(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ２０またはＣＤ１９に結合する抗体を備える抗体結合体であって、
前記抗体は２つ以上の細胞溶解性ドメインに結合され、
前記細胞溶解性ドメインはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチドを備えるか又はこれのみからなり、
前記細胞溶解性ドメインの一方が前記抗体のＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合され、
前記細胞溶解性ドメインの他方が前記抗体のＨ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合される、
抗体結合体。
【請求項２】
ＣＤ２０又はＣＤ１９に結合する抗体のＨ鎖及びＬ鎖を備えるポリペプチド結合体であって、
前記Ｈ鎖及びＬ鎖可変領域の各々は３つのＣＤＲを備え、前記Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端は細胞溶解性ドメインに結合され、前記Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端は細胞溶解性ド
メインに結合され、
前記細胞溶解性ドメインはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチドを備えるか又はこれのみからなる、ポリペプチド結合体。
【請求項３】
前記Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合される細胞溶解性ドメインをさらに備える、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項４】
前記Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合される細胞溶解性ドメインをさらに備える、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項５】
前記結合体は前記Ｈ鎖又はＬ鎖に結合された細胞溶解性ドメインを複数備え、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合され、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合されるか、又は前記Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合される、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項６】
前記結合体は前記Ｈ鎖又はＬ鎖に結合された細胞溶解性ドメインを複数備え、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合されるか、又
は前記Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合される、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項７】
前記結合体は前記Ｈ鎖又はＬ鎖に結合された細胞溶解性ドメインを複数備え、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合され、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合される、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項８】
前記結合体は前記Ｈ鎖又はＬ鎖に結合された細胞溶解性ドメインを複数備え、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合され、当該細解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合され、当該細胞溶解性ドメインの少なくとも１つは前記Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合されるか又は前記Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合される、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項９】
前記Ｈ鎖又はＬ鎖に結合される３、４、５、６、７、又は８個の細胞溶解性ドメインを備える請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１０】
前記Ｈ鎖又はＬ鎖に結合された細胞溶解性ドメインが同一のアミノ酸配列又は異なるア
ミノ酸配列を有する請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１１】
前記細胞溶解性ドメインは最後のアミノ酸の直後で前記Ｈ鎖又はＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端において前記Ｈ鎖又はＬ鎖と接合しており、これよって前記細胞溶解性ドメインと前記Ｈ鎖又はＬ鎖との間に連続したアミノ酸配列を形成している、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１２】
前記Ｈ鎖又はＬ鎖と前記細胞溶解性ドメインとがペプチド配列又は非ペプチドリンカもしくはスペーサによって接合される請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１３】
前記リンカ又はスペーサが線状炭素鎖を備える請求項１２に記載の結合体。
【請求項１４】
前記細胞溶解性ドメインが、１０から１５個のＬ又はＤアミノ酸、１５から２０個のＬ又はＤアミノ酸、１０から２８個のＬ又はＤアミノ酸、１０から５０個のＬ又はＤアミノ酸、又は１５から１００個のＬ又はＤアミノ酸を有する配列からなる、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１５】
前記細胞溶解性ドメインはカチオン性である、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１６】
前記細胞溶解性ドメインが両親媒性のアルファへリックス構造を形成する、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項１７】
前記抗体は前記標的と結合する抗体断片又は部分配列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項１８】
前記抗体又は前記Ｈ鎖もしくはＬ鎖はモノクローナル抗体を含む、請求項１又は２に記
載の結合体。
【請求項１９】
前記抗体又は前記Ｈ鎖もしくはＬ鎖はヒト、ヒト化、霊長類化、又はキメラの抗体を含む、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項２０】
前記Ｈ鎖もしくはＬ鎖又は抗体は、配列ＩＤ番号１２から７３及び８４から９１の何れか、又は配列ＩＤ番号９２から９５、９７から１１１、及び１１９から１３０の何れかに記載した何れかのＨ鎖もくしはＬ鎖又は抗体又は何れかの一又は複数のＣＤＲ配列から選択される、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項２１】
前記結合体は配列ＩＤ番号８２から９１の何れか又は配列ＩＤ番号９２から９５、９７から１１１、及び１１９から１３０の何れかに記載した何れかのＨ鎖結合体、いずれかのＬ鎖結合体、何れかのホール抗体結合体配列を含む、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項２２】
前記ＣＤ２０またはＣＤ１９は細胞によって又は細胞上に発現される、請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項２３】
前記抗体又はポリペプチド結合体が単離又は精製される請求項１又は２に記載の結合体。
【請求項２４】
請求項１又は２の結合体を含む組成物。
【請求項２５】
製剤又は混合物を含む請求項２２に記載の結合体。
【請求項２６】
請求項１又は２の前記抗体又はポリペプチド結合体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１又は２の前記結合体及び抗細胞増殖又は免疫刺激薬剤を含む組成物。
【請求項２８】
請求項１又は２の前記結合体を発現する形質転換された宿主細胞。
【請求項２９】
有害な細胞増殖又は高増殖性疾患を治療するのに有効な量の請求項１又は２の前記結合体を含む単位投与量を含む薬剤。
【請求項３０】
１）抗体Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、２）抗体Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、３）抗体Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、又は４）抗体Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、を含み、
前記細胞溶解性ドメインはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ、及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチドを備えるか又はこれのみからなり、
前記抗体Ｈ鎖又は前記抗体Ｌ鎖はＣＤ２０又はＣＤ１９に結合する、ポリペプチド。
【請求項３１】
１）抗体Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、２）抗体Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、３）抗体Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、又は４）抗体Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、を含み、
前記細胞溶解性ドメインはＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡから選択されるペプチドを備えるか又はこれのみからなり、
前記抗体Ｈ鎖又は前記抗体Ｌ鎖はＣＤ２０又はＣＤ１９に結合し、
前記Ｈ鎖もしくはＬ鎖又は抗体は配列ＩＤ番号１２から７３及び８４から９１の何れか、又は配列ＩＤ番号９２から９５、９７から１１１、及び１１９から１３０の何れかに記載した何れかのＨ鎖もくしはＬ鎖又は抗体又は何れかの一又は複数のＣＤＲ配列から選択される、ポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１又は２の前記結合体又は請求項３０又は３１のポリペプチドを符号化した核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６１／７２０，２５７号（出願日：２０１２年１０月３０日）に基づく優先権を主張するものであり、この米国特許出願の開示は、参照により全体として本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、抗体、抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖、細胞溶解性ペプチド結合体などの薬剤と融合又は結合した抗体断片、及び結合体を用いる方法に関する。これらは、例えば、有害な又は異常な細胞増殖又は高増殖性疾患の治療において用いられる。これらの疾患の例は、上記の抗体、及び抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖と結合する標的を発現する非転移性及び転移性新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍である。
【０００３】
癌患者の５年生存率を考慮すれば、原発性の腫瘍及び転移の治療のための新しい治療法を開発する必要性が明確である。遠隔転移性疾病と診断された場合、肺、結腸直腸、乳房、及び前立腺の癌を患う患者の生存率はわずか１０〜４０％となる。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、抗体と融合した細胞溶解性ドメイン、抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖と融合又は結合した細胞溶解性ドメイン、及び抗体断片と融合又は結合し標的（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ヒト上皮成長因子受容体２あるいはＥｒｂＢ−２、ＣＤ２０）と結合する細胞溶解性ドメインに、少なくとも部分的に基づく。本明細書では、このような融合体を抗体又はポリペプチド結合体、又は融合構造体と称する。細胞と細胞溶解性ドメインとの接触は、細胞膜の破裂の原因となり、細胞死に至ると考えられる。標的と結合する抗体、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖により、細胞溶解性ドメインが標的発現細胞を破壊することが可能になる。この標的発現細胞には、有害な又は異常な増殖細胞又は高増殖性細胞が含まれる。これらの細胞の例は、上記の抗体又はＨ鎖及び／又はＬ鎖が結合する標的を発現する非転移性及び転移性新生物、癌、腫瘍及び悪性腫瘍である。多くの非転移性及び転移性新生物、癌、腫瘍及び悪性細胞が、受容体又は配位子などの標的を過剰に発現する。例えば、多くの非転移性及び転移性新生物、癌、腫瘍及び悪性細胞が、受容体標的（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＣＤ２０）を発現し、この受容体標的は抗体又はポリペプチド結合体又は融合構造体の標的として用いることができる。
【０００５】
結合体は対象となる標的を発現する任意の細胞又は細胞集団と結合するように構成することができる。抗体、その断片、又はそれらのＨ鎖及び／又はＬ鎖が結合対象の標的に基づいて選択され、細胞溶解性ドメインに結合される。結果として生じる抗体又はポリペプチド結合体又は融合構造体は、次に標的を発現する細胞の増殖を低減又は阻害し、それによって当該標的発現細胞の増殖又は成長を低減又は阻害する。
【０００６】
結合体は、標的細胞を殺滅するために、細胞の分裂を必要としない。従って、結合体は分裂細胞及び非分裂細胞に対して有効である。
【０００７】
本発明によれば、細胞溶解性ドメインを含む抗体及びポリペプチド結合体が提供される。一実施形態において、抗体結合体は標的に結合する抗体（又はその断片）を含むか、又は当該抗体から構成される。この抗体は、例えばＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）から選択されるペプチド配列を含むＬ又はＤアミノ酸配列、又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列ＩＤ番号１−６）から選択されるペプチド配列を含むＬ又はＤアミノ酸配列、を含むか、又はこのアミノ酸配列から構成される細胞溶解性ドメインに結合される。ここで、上記のアミノ酸配列は、一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基のいずれかによって置換される。別の実施形態において、ポリペプチド結合体は標的に結合する抗体又はその断片のＨ鎖及び／又はＬ鎖を含むか、又は当該抗体又はその断片から構成される。これらは、例えばＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）から選択されるＬ又はＤアミノ酸配列、又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列ＩＤ番号１−６）から選択されるペプチドを含む配列、を含むか、又はこの配列から構成される細胞溶解性ドメインに結合される。ここで、上記の配列は、一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基のいずれかによって置換される。
【０００８】
より具体的な実施形態において、抗体又はポリペプチド結合体はＨｅｒ２／ｎｅｕに結合する抗体（又はその断片）、又は抗体（例えば、トラスツズマブ、又はペルツズマブ）又はその断片（トラスツズマブ断片、又はペルツズマブ断片）のＨ鎖及び／又はＬ鎖を含む。これらは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）から選択されるＬ又はＤアミノ酸配列、又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列ＩＤ番号１−６）から選択されるペプチドを含む配列、を含むか、又はこの配列から構成される細胞溶解性ドメインに結合される。ここで、上記の配列は、一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基のいずれかによって置換される。
【０００９】
また、本発明によれば、標的に結合する抗体（又はその断片）又は抗体又はその断片のＨ鎖及び／又はＬ鎖、及び第２のドメインを含むか、又はこれから構成される、隔離され精製された結合体が提供される。様々な実施形態において、第２のドメインは、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列ＩＤ番号１−７）である細胞溶解性ドメインを含むか、又はこれから構成される。さらなる実施形態において、第２のドメインは
ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ（配列ＩＤ番号１−６）を含むか、又はこれから構成される。ここで、上記の配列は、一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基のいずれかによって置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基のいずれかによって置換される。
【００１０】
本発明によれば、一又は複数の細胞溶解性ドメインを含むポリペプチドがさらに提供される。様々な実施形態において、ポリペプチドは、以下のドメインを含むか、又はこれから構成される。１）抗体Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、２）抗体Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、３）抗体Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、又は４）抗体Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン。さらなる実施形態において、ポリペプチドは、以下のドメインを含むか、又はこれらから構成される。１）抗体Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン及びカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、又は２）抗体Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン及びカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン。
【００１１】
標的の具体的な例としては、アミノ酸配列（例えば、ポリペプチド、ペプチド、プロテイン）、多糖類、オリゴ糖類、炭水化物、及び脂質があるが、これらには限定されない。標的のクラスの具体的な例としては、受容体及び抗原があるが、これらには限定されない。
【００１２】
標的には、抗原、受容体又は配位子と結合する受容体が含まれ、これらには、ホルモン、成長因子、分化抗原群（総称してＣＤ（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）分子又はＣＤマーカ）、ホルモン及び成長因子類似体、及びホルモン、ホルモン類似体、成長因子、成長因子類似体、及び成長因子及び類似体の断片の断片が含まれる。受容体標的の具体的な例としては、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体あるいはＥｒｂＢ−２）、黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体（ＬＨＲＨ−Ｒ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体、葉酸、及び成長ホルモン（ＧＨ）受容体があるが、これらには限定されない。ＣＤドメインの具体的な例としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、又はＣＤ１５４があるが、これらには限定されない。
【００１３】
抗原標的には、ウイルス性、細菌性、真菌性、及び寄生性の抗原が含まれる。また、抗原標的には腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が含まれる。
【００１４】
抗原は、２個のＨ鎖及び２個のＬ鎖、並びに抗原断片を含む。抗原のＨ鎖及び／又はＬ鎖、又はＨ鎖又はＬ鎖の断片を含むか、又はこれから構成されるポリペプチドは、単一のＨ又はＬ鎖又は単一のＨ又はＬ鎖の断片、又は複数（２個、３個、４個、又はそれ以上）のＨ鎖及び／又はＬ鎖、又は複数のＨ鎖及び／又はＬ鎖の断片を含むことができる。抗原又はその断片のＨ鎖及び／又はＬ鎖を含むペプチドは、２個のＨ鎖及び２個のＬ鎖を含むことができるが、これらは必ずしも必要ではない。よって、本明細書で述べるポリペプチド結合体は、２個のＨ鎖及び２個のＬ鎖からなる生体固有の抗体を除外することができる。
【００１５】
抗体及びその断片は、抗体のＨ鎖又はＬ鎖と区別される他の抗体、その断片、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はポリペプチド配列を有するオリゴマー（高オーダー又は高原子価）の形態、例えばトリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマーなどであってもよい。抗体は、モノクローナル抗体及びモノクローナル抗体の断片を含む。抗体は、哺乳動物、ヒト、ヒト化、霊長類化、及びキメラの配列を含む。
【００１６】
アミノ酸配列（例えば、ポリペプチド、ペプチド、プロテイン、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、細胞溶解性ドメインなど）は、天然（Ｌ）又は非天然（例えば、Ｄ）アミノ酸を含むか、これから構成される。特定の態様において、アミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基の数は、２から１０、１０から１４、１５から２０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸）、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００、１００から１２５、１２５から１５０、１５０から１７５、１７５から２００、２００から２５０、２５０から３００、又はそれ以上である。標準長の抗体Ｈ鎖及びＬ鎖は、通常９０個から１３０個のアミノ酸を縦に配列したものであるが、より短くてもよく、例えば、可変のＨ鎖又はＬ鎖配列からなり、これは、フレームワーク領域を有する、又は有しない１個、２個、又は３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。細胞溶解性ドメインに含まれるアミノ酸の数は、通常１０から１４、１５から２０（すなわち、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個のアミノ酸）、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０であるが、より長く（５０以上）、又はより短く（１０未満）することは任意である。アミノ酸配列は、線形又は循環構造を含むか、又はこれから構成されてもよい。
【００１７】
細胞溶解性ドメインを含む結合体は、抗体（又はその断片）又は抗体のＨ鎖又はＬ鎖の任意の位置に当該細胞溶解性ドメインを有してもよい。よって、細胞溶解性ドメインは、抗体（又はその断片）又は抗体のＨ鎖又はＬ鎖の任意のアミノ酸の位置（アミノ酸残基）に位置してもよい。また、結合体は複数の細胞溶解性ドメインを含んでも良い。従って、Ｈ鎖又はＬ鎖に結合された一又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、又はそれ以上）の細胞溶解性ドメインを、本発明の結合体は含むことができる。
【００１８】
また、細胞溶解性ドメインは、ポリペプチド配列のＣ末端、ＮＨ2末端、又はＣ末端及びＮＨ2末端の両方に位置してもよい。特定の実施形態において、結合体は抗体（又はその断片）のＨ鎖又はＬ鎖、又はＨ鎖又はＬ鎖のＮＨ2末端及びＣ末端のいずれか（又はその両方）に位置する細胞溶解性ドメインを有する。特定の実施形態において、ある細胞溶解性ドメインはＨ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結されるか、又はＨ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結され、またある細胞溶解性ドメインはＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結されるか、又はＬ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結される。複数の細胞溶解性ドメインを有する結合体において、上記のようなドメインはＨ鎖又はＬ鎖に連結され、Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結され、Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結されてもよい。より具体的な態様において、複数の細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＨ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、少なくとも１つがＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＨ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＨ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結されるか、又はＬ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結され、複数の細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＨ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に連結され、細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＨ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結され、細胞溶解性ドメインのうちの少なくとも１つがＬ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に連結される。
【００１９】
結合体が複数の細胞溶解性ドメインを含む実施形態において、当該細胞溶解性ドメインは同一のアミノ酸配列を有する場合と、異なるアミノ酸配列を有する場合とがある。従って、結合体は第２、第３、第４、第５、第６、第７等の細胞溶解性ドメインを含むことができ、これらのいずれか又はすべては互いに同一か又は異なっている。
【００２０】
特定の実施形態において、細胞溶解性ドメインは最後のアミノ酸のすぐ後でＨ鎖又はＬ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端又はカルボキシ（Ｃ）末端においてＨ鎖又はＬ鎖と、例えば共有（例えばペプチド又は非ペプチド）結合によって接合しており、これよって細胞溶解性ドメイン及びＨ鎖又はＬ鎖との間に連続したアミノ酸配列を形成している。さらなる実施形態において、抗体、Ｈ鎖及びＬ鎖、及び細胞溶解性ドメインは、ペプチド又は非ペプチドリンカー又はスペーサーによって接合している。特定の実施形態において、抗体、Ｈ鎖及びＬ鎖、及び細胞溶解性ドメイン、及び細胞溶解性ドメインは、１個から２５個のアミノ酸残基を有するペプチド配列によって接合されているか、又はＣN（Ｎは１個から１００個の炭素原子。例えば、Ｃ、ＣＣ、ＣＣＣ、ＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＣＣ、ＣＣＣＣＣＣＣＣなど）などの線形炭素鎖によって接合されている。より具体的な実施形態において、Ｈ鎖及びＬ鎖及び細胞溶解性ドメイン及び細胞溶解性ドメインは、一又は複数のＡ、Ｓ、又はＧアミノ酸残基を含むか、又はこれらから構成されるペプチド配列によって接合される（例えば、このペプチド配列は、ＧＳＧＧＳ（配列ＩＤ番号８），ＡＳＡＡＳ（配列ＩＤ番号９），ＧＳ，ＡＦ，ＦＫ，ＶＫ，ＦＦＫ，ＦＡ，ＧＳＧＲＳＡ（配列ＩＤ番号１０），ＲＶＲＲＳＶ（配列ＩＤ番号１１），ＳＳ，Ｃｉｔ−Ｖ（Ｃｉｔはシトルリン（Ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ）（Ｈ2ＮＣ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ2）3ＣＨ（ＮＨ2）ＣＯ2Ｈ），Ｖａｌはバリン（Ｖａｌｉｎｅ）），Ｆ−Ｃｉｔ（Ｆはフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ），Ｃｉｔはシトルリン）を含むか、又はこれらから構成される）。
【００２１】
結合体はさらなる（例えば、非細胞溶解性の）ドメインを含むか、これから構成される。このように、様々な態様において、結合体は第２、第３、第４、第５、第６、第７等のドメインを含み、これらは当該結合体に含まれる一又は複数の（又はすべての）細胞溶解性ドメインとは別個のものであってもよい。
【００２２】
結合体は隔離された、及び／又は精製された形態を含むか、又はこれらから構成されてもよい。結合体は調合物又は混合物を含むか、又はこれから構成されてもよい。このような調合物及び混合物は組成物を含む。組成物の例としては、結合体と、対象への使用、投与又は生体内接触に適した薬理学上許容できるキャリア又は賦形剤との混合物、又は結合体と細胞増殖防止剤又は免疫刺激剤との混合物がある。
【００２３】
結合体は単位投与量の形態を含むか、これから構成されてもよく、その例としては、対象への使用又は投与のための投与量がある。一実施形態において、結合体は、有害な細胞増殖又は高増殖性疾患を有する対象に投与するための単位投与量、又は当該対象を治療するのに有効な量になっている。別の実施形態において、結合体は、新生物、腫瘍、又は癌を有する対象に投与するための単位投与量、又は当該対象を治療するのに有効な量になっている。さらに別の実施形態において、結合体は、対象に投与するための単位投与量、又は当該対象の生殖力を低減するのに有効な量になっている。
【００２４】
結合体はキットに含めることができ、本発明の方法又は使用を実施するための指示を任意に付与することもできる。一実施形態において、キットには結合体及び指示が含まれる。この指示は、細胞の増殖を低減又は阻害するため、高増殖性細胞の増殖を低減又は阻害するため、新生物、腫瘍、又は癌細胞の増殖を低減又は阻害するため、高増殖性疾患を有する対象を治療するため、新生物、腫瘍、又は癌を有する対象を治療するため、又は動物の生殖力を低減するためのものである。
【００２５】
また、結合体を符号化した核酸も提供される。様々な実施形態において、核酸配列は、抗体又はポリペプチド結合体の以下のドメインを符号化したものである。１）抗体Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、２）抗体Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、３）抗体Ｈ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、又は４）抗体Ｌ鎖のカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン。別の実施形態において、核酸配列は、抗体又はポリペプチド結合体の以下のドメインを符号化したものである。１）抗体Ｈ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン及びカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン、２）抗体Ｌ鎖のアミノ（ＮＨ2）末端に結合された細胞溶解性ドメイン及びカルボキシ（Ｃ）末端に結合された細胞溶解性ドメイン。
【００２６】
核酸は、細胞内で発現されたときに結合体を符号化した発現ベクターなどのベクターに含まれてもよい。宿主細胞は、ベクター内の核酸（例えば、結合体のすべて又は一部、例えば細胞溶解性ドメインに結合されたＨ鎖及び／又はＬ鎖配列を符号化した核酸）によって、形質転換され、当該細胞はこの核酸によって符号化された結合体を発現する。
【００２７】
本明細書に記載の通り、標的細胞内又は細胞上に発現される。結合体が結合する標的を発現する細胞は、本発明の結合体によって結合の標的とされる。従って、このような細胞は、当該細胞によって発現された標的に結合する結合体を選択することによって、選択的に標的化できる。
【００２８】
標的発現細胞には、例えば高増殖性細胞があるが、これには限定されない。標的を発現する細胞には、さらに、例えば乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頚部細胞、胃細胞、肺細胞、胃部細胞、結腸細胞、膀胱細胞、膠細胞、真皮細胞（例えば、メラニン細胞）、血液細胞、及び子宮内膜細胞が含まれる。
【００２９】
結合体はとりわけ、細胞の増殖の低減又は阻害、細胞増殖の低減又は阻害、高増殖性細胞の増殖の低減又は阻害、新生物、腫瘍、又は悪性細胞の増殖の低減又は阻害、及び高増殖性細胞又は高増殖性疾患などの有害な又は異常な細胞増殖の治療に有用である。高増殖性疾患の例としては、良性の異常増殖、非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍、及び悪性細胞があるが、これらには限定されない。
【００３０】
本発明によれば、細胞の増殖を低減又は阻害する方法、細胞増殖を低減又は阻害する方法、高増殖性細胞の増殖を低減又は阻害する方法、及び新生物、腫瘍、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害する方法がさらに提供される。様々な実施形態において、細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に当該細胞を接触させる工程、細胞増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に細胞を接触させる工程、高増殖性細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に細胞を接触させる工程、及び新生物、腫瘍、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に細胞を接触させる工程が、方法に含まれる。
【００３１】
本発明によれば、結合体が結合する標的を発現する細胞の増殖を選択的に低減又は阻害する方法、結合体が結合する標的を発現する高増殖性細胞の増殖を選択的に低減又は阻害する方法、及び結合体が結合する標的を発現する新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を選択的に低減又は阻害する方法が、さらに提供される。様々な実施形態において、標的発現細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に当該細胞を接触させる工程、高増殖性細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に標的発現細胞を接触させる工程、新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に標的発現細胞を接触させる工程が方法に含まれており、この結合体は細胞によって発現された標的に結合する。
【００３２】
本発明によって標的化される細胞の例としては、任意の標的を発現する細胞が含まれる。よって、このような細胞には、例えば乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頚部細胞、胃細胞、肺細胞、胃部細胞、結腸細胞、膀胱細胞、膠細胞、真皮細胞（例えば、メラニン細胞）、血液細胞、及び子宮内膜細胞が含まれる。より具体的には、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、抗原（例えば、腫瘍関連抗原）、又は分化抗原群（ＣＤ）ドメインなどの受容体を発現する細胞であるが、これらには限定されない。
【００３３】
実施される方法は、とりわけ高増殖性細胞又は有害な増殖細胞などの細胞の増殖、生存、分化、死、又は活動を阻害、低減、又は防止する必要のために、対象に対する投与又は接触の工程を含む。対象の例としては、有害な又は異常な細胞増殖を有する又はそのリスクを有する対象、良性の異常増殖、又は非転移性又は転移性の癌、腫瘍、又は悪性腫瘍（例えば、乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頚部細胞、胃細胞、肺細胞、胃部細胞、結腸細胞、膀胱細胞、膠細胞、真皮細胞（例えば、メラニン細胞）、血液細胞、及び子宮内膜細胞のいずれかにおける固形又は液状の腫瘍）を有する又はそのリスクを有する対象がある。
【００３４】
本発明によれば、高増殖性疾患を有する対象を治療する用法及び方法、及び新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍（転移性、非転移性、又は良性）を有する対象を治療する用法及び方法が、さらに提供される。様々な実施形態において、用法及び方法は、高増殖性疾患を治療するのに十分な量の結合体を対象に投与する工程、及び新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体を対象に投与する工程を含む。
【００３５】
