(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼの非存在下で、ルシフェリン又はその反応性中間体と、少なくとも１つの物質表面とを接触させる工程を含み、前記ルシフェリンと前記物質表面との相互作用により検出可能な発光シグナルを発生させる、発光シグナルの発生方法であって、前記物質表面が、量子ドット、蛍光ポリスチレンマイクロスフェア、蛍光脂質ナノ粒子及び非蛍光性高分子マイクロスフェアから選択される粒子の表面である、前記方法。
【請求項２】
前記ルシフェリンが、デカナール、セレンテラジン及びセレンテラジン類似物から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質表面が蛍光分子を含み、前記検出可能な発光シグナルが前記蛍光分子により放出される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質表面が、分子プローブで覆われている請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ルシフェリンが、異なる蛍光分子と接触し、各蛍光分子が別個の物質表面に結合している請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記接触工程が、界面活性剤の存在下で行われる請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記発光シグナルが、インビトロ又はインビボにおいて生物学的標的を撮像又は検出するためのものである請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
- 請求項１又は２に定義される少なくとも１つのルシフェリン、
- 請求項１及び３〜５のいずれか１項に定義される少なくとも１つの物質表面、及び
- 請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行するための使用説明書
を含み、且つ、いずれのルシフェラーゼも含まない、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法を実行するためのキット。
【請求項９】
前記物質表面が蛍光分子を含む請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
ルシフェラーゼの非存在下であって且つ請求項１及び３〜５のいずれか１項に定義される少なくとも１つの物質表面の存在下における、検出可能な発光シグナルを生成するための請求項１又は２に定義されるルシフェリンの使用。
【請求項１１】
前記物質表面が蛍光分子を含み、前記検出可能な発光シグナルが前記蛍光分子により生成される前記請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素非依存性光子放出メカニズム(EiPE)に基づく、発光シグナルを発生させるための新規な方法に関し、これにより、いずれの触媒酵素の非存在下に生物発光基質が物質表面と接触するときにルミネセンスの光が発生する。特定の実施形態において、当該方法は、蛍光分子による光放出を促進するために利用される。また、本発明は、本発明による方法を実施するためのキット、及び、触媒酵素の非存在下において発光シグナルを生成するための、物質表面の存在下における生物発光基質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルミネセンスの光の放出は、インビボ及びインビトロにおける生物学的標的の検出及び撮像に広く用いられている。光放出に基づく光学的シグナルを発生するメカニズムは本質的に３つあり、化学発光、生物発光及び蛍光発光である。
【０００３】
化学発光は、化学反応からのエネルギーの放出による光としての電磁放射の発生である。
生物発光は、生体による光の生成及び放出である。生物発光は、細菌、真菌、及び藻類からミミズ、イカ及び魚類までの多様な範囲にわたる生物のほとんど全ての主要グループにより示される。これらの種々の生物によって生成される全ての光は、基本的な生化学的経路を共有する。ルシフェリンとして一般に知られる化合物は発光性基質であり、一般にルシフェラーゼと呼ばれる酵素によって改変される。よって、生物発光は、酵素によって触媒される、生体内で起こる化学発光反応であると考えることができる。
【０００４】
ルシフェラーゼは、非反応性オキシルシフェリンを生じる基質ルシフェリンの酸化と光の光子の放出を触媒する様々な酵素である。主なルシフェラーゼは互いに配列相同性を共有しないので、ルシフェラーゼとは総称である。５つの基本的なルシフェリン・ルシフェラーゼ系が存在し、細菌ルシフェリン、渦鞭毛藻類ルシフェリン、バルグリン、セレンテラジン(エクオリン)、及びホタルルシフェリンである。ルシフェリンの５つの別個の化学分類が今日まで知られており、すなわち、アルデヒド、ベンゾチアゾール、イミダゾロピラジン、テトラピロール及びフラビンである。最もよく知られたルシフェリンであるセレンテラジンは、イミダゾロピラジン誘導体である。
【０００５】
蛍光発光は、異なる波長の輻射を吸収した物質による光の放出である。ほとんどの場合、所定の波長の光の吸収は、より長い波長の光の放出を誘導する。蛍光分子は、一般に蛍光体と呼ばれ、励起に続く光の放出に化学反応は関与しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、いずれの触媒酵素(ルシフェラーゼ)の非存在下に生物発光基質(ルシフェリン)が物質表面と接触するときに、予期せぬことにルミネセンスの光が生じることを示した。この現象は、本発明者らによって酵素非依存性光子放出(EiPE)と命名され、図１で説明される。
さらに、本発明者らは、EiPEが、光学及び近赤外スペクトルをカバーする種々の有機及び無機蛍光体による光放出を促進することができる一方で、該分子が従来のエピ蛍光励起過程において励起されたかのように、蛍光体のスペクトル放出特性を正確に維持することを示した(図12)。
【０００７】
現在の結果は、単純及び複合媒体の両方におけるインビトロの条件下と、インビボの条件下でこの現象を実証している
理論に束縛されるものではないが、現在の実験による証拠は、プロセスが、高い価電子密度双極子状態であるドナー(基質)-アクセプター(蛍光体などの蛍光分子)分子間の遠回しの共鳴エネルギー転移(RET)によるものであり、極性環境において影響することを示唆する。
【０００８】
蛍光体などの蛍光分子による光放出を促進するためのEiPEの使用は、従来のルミネセンス光放出システムに対し、いくつかの主要な利点を提供する：
- 従来のエピ蛍光励起過程に存在する、蛍光体などの蛍光分子励起スペクトルから生じる拘束が、EiPEには存在しない。
- BRET/CRETとは対照的に、EiPEは、ドナー(基質)とアクセプター(蛍光体などの蛍光分子)との間の最適化されたスペクトル重複を要しない。
【０００９】
- 光子フラックスが低く、高感度微光レベルの検出器(例えば、イメージングシステム又は光子検出装置)を要するので、EiPEは、標準的な蛍光発光よりも、文字通り一桁高いシグナル/ノイズ比を保証する。
- 時間と共にピーク光蛍光シグナルを低下させ、ノイズを増加させ、且つ感度を低減させる励起照射依存的フォトブリーチを受ける蛍光シグナルとは異なり、EiPEシグナルは全くフォトブリーチせず、EiPEシグナルは何時間も安定に維持される。
【００１０】
- EiPEは、放出バンドパスフィルタの適切な組み合わせを用いて検出可能な蛍光体などの各蛍光分子のスペクトル特性に基づいて別個のスペクトルを容易に識別される蛍光体などの複数の蛍光分子から一つの基質が光子放出を引き起こすことを可能にする点でスペクトルデコンボリューション法及びマルチプレックスアッセイに適合する。これは、同じ検体において混交したシグナル成分の同時検出を可能にする。
【００１１】
- EiPEは、基質からのルミネセンス光放出を利用可能にし、且つ蛍光体などの選択した蛍光分子の特定の放出特性によって決定される程度に赤方偏移させることができる。この過程は、適切な励起光が蛍光体などの選択した蛍光分子のストークスシフト特性から予測可能な赤方偏移した放出光をもたらす従来のエピ蛍光から予測される光出力に極めて似ている。これに対して、標準的な化学発光/生物発光は、基質の特異性によってスペクトル特性が決定されるルミネセンス光放出を生じる触媒駆動型の基質消費に依存する。
