(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）蜂蜜をスチレン−ジビニルベンゼン系吸着材に接触させ、吸着成分を得る工程と、
（ｂ）前記吸着成分をアセトン、酢酸エチル又はエタノールである有機溶媒で溶出して有機溶媒フラクションを得る工程と、
（ｃ）前記有機溶媒フラクションから蜂蜜画分を得る工程と
を含み、
（ｂ）工程が、（ｂ−１）工程、（ｂ−２）工程及び（ｂ−３）工程からなる群から選ばれる少なくとも１つの工程を更に含む方法により得られる、蜂蜜画分。
（ｂ−１）前記有機溶媒で溶出される前記吸着成分を溶出時間によって分画し、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、ヘキサン／酢酸エチルの混合比が４／１である溶媒で展開したときにアニスアルデヒド硫酸試液により発色するＲｆ値０．４９〜０．５５のスポット及び当該スポットよりも発色が薄いＲｆ値０．５６〜０．６２のスポットを有する画分を前記有機溶媒フラクションとして得る工程。
（ｂ−２）前記有機溶媒で溶出される前記吸着成分を溶出時間によって分画し、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／１である溶媒で展開したときにドラーゲンドルフ試液により発色するＲｆ値０及び０．５４〜０．９４のスポットを有する画分を前記有機溶媒フラクションとして得る工程。
（ｂ−３）前記有機溶媒で溶出される前記吸着成分を溶出時間によって分画し、液体クロマトグラフィー質量分析法において下記条件で測定した場合に２．０〜４．０分の保持時間で検出され、かつｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを有するピークを含む画分を前記有機溶媒フラクションとして得る工程。
（測定条件）
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＦＨ  Ｃ１８（φ２．１×１００ｍｍ、ウォーターズ社製）
流速：０．４ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
溶媒：５％Ｂ（０−０．２５分）、５−１００％Ｂ（０．２５−１０分、リニアグラジエント）、１００％Ｂ（１０−１２分）、５％Ｂ（１２−１５分）
Ａ：０．０５％ギ酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル
注入量：２μｌ
【請求項２】
（ｂ）工程により溶出される前記吸着成分が、水又はメタノールで溶出されない成分である、請求項１に記載の蜂蜜画分。
【請求項３】
前記有機溶媒がアセトンである、請求項１又は２に記載の蜂蜜画分。
【請求項４】
（ｂ）工程の前に、前記吸着成分から水で溶出される成分を除去する工程を更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蜂蜜画分。
【請求項５】
（ｂ）工程の前に、前記吸着成分からメタノール、メタノール水溶液又はエタノール水溶液で溶出される成分を除去する工程を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の蜂蜜画分。
【請求項６】
（ｂ）工程が、（ｂ−４）（ｂ−２）工程によって得られる画分を逆相吸着材によって更に分画し、下記（１）及び（２）の少なくとも一方の条件を満たす画分を前記有機溶媒フラクションとして得る工程を更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蜂蜜画分。
（１）シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／０．３である溶媒で展開したときにドラーゲンドルフ試液により発色するＲｆ値０〜０．２２のスポットを有する。
（２）シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／水の混合比が１／１／０．３である溶媒で展開したときにニンヒドリン試液により発色するＲｆ値０．０２〜０．０９、０．１０〜０．２０及び０．３０〜０．５３からなる群から選ばれる少なくとも１つのスポットを有する。
【請求項７】
（ｄ）蜂蜜を酸性吸着材に接触させ、前記酸性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、
（ｅ）前記吸着成分を塩基性水溶液により溶出し、塩基性水溶液フラクションを得る工程と、
（ｆ）前記塩基性水溶液フラクションから蜂蜜画分を得る工程と
を含む方法により得られる、又は
（ｄ’）蜂蜜を塩基性吸着材に接触させ、前記塩基性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、
（ｅ’）前記吸着成分を酸性水溶液により溶出し、酸性水溶液フラクションを得る工程と、
（ｆ’）前記酸性水溶液フラクションから蜂蜜画分を得る工程と
を含む方法により得られる、蜂蜜画分。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の蜂蜜画分を有効成分として含む、オピオイド活性剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の蜂蜜画分を有効成分として含む、鎮咳剤又は鎮痛剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蜂蜜画分に関する。
【背景技術】
【０００２】
蜂蜜が小児のかぜによる咳症状に対して有効性を示す可能性が示唆されている（非特許文献１）。メカニズムとしては、蜂蜜の甘味等による唾液又は気道液の分泌促進等が推定されているが、解明には至っていない（非特許文献２）。
【０００３】
咳は気道の異物又は分泌物を除去する反射機序の１つであり、気道の炎症性変化、構造変化又は化学的・物理的刺激物の吸入によって引き起こされる。咳受容体としてはＡδ−線維に存在する急速応答性の受容体（ｒａｐｉｄｌｙ  ａｄａｐｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＲＡＲｓ）と、Ｃ−線維受容体が知られており、これら咳受容体へ刺激が加わると、上喉頭神経と迷走神経の求心性経路を通って咳嗽を発生させる（非特許文献３）。
【０００４】
鎮咳薬の種類には、中枢性の麻薬性鎮咳薬及び非麻薬性鎮咳薬に加え、気管支拡張剤、去痰剤、抗病原微生物、抗アレルギー剤、抗ＩｇＥ抗体、ステロイド、漢方等の末梢性鎮咳薬がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ian M.Paul, Therapeutic Options for Acute Cough Due to Upper Respiratory Infectionsin Children, Lung, 190 (1), 41-44, (2012).
【非特許文献２】Ian M.Paul, et.al, Effect of Honey, Dextromethorphan, and No Treatment on NocturnalCough and Sleep Quality for Coughing Children and Their Parents, Archives ofpediatrics adolescent medicine, 161 (12), 1140-1146 (2007).
【非特許文献３】村木正人ら、咳嗽の臨床、近畿大医誌、第３５巻（３、４号）、１４５〜１４９頁、２０１０
【非特許文献４】高濱和夫ら、咳‐その多様性と末梢性発現機序、日薬理誌、１０５、４１〜５２頁、１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
麻薬性鎮咳薬は、咳嗽に関する中枢の興奮を低下させるため効力が強いものの、悪心、嘔吐、呼吸抑制、便秘、眠気、排尿障害、依存性、薬剤耐性等の副作用があり、また、気道炎症時の咳に対する抑制作用が弱い。また、非麻薬性鎮咳薬は、依存性や呼吸抑制のような副作用はないものの、めまい、口渇、眠気、食欲不振、便秘、頻脈等の副作用があり、かつ一般に効力が弱い。末梢性鎮咳薬は、咳の刺激を伝える求心路又は中枢からの興奮を伝える遠心路を末梢（気道、肺、呼吸筋等）で遮断するが、原因疾患の治療を行っても改善が不十分であることが少なくない（非特許文献３、４）。既存薬に比べて有効性及び安全性に優れた鎮咳薬の開発が求められている。
