(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失している、または前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が抑制もしくは喪失している非ヒト哺乳動物を、生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物として使用する方法。
【請求項２】
前記非ヒト哺乳動物は、前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非ヒト哺乳動物に高脂肪飼料の給餌を行うことを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターを有効成分として含有する生活習慣病の予防、改善又は治療剤。
【請求項６】
前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である請求項５に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療剤。
【請求項７】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターを有効成分として含有する摂食抑制剤。
【請求項８】
生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、
細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定することを特徴とする、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記被験物質が接触されたときと接触されていないときとを比較して、前記被験物質が接触されたときの前記細胞における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が抑制されている場合に、前記被験物質を生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する請求項８に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項１０】
生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、
非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記非ヒト哺乳動物におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定することを特徴とする、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が抑制されている場合に、前記被験物質を生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する請求項１０に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である請求項８〜１１のいずれか一項に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子若しくはＭａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子若しくはＭａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸を増幅することができるプライマーセットを含むことを特徴とする生活習慣病の検出薬。
【請求項１４】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする生活習慣病の検出薬。
【請求項１５】
生活習慣病を検出するために、被験者由来の生体試料におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定することを特徴とする生活習慣病の検出方法。
【請求項１６】
健常者由来の生体試料と比較して、前記被験者由来の生体試料における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が促進されている場合に、生活習慣病の疑いを判断する請求項１５に記載の生活習慣病の検出方法。
【請求項１７】
前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である請求項１５又は１６に記載の生活習慣病の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失している、又はＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が抑制もしくは喪失している非ヒト哺乳動物である生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物に関する。また、本発明はＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現を制御し得る生活習慣病の予防、改善又は治療剤或いは摂食抑制剤に関する。また本発明は、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法、生活習慣病の検出薬、及び生活習慣病の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん、糖尿病、高血圧、脂質異常症など、生活習慣病といわれる疾患が近年の先進国において増加しており、成人、特に高齢者のクオリティーオブライフの低下や、医療費の増加を引き起こしている。特に生活習慣病の要因として、肥満が世界的に問題となっている。
【０００３】
mab-21遺伝子は、線虫において細胞運命の決定に関与する因子として同定された（非特許文献１）。線虫にはrayと呼ばれる感覚器官が左右９対存在する。線虫のmab-21変異体では、ray 4がray 6へと転換し、rayの融合が生じることが知られている（非特許文献２）。
これまでの研究で、様々な動物種においてmab-21が高度に保存されていることが明らかとなっている。Drosophila、sebrafish、Xenopus、chicken、mouse及びhumanでは、mab-21のオーソログとして、Mab21l1とMab21l2の２つの遺伝子が存在する。
しかし、mab-21ファミリーは既知の遺伝子と全く相同性が無く、既存のモチーフやドメインも見出されない。したがって、アミノ酸配列一次構造からの機能予測は不可能である。
マウスではMab21L1とMab21L2の単独、あるいは両方の発現阻害により、神経管の閉塞異常、脊索、眼、体節の形態異常が起こることが示されており(非特許文献３)、本発明者らによっても、Mab21l1ノックアウトマウスにおいて、水晶体、包皮線、及び肋骨など器官の形態異常が見出されている（特許文献１）。これらの結果は、線虫のみならず脊椎動物においてもMab-21ファミリーが重要な役割を持つことを示唆している。
このように、従来mab-21は、細胞運命の決定や発生に関与する因子として解析が進められきた。しかし、これまでに、生活習慣病とmab-21遺伝子との関連を示したという報告はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００４−３４５９９０号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Baird, S. E. et al., 1991. Pattern formation in the nematode epidermis: deteriminatin of the arrangement of peripheral sense organs in the C. elegans male tail. Development 113, 515-526.
【非特許文献２】Chow, K. L. et al., 1995. The mab-21 gene of Caenorhabditis elegans encodes a novel protein required for choice of alternate cell fates. Development 121, 3615-3626.
