(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
中空不活性または完全活性パルボウイルス粒子を産生するための方法であって、
（ａ）プロデューサー細胞系ＮＢ−３２４Ｋを提供する工程、
（ｂ）好適な条件下で前記細胞系を増殖させる工程、および、０．５〜２×１０−２ＰＦＵ／細胞のＭＯＩでパルボウイルスを用いて２．０〜５．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で前記細胞を感染させる工程、
（ｃ）前記細胞を感染２〜６日後に採取して遠心分離によって細胞ペレットを得る工程、
（ｄ）細胞溶解物を含有するパルボウイルスを得るために、再懸濁した前記細胞ペレットを機械的、物理的、または、化学的細胞溶解方法に供する工程、
（ｅ）前記細胞溶解物を超音波処理し、それをＤＮＡｓｅ処理に供する工程、
（ｆ）濾過によって前記ＤＮＡｓｅ処理したパルボウイルス採取物を清澄化する工程、および、
（ｇ１）２回の連続密度勾配超遠心分離によって前記パルボウイルスを精製する工程であって、第１勾配はイオジキサノール／ＰＢＳステップ勾配であり、第２勾配はイオジキサノール／リンゲルステップ勾配またはイオジキサノール／リンゲル連続勾配であり、一つの分画内で全活性パルボウイルス粒子および別の分画内で中空パルボウイルス粒子を得るための工程、を含む方法。
【請求項２】
前記工程（ｂ）の前記細胞密度は、３．０〜４．０×１０４細胞／ｃｍ２である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（ｆ）のためにプレフィルターを備える０．２μｍフィルターが使用される請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プロデューサー細胞系ＮＢ−３２４Ｋは、
（ａ）少なくとも９５％の生存率、
（ｂ）２０未満の継代数、および／または、
（ｃ）マイコプラズマコンタミネーションの欠如、によって特徴付けされる請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ウイルス産生は、収集システム内で実施される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記収集システムは、１０層式細胞培養チャンバーである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記パルボウイルスは、Ｈ−１ＰＶである請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
天然パルボウイルスカプシド対非集合カプシドタンパク質または変性カプシドの比率を決定する工程を更に含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記比率は、モノクローナル抗体を使用して決定される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体は、受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ３０３０の下で寄託されたハイブリドーマによって産生される抗体ＢＬ−Ｈ１である請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パルボウイルスを生産するため、好ましくはＨ−１ＰＶを生産するための、再現性があり、かつ、効果的でスケーラブルな方法、並びに、（感染性）パルボウイルス粒子を精製するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
Ｈ−１ＰＶは、パルボウイルス科（Parvoviridae）のパルボウイルス亜科（Parvovirinae）サブファミリー内のプロトバルボウイルス（Protoparvovirus）属に属する（非特許文献１：Cotmore他，2014）。Ｈ−１ＰＶは、直径が２５ｎｍの非エンベロープ正二十面体カプシドからなり、非構造的タンパク質−特に、ＮＳ１（８３ｋＤａ）およびＮＳ２（２５ｋＤａ）−並びに、カプシドタンパク質ＶＰ１（８１ｋＤａ）およびＶＰ２（６５ｋＤａ）をコードする、長さ約５ｋｂの一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。また、別のカプシドタンパク質ＶＰ３（６３ｋＤａ）は、ＶＰ２の翻訳後切断によって産生される（非特許文献２：Faisst他，1995、非特許文献３：Halder他，2012、非特許文献４：HansonおよびRhode，1991、非特許文献５：Toolan他，1960）。プロトパルボウイルスはＳ相依存様式で複製し、許容細胞の感染後に溶菌サイクルを受ける（非特許文献６：Burnett他，2006）。Ｈ−１ＰＶの自然宿主はラットであるが、このウイルスは、多数のヒト腫瘍細胞を含む形質転換細胞内で優先的に複製するので、近年極めて大きな関心を集めてきた。したがって、前記ウイルスは、様々な細胞培養および動物モデルにおいて証明されてきた腫瘍細胞崩壊性および腫瘍抑制性を有する（非特許文献７：Nuesch他，2012、非特許文献８：Rommelaere他，2010）。異種移植片モデルでは、Ｈ−１ＰＶは、頸部腫瘍（非特許文献９：Faisst他，1998、非特許文献１０：Li他，2013）、膵臓腫瘍（非特許文献１１：Angelova他，2009b、非特許文献１２：Grekova他，2011）、乳癌（非特許文献１３：Dupressoir他，1989）、神経膠腫（非特許文献１４：Geletneky他，2010、非特許文献１５：Kiprianova他，2011）、および、リンパ腫（非特許文献１６：Angelova他，2009a）を含む多数のヒト腫瘍を抑制することが証明されてきた。更に、Ｈ−１ＰＶは、癌幹細胞を排除することに成功することが証明されている（特許文献１：欧州特許第2404609（A1）号明細書）。これらの前臨床試験による概念実証に基づいて、再発性多形性膠芽腫を有する患者を対象に、2011年には、Ｈ−１ＰＶの最初の臨床試験（第Ｉ／ＩＩａ相）が開始された（非特許文献１７：Geletneky他，2012）。
【０００３】
Ｈ−１ＰＶの治療可能性を試験および最終的に活用するためには、効率的で、簡単かつ再現性のあるウイルス産生方法、並びに、最終ウイルスバッチの定量的および定性的特性解析のための信頼できるアッセイを開発することが不可欠である。ＮＢ−３２４Ｋ細胞内でのＨ−１ＰＶの小規模生産および塩化セシウム（非特許文献３：Halder他，2012、非特許文献１８：Paradiso，1981）またはイオジキサノール（Wrzesinski他，2003、非特許文献１９：Zolotukhin他，1999）密度勾配遠心分離によるＮＢ−３２４Ｋ細胞の精製についての方法は公表されている。文献は、更に、電子顕微鏡法（非特許文献３：Halder他，2012、）または赤血球凝集アッセイ（非特許文献２０：KongsvikおよびToolan，1972）によるＨ−１ＰＶ物理的粒子および定量的ＰＣＲ（非特許文献２１：Lacroix他，2010）によるゲノム含有粒子のプラークアッセイ（非特許文献２２：TattersallおよびBratton，1983）による感染性ビリオンの滴定についても記載している。しかし、ウイルス収率および純度またはウイルス定量および品質モニタリングのための分析方法の感受性を決定および最適化するための系統的な比較分析は実施されてこなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第2404609（A1）号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Cotmore, S.F., Agbandje-McKenna, M., Chiorini, J.A., Mukha, D.V., Pintel, D.J., Qiu, J., Soderlund-Venermo, M., Tattersall, P., Tijssen, P., Gatherer, D. and Davison, A.J., 2014.  The family Parvoviridae.  Archives of virology 159, 1239-47.
【非特許文献２】Faisst, S., Faisst, S.R., Dupressoir, T., Plaza, S., Pujol, A., Jauniaux, J.C., Rhode, S.L. and Rommelaere, J., 1995.  Isolation of a Fully Infectious Variant of Parvovirus H-1 Supplanting the Standard Strain in Human-Cells.  Journal of Virology 69, 4538-4543.
【非特許文献３】Halder, S., Nam, H.J., Govindasamy, L., Vogel, M. , Dinsart, C, Salome, N., McKenna, R. and Agbandje-McKenna, M., 2012.  Production, purification, crystallization and structure determination of H-1 Parvovirus. Acta crystallographica.  Section F, Structural biology and crystallization communications 68, 1571-6.
【非特許文献４】Hanson, N.D. and Rhode, S.L., 3rd, 1991.  Parvovirus NS1 stimulates P4 expression by interaction with the terminal repeats and through DNA amplification.  J Virol 65, 4325-33.
【非特許文献５】Toolan, H.W., Dalldore, G., Barclay, M., Chandra, S. and Moore, A.E., 1960.  An Unidentified, Filtrable Agent Isolated from Transplanted Human Tumors.  Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 46, 1256-8.
【非特許文献６】Burnett, E ., Cotmore, S.F. and Tattersall, P., 2006. Segregation of a single outboard left-end origin is essential for the viability of parvovirus minute virus of mice. J Virol 80, 10879-83.
【非特許文献７】Nuesch, J.P., Lacroix, J., Marchini, A. and Rommelaere, J., 2012.  Molecular pathways: rodent parvoviruses--mechanisms of oncolysis and prospects for clinical cancer treatment.  Clin Cancer Res 18, 3516-23.
【非特許文献８】Rommelaere, J., Geletneky, K., Angelova, A.L., Daeffler, L., Dinsart, C, Kiprianova, I., Schlehofer, J.R. and Raykov, Z., 2010.  Oncolytic parvoviruses as cancer therapeutics. Cytokine & growth factor reviews 21, 185-95.
【非特許文献９】Faisst, S., Guittard, D., Benner, A., Cesbron, J.Y., Schlehofer, J.R., Rommelaere, J. and Dupressoir, T., 1998. Dose-dependent regression of HeLa cell-derived tumours in SCID mice after parvovirus H-1 infection.  International journal of cancer. Journal international du cancer 75, 584-9.
【非特許文献１０】Li, J., Bonifati, S., Hristov, G., Marttila, T., Valmary-Degano, S., Stanzel, S., Schnolzer, M., Mougin, C, Aprahamian, M., Grekova, S.P., Raykov, Z., Rommelaere, J. and Marchini, A., 2013.  Synergistic combination of valproic acid and oncolytic parvovirus H-1PV as a potential therapy against cervical and pancreatic carcinomas.  EMBO molecular medicine 5, 1537-55.
【非特許文献１１】Angelova, A.L., Aprahamian, M., Grekova, S.P., Hajri, A., Leuchs, B., Giese, N.A., Dinsart, C, Herrmann, A., Balboni, G., Rommelaere, J. and Raykov, Z., 2009b.  Improvement of Gemcitabine-Based Therapy of Pancreatic Carcinoma by Means of Oncolytic Parvovirus H-1PV. Clinical Cancer Research 15, 511-519.
【非特許文献１２】Grekova, S.P., Aprahamian, M., Daeffler, L., Leuchs, B., Angelova, A., Giese, T., Galabov, A., Heller, A., Giese, N.A., Rommelaere, J. and Raykov, Z., 2011.  Interferon gamma improves the vaccination potential of oncolytic parvovirus H-1PV for the treatment of peritoneal carcinomatosis in pancreatic cancer. Cancer biology & therapy 12, 888-95.
