(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出する方法であって、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを、液体形態のゲル形成剤を含む複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；
(iv) 微小液滴をゲルビーズに変換するステップ；および
(v) ゲルビーズにおけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップ
を含み、ここでゲルビーズにおけるポリペプチドの凝集物の形成が、サンプル中の1つ以上の凝集シードの存在を示す、前記方法。
【請求項２】
ポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病のリスクがある被験体を同定するかまたは被験体におけるポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を診断、評価もしくはモニタリングするための指標を得る方法であって、
被験体から得られたサンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出するステップを含み、ここで検出するステップが、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを、液体形態のゲル形成剤を含む複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；
(iv) 微小液滴をゲルビーズに変換するステップ；および
(v) ゲルビーズにおけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップ
を含み、ここでゲルビーズにおけるポリペプチドの凝集物の形成がサンプル中の1つ以上の凝集シードの存在を示し、またサンプル中の凝集シードの存在が、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している、前記方法。
【請求項３】
コンフォメーション病が、アルツハイマー病、パーキンソン病、シヌクレイノパチー、タウオパチー、プリオン病、脳β-アミロイド血管症、CADASIL症候群、前頭側頭葉変性症、FTLD-FUS、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、トリプレットリピート疾患、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アレキサンダー病、セイピノパチー、家族性アミロイド神経障害、老人性全身性アミロイドーシス、セルピノパチー、II型糖尿病、大動脈内側アミロイドーシス、ApoAI、AIIまたはAIVアミロイドーシス、フィンランド型家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎/ミオパチー、ロドプシン変異を伴う網膜色素変性症、甲状腺髄様癌、心臓心房性アミロイドーシス、角膜ジストロフィー、皮膚苔癬アミロイドーシス、肺胞タンパク症、歯原性(ピンドボルグ)腫瘍、アテローム性動脈硬化、または遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドの凝集シードを含まない生成物を調製する方法であって、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを、液体形態のゲル形成剤を含む複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；
(iv) 微小液滴をゲルビーズに変換するステップ；
(v) ゲルビーズにおけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップであって、ここでポリペプチドの凝集物の形成が、ゲルビーズ中の1つ以上の凝集シードの存在を示す、前記ステップ；および
(vi) ポリペプチドの凝集シードが存在しないと認められる場合、生成物に含めるためにサンプルを受け入れるステップ
を含む、前記方法。
【請求項５】
ゲル形成剤が、多糖、ポリペプチド、ポリアクリルアミド、アルギン酸塩、ゼラチンまたはアガロースである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
微小液滴が冷却によりゲルビーズに変換される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
試験物質がポリペプチドの凝集に与える影響を測定する方法であって、以下のステップ：
(i) 試験物質、ポリペプチドのモノマーおよび液体形態のゲル形成剤を含む、微小液滴を、形成するステップ；
(ii) ポリペプチドの凝集に適した条件下で微小液滴をインキュベートするステップ；
(iii) 微小液滴をゲルビーズに変換するステップ；および
(iv) ゲルビーズ中に存在するポリペプチドの凝集物の量を決定し、その量を対照ビーズと比較するステップ
を含む、前記方法。
【請求項８】
ポリペプチドのモノマーが蛍光標識され、ポリペプチドの凝集物のその後の形成が、蛍光シグナルを検出することによって決定される、請求項１〜７のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
蛍光シグナルの検出が、形成されたポリペプチド凝集物の構造に関する情報を提供する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光シグナルが、蛍光異方性イメージング顕微鏡法(FAIM)を使用して、フローサイトメーターを使用して、蛍光寿命顕微鏡法を使用して、直接確率論的光学再構成顕微鏡法(dSTORM)を使用して、構造化照明顕微鏡法を使用して、FRET顕微鏡法を使用して、または円偏光二色性を使用して、検出される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
形成されたポリペプチド凝集物の構造を分析するステップを含む、請求項１〜１０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
形成されたポリペプチド凝集物の構造が、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している、請求項２に従属する場合の請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
微小液滴が、ポリペプチドの凝集物の存在下でシグナルを生成するレポーター物質を含有し、ポリペプチドの凝集物のその後の形成が、レポーター物質により生成されるシグナルを検出することによって決定される、請求項１〜１２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
サンプルを複数の微小液滴に分割するステップが、サンプルを微小液滴に乳化するステップを含む、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
油中水型エマルションが形成される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
2つ以上の技術またはアッセイが、ポリペプチド凝集物を検出しまたは分析するために使用される、請求項１〜１５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
対照ビーズがポリペプチドの凝集のモジュレーターを含まず、対照ビーズと比較して低下した量の凝集物は、試験物質がポリペプチド凝集阻害剤であることを示し、また対照ビーズと比較して増加した量の凝集物は、試験物質がポリペプチド凝集促進剤であることを示す、請求項７、または請求項７に従属する場合の請求項８〜１６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
対照ビーズがポリペプチドの凝集阻害剤を含み、またここで対照ビーズと同程度の凝集物の量は、試験物質がポリペプチド凝集阻害剤であることを示し、対照ビーズと比較して増加した量の凝集物は、試験物質がポリペプチド凝集阻害剤ではないことを示す、請求項７、または請求項７に従属する場合の請求項８〜１６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
試験物質がゲルビーズ中に保持される、請求項７〜１８のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２０】
試験物質が、試験物質中のまたは試験物質に結合した第2の部分に対する親和性を有する第1の部分を含む粒子の微小液滴中への含有によりゲルビーズ中に保持される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも50個の試験物質が並行して分析される、請求項７〜２０のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２２】
ポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を治療するための医薬組成物を製造する方法であって、以下のステップ：請求項７〜２１のいずれか1項に従って、試験物質がポリペプチドの凝集に与える影響を測定するステップ；ポリペプチドの凝集を阻害する物質を選択するステップ；場合により該物質を改変するステップ；および該物質を製薬上許容される担体または賦形剤と組み合わせるステップを含む、前記方法。
【請求項２３】
ポリペプチドが、アミロイドβペプチド、タウタンパク質、プリオンタンパク質、α-シヌクレイン、TDP-43、FUS、ハンチンチン、セルピン、トランスサイレチン、ノッチ3、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、セイピン、膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)、プロIAPP、アポリポタンパク質AI、AIIまたはAIV、ゲルゾリン、β2ミクログロブリン、ロドプシン、ケラチン、チューブリン、サーファクタントタンパク質C、歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、血清アミロイドA、メジン、またはリゾチームである、請求項１〜２２のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
アミロイドβペプチドが、Aβ1-40またはAβ1-42である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、凝集タンパク質のアッセイの分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
高齢の生物においてタンパク質がミスフォールドして凝集する傾向の増加は、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン病およびプリオン病などの多くの高齢の病気の根底にあると考えられている。これらの疾患は、特定のポリペプチドの凝集物によって特徴づけられ、アルツハイマー病(AD)の場合、これらは細胞外プラークおよび細胞内のもつれである。プラークは、構成ペプチド(アミロイドベータ(Aβ))の過剰産生が、稀な家族性形態のADを引き起こすのに十分であるため特に興味深い。
【０００３】
これらのコンフォメーション病を引き起こす凝集の根底にある基本的過程を理解することはかなり興味深く、この理解は、治療法の開発と共に、凝集を遅らせたりまたは停止させるのに役立つはずである。コンフォメーション病の病理においてタンパク質凝集が有する中心的役割を考慮すると、当技術分野において、治療法を同定し開発するため、物質が凝集に与える影響を試験するための改善された方法に対する必要性がある。
【０００４】
生物学的に毒性のタンパク質凝集物の生成はin vitroで研究することが可能であり、そこでは、ラグ相と呼ばれる最初の遅延の後に反応が自然に起こるのが見られる。シーディング(播種)と呼ばれる過程において、幾つかの予め形成された凝集物の添加が、特にアミロイド線維が最終生成物である場合に、タンパク質凝集物の形成を大きく促進することも観察される。このような凝集シードの存在は、線虫およびマウスなどの実験生物から得られたバルクサンプル中で測定され、またヒト組織中で観察されている[1-3]。類似のシーディング過程は、牛海綿状脳症および変異型クロイツフェルト・ヤコブ病などのプリオン病において見られる感染性の基礎であると考えられる。さらに、一般的な神経変性疾患に罹患している患者の脳内の病理の広がりは同様に起こり得る。実際に、シーディングは、患者および彼らの介護者を非常に苦しませる苛酷な臨床進行を直接もたらし得る[4]。
【０００５】
現在の技術は、アミロイド様タンパク質凝集物に曝されると蛍光シグナルを生成するコンゴレッド、チオフラビンT、チオフラビンSおよび蛍光コンジュゲート化オリゴチオフェン[5]などの色素を使用して、肉眼サンプル中のタンパク質凝集の測定を可能とする。しかし、これらのバルク相技術は、バックグラウンドの自然シーディングがシーディングの特異的影響をマスキングし、また任意の特異的シグナルが典型的な試験溶液のバルクに希釈されるため、診断試験として使用するには感度が不十分である。末梢組織ならびに体液(例えば血液および尿)において低濃度の凝集シードを検出する場合は、高感度且つ高特異性の試験が求められるだろう[1]。アルツハイマー病などのタンパク質の凝集によって引き起こされるコンフォメーション病の現在の診断試験は、凝集するタンパク質が健康な個体中に存在し、このためこれらのタンパク質のバイオマーカーとしての有用性が限られていることにある程度起因して、典型的には神経心理学的試験に基づくアルゴリズムおよび脳イメージングに依存している。従って、当技術分野では、タンパク質の特定のコンフォメーションまたは特定のコンフォメーションを有するポリペプチドの凝集物を示す臨床的に関連する種の存在を正確に検出することができる新たな改善された診断的アッセイに対する必要性がある。改善されたアッセイはまた、コンフォメーション病を引き起こすタンパク質の凝集の根底にある臨床的に関連する過程をモジュレートする能力について候補治療法をスクリーニングするためにも必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第1の態様において、本発明は、サンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出する方法であって、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；および
(iv)微小液滴におけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップ
を含み、ここで微小液滴におけるポリペプチドの凝集物の形成が、サンプル中の1つ以上の凝集シードの存在を示す、前記方法を提供する。
【０００７】
ポリペプチドの凝集シードは、低濃度の場合、特異的且つ高感度に検出することが困難である。これは、一般的には、凝集シードを含むサンプルが関連ポリペプチドのモノマーと接触し、凝集シードによってシードされたポリペプチド凝集物の形成が検出される凝集シーディングアッセイにより、ポリペプチドの凝集シードが検出されるためである。しかし、凝集シードが低濃度で存在する場合、凝集シードによってシードされた凝集は、ポリペプチドモノマーの自然凝集に埋もれてしまい、このバックグラウンドの自然凝集を超えて、凝集シードによって、シードされた凝集物の存在を特異的且つ高感度に同定することは困難である。自然凝集は比較的遅く、バルク相溶液中で空間的に均一である。バルク相中では、シグナルの均一な低レベルの生成は、空間的に局在している、シグナルの高効率生成と区別することができない。これは、バルク相中では、局所的に生成されたシグナルがバルクに拡散し、このため自然に生成されたシグナルと区別できなくなるからである。
【０００８】
本発明の方法は、シードされた凝集を特異的に検出し、またサンプルを関連ポリペプチドのモノマーと接触させてさらにサンプルを複数のマイクロ流体液滴にコンパートメント化することによってシードされた凝集をバックグラウンドの自然凝集と区別することができる。サンプルを複数の微小液滴中に分割することにより、任意の凝集シードの局所濃度は、凝集シードを含む微小液滴中のシードされた凝集が、バックグラウンドの自然凝集を超えて特異的且つ高感度に検出可能となる程度にまで増加する。