【０００７】
本発明は、優れた鎮咳作用を有する蜂蜜画分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、（ａ）蜂蜜を吸着材に接触させ、吸着成分を得る工程と、（ｂ）上記吸着成分をアセトン、酢酸エチル又はエタノールである有機溶媒で溶出して有機溶媒フラクションを得る工程と、（ｃ）上記有機溶媒フラクションから蜂蜜画分を得る工程とを含む方法により得られる、蜂蜜画分を提供する。上記蜂蜜画分は、優れた鎮咳作用を有する。
【０００９】
（ｂ）工程により溶出される上記吸着成分は、水又はメタノールで溶出されない成分であることが好ましい。これにより、得られる蜂蜜画分をより鎮咳活性の高いものとすることができる。また、上記有機溶媒はアセトンであることが好ましい。
【００１０】
（ｂ）工程の前に、上記吸着成分から水で溶出される成分を除去する工程を更に含むことが好ましい。また、（ｂ）工程の前に、上記吸着成分からメタノール、メタノール水溶液又はエタノール水溶液で溶出される成分を除去する工程を更に含むことが好ましい。
【００１１】
（ｂ）工程は、下記（ｂ−１）工程、（ｂ−２）工程及び（ｂ−３）工程からなる群から選ばれる少なくとも１つの工程を更に含むことが好ましい。
（ｂ−１）上記有機溶媒で溶出される上記吸着成分を溶出時間によって分画し、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、ヘキサン／酢酸エチルの混合比が４／１である溶媒で展開したときにアニスアルデヒド硫酸試液（噴霧後１０５℃で加熱）により発色するＲｆ値０．４９〜０．５５のスポット及び当該スポットよりも発色が薄いＲｆ値０．５６〜０．６２のスポットを有する画分を上記有機溶媒フラクションとして得る工程。
（ｂ−２）上記有機溶媒で溶出される上記吸着成分を溶出時間によって分画し、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／１である溶媒で展開したときにドラーゲンドルフ試液により発色するＲｆ値０及び０．５４〜０．９４のスポットを有する画分を上記有機溶媒フラクションとして得る工程。
（ｂ−３）上記有機溶媒で溶出される上記吸着成分を溶出時間によって分画し、液体クロマトグラフィー質量分析法において下記条件で測定した場合に２．０〜４．０分の保持時間で検出され、かつｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを有するピークを含む画分を上記有機溶媒フラクションとして得る工程。
（測定条件）
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＦＨ  Ｃ１８（φ２．１×１００ｍｍ、ウォーターズ社製）
流速：０．４ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
溶媒：５％Ｂ（０−０．２５分）、５−１００％Ｂ（０．２５−１０分、リニアグラジエント）、１００％Ｂ（１０−１２分）、５％Ｂ（１２−１５分）
Ａ：０．０５％ギ酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル
注入量：２μｌ
【００１２】
（ｂ）工程は、（ｂ−４）工程を更に含むことが好ましい。（ｂ−４）工程は、（ｂ−２）工程によって得られる画分を、逆相吸着材によって更に分画し、下記（１）及び（２）の少なくとも一方の条件を満たす画分を上記有機溶媒フラクションとして得る工程である。
（１）シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／０．３である溶媒で展開したときにドラーゲンドルフ試液により発色するＲｆ値０〜０．２２のスポットを有する。
（２）シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／水の混合比が１／１／０．３である溶媒で展開したときにニンヒドリン試液（噴霧後１０５℃で加熱）により発色するＲｆ値０．０２〜０．０９、０．１０〜０．２０及び０．３０〜０．５３からなる群から選ばれる少なくとも１つのスポットを有する。
【００１３】
また、本発明は、（ｄ）蜂蜜を酸性吸着材に接触させ、上記酸性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、（ｅ）上記吸着成分を塩基性水溶液により溶出し、塩基性水溶液フラクションを得る工程と、（ｆ）上記塩基性水溶液フラクションから蜂蜜画分を得る工程とを含む方法により得られる、又は（ｄ’）蜂蜜を塩基性吸着材に接触させ、上記塩基性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、（ｅ’）上記吸着成分を酸性水溶液により溶出し、酸性水溶液フラクションを得る工程と、（ｆ’）上記酸性水溶液フラクションから蜂蜜画分を得る工程とを含む方法により得られる、蜂蜜画分を提供する。
【００１４】
また、本発明は上記蜂蜜画分を有効成分として含む、オピオイド活性剤を提供する。また、本発明は上記蜂蜜画分を有効成分として含む、鎮咳剤又は鎮痛剤を提供する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、優れた鎮咳作用を有する蜂蜜画分を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】試験例１−１における咳回数を示すグラフである。
【図２】試験例１−２における咳回数を示すグラフである。
【図３】試験例１−３における咳回数を示すグラフである。
【図４】試験例１−４における咳回数を示すグラフである。
【図５】試験例１−５における咳回数を示すグラフである。
【図６】試験例１−６における咳回数を示すグラフである。
【図７】試験例２−１における咳回数を示すグラフである。
【図８】試験例２−２における薄層クロマトグラフィーパターンを示す図である。
【図９】試験例２−２における咳回数を示すグラフである。
【図１０】試験例２−２におけるＬＣＭＳチャートを示す図である。
【図１１】試験例２−３における咳回数を示すグラフである。
【図１２】試験例３−１における咳回数を示すグラフである。
【図１３】試験例３−２における咳回数を示すグラフである。
【図１４】試験例４−１における咳回数を示すグラフである。
【図１５】試験例５−１における咳回数を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１８】
本実施形態に係る蜂蜜画分は、蜂蜜を特定の方法によって分画して得られるものであり、高い鎮咳活性を有する。具体的には、蜂蜜画分は、（ａ）蜂蜜を吸着材に接触させ、上記吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、（ｂ）上記吸着成分をアセトン、酢酸エチル又はエタノールである有機溶媒で溶出して有機溶媒フラクションを得る工程と、（ｃ）上記有機溶媒フラクションから蜂蜜画分を得る工程とを含む方法により得られる。
【００１９】
（ｂ）工程に用いられるエタノールの濃度は、１００％であってもよく、９９％以上であってもよい。
【００２０】
（ａ）工程における吸着材は、吸着材として物質の分離精製に一般的に用いられるものを用いることができ、例えば、活性炭、セルロース、二酸化ケイ素、カオリン、珪藻土、ベントナイト、シリカゲル、アルミナ、ゼオライト、多孔質ガラス、シクロデキストリン等を材質とする吸着材、合成吸着材が挙げられる。吸着材は多孔質であってよい。合成吸着材は、例えば、芳香族系、デキストラン誘導体系、メタクリル酸エステル系等の吸着材であってよい。芳香族系吸着材としては、スチレン−ジビニルベンゼン系吸着材が好ましい。スチレン−ジビニルベンゼン系吸着材である市販品としては、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０、ＨＰ−２１、ＳＰ８５０（三菱化学社製）、ＦＰＸ６６、ＸＡＤ７ＨＰ、ＦＰＸ６２（オルガノ社製）等が挙げられる。合成吸着材は、酸性陽イオン交換樹脂、塩基性陰イオン交換樹脂等のイオン交換樹脂であってもよい。イオン交換樹脂は、後述の酸性吸着材及び塩基性吸着材と同様のものを適用できる。吸着材は、例えば、カラムに充填して用いることができる。