- EiPEは、生物発光とは異なり、宿主の遺伝子的又は化学的改変を必要としない。
【００１２】
EiPEは、蛍光体などのいずれの所定の蛍光分子から特徴的な発光スペクトルを発生させる、化学的で代替となるさらに完全な汎用手段を提供する点で独特である。
このアプローチは、インビトロ及びインビボでの生物学的標的の微光撮像及び検出の範囲と応用を広げる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
よって、本発明は、触媒酵素の非存在下で、生物発光基質又はその反応性中間体と、少なくとも１つの物質表面とを接触させる工程を含み、前記生物発光基質と前記物質表面との相互作用により検出可能な発光シグナルを発生させる、発光シグナルの発生方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明によれば、触媒酵素とは、前記生物発光基質の酸化を触媒して、非反応性酸化基質及び光の光子の放出を生じる酵素をいう。
本発明によれば、反応性中間体とは、触媒酵素と生物発光基質との反応の間に中間体として形成された化合物をいう。
本発明において、生物発光基質とはルシフェリンをいい、触媒酵素とはルシフェラーゼをいう。
本発明によれば、物質表面とは、任意の有機分子又は生体分子を吸着又は共有結合の相互作用することができる物理的界面を提示可能な任意の物体をいう。
【００１５】
本発明によれば、発光シグナルとは、生物発光基質と物質表面との相互作用によって発生する全ての光を表す。「基礎シグナル」は、該基質と該表面との相互作用より生じ(図1A)、これは、基質のルミネセンス発光スペクトルに依存する。例えば、デカナール、セレンテラジン及びその誘導体(h、hcp及びfcp)は天然青色発光を有する。物質表面が蛍光分子を含む場合、「波長固有シグナル」が放出される(図1B)。「波長固有シグナル」は、蛍光分子の発光スペクトルの特性である。理論に束縛されるものではないが、生物発光基質と物質表面との反応によって発生される発光シグナル(基礎シグナル)が前記蛍光分子を励起して、検出可能な発光シグナル(波長固有シグナル)を放出すると考えられる。
【００１６】
特に断りのない限り、「基質」とは「生物発光基質」を指し、「表面」とは「物質表面」を指す。
本発明の方法は、生体(動物又は植物)におけるインビボ、又はインビトロ(生体外)で行ってもよい。インビトロとは、生細胞内、又は試験管内、あるいは任意の他の人工的環境を意味する。細胞は、単細胞生物(細菌、酵母、・・・)、細胞培養物からの細胞、又は生体から採取された細胞を含む任意の細胞であってもよい。
【００１７】
本発明は、ルシフェリンのいずれの分類、すなわち、アルデヒド、ベンゾチアゾール、イミダゾロピラジン、テトラピロール及びフラビンから任意のルシフェリンを用いて行ってもよい。
本願発明の方法の好ましい実施形態によれば、ルシフェリンは、アルデヒド及びイミダゾロピラジンから選択され、好ましくは、デカナール(デカンアルデヒド)、セレンテラジン(6-(4-ヒドロキシフェニル)-2-[(4-ヒドロキシフェニル)メチル]-8-(フェニルメチル)-7H-イミダゾ[3,2-a]ピラジン-3-オン：位置2、6及び8における置換基R1、R2及びR3がそれぞれヒドロキシル(OH)、ヒドロキシル(OH)及びフェニル(Phe)である)及びそのアナログ誘導体から選択される。本発明の方法に適したセレンテラジン類似体の非限定的な例は、セレンテラジンh(天然セレンテラジンの2-デオキシ誘導体；R1=H、R2=OH及びR3=Phe)、セレンテラジンhcp(R1=H、R2=OH及びR3=CP(シクロペンチル))及びセレンテラジンfcp(R1=F(フッ素)、R2=OH及びR3=CP(シクロペンチル))を含む。
【００１８】
物質表面は、蛍光体分子(すなわち基質とは異なる)が結合する表面であって、生物学的アッセイで使用される任意の材料の任意の表面であってもよい。例えば、物質表面は、蛍光体、又はタンパク質などの分子に結合した蛍光体を含む蛍光分子のものであってもよい。本発明の方法に適した材料には、ポリマービーズ、樹脂、金属ナノ粒子、ナノ脂質粒子、脂質ミセル及び生物学的マトリクスが含まれるが、限定されない。生物学的マトリクスの非限定的な例には、アクチンマトリクス、コラーゲンマトリクス、微小管、マイクロフィラメント、及びバイオフィルムを含む。いくつかの実施形態では、材料は、高い表面/体積比を有する。表面は、平面、球状面、滑面又は粗面であってもよい。さらに、材料の表面は修飾されていてもよく、例えば、化学基及び/又は例えば分子プローブ及び/又は蛍光分子を含む化合物で官能化されてもよいし、あるいは磁化されてもよく、表面修飾は、発光シグナルを改善するために用いてもよい。
【００１９】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、前記物質表面は、粒子の表面である。好ましくは、金属、脂質、樹脂、及び/又はポリマーのマイクロスフェア又はナノ粒子であり、ポリスチレンマイクロスフィア、脂質ナノ粒子、又は脂質ミセルなどである。また、粒子は磁化されてもよい。
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、前記物質表面は、生物学的マトリクスの表面であり、好ましくは、アクチンマトリクス、コラーゲンマトリクス、微小管、マイクロフィラメント又はバイオフィルムから選択される。
【００２０】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、前記物質表面は蛍光分子を含み、且つ前記検出可能な発光シグナルは、前記蛍光分子によって放出されるもの(波長固有シグナル)である。上述のように、生物発光基質と物質表面との相互作用によって発生される発光シグナル(基礎シグナル)が前記蛍光分子を励起して、検出可能な発光シグナル(波長固有シグナル)を放出すると考えられる。光放出は、蛍光分子の発光スペクトル特性を維持している。いくつかの実施形態では、蛍光分子は、当技術分野で知られた適切な手段によって、物質表面に結合される。物質表面が粒子のものである場合、蛍光分子は、該表面に結合してもよいし、且つ/又は該粒子の内部に実装されてもよい。蛍光粒子は、有利には、量子ドット、蛍光ポリスチレンマイクロスフェア、又は蛍光脂質ナノ粒子である。蛍光分子は、好ましくは蛍光体である。物質表面は、有利には、興味対象の標的に特異的な分子プローブ(捕捉プローブ)で被覆される。本方法は、例えば、蛍光体で標識されるか又はビオチン化されるか若しくはストレプトアビジン結合蛍光分子と組み合わせて用いられるかのいずれかである標的特異的検出プローブをさらに用いることができる。
【００２１】
好ましくは、本方法は、異なる放出波長の複数の蛍光分子を用いて、好ましくは光学及び近赤外スペクトルをカバーする蛍光分子を用いて行われ、各蛍光分子は、別個の物質表面に結合され、有利には別個の粒子に結合されている。これは、異なる蛍光分子、好ましくは異なるシグナルの検出に使用できる蛍光体による異なる発光シグナルの放出を可能にする。マルチプレックスアッセイは、同じ検体において混交したシグナル成分の検出を可能にする。これらは、多種多様な条件下のインビトロ又はインサイチュでの標的の高感度検出を提供する。
【００２２】
本発明の方法の別の好ましい実施形態によれば、ルシフェリン又はその反応性中間体と物質表面とを接触させる前記工程は、界面活性剤の存在下で行われる。界面活性剤の添加により発光シグナルが増大され、これにより本発明の方法の感度が高まる。好ましくは、界面活性剤は、例えばツイーン20又はトリトンX-100のような非イオン性界面活性剤である。反応工程における界面活性剤の最適濃度は、当技術分野で知られた標準的アッセイによって決定できる。通常、界面活性剤は、0.001％〜0.1％(V/V)、好ましくは0.005％〜0.05％、さらにより好ましくは0.01％の終濃度で用いられる。
【００２３】
