(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定化されたカタラーゼ酵素を調製する方法であって、
セルロースである基質、リン酸バッファまたはホウ酸塩バッファ、及びカタラーゼ酵素を混合して、固形物と液体の混合物を作製するステップと、
前記混合物から前記液体を流し出すステップと、
前記固形物を水でリンスするステップと、
前記固形物とポリビニルアルコールとを十分に混合し、その混合物を乾燥させて粉末を生成するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記リン酸バッファまたは前記ホウ酸塩バッファまたは前記カタラーゼ酵素に対する前記基質の比率が１〜１０であり、前記カタラーゼ酵素に対する前記リン酸バッファまたは前記ホウ酸塩バッファの比率が０．５〜１０であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カタラーゼ酵素は、２５℃で５００ＩＵ／ｇ〜１，０００，０００ＩＵ／ｇの活性値を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記カタラーゼ酵素は、マンガン原子を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記カタラーゼ酵素は、真菌由来であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記セルロースが微結晶性セルロースであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ローションと、前記微結晶性セルロースとを含む皮膚用保湿ローションを製造するための請求項６の方法で調製された安定化されたカタラーゼ酵素の使用。
【請求項８】
前記カタラーゼ酵素が、５００，０００ダルトン未満の分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記真菌が、黒色アスペルギルスであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記セルロースが、微結晶性セルロース粉末を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリビニルアルコールが、８５，０００〜１２４，０００ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記安定化されたカタラーゼ酵素が、４０℃で７２時間、及び５５℃で６時間の熱サイクルを施された後、３５℃で最大１６週間にわたって安定であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記安定化されたカタラーゼ酵素が、前記安定化されたカタラーゼ酵素の過酸化水素に対する比率が１：１であるとき、少なくとも６０％の過酸化水素を分解可能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許仮出願第６１／７６９３９５号（２０１３年２月２６日出願）を基礎とする優先権を主張するものであり、その全内容を本明細書の一部とする。
【０００２】
本発明は、使用時までの保存可能期間及び安定性保持期間を長くするためにカタラーゼ酵素を安定化する方法に関する。本発明はまた、その安定化された酵素に関する。
【背景技術】
【０００３】
酸素は、生命の維持に必要不可欠である。海洋生物は溶解した形態の酸素を利用し、ヒトを含む陸地の生物種は気体の酸素を利用する。酸素不足、即ち低酸素症は、高齢化により四肢（例えば足）における血液循環の悪化した者や、糖尿病等の病気の患者が通常経験する。研究結果によれば、高齢者の皮膚においては、正常より低い、低酸素ストレスがあることも示されている。これは、皮膚の健康状態の悪化や、皺、乾燥、および皮膚弾力の低下等が過剰に見られる状態をもたらす。長きにわたって、化粧料製造者は、このような老化関連の影響の現れを遅らせ、かつ皮膚の健康を維持するための、皮膚軟化剤、エクスフォリエーター（角質・毛穴汚れ除去剤）、保湿剤等の種々の成分を有する皮膚用製剤を提供してきた。皮膚への酸素の直接的な供給を目的とした製剤はほとんど存在しなかった。
【０００４】