【００２１】
（ｂ）工程により溶出される吸着成分は、水又はメタノールで溶出されない成分であることが好ましい。例えば、（ｂ）工程の前に、（ａ）工程で得られた吸着成分を水、メタノール、又はメタノール水溶液で溶出して、吸着成分から水、メタノール、又はメタノール水溶液で溶出される成分を除去することにより、吸着成分中の水又はメタノールで溶出されない成分の割合を高めることができる。メタノール水溶液としては、任意のメタノール濃度のものを用いることができ、例えば５０％メタノール水溶液を用いることができる。また、例えば、（ａ）工程に用いる蜂蜜を予め水に溶解し、蜂蜜水溶液として吸着材に接触させることにより、吸着成分中の水で溶出されない成分の割合を高めることができる。これらの処理により、鎮咳活性の高い画分をより効率的に得ることができる。
【００２２】
また、（ｂ）工程により溶出される吸着成分は、エタノール水溶液で溶出されない成分であってもよい。例えば、（ｂ）工程の前に、（ａ）工程で得られた吸着成分を予めエタノール水溶液で溶出して、吸着成分から水又はエタノール水溶液で溶出されない成分の割合を高めることができる。エタノール水溶液の濃度は例えば２０〜８０％であってよく、４０〜６０％であってもよく、５０％であってもよい。これらの処理によって、鎮咳活性の高い画分をより効率的に得ることができる。
【００２３】
（ｂ）工程の前には、吸着成分から水で溶出される成分を除去する工程、吸着成分からメタノール水溶液で溶出される成分を除去する工程、及び吸着成分からメタノールで溶出される成分を除去する工程を含むことが好ましく、これら３つの工程をこの順に含むことが好ましい。このような分画方法により、得られる蜂蜜画分の鎮咳作用をより高めることができる。
【００２４】
得られる蜂蜜画分を食品用途に用いる場合、（ａ）工程で得られた吸着成分を予め溶出するための溶媒が水及びエタノールであることが好ましく、（ｂ）工程における有機溶媒がエタノールであることが好ましい。
【００２５】
（ｂ）工程では、有機溶媒で溶出される吸着成分を更に分画し、より鎮咳活性の高い画分を選出することが好ましい。吸着成分の分画は、例えば、有機溶媒で吸着成分を溶出する際の溶出時間によって行うことができる。
【００２６】
画分の中から鎮咳活性の高い画分を選出する方法としては、例えば、各画分をシリカゲルの薄層クロマトグラフィーに供し、その展開パターンを指標とする方法を用いることができる。溶出時間によって分画された吸着成分は、その溶出時間によって薄層クロマトグラフィーの展開パターンが異なる傾向があり、展開パターンによって、目的の蜂蜜画分を含む有機溶媒フラクションか否かを判別することができる。吸着成分を溶出時間によって分画し、薄層クロマトグラフィーの展開パターンを指標として目的の画分を得る工程としては、具体的には例えば、下記の（ｂ−１）工程、又は（ｂ−２）工程により行うことができる。
【００２７】
（ｂ−１）工程は、有機溶媒で溶出される吸着成分を溶出時間によって分画し、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、ヘキサン／酢酸エチルの混合比が４／１である溶媒で展開したときにアニスアルデヒド硫酸試液により発色するＲｆ値０．４９〜０．５５のスポット（以下、スポットＡともいう。）及びスポットＡよりも発色が薄いＲｆ値０．５６〜０．６２のスポット（以下、スポットＢともいう。）を有する画分を上記有機溶媒フラクションとして得る工程である。
【００２８】
上記特徴を有する画分は、より高い鎮咳活性を有する。スポットＡのＲｆ値は０．５１〜０．５３であることが好ましく、スポットＢのＲｆ値は０．５８〜０．６０であることが好ましい。なお、目的とする高い鎮咳活性を有する蜂蜜画分より溶出時間の遅い画分として、スポットＢがスポットＡよりも発色が濃い展開パターンを示す画分が得られる。
【００２９】
（ｂ−１）工程で用いるアニスアルデヒド硫酸試液は、ｐ−アニスアルデヒド１３ｍＬ、酢酸５ｍＬ及びエタノール４７８ｍＬを混合し、濃硫酸１８ｍＬを滴下することにより調製することができる。アニスアルデヒド硫酸試液による染色では、試液の噴霧後１０５℃で加熱することにより発色を確認することができる。
【００３０】
（ｂ−２）工程は、有機溶媒で溶出される上記吸着成分を溶出時間によって分画し、シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／１である溶媒で展開したときにドラーゲンドルフ試液により発色するＲｆ値０及び０．５４〜０．９４のスポットを有する画分を有機溶媒フラクションとして得る工程である。上記特徴を有する画分は、より高い鎮咳活性を有する。スポットのＲｆ値は０及び０．６４〜０．８４であることが好ましく、０及び０．６９〜０．７９であることがより好ましく、０及び０．７２〜０．７６であることが更に好ましい。
【００３１】
（ｂ−２）工程において用いられるドラーゲンドルフ試液は、次硝酸ビスマス１．７ｇ、酢酸２０ｍＬ及び蒸留水８０ｍＬを混合して調製した混合液５ｍＬ、ヨウ化カリウム４０ｇ及び蒸留水１００ｍＬを混和して調製した混和液５ｍＬ、酢酸２０ｍＬ、並びに蒸留水７０ｍＬを混合することにより調製することができる。
【００３２】
（ｂ）工程はまた、（ｂ−３）工程を含んでいてもよい。（ｂ−３）工程は、有機溶媒で溶出される上記吸着成分を溶出時間によって分画し、液体クロマトグラフィー質量分析法において後述の条件で測定した場合に２．０〜４．０分の保持時間で検出され、かつｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを有するピークを含む画分を有機溶媒フラクションとして得る工程である。このようなピークを指標として分画することにより、高い鎮咳活性を有する蜂蜜画分を得ることができる。保持時間は２．２〜３．４分であることが好ましく、２．５〜３．１分であることがより好ましく、２．７〜２．９分であることが更に好ましい。
【００３３】
液体クロマトグラフィー質量分析は、例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ウォーターズ社製）により行うことができる。液体クロマトグラフィー質量分析法の測定条件は次のとおりである。
カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＦＨ  Ｃ１８（φ２．１×１００ｍｍ、ウォーターズ社製）、流速：０．４ｍｌ／分、カラム温度：４０℃、溶媒：５％Ｂ（０−０．２５分）、５−１００％Ｂ（０．２５−１０分、リニアグラジエント）、１００％Ｂ（１０−１２分）、５％Ｂ（１２−１５分）、Ａ：０．０５％ギ酸水溶液、Ｂ：１００％アセトニトリル、検出波長：２９５．８ｎｍ、検出マス：ＳＩＲモード：ポジティブモード  ｍ／ｚ（ｃｏｎｅ）：９３．２（１０）、２３９．１（１０）、２５５．４（３０）、２５７．１（３０）、４３８．５（３０）、５８５．３（３０）、ネガティブモード  ｍ／ｚ（ｃｏｎｅ）：１１２．９（３０）、１７５．０（３０）、２５３．２（３０）、２５５．２（３０）、２８５．６（３０）、４４９．８（３０）、５７７．８（３０）
注入量：２μｌ
【００３４】
（ｂ−１）工程、（ｂ−２）工程及び（ｂ−３）工程は、いずれか１つを行ってもよく、複数の工程を行ってもよい。（ｂ−２）工程又は（ｂ−３）工程を行うことによって、（ｂ−１）工程のみを行う場合よりも更に鎮咳活性の高い蜂蜜画分を得ることができる。
【００３５】
（ｂ−４）工程
（ｂ）工程では、（ｂ−２）工程で得られる画分を更に分画し、より鎮咳活性の高い画分を選出することが好ましい。（ｂ−２）工程で得られる画分の更なる分画は、例えば、（ｂ−２）工程で得られる画分を、逆相吸着材を用いて逆相クロマトグラフィー等に供することにより行うことができる。得られる画分から、より鎮咳活性の高い画分を選出する方法としては、例えば、各画分をシリカゲルの薄層クロマトグラフィーに供し、その展開パターンを指標とする方法を用いることができる。逆相クロマトグラフィーの溶出時間により分画された画分は、その溶出時間によって薄層クロマトグラフィーの展開パターンが異なる傾向があり、展開パターンによって、目的の蜂蜜画分を含む画分か否かを判別することができる。具体的には例えば、下記の（ｂ−４）工程により行うことができる。
