(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の検体の量の判定方法であって、
ａ）上記試料と、脱脂剤と、第１検体結合相手でコーティングされた第１の磁性粒子とを、第１の容器内で混合する工程と、
ｂ）上記第１の容器内の混合物をインキュベートして、上記試料に含まれる脂質を沈殿させ、上記試料に含まれる検体を上記第１の検体結合相手に結合させる工程と、
ｃ）上記第１の容器を磁場の影響下に置き、上記第１の磁性粒子を上記第１の容器の内壁部に磁気によって引き寄せる工程と、
ｄ）上記第１の容器内の上記混合物から、非結合の試薬を除去する工程と、
ｅ）結合した検体を溶出液中に溶出させて、上記検体を上記第１の検体結合相手から分離する工程と
を含む精製工程と、
ｆ）上記第１の容器を磁場の影響下に置き、上記第１の磁性粒子を上記第１の容器の内壁部に磁気によって引き寄せる工程と、
ｇ）上記検体を含む上記溶出液の任意の量を、上記第１の容器から第２の容器に移す工程と
を含む移送工程と、
上記第２の容器内において、上記検体を定量化する定量化工程と
を含む方法。
【請求項２】
請求項１において、上記検体が、ビタミンＤ代謝物質またはステロイドである、方法。
【請求項３】
請求項２において、上記検体が、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５Ｄ）または２５−ヒドロキシビタミンＤである、方法。
【請求項４】
請求項２において、上記検体が、アルドステロン、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲストーゲン、およびコレステロールからなる群から選ばれるステロイドである、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項において、上記試料が水性の生物媒質である、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項において、上記の検体の定量化が、イムノアッセイを利用して行われる、方法。
【請求項７】
請求項６において、上記イムノアッセイが、第２の検体結合相手でコーティングされた第２の磁性粒子を使用して実行される、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項において、上記第１および第２の検体結合相手の少なくとも一方が、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、改変抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦＶ、またはＦａｂフラグメントである、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項において、上記脱脂剤がポリアニオン性検体である、方法。
【請求項１０】
請求項９において、上記脱脂剤は、グループＩＩカチオンの存在下では、硫酸デキストラン、リンタングステン酸、およびヘパリンからなる群から選択されるポリアニオン性検体である、方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項において、上記非結合の試薬の除去工程は、上記第１の磁性粒子を洗浄液で洗浄する洗浄工程を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項において、上記溶出液は、方法用緩衝液に塩基性溶液を加え、次いで中和溶液を加えることにより得られる、方法。
【請求項１３】
請求項１２において、上記塩基性溶液は、０．３〜０．６ＮのＮａＯＨである、方法。
【請求項１４】
請求項１２または１３において、上記中和溶液は、０．３〜０．６Ｍのクエン酸である、方法。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項において、上記方法用緩衝液は、ＭＯＰＳ緩衝液中に、ＢＳＡ、ポリペプ、マンニトール、スクロース、トリトン−酸化防止剤混合物、アスコルビン酸ナトリウム、トロロクス、および炭酸水素ナトリウムを含んでいる、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項において、上記精製工程、上記移送工程、および上記定量化工程は、自動イムノアッセイ分析器のような自動分析装置によって実行される、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項において、更に下記の工程、即ち、
複数の容器（１１）と、
略垂直な回転軸を有し、当該回転軸周りに回転自在に駆動されるロータ（７）であって、径方向外方に開口する凹部（８）を画定するロータ（７）と、
上記ロータ（７）の上記凹部（８）内に、上記容器（１１）を装填するのに適した装填装置（９）と、
上記ロータ（７）の上記凹部（８）内に受容されている上記容器（１１）に、試薬および試料を供給するのに適した少なくとも１台のサンプリング兼ピペッティング装置（１３）と、
