくは、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、およびヒスチジンからなる群から選択され、さらに好ましくは、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、およびリジンからなる群から選択される。
【００２６】
一般式（Ｉ）中、Ｘ１はグルタミンまたはアスパラギン、Ｘ６はグルタミンまたはアスパラギン、Ｘ１０はセリンまたはトレオニン、Ｘ１３はアルギニンまたはリジンであることがより好ましい。Ｘ１はグルタミン、Ｘ６はアスパラギン、Ｘ１０はセリン、Ｘ１３はアルギニンであることが特に好ましい。
【００２７】
本発明の実施態様による分子において、ペプチド鎖部分は、ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡというアミノ酸配列を有することが特に好ましい。これらのアルファベットは、当業者が通常用いる一文字略記法によりアミノ酸を表したものである。
【００２８】
上記一般式（Ｉ）においてＲ１として示される部分は、アザクラウンエーテル構造を含む基であり、このアザクラウンエーテルは、クラウンの周上の１つの窒素と、クラウンの周上の相対する位置にあるもう１つの窒素とを介して、一般式（Ｉ）の構造の残りの部分に連結される。クラウンの周上のこれら２つの窒素以外の非炭素原子は、酸素であってもよいし、窒素であってもよい。クラウンの大きさは、１２−クラウン−４から３０−クラウン−１０までであり得、１８−クラウン−６が特に好ましい。
【００２９】
好ましくは、Ｒ１は、下記式（ＩＩ）〜（Ｖ）のいずれかで表される構造を有する。
【化９】
0006622079.tif 000010
【化１０】
0006622079.tif 000011
【化１１】
0006622079.tif 000012
【化１２】
0006622079.tif 000013
【００３０】
式（ＩＩ）〜（Ｖ）の各々において、左右両端に示されている窒素原子は、上記一般式（Ｉ）に示されているカルボニル炭素に共有結合している。
【００３１】
式（ＩＩ）〜（Ｖ）において、ｎは１〜４の整数であり。Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素または炭素数１２以下の炭化水素基もしくは炭素数６以下の炭化水素基であり得る。Ｒ２〜Ｒ５が炭化水素基である場合の例としては、置換または非置換の直鎖状、分岐鎖状、もしくは環状のアルキル基もしくはアリール基またはこれらの複合基が挙げられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、フェニル等が挙げられ、メチルが特に好ましい。
【００３２】
上記一般式（Ｉ）において、Ｒ１基は、上記式（ＩＩ）で表される基であることが好ましい。式（ＩＩ）〜（Ｖ）のそれぞれにおいて、ｎ＝２であることが好ましい。
【００３３】
本発明の分子の好ましい一例は、下記式（ＶＩ）によって表される構造を有するものである。
【化１３】
0006622079.tif 000014
【００３４】
一般式（Ｉ）で表される化合物が、より大きな分子の一部をなす場合もある。例えば、ペプチド部分は、Ｎ末端側および／またはＣ末端側においてさらなるアミノ酸と連結していてもよい。特に、一般式（Ｉ）に示されるペプチドのＮ末端は、Ｔ７ファージのｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合している場合もある。すなわち、本発明の一実施態様による分子は、一般式（Ｉ）で表される構造およびｇｐ１０ポリペプチド部分からなるものであり得る。本発明の実施態様による分子は、ｇｐ１０の代わりに、あるいはｇｐ１０に加えて、検出用／精製用タグその他のオリゴペプチドまたはポリペプチドを含んでいてもよい。
【００３５】
クラウンエーテルおよびクリプタンドは、その環の中に金属イオンを捕える性質を有することが知られる。本発明の実施態様によるクリプタンド分子は、金属イオンと混合することにより、環中にその金属イオンを１つ取り込んだ錯体の形態で提供され得る。この場合において好ましい金属イオンの例としては、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、およびＺｎ２＋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
本発明の実施態様によるクリプタンド分子は、下記において詳しく説明するように、Ｔ７ファージの提示ペプチドをクラウンエーテルで修飾する工程を経て取得することができる。あるいは、ペプチド部分を合成し、または細菌細胞や真核生物細胞に発現させて精製し、クラウンエーテル部分を連結させることによって取得することもできる。これらの実験手法そのものは当業者の通常の技量の範囲内である。
【００３７】
本発明の別の側面では、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃ１２−Ｘ１３−Ｘ１４
で表されるアミノ酸配列を有するペプチドを含有する、ｈｓｐ９０結合剤製造用の組成物が提供される。この組成物中のこのペプチドは、Ｃ４およびＣ１２のシステインの側鎖を介して、アザクラウンエーテルのクラウン周上で相対する２つの窒素原子に連結されて、ｈｓｐ９０結合剤を生じさせるという用途を有する。Ｘ１〜Ｘ１４の各アミノ酸の種類は、上記において特定のクリプタンド分子との関連で説明したものと同様である。
【００３８】
すなわち、本発明の実施態様による上記のペプチド含有組成物において、Ｘ１は任意のアミノ酸であり、Ｘ２は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、Ｘ３は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、Ｘ５は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、Ｘ６は任意のアミノ酸であり、Ｘ７は任意のアミノ酸であり、Ｘ８は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、Ｘ９は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、Ｘ１０は任意のアミノ酸であり、Ｘ１１は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トリプトファン、フェニルアラニン、およびメチオニンからなる群から選択される疎水性アミノ酸であり、Ｘ１３は任意のアミノ酸であり、Ｘ１４は任意のアミノ酸であるか、またはＸ１４は存在しない。Ｘ１〜Ｘ１４（Ｃ４およびＣ１２を除く）は、システインではないことが好ましい。
【００３９】
