【事件の表示】
　特許第３０３００９２号「キメラ動物およびその作製法」の請求項１ないし６３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０３００９２号の請求項１ないし３３に係る特許を維持する。
【理　由】
［１］手続の経緯
　本件特許第3030092号は、PCT/JP96/02427（特願平9-510126号）として平成8年8月29日に国際特許出願（優先権主張　平成7年8月29日JP、平成8年2月15日JP）され、平成12年2月4日に特許の設定登録がなされ、その特許について特許異議申立人小寺秀紀及び大東輝雄より特許異議の申立てがなされたところ、当審により平成15年4月10日付取消理由が通知され、次いで審尋がなされた後、平成16年5月31日付で再度の取消理由が通知されて、平成16年6月16日付で訂正請求がなされたものである。
　　
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の要旨は、請求項１乃至６３を訂正明細書に記載された請求項１乃至３３の通りに訂正しようとするものである。
　そのうちのカテゴリーが異なるか、引用形式で記載されていない請求項、または典型的な請求項として請求項１乃至３，１６乃至１８，２０，２３，２５，２６，３２および３３の記載を下記に示す。
　
【請求項１】　遺伝子を有する単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を有する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、かつ該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物の作製方法であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が1Mb（百万塩基対）以上である、前記方法。
　
【請求項２】　遺伝子を有する単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を有する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持する分化多能性を有する細胞の作製方法であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が1Mb（百万塩基対）以上であり、該細胞の分化後に該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子が発現しうるものである、前記方法。
　
【請求項３（訂正前の請求項４に対応）】　外来染色体あるいはその断片が抗体をコードする領域を含むものである請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
　
【請求項１６（訂正前の請求項１９に対応）】　請求項２記載の方法で作製された、遺伝子を有する外来染色体あるいはその断片を保持する分化多能性を有する細胞であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が1Mb（百万塩基対）以上であり、該細胞の分化後に該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子が発現しうるものである、前記細胞。
　
【請求項１７（訂正前の請求項２０に対応）】　ヒト由来染色体あるいはその断片の塩基長が1Mb以上であって、該ヒト由来染色体あるいはその断片の単一あるいは複数を保持する分化多能性を有する細胞であって、該細胞の分化後に該ヒト由来染色体あるいはその断片上の遺伝子が発現しうるものである、分化多能性を有する細胞。
　
【請求項１８（訂正前の請求項２２に対応）】　請求項１記載の方法で作製された、遺伝子を有する外来染色体あるいはその断片を少なくとも一部の宿主細胞中において保持するキメラ非ヒト動物であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が1Mb（百万塩基対）以上であり、かつ該キメラ非ヒト動物は該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するものである、前記キメラ非ヒト動物。
　
【請求項２０（訂正前の請求項２４に対応）】　ヒト抗体遺伝子を有する塩基長が1Mb以上のヒト2番またはヒト14番染色体断片を少なくとも一部の宿主細胞中において保持し、該ヒト染色体断片上のヒト抗体遺伝子を発現する非ヒト動物。
　
【請求項２３（訂正前の請求項２８に対応）】　ヒト抗体遺伝子を有する塩基長が1Mb（百万塩基対）以上のヒト2番またはヒト14番染色体断片を少なくとも一部の宿主細胞中において保持し、該ヒト染色体断片上のヒト抗体遺伝子を発現する非ヒト動物であって、該非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求の範囲第２０項記載の非ヒト動物。
　
【請求項２５（訂正前の請求項３５に対応）】　請求の範囲第２０項、２１項、２２項、２３項、２４項のいずれか一項に記載の非ヒト動物の個体、組織、細胞またはハイブリドーマにおいて、ヒト抗体遺伝子を発現させ、その産物としてのヒト抗体遺伝子産物を回収することを特徴とする、ヒト抗体遺伝子産物の製造法。
　
【請求項２６（訂正前の請求項３７に対応）】  請求の範囲第２０項、２１項、２２項、２３項、２４項のいずれか一項に記載の非ヒト動物の個体、組織、細胞またはハイブリドーマから、発現しているヒト抗体遺伝子を単離することを特徴とする、ヒト抗体遺伝子産物を産生するためのDNAの作製方法。
　
【請求項３２（訂正前の請求項６２に対応）】　請求の範囲第２０項、２１項、２２項、２３項、２４項、２９項のいずれか一項に記載の非ヒト動物に抗原を免疫し、該非ヒト動物の血液から抗血清を取得することを特徴とする、ヒトポリクローナル抗体の製造方法。
　
【請求項３３（訂正前の請求項６３に対応）】　請求の範囲第２０項、２１項、２２項、２３項、２４項、２９項のいずれか一項に記載の非ヒト動物に抗原を免疫し、該非ヒト動物の血液から抗血清を取得することを特徴とする、ヒト抗体を含む抗血清の製造方法。
　
　具体的には、請求項１，２、１９及び２２において、「外来染色体あるいはその断片」が「遺伝子を有する」ものであることを明確化し、かつ「塩基長が1Mb（百万塩基対）以上」であるものに限定すると共に、「キメラ非ヒト動物」を「外来染色体あるいはその断片を保持し」、かつ「該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する」ものに、また「分化多能性を有する細胞」を、「該細胞の分化後に該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子が発現しうる」ものに限定しようとするものである。
　そして、請求項２４において、「ヒト由来染色体あるいはその断片」を「ヒト2番またはヒト14番染色体断片」であって、「ヒト抗体遺伝子」を有するものに限定しようとするものであり、「非ヒト動物」を「ヒト抗体遺伝子を発現する」ものに限定しようとするものである。同様に、請求項２６においては、「ヒト由来染色体、もしくはそれらの断片」を「ヒト抗体遺伝子を有する塩基長が1Mb以上のヒト2番またはヒト14番染色体断片」に、「保持する非ヒト動物」を「保持し、該染色体断片上のヒト抗体遺伝子を発現する非ヒト動物」に限定しようとするもので、また請求項２８においては、「ヒト由来DNAの単一あるいは複数」を、塩基長が1Mb以上の「ヒト抗体遺伝子を有する」「ヒト2番またはヒト14番染色体断片」に、「ヒト由来DNA上の遺伝子」を、当該染色体断片上の「ヒト抗体遺伝子」に、かつ「非ヒト動物」を「マウス」のみにそれぞれ限定しようとするものである。
　さらに、請求項３，１５，１６，２１，２７，２９，３１〜３４，３６，４０〜４８，５０〜５９を削除し、それ以下の請求項番号を繰り上げて新たな請求項とし、それぞれの引用請求項中の記載を整合させようとするものである。
　その他、請求項３０においては択一的に記載された「ヒト軽鎖λ遺伝子」を削除し、請求項３５，３７，３８及び３９においては「外来あるいはヒト由来遺伝子」を「（発現している）ヒト抗体遺伝子」に、「生物学的に活性な物質」を「ヒト抗体遺伝子産物」にそれぞれ限定しようとするものであり、また、請求項３７における「ハイブリドーマにおいて」を「ハイブリドーマから」に訂正し、請求項３９の「該遺伝子を」を削除しようとするものである。
　上記訂正は、いずれも願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮するか、もしくは明りょうでない記載の釈明を目的として訂正するものであり、いずれも特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められるから、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する特許法第１２６条第２項から第４項までの規定に適合するので、当該訂正を認める。
　         
〔３〕異議申立について：
１．本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１乃至３３に記載された事項により特定されたとおりのものである。
　
２．異議申立理由の概要：
（２−１．）異議申立人小寺　秀紀の異議申立理由について
　異議申立人小寺　秀紀の異議申立理由の概要は、本願は、訂正前の請求項１乃至６３に記載された発明についての明細書中の記載不備があり、特許法第36条第6項第1号及び第2号並びに同条第4項の規定を満たしていないので、本件特許は取り消されるべきである、というものである。 
　具体的には、「非ヒト動物」に係る発明が記載されている訂正前の請求項２８に対して、
　本件発明の必須の構成要件である「構成要件2：ミクロセル融合法を用い」、「構成要件3：染色体または染色体の断片を導入する」ものであり、かつ「構成要件4：導入された染色体または染色体の断片が宿主細胞の染色体から独立または宿主細胞の染色体に転座した状態で存在する」ことが請求項中に記載されていない点、及び
　キメラ非ヒト動物の子孫をも包含する「非ヒト動物」について、明細書中に容易に実施できる程度に記載されていない点、についての記載不備を指摘している。
　しかしながら、そもそも導入方法に関する「構成要件2」や形質転換細胞内における染色体断片の状態に関する「構成要件4」は、本件発明の「非ヒト動物」自体を明確に表現するための必須の要件であるとはいえないところ、訂正前の請求項２８は、前記訂正により請求項２３となり、「ヒト由来DNA」としては、「ヒト抗体遺伝子を有する（塩基長が1Mb（百万塩基対）以上のヒト2番またはヒト14番染色体断片」のみに限定されると共に、「非ヒト動物」も「マウス」のみに限定された。そして、「ヒト抗体遺伝子を有するヒト2番または4番染色体断片」を用いてヒト抗体を発現する「マウス」については、キメラマウスの子孫の場合も含め明細書中の記載により充分に裏付けられているといえるから、請求項２３に記載された発明は、明細書中に当業者が容易に実施できる程度に記載されており、従来技術とも明確に区別できるように充分に特定されて記載されているといえる。
　したがって、異議申立人の上記主張は採用できない。
　異議申立人が同様な主張をしている訂正前の請求項４３、４２は上記訂正により削除されており、訂正前の請求項２０及び２４（訂正後の請求項１７及び２０）など「細胞」自体もしくは「非ヒト動物」自体に係る発明に対する主張については、いずれも上記訂正前の請求項２８の場合と同様の理由で採用できない。
  また、異議申立人は、「キメラ非ヒト動物の作製方法」及び「分化多能性を有する細胞の作製方法」に係る訂正前の請求項１及び２に対して、上記「構成要件2〜4」に加えて「構成要件5：外来遺伝子を発現する」点が必須の構成であること前提として記載不備を主張している。
　ところで、「構成要件2」及び「構成要件3」は訂正前の両請求項中に必須の構成としてもともと記載されており、前記訂正により「構成要件5」が記載されると共に、移入対象の「外来染色体あるいはその断片」が、「遺伝子を有」しかつ「塩基長が1Mb（百万塩基対）以上」のものであることが規定されたことで、先行文献とも明確に区別ができる記載となったということができる。そのようなとき、「構成要件4」は、請求項１及び２の発明における必須の構成とはいえないことは明らかであるから、異議申立人の主張は採用できない。
　他の請求項についての主張も同様の理由で採用できない。
　なお、異議申立人は、最後の拒絶理由後の各請求項についての補正が請求の範囲を拡大するものであり不適切であった点も指摘しているが、この点は特許法第113条に規定する異議申立の理由ではないので検討する必要を認めない。
　以上の通りであるから、異議申立人の主張はいずれも採用しない。
　　
（２−２．）異議申立人大東　輝雄の異議申立理由について
　異議申立人大東　輝雄の異議申立理由の概要は、(1)本願は、訂正前の請求項１乃至６３に記載された発明についての明細書中の記載不備があり、本願は特許法第36条第6項第1号及び第2号並びに同条第4項の規定を満たしておらず、(2)訂正前の請求項１乃至６３に記載された発明は、本件出願前に頒布された甲第３乃至５号証の記載に基づいて当業者が容易に発明できたものであって特許法第29条第2項の規定に違反してなされたものであるから、本件特許は取り消されるべきである、というものである。
　　
（２−２−１．）(1)について：
　異議申立人は、訂正前の請求項１などに記載される用語「保持する」、訂正前の請求項３などに記載される用語「総塩基長が1Mb（百万塩基対）以上」、訂正前の請求項５に記載される用語「抗体をコードする領域」など、各請求項中の各種用語それぞれの用い方に対して、本件発明を不明確にするものである、及び／又は実施可能要件を欠如する、旨の主張をしている。
　しかしながら、特定の用語自体を単独で取り出せば技術用語として不明確な場合があったとしても、当業者は技術常識を勘案しつつ、請求項の記載全体の文脈から用語の意味を理解するから、そもそも請求項の記載を構成する用語ごとに分断して各用語自体の意味の不明確性を論じることは適切ではない。そして、上述の如く、前記訂正により、各請求項の記載がいずれも全体として従来技術との差違が明確となり、しかも明細書中に当業者が実施可能な程度に記載された範囲内のものとなったといえる以上、いずれの用語についての主張も採用できない。
　ところで、異議申立人は、訂正前の請求項３（訂正により削除）または訂正前の請求項４（訂正後の請求項３）などにおいて「動物の作製方法」と「細胞の作製方法」の２つの発明を同時に記載しているので、発明が不明確になっていると主張する。
　しかしながら、例えば訂正後の請求項３が引用している請求項１及び２は、それぞれがいわば最終目的物の製法と中間体の製法の関係にあって、請求項３はその共通する中間体製造工程をさらに限定するものであって、何ら不明確な記載ではない。すなわち、請求項３に接した当業者は、請求項３には、引用する請求項１及び２に記載された発明において、両発明共通の「細胞作製方法」に用いる「外来染色体あるいはその断片」が「抗体をコードする領域を含む」場合に限定されている発明が記載されていることを直ちに理解できるといえるから、当該主張は採用できない。
　他の同様な２つ以上の発明を引用して記載した請求項についての異議申立人の主張も、当該請求項に記載された発明が当該引用の結果として格別不明確になっているとはいえない以上同様に採用できない。
　いずれにしても、異議申立人が主張する(1)の点については採用できない。
　
（２−２−２．）(2)について：
　特許異議申立人は、訂正前の請求項１に記載された発明は、目的遺伝子を含む染色体を移入する方法としてミクロセル法が記載された甲第３号証、YAC法によってヒト抗体遺伝子をES細胞に挿入し、キメラマウスやヒト抗体産生マウスを作製することが記載された甲第４号証、及びヒト染色体を移入した細胞（マウス受精卵）が記載された甲第５号証（異議申立書第18頁では「甲第４号証」と誤記）の記載事項を組み合わせることで当業者が容易に発明をすることができる旨主張している。
　しかしながら、前記訂正後の請求項１は、「遺伝子を有し、かつ塩基長が1Mb（百万塩基対）以上である外来染色体あるいはその断片」を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ当該「外来染色体あるいはその断片」を移入することで、「外来染色体あるいはその断片を保持」し、かつ「当該遺伝子を発現する」キメラ非ヒト動物を作製する方法に係るものである。
　単にヒト染色体を移入した細胞（受精卵）が甲第５号証により公知であったからといって、直ちに甲第４号証のYAC法に代えて甲第３号証のミクロセル法を用いて、ヒト染色体をES細胞に挿入してキメラ非ヒト動物を作製しようと発想することにはならず、まして、そのことによりヒト染色体中の遺伝子がキメラ非ヒト動物において発現できることまでは到底予測することはできなかったとするのが相当である。
　訂正前の他の請求項に記載された発明についても同様であり、また、前記訂正により一部の請求項の記載において従来技術との差違が不明確であった点も解消された。
　したがって、異議申立人が主張する(2)の点についても採用できない。
　
＜引用文献＞
甲第３号証：実験医学, Vol.7, No.2, (1989), P.89-92
甲第４号証：Nature Genetics, Vol.7, (May, 1994), P.13-21
甲第５号証：Science, Vol.245, (1989), P.175-177
　
３．以上述べたように、本件請求項１乃至３３に係る発明は、いずれも申立人の申立て理由によっては、特許を受けることができないとすることができない。
　なお、異議申立人が添付した別紙2の表中には、例えば請求項３０乃至４１などの異議申立理由の欄に「（第29条第1項に該当）」という記載があるものの、当該箇所にはその具体的な理由が記載されておらず、しかも異議申立書中では新規性違反に関しては何らの主張もなされていないので検討しないが、本件訂正後のいずれの請求項に記載された発明も従来技術とは明確に区別できるものであることは上述のとおりであるから、理由がないことは明らかである。
　
〔４〕結語
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
　
【異議決定日】
平成１６年７月１５日（２００４．７．１５）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
キメラ動物およびその作製法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　
遺伝子を有する
し、かつ該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現
であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が１Ｍｂ（百万塩基対）以上である、前記方法。
　【請求項２】　
遺伝子を有する
であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が１Ｍｂ（百万塩基対）以上であり、該細胞の分化後に該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子が発現しうるものである、前記方法。
　【請求項
３
　【請求項
４
　【請求項
５
４
　【請求項
６
４
５
　【請求項
７
　【請求項
８
　【請求項
９
　【請求項
１０
　【請求項
１１
９
１０
　【請求項
１２
９
　【請求項
１３
１２
　【請求項
１４
　【請求項
１５
１４
　【請求項
１６
遺伝子を有する
であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が１Ｍｂ（百万塩基対）以上であり、該細胞の分化後に該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子が発現しうるものである、前記細胞。
　【請求項
１７
　【請求項
１８
遺伝子を有する
であって、該外来染色体あるいはその断片の塩基長が１Ｍｂ（百万塩基対）以上であり、かつ該キメラ非ヒト動物は該外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するものである、前記キメラ非ヒト動物。
　【請求項
１９
請求の範囲第１８項
　【請求項
２０
ヒト抗体遺伝子を有する塩基長が１Ｍｂ以上のヒト２番またはヒト１４番染色体断片
染色体
ヒト抗体
　【請求項
２１
２０
　【請求項
２２
２０項もしくは第２１
ヒト抗体遺伝子を有する塩基長が１Ｍｂ以上のヒト２番または１４番染色体
し、該染色体断片上のヒト抗体遺伝子を発現
　【請求項
２３
ヒト抗体遺伝子を有する
ヒト２番またはヒト１４番染色体断片
染色体断片
ヒト抗体
であって、該非ヒト動物がマウスであることを特徴とする、請求の範囲第２０項記載の非ヒト動物
　【請求項
２４
第２０項、２１項、２２項、２３項のいずれか一項に
　【請求項
２５
２０項、２１項、２２項、２３項、２４項
ヒト抗体
ヒト抗体遺伝子産物
ヒト抗体遺伝子産物
　【請求項
２６
２０項、２１項、２２項、２３項、２４項
から
発現している
抗体
ヒト抗体遺伝子産物
　【請求項
２７
抗体
第２６
　【請求項
２８
２０項、２１項、２２項、２３項、２４
非ヒト動物の
、発現している
抗体
ヒト抗体遺伝子
発現したヒト抗体遺伝子産物
ヒト抗体遺伝子産物
　【請求項
２９
２０項、２１項、２２項、２３項、２４項の
　【請求項
３０
２８
　【請求項
３１
２８
　【請求項
３２
２０項、２１項、２２項、２３項、２４項、２９項
　【請求項
３３
２０項、２１項、２２項、２３項、２４項、２９項
【発明の詳細な説明】
技術分野
　本発明は、キメラ非ヒト動物、その作製法およびその利用法に関する。本発明のキメラ非ヒト動物を用いれば、これまで不可能であった１Ｍｂ（百万塩基対）以上の外来巨大ＤＮＡ断片を動物個体で保持発現させることが可能になる。従って、これを利用することにより、
　・生物学的に活性な物質をコードする遺伝子の全長、例えば、ヒト抗体遺伝子全長を保持し、発現する動物個体の作製が可能になる。この動物から得られる生物学的に活性な物質、例えば、ヒト型抗体は医薬品としての利用価値がある。
　・ヒト巨大遺伝子（組織適合性抗原、ジストロフィン等）の動物個体における機能解析が可能になる。
　・ヒト優性遺伝病及び染色体異常症のモデル動物作製に利用できる。
背景技術
　外来遺伝子を動物個体において発現させる技術、すなわちトランスジェニック動物作製技術は、その遺伝子の生体内機能に関する情報を得るために有用なばかりでなく、遺伝子発現を制御するＤＮＡ配列の同定（例えば、Ｍａｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８，１９８５）、ヒト疾患モデル動物の開発（山村ら，マニュアル疾患モデルマウス，中山書店，１９９４）、さらには家畜の育種（例えば、Ｍｕｌｌｅｒら，Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ，４７：９２３，１９９１）、それを用いた有用物質の生産に利用されてきた（例えば、Ｖｅｌａｎｄｅｒら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８９：１２００３，１９９２）。遺伝子導入の対象としてはこれまでマウスが最も多く用いられてきた。実験動物として詳細に研究され、胚操作技術も確立されているマウスはこの目的に最も適した哺乳動物であるといえる。
　マウス個体への外来遺伝子導入法は大きく分けて２つ知られている。１つは受精卵前核にＤＮＡを注入する方法（Ｇｏｒｄｏｎら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７７：７３８０，１９８０）であり、もう一つは分化全能性を保持した胚幹細胞（以下ＥＳ細胞、という）にＤＮＡを導入し、キメラマウスを作製する方法（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１０２：２５９，１９８８）である。後者の場合、キメラマウスにおいては、ＥＳ細胞の貢献した細胞、組織においてのみ、ＥＳ細胞由来の生殖細胞を経て得られる子孫においてはすべての細胞、組織で導入遺伝子が保持される。これらの技術を利用して現在までに数多くのトランスジェニックマウスが作製されてきた。
　しかし、現状では導入可能なＤＮＡの大きさに限界があり、それがこの技術の利用範囲を大きく制限している。その限界はクローン化可能なＤＮＡの大きさに依存し、これまで最も大きなＤＮＡ断片を導入した例の一つは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）にクローニングされた約６７０ｋｂのＤＮＡ断片である（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５，１９９３）。この実験は、ＹＡＣを保持する酵母とマウスＥＳ細胞を融合することにより行なわれた。ＹＡＣにおいては、約２Ｍｂまでの外来ＤＮＡをクローニングできるとされているが（Ｄｅｎ　Ｄｕｎｎｅｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１：１９，１９９２）、出芽酵母細胞中では、相同ＤＮＡ配列同士の組換え頻度が高いことが知られており、反復配列を多く有するヒトＤＮＡ断片を完全な形で安定に保持することが困難な場合がある。事実、ヒトゲノムＤＮＡを含むＹＡＣライブラリーでは、その２０〜４０％が何らかの組換えを起こしている（Ｇｒｅｅｎら，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１１：５８４，１９９１）。
　もう一つの方法として、ヒト培養細胞から得られる中期染色体を顕微切断し、その断片（１０Ｍｂ以上と推定される）をマウス受精卵に注入することが試みられた（Ｒｉｃｈａら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４５：１７５，１９８９）。この結果得られたマウス個体においてヒト特異的ＤＮＡ配列（Ａｌｕ配列）が検出されたが、ヒト遺伝子発現については確認されていない。また、ここで用いられた染色体調製法では染色体をスライドグラスに固定する際、酢酸メタノールを使用するために、ＤＮＡ自体が小さく断片化してしまうことが避けられず、注入したＤＮＡが一続きのＤＮＡとして存在している可能性は低い。
　いずれにせよ、現在まで１Ｍｂ以上の１続きの外来ＤＮＡ断片をマウス個体へ導入、発現させた例はないといえる。
　マウスに導入することが望まれる、有用かつ興味深いヒト遺伝子：抗体（例えば、Ｃｏｏｋら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：１６２，１９９４）、Ｔ細胞受容体（Ｈｏｏｄら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．ＬＶＩＩＩ，３３９，１９９３）、組織適合性抗原（Ｃａｒｒｏｌら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８４：８５３５，１９８７）、ジストロフィン（Ｄｅｎ　Ｄｕｎｎｅｎら，前記）等は、そのコード領域自体が１Ｍｂを越える大きさを持つことが知られている。とりわけ、ヒト型抗体の医薬品としての重要性から、ヒトの免疫グロブリン重鎖（〜１．５Ｍｂ、Ｃｏｏｋら，前記）、軽鎖κ（〜３Ｍｂ、Ｚａｃｈａｕ，Ｇｅｎｅ，１３５：１６７，１９９３）、軽鎖λ（〜１．５Ｍｂ、Ｆｒｉｐｐｉａｔら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，４：９８３，１９９５）の遺伝子全長を保持し、発現するようなマウスの作製が望まれているがそれは現状の技術では不可能である（日経バイオテク，１９９３．７．５．）。
　また、ヒトの優性遺伝疾患、先天異常を引き起こす染色体異常症（ダウン症等）の原因遺伝子の多くはクローン化されておらず、染色体上の大まかな位置情報のみ利用可能である。例えば、中期染色体をギムザ染色することによって得られるＧバンドは、通常数Ｍｂ〜１０Ｍｂ以上の大きさを有している。従って、ある原因遺伝子が特定のＧバンド上に存在することが明らかとなっても、これらの異常形質をマウスに導入するためには、原因遺伝子周辺の染色体断片（数Ｍｂ以上）を導入することが必要であるが、これも現状の技術では不可能である。
　ここに従来技術の限界である１Ｍｂを越える外来ＤＮＡをマウス個体に導入し、発現させる技術の開発が望まれている。
　動物培養細胞においては、従来技術により上述の限界を越える大きさのＤＮＡを導入することが可能である。これは主に、染色体（ヒトの場合約５０〜３００Ｍｂの大きさを持つ）を媒体として行なわれる。細胞への染色体移入法はいくつか報告されているが（例えば、ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７０：１２５８，１９７３）その中でも望みの染色体を１本だけ導入する方法として最適と考えられているのがミクロセル法である（Ｋｏｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，８０：４１３，１９８９）。ミクロセルと呼ばれる構造体は１本〜数本の染色体が核膜、形質膜に包まれたものである。ある種の細胞において紡垂体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、受容細胞と融合することにより、少数（多くの場合は１本）の染色体を導入することが可能である。この方法により得られた、ヒト染色体を１本だけ保持するモノクロモソーム雑種細胞のライブラリーは既知遺伝子のマッピングや、未知の癌抑制遺伝子、細胞老化遺伝子等の存在する染色体を特定するために利用されてきた（例えば、Ｓａｘｏｎら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，５：３４６１，１９８６）。さらに、ミクロセルにガンマ線を照射することにより、染色体を断片化しその一部を導入することも可能である（Ｋｏｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：３６１，１９９３）。すなわち、ミクロセル法は、１Ｍｂ以上のＤＮＡを動物培養細胞に導入する方法として適していると考えられる。
