(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１３８位、３０１位及び３１０位に下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示される変異を有するか、１３８位、３０１位及び３１０位に相当する位置に下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示される変異を有する変異グリコシドハイドロラーゼであって、１３８位、３０１位及び３１０位、又は１３８位、３０１位及び３１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である変異グリコシドハイドロラーゼ。
（ａ）１３８位又はこれに相当する位置：ヒスチジン
（ｂ）３０１位又はこれに相当する位置：ヒスチジン
（ｃ）３１０位又はこれに相当する位置：グルタミン酸
【請求項２】
さらに、２４８位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がチロシンである、請求項１記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【請求項３】
さらに２２位、８０位、８５位、９９位、１２０位、１８０位、１８６位、２３９位、２４０位、２４３位、２５９位、２８９位、３４９位、３７６位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である、請求項２記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（Ａ）２２位又はこれに相当する位置：アラニン
（Ｂ）８０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｃ）８５位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｄ）９９位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｅ）１２０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｆ）１８０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれに相当する位置：アラニン
（Ｈ）２３９位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれに相当する位置：ロイシン
（Ｊ）２４３位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれに相当する位置：アスパラギン
（Ｌ）２８９位又はこれに相当する位置：グルタミン酸
（Ｍ）３４９位又はこれに相当する位置：メチオニン
（Ｎ）３７６位又はこれに相当する位置：アラニン
【請求項４】
以下のｉ）〜ｖ）から選択される、請求項３記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
ｉ）１８０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記のアミノ酸残基。
（Ｆ）１８０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
ｉｉ）９９位及び１８６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｄ）９９位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はれに相当する位置：アラニン
ｉｉｉ）２２位、１８０位及び３４９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ａ）２２位又はこれに相当する位置：アラニン
（Ｆ）１８０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｍ）３４９位又はこれに相当する位置：メチオニン
ｉｖ）２３９位、２４０位及び２５９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｈ）２３９位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれに相当する位置：ロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれに相当する位置：アスパラギン
ｖ）８０位、１２０位及び３７６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｂ）８０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｅ）１２０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｎ）３７６位又はこれに相当する位置：アラニン
【請求項５】
セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
【請求項８】
請求項７記載の組換えベクターを含む形質転換体。
【請求項９】
請求項８記載の形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項記載の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する洗浄剤組成物。
【請求項１１】
配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１３８位、３０１位及び３１０位におけるアミノ酸残基を下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示されるアミノ酸残基に置換するか、１３８位、３０１位及び３１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示されるアミノ酸残基に置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの界面活性剤耐性の向上方法であって、１３８位、３０１位及び３１０位、又は１３８位、３０１位及び３１０位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である、方法。
（ａ）１３８位又はこれに相当する位置：ヒスチジン
（ｂ）３０１位又はこれに相当する位置：ヒスチジン
（ｃ）３１０位又はこれに相当する位置：グルタミン酸
【請求項１２】
さらに、２４８位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がチロシンである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
さらに２２位、８０位、８５位、９９位、１２０位、１８０位、１８６位、２３９位、２４０位、２４３位、２５９位、２８９位、３４９位、３７６位、又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である、請求項１２記載の方法。
（Ａ）２２位又はこれに相当する位置：アラニン
（Ｂ）８０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｃ）８５位又はこれに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｄ）９９位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｅ）１２０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｆ）１８０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれに相当する位置：アラニン
（Ｈ）２３９位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれに相当する位置：ロイシン
（Ｊ）２４３位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれに相当する位置：アスパラギン
（Ｌ）２８９位又はこれに相当する位置：グルタミン酸
（Ｍ）３４９位又はこれに相当する位置：メチオニン
（Ｎ）３７６位又はこれに相当する位置：アラニン
【請求項１４】
以下のｉ）〜ｖ）から選択される、請求項１３記載の方法。
ｉ）１８０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記のアミノ酸残基。
（Ｆ）１８０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
ｉｉ）９９位及び１８６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｄ）９９位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれに相当する位置：アラニン
ｉｉｉ）２２位、１８０位及び３４９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ａ）２２位又はこれに相当する位置：アラニン
（Ｆ）１８０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｍ）３４９位又はこれに相当する位置：メチオニン
ｉｖ）２３９位、２４０位及び２５９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｈ）２３９位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれに相当する位置：ロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれに相当する位置：アスパラギン
ｖ）８０位、１２０位及び３７６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｂ）８０位又はこれに相当する位置：イソロイシン
（Ｅ）１２０位又はこれに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｎ）３７６位又はこれに相当する位置：アラニン
【請求項１５】
界面活性剤が、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである請求項１１〜１４の
いずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコシドハイドロラーゼが、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、請求項１１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異グリコシドハイドロラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、マンナナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、クチナーゼ、リケナーゼ等の複数の酵素を洗浄補助剤として洗剤に配合することは以前から検討又は実施されている。グリコシドハイドロラーゼの一つであるセルラーゼは、木綿単繊維の非晶質領域に作用し、単繊維内の皮脂汚れ等を効果的に除去するため、衣料用洗剤に配合するのに適している。
【０００３】
衣料用洗剤等の洗剤用酵素として優れた効果を発揮する酵素として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のアルカリセルラーゼが開発され、特許出願されている（特許文献１及び２）。上記ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来のアルカリセルラーゼは、グリコシドハイドロラーゼのファミリー８（ＧＨファミリー８）に属する酵素である。当該ファミリーのグルコシドハイドロラーゼは、β−１，４グルカン、キシラン、キトサン、リケナン等のβ−１，４結合を切断することを特徴とする一群の酵素群である。上記ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素も、カルボキシメチルセルロースや結晶性セルロース等のセルロース分解活性以外にリケナン分解活性も有する、グリコシドハイドロラーゼである。当該ＫＳＭ−Ｎ２５７株由来の酵素（以下、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ）については、同じＧＨファミリー８に属するセルラーゼであるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来のセルラーゼ（非特許文献１）やＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．ＫＳＭ−３３０株由来のセルラーゼ（非特許文献２）とのアミノ酸配列の比較や、酵素タンパク質結晶のＸ線解析により、触媒部位のアミノ酸及び保存アミノ酸の解析が行われている（非特許文献３）。
【０００４】
更にＮ２５７グリコシドハイドロラーゼについては、そのアミノ酸配列上の特定のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することによって、当該酵素の液体洗剤中での安定性や比活性が向上すること、又は耐熱性が向上することが見出されている（特許文献３、特許文献４）。
【０００５】
