(57)【要約】  ワクチン接種法が提供される。本方法は、哺乳動物にヒストンデアセチラーゼ阻害剤を、当該哺乳動物が有する既存の免疫の抗原を送達するワクチンと併用して投与するステップを含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と、前記哺乳動物が有する既存の免疫の抗原を送達するワクチンとを投与するステップを含むワクチン接種法。
【請求項２】
前記抗原が、腫瘍抗原、ウイルス病原体由来の抗原および細菌病原体由来の抗原から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍抗原が、アルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ  １２５、Ｈｅｒ２、ドーパクロム・タウトメラーゼ（ＤＣＴ）、ＧＰ１００、ＭＡＲＴ１、ＭＡＧＥタンパク質、ＮＹ−ＥＳＯ１、ＨＰＶ  Ｅ６およびＨＰＶ  Ｅ７から成る群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原が、ＨＩＶ、ＨｅｐＣ、ＦＩＶ、ＬＣＭＶ、エボラウイルスおよびマイコバクテリウム・ツベルクローシスから成る群から選択される病原体由来である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ヒドロキサミン酸、ベンズアミド類、環状テトラペプチド類、デプシペプチド類、求電子性ケトン類、および脂肪酸化合物から成る群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒドロキサミン酸が、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡおよびパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）から選択され、前記ベンズアミド類が、エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４、およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）から選択され、前記環状テトラペプチド類が、トラポキシンＢであり、および前記脂肪酸化合物が、フェニルブチレートもしくはバルプロ酸でよい請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ワクチンが、前記抗原を発現するウイルスワクチンである請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ウイルスワクチンが、腫瘍崩壊性ウイルスである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍崩壊性ウイルスが、ラブドウイルス、麻疹、ワクシニア、ヘルペス、粘液腫、パルボウイルス、ニューキャッスル病、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスから成る群から選択される請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍崩壊性ウイルスが、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、マラバウイルス、エフェメロウイルス、サイトラブドウイルス、ヌクレオラブドウイルスおよびリッサウイルスから成る群から選択されるベシクロウイルスである請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ワクチンが、Ｉ型インターフェロンの発現を誘導する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ワクチンが、抗原提示Ｂ細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ワクチンが、Ｉ型インターフェロンの発現を誘導する物質と併用して投与される請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ワクチンとヒストンデアセチラーゼ阻害剤とを含む組成物。
【請求項１５】
前記ワクチンが、ウイルスワクチンである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ワクチンが、Ｉ型インターフェロンを誘導するものである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ヒストンデアセチラーゼ阻害剤が、ヒドロキサミン酸、ベンズアミド類、環状テトラペプチド類、デプシペプチド類、求電子性ケトン類、および脂肪酸化合物から成る群から選択される請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ヒドロキサミン酸が、ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡおよびパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）から選択され、前記ベンズアミド類が、エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４、およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）から選択され、前記環状テトラペプチド類が、トラポキシンＢであり、および前記脂肪酸化合物が、フェニルブチレートおよびバルプロ酸でよい請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｉ型インターフェロンの発現を誘導する物質をさらに含む請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
前記物質が、トール様受容体リガンド、イミキモド、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）、ＣｐＧ  ＯＤＮ、イミダゾキノリン、モノホスホリル脂質Ａ、フラジェリン、ＦｉｍＨおよびＮ糖分解ムラミルジペプチドから成る群から選択される請求項１９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にワクチン接種法に関し、特にウイルスワクチンがヒストンデアセチラーゼ（ヒストン脱アセチル化酵素）阻害剤と共投与（coadministration）されるワクチン接種法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）は、遺伝子転写を調節するために必要とされるヒストン修飾を損傷させることによって、遺伝子発現に広範な作用を有する後成的修飾薬である。ＨＤＡＣｉは、腫瘍細胞内のインターフェロンシグナリングを修飾できるので、このため腫瘍崩壊を強化するためのウイルス増感剤として利用できる。癌細胞のインターフェロン応答性における固有の欠損を強調することによって、これらの薬物は正常細胞を感受性にさせることなく腫瘍向性ウイルスの有効性を増加させることができる。したがってＨＤＡＣｉは、ウイルス腫瘍崩壊を促進するために先天性免疫を変化させることができるが、それらが獲得免疫応答に及ぼす影響はこの治療環境では調査されてこなかった。