【非特許文献３】Wong, R. L. and Chow, K. L., 2002. Depletion of Mab21l1 and Mab21l2 messages in mouse embryo arrests axial turning, and impairs notochord and neural tube differentiation. Teratology 65, 70-7.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物の提供、生活習慣病の予防、改善又は治療剤の提供、摂食抑制剤の提供、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法の提供、生活習慣病の検出薬の提供、及び生活習慣病の検出方法の提供、を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、従来細胞運命の決定や発生に関与する因子として知られていたＭａｂ２１ｌ１のノックアウトマウスでは、生活習慣病に関わる様々な症状の発症に耐性を有しており、当該マウスは生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物として使用可能であることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の通りである。
【０００８】
（１）Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失している、または前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が抑制もしくは喪失している非ヒト哺乳動物を、生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物として使用する方法。
（２）前記非ヒト哺乳動物は、前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されたものである、前記（１）に記載の方法。
（３）前記非ヒト哺乳動物に高脂肪飼料の給餌を行うことを含む、前記（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である前記（１）〜（３）のいずれか一つに記載の方法。
（５）Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターを有効成分として含有する生活習慣病の予防、改善又は治療剤。
（６）前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である前記（５）に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療剤。
（７）Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターを有効成分として含有する摂食抑制剤。
（８）生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、
細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定することを特徴とする、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（９）前記被験物質が接触されたときと接触されていないときとを比較して、前記被験物質が接触されたときの前記細胞における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が抑制されている場合に、前記被験物質を生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する前記（８）に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（１０）生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法であって、
非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記非ヒト哺乳動物におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定することを特徴とする、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（１１）前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が抑制されている場合に、前記被験物質を生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択する前記（１０）に記載の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（１２）前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である前記（８）〜（１１）のいずれか一つに記載の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法。
（１３）Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子若しくはＭａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子若しくはＭａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸を増幅することができるプライマーセットを含むことを特徴とする生活習慣病の検出薬。
（１４）Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に反応し得る抗体又はその断片を含むことを特徴とする生活習慣病の検出薬。
（１５）生活習慣病を検出するために、被験者由来の生体試料におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定することを特徴とする生活習慣病の検出方法。
（１６）健常者由来の生体試料と比較して、前記被験者由来の生体試料における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が促進されている場合に、生活習慣病の疑いを判断する前記（１５）に記載の生活習慣病の検出方法。
