(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
マトリクスを形成する少なくとも１つのポリマー材料および同化剤を含む物質送達システムであって、
前記少なくとも１つのポリマー材料はコラーゲンであり、
前記同化剤は、前記マトリクスを形成する前記少なくとも１つのポリマー材料内に含まれ、
前記マトリクスは二相性の足場または二層性の膜であり、
前記同化剤は、５〜１００ｍｃｇ／システムの用量のＦＧＦ−１８化合物である、前記物質送達システム。
【請求項２】
前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との組み合わせである、請求項１に記載の物質送達システム。
【請求項３】
軟骨形成細胞を更に含む、請求項１又は２に記載の物質送達システム。
【請求項４】
前記ＦＧＦ−１８化合物は、
ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド、および
ｂ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチド
から成る群より選択される、請求項１に記載の物質送達システム。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質送達システムを製造する方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリマー材料を含むマトリクスを調製する工程；および、
ｂ）同化剤を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；ここで、前記同化剤は、前記マトリクスを形成する前記少なくとも１つのポリマー材料内に含まれる、を含む前記方法。
【請求項６】
ｃ）軟骨形成細胞を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；
を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
軟骨障害の治療における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質送達システム。
【請求項８】
前記軟骨障害は、変形性関節症、軟骨損傷、および骨軟骨欠損より選択される、
請求項７に記載の使用のための物質送達システム。
【請求項９】
前記物質送達システムは、移植手順により前記治療を必要とする患者に投与される、請求項７または８に記載の使用のための物質送達システム。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の物質送達システムを含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物の分野に関する。より具体的には、本発明は、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）化合物といった同化剤を含む、足場や膜などの物質送達システム（またはインプラント）、かかる送達システムを製造する方法、並びに、それらの使用に関する。本発明に係るインプラントは、変形性関節症、軟骨損傷、または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療のために使用するためのものである。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）は、ＦＧＦ−８及びＦＧＦ−１７と密接に関係したタンパク質の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーのメンバーである。ＦＧＦファミリーのメンバーは、ヘパリン結合ドメインを有するという特徴がある。かかる推定ヘパリン結合ドメインは、ＦＧＦ−１８に関して同定されている。細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリカンと複合体を形成したＦＧＦリガンドが結合されると、受容体介在性情報伝達が惹起されると推定されている。ＦＧＦ−１８は、軟骨細胞および骨芽細胞の増殖因子であることが示されている（Ellsworth et al., 2002;Shimoaka et al., 2002）。ＦＧＦ−１８は、軟骨障害、例えば、変形性関節症及び軟骨損傷等に対するＦＧＦ−１８の単独療法（ＷＯ２００８／０２３０６３）、又はヒアルロン酸との組み合わせ療法（ＷＯ２００４／０３２８４９）が提案されている。
【０００３】
ＦＧＦポリペプチドを含む医薬組成物は、当技術分野で周知である。ＷＯ２０１２１７２０７には、ＦＧＦ−１８、緩衝液、ポロクサマー界面活性物質、及び安定化剤としての糖を含む凍結乾燥製剤が開示されている。前記ＦＧＦ１８凍結乾燥製剤は、ＯＡまたはＣＩの治療に有望な結果を示している。前記凍結乾燥製剤を使用する現在の投与計画は、週１回の注射を３週間にわたり行う治療サイクルである。治療サイクルは繰り返すこともある。
【０００４】
現在のＦＧＦ−１８製剤の主な欠点は、一度関節内投与（ＩＡ）されると、滑液中のＦＧＦ１８の存在により、健康な領域での軟骨の成長も誘導されてしまい制御されなくなってしまうということである。これは、当然ながら、関節の可動性が減少するといった望ましくない効果をもたらし得る。選択的に標的部位のレベルでＦＧＦ１８を送達すれば、損傷を受けた領域のみにおける軟骨の成長を促進し得る。特に、損傷領域のレベルでＦＧＦ１８を送達し、マイクロフラクチャー術と組み合わせると、ＯＡまたはＣＩの治療に非常に有益となり得る。マイクロフラクチャー術は、軟骨下骨に微小な骨折を形成することにより関節軟骨を修復するための外科的な技術である。これが、骨髄由来の多能性間葉系幹細胞の放出を引き起こす（Ringe J. et al., 2012)。ＦＧＦ１８を含む足場または膜を用いて軟骨の孔を充填することで、前記マトリクスに細胞を向かわせ、これにより、細胞の増殖および薬剤の貯蔵を同時に行うための物理的な支持体として作用するのであろう。この理由により、ＦＧＦ１８をゆっくりと足場／膜から周囲組織に放出し、および／または足場／膜中に取り込んだ状態で留めることが好ましいであろう。
【０００５】
組織工学における一般的なアプローチは、３Ｄマトリクス、すなわち足場または膜内に成長因子を閉じ込めることである。これは、受容部位の形状を推定するため、物理的な特性に応じて、移植または注入のいずれであってもよい（Yun et al., 2010）。足場／膜に必須の特性は、生体適合性と吸収性である。従って、足場／膜は、成長、増殖、損傷した組織を再生するための理想的な環境を細胞に提供可能でなくてはならない。理想的には、マトリクスは、元の組織と物理的特性が類似し、細胞を収容可能な微孔（十分な大きさの連続気孔）を提供しなくてはならない（Tessmar and Gopferich, 2007）。
【０００６】