【００３６】
（ｂ−４）工程は、（ｂ−２）工程によって得られる画分を逆相吸着材によって更に分画し、下記（１）及び（２）の少なくとも一方の条件を満たす画分を有機溶媒フラクションとして得る工程である。
（１）シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／０．３である溶媒で展開したときにドラーゲンドルフ試液により発色するＲｆ値０〜０．２２のスポットを有する。
（２）シリカゲルを用いた薄層クロマトグラフィーにおいて、クロロホルム／メタノール／水の混合比が１／１／０．３である溶媒で展開したときにニンヒドリン試液により発色するＲｆ値０．０２〜０．０９、０．１０〜０．２０及び０．３０〜０．５３からなる群から選ばれる少なくとも１つのスポットを有する。
【００３７】
ニンヒドリン試液は、例えばニンヒドリン０．３ｇ、酢酸３ｍＬ及びｎ−ブタノール１００ｍＬを混合することにより調製することができる。ニンヒドリン試液による染色では、試液の噴霧後１０５℃で加熱することにより発色を確認することができる。
【００３８】
逆相クロマトグラフィーは、例えばＯＤＳ（Ｃ１８）カラム、Ｃ８カラム、Ｃ３０カラム等の逆相カラムを用いて高速液体クロマトグラフィーにより行うことができる。逆相のＯＤＳカラムの市販品としては、例えばｃｏｓｍｏｓｉｌ  ５ｃ−１８−ＡＲ−ＩＩ（ナカライテスク社製）、Ｃａｐｃｅｌｌ  Ｐａｋ  Ｃ１８  ＡＱ（資生堂社製）、Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８、Ａｔｌａｎｔｉｓ  Ｔ３（ウォーターズ社製）、ｉｎｅｒｔｓｉｌｌ  ＯＤＳ−３（ＧＬサイエンス社製）、ＴＳＫ  ｇｅｌ  ＯＤＳ−１００Ｓ（東ソー社製）、Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（インタクト社製）、Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ  Ｃ１８、Ｐｒｏ  Ｃ８、Ｐｒｏ  Ｃ１８（ＹＭＣ社製）、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＨＢ  ＯＤＳ−ＵＧ−３、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＨＢ  ＯＤＳ−ＨＧ−３、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ  ＨＢ  Ｃ３０−ＵＧ−３（デベロシル社製）等が挙げられる。
【００３９】
上記（１）における薄層クロマトグラフィー展開パターンのスポットは、Ｒｆ値が０〜０．１２であることが好ましく、Ｒｆ値が０〜０．０６であることがより好ましい。上記（２）における薄層クロマトグラフィー展開パターンは、Ｒｆ値が０．０４〜０．０７、０．１０〜０．１８及び０．３０〜０．５３からなる群から選ばれる少なくとも１つのスポットを有することが好ましく、Ｒｆ値が０．１０〜０．１８であるスポットを有することがより好ましい。
【００４０】
（ｃ）工程では、（ｂ）工程で得られた有機溶媒フラクションから蜂蜜画分を得る。蜂蜜画分は、例えば有機溶媒フラクション中の溶媒を除去することにより、得ることができる。溶媒の除去は、例えば、凍結乾燥、加熱乾燥等により行うことができる。
【００４１】
本実施形態に係る蜂蜜画分はまた、（ｄ）蜂蜜を酸性吸着材に接触させ、酸性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、（ｅ）吸着成分を塩基性水溶液により溶出し、塩基性水溶液フラクションを得る工程と、（ｆ）塩基性水溶液から蜂蜜画分を得る工程とを含む方法により得ることもできる。当該方法により得ることができる蜂蜜画分は、高い鎮咳活性を有する。
【００４２】
（ｄ）工程は、具体的には例えば、イオン交換水等の水に溶解した蜂蜜水溶液を、酸性陽イオン交換樹脂等の酸性吸着材に流すことにより行うことができる。酸性陽イオン交換樹脂のイオン形は、例えば、カルシウムイオン形、ナトリウムイオン形等の塩形であってよい。酸性陽イオン交換樹脂は強酸性陽イオン交換樹脂又は弱酸性陽イオン交換樹脂であってよい。酸性陽イオン交換樹脂としては、例えば、アンバーライト２００ＣＴＮＡ（オルガノ社製）、ＳＫ１Ｂ、ＳＫ１０４、ＳＫ１１０、ＳＫ１１２、ＰＫ２０８、ＰＫ２１２、ＰＫ２１６、ＰＫ２１８、ＰＫ２２０、ＰＫ２２８、ＵＢＫ５３０、ＵＢＫ５３５、ＵＢＫ５３０Ｋ、ＵＢＫ５３５Ｋ、ＵＢＫ５５５、ＷＫ４０、ＷＫ１０、ＷＫ１１、ＷＫ１００（いずれも三菱化学社製）等を用いることができる。酸性陽イオン交換樹脂は、予め酸性水溶液及び水でコンディショニングすることが好ましい。コンディショニングに用いる酸性水溶液としては、例えば１Ｍの塩酸等が好適である。
【００４３】
（ｅ）工程で用いる塩基性水溶液としては、例えば、アンモニア水等のｐＨ８〜９の水溶液を用いることができる。塩基性水溶液はエタノールを含んでいてもよい。（ｅ）工程により溶出される吸着成分は、水で溶出されない成分であることが好ましい。例えば、（ｅ）工程の前に（ｄ）工程で得られた吸着成分を水で溶出し、吸着成分から水で溶出される成分を除去することにより、次の（ｅ）工程により溶出される吸着成分を、水で溶出されない成分とすることができる。
【００４４】
（ｆ）工程において、蜂蜜画分は、例えば塩基性水溶液フラクション中の溶媒を除去することにより得ることができる。溶媒の除去は、例えば、凍結乾燥、加熱乾燥により行うことができる。
【００４５】
本実施形態に係る蜂蜜画分はまた、（ｄ’）蜂蜜を塩基性吸着材に接触させ、塩基性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、（ｅ’）吸着成分を酸性水溶液により溶出し、酸性水溶液フラクションを得る工程と（ｆ’）酸性水溶液から蜂蜜画分を得る工程とを含む方法により得ることができる。
【００４６】
（ｄ’）工程は、具体的には例えば、イオン交換水等の水に溶解した蜂蜜水溶液を、塩基性陰イオン交換樹脂等の塩基性吸着材に流すことにより行うことができる。塩基性陰イオン交換樹脂のイオン形は、例えば、塩化物イオン形等であってよい。塩基性陰イオン交換樹脂は強塩基性陰イオン交換樹脂又は弱塩基性陰イオン交換樹脂であってよい。塩基性陰イオン交換樹脂はＭＲ形であることが好ましく、また、スチレン系であることが好ましい。塩基性陰イオン交換樹脂としては、例えば、アンバーライト２  ＩＲＡ９１０ＣＴ、ＩＲＡ４０２ＢＬ（オルガノ社製）、ＳＡ１０Ａ、ＳＡ１２Ａ、ＳＡ１１Ａ、ＮＳＡ１００、ＵＢＡ１２０（均一粒径品）、ＰＡ３０６Ｓ、ＰＡ３０８、ＰＡ３１２、ＰＡ３１６、ＰＡ３１８Ｌ、ＨＰＡ２５、ＳＡ２０Ａ、ＳＡ２１Ａ、ＰＡ４０８、ＰＡ４１２、ＰＡ４１８、ＷＡ１０、ＷＡ２０、ＷＡ２１Ｊ、ＷＡ３０（三菱化学社製）等を用いることができる。塩基性陰イオン交換樹脂は、予め塩基性水溶液及び水でコンディショニングすることが好ましい。コンディショニングに用いる塩基性水溶液としては、例えば１Ｍの水酸化ナトリウム水溶液等が好適である。
【００４７】
蜂蜜水溶液は、塩基性（ｐＨ８〜９）に調節されていることが好ましい。ｐＨの調節は、蜂蜜水溶液にアンモニア水等の塩基性水溶液を添加することにより行うことができる。
【００４８】
（ｅ’）工程で用いる酸性水溶液としては、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸等のｐＨ２〜３の水溶液を用いることができる。酸性水溶液はエタノールを含んでいてもよい。（ｅ’）工程により溶出される吸着成分は、水で溶出されない成分であることが好ましい。例えば、（ｅ’）工程の前に（ｄ’）工程で得られた吸着成分を水で溶出し、吸着成分から水で溶出される成分を除去することにより、次の（ｅ’）工程により溶出される吸着成分を、水で溶出されない成分とすることができる。
【００４９】
（ｆ’）工程において、蜂蜜画分は、例えば塩基性水溶液フラクション中の溶媒を除去することにより得ることができる。溶媒の除去は、例えば、凍結乾燥、加熱乾燥により行うことができる。
【００５０】