（１７）前記生活習慣病が、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常である前記（１５）又は（１６）に記載の生活習慣病の検出方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物、生活習慣病の予防、改善又は治療剤、摂食抑制剤、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法、生活習慣病の検出薬、及び生活習慣病の検出方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ターゲッティングベクターと、それに対応するマウスゲノムを示す模式図である。
【図２】野生型マウス（ＷＴ）とノックアウトマウス（ＫＯ）とで、体重変化を比較したグラフである。
【図３】野生型マウスとノックアウトマウスとで、体脂肪率を比較したグラフである。
【図４】野生型マウスとノックアウトマウスとで、脂肪組織の体重比重量を比較したグラフである。
【図５】野生型マウスとノックアウトマウスとで、血中インスリン濃度を比較したグラフである。
【図６】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、体重変化を比較したグラフである。
【図７】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとの外見を比較した写真である。
【図８】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、体脂肪率を比較したグラフである。
【図９】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、脂肪組織の体重比重量を比較したグラフである。
【図１０】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、鼠径部脂肪組織脂肪細胞を観察した結果を示す写真である。
【図１１】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、肝臓の組織を観察した結果を示す写真である。
【図１２】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、血中グルコース濃度を比較したグラフである。
【図１３】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、血中グルコース濃度を比較したグラフである。
【図１４】高脂肪食を与えた場合の、野生型マウスとノックアウトマウスとで、血中インスリン濃度を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
≪モデル動物≫
本発明の生活習慣病の耐性、抑制又は改善モデル動物は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失している、または前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が抑制もしくは喪失している非ヒト哺乳動物である。
【００１２】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子は、線虫のｍａｂ−２１のオーソログとして知られるＭａｂ２１ｌ１とＭａｂ２１ｌ２のうちの１つであり、これまでに様々な動物種において、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の塩基配列が公知となっている。配列番号１で表されるアミノ酸配列は、マウスのＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２で表される塩基配列は、マウスのＭａｂ２１ｌ１遺伝子の塩基配列（コーディング領域の配列）である。また、ヒトのＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列は公知である（GeneBank accession number NM005584）。ラットのＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列は公知である（GeneBank accession number NM001109497）
本発明のモデル動物となる任意の非ヒト哺乳動物が有するＭａｂ２１ｌ１遺伝子が公知でない場合であっても、当業者であれば、本発明のモデル動物となる非ヒト哺乳動物のＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列を選択することができる。
【００１３】
ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が喪失しているとは、ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質が本来有する機能が正常に発現されない状態のことをいう。ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が抑制しているとは、ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質が本来有する機能が部分的に抑制されている状態のことをいう。ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質が本来有する機能が部分的に抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型と比較して、生活習慣病の耐性、抑制又は改善と認められる状態（野生型との差異）の少なくとも一つが表れる程度であればよい。
【００１４】
ここで、生活習慣病としては、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常、高血圧、心疾患、脳卒中、骨粗鬆症、関節リューマチ等が挙げられる。
生活習慣病の耐性、抑制又は改善の状態としては、例えば、肥満の改善、脂質異常症の耐性、脂肪肝の改善、糖尿病の抑制又は耐糖能異常の耐性等が挙げられる。肥満の耐性、抑制又は改善の指標としては、体重低下、体脂肪率低下等が挙げられる。脂質異常症の耐性、抑制又は改善の指標としては、血中の脂質（コレステロール、トリグリセリドなど）の量の低下が挙げられる。脂肪肝の耐性、抑制又は改善の指標としては、肝臓に含まれる脂肪の割合の低下が挙げられる。糖尿病および耐糖能の耐性、抑制又は改善の異常の指標としては、血中グルコース濃度の低下、インスリン分泌量の改善、糖負荷試験数値改善等が挙げられる。
【００１５】
ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能の喪失は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失することによっても生じ得る。Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が喪失しているとは、モデル動物となる動物において、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子産物が喪失していることをいう。Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制しているとは、モデル動物となる動物の野生型と比較して、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子産物の量が抑制されていることをいう。Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子産物の量が抑制されている場合には、抑制の程度は、モデル動物となる動物の野生型と比較して、上記に示すような生活習慣病の耐性、抑制又は改善と認められる状態の少なくとも一つが表れる程度であればよい。Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能の抑制は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムなどの発現を生じさせる核酸配列をモデル動物に導入し、遺伝子ノックダウンにより生じさせることができる。
【００１６】
本発明のモデル動物は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されてなることが好ましい。
【００１７】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域とは、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現を調節する領域であって、例えば、プロモーター、サイレンサー、エンハンサー、応答配列である。
【００１８】
ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能の喪失は、例えば、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に変異を導入し、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子を破壊することにより生じさせることができる。Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能の抑制又は喪失は、例えば、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異を導入するすることにより生じさせることができる。
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異を導入する方法は、公知の遺伝子工学的手法である遺伝子改変により行うことができる。変異は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じさせることができる。これらは、例えば、変異原性物質（Mutagen）による処理、紫外線照射、相同組み換え技術等による遺伝子ターゲッティング、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックダウン、Cre-loxP系等による条件的ノックアウト等の手法を用いて行うことができる。
【００１９】
非ヒト哺乳動物としては、特に制限されないが、げっ歯類に分類される動物であることが好ましい。非ヒト哺乳動物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコが挙げあれる。
【００２０】
本発明のモデル動物は、高脂肪飼料の給餌を行うことにより作製されてもよい。
例えば、本発明のモデル動物は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現調節領域に変異が導入されてなり、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現能が抑制もしくは喪失している、または前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の機能が抑制もしくは喪失している非ヒト哺乳動物に、所定の期間高脂肪飼料の給餌を行うことにより、作製されてもよい。
【００２１】
高脂肪飼料とは、飼料全体に含有される脂肪分の割合が１０質量％以上であることが好ましく、２０質量％以上であることがより好ましく、３０質量％以上であることがさらに好ましい。高脂肪飼料の飼料全体に含有される脂肪分の割合の目安としては、１０〜７０質量％であることが好ましく、２０〜５０質量％であることがより好ましく、３０〜４０質量％であることがさらに好ましい。
高脂肪飼料の給餌を行う期間は、１０日以上であることが好ましく、３０日以上であることがより好ましく、５０日以上であることがさらに好ましい。目安としては、１０〜１２０日でことが好ましく、３０〜１００日であることがより好ましく、５０〜８０日であることがさらに好ましい。
高脂肪飼料の給餌を行う対象の動物は、離乳後の動物であることが好ましい。
【００２２】
マウスの場合を例に挙げると、４週齢〜１２週齢のマウスに、１０日以上、１０〜１２０日間高脂肪飼料の給餌を行うことが好ましく、５週齢〜１１週齢のマウスに、３０日以上、３０〜１００日間高脂肪飼料の給餌を行うことがより好ましく、６週齢〜１０週齢のマウスに、５０日以上、５０〜８０日間高脂肪飼料の給餌を行うことがさらに好ましい。
【００２３】
本発明のモデル動物は、生活習慣病の耐性を有する又は生活習慣病の症状の抑制もしくは改善を示す。したがって、生活習慣病のメカニズムの解明や、生活習慣病の治療に有用な物質の探索、生活習慣病の治療方法などの開発に用いることができる。
【００２４】
≪予防、改善又は治療剤≫
発明者らは、後述する実施例において説明するように、Ｍａｂ２１ｌ１のノックアウトマウスが、生活習慣病に関わる様々な症状の発症に耐性を有することを見出した。したがって、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現を部分的に又は完全に抑制する作用を有する物質は、生活習慣病の予防、改善又は治療剤となり得る。
また、発明者らは、Ｍａｂ２１ｌ１のノックアウトマウスでは、飼料の摂食量が野生型マウスと比較して減少することを見出した。したがって、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現を部分的に又は完全に抑制する作用を有する物質は、摂食抑制剤となり得る。
【００２５】
本発明の生活習慣病の予防、改善又は治療剤は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターを有効成分として含有するものである。前記生活習慣病は、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常であることが好ましい。
