(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソソームの単離方法であって、有機双性イオンの存在下で少なくとも１回の精製工程を行うことを含み、（ｉ）前記有機双性イオンがグリシン、アラニン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン（ベタイン）及びタウリンからなる群から選択され、（ｉｉ）前記有機双性イオンの濃度が２０ｍＭ〜３Ｍであり、
（ｉｉｉ）前記少なくとも１回の精製工程が濾過工程又はクロマトグラフィー工程である、単離方法。
【請求項２】
前記有機双性イオンがグリシンである、請求項１記載の単離方法。
【請求項３】
前記有機双性イオンの濃度が、５０ｍＭ〜１００ｍＭ又は１００ｍＭ〜３００ｍＭである、請求項１記載の単離方法。
【請求項４】
前記有機双性イオンの濃度が、３００ｍＭ〜３Ｍである、請求項１記載の単離方法。
【請求項５】
前記少なくとも１回の精製工程を行う前に前記エキソソームを精製しない、または部分的に精製する、または高度に精製する、請求項１記載の単離方法。
【請求項６】
前記少なくとも１回の精製工程の間のオスモル濃度が、２５０ミリオスモル／ｋｇ〜３００ミリオスモル／ｋｇの範囲にある、請求項１記載の単離方法。
【請求項７】
前記少なくとも１回の精製工程の間のオスモル濃度が、２５０ミリオスモル／ｋｇ未満である、請求項１記載の単離方法。
【請求項８】
前記少なくとも１回の精製工程の間のオスモル濃度が、３００ミリオスモル／ｋｇ超である、請求項１記載の単離方法。
【請求項９】
前記少なくとも１回の精製工程が濾過工程を含む、請求項１記載の単離方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１回の精製工程がクロマトグラフィー工程を含む、請求項１記載の単離方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１回の精製工程がサイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項２記載の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で開示される実施形態は、エキソソームの精製方法に関し、より詳細にはエキソソームの精製における低分子量の有機双性イオンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エキソソームは、さまざまな生体液に関連する約３０〜１２０ｎｍの細胞由来の小胞である。その生物学的機能はまだ十分に明らかにされていないが、さまざまな診断応用および治療応用における潜在的な有用性が検討されてきた。それは一般的に、超遠心分離法、フローサイトメトリー、濾過、サイズ排除クロマトグラフィー、およびフィールドフロー分画などのサイズに基づいて識別する技術によって精製される（非特許文献１〜３）。
【０００３】
エキソソームの組成に関しては、Ａ．Ｖｌａｓｓｏｖらによって論じられている（非特許文献４）。エキソソームはヌクレオチドおよびタンパク質カーゴを含み、推定１００００未満のヌクレオチドユニットおよび３００未満のタンパク質で構成される。エキソソームは脂質二重膜の中に含まれ、脂質二重膜は、エキソソーム源に応じて、コレステロール、セラミド、スフィンゴ脂質、および長鎖飽和脂肪アシルを有するホスホグリセリドでさまざまに補強されている。外面はマンノース、ポリラクトサミン、アルファ−２，６−シアル酸、および複合Ｎ結合型グリカンなどの糖類基も有する。
【０００４】
グリシンは、生理的ｐＨで双性イオン形態で存在する天然アミノ酸である。固体粒子とエキソソームの共有結合の後、固体粒子上で未反応アミノ反応性アルデヒドをクエンチするために、グリシンは、エキソソーム研究の分野で、１００ｍＭの濃度でしばしば使用される（非特許文献５）。またグリシンは、精製エキソソームの製剤における充填剤として記載されている（特許文献１）。グリシンは、タンパク質と疎水性表面との非特異的な相互作用を促進することが知られている（非特許文献６、７）。細胞膜の高脂質含有量が、高い表面疎水性を媒介すると理解されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第６，８１２，０２３Ｂ１号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋａｎｇ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．，７（２００８）３４７５−３４８０
【非特許文献２】Ｌａｓｓｅｒ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｓ．Ｅｘｐ．５９（２０１２）ｅ３０３７
【非特許文献３】Ｓｏｋｏｌｏｖａ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  Ｓｕｒｆ．Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，８７（２０１１）１４６−１５０