近年、液体洗剤においては、使用量が従来の液体洗剤の半分程度でよい、いわゆる、濃縮液体洗剤が市販されているが、斯かる濃縮液体洗剤には、高濃度の界面活性剤が配合されている。したがって、酵素にとって極めて厳しい条件になっており、酵素活性や耐熱性の向上と共に、界面活性剤耐性の一層の向上が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３０９７８１号公報
【特許文献２】特開２００２−８５０７８号公報
【特許文献３】特開２０１４−１０７７６号公報
【特許文献４】特開２０１４−１０７７７号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｂｕｅｎｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，４２４８，１９９０
【非特許文献２】Ｏｚａｋｉら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３７，４１−４８，１９９１
【非特許文献３】Ｈａｋａｍａｄａら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１５７０，１７４−１８０，２００２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、耐熱性に優れ、且つ液体洗剤中での安定性、特に界面活性剤に対して優れた安定性を有する変異グリコシドハイドロラーゼを提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼについて更に検討したところ、当該グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列上の複数のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した多重変異体が、優れた耐熱性を有するとともに、液体洗剤中での安定性が向上すること、特に界面活性剤耐性が大幅に向上することを見出した。
【００１０】
すなわち本発明は、以下の１）〜７）に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１３８位、３０１位及び３１０位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である変異グリコシドハイドロラーゼ。
（ａ）１３８位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｂ）３０１位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｃ）３１０位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
２）上記変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。
３）上記遺伝子を含有する組換えベクター。
４）上記組換えベクターを含む形質転換体。
５）上記形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。
６）上記変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤組成物。
７）配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１３８位、３０１位及び３１０位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸残基に置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの界面活性剤耐性の向上方法。
（ａ）１３８位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｂ）３０１位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｃ）３１０位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
【発明の効果】
【００１１】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、優れた耐熱性を有すると共に、液体洗剤での安定性が向上しており、特に優れた界面活性剤耐性を有する。したがって、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを配合した液体洗剤は、安定的に高い酵素活性を維持することができ、高い洗浄力を発揮することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ及びＶａｌを意味する。
【００１３】
本明細書において、「（アミノ酸配列間の）同一性」とは、２つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）したときに両方の配列において同一のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。具体的には、リップマン−パーソン法（Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，（１９８５））によって計算され、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（Ｖｅｒ．１１．０．２；ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行なうことにより算出できる。
【００１４】
本明細書において、別途定義されない限り、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列におけるアミノ酸残基又は塩基の欠失、置換、付加又は挿入に関して使用される「１又は数個」とは、例えば、１〜３７個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個であり得る。また本明細書において、アミノ酸残基又は塩基の「付加」には、配列の一末端及び両末端への１〜数個のアミノ酸又は塩基の付加が含まれる。
【００１５】
本明細書において、「グリコシドハイドロラーゼ活性」とは、β−１，４グルカン、キシラン、キトサン、リケナン等のβ−１，４結合を切断し得る活性をいい、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性、及びキシラナーゼ活性を含む。本明細書において、「グリコシドハイドロラーゼ」とは、グリコシドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質又はポリペプチドをいい、例えば、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性のいずれか１つ以上の活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。
【００１６】
本明細書において、所与の変異タンパク質又はポリペプチドの「親」タンパク質又はポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異タンパク質又はポリペプチドとなるタンパク質又はポリペプチドをいう。
【００１７】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼの３箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した３重置換体、当該３重置換体に対して更に１箇所のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した４重置換体、当該４重置換体に対して更に１箇所以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した多重変置換体を包含する。
３重置換体としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼから、１３８位のアミノ酸残基をヒスチジンに、３０１位のアミノ酸残基をヒスチジンに、及び３１０位のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換することによって得ることができる。あるいは、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼから、１３８位に相当する位置のアミノ酸残基をヒスチジンに、３０１位に相当する位置のアミノ酸残基をヒスチジンに、及び３１０位に相当する位置のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換することによって得ることができる。斯かる３重置換体は、耐熱性が向上すると共に、液体洗剤中での安定性、特に界面活性剤（例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（ＬＡＳ））に対する耐性が向上する。
【００１８】
４重置換体は、上記３重置換体に、さらに２４８位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基をチロシンに置換したものである。斯かる４重置換体は、液体洗剤中での安定性、特に界面活性剤耐性が顕著に向上する。
【００１９】
多重置換体は、上記４重置換体に、さらに２２位、８０位、８５位、９９位、１２０位、１８０位、１８６位、２３９位、２４０位、２４３位、２５９位、２８９位、３４９位、３７６位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、下記（Ａ）〜（Ｎ）のアミノ酸残基に置換したものが挙げられる。斯かる多重置換体は、界面活性剤耐性が更に一層向上する。
（Ａ）２２位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｂ）８０位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｃ）８５位又はこれらに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｄ）９９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｅ）１２０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｈ）２３９位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれらに相当する位置：ロイシン
（Ｊ）２４３位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン
（Ｌ）２８９位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
（Ｍ）３４９位又はこれらに相当する位置：メチオニン
（Ｎ）３７６位又はこれらに相当する位置：アラニン
【００２０】
多重置換体はとしては、上記の（Ａ）〜（Ｎ）の置換を１〜４種組み合わせて、５重置換体、６重置換体、７重置換体又は８重置換体とするのが好ましい。斯かる組み合わせとしては、例えば、下記のｉ）〜ｖ）で示されるものが挙げられる。
ｉ）１８０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記のアミノ酸残基。
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
ｉｉ）９９位及び１８６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｄ）９９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれらに相当する位置：アラニン
ｉｉｉ）２２位、１８０位及び３４９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ａ）２２位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｍ）３４９位又はこれらに相当する位置：メチオニン
ｉｖ）２３９位、２４０位及び２５９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｈ）２３９位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれらに相当する位置：ロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン
ｖ）８０位、１２０位及び３７６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｂ）８０位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｅ）１２０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｎ）３７６位又はこれらに相当する位置：アラニン
【００２１】
上記配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼ、及び上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼは、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼの親グリコシドハイドロラーゼである。以下の本明細書において、これらを、「本発明の親グリコシドハイドロラーゼ」と呼ぶことがある。
【００２２】
本発明の親グリコシドハイドロラーゼのうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼとしては、例えば、Ｎ２５７株〔バチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７３）〕由来のグリコシドハイドロラーゼが挙げられる（特許文献１及び２）。
【００２３】
また本発明の親グリコシドハイドロラーゼのうち、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列とは異なるが、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらにより好ましくは９７％以上、なお好ましくは９８％以上、さらになお好ましくは９９％以上の配列同一性を有し、且つグリコシドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質又はポリペプチド、ならびに、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１個〜数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されており、且つグリコシドハイドロラーゼ活性を有するタンパク質又はポリペプチドが挙げられる。
【００２４】
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるＮ２５７株〔バチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭ  Ｐ−１７４７３）〕由来のグリコシドハイドロラーゼにおいて、触媒活性に関与するアミノ酸は、６３位のグルタミン酸及び１２４位のアスパラギン酸であることが知られている（非特許文献３）。また、バチルス エスピーＫ１７のチトサナーゼの立体構造と比較して、２５３位のグルタミン酸および２６３位のアスパラギンも触媒活性に関与することが分かる。よって、上記配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる本発明の親グリコシドハイドロラーゼにおいて、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の６３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、１２４位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、２５３位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸であり、且つ２６３位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギンである。
【００２５】
本発明の親グリコシドハイドロラーゼとなり得る、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるグリコシドハイドロラーゼの例としては、非特許文献３に記載のＧＨファミリー８に属する他の酵素：例えば、バチルス  サーキュランス由来のセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＡＰ２２９４６、アミノ酸配列同一性９７％）；パエニバチルス  エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＹＰ＿００３２４０６３０、アミノ酸配列同一性９６％）；パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ８（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０８２８３３９７、アミノ酸配列同一性９６％）；パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０７８９７９６４、アミノ酸配列同一性９３％）；及び、パエニバチルス  ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＺＰ＿０９００２３２４、アミノ酸配列同一性８３％）が挙げられる。
【００２６】
本明細書において、「相当する位置のアミノ酸残基」の特定は、公知のアルゴリズムを用いて、目的アミノ酸配列を参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）と比較し、各グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えるように配列を整列（アラインメント）させることにより行なうことができる。グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各グリコシドハイドロラーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。アラインメントは、例えば、上述のリップマン−パーソン法等に基づいて手作業で行うこともできるが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，ｐ．４６７３−４６８０）をデフォルト設定で用いることにより行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ，[ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ]）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ，[ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／Ｗｅｌｃｏｍｅ−ｊ．ｈｔｍｌ]）のウェブサイトから利用することができる。
【００２７】
当業者であれば、上記で得られたアラインメントを、必要に応じて最適なアラインメントとなるようにさらに微調整することできる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニン及びリジン；グルタミン酸及びアスパラギン酸；セリン及びトレオニン；グルタミン及びアスパラギン；バリン、ロイシン及びイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置のアミノ酸残基」と称される。
【００２９】
配列番号２で示されるアミノ酸配列の１３８位はリジン、３０１位はアスパラギン、３１０位はアスパラギン、２４８位はアラニン、２２位はトレオニン、８０位はセリン、８５位はチロシン、９９位はアスパラギン、１２０位はアスパラギン、１８０位はグリシン、１８６位はトレオニン、２３９位はメチオニン、２４０位はセリン、２４３位はアスパラギン、２５９位はリシン、２８９位はリシン、３４９位はトレオニン、３７６位はトレオニンであるが、上記方法を用いることにより、例えば、上述したグリコシドハイドロラーゼであるセルロース分解性キシラナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＰ２２９４６）、パエニバチルス  エスピーＹ４１２ＭＣ１０由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿００３２４０６３０）、パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５由来のｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ  ８（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０８２８３３９７）、パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０７８９７９６４）、及びパエニバチルス  ラクティス１５４由来のリケナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＺＰ＿０９００２３２４）については、下記表１に示すように、当該位置に相当する位置のアミノ酸残基をそれぞれ特定することができる。
【００３０】
【表１】
0006603462.tif 000002
【００３１】
斯くして特定される「相当する位置」は、アミノ酸配列において高い同一性を有し、且つグリコシドハイドロラーゼであるタンパク質同士の間では、その三次元構造中で同等の位置に存在すると考えられる。したがって、相当する位置に存在するアミノ酸残基の変異は、グリコシドハイドロラーゼの特異的機能に対して互いに類似した効果を及ぼすと推定される。
【００３２】
さらに、本発明の親グリコシドハイドロラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列のグリコシドハイドロラーゼが有する次の酵素学的性質のいずれか１つ以上を有するものが、より好ましい：
１）等電点電気泳動法により測定された等電点が９．３である；
２）カルボキシメチルセルロースを液化型で良好に分解する；
３）基質特異性：カルボキシメチルセルース、リケナン、結晶性セルロース又はセロトリオース以上のセロオリゴ糖及を分解し、還元糖を生成する；
４）最適反応ｐＨ：少なくともｐＨ５〜１０で作用し、最適ｐＨは８．５である；
５）最適反応温度：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）で反応を行った場合、最適反応温度は５５℃である；
６）安定ｐＨ範囲：３０℃、６０分間で処理した場合、ｐＨ５〜１１の範囲で安定である；
７）耐熱性：トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）中、１５分間の処理において、５５℃まで安定である；
８）分子量：ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による推定分子量は、４３ｋＤａである。
【００３３】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼにおいて、上述したアミノ酸残基の置換は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。さらに、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、上述したアミノ酸残基の置換に加えて、そのグリコシドハイドロラーゼ活性及び液体洗剤中での安定性向上効果を妨げない限り、他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有していてもよい。当該任意の位置における変異もまた、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。
【００３４】
グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸残基を置換する手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、本発明の親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列をコードするグリコシドハイドロラーゼ遺伝子（以下、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子とも称する）内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、更にその変異遺伝子から変異グリコシドハイドロラーゼを発現させることにより、置換対象のアミノ酸残基が所望のアミノ酸残基に置換された変異グリコシドハイドロラーゼを得ることができる。
【００３５】
親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子への目的の変異の導入は、例えば基本的には、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版  新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２−８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
【００３６】
親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異プライマーを用いて行うことができる。そのような変異プライマーは、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子内の置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその置換対象のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するポリヌクレオチドを含むように設計すればよい。置換対象及び置換後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば、通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。
【００３７】
変異導入はまた、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つの変異プライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）−ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ
Ｒ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）７７（１），ｐ．６１−６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。このＳＯＥ−ＰＣＲ法を用いた変異導入手順については、後述の実施例にも詳述している。
【００３８】
親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したバチルス エスピーＫＳＭ−Ｎ２５７（ＦＥＲＭ  Ｐ-１７４７３）、バチルス  サーキュランス、パエニバチルス  エスピーＹ４１２ＭＣ１０、パエニバチルス  エスピーＨＧＦ５、パエニバチルス  ボルテックスＶ４５３、パエニバチルス  ラクティス１５４、又はそれらの変異株から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。
【００３９】
上記バチルス属菌株からのゲノムＤＮＡの調製は、例えば、Ｐｉｔｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９８９，８：ｐ．１５１−１５６に記載の方法などを用いて行うことができる。親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、調製したｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから切り出した親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を任意のベクター中に挿入した形で調製してもよい。
【００４０】
プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，７０５９−７０７１，１９８９）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて作製することもできる。変異プライマーを含むプライマーセットを使用し、親グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を得ることができる。本発明はこのようにして得られる変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子にも関する。なお本発明において「変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子」とは、変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子のアミノ酸配列をコードする任意の核酸断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及び人工核酸等を含む）を意味する。本発明に係る「遺伝子」は、オープンリーディングフレームに加えて非翻訳領域（ＵＴＲ）などの他のヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００４１】
得られた変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより、組換えベクターを作製することができる。本発明で用いるベクターは特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターがより好ましく、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターであることが更に好ましい。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を組換え生産する上で特に好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ，（１９８５）６０，ｐ．２３５−２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８）１６，ｐ．８７３２）等のシャトルベクター、ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９７８）１３４，ｐ．３１８−３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ，１８（１９８７）ｐ．８−１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド、分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），ｐ．１６３−１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
【００４２】
変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を組換え生産する目的では、ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位などの宿主生物における発現に必須な各種エレメントの他、選択マーカー遺伝子やポリリンカー、エンハンサーなどのシスエレメント、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）等の有用な配列を必要に応じて含み得る。
【００４３】
変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクターを用いて、形質転換体を作製することができる。本発明では、本発明に係る変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクター（具体的には組換え発現ベクター）を宿主細胞に導入することにより形質転換体（形質転換細胞）を作製し、それを組換えタンパク質の発現が誘導される条件下で培養することにより、変異グリコシドハイドロラーゼを産生させることができる。
【００４４】
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞を使用することができる。本発明においては、特に、枯草菌やその変異株等のバチルス属細菌を使用することが好ましい。
【００４５】
形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｂｏｔｔ．Ｋ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，Ｇ．Ａ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９６７）９３，１９２５）、エレクトロポレーション法（Ｂｒｉｇｉｄｉ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９０）５５，１３５）、プロトプラスト形質転換法（Ｃｈａｎｇ，Ｓ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９７９）１６８，ｐ．１１１−１１５）、Ｔｒｉｓ−ＰＥＧ法（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５６，ｐ．１１３０−１１３４）などが挙げられる。
【００４６】
組換えタンパク質生産のための上記形質転換体の培養は、当業者には一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、宿主微生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。培地には、薬剤選択マーカーの種類に対応してアンピシリンやテトラサイクリン等を添加してもよい。プロモーターとして誘導性のものを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した細菌等を培養するときにはイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。培養条件は特に限定されないが、好ましくは形質転換に用いる宿主生物に適した条件下で行われる。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、例えば、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ−マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。
【００４７】
本発明に係る変異グリコシドハイドロラーゼは、無細胞翻訳系を使用して変異グリコシドハイドロラーゼ遺伝子又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、インビトロ転写翻訳系又はインビトロ翻訳系を構成したものである。発現された変異グリコシドハイドロラーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、又は無細胞翻訳系から取得することができる。また、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮したその培養上清や溶菌液上清等の溶液は、粗酵素液としてそのまま使用することもできる。発現された変異グリコシドハイドロラーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。
【００４８】
なお本発明において用いるｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の実験は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，（２００１）３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。特に、枯草菌の遺伝子組換え実験については例えば、吉川博文著"７．２  枯草菌系"「続生化学実験講座１．遺伝子研究法ＩＩ」，（１９８６）東京化学同人社（東京），ｐ．１５０−１６９等の枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。
【００４９】
斯くして、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを得ることができる。従って、本発明はまた、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子（ポリヌクレオチド）、当該遺伝子を含むベクター、及び当該ベクターを含む形質転換体、ならびに当該形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法を提供する。
【００５０】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、グリコシドハイドロラーゼ活性、好ましくはアルカリセルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性、好ましくはセルラーゼ活性を有する。好ましくは、当該酵素活性は、親グリコシドハイドロラーゼと比べて高い。また本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、高温（６０℃）保存した場合や液体洗剤中で長期保存した後でも、親グリコシドハイドロラーゼと比べて酵素活性の低下が少ない。すなわち、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、親グリコシドハイドロラーゼと比べて、耐熱性が向上し、液体洗剤中での安定性が向上している。特に、ＬＡＳに代表される界面活性剤に対する耐性が親グリコシドハイドロラーゼと比べて大幅に向上する。
【００５１】
よって本発明はまた、本発明の親グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸残基を上述のとおり置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの界面活性剤耐性（例えばＬＡＳ耐性）を向上させる方法を提供する。
【００５２】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、各種洗剤配合用酵素、好ましくは、洗剤配合用酵素として有用である。特に、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼは、液体洗剤中での安定性、特に界面活性剤耐性が向上しており、且つ高い酵素活性及び耐熱性を有しているため、結果として、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する液体洗剤は、より強力な酵素洗浄力を発揮することができる。よって本発明はまた、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有する洗浄剤組成物を提供する。
【００５３】
本発明の洗浄剤組成物における本発明の変異グリコシドハイドロラーゼの含有量は、組成物の０．０００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上であり、５質量％以下、好ましくは２質量％以下である。また、０．０００１質量％〜５質量％、好ましくは０．０００１質量％〜２質量％である。また、均一に溶解又は分散可能な範囲で異なる活性を有する酵素を配合することもできる。
【００５４】
本発明の洗浄剤組成物は、本発明のグリコシドハイドロラーゼに加えて、界面活性剤及び水等を含有する。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、及び陽イオン性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００５５】
