(57)【要約】【課題】【解決手段】式１の化合物又はその塩を合成する方法であって、フコースと転移可能な酵素の触媒作用下で式２のフコシルドナーと式Ｈ−Ａ−Ｒ１（Ａ及びＲ１は下記）のアクセプター又はその塩とを反応させる方法、式１’の化合物、その人乳オリゴ糖製造での使用、人乳オリゴ糖製造方法及びフコシルドナー。2014510098.tif 000037（Ａはラクトシル部分であるか、ラクトシル部分とグルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸から選ばれる少なくとも１つの単糖ユニットからなる炭水化物リンカーであり、Ｒ１は以下のアノマー保護基の１つであり［ａ）−ＯＲ２（Ｒ２は触媒水素化分解で除去可能な保護基）、ｂ）−ＳＲ３（Ｒ３は任意置換されたアルキル、任意置換されたアリール又は任意置換されたベンジル）、ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（Ｒ’は独立に−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選ばれる電子求引性基の１つであるか、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンでいずれのメチレン基も任意に１又は２つのアルキル基で置換）を形成しており、Ｒ”はＨ又はアルキル）］、Ｘはグアノシンジフォスファチル部分、ラクトース部分、アジド、フルオライド、任意置換されたフェノキシ基、任意置換されたピリジニルオキシ基、任意置換された式Ａの３−オキソ−フラニルオキシ基、任意に置換された式Ｂの１，３，５−トリアジニルオキシ基、式Ｃの４−メチルウンベリフェリルオキシ基及び式Ｄの基から選択（Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（Ｒｂは独立にＨ又はアルキル）で表わされ、Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノから選ばれ、ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノ）から選択））【選択図】なし
2014510098.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表される化合物又はその塩を合成する方法であって、
【化１】
2014510098.tif 000030
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つであり、
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つであるか、又は、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に、５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
フコースを転移可能な酵素の触媒作用下で、下記式２で表されるフコシルドナーと、式Ｈ−Ａ−Ｒ１（式中、Ａ及びＲ１は上記に定義された通り）で表されるアクセプター又はその塩とを反応させることを特徴とする方法。
【化２】
2014510098.tif 000031
（式中、Ｘは、グアノシンジフォスファチル部分、ラクトース部分、アジド、フルオライド、任意に置換されたフェノキシ基、任意に置換されたピリジニルオキシ基、任意に置換された下記式Ａで表される３−オキソ−フラニルオキシ基、任意に置換された下記式Ｂで表される１，３，５−トリアジニルオキシ基、下記式Ｃで表される４−メチルウンベリフェリルオキシ基、及び下記式Ｄで表される基からなる群より選択される。
【化３】
2014510098.tif 000032
（式中、Ｒａは独立に、Ｈ若しくはアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択され、
ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される））
【請求項２】
酵素が、フコシルトランスフェラーゼ、又は、フコシダーゼであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フコシダーゼが、操作されたトランスフコシダーゼ、又は、操作されたフコシンターゼであることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記操作されたトランスフコシダーゼ又は前記操作されたフコシンターゼが、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スルフォロブス・ソルファタリクス又はテルモトガ・マリチマに由来することを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記フコシダーゼが操作されたα−トランスフコシダーゼであり、且つ、式２で表される化合物が２’−Ｏ−フコシルラクトースであるか、又は、式２中のＸがフルオライド、フェノキシ基、ｐ−ニトロフェノキシ基、２，４−ジニトロフェノキシ基、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ基、４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ基、４，６−ジエトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ基、２−エチル−５−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基、５−エチル−２−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アクセプターが、アノマー保護された形態の脱フコシル化した人乳オリゴ糖であることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
下記式１で表される化合物又はその塩。
【化４】
2014510098.tif 000033
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つである（但し、Ｒ１が−ＯＲ２である場合には、リンカーＡはＮ−アセチルノイラミン酸を含まない）。
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つである、或いは、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”はＨ又はアルキルである））
【請求項８】
下記式１’で表されることを特徴とする、請求項７に記載の化合物。
【化５】
2014510098.tif 000034
（式中、Ａ及びＲ１は請求項７に定義された通りである）
【請求項９】
前記炭水化物リンカーＡが、末端フコシル部分と共に、人乳オリゴ糖グルコシル残基を形成することを特徴とする、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記炭水化物リンカーＡが、ラクトサミニル残基及び／又はイソラクトサミニル残基を含むことを特徴とする、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
２’−Ｏ−フコシルラクトース、３−Ｏ−フコシルラクトース、３’−Ｏ−シアリル−３−Ｏ−フコシル−ラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩＩ、Ｆ−ＬＳＴ  ａ、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ及びＦ−ＬＳＴ  ｃのβ−Ｒ１−グリコシドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
２’−Ｏ−フコシルラクトース、３−Ｏ−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ、Ｆ−ＬＳＴ  ａ、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ及びＦ−ＬＳＴ  ｃのβ−ＯＲ２−及びβ−ＳＲ３−グリコシドからなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２がベンジル又は２−ナフチルメチル基（各基は任意に、フェニル、アルキル又はハロゲンからなる群より選択される少なくとも１つの基で置換される）であり、又はＲ３がフェニル又はベンジルであることを特徴とする、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
フコシル化人乳オリゴ糖又はその塩の製造における、請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の式１’で表される化合物又はその塩の使用。
【請求項１５】
前記人乳オリゴ糖又はその塩がフコシル化人乳オリゴ糖又はその塩であり、前記製造が、前記式１’で表される化合物又はその塩からアノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
人乳オリゴ糖又はその塩を製造する方法であって、下記式１’で表される化合物又はその塩からアノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含む方法。
【化６】
2014510098.tif 000035
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つである（但し、Ｒ１が−ＯＲ２である場合には、リンカーＡはＮ−アセチルノイラミン酸を含まない）。
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つである、或いは、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【請求項１７】
前記式１’で表される化合物又はその塩が、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法によって形成されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
フコシル化オリゴ糖又はその塩を製造する方法であって、
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法に従って、式１で表される化合物又はその塩を合成する工程、及び
前記式１で表される化合物又はその塩からアノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含む方法。
【請求項１９】
下記式２Ａで表される化合物。
【化７】
2014510098.tif 000036
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、好ましくはＲａは独立にＨ、メチル又はエチルである）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フコオリゴ糖配糖体の酵素的合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗菌性、抗ウイルス性、免疫システム及び認知発達促進活性などの特有の生物学的活性に直接関連する人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、非常に重要である。ＨＭＯは、腸内細菌叢の発達及び維持に寄与するヒト腸内システムでプレバイオティクスとして作用することが分かっっている。さらに、ＨＭＯは、抗炎症性物質であることも証明されている。従って栄養産業において、ＨＭＯは、合成及び天然型化合物及びその塩のいずれもが、乳児用粉ミルク、乳児用シリアル、乳児用臨床栄養製品、幼児用粉ミルクなどの生産において、又は、子供、大人、高齢者又は授乳中の女性向けの栄養補助食品もしくは機能的健康食品として、魅力的な成分である。ＨＭＯは、医薬産業においても治療法を開発する上で関心を集めている。
【０００３】