【非特許文献４】Ａ．Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８２０（２０１２）９４０−９４８
【非特許文献５】Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４（２００２）７１３−７２２
【非特許文献６】Ｇａｇｎｏｎ，Ｐ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ａ．１２２１（２０１２）５７−７０
【非特許文献７】Ｍｕｌｌｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．，３６（２０１３）１３２７−１３３４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの態様において、本明細書で開示される実施形態は、エキソソームの単離方法に関する。その単離方法は、分子量が約３５０ダルトン未満の有機双性イオンの存在下で少なくとも１回の精製工程を行うことを含み、有機双性イオンの負電荷部分の緩衝ｐＫは、少なくとも１回の精製工程が行われる作用ｐＨを下回る少なくとも１つの完全なｐＨ単位（ｆｕｌｌ  ｐＨ  ｕｎｉｔ）であり、有機双性イオンの正電荷部分の緩衝ｐＫは、作用ｐＨを上回る少なくとも１つの完全なｐＨ単位である。
【０００８】
エキソソームと小さい有機双性イオンとの組み合わせは、精製の間、エキソソームの回収を高められることが明らかとなっている。理論によって結び付けられることなく、高められた回収は、エキソソームとエキソソームが接触する表面との非特異的相互作用の減少によって媒介されているように見える。これは、１つの適切な双性イオン種の例であるグリシンが、タンパク質と疎水性表面との非特異的相互作用を促進することが知られ、外側のエキソソーム膜の脂質成分は高い疎水性であると理解されるので、一見直観に反している。非特異的相互作用を減らす適当な双性イオンの明らかな能力は、水溶液の極性を高める双性イオンの能力によって媒介されるエキソソームの溶解性の向上を反映し得る。精製の間、エキソソームが非特異的に相互作用し得る表面は、濾過媒体およびクロマトグラフィー媒体を含んでもよい。非特異的相互作用を減少させ溶解性を向上させるのが、異なる現象なのか、または同じ現象の異なる局面なのか、まだ解明されていないが、本明細書で開示される実施形態によれば、エキソソームと双性イオンを組み合わせるいずれの場合においても、精製の間エキソソームの回収の向上がもたらされ得る。
【０００９】
本明細書で開示される方法を実施するのに適した小さい有機双性イオンは、分子量が約７５ダルトン（Ｄａ）のアミノ酸グリシンまたは分子量が約８９Ｄａのアラニンを特に含む。グリシンは、第１級アミノ基に結合された中心炭素、カルボキシル基、および２つの水素原子で構成され、電荷は分子の反対側に存在する。アミノ基とカルボキシル基の間の配列および距離のために、双性イオン形態は高い双極子モーメントを有し、双性イオン形態が存在する水溶液のバルク誘電率を高める効果を有する。ベタイン、タウリン、およびタウロベタインなどのグリシン類似体は、同じ理由で本質的に類似した効果を有する。ただし、ベタインではアミノ基は化学的に修飾され（トリメチル化されている）、９超のｐＨ値で正電荷を維持し、タウリンではカルボキシル基はスルホ基と置換され、２未満のｐＨで負電荷を維持し、タウロベタインでは、アミノ基およびカルボキシル基の両方が修飾され、約３〜約１２のｐＨの全範囲にわたって双性イオン性である。ジアミノ酸、トリアミノ酸、およびより大きな倍数のアミノ酸などの類似したまたは関連した構造は、正電荷と負電荷の間のより大きな距離によって生成されるより大きな双極子モーメントのために、より低い濃度でより効果的であり得る。そのような化合物の例には、限定されないが、特にグリシルグリシン、グリシルグリシルグリシンから同種組成または異種組成のペンタアミノ酸までを含む。分子の反対側の末端でそれぞれの荷電基を有し、中間炭素上の側基が実質的に荷電されていないこれらの例と同様に、少なくとも１つの中間炭素を有し、分子の反対側の末端で逆の電荷を有し、中間炭素上の側基が実質的に荷電されていない他の双性イオンが適している。
【００１０】
いくつかの実施形態では、グリシンまたはアラニンは、ヒトへの注射に安全であることが知られているＦＤＡ承認の米国薬局方記載の非活性成分であるので、特に有用であり得る。グリシンおよびアラニンは、低価格で多くの供給者から広く入手可能なため、さらに有用であり得る。
【００１１】
本明細書では、グリシンは、本発明の実施形態を説明する目的で、非排他的な例として記載され、本発明を限定するものとして見なされるべきでない。いくつかの実施形態によれば、グリシンは５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、最高１Ｍ、２Ｍ、または飽和（約３Ｍ）を含む１００ｍＭ以上の濃度で存在し得る。いくつかのそのような実施形態では、オスモル濃度を標準の生理値にかなり近い値に保持するために、１００ｍＭ以下の濃度を使用することが有益であり得る。実験データは、エキソソームを水溶液中で１００ｍＭのグリシンと組み合わせるときに、精製への有益な効果が、１Ｍのグリシンで得られるものと少なくとも同然であることを示している。いくつかの実施形態では、グリシンの濃度は、１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ超であってもよく、または飽和していてもよい。