組織工学に有用ないくつかのマトリクスが、既に商品化されている。例えば、Chondro-Gide（商標）膜（Geistlich Biomaterials）は、二重層構造に配置されたＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンから構成される。この膜は、いくつかの国、例えばフランスで、自家軟骨細胞移植との組み合わせで（好ましくは承認されたChondroCelect（商標）製品との組み合わせで）承認されている。類似品のMaci（Genzyme）が近年欧州市場で承認された。これは、軟骨細胞特異的なマーカー遺伝子をイクスビボで発現し、Ｉ型およびＩＩＩ型コラーゲン膜（Maix）に播種され、拡大した自家軟骨細胞から構成される。Chondromimetic（商標）（Orthomimetics Ltd）は、ウシＩ型コラーゲンとコンドロイチン−６−硫酸グリコサミノグリカンから構成される足場（コラーゲン／  ＧＡＧ足場）である。このインプラントは、欧州市場向けに承認されている。
【０００７】
例えば、ＷＯ２０１２／１１３８１２は、高分子電解質の多層によるコーティング、すなわち、ポリアニオンの少なくとも１層とポリカチオンの１層により機能が付与されたナノファイバー足場について記載する。例えば、ＦＧＦ１８などの治療用分子は、高分子電解質の多層膜に含まれ得る。具体的には、治療用分子は、ポリアニオンの層を形成できる。前記足場は、場合により、コラーゲンハイドロゲル内に骨芽細胞を、アルギン酸ハイドロゲル内に軟骨細胞を更に含んでもよい。各ハイドロゲルは、コーティングされた足場上に配置される。前記足場は、手術によりインサイチュで移植される。
【０００８】
生理活性タンパク質を含む医薬組成物を調製する場合、前記組成物は、タンパク質の活性が適切な期間維持されるように製剤化されなければならない。タンパク質の活性／安定性の損失は、タンパク質の化学的または物理的不安定性により起こりうる。これらは変性、凝集、又は酸化に著しく起因する。得られた生成物は、従って、医薬的に許容し得ないものである可能性もある。賦形剤および／またはマトリクスの使用は、所定のタンパク質の安定性を向上させることが知られているが、これらの賦形剤の安定化効果は、マトリクス内のポリマー、賦形剤の性質、そして存在する場合、生理活性タンパク質そのものに大きく依存する。
【０００９】
組織工学的な手順は有望であるが、生成された軟骨のインテグレーション率または質を向上させる必要がある。従って、生成された軟骨の良好なインテグレーションと優れた質（すなわち主に硝子軟骨）を可能にする改良された組成物が必要である。また、欠損部位へ治療化合物を提供する代替システムの必要性もある。実際に、硝子軟骨の生成は、治療のため、そして生体マトリクスの成分としての両者に価値がある（Power et al., 2012）。前記組成物は、変形性関節症、軟骨損傷、または骨軟骨欠損といった患者における軟骨障害の治療のための組織工学的手順の枠組みに有用であり得る。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書で開示するのは、マトリクスを形成する少なくとも１つのポリマー材料および同化剤を含む物質送達システムであって、前記同化剤は、前記マトリクスを形成する前記少なくとも１つのポリマー材料内に含まれる、前記物質送達システムである。前記マトリクスは足場または膜である。特定の実施形態では、前記足場は二相性の足場であるか、あるいは前記膜は二層性の膜である。好ましくは、前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンである。代替的に、前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との組み合わせである。前記送達システムに含まれる同化剤は、好ましくはＦＧＦ−１８化合物である。本発明の特定の実施形態では、前記ＦＧＦ−１８化合物は、ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド、および、ｂ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチド、から成る群より選択される。
【００１１】
本発明に係る物質送達システムは、間葉系幹細胞などの軟骨形成細胞を更に含み得る。好ましくは、かかる軟骨形成細胞は軟骨細胞である。特に、軟骨細胞または間葉系幹細胞といった軟骨形成細胞は、治療を必要とする患者または異なるドナー（好ましくは同じ種に属する）から採取または単離される。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、本発明にかかる物質送達システムを製造する方法であって、ａ）少なくとも１つのポリマー材料を含むマトリクスを調製する工程；および、ｂ）同化剤を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；ここで、前記同化剤は、前記マトリクスを形成する前記少なくとも１つのポリマー材料内に含まれる、を含む前記方法を提供する。代替的に、前記方法は、ｃ）軟骨形成細胞を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；を更に含む。
【００１３】
更なる実施形態では、本明細書に開示の物質送達システムは、軟骨障害の治療における使用のためのものである。軟骨障害は、好ましくは変形性関節症、軟骨損傷、および骨軟骨欠損より選択される。
【００１４】
本発明に係る物質送達システムは、好ましくは、移植手順により前記治療を必要とする患者に投与される。
【００１５】
更なる実施形態において本明細書に開示するのは、本発明にかかる物質送達システムを含む製品である。好ましくは、前記製品の構成要素の各々は、即座に（extemporaneously）結合される。代替的に、前記製品の構成要素の各々は、移植前または移植後のいずれかに結合される。
【００１６】
定義
用語「同化化合物」または「同化剤」は、好ましくは軟骨修復につながる、軟骨への同化作用を有する化合物または薬剤として理解されるべきである。本発明の文脈では、「同化化合物」または「同化剤」は、好ましくは軟骨への同化作用を有する治療用タンパク質である。そのような化合物または治療用タンパク質のうち、好ましい化合物は、ＦＧＦ−１８化合物（上記の定義の通り）である。
【００１７】
本明細書で使用する用語「ＦＧＦ−１８化合物」又は「ＦＧＦ−１８」は、ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物学的活性の少なくとも１つを保持するタンパク質であるという意図である。ＦＧＦ−１８は、天然型、その成熟型、組換え型、又は切断型であってもよい。ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物学的活性としては、特に軟骨細胞または骨芽細胞の活性増加（ＷＯ９８／１６６４４）、あるいは軟骨形成の増強（ＷＯ２００８／０２３０６３）が挙げられる。天然又は野生型のヒトＦＧＦ−１８は、関節軟骨の軟骨細胞によって発現されるタンパク質である。ヒトＦＧＦ−１８は、当初ｚＦＧＦ−５と命名されＷＯ９８／１６６４４に詳述されている。配列番号１は、天然のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列に相当し、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２７（Ａｌａ）から成るシグナルペプチドを有する。ヒトＦＧＦ−１８の成熟型は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）のアミノ酸配列（１８０個のアミノ酸）に相当する。