本発明の方法は、当技術分野で知られた標準的アッセイを用いて任意の興味対象の標的を検出するために用いてもよい。これらのアッセイは、標的に結合する分子プローブを用いる、生体(動物又は植物)におけるインビボ又はインビトロでの標的の検出に基づいている。分子プローブは、自由に拡散するか、又はフロー中のビーズに付着させるか、又は拡散カラムに付着させるか、又はスライド/ウェル/マイクロパターン基板(substrates)に付着させることができる。インビトロアッセイは、そのようなウェル、スライド、マイクロスポット、及びビーズなどの様々な形式で実施される。これらのアッセイの例は、酵素アッセイ、核酸アッセイ、受容体-リガンドアッセイ及び免疫アッセイである。免疫アッセイは、特異的抗体による標的の検出に基づく、広く利用されているアッセイである。
【００２４】
本発明の方法は、有利には、研究、バイオテクノロジー、診断、治療、遺伝子解析及び/又は薬物スクリーニングに有用なバイオマーカーの検出のために用いられる。
発光シグナルは、適切なシステムを用いて、好ましくは、当技術分野でよく知られた高感度微光レベル検出器(光電子増倍管、光電陰極、CCDカメラ、増強CMOS/CDDカメラ)を用いて検出される。
【００２５】
本発明の別の側面は、
- 本発明による少なくとも１つの生物発光基質、
- 好ましくは蛍光分子を含み、より好ましくは検出されるべき標的に特異的な分子プローブで被覆され、さらにより好ましくは粒子である、本発明による少なくとも１つの物質表面、
- 本発明による方法を実行するための使用説明書
を含む、本発明に係る方法を実行するためのキットに関し、該キットは、いずれの触媒酵素(ルシフェラーゼ)も含まない。
【００２６】
本発明の別の側面は、本発明による少なくとも１つの物質表面の存在下であって、且つ、ルシフェラーゼの非存在下における、検出可能な発光シグナルを生成するための生物発光基質の使用に関する。好ましくは、前記生物発光基質は、蛍光分子による検出可能なルミネセンス光シグナルの放出を刺激する蛍光分子を含む物質表面とともに用いられる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、診断及び/又は治療目的の本発明の方法及び使用は、インビトロで行われる。他の目的の本発明の方法及び使用は、インビトロ又はインビボで行われる。
【００２８】
EiPEの潜在的応用は、既存及び新規のプローブを用いて特定のシグナルの高感度多価検出を容易にする本方法の能力に基づいて、広範である。特に、EiPEは、アフィニティー分離(細胞及び他の標的)のための既存の方法の増強及び最適化に貢献できる。
【００２９】
- インビトロ及びインサイチュでの標的生体分子の視覚化：定義により、「酵素非依存性」EiPEは、古典的ELISAで使用される酵素結合抗体検出に取って代わるかもしれない。酵素結合抗体と比較したEiPEの利点は、大幅に向上した感度、及び複数のシグナルの検出であると予期される。酵素結合アッセイは、ただ１つ又は２つの特異的シグナルを、増強されたコントラストで検出可能となるように増幅できる。蛍光標識を使用するEiPE検出は、スペクトル検出方法を用いる複数シグナルの同時検出、及び経時的な光信号の統合のための道を開く。
【００３０】
- 細胞及び細胞小器官の分離技術：血液などの複雑な混合物からの細胞、細胞小器官、及びタンパク質の単離は、基礎研究、バイオテクノロジー、診断、治療、遺伝子解析、及び他の応用に重要である。これらの目的に向けて、フロー・フラクション法は重要である；磁性及び誘電性アプローチは、細胞を分離するために、分子認識(例えば、磁性又は誘電性微粒子での細胞の前標識)と組み合わせることができる。図７(標示「Ｍ」)に示されるように、適切な条件下で、強いEiPE光が磁性微小ビーズから発せられています。このような微小ビーズは、表面マーカーに基づいて特定の細胞亜集団を標的とする抗体の共有結合により容易に官能化することができ、磁気細胞分離に用いることができる。同様に、全てのタイプの抗体が付加された磁性粒子自体は、その大きい直径(0.1-10ミクロン)により、EiPEを生じることが十分に予期される。これら全ての場合において、EiPEは、例えば、高感度光学的検出を用いて、磁場内部の磁性粒子結合細胞の蓄積を直接測定する磁性粒子の半定量的リアルタイムモニタリングのための具体的手段を提供できた。血液検体を用いた研究では、血液が、650nmを下回る範囲内の青緑色光ではなく、700nmを上回るスペクトル波長の赤色光を透過する限り、磁性粒子が遠赤外蛍光体でドープされることがより良く、それによりEiPE検出が最適化されることは明らかである。
【００３１】
磁性/誘電性粒子に基づく細胞分離技術に加えて、且つこれと適合することに、細胞親和性クロマトグラフィ、型特異的細胞分離は、細胞表面受容体と、固定マトリクス上に固定化されたリガンドとの間の相互作用に基づく。例えば、一体的に組み立てられたポリアクリルアミド及びポリジメチルアクリルアミドのクリオゲル親和性マトリクスは、哺乳動物細胞のような大きい粒子の対流移動のための高度に相互接続した孔(100μmまで)を有する一体型細胞親和性カラムの構築に用いることができる。このようなカラムは、例えばプロテインＡを用いて、細胞を固定化するために機能化されてもよい。特異的抗体で標識した標的細胞は親和性カラム内に捕捉され、溶出により、これらの特異的に捕捉された細胞は高い収率及び生存率で回収される。親和性クロマトグラフィを用いる細胞分離はまた、多様な方法でのEiPEの実施により増強される。例えば、EiPE適合抗体で標識されたEiPEを生じ得る粒子は、光学的手段により、親和性カラムにおける標識された細胞の亜集団の特異的蓄積を直接明らかにすることができる。例えば、標的親和性カラムは、第二のバイオマーカー、例えば疾患マーカーを検出するために、スペクトル的に異なる(小さい)サイズのEiPE生成微粒子を用いて他のバイオマーカーの読み出しと多重化することができる。
【００３２】
- セラノスティック(theranostic)な応用を対象とするナノ粒子のインビトロ、インサイチュ及びインビボ解析：生物化学における新興分野はナノ粒子送達に関連し、インビボで高い特異性の標的ペイロード送達を提供することを約束する。この種のアプローチは、癌、及び感染のために用い得る小分子の武器庫を増大させる大きな可能性を有する。EiPE法は、多種多様な方法でこのような新興技術を推進するのに有望である。実際、図面及び実施例には、EiPEシグナルが、脂質ナノ粒子、ポリスチレンマイクロスフェア粒子、合成樹脂及び無機量子ドットを含む化学的及び物理的に多様な種類の様々なナノ粒子に潜在的に含まれることが示されている。よって、EiPEが、ナノ粒子技術をスクリーニング、開発、検証、そして最終的にナノ医療及びセラノスティックな応用に適用するための重要なツールを提供することは明らかである。蛍光体の無限の組み合わせが独自のスペクトルの「バーコード」を与え得る無限の可能性に応じてナノ粒子が特異的で独自のスペクトルの指紋を付与されるような、EiPEシグナルのスペクトル特性を調整する簡便かつ強力な能力を考慮して、可能性を説明することができる。EiPEスペクトル特性は別個に調整可能なパラメータであるが、EiPE強度は、粒子の物理化学的特性、例えば、表面/体積、連結、そしておそらく最重要である最も外側の固相界面の官能化状態に依存する。例えば、表IIには、同じ種類のポリスチレンビーズが、表面の官能化(ストレプトアビジン、アミン)に応じて、異なるEiPEシグナル強度を生じることが示されている。そのようなEiPEに基づくツールは、インビトロ及びインビボでのスクリーニング、及びセラノステッィクな応用にも有用である。例えば、脂質ナノ粒子(LNP)は治療送達技術である。図９には、全てのLNPが豊富なEiPEを生じたことが示されている。これに関連し、LNP-EiPEは、LNPのインビトロでの開発、検証及び最終的にインビボでの検出に相当な価値があるであろう。光学的撮像法を用いてカスタムLNPの分布及び標的化をモニターできることは、特にそれらの有効性を定義するために、非常に有利であり、EiPEはこの種の解析を促進するであろう。
【００３３】
- 生体分子分布のインサイチュ解析
