【事件の表示】
　特許第２８７７７８８号「新規なサイトカインに対する抗体」の請求項１、２に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８７７７８８号の請求項１ないし２に係る特許を維持する。
【理　由】
〔１〕手続きの経緯：
　本件特許2877788号は、特願平5-507897号（第１優先権主張：1991年10月25日、US、第２優先権主張：1991年12月5日、US）をもとの出願とする分割出願である特願平9-318110号に係るものであり、平成11年1月22日に特許権の設定登録がなされ、その後エーザイ株式会社、鈴木正一、及び溝部孝彦から特許異議の申立てがなされた。当審において平成13年1月29日付で取消理由が通知され、それに対して意見書と共に提出された明細書の訂正請求に対して平成13年9月3日付で訂正拒絶理由を兼ねた取消理由が通知され、それに対して提出された訂正請求について平成14年4月8日付で訂正拒絶理由が通知されたところ、意見書で訂正明細書案が提示されたため、平成15年11月11日付で再度手交による取消理由が通知されて、新たな明細書の訂正請求がなされたものである。（なお、それ以前の訂正請求はすべて取り下げられているので、最後の訂正請求についてのみ述べる。）
　
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮及び明りょうでない記載の釈明を目的として請求項１及び２を訂正明細書に記載された請求項１及び２の通りに訂正しようとするものであり、具体的には請求項１における「CD40-L」を「特定のアミノ酸配列を有するマウスCD40-L」のみに限定すると共に、請求項の記載を不明確にしていた「またはCD40-L免疫原」の場合を削除しようとするものである。
　当該訂正は、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内における特許請求の範囲の減縮、もしくは明りょうでない記載の釈明にあたるものであり、いずれも特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められる。そして、下記〔３〕で述べる如く、取消理由が発見されないから、特許出願の際独立して特許を受けることができるものであると認められ、適法なものである。
　
〔３〕異議申立について：
１．本件特許に係る発明は、前記特許明細書の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１及び２に記載された事項により特定されたとおりの下記の通りである（以下、あわせて「本件発明」ともいう。）。
　
「【請求項１】CD40-LまたはCD40-L免疫原と免疫反応性の抗体であって、前記CD-40Lが以下の：
(a)配列番号：２のアミノ酸1-260；
(b)配列番号：２のアミノ酸47-260；
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するものである、前記抗体。
【請求項２】モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。」
　
２．各異議申立人の主張について：
２−１．エーザイ株式会社の異議申立：
　特許異議申立人エーザイ株式会社は、本件出願後の甲第４号証の記載事項、甲第５乃至７号証の優先権明細書の記載内容と共に甲第８号証の鑑定書の記載内容を勘案すると、本件訂正前の請求項１及び２に記載された発明は、(1)甲第１及び２号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、かつ(2)本出願以前に出願され本出願後に公開された特願平5-509502号（甲第3号証に対応）の出願当初の明細書に記載された発明であって、その出願人及び発明者が同一であるともいえないことから、訂正前の請求項１及び２に係る特許は特許法第29条第2項及び同第29条の2の規定に違反してなされたものである旨を主張している。
　　
　　　　　　　　　　　　　 記                            
甲第１号証：　Clinical Research,Vol.39,No.2,380A,1991,(April 2,1991)　（刊行物１）
甲第２号証：　J.Immunology,Vol.147,p.3389-3395(1991.11.15)　（刊行物２）
甲第３号証：　特表平7-505761公報（特願平5-509502号）　（刊行物５）　
甲第４号証：　Molecular Immunology,Vol.31,No.6,p.471-484(1994)　（参考資料４）
甲第５号証：　米国出願第792,728号　（特願平5-509502号の優先権証明書：参考資料１）
甲第６号証：　米国出願第783,707号　（本件出願の第１優先権証明書：参考資料２）
甲第７号証：　米国出願第805,723号　（本件出願の第２優先権証明書：参考資料３）
甲第８号証：　旭川医科大学　木村昭治教授の鑑定書
　
２−２．鈴木正一の異議申立：
　特許異議申立人鈴木正一は、甲第６号証記載の周知事項及び本件出願後の甲第４、第７号証及び参考資料１の記載事項と共に甲第５号証の本件優先権証明書の記載事項を勘案すると、本件訂正前の請求項１及び２に記載された発明は、(1)甲第１及び２号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであり、かつ(2)本出願以前に出願され本件出願後に公開された特願平5-509502号（甲第3号証の１に対応、甲第３号証の２が優先権証明書）の出願当初の明細書に記載される発明と実質的に同一であって、その出願人及び発明者が同一であるともいえないものであることから、訂正前の請求項１及び２に係る特許は特許法第29条第2項及び同第29条の2の規定に違反してなされたものである旨、及び(3)訂正前の明細書の出願に係る本件特許は特許法第36条第4項に規定する要件を満たしていない出願に対してなされたものである旨を主張している。
　
　　　　　　　　　　　　　　記
甲第１号証：　Clinical Research,Vol.39,No.2,380A,1991,(April 2,1991)　（刊行物１）
甲第２号証：　J.Immunology,Vol.147,p.3389-3395(1991.11.15)　（刊行物２）
甲第３号証の１：　特表平7-505761公報（特願平5-509502号）　（刊行物５）　
甲第３号証の２：  米国出願第792,728号　（特願平5-509502号の優先権証明書：参考資料１）
甲第４号証：　Molecular Immunology,Vol.31,No.6,p.471-484(1994)　（参考資料４）
甲第５号証：　米国出願第783,707号　（本件出願の第１優先権証明書：参考資料２）
甲第６号証：　日本血液学会雑誌第４７巻第７号第1433-1444頁（昭和５９年）  （刊行物３）
甲第７号証：　Structure,Vol.3,p.1031-1039(1995)　（参考資料５）
　
２−３．溝部孝彦の異議申立：
　特許異議申立人溝部孝彦は、甲第７号証記載の周知事項と共に本件出願後の甲第３及び第４号証の記載事項を勘案すると、本件訂正前の請求項１及び２に記載された発明は、(1)本出願以前に出願され本件出願後に公開された特願平5-509502号（甲第１号証に対応）の出願当初の明細書に記載される発明と実質的に同一であって、その出願人及び発明者が同一であるともいえないものであり、かつ(2)甲第２、第５、第６及び第８号証の記載に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、訂正前の請求項１及び２に係る特許は特許法第29条第2項及び同第29条の2の規定に違反してなされたものである旨、及び(3)訂正前の特許明細書に係る本件特許は特許法第36条第4項に規定する要件を満たしていない出願に対してなされたものである旨を主張している。
　
　　　　　　　　　記
甲第１号証：  特表平7-505761公報（特願平5-509502号）　（刊行物５）
甲第２号証：  Clinical Research,Vol.39,No.2,380A,1991,(April 2,1991)　（刊行物１）
甲第３号証：  Molecular Immunology,Vol.31,No.6,p.471-484(1994)　（参考資料４）
甲第４号証：　ATCC　Cell　Lines　5c8
甲第５号証：  J.Immunology,Vol.147,p.3389-3395(1991.11.15)　（刊行物２）
甲第６号証：  J.Immunology,Vol.146,No.4,p.1118-1124(1991.2.15)  （刊行物４）
甲第７号証：  続生化学実験講座、第５巻、免疫生化学研究法、第126-129頁（1987）
甲第８号証：　日本血液学会雑誌第４７巻第７号第1433-1444頁（昭和５９年）  （刊行物３）
　　　　
３．対比・判断：
　前記訂正がなされたことで、本件発明には、もはやヒトCD-40Lに対する抗体もしくはモノクローナル抗体は含まれないので、各異議申立人が指摘する刊行物５（エーザイの甲第３号証、鈴木正一の甲第３の１号証、溝部孝彦の甲第１号証）に対応した出願明細書の記載に基づく特許法第２９条の２違反についての瑕疵は解消された。
　また、刊行物１（エーザイの甲第１号証、鈴木正一の甲第１号証、溝部孝彦の甲第２号証）及び本件第１優先権主張日後第２優先権主張日前に頒布された刊行物２（エーザイの甲第２号証、鈴木正一の甲第２号証、溝部孝彦の甲第５号証）の記載事項に基づいて容易に発明できるとするヒトCD40-L抗体（モノクローナル抗体）についての主張ももはやなりたたない。
　そこで、以下、マウスCD40-L抗体（モノクローナル抗体）に対する(1)特許法第29条第2項違反の主張、及び(2)特許法第36条違反の主張について検討する。
　
３−１．(1)特許法第29条第2項違反の主張について：
　異議申立人のうち、溝部孝彦は、刊行物４（溝部孝彦の甲第６号証）の記載に基づいてマウスCD40-L抗体もしくはモノクローナル抗体を取得することが当業者に容易になし得た旨主張している。
　刊行物４によれば、マウス由来のヘルパーＴ細胞（Th細胞）をCD3抗体で活性化した「活性化Ｔ細胞膜成分」が精製されており、当該「活性化Ｔ細胞膜成分」にはＢ細胞活性化能があることが示されているとはいえるものの、「Thエフェクター機能の原因となるTh膜分子の正体は不明である（同第1122頁最終段落8-10行）。」と記載されているように、「Ｂ細胞活性化因子」が単離・精製されたわけではなく、単一のタンパク質抗原としての「Ｂ細胞活性化因子」が具体的に記載されているとすらいえない。
　なるほど、木村昭治教授鑑定書（エーザイの甲第８号証）の記載及び刊行物３（鈴木正一の甲第６号証、溝部孝彦の甲第８号証）の記載からみて、本件第１優先権主張日前に、細胞膜自体を用いて細胞膜抗原を認識するモノクローナル抗体を取得する手法自体は周知であり、その成功例も知られていたとしても、刊行物４における「活性化Ｔ細胞膜成分」は多数の表面抗原混合物から構成されると考えられ、その中での「Ｂ細胞活性化因子」が占める割合も不明であるばかりか、そもそも単一成分か否かも不明であるような場合であり、そのような場合であっても直ちに適用できるといえるほどに確実性のある技術であったとまではいえない。
　そして、本件発明においては、マウスCD40-L遺伝子がクローニングされ、全長もしくは可溶性のマウスCD-40Lタンパク質が提供されたことで、はじめて従来技術からみて格段に簡単かつ確実に、当業者がマウスCD40-Lを認識できる抗体もしくはモノクローナル抗体を取得することができるようになったというべきである。このようなとき、本件発明の当該技術分野における貢献は多大なものがあり、その効果は格別なものであるとするのが相当である。
　したがって、各異議申立人の提出した全証拠及び主張を勘案しても、本件発明は刊行物４及び他の各甲号証の記載に基づいて当業者が容易に発明できたものであるとする主張は採用できない。
　
３−２．(2)特許法第36条違反の主張について：
　異議申立人鈴木正一及び溝部孝彦は、本件特許明細書の記載からではマウスCD40-L抗体もしくはモノクローナル抗体についての発明は当業者が容易に実施できない旨を主張している。
　本件明細書には、実際にマウスCD-40L抗体もしくはモノクローナル抗体を取得した例はなく、実施例７（【0109】〜【0111】）として記載されているモノクローナル抗体作製法は、マウスを免疫感作する一般的なモノクローナル抗体作製法が記載されているのみである。むしろ実施例７に記載されるように免疫動物としてマウスを用いた場合には通常免疫寛容が働くと考えられるから、実施例通りに追試してもマウスCD40-Lモノクローナル抗体が容易に取得できない点は、両異議申立人の主張する通りである。
　しかしながら、本件優先権主張日から４年も前に発行された一般的なモノクローナル抗体作製のための教科書的実験マニュアル本である「『単クローン抗体実験マニュアル』講談社サイエンティフィック（1987.11.20）発行、第13-18頁（特に第16頁表2.2）」によれば、本件優先日前には免疫動物としてラットを用いたマウス由来タンパク質のモノクローナル抗体作製例も多数知られており、ラット／ラットのハイブリドーマ系はマウス／マウスの系と同様に簡単に入手可能な実験系であったといえるから、マウスCD40-Lモノクローナル抗体を得ようとする当業者が本件特許明細書を読むときには、実施例７のマウスを適宜ラットに置き換えて理解するということができる。
　そして、本件特許明細書においては、マウスCD40-L遺伝子の全長がクローニングされ、全塩基配列及び対応するアミノ酸配列と共にその可溶化部分が明記されているばかりか、実際にマウスCD40-Lを膜結合蛋白もしくは融合蛋白の形態で発現させそのＢ細胞刺激活性等を確認している。このことは、遺伝子組換え法によりマウスCD40-L本来の生理学的活性を保持したタンパク質、即ち立体構造的にも天然体と類似したマウスCD40-Lタンパク質が取得できたことに他ならず、当該タンパク質は同様に本来の免疫学的活性も保持していると考えるのが自然である。
　そうしてみると、天然体と同様の抗原性を保持したマウスCD40-Lが遺伝子組換え法で大量に取得できるといえるわけだから、当該抗原タンパク質を高濃度で免疫することが可能であり、上述の周知のラット／ラットの系を用いることで、当業者は容易にかつ確実にマウスCD40-Lモノクローナル抗体を取得することができるとすることに無理はない。即ち、本件特許明細書の発明の詳細な説明中には、本件発明が当業者にとって充分に容易に実施できる程度に記載されているとするのが相当である。
　したがって、両異議申立人の上記主張は採用することができない。
　
３−３．以上述べたように、本件発明については、マウスCD40-L抗体（モノクローナル抗体）に対する異議申立人の主張も採用できない。
　　
〔４〕結語
　以上のとおりであるから、特許異議の申立ての理由及び証拠によっては本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
新規なサイトカインに対する抗体
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
　
ＣＤ４０−Ｌと免疫反応性の抗体であって、前記ＣＤ４０−Ｌが以下の：
　
（ａ）配列番号：２のアミノ酸１−２６０；および
　
（ｂ）配列番号：２のアミノ酸４７−２６０
からなるグループから選択されるアミノ酸配列を有するものである、前記抗体
　【請求項２】
　モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、新規なサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）に関する。より具体的には、本発明は、ヒトＣＤ４０に結合し、アゴニスト及びアンタゴニスト活性の両方を有する可溶性で膜結合型のマウス及びヒトサイトカインのクローニングに関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　“インターロイキン”の呼称を有するサイトカインは、免疫エフェクター細胞に影響を及ぼすタンパク質因子である。インターロイキン−１からインターロイキン−１２までで呼ばれているサイトカインが報告されており、インターロイキンと命名されている。他の既知のサイトカインには、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、マスト細胞成長因子（ＭＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）等が含まれる。
　【０００３】
　２種の異なるＴＮＦレセプター（タイプＩ及びタイプＩＩ）のＤＮＡがクローン化されている（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４８：１０１９，１９９０；及びシャル（Ｓｃｈａｌｌ）ら，Ｃｅｌｌ　６１：３６１，１９９０）。両方の型のＴＮＦレセプターは互いに関連していて、そのメンバーに神経成長因子レセプター（ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら，Ｃｅｌｌ　４７：５４５，１９８６）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０（スタメンコビック（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ）ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．８：１４０３，１９８９）、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０（マレット（Ｍａｌｌｅｔｔ）ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．９：１０６３，１９９０）、ヒトＦａｓ抗原（イトウ（Ｉｔｏｈ）ら，Ｃｅｌｌ　６６：２３３，１９９１）及びマウス４−１ＢＢレセプター（クォン（Ｋｗｏｎ）ら，Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２１：４１４，１９８９〔クォンらＩ〕及びクォンら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１９６３，１９８９〔クォンらＩＩ〕）が含まれるレセプターのファミリーに属している。
　【０００４】
　ヒトＣＤ４０タンパク質（ＣＤ４０）は、３０，６００の分子量、及び疎水性アミノ酸を主として含む１９アミノ酸分泌シグナルペプチドを有する２７７アミノ酸のペプチドである（スタメンコビックら）。成熟ヒトＣＤ４０タンパク質の分子量（グリコシル化は除く）は２８，３００である。ヒトＣＤ４０をコードするｃＤＮＡは、バーキットリンパ腫細胞系ラージから調製されたｃＤＮＡライブラリーから単離された。ＣＤ４０ｃＤＮＡによりコードされる推定上のタンパク質は、推定上のリーダー配列、膜貫通ドメイン及び膜結合レセプタータンパク質に共通の幾つかの他の特徴を含む。ＣＤ４０は、Ｂリンパ球、上皮細胞及び幾つかのカルチノーマ（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）細胞系上で発現されることが見出されている。