【００１８】
本発明においてＦＧＦ−１８は、例えば、ＷＯ２００６／０６３３６２で教示される組み換え方法等によって産生することができる。本発明のＦＧＦ−１８は、発現系や条件により、開始メチオニン（Ｍｅｔ）残基または分泌のためのシグナル配列と共に、組み換え宿主細胞において発現される。原核生物の宿主、例えば、大腸菌（E. coli）等において発現される場合、ＦＧＦ−１８はその配列のＮ末端においてさらなるＭｅｔ残基を含む。例えば、ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、大腸菌（E. coli)で発現される場合、Ｎ末端（位置１）のＭｅｔ残基で開始し、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）がこれに続く。
【００１９】
本明細書で使用する用語ＦＧＦ−１８の「切断型」は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）を含むかまたは該残基から成るタンパク質を指す。好ましくは、ＦＧＦ−１８タンパク質の切断型は、「ｔｒＦＧＦ−１８」と命名されたポリペプチド（１７０個のアミノ酸、ｒｈＦＧＦ−１８またはｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎとしても知られる）であり、Ｍｅｔ残基（Ｎ末端）で開始し、野生型ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）がこれに続く。ｔｒＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、配列番号２（配列番号２のアミノ酸残基２〜１７０は、配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６に相当する）に示す。ｔｒＦＧＦ−１８は、ヒトＦＧＦ−１８の組み換え切断型であり、大腸菌（E. coli）で産生される（ＷＯ２００６／０６３３６２）。ｔｒＦＧＦ−１８は、成熟ヒトＦＧＦ−１８と同様の活性を示し、例えば、様々な軟骨組織の修復及び再構築につながる軟骨細胞の増殖や軟骨の沈着を増強することが示されている（ＷＯ２００８／０２３０６３）。
【００２０】
用語「均一」は、製剤の種々の成分が、一緒に混合、ブレンド、撹拌、または溶融されること、すなわち、それらの成分で別個の層を形成しないことを意味する。
【００２１】
本明細書で使用する用語「軟骨障害」とは、外傷などの損傷による傷害に起因する障害、軟骨疾患、および関節炎を包含する。本明細書に記載のＦＧＦ−１８製剤の投与によって治療し得る軟骨障害の例としては、変形性関節症等の関節炎や軟骨損傷などが挙げられるが、これらに限定されない。軟骨石灰化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、強直性脊椎炎、または肋軟骨炎などの軟骨または関節の変性疾患や障害もこの文言に包含される。国際軟骨修復学会（ＩＣＲＳ）は、軟骨欠損の重症度を評価するための関節鏡による評価システムを以下のように提案している。グレード：０（通常）健康な軟骨。グレード１：軟骨にソフトスポットや水疱を有する。グレード２：軟骨に目に見える小さな裂け目を有する。グレード３：病変に深い裂け目（軟骨層の５０％超）を有する。グレード４：軟骨が裂け、下の骨（軟骨下骨）が露出している。（ICRS publication:http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf、page 13を参照のこと）。
【００２２】
本明細書で使用する用語「関節炎」は、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、感染性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病（若年性関節リウマチの発症）、または離断性骨軟骨炎等の障害を包含する。好ましくは、軟骨が傷害を受けている疾患または障害を含む。
【００２３】
用語「変形性関節症」は、関節炎の最も一般的な形態を意図するのに使用される。用語「変形性関節症」は、一次性変形性関節症および二次性変形性関節症（例えば、The Merck Manual, 17th edition, page 449参照）のいずれも包含する軟骨障害であると考えられている。変形性関節症は、軟骨の破壊によって引き起こされることがある。軟骨が細かく破壊され、または軟骨構成要素の変性断片（ＩＩ型コラーゲン様のアグリカン）が、関節からの漏れや骨間の関節における疼痛や腫れを引き起こすことがある。時間が経つにつれて、軟骨が完全に摩耗し、骨同士がぶつかってしまう。変形性関節症は、あらゆる関節に影響するが、通常は、手、そして股関節、膝関節、脚、背骨といった体重を支える関節に関連する。好ましい例では、変形性関節症は、変形性膝関節症または変形性股関節症である。この用語は、特に、ＯＡＲＳＩ分類システムによりステージ１〜ステージ４またはグレード１〜グレード６に分類される変形性関節症の形態を包含する。当業者は、当該技術分野で使用されている変形性関節症の分類、特にＯＡＲＳＩ評価システムを良く認識している（ＯＯＣＨＡＳとも称される；例えば、Custers et al., 2007参照）。変形性関節症は、本発明のＦＧＦ−１８化合物を投与することによって治療できる好ましい軟骨障害の一つである。
【００２４】
本明細書で使用する用語「軟骨損傷」とは、特に外傷から生じる、軟骨の障害または軟骨の損傷である。軟骨損傷は、外傷による物理的な破壊の結果として、特に事故または手術（例えば、マイクロフラクチャー法による手術）後に生じることがある。用語「軟骨損傷」は、軟骨または骨軟骨骨折および半月板の損傷をも含む。関節組織のスポーツによる損傷又はスポーツによる摩耗もまたこの用語の定義内と考えられる。また、この用語は、微小な障害または鈍的な外傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折、または半月板損傷をも含む。
【００２５】
用語「骨軟骨欠損（osteochondral defects：ＯＣＤ）」は、軟骨の欠損が関節内の骨の端を覆う軟骨障害である。これらの欠損は、外傷または損傷に起因する場合が多いが、病理に起因することもある。ＯＣＤは、ＯＡを引き起こすことがある。
【００２６】
用語「マトリクス」は、膜または足場等の三次元（３Ｄ）構造を指す。かかるマトリクスは、「インプラント」として、または、該マトリクスまたはインプラントが更に同化剤を含む場合（すなわち、送達対象の軟骨に同化する作用を有する治療用タンパク質を含む場合）、「物質送達システム」もしくは「送達システム」として使用できる。本明細書で使用する用語「インプラント」、「物質送達システム」、または「送達システム」は交換可能である。
【００２７】
用語「移植（インプランテーション）」または「移植（トランスプランテーション）」は交換可能である。同様に、用語「移植する（インプランティング）」、「移植する（トランスプランティング）」または「システムを載置する」は交換可能である。
【００２８】