ナノ医療は、セラノステッィク医療、化学生物学、生物物理学、免疫学、ナノ粒子の生産、薬物スクリーニング及び細胞生物学/生理学を含む多様な専門技術を利用する。小動物モデルを用いてその中の生体分子の分布をインサイチュでモニタリングすることは、保健当局によって承認された検証プロセスに伴う部分である。例えば、薬物(小分子)の分布を確認する前臨床試験のための現在の最新技術では、小動物モデル(例えばマウス)でのラジオイムノアッセイ(RIA)を使用する。動物をまず(例えばi.v.によって)放射性標識小分子に曝露し、一定期間後に安楽死させ、全体を凍結し、そして動物全体の組織の薄切片をクライオマクロトームにより作製するために準備される。動物全体を数百の薄切片(10〜数百ミクロンの厚さ)に切断し、それらを、放射標識シグナルを定量可能であって研究対象の標的分子の蓄積濃度を推定可能な専用の放射イメージング装置を用いて個別に画像化する。
放射性ヌクレオチドの製造が高価で時間がかかり、研究室でのリスク要因をもたらす限り、放射標識を光子検出に基づく方法に置き換えることが有利であろう。今日、EiPEは、小分子の追跡のために、この状況で使用され得ることが想定される。しかし、動物全体を薄くスライスする方法と組み合わせたEiPEは、おそらく大きな可能性を有する。
【００３４】
本発明をより良く理解し、且つ、同じように実施し得る方法を示すため、例示の目的のみで、以下に、特定の実施形態、方法及びプロセスを、添付の図面を参照して示す。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】EiPE現象の概略図。基質と適切な表面との相互作用により、基礎シグナルが発生する(Ａ)。蛍光体が存在する場合、波長固有シグナルが観察される(Ｂ)。EiPEに適切な相互作用表面の非限定的な例(Ｃ)。
【図２】EiPEの存在の最初の証拠。示されるように、PBS中のリステリア接種(inoculate)、デカナール及びQD705の組み合わせを用いて種々の溶液を形成し、黒色96ウェルプレートに分注した。そして、プレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置して、470nm〜490nm及び695nm〜770nmのフィルタセットの下で観察した。発光が、デカナール＋リステリア・イノキュア、デカナール＋リステリア・イノキュア＋QD705及びデカナール＋QD705の組み合わせで観察された。青色固有シグナルが、リステリア接種が存在した場合にのみ見出された。さらに、リステリア接種の非存在下でさえも、QD705をデカナールと混合した場合には必ずQD705に特有のシグナルが見られた。これが、酵素非依存性光子放出(EiPE)の発見に至る最終的観察である。
【図３】様々なQDでのEiPEを用いた波長固有シグナル生成。基質のみを含む溶液、この場合はセレンテラジン-h、又は、基質及びQD655、QD705もしくはQD800を含む溶液を1xPBS中で調製し、エッペンドルフチューブに分注した。そして、チューブをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置して、全光(Total Light)、530〜550nm、610〜630nm、575〜650nm、695〜770nm、及び810〜870nmの放出フィルタの下で観察した。QDを含んだ各溶液について、正確に対応する放出フィルタでの観察下に最大放出で波長固有シグナルが観察された。各溶液のシグナルを基質コントロールと比較したところ、シグナルの大幅な増加が観察された。この増加は、QD705及びQD800を用いた場合に300倍に近いものであり、シグナルの大規模な特異性を示した。
【図４】様々な蛍光体包埋ポリスチレンマイクロスフェアでのEiPEを用いた波長固有シグナル生成。基質のみを含む溶液、この場合はセレンテラジン-h、又は、基質及び種々の蛍光体を包埋したポリスチレンマイクロスフェアを含む溶液を1xPBSに混合し、黒色96ウェルプレートの個々のウェルに分注した。蛍光体包埋ポリスチレンマイクロスフェアは、次の励起/放出極大を有していた：505nm/550nm、580nm/605nm、660nm/680nm、及び488/650nm。そして、プレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置して、全光、470〜490nm、530〜550nm、610ロングパス、610〜630nm、及び695〜770nmの放出フィルタの下で観察した(それぞれＡ〜Ｆ)。ポリスチレンマイクロスフェアを含んだ各溶液について、正確に対応する放出フィルタでの観察下に最大放出で波長固有シグナルが観察された。
【図５】EiPEを用いた光発生に対する種々の基質の効果。EiPEを用いて光を発生させる能力に対する種々の基質の効果を、セレンテラジン又はその誘導体の一つと、蛍光体包埋マイクロスフェアとを混合することにより調べた。一般に用いられるセレンテラジン誘導体h、hcp及びfcpと混合した２つの異なる蛍光体包埋マイクロスフェアから発生された光を、天然フォームと比較した。溶液を３組で調製し、黒色96ウェルプレートに分注した(Ａ)。プレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置して、全光、530〜550nm、及び575〜650nmの放出フィルタの下で観察した(それぞれＢ〜Ｄ)。マイクロスフェアの位置は、エピ蛍光を用いて確認した(Ｅ及びＦ)。予想どおり、波長固有シグナルが発生し、適切な放出フィルタの下に表れることが確認された。興味深いことに、発生したシグナルの量は、各誘導体によって、また、用いた各蛍光体について変化した。これは、用いた所定の蛍光体について、最大のシグナル発生を増進する理想的誘導体が存在することを示す。
【図６】EiPE基質依存性の分析。図５に示される各取得から得られた光子/s/cm2を、各セレンテラジンコントロールに対して標準化して、各条件について天然と標示した。同様の傾向が、505/550(Ａ)及び580/605(Ｂ)のカルボキシレート官能化蛍光体包埋ポリスチレンビーズについて観察された。セレンテラジン-hを用いた場合に最大のシグナル増強が観察され、そして各誘導体は、コントロールの少なくとも２倍の量を発生した。この結果は、セレンテラジン骨格へのさらなる化学的修飾が、生じる発光の増加をもたらし得ることを意味する。
【図７】ReSyn(登録商標)ビーズの表面積の変化及びEiPEシグナル発生に対するその効果。ReSyn(登録商標)ビーズは、自らの周りに自由かつ自然に巻きつく長いポリマー鎖からなり、これが大きな表面積対体積比のマイクロスフェアを生成する。このように、ポリマーは、非常に多孔質且つその全体にわたって液体の自由移動を可能にするビーズ様構造を生じる。ReSyn(登録商標)ビーズは、様々な架橋度を有するように作製され、よってEiPE反応に利用可能な表面積の量を調節する。等濃度の各ReSyn(登録商標)マイクロスフェア及びセレンテラジン-h基質を1xPBS中に含む溶液を３組調製し、黒色96ウェルプレートに分注した。IVISスペクトルを用いて、利用可能な全てのフィルタセット(490nmから850nmまでの放出を内包する20nmバンドパスフィルタ)の下、得られた発光を観察した。490〜510nmフィルタの下での放出を示した(挿入図)。示されるように、ReSyn(登録商標)Aは最大量の利用可能な表面積を有し、次いでReSyn(登録商標)B、そしてReSyn(登録商標)Cが続く。ReSyn(登録商標)MはReSyn(登録商標)Aの磁性変形体であり、Subは、ビーズを含まないが1xPBS中に基質のみを含む溶液を示す。各ReSyn(登録商標)ビーズについて得られる放出極大は同じ領域(510〜530nm)で発生したが、放出強度は架橋度と強く相関する。
【図８】QD705標識ReSyn(登録商標)ビーズでのEiPEを用いる波長固有シグナルの発生。様々な濃度のQD705で標識された等濃度のReSyn(登録商標)ビーズとセレンテラジン-h基質を1xPBS中に混合したものを３組、黒色96ウェルプレートに分配し、IVISスペクトルの710〜730nmフィルタセットの下で観察した(上部)。得られたp/s/cm2を、最大シグナルを生成したビーズの平均値に標準化した(0.152μM QD705、下部)。プロットしたデータからわかるように、濃度が最も高い場合に、最も強度の高いQD705シグナルが生じた。得られた発光は直線的に減少した。