非イオン性界面活性剤としては、例えば、以下が挙げられる：
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６〜３５）〔特開２０１０−２７５４６８号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＡＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３〜３０、ｍ＝１〜５、ｌ＋ｎ＝１４〜５０）〔特開２０１０−２６５４４５号公報、特開２０１１−６３７８４号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０〜３０、ｎ＝０〜５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−１８９５５１号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ−（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０〜１、ｍ＝１４〜５０、ｎ＝１〜５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２２９３８５号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＡＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３−Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５〜３０、ｎ＝１〜５）〔特開２０１０−２２９３８７号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ−Ｈ及び／又はＲ2−ＣＯＯ−（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０〜５、ｎ＝２〜１０、ｐ＝０〜５、ｑ＝２〜１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２５４８８１号公報〕；
Ｒ1−ＣＯＯ−（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ−Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７−Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３〜５、ｎ＝８〜２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０−２６５３３３号公報〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｌ−（ＰＯ）ｍ−（ＥＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８−Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔国際公開第９８／２４８６５〕；
Ｒ1Ｏ−（ＥＯ）ｍ−（ＰＯ）ｎ−Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０−Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５〜１５、ｎ＝１〜３）〔特開平８−１５７８６７号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＥＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０〜２０）〔特開２００８−７７０６号公報、特開２００９−７４５１号公報、特開２００９−１５５５９４号公報、特開２００９−１５５６０６号公報〕；
Ｒ1（ＣＯ）−（ＡＯ）ｍ−ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９−Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２−Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１−Ｃ３アルキル基、ｍ＝５〜３０）〔特開２００９−１４４００２号公報、特開２００９−１７３８５８号公報、特開２０１０−１８９６１２号公報〕；ならびに、脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等が挙げられる。
【００５６】
陰イオン界面活性剤としては、例えば、カルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、α−オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α−スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。好ましくは炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８〜２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。
【００５７】
陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。両性イオン活性剤としては、アルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０〜１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。
【００５８】
好ましくは、本発明の洗浄剤組成物は、液体洗剤組成物である。当該液体洗剤組成物は、濃縮液体洗剤組成物であってもよい。本明細書において、「濃縮液体洗剤」とは、界面活性剤を４０質量％以上、水を６０質量％未満含有する液体洗剤を意味し得る。好ましくは、界面活性剤を４０〜９０質量％、水を５質量％以上６０質量％未満含有する液体洗剤であり得、より好ましくは、界面活性剤を４５〜９０質量％、水を５質量％以上５５質量％未満含有する液体洗剤であり得、さらに好ましくは、界面活性剤を５０〜７５質量％、水を５〜５０質量％未満含有する液体洗剤であり得る。上記のような「濃縮液体洗剤」の例としては、使用量が従来の半分程度又はそれ以下でよい液体洗剤、例えば、衣料用液体洗剤であれば、水槽式洗濯機で水３０Ｌに対する標準使用量が７〜１３ｇ又はそれ以下と表示されているものを挙げることができる。
【００５９】
本発明の液体洗剤組成物は、さらに、液体洗剤に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、キレート剤、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤及び分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、過酸化水素等の漂白剤、酸化防止剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類等を含み得る。
【００６０】
水溶性ポリマーとしては、例えば、（ｉ）炭素数２〜５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（ｉ）又は（ii）はいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０−２７５４６８号公報）、ならびにアルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９−１５５６０６号公報）等が挙げられる。
【００６１】
水混和性有機溶剤としては、例えばアルカノール類、のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２〜６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、１質量％以上で、４０質量％以下、好ましくは３５質量％以下である。また、１〜４０質量％、好ましくは１〜３５質量％である。
【００６２】
アルカリ剤としては、例えばＣ２−Ｃ４のアルカノールを１〜３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又はポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下である。また、０〜２０質量％、好ましくは０〜１０質量％である。
【００６３】
キレート剤としては、例えばニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１−ヒドロキシエチリデン−１，１−ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、これらのアルカリ金属または低級アミン塩等が挙げられる。本発明の液体洗剤組成物における当該キレート剤の含有量は、０．１質量％以上であるのが好ましく、５質量以下、好ましくは４質量％以下である。また、０．１〜５質量％が好ましく、より好ましくは０．１〜４質量％である。
【００６４】
有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、またはそれらの塩などの多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類が挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が特に好ましい。本発明の液体洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、５質量％以下、好ましくは３質量％以下である。また０〜５質量％、好ましくは０〜３質量％である。
【００６５】
再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸−ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸−メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸−酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９−６２６１４号公報の請求項１〜２１（１頁３欄５行〜３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができるが、配合に適さない場合は除外してもよい。
【００６６】
色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１〜１０質量％が好ましい。
【００６７】
漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤は１〜１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６−３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１〜１０質量％配合することができる。
【００６８】
蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ−Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１〜２質量％配合するのが好ましい。
【００６９】
本発明の変異グリコシドハイドロラーゼ以外の他の酵素としては、例えば、プロテアーゼ、他のセルラーゼ、他のリケナーゼ、他のβ−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、他のキシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等を始めとする加水分解酵素、ならびにそれらのうち２種以上の混合物が挙げられる。
【００７０】
その他成分として、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ビヒドロキシ化合物、蟻酸等の酵素安定化剤、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などの可溶化剤、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１−トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ−リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリコーン等の消泡剤等が挙げられる。
【００７１】
本発明の液体洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましくは衣料用、又は布製品（シーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）用のものである。本発明に係る液体洗剤組成物は、本発明の変異グリコシドハイドロラーゼを含有することにより、酵素を従来品と比べて安定的に含有することができることから、高い酵素洗浄力を発揮することができる。
【００７２】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、方法、あるいは用途を本明細書
に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００７３】