フコース含有ＨＭＯにおいて、フコース残基は、α−グリコシド結合を介して、Ｄ−ガラクトースの２−Ｏ−位、Ｄ−グルコースの３−Ｏ−位、及びＮ−アセチルグルコサミンの３−又は４−Ｏ−位に結合することができる。最も重要なフコシル化ＨＭＯは、２’−Ｏ−フコシルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、３−Ｏ−フコシルラクトース（Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、３’−Ｏ−シアリル−３−Ｏ−フコシル−ラクトース（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、ジフコシルラクトース（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ（Ｇａｌβ１−３［Ｆｕｃα１−４］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ（Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ（Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  Ｉ（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３［Ｆｕｃα１−４］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩ（Ｇａｌβ１−３［Ｆｕｃα１−４］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩＩ（Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、Ｆ−ＬＳＴ  ａ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３［Ｆｕｃα１−４］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ（Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−３［ＮｅｕＡｃα２−６］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、Ｆ−ＬＳＴ  ｃ（ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）、フコシル−ラクト−Ｎ−（ネオ）ヘキサオース、ジフコシル−ラクト−Ｎ−（ネオ）ヘキサオース、シアリル−フコシル−ラクト−Ｎ−（ネオ）ヘキサオース、シアリル−ジフコシル−ラクト−Ｎ−（ネオ）ヘキサオース、及びトリフコシル−ラクト−Ｎ−（ネオ）ヘキサオースである（非特許文献１及び２並びにこれらに引用されている文献）。
【０００４】
天然由来のＨＭＯを得ることには限りがある。ヒトの成熟乳は、最高濃度のＨＭＯ（１２〜１４ｇ／ｌ）を含む天然の乳源であり、その他の乳源には、ウシのミルク（０．０１ｇ／ｌ）、ヤギのミルク及び他の哺乳動物のミルクがある。多数の似た様なオリゴ糖が存在するため、たとえミリグラム単位であっても、ヒト及び他の哺乳動物のミルクからフコオリゴ糖を単離することは、かなり難しい。これまで、ＨＭＯの天然源から何種かのフコオリゴ糖を単離するために開発されてきたのは、ＨＰＬＣ分析法のみである。この天然で入手できる可能性が低いこと及び単離が難しいことが、ＨＭＯの製造のためのバイオテクノロジー及び化学的方法の開発の重要な理由となっている。
【０００５】
複合フコオリゴ糖の化学合成は、保護及び脱保護戦略を用いる多段階合成経路を必要とする。立体選択的化学合成工程は、保護基を広く使用することにより複雑になり得る。これらの戦略は、ハロゲン化グリコシル、チオグリコシド又はトリクロロアセトイミダートドナー活性化を用い、適当な保護グリコシルアクセプターの立体選択的Ｏ−フコシル化を介して、フコシル化オリゴ糖をもたらす。フコシル化のために高価な又は毒性のある化学物質（例えばシアン化水銀、臭化水銀、炭酸銀又は臭化銀）を使用することは、これらの方法を魅力ないものにしている理由のひとつである。同様に、非効率的な立体制御及び／又は低収率が、これらの戦略をさらなる開発に適さないものとしている。さらに、これら戦略は、操作が長く単調で、精製がひどく困難であることを特徴とする。
【０００６】
フコオリゴ糖の酵素生成において、好ましく使用される酵素はフコシルトランスフェラーゼ及びフコシダーゼであった。酵素的フコシル化は通常、高い位置選択性や立体選択性で行われるが、これらの複合酵素システムを用いた手法は、大規模製造を高価なものにし、同様に、困難な精製プロトコールはさらなる技術開発の妨げとなる。これらの欠点は酵素工学（enzyme engineering）における新たな成果によって徐々に克服されてきているように見える（非特許文献３及び４並びにこれらに引用されている文献の報告を参照）。近年、向上したフコシル化活性を有する突然変異体フコシダーゼとして、トランスフコシダーゼ及びフコシンターゼが開発されている（非特許文献５、６及び７）。
【０００７】
天然起源プール（例えばヒトミルク）中に多数のオリゴ糖が存在するため、単離技術では、多量のフコオリゴ糖を得ることができなかった。さらに、極めて似た構造を有する位置異性体が存在するため分離技術はうまくいかなかった。
【０００８】
近年、任意にフコースで置換されたシアロオリゴ糖誘導体が開示されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／００７５８８
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】C. Kunz et al. Annu. Rev. Nutr. 20, 699（2000)
【非特許文献２】T. Urashima et al.：Milk Oligosaccharides, Nova Science Publishers, New York（2011)
【非特許文献３】S. M. Hancock et al. Curr. Opin. Chem. Biol. 10、509（2006)
【非特許文献４】R. Kittl et al. Carbohydr. Res. 345, 1272（2010)
【非特許文献５】G. Osanjo et al. Biochemistry 46, 1022（2007)
【非特許文献６】J. Wada et al. FEBS Lett. 582, 3739（2008)
【非特許文献７】B. Cobucci−Ponzano et al. Chem. Biol. 16, 1097（2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この数十年の間、フコシル化ＨＭＯの調製及び製品化に対する関心は絶えず高まりつつあるが、今もなお、調製の簡素化が可能で、なおかつ、従来の方法で直面している精製の問題の克服又は回避が可能な新規の方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
第１のアスペクトにおいて、本発明は、下記式１で表される化合物又はその塩を合成する方法であって、
【００１３】
【化１】
2014510098.tif 000003
【００１４】
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基（anomeric protecting group）の１つであり、
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解（catalytic hydrogenolysis）により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２
（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つであるか、又は、
２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に、５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、
Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【００１５】
フコースを転移可能な酵素の触媒作用下で、下記式２で表されるフコシルドナーと、式Ｈ−Ａ−Ｒ１（式中、Ａ及びＲ１は上記に定義された通り）で表されるアクセプター又はその塩とを反応させることを特徴とする方法を提供する。
【００１６】
【化２】
2014510098.tif 000004
【００１７】
（式中、Ｘは、グアノシンジフォスファチル部分（guanosine diphosphatyl moiety）、ラクトース部分、アジド、フルオライド、任意に置換されたフェノキシ基、任意に置換されたピリジニルオキシ基、任意に置換された下記式Ａで表される３−オキソ−フラニルオキシ基、任意に置換された下記式Ｂで表される１，３，５−トリアジニルオキシ基、下記式Ｃで表される４−メチルウンベリフェリルオキシ基、及び下記式Ｄで表される基からなる群より選択される。
【００１８】
【化３】
2014510098.tif 000005
【００１９】
（式中、Ｒａは独立に、Ｈ若しくはアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択され、
ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される））
【００２０】
前記酵素は、フコシルトランスフェラーゼ及びフコシダーゼからなる群より選択されることが好ましい。より好ましくは、前記酵素は、操作された（engineered）トランスフコシダーゼ、又は、操作されたフコシンターゼである、フコシダーゼである。前記操作されたトランスフコシダーゼ又は操作されたフコシンターゼは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スルフォロブス・ソルファタリクス又はテルモトガ・マリチマに由来することが好ましい。より好ましくは、前記フコシダーゼ酵素が操作されたα−トランスフコシダーゼであり、且つ、式２で表される化合物が２’−Ｏ−フコシルラクトースであるか、又は、式２中のＸがフェノキシ基、ｐ−ニトロフェノキシ基、２，４−ジニトロフェノキシ基、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ基、４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ基、４，６−ジエトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ基、２−エチル−５−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基、５−エチル−２−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基からなる群より選択されるかのいずれかである。
【００２１】
前記アクセプターは、アノマー保護された（anomerically protected）形態の脱フコシル化した人乳オリゴ糖であることが好ましい。Ａ及びＲ１は、下記第２のアスペクトの発明の好ましい特徴で定義したものであることが好ましい。
【００２２】
第２のアスペクトにおいて、本発明は、下記式１で表される化合物又はその塩を提供する。
【００２３】
【化４】
2014510098.tif 000006
【００２４】
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基（anomeric protecting group）の１つである（但し、Ｒ１が−ＯＲ２である場合には、リンカーＡはＮ−アセチルノイラミン酸を含まない）。
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つであるか、或いは、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【００２５】
好ましくは、本発明における前記化合物は下記式１’で表されることを特徴とする。
【００２６】
【化５】
2014510098.tif 000007
【００２７】
（式中、Ａ及びＲ１は上記に定義された通りである）
【００２８】
前記炭水化物リンカーＡが、末端フコシル部分と共に、人乳オリゴ糖グルコシル残基を形成することが好ましい。前記炭水化物リンカーＡは、ラクトサミニル残基及び／又はイソラクトサミニル残基を含むことが好ましい。炭水化物リンカーＡにおいて、前記ラクトシル部分は、前記リンカーの還元末端にあることが好ましい。
【００２９】
本発明に係る化合物は、２’−Ｏ−フコシルラクトース、３−Ｏ−フコシルラクトース、３’−Ｏ−シアリル−３−Ｏ−フコシル−ラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩＩ、Ｆ−ＬＳＴ  ａ、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ及びＦ−ＬＳＴ  ｃのβ−Ｒ１−グリコシドからなる群より選択されることが好ましい。本発明に係る化合物は、２’−Ｏ−フコシルラクトース、３−Ｏ−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ、Ｆ−ＬＳＴ  ａ、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ及びＦ−ＬＳＴ  ｃのβ−ＯＲ２−及びβ−ＳＲ３−グリコシドからなる群より選択されることがより好ましい。好ましくは、Ｒ２はベンジル又は２−ナフチルメチル基（各基は任意に、フェニル、アルキル又はハロゲンからなる群より選択される少なくとも１つの基で置換される）であり、又はＲ３はフェニル又はベンジルである。
【００３０】
第３のアスペクトにおいて、本発明は、フコシル化人乳オリゴ糖及びその塩の合成における、第２のアスペクトの式１’で表される化合物又はその塩の使用を提供する。
【００３１】
