(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エステル化度が３〜５の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して１質量％以上含み、かつ、エステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して０〜４０質量％含む蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、１，３−特異性を示さないリパーゼの存在下で加水分解して、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得ることを特徴とする、前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法。
【請求項２】
前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中に含まれる前記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量が、前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して２０質量％以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれるエステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルの質量が、前記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して１０質量％以下である、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料のＨＬＢ値が、４〜１５である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記リパーゼが、キャンディダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、リゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ、及びサーモマイセス  ラヌゲノウス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼからなる群から選ばれる１種以上である、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの構成脂肪酸が、炭素数１４〜２２の直鎖飽和脂肪族カルボン酸である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記加水分解が、水と有機疎水性溶媒との混合物中で行われる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物であって、前記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量が、前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して２０質量％以上である、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物。
【請求項９】
請求項８記載の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改質された蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法及びそれによって得られる改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に関する。具体的には、本発明は、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、特定のリパーゼの存在下で加水分解して、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを生成させることを特徴とする、改質された蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法、該方法により得られる改質蔗糖脂肪酸エステル混合物、並びに該改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
蔗糖脂肪酸エステルは、蔗糖の分子内に含まれる８個の水酸基のうち、任意の水酸基を脂肪酸でエステル化したものである。蔗糖脂肪酸エステルは、良好な安全性と生分解性を有するため、従来から界面活性剤、乳化剤、食品添加物、化粧品材料等として利用されてきた。
ここで、蔗糖脂肪酸エステルは、１〜８のエステル化度を有する。該エステル化度は、エステル化された水酸基の数によって決まり、例えば、エステル化度６の蔗糖脂肪酸エステルは、６個の水酸基がエステル化されたものをいう。中でも蔗糖脂肪酸エステルとして、エステル化度が２の、ジエステルが豊富な蔗糖脂肪酸エステルは、化粧品、医薬品及び食品等の分野で求められている。特に、脂肪酸の結合位置によって乳化等の物理的作用が異なる場合があるため、ジエステルの結合位置選択性が重要視されている。
しかし、化学的な反応で蔗糖脂肪酸エステルを得る方法では、所望の位置選択性を有するジエステル含有蔗糖脂肪酸エステルを調製することは困難だった（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２００９−２１５２６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料から、蔗糖の４，６位に脂肪酸が選択的に結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを生成させることを目的とする。
本発明は、又、上記のようにして蔗糖の４，６位に脂肪酸が選択的に結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を提供すること、並びに該改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む食品を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を達成するため、出発原料としてエステル化度が低い蔗糖脂肪酸エステルを多く含み、エステル化度が高い蔗糖脂肪酸エステルが少ない、例えば、エステル化度６〜８の蔗糖脂肪酸エステルが全蔗糖脂肪酸エステルに対して４０質量％以下程度の、特定の蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を選択し、該原料を、１，３−特異性を示さないリパーゼの存在下で加水分解することにより、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを生成させることができることを見出し、本発明に至った。即ち、本発明は、以下の態様を含み得る。