本発明の実施態様によるペプチド含有組成物において、Ｘ２はトリプトファンであり、Ｘ３はバリンであり、Ｘ５はロイシンであり、Ｘ８はトリプトファンであり、Ｘ９はロイシンであり、Ｘ１１はイソロイシンであることが好ましい。また、Ｘ７はプロリンであることが好ましい。
【００４０】
本発明の実施態様によるペプチド含有組成物において、Ｘ１、Ｘ６、Ｘ１０、およびＸ１３は、それぞれ独立して、グルタミン、アスパラギン、セリン、トレオニン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、チロシン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸からなる群から選択される親水性アミノ酸であることが好ましい。より好ましくは、Ｘ１はグルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ６はグルタミンまたはアスパラギンであり、Ｘ１０はセリンまたはトレオニンであり、Ｘ１３はアルギニンまたはリジンである。Ｘ１はグルタミン、Ｘ６はアスパラギン、Ｘ１０はセリン、Ｘ１３はアルギニンであることが特に好ましい。
【００４１】
本発明の実施態様によるペプチド含有組成物中のペプチドは、
ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ
というアミノ酸配列を有することが最も好ましい。
【００４２】
上記組成物中には、ペプチド以外の成分が含有され得るが、そのような成分の例としては、水、還元剤（特に、10BASEd-Tにおいて使用するもの）、緩衝剤、塩（例えば塩化ナトリウムや塩化カリウム等）、防腐剤、およびこれらのいずれかの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の別の側面は、上述した本発明の実施態様によるクリプタンド分子のペプチド部分が融合したｇｐ１０タンパク質を含有する、Ｔ７ファージに関する。本明細書において「融合」とは、２つまたはそれ以上のペプチドがペプチド結合により連結されて１つのペプチドを形成することを意味する。本明細書における「ペプチド」はオリゴペプチドおよびポリペプチドを包含する。
【００４４】
ｇｐ１０のＣ末端と式（Ｉ）の分子のペプチド部分のＮ末端とが、直接ペプチド結合することにより融合していてもよいし、あるいは、リンカーアミノ酸を介して融合していてもよい。リンカーアミノ酸とは、ｇｐ１０の配列と式（Ｉ）に示されるペプチドの配列との間に挿入される１つ以上のアミノ酸である。リンカーアミノ酸は、当業者に知られる切断酵素による切断を可能にするための酵素認識配列や、検出もしくは精製の用に供するタグ配列などを含み得る。切断酵素による切断を行えば、修飾されたペプチド部分が切り出されるため、本発明の第１の側面による、ｇｐ１０部分を含まないクリプタンド分子を得ることができる。
【００４５】
本発明の実施態様によるＴ７ファージは、通常のＴ７ファージと同様、ホスト細菌細胞に感染して増殖することができる。ただし、増殖の際に生じるのは、クラウンエーテル修飾が除去された裸（未修飾）のペプチド鎖を有するファージである。このように増殖されたファージに対して、10BASEd-T法を使用してクラウンエーテル構造をあらためて連結させることにより、増殖前のクラウンエーテル修飾Ｔ７ファージと同一構造のものを多量に得ることができる。
【００４６】
クラウンエーテル部分により提供される利点（あるいは、クリプタンド構造であることに基づく利点）を生かしながら、ペプチド部分のアミノ酸配列を変動することにより、Ｈｓｐ９０以外の標的タンパク質その他の標的分子に結合する新規分子を探索し取得し得ることが理解される。また、異なる結合力を示すさらなるＨｓｐ９０結合性分子も探索し得る。従って、本発明の別の側面は、標的分子に結合することができるクリプタンド分子をスクリーニングする方法に関する。
【００４７】
本発明の一実施態様によるスクリーニング方法では、２つのシステインが１個以上のランダムアミノ酸で隔てられた配列を含むペプチドが、ｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されるように遺伝子操作された、Ｔ７ファージのライブラリーを利用する。ｇｐ１０タンパク質のＣ末端に融合されたこのペプチドは、Ｔ７ファージ粒子の外表面に提示されるため（特許文献１参照）、本明細書において「提示ランダムペプチド」と呼ぶ。本明細書において、「ライブラリー」とは、構造が異なる多数のファージまたは分子の群を意味する。ライブラリーの中から特定の性質（例えば標的タンパク質への結合能）を有するファージまたは分子を選択する過程を「スクリーニング」という。
【００４８】
ランダムアミノ酸とは、当業者に理解されるように、２０種類のアミノ酸のうち無作為に選ばれるいずれかを意味する。同じく当業者に理解されるように、提示ランダムペプチドにおけるランダムアミノ酸は、アミノ酸をコードするＤＮＡの配列をランダム化してそのランダム化ＤＮＡ配列をｇｐ１０遺伝子の一部としてＴ７ファージに組み入れることにより生じさせることができる。１つ１つのＴ７ファージ個体はそれぞれ１種類のｇｐ１０遺伝子ＤＮＡ配列を取り込み１種類の提示ペプチド配列を発現するが、Ｔ７ファージ群全体としてみるとランダムな提示ペプチド配列のライブラリーが得られることとなる。Ｔ７ファージの遺伝子の配列を改変する遺伝子操作法、および改変された遺伝子を組み入れたＴ７ファージを生成する方法は、当業者に知られている。
【００４９】
２つのシステインの間に挿入されるランダムアミノ酸の数は、例えば３〜１２個、あるいは４〜１０個、好ましくは５〜９個であり、７個が特に好ましい。２つのシステインの外側、すなわち、Ｎ末端側のシステインのさらにＮ末端側、もしくはＣ末端側のシステインのさらにＣ末端側、またはその両方に、さらにランダムアミノ酸を加えてもよい。これら外側のアミノ酸の数は、Ｎ末端、Ｃ末端それぞれについて例えば０〜１２個であり得、１〜１０個が好ましく、２〜５個がより好ましく、３個がより好ましい。Ｎ末端側とＣ末端側のランダムアミノ酸の数が異なっていてもよい。一例として、提示ランダムペプチドは、Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｃ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｃ１２−Ｘ１３−Ｘ１４というアミノ酸配列を有することが好ましく、ここで、Ｘ１〜Ｘ３、Ｘ５〜Ｘ１１、Ｘ１３〜Ｘ１４はそれぞれランダムアミノ酸であり、Ｃ４およびＣ１２はそれぞれシステインである、
【００５０】
提示ランダムペプチドを提示したＴ７ファージのライブラリーとクラウンエーテルリンカー化合物とを反応させて、提示ランダムペプチドをクラウンエーテルで修飾することにより、クリプタンド構造が提示されたＴ７ファージのライブラリーを得ることができる。この反応は、例えば10BASEd-T法を使用して、提示ランダムペプチドを提示したＴ７ファージのライブラリーとクラウンエーテルリンカー化合物とを、ＴＣＥＰ等の還元剤の存在下で混合することにより達成することができる（特許文献１、非特許文献１）。このようにして得られたクリプタンドライブラリーは、任意の標的分子に結合するクリプタンド分子のスクリーニングのために有用である。