　【０００５】
　ＣＤ４０に対して向けられたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ヒトＢ細胞の種々の機能的作用を媒介することが示されている。これら作用には：（ａ）同型付着（ゴードン（Ｇｏｒｄｏｎ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８〔ゴードンらＩ〕）；（ｂ）細胞の大きさの増加（ゴードンらＩ及びバーレ（Ｖａｌｌｅ）ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３，１９８９）；（ｃ）抗ＩｇＭ、抗ＣＤ２０ｍＡｂ、フォルボールエステル単独（クラーク（Ｃｌａｒｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：４４９４，１９８６；及びパウリー（Ｐａｕｌｉｅ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０，１９８９）、又はインターロイキン−４と組み合わせたフォルボールエステル（ゴードンら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５，１９８７〔ゴードンらＩＩ〕）で活性化されたＢ細胞の増殖；及び（ｄ）インターロイキン−４（ＩＬ−４）刺激Ｔ−除去培養物からのＩｇＥ（ジャバラ（Ｊａｂａｒａ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１，１９９０；ザング（Ｚｈａｎｇ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６，１９９１）及びＩｇＭ（ガスカン（Ｇａｓｃａｎ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）の産生が含まれる。
　【０００６】
　バンチェレイア（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）ら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｓｐｅｃｔｒｕｍ　３：８，１９９１〔バンチェレイアらＩ〕によりｍＡｂ８９と呼ばれるかかる抗体の１つが、比較的低い抗体濃度（３０ｎｇ／ｍｌ又は約１０−１０Ｍ）でヒトＢ細胞増殖を誘発することが見出されている。増殖は２〜３週間続いて１０倍に拡大したヒトＢ細胞個体群が得られた。ＣＤ４０表面分子がＩｇＭにより架橋された場合は、Ｂ細胞の最高の刺激が起こった。もう１つの抗ＣＤ４０ｍＡｂのＦａｂ断片は、弱い増殖応答を誘発しただけであった。更に、バンチェレイアら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：７０，１９９１〔バンチェレイアらＩＩ〕は、ヒトＦｃレセプターで形質移入したマウス線維芽細胞のＬｔｋ−細胞系及びヒトＣＤ４０に特異的なモノクローナル抗体の両方と共にインキュベートすると、休止期のヒトＢ細胞が持続した増殖の状態に入ることを報告した。バンチェレイアらＩＩは、架橋ＣＤ４０がＢ細胞のクローン拡大に必要であることを見出した。
　【０００７】
　ＣＤ２３は、Ｔ細胞ではなく殆どのＩｇＭ−／ＩｇＤ−成熟Ｂ細胞上で発現されることが見出されている低親和性ＩｇＥレセプターである。ＣＤ２３は配列決定されており、その配列はキクタニ（Ｋｉｋｕｔａｎｉ）ら，Ｃｅｌｌ　４７：６５７，１９８６に記載されている。可溶性ＣＤ２３（ｓＣＤ２３）は、ウサギにおいて発熱反応を誘発し、この反応はヒトＩｇＥの投与によって阻害されることが見出された（ガーデリ（Ｇｈａｄｅｒｉ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　７３：５１０，１９９１）。従って、ＣＤ２３は可溶性ＣＤ４０又はＣＤ４０−Ｌ作用の適切なマーカーであると言える。
　【０００８】
　本発明がなされる以前にＣＤ４０のリガンドは知られていない。従って、当該技術分野において、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０−Ｌ）を同定しかつその特性を明らかにする必要が存在する。
　【０００９】
　【発明が解決しようとする課題】
　新規なサイトカイン（以下“ＣＤ４０−Ｌ”という）を単離してその特性を明らかにした。代表的なマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１及び図１に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号：２に掲げる。代表的なヒトＣＤ４０−ＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１１及び図２に開示し、そのアミノ酸配列も配列番号：１２に掲げる。本発明は、更に、温和な又は苛酷なストリンジェント条件下（ｕｎｄｅｒ　ｍｏｄｅｒａｔｅ　ｏｒ　ｓｅｖｅｒｅ　ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）で、配列番号：１１によって規定されるプローブ（ヒトＣＤ４０−Ｌのコーディング領域）に、配列番号：１１のヌクレオチド４６からヌクレオチド８２８までに及ぶ該配列の断片に、又は図２（配列番号：１１）に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列又はそれらの断片にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる他のＣＤ４０−Ｌポリペプチドも含む。本発明は、更に、遺伝子コードの縮重により、上記の核酸配列によってコードされるポリペプチドに実質的に同一又は実質的に類似のポリペプチドをコードする核酸配列、及びそれらに相補的な配列を含む。
　【００１０】
　ＣＤ４０−Ｌは、そのＣ−末端で細胞外領域を有し、Ｎ−末端で膜貫通領域と細胞内領域を有するタイプＩＩ膜ポリペプチドである。マウスＣＤ４０−Ｌの可溶体は、ＥＬ−４細胞からの上澄み液の中に見出されており、ＥＬ−４細胞は、ここに記載したビオチニル化ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に基づいて選別したものである。可溶性ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌの細胞外領域又はその断片を含む。マウスＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列は図１及び配列番号：２に記載されており、ヒトＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列は図２及び配列番号：１２に記載されている。マウスＣＤ４０−Ｌの細胞外領域は、図１及び配列番号：２のアミノ酸４７からアミノ酸２６０に及んでおり、ヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域は、図２及び配列番号：１２のアミノ酸４７からアミノ酸２６１に及んでいる。ＣＤ４０−Ｌの生物活性は、このサイトカインのＣＤ４０との結合によって媒介されており、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌を含む抗体分泌を含む。
　【００１１】
　本発明は、更に、配列番号：１及び配列番号：１１に及び図１及び２に記載したＣＤ４０−Ｌのヌクレオチド配列又はＣＤ４０−Ｌの該ヌクレオチド配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列から選ばれる少なくとも約１２ヌクレオチドの配列に対応するアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）を提供する。かかるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ＣＤ４０−ＬｍＲＮＡの転写又はポリペプチドの翻訳を阻止する。
　【００１２】
　より更には、本発明は、ＣＤ４０−Ｌ免疫原に特異的な抗体を生ずる免疫原として働くことのできる、配列番号：１又は配列番号：１１によりコードされるアミノ酸配列から選ばれる少なくとも１０アミノ酸のタンパク質配列に対応するＣＤ４０−Ｌペプチド断片を提供する。かかるＣＤ４０−Ｌ免疫原断片は、ＣＤ４０−Ｌに特異的なモノクローナル抗体を供給する際に、抗原決定基として役立ち得る。
　【００１３】
　本発明は、また、ヒトＣＤ４０の細胞外領域を含むヒトＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質及び可溶性ＣＤ４０タンパク質（ｓＣＤ４０）も提供する。ｓＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の両方は、ＣＤ４０−Ｌ又は抗ＣＤ４０ｍＡｂ誘導Ｂ細胞刺激、Ｂ細胞内でのＩＬ−４誘導ＩｇＥ刺激及びＩＬ−４誘導ＣＤ２３誘発を阻害することができる。
　【００１４】
　【課題を解決するための手段】
　マウス及びヒトＣＤ４０のリガンドとして働くことのできる新規なポリペプチドを単離して配列決定した。より詳しくは、これらリガンドをコードするｃＤＮＡをクローン化して配列決定した。更に、組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現方法も提供する。ＣＤ４０−Ｌポリペプチドには、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの誘導体又は類縁体の如き、他の型の哺乳動物ＣＤ４０−Ｌが含まれる。マウス及びヒトＣＤ４０−Ｌは、完全長のＣ−末端においてそれぞれ２１４及び２１５アミノ酸細胞外領域、つまり膜結合ポリペプチドを含む。該細胞外領域は、ＣＤ４０に結合するドメインを含有する。マウス及びヒトＣＤ４０−Ｌは、更に、いずれかの側に荷電したアミノ酸により描写される相同な疎水性２４アミノ酸膜貫通領域及びそれらのＮ−末端において２２アミノ酸細胞内領域を含む。本発明は、更に、該細胞外領域の全部若しくは一部分又は該細胞外領域の誘導体を含む完全長ＣＤ４０−Ｌポリペプチド又はその断片、及びマウス又はヒトＣＤ４０−ＬをコードするｃＤＮＡで形質移入され、膜結合タンパク質としてヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌを発現する哺乳動物細胞を包含する。
　【００１５】
　本発明は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡ配列及びかかる単離されたＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含む。該単離されたＤＮＡ配列及びそれらの相補体は、（ａ）図２（配列番号：１１）に記載したＤＮＡ配列のヌクレオチド１８４から８２８、ヌクレオチド１９３から８２８又はヌクレオチド１９３から７６２及びそれらの相補体、（ｂ）温和なストリンジェント条件下で、（ａ）のＤＮＡ配列又はそれらの相補体とハイブリダイズし、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド、その類縁体又は誘導体をコードするＤＮＡ配列、及び（ｃ）遺伝子コードの縮重により、前述のＤＮＡ配列又はそれらの相補体のいずれかによってコードされるＣＤ４０−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列からなる群から選ばれる。加えて、本発明は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド及びその類縁体をコードするＤＮＡ配列を含むベクター、及びかかるベクターで形質移入された宿主細胞を包含する。
　【００１６】
　ここに開示した新規なサイトカインは、ＣＤ４０、つまりＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーであるレセプター、のリガンドである。従って、ＣＤ４０−Ｌは、例えば、Ｂリンパ球によって発現されることが知られている、ＣＤ４０を介するシグナルの変換を司っているようである。完全長ＣＤ４０−Ｌは、そのＣ−末端において細胞外領域、膜貫通領域、及びそのＮ−末端において細胞内領域を有する膜結合ポリペプチドである。ＣＤ４０−Ｌの可溶体は、該細胞外領域又はその断片から作ることができ、可溶性ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌの膜結合体を発現する細胞からの培養上澄み液中に見出された。マウスＣＤ４０−Ｌの細胞外領域のタンパク質配列は、図１及び配列番号：２のアミノ酸４７からアミノ酸２６０に及ぶ。ヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域のタンパク質配列は、図２及び配列番号：１２のアミノ酸４７からアミノ酸２６１に及ぶ。ＣＤ４０−Ｌの生物活性は、ＣＤ４０又はその種特異的同族体と結合することによって媒介され、Ｂ細胞の増殖及び活性化Ｂ細胞のからのイムノグロブリン分泌の誘発を含む。ＣＤ４０−Ｌ（可溶性モノマー型及びオリゴマー型並びに膜結合型を含む）は、添加ＩＬ−４の存在なしにＢ細胞増殖及びイムノグロブリン分泌（ＩｇＥ分泌は除く）をもたらすことができ、活性を媒介するためにＩＬ−４及び架橋を必要とする抗ＣＤ４０抗体とは対照的である。
　【００１７】
　ＣＤ４０−Ｌとは、ＣＤ４０又はＣＤ４０の哺乳動物同族体に結合することのできるポリペプチドのことをいう。ここで用いる場合、“ＣＤ４０−Ｌ”という用語には、膜貫通及び細胞内領域を欠く可溶性ＣＤ４０−Ｌポリペプチド、ヒトＣＤ４０−Ｌの哺乳動物同族体、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの類縁体、又はヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの誘導体が含まれる。
　【００１８】
　ＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によっても得ることができる。ここで言うＣＤ４０−Ｌ類縁体は、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの配列に実質的に相同性のポリペプチドであるが、１又は２以上の欠失、挿入又は置換の故に、天然配列のＣＤ４０−Ｌ（ヒト又はマウス種）ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する。ＣＤ４０−Ｌの類縁体は、オリゴヌクレオチド合成及び連結により又は部位特異的突然変異誘発により調製したＤＮＡ構築体から合成することができる。
　【００１９】
　グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の如き他の化学部分と共有結合性又は集合性複合体を形成することによって、又はアミノ酸配列突然変異体を作り出すことによって、ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌの一次アミノ酸構造を修飾し、ＣＤ４０−Ｌ誘導体を作り出すことができる。ＣＤ４０−Ｌの共有結合性誘導体は、特定の官能基をＣＤ４０−Ｌアミノ酸側鎖又はＣＤ４０−ＬポリペプチドのＮ−末端若しくはＣ−末端又はその細胞外ドメインに連結することによって調製する。本発明の範囲に入るＣＤ４０−Ｌの他の誘導体には、例えば、Ｎ−末端又はＣ−末端融合のような組換え培養物中での合成によるＣＤ４０−Ｌと他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合性又は集合性複合体又はその断片が含まれる。例えば、該複合体は、翻訳と同時に又は翻訳後に該複合体の移動をその合成部位から細胞膜若しくは細胞壁の内側若しくは外側へと行う、ＣＤ４０−ＬポリペプチドのＮ−末端領域又はＣ−末端領域におけるシグナル又はリーダーポリペプチド配列を含んでもよい（例えば、サッカロミセス属のα−因子リーダー）。ＣＤ４０−Ｌポリペプチド融合体は、ＣＤ４０−Ｌの精製及び同定を容易にするために付加したポリペプチド（例えば、ポリ−Ｈｉｓ）を含んでもよく、又、新規な多官能性存在物を提供するために他のサイトカインとの融合体を含んでもよい。他のサイトカインには、例えば、インターロイキン−１から１３までのいずれか、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＭＧＦ（マスト細胞成長因子）、ＥＧＦ（表皮成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＥＰＯ（エリスロポイエチン）、γ−ＩＦＮ（γ−インターフェロン）、４−１ＢＢ−Ｌ（４−１ＢＢリガンド）及び免疫細胞成長、分化又は機能に影響を及ぼす他のサイトカインが含まれる。
　【００２０】
　本発明の範囲内の核酸配列には、温和な又は苛酷なストリンジェント条件下で、配列番号：１又は配列番号：１１のヌクレオチド配列にハイブリダイズするＤＮＡ及び／又はＲＮＡ配列又は相補的な配列が含まれる。温和にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、例えば、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２　ｅｄ．Ｖｏｌ．１，ｐｐ．１．１０１−１０４，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）に記載されている条件をいう。サムブルークらによって定義された温和でストリンジェントな条件には、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の予備洗浄溶液の使用及び５０℃で一晩の５×ＳＳＣでのハイブリダイゼーションが含まれる。苛酷でストリンジェントな条件には、より高温でのハイブリダイゼーション及び洗浄が含まれる。
　【００２１】
　ＣＤ４０−Ｌの生物活性は、例えば、ＣＤ４０のリガンド結合ドメインへの結合の競合により測定することができる（即ち、競合結合測定法）。マウスＣＤ４０−Ｌ及びヒトＣＤ４０−Ｌの両方がヒトＣＤ４０に結合する。ヒトＣＤ４０についてのマウスＣＤ４０−Ｌ（選別したマウスＥＬ−４０．９細胞上で発現したもの）の結合親和性は、約１．７４×１０９Ｍ−１であった。同じく、ヒトＣＤ４０についてのマウスＣＤ４０−Ｌ（選別していないマウスＥＬ−４６．１細胞上で発現したもの）の結合親和性は、約２．３×１０９Ｍ−１であった。両方の結合親和性測定値は、サイトカイン／サイトカインレセプター結合の通常の範囲内である。
　【００２２】