上記ロータ（７）から取り出された１つの容器（１１）を受容すること、および磁場を生成することに適した磁気沈降兼洗浄モジュール（２３）であって、当該磁気沈降兼洗浄モジュール（２３）に受容されている１つの容器から流体をピペットで移すのに適したピペッティング機（２５）を備える磁気沈降兼洗浄モジュール（２３）と、
上記ロータ（７）から取り出された１つの容器（１１）を受容するのに適した上部開口ハウジング（２７）と、上記上部開口ハウジング（２７）の近傍に配置された第１の磁場生成部（２８）とを備える磁気吸着モジュール（２６）と、
上記ロータ（７）から取り出された１つの容器（１１）の受容、およびこの取り出された容器（１１）に含まれる検体の定量化に適した定量化装置（２９）と
を備える自動分析装置を準備する工程と、
自動での上記精製工程と、を有し、上記移送工程及び上記精製工程では前記自動分析装置を使用する、方法。
【請求項１８】
請求項１７の方法において、上記定量化装置（２９）は、イムノアッセイまたは競合する結合アッセイによって、上記検体の量を測定または判定するよう構成されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の検体の量を判定する新規な方法に関し、より具体的には、イムノアッセイを利用する方法と、当該方法を実行するための自動分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、試料中に存在する検体の量を定量化する方法に関し、具体的には、試料精製における事前の複雑で面倒な分析前段階を必要とすることなく、検体の定量化が可能な方法に関する。
【０００３】
本発明は、また、疾病の診断に使用される検体の量を判定する方法にも関する。
【０００４】
抽出方法および分離方法の簡便化は、方法の改良のためのキーとなる要点である。分離精製工程の必要条件によって、方法時間が著しく長くなり、また、濃度判定だけでなく試料のトレーサビリティにも潜在的エラーが導入される。これは、手動で試料を操作する工程が少なくとも１工程あることに起因する。
【０００５】
試料から脂質のような化合物を除去するためには、多くの手動操作と遠心分離法とを要する沈降工程が必要である。定量化の前の検体精製工程の１つは、有機溶媒の使用を必要とする場合がある。有機溶媒は、毒性を有することがあり、臨床生化学的実験施設で使用するには不便な蒸発装置が必要な場合がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、既存の方法に関連する問題を解決することを目的としている。
【０００７】
すなわち、本発明は、試料中の検体を定量化するための、簡便でありながら効果的な方法に対するニーズを満足するものである。本発明は、脱脂−抽出−精製のための複雑な手動操作を排除することに基づく。本発明により、検査時間を大幅に短縮し、従来の方法よりも効率的で、したがって、コストパフォーマンスにより優れ、すべての操作の完全なトレーサビリティが可能であり、したがって、臨床試験施設における定常的使用により適した方法の提供が可能となる。
【０００８】
本発明は、（試料、脱脂剤、および検体結合相手を同じ容器内で混合する）ワンステップ精製が効率的に機能するという知見に基づく。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、第１の局面においては、本発明は、試料中の検体の定量化方法に関する。この方法は、
ａ）上記試料と、脱脂剤と、第１検体結合相手でコーティングされた第１の磁性粒子とを、第１の容器内で混合する工程と、
ｂ）上記第１の容器内の上記混合物をインキュベートして、上記試料に含まれる脂質を沈殿させ、上記試料に含まれる検体を上記第１の検体結合相手に結合させる工程と、
ｃ）上記第１の容器を磁場の影響下に置き、上記第１の磁性粒子を上記第１の容器の内壁部に磁気によって引き寄せる工程と、
ｄ）上記第１の容器内の上記混合物から、非結合の試薬を除去する工程と、
ｅ）結合した検体を溶出液中に溶出させて、上記検体を上記第１の検体結合相手から分離する工程と
を含み、上記第１の容器内で行われる初期精製工程と、
ｆ）上記第１の容器を磁場の影響下に置き、上記第１の磁性粒子を上記第１の容器の内壁部に磁気によって引き寄せる工程と、
ｇ）上記検体を含む上記溶出液の任意の量を、上記第１の容器から第２の容器に移す工程と
を含む移送工程と、
上記第２の容器内において、上記溶出液に含まれる検体を定量化する定量化工程とを含む。
【００１０】
本発明は、血液、血清、血漿のような、任意のヒトの水性生体媒質に対して、実施可能である。
【００１１】
本発明の一局面によれば、第１および第２の容器の少なくとも一方は、キュベット、チューブ、または同様の容器である。第１および第２の容器のそれぞれが、キュベット、チューブ、または同様の容器であってもよい。
【００１２】
本発明の一局面によれば、第１および第２の容器の少なくとも一方は、ガラス製またはプラスチック製である。第１および第２の容器のそれぞれが、ガラス製またはプラスチック製であってもよい。