【０００９】
従って、サンプルを微小液滴にコンパートメント化することは、凝集アッセイを使用して凝集シードを検出するために特に有利であり、というのも凝集アッセイに必要とされるポリペプチドのモノマーは自然に凝集しやすく、これがバックグラウンドシグナルまたはノイズを生じ、凝集シードに由来する凝集物の特異的検出を困難にするためである。複数の微小液滴を分析することにより、それぞれの微小液滴が、凝集シードを含有していたかまたは含有していなかったか確実に決定することが可能であり、本発明は、初期サンプル中の凝集シードの存在の高感度且つ定量的な分析を可能とする。
【００１０】
バルク相中で実施される古典的な生化学実験は、サンプル中のタンパク質の凝集シードの存在を有用に報告するために十分に高感度または特異的ではない。現在の方法の感度が不十分な検出限界を克服するため、本発明者らは、マイクロ流体液滴(例えば、μm直径およびピコリットル体積を有する油中水型液滴)へのコンパートメント化を用いる方法を開発した。バルク相の、多数の小さなリアクター(例えば約107/ml)へのフラグメント化は、高い局所濃度を作り出す。例えば、サンプル中に1つのシードのみが存在する場合、107個の液滴コンパートメントの1つの中の有効濃度は、107倍増加する。本発明の根底にある原理は、図1に模式的に示される。
【００１１】
本発明の方法は、そのアッセイを使用して患者サンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出することができるため、病気の診断およびモニタリングにおいて特に有用である。従って、本発明はまた、ポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病のリスクがある被験体を同定する方法、または被験体におけるポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を診断、評価もしくはモニタリングする方法であって、被験体から得られたサンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出するステップを含み、ここで検出ステップが、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；および
(iv) 微小液滴におけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップ
を含み、ここで微小液滴におけるポリペプチドの凝集物の形成がサンプル中の1つ以上の凝集シードの存在を示し、またサンプル中の凝集シードの存在が、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している、前記方法も提供する。
【００１２】
本発明者らは、極めて低濃度の凝集シードの存在を高感度且つ特異的に検出する方法を開発した。従って、本発明は、ヒト被験体から得られたサンプル中の凝集シードの存在を検出し、さらに凝集シードの存在をコンフォメーション病のリスク、存在、または重篤度と相関させることを可能とする。上述のとおり、複数の微小液滴を分析することにより、それぞれの微小液滴が凝集シードを含有していたかまたは含有していなかったかを確実に決定することが可能であり、本発明は、初期サンプル中の凝集シードの存在の高感度且つ定量的な分析を可能とし、またこれは有用な診断または予後診断を行うことを可能とする。
【００１３】
本発明の方法は、コンフォメーション病の診断において新たなクラスのバイオマーカーを分析することを可能とするため、特に有利である。コンフォメーション病は、多くの場合、健康な個体中に存在する内因性タンパク質によって引き起こされ、これが病気のバイオマーカーとしてのこれらのタンパク質の濃度を単に測定する有用性を制限する。これは、有毒種を生成するのが、タンパク質のコンフォメーションまたは特定のコンフォメーションのポリペプチドの幾つかのコピーの自己会合であるためである。高感度且つ特異的に凝集シードを検出することにより、本発明は、コンフォメーション病の根底にある臨床的に関連する病理学的形態のタンパク質の検出を可能とする。さらに、凝集シードを検出することにより、本発明の方法は、大きな凝集物が形成される前にコンフォメーション病の早期診断を可能とする。また、本発明は、サンプル中の構造的エピトープの存在を単に報告するのではなく、活性(凝集のシーディング)の定量化を伴うため、著しい進歩も示す。このシーディング活性は、病気の進行において基本的に重要であり、このためこのような測定は、臨床における診断的価値および予後診断的価値を有する。
【００１４】
さらに、コンフォメーション病の根底にあるタンパク質は、一般的には、簡易な診断試験ではアクセスすることができない脳内で凝集する。凝集シードを高感度且つ特異的に検出することにより、本発明は、末梢体液(例えば血液および尿)中での臨床的に関連する病理学的形態のタンパク質の検出を可能とし、これは、診断的試験には実用的である。コンフォメーション病の根底にあるタンパク質の凝集シードは末梢体液中に存在するが、より簡単にアッセイされ得るより大きな凝集物は、脳などのアクセスしにくい組織だけに存在する。
【００１５】
有意には、本発明の方法の感度は、凝集シードを、末梢組織(例えば血液および尿)において、それらが見られる極めて低濃度で検出することを可能とする。上記で説明したとおり、サンプルを関連ポリペプチドのモノマーと接触させ、サンプルを複数のマイクロ流体液滴にコンパートメント化し、またポリペプチド凝集物の形成を検出する凝集アッセイを実施することにより、本発明の方法は、低濃度での凝集シードの特異的且つ高感度な検出を可能とする。
【００１６】
診断方法に加えて、本発明のアッセイは、凝集シードを含まない試薬または生成物を調製するため、また試験反応中に生成された凝集シードの量を定量するために有用であろう。例えば、本発明のアッセイは、凝集シードの形成に影響を与える試薬の能力を評価するのに有用となろう。
【００１７】
特定の実施形態において、微小液滴は、油中水型エマルションなどのエマルションの液滴を含み、また本発明の方法は、油中水型エマルションなどのエマルションの形成を含む。エマルションは、標準的な装置および技術を使用して容易に生成することができる。微小液滴は、マイクロ流体デバイス中で生成することが可能であり、マイクロ流体デバイスで取扱いやすく、特に、本発明におけるように大量のアリコートを分析するのに有用なハイスループットスクリーニングに適している。また、結果として得られる液滴は多分散系であるが、激しい撹拌、ボルテックス、振盪および押し出しステップを伴う、バルクエマルションを生成するための方法も数多くある。
【００１８】
特定の実施形態において、微小液滴はゲル形成剤を含み、微小液滴はゲルビーズに変換される。好ましくは、微小液滴は、微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートした後、ゲルビーズに変換される。微小液滴をゲルビーズに変換することにより、ポリペプチド凝集物は、洗浄を経るにもかかわらずビーズ中に保持される。これは、未凝集モノマーを洗い流すことができるため、ポリペプチド凝集物の極めて高感度且つ特異的な検出を可能とする利点を有している。さらに、ゲルビーズは安定且つ弾力的であり、異なる反応条件間を移行することが可能であり、初期被験体サンプルのコンパートメント化を依然として維持しながら、ポリペプチド凝集物のさらなる詳細な分析を可能とする。従って、特定の実施形態において、微小液滴はゲルビーズに変換され、ポリペプチドモノマーは、洗浄によってゲルビーズから除去される。特定の実施形態において、ゲルビーズは、複数の異なるアッセイに供される。
【００１９】
ゲル形成剤を含む微小液滴中で凝集アッセイを実施し、さらに微小液滴をゲルビーズに変換する利点は、本発明の第2の態様に適用することができる。この第2の態様において、本発明は、試験物質がポリペプチドの凝集に与える影響を測定する方法であって、以下のステップ：
(i) 試験物質、ポリペプチドのモノマーおよび液体形態のゲル形成剤を含む微小液滴を形成するステップ；
(ii) ポリペプチドの凝集に適した条件下で微小液滴をインキュベートするステップ；
(iii) 微小液滴をゲルビーズに変換するステップ；および
(iv) ゲルビーズ中に存在するポリペプチドの凝集物の量を決定し、その量を対照ビーズと比較するステップ
を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
本発明者らは、特に高感度且つ効率的な、ポリペプチド凝集のモジュレーターをアッセイする方法を開発した。ゲル形成剤を含む微小液滴中でアッセイを実施し、この微小液滴をゲルビーズに変換することにより、形成されたポリペプチド凝集物はゲルビーズ中に固定化される。本発明のアッセイは、ゲルビーズを広範に洗浄して、例えばポリペプチドモノマーおよび他の反応物を除去することが可能であり、ポリペプチド凝集物はゲルビーズに保持されるため、特に高感度である。これは、例えば、未凝集物質に由来するバックグラウンドシグナルを低下させる。本発明の方法は、ゲルビーズが安定しており、弾力的で且つ取扱い易いため、特にハイスループットスクリーニングに適している。従って、本発明のアッセイは、多数のゲルビーズを分析することを可能とする。多数のゲルビーズの分析に対応することにより、本発明の方法は、極めて稀な事象を検出することが可能であるため、高められた感度を提供する。さらに、多数のビーズを迅速に試験する能力は、多くの化合物を試験することを可能とする。さらに、ゲルビーズの弾力性は、凝集物が失われることなく、また初期被験体サンプルのコンパートメント化を依然として維持しながら。それらが洗浄されて様々な条件に供されることが可能であり、これが複合アッセイの実施を可能とすることを意味する。
【００２１】
ビーズマトリックスの多孔質構造は、小分子成分および緩衝液がビーズを自由に出入りしながら、凝集したタンパク質を保持する役割を果たす。このようにしてビーズは凝集した生成物の「タイムカプセル」となり、多くの下流の分析方法に供され得る。結果として得られたゲルビーズを洗浄し、小さなオリゴマーおよび分子を除去できることから、捕捉されたタンパク質凝集物に由来する相対シグナルは増加するが未凝集物質に由来するバックグラウンドは除去されるため、例えば蛍光ベースのアッセイの感度が増強される。小さな液滴体積(例えば、47.7pL)は、経済的な実験および多様な冗長性を提供する。例えば、1μLの全反応体積は、105までの同一の液滴およびビーズを生成することが可能であり、平均化技術または個別分析のいずれかのための膨大なプールを構成する。
【００２２】
従って、本発明は、出現するタンパク質凝集物がゲル「ケージ(cage)」で構成されたマイクロビーズ中に閉じ込められる、タンパク質の自己集合反応の研究のための新規なアッセイを提供する。ビーズは、凝集反応がほぼ生理的濃度で進行することを可能とする独特の特性を有する。「ケージ」は、液滴形成ステップの間、液体ゲルを、溶質(例えば、ペプチドおよび薬剤等を含有する水溶液)を含有する試薬と一緒に共コンパートメント化することによって形成される。液滴は、昇温にて液体形態の油相中で形成され、凝集反応を進行させるためのエマルションとして保管することができる。エマルションは氷上で冷却され、研究対象の過程が完了する前または後にビーズの固化を生じさせることができる。次いで、油相が除去され、ビーズが洗浄される。ゲルマトリックス(例えばアガロースポリマーマトリックス)の多孔性内部構造は、大きな凝集物がビーズから抜け出るのを防ぐ一方、可溶性ペプチド、小分子または溶媒は容易に除去される。保持された凝集物は、例えば、蛍光または他の方法により、高度に反復可能且つ定量的な様式で容易に分析することができる。上記の技術は、神経毒性タンパク質の自己集合の取扱い、操作および分析において卓越した柔軟性を提供する。すなわち、試薬を添加したり除去することが可能であり、濃度を変化させ、また結果として生じる分析対象の凝集物は、凝集の動態および結果として生じるアミロイド構造の形態について光学的に情報提供することができる。本発明は、この技術の最初の実証を提供し、Aβの変異体などのタンパク質の凝集が、ほぼ生理的濃度において定量的方法で研究することができることを示す。本発明の方法を使用して、幾つかの光学的技術(蛍光寿命イメージングおよび光学的超解像イメージングなど)を適用して、保持された凝集物を分析することが可能であり、それは形成している凝集物の形態について直接的洞察を与える。さらに、凝集物形成の過程は、保持された凝集物の蛍光の定量化により(内部蛍光(シードされた蛍光モノマーとの共凝集の生成物の蛍光)を測定することにより、または、例えばチオフラビンTおよびS、コンゴレッドなどのアミロイド色素を用いた出現している凝集物の染色後の蛍光の測定により)、例えば、フローサイトメトリー(FACS)分析またはイメージング技術によって、経時的にモニターすることができる。上記の技術は、凝集改変剤として作用し得る薬剤の迅速なスクリーニングに特に有用である。
【００２３】
本発明のこの態様はまた、ポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を治療するための医薬組成物を製造する方法であって、以下のステップ：上記の方法に従って、試験物質がポリペプチドの凝集に与える影響を測定するステップ；ポリペプチドの凝集を阻害する物質を選択するステップ；場合により上記物質を改変するステップ；および上記物質を製薬上許容される担体または賦形剤と組み合わせるステップを含む、前記方法も提供する。本発明のアッセイの感度、およびそのハイスループットスクリーニングへの適合性は、コンフォメーション病の根底にあるポリペプチド凝集に直接影響を与える治療法を作成するためのより効率的な方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】マイクロ流体(バルク相ではない)技術がどのように稀なシードされた凝集事象の検出を可能とするかを模式的に示す。
【図２】単分散ゲルビーズの調製。(A)は、単分散液滴が形成されるPDMSチップを示す。マイクロ流体デバイスは、キャリアオイル(i)、アガロース溶液(ii)および例えばAβペプチド溶液(蛍光標識されたAβペプチド溶液など)が添加されたサンプル(iiiおよびE)のための3つの入口を有する。水性流体相(iiおよびiii)は、(B)に示される接合部の上部で混合され、油中水型エマルション液滴(F)は、水性流が油流(i)と接触するときに「破断流(break-off flow)」によって作成される。入口(ii)と(iii)は、1つの入口を構成していてもよい。新しく出現する液滴(F)は、出口(iv)を通って出る。アガロースゲルビーズは、油中水型エマルション液滴が37℃からより低い温度(アガロースの種類に応じて4〜25℃)へと冷却されるときに生じ、それがアガロースのゲル化を引き起こす。「液滴テンプレート」中でゲルビーズが形成されると、液滴境界が崩壊しアガロースゲルビーズが得られる(D)。次いで、ゲル含有水性液滴をインキュベートし、蛍光レポーターペプチドをサンプル由来シード上に凝集させる(G)；この反応は液滴中で、またゲルが存在する場合にはゲルマトリックス物質中で起こる。インキュベーションステップの後、ゲルビーズは油性液滴エマルションから放出され、組み込まれていない蛍光標識ペプチド溶液の除去を可能とする水性洗浄緩衝液中に懸濁される(H)。(C)および(D)の明視野像は、それぞれエマルション液滴((iv)から出現するとき)および洗浄されたビーズを示す。
【図３】合成Aβ1-42の非標識シードと蛍光標識されたモノマーAβ1-42レポーターペプチドとのインキュベーションは、シードを含まないビーズ(空)と比較して増加した蛍光強度(5μM>0.5μM)を有する液滴をもたらした。フローサイトメーター(MoFlo FACS)中で蛍光分析を実施した。X軸は、サイトメーターを通過する1ビーズ当たりの全蛍光強度を表す。Y軸は、特定のレベルの蛍光を有するビーズの数の正規化カウントである。データ正規化は、示された3つの実験条件について、異なる数の全ビーズが分析されたことを意味する。しかし、データは、様々な最大ピークが全てほぼ同じ高さとなるようにサイズ変更された。