【０００３】
ウイルス腫瘍崩壊および癌免疫療法は、独立型治療として臨床有効性を示す。成功の得られる腫瘍崩壊性ウイルス療法は抗腫瘍免疫を誘導する固有の能力に依存することを示唆する文献がますます増加していて、免疫療法の一つの形態であると規定さえする文献まで登場している。数種の前途有望な臨床的候補は、免疫刺激性トランス遺伝子を発現するように遺伝子組み換えされているウイルスである。しかし、免疫系を刺激することが腫瘍崩壊性ウイルス療法にとって真に有益であるかどうかに関する論議は続いている。実際に、腫瘍崩壊ベクターに対する免疫応答が何らかの事情で促進されると、これはウイルス複製を傷つけて、特に自己抗原が標的とされる場合には、例えば抗原競合などの機序によって腫瘍特異的応答の誘導を傷害させる可能性があり、この場合には異種ウイルス抗原は顕著な利点を有し、腫瘍崩壊が低いために抗原放出は減少する。このため、直接腫瘍崩壊と免疫療法とを併用する最適な戦略は、抗腫瘍免疫および腫瘍崩壊性ウイルス複製の両方を促進することを目指すべきである。
【０００４】
腫瘍崩壊性ウイルスは、近年、抗腫瘍免疫応答の特に強力な追加抗原刺激剤であることが証明されてきた。この治療アプローチは、どちらも同一腫瘍抗原を発現する従来型ウイルスワクチンと腫瘍崩壊性ウイルスワクチンとを併用する。腫瘍崩壊性ワクチンを用いた追加抗原刺激は、初回抗原刺激を受けた動物におけるウイルスによる腫瘍減量および腫瘍特異的ＣＴＬ（細胞毒性Ｔリンパ球）の数の大きな増加の両方をもたらすことができる。逆説的に言えば、この方法は、複製腫瘍崩壊ベクターが腫瘍内で増幅して抗原特異的ＴＩＬｓの数の極めて大きな増加および一部の症例では確定された頭蓋内黒色腫の根絶をもたらすので、腫瘍を持たない動物と比較して腫瘍を持つ動物においてより大きな抗腫瘍免疫応答を実際に生成させる。
【０００５】
バルプロ酸（ＶＰＡ）、ヒドロキサミン酸スベロイルアニリド（ＳＡＨＡ）およびＭＳ−２７５を含む数種のＨＤＡＣｉは、現在、様々な充実性腫瘍および血疫学的悪性腫瘍のための抗癌剤として臨床試験を受けている。急性骨髄性白血病、Ｔ細胞リンパ腫および腎細胞癌においては、前途有望な初期成果が得られている。興味深いことに、それらの直接的な抗腫瘍活性に加えて、これらのＨＤＡＣｉは免疫調節特性を有している。例えば、ＶＰＡ、ＳＡＨＡおよびＭＳ−２７５は全てが癌細胞の免疫原性および免疫認識を促進できることが証明されている。
【発明の概要】
【０００６】
ＨＤＡＣｉと追加抗原刺激用ワクチンとの共投与が、強化された作用を示すことが見い出された。
【０００７】
したがって、本発明の一つの態様では、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と、抗原を送達するワクチンとを哺乳動物に投与するステップを含むワクチン接種法が提供され、前記哺乳動物は、前記抗原に対する既存の免疫を有している。
【０００８】
本発明のまた別の態様では、ワクチンおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤を含む組成物が提供される。
【０００９】
本発明のこれらの態様や他の態様は、以下の図面を参照して後述する詳細な説明において、より明確になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】移植後第１日または第５日（各々、ＡおよびＢ）から開始して、ＰＢＳ、Ａｄ−ＢＨＧ（陰性コントロール、１×１０８ＰＦＵ  ＩＭ）、Ａｄ−ｈＤＣＴ（ＴＡＡトランス遺伝子、１×１０８ＰＦＵ  ＩＭ）、Ａｄ−ｈＤＣＴ＋ＶＳＶ−ｈＤＣＴまたはＡｄ−ｈＤＣＴ＋ＶＳＶ−ｈＤＣＴ＋ＭＳ−２７５を用いて治療された癌モデルの生存曲線を示す図である。
【図２】腫瘍崩壊性ワクチン追加抗原刺激剤とＨＤＡＣｉとの共投与が、腫瘍抗原特異的応答（Ａ）、腫瘍抗原特異的抗体応答（Ｂ）、活性化ＮＫ細胞の数（Ｃ）を維持し、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの共発現（Ｄ）を強化し、腫瘍崩壊性ワクチン追加抗原刺激後に腫瘍抗原特異的Ｔ細胞によって発現するＩＦＮ−γ（Ｅ）およびＴＮＦ−α（Ｆ）の数を強化させ、Ｔ細胞結合活性（Ｇ）を強化することを表示するグラフである。
【図３】腫瘍崩壊性ワクチン追加抗原刺激剤とＨＤＡＣｉとの共投与が、ナイーブＣＤ８＋細胞（Ｂ）、ナイーブＮＫ細胞（Ｃ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｄ）およびＢ細胞（Ｅ）における減少に帰せられる末梢血中の全リンパ球数の減少によって証明されるリンパ球減少症を生成することを示しているグラフである。
【図４】腫瘍崩壊性ワクチン追加抗原刺激剤とＨＤＡＣｉとの共投与が、抗腫瘍応答を維持しながら抗ウイルス応答を減少させることを示しているグラフである。
【図５】腫瘍崩壊性ワクチン追加抗原刺激剤とＨＤＡＣｉとの共投与が、Ｔｒｅｇ頻度（Ａ）を減少させ、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞：Ｔｒｅｇ比（Ｂ）を増加させ、Ｆｏｘｐ３発現レベル（Ｃ）を低下させることを示しているグラフである。
【図６】腫瘍崩壊性ワクチン追加抗原刺激剤とＨＤＡＣｉとの共投与によって誘導されるリンパ球減少症は、全リンパ球（Ａ）、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｂ）、全ＮＫ細胞（Ｃ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｄ）およびＢ細胞（Ｅ）における類似の減少がＣ５７／Ｂ６マウスと同様にＢａｌｂ／ｃマウスにおいて発生したので、系統特異的ではないことを示すグラフである。
【図７】ＶＳＶは、全リンパ球数（Ａ）、ナイーブＣＤ４＋細胞（Ｂ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（Ｃ）およびＢ細胞（Ｄ）によって証明されるようにＭＳ−２７５共投与によって有意に拡大される一過性リンパ球減少症を誘導することを示すグラフである。水平点線は、未治療マウスについての平均計数を表す。
【図８】全リンパ球数によって証明されるように、Ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ単独およびＶＳＶ／ＭＳ−２７５の投与と比較した、Ｐｏｌｙ  Ｉ：ＣとＭＳ−２７５との共投与によって誘導されるリンパ球減少症を示すグラフである。
