(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性線維芽細胞増殖因子を実質的に含まない液体培地中で、
塩基性線維芽細胞増殖因子を結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、前記第１の領域に塩基性線維芽細胞増殖因子を結合し、前記第２の領域により培養容器（但し、多糖類及びタンパク質の少なくとも一方で予めコートされた培養容器を除く。）に多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに接着している、細胞接着活性を有するポリペプチドと、多能性幹細胞とを接触させて、前記多能性幹細胞を培養する培養工程を含む、
多能性幹細胞の培養方法。
【請求項２】
前記ポリペプチドが８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなり、前記第１の領域が下記の配列Ａ−１を含む領域であり、前記第２の領域が下記の配列Ｂ−１を含む領域である、請求項１に記載の多能性幹細胞の培養方法。
配列Ａ−１：配列番号２で示されるアミノ酸配列。
配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、請求項１又は請求項２に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項４】
前記培養工程の前に、
塩基性線維芽細胞増殖因子を結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチドを、培養容器（但し、多糖類及びタンパク質の少なくとも一方で予めコートされた培養容器を除く。）に接触させ、前記第２の領域により前記培養容器に多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに接着させる接着工程と、
前記ポリペプチドに、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する溶液を接触させ、前記第１の領域に塩基性線維芽細胞増殖因子を結合させる結合工程と、
を含む、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
前記培養工程の前に、
さらに、前記ポリペプチドに接触させた前記溶液を除去する除去工程を含む、請求項４に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項６】
塩基性線維芽細胞増殖因子を実質的に含まない液体培地中で、
培養容器（但し、多糖類及びタンパク質の少なくとも一方で予めコートされた培養容器を除く。）に多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに接着している細胞接着活性を有するポリペプチド、及び、前記ポリペプチドが多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに接着している培養容器に直接又は間接的に接着している塩基性線維芽細胞増殖因子と、多能性幹細胞とを接触させて、前記多能性幹細胞を培養する培養工程を含む、
多能性幹細胞の培養方法。
【請求項７】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、前記培養容器に接着している負の電荷を持つ素材に結合したことにより、前記培養容器に間接的に接着している、請求項６に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項８】
塩基性線維芽細胞増殖因子が、負の電荷を持つ前記培養容器に結合したことにより、前記培養容器に直接接着している、請求項６に記載の多能性幹細胞の培養方法。
【請求項９】
塩基性線維芽細胞増殖因子を結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチドであって、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなり、前記第１の領域が下記の配列Ａ−１を含む領域であり、前記第２の領域が下記の配列Ｂ−１を含む領域であるポリペプチドを、培養容器（但し、多糖類及びタンパク質の少なくとも一方で予めコートされた培養容器を除く。）に接触させ、前記第２の領域により前記培養容器に多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに接着させる接着工程と、
前記ポリペプチドに、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する溶液を接触させ、前記第１の領域に塩基性線維芽細胞増殖因子を結合させる結合工程と、
前記培養容器に接着している、塩基性線維芽細胞増殖因子を結合した前記ポリペプチドに、塩基性線維芽細胞増殖因子を実質的に含まない液体を含浸させる含浸工程と、
を含む、
塩基性線維芽細胞増殖因子を結合した細胞接着活性を有するポリペプチドを備え、当該ポリペプチドが、塩基性線維芽細胞増殖因子を実質的に含まない液体を保持した湿潤状態である培養容器を製造する、培養容器の製造方法。
配列Ａ−１：配列番号２で示されるアミノ酸配列。
配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列。
【請求項１０】
前記結合工程と前記含浸工程との間に、さらに、前記ポリペプチドに接触させた前記溶液を除去する除去工程を含む、請求項９に記載の培養容器の製造方法。
【請求項１１】
前記溶液が、塩基性線維芽細胞増殖因子を１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で含有する、請求項９又は請求項１０に記載の培養容器の製造方法。
【請求項１２】
前記結合工程と前記含浸工程との間に、さらに、前記培養容器に接着している、塩基性線維芽細胞増殖因子を結合した前記ポリペプチドを乾燥する乾燥工程を含む、請求項９〜請求項１１のいずれか１項に記載の培養容器の製造方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、請求項９〜請求項１２のいずれか１項に記載の培養容器の製造方法。
【請求項１４】
塩基性線維芽細胞増殖因子を結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、前記第１の領域に塩基性線維芽細胞増殖因子を結合し、前記第２の領域により培養容器（但し、多糖類及びタンパク質の少なくとも一方で予めコートされた培養容器を除く。）に多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに接着している、細胞接着活性を有するポリペプチドであって、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなり、前記第１の領域が下記の配列Ａ−１を含む領域であり、前記第２の領域が下記の配列Ｂ−１を含む領域であるポリペプチドを備え、
前記ポリペプチドが、塩基性線維芽細胞増殖因子を実質的に含まない液体を保持した湿潤状態である、培養容器。
配列Ａ−１：配列番号２で示されるアミノ酸配列。
配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、請求項１４に記載の培養容器。
【請求項１６】
塩基性線維芽細胞増殖因子を結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、前記第１の領域に塩基性線維芽細胞増殖因子を結合した細胞接着活性を有するポリペプチドであって、８０個〜２５０個のアミノ酸残基からなり、前記第１の領域が下記の配列Ａ−１を含む領域であり、前記第２の領域が下記の配列Ｂ−１を含む領域であるポリペプチドを含み、
塩基性線維芽細胞増殖因子を実質的に含まない液体を保持した湿潤状態であり、
培養容器（但し、多糖類及びタンパク質の少なくとも一方で予めコートされた培養容器を除く。）に多糖類及びタンパク質のいずれも介さずに前記ポリペプチドを介して接着させて用いるための、細胞培養用の足場材料。
配列Ａ−１：配列番号２で示されるアミノ酸配列。
配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、請求項１６に記載の細胞培養用の足場材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞が未分化状態を維持しつつ安定して増殖するためには、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor：ｂＦＧＦ）が培地中に存在することが必要と考えられており、ｂＦＧＦは、例えば日本国特許第５７１７３１１号公報及び日本国特許第４６１３０６９号公報に開示されているとおり、多能性幹細胞を培養する液体培地の補充物として使用されている。ｂＦＧＦは、血清又は血清代替物に含まれており、血清又は血清代替物を液体培地に添加することによっても、多能性幹細胞を培養する液体培地の補充物として使用されている。【０００３】
ところで従来、多能性幹細胞の培養においては、マウス線維芽細胞がフィーダー細胞として使用されてきた。しかし、異種動物由来感染症を予防する等の観点から、マウス線維芽細胞に代わる多能性幹細胞培養用の足場が提案されており、例えば国際公開第２０１３／１６４９７０号及びBiomaterials, 2010, Vol.31, No.32, pp.8281-8288には、ヒトビトロネクチンの部分配列を有する組換えポリペプチドが提案されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ｂＦＧＦは、液体培地中での安定性が低い物質であり、液体培地中で徐々に分解、変性、失活等してしまうことが知られている。したがって、多能性幹細胞を未分化状態のままで安定的に増殖させるためには、ｂＦＧＦを液体培地に多量に含有させる、ｂＦＧＦを含有する液体培地を頻繁に交換する、培養中にｂＦＧＦを液体培地に補充する等の必要があった。【０００５】
本発明の実施形態は、上記状況のもとになされた。
本発明の実施形態は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中、又は、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地中でも、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、多能性幹細胞を安定的に増殖させる、多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料を提供することを目的とし、これを解決することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記の課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。【０００７】
［Ａ１］  ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中で、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、第１の領域にｂＦＧＦを結合し、第２の領域により培養容器に接着している、細胞接着活性を有するポリペプチドと、多能性幹細胞とを接触させて、多能性幹細胞を培養する培養工程を含む、多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ２］  第１の領域が負の電荷を持つ、［Ａ１］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ３］  第１の領域が下記の配列Ａ−１、配列Ａ−２又は配列Ａ−３のいずれか一つを含む領域であり、第２の領域が下記の配列Ｂ−１、配列Ｂ−２又は配列Ｂ−３のいずれか一つを含む領域である、［Ａ１］又は［Ａ２］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
配列Ａ−１：配列番号２で示されるアミノ酸配列。
配列Ａ−２：配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、ｂＦＧＦとの結合能を有するアミノ酸配列。
配列Ａ−３：配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、ｂＦＧＦとの結合能を有するアミノ酸配列。
配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列。
配列Ｂ−２：配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、培養容器への接着能を有するアミノ酸配列。
配列Ｂ−３：配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、培養容器への接着能を有するアミノ酸配列。