上記（ｄ）工程では、蜂蜜を酸性吸着材に接触させる前に、上記（ｄ’）及び（ｅ’）工程と同様の工程を行うことにより予め蜂蜜を分画してもよい。すなわち、（ｄ）工程において、蜂蜜を塩基性吸着材に接触させ、塩基性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、吸着成分を酸性水溶液により溶出し、酸性水溶液フラクションを得る工程とを経てから、当該酸性水溶性フラクションを酸性吸着材に接触させて、酸性吸着材に吸着された吸着成分を得てもよい。
【００５１】
逆に、上記（ｄ’）工程では、蜂蜜を塩基性吸着材に接触させる前に、上記（ｄ）及び（ｅ）工程と同様の工程を行うことにより予め蜂蜜を分画してもよい。すなわち、（ｄ’）工程において、蜂蜜を酸性吸着材に接触させ、酸性吸着材に吸着された吸着成分を得る工程と、吸着成分を塩基性水溶液により溶出し、塩基性水溶液フラクションを得る工程とを経てから、当該塩基性水溶性フラクションを塩基性吸着材に接触させて、塩基性吸着材に吸着された吸着成分を得てもよい。このように、異なる種類の吸着材に接触させる工程を経ることにより、更に鎮咳活性の高い蜂蜜画分を得ることができる。
【００５２】
本実施形態において用いられる蜂蜜の由来は特に限定されず、任意の種類の蜂蜜を用いることができる。蜂蜜としては、例えば、百花蜂蜜、アカシア蜂蜜、ソバ蜂蜜、甘露蜂蜜等が挙げられる。蜂蜜の産地は特に限定されない。
【００５３】
本実施形態に係る蜂蜜画分は、高い鎮咳活性を有する。具体的には、本実施形態に係る蜂蜜画分を摂取することによって、咳嗽を予防又は抑制することができる。したがって、本実施形態に係る蜂蜜画分は、鎮咳剤、咳予防剤又は咳抑制剤として用いることができる。
【００５４】
咳は、咳受容体が刺激されることにより誘発される。咳受容体には、Ａδ線維の急速適応受容体とＣ−線維受容体とがあると考えられている。本実施形態に係る蜂蜜画分は、後述の実施例において示されているように、様々な要因で引き起こされるいずれの種類の咳嗽であっても鎮咳作用を有する。
【００５５】
本実施形態に係る蜂蜜画分はオピオイド活性を有する。具体的には、本実施形態に係る蜂蜜画分が有する生理作用の少なくとも一部は、後述の実施例によって示されているように、オピオイド受容体を介して発揮される作用（オピオイド活性）によるものである。したがって、本実施形態に係る蜂蜜画分は、オピオイド活性剤として用いることができる。
【００５６】
オピオイド活性は、鎮咳活性の他、鎮痛、麻酔、情動、呼吸、脈動、体温、消化管機能、摂食、免疫、インシュリンやソマトスタチン等のホルモンの分泌調節、電解質の吸収促進、心筋の収縮調節等に関与することが知られている（参考文献：山口重樹、「オピオイド鎮痛薬の作用機序」、Ａｎｅｔ、Ｖｏｌ．１８、Ｎｏ．３、１２−１５頁、２０１４、特開平６−１２８２８７号公報）。したがって、本実施形態に係る蜂蜜画分は、例えば、鎮痛剤、麻酔剤、情動調節剤、呼吸調節剤、脈動調節剤、体温調節剤、消化管機能調節剤、摂食調節剤、免疫向上剤、ホルモン分泌調節剤、電解質吸収促進剤、心筋収縮調節剤等として用いることもできる。本実施形態に係る蜂蜜画分は、特に鎮咳剤又は鎮痛剤として用いるのに好適である。
【００５７】
本実施形態に係るオピオイド活性剤、鎮咳剤、鎮痛剤、その他の上記剤は、有効成分である蜂蜜画分のみを含むものであってもよく、鎮咳効果、鎮痛効果等の上記生理作用を妨げられない限り、溶媒及びその他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、例えば、薬学的に許容される添加剤（賦形剤、結合材、滑沢剤、崩壊剤、乳化剤、界面活性剤、基剤、溶解補助剤、懸濁化剤等）、食品として許容される成分（例えば、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類、キノン類、ポリフェノール類、アミノ酸、核酸、必須脂肪酸、清涼剤、結合剤、甘味料、崩壊剤、滑沢剤、着色料、香料、安定化剤、防腐剤、徐放調整剤、界面活性剤、溶解剤、湿潤剤）を挙げることができる。
【００５８】
本実施形態に係るオピオイド活性剤、鎮咳剤、鎮痛剤、その他の上記剤に含まれる蜂蜜画分の割合は、本発明の効果が得られる範囲であればよく、最終形態等に応じて適宜調整することができ、例えば総量で０．０００００１〜１００質量％の範囲とすることができる。
【００５９】
本実施形態に係る蜂蜜画分、オピオイド活性剤、鎮咳剤、鎮痛剤、その他の上記剤は、固体、液体、ペースト等のいずれの形状であってもよく、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤等を含む）、カプセル剤、丸剤、粉末剤（散剤）、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、シロップ、ペースト、注射剤（使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液若しくは電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む）等の剤形であってもよい。これらの各種製剤は、例えば、有効成分である蜂蜜画分と、必要に応じて他の成分とを混合して上記剤形に成形することによって調製することができる。
【００６０】
本実施形態に係る蜂蜜画分は、医薬品及び食品そのものとして使用することができ、医薬品及び食品に添加して使用することもできる。食品としては、食品の３次機能、すなわち体調調節機能が強調された食品であることが好ましい。体調調節機能としては、例えば、鎮咳機能、鎮痛機能、麻酔機能、情動調節機能、呼吸調節機能、脈動調節機能、体温調節機能、消化管機能調節機能、摂食調節機能、免疫向上機能、ホルモン分泌調節機能、電解質の吸収促進機能、心筋の収縮調節機能等が挙げられる。食品の３次機能が強調された食品としては、例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント及び特定保健用食品を挙げることができる。
【００６１】
本実施形態に係る蜂蜜画分からなる医薬品若しくは食品、又は本実施形態に係る蜂蜜画分を含む医薬品若しくは食品は、鎮咳用、鎮痛用、麻酔用、情動調節用、呼吸調節用、脈動調節用、体温調節用、消化管機能調節用、摂食調節用、免疫向上用、ホルモン分泌調節用、電解質の吸収促進用、心筋の収縮調節用等であってよい。また、上記医薬品又は食品には、咳を鎮める旨、痛みを鎮める旨、麻酔作用を有する旨、情動を調節する旨、呼吸を調節する旨、脈動を調節する旨、体温を調節する旨、消化管機能を調節する旨、摂食を調節する旨、免疫を向上させる旨、ホルモン分泌を調節する旨、電解質の吸収を促進する旨、心筋の収縮を調節する旨等の表示が付されていてもよい。
【００６２】
本実施形態に係る蜂蜜画分を食品（例えば、健康食品、機能性食品、栄養補助食品又は特定保健用食品）に添加して使用する場合、食品の形態は特に限定されず、例えば、飲料類（コーヒー、ジュース、茶飲料等の清涼飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料等）；スプレッド類（カスタードクリーム等）；ペースト類（フルーツペースト等）；洋菓子類（チョコレート、ドーナツ、パイ、シュークリーム、ガム、ゼリー、キャンデー、クッキー、ケーキ、プリン等）；和菓子類（大福、餅、饅頭、カステラ、あんみつ、羊羹等）；氷菓類（アイスクリーム、アイスキャンデー、シャーベット等）；食品類（カレー、牛丼、雑炊、味噌汁、スープ、ミートソース、パスタ、漬物、ジャム等）；調味料類（ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素等）であってもよい。
【００６３】
本実施形態に係る蜂蜜画分を添加した医薬品又は食品の製法は特に限定されず、適宜公知の方法に従うことができる。例えば、医薬品又は食品の製造工程における中間製品又は最終製品に、本実施形態に係る蜂蜜画分を混合等して、上記の用途に用いられる医薬品又は食品を得ることができる。
【実施例】
【００６４】
以下、実施例により本発明の実施形態を具体的に説明する。本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００６５】
[試験例１]
種々の刺激により咳を誘発したモルモットに対する各種蜂蜜の作用を検討した。
【００６６】
（試験例１−１．クエン酸刺激）
δ線維の急速適応受容体（ＲＡＲｓ）を介した咳嗽に対する蜂蜜の作用を検討するため、ＲＡＲｓを刺激するクエン酸で誘発した咳嗽に対する蜂蜜の鎮咳作用を調べた。
