【事件の表示】
　特許第３４００２８２号「脂質代謝改善剤およびそれを含有する食品」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３４００２８２号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３４００２８２号の請求項１ないし３に係る発明についての出願は、平成９年２月２１日に特願平９−３７７９５号として出願され、平成１５年２月２１日にその特許の設定登録がなされ、その後、原水直子より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１６年７月２６日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)本件明細書の発明の名称の「脂質代謝改善剤およびそれを含有する食品」を、「低比重リポタンパク質抗酸化剤」と訂正する。
(2)本件明細書の「請求項１」及び段落【０００５】の「発酵豆乳を含有する」を、「発酵豆乳を主成分とする」と訂正する。
(3)本件明細書の「請求項３」及び段落【００１２】の「ラクトバチルス・サリバリウス・サリシニウス、ラクトバチルス・ブヒネリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・パラカゼイ・トレランス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・デルブルッキ・ラクチス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ケフィア、ロイコノストック・ラクチス」を削除する。
(4)本件明細書段落【０００１】の「脂質代謝改善剤、それを含有する食品および」を削除する。
(5)本件明細書段落【０００３】、【０００７】、【００１３】（２ヶ所）、【００１５】、及び【００３３】（４ヶ所）の「脂質代謝改善剤」を、「ＬＤＬ抗酸化剤」と訂正する。
(6)本件明細書段落【０００４】の「ＬＤＬに対する優れた抗酸化活性及び脂質の腸管からの吸収抑制作用を有し、脂質代謝改善剤として」を、「優れた抗酸化活性を有し、ＬＤＬ抗酸化剤として」と訂正する。
(7)本件明細書段落【０００５】の「脂質代謝改善剤、ＬＤＬ抗酸化剤、コレステロールの腸管からの吸収抑制剤およびこれを含有する脂質代謝改善食品」を「ＬＤＬ抗酸化剤」と訂正する。
(8)本件明細書段落【０００６】の「脂質代謝改善効果」を、「ＬＤＬ抗酸化効果」と訂正する。
(9)本件明細書段落【００１４】の「脂質代謝改善剤及び」を削除する。
(10)本件明細書段落【００１５】の「脂質代謝改善食品」を、「ＬＤＬ抗酸化食品」と訂正する。
(11)本件明細書段落【００２６】の「実施例２」を、「参考例１」と訂正する。
(12)本件明細書段落【００３３】の「ので、動脈硬化症の予防・改善効果が期待できる」を削除する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　訂正事項(2)は、「発酵豆乳を含有する」を「発酵豆乳を主成分とする」と訂正するものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当し、訂正事項(3)は、９種の微生物を削除するものであるから、特許請求の範囲の減縮或いは明りょうでない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当し、また、訂正事項(1)、(4)ないし(12)は、明りょうでない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当する。
  そして、これらの訂正は、いずれも新規事項の追加に該当せず、実質的に特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４、２項及び同条３項で準用する１２６条２項及び３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．本件発明
　上記II．で示したように上記訂正が認められるから、本件の請求項１ないし３に係る発明（以下、「本件発明１ないし３」という。）は、上記訂正請求に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし３に記載された事項により特定される次のとおりのものである。