方法及び用法は、転移を有する又はそのリスクを有する対象を治療する工程を含む。例えば、腫瘍、癌、又は新生物が対象内の他の部位、位置、又は領域に拡散又は散在するのを低減又は阻害するのに有効な結合体の量。様々な実施形態において、方法又は用法は、原発性の腫瘍又は癌の一又は複数の他の部位への転移、及び一又は複数の他の部位、位置、又は領域における転移の形成又は確立を低減又は阻害し、これによって癌の再発又は腫瘍又は癌の進行を低減又は阻害する。さらなる実施形態において、方法又は用法は、潜在的に又は実際に転移を発生させる腫瘍又は癌細胞（例えば、散在性の腫瘍細胞）の成長、増殖性、移動性、又は侵襲性を低減又は阻害し、原発性の腫瘍又は癌から前記原発性の腫瘍又は癌とは異なる一又は複数の他の部位、位置、又は領域への転移の形成又は確立を低減又は阻害し、転移が形成又は確立された後に、前記原発性の腫瘍又は癌とは異なる一又は複数の他の部位、位置、又は領域における転移の成長又は増殖を低減又は阻害し、又は、転移が形成又は確立された後に、さらなる転移の形成又は確立を低減又は阻害する。さらに別の実施形態において、方法又は用法は、新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の再発又は進行を低減又は阻害する。
【００３６】
本発明によれば、新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の他の部位への転移、又は原発性の新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍より抹消に近い他の部位における新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の転移の形成又は確立を低減又は阻害する方法又は用法がさらに提供される。様々な実施形態において、方法は、新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の他の部位への転移、又は原発性の新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍より抹消に近い他の部位における新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍の転移の形成又は確立を低減又は阻害するのに十分な量の結合体を対象に投与する工程を含む。
【００３７】
よって、本発明によって治療が可能な新生物、腫瘍、癌、及び悪性腫瘍は、転移性、非転移性、又は良性の形態を含む。例えば、固形の細胞の塊、造血細胞、又は癌腫、肉腫（例えば、リンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、又は線維肉腫）、リンパ腫、白血病、腺腫、腺癌、黒色腫、神経膠腫、神経膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、希突起膠細胞腫、中皮腫、網内系、リンパ性、または造血性（例えば、骨髄腫、リンパ腫、又は白血病）新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍があるが、これらには限定されない。
【００３８】
本発明によって治療が可能な新生物、腫瘍、癌、及び悪性腫瘍が存在する又は影響する部位は、肺（小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌）、甲状腺、頭部又は頸部、鼻咽頭、咽頭、鼻または洞、脳、脊椎、副腎、下垂体、乳癌、卵巣癌、子宮、子宮頸部、胃腸（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、肺、尿生殖路（子宮、卵巣、子宮頸部、子宮内膜、膀胱、睾丸、陰茎、前立腺）、グリア、血液学、子宮内膜、リンパ、血液、筋肉、皮膚（例えば、メラノサイト）、または皮膚細胞、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、ウィルムス腫瘍、胆管、Ｂ−ＡＬＬ（Ｂ−細胞リンパ芽球性白血病）、細胞、または血液新生物、腫瘍、癌、または悪性腫瘍である。
【００３９】
方法及び用法は、例えば、他の治療法（例えば、外科的切除、化学療法、免疫療法、放射線療法、熱療法、ワクチン接種など）の候補ではない対象において、単独で実施されてもよい。また、方法及び用法は他の治療法（外科的切除、放射線療法、電離又は化学放射線療法、化学療法、免疫療法、局所的又は部位的熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種）と共に実施されてもよい。このような治療法は、結合体の投与と実質的に同時期に（個別に、又は混合して）、又は結合体の投与の後に、実施されてもよい。一実施形態において、方法又は用法は、抗細胞増殖性、抗新生物性、抗腫瘍性、抗癌性、又は免疫促進性の治療の実施を含む。さらなる実施形態において、方法又は用法は、アルキル化剤、抗代謝産物、植物抽出物、植物アルカロイド、ニトロソ尿素、ホルモン、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、シクロホスファミド、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、プレドニゾロン、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、チオグアニン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、５−アザシチジン（５−ＡＺＣ）及び５−アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシ尿素、シスプラチン、カルボプラチン、オキシプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキサン（例えば、タキソール又はパクリタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシン又はジブロモマン二トール、トポイソメラーゼ阻害剤、（イリノテカン、トポテカン、エトポシド、テニポシド）、ゲムシタビン、ペメトレキセドなどの投与を含む。
【００４０】
細胞又は免疫療法は、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はＢ細胞、抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン又はケモカインを含む。本発明の組成物、方法、又は用法において結合体とともに適用可能なさらなる薬剤には、抗体（単クローン抗体）又は小分子などの標的薬物又は生物製剤が含まれる。
【００４１】
本発明の方法は、対象に利益をもたらすことを含む。特定の実施形態において、治療の方法は、新生物、腫瘍、癌又は悪性細胞の質量、体積、サイズ、個数を部分的又は完全に破壊して、新生物、腫瘍、癌又は悪性細胞の壊死、溶解、アポトーシスを刺激、誘発、又は増加させ、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の体積、サイズ、細胞質量を低減し、新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍の体積、質量、サイズ、又は個数の進行又は増加を防止し、又は寿命を延長し、副作用又は新生物、腫瘍、癌又は悪性腫瘍に関連する又はそれらによって引き起こされる合併症の重症度、持続期間、又は頻度を低減し、痛み、不快感、吐き気、脱力感、又は無気力を低減し、又はエネルギー、食欲、改善された移動性、又は心理的健康を向上させる。
【００４２】
この方法によって治療が可能な対象には、哺乳動物が含まれる。特定の実施形態において、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１Ａ及び図１Ｂは、Ｈｅｒ２−ｎｅｕ受容体陽性のＡ）乳癌細胞株（ＳＫＢＲ−３）、及びＢ）卵巣癌細胞株（ＳＫＯＶ−３）に対する、組換えｓｃＦｖ−ＣH３（裸抗体）、ｓｃＦｖ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ１８、及びｓｃＦｖ−ＣH３−ＧＳ−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）の細胞毒性を４８時間後に測定した結果を示す。
【００４４】
【図２】図２Ａ及び図２Ｂは、生理食塩水を注入したマウスを対照とし、ＳＫＯＶ−３異種移植マウス内での６４日間にわたる観察期間において、裸モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、Ａ）ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８、及びＢ）組替えｓｃＦｖ−ＣH３裸抗体及びｓｃＦｖ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８結合体で処理したマウスから採取した腫瘍の体積の中央値を示す。
【００４５】
【図３】生理食塩水を注入したマウスを対照とし、ＳＫＯＶ−３異種移植マウス内での６４日目における、ＭＡｂ（裸）、ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８、組替えｓｃＦｖ−ＣH３裸抗体、及びｓｃＦｖ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８結合体で処理したマウスから採取した腫瘍の重量の平均値を示す。
【００４６】
【図４】生理食塩水を注入したマウスを対照とし、ＳＫＯＶ−３異種移植マウス内での６４日にわたる観察期間において、ＭＡｂ（裸）、ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８、組替えｓｃＦｖ−ＣH３裸抗体、及びｓｃＦｖ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８結合体で処理したマウスの体重の平均値を示す。
【００４７】
【図５】ＡＤＣＨ鎖及びＬ鎖発現に用いられるｐＣＭＶＴｎＴ発現ベクター（プロメガ）を示す。
【００４８】
【図６】産生されたＡＤＣの抗Ｐｈｏｒ１８免疫ブロットを示す。それらは、Ｈ１Ｌ１（ＩｇＧ１），Ｈ３Ｌ１（ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），Ｈ１Ｌ３（ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），Ｈ２Ｌ２（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１），及びＨ１Ｌ２（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ）である。
【００４９】
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、還元プロテインの、Ａ）抗Ｐｈｏｒ１８プローブ及びＢ）抗カッパＬ鎖プローブを用いた、産生されたＡＤＣの品質分析を示す。それらは、抗Ｈｅｒ２抗体，Ｈ１Ｌ１（裸），Ｈ１Ｌ３（ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），及びＨ３Ｌ１（ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１）である。
【００５０】
【図８】産生されたＡＤＣの抗ＩｇＧ及び抗Ｐｈｏｒ１８免疫ブロットを示す。それらは、Ｈ１Ｌ３（ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），Ｈ１Ｌ２（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−  ＩｇＧ１，及びＨ２Ｌ２（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１）である。
【００５１】
【図９】Ｄａｕｄｉ細胞におけるカスパーゼ３／７活性に対する、化学的に結合した抗体ＣＤ２０及びホール抗体ＣＤ２０−Ｐｈｏｒ１８結合体の効果を示す。
【００５２】
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、組替えにより産生されたｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８の生体外活性を、ＣＤ２０発現Ｄａｕｄｉ細胞において裸のｓｃＦｖと比較して示す。各裸の及び結合された抗体を用いた培養の２時間経過時にＡ）細胞膜の完全性が測定され、２４時間経過時にＢ）細胞の生存率が測定された。裸のｓｃＦｖは細胞膜を分解せず、標的細胞を殺滅することもなかったが、ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体は膜の分解及び細胞の殺滅を示した。
【００５３】
【図１１】裸のｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体について測定された生体外カスパーゼ３／７活性を示す。ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８は濃度に依存する形でカスパーゼ３／７活性を向上させた。スタウロスポリンをカスパーゼ活性のコントロールとした。裸のｓｃＦｖは検出できる程度にはカスパーゼを活性化しなかった。
【００５４】
【図１２】酵母システムにおけるトランスフェクションに用いられる、抗ＣＤ２０ＡＤＣ及び裸の抗体発現の発現ベクターを示す。
【００５５】
【図１３】図１３Ａから図１３Ｄは、ｓｃＦｖＦｃ及びＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８の生体外活性を、ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞株においてＡ）４時間後、Ｂ）２４時間後に、ＣＤ２０陰性Ｕ９３７細胞においてＣ）４時間後、Ｄ）２４時間後に測定した結果を示す。
【００５６】
【図１４】抗ＣＤ２０ＡＤＣ及び裸の抗体発現の発現ベクターを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、第２の細胞溶解性ドメインと接合又は融合する標的に結合する部分を含む結合体に少なくとも部分的に基づく。通常の構成では、結合体は第１の標的結合ドメイン（例えば、抗体、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖）及び細胞溶解性ドメインを含む第２のドメインを含み、これ又はこれらは細胞にとって直接的に又は間接的に有毒であるため、細胞の増殖性又は生存力を低減し、又は細胞の死、殺滅、又はアポトーシスを刺激、誘発、増加、又は増進する。
【００５８】
本発明によれば、標的に結合する抗体、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖、及び第２の細胞溶解性又は有毒ドメインを含むか、又はこれから構成される結合体が提供される。一実施形態において、結合体は、抗体又はその断片、及び細胞溶解性ドメインを含んでおり、この細胞溶解性ドメインは、１０個から１００個の残基を有するＬ又はＤアミノ酸配列を含むか、又はこれらから構成されている。このアミノ酸配列には、例えば、（リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）、及びアラニン（Ａ）などのアミノ酸から選択される）以下のペプチド配列が含まれる。ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）。他の実施形態において、結合体は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖及び、細胞溶解性ドメインを含んでおり、この細胞溶解性ドメインは、１０個から１００個の残基を有するＬ又はＤアミノ酸配列を含むか、又はこれらから構成されている。このアミノ酸配列は、以下から選択される。ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）。
【００５９】
本明細書で用いられるように、「結合体」又は「融合構造体」及びその文法的な変形である用語は、この構造体が、互いに区別され自然界には通常共存しない２つの異なる分子エンティティから派生、取得、又は隔離、あるいはこれらの分子エンティティに基づき、又は倣った部分を含んでいることを意味する。すなわち、例えば、結合体の第１の部分は抗体又は抗体断片、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖を含むか、これから構成され、結合体の第２の部分は細胞溶解性の部分又はドメインを含むか、これから構成され、第１及び第２の部分／ドメインはそれぞれ別個の構造を有している。結合体は「融合構造体」とも呼ばれ、標的と結合する抗体又は抗体断片、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖、又は第２の細胞溶解性のドメイン又は部分を含むか、又はこれらから構成されている。
【００６０】
結合体の第１のドメイン及び／又は第２のドメインは、アミノ酸配列（ペプチド、ポリペプチド、プロテイン、レクチン）、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及び炭水化物（単糖類、シアル酸、ガラクトース、マンノース、フコース、アセチルノイラミン酸など）を含むか、又はこれらから構成される。「アミノ酸配列」、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書において交換可能に用いられ、アミド結合又はそれと等価な結合によって共有結合された２つ以上のアミノ酸、又は「残基」を指し示す。アミノ酸配列は、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、又はＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）によって形成された結合を含む、非天然及び非アミドの化学結合によって結合されてもよい。非アミドの結合は、例えば、ケトメチレン、アミノメチレン、オレフィン、エーテル、チオエーテル等を含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第７巻，２６７−３５７頁、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８３年），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，ニューヨークを参照。）
【００６１】
結合体又は融合構造体の第１及び第２の（細胞溶解性）ドメインは、Ｌアミノ酸配列、Ｄアミノ酸配列、及びＬアミノ酸とＤアミノ酸を混合したアミノ酸配列を含む。第１及び第２のドメインのアミノ酸配列の結合体は、線形又は循環構造であってもよく、さらに別の部分（例えば、第３、第４、第５、第６、第７のドメイン等）と結合されてもよく、内部又は分子間ジスルフィド結合を形成し、同一又は異なる抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又は細胞溶解性配列を有する他の結合体を用いて、又は他の全く異なる分子を用いて、より高いオーダーのマルチマー又はオリゴマー（トリマー、テトラマー、ペンタマー、ヘキサマー、ヘプタマーなど）を形成する。
【００６２】
結合体の長さは、例えば、約１０から１５、１５から２０、２０から２５、２５から５０、５０から１００、１００から１５０、１５０から２００、２００から３００、又はそれ以上のアミノ酸残基の長さとなる。特定の実施形態において、第１又は第２のドメインは、約１から１０、１０から２０、１５から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００、又はそれ以上の残基を含むか、又はそれらから構成される。さらに具体的な実施形態において、細胞溶解性ドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又はそれ以上の残基を有するアミノ酸配列、又は１０、１１、１２、１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、又はそれ以上の残基を有するアミノ酸配列を含むか、又はこれらから構成される。
【００６３】
結合体は、標的（例えば、受容体）と結合する第１の部分の抗体又は抗体断片、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖、及び両親媒性のアルファへリックスを形成可能な細胞溶解性ドメインを含むか、又はこれから構成される第２の部分を含むか、又はこれらから構成される。両親媒性のアルファへリックスは、アルファへリックスの一方側にほとんどが親水性のアミノ酸を含み、他方側にほとんどが疎水性のアミノ酸を含む。アルファへリックスは３．６個の残基ごとに完全に１回転するため、両親媒性のアルファへリックスのアミノ酸配列は、３個から４個の残基ごとに親水性及び疎水性残基が交互に並ぶことになる。ＰＮＮＰＮＮＰが反復するパターン又はモチーフは両親媒性のアルファへリックスを形成すると予測され、ここでＰは陽性のアミノ酸残基を表し、Ｎは中性のアミノ酸残基を表す。ＰＮＮＰＮＮＰが反復するパターンは、細胞溶解性ペプチドが陰性の細胞膜と相互作用するための陽性結合部位、及び膜相互作用／浸透のための疎水性部位を提供する。よって結合体は、一又は複数の途切れないＰＮＮＰＮＮＰ反復パターン又はモチーフ、又は一又は複数の途切れたＰＮＮＰＮＮＰ反復パターン又はモチーフを有する細胞溶解性ドメインを含み、このドメインが両親媒性アルファへリックスを形成する。例えば、１５又は１８の残基を有するアミノ酸配列、例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ（配列ＩＤ番号１）及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号４）は、途切れない及び途切れたＰＮＮＰＮＮＰ反復モチーフを有する。
【００６４】
本明細書で開示するように、結合体は標的に結合する抗体及び抗体断片を含む。「抗体」とはモノクローナル又はポリクローナルの免疫グロブリン分子を指し、その例はＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、及びそれらの任意のサブクラスである。ＩｇＧのサブクラスの例としては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４があり、様々なグリコシル化パターンを有する人工的に産生された抗体サブクラス及び組替え抗体が含まれる。
【００６５】
また、結合体は標的と結合する抗体のＨ鎖又はＬ鎖、又は抗体のＨ鎖又はＬ鎖の断片を含む。このような結合体は標的と結合する抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖の断片を複数含んでもよい。
【００６６】
抗体断片及び抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖の断片は、超可変（標的結合）領域、又は抗体のＨ鎖及び／又はＬ鎖内の相補性決定領域（ＣＤＲ）又はフレームワーク領域（ＦＲ）のいずれか又はすべてを含んでおり、標的との結合をなすのに十分である。抗体断片の具体的な例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｖ、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖｓ  （ｓｄＦｖ）、ＶL、ＶH、Ｃａｍｅｌ  Ｉｇ、Ｖ−ＮＡＲ、ＶＨＨ、三重特異性（Ｆａｂ３）、二重特異性（Ｆａｂ２）、二重特異性抗体（（ＶL−ＶH）2又は（ＶH−ＶL）2）、三重特異性抗体（三価）、四重特異性抗体（四価）、小型特異性抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（（ｓｃＦＶ−ＣH３）2）、二重特異性単鎖Ｆｖ（Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ）、ＩｇＧｄｅｌｔａＣH２、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）2−Ｆｃ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）（例えば、ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：２、ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：４、ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：７、ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：８）、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、アビマー（ａｖｉｍｅｒ）、又はナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）がある。
【００６７】
抗体、抗体のＨ鎖及び単鎖、及びそれらの断片は、Ｂ細胞などの細胞によって産生された、又は細胞上に発現されたもの、又はＣＨＯ細胞などの他の細胞によって産生されるように合成又は人工的に作製されたものを含む。このような抗体、抗体のＨ鎖及び単鎖、及びそれらの断片は、改善された特性を有するものを含む。例えば、生体内での向上した漿液安定性及び／又は半減期、ＰＫなどである（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，第１巻，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎ  Ｒ及びＤｕｅｂｅｌ  Ｓ，版，２０１０年，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，国際公開第２００６／１３０８３４号、及びＨｏｒｔｏｎ他，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６８：８０４９（２００８年）に記載されている通りである）。Ｆｃにおける非限定的な変形例としては、例えば、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｈ４３５Ｒ、Ｈ４３５Ｑ、Ｇ２３６Ｒ、Ｌ３２８  Ｒ、Ｓ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅがある。ＩｇＧ１における非限定的な変形例は、Ｆｃ領域の第２３８，２５２，２５３，２５４，２５５，２５６，２６５，２７２，２８９，２８８，３０３，３０５，３０７，３０９，３１１，３１２，３１７，３４０，３５６，３６０，３６２，３７６，３７８，３８０，３８２，３８６，３８８，４００，４１３，４１５，４２４，４３３，４３４，４３５，４３９及び／又は４７７番目の残基に存在し得る。
【００６８】
抗体、抗体のＨ鎖及び単鎖、及びそれらの断片は標的に結合する。標的の具体的な例としては、アミノ酸配列（例えば、ポリペプチド、ペプチド、プロテイン）、多糖類、オリゴ糖類、炭水化物、及び脂質があるが、これらには限定されない。標的のクラスの具体的な例としては、受容体及び抗原があるが、これらには限定されない。このような標的は細胞によって、又は細胞上（例えば、細胞膜上）に発現され得る。
【００６９】
標的には、ホルモン、成長因子、ホルモン及び成長因子類似体、及び成長因子、成長因子類似体、及び成長因子及び類似体の断片の断片に結合する受容体が含まれる。受容体標的の具体的な例としては、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ヒト上皮成長因子受容体あるいはＥｒｂＢ−２）、黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体（ＬＨＲＨ−Ｒ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）、葉酸及び成長ホルモン（ＧＨ）受容体があるが、これらには限定されない。さらに具体的な受容体標的の例としては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）家族受容体（例えば、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦベータ（リンホトキシン、ＬＴ）、ＴＲＡＩＬ、Ｆａｓ、ＬＩＧＨＴ、又は４−１ＢＢ）、又は腫瘍フェトプロテイン（ｏｎｃｏｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）（５Ｔ４）があるが、これらには限定されない。さらに具体的な受容体標的の例としては、免疫グロブリン様受容体（例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、又はＣＤ１５４）、又はその他の受容体（例えば、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、成長因子受容体、又はケモカイン受容体）があるが、これらには限定されない。
【００７０】
抗原標的には、ウイルス性、細菌性、真菌性、及び寄生性の抗原が含まれる。また、抗原標的には腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が含まれる。ＴＡＡ標的の具体的な例としては、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＡ−１２５（上皮性卵巣癌）、可溶性インターロイキン２（ＩＬ−２）受容体、ＲＡＧＥ−１、チロシナーゼ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、糖タンパク質（ｇｐ）７５、ｇｐ１００、ベータカテニン、ＰＲＡＭＥ、ＭＵＭ−１、ＺＦＰ１６１、Ｕｂｉｑｕｉｌｉｎ−１、ＨＯＸ−Ｂ６、ＹＢ−１、オステオネクチン、ＩＬＦ３、ＩＧＦ−１、腫瘍フェトプロテイン（ｏｎｃｏｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）、黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体（ＬＨＲＨ−Ｒ）、成長ホルモン（ＧＨ）受容体、ホスファチジルセリン、卵巣刺激ホルモン受容体、ＶＧＥＦ受容体、葉酸受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、又はＣＤ１５４があるが、これらには限定されない。
【００７１】
本明細書に開示するように、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＣＤ２０のような受容体は、通常細胞上（例えば、膜受容体）又は細胞内に発現されるか、又は存在する。Ｈｅｒ２／ｎｅｕのような受容体は、細胞膜表面と会合するか、又は細胞膜を横断する。ＣＤ２０は通常内部に吸収されることはなく、Ｂ細胞及びＢ細胞悪性腫瘍の表面上に発現される。よって、受容体は標準長を有する完全形のネイティブな受容体であり、細胞外の膜貫通又は細胞質部分、並びにその不完全な形態又は断片（例えば、細胞外の膜貫通又は細胞質部分、又はＨｅｒ２／ｎｅｕ単独又はその組合せのような受容体の部分列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ））を含んでいる。例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのような可溶性受容体は、通常膜貫通領域を持たず、またネイティブな細胞外又は細胞質領域の全体又は一部を持たないこともあり得る（この領域がネイティブな受容体、例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕに存在している場合）。このような不完全な形態及び断片は、結合体に対する少なくとも部分的な結合を維持することができる。
【００７２】
抗体、Ｈ鎖、単鎖、及びそれらの断片の例としては、受容体上に存在するエピトープに結合するものがある。抗体、抗体のＨ鎖又は単鎖、又はそれらの断片が結合するＨｅｒ２／ｎｅｕエピトープの例としては、ＨＥＲ−２（ｐ５−１３）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ８−１６）Ａ２４、ＨＥＲ−２（ｐ４８−５６）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ６３−７１）Ａ２４、ＨＥＲ−２（ｐ１０６−１１４）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ３６９−３７７）Ａ２、Ａ３、Ａ２６、ＨＥＲ−２（ｐ４３５−４４３）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ６５４−６６２）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ６６５−６７３）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ６８９−６９７）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ７５４−７６２）Ａ３、Ａ１１、Ａ３３、ＨＥＲ−２（ｐ７７３−７８２）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ７８０−７８８）Ａ２４、ＨＥＲ−２（ｐ７８５−７９４）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ７８９−７９７）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ７９９−８０７）Ａ２、ＨＥＲ−２（ｐ９５２−９６１）Ａ２、及びＨＥＲ−２（ｐ１０２３−１０３２）Ａ２がある（Ｈｅｒ２／ｎｅｕエピトープのアミノ酸位置番号は、「ｐ」とその後のアラビア数字によって示される）。
【００７３】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合する抗体の例としては、米国特許第５，８２１，３３７号にて記載されたヒト化抗ＥｒｂＢ２抗体ｈｕＭＡｂ４Ｄ１−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、ヒト化５２０Ｃ９（国際出願第９３／２１３１９号）、及び米国特許第７，０９７，８４０号にて記載されたヒト化２Ｃ４（ペルツズマブ）及びＵＳ２００９／０２８５８３７Ａ１にて開示されたペルツズマブ変異体がある。Ｈｅｒ２／ｎｅｕに結合する代表的な抗体、Ｈ鎖、単鎖、及びそれらの断片を表Ａに示したが、これらには限定されない。
（以下表Ａ：配列ＩＤ番号１２−３９）
【００７４】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１：
【表Ａ−１】
0006559066.tif 000002
【００７５】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２：
【表Ａ−２】
0006559066.tif 000003
【００７６】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３：
【表Ａ−３】
0006559066.tif 000004
【００７７】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４：
【表Ａ−４】
0006559066.tif 000005
【００７８】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５：
【表Ａ−５】
0006559066.tif 000006
【００７９】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６：
【表Ａ−６】
0006559066.tif 000007
【００８０】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７：
【表Ａ−７】
0006559066.tif 000008
【００８１】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８：
【表Ａ−８】
0006559066.tif 000009
【００８２】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５：
【表Ａ−９】
0006559066.tif 000010
【００８３】
抗体配列変換（米国特許第７，４３５，７９７号  ＳＱ１及び２）
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５：
【表Ａ−１０】
0006559066.tif 000011
【００８４】
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８
（ＶLの場合、Ｑ２７，Ｄ２８，Ｎ３０，Ｔ３１，Ａ３２，Ｙ４９，Ｆ５３，Ｙ５５，Ｒ６６Ｈ９１，Ｙ９２，Ｔ９４。ＶHの場合、Ｗ９５，Ｄ９８，Ｆ１００，Ｙ１００，Ｙ１０２）
【表Ａ−１１】
0006559066.tif 000012
【００８５】
ペルツズマブ配列（ＵＳ２０１０／００１５１５７Ａ１）
【表Ａ−１２】
0006559066.tif 000013
【００８６】
ペルツズマブ変異体（ＵＳ２００９／０２８５８３７Ａ１）
【表Ａ−１３】
0006559066.tif 000014
【００８７】
ペルツズマブ配列：ヒト化２Ｃ４，７Ｃ２，７Ｆ３，７Ｄ３，３Ｅ８，４Ｄ５，２Ｈ１１，３Ｈ４（米国特許第７，０９７，８４０号）
【表Ａ−１４】
0006559066.tif 000015
【００８８】