また、本発明の摂食抑制剤は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターを有効成分として含有するものである。
【００２６】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイムは、入手したＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列情報に基づいて容易に設計することができる。配列情報として用いるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列は、投与対象の動物のＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列であることが好ましいが、これに制限されない。ＲＮＡｉ誘導性核酸とは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸であり、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡを例示できる。これらの物質を細胞内に導入することにより、生活習慣病の予防、改善若しくは治療、又は摂食の抑制を行うことが挙げられる。
【００２７】
生活習慣病の予防、改善又は治療剤を細胞内に導入する方法は、特に制限されず、レトロウイルス、アデノウイルス等のウイルスベクターによる導入、リポソーム法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。
【００２８】
生活習慣病の予防、改善又は治療剤は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の製剤として経口的に、又は、注射剤、坐剤等の製剤として非経口的に投与してもよい。
【００２９】
これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を用いて、周知の方法で製造することができる。
【００３０】
賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００３１】
結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００３２】
崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００３３】
滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００３４】
乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００３５】
安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。
【００３６】
希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。
【００３７】
注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、生活習慣病の予防、改善又は治療剤の製造のための、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターの使用を提供する。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に対するＲＮＡｉ誘導性核酸、アンチセンス核酸、アプタマー若しくはリボザイム又はそれらの発現ベクターの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、生活習慣病の予防、改善又は治療方法を提供する。
【００４０】
≪スクリーニング方法≫
本発明の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法は、細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定するもの、或いは、非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記非ヒト哺乳動物におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定するものである。前記生活習慣病は、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常であることが好ましい。
【００４１】
発明者らは、後述する実施例において説明するように、Ｍａｂ２１ｌ１のノックアウトマウスでは、生活習慣病に関わる様々な症状の発症に耐性を有することを見出した。したがって、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現は、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニングの指標となり得る。
【００４２】
本発明の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法は、例えば、細胞に被験物質を接触させ、前記細胞におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定し、前記被験物質が接触されたときと接触されていないときとを比較して、前記被験物質が接触されたときの前記細胞における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が抑制されている場合に、前記被験物質を生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択することを行ってもよい。
また、例えば、非ヒト哺乳動物に被験物質を投与し、前記非ヒト哺乳動物におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定し、前記被験物質が投与されたときと投与されていないときとを比較して、前記被験物質が投与されたときの前記非ヒト哺乳動物における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が抑制されている場合に、前記被験物質を生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として選択することをおこなってもよい。
【００４３】
被験物質としては、特に制限はなく、例えば、ペプチド、タンパク質、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液等が挙げられる。