ルーマニア産アカシア蜂蜜又は日本産ソバ蜂蜜を、モルモットの体重１ｋｇ当たり蜂蜜１ｇの割合（以下、１ｇ／ｋｇ等と表記する。）で正常モルモットに胃内投与した。各蜂蜜は水に溶解したものを胃内投与した。投与３０分後にクエン酸（０．１Ｍ）を５分間噴霧し、噴霧開始直後から３０分間の咳反射の回数を計測した。コントロールとして、蜂蜜水溶液の代わりに水又はデキストロメトルファン（ＤＭ）水溶液（ＤＭ１００ｍｇ／ｋｇ）を用いた他は上記と同様の方法でクエン酸により咳を誘発し、咳反射の回数を計測した。結果を図１に示す。アカシア蜂蜜又はソバ蜂蜜１ｇ／ｋｇの投与により、水のみを与えた場合に比べ咳の回数が有意に減少した。
【００６７】
（試験例１−２．カプサイシン刺激）
Ｃ−線維を介した咳嗽を誘発するカプサイシンを用いて蜂蜜の鎮咳作用を調べた。アカシア蜂蜜水溶液を蜂蜜０．１ｇ／ｋｇ、０．３ｇ／ｋｇ又は１ｇ／ｋｇの割合で正常モルモットに胃内投与した。投与３０分後にカプサイシン（１０−５Ｍ）を５分間噴霧し、その後３０分間の咳反射の回数を計測した。コントロールとして、蜂蜜水溶液の代わりに、水又はＤＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）水溶液を用いた。結果を図２に示す。アカシア蜂蜜１ｇ／ｋｇの投与により、ＤＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）とほぼ同等の鎮咳効果を示した。また、蜂蜜の鎮咳作用は濃度依存的であることが示された。
【００６８】
（試験例１−３．タバコ煙刺激）
タバコ煙抽出液（ＣＳＥ）を１週間モルモットの気管内に投与して、気道炎症を誘導したモルモットを用い、蜂蜜としてアカシア蜂蜜のみを用いた他は、上記試験例１−１と同様の方法で、モルモットにクエン酸刺激により咳嗽を誘発し、蜂蜜の鎮咳作用を調べた。結果を図３に示す。ＣＳＥ投与を行っていない健常モルモットの咳回数も併せて示す。アカシア蜂蜜１ｇ／ｋｇの投与により、ＤＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）とほぼ同等の鎮咳効果を示した。
【００６９】
（試験例１−４．亜硫酸ガス刺激）
粘液貯留亢進、当該感受性の亢進及び好中球湿潤といった亜急性軌道炎症に特徴的な病態を示すことが知られている亜硫酸ガス曝露モルモットを用いて、クエン酸刺激により誘発された咳嗽に対する蜂蜜の作用を調べた。亜硫酸ガスを１週間曝露したモルモットを用い、蜂蜜投与割合を０．１ｇ／ｋｇ、０．３ｇ／ｋｇ又は１ｇ／ｋｇとした他は上記試験例１−１と同様の方法で、モルモットにクエン酸刺激により咳嗽を誘発し、蜂蜜の鎮咳作用を調べた。結果を図４に示す。アカシア蜂蜜及びソバ蜂蜜は、１ｇ／ｋｇの投与により、ＤＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）とほぼ同等の鎮咳効果を示した。
【００７０】
（試験例１−５．卵白アルブミン）
咳喘息、アトピー性咳嗽等に代表される好酸球性炎症時の咳嗽に対する作用を検討するため、卵白アルブミン（ＯＶＡ）感作による気管支喘息モデルを作製し、上記試験例１−１と同様にクエン酸刺激により咳嗽を誘発し、蜂蜜の鎮咳作用を調べた。気管支喘息モデルとしては、左耳介にＯＶＡを皮下投与し、アナフィラキシー反応陽性となった個体のみを試験に用いた。結果を図５に示す。アカシア蜂蜜１ｇ／ｋｇの投与により、ＤＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）より高い鎮咳効果を示した。
【００７１】
（試験例１−６）
甘露蜂蜜（０．８ｇ／ｋｇ）及びアカシア蜂蜜（１ｇ／ｋｇ）をそれぞれ正常モルモットに胃内投与した。各蜂蜜は水に溶解したものを胃内投与した。試験例１−１と同様に、投与３０分後にクエン酸（０．１Ｍ）を５分間噴霧し、噴霧開始直後から３０分間の咳反射の回数を計測した。コントロールとして、蜂蜜水溶液の代わりに水を用いた。結果を図６に示す。甘露蜂蜜はアカシア蜂蜜と同等の鎮咳活性を有することが確認された。
【００７２】
［試験例２］
（試験例２−１）
アカシア蜂蜜を１００．００ｇ量りとり、水２Ｌに溶解して蜂蜜水溶液を調製した。Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０（三菱化学社製）を充填したカラム（φ５×３１ｃｍ、５００ｍＬ）に蜂蜜水溶液をゆっくり５回流し、未吸着成分を水フラクションとして回収した。上記カラムに、５０％メタノール水溶液、メタノール、アセトンをそれぞれ２Ｌずつ順次流し、５０％メタノールフラクション（１６．８６ｇ）、メタノールフラクション（９８．３３ｍｇ）、アセトンフラクション（５２．０３ｍｇ）として回収した（かっこ内は各フラクション中の溶媒を除いた蜂蜜画分の量を示す。以下同じ。）。水フラクションを凍結乾燥して重量を計測したところ、水フラクション中の水を除く蜂蜜画分量は７３．１ｇであった。
【００７３】
水に溶解した各蜂蜜画分の蜂蜜１ｇ／ｋｇ相当量を正常モルモットに胃内投与した。投与３０分後にクエン酸（０．１Ｍ）を５分間噴霧し、噴霧開始直後から３０分間の咳反射の回数を計測した。コントロールとして、蜂蜜画分水溶液の代わりに水又はＤＭ水溶液（ＤＭ０．３ｍｇ／ｋｇ）を用いた。結果を図７に示す（平均±標準偏差、ｎ＝５〜６、＊＊＊：ｐ＜０．０００１（対コントロール））。アセトンフラクション０．５２ｍｇ／ｋｇにＤＭ０．３ｍｇ／ｋｇに匹敵する明確な鎮咳効果が認められた。分画前の蜂蜜と比較すると、アセトンフラクション中の蜂蜜画分の比活性は１，９２３倍であった。
【００７４】
（試験例２−２）
アカシア蜂蜜を２００．００ｇ量りとり、水４Ｌに溶解して蜂蜜水溶液を調製した。Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０を充填したカラム（φ５×３１ｃｍ、５００ｍＬ）に蜂蜜水溶液をゆっくり５回流した後、当該カラムに、５０％メタノール水溶液、メタノール、をそれぞれ４Ｌずつ順次流し、５０％メタノールフラクション（３０．５４ｇ）、メタノールフラクション（４１．５６ｍｇ）として回収した。さらに上記カラムにアセトン４Ｌを流し、溶出時間毎にアセトンフラクションを分取した。
【００７５】
得られた各アセトンフラクション中の蜂蜜画分について、薄層クロマトグラフィー分析を行った。Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ２５４プレート（０．５ｍｍ）を用い、各サンプル１０ｍｇを１ｍＬのアセトンに溶解したものをスポットした。ヘキサン／酢酸エチルの混合比が４／１の溶媒で展開し、乾燥後、アニスアルデヒド硫酸試液をプレートに噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。アニスアルデヒド硫酸試液は、ｐ−アニスアルデヒド１３ｍＬ、酢酸５ｍＬ及びエタノール４７８ｍＬを混合し、濃硫酸１８ｍＬを滴下したものを用いた。蜂蜜画分の展開パターンは、３種類に分類されたため、それぞれ溶出時間順にアセトンフラクション１（２７．８ｍｇ）、アセトンフラクション２（５１．４ｍｇ）、アセトンフラクション３（９．８９ｍｇ）とした。アセトンフラクション全体及びアセトンフラクション１〜３の展開結果を図８に示す。アセトンフラクション１は、Ｒｆ値が０．０８、０．４７、０．５２、０．５９であるスポットを少なくとも有しており、Ｒｆ値０．５９のスポットが０．５２のスポットよりも発色が薄いことが特徴であった。アセトンフラクション２は、Ｒｆ値０．５２及び０．５９のスポットを少なくとも有していたが、Ｒｆ値０．５９のスポットが最も濃く発色していることが特徴であった。アセトンフラクション３はレーン全体の発色が薄いことが特徴であった。
【００７６】
アセトンフラクション１〜３について、それぞれのフラクションから溶媒を除去して得た蜂蜜画分を水に溶解し、各画分の蜂蜜１ｇ／ｋｇ相当量を正常モルモットに胃内投与した。投与３０分後にクエン酸（０．１Ｍ）を５分間噴霧し、噴霧開始直後から３０分間の咳反射の回数を計測した。コントロールとして、蜂蜜画分水溶液の代わりに水を用いた。結果を図９に示す。アセトンフラクション１（０．１４ｍｇ／ｋｇ）に高い鎮咳活性が認められた。分画前の蜂蜜と比較すると、アセトンフラクション１中の蜂蜜画分の比活性は７，１４３倍であった。