【図９】Global Acorn(登録商標)社からのローダミン6装填脂質ナノ粒子(LNP)でのEiPEを用いる波長固有シグナルの発生。Global Acorn社からの脂質ナノ粒子の３種の構成物をセレンテラジン-hと1xPBS中に混合し、黒色96ウェルプレートに分配した。該３種の構成物は、コントロール(すなわち、蛍光体が付加も内包もされていない)LNP(C LNP)、ローダミン6の表面への結合及びLNPの中心への装填の両方がなされたもの(R1)、及びローダミン6が中心にのみ装填されたもの(R2)からなる。プレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置して、全光、470〜490nm、530〜550nm、575〜650nm、及び610ロングパス(LP)放出フィルタの下で観察した(上部画像)。各フィルタセット下での各LNPの対応するp/s/cm2をコントロールLNPに標準化した(下部)。図に示すように、ローダミン6で標識され且つローダミン6を含むLNPは、全光、575〜650nm、及び610ロングパス放出フィルタの下で最大量のシグナルを生成した。これは、蛍光体又は蛍光ナノ粒子を付加させることができ且つ発光波長が予測される生体適合性ポリマー骨格を作製する可能性があることを示している。
【図１０】懸濁液における、固定されたJ774A.1マウスマクロファージの存在下の蛍光体包埋マイクロスフェアでのEiPEを用いるシグナルの発生。同じ数の固定されたJ774A.1マウスマクロファージを黒色96ウェルプレートのウェルに分配した。同じウェルに、最大励起波長及び放出波長がそれぞれ580及び605 nmである0.5μm蛍光体包埋マイクロスフェアを数を逓減させて分配してマイクロスフェア対マクロファージ比が20788から20までの範囲となるようにし、１つのウェルにはマイクロスフェアがないように維持した(0と表記)。マイクロスフェアを分配した後、1xPBS中のセレンテラジン-hを等量で各ウェルに添加し、プレートを速やかにIVISスペクトル生物発光イメージングシステムに設置した。プレートを、利用可能な全ての放出フィルタ(490nm‐850nmの範囲)の下で観察した。各フィルタの下で各ウェルについて光子/秒/cm2の総計を測定した。各ウェルについて610‐630 nmにて得られた全フラックスを、510‐530 nmで見られたフラックスにより標準化し、赤色シグナルにおいて得られた増強を示した。各条件を３回繰り返した。図に示すように、ビーズが存在するときは常に、実質的な波長固有シグナルがマイクロスフェア対マクロファージ比に依存した大きさで発生した。マイクロスフェア特異的シグナルは、マクロファージ当たりわずか20個のマイクロスフェアでバックグラウンドから明確に識別可能である。
【図１１】インビボ条件下のEiPEの存在。４匹の６週齢の雌BALB/cマウスの背面を破壊し、該マウスを全身麻酔下に置いた。1xPBS中のセレンテラジン-hのみを含む１つ目の溶液を調製し、コントロールとして用いた(Coel)。1xPBS中のセレンテラジン-hをQD705と共に含む第２の溶液を調製した(Coel+QD705)。１匹のマウスにCoelコントロールの皮下注射を１回受けさせ、該マウスを全光、470〜490nm、及び695〜770nmの放出フィルタの下で画像化した。他の３匹のマウスにCoel+QD705溶液の同一量の注射を受けさせ、これらのマウスも同じフィルタセットの下で画像化した(Ａ〜Ｃ)。QD705の位置は、エピ蛍光により確認した(Ｄ)。各フィルタセット下で得られたp/s/cm2を比較した(Ｅ)。図に示すように、Coel+QD705溶液が存在する場合は、Coelコントロールに比べて、ほぼ３倍の総シグナルの増加が観察された。この差異はQD705特異的フィルタを用いたときにより強くなり、ほぼ20倍のシグナルの増加がもたらされる。
【図１２】EiPEを用いて、ほぼ全ての光学スペクトルをカバーする複数の発光光源からの蛍光体特異的シグナルを発生させる。1xPBS中のセレンテラジン-hを多数の蛍光体及び蛍光ナノ粒子と混合し、これらは505/550nm、580/605nm、及び660/680nm ポリスチレンマイクロスフェア(それぞれ黄色、ピンク、及び遠赤外)；QD655、QD705、及びQD800；及び未結合ストレプトアビジン官能Alexa色素(555、633、及び700)を含む。溶液を３組調製し、黒色96ウェルプレートに分配した。該プレートを、利用可能な全てのフィルタセット(490nm‐850nmの範囲)の下でIVIS100スペクトル生物発光イメージングシステムにより観察した。各蛍光体について全体の発光スペクトルを取得し、ピーク放出波長に対して標準化した。図に示すように、各化合物の適切な蛍光発光スペクトルがEiPEを用いて得られた。
【図１３】EiPEを用いる多重スペクトルデコンボリューション。３種の蛍光体(A、B、C)の１つでドープしたポリスチレンビーズを96ウェルプレート中にセレンテラジン-hの存在下にv/vで混合し(AB、AC、BC、ABC)、EiPE光を明らかにするために処置した。マルチウェルプレートをまず蛍光照明を用いてコントロールとして視覚化し(左パネル)、次にEiPE光発生を用いて視覚化した(右パネル)。20nmのバンド幅で490〜730 nmの視覚スペクトル範囲をカバーする８つのフィルタセットを用いて、スペクトルデコンボリューションを行った。３つの「コンポーネント」チャンネルのスペクトルデコンボリューションにより、蛍光及びEiPE照明について同一である単独及び混合の両方のビーズの存在を明らかにした。
【図１４】トリトンX-100(商標)の添加がEiPEシグナルを増加させる。セレンテラジン-h(5μg/mL)、示された濃度のトリトンX-100(商標)、及び示された濃度の緑色蛍光スフェア(Ａ)又は遠赤外蛍光スフェア(Ｂ)を含む溶液を黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分配した。コントロールのウェルには、(i)基質及び種々の濃度のトリトンX-100(商標)、及び(ii)界面活性剤は無いがセレンテラジン-hは有する種々の濃度の蛍光スフェアを含めた。調製されたプレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置し、１分間の露光時間を用いて全光、500 nm、700 nmフィルタセットの下で観察した。そして、得られた光子/秒/cm2(p/s/cm2)フラックスをプロットした。図に示すように、トリトンX-100(商標)を低濃度(0.025又は0.05%)の蛍光スフェアに添加することで、EiPEにより生成されるシグナルを３〜４倍に向上できる。
【図１５】ツイーン-20(商標)の添加がEiPEシグナルを増加させる。セレンテラジン-h(5μg/mL)、示された濃度のツイーン-20(商標)、及び示された濃度の緑色蛍光スフェア(Ａ)又は遠赤外蛍光スフェア(Ｂ)を含む溶液を黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分配した。コントロールのウェルには、(i)基質及び種々の濃度のツイーン-20(商標)、及び(ii)界面活性剤は無いがセレンテラジン-hは有する種々の濃度の蛍光スフェアを含めた。調製されたプレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置し、１分間の露光時間を用いて全光、500 nm、700 nmフィルタセットの下で観察した。そして、得られた光子/秒/cm2(p/s/cm2)フラックスをプロットした。図に示すように、ツイーン-20(商標)を低濃度(0.025又は0.05%)の蛍光スフェアに添加することで、EiPEにより生成されるシグナルを３〜４倍に向上できる。
【実施例】
【００３６】
実施例１：材料
一般的試薬