　ＣＤ４０−Ｌポリペプチドについての競合結合測定法の１つの形は、放射標識した可溶性の図１（配列番号：１）によるマウスＣＤ４０−Ｌ又は図２（配列番号：１１）によるヒトＣＤ４０−Ｌ、及びＣＤ４０を発現する無傷細胞（例えば、ヒトＢ細胞）を用いる。無傷細胞の代わりに、プロテインＡ又はプロテインＧ相互作用を介してそのＦｃ領域で固相に結合した（ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の如き）可溶性ＣＤ４０と置き換えてもよい。競合結合測定法の第２の形は、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の如き放射標識した可溶性ＣＤ４０、及びＣＤ４０−Ｌを発現する無傷細胞を用いる。また、可溶性ＣＤ４０−Ｌを固相に結合してもよい。
　【００２３】
　競合結合測定法は、標準的な方法を用いて行うことができる。例えば、放射標識マウスＣＤ４０−Ｌを用いて推定上のＣＤ４０−Ｌ同族体と競合させ、表面結合ＣＤ４０に対する結合活性を測定することができる。競合的オートラジオグラフプレート結合測定法により定量的結果を得ることができ、又定量的結果を得るためにスキャッチャードプロットを用いることもできる。
　【００２４】
　ＣＤ４０を発現する無傷細胞での競合結合測定法は、２つの方法で行うことができる。第１の方法では、懸濁液中で又は組織培養プレートへの粘着によるかのいずれかでＢ細胞を成育させる。粘着細胞は、３７℃で１０分間、５ｍＭ　ＥＤＴＡで処理することによって剥がすことができる。第２の方法では、膜結合ＣＤ４０を発現する形質移入ＣＯＳ細胞を用いることができる。ＣＯＳ細胞又は他の哺乳動物細胞を適当なベクター中のヒトＣＤ４０ｃＤＮＡで形質移入して、細胞外領域を有する完全長ＣＤ４０を細胞外に発現させることができる。
　【００２５】
　また、可溶性ＣＤ４０を、カラムクロマトグラフィーマトリックス、又は試験管又は１２５Ｉの如き検出可能な部分の存在についての分析に適する類似の支持体の如き固相に結合してもよい。固相への結合は、例えば、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を得て、それをプロテインＡ又はプロテインＧ表面に結合させることによって行うことができる。
　【００２６】
　ＣＤ４０−Ｌ及びその同族体の生物活性を測定する他の手段は、複合化した可溶性ＣＤ４０（例えば、１２５Ｉ−ＣＤ４０／Ｆｃ）を上記と類似の競合測定法において用いることである。しかしながら、この場合は、ＣＤ４０−Ｌを発現する無傷細胞、又は固体支持体に結合した可溶性ＣＤ４０−Ｌを用いて、推定上のＣＤ４０同族体を含有するサンプルに複合化した可溶性ＣＤ４０のＣＤ４０−Ｌへの結合についての競合を測定する。
　【００２７】
　ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖検定法で生物活性を測定することによって分析してもよい。ヒトＢ細胞は、デフランス（Ｄｅｆｒａｎｃｅ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：１１３５，１９８７により記載された陰性選択法及びパーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）密度沈降法による精製により、ヒト扁桃腺から得ることができる。バーキットリンパ腫細胞系を用いて、ＣＤ４０−Ｌに応答する細胞増殖を測定してもよい。バーキットリンパ腫細胞系の例には、例えば、ラージ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８６）、ダウジ（Ｄａｕｄｉ）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２１３）及びナマルワ（Ｎａｍａｌｗａ）（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１４３２）が含まれる。膜結合ＣＤ４０−ＬはＢ細胞増殖を刺激した。オリゴマー、好ましくはダイマーのＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖を刺激することができる。ＣＤ４０（レセプター）は、Ｂ細胞のＣＤ４０−Ｌ増殖に対抗する。
　【００２８】
　ＣＤ４０−Ｌ生物活性を測定するための他の分析法は、ＣＤ４０−Ｌ又はその誘導体又は類縁体による活性化に応答してＢ細胞により産生されるイムノグロブリンを測定することである。例えば、培養液中５×１０５細胞／ｍｌのＢ細胞と共に少なくとも７日間インキュベートすることによって、ポリクローナルイムノグロブリン分泌を測定することができる。イムノグロブリン（Ｉｇ）産生は、マリスゼウスキー（Ｍａｌｉｓｚｅｗｓｋｉ）ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３０２８，１９９０〔マリスゼウスキーらＩ〕又はマリスゼウスキーら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：１７３５，１９９０〔マリスゼウスキーらＩＩ〕に記載された如きＥＬＩＳＡ分析法により測定することができる。マウスＢ細胞は、例えば、マウスから採取して、グラブシュタイン（Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１４０５，１９８６〔グラブシュタインらＩ〕、マリスゼウスキーらＩ及びマリスゼウスキーらＩＩに記載された操作に従って培養することによって得ることができる。
　ＣＤ４０−Ｌを、ＣＤ４０を発現する細胞を検出するための結合分析に用いることもできる。例えば、図１（配列番号：１）によるマウスＣＤ４０−Ｌ若しくは図２（配列番号：１１）によるヒトＣＤ４０−Ｌ、又はその細胞外ドメイン又は断片を、１２５Ｉの如き検出可能部分と複合化させることができる。１２５Ｉでの放射標識は、高い特異的活性に標識された機能性１２５Ｉ−ＣＤ４０−Ｌ分子を生成する多くの標準的方法のいずれかにより行うことができる。また、比色定量又は蛍光定量反応を触媒することのできる酵素の如き他の検出可能部分、ビオチン又はアビジンを用いてもよい。ＣＤ４０を発現する細胞を複合化ＣＤ４０−Ｌと接触させることができる。インキュベーション後に未結合複合化ＣＤ４０−Ｌを除いて、検出可能部分を用いて結合を測定する。
　【００３０】
　ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、ダイマー又はトリマーの如きオリゴマーとして存在してもよい。オリゴマーは、異なるＣＤ４０−Ｌポリペプチド上のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合により連結される。また、２つの可溶性ＣＤ４０−ＬドメインをＧｌｙ４ＳｅｒＧｌｙ５Ｓｅｒリンカー配列、又は米国特許第５，０７３，６２７号に記載された他のリンカー配列で連結することができる。なお、米国特許第５，０７３，６２７号は参照によりここに組み入れられるものとする。ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質について記載したようにして、可溶性ＣＤ４０−ＬのＣ−末端（細胞外ドメイン）をＩｇＧ１のＦｃ領域（例えば、配列番号：３）に融合させることによって、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを作り出してもよい。ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質は、その組み立てが抗体分子のＨ鎖に非常に似ており、二価のＣＤ４０−Ｌを形成している。融合タンパク質が抗体のＨ鎖とＬ鎖の両方でできているなら、４つのＣＤ４０−Ｌ細胞外ドメインだけでＣＤ４０−Ｌオリゴマーを形成することが可能である。
　【００３１】
　融合タンパク質は、望ましい配列からの断片の酵素切断及び連結の慣用技術を用いて調製してもよい。合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法を用いて目的の断片を調製及び／又は増幅することができる。目的の配列に該当する合成オリゴヌクレオチドのオーバーラッピングを使用して、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築体を調製することもできる。融合タンパク質は、ＣＤ４０−Ｌと、リーダー（又はシグナルペプチド）配列、Ｆｃ領域、リンカー配列、及び融合タンパク質を容易に精製できかつ速やかに検出できる手段を提供する高度に抗原性の部分をコードする配列を含む２又は３以上の付加的な配列を含むこともできる。
　【００３２】
　シグナルペプチドは、細胞からのタンパク質の分泌を促進する。代表的はシグナルペプチドは、ヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７；グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：３０２，１９８９；図２Ｂ）のリーダー配列のアミノ末端２５アミノ酸である。他のシグナルペプチドを用いてもよい。例えば、ＩＬ−７リーダー配列内の一定のヌクレオチドを、アミノ酸配列を変化させることなく変化させることができる。更に、ＩＬ−７配列がリーダー配列として働く能力に影響を及ぼさないアミノ酸変化を行うことができる。
　【００３３】
　Ｆｌａｇ（登録商標）オクタペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）は、融合タンパク質の生物活性を変化させず、高度に抗原性であって特異的モノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供し、発現された融合タンパク質の検出と迅速にしかつ精製を容易にする。Ｆｌａｇ（登録商標）配列も、Ａｓｐ−Ｌｙｓ対合の直後の残基においてウシ粘膜エンテロキナーゼにより特異的に切断され、このペプチドでキャップされた融合タンパク質は、大腸菌内での細胞内分解に対して抵抗性であり得る。Ｆｌａｇ（登録商標）配列に結合するマウスモノクローナル抗体を、受託番号ＨＢ９２５９でＡＴＣＣに寄託した。Ｆｌａｇ（登録商標）配列を含む融合タンパク質の精製において該抗体を使用する方法は、米国特許第５，０１１，９１２号に記載されており、参照によってここに組み入れられるものとする。
　【００３４】
　適当なＦｃ領域は、プロテインＡ又はプロテインＧに結合でき、また別に、該Ｆｃ領域を含む融合タンパク質の精製又は検出に用いることのできる抗体によって認識されるＦｃ領域として定義される。好ましいＦｃ領域には、ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１のＦｃ領域が含まれる。１つの例は、配列番号：３に示したヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域であり、もう１つの例は、鋳型としてヒトｃＤＮＡを用いる、配列番号：９及び配列番号：１０からのオリゴヌクレオチドプライマーからのＰＣＲにより得られるｃＤＮＡによりコードされるＦｃ領域である。適当なＦｃ領域の一部分も用いることができ、例えば、プロテインＡへの結合を司っているアミノ酸の配列を欠失した結果、生じたＦｃ領域がプロテインＡにではなくプロテインＧに結合するようになったヒトＩｇＧ１のＦｃ領域がある。
　【００３５】
　〔Ｇｌｙ４Ｓｅｒ〕３繰り返し配列は、ＣＤ４０−Ｌがその第二及び第三構造に正確に折り重なるのを確実にするのに充分な距離だけ、ＣＤ４０−Ｌの細胞外領域を融合タンパク質のＦｃ部分から離すリンカー配列を提供する。適するリンカー配列は、（１）柔軟に延びたコンフォメーションに適合し、（２）融合タンパク質の機能性ドメインと相互作用するおそれのある整然とした第二構造を形成しようとする傾向を示さず、そして（３）機能性タンパク質ドメインとの相互作用を助長するおそれのある疎水性又は荷電性が最小のものであろう。柔軟なタンパク質領域内の典型的な表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒが含まれる。事実上、Ｇｌｙ、Ａｓｎ及びＳｅｒを含有するアミノ酸配列のあらゆる組み合わせが、リンカー配列についての上の規準を満足すると考えられる。Ｔｈｒ及びＡｌａの如き他の殆ど中性のアミノ酸をリンカー配列に用いてもよい。リンカー配列の長さは多様に変化してもよいが、該融合タンパク質の生物活性に有意な影響を与えてはならない。融合したタンパク質が、機能性ドメインを離して立体的干渉を防ぐのに用いることのできる必須ではないＮ−又はＣ−末端アミノ酸領域を有する場合は、リンカー配列は不要である。
　【００３６】
　ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、図１（配列番号：１）及び図２（配列番号：１１）に示したＣＤ４０−Ｌの細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドとして又はマウス及びヒト配列についてそれぞれ図１（配列番号：１）及び図２（配列番号：１１）に示した該細胞外ドメイン、膜貫通領域及び短い細胞内ドメインを含む膜結合ポリペプチドとして存在してもよい。更に、本発明は、ジスルフィド相互作用により連結されるか、又はスペーサーアミノ酸連結基を有するか若しくは有しない融合ポリマーとして発現されるＣＤ４０−Ｌ細胞外ドメインのオリゴマー又はその断片を包含する。例えば、ダイマーＣＤ４０−Ｌ分子は、ＩｇＧ　Ｆｃ領域連結基により連結され得る。
　【００３７】
　理論に拘束されることないが、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌは、従来はＩＬ−４の存在下で架橋抗ＣＤ４０抗体によって達成されたに過ぎなかったＩｇ形成及びＢ細胞の増殖を刺激する活性をもたらすことができる。更に、ＣＤ４０−Ｌの細胞外ドメインだけを含み、ＣＤ４０レセプターに結合できるモノマー可溶性ＣＤ４０−Ｌは、膜結合及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌ及び／又は架橋抗ＣＤ４０抗体の活性に対抗するのに役立つと考えられる。更に、膜結合ＣＤ４０−ＬとＣＤ４０との相互作用が、抗原特異性抗体産生及びポリクローナルＩｇ分泌の両方へのＢ細胞成長及び分化のＴ細胞接触依存性誘発を司る主要な分子相互作用であると考えられる。この点で、完全長ＣＤ４０−Ｌ（即ち、膜結合性であり、細胞内ドメイン、膜貫通領域及び細胞外ドメイン又はそれらの断片を有する）をコードするｃＤＮＡで形質移入された哺乳動物細胞は、Ｂ細胞成長、分化及び抗原特異性抗体産生の刺激を誘発するＴ細胞の能力に関し、Ｔ細胞を真似ることができる。オリゴマー可溶性ＣＤ４０−Ｌ、好ましくは細胞外領域のダイマーの活性は、膜結合ＣＤ４０−Ｌの生物活性を真似ることができると考えられる。更に、可溶性モノマーＣＤ４０−Ｌ（該細胞外ドメイン又はその断片を含む）は、ＣＤ４０レセプターに結合してＴ細胞とＢ細胞の相互作用を阻止し、従って、それ自体モノマー型又はオリゴマー型であってもよいＣＤ４０（レセプター）細胞外ドメインに類似する活性を有することができる。また、ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞成長、分化及び抗原特異性抗体産生の刺激を誘発できる可溶性因子として働くために、オリゴマー（好ましくはダイマー）であることができる。従って、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０アゴニストとして働く一方で、可溶性（モノマー）ＣＤ４０−Ｌ及び可溶性ＣＤ４０は、シグナルを有意に伝達することなくＣＤ４０レセプター部位を遮断することにより又はＢ細胞及び他の標的細胞上のＣＤ４０部位にＣＤ４０−Ｌが結合するを阻止することにより、ＣＤ４０アンタゴニストとしても働くと考えられる。
　【００３８】
　ＣＤ４０アゴニスト及びＣＤ４０アンタゴニストの両方は有用な治療活性を有するであろう。例えば、ＣＤ４０アゴニスト（即ち、膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びオリゴマーＣＤ４０−Ｌ）は、ワクチンアジュバントとして及びハイブリドーマ細胞からのｍＡｂ産生を刺激するのに有用である。ＣＤ４０アンタゴニスト（即ち、ＣＤ４０レセプター、ＣＤ４０／Ｆｃ及びできるだけ可溶性のモノマーＣＤ４０−Ｌ）は、アレルギー、狼瘡、慢性間接リウマチ、インシュリン依存真性糖尿病（ＩＤＤＭ）、対宿主性移植片病（ＧＶＨＤ）等の如き高レベルの抗原抗体複合体の存在を特徴とする自己免疫疾患の治療に有用である。
　【００３９】
　ヒトＢ細胞からのＩｇＥ分泌は、Ｔ細胞存在下でＩＬ−４により誘発され得る（ベルセリ（Ｖｅｒｃｅｌｌｉ）ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：１２９５，１９８９）。更に、ＩｇＥ産生は、抗ＣＤ４０ｍＡｂの添加によって、Ｔ細胞除去ＰＢＭ（末梢血単核細胞）から誘発され得る（ジャバラら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１，１９９０及びザングら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１８３６，１９９１）。本発明は、更に、Ｔ細胞存在下のＩＬ−４により又はＣＤ４０−Ｌ（好ましくは、膜結合ＣＤ４０−Ｌ）により活性化された活性化Ｂ細胞からのＩｇＥ産生を阻害する方法であって、ここに記載したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質又は配列番号：３に記載したｃＤＮＡ配列によりコードされる可溶性ＣＤ４０を有効量投与することを含む方法を包含する。同様に、ＣＤ４０レセプター及びできるだけ可溶性のＣＤ４０−Ｌ（モノマーだけ）も、他の抗体アイソタイプの分泌を遮断することができる。
　【００４０】
　本発明は、更に、天然パターンのグリコシル化を伴うか又は伴わないＣＤ４０−Ｌポリペプチドを包含する。酵母又は哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−７細胞）内で発現されたＣＤ４０−Ｌは、何を発現系に選ぶかに依存して、分子量及びグリコシル化パターンに関し、天然ＣＤ４０−Ｌポリペプチドと類似していても有意に異なっていてもよい。大腸菌の如き細菌発現系でのＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現により、グリコシル化されていない分子が得られる。
　【００４１】