【図４】蛍光標識されたモノマーAβ1-42レポーターペプチドとハエ脳抽出物とのインキュベーションは、バックグラウンド蛍光強度を有する液滴集団(対照ハエ脳系統およびAβ1-42ハエ脳系統、5〜9単位)をもたらす。しかし、Aβ1-42シード凝集を発現するハエに由来する脳抽出物は、新たな、強い蛍光を発するビーズ亜集団を生成する(アスタリスク)。脳抽出物を有さない対照反応は、蛍光を生じなかった(0〜1単位、空ビーズ系統)。フローサイトメーター(MoFlo FACS)中で蛍光分析を実施した。
【図５】対照マウスの脳抽出物を含有する液滴の蛍光寿命(中央のバー)は、PBSのみを含有する液滴(左手のバー)と同じである。対照的に、Aβ発現マウスの脳抽出物は、より長い蛍光寿命を有する液滴の生成をもたらし、これは、規則性の低い構造を示している(右手のバー)。
【図６】Aβ1-40線維がアガロースビーズの内部で形成されたことを示す、ハーフ-TIRFモードで実施された蛍光イメージ。(A) ハーフ-TIRFモードで実施された蛍光イメージ。(B) 全アガロースビーズの3Dボリューム像。
【図７】(A) Aβ1-40-Hilyte488を含有する45μm直径のアガロースビーズ中の領域を描く標準広視野蛍光イメージ。凝集は、イメージを撮影する前に24時間進行させた。(B) 構造化照明顕微鏡法を使用してイメージ化されデコンボリューションされた(A)に示されているのと同じ領域のデコンボリューションイメージ。そのイメージデータは、16枚のイメージスライス(500nm間隔)の一群から得られた。
【図８】24時間インキュベートされた、Aβ1-40-Hilyte647を有するアガロースビーズの内部の選択された領域のdSTORMイメージング。(A) アガロースビーズの内部に形成されたAβ1-40線維の蛍光イメージ。(B) (A)の蛍光イメージに対応する、ハーフ-TIRFモードで実施されたdSTORMイメージ。
【図９】内部に様々な形態のAβ1-40が調製されたアガロースビーズの蛍光寿命イメージ。(A) Aβ1-40ペプチドモノマーと混合され、ビーズ形成後速やかに洗浄されたアガロースビーズ、(B) アガロースビーズを、液滴形成前に24時間インキュベートされたHF488Aβ1-40ペプチドと混合した。液滴およびビーズの形成後、油/水界面が崩壊し、一方モノマーおよびHF488Aβ1-40の小型の凝集物がアガロースビーズから洗い流された。(C) Aβ1-40ペプチドをアガロースビーズ中で24時間インキュベートし、その後洗浄した。条件：37℃、Napi pH7.4。
【図１０】様々な濃度および条件におけるHiLyte488標識されたAβ1-40を含有するビーズの共焦点蛍光寿命イメージ。(A) 各ビーズについて平均した蛍光寿命の低下が、3つの異なる開始濃度(1μM、2.5μMおよび5μMのAβ1-40；それぞれ上向き三角、丸および四角)について、また異なる凝集時点において示される。また測定値は、バルク溶液中の5μM Aβ1-40の濃度についても示される(下向き三角)。凝集は、溶液中と比較すると、ビーズ中でより迅速に起こり、また凝集速度は濃度依存的である。(B) 高寿命を含有する画素数と比較した低寿命を含有する画素数として規定される、1個のビーズ当たりの相対的「凝集物数」が示される(条件：37℃、Napi pH7.4)。
【図１１】Aβ1-40ペプチドビーズのフローサイトメトリー分析は、凝集の時間的経過を高感度で定量することを可能とする。グラフは、3つの異なるペプチド濃度について、Aβ1-40の蛍光凝集物を含有するビーズのパーセントが経時的に増加することを示す(四角：1μM、丸：2.5μM、三角：5μM)。
【図１２】シロ(scyllo-)イノシトールによる凝集の阻害。シロイノシトールおよびアミロイドモノマー(Aβ1-42)を液滴にコンパートメント化し、1：1(各時点の中央のバー)または1：20(各時点の右手のバー)のアミロイド：阻害剤の比でそれぞれインキュベートした。各時点の左手のバーは、シロイノシトールを有さない対照を表す。棒グラフは、シロイノシトールの存在下または不存在下におけるHF488Aβ1-42のフローサイトメトリー分析の結果を示す。
【図１３】ビーズ中のシードされた凝集物の形成の蛍光検出システムの模式図。アミロイドゲルビーズ(A)は、(B)によって表される平面レーザー誘起蛍光(PLIF)デバイスのレーザー光を通るキャピラリーを通過する。各液滴の蛍光ピークは光ファイバーシステム(C)を用いて定量化される。グラフは、蛍光球(より高いピーク)と混合されて核の周囲に蛍光凝集物(より低いピーク)を示すJurkat細胞のスクリーニングから得られたデータを表す。Jurkat細胞中の蛍光凝集物は、ゲルビーズ中で検出されるアミロイド凝集物とサイズが類似しており、模式的に表される(D)。
【図１４】バックグラウンドを超える、発病した(AD)マウス脳サンプルと発病していない(WT)マウス脳サンプルのアッセイ測定値の比較。この図は、マウス脳から得られた様々な濃度のADサンプルとWTサンプルの差異を示す。0.2mg/mlを超える全タンパク質濃度においては、シグナルに有意差がある。
【図１５】マウス血清における、ADのマーカーとしての、Aβ42のシードされた凝集の検出。アルツハイマーマウスモデル(高齢CRND8マウス、実線)の血清を、齢数が一致した発病していない同腹子対照(破線)の血清と比較した。高蛍光ビーズの周波数は、AD血清の方がWT血清より高い。バックグラウンドトレース(点線、血清なし)は、自然凝集シグナルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
凝集シード
本明細書中で使用される「凝集シード」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの可溶性オリゴマーを指す。典型的には、オリゴマーは、非共有結合的相互作用により結合したモノマーを含む。凝集シードは、凝集物形成の動態において、核形成に関連するラグ相を短縮する。従って、凝集シードは、類似モノマーまたは同一モノマーの凝集を開始し促進する。例えば、凝集シードは、配列相同性を有するモノマータンパク質の線維化を促進する。凝集シードはまた、不正な分子テンプレーティングにより作用することもあり得る。
【００２６】
一般的に、凝集シードは単一のペプチド種を含み、同じペプチド種のモノマーの凝集をシードする。通常、ポリペプチドがネイティブ構造を有する場合、凝集シードは、少なくとも部分的にミスフォールドしているが完全には変性していないペプチドを含む。従って、特定の実施形態において、凝集シードはミスフォールドしたペプチドの可溶性オリゴマーである。特定の実施形態において、凝集シードは2〜20個のモノマーを含む。
【００２７】
微小液滴
「微小液滴」は、標準的なマイクロ流体技術及びデバイスを使用して操作することができるサンプルの小さな液滴である。本発明の特定の実施形態において、微小液滴は、1μl未満、500nl未満、100nl未満、10nl未満、1nl未満、500pl未満、400pl未満、300pl未満、200pl未満、100pl未満、又は50pl未満の体積を有する。本発明の特定の実施形態において、微小液滴は、0.5pl〜1μl、0.5pl〜500nl、1pl〜200nl、20pl〜100nl、20pl〜1nl、20pl〜500pl、20pl〜300pl、20pl〜200pl、20pl〜100pl、30pl〜100p、または30pl〜80plの体積を有する。特定の実施形態において、微小液滴は、1mm未満、500μm未満、400μm未満、300μm未満、200μm未満、100μm未満、80μm未満、70μm未満、60μm未満、または50μm未満の直径を有する。特定の実施形態において、微小液滴は、1μm〜1mm、10μm〜500μm、10μm〜250μm、または20μm〜100μmの直径を有する。凝集シードの検出において使用される場合、その微小液滴のサイズは、シードされた凝集が自然凝集より速く進行することを可能とする。これはまた、タンパク質のモノマーの濃度にも依存し得る。当業者であれば、微小液滴の適切なサイズを決定することが可能であり、また当業者であれば、タンパク質のモノマーの適切な濃度を決定することができる。
【００２８】
サンプルがコンパートメント化される微小液滴の数は、サンプルの体積および微小液滴の体積によって決まる。目的のサンプル(例えば臨床サンプル)の全体が試験され、また微小液滴にコンパートメント化される必要はない。サンプルの試験される部分は、全サンプルに関する有用な情報を提供するのに十分でなければならない。当業者は、サンプルの試験に適した部分を決定することができる。特定の実施形態において、「複数の微小液滴」は、少なくとも103、104、105、106、107、108または109個の微小液滴である。
【００２９】
微小液滴は、水性の反応混合物を、界面活性剤を含む非水性の液体(例えば油)中に乳化することによって生成することができる。任意の好適な界面活性剤を使用することができる。マイクロ流体水性液滴の生成のための技術は当技術分野において周知である[6-12]。
【００３０】
微小液滴は、好ましくは単分散系であり、すなわち、微小液滴は、好ましくは均一なサイズを有する。
【００３１】
古典的には、タンパク質凝集のアッセイはマイクロウェルプレート中で行われ[13]、これは薬学実験及び生化学実験の標準形式である。しかし、近年、アッセイは、ナノリットルボリュームまたはピコリットルボリュームにまでスケールダウンされていると報告されている[14,15]。この小型化は、アッセイ成分の、マイクロ流体デバイス中で生成される油中水型エマルション液滴へのコンパートメント化によって達成される[16-19]。上記のデバイスは、10kHz以下の速度で液滴を生成し且つ操作することができる。完全に自動化されたモジュラーワークフローは、液滴ソーティング[21-23]および液滴融合[24,25]などの物理的単位操作を組み込むように設計することが可能であり[20]、またさらにPCR[26,27]、in vitroタンパク質発現[28]、酵素反応[25,29]または細胞ベースのアッセイ[30-32]などの生化学過程も組み込むことができる。0.5pL〜4nLの微小な液滴体積もまた、溶液ベースの化合物スクリーニングの利益を与える。これらの特性は、高度な分析技術[33-37]と組み合わせて、液滴アッセイをハイスループット様式で実施することを可能とする。試薬を節約することに加えて、液滴境界によって提供されるコンパートメント化は、当業者が実験を設計し、従来のアンサンブル実験においてはマスキングされる情報にアクセスすることを可能とする。さらに、細胞様の閉じ込めまたは界面現象から生じる影響を、液滴コンパートメントの内部で再現することができる。
【００３２】
微小液滴は、任意の適切な手段を使用して調製し且つ取り扱うことができる。例えば、従来のソフトリソグラフィー技術、FFチップまたは市販のガラスチップを使用して構築されたマイクロ流体デバイスを使用することができる。
【００３３】
凝集しやすいポリペプチド
本発明の方法は、任意の凝集しやすいポリペプチドまたはタンパク質と共に使用するのに適している。特定の実施形態において、タンパク質は、Aβ1-40またはAβ1-42などのアミロイドβペプチド、タウタンパク質、プリオンタンパク質、α-シヌクレイン、TDP-43、FUS、ハンチンチン、セルピン、トランスサイレチン、ノッチ3、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、セイピン、膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)、プロIAPP、アポリポタンパク質AI、AIIまたはAIV、ゲルゾリン、β2ミクログロブリン、ロドプシン、ケラチン、ケラトエピセリン、チューブリン、サーファクタントタンパク質C、歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、血清アミロイドA、メジン、またはリゾチームである。
【００３４】
好ましい実施形態において、タンパク質は、アミロイドβペプチド、Aβ1-40、Aβ1-42、IAPP、α-シヌクレイン、プリオンタンパク質またはハンチンチンなどのアミロイド凝集物を形成するタンパク質である。凝集シードによる凝集のシーディングは、アミロイド凝集物の形成において特に重要である。好ましい実施形態において、タンパク質は、神経変性障害を引き起こすタンパク質である。神経変性障害を引き起こす凝集シードの検出は、凝集タンパク質が脳内に蓄積し、このため末梢組織中の凝集シードを検出することが有用であることから、特に重要である。好ましい実施形態において、タンパク質はプリオンタンパク質である。特に好ましい実施形態において、タンパク質は、Aβ1-40またはAβ1-42などのアミロイドβペプチドである。アミロイドベータは、セクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質からプロセシングされる36〜43個のアミノ酸のペプチドである。Aβ1-40は優勢型であり、血漿、脳脊髄液および脳間質液中で循環しているのが見出されている。Aβ1-42は、より凝集性であり且つ病気の発症に関連しており、またより重篤な病気に関連している。Aβ1-40とAβ1-42はいずれもプラーク中で見出される。
【００３５】
凝集物の検出および分析
本発明の方法における微小液滴、また場合によりゲルビーズの使用は、形成される凝集物の迅速なハイスループット分析を可能とし、この分析は、サンプル中の凝集シードを検出し、また試験物質がタンパク質の凝集に与える影響を測定するのに有用である。
【００３６】
本発明のいずれかの態様の特定の実施形態において、本方法は、ポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップを含み、このステップは、微小液滴中のポリペプチドの凝集物の存在を決定するステップを含み得る。本発明のいずれかの態様の特定の実施形態において、タンパク質モノマーが標識され、また、タンパク質の凝集物の存在を決定するステップが、標識を検出するステップを含む。特定の実施形態においては、タンパク質モノマーが蛍光標識され、また、タンパク質の凝集物の存在を決定するステップは、蛍光シグナルを検出するステップを含む。好ましい実施形態において、蛍光シグナルは、フローサイトメーターまたは蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用して検出される。特定の実施形態において、蛍光シグナルの大きさは、タンパク質凝集物の存在と相関している。特定の実施形態において、FACSを使用して得られた蛍光シグナルのプロファイルは、タンパク質凝集物の存在を示す。特定の実施形態において、蛍光シグナルのプロファイルは、形成されたタンパク質凝集物の構造を示す。例えば、実施例2および3は、凝集シードによって開始された、シードされた凝集により形成された凝集物が、自然凝集により形成された凝集物と区別し得るプロファイルをもたらすことを示す。従って、特定の実施形態において、タンパク質の凝集物の存在を決定するステップは、蛍光シグナルの大きさを、存在するタンパク質凝集物の量と相関させるステップを含む。特定の実施形態において、蛍光シグナルの大きさは、試験サンプル中の凝集シードの存在を示すか、または試験物質がタンパク質の凝集に与える影響を示す。
【００３７】
実施例2および3に示されるとおり、蛍光標識されたタンパク質モノマーの使用および蛍光シグナルの検出は、合成凝集シードおよび病気の動物モデルに由来する凝集シードの特異的検出を可能とする。遊離タンパク質モノマー、自然に形成された凝集物、およびシードされた凝集物によって生成された蛍光シグナルには、有意且つ容易に検出可能な差異が存在した。シード含有サンプルのアリコートを蛍光標識されたモノマーAβペプチドを含有する溶液とピコリットル体積でインキュベートすることにより、蛍光標識されたモノマーAβペプチドのシードされた凝集の過程から生成された凝集物に由来する蛍光シグナルが特異的に測定された。
【００３８】
実施例7および8に示されるとおり、蛍光標識されたタンパク質モノマーの使用および蛍光シグナルの検出は、タンパク質の凝集およびこの凝集のモジュレーションの高感度な測定およびモニタリングを可能とする。
【００３９】
蛍光標識されたタンパク質モノマーに由来する光シグナルは、多数の生物物理学的技術による研究に適している。例えば、特定の実施形態において、蛍光寿命顕微鏡法は、形成された凝集物を検出および/または調査するために使用される。タンパク質モノマーがアミロイド構造に凝集するとき、蛍光寿命の低下が観察される[37]。さらに、異なる種類の凝集物の蛍光寿命は区別することが可能であり、より長い蛍光寿命は、より不規則な凝集物の存在と相関している。診断方法において、より不規則な凝集物および/またはより不規則な凝集物を生成するシードの存在は、病気の重篤度またはリスクの増加と相関し得る。さらにまた、試験物質がタンパク質の凝集に与える影響も、検出される凝集物の規則度の変化により、例えば、蛍光寿命顕微鏡法によって検出することができる。