　培養細胞からマウス個体を作り出すことができないかという期待は、分化全能性を安定に保持するＥＳ細胞の発見（Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４，１９８１）により確実に現実のものとなった。このＥＳ細胞には外来遺伝子、種々の突然変移、さらには、標的遺伝子組換えによる変異が導入可能となり、マウス個体レベルの遺伝的改変が自在に行なえるようになった（例えば、Ｍａｎｓｏｕｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３３６：３４８，１９８８）。一方、巨大ＤＮＡの導入という意味では前述のＹＡＣベクターにクローニング可能な外来ＤＮＡ断片の大きさが限界と考えられてきた。その大きさを越えるＤＮＡを培養細胞に導入可能な染色体移入という従来技術がマウス個体レベルへの遺伝子導入に利用されたことはなく、またその達成は困難であると考えられてきた（村松ら，トランスジェニックバイオロジー，講談社サイエンティフィク，ｐ１４３−，１９８９）。
　理由としては、以下のようなものが挙げられる。
・受容細胞を正常核型のマウスＥＳ細胞としてこれにヒト染色体導入を行なう場合、それは染色体異常そのものを導入することである。これまで、顕微鏡によって識別可能な染色体レベルの大きな遺伝子異常はマウスの発生にとって多くの場合致死的であると考えられてきた（Ｇｒｏｐｐｒら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｚｏｏｌ．，２２８：２５３，１９８３；相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８　ジーンターゲティング，羊土社，１９９５）。
・我々が得ることのできるヒト染色体は通常、有限増殖の正常繊維芽細胞、あるいは癌細胞等の分化した体細胞のものであり、そのような体細胞由来の染色体が未分化なＥＳ細胞に導入された場合、ＥＳ細胞を分化させたり（Ｍｕｌｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３１１：４３８，１９８４）、老化させてしまうのではないか（Ｓｕｇａｗａｒａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：７０７，１９９０）と考えられた。
・体細胞由来の染色体が初期胚に導入された場合、胚発生過程で生殖細胞由来のそれと同様に正しく機能し、多様な組織、細胞における特異的遺伝子発現を担うことができるかという問題についての研究は非常に少ない。この２者における大きな違いの一つは染色体ＤＮＡのメチル化状態と想像される。これは細胞の分化に伴って変化し、組織特異的な遺伝子発現における重要な役割が示唆されている（Ｃｅｄｅｒ，Ｃｅｌｌ，５３：３，１９８８）。例えば、抗体遺伝子の活性化に不可欠な部位特異的ＤＮＡ組換え反応について、メチル化した基質をＢ細胞に導入した場合、メチル化の状態は複製後も保持され、組換え反応を阻害するという報告がある（Ｈｓｉｅｈら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１１：３１５，１９９２）。また、株化された細胞中では生体内と比較して、ｄｅ　ｎｏｖｏのメチル化が起こりやすいとされている（Ａｎｔｅｑｕｅｒａら，Ｃｅｌｌ，６２：５０３，１９９０）。よってこれまでの研究から、繊維芽細胞や、ヒト−マウス雑種細胞のおそらく高度にメチル化されているであろう抗体遺伝子がマウスのＢ細胞で正常に発現すると想像することは容易ではなかった。
　ここで、関連するものとしてＩｌｌｍｅｎｓｅｅらの２つの報告（Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７５；１９１４，１９７８；Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，７６：８７９，１９７９）に注目しなければならない。１つはヒト肉腫細胞とマウスＥＣ細胞、もう１つはラット肝癌細胞とマウスＥＣ細胞の全細胞融合により得られた融合株からキメラマウスを作製したという報告である。これらの報告においてはその実験結果に数多くの疑問点が指摘され、その信憑性は低いと考えられている（野口ら，マウスのテラトーマ，理工学社，５節，１９８７）。また、一日も早い追試が望まれていたにも関わらず、報告から１７年を経た現在までこの実験を再現できたという報告は存在しない。従って、これらの報告によっては、マウス個体において外来染色体を保持させ、該染色体上の遺伝子を発現させ得たということはできないと考えられてきた。
　こうした状況において、染色体断片ほどの巨大ＤＮＡをマウスをはじめとする動物個体に導入し、発現させることは困難とされ、実際この問題について検討がなされたことは上記のＩｌｌｍｅｎｓｅｅらの報告以来ない。
　従って、本発明は、外来染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物およびその子孫、並びに前記のキメラ非ヒト動物の作製法を提供することを目的とする。
　また、本発明は、前記のキメラ非ヒト動物およびその子孫に由来する組織および細胞を提供することを目的とする。
　さらに、本発明は、前記のキメラ非ヒト動物およびその子孫に由来する細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイブリドーマを提供することも目的とする。
　さらにまた、本発明は、非ヒト動物の個体、組織または細胞を用いて、外来染色体またはその断片上の遺伝子の発現産物である生物学的に活性な物質を製造する方法を提供することを目的とする。
発明の開示
　発明者は前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、ヒト正常繊維芽細胞由来染色体あるいはその部分断片をミクロセル法によりマウスＥＳ細胞に導入し、それを安定に保持する株を得ることに成功した。さらにこのＥＳ細胞株から、その正常組織においてヒト染色体を保持し、ヒト抗体重鎖遺伝子を含む複数のヒト遺伝子を発現するキメラマウスを得た。我々はこの一連の方法により、これまで不可能であった巨大ＤＮＡ断片の個体における保持、及び該ＤＮＡ断片上の遺伝子の発現を可能にした。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（１）単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、キメラ非ヒト動物の作製法。
（２）単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含むミクロセルを作製し、該ミクロセルとの融合により、分化多能性を保持する細胞へ前記単一または複数の外来染色体あるいはその断片を移入させることを特徴とする、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞の作製法。
（３）前記（１）の方法により作製することができ、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物、および前記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現するその子孫。
（４）前記（２）の方法により作製することができ、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を含む分化多能性を保持する細胞。
（５）キメラ非ヒト動物を作製するための前記（４）の分化多能性を保持する細胞の使用。
（６）前記（３）のキメラ非ヒト動物またはその子孫の交配により得られる、単一または複数の外来染色体あるいはその断片を保持し、該染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現する非ヒト動物およびその子孫。
（７）前記（３）のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または前記（６）の非ヒト動物もしくはその子孫に由来する組織。
（８）前記（３）のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または前記（６）の非ヒト動物もしくはその子孫に由来する細胞。
（９）前記（８）の細胞とミエローマ細胞との融合により作製されたハイブリドーマ。
（１０）前記（３）のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または前記（６）の非ヒト動物もしくはその子孫を、前記の染色体あるいはその断片上の遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒト動物と交配させることにより作製された非ヒト動物およびその子孫。
（１１）前記（３）のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または前記（６）の非ヒト動物もしくはその子孫の個体、組織または細胞において、単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物としての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、生物学的に活性な物質の製造法。
（１２）前記（３）のキメラ非ヒト動物もしくはその子孫または前記（６）の非ヒト動物もしくはその子孫を、前記の染色体あるいはその断片上の遺伝子と同じあるいは相同の遺伝子が欠損している系統の非ヒト動物と交配させ、誕生した子動物の個体、組織または細胞において、前記の単一または複数の外来染色体あるいはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物としての生物学的に活性な物質を回収することを特徴とする、生物学的に活性な物質の製造法。
図面の簡単な説明
　第１図は、ヒト２番染色体（断片）を保持するＡ９細胞の解析（ＰＣＲ解析）の結果が示されている。
　第２図は、Ｅ１４耐性株においてヒト２２番染色体（断片）が保持されていることが示されている（ＰＣＲ解析）。
　第３図は、２２番染色体導入ＥＳ細胞由来キメラマウスにおいてヒトＬ１配列が保持されていることを示す電気泳動写真である（サザン解析）。
　第４図は、ヒト２２番染色体導入キメラマウス臓器におけるヒト染色体の保持の様子を示す電気泳動写真である（ＰＣＲ解析）。
　第５図は、ヒト２２番染色体導入キメラマウスにおけるヒト遺伝子発現（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す電気泳動写真である。
　第６図は、ヒト２２番染色体導入キメラマウス臓器におけるヒト遺伝子発現（ＲＴ−ＰＣＲ）の結果を示す電気泳動写真である。
　第７図は、Ｅ１４耐性株においてヒト４番染色体（断片）が保持されていることが示されている（ＰＣＲ解析）。
　第８図は、ヒト４番染色体導入Ｅ１４細胞株におけるヒトＬ１配列の検出（サザン解析）の結果を示す電気泳動写真である。
　第９図は、ヒト４番染色体導入ＥＳ細胞由来キメラマウスにおいてヒトＬ１配列が保持されていることを示す電気泳動写真である。（サザン解析）。
　第１０図は、ＴＴ２耐性株においてヒト１４番染色体（断片）が保持されていることが示されている（ＰＣＲ解析）。
　第１１図は、ヒト１４番染色体導入ＥＳ細胞由来キメラマウス臓器におけるヒト染色体の保持の様子を示す電気泳動写真である（ＰＣＲ解析）。
　第１２図は、尻尾由来繊維芽細胞Ｇ４１８耐性テストの結果が示されている。
　第１３図は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中のヒト抗体ＩｇＭ濃度（ＥＬＩＳＡ）が示されている。
　第１４図は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中のヒト抗体ＩｇＧ濃度（ＥＬＩＳＡ）が示されている。
　第１５図は、ヒトＩｇＭ産生ハイブリドーマクローンＨ４Ｂ７の解析（ＥＬＩＳＡ）の結果が示されている。
　第１６図は、ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２細胞株ＰＧ１５）のＦＩＳＨ解析の結果を示す染色体の形態の写真である。
　第１７図は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒト血清アルブミンヒトＩｇＧ抗体価の増加が示されている。
　第１８図は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒト血清アルブミンヒトＩｇκ抗体価の増加が示されている。
　第１９図は、ヒト２２番染色体導入ＴＴ２細胞株におけるヒトＬ１配列の検出（サザン解析）の結果を示す電気泳動写真である。
　第２０図は、ヒト血清アルブミン免疫キメラマウス血清中の抗ヒト血清アルブミンヒトＩｇλ抗体価の増加が示されている。
　第２１図は、ヒト２番染色体部分断片導入キメラマウスの子孫においてヒト２番染色体部分断片が保持されていることが示されている（ＰＣＲ解析）。
　第２２図は、ヒト１４番染色体導入キメラマウス脾臓において細胞表面にヒトμ鎖が発現している細胞の存在を示している（フローサイトメトリー解析）。
　第２３図は、ＬｏｘＰ−ｐｓｔＮＥＯプラスミドＤＮＡの構造を示している。
　第２４図は、マウス抗体重鎖ＣμのゲノムＤＮＡの構造を示している。
　第２５図は、マウス抗体軽鎖κのゲノムＤＮＡの構造を示している。
　第２６図は、マウス抗体重鎖ターゲッティングベクター及び、サザンブロット用プローブの構造と相同組換え体で検出されるべきＤＮＡ断片について示している。
　第２７図は、マウス抗体軽鎖κターゲッティングベクター及び、サザンブロット用プローブの構造と相同組換え体で検出されるべきＤＮＡ断片について示している。
　第２８図は、マウス抗体重鎖相同組換え体及び相同組換え体由来高濃度Ｇ４１８耐性株のサザン解析の結果を示す電気泳動写真である。
発明を実施するための最良の形態
　ヒト染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するマウス個体は、
（１）標識されたヒト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製
（２）分化多能性を保持するマウス細胞へのミクロセル法によるヒト染色体またはその断片の移入
（３）上記マウス細胞を用いたキメラマウスの作製
（４）キメラマウスにおけるヒト染色体保持及び、ヒト遺伝子発現確認
の過程を経ることにより得ることができる。なお、ここでは、ヒト染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現する非ヒト動物として、マウスを例にとった（以下、このマウスを「ヒト染色体導入マウス」と称する。）。
　ここでヒト染色体とは、ヒト細胞由来の天然のＤＮＡと蛋白質の複合体のことを指す。正常なヒト染色体は２３種（雄は２４種）４６本存在し、それぞれ約５０〜３００Ｍｂの長さのＤＮＡを含むとされるが、本発明においては独立染色体として安定に複製、分配が可能な部分断片、およびマウス染色体上に転座し、安定に保持されている部分断片も含まれる。そのＤＮＡの大きさは通常１Ｍｂ以上だが、それ以下の場合もある。本発明の特徴は大腸菌、酵母等でのクローニングあるいは細胞からのＤＮＡ抽出処理等を行なわず、染色体そのものを媒体としてマウス個体でヒト遺伝子を保持、発現させることにある。
　また、ヒト染色体導入マウスとは、その正常体細胞の全てまたは一部において、単一あるいは複数のヒト染色体あるいはその断片を保持するものを指す。さらには、その正常体細胞の全てまたは一部において、ヒト染色体上の単一あるいは複数のヒト遺伝子を発現しているものを指す。
（１）標識されたヒト染色体またはその断片を保持する染色体供与細胞の作製
　染色体供与細胞としては、１）受容細胞で選別可能なマーカーで標識されたヒト染色体を保持し、２）それ以外のヒト染色体を含まない、３）ミクロセル形成能が高い細胞、が望ましい。
　ヒト染色体提供の材料としては、ヒト由来のあらゆる細胞株、癌細胞、初代培養細胞を用いることが出来るが、染色体の欠失、増幅等の異常の可能性が低く、また培養が容易な点を考慮すると正常繊維芽細胞が適している。
　まず１）について、ヒト細胞は薬剤（Ｇ４１８，ピューロマイシン，ハイグロマイシン，ブラストサイジン）耐性等のマーカー遺伝子を発現するベクターにより形質転換することができる。ここで用いるマーカー発現制御のためのプロモーターとしては、ヒト細胞のみならず、マウスＥＳ細胞のような受容細胞で効率よく働くものが望ましい。この目的にはＳＶ４０エンハンサーと単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターの連結したもの（Ｋａｔｏｈら，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１２：５７５，１９８７）、マウスＰＧＫ−１プロモーター（Ｓｏｒｉａｎｏら，Ｃｅｌｌ，６４：６９３，１９９１）等を用いることが出来る。エレクトロポレーション（石田ら，細胞工学実験操作入門，講談社，１９９２）等による形質転換を実施し、選択することにより、導入されたマーカー遺伝子が、２３種４６本あるヒト染色体上にランダムに挿入されたようなヒト細胞形質転換体のライブラリーを得ることが出来る。
　３）については、多くのヒト正常細胞がミクロセル形成能が非常に低いので、上記の形質転換体をミクロセル形成能の高い細胞例えば、マウスＡ９細胞（Ｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｍ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，９３：５７，１９９１）と全細胞融合することにより、形成能を付与することが出来る。マウス−ヒト雑種細胞では、ヒト染色体が選択的に消失することが知られているが、ここで得られた融合株は、先述のマーカーで選択することにより、マーキングされたヒト染色体を安定に保持することが出来る。
　さらに、２）の条件を満たすために、この細胞融合株からミクロセルを取得し、マウスＡ９細胞と再度融合することが望ましい。この場合も、ヒト染色体上のマーカーで選択することにより、得られるミクロセル融合株の多くは、１）、２）、３）の条件を満たしたものであると考えられる。マーキングされたヒト染色体の同定は、最終段階で得られるマウス−ヒトモノクロモソーム雑種細胞において、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェインリアクション、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７，１９８８）、サザンブロット解析（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４）、ＦＩＳＨ（フルオレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション、Ｌａｗｒｅｎｃｅら，Ｃｅｌｌ，５２：５１，１９８８）解析等により調べることが出来る。ある特定の染色体導入を望む場合には、多くのヒト細胞形質転換体クローンについて、それぞれ上記の過程を繰り返して、目的染色体がマーキングされたものを探す。あるいは、ヒト細胞形質転換体クローンの混合物について上記の過程を実施し、得られる多数のマウス−ヒトモノクロモソーム雑種細胞についてヒト染色体の同定を行なうことが可能である。
　さらに、導入を望む染色体上のＤＮＡ配列を標的とした相同組換え（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ，５１：５０３，１９８７）により、特定の部位にマーカー遺伝子を挿入することも可能である。
　マウス−ヒト雑種細胞から調製したミクロセルにガンマ線照射することにより、マーキングされたヒト染色体を断片化してマウスＡ９細胞に導入することも出来る。また、ミクロセルにガンマ線照射しない場合でも、ある割合で部分断片化したヒト染色体が移入されることがある。これらの場合、得られるミクロセル融合株は、マーキングされたヒト染色体の部分断片を保持している。これらは、受容細胞に染色体部分断片を導入したい場合に用いることができる。
（２）分化多能性を保持するマウス細胞へのヒト染色体またはその断片の移入
　これまでに、種々の系統のマウス由来の胚性癌腫細胞（ＥＣ細胞、Ｈａｎａｏｋａら，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，４８：８３，１９９１）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞、Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１５４，１９８１）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞、Ｍａｔｓｕｉら，Ｃｅｌｌ，７０：８４１，１９９２）がマウス初期胚に注入あるいは共培養することによりその正常体細胞に寄与する、すなわちキメラマウス作製可能であることが報告されている。ＥＳ、ＥＧ細胞はその能力が特に高く、多くの場合生殖細胞にも寄与し、その細胞由来の子孫を作ることができる。ＥＣ細胞は主に生殖細胞癌から、ＥＳ細胞は胚盤胞の内部細胞塊から、ＥＧ細胞は発生初期に出現する始原生殖細胞から得られる。本発明におけるヒト染色体移入の受容細胞としてはこれらの細胞株及びその変異株、さらにはマウス個体において全て、あるいは一部の正常体細胞に分化可能なあらゆる未分化細胞を用いることができる。
　受容細胞へのヒト染色体移入の材料としては（１）で得られたヒト染色体供与細胞から調製されるミクロセルあるいはガンマ線照射したミクロセルを用いることができる。受容細胞への移入は〈清水素行，細胞工学ハンドブック，羊土社，１９９２〉等に記された方法で受容細胞とミクロセルを融合することにより行なう。ミクロセル供与細胞においてはあるヒト染色体またはその断片が受容細胞において選別可能なマーカーを保持している。この中から、（１）と同様ＰＣＲ、サザンブロット解析、ＦＩＳＨ解析等により、導入を目的とする遺伝子あるいは染色体あるいはその断片を保持する株を選択すれば、あらゆるヒト染色体、あるいはその断片を導入することが可能である。また、異なる選択マーカーを保持する複数の染色体、あるいはその断片を逐次導入することにより、これらを同時に保持する受容細胞を得ることもできる。さらに、すでにあるヒト染色体を導入した細胞株の中から、導入染色体数が増加したものを選抜することも可能である。これは通常、培養液中に添加する選択薬剤の濃度を高めることにより達成される。
　ヒト染色体上のマーカー（Ｇ４１８耐性等）により選抜された受容細胞が、供与細胞の保持していたヒト染色体の全部あるいは一部を保持していることは、以下のようにして確認される。選抜された受容細胞から抽出したゲノムＤＮＡを用い、プローブとしてヒト特異的繰り返し配列（Ｌ１、Ａｌｕ等、Ｋｏｒｅｎｂｅｒｇら，Ｃｅｌｌ，５３：３９１，１９８８）、ヒト遺伝子等を用いたサザン解析により検出される。また、ヒト遺伝子特異的プライマーによるＰＣＲ法、及びヒト染色体特異的プローブ（Ｌｉｃｈｔｅｒら，Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８０：２２４，１９８８）を用いたフルオレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の染色体解析により確認することができる。
（３）ヒト染色体導入ＥＳ細胞からのキメラマウス作製
　（２）で得られたＥＳ細胞株からのキメラマウス作製は、〈相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲティング，羊土社，１９９５〉等に記された方法で行なう。効率的なキメラマウス作製を行なうための宿主胚の発生時期、系統等の選択については、それぞれのＥＳ細胞株についてすでに検討された条件を用いることが望ましい。例えば、ＣＢＡ×Ｃ５７ＢＬ／６　Ｆ１由来のＴＴ２細胞（野生色、Ｙａｇｉら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１４：７０，１９９３）、についてはＢａｌｂ／ｃ（白色、日本クレア社）あるいはＩＣＲ（白色、日本クレア社）由来の８細胞期胚を宿主胚として用いるのが望ましい。
（４）キメラマウスにおけるヒト染色体の保持及びヒト遺伝子発現
　ＥＳ細胞株を注入した胚から誕生したマウスにおけるＥＳ細胞の貢献率は、その毛色によりおおまかに判定することができる。但し、毛色に全く貢献が見られないからといって他の組織で貢献がないとは断定できない。より詳細な、キメラマウス各組織におけるヒト染色体の保持は各組織より抽出されたゲノムＤＮＡを用いたサザン解析、ＰＣＲ等によって確認することができる。
　導入ヒト染色体上の遺伝子発現は以下のようにして確認される。ヒト染色体由来ｍＲＮＡの発現は各組織由来ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ法（Ｋａｗａｓａｋｉら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，８５：５６９８，１９８８）、ノーザンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，前記）により検出される。蛋白質レベルの発現は、マウスの相同蛋白質との交差反応性を最小にした抗ヒト蛋白質抗体による酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ、富山・安東，単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィク，１９８７；石川，超高感度酵素免疫測定法，学会出版センター，１９９３）、ウエスタンブロット法（Ａｕｓｕｂｅｌら，前記）あるいは、電気泳動度の違いを利用したアイソザイム分析（Ｋｏｉら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，８０：４１３，１９８９）等により検出される。さらに、キメラマウス細胞中でのヒト染色体の保持及び該染色体上の遺伝子の発現が、キメラマウス由来初代培養細胞での薬剤耐性マーカー遺伝子発現による耐性細胞の出現より確認できる。
　例えば、ヒト免疫グロブリン重鎖の存在するヒト１４番染色体を保持するＥＳ細胞から作製されたキメラマウスについて、キメラマウス血清中のヒトＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ等をマウス抗体との交差反応性を最小にした抗ヒトＩｇ抗体による酵素免疫測定法により検出することができる。また、このキメラマウスをヒト由来抗原（例えばヒト血清アルブミン）により免疫し、その脾臓細胞とマウスミエローマを融合することにより得られる、ハイブリドーマ（安東・千葉，単クローン抗体実験操作入門，講談社サイエンティフィク，１９９１）をＥＬＩＳＡによりスクリーニングすることにより、ヒト免疫グロブリン重鎖を産生するハイブリドーマを得ることができる。
　以上、マウスを例にとり、ヒト染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物の作製法を説明したが、本発明において、キメラ非ヒト動物へ移入される染色体またはその断片は、ヒト由来のものに限られず、広く外来染色体またはその断片を移入し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現させることが可能である。ここで、「外来染色体」とは、分化多能性を保持する細胞へ移入され、キメラ非ヒト動物において、該染色体またはその断片上の遺伝子が発現することを特徴とするものであり、その由来ととする生物種は特に限定されるものではない。また、本発明の方法により、キメラマウスのみならず、他のキメラ動物、例えば、ラット、ブタ等の哺乳類その他のキメラ動物も作製することができる。マウス以外の動物種におけるＥＳ細胞あるいはＥＳ様細胞の樹立はラット（Ｉａｎｎａｃｃｏｎｅら，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１６３，２８８−，１９９４）、ブタ（Ｗｈｅｅｌｅｒら，Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．Ｄｅｖ．，６，５６３−，１９９４）、ウシ（Ｓｉｍｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，６１４３−６１４７，１９９４）において報告され、さらにメダカ、ニワトリ等でも試みられている（トランスジェニック動物，蛋白質核酸酵素，１９９５年１０月号増刊，共立出版）。また、ヒツジにおいてはＥＳ様細胞（ＥＤ細胞）さらにはそれを１０代以上継代して得られる上皮様細胞由来の核を移植された未受精卵が正常に発生することが知られている（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，Ｎａｔｕｒｅ，３８０，６４−，１９９６）。これらＥＳあるいはＥＳ様細胞を受容細胞とした外来染色体移入によってマウスの場合と同様に外来染色体あるいはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物が作製可能である。
　また、本発明において、外来染色体あるいはその断片が移入される、分化多能性を保持する細胞は、前述のＥＳ細胞、ＥＣ細胞、ＥＧ細胞に限られるものではない。例えば、骨髄幹細胞に外来染色体あるいはその断片を移入することが可能であり、該骨髄幹細胞の生体への移植により、遺伝病等の治療を行うことが可能である。
　キメラ非ヒト動物において、外来染色体を保持するＥＳ細胞がその生殖細胞に分化した場合、生殖により得られる子孫にも導入染色体または断片が認められ、その子孫は導入された染色体または断片上の遺伝子を発現する。
　上記のようにして得られるキメラ非ヒト動物またはその子孫を利用して、外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現させ、その産物を回収することにより、生物学的に活性な物質を製造することができる。具体的には、キメラ非ヒト動物または子孫の個体を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で飼育し、その後発現産物を動物の血液、腹水などから回収することができる。あるいはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫の組織、細胞あるいはそれを不死化したもの（例えば、ミエローマ細胞との融合により不死化したハイブリドーマ）などを外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後発現産物を培養物から回収することができる。さらには、これらキメラ非ヒト動物またはその子孫の組織、細胞、あるいはそれを不死化したものから抽出した外来染色体あるいはその断片、または外来染色体またはその断片を構成するＤＮＡ、さらにはまた、キメラ非ヒト動物またはその子孫の組織、細胞、あるいはそれを不死化したものに保持された外来染色体あるいはその断片に由来するｃＤＮＡを動物細胞あるいは昆虫細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、肝ガン細胞、ミエローマ細胞、ＳＦ９細胞等）に導入し、該細胞を外来染色体またはその断片上の遺伝子を発現しうる条件下で培養し、その後発現産物（例えば、特定の抗原特異的な抗体蛋白質等）を培養物から回収することができる。発現産物は遠心分離などの公知の方法に従って回収することができ、さらに、硫安分画、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィーなどの公知の方法に従って精製することができる。生物学的に活性な物質は、外来染色体上にコードされているあらゆる物質を含み、例えば、抗体、特にヒト抗体などを挙げることができる。例えば、得られたキメラ動物の脾細胞あるいはそのハイブリドーマなどの不死化細胞から該染色体上のヒト抗体遺伝子をクローニングし、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）やミエローマ細胞に導入してヒト抗体を生産することができる（Ｌｙｎｅｔｔｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１１２１−，１９９２；Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，１６９−，１９９２）。