「【請求項１】　乳酸菌を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳を主成分とすることを特徴とする低比重リポタンパク質抗酸化剤。
【請求項２】　該乳酸菌が、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属およびロイコノストック属より選ばれる一種又は二種以上である請求項１記載の低比重リポタンパク質抗酸化剤。
【請求項３】　該乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・サリバリウス・サリバリウス、ラクトバチルス・パラカゼイ・パラカゼイ、ラクトバチルス・デルブルッキ・デルブルッキ、ラクトバチルス・デルブルッキ・ブルガリクス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス・ブレビス、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトコッカス・ラクチス・ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス・クレモリス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびロイコノストック・メセンテロイデス・クレモリスより選ばれる１種又は２種以上である請求項１又は２記載の低比重リポタンパク質抗酸化剤。」
　
２．異議申立て理由の概要
　特許異議申立人は、下記の甲第１号証ないし甲第７号証を提出し、（１）訂正前の請求項３及び明細書段落【００１２】には、平成１２年６月１２日受付の手続補正書により多数の菌種が追加されているが、これらの微生物の中には、ＬＤＬ抗酸化作用があることについて出願当初の明細書に全く記載されていないものが含まれており、上記補正は、出願当初の明細書に記載した事項の範囲内においてなされたものではないから、特許法１７条の２，３項の規定に違反している、（２）本件明細書には、記載の不備があるから、特許法３６条４項又は同条６項２号に規定する要件を具備しない、（３）訂正前の本件請求項１ないし３に係る発明は、甲第１号証又は甲第２号証に記載された発明である、或いは、甲第１号証ないし甲第７号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条１項３号或いは同条２項の規定に違反している、と主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　　　記
　甲第１号証：特開平９−２３８４８号公報
　甲第２号証：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．
　　　　　　　１７，Ｎｏ．６，５７３〜５７８頁
　甲第３号証：Ｔｈｅ　Ｌｉｐｉｄ、Ｖｏｌ．６，Ｎｏ３，
　　　　　　　１８２〜１９１頁
　甲第４号証：特開平４−２６４０３４号公報
　甲第５号証：特開平８−９９８８８号公報
　甲第６号証：国際公開ＷＯ８９／００４２５号公報
　甲第７号証：特開平３−１２７７１３号公報
　
３．判断
（１）特許法１７条の２，３号について
　上記訂正請求により、本件明細書の「請求項３」及び段落【００１２】に記載されていた「ラクトバチルス・サリバリウス・サリシニウス、ラクトバチルス・ブヒネリ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・パラカゼイ・トレランス、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・デルブルッキ・ラクチス、ラクトバチルス・ガリナラム、ラクトバチルス・ケフィア、ロイコノストック・ラクチス」は削除されたので、最早、特許異議申立人の主張には理由がない。
　
（２）特許法３６条４項又は同条６項２号について
