(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ０１２を含む頭蓋内脳腫瘍治療剤であって、
前記ＮＫ０１２はＳＮ−３８を放出するものであり、
前記頭蓋内脳腫瘍治療剤は、対流増強送達系を介して中枢神経系に投与するためのものであることを特徴とする、頭蓋内脳腫瘍治療剤。
【請求項２】
対流増強送達系が浸透圧ポンプである、請求項１に記載の頭蓋内脳腫瘍治療剤。
【請求項３】
対流増強送達系が注入ポンプである、請求項１に記載の頭蓋内脳腫瘍治療剤。
【請求項４】
頭蓋内脳腫瘍が悪性神経膠腫である、請求項１から３のいずれか一項に記載の頭蓋内脳腫瘍治療剤。
【請求項５】
頭蓋内脳腫瘍治療剤が、頭蓋内脳腫瘍領域に投与される、請求項１から４のいずれか一項に記載の頭蓋内脳腫瘍治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権が、２０１４年８月２５日出願の米国特許仮出願第６２／０４１，３７２号に対して主張され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトの中枢神経系（ＣＮＳ）へのＳＮ−３８装填ポリマーミセルの効率的な送達に一般に関する。特に、本発明は、頭蓋内脳腫瘍、より詳細には悪性神経膠腫の治療のための化学療法に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経膠芽種のような悪性脳腫瘍は、外科的切除、放射線療法および全身化学療法を含む集中的な集学的治療にもかかわらず、依然として治療することが困難な新生物として残されている。全身化学療法は、血管脳関門への浸透が不十分であるので、高用量の多くの抗癌薬を必要とする（Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  ＤＲ．Ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ−ｔｕｍｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．２０００年；２（１）：４５−５９頁を参照すること。また、Ｈｕｙｎｈ  ＧＨ、Ｄｅｅｎ  ＤＦ、Ｓｚｏｋａ  ＦＣ  Ｊｒ．Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２００６年；１１０（２）：２３６−２５９頁を参照すること。）。したがって、全身的な副作用が脳腫瘍を有する患者における化学療法プロトコールにとっての制限因子であり、ヒト神経膠芽種の治療における効率的で特定的な送達方法の必要性が強調されている。
【０００４】
対流増強送達（ＣＥＤ）は、作用物質を連続陽圧注入に基づいて腫瘍および周囲の実質に直接送達することによって血液脳関門を迂回する送達系である（Ｂｏｂｏ  ＲＨ、Ｌａｓｋｅ  ＤＷ、Ａｋｂａｓａｋ  Ａ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ、Ｄｅｄｒｉｃｋ  ＲＬ、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＥＨ．Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９４年；９１（６）：２０７６−２０８０頁を参照すること。）。ＣＥＤは、濃度勾配により誘導される拡散伝播のみならず、連続陽圧注入によっても駆動されるので、大量の分布を達成することができる（Ｃｈｅｎ  ＭＹ、Ｌｏｎｓｅｒ  ＲＲ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ、Ｇｏｖｅｒｎａｌｅ  ＬＳ、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＥＨ．Ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒｉａｔｕｍ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ｃａｎｎｕｌａ  ｓｉｚｅ，ｉｎｆｕｓａｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｃａｎｎｕｌａ  ｓｅａｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９９年；９０（２）：３１５−３２０頁を参照すること。）。重要なことは、ＣＥＤにより腫瘍床（ｔｕｍｏｒ  ｂｅｄ）への直接的な到達手段が提供されることから、薬物の高い局所濃度がもたらされるとともに全身吸収は最小限であることである（Ｙｕｎ  Ｊ、Ｒｏｔｈｒｏｃｋ  ＲＪ、Ｃａｎｏｌｌ  Ｐ、Ｂｒｕｃｅ  ＪＮ．Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ  ａｇｅｎｔｓ：ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１３年；２０１３：１０７５７３を参照すること。）。現在、ＣＥＤは、パーキンソン病（Ｅｂｅｒｌｉｎｇ  ＪＬ、Ｊａｇｕｓｔ  ＷＪ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  ＣＷら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓａｆｅｔｙ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｈＡＡＤＣ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００８年；７０（２１）：１９８０−１９８３頁を参照すること。また、Ｇｉｌｌ  ＳＳ、Ｐａｔｅｌ  ＮＫ、Ｈｏｔｔｏｎ  ＧＲら、Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３年；９（５）：５８９−５９５頁を参照すること。）および神経腫瘍学（Ｋｕｎｗａｒ  Ｓ．Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ：ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｉｍ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ  Ｓｕｐｐｌ．２００３年；８８：１０５−１１１頁を参照すること。また、Ｍａｒｄｏｒ  Ｙ、Ｒｏｔｈ  Ｙ、Ｌｉｄａｒ  Ｚら、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔａｘｏｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１年；６１（１３）：４９７１−４９７３頁を参照すること。）のような神経変性疾患の治療において臨床試験されている