［Ａ４］  ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ５］  ポリペプチドが、第１の領域を分子末端に有する、［Ａ１］〜［Ａ４］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ６］  ポリペプチドが、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列を基にした組換え体である、［Ａ１］〜［Ａ５］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ７］  ポリペプチドが、８０個〜５００個のアミノ酸残基からなる、［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ８］  ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値が−２．０〜−０．９５である、［Ａ１］〜［Ａ７］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ９］  培養工程の前に、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチドを、培養容器に接触させ、第２の領域により培養容器に接着させる接着工程と、ポリペプチドに、ｂＦＧＦを含有する溶液を接触させ、第１の領域にｂＦＧＦを結合させる結合工程と、を含む、［Ａ１］〜［Ａ８］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１０］  培養工程の前に、さらに、ポリペプチドに接触させた溶液を除去する除去工程を含む、［Ａ９］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１１］  溶液が、ｂＦＧＦを１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で含有する、［Ａ９］又は［Ａ１０］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１２］  液体培地中で、培養容器に直接又は間接的に接着しているｂＦＧＦ、及び、培養容器に接着している細胞接着活性を有するポリペプチドと、多能性幹細胞とを接触させて、多能性幹細胞を培養する培養工程を含む、多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１３］  ｂＦＧＦが、培養容器に接着している負の電荷を持つ素材に結合したことにより、培養容器に間接的に接着している、［Ａ１２］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１４］  ｂＦＧＦが、負の電荷を持つ培養容器に結合したことにより、培養容器に直接接着している、［Ａ１２］に記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１５］  液体培地が、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地である、［Ａ１２］〜［Ａ１４］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。
［Ａ１６］  多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、［Ａ１］〜［Ａ１５］のいずれか１つに記載の多能性幹細胞の培養方法。【０００８】
［Ｂ１］  ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチドを、培養容器に接触させ、第２の領域により培養容器に接着させる接着工程と、ポリペプチドに、ｂＦＧＦを含有する溶液を接触させ、第１の領域にｂＦＧＦを結合させる結合工程と、を含む、ｂＦＧＦを結合した細胞接着活性を有するポリペプチドを備える培養容器を製造する、培養容器の製造方法。
［Ｂ２］  さらに、ポリペプチドに接触させた溶液を除去する除去工程を含む、［Ｂ１］に記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ３］  溶液が、ｂＦＧＦを１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で含有する、［Ｂ１］又は［Ｂ２］に記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ４］  さらに、培養容器に接着している、ｂＦＧＦを結合したポリペプチドを乾燥する乾燥工程を含む、［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ５］  さらに、培養容器に接着している、ｂＦＧＦを結合したポリペプチドに、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を含浸させる含浸工程を含む、［Ｂ１］〜［Ｂ４］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ６］  第１の領域が配列Ａ−１、配列Ａ−２又は配列Ａ−３のいずれか一つを含む領域であり、第２の領域が配列Ｂ−１、配列Ｂ−２又は配列Ｂ−３のいずれか一つを含む領域である、［Ｂ１］〜［Ｂ５］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ７］  ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、［Ｂ１］〜［Ｂ６］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ８］  ポリペプチドが、第１の領域を分子末端に有する、［Ｂ１］〜［Ｂ７］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ９］  ポリペプチドが、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列を基にした組換え体である、［Ｂ１］〜［Ｂ８］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ１０］  ポリペプチドが、８０個〜５００個のアミノ酸残基からなる、［Ｂ１］〜［Ｂ９］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ１１］  培養容器が多能性幹細胞の培養用である、［Ｂ１］〜［Ｂ１０］のいずれか１つに記載の培養容器の製造方法。
［Ｂ１２］  多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、［Ｂ１１］に記載の培養容器の製造方法。【０００９】
［Ｃ１］  ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、第１の領域にｂＦＧＦを結合し、第２の領域により培養容器に接着している、細胞接着活性を有するポリペプチドを備える培養容器。
［Ｃ２］  ポリペプチドが乾燥状態である、［Ｃ１］に記載の培養容器。
［Ｃ３］  ポリペプチドが、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態である、［Ｃ１］に記載の培養容器。
［Ｃ４］  第１の領域が配列Ａ−１、配列Ａ−２又は配列Ａ−３のいずれか一つを含む領域であり、第２の領域が配列Ｂ−１、配列Ｂ−２又は配列Ｂ−３のいずれか一つを含む領域である、［Ｃ１］〜［Ｃ３］のいずれか１つに記載の培養容器。
［Ｃ５］  ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、［Ｃ１］〜［Ｃ４］のいずれか１つに記載の培養容器。
［Ｃ６］  ポリペプチドが、第１の領域を分子末端に有する、［Ｃ１］〜［Ｃ５］のいずれか１つに記載の培養容器。
［Ｃ７］  ポリペプチドが、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列を基にした組換え体である、［Ｃ１］〜［Ｃ６］のいずれか１つに記載の培養容器。
［Ｃ８］  ポリペプチドが、８０個〜５００個のアミノ酸残基からなる、［Ｃ１］〜［Ｃ７］のいずれか１つに記載の培養容器。
［Ｃ９］  多能性幹細胞の培養用である、［Ｃ１］〜［Ｃ８］のいずれか１つに記載の培養容器。
［Ｃ１０］  多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、［Ｃ９］に記載の培養容器。【００１０】
［Ｄ１］  ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、第１の領域にｂＦＧＦを結合した細胞接着活性を有するポリペプチド、を含む細胞培養用の足場材料。
［Ｄ２］  乾燥状態である、［Ｄ１］に記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ３］  ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態である、［Ｄ１］に記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ４］  第１の領域が配列Ａ−１、配列Ａ−２又は配列Ａ−３のいずれか一つを含む領域であり、第２の領域が配列Ｂ−１、配列Ｂ−２又は配列Ｂ−３のいずれか一つを含む領域である、［Ｄ１］〜［Ｄ３］のいずれか１つに記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ５］  ポリペプチドが、さらに、ＲＧＤモチーフを有する、［Ｄ１］〜［Ｄ４］のいずれか１つに記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ６］  ポリペプチドが、第１の領域を分子末端に有する、［Ｄ１］〜［Ｄ５］のいずれか１つに記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ７］  ポリペプチドが、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列を基にした組換え体である、［Ｄ１］〜［Ｄ６］のいずれか１つに記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ８］  ポリペプチドが、８０個〜５００個のアミノ酸残基からなる、［Ｄ１］〜［Ｄ７］のいずれか１つに記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ９］  多能性幹細胞の培養用である、［Ｄ１］〜［Ｄ８］のいずれか１つに記載の細胞培養用の足場材料。
［Ｄ１０］  多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、［Ｄ９］に記載の細胞培養用の足場材料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の実施形態によれば、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中、又は、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地中でも、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、多能性幹細胞を安定的に増殖させる、多能性幹細胞の培養方法、培養容器の製造方法、培養容器、及び細胞培養用の足場材料が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例３においてｂＦＧＦ量を吸光度測定により定量した結果を示すグラフである。
【図２】実施例４において培養したヒトｉＰＳ細胞の光学顕微鏡像である。
【図３】実施例６において遺伝子発現量を相対評価した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下に、本発明の実施形態について説明する。なお、これらの説明及び実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【００１４】
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
【００１５】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。
【００１６】
本明細書において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。
【００１７】
本明細書では、アミノ酸配列におけるアミノ酸残基を、当該技術分野で周知の、一文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇ」）又は三文字表記（例えば、グリシン残基を「Ｇｌｙ」）で表記する場合がある。
【００１８】
本明細書におけるアミノ酸配列に関する「同一性」とは、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４ｔｈＥｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照）を用いて計算される値を指す。例えば、配列番号３に対して同一性８０％以上とは、ＢＬＡＳＴにおけるＭａｘ Ｉｄｅｎｔｉｔｙの値が８０以上であることを示す。
【００１９】
本明細書において、アミノ酸配列の特定のアミノ酸残基について使用される「対応するアミノ酸残基」等の表現は、対比する２つ以上のアミノ酸配列を、当該技術分野で周知の仕方で、挿入、欠失、及び置換を考慮に入れた上で、同一となるアミノ酸残基が最も多くなるように整列（アライメント）させた際に、基準となるアミノ酸配列における特定のアミノ酸残基の位置に一致する、他方のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基を意味する。
【００２０】
本開示において、液体培地又は液体が「ｂＦＧＦを実質的に含まない」とは、ｂＦＧＦが、液体培地又は液体の成分として、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ且つ多能性幹細胞を安定的に増殖させるために必要とされる最小限の量以上に含まれていないことを意味する。具体的には、液体培地又は液体のｂＦＧＦ濃度は、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ未満であり、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ未満であり、更に好ましくは検出限界以下である。
【００２１】
本開示において、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチドを「特定ポリペプチド」ということがあり、第１の領域にｂＦＧＦを結合した特定ポリペプチドを「特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体」ということがある。
【００２２】
本開示は、多能性幹細胞の培養方法として、第１の実施形態及び第２の実施形態を提供する。以下に、これら２つの実施形態を順に説明する。
【００２３】
＜多能性幹細胞の培養方法：第１の実施形態＞
第１の実施形態は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中で、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、第１の領域にｂＦＧＦを結合し、第２の領域により培養容器に接着している、細胞接着活性を有するポリペプチドと、多能性幹細胞とを接触させて培養する培養工程を含む、多能性幹細胞の培養方法である。
【００２４】
つまり、第１の実施形態は、培養容器に接着した状態の特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体に多能性幹細胞を接触させて培養する。第１の実施形態において、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体は、多能性幹細胞が増殖するための足場となる。
【００２５】