医療用、例えば、損傷した皮膚（創傷、炎症、及び外傷）の治療のため、更に近年では無傷の皮膚の処置のための皮膚への酸素供給が試みられてきた。例えば、Ｌａｄｉｚｉｎｓｋｙは、酸素を発生する創傷用包帯剤の特許を取得した（特許文献１）。最近では、Ｇｉｂｂｉｎｓらが、ポリアクリル酸塩ポリマーをベースにした酸素を発生する発泡包帯剤の製造方法で特許を取得した（特許文献２）。酸素を発生する発泡包帯剤の製造方法は簡単であるが、包帯剤自体はいくつかの欠点を有する。例えば、包帯剤の保存可能期間は、時間の経過につれて包帯剤から酸素が発泡セルから分散してしまうため十分長くはない。短い保存期間の問題を解決するため、発泡包帯剤の代替物として、オンデマンドの酸素発生局所組成物が提案された（Ｌａｄｉｚｉｎｓｋｙ、特許文献３）。特許文献３に開示のものでは、触媒を含むゲルと過酸化物が別々のリザーバに含められ、塗布の直前に混合されて、その混合物は皮膚に塗布されて、接触した状態を維持するように皮膚をカバーする。化粧品用途であれ医療用途であれ、酸素の発生は、概して、通常は過酸化水素である過酸化物の触媒を用いた分解によって達成される。
【０００５】
触媒と過酸化物を用いるあらゆる用途でみられる問題は、保存中、短時間の間に触媒が不活性化し得ることである。高温は、多くの触媒の不活性化を促進する。近代的な配送と顧客の利用のために、製品は、パッケージング、配送、展示、販売のために十分な期間にわたって安定であり、かつ及び使用者の自宅や他の場所において安定であることが重要である。組成物中の過酸化物及び／または触媒の安定化は、製品の長期間の保存を可能にする進歩となろう。製品が配送業界において一般的にみられる高温状態でも安定的であれば、それも望ましいことであろう。
【０００６】
長期間かつ高温下で触媒及び／または過酸化物を安定化させる方法の必要性が存在する。これにより、顧客が使用できるようになる前に製品が不活性化することなく、製品を製造、パッケージング、保管、配送することが可能となる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，７９２，０９０号明細書
【特許文献２】米国特許第７，１６０，５５３号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／００７４８８０号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
より長期間にわたって安定性を維持し得るように、触媒、特にカタラーゼを安定化させる方法が提供される。高温において触媒を安定化させる方法も提供される。
【０００９】
本発明の方法では、基質をリン酸ホウ酸塩及びカタラーゼと十分に混合し、水でリンスして、乾燥した固形物を得る。乾燥した固形物は、更なる安定化のために、ポリビニルアルコールと混合し、乾燥させてもよい。この安定化された粉末は、種々の皮膚適用溶液（ローション、軟膏等）と混合することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
不活性化することなく保管可能となるようにカタラーゼを安定化する方法について、以下に記す。カタラーゼは、通常は細菌及び真菌によって産生される酵素であり、過酸化物を酸素に分解する触媒として使用できる。この分解は非常に短時間で生ずるが、分解は、それがうまく行われるためには、所与の量の過酸化物に対して十分な量のカタラーゼを有しているか否かに依存する。カタラーゼは、時間の経過につれて容易に失活し得るので、カタラーゼの安定化は、その有用な寿命を延ばし、その商品としての利用可能性を向上させ得る。配送中に曝される温度は多くの触媒を不活性化させるのに十分に高い温度であり得ることから、高温での安定化もまた重要である。
【００１１】
以下の手順は、カタラーゼが安定化及び保存の後にどの程度その活性を維持するかを決定するために用いられるカタラーゼ活性の測定方法として一般的に利用されるものである。その手順の説明の後に、本発明の安定化されたカタラーゼの調製の実施例を記す。下記の実施例では、基質として微結晶性セルロースを用いているが、セラミックや金属を含むあらゆる適切な基質を使用できることに留意されたい。
【００１２】
カタラーゼ活性の有無の解析
【００１３】
カタラーゼ酵素の活性値は、国際単位（ＩＵ）で定められる。溶液または（懸濁液中の）固形粉末は、それが２５℃でｐＨ７のとき一分当たり１マイクロモルの過酸化水素を分解できる場合に１ＩＵ／ｍｌまたはｇの活性を有すると定義される。カタラーゼ活性の解析中に、過酸化水素濃度は好ましくは１０〜５０ｍＭに維持される。
【００１４】
カタラーゼ活性を測定するための解析手順は単純で、酵素関連業界の当業者には既知のものである。簡単に説明すると、未知の濃度のカタラーゼ溶液を過酸化水素溶液に添加した後、ＵＶ可視化分光光度計を用いて２４０ｎｍの過酸化物吸収を経時的にモニタリングする。吸光度は過酸化物濃度に線形相関することから、吸光度−時間データを用いて、過酸化物濃度−時間データが得られる。２４０ｎｍにおける過酸化水素のモル吸光係数は３９．４リットル／モル−ｃｍであることに留意されたい。動的データから、初期値（時間０）が得られ、それがカタラーゼ活性を計算するために用いられる。
