(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
単球を樹状細胞へと分化させるためのインビトロ方法であって、
ヒトVentXポリペプチドをコードする発現構築物を単球に導入する工程
を含み、該VentXポリペプチドが単球で過剰発現し、それにより単球が樹状細胞へと分化する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張および関連出願
本出願は、2013年4月10日に提出された米国仮出願第61/810,610号の恩典を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に明示的に組み入れられる。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、概して、ヒト生物学での発見、ならびにそれに基づく治療用および診断用の組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、ヒトホメオボックス転写因子VentX、ならびに、それによるヒト樹状細胞の分化および成熟の調節、ならびに、関連する治療用および診断用の組成物と使用の方法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
樹状細胞（DC）は、免疫応答の開始および免疫恒常性の維持において重大な役割を果たす最も強力な専門的抗原提示細胞である。DCは、骨髄の造血幹細胞/多能性前駆細胞に由来し、末梢非リンパ系組織に未成熟状態で存在する（Geissmann, et al., 2010 Science 327(5966): p.656-61（非特許文献1）；Liu, et al. 2010 Immunol Rev 234(1): p.45-54（非特許文献2））。これらの未成熟DCは、様々な抗原を効率的に取り込みかつプロセシングし得る。炎症性サイトカイン、または細菌のリポ多糖（LPS）などの微生物構成要素による刺激によって、未成熟DCは成熟過程を受けかつ局所リンパ節へ移動し始め、そこでCD40を介して抗原特異的T細胞上のCD40リガンドと相互作用し、かつ強力な免疫刺激細胞または免疫寛容原性細胞へと成熟する（除去）（Geissmann, et al., 2010 Science 327(5966): p.656-61（非特許文献1）；Randolph, et al. 2005 Nat Rev Immunol 5(8): p.617-28（非特許文献3）；Mellman, et al. 2005 Adv Exp Med Biol 560: p.63-7（非特許文献4））。DCの成熟は、MHCクラスIIおよび共刺激性分子の発現の上方調節、免疫刺激性サイトカインの産生、ならびにナイーブT細胞および抗原特異的T細胞を刺激する能力の獲得と相関する。
【０００４】
腸粘膜はDCに富み、これらは粘膜固有層に存在し、病原体侵入に対する免疫応答を調節する。腸DCの成熟および機能は、宿主因子および微生物構成要素の両方によって調節される。腸DCは、トール様受容体（TLR）ファミリーのメンバーなどのパターン認識受容体を通じて病原体の存在を検出する。腸DCの異常な成熟および活性化は、炎症性腸疾患（IBD）などの自己免疫性/炎症性病態において病因的役割を果たすとみなされている。IBD患者の炎症を起こした粘膜から単離されたDCでは、TLR2、TLR4、CD40の発現が増強されることが分かっている。さらに、異常なTLRシグナル伝達は、患者をクローン病に罹患させやすくすることが分かっている。証拠は増加しつつあり、自己免疫性−炎症性病態の管理においてDCを標的とすることの潜在的役割を示唆している。しかしながら、現在のところ、DCの成熟および機能を調整するために操作され得る内因性DC因子についてはほとんど知られていない。
【０００５】
循環中の単球由来DCは炎症の発症に関与しており、インビトロにおけるヒト単球由来樹状細胞は、DC分化の分子メカニズムを探るためのモデルシステムとして広く用いられている。循環中の単球由来DCは炎症の発症に関与している。以前の研究により、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）およびIL4は、末梢血CD14＋単球のCD14−CD1a＋DCへの分化を推進することが示された。IL6、IL10、およびγ-IFNなどのいくつかのサイトカインは、DCへの単球分化を負に調節することが示されており、一方で他のサイトカインは、DC分化を促進することが報告されている（Chomarat, et al. 2000 Nat Immunol 1(6): p.510-4（非特許文献5）；Mitani, et al. 2000 Br J Haematol 109(2): p.288-95（非特許文献6）；Allavena, et al. 1998 Eur J Immunol 28(1): p.359-69（非特許文献7）；Delneste, et al. 2003 Blood 101(1): p.143-50（非特許文献8）；Chomarat, et al. 2003 J Immunol 171(5): p.2262-9（非特許文献9）；Iwamoto, et al. 2007 J Immunol 179(3): p.1449-57（非特許文献10）；Gabriele, et al. 2004 Blood 103(3): p.980-7（非特許文献11））。最近の遺伝子プロファイリング解析により、ヒトCD14＋単球からDCへの分化の誘導の際に差次的に発現される膨大な数の遺伝子が明らかになっている（Le Naour, et al. 2001 J Biol Chem 276(21): p.17920-31（非特許文献12））。それにもかかわらず、ヒト単球からDCへの分化の根底にある主要な転写調節メカニズムは、依然としてほとんど理解されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Geissmann, et al., 2010 Science 327(5966): p.656-61
【非特許文献２】Liu, et al. 2010 Immunol Rev 234(1): p.45-54
【非特許文献３】Randolph, et al. 2005 Nat Rev Immunol 5(8): p.617-28
【非特許文献４】Mellman, et al. 2005 Adv Exp Med Biol 560: p.63-7
【非特許文献５】Chomarat, et al. 2000 Nat Immunol 1(6): p.510-4
【非特許文献６】Mitani, et al. 2000 Br J Haematol 109(2): p.288-95
【非特許文献７】Allavena, et al. 1998 Eur J Immunol 28(1): p.359-69
【非特許文献８】Delneste, et al. 2003 Blood 101(1): p.143-50
【非特許文献９】Chomarat, et al. 2003 J Immunol 171(5): p.2262-9
【非特許文献１０】Iwamoto, et al. 2007 J Immunol 179(3): p.1449-57
【非特許文献１１】Gabriele, et al. 2004 Blood 103(3): p.980-7
【非特許文献１２】Le Naour, et al. 2001 J Biol Chem 276(21): p.17920-31
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、VentXがDCの成熟および機能の主要な調節因子であるという発見、ならびにVentXが炎症性疾患への介入および免疫療法の標的として働き得るという発見に、部分的に基づく。
【０００８】
VentXは、BMP4シグナル伝達経路のアフリカツメガエル（Xenopus）ホメオボックス遺伝子Vent/Xomのヒトホモログであり、造血細胞および免疫細胞の増殖および分化を制御する新規な造血転写因子であると最近明らかになった。アフリカツメガエル胚発生における逆遺伝学的モデル化により古典的（canonical）Wntシグナル伝達の新規なLEF/TCF関連アンタゴニストとしてまず同定されたVentXは、p53/p21およびp16ink4a/Rb腫瘍抑制経路の転写活性化因子であることが見出された。造血細胞発生におけるVentXの重大な役割は、HSC/MPPおよび単球の両方の増殖およびマクロファージ最終分化への分化を制御することにおけるその役割によって、さらに示された。
【０００９】
本明細書において開示されるように、VentXは、末梢血ならびに腸粘膜の両方から単離されたヒト初代DCにおいて発現することが示されている。機能喪失型および機能獲得型の手法の両方を利用して、VentXがIL6介在性メカニズムを通じてDCの分化および成熟を調節したことが実証されている。VentX発現は、IBD患者の炎症を起こした粘膜から単離されたDCにおいて上昇しており、かつVentX のノックダウンは、DCの成熟応答を減退させた。さらに、VentXは、コルチコステロイドの下流の標的およびエフェクターである。本明細書において開示されるデータは、VentXがDCの成熟および機能の主要な調節因子であること、ならびにVentXが炎症性疾患に対する介入および免疫療法の標的として働き得ることを実証している。
【００１０】
一局面において、本発明は、概して、樹状細胞を調節するための方法に関する。該方法は、その必要がある対象に、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの調整効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む。
【００１１】
別の局面において、本発明は、概して、樹状細胞に対する調節機能について化合物をスクリーニングするための方法に関する。該方法は、（a）VentXプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程；（b）該細胞と候補化合物とを接触させる工程；および（c）VentX発現の活性を測定する工程を含む。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、概して、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの調整効果を介して樹状細胞に対する調節効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む、薬学的組成物に関する。
【００１３】
さらに別の局面において、本発明は、概して、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの発現プロファイルを検出する工程を含む、樹状細胞の成熟と関連した炎症性病態について対象を診断するための方法に関する。ある特定の態様において、炎症性病態は自己免疫疾患である。
【００１４】
さらに別の局面において、本発明は、概して、腫瘍を抑制するための方法に関する。該方法は、その必要がある対象に、樹状細胞機能に対する調整効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む。
[本発明1001]
その必要がある対象に、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの調整効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む、樹状細胞を調節するための方法。
[本発明1002]
樹状細胞を調節することが、樹状細胞の成熟応答に影響を及ぼすことを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
生物学的または化学的作用物質が、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの阻害効果を発揮する、本発明1001の方法。
[本発明1004]
生物学的または化学的作用物質がポリペプチドである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
生物学的または化学的作用物質が、ホメオドメインを欠いたVentX変異体を遮断ポリペプチドとして含む、本発明1001の方法。
[本発明1006]
生物学的または化学的作用物質が抗体フラグメントである、本発明1001の方法。
[本発明1007]
生物学的または化学的作用物質がオリゴヌクレオチドである、本発明1001の方法。
[本発明1008]
オリゴヌクレオチドがRNAiである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