【００５１】
クラウンエーテルリンカー化合物としては、アザクラウンエーテルのクラウン周上で相対する２つの窒素原子に、ハロアセチル基またはハロアセトアミド基が連結された構造を有するジハロゲン化合物を好ましく使用することができる。クラウンの周上のこれら２つの窒素以外の非炭素原子は、酸素であってもよいし、窒素であってもよい。クラウンの大きさは、１２−クラウン−４から３０−クラウン−１０までであり得、１８−クラウン−６が特に好ましい。より具体的には、下記の式（ＶＩＩ）〜（Ｘ）のいずれかで表される構造を有するジハロゲン化合物を使用することができ、
【化１４】
0006622079.tif 000015
【化１５】
0006622079.tif 000016
【化１６】
0006622079.tif 000017
【化１７】
0006622079.tif 000018
各式中、ｎは１〜４の整数であり、Ｒ２〜Ｒ５は、それぞれ独立して、水素または炭素数１２以下の炭化水素基もしくは炭素数６以下の炭化水素基であり、丸で囲まれたＸはハロゲンを示す。Ｒ２〜Ｒ５が炭化水素基である場合の例としては、置換または非置換の直鎖状、分岐鎖状、もしくは環状のアルキル基もしくはアリール基またはこれらの複合基が挙げられ、より具体的にはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、フェニル等が挙げられる。ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、またはＡｔであり得、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであることが好ましく、Ｂｒであることが特に好ましい。前記ペプチドとの反応後には、このハロゲンが、ペプチドのシステインの側鎖に由来する硫黄原子に置き換わることとなる。これらのリンカー化合物は、容易に入手できる材料化合物を使用して、当業者に知られる有機化学的手法により合成することができる。
【００５２】
上記反応で使用され得る還元剤の例としては、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、およびβ−メルカプトエタノール等が挙げられるが、ＴＣＥＰが特に好ましい。例えばＴＣＥＰのようなトリアルキルホスフィンは、ハロ酢酸やそのアミド誘導体と反応してしまうことが報告されている。このため、一般的には、システイン残基の還元およびアルキル化は、二段階の独立した反応により行われる。しかしながら、10BASEd-T法では、ＴＣＥＰによる還元の後に精製を行うことなく、一段階で、すなわち、「ワンポット」で、還元およびアルキル化の反応ができる（特許文献１参照）。
【００５３】
上記ワンポット反応における還元剤の濃度は、当業者が適宜決定することができ、特に限定されないが、好ましくは１０〜２０００μＭ、より好ましくは１００〜１０００μＭ、さらに好ましくは２００〜８００μＭ、最も好ましくは４００〜６００μＭである。
【００５４】
なお、ここでは、クリプタンド構造を含んだ修飾Ｔ７ファージのライブラリーを作成するための反応について説明したが、本発明の実施態様による特定のクリプタンド分子または特定のクラウンエーテル修飾Ｔ７ファージを取得するために同様の反応を使用することもできる。その場合、提示ランダムペプチドの代わりに特定のアミノ酸配列の提示ペプチドを使用すればよい。
【００５５】
上記のようにして得られる、クリプタンド構造を含んだ修飾Ｔ７ファージのライブラリーを、標的分子と混合し、溶液中で両者を接触させる。その結果、ライブラリーに含まれるファージのうち、標的分子に対する親和性を有するクリプタンド構造を提示しているファージが、標的分子に選択的に結合する。これらの混合・結合およびそれに続く洗浄の具体的手順は、当業者が標準的技術に基づいて適宜設計することができ、特許文献１等にも例示されている。
【００５６】
修飾Ｔ７ファージは、金属イオンを添加することにより、クリプタンドの環中にその金属イオンを１つ取り込んだ錯体の状態として標的分子と混合してもよい。この場合において好ましい金属イオンの例としては、Ｍｇ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｕ２＋、およびＺｎ２＋が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
「標的分子」とは、スクリーニングにより得られる分子の結合標的となることが意図される分子を意味する。標的分子は、ユーザーによって任意に選ばれる分子であり、典型的にはタンパク質（標的タンパク質）であるが、核酸、糖、脂質、その他のマクロ分子、あるいはそれらの複合体等でもあり得る。標的タンパク質は、全長タンパク質であってもよいし、タンパク質の断片であってもよい。一例において、標的タンパク質は、Ｈｓｐ９０のＮ末端ドメイン断片である。標的タンパク質はまた、他のペプチド（オリゴペプチドおよびポリペプチドを含む）のタグに融合された形態でスクリーニングに用いられてもよい。そのようなペプチドタグの例としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ等が挙げられるが、これらに限定されない。標的タンパク質はまた、ビオチン化などの修飾がなされたものであってもよい。これらの付随的構造は、標的タンパク質の精製やカラムにおける結合・溶出の操作を促進し得る。
【００５８】
次に、標的分子の種類に応じた適切な手段を用いて、標的分子およびそれに結合した修飾Ｔ７ファージ群を、標的分子に結合していない修飾Ｔ７ファージ群から分離する。例えば、標的タンパク質がＧＳＴ融合タンパク質の形態のものであるならば、グルタチオンに対する親和性クロマトグラフィーにより、標的タンパク質およびそれに結合した修飾Ｔ７ファージ群を分離・回収し、未結合の修飾Ｔ７ファージ群を除去することができる。ファージを標的分子と混合し、結合したファージを未結合のファージから分離して回収することを含むこれら一連の操作を、「ポジティブセレクション」という。ポジティブセレクション後に得られたファージ群は、もとのライブラリーに含まれていた全ファージ群の一部（亜群）である。
【００５９】
なお、標的タンパク質がタグに融合した形態である場合には、ポジティブセレクションに先立って、タグ部分そのものに結合するファージを除去しておく「ネガティブセレクション」を行うことが好ましい。ネガティブセレクションにおいては、ポジティブセレクションとは逆に、結合した画分を捨て、結合しなかった画分を回収して以降の実験に使用する。同様に、結合・洗浄の操作の際にビーズ等の担体を使用する場合には、それら担体に結合するファージを除去するためのネガティブセレクションを行うことが好ましい。