第１の実施形態においては、特定ポリペプチドがｂＦＧＦを結合しており、これによりｂＦＧＦの分解、変性、又は失活が抑制される。そして、多能性幹細胞は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体に接触しながら培養されるので、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体中のｂＦＧＦの作用を受けて、未分化状態を維持しつつ安定的に増殖する。
【００２６】
したがって、第１の実施形態によれば、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中で多能性幹細胞の培養が可能であり、また、ｂＦＧＦを培養環境に補充する目的で、ｂＦＧＦを含有する液体培地を頻繁に交換すること、及び／又は、培養中に液体培地にｂＦＧＦを添加することを要しない。
【００２７】
以下に、第１の実施形態の詳細を説明する。
【００２８】
［特定ポリペプチド］
特定ポリペプチドとしては、ｂＦＧＦを結合する第１の領域と、培養容器に接着する第２の領域とを有し、且つ細胞接着活性を有していれば、アミノ酸配列及びアミノ酸残基数は特に制限されない。
【００２９】
本開示において、ポリペプチド又はそのアミノ酸配列について「ｂＦＧＦを結合する」及び「ｂＦＧＦとの結合能を有する」とは、ポリペプチドがｂＦＧＦに、タンパク質−タンパク質間の一般的な相互作用（水素結合、イオン結合、静電的相互作用、疎水性相互作用、ファンデルワールス力による結合等）により結合すること及び結合し得ることを意味する。本開示において、ポリペプチドが、ｂＦＧＦとの結合能を有するか否かは、以下の方法で判断する。
【００３０】
ポリペプチドにｂＦＧＦを濃度１００ｎｇ／ｍｌにて接触させる。例えば、ポリペプチドを培養容器に接着させたのちに、ｂＦＧＦ濃度１００ｎｇ／ｍｌの溶液（例えば、ｂＦＧＦ水溶液、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地）を培養容器に注ぎ入れる。ほかには、ポリペプチドが液体中にある場合は、そのポリペプチド液にｂＦＧＦを濃度が１００ｎｇ／ｍｌになるように添加してもよい。そして、３７℃下に２４時間静置し、２４時間の静置後、ｂＦＧＦに対する抗体を用いたＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）を行い、ｂＦＧＦの検出を試みる。ｂＦＧＦ濃度１００ｎｇ／ｍｌの溶液（例えば、ｂＦＧＦ水溶液、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地。これら溶液中ではｂＦＧＦが他の化合物と複合体を形成していないので、３７℃下に２４時間静置することにより、ｂＦＧＦがＥＬＩＳＡにより検出できない形態に変化する。）と比較して、検出されるｂＦＧＦ量が有意に高い場合、ポリペプチドはｂＦＧＦとの結合能を有すると判断する。
【００３１】
本開示において、ポリペプチド又はそのアミノ酸配列について「培養容器に接着する」及び「培養容器への接着能を有する」とは、培養容器の細胞培養表面（以下「培養表面」ということがある。）に対して、ポリペプチドが化学的な処理によることなく接着すること及び接着し得ることを意味する。ポリペプチドが、培養容器の培養表面に対して接着能を有するか否かは、以下の方法で判断する。
【００３２】
内表面をプラズマ処理したポリスチレン製の培養容器に、２００ｐｍｏｌ／ｃｍ２となるようにポリペプチド含有溶液を注入して３７℃下に２時間静置する。２時間の静置後、リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にて２回洗浄した後に、培養表面にポリペプチドが１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上残存するか否かにより判断する。培養表面に残存するポリペプチド量は、ポリペプチドを認識する抗体を用いたＥＬＩＳＡ、又は、接着したポリペプチドを加水分解し、生じたアミノ酸量を測定するＨＰＬＣ（High Performance Liquid Chromatography）によって定量しうる。
【００３３】
本開示において、ポリペプチド又はそのアミノ酸配列の細胞接着活性は、培養対象の細胞に対する接着活性であり、公知の方法で確認しうる。例えば、ポリペプチドで培養表面をコーティングした培養容器に細胞を播種してインキュベートし、培養表面に接着した細胞を計数することで確認できる。具体的な方法は、例えば、Methods in Enzymology 82: 803-831, 1982（Ruoslahti, E. et al.）及び、Nature 352: 438-441, 1991（Williams, D. A. et al.）に記載されている。
【００３４】
特定ポリペプチドとしては、第１の領域が負の電荷を持つポリペプチドが好ましい。ｂＦＧＦが正の電荷を持つところ、第１の領域が負の電荷を持つことにより、第１の領域がｂＦＧＦと静電的に結合する。なお、ポリペプチド又はその一部が正又は負の電荷を持つか否かは、ポリペプチド又はその一部が置かれているｐＨ環境に依存する。第１の領域が「負の電荷を持つ」とは、細胞培養下、例えばｐＨ７．４の液体培地中で、負の電荷を持つことを意味する。細胞培養下において第１の領域が負の電荷を持つ実施形態としては、例えば、第１の領域の等電点が６以下である実施形態が挙げられ、第１の領域の等電点が１〜６である実施形態が好ましく、２〜５である実施形態がより好ましい。
【００３５】
特定ポリペプチドとしては、例えば、ビトロネクチン、フィブロネクチン、Ｉ型コラーゲン、IV型コラーゲン等の天然タンパク質、これら天然タンパク質のアミノ酸配列に基づいて設計された組換えタンパク質、及びこれらの混合物が挙げられる。特定ポリペプチドは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００３６】
ビトロネクチンとしては、ヒトビトロネクチンが好ましく、具体的には、配列番号１で示される４５９アミノ酸残基のポリペプチドが好ましい。ヒト体内で生産される天然ヒトビトロネクチンは、アミノ酸の一部に糖鎖が結合した糖タンパク質であることが確認されている。
【００３７】
配列番号１
ＤＱＥＳＣＫＧＲＣＴＥＧＦＮＶＤＫＫＣＱＣＤＥＬＣＳＹＹＱＳＣＣＴＤＹＴＡＥＣＫＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰＥＤＥＹＴＶＹＤＤＧＥＥＫＮＮＡＴＶＨＥＱＶＧＧＰＳＬＴＳＤＬＱＡＱＳＫＧＮＰＥＱＴＰＶＬＫＰＥＥＥＡＰＡＰＥＶＧＡＳＫＰＥＧＩＤＳＲＰＥＴＬＨＰＧＲＰＱＰＰＡＥＥＥＬＣＳＧＫＰＦＤＡＦＴＤＬＫＮＧＳＬＦＡＦＲＧＱＹＣＹＥＬＤＥＫＡＶＲＰＧＹＰＫＬＩＲＤＶＷＧＩＥＧＰＩＤＡＡＦＴＲＩＮＣＱＧＫＴＹＬＦＫＧＳＱＹＷＲＦＥＤＧＶＬＤＰＤＹＰＲＮＩＳＤＧＦＤＧＩＰＤＮＶＤＡＡＬＡＬＰＡＨＳＹＳＧＲＥＲＶＹＦＦＫＧＫＱＹＷＥＹＱＦＱＨＱＰＳＱＥＥＣＥＧＳＳＬＳＡＶＦＥＨＦＡＭＭＱＲＤＳＷＥＤＩＦＥＬＬＦＷＧＲＴＳＡＧＴＲＱＰＱＦＩＳＲＤＷＨＧＶＰＧＱＶＤＡＡＭＡＧＲＩＹＩＳＧＭＡＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮＳＲＲＰＳＲＡＴＷＬＳＬＦＳＳＥＥＳＮＬＧＡＮＮＹＤＤＹＲＭＤＷＬＶＰＡＴＣＥＰＩＱＳＶＦＦＦＳＧＤＫＹＹＲＶＮＬＲＴＲＲＶＤＴＶＤＰＰＹＰＲＳＩＡＱＹＷＬＧＣＰＡＰＧＨＬ
【００３８】
配列番号１で示されるビトロネクチンは、ｂＦＧＦを結合する第１の領域と、培養容器に接着する第２の領域とを有しており、ｂＦＧＦとの結合能及び培養容器への接着能を有する。配列番号１で示されるビトロネクチンは、さらに、細胞接着活性を示す領域も有しており、培養対象の細胞に接着する。
【００３９】
特定ポリペプチドとしては、抗原性物質及び感染源の混入の虞が少ない観点から、天然ヒトビトロネクチン（配列番号１）のアミノ酸配列に基づいて設計された組換え体が好ましい。以下、この組換え体を「組換えビトロネクチン」ということがある。
【００４０】
特定ポリペプチドとしては、第１の領域として、下記の配列Ａ−１〜Ａ−３のいずれか一つを含む領域を有し、第２の領域として、下記の配列Ｂ−１〜Ｂ−３のいずれか一つを含む領域を有するポリペプチドが好ましい。
【００４１】
配列Ａ−１：配列番号２で示されるアミノ酸配列。
配列Ａ−２：配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、ｂＦＧＦとの結合能を有するアミノ酸配列。
配列Ａ−３：配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、ｂＦＧＦとの結合能を有するアミノ酸配列。
【００４２】
配列番号２
ＤＱＥＳＣＫＧＲＣＴＥＧＦＮＶＤＫＫＣＱＣＤＥＬＣＳＹＹＱＳＣＣＴＤＹＴＡＥＣＫＰＱ
【００４３】
配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列。
配列Ｂ−２：配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、培養容器への接着能を有するアミノ酸配列。
配列Ｂ−３：配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、培養容器への接着能を有するアミノ酸配列。
【００４４】
配列番号３
ＰＲＰＳＬＡＫＫＱＲＦＲＨＲＮＲＫＧＹＲＳＱＲＧＨＳＲＧＲＮＱＮ
【００４５】
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、配列番号１における１番目〜４２番目の４２アミノ酸残基であり、ソマトメジンＢ様ドメインに相当する。本開示において、配列番号２で示されるアミノ酸配列、及びこれと同一性を有するアミノ酸配列を「ＳＭＢドメイン」ということがある。ＳＭＢドメインは、ｂＦＧＦとの結合能を有する。
【００４６】
配列番号３で示されるアミノ酸配列は、配列番号１における３４２番目〜３７３番目の３２アミノ酸残基であり、ヘパリン結合ドメインに相当し、ヘモペキシン様ドメインＩＩの一部に含まれる。本開示において、配列番号３で示されるアミノ酸配列、及びこれと同一性を有するアミノ酸配列を「ヘパリン結合ドメイン」ということがある。ヘパリン結合ドメインは、培養容器への接着能を有する。ヘパリン結合ドメインは、ポリペプチドの親水性を担保しポリペプチドの疎水凝集を抑制する効果も奏する。
【００４７】
配列Ａ−２は、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００４８】
配列Ａ−３は、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、好ましくは１個〜８個、より好ましくは１個〜４個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列である。
【００４９】
配列Ｂ−２は、配列番号３で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００５０】
配列Ｂ−３は、配列番号３で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、好ましくは１個〜６個、より好ましくは１個〜３個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列である。
【００５１】
特定ポリペプチドは、さらに、ＲＧＤモチーフを有することが好ましい。ＲＧＤモチーフとは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸）からなり、細胞接着活性を有するアミノ酸配列である。天然ヒトビトロネクチンおけるＲＧＤモチーフは、配列番号１における４５番目〜４７番目の配列である。
【００５２】
特定ポリペプチドは、細胞接着活性の観点から、ＲＧＤモチーフを分子表面に露出することが好ましい。したがって、特定ポリペプチドにおけるＲＧＤモチーフの直前及び直後のアミノ酸配列は、ＲＧＤモチーフによる細胞接着活性を有する天然タンパク質（例えば、天然ヒトビトロネクチン）のアミノ酸配列に基づいて設計されることが好ましい。本観点から、特定ポリペプチドの一実施形態は、ＲＧＤモチーフの直前又は直後に下記の（ａ）又は（ｂ）の少なくとも一方を有しており、特定ポリペプチドの別の一実施形態は、ＲＧＤモチーフの直前及び直後に下記の（ａ）及び（ｂ）の双方を有している。
【００５３】
（ａ）配列番号１における４３番目〜４４番目のアミノ酸配列。
（ｂ）配列番号１における４８番目〜５５番目のアミノ酸配列。
【００５４】
（ａ）は、ＲＧＤモチーフの直前にあることが好ましく、（ｂ）は、ＲＧＤモチーフの直後にあることが好ましい。（ａ）及び（ｂ）は、ＲＧＤモチーフの細胞接着活性を損なわない範囲で、それぞれ１個又は２個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であってもよい。
【００５５】
特定ポリペプチドにおいて、第１の領域と第２の領域との相対位置に特に制限はない。特定ポリペプチドの一実施形態においては、第１の領域が第２の領域のＮ末端側に位置している。
【００５６】
特定ポリペプチドがＲＧＤモチーフを有する場合、特定ポリペプチドにおいて、ＲＧＤモチーフの位置に特に制限はない。特定ポリペプチドの一実施形態においては、ＲＧＤモチーフが、第１の領域と第２の領域との間に位置している。
【００５７】
特定ポリペプチドは、ｂＦＧＦとの結合能を高める観点、及び、結合したｂＦＧＦを分子表面に露出させる観点から、第１の領域を分子末端に有することが好ましい。特定ポリペプチドの一実施形態においては、第１の領域がＮ末端に位置している。
【００５８】
特定ポリペプチドとしては、第１の領域とＲＧＤモチーフとを含む領域が、配列番号１における１番目〜５５番目のアミノ酸配列、又はこれと同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。つまり、特定ポリペプチドとしては、第１の領域とＲＧＤモチーフとを含む領域が、下記の配列Ｃ−１〜Ｃ−３のいずれか一つからなる領域であることが好ましい。
【００５９】
配列Ｃ−１：配列番号４で示されるアミノ酸配列。
配列Ｃ−２：配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、ｂＦＧＦとの結合能及びＲＧＤモチーフを有するアミノ酸配列。
配列Ｃ−３：配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、ｂＦＧＦとの結合能及びＲＧＤモチーフを有するアミノ酸配列。
【００６０】
配列番号４