【００１３】
上記移送工程は、サンプリング兼ピペッティング装置を使用して実行可能である。
【００１４】
本発明の一局面によれば、上記インキュベート工程は、試料を脱脂する工程を含む。
【００１５】
なお、脱脂剤は、好適には、試料中の脂質の沈降を促進するよう構成されている。
【００１６】
マグネシウム、マンガン、またはカルシウムなどのグループＩＩカチオンの存在下では、上記脱脂剤は、硫酸デキストラン、リンタングステン酸、またはヘパリンなどのポリアニオン性検体であってもよい。
【００１７】
上記脱脂剤を使用した、このインキュベートによって、（脱脂剤の働きにより）脂質を沈殿させ、磁性粒子をコーティングする第１の検体結合相手に検体を結合させることができる。
【００１８】
本発明の一局面によれば、上記非結合の試薬の除去工程は、第１の磁性粒子を洗浄液で洗浄する洗浄工程を含む。
【００１９】
本発明の特定の一局面によれば、上記溶出液は、例えば０．３Ｎ〜０．６ＮのＮａＯＨのような塩基性溶液を、結合した検体が入った第１の容器に加えることにより得られる。次いで、クエン酸、より正確には０．３〜０．６Ｍのクエン酸のような中和溶液および方法用緩衝液を、第１の容器に加える。
【００２０】
本発明のさらなる特定の一局面によれば、上記方法用緩衝液は、ＭＯＰＳ緩衝液中に、ＢＳＡ、ポリペプ（ｐｏｌｙｐｅｐ）、マンニトール、スクロース、トリトン−酸化防止剤混合物、アスコルビン酸ナトリウム、トロロクス、および炭酸水素ナトリウムを含む。
【００２１】
本発明の特定の一局面によれば、第１および第２の容器に対する、液体（溶液状の試薬、緩衝液、洗浄液、等）の添加および除去は、ピペッティング手段によって実行され得る。
【００２２】
本発明の特定の一局面によれば、上記検体は、何らかのビタミンＤ代謝物質、より好ましくは１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５Ｄ）であってもよく、あるいは、アルドステロン、アンドロゲン、エストロゲン、プロゲストーゲン、またはコレステロールのようなステロイドであってもよい。上記ビタミンＤ代謝物質は、２５−ヒドロキシビタミンＤ２または２５−ヒドロキシビタミンＤ３のような２５−ヒドロキシビタミンＤであってもよい。
【００２３】
本発明の好ましい一局面によると、上記検体は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ（１，２５Ｄ）である。この検体の血液中での濃度は非常に低く、通常の濃度は１０〜１００ピコグラム／ｍｌであるため、その測定は難しい。
【００２４】
ヒトの血液中の１，２５Ｄの濃度は、身体でのビタミンＤ代謝の効果を示す優れた指標であり、且つ、慢性腎疾患の好適な指標である。
【００２５】
これまで、１，２５Ｄのレベルの判定方法の開発は困難であったが、これは主に、血液中の１，２５Ｄの濃度が極端に低いことに起因している。
【００２６】
１，２５Ｄの測定は、自動化システムによる分析または手動による方法を使用した分析に先立って、複数の手間のかかる抽出工程が実施されることでよく知られている。現在の市場において利用可能な既存の抽出方法は、精製カラム、回転器、遠心機、および窒素蒸発器を含む多数の機器を必要とする。溶媒が必要なことも多く、試料の確実な識別が損なわれる。
【００２７】
検体の定量化は、当業者に公知の任意の技術で実行可能である。本発明は、概して、検体の定量化を行うための、以下の技術に関する。
【００２８】
・血清または他の水性生体媒体を使用して行われ、使用される測定の原理が基本的には分光光度法である、臨床化学検査または生化学検査
・ＥＬＩＳＡやＥＩＡのような異なる技術的方法に従って行われるイムノアッセイであって、その測定が、分光光度法、蛍光発光、またはルミネセンスによるＣＬＩＡにより行われるもの
本発明の特定の一局面によれば、検体の定量化は、イムノアッセイにより実行され、このイムノアッセイは、第２の検体結合相手を使用して行われる。
【００２９】
本発明の特定の一局面によれば、第１および第２の検体結合相手の少なくとも一方、および、例えば、第１および第２の検体結合相手のそれぞれが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、改変抗体、ヒト化抗体、ｓｃＦＶ、またはＦａｂフラグメントであり得る。
【００３０】
本発明の特定の一局面によれば、第１および第２の検体結合相手は同一であるか、または、互いに異なる。
【００３１】
試料中に低濃度で存在する検体を定量化するための好適な方法の１つは、競合結合方法によるものである。この競合結合方法は、検体が小型分子であって、複数の結合の可能性がない場合に必要とされる。適切な競合結合方法としては様々なものがあり、当業者にはよく知られているであろう。典型的な競合結合方法においては、検体結合相手を、検体の標識形態と、同じ検体の非標識形態を含有していると思われる試料とに接触させる。
【００３２】