様々な特性を有する追加の抗ＥｒｂＢ２抗体は、Ｔａｇｌｉａｂｕｅら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ４７：９３３−９３７  （１９９１）；  ＭｃＫｅｎｚｉｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ４：５４３  （１９８９）；  Ｍａｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：５３６１  （１９９１）；  Ｂａｃｕｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  ３：３５０  （１９９０）；  Ｓｔａｎｃｏｖｓｋｉら、ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）  ８８：８６９１  （１９９１）；  Ｂａｃｕｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２５８０  （１９９２）；  Ｘｕら、Ｉｎｔ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ５３：４０１−４０８  （１９９３）；  ＷＯ  ９４／００１３６；  Ｋａｓｐｒｚｙｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：２７７１  （１９９２）；  Ｈａｎｃｏｃｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５１：４５７５  （１９９１）；  Ｓｈａｗｖｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：１３６７  （１９９４）；  Ａｒｔｅａｇａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５４：３７５８  （１９９４）；  Ｈａｒｗｅｒｔｈら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２６７：１５１６０  （１９９２）；  米国特許第５，７８３，１８６号；  及びＫｌａｐｐｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １４：２０９９  （１９９７）に記載されている。このような抗体、抗体のＨ鎖、及び／又はＬ鎖、及びそれらの断片に基づく結合体が、本発明に含まれる。
【００８９】
本明細書に開示するように、標的（例えば、受容体）に結合する骨格様構造体が、本発明の結合体に含まれる。このような構造体には、アフィボディ、アプタマー、アビマー、及びナノ抗体が含まれる。このような抗体、アプタマー、アビマー、及びナノ抗体もまた、本発明に含まれる。
【００９０】
Ｈｅｒ２／ｎｅｕと結合する抗体の例としては、ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：２，ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：４，ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：７，ＺＨｅｒ２−ｎｅｕ：８，及びＦａｂ６３があるが、アフィボディ配列を表Ｂに示す。
（表Ｂ：配列ＩＤ番号４０−４７）
【表Ｂ】
0006559066.tif 000016
【００９１】
ＣＤ２０標的抗体には、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、オファツムマブ（Ｏｆａｔｕｍｕｍａｂ）（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標））、トシツムマブ（Ｔｏｓｉｔｕｍｕｍａｂ）（ＧＳＫ）、イブリツモマブ（Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）（ＩＤＥＣ）、（Ｉｖａｎｏｖ，２００８年参照）、２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０）、７Ｄ８、ＩｇＭ２Ｃ６、ＩｇＧ１  ２Ｃ６、１１Ｂ８、Ｂ１、２Ｈ７、ＬＴ２０、１Ｆ５、及びＡＴ８０があるが、これらはＴｅｅｌｉｎｇらによって記述されている（ＵＳ２００４／０１６７９１９）。抗ＣＤ２０ＶL鎖及びＶH鎖及びホール抗体の例が以下の表Ｃに記載されている（太字はそれぞれ各鎖ごとの相補的決定領域（ＣＤＲ）、すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を示す）。
（以下表Ｃ：配列ＩＤ番号４８−６９）
【表Ｃ−１】
0006559066.tif 000017
リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ）（登録商標）、ＶL鎖、及びＶH鎖
【表Ｃ−２】
0006559066.tif 000018
イブリツモマブ（ＩＤＥＣ）
【表Ｃ−３】
0006559066.tif 000019
トシツモマブ：マウス−ヒトキメラ抗ＣＤ２０（イブリツモマブと同じＶドメインで、定数領域のみが異なる。）
【表Ｃ−４】
0006559066.tif 000020
２Ｃ６  ＵＳ７８５０９６２Ｂ２（Ｔｅｅｌｉｎｇら）
【表Ｃ−５】
0006559066.tif 000021
２Ｆ２  ＵＳ２００４／０１６７３１９Ａ１（Ｔｅｅｌｉｎｇら）
【表Ｃ−６】
0006559066.tif 000022
１１Ｂ８  ＵＳ２００４／０１６７３１９Ａ１（Ｔｅｅｌｉｎｇら）
【表Ｃ−７】
0006559066.tif 000023
７Ｄ８  ＵＳ２００４／０１６７３１９Ａ１（Ｔｅｅｌｉｎｇら）
【表Ｃ−８】
0006559066.tif 000024
ホール抗体薬剤配列  
イブリツモマブ（ＩＤＥＣ）（Ｉｖａｎｏｖ，  ２００８年参照）
【表Ｃ−９】
0006559066.tif 000025
リツキシマブ  
【表Ｃ−１０】
0006559066.tif 000026
トシツモマブ
【表Ｃ−１１】
0006559066.tif 000027
【００９２】
抗黄体形成ホルモン放出ホルモン受容体（ＬＨＲＨ−Ｒ）抗体Ｌ鎖（ＶL）及びＨ鎖（ＶH）配列を、表Ｄに示す。
（以下表Ｄ：配列ＩＤ番号７０−７３）
【表Ｄ（Ａ）】
0006559066.tif 000028
【表Ｄ（Ｂ）】
0006559066.tif 000029
【００９３】
本発明は、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はそれらの断片部分、細胞溶解性ドメイン、又は結合体のその他のドメインにおいて、結合体のアミノ酸修飾（例えば、同類又は非同類の置換、付加、又は削除）などの修飾又は変異を含む。このように、抗体、抗体Ｈ鎖、抗体Ｌ鎖、それらの断片、又は細胞溶解性ドメインの一又は複数の残基の修飾部を含む結合体は、標的との結合及び／又は細胞溶解性活性を破壊しないかぎり、何個の修飾部又は変異部を組み込んでもよい。よって、例えば、受容体（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＣＤ２０）などの標的に結合する修飾された抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はその断片は、少なくとも部分的に標的（受容体）との結合を維持することができ、又は修飾された細胞溶解性ドメインは少なくとも部分的に細胞の殺滅又はアポトーシスなどの細胞溶解性活性を維持できる。
【００９４】
“同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）”とは、生物学的に、化学的に又は構造的に類似の残基によって、一つのアミノ酸を置換することである。生物学的に類似であるとは、置換が生物学的な活性、例えば細胞溶解性活性と両立することを意味する。構造的に類似であるとは、アラニン、グリシン、及びセリンなどのようにアミノ酸が類似の長さを有する、又は類似のサイズを有する側鎖を持ち、又は両親媒性のアルファへリックスのように第１、第２、又はさらなるドメインの構造が維持されることを意味する。化学的に類似であるとは、残基が同じ電荷を有する、又は、共に親水性及び疎水性を有することを意味する。具体的な例としては、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような一の疎水性残基による置換、又は、リシンのアルギニンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、アスパラギンのグルタミンによる置換のような一の極性残基による置換、又は、スレオニンのセリンによる置換等が含まれる。定常のアッセイを用いて、結合体の変異体が標的結合活性又は細胞溶解性活性などの活性を有するか否かを判定することができる。
【００９５】
よって、例えば抗体、抗体のＨ鎖及びＬ鎖、及びそれらの断片、並びに細胞溶解性ドメイン（又は存在すれば、さらなるドメイン）の修飾部と変異部は、本明細書で記述する様々な配列を含む。細胞溶解性ドメインの修飾部は、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）の配列か、又はこのような細胞溶解性ドメインを含むか又はこれから構成される配列を有するが、これらには限定されない。
【００９６】
特定の実施形態において、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、それらの断片、又は細胞溶解性ドメインの部分列（ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、基準配列と等しい少なくとも１から５、５から１０、１０から１５、１５から２０、２０から２５、２５から３０、３０から３５、３５から４０、４０から５０、５０から６０、６０から７０、７０から８０、８０から９０、９０から１００、又はそれ以上のアミノ酸残基を有する。さらなる特定の実施形態において、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、それらの断片、及び／又は細胞溶解性ドメインの一又は複数（例えば、１から３、３から５、５から１０、１０から２０、２０から３０、又はそれ以上）のアミノ酸残基の置換又は削除によって、基準配列と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又はそれ以上の一致率を有する配列を得ることができる（例えば、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、それらの断片、又は細胞溶解性ドメイン、例えば、ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７））。
【００９７】
特定の実施形態において、結合体は、標的（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＣＤ２０などの受容体）と結合する抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はその断片、及び以下のＬ又はＤアミノ酸配列を含むか、又はこれから構成される第２の細胞溶解性ドメインを含む。ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，又はＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）。ここで、上記の配列は、一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基によって置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基によって置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基によって置換される。別の具体的な実施形態において、結合体は、標的（例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＣＤ２０などの受容体）と結合する抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はその断片、及び以下のＬ又はＤアミノ酸配列を含むか、又はこれから構成される第２のドメインを含む。ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦ，ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡ，及びＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号１−７）。ここで、上記の配列は、一又は複数のＫ残基がＦ又はＬ残基によって置換され、一又は複数のＦ残基がＫ、Ａ、又はＬ残基によって置換され、一又は複数のＡ残基がＫ、Ｆ、又はＬ残基によって置換される（例えば、１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，又は２８個の残基を縦に有する）。
【００９８】
「同一（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」及びその同意語は、２つ又は２つを超える対象エンティティ（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）が同じであることを意味する。このように、２つのアミノ酸配列が同一である場合、これらのアミノ酸は同じアミノ酸配列を有する。同一な「エリア（ａｒｅａ）」「領域（ｒｅｇｉｏｎ）」又は「ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）」とは、２つ又は２つを超える対象エンティティの一部分が同じであることを指す。このように、一又は複数の配列領域に亘って２つのアミノ酸配列が同一又は相同である場合、これらのアミノ酸配列はこれらの領域において同一である。「相補的」という用語は、核酸配列を示す際に用いた場合、対象領域が１００％相補的であること、すなわち、不一致なしの１００％ベースの対形成を示すことを意味する。
【００９９】
構造的かつ機能的に関連するタンパク質間の配列の保存量に差異があるため、機能又は活性を維持するために求められる配列の一致量は、タンパク質、領域、又はその領域の機能又は活性（例えば、標的との結合又は細胞溶解性）に依存する。例えば、細胞溶解性ペプチド配列の場合、ＰＮＮＰＮＮＰ配列が複数回反復するパターン又はモチーフは存在し得るが、一又は複数の途切れた又は途切れないＰＮＮＰＮＮＰ配列の反復パターン又はモチーフは存在する必要がない。
【０１００】
２つの配列の間の一致の程度は、当該技術分野で知られたコンピュータプログラム及び数値計算アルゴリズムを使用して確かめることができる。このような配列パーセント一致率（相同性）を計算するアルゴリズムは、通常、比較領域における配列ギャップ及び不一致を計算する。例えば、ＢＬＡＳＴ（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）探索アルゴリズム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３、１９９０年（ＮＣＢＩを通じて入手可能）を参照）は、例として、次のような検索パラメータを使用している：Ｍｉｓｍａｔｃｈ  −２；  ｇａｐ  ｏｐｅｎ  ５；  ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ２。ポリペプチド配列を比較する場合には、典型的には、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを、ＰＡＭ１００，  ＰＡＭ  ２５０，  ＢＬＯＳＵＭ  ６２  又はＢＬＯＳＵＭ  ５０のようなスコアリング行列と組み合わせて使用する。一致の程度を定量化するのに、ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２及びＦＡＳＴＡ３）及びＳＳＥＡＲＣＨ配列比較プログラムも使用されている（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８年）；  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １３２：１８５（２０００年）；  及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５（１９８１年））。ドロネー（Ｄｅｌａｕｎａｙ）ベースの位相マッピングを使用して、タンパク質構造類似性を定量化するプログラムも開発されている（Ｂｏｓｔｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３０４：３２０（２００３年））。
【０１０１】
結合体のアミノ酸残基は、共有又は非共有結合によって接合できる。共有結合の非限定的な例としては、アミド結合、非天然及び非アミド化学結合があり、これらは例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二官能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、又はＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を含む。アミド結合に代わる連結基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−に代えて−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ2−）、アミノメチレン（ＣＨ2−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ2−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ2−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ4−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、又はエステル（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３年），  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｖｏｌ．  ７，  ｐｐ  ２６７−３５７，  “Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  ＮＹを参照）がある。
【０１０２】
細胞溶解性ドメイン（及び存在すればさらなるドメイン）は、標的との結合を破壊しない限り、抗体、抗体断片、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又は抗体のＨ鎖又はＬ鎖の断片のどの位置にあってもよい。細胞溶解性ドメインは、抗体Ｈ鎖又はＬ鎖のアミノ末端、又はカルボキシル末端に位置してもよいが、これらには限定されない。付加的なドメイン（例えば、第３、第４、第５、第６、第７のドメイン等）が存在する場合、付加的なドメインもどの位置にあってもよい。
【０１０３】
第１の部分の抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、及びそれらの断片、及び第２の（細胞溶解性）ドメイン（及び存在すれば、付加的なドメイン）は、共有結合又は非共有結合によって互いに融合又は接合できる。第１の部分の抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、及びそれらの断片、及び第２の（細胞溶解性）ドメイン（及び存在すれば、付加的なドメイン）は、互いに隣接してもよく、又はこれら２つのドメインの間に位置するヒンジ、スペーサ、又はリンカなどの介在領域によって隔てられてもよい。
【０１０４】
リンカ又はスペーサの例としては、連続的炭素原子（Ｃ）鎖（例えば、ＣＣＣＣＣ）などの非ペプチドリンカ又はスペーサがある。多炭素鎖は、グルタル酸、コハク酸、及びアジピン酸などのカルボキシル酸（例えば、ジカルボン酸）を含む。具体的な例としては、アルファ−アミノカプロン酸などの六炭素リンカがあるが、これには限定されない。
【０１０５】
リンカ又はスペーサのさらなる例としては、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はそれらの断片と、第２の（細胞溶解性）ドメイン（又は存在すれば、付加的なドメイン）との間に位置するペプチドスペーサ又はリンカなどの、一又は複数のアミノ酸残基がある。ペプチドスペーサ又はリンカの配列は、任意の長さを有するが、通常は約１から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、又は４０から５０のアミノ酸残基からなる。特定の実施形態において、２つ（又はそれ以上）のドメインの間に位置するペプチドスペーサ又はリンカは、１から５、１から１０、１から２０、１から２５のＬ又はＤアミノ酸残基、又は１から４、１から６、又は１から８のＬ又はＤアミノ酸残基からなる。第１及び第２のドメインの間に位置する配列に含まれる具体的なアミノ酸残基には、Ａ、Ｓ、又はＧアミノ酸残基のうちの一又は複数が含まれる。第１及び第２のドメインの間に位置するペプチドの具体的な例としては、以下に含まれる配列があるが、これには限定されない。ここでＧＳＧＧＳ（配列ＩＤ番号９）、ＡＳＡＡＳ（配列ＩＤ番号８）、又は特定のリンカ配列の倍数（ＧＳＧＧＳ（配列ＩＤ番号９））ｎ、又は（ＡＳＡＡＳ（配列ＩＤ番号８））ｎ、ただしｎは１から５、５から１０、１０から２０など。アミノ酸及びペプチドの誘導体が２つ（又はそれ以上）のドメインの間に位置してもよい。アミノ酸誘導体の具体的な例としては、リジン誘導体があるが、これには限定されない。
【０１０６】
スペーサ又はリンカ、又は第３、第４、第５、第６、第７のドメイン等を有する又は有しない結合体は、その全体が天然のアミノ酸又は合成された非天然のアミノ酸又はアミノ酸類似体から構成され、又は誘導体化された形態を含む。様々な実施形態において、結合体は、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、又はそれらの断片、及び／又は第２の（細胞溶解性）ドメイン（及び存在すれば、付加的なドメイン）内に、一又は複数のＤアミノ酸、Ｄアミノ酸とＬアミノ酸の混合物、又は全体がＤアミノ酸残基で構成された配列を含む。
【０１０７】
結合体は、非天然の構造を有する構成要素の任意の組合せを含むことができ、これらの構成要素は３つの構造グループからなる。ａ）天然のアミド結合（「ペプチド結合」）以外の残基連結グループ、ｂ）自然に発生するアミノ酸残基の代わりの非天然残基、又はｃ）二次的な構造的擬態を誘発する、すなわち、二次的な構造、例えばアルファへリックスコンフォーメーションを誘発又は安定化する残基。結合体は、分子のアミノ末端及びカルボキシ末端の間の末端間アミノ結合、又は分子内又は分子間のジスルフィド結合などの循環構造を含む。結合体は生体外又は生体内で修飾され、例えば、翻訳後に修飾されて、例えば、糖質又は炭水化物残基、リン酸基、脂肪酸、脂質を含んでもよい。
【０１０８】
付加の具体的な例としては、第３、第４、第５、第６、又は第７のドメインがある。よって、２つのドメインを有する結合体は、それらのドメインに共有結合される一又は複数の付加的な（第３、第４、第５、第６、第７などの）ドメインを含むことができ、これらの付加的なドメインが、異なる又は相補的な機能又は活性を付与する。付加的なドメインの例としては、単離を容易にするドメインがあり、このドメインは例えば、固定された金属に対する精製を可能にするポリヒスチジントラクト及びヒスチジントリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロブリンに対する精製を可能にするプロテインＡ結合ドメイン、及びＦＬＡＧＳ拡張／親和性精製システムで用いられるドメイン（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，  Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）を含む。精製ドメインと結合体との間にＦａｃｔｏｒ  Ｘａ又はエンテロキナーゼなどの切断可能な配列を任意に含ませることによって、精製を容易にすることができる。例えば、発現ベクターは、６つのヒスチジン残基と結合された結合体符号化核酸配列と、その後のチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位を含むことができる。ヒスチジン残基は結合体の検知と精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位は構造体を精製してプロテインの残りを取り除く手段を提供する（例えば、Ｋｒｏｌｌ，  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２：４４１  （１９９３年）を参照）。
【０１０９】
結合体の活性は様々な要因で影響を受けるため、これらの要因の一又は複数を考慮することによって結合体を設計又は最適化することができる。このような要因は、例えば、細胞に対する毒性に影響を与える長さである。細胞溶解性ペプチドドメインを形成するアルファへリックスの細胞殺滅活性は、当該へリックスの安定性にも依存し得る。リンカ及びスペーサは、細胞溶解性ドメインの膜相互作用及び細胞溶解性ドメインの螺旋構造に影響を与え得る。細胞溶解性ペプチドドメインの電荷も、ドメイン内に存在する特定のアミノ酸残基によって部分的に判別されるが、細胞殺滅能力に影響を与える。細胞溶解性ドメイン（特にアミノ酸残基、又はＮ又はＣ末端）に対する抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、及び第２の（細胞溶解性）ドメイン（及び存在すれば、付加的なドメイン）の配置も、結合体の細胞殺滅活性に影響を与え得る。
【０１１０】
一又は複数の非自然発生的なアミノ酸又は誘導体を用いて細胞溶解性ペプチドドメインを構築することによって、生体内の結合体の半減期を増加させることができる。例えば、Ｄアミノ酸を有する（例えば、すべての残基のうちの最大３０％、４０％、５０％、６０％、又はそれ以上がＤエナンチオマーである）結合体は、漿液加水分解に対する耐性があるため、より長い時間活性を維持することができ、生体内能力を増加させる。さらに、一又は複数の非自然発生的なアミノ酸又は誘導体を用いて細胞溶解性ペプチドドメインを構築することによって、溶血性の活性を低減することができる。また、このようなＤエナンチオマーを有する結合体は、溶液内でモノマーになる強い傾向を有し、有意に集合することはない。
【０１１１】
ペプチド及びペプチド模倣薬は、当該技術分野で知られている方法を用いて生産及び単離することができる。当該技術分野で知られた化学的な方法（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  （１９８０年）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ２１５；  Ｈｏｒｎ  （１９８０年）；  及び  Ｂａｎｇａ，  Ａ．Ｋ．，  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （１９９５年）  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ参照）を使用して、ペプチドの全体又は部分を合成することができる。ペプチドの合成は、様々な固相法（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２  （１９９５年）；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２８９：３（１９９７年）参照）を用いて行うことができ、また、製造者の指示に従って、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  ペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、自動化合成を実現してもよい。ペプチド及びペプチド模倣薬は、組合せ法を用いて合成することができる。模倣薬を組み込んだ合成残基及びポリペプチドは、当該技術分野において知られた様々な手順及び方法を用いて合成することができる（例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ  Ｖｏｌｕｍｅｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  ＮＹを参照）。化学修飾法を用いて修飾されたペプチドを生産することができる（例えば、Ｂｅｌｏｕｓｏｖ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３４４０  （１９９７年）；  Ｆｒｅｎｋｅｌ，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．  １９：３７３  （１９９５年）；  ａｎｄ  Ｂｌｏｍｍｅｒｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６  （１９９４年）参照）。
【０１１２】
本発明はさらに、本発明の結合体を符号化した核酸（及び抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、及びそれらの断片の部分、及び第２の（細胞溶解性）ドメイン、及び存在すれば、付加的なドメイン）、及び結合体を符号化した核酸を含むベクターを提供する。本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ヌクレオチド配列、プライマ、オリゴヌクレオチドまたはプローブとも称されうる核酸は、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドまたは混合されたポリリボ―ポリデオキシリボヌクレオチドおよびそのαアノマー型のいずれかである任意の長さの、自然または修飾されたプリンおよびピリミジン含有ポリマーをさす。２つ以上のプリン及びピリミジン含有ポリマーは、通常リン酸エステル結合又はその類似体によって結合される。上記の用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含めて、すべての形態の核酸を交換可能に指し示すことができる。核酸は、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖、及び線形又は循環式であってもよい。核酸にはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及びアンチセンスを含む。ＲＮＡ核酸はスプライスされた、又はスプライスされていないｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、又はアンチセンスであってよい。核酸は自然発生又は合成のものを含み、並びにヌクレオチド類似体及び誘導体を含む。
【０１１３】
遺伝情報の縮重の結果、核酸は本発明の結合体を符号化した配列に対して縮重配列を含む。このように、結合体を符号化した縮重核酸配列が提供される。
【０１１４】
核酸は、様々な既知の標準的なクローニング及び化学合成法を用いて生産することができ、また部位特異的な突然変異誘発又は当業者に知られたその他の組み換え技術を用いて、意図的に改変することができる。ポリヌクレオチドの純度は、シーケンシング、ゲル電気泳動、ＵＶ分光測定により測定可能である。
【０１１５】
核酸は核酸構造体の中に挿入され、その中で核酸の発現は、本明細書において「発現カセット」と呼ばれる「発現制御要素」によって影響され、又は調整されている。「発現抑制要素」という用語は、核酸配列の発現を調整し又はそれに影響する一又は複数の核酸配列要素を指す。発現制御要素は必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネータ、遺伝子サイレンサ、プロテイン符号化遺伝子の前の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）などを含み得る。
【０１１６】
核酸配列に作動的に結合された発現制御要素は、核酸配列の転写及び、必要に応じて翻訳を制御する。「作動的に結合」という用語は並列を意味し、対象の構成要素が意図したように機能することができる関係にあることを示す。通常、発現制御要素は遺伝子の５’又は３’末端に並列しているが、イントロンであってもよい。
【０１１７】
発現制御要素は、構造的に転写を活性化し、誘導可能な（すなわち、活性化には外的シグナルを要する）要素、又は抑圧解除可能な（すなわち、転写を停止するにはシグナルを要し、シグナルが存在しない場合、転写は活性化又は「抑圧解除」される）要素を含む。また、本発明の発現カセットに含まれるのは、特定の細胞種類又は組織について制御可能な遺伝子発現を行うのに十分な制御要素（すなわち、組織特異的な制御要素）である。通常、このような要素は符号化配列の上流又は下流（すなわち、５’及び３’）に配置される。プロモータは一般的に符号化配列の５’に配置される。プロモータは、組み換えＤＮＡ又は合成技術によって生産されるが、本発明のポリヌクレオチドの転写を行うために用いることができる。「プロモータ」は、転写を指示するために十分な最小限の配列要素を意味する。
【０１１８】
核酸をプラスミドに挿入して宿主細胞内で増殖させ、その後必要に応じて遺伝子操作を行ってもよい。プラスミドは宿主細胞内で安定的に増殖できる核酸であり、プラスミドは核酸の発現を促進するために発現制御要素を含むこともできる。本明細書においてベクターはプラスミドと同義に用いられ、宿主細胞内での発現のために発現制御要素を含むこともできる。プラスミド及びベクターは、通常、細胞内で増殖させるための複製開始点、及びプロモータを少なくとも含む。よってプラスミド及びベクターは、例えば、結合体を符号化した核酸の遺伝子操作、結合体又はアンチセンス核酸の生産、及び宿主細胞及び生体内の結合体の発現に有用である。
【０１１９】
細菌系プロモータは、Ｔ７、及びバクテリオファージλのｐＬ、ｐｌａｃ、ｐｔｒｐ、ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモータ）、及びテトラサイクリン応答性プロモータなどの誘導性プロモータを含む。昆虫細胞系プロモータは、構成的または誘導性プロモータ（例えばエクジソン）を含む。哺乳類細胞構成的プロモータは、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ウシ乳頭腫ウィルス（ＢＰＶ）および他のウィルスプロモータ、または哺乳類細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインＩＩＡプロモータ；熱ショックプロモータ）または哺乳類ウィルス（例えば、アデノウィルス後期プロモータ；誘導性マウス乳癌ウィルス末端反復配列）に由来する誘導性プロモータを含む。あるいは、適切な宿主細胞においてタンパク質または抗体を導入し、結合体の発現を導くために、レトロウィルスゲノムが遺伝子操作されうる。
【０１２０】
発現系には、ｉｎ  ｖｉｖｏの使用のために設計されたベクターがさらに含まれる。特定の非限定的な例には、アデノウィルスベクター（米国特許第５，７００，４７０号および第５，７３１，１７２号）、アデノ関連ベクター（米国特許第５，６０４，０９０号）、単純ヘルペスウィルスベクター（米国特許第５，５０１，９７９号）、レトロウィルスベクター（米国特許第５，６２４，８２０号、第５，６９３，５０８号および第５，６７４，７０３号）、ＢＰＶベクター（米国特許第５，７１９，０５４号）およびＣＭＶベクター（米国特許第５，５６１，０６３号）が含まれる。
【０１２１】
酵母ベクターは、構成的および誘導性プロモータを含む（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ等、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻、第１３章、編，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８；Ｇｒａｎｔ等、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６（１９８７），編．Ｗｕ  ＆  Ｇｒｏｓｓｍａｎ；Ｂｉｔｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５２：６７３（１９８７），編．Ｂｅｒｇｅｒ  ＆  Ｋｉｍｍｅｌ，Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；およびＳｔｒａｔｈｅｒｎ等、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（１９８２）編．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，第ＩおよびＩＩ巻を参照）。ＡＤＨまたはＬＥＵ２等の構成的イーストプロモータまたはＧＡＬ等の誘導性プロモータが用いられうる（Ｒ．Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ  ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第１１巻、第３章、編．Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，ワシントンＤ．Ｃ．，１９８６）。例えば相同的組み換えによる、イースト染色体への外来核酸配列の組み入れを促進するベクターは、従来技術において周知である。挿入されるポリヌクレオチドが、従来のベクターに大きすぎる（例えば約１２Ｋｂ以上）場合に、イースト人工染色体（ＹＡＣ）が典型的に使用される。
【０１２２】
発現ベクターは、選択圧に対する耐性を与える選択可能マーカまたは識別可能マーカ（例えばβ―ガラクトシダーゼ）も含み得、これにより、選択されるベクターを有する細胞の選択、成長および増殖が可能となる。あるいは、選択可能マーカは、結合体を符号化した核酸を含む第一ベクターと宿主細胞中に同時トランスフェクションされる、第二ベクター上に存在しうる。
【０１２３】
選択系には、それぞれｔｋ―、ｈｇｐｒｔ―またはａｐｒｔ―細胞において用いられうる、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ等、Ｃｅｌｌ  １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン―グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ４８：２０２６（１９６２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ等、Ｃｅｌｌ  ２２：８１７（１９８０））遺伝子が含まれるがこれに限られない。さらに、抗代謝耐性が、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｏ’Ｈａｒｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１５２７（１９８１））；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ遺伝子（Ｍｕｌｌｉｇａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ―４１８に対する耐性を与えるネオマイシン遺伝子（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ―Ｇａｒａｐｉｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１（１９８１））；ピューロマイシン；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるハイグロマイシン遺伝子（Ｓａｎｔｅｒｒｅ等、Ｇｅｎｅ  ３０：１４７（１９８４））の選択の基礎として用いられうる。追加的な選択可能遺伝子には、細胞がトリプトファンに代えてインドールを利用することを許容するｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンに代えてヒスチノールを利用することを許容するｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８０４７（１９８８））；およびオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤２―（ジフルオロメチル）―ＤＬ―オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を与えるＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が含まれる。