ＤＱＥＳＣＫＧＲＣＴＥＧＦＮＶＤＫＫＣＱＣＤＥＬＣＳＹＹＱＳＣＣＴＤＹＴＡＥＣＫＰＱＶＴＲＧＤＶＦＴＭＰＥＤＥ
【００６１】
配列Ｃ−２は、配列番号４で示されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００６２】
配列Ｃ−３は、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列である。
【００６３】
特定ポリペプチドの一実施形態においては、配列Ｃ−１〜Ｃ−３のいずれか一つからなる領域がＮ末端に位置している。この実施形態の特定ポリペプチドは、ｂＦＧＦとの結合能を高める観点、結合したｂＦＧＦを分子表面に露出させる観点、及びＲＧＤモチーフを分子表面に露出させる観点から、好ましい。
【００６４】
特定ポリペプチドは、第１の領域、第２の領域、及びＲＧＤモチーフ以外の他のアミノ酸配列を含んでいてもよく、他のアミノ酸配列としては、天然ヒトビトロネクチン（配列番号１）の部分配列が好ましい。これにより、特定ポリペプチドは、ヒトビトロネクチンに近い性質を具備しうる。
【００６５】
特定ポリペプチドは、ｂＦＧＦとの結合能、培養容器への接着能、細胞接着活性、又は凝集抑制の観点から、第２の領域の直前又は直後に、天然ヒトビトロネクチン（配列番号１）の部分配列を含むことが好ましい。この部分配列としては、例えば、下記の配列Ｄ−１〜Ｄ−３、配列Ｅ−１〜Ｅ−３が挙げられる。
【００６６】
配列Ｄ−１：配列番号１で示されるアミノ酸配列の２６９番目〜３４１番目のアミノ酸配列（配列ｄ−１）又はその部分アミノ酸配列。
配列Ｄ−２：配列ｄ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
配列Ｄ−３：配列ｄ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列。
【００６７】
配列Ｅ−１：配列番号１で示されるアミノ酸配列の３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列（配列ｅ−１）又はその部分アミノ酸配列。
配列Ｅ−２：配列ｅ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。
配列Ｅ−３：配列ｅ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列。
【００６８】
上記において「部分アミノ酸配列」とは、所定範囲のアミノ酸配列の一部であって、連続する３アミノ酸残基以上で構成されたアミノ酸配列を意味する。
【００６９】
配列Ｄ−２は、配列ｄ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する配列であり、例えば、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００７０】
配列Ｄ−３は、配列ｄ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、例えば、１個〜２０個、１個〜１０個、又は１個〜５個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列である。
【００７１】
配列Ｅ−２は、配列ｅ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する配列であり、例えば、８５％以上、９０％以上、又は９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００７２】
配列Ｅ−３は、配列ｅ−１のアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列に対して１個又は数個のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列であり、例えば、１個〜２０個、１個〜１０個、又は１個〜５個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列である。
【００７３】
特定ポリペプチドが組換えビトロネクチンであり、第１の領域、第２の領域、及びＲＧＤモチーフ以外の他のアミノ酸配列を含んでいる場合、他のアミノ酸配列は、配列番号１で示されるアミノ酸配列のシステイン残基の位置に、システイン残基以外のアミノ酸残基を有していてもよい。これにより、システイン残基による分子内架橋又は分子間架橋の形成を防ぐことができ、好ましい。システイン残基を置換する他のアミノ酸残基としては、セリン残基、アラニン残基、グリシン残基等を挙げることができる。中でも、システイン残基と類似の構造を有する観点から、セリン残基、アラニン残基が好ましい。
【００７４】
特定ポリペプチドが組換えビトロネクチンである場合、配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、５６番目〜２６８番目のアミノ酸残基は含まなくてもよい。本領域は、本開示において特定ポリペプチドに要求される性能への寄与が少ないと考えられる。
【００７５】
特定ポリペプチドは、細胞接着活性、ｂＦＧＦとの結合能、及び培養容器への接着能が損なわれない範囲で、これまで述べた以外の他の付加的なアミノ酸残基を有していてもよい。このようなアミノ酸残基としては、例えば、ポリペプチドを組換え技術によって作製するために付加される付加配列が挙げられる。具体的には、Ｎ末端のメチオニン残基、タグ配列（例えば、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ等）、各領域間のリンカー配列（例えば、ＧＧＳ、ＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ等が繰り返した配列）等が挙げられる。
【００７６】
特定ポリペプチドは、８０個〜５００個のアミノ酸残基からなることが好ましい。８０アミノ酸残基以上であると、ｂＦＧＦとの結合能、培養容器への接着能、細胞接着活性、及び細胞増殖活性が良好に奏される。本観点から、特定ポリペプチドのアミノ酸残基は、８０個以上が好ましく、８５個以上がより好ましく、９０個以上が更に好ましく、１００個以上が更に好ましい。一方、５００アミノ酸残基以下であると、タンパク質同士の会合又は架橋又は凝集が起こりにくい。本観点から、特定ポリペプチドのアミノ酸残基は、５００個以下が好ましく、４８０個以下がより好ましく、４６０個以下が更に好ましく、４００個以下が更に好ましく、３００個以下が更に好ましく、２５０個以下が更に好ましく、２００個以下が更に好ましく、１８０個以下が更に好ましく、１５０個以下が更に好ましい。これらの上限値又は下限値はいずれを組み合わせてもよく、特定ポリペプチドは、例えば、８０個〜４００個のアミノ酸残基、８０個〜３００個のアミノ酸残基、８０個〜２５０個のアミノ酸残基、８０個〜２００個のアミノ酸残基、８０個〜１５０個のアミノ酸残基、又は１００個〜１５０個のアミノ酸残基からなる。
【００７７】
特定ポリペプチドは、ＧＲＡＶＹ（Ｇｒａｎｄ  Ａｖｅｒａｇｅ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ）値が−２．０〜−０．９５であることが、培養容器への接着能に優れる観点および疎水凝集を防ぐ観点から好ましい。ＧＲＡＶＹ値（Kyte J., Doolittle R. F. (1982), J. Mol. Biol, 157: 105-132）は、その値が大きいほどポリペプチドの疎水度が高いことを意味する。ＧＲＡＶＹ値が−０．９５以下であると、疎水凝集が発生しにくい。本観点から、特定ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、−０．９５以下が好ましく、−０．９７５以下がより好ましく、−１．０以下が更に好ましく、−１．１０以下が更に好ましい。一方、ＧＲＡＶＹ値が−２．０以上であると、細胞増殖活性及び培養容器への接着能が発揮されやすく、ＧＲＡＶＹ値が大きくなるにつれて上記効果がよい傾向がある。本観点から、特定ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、−２．０以上が好ましく、−１．７０以上がより好ましく、−１．６０以上が更に好ましい。特定ポリペプチドのＧＲＡＶＹ値は、例えば、アミノ酸配列中の疎水性アミノ酸（例えば、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）の割合の増減、アミノ酸残基数の増減等により調整しうる。
【００７８】
特定ポリペプチドとしては、ｂＦＧＦとの結合能、培養容器への接着能、細胞接着活性、細胞増殖活性、及び未分化維持性の観点から、第１の領域及びＲＧＤモチーフを含む領域として下記（１）を有し、第２の領域として下記（２）を有し、さらに、下記（３）又は（４）の少なくとも一方を有し、８０個〜５００個のアミノ酸残基からなるポリペプチドが好ましい。
【００７９】
（１）配列番号１における１番目〜５５番目のアミノ酸配列（即ち、配列Ｃ−１：配列番号４で示されるアミノ酸配列）又はこれと同一性を有するアミノ酸配列（即ち、配列Ｃ−２又は配列Ｃ−３）のいずれかからなる領域。
（２）配列番号１における３４２番目〜３７３番目のアミノ酸配列（即ち、配列Ｂ−１：配列番号３で示されるアミノ酸配列）又はこれと同一性を有するアミノ酸配列（即ち、配列Ｂ−２又は配列Ｂ−３）のいずれかからなる領域。
（３）配列番号１における２６９番目〜３４１番目のアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列（即ち、配列Ｄ−１）又はこれらと同一性を有するアミノ酸配列（即ち、配列Ｄ−２又は配列Ｄ−３）のいずれかからなる領域。
（４）配列番号１における３７４番目〜４５９番目のアミノ酸配列若しくはその部分アミノ酸配列（即ち、配列Ｅ−１）又はこれらと同一性を有するアミノ酸配列（即ち、配列Ｅ−２又は配列Ｅ−３）のいずれかからなる領域。
【００８０】
特定ポリペプチドの一実施形態において、上記（１）〜（４）はＮ末端側から（１）（３）（２）（４）の順に並んでいる。
【００８１】
特定ポリペプチドのアミノ酸配列の具体例を表１に挙げる。アミノ酸配列中のＳＭＢドメイン、ＲＧＤモチーフ、及びヘパリン結合ドメインに下線を付す。
【００８２】
【表１】
0006559239.tif 000002
【００８３】
特定ポリペプチドのアミノ酸配列の具体例としては、配列番号５〜１５で示されるアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加されたアミノ酸配列も挙げられる。Ｎ末端のメチオニン残基は、例えば、ポリペプチドを組換え技術によって作製する際に付加される。
【００８４】
特定ポリペプチドは、当業者に公知の遺伝子組換え技術によって製造することができ、例えば、国際公開第２０１３／１６４９７０号に記載の方法に準じて製造することができる。具体的には、天然ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列に基づいて設計されたアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得し、これを発現ベクターに組み込んで組換え発現ベクターを作製し、これを適当な宿主に導入して形質転換体を作製する。得られた形質転換体を適当な培地で培養することにより、組換えビトロネクチンを含む培養物を生産し、培養物から組換えビトロネクチンを回収することにより、特定ポリペプチドとしての組換えビトロネクチンを得る。
【００８５】
［液体培地］
第１の実施形態において使用される液体培地は、ｂＦＧＦを実質的に含まない限り、特に制限されるものではない。液体培地は、培養対象となる多能性幹細胞の種類に応じた成分を含んでいてよい。液体培地としては、公知の哺乳動物細胞用の基本培地（好ましくはヒト細胞用の基本培地、より好ましくはヒト幹細胞用の基本培地）であってｂＦＧＦを含有しない液体培地；公知の哺乳動物細胞用の基本培地（好ましくはヒト細胞用の基本培地、より好ましくはヒト幹細胞用の基本培地）からｂＦＧＦを抜いた液体培地；が好ましい。本開示に適用しうる哺乳動物細胞用の基本培地としては、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、DMEM:F-12（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）、MEMα（Minimum Essential Medium Alpha）、BME（Basal Medium Eagle）、RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、E8 base medium（Nature Protocols 7: 2029-2040, 2012）、SkBM（Skeletal Muscle Cell Basal Medium）、MCDB104、MCDB153、199、L15、mTeSR1、TeSR2等が挙げられる。
【００８６】
液体培地には、一般的に添加される各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；亜セレン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等の無機塩；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；ＴＧＦ−β（transforming growth factor-β）、ＥＧＦ（epidermal growth factor）等の細胞増殖因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；などを通常の濃度で添加してもよい。上記成分は、培養期間全体にわたって濃度を目的の範囲に保つために、多能性幹細胞の培養中に液体培地に補充してもよい。
【００８７】
液体培地は、液体培地にｂＦＧＦが混入することを抑制する観点、及び、抗原性物質や感染源などの異物が多能性幹細胞に混入することを抑制する観点から、血清及び血清代替物を含まないことが好ましい。
【００８８】
液体培地のｐＨは、例えばｐＨ７．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．３〜７．４である。
【００８９】
［培養条件］
第１の実施形態における培養条件は、一般的な条件を適用してよい。例えば、温度３７℃且つ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。多能性幹細胞を継代する場合、一般的な継代方法を適用してよい。
【００９０】