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｒｏｏｔｈｕｉｓ  ＤＲ．Ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ−ｔｕｍｏｒ  ｂａｒｒｉｅｒｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．２０００年；２（１）：４５−５９頁
【非特許文献２】Ｈｕｙｎｈ  ＧＨ、Ｄｅｅｎ  ＤＦ、Ｓｚｏｋａ  ＦＣ  Ｊｒ．Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｒｕｇ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２００６年；１１０（２）：２３６−２５９頁
【非特許文献３】Ｂｏｂｏ  ＲＨ、Ｌａｓｋｅ  ＤＷ、Ａｋｂａｓａｋ  Ａ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ、Ｄｅｄｒｉｃｋ  ＲＬ、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＥＨ．Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９４年；９１（６）：２０７６−２０８０頁
【非特許文献４】Ｃｈｅｎ  ＭＹ、Ｌｏｎｓｅｒ  ＲＲ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＰＦ、Ｇｏｖｅｒｎａｌｅ  ＬＳ、Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  ＥＨ．Ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｔｒｉａｔｕｍ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔｅ  ｏｆ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ，ｃａｎｎｕｌａ  ｓｉｚｅ，ｉｎｆｕｓａｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｃａｎｎｕｌａ  ｓｅａｌｉｎｇ  ｔｉｍｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９９年；９０（２）：３１５−３２０頁
【非特許文献５】Ｙｕｎ  Ｊ、Ｒｏｔｈｒｏｃｋ  ＲＪ、Ｃａｎｏｌｌ  Ｐ、Ｂｒｕｃｅ  ＪＮ．Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｌｉｏｍａ  ａｇｅｎｔｓ：ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｊ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２０１３年；２０１３：１０７５７３
【非特許文献６】Ｅｂｅｒｌｉｎｇ  ＪＬ、Ｊａｇｕｓｔ  ＷＪ、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  ＣＷら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓａｆｅｔｙ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｈＡＡＤＣ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．２００８年；７０（２１）：１９８０−１９８３頁
【非特許文献７】Ｇｉｌｌ  ＳＳ、Ｐａｔｅｌ  ＮＫ、Ｈｏｔｔｏｎ  ＧＲら、Ｄｉｒｅｃｔ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００３年；９（５）：５８９−５９５頁
【非特許文献８】Ｋｕｎｗａｒ  Ｓ．Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ：ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｉｍ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｆｒｏｍ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ  Ｓｕｐｐｌ．２００３年；８８：１０５−１１１頁
【非特許文献９】Ｍａｒｄｏｒ  Ｙ、Ｒｏｔｈ  Ｙ、Ｌｉｄａｒ  Ｚら、Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔａｘｏｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１年；６１（１３）：４９７１−４９７３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
技術的課題
しかし、ＣＥＤを介した治療剤の投与は、作用物質の正確で一貫した送達を含む様々な課題を有する（Ｓａｗａｍｕｒａ  Ｙ、Ｓｈｉｒａｔｏ  Ｈ、ｄｅ  Ｔｒｉｂｏｌｅｔ  Ｎ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒｓ．Ａｄｖ  Ｔｅｃｈ  Ｓｔａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１９９９年；２５：１４１−１５９頁を参照すること。）。したがって、本発明の発明者らは、再現性のある送達プロファイルを提供することができ、用量制限的な全身性または神経性毒性を引き起こすことなく予後を改善することができる、ＣＥＤによって送達される新たな治療剤の設計に焦点を合わせている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