（a）VentXプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程；（b）該細胞と候補化合物とを接触させる工程；および（c）VentX発現の活性を測定する工程を含む、樹状細胞に対する調節機能について化合物をスクリーニングするための方法。
[本発明1010]
化合物が小分子作用物質である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
化合物がポリペプチドである、本発明1009の方法。
[本発明1012]
化合物がオリゴヌクレオチドである、本発明1009の方法。
[本発明1013]
ヒトホメオボックス遺伝子VentXの調整効果を介して樹状細胞に対する調節効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む、薬学的組成物。
[本発明1014]
調整効果が、炎症性病態の処置に関連のある阻害効果を含む、本発明1013の薬学的組成物。
[本発明1015]
炎症性病態が自己免疫疾患である、本発明1014の薬学的組成物。
[本発明1016]
生物学的または化学的作用物質がポリペプチドである、本発明1013の薬学的組成物。
[本発明1017]
生物学的または化学的作用物質が抗体である、本発明1013の薬学的組成物。
[本発明1018]
生物学的または化学的作用物質がオリゴヌクレオチドである、本発明1013の薬学的組成物。
[本発明1019]
ヒトホメオボックス遺伝子VentXの発現プロファイルを検出する工程を含む、樹状細胞の成熟と関連した炎症性病態について対象を診断するための方法。
[本発明1020]
炎症性病態が自己免疫疾患である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
その必要がある対象に、樹状細胞機能に対する調整効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む、腫瘍を抑制するための方法。
[本発明1022]
樹状細胞機能に対する調整効果が、ヒトホメオボックス遺伝子VentXを介した調整効果を含む、本発明1021の方法。
[本発明1023]
生物学的または化学的作用物質がポリペプチドである、本発明1022の方法。
[本発明1024]
生物学的または化学的作用物質が抗体フラグメントである、本発明1022の方法。
[本発明1025]
生物学的または化学的作用物質がオリゴヌクレオチドである、本発明1022の方法。
[本発明1026]
オリゴヌクレオチドがRNAiである、本発明1025の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する。材料および方法において記載されるように、ヒト初代単球に、VentXを標的とするモルフォリノ（MO）オリゴヌクレオチドまたは対照MOをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、樹状細胞分化を誘導した。サイトカイン添加の5日後に細胞を収集し、かつCD1aおよびCD14の表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。
【図１Ｂ】VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する。棒グラフは、VentX MOまたは対照MOをトランスフェクトされた単球由来のCD14−CD1a＋細胞のパーセンテージを示した。結果は、（A）における6回の異なる実験についての平均＋標準偏差（SD）であった。
【図１Ｃ】VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する。上記で記載されるように、単球に、VentX MOまたは対照MOオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。サイトカインの添加の5日後に、CD1bの表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。示される結果は、少なくとも5回の別個の実験についての代表的なものである。
【図１Ｄ】VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する。上記で記載されるように、単球に、VentX MOまたは対照MOオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。サイトカインの添加の5日後に、CD1cの表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。示される結果は、少なくとも5回の別個の実験についての代表的なものである。
【図１Ｅ】VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXプラスミドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクションの2時間後にサイトカインを培養培地に添加し、かつサイトカイン添加の3日後に、フローサイトメトリー解析のために細胞を収集した。CD1a発現についての解析のために、GFP陽性集団にゲートをかけた。
【図１Ｆ】VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する。（E）における4回の別個の実験についての平均＋SDを示した。
【図２Ａ】VentX過剰発現はTHP1細胞から樹状細胞への分化を促進する。テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でGFPまたはGFP.VentXを発現するTHP1細胞株を、1.0μg/mLのドキシサイクリン（DOX）で10日間処理した。表示される日数における細胞数をカウントしかつプロットした。
【図２Ｂ】VentX過剰発現はTHP1細胞から樹状細胞への分化を促進する。DOXへの10日間の曝露後の、GFPまたはGFP.VentXを発現するTHP1細胞についての細胞周期プロファイル。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、かつフローサイトメトリーによって解析した。
【図２Ｃ】VentX過剰発現はTHP1細胞から樹状細胞への分化を促進する。THP1細胞をDOXで3日間処理し、かつ収集した。p21およびc-mycのmRNAのRNAレベルを、リアルタイムPCRによって解析した。
【図２Ｄ】VentX過剰発現はTHP1細胞から樹状細胞への分化を促進する。THP1細胞をDOXで3日間処理し、かつ収集した。p21およびc-mycのmRNAのタンパク質レベルを、ウェスタンブロットによって解析した。
【図２Ｅ】VentX過剰発現はTHP1細胞から樹状細胞への分化を促進する。THP1細胞をDOXで処理し、かつ材料および方法において記載される条件下で培養して、樹状細胞分化を誘導した。処理の2日後に、細胞を収集して、表示される抗原の表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。
【図２Ｆ】VentX過剰発現はTHP1細胞から樹状細胞への分化を促進する。THP1細胞をDOXで処理し、かつ材料および方法において記載される条件下で培養して、樹状細胞分化を誘導した。細胞を位相差顕微鏡法を用いて撮影して、VentX発現細胞の形態変化を示した。示される結果は、少なくとも3回の別個の実験についての代表的なものである。
【図３Ａ】VentXはIL6発現を抑制する。単球に、VentX MOまたは対照MOをトランスフェクトし、かつGM-CSFおよびIL4を培養培地中に5日間添加した。細胞内IL6レベルをフローサイトメトリーによって測定した。
【図３Ｂ】VentXはIL6発現を抑制する。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。次いで、細胞をGM-CSFおよびIL4の存在下で3日間培養した。トランスフェクトされた細胞においてIL6についての細胞内染色を実施し、かつGFP陽性細胞におけるIL6レベルをフローサイトメトリーによって解析した。示される結果は、少なくとも3回の別個の実験についての1回の代表的なものである。
【図３Ｃ】VentXはIL6発現を抑制する。上記で記載されるように、単球にトランスフェクトしかつ収集した。リアルタイムPCRを実施して、IL6のmRNAレベルを測定した。
【図３Ｄ】VentXはIL6発現を抑制する。-592bpのヒトIL6プロモーターレポーターを、pcDNA-GFPまたはpcDNA-VentXプラスミドとともに、初代単球にエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、細胞を収集して、ルシフェラーゼ活性を解析した。
【図３Ｅ】VentXはIL6発現を抑制する。ドキシサイクリンにより誘導されるとVentXを発現するU2OS細胞に、様々なIL6プロモーターレポーターをトランスフェクトした。DOX添加の2日後に細胞を収集し、かつDOXの存在または非存在下でのルシフェラーゼ活性を解析した。
【図３Ｆ】VentXはIL6発現を抑制する。NFκB結合部位変異体を有する-80bpのIL6プロモーターレポーターを、U2OS細胞にトランスフェクトした。次いで、DOXを培地中に添加してまたは入れずに、トランスフェクションの2日後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【図３Ｇ】VentXはIL6発現を抑制する。GFPまたはGFP.VentXを発現するTHP1細胞をDOXで2日間処理し、かつ抗NFκB/p65抗体を用いたChIPアッセイのために収集した。材料および方法において記載されるように、NFκB結合部位を含有するヒトIL6プロモーター領域をリアルタイムPCRによって増幅した。示される結果は、1つの代表的な実験からの三つ組についてのM＋SDであり、3回の独立した実験が実施された。
【図４】自己分泌IL6の増強は、VentXノックダウンを有する樹状細胞における分化不良に寄与する。表示されるように、ヒト初代単球に、VentX MOまたは対照MOをトランスフェクトした。2日目に、サイトカインGM-CSF＋IL4を、中和IL6抗体または対照免疫グロブリン（IgG）とともに培養培地中に添加した。サイトカイン添加の5日後に細胞を収集し、かつフローサイトメトリーによって解析した（左のパネル）。4回の別個の実験についての平均＋SDを右のパネルに示した。
【図５Ａ】VentXを過剰発現する樹状細胞についてのPCRアレイ解析。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXプラスミドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。2時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、DC分化を誘導した。トランスフェクションの3日後に、一晩の処理のためにLPSを添加し、かつ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりGFPで選別した。全RNAを単離し、かつ表示される遺伝子のmRNAレベルをPCRアレイによって解析した。
【図５Ｂ】VentXを過剰発現する樹状細胞についてのPCRアレイ解析。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXプラスミドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。2時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、DC分化を誘導した。トランスフェクションの3日後に、一晩の処理のためにLPSを添加し、かつ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりGFPで選別した。全RNAを単離し、かつ表示される遺伝子のmRNAレベルをPCRアレイによって解析した。
【図５Ｃ】VentXを過剰発現する樹状細胞についてのPCRアレイ解析。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXプラスミドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。2時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、DC分化を誘導した。トランスフェクションの3日後に、一晩の処理のためにLPSを添加し、かつ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりGFPで選別した。全RNAを単離し、かつ表示される遺伝子のmRNAレベルをPCRアレイによって解析した。