【００４４】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現の測定は、通常の遺伝子発現解析に用いられる手法用いることができ、ｍＲＮＡレベルで行ってもよい。例えば、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、レポーターアッセイ等を利用できる。ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現の測定は、通常のタンパク質検出に用いられる手法用いることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等を利用できる。
【００４５】
本発明の生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質のスクリーニング方法により選択された物質は、生活習慣病の予防、改善又は治療に有用な物質の候補物質として利用できる。
【００４６】
≪検出薬≫
本発明の生活習慣病の検出薬は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子若しくはＭａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子若しくはＭａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸を増幅することができるプライマーセット、又はＭａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に反応し得る抗体若しくはその断片を含むものである。
【００４７】
発明者らは、後述する実施例において説明するように、Ｍａｂ２１ｌ１のノックアウトマウスでは、生活習慣病に関わる様々な症状の発症に耐性を有することを見出した。したがって、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の存在、発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を検出することで、生活習慣病が検出され得る。
【００４８】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸を増幅することができるプライマーセットは、入手したＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列情報に基づいて容易に設計することができる。配列情報として用いるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列は、投与対象の動物のＭａｂ２１ｌ１遺伝子の配列であることが好ましいが、これに制限されない。
【００４９】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸とは、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の例えば、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、該ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ、およびそれらの断片が挙げられる。
【００５０】
前記オリゴヌクレオチド及び前記プライマーセットの核酸は、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸にハイブリダイズし得る配列の他に、任意の物質や配列を有していてもよい。当該物質としては、発光物質、蛍光物質、放射性物質等の標識物質、ペルオキシターゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素が挙げられる。
【００５１】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に反応し得る抗体は、本分野において一般的な手法により得ることができる。例えば、ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に基づいて得られたポリペプチドを抗原として使用し、任意の非ヒト動物へと免疫して、当該抗体が得られる。抗体は、目的の抗体を生産するハイブリドーマを作成する等して得てもよい。
ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に反応し得る抗体はＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に対する特異的抗体であることが好ましい。特異的抗体とは、ＭＡＢ２１Ｌ１には結合するが、類似のタンパク質等の他の分子に対しては結合しない抗体か、又は、他の分子に結合する場合であってもＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質としての検出が可能な程度の極めて低い程度でしか他のタンパク質に対しては結合しない抗体を意味する。
【００５２】
また、本発明によれば、本発明の生活習慣病の検査薬を含むキットを提供することができる。当該キットは、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド、Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子に由来する核酸を増幅することができるプライマーセット、及びＭａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質に反応し得る抗体又はその断片からなる群から選ばれるすくなくとも一つを備える。キットには、遺伝子発現解析、タンパク質検出に使用される試薬類、器具等を備えていてもよい。これらの試薬類は、例えば、核酸抽出試薬、核酸増幅試薬、核酸検出試薬、タンパク質抽出試薬、タンパク質検出試薬が挙げられる。
【００５３】
≪検出方法≫
本発明の生活習慣病の検出方法は、生活習慣病を検出するために、被験者由来の生体試料におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定するものである。前記生活習慣病は、肥満、脂質異常症、脂肪肝、糖尿病又は耐糖能異常であることが好ましい。
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現、又はＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現の測定は、上述した本発明の生活習慣病の検出薬を用いて行うことができる。
【００５４】
Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現の測定は、通常の遺伝子発現解析に用いられる手法用いることができ、ｍＲＮＡレベルで行ってもよい。例えば、ノーザンブロット解析、ＲＴ−ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、in situハイブリダイゼーション法、レポーターアッセイ等を利用できる。ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現の測定は、通常のタンパク質検出に用いられる手法用いることができ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ法、免疫染色法等を利用できる。
【００５５】
本発明の生活習慣病の検出方法では、例えば、被験者由来の生体試料におけるＭａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子がコードするＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現を測定し、健常者由来の生体試料と比較して、前記被験者由来の生体試料における前記Ｍａｂ２１ｌ１遺伝子の発現又は前記ＭＡＢ２１Ｌ１タンパク質の発現が促進されている場合に、生活習慣病の疑いを判断することを行ってもよい。
【００５６】
被験者由来の生体試料としては、特に制限されないが、被験者から採取した血液、血漿、血清、尿、精液、汗、細胞滲出液等の体液、細胞、組織、及びそれらの調整物が挙げられる。
【実施例】
【００５７】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００５８】
＜Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスの作出＞
基本的な実験手法はＳａｍｂｒｏｏｋ （Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９） らの方法に従って行った。
生体内でのＭａｂ２１Ｌ１の役割を明らかにするために、特許文献１に記載の方法に沿って、Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスの作出を行った。まず、１２９系統マウスゲノムライブラリーから、Ｍａｂ２１Ｌ１ ｃＤＮＡをプローブとして、Ｍａｂ２１Ｌ１ゲノミッククローンを得た。このクローンを用いて、図１に示したＭａｂ２１Ｌ１ ＯＲＦの上流約 ５ｋｂと下流 ２ｋｂを含む ターゲッティングベクターを作製した。
【００５９】
直線化ターゲッティングベクター（３０μｇ）をＥＳ細胞中にエレクトロポレーションした。４００ Ｇ４１８−耐性クローン由来のゲノムＤＮＡをＫｐｎＩおよびＳａｌＩで消化し、５’および３’プローブを用いサザンブロットした。８つの相同組換え体が得られ、これらのうち、２クローンから８細胞期集合胚法（Ｗｏｏｄ Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ． （１９９３））によりキメラマウスを作出した。キメラの雄をＣ５７ＢＬ／６の雌と交配させ、そして標的対立遺伝子の送達は、妊娠したマウスのテールチップＤＮＡをサザンブロッティングすることにより確認した。ヘテロ接合型マウスを交配させ、ホモ接合型マウスを作出した。２つの系統が同じ表現型を示した。子および胎仔の遺伝子型を、５’プローブを用いるサザンブロッティングによるか、または特定のプライマー
ｍ１Ｆ、５’−ＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＴＣ−３’
ｍ１Ｒ、５’−ＧＣＡＧＡＴＡＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧ−３’、および
ｎｅｏＲ、５’−ＧＣＡＴＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＧＡＡＴＴＣ−３’
を用いるＰＣＲによるか、何れかにより決定した。
【００６０】
得られたヘテロ接合型マウスは正常であった。ヘテロマウスを交配し、得られたこの遺伝子型を生後３週間目で確認した。野生型、ヘテロ接合型、ホモ接合型マウスの出現頻度はそれぞれ約２５％、５０％、２５％であり、メンデル比に合致した。このことから、Ｍａｂ２１Ｌ１は生存には不要であることが判明した。ホモ接合型マウスにおいてＭａｂ２１Ｌ１転写産物が検出されないことから、このマウスがｎｕｌｌ ｍｕｔａｎｔであることを確認した。
以下、ホモ接合型のＭａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスをノックアウトマウスという。
【００６１】
＜Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスの表現型（Control Diet-Fed）＞
まず、野生型マウスとノックアウトマウスとで、両者の体重の比較を行った。体重測定は、離乳後〜８週齢の期間、通常のノーマルダイエット（ｃＥ２，日本クレア社）を与え、その後８〜２０週齢の期間、脂肪分を抑えたコントロールダイエット（Control Diet-Fed）（D12450B、Research Diets社製）を与えて飼育したマウス（ｎ = ４）について、生後８〜１７週にかけて行った。上記ノーマルダイエット（cE-2, 日本クレア社）の脂肪含有量は５．１質量％である。上記コントロールダイエットの脂肪含有量は４．３質量％である。
【００６２】
図２は、野生型マウス（ＷＴ）とノックアウトマウス（ＫＯ）とで、両者の体重を比較したグラフである。測定を行った全ての時点において、ノックアウトマウスのほうが野生型マウスと比べて体重が軽いことが判明した。また、マウスの体格も、野生型マウスと比べて、ノックアウトマウスでは小さかった。
【００６３】
次に、野生型マウスとノックアウトマウスとで、両者の体脂肪率の比較を行った。体脂肪率の測定は、離乳後〜８週齢の期間、上記ノーマルダイエットを与え、その後８〜２０週齢の期間上記コントロールダイエット（Control Diet-Fed）を与えて飼育した２０週齢のマウス（ｎ = ４）に対して行った。体脂肪率はＣＴスキャン（Latheta LCT-200、日立アロカメディカル社製）を用いて、ＣＴ画像解析により計測した。
図３は、野生型マウスとノックアウトマウスとで、両者の体脂肪率を比較したグラフである。ノックアウトマウスは、野生型マウスと比べて体脂肪率が低いことが判明した。
【００６４】
また、体脂肪率の測定を行った上記マウス（２０週齢）から、解剖によって各部位の脂肪組織を取り出し、体重比重量を測定した（ｎ = ４）。測定対象の脂肪組織は、鼠径部（Inguinal）、精巣上体周囲(Epididymal)、腸間膜(Mesenteric)、後腹膜(Retropreitoneal)、腎周囲(Perinepheric)、肩甲骨間褐色(Interscapular brown)脂肪組織（Adipose tissue : AT）である。
図４に、野生型マウスとノックアウトマウスの、上記各部位の脂肪組織の体重比重量を比較したグラフを示す。測定対象とした全ての部位において、ノックアウトマウス脂肪組織の体重比重量値は、野生型マウスと比べて低いことが判明した。