【００４０】
特定の実施形態において、レポーター標識に由来する蛍光寿命を測定するために使用される方法としては、例えば、時間ゲート検出[38]、時間相関単一光子計数法[39]、または周波数ドメイン寿命イメージング法[40]などの時間ドメイン法が挙げられる。
【００４１】
特定の実施形態において、標識されたモノマーが凝集種に集合する際に生じる放射光の偏光状態の変化をモニターする蛍光異方性イメージング顕微鏡法(FAIM)を使用してタンパク質凝集がモニターされる[41]。
【００４２】
当業者であれば、本発明に従って微小液滴またはゲルビーズ中の凝集物の存在を検出し、凝集物の構造を決定するために使用し得る技術について認識している。例えば、特定の実施形態において、フローサイトメーター、蛍光寿命顕微鏡法、直接確率論的光学再構成顕微鏡法(dSTORM)、構造化照明顕微鏡法またはFRET顕微鏡法が、凝集物を検出しまたは凝集物の構造を決定するために使用される。代替的実施形態においては、円偏光二色性が使用される[42,43]。
【００４３】
蛍光標識されたタンパク質モノマーの使用は、凝集シードの高感度な検出を可能とする。蛍光強度は、生成された凝集物の量について報告するが、寿命測定は、形成された凝集物のタイプ(例えばサイズまたは規則度)についての情報を提供し、このようにして、液滴がシードされた凝集物を含有しているのかまたはシードされていない凝集物を含有しているのかを決定するための第2の策を提供する。蛍光シグナルのプロファイルは、凝集物の構造に関してさらなる詳細を決定するために使用することができる。実施例4に示されるとおり、蛍光寿命顕微鏡法を使用して、凝集シードの存在に基づいて、病気のマウスの脳抽出物と対照マウスの脳抽出物(緩衝液のみと共にインキュベートしたビーズと同じシグナルを生じる)とを区別することができる。
【００４４】
特定の実施形態において、タンパク質モノマーは、Alexa647などのAlexa Fluor(商標)色素によって標識される。Alexa Fluor色素は、クマリン、ローダミン、キサンテン(例えばフルオレセイン)、およびシアニン色素のスルホン化を通して合成される。特定の実施形態において、タンパク質モノマーは、Hilyte 488などのHiLyte Fluor(商標)色素によって標識される。さらに好適な蛍光レポーターとしては、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体(例えばO-メチル-フルオレセインまたはフルオレセインイソチオシアネート(FITC))、フィコエリトリン、ユーロピウム、TruRed、アロフィコシアニン(APC)、PerCP、リサミン、ローダミン、B X-ローダミン、TRITC、BODIPY-FL、FluorX、レッド613、R-フィコエリトリン(PE)、NBD、ルシファーイエロー、カスケードブルー、メトキシクマリン、アミノクマリン、テキサスレッド、ヒドロキシクマリン、Alexa Fluor(商標)色素(分子プローブ)(例えばAlexa Fluor(商標)350、Alexa Fluor(商標)488、Alexa Fluor(商標)546、Alexa Fluor(商標)568、Alexa Fluor(商標)633、Alexa Fluor(商標)647、Alexa Fluor(商標)660およびAlexa Fluor(商標)700)、スルホネートシアニン色素(AP Biotech)(例えばCy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7)、IRD41、IRD700(Li-Cor, Inc.)、NIR-1(Dejindom、日本)、ラホヤブルー(La Jolla Blue)(ジアトロン)、DyLight(商標)405、488、549、633、649、680および800、反応性色素(Reactive Dyes)(Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc)またはLI-COR(商標)色素(例えばIRDye(商標)(LI-COR(商標) Biosciences))が挙げられる。特定の実施形態において、上記のタンパク質は、GFP、YFP、mRFPまたはTFPなどの融合タンパク質で標識された組み換えタンパク質である。当業者は、タンパク質を標識するために使用することができる他の融合タンパク質について熟知している。
【００４５】
特定の実施形態において、凝集物の形成はレポーター物質を使用して検出される。例えば、特定の実施形態において、タンパク質のサンプルおよびモノマーはレポーター物質と混合され、タンパク質の凝集物の形成を検出するステップは、レポーター物質を検出するステップを含む。このような実施形態において、レポーター物質は、アミロイド凝集物などのタンパク質凝集物の存在下にある場合に、特異的シグナルを生成する。特定の実施形態において、レポーター物質は、チオフラビンT、コンゴレッド、または(トランス,トランス)-1-ブロモ-2,5-ビス-(3-ヒドロキシカルボニル-4-ヒドロキシ)スチリルベンゼン(BSB)である。
【００４６】
本発明のいずれかの態様の特定の実施形態において、特定のビーズまたは液滴は、形成された凝集物の程度または構造に基づいて単離される。次いで、単離されたビーズまたは液滴をさらに分析することができる。これは、ゲルビーズが使用される場合、ビーズがタンパク質凝集物を保持し、緩衝液等をさらなる分析的反応を実施するために交換することを可能とするため特に有用である。例えば、特定の実施形態において、本発明の方法は、シードされた凝集により形成された凝集物または特定のサイズの凝集物を含むビーズまたは液滴を単離するステップを含む。
【００４７】
さらに、本発明の特定の実施形態において、アッセイ中に形成された凝集物の構造が、より詳細な診断を提供するために分析される。従って、特定の実施形態において、タンパク質の凝集物の存在を決定するステップは、凝集物の構造または1つ以上の生物物理学的特徴を決定するステップを含む。別法として、特定の実施形態において、上記の方法は、凝集物の構造または1つ以上の生物物理学的特徴を決定するさらなるステップを含む。このような実施形態において、凝集物の構造および生物物理学的特徴は、診断を提供するために使用される、被験体から得られたサンプル中に存在する凝集シードを分類するために使用される。例えば、特定の実施形態において、より不規則な凝集物をシードする凝集シードの存在は、病気の重篤度またはリスクの増大と相関している。特定の実施形態において、より迅速なタンパク質の凝集をシードする凝集シードの存在は、病気の重篤度またはリスクの増加と相関している。
【００４８】
従って、本発明の特定の実施形態において、微小液滴中のタンパク質の凝集物の存在を決定するステップは、タンパク質の凝集物の存在または不存在を検出するステップ；タンパク質の凝集物の量を測定または定量化するステップ；および/またはタンパク質の凝集物の構造(例えば規則度)を分析するステップを含む。
【００４９】
本発明の特定の実施形態において、試験対象のサンプルは、アッセイにおいて使用する前に希釈される。例えば、被験体から得られた臨床サンプルなどのサンプルは、5、10、50、100または1000倍希釈することができる。アッセイの感度および特異性ならびにその凝集シードの存在を検出する能力は、このような希釈を通して改善することができる。
【００５０】
本明細書中に開示される任意の方法のステップは、任意の順序で実施することができる。
【００５１】
通常、アッセイから得られた生データは、それらの使用前に何らかの操作を必要とする。例えば、大部分の検出技術の性質は、凝集シードまたは凝集物が実際には存在しない場合でも多少のシグナルが見られる場合があることを意味し、このため、このノイズは、結果を解釈する前に除去することができる。同様に、補償を要する母集団中の凝集シードのバックグラウンドレベルが存在する可能性がある。バックグラウンドシグナルは、バックグラウンドに起因するセカンドピークまたはセカンドピークの創出における可能なバックグラウンド率を含み得る。
【００５２】
データは、実験間比較を容易にするためにスケーリングまたは標準化を必要とし得る。これらのおよび類似の課題、ならびにそれに対応する技術は、診断顕微鏡法および蛍光顕微鏡法の分野において周知である。
【００５３】
特定の実験においてバックグラウンドシグナルを補償するための様々な技術を利用することができる。例えば、反復測定は、通常、アッセイ間変動を決定するために実施され、反復に由来する平均値を比較することができる。シグナルは、単一の実験における分散に従って調整することができる。この種のデータ変換は、異なる実験間の変動にもかかわらず有効なアレイ間比較を可能とするための技術において標準的である。
【００５４】
病気を診断、評価、モニタリングするまたは病気のリスクを同定する方法
上記で考察されるとおり、本発明の方法は、病気の診断、予後診断を提供するため、または病気を発症するリスクを同定するための、患者サンプルにおける凝集シードの存在の検出に特に有用である。
【００５５】
本発明の方法は、特定のタンパク質の凝集によって引き起こされる病気の診断、予後診断および上記の病気のリスクの診断に有用である。このような病気はコンフォメーション病として知られている。
【００５６】
当業者には明らかであるとおり、本発明の方法は、凝集シードが検出されるタンパク質の凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を診断、評価、モニターする、または上記のコンフォメーション病のリスクを同定するために使用される。従って、Aβ1-40またはAβ1-42の凝集シードはアルツハイマー病の診断において検出され、またα-シヌクレインの凝集シードは、パーキンソン病の診断において検出される、等である。本発明の方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病および他のシヌクレイノパチー、タウオパチー、プリオン病、脳β-アミロイド血管症、CADASIL症候群、前頭側頭葉変性症、FTLD-FUS、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病および他のトリプレットリピート疾患、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アレキサンダー病、セイピノパチー、家族性アミロイド神経障害、老人性全身性アミロイドーシス、セルピノパチー、II型糖尿病、大動脈内側アミロイドーシス、ApoAI、AIIまたはAIVアミロイドーシス、フィンランド型家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎/ミオパチー、ロドプシン変異を伴う網膜色素変性症、甲状腺髄様癌、心臓心房アミロイドーシス、角膜ジストロフィー、皮膚苔癬アミロイドーシス、肺胞タンパク症、歯原性(ピンドボルグ)腫瘍、アテローム性動脈硬化、ならびに全身性アミロイドーシス(例えば遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシス、AAおよびAL)を診断、評価、モニタリングするため、また上記の病気のリスクを同定するために有用である。
【００５７】
凝集シードがコンフォメーション病の発病において果たす中心的役割については十分に知られている。シードされた(プリオン様)タンパク質の凝集が初発病巣から広がることが理解されている[4]。シードされた凝集のマウスモデルは、アルツハイマー病の病理においてAβおよび細胞内タンパク質タウの両方に関係していた[2,3,44-46]。Aβおよびタウの両方について、モデルげっ歯類に予め形成された凝集物を接種すると、これらのげっ歯類において最終的には自然に起こるものである、プラークおよびもつれの病理学的沈着を促進する可能性があることが示されている。さらに、同様の接種は、接種されなかったとしたら健康なままであったであろうげっ歯類において、新たなタウ病変をシードし得るという優れた証拠がある[2,46]。タンパク質のシードされた凝集は、特にプリオンタンパク質およびアミロイドの形成に関して十分に理解されている。プリオンタンパク質は、確率論的にまたは変異の結果としてミスフォールドして凝集する可能性があり、結果として得られるシードは、個々のタンパク質中で、および個々のタンパク質間で広がり、ミスフォールディングおよび神経毒性のカスケードを創出し得る[47,48]。凝集およびアミロイド形成のin vitro研究は、モノマーの純粋溶液が、多くの場合、ラグ相と呼ばれる長い期間に安定していることを示している。この期間中にシード形成の確率論的過程が起こり、線維が成長して破砕するときにアミロイド形成のバーストをもたらし、このためモノマーペプチドが急激に加わるさらに多くの部位を生じる[49,50]。これらの線維は、その後の凝集反応に再びドープされると、多くの場合、ラグ相を消失させ、さらなるアミロイドの形成を促進する。凝集シードを通したプリオン様の感染性は、ハンチントン病[1]、パーキンソン病、および運動ニューロン病[51]などの他のコンフォメーション病においても示されている。従って、凝集シードの検出は、コンフォメーション病の診断において有用且つ有効である可能性が高い。
【００５８】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、神経変性病を診断、評価、モニタリングするまたは神経変性病のリスクを同定するための方法である。脳にはアクセスすることができないが、凝集シードは血液などの末梢体液中に見出すことができるため、本発明の方法は神経変性病に特に有用である。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明の方法は、アミロイドパチーを診断、評価、モニタリングするためまたはアミロイドパチーのリスクを同定するための方法である。本発明の方法は、凝集シードによる凝集のシーディングがアミロイド凝集物の形成において特に重要であり、このため凝集シードの検出を含む診断が特に正確且つ有用である可能性が高いことから、アミロイドパチーに特に有用である。
【００６０】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法は、アルツハイマー病のリスクがある被験体を同定するため、またはアルツハイマー病を診断、評価またはモニタリングするための方法である。
【００６１】
被験体は、典型的にはヒトであろう。しかし、一部の実施形態において、本発明は、非ヒト生物、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、シカ、ニワトリ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ネコ、イヌ、あるいは非ヒト霊長類(サルまたは類人猿(例えばマカクもしくはチンパンジー)において有用である。
【００６２】
一部の実施形態において、本発明の方法は、被験体からサンプルを得る初期ステップを含む。しかし、他の実施形態において、サンプルは、本発明の方法とは別に、また本発明の方法を実施する前に得られる。次いでサンプルが得られた後、本発明の方法をin vitroで実施し得る。
【００６３】
本発明の特定の診断方法において、試験対象のサンプルは、血液サンプル(例えば血清サンプルまたは血漿サンプル)、尿サンプル、脳脊髄液サンプル、唾液サンプル、涙サンプル、リンパ液サンプルまたは尿サンプルである。上記で考察されるとおり、本発明の高感度な方法は、末梢体液中の低濃度の凝集シードを検出するのに適している。本発明の好ましい実施形態において、サンプルは、血清サンプルまたは血漿サンプルである。
【００６４】
凝集シードの検出は、被験体から採取されたサンプルに対して直接実施されてもよいし、またはサンプルは被験体から採取されるときと分析されるときの間に処理されてもよい。例えば、血液サンプルは、細胞を除去して分析対象の凝集シードを含有する血漿を残すように、または細胞および様々な凝固因子を除去して分析対象の凝集シードを潜在的に含有する血清を残すように処理することができる。幾つかの体液については、このような分離処理は通常必要とされるわけではなく(例えば、尿、涙または唾液)、他の処理を用いることができる。例えば、様々な種類のサンプルを、身体から採取するときと分析するときの間に、例えば、希釈、アリコート化、サブサンプル化、加熱、凍結、照射等の処理に供することが可能であり、例えば、血清は、通常は分析の前に保存、凍結される。さらにまた、様々なサンプル種に対して処理試薬を添加することが一般的である(例えば、血液サンプルへの抗凝血剤の添加)。