【００６０】
ポジティブセレクションによって分離されたファージ群は、そのままホスト細菌に感染させることができる。例えば、ビーズへの結合を利用して標的タンパク質およびそれに結合したファージをまとめて分離した場合は、これらのものの複合体を含むビーズをそのまま感染反応に用いることができる。もちろん、ビーズからの分離あるいは標的タンパク質からの分離が可能であれば、分離したファージ単体を感染に用いてもよい。Ｔ７ファージが感染可能なあらゆるホスト細菌を使用し得るが、通常は大腸菌（例えばＢＬＴ５４０３株）がホスト細菌として使用される。感染方法としては当業者に知られる標準的な方法を使用することができる。
【００６１】
当業者には理解されるように、ホスト細菌への感染により、標的分子に結合していたクリプタンド構造に対応するペプチド配列を提示するＴ７ファージを増殖させることができる。しかしながら、上述したように、増殖により得られた新たなファージ粒子は、提示ペプチドにおいてクラウンエーテル修飾を有していない。そこで、増殖されたＴ７ファージを、上記においてファージライブラリーに対して行ったのと同様にしてクラウンエーテルリンカー化合物と反応させ（10BASEd-T反応）、クリプタンド構造を含んだ修飾Ｔ７ファージ群を再取得する。このようにして再取得された修飾Ｔ７ファージ群は、もとの修飾ファージライブラリーと比較して、標的分子結合能を有するファージが濃縮されている。
【００６２】
ポジティブセレクションを繰り返せば繰り返すほど、標的分子に対する結合能を有するファージがより濃縮されていくことが理解される。従って、本スクリーニング方法では、上記において再取得された修飾Ｔ７ファージ群を、標的分子と再び混合し、標的分子に結合する修飾Ｔ７ファージを再び分離する。すなわち、２度目のポジティブセレクションを行う。このようにして、標的分子に結合することができるクリプタンド分子を含むファージを取得し得る。
【００６３】
その後、分離されたファージの感染・増殖、クラウンエーテルリンカー化合物による修飾、標的分子への結合、結合したファージの分離というサイクルを、少なくともさらに１回繰り返すことが好ましく（合計３ラウンド）、少なくとも４回繰り返すことがより好ましい（合計６ラウンド）。これらの反復により、標的分子に対する結合能を有するファージが著しく濃縮され、より高い結合力を有する分子が含まれる率が高くなる。所望の分子を単離するために何ラウンドの繰り返しが必要であるかは、標的分子の種類によって異なり得る。
【００６４】
このように、標的に結合するファージのポジティブセレクションと増殖とを繰り返して、結合能を有するファージ（ペプチド）を濃縮していく手法は一般に「バイオパニング」とも呼ばれる。
【００６５】
最後のポジティブセレクション後に、分離されたファージを感染・増殖させ、任意の数のクローンを単離して、結合能力の確認を行うことができる。結合能力の確認のためには、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）等、当業者に知られた手法を適宜使用すればよい。また、これらクローンにおけるｇｐ１０遺伝子のコーディング領域末端部分のＤＮＡ配列を決定することにより、結合能力を提供したクリプタンドのペプチド部分のアミノ酸配列を決定することができる。
【実施例】
【００６６】
以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００６７】
［概要］
ランダム化されたペプチド配列 Ｘ３ＣＸ７ＣＸ３（ここで、Ｘ３は３つのランダムなアミノ酸を表し、Ｘ７は７つのランダムなアミノ酸を表し、Ｃはシステインを表す）を提示するＴ７ファージのライブラリーに対して、10BASEd-T法を用いてクラウンエーテル修飾を行い、クリプタンド構造を有するファージのライブラリー（クリプタンドライブリー）を作製した。
【００６８】
上記の修飾したファージを用いて、標的タンパク質ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤ（Ｈｓｐ９０のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）をＧＳＴタグに融合させたもの）に対するポジティブセレクションおよびＧＳＴに対するネガティブセレクションを行い、Ｈｓｐ９０  ＮＴＤ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＹＥＲ）に対する結合力を持ったクリプタンドを有するＴ７  ファージの濃縮を６回行った。
【００６９】
ポジティブセレクション（０〜６ラウンド目）にて得られたファージを増殖させて、その懸濁液に対し10BASEd-Tによるクラウンエーテル修飾反応を行い、その後ＥＬＩＳＡにてＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに対する結合能の評価を行ったところ、無修飾ペプチド（ｍｏｃｋ）およびクリプタンド（クラウンエーテル修飾ペプチド）の双方から、ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに結合するペプチドの存在が観察された。
【００７０】
クリプタンドライブラリー中からＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに結合する新規の分子を単離して獲得するために、ポジティブセレクションの６ラウンド目終了後に無作為に選出したクローン２２個に対し、それぞれ10BASEd-Tにて無修飾ペプチドおよびクリプタンド（クラウンエーテル修飾ペプチド）を作製し、再度ＥＬＩＳＡにてＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに対する結合能の評価を行った。
【００７１】
その結果、２２個のクローンの中から、ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに強く結合するクリプタンド構造を持つクローンが１つ見出された。このクリプタンド構造のペプチド部分のアミノ酸配列を、ＤＮＡシーケンス解析を介して決定し、既知のＨｓｐ９０結合ペプチドの配列と比較したが、両者の配列に共通性は見られなかった。
【００７２】
［Ｔ７ファージライブラリーの作製］
Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂシステム（メルクミリポア社）を用い、マニュアルに従いながら、ｇｐ１０のＣ末端に提示ペプチドが融合されたＴ７ファージライブラリーを作製した。その際、検出および解析を容易にするために、ｇｐ１０と提示ペプチドとの間には、エンテロキナーゼ切断部位の配列（ＤＤＤＤＫ）を有するＦＬＡＧタグを挿入した。提示ペプチドは、２つのシステイン残基およびそれらを囲むランダムな配列を有するようにデザインした。手短に述べると、まず、以下の塩基配列：5’- GGTGGAGGTGGCGACTACAAGGATGACGATGACAAGGGATCA(NNK)3TGC(NNK)7TGT(NNK)3TGAAAGCTTGGA-3’（配列番号１）を有するオリゴヌクレオチドを合成した（Nはランダム化したヌクレオチド（すなわち「A、C、G、またはT」）を意味し、Kは「GまたはT」を意味する）。制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの認識配列をそれぞれ含む適切な２つのプライマーを用いたＰＣＲによって、上記オリゴヌクレオチドから二本鎖ＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ産物を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ＤＮＡ断片をさらに精製し、Ｔ７Ｓｅｌｅｃｔ１０−３ｂベクターにライゲーションした。このライゲーション産物およびＴ７パッケージングエキストラクトを用いてパッケージングを行った後、大腸菌ＢＬＴ５４０３細胞に感染させた。無作為に選んだクローンのＤＮＡ配列をチェックすることにより、Ｔ７ライブラリーの品質を確認した。
【００７３】
［クラウンエーテル誘導体の有機合成］
下記のスキーム１に従って、市販の化合物からクリプタンド前駆体としてのアザクラウンエーテル誘導体を合成した。
【化１８】
0006622079.tif 000019
【００７４】
０．３０ｇ（１．１ｍｍｏｌ）の1,4,10,13-テトラオキサ-7,16-ジアザシクロオクタデカンを２．０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、０℃氷水中にて０．６０ｍＬのN,N-ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を加え、１５分間攪拌した。その後、シリンジを用いて０．３０ｍＬ（２．３ｍｍｏｌ）のブロモアセチルブロミドを徐々に滴下したのち混合物を徐々に室温に戻し、そのまま５．５時間攪拌した。ＴＬＣ（ＭｅＯＨ）にて反応溶液を確認したところ、原料のＲｆ値０．４に対し、生成物はＲｆ値０．７を示した。原料が消失したことが確認されたため、反応溶液を減圧濃縮した。得られた粗生成物は、逆相中圧液体クロマトグラフィー（reverse-phase middle pressure liquid chromatography）（山善ＯＤＳカラム２６×３００ｍｍ、流速２０ｍＬ／分、４０分間にわたる純水中５〜１００％ＭｅＯＨの勾配、λ＝２６０ｎｍ）にて精製を行い、目的のジブロモ体を収率３０％にて得た（０．１５ｇ）。図１参照。このジブロモ体は、クラウンエーテルリンカー化合物として以下の実験に用いることができる。
【００７５】
［クラウンエーテル誘導体によるＴ７ファージの化学修飾（クリプタンド化）］
（１）モデルファージに対するクラウンエーテル修飾
ライブラリーを用いたセレクション（分子進化）実験に先立ち、ファージ上の提示ペプチドに対してクラウンエーテルによる修飾化が可能であるか否かを調べた。すなわち、モデルファージ（ｇｐ１０−ＦＬＡＧタグ−ＧＳＲＶＳＣＧＧＲＤＲＰＧＣＬＳＶ）に対して10BASEd-T法を用いてクラウンエーテルによる修飾を行った後、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる質量測定を行った。具体的手順を以下に示す。
【００７６】
（２）10BASEd-Tによるクラウンエーテル修飾化の具体的手順
１．５ｍＬサンプルチューブにファージ量：２．４×１０１１ｐｆｕ分のモデルファージのモノクローン懸濁液を入れる。（１サンプルあたり１．２×１０１１ｐｆｕ分使用する。後にクラウンエーテル修飾用とｍｏｃｋ修飾用に二等分するため、あらかじめ２サンプル分のファージを調製した。）
↓ 
↓ファージ懸濁液の体積の１／５倍量の２０％  ＰＥＧ−６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加える。
↓ピペッティング、ボルテックス
↓遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間）
↓上清除去
↓１Ｍ  ＮａＣｌを１８０μＬ加える。
↓超音波処理（５分間）
↓ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を５２０μＬ加える。
↓超音波処理（１分間）
↓卓上遠心分離（室温、１２，０００ｒｐｍ、５分間）
新たな１．５ｍＬサンプルチューブに、上清６９０μＬを入れる。
以下、４℃の氷水を使って、温度を上げないようにして実験を行った。
↓１０ｍＭ  ＴＣＥＰ−ＮａＯＨ（ｐＨ  ７）を４０μＬ加える。
↓３６５μＬずつ２等分する。一方はクラウンエーテル修飾用（イ）であり、他方はＴＭＲＩＡ（ハロアセトアミド類の蛍光物質であるテトラメチルローダミン−５−ヨードアセトアミド）修飾用（ロ）である。
↓各ファージ懸濁液３６５μＬに対し、
（イ）１０ｍＭのクラウンエーテルリンカー化合物水溶液６．５μＬを加える（最終濃度：１７４μＭ）。
（ロ）１ｍＭのＴＭＲＩＡを６５μＬ加える（最終濃度：１５１μＭ）。
↓ロータリーミキサー（日伸理化）で撹拌 （４℃、３時間）
↓１００ｍＭのベータ・メルカプトエタノールを２２μＬ  加える。
↓ロータリーミキサー（日伸理化）で撹拌（４℃、１時間）
↓ファージ懸濁液の体積の１／５倍量の２０％  ＰＥＧ−６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加える。
↓ピペッティング、ボルテックス
↓遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分間）
↓上清除去
↓４０μＬの標準的な１×ＳＤＳサンプルバッファーを加える。
↓超音波処理（５分間）
↓９５℃で保温（５分間）
↓ 
電気泳動用の（イ）クラウンエーテル修飾ファージライブラリー溶液、および（ロ）ＴＭＲＩＡ修飾ファージライブラリー溶液が完成
↓ 
↓完成した溶液を全量用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％アクリルアミドゲル、２５ｍＡ、６０分間）を行う。
↓ゲルのＣＢＢ（クーマシーブリリアントブルー）染色（３０分間）
↓ゲルの洗浄（１０分間）
↓バイオ・ラッド社製ChemiDoc XRS PLUSを用いたゲルの撮影
【００７７】
（３）修飾された目的物の溶出
目的物であると考えられる４５ｋＤａ付近のバンドをゲルから切り出し、ゲル片を約１ｍｍ四方の大きさに切り分けた後、１．５ｍＬサンプルチューブに取り分けた。
↓１００μＬの脱色液を入れて振とう（３７℃、８００ｒｐｍ、１０分間）×２回
↓脱色液を除去