【化６】
2014510098.tif 000008
【００３２】
（式中、Ａ及びＲ１は上記に定義された通りであり、Ａは末端フコシル部分と共に人乳オリゴ糖グルコシル残基であることが好ましい）。
【００３３】
前記合成は、アノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含む。
【００３４】
Ａ及びＲ１は、上記第２のアスペクトの発明の好ましい特徴で定義したものであることが好ましい。
【００３５】
第４のアスペクトにおいて、本発明は、人乳オリゴ糖又はその塩を製造する方法であって、下記式１’で表される化合物又はその塩からアノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含む方法を提供する。
【００３６】
【化７】
2014510098.tif 000009
【００３７】
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つである（但し、Ｒ１が−ＯＲ２である場合には、リンカーＡはＮ−アセチルノイラミン酸を含まない）。
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つであるか、或いは、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【００３８】
式１で表される化合物又はその塩は、第１のアスペクトの発明の方法によって形成されることが好ましい。好ましくは、前記方法は、第１のアスペクトの発明の方法に係る式１で表される化合物又はその塩の形成における、第６のアスペクトの式２Ａで表される化合物の、フコシルドナーとしての使用を含む。より好ましくは、該方法は、第７のアスペクトの発明の方法に係る式２Ａで表される化合物を形成する工程を含む。
【００３９】
Ａ及びＲ１は、上記第２のアスペクトの発明の好ましいアスペクトで定義したものであることが好ましい。
【００４０】
第５のアスペクトにおいて、本発明はフコシル化オリゴ糖又はその塩を製造する方法であって、
第１のアスペクトの方法に従って、式１で表される化合物又はその塩を合成する工程、及び
前記式１で表される化合物又はその塩からアノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
好ましくは、前記方法は、第１のアスペクトの発明の方法に係る式１で表される化合物又はその塩の形成における、第６のアスペクトの式２Ａで表される化合物の、フコシルドナーとしての使用を含む。より好ましくは、該方法は、第７のアスペクトの発明の方法に係る式２Ａで表される化合物を形成する工程を含む。
【００４２】
Ａ及びＲ１は、上記第２のアスペクトの方法の好ましいアスペクトで定義したものであることが好ましい。
【００４３】
第６のアスペクトにおいて、本発明は、式２Ａで表される化合物を提供する。
【００４４】
【化８】
2014510098.tif 000010
【００４５】
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、好ましくはＲａは独立にＨ、メチル又はエチルである）
【００４６】
前記式２Ａで表される化合物は、第１、第３、第４又は第５のアスペクトの発明においてフコシルドナーとして使用されることが好ましい。
【００４７】
第７のアスペクトにおいて、本発明は、第６のアスペクトの発明の化合物を合成する方法であって、
ａ）下記式３で表されるフコシル誘導体と下記式４で表される化合物とをカップリングする工程、及び
【００４８】
【化９】
2014510098.tif 000011
【００４９】
（式中、Ｒ２及びＲ３は独立に、水素化分解により除去可能な基又はアシルであり、Ｙはハロゲン、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＣＣｌ３、−Ｏ−ペンテニル、−ＯＡｃ、−ＯＢｚ又は−ＳＲ４である（式中、Ｒ４はアルキル又は任意に置換されたフェニルである））
【００５０】
【化１０】
2014510098.tif 000012
【００５１】
（式中、Ｒａは上記に定義された通りである）
【００５２】
Ｒ２及びＲ３保護基を除去する工程を含む方法を提供する。
【００５３】
Ｒ２及びＲ３が同一であり、それぞれベンジル、４−メトキシベンジル又は４−メチルベンジルであり、Ｙがトリクロロアセトイミダートである式３で表される化合物が、２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−オキソ−（２Ｈ）−フランとカップリングされ、そして触媒水素化分解されることが好ましい。
【００５４】
第８のアスペクトにおいて、本発明は第１のアスペクトの発明に従って形成された化合物を提供する。
【００５５】
第９のアスペクトにおいて、本発明は実質的に本明細書に記載された化合物、方法及び使用を提供する。
【００５６】
いずれのアスペクトの発明に関して説明された全ての特徴は、全ての他のアスペクトの発明に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
本発明は、アノマー位で保護されたフコオリゴ糖及びその塩と、その製造方法を提供する。
【００５８】
オリゴ糖の製造にどのような経路をとったとしても、最終目的物である非保護オリゴ糖は水にしか溶解せず、そのことは製造の後の工程における難題となる。製造工程に通常用いる有機溶媒は、プロセスの最終段階の反応に適していない。
【００５９】
本発明は、酵素フコシル化反応（enzymatic fucosylation reaction）における水溶性１−Ｏ−、１−Ｓ又は１−Ｎ−保護オリゴ糖中間体（protected oligosaccharide intermediate）及びその塩の利用に基づき、そして選ばれた保護基は、フコシル化グリカンを生じさせる簡素でクリーンで略定量的な反応において除去されてもよい。また、前記アノマー保護基は、前記オリゴ糖中間体に、強力な精製プロセスを助ける物理的特性及び化学的特性を提供することが好ましい。例えば、疎水性部分を導入することにより、水溶性も残しながら、誘導体をアルコールなどの有機プロトン性溶媒に溶解可能にする。これにより、サイズ排除クロマトグラフィーや逆相クロマトグラフィーなどの分離／精製技法に採用できる、幅広い水とアルコールの割合を有する移動相を使用することができる可能性が生まれる。また、導入された基における置換基を注意深く設計することにより、場合によっては結晶化合物を実現することができ、生成物精製に結晶化のみを用いた強力な製造方法の開発が可能となる。さらに、前記芳香族１−Ｏ−保護基は、副生物生成を防ぐ穏和で繊細な条件下で最終工程において、触媒水素化分解によって除去することができ、それは明らかに利点である。触媒還元（catalytic reduction）は、水溶液中で発生し得る。
【００６０】
（一般用語）
本発明において、用語「ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカー」は、Ｃ−１アノマー炭素原子によってＲ１基に結合した非保護ラクトース残基を意味する。ラクトース部は、直鎖又は分岐構造を有し、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される単糖ユニットを有するオリゴ糖の一部であってもよい。炭水化物リンカーＡにおける単糖は、グリコシド間結合に関わるＯＨ基及び還元末端のアノマーＯＨを除いて、非保護及び非置換のＯＨ基を有する。末端フコシル部分は、上記オリゴ糖残基を含有するラクトース又はラクトースのヒドロキシル基の１つに結合している。
【００６１】
本明細書において用語「水素化分解により除去可能な保護基」とは、酸素の１つ（好ましくは式１で表される化合物の１−酸素）とＣ−Ｏ結合を有する基であり、触媒量のパラジウム、ラネーニッケル又は水素化分解で用いられるその他の適切な金属触媒の存在下で水素によって該結合が切断され、その結果、親ヒドロキシ基がデマスキングされる基を意味する。このような保護基はよく知られており、「P. G. M. Wuts and T. W. Greene：Protective Groups in Organic Synthesis John Wiley & Sons,2007」に記載されている。好適な保護基としては、ベンジル、ジフェニルメチル（ベンズヒドリル）、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル又はトリフェニルメチル（トリチル）基が挙げられ、いずれもアルキル、アルコキシ、フェニル、アミノ、アシルアミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル、アジド、ハロゲンアルキル、又はハロゲンから選択される１以上の基で任意に置換されてもよい。置換基は、もし存在するならば、１または複数の芳香環上にあることが好ましい。特に好適な保護基としては、フェニル、アルキル又はハロゲンから選択される１以上の基で任意に置換されたベンジル又は２−ナフチルメチル基が挙げられる。より好ましくは、保護基は非置換ベンジル、非置換２−ナフチルメチル、４−クロロベンジル、３−フェニルベンジル及び４−メチルベンジルから選択される。これらの特に好適でより好ましい保護基は、それぞれ、水素化分解の副生成物が、もっぱらトルエン、２−メチルナフタレン、又は、置換トルエン誘導体又は２−メチルナフタレン誘導体であるという利点を有する。このような副生成物は、数トンの規模でも、水溶性オリゴ糖産物から蒸発及び／又は抽出過程を介して容易に除去することができる。
【００６２】
本明細書中、用語「アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルなどの、炭素数１から６の直鎖又は分岐鎖の飽和炭化水素基を意味する。
【００６３】
更に本明細書において、「アノマー保護基Ｒ１を除去する」は、Ｒ１基をヒドロキシル基に転換することを意味する。
【００６４】
また、用語「アリール」は、フェニル又はナフチルなどのホモ芳香族基を意味する。
【００６５】
また、「アシル」は、Ｒ−Ｃ（＝Ｏ）−基であって、ＲがＨ、アルキル（上記参照）、又はアリール（上記参照）であるものを意味する（例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、ピバロイル、ベンゾイルなど）。該アルキルもしくはアリール残基は、非置換であってもよく、アルキル（アリール残基のみ）、ハロゲン、ニトロ、アリール、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、カルバモイル、Ｎ−アルキルカルバモイル、Ｎ、Ｎ−ジアルキルカルバモイル、アジド、ハロゲンアルキル又はヒドロキシアルキルから選択される１以上の基で置換されていてもよく、アシル基、例えば、クロロアセチル、トリクロロアセチル、４−クロロベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、４−フェニルベンゾイル、４−ベンズアミドベンゾイル、４−（フェニルカルバモイル）−ベンゾイル、グリコリル、アセトアセチルなどを生じる。
【００６６】
「アルキルオキシ」又は「アルコキシ」は、酸素原子を介して親分子部分と結合しているアルキル基（上記参照）、例えばメトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシなどを意味する。
【００６７】
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを意味する。
【００６８】
「アミノ」は、−ＮＨ２基を意味する。
【００６９】
「アルキルアミノ」は、−ＮＨ−基を介して親分子部分と結合しているアルキル基（上記参照）、例えばメチルアミノ、エチルアミノなどを意味する。
【００７０】
「ジアルキルアミノ」は、窒素原子を介して親分子部分と結合している同じか又は異なる２つのアルキル基（上記参照）、例えばジメチルアミノ、ジエチルアミノなどを意味する。
【００７１】
「アシルアミノ」は、−ＮＨ−基を介して親分子部分と結合しているアシル基（上記参照）、例えばアセチルアミノ（アセトアミド）、ベンゾイルアミノ（ベンズアミド）などを表す。
【００７２】
「カルボキシル」は、−ＣＯＯＨ基を意味する。
【００７３】
「アルキルオキシカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−基を介して親分子部分と結合しているアルキルオキシ基（上記参照）、例えばメトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニルなどを意味する。
【００７４】
「カルバモイル」は、Ｈ２Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−基である。
【００７５】
「Ｎ−アルキルカルバモイル」は、−ＨＮ−Ｃ（＝Ｏ）−基を介して親分子部分と結合しているアルキル基（上記参照）、例えばＮ−メチルカルバモイルなどを意味する。
【００７６】
「Ｎ，Ｎ−ジアルキルカルバモイル」は、＞Ｎ−Ｃ（＝Ｏ）−基を介して親分子部分と結合している同じ又は異なる２つのアルキル基（上記参照）、例えばＮ，Ｎ−メチルカルバモイルなどを意味する。