【００６５】
本発明の特定の実施形態において、上記の方法は、付加的な試験および分析を実施するステップをさらに含む。例えば、診断は、一般的に、被験体の年齢、彼らの病気の家族歴、他のバイオマーカー、および/または任意の症候の検討も含むだろう。さらに、被験体の病気のリスクを評価するステップは、一般的に、被験体の年齢、彼らの病気の家族歴、他のバイオマーカー、およびライフスタイルなどの多数の可変要素を含むだろう。病気のリスクの評価に達するためにアルゴリズムを使用することができる。当業者は、好適なアルゴリズムを開発する方法について認識している。
【００６６】
本発明の特定の実施形態において、患者の臨床サンプル中の凝集シードの存在またはレベルを、対照サンプルと比較することができる。対照サンプルは、病気を有していない患者もしくは患者群、または病気を有する患者もしくは患者群に由来し得る。対照サンプルは、空サンプルであってよい。本発明の特定の実施形態において、患者のサンプル中の凝集シードの存在またはレベルを参照値と比較することができる。特定の実施形態において、患者の臨床サンプル中の凝集シードの存在またはレベルを閾値と比較することが可能であり、閾値を超える凝集シードの存在またはレベルは、病状の存在を示すか、または病状のリスクの増加を示す。参照値または閾値は、多数の患者サンプルの分析から得られる。この分析は、健康な患者から得られたサンプルと病気の患者から得られたサンプルとを比較するステップを含み得る。この分析は、病気を発症する前の患者から得られたサンプルと病気を発症した後の患者から得られたサンプルとを比較する長期的研究であってもよい。
【００６７】
本発明の方法は、患者を経時的にモニタリングするステップを含んでいてよく、さらに凝集シードの存在下の変化を評価するため、また改善された診断またはリスクの評価を提供するために、何か月または何年にもわたって回収された多数のサンプルを試験するステップを含んでいてもよい。被験体から得られたサンプル中の凝集シードの存在が経時的に増加する場合、病気のリスクが増加し得るか、または予後が好ましくないものとなる可能性がある。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明の方法は、病気の治療を受けている患者における病気の進行をモニタリングする方法である。このような実施形態において、凝集シードの存在またはレベルは、治療の有効性を評価するため、治療の投与前および治療の投与後に測定することができる。凝集シードの存在またはレベルが低下する場合、治療を継続することができる。凝集シードの存在またはレベルが増加する場合、治療を中止するか、または変更することができる。治療は、凝集タンパク質の凝集の予防または低下において直接標的化されてもよいし、または、治療は病気の過程に関与する異なる機構(例えば凝集タンパク質の生成などの上流機構)において標的化されてもよい。本発明の方法は、特定のタンパク質の凝集によって引き起こされる病気の治療(例えば、凝集タンパク質と直接相互作用する治療および他の病気の標的と相互作用する治療など)の有効性を測定するのに有用であろう。病気の過程に関与する他の標的または機構と相互作用する治療を評価する場合、本発明の方法を使用して測定される凝集シードの存在またはレベルは、治療に対する個人の応答の指標を提供し得る。
【００６９】
本発明の方法において、臨床サンプル中の凝集シードの存在は、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している。特定の実施形態において、臨床サンプル中の凝集シードの絶対量または相対量は、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している。特定の実施形態において、凝集シードの特性は、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している。例えば、ある種のシードは特に凝集性でより迅速なタンパク質の凝集をシードすることが可能であり、また従って極めて高い病気のリスクと、または極めて重篤な病気と関連している可能性がある。さらにまた、ある種のシードは、より不規則なタンパク質の凝集物をシードし、また従ってより高い病気のリスクまたはより重篤な病気と関連している可能性がある。上記に説明されるとおり、サンプル中の凝集シードの特性は、シグナルの振幅(例えば全蛍光シグナル)、またはシグナルのプロファイル(例えば蛍光寿命シグナルまたは発光スペクトルおよび励起スペクトルの変化)を使用して決定することができる。
【００７０】
凝集シードのレベルは、陰性対照において見られるレベルとは有意に異なるはずである。高度な統計ツール(例えば、主成分分析、監視されていない階相的クラスタリングおよび線形モデリング)を使用して、2つのレベルが同じかまたは異なるかを決定することができる。
【００７１】
本発明の方法が、被験体がコンフォメーション病を有することを示す場合、その後にさらなるステップを続けることができる。例えば、被験体は、確認的診断手順(例えば被験体の身体検査を伴う確認的診断手順)を受けてもよく、および/またはコンフォメーション病を治療するのに適した治療薬(1種または複数種)によって治療されてもよい。
【００７２】
本発明はまた、(i) サンプルに帰するデータにアクセスするコード(このデータは微小液滴または微小液滴集団中のタンパク質凝集物の測定値を含む)、および(ii) サンプル中の凝集シードのレベルを表すためにデータを評価するためのアルゴリズムを実行するコード、を含むソフトウェア製品も提供する。このソフトウェア製品はまた、(iii) ステップ(ii)の結果を評価するためのアルゴリズムを実行して、被験体が関連するコンフォメーション病を有するか否かの診断的指標を提供するコードも含み得る。パート(iii)において使用するための好適なアルゴリズムとしては、サポートベクターマシンアルゴリズム、人工神経ネットワーク、ツリーベース法、遺伝的プログラミング等が挙げられる。アルゴリズムは、好ましくは、パート(ii)のデータを分類して、関連のコンフォメーション病を有する被験体と有さない被験体とを、このような被験体から採取されたサンプル中で測定された凝集シードレベルに基づいて区別することができる。本発明はまた、このようなアルゴリズムを訓練するための方法も提供する。凝集シードの存在またはレベルは、上記で考察されるとおり、既知のバイオマーカーと組み合わせて使用することができる。
【００７３】
本発明はまた、本発明のソフトウェア製品が搭載されているおよび/または本発明のソフトウェア製品を動かすコンピューターも提供する。
【００７４】
本発明はまた、本発明の方法の結果を通信する方法にも及ぶ。この方法は、アッセイ結果および/または診断結果を通信するステップを含み得る。このような通信は、例えば、技師、医師または患者に対する通信であり得る。一部の実施形態において、本発明の検出方法はある国で実施され、その結果は異なる国の受信者に通信されるだろう。
【００７５】
本発明の方法は、任意の被験体に診断を提供するのに有用である。特定の実施形態において、被験体は、少なくとも30歳(例えば、>35歳、>40歳、>45歳、>50歳、>55歳、>60歳、>65歳、>70歳)である。好ましい実施形態において、被験体は少なくとも50歳である。
【００７６】
被験体は、発症前の可能性もあれば、既に臨床的症候を示している可能性もある。発症前の被験体については、本発明は、何の予防策も講じられていない場合、将来症候が発症し得ることを予測するのに有用である。既に臨床的症候を提示している被験体については、本発明は、別の診断を確認または解決するために使用することができる。被験体は既に治療を開始していてもよい。
【００７７】
本発明は、比較的簡単且つ安価に実行することができるため、既にコンフォメーション病を有している疑いがある患者において使用されることに限定されない。むしろ、本発明は、母集団または高リスク集団(例えば上記に挙げられる少なくとも30歳の被験体)をスクリーニングするために使用することができる。
【００７８】
本発明の代替的な実施形態において、サンプルは、プリオン含有動物糞便で汚染されている疑いがある領域から回収されたサンプルなどの環境的サンプルである(例えばヒツジのスクレイピー)。従って、特定の実施形態において、本発明の方法は、動物を飼うために使用される建物または土地に由来するまたはこれらから得られるサンプルを用いて使用される。特定の実施形態において、本発明の方法は、プリオンタンパク質を含んでいる疑いがあるサンプル(例えば食物サンプル)を用いて使用される。
【００７９】
ゲルビーズ
本発明のいずれかの態様におけるゲル形成剤の使用およびゲルビーズの形成は、凝集物を保持しながら未凝集モノマーおよび他の因子を洗い流すことが可能であり、また適合性がない可能性があるアッセイ間でゲルビーズを容易に移行させることができるため、アッセイの感度を高め、その機能性を増加させる。
【００８０】
ゲルビーズ「ケージ」は、昇温(例えば37℃)で液体アガロースなどのゲル形成剤を共コンパートメント化し、次いで、後で温度を降下させる(例えば25℃に)ことによって液滴の内部を固化し、アガロースマトリックスのゾル-ゲル転移を開始することによって形成される。一度固化されると、これらのアガロースマイクロビーズは、洗浄を経るにもかかわらず大きなタンパク質凝集物を保持し、フローサイトメトリー(フローサイトメーターまたは蛍光活性化セルソーター(FACS)を使用する)などの様々な標準的な実験室操作に適している。アガロースビーズへのシードの閉じ込めは、バックグラウンド媒体への蛍光シグナルの拡散損失を防止し、陽性ビーズのロバストな観察を可能とする。バルク相ではなくコンパートメント中で測定することによって得られる感度の増加に加えて、洗浄手順は、バックグラウンド蛍光が蛍光凝集物中で除去され、蛍光凝集物がより良好なシグナル/ノイズ比で検出されることを確実にする。
【００８１】
ゲル形成剤は、例えば条件の変更(加熱、冷却、またはpHの変更)によって液体からゲルに固化され得る薬剤(例えば多糖またはポリペプチドなどのポリマー)である。別法として、ゲル形成剤は、架橋反応によりゲルに固化することもできる。架橋反応は、架橋剤を液滴中に送達するか、または液滴をUV光で処理することによって開始することもできる。微小液滴が(例えば冷却によって)ゲルビーズに変換された場合、これらは安定しており且つ多孔質である。
【００８２】
好適なゲル形成剤としては、例えばアルギン酸塩、ゼラチンおよびアガロースならびにマイクロ流体デバイスのチャネル中を移動するのに十分に流動性のゾル相を有する他のゲルが挙げられる。好ましくは、二糖(D-ガラクトースおよび3,6-アンヒドロ-L-ガラクトピラノース)の繰り返し単位で構成される直鎖ポリマーであるアガロースが用いられる。代替的実施形態において、ゲル形成剤は、ポリアクリルアミドである。ゲル形成剤は、任意の便利な方法によって(例えば条件を変化させることにより)ビーズに固化することができる。好ましくは、ハイドロゲル形成剤は、温度を変更することによって(例えば冷却することにより)固化される。
【００８３】
例えば、ゲル形成剤がアガロースである場合、温度を例えば25℃未満、20℃未満、15℃未満、10℃未満または5℃未満に低下させることによってゲルを固化することができる。正確なゲル化温度は、アガロースの種類およびその濃度に依存し、当業者が容易に決定することができる。例えば、0.5％〜2％(w/v)の超低融点アガロースIX-A型(Sigma)は、約17℃のゲル化点を有する。アガロースまたは他のゲル形成剤は、氷上で冷却することによって固化することができる。
【００８４】
微小液滴中でゲル形成剤が固化することにより、固化したゲルがビーズになる。固化ビーズ集団は単分散系であってよい。別法として、この集団は多分散系であってもよい。
【００８５】
乳化およびゲルビーズの生成の後、水性の微小液滴を脱乳化することができる。一部の実施形態において、脱乳化剤(例えば弱界面活性剤)をエマルションに添加して相を分離し、ビーズを含有する水相を取り出すことができる。油と界面活性剤との任意の好適な混合物を使用することができる。脱乳化剤は、油/水界面において界面活性剤と競合し、界面を崩壊させる。好適な弱界面活性剤としては、例えば、パーフルオロオクタノール(PFO)および小さな親水性基を有する他のフッ素化合物(フッ素化油が使用される場合)、またはSDSおよびTritonを含有する緩衝液、ならびに一方に炭素鎖を有し他方に小さな親水性基(鉱物油が使用される場合)を有する他の化合物が挙げられる。脱乳化剤をエマルションに添加し、混合物を例えばピペットで撹拌することができる。他の実施形態において、エマルションを遠心分離して相を分離し、ビーズを含有する水相を取り出すことができる。ゲルビーズの再乳化に適した技術は、当技術分野において公知である[52]。
【００８６】
試験物質が凝集に与える影響をアッセイする方法
本発明の方法における微小液滴およびゲルビーズの使用は、試験物質がタンパク質の凝集に与える影響の高感度な分析を可能とする。本発明の方法は、使用される小さな試薬体積および、例えばマイクロ流体技術およびフローサイトメトリー技術を使用したゲルビーズの取り扱いの容易さのため、特に候補治療法のハイスループットスクリーニングおよびタンパク質の凝集を阻害するのに有効な物質または化合物の同定に適している。
【００８７】
候補化合物すなわち試験物質は、小さな有機分子、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、核酸分子、抗体(もしくはそのフラグメント)または任意の他の好適なクラスの分子であり得る。
【００８８】
本発明のスクリーニング法において使用するための候補化合物は、当技術分野において公知のコンビナトリアルラボラトリー法を使用して得ることができる。例えば、候補化合物は、生物学的ライブラリー、ペプトイドライブラリー、空間的にアドレス指定可能な並列固相または溶液相ライブラリー、または合成ライブラリーに由来し得る。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当業者に公知である[53-59]。化合物のライブラリーは、溶液中[60]に、またはビーズ[61]、チップ[62]、細菌もしくは胞子[63]、プラスミド[64]上に、またはファージ[65-68]上に存在し得る。試験物質が核酸によってコードされる場合、上記の方法は、好ましくは核酸が微小液滴の内部で発現されるステップを含む。
【００８９】
本発明の方法の特定の実施形態において、様々な試験物質の集団が複数の微小液滴にコンパートメント化される。特定の実施形態において、微小液滴のインキュベーション、微小液滴のゲルビーズへの変換およびタンパク質凝集物の検出の後、特定のビーズが単離される。例えば、標準的な分類装置を使用して、タンパク質凝集物を含まないか、または比較的少量のタンパク質凝集物を含むビーズを単離することができる。その後、単離されたビーズ中に存在する試験物質(凝集物の形成を阻害する)を同定し、また場合によりさらなる分析または開発のために選択することができる。
【００９０】
特定の実施形態において、本発明の方法は、試験物質の集団(例えば上記のライブラリーに由来する試験物質集団)を、凝集タンパク質のモノマーおよびゲル形成剤とバルク相中で接触させるステップを含む。その後、乳化を通して(例えばマイクロ流体デバイスを使用して)単分散微小液滴の集団を形成することができる。溶液は、各微小液滴が試験物質を1つも含まないか、または1つの試験物質を含む(すなわち試験物質がエマルションにコンパートメント化される)ように乳化することができる。
【００９１】
特定の実施形態において、有効な試験物質の同定を支援するため、試験物質とそのゲルビーズとの会合が維持される。試験物質は、任意の便利な方法によってゲルビーズに保持され得る。特定の実施形態において、これは、粒子を、抗体もしくはタグまたは他の部分を含む微小液滴に含めることによって達成される。例えば、それぞれが第1の部分を含む試験物質のライブラリーをアッセイし得る。このライブラリーは、凝集タンパク質のモノマー、ゲル形成液体、および第1の部分に対する親和性を有する第2の部分を含む粒子を有する微小液滴にコンパートメント化され得る。微小液滴のゲルビーズへの変換後、それぞれのゲルビーズは、特定の試験物質の影響下で形成されたタンパク質凝集物を保持するであろう。それぞれのゲルビーズはまた、第1の部分および第2の部分を介して粒子と会合する関連の特定の試験物質も保持するであろう。使用される粒子は、ゲルビーズの孔サイズより大きくなければならない。このような方法は、小分子をアッセイする場合に特に有用である。