　本発明により得られるヒト２番、１４番、２２番染色体（断片）を保持するキメラマウス及びその子孫は、ヒト抗体重鎖（１４番染色体上）、軽鎖κ（２番染色体上）、軽鎖λ（２２番染色体上）それぞれの遺伝子の機能的配列の大部分を保持し得る。すなわち、酵母人工染色体等を用いてヒト抗体遺伝子の一部を導入した既知のトランスジェニックマウス（Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１３−，１９９４，Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−，１９９４等）と比較して、ヒトにおいて観察されるものにより近い、非常に多様なヒト抗体レパートリーを発現することが可能である。また、本発明により得られる２番＋１４番、２２番＋１４番等の染色体（断片）を同時に保持するキメラマウス及びその子孫、並びに、それらを交配することにより得られる２番＋１４番＋２２番等の染色体（断片）を同時に保持するマウス及びその子孫は、重鎖、軽鎖の両者がヒト由来である完全なヒト抗体を産生することが可能である。これらのマウスはヒト由来抗原に対してそれを異物とみなして免疫反応を起こし、抗原特異的ヒト抗体を産生することができる。この性質は治療用のヒトモノクローナル抗体、あるいはヒトポリクローナル抗体を得るために非常に有用である（Ｇｒｅｅｎら、前記、Ｌｏｎｂｅｒｇら、前記）。一方、特定の抗原に対して親和性の高いヒト抗体を得る効率を上げるためには、マウス抗体を産生せず、ヒト抗体のみを産生するマウスを作成することが望まれる（Ｇｒｅｅｎら、前記、Ｌｏｎｂｅｒｇら、前記）。本発明において、これは典型的には既知の手法を用いて以下の方法ＡあるいはＢにより達成される。
方法Ａ：マウス抗体欠損ＥＳ細胞およびマウス抗体欠損キメラ宿主胚を用いる方法。
方法Ｂ：ヒト染色体導入キメラマウスよりヒト染色体を保持する子孫を得てマウス抗体遺伝子を欠損するマウス系統との交配を行う方法。
　以下にＡ，Ｂそれぞれの方法の典型的な例について以下に具体的に記す。
方法Ａの具体的手順
１．マウスＥＳ細胞に２コピー存在するマウス抗体重鎖遺伝子の一方を標的遺伝子相同組み換え法（Ｊｏｙｎｅｒら，Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９３，ＩＲＬ　ＰＲＥＳＳ）を用いて破壊する。遺伝子破壊箇所には後に部位特異的組換えにより除去可能な配列、例えばｌｏｘＰ配列（Ｃｒｅレコンビナーゼにより組み換え、Ｓａｕｅｒら、前記、他にＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ配列を用いたＯ’Ｇｏｒｍａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１，１３５１−，１９９１の例がある）にはさまれたＧ４１８耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を挿入する。
２．一方の抗体重鎖遺伝子が破壊された上記薬剤耐性マウスＥＳ細胞を高濃度の薬剤存在下で培養し、高濃度薬剤耐性となった株を選抜する。これらの株をスクリーニングすることにより両方の抗体重鎖遺伝子が破壊された株が得られる（相沢慎一、前記）。
３．２．で得られた両方の抗体重鎖遺伝子が破壊されたマウスＥＳ細胞に１．で薬剤耐性遺伝子の両側に挿入した組換え配列の間で部位特異的組み換え反応を起こす酵素遺伝子、例えばＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子（Ｓａｕｅｒら、前記）を一時的に導入し、ｌｏｘＰ配列の間で組み換え反応が起こって両方の抗体重鎖遺伝子に挿入された薬剤耐性遺伝子が除去された薬剤感受性株を選抜する（高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、ｐ２５５−、１９９５、羊土社）。
４．マウス抗体軽鎖κ遺伝子ついて上記１〜３の過程を繰り返し、最終的に抗体重鎖及びκ鎖を完全に欠損した薬剤感受性株を取得する。
５．４の株（抗体重鎖、κ鎖欠損マウスＥＳ細胞）を受容細胞としたミクロセル融合により、薬剤耐性マーカー（例えばＧ４１８耐性遺伝子）でマーキングされたヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト１４番染色体（断片）を導入する。
６．５で得られた株を受容細胞としたミクロセル融合により、５とは異なる薬剤耐性マーカー（例えばピューロマイシン耐性遺伝子）でマーキングされたヒト抗体軽鎖遺伝子を含むヒト２番染色体（断片）あるいは２２番染色体（断片）またはその両者を導入する。
７．自らの抗体を産生することができないマウス系統（例えばＲＡＧ−２ノックアウトマウス、Ｓｈｉｎｋａｉら，Ｃｅｌｌ，６８，８５５−，１９９２、膜型μ鎖ノックアウトマウス、Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−，１９９１）から得た胚を宿主胚として６で得られたＥＳ細胞とのキメラマウスを作成する。
８．得られるキメラマウスにおいてほとんどの機能的なＢリンパ球はＥＳ細胞に由来する（高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、ｐ２３４−、羊土社、１９９５）。このＢリンパ球においてはマウス重鎖、κ鎖が欠損しているため、主として導入染色体上の機能的なヒト抗体遺伝子よりヒトの抗体のみが産生される。
方法Ｂの具体的手順
１．ヒト抗体重鎖、軽鎖κまたは軽鎖λを含むヒト染色体あるいはその断片を保持するキメラマウスからそれらを安定に保持する継代可能な子孫を得る。
２．１．で得られたヒト抗体重鎖または軽鎖を発現するマウス系統あるいはそれらの交配により得られたヒト抗体重鎖および軽鎖の両者を発現するマウス系統と自らの抗体遺伝子が欠損しているマウス系統（例えば膜型μ鎖ノックアウトマウス、前記、軽鎖κノックアウトマウス、Ｃｈｅｎら、ＥＭＢＯ　Ｊ．，３，８２１−，１９９３）との交配により、マウス抗体重鎖、及び軽鎖κの欠損についてホモ接合体であり、なおかつヒト抗体重鎖（１４番）＋軽鎖κ（２番）、抗体重鎖（１４番）＋軽鎖λ（２２番）あるいはヒト抗体重鎖（１４番）＋軽鎖κ（２番）＋軽鎖λ（２２番）を含むヒト染色体を保持するマウス系統を得る。このマウス系統においてはマウス抗体重鎖、軽鎖κ遺伝子が欠損しているため、主として導入染色体上の機能的なヒト抗体遺伝子よりヒトの抗体のみが産生される。
　なお、上記のＡおよびＢの方法は、ヒト抗体のみならず、外来染色体上に存在するあらゆる遺伝子の産物を効率的に得るために、用いることができる。
　以下に実施例を示して具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでない。
（実施例１）Ｇ４１８耐性標識されたヒト染色体（断片）を保持する染色体供与細胞の作製
　Ｇ４１８耐性遺伝子を含むプラスミドｐＳＴｎｅｏＢ（Ｋａｔｏｈら、Ｃｅｌｌ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．，１２：５７５，１９８７；Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（ＪＣＲＢ），Ｄｅｐｏｓｉｔ　Ｎｕｍｂｅｒ：ＶＥ０３９）を制限酵素Ｓａｌｌ（宝酒造）で線状化し、ヒト正常繊維芽細胞ＨＦＬ−１（ＲＩＫＥＮ　Ｃｅｌｌ　Ｂａｎｋより入手、ＲＣＢ０２５１）へ導入した。ＨＦＬ−１細胞をトリプシン処理し、５ｘ１０６個／ｍｌとなるようにダルベッコのリン酸バッファー（ＰＢＳ）に懸濁してから１０μｇＤＮＡ存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーションを行なった（石田ら，細胞工学実験操作入門，講談社，１９９２）。２５μＦの容量で１０００Ｖの電圧を４ｍｍ長のエレクトロポレーションセル（１６５−２０８８、バイオラッド）を用いて室温で印加した。エレクトロポレーションした細胞を１５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したイーグルＦ１２培地（以下Ｆ１２、という）を含む１００ｍｍ組織培養用プラスチックシャーレ（コーニング）３〜６枚に播種した。１日後に２００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ，シグマ）を含む１５％ＦＢＳを添加したＦ１２培地と置き換えた。２〜３週間後に生じたコロニー１００個程度を一つの集団として５２グループにそれぞれまとめ、１００ｍｍシャーレに再び播種し培養した。
　マウスＡ９細胞（Ｏｓｈｉｍｕｒａ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，９３：５７，１９９１，ＪＣＲＢ０２１１）を１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（以下ＤＭＥＭ、という）中、１００ｍｍシャーレで培養した。５２グループのＧ４１８耐性ＨＦＬ−１細胞を１５％牛胎児血清（ＦＢＳ）と２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したＦ１２中で、それぞれ１００ｍｍシャーレで培養した。マウスＡ９細胞とＨＦＬ−１細胞をトリプシン処理後それぞれ四分の一から半分量ずつ混合し、１００ｍｍシャーレに播種し１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭと１５％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＦ１２との等量混合物中で半日から一日培養した。細胞融合は（清水ら，細胞工学ハンドブック，羊土社，ｐ．１２７−，１９９２）に記述されている方法に従った。ＤＭＥＭで細胞表面を２回洗った後、２ｍｌのＰＥＧ（１：１．４）溶液で１分間処理し、さらに、２ｍｌのＰＥＧ（１：３）溶液に換え１分間処理した。ＰＥＧ溶液を吸い取り、無血清培地（ＤＭＥＭ）で３回洗った後、通常の培地（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）で１日間培養した。細胞をトリプシン処理により分散し、ウワバイン（１ｘ１０−５Ｍ，シグマ）およびＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む二重選択培地（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に懸濁し、１００ｍｍシャーレ３枚に播種した。約３週間培養した後、生じたコロニーをトリプシン処理により細胞を分散しＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）で培養した。
　トリプシン処理により細胞を分散し２グループを一つにまとめて、６本の２５ｃｍ２遠心用フラスコ（コースター、３０２５）にて細胞密度が７０〜８０％飽和程度まで培養した。コルセミド（０．０５μｇ／ｍｌ，デメコルシン，和光純薬）を含む培養液（２０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）に変換し、２日間培養しミクロセルを形成させた。培養液を除去し、予め保温（３７℃）しておいたサイトカラシンＢ（１０μｇ／ｍｌ，シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル製遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、３４℃、８０００ｒｐｍ，１時間の遠心を行なった。ミクロセルを無血清培地に懸濁し、フィルターで濾過し精製した。マウスＡ９細胞を８０％飽和の状態まで培養した２５ｃｍ２フラスコに精製した微小核を加えＰＥＧ溶液で融合させた。Ｇ４１８を含む選択培地で培養しコロニーを単離した。各クローンが保持するヒト染色体（２番、４番、１４番、２２番）は以下の通り同定した。上記以外のすべての実験操作及び試薬等は〈清水ら、細胞工学ハンドブック、羊土社、ｐ．１２７−〉に従った。
（１）ＰＣＲ解析
　単離した細胞を培養し、細胞からＰｕｒｅｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ　Ｓｙｓｔｅｍ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、このゲノムＤＮＡを鋳型とし、ヒト染色体特異的なプライマーを用いてＰＣＲ法で２、４、１４、２２番ヒト染色体を保持するクローンを選抜した。ＰＣＲ増幅は約０．１μｇのゲノムＤＮＡを使用し（Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ実験マニュアル，ＨＢＪ出版局，１９９１，サーマルサイクラーはＧｅｎｅＡｍｐ９６００，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社を使用）に従い行なった。ＴａｑポリメラーゼはＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製を用い、反応条件は、９４℃５分を１サイクル行なった後、変性９４℃１５秒、アニーリング５４〜５７℃１５秒（プライマーにより適宜変更）、伸長７２℃２０秒を３５サイクル行なった。プライマーは各染色体上に存在する遺伝子（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋ５，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３）及び多型性マーカー（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＳＴＳ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐａｉｒ，ＢＩＯＳ社；Ｗｅｉｓｓｅｎｂａｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ３５９：７９４，１９９２；Ｗａｌｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：２２，１９９４等）を用いた。遺伝子プライマーはＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した。多型性プライマーの名称及び、遺伝子プライマーの配列はそれぞれの染色体について以下の実施例で示した（２番：実施例１、４番：実施例６、１４番：実施例９、２２番：実施例２）。２番染色体の同定には以下に示す遺伝子マーカー及び多型性マーカー（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＳＴＳ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐａｉｒ，ＢＩＯＳ社：Ｄ２Ｓ２０７，Ｄ２Ｓ１７７，Ｄ２Ｓ１５６，Ｄ２Ｓ１５９　ＢＩＯＳ社）を用いた。
（２）フルオレッセンス　インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（松原ら，ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト２番、４番、１４番、２２番染色体特異的プローブ（ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ　ＰＡＩＮＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ，Ｃａｍｂｉｏ社）を用いて行なった。
　例えば、２番染色体を保持するクローンは２６グループ（７４５クローン）中１０グループに１個以上のクローンを得た。このうち用いた２番染色体特異的なプライマーすべてに陽性であったのは５クローンだった。これらのクローンをＦＩＳＨ解析した。ＦＩＳＨ解析は（松原ら，ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に記された方法に従い、ヒト２番染色体特異的プローブ（ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ　ＰＡＩＮＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ，ＣＡＮＢＩＯ社）を用いて行なった。すべてのプライマーに陽性な細胞ではヒト２番染色体がほぼ完全な形で観察され、１部のプライマーのみ陽性なクローンのうちいくつかのクローンではヒト２番染色体よりも小さな独立染色体が観察され、あるいはヒト２番染色体以外の染色体と融合しているような形の染色体を持つ細胞も観察された（第１図）。第１図において、横列がクローン名、縦列はＰＣＲに使用したプライマーを示す。●は陽性を、×は陰性を示した。また、ＦＩＳＨにより観察されたヒト２番染色体の存在形態を最下行に示した。記載のないものは実施していない。
　同様にして、ヒト４番、１４番、２２番染色体を保持するＡ９細胞を得た。
（実施例２）マウスＥＳ細胞へのミクロセル法によるヒト２２番染色体導入
　染色体供与細胞として、（実施例１）で得られたヒト２２番染色体を保持するマウスＡ９細胞株（以下Ａ９／＃２２、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウスＥＳ細胞株Ｅ１４（Ｍａｒｔｉｎ　Ｌ．Ｈｏｏｐｅｒより入手、Ｈｏｏｐｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，３２６：２９２，１９８７）を用いた。Ｅ１４の培養法は〈相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５〉に記された方法に従い、栄養細胞としては、マイトマイシンＣ（シグマ）処理したＧ４１８耐性ＳＴＯ細胞株（大阪大学、近藤寿人教授より入手）を用いた。まず清水ら（細胞工学ハンドブック、羊土社、１９９２）の報告した方法に従い、約１０８個のＡ９／＃２２からミクロセルを調製した。得られたミクロセルは全量を５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した。約１０７個のＥ１４をトリプシンで分散させた後、ＤＭＥＭで３回洗浄し、５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁した後、ミクロセルとあわせ、１２５０ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を除いた。沈殿をタッピングによりよくほぐし、１：１．４ＰＥＧ溶液（５ｇ　ＰＥＧ１０００，〈和光純薬〉，１ｍｌ　ＤＭＳＯ〈シグマ〉を６ｍｌ　ＤＭＥＭに溶解）０．５ｍｌを加えて室温で１分３０秒静置した後、１０ｍｌのＤＭＥＭをゆっくりと加えた。直ちに１２５０ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を除き、沈殿を３０ｍｌのＥＳ細胞用培地に懸濁し、あらかじめ栄養細胞をまいた直径１００ｍｍの組織培養プラスチックシャーレ（コーニング）３枚に播種した。２４時間後に３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ，シグマ）を加えた培地と交換し、その後毎日培地交換を行なった。１週間〜１０日後には薬剤耐性コロニーが出現する。その出現頻度はＥ１４細胞１０７個あたり０〜５個であった。そのコロニーをピックアップし増殖させ、５×１０６個あたり１ｍｌの保存用培地（ＥＳ細胞用培地＋１０％ＤＭＳＯ〈シグマ〉）に懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。同時に各薬剤耐性株について１０６〜１０７個の細胞からゲノムＤＮＡをＰｕｒｅｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ　Ｓｙｓｔｅｍ社）により調製した。
　ヒト２２番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった（Ｋｏｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：３６１，１９９３）。約１０８個のＡ９／＃２２より取得したミクロセルを５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、ガンマセル４０（カナダ原子力公社製）により、氷上で６０Ｇｙのガンマ線を照射した（１．２Ｇｙ／分×５０分）。ガンマ線照射したミクロセルは未照射ミクロセルと同様に融合、薬剤耐性株選抜を行なった結果、薬剤耐性株の出現頻度はＥ１４細胞１０７個あたり１〜７個であった。薬剤耐性株については未照射の場合と同様にして凍結保存、ＤＮＡ取得を行なった。
　未照射ミクロセル薬剤耐性株Ｅ１４／＃２２−９、Ｅ１４／＃２２−１０、ガンマ線照射ミクロセル薬剤耐性株Ｅ１４／＃２２−１４、Ｅ１４／＃２２−２５における導入染色体の保持は以下の（１）〜（３）により確認した。
（１）ＰＣＲ解析（第２図）
　薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２２番染色体上に存在する遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，前記）及び多型性マーカー（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＳＴＳ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐａｉｒ，ＢＩＯＳ社：Ｄ２２Ｓ３１５，Ｄ２２Ｓ２７５，Ｄ２２Ｓ２７８，Ｄ２２Ｓ２７２，Ｄ２２Ｓ２７４；Ｎａｔｕｒｅ３５９：７９４，１９９２）の存在をＰＣＲ法により検出した。ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した遺伝子プライマーオリゴヌクレオチドの配列を記す。
　約０．１μｇのゲノムＤＮＡを鋳型として上記の１０種のプライマーについてＰＣＲ増幅（Ｉｎｎｉｓら，前記）を行なった。その結果、未照射の２株は全てのプライマー、ガンマ線照射した２株については一部のプライマーについて期待される長さの増幅産物が検出された。以上の結果を第２図に示す。第２図において、左側にヒト２２番染色体のＧバンド像に基づく模式的な染色体地図、また、位置が明らかになっているいくつかのマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，ＧＥＮＥＴＩＣ　ＭＡＰＳ，６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢＯＯＫ５等）。遺伝子及び多型性マーカーの並び方は、現在までに入手出来る情報（Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＨＵＭＡＮ　ＧＥＮＥＴＩＣ　ＭＡＰ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：２２，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ３５９：７９４，１９９２等）を基に、大まかな位置関係を示したもので、順序は必ずしも正確ではない。４種のＧ４１８耐性Ｅ１４細胞株について、ＰＣＲにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは■で、検出されなかったマーカーを□で示した。下側にはＦＩＳＨ解析による観察結果を示した。Ａ９／＃２２は、染色体供与細胞である。
（２）サザンブロット解析
　サザンブロット解析はヒト特異的な繰り返し配列であるＬ１配列（ハプロイドゲノム当たり１０４〜１０５コピー存在、ＲＩＫＥＮ　ＤＮＡ　Ｂａｎｋより入手、Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３；７８１３，１９８５，ｐＵＫ１９Ａ由来１．４ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片）をプローブとして、制限酵素（ＢｇｌＩＩ、宝酒造製）処理を行なった約２μｇのゲノムＤＮＡに対して〈Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９４〉に記された方法に従い行なった。その結果、各薬剤耐性株ＤＮＡにおいてヒトＬ１配列とハイブリダイズするバンドが多数検出された。未照射の２株についてはそのパターン及び、各バンドの濃度から推定できるヒト染色体ＤＮＡのマウスゲノムＤＮＡに対する量比はＡ９／＃２２のそれと同等であった。ガンマ線照射株の全体のシグナル強度はＡ９／＃２２と比較した場合、ＰＣＲ解析で示された欠失の程度と相関していた。
（３）フルオレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（松原ら，ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）に記された方法に従い、ヒト２２番染色体特異的プローブ（ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ　ＰＡＩＮＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ，Ｃａｍｂｉｏ社）を用いて行なった。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて、Ｅ１４／＃２２−９はマウス染色体に転座した形で、他の３株は独立した染色体としてヒト２２番染色体が検出された。
　以上の実験により、得られたＧ４１８耐性株Ｅ１４／＃２２−９、Ｅ１４／＃２２−１０はヒト２２番染色体の全てあるいは大部分を、Ｅ１４／＃２２−１４、Ｅ１４／＃２２−２５はその部分断片を保持することが確かめられた。
（実施例３）ヒト２２番染色体を保持するＥＳ細胞からのキメラマウス作製
　一般的なマウス胚取得、培養、ＥＳ細胞の胚への注入、仮親子宮への移植等の手技については、〈相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５〉に記された方法に従った。（実施例２）で得られ、ヒト２２番染色体を保持していることが確認されたＧ４１８耐性ＥＳ細胞株Ｅ１４／＃２２−９を凍結ストックより立ち上げ、Ｃ５７ＢＬ／６×Ｃ３Ｈ　Ｆ１雌マウス（日本クレア社）をＣ３Ｈ雄マウス（日本クレア社）と交配することにより取得した胚盤胞期胚に胚あたり１０〜１５個注入した。偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のＥＳ細胞注入胚を移植した。その結果を（第１表）に示す。
　計１６６個の注入胚を移植した結果２９匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚由来の野生色（濃茶）の中にＥ１４細胞由来の薄灰色が認められるかどうかにより判定される。誕生した２９匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部分のある、すなわち、Ｅ１４細胞の貢献の認められる個体は１６匹であった。また、最高の貢献率はＫ２２−２２における約４０％であった。
　この結果より、ヒト２２番染色体を保持するマウスＥＳ細胞株Ｅ１４／＃２２−９はキメラ形成能、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例４）ヒト２２番染色体を保持するＥＳ細胞由来キメラマウス各組織におけるヒト染色体ＤＮＡの保持確認
　（実施例３）の毛色による判定に加えて、尻尾より調製したゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ解析により、導入染色体の保持を確認した。誕生後３週以上を経たキメラマウスから〈勝木元也，発生工学実験マニュアル，講談社サイエンティフィク，１９８７〉に記された方法に従い尻尾を取得し、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔを用いてゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡを鋳型として（実施例２）で使用した多型性プライマーのうちＰＶＡＬＢ、Ｄ２２Ｓ２７８を用いて増幅産物の確認を行なった。毛色に貢献の見られた個体のうち１０匹について解析を行った結果、全ての個体において少なくともいずれかのプライマーによる増幅産物が確認された。
　サザン解析は（実施例２）と同様に、ヒトＬ１配列をプローブとして用い、６個体のキメラマウス、１個体の非キメラマウスの２μｇの尻尾ゲノムＤＮＡに対して行なった。その結果、全てのキメラ個体において多数のヒトＬ１配列の存在が認められ、そのパターンはＥ１４／＃２２−９と類似していた。マウスゲノムに対する量比は最も多いもので１０％程度であった（第３図）。第３図において、各レーンとも、ＢｇｌＩＩ消化した２μｇのゲノムＤＮＡを使用した。３２Ｐ標識ヒトＬ１配列をプローブとし、シグナルはイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フイルム社）により検出した。右より、キメラマウス（Ｋ２２−６，７，８，９，１０，１１，１２：９は非キメラ）の尻尾由来ゲノムＤＮＡおよびコントロールＤＮＡ（Ｃ：Ｃは、Ｅ１４／＃２２−９とＥ１４ゲノムＤＮＡを１：９の重量比で混合したもの）のレーンである。左側にＤＮＡ分子量、右側に各キメラ個体のキメラ率を示した。（−：０％、＋：〜１０％、＋＋：１０〜３０％）