〔１〕エステル化度が３〜５の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して１質量％以上含み、かつ、エステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して０〜４０質量％含む蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、１，３−特異性を示さないリパーゼの存在下で加水分解して、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得ることを特徴とする、前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法。
〔２〕前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中に含まれる前記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量が、前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して２０質量％以上である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれるエステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルの質量が、前記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して１０質量％以下である、前記〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料のＨＬＢ値が、４〜１５である、前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項記載の方法。
〔５〕前記リパーゼが、キャンディダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、リゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ、及びサーモマイセス  ラヌゲノウス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼからなる群から選ばれる１種以上である、前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項記載の方法。
〔６〕前記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの構成脂肪酸が、炭素数１４〜２２の直鎖飽和脂肪族カルボン酸である、前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項記載の方法。
〔７〕前記加水分解が、水と有機疎水性溶媒との混合物中で行われる、前記〔１〕〜〔６〕のいずれか１項記載の方法。
〔８〕前記〔１〕〜〔７〕のいずれか１項記載の方法により得られ、かつ、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物であって、前記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量が、前記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して２０質量％以上である、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物。
〔９〕前記〔８〕記載の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む食品。
【０００６】
より具体的には、本発明は、以下の態様を含み得る。
［Ａ］全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度が３〜５の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して１質量％以上含み、かつ、エステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して０〜４０質量％含む蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、キャンディダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、リゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ、及びサーモマイセス  ラヌゲノウス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼからなる群から選ばれ、かつ、１，３−特異性を示さないリパーゼの存在下、４０〜６０℃の温度で加水分解して、蔗糖の４，６位に、炭素数が１４〜２２の直鎖飽和脂肪族カルボン酸から選択される脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得ることを特徴とし、ここで、上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量が、上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して２０質量％以上である、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法。
［Ｂ］上記［Ａ］の方法により得られ、かつ、上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物であって、上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量が、上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルに対して２０質量％以上の量である、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物。