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１３８位、３０１位及び３１０位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である変異グリコシドハイドロラーゼ。
（ａ）１３８位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｂ）３０１位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｃ）３１０位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
＜２＞さらに、２４８位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がチロシンである、＜１＞の変異グリコシドハイドロラーゼ。
＜３＞さらに２２位、８０位、８５位、９９位、１２０位、１８０位、１８６位、２３９位、２４０位、２４３位、２５９位、２８９位、３４９位、３７６位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である、＜２＞の変異グリコシドハイドロラーゼ。
（Ａ）２２位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｂ）８０位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｃ）８５位又はこれらに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｄ）９９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｅ）１２０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｈ）２３９位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれらに相当する位置：ロイシン
（Ｊ）２４３位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン
（Ｌ）２８９位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
（Ｍ）３４９位又はこれらに相当する位置：メチオニン
（Ｎ）３７６位又はこれらに相当する位置：アラニン
＜４＞以下のｉ）〜ｖ）から選択される、請求項３記載の変異グリコシドハイドロラーゼ。
ｉ）１８０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記のアミノ酸残基。
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
ｉｉ）９９位及び１８６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｄ）９９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれらに相当する位置：アラニン
ｉｉｉ）２２位、１８０位及び３４９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ａ）２２位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｍ）３４９位又はこれらに相当する位置：メチオニン
ｉｖ）２３９位、２４０位及び２５９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｈ）２３９位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれらに相当する位置：ロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン
ｖ）８０位、１２０位及び３７６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｂ）８０位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｅ）１２０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｎ）３７６位又はこれらに相当する位置：アラニン
＜５＞前記配列同一性が９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である＜１＞〜＜４＞のいずれかの変異グリコシドハイドロラーゼ。
＜６＞セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、＜１＞〜＜５＞のいずれかの変異グリコシドハイドロラーゼ。
＜７＞＜１＞〜＜６＞のいずれかの変異グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子。
＜８＞＜７＞の遺伝子を含有する組換えベクター。
＜９＞＜８＞の組換えベクターを含む形質転換体。
＜１０＞＜９＞の形質転換体を用いる変異グリコシドハイドロラーゼの製造方法。
＜１１＞＜１＞〜＜６＞のいずれかの変異グリコシドハイドロラーゼを含有する洗浄剤組成物。
＜１２＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列において、１３８位、３０１位及び３１０位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基に置換することを含む、グリコシドハイドロラーゼの界面活性剤耐性の向上方法。
（ａ）１３８位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｂ）３０１位又はこれらに相当する位置：ヒスチジン
（ｃ）３１０位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
＜１３＞さらに、２４８位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基がチロシンである＜１２＞の方法。
＜１４＞さらに２２位、８０位、８５位、９９位、１２０位、１８０位、１８６位、２３９位、２４０位、２４３位、２５９位、２８９位、３４９位、３７６位又はこれらに相当する位置におけるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が下記のアミノ酸残基である、＜１３＞の方法。
（Ａ）２２位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｂ）８０位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｃ）８５位又はこれらに相当する位置：フェニルアラニン
（Ｄ）９９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｅ）１２０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｈ）２３９位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれらに相当する位置：ロイシン
（Ｊ）２４３位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン
（Ｌ）２８９位又はこれらに相当する位置：グルタミン酸
（Ｍ）３４９位又はこれらに相当する位置：メチオニン
（Ｎ）３７６位又はこれらに相当する位置：アラニン
＜１５＞以下のｉ）〜ｖ）から選択される、＜１４＞の方法。
ｉ）１８０位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が、下記のアミノ酸残基。
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
ｉｉ）９９位及び１８６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｄ）９９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｇ）１８６位又はこれらに相当する位置：アラニン
ｉｉｉ）２２位、１８０位及び３４９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ａ）２２位又はこれらに相当する位置：アラニン
（Ｆ）１８０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｍ）３４９位又はこれらに相当する位置：メチオニン
ｉｖ）２３９位、２４０位及び２５９位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｈ）２３９位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｉ）２４０位又はこれらに相当する位置：ロイシン
（Ｋ）２５９位又はこれらに相当する位置：アスパラギン
ｖ）８０位、１２０位及び３７６位、又はこれらに相当する位置のアミノ酸残基が、それぞれ下記のアミノ酸残基。
（Ｂ）８０位又はこれらに相当する位置：イソロイシン
（Ｅ）１２０位又はこれらに相当する位置：アスパラギン酸
（Ｎ）３７６位又はこれらに相当する位置：アラニン
＜１６＞界面活性剤が、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウムである＜１２＞〜＜１５＞のいずれかの方法。
＜１７＞前記配列同一性が９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上である＜１２＞〜＜１６＞のいずれかの方法。
＜１８＞前記グリコシドハイドロラーゼが、セルラーゼ活性、リケナーゼ活性及びキシラナーゼ活性からなる群より選択される１つ以上の酵素活性を有する、＜１２＞〜＜１７＞のいずれかの方法。
【実施例】
【００７４】
本発明の例示的実施形態として、さらに以下の組成物、方法、あるいは用途を本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００７５】
参考例１  Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼの調製
グリコシドハイドロラーゼの調製方法について、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＳＭ−Ｎ２５７株（ＦＥＲＭＰ−１７４７３）由来のＮ２５７グリコシドハイドロラーゼを例として以下に示す。
Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ（配列番号２）をコードする遺伝子（配列番号１）〔以下、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子とも称する；塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０５９２６７に基づき入手可能；Ｈａｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１５７０，２００２，ｐ．１７４−１８０〕におけるＮ２５７グリコシドハイドロラーゼのＮ末端アミノ酸からターミネーター配列までをコードする核酸断片を増幅した。さらに、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）〔以下、Ｓ２３７セルラーゼ遺伝子とも称する；塩基配列はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１８４２０に基づき入手可能；Ｈａｋａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６４（１１），２０００，ｐ．２２８１−２２８９；特開２０００−２１００８１号公報〕のプロモーター及びシグナル配列の核酸断片を増幅した。
ＳＯＥ−ＰＣＲにて２つの核酸断片を連結し、シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ｉｓｈｉｗａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８５，６０，ｐ．２３５−２４３）に導入することで、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子を含む発現プラスミドを作製した。
【００７６】
詳細には、初めにバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｓ２３７株からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、表１に示すプライマーＳ２３７ＵＢ１  ＦＷ（配列番号４）とＳ２３７−ＰＳ  ＲＶ（配列番号５）からなるプライマーセットを用いて、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）のプロモーター及びシグナル配列を含むＤＮＡ断片１を増幅した。
次に、バチルス  サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＫＳＭ−Ｎ２５７株からゲノムＤＮＡを常法により抽出し、これを鋳型ＤＮＡとして、表１に示すＮ２５７ｍａｔ−Ｑｓｔｅｒ  ＦＷ（配列番号６）とＮ２５７−Ｃｒｙｔｅｒ  ＲＶ（配列番号７）からなるプライマーセットを用いて、Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の成熟タンパク質コード領域及びターミネーター配列（配列番号１の３３８番塩基以降）を含むＤＮＡ断片２を増幅した。