【非特許文献１３】Dupressoir, T., Vanacker, J.M., Cornells, J.J., Duponchel, N. and Rommelaere, J., 1989.  Inhibition by parvovirus H-1 of the formation of tumors in nude mice and colonies in vitro by transformed human mammary epithelial cells. Cancer research 49, 3203-8.
【非特許文献１４】Geletneky, K., Kiprianova, I., Ayache, A., Koch, R. , Herrero, Y.C.M., Deleu, L., Sommer, C, Thomas, N., Rommelaere, J. and Schlehofer, J.R., 2010.  Regression of advanced rat and human gliomas by local or systemic treatment with oncolytic parvovirus H-1 in rat models.  Neuro-oncology 12, 804-14.
【非特許文献１５】Kiprianova, I., Thomas, N., Ayache, A., Fischer, M., Leuchs, B., Klein, M., Rommelaere, J. and Schlehofer, J.R., 2011.  Regression of Glioma in Rat Models by Intranasal Application of Parvovirus H-1.  Clinical Cancer Research 17, 5333-5342.
【非特許文献１６】Angelova, A.L., Aprahamian, M., Balboni, G., Delecluse, H.J., Feederle, R., Kiprianova, I., Grekova, S.P., Galabov, A.S., Witzens-Harig, M., Ho, A.D., Rommelaere, J. and Raykov, Z., 2009a.  Oncolytic rat parvovirus H-1PV, a candidate for the treatment of human lymphoma: In vitro and in vivo studies. Molecular therapy; The journal of the American Society of Gene Therapy 17, 1164-72.
【非特許文献１７】Geletneky, K., Huesing, J., Rommelaere, J., Schlehofer, J.R., Leuchs, B., Dahm, M., Krebs, 0., von Knebel Doeberitz, M., Huber, B. and Hajda, J., 2012.  Phase I/IIa study of intratumoral/intracerebral or intravenous/intracerebral administration of Parvovirus H-1 (ParvOryx) in patients with progressive primary or recurrent glioblastoma multiforme: ParvOryxOl protocol. BMC cancer 12, 99.
【非特許文献１８】Paradiso, P.R., 1981.  Infectious process of the parvovirus H-1: correlation of protein content, particle density, and viral infectivity.  J Virol 39, 800-7.
【非特許文献１９】Zolotukhin, S., Byrne, B.J., Mason, E., Zolotukhin, I., Potter, M., Chesnut, K., Summerford, C, Samulski, R.J. and Muzyczka, N., 1999.  Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield.  Gene Ther 6, 973-85.
【非特許文献２０】Kongsvik, J.R. and Toolan, H.W., 1972. Effect of proteolytic enzymes on the hemagglutinating property of the parvoviruses, H-1, H-3, and RV.  Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. Society for Experimental Biology and Medicine 140, 140-4.
【非特許文献２１】Lacroix, J., Leuchs, B., Li, J., Hristov, G., Deubzer, H.E., Kulozik, A.E., Rommelaere, J., Schlehofer, J.R. and Witt, O., 2010.  Parvovirus H1 selectively induces cytotoxic effects on human neuroblastoma cells.  International journal of cancer.  Journal international du cancer 127, 1230-9.
【非特許文献２２】Tattersall, P. and Bratton, J., 1983.  Reciprocal productive and restrictive virus-cell interactions of immunosuppressive and prototype strains of minute virus of mice.  J Virol 46, 944-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の基礎にある技術的課題は、パルボウイルスの産生、精製および特性解析を標準化および最適化することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記技術的課題の解決は、特許請求の範囲において特徴付けた実施形態を提供することにより達成される。
【０００８】
腫瘍細胞崩壊性のプロトパルボウイルスに関する研究は、再発性の切除可能な悪性神経膠腫を有する患者におけるＨ−１ＰＶの最初の第Ｉ／ＩＩａ相試験に伴って、臨床プラクティスに転換する段階に達している（Geletneky他，2012）。この臨床試験は、有効性を評価し、例えば、膵臓癌もしくは神経芽細胞腫などの他の癌に対するアプローチに拡張することを目的とする更なる臨床試験が後に続くと予期されている（Lacroix他，2010、Li他，2013）。これらの開発は、プロトパルボウイルスの産生および特性解析のための堅固な手法の利用可能性に左右される。一方では、概念の実証を提供することができる前臨床試験データを生成するためには、標準化された手法が必要とされる。明確に特性解析されたウイルス調製物および分析方法の使用は、実際に、腫瘍学における腫瘍細胞崩壊性プロトパルボウイルスの治療有効性の妥当な再現性のある証拠を得るための前提条件である。他方では、臨床バッチを生成することおよびそれらの仕様を確立することに責任を追っている認証施設に技術および標準を移すための標準操作手順もまた必要とされる。
【０００９】
本発明を導くに至った実験中に、改善されたウイルスバッチ清澄化および感染性粒子精製を通して望ましくないコンタミネーションの排除を伴う、大規模ウイルス生産のための重要な革新が導入された。本発明者らは、抗癌ウイルス療法のための前臨床試験および臨床試験の両方においてＨ−１ＰＶを活用するための基礎としての標準化された産生、精製および特性解析手法を開発することに焦点を当ててきた。二つの感染ストラテジおよび二つのウイルス精製ストラテジを試験し、結果として生じたウイルス調製物をそれらの純度、並びに、完全粒子、感染性粒子および中空粒子含量について比較した。従来型収集システム（例えば、１０層式ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（ＣＳ）チャンバー、好ましい収率、感染細胞当たりの１×１０３感染単位）内でシミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）（TattersalおよびBratton，1983）を用いて形質転換されたＮＢ−３２４Ｋヒト新生児腎細胞を培養して感染させる工程を含む採用された産生方法は、単純で、スケーラブルであり、かつ再現性がある。コンタミネーションしているＤＮＡおよびタンパク質を排除するための後処理プロセス（downstream processing）には、ＤＮＡｓｅ処理、濾過および二回のイオジキサノール密度勾配遠心分離が含まれ、第１勾配はステップ勾配であり、第２勾配はステップ勾配（例えば、到達力価：１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）若しくは、連続勾配（例えば、到達力価：３×１０１１ＰＦＵ／ｍＬ）のいずれかである。研究目的で中空ビリオンの感染性粒子無含有調製物を得るための、塩化セシウム密度勾配遠心分離の後にＵＶ照射（例えば、到達した力価：１×１０１４個の物理的粒子／ｍＬ）を実施する手法もまた開発された。物理的粒子の迅速な感受性（および、したがって、粒子対感染性率）決定のために、集合（assembled）カプシドを特異的に標的とする新規なモノクローナル抗体に基づいて、「カプシド−ＥＬＩＳＡ」が開発された。
【００１０】
本発明は、この標準化の努力について具体的に説明する。本発明は、前臨床研究を支援するための方法について記載する。Ｈ−１ＰＶストック調製の改善は、三段階、（１）再現性のある標準化された大規模ウイルス生産、（２）代替手法によるウイルスの精製および濃縮、および、（３）品質管理基準の実行で達成された。
【００１１】
（Ａ）再現性のある標準化された大規模Ｈ−１ＰＶ生産
堅固な標準化されたＨ−１ＰＶ産生方法は、以下に例示され、図９に要約したように、五つの個別ウイルスバッチについて確立された。
【００１２】