【００７７】
メタノールフラクション及びアセトンフラクション１、２について、下記条件によりＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｍｉｃｔｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｐｒｅｍｉｕｍ（ウォーターズ社製））による分析を行った。カラムはＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＦＨ  Ｃ１８（φ２．１×１００ｍｍ、ウォーターズ社製）を用いた。移動相は０．０５％ギ酸水溶液（Ａ）、１００％アセトニトリル（Ｂ）を用い、グラジエントは、５％Ｂ（０−０．２５分）、５−１００％Ｂ（０．２５−１０分、リニアグラジエント）、１００％Ｂ（１０−１２分）、５％Ｂ（１２−１５分）とした。注入量は２μｌ、流速は０．４ｍｌ／分、カラム温度は４０℃とし、ＵＶ２９５．８ｎｍで検出した。また、下記条件により分子イオンピークを検出した。
ＭＳ検出法：ＳＩＲ
モード：ポジティブモード  ｍ／ｚ（ｃｏｎｅ）：９３．２（１０）、２３９．１（１０）、２５５．４（３０）、２５７．１（３０）、４３８．５（３０）、５８５．３（３０）、ネガティブモード  ｍ／ｚ（ｃｏｎｅ）：１１２．９（３０）、１７５．０（３０）、２５３．２（３０）、２５５．２（３０）、２８５．６（３０）、４４９．８（３０）、５７７．８（３０）
【００７８】
各フラクションについて得られたチャートを図１０に示す。鎮咳活性の高かったアセトンフラクション１にのみ、２．８分の保持時間で、２９５．８ｎｍの紫外線吸収を有し、ｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを持つピークが含まれていた。また、アセトンフラクション１及びアセトンフラクション２に、保持時間５．７分のクリシンが多く含まれていた。
【００７９】
（試験例２−３）
アカシア蜂蜜を２００．００ｇ量りとり、上記試験例２−２と同様に、Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０を充填したカラムに蜂蜜水溶液をゆっくり５回流した後、当該カラムに、５０％メタノール水溶液、メタノールをそれぞれ４Ｌずつ順次流した。さらに、アセトン４Ｌをカラムに流し、溶出時間の早いものから順に１００ｍＬを１０本、続いて１０００ｍＬを３本回収した。得られたフラクションをそれぞれアセトンフラクション１−１〜１−１０、アセトンフラクション２（５０．５９ｍｇ）、アセトンフラクション３（５．０９ｍｇ）、アセトンフラクション４（３．４８ｍｇ）とした。アセトンフラクション１−１〜１−１０について、溶媒を除去してそれぞれ蜂蜜画分を得た。
【００８０】
アセトンフラクション１−１〜１−１０から得られた蜂蜜画分について薄層クロマトグラフィー分析を行った。Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ２５４プレート（０．５ｍｍ）を用い、各サンプル１０ｍｇを１ｍＬのアセトンに溶解したものを２回ずつスポットした。クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／１である溶媒で展開し、乾燥後、ドラーゲンドルフ試液をプレートに噴霧して発色させた。ドラーゲンドルフ試液は、次硝酸ビスマス１．７ｇ、酢酸２０ｍＬ及び蒸留水８０ｍＬを混合して調製した混合液５ｍＬ、ヨウ化カリウム４０ｇ及び蒸留水１００ｍＬを混和して調製した混和液５ｍＬ、酢酸２０ｍＬ、並びに蒸留水７０ｍＬを混合することにより調製したものを用いた。各サンプルについて発色が確認されたスポットのＲｆ値を表１に示す。アセトンフラクション１−７、１−８、１−９、１−１０はＲｆ値が０、０．７４であるスポットを有していた。アセトンフラクション１−１、１−２、１−３、１−４、１−５、１−６は、Ｒｆ値０．７４にスポットを有していたが、原点（Ｒｆ値０）にはスポットを有していなかった。以降の検討には、同様の傾向の展開パターンを示すアセトンフラクション１−１〜１−６の６つのフラクション（アセトンフラクション１−１−６（１．８２ｍｇ））、及び１−７〜１−１０の４つのフラクション（アセトンフラクション１−７−１０（２１．７２ｍｇ））をまとめて用いた。
【００８１】
【表１】
0006465299.tif 000002
【００８２】
アセトンフラクション１−１−６、１−７−１０、及びアセトンフラクション１−１〜１−１０の混合物（アセトンフラクション１）から得られた各蜂蜜画分の蜂蜜２ｇ／ｋｇ相当量をそれぞれ正常モルモットに胃内投与し、試験例２−２と同様の方法で鎮咳作用を調べた。コントロールとして、蜂蜜画分水溶液の代わりに、水又はＤＭ水溶液（ＤＭ１００ｍｇ／ｋｇ）を用いた。結果を図１１に示す（＊：ｐ＜０．０１）。アセトンフラクション１−７−１０（０．２１７ｍｇ／ｋｇ）に高い鎮咳活性が認められた。分画前の蜂蜜と比較すると、アセトンフラクション１−７−１０中の蜂蜜画分の比活性は４，６３０倍であった。また、試験例２−２と同様にＬＣＭＳ分析を行うと、アセトンフラクション１−７−１０には２．８時間の保持時間で２９５．８ｎｍの紫外線吸収を有し、ｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを持つピークが含まれていたが、アセトンフラクション１−１−６には当該ピークは含まれていなかった。
【００８３】
（試験例２−４）
アカシア蜂蜜を２００．００ｇ量りとり、水４Ｌに溶解して蜂蜜水溶液を調製した。Ｄｉａｉｏｎ  ＨＰ−２０を充填したカラム（φ５×３１ｃｍ、５００ｍＬ）に蜂蜜水溶液をゆっくり５回流した後、５０％エタノールを４Ｌ流した。さらに、当該カラムにエタノール４Ｌを流して２Ｌずつ順次回収した後、アセトン４Ｌを流して１Ｌずつ回収し、それぞれ、５０％エタノールフラクション（３４．２４ｇ）、エタノールフラクション１（２３．１４ｍｇ）、エタノールフラクション２（１２．７１ｍｇ）、アセトンフラクション１（１６．８６）ｍｇ、アセトンフラクション２（２６．８２ｍｇ）、アセトンフラクション３−４（６．７９ｍｇ）として回収した。
【００８４】
得られた各フラクションから溶媒を除去して得た蜂蜜画分を水に溶解し、各蜂蜜画分の蜂蜜１ｇ／ｋｇ相当量をそれぞれ正常モルモットに胃内投与し、投与３０分後にクエン酸（０．１Ｍ）を５分間噴霧し、噴霧開始直後から３０分間の咳反射の回数を計測した。エタノールフラクション２（０．６２ｍｇ／ｋｇ）及びアセトンフラクション１（０．０７ｍｇ／ｋｇ）には、ＤＭ水溶液（１００ｍｇ／ｋｇ）よりは弱いものの、鎮咳効果が認められた（図示せず）。
【００８５】
［試験例３］
（試験例３−１）
上記試験例２で得られたアセトンフラクション１−７−１０の１６．９６ｍｇを用いてＨＰＬＣ分取を行った。カラムはＣｏｓｍｏｓｉｌ  ５Ｃ−１８−ＡＲ−ＩＩ（φ２０ｍｍ×２５０ｍｍ、ナカライテスク）を用いた。移動相は０．１％ＴＦＡ水（Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）を用い、グラジエントは、５０％Ｂ（０−５分）、５０−１００％Ｂ（５−５５分、リニアグラジエント）、１００％Ｂ（５５−６５分）、５０％Ｂ（６５−７５分）とした。流速は１０ｍＬ／分、カラム温度は４０℃、注入量は５０μＬとし、ＵＶ２４５ｎｍで検出した。それぞれ保持時間０〜２５分（ＨＰＬＣフラクション１、１．７１ｍｇ）、２５〜５４分（ＨＰＬＣフラクション２、３．８８ｍｇ）、５４分（ＨＰＬＣフラクション３、１．８４ｍｇ）、５４〜７５分（ＨＰＬＣフラクション４、４．８９ｍｇ）のフラクションを回収した。
【００８６】
得られたフラクションについて２通りの方法により薄層クロマトグラフィー分析を行った。Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ２５４プレート（０．５ｍｍ）を用い、各サンプル１０ｍｇを１ｍＬのアセトンに溶解したものを１回ずつスポットした。１つめの方法として、クロロホルム／メタノール／酢酸の混合比が９／１／０．３である溶媒で展開し、乾燥後、試験例２−３と同様にドラーゲンドルフ試液をプレートに噴霧して発色させた。各サンプルについて発色が確認されたスポットのＲｆ値を表２に示す。アセトンフラクション１についての結果を併せて示す。ＨＰＬＣフラクション１では、Ｒｆ値０〜０．０３及び０．５６に発色したスポットが確認された。ＨＰＬＣフラクション２及び３では、Ｒｆ値０〜０．０３のスポットは見られなかった。