【図５Ｄ】VentXを過剰発現する樹状細胞についてのPCRアレイ解析。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXプラスミドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。2時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、DC分化を誘導した。トランスフェクションの3日後に、一晩の処理のためにLPSを添加し、かつ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりGFPで選別した。全RNAを単離し、かつ表示される遺伝子のmRNAレベルをPCRアレイによって解析した。
【図５Ｅ】VentXを過剰発現する樹状細胞についてのPCRアレイ解析。単球に、pcDNA-GFPまたはpcDNA-GFP.VentXプラスミドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。2時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、DC分化を誘導した。トランスフェクションの3日後に、一晩の処理のためにLPSを添加し、かつ細胞を収集し、フローサイトメトリーによりGFPで選別した。全RNAを単離し、かつ表示される遺伝子のmRNAレベルをPCRアレイによって解析した。
【図５Ｆ】VentXを過剰発現する樹状細胞についてのPCRアレイ解析。選択された遺伝子のmRNAレベルを、異なるプライマーセットを用いてリアルタイムPCRによって測定した。示される結果は、2回の独立した実験のうちの1回からの三つ組についての平均＋SDであり、差異は、すべての遺伝子に関して、2つの群の間で有意に異なった（p＜0.05）。
【図６Ａ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。5人のIBD患者の炎症を起こしたおよび炎症を起こしていない腸粘膜からLPDCを単離した。VentXレベルをリアルタイムPCRで測定した。
【図６Ｂ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。LPDCに、VentXを標的とするsiRNAまたは対照GFPをエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、その後に、培地中での2日間の培養が続いた。次いで、細胞をLPSで一晩刺激して成熟を誘導し、かつ表面マーカーおよび細胞内サイトカイン/ケモカインについてのフローサイトメトリー解析のために収集した。塗りつぶされたヒストグラムは、siGFPトランスフェクションを表す。
【図６Ｃ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。棒グラフは、（B）における4回の異なる実験についての平均蛍光強度（MFI）を示している。結果は、対照に対して正規化されたMFIのパーセンテージとして表現されている。差異は、有意でない（N.S）CD83を除いて、2つの群の間で有意に異なった（p＜0.05）。
【図６Ｄ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。siGFPまたはsiVentXをトランスフェクトされたLPDCを、表示される遺伝子のmRNA発現レベルについて解析した。差異は、CCL19およびCXCL1を除いて、2つの群の間で有意に異なった（p＜0.05）。
【図６Ｅ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。混合リンパ球反応において、VentXのノックダウンにより、同種T細胞増殖を刺激するDCの能力は損なわれた。
【図６Ｆ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。DCをプレドニゾロン（10μg/ml）で48時間処理しまたは擬似処理し、かつVentXレベルをリアルタイムPCRで測定した。
【図６Ｇ】VentXは、固有層DCの成熟に必要とされる。表示されるように、DCにGFPまたはVentXをトランスフェクトし、プレドニゾロンで処理した。24時間後にLPSを添加し、トランスフェクションの48時間後に細胞を収集して、CCL3、CCL5、IL12A、およびTNFαのmRNAレベルを解析した。示される結果は、2回の独立した実験のうちの1回からの三つ組についての平均＋SDである。
【図Ｓ１】単球および樹状細胞におけるVentXの発現。末梢血から単離されたヒト初代単球を、GM-CSF＋IL4の存在下で5日間培養して、樹状細胞分化を誘導した。（A）新鮮な単球および分化した樹状細胞から単離された全RNAを、逆転写および従来的PCRに供した。VentXおよびGAPDHのPCR産物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、かつエチジウムブロマイド染色によって可視化した。（B）新鮮な単球および分化した樹状細胞から全細胞溶解物を収集し、かつVentXタンパク質レベルを、VentX特異的抗体を用いたウェスタンブロット解析によって測定した。チューブリンをローディング対照として用いた。
【図Ｓ２】VentXモルフォリノ（MO）オリゴヌクレオチドによる、DCにおけるVentX発現のノックダウン。材料および方法において記載されるように、初代ヒト単球（それぞれ10M）に、VentXを標的とするMOオリゴヌクレオチド（VentX MOおよびVentX MO-2）または対照MOオリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。24時間後にサイトカインGM-CSFおよびIL4を添加し、かつサイトカイン添加の5日後に、VentXタンパク質レベルについてのウェスタンブロット解析のために細胞を回収した。チューブリンをローディング対照として用いた。VentXノックダウン効率の定量化をデンシトメトリーによって測定した。
【図Ｓ３】樹状細胞マーカーの表面発現に対するVentXノックダウンの効果。材料および方法において記載されるように、ヒト初代単球に、VentXを標的とするモルフォリノ（MO）オリゴヌクレオチドまたは対照MOをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、GM-CSFおよびIL4を培養培地に添加して、樹状細胞分化を誘導した。サイトカイン添加の5日後に細胞を収集し、かつCD11c、CD16、CD36、CD64の表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。実線：対照MOをトランスフェクトされた細胞；点線：VentX MOをトランスフェクトされた細胞；色付きのヒストグラム：アイソタイプ対照。
【図Ｓ４】THP1細胞の分化マーカーに対するVentX過剰発現の効果。THP1細胞をDOXで処理し、かつ材料および方法において記載される条件下で培養して、樹状細胞分化を誘導した。処理の2日後に、細胞を収集して、表示される抗原の表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。
【図Ｓ５】単球において、VentXのノックダウンは、GM-CSF受容体（CD116）の発現を下方調節する。（A）材料および方法において記載されるように、初代ヒト単球に、VentXを標的とするMOオリゴヌクレオチドまたは対照MOオリゴヌクレオチドをエレクトロポレーションによりトランスフェクトした。24時間後にサイトカインGM-CSFおよびIL4を添加し、かつサイトカイン添加の5日後に細胞を回収した。CD116の表面発現をフローサイトメトリーによって解析した。実線：対照MOをトランスフェクトされた細胞；点線：VentX MOをトランスフェクトされた細胞。（B）4回の別個の実験についての平均＋SDを示した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
下記の定義は、関連技術分野における当業者によって一般に理解される概念の概要として提供され、かつ本明細書において開示される主題を理解する目的のために提供される。該定義は、本発明または本明細書における特許請求の範囲の限定であることを意味するわけではない。
【００１７】
本明細者において使用するとき、「抗体」という用語は、エピトープまたは抗原決定基に結合し得る分子を指す。該用語には、一本鎖抗体を含めた、抗体全体およびその抗原結合フラグメントが含まれることが意図される。抗体は、任意の動物起源に由来し得る。好ましくは、抗体は、哺乳類、例えばヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマなど、または他の適切な動物のものである。抗体は、ポリペプチド抗原またはポリヌクレオチド抗原を認識し得る。該用語には、例えば免疫グロブリンの抗原結合フラグメント、重鎖の可変および/または定常領域、軽鎖の可変および/または定常領域、相補性決定領域（cdr）、ならびにフレームワーク領域を含めた、活性フラグメントが含まれる。該用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物、それだけでなくハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、ハイブリッド抗体分子、F(ab)2およびF(ab)フラグメント；Fv分子（例えば、非共有結合性ヘテロ二量体）、二量体および三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ、ヒト化抗体分子、ならびにそのような分子から得られる任意の機能的フラグメントを含む調製物が含まれ、そのようなフラグメントは特異的結合を保持する。
【００１８】
「１つの」または「ある」または「その」抗体という単数形の用語の使用は、1つを上回る種類の抗体が組成物または調製物中に存在していることが明らかである場合、単一抗体に限定することを意図されるわけではない。加えて、別様に示されていない限り、「抗体」に対する単数形の用語には、それらの構造または特異性が必ずしも不均一ではない抗体の収集物が含まれ得る。
【００１９】
本明細書において使用するとき、「ヒト化」抗体という用語は、非ヒト種由来の免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位と、ヒト免疫グロブリンの構造および/または配列に基づく残りの免疫グロブリン構造とを有する、分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全可変ドメイン、または該可変ドメインにおける適当なフレームワーク領域に結合させた相補性決定領域（CDR）のみのいずれかを含み得る。抗原結合部位は、野生型、または1個もしくは複数個のアミノ酸置換によって改変された、例えばヒト免疫グロブリンにより似るように改変されたものであり得る。いくつかの形態のヒト化抗体は、すべてのCDR配列を保存している（例えば、マウス抗体由来の6個すべてのCDRを含有するヒト化マウス抗体）。ヒト化抗体の他の形態は、元の抗体に対して改変されている1個または複数個のCDR（1、2、3、4、5、6個）を有する。
【００２０】
抗体結合の文脈における「特異的に結合する」という用語は、特定のエピトープへの抗体の高い親和性結合および/または高いアフィニティー結合を指す。ゆえに、1つのエピトープ（「第1のエピトープ」）に特異的に結合し、かつ別のエピトープ（「第2のエピトープ」）には特異的に結合しない抗体は、「特異的抗体」である。2つのエピトープが互いに相同性または他の類似性を有する場合、第1のエピトープに特異的な抗体は、第2のエピトープと交差反応しかつ結合し得る。ポリヌクレオチドの文脈における「特異的に結合する」という用語は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを指す。DNA/DNAおよびDNA/RNAハイブリダイゼーション反応の両方のストリンジェンシーを増加させる条件は、広く知られておりかつ当技術分野において公表されている（Curr. Prot. Molec. Biol, John Wiley & Sons (2001)）。
【００２１】