単一の１０層式ＣＳチャンバーを用いて、前臨床試験および臨床試験での使用と適合する濃度１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬを備える２×１０１１ＰＦＵのウイルス収率が達成された。この収率は、感染細胞当たり約１×１０３個の感染性粒子の生産性に相当する。１０層式システムは、１００×１０ｃｍの細胞培養皿とほぼ同一の付着面積を提供する（Halder他，2012）。効率的な産生は、９５％を超える生存率、２０未満の継代数、マイコプラズマコンタミネーションの欠如（Multiplexion、独国）およびＦＢＳの一貫性の品質とともに、プロデューサー細胞（ＮＢ−３２４Ｋ）の良好な状態に起因して可能であった。
【００１３】
ローラーボトルシステム内でＨ−１ＰＶ産生の規模を拡張することを目指した初期の試みは、間欠的な５％のＣＯ２ガス処理およびＨｅｐｅｓ／ＮａＨＣＯ３緩衝化を適用した場合でさえ、失敗に終わった（データは示していない）。しかし、本発明者らは、ウイルス産生のための最適な細胞内環境をＣＯ２ガス処理によって達成した。
【００１４】
規模拡張を達成するための単純で効率的な方法は、５の１０層式チャンバーから１×１０１２ＰＦＵまでの回収量をもたらすＣＳチャンバーを使用することであった。さらなる規模拡張は４０層式チャンバーを使用することで可能になるであろうが、４０層式チャンバーの振とうおよびガス処理の取扱いはより煩雑である。付着性細胞を用いた更なる規模拡張は、ワクチン産生について記載されたように、キャリア（carrier）の使用を包含するであろう（Rajendran他，2014）。魅力的な代替法は、ミンク腸炎ＰＶワクチン産生について記載されたように（Hundt他，2007）、波炉（wave reactor）内で懸濁細胞培養を使用することであろう。付着性細胞および懸濁細胞での高力価組換えＡＡＶベクター産生に関する関連方法は、国際公開第2015/031686（A1）号パンフレットに記載されている。
【００１５】
（Ｂ）Ｈ−１ＰＶ調製物の効率的な精製および濃縮
未処理ウイルス採取物は、完全粒子、中空粒子および中間密度粒子を含有しており、ウイルスおよび宿主細胞のＤＮＡおよびタンパク質の両方によってコンタミネーションされた。これらを最初にＤＮＡｓｅ処理し、次にフィルター（例えば、０．２μｍフィルター）に通して清澄化した。これは宿主細胞ＤＮＡおよび非パッケージウイルスＤＮＡの３７％および全タンパク質の２４％の排除を生じさせた。宿主細胞ＤＮＡの残留断片は、６２ｂｐより小さいことが証明された。
【００１６】
Ｈ−１ＰＶは、更にイオジキサノールまたはＣｓＣｌ勾配遠心分離により精製した。これらの方法を、得られたＨ−１ＰＶ力価、中空粒子からの完全粒子の分離、および、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の電子顕微鏡法およびクマシーブルー染色によって測定した夾雑タンパク質の存在に関して比較した。近年の報告書（Halder他，2012）では、電子顕微鏡法によって証明されたように、３ラウンドのＣｓＣｌ遠心分離を通して中空粒子対完全粒子の高精製が達成された。それでもＣｓＣｌには毒性があるために、この手法は前臨床試験用および臨床試験用ウイルスバッチの標準精製には推奨されない。このことに刺激され、本発明者らは、連続ＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル密度勾配遠心分離を含む二段階精製手法を開発した。
【００１７】
ＣｓＣｌ勾配分画とＶＩＳ−リンゲル勾配分画との比較は、これらの方法の良い点と悪い点を示している。一方では、ＣｓＣｌ勾配遠心分離は、中空粒子分画内の粒子対ＰＦＵ比はＣｓＣｌ密度勾配遠心分離後の方が前記ＶＩＳ−リンゲルステップ後より１０倍高く、比力価が１０１４ＰＰ／ｍｇ（タンパク質）を超えていたことから、研究目的での中空ビリオンを調製するための精選方法であると思われる。他方、二段階イオジキサノール勾配遠心分離手法は、ＣｓＣｌの毒性（臨床試験適用の場合における短所）を回避するので、そして、コストがより低く、消費時間が短いので（ＣｓＣｌ遠心分離のための３日間に比して半日間）、感染性粒子を精製するためのより優れた方法として浮上した。更に、この手法は、約５×１０１１ＰＦＵ／ｍｇ（タンパク質）の比活性力価を生じさせる。Ｖｉｓ−リンゲル完全粒子分画におけるウイルス濃度は約１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬであり、Ｖｉｓ−リンゲルステップ勾配を連続勾配と取り換えると３×１０１１ＰＦＵ／ｍＬまでに増加した。Ｖｉｓ−リンゲル勾配から収集したウイルス分画は２年間にわたり安定性で、これらの分画を何らかのそれ以上の緩衝剤交換を行わずにウイルスストックとして使用することを可能にした。これらの様々な理由から、イオジキサノール精製手法は、感染性Ｈ−１ＰＶのストックを調製するために日常的に使用されている。本明細書に提示した密度勾配遠心分離に加えて、他のシステム内で妥当性が確認された他のウイルス精製手法は、腫瘍崩壊性ＰＶの調製へのそれらの適用可能性について試験する価値がある。クロマトグラフィーおよびクロマトフォーカシングは、ＡＡＶについて証明されたように（Qu他，2007）、中空粒子および完全粒子がクロマトグラフィーによって分離することができるので、大規模生産のために特に関心が高い（Okada他，2009）。前記プロトパルボウイルスＭＶＭを捕獲するための膜吸収の使用についても、近年記載されてきた（Weaver他，2013）。
【００１８】
（Ｃ）完全粒子バッチおよび中空粒子バッチの高品質性
ハーモナイゼーション国際会議は、“”Specifications：Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological／Biological Products”（Q6B，1999）において、このタイプの産物のためのガイドラインを発行した。これらのガイドラインは、それらの物理化学的特性、生物学的活性、免疫化学的特性、量、純度、不純物およびコンタミネーション物質を含む、製剤が特性解析されなければならないレベルを規定している。原則として、前記原料物質、精製工程および処方が、製剤の一貫性の品質を保証する。Ｈ−１ＰＶバッチは、ＩＣＨガイドラインにしたがって定量および特定される。本発明において取り扱った特定の課題は、中空粒子による完全粒子ウイルスストックのコンタミネーションであった。これは、中空粒子が非毒性ではあるが、細胞生理学に影響を及ぼして、抗ウイルス免疫応答を誘導する可能性があるために、重要である（Gao他，2014）。したがって、ゲノム含有ビリオンおよび全物理的ウイルス粒子の両方を定量するための方法が必要とされる。定量的ＰＣＲは完全ビリオンを定量するための良好な方法であると思われるが、物理的粒子定量のより便宜的方法が必要とされる。本発明においては、集合Ｈ−１ＰＶカプシドを特異的に認識する、前記ｍＡｂ  ＢＬ−Ｈ１を使用する「カプシド−ＥＬＩＳＡ」が開発された。このＥＬＩＳＡは、パルボウイルス粒子を検出するために伝統的に使用されてきた前記赤血球凝集反応検定ほど煩雑ではなく、信頼性がより高く、更に感受性がより高いことが証明された。完全ビリオンバッチから中空粒子を清澄化することは、依然として精製手法を更に改善するための目標である。これとは逆に、感染性ビリオンを全く含まない、および、ウイルス感染性の非存在下でそれらのインビトロおよびインビボ作用について試験できる中空粒子ストックを得ることもまた重要である。これは、感染性ビリオンを不活化するために中空粒子バッチをＵＶ光で照射することにより達成された。前記手法は、含有する感染性ビリオンが１０−１０％未満である中空粒子バッチを生じさせる。
【００１９】
（Ｄ）ＢＬ−Ｈ１モノクローナル抗体の適用範囲
ウイルスストックの定性的および定量的制御における使用に加えて、ｍＡｂ  ＢＬ−Ｈ１は、前臨床試験および臨床試験両方に付随する研究にとって価値が高いことが判明した。それは、処置動物由来の血清中のＨ−１ＰＶ特異的抗体を定量するための標準物質として使用されており（Grekova他，2011）、将来は患者における血清変換を監視するために使用することができよう。ＢＬ−Ｈ１は、ＥＬＩＳＡにおいて感染被験者におけるウイルス血症を検出する捕捉抗体としても、そして、ＰＶ感染についての動物施設由来のラットをスクリーニングするためにも使用することができる（欧州特許第2332986（A1）号明細書）。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ウイルスカプシドタンパク質を標的とする抗体の特性解析を示す図である。  感染性Ｈ−１ＰＶ分子クローンでトランスフェクトされた２９３Ｔ  ＨＥＫ細胞から調製されたタンパク質抽出物がスクロース勾配遠心分離によって分析された。個別分画は、ＧＰ、ＩＵ、ＨＡＵおよびＶＰタンパク質の存在について分析された。ＶＰは、ＢＬ−Ｈ１またはαＶＰ抗体を用いるウェスタンドットブロッティングによってそれぞれ検出された。データは、ＢＬ−Ｈ１  ｍＡｂが集合カプシドを特異的に認識するが、αＶＰはＶＰタンパク質を認識することを示している。
【図２】Ｈ−１ＰＶカプシドＥＬＩＳＡの特性解析を示す図である。  ４５０ｎｍでの吸光度は、添加されたＨ−１ＰＶ粒子の数（ＥＬＭＩによって決定）に対してプロットされた。指示した数値は、標準偏差バーを伴う３回の独立測定の平均値を表す。線形用量反応はデータの回帰分析から引き出された。「ＱＣ−Ｌ」および「ＱＣ−Ｍ」と指示したサンプルは、それぞれ４および８×１０８個の粒子を含有しており、引き続いて、低濃度および中濃度の品質管理標準物質として使用された。
【図３】ＣｓＣｌ勾配遠心分離による完全Ｈ−１ＰＶカプシドからの中空Ｈ−１ＰＶカプシドの分離を示す図である。  カプシドは、赤血球凝集アッセイ（ＨＡＵ）またはカプシド−ＥＬＩＳＡ（ＰＰ）のいずれかによって検出されたが、ウイルス粒子を含有するゲノム（ＧＰ）はＱ−ＰＣＲによって定量された。
【図４】Ｈ−１ＰＶ産生の再現性を示す図である。  １０層式ＣＳ内での産生後、ウイルス採取物が調製および分析された。ＰＦＵ、ＧＰおよびＰＰ力価が決定され、感染時点でＣＳ内の細胞数に比較して表示された。５回の独立産生についての数値を示した。
【図５ａ】（ａ）連続的なＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル、または、（ｂ）ＣｓＣｌのいずれかでの密度勾配遠心分離後における中空粒子からの完全粒子の分離の程度を示す図である。  指示した分画の前記ＰＦＵ、ＧＰ、および、ＰＰ力価を示した（５回の独立実験からの標準偏差を伴う平均値）。
【図５ｂ】（ａ）連続的なＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル、または、（ｂ）ＣｓＣｌのいずれかでの密度勾配遠心分離後における中空粒子からの完全粒子の分離の程度を示す図である。  指示した分画の前記ＰＦＵ、ＧＰ、および、ＰＰ力価を示した（５回の独立実験からの標準偏差を伴う平均値）。