【図９】ＭＳ−２７５（Ａ）および不活性ＭＳ−２７５アナログ（Ｂ）の構造を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
ヒストンデアセチラーゼ阻害剤を、抗原を発現するように適応させたワクチンと併用して哺乳動物に投与するステップを含むワクチン接種法が提供され、前記哺乳動物は、前記抗原に対する既存の免疫を有する。
【００１２】
本明細書で使用する用語「ワクチン」は、標的抗原に対する免疫原性応答を誘導する生物学的製剤を意味する。ワクチンの例には、ウイルス、細菌、タンパク質および核酸ワクチンが含まれる。用語「ウイルスワクチン」は、標的抗原に対する免疫原性応答を誘導するウイルスを意味する。
【００１３】
用語「哺乳動物」は、ヒトならびに非ヒト哺乳動物を意味する。
【００１４】
本方法は、対象となる哺乳動物が有する既存の免疫の抗原を送達する又は発現するワクチンの前記哺乳動物への投与を含むものである。本明細書で使用する用語「既存の免疫」は、抗原を用いたワクチン接種によって誘導される免疫、ならびに所定の抗原への先行曝露の結果として生じる哺乳動物内の自然に存在する免疫を含むことが意図されている。
【００１５】
既存の免疫を確立するために、本方法は、哺乳動物に標的細胞に対する免疫応答を誘導するために適切な抗原を用いてワクチン接種するステップ、例えば初回抗原刺激ステップを含むことができる。適切な抗原には、腫瘍抗原、ウイルス抗原、および特にウイルス病原体、例えばＨＩＶ、ＨｅｐＣ、ＦＩＶ、ＬＣＭＶ、エボラウイルス、ならびに細菌病原体、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシス（mycobacterium tuberculosis）に由来する抗原が含まれる。
【００１６】
一つの実施形態では、抗原は腫瘍抗原、例えば腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）、例えば哺乳動物において免疫応答を始動させる、腫瘍細胞内で生成される物質である。そのような抗原の例には、腫瘍胎児抗原、例えばアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）および癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、表面糖タンパク質、例えばＣＡ−１２５およびメソテリン、癌遺伝子、例えばＨｅｒ２、黒色腫関連抗原、例えばドーパクロム・タウトメラーゼ（ＤＣＴ）、ＧＰ１００およびＭＡＲＴ１、癌精巣抗原、例えばＭＡＧＥタンパク質およびＮＹ−ＥＳＯ１、ウイルス癌遺伝子、例えばＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７、通常は胚もしくは胚体外組織に限定される腫瘍内で異所的に発現するタンパク質、例えばＰＬＡＣ１が含まれる。当業者であれば理解するように、所定の癌の治療において使用するためには１つ以上の抗原が特に適合するので、抗原は本方法を使用して治療対象の癌のタイプに基づいて選択することができる。例えば、黒色腫を治療するためには、黒色腫関連抗原、例えばＤＣＴを使用できる。用語「癌」は、本明細書では、黒色腫、肉腫、リンパ腫、癌、例えば脳腫瘍、乳癌、肝臓癌、胃癌および結腸癌、ならびに白血病を含むがそれらに限定されない任意の癌を含むために使用される。
【００１７】
抗原は、それ自体で、または好ましくは、ベクター、例えばラブドウイルス、アデノウイルス（Ａｄ）、ポックスウイルスもしくはレトロウイルスベクター、プラスミドまたは負荷抗原提示細胞、例えば樹状細胞を介して投与することができる。抗原をベクター内に導入する方法は、当業者には公知である。一般に、ベクターは抗原を発現するように修飾される。これに関連して、選択された抗原をコードする核酸は、明確に確立された組み換えテクノロジーを使用して選択されたベクター内に組み込まれる。
【００１８】
抗原は、静脈内、筋肉内または鼻腔内を含むがそれらに限定されない数種の方法の内のいずれか一つで哺乳動物に投与される。当業者であれば理解できるように、抗原、またはこの抗原を組み込んでいるベクターは、適切な担体、例えば食塩液もしくは他の適切なバッファー中で投与される。選択された抗原を用いたワクチン接種後、免疫応答は、この哺乳動物によってある免疫応答間隔、例えば少なくとも約２４時間、好ましくは少なくとも約２〜４日間以上、例えば少なくとも約１週間および場合によっては数カ月間、数年間または潜在的に生涯を通して生成される。
【００１９】
抗原への免疫応答を確立するために、この抗原を用いたワクチン接種は、明確に確立された技術を使用して実施される。したがって、選択された抗原、もしくはこの抗原を発現するベクターは、免疫応答を生成するために十分な量でこの哺乳動物に投与することができる。当業者であれば理解できるように、免疫応答を生成するために必要な量は、例えば、選択された抗原、この抗原を送達するために使用されるベクター、および治療対象の哺乳動物、例えば、種、年齢、身体の大きさなどを含む多数の因子に伴って変動する。これに関連して、例えば免疫応答を生成するためには、マウスへの最小で少なくとも約１０７ＰＦＵ、またはヒトへの少なくとも約１０９ＰＦＵのアデノウイルスベクターの筋肉内投与で十分である。
【００２０】
また別の実施形態では、この抗原への免疫応答は、この哺乳動物内で自然に発生する可能性があり、免疫応答を誘導するために初回抗原刺激ステップは必要とされない。抗原への自然に発生する免疫応答は、この抗原への何らかの先行曝露の結果として生じることがある。
【００２１】
この哺乳動物内で所定の抗原への免疫応答が適切な免疫応答間隔内で生成されると、次にこの抗原を送達もしくは発現するために適応させた追加抗原刺激ワクチン、例えばウイルスワクチンもしくは抗原提示細胞がＨＤＡＣｉと結び付けてこの哺乳動物に投与される。
【００２２】
選択された抗原を発現するウイルスワクチンは、標準組み換え技術を使用してこの抗原をコードするトランス遺伝子を適切なウイルスに組み込むステップによって調製できる。例えば、トランス遺伝子は、このウイルスのゲノム内に組み込むことができ、または、このトランス遺伝子を組み込んでいるプラスミドを用いてこのウイルス内に組み込むことができる。これに関連して使用するために適切なウイルスには、腫瘍崩壊性ウイルス、ならびに複製（例えば、ポックスウイルス）および非複製（例えば、レトロウイルスもしくはアデノウイルス）ワクチンベクターの両方が含まれる。本方法は、利用できる腫瘍崩壊性ウイルスに関して特に制限されず、哺乳動物に投与するために適切でありながら腫瘍を破壊することのできる任意の腫瘍崩壊性ウイルスを含むことができる。本方法において利用できる腫瘍崩壊性ウイルスの例には、ラブドウイルス、例えばベシクロウイルス、例えば水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびマラバ（Ｍａｒａｂａ）ウイルス、エフェメロウイルス（Ephemerovirus）、サイトラブドウイルス（Cytorhabdovirus）、ヌクレオラブドウイルス（Nucleorhabdovirus）およびリッサウイルス（Lyssavirus）、ならびに麻疹、ワクシニア、ヘルペス、粘液腫、パルボウイルス、ニューキャッスル病、アデノウイルスおよびセムリキ森林ウイルスが含まれる。