【００８７】
【表２】
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【００８８】
２つめの方法として、上記と同様にサンプルをスポットしたプレートをクロロホルム／メタノール／水の混合比が１／１／０．３である溶媒で展開し、乾燥後、ニンヒドリン試薬をプレートに噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。各サンプルについて発色が確認されたスポットのＲｆ値を表３に示す。ＨＰＬＣフラクション１では、Ｒｆ値０．０６、０．４４、０．４７及び０．６２の、発色したスポットが確認された。
【００８９】
【表３】
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【００９０】
ＨＰＬＣフラクション１〜４、及び試験例２−３のアセトンフラクション１−７−１０から得られた各蜂蜜画分の蜂蜜２ｇ／ｋｇ相当量をそれぞれ正常モルモットに胃内投与し、試験例２−２と同様の方法で鎮咳作用を調べた。コントロールとして、蜂蜜画分水溶液の代わりに水を用いた。結果を図１２に示す。ＨＰＬＣフラクション１（０．０１７ｍｇ／ｋｇ）に高い鎮咳活性が認められた。分画前の蜂蜜と比較すると、ＨＰＬＣフラクション１中の蜂蜜画分の比活性は５８，８２４倍であった。また、試験例２と同様にＬＣＭＳ分析を行うと、ＨＰＬＣフラクション１には、２．８分の保持時間で２９５．８ｎｍの紫外線吸収を有し、ｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを持つピークが含まれていた。
【００９１】
（試験例３−２）
試験例２−３で得られたアセトンフラクション１−７−１０の１４．５６ｍｇを用いて、分取する保持時間を変更した他は試験例３−１と同様の条件でＨＰＬＣ分取を行った。保持時間０〜４分（ＨＰＬＣフラクション１’、０．２９ｍｇ）、４〜９分（ＨＰＬＣフラクション２’、１．７３ｍｇ）、９〜１２分（ＨＰＬＣフラクション３’、０．３２ｍｇ）、１２〜１９分（ＨＰＬＣフラクション４’、０．９１ｍｇ）、２０分（ＨＰＬＣフラクション５’、０．７０ｍｇ）、２０〜２３分（ＨＰＬＣフラクション６’、１．２７ｍｇ）、２３〜２６分（ＨＰＬＣフラクション７’、０．７９ｍｇ）のフラクションを回収した。
【００９２】
得られたフラクションについて薄層クロマトグラフィー分析を行った。Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ２５４プレート（０．５ｍｍ）を用い、各サンプル１０ｍｇを１ｍＬのアセトンに溶解したものを２回ずつスポットした。クロロホルム／メタノール／水の混合比が１／１／０．３である溶媒で展開し、乾燥後、試験例３−１で用いたものと同様にニンヒドリン試薬をプレートに噴霧し、１０５℃で加熱して発色させた。各サンプルについて発色が確認されたスポットのＲｆ値を表４に示す。ＨＰＬＣフラクション１’では、Ｒｆ値０．０５、０．１２及び０．５１の発色したスポットが確認された。
【００９３】
【表４】
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【００９４】
ＨＰＬＣフラクション１’〜７’から得られた各蜂蜜画分の蜂蜜２ｇ／ｋｇ相当量をそれぞれ正常モルモットに胃内投与し、試験例２−２と同様の方法で鎮咳作用を調べた。コントロールとして、蜂蜜画分水溶液の代わりに水を用いた。結果を図１３に示す。ＨＰＬＣフラクション１’（０．００２９ｍｇ／ｋｇ）に高い鎮咳活性が認められた。分画前の蜂蜜と比較すると、ＨＰＬＣフラクション１’中の蜂蜜画分の比活性は３２２，８２８倍であった。
【００９５】
［試験例４］
（試験例４−１）
アカシア蜂蜜９０．００ｇを０．２Ｍアンモニア水５５ｍＬ及び水８０ｍＬで希釈してｐＨ９の蜂蜜水溶液を調製し、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液及び水でコンディショニングした強塩基性陰イオン交換樹脂（ＩＩ形  ＩＲＡ９１０ＣＴ  ＣＬ、φ３×１３ｃｍ、９０ｍＬ、オルガノ社製）を充填したカラムに流した。当該カラムに、イオン交換水（１０８０ｍＬ）及び１Ｍ塩酸（３６０ｍＬ）をそれぞれこの順に流した。１Ｍ塩酸フラクションを回収し、１Ｍ塩酸及び水でコンディショニングした強酸性陽イオン交換樹脂（２００ＣＴＮＡ、φ２×１５．５ｃｍ、４５ｍＬ、オルガノ社製）を充填したカラムに流した。このカラムに、イオン交換水（１８０ｍＬ）及び１Ｍアンモニア水（１８０ｍＬ）をそれぞれこの順に流し、１Ｍアンモニア水フラクション（３０．７６ｍｇ）を回収した。得られた各フラクションの蜂蜜１ｇ／ｋｇ相当量に対し、試験例２−２と同様の方法により鎮咳作用を調べたところ、１Ｍアンモニア水フラクションに強い鎮咳活性が認められた（図１４）。分画前の蜂蜜と比較すると、１Ｍアンモニア水フラクション中の蜂蜜画分の比活性は、３，０３０倍であった。
【００９６】
試験例４−１で得られた１Ｍアンモニア水フラクションについて、試験例２−２と同様の条件でＬＣＭＳ分析を行った。１Ｍアンモニア水フラクションには、２．８分の保持時間で２９５．８ｎｍの紫外線吸収を有し、ｍ／ｚ４３８［Ｍ＋Ｈ］及びｍ／ｚ４３６［Ｍ−Ｈ］の分子イオンピークを持つピークが含まれていた。
【００９７】
（試験例４−２）
アカシア蜂蜜４０．００ｇをイオン交換水（６０ｍＬ）で希釈してｐＨ４の蜂蜜水溶液を調製し、１Ｍ塩酸及び水でコンディショニングした強酸性陽イオン交換樹脂（２００ＣＴＮＡ、φ２×１４．５ｃｍ、４３ｍＬ、オルガノ社製）を充填したカラムに流した。当該カラムに、イオン交換水（３４４ｍＬ）、０．５Ｍアンモニア水（１７２ｍＬ）及び１Ｍアンモニア水（１７２ｍＬ）をそれぞれこの順に流し、０．５Ｍアンモニア水フラクション（１．９４ｍｇ）及び１Ｍアンモニア水フラクション（６２．５ｍｇ）を回収した。得られた各フラクションの蜂蜜１ｇ／ｋｇ相当量に対し、試験例２−２と同様の方法により鎮咳作用を調べたところ、両フラクションに強い鎮咳活性が認められた（図示せず）。
【００９８】
［試験例５］
（試験例５−１）
蜂蜜の鎮咳作用がオピオイド受容体を介するか否かを検討するため、ナロキソンの蜂蜜の鎮咳作用への影響を調べた。
亜硫酸ガス曝露モルモットを用い、クエン酸（０．１Ｍ）で咳を誘発させた。このモルモットに、アカシア蜂蜜（１ｇ／ｋｇ）又は試験例２−１で得られたアセトンフラクション（０．７ｍｇ／ｋｇ）を胃内投与した群、ナロキソン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与してから３０分後にアカシア蜂蜜（１ｇ／ｋｇ）又は上記アセトンフラクション（０．７ｍｇ／ｋｇ）を胃内投与した群、及び水のみを投与した群（コントロール）に分けて、咳回数を測定した。その結果、蜂蜜又はアセトンフラクションを投与した群は、コントロールに比べて有意に咳発現回数が減少した。一方、ナロキソン投与後に蜂蜜又はアセトンフラクションを投与した群では、咳回数はコントロールと同程度であった（図１５）。
【００９９】
（試験例５−２）
蜂蜜（１ｇ／ｋｇ）又はアセトンフラクション（０．７ｍｇ／ｋｇ）を試験例３−２で得られたＨＰＬＣフラクション１’（０．００２９ｍｇ／ｋｇ）に置き換えた以外は試験例５−１と同様の方法で、鎮咳作用へのナロキソンの影響を調べた。その結果、ナロキソン（０．３ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与してから３０分後にＨＰＬＣフラクション１’を胃内投与した群では、ナロキソンを併用しない場合に比べて鎮咳作用が減少する傾向が確認された（図示せず）。
【０１００】
蜂蜜の鎮咳作用はオピオイド受容体のアンタゴニストであるナロキソンの腹腔内投与により消失したことから、蜂蜜の鎮咳作用の少なくとも一部はオピオイド受容体を介した作用であることが示唆された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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