【図６ａ】完全粒子および中空粒子分画内の回収率、比活性および粒子対感染性率を示す図である。  ウイルス採取物が清澄化され、次にＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル密度勾配遠心分離またはＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製された。清澄化採取物、ウイルス含有ＩＯＤ−ＰＢＳ勾配分画、完全粒子および中空粒子ＶＩＳ−リンゲル勾配分画、並びに、完全粒子および中空粒子ＣｓＣｌ勾配分画のサンプルが分析された。（ａ）中間分画および完全粒子分画内の比活性（ＰＦＵ／ｍｇ）、ＰＦＵ回収率（％）およびＰＰ／ＰＦＵ比、（ｂ）中間分画および中空粒子分画内の比カプシド力価（specific capsid titer）（ＰＰ／ｍｇ）、ＰＰ回収率（％）およびＰＰ／ＰＦＵ比。
【図６ｂ】完全粒子および中空粒子分画内の回収率、比活性および粒子対感染性率を示す図である。  ウイルス採取物が清澄化され、次にＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル密度勾配遠心分離またはＣｓＣｌ密度勾配遠心分離によって精製された。清澄化採取物、ウイルス含有ＩＯＤ−ＰＢＳ勾配分画、完全粒子および中空粒子ＶＩＳ−リンゲル勾配分画、並びに、完全粒子および中空粒子ＣｓＣｌ勾配分画のサンプルが分析された。（ａ）中間分画および完全粒子分画内の比活性（ＰＦＵ／ｍｇ）、ＰＦＵ回収率（％）およびＰＰ／ＰＦＵ比、（ｂ）中間分画および中空粒子分画内の比カプシド力価（specific capsid titer）（ＰＰ／ｍｇ）、ＰＰ回収率（％）およびＰＰ／ＰＦＵ比。
【図７】連続ＶＩＳ−リンゲル勾配遠心分離によるＨ−１ＰＶの濃縮を示す図である。  Ｈ−１ＰＶ採取物が清澄化され、次に、最初はＩＯＤ−ＰＢＳステップ勾配および次にＶＩＳ−リンゲル連続勾配で、密度勾配遠心分離によって精製された。ＧＰおよびＩＵ力価は、ＩＯＤ−ＰＢＳステップ勾配後に清澄化ウイルス採取物内で、そして、連続勾配の分画１〜１０内で決定された。前記ＩＵリッチ分画４〜６が更に分析され、３．０×１０１１ＰＦＵ／ｍＬまでの感染性Ｈ−１ＰＶ濃度が証明された。
【図８】連続精製工程からのウイルスバッチのタンパク質組成を示す図である。  パネルａ、ｂ：ウイルスサンプル（１×１０１０ＰＰ）からのタンパク質抽出物がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析され、（ａ）銀染色または（ｂ）αＶＰ抗体を用いた免疫ブロッティングによって解明された。レーン１：ウイルス採取物、レーン２：清澄化ウイルス採取物、レーン３〜７：（３）完全粒子、（４）中間  完全／中空粒子、（５）中空粒子、（６）ＵＶ照射中間  完全／中空粒子、および、（７）ＵＶ照射中空粒子に相当するＣｓＣｌ勾配分画、レーン８：ＩＯＤ−ＰＢＳ勾配からのウイルス粒子、レーン９〜１１：（９）完全粒子、（１０）中間  完全／中空粒子、および、（１１）中空粒子に相当するＶＩＳ−リンゲル勾配分画、Ｍ：サイズマーカー。パネルｃ、ｄ：（ｃ）ＵＶ照射前、および、（ｄ）ＵＶ照射後の中空粒子分画を示す電子顕微鏡写真。
【図９】（Ａ）感染性粒子、および、（Ｂ）中空粒子を調製するための推奨手法を用いたＨ−１ＰＶ産生のフロー図を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
したがって、本発明は、完全活性パルボウイルス粒子、および、中空非活性パルボウイルス粒子を産生するための方法であって、
（ａ）プロデューサー細胞系ＮＢ−３２４Ｋを提供する工程、
（ｂ）好適な条件下で前記細胞系を増殖させる工程、および、０．５〜２×１０−２ＰＦＵ／細胞のＭＯＩを備えるパルボウイルスを用いて２．０〜５．０×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で前記細胞を感染させる工程、
（ｃ）前記細胞を感染２〜６日後に採取して遠心分離によって細胞ペレットを得る工程、
（ｄ）細胞溶解物を含有するパルボウイルスを得るために、再懸濁した前記細胞ペレットを機械的、物理的、または、化学的な細胞溶解に供する工程、
（ｅ）前記細胞溶解物を超音波処理して前記細胞溶解物をＤＮＡｓｅ処理に供する工程、
（ｆ）濾過によって前記ＤＮＡｓｅ処理したパルボウイルス採取物を清澄化する工程、および、
（ｇ１）２回の連続密度勾配超遠心分離によって前記パルボウイルスを精製する工程であって、第１勾配はイオジキサノール／ＰＢＳステップ勾配であり、第２勾配はイオジキサノール／リンゲルステップ勾配またはイオジキサノール／リンゲル連続勾配であり、一つの分画内で全活性パルボウイルス粒子およびまた別の分画内で中空パルボウイルス粒子を得るためものである、工程、または
（ｇ２）中空パルボウイルス粒子を得るために前記パルボウイルスを連続ＣｓＣｌ勾配超遠心分離によって精製する工程、を含む方法に関する。
【００２２】
最適な結果を得るために、前記プロデューサー細胞系ＮＢ−３２４Ｋは、（ａ）少なくとも９５％の生存性、（ｂ）２０未満の継代数、（ｃ）マイコプラズマコンタミネーションの欠如、および（ｄ）ＳＶ４０産生の欠如を特徴とする。
【００２３】
好ましくは、本発明の前記方法は、パルボウイルスＨ−１ＰＶを産生／精製するために使用される。
【００２４】
当業者であれば、プロデューサー細胞系を増殖させるため、および、細胞をパルボウイルスで感染させるための一般的条件を知っている。通常は、細胞は、例えば、５％のＣＯ２雰囲気下で熱不活化ウシ胎児血清（例えば、５％のＦＢＳ）を含む最小必須培地中において３７℃で培養される。好ましくは、前記培地には、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補給すべきである。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、工程（ｂ）の前記細胞の密度は、３．０〜４．０×１０４細胞／ｃｍ２である。
【００２６】
本発明の方法の更に好ましい実施形態では、ウイルス産生は、単回使用細胞培養システム内、好ましくは、１０層式細胞培養チャンバー内、例えばＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（ＣＳ）チャンバー内で実施される。更なる規模拡張は、４０層式ＣＳチャンバー若しくは搬送システムを用いて達成することができる。
【００２７】
好ましくは、採取のために、培養培地が吸引され、感染細胞は好適な緩衝剤および／または酵素、例えば、ＰＢＳ−ＥＤＴＡ若しくはトリプシンを用いて処理される。培地上清および脱離細胞は、細胞ペレットを得るために、好ましくは５，０００ｇで、好ましくは約５分間にわたり遠心分離される。当業者であれば、プロデューサー細胞からパルボウイルスを遊離させるための好適な機械的、化学的または、物理的方法を知っている。好ましくは、これは凍結／融解サイクル、超音波処理および／またはＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｓ１００処理によって実施できる。当業者であれば、前記細胞を超音波処理し、この後にＤＮＡｓｅ処理するための好適な方法についても知っている。例えば、前記細胞は、十分な時間にわたり３０〜７０Ｗで超音波処理することができ、ＤＮＡｓｅ処理は、２０〜８０Ｕ／ｍＬのＤＮＡｓｅを用いて、通常は３７℃で１０〜５０分間実施される。
【００２８】
完全活性パルボウイルス粒子の更なる精製および濃縮のためには、イオジキサノール／ＰＢＳ（ＩＯＤ−ＰＢＳ）およびVisipaque／リンゲル（Ｖｉｓ−リンゲル）密度勾配が実施される。下記では、これらの工程について更に詳細に説明する。
【００２９】
上記の「イオジキサノール」は、「Visipaque」（ヒトへの注射に使用）または「イオジキサノルム（Iodixanolum）」（研究用）に対する同義語である。化学構造は、
【化１】
0006608969.tif 000002
である。
【００３０】
ＩＵＰＡＣ名は、５−［アセチル−［３−［Ｎ−アセチル−３，５−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピルカルバモイル）２，４，６，−トリヨードアニリノ］２−ヒドロキシプロピル］アミノ］−１−Ｎ，３，Ｎ−ビス（２，３−ジヒドロキシプロピル）−２，４，６−トリヨードベンゼン−１，３−ジカルボキサミド（5-[acetyl-[3-[N-acetyl-3,5-bis(2,3-dihydroxypropylcarbamoyl)2,4,6,-triiodoanilino]2-hydroxypropyl]amino]-1-N,3,N-bis(2,3-dihydroxypropyl)-2,4,6-triiodobenzene-1,3-dicarboxamide）である。ＣＡＳ番号は、92339-11-2である。Visipaqueは更に、ＣＴイメージングのための周知の造影剤である。
【００３１】
（ｉ）ＩＯＤ−ＰＢＳ密度勾配およびＶｉｓ−リンゲル密度勾配
したがって、タンパク質を除去するために、Zolotukhinによって記載された（Zolotukhin他，1999）ステップ密度勾配遠心分離を実施した。好ましい実施形態では、Quicksealチューブ（Beckman、独国、例えば２５×８９ｍｍ）に１０〜５０ｍＬ、好ましくは２０ｍＬのウイルス懸濁液を充填した。この懸濁液の下に、緩衝剤、例えば、ＰＢＳ中の、２〜５層、例えば、４層のイオジキサノール（Alexis Shield、ノルウェー）を置いた。好ましいイオジキサノール濃度、１５、２５、４０および６０％。超遠心分離は、超遠心分離機において好適な時間および速度で、好ましくは、２２７，２２０の相対遠心分離力（ＲＣＦ）に相当する５０，０００ｒｐｍの５０．２  Ｔｉローター（Beckman、Ｌ８７０Ｍ、独国）で４℃、２時間で実施した。通常、４０％のイオジキサノール層から３．５ｍＬのウイルス懸濁液が収集された。この後、更にタンパク質を除去して中空粒子から完全粒子を分離するために、緩衝剤、好ましくは、リンゲル液（B．Braun、独国）中に希釈したVisipaque（GE Healthcare、ノルウェー）を使用して第２密度勾配遠心分離を実施した。好ましい実施形態では、Quicksealチューブ（例えば、２５×８９ｍｍ）に緩衝剤、例えば、リンゲル液中に、少なくとも１：２．５で希釈したＩＯＤ−ＰＢＳ密度勾配からのウイルス懸濁液を充填した。この後、１〜１０ｍＬ（例えば、５ｍＬ）の２５％、１〜１０ｍＬ（例えば、４ｍＬ）の４０％、および、１〜１０ｍＬ（例えば、４ｍＬ）の５５％のリンゲル液中のVisipaqueを下に置いた。４０％の層を検出するために、２５％および５５％のVisipaque／リンゲル相がフェノールレッドで着色された参照勾配を作成した。更に、前記４０％相を前記サンプルチューブ上の外側に表示した。超遠心分離は、好適な条件下で、例えば、５０，０００ｒｐｍに設定した５０．２  Ｔｉローター内において４℃で２時間実施した。次に、前記４０％相の２つの分画、好ましくは、１〜５ｍＬ、例えば２．５ｍＬの完全粒子分画（４０％層の下方のバンド）および、好ましくは０．１〜１．５ｍＬの、例えば、８００μＬの中空粒子分画（４０％層の上方のバンド）をシリンジおよび中空針を用いて収集した。屈折計（ＡＲ２００、Reichert Analytical Instruments、独国）を使用して５μＬサンプルの屈折率を測定し、分画を取り出した領域の密度は、イオジキサノールについての参照表（AXIS-SHIELD、ノルウェー）を用いて計算した。