　生物活性又は結合に必要ではない、アミノ酸残基若しくは配列の種々の付加体若しくは置換体、又は末端若しくは内部残基若しくは配列の欠失体をコードするＤＮＡ構築体を調製することができる。例えば、細胞外ＣＤ４０−Ｌ　Ｎ−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を前もって排除し、酵母発現系を用いて同種の炭水化物減少類縁体を発現させることができる。真核性ポリペプチドにおけるＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸三連体Ａｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられる。ここで、ＸはＰｒｏを除くいずれかのアミノ酸であり、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒである。この三連体をコードするヌクレオチド配列を適当に修飾すると、Ａｓｎ側鎖における炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加又は欠失をもたらすであろう。他の例では、タンパク質の復元の際の正しくない分子内ジスルフィド橋の形成を防ぎながら、Ｃｙｓ残基をコードする配列を変化させて、Ｃｙｓ残基を欠失又は他のアミノ酸と置換させることができる。ヒトＣＤ４０−Ｌは、その細胞外ドメイン内に５つのＣｙｓ残基を含む。かくして、タンパク質三次構造又はジスルフィド結合形成に影響を及ぼさずに、該５つのＣｙｓ残基のうち少なくとも１つを他のアミノ酸で置換するか又は欠失させることができる。
　【００４２】
　突然変異誘発への他のアプローチは、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母系における発現を増進するために二塩基性アミノ酸残基をコードする配列の修飾を包含する。末端又は内部残基又は配列をコードする配列を欠失させることにより、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドのサブユニットを構築してもよい。
　【００４３】
　ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、多エクソン遺伝子によりコードされる。本発明は、更に、転写後の異なるｍＲＮＡスプライシングを原因とすることができる別のｍＲＮＡ構築体、及びここに開示したｃＤＮＡと同一性又は類似性を有する領域を共有する別のｍＲＮＡ構築体を包含する。
　【００４４】
　アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＣＤ４０−ＬｍＲＮＡ（センス）又はＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含む。本発明によるアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：１若しくは配列番号：１１の、又は配列番号：１若しくは配列番号：１１に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡの断片を含む。かかる断片は、少なくとも約１４のヌクレオチドを含む。好ましくは、かかる断片は、約１４〜約３０のヌクレオチドを含む。ＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作り出す能力は、例えば、シュタイン（Ｓｔｅｉｎ）及びコーエン（Ｃｏｈｅｎ），Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４８：２６５９，１９８８及びファン・デル・クロール（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ）ら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：９５８，１９８８に記載されている。
　【００４５】
　アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合により、二重鎖の形成がもたらされ、この二重鎖形成が、該二重鎖の分解の増進、転写又は翻訳の早期終結を含む幾つかの手段のうちの１つ又は他の手段により翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を遮断する。適するポリメラーゼプロモーターには、あらゆるＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーター、又はあらゆるＤＮＡポリメラーゼについてのプロモーターが含まれる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖−ホスホジエステル主鎖（又はＷＯ９１／０６６２９に記載されたものの如き他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含む。この場合、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに耐性である。耐性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、ｉｎ　ｖｉｖｏで安定である（即ち、酵素分解に対して抵抗できる）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたものの如き有機部分、及びポリ（Ｌ−リシン）の如き標的核酸配列についての該オリゴヌクレオチドの親和性を高める他の部分に共有結合したオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリプチシン（ｅｌｌｉｐｔｉｃｉｎｅ）の如き挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）、及びアルキル化剤又は金属錯体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに付けて、標的ヌクレオチド配列に対する該アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合特異性を変えてもよい。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含むあらゆる遺伝子移入法、又はエプスタイン・バー・ウィルスの如き他の遺伝子移入ベクターによって標的核酸配列を含有する細胞の中に導入することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、該アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適当なレトロウィルスベクターの中に挿入し、次いで、細胞と該挿入した配列を含有するレトロウィルスベクターをｉｎ　ｖｉｖｏ又はｅｘ　ｖｉｖｏのいずれかで接触させることによって、標的核酸配列を含有する細胞の中に導入される。適するレトロウィルスベクターには、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃ（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６を参照のこと）と呼称される二重コピーベクターが含まれるがこれらに限定されない。また、他のプロモーター配列を用いて該オリゴヌクレオチドを発現してもよい。
　【００４６】
　センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、また、ＷＯ９１／０４７５３に記載されたようなリガンド結合分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞の中に導入してもよい。適するリガンド結合分子には、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれるがこれらに限定されない。リガンド結合分子の複合化が、該リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨害しないか、又は該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはその複合体が細胞の中に入り込むのを遮断しないのが好ましい。
　【００４７】
　また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたようなオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成によって、標的核酸配列を含有する細胞の中に導入してもよい。該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは内因性リパーゼによって細胞内で解離される。
　【００４８】
　マウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡの配列を直接発現法によって得た。ヒトＣＤ４０−Ｌの配列は、マウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡをプローブとして用いて種間交叉ハイブリダイゼーション法によって得た。
　【００４９】
　本発明者らは、まず、スタメンコビック（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ）らに公表された配列（配列番号：４）に基づくプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により、ヒトＣＤ４０の細胞外領域のクローン（そのレセプター）を得ることによってマウスＣＤ４０−Ｌをクローン化した。上流のオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号：５）が、ＣＤ４０のイニシエーターメチオニンから上流にＳａｌＩ部位を導入し、下流のオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＧＴＣＴＡＧＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号：６）は、ＣＤ４０のアミノ酸１９２の後ろに終結コドンを挿入し、そのあとにＸｂａ１及びＳａｌＩ部位が続く。増幅したｃＤＮＡをＳａｌＩで消化し、ｐＤＣ４０６（マクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．１０：２８２１，１９９１）にクローン化してｐＤＣ４０６／ｓＣＤ４０を構築した。
　【００５０】
　第２のＣＤ４０レセプター断片（配列番号：４）を、ヒトＩｇＧ１（配列番号：３）のＦｃドメインへの融合用にＰＣＲ法により得た。簡単に説明すると、上流のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：５）及び融合鋳型（配列番号：４）は前と同じであった。下流のオリゴヌクレオチドプライマーは、ＣＤ４０のアミノ酸１９３の後ろにアミノ酸Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（配列番号：８）を挿入する５’−ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣ−３’（配列番号：７）であった。Ｇｌｕ及びＰｒｏは、ヒトＩｇＧ１の蝶番部の最初の２つのアミノ酸であり、そのあとにＢｇｌ　ＩＩ　制限部位が続く。該Ｂｇｌ　ＩＩ　制限部位は、ＣＤ４０の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の残りに融合するのに用いた。
　【００５１】
　他のレセプターからのリガンド結合ドメインを含む他の融合タンパク質は、レセプターのリガンド結合ドメインのＤＮＡ配列を得て、プロテインＡ若しくはプロテインＧ、又はアフィニティ精製のできる他のポリペプチド、例えば、アビジン又はストレプトアビジンに結合する抗体分子のＦｃ領域をコードするＤＮＡ配列にこの配列を融合させることによって作ることができる。得られる遺伝子構築体を哺乳動物細胞の中に導入して、融合タンパク質の一過性発現を行うことができる。レセプター／Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡ又はプロテインＧアフィニティ精製により精製することができる。レセプター／アビジン融合タンパク質は、ビオチンアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。その後、高濃度の塩溶液又は他の適当な緩衝液で溶出することによって、該融合タンパク質をカラムから分離することができる。
　【００５２】
　本発明者らは、ヒトの細胞からのｃＤＮＡを鋳型として用い、上流のオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＴＡＴＴＡＡＴＣＡＴＴＣＡＧＴＡＧＧＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：９）及び下流のオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＧＣＣＡＧＣＴＴＡＡＣＴＡＧＴＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡ−３’（配列番号：１０）を用いるＰＣＲ増幅法により、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域をコードするｃＤＮＡを得た。該ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡは、蝶番部の開始部位の近くにＢｇｌ　ＩＩ　を導入した。これは、ＣＤ４０の細胞外ドメインを連結してｓＣＤ４０／Ｆｃ融合ｃＤＮＡを構築するのに用い、この融合ｃＤＮＡは、ｐＤＣ４０６内に連結してｐＤＣ４０６／ＣＤ４０／Ｆｃを構築した。他の適するＦｃ領域は、高い親和性でプロテインＡ又はプロテインＧと結合できるあらゆる領域として定義され、ヒトＩｇＧ１又はマウスＩｇＧ１のＦｃ領域が含まれる。１つの例は、配列番号：３に示したヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域又はヒトｃＤＮＡを鋳型として配列番号：９及び配列番号：１０からのオリゴヌクレオチドプライマーからのＰＣＲにより得られるｃＤＮＡである。
　【００５３】
　レセプター／Ｆｃ融合分子は、好ましくは、組換え哺乳動物細胞の培養で合成される。というのは、それらは原核細胞発現法により合成するには一般にあまりに大きくかつ複雑過ぎるからである。レセプター／Ｆｃ融合タンパク質の発現に適する哺乳動物細胞の例には、ＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ７０）及びＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１）が含まれ、両方共サルの腎臓由来のものである。
　【００５４】
　ＤＮＡ構築体ｐＤＣ４０６／ＣＤ４０／Ｆｃをサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤＣ４０６プラスミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）由来の調節配列を含む。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、エプスタイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ヒトＣＭＶ即時−初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）エンハンサー／プロモーター由来のＥＢＮＡ−１を構成的に発現する遺伝子でＣＶ−１細胞系を形質移入することにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤＣ４０６の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
　【００５５】
　ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を発現する形質移入体は、初めに、ドットブロット法又はウェスタンブロット法を用いて同定される。次いで、上澄み液をドットブロット又はゲル電気泳動に付してから、Ｇ２８−５ｍＡｂ（ヒトＣＤ４０レセプターに結合する抗体）と結合させるために該電気泳動したタンパク質を移す。次いで、ブロットしたタンパク質を放射標識１２５Ｉ−プロテインＡと共にインキュベートし、洗浄して未結合標識を除き、そしてＦｃの発現について検査した。モノクローナル抗体Ｇ２８−５は、クラーク（Ｃｌａｒｋ）らの前記文献に従って作った。
　【００５６】
　該融合構築体を発現する細胞を同定したので、形質移入細胞の大規模培養を行って、ＣＤ４０／Ｆｃを発現する細胞からの上澄み液を蓄積した。上澄み液中のＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に説明すると、哺乳動物細胞上澄み液を（例えば、０．４５μフィルターで）濾過し、濾液をプロテインＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（シュライハー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）及びシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ），キーン（Ｋｅｅｎｅ），ＮＨ）に４℃で１．５ｃｍ×１２．０ｃｍカラムについて８０ｍｌ／ｈの流速で適用することによって、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する１リッターの培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなくなるまで、カラムをＰＢＳ中の０．５Ｍ　ＮａＣｌで洗浄した。最後に、ＰＢＳでカラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ２．８の２５ｍＭクエン酸緩衝液でカラムから溶出させ、ｐＨ９．１の５００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。該溶出したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルにより、＞９８％純度であることが分かった。
　【００５７】
　ここに記載したようにして、可溶性ＣＤ４０（ｓＣＤ４０）及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を作った。形質移入ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞により発現されたｓＣＤ４０をアフィニティ精製するために、該上澄み液をＧ２８−５（抗ＣＤ４０ｍＡｂ）アフィニティカラムに通して精製した。タンパク質含有画分をプールし、Ｇ２８−５結合測定及び還元剤として１ｍＭジチオスレイトールの存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナトリウムドデシルサルフェート・ポリアクリルアミドゲル電気泳動）による分析のためにアリコートを取った。分子量２８，１００ダルトンの１本のバンドが見られた。還元剤なしでは、ｓＣＤ４０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は２本のバンドを示し、大きいバンドの分子量は５６，０００であり、小さい方のバンドの分子量は２８，０００であった。該バンディングパターンは、ｓＣＤ４０の大部分は溶液中でジスルフィド結合ホモダイマーとして存在することを示している。２８，０００のバンドはフリーのモノマーである。