【実施例】
【００１５】
実施例１（比較例） ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）で外面被覆されたカタラーゼで被覆されたセルロース（ＣＣＰ）の調製（非吸収法）
【００１６】
ＰＶＡで外面被覆されたセルロース・カタラーゼ複合体（以下、ＣＣＰという）のベンチスケールの調製方法について報告する。この方法は長時間の吸収ステップを含まないものだった。その原理的意義は、長期にわたって安定なＣＣＰを短時間で、即ち商業的には常に望ましい方式で作製できるかを確認することである。
【００１７】
簡単に説明すると、微結晶性セルロース粉末（６．０ｇ、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＣ１０５（ＦＭＣ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ製））をペトリ皿に置いた。セルロースに対して、十分な量のカタラーゼ溶液（グレード１５００Ｌ、活性：５０，０００ＩＵ／ｍｌ（ＢＩＯ−ＣＡＴ  Ｉｎｃ．米国バージニア州トロイ））を、ＣＣＰの目標の理論上の活性値が約１０，０００ＩＵ／ｇとなるように添加した。ペトリ皿のスラリーを１５分間撹拌した後、皿を真空チャンバに置いて水分を除去し、粉末を乾燥させた。定期的に、ペトリ皿の重量をチェックした。重量が無変化になったことを確認したとき、真空環境に置くのを止めた。皿の重量を再測定し、約５．９８ｇのＣＣＰ粉末を得た。ＣＣＰの活性値は、２９２２ＩＵ／ｇであることが分かった（カタラーゼ活性の測定の概要の説明を参照）。次のステップにおいて、十分な量の２．４％ｗ／ｗのＰＶＡ溶液（ＰＶＡ９８＋％加水分解、ＭＷ：８５Ｋ〜１２４Ｋ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製））を、ＰＶＡ／セルロース質量比が０．０２となるようにＣＣＰに添加した。再度、ペトリ皿のスラリーを１５分間撹拌した。その後、溶液の除去のために皿を真空チャンバに戻した。皿の重量が無変化になったことを確認したとき（数時間かかる）、真空環境に置くのを止めた。
【００１８】
乾燥したＣＣＰを皿の表面から掻き落とし、バイアル瓶に移し、４℃で保管した。ＣＣＰの活性の測定値は５２７ＩＵ／ｇであった。従って、ＰＶＡ被覆及び乾燥の後、ＣＣＰの有意な失活が生じた。
【００１９】
経時劣化の効果を理解するために、ＣＣＰ粉末の乾燥サンプルを４℃、２５℃、及び４０℃で１週間維持し、その後それらの活性を再度測定した。２５℃及び４０℃では、活性値はそれぞれ３４４ＩＵ／ｇ及び９９ＩＵ／ｇとなり、３５％及び８１％の失活が生じた。４℃では、測定値は４４１ＩＵ／ｇであり、１６％の失活がみられた。活性値測定の結果から、単に各成分をブレンドし、得られた混合物を乾燥することによる単純なＣＣＰの調製では、長期にわたって安定なＣＣＰプロトタイプは作り出されないことは明白である。
【００２０】
実施例２ ＰＶＡで外面被覆されたカタラーゼを吸収したセルロース粉末の調製
【００２１】
ここでは、単にカタラーゼ、セルロース粉末、及びＰＶＡを混合するのではなく、カタラーゼ酵素を吸収した微結晶性セルロース粉末を調製し、次に保護のためのＰＶＡの薄い被膜で外面被覆する（ＣＣＰ−Ａ）方法について記す。この方法は、カタラーゼがどのようにセルロース粉末に適用されるかという点を除いて、実施例１に記載したＣＣＰの作製方法と同一である。
【００２２】
予め重量が測定された空の円錐形の底部を有するＰＰ（ポリプロピレン）管（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ製）に、所定の重量（０．５ｇ）の微結晶性粉末（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）ＰＣ１０５）を添加した。この添加の後、４．５ｍｌのリン酸バッファまたはホウ酸塩バッファ（０．０５Ｍ、ｐＨ：６．７）及び０．５ｍｌの５０００Ｕ／ｍｌの活性値を有する希釈カタラーゼ溶液を加えた。希釈溶液は、約５０，０００Ｕ／ｍｌの活性値を有するカタラーゼストック溶液（グレード１５００Ｌ）から調製した。内容物をボルテックスミキサー上で短時間混合し、管を８００ｒｐｍで２４時間に設定したシェーカーに置いた。
【００２３】