検体結合相手に結合した標識検体の量は、上記試料中の非標識検体の割合を示す。あるいは、競合結合方法においては、検体の標識形態に結合した検体結合相手を用意し、この検体結合相手に検体の非標識形態を含有していると思われる試料を添加し、存在する非標識検体の量を示す、置換された標識検体の量を測定する。
【００３３】
さらなる特定の一局面によれば、本発明の方法は、完全自動化して実行可能である。本発明のさらに好ましい一局面によると、上記の方法は、自動イムノアッセイ分析器のような、自動分析装置によって実行される。
【００３４】
上記方法に固有の革新は、分析前段階を手動で実行、または、別個の機器を使用して実行する代わりに、同一の装置で完全自動化している点である。
【００３５】
本発明の一局面によると、供給、ピペッティング、インキュベート、混合のすべての工程が、上記自動分析装置によって管理される。
【００３６】
本発明は、さらに、本発明に係る方法を実行するよう構成された自動分析装置に関し、より具体的には、次のような自動分析装置に関する。
【００３７】
複数の容器と、
略垂直な回転軸を有し、当該回転軸周りに回転自在に駆動されるロータであって、径方向外方に開口する凹部を画定するロータと、
上記ロータの上記凹部内に、上記容器を装填するのに適した装填装置と、
上記ロータの上記凹部内に受容されている上記容器に、試薬および試料を供給するのに適した、少なくとも１台のサンプリング兼ピペッティング装置と、
上記ロータから取り出された１つの容器を受容すること、および磁場を生成することに適した磁気沈降兼洗浄モジュールであって、当該磁気沈降兼洗浄モジュールに受容されている１つの容器から流体をピペットで移すのに適したピペッティング機を備える磁気沈降兼洗浄モジュールと、
上記ロータから取り出された１つの容器を受容するのに適した上部開口ハウジングと、上記上部開口ハウジングの近傍に配置された第１の磁場生成部とを備える、磁気分離モジュールとも称される磁気吸着モジュールと、
上記ロータから取り出された１つの容器の受容、およびこの取り出された容器に含まれる検体の定量化に適した定量化装置とを備え、
上記サンプリング兼ピペッティング装置は、磁気吸着モジュールに受容されている１つの容器から、上記ロータに受容されている別の容器に、任意の量の溶液を移すことに適している、自動分析装置である。
【００３８】
したがって、溶出液の使用により、第１の容器に含まれる検体が、磁性粒子から分離されると、上記ロータは上記第１の容器を磁気吸着モジュール内に移送する。磁気吸着モジュールは、第１の容器に含まれる磁性粒子を、第１の容器の内壁部に引き寄せる。その後、サンプリング兼ピペッティング装置が、第１の容器内の溶出液を一定量、磁性粒子を除いて、吸い上げ、この溶出液を、ロータに受容されている第２の容器に分注する。
【００３９】
この第２の容器は、具体的には、溶液中の検体の定量化に使用される。上記溶液中の検体の濃度は、競合結合方法のような、当業者に公知の方法で測定される。競合結合方法は、検体の分子が小さく、複数の結合の可能性がない場合に必要である。適切な競合結合方法には様々なものがあるが、当業者にはよく知られているであろう。
【００４０】
本発明の一局面によると、上記自動分析装置は、制御ユニットを備え、当該制御ユニットは、本発明の方法を実行するために、上記自動分析装置の複数の装置およびモジュールを制御する。
【００４１】
本発明の一局面によると、第１の磁場生成部は、上記上部開口ハウジングの近傍に配置されている。
【００４２】
本発明の一局面によると、上記第１の磁場生成部は、上記上部開口ハウジング内に受容された容器の側壁に沿って延びるよう構成されている。
【００４３】
本発明の一局面によると、上記第１の磁場生成部は、上部開口ハウジング内に受容されている容器に含まれる磁性粒子を、当該容器の内壁部に引き寄せるよう構成されており、好適には、当該容器の側壁内部に引き寄せるよう構成されている。
【００４４】
本発明の一局面によると、上記磁気沈降兼洗浄モジュールは、磁場を生成するために配置された第２の磁場生成部を備える。
【００４５】
本発明の一局面によると、上記ピペッティング機は、上記磁気沈降兼洗浄モジュール内に受容されている容器に洗浄液を供給するのに適する。
【００４６】
本発明の一局面によると、上記少なくとも１台のサンプリング兼ピペッティング装置は、ロータに受容されている容器に、塩基性溶液と、方法用緩衝液と、中和溶液とを供給するのに適している。
【００４７】
本発明の一局面によると、上記少なくとも１台のサンプリング兼ピペッティング装置は、上記磁気吸着モジュールに受容されている容器から、検体を含む任意の量の溶出液を吸い上げ、当該溶出液をロータに受容されている別の容器に分注するのに適している。
【００４８】
本発明の一局面によると、上記少なくとも１台のサンプリング兼ピペッティング装置は、第１および第２の収容ゾーンから、分析対象の試料および試薬をサンプリングすることに適しており、これら試料と試薬とをロータの凹部に配置された容器に移送するのに適している。
【００４９】
本発明の一局面によると、上記磁気吸着モジュールは、廃棄物容器の上方に配置されている。
【００５０】