多能性幹細胞の播種密度は、特に制限はなく、一般的な条件を適用してよい。例えば、１×１０３個／ｃｍ２〜１×１０５個／ｃｍ２程度の播種密度としてよい。また、１０μｍ〜１００μｍの細胞塊を１個／ｃｍ２〜５個／ｃｍ２程度の播種密度としてもよい。
【００９１】
第１の実施形態においては、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体が培養容器に接着していることにより、液体培地を交換する際に、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体が培養容器から失われにくい。また、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体中のｂＦＧＦは、特定ポリペプチドに結合していることにより、分解、変性、又は失活が抑制される。したがって、第１の実施形態によれば、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地を交換しながら、同じ培養容器内で継続して多能性幹細胞を培養することができる。
【００９２】
第１の実施形態において、一連の培養に用いる液体培地は、同一組成でなくてもよい。第１の実施形態は、多能性幹細胞を未分化状態に維持することができるかぎり、異なる組成の液体培地に置き換えながら培養を継続してもよい。
【００９３】
第１の実施形態においては、抗原性物質や感染源などの異物が多能性幹細胞に混入することを抑制する観点から、フィーダー細胞を用いないことが好ましい。第１の実施形態においては、培養容器に接着した特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体が、多能性幹細胞が増殖するための足場として機能するので、フィーダー細胞を要しない。
【００９４】
［多能性幹細胞］
第１の実施形態の培養対象となる細胞は、多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己複製能」と三胚葉系列すべてに分化できる「多分化能」とを有する未分化細胞である。多能性幹細胞としては、例えば、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell：ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell：ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell：ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell：ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）等が挙げられる。本開示の培養対象となる多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞が好ましい。ｉＰＳ細胞には、Nature 448:313-317 (2007)、及びCell 126:663-676 (2006)に記載されている細胞、又はこれに類する細胞が包含される。
【００９５】
多能性幹細胞が未分化状態を維持しているか否かは、公知の方法で確認しうる。例えば、未分化マーカーの発現をフローサイトメトリー又は免疫染色により確認する方法、免疫不全マウスの皮下にインジェクションした際のテラトーマ形成の確認、等により確認しうる。
【００９６】
多能性幹細胞は、フィーダー細胞依存性の細胞でもよいが、フィーダー細胞非依存性の細胞が好ましい。フィーダー細胞非依存性の細胞は、例えば、後述する本開示の培養容器を用いて、フィーダー細胞の非存在下で、数次にわたる継代操作を行うことにより選抜しうる。
【００９７】
［培養容器］
第１の実施形態において培養容器は、少なくとも細胞培養が行われる培養表面に、細胞が増殖するための足場として、培養容器に接着した特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える。
【００９８】
第１の実施形態に用いられる培養容器の本体としては、当該技術分野で細胞培養用として公知のあらゆる培養容器が挙げられる。材質は特に制限されず、例えば、樹脂（例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン樹脂）、ガラス、多孔質フィルター、中空繊維、セラミック等が挙げられる。形状も特に制限されず、マルチウェルプレート、ペトリディッシュ、マイクロアレイ用プレート、チューブ、フラスコ、ローラーボトル、バッグ等が挙げられる。培養容器の本体としては、特定ポリペプチド及び特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体の接着性の観点から、培養表面にプラズマ放電等による電荷処理が施されたポリスチレン製の培養容器が好ましい。本明細書において、プラズマ放電による電荷処理を「プラズマ処理」と言う。
【００９９】
第１の実施形態は、予め準備した培養容器を用いて培養工程を行ってよい。第１の実施形態に用いる培養容器は、後述する本開示の培養容器の製造方法により製造することができる。
【０１００】
第１の実施形態は、培養工程の前に、下記の接着工程及び結合工程により培養容器の培養表面を調製することを含んでいてもよい。この実施形態によれば、培養容器の準備と多能性幹細胞の培養とが連続的に順次行われる。この実施形態は、液体培地にｂＦＧＦが混入することを抑制する観点から、さらに下記の除去工程を含むことが好ましい。
【０１０１】
接着工程：ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチド（特定ポリペプチド）を、培養容器に接触させ、第２の領域により培養容器に接着させる工程。
結合工程：特定ポリペプチドに、ｂＦＧＦを含有する溶液を接触させ、第１の領域にｂＦＧＦを結合させる工程。
除去工程：特定ポリペプチドに接触させた、ｂＦＧＦを含有する溶液を、除去する工程。
【０１０２】
接着工程、結合工程、及び除去工程は、＜培養容器の製造方法＞の項において説明する各工程と同義であり、好ましい態様も同様である。
【０１０３】
＜多能性幹細胞の培養方法：第２の実施形態＞
第２の実施形態は、液体培地中で、培養容器に直接又は間接的に接着しているｂＦＧＦ、及び、培養容器に接着している細胞接着活性を有するポリペプチドと、多能性幹細胞とを接触させて、多能性幹細胞を培養する培養工程を含む、多能性幹細胞の培養方法である。
【０１０４】
第２の実施形態において、ｂＦＧＦは培養容器に直接又は間接的に接着しており、一方、細胞接着活性を有するポリペプチドは、ｂＦＧＦと複合体を形成せずに培養容器に接着している。
【０１０５】
第２の実施形態において、ｂＦＧＦは、培養容器に直接接着していることにより、又は、他の素材を介して培養容器に接着していることにより、その分解、変性、又は失活が抑制される。そして、多能性幹細胞は、培養容器に接着している細胞接着活性を有するポリペプチドを増殖のための足場とし、ｂＦＧＦに接触しながら培養されるので、未分化状態を維持しつつ安定的に増殖する。
【０１０６】
したがって、第２の実施形態によれば、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中、又は、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地中でも、多能性幹細胞の培養が可能であり、また、ｂＦＧＦを培養環境に補充する目的で、ｂＦＧＦを含有する液体培地を頻繁に交換すること、及び／又は、培養中に液体培地にｂＦＧＦを添加することを要しない。
【０１０７】
以下に、第２の実施形態の詳細を説明する。
【０１０８】
［ポリペプチド］
第２の実施形態におけるポリペプチドは、培養容器への接着能と、細胞接着活性とを有するものであれば、特に制限されない。第２の実施形態におけるポリペプチドとしては、公知の多能性幹細胞培養用の足場素材であるポリペプチド、例えば、ビトロネクチン、ビトロネクチン由来のポリペプチド、ラミニン、ラミニン由来のポリペプチド等が挙げられる。これらポリペプチドは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【０１０９】
ビトロネクチン由来のポリペプチドの一例としては、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）から、１番目〜４４番目のアミノ酸配列の一部若しくは全部、又は、３７９番目〜４４９番目のアミノ酸配列の一部若しくは全部、の少なくとも一方が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。ビトロネクチン由来のポリペプチドの一例としては、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列から、１番目〜４４番目のアミノ酸配列の一部若しくは全部、及び、３７９番目〜４４９番目のアミノ酸配列の一部若しくは全部、が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドがより好ましく、ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列から、１番目〜４４番目のアミノ酸配列の一部、及び、３７９番目〜４４９番目のアミノ酸配列の一部、が欠失したアミノ酸配列からなるポリペプチドが更に好ましい。
【０１１０】
ビトロネクチン由来のポリペプチドの別の一例としては、下記のポリペプチドが好ましい。
・ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における６２番目〜４７８番目のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
・ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における６２番目〜４７８番目のアミノ酸配列と８０％以上（つまり８０％〜１００％。好ましくは９０％〜１００％）の同一性を有し、培養容器への接着能及び細胞接着活性を有するポリペプチド。
・ヒトビトロネクチンのアミノ酸配列（配列番号１）における６２番目〜４７８番目のアミノ酸配列に対して１個又は数個（好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜５個）のアミノ酸残基が付加、置換又は欠失した、培養容器への接着能及び細胞接着活性を有するポリペプチド。
【０１１１】
ビトロネクチン由来のポリペプチドのさらに別の一例としては、市販の組換え型ビトロネクチンであるＶＴＮ−Ｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）が挙げられ、第２の実施形態に好適に使用することができる。
【０１１２】
ラミニン由来のポリペプチドとしては、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメント、又はヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントを有するポリペプチドが好ましい。ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１のＥ８フラグメントに相当するヒトラミニンα５β１γ１のフラグメントを意味し、ヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントは、マウスラミニン１１１Ｅ８に相当するヒトラミニンα３β３γ２のフラグメントを意味する。ラミニン由来のポリペプチドの具体例としては、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ社製）が挙げられ、第２の実施形態に好適に使用することができる。
【０１１３】
［培養容器に接着しているｂＦＧＦ］
第２の実施形態においては、ｂＦＧＦが培養容器に直接又は間接的に接着している。第２の実施形態は、（Ａ）ｂＦＧＦが、培養容器に接着している負の電荷を持つ素材に静電的に結合したことにより、培養容器に間接的に接着している、又は、（Ｂ）ｂＦＧＦが、負の電荷を持つ培養容器に静電的に結合したことにより、培養容器に直接接着している、のいずれかが好ましい。
【０１１４】
−実施形態（Ａ）−
ｂＦＧＦを培養容器に間接的に接着させる、負の電荷を持ち且つ培養容器への接着能を有する素材としては、例えば、アルカリ処理ゼラチンが挙げられる。なお、素材が正又は負の電荷を持つか否かは、素材が置かれているｐＨ環境に依存する。素材が「負の電荷を持つ」とは、細胞培養下、例えばｐＨ７．４の液体培地中で、負の電荷を持つことを意味する。また、素材が「培養容器に接着する」及び「培養容器への接着能を有する」とは、培養容器の細胞培養表面に対して、化学的な処理によることなく接着すること及び接着し得ることを意味する。
【０１１５】
実施形態（Ａ）に用いる培養容器は、例えば、ｂＦＧＦと、負の電荷を持ち且つ培養容器への接着能を有する素材と、培養容器への接着能及び細胞接着活性を有するポリペプチドとを含有する溶液を培養容器に注ぎ、インキュベートすることにより調製できる。上記の培養容器の本体は、第１の実施形態における培養容器の本体と同様である。
【０１１６】
実施形態（Ａ）は、例えば、上記の方法で調製した培養容器に、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地、又は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地を収容して実施される。
【０１１７】
実施形態（Ａ）は、負の電荷を持つ素材及び細胞接着活性を有するポリペプチドが接着している培養容器と、ｂＦＧＦを含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞の培養を開始することを含む培養方法でもよい。この場合、培養開始時の液体培地に含まれていたｂＦＧＦが上記素材を介して培養容器に接着し、液体培地は、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地、又は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地となる。
【０１１８】
−実施形態（Ｂ）−
細胞培養が行われる培養表面に負の電荷を持つ培養容器としては、例えば、スルホ基で表面修飾されたポリスチレン製培養容器、カルボキシル基で表面修飾されたポリスチレン製培養容器が挙げられる。
【０１１９】
実施形態（Ｂ）に用いる培養容器は、例えば、ｂＦＧＦと、培養容器への接着能及び細胞接着活性を有するポリペプチドとを含有する溶液を、培養表面に負の電荷を持つ培養容器に注ぎ、インキュベートすることにより調製できる。