↓３０μＬの還元液を加える（６０℃、１０分間）
↓還元液を除去
↓３０μＬの修飾液を加える（室温、１時間、暗所）
↓修飾液を除去
↓２００μＬの脱色液を入れて振とう（３７℃、８００ｒｐｍ、１０分間）
↓脱色液を除去
↓５０μＬのアセトニトリルを加える（室温、５分間）
↓アセトニトリルを除去
↓エバポレーターを用いてゲル片を乾燥（１０分間）
↓１０μＬの活性化トリプシン液を加える（室温、１５分間）
↓２５μＬの消化液を加える（３７℃、１２時間）
↓消化液混合物（Ａ）を新しい１．５  ｍＬチューブに移し、その（Ａ）に５μＬの１％ギ酸を加える
↓残ったゲル片（Ｂ）にも２０μＬの１％ギ酸を加え、超音波処理する（１０分間）
↓（Ｂ）の溶液画分だけを（Ａ）に移し取る
↓（Ａ）、（Ｂ）の混合溶液が酸性であることを確認
↓
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析
【００７８】
上記溶出に用いた試薬を表１にまとめた。
【表１】
0006622079.tif 000020
【００７９】
（４）モデルファージに対するクラウンエーテル修飾化の結果
モデルファージ上の提示ペプチドに対してクラウンエーテル修飾を施した試料の、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる解析結果を図２に示す。図２に示されているように、クラウンエーテル修飾されたペプチドに相当するフラグメントが検出された。この結果から、モデルファージ上の提示ペプチドに対して10BASEd-T法を用いて行ったクラウンエーテル修飾化が成功していることがわかる。
【００８０】
［10BASEd-T反応におけるクラウンエーテル濃度の最適化］
（１）最適化実験の具体的手順
２００μＭのフルオレセインヨードアセトアミド（ＦＬ−ＩＡ）を用いて10BASEd-Tを行った場合、ほぼ全てのＴ７ファージ提示ペプチドがＦＬ−ＩＡによって化学修飾されていた（＞９５％）。これを利用して、10BASEd-T反応におけるクラウンエーテルリンカー化合物の最適濃度を決定した。この手法はTokunaga et al., Molecules, 19, 2481-2496 (2014)に記述されており、ここでは、同文献の図２に示された手順と同様の実験を行った。なお、上述のものと同じモデルファージを用いた。具体的な手順を以下に示す。
【００８１】
１．５ｍＬサンプルチューブにファージ量：１．０×１０１２ｐｆｕ分のモデルファージのモノクローン懸濁液を入れる。
↓ 
↓ファージ懸濁液の体積の１／５倍量の２０％  ＰＥＧ−６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加える。
↓ピペッティング、ボルテックス
↓遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間）
↓上清除去
↓１８０μＬの１Ｍ  ＮａＣｌを加える。
↓超音波（５分間）
↓５２０μＬのＰＢＳを加える。
↓超音波処理（１分間）
↓卓上遠心分離 （室温、１２，０００ｒｐｍ、５分間）
新たな１．５ｍＬサンプルチューブに、上清６９０μＬを入れる（以下においてこれをファージ液という）。
以下、４℃の氷水を使って、温度を上げないようにして実験を行った。
１．５ｍＬチューブに、下記の組成の混合液を８サンプル分調製する。
ファージ液  …  ８０μＬ
１０ｍＭ  ＴＣＥＰ−ＮａＯＨ    …  ５μＬ
１０ｍＭ  クラウンエーテルリンカー化合物水溶液    …  ＸμＬ
ＰＢＳ  …  残部
------------------------------------------------------------------------
合計  …  １００μＬ
クラウンエーテルの濃度を０μＭ〜１ｍＭの間で変動させるために、Ｘ＝０，０，１，２，４，６，８，１０とした。（後に、ＦＬ−ＩＡで修飾しない陰性対照が必要になるため、Ｘ＝０μＬのサンプルを２つ調製した。）
↓ロータリーミキサー（日伸理化）で撹拌（４℃、３時間）
↓２ｍＭのＦＬ−ＩＡ水溶液／ＤＭＳＯ＝１：１の液を１０μＬ加える。
↓ロータリーミキサー（日伸理化）で撹拌（４℃、３時間）
↓５μＬの１００ｍＭベータ・メルカプトエタノールを加える。
↓ロータリーミキサー（日伸理化）で撹拌 （４℃、３０分間）
↓ファージ懸濁液の体積の１／５倍量の２０％  ＰＥＧ−６０００／２．５Ｍ  ＮａＣｌを加える。
↓ピペッティング、ボルテックス
↓遠心分離（４℃、１５，０００ｒｐｍ、１５分）
↓上清除去
↓４０μＬの１×ＳＤＳサンプルバッファーを加える
↓超音波処理（５分間）
↓９５℃で保温（５分間）
↓遠心分離（室温、１２，０００ｒｐｍ、５分間）
↓完成した溶液を１５μＬ用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミドゲル、２５ｍＡ、６０分間）
↓ 
バイオ・ラッド社製ChemiDoc XRS PLUSおよび日立ソリューションズ製FMBIO（登録商標）IIIを用いたゲルの撮影
【００８２】
（２）最適化実験の結果
上記のように、まず異なる量のクラウンエーテルで修飾し続いてＦＬ−ＩＡで修飾したｇｐ１０融合ペプチドを電気泳動して、ＦＬ−ＩＡ由来の蛍光を検出した結果（ChemiDoc XRS PLUSにより撮影したゲル）を図３Ａに示す。また、ＦＬ−ＩＡの蛍光強度をグラフ化したものを図３Ｂに示す（FMBIO IIIによりゲルをスキャンした後、定量化した）。
【００８３】
図３Ａ、Ｂより、クラウンエーテルの濃度を上げるにつれて蛍光強度が落ちている（すなわち、濃度依存的にクラウンエーテル修飾が増加し、後から加えられたＦＬ−ＩＡが修飾できる余地が減少している）ことがわかる。更に、クラウンエーテル濃度を４００μＭまで上昇させた場合には蛍光強度がほとんど無くなっている（すなわち、ほとんど全ての提示ペプチドがクラウンエーテルによって修飾されきっている）ことがわかる。以上の結果から、10BASEd-Tにおけるクラウンエーテルリンカー化合物の最適濃度は（やや余裕を持たせて）５００μＭと決定した。後述するスクリーニングにおいては、10BASEd-T反応の際のクラウンエーテルリンカー化合物の濃度は５００μＭとした。
【００８４】
［クリプタンド化したＴ７ファージのライブラリーを用いた、Ｈｓｐ９０結合性クリプタンドのスクリーニング］
上述したＴ７ファージライブラリーに対して10BASEd-T法によるクラウンエーテル修飾を行うことで、クリプタンドライブラリーを作製した。このクリプタンドライブラリーを初期ライブラリーとして用いて、ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに対するポジティブセレクションを経たファージ群の増殖・再修飾を繰り返してバイオパニングを行うことにより、標的タンパク質Ｈｓｐ９０に特異的に結合するクリプタンド構造が提示されたファージを順次濃縮し、スクリーニングを行った（なお、ＧＳＴおよびグルタチオンビーズに対するネガティブセレクションを行うことによって、これらの部分に結合するファージは事前に排除した）。この例では、合計６ラウンドのポジティブセレクションを行った。最終的にＥＬＩＳＡアッセイで結合が確認できたファージクローンのＤＮＡ配列を決定することにより、ファージ上の提示ペプチドの配列を解析した。これら一連の手順の概略を図４に示す。