【０１２４】
結合体を発現する宿主細胞、及び結合体（例えば、抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、及びそれらの断片、及び第２の（細胞溶解性）ドメイン、及び存在すれば、さらなるドメイン）を符号化した核酸によって形質転換された宿主細胞、及びこれらの結合体を符号化した核酸を含むベクターが提供される。一実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。一実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。様々な態様において、真核細胞はイースト又は哺乳動物（例えば、ヒト、霊長目）細胞である。
【０１２５】
本明細書で用いられるように、「宿主細胞」とは、核酸が導入されて増殖し、転写され、又は発現された結合体を符号化した細胞である。この用語は、宿主細胞のあらゆる子孫又はサブクローンをも含む。宿主細胞は結合体を発現する細胞を含む。
【０１２６】
宿主細胞には、細菌およびイースト等の微生物；および植物、昆虫および哺乳類細胞が含まれるがこれに限られない。例えば、組換えバクテリオファージ核酸、プラスミド核酸またはコスミド核酸発現ベクターにより形質転換される細菌；組換えイースト発現ベクターにより形質転換されるイースト；組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウィルス、ＴＭＶ）によりインフェクションされるか、組換えプラスミド発現ベクター（例えばＴｉプラスミド）により形質転換される植物細胞系；組換えウィルス発現ベクター（例えばバキュロウィルス）によりインフェクションされる昆虫細胞系；および組換えウィルス発現ベクター（例えばレトロウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス）によりインフェクションされる動物細胞系、または一時的または安定的増殖または発現のために操作される形質転換動物細胞系が、提供される。
【０１２７】
抗体及びポリペプチド結合体、結合体を符号化した核酸、及び結合体を発現するか、又は結合体を符号化した核酸によって形質転換されたベクターは、隔離又は精製された形態を含む。本発明の結合体又は組成物の修飾語として使用される場合の、用語「単離された」は、組成物が人工的に作製されるか、実質的に完全にまたは少なくとも部分的に、自然のｉｎ  ｖｉｖｏ環境から分離されることを意味する。一般に、単離された組成物は、自然で通常伴われる一つ以上の物質、例えば一つ以上のタンパク質、核酸、脂質、炭水化物、細胞膜を実質的に伴わない。用語「単離される」は、マルティマー／オリゴマー、変異体、修飾または誘導体化された形態等の組成物の代替的物理的形態、または人工的に作製された宿主細胞に発現される形態を除外しない。用語「単離される」は、組み合わせのいずれかが人工的に作製される組み合わせがある形態（例えば医薬製剤および組み合わせ組成物）も除外しない。
【０１２８】
自然で通常伴われる物質を一部、相当数、ほとんどまたは全て含まない場合に、「単離される」組成物は、「精製される」ともなりうる。したがって、実質的に純粋でもある単離された結合体は、例えばタンパク質ライブラリのタンパク質またはゲノムまたはｃＤＮＡライブラリの核酸等、無数の他の配列中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含まない。「精製された」組成物は、一つ以上の他の分子と組み合わせられうる。
【０１２９】
本発明によれば、結合体の混合物または組み合わせの組成物が提供される。一実施形態においては、混合物は、一又は複数の結合体及び薬理学上許容できるキャリア又は賦形剤を含む。他の実施形態においては、混合物は、一又は複数の結合体及び抗細胞増殖、抗腫瘍、抗癌、又は抗新生物治療薬又は薬剤を含む。さらなる実施形態においては、混合物は、一又は複数の結合体及び免疫増強薬剤を含む。薬理学上許容可能なキャリア又は賦形剤内の一又は複数の結合体と、抗細胞増殖、抗腫瘍、抗癌、又は抗新生物治療薬又は薬剤、及び免疫増強治療薬又は薬剤のうちの一又は複数との組合せが提供される。
【０１３０】
標的（例えば、受容体）と結合する抗体、Ｈ鎖、Ｌ鎖、及びそれらの断片、及び第２の（細胞溶解性）ドメインなどの、本発明の結合体は標的細胞の溶解、細胞死、又はアポトーシスのために用いることができる。このような細胞は選択的に標的化することができる。例えば、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ又はＣＤ２０などの受容体を発現する細胞を結合体によって標的化し、それによって、受容体をほとんど発現しない細胞よりも優先的に殺滅することができる。
【０１３１】
本発明によれば、標的（例えば、受容体）を発現する細胞の増殖を低減又は阻害する方法及び用法、及び細胞増殖を低減又は阻害する方法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、標的発現細胞を、当該細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含む。一実施形態において、方法は、標的発現細胞を、細胞増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含む。
【０１３２】
また、標的（例えば、受容体）を発現する高増殖性細胞の増殖を低減又は阻害する方法及び用法、及び標的（例えば、受容体）を発現する高増殖性細胞の増殖を低減又は阻害する方法及び用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、高増殖性標的発現細胞又は高増殖性標的発現細胞を、増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含む。
【０１３３】
さらに、標的（例えば、受容体）を発現する非転移性又は転移性の新生物、癌、腫瘍、及び悪性細胞の増殖を低減又は阻害する方法及び用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、新生物、癌、腫瘍、又は悪性標的発現細胞を、標的発現細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含む。
【０１３４】
さらに、標的（例えば、受容体）を発現する休眠状態の又は分裂しない非転移性又は転移性の新生物、癌、腫瘍、及び悪性細胞の増殖を低減又は阻害する方法及び用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、休眠状態の又は分裂しない新生物、癌、腫瘍、又は悪性標的発現細胞を、休眠状態の又は分裂しない細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含む。
【０１３５】
さらに、標的（例えば、受容体）を発現する細胞（例えば、高増殖性細胞）の増殖を選択的に低減又は阻害する方法及び用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、標的発現細胞を、当該細胞（例えば、高増殖性細胞）の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含み、この結合体は当該細胞によって発現された標的（例えば、受容体）と結合する。
【０１３６】
さらに、標的（例えば、受容体）を発現する新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を選択的に低減又は阻害する方法及び用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、細胞を、新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害するのに十分な量の結合体に接触させる工程を含み、この結合体は当該細胞によって発現された標的（例えば、受容体）と結合する。
【０１３７】
「接触」という用語は、２以上のエンティティの間（例えば、結合体と標的及び／又は細胞との間）の間接的な結合又は相互作用を意味する。本明細書で用いられる接触とは、溶液内、固相内、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、細胞内、及びｉｎ  ｖｉｖｏを含む。ｉｎ  ｖｉｖｏの接触は、投与と呼ばれる。
【０１３８】
非選択的に又は選択的に増殖を低減又は阻害する標的となる細胞は、標的（例えば、受容体）を発現する細胞を含む。よって、このような細胞には、乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頚部細胞、胃細胞、肺細胞、胃部細胞、結腸細胞、膀胱細胞、膠細胞、真皮細胞（例えば、メラニン細胞）、血液細胞、及び子宮内膜細胞が含まれるが、これらには限定されない。
【０１３９】
本発明の結合体、方法及び用法は、標的（例えば、受容体）を発現する細胞を含む有害な又は異常な細胞増殖及び高増殖性疾患の治療にも適用できる。したがって、本発明によれば、有害な又は異常な細胞増殖及び高増殖性疾患を治療する方法又は用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、（治療の必要がある）対象に、有害な又は異常な細胞増殖又は高増殖性疾患を治療するのに十分な量の結合体を投与する工程を含む。
【０１４０】
「高増殖性疾患」という用語は、あらゆる有害な又は異常な細胞の生存（例えば、予定された細胞死又はアポトーシスが行われないこと）、成長、又は増殖を指す。このような高増殖性疾患は、良性の異常増殖、非転移性及び転移性の新生物、癌、腫瘍、及び悪性細胞を含む。有害な又は異常な細胞増殖及び高増殖性疾患は、対象内のあらゆる細胞、組織、器官に影響し得る。有害な又は異常な細胞増殖及び高増殖性疾患は、対象内で、局所的に、特定部位に、又は全身に存在し得る。高増殖性疾患は多数の組織及び器官から発生し得る。これらの組織及び器官には、乳房、肺（例えば、小細胞又は非小細胞）、甲状腺、頭頸部、脳、鼻咽頭、咽喉、鼻腔、リンパ系、副腎、下垂体、甲状腺、リンパ、胃腸（口、食道、胃、十二指腸、回腸、空腸（小腸）、結腸、直腸）、尿生殖路（子宮、卵巣、膣、子宮頸、子宮内膜、卵管、膀胱、精巣、陰茎、前立腺）、腎臓、膵臓、肝臓、骨、骨髄、リンパ、血液（血液）、脳（神経膠）、筋肉、皮膚、真皮（例えば、メラニン細胞）、及び幹細胞があるが、これらには限定されない。これらから他の二次的部位に転移することもあるが、しないこともある。
【０１４１】
本発明の結合体及び方法及び用法は、あらゆる細胞、器官、又は組織に由来する転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物に適用できる。このような疾患は、事実上あらゆる種類の細胞又は組織に影響する。それは例えば、癌腫、肉腫、黒色腫、神経及び網内系又は造血系新生物疾患（例えば、骨髄腫、リンパ腫、又は白血病）である。
【０１４２】
本明細書で用いられるように、「新生物」及び「腫瘍」という用語は、正常の場合よりも成長、増殖、又は生存が増強された、例えば、細胞増殖又は分化疾患を有する細胞、又は細胞の集団を指す。腫瘍とは明確な集団又は増殖物を形成した新生物である。「癌」又は「悪性腫瘍」とは、隣接する空間、組織、又は器官に侵入する新生物又は腫瘍のことである。「転移」は、原発部位から対象内の一又は複数の二次部位に散在又は拡散した新生物、腫瘍、癌、又は悪性腫瘍を指すが、この二次部位は原発腫瘍又は癌とは別個のものである。このような細胞のすべて又は一部は標的（例えば、受容体）を発現できるため、本発明に従う結合体によって標的化され得る。
【０１４３】
新生物、腫瘍、癌、及び悪性細胞（転移性又は非転移性）は、休眠状態の又は残存する新生物、腫瘍、癌、及び悪性細胞を含み、そのすべて又は一部が標的（例えば、受容体）を発現する。通常、このような細胞は分裂していない残存腫瘍細胞から構成される（Ｇ０−Ｇ１停止）。これらの細胞は原発部位に残存するか、又は拡散した新生物、腫瘍、又は悪性細胞として残存することができ、微小残余病変となる。これらの休眠状態の新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞は無症状のままであるが、これらの休眠状態の細胞が一旦増殖すると、深刻な症状及び死をもたらす。本発明の方法を用いて、休眠状態の新生物、腫瘍、癌、又は悪性細胞の増殖を低減又は阻害することが可能であり、それによって腫瘍又は癌の再発、又は腫瘍又は癌の転移又は進行を低減又は阻害することができる。
【０１４４】
本発明によれば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物を有する対象を治療する方法が提供される。一実施形態において、方法は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物を治療（例えば、増殖を低減又は阻害）するのに十分な量の結合体を、（治療が必要な）対象に投与する工程を含む。
【０１４５】
転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物は、どの段階にあってもよく、例えば、段階I、II、III、IV、Vなど、早期の又は進行した段階となり得る。転移性又は
非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物は、前治療が行われたものでも、安定化状態（非進行）でも、寛解状態でもよい。
【０１４６】
転移については、本発明の方法を用いて原発腫瘍又は癌の他の部位への転移、又は原発腫瘍又は癌から離れた他の部位における転移腫瘍又は癌の形成又は定着を低減又は阻害し、これにより、腫瘍又は癌の再発又は腫瘍又は癌の進行を阻害又は低減することができる。よって、本発明の方法は、とりわけ、１）潜在的に又は実際に転移を発生させる腫瘍又は癌細胞（例えば、散在性の腫瘍細胞（ＤＴＣ））の成長、増殖性、移動性、又は侵襲性を低減又は阻害する工程と、２）原発性の腫瘍又は癌から前記原発性の腫瘍又は癌とは異なる一又は複数の他の部位、位置、又は領域への転移の形成又は確立を低減又は阻害する工程と、３）転移が形成又は確立された後に、前記原発性の腫瘍又は癌とは異なる一又は複数の他の部位、位置、又は領域における転移の成長又は増殖を低減又は阻害する工程と、４）転移が形成又は確立された後に、さらなる転移の形成又は確立を低減又は阻害する工程と、を含む。
【０１４７】
転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物の細胞（そのすべて又は一部が標的（例えば、受容体）を発現する）が集合して「固形」の細胞塊になるか、又は分散もしくは拡散する。「固形」の腫瘍とは、通常集合して塊を形成する癌、新生物又は転移癌を指す。具体的な例としては、乳腺細胞、卵巣細胞、子宮細胞、子宮頚部細胞、胃細胞、肺細胞、胃部細胞、結腸細胞、膀胱細胞、膠細胞、真皮細胞（例えば、メラニン細胞）、及び子宮内膜細胞の腫瘍／癌が含まれるが、これらには限定されない。
【０１４８】
上皮または内分泌組織の悪性病変をさす癌腫は、呼吸器系癌腫、胃腸系癌腫、泌尿生殖系癌腫、精巣癌腫、乳腺癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫を含む。典型的な癌腫には、子宮、頸部、肺、前立腺、乳腺、頭頸部、結腸、膵臓、精巣、副腎、腎臓、食道、胃、肝臓および卵巣から形成するもの含まれる。用語は、例えば癌および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む、癌肉腫も含む。腺癌は、腺組織の癌腫、または腫瘍が腺様構造を形成するものを含む。
【０１４９】
肉腫は、間葉系細胞起源の悪性腫瘍をさす。例示的な肉腫は、例えばリンパ肉腫、脂肪肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫および繊維肉腫を含む。
【０１５０】
神経新生物は、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、希突起膠細胞腫を含む。
【０１５１】
通常は固形塊を形成しないためにびまん性の新生物をさす「液性腫瘍」。具体例には、リンパ腫、骨髄腫および白血病等の、細網内皮系または造血系の新生物が含まれる。白血病の非限定的な例には、急性および慢性リンパ芽球、骨髄芽球性および多発性骨髄腫が含まれる。典型的に、このような病気は、低分化型急性白血病、例えば赤芽球性白血病および急性巨核芽球性白血病から生じる。具体的な骨髄性疾患には、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）が含まれるがこれに限られない。リンパ性悪性疾患には、Ｂ細胞系統ＡＬＬおよびＴ細胞系統ＡＬＬを含む急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、有毛状細胞性白血病（ＨＬＬ）、およびワルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ）が含まれるがこれに限られない。具体的な悪性リンパ腫には、非ホジキンリンパ腫およびその異型、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大型顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、およびリード―シュテルンベルク病が含まれるがこれに限られない。
【０１５２】
本明細書に開示するように、有害な又は異常な細胞増殖又は高増殖性疾患は、子宮、乳房、膣、子宮頚部、子宮内膜、及び卵管で発生し得る。よって、本発明によれば、子宮、乳房、膣、子宮頚部、子宮内膜、及び卵管の高増殖性疾患を治療する方法及び用法が提供される。一実施形態において、方法又は用法は、子宮、乳房、膣、子宮頚部、子宮内膜、及び卵管の高増殖性疾患を治療するのに十分な量の結合体を対象に投与する工程を含む。
【０１５３】
抗細胞増殖活性又は効果を有する組成物、治療法、プロトコル、療法を結合体と組み合わせるか、又は本発明の方法又は用法の中で組み合わせて用いてもよい。従って、本発明の結合体及び方法及び用法は、抗増殖、抗腫瘍、抗癌、抗新生物、及び抗転移の治療、プロトコル、及び療法を含み、これには、腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物の成長、進行、転移、増殖、又は生存などの高増殖性疾患、又は生体外又は生体内における悪化を阻害、縮小、妨害、遅延、低減、又は防止する、他の任意の組成物、治療、プロトコル、又は治療法が含まれる。抗増殖（例えば腫瘍）療法の非限定的な具体例には、化学療法、免疫療法、放射線療法（電離又は化学的）、局所的熱（温熱療法）療法、外科用切除、及びワクチン接種が含まれる。結合体は、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、抗転移、又は免疫増強治療又は療法の適用の前、それと実質的に同時、又はその後に投与することができる。結合体は、抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、抗新生物、又は免疫増強治療又は療法、転移性又は非転移性腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物との組合せの組成物として投与又は使用することができる。
【０１５４】
抗増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、及び抗転移組成物、療法、プロトコルまたは治療は、細胞周期進行または細胞増殖を防止、妨害、中断、阻害または遅延させ；アポトーシスまたは細胞死を刺激または増強し、核酸またはタンパク質合成または代謝を阻害し、細胞分裂を阻害し、または細胞生存、または必要な細胞生存因子、成長因子またはシグナリング経路（細胞外または細胞内）の産生または利用を減少、低減または阻害するものを含む。抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、及び抗転移活性を有する化学薬品クラスの非限定的な例には、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物エキス、植物アルカロイド、ニトロソウレア、ホルモン、ヌクレオシドおよびヌクレオチドアナログが含まれる。抗細胞増殖、抗新生物、抗腫瘍、抗癌、及び抗転移活性を有する薬物の具体的な例には、シクロホスファミド、アザチオプリン、サイクロスポリンＡ、プレドニソロン、メルファラン、クロランブシル、メクロレタミン、ブスルファン、メトトレキセート、６―メルカプトプリン、チオグアニン、５―フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、ＡＺＴ、５―アザシチジン（５―ＡＺＣ）、およびデシタビン（５―アザ―２’デオキシシチジン）、シタラビン、１―ベータ―Ｄ―アラビノフラノシル―５―アザシトシンおよびジヒドロ―５―アザシチジン等の５―アザシチジン関連化合物、ブレオマイシン、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、マイトマイシンＣ、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾトシン、ヒドロキシウレア、シスプラチン、ミトタン、プロカルバジン、ダカルバジン、タキサン（例えば、タキソール又は、パクリタキセル）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ドキソルビシンおよびジブロモマンニトールが含まれる。
【０１５５】
本結合体及び方法及び用法とともに適用可能な追加的な薬剤が当業者に知られ、用いられうる。例えば、結合体に用いられる抗体とは異なる抗体、細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、及びケモカインなどの生物製剤を投与又は使用することができる。モノクローナル抗体の例としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、ペルツズマブ（Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ラニビズマブ（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標））、セキュキマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標））、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、イピリムマブ、ザルツムマブ、ダロツズマブ、フィギツムマブ、ラムシルマブ、ガリキシマブ、ファレツズマブ、オクレリズマブ、オファツムマブ（Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標））、トシツムマブ、イブリツモマブ、２Ｆ２（ＨｕＭａｘ−ＣＤ２０）、７Ｄ８、ＩｇＭ２Ｃ６、ＩｇＧ１  ２Ｃ６、１１Ｂ８、Ｂ１、２Ｈ７、ＬＴ２０、１Ｆ５、又はＡＴ８０ダクリズマブ（Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標））、クローンＡ９Ｅ４、Ｆ１Ｇ４、ＡＴ２Ｇ７、ＧＮＲＨ０３、ＧＮＲＨＲ２などの抗ＬＨＲＨ受容体抗体があり、これらはとりわけ本発明に従う結合体と組み合わせて用いることができる。
【０１５６】
本発明の結合体との共用に適用できるその他の標的化薬剤は、キナーゼ阻害剤である。例えば、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標））、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標））、ソラフェニブ（Ｎｅｖａｘａｒ（登録商標））、ニロチニブ（Ｔａｓｉｇｎａ（登録商標））である。細胞成長因子、細胞生存因子、細胞分化因子、サイトカイン、及びケモカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、ＴＮＦβ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、エオタキシン、エオタキシン−２、Ｉ−３０９／ＴＣＡ３、ＡＴＡＣ、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＬＡＲＣ／ＭＩＰ−３α、ＰＡＲＣ、ＴＡＲＣ、ＣＫβ、ＣＫβ６、ＣＫβ７、ＣＫβ８、ＣＫβ９、ＣＫβ１１、ＣＫβ１２、Ｃ１０、ＩＬ−８、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２、ＰＢＰ／ＣＴＡＰＩＩＩ−ＴＧ／ＮＡＰ−２、Ｍｉｇ、ＰＢＳＦ／ＳＤＦ−１、及びｌｙｍｐｈｏｔａｃｔｉｎがあるが、これらには限定されない。
【０１５７】
さらなる例は、免疫増強治療及び療法であり、細胞ベースの治療法を含むが、これには限定されない。特に、免疫増強治療及び療法は、リンパ球、形質細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞を含む。
【０１５８】
転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物を治療する方法及び用法、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物を有している、又は有しているリスクのために治療が必要な対象を治療する方法及び用法、抗増殖、抗腫瘍、抗癌、抗新生物、又は抗悪性腫瘍療法の効果を高める、または改善する方法及び用法が提供される。各実施形態において、方法は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変、又は新生物を有するかそのリスクがある対象に、結合体を、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または、新生物を治療するために十分な量、投与するステップと；対象に、結合体を、対象を治療するために十分な量、投与するステップと；転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または、新生物の療法を受けているか受けた対象に、結合体を、抗増殖、抗腫瘍、抗癌、抗新生物、又は抗悪性病変療法の効果を高めるために十分な量、投与するステップとを含む。
【０１５９】
本発明の方法及び用法は、有害又は異常な細胞増殖又は高増殖性疾患の存在、例えば一つ以上の症状の所見の前（すなわち予防）、同時または後に実施されうる。結合体を、有害又は異常な細胞増殖または高増殖性疾患の症状の発現の前、同時または直後に投与又は使用することにより、対象における一つ以上の症状の発生、頻度、重症度、進行または持続時間が減少しうる。さらに、結合体を、有害又は異常な細胞増殖または高増殖性疾患の一つ以上の症状の発現の前、同時または直後に投与することにより、高増殖性細胞（例えば癌転移）が、対象の他の領域、組織または臓器に広がること、及び高増殖性細胞（例えば癌転移）が、対象の他の領域、組織または臓器に定着することを減少または防止しうる。
【０１６０】
本発明の結合体及び方法及び用法、例えば、治療法及び用法は、対象に検出可能または測定可能な治療的利益または改善を提供しうる。治療的利益または改善は、対象に対する任意の測定可能または検出可能、客観的または主観的、一時的、一過性、または長期的利益、または、対象の組織、臓器、細胞または細胞集団の、状態、疾患または病気、有害な症状、または根本原因の任意の程度の改善である。
【０１６１】
治療的利益または改善には、疾患、病気または状態と関連した一つ以上の症状または合併症、または疾患、病気または状態の根本原因または影響の発生、頻度、重症度、進行または持続時間の低減または減少が含まれるがこれに限られない。したがって、本発明の結合体及び方法及び用法には、治療的利益または改善を対象に提供するステップが含まれる。
【０１６２】
治療的利益または改善が所望の結果である本発明の方法又は用法においては、結合体が、必要な対象に、十分または有効な量、投与されうる。「十分な量」または「有効な量」は、単一用量または複数用量で、単独または一つ以上の他の組成物（化学療法または免疫刺激薬物等の治療剤）、治療、プロトコル、または治療計画薬剤との組み合わせにおいて、任意の持続時間の（長期または短期の）検出可能な反応、任意の測定可能または検出可能な程度、または任意の持続時間の、対象における所望の結果または対象に対する利益を提供する量をさす。（例えば、治療的利益または改善を提供するための）治療のための用量または「十分な量」または「有効な量」は、典型的には、疾患、病気または状態、または疾患、病気または状態の一つ、複数または全ての有害な症状、影響または合併症を、測定可能な程度まで向上させるために有効であるが、疾患、病気または状態または症状の進行または悪化の抑制または阻害は、良好な結果であると考えられる。
【０１６３】
用語「向上する」は、対象の状態の検出可能な客観的または主観的な改善を意味する。検出可能な改善には、疾患、病気または状態を原因とするかこれに関連する症状の発生、頻度、重症度、進行または持続時間の客観的または主観的な減少、疾患、病気または状態の根本原因または影響の改善、または疾患、病気または状態の逆戻りが含まれる。
【０１６４】
したがって、治療は、疾患、病気または状態、または関連する症状または影響、または根本原因の阻害、減少または防止；疾患、病気、状態、症状または影響、または根本原因の進行または悪化、または疾患、病気、状態、または症状の一つ以上の追加的な症状のさらなる悪化または発生の阻害、減少または防止をもたらしうる。したがって、良好な治療結果は、「治療的効果」または「利益」または対象における状態、疾患、病気または症状の一つ以上の症状、または根本原因または影響の発生、頻度、重症度、進行または継続時間の阻害、減少または防止をもたらす。したがって、状態、疾患、病気または症状の一つ以上の根本原因に作用する治療方法が、有益であると考えられる。疾患または状態の進行または悪化の安定化または阻害も、良好な治療結果である。
【０１６５】
したがって、治療的利益または改善は、状態、疾患または病気に関連するいずれか一つ、大半または全ての症状、合併症、影響または根本原因の完全な消失である必要はない。したがって、対象の状態の漸進的改善、または発生、頻度、重症度、進行、または継続時間の部分的減少、または、一つ以上の関連する有害な症状または合併症または影響または根本原因、疾患または病気の生理的、生化学的、または細胞的兆候または特徴の一つ以上の悪化または進行（例えば、状態、疾患または病気の一つ以上の症状または合併症の安定化）の阻害または回復が、短期または長期間（時間、日、週、月等）ある場合に、良好なエンドポイントが達成される。
【０１６６】
特定の実施形態において、治療の方法及び用法が、転移性又は非転移性腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物の細胞の質量、体積、大きさ、又は細胞の数の部分的又は完全な破壊を生じ、転移性又は非転移性腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物の細胞の壊死、溶解、又はアポトーシスを刺激、誘発、又は増加させ、転移性又は非転移性腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物の体積、大きさ、細胞質量を低減し、転移性又は非転移性腫瘍、癌、悪性腫瘍、新生物の体積、質量、大きさ、又は細胞数の増加を阻害又は防止し、高増殖性細胞（例えば、転移性）が対象内の他の（二次的）部位、領域、組織、又は器官へ拡散すること、又は高増殖性細胞（例えば、転移性）が対象内の他の（二次的）部位、領域、組織、又は器官に定着することを阻害又は低減し、又は対象の寿命を延長する。さらなる特定の実施形態において、治療の方法又は用法が、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物に関連した、又はそれらに起因する有害な症状又は合併症の重症度、持続期間、又は頻度を低減又は縮小する。
【０１６７】
十分な量または有効な量は、単回投与において提供されうるがその必要はなく、また、単独投与または別の組成物（例えば化学療法または免疫刺激剤）、治療、プロトコルまたは治療計画と組み合わせて投与されうるが、その必要はない。例えば、量は、対象の必要、治療される疾患、病気または状態のステータス、または治療の副作用により示されるとおりに、比例的に増加されうる。さらに、十分な量または有効な量は、第二組成物（例えば化学療法または免疫刺激剤）、治療、プロトコルまたは治療計画を伴わずに単一または複数の用量において与えられる場合には、十分または有効である必要はない。所与の対象において有効または十分であるとみなされる上では、そのような用量に加えて追加的な用量、量または持続時間、または追加的な組成物（例えば化学療法または免疫刺激剤）、治療、プロトコルまたは治療計画も含まれうるためである。十分であるとみなされる量には、別の治療、治療計画またはプロトコルの使用の減少をもたらす量も含まれる。
【０１６８】
十分な量または有効な量は、治療されるどの対象においても予防または治療上有効である必要はないし、所与の群または集団の治療される対象の大多数に有効である必要もない。治療または療法に典型的であるように、一部の対象は、所与の治療、治療計画またはプロトコルに対して強い反応または弱い反応を示す。十分な量または有効な量は、群または一般集団ではなく、特定の対象における、十分性または有効性を意味する。このような量は、有害、異常、または不正常な細胞増殖または高増殖性疾患（例えば転移性又は非転移性の癌、腫瘍、悪性病変又は新生物）のタイプまたはステージ等の治療される状態、所望の治療効果、ならびに個々の対象（例えば対象における生物学的利用能、対象の性別、年齢等）に部分的に依存する。
【０１６９】
高増殖性疾患（例えば転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変、又は新生物）等の有害又は異常な細胞増殖に対する、治療的利益または改善の非限定的な具体例には、細胞の大きさ、質量または体積の減少、細胞の大きさ、質量または体積の増加の阻害、悪化または進行の遅延または阻害、細胞壊死、細胞溶解またはアポトーシスの刺激、新生物、悪性腫瘍、又は転移の低減又は阻害、死亡率の低減、対象の寿命の延長が含まれる。したがって、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または新生物の完全な消失は生じていない場合であっても、細胞の大きさ、質量、体積または転移の増加の阻害または遅延（安定化）により、数日、数週間または数ヶ月間でも寿命が延長（死亡率を減少）されうる。減少または低減されうる高増殖性疾患（例えば転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変、又は新生物）に関連する有害な症状および合併症には、例えば痛み、嘔気、不快感、食欲不振、無気力および虚弱が含まれる。主観的な感覚の改善（例えばエネルギー、食欲の増加、嘔気の減少、可動性または心理的健康状態の改善等）などの、高増殖性疾患（例えば転移性又は非転移性の癌、腫瘍、悪性病変、又は新生物）等の有害又は異常な細胞増殖の症状の発生、頻度、重症度、進行、または継続時間の減少は、全て、治療的利益または改善の例である。
【０１７０】
例えば、結合体の、十分または有効な量は、投与により高増殖性疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変、又は新生物）の有害又は異常な細胞増殖の治療に必要とされる化学療法薬物、放射線、免疫療法の減量がもたらされる場合には、治療効果を有すると考えられる。
【０１７１】
用語「対象」は、動物、典型的にはヒト、非ヒト霊長類（類人猿、テナガザル、チンパンジ、オランウータン、マカク）、家庭動物（イヌおよびネコ）、家畜（ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）および実験動物（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）等の哺乳類動物をさす。対象は、動物疾患モデル、例えば、結合体のｉｎ  ｖｉｖｏ分析のための、高増殖性疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変、又は新生物）等の有害または異常な細胞増殖の動物モデルを含む。
【０１７２】
治療に適切な対象には、寛解期の対象を含めて、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または新生物を有するかそのリスクがある者、抗増殖（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または新生物）療法を将来受けるか現在または既に受けている者が含まれる。「リスクがある」対象は、典型的には、有害または異常な細胞増殖、過形成（例えば腫瘍）の発症と関連したリスク因子を有する。
【０１７３】
リスクがある又はその候補である対象の具体例としては、結合体が結合する標的（例えば、受容体）を発現する細胞を有する対象であり、特に壊死、溶解、又は破壊の標的となる細胞が、非標的細胞よりも多くの又は多量の標的（例えば、受容体）を発現する対象である。このような細胞は、選択的又は優先的に、壊死、溶解、又は殺滅の標的とすることができる。
【０１７４】