２４時間後、管から液体を流し出し、残った固形物を各回５ｍｌの脱イオン水で３回リンスした。各リンス後に、液体は廃棄した。３回目のリンスの後、管中の湿ったセルロース固形物に１ｍｌの１％ｗ／ｗのＰＶＡ溶液を添加し、内容物をボルテックスミキサーで均一に混合した。得られた上清をペトリ皿に注いだ。管中に残ったすべてのセルロースは２ｍｌの脱イオン水を加えることによって再懸濁し、上清をペトリ皿に移した。
【００２４】
ペトリ皿の液体は、換気フード内において室温で一晩空気乾燥させた。乾燥したＣＣＰ−Ａ粉末を、鋭利ではないナイフで皿表面から静かに掻き落とし、重量を測定した（０．４ｇ）。セルロース重量ベースでのＣＣＰ―Ａの歩留まりは約８０％であった。
【００２５】
この実施例では、複数回のカタラーゼ活性測定を行った。第１回目は、湿ったセルロースのカタラーゼ活性値を測定した（２２８２Ｕ／ｇ）。第２回目は、乾燥後に、得られたＣＣＰ−Ａの活性値を測定し、１９８０Ｕ／ｇを得た。この値は乾燥後に約１３％失活しているが、実施例１でみられた結果と比較すると依然として妥当なレベルと考えられた。
【００２６】
実施例３ ５００ＩＵ／ｇの活性のＣＣＰ−Ａをブレンドした皮膚用保湿剤の調製
【００２７】
この試験の目的は、（ｉ）ＣＣＰ−Ａサンプルを調製し、（ｉｉ）そのＣＣＰ−Ａを皮膚用保湿ローションにブレンドし、かつ（ｉｉｉ）ＣＣＰ−Ａをブレンドした皮膚用保湿剤を（配送環境をシミュレートするために）熱サイクルにかけ、２年間の保存可能期間に対応する加速経時劣化試験を行うことにある。ここで用いられる皮膚保湿剤はＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（米国カリフォルニア州、ファウンテンバレー）製の皮膚保湿ローション製剤１５５３−０７であるが、この手順は、実質的にあらゆるスキンローション、軟膏等についても用いることができると考えられる。
【００２８】
ＣＣＰ−Ａ粉末の調製
以下の成分を１５ｍｌの円錐形ＰＰ管に加えて、セルロース上のカタラーゼの吸収を起こすために室温でシェーカーに置いた。
微結晶性セルロース          ０．５５ｇ
ＢＩＯ−ＣＡＴ  １５００Ｌ  １．６７ｍｌ
リン酸（またはホウ酸塩）バッファ              ３．３３ｍｌ
【００２９】
吸収ステップの後、実施例２と同じ手順に従って、ＣＣＰ−Ａ粉末を得た。全部で４つのバッチを作製し、プールした後、これらのバッチから概ね２．５ｇの粉末が得られた。セルロースに基づく歩留まりは１００％以上であったが、これは長期間の乾燥後でさえも残っていた約１０％の水分の結果であった。得られた粉末は自由流動性であったので、次のステップでは更なる処理をすることなく使用した。ＣＣＰ−Ａのプールされたサンプルのカタラーゼ活性の測定値は５１０３ＩＵ／ｇであった。
【００３０】
ＣＣＰ−Ａをブレンドした皮膚用保湿剤の調製
乾燥したＣＣＰ−Ａ粉末（１．５ｇ）を、皮膚用保湿剤ローション（１３．５ｇ）に１０％ｗ／ｗの負荷でブレンドし、サンプルにおいて約５００ＩＵ／ｇの開始時カタラーゼ活性値を得た。ローション中におけるカタラーゼ活性測定の困難さのために、カタラーゼの存在は、過酸化水素をＢｅｎｃｈＭａｒｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製０２Ｒｅｓｅｒｖｏｒ１５７４−０６を１：１の比率で混合した後、過酸化水素の分解を定量することによって間接的に確認した。作りたてのカタラーゼを含む皮膚用保湿剤ローションは、５分余りで過酸化物を１００％分解した。（合格基準は、２０分後に最小で６０％の分解とした。）
【００３１】
５００ＩＵ／ｇでＣＣＰ−Ａを含む皮膚用保湿剤ローションの熱サイクル及び加速経時劣化
カタラーゼは３７℃以上の温度で劣化することが知られており低温条件（−２０℃）は特別な結果は生じないことから、省略式熱サイクルを使用した。省略式熱サイクルでは、ローションのサンプルを４０℃で７２時間経時劣化させた後、５５℃で６時間経時劣化させた。次に、サンプルを３５℃に設定されたオーブン中に置き、加速経時劣化のために１６週間にわたってその過酸化物分解効果をモニタリングした。化粧剤業界の基準として、３５℃で１６週間の経時劣化は、実時間で２年間の保存可能期間の合理的な推定値と考えられる。対照としての役割を果たす第２のサンプルを室温（約２５℃）に維持した。
【００３２】
下記の表は、１６週間にわたる過酸化物分解値のパーセンテージを示す。全ての値が合格基準として設定した６０％超であることに注意されたい。それでも、これらは実験誤差の範囲内で６０％に近い値である。従って、本発明者は、ＣＣＰ−Ａを有する皮膚用保湿剤ローションのサンプルは、配送環境に耐える能力をもつことが立証され、２年間の保存可能期間も満たしたものと結論付けた。