本発明の用語「徐放（slow release）」は、低量の所与の化合物、例えばＦＧＦ−１８化合物が、少なくとも４週間以上の期間にわたって放出されることを意味する。
【００２９】
発明の詳細な説明
マトリクスまたはインプラントを利用する軟骨修復手順は、有望であるものの、生成した軟骨の品質をさらに向上させる必要がある。従って、生成軟骨の良好なインテグレーションと良好な質を可能にする送達システム（すなわち、主に硝子軟骨）の改善の必要性が存在する。驚くべきことに、ＦＧＦ−１８は、例えば、コラーゲン膜またはコラーゲン／グリコサミノグリカン足場のようなマトリクス内で使用されると、マトリクス単独、または異なるタンパク質と組み合わせたマトリクスよりも優れた修復組織を生成することが見出された。
【００３０】
本発明の主な目的は、従って、マトリクスを形成する少なくとも１つのポリマー材料および同化剤を含む物質送達システムであって、前記同化剤は、前記マトリクスを形成する前記少なくとも１つのポリマー材料内に含まれる、前記物質送達システムである。かかるマトリクスは、軟骨レベルで導入するのに好適である。本発明に係る物質送達システムは軟骨形成細胞を更に含み得る。物質送達システムは、他の賦形剤または他の構成要素を更に含んでもよい。かかる送達システムを使用する利点は、同化化合物を既に含んでいるインプラントを軟骨または骨軟骨欠損部内に直接導入できることである。あるいは、存在する場合、同化剤および／または軟骨形成細胞を、インプラントを欠損部内へ移植した後でインプラント内に導入してもよい。
【００３１】
別の実施形態では、本発明は、物質送達システムまたはインプラントを製造する方法であって、ａ）少なくとも１つのポリマー材料を含むマトリクスを調製する工程；および、ｂ）同化剤を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；ここで、前記同化剤は、前記マトリクスを形成する前記少なくとも１つのポリマー材料内に含まれる、を含む前記方法。代替的に、前記方法は、ｃ）軟骨形成細胞を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程を更に含む。工程ｂ）およびｃ）のいずれか一方は、欠損部への移植前または移植後（すなわちインサイチュ）のいずれかに行い得る。
【００３２】
更なる実施形態において本明細書に開示するのは、本発明に係る物質送達システムを含む製品である。好ましくは、前記製品の構成要素は、即座に（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓｌｙ）結合される。あるいは、前記製品の構成要素は、移植前または移植後のいずれかに結合される。さらに開示するのは、発明に係る送達システムを作成する説明書を提供する包装材料である。
【００３３】
本発明の文脈では全体として、マトリクス（またはインプラント）は好ましくは足場または膜である。特定の実施形態では、前記足場は二相性の足場であるか、あるいは前記膜は二層性の膜である。好ましくは、前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンである。代替的に、前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との組み合わせである。マトリクスは、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（商標）膜、Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ（商標）足場といったすでに市販されているマトリクス、または他の任意の市販されているマトリクス（規制当局によって承認済または未承認のいずれも）であり得る。あるいは、マトリクスを社内（インハウス）で製造することもある。
【００３４】
送達システムに含まれる（マトリクスを形成する少なくとも１つのポリマー材料内に含まれる）同化剤（すなわち、軟骨に対する同化作用を有する治療用タンパク質）は、好ましくはＦＧＦ−１８化合物である。本発明の特定の実施形態では、ＦＧＦ−１８化合物は、ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド、および、ｂ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチドから成る群より選択される。特に本化合物は、ヒト野生型成熟ＦＧＦ−１８またはｔｒＦＧＦ−１８より選択される。より好ましくは、ＦＧＦ−１８化合物はｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎである。
【００３５】
本発明の文脈では、ＦＧＦ−１８化合物といった同化剤は、送達システムに約０．０５〜２００ｍｃｇ／システム、または好ましくは約０．５〜１００ｍｃｇ／システム、またはより好ましくは約１、５、６、１０、１５、２０、２５、３０、３２、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０または２００ｍｃｇ／システム、また更により好ましくは約５、６、１０、２０、３０、３２、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｃｇ／システムの用量で添加される。
【００３６】
軟骨形成細胞を送達システムに添加する場合、かかる軟骨形成細胞は好ましくは軟骨細胞である。特に、軟骨細胞などの軟骨形成細胞は、哺乳動物から採取または単離され、培養培地内で拡大され、その後マトリクスと一緒に移植される（細胞の添加は移植の前か後のいずれか）。特定の実施形態では、細胞を拡大する培養培地は、ＦＧＦ−１８化合物といった同化剤を含み得る。このような場合、同化化合物は好ましくは培養培地に１週間あたり約１日、培養または保存培地に間欠的に添加され、前記１日の添加は、少なくとも２週間の培養、少なくとも３週間の培養または少なくとも４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される。好ましくは、前記同化化合物は培養培地に１週間あたり１日、培養または保存培地に間欠的に添加され、前記１日の添加は、２週間の培養、３週間の培養または４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される。代替的に、前記同化化合物は培養培地に１月あたり約１日、培養または保存培地に間欠的に添加され、前記１日の添加は、少なくとも２月間の培養、少なくとも３月間の培養、または少なくとも４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される。好ましくは、前記同化化合物は培養培地に１月あたり１日、培養または保存培地に間欠的に添加され、前記１日の添加は、２月間の培養、３月間の培養、または４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される。
【００３７】