また、リスクがある対象は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離又は化学放射線治療、局所的又は部位的熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種の候補者及びそれらを受けた者を含む。したがって、本発明は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性病変または新生物、または、例えば転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物の休眠または寛解期間後の再現または再成長による、関連の合併症のリスクがある対象の治療に適用可能である。
【０１７５】
リスク因子には、性別、ライフスタイル（食事、喫煙）、職業（医療および病院職員、農業および牧畜労働者）、環境因子（発癌物質曝露）、家族歴（自己免疫不全、糖尿病等）、遺伝的素因等が含まれる。例えば、黒色腫を発症するリスクがある対象には、過度の日光曝露（紫外線）、白い肌、多数の母斑（形成異常母斑）、患者の表現型、家族歴、または過去の黒色腫の病歴が含まれる。したがって、癌を発症するリスクがある対象は、ライフスタイル、職業、環境因子、家族歴、および腫瘍関連遺伝子、遺伝子欠失または遺伝子変異の遺伝子検査により特定されうる。例えば、乳癌を発症するリスクがある対象は、Ｂｒｃａｌを欠く。結腸癌を発症するリスクがある対象は、若年または高頻度のポリープ形成、または例えば大腸腺腫症遺伝子（ＡＰＣ）等の癌抑制遺伝子等の欠失または変異を有する。
【０１７６】
他の治療ができない者も対象に含まれる。例えば、ある対象は外科的切除、化学療法、免疫療法、電離又は化学放射線療法、局所的又は部位的な熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種の適切な候補者ではない場合がある。本発明に従う治療の対象となりうる候補者は、外科的切除、化学療法、免疫療法、電離又は化学放射線療法、局所的又は部位的な熱療法（温熱療法）、又はワクチン接種の候補者でないものを含む。
【０１７７】
結合体は単位投与量又は単位投与量形式で調合されてもよい。一実施形態において、結合体は、有害な又は異常な細胞増殖又は高増殖性疾患を有する対象の治療に有効と考えられる量になっている。一実施形態において、結合体は、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物をを有する対象の治療に有効と考えられる量になっている。単位投与量の例は、約１から２５、２５から２５０、２５０から５００、５００から１０００、１０００から２５００、２５００から５０００、５０００から２５，０００、５０００から５０，０００ｇ、及び約１から２５、２５から２５０、２５０から５００、５００から１０００、１０００から２５００、又は２５００から５０００、５０００から２５，０００、５０００から５０，０００、又は５０，０００から１００，０００ｍｇである。
【０１７８】
本発明の結合体及び方法及び用法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、又はｉｎ  ｖｉｖｏで接触又は提供されてもよい。結合体は、単一または複数用量の効果を提供するために、有効かつ十分な量を投与することができる。投与量の範囲は、例えば、約１から２５、２５から２５０、２５０から５００、５００から１０００、１０００から２５００、２５００から５０００、５０００から２５，０００、５０００から５０，０００、又は５０，０００から１００，０００μｇ／ｋｇを連日、隔日、又は断続的に投与する。単一または複数用量を連日、隔日、又は断続的に投与できる。
【０１７９】
全身的、領域的または局所的投与により、任意の経路で、結合体が投与され、方法が実施されうる。例えば、結合体が、全身、領域的または局所的に、静脈内、経口（例えば摂取または吸入）、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、腔内、頭蓋内、経皮（局所）、非経口、例えば経粘膜または直腸投与されうる。医薬製剤を含む本発明の組成物および方法及び用法は、（微小）封入送達システムにより投与され、または投与のためにインプラントにパッケージされうる。
【０１８０】
本発明は、医薬品組成物に含まれる結合体、及び方法及び用法をさらに提供する。医薬品組成物とは、「薬理学上許容可能な」および「生理的に許容可能な」担体、希釈液または賦形剤をいう。本明細書で使用されるところの、担体、希釈液または賦形剤をさす場合の「薬理学上許容可能な」および「生理的に許容可能な」という用語は、医薬品投与および製剤の他の成分に適合する、溶媒（水性または非水性）、界面活性剤、溶液、エマルション、分散媒、コーティング、および等張性の吸収促進又は遅延薬剤を含む。このような製剤は、（コートまたは非コート）錠剤、（硬または軟）カプセル、ミクロビーズ、エマルション、粉末、顆粒、結晶、懸濁液、シロップまたはエリキシルに含まれうる。
【０１８１】
医薬品組成物は、特定の投与経路に適合するように調製されうる。非経口、皮内または皮下投与のための組成物は、水、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒等の滅菌希釈剤を含みうる。製剤は、微生物増殖を防止するための一つ以上の保存剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩等のバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の張化剤）を含みうる。
【０１８２】
注射のための医薬品組成物には、滅菌注射可能溶液または分散の即時製剤のための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散および滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のためには、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、およびポリエセイレン（ｐｏｌｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ）グリコール）およびそれらの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒でありうる。例えば、レシチン等のコーティングを用いて、または界面活性剤を用いて、流動性が維持されうる。抗菌剤および抗真菌剤には、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールが含まれる。例えばアルミニウムモノステアレートおよびゼラチン等、吸収を遅延させる薬剤を含めて、注射可能組成物の吸収を延長することができる。ポリソルベート２０及びポリソルベート８０を、例えば最大１％まで混合製剤に添加することができる。他の添加剤としては、ヒスチジンＨＣｌ、α，α−トレハロース二水和物を含むが、これらには限定されない。
【０１８３】
追加的な医薬製剤および送達システムは、公知技術であり、発明の方法で適用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，ペンシルベニア州イーストン；Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ（１９９６）第１２版、Ｍｅｒｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，ニュージャージー州ホワイトハウス；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，ペンシルベニア州ランカスター、（１９９３）；およびＰｏｚｎａｎｓｋｙ等、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒ．Ｌ．Ｊｕｌｉａｎｏ編、ニュージャージー州オクスフォード（１９８０）、ｐｐ．２５３―３１５を参照）。
【０１８４】
本発明は、適切なパッケージ材料にパッケージされた、本発明の結合体、その組み合わせ組成物および医薬製剤を含むキットを提供する。キットは、構成要素の説明または中の構成要素のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの使用のための指示を含むラベルまたはパッケージインサートを選択的に含む。典型的な指示には、細胞の増殖を減少または阻害し、高増殖性細胞などの有害又は異常な細胞の増殖を減少または阻害し、転移性又は非転移性の腫瘍、癌細胞、悪性病変、又は新生物の増殖を減少または阻害し、高増殖性疾患を有する対象を治療し、転移性または非転移性腫瘍、癌、悪性病変、又は新生物を有する対象を治療するための指示が含まれる。
【０１８５】
キットはこのような構成要素の集合を含むことができる。この集合は、例えば、２つ以上の結合体のみ、又は他の治療上有用な組成物（例えば、抗増殖又は免疫増強薬剤）との組合せである。
【０１８６】
「パッケージ材料」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造体をいう。パッケージ材は、成分を無菌状態で維持することができ、一般的にそのような目的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、ホイル、アンプル、バイアル、チューブなど）で作ることができる。
【０１８７】
本発明のキットは、ラベルまたはインサートを含みうる。ラベルまたはインサートは、「印刷物」、例えば紙またはボール紙を含み、または構成要素、キットまたはパッケージ材料（例えばボックス）とは別であるかこれらに固定され、またはキット構成要素を含むアンプル、チューブまたはバイアルに取り付けられる。ラベルまたはインサートは、ディスク（例えばフロッピー（登録商標）ディスケット、ハードディスク、ＺＩＰディスク）等の計算機可読媒体、ＣＤ―またはＤＶＤ―ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ等の光ディスク、またはＲＡＭおよびＲＯＭ等の電子記憶媒体、または磁気／光学記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体またはメモリタイプカード等のこれらのハイブリッド等の、を追加的に含みうる。
【０１８８】
ラベル又は挿入物には、一の又は複数のコンポーネントを識別する情報を含めることができ、例えば、ドーズ量、作用メカニズムを含む有効成分の臨床薬理学、薬物動態および薬力学の情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、製造業者情報、ロット番号、製造場所及び日付を特定する情報を含めることができる。
【０１８９】
ラベル又は挿入物には、キットのコンポーネントを使用することができる病状、疾患、病気、又は症状に関する情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、方法、治療プロトコル若しくは治療レジメンにおけるキットのコンポーネントの一つ又は複数を使用する臨床医または対象のための使用説明書を含めることができる。使用説明書には、投与量、頻度または期間、および本明細書に記載の方法、治療プロトコル又は治療レジメンのいずれかを実施する際の指示を含めることができる。典型的な指示には、有害又は異常な細胞増殖、高増殖性細胞及び疾患（例えば、転移性又は非転移性の腫瘍、癌、悪性腫瘍、又は新生物）を治療するための指示が含まれる。したがって、本発明のキットは、本明細書に記載される方法及び用法のいずれかを実施するためのラベルまたは指示をさらに含みうる。
【０１９０】
ラベル又は挿入物には、コンポーネントが、提供し得ることが何らかの利益についての情報、例えば、予防的利益または治療的利益についての情報を含めることができる。ラベル又は挿入物には、可能性のある副作用に関する情報を含めることができ、例えば、特定の組成物を使用することが適切ではない状況に関して、対象又は臨床医に警告する情報を含めることができる。対象が、当該組成物と適合しない可能性がある一の又は複数の他の薬を服用している、服用する予定がある又は有している、又は、対象が、現在、当該組成物と適合しない別の治療プロトコルまたは治療レジメンを受けている、受ける予定がある又は有している場合に、有害な副作用が発生することがあるため、説明書には、このような不適合性に関する情報を含めることができる。
【０１９１】
発明キットは、他の構成要素をさらに含みうる。キットの各構成要素は、それぞれの容器に封入され、様々な容器が全て単一のパッケージ内にありうる。発明キットは、冷蔵用に設計されうる。発明キットはさらに、本発明のペプチドまたは抗体を発現する宿主細胞またはコード核酸を含むそれを含むように設計されうる。キット内の細胞は、細胞の使用準備が整うまで、適切な貯蔵条件下で維持されうる。例えば、細胞を解凍し、成長されられるように、一つ以上の細胞を含むキットが、適切な細胞貯蔵媒体を含みうる。
【０１９２】
別に定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、当技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと同様な又は等価な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料について、以下に記載する。
【０１９３】
本明細書で引用した全ての出願、刊行物、特許および他の参考文献、ＧｅｎＢａｎｋの引用及びＡＴＣＣの引用は、その全体が援用される。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先される。
【０１９４】
本明細書で使用されている単数形であることを示す“一の（ａ）”、“及び（ａｎｄ）”、“その（ｔｈｅ）”との言葉は、別途明示されない限り、複数のものも含む。よって、例えば、「結合体」又は「標的（例えば、受容体）」、又は「細胞溶解性ドメイン」への言及は、複数のこのような結合体、標的、又は細胞溶解性ドメインなどを含む。
【０１９５】
本明細書において用いられるように、当ドキュメントにおいては数値はしばしば範囲形式で提示される。範囲形式を使用するのは便宜性及び簡略化のみを目的としており、文脈によって別途明示されない限り、本発明の範囲を固定的に限定するものと見なされるべきではない。したがって、文脈によって別途明示されない限り、ある範囲は、すべての可能な部分的範囲、その範囲内のすべての個々の数値、及びそれらの範囲内の整数と範囲内の値の端数又は整数とを含むすべての数値又は数値範囲を含む。この構成は範囲の広さに関係なく、この特許ドキュメント全体にわたるすべての文脈において適用される。よって、９０から１００％の範囲への言及は、９１から９９％、９２から９８％、９３から９５％、９１から９８％、９１から９７％、９１から９６％、９１から９５％、９１から９４％、９１から９３％などを含む。９０から１００％の範囲への言及は、９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９５％，９７％等、並びに、９１．１％，９１．２％，９１．３％，９１．４％，９１．５％等、及び、９２．１％，９２．２％，９２．３％，９２．４％，９２．５％等を含む。
【０１９６】
さらに、１から５０００倍への言及は、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０倍等、並びに１．１，  １．２，  １．３，  １．４，  １．５倍等、２．１，  ２．２，  ２．３，  ２．４，  ２．５倍等、及びそのような範囲内のあらゆる数値範囲、例えば、１から２、５から１０、１０から５０、５０から１００、１００から５００、１００から１０００、５００から１０００、１０００から２０００、１０００から５０００等を含む。さらなる例において、ＫＤ１０５から約ＫＤ１０１３の範囲への言及は、そのような値に含まれる、又はそれらを包含するあらゆる数値範囲を含む。
【０１９７】
本明細書において用いられるように、一連の範囲が当ドキュメント全体にわたって開示されている。一連の範囲を使用する際には、他の範囲を提供するためにより上位の又は下位の範囲の組合せが含まれる。この構成は範囲の広さに関係なく、この特許ドキュメント全体にわたるすべての文脈において適用される。よって、例えば、５から１０、１０から２０、２０から３０、３０から４０、４０から５０、５０から７５、７５から１００、１００から１５０、１５０から１７１などの一連の範囲への言及は、５から２０、５から３０、５から４０、５から５０、５から７５、５から１００、５から１５０、５から１７１、及び１０から３０、１０から４０、１０から５０、１０から７５、１０から１００、１０から１５０、１０から１７１、及び２０から４０、２０から５０、２０から７５、２０から１００、２０から１５０、２０から１７１等を含む。
【０１９８】
本発明は、多くの実施形態を記述するために断定的な言語を使用して、本明細書に開示されている。。本発明は、物質または材料、方法ステップおよび条件、プロトコル、手順、アッセイまたは分析等の、特定の内容が完全または部分的に除外される実施形態も特に含む。したがって、本発明は、本明細書において一般に本発明が含まないものという観点では表現されないが、発明に特に含まれるとされない態様であっても本明細書において開示されている。
【０１９９】
本発明の多数の実施形態を説明した。しかしながら、本発明の精神と範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われうることが理解されよう。したがって、以下の実施例は、請求項に記載される本発明の範囲を制限することではなく、説明することを目的としたものである。
【実施例】
【０２００】
実施例１
インビトロ研究において組換え的に生成された抗体の細胞傷害性を測定するために（抗体として）、Ｈｅｒ−２レセプターに対するｓｃＦｖ−ＣH３を、溶解性ペプチドであるＰｈｏｒ−１８（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ）または（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）に結合体化した。様々なリンカー（ＧＳおよびＮＲＶＲＲＳ（配列ＩＤ番号７５））、および抗体分子１つあたり１または２分子の溶解性ペプチドを研究した。
【０２０１】
研究されたペプチドは：Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦｖ−ＣH３−Ｐｈｏｒ−１８（２分子のＰｈｏｒ−１８が抗体のＮおよびＣ末端に接続されたもの）、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８（１分子のＰｈｏｒ−１８がＣ末端においてＧＳリンカーによって抗体に接続されたもの）、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）（１分子の（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）がＣ末端においてＧＳリンカーによって抗体に連結されたもの）、ｓｃＦＶ−ＣH３−−ＮＲＶＲＲＳ（配列ＩＤ番号７５）−Ｐｈｏｒ−１８（１分子のＰｈｏｒ−１８がＣ末端においてＮＲＶＲＲＳリンカーによって抗体に連結されたもの）、およびｓｃＦＶ−ＣH３−ＮＲＶＲＲＳ−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）（１分子の（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）がＣ末端においてＮＲＶＲＲＳリンカーによって抗体に連結されたもの）だった。Ｈｅｒ−２レセプター陽性細胞（ＳＫＢＲ−３およびＳＫＯＶ−３、それぞれヒト乳がん細胞およびヒト卵巣がん細胞）およびＨｅｒ−２レセプター陰性乳がん細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）において、細胞傷害性を裸の抗体（溶解性ペプチドを有しない抗体）と比較した。
実施例２
【０２０２】
この実施例では、本明細書中に記載される研究において使用された様々な材料および方法を記載する。
【０２０３】
材料：組換えＤＮＡ法を用いることにより、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を組換え抗体として大腸菌において合成した。ｓｃＦＶ−ＣH３抗体（Ｏｌａｆｓｅｎ  Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １７，３１５−３２３，２００４）を、表１に記載されるようにペプチドリンカーを介してまたはリンカーなしで、Ｐｈｏｒ−１８または両親媒性アルファ−ヘリックス溶解性ペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）のいずれかに結合体化し、インビトロにおいて細胞傷害性について解析した。そのプラスミドは、遺伝子のコドン最適化によって得た。その遺伝子を、Ｎ−Ｈｉｓタグ配列とともに合成し、そのプラスミドを大腸菌発現ベクターｐＵＣ５７にサブクローニングした。発現の最適化および評価の後、Ｈｉｓ−タグ産物を選択し、１Ｌの細菌発現産物を、１工程の親和性精製において精製した。各構築物に対するプラスミド遺伝子挿入物の配列を、表１に記載する。
（以下表１：組換えＨｅｒ２／ｎｅｕ抗体および抗体結合体の各々を生成するためのプラスミド挿入物のヌクレオチド配列。）
１．Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｓｃＦｖ−ＣH３：（配列ＩＤ番号７６）
【表１−１】
0006559066.tif 000030
２．ｓｃＦｖ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ１８：（配列ＩＤ番号７７）
【表１−２】
0006559066.tif 000031
３．  ｓｃＦｖ−ＣH３−ＧＳ−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ：（配列ＩＤ番号７８）
【表１−３】
0006559066.tif 000032
４．  ｓｃＦｖ−ＣH３−ＮＲＶＲＲＳ−Ｐｈｏｒ１８：（配列ＩＤ番号７９）
【表１−４】
0006559066.tif 000033
５．  ｓｃＦｖ−ＣH３−ＮＲＶＲＲＳ−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ：（配列ＩＤ番号８０）
【表１−５】
0006559066.tif 000034
６．Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦｖ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８：（配列ＩＤ番号８１）
【表１−６】
0006559066.tif 000035
【０２０４】
モノクローナル抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ＩｇＧ１（ＭＡｂ）へのＰｈｏｒ−１８の化学的結合体化：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の精製された抗体を、およそ２ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮する。Ｎ−スクシニジル−３−（２−ピリジロチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の２０ｍＭ溶液を、新たにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に調製し、その抗体溶液に２０倍過剰で加える。その混合物を室温で約３０分間インキュベートすることにより、抗体−リンカー中間体を生成する。過剰な未反応のＳＰＤＰをサイズ排除により除去する。システインを含む細胞傷害性分子を、１０倍過剰のレダクタクリル（ｒｅｄｕｃｔａｃｒｙｌ）試薬との反応によって完全に還元した後、抗体−リンカー構築物と１０倍過剰で混合する。その反応物を室温で１８時間インキュベートし、次いで、脱塩することにより、未反応の細胞毒分子を除去する。その溶液を、貯蔵前に濾過滅菌する。
【０２０５】
インビトロ：組換え抗体調製物（結合体化されたものおよび結合体化されていないもの）の細胞傷害性を測定するために、インビトロ細胞傷害性研究を行い、溶解性ペプチドＰｈｏｒ−１８をコントロールインキュベーションにおいて使用した。９６ウェルプレートにおいて２，０００細胞／ウェルで細胞を調製し、４８時間にわたって接着させた。凍結乾燥された形態のＰｈｏｒ−１８を新たに食塩水に溶解し、０、０．００００１、０．０００１、０．００１、０．０１、０．１、１、１０、２５および１００μＭと濃度を上げながらマルチウェルプレートに加えた。Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ緩衝液中の、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体−Ｐｈｏｒ−１８結合体（Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦＶ−ＣH３−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＮＲＶＲＲＳ（配列ＩＤ番号７５）−Ｐｈｏｒ−１８、Ｈｅｒ２抗体−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）（ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）およびｓｃＦＶ−ＣH３−ＮＲＶＲＲＳ（配列ＩＤ番号７５）−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ）（配列ＩＤ番号７４）またはｓｃＦＶ−ＣH３−レセプター抗体（裸）を、食塩水で希釈し、０、０．００１２、０．０１２、０．１２、１．２、６．０、１２．０、１２０、３６０および７２０ｎＭと濃度を上げながら細胞に加えた。３７℃において４８時間インキュベーションを行った。ホルマザン変換アッセイ（ＭＴＴアッセイ）を用いて細胞生存率を測定した。コントロールは、０および１００％細胞死に対する参照として、それぞれＵＳＰ食塩水または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００TMを含んだ。すべてのデータを、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ４TMソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，Ｉｎｃ）を用いて処理し、解析した。
実施例３
【０２０６】
この実施例では、抗Ｈｅｒ２−Ｐｈｏｒ−１８抗体結合体がＨｅｒ２発現乳がん細胞を殺滅したことを示唆する研究を記載する。
【０２０７】
表２に示されるように、抗Ｈｅｒ２−Ｐｈｏｒ−１８抗体結合体（Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦＶ−ＣH３−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＮＲＶＲＲＳ（配列ＩＤ番号７５）−Ｐｈｏｒ−１８）は、４８時間後までにＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性のヒト乳がんＳＫＢＲ−３およびヒト卵巣がんＳＫＯＶ−３細胞株を殺滅した一方で、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性ヒト乳がんＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、殺滅されなかった。細胞傷害性の証拠は、インキュベーションの２４時間後でも顕微鏡によって観察された。予想どおり、結合体化されていないＰｈｏｒ−１８は、適度の細胞傷害性しか示さなかった。
【０２０８】
Ｐｈｏｒ−１８に結合体化されたＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体は、溶解性ペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）に結合体化された抗体よりも有意に細胞傷害性だった（図１、表２）。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞が、いずれの組換え抗体−溶解性ペプチド結合体によっても殺滅されなかったことから、それらの抗体の細胞傷害性は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターによって媒介されたことが示唆される。「裸の」（結合体化されていない）抗体（ｓｃＦＶ−ＣH３）は、３つすべての細胞株において細胞傷害性でなかったことから、その抗体−溶解性ペプチド結合体の細胞殺滅特性が、溶解性ペプチドの負荷の存在および溶解性ペプチドの配列に起因したと示唆される。また、予想どおり、結合体化されていないＰｈｏｒ−１８は、すべての細胞株において非常に最小の非特異的な細胞傷害性しか示さなかった（表２）。
（表２）Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター陽性ＳＫＯＶ−３、ＳＫＢＲ−３およびＨｅｒ２／ｎｅｕレセプター陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞における、抗Ｈｅｒ２−Ｐｈｏｒ−１８抗体結合体（ｓｃＦＶ−ＣH３−Ｐｈｏｒ−１８および−ｓｃＦＶ−ＣH３−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）結合体、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ｓｃＦＶ−ＣH３）ならびに結合体化されていないＰｈｏｒ−１８のインビトロ細胞傷害性。値は、ｎＭの単位で表わされるＩＣ50である。
【表２】
0006559066.tif 000036
【０２０９】
上記の結果は、組換え的に生成されたＨｅｒ２抗体ｓｃＦＶ−ＣH３−Ｐｈｏｒ−１８およびＨｅｒ２抗体ｓｃＦＶ−ＣH３−（ＫＬＡＫＬＡＫ）2ＫＬＡＫ（配列ＩＤ番号７４）結合体が、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター発現細胞株に対してナノモルの範囲において活性であることを示唆している。結合体化されていない抗体または遊離溶解性ペプチド（Ｐｈｏｒ−１８）は、効果がなかったことから、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターに結合するリガンド（例えば、抗体）に対する溶解性ペプチドの結合体化が、細胞傷害性の効力を増強すると示唆される。
実施例４
【０２１０】
この実施例には、溶解性ペプチドＰｈｏｒ−１８（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号４））に結合体化された、Ｈｅｒ−２レセプターに対する組換え的に生成された抗体（ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８）、および化学的に結合体化されたＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８結合体の、Ｈｅｒ２陽性卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ−３に対するインビトロ細胞傷害性研究の説明が含まれる。
【０２１１】
９６ウェルプレートにおいて５，０００細胞／ウェルで細胞を調製し、４８時間にわたって接着させた。ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３を食塩水に希釈し、０、０．００１２、０．０１２、０．１２、１．２、６．０、１２、１２０、３６０および７２０ｎＭと濃度を上げながら加えた（濃度１つあたりＮ＝８データポイント）。３７℃において２４時間インキュベーションを行った。ホルマザン変換アッセイ（ＭＴＴアッセイ）を用いて細胞生存率を測定した。コントロールは、０および１００％細胞死に対する参照として、それぞれＵＳＰ食塩水または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００TMを含んだ。
【０２１２】
Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ４TMソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，Ｉｎｃ）を用いてデータを処理し、解析した。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。ホールＭＡｂ−Ｐｈｏｒ−１８では、６０．５３±３．８ｎＭのＩＣ50値となり、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８は、５９．８±３．８ｎＭだった。「裸の」（結合体化されていない）抗体（ＭＡｂおよびｓｃＦＶ−ＣH３）は、細胞傷害性でなかった。インビトロにおいて、化学的に連結されたＨＥＲ２抗体（ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８）および組換えＰｈｏｒ１８結合体（ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８）は、ＳＫＯＶ−３細胞に対して類似の毒性を示した一方で、裸の組換え抗体（ｓｃＦＶ−ＣH３）は、毒性でなかった。
実施例５
【０２１３】
この実施例では、様々な用量の抗Ｈｅｒ２−Ｐｈｏｒ−１８抗体結合体（ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８、ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ１８）、裸のホール抗体（ＭＡｂ）および裸の組換え抗体（ｓｃＦＶ−ＣH３）での処置を用いた、ヒト卵巣がんのマウス異種移植片モデルにおけるインビボ研究を記載する。
【０２１４】
雌Ｎｕ／Ｎｕマウスの皮下にＳＫＯＶ−３／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（４×１０6細胞）を注射した。４２日目に殺傷されたマウスの腫瘍重量をベースラインとした。簡潔には、１３０．３±１０．２５ｍｍ3という腫瘍体積の中央値の腫瘍に対して腫瘍細胞注射後の４３日目に処置を開始し、処置を外側尾静脈への単回のボーラス注射として４７、５０、５４、５７および６０日目に続けた。
【０２１５】
この研究全体にわたって、腫瘍の体積を１週間に２回測定し、体重を計測した。最後のネクロプシーを、腫瘍細胞注射後の６４日目に行い、腫瘍を切除し、計量し、組織学的評価のためにホルマリン中で固定した。
【０２１６】
処置は：食塩水コントロール、裸のモノクローナルホール抗Ｈｅｒ２抗体であるＭＡｂ（３ｍｇ／ｋｇ）、裸の組換えＨｅｒ２抗体（ｓｃＦＶ−ＣH３）（３ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８（０．３および３ｍｇ／ｋｇ）、ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ−１８（０．３および３ｍｇ／ｋｇ）だった。処置開始時に屠殺されたマウスの腫瘍を、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプターの免疫組織化学評価に供した。各群は、８〜９匹のマウスからなった。
【０２１７】
マウスのすべての群が、注射を十分許容した。マウスは、注射の結果として死亡することはなかった。
【０２１８】
抗体に結合体化されたＰｈｏｒ−１８の注射および裸の抗体の、最初の腫瘍に対する作用（体積および腫瘍重量、図２Ａ、２Ｂおよび３）および体重に対する作用を図４に図示する。図２Ａおよび２Ｂは、研究経過中の腫瘍体積の中央値、ならびに食塩水コントロール、ならびにＭＡｂ（裸）（３ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＦＶ−ＣH３（３ｍｇ／ｋｇ）、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８（０．３および３ｍｇ／ｋｇ）、ＭＡｂ−Ｐｈｏｒ−１８（０．３および３ｍｇ／ｋｇ）で処置されたマウスの各個別の処置群に対する６４日目の平均腫瘍重量を示している。
【０２１９】
腫瘍の体積および重量は、３ｍｇ／ｋｇの化学的に連結されたＭＡｂ−Ｐｈｏｒ−１８（ｐ＜０．０４）または組換え的に生成されたｓｃＦＶ−ＣH３−Ｐｈｏｒ−１８結合体（ｐ＜０．０２）で処置されたすべての動物において有意に減少した。裸のＭＡｂまたはｓｃＦＶ−ＣH３は、３ｍｇ／ｋｇの用量において、食塩水コントロールと比べて腫瘍体積または腫瘍重量を減少させなかった（図２Ａ、２Ｂおよび３）。Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｚｍ４においてウィルコクソンの符号順位検定を用いて統計解析を行った。体重は、すべての処置群およびコントロール動物において安定していた（図４）。
実施例６
【０２２０】
この実施例では、溶解性ペプチドＰｈｏｒ−１８（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号４））に結合体化された、Ｈｅｒ−２レセプターに対する組換え的に生成された抗体の、卵巣がん細胞に対するインビトロ細胞傷害性研究を記載する。
【０２２１】
ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８（１分子のＰｈｏｒ−１８が、ＶL−−Ｇリンカー−−ＶH−ＣH２−ＣH３−−Ｇリンカー−ＣH３−ＣH２−−ＶH−−−Ｇリンカー−ＶL−ＧＳ−（Ｐｈｏｒ−１８）からなるＧＳリンカーによってＣ末端において抗体に接続されたもの）。Ｈｅｒ−２レセプター陽性細胞（ＳＫＯＶ−３，ヒト卵巣がん細胞）における裸の抗体（ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３；溶解性ペプチドなしの抗体）と細胞傷害性を比較した。
【０２２２】
材料：組換えＤＮＡ法を用いることにより、抗Ｈｅｒ２抗体をｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３抗体として大腸菌において合成した。その抗体（Ｏｌａｆｓｅｎ  Ｔ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １７，３１５−３２３，２００４）を、ペプチドリンカーを介していずれかのＰｈｏｒ−１８に結合体化し、インビトロにおける細胞傷害性について解析した。そのプラスミドは、遺伝子のコドン最適化によって得た。その遺伝子を、Ｎ−Ｈｉｓタグ配列とともに合成し、そのプラスミドを大腸菌発現ベクターｐＵＣ５７にサブクローニングした。発現の最適化および評価の後、Ｈｉｓ−タグ産物を選択し、１Ｌの細菌発現産物を、１工程の親和性精製において精製した。各構築物に対するアミノ酸配列を、表３に記載する。