【００３２】
（ｉｉ）連続Ｖｉｓ−リンゲル勾配
連続Ｖｉｓ−リンゲル勾配のために、Quicksealチューブに、約１．３〜１．４、例えば、１．３８１５（３０％のVisipaqueに相当する）の屈折指数までリンゲル液に希釈したウイルス懸濁液を充填した。前記ウイルス懸濁液の下に、０．１〜１ｍＬ、好ましくは０．５ｍＬの６０〜７０％、好ましくは、６５．２％のVisipaqueクッションを置き、前記チューブに、好ましくは、３０％のVisipaque／リンゲル液を完全に充填した。超遠心分離は、好適な条件下で、例えば、６３，０００ｒｐｍでの７０．１  Ｔｉローター内において４℃で１０時間実施した。約５００μＬの分画を制御滴下法（controlled dripping）の下で底部から収集した。
【００３３】
上記のように、本発明によると、中空不活性粒子を得るために、ＣｓＣｌ密度勾配が実施される。ＣｓＣｌ密度勾配は、以前に記載されたように確立された（Paradiso，1981）。好ましい実施形態では、ポリアロマー製遠心チューブ（Beckmann、独国、１４×９５ｍｍ）に１〜１０ｍＬ、好ましくは、５ｍＬのＣｓＣｌを約１．４ｇ／ｃｍ３の密度で充填し、この上に０．１〜２ｍＬ、好ましくは１ｍＬの１Ｍサッカロース、次に５ｍＬのウイルス懸濁液を充填した。超遠心分離は、好適な条件下で、好ましくは３９，０００ｒｐｍに設定したＳＷ４１ローター内で１５℃にて少なくとも２０時間実施した。底部から様々な分画（例えば、分画＃１：５００μＬ、分画＃２：３００μＬ、分画＃３〜２０：２００μＬ）を収集し、カプシド（物理的粒子、ＰＰ）含量を下記に記載する新規なＥＬＩＳＡ（カプシド−ＥＬＩＳＡ）、または、赤血球凝集アッセイによって測定した。赤血球凝集単位を検出するために（KongsvikおよびToolan，1972）、分画は緩衝剤（例えば、ＰＢＳ）中で１：１０〜１：５０、例えば１：２５に希釈し、更に、丸底９６ウエルプレート（Greiner Bio-One、独国）内で連続的（例えば、１：２）に希釈した。次に、ＰＢＳ中の、好適な量、好ましくは、２５μＬの２％のモルモット赤血球懸濁液（Charles River Laboratories、独国）を加えた。前記プレートを、例えば、４℃で１時間インキュベートし、赤血球凝集が完了した時点の力価を最高希釈率として読み取った。屈折指数を測定し、ＣｓＣｌについての参照表にしたがって前記密度を計算した（Griffith，2006）。完全カプシドまたは中空カプシドを含有する分画をプールし、室温でおよそ３０分間にわたり、例えば、１，０００体積のＶＴＥ緩衝剤に対して直接的に透析した。この後に、毒性ＣｓＣｌを除去するために４℃で数回、好ましくは３回の透析サイクルを実施した。
【００３４】
また別の好ましい実施形態では、中空粒子は、前記Ｖｉｓ−リンゲル勾配遠心分離後に得ることもできる。上記したように、前記中空粒子分画は、４０％層内の上方バンドとして位置する。
【００３５】
中空粒子プール内の残留感染性粒子を不活化するためには、前記中空粒子分画は非活性化工程に供せられる。好適な非活性化法は、ＵＶ不活化法（Tuynder他，2004）、化学的、物理的、および／または、熱的方法である。特に、前記ＵＶ不活化法が好ましい。
【００３６】
本発明は、天然パルボウイルスカプシド対非集合カプシドタンパク質、または、変性カプシドの比率を決定するための方法を更に提供する。好ましい実施形態では、前記比率は、モノクローナル抗体を使用して決定される。特に好ましいモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ１（受託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ３０３０下で寄託されたハイブリドーマによって産生される）である。当業者であれば、この抗体を使用するために好適なフォーマット、例えばＥＬＩＳＡを知っている。下記の実施例は、本発明を説明することを意図しているが、本発明を限定することは意図していない。当該の実施例は使用できる方法の典型であるが、当業者に公知の他の方法もまた代わりに利用することができる。
【実施例】
【００３７】
実施例１
材料および方法
（Ａ）プロデューサー細胞系、Ｈ−１ＰＶウイルスストック
シミアン・ウイルス４０（ＳＶ４０）を用いて形質転換させたＮＢ−３２４Ｋヒト新生児腎細胞（TattersallおよびBratton，1983）を５％のＣＯ２雰囲気下で５％の熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Biowest、仏国）を含む最小必須培地（ＭＥＭ、Sigma、独国）中で３７℃にて培養した。前記培地には、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミン（Life Technologies、独国）を補充した。産生するために、６，３６０ｃｍ２の増殖面積を備える１０層式ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）培養チャンバー（Corning、独国）内に１７５ｃｍ２のＹ型フラスコ（Nunc、デンマーク国）で増殖させたＮＢ−３２４Ｋ細胞を播種した。０．４％のトリパンブルー（Invitrogen（商標）、独国）を用いて生細胞を染色することによって、細胞密度および生存率を測定した。細胞数は、Countess（登録商標）セルカウンター（Life Technologies、独国）を用いて計数した。社内精製Ｈ−１ＰＶウイルスストックを使用して、前記細胞を感染させた。
【００３８】
（Ｂ）Ｈ−１ＰＶの産生
便宜的な単回使用産生システムとして、１０層式ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）（ＣＳ）を選択した。細胞播種および感染を同時に実施するために、ＮＢ−３２４Ｋ細胞を１０層式ＣＳ内に３．６×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、直ちにＨ−１ＰＶを用いて細胞当たり０．０１プラーク形成単位（ＰＦＵ）の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染中のｐＨは、７．０±０．１であった。前記感染細胞を５％のＣＯ２雰囲気下の３７℃で４日間にわたり、顕微鏡下で観察される死細胞および脱離細胞のパーセンテージとして測定される前記細胞変性作用（ＣＰＥ）が少なくとも３０％に達するまでインキュベートした。同時ではない播種および感染のためには、ＮＢ−３２４Ｋ細胞を１０層式ＣＳ内に７．９×１０３細胞／ｃｍ２で播種し、それまでにコントロールフラスコ培養で測定されたおよそ３．６×１０４細胞／ｃｍ２の密度に達する時間により、３日間にわたり増殖させた。次に、これらのアンカー細胞を上記したように０．０１ＰＦＵ／細胞のＭＯＩで感染させ、４日間インキュベートした。採取するために、前記培地を吸引し、感染細胞をＰＢＳ／１ｍＭのＥＤＴＡを用いて処理した。前記培地上清および脱離細胞を５分間にわたり５，０００×ｇで遠心した。前記ペレットをＰＢＳで洗浄し、０．０５ＭのＴｒｉｓ  ＨＣ１、３０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有するウイルスＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ緩衝剤（ｐＨ８．７）（ＶＴＥ）中に再懸濁させ、回の凍結／融解サイクルに供した。５，０００×ｇでの５分間の遠心分離後、細胞断片を廃棄した。次に前記細胞溶解液をＳｏｎｏｒｅｘ  Ｓｕｐｅｒ  １０Ｐ超音波ホモジナイザー（Bandelin、独国）内で４８Ｗにて１分間超音波処理し、ＤＮＡｓｅ（５０Ｕ／ｍＬ、Sigma、独国）を用いて３７℃で３０分間処理した。
【００３９】
（Ｃ）Ｈ−１ＰＶの精製
前記ＤＮａｓｅ処理ウイルス採取物は、０．２μｍのSartolab（登録商標）Ｐ２０  Ｐｌｕｓフィルター（Sartorius、独国）に通す濾過によって清澄化した。ウイルスを精製するためには、一つはイオジキサノール−ＰＢＳ（ＩＯＤ−ＰＢＳ）を用いて、および、一つはVisipaque−リンゲル（ＶＩＳ−リンゲル）を用いて−または、塩化セシウム密度勾配の後にＶＴＥ緩衝剤に対する透析を行ういずれか二つの連続ステップ勾配を用いる二種の異なる方法を使用した。
【００４０】
（ｉ）ＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル密度勾配
タンパク質を除去するために、Zolotukhin（Zolotukhin他，1999）によって記載されたステップ密度勾配遠心分離を実施した。このために、２５×８９ｍｍのQuicksealチューブ（Beckmann、独国）に２０ｍＬのウイルス懸濁液を充填した。この懸濁液の下に、ＰＢＳ中の４層のイオジキサノール（Alexis Shield、ノルウェー）（イオジキサノール濃度；１５、２５、４０および６０％）を置いた。超遠心分離は、２２７，２２０の相対遠心分離力（ＲＣＦ）に相当する５０，０００ｒｐｍに設定した５０．２  Ｔｉローター（Beckmann、Ｌ８７０Ｍ、独国）内で４℃にて２時間実施した。通常、前記４０％のイオジキサノール層から３．５ｍＬのウイルス懸濁液が収集された。この後、更にタンパク質を除去して中空粒子から完全粒子を分離するために、リンゲル液（B.Braun、独国）中に希釈したVisipaque（GE Healthcare、ノルウェー）を使用して第２密度勾配遠心分離を実施した。このためには、リンゲル液中に少なくとも１：２．５で希釈したＩＯＤ−ＰＢＳ密度勾配からのウイルス懸濁液を２５×８９ｍｍのQuicksealチューブに充填した。この後、リンゲル液中の５ｍＬの２５％、４ｍＬの４０％および４ｍＬの５５％のVisipaqueを下に置いた。４０％の層を検出するために、２５％および５５％のVisipaque／リンゲル相がフェノールレッドで着色された参照勾配を作成した。更に、前記４０％相を前記サンプルチューブ上の外側に表示した。超遠心分離は、５０，０００ｒｐｍに設定した５０．２  Ｔｉローター内において４℃で２時間実施した。この後に、シリンジおよび中空針を用いて、前記４０％相の二つの分画を収集した。２．５ｍＬの前記完全粒子分画（４０％層の下方のバンド）、および、８００μＬの前記中空粒子分画（４０％層の上方のバンド）。屈折計（ＡＲ２００、Reichert Analytical Instruments、独国）を使用して５μＬサンプルの屈折率を測定し、イオジキサノールについての参照表（AXIS-SHIELD、ノルウェー）を用いて分画を取り出した領域の密度を計算した。