【００２３】
抗原発現ウイルスは、ＨＤＡＣｉと結び付けて既存の免疫から結果として生じる免疫応答を追加抗原刺激するために適切な量で投与される。一つの実施形態では、腫瘍抗原を発現する腫瘍崩壊性ウイルスは、有効量のＨＤＡＣｉと結び付けて腫瘍崩壊性ウイルス療法のために適切な量で投与される。各々の量は、当業者であれば理解されるように、少なくとも選択されたウイルス、選択されたＨＤＡＣｉおよび治療対象の哺乳動物に伴って変動する。例えば、マウスにＩＶ投与される最小１０８ＰＦＵの腫瘍崩壊性ＶＳＶは、腫瘍崩壊療法のために十分である。対応する量は、ヒトにおいて使用するために十分である。
【００２４】
ウイルスワクチンは、ＨＤＡＣｉと結び付けて投与される。本発明による適切なヒストンデアセチラーゼ阻害剤（ＨＤＡＣｉ）には、ヒドロキサミン酸、例えばボリノスタット（vorinostat）（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（belinostat）（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、トリコスタチンＡおよびパノビノスタット（panobinostat）（ＬＢＨ５８９）；ベンズアミド類、例えばエンチノスタット（entinostat）（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４、およびモセチノスタット（mocetinostat）（ＭＧＣＤ０１０３）、環状テトラペプチド類（例えば、トラポキシンＢ）、およびデプシペプチド類、求電子性ケトン類、および脂肪酸化合物、例えばフェニルブチレートおよびバルプロ酸が含まれるがそれらに限定されない。治療量のＨＤＡＣｉは、本方法において哺乳動物に、例えばこのウイルスワクチンへの免疫学的応答を強化するために十分な量で投与される。このＨＤＡＣｉは、例えば、経口、皮下、静脈内、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、筋肉内、動脈内、髄内、気管内、吸入、眼内、経皮、膣もしくは直腸手段を含む任意の適切な投与可能な形態を使用して投与することができる。
【００２５】
ウイルスワクチンおよびヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、本発明の方法にしたがって単独で投与、または組成物中で一緒に結合することができ、１つ以上の医薬上許容されるアジュバントもしくは担体と結合することもできる。表現「医薬上許容される」は、薬学分野において使用するために許容される、つまり容認できないほど毒性ではない、またはさもなければ哺乳動物に投与するために非適合ではないことを意味する。医薬上許容されるアジュバントの例には、希釈剤、賦形剤などが含まれるがそれらに限定されない。薬物製剤についてのガイダンスに関しては、概して「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」，２１ｓｔ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５を参照することができる。アジュバントの選択は、組成物の意図される投与様式に左右される。本発明の一つの実施形態では、本化合物は注入、または皮下もしくは静脈内いずれかの注射により投与のために調製され、したがって無菌および発熱物質無含形態および場合により緩衝された、もしくは等張性にされた水溶液として利用される。したがって、本化合物は蒸留水中で、またはより望ましくは、食塩液、リン酸緩衝食塩液もしくは５％デキストロース溶液中で投与することができる。錠剤、カプセル剤、ロゼンジ剤、水溶液もしくは非水溶液中の液剤もしくは懸濁剤、水中油型もしくは油中水型液体エマルジョン、エリキシル剤もしくはシロップ剤による経口投与のための組成物は、糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプン類、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース類を含むセルロースおよびその誘導体；粉末状トラガント；モルト；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えば落花生油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油およびコーン油；ポリオール類、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビタール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸類；水；等張性食塩液およびリン酸緩衝液を含むアジュバントを使用して調製される。湿潤剤、潤滑剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム、安定剤、タブレット成形剤、崩壊剤、酸化防止剤、保存料、着色剤および着香料もまた存在することができる。また別の実施形態では、本組成物は、クリーム剤、ローション剤もしくは軟膏剤として局所投与するために調製することができる。そのような局所投与のためには、本組成物は、適切な基剤、例えばトリグリセリド基剤を含むことができる。そのようなクリーム剤、ローション剤および軟膏剤は、界面活性剤および他の化粧品用添加物、例えば皮膚軟化剤などならびにフレグランスをさらに含有することができる。例えば、その中で適切な推進剤アジュバントが使用される鼻腔送達用のエーロゾル製剤もまた調製することができる。本発明の組成物は、ボーラス剤、舐剤、もしくはペースト剤として投与することもできる。経口、鼻腔、直腸もしくは膣投与を含むこれらの領域に影響を及ぼす感染症を治療するための粘膜投与のための組成物もまた含まれる。そのような組成物には、一般に、例えばカカオ脂、ポリエチレングリコール、坐剤用ワックス、サリチル酸塩または他の適切な担体を含む１つ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体が含まれる。例えばその保管寿命を延長するために役立つことができる他のアジュバントは、それが投与される方法とは無関係に本組成物に加えることもできる。
【００２６】