【００７７】
（フコシル化オリゴ糖）
本発明は、下記式１で表されるフコシル化オリゴ糖及びその塩を提供する。
【００７８】
【化１１】
2014510098.tif 000013
【００７９】
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つである（但し、Ｒ１が−ＯＲ２である場合には、リンカーＡはＮ−アセチルノイラミン酸を含まない）。
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つである、或いは、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【００８０】
少なくとも１つのシアリル残基を含有する本発明の式１で表されるオリゴ糖は塩の形態（これは、化学量論比にある負電荷を有するシアリル化オリゴ糖の酸残基及び１以上のカチオンからなる結合イオン対を意味する）であってもよい。該カチオンは、正電荷を有する原子又は分子である。該カチオンは、無機カチオンでも有機カチオンでもよい。無機カチオンとしては、アンモニウムイオン、アルカリ金属、アルカリ土類金属、及び遷移金属イオンが好ましく、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、及びＣｕ２＋がより好ましく、さらに好ましくは、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｆｅ２＋、及びＺｎ２＋である。正電荷を帯びた塩基性有機化合物は、関連性のある有機カチオンであってもよい。このような正電荷を帯びたカウンターパートとしては、ジエチルアミン、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、イミダゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ベンジルアミン、エチレンジアミン、メグルミン、ピロリジン、コリン、トリス−（ヒドロキシメチル）−メチルアミン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピロリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペリジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）モルホリン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン又はＬ−リジン単位を有するオリゴペプチド、又はＮ−末端に遊離アミノ基を有するオリゴペプチドなど（これらは全てプロトン化されたもの）が好ましい。このような塩の形成は、安定性、添加剤との相溶性、溶解性及び結晶形成能力などの式１で表されるオリゴ糖全般の性質の改変に使用することができる。
【００８１】
本発明の好ましい形態は式１’で表される化合物に関する。
【００８２】
【化１２】
2014510098.tif 000014
【００８３】
（式中、Ａ及びＲ１は上記に定義された通り）
【００８４】
より好ましい形態において、リンカーＡは末端フコシル部分と共に、人乳オリゴ糖グルコシル残基を形成する。言い換えれば、式１’で表される化合物は、フコース含有人乳オリゴ糖Ｒ１−グリコシドを含む。
【００８５】
より好ましい別の形態において、リンカーＡは、１つ又は複数のラクトサミニル及び／又はイソラクトサミニル残基を含む。ラクトサミニル又はイソラクトサミニル残基は、ラクトシル部分の３’−ＯＨ基に結合していることが好ましい。
【００８６】
より好ましい更に別の形態において、Ｒ２は、フェニル、アルキル又はハロゲンからなる群より選択される少なくとも１つの基で任意に置換されたベンジル又は２−ナフチルメチル基であり、Ｒ３はフェニル又はベンジルである。
【００８７】
特に好ましい形態において、式１’で表される化合物は、２’−Ｏ−フコシルラクトース、３−Ｏ−フコシルラクトース、３’−Ｏ−シアリル−３−Ｏ−フコシル−ラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−ジフコ−ヘキサオース  ＩＩＩ、Ｆ−ＬＳＴ  ａ、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ及びＦ−ＬＳＴ  ｃのβ−Ｒ１−グリコシドからなる群より選択され、好ましくは、２’−Ｏ−フコシルラクトース、３−Ｏ−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  ＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオース  Ｖ、Ｆ−ＬＳＴ  ａ、Ｆ−ＬＳＴ  ｂ及びＦ−ＬＳＴ  ｃのβ−ＯＲ２−及びβ−ＳＲ３−グリコシドからなる群より選択される。
【００８８】
式１で表される化合物を提供する利点は、非グリコシル化フコオリゴ糖に比べて、アノマー保護フコシル化オリゴ糖グリコシドをより容易に精製できることである。反応化合物の極性が異なるため、逆相クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーによる式１で表される化合物の単離が可能である。水を使用する逆相クロマトグラフィーの場合、式１で表される化合物は、同じく反応混合物中の高極性化合物に比べてかなりゆっくり移動するため、該極性化合物を簡単に溶出することができる。そして、式１で表される化合物は、例えばアルコールなどでカラム上から洗浄することができる。
【００８９】
（フコシル化／トランスフコシル化反応）
また、本発明は下記式１で表されるフコシル化オリゴ糖及びその塩を合成する方法であって、
【００９０】
【化１３】
2014510098.tif 000015
【００９１】
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つであり、
ａ）−ＯＲ２（Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２
（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つである、又は、
２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に、５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、
Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【００９２】
フコースを転移可能な酵素の触媒作用下で、下記式２で表されるフコシルドナーと、式Ｈ−Ａ−Ｒ１（Ａ及びＲ１は上記に定義された通り）で表されるアクセプター又はその塩とを反応させることを特徴とする方法を提供する。このプロセスをスキーム１に表す。
【００９３】
【化１４】
2014510098.tif 000016
【００９４】
（式中、Ｘは、グアノシンジフォスファチル部分、ラクトース部分、アジド、フルオライド、任意に置換されたフェノキシ基、任意に置換されたピリジニルオキシ基、任意に置換された下記式Ａで表される３−オキソ−フラニルオキシ基、任意に置換された下記式Ｂで表される１，３，５−トリアジニルオキシ基、下記式Ｃで表される４−メチルウンベリフェリルオキシ基、及び下記式Ｄで表される基からなる群より選択される。
【００９５】
【化１５】
2014510098.tif 000017
【００９６】
（式中、Ｒａは独立に、Ｈ若しくはアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択され、
ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される））
【００９７】
【化１６】
2014510098.tif 000018
【００９８】
このトランスフコシル化反応は、約ｐＨ４〜９の従来の方法で行うことができ、温度は約１０〜５０℃であることが好ましく、より好ましくは約３０〜４０℃である（但し、５０〜８０℃、好ましくは６０〜７０℃で培養が行われる好熱性酵素を除く）。その際、式Ｈ−Ａ−Ｒ１で表されるアクセプターと、式２で表されるフコシルドナーの培養は、好ましくは１０ｍＵ／ｌ〜１００Ｕ／ｌの濃度の酵素で生じる。ここで、規定量（defined amount）の式２で表されるドナーから始まり、１μｍｏｌの式１で表される化合物を形成可能な活量（activity）を１ユニット（Ｕ）と定義する。好適には、培養は水性反応媒体（リン酸塩、カーボネイト、アセテート、ボレート、クエン酸塩若しくはトリスバッファー又はこれらの組み合わせ等の緩衝剤を含有することが好ましい）において行うことができる。また、反応を促進するために、水溶性有機溶媒（好ましくはＣ１〜Ｃ４のアルコール、ＤＭＦ又はＤＭＳＯを反応混合物に加えても良い。また、反応を促進するために、０．１〜５０ｇ／ｌの界面活性剤を加えてもよい。例えば、ポリオキシエチレンオクタデシルアミン（例えば、Ｎｙｍｅｅｎ  Ｓ−２１５、日油株式会社製）などの非イオン性界面活性剤、セチルトリメチル臭化アンモニウム及びアルキルジメチルベンジル塩化アンモニウム（例えば、日油株式会社製のカチオンＦ２−４０Ｅ）などのカチオン性界面活性剤、及び、ラウロイルサルコシン酸などのアニオン性界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば、日油株式会社製の第三級アミンＦＢ）などの第三級アミンが挙げられる。また、０．１〜５０ｍｌ／ｌの有機溶媒（例えばキシレン、トルエン、脂肪酸アルコール、アセトン及び酢酸エチル）、及び０．１〜５ｇ／ｌの無機塩類（例えばＭｎＣｌ２又はＭｇＣｌ２）を反応混合物に加えてもよい。
【００９９】
（フコシル化／トランスフコシル化反応においてフコースを転移可能な酵素）
生体系（biological system）において、フコシルトランスフェラーゼ及びフコシダーゼは、フコシル化を行ない、フコオリゴ糖を得ることができる。
【０１００】
フコシルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．４．１に分類される）は、高度の位置及び立体化学的制御でＬ−フコースをフコシルヌクレオチドからアクセプターへ転移する。哺乳動物において様々なフコシルトランスフェラーゼが見られ、主にゴルジ体に位置している。α−１−２フコシルトランスフェラーゼは、フコースをガラクトースの２−Ｏ−位へ転移する。α−１−４フコシルトランスフェラーゼによって４−Ｏ−位のＧｌｃＮＡｃをフコシル化することができる。一方、α−１−３フコシルトランスフェラーゼは、フコースのＧｌｃＮＡｃ及びグルコースの３−Ｏ−位への転移を触媒する。
【０１０１】
フコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３８及び３．２．１．５１に分類される）は哺乳動物、植物、菌類及びバクテリアなど生体において存在する。これらの酵素は、ＣＡＺＹ命名法（http://www.cazy.org; B. L. Cantarel et al. Nucleic Acids Res. 37、D233（2009)）が規定するグリコシドヒドロラーゼのファミリー２９、３５及び９５（ＧＨ２９、ＧＨ３５及びＧＨ９５）に属する。ＧＨ２９のフコシダーゼは保持酵素である（３Ｄ構造：（β／α）８）。一方、ＧＨ９５のフコシダーゼは転化酵素である（３Ｄ構造：（α／α）６）。ＧＨ２９ファミリーの基質特異性は広いが、ＧＨ９５ファミリーの基質特異性はα１，２−結合フコシル残基に限定される。ＧＨ２９ファミリーは２つのサブファミリーに分かれるようである。典型的には１つのサブファミリーはα１，３−及びα１，４−フルコシル結合に対して限定的な特異性を有する。更なるサブファミリーのメンバーはより広い特異性を有し、全てのα−フコシル結合を対象にしている。フコシダーゼは一般的にグリカンの末端フコシル残基を加水分解する。しかし、これらの酵素は、トランスフコシル化活性を有するため、速度論的に制御された条件下で、フコシル化反応の触媒として働くことができる。
【０１０２】
フコシダーゼを含むグルコシダーゼの有用性はさまざまな工学的手法において役に立っている。
【０１０３】
「合理的エンジニアリング」技術において、新規の変異酵素（突然変異体）は、点突然変異により産生される。前記突然変異は、通常、酵素の活性部位に影響を及ぼす。トランスグリコシル化に必要な反応性ホスト−ゲスト錯体形成のための適切な環境がないため、触媒的求核残基を非求核性残基で置換することで、トランスグリコシル化活性の低い不活性突然変異体又は変異酵素が形成される。しかしながら、天然のフコシルドナーに比べ活性の高いフコシルドナーの存在下においては、突然変異酵素は、フコース残基を適切なアクセプターへ効率的に転移することができる。そのような突然変異体グルコシダーゼはグライコシンターゼと呼ばれている。酵素の合理的エンジニアリングは、通常、静的タンパク質立体構造への依存を必要とする。合理的エンジニアリングによって、アクセプター依存性位置選択性による、ビフィドバクテリウム・ビフィダムからのα−１，２−Ｌ−フコシンターゼ及び有効な（efficient）スルフォロブス・ソルファタリクス及びテルモトガ・マリチマからのα−Ｌ−フコシンターゼが近年開発され、提供されている（非特許文献６及び７）。これらの変異酵素は生成物の加水分解活性が欠けていてもよい