【００１２】
本明細書で開示されるグリシンまたは他の双性イオン剤は、１種以上のいわゆる双性イオン緩衝剤、例えばＨｅｐｅｓ（ヒドロキシエチルピペラジンエタンスルホン酸）と組み合わせてもよい。Ｈｅｐｅｓは約７のｐＫを有し、約１０〜約２０ｍＭの濃度でエキソソーム緩衝剤として一般的に用いられる。そのような緩衝剤は、それらのｐＫの１ｐＨ単位以内で緩衝のために使用されるとき、開示された効果を生む双性イオンとは見なされない。その理由は、こうした場合、アミノ基は部分的にイオン化され、非中性電荷を有する種を残し、それは、双極子モーメントおよび溶媒の誘電率を高める能力を減らすと考えられるためである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は、界面活性剤と組み合わせてもよい。ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯなどのいくつかの界面活性剤は双性イオン性であるが、開示された効果を生む種とは見なされない。その理由は、電荷が分子の反対側の末端になく、互いに近くに位置し、それによって強い双極子モーメントを生成しないので、媒体の誘電率を高める能力を欠くためである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は、従来の無機緩衝剤および塩と組み合わせてもよい。いくつかのそのような実施形態では、緩衝剤は、一般的に使用される薬剤、例えば、リン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウム、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウム、および他の無機緩衝剤および塩を含んでもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は単糖類や多糖類などの糖と組み合わせてもよい。いくつかのそのような実施形態では、これらはマンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロースなどの糖を含んでもよい。
【００１６】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は、ＨｅｐｅｓまたはＭＥＳなどの緩衝剤と組み合わされる。これらは双性イオン緩衝剤として販売されているが、荷電残基の少なくとも１つが部分的に滴定されるので、それらが使用されるｐＨ値では適切な双性イオン性ではない。したがって、それらは開示されたプロセスの有益な効果に寄与しない。
【００１７】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチルスルホキシド、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、またはポリビニルピロリドン等を含む有機溶媒またはポリマーと組み合わせてもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は、特定の金属イオン種と組み合わせてもよい。いくつかのそのような実施形態では、その金属種は、カルシウム、マグネシウム、鉄、他の金属イオン種、または複数の金属イオン種の組み合わせからなる群から選択される１つ以上であってもよい。
【００１９】
いくつかの実施形態では、グリシンまたは他の双性イオン剤は、特定のキレート剤種と組み合わせてもよい。いくつかのそのような実施形態では、そのキレート種は、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、ＴＲＥＮ（トリス（２−アミノエチル）アミン）、他のキレート剤、またはキレート剤の組み合わせを含む群からの１つ以上であってもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態では、他の物質とともに使用されるときのグリシンまたは他の双性イオン剤は、生理的オスモル濃度の限度を超えないでグリシンの十分な高濃度を可能にするために減らされる他の物質の濃度を使用してもよい。一つのそのような実施形態では、例えば塩の濃度を、組成物の導電率を約１５ｍＳ／ｃｍの標準生理値未満になるように減らしてもよい。一つのそのような実施形態では、特に塩化ナトリウムの濃度を約２５ｍＭに減らしてもよく、リン酸緩衝液の濃度を約２０ｍＭに制限してもよく、それによってグリシンの濃度を、約２５０〜約３００ｍＯｓｍ／ｋｇの目標オスモル濃度を著しく超えないで約７５ｍＭにすることができる。他のそのような実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、約２０ｍＭのリン酸塩と組み合わせて約５０ｍＭに減らしてもよく、それによってグリシンの濃度を約５０ｍＭにすることができる。いくつかの実施形態では、糖または他の浸透物質の濃度を同様に管理してもよい。