（表３）各組換え抗体、（Ａ）ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３；および抗体結合体（Ｂ）ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８を生成するためのアミノ酸配列
【表３（Ａ）】
0006559066.tif 000037
ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３及び抗体結合体（配列ＩＤ番号８２）
【表３（Ｂ）】
0006559066.tif 000038
ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ１８：（配列ＩＤ番号８３）
【０２２３】
インビトロ細胞傷害性研究を行うことにより、組換え抗体調製物（ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３、ｓｃＦＶ−ＣH３およびｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８）の細胞傷害性を測定した。Ｈｅｒ−２レセプター陽性ＳＫＯＶ−３細胞を、９６ウェルプレートにおいて２，０００細胞／ウェルで調製し、４８時間にわたって接着させた。Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ緩衝液中のＨｅｒ２抗体−Ｐｈｏｒ−１８結合体（ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３−ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８、ｓｃＦＶ−ＣH３ＧＳ−Ｐｈｏｒ−１８）または裸の抗体（ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３、ｓｃＦＶ−ＣH３）を、食塩水で希釈し、０、０．００１２、０．０１２、０．１２、１．２、６．０、１２．０、１２０、３６０および７２０ｎＭと濃度を上げながら細胞に加えた。３７℃において４８時間インキュベーションを行った。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて細胞生存率を測定した。コントロールは、０および１００％細胞死に対する参照として、それぞれＵＳＰ食塩水または０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００TMを含んだ。すべてのデータを、Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ４TMソフトウェア（Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，Ｉｎｃ）を用いて処理し、解析した。
【０２２４】
Ｐｈｏｒ−１８に結合体化されたＨｅｒ２抗体（ｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３、ｓｃＦＶ−ＣH３）は、ｓｃＦＶ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８の場合は５３．７±０．６３ｎＭおよびｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３−Ｆｖ−Ｐｈｏｒ−１８の場合は５６．７±０．９２ｎＭというＩＣ50値となった。「裸の」（結合体化されていない）抗体であるｓｃＦｖ−ＣH２−ＣH３、ｓｃＦＶ−ＣH３は、細胞傷害性でなかった。インビトロにおける組換えＰｈｏｒ−１８結合体は、ＳＫＯＶ−３細胞に対して類似の毒性を示す。
実施例７
【０２２５】
本実施例では、哺乳類の発現系において、配置が画定された細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）、及び抗体ごとに特定の数の２，４，及び６個のＰｈｏｒ１８細胞溶解性ドメインを有するホール抗Ｈｅｒ２−ＩｇＧ１−Ｐｈｏｒ１８抗体結合体の構成及び発現を記述する。これらの結合体は抗体薬剤結合体（ＡＤＣ）とも称する。
【０２２６】
哺乳類系（ＣＨＯ細胞）におけるホールＩｇＧ１抗体Ｐｈｏｒ１８（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号４））結合体の組換え発現は、２つの異なる分泌シグナル配列を用いて行われた。すなわち、抗体のＨ鎖及びＬ鎖の特許された分泌シグナル配列、及びヒトＩｇＧカッパＬ鎖分泌シグナルである。発現された抗Ｈｅｒ２  ＩｇＧ１抗体（Ｈｅｒ−２受容体に対するヒト化された可変Ｌ鎖及びＨ鎖ドメイン領域）、及びＰｈｏｒ１８対抗体の化学量論比が２，４，及び６である様々な抗Ｐｈｏｒ１８結合体の特性が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット解析、及び表面プラズモン共鳴（選択されたＡＤＣ）を用いて明らかにされた。
【０２２７】
Ｈ鎖又はＬ鎖のＣ末端又はＮ末端Ｐｈｏｒ１８結合を有する、組換えによって産生された（完全なＩｇＧ１抗体としての）抗体の収率、純度、及び細胞毒性を分析した。ホール抗体分子に結合された細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）の２，４，及び６個の分子が発現された。「非結合抗Ｈｅｒ２抗体」、抗Ｈｅｒ２抗体のＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列を表４に示す。
（表４）Ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ  ＤＢ０００７２による抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体のアミノ酸配列ヒトＩｇＧ１と比較して、抗Ｈｅｒ２抗体のＣH１ドメインには付加的なアミノ酸が１つ存在する。
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕＬ鎖（裸Ｌ１）（配列ＩＤ番号８４）
【表４（Ａ）】
0006559066.tif 000039
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕＨ鎖（裸Ｈ１）（配列ＩＤ番号８５）
【表４（Ｂ）】
0006559066.tif 000040
【０２２８】
抗体−溶解性ペプチド結合体のＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列を表５に示す。遺伝子合成は、チャイニーズハムスター卵巣細胞に好適なコドン使用頻度を用いてＧｅｎｅｗｉｚ，  Ｉｎｃ  （Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，  ニュージャージャー州）において行われた。転写したものを結紮してｐＵＣ５７細菌プラスミドを形成した。
（表５）溶解性ペプチド（Ｐｈｏｒ１８，  ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号４））−抗体Ｈ鎖及びＬ鎖結合体のアミノ酸配列
Ｐｈｏｒ１８−ＶＬＬ鎖（Ｌ２）：（配列ＩＤ番号８６）
【表５（Ａ）】
0006559066.tif 000041
ＣL−Ｐｈｏｒ１８Ｌ鎖（Ｌ３）：（配列ＩＤ番号８７）
【表５（Ｂ）】
0006559066.tif 000042
Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８Ｌ鎖（Ｌ４）：（配列ＩＤ番号８８）
【表５（Ｃ）】
0006559066.tif 000043
Ｐｈｏｒ１８−ＶＨＨ鎖（Ｈ２）：（配列ＩＤ番号８９）
【表５（Ｄ）】
0006559066.tif 000044
ＣH３−Ｐｈｏｒ１８Ｈ鎖（Ｈ３）：（配列ＩＤ番号９０）
【表５（Ｅ）】
0006559066.tif 000045
Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８Ｈ鎖（Ｈ４）：（配列ＩＤ番号９１）
【表５（Ｆ）】
0006559066.tif 000046
【０２２９】
Ｈ鎖及びＬ鎖の転写物は、５’  ＥｃｏＲ１及び３’  Ｘｂａ１制限部位を含むプライマーを有するＰＣＲを用いてＧｅｎｅｗｉｚ  ｐＵＣ５７プラスミドから合成され、指向的結紮によってｐＣＭＶＴｎ哺乳類発現プラスミドのマルチクローニング部位となる（図５，Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ウィスコンシン州，  Ｌ５６２０，  ロット１４５２４９１９）。各転写物は５’末端においてＫｏｚａｋコンセンサス配列及び分泌シグナルを含んでいた。
【０２３０】
抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体がＬｏｎｚａ  Ｉｎｃ．  （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）によって生産された。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞哺乳類発現系を用いて、裸（すなわち、細胞溶解性ドメインがない）抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ  ＩｇＧ１、及び細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）を画定された位置（Ｎ又はＣ末端）に有するＡＤＣを、１個のホール抗体に対して２，４，及び６個の細胞溶解性ドメインの比で産生した。
【０２３１】
要するに、フリースタイルのＣＨＯ懸濁液細胞発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ｃａｔ＃  Ｋ９０００−２０）を用いて、８ｍＭ  ｇｌｕｔａｍａｘ及び５ｍｌ／Ｌのペニシリン／ストレプトマイシンを補ったフリースタイルのＣＨＯ発現培地で、ＦＳ−ＣＨＯ細胞を成長させた。細胞を解凍してペニシリン／ストレプトマイシンのない成長培地に入れた。この培地は予め３７℃に温められ、８％のＣＯ2雰囲気内で平衡を保ち、３０ｍｌの量を振盪フラスコ内で１２５から１３５ｒｐｍで成長させた。細胞密度は凝集を避けるために１×１０6細胞／ｍｌ以下に維持した。
【０２３２】
ＦＳ−ＣＨＯ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプロトコルに従ってトランスフェクトされた。ＦＳ−ＣＨＯ細胞は解凍後に７日以上膨張させた。細胞数は２４時間ごとに倍になった。トランスフェクションの前日に、凝集した細胞を取り除き、細胞をペレット状にしてＰ／Ｓフリー培地で５×１０5／ｍｌの密度で再度サスペンションを行った。トランスフェクションの当日、細胞を必要に応じて９×１０5細胞／ｍｌに調整し、生存率は９９％に近かった。１８０ｍｌの細胞を入れた５００ｍｌ容量のスピナーフラスコ（ＶＷＲ，  ｃａｔ＃  ＰＢＶ１２５）の各々を、１８０μｌのＦＳＭａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃  １６４４７−１００）と混合した１８０μｇのトータルプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。ＤＮＡ混合物を少しずつ添加しながら、細胞に高速で渦を発生させた。分析されたＨ鎖とＬ鎖の比は、３：２、１：１、及び２：３であった。
【０２３３】
細胞培地に分泌され、トランスフェクションの４日後から６日後に採取されたＡＤＣを、プロテインＡカラムを用いて精製した。約０．２５ｍｌのプロテインＡ樹脂（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌ００２１０、樹脂１ｍｌにつき２０ｍｇ  ＩｇＧを超える能力）を用いて、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ製品プロトコル及び提供されたバッファの記述に従い、分泌されたＡＤＣをＦＳ−ＣＨＯ培地から分離した。ＡＤＣは０．１ＭグリシンｐＨ２．５の低ｐＨ溶出緩衝液を０．５ｍｌ用いて溶出し、溶出液は再度カラムで処理され、２度目の回収が行われる。１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）によってｐＨを６．５に調整した。
【０２３４】
プロテインの存在を確認するため、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４から１５％のＴＧＸゲル、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｓ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ，  ｃａｔ＃  ４５６−１０８４）分析を用いた。ゲル上で分離されたＡＤＣは、銀染色されていた（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  Ｐｒｏｔ  Ｓｉｌ１  ｋｉｔ）。抗Ｐｈｏｒ１８ウサギポリクローナルはＣｏｖａｎｃｅ社（Ｄｅｎｖｅｒ，  ＰＡ，  ｃａｔ＃  ３３８９８３）製のものを用い、検出のために抗ウサギＨＲＰを用いた（ｃａｔ＃  １１１−０３５−０４６，  Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）。ＡＤＣの検出は、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製の抗ヒトＩｇＧを用いて行った（ｃａｔ＃  １０９−０３５−０８８）。Ｌ鎖の存在は、ＨＲＰマウス抗ヒトカッパ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃０５３９２０）を用いて低減ＡＤＣを基に確認した。
【０２３５】
ＡＤＣの配合において、２０倍の溶液中のＤＰＢＳ塩及びポリソルベート２０（ＰＳ２０）をプロテインＡ溶出緩衝液（Ｔｒｉｓ−グリシン、５０ｍＭから１００ｍＭ）に以下の最終濃度で添加し、冷凍−解凍サイクルの間４℃で保存するために安定化させた：ＣａＣｌ2  １００ｍｇ／Ｌ，  ＭｇＣｌ2  （・６Ｈ２Ｏ）  １００ｍｇ／Ｌ，  ＫＣｌ  ２００ｍｇ／Ｌ，  ＮａＣｌ  ８ｇ／Ｌ，及び０．０９  ｍｇ／ｍｌ  ＰＳ２０。プロテイン濃度を測定するために、いくつかの群において、各サンプルのＯＤ280を分光光度計によって測定した。ＡＤＣ濃度［ｍｇ／ｍｌ］は、消光率１．４（アミノ酸配列に基づく）を用いて算出された。より精度を高めるため、ＡＤＣ濃度は抗ヒトＩｇＧイライザアッセイ（Ｇｅｎｗａｙ，  ４０−３７４−１３００３７）によって測定された。
【０２３６】
第１の抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体ベースのＡＤＣはシグナル配列の規則の下で産生され、発現分析が行われた。産生されたＡＤＣは：Ｈ１Ｌ１  （裸），  Ｈ２Ｌ２  （Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１），  Ｈ２Ｌ１  （Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１），  Ｈ１Ｌ２  （Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１），  Ｈ１Ｌ３  （ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１）  Ｈ３Ｌ１  （ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），  Ｈ３Ｌ３  （ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），  Ｈ３Ｌ４（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），  及びＨ４Ｌ３  （Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１）である。分光光度的（ＯＤ280）分析に基づき、ＡＤＣの平均収率はＨ２Ｌ２  ＝  ０．１２ｍｇ／Ｌ  及び  Ｈ１Ｌ３  ＝  ０．８ｍｇ／Ｌであった。
【０２３７】
表６は各ＡＤＣの記述、略記、及び細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）の数と配置を示す。
（表６）ＡＤＣ記述及び略称
【表６】
0006559066.tif 000047
【０２３８】
ＡＤＣの特性を低減された抗体の免疫ブロットに基づいて分析し、Ｈ鎖及びＬ鎖が視覚化できるようにした。Ｐｈｏｒ１８の存在はＨ１Ｌ２  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１  （Ｈ１Ｌ２）のＬ鎖、Ｈ１Ｌ３  （ＣL−Ｐｈｏｒ１８−  ＩｇＧ１）のＬ鎖、及びＨ３Ｌ１  （ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１）のＨ鎖において確認され、Ｌ鎖のＣ末端にのみＰｈｏｒ１８が存在する（図６）。
【０２３９】
Ｈ鎖及びＬ鎖におけるＰｈｏｒ１８の存在は、Ｐｈｏｒ１８結合体を有するＨ鎖のウェスタンブロット分析（図７Ａ）において確認した。Ｈ１Ｌ１及び抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、裸の抗体を負のコントロールとしたが、Ｐｈｏｒ１８をプローブするバンドを示さなかった。組換えによって産生された抗体及び抗体結合体内のＬ鎖の存在は、Ｈ１Ｌ１  （ＩｇＧ１），  Ｈ３Ｌ１  （ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１），  Ｈ１Ｌ３  （ＩｇＧ１−ＣL−Ｐｈｏｒ１８）に対するウェスタンブロット分析（カッパＬ鎖）において確認され、Ｈ２Ｌ２  （Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１）は、ＩｇＧウェスタンブロット分析、カッパＬ鎖ウェスタンブロット分析（図７Ｂ）、及び抗Ｐｈｏｒ１８免疫ブロット（図６及び７Ａ）に基づいて、Ｈ鎖及びＬ鎖の両方を有していた。
【０２４０】
このデータは、細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）対抗体の所定の化学量論比が２，４，及び６であり、所定の位置にある細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）を有する哺乳類発現系内で、ホール抗体−溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）結合体が産生できることを示している。
実施例８
【０２４１】
本実施例は、８個のＡＤＣの効力及び特異性の説明を含む。
【０２４２】
Ｎ又はＣ末端において２，４，又は６個のＰｈｏｒ１８分子と結合した抗Ｈｅｒ−２受容体（ＩｇＧ１）を有するＡＤＣを、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性の卵巣がん細胞株（ＳＫＯＶ−３ヒト卵巣がん細胞）を用いて生体外で分析し、「裸の」抗体と比較した。Ｈｅｒ−２受容体陰性、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性のヒト乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）をコントロールとした。
【０２４３】
要するに、ＳＫＯＶ−３（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性、継代数ｐＵ５１）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性、ＥＲ陰性、ＰＲ陰性、ｐｕ１４）細胞は、細胞乖離バッファを用いた熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞２，０００個の密度で接種された。２日後、細胞に真水（７５μｌ）を補給し、細胞培地内で調製された各ＡＤＣ及び裸の抗体を４倍連続希釈したもの２５μｌを添加して培養した。
【０２４４】
４時間培養した細胞に対して、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ９２９２  ｌｏｔ  ＃  ３１７８７２）を用いて膜完全性のアッセイを行った。発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ  ７５７２，  ｌｏｔ  ３１５１１２０２）を用いて、細胞の生存率を２４、４８、及び７２時間後に測定した。１００％の細胞生存率（培地）及び１００％の細胞死（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）のためのコントロールを同じ条件の下で培養した。
【０２４５】
データは処理及び分析を行ってＩＣ50値を得た。使用したソフトウェアはＷｉｎｄｏｗｓ用Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５．００版，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ  （Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，  Ｉｎｃ）である。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各試験はそれぞれ２から３個のウェルの二重プレートを用いて行われ、時点ごとに４から６のデータ点のＮを得た。
【０２４６】
各ＡＤＣの濃度は、分光光度法（ＯＤ280）によって、及び一部のケースではイライザアッセイを用いてＩｇＧ測定法によって測定した。各ＡＤＣ及び裸の抗体は、冷凍したストックから調製されて、初期濃度によっては最高濃度８００ｎＭ以下に達する。
【０２４７】
連続希釈液は細胞培地内で調製され、ウェルごとの最終濃度は０，  ０．００１，  ０．０１，  ０．１，  １，  １０，  １００  及び２００ｎＭに達し、これらは分光光度法で測定した濃度の場合の０．０００１５，  ０．００１５，  ０．０１５，  ０．１５，  １．５，  １５，  ３０  及び６０  μｇ／ｍｌに対応する。ＩｇＧの含有物を有する研究のために、可能な限り最高の濃度を試験し、その後各ＡＤＣについて１：１  及び  １：１０の希釈を行った。
【０２４８】
様々な時点において、組換えによって発現されたＡＤＣの活性を測定した。最初期に現れる活性の兆候は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性のＳＫＯＶ−３細胞において４時間のＡＤＣ曝露の後に、膜完全性に対する影響として測定された。
【０２４９】
可変Ｌ鎖（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１）上にＰｈｏｒ１８を有するＮ末端結合ＡＤＣは、標的細胞膜（ＩＣ50  ＝  １８７．９  ±  １２．８  ｎＭ）を分解した。Ｐｈｏｒ１８分子を１個有するＣ末端結合ＡＤＣ（ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１）は、検出可能な膜活性がなかった。裸の抗Ｈｅｒ２−ＩｇＧ１も、膜完全性に対する検出可能な影響を示さなかった。
【０２５０】
表７はこの活性研究の結果をまとめたものである。負のコントロール（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性）であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１と比較すると、ＡＤＣは標的細胞株ＳＫＯＶ−３に対する高い特異性を示した。
【０２５１】
最大毒性レベルを４８時間後に測定した。抗体ごとに２個のＰｈｏｒ１８を有するＣ末端結合ＡＤＣであるＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１  （２７．４±５．１  ｎＭ，  ２個のＰｈｏｒ１８／抗体，  Ｈ３Ｌ１，  Ｃ末端）と比較すると、Ｎ末端結合ＡＤＣであるＰｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１  （１３．０２±２．３  ｎＭ，  ２個のＰｈｏｒ１８／抗体，  Ｎ末端）及びＨ２Ｌ１  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１  （６．９±３．４  ｎＭ，  ２個のＰｈｏｒ１８／抗体，  Ｎ−末端）の場合は、ＩＣ50値［ｎＭ］が低ナノモル領域にあった。
【０２５２】
Ｎ末端上に４分子のＰｈｏｒ１８を有するＮ末端結合ＡＤＣは、ＩＣ50値が０．５４±０．２  ｎＭ  （Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１，  ４個のＰｈｏｒ１８／抗体，  Ｎ末端，  Ｈ２Ｌ２）であり、これに相当するＣ末端結合ＡＤＣであるＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１の場合は、（３６．３±１０．６  ｎＭ，  ４個のＰｈｏｒ１８／抗体，  Ｈ３Ｌ３，  Ｃ末端，  ｐ＜０．００１）であった。Ｎ末端における細胞溶解性ドメイン結合は、Ｃ末端における結合の７０倍の能力があった。
【０２５３】
これらのデータは、抗体ごとに２及び４分子の化学量論比の場合について、Ｎ末端Ｐｈｏｒ１８結合を有するＡＤＣがＣ末端Ｐｈｏｒ１８結合よりも優れていることを示している。
【０２５４】
Ｐｈｏｒ１８結合が抗体ごとに２分子から４分子に増加することによって、Ｃ末端ではなくＮ末端における結合を有する、１２倍の能力を持つＡＤＣが生じた。抗体ごとに６個のＰｈｏｒ１８分子と結合されるＡＤＣは同じ効力を示したが、そのＩＣ50値は、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１（６個のＰｈｏｒ１８，  Ｎ及びＣ末端，  Ｈ３Ｌ４）については１．１±０．２  ｎＭであり、Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１  （６個のＰｈｏｒ１８，  Ｈ４Ｌ３）については、１．１±０．４  ｎＭであった。
【０２５５】
裸の抗Ｈｅｒ２−ＩｇＧ１は、ＳＫＯＶ−３標的細胞において４８時間後に実質的により少ない細胞殺滅活性を示した（ＩＣ50値は２３４．６±４９  ｎＭ）。同じ条件の下で、標的陰性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を殺滅するＡＤＣはなかった。
【０２５６】
これらのデータは、細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）結合抗Ｈｅｒ−２受容体抗体（ＡＤＣ）がＨｅｒ２／ｎｅｕ発現細胞に対して非常に特異的であることを示している。標的受容体が存在しなければ、細胞は損傷しないままとなる。
【０２５７】
細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）結合抗体（ＡＤＣ）の効力は、結合の位置、及び細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）分子の数に依存する。標的細胞に対する最高の効力は、抗体ごとに２及び４個の細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）分子を有するＮ末端細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）抗体結合体について観測された。Ｎ末端結合は、Ｃ末端細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）抗体結合と比較して、７０倍の活性の増加を示した。Ｎ末端Ｐｈｏｒ１８結合ＡＤＣは、抗体ごとに２及び４個のＰｈｏｒ１８分子を有するＣ末端Ｐｈｏｒ１８結合体と比較して、より高い効力を持っていた。さらに、Ｎ末端結合は、標的細胞ＳＫＯＶ−３の膜完全性の低減に対する測定可能な効果を示した。
【０２５８】
結合された細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）分子の数を抗体ごとに６個に増やすことによって、低ナノモル領域において最大の活性が得られた。Ｐｈｏｒ１８結合ＡＤＣは、裸の抗体と比較して最大で４３３倍の効力を示した。
（表７）ＣＨＯ細胞で産生されたＡＤＣ及び裸の抗体の生体外活性
【表７】
0006559066.tif 000048
実施例９
【０２５９】
本実施例は、ＩｇＧカッパシグナル配列を用いたＡＤＣ発現の最適化の説明を含む。ＡＤＣの特性及び発現レベルの向上について、代替分泌シグナルペプチドを評価した。Ｎ末端Ｐｈｏｒ１８を有するＨ鎖及びＬ鎖の発現のためのヒトＩｇＧカッパシグナル配列を産生するために、５’末端の新しいシグナルペプチドを用いた、Ｌ２（Ｐｈｏｒ１８−ＶL
）、Ｌ４（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８）、及びＨ２（Ｐｈｏｒ１８−ＶH）抗体のＨ鎖及びＬ鎖転写のための新しい遺伝子合成がＧｅｎｅｗｉｚ，  Ｉｎｃ．によって行われた。ヒトＩｇＧカッパシグナルペプチドのアミノ酸配列はＭＱＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＡである（Ｆｅｌｇｅｎｈａｕｅｒ  Ｍら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：４９２７  （１９９０））。
【０２６０】
ｉｇｋ分泌シグナルを用いて産生されたＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１のＡＤＣは、抗ＣLカッパ及び抗Ｐｈｏｒ１８を用いてプローブした還元プロテインの免疫ブロットにおけるＬ鎖のための強いシグナルを有していた。ＩｇＧカッパシグナルペプチドはより高い発現及び特性を誘発したため、ｉｇｋ転写物がＡＤＣの産生のために選択された。ＩｇＧカッパシグナル配列を用いてＣＨＯ細胞内に発現されたＡＤＣの産生レベルは、イライザ定量化に基づいて、以下の通りであった。Ｈ１Ｌ１は０．８ｍｇ／Ｌ，  ＣL−Ｐｈｏｒ１８−  ＩｇＧ１は０．８ｍｇ／Ｌ，  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１は０．３ｍｇ／Ｌ，及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１は０．１５ｍｇ／Ｌであった。ＩｇＧカッパシグナル配列を有するＮ末端Ｐｈｏｒ１８ＡＤＣのいくつかの付加的なバッチを、発現レベル、特性、及び生体外の効力について、同等の発現レベルとともに産生及び分析した。
【０２６１】
Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１  （Ｈ１Ｌ２），  ＩｇＧ１−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１  （Ｈ１Ｌ３），及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１  （Ｈ２Ｌ２）。これらのＮ末端及びＣ末端結合Ｐｈｏｒ１８ＡＤＣを、抗Ｐｈｏｒ１８免疫ブロット、ＩｇＧ及びカッパＬ鎖ウェスタンブロット分析によって、特性及び純度について分析した（図８）。Ｐｈｏｒ１８の存在は、Ｈ鎖及びＬ鎖においてそれらの分子量によって確認した（図８）。
【０２６２】
ＡＤＣの免疫ブロット分析は、ｉｇｋ分泌シグナルによって産生されたＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１、ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ１、及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１のＡＤＣが、Ｐｈｏｒ１８とともに存在するＨ鎖及びＬ鎖を有していることを示した。発現レベルは、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１の両方について０．５ｍｇ／Ｌよりも低かった。
実施例１０
【０２６３】
本実施例は、Ｈｅｒ２／ｎｅｕプロテインの抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体への結合と比較した、Ｈｅｒ２／ｎｅｕプロテインのＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１に対する結合キネティクスの特徴を明らかにする研究を記述する。
【０２６４】
表面プラズモン共鳴の研究は、ＢｉｏＲａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎシステム上で、ヤギ抗ヒトＩｇＧでコーティングされたＧＬＭセンサチップを用いて行われた。ＡＤＣ（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１）及び抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体を、５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、捕捉のために抗ヒトＩｇＧ表面上に注入した。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体は、１５０ＲＵから１０００ＲＵに捕捉された。Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１の捕捉レベルは２００から９００ＲＵの間であった。
【０２６５】
ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ＃１００４−Ｈ０８Ｈ）は、３倍希釈系列（Ｎ＝４）における最高の濃度である５０ｎＭで分析された。２５データは２５℃で収集された。標的表面からの反応は、基準面によって減算された後に１：１相互作用モデルに包括的に適合された。結合定数は表８に示す通り測定された。
（表８）２５℃で測定された結合定数
【表８】
0006559066.tif 000049
【０２６６】
この結果は、ＥｒｂＢ２が抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体に８４±１３ｐＭの親和性で結合し、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１にそれぞれ約２．５倍及び２倍弱い２００±２４及び１７５±１３ｐＭの親和性で結合したことを示している。最も顕著な差異は会合速度において見られ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の会合速度はＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１の会合速度よりも約２倍速い。このように、ホール抗体に結合されたＰｈｏｒ１８の結合キネティクスは抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体と類似であり、このことは結合特性が様々なＬ鎖及びＨ鎖において結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によってほとんど影響されないことを示す。
実施例１１
【０２６７】
本実施例はＡＤＣの細胞毒性についての特性を明らかにし評価する研究を記述する。
【０２６８】
異なる発現バッチを準備した。ＡＤＣ濃度は分光光度測定（ＯＣ280）、及びＩｇＧ定量化アッセイによって測定した。抗体（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１）ごとの２及び４個のＰｈｏｒ１８分子について、Ｎ末端Ｐｈｏｒ１８結合を有する選択されたＡＤＣの連続希釈液は、実施例１０において示すように調製された。生体外活性は、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１のそれぞれの調製物におけるＩｇＧ含有量に基づく。
【０２６９】
４時間後の時点を分析してＡＤＣの細胞膜完全性に対する効果を測定した（表８）。Ｐｈｏｒ１８対抗体の化学量論比が２及び４であるＡＤＣは、４時間の曝露の後にＳＫＯＶ−３標的陽性細胞の細胞膜を分解した（ＩＣ50値はＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１については２１．５±１であり、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１については２．５１±０．２ｎＭであった）。膜活性はＮ末端４Ｐｈｏｒ１８結合抗体の方が１０倍高かった。
【０２７０】
細胞死は２４時間後に、ＩＣ50値がＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１  （３．７±０．９  ｎＭ）及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１  （０．２±０．０４  ｎＭ）について低ナノモル領域にある状態で計測された。Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩＧＧ１及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１の最大効力は、４８時間後にＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１  （０．５４±０．２  ｎＭ）及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１  （０．０７±０．０２  ｎＭ；  ｐ＜０．０００１）について計測された。両方のケースにおいて、４Ｐｈｏｒ１８抗体結合体（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１）の生体外効力は、２Ｐｈｏｒ１８抗体結合体（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１）（ｐ＜０．０００１）よりも１０から２０倍高かった。裸の抗体は、２４時間後及び４８時間後において２２５．８±４３及び２９５．３±８０．６ｎＭでＨｅｒ２／ｎｅｕ陽性標的細胞（ＳＫＯＶ−３）を殺滅した。
【０２７１】