【０１０４】
「定方向進化」と呼ばれる第二手法は、選択された天然グルコシダーゼ酵素のランダム変異導入法を含み、それぞれが単一又は複数の位置で変異させられた酵素変異体のライブラリが創られる。前記酵素変異体は、わずかに変異した特性を持つ組み換え変異体の産生に適している微生物（例えば大腸菌又は出芽酵母（S. cerevisiae））に挿入される。改良された酵素変異体を発現するクローンは、迅速かつ信頼できるスクリーニング法で同定され、選択され、突然変異プロセスの次のラウンドに持ち込まれる。繰り返される突然変異、組み換え及び選択のサイクルは、所望の活性及び／又は特異性を有する突然変異体が得られるまで続けられる。定方向進化によってテルモトガ・マリチマからのα−Ｌ−フコシダーゼが近年有効なα−Ｌ−トランスフコシダーゼに転換されている（非特許文献５）。引用文献はクローニング、突然変異、選択、組み換え及びタンパク質精製工程について詳細に説明している。
【０１０５】
トランスフコシダーゼ活性保持し、非特許文献５のα−Ｌ−トランスフコシダーゼのように公知の酵素配列と配列類似性／相同性を少なくとも７０％（例えば７５％）、好ましくは８０％（例えば８５％）有するトランスフコシダーゼ及び／又はフコシンターゼ酵素突然変異体は、本発明において使用することができると想定される。配列類似性は少なくとも９０％であることが好ましく、より好ましくは９５％、９７％、９８％又は最も好ましくは９９％である。
【０１０６】
操作されたトランスフコシダーゼ及びフコシンターゼは、天然型のフコシダーゼ及びフコシルトランスフェラーゼに比べてより広いドナー及びアクセプターの特異性を有し、そのため特に広範囲の反応に使用されうる。したがって、操作された酵素は、工業的利用に有利である。
【０１０７】
したがって、本発明のトランスフコシル化プロセスにおいて好ましく用いられるフコシダーゼ酵素は、操作されたフコシダーゼ酵素、より好ましくは天然型（naturally occuring）α−Ｌ−フコシダーゼから定方向進化プロセス（directed evolution process）により得られるα−Ｌ−トランスフコシダーゼである。前記α−Ｌ−フコシダーゼは、少なくとも１（好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも３、最も好ましくは少なくとも４）の突然変異−組み換えシーケンス（mutation-recombination sequence）で定方向進化プロセスが行われた、テルモトガ・マリチマに由来する天然型で熱安定性のα−Ｌ−フコシダーゼから得られるこのが好ましい。本発明のプロセスにおいて用いられる別の好ましい酵素は、野生型（wild type）α−Ｌ−フコシダーゼから合理的エンジニアリング方法によって得られたα−Ｌ−フコシンターゼである。前記野生型α−Ｌ−フコシダーゼは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、スルフォロブス・ソルファタリクス又はテルモトガ・マリチマ種から得たものであり、点突然変異によってα−Ｌ−フコシンターゼに転換されていることが好ましい。
【０１０８】
より好ましくは、フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する酵素は、テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７、ビフィドバクテリウム・ロンガムスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１、ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１、又はラクトバチルス・カゼイＢＬ２３等に由来するα−Ｌ−フコシダーゼから選択してもよい。
【０１０９】
より好ましくは、フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する酵素は、下記寄託番号で定義されるα−Ｌ−フコシダーゼから選択することができる。ｇｉ｜４９８０８０６（テルモトガ・マリチマＭＳＢ８、配列番号１）、ｇｉ｜１３８１６４６４（スルフォロブス・ソルファタリクスＰ２、配列番号２）、ｇｉ｜３４４５１９７３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４、配列番号３）、ｇｉ｜２４２３４５１５５（ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ＪＣＭ１２５４、配列番号４）、ｇｉ｜２１３５２４６４７（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス、ＡＴＣＣ１５６９７、配列番号５）、ｇｉ｜２１３５２２６２９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜２１３５２２７９９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜２１３５２４６４６（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＡＴＣＣ１５６９７）、ｇｉ｜３２０４５７２２７（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５７４０８（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５９３６９（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３２０４５９３６８（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＪＣＭ１２２２）、ｇｉ｜３１０８６７０３９（ビフィドバクテリウム・ビフィダム  ＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３１０８６５９５３（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＰＲＬ２０１０）、ｇｉ｜３０９２５０６７２（ビフィドバクテリウム・ビフィダムＳ１７）、ｇｉ｜３０９２５１７７４（ビフィドバクテリウム・ビフィダム  Ｓ１７）、ｇｉ｜２９６１８２９２７（ビフィドバクテリウム・ロンガムスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１）、ｇｉ｜２９６１８２９２８（ビフィドバクテリウム・ロンガムスピーシーズ・ロンガムＪＤＭ３０１）、ｇｉ｜２８３１０３６０３（ビフィドバクテリウム・デンティウムＢｄ１）、ｇｉ｜１９０７１３１０９（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号６）、ｇｉ｜１９０７１３８７１（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号７）、ｇｉ｜１９０７１３９７８（ラクトバチルス・カゼイＢＬ２３、配列番号８）等、又は、上記フコシダーゼ及び／又はトランス−フコシダーゼ活性を有する酵素配列の１つと、全体の野生型アミノ酸レベルと比べて少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、同様により好ましくは少なくとも８５％、更により好ましくは少なくとも９０％及び最も好ましくは少なくとも９５％又は更に９７％、９８％又は９９％の配列同一性（identity）を示す配列。
【０１１０】
特に好ましいフコシダーゼ／トランス−フコシダーゼ活性を有するα−Ｌ−フコシダーゼを下記表１に列挙する。
【０１１１】
【表１】
2014510098.tif 000019
【０１１２】
（フコシル化／トランスフコシル化反応のドナー）
下記式２で表される化合物は、本発明のフコシル化／トランスフコシル化反応において、フコシルドナーとして機能することができる。
【０１１３】
【化１７】
2014510098.tif 000020
【０１１４】
（式中、Ｘは、グアノシンジフォスファチル部分、ラクトース部分、アジド、フルオライド、任意に置換されたフェノキシ基、任意に置換されたピリジニルオキシ基、任意に置換された下記式Ａで表される３−オキソ−フラニルオキシ基、任意に置換された下記式Ｂで表される１，３，５−トリアジニルオキシ基、下記式Ｃで表される４−メチルウンベリフェリルオキシ基、及び下記式Ｄで表される基からなる群より選択される。
【０１１５】
【化１８】
2014510098.tif 000021
【０１１６】
（式中、Ｒａは独立に、Ｈ若しくはアルキルであるか、又は、２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、
Ｒｃは独立にアルコキシ、アミノ、アルキルアミノ及びジアルキルアミノからなる群より選択され、
ＲｄはＨ、アルキル及び−Ｃ（＝Ｏ）Ｒｅ（式中、ＲｅはＯＨ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドラジノ、アルキルヒドラジノ、ジアルキルヒドラジノ又はトリアルキルヒドラジノである）からなる群より選択される））
【０１１７】
好ましい形態において、式２で表される化合物が２’−Ｏ−フコシルラクトースであるか、又は、式２中のＸがフェノキシ基、ｐ−ニトロフェノキシ基、２，４−ジニトロフェノキシ基、２−クロロ−４−ニトロフェノキシ基、４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ基、４，６−ジエトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イルオキシ基、２−エチル−５−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基、５−エチル−２−メチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルオキシ基からなる群より選択されるかのいずれかであり、フコシル化反応において操作されたトランスフコシダーゼ酵素が採用された場合に、フコシルドナーとして用いられる。別の好ましい形態において、フコシンターゼ触媒の存在下でトランスフコシル化が行われる場合には、式２で表される化合物（Ｘはフッ化物又はアジド）は、ドナーとしての選択肢になる。更に好ましい形態において、フコシルトランスフェラーゼ酵素によりフコシル化が媒介される場合には、式２で表される化合物はＧＤＰ−フコースである。
【０１１８】
特に好ましいフコシルドナーは式２Ａで表されることを特徴とする。
【０１１９】
【化１９】
2014510098.tif 000022
【０１２０】
（式中、Ｒａは独立にＨ又はアルキルであるか、又は２つの隣接するＲａ基は＝Ｃ（Ｒｂ）２基（式中、Ｒｂは独立にＨ又はアルキルである）で表わされ、好ましくはＲａは独立にＨ、メチル又はエチルである）
【０１２１】
式２Ａで表されるフコシルドナーは、水溶性が高く、フコシル化後の脱離基は紫外検出で容易に検出でき、この脱離基は果物の天然香料で、食品工業に用いた時に規制の問題を引き起こさないため、フコシル化／トランスフコシル化反応において特に有利なドナーである。
【０１２２】
式２Ａで表される化合物は、以下の工程を含む反応において合成することができる。
ａ）下記式３で表されるフコシル誘導体と下記式４で表される化合物とをカップリングする工程、及び
【０１２３】
【化２０】
2014510098.tif 000023
【０１２４】
（式中、Ｒ２及びＲ３は独立に、水素化分解により除去可能な基又はアシルであり、Ｙはハロゲン、−ＯＣ（＝ＮＨ）ＣＣｌ３、−Ｏ−ペンテニル、−ＯＡｃ、−ＯＢｚ又は−ＳＲ４である（式中、Ｒ４はアルキル又は任意に置換されたフェニルである））
【０１２５】
【化２１】
2014510098.tif 000024
【０１２６】
（式中、Ｒａは上記に定義された通りである）
【０１２７】
ｂ）Ｒ２及びＲ３保護基を除去する工程。
【０１２８】