【００２１】
いくつかの実施形態では、エキソソームと組み合わされるときのグリシンまたは他の双性イオン剤は、エキソソームが常にグリシンの存在下にあるように、グリシンを連続して供給できる状態で処理してもよい。他の実施形態では、精製の少なくとも１つの段階の間、グリシンはエキソソームとともに存在してもよいが、引き続き存在する必要はない。
【００２２】
いくつかの実施形態では、エキソソームとともに使用されるグリシンまたは他の双性イオン剤は、未精製の、または部分的に精製された、または高度に精製されたエキソソームを含む製剤における使用を含んでもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明をより理解しやすくするために下記の語を定義する。さらなる定義は詳細な説明を通して記載する。
【００２４】
「双性イオン」とは、同じ分子上に存在する別個の異なる正電荷部分および負電荷部分を有する分子のことを言う。双性イオンは、さまざまなアミノ酸および２つ以上のアミノ酸サブユニットを含むアミノ酸ポリマーを含み、特定のポリマーにおけるそれぞれのサブユニットは互いに同一または異なってもよい。
【００２５】
「エキソソーム」とは、例えば細胞培養液などの多くの生体液に存在する直径３０〜１００ｎｍの細胞由来の小胞のことを言う。
【００２６】
「オスモル濃度」とは、溶液の１リットル当たりの溶質粒子のオスモルとして表される溶液中の１つ以上の浸透圧的に活性な物質の浸透圧濃度のことを言う。溶液のオスモル濃度はしばしば、生体分子または生体分子集合体の官能性および／または安定性の臨界パラメーターである。
【００２７】
「オスモル」とは、溶液中で解離し、粒子（分子およびイオン）の１モル（アボガドロ数）を形成する溶質の量と等しい浸透圧の単位のことを言う。
【００２８】
いくつかの実施形態では、エキソソームの単離方法は、分子量が約３５０ダルトン未満の有機双性イオンの存在下で少なくとも１回の精製工程を行うことを含み、この単離方法では、有機双性イオンの負電荷部分の緩衝ｐＫは、少なくとも１回の精製工程が行われる作用ｐＨを下回る少なくとも１つの完全なｐＨ単位であり、有機双性イオンの正電荷部分の緩衝ｐＫは、作用ｐＨを上回る少なくとも１つの完全なｐＨ単位である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、有機双性イオンは、少なくとも１つの炭素原子による分離が存在するように、正電荷窒素基と有機双性イオン上の正電荷窒素基より遠位の負電荷基とを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの炭素原子は非電荷側鎖を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程の作用条件下での有機双性イオンのモル誘電増分は２０超である。いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程の作用条件下での有機双性イオンのモル誘電増分は約１７超である。いくつかの実施形態では、モル誘電増分はグリシンのものであり、約１８（より古い測定）〜約２２．６の範囲にあることが示された。例えば、ｗｗｗ．ｂｉｏ．ｇｒｏｕｐｓ．ｅｔ．ｂｙｕ．ｎｅｔ／Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ＿Ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ．ｐｈｔｍｌを参照のこと。
【００３２】
いくつかの実施形態では、有機双性イオンは、アミノ酸または２〜５個のアミノ酸を含むペプチドであり、アミノ酸またはペプチドアミノ酸は、グリシン、アラニン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルグリシン、すなわちベタイン、およびタウリンからなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの有機双性イオン剤は、グリシンまたはアラニンである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、有機双性イオンの濃度は、（ａ）約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、（ｂ）約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、（ｃ）約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、（ｄ）約３００ｍＭ〜約３Ｍ、および（ｅ）飽和、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、その濃度は、任意の中間値または中間の範囲であってもよい。
【００３５】