【０１２０】
実施形態（Ｂ）は、例えば、上記の方法で調製した培養容器に、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地、又は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地を収容して実施される。
【０１２１】
実施形態（Ｂ）は、細胞接着活性を有するポリペプチドが接着している、培養表面に負の電荷を持つ培養容器と、ｂＦＧＦを含む液体培地とを用いて、多能性幹細胞の培養を開始することを含む培養方法でもよい。この場合、培養開始時の液体培地に含まれていたｂＦＧＦが培養容器に接着し、液体培地は、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地、又は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地となる。
【０１２２】
以上に説明したほか、第２の実施形態における［液体培地］、［培養条件］、及び［多能性幹細胞］に関しては、第１の実施形態において記載した事項と同様である。ただし、第２の実施形態においては、液体培地のｂＦＧＦ含有量は特に制限されるものではない。第２の実施形態における液体培地としては、通常よりｂＦＧＦの含有量が少ない液体培地が好ましく、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地が好ましい。
【０１２３】
＜培養容器の製造方法＞
本開示の培養容器の製造方法は、下記の接着工程及び結合工程を含む。下記の接着工程及び結合工程を経ることにより、培養容器には、ｂＦＧＦを結合した細胞接着活性を有するポリペプチドが配置される。即ち、本開示の培養容器の製造方法によれば、細胞が増殖するための足場として特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える培養容器が提供される。
【０１２４】
接着工程：ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチド（特定ポリペプチド）を、培養容器に接触させ、第２の領域により培養容器に接着させる工程。
結合工程：特定ポリペプチドに、ｂＦＧＦを含有する溶液を接触させ、第１の領域にｂＦＧＦを結合させる工程。
【０１２５】
本開示の培養容器の製造方法は、細胞を培養する際に使用する液体培地にｂＦＧＦが混入することを抑制する観点から、さらに、下記の除去工程を含むことが好ましい。
【０１２６】
除去工程：特定ポリペプチドに接触させた、ｂＦＧＦを含有する溶液を、除去する工程。
【０１２７】
接着工程は、例えば、特定ポリペプチドを含有する液（特定ポリペプチド含有液）を培養容器に注ぎ又は培養容器の表面に塗布し、温度２５℃〜４０℃下に３０分間〜２４時間静置することを含む。特定ポリペプチド含有液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水、水等に、特定ポリペプチドを溶解又は分散させて調製すればよい。特定ポリペプチド含有液の特定ポリペプチド濃度は、例えば、１０μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬである。特定ポリペプチドは、第２の領域を介して培養容器に接着し得るので、化学的な処理による培養容器への固定処理を必要としない。
【０１２８】
特定ポリペプチドは、培養容器の表面に、１ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜１０００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲で接着させることが好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ２〜３００ｐｍｏｌ／ｃｍ２の範囲で接着させることがより好ましい。
【０１２９】
結合工程は、例えば、特定ポリペプチドにｂＦＧＦを含有する溶液（ｂＦＧＦ含有溶液）を接触させ、温度２５℃〜４０℃下に３０分間〜２４時間静置することを含む。
【０１３０】
結合工程で用いるｂＦＧＦ含有溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水、注射用水、イオン交換水等に、ｂＦＧＦを溶解又は分散させて調製すればよい。また、ｂＦＧＦを含有する液体培地を、ｂＦＧＦ含有溶液として用いてもよい。ｂＦＧＦ含有溶液のｂＦＧＦ濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬである。
【０１３１】
結合工程におけるｂＦＧＦ含有溶液の使用量は、特定ポリペプチド１００分子当たり、ｂＦＧＦが１分子〜１０分子となる量が好ましい。容積としては、特定ポリペプチド全体が浸る程度以上の量が好ましい。
【０１３２】
接着工程と結合工程は、いずれを先に行ってもよく、共に行ってもよい。例えば、接着工程を先に行い、特定ポリペプチドを培養容器に接着させた後、培養容器にｂＦＧＦ含有溶液を注いで静置し結合工程を行ってもよい。ほかに、例えば、ｂＦＧＦ含有溶液に特定ポリペプチドを溶解又は分散させて混合液を調製し、この混合液を静置して結合工程を行った後、この混合液を培養容器に注いで静置し接着工程を行ってもよい。ほかに、例えば、ｂＦＧＦ含有溶液に特定ポリペプチドを溶解又は分散させて調製した混合液を培養容器に注いで静置し、培養容器の表面において接着工程と結合工程とを共に行ってもよい。
【０１３３】
除去工程は、結合工程に使用したｂＦＧＦ含有溶液を、例えば、ガラス器具を用いて吸引することを含む。ｂＦＧＦ含有溶液を除去した後、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体をリン酸緩衝液等で洗浄してもよい。
【０１３４】
本開示の培養容器の製造方法は、培養容器に接着している特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を乾燥する乾燥工程を含んでいてもよい。乾燥工程を行うことにより、乾燥状態の特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える培養容器が得られる。
【０１３５】
乾燥工程は、除去工程と共に行われる工程であってもよい。即ち、ｂＦＧＦ含有溶液を充分に除去する除去工程が乾燥工程を兼ね、本工程を経ることで乾燥状態の特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える培養容器が得られる。ほかに、乾燥工程は、例えば、低湿度環境下の静置、送風乾燥、凍結乾燥等の乾燥処理を行う工程であってもよい。これらの乾燥処理は、接着工程及び結合工程を行った後に続けて行ってもよく、除去工程を行った後に行ってもよい。
【０１３６】
本開示の培養容器の製造方法は、培養容器に接着している特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体に、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を含浸させる含浸工程を含んでいてもよい。含浸工程を行うことにより、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える培養容器が得られる。含浸工程は、接着工程及び結合工程を行った後に続けて行ってもよく、除去工程を行った後に行ってもよく、乾燥工程を行った後に行ってもよい。
【０１３７】
上記のｂＦＧＦを実質的に含まない液体としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水；哺乳動物細胞用の基本培地であってｂＦＧＦを含有しない液体培地；哺乳動物細胞用の基本培地からｂＦＧＦを抜いた液体培地；等が挙げられる。
【０１３８】
含浸工程は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える培養容器を得るために、必ずしも必要な工程ではない。例えば、結合工程において特定ポリペプチドに接触させたｂＦＧＦ含有溶液中のｂＦＧＦが特定ポリペプチドに結合し、特定ポリペプチドに接触している溶液がｂＦＧＦを実質的に含まなくなった場合、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える培養容器が得られる。
【０１３９】
本開示の培養容器の製造方法によれば、次に説明する培養容器が得られる。
【０１４０】
＜培養容器＞
本開示の培養容器は、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、第１の領域にｂＦＧＦを結合し、第２の領域により培養容器に接着している、細胞接着活性を有するポリペプチドを備える。即ち、本開示の培養容器は、細胞が増殖するための足場として、培養容器に接着した特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を備える。
【０１４１】
本開示の培養容器は、一実施形態として、本開示の培養方法の第１の実施形態に用いられる。つまり、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地を収容して、多能性幹細胞を培養するために用いられる。この場合、本開示の培養容器が備える特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体は、多能性幹細胞が増殖するための足場となる。なお、本開示の培養容器の用途は、多能性幹細胞の培養用途に限られるものではなく、体性幹細胞、生体を構成する体細胞、体細胞の前駆細胞などの培養に用いてもよい。
【０１４２】
本開示の培養容器においては、特定ポリペプチドがｂＦＧＦを結合しており、これによりｂＦＧＦの分解、変性、又は失活が抑制される。そして、多能性幹細胞は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体に接触しながら培養されるので、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体中のｂＦＧＦの作用を受けて、未分化状態を維持しつつ安定的に増殖する。したがって、本開示の培養容器によれば、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地中で多能性幹細胞の培養が可能であり、また、ｂＦＧＦを培養環境に補充する目的で、ｂＦＧＦを含有する液体培地を頻繁に交換すること、及び／又は、培養中に液体培地にｂＦＧＦを添加することを要しない。
【０１４３】
本開示の培養容器においては、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体が培養容器に接着していることにより、液体培地を交換する際に、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体が培養容器から失われにくい。また、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体中のｂＦＧＦは、特定ポリペプチドに結合していることにより、分解、変性、又は失活が抑制される。したがって、本開示の培養容器によれば、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体培地を交換しながら、同じ培養容器内で継続して多能性幹細胞を培養することができる。
【０１４４】
本開示の培養容器において、細胞が増殖するための足場（単に「足場」ともいう。）は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特定ポリペプチド自体（ｂＦＧＦが結合していない状態の特定ポリペプチド）；ラミニン、ゼラチン等の公知の細胞外マトリックス；これらの細胞外マトリックスに付着した細胞増殖因子；などが挙げられる。
【０１４５】
本開示の培養容器の一実施形態は、培養容器に接着している特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体、つまり足場が乾燥状態である。この実施形態の培養容器は、足場が乾燥状態であることにより、足場に含まれるｂＦＧＦの分解、変性、又は失活が抑制される観点から好ましい。
【０１４６】
本開示の培養容器の一実施形態は、培養容器に接着している特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体、つまり足場が、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態である。この実施形態の培養容器は、足場が液体を保持していることにより、特定ポリペプチドとｂＦＧＦとの結合（即ち、タンパク質−タンパク質間の一般的な相互作用による結合）が保たれやすい観点から好ましい。
【０１４７】
上記のｂＦＧＦを実質的に含まない液体としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水；哺乳動物細胞用の基本培地であってｂＦＧＦを含有しない液体培地；哺乳動物細胞用の基本培地からｂＦＧＦを抜いた液体培地；等が挙げられる。
【０１４８】
本開示において、細胞が増殖するための足場及び細胞培養用の足場材料について「乾燥状態」とは、液体成分がまったく存在しない状態に限らず、結合工程を行った後に吸引処理による除去工程で実現できる程度以下に液体成分が失われている状態を意味し、液体吸収性能を有している状態を意味する。本開示において、細胞が増殖するための足場及び細胞培養用の足場材料について「湿潤状態」とは、「乾燥状態」ではない状態を意味し、充分に液体を吸収した状態を意味する。
【０１４９】
＜細胞培養用の足場材料＞
本開示によれば、細胞培養用の足場材料（単に「足場材料」ともいう。）も提供される。本開示の足場材料は、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、第１の領域にｂＦＧＦを結合した、細胞接着活性を有するポリペプチド、を含む。即ち、本開示の足場材料は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を含む足場材料である。
【０１５０】
本開示の足場材料は、細胞が増殖するための足場を培養容器に設けるために使用される。本開示の足場材料によって培養容器に設けられた足場は、多能性幹細胞の未分化状態を維持しつつ、多能性幹細胞を安定的に増殖させる足場として機能する。なお、本開示の足場材料の用途は、多能性幹細胞の培養用途に限られるものではなく、体性幹細胞、生体を構成する体細胞、体細胞の前駆細胞などの培養に用いてもよい。