［Ｃ］上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む食品。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、出発原料としてエステル化度が低い蔗糖脂肪酸エステルを多く含む蔗糖脂肪酸エステル混合物原料、即ち、エステル化度が３〜５の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して１質量％以上含み、かつ、エステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して０〜４０質量％含む蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、特定のリパーゼの存在下で加水分解して、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得ることができる。当該蔗糖ジ脂肪酸エステルの生成は、上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対する上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量の割合を、例えば、２０質量％以上、好ましくは２３質量％以上とすることができる。このようにして得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物は、良好な界面活性剤として、乳化用途、食品への吸油阻害剤、油脂の結晶調整剤などに好ましく用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】実施例１で得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中における、全糖脂肪酸エステルに対する各エステル化度１〜８の蔗糖脂肪酸エステルの質量％（エステル濃度[質量％]）を示す。
【図２】実施例２で得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中における、全糖脂肪酸エステルに対する各エステル化度１〜８の蔗糖脂肪酸エステルの質量％（エステル濃度[質量％]）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法＞
本発明の一つの態様は、エステル化度が３〜５の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して１質量％以上含み、かつ、エステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して０〜４０質量％含む蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、特定のリパーゼの存在下で加水分解して、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得ることを特徴とする、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法である。以下、当該製造方法について詳述する。
＜蔗糖脂肪酸エステル混合物原料＞
蔗糖脂肪酸エステル混合物原料は、本発明の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法の原料として用いられる、エステル化度の異なる複数の蔗糖脂肪酸エステルを含む混合物である。蔗糖脂肪酸エステルは、８個ある蔗糖のヒドロキシル基に１〜８個の任意の数の脂肪酸が結合したエステルである。結合した脂肪酸（即ち、構成脂肪酸）の数によって、蔗糖脂肪酸エステルは、１置換体（モノエステル）から８置換体（オクタエステル）まで存在する。蔗糖脂肪酸エステルのエステル化度は、この構成脂肪酸の数を示すものであり、１置換体はエステル化度１、８置換体はエステル化度８と表現される。
【００１０】
本発明で使用し得る蔗糖脂肪酸エステル混合物原料は、エステル化度が低い蔗糖脂肪酸エステルを多く含む蔗糖脂肪酸エステル混合物が好適である。具体的には、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中、エステル化度が１〜２の蔗糖脂肪酸エステルを全蔗糖脂肪酸エステルに対して９９質量％以下であることが好ましく、より好ましくは３０〜９８質量％、更に好ましくは４０〜９８質量％、殊更好ましくは５０〜９０質量％の量で含有することが好ましい。また、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中のエステル化度３〜５の蔗糖脂肪酸エステルの割合は、１質量％以上であることが好ましく、より好ましくは２〜７０質量％、更に好ましくは５〜５０質量％、殊更好ましくは１０〜３０質量％の量で含有することが適当である。さらに、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中のエステル化度が６〜８の蔗糖脂肪酸エステルの割合は、０〜４０質量％であることが好ましく、また、１〜４０質量％であってもよく、より好ましくは０〜２０質量％、更に好ましくは０〜１０質量％、殊更好ましくは０〜５質量％、特に好ましくは０〜３質量％の量で含有することが適当である。
また、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中のエステル化度１〜３の蔗糖脂肪酸エステルの割合が、７０質量％以上、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０以上であることが好適であり、又、当該割合が、１００質量％以下、好ましくは９９質量％以下、より好ましくは９５質量％以下の量であることが好ましい。
さらに、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中において、［エステル化度が１の蔗糖脂肪酸エステル］／［エステル化度が２の蔗糖脂肪酸エステル］の質量比は、例えば１／２〜５／１、好ましくは１／１〜４／１、より好ましくは、１．２／１〜３．５／１である。
【００１１】