　特許異議申立人は、(a)訂正前の請求項１に係る「含有する」という記載は不明瞭である、(b)「ＬＤＬ抗酸化剤」という用途は、「脂質代謝改善剤」、「コレステロールの腸管からの吸収抑制剤」、「脂質代謝改善食品」等の用途とどのように異なるのか不明である、(c)「脂質代謝改善剤」、「脂質代謝改善食品」及び「コレステロールの腸管からの吸収抑制剤」の発明に係る請求項を除外したのに、発明の詳細な説明においてはこれらに関連する事項が何ら除外されていない、(d)実施例１には、根拠となった電気泳動の移動距離の実測値が記載されておらず不明瞭である、並びに(e)平成１４年８月１９日付意見書の「表１」には移動距離が記載されているが、各サンプル間の差は非常にわずかな差であり、これに基づく比抑制率は、単なる実験誤差に過ぎないものを過大評価したものである、と主張している。
　(a)について
　上記訂正請求により、「含有する」は「主成分とする」と訂正され、本件発明に係る発酵豆乳がＬＤＬ抗酸化活性を示す主成分であることが明確となったので、最早、上記主張には理由がない。
　(b)について
　本件明細書段落【０００２】に記載のように、ＬＤＬの酸化変性は動脈硬化の発端となっており、血中脂質量、脂質の代謝異常、血管壁の異常、血小板の機能などとともに、動脈硬化の発生原因の一つではあるが、これは血中脂質量等とは明確に区別される症状であるから、上記主張には理由がない。
　(c)について
　上記訂正請求により、「脂質代謝改善剤」、「脂質代謝改善食品」及び「コレステロールの腸管からの吸収抑制剤」という記載は、特許明細書の発明の詳細な説明から削除されたので、最早、上記主張には理由がない。
　(d)について
　平成１６年７月２６日付特許異議意見書にて、本件明細書の「実施例１」における電気泳動の移動距離の実測値が示され、かかる実測値を参酌すると、特許明細書の「表１」に記載の比抑制率についての数値を信用することができるから、最早上記主張には理由がない。
　(e)について
　特許異議申立人は、平成１４年８月１９日付意見書の「表１」に記載の比抑制率について縷々主張しているが、これは、特許異議申立人が追試を実施したことに基づくものではなく、単なる憶測に過ぎないものであるから、上記主張は採用の限りでない。
　
（３）特許法２９条１項３号又は同条２項について
（Ａ）甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、「乳酸菌発酵乳、乳酸菌と酵母との共生発酵乳、これらの処理物、またはこれらの混合物を有効成分として含有する脳機能改善、学習能力増強および記憶力増強作用を有する機能性食品。」（特許請求の範囲の請求項１）、「前記乳酸菌発酵乳および乳酸菌と酵母との共生発酵乳は、獣乳、豆乳等の全乳・・・を乳酸菌で発酵・・・させることにより得られる。」（段落【０００９】）、及び「前記乳酸菌としてはストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ラクトバシルス属、ビフィドバクテリウム属等に属する乳酸菌を用いることができ、・・・・・」（段落【００１０】）と記載されている。
　甲第２号証には、「大豆タンパク質の血清脂質改善作用」との表題の下に、「特に大豆タンパク質の抗動脈硬化作用については多くの報告があり、筆者らも、大豆タンパク質にはコレステロール低下作用、ＬＤＬ分子の巨大化抑制作用、抗過酸化作用ならびに血圧低下作用のあることを報告してきた。」（５７３頁左欄９〜１４行）、「そこで、われわれは、脱脂大豆から調製した大豆グロブリン溶液を乳酸菌発酵させ酸性飲料化した大豆タンパク質醗酵飲料（Ｇ−９）を志願者に量を変えて投与し、その効果を検討した。」（５７３頁左欄下３行〜右欄１行）、及び「Ｂ群では、高コレステロール血者の血清総コレステロール濃度は、投与開始１ヵ月後から有意に減少した。」（５７４頁右欄１９〜２１行）と記載されている。
　甲第３号証には、「大豆蛋白質の抗動脈硬化作用」との表題の下に、「大豆中には多くの蛋白質が含有されているが、その蛋白質にはヒトにおいてもラットならびに家兎においても抗動脈硬化作用がある。・・・(2)大豆蛋白質にはコレステロール負荷によるＬＤＬの分子サイズの増大を抑制する作用がある。・・・(4)大豆蛋白質には血漿リポ蛋白の被過酸化性を抑制する作用がある。」（２２頁「Summary」の欄）、「豆腐の製造方法とほぼ同じ工程で作った豆腐様物質からニガリやundesirable taste物質を排除するために、食塩、エタノールならびにイーストを作用させ、水分６１．９％、蛋白質１０．６％、炭水化物１６．８％、脂質８．２％、灰分２．５％のソイクリーム、ならびにソイクリームにさらに水分を加えたソイミルクを作製した。」（２３頁左欄末行〜右欄５行）、「動脈粥状硬化巣には多量の脂質を取込んだマクロファージや平滑筋細胞が認められることから、動脈硬化の成因としてマクロファージならびに平滑筋細胞の泡沫化が重要視されている。・・・なかでもヒトの生体内に存在している過酸化ＬＤＬが注目されている。したがって、動脈硬化発症においてＬＤＬの被過酸化性はきわめて重要であり、その抑制は動脈硬化性疾患の発症を予防することにもなる。」（２７頁左欄末行〜右欄８行）、及び「大豆から得られたソイミルクの飲用は血漿中のＬＤＬ被過酸化性を明らかに抑制する。」（３０頁左欄４〜５行）と記載されている。