課題の解決手段
ＮＫ０１２は、両親媒性ブロックコポリマーであるポリ（エチレングリコール）−ポリ（アミノ酸）（ＳＮ−３８）の自己集合により水性培地において構築される新規のＳＮ−３８装填ポリマーミセルである（Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｆ、Ｋｉｔａｇａｗａ  Ｍ、Ｎｅｇｉｓｈｉ  Ｔら、Ｎｏｖｅｌ  ＳＮ−３８−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ、ＮＫ０１２、ｅｒａｄｉｃａｔｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ｂｕｌｋｙ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００６年；６６（２０）：１００４８−１００５６頁を参照すること。）。ＳＮ−３８はイリノテカンの活性代謝産物であり、イリノテカンはカンプトテシンの類縁体である。ＮＫ０１２は薬物送達系として分類されており、いくつかの前臨床および臨床研究は製剤が浸透性および保持効果の増強に起因して固形腫瘍組織に選択的に蓄積し、長時間存続すると思われることを示している（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ．Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ＮＫ０１２、ａｎ  ＳＮ−３８−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ、ｗｈｉｃｈ  ｉｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ＥＰＲ  ｅｆｆｅｃｔ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１１年；６３（３）：１８４−１９２頁を参照すること。）。全身投与されたＮＫ０１２は、脳腫瘍に対して抗腫瘍効果を有するが（Ｋｕｒｏｄａ  Ｊ、Ｋｕｒａｔｓｕ  Ｊ、Ｙａｓｕｎａｇａ  Ｍ、Ｋｏｇａ  Ｙ、Ｓａｉｔｏ  Ｙ、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  Ｙ．Ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＳＮ−３８−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ、ＮＫ０１２、ａｇａｉｎｓｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２００９年；１２４（１１）：２５０５−２５１１頁を参照すること。また、Ｋｕｒｏｄａ  Ｊ、Ｋｕｒａｔｓｕ  Ｊ、Ｙａｓｕｎａｇａ  Ｍら、Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ＮＫ０１２、ａ  ７−ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ−ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅ、ｏｎ  Ｕ８７ＭＧ  ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１０年；１６（２）：５２１−５２９頁を参照すること。）、初期局所脳送達に最適な方法は、確立されていない。
【０００８】
本発明者らは、齧歯類同所性脳腫瘍モデルにおいてＣＥＤにより送達されたＮＫ０１２の分布プロファイルと治療効果とを比較し、ＣＥＤを介したＮＫ０１２が齧歯類脳腫瘍モデルにおいて生存期間を有意に延長することを見出した。
【０００９】
本発明の第１の態様によると、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルを対象に送達するための方法であって、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルを、対流増強送達系を介して対象の中枢神経系に投与するステップを含む方法が提供される。この態様において、対流増強送達系は、浸透圧ポンプまたは注入ポンプである。対象はヒトである。加えて、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルは、対象の脳の標的領域に投与される。
【００１０】
本発明の第２の態様によると、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルを、頭蓋内脳腫瘍を有する対象に送達するための方法であって、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルを、対流増強送達系を介して対象の中枢神経系に投与するステップを含み、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルが、ＳＮ−３８およびブロックコポリマーを含む方法が提供される。この態様において、頭蓋内脳腫瘍は悪性神経膠腫である。加えて、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルは、対象の脳の標的領域に投与される。
【００１１】
本発明の第３の態様によると、対象の頭蓋内脳腫瘍を治療するための方法であって、（ａ）ＳＮ−３８装填ポリマーミセルを含む調製物を提供するステップおよび（ｂ）調製物を、対流増強送達系を介して対象の中枢神経系に投与するステップを含み、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルがＳＮ−３８を放出し、ＳＮ−３８が、頭蓋内脳腫瘍の治療に適した治療効果を対象にもたらす方法が提供される。この態様において、頭蓋内脳腫瘍は悪性神経膠腫である。
【００１２】
本発明の第４の態様によると、対流増強送達系を対象に使用するための方法であって、ＳＮ−３８装填ポリマーミセルを含有する調製物を対象の頭蓋腔に送達するステップを含む方法が提供される。この態様において、対流増強送達は、浸透圧ポンプまたは注入ポンプである。
【００１３】