本明細書において使用するとき、「抗原」という用語は、抗体によって結合され得る分子を指す。抗原は、さらに、免疫系によって認識され得、かつ/またはBリンパ球および/もしくはTリンパ球の活性化につながる体液性免疫応答および/もしくは細胞性免疫応答を誘導し得る。しかしながら、これは、少なくともある特定の場合において、抗原がTh細胞エピトープを含有しまたはそれに連結され、かつアジュバント中に与えられていることを必要とし得る。抗原は、1つまたは複数のエピトープ（B細胞および/またはT細胞エピトープ）を有し得る。上記で言及された特異的反応とは、抗原が、その対応する抗体またはTCRとは（典型的には高度に選択的な様式で）好ましく反応し、他の抗原によって惹起され得る多数の他の抗体またはTCRとは好ましく反応しないことを表すことが、意図される。本明細書において用いられる抗原は、いくつかの個々の抗原の混合物でもあり得る。
【００２２】
本明細書において使用するとき、「エピトープ」という用語は、個々の抗体またはT細胞受容体による認識の基本要素または最小単位、および従って、該抗体またはT細胞受容体が結合する特定のドメイン、領域、または分子構造を指す。抗原は、無数のエピトープからなり得るが、ハプテンは、典型的に数個のエピトープしか含有し得ない。
【００２３】
本明細書において使用するとき、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すために本明細書において互換可能に用いられる。それらには、二本鎖および一本鎖配列の両方が含まれ得、かつウイルス、原核生物、および真核生物供給源由来のcDNA；mRNA；ウイルス供給源（例えば、DNAウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物供給源由来のゲノムDNA配列；RNAi；cRNA；アンチセンス分子；リボザイム；ならびに合成DNA配列が含まれるが、それらに限定されるわけではない。該用語は、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含む配列も捕捉する。
【００２４】
本明細書において使用するとき、「相補的」ヌクレオチド配列核酸分子とは、その塩基対相補体から構成されるものである。アデニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドは、チミジン塩基を有するものと相補的であり、チミジン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドは、アデニン塩基を有するものと相補的である。シトシン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドは、グアニン塩基を有するものと相補的であり、グアニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドは、シトシン塩基を有するものと相補的である。アデニン塩基を有するリボヌクレオチドは、ウラシル塩基を有するものと相補的であり、ウラシル塩基を有するデオキシリボヌクレオチドは、アデニン塩基を有するものと相補的である。シトシン塩基を有するリボヌクレオチドは、グアニン塩基を有するものと相補的であり、グアニン塩基を有するデオキシリボヌクレオチドは、シトシン塩基を有するものと相補的である。
【００２５】
本明細書において使用するとき、「プロモーター」という用語は、哺乳類細胞においてRNAポリメラーゼに結合し得、かつそれに機能的に連結された下流（3'方向）コード配列の転写を開始させ得るDNA調節領域を指す。本発明の目的のために、プロモーター配列は、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで、関心対象の遺伝子の転写を開始させるのに必要な最小数の塩基または要素を含む。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにRNAポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）があり得る。真核生物プロモーターは、必ずではないが多くの場合、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを含有する。プロモーターには、天然に核酸分子に隣接しているもの、および天然には核酸分子に隣接していないものが含まれる。加えて、「プロモーター」という用語には、誘導性プロモーター、cre-loxプロモーターなどの条件付き活性プロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターが含まれる。
【００２６】
本明細書において使用するとき、「トランスフェクトされた」という用語は、リポフェクタミンなどの任意の促進剤の添加を行ってまたは行わずに導入されたDNAまたはRNAを含有していることを意味する。当技術分野において公知であるトランスフェクションのための方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラントランスフェクション、原形質融合、エレクトロポレーション、およびリポフェクションが含まれる。
【００２７】
本明細書において使用するとき、「核酸分子の発現」という用語は、核酸分子に含有される情報の遺伝子産物への転換を指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造RNA、または他の任意のタイプのRNA）の直接転写産物、またはmRNAの翻訳によって産生されるペプチドもしくはポリペプチドであり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、およびエディティングなどの過程によって改変されているRNA、ならびに例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADPリボシル化、ミリストイル化（myristilation）、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
【００２８】
本明細書において使用するとき、「宿主細胞」という用語は、任意の組換えベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るまたはレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を指す。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、かつ子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な変異および/または変化により、必ずしも元の親細胞と（形態または全DNA相補体が）完全に同一ではない可能性がある。宿主細胞には、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドでインビボまたはインビトロでトランスフェクトされたまたは感染させた細胞が含まれる。本発明の組換えベクターを含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と称され得る。
【００２９】
本明細書において使用するとき、「単離された」または「実質的に単離された」分子（ポリペプチドまたはポリヌクレオチドなど）という用語は、天然においてよりも高い濃度で存在するように操作されている、またはその天然環境から取り出されているものである。例えば、対象抗体は、天然においてそれに付随している対象抗体ではない材料の少なくとも10％、または20％、または40％、または50％、または70％、または90％が取り除かれている場合、単離されている、精製されている、実質的に単離されている、または実質的に精製されている。例えば、生きた動物に天然に存在しているポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いる。さらに、本発明の目的に関しては、ベクター内に含有された組換えDNA分子は単離されたと見なされる。単離されたRNA分子には、DNAおよびRNA分子のインビボまたはインビトロでのRNA複製産物が含まれる。単離された核酸分子には、合成により産生された分子がさらに含まれる。加えて、組換え宿主細胞内に含有されたベクター分子も単離されている。ゆえに、すべての「単離された」分子が、「精製されて」いる必要はない。
【００３０】
本明細書において使用するとき、分子に関して用いられる場合に「精製された」という用語は、精製されている分子の濃度が、その天然環境においてまたはそれが産生された、見出された、もしくは合成された環境においてそれに付随する分子と比べて増加していることを意味する。天然に付随する分子には、タンパク質、核酸、脂質、および糖類が含まれるが、一般的に、水、緩衝液、および、精製されている分子の完全性を維持するためまたは精製を促すために添加される試薬は含まれない。この定義に従い、ある物質とは、その夾雑物と比べて考慮した場合に5％以上、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上、または100％の純度であり得る。
【００３１】
本明細書において使用するとき、「生物学的に活性な」実体、または「生物学的活性」を有する実体という用語は、天然に存在する分子の構造機能、調節機能、もしくは生化学的機能、または代謝過程もしくは生理的過程に関係したもしくはそれと関連した任意の機能を有するものである。生物学的に活性なポリヌクレオチドフラグメントは、本発明のポリヌクレオチドの活性と同様の活性を呈するものであるが、必ずしも同一である必要はない。生物学的活性には、向上した所望の活性または低下した非所望の活性が含まれ得る。例えば、（ハイブリダイゼーションなどの）別の分子との分子相互作用に関係する場合、疾患病態の緩和において治療的価値を有する場合、免疫応答の誘導において予防的価値を有する場合、（例えば、あるポリヌクレオチド分子に固有であるとして検出され得るかまたはポリメラーゼ連鎖反応においてプライマーとして用いられ得る、該ポリヌクレオチドの生物学的に活性なフラグメントなどの）分子の存在の判定において診断的および/または予後的な価値を有する場合、実体は、生物学的活性を実証する。生物学的に活性なポリペプチドまたはそのフラグメントには、生物学的反応に関係し得るものが含まれる。
【００３２】
本明細書において使用するとき、「対象」、「個体」、および「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含めた、生きた動物を指すために本明細書において互換可能に用いられる。対象は、例えば抗原刺激に対して、ならびに細胞表面受容体結合を通じた刺激性および阻害性シグナル伝達に対して応答し得る免疫細胞を保有する生物であり得る。対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳類、例えばイヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、およびマウスなどの哺乳類であり得る。「対象」という用語は、疾患に関して全く正常である、またはすべての点において正常である個体を除外するわけではない。
【００３３】
本明細書において使用するとき、「患者サンプル」とは、患者に由来する任意の生物学的標本である。該用語には、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液、精液、および他の液体サンプルなどの生物学的流体、ならびに生物学的起源の細胞および組織が含まれるが、それらに限定されるわけではない。該用語には、細胞またはそれに由来する細胞、ならびに培養下の細胞、細胞上清、および細胞溶解物を含めた、その子孫も含まれる。それには、臓器または組織培養物に由来する流体、組織生検サンプル、腫瘍生検サンプル、糞便サンプル、および生理学的組織から抽出された流体、ならびに固形組織、組織切片、および細胞溶解物から解離された細胞がさらに含まれる。この定義は、試薬による処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドなどのある特定の構成要素の富化など、それらの入手後に任意の手段で操作されているサンプルを包含する。該用語には、患者サンプルの誘導体および画分も含まれる。患者サンプルは、診断用アッセイ、予後アッセイ、または他のモニタリングアッセイにおいて用いられ得る。
【００３４】
本明細書において使用するとき、「調整する」という用語は、適切な対照と比較した場合の、測定される活性の増加もしくは減少、刺激、阻害、干渉、または遮断の直接的または間接的な提供を指す。ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの「調整因子」、または「作用物質」とは、適切な対照と比較した場合にポリペプチドまたはポリヌクレオチドの測定される活性に影響を及ぼす、例えば増加させる、減少させる、刺激する、阻害する、干渉する、または遮断する物質を指すために、本明細書において互換可能に用いられる用語である。
【００３５】