　甲第４号証には、「乳酸桿菌の菌体及び／または菌体親水性溶媒抽出物を有効成分とする生体内過酸化脂質抑制剤。」（特許請求の範囲）、及び「近年、生体内における過酸化脂質の生成、蓄積が、ヒトの老化（・・・）や動脈硬化症、心筋症、脳血栓症などの循環器系疾患、あるいは各種肝疾患や各種腫瘍などの発症に影響を及ぼしていることが報告され、これらの治療及び予防の目的で生体内過酸化脂質の生成を抑制する方法が注目されるようになってきている。」（段落【０００２】）と記載されている。
　甲第５号証には、「乳酸菌のビフィドバクテリウム・ロンガム（・・）またはラクトバチルス・アシドフィルス（・・）の培養上清を有効成分とするグルタチオンペルオキシダーゼ活性化剤。」（特許請求の範囲）、「近年、生体内における過酸化脂質の生成と蓄積が、・・・ヒトの老化や動脈硬化症、心筋症、脳血栓症などの循環器系疾患、あるいは各種肝疾患や腫瘍などの発症に影響を及ぼしていることが報告されており、これらの治療や予防を目的として、生体内過酸化脂質の生成を抑制する方法が検討されている。」（段落【０００２】）、及び「また、血漿リポタンパク質画分の過酸化脂質量も有意に低下したことから、・・・ラクトバチルス・アシドフィルス（・・）培養上清は、生体内の過酸化脂質抑制作用を有することが判った。」（段落【００５１】）と記載されている。
　甲第６号証は、「過酸化脂質減少剤」に関し「食品中に含まれる過酸化脂質は、消化管粘膜等を傷害し、また、その一部は生体内に取り込まれ、さまざまな影響を与えることが知られている。例えば生体内で不飽和脂肪酸を多く含んでいる細胞膜に過酸化脂質が生成されると種々の酵素の活性低下をきたすこと、・・・又、血管壁が硬化し、・・・現実には動脈硬化、・・・といった老化性の機能退行が現われる」（１頁１６〜２４行）、及び「エンテロコッカス属（・・）、ラクトバシラス属（・・）、ビフィドバクテリウム属（・・）、又はサッカロマイセス属（・・）に属する微生物から得られる生菌体、死菌体及びそれらの不溶性成分からなる群から選んだ少なくとも１種を有効成分として含有する過酸化脂質減少剤。」（請求の範囲）と記載されている。
　甲第７号証は、「豆乳の乳酸菌醗酵液を含有することを特徴とする化粧料。」（特許請求の範囲）、及び「本発明は、豆乳の乳酸菌醗酵液を有効成分とする皮脂の酸化を防止し、人の肌を白くする化粧料に関する。」（１頁左下欄８〜１０行）と記載され、さらに「試験例２　抗酸化能」として、豆乳の乳酸菌醗酵液をリノール酸エタノール溶液に供し、その過酸化物価を経時的に見た場合、この乳酸菌醗酵液は極めて優れた抗酸化能を有することが示されている。
　
（Ｂ）判断
（本件発明１について）
　本件発明１は、「乳酸菌を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳を主成分とすることを特徴とする低比重リポタンパク質抗酸化剤」（以下、「低比重リポタンパク質」を「ＬＤＬ」という場合がある。）であるところ、甲第１号証には、乳酸菌を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳について記載されているものの、ＬＤＬ抗酸化剤について言及するところはない。
　すなわち、甲第１号証には、脳機能改善、学習能力増強及び記憶力増強作用について記載されているが、これは、ＬＤＬ抗酸化作用とは無関係の別異の作用である。
　そうすると、本件発明１は、甲第１号証に記載された発明であるとはいえない。
　甲第２号証には、大豆タンパク質はコレステロール低下作用、ＬＤＬ分子の巨大化抑制作用、抗過酸化作用及び血圧低下作用があること、並びに「脱脂大豆から調製した大豆グロブリン溶液を乳酸菌発酵させ酸性飲料化した大豆タンパク質醗酵飲料」を志願者に投与した場合、高コレステロール血者の血清総コレステロール濃度が、投与開始１ヵ月後から有意に減少したことが記載されている。しかし、ＬＤＬ分子の巨大化抑制作用が、ＬＤＬの抗酸化作用とどのように関係するのか不明であり、また、大豆タンパク質の抗過酸化作用が、ＬＤＬに対しても有効であるのか不明であることに照らして考えると、大豆タンパク質がＬＤＬ抗酸化作用を有するとは直ちにはいえず、また、血清総コレステロール濃度の減少は、ＬＤＬの抗酸化と直接結びついているともいえない。