　さらに、毛色に５％程度の貢献の見られたキメラ個体（Ｋ２２−７）について脳、肝臓、筋肉、心臓、脾臓、胸腺、卵巣、腎臓からＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）によりゲノムＤＮＡを取得し、それぞれの組織について、（実施例２）で使用した遺伝子プライマーのうちＭＢ、ＤＩＡ１を用いてＰＣＲ解析を行なった。その結果２つのプライマーとも全ての組織において期待される増副産物が確認された。ＤＩＡ１プライマーによる結果を（第４図）に示す。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、臭化エチジウム染色して検出した。第４図の各レーンは左からＢ：脳、Ｌ：肝臓、ＳＭ：骨格筋、Ｈ：心臓、Ｓｐ：脾臓、Ｔｈ：胸腺、Ｏｖ：卵巣、Ｋ：腎臓、ｎｃ：非キメラマウス尻尾ＤＮＡ（陰性コントロール）、ｐｃ：ヒト繊維芽細胞（ＨＦＬ−１）ＤＮＡ（陽性コントロール）を示す。
　これらの結果より、Ｅ１４／＃２２−９はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、かつヒト２２番染色体を保持していることが確かめられた。
（実施例５）ヒト２２番染色体を保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおけるヒト遺伝子の発現
　ヒト遺伝子発現確認のための試料としては、毛色に５％程度の貢献の見られた個体（Ｋ２２−７）の尻尾を液体窒素にて凍結後粉砕したものを用いた。これは皮膚、骨、筋肉、血液等の組織の混合したものである。これよりＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を使用して総ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ法により、ヒト−ミオグロビン（ＭＢ）、ヒト−チトクロームｂ５レダクターゼ（ＤＩＡ１）のｍＲＮＡの検出を行なった。ＲＴ−ＰＣＲは〈Ｉｎｎｉｓら，ＰＣＲ実験マニュアル，ＨＢＪ出版局，１９９１〉に記された方法に従って行なった。逆転写反応用プライマーは、ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチド（終濃度１００ｐｍｏｌ、宝酒造製）を、逆転写酵素はＢＲＬ社製（スーパースクリプト）を使用した。ｃＤＮＡを鋳型とした増幅に用いたプライマーを記す。
　その結果、両遺伝子のｍＲＮＡに特異的な増幅産物が検出された（第５図）。ＲＴ−ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、臭化エチジウム染色して検出した。第５図において、Ｍはマーカー（ＨｉｎｄＩＩＩ消化λＤＮＡ＋ＨａｅＩＩＩ消化φＸ１７４ＤＮＡ，宝酒造）、ＭＢはヒトミオグロビン、ＤＩＡ１はヒトチトクロームｂ５レダクターセ、ＷＴは野生型Ｃ３Ｈマウスを示す。
　さらに同じ個体（Ｋ２２−７）について、脳、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓、卵巣、骨格筋からＩＳＯＧＥＮを使用して総ＲＮＡを抽出し、上記の２種のプライマーにより各臓器のＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＤＩＡ１は全ての臓器で、ＭＢは心臓と骨格筋のみで期待される増幅産物が確認された（第６図）。ミオグロビンは筋細胞特異的に発現することが知られており（Ｂａｓｓｅｌ−Ｄｕｂｙら，ＭＣＢ，１２：５０２４，１９９２）、この結果は導入したヒト染色体上の遺伝子がマウス個体で正常な組織特異的発現制御を受け得ることを示している。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、臭化エチジウム染色して検出した。第６図において、各レーンは左からＢ：脳、Ｈ：心臓、Ｔｈ：胸腺、Ｌ：肝臓、Ｓｐ：脾臓、Ｋ：腎臓、Ｏｖ：卵巣、ＳＭ：骨格筋、Ｍ：マーカー（上記）を示す。ＭＢの結果において観察される下方のバンドは非特異的産物と考えられる。
　すなわち、導入されたヒト２２番染色体はキメラマウスの正常組織において機能し得ることが確かめられた。
（実施例６）ヒト４番染色体またはその部分断片のＥＳ細胞への導入
　染色体供与細胞として、（実施例１）で得られたヒト４番染色体を保持するマウスＡ９細胞株（以下Ａ９／＃４、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウスＥＳ細胞株Ｅ１４（実施例２と同様）を用いた。ミクロセル融合実験およびＧ４１８耐性株の選択は（実施例２）と同様に行なった。薬剤耐性株の出現頻度はＥ１４細胞１０７個あたり１〜２個であった。薬剤耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。薬剤耐性株Ｅ１４／＃４−４、Ｅ１４／＃４−７、Ｅ１４＃４−１１におけるヒト４番染色体またはその断片の保持は以下の（１）〜（３）により確認した。
（１）ＰＣＲ解析（第７図）
　薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト４番染色体上に存在する遺伝子（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋ５，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３）及び多型性マーカー（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＳＴＳ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐａｉｒ　ＢＩＯＳ社：Ｄ４Ｓ３９５，Ｄ４Ｓ４１２，Ｄ４Ｓ４２２，Ｄ４Ｓ４１３，Ｄ４Ｓ４１８，Ｄ４Ｓ４２６，Ｆ１１；Ｎａｔｕｒｅ３５９：７９４、１９９２）の存在をＰＣＲ法により検出した。ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した遺伝子プライマーオリゴヌクレオチドの配列を記す。
　上記の１１種のプライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、３株共に、全て、あるいは一部のプライマーについて期待される増幅産物が確認された。Ｅ１４／＃４−４、Ｅ１４／＃４−７株のように一部領域に欠失がみられるものもあった。以上の結果を第７図に示す。第７図において、左側にヒト４番染色体のＧバンド像に基づく模式的な染色体地図、また、位置が明らかになっているいくつかのマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した（実施例２参照）。遺伝子及び多型性マーカーの並び方は、現在までに入手出来る情報（実施例２参照）を基に、大まかな位置関係を示したもので、順序は必ずしも正確ではない。３種のＧ４１８耐性Ｅ１４細胞株について、ＰＣＲにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは■で、検出されなかったマーカーを□で示した。下側にはＦＩＳＨ解析による観察結果を示した。Ａ９／＃４は染色体供与細胞を示す。
（２）サザンブロット解析（第８図）
　サザンブロット解析は（実施例２）と同様に、Ｅ１４／＃４−４、Ｅ１４／＃４−７より取得したゲノムＤＮＡについてヒトＬ１配列をプローブとして行なった。その結果、両株ＤＮＡにおいてヒトＬ１配列とハイブリダイズするバンドが多数検出された。Ａ９／＃４と比較して、全体のシグナル強度はＰＣＲ解析で示された欠失の程度と相関していた。第８図において、各レーンとも、ＢｇｌＩＩ消化した２μｇのゲノムＤＮＡを使用した。３２Ｐ標識ヒトＬ１配列をプローブとし、シグナルはイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フイルム社）により検出した。第８図において、各レーンは、左から、１：Ａ９＃４、（染色体供与細胞）、２：Ａ９１＃４＋Ａ９（１：２）、３：Ａ９／＃４＋Ａ９（１：９）、４：Ａ９、５：Ｅ１４／＃４−７、６：Ｅ１４／＃４−４を示す。２、３は２種のＤＮＡを括弧内に示した比率で混合したものである。左側にＤＮＡ分子量を示した。
（３）フルオレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（実施例２）と同様に、ヒト４番染色体特異的プローブ（ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ　ＰＡＩＮＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ，Ｃａｍｂｉｏ社）を用いて行なった。その結果、３株すべてのほとんどの分裂像において、ヒト４番染色体あるいはその部分断片が検出された。Ｅ１４／＃４−４はマウス染色体に転座した形で、他の２株は独立した染色体として存在していた。観察されるヒト染色体の相対的な大きさは、ＰＣＲ解析の結果から推測されるそれと一致していた。
　以上の実験により、得られたＧ４１８耐性株はヒト４番染色体の全てあるいはその部分断片を保持することが明かとなった。
（実施例７）ヒト４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞からのキメラマウス作製
　ヒト４番染色体部分断片を保持していることが確認されたＧ４１８耐性ＥＳ細胞株Ｅ１４／＃４−４、Ｅ１４／＃４−７を凍結ストックより立ち上げ、（実施例３）と同様にして取得した胚盤胞期胚に胚あたり１０〜１５個注入した。偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のＥＳ細胞注入胚を移植した。その結果を（第２表）に示す。
　計２４０個の注入胚を移植した結果１３匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚由来の野生色（濃茶）の中にＥ１４細胞由来の薄灰色が認められるかどうかにより判定される。誕生した１３匹のうち毛色に明らかに薄灰色の部分のある、すなわち、Ｅ１４細胞の貢献の認められる個体は７匹であった。また、最高の貢献率はＥ１４／＃４−７由来の１個体において約１５％であった。
　この結果より、ヒト４番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株Ｅ１４／＃４−４、Ｅ１４／＃４−７はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例８）ヒト４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおけるヒト染色体ＤＮＡの保持及び、Ｇ４１８耐性遺伝子の発現確認
（１）ＰＣＲ解析
　（実施例７）で得られたキメラマウスのうちＥ１４／＃４−７由来の１個体（Ｋ＃４−７−１：キメラ率約５％）、Ｅ１４／＃４−４由来の１個体（Ｋ＃４−４−４１：キメラ率約５％）について（実施例４）と同様に尻尾よりゲノムＤＮＡを調製した。それを鋳型とし、（実施例６）で示した４番染色体解析用プライマーのうちＥ１４／＃４−７、Ｅ１４／＃４−４で検出された多型性マーカーＦ１１についてＰＣＲ解析を行なった。その結果、２個体とも期待される増幅産物が検出された。
（２）サザン解析（第９図）
　サザン解析は（実施例２）と同様、Ｅ１４／＃４−７由来の１個体（Ｋ＃４−７−１：キメラ率約５％）についてヒトＬ１配列をプローブとして用い、２μｇの尻尾由来ゲノムＤＮＡに対して行なった。その結果、多数のヒトＬ１配列の存在が認められ、そのパターンはＥ１４／＃４−７と類似していた。マウスゲノムに対する量比はＥ１４／＃４−７の約１０％程度であった。第９図において、各レーンとも、ＢｇｌＩＩ消化した２μの尻尾由来ゲノムＤＮＡを使用した。３２Ｐ標識ヒトＬ１配列をプローブとし、シグナルはイメージアナライザーＢＡＳ２０００（富士写真フイルム社）により検出した。左側にＤＮＡ分子量を示した。各レーンは左から１：Ｋ＃４−７−１、２：ブランク、３：Ｅ１４／＃４−７を示す。
（３）尻尾由来繊維芽細胞のＧ４１８耐性試験
　キメラマウスのうち、Ｅ１４／＃４−７由来の１個体（Ｋ＃４−７−１：キメラ率約５％）、Ｅ１４／＃４−４由来の１個体（Ｋ＃４−４−４１：キメラ率約５％）について尻尾から以下のように繊維芽細胞を調製した。ＤＮＡ調製（実施例４）と同様にキメラマウスの尻尾を５ｍｍ〜１０ｍｍ切断し、ＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡで数回洗浄した後、メスで切れ込みをいれて表皮を除去し、内部の組織をメスで細かく切り刻む。組織細片を５ｍｌのＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡをいれたチューブに移し、３０分〜１時間室温静置する。その後、１ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡを残して上清を取り除き、１ｍｌの０．２５％トリプシン／ＰＢＳを加え、５〜１０分間室温でタッピングあるいはピペッティングしながら組織をよくほぐす。１０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、沈殿を２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に懸濁し、３５ｍｍシャーレに播種する。７〜１０日の培養後、トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、シャーレあたり約１０４個の細胞を３５ｍｍシャーレ２枚に播種し、うち１枚に終濃度４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を加え、５〜７日間培養し、それぞれのシャーレの生細胞を観察する。この条件で、野生型ＩＣＲマウス由来の繊維芽細胞は、Ｇ４１８存在下でほぼ１００％死滅する。この結果、２個体共Ｇ４１８耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。
　これらの結果より、Ｅ１４／＃４−７、Ｅ１４／＃４−４はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、かつヒト４番染色体部分断片を保持していることが確認された。
（実施例９）マウスＥＳ細胞へのヒト１４番染色体またはその断片の導入
　染色体供与細胞として、（実施例１）で得られたヒト１４番染色体を保持するマウスＡ９細胞株（以下Ａ９／＃１４、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウスＥＳ細胞株ＴＴ２（ライフテックオリエンタル社より購入、Ｙａｇｉら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１４：７０，１９９３）を用いた。ＴＴ２の培養法は〈相沢慎一，バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５〉に記された方法に従い、栄養細胞はマイトマイシンＣ（シグマ）処理したＧ４１８耐性初代培養細胞（ライフテックオリエンタル社より購入）を用いた。ミクロセル融合実験およびＧ４１８耐性株の選択は（実施例２）と同様に行なった。薬剤耐性株の出現頻度はＴＴ２細胞１０７個あたり３〜６個であった。薬剤耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。
　ヒト１４番染色体の断片化はミクロセルにガンマ線照射することにより行なった（Ｋｏｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６０：３６１，１９９３）。約１０８個のＡ９／＃１４より取得したミクロセルを５ｍｌのＤＭＥＭに懸濁し、ガンマセル４０（前記）により、氷上で３０Ｇｙのガンマ線を照射した（１．２Ｇｙ／分×２５分）。ガンマ線照射したミクロセルを未照射ミクロセルと同様に融合、薬剤耐性株選抜を行なった結果、薬剤耐性株の出現頻度はＴＴ２細胞１０７個あたり３個であった。薬剤耐性株については（実施例２）と同様にして凍結保存、ＤＮＡ取得を行なった。
　ガンマ線未照射ミクロセル移入によるＧ４１８耐性株１−４、１−５、ガンマ線（３０Ｇｙ）照射ミクロセル移入によるＧ４１８耐性株３−１、３−２計４株におけるヒト１４番染色体または部分断片の保持は以下の（１）、（２）により確認した。
（１）ＰＣＲ解析（第１０図）
　薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト１４番染色体上に存在する遺伝子（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，６ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｏｏｋ５，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３）及び多型性マーカー（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ　ＳＴＳ　Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐａｉｒ　ＢＩＯＳ社：Ｄ１４Ｓ４３，Ｄ１４Ｓ５１，Ｄ１４Ｓ６２，Ｄ１４Ｓ６５，Ｄ１４Ｓ６６，Ｄ１４Ｓ６７，Ｄ１４Ｓ７２，Ｄ１４Ｓ７５，Ｄ１４Ｓ７８，Ｄ１４Ｓ８１，ＰＣＩ；Ｎａｔｕｒｅ３５９：７９４、１９９２；Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７：２２，１９９４）の存在をＰＣＲ法により検出した。ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した遺伝子プライマーオリゴヌクレオチドの配列を記す。
　薬剤耐性株４株のゲノムＤＮＡを鋳型として、上記の１８種のプライマーについて（実施例２）同様にＰＣＲ増幅を行なった結果、全て、あるいは一部のプライマーについて期待される増幅産物が確認された。ガンマ線照射したミクロセルを用いて得られた薬剤耐性株３−１、３−２は、１４番染色体の一部領域を欠失している傾向が認められた。また、未照射ミクロセルを用いた場合でも１−４株のごとく欠失がみられるものもあった。以上の結果を第１０図に示す。第１０図において、左側にヒト１４番染色体のＧバンド像に基づく模式的な染色体地図、また、位置が明らかになっているいくつかのマーカーについてはどのバンドに位置するかを示した（実施例２参照）。遺伝子及び多型性マーカーの並び方は、現在までに入手出来る情報（実施例２参照）を基に、大まかな位置関係を示したもので、順序は必ずしも正確ではない。４種のＧ４１８耐性ＴＴ２細胞株について、ＰＣＲにより期待される増幅産物が検出されたマーカーは■で、検出されなかったマーカーを□で示した。Ａ９／＃１４は染色体供与細胞である。右端には実施例１１（１）の結果が示されている。
（２）フルオレッセンスインサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（松原ら，ＦＩＳＨ実験プロトコール、秀潤社、１９９４）に記された方法に従い、ヒト１４番染色体特異的プローブ（ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ　ＰＡＩＮＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ，Ｃａｍｂｉｏ社）を用いて行なった。その結果、４株すべてについてほどんとの分裂像に、ヒト１４番染色体あるいはその部分断片が、独立した染色体として観察された。観察されるヒト染色体の相対的な大きさは、ＰＣＲ解析の結果から推測されるそれと一致していた。
　以上の実験により、得られたＧ４１８耐性株１−４、１−５、３−１、３−２はヒト１４番染色体の全てあるいはその部分断片を保持することが確かめられた。
（実施例１０）ヒト１４番染色体断片を保持するＥＳ細胞からのキメラマウス作製
　（実施例９）で得られ、ヒト１４番染色体断片を保持していることが確認されたＧ４１８耐性ＥＳ細胞株４株（１−４、３−１、３−２、１−５）を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲあるいはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり８〜１０個注入した。ＥＳ培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。その結果を（第３表）に示す。
　計４９４個の注入胚を移植した結果、６４匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した６４匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は８匹であった。また、最高の貢献率は１−４由来の１個体における約８０％であった。
　この結果より、ヒト１４番染色体またはその断片を保持するＧ４１８耐性ＥＳ細胞株（１−４、１−５、３−１、３−２）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例１１）ヒト１４番染色体断片を保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおけるヒト１４番染色体断片の保持確認
　（実施例１０）で得られたキメラマウスにおけるヒト１４番染色体部分断片の保持は以下の（１）〜（３）により確認した。
（１）各種組織由来ＤＮＡを用いたＰＣＲ解析キメラマウスのうち３−１由来の個体（Ｋ３−１−１：キメラ率約２５％）について（実施例４）と同様に尻尾よりゲノムＤＮＡを調製した。それを鋳型とし、（実施例９）で示した１４番染色体解析用プライマーのうち３−１で検出された１４種全てについてＰＣＲ解析を行なった。その結果、１４種すべてについて期待される増幅産物が検出された（第１０図）。
　さらに、同じ個体（Ｋ３−１−１）について脳、腎臓、脾臓、心臓、肝臓、胸腺からＰｕｒｅｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ＫｉｔによりゲノムＤＮＡを取得し、それぞれの組織について、ＩＧＭプライマー（実施例９）を用いたＰＣＲ解析を行なった。その結果全ての組織において期待される増幅産物が確認された（第１１図）。ＰＣＲ産物は２％アガロースゲルにて電気泳動した後、臭化エチジウム染色して検出した。第１１図において、各レーンは左からＢ：脳、Ｋ：腎臓、Ｓｐ：脾臓、Ｈ：心臓、Ｌ：肝臓、Ｔｈ：胸腺、ｐｃ：ヒト繊維芽細胞（ＨＦＬ−１）ＤＮＡ（陽性コントロール）、ｎｃ：非キメラマウス尻尾ＤＮＡ（陰性コントロール）、Ｍ：マーカー（ＨｉｎｄＩＩＩ消化λＤＮＡ＋ＨａｅＩＩＩ消化φＸ１７４ＤＮＡ，宝酒造）を示す。
（２）尻尾由来繊維芽細胞のＧ４１８耐性試験
　キメラマウスのうち、３−２由来の２個体（Ｋ３−２−１：キメラ率約２５％，Ｋ３−２−３：キメラ率約５０％）、１−４由来の１個体（Ｋ１−４−１：キメラ率約８０％）について尻尾から以下のように繊維芽細胞を調製した。ＤＮＡ調製（実施例４）と同様に３〜６週令のキメラマウスの尻尾を５ｍｍ〜１０ｍｍ切断し、ＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡで数回洗浄した後、メスで切れ込みをいれて表皮を除去し、内部の組織をメスで細かく切り刻む。組織細片を５ｍｌのＰＢＳ／１ｍＭ　ＥＤＴＡをいれたチューブに移し、３０分〜１時間室温静置する。その後、１ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡを残して上清を取り除き、１ｍｌの０．２５％トリプシン／ＰＢＳを加え、５〜１０分間室温でタッピングあるいはピペッティングしながら組織をよくほぐす。１０００ｒｐｍ，１０分間遠心し、沈殿を２ｍｌのＤＭＥＭ（１０％ＦＣＳ）に懸濁し、３５ｍｍシャーレに播種する。７〜１０日の培養後、トリプシン処理により細胞をシャーレからはがし、シャーレあたり約１０４個の細胞を３５ｍｍシャーレ４枚に播種し、うち２枚に４００μｇ／ｍｌのＧ４１８を加え、５〜７日間培養し、それぞれのシャーレの生胞数をカウントする。この条件で、野生型ＩＣＲマウス由来の繊維芽細胞は、Ｇ４１８存在下でほぼ１００％死滅する。非選択培地での生細胞数に対する選択培地での生細胞数の割合は、Ｇ４１８耐性繊維芽細胞の増殖速度が２つの条件で同等であると仮定すれば、Ｇ４１８耐性ＥＳ細胞株由来繊維芽細胞の繊維芽細胞集団における貢献率を反映していると考えられる。この結果、（第１２図）に示した通り、３個体共Ｇ４１８耐性の繊維芽細胞の存在が認められた。第１２図において、耐性率はそれぞれの個体について２組の選択／非選択３５ｍｍシャーレから得られた値を平均した。ＩＣＲは野生型ＩＣＲマウスを示す。
（３）尻尾由来Ｇ４１８耐性繊維芽細胞のＦＩＳＨ解析
　（実施例２）と同様な方法で、上記（２）で得られたＧ４１８耐性繊維芽細胞（Ｋ３−２−３，Ｋ１−４−１由来）のＦＩＳＨ解析を行なった。プローブはＨＦＬ−１細胞（実施例１）より抽出したヒト全ＤＮＡをＦＩＴＣ標識した（松原ら，ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）ものを用いた。その結果、２個体共、ほとんどの分裂像に独立したヒト染色部分断片が観察された。
　これらの結果より、ヒト１４番染色体部分断片を保持したＴＴ２細胞株はマウス個体において種々の正常組織に貢献し、かつヒト１４番染色体部分断片を保持していることが確かめられた。
（実施例１２）ヒト２番染色体部分断片のＥＳ細胞への導入
　染色体供与細胞として、（実施例１）で得られたヒト２番染色体部分断片を保持するマウスＡ９細胞Ｗ２３（以下Ａ９／＃２　Ｗ２３、という）を用いた。染色体受容細胞としてはマウスＥＳ細胞株ＴＴ２（実施例９）を用いた。ミクロセル融合実験およびＧ４１８耐性株の選択は（実施例２）と同様に行なった。薬剤耐性株の出現頻度はＴＴ２細胞１０７個あたり１〜３個であった。薬剤耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。薬剤耐性株５−１、５−２、５−３におけるヒト２番染色体部分断片の保持は以下の（１）、（２）により確認した。
（１）ＰＣＲ解析
　薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２番染色体上に存在する遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，前記）のうち、染色体供与細胞Ａ９／＃２　Ｗ２３において検出されたＣκ、ＦＡＢＰ１の存在をＰＣＲ法により検出した。
　各プライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、３株共に、両方のプライマーについて期待される増幅産物が確認された。
（２）フルオレッセンスｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（実施例２）と同様な方法で、ヒト２番染色体特異的プローブ（ＣＨＲＯＭＯＳＯＭＥ　ＰＡＩＮＴＩＮＧ　ＳＹＳＴＥＭ，Ｃａｍｂｉｏ社）を用いて行なった。その結果、３株すべてのほとんどの分裂像において、ヒト２番染色体部分断片が独立した染色体として検出された。その大きさはＡ９／＃２　Ｗ２３で観察されたものと同等であった。
　以上の実験により、得られたＧ４１８耐性株はヒト２番染色体部分断片を保持することが確かめられた。
（実施例１３）ヒト２番染色体断片を保持するＥＳ細胞からのキメラマウス作製
　（実施例１２）で得られ、ヒト２番染色体部分断片を保持していることが確認されたＧ４１８耐性ＥＳ細胞株５−１を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲあるいはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり１０〜１２個注入した。ＥＳ培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。
　キメラ作製の結果を（第４表）に示す。
　計２６４個の注入胚を移植した結果、５１匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した５１匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は１８匹であった。また、最高の貢献率は約８０％であった。
　この結果より、ヒト２番染色体部分断片を保持するＧ４１８耐性ＥＳ細胞（５−１）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例１４）ヒト１４番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒト抗体重鎖の検出
　血清中のヒト抗体濃度をエンザイムリンクドイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。ＥＬＩＳＡは以下に記載されている方法に従った。富山・安東、単クローン抗体実験マニュアル、講談社、１９８７；安東・千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社、１９９１；石川、超高感度酵素免疫測定法、学会出版センター、１９９３；Ｅｄ　Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｄ　Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；Ａ．Ｄｏｙｌｅ　ａｎｄ　Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｅｌｌ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｌｔｄ．，１９９６。これらの文献に記載の方法を参考にして、測定系によっては反応時間や温度を４℃で終夜行うなどの改良を行った。測定しようとするヒト免疫グロブリンに対する抗体あるいは抗原を、０．５から１０μｇ／ｍｌ程度に（１００から５０００倍）に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩コーティングした。血清試料の測定では、ブロッキング、試料および標識抗体の希釈に５％マウス血清（シグマ、Ｍ５９０５）を添加したＰＢＳを、ハイブリドーマ培養上清の測定には１％牛胎児血清を添加したＰＢＳを用いた。２０倍にキメラマウス血清を希釈する場合にはＰＢＳを用いて希釈した。コーティングしたプレートを洗浄した後、ブロッキングを１時間以上行った。プレートを洗浄後、試料を加え３０分以上インキュベートした。プレート洗浄後１００から５０００倍に希釈した酵素標識抗ヒト免疫グロブリン抗体を加えて、１時間以上インキュベートした後、プレートを洗浄し基質液を加えて発色させた。また測定系によって、基本的には同じ操作で、ビオチン標識した抗体を用い、プレート洗浄後これにアビジン−酵素複合体を加えてインキュベートした後洗浄し基質液を加えた。マイクロプレートリーダー（バイオテック、ＥＬ３１２ｅ）で吸光度を測定した。