【０１５１】
本開示の足場材料を用いて多能性幹細胞を培養すれば、ｂＦＧＦを実質的に含有しない液体培地中で、未分化状態を維持しつつ安定的に増殖させることができる。
【０１５２】
本開示の足場材料は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体以外の他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特定ポリペプチド自体（ｂＦＧＦが結合していない状態の特定ポリペプチド）；ラミニン、ゼラチン等の公知の細胞外マトリックス；これらの細胞外マトリックスに付着した細胞増殖因子；などが挙げられる。
【０１５３】
本開示の足場材料の一実施形態は、乾燥状態の足場材料である。この実施形態の足場材料は、乾燥状態であることにより、足場材料に含まれるｂＦＧＦの分解、変性、又は失活が抑制される観点から好ましい。この実施形態の足場材料の使用態様としては、足場材料を液体（例えば、リン酸緩衝液）に溶解又は分散した後、培養容器に注ぐ又は塗布することが挙げられる。これにより、培養容器に接着した特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を含む足場が、培養容器の培養表面に形成される。
【０１５４】
本開示の足場材料の一実施形態は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の足場材料である。この実施形態の足場材料は、液体を保持していることにより、特定ポリペプチドとｂＦＧＦとの結合（即ち、タンパク質−タンパク質間の一般的な相互作用による結合）が保たれやすい観点から好ましい。この実施形態の足場材料の使用態様としては、例えば、足場材料を培養容器の培養表面に薄く載置する又は塗布することが挙げられる。これにより、培養容器に接着した特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を含む足場が、培養容器の培養表面に形成される。
【０１５５】
上記のｂＦＧＦを実質的に含まない液体としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水；哺乳動物細胞用の基本培地であってｂＦＧＦを含有しない液体培地；哺乳動物細胞用の基本培地からｂＦＧＦを抜いた液体培地；等が挙げられる。
【０１５６】
本開示の足場材料は、ｂＦＧＦを結合する第１の領域及び培養容器に接着する第２の領域を有し、且つ細胞接着活性を有するポリペプチド（特定ポリペプチド）に、ｂＦＧＦを含有する溶液（ｂＦＧＦ含有溶液）を接触させ、第１の領域にｂＦＧＦを結合させる結合工程により製造できる。本工程は、例えば、特定ポリペプチドにｂＦＧＦ含有溶液を接触させ、温度２５℃〜４０℃下に３０分間〜２４時間静置することを含む。
【０１５７】
結合工程で用いるｂＦＧＦ含有溶液は、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水、注射用水、イオン交換水等に、ｂＦＧＦを溶解又は分散させて調製すればよい。また、ｂＦＧＦを含有する液体培地を、ｂＦＧＦ含有溶液として用いてもよい。ｂＦＧＦ含有溶液のｂＦＧＦ濃度は、例えば、１ｎｇ／ｍＬ〜１００００ｎｇ／ｍＬであり、好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬであり、より好ましくは１００ｎｇ／ｍＬ〜１０００ｎｇ／ｍＬである。
【０１５８】
結合工程におけるｂＦＧＦ含有溶液の使用量は、特定ポリペプチド１００分子当たり、ｂＦＧＦが１分子〜１０分子となる量が好ましい。容積としては、特定ポリペプチド全体が浸る程度以上の量が好ましい。
【０１５９】
上記の製造方法は、細胞を培養する際に使用する液体培地にｂＦＧＦが混入することを抑制する観点から、さらに、特定ポリペプチドに接触させたｂＦＧＦ含有溶液を除去する除去工程を含むことが好ましい。本工程は、例えば、ｂＦＧＦ含有溶液を、ガラス器具を用いて吸引することを含む。ｂＦＧＦ含有溶液を除去した後、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体をリン酸緩衝液等で洗浄してもよい。
【０１６０】
上記の製造方法は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体を乾燥する乾燥工程を含んでいてもよい。本工程を行うことにより、乾燥状態の足場材料が得られる。
【０１６１】
乾燥工程は、除去工程と共に行われる工程であってもよい。即ち、ｂＦＧＦ含有溶液を充分に除去する除去工程が乾燥工程を兼ね、本工程を経ることで乾燥状態の足場材料が得られる。ほかに、乾燥工程は、例えば、低湿度環境下の静置、送風乾燥、凍結乾燥等の乾燥処理を行う工程であってもよい。これらの乾燥処理は、結合工程を行った後に続けて行ってもよく、除去工程を行った後に行ってもよい。
【０１６２】
上記の製造方法は、特定ポリペプチド／ｂＦＧＦ複合体に、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を含浸させる含浸工程を含んでいてもよい。本工程を行うことにより、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の足場材料が得られる。含浸工程は、結合工程を行った後に続けて行ってもよく、除去工程を行った後に行ってもよく、乾燥工程を行った後に行ってもよい。
【０１６３】
上記のｂＦＧＦを実質的に含まない液体としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、生理食塩水；哺乳動物細胞用の基本培地であってｂＦＧＦを含有しない液体培地；哺乳動物細胞用の基本培地からｂＦＧＦを抜いた液体培地；等が挙げられる。
【０１６４】
含浸工程は、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の足場材料を得るために、必ずしも必要な工程ではない。例えば、結合工程において特定ポリペプチドに接触させたｂＦＧＦ含有溶液中のｂＦＧＦが特定ポリペプチドに結合し、特定ポリペプチドに接触している溶液がｂＦＧＦを実質的に含まなくなった場合、ｂＦＧＦを実質的に含まない液体を保持した湿潤状態の足場材料が得られる。
【実施例】
【０１６５】
以下に、実施例により発明の実施形態を詳細に説明するが、発明の実施形態は、これら実施例により限定されるものではない。【０１６６】
下記において、物質濃度に関し「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。また、培地の物質濃度に関し、特に断りのない限り「％」は「ｖ／ｖ％」である。【０１６７】
下記において、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝液（phosphate buffered saline）を意味し、「ＥＤＴＡ」とは、エチレンジアミン四酢酸（ethylenediaminetetraacetic acid）を意味する。【０１６８】
下記の各実施例において、ｂＦＧＦとしては、組換え型ｂＦＧＦ（和光純薬工業）を使用した。【０１６９】
＜実施例１：特定ポリペプチドの調製＞
ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）を利用した常法にて、配列番号１６に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅した。以下、配列番号１６に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドを、ＲＣＰ−１という。ＲＣＰ−１のアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の１番目〜５５番目、２７０番目〜２７７番目及び２９５番目〜３７３番目に対応し、２７４番目のシステイン残基がセリン残基に置換されており、Ｎ末端には、ポリペプチドを組換え技術によって作製する際に付加されるメチオニン残基が付加している（表２参照。ＳＭＢドメイン、ＲＧＤモチーフ、及びヘパリン結合ドメインに下線を付す。）。つまり、ＲＣＰ−１のアミノ酸配列は、配列番号９に示すアミノ酸配列のＮ末端にメチオニン残基が付加した配列である。ＲＣＰ−１のＧＲＡＶＹ値は、−１．０７２である。【０１７０】
【表２】
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【０１７１】
ＲＣＰ−１の発現ベクターは、予め制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ社）にて切断処理したベクターｐＥＴ−２８ｂ（＋）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、「Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ」は登録商標）を用いて上記ＤＮＡを挿入して構築した。発現ベクターの配列は、シークエンス解析により確認した。【０１７２】
作製したＲＣＰ−１発現ベクターを、大腸菌コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に常法により導入し、カナマイシン含有ＬＢプレートに塗布して、３７℃下１６時間インキュベートした。コロニーダイレクトＰＣＲ法によりベクターの導入を確認した後、１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（和光純薬工業）を添加して、３７℃下５時間振盪培養し、ポリペプチドの発現を誘導した。【０１７３】
菌体を遠心処理にて回収し、菌体を洗浄用バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．６）に再懸濁した。菌体を超音波破砕した後、４℃下、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心し、不溶性画分を回収した。０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を含む洗浄用バッファで洗浄した後、低濃度尿素バッファ（Ｌｏｗ Ｕｒｅａ Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２Ｍ尿素、ｐＨ７．６）に再懸濁し、超音波を印加した。遠心処理にて不溶性画分を回収した後、高濃度尿素バッファ（Ｈｉｇｈ Ｕｒｅａ Ｂｕｆｆｅｒ：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を添加し、超音波を印加して不溶性画分を可溶化した。【０１７４】
上記の方法により得られたＲＣＰ−１を含む溶液を、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ１００（ＧＥヘルスケア社）及びＨｉＴｒａｐ Ｈｅｐａｒｉｎ ＨＰ ５ｍＬ（ＧＥヘルスケア社、「ＨｉＴｒａｐ」は登録商標）を用いて精製した。高濃度尿素バッファを結合用バッファとして、高塩濃度調整バッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．６）を溶出用バッファとして用いて段階的溶出を行い、ＲＣＰ−１を精製した。【０１７５】
精製後のＲＣＰ−１溶液を、ディスポーザブル透析カセットＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（分画分子量３．５Ｋ）（Ｐｉｅｒｃｅ社、「Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ」は登録商標）を用いて透析した。透析外液は、透析用バッファ（ＰＢＳ、１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を基本バッファとし、段階透析にて尿素を除去した。最終透析産物の吸光度（波長２８０ｎｍ）を分光光度計ＮａｎｏＤｒｏｐ（登録商標、Ｔｈｒｅｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて測定し、ＲＣＰ−１濃度を定量した。【０１７６】
以下の実施例には、上記の最終透析産物を使用した。以下の実施例において試料調製に用いるＲＣＰ−１とは、上記の最終透析産物を意味する。【０１７７】
＜実施例２：ＲＣＰ−１とｂＦＧＦとの結合性の評価（１）＞
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）とＲＣＰ−１を、ＲＣＰ−１濃度が表３に示す濃度になるよう混合し、３７℃下で２４時間静置した。２４時間後、混合物全体について、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いてｂＦＧＦを定量した。結果を表３に示す。【０１７８】
ＲＣＰ−１の代わりに、ヘパリン、デキストラン硫酸ナトリウム、又は市販の組換え型ビトロネクチンであるＶＴＮ−Ｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、上記と同様の試験を行った。ヘパリン及びデキストラン硫酸ナトリウムは、ｂＦＧＦと結合してｂＦＧＦを安定化することが知られている。ＶＴＮ−Ｎのアミノ酸配列は、配列番号１に示すアミノ酸配列の４３番目〜４５９番目に対応している。【０１７９】
【表３】
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【０１８０】
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地になにも添加しない場合、２４時間後には約９割のｂＦＧＦがＥＬＩＳＡ法で検出できない形態に変化したが（分解、変性、又は失活したと考えられる。）、ヘパリン又はデキストラン硫酸ナトリウムの添加により、ｂＦＧＦの上記変化がほぼ完全に抑制された。【０１８１】
ＶＴＮ−ＮをＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地に添加した場合、２４時間後のｂＦＧＦ量は、なにも添加しない場合と同程度か、それ以下であった。この結果は、ＶＴＮ−ＮはｂＦＧＦと結合できず、ｂＦＧＦを安定化できないことを示している。【０１８２】
ＲＣＰ−１をＥｓｓｅｎｔｉａｌ８培地に添加した場合、２４時間後のｂＦＧＦ量は初期の約３割〜４割であり、しかもＲＣＰ−１の濃度が高いほど、２４時間後のｂＦＧＦ量が多かった。この結果は、ＲＣＰ−１がｂＦＧＦと結合してｂＦＧＦを安定化することを示している。【０１８３】
＜実施例３：ＲＣＰ−１とｂＦＧＦとの結合性の評価（２）＞