本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態および添付の図面に関連して考慮したとき容易に理解され、図中、同様の名称は様々な図面において同様の要素を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヒト、ラットおよびマウスの神経膠腫細胞におけるＮＫ０１２のインビトロ増殖阻害活性を示すグラフである。
【図２Ａ】正常なラットにおけるＮＫ０１２の分布の評価を示す。ＣＥＤによりラット脳の線条体に注入された遊離ＳＮ−３８（０．２ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）の分布を示す画像である。
【図２Ｂ】正常なラットにおけるＮＫ０１２の分布の評価を示す。ＣＥＤによりラット脳の線条体に注入されたＮＫ０１２（０．２ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）の分布を示す画像である。
【図２Ｃ】正常なラットにおけるＮＫ０１２の分布の評価を示す。ＮＫ０１２および遊離ＳＮ−３８が注入された後の分布の平均体積を示すチャートである。
【図３】２．０ｍｇ／ｍｌ溶液としての０．０４ｍｇのＮＫ０１２のＣＥＤが無処置の線条体に局所注入された後の、脳組織における代表的な組織学的変化を示す。
【図４Ａ】齧歯類同所性脳腫瘍モデルにおけるＮＫ０１２のＣＥＤの効果を示すグラフである。５％のグルコース、遊離ＳＮ−３８およびＮＫ０２の単回ＣＥＤ注入による、９Ｌの腫瘍を有するラットにおける結果を示す。
【図４Ｂ】齧歯類同所性脳腫瘍モデルにおけるＮＫ０１２のＣＥＤの効果を示すグラフである。Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞が移植され、腫瘍移植の５日後にＮＫ０１２を受けた動物の結果を示す。
【図５Ａ】ＣＥＤを使用してラット脳に同時投与されたＧｄの多重蛍光およびＭＲ画像を含む一連の画像を示す。
【図５Ｂ】ＭＲＩデータおよび組織学的蛍光データに基づいて計算された分布体積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、以下の手順によって実施される。
【００１６】
材料および方法
薬物および細胞系
ＳＮ−３８を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、貯蔵溶液として、ジメチルスルホキシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．）に４０ｍｇ／ｍｌで溶解した。ＮＫ０１２は、日本化薬株式会社（東京、日本）から提供を受けた。注入溶液を、５％グルコース溶液から調製した。ヒトの神経膠芽種細胞系Ｕ８７ＭＧ、ラットの神経膠芽種細胞系９Ｌおよび神経膠芽種細胞系Ｆ９８、ならびにマウスの神経膠腫細胞系ＧＬ２６１（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する基本培地中において、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養した。
【００１７】
インビトロ細胞障害性アッセイ
インビトロ細胞増殖を、水溶性テトラゾリウム（ＷＳＴ）アッセイにより測定した。簡潔には、細胞（５×１０３細胞／ウエル）を９６ウエルプレートにおいて三重に平板培養し、２４時間にわたって結合させ、次に増殖培地を、様々な濃度のＮＫ０１２を含有する新たな培地に交換した。７２時間インキュベートした後、１０％のＷＳＴ−８処理溶液（Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（登録商標）；株式会社同仁化学研究所、熊本、日本）を各ウエルに加え、続いて１時間インキュベートした。次に４５０ｎｍでの吸光度を、９６ウエル分光光度プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）によって測定した。細胞生存度を三重に測定し、３回繰り返した。データを平均化し、未処理対象に対して標準化して、用量応答曲線を生成した。生細胞の数を、以下の式を使用して計算した。
対照％＝（それぞれの吸光度−ブランクウエルの吸光度）／対照ウエルの吸光度×１００。
【００１８】
動物
１２週齢の雄フィッシャー３４４ラットを、日本エスエルシー株式会社（浜松、静岡、日本）から購入した。８週齢の雄無胸腺ヌードラット（Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ）を、日本クレア株式会社（東京、日本）から購入した。動物研究に使用したプロトコールは、東北大学大学院医学系研究科附属動物実験施設（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｏｈｏｋｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｇｒａｄｕａｔｅ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により承認された。
【００１９】
頭蓋内腫瘍移植
フィッシャー３４４ラットを９Ｌモデルに使用し、Ｆ３４４／ＮＪｃｌ−ｒｎｕ／ｒｎｕ（ヌード）ラットをＵ８７ＭＧモデルに使用した。９ＬおよびＵ８７ＭＧの細胞を、以前に記載されたように得た（Ｓａｉｔｏ  Ｒ、Ｂｒｉｎｇａｓ  ＪＲ、Ｐａｎｎｅｒ  Ａら、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ  ｐｒｏｌｏｎｇｓ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４年；６４（１９）：６８５８−６８６２頁を参照すること。）。簡潔には、９ＬおよびＵ８７ＭＧの細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡの使用により採取し、続いて完全培地で１回洗浄し、移植のために冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。ＰＢＳの１０μｌあたり１×１０４（９Ｌ）または２×１０５（Ｕ８７ＭＧ）の細胞を含有する細胞懸濁液を、ラット脳の線条体領域への移植に使用した。深いイソフルラン麻酔下において、ラットを小動物用定位フレーム（Ｄａｖｉｄ  Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｕｊｕｎｇａ，ＣＡ）に入れた。矢状切開を皮膚に開けて、頭蓋を露出させ、穿頭孔を、小型歯科用ドリルの使用により頭蓋の十字縫合から０．５ｍｍ前方および３ｍｍ側方に開けた。５マイクロリットルの細胞懸濁液を、脳の表面から４．５ｍｍの深さに注射した。２分間待った後、更に５μｌを４ｍｍの深さに注射した。最後に２分間待った後、針を取り出し、創傷を縫合糸により閉じた。