【００８５】
［ＥＬＩＳＡによる結合能評価の結果］
０〜６ラウンド（Ｒ０〜Ｒ６）のポジティブセレクション終了後に感染・増殖させた試料に対し、再度10BASEd-Tを用いてクラウンエーテル修飾反応を行い（この際、陰性対照として未修飾の試料も用意した）、ＥＬＩＳＡにて標的タンパク質ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤまたは対照タンパク質ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に対する結合能の評価を行った。このアッセイにおいて結合量を表す発色強度の測定結果を図５に示す。
【００８６】
図５によれば、５ラウンド（Ｒ５）目から、未修飾のファージ群においてＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに結合するファージが急激に濃縮されていることがわかる。クラウンエーテル修飾のファージ群の方は６ラウンド（Ｒ６）目から顕著に濃縮されているが、未修飾のファージ群と比べると、ポリクローナルでの結合力はより弱い（すなわち、個々のファージではなくファージ群全体としての結合量は、より低い）と見られる。
【００８７】
しかしながら、クラウンエーテル修飾のファージ群中には、個々のモノクローンとして強い結合力を持つクリプタンド分子が含まれていることが期待できる。従って、６ラウンド目直後のタイターチェックにて得られたファージプラークの中から、無作為に２２個のモノクローンを選んで番号を振り、10BASEd-Tによる再修飾を行い、個々のクローンについて再度ＥＬＩＳＡにて結合能の評価を行った。このＥＬＩＳＡで測定される発色強度はモノクローンとしての結合力の強さを表す。測定結果を図６に示す。
【００８８】
図６より、クラウンエーテル修飾された１８番のモノクローンは、ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに対して強い結合力を持つことが確認できた。
【００８９】
［ＤＮＡ配列決定を介したペプチド配列の解析］
クラウンエーテル修飾をすることでＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに結合することが確認された上記１８番のモノクローンを用いて、ＰＣＲによってｇｐ１０遺伝子のＤＮＡ増幅を行い、ＰＣＲ産物を精製した。そして提示ペプチドのＤＮＡ配列を決定した。その結果、このクローンの提示ペプチドは下記のアミノ酸配列を有することが明らかになった。
１８番クローンの提示ペプチド配列：
ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ
下線で示したシステインは初期ライブラリーにおいてランダム化されていなかったアミノ酸であり、このシステインの側鎖がクラウンエーテルと連結する。
【００９０】
一方、今日までの研究により、Ｈｓｐ９０  ＮＴＤに結合するペプチドとして下記の配列のものが知られている（非特許文献１参照）。なお、□は任意のアミノ酸を示す。上記同様、下線で示したシステインはランダム化されていないアミノ酸であり、実際にはこれら２つのシステインがジスルフィド結合を形成している。
先行技術のＨｓｐ９０結合性ペプチドの配列：
Ｒ□ＴＣＹ□□□□□□Ｃ□□Ｗ
【００９１】
そして、特許文献１および非特許文献１で記述されたＨｓｐ９０  ＮＴＤ結合性環状分子（非クリプタンド）のペプチド部分の配列は下記のとおりであった。
先行技術のＨｓｐ９０結合性環状分子のペプチド部分の配列：
ＲＳＷＣＲＫＳＲＫＮＳＧＧＧＬＶＷＣＦ
【００９２】
上記３つのアミノ酸配列を比べると、システイン以外の共通性は全くと言っていいほど見出されない。このことから、既知のＨｓｐ９０  ＮＴＤ結合性ペプチドの場合とは異なり、本発明においては、クラウンエーテルとペプチドとが合わさって形成する独特の固いクリプタンド様の構造が、Ｈｓｐ９０に結合する上で有利に働き、全く目新しい配列の同定につながったと考えられる。
【００９３】
［Ｈｓｐ９０結合性クリプタンドの化学合成、および各種物性の測定］
上記１８番クローンと同じ配列（Ｈ２Ｎ−ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ−ＯＨ）を有するペプチドを、GenScript社（米国ニュージャージー州）に委託して合成・分析した。合成ペプチドの純度は９０％超と推定された。上記スキーム１において示したアザクラウンエーテル誘導体（ジブロミド化合物）をこのペプチドとともに環状化するために、ペプチド（１２ｍｇ、７．１μｍｏｌ）を７０ｍＬのリン酸バッファー（１０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．４）に溶解して最終濃度０．１０ｍＭの水溶液とし、その後、少量の水に溶解したジブロミド化合物（１７ｍｇ、０．４８ｍＭ）と中和したＴＣＥＰ（０．５０ｍＭ）とを５分間かけて徐々に加えた。この混合物を、室温の暗所において揺らしながら３時間インキュベートして反応を行った。残ったジブロミドを不活性化するために、２−メルカプトエタノール原液（５．０μＬ、１．０ｍＭ）をさらに反応混合物に加え、室温の暗所において揺らしながらさらに３０分間インキュベートした。その後、混合物を凍結乾燥した。凍結乾燥物を１％ギ酸／２５％ＤＭＳＯの水溶液中に溶解し、XTerra Prep MS C18カラム（１０×５０ｍｍ、ウォーターズ社）を備えた逆相ＨＰＬＣ（島津製作所）を用いて、上記反応の産物であるクリプタンド分子を精製した。クリプタンド分子は、０．１％ギ酸を含む０〜１００％の直線的アセトニトリル勾配を５０分間にわたって使用して流速４ｍＬ／分にて分離した。得られたクリプタンド分子（５．０ｍｇ、収率３５％）を凍結乾燥し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳおよびＮＭＲで分析した。
【００９４】
図７は、０．１％ギ酸を含み５０分間にわたる０〜１００％の直線的メタノール勾配を使用して分析したクリプタンド分子のＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。（Ａ）は全イオンクロマトグラフィー、（Ｂ）は２９．６分付近のＭＳスペクトル、（Ｃ）は１０１６．８のｍ／ｚを有するフラグメントのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。環状化の前は、直鎖ペプチド（Ｈ２Ｎ−ＱＷＶＣＬＮＰＷＬＳＩＣＲＡ−ＯＨ）のほとんどのｂおよびｙ  ＭＳ／ＭＳフラグメントが同定可能であったが（データは示していない）、環状化後は、限られた数のＭＳ／ＭＳフラグメントしか見出されない。