　【００５８】
　銀染色によりＣＤ４０タンパク質を可視化した。サンプルタンパク質濃度は、超純粋ウシ血清アルブミンをスタンダードとするマイクロＢＣＡ測定法（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて測定した。可溶性ＣＤ４０純度及びタンパク質濃度は、アミノ酸分析により確認した。精製した可溶性ＣＤ４０をＰＶＤＦペーパーに吸収させ、アプライド・バイオシステムズ・モデル４７７Ａタンパク質配列分析装置で、Ｎ−末端タンパク質配列分析についてのメーカーの説明書に従って、該ペーパーを自動エドマン分解に付した。この操作は、ｓＣＤ４０のタンパク質配列を点検した。
　【００５９】
　可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質は、抗ＣＤ４０ｍＡｂ（Ｇ２８−５）の不存在下でヒトＢ細胞応答を調節することができた。精製した扁桃腺Ｂ細胞を抗ＩｇＭ及びヒトＩＬ−４と一緒に培養して、ｓＣＤ４０又はＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを添加した。どの型のＣＤ４０も、（トリチウム標識チミジン取り込みにより測定して）Ｂ細胞増殖への阻害作用を有さなかった。対照的に、ＩＬ−４レセプターは、濃度に依存して、ＩＬ−４誘導Ｂ細胞増殖を阻害した。
　【００６０】
　２ドナーＭＬＣ（混合リンパ球培養）系でＩＬ−４誘導ＩｇＥ分泌を阻害する能力について可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを試験した。３実験において、ＣＤ４０の濃度が増加するにつれて、ＩｇＥ産生のレベルが減少した。１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した可溶性ＣＤ４０は、アレルギーのこのモデルにおけるＩｇＥ分泌を完全に阻害することができた。更に、ＣＤ４０／Ｆｃもその可溶性等価物と類似の作用を有した。しかしながら、ＩＬ−７レセプター・Ｆｃ融合タンパク質（公表されたＩＬ−７レセプター配列で類似の操作により作った）の添加は、このモデルにおけるＩｇＥの分泌に影響を及ぼさなかった。
　【００６１】
　ＣＤ２３のレベルもｓＣＤ４０又はＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に対応して同じＭＬＣで測定した。可溶性ＣＤ４０は、ＩＬ−４単独で刺激した培養物に比較して、６日目で小さいが再現性よくｓＣＤ２３レベルを低下させたが、１２日目に同じ培養物においてより強い阻害作用を示した。ＩＬ−４刺激Ｔ除去ＰＢＭ（末梢血マクロファージ）Ｅ−細胞による可溶性ＣＤ２３の誘発もｓＣＤ４０の添加により同じく影響を受け、６日目でｓＣＤ２３レベルが小さく低下し、１２日目でより著しい阻害作用を示した。各培養系において、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質での結果は、ｓＣＤ４０での結果と実質的に同じであった。
　【００６２】
　ＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡを単離するために、市販の固相剤（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ，ピアス）を用いて、精製したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を１２５Ｉで放射標識した。この操作において、５μｇのＩＯＤＯ−ＧＥＮを１０×７５ｍｍガラス試験管の底にプレートし、７５μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）及び２０μｌ（２ｍＣｉ）Ｎａ１２５Ｉと共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで、４５μｌＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）中に５μｇのＣＤ４０／Ｆｃを含有する第２ガラス試験管に該溶液を移して、この反応混合液を４℃で２０分間インキュベートした。２ｍｌ充填容量のセファデックス（登録商標）Ｇ−２５（シグマ）でゲル濾過することによってこの反応混合物を分画してから、２．５％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％（ｖ／ｖ）ナトリウムアジド及びｐＨ７．４の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ結合培地を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で平衡化した。最終プールの１２５ＩＣＤ４０／Ｆｃを結合培地中１×１０−７Ｍの作業ストック溶液に希釈して、レセプター結合活性の検出し得る損失なしに４℃で１ヵ月まで貯蔵した。
　【００６３】
　ビオチニル化ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の結合に基づいて、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分離）により選別したＥＬ−４細胞系からｃＤＮＡライブラリーを調製した。選別したＥＬ−４細胞によるＣＤ４０のリガンドの発現に基づく蛍光強度の有意な変化があるまで、細胞を５回選別した。該５回選別細胞をＥＬ−４０．５細胞と呼び、ＥＬ−４０．５ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリーを作成するためにこれら細胞を培養した。簡単に説明すると、ｃＤＮＡを合成し、空のｐＤＣ４０６ベクターの中に挿入して大腸菌に中に形質転換した。形質転換体をプールし、該プールからのＤＮＡを単離し、ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の中に形質移入して発現クローニングライブラリーを作成した。形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞をスライド上で３日間培養してＣＤ４０−Ｌを一過性発現させた。次いで、該形質移入細胞を含有するスライドを放射標識ＣＤ４０／Ｆｃと一緒にインキュベートし、洗浄して未結合ＣＤ４０／Ｆｃを除き、そしてグルタルアルデヒドで定着した。該定着スライドを液状写真乳剤に漬けて暗所で露光した。該スライドを現像した後、顕微鏡でそれらを別々に検査して、明るいバックグランドに対するオートラジオグラフの銀粒子の存在によりＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を同定した。
　【００６４】
　ＥＬ−４０．５細胞からの発現クローニングライブラリーをスクリーニングし、約２０００の別々のクローンを含有する１つのプールを、１２５Ｉ標識ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質との結合について陽性であると同定した。このプールを約２００コロニーのより小さなプールに分割した。該小さなプールを上記のようにしてスクリーニングした。該小さなプールのうちの１つがＣＤ４０−Ｌについて陽性であった。
　【００６５】
　１つのクローンを単離して標準法により配列決定し、図１及び配列番号：１に示したマウスＣＤ４０−ＬのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列を得た。
　【００６６】
　ヒト同族ＣＤ４０−ＬｃＤＮＡを種間交叉ハイブリダイゼーション法により見出した。簡単に説明すると、ＣＤ３（１０ｎｇ／ｍｌ）及びインターロイキン−２（ＩＬ−２，１０ｎｇ／ｍｌ）に結合するＯＫＴ３抗体（ＡＴＣＣ，ロックビル，ＭＤ）で６日間処理した末梢血リンパ球から、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｃＤＮＡライブラリーを作った。該ＰＢＬ細胞を洗浄し、次いで１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ（フォルボールミリステートアセテート，シグマ，セントルイス）及び５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））で４時間刺激した。刺激したＰＢＬ細胞からｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを生成させてｃＤＮＡをＥｃｏＲＩリンカーに連結した。連結したｃＤＮＡを、メーカーの説明書に従って、λｇｔ１０ファージクローニングビヒクル（ギガパック（登録商標）ストラタジーン，サンディエゴ，ＣＡ）のＥｃｏＲＩ部位に挿入した。ファージを増幅し、１５ｃｍプレート当たり約２０，０００ファージの密度でプレートして、マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２，ｐｐ．３１６−３２８に記載されているようにして、ファージリフトを行った。配列番号：１及び図１のヌクレオチド１３からヌクレオチド７９３までのマウスＣＤ４０−Ｌのコーティング領域に対応するマウスプローブを構築した。このプローブは、温和または苛酷なストリンジェント条件で、ＰＢＬライブラリーファージリフトとハイブリダイズした。簡単に説明すると、ハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ、１×デンハルツ溶液、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％Ｎｐ４０（ノニデットＰ−４０洗浄剤）で６３℃で一晩行うものであった。これに続いて、３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５℃で３時間洗浄し、Ｘ線フィルムに一晩露光した。１０００プラーク当たり約１プラークの頻度で陽性プラークを同定した。陽性プラークを２回精製して増幅した培養物からｃＤＮＡを調製した。
　【００６７】
　ここに開示したマウス又はヒトＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ配列は、種間交叉ハイブリダイゼーション法によりマウス又はヒトＣＤ４０−Ｌの他の哺乳動物同族体をコードするｃＤＮＡを得るために用いることができる。簡単に説明すると、図１（配列番号：１）に記載したマウスＣＤ４０−Ｌ又は図２（配列番号：１１）に記載したヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域のヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチドプローブを作成する。このプローブは、マニアチスらの前記文献に記載されたものの如き標準法によって作ることができる。マウス又はヒトプローブを用いて、温和なストリンジェント条件で、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックライブラリーをスクリーニングする。哺乳動物ｃＤＮＡライブラリー又はゲノミックライブラリーの例には、ｃＤＮＡについて、哺乳動物の末梢血リンパ球から作られるライブラリーが含まれる。また、種々の細胞系から単離した種々のｃＤＮＡライブラリー又はｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングして、哺乳動物ＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ又はｍＲＮＡの適当な供給源を確認することができる。
　【００６８】
　組換えＤＮＡ法によるＣＤ４０−Ｌの発現のための組換え発現ベクターは、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子由来のものの如き適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結された、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードする合成又はｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を含むＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列を含む。調節配列の例には、遺伝子発現において調節の役割を有する配列（例えば、転写プロモーター又はエンハンサー）、任意要素である転写を制御するためのオペレーター配列、ｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適当な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列に機能的に関係する場合は、機能できるように連結される。かくして、プロモーターヌクレオチド配列がＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列の転写を制御する場合は、該プロモーターヌクレオチド配列はＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列に機能できるように連結される。更に、リボソーム結合部位がベクター内で翻訳を促進する位置にある場合は、該リボソーム結合部位はＣＤ４０−Ｌポリペプチドのための配列に機能できるように連結しているといえる。加えて、シグナルペプチドをコードする配列を発現ベクターの中に組み込むことができる。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のためのＤＮＡ配列をＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列に機能できるように連結してもよい。該シグナルペプチドは、酵母宿主細胞により翻訳される融合ポリペプチドの細胞外分泌を向上させることができる前駆体アミノ酸配列として発現される。
　【００６９】
　ＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。原核細胞には、グラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば、大腸菌又は杆菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュードモナス属、ストレプトミセス属、及びブドウ球菌属に属するいろいろな他の種が含まれる。高等真核細胞には哺乳動物器官の株化細胞系が含まれる。ここに開示したＤＮＡ構築体由来のＲＮＡを用い、無細胞翻訳系を用いてＣＤ４０−Ｌポリペプチドを産生することもできるかも知れない。細菌、菌類、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いるのに適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、パウエルスら、Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８５）に記載されている。
　【００７０】
　大腸菌の如き原核宿主細胞においては、ＣＤ４０−Ｌポリペプチド又は類縁体は、該原核宿主細胞内での該組換えポリペプチドの発現を促進するために、Ｎ−末端メチオニン残基を含んでもよい。該Ｎ−末端Ｍｅｔを、発現した組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドから切断してもよい。原核宿主細胞は、広範囲なタンパク質分解又はジスルフィドプロセシングが必要でないＣＤ４０−Ｌポリペプチドの発現に用いることができる。
　【００７１】
　組換えＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列を保持する発現ベクターを適した宿主微生物又は哺乳動物細胞系の実質的に均質な培養液に形質移入又は形質転換する。形質転換された宿主細胞は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換又は形質移入された細胞で、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現する。発現されたＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、宿主細胞の性質及び該宿主細胞内の挿入された遺伝子構築体に依存して、該宿主細胞内と止まりかつ／又は培養上澄み液内に分泌されるであろう。
　【００７２】
　原核宿主細胞内に形質移入された発現ベクターは、一般に、１又は２以上の表現型選択可能マーカー（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ　ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ　ｍａｒｋｅｒｓ）を含む。表現型選択可能マーカーは、例えば、抗生物質耐性を与えるか又は独立栄養要求性を満たすタンパク質をコードする遺伝子、及び該宿主内での増幅を保証するために該宿主により認識される複製起点である。原核宿主細胞に有用な他の発現ベクターは、市販のプラスミド由来の細菌起源の選択可能マーカーを含む。この選択可能マーカーは、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の遺伝子要素を含むことができる。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定する簡単な手段を提供する。ｐＢＲ３２２“バックボーン”部分は、適当なプロモーター及びＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ配列と連結している。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（ファルマシア・ファイン・ケミカルズ，ウプサラ，スウェーデン）及びｐＧＥＭ１（プロメガ・バイオテック，マジソン，ＷＩ，ＵＳＡ）が含まれる。
　【００７３】