セレンテラジン-hは２つの異なる商業的供給源(シグマアルドリッチ、フランス及びZymera社、USA)から入手した。セレンテラジン(天然)及び他のセレンテラジン誘導体(hcp及びfcp)はシグマアルドリッチ(フランス)から入手した。特に明記しない限り、使用したセレンテラジン-hはZymera社から提供された。全てのセレンテラジンを0.5 mg/mLの濃度となるまで直ちに1,2-プロパンジオール(シグマアルドリッチ、フランス)中に溶解した。得られた溶液を50μLのアリコートに分注し、使用するまで−20℃で保存した。使用前に、セレンテラジンを10倍に希釈して、最終ストック濃度0.05 mg/mLとした。
デカナール(シグマアルドリッチ、フランス)を使用時まで暗所に保存した。
量子ドット(2 mM溶液)及び蛍光ポリスチレンマイクロスフェア(2％固形物)はライフテクノロジーズ社(USA)から取得し、そのまま使用した。カスタムポリマーマイクロスフェアはReSyn(登録商標)、LLC(南アフリカ)により提供され、カスタム脂質ナノ粒子はGlobal Acorn社(イギリス)により提供された。
【００３７】
【表１】
0006495320.tif 000002
【００３８】
生物発光イメージング
IVIS100又はIVISスペクトル(いずれもパーキンエルマー社により提供される)を用いて、全ての発光イメージを取得した。IVIS100は、図に示すように複数のバンドパスフィルタを備えた。全光とは、放出フィルタが存在しないことを示し、よって全ての放出波長を検出することを可能にする。IVISスペクトルは、それぞれが20 nmのバンド幅を有する490 nm−850 nmの範囲の18のバンドパスフィルタを含む。各システムは、標準的なエピ蛍光イメージング機能を提供した。取得データはソフトウェアLivingImageバージョン4.1及び4.2を用いて分析した。
【００３９】
マクロファージ
J774A.1マウスマクロファージ(ATCC)を、標準的条件(10％ウシ胎仔血清を含むDMEM)の下で増殖させた。
【００４０】
改変バクテリオファージ
感染リステリアからのluxAB発現を誘導する遺伝物質を含む改変バクテリオファージは、標準的な分子生物学的技術を用いて調製した。
【００４１】
マウス
６週齢の雌のBALB/cマウスをJanvier社(フランス)から取得し、動物倫理に関する欧州連合の全ての規則及び規制に従う標準的生育条件の下で維持した。実験の直後、マウスを犠牲にし、適切に処分した。
【００４２】
実施例２：EiPEの存在の最初の証拠
１．方法
リステリアの新鮮な一晩培養物からのアリコートを、luxAB発現を誘導する遺伝物質を含む改変バクテリオファージに２時間まで曝露した。曝露後、リステリア及びバクテリオファージの混合物の３つの100μLアリコートを黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分注した。これらのウェルのうち、１つのウェルに10μLのデカナールを添加し、一方、第二番目は10μLのデカナール及び10μLのQD705を受容した。コントロールとして、第三番目のウェルには何も添加しなかった。第四番目のウェルに100μLの1xPBS、10μLのデカナール及び10μLのQD705を添加した。調製したプレートをIVIS100に設置し、30秒の露光時間を用いて、全光、470nm〜490nm及び695nm〜770nmのフィルタセットの下で観察した。QD705の位置はエピ蛍光を用いて確かめた。
【００４３】
２．結果
PBS中のリステリア・イノキュア、デカナール及びQD705の組み合わせを用いて(図２)、種々の溶液を形成し、黒色96ウェルプレートに分注した。そして、プレートをIVIS100生物発光イメージングシステムに設置して、全光、470nm〜490nm(図２)及び695nm〜770nm(図２)のフィルタセットの下で観察した。発光が、デカナール＋リステリア・イノキュア、デカナール＋リステリア・イノキュア＋QD705及びデカナール＋QD705の組み合わせで観察された。全光フィルタセットの下では３つの条件全てについてシグナルが見られたが、青色固有シグナルは、リステリア・イノキュアが存在した場合にのみ見出された。さらに、リステリア・イノキュアの非存在下でさえも、QD705をデカナールと混合した場合には必ずQD705に特有のシグナルが見られた。これが、酵素非依存性光子放出(EiPE)の発見に至る最終的観察である。QD705の位置はエピ蛍光により確認した。
【００４４】
実施例３：様々なQDでのEiPEを用いた波長固有シグナル生成
４つの異なる溶液を調製し、エッペンドルフチューブに分注した。第１のチューブは、80μLの1xPBS及び20μLのセレンテラジン-hを含んだ。残りのチューブは、75μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び5μLのQD655、QD705又はQD800を含んだ。混合して、チューブをIVIS100に設置し、全光、530〜550nm、610〜630nm、575〜650nm、695〜770nm、及び810〜870nmの放出フィルタの下、60秒に設定した露光時間で視覚化した。種々のQDの位置はエピ蛍光を用いて検証した。酵素非依存性発光から得られた光子フラックス(光子/秒/cm2；p/s/cm2)を、PBSコントロールであるチューブ１に対して標準化した。
【００４５】
QDを含んだ各溶液について、正確に対応する放出フィルタでの観察下に最大放出で波長固有シグナルが観察された。QDの位置はエピ蛍光を用いて確かめた。各溶液のシグナルを基質コントロールと比較したところ、シグナルの大幅な増加が観察された(図３)。この増加は、QD705及びQD800を用いた場合に300倍に近いものであり、シグナルの大規模な特異性を示した。
【００４６】
実施例４：様々な蛍光体包埋ポリスチレンマイクロスフェアでのEiPEを用いた波長固有シグナル生成
５つの異なる溶液を調製し、黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分注した。最初の４つは、70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び示された励起/放出極大(505nm/550nm、580nm/605nm、660nm/680nm、及び488/650nm)を有する10μLの蛍光ポリスチレンマイクロスフェアを含んだ。第５のウェルは、80μLの1xPBS及び20μLのセレンテラジン-hを含んだ。プレートをIVIS100に設置し、60秒の露光時間を用いて、全光、470〜490nm、530〜550nm、610ロングパス、610〜630nm及び695〜770nmのフィルタの下で視覚化した。
ポリスチレンマイクロスフェアを含んだ各溶液について、正確に対応する放出フィルタでの観察下に最大放出で波長固有シグナルが観察された(図４Ａ〜４Ｆ)。
【００４７】
実施例５：EiPEを用いた光発生に対する種々の基質の効果
２つの異なる標準0.5μmポリスチレンマイクロスフェア(ライフテクノロジーズ社)を用いて、観察されたEiPE効果について基質依存性を調べるために、種々のセレンテラジン誘導体(h、天然、hcp及びfcp；シグマアルドリッチ)を用いた。マイクロスフェアの励起/放出極大は、それぞれ580nm/605nm及び505nm/515nmであった。各ウェルは70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン誘導体、及び10μLの蛍光マイクロスフェアを含み、黒色96ウェルプレートに分配した。そして、プレートをIVIS100に設置し、60秒の露光時間を用いて、示されたフィルタセットの下で視覚化した。マイクロスフェアの位置はエピ蛍光により確認した。２種類の関連する蛍光マイクロスフェアについて、各ウェルから得られたEiPE誘導性発光を、「天然」セレンテラジン誘導体の平均光子フラックスに対して標準化した。シグナルの増加倍率を、発光反応を誘導するために用いたセレンテラジン誘導体に対してプロットした。
【００４８】
予想どおり、波長固有シグナルが発生し、適切な放出フィルタの下に表れることが確認された(図５)。興味深いことに、発生したシグナルの量は、各誘導体によって、また、用いた各蛍光体について変化した。これは、用いた所定の蛍光体について、最大のシグナル発生を増進する理想的誘導体が存在することを示す。同様の傾向が、505/550(Ａ)及び580/605(Ｂ)のカルボキシレート官能化蛍光体包埋ポリスチレンビーズについて観察された(図６)。セレンテラジン-hを用いた場合に最大のシグナル増強が観察され、そして各誘導体は、コントロールの少なくとも２倍の量を発生した。この結果は、セレンテラジン骨格へのさらなる化学的修飾が、生じる発光の増加をもたらし得ることを意味する。