　生後２９日から３５日のキメラマウス（実施例１０、Ｋ３−１−２，Ｋ３−２−２，Ｋ３−２−３）より採血しＥＬＩＳＡで解析した。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈した抗ヒトＩｇＭマウスモノクローナル抗体（シグマ，Ｉ６３８５）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、マウス血清（シグマ、Ｍ５９０５）を加えたＰＢＳで希釈した血清試料を加えた。次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（Ｔａｇｏ，２３９２）を加えてインキュベートした後、ＡＢＴＳ基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，５０６２００）の添加により酵素活性を４０５ｎｍの吸光度で評価した。精製されたヒトＩｇＭ抗体（オルガノン・テクニカ，６００１−１５９０）またはヒトＩｇＧ抗体（シグマ，Ｉ４５０６）を標準とした。標準はマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。またヒトＩｇＧ測定には抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（シグマ，Ｉ３３８２）をプレートに固定し、ペルオキシダーゼ標準抗ヒトＩｇＧヤギ抗体（シグマ，Ａ０１７０）で検出した。その結果を（第５表）に示す。ヒトＩｇＭとＩｇＧは共に検出された。
　また生後２７日、３４日、４１日の３回にわたりヒト１４番染色体断片を保持したキメラマウス（実施例１０、Ｋ３−１−１，Ｋ３−２−１）に、ＰＢＳに溶解したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ，シグマ，Ａ３７８２）２ｍｌをアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，ＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｈｅｍ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｉｎｃ．）と混合しその０．２５ｍｇ／ｍｌを０．２ｍｌを免疫した。このキメラマウス血清も同様にＥＬＩＳＡによって解析した。その結果を（第１３図、第１４図）に示す。結果は、ＨＳＡで免疫したキメラマウス血清中のヒト抗体濃度は免疫後上昇し、個体Ｋ３−１−１ではヒトＩｇＭ１８μｇ／ｍｌとＩｇＧ２．６μｇ／ｍｌが免疫後１７日目の血清中に検出された。ヒト染色体を導入していないマウスの血清ではヒト抗体の力価は有意ではなかった。
（実施例１５）ヒト１４番染色体導入キメラマウスからのヒト抗体重鎖産生ハイブリドーマ取得
　（実施例１４）においてヒトアルブミンで免疫したキメラマウス（Ｋ３−１−１，実施例１４）から生後４４日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法は〈安東、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク，１９９１〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ．８．６５３（大日本製薬より購入、０５−５６５）を使用した。９６穴プレート１０枚にまき込み、１週間培養後培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析した。ＥＬＩＳＡ法は抗ヒトＩｇＭマウスモノクローナル抗体（シグマ、Ｉ６３８５）をプレートに固定化して実施例１４と同様に行ない、陽性のクローンを６個得た。またＨＳＡを抗原とし５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で濃度５μｇ／ｍｌの溶液とし、ＥＬＩＳＡプレートの全ウエルに１００μｌづつ分注した。ペルオキシダーゼで標識した抗ヒトＩｇＡ＋ＩｇＧ＋ＩｇＭヤギ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，０４−１０−１７）を用いて検出した。プレート１０枚中陽性のクローンを１つ確認した。このクローンは６個のヒトＩｇＭ陽性クローンのうちの１つであった。このクローン（Ｈ４Ｂ７）をさらに培養し、培養上清を希釈しＨＳＡを抗原として上述のようにペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＭヤギ抗体（Ｔａｇｏ，２３９２）を用いてＥＬＩＳＡを行なったところ、培養上清の希釈率の増加にともなって吸光度の減少が認められた。一方ヒトＩｇＭ（オルガノン・テクニカ，６００−１５９０）を培地によって２μｇ／ｍｌに希釈した試料では希釈率によらず吸光度は低かった。これはハイブリドーマＨ４Ｂ７が生産する抗体がＨＳＡに特異性のある抗体であることを示唆するものである（第１５図）。第１５図において、横軸は培養上清試料の希釈率を縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度を示した。
（実施例１６）Ｇ４１８耐性マーキングされたヒト２番染色体断片のピューロマイシン耐性による再マーキング
　Ｇ４１８耐性で標識されたヒト２番染色体断片を保持するＡ９細胞（Ｗ２３）（実施例１、第１図参照）を１００ｍｍシャーレでＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む選択培地（１０％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ）で培養した。ピューロマイシン耐性遺伝子を含むプラスミドｐＰＧＫＰｕｒｏ（ＷＨＩＴＥＨＥＡＤ　ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ，Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ　Ｗ．Ｌａｉｒｄから分与）をトランスフェクション前に制限酵素Ｓａｌｌ（宝酒造）で線状化した。細胞をトリプシン処理し、５ｘ１０６個／ｍｌとなるようにダルベッコのリン酸バッファー（ＰＢＳ）に懸濁してから１０μｇＤＮＡ存在下でジーンパルサー（バイオラッド）を用いてエレクトロポレーション（実施例１参照）を行なった。２５μＦの容量で１０００Ｖの電圧を４ｍｍ長のエレクトロポレーションセル（実施例１）を用いて室温で印加した。エレクトロポレーションした細胞を１００ｍｍシャーレ３〜６枚に播種した。１日後に１０μｇ／ｍｌのピューロマイシン（シグマ，Ｐ−７２５５）およびＧ４１８（８００μｇ／ｍｌ）を含む二重選択培地と置き換えた。２〜３週間後に生じたコロニー２００個程度を一つの集団としてまとめた。この細胞を３つの集団についてそれぞれ２５ｃｍ２フラスコ２〜３本中で培養し、ミクロセルを形成させ２５ｃｍ２フラスコで培養したマウスＡ９細胞と実施例１と同様に融合した。１００ｍｍシャーレ２枚に移しＧ４１８とピューロマイシンを含む上記の二重選択培地で培養し、３つの集団のうち１つの集団から２つの二重薬剤耐性クローンが得られた。このクローンではヒト２番染色体断片にピューロマイシン耐性マーカーが導入された可能性が高い。
（実施例１７）ヒト染色体導入ＥＳ細胞における導入ヒト染色体倍加
　Ｇ４１８耐性遺伝子でマーキングされたヒト１４番染色体断片を保持するＥＳ細胞株（Ｅ１４／＃１４−３６）を、高濃度のＧ４１８を添加した培地中で培養することにより、ヒト染色体が倍化したＥＳ細胞のクローンを取得した（バイオマニュアルシリーズ８、ジーンターゲティング、羊土社、１９９５）。Ｇ４１８耐性マウス初代細胞（ライフテックオリエンタルより購入）をマイトマイシン処理することなく１００ｍｍシャーレに播種し栄養細胞とした。この１００ｍｍシャーレにＥ１４／＃１４−３６を播種し、半日後Ｇ４１８濃度１６ｍｇ／ｍｌの培地と交換した。１〜２日毎に培地交換し１週間後にＧ４１８濃度を１０ｍｇ／ｍｌとして培養を続け、生じたコロニーの中から１５個を取り出し培養し、染色体をヒト１４番特異的プローブ（実施例９参照）を用いてＦＩＳＨ解析した。結果として８クローンでヒト１４番染色体断片が倍化していた。
（実施例１８）ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を同時に保持するマウスＥＳ細胞株の取得
　（実施例１６）において取得した二重薬剤耐性クローンのうちＰＧ１をミクロセル供与細胞、野生型Ａ９細胞を受容細胞としたミクロセル移入実験により、ＰＧ１が保持するヒト２番染色体部分断片がさらにピューロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされていることを確認した。ミクロセル取得及びＡ９細胞との融合は（実施例１）と同様に行なった。その結果、ミクロセル融合１０日後に計５９個のＧ４１８耐性コロニーが出現した。これらのコロニーについて８μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地に交換後、さらに３日間培養したところ、４５個（７６％）のコロニーが生存した。ミクロセル法においては、１つの受容細胞に、多くの場合１本あるいは少数の染色体のみが移入されることから、両耐性遺伝子が高率に同時に移入されることは、すなわち、ＰＧ１が保持するＧ４１８耐性標識されたヒト２番染色体部分断片がピューロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされていることを示している。さらに、ヒト２番染色体部分断片上の各マーカー遺伝子検出のため、Ａ９／＃２　Ｗ２３（Ｇ４１８耐性のみ：実施例１６）についてはｐＳＴｎｅｏＢ（実施例１）、ＰＧ１についてはｐＰＧＫＰｕｒｏ（実施例１６）をプローブとしたＦＩＳＨ解析を行なった（松原ら，ＦＩＳＨ実験プロトコール，秀潤社，１９９４）。その結果、Ａ９／＃２　Ｗ２３では（実施例１２）で確認されたヒト２番染色体部分断片のそれぞれの姉妹染色分体上に１個づつ、計２個のシグナルが観察された。これは、ヒト２番染色体部分断片上の１箇所にｐＳＴｎｅｏＢが挿入されていることを示す。また、ＰＧ１では同等の大きさの染色体断片上に計４個のシグナルが観察された。ｐＳＴｎｅｏＢとｐＰＧＫＰｕｒｏはベクター部分で相同の配列を持つので、ｐＰＧＫＰｕｒｏプローブではｐＳＴｎｅｏＢも検出される。すなわち、ＰＧ１で観察された４個のシグナルのうち、２個はｐＳＴｎｅｏＢ、一方の２個はｐＰＧＫＰｕｒｏ由来のシグナルと考えられる。この結果より、ＰＧ１が保持するヒト２番染色体部分断片は、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性両者によりマーキングされていることが確認された。
　ヒト２番染色体部分断片、１４番染色体部分断片を同時に保持するマウスＥＳ細胞取得のため、染色体供与細胞としてこのＰＧ１細胞株を用いた。染色体受容細胞としてはすでにヒト１４番染色体部分断片を保持しているＧ４１８耐性ＴＴ２細胞株１−４（実施例９）を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は０．７５μｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度で他は（実施例９）のＧ４１８耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は１−４細胞１０７個あたり３〜７個であった。これらのピューロマイシン耐性株は３００μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下でも増殖することからＧ４１８耐性も同時に保持していることが確認された。二重薬剤耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。ヒト２番染色体部分断片及び、ヒト１４番染色体部分断片の保持は二重薬剤耐性株ＰＧ５、ＰＧ１５、ＰＧ１６については以下の（１）により、ＰＧ１５についてはさらに（２）により確認した。
（１）ＰＣＲ解析
　二重薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２番、１４番染色体上に存在する遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，前記）のうち、２番染色体については（実施例１２；Ａ９／＃２　Ｗ２３）、１４番染色体については（実施例９；ＴＴ２／＃１４　１−４）で存在が確認されている各プライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、３株共に、全てのプライマーについて期待される増幅産物が確認された。
（２）フルオレッセンスｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
　ＦＩＳＨ解析は（実施例１１）と同様に、ヒト全ＤＮＡをＦＩＴＣ標識したものをプローブとして用いて行なった。その結果、ほとんどの分裂像において、大小２つのヒト染色体断片が確認された。大きい方は（実施例９；ＴＴ２／＃１４　１−４）でヒト１４番染色体特異的プローブにより確認された部分断片と、小さい方は（実施例１２；ＴＴ２／＃２５−１）でヒト２番染色体特異的プローブにより確認された部分断片と同等の大きさであった。（第１６図）にその結果を示す。図中輝度の低い染色体はマウス由来のもの、ＦＩＴＣの蛍光により輝度の高い大小２つの染色体断片（矢印にて指示）はヒト由来のものであり、それぞれヒト１４番、２番染色体部分断片と考えられる。
　以上の実験により、得られた二重耐性ＥＳ細胞株はヒト２番染色体部分断片、１４番染色体部分断片を同時に保持することが確かめられた。
（実施例１９）ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を同時に保持するマウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作製
　（実施例１８）で得られ、ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持していることが確認されたＧ４１８、ピューロマイシン二重耐性ＴＴ２細胞株ＰＧ５、ＰＧ１５、ＰＧ１６を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲまたはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり１０〜１２個注入した。ＥＳ細胞用培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。
　キメラ作製の結果を（第６表）に示す。
　計５５１個の注入胚を移植した結果、７３匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した７３匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は２３匹であった。
　この結果より、ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞株（ＰＧ５、ＰＧ１５、ＰＧ１６）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例２０）ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を同時に保持するＥＳ細胞由来キメラマウス血清におけるヒト抗体の検出
　（実施例１９）で作製したキメラマウスのうち、ＫＰＧ−１５（９週齢；ＰＧ５由来、キメラ率１０％）、ＫＰＧ−１８（５週齢；ＰＧ５由来、キメラ率１０％）の２匹に対して、ＰＢＳに溶解したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ、Ａ３７８２）とアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ、ＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｉｎｃ．）とを混合して０．２５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ溶液を調整し０．２ｍｌを免疫した。免疫直前、及び８日後のキメラマウスより採血し、血清中のヒト抗体μ鎖およびヒト抗体κ鎖をＥＬＩＳＡ法を用いて検出した（実施例１４参照）。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈した抗ヒト抗体κ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＡＩ−３０６０）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでビオチン標識抗ヒト抗体κ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＢＡ−３０６０）を加えてインキュベートしさらにビオチン化ワサビペルオキシダーゼとアビジンＤＨの複合体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキットＰＫ４０００）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質として３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン（ＴＭＢＺ、住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製されたκ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＧ（シグマ、Ｉ−３８８９）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。μ鎖については５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈した抗ヒトμ鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、Ｉ−６３８５）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒトμ鎖マウス抗体（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＭＰ００８）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製されたμ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＭ（オルガノン・テクニカ、６００１−１５９０）を標準としマウス血清（シグマ、Ｍ５９０５）を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。その結果、２個体とも免疫前においてヒト抗体μ鎖、κ鎖両者が検出され、その血清中濃度は、免疫後上昇した（第７表、第８表）。
　この結果より、ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおいてヒト抗体重鎖、軽鎖遺伝子は機能することが確認された。
（実施例２１）ヒト１４番染色体断片導入キメラマウス血清における抗ＨＳＡヒト抗体γ鎖の検出
　（実施例１０）と同様にして作製したヒト１４番染色体断片を保持したキメラマウス（Ｋ９、Ｋ１１；共にＴＴ２細胞株３−２由来、キメラ率はそれぞれ５０％、３０％）に対して、生後７９日、９３日、１０７日、１３３日の４回（Ｋ９）、または生後７４日、８８日、１１１日（Ｋ１１）の３回にわたり（実施例２０）と同様にＨＳＡを免疫した。このキメラマウス血清中のヒト血清アルブミンに対するヒトγ鎖を含む抗体をＥＬＩＳＡ法によって検出した（実施例１４参照）。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈したＨＳＡ（シグマ、Ａ３７８２）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧマウス抗体（ファーミンジェン、０８００７Ｅ）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質としてＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ、住友ベークライト、ＭＬ−１１３００）の添加により酵素活性を４９０ｎｍの吸光度で評価した。ＨＳＡで免疫したキメラマウス血清中の抗ＨＳＡヒトＩｇＧの力価は免疫後上昇した。対照ＩＣＲマウスでは、ＨＳＡ免疫後の抗ＨＳＡヒトＩｇＧの力価はバックグランドレベルであった。結果を（第１７図）に示した。第１７図において横軸はキメラマウスにＨＳＡを免疫してからの日数を、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を示した。この結果より、ヒト１４番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、ＨＳＡ抗原刺激に対して抗原特異的ヒトＩｇＧの抗体価上昇が起こることが確認された。
（実施例２２）ヒト２２番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒト抗体λ鎖の検出
　９ヶ月齢のキメラマウス（実施例３、Ｋ２２−７；キメラ率１０％）より採血し、血清中のヒト抗体λ鎖をＥＬＩＳＡ法を用いて検出した（実施例１４参照）。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈した抗ヒト抗体λ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＡＩ−３０７０）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでビオチン標識抗ヒト抗体λ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＢＡ−３０７０）を加えてインキュベートしさらにビオチン化ワサビペルオキシダーゼとアビジンＤＨとの複合体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキットＰＫ４０００）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質としてＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製されたλ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＧ（シグマ、Ｉ−４０１４）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。１８０ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＧに相当する濃度のヒト抗体λ鎖がキメラマウス中に検出された。この結果より、ヒト２２番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒト抗体λ鎖遺伝子が機能することが確認された。
（実施例２３）ヒト２番染色体断片導入キメラマウス血清におけるヒト抗体κ鎖の検出
　５週齢のキメラマウス（実施例１３、Ｋ２−８、キメラ率は７０％）および９週齢のキメラマウス（実施例１３、Ｋ２−３、Ｋ２−４、Ｋ２−１２、キメラ率はそれぞれ５０％、２０％、８０％）より採血し、血清中のヒト抗体κ鎖をＥＬＩＳＡ法を用いて検出した（実施例１４）。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈した抗ヒト抗体κ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＡＩ−３０６０）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでビオチン標識抗ヒト抗体κ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＢＡ−３０６０）を加えてインキュベートしさらにビオチン化ワサビペルオキシダーゼとアビジンＤＨの複合体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製されたκ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＧ（シグマ、Ｉ−３８８９）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。結果を（第９表）に示した。
　またヒト２番染色体断片を保持したキメラマウス（実施例１３、Ｋ２−３、およびＫ２−４）に生後６６日、８０日、１０２日の３回にわたり（実施例２０）と同様にＨＳＡを免疫した。またキメラマウス（Ｋ２−１２）に生後６３日、７７日、９１日、１１６日の４回にわたり、このキメラマウス血清中のＨＳＡに対するヒト抗体κ鎖をＥＬＩＳＡ法によって検出した（実施例１４参照）。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈したＨＳＡ（シグマ、Ａ３７８２）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、試料を加え、次いでビオチン標識抗ヒト抗体κ鎖ヤギ抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＢＡ−３０６０）を加えてインキュベートしさらにビオチン化ワサビペルオキシダーゼとアビジンＤＨの複合体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質としてＯＰＤ（住友ベークライト、ＭＬ−１１３００）の添加により酵素活性を４９０ｎｍの吸光度で評価した。ＨＳＡで免疫したキメラマウス血清中の抗体ＨＳＡヒトκ鎖の力価は免疫後上昇した。一方対照ＩＣＲマウスでは、ＨＳＡ免疫後の抗ＨＳＡヒト抗体κ鎖の力価はバックグランドレベルであった。結果を（第１８図）に示した。第１８図において横軸はキメラマウスにＨＳＡを初めて免疫してからの日数を、縦軸は４９０ｎｍにおける吸光度を示した。これらの結果より、ヒト２番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいてヒト抗体κ鎖遺伝子が機能し、さらにはＨＳＡ抗原刺激に対して抗原特異的ヒトＩｇκの抗体価上昇が起こることが確認された。
（実施例２４）ヒト１４番染色体導入キメラマウスからのヒト抗体重鎖（μ鎖もしくはγ鎖）産生ハイブリドーマ取得
　（実施例２１）においてＨＳＡで免疫したキメラマウスＫ９から生後１３６日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法は〈安東・千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク，１９９１〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、Ｓｐ−２／Ｏ−Ａｇ１４（大日本製薬、０５−５５４）を使用した。培養液にＯＲＩＧＥＮ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ（ＨＣＦ、ボクスイ・ブラウン）を１０％添加し９６穴プレート８枚にまき込み、３日後に培養液中にＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ添加した。１〜３週間培養後の培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析した（実施例１４参照）。μ鎖は５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で希釈した抗ヒトμ鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、Ｉ−６３８５）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、ＰＢＳで希釈した試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒトμ鎖マウス抗体（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＭＰ００８）を加えてインキュベートした後、基質として２，２−アジノジ−（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ、Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．、０４−１０−１７）を用いて検出し７個の陽性ウェルを得た。γ鎖については抗ヒトγ鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、Ｉ−６２６０）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、ＰＢＳで希釈した試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒトγ鎖マウス抗体（ファーミンジェン、０８００７Ｅ）を加えてインキュベートした後、ＡＢＴＳ（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．、０４−１０−１７）を用いて検出し２個のヒト抗体γ鎖陽性ウェルを得た。
（実施例２５）ヒト２番染色体導入キメラマウスからのヒト抗体軽鎖産生ハイブリドーマ取得
　（実施例２３）においてＨＳＡで免疫したキメラマウスＫ２−３から生後１０５日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法は〈安東・千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク，１９９１〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（大日本製薬、０５−５６５）を使用した。培養液にＨＣＦ（ボクスイ・ブラウン）を１０％添加し９６穴プレート１０枚にまき込み、３日後培養液中にＧ４１８を１ｍｇ／ｍｌ添加し、１〜３週間培養しコロニーが出現したウェルの培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析した。ＥＬＩＳＡ法は（実施例２３）と同様に行ない、ヒト抗体κ鎖陽性のクローンを２個得た。
（実施例２６）Ｇ４１８耐性マーキングされたヒト２２番染色体のピューロマイシン耐性による再マーキング