反応工程ａ）は、非プロトン性溶媒又は複数非プロトン性溶媒の混合液中、活性因子の存在下、従来の方法で行うことができる。グルコシル化反応は一般的に重金属イオン及びルイス酸によって促進される。グルコシルトリクロロアセトイミダート（すなわち、Ｘは−ＯＣ（＝ＮＨ）ＣＣｌ３）は、触媒量のトリメチルシリルトリフラート又はＢＦ３−エーテラート等のルイス酸によって活性化させることができる。グルコシルハライド（すなわち、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）は重金属イオン（主に水銀又は銀）によって活性化される。グルコシルアセテート又はベンゾエート（すなわち、Ｘは−ＯＡｃ又は−ＯＢｚ）は好ましくは先ず求電子的活性化されて反応中間体を得て、そして式４で表される化合物で処理される。典型的な活性化因子の選択肢としては、ブレンステッド酸（例えば、ｐ−ＴｓＯＨ、ＨＣｌＯ４又はスルファミン酸）、ルイス酸（例えば、ＺｎＣｌ２、ＳｎＣｌ４、トリフラート塩、ＢＦ３−エーテラート、トリチルペルクロラート、ＡｌＣｌ３又はトリフリン酸無水物）又はその混合物。ペンテニルグリコシド（すなわち、Ｘは−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＣＨ＝ＣＨ２）は、ＮＢＳ又はＮＩＳ等のプロモーターの存在下、式４で表される化合物でトランスグルコシル化されてもよい。プロトン性酸又はルイス酸（トリフリン酸、Ａｇ−トリフラート等）は反応を促進することができる。チオグリコシド（すなわち、Ｘはアルキルチオ−又は任意に置換されたフェニルチオ基）は、水銀（ＩＩ）塩、Ｂｒ２、Ｉ２、ＮＢＳ、ＮＩＳ、トリフリン酸、トリフラート塩、ＢＦ３−エーテラート、トリメチルシリルトリフラート、ジメチル−メチルチオスルホニウムトリフラート、フェニルセレニルトリフラート、ヨードニウムジコリジンペルクロラート、テトラブチルアンモニウムヨージド又はそれらの混合物、好ましくはＢｒ２、ＮＢＳ、ＮＩＳ又はトリフリン酸などのチオフィリックプロモーターによって活性化させることができる。
【０１２９】
ｂ）工程において、Ｒ２及びＲ３保護基は除去され、式２で表される化合物Ａが得られる。水素化分解（すなわち任意に置換されたベンジル基）により除去可能な基は、触媒水素化分解反応（後述）において脱保護されてもよい。アシル保護基は、ＮａＯＭｅ、ＮａＯＥｔ又はＫＯｔＢｕ等のアルコラート存在下、メタノール、エタノール、プロパノール又はｔ−ブタノール等のアルコール溶媒において、塩基触媒されたトランスエステル化脱保護反応において除去することができる。
【０１３０】
好ましい方法において、Ｒ２及びＲ３が同一であり、それぞれベンジル、４−メトキシベンジル又は４−メチルベンジルであり、Ｙがトリクロロアセトイミダートである式３で表される化合物が、２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−オキソ−（２Ｈ）−フランとカップリングされ、そして触媒水素化分解される。
【０１３１】
（フコシル化／トランスフコシル化反応のアクセプター）
式Ｈ−Ａ−Ｒ１で表されるアクセプター及びその塩（式中、Ａ及びＲ１は上記に定義された通り）は、本発明の酵素的フコシル化／トランスフコシル化反応においてグルコシル化させることができる。
【０１３２】
好ましい形態において、式Ｈ−Ａ−Ｒ１で表されるアクセプターは、アノマー保護形態の脱フコシル化したＨＭＯである。最も重要な脱フコシル化した、アノマー保護形態のＨＭＯは、ラクトース、３’−シアリルラクトース、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオタトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ＬＳＴ  ａ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ＬＳＴ  ｂ（Ｇａｌβ１−３［ＮｅｕＡｃα２−６］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）及びＬＳＴ  ｃ（ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）からなる群より選択され、いずれも１−Ｏ−、１−Ｓ−又は１−Ｎ−グリコシドの形態である。より好ましい形態において、アクセプターは３’−シアリルラクトース、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ＬＳＴ  ａ（ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、ＬＳＴ  ｂ（Ｇａｌβ１−３［ＮｅｕＡｃα２−６］ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）及びＬＳＴ  ｃ（ＮｅｕＡｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）からなる群より選択され、いずれもアノマー位において水素化分解により除去可能な基で（好ましくは任意に置換されたベンジル又はナフチルメチル基で）Ｏ−グルコシル化されている。最も好ましい形態において、アクセプターは、任意に置換されたベンジルラクトシド、任意に置換されたベンジル３’−シアリルラクトシド、任意に置換されたベンジル２’−フコシルラクトシド、任意に置換されたベンジル３−フコシルラクトシド、任意に置換されたベンジルＬＮＴ−グリコシド及び任意に置換されたベンジルＬＮｎＴ−グリコシドからなる群より選択される。
【０１３３】
アクセプターは以下により合成することができる。まず、５０〜１２５℃でラクトースを無水酢酸及び酢酸ナトリウムで処理し、ついで、ＤＣＭ、トルエン、ＴＨＦなどの有機溶媒中、Ｒ２−ＯＨ又はＲ３−ＳＨ（好ましくは、ベンジル／置換ベンジルアルコール又はアルキル−、ベンジル−又はフェニル−ＳＨ）を用い、ルイス酸触媒によるグリコシル化を行う。その後、グリコシル化生成物の最終Ｚｅｍｐｌｅｎ脱保護を経て、アクセプター（Ｒ１は−ＯＲ２又は−ＳＲ３）が得られる。
【０１３４】
アクセプターは以下によっても合成することができる。ＤＣＭ、アセトニトリル、ＴＨＦ又はジオキサンなどの有機溶媒中、０〜５０℃で、遊離アノマーＯＨで完全にもしくは部分的に保護されたオリゴ糖（好ましくは脱フコシル化したＨＭＯ）を、ハロゲン化Ｒ２（好ましくは、ハロゲン化ベンジル又は置換ハロゲン化ベンジル）及び、水素化ナトリウム、ポタッシウムｔ−ブトキシド、炭酸カリウム又は無機水酸化物で処理する。アノマーＯ−保護の後、他の保護基の除去を行い、その結果、式Ｈ−Ａ−ＯＲ２で表されるアクセプターが得られる。
【０１３５】
ビニル性グルコシルアミンアクセプターは、ラクトース又は脱フコシル化したＨＭＯを含水炭酸水素アンモニウムで処理し、その後、得られたラクトシルアミンと活性ビニル試薬（activated vinyl reagent）（アルコキシメチレン化又はジアルキルアミノメチレン化マロン酸誘導体）とを、塩基の存在下又は非存在下で反応させることで合成することができる（C. Ortiz Mellet et al. J. Carbohydr. Chem. 12, 487（1993)、及びＷＯ２００７／１０４３１１）。
【０１３６】
（トランスフコシル化反応の立体選択性及びレギオ選択性）
本発明におけるトランスフコシル化反応は好ましくは立体選択的におこわなれ、α−フコシル結合が形成される。
【０１３７】
（フコース含有オリゴ糖の合成におけるフコシル化オリゴ糖誘導体の使用）
本発明の別のアスペクトは、フコシル化オリゴ糖及びその塩の合成における、式１で表される化合物及びその塩の使用であり、前記合成はアノマー保護基Ｒ１を除去する工程を含む。
【０１３８】
一態様においては、Ｒ１は−ＯＲ２であり、Ｒ２は水素化分解により除去可能な保護基である。Ｒ２保護基の除去は典型的にはプロトン性溶媒又は複数プロトン性溶媒の混合液中で行われる。プロトン性溶媒は水、酢酸及びＣ１−Ｃ６アルコールからなる群より選択することができる。１種以上のプロトン性溶媒と、１種以上の適当な部分的又は完全にプロトン性溶媒と混合できる非プロトン性有機溶媒（たとえばＴＨＦ、ジオキサン、酢酸エチル又はアセトン）との混合液も用いることができる。水、１種以上のＣ１−Ｃ６アルコール又は水と１種以上のＣ１−Ｃ６アルコールの混合液は、溶媒系として好ましく用いられる。式１で表される化合物を任意の濃度で含有する溶液又は懸濁液を用いることができる。パラジウム、ラネーニッケル又はその他の適切な金属触媒（好ましくはパラジウム炭素又はパラジウムブラック）等の触媒の存在下で、１〜５０バール（ｂａｒ）の水素雰囲気下、１０〜１００℃、好ましくは２０〜６０℃で反応混合物を、反応が完了するまで混合する。触媒の濃度は通常炭水化物の重量に基づき０．１％〜１０％の範囲である。好ましくは、触媒の濃度は０．１５％〜５％、より好ましくは０．２５％〜２．２５％の範囲である。移動水素化分解を行ってもよく、原位置で（in situ）シクロヘキセン、シクロヘキサジエン、蟻酸又は蟻酸アンモニウムから水素が発生する。有機又は無機の塩基／酸、及び／又は、塩基性及び／又は酸性のイオン交換樹脂を添加して、触媒水素化分解の反応速度を向上してもよい。ハロゲン置換基が前駆体の置換ベンジル部分に存在する場合、塩基性物質の使用は特に好ましい。好ましい有機塩基としては、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、アンモニア、カルバミン酸アンモニウム、又はジエチルアミンが挙げられる。好ましい有機／無機イオン交換樹脂としては蟻酸、酢酸、プロピオン酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、ＨＣｌ又はＨＢｒが挙げられる。これらの条件によって簡易に便利に精巧にアノマー保護基Ｒ１を除去し、純フコシル化オリゴ糖が得られる。該純フコシル化オリゴ糖は反応混合物から従来のプロセス工程を用いて、結晶、非晶体、シロップ又は濃縮水溶液の状態で単離することができる。
【０１３９】
別の態様においては、Ｒ１は−ＳＲ３であり、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール又は任意に置換されたベンジル、これらの化合物は次の方法で対応する還元糖誘導体に転換されていてもよい。式１で表されるチオグリコシドを水又は水含有双極性非プロトン性溶媒に溶解し、水銀（ＩＩ）塩、Ｂｒ２、Ｉ２、ＮＢＳ、ＮＩＳ、トリフリン酸又はトリフラート塩又はこれらの混合等のチオフィリック活性化因子を添加する。活性化中間体は、反応環境に存在する水と容易に反応し、脱保護フコオリゴ糖が生成される。
【０１４０】
別の態様においては、式１で表される化合物（Ｒ１は−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２であり、Ｒ’は−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル、−ＣＯＮＨ−ベンジル、−ＣＯＮ（アルキル）２及び−ＣＯＮ（ベンジル）２から選択される電子求引性基であるか、又は２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、隣接の炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオンを形成しており、いずれのメチレン基は１又は２つのアルキル基で置換されており、Ｒ”はＨ又はアルキルである）から非環式ビニル性アミン基を除去することによってフコシル化オリゴ糖を形成することができる。エナミン構造はアミノ化合物又はハロゲンで処理することによって分離することができる。反応に用いる溶媒としては、メタノール、エタノール、水、酢酸、又は 酢酸エチル、及びこれらの混合液が挙げられる。反応に用いるアミノ化合物としては、含水及び無水の第一級アミン（例えば、エチルアミン、プロピルアミン及びブチルアミン）、ヒドラジン類（例えばヒドラジン水和物及びヒドラジンアセテート）、ヒドロキシルアミン誘導体、アンモニア水溶液及びアンモニアガスが挙げられる。また、非環式ビニル性アミンは、塩素ガス又は臭素等のハロゲンで開裂させることができる。両方のタイプの反応においても、アノマー位にアミン官能性を得ることができ、中性又は僅かに酸性のｐＨ（約ｐＨ４〜７）下におけるその加水分解からフコシル化オリゴ糖が容易に得られる。
【０１４１】
好ましくは、式１で表される化合物は、式１’で表される化合物である。
【０１４２】
【化２２】
2014510098.tif 000025
【０１４３】
（式中、Ａは、ラクトシル部分である炭水化物リンカー、又は、ラクトシル部分と、グルコース、ガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース及びＮ−アセチルノイラミン酸からなる群より選択される少なくとも１つの単糖ユニットとからなる炭水化物リンカーであり、
Ｒ１は、以下のアノマー保護基の１つである（但し、Ｒ１が−ＯＲ２である場合には、リンカーＡはＮ−アセチルノイラミン酸を含まない）。
ａ）−ＯＲ２（式中、Ｒ２は触媒水素化分解により除去可能な保護基である）、
ｂ）−ＳＲ３（式中、Ｒ３は任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアリール、又は任意に置換されたベンジルである）、
ｃ）−ＮＨ−Ｃ（Ｒ”）＝Ｃ（Ｒ’）２（式中、各Ｒ’は独立に、−ＣＮ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯ−アルキル、−ＣＯ−アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ−アルキル又は−ＣＯＮ（アルキル）２から選択される電子求引性基の１つである、或いは、２つのＲ’基は結合して−ＣＯ−（ＣＨ２）２−４−ＣＯ−を形成し、該２つのＲ’基が結合している炭素原子と共に５〜７員環のシクロアルカン−１，３−ジオン（該ジオンにおいて、いずれのメチレン基も任意に、１又は２つのアルキル基で置換される）を形成しており、Ｒ”は、Ｈ又はアルキルである））