いくつかの実施形態では、有機双性イオンの濃度は、（ａ）約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、（ｂ）約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、（ｃ）約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、（ｄ）約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、（ｅ）約３００ｍＭ〜約３Ｍ、および（ｆ）飽和、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、その濃度は、任意の中間値または中間の範囲にあってもよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程を行う前に、エキソソームを精製しない、または部分的に精製する、または高度に精製する。いくつかのそのような実施形態では、精製レベルは、約５％、１０％、２０％、４０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または約９９．９％の精製である。すなわち、少なくとも１回の精製工程の前に、任意のレベルに精製することができる。いくつかの実施形態では、エキソソームの純度レベルは、１％未満の汚染物質量、１％超の汚染物質量、１０％超の汚染物質量、５０％超の汚染物質量、９０％超の汚染物質量、９５％超の汚染物質量、または９９％超の汚染物質量、またはそれらの範囲内の中間値を示す。
【００３７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程の間のオスモル濃度は、約２５０ミリオスルモル／ｋｇ〜約３００ミリオスルモル／ｋｇの範囲にある。
【００３８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程の間のオスモル濃度は、約２５０ミリオスルモル／ｋｇ未満である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程の間のオスモル濃度は、約３００ミリオスルモル／ｋｇ超である。いくつかの実施形態では、双性イオンはより高い濃度でもより低い濃度でも有益な効果を有し得るが、オスモル濃度は約２５０〜約３００の範囲にある。
【００４０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程は濾過工程を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程はクロマトグラフィー工程を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程はフィールドフロー分画工程を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１回の精製工程は遠心分離工程を含む。
【００４４】
本明細書で開示される方法における使用のための特定の組成物の開発における有用な出発点は、１００ｍＭグリシンを含む緩衝剤を用いてエキソソームの水性製剤を平衡化することである。緩衝剤は、１リットル当たり約２８０〜約３１０ミリオスモルのいわゆる生理的オスモル濃度を具現化してもよい。浸透圧計がない場合の適切な出発点の一例は、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシンでｐＨ７．０である。他の例として、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのグリシンでｐＨ７．０である。Ｈｅｐｅｓは、ヒスチジンなどの他の双性イオン緩衝剤や双性イオン緩衝剤の混合物に置換してもよい。ＮａＣｌは他の塩または他の塩の混合物に置換してもよい。グリシンは、他の双性イオン種または双性イオン種の組み合わせに置換してもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、有益な効果を生むために使用される所定の双性イオン種または双性イオン種の混合物の量は、サイズ排除クロマトグラフィーなどの処理を行って測定してもよく、その後、エキソソームの正確な定量を可能にする分析方法が行われる。本明細書で開示される方法では、実験を繰り返し行ってもよく、それぞれの実験は、例えば約１０、約２０、約４０、約８０、または約１６０ｍＭなどの一定の濃度の双性イオン種の単一の種を使用する。いくつかの実施形態では、方法は、双性イオン種の組み合わせを使用して行ってもよく、この組み合わされた双性イオン種の濃度は、約１０、約２０、約４０、約８０、または約１６０ｍＭである。その後の処理工程は、いかなる許容度が望まれても有効な最低濃度を特定するために行うことができる。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウムまたは他の塩の濃度もさまざまであってもよい。いくつかの実施形態では、緩衝イオンの濃度もさまざまであってもよい。いくつかの実施形態では、ｐＨはさまざまであってもよいが、一般的に６．５〜７．５の範囲内にある。実験計画法（ＤｏＥ）などの統計的手法は、複数の変数が評価されている場合、有効な結果を得るために処理変数の数を著しく減らすために使用されてもよいことが認められるであろう。