本明細書において使用するとき、「疾患」または「障害」という用語は、病理学的病態、例えば、症状または他の同定因子によって健常なまたは正常な状態から外れるとして同定され得るものを指す。「疾患」という用語には、障害、症候群、病態、および負傷が含まれる。疾患には、増殖性疾患、炎症性疾患、免疫疾患、代謝性疾患、感染性疾患、および虚血性疾患が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００３６】
本明細書において使用するとき、「炎症性病態」という用語は、関節リウマチ、骨関節炎、若年性特発性関節炎、乾癬、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息、鼻炎）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、大腸炎）、エンドトキシンにより推進される疾患状態（例えば、バイパス手術後の合併症、または例えば慢性心不全に寄与する慢性エンドトキシン状態）、および関節の軟骨など、軟骨が関与する関連疾患を含めた、病態の群を指す。とくに、該用語は、関節リウマチ、骨関節炎、アレルギー性気道疾患（例えば、喘息）、および炎症性腸疾患を指す。
【００３７】
本明細書において使用するとき、「自己免疫疾患」という用語は、COPD、喘息（例えば、内因性喘息、外因性喘息、塵挨喘息、小児喘息）、とくに慢性のもしくは常習的な喘息（例えば、遅延型喘息および気道過敏症）、気管支喘息を含めた気管支炎などの病態を含めた閉塞性気道疾患、全身性エリテマトーデス（SLE）、多発性硬化症、I型糖尿病およびそれに伴う合併症、アトピー性湿疹（アトピー性皮膚炎）、接触性皮膚炎、およびさらなる湿疹性皮膚炎、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎）、アテローム性動脈硬化症、ならびに筋萎縮性側索硬化症を含めた、疾患の群を指す。とくに、該用語は、COPD、喘息、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、および炎症性腸疾患を指す。
【００３８】
本明細書において使用するとき、「増殖性疾患」という用語は、癌（例えば、子宮平滑筋肉腫または前立腺癌）、骨髄増殖性障害（例えば、真性多血症、本態性血小板血症、および骨髄線維症）、白血病（例えば、急性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病）、多発性骨髄腫、乾癬、再狭窄、硬化性皮膚炎（sclerodermitis）、または線維症などの病態を指す。とくに、該用語は、癌、白血病、多発性骨髄腫、および乾癬を指す。
【００３９】
本明細書において使用するとき、「癌」および「癌性」という用語は、典型的に、無調節な細胞成長を特徴とする、哺乳類における生理的病態を指すまたは記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および白血病が含まれるが、それらに限定されるわけではない。そのような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌腫、肺癌、膵臓癌、子宮頸癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌腫、および頭頸部癌が含まれる。
【００４０】
本明細書において使用するとき、「腫瘍」という用語は、任意の悪性細胞または新生細胞を指す。
【００４１】
本明細書において使用するとき、「処置」という用語は、ヒトを含めた哺乳類における疾患に対する救済策の任意の投与または適用を含めた、予防的および/または治療的な処置のいずれかを網羅し、かつ疾患の阻害を含む。それには、退縮を引き起こす、または喪失した、欠落した、もしくは欠陥のある機能を回復させるもしくは修復する、または非効率的な過程を刺激するなどによって、疾患進行を停止することおよび疾患を軽減することが含まれる。本明細書において使用するとき、「防止する」という用語には、疾患にかかりやすい傾向があり得るが疾患を有するとはまだ診断されていない対象において、疾患の出現または再発に対する予防を提供することが、含まれる。処置および予防は、ヒトを含めた生物に施されるか、またはインビボ、インビトロ、もしくはエクスビボで細胞に施され得、該細胞はその後対象に投与され得る。
【００４２】
本明細書において使用するとき、「有効量」という用語は、所望の生物学的効果を実現するのに必要なまたは十分な量を指す。組成物の有効量とは、この選択された結果を達成する量であり、そのような量は、当業者によって日常的事項として決定され得る。例えば、免疫系の欠損を処置するための有効量は、免疫系の活性化を引き起こす（これは、抗原へ曝露されると抗原特異的免疫応答の発生をもたらす）のに必要な該量であり得る。該用語は、「十分量」と同義でもある。任意の特定の適用のための有効量は、処置されている疾患もしくは病態、投与されている特定の組成物、対象のサイズ、および/または疾患もしくは病態の重症度などの因子に応じて変動し得る。当業者であれば、過度の実験を必要とすることなく、本発明の特定の組成物の有効量を経験的に決定することができる。
【００４３】
本明細書において使用するとき、「担体」という用語は、固体、半固体、または液体の充填剤、希釈剤、封入材料、製剤化助剤、または任意の従来的タイプの賦形剤を指す。「薬学的に許容される担体」とは、非毒性の「担体」を指す。薬学的に許容される担体は、採用される投薬量および濃度においてレシピエントにとって非毒性であり、かつ製剤の他の成分と適合する。薬学的に許容される担体は、例えばビヒクル、アジュバント、または希釈剤であり得る。
【００４４】
本明細書において使用するとき、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換可能に用いられ、最小の長さに限定されるわけではない。ゆえに、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などは、該定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方が、該定義によって包含される。該用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化なども含まれる。さらに、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する（一般的には、性質が保存的な）欠失、付加、および置換などの改変を含むタンパク質を指し得る。これらの改変は、意図的であり得るまたは偶発的であり得る。
【００４５】
本明細書において使用するとき、「受容体」という用語は、リガンドと称される別の分子と相互作用し得るタンパク質もしくは糖タンパク質、またはそれらのフラグメントを指す。リガンドは、任意のクラスの生化学的または化学的化合物に属し得る。リガンドは通常、受容体へ結合すると、シグナル伝達経路の開始などの細胞応答を通常は開始させる細胞外分子である。受容体は、必ずしも膜結合型タンパク質である必要はない。
【００４６】
本明細書において使用するとき、核酸分子に関する「組換え」という用語は、その起源または操作のせいで、天然においてそれに付随するポリヌクレオチドのすべてまたは一部には付随していない、ゲノム起源、cDNA起源、ウイルス起源、半合成起源、および/または合成起源のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。宿主細胞に関して用いられる「組換え」という用語は、組換えポリヌクレオチドが導入されている宿主細胞を意味する。
【００４７】
本明細書において使用するとき、「組換えウイルス」という語句は、人間の手によって遺伝子改変されているウイルスを指す。該語句は、当技術分野において公知の任意のウイルスを網羅する。
【００４８】
本明細書において使用するとき、「ベクター」という用語は、遺伝子材料を宿主細胞または生物に伝達するために用いられる作用物質（例えば、プラスミドまたはウイルス）を指す。ベクターは、DNAまたはRNAのいずれかから構成され得る。
【００４９】
本明細書において使用するとき、「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、干渉RNAが標的遺伝子と同じ細胞内にある場合に、（すなわち、干渉RNAの配列に相補的であるmRNAの分解を仲介することによって）標的遺伝子の発現を低下させ得るまたは阻害し得る二本鎖RNA（すなわち、二重鎖RNA）を指す。ゆえに、干渉RNAとは、2本の相補鎖によって、または1本の自己相補鎖によって形成される二本鎖RNAを指す。干渉RNAは、標的遺伝子と実質的なもしくは完全な同一性を有し得る、またはミスマッチの領域（すなわち、ミスマッチモチーフ）を含み得る。干渉RNAの配列は、全長の標的遺伝子またはその部分配列に相当し得る。干渉RNAには、「低分子（small）干渉RNA」または「siRNA」、例えば長さが約15〜60個、15〜50個、または15〜40個の（二重鎖）ヌクレオチド、より典型的には長さが約15〜30個、15〜25個、または19〜25個の（二重鎖）ヌクレオチドの干渉RNAが含まれる。
【００５０】
本明細書において使用するとき、「サンプル」という用語は、ヒト、動物由来のサンプル、または研究用サンプル、例えば細胞、組織、臓器、体液、気体、エアロゾル、スラリー、コロイド、もしくは凝固した材料を指す。「サンプル」は、例えばヒトもしくは動物から取り出すことなくインビボで試験され得るか、またはインビトロで試験され得る。サンプルは、例えば組織学的方法による加工の後に試験され得る。「サンプル」は、例えば、体液もしくは組織サンプルを含む細胞、または体液もしくは組織サンプルから分離された細胞も指す。「サンプル」は、ヒトもしくは動物から新たに採取された細胞、組織、臓器、もしくは体液、または、加工されたもしくは保管された細胞、組織、臓器、もしくは体液も指し得る。
【００５１】
発明の詳細な説明
本発明は、VentXがDCの成熟および機能の調節において必須の役割を果たすという発見に部分的に基づく。VentXは、IL6介在性メカニズムを通じてDCの分化および成熟を調節する。VentX発現は、IBD患者の炎症を起こした粘膜から単離されたDCにおいて上昇しており、かつVentX のノックダウンは、DCの成熟応答を減退させた。本明細書において開示されるデータは、VentXが炎症性疾患に対する介入および免疫療法の標的として働き得ることを実証している。
【００５２】
本明細書における開示は、単球におけるVentX発現の除去が、DCへのそれらの分化を著しく損なうことを証明するものである。逆に、単球系細胞THP1におけるVentXの過剰発現は、DCへのそれらの分化を加速させる。IL6発現の増加は、VentXノックダウンを有する単球におけるDC分化不良を部分的に説明した。臨床的に重要なことは、炎症性腸疾患患者の炎症を起こした粘膜由来の腸固有層DC（LPDC）においてVentX発現が上昇したという知見である。ノックダウン実験により、VentXはLPDCの成熟に必須であることが示された。加えて、ステロイド処理により、LPDCにおけるVentX発現は顕著に下がり、かつステロイドの効果に対抗したVentXの発現が強化された。結論として、本明細書において開示されるデータは、VentXが、DCの分化および成熟の重大な転写調節因子であり、かつ免疫調節および免疫療法の潜在的な介入標的であることを実証している。
【００５３】
DCの分化および成熟のメカニズムは、免疫調節および免疫療法におけるその潜在的適用のために、重大な関心を集める焦点となる。豊富な情報により、DCへの単球分化に影響を及ぼすサイトカインについて分かってきているものの、DC分化の根底にある主要な転写調節事象は、依然として十分に明らかになっていない（Gabriele, et al. 2004 Blood 103(3): p.980-7；Hart, et al. 2005 Gastroenterology 129(1): p.50-65；Dillon, et al. 2010 J Immunol 184(12): p.6612-21；Bell, et al. 2001 J Immunol 166(8): p.4958-67）。本研究において、ヒトホメオボックスタンパク質VentXは、DCの分化および成熟の主要な調節因子であることが示された。IBD患者の炎症を起こした粘膜から単離されたDCにおいてVentX発現が上昇していることを示す証拠が提供された。VentXは、自己免疫性−炎症性病態を処置するために一般に用いられるコルチコステロイドの下流標的であることが見出された。
【００５４】