本方法は、初回免疫応答は損傷させられるが、例えばウイルスワクチン単独によって誘導される応答と比較して、所定の抗原に対する二次免疫応答が強化される、例えば少なくとも約２倍以上、例えば約４倍以上、例えば約６〜８倍以上強化される哺乳動物において有効な相乗作用性ワクチン接種を提供する。この作用に寄与する因子は、この方法に誘導される選択的リンパ球減少症であり、それによりナイーブリンパ球がこの併用によって選択的に枯渇させられる。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤と本ワクチン追加抗原刺激剤との併用はさらに、自己抗原に対するワクチン接種の結果として生じる自己免疫続発症を、そのようなワクチン接種の作用、例えば抗腫瘍作用を低下させることなく減少させる。
【００２７】
一つの実施形態では、抗原に対する既存の免疫を有する哺乳動物における免疫応答を追加抗原刺激する方法であって、この抗原がこの哺乳動物に、例えば、Ｂ細胞を感染させることのできるベクターによって、例えばＢ細胞などの抗原提示細胞によって、Ｉ型インターフェロンの発現を誘導するベクターによって、またはＩ型インターフェロンの発現を誘導する物質と併用したベクターによって、この抗原免疫応答が強化され、この初回免疫応答が損傷させられるワクチン接種を達成するために静脈内投与される方法が提供される。用語「既存の免疫」は上記に規定されていて、上述したように達成することができる。本方法は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原および特にウイルス病原体から誘導される抗原、例えばＨＩＶ、ＨｅｐＣ、ＦＩＶ、ＬＣＭＶ、エボラウイルスならびに細菌病原体、例えばマイコバクテリウム・ツベルクローシスを含む任意の抗原に関して追加抗原刺激するために利用することができる。
【００２８】
当業者であれば、明確に確立された組み換え技術を用いて選択された抗原を発現するベクターを調製することができる。抗原を当該哺乳動物に送達する際に使用するための適切なベクターには、好ましくはＩ型インターフェロン、例えば上記に規定したような、ベシクロウイルスおよびマラバをベースとするウイルスを含むラブドウイルスの発現を誘導するベクターが含まれる。変異ウイルスベクターもまた、本方法において使用するために適切である。複製インコンピテント形を含む変異弱毒化ウイルスは、本方法において使用するために特に有益である。
【００２９】
抗原発現ベクターは、Ｉ型インターフェロンの発現を誘導する物質と併用することができる。そのような物質の例には、イミキモド（imiquimod）、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）、ＣｐＧ  ＯＤＮ、イミダゾキノリン、モノホスホリル脂質Ａ、フラジェリン、ＦｉｍＨおよびＮ−糖分解ムラミルジペプチドを含むがそれらに限定されないトール様受容体（ＴＬＲ）リガンドもしくはアジュバントが含まれる。この抗原免疫応答が強化され、初回免疫応答が損傷させられるワクチン接種を達成するために、ベクターはインターフェロンを誘導してリンパ球減少症を引き起こすために十分である量のＩ型インターフェロン誘導剤と併用される。
【００３０】
選択された抗原を発現させるためにベクターが調製されると、このベクターは、この哺乳動物に、上述したようにＨＤＡＣｉと結合して最適な免疫の追加抗原刺激のために、例えば静脈内投与される。投与されるベクターの量は、選択されたベクターならびに哺乳動物に伴って同様に変動することになる。既存の免疫に関連して、抗原発現ベクターは、この哺乳動物にこの既存の免疫のピーク免疫応答に先行して、または一致して投与することができる。抗原発現ベクターは、既存の免疫を初回抗原刺激するエフェクター期に続いてこの既存の免疫を追加抗原刺激するためにこの哺乳動物に最適に投与される。
【００３１】
以下では本発明の実施形態を特定の実施例を参照しながら説明するが、本実施例は限定的であると見なすべきではない。
【実施例】
【００３２】
（方法）
（マウス）
年齢を適応させた（実験開始時に８〜１０週齢）雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州ウィルミントン）から購入し、マクマスター大学中央動物施設の飼料および水が随意に提供される制御環境に収容した。全動物実験は、カナダ動物飼養委員会（Ｃａｎａｄｉａｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）ガイドラインに準拠してマクマスター大学の実験動物試験審査委員会（ＭｃＭａｓｔｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ’ｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｂｏａｒｄ）によって承認された。
【００３３】
（ウイルスベクター）
複製欠損性ｒＨｕＡｄ５−ｈＤＣＴベクターは、Ｅ１／Ｅ３が欠失していて、全長ｈＤＣＴ遺伝子を発現し、２９３細胞内で増殖させ、ＣｓＣｌ勾配上で精製した。複製可能なｒＶＳＶ−ｈＤＣＴおよびｒＶＳＶ−ＧＦＰについては記載されている（Ｓｔｏｊｄｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，４（４），２６３−２７５）。ｒＨｕＡｄ５−ＢＨＧおよびｒＶＳＶ−ＭＴは、トランス遺伝子が欠如するコントロールベクターであった。
【００３４】
（プライム−ブーストプロトコール）
マウスを１×１０８ｐｆｕのｒＨｕＡｄ５の筋肉内注射によって初回抗原刺激した。追加抗原刺激するために、１×１０９ｐｆｕのｒＶＳＶを１４日間隔でｉ．ｖ．注射した。ＨＤＡＣｉ治療のために、ＭＳ−２７５（ＤＭＳＯ中に溶解させ、食塩液中で希釈させた）はＶＳＶ投与と共投与し、その後４日間にわたり０．１ｍｇをＩＰ投与した。
【００３５】
（癌モデル）
脳腫瘍を樹立するために、マウスには１μＬのＰＢＳ中の１×１０３個のＢ１６−Ｆ１０細胞の頭蓋内注射を受けさせた。マウスを定位固定し（Ｘｙｍｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カナダ国ケベック）、麻酔下で頭蓋骨を露出させるために手術用メスを用いて頭皮に切開部を作成した。注射部位で頭蓋骨を通して小さな穿孔を開けた。細胞は、１０μＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ社、ネバダ州リーノー）上に取り付けた２６ゲージニードルを用いて、脳の右半球の以下の部位（全長に比較して）：０．６２ｍｍ前方、２．２５ｍｍ側方および４．０ｍｍ深部で注射した。細胞は１分間かけて注射し、ニードルは注射経路に沿った逆流を最小限に抑えるために抜去前の２分間にわたりその場所に放置した。頭皮切開部は、ステンレススチール製クリップを用いて閉鎖し、７〜１０日後に除去した。
【００３６】
（ペプチド類）
Ｈ−２Ｋｂ（ＤＣＴ１８０−１８８、ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ）に結合するＤＣＴ由来の免疫優勢エピトープは、ＰｅｐＳｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（オランダ国レリスタット）によって合成した。ＶＳＶのＮタンパク質（ＲＧＹＶＹＱＧＬ）由来のＨ−２Ｋｂ−制限ペプチドは、Ｂｉｏｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（カリフォルニア州ヘイワード）から購入した。