【００２０】
ＣＥＤ
注入は、以前に記載されたＣＥＤ方法を使用して実施した（Ｓａｉｔｏ  Ｒ、Ｂｒｉｎｇａｓ  ＪＲ、ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ＴＲら、Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎｔｏ  ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｒａｔ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｍｏｎｉｔｏｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４年；６４（７）：２５７２−２５７９頁を参照すること。また、Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｔ、Ｓａｉｔｏ  Ｒ、Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓら、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２００８年；１０９（５）：８６７−８７３頁を参照すること。）。簡潔には、微小注入ポンプ（ｍｉｃｒｏｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｐｕｍｐ）（ＢｅｅＨｉｖｅ；Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｗｅｓｔ  Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）に装着された１ｍｌシリンジに接続した無還流段階設計注入カニューレ（ｒｅｆｌｕｘ−ｆｒｅｅ  ｓｔｅｐ−ｄｅｓｉｇｎ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｃａｎｎｕｌａ）を使用して、注入速度を制御した。深いイソフルラン麻酔下において、ラットを小動物用定位フレーム（株式会社ナリシゲ、東京、日本）に入れた。矢状切開を開けて、頭蓋を露出させ、続いて穿頭孔を、小型歯科用ドリルの使用により頭蓋の十字縫合から０．５ｍｍ前方および３ｍｍ側方の位置に開けた。以下の上昇注入速度を適用して、２０μｌの総注入体積を達成した。０．２μｌ／分で１５分間、０．５μｌ／分で１０分間および０．８μｌ／分で１５分間。
【００２１】
蛍光顕微鏡法によるラット脳組織におけるＮＫ０１２およびＳＮ−３８分布の評価
正常なフィッシャー３４４ラット（各群に３匹のラット）は、ＮＫ０１２および遊離ＳＮ−３８（２ｍｇ／ｍｌのＳＮ−３８当量の２０μｌの溶液）の使用によりＣＥＤを受け、ＣＥＤの直後に安楽死させた。一連の冠状組織切片（厚さ２０μｍ）を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｃｒｙｏ３（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）の使用により調製し、凍結切片を、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ９０００（株式会社キーエンス、大阪、日本）により、３７７ｎｍの励起波長および４４７ｎｍの発光波長で検査して、組織内のＮＫ０１２の分布を評価した。画像データをＢＺ−ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １．１０ソフトウエア（キーエンス）の使用により記録した。
【００２２】
ＮＫ０１２の毒性評価
およそ２５０ｇの重さの４匹の健康な雄フィッシャー３４４ラットは、ＮＫ０１２（２．０ｍｇ／ｍｌの遊離ＳＮ−３８当量の２０μｌの溶液）の使用によりＣＥＤを受けた。ラットを、生存期間、ならび注意力、毛づくろい、摂食、排泄物、皮膚、毛皮、粘液、膜の状態、歩行運動、呼吸および姿勢を含む一般的な健康について毎日モニターした。ラットにジエチルエーテルで深く麻酔をかけ、ＣＤＥ処理の１４日後に、０．９％食塩水、続いて冷４％パラホルムアルアルデヒドを心臓を通して灌流（ｔｒａｎｓｃａｒｄｉａｌｌｙ  ｐｅｒｆｕｓｅｄ）した。脳を取り出し、同じ固定剤により４℃で一晩にわたって後固定し、パラフィン切片（４μｍ）を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色により組織学的に検査した。
【００２３】
９ＬおよびＵ８７ＭＧの同所性脳腫瘍モデルにおける生存率研究
９Ｌ腫瘍細胞を移植した２０匹のラットを、腫瘍細胞移植の５日後に３つの群に無作為に分け、以下のように処理した。（１）対照としてＰＢＳ（ｎ＝７）のＣＥＤ、（２）遊離ＳＮ−３８（ｎ＝７）のＣＥＤおよび（３）ＮＫ０１２（ｎ＝６）のＣＥＤ。Ｕ８７ＭＧ腫瘍細胞を移植した１４匹のラットを、腫瘍細胞移植の５日後に２つの群に無作為に分け、以下のように処理した。（１）対照としてＰＢＳ（ｎ＝７）のＣＥＤおよび（２）ＮＫ０１２（ｎ＝７）のＣＥＤ。ＣＥＤ注入を、対照群では２０μｌの５％グルコース、ＮＫ０１２群では２０μｌの５％グルコース中４０μｇのＮＫ０１２およびＳＮ−３８群では、５０％ジメチルスルホキシドの２０μｌの５％グルコース中溶液中の４０μｇの遊離ＳＮ−３８から構成した。他の全てのラットを、生存期間について毎日モニターした。生存期間を、ログランク検定の使用により処理群の間で比較した。推定生存率を、プランメイヤー曲線により表した。
【００２４】
ＮＫ０１２分布を可視化するガドリニウム（Ｇｄ）の同時注入