哺乳動物は好ましくは治療を必要とする患者または異なるドナー（好ましくは同じ種に属する）である。前記哺乳動物は特にヒトである。しかし、ウマ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラットまたはマウスのような哺乳動物であってもよいがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書に記載する物質送達システムは好ましくは軟骨障害の治療における使用のためのものである。代替的に、本発明にかかる物質送達システムを投与する工程を含む、軟骨障害の治療のための方法も本明細書に開示する。あるいは、本発明にかかるインプラントを投与する工程を含む、軟骨障害の治療のための方法であって、ＦＧＦ−１８化合物等の同化剤および／または軟骨形成細胞を、移植前または移植後のいずれかに前記インプラント内に添加する前記方法も含まれる。軟骨障害は、好ましくは変形性関節症、軟骨損傷、および骨軟骨欠損より選択される。
【００３９】
本発明に係る物質送達システムは、好ましくは移植（インプランティングまたはトランスプランティング）を介して、あるいは当該システムを関節軟骨の修復、再生または増殖を必要とする部位に配置することにより、前記治療を必要とする患者に投与される。
【００４０】
以下の実施例は本発明をさらに説明するために示す。本発明の範囲は、以下の実施例のみからなるものと解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１ａは、対照群のヒツジの体重負荷の割合（％）を示す。図１ｂは、関節内ＦＧＦ−１８により処理された群の体重負荷の割合（％）を示す。図１ｃは、手術の時点でＣｈｏｎｄｒｉ−Ｇｉｄｅ膜上に適用された３２μｇのｒｈＦＧＦ−１８により処理された群の体重負荷の割合（％）を示す。図１ｄは、手術の時点でＣｈｏｎｄｒｉ−Ｇｉｄｅ膜上に適用された６．４μｇのｒｈＦＧＦ−１８により処理された群の体重負荷の割合（％）を示す。
【００４２】
【図２】図２は、総ＩＣＲＳスコアに対するｒｈＦＧＦ１８の効果を示す。
【００４３】
【図３】図３は、修復軟骨の剛性に対するｒｈＦＧＦ１８の効果を示す。
【００４４】
【図４】図４は、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアに対するｒｈＦＧＦ１８の効果を示す。
【００４５】
【図５】図５は、剖検でのＭＦＣ及びＬＴＳ（ｐ＝０．０３８１）の変性による変化（degenerative change）を示す。
【００４６】
【図６】図６は、ＭＦＣ（ｐ＝０．００１５）及びＬＴＳ（ｐ＞０．０５）の国際軟骨修復学会総修復スコアを示す。
【００４７】
【図７】図７は、ＭＦＣ（ｐ＞０．０５）及びＬＴＳ（＝０．００３３）における欠損部の剛性測定値を、反対側の脚に対する測定値の割合（％）として示す。
【００４８】
【図８】図８は、ＭＦＣ（ｐ＞０．０５）及びＬＴＳ（＝０．００３３）における欠損部の剛性測定値を、病変部周囲の軟骨の測定値に対する割合（％）として示す。
【００４９】
【図９】図９は、ＭＦＣ（ｐ＝０．０３９０）及びＬＴＳ（ｐ＞０．０５）の両者についての修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを、群間の比較として示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
配列番号１：天然ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列。
【００５１】
配列番号２：組み換え切断型ＦＧＦ−１８（ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎ）のアミノ酸配列。
【００５２】
配列番号３：組み換えＢＭＰ−７（エプトテルミンアルファとしても知られる）のアミノ酸配列。
【００５３】
材料：
本実施例の組み換え切断型ＦＧＦ−１８（ｒｈｒＦＧＦ１８）は、ＷＯ２００６／０６３３６２に記載される技術に従い大腸菌における発現により調製した。以下の実施例において、ｒｈｒＦＧＦ１８、ＦＧＦ−１８、及びｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎは、互換的に使用される。
【００５４】
方法
歩行分析：
床反力計（Accusway, AMTI, USA）を用いて、手術された脚の体重負荷を定量した。体重負荷を、手術前、手術の２週、４週、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月及び５ヶ月後、歩行下で測定した。平均体重負荷の計算をするために、各時点で、各動物に、歩行下で合計１０回の記録を行った。各測定値を、Ｎ／ｋｇの力に変換し、各動物について手術前に得られた測定体重負荷に対する割合（％）として計算した。体重負荷データを、最終分析のために処理群に分けた。
【００５５】
全体的な形態観察：
関節を切開し、写真撮影し、そして骨軟骨欠損部の表面を、国際軟骨修復学会（ＩＣＲＳ）スコアを用いブラインドでスコアを付けた（表３）。
【００５６】
機械的試験：
全体的な形態観察を行った後、各移植部位に非破壊的機械試験を行い、インプラント又は空の欠損部を囲む軟骨表面に対する変化を判定した。剛性測定を、骨軟骨欠損部の中心、形成された骨軟骨欠損部の元々の縁から１ｍｍの距離で、１２、３、６及び９時の位置、及び病変周囲内で軟骨の縁から１ｍｍの距離で、ハンドヘルドデジタルデュロメーター（Shore S1, M scale, Instron Ltd, UK）を用いて、二重に行った。＋／−５の較正誤差を含む０〜１００の点数を付した。次に、それらの測定を、解剖学的部位が同じ反対側の脚でも行った。
【００５７】
組織学的検査：
剛性測定に続いて、検体を、ギ酸／クエン酸ナトリウムにおいて、２週間にわたって脱灰した。完全に脱灰した後、検体を、濃度が段階的に上昇する一連のエタノール交換により脱水し、次に、パラフィンワックスに包埋した。１０μｍの厚さの切片を、欠損部の中央部分を通るように切り出した。切片を、トルイジンブル及びサフラニンＯ／ファストグリーにより染色した。組織切片を、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを用いて、研究者がブラインドで採点した（表４）。次に、実験群内で中央値の合計の修正Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアが最良値を記録した動物を同定し、それらの切片に対して免疫組織化学的検査を行った。合計の修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアの他に、採点システムの個々の成分を別々に分析した。
【００５８】
免疫組織化学的検査：
以下の一次抗体を本研究に使用した：モノクローナルマウス抗ヒトＩ型コラーゲン（MP Biomedicals, US）、モノクローナルマウス抗ヒトII型コラーゲン（MP Biomedicals, US）、及びモノクローナルマウス抗ウサギＶＩ型コラーゲン（Abcam、UK）。ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗ウサギ及びマウス免疫グロブリンを適宜使用し、着色反応を、０．１％３′，３−ジアミノベンジジンテトラクロライド（ＤＡＢ）／０．０１％過酸化水素により進行させた。全実験において、対照として通常の種特異的血清を使用した。
【００５９】
統計学的分析：