　そして、特許権者が提出した平成１４年８月１９日付意見書に記載の比較実験結果である「表１」によると、ＬＤＬ変性抑制率が、発酵豆乳では「２０．０」、大豆タンパク質では「４．７」、及び発酵大豆タンパク質では「７．０」であって、発酵豆乳は、大豆タンパク質或いは発酵大豆タンパク質よりも格段に高い数値を示していることを踏まえると、発酵豆乳は、大豆タンパク質或いは発酵大豆タンパク質とはＬＤＬ抗酸化作用という観点からは、全く別異のものであるといえるので、結局、本件発明１は、甲第２号証に記載された発明であるとはいえない。
　甲第３号証には、「大豆から得られたソイミルクの飲用は血漿中のＬＤＬ被過酸化性を明らかに抑制する。」との記載はあるものの、この「ソイミルク」は、豆腐様物質からニガリやundesirable taste物質を排除して調製したソイクリームに水分を加えたものであって、発酵豆乳よりは豆乳の成分に近いと解されるところ、上記比較実験結果の「表１」によれば、豆乳のＬＤＬ変性抑制率は「５．１」であって、大豆タンパク質と同程度のもので発酵豆乳よりは遙かに低い数値である。
　甲第３号証には、発酵豆乳について言及するところはないのであるから、甲第１号証或いは甲第２号証に甲第３号証に係る事項を組み合わせても、本件発明１が当業者において容易に想到し得たとはいえない。
　甲第４号証には、乳酸桿菌が、甲第５号証及び甲第６号証には、ラクトバチルス属菌が、過酸化脂質抑制作用を有することが記載されている。
　しかるに、先に述べたとおり上記比較実験結果の「表１」において、大豆タンパク質では「４．７」で、それを乳酸菌で発酵した発酵大豆タンパク質では「７．０」と、発酵大豆タンパク質では、ＬＤＬ変性抑制率が若干上昇しているが、豆乳とそれを発酵した発酵豆乳とでは、それぞれ「５．１」と「２０．０」であって、発酵豆乳では、それが著しく上昇している。
　そうすると、乳酸桿菌やラクトバチルス属菌にＬＤＬ抗酸化作用が若干見られるとしても、発酵豆乳において示されるＬＤＬ抗酸化作用は、甲第４号証ないし甲第６号証に記載された事項から予測されるところを超えて優れているといえる。
　してみれば、甲第１号証或いは甲第２号証に甲第４号証ないし甲第６号証に記載の事項を加味しても本件発明１は容易に想到し得ないというべきである。
　甲第７号証には、発酵豆乳が優れた抗酸化能を有することが記載されている。しかし、ここでの抗酸化能は、リノール酸におけるもので、ＬＤＬに対してどうであるかは不明である。しかも、甲第７号証は、化粧料に関するものであり、これ以上本件発明１について教示するところはない。
　以上のとおりであるので、本件発明１は、甲第１号証ないし甲第７号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
（本件発明２及び本件発明３について）
　本件発明２及び本件発明３は、本件発明１に係る「乳酸菌」を、本件発明２では「属」レベルに、本件発明３では「種」レベルに更に限定したものであるから、本件発明１についての上記判断と同様の理由により、甲第１号証ないし甲第７号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件請求項１ないし３についての特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１ないし３についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年８月２５日（２００４．８．２５）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
低比重リポタンパク質抗酸化剤
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　乳酸菌を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳を主成分とすることを特徴とする低比重リポタンパク質抗酸化剤。