最近の研究により、VentXは、すべての系統の造血細胞の個体発生（ontogenesis）の間にその発現が制限されかつ高度に調節される、主要な造血転写因子であることが示された。VentXは、初期造血と最終的な分化および成熟との両方の間、造血細胞の増殖および分化を支配することが見出された。機構的には、VentXは、古典的Wntシグナル伝達に拮抗しかつp53/p21およびpRb/pl6老化経路を活性化して、細胞増殖に対してその効果を発揮することが見出された。その一方で、VentXは、造血細胞の系統分化の際、多様な細胞分化シグナル伝達を活性化する。VentXのノックダウンは、初期段階ならびに最終段階の両方の間、造血細胞の分化を遮断し、このことは、VentXが造血細胞の分化に対する全般的な許容因子であることを示唆している。VentXが系統発生において役割を果たすかどうかは、さらに明らかにされる必要がある。U937細胞におけるVentXの異所性発現はマクロファージ発生を促進し、一方でTHP1細胞におけるVentXの異所性発現はDC発生を促進することが、結果により示され、このことは、造血細胞の分化に対するVentXの効果が細胞タイプ特異的であることを示唆した。
【００５５】
VentXにより調節されるDC分化の根底にあるメカニズムの探索は、DC分化に関与する重大なシグナルであるIL6につながった（Chomarat, et al. 2000 Nat Immunol 1(6): p.510-4；Mitani, et al. 2000 Br J Haematol 109(2): p.288-95；Park, et al. 2004 J Immunol 173(6): p.3844-54）。先行研究により、γ-IFN、Wnt5a、HLA-G、および転写因子ESE-3によるDC分化の阻害は、IL6の分泌またはシグナル伝達の増加につながることが示された［9、35〜38］（Delneste, et al. 2003 Blood 101(1): p.143-50；Liang, et al. 2008 Proc Natl Acad Sci USA 105(24): p.8357-62；Appel, et al. 2006 Blood 107(8): p.3265-70；Valencia, et al. 2011 J Immunol 187(8): p.4129-39；Bharadwaj, et al. 2007 Cancer Res 67(11): p.5479-88）。結果は、VentXノックダウンを有するDCにおいてIL6発現が増加し（図3AおよびC）、一方でVentXの過剰発現がIL6発現を阻害する（図3BおよびC）ことを示した。重要なことに、VentXノックダウンにおける損なわれたDC分化は、IL6抗体でIL6シグナル伝達を減退させることによって部分的に救済され得る。機構の探索により、VentXは、THP1細胞において、IL6プロモーター領域へのNFκB結合に対するその効果を部分的に通じてIL6発現を調節することが示唆された。分化に対するVentXの細胞タイプ特異的効果と一貫して、以前の研究により、VentXは、マクロファージU937細胞においてIL発現を促進することが示された。VentXにより調節されるIL6発現の細胞タイプ特異的効果の根底にあるメカニズムは重大な関心対象であり現在の調査の標的である。
【００５６】
DC生物学における最近の進歩により、循環中の単球の異常な成熟および活性化は、腸粘膜炎症の発症に関与することが示唆された。VentX発現が、IBD患者の炎症を起こした粘膜から単離されたDC細胞において異常に上昇しているという知見は、DCの分化および成熟の新規な主要調節因子としてのVentXの同定についての臨床的関連性を示唆した。DC活性および自己免疫性/炎症性病態を調整することにおいてVentXを標的とすることの潜在的適用性は、VentXがコルチコステロイドの下流標的であるという知見、ならびにVentXがDCの成熟および活性化に対するステロイドの阻害効果を仲介するという知見によって示されている。VentXにより調節されるDCの分化および活性化が、宿主因子および微生物因子によってどのように調整されるかを明らかにするためには、さらなる研究が必要とされる。そのような情報は、IBDにおける腸粘膜の領域化損傷を理解するために重大であろう。コルチコステロイドおよび他の現在利用可能な免疫抑制剤に難治であることは、自己免疫性かつ炎症性の疾患を管理することの中心的課題である。
【００５７】
一局面において、本発明は、概して、樹状細胞を調節するための方法に関する。該方法は、その必要がある対象に、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの調整効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む。
【００５８】
ある特定の態様において、樹状細胞を調節することは、樹状細胞の成熟応答に影響を及ぼすことを含む。
【００５９】
ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質は、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの阻害効果を発揮する。
【００６０】
ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質はポリペプチドである。
【００６１】
ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質は、ホメオドメインを欠いたVentX変異体を遮断ポリペプチドとして含む。
【００６２】
ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質は抗体フラグメントである。
【００６３】
ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質はオリゴヌクレオチドである。ある特定の態様において、オリゴヌクレオチドはRNAiである。
【００６４】
別の局面において、本発明は、概して、樹状細胞に対する調節機能について化合物をスクリーニングするための方法に関する。該方法は、（a）VentXプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する工程；（b）該細胞と候補化合物とを接触させる工程；および（c）VentX発現の活性を測定する工程を含む。
【００６５】
ある特定の態様において、候補化合物は小分子作用物質である。
【００６６】
ある特定の態様において、候補化合物はポリペプチドである。
【００６７】
ある特定の態様において、候補化合物はオリゴヌクレオチドである。
【００６８】
さらに別の局面において、本発明は、概して、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの調整効果を介して樹状細胞に対する調節効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む、薬学的組成物に関する。
【００６９】
薬学的組成物のある特定の態様において、調整効果は、炎症性病態の処置に関連のある阻害効果を含む。
【００７０】
薬学的組成物のある特定の態様において、炎症性病態は自己免疫疾患である。
【００７１】
薬学的組成物のある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質はポリペプチドである。
【００７２】
薬学的組成物のある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質は抗体である。
【００７３】
薬学的組成物のある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質はオリゴヌクレオチドである。
【００７４】
さらに別の局面において、本発明は、概して、ヒトホメオボックス遺伝子VentXの発現プロファイルを検出する工程を含む、樹状細胞の成熟と関連した炎症性病態について対象を診断するための方法に関する。ある特定の態様において、炎症性病態は自己免疫疾患である。
【００７５】
さらに別の局面において、本発明は、概して、腫瘍を抑制するための方法に関する。該方法は、その必要がある対象に、樹状細胞機能に対する調整効果を発揮する生物学的または化学的作用物質を含む組成物の治療上有効量を投与する工程を含む。
【００７６】
ある特定の態様において、樹状細胞機能に対する調整効果は、ヒトホメオボックス遺伝子VentXを介した調整効果を含む（例えば、DC細胞への誘導されたまたは直接のトランスフェクションを介してVentXを増加させることによって、DC機能を増強する）。ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質はポリペプチドである。ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質は抗体フラグメントである。ある特定の態様において、生物学的または化学的作用物質はオリゴヌクレオチドである。ある特定の態様において、オリゴヌクレオチドはRNAiである。
【００７７】
VentXは初代単球から樹状細胞への分化を調節する
VentXがヒト初代単球において発現しているという最近の知見を受けて、GM-CSFおよびIL-4処理によって誘導される初代単球から樹状細胞への分化の際の、VentX発現を調べた（Grassl, et al. 1999 J Am Soc Nephrol 10(7): p.1466-77）。VentX発現は、誘導されたDC分化の際に、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で顕著な増加を受けることが見出された（図S1）。DC分化におけるVentXの潜在的役割を探索するために、インビトロでのDC分化に対するVentXノックダウンの効果を調べた。インビトロにおける単球からDCへの分化にはGM-CSFおよびIL4との5〜7日間のインキュベーションを要する（Iwamoto, et al. 2007 J Immunol 179(3): p.1449-57；Gabriele, et al. 2004 Blood 103(3): p.980-7）のに対して、VentX siRNAによりもたらされた、トランスフェクションから5日後の単球におけるVentXノックダウン効率は、わずかであった（データ公表せず）。単球においてVentXの長期間持続するノックダウン効果を得るために、モルフォリノ（MO）介在性VentXノックダウンストラテジーを開発した。2種の異なるモルフォリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し（VentX MOおよびVentX MO-2）、VentXのノックダウン効率について試験した。図S2に示されるように、両モルフォリノ配列は、トランスフェクションの5日後に、対照配列と比較してDCにおけるVentX発現を阻害した。新たに単離されたCD14＋CD1a−単球は、GM-CSFおよびIL-4とともに培養された場合、未成熟CD14−CD1a＋DCにインビトロで分化する（Bell, et al. 2001 J Immunol 166(8): p.4958-67）。CD1a抗原の表面発現を、対照MOまたはVentX MOをトランスフェクトされた単球においてそれぞれ調べた。図1に示されるように、VentX MO MOのトランスフェクションは、対照MOと比較して、CD14−CD1a＋細胞のパーセンテージの実質的な低下につながった（図1A〜B）。単球由来DCのさらなる分化マーカーと見なされるCD1b、CD1c、およびCD11cの表面発現は、VentX MOをトランスフェクトされた細胞において同様に下方調節された（図1C〜D、図S3）（Osugi, et al. 2002 Blood 100(8): p.2858-66）。VentX MOのトランスフェクションは、DCにおいて過度の細胞死を引き起こさず（データ示さず）、それは、分化の減少が細胞生存率の悪化によるものであるという可能性を排除した。CD16、CD36、およびCD64、マンノース受容体（MR）、ならびにトール様受容体4（TLR4）欠失（delete）などの他の表面抗原の発現は、VentX MOをトランスフェクトされたDCにおいて変化しないままであり（図S3）、このことは、VentX MOトランスフェクションが、DC分化に対して特異的効果を発揮することをさらに支持した。DC分化の調節におけるVentXの役割を裏付けるために、VentXを初代単球において異所的に発現させ、かつサイトカイン処理の3日後にCD14−CD1a＋細胞を測定した。単球におけるVentXの過剰発現は、DC分化を大幅に加速させた（図1E〜F）。まとめると、これらのデータは、VentXが初代単球からDCへの分化の重大な調節因子であることを実証した。
【００７８】
VentXは樹状細胞分化を促進する