【００９２】
試験物質を保持するために使用される粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子であってよい。この粒子は、磁気ビーズであってもよい。好適なナノ粒子またはマイクロ粒子は、当技術分野において周知である。例えば、粒子は、試験物質に結合する抗体などの薬剤でコーティングされていてよい。一部の実施形態において、試験物質はエピトープタグを含む。粒子は、エピトープタグに結合する抗体または他の結合メンバーでコーティングされていてよい。好適なエピトープタグは当技術分野において周知であり、例えば、HA(ヘマグルチニン)、MRGS(H)6、DYKDDDDK(FLAGTM)、T7-、S-(KETAAAKFERQHMDS)、ポリ-Arg(R5-6)、ポリ-His(H2-10)、ポリ-Cys(C4)、ポリ-Phe(F11)、ポリ-Asp(D5-16)、ストレプトタグ、ストレプトタグII(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)、インフルエンザ-HAタグ[69]、Glu-Glu-Pheタグ[70]、タグ100(Qiagen；哺乳動物MAPキナーゼ2に由来する12aaタグ)、Cruzタグ09(商標)(MKAEFRRQESDR、Santa Cruz Biotechnology Inc.)およびCruzタグ22(商標)(MRDALDRLDRLA, Santa Cruz Biotechnology Inc.)が挙げられる。既知のタグ配列は、参考文献71において概説される。Strepタグは、一部の好ましい実施形態において使用することができる。抗体または他の結合メンバーは、粒子に共有結合していてもよいし、または間接的に結合していてもよく、例えば、これらはビオチン化されていてもよいし、また標準的な方法を使用して、ビオチン-ストレプトアビジン結合を通してストレプトアビジンコーティングされた粒子に結合していてもよい。
【００９３】
試験物質の保持のための好適な保持剤としては、ゲルに捕捉されるのに十分に大きく、ビーズから拡散することができない粒子(例えばウイルス粒子などの非合成粒子、またはナノ粒子もしくはマイクロ粒子などの合成粒子、またはシクロデキストリンもしくはデキストランなどのポリマー)が挙げられる。
【００９４】
別法として、試験物質は、ゲルビーズのマトリックス自体への結合により(例えばマトリックスに対する親和性を有するコンジュゲート化部分の使用により)保持されていてもよい。ゲルマトリックスは、試験物質を結合する部分(例えばストレプトアビジンもしくはビオチン、または別の好適な結合メンバー)を含み得る。比較的大きな試験物質は、それらのサイズの結果としてゲルビーズ中に保持され得る。
【００９５】
試験物質(例えば小分子化合物)は、同等の方法で、例えば、光シグナル(例えば量子ドット)または同定のためにPCR増幅して配列決定することができるDNAの特徴的断片によってコードされる化学的に結合した小分子試験物質を有するナノ粒子を使用することによって[72]、添加することができる。
【００９６】
特定の実施形態において、微小液滴集団中で個々の試験物質がアッセイされる。
【００９７】
特定の実施形態において、本発明は、試験物質がタンパク質凝集物の脱凝集に与える影響を測定するステップを含む。本発明のこの実施形態において、上記の方法は、試験物質を有する凝集物を含むゲルビーズをインキュベートするステップ、およびその後ゲルビーズ中に存在するタンパク質の凝集物の量を決定し、その量を対照ビーズと比較するステップを含み得る。このようにして同定される物質は、コンフォメーション病を治療し、その進行を逆転させるために有用であり得る。
【００９８】
候補化合物がタンパク質凝集のモジュレーターである化合物として同定されると、in vitroまたはin vivoで(例えば動物モデルを使用して)、その化合物の機能を確認するためのさらなる実験を実施することが望ましい可能性がある。
【００９９】
キット
本発明は、本発明の方法を実行するためのキットも提供する。特定の実施形態において、キットは、凝集タンパク質の標識されたモノマーおよびゲル形成剤を含む。特定の実施形態において、標識は蛍光標識である。特定の実施形態において、ゲル形成剤は、アルギン酸塩、ゼラチンまたはアガロースである。
【実施例】
【０１００】
実施例1 - ゲルビーズの調製
デバイスの製作
この研究において使用されるマイクロ流体デバイスは、従来のソフトリソグラフィー技術を使用して構築された(図2)。手短に言えば、マスターをシリコンウエハ(Compart Technology Ltd.)上のSU-8 2025(Microchem Corp.)から作製した。Slygard 184(Dow Corning)を、樹脂 対 架橋剤の10：1(w/w)の比で混合し、次いでマスター上に流した。回転塗布機の速度を2つの回転相：最初は300rpm/秒の加速度において500rpmで5秒、またその後300rpm/秒の加速度において1650rpmで40秒、に調整することによって50μmの厚みが達成された。脱気後、デバイスを65℃で6時間硬化し、PDMSを切断してマスターを剥離した。デバイス(全長約1〜5cm)を、30秒間空気プラズマに曝し(Femto Diener)、標準的な顕微鏡用スライドガラス(Agar Scientific)上に密封した。次いで、チャネルを、使用前に65℃で10〜12時間焼くことによって疎水性にした。その後デバイスをホットプレート上に置いて130℃に加熱することによって電極を製作した。
【０１０１】
ゲルビーズの形成
フロー集束幾何構造を備えたマイクロ流体液滴生成器[73]を使用して、油中水型液滴を生成した。液滴の内容物は、供給流の内容物によって決定された。すなわち、ペプチド緩衝液溶液をアガロースゲル溶液と混合し、界面活性剤(例えば、0.5％(w/w)フッ素トリブロックコポリマー)を含有するHFE7500油で捕捉した[74,75]。別法として、多くの代替的油/界面活性剤の組み合わせ(例えば、約3％のAbil EM 90を含有する鉱物油、または約4.5％(w/w)のSpan 80および約0.5％(w/w)のTween 80を含有する鉱物油(95％(w/w)))を使用することができる。エマルション液滴は、およそ4.4kHzの周波数で生成した。その後、エマルション液滴を回収し、冷却により(例えば氷上またはウォーターバス中で)「永久化」した。ここで液体アガロースを含有するエマルション液滴を作出し、冷却してアガロース含有液滴のゲルビーズへの変換を引き起こした。その後、1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクタノール(97％)油を添加することによってビーズの界面活性剤層コーティングを除去することにより、エマルションを破壊した。鉱物油/非フッ素界面活性剤の組み合わせの場合、エマルションは、例えば、マイクロチューブ中でエマルションを凍結し、最大速度で5分間遠心分離することによって破壊することができる。水相は油層の下になるだろう。
【０１０２】
最終的に、裸のゲルビーズをNapi(リン酸ナトリウム)緩衝液(pH7.4、50μMリン酸ナトリウム)で3回洗浄し、光学的アッセイが行われるまで緩衝液中に保存した。この最終ステップにおいて、凝集していないペプチドがビーズから抽出された。対照的に、大きな凝集物は、アガロースゲルマトリックスから離れるには嵩高過ぎるため、ビーズの内部に捕捉される。アガロースビーズは凝集物を保持することができるが、そのゲルマトリックスを通して成分の添加および抽出も可能とすることができ、それは様々な設定で凝集物を研究するためのプラットフォームを提供する。ビーズの形成を示す模式図は、図2に提供される。
【０１０３】
従って、単分散液滴はマイクロ流体デバイス中で生成され、全試薬と一緒にロードされる。規定の凝集時間間隔でオフラインインキュベーションした後、液滴は、氷上で回収しインキュベートすることができる。温度降下は、さらなる凝集反応が起こるのを防止し、凝集を効果的に阻害する。さらに、低下したインキュベーション温度はアガロースのゲル化点を下回り、液滴の、多孔質かつ安定したビーズへの変換を引き起こし、この変換は2分またはそれ未満の間に完了する。ビーズ構造は、その後の周囲条件への温度上昇に際しても、また1H,1H,2H,2H-パーフルオロオクタノール(97％)油の添加を通して液滴油境界を除去した後でも、または遠心分離による相分離による鉱物油/非フッ素界面活性剤の組み合わせの場合においても、存続する。アガロースビーズマトリックスの多孔質構造は凝集したアミロイドを保持するように働くが、小分子成分と緩衝液はビーズを自由に出入りする。このようにしてビーズは凝集生成物の「タイムカプセル」となり、多くの下流の分析方法に供することができる。得られたアガロースビーズを洗浄し、小さなオリゴマーおよび分子を除去する能力は、蛍光ベースのアッセイの感度を高めるが、これは、捕捉されたアミロイドに由来する相対シグナルは増加するが、未凝集物質に由来するバックグラウンドは除去されるためである。小さな液滴体積(〜50pL)は、経済的な実験および多様な冗長性を提供する。例えば、1μLの全反応体積は、105までの同一の液滴およびビーズを生成することが可能であり、これは平均化技術または個別の分析のいずれかのための膨大なプールを構成する。
【０１０４】
実施例2 - 全蛍光を用いたマイクロ流体液滴中のAβの凝集シードの検出
この実施例は、マイクロ流体液滴ゲルビーズを使用したAβの合成凝集シードの成功裏の検出を実証する。合成シードは、10日間インキュベートされた非標識Aβ1-42から生成した(50μM、Napi緩衝液、pH7.4)。次いで、これらのシードを蛍光標識されたAβ1-42モノマーと共にマイクロ流体液滴中でインキュベートした。液滴の全蛍光を、FACS分析を使用して測定し、合成シードなしでインキュベートした液滴(すなわち蛍光標識されたモノマーのみを含んでいた液滴)の蛍光と比較した。図３に示されるとおり、合成シード(5μMおよび0.5μM)を含有する液滴は、シードを含んでいなかったビーズ(空ビーズ)と比較して増加した蛍光強度を示した。従って、シードの存在は、アミロイド線維の急激な生成がシードの存在に起因する液滴を表す、高い蛍光強度を有する液滴の集団をもたらす。シードを含む液滴の集団は、シードを含まない集団と区別することができる。
【０１０５】
実施例3 - 全蛍光を用いたハエ脳サンプルにおけるAβの凝集シードの検出
この実施例は、アルツハイマー病のショウジョウバエ(Drosophila)モデルの脳抽出物から得られたサンプル中のAβの凝集シードの成功裏の検出を実証する[76,77]。実施例2に示されるとおり、ビーズの全集団を考慮に入れて、蛍光強度の分布を測定した。
【０１０６】
この実験は、Aβ1-42ペプチドを発現するトランスジェニックハエを使用した。野生型のハエを対照として使用した。以下に概略されるプロトコルを使用して脳抽出物を調製した。
【０１０７】
1. 5、10および25日齢の雄ハエを1.5mlのスナップトップチューブに収集した。ハエを液体窒素中で30秒間スナップ凍結し、次いで30秒間ボルテックスした。
2. ステップ1をさらに2回繰り返した。
3. スナップトップチューブの内容物をドライアイスベッド上の計量ボート上に置き、頭を体の残りの部分から分離した。
4. 頭を新しい1.5mlのスナップトップチューブに収集した(対照用に30〜50個の頭、またAβハエ用に30〜50個の頭)。
5. ハエの頭を、使い捨てのプラスチック製乳鉢を使用して、15μlのPBS+0.05％(w/v)SDS中でホモジナイズした。
6. 次いで、サンプルを、氷冷ウォーターバス中で最大強度で8分間超音波処理した。
7. 続いて、サンプルを3,000gで1分間遠心分離した。
8. BioRadタンパク質アッセイ(またはナノドロップ)を使用して抽出物のタンパク質濃度を決定し、3mg/mlに調整した。
9. 上清を回収し、−80℃で保存した。
【０１０８】
ハエ脳サンプルを、蛍光標識されたAβ1-42モノマーと共にマイクロ流体液滴中でインキュベートした。液滴の全蛍光は、FACS分析を使用して測定した。実施例2に示されるとおり、蛍光標識されたペプチドのシードされた(播種された；seeded)凝集は、シードされていない凝集と比較した場合に促進されるはずであり、このため、凝集シード(Aβ1-42ハエ由来の非標識サンプルに由来する)を含有するビーズは特定の時間内により多くの凝集物を蓄積し、従ってより高い蛍光シグナルを有するはずであると予想された。図4は、ハエ脳抽出物の不存在下で、大部分のビーズ中では極めてわずかな蛍光シグナルしか保持されていない(空ビーズ)ことを示す。対照的に、対照ハエ(野生型)の脳抽出物の添加は、集団(対照ハエの脳系統)において有意な右シフトをもたらし、これはアガロースおよび蛍光Aβ1-42ペプチドへの非特異的結合、あるいはいくらかの非特異的シード活性を示唆する。しかし、Aβ1-42を発現するハエに由来する脳抽出物がアッセイに添加される場合、新たな、強い蛍光を発する亜集団(Aβ42ハエ脳系統、アスタリスク)が認められる。これは、1つの(または潜在的にはさらに多くの)シードを含有し、このため野生型脳抽出物と共にインキュベートされたシードされていないビーズと比較してより多くの蛍光凝集物を経時的に蓄積するビーズを表す。
【０１０９】
本発明者らは、アッセイのシグナル 対 ノイズ比は抽出物が希釈されるほど高いことを観察し、またこれはマイクロ流体技術により生じ得るデジタルシグナルの強力な特徴である。
【０１１０】
実施例4 - 蛍光寿命顕微鏡法を用いた、ハエ脳サンプルおよびマウス脳サンプル中のAβの凝集シードの検出
【０１１１】
シードされた凝集物の生成を測定することができる第２の方法は、蛍光寿命イメージングを使用することである。この技術は、極めて短い励起後、どのように蛍光シグナルが経時的に減衰するかの測定に依存する。通常、HiLyte蛍光色素を有する溶液中のモノマーペプチドは、約4000ピコ秒の寿命を有する。ペプチドが凝集する場合、蛍光減衰の動態は、半減期が約2500psに低下し得るように促進される。
【０１１２】
本発明者らは、これらの極値間で、シードされた凝集物の構造的内容物を評価することができる。興味深いことに、本発明者らは、自然凝集(PBSのみを添加した)は、対照マウスの脳とのインキュベーションによって生じる凝集物と区別し得ない低い半減期をもたらすが、病気のマウスの脳からシードされた凝集物は著しく長い半減期を有することを見出している。このことは、病気のシードされた凝集物が、自然凝集物よりも構造化されていないことを意味し、またこれは、凝集シードを含むサンプルを、凝集シードを含まないサンプルと区別することができるさらなる方策を実証する。
【０１１３】
以下のプロトコルを使用して、2つのマウス系統に由来する脳抽出物をPBS中で作製した。
【０１１４】
1.  海馬および皮質マウス脳組織(同腹子対照およびAPP発現CRND8マウス[78]に由来する)を-80℃のフリーザーから取り出し、氷上で保持した。
【０１１５】
2.  上記の組織を、使い捨て計量ボートを使用して秤量し、滅菌メスを使用してこれを小片に切断した。
【０１１６】
3.  粒子の皮膚との接触および吸入を回避するために実験用コート、手袋およびマスクを着用し、排気キャビネット中でダウンス型(Douce)ホモジナイザーを使用して組織をホモジナイズした。
【０１１７】
4.  最初に対照サンプルをホモジナイズした。組織をホモジナイザーに入れ、オートクレーブしたPBS(10％PBS(w/v)、例えば、1gの組織に対して10ml PBS)に懸濁した。
【０１１８】
5.  上記の物質をエッペンドルフチューブに集め、2分間ボルテックスした。
【０１１９】
6.  ホモジナイザーを洗浄し、ステップ4および5を繰り返して病気サンプル(APP発現)を調製した。
【０１２０】
7.  サンプルを処理した後、ホモジナイザーを2mlの1x PBSで洗浄し、対照サンプルとして使用した。
【０１２１】
8.  サンプルを、密封したチューブで氷冷ウォーターバス中で最大強度で8分間超音波処理した。
【０１２２】
9.  サンプルを3,000gで5分間遠心分離した。
【０１２３】
10.  ピペットを使用して中間層を新たなエッペンドルフチューブに回収した。
【０１２４】
11.  サンプルを再度3,000gで遠心分離し、任意の残った破片を除去した。
【０１２５】
12.  上清を新しいチューブに回収し、-80℃で保存した(10％(w/v)抽出物)。