６匹のラットには、２０μｌのＧｄ−ジエチレントリアミンペンタ酢酸（５ｍＭ）を、２ｍｇ／ｍｌのＮＫ０１２と共に線条体に同時注入した。注入のおよそ１時間後に、直径３８ｍｍのバードケージ型コイル（ｂｉｒｄｃａｇｅ  ｃｏｉｌ）を有する７．０テスラＰｈａｒｍａＳｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の使用により、ＭＲＩを実施した。最初に各ラットには、４％のイソフランおよび空気／酸素混合物（７：３）で麻酔をかけた。イソフランレベルを、ＭＲＩの際に２．０±０．５％に低下した。ＭＲＩの全体にわたって、動物の体温をフィードバック制御温風システム（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｏｎｙ  Ｂｒｏｏｋ，ＮＹ）により３６±１℃に保った。呼吸および直腸温度を、小動物モニタリングシステム（ＳＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により連続してモニターした。注入部位でのＮＫ０１２とＧｄの分布体積の関係を調査するため、ＭＲ画像に基づいたＧｄ分布体積を、ヒト入力シードポイント（ｈｕｍａｎ−ｅｎｔｅｒｅｄ  ｓｅｅｄ  ｐｏｉｎｔ）により目的の三次元領域（ＲＯＩ）を成長させる閾値セグメンテーション（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用するＯｓｉｒｉＸ（ＯｓｉｒｉＸ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて計算した。用いた低閾値を、反対側に対して最大６０％増加した。「ＲＯＩ」ドロップダウンメニューの「Ｇｒｏｗ  Ｒｅｇｉｏｎ（２Ｄ／３Ｄセグメンテーション）」ツールは、Ｇｄ分布の自動的なアウトライン化を可能にした。
【００２５】
ＮＫ０１２分布の組織学的評価では、ラットをそれぞれのＭＲＩセッションの直後に安楽死させた。脳を採取し、氷冷イソペンタンを使用して新鮮なままで凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｃｒｙｏ３（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．）を使用して一連の冠状切片（２０μｍ）に切断した。ＳＮ−３８により生成された蛍光シグナルを、蛍光顕微鏡ＢＩＯＲＥＶＯ  ＢＺ９０００（キーエンス）により、３７７ｎｍの励起波長および４４７ｎｍの発光波長で可視化して、ＮＫ０１２の分布を評価した。画像データをＢＺ−ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １．１０ソフトウエア（キーエンス）を用いて記録した。ＮＫ０１２の分布体積を、ＩｍａｇｅＪソフトウエアの使用により分析した。蛍光顕微鏡画像によって決定されたＮＫ０１２の分布体積を、７．０テスラＭＲＩにより検出されたＧｄの分布体積と比較した。
【００２６】
統計分析
統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の使用により実施した。全ての実験を３回繰り返し、２つの試料の比較における差を、スチューデントｔ検定により決定した。生存率分析を、カプランメイヤー曲線およびログランク検定の使用により実施した。有意性はＰ＜０．０５によって決定した。
【００２７】
結果
インビトロにおけるＮＫ０１２の効力
ＷＳＴアッセイは、神経膠腫細胞系のＵ８７ＭＧ、９Ｌ、Ｆ９８およびＧＬ２６１の増殖が、ＮＫ０１２によって強力に阻害されたことを示した。ＮＫ０１２の最大半量阻害濃度は、Ｕ８７ＭＧ、９Ｌ、Ｆ９８およびＧＬ２６１の細胞系において、それぞれ０．１５４、０．１９６、０．１８４および０．１５１１μＭであった。（図１）。
【００２８】
図１は、ヒト、ラットおよびマウスの神経膠腫細胞におけるＮＫ０１２のインビトロ増殖阻害活性を示す。Ｕ８７ＭＧ、９Ｌ、Ｆ９８およびＧＬ２６１の細胞を、９６ウエルプレートに入れ、様々なＮＫ０１２（０−６μＭ）濃度により７２時間にわたって処理した。７２時間インキュベートした後、１０％のＣＣＫ−８試薬を各ウエルに加え、続いて３７℃で１時間インキュベートし、次に４５０ｎｍでの吸光度を９６ウエル分光光度プレートリーダーにより測定した。細胞生存度を三重に測定し、３回繰り返した。データを平均化し、未処理対象に対して標準化して、用量応答曲線を生成した。
【００２９】
正常なラット脳におけるＮＫ０１２およびＳＮ−３８の分布
遊離ＳＮ−３８の分布（図２Ａ）は、ＣＥＤが正常なラット線条体に入った後に完全に制限されたが、ＮＫ０１２の分布（図２Ｂ）は、拡散的であり、広範囲に及んだ。図２Ａは、遊離ＳＮ−３８（Ａ）の分布を示し、一方、図２Ｂは、ＣＥＤによりラット脳の線条体に注入されたＮＫ０１２（０．２ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ）の分布を示す。動物を、注入の直後に安楽死させ、一連の切片を、クリオスタット（厚さ２０μｍ、間隔１ｍｍ）の使用により得た。明視野画像は、脳組織を明らかにし（上側）、蛍光顕微鏡により可視化された同じ切片では、紫外線下でＳＮ−３８により生成された蛍光が検出される（下側）。代表的なラットから得た一連の画像を図２Ａおよび２Ｂに示す。遊離ＳＮ−３８およびＮＫ０１２の平均分布体積は、それぞれ１７．００±２．６５および７９．３９±１２．９９ｍｍ３であった（Ｐ＜０．０００１、図２Ｃ）。局所的な脳損傷の増加が、遊離ＳＮ−３８を受けた脳において見出されたことに留意すること。
【００３０】
正常なラット脳におけるＮＫ０１２の毒性
４０μｇのＮＫ０１２のＣＥＤ注入を受けたラットは、神経症状を有することなく生存し、ＣＥＤの１４日後に安楽死させた。脳切片（４μｍ）を、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために得た。組織学的研究は、針跡による僅かな組織損傷のみを明らかにした（図３）。すなわち、ラットは神経症状を有することなく、無視できるほどの組織損傷によって生存した。
【００３１】
９ＬおよびＵ８７ＭＧの同所性脳腫瘍モデルにおけるＣＥＤにより送達されたＮＫ０１２の抗腫瘍効力
最初に、９Ｌ同所性脳腫瘍モデルのラットの生存期間を試験した。ＰＢＳを受けた対照群のラットは、腫瘍進行を示す神経症状のため、腫瘍細胞移植の１９〜３１日後に全て安楽死させた（図４Ａ）。この群の生存期間中央値は、２９日間であった。０．０４ｍｇのＳＮ−３８をＣＥＤにより受けたＳＮ−３８群のラットは、腫瘍関連症状のため、移植の２４〜３０日後に安楽死させた（平均生存期間２８日間、Ｐ＝０．２８４６、ログランク検定）。０．０４ｍｇのＮＫ０１２をＣＥＤにより受けたＮＫ０１２群のラットは、２７〜４４日間生存した。この群の生存期間中央値は、４２日間であった（対照群と比較してＰ＝０．００６３、ＳＮ−３８群と比較してＰ＝０．００４５、ログランク検定）。