本発明の蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に元々含まれる蔗糖ジ脂肪酸エステル中には、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルはほとんどない。本発明の蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれているエステル化度２の蔗糖ジ脂肪酸エステルの全質量に対する、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量は、通常１０質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは０〜３質量％である。一方、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中に通常含まれている蔗糖ジ脂肪酸エステルは、６，６’位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルである。本発明の蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれているエステル化度２の蔗糖ジ脂肪酸エステルの全質量に対する、蔗糖の６，６’位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量は、通常９０質量％以上、好ましくは９５質量％以上、より好ましくは９７〜１００質量％である。ここで、当該６，６’位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの構造式（Ｉ）と、本発明において着目している蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの構造式（ＩＩ）を以下に示す。
0006459115.tif 000002
0006459115.tif 000003
（式（Ｉ）及び（ＩＩ）中、Ａ1及びＡ2は、それぞれ独立に１価の脂肪酸基（構成脂肪酸）である。）
【００１２】
蔗糖脂肪酸エステルの構成脂肪酸（例えば、上記式(Ｉ)及び(ＩＩ)のＡ1及びＡ2基を構成する脂肪酸）としては、脂肪族カルボン酸が挙げられる。脂肪族カルボン酸としては、炭素数が２〜２２、好ましくは８〜２２、更に好ましくは１４〜２２の脂肪族カルボン酸の直鎖飽和脂肪族カルボン酸、直鎖不飽和脂肪族カルボン酸、分岐鎖飽和脂肪族カルボン酸及びこれらの混合物を用いることができる。例としては、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、セロチン酸、パルミトオレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、アラキドン酸、エルカ酸、酢酸、イソ酪酸等が挙げられるがこれに限定するものではない。好ましくは、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸である。
本発明では、上記蔗糖脂肪酸エステルの構成脂肪酸が、炭素数が１４〜２２の直鎖脂肪族カルボン酸であることが、特に好ましい。最も好ましくは、ステアリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、エルカ酸、ベヘン酸などの直鎖脂肪族カルボン酸である。なお、この場合、炭素数が１４〜２２の直鎖脂肪族カルボン酸以外の構成脂肪酸も含むこともできるが、炭素数が１４〜２２の直鎖脂肪族カルボン酸以外の構成脂肪酸は５０質量％未満が好ましく、０〜４０質量％がより好ましく、０〜１０質量％がさらに好ましく、０〜５質量％が最も好ましい。
特に好ましくは、パルミチン酸とステアリン酸の組み合わせである。より好ましくは、パルミチン酸：ステアリン酸の質量比が２０〜４０：８０〜６０、さらに好ましくは２５：３５：７５〜６５、殊更好ましくは３０：７０である。
構成脂肪酸の種類は、蔗糖脂肪酸エステルの種類によって同一でも異なっていてもよいし、一つの蔗糖脂肪酸エステル内に複数の脂肪酸エステルを有する場合は、蔗糖脂肪酸エステル内の各構成脂肪酸が同一でも異なっていてもよい。例えば、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれる上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）の蔗糖ジ脂肪酸エステルは、互いに同一の脂肪酸エステルを有していても異なる脂肪酸エステルを有していてもよい。また、本発明が着目する蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステル（ＩＩ）のＡ1及びＡ2を構成する脂肪酸は、同一でも異なっていてもよい。但し、全蔗糖脂肪酸エステルを構成する脂肪酸が同一であることが好ましい。
【００１３】
＜ＨＬＢ値＞
ＨＬＢとは、Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ  Ｌｙｐｏｐｈｉｌｅ  Ｂａｌａｎｃｅの略であって、乳化剤が親水性か親油性かを知る指標となるもので、０〜２０の値をとる。ＨＬＢ値が小さい程、親油性が強いことを示す。本発明においてはＧｒｉｆｆｉｎ（グリフィン）の算出法を用いる。Ｇｒｉｆｆｉｎの算出法は、
グリフィン式：ＨＬＢ＝２０×｛（親水部分の分子量）／（全分子量）｝
からＨＬＢの値を算出する方法を言う。式中、親水部分とは、蔗糖脂肪酸エステル分子全体から、構成脂肪酸の炭化水素鎖を除いた部分を言う。
本発明において、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料のＨＬＢ値は、いかなる値も取り得るが、例えば３以上、好ましくは４〜１５である。
【００１４】
＜リパーゼ＞
本発明において使用できるリパーゼは、１，３−特異性を示さないリパーゼである。１，３−特異性を示さないリパーゼとは、グリセロール又はアシルグリセロールの反応に用いる場合にグリセロールの１，２，３位に対して、ほとんど区別することなく作用するリパーゼである。これらのリパーゼとして、リポプロテインリパーゼ、モノアシルグリセロリパーゼ、ジアシルグリセロリパーゼ、トリアシルグリセロリパーゼ、ガラクトリパーゼ、フォスフォリパーゼ等が挙げられる。これらのうち、トリアシルグリセロリパーゼが好ましい。