【００４９】
実施例６：表面官能化が、得られるEiPE誘導性発光に影響する
種々の表面修飾(非反応性、アミン、及びストレプトアビジン)がなされた蛍光包埋ポリスチレンマイクロスフェアを用いて、EiPEの表面官能化への依存性を調べた。ここで、非反応性とはカルボキシレート官能化を指し、これはほとんどの化学物質の存在下で比較的不活性である。マイクロスフェアを含むウェルは、70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び10μLの各マイクロスフェアで構成された。第４のウェルは、80μLの1xPBS及び20μLのセレンテラジン-hを含んだ。最後に、別のコントロールを、70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び10μLの各マイクロスフェアの標準的プロトコルに従って、非蛍光カルボキシレートマイクロスフェアを用いて設置した。
【００５０】
同一濃度のマイクロスフェア及びセレンテラジン-hを含む、黒色96ウェルプレート中に調製された溶液を、IVIS100生物発光イメージングシステムの全光フィルタセットの下で観察した。得られた光子/秒/cm2(p/s/cm2)フラックスを、表IIに示す。
【００５１】
【表２】
0006495320.tif 000003
【００５２】
以上のように(表II)、表面官能化への依存性が存在する。
【００５３】
実施例７：ReSyn(登録商標)ビーズの表面積の変化及びEiPEシグナル発生に対するその効果
ReSyn(登録商標)により提供される種々の架橋度を有する非蛍光性高分子マイクロスフェアを用いて、EiPEの表面積依存性を調べた。
ReSyn(登録商標)ビーズは、自らの周りに自由かつ自然に巻きつく長いポリマー鎖からなり、これが大きな表面積対体積比のマイクロスフェアを生成する。このように、ポリマーは、非常に多孔質且つその全体にわたって液体の自由移動を可能にするビーズ様構造を生じる。ReSyn(登録商標)ビーズは、様々な架橋度を有するように作製され、よってEiPE反応に利用可能な表面積の量を調節する。４種のマイクロスフェア：A、B、C、及びMを用いた。これらはAからBへ、そしてCへと架橋度が増加し且つ利用可能な表面積が減少した。タイプMは、架橋度が明記されていない磁性化ビーズであったが、Aと同程度であると予測される。70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び10μLの各マイクロスフェアを含む３組の溶液を黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分配した。コントロールとして、80μLの1xPBS及び20μLのセレンテラジン-hを３組調製し、第２の黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分注した。そして、２枚のプレートをIVISスペクトルに設置し、30秒の露光時間を用いて、利用可能な全ての放出フィルタセット２(490nmから850nmまでの放出を内包する20nmバンドパスフィルタ)の下で観察した。次いで、各種のビーズ及びコントロールについて見出された光子フラックス(p/s/cm2)の平均標準偏差を算出し、それぞれのバンドパスフィルタの中心波長に対してプロットした。
【００５４】
示されるように(図７)、ReSyn(登録商標)Aは最小量の架橋を有し、次いでReSyn(登録商標)B、そしてReSyn(登録商標)Cが続いた。ReSyn(登録商標)MはReSyn(登録商標)Aの磁性変形体であるが、Subは、ビーズを含まず、1xPBS中に基質のみを含む溶液を示す。各ReSyn(登録商標)ビーズについて得られる放出極大は同じ領域(510〜530nm)で発生したが、放出強度は架橋度と強く相関する。結果は、より多くの表面積が利用可能であれば、より多くのシグナルが発生することを示し、ビーズの表面がEiPE効果に強く影響を与えることを示唆する。
【００５５】
実施例８：QD705標識ReSyn(登録商標)ビーズでのEiPEを用いる波長固有シグナルの発生
種々の濃度のQD705で標識されたカスタム非蛍光性高分子マイクロスフェアはReSyn(登録商標)により提供され、これらを用いて波長依存的発光性粒子を作製できることを実証した。マイクロスフェアを４種の異なる濃度のQD705：0、0.037、0.081、及び0.152μMで標識した。70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び10μLのマイクロスフェアを含む３組の溶液を調製し、黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分配した。そして、プレートをIVISスペクトルに設置し、710〜730nmフィルタセットの下で観察した。得られた光子フラックスを、最も高いQD705濃度から観察された平均シグナルにより標準化した。
【００５６】
プロットしたデータ(図８)からわかるように、濃度が最も高い場合に、最も強度の高いQD705シグナルが生じた。得られた発光は直線的に減少した。これは、蛍光体又は蛍光ナノ粒子を付加させることができ且つ発光波長が予測される生体適合性ポリマー骨格を作製する可能性があることを示す。
【００５７】
実施例９：Global Acorn(登録商標)社からのローダミン6装填脂質ナノ粒子(LNP)でのEiPEを用いる波長固有シグナルの発生
蛍光体を含まないカスタム脂質ナノ粒子(C LNP)(Global Acorn社、UK)を、表面標識し且つローダミン6を含めたもの(R1)、又はローダミン6を含めただけのもの(R2)を用いて、高度に生体適合性の波長依存的発光性粒子を作製できることをさらに実証した。70μLの1xPBS、20μLのセレンテラジン-h、及び10μLの各脂質ナノ粒子からなる３つの異なる溶液を調製し、黒色96ウェルプレートの個々のウェル中に分注した。プレートをIVIS100に設置し、60秒の露光時間にて、示されたフィルタセットの下で視覚化した。各粒子タイプについて得られた光子フラックス(p/s/cm2)を、C LNPについて見出された値に対して標準化した。
【００５８】
図に示すように(図９)、ローダミン6で標識され且つローダミン6を含むLNPは、全光、575〜650nm、及び610LP放出フィルタの下で最大量のシグナルを生成した。これは、蛍光体又は蛍光ナノ粒子を付加させることができ且つ発光波長が予測される生体適合性ポリマー骨格を作製する可能性があることを示している。
【００５９】
実施例10：懸濁液における、固定されたJ774A.1マウスマクロファージの存在下の蛍光体包埋マイクロスフェアでのEiPEを用いる波長固有シグナルの発生
J774A.1マウスマクロファージを、10％ウシ胎仔血清を含む標準的DMEM中で増殖させた。約70％コンフルエンスの新鮮な培養物から出発し、細胞培養培地を除去して5 mLのトリプシンに置き換えた。細胞を37℃で5分間曝露した。得られた細胞懸濁液を15 mLのファルコンチューブに入れ、1000 rpmで5分間遠心分離した。細胞を、1xPBSを用いて3回洗浄した後、1％PFAを用いて懸濁液中で15分間固定した。完了すると、固定された細胞を再び1xPBSで3回洗浄して計数した。そして、細胞濃度を、100μL当たり70,000個の濃度となるように調整した。その後、100μLの細胞懸濁液を、黒色96ウェルプレートの36ウェルに分注した。
【００６０】
初期濃度が2％固形分である、580 nmの励起極大及び605 nmの発光極大を有する赤色蛍光ポリスチレンマイクロスフェア(直径0.5μm)(ライフテクノロジーズ社)を、1xPBSを用いて連続的に２倍ずつ12個に希釈した。各希釈液を３つの個々のウェルに添加して３つ組となるよう、希釈液から10μLを各ウェルに添加した。このように、ビーズ対細胞の比は20,788ビーズ：細胞から20ビーズ：細胞まで低下する範囲となった。さらに、20μLのセレンテラジン-hを各ウェルに添加した。そして、完成したプレートIVISスペクトルに設置し、60秒の露光時間を用いて、利用可能な全ての放出フィルタセット２(490nm‐850nmの範囲)の下で視覚化した。各フィルタ下での各ウェルについての全光子フラックス(p/s/cm2)の平均及び標準偏差を波長に対してプロットした。各条件を３回繰り返した。