【００４１】
（ｉｉ）連続ＶＩＳ−リンゲル勾配
連続Ｖｉｓ−リンゲル勾配のために、Quicksealチューブに１．３８１５の屈折指数までリンゲル液に希釈した（３０％のVisipaqueに相当する）ウイルス懸濁液を充填した。前記ウイルス懸濁液の下に、０．５ｍＬの６５．２％のVisipaqueクッションを置き、前記チューブに３０％のVisipaque／リンゲル液を完全に充填した。超遠心分離は、６３，０００ｒｐｍに設定した７０．１  Ｔｉローター内において４℃で１０時間実施した。約５００μＬの分画を制御滴下法の下で底部から収集した。
【００４２】
（ｉｉｉ）塩化セシウム密度勾配および赤血球凝集アッセイ
ＣｓＣｌ密度勾配は、以前に記載されたように確立された（Paradiso，1981）。このために、１４×９５ｍｍのポリアロマー製遠心チューブ（Beckmann、独国）に５ｍＬのＣｓＣｌを１．４ｇ／ｃｍ３の密度で充填し、この上に１ｍＬの１Ｍサッカロース、次に５ｍＬのウイルス懸濁液を充填した。超遠心分離は、３９，０００ｒｐｍに設定したＳＷ４１ローター内で１５℃にて少なくとも２０時間実施した。底部から様々な分画（例えば、分画＃１：５００μＬ、分画＃２：３００μＬ、分画＃３〜２０：２００μＬ）を収集し、カプシド（物理的粒子、ＰＰ）含量を本明細書に記載した新規なＥＬＩＳＡ（カプシド−ＥＬＩＳＡ）、または、赤血球凝集アッセイによって測定した。赤血球凝集単位を検出するために（KongsvikおよびToolan，1972）、分画をＰＢＳ中に１：１．２５で希釈し、更に丸底９６ウエルプレート（Greiner Bio-One、独国）内で連続的に１：２に希釈した。次に、ＰＢＳ中の、２５μＬの２％のモルモット赤血球懸濁液（Charles River Laboratories、独国）を加えた。前記プレートを４℃で１時間インキュベートし、赤血球凝集反応が完了した時点の力価を最高希釈率として読み取った。屈折指数を測定し、ＣｓＣｌについての参照表にしたがって密度を計算した（Griffith，2006）。完全または中空カプシドを含有する分画をプールし、室温でおよそ３０分間にわたり１，０００体積のＶＴＥ緩衝剤に対して直接的に透析した。この後に、前記毒性ＣｓＣｌを除去するために４℃で３回の透析サイクルを実施した。
【００４３】
（Ｄ）中空粒子プールのＵＶ不活化
前記中空粒子プール内の残留感染性粒子を不活化するために、５００μＬの中空粒子分画を無菌層流フード下の６ｃｍ培養皿（Greiner Bio-One、独国）の中心に置いた。２５４ｎｍで発光するＵＶランプ（ＮＵ−４型、Herolab、独国）を使用して、放射計（ＶＬＸ−３Ｗ、Benda、独国）を用いて測定した０．５ｍＷ／ｃｍ２でサンプルを照射した。前記サンプルは、ＵＶを使用しない５分間の間隔をあけて、４回、２分間ずつ照射した。
【００４４】
（Ｅ）ウイルスの定量および特性解析
（ｉ）プラーク形成アッセイ
プラークアッセイは、本質的にTattersallおよびBratton，1983に記載されたように実施した。ＮＢ−３２４Ｋ細胞は、５％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＭＥＭ培地中で単層培養により増殖させた。ＮＢ−３２４Ｋ細胞は、Ｈ−１ＰＶの連続希釈液を用いて６０％のコンフルエンスで感染させ、３７℃で１時間インキュベートした。次に接種原（inoculum）をバクトアガーオーバーレイ（５％のＦＢＳを含有するＭＥＭ中で１．７％）と置換した。感染４日後、バクトアガー（Becton Dickinson、独国）を含有する０．０２％のトルイレンレッド染色液（Sigma、独国）の添加により生細胞を１８〜２４時間にわたり染色した。前記培養皿を３７℃の５％のＣＯ２雰囲気下でインキュベートした。感染５日後にライトボックス上でプラーク形成単位を計数し、プラーク形成単位の濃度をＰＦＵ／ｍＬで表示した。
【００４５】
（ｉｉ）感染性Ｈ−１ＰＶについてのＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ
ＮＢ−３２４Ｋ細胞（７．６×１０３細胞／ウエル）は、Ｈ−１ＰＶによって感染させる２４時間前に、９６ウエルプレート内に播種した。前記ＮＢ−３２４Ｋ細胞をＨ−ｌＰＶの１０倍連続希釈液で感染させ、５％のＣＯ２雰囲気下において３７℃で７２時間インキュベートした。−８０°Ｃでの凍結およびアルカリ性融解（１．５ＭのＮａＯＨ）後、それらのＤＮＡをＣＬ−１０００紫外線架橋剤（ＵＶＰ、米国）で架橋させたナイロン膜に移し、ＮＳｌ特異的３２Ｐ放射標識プローブとハイブリダイズさせた後にオートラジオグラフィーにかけた。ウイルス滴定を二回実施し、力価はｍＬ当たりの感染単位（ＩＵ）で表示した（Lacroix他，2010）。
【００４６】
（ｉｉｉ）ゲノム含有ウイルス粒子の決定
ゲノム含有ウイルス粒子（ＧＰ）の数は、本質的には以前に記載されたように（Lacroix他，2010）、Ｑ−ＰＣＲによって決定した。各ウエルには、１×のＰｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商標）（TaKaRa、仏国）、０．３μΜの標識ＮＳｌ−ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、０．３μΜの各プライマーおよび３μＬの鋳型を含有する２０μＬの反応ミックスを充填した。Ｑ−ＰＣＲは、Ａｂｉ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ配列検出システムで実施し、結果は前記ＳＤＳ  ２．１ソフトウエア（Applied Biosystems、独国）を用いて処理した。
【００４７】
（ｉｖ）Ｈ−１ＰＶのカプシド−ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、カプシド（完全または中空、以下では「物理的粒子」またはＰＰと呼ぶ）検出のために開発された。柔軟性の９６ウエルのＵ底プレート（BD Falcon、ニュージーランド）を４℃で一晩、ＰＢＳ中の２ｎｇ／μＬの１００μＬのモノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ１でコーティングした。この抗体の前記開発（Leuchs他，2010）については下記に記載する。前記コーティング液を除去し、２００μＬのブロッキング緩衝剤（ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍＬのカゼイン（Sigma、独国）および０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０（Sigma、独国））を各ウエルに加え、前記混合液を３７℃で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝剤を吸引し、前記ウエルをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０により洗浄し、この後に前記陽性コントロール、前記陰性コントロール、前記サンプルおよびＨ−１ＰＶ標準物質の連続希釈液（それらの全部がＰＢＳ緩衝剤中に含まれる）を１００μＬ／ウエルで二回ずつプレーティングした。前記プレートを３７℃で１時間インキュベートした。前記反応混合物を吸引し、前記ウエルを洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（０．１μｇ／ｍＬ）で標識した１００μＬのｍＡｂ  ＢＬ−Ｈ１を各ウエルに加え、３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを吸引し、前記ウエルをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０で洗浄した。１００μＬの３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（Sigma、独国）を各ウエルに加え、前記プレートを室温の暗所で１５分間インキュベートした。前記反応は、１ウエル当たり１００μＬの１ＭのＨ２ＳＯ４を加えることにより停止させた。サンプル吸光度は、４５０ｎｍでＡｓｃｅｎｔ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎプレートリーダー（Thermov Fisher Scientific、独国）を使用して測定した。
【００４８】
（ｖ）ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイおよびブラッドフォードアッセイ
タンパク質濃度は、５〜２５０μｇ／ｍＬの動作範囲でＰｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット２３２２７（Pierce、米国）を使用して決定した。前記タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）標準物質を用いて決定し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００を用いて測定した。前記ブラッドフォードアッセイは、標準物質としてのＢＳＡ（Sigma、独国）を用いて、９６ウエルプレート内で５０〜２，０００μｇ／ｍＬの動作範囲で実施した。
【００４９】
（ｖｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色およびウェスタンブロッティング
ウイルス調製物の前記純度を評価するために、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し（SERVA Electrophoresis、独国）、次に銀染色（Invitrogen、独国）およびウェスタンブロッティングを実施した。ウイルスカプシドタンパク質（ＶＰ）の検出のためには、ウサギポリクローナル抗ＶＰ（αＶＰ）（C.Dinsart、ＤＫＦＺ、ハイデルベルクによって提供された）およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Amersham（商標）ＥＣＬウェスタンブロッティング分析）を使用した。
【００５０】
（ｖｉｉ）ＤＮＡの測定