　【請求項２】　該乳酸菌が、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属およびロイコノストック属より選ばれる一種又は二種以上である請求項１記載の低比重リポタンパク質抗酸化剤。
　【請求項３】　該乳酸菌が、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・サリバリウス・サリバリウス、ラクトバチルス・パラカゼイ・パラカゼイ、ラクトバチルス・デルブルッキ・デルブルッキ、ラクトバチルス・デルブルッキ・ブルガリクス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス・ブレビス、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトコッカス・ラクチス・ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス・クレモリス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルスおよびロイコノストック・メセンテロイデス・クレモリスより選ばれる１種又は２種以上である請求項１又は２記載の低比重リポタンパク質抗酸化剤。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、豆乳に乳酸菌を作用させて得られる発酵豆乳を主成分とする低比重リポタンパク質抗酸化剤に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　従来、動脈硬化症の予防・改善法としては、血中コレステロール量を低下させることが一般的に行なわれており、かかる方法は、高コレステロール血症、特に高ＬＤＬ（低比重リポタンパク質）コレステロール血症の改善において効果的である（馬淵　宏ら（１９８７）Ｃｏｒｏｎａｒｙ　ｖｏｌ４，２８１）。一方、動脈硬化の発生は、ＬＤＬの酸化変性が発端となって起こることが報告（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ　Ｄら（１９８９）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ，３２１，１１９６−１１９７）されており、ＬＤＬに対し抗酸化活性を有する物質が注目されている。また、豆乳には、大豆蛋白質、リン脂質、イソフラボンが含まれており、脂質代謝に有効であることが期待されている。しかしながら、豆乳には特有の不快臭や不快味があるため多くの消費者から敬遠されているのが現状である。
　【０００３】
　【発明が解決しようとする課題】
　したがって、本発明の目的は、動脈硬化症予防・改善に優れたＬＤＬ抗酸化剤を提供することにある。
　【０００４】
　【課題を解決するための手段】
　かかる実情に鑑み、本発明者らは、豆乳の持つ有効成分に着目し、鋭意研究を行った結果、豆乳に乳酸菌を作用させて得られた発酵豆乳が、優れた抗酸化活性を有し、ＬＤＬ抗酸化剤として有用であることを見出し、本発明を完成した。
　【０００５】
　すなわち、本発明は、乳酸菌を豆乳に作用させて得られる発酵豆乳を主成分とすることを特徴とするＬＤＬ抗酸化剤を提供することにある。
　【０００６】
　なお、豆乳特有の不快臭を軽減することを目的として、乳酸菌やビィフィズス菌で豆乳を発酵させることなどが試みられているが、発酵豆乳に優れたＬＤＬ抗酸化効果があることは未だ報告されていない。
　【０００７】
　【発明の実施の形態】
　本発明のＬＤＬ抗酸化剤は、豆乳に乳酸菌を作用させて得られた発酵豆乳を主成分とする。ここで、本発明において用いられる発酵豆乳は、豆乳に乳酸菌を作用させて得られるものであり、例えば以下の工程に従い製造されるものが挙げられる。
　【０００８】
豆乳の製造（工程１）
　本発明で用いる豆乳はいかなる方法で製造されたものであってもよいが、例えば、原料となる大豆を水につけた後、熱水又は０．５〜１．０重量％（以下、単に％で示す）の炭酸ナトリウムを含む熱水を添加して磨砕後、おからを取り除き、更に加熱殺菌することにより製造することができる。
　【０００９】
　ここで、本発明において用いられる豆乳の原料となる大豆は、特に制限はないが、油脂を含有した丸大豆、脱皮大豆、又はフレーク大豆等を原料としたものが好ましく、特に脱皮大豆を原料としたものが好ましい。