ヒト単球系細胞株THP1は、適当な分化条件下で、初代DCのものと同様の表現型特性および機能特性を有する未成熟および成熟DCに分化するように誘導され得る（Ogasawara, et al. 2009 Biochem Biophys Res Commun 389(3): p.543-9；Menetrier-Caux, et al. 1998 Blood 92(12): p.4778-91）。樹状細胞分化に対するVentXの効果およびその根底にあるメカニズムをさらに探索するために、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でGFPまたはGFP.VentXを発現する安定型THP1細胞株を生成した。VentXは、抗増殖性および分化促進性の転写因子として機能することが報告されている（Wu, et al. 2011 J Clin Invest 121(7): p.2599-613；Kamada, et al. 2008 J Clin Invest 118(6): p.2269-80；Berges, et al. 2005 Biochem Biophys Res Commun 333(3): p.896-907；Grassl, et al. 1999 J Am Soc Nephrol 10(7): p.1466-77）。ゆえに、VentXの過剰発現がTHP1細胞の増殖に対して阻害的役割を発揮し得るかどうかを、初めて調べた。先行研究と一貫して、THP1細胞におけるVentXの発現は、明らかな成長阻害（図2A）およびG1細胞周期停止（図2B）を誘導し、それは、VentXによるc-mycの下方調節およびp21発現の上方調節を伴った（図2C〜D）。THP1細胞のDC分化に対するVentX発現の効果を判定するために、GFPを形質導入されたTHP1細胞の軽度の分化が観察され得る準最適誘導条件を開発した（図2Eの上のパネル）。この条件下において、VentXの過剰発現は、THP1細胞のDC分化を有意に加速させた。図2Eに示されるように、VentXを形質導入されたTHP1細胞は、CD1a、CD11c、CD40、CD86、およびHLA-DRの表面発現の顕著な増加を呈し、これらの細胞におけるDC分化の増強を示した。CD36、CD64、およびCD80の発現は、VentXを形質導入されたTHP1細胞において大部分が変化しないままであった（図S4）。際立ったことには、VentXを形質導入されたTHP1細胞は、初代単球に由来するDCの形態に似て、広範な樹状突起形成を有して接着性かつ扁平になった（図2F、右のパネル）。対照的に、そのような形態変化は、GFPを形質導入された細胞では観察されなかった（図2F、左のパネル）。全体として、これらの結果は、VentXがDC分化において全般的役割を果たし得ることを示唆している。
【００７９】
IL-6はDC分化のVentX調節を仲介する
VentXにより調節されるDCの分化および成熟の根底にあるメカニズムを解明するために、DC発生に重要であることが知られるサイトカインの発現レベルを、逆転写PCRおよび細胞内染色によって解析した。IL1β、TNFα、およびIL10発現の明らかな変化は検出されなかったのに対して（データ示さず）、IL6発現はVentX MOをトランスフェクトされた細胞において一貫して増加した（図3AおよびC）。IL6は、CD14＋単球およびCD34＋前駆細胞の両方からのDCの分化および成熟を阻害することが示されている（Gabriele, et al. 2004 Blood 103(3): p.980-7；Dendorfer, et al. 1994 Mol Cell Biol 14(7): p.4443-54；Isshiki, et al. 1990 Mol Cell Biol 10(6): p.2757-64；Libermann, et al. 1990 Mol Cell Biol 10(5): p.2327-34）。ノックダウン実験の結果を裏付けするために、IL6の発現レベルに対するVentXの異所性発現の効果を調べた。機能喪失型の手法と一貫して、VentXの過剰発現は、初代単球においてIL6 mRNAレベルを低下させ（図3C）、かつIL6産生を阻害した（図3B）。VentXが転写レベルでIL6発現を阻害するかどうかを判定するために、IL6プロモーターを用いたルシフェラーゼレポーターアッセイを実施した。592bpのIL6プロモータールシフェラーゼレポーターの活性およびいくつかの欠失変異体構築物に対するVentXの効果を査定した（de Jong, et al. 1999 J Leukoc Biol 66(2): p.201-4）。図3Dに示されるように、VentXは、初代単球において、-592bpのIL6プロモーター活性を有意に阻害した。以前の研究は、AP1の結合部位（-283〜-277bp）、C/EBPの結合部位（-158〜-145bpおよび-87〜-76bp）、およびNFκBの結合部位（-75〜-63bp）を含めた、ヒトIL-6プロモーターにおけるいくつかの機能的シス調節エレメントを記述している33〜36。興味深いことには、NFκB結合部位しか含有しない33-80bpのIL6プロモーターの活性は、VentXによって、-592bpのIL6プロモーターのものと同様の程度まで抑制され（図3E）、このことは、VentXがNFκB結合部位を標的としてIL6発現を調節し得ることを示した。この仮説を試験するために、IL6プロモーターの変異解析を実施し、そして-80bpのIL6プロモーター上にあるNFκB結合部位の変異は、プロモーターレポーター活性を阻害し得るVentXの能力を無効にすることが見出された（図3F）。NFκBが、VentXにより調節されるIL6発現に関与しているかどうかを判定するために、NFκBの発現およびIL6プロモーターとのその相互作用に対するVentXの効果を調べた。VentXは、NFκBの発現に影響を及ぼさないことが見出された（データ示さず）。しかしながら、クロマチン免疫沈降アッセイを用いると、VentXの異所性発現は、NFκBのIL6プロモーターへの結合の低下につながることが見出され（図3G）、VentXは、IL6プロモーターとのNFκB相互作用を阻害することを通じて、IL6発現を転写レベルで抑制することが示唆された。VentX MOをトランスフェクトされた単球における損なわれたDC分化が、これらの細胞におけるIL6分泌の増加に起因し得るかどうかをさらに調査した。この問題に取り組むために、IL6に対する中和抗体を、VentX MOをトランスフェクトされた単球の培養培地に添加し、かつDCの分化を、CD1a表面発現についてのフローサイトメトリー解析により査定した。図4に示されるように、特異的抗体でIL6活性を中和することにより、VentX MOをトランスフェクトされた単球におけるDC分化不良が有意に改善され、VentXは、少なくとも部分的に、IL6自己分泌産生を調整するこ��を通じて、DC分化を調節することが示された。
【００８０】
VentXは樹状細胞成熟を調節する
LPSなどの細菌構成要素による刺激により、DCは成熟の過程を受ける。VentXがDC成熟において役割を果たすかどうかを探索するために、LPSにより誘導された成熟過程の間のDC遺伝子発現プロファイルの変化に対するVentXの効果を、PCRアレイ手法を用いて調べた。該PCRアレイは、抗原の取り込みおよび提示に関与する遺伝子、DC成熟に重要なサイトカイン/ケモカイン、ならびにそれらの受容体を含む。このアレイには、炎症に関わる細胞表面受容体およびシグナル伝達因子も含まれる。図5A〜Eに示されるように、VentXの過剰発現は、CD1抗原、共刺激因子CD80およびCD86、HLA分子、炎症促進性サイトカインIL12およびTNFα、ケモカインCCL2（MCP-1）、CCL3（MIP-1α）、およびCCL5（RANTES）、ケモカイン受容体CCR5およびCXCR4、ならびにトール様受容体（TLR）など、多種多様な遺伝子の上方調節を誘導した。加えて、CSF1R（M-SCF受容体）およびCDKN1A（p21）の発現も、以前に実証されたように増加した（Wu, et al. 2011 J Biol Chem 286(14): p.12693-701；Wu, et al. 2011 J Clin Invest 121(7): p.2599-613）。PCRアレイの結果を、異なるプライマーのセットを用いた、独立したPCR反応によってさらに検証した。図5Fに示されるように、独立した定量的PCR実験は、PCRアレイと一貫した結果をもたらし、したがって、DC成熟過程の間のVentXの潜在的役割を示唆した。
【００８１】
VentXは腸粘膜炎症の間のDC成熟を調節する
DCの異常な活性化は、炎症性腸疾患の発症における粘膜炎症に関わっている。この問題に取り組むために、腸固有層DC（LPDC）を、潰瘍性大腸炎およびクローン病を有する患者の炎症を起こした粘膜ならびに正常な粘膜から単離した。これらのDCにおけるVentX発現レベルを、RT-PCR法によって測定した。図6Aに示されるように、VentX発現レベルは、炎症を起こしていないエリア由来のLPDCと比較して、炎症を起こしたエリア由来のLPDCにおいて有意に上昇していた（図6A）。VentXの発現の上昇が、DCの異常な活性化と関係しているかどうかを判定するために、LPDCの成熟および活性化に対するVentXノックダウンの効果を試験した。図6B〜Cに示されるように、LPDCにおけるVentXのノックダウンは、調べた細胞表面マーカーの中でも、IBD患者の炎症を起こした腸粘膜由来のDCにおいて上方調節されることが以前に示されている共刺激因子CD40、CD80、およびCD86、ケモカイン受容体CCR7、ならびにパターン認識受容体TLR2およびTLR4の発現を、有意に下方調節した。CD83の発現は、VentXノックダウンによって影響を受けなかった。細胞内染色により、VentXノックダウンを有するLPDCは、より少ない炎症性サイトカインIL12、TNFα、およびケモカインCCL3、CCL5を産生することが実証された。一貫して、逆転写PCRにより、対照LPDC細胞と比較して、VentXノックダウンを有するLPDC細胞におけるCCL2、CCL3、CCL5、CXCL12、IL12、TNFα、およびTLRに対するmRNAレベルが有意に減少したことが明らかとなった（図6D）。表現型の特徴付けに加えて、機能解析により、LPDC細胞におけるVentXノックダウンは、初代T細胞の増殖を刺激し得るDCの能力を有意に損なうことが示された（図6E）。コルチコステロイドなどの免疫抑制剤は、中程度から重度のIBD患者における粘膜炎症の管理における主要な処置様式であり続けており、DCの成熟および機能を調整することが報告されている（de Jong, et al. 1999 J Leukoc Biol 66(2): p.201-4；Piemonti, et al. 1999 J Immunol 162(11): p.6473-81）。VentXがIBDにおけるステロイド処置の下流標的であり得るかどうかを判定するために、インビトロでプレドニゾロンで処理されたLPDCにおいて、VentX発現レベルを調べた。図6Fに示されるように、ステロイド処理は、LPDCにおけるVentX発現、ならびにIL2、TNF、CCL5などの炎症促進性サイトカインの発現（図6G）を劇的に減少させた。VentXをDCにおいて異所的に発現させた場合、炎症促進性サイトカインの発現に対するコルチコステロイドの阻害効果は有意に減退し、このことは、ステロイドが、一部には、DCにおいてVentX発現の下方調節を通じて、その抗炎症性を発揮することを示唆している。
【実施例】
【００８２】
実験
材料および方法
ヒト初代細胞の単離および処理
Dana-Farber Cancer Instituteにおいて、健常成人ドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）を、フィコール密度勾配遠心分離によって単離した。抗CD14抗体をコーティングした磁気マイクロビーズ（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を用いて、CD14＋単球をPBMCから精製した。10％ウシ胎仔血清（FBS）、GM-CSF（100ng/ml）、およびIL4（20ng/ml）（PeproTech, Rocky Hill, NJ）を含有するRPMI 1640培地を用いて、単球を1×106細胞/mlで12ウェルプレート中にて培養した。サイトカインを2または3日おきに合計5日間培養物に添加して、樹状細胞分化を誘導した。IL6に対する中和抗体をR&D Systems（Minneapolis, MN）から購入し、2.5μg/mlの1日用量で用いた。腸粘膜を、クローン病および潰瘍性大腸炎を含めた炎症性腸疾患を有すると診断された患者から外科的に切除された標本から獲得した。標本を、炎症を起こした粘膜および炎症を起こしていない粘膜の両方から採取し、かつ肉眼的におよび顕微鏡的に確認した。以前に記載された技術を用いて、固有層単核細胞を単離した（Dillon, et al. 2010 J Immunol 184(12): p.6612-21；Kamada, et al. 2008 J Clin Invest 118(6): p.2269-80）。磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）を用いて、LPDCをCD19−CD1c＋細胞の画分として精製した。DCの成熟を促進するために、100ng/mlの大腸菌（E Coli）LPS（Sigma-Aldrich）を培地に添加し、かつ24時間さらに培養した。ヒト材料を用いた実験は、Brigham and Women's Hospitalの施設内審査委員会によって承認されたガイドラインに従って実施された。