【０１４４】
上述した手順に従って本発明の新規のフコース−含有ＨＭＯのβ−Ｒ１−グリコシドのアノマー保護基を除去することにより、フコース−含有人乳オリゴ糖を容易に生成することができる。本発明のその他の特徴は、以下実施例の説明において明らかにされるものである。該実施例は例証のみを目的としているものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１４５】
（実施例１．フコシルアクセプターの製造）
Ａ）一般的方法：室温で、ラクトース（５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）及びＴｓＯＨ・Ｈ２Ｏ（０．２ｇ、１．０５ｍｍｏｌ）を一度に、ＤＭＦ（２０ｍｌ）及びベンズアルデヒドジメチルアセタール（５．５ｍｌ、３５．４ｍｍｏｌ、２．４当量）の混合物に加えた。該反応混合物を、防湿下、７０℃で１時間強撹拌した。 冷却後、トリエチルアミン（０．１５ｍｌ）を加え、揮発性成分（ＭｅＯＨ、トリエチルアミン、残存ベンズアルデヒドジメチルアセタール）を真空で除去した。この反応混合物に、ベンジルブロミド誘導体（１．５当量；試薬が固体の場合、予め５〜１０ｍｌのＤＭＦに溶解したもの）を加え、該混合物を２０分間０℃で冷却した。更に冷却中、ＮａＨ（０．８ｇ、５５％鉱油分散液、１．３当量）を一度に加え、該混合物を冷却下、水素の形成が停止するまで撹拌し、その後室温で２〜３時間、撹拌した。メタノール（２ｍｌ）を注意深く加え、該反応混合物をさらに５分撹拌した。該反応混合物を、１００ｍｌのＤＣＭと１００ｍｌの水に分け、抽出した。水層は、１００ｍｌのＤＣＭで二回逆抽出した。混合有機相を濃縮した、残留物を１００ｍｌのアセトニトリルに溶解し、１００ｍｌのヘキサンで抽出した。アセトニトリルを蒸留除去し、５０℃にて、残留物をイソプロパノール（１０ｍｌ）及びイソプロピルエーテル（５０ｍｌ）に得た。２〜１２時間、透明溶液を−２０℃まで冷却させた。得られた結晶をろ過して得て、ＴＢＭＥで二回洗浄し、乾燥させた。ＴＢＭＥ（〜５０ｍｌ）及びエタノール（〜２０ｍｌ）の混合液から再結晶化を行ってもよい。
【０１４６】
４−クロロベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：１．７１ｇ
【０１４７】
４−メチルベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：３．２０ｇ
【０１４８】
３−フェニルベンジル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：２．７０ｇ
【０１４９】
２−ナフチルメチル４’，６’−Ｏ−ベンジリデン−β−ラクトシド
収量：１．７７ｇ
【０１５０】
Ｂ）室温で、メタノール（１０ｍｌ）及び水（０．５ｍｌ）中の上記ベンジリデンアセタール（５００ｍｇ）のうちの１つの混合物に、ＴＦＡを加え、防湿下で該反応混合物を２〜４時間撹拌し、その後濃縮した。残存する物質を、エタノールで３〜４回共蒸発させ、粗固体を得た。乾燥後、得られた粗固体を、メタノール（〜１０−３５ｍｌ）及び水（〜０−２ｍＬ）の混合物から再結晶化してもよい。
【０１５１】
４−クロロベンジルβ−ラクトシド
収量：３３３ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝１３５．２５、１３３．６７、１３０．３０、１２８．７０、１０３．００、１０１．１３、７８．３９、７５．４４、７４．８９、７４．４９、７２．８８、７２．５８、７１．０３、７０．８３、６８．６２、６１．１１、６０．１３
【０１５２】
４−メチルベンジルβ−ラクトシド
収量：４３９ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝１３８．９１、１３３．５０、１２９．３７、１２９．０７、１０３．０１、１００．９６、７８．４３、７５．４４、７４．８７、７４．５２、７２．９０、７２．５９、７１．４７、７１．０３、６８．６３、６１．１１、６０．１７、２０．３４
【０１５３】
３−フェニルベンジルβ−ラクトシド
収量：４３８ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、ｄ６−ＤＭＳＯ／ｄ４−ＭｅＯＨ／Ｄ２Ｏ  ８：１：１）：δ＝１４０．２９、１４０．２４、１３８．８８、１２９．１３、１２９．０２、１２７．６６、１２６．８８、１２６．８３、１２６．０３、１２５．９０、１０３．９５、１０２．０３、８０．７６、７５．６５、７５．０７、７５．００、７３．３４、７３．２８、７０．６６、６９．８１、６８．２７、６０．５６
【０１５４】
２−ナフチルメチルβ−ラクトシド
収量：３７８ｍｇ
１３Ｃ−ＮＭＲ（７５．１ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ／ｄ６−ＤＭＳＯ）：δ＝１３４．９６、１３３．２４、１３３．１２、１２８．５９、１２８．３１、１２８．０８、１２７．４６、１２６．９８、１２６．９０、１２６．７９、１０３．２６、１０１．５９、７８．８９、７５．６２、７５．０９、７４．８１、７３．１４、７２．８１、７１．３３、７１．１４、６８．７５、６１．２２、６０．３９
【０１５５】
Ｃ）
【０１５６】
【化２３】
2014510098.tif 000026
【０１５７】
アルゴン下、１０ｇ（８．１３ｍｍｏｌ）のベンジル２，３，６，２’，６’−ペンタ−Ｏ−（４−クロロベンゾイル）−４’−Ｏ−ベンゾイル−β−ラクトシド、及び１０ｇ（１．６当量）のメチルＮ−トリクロロアセチル−３，６，２’，３’，４’６’−ヘキサ−Ｏ−アセチル−１−チオ−ラクトサミニドを、３５ｍｌの乾燥ＣＨＣｌ３に溶解した。室温でこの溶液に、３．７ｇのＮＩＳ及び４９０ｍｇのＡｇＯＴｆを加え、約２０分撹拌し続けた。トリエチルアミン（５ｍｌ）をスラリーに加え、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍｌ）で希釈し、その後２回チオ硫酸ナトリウム溶液（１０％）で抽出した。その後、有機相を分離し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮し、得られたシロップを、ＣＨ２Ｃｌ２：アセトン（９８：２→９５：５）の勾配を用いて、シリカゲルのカラムでクロマトグラフィーにかけた。
収量：１２．７ｇ、８０％．ＭＳ（ＥＳＰ）：１９７２．１［Ｍ＋Ｎａ］＋、１９８８．１［Ｍ＋Ｋ］＋、１９４８．２［Ｍ−Ｈ］−、１９８４．０［Ｍ＋Ｃｌ］−．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１０１．２、１００．７、１００．０、９８．８（アノマー炭素）
【０１５８】
【化２４】
2014510098.tif 000027
【０１５９】
上記で調製した１０ｇ（５．１ｍｍｏｌ）の四糖を、ＭｅＯＨ（１１０ｍｌ）に溶解し、ＮａＯＭｅ（ＭｅＯＨにおいて１Ｍ）の溶液を、ｐＨが１０になるまで加えた。該溶液を、４０℃で５時間撹拌し、次にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲ１２０Ｈ＋樹脂を加えて中和し、該樹脂をろ過して得て、濾液を蒸発させ乾燥した。残留物を、温かいＤＭＦ（１０ｍｌ）に溶解し、ｉＰｒ２Ｏ（１５０ｍｌ）に滴下し、懸濁液をさらに３時間撹拌した。沈殿物をろ過して得て、ｉＰｒ２Ｏ（２ｘ２０ｍｌ）で洗浄し、次いで乾燥させて、４．２ｇのオフホワイト粉末状の生成物を得た（９１％）。
ＭＳ（ＥＳＰ）：９００．１［Ｍ−Ｈ］−．
１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：１０５．６、１０５．５、１０４．２、１０３．７（アノマー炭素）
【０１６０】
【化２５】
2014510098.tif 000028
【０１６１】
上記で調製した四糖の３５ｇの化合物を、１１０ｍｌのＭｅＯＨ及び１１０ｍｌのＫＯＨ水溶液（７．５ｇ）に溶解し、該混合液を室温で１日撹拌した。次に、該混合液を氷浴で冷却し、ＨＣｌ−ガスで中和し、濃縮して乾燥した。 得られた粗製の茶褐色のガラスを、室温で１日間、ピリジン（１５０ｍｌ）及び無水酢酸（１５０ｍｌ）を用いてアセチル化した。溶液を濃縮し、得られたシロップをＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、有機相を１ＭのＨＣｌ溶液、次いで飽和ＮａＨＣＯ３溶液で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過及び濃縮し、４３ｇの茶褐色の泡を得た。その茶褐色の泡を、溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２：アセトン（８：２）の勾配を用いて、カラムクロマトグラフィーにかけた。
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：１０１．２、１００．８、１００．４、９９．２（アノマー炭素）
【０１６２】
【化２６】
2014510098.tif 000029
【０１６３】
上記で調製された１４０ｇ（１０７．５ｍｍｏｌ）の過アセチル化四糖を、１．５ＬのＭｅＯＨに溶解し、ＮａＯＭｅ溶液（１Ｍ）をｐＨが１０になるまで加え、次いで該混合液を５０℃で一晩撹拌した。該反応混合液から生成物を結晶化した。該混合物を室温まで冷却し、さらに冷却し、ろ過した。濾液（filtrate）を、冷たいＥｔＯＨで洗浄し、乾燥させ、６９ｇの白色粉末状ベンジルβ−ＬＮｎＴ（８６．５ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
１３Ｃ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ：１０５．６、１０５．５、１０５．４、１０３．６（アノマー炭素）
融点：２８４〜２８６℃
【０１６４】
Ｄ）「Y. Nagao et al. Chem. Pharm. Bull. 43,1536（1995)」に記載の手順に従って、フェニル１−チオ−β−ラクトシド及びベンジル１−チオ−β−ラクトシドを調製した。特徴は文献に報告されている通りであった。
【０１６５】
Ｅ）「A. Malleron et al. Carbohydr. Res. 341,29（2006)」に従ってＧａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（１−Ｏ−ベンジル−β−ＬＮＴ）を調製することができた。
【０１６６】
（実施例２．式２で表されるフコシルドナーＡの製造）
ａ）２，３，４−トリ−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−フコピラノーストリクロロアセトイミダート（α／β混合、ＮａＨの存在下、定量的収率で、８５ｍｍｏｌの２，３，４−トリ−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−Ｌ−フコピラノース及びトリクロロアセトニトリルから調製）のジエチルエーテル（１００ｍｌ）液を、−１４℃の２，５−ジメチル−４−ヒドロキシ−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン（８５ｍｍｏｌ）及びＴＭＳ−トリフラート（１．２ｍｌ）のジエチルエーテル（２００ｍｌ）混合液に加えた。３時間後、冷却浴を外し、撹拌を１時間続けた。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３液（３ｘ１５０ｍｌ）及び塩水（１５０ｍｌ）で抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させた。得られたシロップをカラムクロマトグラフィーで精製し、２３．２７ｇの２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イル２，３，４−トリ−Ｏ−（４−メトキシベンジル）−α−Ｌ−フコピラノシドを濃い黄色のシロップ状の１：１ジアステレオ異性体混合物として得た。
ＣＤＣｌ３における選択されたＮＭＲケミカルシフト：アノメリックプロトン：５．３２及び５．５７ｐｐｍ、Ｊ１，２＝３．４Ｈｚ
アノマー炭素：１１３．８１及び１１３．９５Ｈｚ
【０１６７】
ｂ）室温で６時間、Ｈ２下、上記生成物及びパラジウム木炭（１２．５ｇ）の酢酸エチル（１ｌ）懸濁液を撹拌した。触媒を濾過して、酢酸エチルで洗浄した。化合した濾液を蒸発して固体とし、酢酸エチルに懸濁し、５℃で一晩放置した。濾過して結晶物質を得て、乾燥した。母液をカラムクロマトグラフィーに供した。結合物は、５．５０ｇの２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド（白色固体の１：１ジアステレオ異性体混合物）であった。
ＤＭＳＯ−ｄ６における選択されたＮＭＲケミカルシフト：アノメリックプロトン：５．０７及び５．５２ｐｐｍ、Ｊ１，２＝２．６Ｈｚ
アノマー炭素：１００．１９及び１０１．０３Ｈｚ
ガスクロマトグラフ（ＧＣ）による純度（シリル化後）：９８．９％。
【０１６８】
（実施例３．トランスフコシル化反応）