ＤＮＡは、Nanodrop分光光度計を用いて２６０ｎｍで前記吸光度を測定することにより定量した。前記ウイルス調製物中のヒトゲノムＤＮＡは、前記製造業者の指示にしたがって、ｈ−ＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）を検出するために前記Quantifiler（登録商標）ヒトＤＮＡ定量キット（Applied Biosystems、独国）を用いるＱ−ＰＣＲによって定量した。前記検出限界は、２６ｎｇ／ｍＬであり、前記アンプリコンのサイズは６２ｂｐであった。陽性コントロールとして、ＮＢ−３２４Ｋ細胞ゲノムＤＮＡを使用した。
【００５１】
（ｖｉｉｉ）エンドトキシンおよび無菌性
エンドトキシンによるコンタミネーションは、Endosafe（登録商標）Ｇｅｌ−Ｃｌｏｔカブトガニアメーバ様細胞（Limulus Amebocyte）溶解物アッセイ（Charles River Laboratories、独国）を用いて試験した。前記アッセイの前記感受性は、１ｍＬ当たり０．２５エンドトキシン単位（ＥＵ）であった。各Ｈ−１ＰＶ調製物は、３７℃で５日間にわたり２．５μＬの大豆／ペプトン寒天上の前記調製物をインキュベートすることによって細菌性もしくは真菌性コンタミネーションの非存在についてチェックした。
【００５２】
（ｉｘ）電子顕微鏡法
ウイルス調製物の定性的分析のために、電子顕微鏡画像を撮影した。このために、５μＬのウイルス懸濁液を使用準備の整ったカーボンコーティングを施した銅グリッドに加え、２分間インキュベートした。次に前記グリッドを５μＬの二回蒸留水で洗浄し、２％の酢酸ウラニル液で３０秒間コーティングした。前記液滴は、Ｗｈａｔｍａｎ  ５０濾紙を使用して前記グリッドから吸着させ、前記グリッドをおよそ１分間乾燥させた。顕微鏡写真は、Ｚｅｉｓｓ透過型電子顕微鏡を２０，１００倍の倍率で使用して撮影した。
【００５３】
（Ｆ）前記モノクローナル抗体ＢＬ−Ｈ−１の開発および特性解析
Ｈ−１ＰＶカプシド（ＰＰ）に対するモノクローナル抗体を産生するために、Ｂａｌｂ／ｃマウス（Charles River、独国）を三カ月間にわたり三回、各時点に１．２×１０８ＰＦＵを用いる腹腔内注射で免疫した。Ｈ−１ＰＶの最終注射の一週間後、マウスの脾臓を切除し、脾臓細胞をＸ６３／Ａｇ８リンパ腫細胞（Kuck他，2007、Wobus他，2000）と融合させた。前記ハイブリドーマ細胞を増殖させ、単一クローン由来の前記上清をＨ−１ＰＶに対してウェスタンドットブロッティングによってスクリーニングした。単一コロニー分析により陽性ウエルを選択し、三ラウンドの選択後、前記選択したハイブリドーマ細胞を使用してＣＥＬＬｉｎｅ  １０００バイオリアクター（Integra Biosciences AG、スイス国）内でＢＬ−Ｈ１抗体を産生した。１０％のＦＢＳ、１００μｇ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．２）を補給したＲＰＭＩ  １６４０培地を使用して、前記ハイブリドーマ細胞を培養した。前記ＢＬ−Ｈ１抗体のサブクラスは、前記Amershamマウスモノクローナル抗体イソタイプ分類キット（Braunschweig、独国）を用いて決定した。精製は、前記ＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＡ  ＨＰ親和性カラムキット（GE Healthcare、スウェーデン国）およびＡｅｋｔａプライムシステム（GE Healthcare、独国）を使用して実施した。前記ＩｇＧ２ａ濃度は、前記マウスＩｇＧ２ａ  ＥＬＩＳＡセット（BD Biosciences、独国）を使用して決定した。
【００５４】
（ｉ）ウェスタンドットブロッティングによるＨ−１ＰＶの分析
精製Ｈ−１ＰＶ（１×１０８ＰＦＵ／ドット）またはスクロース密度勾配分画（１００μＬのＰＢＳ中に１：１０で希釈）は、真空ブロッターを用いてニトロセルロース膜（AppliChem、独国）に移した。洗浄工程は、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ（登録商標）  ２０を用いて実施した。前記膜は、５％の脱脂粉乳を含有するＰＢＳを用いて１時間ブロッキングした。ハイブリドーマスクリーニングのために、４０μＬの未希釈ハイブリドーマ上清を少なくとも３時間インキュベートした。スクロース勾配分析のために、精製ｍＡｂ  ＢＬ−Ｈ１（１：１，０００）またはαＶＰ抗体（１：５００に希釈した）のいずれかを使用した。次に前記膜を室温で３０分間洗浄し、ＰＢＳ中の二次ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体（GE Healthcare、独国）またはヤギ抗ウサギ抗体（GE Healthcare、独国）と一緒にインキュベートした。検出は、ＥＣＬ  ＰｌｕｓおよびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ  ＥＣＬ（Amersham Biosciences GmbＨ、独国）を用いて実施した。
【００５５】
（ｉｉ）集合および非集合ウイルスカプシドタンパク質のスクロース密度勾配分画
抽出物は、感染性Ｈ−１ＰＶ分子クローン（Kestler他，1999）を用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ−１１２６８、American Tissue Culture Collection）から調製し、トランスフェクション７２時間後に採取した。１ｍＬの抽出物を１０〜５０％の線形スクロース勾配に移した。遠心分離は、２８，０００ｒｐｍに設定したＴＳＴ  ４１．１４（Kontron）ローター内で４℃にて３．３時間実施した。分画（４００μＬ）を収集し、ウェスタンブロッティングおよび赤血球凝集アッセイによって分析した。前記分画を更に感染性およびゲノム含有粒子についてもアッセイした。
【００５６】
実施例２
Ｈ−１ＰＶの特性解析
本発明の目的の一つは、前記Ｈ−１ＰＶの製造手法を標準化することであった。これは、標準操作手順を確立するために、上流、および、下流プロセス工程を特徴付けること、再現性を保証すること、並びに、前記最終産物の前記同一性、純度、および、安全性を完全に特徴付けることを包含していた。
【００５７】
細胞の調製および感染の二種の代替法をコアの産生プロセスから上流で試験した。コアの産生から下流の二種の異なる精製工程についても比較した。表１は、産生手法における中間工程および下記に記載する前記最終産物を特徴付けるために使用した前記アッセイを要約したものである。物理的粒子をより便宜的に定量するためには、以下に記載する新規なアッセイを確立することが不可欠であった。
【００５８】
【表１】
0006608969.tif 000003
【００５９】
本試験の二つの目標は、中空粒子から完全粒子を分離すること、および、最終産物の粒子対感染性率を決定することであった。パルボウイルス治療の治療有効性および予想免疫反応の両方に影響を及ぼすはずのこの比率を決定するためには、物理的粒子の総数を決定することが必要である（Rajendran他）。ＰＰを定量するための便宜的方法を開発するために、本発明者らは、天然カプシドを認識するが非集合カプシドタンパク質または変性カプシドを認識することができない、Ｈ−１ＰＶに対するモノクローナル抗体を産生した。ＢＬ−Ｈ１と呼ばれるこの抗体は、ＩｇＧ２ａ型の抗体である。この抗体の特異性は、感染性Ｈ−１ＰＶ分子クローンを用いてトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の抽出物のスクロース密度遠心分離後に得られた分画を対象に実施した様々な分析の結果を示している図１に例示した。ウェスタンドットブロット上では、αＶＰ抗血清（主として非集合カプシドタンパク質を認識する）、および、ｍＡｂ  ＢＬ−Ｈ１の両方を備えるシグナルを生じさせる最適な分画は分画９〜１８であった。これらの分画は、赤血球凝集反応を測定することによって証明された集合カプシド、ＧＰおよびＩＵを含有することが見いだされた。ＢＬ−Ｈ１は非集合または部分集合カプシドタンパク質を含有する分画３〜８とは反応しなかった。分画９〜１９は、中空粒子およびゲノム含有粒子の両方を含んでおり、感染性粒子は分画１２〜１９内で濃縮されていた。興味深いことに、前記赤血球凝集反応シグナルおよびＢＬ−Ｈ１シグナルは前記勾配の同一領域に限定されたが、後者のピークはより高い密度に向かってシフトした。更に、ＢＬ−Ｈ１は変性カプシドタンパク質とは反応しないことが見いだされ、密接に関連するマウスのプロトパルボウイルス微小ウイルスのカプシドとは交差反応を示さなかった（データは示していない）。
【００６０】
実施例３
Ｈ−１ＰＶカプシドを定量するためのＥＬＩＳＡ
Ｈ−１ＰＶ産生を通して物理的粒子を定量するために、本発明者らは、ｍＡｂ  ＢＬ−Ｈ１を使用する「カプシド−ＥＬＩＳＡ」を開発した。前記ＥＬＩＳＡを標準化するために、Ｈ−１ＰＶを公知の力価を備えるアデノウイルス５型（Ａｄ５、American Type Culture Collection）のストックの適切な希釈液と混合し、前記混合物を電子顕微鏡法によって可視化した。無作為に選択した８枚の画像上で、Ｈ−１ＰＶ粒子およびＡｄ５粒子を計数し、公知のＡｄ５力価と関連付けてＨ−１ＰＶ粒子の数を決定した。ＥＬＩＳＡは、ＰＰの数（２．５×１０９〜３．９×１０７ＰＰの範囲内）と４５０ｎｍでの吸光度との再現性のある線形関係を示した（図２）。試験した希釈液中の二つであるＱＣ−Ｌ（低ビリオンロード）およびＱＣ−Ｍ（中ビリオンロード）をこの後のアッセイにおける品質コントロールとして使用した。完全Ｈ−１ＰＶカプシドから中空粒子を分離するためにＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を使用した場合、このＥＬＩＳＡは、両方の定量を許容した。これは、（本発明者らのカプシド−ＥＬＩＳＡおよび赤血球凝集アッセイによって決定した）カプシドの分布、および、遠心分離後のゲノム含有粒子の分布を示している図３に例示されている。物理的粒子を検出するための前記二種の方法は、スーパーインポーズ可能なプロファイルを生じさせ、中空カプシドについての一つの主要ピーク、および、完全カプシドについての二つの小さなピークを生じさせた。ＤＮＡ含有カプシドのＰＣＲ検出も同様に二つの密度群（４〜６分画および７〜１０分画）を明らかにした。中間密度粒子は干渉性欠陥粒子からなる可能性があるが（FaustおよびWard，1979）、中間密度粒子の性質はこれ以上分析されなかった。それでも、本発明者らの結果は、前記開発したＥＬＩＳＡが物理的粒子の日常的検出のために好適であることを明白に示している。
【００６１】
実施例４
Ｈ−１ＰＶの大規模生産
（Ａ）細胞の播種および感染の最適化