上記ＤＮＡ断片１、２の増幅は、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行った。ＰＣＲの反応液は、適宜希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、センスプライマー及びアンチセンスプライマーを各々２０ｐｍｏｌ、及びＰｙｒｏｂｅｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ混合し、水を加えて反応液総量を５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間及び７２℃で１〜５分間（目的増幅産物に応じて調整したが、目安は１ｋｂ当たり１分間）の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で５分間反応させる条件で行った。
上記で得られたＤＮＡ断片１及び２を鋳型として、Ｓ２３７セルラーゼのプロモーター及びシグナル配列とＮ２５７成熟タンパク質コード領域及びターミネーター配列とを含むＤＮＡ断片を、表２に示すＳ２３７ＵＢ１  Ｆｗ（配列番号４）とＮ２５７−Ｃｒｙｔｅｒ  Ｒｖ（配列番号７）からなるプライマーセットを用いて、ＳＯＥ−ＰＣＲによって増幅した。
【００７７】
【表２】
0006603462.tif 000003
【００７８】
シャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ｉｓｈｉｗａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８５，６０，ｐ．２３５−２４３）をＳｍａＩにて制限酵素処理し、これに増幅断片を挿入し、組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を構築した。プラスミド中に挿入されたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子断片については、３１００ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて配列決定することにより、Ｓ２３７セルラーゼをコードする遺伝子（配列番号３）のプロモーター及びシグナル配列とＮ２５７成熟タンパク質コード領域及びターミネーター配列とが連結したヌクレオチド配列を有することを確認した。次いでプロトプラスト形質転換法により、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９））を組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を導入して形質転換した。
【００７９】
プロトプラスト形質転換法では、まず、枯草菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を、５０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）中で３７℃にて約２時間振盪培養し、６００ｎｍにおける吸光度が０．４となった時点で、室温で遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を集めた。集めた菌体を５ｍＬのＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ  ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で１時間保温して菌体をプロトプラスト化した。保温終了後、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に、１０μＬのプラスミド溶液（Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを含む）と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌して室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を、３７℃で９０分間振盪（１２０ｒｐｍ）した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、ロイシン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）］上に塗布し、３０℃で７２時間培養して、生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体を１０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で３０℃にて一夜振盪培養を行い、更にこの培養液０．０５ｍＬを５０ｍＬの２×Ｌ−マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４−５水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン）に接種し、３０℃にて３日間振盪培養を行った。培養によって得られたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼを含む培養液を遠心分離し、培養上清を得た。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて、培養上清に含まれる蛋白質がＮ２５７グリコシドハイドロラーゼであることを確認した。
【００８０】
参考例２  グリコシドハイドロラーゼ活性の測定（ＤＮＳ法）
セルラーゼ活性測定は９６穴プレートを用いて測定を行った。１．０％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、日本製紙）及び５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）を調製し、基質溶液とした。この基質溶液９０μＬに対し、適当な濃度に希釈した酵素液（培養上清）１０μＬを加え、４０℃で２０分反応した後、ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）溶液１００μＬを加えて１００℃で５分間熱処理し、速やかに氷水中で冷却した。冷却した溶液１００μＬを９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）へと移し、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ社）を用いて５３５ｎｍの吸光度を測定した。４０℃、１００℃での熱処理はＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。また、サンプルの希釈、基質反応液への添加、ＤＮＳ溶液の添加にはマルチディスペンサーＥＤＲ３８４Ｓ（バイオテック）を用いた。吸光度に基づいて酵素反応により生成した還元糖の量を測定し、上記条件下で１分間に１μｍｏｌのＤ−グルコース相当の還元糖を遊離する活性を１ｕｎｉｔ（Ｕ）として、グリコシドハイドロラーゼのセルラーゼ活性（Ｕ）を求めた。
【００８１】
参考例３  液体洗剤保存後のグリコシドハイドロラーゼの残存活性の測定
酵素液として、グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清を用いた。評価用液体洗剤としては、液体洗剤処方品（非イオン性界面活性剤〔炭素数１２〜１６；平均エチレンオキシド付加モル数１２．０のポリオキシエチレンアルキルエーテル〕２０重量％；アルキルベンジルジメチルアンモニウムクロライド〔アルキル基炭素数８〜１８〕１重量%；ソフタノール７０Ｈ（日本触媒製）２０重量％；アクリル酸マレイン酸コポリマー１．５重量％；モノエタノールアミン１．５重量％；クエン酸１．１５重量％；ブチルジグリコール５重量％；エタノール２重量％；亜硫酸ナトリウム０．２重量％；水４７．６５重量％）をベースに調製した溶液（液体洗剤処方品  ４８６μＬ、１０％亜硫酸ナトリウム  ５．４μＬ、３５％塩化カルシウム  ３．１μＬ、プロテアーゼ  ５．４μＬを含有）を用いた。９６穴ディープウェルプレートの各ウェルに評価用液体洗剤を５００μＬずつ分注し、さらに酵素液（培養上清）を４３μＬずつ添加し、試験サンプルとした。酵素液添加の直後と４０℃にて７日間保存後に試験サンプル中のセルラーゼ活性を測定した。セルラーゼ活性の測定は、試験サンプルをイオン交換水にて１０倍希釈したものを用いて、参考例２と同様の方法にて行った。酵素液添加直後の活性に対する３日間保存後の活性の割合を、酵素の残存活性とした。
プロテアーゼはバチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６５３２）由来のアルカリプロテアーゼであって、８０Ｕ／ｍＬの酵素溶液を用いた。なお、当該プロテアーゼの活性は特開２００４−３０５１７５に記載の合成基質法を用いて決定した。
【００８２】
参考例４  グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性の測定
５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）で適当な濃度に希釈した酵素液（グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清）を６０℃で１０分間保温した。保温操作には、ＰＣＲプレートとＰＣＲサイクラーＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。保温前後のサンプルのセルラーゼ活性を参考例２と同様の方法にて測定し、保温前に対する保温後の残存活性（％）〔（保温後のセルラーゼ活性）／（保温前のセルラーゼ活性）×１００〕を求めた。
【００８３】
参考例５  ＬＡＳ存在下グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性の測定
１％ＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、Linear Alkylbenzene Sulfonete）を添加した５０ｍＭグリシン緩衝液（ｐＨ９．０）で適当な濃度に希釈した酵素液（グリコシドハイドロラーゼを含む培養上清）を４０℃で６０分間保温した。保温操作には、ＰＣＲプレートとＰＣＲサイクラーＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。保温前後のサンプルのセルラーゼ活性を参考例２と同様の方法にて測定し、保温前に対する保温後の残存活性（％）〔（保温後のセルラーゼ活性）／（保温前のセルラーゼ活性）×１００〕を求めた。
【００８４】
参考例６  ランダム変異体の調製
組換えプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７或いはその変異プラスミドを鋳型に、表１に示したプライマーＸｂａ−ＦとＢａｍ−Ｒのプライマーセットを用いて、ランダム変異ＰＣＲ反応をＧｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）の方法に準じて行った。ＰＣＲの反応液は、２０μｇ／ｍＬに希釈した鋳型ＤＮＡを１μＬ、Ｘｂａ−ＦおよびＢａｍ−Ｒのプライマーを各々２５ｐｍｏｌ、４０ｍＭ  ｄＮＴＰを１μＬ、及びＤＮＡポリメラーゼを１μＬ混合し、水を加えて反応液総量を５０μＬにして調製した。ＰＣＲ反応は、９８℃で１分間、６２℃で１分間及び７２℃で１分間の３段階の温度変化を３０サイクル繰り返した後、７２℃で１０分間反応させる条件で行った。得られたＰＣＲ断片はＮｕｃｌｅｏＦａｓｔ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ（ＭＡＣＨＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて精製し、適量の水に溶出した。
得られたＰＣＲ断片およびシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ（ヤクルト本社；Ｉｓｈｉｗａ，Ｈ．＆Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｈ．，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８５，６０，ｐ．２３５−２４３）をそれぞれＸｂａＩとＢａｍＨＩにて制限酵素処理した後連結し、プラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７のランダム変異ライブラリーを構築した。このライブラリーを大腸菌コンピテントセルＨＢ１０１（タカラバイオ）に形質転換した。形質転換体の選抜はＬＡＳ入りのセルラーゼハロー培地（１％トリプトンペプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天、５０ｐｐｍテトラサイクリン、１％カルボキメチルセルロース、０．０１％トリパンブルー、１％ＬＡＳ）にて、４５℃、２日培養で行った。ハローが大きかった形質転換体を選出し、プラスミドを抽出した。プラスミド中に挿入されたＮ２５７グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の変異個所については、３１００  ＤＮＡシーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。次いでプロトプラスト形質転換法により、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株（Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９））を抽出した変異を持つプラスミドｐＨＹ−Ｎ２５７を導入して形質転換した。