これらのリパーゼを産生する微生物としては、細菌、酵母、糸状菌、放線菌等特に限定されるものではないが、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、アスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、エスチエリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、マイコトルラ属（Ｍｙｃｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｕｍ  ｓｐ．）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｕｍ  ｓｐ．）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、クロストリデイウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）、ジオトリカム属（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）、サッカロマイコプシス属（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ノカルデイア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ  ｓｐ．）、フザリウム属（Ｆｕｚａｒｉｕｍ  ｓｐ．）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ  ｓｐ．）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐ．）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、フィコマイセス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、プチニア属（Ｐｕｃｃｉｎｉａ  ｓｐ．）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、などが挙げられる。
本発明では、これらのうち、アルカリゲネス属、シュードモナス属、キャンディダ属、アスペルギルス属、リゾムコール属、ムコール属、サーモマイセス属、リゾプス属又はペニシリウム属由来のリパーゼが好ましい。中でも、アルカリゲネス属のＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｓｐ．由来のリパーゼ、キャンディダ属のキャンディダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、サーモマイセス属のサーモマイセス  ラヌゲノウス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼ、リゾプス属のリゾプス  デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｄｅｌｅｍａｒ）由来のリパーゼ、及びリゾプス属のリゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼがより好ましい。キャンディダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）由来のリパーゼ、リゾプス  オリザエ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のリパーゼ、サーモマイセス  ラヌゲノウス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパーゼが特に好ましい。
本発明で使用するリパーゼとしては、培養し、リパーゼの培地成分等を含有したリパーゼ含有水性液体を乾燥して得られたものでもよいが、これらを含有していないもの、つまり実質的にリパーゼ自体から構成されるものが好ましい。本発明で使用できるリパーゼとしては、リパーゼ含有水性液体、もしくはリパーゼを含有する粉末を使用することができる。例えば、リパーゼの培養後、菌体を除去して製造されたリパーゼ含有水性液体、固定化したもの、もしくはさらに粉末化したものがより好ましい。
【００１５】
リパーゼ含有水性液体としては、菌体を除去したリパーゼ培養液、精製培養液、これらから得たリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販のリパーゼ粉末を再度水に溶解・分散させたもの、市販の液状リパーゼ等が挙げられる。さらに、リパーゼ活性をより高めるために塩類等の低分子成分を除去したものがより好ましく、また、粉末性状をより高めるために糖等の低分子成分を除去したものがより好ましい。
【００１６】
固定化リパーゼは、リパーゼをシリカ、セライト、珪藻土、パーライト、ポリビニールアルコール、陰イオン交換樹脂、フェノール吸着樹脂、疎水性担体、陽イオン交換樹脂、キレート樹脂等の担体に固定化したものを用いることができる。このような固定化リパーゼとしては、特に限定するものではないが、固定化リパーゼは、そのまま使用するか、又は該固定化リパーゼを粉砕したものを使用することができる。
【００１７】
粉末リパーゼは、リパーゼ含有水性液体をスプレードライ、フリーズドライ、溶剤沈澱後の乾燥などの方法で乾燥、粉末化したものであり、特に限定するものではないが、例えば、キャンディダ  ルゴサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｕｇｏｓａ）由来の、天野エンザイム株式会社の商品：リパーゼＡＹ「アマノ」３０、名糖産業株式会社の商品：「リパーゼＯＦ」等を用いることができる。
本発明で使用するリパーゼとしては、より好ましくは、粉末リパーゼが適当である。
【００１８】
＜加水分解＞
リパーゼを用いた本発明の蔗糖脂肪酸エステル混合物原料の加水分解反応としては、通常用いられる加水分解反応を使用することができる。具体的には、例えば、原料となる蔗糖脂肪酸エステル混合物に水及び任意に水以外の溶媒を加え、さらに所定量のリパーゼを加えることにより加水分解反応を行う。ここで、水は、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料１ｇに対し、例えば、１〜５０ｇ、好ましくは、５〜２５ｇ、より好ましくは１０〜２０ｇ加えられる。溶媒としては、有機溶媒、特に有機疎水性溶媒を好ましく使用することができる。具体的に、溶媒としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルエチルケトン、アセトン、アルコール等の有機親水性溶媒（水に溶解する）、並びに、イソオクタン、キシレン、トルエン、ヘキサン、クロロホルム、クロロベンゼン等の有機疎水性溶媒（水に不溶）を１種または２種以上の混合物として用いることができる。溶媒は、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料がある程度溶解できる量があればよい。特に、イソオクタンやクロロホルムなどの水に不溶の有機疎水性溶媒は、酵素と有機疎水性溶媒の除去が容易となることから好ましい。水と溶媒との混合物としては、水と有機溶媒との混合物が好ましく、水と有機疎水性溶媒との混合物がより好ましく、水とイソオクタンとの混合物が殊更好ましい。溶媒は、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料１ｇに対し、例えば、０．５〜３０ｇ、好ましくは、１〜２０ｇ、より好ましくは３〜１０ｇ加えられる。好ましくは水と水以外の溶媒との混合物が使用され、水／水以外の溶媒の質量比は、例えば５／１〜１／５、好ましくは３／１〜１／３、より好ましくは２／１〜１／１である。