本発明の一局面によると、上記の上部開口ハウジングは、外方および内方、具体的には、径方向外側および径方向内側に開口している。
【００５１】
本発明の一局面によると、定量化装置は、取り出された容器に含まれる検体の、例えば濃度のような量を測定または判定するように構成されている。
【００５２】
本発明の一局面によると、定量化装置は、イムノアッセイや競合結合アッセイのような結合アッセイによって、検体の例えば濃度のような量を測定または判定するように構成されている。
【００５３】
本発明の一局面によると、定量化装置は、ルミネセンスを発生させて読み取るルミノメータである。この定量化装置は、ロータから取り出された容器を受容するのに適した遮光室と、発生したルミネセンスを定量化するのに適した光電子増倍管とを備える。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、本発明の自動分析装置の斜視図である。
【図２】図２は、図１に示す自動分析装置の部分斜視図である。
【図３】図３は、図１に示す自動分析装置の部分斜視図である。
【図４】図４は、本発明に係る、試料中の検体の量の判定方法を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
添付の図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【００５６】
本発明に係る、試料中の検体の量を判定するための自動分析装置２を図１〜図３に示す。
【００５７】
自動分析装置２は、試薬と分析対象の試料を収容するための第１の部分３と、測定および分析のための第２の部分４とを備える。第１の部分３は、試料カートリッジ５を受容するのに適した第１の収容ゾーン３ａを含む。上記試料カートリッジ５の各々は、１つの試料キャリア５ａと当該試料キャリア５ａ上に配置された試料容器５ｂとを含む。上記第１の部分３は、また、試薬カートリッジ６を受容するのに適した第２の収容ゾーン３ｂを含む。上記試薬カートリッジ６の各々は、１つの試薬キャリア６ａと当該試薬キャリア６ａ上に配置された試薬容器６ｂとを含む。上記試料容器に含まれる試料は、血液試料、血清、または血漿であってもよい。上記試薬容器に含まれる試薬は、溶出液、中和溶液、緩衝液、脱脂剤、または、検体結合相手が移植またはコーティングされた磁性粒子を含む溶液であってもよい。そのような溶液としては、定量化する検体に対応する抗体により官能化された磁性ナノ粒子を含有する溶液が挙げられる。
【００５８】
自動分析装置２は、さらに、略垂直な回転軸を有するとともに、モータ（図示省略）により上記回転軸周りに回転自在に駆動されるロータまたは回転ラック７を備える。ロータ７には、径方向外方に開口する凹部８が画定されている。
【００５９】
自動分析装置２は、反応キュベット１１を収容し、当該反応キュベット１１をロータ７の凹部８に装填するのに適した、装填装置９をさらに備える。
【００６０】
また、自動分析装置２は、サンプリング兼ピペッティング装置１３を備える。このサンプリング兼ピペッティング装置１３は、第１の収容ゾーン３ａに受容されている試料カートリッジ５から、試料をサンプリングすることと、第２の収容ゾーン３ｂに受容されている試薬カートリッジ６から試薬をサンプリングすることに適している。サンプリング兼ピペッティング装置１３は、また、サンプリング後の試料および試薬を、ロータ７の凹部８に受容された反応キュベット１１に分注することにも適している。
【００６１】
特に、サンプリング兼ピペッティング装置１３は、サンプリング針１５を有するサンプリングヘッド１４を備える。サンプリング兼ピペッティング装置１３は、さらに、第１の水平方向Ｄ１に沿って自動分析装置２の筐体に対して変位可能な第１の支持体１６と、この第１の支持体１６により支持されるとともに、上記第１の水平方向Ｄ１に直交する第２の水平方向Ｄ２に沿って第１の支持体１６に対して変位可能な第２の支持体１７とを備える。サンプリングヘッド１４は、第２の支持体１７に支持されるとともに、垂直方向Ｄ３に沿って第２の支持体１７に対して変位可能である。
【００６２】
サンプリング兼ピペッティング装置１３は、さらに、第１の支持体１６を第１の水平方向Ｄ１に沿って変位させるのに適した第１の変位手段１８と、第２の支持体１７を第２の水平方向Ｄ２に沿って変位させるのに適した第２の変位手段１９と、サンプリングヘッド１４を垂直方向Ｄ３に沿って変位させるのに適した第３の変位手段２１とを備える。
【００６３】
サンプリングヘッド１４は、好適には、サンプリング針１５を振動させるのに適している。これにより、サンプリング針１５が反応キュベット１１の内部に配置されているときに、反応キュベット１１の内容物を混合できる。
【００６４】
自動分析装置２は、さらに、ロータ７に対して径方向に配向された、磁気沈降兼洗浄モジュール２３を１台以上備えている。各磁気沈降兼洗浄モジュール２３は、永久磁石や電磁石が磁場を生成するよう配置された、永久磁石や電磁石のような磁場生成部を有する沈降部２４と、沈降部２４に配置された反応キュベット１１から液体内容物を除去するとともに当該反応キュベット１１に洗浄液を導入するためのピペッティング機２５とを備える。