　Ｇ４１８耐性で標識されたヒト２２番染色体を保持するＡ９細胞（Ａ９／＃２２γ２；実施例１で取得）について、（実施例１６）と同様な方法でヒト２２番染色体のピューロマイシン耐性による再マーキングを行った。γ２細胞にｐＰＧＫＰｕｒｏをエレクトロポレーションして得られた二重薬剤耐性株コロニー２００個程度を一つの集団とし、３つの集団（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）を供与細胞として野生型マウスＡ９細胞へのミクロセル移入を行なった。その結果、Ｐ１より６個、Ｐ２より１個、Ｐ３より３個の二重薬剤耐性クローンが得られた。取得した二重薬剤耐性クローンのうちＰ３由来の６−１をミクロセル供与細胞、野生型Ａ９細胞を受容細胞としたミクロセル移入実験により、ヒト２２番染色体がさらにピューロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされていることを確認した（実施例１８）。ミクロセル取得及びＡ９細胞との融合は（実施例１）と同様に行なった。その結果、ミクロセル移入１１日後に２８個のＧ４１８耐性コロニーが出現した。これらのコロニーについて８μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地に交換した後、さらに３日間培養したところ、２１個（７５％）のコロニーが生存した。ミクロセル法においては、１つの供与細胞に、多くの場合１本あるいは少数の染色体のみが移入されることから、両耐性遺伝子が高率に同時に移入されることは、すなわち、６−１が保持するＧ４１８耐性標識されたヒト２２番染色体がさらにピューロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされていることを示している。
（実施例２７）ヒト抗体重鎖を産生するハイブリドーマからのヒト抗体重鎖可変領域ｃＤＮＡの取得及び塩基配列決定
　（実施例１５）において取得されたヒト抗体重鎖（ＩｇＭ）を産生するハイブリドーマのうち、Ｈ４Ｂ７（ＨＳＡ特異的）及びＨ８Ｆ９（非特異的）より、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を使用して、総ＲＮＡを取得した。ｃＤＮＡの合成は、Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ　Ｔ−ｐｒｉｍｅｄ　１ｓｔ　ｓｔｒａｎｄキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用い各々５μｇの総ＲＮＡを使用した。得られたｃＤＮＡについて下記に示したプライマー（Ｌａｒｒｉｃｋら，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，７，９３４−，１９８９、Ｗｏｒｄら，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１，２９６−，１９８９を参考に作製）によりＰＣＲを行ない、ヒト抗体重鎖可変領域を増幅した。
　　＊（　）はその位置の塩基が（　）内のいずれかからなる混合物であることを示す。
　Ｈ４Ｂ７、Ｈ８Ｆ９共に、１回目のＰＣＲはＨＳ１×ＣＭ１、ＨＳ２×ＣＭ１、ＨＳ３×ＣＭ１の３種のプライマーの組み合わせについて行い（９４℃１分、５０℃２分、７２℃３分、４０サイクル、パーキンエルマー社、サーマルサイクラー１４０使用）、そのＰＣＲ産物をそれぞれＨＳ１×ＣＭ２、ＨＳ２×ＣＭ２、ＨＳ３×ＣＭ２のプライマーで再度増幅した（温度条件は前記同様、３０サイクル）。増幅産物は１．５％アガロース電気泳動後、臭化エチジウム染色することにより検出した。その結果、Ｈ４Ｂ７についてはＨＳ３×ＣＭ２のプライマーで約４９０ｂｐの増幅産物が確認された。また、Ｈ８Ｆ９については、ＨＳ３×ＣＭ２プライマーで微かなバンドが同様の位置に確認されたのでこのプライマーで再度増幅した（温度条件は前記同様、３０サイクル）。その結果、増幅産物は非常に強いシグナルとして検出された。これらのＰＣＲ産物は、石田ら（遺伝子発現実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９９５）の方法に従い、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ベクターのＳｍａＩ部位にクローニングした。増幅産物の挿入されたプラスミドのうち＃２、＃３、＃４（Ｈ４Ｂ７）、＃１１、＃１３、＃１４（Ｈ８Ｆ９）について、自動蛍光シーケンサー（Ａｐｐｌｙｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍ社）により、増幅産物の塩基配列を決定した。得られた塩基配列及び予想されるアミノ酸配列をすでに報告されているヒト抗体ＶＨ領域（Ｍａｒｋら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，９８５−，１９９１）、ＪＨ領域（Ｒａｖｅｔｃｈら，Ｃｅｌｌ，２７，５８３−，１９８１）の配列と比較した結果、Ｈ４Ｂ７、Ｈ８Ｆ９共に、ＶＨ４ファミリー、ＪＨ２の組み合わせからなることが判明した。この結果は、ヒト１４番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、完全な機能的ヒト抗体重鎖蛋白質が産生されていることを示している。
（実施例２８）ヒト抗体κ鎖を発現するキメラマウス脾臓からのヒト抗体κ鎖ｃＤＮＡの取得と塩基配列決定
　（実施例１３）において取得され、（実施例２３）においてヒト抗体κ鎖を発現することが確認されたキメラマウスＫ２−８の脾臓より（実施例５）と同様な方法で合成したｃＤＮＡについて、下記のプライマー（Ｌａｒｒｉｃｋら，ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，７，９３４−，１９８９、Ｗｈｉｔｅｈｕｒｓｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２０，４９２９−，１９９２を参考に作製）によりＰＣＲを行ない、ヒトκ鎖可変領域を増幅した。陰性コントロールとしてＫ２−８より取得した肝臓由来ｃＤＮＡ及び、（実施例１０）のＴＴ２／＃１４　３−２由来キメラマウスＫ３−２−２より取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いた。
　　＊（　）はその位置の塩基が（　）のいずれかからなる混合物であることを示す。
　ＰＣＲはＫＶＭＩＸ×ＫＣ２、ＫＶＭＩＸ×ＫＣ３プライマーの組み合わせで９４℃１５秒、５５℃１５秒、７２℃２０秒、４０サイクル（パーキンエルマー社、サーマルサイクラー９６００使用）の条件で行なった。増幅産物は１．５％アガロース電気泳動後、臭化エチジウム染色することにより検出した。その結果、両者の組み合わせ共に、期待される約４２０ｂｐｓ（ＫＣ２）、約４５０ｂｐｓ（ＫＣ３）の長さの増幅産物が検出された。一方、２種の陰性コントロールでは特異的増幅産物は検出されなかった。これらの増幅産物は、石田ら（遺伝子発現実験マニュアル、講談社サイエンティフィク、１９９５）の方法に従い、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ベクターのＳｍａＩあるいはＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。増幅産物の挿入されたプラスミドのうちＫＶＭＩＸ×ＫＣ２由来のＶＫ−＃１クローン１種類について、自動蛍光シーケンサー（Ａｐｐｌｙｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍ社）により、増幅産物の塩基配列を決定した。得られた塩基配列はヒトＩｇκ鎖の開始コドンから定常領域に至るまで終始コドンを含まないので、クローニングされた増幅産物は機能的ヒトＩｇκ鎖可変領域をコードしていると考えられる。また、すでに報告されているヒト抗体Ｖκ領域（Ｋｌｅｉｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，３２４８−，１９９３）、Ｊκ領域（Ｗｈｉｔｅｈｕｒｓｔら、前記）の塩基配列と比較した結果、Ｖκ３ファミリー、Ｊκ４の組み合わせからなることが判明した。この結果は、ヒト２番染色体部分断片を保持するキメラマウスにおいて、完全な機能的ヒト抗体κ鎖蛋白質が産生されていることを示している。
（実施例２９）ヒト１４番染色体断片を保持するキメラマウスの血清中のヒト抗体γ鎖サブクラスおよびμ鎖の検出、および定量
　（実施例１０）の生後１１週齢のキメラマウス（Ｋ１５ＡおよびＫ１６Ａ；１−４由来、キメラ率７０、５０％）より採血し、血清中のヒト抗体γ鎖サブクラス濃度を（実施例１４）に従いＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。
［ヒトＩｇＧ１の測定］抗体ヒトＩｇＧ抗体（シグマ、Ｉ−６２６０）をＰＢＳで希釈し、９６穴マイクロタイタープレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ１抗体（ファーミンジェン、０８０２７Ｅ）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒトＩｇＧ１（シグマ、Ｉ−３８８９）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。
［ヒトＩｇＧ２の測定］抗ヒトＩｇＧ２抗体（シグマ、Ｉ−９５１３）をＰＢＳで希釈し、９６穴マイクロタイタープレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（シグマ、Ａ−０１７０）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒトＩｇＧ２（シグマ、Ｉ−４１３９）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。
［ヒトＩｇＧ３の測定］抗ヒトＩｇＧ３抗体（シグマ、Ｉ−７２６０）を１００ｍＭグリシン塩酸バッファーｐＨ２．５で希釈し５分間室温で放置した後、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０で１０倍に希釈し、９６穴マイクロタイタープレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（ファーミンジェン、０８００７Ｅ）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒトＩｇＧ３（シグマ、Ｉ−４３８９）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。
［ヒトＩｇＧ４の測定］抗ヒトＩｇＧ４抗体（シグマ、Ｉ−７６３５）を１００ｍＭグリシン塩酸バッファーｐＨ２．５で希釈し５分間室温で放置した後、１００ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０で１０倍に希釈し、９６穴マイクロタイタープレートをコーティングした。血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識した抗ヒトＩｇＧ抗体（ファーミンジェン、０８００７Ｅ）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。精製された濃度既知のヒトＩｇＧ４（シグマ、Ｉ−４６３９）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。
［ヒトＩｇＭの測定］μ鎖についてはＰＢＳで希釈した抗ヒトμ鎖マウスモノクローナル抗体（シグマ、Ｉ−６３８５）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒトμ鎖マウス抗体（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＭＰ００８）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質としてＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価し、精製されたμ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＭ（オルガノン・テクニカ、６００１−１５９０）を標準としマウス血清（シグマ、Ｍ５９０５）を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。
　結果を表１０に示す。キメラマウスＫ１５ＡとＫ１６Ａの２個体でＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４のすべてのサブクラスおよびＩｇＭが検出された。
（実施例３０）ヒト２２番染色体を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２）の取得
　ヒト２２番染色体を保持するマウスＥ２細胞（ＴＴ２）取得のため、染色体供与細胞として（実施例２６）で取得した６−１（Ａ９／＃２２，Ｇ４１８，ピューロマイシン耐性）細胞株を用いた。染色体受容細胞としては野生型ＴＴ２細胞株（実施例９）を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は０．７５μｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度で他は（実施例９）のＧ４１８耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度はＴＴ２細胞１０７あたり１〜２個であった。ピューロマイシン耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。ヒト２２番染色体の保持はピューロマイシン耐性株ＰＧ２２−１について以下の（１）、（２）により確認した。
（１）ＰＣＲ解析
　ピューロマイシン耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２２番染色体上に存在する遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，前記）のうち、（実施例２；Ａ９／＃２２）で存在が確認されている１０種のプライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、（実施例２；Ａ９／＃２２）に存在した全てのマーカーが検出された。
（２）サザンブロット解析
　（実施例２）で示した方法に従い、ヒトＬ１配列をプローブとして用い、陰性コントロール野生型ＴＴ２、染色体供与細胞６−１、ピューロマイシン耐性ＴＴ２細胞株ＰＧ２２−１由来のゲノムＤＮＡについて行った。その結果を（第１９図）に示す。図中左側にＤＮＡ分子量を示した。ＰＧ２２−１におけるバンドパターンは６−１のそれと一致し、シグナル強度も同程度であることから、６−１細胞株中の２２番染色体は確かにＰＧ２２−１に移入されたことが確認された。
　以上の実験によりピューロマイシン耐性ＴＴ２細胞株ＰＧ２２−１はヒト２２番染色体の全てあるいは大部分を保持することが確認された。
（実施例３１）ヒト２２番染色体を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２）からのキメラマウス作製
　（実施例３０）で得られ、ヒト２２番染色体を保持していることが確認されたピューロマイシン耐性ＴＴ２細胞株ＰＧ２２−１を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲまたはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり１０〜１２個注入した。ＥＳ細胞用培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。
　キメラ作製の結果を（第１１表）に示す。計２６６個の注入胚を移植した結果、３６匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した３６匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は８匹であった。
　この結果より、ヒト２２番染色体を保持するＥＳ細胞株（ＴＴ２由来、ＰＧ２２−１）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例３２）ヒト２２番染色体を保持するキメラマウスの血清中のヒト抗体λ鎖の検出、および定量
　（実施例３１）のキメラマウスＫＰＧ２２−１〜３の血清中のヒト抗体濃度を（実施例１４）に従いＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。生後２ヶ月のキメラマウスより採血し、血清中のヒト抗体λ鎖をＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。ＰＢＳで希釈した抗ヒト免疫グロブリンλ鎖抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＩＡ−３０７０）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでビオチン標識した抗ヒト免疫グロブリンλ鎖抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＢＡ−３０７０）を加えてインキュベートしさらにビオチン化ワサビペルオキシダーゼとアビジンＤＨの複合体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価し、精製されたλ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＭ（大日本製薬、Ｕ１３２００）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。結果を第１２表に示す。この結果より２２番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒト抗体λ鎖遺伝子が機能することが確認された。
（実施例３３）ヒト２２番染色体導入キメラマウス血清における抗ヒトＨＳＡヒト体λ鎖の検出
　キメラマウス（実施例３１、ＫＰＧ２２−３）に生後７９日、９４日、１１０日の３回にわたり（実施例２０）と同様にＨＳＡを免疫した。血清中のヒト抗体λ鎖を（実施例１４）に従いＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。５０ｍＭの炭酸−炭酸水素バッファーｐＨ９．６で５μｇ／ｍｌに希釈したＨＳＡ（シグマ、Ａ３７８２）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでビオチン標識した抗ヒト免疫グロブリンλ鎖抗体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、ＢＡ−３０７０）を加えてインキュベートしさらにビオチン化ワサビペルオキシダーゼとアビジンＤＨの複合体（ＶＥＣＴＯＲ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット）を加えてインキュベートした後、ＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価した。ＨＳＡで免疫したキメラマウス血清中の抗ＨＳＡヒトλ鎖の力価は免疫後上昇した。一方対照としたＩＣＲマウスでは、ＨＳＡ免疫後の抗ＨＳＡヒト抗体λ鎖の力価はバックグランドレベルであった。結果を（第２０図）に示す。第２図において横軸はキメラマウスに初めてＨＳＡを免疫してからの日数を、縦軸は４５０ｎｍにおける吸光度を示した。これらの結果より、ヒト２２番染色体を保持するキメラマウスにおいてヒト抗体λ鎖遺伝子が機能し、さらにはＨＳＡ抗原刺激に対して抗原特異的ヒトＩｇλの抗体価上昇が起こることが確認された。
（実施例３４）ヒト２２番染色体導入キメラマウスからのヒト抗体軽産生ハイブリドーマ取得
　（実施例２５）と同様に（実施例３３）においてヒトアルブミンで免疫したキメラマウスＫＰＧ２２−３から生後１１３日目に脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの作製法は〈安東・千葉、単クローン抗体実験操作入門、講談社サイエンティフィク，１９９１〉に記された方法に従い、ミエローマ細胞としては、ＳＰ−２／Ｏ−Ａｇ１４（大日本製薬、０５−５５４）を使用した。培養液にＨＣＦ（エア・ブラウン）を１０％添加し９６穴プレート５枚にまき込み、１〜３週間培養しコロニーが出現したウェルの培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析した。ＥＬＩＳＡ法は（実施例３３）と同様に行ない、ヒト抗体λ鎖陽性のクローンを４個得た。
（実施例３５）ヒト２２番染色体部分断片及び、１４番染色体部分断片を同時に保持するマウスＥＳ細胞株の取得
　ヒト２２番染色体、１４番染色体部分断片を同時に保持するマウスＥＳ細胞取得のため、染色体供与細胞として（実施例２６）で取得した６−１（Ａ９／＃２２，Ｇ４１８，ピューロマイシン耐性）細胞株を用いた。染色体受容細胞としてはすでにヒト１４番染色体部分断片を保持しているＧ４１８耐性ＴＴ２細胞株１−４（実施例９）を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は０．７５μｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度で他は（実施例９）のＧ４１８耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度は１−４細胞１０７個あたり１〜２個であった。これらのピューロマイシン耐性株は３００μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下でも増殖することからＧ４１８耐性も同時に保持していることが確認された。二重薬剤耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。ヒト２２番染色体及び、ヒト１４番染色体部分断片の保持は二重薬剤耐性株ＰＧ２２−５について以下のＰＣＲ解析により確認した。二重薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２２番、１４番染色体上に存在する遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，前記）のうち、２２番染色体については（実施例２；Ａ９／＃２２）、１４番染色体については（実施例９；ＴＴ２／＃１４　１−４）で存在が確認されている各プライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、２２番染色体については１０種のうち３種のマーカー（Ｄ２２Ｓ２７５，Ｄ２２Ｓ３１５，Ｉｇλ）、１４番染色体についてはＴＴ２／＃１４　１−４に存在した全てのマーカーが検出された。以上の実験により、得られた二重耐性ＴＴ２細胞株はヒト２２番染色体部分断片、１４番染色体部分断片を同時に保持することが確かめられた。
（実施例３６）ヒト２２番染色体部分断片及び、１４番染色体部分断片を同時に保持するマウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作製
　（実施例３５）で得られ、ヒト２２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持していることが確認されたＧ４１８、ピューロマイシン二重耐性ＴＴ２細胞株ＰＧ２２−５を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲまたはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり１０〜１２個注入した。ＥＳ細胞用培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。
　キメラ作製の結果を（第１３表）に示す。計３０２個の注入胚を移植した結果、１６匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した１６匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は５匹であった。
　この結果より、ヒト２２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞株（ＰＧ２２−５）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例３７）ヒト２２番染色体部分断片及び、１４番染色体部分断片を同時に保持するＥＳ細胞由来キメラマウス血清中のヒト抗体λ鎖およびヒト抗体μ鎖の検出・定量
　（実施例３６）のキメラマウス（ＫＰＧ２２−９、１０、および１２）に対して、ＨＳＡを免疫した。ＫＰＧ２２−９とＫＰＧ２２−１０には生後１１週齢で免疫し、その２週間後に採血した。ＫＰＧ２２−１２には生後７週齢と９週齢の２度免疫し、２度目の免疫の２週間後に採血した。
　血清中のヒト抗体μ鎖およびヒト抗体λ鎖さらにヒトλ鎖かつヒトμ鎖を有する抗体を（実施例１４）に従いＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。
　完全ヒト抗体の検出にはＰＢＳで希釈した抗ヒト免疫グロブリンλ鎖抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．、０１−１０−１１）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンμ鎖抗体（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＭＰ００８）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質としてＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価し、精製されたλ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＭ（大日本製薬、Ｕ１３２００）をマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈したものと比較し血清中のヒト抗体濃度を求めた。ヒト抗体μ鎖およびヒト抗体λ鎖をＥＬＩＳＡ法を用いて（実施例２９）および（実施例３２）と同様に検出・定量した。結果を第１４表に示す。キメラマウスではλ鎖とμ鎖がともに検出された。ヒト抗体μ鎖かつλ鎖を持つ抗体も検出された。この結果より、ヒト２２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおいてヒト抗体λ鎖遺伝子とヒト抗体μ鎖遺伝子は同時に機能し、一部のＢ細胞では重鎖と軽鎖がともにヒトである完全抗体が産生されることが確認された。
　また対照として測定したヒト１４番染色体のみを保持する（実施例１０）のキメラマウス（Ｋ９）、ヒト２２番染色体のみを保持する（実施例３１）のキメラマウス（ＫＰＧ２２−２）の血清中のヒト抗体λ鎖かつμ鎖を持つ抗体濃度はバックグランドレベルであり、ここでの検出系はヒトλ鎖かつμ鎖を持つ完全抗体のみを検出していることが確認された。
（実施例３８）ヒト２番染色体部分断片及び、１４番染色体部分断片を同時に保持するＥＳ細胞由来キメラマウス血清におけるヒト抗体の検出（ヒトκ鎖かつヒトμ鎖を有する抗体）
　（実施例１９）で作製したキメラマウスＫＰＧ−１５（ＴＴ２ＥＳクローンＰＧ５由来、キメラ率１０％）に対して、生後２から３ヶ月齢の間に、ＰＢＳに溶解したヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、シグマ、Ａ３７８２）とアジュバント（ＭＰＬ＋ＴＤＭ　Ｅｍｕｌｓｉｏｎ，ＲＩＢＩ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅｓｅａｃｈ　Ｉｎｃ．）とを混合して０．２５ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ溶液を調製し０．２ｍｌを３回免疫し、採血した。また生後６週齢の（実施例１９）のキメラマウスＫＰＧ−２６（ＴＴ２ＥＳクローンＰＧ６由来、キメラ率４０％）から採血した。血清中の完全ヒト抗体濃度を（実施例１４）に従いＥＬＩＳＡ法で検出した。ＰＢＳで希釈した抗ヒト免疫グロブリンκ鎖抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．、０１−１０−１０）を９６穴マイクロタイタープレートにコーティングし、マウス血清（シグマ、Ｍ５９０５）を加えたＰＢＳで希釈した血清試料を加え、次いでペルオキシダーゼ標識抗ヒト免疫グロブリンμ鎖抗体（Ｔｈｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｉｔｅ　Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＭＰ００８）を加えてインキュベートした後、ペルオキシダーゼ基質としてＴＭＢＺ（住友ベークライト、ＭＬ−１１２０Ｔ）の添加により酵素活性を４５０ｎｍの吸光度で評価し、精製されたκ鎖を持つ濃度既知のヒトＩｇＭ（オルガノン・テクニカ、６００１−１５９０）を標準としマウス血清を添加したＰＢＳで段階的に希釈した。κ鎖、μ鎖については（実施例２０）と同様にして濃度を求めた。結果を第１５表に示す。ヒト抗体μ鎖かつκ鎖を持つ抗体が検出された。また対照としたヒト１４番染色体のみを保持する（実施例１０）のキメラマウス（Ｋ９）、ヒト２番染色体のみを保持する（実施例１３）のキメラマウス（Ｋ２−９）血清中のヒト抗体でκ鎖かつμ鎖を持つ抗体濃度は０．００２ｍｇ／ｍｌ以下でバックグランドレベルであった。この結果より、ヒト２番染色体部分断片及び１４番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞由来キメラマウスにおいてヒト抗体κ鎖遺伝子とヒト抗体μ鎖遺伝子は同時に機能し、一部のＢ細胞では重鎖と軽鎖がともにヒトである完全抗体が産生されることが確認された。
（実施例３９）ヒト２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ，ＸＯ）の取得