【００６５】
次に、野生型マウスとノックアウトマウスの、血中インスリン濃度の比較を行った。血中インスリン濃度の測定は、離乳後〜８週齢の期間、上記ノーマルダイエットを与え、その後８〜２０週齢の期間上記コントロールダイエット（Control Diet-Fed）を与えて飼育した２０週齢のマウス（ｎ = ４）に対して行った。
結果を図５に示す。ノックアウトマウスの血中インスリン濃度は野生型マウスと比べて低い傾向にあったため、ノックアウトマウスのインスリン感受性が向上していることが示唆された。
【００６６】
＜Ｍａｂ２１Ｌ１遺伝子欠損マウスの表現型（High-Fat Diet-Fed）＞
ノックアウトマウスで確認された体脂肪率低下の表現型を顕在化させるために、マウスにハイファットダイエット（High-Fat Diet-Fed）（D12492、Research Diets社製）を与えて飼育し、表現型の差異を調べた。上記ハイファットダイエットの脂肪含有量は３４．９質量％である。
まず、野生型マウスとノックアウトマウスのそれぞれに対し、コントロールダイエット（D12450B、Research Diets社製）を与えた場合、又はハイファットダイエットを与えた場合について、両者の体重の比較を行った。ハイファットダイエットを与えた場合の測定は、マウスに離乳後〜８週齢までノーマルダイエットを与えた後、８〜１７週齢までハイファットダイエットを与えて行った。コントロールダイエットを与えた場合の測定は、マウスに離乳後〜８週齢までノーマルダイエットを与えた後、８〜１７週齢までコントロールダイエットを与えて行った。
【００６７】
図６に、体重測定の結果を示す。図６中、
ＣＤ：ＷＴは、野生型マウスにコントロールダイエットを与えた場合、
ＣＤ：ＫＯは、ノックアウトマウスにコントロールダイエットを与えた場合、
ＨＦＤ：ＷＴは、野生型マウスにハイファットダイエットを与えた場合、
ＨＦＤ：ＫＯは、ノックアウトマウスにハイファットダイエットを与えた場合、を示す。
コントロールダイエットを与えた場合、又はハイファットダイエットを与えた場合の測定結果の比較は、同週齢のマウスに対して実施した。グラフの横軸は、コントロールダイエット又はハイファットダイエットを与えた期間のマウスの週齢を示す。
【００６８】
ＨＦＤ：ＷＴのマウスでは、ＣＤ：ＷＴのマウスに比べて顕著な体重の増加がみられた。一方でＨＦＤ：ＫＯのマウスでは、ＣＤ：ＫＯのマウスと比べて、体重の増加はみられなかった。図７は、ＨＦＤ：ＷＴ、ＨＦＤ：ＫＯのマウス（図５：２０週齢時点）を示す写真である。
このことから、ノックアウトマウスは、高脂肪食を摂取しても太りにくいことが判明した。
【００６９】
次に、野生型マウスとノックアウトマウスとで、両者の体脂肪率の比較を行った。体脂肪率の測定は、離乳後〜８週齢までノーマルダイエットを与えた後、８〜２０週齢の期間ハイファットダイエット（High-Fat Diet-Fed）を与えて飼育した２０週齢のマウス（ｎ = ４）に対して行った。体脂肪率はＣＴスキャン（上記）を用いて、ＣＴ画像解析により計測した。
図８は、野生型マウスとノックアウトマウスとで、両者の体脂肪率を比較したグラフである。ノックアウトマウスは、野生型マウスと比べて体脂肪率が有意に低いことが判明した（図８中＊は、ｐ＜０．０５を表す）。
【００７０】
また、体脂肪率の測定を行った上記マウス（２０週齢）から、解剖によって各部位の脂肪組織を取り出し、体重比重量を測定した（ｎ = ４）。測定対象の脂肪組織は、鼠径部（Inguinal）、精巣上体周囲(Epididymal)、腸間膜(Mesenteric)、後腹膜(Retropreitoneal)、腎周囲(Perinepheric)、肩甲骨間褐色(Interscapular brown)脂肪組織（Adipose tissue : AT）である。
図９に、野生型マウスとノックアウトマウスの、上記各部位の脂肪組織の体重比重量を比較したグラフを示す。測定対象とした全ての部位において、ノックアウトマウスの脂肪組織の体重比重量値は、野生型マウスと比べて低いことが判明した。特に、鼠径部（Inguinal）、腸間膜(Mesenteric)、及び肩甲骨間褐色(Interscapular brown)脂肪組織（Adipose tissue : AT）において、ノックアウトマウスの脂肪組織の体重比重量値が、野生型マウスと比べて有意に低いことが判明した（図９中＊は、ｐ＜０．０５を表す）。
【００７１】
次に、体重比重量において有意差のあった鼠径部脂肪組織について、ＨＥ染色によって細胞の形態を観察した。
結果を図１０に示す。観察は体脂肪率の測定を行った上記マウス（２０週齢）に対して行った。野生型マウスの脂肪細胞はノックアウトマウスと比べて大きく、肥大化していた。
【００７２】
同じくHE染色によって、肝臓の形態を観察した。観察は体脂肪率の測定を行った上記マウス（２０週齢）に対して行った。
結果を図１１に示す。野生型マウスの肝臓は脂肪肝となっており、ノックアウトマウスの肝臓は脂肪肝となっていないことがわかった。
【００７３】
次に、野生型マウスとノックアウトマウスとで糖負荷試験を行い、両者の耐糖能の比較を行った。糖負荷試験は、離乳後〜８週齢までノーマルダイエットを与えた後、８〜１８週齢の期間ハイファットダイエット（High-Fat Diet-Fed）を与えて飼育した１８週齢のマウス（ｎ = ４）に対して、グルコース２ｇを生理食塩水２０ｍＬにとかしたものを、マウスの体重１ｇあたり１０μＬ経口投与して行った。
結果を図１２〜１３に示す。図１２は、グルコース投与後の各経過時間でのマウス血中グルコース濃度の値である。図１３は、グルコース投与後の経過時間０〜２時間における血中グルコース濃度の平均値である。野生型マウスはノックアウトマウスよりも血中グルコース濃度が有意に高い傾向が見られ（図１２〜１３中、各＊はそれぞれｐ＜０．０５を表す。）、ノックアウトマウスでは耐糖能が向上していることが示された。
【００７４】
次に、野生型マウスとノックアウトマウスの、血中インスリン濃度の比較を行った。血中インスリン濃度の測定は、離乳後〜８週齢までノーマルダイエットを与えた後、８〜２０週齢の期間ハイファットダイエット（High Fat Diet-Fed）を与えて飼育した２０週齢のマウス（ｎ = ４）に対して行った。
結果を図１４に示す。ノックアウトマウスの血中インスリン濃度は野生型マウスと比べて低い傾向にあったため、ノックアウトマウスのインスリン感受性が向上していることが示唆された。
【００７５】
以上で説明した各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0006465379.tif 000009
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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