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５統計ソフトウェアパッケージ（Graphpad Software Inc, La Jolla, CA）を、データ分析に使用した。各エンドポイントについて群間及び群内の統計学的有意性を、主に、後ｈｏｃ  Ｄｕｎｎｓ多重比較検定と、ノンパラメトリック  Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて決定した。一例では、後ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ多重比較検定と、一方向ＡＮＯＶＡ検定を使用した。すべての分析においてｐ＜０．０５のレベルで有意とした。
【００６０】
実施例１：ｒｈＦＧＦ−１８を含むコラーゲン足場：
方法：
３〜５齢の３５匹の骨格の成熟したＷｅｌｓｈヤマヒツジを、この研究に用いた。動物は、７つの処理群に分け、このうち２群は対照とした（表１）。手術の前、すべての動物に、イソフルランと亜酸化窒素と酸素との混合物を用いて麻酔した。動物を、背側横臥位に配置し、手術準備が終わったら、左膝関節を内側膝蓋支帯を介して切開した。膝蓋骨亜脱臼に続いて、全層にわたり直径８ｍｍの軟骨欠損部を、パンチ生検及び掻爬を用いて、内側大腿顆の体重負荷面上に生成した。注意深く確実に、石灰化軟骨を軟骨下骨から除き、欠損部の縁が軟骨下骨に対し垂直になるようにした。欠損部の作成に続き、６個の微小破壊孔をマイクロピックを用いて、欠損部に作成した。それらの微小破壊孔は、軟骨下骨プレートを通過させた。微小破壊の生成に続き、処理を受けた群において、適切な量のｒｈＦＧＦ−１８を充填したＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜を、Ｔｉｓｓｅａｌ  Ｆｉｂｒｉｎ糊を用いて、軟骨欠損部に接着し、関節を標準態様で閉じた。
【００６１】
関節内投与対象の動物には、３０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ−１８を１週間に１回、内側大腿脛骨関節内に注入することを、３週間行った。ｒｈＦＧＦ−１８の投与を１サイクル行った動物は、手術から４、５及び６週後に注入を行い、ｒｈＦＧＦ−１８の投与を２サイクル行った動物は、手術から１６、１７及び１８週後に注入を行った。すべての動物は、手術後６ヶ月で屠殺した。
【００６２】
【表１】
0006510547.tif 000002
【００６３】
結果：
歩行分析：
対照群（図１ａ）においては、手術後の著しい体重負荷の低下、そしてその後、時間の経過に伴い術部の脚に対する体重負荷がゆっくりと上昇した。２ヶ月までには体重負荷は手術前のレベルに戻った、すなわち手術前に記録された値と、２、３、４及び５ヶ月での値との間に、統計学的差異はなかった。
【００６４】
Ｂ群（図１ｂ）においては、対照に比較して、手術後の体重負荷が有意に上昇し（Ｂ群の平均値７３．４＋／−１３．７に比較して、対照の平均値は４６．３＋／−２３．６３である）（ｔ検定ｐ＜０．０００１）、そしてその後、時間の経過に伴い術部の脚に対する体重負荷がゆっくりと上昇した。手術後の体重負荷は、１月目で検出された体重負荷と比較して統計学的に有意な差異があった（Ｐ＜０．０５）。他の有意性は検出されなかった。２ヶ月までには体重負荷は手術前のレベルに戻った、すなわち手術前に記録された値と、２、３、４及び５ヶ月での値との間に、統計学的差異はなかった。
【００６５】
対照及び関節内ｒｈＦＧＦ−１８群とは対照的に、Ｈ群においては、手術前の体重負荷と、手術後の体重負荷との間に有意な差異は検出されず（図１ｃ）、すなわち、動物はこの時間枠の間、外科的介入が起こったことを検出できなかった。これは、測定されたすべての他の群において手術から２週間後に検出される体重負荷の低下に対し有意な差異であった。
【００６６】
Ｇ群においては、手術後の体重負荷は、２ヶ月までに、手術後のレベルと有意差がないレベルに戻った（図１ｄ）。高用量のｒｈＦＧＦ−１８／膜に見られる傾向に類似する傾向があった。
【００６７】
結果：
全体的な形態観察：
治癒した組織の全体の形態に対するｒｈＦＧＦ１８の効果を、ＩＣＲＳスコアを用いて定量化した（表３）。ＩＣＲＳの全形態スコアシステムにより測定される病変の全体の形態に統計学的に有意な差異はなかった。ＩＣＲＳ形態スコアの成分の個々の分析では、統計学的に有意な結果がある成分は同定されなかった。それらの結果により、フォースプレートを用いた評価では、手術の時点でＣｈｏｒｄｒｉ−Ｇｉｄｅ膜に適用された３２μｇのｒｈＦＧＦ−１８の添加により、手術から２週間後の術後疼痛が有意に低下することが示唆される。他の有意な差異は検出されなかった。
【００６８】
結果：
剛性：
軟骨欠損部及び反対側の手術していないほうの脚の対応部位の剛性の測定を、ハンドヘルドデジタルデュロメータ（Shore S1, M scale, Instron Ltd, UK）を用いて行った（図３）。群間に有意な差異はなかった。（この実験において、本発明者は対照軟骨と一致する程度に手術したほうの脚の軟骨の物理的な剛性の回復を目指している）、従って、手術したほうの脚と手術していないほうの脚との間の有意な差異がないことは望ましい結果である。
【００６９】
結果
組織学的検査：
病変及び隣接する組織における組織学的な修復の質を、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを用いて定量化した（図４）。有意な差異は、Ｋｉｓｋａｌｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定により検出されなかった。他の手段でデータを評価するために、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを、後ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ検定により実施した。両対照群（Ａ群及びＣ群）は予想通り、統計学的に有意な差異は存在しなかった。これまでの研究で示されたように、２サイクルのｒｈＦＧＦ−１８の関節内投与により、修正されたＯ’ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアが有意に改善した。さらに、６．４μｇ及び３２μｇのｒｈＦＧＦ−１８がＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（商標）膜上に適用される場合、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアが統計学的に有意に上昇した。関節内注入されるＦＧＦ−１８と、手術の時点で膜上に適用される３２μｇのｒｈＦＧＦ−１９との間に差異はなかった。
【００７０】
結果：
修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアのサブ分析：
修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアの成分のサブ分析を実施し、特にどの組織学的パラメーターが、ｒｈＦＧＦ−１８の包含により影響される、影響されないかを同定した。すべてのデータを含めた場合の統計学的に有意な差異は、スコアリングシステムの個々の成分の何れにも検出されなかった。