透析用バッファにＲＣＰ−１を添加し、ＲＣＰ−１濃度２５μｇ／ｍＬのＲＣＰ−１溶液を調製した。別途、注射用水にｂＦＧＦを添加し、ｂＦＧＦ濃度１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ水溶液を調製し、さらに、注射用水で２倍に段階希釈したｂＦＧＦ水溶液、１０倍希釈したｂＦＧＦ水溶液、及び１００倍希釈したｂＦＧＦ水溶液を調製した。【０１８４】
ＲＣＰ−１溶液をプラズマ処理済ポリスチレン製Ｆａｌｃｏｎ９６ウェルプレート（コーニング社、「Ｆａｌｃｏｎ」は登録商標）の各ウェルに６４μＬずつ入れ、３７℃下で２時間静置することによって、各ウェルの内面にＲＣＰ−１を接着させた。２時間の静置後の各ウェルから上清を吸引除去し、ｂＦＧＦ水溶液を各ウェルに２００μＬ添加し、３７℃下で２４時間静置した。【０１８５】
２４時間の静置後、各ウェルから上清を吸引除去し、各ウェルにイオン交換水で２０％に希釈したイムノブロック（ブロッキング剤、ＤＳファーマバイオメディカル社）を３００μＬ添加し、２５℃下に３０分間静置した。その後、各ウェルから上清を吸引除去し、ＰＢＳ−Ｔ（０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０配合のＰＢＳ）で３回洗浄後、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて吸光度（波長４５０ｎｍ）を測定した。結果を図１に示す。【０１８６】
ＲＣＰ−１の代わりに、組換え型ビトロネクチンＶＴＮ−Ｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、上記と同様の試験を行った。【０１８７】
図１に示すとおり、各ウェル内のＶＴＮ−ＮにｂＦＧＦ水溶液を接触させた場合は、吸光度の上昇が確認できなかった。一方、各ウェル内のＲＣＰ−１にｂＦＧＦ水溶液を接触させた場合は、ｂＦＧＦ水溶液の濃度依存的に吸光度が上昇した。この結果は、各ウェルの内面に接着したＲＣＰ−１にｂＦＧＦが結合することを示している。【０１８８】
＜実施例４：ｂＦＧＦと結合したＲＣＰ−１がｉＰＳ細胞にもたらす作用の評価（１）＞
多能性幹細胞として、株式会社ｉＰＳポータル（日本国京都府京都市上京区河原町通今出川下る梶井町４４８番地５）から分譲された、ヒトｉＰＳ細胞２０１Ｂ７を用いた。【０１８９】
ヒトｉＰＳ細胞の維持培養は、液体培地としてＴｅＳＲ−Ｅ８（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、「ＴｅＳＲ」は登録商標）を用い、組換え型ビトロネクチンＶＴＮ−Ｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）でコーティングした培養容器を用い、温度３７℃／ＣＯ２濃度５％（ｖ／ｖ、以下同じ）のインキュベーターで行った。液体培地はｉＰＳ細胞の播種翌日を除き、毎日交換した。継代操作は、トリプシン代替物ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で３７℃下５分間処理し、シングルセルに分離して行った。シングルセルに分離する際の液体培地には、終濃度１０μＭのＹ−２７３６２（(R)-(＋)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide・2HCl・H2O、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤、和光純薬工業）を添加した。【０１９０】
維持培養していたヒトｉＰＳ細胞をシングルセルに分離し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（１００ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを含有）又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ７培地（ｂＦＧＦを含有しない以外はＥｓｓｅｎｔｉａｌ８と同組成）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。【０１９１】
透析用バッファにＲＣＰ−１を添加し、ＲＣＰ−１濃度２５μｇ／ｍＬのＲＣＰ−１溶液を調製した。ＲＣＰ−１溶液をプラズマ処理済ポリスチレン製Ｆａｌｃｏｎ６ウェルプレート（コーニング社、「Ｆａｌｃｏｎ」は登録商標）の各ウェルに１ｍＬずつ入れ、３７℃下で２時間静置することによって、各ウェルの内面にＲＣＰ−１を接着させた。【０１９２】
上記の処理により、内面にＲＣＰ−１を備えたウェルを得た。さらに、一部のウェルには、上清を吸引除去した後、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地を２ｍＬ添加して３７℃下で２４時間静置し、各ウェル内面のＲＣＰ−１にｂＦＧＦを結合させた。以下、ＲＣＰ−１を備えたウェルを「ＲＣＰ−１ウェル」といい、さらにｂＦＧＦ処理したウェルを「ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェル」という。【０１９３】
ＲＣＰ−１ウェル及びｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルに、上清を吸引除去した後に、前述の細胞懸濁液を細胞数が５００００個／ウェルとなるように播種した。その後、播種翌日を除き、液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）を毎日交換しながらヒトｉＰＳ細胞を培養した。播種５日後の細胞数を表４に示す。また、播種５日後の細胞の光学顕微鏡像を図２に示す。【０１９４】
ＲＣＰ−１の代わりに、組換え型ビトロネクチンＶＴＮ−Ｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、上記と同様の試験を行った。以下、ＶＴＮ−Ｎを備えたウェルを「ＶＴＮ−Ｎウェル」といい、さらにｂＦＧＦ処理したウェルを「ｂＦＧＦ処理ＶＴＮ−Ｎウェル」という。【０１９５】
【表４】
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【０１９６】
表４に示すとおり、ヒトｉＰＳ細胞は、ＲＣＰ−１ウェルを用いた場合でもＶＴＮ−Ｎウェルを用いた場合でも、ｂＦＧＦ含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地）で培養すると安定的に増殖し、それぞれ細胞数２．４×１０５、２．５×１０５に増殖した。これに対して、ヒトｉＰＳ細胞は、ＲＣＰ−１ウェルを用いた場合でもＶＴＮ−Ｎウェルを用いた場合でも、ｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養すると細胞増殖が抑制され、それぞれ細胞数８．５×１０４（約３５％）、７．２×１０４（約２９％）にとどまった。【０１９７】
ヒトｉＰＳ細胞は、ｂＦＧＦ処理ＶＴＮ−Ｎウェルを用いた場合、ｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養すると細胞増殖がさらに抑制され、細胞数５．７×１０４（約２３％）にとどまった。一方、ヒトｉＰＳ細胞は、ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルを用いた場合、ｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養しても安定的に増殖し、細胞数２．６×１０５（約１０８％）であった。【０１９８】
以上の結果は、培養容器の内面に接着したＲＣＰ−１がｂＦＧＦと結合してｂＦＧＦを安定化していること、ＲＣＰ−１と結合したｂＦＧＦからのシグナルによってｉＰＳ細胞の増殖が促されること、を示している。【０１９９】
図２から分かるとおり、ヒトｉＰＳ細胞は、ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルを用いてｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養された場合、ヒトｉＰＳ細胞に特徴的な形態（核の占有割合が高く且つ細胞の境界が不明瞭）を有しており、未分化状態が維持されていた。【０２００】
＜実施例５：ｂＦＧＦと結合したＲＣＰ−１がｉＰＳ細胞にもたらす作用の評価（２）＞
Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地にｂＦＧＦを添加して、ｂＦＧＦ濃度１０００ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬの液体培地を調製した。【０２０１】
実施例４と同様の方法で、内面にＲＣＰ−１を備えたウェル（ＲＣＰ−１ウェル）を準備し、各ウェルに上記液体培地を２ｍＬ添加して３７℃下で２４時間静置し、各ウェル内面のＲＣＰ−１にｂＦＧＦを結合させた。上清を吸引除去した後、各ウェルに、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地にヒトｉＰＳ細胞を懸濁した細胞懸濁液を細胞数が５００００個／ウェルとなるように播種した。その後、播種翌日を除き、液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）を毎日交換しながらヒトｉＰＳ細胞を培養した。播種５日後の細胞数を表５に示す。【０２０２】
【表５】
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【０２０３】
表５に示すとおり、ヒトｉＰＳ細胞は、ｂＦＧＦが結合したＲＣＰ−１を備えたウェルを用いることにより、液体培地がｂＦＧＦを含有しなくても安定的に増殖した。【０２０４】
＜実施例６：ｂＦＧＦと結合したＲＣＰ−１がｉＰＳ細胞にもたらす作用の評価（３）＞
実施例４で培養したヒトｉＰＳ細胞を剥離回収し、ＲＮＡ精製キットＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ（タカラバイオ社）を用いてｍＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡを逆転写反応用試薬ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（タカラバイオ社、「ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ」は登録商標）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、リアルタイムＰＣＲシステムＴａｑＭａｎ Ａｒｒａｙ Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ Ｐａｎｅｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、「ＴａｑＭａｎ」は登録商標）を用いてサイクル比較法（ΔΔＣＴ法）により９０種類の遺伝子の発現量を相対評価した。結果を図３に示す。【０２０５】
図３に示すとおり、ＲＣＰ−１ウェルを用いてｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養したヒトｉＰＳ細胞は、ＲＣＰ−１ウェルを用いてｂＦＧＦ含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地）で培養したヒトｉＰＳ細胞とは遺伝子発現パターンが異なっており、この結果は、ｂＦＧＦ非存在下でヒトｉＰＳ細胞の分化が進行したことを示している。【０２０６】
これに対して、ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルを用いてｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養したヒトｉＰＳ細胞は、ＲＣＰ−１ウェルを用いてｂＦＧＦ含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地）で培養したヒトｉＰＳ細胞と同等の遺伝子発現パターンを示していた。この結果は、ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルは、ｂＦＧＦ含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地）と同程度に、ヒトｉＰＳ細胞の性質を維持する能力があることを示している。【０２０７】
＜実施例７：培養過程の液体培地に含まれるｂＦＧＦ量の評価＞
実施例４と同様の方法で、ＲＣＰ−１を備えたウェル（ＲＣＰ−１ウェル）と、さらにｂＦＧＦ処理したウェル（ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェル）を準備した。【０２０８】
維持培養していたヒトｉＰＳ細胞をシングルセルに分離し、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地又はＥｓｓｅｎｔｉａｌ７培地に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。【０２０９】
ＲＣＰ−１ウェル及びｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルに、上記の細胞懸濁液を細胞数が５００００個／ウェルとなるように播種した。播種１、２、３日後の培養上清を回収し、Ｈｕｍａｎ ｂＦＧＦ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ社）を用いて各培養上清の吸光度（波長４５０ｎｍ）を測定し、各培養上清中のｂＦＧＦ量を定量した。結果を表６に示す。【０２１０】
【表６】
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【０２１１】
表６に示すとおり、ヒトｉＰＳ細胞を、ｂＦＧＦ処理ＲＣＰ−１ウェルを用いてｂＦＧＦ非含有液体培地（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ７培地）で培養した場合、培養上清にｂＦＧＦが検出されなかった。この結果は、ＲＣＰ−１に結合したｂＦＧＦが、細胞培養中に液体培地に移行しないことを示している。【０２１２】
２０１５年８月１３日に出願された日本国特許出願２０１５−１５９９６７号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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