【００３７】
（抗体／テトラマー）
フローサイトメトリーアッセイのために、以下の標的を認識するモノクローナル抗体を使用した：ＣＤ１６／ＣＤ３２（Ｆｃブロック）、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）、ＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）、ＴＮＦ−α（ＭＰ６−ＸＴ２２）、ＣＤ１９（１Ｄ３）、Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２）、ＮＫ１．１（ＰＫ１３６）、ＫＬＲＧ−１、ＣＤ４４（ＩＭ７）、ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）、ＣＤ１０７ａ（１Ｄ４Ｂ）、Ｈ−２Ｋｂ（ＡＦ６８８．５）およびＩ−Ａｂ（２５−９−１７）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カナダ国オンタリオ州ミシソーガから）およびＦｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、米国カリフォルニア州サンディエゴ）。
【００３８】
（抗原特異的Ｔ細胞応答の検出）
様々な組織から調製した単細胞懸濁液を５時間にわたり３７℃でペプチド（１μｇ／ｍＬ）を用いて再刺激し、ブレフェルジンＡ（ゴルジプラグ、１μｇ／ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）をインキュベーションの最終４時間中に加えた。細胞はＦｃブロックを用いて処置し、ＣＤ３およびＣＤ８の表面発現について染色した。細胞を引き続き固定し、透過化し（Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αについて染色した。データはＦＡＣＳＤｉｖａソフトウエアとともにＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して収集し、ＦｌｏｗＪｏソフトウエア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ社、オレゴン州アッシュランド）を用いて分析した。
【００３９】
（Ｔ細胞機能的結合活性アッセイ）
脾細胞は、できる限り低い濃度が提供されるように一連の希釈シリーズのＳＶＹペプチドに曝露させた。細胞は、この刺激中にゴルジプラグを用いて処置し、上述のような細胞内染色によってＩＦＮ−γを測定するためにフローサイトメトリーによって評価した。
【００４０】
（ＤＣＴ特異的抗体の定量）
ＤＣＴを発現するように遺伝子組み換えされたＵ２ＯＳ細胞は、マルチウエルプレート内にプレーティングし、コンフルエンスになるまで増殖させた。次に細胞を固定し、透過化した。治療したマウスからの血清を連続的に希釈し、これらの固定単分子層を探査するために使用した。インキュベーション後、未結合抗体を洗い流し、結合ＤＣＴ特異的抗体は蛍光タグを有する抗マウス二次抗体を用いて検出した。蛍光シグナルを検出して血清中に存在する抗ＤＣＴ抗体の力価を測定した。
【００４１】
（統計的分析）
グラフ作成のためには、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウエア、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用した。統計的分析のためには、ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍおよびＭｉｎｉｔａｂ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌソフトウエア（Ｍｉｎｉｔａｂ社、米国ペンシルベニア州ステートカレッジ）を使用した。必要な場合は、データを対数変換によって正規化した。免疫応答データをクエリーするためには、スチューデント（Ｓｔｕｄｅｎｔ）の両側ｔ検定、一方向もしくは二方向ＡＮＯＶＡまたは一般線形モデリングを使用した。平均値間の差は、ｐ≦０．０５で有意と見なした。平均値＋標準誤差バーを示す。生存期間データは、カプラン−マイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）法およびログ・ランク検定を用いて分析した。
【００４２】
（結果）
（ＭＳ−２７５は腫瘍崩壊性追加抗原刺激ワクチンと結合して治療転帰を劇的に改善する）
国際公開第２０１０／１０５３４７号パンフレットに記載されたＭＳ−２７５とプライム−ブースト（初回抗原刺激−追加抗原刺激）レジメンとの潜在的相乗作用を決定するために、進行性脳黒色腫モデルを黒色腫細胞系Ｂ１６−Ｆ１０ならびに正常メラニン形成細胞（Ｂｒｉｄｌｅ  ＪＩ／ＭＴ）によって発現する規定された黒色腫関連抗原であるドーパクロム・タウトメラーゼ（ＤＣＴ）とともに使用した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞の頭蓋内接種の１日もしくは５日後、ヒトＤＣＴを発現する組み換えヒト５型アデノウイルスベクター（ｒＨｕＡｄ５−ｈＤＣＴ）および同一抗原を発現する腫瘍崩壊性組み換えＶＳＶ（ｒＶＳＶ−ｈＤＣＴ）を用いてマウスを１４日間隔で連続的に治療した。腫瘍崩壊を強化することを目標に、ｒＶＳＶを用いて追加抗原刺激する状況においてＭＳ−２７５を投与した。これはさらにｒＶＳＶの残留および追加抗原刺激されたＣＴＬ応答のピークと一致した。図１ａおよびｂに記載のデータは、未治療動物における平均生存期間が１５日間であったことを示していて、小さな治療ウインドウを備えるこのモデルの悪性度を確証している。ｒＨｕＡｄ５−ｈＤＣＴ単独を用いたワクチン接種は、１日齢および５日齢治療モデルにおいて動物の生存期間を各々２８日間および２５日間のメジアン値に延長させた。その後の腫瘍崩壊性ワクチンｒＶＳＶ−ｈＤＣＴの送達は、動物生存期間を有意に強化した（図１ａ）。しかし生存率の改善にもかかわらず、プライム−ブーストレジメンを用いて治療された大多数の動物は、特に５日齢の腫瘍を有するマウスは、以前の観察と一致して、結局は腫瘍進行に負けた（図１ｂ）。ｒＶＳＶ−ｈＤＣＴ送達時点でのＭＳ−２７５との同時治療は、併用療法の有効性を劇的に強化し、治療開始時に、１日齢または５日齢腫瘍を各々有していたマウスの８５％（ｎ＝１３）および６４％（ｎ＝１１）を治癒させた。ＭＳ−２７５単独は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞増殖がインビトロ阻害されたにもかかわらず、この癌モデルにおける有効性に作用を示さなかった。