【００６５】
自動分析装置２は、また、各々が１台の磁気沈降兼洗浄モジュール２３に対応する第１のリニアアクチュエータ（図示省略）を複数備える。第１のリニアアクチュエータの各々は、遠心径方向運動によって、ロータ７から１つの反応キュベット１１を取り出すとともに、対応する磁気沈降兼洗浄モジュール２３の磁場生成部の近傍に当該取り出した反応キュベット１１を配置するのに適している。
【００６６】
したがって、検体結合相手がコーティングされた磁性粒子を含む反応キュベット１１が、磁気沈降兼洗浄モジュール２３内に配置されると、対応する磁場生成部よって上記反応キュベット１１に含まれる磁性粒子がキュベットの内壁部に引き寄せられる。次いで、上記磁性粒子およびこれら磁性粒子に結合した検体を除く、反応キュベット１１の内容物が、上記磁気沈降兼洗浄モジュール２３内のピペッティング機２５によって吸い出される。その後、磁性粒子を洗浄するために、ピペッティング機２５によって、洗浄液が反応キュベット１１内に導入される。所定の時間の後、上記洗浄液は、ピペッティング機２５によって吸い出される。反応キュベット１１の処理が完了すると、上記の磁気沈降兼洗浄モジュール２３に対応する第１のリニアアクチュエータの遠心運動によって、当該反応キュベット１１は再びロータ７に導入される。
【００６７】
自動分析装置２は、さらに、磁気吸着モジュール２６を備える。磁気分離モジュールとも称されるこの磁気吸着モジュール２６は、ロータ７に対して径方向に配向されるとともに、サンプリング兼ピペッティング装置１３の近傍に配置されている。磁気吸着モジュール２６は、ロータ７から取り出された１つの反応キュベット１１を受容するのに適した上部開口ハウジング２７が画定されたケースと、上記ケースに取り付けられるとともに上部開口ハウジング２７の近傍に配置された、永久磁石や電磁石のような磁場生成部２８とを備える。自動分析装置２は、磁気吸着モジュール２６に対応する第２のリニアアクチュエータ（図示省略）を備える。第２のリニアアクチュエータは、遠心径方向運動によって、ロータ７から反応キュベット１１を取り出すとともに、当該取り出した反応キュベット１１を上部開口ハウジング２７内、すなわち、磁場生成部２８の近傍に配置するのに適している。好適には、上記の上部開口ハウジング２７は、径方向外側および径方向内側にも開口している。
【００６８】
なお、上記のサンプリング兼ピペッティング装置１３は、磁気吸着モジュール２６の上部開口ハウジング２７内に受容された反応キュベット１１の内容物の任意の量をサンプリングするのに適しているとともに、ロータ７に受容された別の反応キュベットに上記の量を分注するのに適している。
【００６９】
したがって、溶出液、検体、および磁性粒子を含む反応キュベット１１が、磁気吸着モジュール２６内に配置されると、対応する磁場生成部２８がこの反応キュベット１１に含まれる磁性粒子を反応キュベット１１の内壁部に引き寄せる。磁性粒子を除く反応キュベット１１の内容物が、サンプリング兼ピペッティング装置１３によって吸い出され、ロータ７に受容されている別の反応キュベット１１に分注される。
【００７０】
好ましくは、上記磁気吸着モジュール２６は、廃棄物容器の上方に配置されるとともに、上部開口ハウジング２７に反応キュベット１１が新たに導入されると、この新たに導入された反応キュベット１１が先に導入された反応キュベット１１を上部開口ハウジング２７の外部に押し出すように構成されている。そして、押し出された反応キュベット１１は、重力によって上記廃棄物容器内に落下する。
【００７１】
自動分析装置２は、さらに、反応キュベット１１に含まれる検体を定量化するのに適した、定量化装置２９を備える。この定量化装置２９は、ルミネセンスを発生させて読み取るルミノメータであることが好ましい。定量化装置２９は、特に、ロータ７から取り出された反応キュベット１１を受容するのに適した遮光室３１と、発生したルミネセンスを定量化するのに適した、公知の光電子増倍管（図示省略）とを備え得る。この測定は、測定対象である検体の濃度に左右される。測定が完了すると、反応キュベット１１が定量化装置２９から取り出され、定量化装置２９が備えるリニアアクチュエータの働きにより、その内容物が廃棄物容器に廃棄される。
【００７２】
自動分析装置２は、また、自動分析装置２の上記の装置およびモジュールを制御するよう構成された制御ユニット３１を備える。
【００７３】
自動分析装置２は、さらに、サンプリング兼ピペッティング装置１３のサンプリング針１５を水洗いして汚染除去するのに適した、水洗い・汚染除去システム（図示省略）を備える。
【００７４】
図４には、本発明に係る、試料中の検体の量の測定方法が示されている。この方法は、本発明の上記の自動分析装置２によって実行される。
【００７５】
本発明に係る、試料中の検体の量の測定方法は、次の工程を含む。
【００７６】
・ロータ７に受容されている第１の反応キュベット１１内で、サンプリング兼ピペッティング装置１３を使用して、定量化対象の検体３３を含む試料と、脱脂剤３４と、第１の検体結合相手３６がコーティングされた磁性粒子３５を含有する第１の溶液とを混合する工程（工程Ｓ１）；