一般的方法：脱気培養緩衝液中、ｐＨ５．０〜９．０下、適当なフコシルドナー（例えば、ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド、α−Ｌ−フコシルフルオライド、２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド又は２’−Ｏ−フコシルラクトース）とアクセプター（１０〜５００ｍｍｏｌ、ドナー：アクセプター比は５：１〜１：５）との溶液を、組み換えα−フコシダーゼ、α−トランスフコシダーゼ又はα−フコシンターゼで培養した。２０〜７０℃で２４時間、反応混合物を撹拌した。反応の異なる時間で複数のサンプルを取り、ｐＨ１０の１ＭのＮａＨＣＯ３溶液を添加して反応を停止し、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び／又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で分析した。反応の完了後、酵素は変性され、遠心分離した。得られた溶液を減圧下で蒸発させた。凍結乾燥後、乾燥残渣を水に溶解し、水を用いたバイオゲルクロマトグラフィー（Ｐ−２  Ｂｉｏｇｅｌ、１６ｘ９００ｍｍ）、又は逆相クロマトグラフィーで精製した。収率は、２．５〜８５％の間であった。
【０１６９】
トランスフコシル化反応において用いた及びテストした組換え酵素：
Ｐ２５  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｇ２２６Ｓ  Ｙ２３７Ｈ  Ｔ２６４Ａ  Ｌ３２２Ｐ含有；
Ｍ３  テルモトガ・マリチマ（配列番号１参照）より  突然変異体Ｙ２３７Ｈ  Ｙ２６７Ｆ  Ｌ３２２Ｐ含有。
【０１７０】
非特許文献７に記載されているように、これらのトランスフコシダーゼは大腸菌において産生された。精製されたトランスフコシダーゼＰ２５及びＭ３はそれぞれ−２０℃又は＋４℃で保管された。
【０１７１】
酵素に最適な緩衝液：５０ｍＭのクエン酸／リン酸ナトリウム緩衝液及び１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ＝５．５
【０１７２】
最適な温度：６０℃（但し、α−Ｌ−フコシルフルオライドアクセプターについては、温度は３５℃）
【０１７３】
ＬＣ−ＭＳの条件：
機器：ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ２０００  ｔａｎｄｅｍ  ＭＳ
イオン化モード：ポジティブモードのエレクトロスプレー
スキャンタイプ：Ｑ１ＭＳ
サンプル挿入モード：ＨＰＬＣ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＨＩＬＩＣ  ２５０ｘ４．６ｍｍ
流れ：イソクラティック（水−アセトニトリル  ２２：７８）
流速：１ｍｌ／分  注入量：５μｌ
【０１７４】
ａ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
ドナー：ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド、α−Ｌ−フコシルフルオライド又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ（２’−Ｏ−フコシルラクトースから化学的手段により得た標準サンプルと比較して同定した）
特徴的な１Ｈ  ＮＭＲピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．４１−７．２５（ｍ、５Ｈ、芳香族）、５．２０（ｄ、１Ｈ、Ｊ１”，２”＝２Ｈｚ、Ｈ−１”）、４．８２及び４．５９（ＡＢｑ、２Ｈ、Ｊｇｅｍ＝１２．３Ｈｚ、−ＣＨ２Ｐｈ）、４．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ１’，２’＝７．３１Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．２８（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝７．７９Ｈｚ、Ｈ−１）、１．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ５”，６”＝６．４３Ｈｚ、Ｈ−６”）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３７．９７、１２８．１５、１２８．１５、１２７．５８、１２７．５８及び１２７．４３（芳香族）、１０１．８６、１００．９４及び１００．２０（Ｃ−１、Ｃ−１’及びＣ−１”）、７７．６８、７６．７８、７５．３６、７５．３３、７４．７０、７３．７９、７３．４５、７１．６０、６９．７２、６９．６９、６８．７４、６８．２０、６６．３８、６０．２３及び５９．８１（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−２’、Ｃ−３’、Ｃ−４’、Ｃ−５’、Ｃ−６’、Ｃ−２”、Ｃ−３”、Ｃ−４”、Ｃ−５”及びＣＨ２Ｐｈ）、１６．４７（Ｃ−６”）．
【０１７５】
ｂ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−ＣＨ２−（４−ＮＯ２−Ｐｈ）
ドナー：ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−ＣＨ２−（４−ＮＯ２−Ｐｈ）（２’−Ｏ−フコシルラクトースから化学的手段により得た標準サンプルと比較して同定した）
特徴的な１Ｈ  ＮＭＲピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：８．２０及び７．６８（各ｄ、４Ｈ、芳香族）、５．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ１”，２”＝２Ｈｚ、Ｈ−１”）、４．９７及び４．７６（ＡＢｑ、２Ｈ、Ｊｇｅｍ＝１２．３Ｈｚ、−ＣＨ２Ｐｈ）、４．４０（ｄ、１Ｈ、Ｊ１’，２’＝９．５３Ｈｚ、Ｈ−１’）、４．３２（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝８．０４Ｈｚ、Ｈ−１）、１．０４（ｄ、１Ｈ、Ｊ５”，６”＝６．４３Ｈｚ、Ｈ−６”）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１６２．３８、１４７．６８、１２７．９５、１２７．９５、１２３．３３及び１２３．３３（芳香族）、１０２．１８、１００．９５及び１００．１８（Ｃ−１、Ｃ−１’及びＣ−１”）、７７．６２、７６．７４、７５．３６、７５．３６、７４．６１、７３．７８、７３．４５、７１．５９、６９．６７、６８．７４、６８．６７、６８．２１、６６．３８、６０．２２及び５９．７７（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−２’、Ｃ−３’、Ｃ−４’、Ｃ−５’、Ｃ−６’、Ｃ−２”、Ｃ−３”、Ｃ−４”、Ｃ−５”及びＣＨ２Ｐｈ）、１６．４５（Ｃ−６”）．
【０１７６】
ｃ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｓ−Ｂｎ
ドナー：ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｓ−Ｂｎ（２’−Ｏ−フコシルラクトースから化学的手段により得た標準サンプルと比較して同定した）
特徴的な１Ｈ  ＮＭＲピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．３６−７．２０（ｍ、５Ｈ、芳香族）、５．００（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ−１”）、．４．３４（ｄ、１Ｈ、Ｊ１’，２’＝６．８０Ｈｚ、Ｈ−１’）、３．９８（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝９．３３Ｈｚ、Ｈ−１）、３．９４及ビ３．７８（ＡＢｑ、２Ｈ、Ｊｇｅｍ＝１２．７７Ｈｚ、−ＣＨ２Ｐｈ）、１．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ５”，６”＝６．４７Ｈｚ、Ｈ−６”）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３８．１２、１２９．１１、１２９．１２、１２８．２９、１２８．２９及ビ１２４．８４（芳香族）、１００．９０及び１００．３９（Ｃ−１’及びＣ−１”）８２．７４（Ｃ−１）、７９．４４、７７．８５、７７．０５、７６．２７、７５．３８、７３．７４、７２．９４、７１．６３、６９．７２、６８．７８、６８．１８、６８．３８、６０．２４及び６０．１０（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−２’、Ｃ−３’、Ｃ−４’、Ｃ−５’、Ｃ−６’、Ｃ−２”、Ｃ−３”、Ｃ−４”、Ｃ−５”）、３２．２９（−ＣＨ２Ｐｈ）、１６．４７（Ｃ−６”）．
【０１７７】
ｄ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｓ−Ｐｈ
ドナー：ｐ−ニトロフェニルα−Ｌ−フコピラノシド又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：Ｆｕｃα１−２Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｓ−Ｐｈ（２’−Ｏ−フコシルラクトースから化学的手段により得た標準サンプルと比較して同定した）
特徴的な１Ｈ  ＮＭＲピーク（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７．５０−７．４６及び７．３８−７．２２（ｍ、５Ｈ、芳香族）、５．０２（ｄ、１Ｈ、Ｊ１”，２”＝２．２１Ｈｚ、Ｈ−１”）、４．６６（ｄ、１Ｈ、Ｊ１，２＝９．７８Ｈｚ、Ｈ−１）、４．３５（ｄ、１Ｈ、Ｊ１’，２’＝７．４１Ｈｚ、Ｈ−１’）、１．０５（ｄ、１Ｈ、Ｊ５”，６”＝６．４６Ｈｚ、Ｈ−６”）．
１３Ｃ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１３４．２０、１３０．１５、１３０．１５、１２８．８６、１２８．８６及び１２６．５９（芳香族）、１００．８４及び１００．１２（Ｃ−１’及びＣ−１”）、８６．３５（Ｃ−１）、７９．０６、７６．９９、７６．７０、７５．８４、７５．３２、７３．６８、７２．２２、７１．４５、６９．５４、６８．６５、６８．０５、６６．３８、６０．１２及び５９．５４（Ｃ−２、Ｃ−３、Ｃ−４、Ｃ−５、Ｃ−６、Ｃ−２’、Ｃ−３’、Ｃ−４’、Ｃ−５’、Ｃ−６’、Ｃ−２”、Ｃ−３”、Ｃ−４”、Ｃ−５”）、１６．４４（Ｃ−６”）．
【０１７８】
ｅ）アクセプター：Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
ドナー：α−Ｌ−フコシルフルオライド、２’−Ｏ−フコシルラクトース又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：モノフコシル化Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ、ＬＣ−ＭＳにより正しい分子量を確認した（９４４［Ｍ＋Ｈ］＋、９６１［Ｍ＋ＮＨ４］＋、９６６［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０１７９】
ｆ）アクセプター：Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ
ドナー：α−Ｌ−フコシルフルオライド、２’−Ｏ−フコシルラクトース又は２，５−ジメチル−３−オキソ−（２Ｈ）−フラン−４−イルα−Ｌ−フコピラノシド
生成物：モノフコシル化Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃβ１−Ｏ−Ｂｎ、ＬＣ−ＭＳにより正しい分子量を確認した（９４４［Ｍ＋Ｈ］＋、９６１［Ｍ＋ＮＨ４］＋、９６６［Ｍ＋Ｎａ］＋）
【０１８０】
好ましい形態を参照して本発明を説明したが、当然のことながら様々な変形が本発明の範囲内で可能である。
【０１８１】
本明細書において、他に明記のない限り、単語「又は（or）」は、述べられた条件の一方又は両方が満たされる場合に真値を返す演算子という意味で用いられており、これと対照的なのは、複数ある条件の中の１つだけ満たすことを要する「排他的ＯＲ（exclusive or）」という演算子である。単語「を含む（comprising）」は「を含む（including）」という意味で用いられているのであって、「からなる（consisting of）」ではない。上記で認めた全ての従来の教示は本明細書に参照することにより組み込まれる）。本明細書における先に発行された文献のいかなる認識も、該文献の教示が本明細書の時点におけるオーストラリア又は他国の共通の一般知識であるという自白又は表明として捉えるべきではない。
【配列表】
2014510098000001.app
【国際調査報告】
2014510098.tif 000038
2014510098.tif 000039