【０１２６】
第1の系統は正常な実験室マウスであり、第2の同腹子対照マウスは、同じ系統に由来するがヒトアミロイド前駆タンパク質(APP)の病気関連変異体についてトランスジェニックであった。結果として、そのトランスジェニックマウスはAβ凝集物を蓄積し、AD関連表現型を示し、ADのモデルとして使用されている。本発明者らは、アガロース含有微小液滴中で脳抽出物が蛍光標識されたAβ1-42ペプチドと混合されたときに生じた凝集物の生物物理学的特徴を比較した。蛍光寿命顕微鏡法を使用して、洗浄ステップ後にマイクロビーズ中に保持された凝集物の構造を調べた。図５に示されるとおり、対照マウスの脳抽出物の存在下で形成される凝集物の蛍光寿命が、ビヒクル(PBS)の存在下で形成される凝集物の寿命と同じであったことが見出された。対照的に、病気のマウスの抽出物に曝されたビーズ中の凝集物の蛍光寿命は顕著に延長したが、これは、この場合に生成されたAβ種の規則性が低くなったことを示唆していた。
【０１２７】
実施例5 - アガロースビーズ中の凝集物のイメージング
ビーズ構造中でのアミロイドの核形成および成長の空間的分布を観察するため、本発明者らは、薄層斜光照明法(highly inclined illumination)[79]、およびエピ蛍光顕微鏡法、ならびに直接確率論的光学再構成顕微鏡法(dSTORM)[42,43]を使用して凝集物の分布を調べた。後者は、20nmまでの解像度で特徴を解像することを可能とする光学超解像イメージング技術である[80]。図6Aは、アガロースビーズにおいて5μMで24時間インキュベートされたHiLyte488-Aβ1-40凝集物から得られた単一イメージスライスを示す。イメージは、薄層斜光照明法(highly inclined illumination)(HiLo)[42,79]を用いて得られ、ビーズの中心を通るスライスを表す。図6Bは、ビーズ中のタンパク質分布の3Dレンダリングを示す。タンパク質がビーズ構造全体にわたってチャネル様の特徴で蓄積することは明らかであり、それはアガロースゲルマトリックスの多孔質構造を反映している。本発明者らはTEMイメージングを実施し、Griessの方法を使用して[81,82]、本発明のアガロースビーズ中の孔サイズが200nmの範囲内となると推定した。これは、類似のシステム[83]について以前に報告されたサイズと同様である。モノマーは洗浄ステップ後に除去されるため、図6からは凝集物がチャネル構造で保持されていることは明らかである。実際、チャネル構造が凝集の動態に対して顕著な影響を及ぼすと仮定することができ、この話題は次の節で探究される。
【０１２８】
図7は、光の波長より小さい解像度で特徴をイメージ化することができる超解像技術である構造化照明顕微鏡法(SIM)を示す[84,85]。本発明者らは、OMX顕微鏡(Applied Precision、米国)を使用して、構造化照明パターンおよびその後のイメージ再構成によるビーズを通る光学的イメージスライスの連続記録(45μm直径のビーズから得られた16μmスライスの蛍光イメージがOMXにより得られた)により、ビーズの内部の凝集物の位置を可視化した。結果は図7に示される。図7(A)は、ビーズ中のスライスの標準的な広視野イメージを示す。図7(B)では、同じ領域がSIMを用いて可視化されている。明らかに、この技術により解像度とコントラストの両方が大幅に高められている。Aβ1-40-Hilyte488の凝集物は、アガロースマトリックス中と溶液中で区別することができる。0.6％(w/w)アガロースから形成されるゲル中の平均孔径は、以前は100〜300nmの範囲であると報告されていた[83]。従って、アガロース「ケージ」構造は、このサイズより大きな凝集物を保持する際に有効である。モノマーは洗浄ステップ後に除去され、このため凝集物は、アガロース固化の際にそれらの高分子状態で効果的に「凍結」される。ビーズ内部の凝集物のランダム分布は、ビーズの空隙中で凝集が起こることを示唆する。油/水界面において優先的凝集が起こっているようには見えなかった。凝集物およびモノマーの孔中への閉じ込めは、混雑した環境(例えば細胞内)において観察される影響と同様に、核形成および成長の速度に影響を与える可能性がある[37]。ビーズ中の成長動態は、次の節で詳細に研究される。
【０１２９】
広視野HiLoの解像度は、個々の凝集物を解像するには十分ではないため、本発明者らは、Alexa647標識されたAβ1-40について、同様の条件下で高解像度dSTORM実験を実施した。従来のフルオロフォアは、効率的な光スイッチ可能な蛍光プローブとして使用することができると報告されている[86]。活性化フルオロフォアを用いることなく様々な波長の光を照射することにより、これらのプローブについて蛍光状態と暗状態の可逆的サイクルが生じ得る。これが、ナノメートル精度と副回折-解像イメージを有する確率論的光学再構成顕微鏡法(STORM)の原理である。dSTORMイメージングによってAβ1-42構造観察の顕著な改善が証明された[87]。アガロースビーズの内部に形成された凝集物の詳細な構造を検出するため、油浸対物レンズを備えた全反射照明蛍光(TIRF)機器構成によって超解像蛍光イメージングを実施した[88]。アガロースビーズ内部の凝集物の明らかな構造を可視化するため、比較的小さな領域を選択して拡大した(図8)。
【０１３０】
dSTORMイメージの作成のため、フォトスイッチング緩衝液を調製し、ビーズリザーバーに注入した。スイッチング緩衝液への酸素混入は、イメージング過程を開始する前にリザーバーを密封することによって防止した。アガロースビーズの特定の領域のイメージ5000個を記録した。カスタムメイドのMatlabコードに基づいてイメージを再構築した。凝集物の明らかな構造および異なる長さは、最小およそ100nmのサイズまで観察することができた。
【０１３１】
実施例6 - 凝集の蛍光寿命分析
この実施例は、スクリーニングに有用なビーズ中のアミロイドの凝集状態を評価しモニターするための蛍光寿命イメージングの使用を実証する。
【０１３２】
Hilyte488標識されたAβ1-40の寿命シフトを、TCSPC(時間相関単一光子計数法(Time-Correlated Single Photon Counting))共焦点顕微鏡セットアップ上でモニターした。アガロースビーズを60 X 0.25油対物レンズ(Leica)によってイメージ化した。レーザー光は超連続光源(20mHz)によって生成し、タグ化フルオロフォアHilyte488を励起するために励起は488nmに設定した。発光は、515nmのロングパスフィルターでフィルター透過した。検出可能な凝集を依然として生じさせることができるAβ1-40の最低可能濃度を探索するため、3つの異なる濃度のAβ1-40をNapi緩衝液溶液(5μM、2.5μMおよび1μM)中で調製し、1.5％アガロース溶液と混合した。0.75％アガロースエマルションサンプルを37℃でそれぞれ2、4、6、8、24および48時間インキュベートした。その後、上記のとおりエマルション液滴を固定化し、破壊しさらに洗浄し、TCSPC分析のために使用した。
【０１３３】
ビーズケージ化アミロイドサンプルの蛍光寿命を、カスタム設計された顕微鏡法セットアップを使用してTCSPCによって分析した[89]。本発明者らは以前に、蛍光的にタグ化されたアミロイド凝集物の蛍光寿命が、凝集状態の高感度な読み出し情報であり、低下する寿命は、増加する凝集度を示していることを示した[37]。現在の研究の主要な動機は、凝集の分子機構を研究するための新たなプラットフォームとしての、また潜在的な凝集阻害小分子剤のスクリーニングのための寿命イメージングを微小液滴技術と共に確立することであった。図10は、様々な濃度および条件における、HiLyte488標識されたAβ1-40を含有するビーズの共焦点蛍光寿命イメージを示す。図9Aは、Aβ1-40のモノマー溶液と混合されたアガロースビーズを示す。明らかに、モノマーはアガロースビーズを満たしており、蛍光シグナルは輪郭が示されているビーズの内部と外部の両方から観察される。均一な青色は約4000psの平均寿命を示し、これは単離されたフルオロフォア標識の値に近い。ビーズをNapi pH7.4緩衝液で洗浄すると、ビーズから全てのペプチドが完全に除去され、蛍光を観察することはできない(データは示していない)。図9Bは、24時間のインキュベーション後にバルク溶液中に出現する5μMのHiLyte488標識されたAβ1-40の凝集物を示す。アガロースビーズを凝集物含有溶液に添加し、その混合物を洗浄ステップに供して、ペプチドのモノマーおよび小さなオリゴマーを除去した。ビーズが、その寿命がモノマー混合物の寿命より著しく短い凝集物を保持することは明らかである(図9(A))。ビーズの外部のシグナルは存在せず、またビーズ中でモノマーに由来するバックグラウンドはほどんど観察されない(図9(B))。この結果は、液滴ケージの凝集物保持能力を実証している。図9(C)は、図9(B)と同様の条件下で得られた凝集物を示すが、今回は、凝集はアガロースビーズの存在下で進行させた。この場合も同様に、混合物は24時間後に緩衝液溶液中で洗浄され、また同様に、そのケージが凝集種に対する効率的な保持器としての役割を果たし、モノマー形態または小さなオリゴマー形態のペプチドは受け入れないことは明らかである。バルク溶液中で生成される凝集物とは対照的に、寿命は約3000psから約2500psに低下し、それは、バルク溶液と比較して、ビーズ中で凝集がより効率的に進行することを示唆する。
【０１３４】
これをより定量的に調べるため、ビーズ中の異なる濃度のペプチドについて凝集の時間的経過を測定し、バルク測定値と比較した(図10)。次第に成熟するAβ1-40アミロイドのサンプルは、3500から1500psに低下する寿命を示した(図10(A))。この範囲の寿命低下は、蛍光寿命イメージング顕微鏡法(FLIM)によりバルク溶液中で以前に観察された寿命低下と同じであり[37]、ビーズ中とバルク中でタンパク質が同様の構造的形態を取る[87]ことを示す。しかし、液滴中では、観察された低下は、経時的にはるかに迅速に起こり、ビーズがタンパク質の自己集合反応を促進するという本発明者らの仮説を裏付けている。図10(A)において、各ビーズについて平均化した蛍光寿命の低下は、3つの異なる開始濃度(1-5μMのAβ1-40、それぞれ上向き三角、丸および四角)について、また異なる凝集時点において示されている。測定値は、バルク溶液中の5μM Aβ1-40の濃度(下向き三角)についても示される。凝集の時間的経過は、溶液中と比較してビーズ中ではるかに迅速に生じ、凝集の速度はさらに濃度依存的であることが明らかである。図10(B)では、高寿命を含む画素数と比較して低寿命を含む(すなわち3000psの閾値を超えるかまたは下回る)画素数として定義されるビーズ1個当たりの相対的「凝集物数」が示される。類似の開始濃度について、凝集物数は、バルク中で観察される凝集物数と比較すると、ビーズ中で著しく高い。これらの傾向は、部分的には、ビーズケージがモノマーが洗い流される一方で比較的大きな凝集物サイズのトラップとしての役割を果たすという事実によって引き起こされる。これは、(長)寿命の可溶性(主にモノマー性)Aβ1-40が優位な溶液中の測定値と比較して、シグナル対ノイズ比を改善する。そのアッセイは、バルク中で可能なペプチド濃度をはるかに下回る1μMもの低いペプチド濃度のAβ1-40の凝集物を確実に検出する。凝集物の数は、24時間から48時間にかけて低下し、それは凝集物「合体」または場合により線維形成を示す。とりわけ、溶液中で検出するのが困難な、中間寿命を有する凝集物をより迅速にアクセスすることができる。これらの特性は、例えば、懸命な薬剤探索努力の焦点である潜在的な凝集阻害剤の、高感度かつ迅速な試験を可能とするスクリーニング適用における潜在的な使用のために好ましい。
【０１３５】
実施例7 - Aβ1-40の自然凝集を検出して観察するためのフローサイトメトリーの使用
この実施例は、自然(シードされていない)凝集を測定するためのゲルビーズの使用について記載する。HiLyte488標識されたAβ1-40ペプチドから生じるビーズ中のタンパク質凝集物の数はフローサイトメトリーによって分析され、ビーズケージ中に保持された凝集物からその結果として生じた蛍光の測定により定量された。4.4KHzの液滴生成速度で、約5.3×106個の液滴の集団が20分間にわたって得られ、この中から約2×105個の液滴のアリコートを取り出した。この液滴は、凝集の時間的経過(96時間まで)を通して含まれ、定期的間隔で分析された。図11は、経時的に出現する凝集物数の増加を示す。1μMもの低い濃度でAβ1-40ペプチドが凝集するのを見ることができることは注目に値し、ここで顕著なシグナルが>24時間得られる(図11、黒色の四角を参照)。この濃度は、Aβ1-40が同様の条件下でバルク溶液中で凝集物を形成するにはあまりにも低すぎる。多孔質ビーズ構造が、生理学的条件下で細胞中に存在する混雑環境(ここでは低濃度のペプチドで凝集が頻繁に観察される)により類似する幾何学的閉じ込めを通して凝集過程を促進することができる。さらなる分析(次の節を参照)は、実際にAβ1-40が凝集物形態でビーズ中に存在することを明らかにした。これらの知見は、約10μMのペプチド濃度未満での観察を可能としない大部分の高感度な報告された方法[89-91]の感度より優れている、ビーズベースの凝集アッセイの卓越した感度の証明となる。伝統的なバルクシステムでは、50μM未満のAβ1-40ペプチド濃度について信頼性のある読み出し情報は報告されなかった。
【０１３６】
FACS分析
処理されたゲルビーズは水性の緩衝液溶液中に保存されたため、これらは、凝集過程を評価し、アガロースビーズ内部の凝集物の異なる強度を比較するために、水性の担体流体を必要とする技術であるフローサイトメトリーすなわちFACSにより試験することができた。インキュベートして洗浄した、HiLyte488標識されたAβ1-40凝集物を有するアガロースビーズをFACSに送り、蛍光凝集物を有するビーズを計数した。アガロースのみを有しAβ1-40は有さない空ビーズもまた、FACS試験の対照群として調製した。凝集物を含有するビーズのパーセントを、プログラムSummitを使用して計算した。条件：37℃、Napi pH7.4。
【０１３７】
実施例8 - 凝集阻害剤のスクリーニング
この実施例は、既知のAβ凝集阻害剤を成功裏に同定するための本発明のアッセイの使用を実証する。凝集性Aβ1-42モノマーを、既知のAβ凝集阻害剤であるシロイノシトールと共にゲルビーズ中でインキュベートした。図12に示されるとおり、シロイノシトールによる凝集の阻害が検出された。
【０１３８】
従って、本発明のアッセイは、既知の阻害剤を同定することが可能であり、またさらなる凝集阻害剤を同定するのに有用であろう。
【０１３９】
実施例9 - 蛍光の光ファイバー検出
本発明のアッセイおよび方法は、液滴生成と蛍光検出が統合された簡易化システムを包含する。例えば、液滴およびビーズ形成のためのチップデバイスは、(PDMSの代わりに)より硬いプラスチックまたはガラスで構築することができる。さらに、光ファイバーベースのシステムを使用して、ビーズがキャピラリーを通過してポータブルレーザー誘起蛍光(PLIF)リーダーで検出されるときにビーズ中の蛍光凝集物を検出することができる。図13は、このようなシステムの概要を提供する。所望の場合、何千個ものビーズをキャピラリーに入れ、検出器を通過して移動させて測定することが可能である。これは、十分な数の凝集物が生じた場合に時間的経過をとり、同定するために便利であり、その結果大規模分析を実施することができる。
【０１４０】
実施例10 - 病気の進行の調査
本発明のアッセイおよび方法は、病気の進行をモニタリングするために使用することができる。先の実施例において使用されたアルツハイマー病のショウジョウバエ(Drosophila)モデルは、前駆症状から中等度の病気を経て死亡するまでの病気サイクルを30日以内にセットアップするできることに基づいて、実験的に観察され且つ計算的に予測される凝集挙動と神経毒性との間の重要な関連性を提供する[92]。幾つかの神経学的アッセイ(例えば、運動能力、寿命低下および組織学的指標[93,94])が利用可能であり、また液滴ビーズアッセイを用いて得られた凝集シードの測定値は、これらの既知の指標と相関し得る。
【０１４１】