加水分解に用いられるリパーゼとしては、上述したリパーゼ及び任意に助剤を用いることができる。リパーゼは、例えば、１０，０００Ｕ／ｍＬの酵素濃度のリパーゼを、蔗糖脂肪酸エステル混合物原料１ｇに対し、例えば１〜３０ｍＬ、好ましくは２〜２０ｍＬ、より好ましくは３〜１５ｍＬ加えられる。
【００１９】
加水分解反応は、例えば、常圧下、室温（２０℃）〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、より好ましくは４０〜６０℃の温度で、例えば１〜４８時間、好ましくは６〜３６時間、より好ましくは１２〜２４時間、任意に撹拌しながら行われる。また、加水分解反応は、上述のリパーゼを加えて加水分解反応を行う加水分解反応工程の前に、リパーゼを加えずに撹拌する予備撹拌工程を含んでもよい。予備撹拌工程は、例えば５〜６０分、好ましくは１０〜５０分、より好ましくは２０〜４０分継続する。加水分解反応工程は、例えば、上記所定量のリパーゼを１度に投入してもよいが、所定量のリパーゼを２〜３０回、好ましくは３〜２０回、より好ましくは５〜１５回に分けて投入してもよい。分けて投入する場合の１回の投与量は、投与回数にもよるが、例えば０．１〜２０ｍＬ、好ましくは０．５〜１０ｍＬ、より好ましくは０．７〜５ｍＬである。リパーゼを投入する時期は、上記予備撹拌工程終了直後の他、第１回リパーゼ投入から１〜３時間おき、好ましくは１〜２時間おきに投入してもよい。
【００２０】
＜改質蔗糖脂肪酸エステル混合物＞
上述のようにして加水分解を行うことにより、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルを実質的に含む改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得ることができる。改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中に含まれる上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量は、上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルの質量に対して例えば１０〜９９質量％、好ましくは１５〜８０質量％、より好ましくは２０〜６０質量％、更に好ましくは２３〜５０質量％である。上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量は、上記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料中に含まれる蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量に比べて増加している。例えば、好ましくは、［上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルに対する上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量割合］／［上記蔗糖脂肪酸エステル混合物原料に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルに対する上記蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの質量割合］の割合が１２０／１００以上、より好ましくは１３０／１００以上、更に好ましくは１４０／１００〜３００／１００である。また、本発明の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれるエステル化度２の蔗糖ジ脂肪酸エステルの全質量に対する、上記改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量は、例えば２０〜９９質量％、好ましくは２５〜９０質量％、より好ましくは３０〜８０質量％、更に好ましくは４５〜７０質量％である。
【００２１】
改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度１〜２の蔗糖脂肪酸エステルの割合は、例えば５０質量％以上、好ましくは６０質量％以上、より好ましくは７０質量％以上、更に好ましくは７０〜９０質量％であることが好適である。改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度３〜５の蔗糖脂肪酸エステルの割合は、例えば１質量％以上、好ましくは０〜５０質量％、より好ましくは０〜４０質量％以上、更に好ましくは１〜３０質量％であることが好適である。また、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度１〜３の蔗糖脂肪酸エステルの割合が、例えば７０質量％以上、好ましくは８０質量％以上、より好ましくは９０〜９５質量％であることが好適である。さらに、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度６〜８の蔗糖脂肪酸エステルの割合が、例えば１０質量％以下、好ましくは５質量％以下、より好ましくは４質量％以下、さらに好ましくは０〜３質量％であることが好ましい。より詳細には、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度１の蔗糖脂肪酸エステルは、１０〜６０質量％の割合、好ましくは２０〜５０質量％の割合で、エステル化度２の蔗糖脂肪酸エステルは、３０〜７０質量％の割合、好ましくは４０〜５０質量％の割合で、エステル化度３の蔗糖脂肪酸エステルは、１〜４０質量％の割合、好ましくは５〜３０質量％の割合で、エステル化度４の蔗糖脂肪酸エステルは、０〜１０質量％の割合、好ましくは１〜７質量％の割合で、エステル化度５以上の蔗糖脂肪酸エステルは、１０質量％以下の割合、好ましくは５質量％以下、より好ましくは０〜３質量％の割合で、それぞれ含有することが好ましい。