　【００１０】
　また、かかる豆乳には、必要に応じて、製造後、次の工程である微生物処理のために、ショ糖、ブドウ糖、果糖、転化糖等の食品に用いられる糖や、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、ペプチド等の微生物の増殖に必要な栄養素を添加してもよく、微生物の至適ｐＨに調整するために豆乳にクエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸等の食品に用いられる酸を添加してもよい。
　【００１１】
豆乳の発酵（工程２）
　前記工程１で製造した豆乳に乳酸菌を作用させる方法は特に限定されず、例えば、培養した乳酸菌の菌液を上記豆乳に接種した後、その微生物に適した温度、時間、嫌気性菌ならば嫌気性等の条件を適宜決定して発酵を行えばよい。なお、発酵は、菌株を複数種組み合わせた混合発酵であってもよいし、菌株を複数種組み合わせた連続発酵であってもよい。
　【００１２】
　ここで、豆乳に作用させる乳酸菌はそれ自体又はその代謝産物等が人体に有害なものでなければ、特に限定されるものでないが、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属又はロイコノストック属に属する乳酸菌が好ましく、特に、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・サリバリウス・サリバリウス、ラクトバチルス・パラカゼイ・パラカゼイ、ラクトバチルス・デルブルッキ・デルブルッキ、ラクトバチルス・デルブルッキ・ブルガリクス、ラクトバチルス・アミロボラス、ラクトバチルス・ブレビス・ブレビス、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・クリスパータス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトコッカス・ラクチス・ラクチス、ラクトコッカス・ラクチス・クレモリス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ロイコノストック・メセンテロイデス・クレモリス等が好ましい。
　【００１３】
　豆乳に乳酸菌を作用させて得られた発酵豆乳は、そのまま本発明のＬＤＬ抗酸化剤とすることができるが、食品や経口医薬品に通常使用されている添加物を加えてもよい。ここで用いる添加物としては、糖類、蛋白質、脂質、ビタミン類、植物抽出物、動物抽出物、ゲル化剤、香料、着色剤等が挙げられる。なお、本発明のＬＤＬ抗酸化剤に用いる発酵豆乳は、未殺菌のままでも、殺菌してからでも用いることができる。
　【００１４】
　本発明の低比重リポタンパク質抗酸化剤を医薬として使用する場合の投与量は、投与法、患者の年齢体重、容態によって異なるが、経口投与の場合、成人患者に対して１日あたり１００〜５００ｍｌとすることが好ましい。
　【００１５】
　また、本発明のＬＤＬ抗酸化剤は、任意の範囲で食品に添加して用いることができ、ＬＤＬ抗酸化食品とすることができる。食品としては、乳酸菌飲料、発酵乳、豆乳、牛乳、チーズ、プリン、アイスクリーム等に１０〜８０％、好ましくは４０〜７０％程度含有させればよく、その他ビスケット、パン等に含有させることもできる。
　【００１６】
　【実施例】
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
　【００１７】
実施例１
　素豆乳（四国化工機製）にグルコースを１％（Ｗ／Ｖ）加え、ｐＨを２Ｍクエン酸で６．８としたのち、１００℃、３０分蒸気滅菌したものを豆乳培地とした。これにヒト由来乳酸菌のシードスターターを０．５〜１％接種し、至適温度（２６〜３７℃）の範囲で７日間培養した。培養終了後、各菌液を１ｇずつ供栓付試験管にとったのち、メタノールを７ｍｌ加え、時々攪拌しながら一晩４℃で放置した。その後、遠心分離（１５００×ｇ，５℃）し、上清を１０ｍｌにメスアップして１０倍希釈サンプルとした。測定までこれを−２０℃で保存し、抗酸化性を測定する際に更に４倍希釈して使用した。
　【００１８】
　シリアンハムスター（雄６週齢）をＭＦ飼料で１週間予備飼育したのち、０．５％コレステロール、および５％ラードを添加したＭＦ飼料で２週間飼育した。解剖前日に２４時間絶食させ、腹部大動脈から採血を行い、ＥＤＴＡ法により血漿を調製した。この血漿から超遠心法によりＬＤＬ画分を採取し、生理的リン酸緩衝液で２４時間解析したのち、適当な濃度に希釈して酸化反応用ＬＤＬとした。