【００８３】
VentXノックダウン
メーカーの指示に従ってHuman Monocyte Nucleofector Kit（Lonza, Walkersville, MD）を用いて、ヒト初代単球にモルフォリノ（MO）アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトした。簡潔には、VentX MOオリゴヌクレオチド
0006559117.tif 000002
、または標準対照MOオリゴヌクレオチドのいずれかを2.5nmol含む100μlのnucleofector溶液中に10×106個の単球を再懸濁し、かつNucleofector II Device（Lonza）を用いてエレクトロポレーションした。次いで、細胞を装置からすぐに取り出し、2mMグルタミンおよび10％ FBSを含有する、事前に温めた1mlのHuman Monocyte Nucleofector Mediumを用いて一晩インキュベートした。次いで、細胞を完全RPMI培地中に再懸濁し、かつ適当なサイトカインで処理して、DCへの分化を誘導した。すべてのMOオリゴヌクレオチドをGene Tools（Philomath, OR）から発注した。以前の研究で記載されているように、VentXを標的とするsiRNAをLPDCにトランスフェクトした（Wu, et al. 2011 J Clin Invest 121(7): p.2599-613）。
【００８４】
VentXを条件付きで発現するTHP1細胞株の生成
ヒト単球系白血病細胞株THP1を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC; Manassas, VA）から獲得した。GFP.VentXまたはGFPを発現するドキシサイクリン誘導性レトロウイルスは、以前の研究で記載されている（Wu, et al. 2011 J Clin Invest 121(7): p.2599-613）。GFP.VentXを条件付きで発現するTHP1細胞株を、pRetroX-GFP.VentXおよびpRetroX-Tet-On Advancedレトロウイルスの共形質導入により生成し、かつ1.0μg/mlのドキシサイクリンとの24時間のインキュベーション後に、GFP.VentX陽性細胞をFACSAria高速ソーター（BD Bioscience, San Jose, CA）によって選別した（Dana-Farber Cancer Institute Flow Cytometry Core Facility）。次いで、選別された細胞を、ドキシサイクリンの非存在下でRPMI 1640培地中で維持した。GFPを条件付きで発現するTHP1細胞株を、対照として同様に生成した。THP1細胞からDCへの分化を誘導するために、以前に記載されたサイトカインカクテルを一部改変して、細胞を処理した（Berges, et al. 2005 Biochem Biophys Res Commun 333(3): p.896-907）。簡潔には、10％ FBS、100ng/ml GM-CSF、50ng/ml IL4およびTNF-α、100ng/mlイオノマイシンを補給したRPMI 1640培地中で12ウェルプレート中にて2日間細胞を成長させた。この準最適条件下では、GFP発現THP1細胞において軽度のDC分化しか観察されず、それにより、本発明者らは、このモデル細胞株においてDC分化に対するVentX発現の効果を測定することが可能となった。
【００８５】
FACS解析
蛍光色素抱合型抗体（eBioscience, San Diego, CA）による細胞の免疫染色後に、DCおよびTHP1細胞についての表現型解析をフローサイトメトリーを用いて実施した。以下のFITCまたはPE抱合型抗体：抗CD1a、CD1b、CD1c、CD11c、CD14、CD16、CD36、CD40、CD64、CD80、CD83、CD86、CD116、CCR7、HLA-DR、TLR2、およびTLR4を用いた。CCL3、CCL5、IL6およびIL12 p70、ならびにTNFαについての細胞内染色を、メーカーによって提供されたプロトコールに従って、PE抱合型抗体を用いて実施した。アイソタイプ対照染色を、すべての実験に対して並行して実施した。細胞周期解析をヨウ化プロピジウム（PI）染色によって行った。染色された細胞を、FlowJoソフトウェアを用いたFACScanフローサイトメーター（BD Bioscience）で解析した。結果は、陽性細胞のパーセンテージ、またはアイソタイプ対照抗体から得られたMFIを差し引いた後の平均蛍光強度（MFI）値として表現されている。
【００８６】
ルシフェラーゼレポーターアッセイ
ヒトIL6プロモーター領域の-592bpフラグメントを、順方向プライマー：
0006559117.tif 000003
および逆方向プライマー：
0006559117.tif 000004
を用いて増幅した。-225bpおよび-80bpのプロモーターを、同じ逆方向プライマー、ならびにそれぞれ以下の順方向プライマー：
0006559117.tif 000005
を用いて増幅した。増幅産物を制限酵素Mlu IおよびXho Iで消化し、その後、消化されたフラグメントをpGL3ルシフェラーゼレポーター内にクローニングした。初代単球へのpcDNA-VentXプラスミドまたは対照pcDNA-GFPプラスミドとのレポータープラスミドのトランスフェクションを、エレクトロポレーションにより行った。レポータープラスミドを、テトラサイクリン誘導性VentXを安定して発現するU2OS細胞にもトランスフェクトし［18］、かつテトラサイクリンの非存在または存在下でレポーター活性を評価した。各トランスフェクションには10ngのウミシイタケ（Renilla）ルシフェラーゼプラスミドを含めて、レポーター活性を正規化した。トランスフェクションまたはテトラサイクリンの添加の48時間後に細胞を収集し、かつDual-Luciferase Reporter Assay System（Promega, Madison, WI）で解析した。ルシフェラーゼレポーターのNFκB結合部位の変異を、Stratagene（Santa Clara, CA）製のQuikChange（登録商標）Site-Directed Mutagenesis Kitにより達成した。以前に報告されているように、野生型NFκB結合配列
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を
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に変異させた（Grassl, et al. 1999 J Am Soc Nephrol 10(7): p.1466-77）。
【００８７】
ChIPアッセイ
GFPまたはGFP.VentXを条件付きで発現するTHP1細胞株を採用して、VentX発現により、IL6プロモーター領域へのNFκB結合が損なわれるかどうかを検出した。細胞を1.0μg/mlのドキシサイクリンで2日間処理し、かつクロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイのために収集した。メーカーの指示に従ってCell Signaling（Danvers, MA）製のSimpleChIP（登録商標）Enzymatic Chromatin IP Kitを用いて、ChIP手順を実施した。NFκB/p65抗体（Cell Signaling）を免疫沈降に用いた。NFκB結合部位を含有するヒトIL6プロモーター領域を、順方向プライマー：
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および逆方向プライマー：
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を用いて定量的PCRによって増幅した。
【００８８】
PCRアレイ、リアルタイムPCR、ウェスタンブロット、および混合リンパ球反応
Dendritic & Antigen Presenting Cell PCR ArrayをSABiosciences（Valencia, CA）から購入した。このアレイ上のすべての遺伝子に対するGeneBankアクセス番号は、表S1に列挙されている。リアルタイムPCRをLightCycler（登録商標）（480 Real-Time PCR System；Roche, Indianapolis, IN）で実施した。VentX、IL6、IL12、p21、c-myc、CCL2、CCL3、CCL5、CCL19、CXCL1、CXCL12、CD1a、TNFα、TLR2、およびTLR4のmRNAレベルの検出に用いられたプライマーは、表S2に示されている。以前の研究で記載されているように、ウェスタンブロット解析を行った（Wu, et al. 2011 J Clin Invest 121(7): p.2599-613）。p21およびc-mycに対する一次抗体はCell Signaling製であり、抗VentX抗体をAbcam（Boston, MA）から購入した。BrdUを培養物に添加してT細胞増殖を判定する点を除いて、以前に記載されているように、混合リンパ球反応を実施した（Wu, et al. 2011 J Clin Invest 121(7): p.2599-613）。組み入れられたBrdUをPE抱合型抗BrdU抗体で検出し、かつフローサイトメトリーで解析した。
【００８９】
統計学的解析
スチューデントt検定を用いて統計学的有意性を算出し、かつp＜0.05を統計学的に有意であると見なした。
【００９０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈上別様にはっきりと記述されていない限り、「1つの」、「ある」、および「その」という単数形形態には、複数形の指示対象が含まれる。
【００９１】
別様に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての技術的および科学的な用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様のまたは同等の任意の方法および材料を、本明細書において開示される態様の実践または試験において用いることもできるが、好ましい方法および材料がここでは記載されている。本明細書において挙げられる方法は、開示される特定の順序に加えて、論理的に可能である任意の順序で行われ得る。
【００９２】
参照による組み入れ
本開示では、特許、特許出願、特許公報、雑誌、本、論文、ウェブコンテンツなど、他の文書への参照および引用がなされている。そのようなすべての文書は、参照により本明細書においてそれらの全体として本明細書によって組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられることが述べられているが、本明細書において明確に記されている既存の定義、記述、または他の開示材料と矛盾する任意の材料またはその一部は、その組み入れられる材料と本開示材料との間で矛盾が生じない程度にのみ組み入れられる。矛盾する場合には、本明細書において開示される態様を好ましい開示として支持して、矛盾は解消されるべきである。
【００９３】
同等物
代表的な実施例は、本局面を例証するのを助けることを意図されるものであり、それらは、範囲を限定することを意図されるものではなく、また範囲を限定すると解釈されるべきでもない。実際、本明細書において示されかつ記載されるものに加えて、様々な改変およびその多くのさらなる態様が、本明細書に含まれる実施例ならびに科学的文献および特許文献への参照を含めた、本文書の全内容から当業者に明白になるであろう。実施例は、その様々な態様およびその同等物において、本明細書において開示される態様の実践に適応され得る重要なさらなる情報、例示、および指針を含有する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図６Ｇ】
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【配列表】
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