本発明者らは、最初に感染時の細胞密度、ＭＯＩ、および、採取時を最適化した。前記ウイルス最高収率は、およそ３０％のＣＰＥとともに、３．６×１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度、１×１０−２ＰＦＵ／細胞のＭＯＩおよび感染４日後の採取で得られた（データは示していない）。これらの条件は、引き続いて全産生実験において使用したが、唯一の相違は、一部の細胞を１７５ｃｍ２のＹ型フラスコ内で増殖させ、採取し、ＣＳに移して直ちに感染させたが、他の細胞は感染前３日間にわたり前記ＣＳ内で増殖するに任せたことであった。
【００６２】
表２ａは、感染させて同時に播種した細胞および感染前に前記ＣＳ内で３日間にわたり増殖させられた細胞が、感染細胞当たりのウイルス産生または感染細胞当たりの上清内へのウイルス放出のいずれに関しても有意に相違しなかったことを示している。どちらの場合も、感染細胞当たりおよそ１×１０３ＰＦＵが産生されたが、これは１０層式ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）当たり２×１０１１ＰＦＵの平均収率に一致する。得られた前記ウイルス採取物中のタンパク質濃度は、前記二種の手法についてほぼ類似しており（２×１０３ｇ／ｍＬ）、これは前記二種の培養が採取時に同一密度に達したことを示している。播種３日後の感染が同時の播種および感染と比較して作用時間および材料を節約したので、前者のアプローチを採用した。培養培地上清は、相当に低い濃度（およそ１０７ＰＦＵ／ｍＬ）で、全ＰＦＵの１０％しか含有していなかった。上清を濃縮する工程は面倒で、時間を消費し、非効率であるので、ルーチン産生では、この分画を廃棄した。
【００６３】
【表２ａ】
0006608969.tif 000004
【００６４】
（Ｂ）標準化上流プロセスおよびＨ−１ＰＶ収率の再現性
図４に示したように、前記Ｈ−１ＰＶビリオンの収率は、５回の独立産生にわたり高度に再現性であった。粒子対感染性比（ＰＰ／ＰＦＵ）およびゲノム含有粒子の比率（ＰＰ／ＧＰ）もまたこれらの産生間で類似であった。ＰＦＵ対ＧＰ対ＰＰの比率は、１：７×１０２：５×１０３であった。したがって、平均して、指標細胞は、産生性感染を受けるためには７×１０２ゲノム含有ビリオンで感染させなければならないと思われた。全ビリオンの約１４％は、カプシド封入ゲノムを含有していた。
【００６５】
実施例５
Ｈ−１ＰＶの精製
（Ａ）Ｈ−１ＰＶ採取物のＤＮａｓｅ消化および清澄化
未処理ウイルス採取物は、非カプシド封入ウイルスおよび宿主細胞ＤＮＡを消化するためにＤＮａｓｅを用いて処理し、次にSartolab（登録商標）Ｐ２０  Ｐｌｕｓフィルターに通す濾過によって清澄化した。個々の５バッチについて得られた結果は、これらの工程の有意性を証明した。前記ヒトＤＮＡ定量キットを用いて測定したように、前記宿主細胞ＤＮＡの９９．８％は、ＤＮａｓｅ処理によって除去した。それでもＡ２６０ｎｍ測定によって決定されたように、前記全ＤＮＡの３７％しか除去されなかった。前記残留ＤＮＡは、ＤＮＡ検出のために使用されるｈ−ＴＥＲＴアンプリコン（６２ｂｐ）より小さい保護されたウイルスゲノムおよび／または細胞ＤＮＡ断片であろう。図８ａに例示したように、濾過工程は、宿主細胞およびＦＢＳ由来タンパク質の２４％を排除した。清澄化後には前記感染性ビリオンの８０％超および物理的粒子の１００％が回収された（表２ｂ）。結論として、この第１精製工程は高速で、有意な量の外来ＤＮＡおよびタンパク質を排除する。
【００６６】
【表２ｂ】
0006608969.tif 000005
【００６７】
（Ｂ）中空粒子からの完全粒子の分離
中空Ｈ−１ＰＶ粒子から完全Ｈ−１ＰＶ粒子を分離するために、二種の勾配遠心分離手法を比較した。二つの１０層式ＣＳ培養からの五つの個別Ｈ−１ＰＶ採取物を用いて類似の結果が得られた。清澄化後、各採取物を二つの同等部分に分割し、一方は、二つの連続ステップ勾配、ＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲルによって精製したが、ヒトへ注射するためには後者のリンゲルおよびVisipaque調製物の方が良好に適していた。材料および方法の項で記載したように、二つの分画を収集したが、完全粒子分画（前記４０％相の下方バンド）は１．２５／ｍＬの近似密度を備え、中空粒子分画（前記４０％相の上方バンド）は１．２３ｇ／ｍＬの近似密度を備えていた。図５ａに示したように、完全粒子分画内の感染性粒子の平均力価は１．３×１０１０ＰＦＵ／ｍＬであったが、他方、ＧＰおよびＰＰ濃度は、それぞれ９．２×１０１２ＧＰ／ｍＬおよび１．７×１０１３ＰＰ／ｍＬであった。中空粒子分画における力価は、６．３×１０９ＰＦＵ／ｍＬ、４．６×１０１２ＧＰ／ｍＬおよび３．９×１０１３ＰＰ／ｍＬであった。
【００６８】
【表２ｃ】
0006608969.tif 000006
【００６９】
中空粒子を得るための代替法として、前記ウイルス採取物の残り半分を連続ＣｓＣｌ密度勾配により分画化し、この後にＶＴＥに対する透析を実施した。図５ｂに示したように、中空粒子分画はわずかに高い粒子濃度（１．１×１０１４ＰＰ／ｍＬ）を示し、依然として残留感染性ウイルスを含有していた（１．８×１０９ＰＦＵ／ｍＬ、１．２×１０１２ＧＰ／ｍＬ）。完全粒子分画内の感染性粒子は、前記ＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル勾配遠心分離後に得られたＰＦＵ力価に匹敵するＰＦＵ力価を有していたが（１．０×１０１０ＰＦＵ／ｍＬ）、中空粒子によるコンタミネーションはわずかに減少していた（１．４×１０１３ＰＰ／ｍＬ）。どちらの方法も優れた再現性を示した。
【００７０】
（Ｃ）感染性Ｈ−１ＰＶ粒子の回収および濃縮
図６ａに示したように、ＩＯＤ−ＰＢＳ密度勾配遠心分離は、感染性粒子の有意な消失（４６％）をもたらした。続くＶＩＳ−リンゲル勾配工程での消失は、極めてわずかであった。結合イオジキサノール勾配遠心分離が感染性ウイルス分画から全タンパク質の９０％超の排除をもたらしたことは注目に値する。ＩＯＤ−ＰＢＳ工程は、比活性における１５．４倍の増加をもたらし、ＶＩＳ−リンゲル工程は、更に５．９倍の増加をもたらした。したがって、この精製プロセスを通して、３×１０１１ＰＦＵ／ｍｇ（タンパク質）への比活性における全体で９１倍の増加が達成された。他方、ＣｓＣｌ密度勾配精製は感染性粒子の消失はわずかに高いだけであったが（５７％）、より効率的なタンパク質排除をもたらし、比活性の２２７倍の増加を生じさせた。結果として生じた粒子対感染性比（ＰＰ／ＰＦＵ）は、両方の精製後に１０３：１に近かった。
【００７１】
（Ｄ）中空粒子の回収
図６ｂに示したように、中空粒子分画内の物理的粒子の回収率は、ＩＯＤ−ＰＢＳおよびＶＩＳ−リンゲル密度勾配遠心分離後（７％）よりもＣｓＣｌ密度勾配精製後の方が高かった（清澄化ウイルス採取物からの全ＰＰの７８％）。更に、ＶＩＳ−リンゲル中空粒子分画は、ＣｓＣｌ中空粒子分画（ＧＰ対ＰＰ比：１：１０２；ＰＦＵ対ＰＰ比：１：１０５）に比較して相当に高い比率のＧＰ（ＧＰ対ＰＰ比：１：１０）およびＰＦＵ（ＰＦＵ対ＰＰ比：１：１０４）を含有していた。これにより、本発明者らは、中空カプシドを精製するためにはＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を推奨する。ＣｓＣｌ中空粒子分画のカプシド濃度は、約１．４×１０１４ＰＰ／ｍｇ（タンパク質）であった。
【００７２】
（Ｅ）連続ＶＩＳ−リンゲル勾配遠心分離によるＨ−１ＰＶの濃縮
上記のＩＯＤ−ＰＢＳ／ＶＩＳ−リンゲルおよびＣｓＣｌ精製法によって得たウイルスバッチ内の感染性粒子の力価は、約１×１０１０ＰＦＵ／ｍＬであった。一部の用途についてはより高い力価が必要とされるので、本発明者らは、前記ＶＩＳ−リンゲル工程勾配を連続勾配と置換することを試みた。これにより本発明者らは、３×１０１１ＰＦＵ／ｍＬの力価を達成することができた（図７）。
【００７３】
実施例６
不活化中空粒子
ＣｓＣｌ分画化後に得られた中空粒子分画内では、依然として感染性ウイルスを検出することができた（ＰＦＵ対ＰＰ比：１：１０５）。非感染性コントロールとして中空粒子の使用を許容するためには、カプシド構造を変化させることなくウイルス感染性を排除する不活化法を開発することが不可欠であった。これは、ＵＶ照射によって達成された（表３）。ＵＶ照射はＰＰ力価を変化させなかったが、測定したＧＰ力価を９０％減少させた。これはおそらく、Ｑ−ＰＣＲによるそれらの滴定を用いてウイルスゲノム内で誘導されたＤＮＡ損傷の干渉に起因すると思われる。重要なことに、ＵＶ照射はウイルス感染性を７対数超減少させ、残留感染性は７×１０１１ＰＰ当たり１ＰＦＵと低かった。これは、Ｈ−１ＰＶの腫瘍崩壊作用の前臨床試験における非感染性コントロールとしてＵＶ照射した中空粒子の精製調製物を使用することを可能にした（Kiprianova他，2011）。
【００７４】
【表３】
0006608969.tif 000007
【００７５】
実施例７
前記Ｈ−１ＰＶ調製物の純度
前記Ｈ−１ＰＶ調製物をタンパク質およびＤＮＡコンタミネーション、エンドトキシンの存在、並びに、無菌性について分析した。精製プロセスにおける様々な工程および勾配分画からのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、銀染色により明らかにした。図８ａに例示したように、予想ウイルスポリペプチドであるＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３が検出された。密度勾配分画化後に残留している不純物の量は、低値から検出不能までであった。二種の精製法は同様に効果的であった。ＣｓＣｌ精製中空粒子には、中空カプシドがＶＰ２からＶＰ３切断を受けることができない（Paradiso他，1984、Tattersall他，1976）という事実に一致して、ＶＰ３が欠如したことは注目に値する。ＵＶ照射後には、有意なカプシドタンパク質分解は観察されなかった。ウェスタンブロット分析は、ＶＰポリペプチドバンドの同一性を確証した（図８ｂ）。電子顕微鏡法によって、非ＵＶ照射カプシドとＵＶ照射カプシドとの超微細構造的差は全く観察されなかった（図８ｃ、ｄ）。どの前記精製法を使用しても全カプシドの精製バッチは２．５ＥＵ／ｍＬ未満しか含有していなかったが、他方、中空不活化粒子バッチは、５ＥＵ／ｋｇ（体重）の米国食品医薬品局の制限下での動物モデルにおけるＨ−１ＰＶ調製物の使用と適合して、２５ＥＵ／ｍＬ未満を含有していた（MalyalaおよびSingh，2008）。全調製物は無菌であることが実証された。
【００７６】
参照文献リスト
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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