　ヒト２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞（ＸＯ）取得のため、染色体供与細胞として（実施例１６）で取得したＰＧ１細胞株を用いた。染色体受容細胞としては（３９，ＸＯ）の染色体構成を持ち、キメラマウスにおいて効率よく卵細胞に分化することが報告されている（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５）ＴＴ２Ｆ細胞株（ライフテックオリエンタル社より購入）を用いた。ミクロセル融合実験およびピューロマイシン耐性株の選択は０．７５μｇ／ｍｌのピューロマイシン濃度で他は（実施例９）のＧ４１８耐性株選択の場合と同様に行なった。この結果出現したピューロマイシン耐性株の出現頻度はＴＴ２Ｆ細胞１０７個あたり５個であった。これらのピューロマイシン耐性株の凍結保存、ゲノムＤＮＡ取得は（実施例２）と同様に行なった。ヒト２番染色体部分断片の保持は薬剤耐性株Ｐ−２０，Ｐ−２１について以下のＰＣＲ解析により確認した。薬剤耐性株ゲノムＤＮＡを鋳型としてヒト２番染色体上に存在する遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｍａｐｓ，前記）のうち、（実施例１；Ａ９／＃２　ｗ２３）で存在が確認されているプライマーＣκ，ＦＡＢＰ１、Ｖκ１−２の３種についてＰＣＲ増幅を行なった結果、２株共に、３種全てのプライマーについて期待される増幅産物が確認された。
　以上の実験により、得られたピューロマイシン耐性ＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ，ＸＯ）はヒト２番染色体部分断片を保持することが確かめられた。
（実施例４０）ヒト２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ，ＸＯ）からのキメラマウス作製
　（実施例３９）で得られ、ヒト２番染色体部分断片を保持していることが確認されたピューロマイシン耐性ＴＴ２Ｆ細胞株Ｐ−２１を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲまたはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雄雌マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり１０〜１２個注入した。ＥＳ細胞用培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。
　計１４１個の注入胚を移植した結果、２０匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。キメラ作製の結果を（第１６表）に示す。誕生した２０匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は９匹であった。うち４個体は毛色が完全に野生色の（ＥＳ細胞に由来する）キメラマウスであった。
　この結果より、ヒト２番染色体部分断片を保持するＥＳ細胞株（Ｐ−２１）はキメラ形成能を保持している、すなわちマウス個体の正常組織に分化する能力を保持していることが確認された。
（実施例４１）ヒト２番染色体部分断片を保持するＴＴ２Ｆ由来キメラマウスの血清中のヒト抗体κ鎖の検出、および定量
　（実施例４０）の生後約１ヶ月齢のキメラマウス（Ｐ−２１由来、キメラ率１００％、Ｋ２−１Ｆ〜４Ｆ）より採血し血清中のヒト抗体κ鎖濃度を（実施例２０）と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。
　結果を第１７表に示す。使用するＥＳ細胞をＴＴ２Ｆとしてもヒト抗体κ鎖遺伝子がキメラマウス中で機能することが確認された。
（実施例４２）ヒト２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞（ＴＴ２Ｆ，ＸＯ）由来キメラマウスの子孫におけるヒト染色体保持の検出
　（実施例４０）で得られた雌キメラマウスのうちＫ２−１Ｆ，Ｋ２−４Ｆ（共に毛色のキメラ率１００％）について雄ＩＣＲマウスとの交配によりＥＳ細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。この交配においてＩＣＲ雄マウス（アルビノ、劣性）由来精子により受精したキメラマウス中のＴＴ２Ｆ細胞（野生色：優性）由来の卵子からは野生色、ＩＣＲ由来卵子からは白色の子マウスが誕生する。それぞれ１回の交配によって得られた生存可能な子マウス（Ｋ２−１Ｆ：１０匹、Ｋ２−４Ｆ：５匹）のすべてがＥＳ細胞由来の毛色である野生色を示した。これらの子マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡについてヒト染色体断片の保持をＰＣＲ法により検討した。Ｐ−２１（実施例３９）で存在が確認されている３種のプライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、１０匹中４匹（Ｋ２−１Ｆ）、５匹中２匹（Ｋ２−４Ｆ）においてＰ−２１で検出された３種のマーカーの存在が確認された。１５匹の子マウスのＰＣＲの結果を（第２１図）に示す。図中右側にマーカー（φＸ１７４，ＨａｅＩＩＩ断片，ニッポンジーン）および主なバンドのＤＮＡ分子量を、左側にそれぞれのプライマーによって期待される増幅産物の長さを矢印で示した。右側に陽性コントロールとして親キメラＫ２−１Ｆ、Ｋ２−４Ｆの尻尾由来ＤＮＡを用いた結果も示す。これらの結果は、ヒト２番染色体部分断片を保持するＴＴ２Ｆ細胞株Ｐ−２１がキメラマウス中で機能的な卵子に分化し、その卵子由来の子孫にヒト２番染色体部分断片が伝達されたことを示している。
（実施例４３）ヒト２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞（ＴＴ２，ＸＹ）由来キメラマウスの子孫におけるヒト染色体保持の検出
　（実施例１３）で得られたキメラマウスのうちＫ２−１８（雄、キメラ率７０％）とＫ２−１９（雌、キメラ率６０％）及び同腹の非キメラ雌を混合して交配し、ＥＳ細胞由来の子孫が誕生するかを検討した。ＴＴ２細胞は（４０，ＸＹ）の染色体構成を持つので雄キメラＫ２−１８において機能的な精子に分化している可能性がある。その場合キメラマウス中のＴＴ２細胞（野生色、優性）由来精子により受精したＩＣＲ（白色：劣性）由来の卵子からは野生色の子マウスが誕生する。交配によって得られた生存可能な子マウス計１１０匹のうち１０匹がＥＳ細胞由来の毛色である野生色を示した。これらの野生色子マウス１０匹のうち７匹の尻尾より調製したゲノムＤＮＡについてヒト染色体断片の保持をＰＣＲ法により検討した。５−１株（ＴＴ２／＃２ｆｇ．，実施例１２）で存在が確認されている２種のプライマー（Ｃκ、ＦＡＢＰ１）及び、（実施例１）で示したＶκ１−２プライマーについてＰＣＲ増幅を行なった結果、７匹中２匹において３種のマーカー全てのの存在が確認された。この結果は、ヒト２番染色体部分断片を保持するＴＴ２細胞株５−１がキメラマウス中で機能的な精子に分化し、その精子由来の子孫にヒト２番染色体部分断片が伝達されたことを示している。
（実施例４４）キメラマウス子孫の血清中のヒト抗体κ鎖の検出、および定量
　（実施例４２）のキメラマウス子孫Ｋ２−１Ｆ−１〜１０およびＫ２−４Ｆ−１〜５の血清中のヒト抗体κ鎖濃度をＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。生後約４〜６週齢のマウスより採血し、血清中のヒト抗体κ鎖を（実施例２０）と同様にＥＬＩＳＡ法を用いて検出した。結果を（実施例４２）で得られた染色体保持の結果と共に第１８表に示す。キメラマウスから生まれた子孫においてもヒト抗体κ鎖遺伝子が機能することが確認された。
（実施例４５）ヒト１４番染色体部分断片導入キメラマウス脾臓細胞の解析
　フローサイトメトリーによる解析は下記の文献に記載の方法に従った。日本生化学会編、新生化学実験講座１２分子免疫学Ｉ−免疫細胞・サイトカイン−１９８９、東京化学同人；東京大学医科学研究所　制癌研究部編、細胞工学別冊８　新細胞工学実験プロトコール、１９９１、秀潤社；Ａ．Ｄｏｙｌｅ　ａｎｄ　Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，“Ｃｅｌｌ　＆　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ”，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｂｙ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｌｔｄ．，１９９６。（実施例１９）の生後６ヶ月齢のキメラマウス（ＫＰＧ０６；ＰＧ１６由来、キメラ率３０％）から脾臓をとりだし、塩化アンモニウム水溶液で処理した後ラット血清を１％含むＰＢＳ中で、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）抗体（ファーミンジェン、０１１２４Ａ）で細胞を染色した。洗浄後５％マウス血清を含むＰＢＳ中でビオチン標識抗ヒトＩｇＭ抗体（ファーミンジェン、０８０７２Ｄ）または対照としてビオチン標識抗ヒトλ鎖抗体（ファーミンジェン、０８１５２Ｄ）と反応させた後、ストレプトアビジンフィコエリスリン（ファーミンジェン、１３０２５Ｄ）で染色し、フローサイトメトリー（ベクトンデッキンソン、ＦＡＣＳｏｒｔ）で解析した。また対照としてヒト染色体を保持しないＩＣＲマウスも同様に解析した。第２２図に結果を示す。図中横軸はヒトＩｇＭ、縦軸はＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を示す。Ｂ細胞マーカーＣＤ４５Ｒ陽性（ＦＩＴＣ）でかつヒトＩｇＭ陽性（ＰＥ）である細胞集団が４％増加しており、これによってキメラマウスではヒト抗体μ鎖を細胞表面に発現している細胞の存在が確認された。
（実施例４６）ヒト抗体重鎖、κ鎖、λ鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡからのヒト抗体遺伝子可変領域クローニングと塩基配列決定
　（実施例２９）、（実施例２３）、（実施例３２）においてヒト抗体重鎖、κ鎖、λ鎖をそれぞれ発現することが確認されたキメラマウスＫ１５Ａ（１−４株由来、実施例１０に示した方法で作製）、Ｋ２−８（実施例１３で作製）、ＫＰＧ２２−２（実施例３１で作製）の脾臓由来ＲＮＡより（実施例５）と同様な方法で合成したｃＤＮＡについて、下記のプライマーによりＰＣＲを行ない、それぞれのヒト抗体遺伝子可変領域を増幅した。陰性コントロールとして非キメラマウスＩＣＲより取得した脾臓由来ｃＤＮＡを用いた。参考文献の記載のないプライマーはＧｅｎｂａｎｋ等のデータベースより入手した塩基配列をもとに作製した。
・
Ｋ１５Ａ
可変領域：ＶＨ１／５ＢＡＣＫ（５９℃，３５ｃｙｃｌｅｓ，Ｍａｒｋｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，２１，９８５−，１９９１），ＶＨ４ＢＡＣＫ（５９℃，３５ｃｙｃｌｅｓ，Ｍａｒｋｓら，前記），ＶＨ３ＢＡＣＫ（１ｓｔＰＣＲ：５９℃，３５ｃｙｃｌｅｓ，２ｎｄＰＣＲ：５９℃，３５ｃｙｃｌｅｓ，Ｍａｒｋｓら，前記）
・Ｋ２−８（軽鎖κ）
可変領域用：Ｖｋ１／４ＢＡＣＫ（５５℃，４０ｃｙｃｌｅｓ，Ｍａｒｋｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｎｏｌ．，２１，９８５−，１９９１），Ｖｋ２ＢＡＣＫ（５５℃，４０ｃｙｃｌｅｓ，Ｍａｒｋｓら，前記），Ｖｋ３ＢＡＣＫ（５５℃，４０ｃｙｃｌｅｓ，Ｍａｒｋｓら，前記）
・
ＫＰＧ２２−２
定常領域用：ＣλＭＩＸ（以下の３種のプライマーを等モル比で混合したもの）
可変領域用：Ｖλ１ＬＥＡ１（５５℃，４０ｃｙｃｌｅｓ，Ｗｉｌｌｉａｍｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１４５６−，１９９３），Ｖλ２ＭＩＸ（５５℃，４０ｃｙｃｌｅｓ，前記のＷｉｌｌｉａｍｓらの報告にあるＶλ２ＬＥＡ１，Ｖλ２ＪＬＥＡＤを等モル比で混合したもの），Ｖλ３ＭＩＸ（５５℃，４０ｃｙｃｌｅｓ，前記のＷｉｌｌｉａｍｓらの報告にあるＶλ３ＬＥＡ１，Ｖλ３ＪＬＥＡＤ，Ｖλ３ＢＡＣＫ４を等モル比で混合したもの）
　それぞれ定常領域用×可変領域用（重鎖３種、κ鎖３種、λ鎖３種）の組み合わせで９４℃１５秒、それぞれの可変領域プライマーに示したアニーリング温度１５秒、７２℃２０秒、それぞれの可変領域プライマーに示したサイクル数（パーキンエルマー社、サーマルサイクラー９６００使用）の条件で行なった。ＶＨ３ＢＡＣＫにおける２ｎｄＰＣＲは１ｓｔＰＣＲの増副産物を（ＨＩＧＭＥＸ１−１×ＶＨ３ＢＡＣＫ）のプライマーの組み合わせで再度増幅した。全ての増幅産物は１．５％アガロース電気泳動後、臭化エチジウム染色することにより検出した。その結果、全て組み合わせにおいて、期待される長さ（重鎖：４７０ｂｐ付近、軽鎖κ：４００ｂｐ付近、軽鎖λ：５１０ｂｐ付近）の増副産物が検出された。一方、陰性コントロールでは全てにおいて同じ位置に特異的増幅産物は検出されなかった。これらの増幅産物は、アガロースゲルよりｐｒｅｐ．Ａ．ｇｅｎｅ（バイオラッド）により抽出した後、制限酵素処理（重鎖：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｓｔＩ、軽鎖κ：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰｖｕＩＩ、軽鎖λ：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ）し、ｐＵＣ１１９（宝酒造）ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ部位（重鎖）、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｃＩＩ部位（κ鎖）、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＥｃｏＲＩ部位（λ鎖）にクローニングした。増幅産物の挿入されたプラスミドのうち以下のもの（右側に示したクローン数）について、自動蛍光シーケンサー（Ａｐｐｌｙｅｄ　Ｂｉｏ　Ｓｙｓｔｅｍ社）により、増幅産物の塩基配列を決定した。
　　・ＨＩＧＭＥＸ１−２×ＶＨ１／５ＢＡＣＫ：１０クローン、
　　・ＨＩＧＭＥＸ１−２×ＶＨ４ＢＡＣＫ：８クローン、
　　・ＨＩＧＭＥＸ１−２（２ｎｄ　ＰＣＲ，ＨＩＧＭＥＸ１−１）×ＶＨ３ＢＡＣＫ：５クローン
　　・ＫＣ２Ｈ×Ｖκ１／４ＢＡＣＫ：６クローン、
　　・ＫＣ２Ｈ×Ｖκ２ＢＡＣＫ：７クローン、
　　・ＫＣ２Ｈ×Ｖκ３ＢＡＣＫ：４クローン、
　　・ＣλＭＩＸ×Ｖλ１ＬＥＡ１：５クローン、
　　・ＣλＭＩＸ×Ｖλ２ＭＩＸ：６クローン、
　　・ＣλＭＩＸ×Ｖλ３ＭＩＸ：５クローン
　得られた塩基配列をＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｅｎｇｎｅｅｒｉｎｇ）により解析した結果、全てがヒト由来配列であり、κ鎖、λ鎖の全て、重鎖の計２３種中２１種が開始コドンから定常領域に至るまで終始コドンを含まない機能的配列であった。決定された配列からお互いに同一なものを除くと重鎖１７種、κ鎖１種、λ鎖１２種のそれぞれ異なる可変領域配列が同定された。
（実施例４７）ヒト抗体重鎖、κ鎖、λ鎖をそれぞれ発現するキメラマウス脾臓由来ｃＤＮＡからのヒト抗体遺伝子可変領域塩基配列の解析
　（実施例４６）において決定された塩基配列（重鎖１７クローン、κ鎖１１クローン、λ鎖１２クローン）について以下の点について解析を行った。
１．各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列Ｖ遺伝子断片を特定
２．各可変領域配列において使用されている既知の生殖系列Ｊ遺伝子断片を特定
３．重鎖可変領域において使用されている既知の生殖系列Ｄ断片を特定
４．１、２、３の結果をもとにした重鎖可変領域におけるＮ領域の付加の同定
５．各可変領域塩基配列から導かれるアミノ酸配列の決定
　その結果を（第１９表）に示す。１、２についてはＧｅｎｂａｎｋに登録されている生殖系列Ｖ及びＪ断片とのホモロジー検索をＤＮＡＳＩＳにより行い特定した。ＶＨ断片は（Ｃｏｏｋら，Ｎａｔｕｒｅ　ｇｅｎｔｉｃｓ，７，１６２−，１９９４）、Ｖκ断片は（Ｋｌｅｉｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２３，３　２４８−，１９９３）、Ｖλ断片は（Ｗｉｌｌｉａｍｓら，前記）の表記法に従い、各Ｖ断片ファミリー名と共に表中に記した。３については（Ｉｃｈｉｈａｒａら，Ｔｈｅ　ＥＭＢＯ　Ｊ．，７，１３，４１４１−，１９８８）の報告に記された生殖系列Ｄ断片とのホモロジー検索をＤＮＡＳＩＳにより行い、連続して８ｂｐ以上一致することを指標として決定し表中に記した。ＤＮ＊については（Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１３−，１９９４）で報告された新しいＤＮファミリー断片と考えられる。４については１（Ｖ）、２（Ｊ）、３（Ｄ）の結果をもとに、いずれの生殖系列断片にも見いだされない塩基配列をＮ領域とみなした。その結果、Ｄ領域の特定された１３種中１１種にＮ領域が観察され、その平均の長さは８．７ｂｐであった。５については各塩基配列をＤＮＡＳＩＳを使用して１文字表記のアミノ酸配列に変換した。表中にはＣＤＲ３領域のみ示した。表中右側に各可変領域のクローニングに使用したプライマー名及び各クローン名を記した。
（実施例４８）ＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞の抗体遺伝子（重鎖、軽鎖κ）ノックアウト用のターゲッティングベクターの作製
　マウス抗体遺伝子（重鎖、軽鎖κ）が破壊されたＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）細胞へＧ４１８耐性遺伝子でマーキングされたヒト１４番染色体断片（実施例９）およびピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒト２番（実施例１８）または２２番染色体（実施例３５）を導入することが可能となる。このようなヒト１４番＋２番またはヒト１４番＋２２番染色体を導入したマウス抗体遺伝子（重鎖、軽鎖κ）遺伝子破壊ＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞を用いて、（重鎖＋κ鎖：実施例１９、重鎖＋λ鎖：実施例３６）の方法によって作成されたキメラマウスでは、主に重鎖と軽鎖がヒト由来の抗体が産生されることが期待される。以下に示す第２３図〜第２７図における制限酵素の略称等は、以下のとおりである。
制限酵素：Ｋｐ：ＫｐｎＩ、Ｂ：ＢａｍＨＩ、ＲＩ：ＥｃｏＲＩ、ＲＶ：ＥｃｏＲＶ、Ｎ：ＮｏｔＩ、ＳＩＩ：ＳｃａＩＩ、Ｓｃａ：ＳｃａＩ、Ｓｆｉ：ＳｆｉＩ、Ｓｍ：ＳｍａＩ、Ｘ：ＸｈｏＩ、ＳＩ：ＳａｌＩ、ｄＫｐ：ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ＫｐｎＩ、（Ｘ）：ラムダベクター由来のＸｈｏＩ切断部位。
点線部分：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩＩ（＋）プラスミドＤＮＡ
１．Ｇ４１８耐性遺伝子の両側にＬｏｘＰ配列を入れたＬｏｘＰ−ｐｓｔＮＥＯプラスミドの作製
　ＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）細胞の抗体遺伝子をノックアウトした後、Ｇ４１８耐性遺伝子を除去するためにＧ４１８耐性遺伝子（実施例１）の両端にＣｒｅリコンビネース（Ｓａｕｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５，５１６６−，１９８８）の認識配列であるＬｏｘＰ配列（Ｓａｕｅｒら、前記）を同じ向きに入れる必要がある。ｐＳＴｎｅｏＢプラスミドＤＮＡ（実施例１）より制限酵素ＸｈｏＩでｐｓｔＮＥＯ遺伝子を切り出し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を精製したのちＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ社製Ｂｌｕｎｔｉｎｇ　ｅｎｄキット）により両端を平滑化した。ＬｏｘＰ配列が入ったプラスミドＤＮＡ　ｐＢＳ２４６（Ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＢＳ２４６，ｌｏｘＰ２　Ｃａｓｓｅｔｔｅ　Ｖｅｃｔｏｒ，Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ４９５９３１７）は、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社より購入した。このプラスミドのＥｃｏＲＩ及びＳｐｅＩ切断部位へＸｈｏＩリンカーＤＮＡを挿入することによってＸｈｏＩ認識配列に変更したものを使用した。この改変ｐＢＳ２４６のＥｃｏＲＶ切断部位へ上記ｐｓｔＮＥＯ　ＤＮＡ断片を挿入してプラスミドＬｏｘＰ−ｐｓｔＮＥＯを得た（第２３図）。
２．Ｃ５７ＢＬ／６由来抗体重鎖Ｃμ（ＩｇＭ定常領域）、軽鎖Ｊκ−Ｃκ（Ｉｇκ連結領域および定常領域）を含むゲノムＤＮＡクローンの単離
　ＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとＣＢＡマウスのＦ１マウス由来であることから、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のゲノムＤＮＡクローンを用いて抗体遺伝子ノックアウト用ベクターを作製することにした。ゲノムＤＮＡライブラリーは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社ａｄｕｌｔ　Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ　ｍａｌｅ　ｌｉｖｅｒ由来ラムダＤＮＡライブラリーを使用した。スクリーニングのためにプローブとしては、以下の合成ＤＮＡ配列（６０ｍｅｒ）を用いた。
　単離されたラムダクローンを解析して、重鎖Ｃμまたは軽鎖Ｊκ−Ｃκを含むＤＮＡ断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫＩＩ（＋）プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）へサブクローニングした（重鎖Ｃμ：第２４図；軽鎖Ｊκ−Ｃκ：第２５図）。これらのＤＮＡ断片を用いて、以下のようにＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞中のマウス抗体遺伝子破壊のためのターゲッティングベクターを作製した。
３．マウス抗体重鎖遺伝子破壊用ベクタープラスミドの作製
　２で調製したマウス抗体重鎖定常領域を含むゲノムＤＮＡのＣμをコードする領域の内で、第２〜第４エクソンが含まれるＤＮＡ断片（ＢａｍＨＩ〜ＸｈｏＩ）を１で作製したＬｏｘＰ−ｐｓｔＮＥＯ遺伝子と置き換えた（第２６図）。ｐｓｔＮＥＯの転写方向は、抗体遺伝子の転写方向とは逆向きとなっている。このプラスミドＤＮＡは、大腸菌ＪＭ１０９を用いて増幅し、セシウムクロライド平衡遠心により精製した（細胞工学実験操作入門、１９９２年講談社刊）。精製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＳａｃＩＩにより、一箇所切断してＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞へのトランスフェクションに使用した。形質転換体ＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞の中から抗体重鎖部分がターゲッティングベクターと相同組換えが起こったクローンを検出するための形質転換ゲノムＤＮＡサザンブロット用のプローブとして、Ｃμの上流に存在するスイッチ領域のＤＮＡ断片（約５００塩基対）を用いた。このＤＮＡ断片は以下の条件で１２９マウスゲノムＤＮＡをＰＣＲ増幅して得た。
テンプレートＤＮＡ：ＥｃｏＲＩ消化１２９マウスゲノムＤＮＡ１μｇ
反応バッファー、デオキシヌクレオチドミックス、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｋａｒａ社製のものを使用。
反応条件：９４度Ｃ，３分，１回→９４度Ｃ，１分；５５度Ｃ，２分；７２度Ｃ，２分；３回→９４度Ｃ，４５秒；５５度Ｃ，１分；７２度Ｃ，１分；３６回
　増幅されたＤＮＡがＧｅｎｂａｎｋのデータベースにあるとおり、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで一箇所切断されえることを確認して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのＥｃｏＲＶ切断部位へサブクローニングした。このプラスミドＤＮＡ（Ｓ８）を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断して、アガロースゲル電気泳動でＰＣＲ断片（約５５０塩基対）を精製したものをプローブとした。ターゲッティングベクターで形質転換したＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、上記プローブで検出する。
４．マウス抗体遺伝子軽鎖ｋ破壊用ベクターの作製
　２で調製したマウス抗体軽鎖κＪ領域および定常領域を含むゲノムＤＮＡのＪ領域（Ｊ１〜Ｊ５）が含まれるＤＮＡ断片（ＥｃｏＲＩ〜ＳａｃＩＩ）を１で作製したＬｏｘＰ−ｐｓｔＮＥＯ遺伝子と置き換えた（第２７図）。ｐｓｔＮＥＯの転写方向は、抗体遺伝子の転写方向と同じ向きとなっている。このプラスミドＤＮＡは、大腸菌ＪＭ１０９を用いて増幅し、セシウムクロライド平衡遠心により精製した。精製したプラスミドＤＮＡは、制限酵素ＫｐｎＩにより、一箇所切断してＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞へのトランスフェクションに使用した。形質転換体ＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞の中から抗体重鎖部分がターゲッティングベクターと相同組換えが起こったクローンを検出するための形質転換体ゲノムＤＮＡサザンブロット用のプローブとして、軽鎖Ｊκ−ＣκゲノムＤＮＡ（第２５図参照）の３′端のＤＮＡ断片（ＸｈｏＩ〜ＥｃｏＲＩ；約１．４ｋ塩基対）を用いた。ターゲッティングベクターで形質転換したＴＴ２（またはＴＴ２Ｆ）ＥＳ細胞のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩで消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、上記プローブで検出する。
（実施例４９）マウスＥＳ細胞抗体重鎖遺伝子破壊株の取得
　抗体重鎖遺伝子相同組換え体取得の為、（実施例４８）−３で作成した抗体重鎖ターゲッティングベクターを制限酵素ＳａｃＩＩ（宝酒造）で線状化し、（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，羊土社，１９９５）の方法に従いマウスＥＳ細胞ＴＴ２Ｆへ導入した。ＴＴ２Ｆ細胞をトリプシン処理し、２．５ｘ１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから５μｇＤＮＡを加え、ジーンパルサー（バイオラッド、抵抗器ユニット接続せず）を用いてエレクトロポレーションを行なった。９６０μＦの要領で２５０Ｖの電圧を４ｍｍ長のエレクトロポレーションセルを用いて室温で印加した。エレクトロポレーションした細胞を２０ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞をまいた１００ｍｍ組織培養プラスチックシャーレ（コーニング）２枚に播種した。同様に１０，１５μｇＤＮＡを用いた実験も行った。１日後に３００μｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ，シグマ）を含む培地と置き換えた。７〜９日後に生じたコロニー計１７６個をピックアップし、それぞれを１２穴プレートでコンフルーエントになるまで増殖させ、その４／５を０．２ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ〈シグマ〉）に懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。残りの１／５は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して（実施例２）に示した方法でゲノムＤＮＡを取得した。これらのＧ４１８耐性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、（実施例４８）−３に示したプローブで相同組換え体を検出した。その結果１７６株中３株が相同組換え体であるという結果を得た。野生型ＴＴ２Ｆ細胞及び相同組換え体＃１３１、＃１４１のサザンブロット解析の結果を（第２８図）左側３レーンに示す。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ消化により２本のバンド（ａ、ｂ）が検出される。相同組換え体においては、これらのいずれかのバンドが消失し、新たに下部にバンド（ｃ）が現われることが予想される。図中＃１３１，＃１４１においてａのバンドが消失し、新たにｃのバンドが出現している。図中左側にはＤＮＡの大きさを示した。すなわちこれらのクローンは抗体重鎖遺伝子の片方のアレルが相同組換えにより破壊されたものである。
（実施例５０）抗体重鎖相同組換え体ＥＳ細胞からのキメラマウス作成
　（実施例４９）で得られた抗体重鎖相同組換え体ＴＴ２Ｆ細胞株＃１３１を凍結ストックより立ち上げ、ＩＣＲまたはＭＣＨ（ＩＣＲ）（日本クレア社）雌雄マウスの交配により得られた８細胞期胚に胚あたり１０〜１２個注入した。ＥＳ細胞用培地（実施例９）で一晩培養して胚盤胞に発生させた後、偽妊娠処理後２．５日の仮親ＩＣＲマウス（日本クレア社）の子宮に片側の子宮あたり約１０個のインジェクション胚を移植した。計９４個の注入胚を移植した結果、２２匹の子マウスが誕生した。キメラ個体は、毛色において宿主胚（ＩＣＲ）由来の白色の中にＴＴ２Ｆ細胞由来の野生色（濃茶）が認められるかどうかにより判定される。誕生した２２匹のうち毛色に明らかに野生色の部分のある、すなわち、ＥＳ細胞の貢献の認められる個体は１８匹であった。うち１６個体は毛色の８０％以上が野生色の（ＥＳ細胞に由来する）雌キメラマウスであった。この結果より、抗体重鎖相同組換え体ＥＳ細胞株＃１３１はキメラ形成能を保持していることが確認された。得られたキメラマウスのうち多くの個体は非常に高い貢献率を示す雌であるので、ＥＳ細胞が機能的な生殖細胞（卵子）に分化している可能性が高い。キメラマウスのうち１００％の貢献率を示す雌キメラ２個体をＭＣＨ（ＩＣＲ）雄マウスと交配した結果、生まれた子マウスはすべて野生色を示した。これらの子マウスは＃１３１由来であり（実施例４２参照）、２匹に１匹の割合で破壊された抗体重鎖アレルが伝達していると考えられる。