【００３３】
【表１】
0006461014.tif 000002
【００３４】
実施例４ １０００ＩＵ／ｇの活性のＣＣＰ−Ａをブレンドした皮膚用保湿剤の調製
【００３５】
以下の変更点を除いて実施例３と同様の方式でＣＣＰ−Ａを調製した。
微結晶性セルロース          ２．００ｇ
ＢＩＯ−ＣＡＴ  １５００Ｌ  ２．００ｍｌ
リン酸（またはホウ酸塩）バッファ              ３．００ｍｌ
得られたＣＣＰ−Ａ粉末は、２１，０００ＩＵ／ｇの酵素活性を有していた。
【００３６】
カタラーゼを吸収させた皮膚用保湿剤のブレンドを、セルロース粉末（１．０ｇ）をベースの皮膚用保湿剤ローション（１９．０ｇ）にブレンドして、開始時活性値が約１０００ＩＵ／ｇ、即ち実施例３のサンプルの値の２倍となるように調製した。そのサンプルを実施例３と同様に熱サイクルにかけ、次に３５℃で熱的に経時劣化させ、同一の対照サンプルは２５℃に維持した。前と同様に、各週毎に、過酸化物を分解するサンプルの効果を、１６週間にわたってモニタリングした。得られた結果はパーセント分解値として下記の表に示す。
【００３７】
【表２】
0006461014.tif 000003
【００３８】
全期間にわたる過酸化物分解の結果は、常に６０％超であり、従って設定した基準を十分に満たしている。そのような非常に不都合な環境におけるカタラーゼに対する優れた安定化効果が立証されたことは、当業者の知識の範囲内にあって初めてのことである。実施例３及び４におけるパーセント分解率の結果を比較すると、安定的な市販の皮膚用保湿剤ローションにおいては、開始時カタラーゼ活性が５００〜１０００ＩＵ／ｇで２年間の保存可能期間を有するものが選択されるとみられる。この実施例におけるローションサンプルは、試験は行っていないが、１６週を超えて同じ過酸化物分解効果を示し得た可能性も十分にある。そのような長期間の保存可能期間を有するため、本発明のローションのプロトタイプは、既に現在市販されているあらゆるカタラーゼ含有製品より機能的に優れている。
【００３９】
上述の実施例２〜４によって示されたように、本明細書において、微結晶性セルロース粉末、リン酸（またはホウ酸塩）バッファ、及びカタラーゼ酵素を十分に混合して、固形物と液体の混合物を作製するステップにより安定化された微結晶性セルロースを調製する方法が提供される。次に前記液体を前記混合物から流し出し、残った固形物を水でリンスする。一般的に、リン酸（またはホウ酸塩）バッファまたはカタラーゼ酵素に対するセルロースの比率は１〜１０であり、カタラーゼ酵素に対するリン酸（またはホウ酸塩）バッファの比率は０．５〜１０である。得られた酵素は、２５℃で５００ＩＵ／ｇ〜１０００，０００ＩＵ／ｇの活性を有する。
【００４０】
実施例はまた、乾燥した流動性を有するカタラーゼ含有粉末が、本明細書に記載の方法によって作成され得ることも示している。カタラーゼは乾燥形態で安定化させるのが困難であることが知られており、従ってこの簡単な方法は、触媒の安定化の分野での進歩をもたらすものである。
【００４１】
本明細書に記載されたカタラーゼの安定化に加えて、予想外の発見として、異なる生物に由来するカタラーゼのなかで、真菌、黒色アスペルギルスに由来するものが、曝される熱や化学的環境に対して最も安定的であることも見いだされた。セルロースに吸収された状態にあるバッファ溶液中のカタラーゼは、化粧料組成物中の化学物質成分または熱による劣化に対する耐性を示し、厳しい条件の配送中に活性を失わず、かつ加速された経時劣化をシミュレートする熱の下で長期化された経時劣化期間を有する組成物を製造するために必要な活性を保持した。
【００４２】
望ましいカタラーゼ源が真菌の黒色アスペルギルスであるとしても、他の種々の市販されている真菌株も利用できることを、当業者は理解されよう。本発明は、あらゆる真菌株を含む、あらゆるカタラーゼ源に由来するカタラーゼを包含することに留意することは重要である。黒色アスペルギルスに由来するカタラーゼ分子は、マンガン原子を含むことが知られている。カタラーゼは遺伝子組換え生物に由来するものであってもよく、この場合、黒色アスペルギルスまたは一般的に真菌に由来するものであり得るカタラーゼ生成ベクターが導入されるホスト生物が真菌または他の生物であり得る。従って、より広い態様では、本発明は、真菌または他の生物等の由来とは無関係に、その分子構造の内部に１つまたは複数のマンガン原子を有するカタラーゼを包含する。その分子構造にマンガン分子を有し、かつ分子量が５００，０００ダルトン未満のカタラーゼが望ましい。