プロトプラスト形質転換法では、まず、枯草菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を、５０ｍＬのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）中で３７℃にて約２時間振盪培養し、６００ｎｍにおける吸光度が０．４となった時点で、室温で遠心分離（７０００ｒｐｍ、１５分間）により菌体を集めた。集めた菌体を５ｍＬのＳＭＭＰ［０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ  ３（Ｄｉｆｃｏ）］に懸濁後、ＳＭＭＰ溶液に溶解した５００μＬのリゾチーム溶液（３０ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で１時間保温して菌体をプロトプラスト化した。保温終了後、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、５ｍＬのＳＭＭＰに懸濁しプロトプラスト溶液を調製した。０．５ｍＬのプロトプラスト溶液に、１０μＬのプラスミド溶液（Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドベクターを含む）と１．５ｍＬの４０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ８０００、Ｓｉｇｍａ）を加え、緩やかに攪拌して室温で２分間放置した後、直ちに５ｍＬのＳＭＭＰ溶液を混和し、室温で遠心分離（２８００ｒｐｍ、１５分間）によりプロトプラストを集め、１ｍＬのＳＭＭＰ溶液に再懸濁した。プロトプラスト懸濁液を、３７℃で９０分間振盪（１２０ｒｐｍ）した後、テトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭ３再生寒天培地［０．８％（ｗ／ｖ）寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、ロイシン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）］上に塗布し、３０℃で７２時間培養して、生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００８５】
実施例１  グリコシドハイドロラーゼ変異体ＳＧ１３の作製と評価
参考例６に記載した方法にで、野生型（親）Ｎ２５７グリコシドハイドロラーゼ成熟酵素領域のランダム変異を、ｐＨＹ−Ｎ２５７（参考例１を参照）を鋳型にＧｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて行い、ＬＡＳ耐性が向上した変異体ＳＧ１３を取得した。ＳＧ１３はＮ２５７のＤＮＡ配列の７４９位のＡがＣに、７５１位のＧがＴに、１２３８位のＡがＣに、１２６５位のＡがＧに、１２６７位のＣがＡに変わり、アミノ酸配列の１３８位のＫがＨに、３０１位のＮがＨに、３１０位のＮがＥに変わった変異体であることを確認した。ＳＧ１３変異体から抽出したプラスミドはｐＨＹ−ＳＧ１３と称する。参考例１と同様に、大腸菌より抽出したプラスミドｐＨＹ−ＳＧ１３を枯草菌に導入し、得られた形質転換体を培養した。得られた培養物から遠心分離にて菌体を除いて培養上清を取得した。
【００８６】
参考例３記載の方法にて、実施例１で得た変異グリコシドハイドロラーゼの７日保存後の残存セルラーゼ活性を測定した。同様の方法で測定した親グリコシドハイドロラーゼの７日保存後の残存活性を１００％としたときの、ＳＧ１３変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素の安定性を評価した。
【００８７】
また、参考例４記載の方法にて、実施例１で得た変異グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を測定した。同様の方法で測定した親グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を１００％としたときの、ＳＧ１３変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素の耐熱性を評価した。
【００８８】
また、参考例５記載の方法にて、実施例１で得た変異グリコシドハイドロラーゼのＬＡＳ存在下グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を測定した。同様の方法で測定した親グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を１００％としたときの、ＳＧ１３変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素のＬＡＳ耐性を評価した。
結果を表２に示す。ＳＧ１３変異体は、親グリコシドハイドロラーゼと比較して安定性、耐熱性およびＬＡＳ耐性が向上していた（表３）。
【００８９】
【表３】
0006603462.tif 000004
【００９０】
実施例２  ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼの切断点変異体ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙの作製と評価
（１）ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼの切断点変異体ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙの作製
ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼについては、液体洗剤中において２断片に切断されることがＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認された。この切断された２断片のアミノ酸Ｎ−末端解析により、アミノ酸配列の２４７位のアラニンと２４８位のアラニンの間に切断されたことを判明した。
大腸菌から抽出し、十分に希釈したプラスミドｐＨＹ−ＳＧ１３を鋳型とし、表１に示したプライマーＡ２４８−ＦＷ（配列位号１０）とＡ２４８−ＲＶ（配列位号１１）からなるプライマーセット、及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、インバースＰＣＲを行った。詳細には、鋳型としてｐＨＹ−ＳＧ１３  １００ｐｇ、各プライマー（フォワード、リバース）２μＭ、Ｋｉｔに付属のＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＭＡＸ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ２５μＬを、滅菌水を用いて５０μＬに調製した。反応は、変性を９８℃  １０秒、アニーリングを５５℃  ５秒、伸長を７２℃  ４５秒で３０サイクルにて行った。本ＰＣＲシステムでは、プラスミドを鋳型に５’側が１５塩基オーバーラップしたプライマーを用いて、インバースＰＣＲを行うことによって、オーバーラップ部分が５’側に突出したプラスミドの配列を全て含むＰＣＲ産物を得ることができる。この増幅産物は形質転換可能な環状構造をとることが出来るため、この増幅産物を用いることで形質転換を直接行うことができる。本実施例では、フォワードプライマーのオーバーラップ配列直後の３’側の３塩基を目的のアミノ酸の塩基配列に変えることで、同じ位置のアミノ酸残基を置換する場合には、リバースプライマーを共用できるようにした。以上の方法により、ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼ遺伝子の２４８位のアラニン残基に対応する位置をチロシンに置換した変異を含むｐＨＹ−ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙを得た。制限酵素ＤｐｎＩ（ＴＯＹＯＢＯ）を用いて鋳型プラスミドを消化した後に、ＮｕｃｌｅｏＦａｓｔ  ９６  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅ（ＭＡＣＨＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）を用いて増幅産物を精製した。次いで、参考例１と同様に、組換えプラスミドｐＨＹ−ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙを枯草菌に導入し、得られた形質転換体を培養した。得られた培養物から遠心分離にて菌体を除いて培養上清を取得した。この培養上清は、ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼのアミノ酸配列（配列位号２）の２４８位のアラニンがチロシンに置換された変異グリコシドハイドロラーゼ（以下、ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙとも称する）を含む。
【００９１】
（２）ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼの切断点変異体ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙの評価
参考例３記載の方法にて、実施例２で得たＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙグリコシドハイドロラーゼの７日保存後の残存セルラーゼ活性を測定した。同様の方法で測定したＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼの７日保存後の残存活性を１００％としたときの、ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙ変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素の安定性を評価した。
また、参考例４記載の方法にて、実施例２で得たＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙ変異グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を測定した。同様の方法で測定したＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を１００％としたときの、ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙ変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素の耐熱性を評価した。
また、参考例５記載の方法にて、実施例２で得たＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙ変異グリコシドハイドロラーゼのＬＡＳ存在下グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を測定した。同様の方法で測定したＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を１００％としたときの、ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙ変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素のＬＡＳ耐性を評価した。
結果を表３に示す。ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙ変異体は、ＳＧ１３グリコシドハイドロラーゼと比較して安定性、耐熱性およびＬＡＳ耐性が向上していた（表４）。
【００９２】
【表４】
0006603462.tif 000005
【００９３】
実施例３  ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙグリコシドハイドロラーゼからランダム変異体の作製と評価
参考例６に記載した方法にで、ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙグリコシドハイドロラーゼ成熟酵素領域のランダム変異を、ｐＨＹ−ＳＧ１３＿Ａ２４８Ｙを鋳型にＧｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて行い、ＬＡＳ耐性が向上した変異体を取得した（表４）。参考例１と同様に、大腸菌より抽出したプラスミドを枯草菌に導入し、得られた形質転換体を培養した。得られた培養物から遠心分離にて菌体を除いて培養上清を取得した。
参考例５記載の方法にて、実施例３で得た変異グリコシドハイドロラーゼのＬＡＳ存在下グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を測定した。同様の方法で測定したＳＧ１３＿Ａ２４８グリコシドハイドロラーゼの保温後における残存活性を１００％としたときの、変異グリコシドハイドロラーゼの相対残存活性を求め、酵素のＬＡＳ耐性を評価した。
結果を表４に示す。すべての変異体は、ＳＧ１３＿Ａ２４８グリコシドハイドロラーゼと比較してＬＡＳ耐性が向上していた（表５）。
【００９４】
【表５】
0006603462.tif 000006
【配列表】
0006603462000001.app