　プロモーター配列は、普通、組換え原核宿主細胞発現ベクターに用いられる。普通のプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ（ペリシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（チャン（Ｃｈａｎｇ）ら，Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５，１９７８；及びジョデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら，Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４，１９７９）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ジョデルら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７，１９８０；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（マニアチスら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２，１９８２）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰＬプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列を用いる。該λＰＬプロモーターの誘導体が組み込まれているアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内のレジデント）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内のレジデント）が含まれる。
　【００７４】
　ＣＤ４０−Ｌを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミセス属（例えば、サッカロミセス・セレビシエ）から発現してもよい。ピチア（Ｐｃｈｉａ）属又はクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の如き他の酵母の属を用いてもよい。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点配列、ａｕｔｏｎｏｍｏｏｓｌｙ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、及び転写終結のための配列を含有することが多いであろう。好ましくは、酵母ベクターは、複製起点配列及び選択可能マーカーを含む。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、メタロチオネインのためのプロモーター、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３，１９８０）又は他の解糖酵素（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；及びホーランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４９００，１９７８）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルコトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレ−トムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、ヒッツェマン，ＥＰ−Ａ−７３，６５７に更に記載されている。
　【００７５】
　大腸菌内での選択及び複製のために、例えば、ｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子及び複製起点）を用いて酵母ベクターを組み立てることができる。酵母発現構築体内に含まれることができる他の酵母ＤＮＡ配列には、グルコース抑制可能ＡＤＨ２プロモーター及びα−因子分泌リーダーが含まれる。該ＡＤＨ２プロモーターは、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌｌ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２６７４，１９８２）及びベイヤー（Ｂｅｉｅｒ）ら（Ｎａｔｕｒｅ　３００：７２４，１９８２）に記載されている。酵母α−因子分泌リーダー配列は異種ポリペプチドの分泌を行う。α−因子分泌リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、カーヤン（Ｋｕｒｊａｎ）ら，Ｃｅｌｌ　３０：９３３，１９８２及びビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：５３３０，１９８４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者に知られている。リーダー配列の３’末端の近傍を修飾して１又は２以上の制限部位を含有させてもよい。これは、構造遺伝子へのリーダー配列の融合を促進するであろう。
　【００７６】
　酵母形質転換の手順は当業者に知られている。かかる手順の１つは、ヒネン（Ｈｉｎｎｅｎ）らにより、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：１９２９，１９７８に記載されている。ヒネンらの手順は、選択培地中でＴｒｐ＋形質転換体を選択しており、該選択培地は、０．６７％酵母窒素原基礎培地、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。
　【００７７】
　ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現を誘発するために“富（ｒｉｃｈ）”培地内で成育させてもよい。富培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなるものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から使い尽くされたときに起こる。
　【００７８】
　哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現することもできるかも知れない。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１）（グルツマン（Ｇｌｕｚｍａｎ）ら，Ｃｅｌｌ　２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０）細胞系が含まれる。適する哺乳動物発現ベクターは、複製起点、プロモーター配列、構造遺伝子に連結したエンハンサー、リボソーム結合部位の如き他の５’又は３’ブランキング非転写配列、ポリアデニル化部位、スプライス供与体及び受容体部位、及び転写終結配列等の非転写（ｎｏｎｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）要素を含む。
　【００７９】
　哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列をウィルスゲノムから切り取ってもよい。例えば、普通に用いられる哺乳動物細胞プロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位を用いて、哺乳動物宿主細胞内の構造遺伝子配列の発現に必要な他の遺伝子要素を供給してもよい。ウィルス初期及び後期プロモーターは、その両方がウィルス複製起点も含有することができる断片としてウィルスゲノムから容易に得られるので、特に有用である（ファイアス（Ｆｉｅｒｓ）ら，Ｎａｔｕｒｅ　２７３：ｌ１３，１９７８）。ＳＶ４０ウィルス複製起点部位内に位置するＨｉｎｄＩＩＩ部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ｂｐ配列が含まれていることを条件として、より小さい又はより大きなＳＶ４０断片も用いることができる。
　【００８０】
　代表的な哺乳動物発現ベクターは、オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）及びバーグ（Ｂｅｒｇ）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９８３）により開示されているようにして構築することができる。コスマン（Ｃｏｓｍａｎ）らによりＮａｔｕｒｅ　３１２：７６８，１９８４に記載された有用な高発現ベクター、つまりＰＭＬＳＶ　Ｎ１／Ｎ４をＡＴＣＣ３９８９０として寄託した。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６及び１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１，４１５号に記載されている。これらは、参照によりここに組み入れられるものとする。ＣＤ４０−Ｌの如きタイプＩＩタンパク質細胞外領域の発現のためには、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）についてのシグナル配列、又は１９８４年７月２日に出願された米国特許出願第０６／６２６，６６７号に記載されたインターロイキン−２レセプターについてのシグナル配列の如き異種のシグナル配列を加えるべきである。
　【００８１】
　ヒト又はマウスＣＤ４０−Ｌは、細胞内及び膜貫通領域が含まれている場合には膜結合型で、又細胞外領域だけの場合は可溶型で作ることができる。本発明者らは、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を産するために、哺乳動物細胞内で完全長マウスＣＤ４０−Ｌを発現させた。本明細書中の実施例６に記載した方法を用いて、ＨＡＶＥＯベクター内の図１（配列番号：１）に示したｃＤＮＡで又はＨＡＶＥＯ空ベクターでＣＶ−１細胞を形質移入した。これは、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌを発現する形質移入ＣＶ−１細胞を産した。これら細胞を、以下の実施例１０〜１３に報告した一連の実験用に、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの供給源として用いた。
　【００８２】
組換えＣＤ４０−Ｌポリペプチドの精製
　ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを発現するのに必要な培養条件下で、形質転換した宿主細胞を培養することによって調製することができる。次いで、生成した発現ポリペプチドを培養培地又は細胞抽出物から精製することができる。所望により、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はミリポア・ペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）超濾過装置を用いて、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを濃縮してもよい。濃縮工程後、ゲル濾過媒質の如き精製マトリックスに適用することができる。また、例えば、ペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は支持体、等のアニオン交換樹脂を使用することができる。該マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に普通に用いられる他のタイプであってもよい。また、カチオン交換工程を採用してもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。
　【００８３】
　最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒質（例えば、ペンダントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を採用して、ＣＤ４０−Ｌを更に精製することができる。実質的に均質な組換えタンパク質を得るために、前述の幾つか又は全ての精製工程を組み合わせて採用することもできる。
　【００８４】
　ＣＤ４０リガンド結合ドメインを含むアフィニティカラムを利用して、発現したＣＤ４０−Ｌポリペプチドをアフィニティ精製することも可能である。ＣＤ４０−Ｌポリペプチドは、高い塩濃度の溶出用緩衝液でアフィニティカラムから分離することができ、次いで、使用するために低い塩濃度の緩衝液で透析することができる。
　【００８５】
　細菌培養で産生した組換えタンパク質は、通常、最初に宿主細胞を崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチドの場合には細胞ペレットから抽出し、可溶性ポリペプチドの場合には上澄み液から抽出した後、１又は２以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを採用してもよい。微生物細胞は、凍結融解の繰り返し、音波破砕、機械的崩壊、又は細胞溶解剤を用いる方法を含む、あらゆる慣用的方法によって崩壊することができる。
　【００８６】
　形質転換酵母宿主細胞は、好ましくはＣＤ４０−Ｌをポリペプチド分泌物として発現させるために用いる。これは精製を簡単にする。酵母宿主細胞醗酵から分泌された組換えポリペプチドは、ウルダル（Ｕｒｄａｌ）ら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。ウルダルらは、分取ＨＰＬＣカラムでの組換えヒトＩＬ−２の精製に、２つの逐次（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ）逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。
　【００８７】
ＣＤ４０−Ｌ組成物の投与
　本発明は、適当な希釈剤又は製剤上の担体中に有効量のＣＤ４０−Ｌを含む治療用組成物及び該組成物を用いて哺乳動物を治療する方法を提供する。治療用途には、症状に適する方法で治療するために、精製したＣＤ４０−Ｌ又は生物学的に活性なその類縁体を、患者に、好ましくはヒトに投与する。かくして、例えば、目的の治療効果を得るために投与される（例えば、可溶性細胞外ドメイン又はその断片の形の）ＣＤ４０−Ｌ医薬組成物を、濃縮塊注射、継続的点滴、徐放型移植、又は他の適当な方法によって与えることができる。典型的には、ＣＤ４０−Ｌ治療剤は、生理学的に許容できる製剤上の担体、補助剤又は希釈剤と混合した精製ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを含む医薬組成物の形で投与されよう。かかる担体は、採用する投与量及び濃度で患者に対して非毒性であろう。通常は、かかる組成物の製剤は、ＣＤ４０−Ｌポリペプチドを、緩衝剤；アスコルビン酸の如き酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質；アミノ酸；グルコース、スクロース又はデキストランを含む炭水化物；ＥＤＴＡの如きキレート剤；グルタチオン及び他の安定剤及び補助剤と混合することを伴う。中性緩衝食塩水又は同種の血清アルブミンと混合した食塩水は、非常に適した希釈剤である。ＣＤ４０−Ｌセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、コードする核酸配列及び有効なセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する有効量のベクターを投与することによってｉｎ　ｖｉｖｏで投与してもよい。更に、ＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ又はｍＲＮＡを含有する細胞を個体から取り、遺伝子移入技術を用いて該細胞内にアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを組み込み、そして該細胞を該個体内に再注入することにより、ＣＤ４０−Ｌセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドをｅｘ　ｖｉｖｏで投与してもよい。
　【００８８】
　以下の実施例は特定の態様を説明しすることを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
　【００８９】
　【実施例】
　　　
実施例１
　この実施例は、ＣＤ４０リガンドをコードするｃＤＮＡクローンの検出に用いる可溶性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ／ＦｃＤＮＡ構築体の構築を説明するものである。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を用い、スタメンコビックらの前記文献に公表された配列に基づいて、完全ＣＤ４０ヒトレセプター配列の細胞外領域又はリガンド結合ドメインのｃＤＮＡ配列を得た。ＣＤ４０プラスミド（ＣＤＭ８）をＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。ＣＤＭ８は、スタメンコビックらの文献に記載されており該著者から得たものである。５’（上流）及び３’（下流）オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（サルキ（Ｓａｒｋｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７，１９８８）を用いて、ＣＤ４０細胞外リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅した。上流のオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＧＴＣＴＧＣＣ−３’（配列番号：５）は、ＣＤ４０のイニシエーターメチオニンから上流にＳａｌＩ部位を導入し、下流のオリゴヌクレオチドプライマー　５’−ＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＧＧＣＴＣＴＡＣＧＴＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＧＧＡＣ−３’（配列番号：７）は、ＣＤ４０のアミノ酸１９３の後ろにアミノ酸Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ（配列番号：８）を挿入する。Ｇｌｕ及びＰｒｏは、ヒトＩｇＧ１の蝶番部の最初の２つのアミノ酸であり、そのあとにＢｇｌ　ＩＩ　制限部位が続く。該Ｂｇｌ　ＩＩ　制限部位は、ＣＤ４０の細胞外ドメインをヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の残りに融合するのに用いた。
　【００９０】
　ＤＮＡ構築体ｐＤＣ４０６／ＣＤ４０／Ｆｃをサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤＣ４０６プラスミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）由来の調節配列を含む。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞系は、エプスタイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ヒトＣＭＶ即時−初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）エンハンサー／プロモーター由来のＥＢＮＡ−１を構成的に発現する遺伝子でＣＶ−１細胞系を形質移入することにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤＣ４０６の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