【００６１】
図に示すように(図10)、ビーズが存在するときは常に実質的な波長固有シグナルが、マイクロスフェア対マクロファージの比に依存した大きさで発生した。マイクロスフェア特異的シグナルは、マクロファージ当たりわずか20個のマイクロスフェアでバックグラウンドから明確に識別可能である(挿入図)。この比は一般にほぼ達成可能であり、標的とするEiPEをインビトロ及びインビボの用途に向けて開発できることを示唆する。
【００６２】
実施例11：インビボ条件下のEiPEの存在
50μLのセレンテラジン-hと150μLの1xPBS、又は50μLのセレンテラジン-h、50μLのQD705及び150μLの1xPBSのどちらかを含む２つの溶液をエッペンドルフチューブに調製し、これらを用いて２つの異なるシリンジを満たした。４匹の６週齢の雌BALB/cマウスの背面を破壊し、該マウスを全身麻酔(イソフルラン)下に置き、50μLのコントロール(QD705なし、マウス１匹)又は50μLのQD705含有溶液(マウス３匹)を注射した。そして、マウスをIVIS100に置き、麻酔下に維持した。マウスを全光、470〜490 nm、及び695〜770 nmのフィルタセットの下、60秒の露光時間ですみやかに視覚化した(図11Ａ〜11Ｃ)。QD705の位置はエピ蛍光を用いて確かめた(図11Ｄ)。そして、各フィルタセットの下での全光子フラックス(p/s/cm2)をプロットした(図11Ｅ)。
【００６３】
図に示すように(図11)、Coel+QD705溶液が存在する場合は、Coelコントロールに比べて、ほぼ３倍の総シグナルの増加が観察された。この差異はQD705特異的フィルタを用いたときにより強くなり、ほぼ20倍のシグナルの増加がもたらされる。また、セレンテラジン-h基質が存在しないQD705の注射を受けたマウスを取得した。予想どおり、この場合は最小のシグナルが観察された。ここに示した結果は、インビボでルミネセンスを発生させるツールとしてのEiPEの可能性を実証する。生体適合性マーカーの使用を検証する従前の証拠がある場合、EiPE現象は、波長固有シグナルを発生する能力と共に、インビボ及びインビトロでの用途に大きな可能性を有する。
【００６４】
実施例12：EiPEを用いて、ほぼ全ての光学スペクトルをカバーする複数の発光光源からの蛍光体特異的シグナルを発生させる
1xPBS中のセレンテラジン-hを多数の蛍光体及び蛍光ナノ粒子と混合し、これらは505/550nm、580/605nm、及び660/680nm ポリスチレンマイクロスフェア(それぞれ黄、ピンク、及び遠赤外)；QD655、QD705、及びQD800；及び未結合ストレプトアビジン官能Alexa色素(555、633、及び700)を含む。溶液を３組調製し、黒色96ウェルプレートに分配した。ウェルの内容物を、以下の表IIIに明示する(リストされているのは１回だけであるが、各溶液は３回繰り返されたことに留意されたい)：
【００６５】
【表３】
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【００６６】
そして、調製したプレートをIVISスペクトルに設置し、利用可能な全てのフィルタセット(490nm‐850nmの範囲)の下で調べた。そして、各ビーズについて観察された光子フラックスを、その最大放出波長の平均光子フラックスに対して標準化した。次いで、得られた標準化値を平均して、標準偏差を算出し、用いたフィルタセットに対してデータをプロットした。
図に示すように(図12)、各化合物の適切な蛍光発光スペクトルがEiPEを用いて得られた。このことは、蛍光体の放出波長にほとんど関係なく、EiPEを幅広い蛍光体に適用できることを実証する。さらに、スペクトルの指紋及び多重化を決定するのにEiPEを用いることができ、類のないスペクトル精度を可能にする。
【００６７】
実施例13：EiPEを用いる多重スペクトルデコンボリューション
３種の蛍光体(A、B、C)の１つでドープしたポリスチレンビーズを96ウェルプレート中にセレンテラジン-hの存在下にv/vで混合し(AB、AC、BC、ABC)、EiPE光を明らかにするために処置した。マルチウェルプレートをまず蛍光照明を用いてコントロールとして視覚化し(図13；左パネル)、次にEiPE光発生を用いて視覚化した(図13；右パネル)。20nmのバンド幅で490〜730 nmの可視スペクトル範囲をカバーする８つのフィルタセットを用いて、スペクトルデコンボリューションを行った。３つの「コンポーネント」チャンネルのスペクトルデコンボリューションにより、蛍光及びEiPE照明について同一である単独及び混合の両方のビーズの存在が明らかになり、よって、後者が、混合した蛍光体の多重化スペクトルデコンボリューションのための方法に基づく新規な代替ルミネセンスとして有用であることが確認された。
【００６８】
実施例14.界面活性剤の添加がEiPEシグナルを増加させる
蛍光ポリスチレンマイクロスフェアを用いて、EiPEシグナルに対する界面活性剤添加の効果を調べた。
カルボキシレート修飾緑色蛍光スフェア(0.1μm; 505/515 nm; 2%固形分の溶液; モレキュラープローブス社/ライフテクノロジーズ社)及び遠赤外蛍光スフェア(0.2μm; 660/685 nm; 2%固形分の溶液; モレキュラープローブス社/ライフテクノロジーズ社)をH2O中の2Xストック溶液として調製し、それぞれを0.025、0.05、0.25及び0.5 %の終濃度で用いた。
トリトンX-100(商標)及びツイーン-20(商標)をH2O中の10Xストック溶液として調製し、それぞれを0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.25及び0.5 %の終濃度で用いた。
【００６９】
100μLの種々の濃度の各マイクロスフェア、20μLの種々の濃度の各界面活性剤、20μLのセレンテラジン-h(5μg/mL)及び60μLのH2Oの組み合わせを５枚の黒色96ウェルプレートの個々のウェルに分注した。コントロールのウェルには、(i)セレンテラジン-h及び種々の濃度の各界面活性剤(蛍光スフェアなし)及び(ii)界面活性剤は無いがセレンテラジン-hは有する種々の濃度の蛍光スフェアを含めた。調製されたプレートをIVISスペクトル生物発光イメージングシステムに設置し、１分間の露光時間を用いて全光、500 nm、700 nmフィルタセットの下で観察した。マイクロスフェアの位置はエピ蛍光を用いて確認した(励起：500 nm/放出：540 nm及び励起：675 nm/放出：720 nm)。そして、トリトンX-100又はツイーン-20の存在下に得られた光子/秒/cm2(p/s/cm2)フラックスをプロットした(図14及び15)。
【００７０】
図に示すように(図14及び15)、界面活性剤(トリトンX-100又はツイーン-20のいずれか)を、低濃度(0.025又は0.05%)の蛍光体に添加することで、EiPEにより生成されるシグナルを３〜４倍に向上できる。
0.01%の界面活性剤は、溶液中に0.025又は0.05%で存在する緑色蛍光スフェアのシグナルを増加させるのに最適である。予期したとおり、これは、700 nmではなく、開放された構成又は500 nmフィルタで見られた。
光が500 nmではなく700 nmにて放射され、増加したEiPEが高濃度のビーズで見られたという相違はあるが、同様の観察が遠赤外蛍光スフェアを用いてなされた。
全体として、これらの観察は、界面活性剤を、粒子当たりのEiPE光出力を増加させるための添加剤として使用することができ、より少ない粒子でより良いEiPE検出を可能にすることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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