【００３２】
続いて、Ｕ８７ＭＧ脳腫瘍移植片を有するラットの生存期間を試験した。対照群のラットは、腫瘍進行を示す神経症状のため、移植の１５〜２３日後に安楽死させた（生存期間中央値２１日間、図４Ｂ）。ＮＫ０１２群のラットは、腫瘍細胞移植の２３〜３３日後に安楽死させた（生存期間中央値２８日間）。ＮＫ０１２によるＣＥＤ処理は、対照と比較して有意な生存利益をもたらした（Ｐ＝０．０００３、ログランク検定）。
【００３３】
分布体積と組織学的分析の相関関係
ＮＫ０１２の組織分布は一貫しており、そこで続いて同時注入Ｇｄの分布と比較した。正常なラット脳におけるＮＫ０１２分布体積を、ＳＮ−３８により生成された蛍光の組織学的検出によって決定した。ＭＲＩを使用して、ＣＥＤの際に齧歯類脳におけるＮＫ０１２分布をモニターする実現性を評価するため、ＧｄおよびＮＫ０１２混合物をＣＥＤにより６匹のラットに注入した。Ｇｄの強く明瞭に画定された分布が、注入直後に得られたＴ１加重ＭＲＩにより、それぞれの注入部位において観察された。Ｇｄの分布体積は、画像処理ワークステーションを使用して、オープンソースＤＩＣＯＭ（Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）リーダーであるＯｓｉｒｉＸにより測定した。Ｔ１加重ＭＲＩは、造影増強と、ＳＮ−３８により生成された蛍光の組織学的検出により決定されたＮＫ０１２の分布との間の密接な相関関係を実証した（図５）。
【００３４】
考察
ＣＥＤは、治療剤をＣＮＳの標的領域に特異的に送達する有望な方法であるが、ＣＥＤを用いるＰＲＥＣＩＳＥ無作為化第ＩＩＩ相臨床試験は、臨床的エンドポイントを満足させることに失敗した（Ｋｕｎｗａｒ  Ｓ、Ｃｈａｎｇ  Ｓ、Ｗｅｓｔｐｈａｌ  Ｍら、ＰＲＥＣＩＳＥ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｐｈａｓｅ  ＩＩＩ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＣＥＤ  ｏｆ  ＩＬ１３−ＰＥ３８ＱＱＲ  ｖｓ  Ｇｌｉａｄｅｌ  ｗａｆｅｒｓ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．２０１０年；１２（８）：８７１−８８１頁を参照すること。）。薬物分布は、この研究において評価されなかったが、ＢｒａｉｎＬＡＢ  ｉＰｌａｎ（登録商標）Ｆｌｏｗソフトウエアの使用により薬物予測分布を推定する遡及的分析は、切除空洞の２ｃｍの境界域と画定されている関連標的体積の推定範囲が、平均して２０．１％の低さであったことを報告した（Ｓａｍｐｓｏｎ  ＪＨ、Ａｒｃｈｅｒ  Ｇ、Ｐｅｄａｉｎ  Ｃら、ＰＲＥＣＩＳＥ  Ｔｒｉａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ．Ｐｏｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｘｐｌａｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＲＥＣＩＳＥ  ｔｒｉａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２０１０年；１１３（２）：３０１−３０９頁を参照すること。）。したがって、不十分な薬物分布は、ＰＲＥＣＩＳＥ試験の失敗を説明している可能性がある。
【００３５】
分布体積は、ＣＥＤにより送達される治療剤の抗腫瘍効力に影響を与える主要な特性である。しかし、異なる物理的および化学的特性を有する局所適用作用物質は、齧歯類脳へのＣＥＤの際に異なる分布体積を実証している（Ｓａｉｔｏ  Ｒ、Ｋｒａｕｚｅ  ＭＴ、Ｎｏｂｌｅ  ＣＯら、Ｔｉｓｓｕｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｕｓａｔｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ  ｒｏｄｅｎｔ  ｂｒａｉｎｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００６年；１５４（１−２）：２２５−２３２頁を参照すること。）。したがって、ＣＥＤによって試験される化学療法剤は、要求される分布を達成するために特異的に製剤化されるべきである。ＣＥＤにより送達される個別の作用物質の分布特徴は、評価することが困難であるが、リポソームおよびミセルのような薬物担体の有効性は、以前に実証された。齧歯類脳腫瘍モデルにおけるリポソームまたはミセル製剤により送達されるドキソルビシンの効力は、既に実証されている（Ｋｉｋｕｃｈｉ  Ｔ、Ｓａｉｔｏ  Ｒ、Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｓら、Ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｃｏａｔｅｄ  ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｒａｔ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ｇｌｉｏｍａ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．２００８年；１０９（５）：８６７−８７３頁を参照すること。また、Ｉｎｏｕｅ  Ｔ、Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｙ、Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  Ｍら、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌａｒ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ｉｎｆｕｓｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｔｒａｃｒａｎｉａｌ  ９Ｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．２００９年；１１（２）：１５１−１５７頁を参照すること。）。更なる調査は、ＣＥＤにより送達される臨床的に有望な作用物質および臨床的に関連する送達方法を探求する。