　【００１９】
　ＬＤＬが酸化変性を受けると陰性荷電が増大し、アガロースゲル上で電気泳動を行うと移動距離が大きくなることから、移動距離の増大を酸化の指標として発酵豆乳の抗酸化性を調べた。
　【００２０】
　ＬＤＬ（終濃度５００μｇ／ｍｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ）は、サンプル添加後、５μＭ　ＣｕＳＯ４存在下で３７℃６時間インキュベートして酸化させ、ＥＤＴＡ添加ののち氷水中で冷却して反応を止めた。また、サンプルの代わりにメタノールを加えたものをコントロールとし、メタノール、ＥＤＴＡ添加後、０℃でインキュベートしたものをブランクとした。
　【００２１】
　反応液１μｌを１％アガロースゲル（マルチトラックＬＤＨアイソザイムゲル・１６：ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ）にアプライし、９０Ｖで４５分間泳動後、コーコレスト・Ａ（日本ケミファ）によるコレステロール染色を行った。ゲルを乾燥後、各レーンにおけるＬＤＬの移動距離を測定した。ブランクをＬＤＬが全く酸化されていない状態と仮定し、コントロールと比べてサンプル添加により移動距離の増大が抑制された割合をＬＤＬ変性抑制率とした。
　【００２２】
　計算式は（１）に示した。なお、抗酸化性は豆乳培地の値を１００としたときの比抑制率として表した。
　【００２３】
（数１）
　【００２４】
　【表１】
　【００２５】
　以上の結果により、乳酸菌による発酵豆乳は、ＬＤＬ抗酸化活性を有し、豆乳と比較しても優れたＬＤＬ抗酸化活性が認められた。
　【００２６】
参考例１
　１０％脱脂粉乳に必要に応じて０．５％酵母エキスやグルコースを添加した培地にて前培養した乳酸菌を１％グルコースを加えクエン酸でｐＨを６．８〜６．９に調整した素豆乳（四国化工機（株）製、１００℃９０分滅菌）に０．５〜１％接種し所定温度で２日間培養した。
　【００２７】
　上記のとおり調製した発酵豆乳２００ｍｇに、後述する方法で調製した人工脂質ミセルを２００μｌを加えて、３７℃で１時間放置後、遠心分離（８０００×ｇ，１５分）し上清のコレステロール濃度をデタミナＴＣ５５５（協和メディックス）を用いて測定した。コントロールとしては素豆乳を用い、各発酵豆乳の沈殿に移行したコレステロール量を下記式（２）によりコレステロール不溶化率とした。
　【００２８】
（数２）
　【００２９】
〔人工脂質ミセルの調製〕
　リン酸バッファー（１５０ｍＭ，ｐＨ７．０）７５ｍｌに、ｏｘｇａｌｌ（ＤＩＦＣＯ社製）２ｇ、コレステロール（和光純薬工業製）９２１ｍｇ、リゾフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ社製）１３５ｍｇの順で加えて溶解し、次いでモノオレイン酸（東京化成工業（株）社製）９０．２ｍｇ、オレイン酸（和光純薬工業（株）社製）７０２．２ｍｇを加え混合し、リン酸バッファーを加えて全量を１００ｍｌとした。溶液を攪拌しながら、室温での超音波処理（ＳＯＮＩＦＲ（ＢＲＡＮＳＯＮ社製），スモールチップ）を行った。このエマルジョン及びミセル溶液をしばらく攪拌後１００，０００×ｇ、２５℃にて超遠心分離を１６〜１８時間行った。超遠心分離後、透明なミセル層のみを回収し、人工脂質ミセルを調製した。
　【００３０】
　【表２】
　【００３１】
　【表３】
　【００３２】
　以上の結果により、乳酸菌による発酵豆乳はいずれも豆乳に比べミセル不溶化作用が強かった。コレステロールが小腸粘膜から吸収されるにはミセルに溶解していることが必須である。よって発酵豆乳は豆乳よりもコレステロールの吸収を抑制することが期待される。
　【００３３】
　【発明の効果】
　本発明のＬＤＬ抗酸化剤は、腸管からのコレステロールの吸収を抑制し、血中コレステロール濃度を低下させることが期待できる。また、本発明のＬＤＬ抗酸化剤は、ＬＤＬに対する優れた抗酸化活性を有するので、動脈硬化の発端とされるＬＤＬの酸化変性を効果的に防止することができる。更に、本発明のＬＤＬ抗酸化剤は、豆乳に乳酸菌を作用させて得られた発酵豆乳からなるので、安全性にも全く問題のない官能的にも優れたＬＤＬ抗酸化剤であり、動脈硬化の予防および治療に有用である。