【００４３】
（ＮＫ細胞および二次腫瘍特異的ＣＴＬおよび抗体応答の大きさはＭＳ−２７５の存在下では保存される）
このモデルにおけるプライム−ブーストワクチン接種の有効性は、腫瘍特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさと直接的に相関していた。ＨＤＡＣ阻害が腫瘍崩壊性ウイルス療法中の免疫応答に及ぼす影響が調査されていないことを前提に、この療法の重要な成分が強化され、有効性における劇的な改善をもたらすか否かを決定した。ＤＣＴ特異的ＩＦＮ−γ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｒＶＳＶ追加抗原刺激ワクチン接種５および１２日後に、ｒＶＳＶにより誘導された二次Ｔ細胞応答が第５日にピークに達し、１２日後には低下するという以前の観察所見に基づいて、循環中において定量した。ＤＣＴ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさは、ＭＳ−２７５による影響を受けなかった（図２ａ）。並行して、血漿中のＤＣＴ特異的ＩｇＧ抗体を細胞内ウエスタンブロッティングアッセイを用いて測定した（図２ｂ）。これらの結果は、この療法のこれまでに評価されていなかった態様を解明した。つまり、Ｔ細胞のような腫瘍特異的抗体が有意に追加抗原刺激された。Ｔ細胞と同様に、二次抗体応答は、ＭＳ−２７５による影響を受けなかった。さらに、ｒＶＳＶを用いた追加抗原刺激ワクチン接種はＩＦＮ−γを産生して脱顆粒を受けることのできる（ＣＤ１０７ａ発現に基づく）循環ＮＫ細胞の数を増加させるが、ＭＳ−２７５はこれに影響を及ぼさないこともまた見いだされた（図２ｃ）。これらをまとめると、これらの所見は、ＭＳ−２７５の改良された治療作用が、高い大きさのエフェクター応答の誘導に起因したのではなかったことを示唆している。
【００４４】
（ＭＳ−２７５を用いた強化された有効性は改良されたＣＴＬの品質と相関する）
ｒＨｕＡｄ５／ｒＶＳＶ単独と比較して、ＭＳ−２７５の添加はＴＮＦ−αを共発現したＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度（図２ｄ）ならびにそれらのＴＮＦ−α（図２ｅ）およびＩＦＮ−γ（図２ｆ）産生の強度を増加させた。これは、ＭＳ−２７５が活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の質を改善できることを示唆している。より優れた質のＴ細胞は、ＭＨＣ−ペプチド複合体（ｒｅｆ）とのより高い結合活性同種相互作用と関連していることが多い。このため、ＭＳ−２７５を用いて、または用いずに治療されたマウス由来のＴ細胞の機能的結合活性を決定した。このアッセイのために十分な細胞を獲得するために、脾細胞を使用した。これらの細胞をＤＣＴ由来の免疫優勢ペプチドの連続希釈液に曝露させた（ＤＣＴ１８０−１８８；濃度範囲：１μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ）。興味深いことに、マウスがＨＤＡＣｉ治療を摂取した場合に、最低濃度のペプチドに５．６倍以上のＣＤ８＋Ｔ細胞が応答することができた（図２ｇ）。
【００４５】
（ＭＳ−２７５は、ＶＳＶ追加抗原刺激ワクチン接種中にリンパ球減少症を誘発する）
驚くべきことに、腫瘍特異的ＣＴＬおよび活性化ＮＫ細胞の数はＭＳ−２７５治療によって影響を受けなかったが、治療されたマウスにおいて一過性であるが重度のリンパ球減少症が観察された（図３ａ）。実際に、より厳密な試験は、ＭＳ−２７５が循環中ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ８ｈｉｇｈＣＤ４４−ＣＤ６２Ｌ＋ＫＬＲＧ−１−）（図３ｂ）の重度の消失を誘発すること、および静止ＮＫ細胞（ＣＤ１０７ａ−ＩＦＮ−γ−）（図３ｃ）がＭＳ−２７５を用いた治療中に実質的に減少することを示した。さらに、全ＣＤ４＋Ｔ細胞の７７％減少は、同一時点に見られた（図３ｄ）。これらの罹患した細胞集団は、追加抗原刺激されたＣＴＬ応答のピークの１週間後におそらくＭＳ−２７５治療の中止およびＶＳＶクリアランスに起因して回復し始めた。最も著明なことに、Ｂ細胞の９７％が排除され、それらの回復は他の細胞集団よりはるかに緩徐であった（図３ｅ）。このリンパ球減少性作用は腫瘍の存在に依存せず（データは示していない）、系統特異的でもなかったので（図６）、これはこれが一般的現象であることを示唆している。これらの結果は、ナイーブＴ、ＢおよびＮＫ細胞を含む他のリンパ球集団を同時に排除しながら、ＣＤ８＋Ｔ細胞および抗体の二次拡大を可能にするＭＳ−２７５の新規な特性を明らかにしている。このリンパ球減少性環境は、エフェクター細胞の拡大および機能を促進するためにより多くの物理的空間および増殖因子を提供できるだけではなく、ＶＳＶに対する免疫応答の転帰およびその腫瘍崩壊作用もまた調節することができる。
【００４６】
類似の結果は、ＨＤＡＣｉ、ＣＩ−９９４を使用して達成された。
【００４７】
図７は、３０日間をかけてマウスの末梢血中で測定された全リンパ球数を示している。血液１μＬ当たりの細胞数は、治療後３０日間にわたり決定した。このウイルスは、単独では穏やかな作用を有するＨＤＡＣｉ薬（ＭＳ−２７５）との共投与によって有意に拡大される極めて一過性のリンパ球減少症を単独で誘導する。重要なことに、ＨＤＡＣ阻害特性が欠如する薬物アナログは、ＨＤＡＣ阻害にとっての要件であることを示している作用を有していない。これらの作用は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＢ細胞にまで及ぶ。
【００４８】
ＭＳ−２７５が初回免疫応答を損傷させる能力は、それがｒＶＳＶ追加抗原刺激ベクターに対する免疫応答を弱めることができるかどうかの決定を促進した。これを評価するために、ｒＶＳＶのＮタンパク質由来のＫｂ−制限免疫優勢エピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ｒＶＳＶ接種７日後に測定した。図４ａに示したように、ＤＣＴ特異的ＣＴＬの数はＭＳ−２７５治療によって影響を受けなかったが、ｒＶＳＶ応答性ＣＴＬｓは有意に減少したので、これはＭＳ−２７５がメモリおよびナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大に示差的に影響を及ぼすことを示唆している。
【００４９】
まとめると、これらの結果は、拡大されたウイルス腫瘍崩壊を可能にする、腫瘍崩壊性ウイルスに対する応答を遅延させながら、ＭＳ−２７５と腫瘍に対する集中的な免疫応答をもたらす腫瘍崩壊性ウイルスをベースとする追加抗原刺激ワクチンとを併用することが極めて大きな利益になることを指摘している。
【００５０】
（インターフェロンＩ型の発現を誘導する物質はＭＳ−２７５共投与によって拡大されるリンパ球減少症を誘導する）