（実施例５１）抗体重鎖相同組換え体からの２重破壊株の取得
　片側アレルがＧ４１８耐性遺伝子の挿入により破壊されたＥＳ細胞株において、培養液中のＧ４１８濃度を上げて培養することにより得られる高濃度Ｇ４１８耐性株をスクリーニングすれば両側アレル共に破壊された株を取得することが可能なことが報告されている（相沢慎一ら、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５）。これに基づき、我々はＴＴ２Ｆ抗体重鎖相同組換え体＃１３１，＃１４１について両側アレルの破壊株取得の為、以下の実験を行った。まず、＃１３１，＃１４１両株について致死Ｇ４１８濃度検定のため３５ｍｍシャーレ各１０枚（この実施例においては栄養細胞はマイトマイシン処理をしていないＧ４１８耐性初代培養細胞を使用した。実施例９参照）に１枚あたり約１００個の細胞を播種し、０，０．５，１，２，３，５，８，１０，１５，２０ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ、シグマ）をそれぞれ含むＥＳ培地中で１０日間培養した。その結果３ｍｇ／ｍｌの濃度までは明らかなコロニーが認められたが、５ｍｇ／ｍｌではコロニー形成は認められなかった。この結果をもとに最小致死濃度を５ｍｇ／ｍｌと決定し、４，５，６，７，８ｍｇ／ｍｌの各濃度で高濃度Ｇ４１８耐性株の選抜を行った。＃１３１，＃１４１それぞれについて１００ｍｍシャーレ計１０枚に１枚当たり約１０６個の細胞を播種し、上記の各濃度のＧ４１８を含むＥＳ培地（５段階、各濃度シャーレ２枚づつ）により培養した。培養開始１２日後に７ｍｇ，８ｍｇ／ｍｌのシャーレにおいて明らかなコロニー（＃１３１：１２株、＃１４１：１０株）をピックアップし、（実施例４９）と同様に凍結保存、ＤＮＡ取得を行った。これらの高濃度Ｇ４１８耐性株ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、（実施例４８）−３に示したプローブで両側アレルの破壊された株を検出した。その結果＃１３１株由来の１株（＃１３１−３）が両側アレル破壊株であるという結果を得た。＃１３１由来の６株についてのサザンブロット解析の結果を（第２８図）に示す。野生型ＴＴ２Ｆ細胞ではＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ消化により２本の野生型バンド（ａ、ｂ）が検出される。片側アレル相同組換え体（＃１３１，＃１４１）においては、上部のバンドａが消失し、新たにバンドｃが現われる（実施例４９）。さらに両側アレルが破壊されることにより、もう一方の野生型バンドｂが消失し、破壊型バンドｃのみとなることが予想される。図中３（＃１３１−３）のクローンにおいてこのバンドパターンが観察された。すなわちこのクローンは抗体重鎖遺伝子の両方のアレルが破壊されたものである。
（実施例５２）抗体重鎖欠損ホモ接合体ＴＴ２Ｆ細胞株からのＧ４１８耐性マーカー遺伝子の除去
　（実施例５１）で取得された抗体重鎖両側アレル破壊株（高濃度Ｇ４１８耐性株＃１３１−３）のＧ４１８耐性マーカー遺伝子を以下の手順により除去した。Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子の両側に挿入したｌｏｘＰ配列（実施例４８−１）の間で部位特異的組換えを起こすＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＢＳ１８５（ＢＲＬ）を（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５、及び高津聖志ら、実験医学別冊、免疫研究の基礎技術、ｐ２５５−、１９９５、羊土社）の方法に従い＃１３１−３株へ導入した。＃１３１−３細胞をトリプシン処理し、２．５ｘ１０７個／ｍｌとなるようにＨＢＳに懸濁してから３０μｇのｐＢＳ１８５ＤＮＡを加え、ジーンパルサー（バイオラッド、抵抗器ユニット接続せず）を用いてエレクトロポーションを行なった。９６０μＦの要領で２５０Ｖの電圧を４ｍｍ長のエレクトロポレーションセル（実施例１）を用いて印加した。エレクトロポレーションした細胞を５ｍｌのＥＳ培地に懸濁し、あらかじめフィーダー細胞をまいた６０ｍｍ組織培養プラスチックシャーレ（コーニング）１枚に播種した。２日後に細胞をトリプシン処理し、フィーダー細胞をまいた１００ｍｍシャーレ３枚にそれぞれシャーレ１枚当たり１００、２００、３００細胞となるように再度播種した。ジーンパルサーの設定（抵抗器ユニット接続、抵抗値無限大）のみ変更した条件でも同様に行った。７日後に生じたコロニー計９６個をピックアップし、トリプシン処理した後２つに分け、フィーダー細胞をまいた４８穴プレート及びゼラチンコート処理のみを行った４８穴プレート２枚にそれぞれ播種した。後者は３００μ／ｍｌのＧ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ、シグマ）を含む培地で３日間培養し、その生存率でＧ４１８耐性を判定した。その結果６クローンがＧ４１８存在下で死滅した。これらのＧ４１８感受性株を３５ｍｍシャーレでコンフルーエントになるまで増殖させ、その４／５を０．５ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ〈シグマ〉）に懸濁し、−８０℃にて凍結保存した。残りの１／５は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して（実施例２）に示した方法でゲノムＤＮＡを取得した。これらのＧ４１８感受性ＴＴ２Ｆ細胞株ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むｐＳＴｎｅｏＢ由来３．２ｋｂ　ＸｈｏＩ断片（プローブＡ）でＧ４１８耐性遺伝子の除去を確認した。その結果、＃１３１−３において観察される、プローブＡとハイブリダイズするバンドが、感受性株においては全く検出されなかった。これらの結果より、取得されたＧ４１８感受性株において確かにＧ４１８耐性マーカー遺伝子が除去されていることが確認された。さらに上記と同様な方法でｐＢＳ１８５ＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化したプローブＢを用いてサザン解析を行った結果、これらＧ４１８感受性株にプローブＢとハイブリダイズする特異的なバンドは検出されなかったことから、Ｃｒｅレコンビナーゼを含むｐＢＳ１８５は感受性株染色体に挿入されていないと考えられる。すなわち、これらの感受性株は実施例４８−４に示した抗体軽鎖ノックアウトベクター（Ｇ４１８耐性遺伝子の両側にｌｏｘＰ配列が存在する）による形質転換を行うことができる。
（実施例５３）抗体重鎖欠損ＥＳ細胞へのヒト１４番染色体（抗体重鎖）の導入
　（実施例５２）で得られた、内在性の抗体重鎖を欠損するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ由来、Ｇ４１８感受性）に（実施例９）で示した通りにＧ４１８耐性遺伝子によりマーキングされたヒト１４番染色体（抗体重鎖遺伝子を含む）をミクロセル法により導入する。得られるＧ４１８耐性株においてＰＣＲ解析等（実施例９）によりヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト１４番染色体（断片）の保持が確認される。
（実施例５４）ヒト１４番染色体（断片）を保持する抗体重鎖欠損ＥＳ細胞株へのヒト２番染色体断片あるいは２２番染色体の導入
　（実施例５３）で得られた、ヒト１４番染色体断片を保持する抗体重鎖欠損マウスＥＳ細胞株（Ｇ４１８耐性）に（実施例１８、３５）で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子によりマーキングされたヒト２番染色体断片（抗体軽鎖κ遺伝子を含む）あるいはヒト２２番染色体（抗体軽鎖λ遺伝子を含む）をミクロセル法により導入する。得られるピューロマイシン、Ｇ４１８二重薬剤耐性株においてＰＣＲ解析等（実施例１８、３５）によりヒト１４番染色体（断片）及び２番染色体断片あるいは２２番染色体（断片）の保持が確認される。
（実施例５５）ヒト抗体重鎖遺伝子を含む１４番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖欠損マウスＥＳ細胞からのキメラマウス作成
　（実施例５３）で取得されるヒト抗体重鎖遺伝子を含む１４番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作成は（実施例１０）で示した方法により行う。ここで得られるキメラマウスにおいては、ＥＳ細胞株由来のＢ細胞で産生されるヒト抗体重鎖が（実施例１４）で示した方法により検出される。また、このＥＳ細胞由来のＢ細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子は導入染色体上のヒト由来のもののみであるので、ＥＳ細胞株由来Ｂ細胞の多くはヒト抗体重鎖を産生する。
（実施例５６）ヒト１４番＋２番、１４番＋２２番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖欠損マウスＥＳ細胞からのキメラマウス作成
　（実施例５４）で取得されるヒト１４番＋２番、１４番＋２２番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖遺伝子欠損マウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作成は（実施例１９、３６）等で示した方法により行う。ここで得られるキメラマウスにおいては、ＥＳ細胞株由来のＢ細胞でヒト抗体重鎖及び軽鎖κあるいは軽鎖λが（実施例１４、２３、３２）で示した方法により検出される。また、（実施例５５）と同様にこのＥＳ細胞由来のＢ細胞において機能的な抗体重鎖遺伝子は導入染色体上のヒト由来のもののみであるので、ＥＳ細胞由来Ｂ細胞の多くはヒト抗体重鎖を産生する。さらに、（実施例３７、３８）で示したように重鎖、軽鎖が共にヒト由来である完全なヒト抗体分子が検出される。
（実施例５７）ヒト１４番＋２番、１４番＋２２番染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖欠損マウスＥＳ細胞由来キメラマウスからのヒト抗体産生ハイブリドーマ取得
　（実施例１５、２５、３４）と同様に（実施例５６）で作成されるキメラマウスに目的とする抗原で免疫し、脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作成する。１〜３週間培養し培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析する。ＥＬＩＳＡ法は（実施例１４、１５、２１、２４、２５、３３、３４、３７、３８）に示した方法で行ない、ヒト抗体陽性及びヒト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
（実施例５８）抗体重鎖欠損ホモ接合体マウスＥＳ細胞からの抗体軽鎖遺伝子破壊株の取得
　（実施例５２）で取得した抗体重鎖欠損ホモ接合体ＴＴ２Ｆ細胞株（Ｇ４１８感受性）においてさらに抗体軽鎖遺伝子を破壊した相同組換え体を以下の手順で取得する。（実施例４８−４）で作成した抗体軽鎖ターゲッティングベクターを制限酵素ＫｐｎＩ（宝酒造）で線状化し、（相沢慎一、バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲティング，羊土社，１９９５）の方法に従い上記ＴＴ２Ｆ細胞株（Ｇ４１８感受性）へ導入する。７〜９日後に生じたコロニーをピックアップし、（実施例４９）に示した方法で凍結保存、ゲノムＤＮＡを取得する。Ｇ４１８耐性株ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロット解析を行ない、（実施例４８−４）に示したプローブで相同組換え体を検出する。
（実施例５９）抗体軽鎖相同組換え体からの２重破壊株の取得
　（実施例５８）で得られたＴＴ２Ｆ抗体軽鎖相同組換え体（かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体）について軽鎖両側アレルの破壊株を以下の手順により取得する。（実施例５１）と同様な方法で高濃度Ｇ４１８耐性株を取得し、凍結保存、ＤＮＡ取得を行なう。高濃度Ｇ４１８耐性株ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、（実施例４８−４）に示したプローブで両側アレルの破壊された株を検出する。
（実施例６０）抗体軽鎖欠損ホモ接合体（かつ抗体重鎖欠損ホモ接合体）ＴＴ２Ｆ細胞株からのＧ４１８耐性マーカー遺伝子の除去
　（実施例５９）で取得された抗体軽鎖両側アレル破壊株（高濃度Ｇ４１８耐性株）のＧ４１８耐性マーカー遺伝子を（実施例５２）で示した手順により除去する。Ｇ４１８耐性マーカー遺伝子の両側に挿入したｌｏｘＰ配列（実施例４８−１）の間で部位特異的組換えを起こすＣｒｅレコンビナーゼ遺伝子を含む発現ベクターｐＢＳ１８５（ＢＲＬ）を（実施例５２）の方法に従い上記の株へ導入する。（実施例５２）と同様に得られるＧ４１８感受性株を３５ｍｍシャーレでコンフルーエントになるまで増殖させ、その４／５を０．５ｍｌの保存用培地（ＥＳ培地＋１０％ＤＭＳＯ〈シグマ〉）に懸濁し、−８０℃にて凍結保存する。残りの１／５は１２穴ゼラチンコートプレートに播種し、２日間培養して（実施例２）に示した方法でゲノムＤＮＡを取得する。これらのＧ４１８感受性ＴＴ２Ｆ細胞ゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造）で消化し、アガロースゲル電気泳動で分離後サザンブロットを行ない、Ｇ４１８耐性遺伝子を含むｐＳＴｎｅｏＢ由来３．２ｋｂＸｈｏＩ断片をプローブとし、Ｇ４１８耐性遺伝子の除去を確認する。
（実施例６１）抗体重鎖、軽鎖欠損ＥＳ細胞株へのヒト１４番染色体（抗体重鎖）の導入
　（実施例６０）で得られた。内在性の抗体重鎖及び軽鎖の両者を欠損するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ由来、Ｇ４１８感受性）に（実施例９）で示した通りにＧ４１８耐性遺伝子によりマーキングされたヒト１４番染色体（ヒト抗体重鎖遺伝子を含む）をミクロセル法により導入する。得られるＧ４１８耐性株においてＰＣＲ解析等（実施例９）によりヒト抗体重鎖遺伝子を含むヒト１４番染色体（断片）の保持が確認される。
（実施例６２）抗体重鎖、軽鎖欠損かつヒト１４番染色体（抗体重鎖）を保持するＥＳ細胞株へのヒト２番染色体（軽鎖κ）の導入
　（実施例６１）で得られた、内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒト１４番染色体を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ由来、Ｇ４１８耐性）に（実施例１８）で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒト２番染色体（ヒト抗体軽鎖κ遺伝子を含む）部分断片をミクロセル法により導入する。得られるピューロマイシン、Ｇ４１８二重薬剤耐性株においてＰＣＲ解析等（実施例１８）によりヒト１４番染色体（断片）及び２番染色体断片の保持が確認される。
（実施例６３）抗体重鎖、軽鎖欠損かつヒト１４番染色体（抗体重鎖）を保持するＥＳ細胞株へのヒト２２番染色体（軽鎖λ）の導入
　（実施例６１）で得られた、内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒト１４番染色体を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ由来、Ｇ４１８耐性）に（実施例３５）で示した通りにピューロマイシン耐性遺伝子でマーキングされたヒト２２番染色体（ヒト抗体軽鎖λ遺伝子を含む）をミクロセル法により導入する。得られるピューロマイシン、Ｇ４１８二重耐性株においてＰＣＲ解析等（実施例３５）によりヒト１４番染色体（断片）及び２２番染色体（断片）の保持が確認される。
（実施例６４）ヒト２番（抗体軽鎖κ）、１４番（抗体重鎖）、２２番（抗体λ鎖）染色体あるいはその部分断片を同時に保持する内在性抗体重鎖、軽鎖欠損マウスＥＳ細胞の取得
　３種のヒト染色体を同時に保持するマウスＥＳ細胞を得るために、ヒト２番あるいは２２番染色体をブラストサイジン耐性（Ｉｚｕｍｉら、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，１９７，２２９，１９９１）、ハイグロマイシン耐性（Ｗｉｎｄら、Ｃｅｌｌ，８２，３２１−，１９９５）等のマーカー遺伝子の挿入によりマーキングする。これは（実施例１６、２６）に示した方法により行う。（実施例６２）で得られた、内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損でありかつヒト１４番染色体（断片）及び２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ由来、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）に（実施例９）で示した方法と同様にブラストサイジン耐性あるいはハイグロマイシン耐性等でマーキングされたヒト２２番染色体（ヒト抗体軽鎖λ遺伝子を含む）を導入する。ＥＳ細胞培養のフィーダー細胞はそれぞれの選択マーカーに適したものを使用する。ハイグロマイシン耐性マーカーを使用する場合は、そのマーカーを保持し、発現するトランスジェニックマウス系統より得た初代培養繊維芽細胞（Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．７，１２７３−，１９９５）を使用する。得られるＧ４１８、ピューロマイシン、ハイグロマイシン（あるいはブラストサイジン）三重耐性株は上記３種のヒト染色体（断片）を保持していることがＰＣＲ解析等（実施例９、１８、３５）により確認される。（実施例６３）で得られた内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損でありかつヒト１４番染色体（断片）及び２２番染色体部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株（ＴＴ２Ｆ由来、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）へのハイグロマイシンあるいはブラストサイジン耐性遺伝子でマーキングされたヒト２番染色体断片の導入も同様に行う。
（実施例６５）ヒト抗体遺伝子（重鎖＋軽鎖）を含む染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖遺伝子欠損マウスＥＳ細胞からのキメラマウス作成
　（実施例６１、６２、６３、６４）で取得されるヒト抗体遺伝子を含む染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖遺伝子欠損マウスＥＳ細胞株からのキメラマウス作成は（実施例１０）等で示した方法により行う。ここで得られるキメラマウスにおいては、宿主胚由来のＢ細胞で産生されるマウス抗体とＥＳ細胞株由来のＢ細胞で主に産生されるヒト抗体が（実施例１４、２３、３２）で示した方法により検出される。また、このＥＳ細胞由来のＢ細胞において機能的な抗体重鎖及び軽鎖κ遺伝子は導入染色体上のヒト由来のもののみであるので、ＥＳ細胞由来のＢ細胞の多くはヒト抗体重鎖及び軽鎖κを産生する（Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−，１９９４）。さらに、（実施例３７、３８）で示した方法により重鎖、軽鎖が共にヒト由来である完全なヒト抗体分子が検出される。
（実施例６６）ヒト抗体遺伝子（重鎖＋軽鎖）を含む染色体（断片）を保持する内在性抗体重鎖、軽鎖遺伝子欠損マウスＥＳ細胞由来キメラマウスからのヒト抗体産生ハイブリドーマ取得
　（実施例２５）と同様に（実施例６５）で得られるキメラマウスに目的とする抗原で免疫し、脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作成する。１〜３週間培養し培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析する。ＥＬＩＳＡ法は（実施例１４、１５、２１、２２、２３、２４、２５、３３、３４、３７、３８）に示した方法で行ない、ヒト抗体陽性及びヒト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
（実施例６７）重鎖遺伝子欠損宿主胚とのキメラマウス作成
　（実施例４９）で作成した内在性抗体重鎖片側アレル欠損ＴＴ２Ｆ細胞株由来キメラマウスの子孫のうち野性色を示すものについてサザン解析あるいはＰＣＲ（実施例４９）等により欠損アレルを保持する個体を選抜する（期待される確率は１／２である）。これらの抗体重鎖欠損ヘテロ接合体の雌雄個体の交配により生まれる子マウスについてサザン解析（実施例４９参照）、リンパ球表面でのμ鎖発現（Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−，１９９１）等の解析を行い、両側アレルが欠損し、自身の機能的な抗体をほとんど産生できない抗体重鎖欠損ホモ接合体を得ることができる（期待される確率は１／４である、膜型μ鎖欠損マウスにおける結果：Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−，１９９１参照）。清浄な環境で飼育したホモ接合体雌雄個体の交配により得られる胚をキメラマウス作成の際の宿主として利用できる。この場合キメラマウスにおいて機能的なＢ細胞はほとんど注入したＥＳ細胞に由来する。ＲＡＧ−２欠損マウス（Ｓｈｉｎｋａｉら，Ｃｅｌｌ，６８，８５５−，１９９２）等、機能的なＢ細胞を自ら作ることができない他のマウス系統もこの目的に同様に利用できる。このシステムにおいて（実施例６２、６３、６４）で得られる内在性抗体重鎖及び軽鎖欠損かつヒト１４番＋２番あるいは１４番＋２２番あるいは１４番＋２番＋２２番染色体（断片）を保持するマウスＥＳ細胞株を使用し（実施例１０）等に示した方法でキメラマウスを作成する。得られるキメラマウスではＥＳ細胞由来のＢ細胞において機能的なヒト抗体重鎖（１４番染色体上）、軽鎖κ（２番染色体上）、軽鎖λ（２２番染色体上）遺伝子により主にヒト重鎖及びヒト軽鎖からなる抗体を生産する。
（実施例６８）ヒト１４番染色体（断片）導入ＥＳ細胞由来キメラマウス子孫におけるヒト染色体の保持
　（実施例９）と同様な方法及び、（実施例９）のマウスＥＳ細胞をＴＴ２Ｆ（３９、ＸＯ、実施例３９）に置き換えた方法を利用して得られるヒト１４番染色体（断片）を保持するキメラマウスと野生型ＩＣＲマウス（アルビノ、日本クレア社）を混合して交配する。誕生する野生色の子マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡについてヒト１４番染色体断片の保持をＰＣＲ法により検討する（実施例９、４２、４３参照）。ヒト１４番染色体（断片）を保持するマウスＥＳ細胞株は（実施例４２）及び（実施例４３）で示した通りにキメラマウス中で機能的な卵子あるいは精子に分化し、それ由来の子孫にヒト１４番染色体（断片）が伝達可能である。すなわちヒト抗体重鎖遺伝子を含む１４番染色体（断片）を保持する継代可能なマウス系統を確立することができる。本実施例及び以下の実施例６９〜７４において、ヒト１４番染色体（断片）はヒト抗体重鎖遺伝子、ヒト２番染色体（断片）はヒト抗体κ鎖遺伝子を、ヒト２２番染色体（断片）はヒト抗体λ遺伝子を、それぞれ含むものを指す。
（実施例６９）ヒト２２番染色体（断片）導入ＥＳ細胞由来キメラマウス子孫におけるヒト染色体の保持
　（実施例３０）と同様な方法及び、（実施例３０）のマウスＥＳ細胞をＴＴ２Ｆ（３９、ＸＯ）に置き換えた方法を利用して得られるヒト２２番染色体（断片）を保持するキメラマウスとＩＣＲマウスを混合して交配する。誕生する野生色の子マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡについてヒト２２番染色体断片の保持をＰＣＲ法により検討する（実施例３０、４２、４３参照）。ヒト２２番染色体あるいはその部分断片を保持するマウスＥＳ細胞株は（実施例４２）及び（実施例４３）で示した通りにキメラマウス中で機能的な卵子あるいは精子に分化し、それ由来の子孫にヒト２２番染色体（断片）が伝達可能である。すなわちヒト抗体軽鎖λ遺伝子を含む２２番染色体（断片）を保持する継代可能なマウス系統を確立することができる。
（実施例７０）ヒト２番染色体断片及び１４番染色体（断片）を同時に保持するマウス個体の交配による作成
　（実施例４２）あるいは（実施例４３）で得られたヒト２番染色体断片を保持するマウス系統と（実施例６８）で得られるヒト１４番染色体（断片）を保持するマウス系統を交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡをＰＣＲ法等（実施例９、４２、４３）により解析して、ヒト２番染色体部分断片及びヒト１４番染色体（断片）を同時に保持する個体を得る。
（実施例７１）ヒト２２番染色体（断片）及び１４番染色体（断片）を同時に保持するマウス個体の交配による作成
　（実施例６９）で得られるヒト２２番染色体（断片）を保持するマウス系統と（実施例６８）で得られるヒト１４番染色体（断片）を保持するマウス系統を交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡをＰＣＲ法等（実施例３０、４２、４３）により解析して、ヒト２２番染色体（断片）及びヒト１４番染色体（断片）を同時に保持する個体を得る。
（実施例７２）ヒト２番染色体断片、１４番染色体（断片）及び２２番染色体（断片）を同時に保持するマウス個体の交配による作成
　（実施例７１）で得られるヒト２２番染色体（断片）及びヒト１４番染色体（断片）を保持するマウス系統を（実施例４２、４３）で得られたヒト２番染色体断片を保持するマウス系統と交配することにより生まれる子マウスの尻尾より調製したゲノムＤＮＡをＰＣＲ法等（実施例９、３０、４２、４３）により解析して、ヒト２２番染色体（断片）及びヒト１４番染色体（断片）及びヒト２番染色体部分断片の３種のヒト染色体を同時に保持する個体を得る。あるいは（実施例７０）で得られるヒト２番染色体（断片）及びヒト１４番染色体（断片）を保持するマウス系統と（実施例６９）で得られるヒト２２番染色体断片を保持するマウス系統と交配することによっても同様に３種のヒト染色体を同時に保持するマウス個体を得る。
（実施例７３）完全なヒト抗体を主として産生するマウス系統の交配による作成
　ヒト２番＋１４番（実施例７０）、１４番＋２２番（実施例７１）、２番＋１４番＋２２番（実施例７２）染色体を保持するマウス系統を内在性抗体重鎖（実施例６７；Ｋｉｔａｍｕｒａら，Ｎａｔｕｒｅ，３５０，４２３−，１９９１）、軽鎖κ（Ｚｏｕら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１２，８１１−，１９９３；Ｃｈｅｎら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，１２，８２１−，１９９３）遺伝子を欠損しているマウス系統と交配を繰り返し、ヒト２番＋１４番、１４番＋２２番、または２番＋１４番＋２２番染色体を保持するマウスをＰＣＲ解析等（実施例９、３０、４２、４３）により選抜し、主に完全なヒトを産生するマウス系統を確立する（Ｇｒｅｅｎら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７，１３−，１９９４，Ｌｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−，１９９４）。
（実施例７４）交配により得られるヒト抗体遺伝子を含むヒト染色体を保持するマウス系統からのヒト抗体産生ハイブリドーマ取得
　（実施例２５）と同様に（実施例４２、４３、６８、６９、７０、７１、７２、７３）で得られるヒト抗体遺伝子を含むヒト染色体を保持するマウス個体に目的とする抗原で免疫し、脾臓を取り出し、ミエローマ細胞と細胞融合し、ハイブリドーマを作成する。１〜３週間培養し培養上清をＥＬＩＳＡ法で解析する。ＥＬＩＳＡ法は（実施例１４、１５、２１、２２、２５、３３、３４、３７、３８）に示した方法で行ない、ヒト抗体陽性及びヒト抗体陽性かつ免疫した抗原特異的クローンを得る。
（実施例７５）マウス抗体重鎖両側アレル破壊ＴＴ２Ｆ細胞株由来キメラマウスの血清中のマウスＩｇＭの検出および定量
　（実施例５１）で取得されたマウス抗体重鎖両側アレル破壊ＴＴ２Ｆ細胞株（＃１３１−３）より（実施例４０）に示した方法で誕生した子マウスのうちキメラ率がそれぞれ０％、５０％、９９％の３個体について血清中のマウスＩｇＭの検出および定量を行った。生後約２週齢のキメラマウスより採血し血清中のマウスＩｇＭ濃度を（実施例１４）のＥＬＩＳＡ法を用いて定量した。ＰＢＳで希釈した抗マウスＩｇＭ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，０１−１８−０３）を固定し、次いで５％ＦＢＳを添加したＰＢＳで希釈した血清試料を加えた。ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＭ抗体（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ　＆　Ｐｅｒｒｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，０７４−１８０３）を加え、ＴＭＢＺを基質とし、４５０ｎｍの吸光度を測定した。精製さたマウスＩｇＭ（ファーミンジェン、０３０８１Ｄ）を標準とし段階的にＦＢＳ添加のＰＢＳで希釈した。結果を第２０表に示す。マウス抗体重鎖の両側アレルが破壊されたＴＴ２Ｆ細胞由来ののキメラマウスのうち、キメラ率が９９％のものはマウスＩｇＭ濃度が低く、ＥＳ細胞のマウス重鎖遺伝子がほとんど機能しないことが確認された。
産業上の利用可能性
　本発明により、単一または複数の外来染色体またはの断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現するキメラ非ヒト動物が提供された。本発明のキメラ非ヒト動物を利用して、生物学的に活性な物質を製造することができる。
　本発明により、単一または複数の外来染色体またはその断片を保持し、該染色体またはその断片上の遺伝子を発現する分化多能性を持つ細胞が提供された。該細胞を利用して、骨髄移植等による遺伝病治療を行うことができる。