さらに、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中において、［エステル化度が１の蔗糖脂肪酸エステル］／［エステル化度が２の蔗糖脂肪酸エステル］の質量比は、例えば２／１〜１／４、好ましくは１．５／１〜１／３、より好ましくは、１．２／１〜１／２である。
【００２２】
本発明の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の好適なエステル組成は、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の全蔗糖脂肪酸エステルに対し、エステル化度１の蔗糖脂肪酸エステルを、１０〜６０質量％、好ましくは、２０〜５０質量％；エステル化度２の蔗糖脂肪酸エステルを、３０〜６０質量％、好ましくは、４０〜５０質量％；エステル化度３の蔗糖脂肪酸エステルを、５〜３０質量％、好ましくは、５〜２５質量％；エステル化度４の蔗糖脂肪酸エステルを、０〜１５質量％、好ましくは、０〜１０質量％；エステル化度５の蔗糖脂肪酸エステルを、０〜１０質量％、好ましくは、０〜５質量％；エステル化度６以上の蔗糖脂肪酸エステルを、０〜５質量％、好ましくは、０〜２質量％である（但し、各蔗糖脂肪酸エステルの質量％の合計が１００質量％となるように調整される）。
【００２３】
＜改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の用途＞
本発明の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物は、食品、飲料、化粧品、洗剤などの用途において、乳化剤、結晶調整剤、消泡剤、離型剤等として用いることができる。特に、食品用としては、乳化用、結晶調整用、粘度調整用、保水用の各用途として、本発明の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を用いることができる。
特に、本発明の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む食品としては、例えば、チョコレート、マーガリン、ショートニング、ドレッシング、クリーム等が挙げられる。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例及び比較例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これらは本発明をいかなる意味においても制限するものではない。
［評価方法］
・エステル組成
蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれるエステルの組成分析を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて行った。具体的にはＧＰＣカラム及びＯＤＳカラムを使用した。各カラムを用いた分析条件を以下に示す。
【００２５】
ＧＰＣカラム分析条件
検出器：Ｓｈｏｄｅｘ示差屈折計ＲＩ−７４
カラム（カラム１とカラム２の２本連結）：（カラム１）ＰＬ−ｇｅｌ（ポリマー・ラボラトリー社製）粒子サイズ５μｍ  孔径１０ｎｍ  ３００ｍｍ×７．５ｍｍ、（カラム２）ＰＬ−ｇｅｌ（ポリマー・ラボラトリー社製）粒子サイズ５μｍ  孔径５０ｎｍ  ３００ｍｍ×７．５ｍｍ
カラム温度：３０℃
溶離液：特級テトラヒドロフラン（安定剤含有）
流速：０．６ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
分析時間：４３分
【００２６】
ＯＤＳカラム分析条件
検出器    Ｓｈｏｄｅｘ示差屈折計ＲＩ−７４
カラム：ＺＯＲＢＡＸ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＰｌｕｓＣ１８（アジレント・テクノロジー株式会社製）粒子サイズ３．５μｍ  １５０ｍｍ×４．６ｍｍ
カラム温度：２５℃
溶離液：特級テトラヒドロフラン（安定剤含有）：特級メタノール＝５５：４５
流速：０．８ｍＬ／分
注入量：１０μＬ
分析時間：１６分
【００２７】
はじめにＧＰＣカラムを使用し、エステル化度１、２、３及びエステル化度４以上の蔗糖脂肪酸エステルの組成を測定した。次にＯＤＳカラムを使用し、エステル化度４、５、６、７及び８の蔗糖脂肪酸エステルの組成割合を測定した。先のＧＰＣカラムの測定結果とＯＤＳカラムの組成割合結果から、エステル化度１〜８の各組成を算出した。
【００２８】
・改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれるジエステル画分のＮＭＲ測定
改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれるジエステル画分をＮＭＲで測定するために、まず薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を用いてジエステルの分画を行った。ＴＬＣの条件は以下の通りである。
展開溶媒：クロロホルム／メタノール／酢酸／水＝８０／１０／８／２に調製した溶媒
ＴＬＣ：シリカゲル７０プレートワコー（和光純薬製）の順相系ＴＬＣ
また、得られたジエステル画分をＣＤ3ＯＤに溶解し、Ｖａｒｉａｎ  ＧＥＭＩＮＩ２０００（アジレント・テクノロジー社製）のＮＭＲで分析した。
【００２９】
［改質蔗糖脂肪酸エステル混合物の製造方法］
［実施例１］