【００９５】
［Ｈｓｐ９０  ＮＴＤ結合性クリプタンドのＣＤスペクトル］
直鎖状リンカーペプチド（すなわちクラウンエーテル修飾前のペプチド）とクリプタンドとの両方について、ＣＤ（circular dichroism）スペクトルを測定した。手短に述べると、それぞれの化合物をリン酸バッファー（２０ｍＭリン酸、ｐＨ７．４）に溶解して最終濃度２０μＭとし、２５℃にて円二色性分散計（J-720W、JASCO社製）および１ｃｍ光路長の石英セルを用いてスペクトルを測定した。
【００９６】
直鎖状ペプチドおよびクリプタンドの両方において、互いに類似した特徴的なかたちのピークが観察された（図８）。この結果は、ペプチドの二次構造が、クラウンエーテルの結合によって壊されるどころかむしろ剛直な環状構造の一部として堅持されていることを示唆している。これは、構造の柔軟性の高さを示していた先行技術の非クリプタンド型クラウン類縁体とは対照をなすものであり（非特許文献１）、本発明のクリプタンド分子が強い結合力を示す一因となっていると考えられる。
【００９７】
［等温滴定型カロリメトリー（ＩＴＣ）］
ＩＴＣ実験は、MicroCal iTC200（ＧＥヘルスケア社製）を使用して行った。限外濾過カラム（vivaspin column 500、分子量カットオフ１０ｋＤａ、ＧＥヘルスケア社製）を使用してＧＳＴタグ化Ｈｓｐ９０  ＮＴＤを濃縮し、バッファーをリン酸バッファー（２０ｍＭリン酸−ＫＯＨ、ｐＨ７．２、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ）に置き換えた。ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を決定した。滴定実験のために、ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤまたはＧＳＴとクリプタンドとをそれぞれ５μＭと５０μＭとに希釈した。滴定は２５℃で行った。インジェクションパラメータは以下のようにした：体積２μＬ、持続時間４秒間、間隔６０秒間、およびフィルター時間５秒間。リファレンスパワーは５μｃａｌ／ｓに設定した。オリジンソフトウェア７．０（MicroCal）を使用してデータを分析した。１：１相互作用モデルを使用してカーブフィッティングを行った。
【００９８】
ＩＴＣ実験の結果（図９）は、このクリプタンド分子がＨｓｐ９０  ＮＴＤに特異的に結合し、ＧＳＴには結合しないことを明確に示している。ＧＳＴへの結合に関して得られたデータは特異的相互作用の欠如を示す無秩序なものである。Ｈｓｐ９０  ＮＴＤへの結合に関して得られた解離定数ＫＤは６２ｎＭであったが、これは、先行技術の非クリプタンド環状分子（非特許文献１）をはるかに上回り、抗体に匹敵するほどの強い結合力を表す数値である。また、エンタルピー変化ΔＨは、上記先行技術の環状分子で得られた値（−１３．７ｋｃａｌ／ｍｏｌ）より大きな変化となっている（−１６．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。このことは、本発明の実施態様によるこのクリプタンド分子が、相対的に標的タンパク質と水素結合しやすいことを示唆している。なお、−ＴΔＳ＝７．０であり、測定温度は２５℃であることから、エントロピー変化ΔＳは−７０００／（２７３＋２５）＝−２３．５ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇと計算される。これは、非特許文献１のものの−１９．６ｃａｌ／ｍｏｌ／ｄｅｇと比べると類似しており、あるいはむしろエントロピー的にはごくわずかに不利であることを示す値である。非特許文献１のクラウン様分子に比べて環構造が小さく、かつ、より剛直である２環構造である本クリプタンドにおいて、結合に伴うエントロピーロスが微増している（すなわちエントロピー的にはごくわずかに不利である）のは、標的分子との結合に伴う水素結合の数が増えてエントロピーロス（不利さ）が生じる一方で、適度な剛直性を有していることによるエントロピーロスの低減（有利さ）がそれを相殺し、結果的にΔＳが殆ど同じ値となったものと推測される。
【００９９】
［核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定］
５００ＭＨｚ分光計（JNM-ECA500、Jeol Resonance社製）を使用して、３０℃にて、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹおよびＳＴＤ（Saturation Transfer Difference）測定を含むＮＭＲ実験を行った。クリプタンドの通常の１次元プロトンＮＭＲ（１Ｈ  ＮＭＲ）スペクトルの帰属は、各種２次元ＮＭＲスペクトル（具体的には、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ（ミキシング時間１５０ミリ秒）、ＮＯＥＳＹ（ミキシング時間０．５秒））を測定して総合的に解析することにより行った。全てのＮＭＲスペクトルの測定は、クリプタンド（０．３２ｍＭ）を、溶媒を９０％Ｄ２Ｏ、１０％ＤＭＳＯ−ｄ６として作製した１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かすことで行った。飽和移動差ＮＭＲスペクトル（ＳＴＤ−ＮＭＲ）の測定は、飽和時間を４秒として、６０ミリ秒のガウス型パルスをＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤタンパク質のみに照射して選択的飽和をさせることにて行った。ＧＳＴ−Ｈｓｐ９０  ＮＴＤタンパク質に対するオンレゾナンスおよびオフレゾナンスのパルス照射位置は、それぞれ０．５および−１０ｐｐｍにて行い、ＳＴＤ−ＮＭＲスペクトルはそれらの差分を取ることにより得た。ＳＴＤ−ＮＭＲスペクトル測定時における総積算回数は７４３２回であり、ドメインデータポイントは４０９６である。
【０１００】
ＳＴＤ−ＮＭＲの結果（図１０）は、本発明の実施態様によるクリプタンド分子のペプチド部分のうち、アラニン（Ａ）を除く疎水性アミノ酸、すなわちトリプトファン（Ｗ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）およびバリン（Ｖ）がＨｓｐ９０への結合において特に重要な役割を果たしていることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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