【００４６】
いくつかの実施形態では、未精製製剤は、透析濾過によって双性イオン含有溶液に平衡化してもよく、透析濾過のプロセスは、膜中の孔を通過することによっていくらかの汚染物質を除去する効果も有する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、エキソソームは遠心分離によって沈降させてもよく、双性イオン含有緩衝剤中でそれらを再懸濁することによって双性イオン含有環境に平衡化してもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態では、双性イオンは、乾燥双性イオンを直接添加することによって、または少なくとも双性イオン種を含有する高濃度溶液を添加することによってエキソソーム含有製剤に添加してもよい。
【００４９】
いくつかの実施形態では、エキソソーム製剤は、例えば単純乾燥、凍結乾燥、ガラス化などの製剤から水を効果的に除去する方法によって、保存前に双性イオン含有溶液に平衡化してもよい。
【実施例】
【００５０】
実施例１
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるエキソソームおよびグリシンの組み合わせの処理。幅１．６ｃｍ、高さ１５ｃｍのセファクリルＳ−４００ＨＲの３０ｍＬカラムを、ｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１００ｍＭのグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝剤を用いて平衡化した。接線流精密濾過によって濃縮されたエキソソーム、およびそのエキソソームとほぼ同じ複合ＵＶ吸光度を有する汚染物質を含む水性製剤７ｍＬからなる試料をカラムに適用した。緩衝剤を６０ｃｍ／時の線流速でカラムに供給して分画を行った。その試行を１００ｍＭグリシンの代わりに１Ｍグリシンを用いて繰り返した。グリシンを含まないｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌの緩衝剤を用いて対照を行った。ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（ナノサイト）による解析は、１００ｍＭグリシンを用いて行った処理は約９９％のエキソソームの回収率を示した。１Ｍのグリシンの実験は、約９５％の回収率を示し、グリシンを欠く対照は約９０％の回収率を示した。ピーク最高点でのＵＶ吸光度によるエキソソームの定量は、約１００％、約９２％、および約６７％の相対回収率をそれぞれ示した。全てのタンパク質汚染物質の約９５％を全ての実験で除去した。この実施例は、エキソソームの回収を評価し得る２つの手段を示している。エキソソームおよび双性イオンを含む組成物が他の表面および／または他の条件下で接触した後、類似した方法がエキソソーム回収率の測定のために使用することができることは当業者には明らかであろう。
【００５１】
実施例２
１００ｍＭのグリシン中でのサイズ排除クロマトグラフィーによるエキソソームの処理。限外濾過によって濃縮されたエキソソームを、実施例１に記載のカラムと同じＳＥＣカラムに適用したが、エキソソームはｐＨ７．０の２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのグリシンに平衡化した。ナノサイトによって測定されたエキソソーム回収率は約９９％であった。非エキソソームタンパク質の含有量は約９５％減少した。
【００５２】
双性イオン媒介による誘電率の上昇の効果は、精製方法に関して明白であるはずなので、分画がサイズに基づく全ての精製方法に関して、また同様に分画がイオン交換クロマトグラフィーなどの電荷に基づく全ての精製方法に関しても、同様の効果が得られることは当業者には明らかであろう。
【００５３】
本明細書で引用した全ての引用文献は、それぞれの文献または特許または特許出願が、全ての目的のために、その全体において、参照によって援用されるために具体的に、個別に示されるのと同じ程度に、全ての目的のために、それらの全体において、参照によって援用される。参照によって援用される文献および特許または特許出願が、本明細書に含まれる開示に矛盾するという点で、本明細書は、そのようないかなる矛盾材料に取って代わり、および／または優先されることが意図される。
【００５４】
本明細書および請求項で使用される成分、クロマトグラフィー条件などの量を表す全ての数字は、「約」の語によって全ての場合において変更されることが理解される。したがって、逆に示されない限り、本明細書および請求項に記載された数値パラメーターは、本明細書によって得ようとする所望の成果によって変化し得る近似値である。
【００５５】
当業者には明らかであるように、本発明の多くの改良および変更は、その精神および範囲を逸脱しない限り行うことができる。本明細書に記載の特定の実施形態は、例として示され、限定することは全く意図していない。本明細書および実施例は例示としてのみ見なされることが意図され、本発明の真の範囲および精神は以下の請求項によって示される。