リパーゼとして、１，３−特異性を示さない粉末リパーゼであるリパーゼＡＹ「アマノ」３０（天野エンザイム株式会社製、以下、リパーゼＡＹと言う：キャンディダ  ルゴサ由来）を用いた。このリパーゼＡＹを水に溶解し、１０，０００Ｕ／ｍＬの酵素濃度を有するリパーゼ溶液を調製した。蔗糖脂肪酸エステル混合物原料としては、ＤＫエステルＦ−５０（ＨＬＢ＝６、構成脂肪酸は、パルミチン酸約３０質量％、ステアリン酸約７０質量％、第一工業製薬株式会社製）を準備した。このＤＫエステルＦ−５０蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を、８０ｇ容量のサンプル瓶に１ｇ加え、さらに溶媒として特級イソオクタン６ｇ及び水１２ｇを加えた。サンプル瓶を５０℃の温浴に浸し、３０分間スターラーで撹拌した(予備撹拌工程)。その後、先に調製したリパーゼ溶液１ｍＬを添加し、加水分解反応を開始した(加水分解反応工程)。この最初のリパーゼ溶液の添加から２時間おきにリパーゼ溶液を１ｍＬずつ添加し(リパーゼを合計１１回添加、合計１１ｍＬ添加)、上記最初のリパーゼ溶液添加から２２時間後を反応終了とし、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む反応物を得た。反応終了後、この改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を含む反応物をエバポレーター、凍結乾燥にかけて、反応溶媒を取り除き、粗製の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を単離した。その後、クロロホルム／メタノール(容量比)＝１／１溶液に再溶解し、濾過により改質蔗糖脂肪酸エステル混合物からリパーゼＡＹを除去した。濾過後、エバポレーター、凍結乾燥により上記クロロホルム／メタノール(容量比)＝１／１溶液を取り除き、精製した改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得た。
［実施例２］
蔗糖脂肪酸エステル混合物原料として、ＤＫエステルＦ−１６０（ＨＬＢ＝１５、構成脂肪酸は、パルミチン酸約３０質量％、ステアリン酸約７０質量％、第一工業製薬株式会社製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を得た。
【００３０】
これらの実施例１及び２の改質蔗糖脂肪酸エステル混合物を上述したＨＰＬＣ分析に供し、含まれる蔗糖脂肪酸エステルの種類及びその含有量(質量％)を分析した。実施例１及び２の結果を以下の表１及び図１（実施例１）及び図２（実施例２）に示す。
【００３１】
表１
0006459115.tif 000004
＊表中、実施例の数値は、エステル化度１〜８の全蔗糖脂肪酸エステルの混合物の合計質量に対する質量％（エステル濃度）である。
【００３２】
さらに、実施例で得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物中（特に、エステル化度２の蔗糖ジ脂肪酸エステル中）に、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルが含まれていることを確認するために、ＮＭＲ測定を行った。
上述の通りのＮＭＲ測定条件にて、実施例１で得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物をＴＬＣに展開し、改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれるジエステル画分を収集した。得られた改質蔗糖脂肪酸エステルのジエステル画分を、ＮＭＲ測定したところ、以下のような結果となった。
【００３３】
・ＮＭＲ測定結果
1H NMR δ(ppm、400MHz、313K、CD3OD): 0.89(6H, t, J=6.9 Hz), 1.28(50H, m), 1.64-1.59(4H, m), 2.38-2.31(4H, m), 3.52(1H, dd, J=9.9,3.8 Hz,C-2), 3.63-3.57(2H, m, C-1'), 3.81-3.72(3H, m, C-5', C-6'), 3.86(1H, t , J=9.5 Hz,C-3), 3.97(1H, t , J=7.9 Hz,C-4'),4.11-4.08(3H, m, C-6, C-3'), 4.27-4.20(1H, m, C-5), 4.85(1H, t, J=9.8 Hz, C-4), 5.43(1H, d, J=3.8 Hz, C-1)
13C NMR δ(ppm、400MHz、313K、CD3OD):63.7(C-6)、63.8(C-6')、64.3(C-1')、69.8(C-5)、71.9(C-4)、72.5(C-3)、73.2(C-2)、75.9(C-4')、79.3(C-3')、83.8(C-5')、93.2(C-1)、105.3(C-2')、174.8、174.1(エステルカーボン)
【００３４】
表２
0006459115.tif 000005
【００３５】
これらより、実施例１の改質蔗糖脂肪酸エステルは、４，６位置換ジエステル含有蔗糖脂肪酸エステルを含むことがわかった。なお、実施例２においても実施例１と同様のＮＭＲ測定を行い、実施例２の改質蔗糖脂肪酸エステルも、４，６位置換ジエステル含有蔗糖脂肪酸エステルを含むことがわかった。
【００３６】
ここで、実施例１及び２で得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量は、当該改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれる全蔗糖脂肪酸エステルに対して、それぞれ２６質量％(実施例１)及び２３質量％(実施例２)であった。さらに、実施例１及び２で得られた改質蔗糖脂肪酸エステル混合物に含まれるエステル化度２の蔗糖ジ脂肪酸エステルの全質量に対する、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの量は、それぞれ５８質量％(実施例１)及び５０質量％(実施例２)であった。
【００３７】
表３
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＊表中、実施例の数値は、質量％（エステル濃度）である。
【００３８】
このように、実施例１及び２とも、特定の蔗糖脂肪酸エステル混合物原料を特定のリパーゼの存在下で加水分解することにより、蔗糖の４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの含有割合を増加させることができた。
【００３９】
［比較例３］
リパーゼとして、１，３−特異性を示すリパーゼであるリパーゼＡ「アマノ」６（天野エンザイム株式会社製：アスペルス  ニガー由来）、またはＲＭ−ＩＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ：リゾコール  ミーヘイ由来）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で加水分解を行ったが、４，６位に脂肪酸が結合している蔗糖ジ脂肪酸エステルの生成は確認できなかった。
【図１】
0006459115.tif 000007
【図２】
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