Aβペプチドの様々なアイソフォーム(1-40、1-42および1-42の北極変異体)を発現するトランスジェニックショウジョウバエを作成し、40日まで老化させた。所要の日齢において、50匹のハエのアリコートをCO2中で一時的に麻酔し、次いで、スナップトップチューブに入れて液体窒素中で凍結した。凍ったままボルテックスすることにより頭切除した後、頭を回収し、使い捨て乳棒を使用して50μlの氷冷PBS中でホモジナイズした。ホモジネートを10,000gで5分間遠心分離し、ペレットを捨てる。ナノドロップ(OD280nm)を使用して上清のタンパク質濃度を見積もり、PBSを添加して3mg/mlの標準抽出物を作成する。対照サンプルとしては、導入遺伝子を発現していない類似のハエまたは別の非関連神経毒性凝集を起こしやすいポリペプチド(例えばpolyQ)を発現しているハエ[95]が挙げられる。他の対照において、Aβ発現ハエ抽出物は、非Aβの影響を抑制するために2つのモノクローナル抗体(4G8および6E10)を使用して免疫枯渇される。また非トランスジェニックハエ抽出物も、模擬的に免疫枯渇される。本発明のマイクロ流体アッセイを用いた測定値は、ハエにおける病気の表現型、例えば脳Aβレベルおよび酸化ストレスマーカーなどの生化学マーカー、ならびに運動アッセイおよび死亡率(特に死亡率軌道プロットの傾き(死亡する可能性 対 時間の対数))などの表現型の測定値と相関している。
【０１４２】
液滴ビーズアッセイを用いて得られる凝集シードの測定値もまた、神経変性病のマウスモデルにおける病気の進行と相関し得る。ハエについては、脳抽出物が唯一の利用可能なサンプルであるが、マウスモデルは、液滴ビーズアッセイにおいて分析することができる様々な異なるサンプルを利用できる。例えば、アルツハイマー病のCRND8マウスモデルを利用することができる。複数種の組織抽出物(脳(例えば図14参照)、血清(例えば図15参照)および尿)が試験され、また本発明のアッセイは、これらのサンプル中の凝集シードの存在を検出するために使用される。マウスの脳および血清サンプルは、上記のハエ脳サンプルと同様に処理され、3mg/mlのタンパク質の原液が得られる。尿サンプルは遠心分離され、上清は10x PBSで9：1に希釈される。10セットのCRND8マウス組織およびそれらの非トランスジェニック同腹子に由来する同様の数のマウス組織が使用される。マウス実験のための対照サンプルは、ハエ対照と同様である。特に、CRND8抽出物を免疫枯渇させると、シグナルの損失を生じる。ハエ実験およびマウス実験の両方において、比較的高い蛍光寿命を有する高蛍光強度の液滴のAβ依存性集団が測定される。これらの結果は、生物における表現型のステージ分類と相関している。特に、どれだけ早くシグナルが見えるかおよび表現型がより重篤になるにつれてそれがどのように発展するかが決定される。
【０１４３】
液滴ビーズアッセイを用いて得られた凝集シードの測定値はまた、ヒトの病気の進行とも相関し得る。ハエおよびマウスについての方法と同様に、10人のAD患者(中等度〜重篤)ならびに10人の年齢適合および性別適合非認知症対照に由来する死後凍結脳組織(海馬)から得られた抽出物が回収される。同じ患者に由来するCSFサンプルは、マウス尿サンプルについて使用した方法と同じ方法によって調製される。本発明のアッセイは、アルツハイマー病を有する被験体の脳内の凝集シードを検出するために使用され、凝集シードの量は、上記の動物モデルにおけるように、病気の進行と相関している。
【０１４４】
実施例11 - 全蛍光を用いたマウス脳サンプル中のAβの凝集シードの検出
この実施例は、アルツハイマー病のモデルであるCRND8[78]マウスおよび同腹子対照マウスの脳抽出物から得られたサンプル中のAβの凝集シードの成功裏の検出を実証する。実施例2に示されるとおり、ビーズの全集団を考慮に入れて、蛍光強度の分布を測定した。
【０１４５】
この実験は、脳内でヒトAβ1-42ペプチドを生成するトランスジェニックCRND8マウスを使用した。野生型、同腹子対照マウスを対照として使用した。以下に概略されるプロトコルを使用して、脳抽出物を調製した。
【０１４６】
1. 200mgのマウス脳皮質を、使い捨てのプラスチック製乳鉢を使用して、50μlのPBS+0.05％(w/v)SDS中でホモジナイズした。
2. 次いで、サンプルを、氷冷ウォーターバス中で最大強度で8分間超音波処理した。
3. 次いで、サンプルを3,000gで1分間遠心分離した。
4. 上清を保持し、BioRadタンパク質アッセイ(またはナノドロップ)を使用して抽出物のタンパク質濃度を決定し、PBSの添加によって3mg/mlに調整した。
5. サンプルを-80℃で保存した。
【０１４７】
マウス脳サンプルを、蛍光標識されたAβ1-42モノマーと共にマイクロ流体液滴中でインキュベートした。液滴の全蛍光は、FACS分析を使用して測定した。実施例2に示されるとおり、蛍光標識されたペプチドのシードされた凝集は、シードされていない凝集と比較した場合に促進されるはずであり、このため、凝集シード(CRND8マウスに由来する非標識サンプルから得られた)を含有するビーズは、特定の時間内により多くの蛍光標識された凝集物を蓄積し、従ってより高い蛍光シグナルを有するはずであると予想された。図14は、脳抽出物を含有しない対照ビーズ中の蛍光強度中央値で除算した、脳抽出物を含有するビーズの蛍光強度中央値の比を比較する。脳サンプルの一連の希釈にわたって、対照脳抽出物(標識WT)と比較して、CRND8(アルツハイマーモデルマウス)におけるAβ1-42凝集シードの存在を報告する特異的シグナルが存在した(図14、標識AD)。このシグナルは、0.2mg/mlおよび1mg/mlの抽出物濃度について見られた。
【０１４８】
実施例12 - 全蛍光を用いたマウス血清サンプル中のAβの凝集シードの検出
この実施例は、アルツハイマー病のモデルであるCRND8[78]マウスおよび同腹子対照マウスの血清から得られたサンプル中のAβの凝集シードの成功裏の検出を示す。実施例2に示されるとおり、ビーズの全集団を考慮に入れて、蛍光強度の分布を測定した。
【０１４９】
この実験は、脳内でヒトAβ1-42ペプチドを生成するトランスジェニックCRND8マウスを使用した。野生型、同腹子対照マウスを対照として使用した。以下に概略されるプロトコルを使用して脳抽出物を調製した。
【０１５０】
1. 300μlのマウス血液を、1.5mlスナップトップチューブ中で凝固させた。
2. 次いで、サンプルを3,000gで1分間遠心分離した。
3. 血清上清を保持し、BioRadタンパク質アッセイ(またはナノドロップ)を使用してタンパク質濃度を決定し、PBSの添加により3mg/mlに調整した。
4. サンプルを-80℃で保存した。
【０１５１】
100μg/mlのマウス血清サンプルを、蛍光標識されたAβ1-42モノマーと共にマイクロ流体液滴中でインキュベートした。液滴の全蛍光は、FACS分析を使用して測定した。実施例2に示されるとおり、蛍光標識されたペプチドのシードされた凝集は、シードされていない凝集と比較した場合には促進されるはずであり、このため、凝集シード(CRND8マウスに由来する非標識サンプルから得られた)を含有するビーズは、特定の時間内により多くの蛍光標識された凝集物を蓄積し、従ってより高い蛍光シグナルを有するはずであると予想された。図15は、同腹子対照マウス血清に由来する血清を含有するビーズ(破線)と比較して、病気のマウスに由来する血清を含有するビーズの＞10,000個の集団の蛍光強度(CRND8マウス、アルツハイマーモデル血清、実線)を比較する。脳抽出物の不存在下においては、蛍光はバックグラウンドレベルであり、自然凝集を報告していた(点線)。
【０１５２】
CRND8由来のビーズの集団の蛍光強度は、対照マウスの血清に由来するビーズより高かった。これは、血液または血清などの末梢組織中で、臨床標本中の濃度と同程度の濃度で凝集Aβシードを検出することができることを示す。
【０１５３】
本発明は例としてのみ記載され、本発明の範囲および精神の範囲内に残ったまま変更し得ることが理解されるだろう。
本発明として以下の態様が挙げられる。
[1]サンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出する方法であって、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；及び
(iv) 微小液滴におけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップ
を含み、ここで微小液滴におけるポリペプチドの凝集物の形成が、サンプル中の1つ以上の凝集シードの存在を示す、前記方法。
[2]ポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病のリスクがある被験体を同定するかまたは被験体におけるポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を診断、評価もしくはモニタリングする方法であって、
被験体から得られたサンプル中のポリペプチドの凝集シードの存在を検出するステップを含み、ここで検出するステップが、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；および
(iv) 微小液滴におけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップ
を含み、ここで微小液滴におけるポリペプチドの凝集物の形成がサンプル中の1つ以上の凝集シードの存在を示し、またサンプル中の凝集シードの存在が、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している、前記方法。
[3]コンフォメーション病が、アルツハイマー病、パーキンソン病、シヌクレイノパチー、タウオパチー、プリオン病、脳β-アミロイド血管症、CADASIL症候群、前頭側頭葉変性症、FTLD-FUS、筋委縮性側索硬化症、ハンチントン病、トリプレットリピート疾患、アミロイドーシスを伴う遺伝性脳出血、アレキサンダー病、セイピノパチー、家族性アミロイド神経障害、老人性全身性アミロイドーシス、セルピノパチー、II型糖尿病、大動脈内側アミロイドーシス、ApoAI、AIIまたはAIVアミロイドーシス、フィンランド型家族性アミロイドーシス、リゾチームアミロイドーシス、フィブリノーゲンアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、封入体筋炎/ミオパチー、ロドプシン変異を伴う網膜色素変性症、甲状腺髄様癌、心臓心房性アミロイドーシス、角膜ジストロフィー、皮膚苔癬アミロイドーシス、肺胞タンパク症、歯原性(ピンドボルグ)腫瘍、アテローム性動脈硬化、または遺伝性非神経障害性全身性アミロイドーシスである、[2]に記載の方法。
[4]微小液滴が液体形態のゲル形成剤を含み、ここで前記方法が微小液滴をゲルビーズに変換するステップを含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]ゲル形成剤が、アルギン酸塩、ゼラチンまたはアガロースである、[4]に記載の方法。
[6]微小液滴が冷却によりゲルビーズに変換される、[4]または[5]に記載の方法。
[7]ポリペプチドの凝集シードを含まない生成物を調製する方法であって、以下のステップ：
(i) サンプルをポリペプチドのモノマーと接触させるステップ；
(ii) サンプルを複数の微小液滴に分割するステップ；
(iii) 微小液滴をポリペプチドの凝集に適した条件下でインキュベートするステップ；
(iv)微小液滴におけるポリペプチドの凝集物のその後の形成を決定するステップであって、ここでポリペプチドの凝集物の形成が、微小液滴中の1つ以上の凝集シードの存在を示す、前記ステップ；および
(v) ポリペプチドの凝集シードが存在しないと認められる場合、生成物に含めるためにサンプルを受け入れるステップ
を含む、前記方法。
[8]試験物質がポリペプチドの凝集に与える影響を測定する方法であって、以下のステップ：
(i) 試験物質、ポリペプチドのモノマーおよび液体形態のゲル形成剤を含む、微小液滴を形成するステップ；
(ii) ポリペプチドの凝集に適した条件下で微小液滴をインキュベートするステップ；
(iii) 微小液滴をゲルビーズに変換するステップ；および
(iv) ゲルビーズ中に存在するポリペプチドの凝集物の量を決定し、その量を対照ビーズと比較するステップ
を含む、前記方法。
[9]ポリペプチドのモノマーが蛍光標識され、ポリペプチドの凝集物のその後の形成が、蛍光シグナルを検出することによって決定される、[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]蛍光シグナルの検出が、形成されたポリペプチド凝集物の構造に関する情報を提供する、[9]に記載の方法。
[11]蛍光シグナルが、フローサイトメーターを使用して、蛍光寿命顕微鏡法を使用して、直接確率論的光学再構成顕微鏡法(dSTORM)を使用して、構造化照明顕微鏡法を使用して、FRET顕微鏡法を使用して、または円偏光二色性を使用して、検出される、[9]または[10]に記載の方法。
[12]形成されたポリペプチド凝集物の構造を分析するステップを含む、[1]〜[11]のいずれかに記載の方法。
[13]形成されたポリペプチド凝集物の構造が、病気のリスク、存在、または重篤度と相関している、[2]に従属する場合の[12]に記載の方法。
[14]微小液滴が、ポリペプチドの凝集物の存在下でシグナルを生成するレポーター物質を含有し、ポリペプチドの凝集物のその後の形成が、レポーター物質により生成されるシグナルを検出することによって決定される、[1]〜[13]のいずれかに記載の方法。
[15]サンプルを複数の微小液滴に分割するステップが、サンプルを微小液滴に乳化するステップを含む、[1]〜[14]のいずれかに記載の方法。
[16]油中水型エマルションが形成される、[15]に記載の方法。
[17]2つ以上の技術またはアッセイが、ポリペプチド凝集物を検出しまたは分析するために使用される、[1]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18]対照ビーズがポリペプチドの凝集のモジュレーターを含まず、対照ビーズと比較して低下した量の凝集物は、試験物質がポリペプチド凝集の阻害剤であることを示し、また対照ビーズと比較して増加した量の凝集物は、試験物質がポリペプチド凝集の促進剤であることを示す、[8]、または[8]に従属する場合の[9]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[19]対照ビーズがポリペプチドの凝集阻害剤を含み、またここで対照ビーズと同程度の凝集物の量は、試験物質がポリペプチド凝集阻害剤であることを示し、対照ビーズと比較して増加した量の凝集物は、試験物質がポリペプチド凝集阻害剤ではないことを示す、[8]、または[8]に従属する場合の[9]〜[17]のいずれかに記載の方法。
[20]試験物質がゲルビーズ中に保持される、[8]〜[19]のいずれかに記載の方法。
[21]試験物質が、試験物質中のまたは試験物質に結合した第2の部分に対する親和性を有する第1の部分を含む微小液滴中への粒子の含有によりゲルビーズ中に保持される、[20]に記載の方法。
[22]少なくとも50個、少なくとも100個、少なくとも500個、または少なくとも1000個の試験物質が並行して分析される、[8]〜[21]のいずれかに記載の方法。
[23]ポリペプチドの凝集によって引き起こされるコンフォメーション病を治療するための医薬組成物を製造する方法であって、以下のステップ：[8]〜[22]のいずれかに従って、試験物質がポリペプチドの凝集に与える影響を測定するステップ；ポリペプチドの凝集を阻害する物質を選択するステップ；場合により該物質を改変するステップ；および該物質を製薬上許容される担体または賦形剤と組み合わせるステップを含む、前記方法。
[24]ポリペプチドが、Aβ1-40またはAβ1-42などのアミロイドβペプチド、タウタンパク質、プリオンタンパク質、α-シヌクレイン、TDP-43、FUS、ハンチンチン、セルピン、トランスサイレチン、ノッチ3、グリア細胞繊維性酸性タンパク質、セイピン、膵島アミロイドポリペプチド(IAPP)、プロIAPP、アポリポタンパク質AI、AIIまたはAIV、ゲルゾリン、β2ミクログロブリン、ロドプシン、ケラチン、チューブリン、サーファクタントタンパク質C、歯原性エナメル芽細胞関連タンパク質、カルシトニン、心房性ナトリウム利尿因子、血清アミロイドA、メジン、またはリゾチームである、[1]〜[23]のいずれかに記載の方法。
【０１５４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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