【００３６】
抗癌植物性アルカロイドの７−エチル−１０−ヒドロキシ−カンプトテシン（ＳＮ−３８）は、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ阻害剤として作用する広域性抗癌カンプトテシン類縁体である。ＳＮ−３８のプロドラッグであるイリノテカン塩酸塩（ＣＰＴ−１１）は、再発性神経膠芽種を有する患者においていくらかの抗腫瘍活性を示しており、いくつかの試験において０％から１７％の応答率を有している（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＨＳ、Ｐｅｔｒｏｓ  ＷＰ、Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＡＨら、Ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１９９９年；１７（５）：１５１６−１５２５頁を参照すること。また、Ｃｌｏｕｇｈｅｓｙ  ＴＦ、Ｆｉｌｋａ  Ｅ、Ｋｕｈｎ  Ｊら、Ｔｗｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｅｖｅｒｙ−３−ｗｅｅｋ  ｒｅｇｉｍｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ．２００３年；９７（９  Ｓｕｐｐｌ）：２３８１−２３８６頁を参照すること。更に、Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ  ＭＣ．  Ｓａｌｖａｇｅ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ＣＰＴ−１１  ｆｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．２００２年；５６（２）：１８３−１８８頁を参照すること。更に、Ｐｒａｄｏｓ  ＭＤ、Ｌａｍｂｏｒｎ  Ｋ、Ｙｕｎｇ  ＷＫら、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ａ  ｐｈａｓｅ  ２  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ（ＣＰＴ−１１）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｇｌｉｏｍａ：ａ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｓｔｕｄｙ．Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ．２００６年；８（２）：１８９−１９３頁を参照すること。）。ＣＰＴ−１１の活性は、ＣＰＴ−１１からＳＮ−３８への変換率によって決まる。このように、ＳＮ−３８の直接的な使用は神経膠芽種の治療に有効でありうるが、臨床適用は、ＳＮ−３８が高い毒性をもって水不溶性であるために制限されており、したがって、静脈内に投与することができない。
【００３７】
本発明は、ＣＥＤにより注入されたＳＮ−３８が、重篤な局所組織損傷を引き起こし、分布が注入部位の周囲に完全に限定されていることを開示している（図２Ａ）。対照的に、ＮＫ０１２は、ＣＥＤにより一貫して広範囲に分布された（図２Ｂ）。局所的に送達されたＮＫ０１２は、ＳＮ−３８と比較して９Ｌ同所性脳腫瘍モデルにおいて優れた抗腫瘍活性を有し、カプランメイヤー分析は、ＳＮ−３８群と比較して統計的に有意な差を明らかにした（Ｐ＝０．００４５）。加えて、組織学的検査は、４０μｇのＮＫ０１２を受けたラット脳において最小限の脳組織損傷を明らかにし、同じ用量のＳＮ−３８は、自由投与（ｆｒｅｅ  ａｄｍｉｎｉｏｓｔｒａｔｉｏｎ）によって重篤な損傷を引き起こした。近年、用量ではなく濃度が、ＣＥＤによる広範囲な送達後の局所組織毒性における制御因子であることが実証されている（Ｚｈａｎｇ  Ｒ、Ｓａｉｔｏ  Ｒ、Ｍａｎｏ  Ｙら、  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｄｏｓｅ  ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｌｏｃａｌ  ｂｒａｉｎ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｇｅｎｔｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｂｙ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３年；２２２：１３１−１３７頁を参照すること。）。これらの知見は、２ｍｇ／ｍｌ以下のＳＮ−３８を含有するＮＫ０１２の製剤が、ＣＥＤ用途において安全であることを示唆している。
【００３８】
本発明は、ＭＲＩを使用して脳中におけるＮＫ０１２のＣＥＤをモニターする方法を確立して、このＣＥＤに基づいた療法の臨床的に関連する用途を探求した。ＧｄとＮＫ０１２の分布との間の密接な相関関係が観察された。したがって、ＮＫ０１２の分布を、ＣＥＤの際にＧｄの同時送達によってモニターすることができ、脳標的への治療剤の有効な送達を確実にすることにおいて重要な意味をもちうる。
【００３９】
本発明は、ＮＫ０１２をＣＥＤによって脳に効率的に投与することができ、用量制限的な全身性または神経性毒性を正常な脳に引き起こすよりも低い濃度で神経膠芽種細胞に対して活性を生じる、実験的な証拠を提供する。ＮＫ０１２の分布を、同時送達されたＧｄのＭＲＩによりモニターすることができる。そのような、ＣＥＤにより投与されるＮＫ０１２は、神経膠芽種を有する患者を治療する有望な治療手段である。
【産業上の利用可能性】
【００４０】
ＮＫ０１２のＣＥＤである本発明は、頭蓋内脳腫瘍、特に悪性神経膠腫の有効な治療選択肢を対象とする。ＮＫ０１２のＭＲＩ誘導ＣＥＤは、臨床用途において可能性を有する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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