雌性マウス（８〜１０週齢のＣ５７ＢＬ／６）単回用量のＰｏｌｙＩ：Ｃ（１００μＬのリン酸緩衝食塩液中の２００μｇ、Ｓｉｇｍａ社）を用いて治療し、ＰｏｌｙＩ：Ｃ併用ＭＳ−２７５治療群として腹腔内注射によって５日間にわたり１日１回０．１ｍｇのＭＳ−２７５を用いて治療した。ＰｏｌｙＩ：Ｃは、Ｉ型インターフェロン発現の伝統的誘導因子である。単回投与のＰｏｌｙＩ：Ｃ単独を用いて治療されたマウスをＰｏｌｙＩ：Ｃ治療群と見なしたが、他方５日間にわたる５回の用量のＭＳ−２７５を用いて治療されたマウスは薬物単独治療群を表す。血液は眼窩周囲洞から採取し、赤血球はＡＣＫ溶解バッファーを用いて溶解させた。末梢血リンパ球数は、図８に示したように、ＰｏｌｙＩ：Ｃ注射（Ｎ＝３）の２時間、６時間、２４時間、４８時間、７２時間および１２０時間後に評価した。データは、ＦＡＣＳＣａｎｔｏフローサイトメーターによって、ＦＡＣＳＤｉｖａ  ５．０．２ソフトウエア（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて収集し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｍａｃ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ社、オレゴン州アッシュランド）を用いて分析した。ウイルスの非存在下で、ＰｏｌｙＩ：Ｃは、薬物によって拡大される同一リンパ球減少症を生成する。したがって、この薬物はインターフェロンの誘導因子の存在下でこれらの作用を誘導する。
【００５１】
（ＭＳ−２７５は、Ｔｒｅｇｓ、特に高レベルのＦｏｘｐ３を発現し、腫瘍細胞上でＭＨＣ発現をアップレギュレートするＴｒｅｇｓを減少させる）
リンパ球減少症、特に当該モデル内でＭＳ−２７５によって誘導された全ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ上に直接的衝撃をもたらしたとの評価をもたらす。図５ａにおけるデータは、Ｔｒｅｇｓの数が追加抗原刺激免疫中に有意に減少するが（７５％減少）、他の細胞集団より迅速に回復すると思われることを示した（図３ａ〜ｅ）。これは、ＤＣＴ特異的ＣＤ８＋細胞対Ｔｒｅｇ細胞比における３倍を超える増加をもたらした（図５ｂ）。特に、ＴｒｅｇｓによるＦｏｘｐ３発現の強度はＭＳ−２７５治療後にはマウスにおいては有意に低かったが（図５ｃ）、これは当該薬物がより強力な抑制機能を有するＦｏｘｐ３高Ｔｒｅｇｓを選択的に除去できることを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＭＳ−２７５が少なくとも腫瘍崩壊性追加抗原刺激ワクチンの状況において、Ｔｒｅｇ活性を直接的にダウンレギュレートでき、余り厳密には調節されていない環境において大きな二次ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が機能することを可能にすることを証明している。
【００５２】
（ＭＳ−２７５はワクチン誘導性自己免疫白斑を防止する）
本明細書で利用した腫瘍崩壊性ワクチンベクターは、正常メラニン形成細胞中で発現した自己抗原に対する極めて強力な免疫応答をもたらすが、これはｒＨｕＡｄ５−ｈＤＣＴおよびｒＶＳＶ−ｈＤＣＴ両方を用いて治療されたマウスにおいて重度の自己免疫白斑をもたらす（図６、４回の実験からの各群における複数のマウスを表す）。ＭＳ−２７５共投与がこれらのマウスにおけるＴｒｅｇ頻度を有意に減少させることを前提にすると、当該薬物はこの自己免疫病理を悪化させると予測できる。注目すべきことに、プライム−ブーストワクチン接種による全身性白斑の誘導は、抗腫瘍有効性の強化とは強度に対照的に、ＭＳ−２７５を用いた併用治療によってほぼ完全に無効にされた。これは、薬理学的薬物が自己腫瘍抗原に対するワクチン接種療法中の自己腫瘍免疫からの望ましくない自己免疫続発症の分離を達成できることを示唆している。
【００５３】
（ＶＳＶおよびＭＳ−２７５の共投与は骨髄および胸腺における未成熟リンパ球前駆体を枯渇させた）
マウスはＶＳＶの単回尾静脈注射（ｉ．ｖ．）（２００μＬのリン酸緩衝食塩液中の２×１０９ＰＦＵ  ＶＳＶ）を用いて感染させ、０．１ｍｇのＭＳ−２７５をＶＳＶ併用ＭＳ−２７５治療群として３日間にわたり１日１回の腹腔内注射によって治療した。ＶＳＶの単回投与単独で感染させたマウスはＶＳＶ治療群と見なしたが、他方３日間にわたり３種の用量のＭＳ−２７５もしくはＭＳ−２７５アナログ（図９に示した）を用いて治療されたマウスは、各々薬物単独またはアナログ単独治療群であり、ナイーブマウスはウイルスもしくは薬物で治療されなかった（Ｎ＝３）。胸腺もしくは骨髄（大腿骨および脛骨）由来のリンパ球はＶＳＶ注射３日後に採取した。次に細胞を、抗ＣＤ１６／３２およびＣＤ４／ＣＤ８もしくはＢ２２０／ＩｇＭに対する抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）によって蛍光標識した表面マーカーを用いて処理した。リンパ球前駆体は、胸腺（未成熟Ｔ細胞）および骨髄（未成熟Ｂ細胞）の両方において併用療法によって枯渇させた。したがって、拡大されたリンパ球減少症は、一部には、末梢において枯渇したリンパ球に置換できる前駆体の減少に起因する。
【００５４】
（考察）
腫瘍崩壊性ワクチン療法と結合して使用した場合、１型ＨＤＡＣｓのベンズアミドクラスの阻害剤であるＭＳ−２７５は、腫瘍内のウイルス複製およびＭＨＣ発現を強化するだけではなく、先天性の免疫系群に計り知れない影響も及ぼす。この併用療法は、Ｔｒｅｇｓを有意に減少させ、したがって腫瘍に対する集中的および抑制された免疫応答を生成しながら、腫瘍崩壊性ウイルスに対する細胞性および体液性両方の免疫応答を損傷させる選択的リンパ球減少症をもたらす。望ましくない免疫細胞を枯渇させて有益である免疫細胞を維持することによって、この併用は２つの相違する物質のそれぞれの長所を提供するが、このとき当該免疫系は治療ウイルスに応答する能力が損傷されるが、腫瘍は攻撃し続けるので、したがって当該療法を劇的に強化し、極めて課題の大きな癌モデルにおいて６０〜８０％の恒久的治癒率をもたらす。これは、初めて抗黒色腫有効性が劇的に強化され、同時および同等に白斑が劇的に減少したことを意味する。
【００５５】
要約すると、腫瘍崩壊性ワクチン療法が先天性免疫を損傷させて、抗ウイルスおよび抗腫瘍両方の後天性免疫の有意な修飾を媒介するためにＨＤＡＣｉと併用された。免疫応答を腫瘍に集中させながら抗ウイルス応答を遅延させることによって、ウイルス腫瘍崩壊が拡大され、抗腫瘍有効性が強化され、自己免疫続発症が減少させられた。
【００５６】
本明細書に言及した全ての参考文献は、ここに引用することで本明細書の一部となすものとする。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
2014510073.tif 000016
2014510073.tif 000017
2014510073.tif 000018