・ロータ７を使用して、第１の反応キュベット１１内の混合物をインキュベートし、脱脂剤３４の働きにより脂質を沈殿させ、検体３３を第１の検体結合相手３６に結合させる工程（工程Ｓ２）；
・ロータ７を使用して、第１の反応キュベット１１を磁気沈降兼洗浄モジュール２３の前に移動させる工程；
・ロータ７から第１の反応キュベット１１を取り出し、当該反応キュベット１１を上記磁気沈降兼洗浄モジュール２３の磁場生成部の近傍に配置し、磁気沈降兼洗浄モジュール２３の磁場生成部により磁性粒子３５が第１の反応キュベット１１の内壁部に引き寄せられるようにする工程；
・磁気沈降兼洗浄モジュール２３のピペッティング機２５を使用して、第１の反応キュベット１１から結合していない試薬を吸い上げる工程（工程Ｓ３）；
・磁性粒子を洗浄するために、ピペッティング機２５を使用して、洗浄液を第１の反応キュベット１１に分注する工程；
・ピペッティング機２５を使用して、上記洗浄液を第１の反応キュベット１１から吸い上げる工程；
・洗浄後の第１の反応キュベット１１を、ロータ７に再度装填する工程；
・サンプリング兼ピペッティング装置１３を使用して、溶出液を第１の反応キュベット１１に供給し、結合した検体を溶出させる、すなわち、検体３３を磁性粒子３５から分離させる工程（工程Ｓ４）；
・ロータ７を使用して、第１の反応キュベット１１を、磁気吸着モジュール２６の前に移動させる工程；
・ロータ７から第１の反応キュベット１１を取り出し、当該第１の反応キュベット１１を磁気吸着モジュール２６内に配置し、磁気吸着モジュール２６の磁場生成部２８により磁性粒子３５が第１の反応キュベット１１の内壁部に引き寄せられるようにする工程；
・サンプリング兼ピペッティング装置１３を使用して、第１の反応キュベット１１から、上記溶出液と検体とを吸い上げる工程（工程Ｓ５）
・サンプリング兼ピペッティング装置１３を使用して、上記の溶出液と検体３３とを、ロータ７に受容されている空の第２の反応キュベット１１´に分注する工程（工程Ｓ６）；
・サンプリング兼ピペッティング装置１３を使用して、上記第２の反応キュベット１１¢に、第２の検体結合相手３８がコーティングされた磁性粒子３７を含有する第２の溶液を供給する工程（工程Ｓ７）；および
・第２の反応キュベット１１´に含有される溶出液中の検体を定量化する工程。
【００７７】
以下の実施例に基づき、本発明を例示する。以下の実施例のすべては、限定的でなく、且つ、すべてを網羅しているわけではない。
【００７８】
実施例
実施例１：本発明による、試料中の１．２５Ｄ濃度量の測定
ヒトの血液中の１，２５Ｄの分析は、身体におけるビタミンＤ代謝の効果を示す優れた指標となる。
【００７９】
１，２５Ｄのレベルを判定するための分析方法の開発は困難であったが、これは、主に、血液中の１，２５Ｄの濃度が極端に低いことに起因する。
【００８０】
１，２５Ｄは、自動化システムによる分析または手動による方法を使用した分析に先立って、複数の手間のかかる抽出工程が実施されることでよく知られている。現在の市場において利用可能な既存の抽出方法は、精製カラム、回転器、遠心機、および窒素蒸発器を含む多数の機器を必要とする。溶媒が必要なことも多く、試料の確実な識別が損なわれる。
【００８１】
本発明に係る、試料中の１．２５Ｄの測定は、第１のキュベット内において、１，２５Ｄのための試料事前処理を試料の脱脂により行うことから開始される。脱脂は、１０ｇ硫酸デキストラン（５０ｋ）（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｄ８７８７）２２μＬを、０．５Ｍ塩化マグネシウム１Ｌと試料２１８μＬとに混合したものを用いて行う。
【００８２】
脱脂の直後、１,２５Ｄは、最適化置換溶液（ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）３１４μＬと併用される、抗１,２５Ｄ抗体４６μＬでコーティングした磁性粒子（ＭＰ）上に捕捉される。置換試薬は、１リットルあたり、リン酸水素二カリウム三水和物を４．０３５ｇ、第一リン酸カリウムを０．４８９ｇ、塩化ナトリウムを１９．５ｇ、ＡＮＳＡを４．１９ｇ、ワルファリンを０．２０９ｇ、メタノールを１０４．７ｍＬ含む。抗１，２５ＤでコーティングされたＭＰは、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（登録商標）Ｓｐｅｅｄｂｅａｄｓカルボキシル化粒子１ｇあたり、３６〜１４４ｍｇの抗１，２５Ｄ抗体を結合させることで作製する。ＭＰの直径は０．８μｍであり、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のカタログ番号４５１５２１０５０５０３５０から入手した。１．２５Ｄを粒子上に捕捉するには、脱脂した試料をＭＰとともに、３７℃で１０分間インキュベートすれば十分であった。
【００８３】