前述の結果と整合しているが、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１はＰｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１よりも１０倍高い活性を示す、最も活性のあるＡＤＣであった。Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陰性コントロール細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、裸の抗体によっても、又はＡＤＣ（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ１又はＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ１）によっても殺滅されなかった（表９）。このデータは、Ｃ末端Ｐｈｏｒ１８結合体と比較して、より多くのＰｈｏｒ１８（４対２）が抗体のＮ末端ドメインに結合されると、効力が高まることを実証している。
（表９）Ｈｅｒ２／ｎｅｕ陽性卵巣がん細胞株に対する、２及び４個のペプチドのＮ末端Ｐｈｏｒ１８結合を有する組換えによって産生されたＡＤＣの生体外活性。
【表９】
0006559066.tif 000050
実施例１２
【０２７２】
本実施例では、ＣＤ２０と結合するＡＤＣの産生について説明する。
【０２７３】
ＣＤ２０はＢ細胞悪性腫瘍の表面上に発現され、内部に入らない表面標的である。抗体断片結合体は大腸菌（単鎖断片及びＰｈｏｒ１８結合体）及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（単鎖二量体及びＰｈｏｒ１８結合体）内で産生され、２，４，及び６個のＰｈｏｒ１８分子を有するホール抗体結合体はＣＨＯ細胞内で発現された。抗ＣＤ２０ＩｇＧ１抗体ＡＴ８０及びＭＳ４Ａ１との化学結合が行われた。
【０２７４】
化学結合−ＡＴ８０（マウスＩｇＧ１、Ｔｅｎｏｖｕｓ）及びＭＳ４Ａ１（リツキシマブ様、Ｒ＆Ｄ）  精製抗体ＩｇＧ１  ＡＴ８０及びＩｇＧ１  ＭＳ４Ａ１が得られ、Ｐｈｏｒ１８との化学結合のために用いられた。これらの抗体はおよそ２ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮されたリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に入れられた。ＳＰＤＰの２０ｍＭ溶液を、新たにＤＭＳＯ中に調製し、その抗体溶液に２０倍過剰で加えた。その混合物を室温で約３０分間インキュベートすることにより、抗体−リンカー中間体を生成した。過剰な未反応のＳＰＤＰをサイズ排除クロマトグラフィにより除去する。システインを含む細胞毒素分子を、１０倍過剰のレダクタクリル（ｒｅｄｕｃｔａｃｒｙｌ）試薬との反応によって完全に還元した後、抗体−リンカー構築物と１０倍過剰で混合した。その反応物を室温で１８時間インキュベートし、次いで、脱塩することにより、未反応の細胞毒分子を除去する。その溶液を、貯蔵前に濾過滅菌する。最終的なＡＤＣの濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテイン計測によって測定したところ、ＡＴ８０−Ｐｈｏｒ１８結合体については０．７６ｍｇ／ｍｌであり、ＭＳ４Ａ１−Ｐｈｏｒ１８結合体については０．３４ｍｇ／ｍｌであった。結合にＳＰＤＰを用いる抗体ごとのＰｈｏｒ１８分子の数は、通常抗体ごとに３から５個のＰｈｏｒ１８分子となる。
【０２７５】
Ｐｈｏｒ１８と化学結合したＣＤ２０と対抗する２つの抗体は、細胞外のＣＤループの異なるドメインと結合するため、分析された。生体外の研究によって、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ，  バーキットリンパ腫）内の、「裸」の抗体（ＩｇＧ１）を有する２つの化学結合したＣＤ２０標的ホール抗体ＩｇＧ１−Ｐｈｏｒ１８結合体の細胞毒性を比較した。ＣＤ２０陰性白血病細胞（Ｕ９３７）をコントロールとした。
【０２７６】
裸の抗体抗ＣＤ２０−ＩｇＧ１−Ｐｈｏｒ１８は、０．３４ｍｇ／ｍｌ（ＭＳ４Ａ−Ｐｈｏｒ１８）及び０．７６ｍｇ／ｍｌ（ＡＴ−８０−Ｐｈｏｒ１８）の濃度で化学的に結合された（ＭＳ４Ａ及びＡＴ８０）、分子量約１５８，０００ｇ／ｍｏｌ。細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）にて取得した。ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ２）、Ｒａｊｉ（ＣＤ２０陽性、ｐ２）、及びヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＣＤ２０陰性、ｐ１０）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞３，０００個の密度で接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を補給し、ＭＳ４Ａ１−Ｐｈｏｒ１８及びＡＴ８０−Ｐｈｏｒ１８の４倍連続希釈したもの２５μｌを添加して培養した。これらの濃度は０．００１，０．０１，０．１，１，１０，１００及び５００ｎＭ（Ｎ＝６）であった。２時間から５時間培養した細胞に対して、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ９２９２  ｌｏｔ  ＃  ３０１３２９）を用いて膜完全性のアッセイを行った。発光式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ  ７５７２，  ｌｏｔ  ３００６８１０２）を用いて、細胞の生存率を２４及び４８時間後に測定した。
【０２７７】
化学的に結合したＭＳ４Ａ１−Ｐｈｏｒ１８及びＡＴ８０−Ｐｈｏｒ１８の膜活性を試験した。ＭＳ４Ａ１−Ｐｈｏｒ１８は２時間から５時間後にＣＤ２０陽性細胞株Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉにおいて活性がなかったが、一方でＡＴ−８０−Ｐｈｏｒ１８は、１０６．１±２．９ｎＭというＩＣ50値でＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞内の膜完全性を破壊した。Ｄａｕｄｉ細胞はＡＴ−８０−Ｐｈｏｒ１８結合体によって４８時間以内に１１．９±０．９ｎＭというＩＣ50値で殺滅され、Ｒａｊｉ細胞は６．３±１．０２ｎＭというＩＣ50値で殺滅された。ＣＤ２０陰性コントロール細胞株Ｕ９３７は、裸のＡＴ−８０抗体にもＡＴ−８０−Ｐｈｏｒ１８結合体にも殺滅されなかった。
【０２７８】
ＭＳ４Ａ１−Ｐｈｏｒ１８結合体は、Ｒａｊｉ細胞において低活性を示し、２４時間及び４６時間後におけるＩＣ50値は２６７±１３及び２２７±１１ｎＭであった。Ｄａｕｄｉ細胞はＭＳ４Ａ１−Ｐｈｏｒ１８結合体に対して感受性がより高く、ＩＣ50値は１０．６±２．１及び３．０±１．２ｎＭであった。裸のＭＳ４Ａ１抗体はＲａｊｉ細胞株にもＤａｕｄｉ細胞株にも毒性を有さなかった。ＣＤ２０陰性ヒト白血病細胞（Ｕ９３７）は、いずれのＡＤＣによっても殺滅されなかった（表１０）。
【０２７９】
これらのデータは、化学的に結合したＰｈｏｒ１８ＡＤＣがＣＤ２０陽性細胞と接触するとそれを殺滅し、内部に侵入する必要がないと思われることを示している。細胞毒性はＣＤ２０標的に特異的であり、ＡＤＣの結合ドメインに依存している。
（表１０）ＣＤ２０陽性非ホジキンリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ及びＤａｕｄｉ、及びＣＤ２０陰性細胞株Ｕ９３７における、化学的に結合された抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１−Ｐｈｏｒ１８結合体の生体外活性
【表１０】
0006559066.tif 000051
実施例１３
【０２８０】
本実施例では、ＣＤ２０標的ＡＤＣのカスパーゼ活性化の比較について説明する。
【０２８１】
ＣＤ２０標的ＡＤＣは細胞内部に入らない。細胞死の開始は、アポトーシス関連の経路を決定することにより計測である。初期のアポトーシスの過程では、カスパーゼ３及び７の活性化が見られる。カスパーゼはシステインアスパラギン酸特異的プロテアーゼ族のメンバであり、哺乳類細胞におけるアポトーシスの重要なエフェクタの役割を担う。このアッセイは発光原（ｌｕｍｉｎｏｇｅｎｉｃ）カスパーゼ３／７基板を提供し、この基板は、カスパーゼ活性、ルシフェラーゼ活性、及び細胞溶解に最適化された試薬内に、テトラペプチド配列ＤＥＶＤを含む。
【０２８２】
生体外の研究によって、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ，  バーキットリンパ腫）内の、「裸」の抗体（ＩｇＧ１−ＡＴ８０）を有する化学結合したＣＤ２０標的ホール抗体ＩｇＧ１−Ｐｈｏｒ１８結合体のカスパーゼ活性を比較した。
【０２８３】
ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ２）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞３，０００個の密度で接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を供給し、ＡＴ８０−Ｐｈｏｒ１８（０．７６ｍｇ／ｍｌ）、又は１５及び７５μｇ／ｍｌ（１００及び５００ｎＭ）（Ｎ＝６）の裸の抗体ＡＴ−８０で培養した。１０μＭのスタウロスポリンをカスパーゼ３／７活性の正のコントロールとした。５時間の培養の後、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｇｌｏ  ３／７  Ｇ８１１Ｃ  ｌｏｔ  ＃  ２８７３１８０２）を用いて、培地のカスパーゼ３／７レベルのアッセイを行った。
【０２８４】
カスパーゼ３／７活性化は、発光測定シグナルからの発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）をもとに算出された。スタウロスポリンのカスパーゼ３／７活性化を１００％に設定し、試薬の添加のない細胞懸濁液のみを０％のカスパーゼレベルとした。ＡＴ８０−Ｐｈｏｒ１８のカスパーゼ３／７レベルは、１５μｇ／ｍｌでは１３±２．６％に上昇し、７５μｇ／ｍｌでは８５．７±５に達した。結合していないＡＴ−８０は、１５又は７５μｇ／ｍｌの濃度ではカスパーゼ活性を示さなかった（−１２．３及び−２．３％）。最大投与量のＡＴ８０−Ｐｈｏｒ１８は、スタウロスポリンに匹敵するカスパーゼ活性を生じた（ｐ＝０．０６）（図９）。
【０２８５】
Ｐｈｏｒ１８結合ＡＤＣは、標的細胞に結合したときにカスパーゼ３／７を活性化し、そのため５時間以内にアポトーシスによる細胞死を促進する。
実施例１４
【０２８６】
本実施例では、大腸菌内の発現構造体及び単鎖抗ＣＤ２０Ｐｈｏｒ１８（ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８）結合体の特性の説明を行う。
【０２８７】
単鎖Ｆｖ抗ＣＤ２０断片は、リツキサンＣＤＲをｐ１８５のヒト化可変領域に挿入することによって設計された。精製のためにポリヒスチジンタグをプロテインのＮ末端に付加した。アミノ酸配列を以下に示す。太字は挿入されたＣＤＲを表す。ポリグリシンフレキシブルリンカをＶL及びＶHドメインの間に挿入し、Ｐｈｏｒ１８をＣ末端でＧＳリンカの後に配置した。
ｓｃＦｖ断片（裸の抗体）のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号９２）
【表Ｅ−１】
0006559066.tif 000052
ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体（Ｃ末端）のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号９３）
【表Ｅ−２】
0006559066.tif 000053
【０２８８】
この抗体断片はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から大腸菌内での産生のために取り寄せたものである。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社は自らのｐＧＳ２１ａ発現プラスミドを用いて、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ細胞内での産生を行った。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社は大腸菌封入体からプロテインを分離した。
【０２８９】
裸のｓｃＦｖ断片は親和性クロマトグラフィによって精製され、０．３１ｍｇ／ｍｌの濃度で１５ｍｇ／Ｌの収率を生じ、純度は８５％と測定された。分子量はクーマシィー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて２７，０８８ｇ／ｍｏｌと測定された。Ｐｈｏｒ１８結合体は、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、収率が１５ｍｇ／Ｌ、純度が８５％であった。分子量は２９，３４９ｇ／ｍｏｌと測定された。裸の抗体及びＡＤＣは共に、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）中に提供された。
【０２９０】
抗ＣＤ２０  ＳｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８は、分子量が２９．３ｋＤと算出された。抗体断片に精製のためにポリヒスチジンタグを発現させた。抗ヒスチジンでプローブされたプロテインの免疫ブロット及びクマシーブルーで染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、分子量が正しい範囲にあることが示された。
実施例１５
【０２９１】
本実施例では、大腸菌内の組換えにより産生されたＣＤ２０標的Ｆｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体の発現及び特徴を説明する。
【０２９２】
二価抗ＣＤ２０ミニボディは、フレキシブル・グリシン−セリン・リンカを可変ドメイン間及びＣH３ドメイン間に付加し、Ｆｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖミニボディを生じさせることによって、設計される。封入体からの精製のためにポリヒスチジンタグをプロテインのＮ末端に付加し、Ｐｈｏｒ１８はＣ末端でＧＳリンカの後に配置した。アミノ酸配列を以下に示す。可変ドメインに挿入されたＣＤＲを太字で表し、ＣH３ドメインを小文字で表す。
抗ＣＤ２０ミニボディＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖのアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号９４）
【表Ｅ−３】
0006559066.tif 000054
抗ＣＤ２０Ｐｈｏｒ１８ミニボディ結合体Ｆｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖ−Ｐｈｏｒ１８のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号９５）
【表Ｅ−４】
0006559066.tif 000055
【０２９３】
この抗体断片はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から大腸菌内での産生のために取得したものである。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社は自らのｐＧＳ２１ａ発現プラスミドを用いて、大腸菌ＡｒｃｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓ細胞内での産生を行った。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社は大腸菌封入体からプロテインを分離した。
【０２９４】
裸の抗ＣＤ２０ミニボディは親和性クロマトグラフィによって精製され、０．２３ｍｇ／ｍｌの濃度で３ｍｇ／Ｌの収率を生じ、純度は８０％と測定された。分子量はクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を用いて７８，９８８ｇ／ｍｏｌと測定された。Ｐｈｏｒ１８結合体は、クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、収率が３  ｍｇ／Ｌ、純度が７０％であった。分子量は９３，５１５ｇ／ｍｏｌと測定された。裸の抗体及びＡＤＣは共に、５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５から２０％のグリセロール、ｐＨ８から９．５の溶液中に提供された。
【０２９５】
裸の単鎖Ｆｖ及び抗ＣＤ２０ミニボディ及びｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８及びＣＤ２０−Ｐｈｏｒ１８結合体を大腸菌内で発現させた。各抗体断片の主鎖に対応した明確に異なる分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロットによって実証された。
実施例１６
【０２９６】
本実施例では、ＣＤ２０陽性及びＣＤ２０陰性の細胞株における、ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２０裸ミニボディ及びＰｈｏｒ１８結合体の生体外分析を説明する。
【０２９７】
生体外の研究によって、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ，  バーキットリンパ腫）内の、「裸」の抗体（ｓｃＦｖ及び抗ＣＤ２０ミニボディ）を用いた細菌発現系における、組換えによって産生されたＣＤ２０標的ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８及び抗ＣＤ２０−Ｐｈｏｒ１８ミニボディの細胞毒性を比較した。ＣＤ２０陰性白血病細胞（Ｕ９３７）をコントロールとした。
【０２９８】
各裸の抗体断片及びＡＤＣの濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ方式に従って測定した。分子量２７，０８８ｇ／ｍｏｌ、濃度０．３  ｍｇ／ｍｌの裸の抗体ｓｃＦｖ、分子量７８，９８８ｇ／ｍｏｌ、濃度０．２３１ｍｇ／ｍｌのミニボディ、Ｐｈｏｒ  １８結合抗体は、ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８（分子量２９，３４９ｇ／ｍｏｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ）及びミニボディ−Ｐｈｏｒ１８（分子量９３，５１５、０．４８ｍｇ／ｍｌ）であった。細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）にて取得した。ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ８）、及びヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＣＤ２０陰性、ｐ１６）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞２，０００個の密度で接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を補給し、細胞培地で調製されたｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８、ミニボディ−Ｐｈｏｒ１８ＡＤＣ、及び裸の抗体断片（ｓｃＦｖ及びミニボディ）の４倍連続希釈したもの２５μｌを添加して培養した。これらの濃度は０．０００１，０．００１，０．０１，０．１，１，１０，１００，２００，及び５００ｎＭ（Ｎ＝６）であった。４時間培養した細胞に対して、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ９２９２  ｌｏｔ  ＃  ３０１３２９）を用いて膜完全性のアッセイを行った。発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ  ７５７２，  ｌｏｔ  ３００６２１０２）を用いて、細胞の生存率を２４、４８、及び７２時間後に測定した。
【０２９９】
１００％の細胞生存率（培地）及び１００％の細胞死（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）のためのコントロールを同じ条件の下で培養した。
【０３００】
データは処理及び分析を行ってＩＣ50値を得た。使用したソフトウェアはＷｉｎｄｏｗｓ用Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５．００版，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ  （Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，  Ｉｎｃ）である。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各試験は２から３個のウェルを有する２枚のプレートを用いて行われ、時点ごとに４から６のデータ点のＮを得た。
【０３０１】
組換えｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体が大腸菌内で発現された。図１０及び表１１に示すように、抗ＣＤ２０−ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体は、ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞内で膜完全性を破壊した。ヒトバーキットリンパ種細胞（Ｄａｕｄｉ）は４８時間以内に殺滅されたが、ＣＤ２０陰性ヒト白血病細胞（Ｕ９３７）は殺滅されなかった。裸のｓｃＦｖ抗体はいずれの細胞株をも殺滅しなかった。細胞の生存率データのヒルプロット分析により、ミニボディ結合体のＩＣ50値はＤａｕｄｉ細胞内で２４時間後に１０．０２±０．５ｎＭ、４８時間後に１．５±０．３ｎＭという結果が得られた。裸のｓｃＦｖに毒性はなかった。ＣＤ２０陰性細胞株Ｕ９３７は、裸のｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８、又はミニボディ−Ｐｈｏｒ１８のいずれにも殺滅されなかった。ミニボディ−Ｐｈｏｒ１８結合体の生体外活性は、ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞において２４時間後及び４６時間後に１０．５±０．５及び３．９±１．６ｎＭであった。裸のミニボディに毒性はなかった。
（表１１）ＣＤ２０を標的とするｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８及びＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖ−Ｐｈｏｒ１８、及びｓｃＦｖ及びＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖの生体外毒性Ｄａｕｄｉ細胞（ＮＨＬ）はＣＤ２０について陽性であり、Ｕ９３７細胞（白血病）はＣＤ２０について陰性である。
【表１１】
0006559066.tif 000056
【０３０２】
効力のあるｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８及びＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体は大腸菌において発現され、裸のｓｃＦｖ又はＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖよりも効力を有していた。ＣＤ２０標的ＡＤＣは標的細胞を特異的に殺滅した。細胞死は内部への取込みとは無関係であった。ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８又はＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖ−Ｐｈｏｒ１８はアポトーシスの経路を活性化したが、裸のｓｃＦｖ抗体断片は活性化しなかった。Ｃ末端結合ｓｃＦｖ及びＦｖ−ＣH３−ＣH３−Ｆｖ結合体は、２４時間後のナノモル領域の活性が類似していた。
実施例１７
【０３０３】
本実施例では、ＣＤ２０標的ＡＤＣの考え得る作用機序を説明する。
【０３０４】
生体外の研究によって、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ，  バーキットリンパ腫）内の、「裸」の抗体（ｓｃＦｖ）を有する組換えによって発現されたＣＤ２０標的ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８結合体のカスパーゼ活性を比較した。ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、ｐ５）及びＲａｊｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ３）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞３，０００個の密度で接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を供給し、ｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８（０．３６５ｍｇ／ｍｌ）、又は５及び１５μｇ／ｍｌ（１００及び５００ｎＭ）（Ｎ＝６）の裸の抗体ｓｃＦｖで培養した。１０μＭのスタウロスポリンをカスパーゼ３／７活性化の正のコントロールとした。５時間後に、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃａｓｐａｓｅ  Ｇｌｏ  ３／７  Ｇ８１１Ｃ  ｌｏｔ  ＃  ２８７３１８０２）を用いて、カスパーゼ３／７活性化のアッセイを行った。
【０３０５】
相対的なカスパーゼ３／７活性化は、発光測定シグナルからの発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌｉｇｈｔ  ｕｎｉｔ）をもとに算出された。スタウロスポリンのカスパーゼ３／７活性化を１００％に設定し、０％の活性化となるコントロールとして試薬を用いなかった。５μｇ／ｍｌのｓｃＦｖ−Ｐｈｏｒ１８は、スタウロスポリンと比較すると、カスパーゼ３／７レベルを１８．３±０．８及び２９．３±０．９％に上昇させた。
【０３０６】
Ｐｈｏｒ１８結合ＡＤＣは標的細胞内でカスパーゼ３／７を活性化し、よってアポトーシスによる細胞死を促進する。従って、単鎖又はミニボディ断片としての抗体Ｐｈｏｒ１８結合体は、組換えによって産生でき、かつ標的細胞内に取り込まれなくても活性を有する。ＡＤＣによるカスパーゼ活性化は、考え得る作用機序であってもよい。
実施例１８
【０３０７】
本実施例では、Ｎ又はＣ末端に結合されたＰｈｏｒ１８を有し、抗体断片ごとに１個及び２個のＰｈｏｒ１８の化学量論を有する、ＣＤ２０標的ｓｃＦｖＦｃＰｈｏｒ１８結合体の発現について説明する。
【０３０８】
組換え級数（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｅｒｉｅｓ）はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ，  ＵＳＡ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）により、大腸菌内でペリプラズム分泌を用いて産生された。転写物が合成され、コドンの使用は大腸菌に最適化された。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社のｐＧＳ−２１ａ発現ベクターを用いた。発現されたプロテインは、アミノ酸ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列ＩＤ番号１０１）で構成される切断可能なＰｅｌＢ細菌シグナル配列をＮ末端に付加することにより、大腸菌のペリプラズムに向けられた。リツキサンＣＤＲがｐ１８５ハーセプチンのヒト化可変領域に挿入された。４つのグリシンとセリンが、可変領域を連結して柔軟性を付加した。Ｐｈｏｒ１８はＮ末端、Ｃ末端、又はその両方に配置された。抗体断片のアミノ酸配列は以下の通りである。
【０３０９】
切断されたＰｅｌＢＮ末端シグナル配列  ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ（配列ＩＤ番号９６）
ｓｃＦｖ−Ｆｃ（裸の抗体）のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号９７）
【表Ｅ−５】
0006559066.tif 000057
細胞溶解性ペプチドＰｈｏｒ１８−抗体結合体のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ
Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８：Ｎ及びＤ末端結合（配列ＩＤ番号９８）
【表Ｅ−６】
0006559066.tif 000058
細胞溶解性ペプチドＰｈｏｒ１８−抗体結合体のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ
Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦｖ−Ｆｃ：Ｎ末端結合（配列ＩＤ番号９９）
【表Ｅ−７】
0006559066.tif 000059
細胞溶解性ペプチドＰｈｏｒ１８−抗体結合体のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ
Ｐｈｏｒ１８−ｓｃＦｖ−Ｆｃ：Ｃ末端結合（配列ＩＤ番号１００）
【表Ｅ−８】
0006559066.tif 000060
【０３１０】
ＡＤＣはプロテインＡ親和性クロマトグラフィによって精製され冷凍保存された（−２０℃）。各裸の抗体断片及びＡＤＣの濃度は分光光度法（ＯＤ280）によって測定した。裸の抗体は分子量５２，５６２ｇ／ｍｏｌ、濃度１．１ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ−Ｆｃであり、Ｐｈｏｒ１８結合抗体はＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ（分子量５４，６８５ｇ／ｍｏｌ，  １．０  ｍｇ／ｍｌ）、Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−ｓｃＦｖＦｃ（分子量５４，６８５ｇ／ｍｏｌ，  ０．８  ｍｇ／ｍｌ）であり、これらは単鎖を形成した。
実施例１９
【０３１１】
本実施例では、生体外研究におけるｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体の活性を説明する。
【０３１２】
Ｎ又はＣ末端、及びＮ及びＣ末端にＰｈｏｒ１８を有する大腸菌発現系における組換えによって産生されたＣＤ２０標的ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体を、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ，  バーキットリンパ腫）内で「裸」の抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）と比較した。ＣＤ２０陰性白血病細胞（Ｕ９３７）をコントロールとした。大腸菌発現ＡＤＣは単鎖であり、ＶL鎖のＮ末端（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ）、ＣH３鎖のＣ末端（ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８）において１個のＰｈｏｒ１８分子と結合した。
【０３１３】
各裸の抗体断片及びＡＤＣの濃度は分光光度法（ＯＤ280）によって測定した。裸の抗体は分子量５２，５６２ｇ／ｍｏｌ、濃度１．１ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ−Ｆｃであり、Ｐｈｏｒ１８結合抗体はＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ（分子量５４，６８５ｇ／ｍｏｌ，  １．０ｍｇ／ｍｌ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８（分子量５４，６８５ｇ／ｍｏｌ，  ０．８ｍｇ／ｍｌ）であった。ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ７）、及びヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＣＤ２０陰性、ｐ６）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞２，０００個の密度で解離緩衝液を用いて接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を補給し、細胞培地で調製された各ＡＤＣ及び裸の抗体断片を４倍連続希釈したもの２５μｌを用いて培養した。これらの濃度は、ｓｃＦｖＦｃ，  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ，及びｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８のいずれも０．０１，  ０．１，  １，  １０，  １００，  ２００及び５００ｎＭであった。
【０３１４】
４時間培養した細胞に対して、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ９２９２  ｌｏｔ  ＃  ２６２２９６０１）を用いて膜完全性のアッセイを行った。発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ  ７５７２，  ｌｏｔ  ３０７３１６０２）を用いて、細胞の生存率を２４時間後に測定した。１００％の細胞生存率（培地）及び１００％の細胞死（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）のためのコントロールを同じ条件の下で培養した。
【０３１５】
データは処理及び分析を行ってＩＣ50値を得た。使用したソフトウェアはＷｉｎｄｏｗｓ用Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５．００版，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ  （Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，  Ｉｎｃ）である。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各試験は２から３個のウェルを有する２枚のプレートを用いて行われ、時点ごとに４から６のデータ点のＮを得た。
【０３１６】
Ｎ末端又はＣ末端に１個のＰｈｏｒ１８を有する組換えＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体が大腸菌内で発現された。表１２に示すように、抗ＣＤ２０Ｐｈｏｒ１８結合体であるＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃは、４時間後にＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞内の膜完全性を破壊し、この際のＩＣ50値は２７７±３７．５ｎＭであった。Ｃ末端結合体であるｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８では、２５５８±２５９ｎＭという１０倍も高い値が得られた。裸のミニボディに毒性はなかった。
【０３１７】
ヒトバーキットリンパ種細胞（Ｄａｕｄｉ）は２４時間以内に殺滅され、この際のＩＣ50値は、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃが２１．８±０．８ｎＭであり、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が４２２．６±４７．５ｎＭであった。
【０３１８】
裸のｓｃＦｖは、ＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞株において６７７．２±４５．３ｎＭの値で細胞の殺滅を発生させた。ＣＤ２０陰性ヒトリンパ種細胞（Ｕ９３７）は４時間後には殺滅されず、標的細胞株と比較するとより低い感受性を示したが、そのＩＣ50値は裸のｓｃＦｖＦｃが４９５．４±３５．２ｎＭ、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃが１０５．３±１５．６ｎＭ、及びｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８結合体が７２２．３±３３．２ｎＭであった。
（表１２）ＣＤ２０を標的とするＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８、及びｓｃＦｖ−Ｆｃの生体外毒性Ｄａｕｄｉ細胞（ＮＨＬ）はＣＤ２０について陽性であり、Ｕ９３７細胞（白血病）はＣＤ２０について陰性である。
【表１２】
0006559066.tif 000061
【０３１９】
Ｎ末端結合Ｐｈｏｒ１８抗体断片は、Ｃ末端結合Ｐｈｏｒ１８抗体断片よりも毒性が強かった。
実施例２０
【０３２０】
本実施例では、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（酵母菌）内で産生されたＣＤ２０標的ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８の発現及び活性を説明する。
【０３２１】
４個の抗ＣＤ２０単鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体断片は、リツキサンＣＤＲをｐ１８５のヒト化可変領域に挿入することによって設計された。挿入されたＣＤＲは下記のアミノ酸配列において太字で示す。ポリＧリンカを可変領域とヒト定常ドメインヒンジＣH２及びＣH３との間に用いた。以下に示す抗体断片配列の順序は以下の通りである：裸の抗体、Ｃ末端及びＮ末端Ｐｈｏｒ１８、Ｎ末端Ｐｈｏｒ１８のみ、Ｃ末端Ｐｈｏｒ１８のみ。各構造体のアミノ酸配列を以下に示す。