　【００９１】
　該融合構築体を発現する細胞を同定したので、形質移入細胞の大規模培養を行って、ＣＤ４０／Ｆｃを発現する細胞からの上澄み液を蓄積した。上澄み液中のＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に説明すると、哺乳動物細胞上澄み液を（例えば、０．４５μフィルターで）濾過し、濾液をプロテインＡ／Ｇ抗体アフィニティカラム（シュライハー（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）及びシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ），キーン（Ｋｅｅｎｅ），ＮＨ）に４℃で１．５ｃｍ×１２．０ｃｍカラムについて８０ｍｌ／ｈの流速で適用することによって、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する１リッターの培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなくなるまで、カラムをＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）中の０．５Ｍ　ＮａＣｌで洗浄した。最後に、ＰＢＳでカラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ２．８の２５ｍＭクエン酸緩衝液でカラムから溶出させ、ｐＨ９．１の５００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。該溶出したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルにより、＞９８％純度であることが分かった。
　【００９２】
　市販の固相剤（ＩＯＤＯ−ＧＥＮ，ピアス）を用いて、精製したＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を１２５Ｉでヨウ素化した。この操作において、５μｇのＩＯＤＯ−ＧＥＮを１０×７５ｍｍガラス試験管の底にプレートし、７５μｌの０．１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）及び２０μｌ（２ｍＣｉ）Ｎａ１２５Ｉと共に４℃で２０分間インキュベートした。次いで、４５μｌＰＢＳ中に５μｇのＣＤ４０／Ｆｃを含有する第２ガラス管に該溶液を移して、この反応混合液を４℃で２０分間インキュベートした。２ｍｌ充填容量のセファデックス（登録商標）Ｇ−２５（シグマ）でゲル濾過することによってこの反応混合物を分画してから、２．５％（ｖ／ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．２％（ｖ／ｖ）ナトリウムアジド及びｐＨ７．４の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ結合培地を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で平衡化した。最終プールの１２５ＩＣＤ４０／Ｆｃを結合培地中１×１０−７Ｍの作業ストック溶液に希釈して、レセプター結合活性の検出し得る損失なしに４℃で１ヵ月まで貯蔵した。
　【００９３】
　約５０〜６０％の標識取り込みが認められた。放射性ヨウ素化は、１×１０１５〜５×１０１５ｃｐｍ／ｎｍｏｌの範囲の比活性をもたらした（タンパク質の分子当たり放射性ヨウ素原子０．４２〜２．０）。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、予想値と一致する単一の標識ポリペプチドの存在が明らかとなった。該標識融合タンパク質は、９８％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）より大きい沈澱性であった。これは、１２５Ｉが該タンパク質に共有結合したことを示している。
　【００９４】
　　　
実施例２
　この実施例は、ＣＤ４０−Ｌを発現すると推定される細胞系の選択を説明するものである。実施例１に記載した放射標識ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を用いて幾つかの細胞系をスクリーニングした。簡単に説明すると、標準法に従って定量的な結合性研究を行い、種々の細胞系についてスキャッチャードプロットを得た。クローン細胞系（ＥＬ−４，ＡＴＣＣカタログＴＩＰ３９）マウス胸腺腫細胞系を同定して選別した。選別に先立って、ＥＬ−４細胞が細胞当たり約４５０分子のＣＤ４０−Ｌを発現することを見出した。７回選別細胞をＥＬ−４０．７と呼び、これを成育させると細胞当たり約１０，０００分子のＣＤ４０−Ｌを発現することが見出された。最後に、９回選別細胞をＥＬ−４０．９と呼び、これを成育させると細胞当たり約１５，０００分子のＣＤ４０−Ｌを発現することを見出された。
　【００９５】
　　　
実施例３
　この実施例は、マウスＣＤ４０−Ｌの発現クローニングのためのｃＤＮＡライブラリーの調製を説明するものである。該ライブラリーは、ＥＬ−４０．５と呼ぶマウス胸腺腫細胞系ＥＬ−４（ＡＴＣＣ　ＴＩＰ３９）の５回選別クローンから調製した。ＥＬ−４０．５細胞は、ＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーター）中、ビオチニル化ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質で５回選別したＥＬ−４細胞であった。米国特許第４，９６８，６０７号に本質的に記載されたＥＬ−４０．５から得たＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作った。なお、この開示内容は参照によりここに組み入れられるものとする。簡単に説明すると、ＥＬ−４０．５細胞系から抽出したトータルＲＮＡから単離したポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの逆転写によりｃＤＮＡライブラリーを構築した。該ライブラリー構築法は、オウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，（１９８７）に記載された方法と実質的に同じであった。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーにより単離し、二本鎖ｃＤＮＡは、実質的にガブラー（Ｇｕｂｌｅｒ）ら，Ｇｅｎｅ　２５：２６３，１９８３に記載された通りに作った。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ断片を、ランダムヘキサヌクレオチドをプライマーに用いて逆転写酵素によりＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに転化した。次いで、ＲＮアーゼＨをＤＮＡポリメラーゼＩと組み合わせて用いて、該ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを二本鎖ｃＤＮＡ断片に転化した。生成した二本鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼでブラントエンド型にした。
　【００９６】
を、ヘイマーレ（Ｈａｙｍｅｒｌｅ）ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：８６１５，１９８６に記載されているようにして、生成したブラントエンド型ｃＤＮＡの５’末端に連結した。６８℃でのゲル濾過クロマトグラフィーにより未連結アダプターを除いた。これは、２４ヌクレオチド非自己相補的（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）オーバーハングをｃＤＮＡ上に残した。同じ操作を用いて、哺乳動物発現ベクターｐＤＣ４０６の５’ＳａｌＩ末端を、ｃＤＮＡに付加したものと相補的な２４ヌクレオチドオーバーハングに転化した。アダプター化ベクターとｃＤＮＡの最適割合をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼの存在下で連結した。透析した連結混合物を大腸菌株ＤＨ５α内にエレクトロポレーションで取り込ませ、アンピシリンプレート上で形質転換体を選択した。
　【００９７】
　プール当たり約２，０００クローンの形質転換大腸菌からなる複数のプールからプラスミドＤＮＡを単離した。ＤＥＡＥ−デキストランを用いて、単離したＤＮＡをＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の不完全集密層内に形質移入し、続いてルスマン（Ｌｕｔｈｍａｎ）ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：１２９５，１９８３及びマクカッチャン（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ）ら，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．４１：３５１，１９８６に記載された操作に実質的に従ってクロロキン処理を行った。
　【００９８】
　ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を完全培地（１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、及び２ｍＭＬ−グルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地）中に維持し、１ウェル有室スライド（ｃｈａｍｂｅｒｅｄ　ｓｌｉｄｅｓ）（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）に約２×１０５細胞／ウェルの密度でプレートした。該スライドを１ｍｌヒトフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌＰＢＳ）で３０分間前処理し、続いてＰＢＳで１回洗浄した。１層に成育している粘着細胞から培地を除いて、６６．６μＭクロロキンサルフェートを含有する１．５ｍｌ完全培地に置き換えた。約０．２ｍｌのＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中に２μｇＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン）を該細胞に加えて、該混合物を３７℃で約５時間インキュベートした。インキュベーション後、培地を除いて１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する完全培地を添加することによって、該細胞に２．５〜２０分間衝撃を与えた。衝撃を与えた後、溶液を新たな完全培地と置き換えた。細胞を２〜３日間培養して成育させて、挿入したＤＮＡ配列を一過性発現させた。これら条件により、生存するＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞中、３０〜８０％の形質移入頻度がもたらされた。
　【００９９】
　　　
実施例４
　この実施例は、実施例１で作った標識ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質での実施例３で作った発現クローニングライブラリーのスクリーニングを説明するものである。４８〜７２時間後、実施例１で調製した放射性ヨウ素化ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を用いて、実施例３で作ったＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の形質移入単層を、ＣＤ４０−Ｌの発現についてスライドオートラジオグラフィーにより分析した。形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍｇ／ｍｌナトリウムアジド、ｐＨ７．２の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、及び５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭＩ１６４０）で１度洗浄し、１×１０−９Ｍ１２５Ｉ−ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質を含有する結合培地中で４℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、該有室スライド内の細胞を結合培地で３回洗浄し、続いてＰＢＳ（ｐＨ７．３）で２回洗浄して未結合放射標識融合タンパク質を除いた。
　【０１００】
　ＰＢＳ中の１０％グルタルアルデヒド中でインキュベート（室温で３０分間）することによって該細胞を定着させ、ＰＢＳ中で２回洗浄して風乾した。該スライドをコダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（水で６倍希釈）中に漬け、そして光遮断ボックス内の暗所で２〜４日間室温で露光した。該スライドをコダックＤ１９現像液中で現像し、水で濯いでＡｇｆａ　Ｇ４３３Ｃ定着剤中で定着した。該スライドを２５〜４０×の倍率の顕微鏡で個別に検査した。明るいバックグランドに対するオートラジオグラフィーの銀粒子の存在により、ＣＤ４０−Ｌを発現する細胞を示す陽性のスライドを特定した。
　【０１０１】
　約２０００の別々のクローンを含有する１つのプールが、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質との結合について強い陽性と同定された。このプールを力価測定してプレートし、それぞれ約２００コロニーを含有するプレートを得た。各プレートを掻き取って、上記と同じ操作に従ってＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞内に形質移入するためにプールしたプラスミドＤＮＡを得た。先に記載したスライドオートラジオグラフィーにより該より小さなプールをスクリーニングした。該小さなプールのうちの１つについて、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質に結合できる発現遺伝子産物が存在することが示され、これがＣＤ４０−Ｌについて陽性であるクローンを含有した。
　【０１０２】
　この陽性の小さなプールを力価測定してプレートし、別々のコロニーを得た。約４００の別々のコロニーを採取して９６ウェルプレートの別々のウェル内の培養培地に接種した。行及び列毎にプールすることにより培養物を混合し、該混合した培養物を用いて最終ラウンドの形質移入及びスクリーニング用のＤＮＡを調製した。陽性行及び陽性列の交叉部分が強い陽性コロニーであることを示した。１０の強い陽性コロニー（即ち、候補クローン）を同定した。それぞれの候補クローンからＤＮＡを単離して、形質移入及びスクリーニングを行った。５候補クローンがＣＤ４０／Ｆｃへの結合により陽性であった。５陽性候補クローン全てが１４６８ヌクレオチドのｃＤＮＡ挿入体を含有することが、ジデオキシヌクレオチド配列決定法により確認された。該ＣＤ４０−ＬクローンのｃＤＮＡコーティング領域は、図１及び配列番号：１の配列に対応する。
　【０１０３】
　ｐＤＣ４０６−ｍＣＤ４０−Ｌと命名した、マウスＣＤ４０−Ｌ配列を含有するクローニングベクターを、１９９１年１２月６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロックビル，ＭＤ（ＡＴＣＣ）に、受託番号６８８７２で寄託した。このクローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１及び図１に示した。
　【０１０４】
　　　
実施例５
　この実施例は、マウスＣＤ４０−Ｌの配列からデザインしたプローブを用いてヒトＣＤ４０−Ｌ同族体を単離するのに用いた種間交叉ハイブリダイゼーション法を説明するものである。マウスＣＤ４０−ＬクローンｐＤＣ４０６−ＣＤ４０−Ｌからコーティング領域（ヌクレオチド１３からヌクレオチド７９３まで）を切り取り、ランダムプライマー（べーリンガー・マンハイム）を用いて該断片を３２Ｐ標識することによって、マウスＣＤ４０−Ｌプローブを作った。
　【０１０５】
　λｇｔ１０アームを用いて、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）ｃＤＮＡライブラリーをλファージベクター内に構築し、市販のキット（ギガパック（登録商標）ストラタジェン，サンディエゴ，ＣＡ）を用い、メーカーの説明書に従ってｉｎｖｉｔｒｏでパッケージングした。該ＰＢＬ細胞は、正常なボランティアから得、１０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（抗ＣＤ３抗体）、及び１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−２（イムネックス，シアトル，ＷＡ）で６日間処理したものである。該ＰＢＬ細胞を洗浄し、５００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（カルバイオケム）及び１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡ（シグマ）で４時間刺激した。該刺激したＰＢＬ細胞からｍＲＮＡ及びｃＤＮＡを得て、メーカーの説明書に従ってλｇｔ１０ファージベクター（ギガパック（登録商標）ストラタジェン）内にパッケージングした。
　【０１０６】
　該マウスプローブを、６×ＳＳＣ（１５ｍＭクエン酸トリナトリウム、及び１６５ｍＭ塩化ナトリウム）、１×デンハルツ溶液、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％Ｎｐ４０中、６３℃で一晩、ファージｃＤＮＡにハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションに続いて、３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで、約５５℃で３時間洗浄した。オートラジオグラフィーにより、特異的なバンドを可視化した。
　【０１０７】
　ｈＣＤ４０−Ｌと命名した、ヒトＣＤ４０−Ｌ配列を含有するクローニングベクターを、１９９１年１２月６日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション，ロックビル，ＭＤ（ＡＴＣＣ）に、受託番号６８８７３で寄託した。このクローンのヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を配列番号：１１及び図２に示した。