【００７１】
結果：
免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）：
Ｉ、II及びVI型コラーゲンについてのＩＨＣを実施した。これにより、対照サンプルにおいて生成される修復組織が主に硝子／線維軟骨の混合物であったことが実証された（ＩＨＣはＩ及びII型コラーゲンを示す。組織的VI型コラーゲン染色はほぼない）。対照的に、ｒｈＦＧＦ−１８の存在下で、修復組織は、II型コラーゲン陽性であり、そして細胞周囲に明確なVI型コラーゲン染色があり、成熟した硝子軟骨の修復を示している。それらの結果は、手術後、ｒｈＦＧＦ−１８の２サイクルの関節内投与、又は手術時にＣｈｏｎｄｒｉ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜に送達される３２μｇのｒｈＦＧＦにより、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアの有意な改善を導くことを示唆する。組織学的検査により、それらのｒｈＦＧＦ−１８送達システムの存在下で生成される修復組織が、対照において、そして手術の時点で前記膜上に送達される低用量のｒｈＦＧＦ−１８により処理された動物において生成された、硝子／線維軟骨組織の混合物と比較して、II及びVI型コラーゲン陽性である、すなわち硝子軟骨であることが実証された。
【００７２】
結論：
この研究において、本発明者は、手術時にＣｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（登録商標）膜に送達される３２μｇのｒｈＦＧＦ−１８の包含が、手術から２週後の術後疼痛を（対照、前記膜上に適用された低容量のｒｈＦＧＦ−１８、及びｒｈＦＧＦ−１８の関節内投与に比較して）有意に低減し、対照及び前記膜上に適用された低用量のｒｈＦＧＦ−１８に比較して、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを有意に改善し、そしてｒｈＦＧＦ−１８の関節内投与と同等の修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを有したことを実証した。それらの結果は、少数の動物で実験したものの、Ｃｈｏｎｄｒｏ−Ｇｉｄｅ（商標）膜上へのｒｈＦＧＦ−１８の適用がマイクロフラクチャーにより処理された軟骨欠損に対し効果的な治療であることを示唆する。
【００７３】
実施例２：ｒｈＦＧＦ−１８を含むコラーゲン／ＧＡＧ足場：
方法：
骨軟骨欠損部（５．８×６ｍｍ）を、２４匹の骨格の成熟したＷｅｌｓｈヤマヒツジの右膝関節の大腿骨内側顆（ＭＦＣ）及び横滑車溝（ＬＴＳ）に作成した。欠損部は、何も充填しない（対照；Ａ群）、又は６×６ｍｍのコラーゲン／ＧＡＧ足場（Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃの足場）をそのまま充填（足場のみ；対照：Ｂ群）、又はｒｈＦＧＦ−１８（３０μｇ；Ｃ群）又はＢＭＰ−７（１００μｇ；Ｄ群）と組み合わせて充填した（各群についてｎ＝６）（表２を参照）。６月目に、ヒツジは人道的に安楽死させ、この時点で、修復組織に、非破壊的物理試験、ＩＣＲＳ修復スコアによる全体的評価を行い、そして変性による変化（degenerative change）の存在について評価した。これに続いて、プロテオグリカンの軟骨特異的マーカー（サフラニンＯ／ファストグリーン）、及びＩ、II及びＶＩ型コラーゲンを観察する組織学的及び免疫組織化学的分析を行った。切片を、半定量的に修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌスコアを用いて採点した。統計学的分析は、有意性のレベルとして設定されるｐ＜０．０５でのＢｏｎ  Ｆｅｒｒｏｎｉの補正を用い、一方向ＡＮＯＶＡ及び後−ｈｏｃ検定を行った。
【００７４】
Ｃｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ（Orthomimetics Ltd）は、Ｉ型ウシコラーゲンとコンドロイチン−６−硫酸グリコサミノグリカンから構成される足場（コラーゲン／ＧＡＣ足場）である。
【００７５】
【表２】
0006510547.tif 000003
【００７６】
結果：
全体的な形態観察：
何れの動物も、手術後、なんら感染の徴候を示さなかった。変性による変化が、特に対照群における多くの動物のＬＴＳに見られた（図５）。これはおそらく、横近接膝蓋骨アプローチの結果、膝蓋大腿の生体力学による変化があったためであろう。ノンパラメトリック分析により、足場のみと比較して、ＢＭＰ−７群における変性に統計学的に有意な差異が見られた（ｐ＝０．０３８１）。
【００７７】
結果：
軟骨修復スコア：
すべての動物は、処理群を知らされていないブラインドの観察者により採点された。図６は、群間のスコアの分布を示す。ＦＧＦ−１８及びＢＭＰ−７の両者は、空の欠損部に比較して、ＩＣＲＳ修復スコアの有意な改善が見られた（ｐ＜０．０５）。修復が改善するという傾向は、足場のみに比較して、両成長因子がある場合に見られたが、群間に統計的に有意な差異は存在しなかった（ｐ＞０．０５）。ＭＦＣにおける成長因子よりも対照間のばらつきが大きかったが、ＬＴＳでは逆のことが言える。
【００７８】
結果：
機械的試験：
Ｓｈｏｒｅ  Ｓ１デジタルデュロメータ（Instron）を用いて、観察者により繰り返し測定した。ＭＦＣにおいては（図７）、反対側の脚（ｐ＝０．３１）又は病変部周囲軟骨（ｐ＝０．５７３）の剛性の割合（％）の平均についての処理群間に差異はなかった。ＬＴＳにおいては（図８）、ＢＭＰ−７は、反対側の脚の軟骨に比較して、ｒｈＦＧＦ−１８及び空の欠損部の両者よりも剛性が有意に低く（ｐ＝０．００３３）、そして病変部周囲軟骨に比較して、足場のみ及びｒｈＦＧＦ−１８の両者よりも剛性が低がった（ｐ＝０．０００２）（すべての後ｈｏｃ分析についてｐ＜０．０５）。
【００７９】
結果：
組織学的及び免疫組織化学的検査：
対照群Ａ＝空の欠損部（写真は示さず）：空の欠損部に組織が良好に充填していることが、動物全体で一般的に見られた。欠損部の大部分では、薄い軟骨層を有する位置の前進が見られた。陽性サフラニンＯ染色が、すべてのＭＦＣ欠損部に見られたが、ＬＴＳにおいては染色が比較的不良であった。すべての欠損部でＩ型コラーゲン染色の陽性を示し、いくつかの欠損部でII型コラーゲンの陽性を示した。細胞周囲VI型コラーゲンの染色が陽性を示した欠損部はなかった。それらの観察事項により、線維軟骨の修復が欠損部に存在し、多くは繊維状の修復組織を示すことが示唆される。
【００８０】
対照群Ｂ＝足場のみ（写真は示さず）：良好な横方向のインテグレーションがすべての欠損部で見られた。関節軟骨を再生しようとする動きが特にＭＦＣで見られ、ここでは深部のカラムの裂孔内に軟骨細胞が見られ、表面部でより平坦な軟骨細胞が見られた。これは横方向の縁に主に見られ、中央部では無秩序な組織がしばしば見られた。裂け目又は亀裂が６個のＭＦＣ欠損部のうち４個の軟骨層の中央部にあり、全ての欠損部で深部側面に足場が残留するという傾向が繰り返しみられた。しかしながら、この残留する足場は、多孔性構造体における新しい結合組織であり、この新しい材料が沈着していることを示唆する。この切片は、中程度のサフラニンＯ染色と、Ｉ及びII型コラーゲン染色の混合画像を示す。また、ある程度の細胞周囲VI型染色のが横方向の縁にも見られ、中央部では主に領域間マトリクス染色が見られた。それらの知見により、いくつかの領域が特に横方向の縁における硝子軟骨様の特徴を有するという線維軟骨の修復が示される。