裸の抗体のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号１０１）
【表Ｅ−９】
0006559066.tif 000062
結合抗体Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号１０２）
【表Ｅ−１０】
0006559066.tif 000063
結合抗体Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃのアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号１０３）
【表Ｅ−１１】
0006559066.tif 000064
結合抗体ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８のアミノ酸配列、太字はＣＤＲ（配列ＩＤ番号１０４）
【表Ｅ−１２】
0006559066.tif 000065
４個のｓｃＦｖ−Ｆｃ断片のための遺伝子合成は米国Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社から取り寄せたものであり、コドンはＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社においてＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ酵母菌株ＧＳ１１５内での産生のために最適化された。Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ社は各発現プラスミドをＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社の酵母菌発現プラスミドｐＰＩＣＺαＡ（ｃａｔ＃Ｖ１９５−２０  ｌｏｔ＃９００４７９，  図１２）にサブクローニングした。この発現プラスミドは酵母菌αファクター分泌シグナルを有しているため、抗体プロテインは培地から分離することができた。
【０３２２】
ＣＤ２０標的ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体の特性を銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって明らかにすることによって、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ＡＤＣが単鎖二量体であり、ＶL鎖（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ）のＮ末端、ＣH３鎖（ｓｃＦｖＦｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８）のＣ末端、及びＶL鎖のＮ末端とＣH３鎖のＣ末端（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８）で２個又は４個のＰｈｏｒ１８分子と結合したことが示された。
【０３２３】
各裸の抗体断片及びＡＤＣの濃度は分光光度法（ＯＤ280）によって測定した。裸の抗体は分子量１０２，０７８ｇ／ｍｏｌ、濃度０．２６ｍｇ／ｍｌのｓｃＦｖ−Ｆｃであり、Ｐｈｏｒ１８結合抗体は、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ（分子量１０６，６１６ｇ／ｍｏｌ，  ０．５ｍｇ／ｍｌ）、ｓｃＦｖＦｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８（分子量１０６，６１６ｇ／ｍｏｌ，  ０．１７ｍｇ／ｍｌ）、及びＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８（分子量１１１，１５４ｇ／ｍｏｌ，  ０．７ｍｇ／ｍｌ）であった。
【０３２４】
生体外の研究によって、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ，  バーキットリンパ腫）内の、「裸」の抗体（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）を用いた酵母菌発現系における、組換えによって産生されたＣＤ２０標的ｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体の細胞毒性を比較した。ＣＤ２０陰性白血病細胞（Ｕ９３７）をコントロールとした。Ｐｉｃｈｉａ発現ＡＤＣは単鎖二量体であり、ＶL鎖（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃ）のＮ末端、ＣH３鎖（ｓｃＦｖＦｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８）のＣ末端、及びＶL鎖のＮ末端とＣH３鎖のＣ末端（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８）で２個又は４個のＰｈｏｒ１８分子と結合したことが示された。
【０３２５】
ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ３）、及びヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＣＤ２０陰性、ｐ１２）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞２，０００個の密度で解離緩衝液を用いて接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を補給し、細胞培地で調製された各ＡＤＣ及び裸の抗体断片（ｓｃＦｖ及びミニボディ）を４倍連続希釈したもの２５μｌを添加して培養した。これらの濃度はＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８及びＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃが０．０１３，  ０．１３３，  １．３３，  １３．３，  １３３，  ２６６，及び６３３ｎＭであり、裸の抗体ｓｃＦｖ−Ｆｃ及びｓｃＦｖＦｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が０．０１３から２６６ｎＭであった。
【０３２６】
４時間培養した細胞に対して、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ９２９２  ｌｏｔ  ＃  ２６２２９６０１）を用いて膜完全性のアッセイを行った。発光式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ  ７５７２，  ｌｏｔ  ３１３８６５０１）を用いて、細胞の生存率を２４及び４８時間後に測定した。１００％の細胞生存率（培地）及び１００％の細胞死（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）のためのコントロールを同じ条件の下で培養した。
【０３２７】
データは処理及び分析を行ってＩＣ50値を得た。使用したソフトウェアはＷｉｎｄｏｗｓ用Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５．００版，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ  （Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，  Ｉｎｃ）である。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各試験は２から３個のウェルを有する２枚のプレートを用いて行われ、時点ごとに４から６のデータ点のＮを得た。
【０３２８】
組換えＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体はＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現された。図１３及び表１３に示す通り、抗ＣＤ２０−Ｐｈｏｒ１８結合体は、４時間後にＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞内の膜完全性を破壊し、このときのＩＣ50値はＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が６．２±２ｎＭ、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃが２３．５±２．５ｎＭ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が２８２．４±１５ｎＭであった。結合していない裸のｓｃＦｖＦｃに毒性はなかった。ヒトバーキットリンパ種細胞（Ｄａｕｄｉ）は２４時間以内に殺滅され、このときのＩＣ50値はＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が９．９±２ｎＭ、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃが１８．８±４ｎＭ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が１４１．１±６ｎＭであった。裸のｓｃＦｖＦｃのＩＣ50値は２８７±２８ｎＭであった。最も低いＩＣ50値は４８時間後に計測され、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が１．６±０．３ｎＭ、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃが３．４±０．０５ｎＭ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が１０６±１０ｎＭであった。裸のｓｃＦｖＦｃのＩＣ50値は３３９±２６ｎＭであった。ＣＤ２０陰性ヒト白血病細胞（Ｕ９３７）は、結合された、及び結合されていないＡＤＣのいずれにも同じ反応を示した。４時間後には膜完全性に影響はなく、２４時間後のＩＣ50値は裸のｓｃＦｖ−Ｆｃと匹敵し、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が２９８±１３．４，  ２４６．１±１４．８、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖＦｃが８７５±８１、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８が２７４±１５４ｎＭであった。
【０３２９】
これらのデータはＮ末端結合ＡＤＣがＣ末端結合ＡＤＣよりも効力が大きいことを実証している。４個のＰｈｏｒ１８分子を有するＡＤＣは、２個のＰｈｏｒ１８分子を有する結合体よりも活性が大きかった。
（表１３）ＣＤ２０を標的とするＰｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８、及びｓｃＦｖ−Ｆｃの生体外毒性Ｄａｕｄｉ細胞（ＮＨＬ）はＣＤ２０について陽性であり、Ｕ９３７細胞（白血病）はＣＤ２０について陰性である。
【表１３】
0006559066.tif 000066
【０３３０】
Ｎ又はＣ末端及びＮ及びＣ末端に２個又は４個のＰｈｏｒ１８分子を有する、効力のあるｓｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体がＰｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ内で発現された。これらのＡＤＣは裸のｓｃＦｖ−Ｆｃよりも効力が大きかった。ＳｃＦｖ−Ｆｃ−Ｐｈｏｒ１８結合体は、Ｎ及びＣ末端が結合されている場合、又はＮ末端が結合されている場合に、標的細胞の膜完全性を破壊した。Ｃ末端の結合は、Ｎ末端結合ＡＤＣ、及びＮ及びＣ末端結合ＡＤＣと比較して活性が５０から１００倍低かった。ＣＤ２０標的ＡＤＣは標的細胞を特異的に殺滅した。細胞死は内部への取込みとは無関係であった。ＡＤＣがより多くのＰｈｏｒ１８を有することで、より大きな効力が生じた。
実施例２１
【０３３１】
本実施例は哺乳類系において産生されるＩｇＧ２−Ｐｈｏｒ１８結合体について説明する。
【０３３２】
ＣＨＯ細胞で発現されるＣＤ２０標的ＡＤＣはホール抗体であり、２、４、及び６個のＰｈｏｒ１８と異なる位置で結合された。産生されたＡＤＣの特徴を明らかにして、Ｈ鎖及びＬ鎖上のＰｈｏｒ１８の存在、及びそれらの分子量を確認した。
【０３３３】
ＣＨＯ細胞発現系の組換えによって産生されたＣＤ２０標的ＩｇＧ２−Ｐｈｏｒ１８結合体を用いて生体外で細胞毒性を測定し、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ，  バーキットリンパ腫）において「裸」の抗体（リツキサン）と比較した。ＣＤ２０陰性白血病細胞（Ｕ９３７）をコントロールとした。
【０３３４】
抗ＣＤ２０−ＡＤＣのＶL及びＶHドメインは、ＣＤＲがリツキサン抗ＣＤ２０−ＣＤＲによって置き換えられた抗ｐ１８５ハーセプチンのヒト化配列である。ホールヒトＩｇＧ２は定常軽鎖（ＣL）ドメインのλアイソフォームを有する完全な抗体バックボーンに用いられた。
【０３３５】
ＩｇＧ２アイソフォームはＦｃＲ相互作用を最小化し、リツキサンＡＤＣによる免疫細胞の結合及び殺滅を制限するように選択された。遺伝子合成はＧｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪによって行われ、コドンの使用はＣＨＯ細胞に最適化された。「非結合」抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２０抗体のＨ鎖及びＬ鎖のアミノ酸配列を以下に示す。可変ドメインのリツキサンＣＤＲを太字で示す。
抗ＣＤ２０抗体のリツキサンＣＤＲを有するＬ鎖及びＨ鎖のアミノ酸配列
【表Ｅ−１３】
0006559066.tif 000067
【０３３６】
哺乳類系（ＣＨＯ細胞）内のホールＩｇＧ２抗体−Ｐｈｏｒ１８（ＫＦＡＫＦＡＫＫＦＡＫＦＡＫ  ＫＦＡＫ（配列ＩＤ番号４））結合体の組換え発現Ｈ鎖及びＬ鎖の転写物は、Ａｓｃ１及びＥｃｏＲ１制限部位を有するＰＣＲプライマーを用いてＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社のＤＮＡ転写物から合成され、指向的クローニングによってｐＳＥＣＴａｇ２哺乳類発現プラスミドとなった（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃａｔ＃  Ｖ９００−２０，  ｌｏｔ  ８４２６２６）。ｐＳｅｃＴａｇ２プラスミドが選択されたのは、抗体の分泌のための哺乳類ＣＭＶプロモータ及びＩｇｋシグナル配列を有しているからである。シグナル配列に対する発現プラスミド内のマルチクローニング部位の位置のために、発現されたＡＤＣプロテイン内のシグナルペプチドの切断後も以下の６つのアミノ酸は各ペプチドのＮ末端に残留する。これはＤＡＡＱＰＡ（配列ＩＤ番号１５２）というプラスミド設計のためである。
Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社のＡＤＣ転写ＤＮＡ配列を、Ｐｈｏｒ１８（イタリック体）を有するＡＤＣの完全なＬ鎖及びＨ鎖で以下に示す。
ＣＨＯ細胞におけるＣＤ２０標的抗体−Ｐｈｏｒ１８結合体の発現のための遺伝子の配列
完全なＡＤＣＬ鎖標的配列は以下の通りである。（配列ＩＤ番号１１０）
【表Ｅ−１４】
0006559066.tif 000068
完全なＡＤＣＨ鎖標的配列は以下の通りである。（配列ＩＤ番号１１１）
【表Ｅ−１５】
0006559066.tif 000069
Ｌ鎖及びＨ鎖をサブクローニングするのに用いられたＰＣＲプライマーを以下に示す。
ＡＤＣ  ＰＣＲプライマー
順方向プライマーはＡＳＣＩ制限部位（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）を５’末端に有する。
逆方向プライマーはＥｃｏＲ１制限部位（ＧＡＡＴＴＣ）を５’末端に有する。
Ｌ鎖プライマー（配列ＩＤ番号１１２−１１５）
４８０Ｌ  順方向：ＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣ  ＧＡＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＡＧＣＣ  （Ｔｍ＝５５．６）
４８５Ｌ  順方向：ＧＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣ  ＡＡＧＴＴＣＧＣＡＡＡＧＴＴＣＧＣＣＡＡ  （Ｔｍ＝６３）
４８０Ｌ  逆方向：ＧＧＧ  ＧＡＡＴＴＣ  ＴＴＡＴＣＡＧＣＴＡＣＡＴＴＣＧＧＴＴＧＧＴ（Ｔｍ＝５８．６５）
４８７Ｌ  逆方向：ＧＧＧ  ＧＡＡＴＴＣ  ＴＴＡＴＣＡＴＴＴＡＡＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＴＧＣＴ  （Ｔｍ  ＝  ６１．３７）  Ｍａｒ１８
Ｈ鎖プライマー（配列ＩＤ番号１１６−１１８）
４８０Ｈ  順方向：ＧＧＧ  ＧＧＣＧＣＧＣＣ  ＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＡＡＧ  （Ｔｍ＝６１）
４８５Ｈ  順方向：ＧＧＧ  ＧＧＣＧＣＧＣＣ  ＡＡＧＴＴＣＧＣＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＡＡＧＡ（Ｔｍ＝６０．２５）
４８０Ｈ  逆方向：ＧＧＧ  ＧＡＡＴＴＣ  ＴＴＡＴＣＡＴＴＴＧＣＣＧＧＧＧＧＡ  （Ｔｍ＝  ６２）
【０３３７】
裸のＩｇＧ２抗体、２つのＰｈｏｒ１８分子を有するＰｈｏｒ１８−ＩｇＧ２結合体（Ｐｈｏｒ１８−ＶLＩｇＧ２，  Ｐｈｏｒ１８−ＶHＩｇＧ２）、４つのＰｈｏｒ１８分子を有するＰｈｏｒ１８−ＩｇＧ２結合体（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＩｇＧ２）、６つのＰｈｏｒ１８分子を有するＰｈｏｒ１８−ＩｇＧ２結合体（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２）、及び８つのＰｈｏｒ１８分子を有するＰｈｏｒ１８−ＩｇＧ２結合体（Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ２及びＰｈｏｒ１８−ＶL−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＶH−Ｐｈｏｒ１８−ＣH３−ＩｇＧ２のアミノ酸配列を以下に示す。
裸の抗体、細胞溶解性ペプチドＰｈｏｒ１８−抗体Ｈ鎖及びＬ鎖結合体のアミノ酸配列
【表Ｅ−１６】
0006559066.tif 000070
【表Ｅ−１７】
0006559066.tif 000071
【表Ｅ−１８】
0006559066.tif 000072
【表Ｅ−１９】
0006559066.tif 000073
【表Ｅ−２０】
0006559066.tif 000074
【表Ｅ−２１】
0006559066.tif 000075
【０３３８】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のプロトコルを用いて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のフリースタイル懸濁液培養ＣＨＯ細胞（Ｆｒｅｅ−ｓｔｙｌｅ  ＭＡＸ  ＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｃａｔ＃  Ｋ９０００−２０）をトランスフェクトした。要するに、ＦＳ−ＣＨＯ細胞は解凍して急速培養フェーズに入った後６から７日間膨張させ、その間細胞数は２４時間ごとに倍増した。トランスフェクションの前日に、凝集した細胞を取り除き、細胞をペレット状にしてＰ／Ｓフリー培地で５×１０5／ｍｌの密度で再度サスペンションを行った。トランスフェクションの当日、３０ｍｌの培養液中の細胞を必要に応じて９×１０5細胞／ｍｌに調整し、生存率は９９％に近かったと考えられる。
【０３３９】
３０ｍｌの細胞を入れた１２５ｍｌ容量のスピナーフラスコ（ＶＷＲ，  ｃａｔ＃  ＰＢＶ１２５）の各々を、１８０μｌのＦＳＭａｘトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃  １６４４７−１００）と混合した３５μｇのトータルプラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。ＤＮＡの濃度は１ｍｇ／ｍｌ以上になったと考えられる。ＤＮＡ混合物を少しずつ添加しながら、細胞に高速で渦を発生させた。試験されたＨ鎖とＬ鎖の比は、３：２、１：１、及び２：３であった。
【０３４０】
トランスフェクションの３日後及び６日後にプロテインを採取した。約０．２５ｍｌのプロテインＡ樹脂（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌ００２１０、樹脂１ｍｌにつき２０ｍｇ  ＩｇＧを超える能力）を用いて、提供されたＧｅｎｓｃｒｉｐｔ社のプロトコルに従い、分泌されたＡＤＣをＦＳ−ＣＨＯ培地から分離した。発現された抗ＣＤ２０  ＩｇＧ２抗体（ＣＤ２０受容体に対するヒト化された可変Ｌ鎖及びＨ鎖ドメイン領域）、及びＰｈｏｒ１８対抗体の化学量論比が２：１，４：１，及び６：１である様々な抗Ｐｈｏｒ１８結合体の特性が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット解析を用いて明らかにされた（表１４）。
（表１４）ＣＤ２０標的ＡＤＣのＡＤＣ記述
【表１４】
0006559066.tif 000076
【０３４１】
ＡＤＣはウェスタンブロットによって抗Ｐｈｏｒ１８を用いてプローブされた。すべてのＡＤＣはＨ鎖及びＬ鎖上に単一のＰｈｏｒ１８を有している。Ｈ鎖又はＬ鎖のＣ末端又はＮ末端Ｐｈｏｒ１８結合を有する、組換えによって産生された（完全なＩｇＧ２抗体としての）抗体の収率、純度、及び細胞毒性を分析した。ホール抗体分子に結合された細胞溶解性ドメイン（Ｐｈｏｒ１８）の２，４，及び６個の分子が発現された。
【０３４２】
組換えによって産生された抗体及び抗体−Ｐｈｏｒ１８結合体の濃度は、分光光度測定（ＯＤ280）され、その結果は以下通りであった：ＩｇＧ２（分子量１５０，０００；  １．０９６ｍｇ／ｍｌ），  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ２（分子量１５４，３４０ｇ／ｍｏｌ，  ０．５６１ｍｇ／ｍｌ），  Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２（分子量１５４，３４０ｇ／ｍｏｌ，  ０．１ｍｇ／ｍｌ），  及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＩｇＧ２（分子量１５８，４００ｇ／ｍｏｌ，  ０．５６１ｍｇ／ｍｌ），  及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ２（分子量１６２，６００，  ０．０７ｍｇ／ｍｌ）。
実施例２２
【０３４３】
本実施例では、組換えによって産生されたＩｇＧ２−Ｐｈｏｒ１８結合体の生体外活性を説明する。
【０３４４】
哺乳類発現系における組換えによって産生されたＣＤ２０標的ＩｇＧ２−Ｐｈｏｒ１８結合体の細胞毒性を、ＣＤ２０陽性細胞（Ｄａｕｄｉ、バーキットリンパ腫）において「裸」の抗体（ＩｇＧ２）と比較した。ＣＤ２０陰性白血病細胞（Ｕ９３７）をコントロールとした。ＣＨＯ細胞発現ＡＤＣは完全な抗体であり、２、４、及び６個のＰｈｏｒ１８分子とＶL鎖のＮ末端、ＶH鎖のＮ末端、ＶH及びＶL鎖のＮ末端、及びＶL鎖，ＶH鎖のＮ末端及びＣL鎖のＣ末端で結合された。配列記述を表１４にまとめた。
【０３４５】
ヒト非ホジキンリンパ腫細胞Ｄａｕｄｉ（ＣＤ２０陽性、継代数ｐ６）、及びヒト白血病細胞株Ｕ９３７（ＣＤ２０陰性、ｐ１０）を、熱不活性の完全培地において、不透明のプレート内でウェルごとに細胞２，０００個の密度で解離緩衝液を用いて接種した。２４時間後に細胞に新鮮な培地（７５μｌ）を補給し、細胞培地で調製された各ＡＤＣ及び裸の抗体を４倍連続希釈したもの２５μｌを添加して培養した。これらの濃度はＩｇＧ２，  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ２，  Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２，及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＩｇＧ２が０．００１から２００ｎＭの間、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ２が０．００１から１００ｎＭの間であった。
【０３４６】
４時間培養した細胞に対して、発光測定式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  Ｃｙｔｏｔｏｘ  Ｇｌｏ  Ｇ９２９２  ｌｏｔ  ＃  ３１７８７２）を用いて膜完全性のアッセイを行った。発光式アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｗ，  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ，  Ｇ  ７５７２，  ｌｏｔ  ３３６２６２）を用いて、細胞の生存率を２４及び４８時間後に測定した。
【０３４７】
１００％の細胞生存率（培地）及び１００％の細胞死（０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）のためのコントロールを同じ条件の下で培養した。
【０３４８】
データは処理及び分析を行ってＩＣ50値を得た。使用したソフトウェアはＷｉｎｄｏｗｓ用Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ  ５．００版，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ，  ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ  （Ｇｒａｐｈ  Ｐａｄ  Ｐｒｉｚｍ，  Ｉｎｃ）である。有意性に対する統計解析を両側のスチューデントのＴ検定によって行った。各試験はそれぞれ２から３個のウェルの二重プレートを用いて行われ、時点ごとに４から６のデータ点のＮを得た。
（表１５）ＣＤ２０を標的とする抗ＣＤ２０  ＩｇＧ２、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ２、Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＩｇＧ２、及びＰｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ２の生体外毒性Ｄａｕｄｉ細胞（ＮＨＬ）はＣＤ２０について陽性であり、Ｕ９３７細胞（白血病）はＣＤ２０について陰性であった。
【表１５】
0006559066.tif 000077
【０３４９】
膜完全性の破壊は４時間後に計測されたが、その際のナノモル濃度はＰｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２（２つのＰｈｏｒ１８）が１，１０８±１９８、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＩｇＧ２（４つのＰｈｏｒ１８）が１０９．６±２０．１、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ２（６つのＰｈｏｒ１８）が７１．６±２９であった。裸の抗体は２４時間後及び４８時間後にはＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞に対して毒性を持たなかった。
【０３５０】
２４時間後に標的細胞の殺滅は、ＩＣ50値［ｎＭ］が８２４±６３，  ７５．２４±３７．５（２個のＰｈｏｒ１８），  ４０．１±１５．１（４個のＰｈｏｒ１８），及び１８．８±５．９（６個のＰｈｏｒ１８）ｎＭとなって発現した。４８時間後に計測された最大効果は、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−ＩｇＧ２がＩＣ50値［ｎＭ］＞４３６、  Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２（２個のＣＬＩＰ）が４．８±２、  Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＩｇＧ２（４個のＣＬＩＰ）が２０．４±８．２ｎＭ、Ｐｈｏｒ１８−ＶL−Ｐｈｏｒ１８ＶH−ＣL−Ｐｈｏｒ１８−ＩｇＧ２（６個のＰｈｏｒ１８）が１．９±０．２ｎＭであった。ＣＤ２０陰性細胞株（Ｕ９３７）は４時間後及び２４時間後に、裸の抗体又は２、４、及び６個のＰｈｏｒ１８と結合したＡＤＣのいずれにも殺滅されなかった。４８時間後の毒性レベルは類似しており、ＩＣ50値は２４９及び２５８ｎＭであった。これらのデータは、Ｐｈｏｒ１８の位置によってＣＤ２０−ＡＤＣの効力が決定されることを実証しており、Ｐｈｏｒ１８−ＶH−ＩｇＧ２の効力は増加している。抗体ごとのＰｈｏｒ１８分子の数が増えると、効力が増加した。
【０３５１】
Ｐｈｏｒ１８抗体化学量論が２，  ４，  及び６であるホール抗体Ｐｈｏｒ１８結合体は、組換えによってＣＨＯ細胞内に発現された。これらの抗体薬剤結合体は、Ｈ鎖及びＬ鎖にＰｈｏｒ１８分子が存在することを裏付けた。これらは４時間後の膜分解活性により、生体外のＣＤ２０陽性細胞内での活性を示した。４８時間後に一桁のナノモル活性を測定したが、６個及び４個のＰｈｏｒ１８を有するＡＤＣにおいて最も高い値となった。
【０３５２】
内部取込みを行わないＣＤ２０抗体結合体は、４時間以内に標的細胞（Ｄａｕｄｉ）の膜完全性を破壊した。２４時間後には細胞死が観察されたが、ＩＣ50値は低ナノモル領域内であった。ＣＤ２０陰性細胞（Ｕ９３７）は殺滅されなかった。４個又は６個のＣＬＩＰを有する完全なＩｇＧ２ＡＤＣは、２個のＰｈｏｒ１８を有する結合体と比較すると標的陽性細胞に対する効力が増加した。Ｐｈｏｒ１８がＮ末端上に位置することによって、より効力の大きいＡＤＣが産生された。抗体ごとのＰｈｏｒ１８の数が増えると、効力が増加した。
【０３５３】
Ｎ末端ドメインに結合した抗体上のＰｈｏｒ１８の数（６個、４個、２個）が多いほど、裸の抗体と比較して効力が大きくなる。
実施例２３
【０３５４】
本実施例では、本発明の抗体及びポリペプチド結合体が産生され、裸の抗体及びそのＰｈｏｒ１８が結合する代表的な標的プロテインの標的配列情報を含む。
【０３５５】
ＥＲＢＢ２  （ＨＥＲ２／ＮＥＵ）  アイソフォーム１  ［ＵｎｉＰａｒｃ］：（配列ＩＤ番号１３１）
【表Ｅ−２２】
0006559066.tif 000078
【０３５６】
ＣＤ１９：Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４、Ｂ細胞コレセプターの構成要素、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１１７１５６９．１：
ＯＲＩＧＩＮ（配列ＩＤ番号１３２）
【表Ｅ−２３】
0006559066.tif 000079
【０３５７】
ＣＤ２０：Ｂ細胞上に見られるＩＩＩ型膜透過プロテインであり、細胞膜中にカルシウムチャネルを形成して細胞活性化に必要なカルシウムの流入を可能にしており、Ｂ細胞リンパ腫、毛様細胞白血病、及びＢ細胞慢性リンパ球白血病に発現される。抗ＣＤ２０抗体としてこれらの疾病の治療に重要なものは、以下の通りである。リツキシマブＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６８７６９．２，  ＭＳ４Ａ１−Ｐ１１８３６：（配列ＩＤ番号１３３）
【表Ｅ−２４】
0006559066.tif 000080
【０３５８】
ＣＤ２２：シアル酸をＮ末端に配置された免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインに特異的に結合させる糖結合膜透過プロテインである。免疫グロブリンスーパーファミリー及びＳＩＧＬＥＣファミリーのメンバである。ＣＤ２２はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナリングの抑制受容体として機能する。ＮＣＢＩ参照配列  ＮＰ＿００１１７２０２８．１：
ＯＲＩＧＩＮ（配列ＩＤ番号１３４）
【表Ｅ−２５】
0006559066.tif 000081
【０３５９】
ＣＤ２３：成熟したＢ細胞、単球、活性化されたマクロファージ、好酸球、血小板、及び樹枝状細胞に見られるＩＩ型膜透過プロテインであり、ＩｇＥと複合体化した抗体の捕捉及び処理を増進する。ＮＣＢＩ参照配列  ＮＰ＿００１１９３９４８．２：
ＯＲＩＧＩＮ（配列ＩＤ番号１３５）
【表Ｅ−２６】
0006559066.tif 000082
／／
【０３６０】
ＣＤ２７：ＴＣＦ受容体休止期記憶Ｂ細胞の表面に存在する。ＮＣＢＩ参照配列  ＮＰ＿００１２３３．１：
ＯＲＩＧＩＮ（配列ＩＤ番号１３６）
【表Ｅ−２７】
0006559066.tif 000083
【０３６１】
ＣＤ２８：すべてのＴ細胞上に存在し、また適当なリガンドと対になり、ＣＤ８０とＣＤ８６のいずれにもなり得るＢ７に分類された場合、Ｔ細胞に対する共刺激効果を有する。また、特に組織に侵入した後、好酸性の顆粒球に対して発現される。そこでその結紮によって、効力のある神経毒であるＩＬ−２、ＩＬ−１３、並びにＩＦＮ−γが放出される。Ｃｈｅｃｋｓｕｍ  １Ｄ９Ｂ６５５２Ａ５８７８Ｄ０Ｆ：（配列ＩＤ番号１３７）
【表Ｅ−２８】
0006559066.tif 000084
【０３６２】
ＣＤ３０：活性化されたＴ及びＢ細胞上に存在するＩ型の膜透過プロテインであり、細胞の活性化及び／又は分化に関与し、ホジキン病、一部のＴ細胞リンパ腫、及び退生的な大細胞リンパ腫において発現される。（配列ＩＤ番号１３８）
【表Ｅ−２９】
0006559066.tif 000085
【０３６３】
Ｐ２８９０８−２，  腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー８、ヒト（配列ＩＤ番号１３９）：
【表Ｅ−３０】
0006559066.tif 000086
【０３６４】
ＣＤ３１：血小板及び内皮細胞上の細胞接着分子であるＰＥＣＡＭ−１（配列ＩＤ番号１４０）。
【表Ｅ−３１】
0006559066.tif 000087
【０３６５】
ＣＤ３３：急性骨髄性白血病芽球、成熟単球を含む、未成熟な脊髄細胞に見られる未知の機能のマーカーである。Ｐ２０１３８：（配列ＩＤ番号１４１）
【表Ｅ−３２】
0006559066.tif 000088
【０３６６】
ＣＤ３４：造血前駆細胞（臍帯血内に高濃度で見られる）、血管内皮、及び胎児線維芽細胞に見られる肝細胞マーカー、接着。アイソフォームＣＤ３４−Ｆ（配列ＩＤ番号１４２）
【表Ｅ−３３】
0006559066.tif 000089
【０３６７】
ＣＤ４０：抗原提示細胞に見られる共刺激プロテイン。ＣＤ４０はＴ細胞上のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）と結合してＢ細胞内で抗体アイソタイプの切り替えを誘発する。アイソフォームＩ（配列ＩＤ番号１４３）
【表Ｅ−３４】
0006559066.tif 000090
【０３６８】
ＣＤ５２：Ｐ３１３５８ｍ（配列ＩＤ番号１４４）
【表Ｅ−３５】
0006559066.tif 000091
【０３６９】
Ｑ９ＵＪ８１（配列ＩＤ番号１４５）
【表Ｅ−３６】
0006559066.tif 000092
【０３７０】
ＣＤ５６：神経細胞接着分子１省略名＝Ｎ−ＣＡＭ−１、代替名。ＣＤ＿抗原＝ＣＤ５６アイソフォーム１（配列ＩＤ番号１４６）
【表Ｅ−３７】
0006559066.tif 000093
【０３７１】
ＣＤ７０：腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー７Ｐ３２９７０  （ＣＤ７０＿ＨＵＭＡＮ）（配列ＩＤ番号１４７）
【表Ｅ−３８】
0006559066.tif 000094
【０３７２】
ＣＤ１２３：ＩＬ３ＲＡ．アイソフォーム１（配列ＩＤ番号１４８）
【表Ｅ−３９】
0006559066.tif 000095
【０３７３】
ＣＤ１５４：ＣＤ４０のためのリガンドである。これは多くの役割を果たす共刺激分子であり、Ｂ細胞を活性化することで最も知られているが、ＭＨＣ分子によるＡＰＣ上でのＴ細胞受容体刺激と関連してＡＰＣの活性化を誘発することでも知られている。Ｑ３Ｌ８Ｕ２：（配列ＩＤ番号１４９）
【表Ｅ−４０】
0006559066.tif 000096
【０３７４】
ＣＤ１３８：シンデカン、形質細胞表面糖タンパク質であり、シンデカン１として知られる。シンデカンはコラーゲン、フィブロネクチン、及びトロンボスボンジンのためのアルファ受容体として機能する。Ｐ１８８２７：（配列ＩＤ番号１５０）
【表Ｅ−４１】
0006559066.tif 000097
【０３７５】
腫瘍フェトプロテイン（ｏｎｃｏｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）−５Ｔ４トロホブラスト糖タンパク質ＮＣＢＩ参照配列  ＮＰ＿００１１５９８６４．１：
ＯＲＩＧＩＮ（配列ＩＤ番号１５１）
【表Ｅ−４２】
0006559066.tif 000098
【図１Ａ】
0006559066.tif 000099
【図１Ｂ】
0006559066.tif 000100
【図２Ａ】
0006559066.tif 000101
【図２Ｂ】
0006559066.tif 000102
【図３】
0006559066.tif 000103
【図４】
0006559066.tif 000104
【図５】
0006559066.tif 000105
【図６】
0006559066.tif 000106
【図７Ａ】
0006559066.tif 000107
【図７Ｂ】
0006559066.tif 000108
【図８】
0006559066.tif 000109
【図９】
0006559066.tif 000110
【図１０Ａ】
0006559066.tif 000111
【図１０Ｂ】
0006559066.tif 000112
【図１１】
0006559066.tif 000113
【図１２】
0006559066.tif 000114
【図１３Ａ】
0006559066.tif 000115
【図１３Ｂ】
0006559066.tif 000116
【図１３Ｃ】
0006559066.tif 000117
【図１３Ｄ】
0006559066.tif 000118
【図１４】
0006559066.tif 000119
【配列表】
0006559066000001.app