ＭＰを、水１Ｌあたり、リン酸水素二カリウム三水和物を０．６ｇ、第一リン酸カリウムを０．９７ｇ、塩化ナトリウムを１．０ｇ、ｔｗｅｅｎ２０を１．０ｇ、ｐｒｏｃｌｉｎ−３００を１．０ｇ、アジ化ナトリウムを０．１ｇ含む洗浄液（ＩＤＳカタログ番号ＩＳ−ＣＷ１００）で洗浄する。ＭＰは、少なくとも４回洗浄する必要があり、その後、ＭＯＰＳナトリウム塩を２３１ｍｇ、ＭＯＰＳを２０９ｍｇ、アジ化ナトリウムを０．９ｇ含むＭＯＰＳ緩衝液により１回洗浄し、反応混合物中の非結合物および沈殿物を取り除く。
【００８４】
０．４Ｎ水酸化ナトリウムを７５μｌ使って、ＭＰ上に捕捉された１，２５Ｄを６分間溶出させる。その後、０．４Ｍクエン酸を２５μＬとアッセイ緩衝液１００μＬとを使用して、中和工程を行い、アッセイ検定物質と同じ塩基性化合物を得る。１,２５Ｄの測定のために、１２０μＬの溶出液を、第１のキュベットから第２のキュベットに移す。
【００８５】
１，２５−ジヒドロキシビタミンＤアッセイ試薬（ＩＤＳカタログ番号ＩＳ−２４００）を利用して、１，２５Ｄを測定する。抽出された１，２５Ｄを含む溶出液１２０μＬを、ビオチン化ヒツジ抗１，２５Ｄ抗体を使用してインキュベートする。次いで、１，２５Ｄ−アクリジニウム配合体を加えるが、これは抗体結合部位について競合する。次に、ストレプトアビジンがコーティングされた磁性粒子を加え、次のさらなるインキュベート工程の後に、磁性粒子を洗浄して非結合物質を取り除く。トリガー試薬の添加に続いて、フラッシュ化学発光反応が開始される。この光シグナルは、相対光ユニット（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔｓ，ＲＬＵ）としての光電子増倍管によって測定されるが、試料中に存在する１，２５Ｄの量と反比例の関係にある。
【００８６】
この方法により、３ｇ／ｄＬトリグリセリド、３００ｍｇ／ｄＬコレステロール、および７．５５ｇ／ｄＬアルブミンまでの、高脂質の試料を扱うことができる。この完全自動化された方法は、実施例２において、ＩＤＳ−ｉＳＹＳ  １，２５Ｄ免疫カプセル（ｉｍｍｕｎｏｃａｐｓｕｌｅ）抽出方法と良好な相関性を示した。
【００８７】
ここでは、抗１，２５Ｄ抗体でコーティングされた磁性粒子および最適化された抽出用試薬を使用すれば、ＭＰを洗浄し且つＭＰから溶出液を収集するための磁気分離機以外には多数の機器を使用する必要なく、ヒトの血清から１，２５Ｄを直接抽出可能であるという知見が得られた。全抽出プロセスにかかる時間は、約２１分であり、最初の結果が得られるまでの時間は、９３分である。
【００８８】
実施例２：既知の方法による、試料中の１，２５Ｄ濃度量の測定
ラベル付ガラス製チューブまたはプラスチック製チューブに試料５００μＬを加え、次いで、１Ｌの０．５Ｍ塩化マグネシウムに１０ｇ硫酸デキストラン（５０ｋ）（Ｓｉｇｍａ社、カタログ番号Ｄ８７８７）を含む脱脂試薬を５０μＬ加え、このチューブ内の試料を脱脂する。これを混合し、２０００ｇで１５分間遠心する。
【００８９】
カプセルにラベル付けをする。カプセルのスクリューキャップをはずす。脱脂済み試料１５０μＬを、１，２５Ｄに非常に特異的なモノクローナル抗体が付加された固相の懸濁液を含むカプセルに加える。キャップを再度しっかりと閉める。カプセルを、室温で、反転させながら９０分間回転させて、１，２５Ｄをモノクローナル抗体に結合させる。
【００９０】
カプセルを３〜５分間直立した状態とし、ゲルを沈降させる。スクリューキャップをはずし、カプセルから底部栓を取る。各カプセルをガラス製チューブまたはプラスチック製チューブに入れ、５００〜１０００ｇで１分間遠心する。
【００９１】
上記カプセルを、水で３回洗浄する。１回の洗浄ごとに、１分間のインキュベートと、次いで５００〜１０００ｇで１分間の遠心とを行う。これにより、潜在的妨害物質を取り除く。
【００９２】
適切にラベル付けされたポリプロピレン製の底部円錐形２ｍＬチューブに、カプセルを移す。１５０μＬのエタノールを使用して、捕捉された１，２５Ｄを３回溶出させる。１回の溶出ごとに、１〜２分間のインキュベートと、次いで５００〜１０００ｇで１分間の遠心とを行う。
【００９３】
カプセルを廃棄する。溶出液が入ったマイクロチューブを、加熱ブロックまたは水槽に入れ、窒素の緩流下、４０℃で４０〜６０分間蒸発させる。各マイクロチューブを２００μＬのアッセイ緩衝液で再調整する。
【００９４】
実施例１に記載のように、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤアッセイ試薬（ＩＤＳカタログ番号ＩＳ−２４００）を利用して、再調整後の免疫精製された試料を測定する。
【００９５】
全抽出プロセスにかかる時間は、約４時間であり、最初の結果が得られるまでの時間は、約５時間である。
【００９６】
言うまでもなく、本発明は、上述の非限定的な実施形態に限定されるものではなく、反対に、その実施形態のすべてを包含する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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