【００８１】
ＦＧＦ−１８処理群Ｃ（写真は示さず）：すべての欠損部は、良好な軟骨下骨再生を示し、そして多くで、その場に足場が残存していることが観察された。欠損部に嚢胞の形成はなかった。裂け目は、一般的に、足場と関連することが多い欠損部へ縦に延伸する欠損部の中央部に見られた。軟骨層の厚さが、６個のＭＦＣ欠損部のうち５個において再生されおり、そして６個のＭＦＣ欠損部のうち２個は特に横方向に再生され、宿主軟骨とのインテグレーションが優れており、組織のほとんどは硝子軟骨構造に類似していた。より多くの線維軟骨組織修復が中央に見られることが多かった。一般的に、良好なサフラニンＯ染色が、欠損部全体にみられ、これにより良好なプロテオグリカンの生成が示唆される。最良の場合、Ｉ型コラーゲン染色が陰性で、II型及び細胞周囲ＶＩ型コラーゲン染色が陽性であり、硝子軟骨に非常に類似する修復組織が示される。一般的に、硝子軟骨を示す可能性の高い領域を有する修復組織は、良質の線維軟骨と混合されていることが見られた。
【００８２】
ＢＭＰ−７処理群Ｄ（写真は示さず）：不良な欠損部充填が、６個のＬＴＳ欠損部のうち４個に見られ、そして他の２つの欠損部においては、非常に不良なサフラニンＯ染色が見られた。横方向のインテグレーションは良くても中程度であり、線維軟骨組織のインテグレーションや隣接する元々の組織とのインテグレーションは不良であった。ＭＦＣにおいては、プロテオグリカン沈着が改善され、このことは、サフラニンＯ染色の増加により見られる。しかし、軟骨層の厚さは、生来の軟骨に比べほとんど低減した。６個のＭＦＣ欠損部のうち２つは、大きな軟骨下嚢胞と接していた。それらは嚢胞を遮断することが判明し、関節表面と通じず、慢性的な炎症性細胞により裏打ちされているようであった。わずかな足場のみが嚢胞と接していた。良くても、線維軟骨が観察され、Ｉ及びII型コラーゲンの両者に対する染色が陽性であった。正常な細胞周囲ＶＩ型コラーゲン染色を示す切片はなかった。残留する足場が、ＬＴＳに比較して、ＭＦＣにおける欠損部の大部分に見られた。多数の嚢胞が、他の処理群の何れよりも、ＢＭＰ−７に関するＭＦＣにおいて見られた（両者とも多いが）。
【００８３】
結果：
組織学断片の半定量的分析：
サフラニンＯ／ファストグリーン断片の全てを、関節軟骨修復分析の専門家であるブラインドの観察者により、修正されたＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ組織学スコアを用いて採点した。空の欠損部と比較して、ＭＦＣにおけるｒｈＦＧＦ−１８群に有意な改善が見られた（ｐ＝０．０３９０）（図９）。類似する傾向がＬＴＳにおいて観察されたが、しかしながら、統計学的に有意ではなかった。興味深いことに、ＢＭＰ−７群は、全てのＬＴＳにおいてばらつきが大きく最悪な結果を示した。
【００８４】
結論：
この研究の結果に基づくと、ｒｈＦＧＦ１８を、ヒツジ骨軟骨欠損モデルにおいてＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ足場と組み合わせると、足場のみ、又はＣｈｏｎｄｒｏｍｉｍｅｔｉｃ足場と組み合わせたＢＭＰ−１よりも、優れた修復組織を生成すると結論付けることができる。
【００８５】
本発明は、以下を包含する。
１）マトリクスを形成する少なくとも１つのポリマー材料および同化剤を含む物質送達システム。
【００８６】
２）前記マトリクスは足場または膜である、１）に記載の物質送達システム。
【００８７】
３）前記足場は二相性の足場であるか、あるいは前記膜は二層性の膜である、２）に記載の物質送達システム。
【００８８】
４）前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンである、１）〜３）のいずれか１項に記載の物質送達システム。
【００８９】
５）前記少なくとも１つのポリマー材料は、コラーゲンとグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）との組み合わせである、１）〜３）のいずれか１項に記載の物質送達システム。
【００９０】
６）軟骨形成細胞を更に含む、１）〜５）のいずれか１項に記載の物質送達システム。
【００９１】
７）前記同化剤は、ＦＧＦ−１８化合物である、１）〜６）のいずれか１項に記載の物質送達システム。
【００９２】
８）前記ＦＧＦ−１８化合物は、
ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド、および
ｂ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチド
から成る群より選択される、７）に記載の物質送達システム。
【００９３】
９）１）〜８）のいずれか１項に記載の物質送達システムを製造する方法であって、
ａ）少なくとも１つのポリマー材料を含むマトリクスを調製する工程；および、
ｂ）同化剤を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；を含む前記方法。
【００９４】
１０）ｃ）軟骨形成細胞を、工程ａ）で調製したマトリクスに添加する工程；
を更に含む、９）に記載の方法。
【００９５】
１１）軟骨障害の治療における使用のための、１）〜８）のいずれか１項に記載の物質送達システム。
【００９６】
１２）前記軟骨障害は、変形性関節症、軟骨損傷、および骨軟骨欠損より選択される、１１）に記載の使用のための物質送達システム。
【００９７】
１３）前記物質送達システムは、移植手順により前記治療を必要とする患者に投与される、１１）または１２）に記載の使用のための物質送達システム。
【００９８】
１４）１）〜８）のいずれか１項に記載の物質送達システムを含む製品。
【００９９】
１５）構成要素の各々は、移植前または移植後のいずれかに結合される、１４）に記載の製品。
【０１００】
【表３】
0006510547.tif 000004
【０１０１】
【表４】
0006510547.tif 000005
【０１０２】
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【図１】
0006510547.tif 000006
【図２】
0006510547.tif 000007
【図３】
0006510547.tif 000008
【図４】
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【図５】
0006510547.tif 000010
【図６】
0006510547.tif 000011
【図７】
0006510547.tif 000012
【図８】
0006510547.tif 000013
【図９】
0006510547.tif 000014
【配列表】
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