　【０１０８】
　　　
実施例６
　この実施例は、ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞内での膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの発現を説明するものである。マクマハン（ＭｃＭａｈａｎ）ら，ＥＭＢＯ　Ｊ．１０：２８２１，１９９１に記載され、本明細書の実施例３に記載した方法の如き標準法を用いて、ＨＡＶＥＯベクター内のマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ又は空のＨＡＶＥＯベクターをＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞内に形質移入した。簡単に説明すると、１０％ウシ胎児血清を補充した１０ｍｌのダルベッコ最小必須培地（メディアム）に、１０ｃｍ培養皿当たり２×１０６細胞の密度でＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞をプレートした。細胞を３７℃で一晩粘着させた。該メディアムを、６６．７μＭクロロキン及びｍＣＤ４０−Ｌをコードする５μｇのｃＤＮＡを含有するＤＮＡ混合物を含有する１．５ｍｌのメディアムと置き換えた。１７５μｌ及び２５μｌのＤＥＡＥデキストラン（ＰＢＳ中４ｍｇ／ｍｌ）を含む培地も該細胞に添加した。該細胞とｃＤＮＡを３７℃で５時間インキュベートした。該ｃＤＮＡ混合物を除いて、１０％ＤＭＳＯを含有する１ｍｌの新たなメディアムで該細胞に２．５分間衝撃を加えた。該メディアムを新たなメディアムと置き換えて、細胞を少なくとも３日間成育させた。
　【０１０９】
　　　
実施例７
　この実施例は、ＣＤ４０−Ｌに対するモノクローナル抗体の調製を説明するものである。精製マウスＣＤ４０−Ｌ又はヒトＣＤ４０−Ｌの試料を、ここに記載したＣＯＳ細胞発現及びＣＤ４０／Ｆｃアフィニティ精製により調製する。精製ＣＤ４０−Ｌは、慣用法、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載された方法を用いて、ＣＤ４０−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成することができる。簡単に説明すると、ＣＤ４０−Ｌを免疫原として完全フロインドアジュバント中に乳化し、１０〜１００μｇの範囲の量を皮下又は腹腔内注射してマウスを免疫感作する。１０〜１２日後、免疫感作した該動物に、不完全フロインドアジュバント中に乳化したＣＤ４０−Ｌを追加注射する。その後、週１回から週２回の免疫スケジュールでマウスを周期的に注射する。ＣＤ４０−Ｌ抗体についてドットブロット分析又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）により試験するために、眼縁後部からの採血又は尾の先端の切除により、血清サンプルを周期的に採取する。
　【０１１０】
　適当な抗体力価の検出に続いて、食塩水中のＣＤ４０−Ｌを陽性マウスに最後に１回静脈内注射する。３〜４日後に、該動物を殺して、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をマウスミエローマ細胞系（例えば、ＮＳ１又はＡｇ８．６５３）と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成し、これをＨＡＴ（ハイポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中でマルチプルマイクロタイタープレートにプレートして、未融合細胞、ミエローマハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
　【０１１１】
　エングバル（Ｅｎｇｖａｌｌ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ．８：８７１，１９７１及び米国特許第４，７０３，００４号に開示された方法を適用して、精製ＣＤ４０−Ｌに対する反応性について、このハイブリドーマ細胞をＥＬＩＳＡによりスクリーニングする。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ＣＤ４０−Ｌモノクローナル抗体を含有する腹水を得ることができる。また、種々の方法により、ハイブリドーマ細胞をフラスコ又は回転容器中でｉｎ　ｖｉｔｒｏで成育させることができる。マウス腹水中に生成したモノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈澱をしてからゲル排除クロマトグラフィーに付することによって精製することができる。また、ＣＤ４０−Ｌへの結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーができるので、プロテインＡ又はプロテインＧへの抗体結合に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
　【０１１２】
　　　
実施例８
　この実施例は、ｓＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の抗アレルギー治療作用を説明するものである。可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを、２ドナーＭＬＣ系におけるＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）誘導ＩｇＥ分泌を阻害するそれらの能力について試験した。３実験からのデータを表１に示す。
　【０１１３】
　【表１】
　【０１１４】
　培養１２日後にＩｇＥレベルをＥＬＩＳＡ法により測定した。簡単に説明すると、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）で１：５００に希釈したマウスｍＡｂ抗ヒトＩｇＥ（ジメド（Ｚｙｍｅｄ））で平底９６ウェルマイクロタイタープレート（コーニング）をコーティングした。３回洗浄した後、５％脱脂粉乳を用いて遮断工程を行い、続いてヒトＩｇＥスタンダード又は試験上澄み液を滴定した。３回洗浄した後、ビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＥ（キルケガード（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ）及びペリー（Ｐｅｒｒｙ））を１：５００の希釈度で添加した。この後、更に洗浄し、次いで、１：５００の希釈度でストレプトアビジン−ＨＲＰ（ジメド）を添加した。更に洗浄した後、ＴＭＢ基質（キルケガード及びペリー）を用いて反応を行い、５２０ｎｍで吸光度を測定した。全ての洗浄工程は、ＰＢＳプラス０．０５％ツィーン中で行った。全てのインキュベーション工程は、１００μｌ／ウェルの容量で室温で１時間行った。この測定法の感度は、１００ｐｇ／ｍｌである。
　【０１１５】
　　　
実施例９
　この実施例は、可溶性ＣＤ２３がＩＬ−４（５ｎｇ／ｍｌ）刺激Ｂ細胞から脱落するのを阻害するｓＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の作用を説明するものである。可溶性ＣＤ４０及びＣＤ４０／Ｆｃを、２ドナーＭＬＣ系におけるＩＬ−４誘導ｓＣＤ２３脱落を阻害するそれらの能力について試験した。３実験からのデータを表２に示す。
　【０１１６】
　【表２】
　【０１１７】
　培養６及び１２日後に市販のｓＣＤ２３ＥＬＩＳＡ検出キット（ビンディング・サイト，サンディエゴ，ＣＡ）により可溶性ＣＤ２３レベルを測定した。その感度限界は５００ｐｇ／ｍｌであった。約１×１０５細胞／ウェルを、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（インターマウンテン・サイエンティフィック，バウンチファル，ＵＴ）で、表２に示した時間、示した添加物の存在下又は不存在下で３重に培養した。結果はｓＣＤ４０の抗アレルギー作用を示している。ｓＣＤ４０の代わりにＣＤ４０／Ｆｃを用いて類似の研究を行い（データは示していない）、類似の結果が得られた。従って、実施例８及び９のこれらデータは、ＣＤ４０についての抗アレルギー特性を示すものである。
　【０１１８】
　　　
実施例１０
　この実施例は、ヒトＢ細胞についての膜結合マウスＣＤ４０−ＬのＢ細胞増殖活性を説明するものである。ヒストパクー（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）（登録商標）（シグマ，セントルイス，ＭＯ）での密度勾配遠心分離により、正常なボランティアからの末梢血からヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム処理ＳＲＢＣ（ヒツジ赤血球）でのロゼッティング及び更にヒストパクーでの密度勾配遠心分離によりＴ細胞を除くことによって、細胞（Ｅ−）のＴ細胞除去試料を得た。１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を加えたＰＲＭＩ培地中、３７℃、１０％ＣＯ２雰囲気下で、Ｂ細胞増殖分析をＥ−試料で行った。約１×１０５Ｅ−細胞／ウェルを、平底９６ウェルマイクロタイタープレート（コーニング）で、７日間、形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞（実施例６に記載した）の存在下で３重に培養した。該ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞は、マウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ又は空ベクターで形質移入されたものである。培養の最終８時間、該細胞を１μＣｉ／ウェルのトリチウム標識チミジン（２５Ｃｉ／ｎｍｏｌｅ，アマシャム，アーリントンハイト，ＩＬ）でパルスした。自動細胞採取装置でグラスファイバーディスク上に細胞を採取し、取り込まれたｃｐｍを液体シンチレーションスペクトロメトリにより測定した。
　【０１１９】
　図４ａは、空ベクター（ＨＡＶＥＯ）又はＨＡＶＥＯベクター中のマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞のヒトＢ細胞増殖の比較を示している。これらデータは、膜結合ＣＤ４０−Ｌが、協同分裂促進因子の不存在下でヒトＢ細胞増殖を刺激することを示している。図４ｂは、培養物中に１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４を添加した以外は同じ実験を示している。この実験では、ＩＬ−４が膜結合マウスＣＤ４０−ＬのＢ細胞分裂促進活性を僅かに増進している。図５は、図４ｂに示した実験を繰り返したものである。しかしながら、該実験を繰り返した場合には、ＩＬ−４協同分裂促進活性の形跡はなかった。ＣＤ４０−Ｌの分裂促進活性の形跡はあった。従って、膜結合ＣＤ４０−ＬはヒトＢ細胞の増殖を刺激する。
　【０１２０】
　　　
実施例１１
　この実施例は、実施例１０で単離したＥ−細胞からのＩｇＥ産生及びＣＤ２３脱落を刺激する膜結合マウスＣＤ４０−Ｌの作用を説明するものである。約１×１０５細胞／ウェルを平底９６ウェルヌンクマイクロタイタープレート（インターマウンテン・サイエンティフィック，バウンチファル，ＵＴ）で、イスコフ（Ｉｓｃｏｖｅ，ｓ）修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）プラス１０％ＦＣＳ中、１０％ＣＯ２の加湿雰囲気下で３重に培養した。培地には、５０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン（シグマ）、０．５％ウシ血清アルブミン（シグマ）及びそれぞれ１μｇ／ｍｌのオレイン、リノレイン及びパルミチン酸（シグマ）を補充した。５ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４の存在下で、Ｅ−細胞を１０日間培養した。マウスＣＤ４０−Ｌ又は空ベクターで形質移入したある力価のＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞を添加した。１０日後、実施例８に記載したＥＬＩＳＡ法によりＩｇＥを又は実施例９に記載した方法によりＣＤ２３脱落を分析した。
　【０１２１】
　図６は、Ｅ−細胞と空ベクター（ＨＡＶＥＯ）又はＣＤ４０−Ｌで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の培養物について、上澄み液中のＩｇＥ産生（ｎｇ／ｍｌ）の比較を示している。３０００ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞までは差が見られないが、１００００又は３００００のＣＤ４０−Ｌ形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の添加で、有意なＩｇＥ産生がもたらされた。比較として、Ｅ−細胞を培地単独で又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４と共に又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４プラス５００ｎｇ／ｍｌＧ２８−５抗体と共にインキュベートした場合、ＩｇＥ産生はそれぞれ４．７、２．９及び＞６００ｎｇ／ｍｌであった。図７において、ＣＤ２３脱落を測定した場合、ＣＤ４０−Ｌで形質移入された１００００又は３００００のＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞は、空ベクターコントロールＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞に比較して、増加したＣＤ２３脱落を示した。比較として、Ｅ−細胞を培地単独で又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４と共に又は５ｎｇ／ｍｌＩＬ−４プラス５００ｎｇ／ｍｌＧ２８−５抗体と共にインキュベートした場合、ＣＤ２３脱落はそれぞれ＜０．１、２．４及び１１．２ｎｇ／ｍｌであった。これらデータは、ＩｇＥ産生及びＣＤ２３脱落の両方が膜結合ＣＤ４０−Ｌに付随する生物活性であることを示している。
　【０１２２】
　　　
実施例１２
　この実施例は、Ｂ細胞増殖活性、ポリクローナルイムノグロブリン（Ｉｇ）産生、抗原特異性抗体形成及び膜結合及び可溶性ＣＤ４０−Ｌを臨床応用に用いる種々の方法を説明するものである。本発明者らは、前記のグラブシュタインらＩ、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキーらＩＩに記載された操作に従って、マウス脾臓Ｂ細胞を得た。簡単に説明すると、Ｔ細胞抗血清及び補体を用いるＴ細胞除去及び、セファデックス（登録商標）Ｇ１０カラムに通すことによる粘着細胞除去、及びヤギ抗マウスＩｇＭでコーティングしたペトリ皿上でのパンニングによるＢ細胞陽性選択により、細胞の混合培養物を精製した。精製したＢ細胞を、ＲＰＭＩ、ウシ胎児血清（Ｂ細胞増殖分析用に５％及びプラーク形成細胞分析又はポリクローナル抗体分析用に２０％）、２−メルカプトエタノール、抗生物質、アミノ酸、及びビルベート中で培養した。Ｂ細胞増殖は、実施例１０及び前記のグラブシュタインらＩ、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキーらＩＩに記載された測定法に従って測定した。抗原特異性抗体形成は、グラブシュタインら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１９９，１９８６〔グラブシュタインらＩＩ〕に記載された操作に従って測定した。簡単に説明すると、抗原特異性抗体形成は、抗原としてヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）（０．０３％ｖ／ｖ）を１ｍｌ当たり１×１０６マウスＢ細胞の培地２．０ｍｌ中で用いた。該Ｂ細胞培養物を５日間インキュベートして、前記のグラブシュタインらＩＩに記載されたイエルネ溶血プラーク測定法により、プラーク形成細胞を測定した。細胞数はコールタカウンター（ｃｏｕｌｔｅｒ　ｃｏｕｎｔｅｒ）で計数した。ポリクローナルＩｇ分泌は、前記のマリスゼウスキーらＩ及び前記のマリスゼウスキーらＩＩに記載されたようにして、２．０ｍｌ培地当たり１×１０６Ｂ細胞の７日目培養物中で、アイソタイプ特異的ＥＬＩＳＡ分析法により測定した。
　【０１２３】
　ＣＤ４０−Ｌ若しくは空ベクターで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞、又は７Ａ１細胞（Ｔ細胞ヘルパークローン）によるＢ細胞増殖の結果を図８、１０及び１２に示す。これらデータは、ＣＤ４０−Ｌにより最も大きいＢ細胞増殖が生じたことを示している。Ｔ細胞ヘルパー細胞７Ａ１及び７Ｃ１は、Ｂ細胞増殖に小さな作用しか有さなかった。
　【０１２４】
　抗原特異性抗体形成に関する種々の細胞の作用を図９及び１１に示す。図９は、プラーク形成細胞を、Ｔ細胞ヘルパークローン７Ａ１と可溶性ＣＤ４０−Ｌを分泌するマウスＥＬ−４０．９細胞とを比較しながら示している。ＥＬ−４０．９細胞は、抗原特異性抗体形成に関して阻害的作用を有しているようである。図１１は、Ｔ細胞ヘルパー細胞７Ｃ２及び空ベクター又はＣＤ４０−Ｌのいずれかで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞についてのＰＦＣ（プラーク形成細胞）を示す。７Ｃ２細胞及び膜結合ＣＤ４０−Ｌの両方が、抗原特異性抗体形成（ＰＦＣ）を刺激した。図１３は、１０ｎｇ／ｍｌインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下又は不存在下でのＣＤ４０−Ｌ及び７Ａ１細胞の抗原特異性抗体形成を比較している。ＩＬ−２は、７Ａ１細胞についてＰＦＣを増加したが、膜結合ＣＤ４０−Ｌにより生ずるＰＦＣを増加しなかった。
　【０１２５】
　マウスＢ細胞によるポリクローナルＩｇ産生を、刺激又は阻害について、サイトカインＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−５（ＣＯＳ細胞上澄み液の１：４０希釈液）の存在下で又はサイトカインを添加せずに、膜結合ＣＤ４０−Ｌ、コントロールＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞及びヘルパーＴ細胞７Ａ１で比較した。ＩｇＡ、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＭ及びＩｇＧ１の量をそれぞれ表３〜８に示す。
　【０１２６】
　【表３】
　【０１２７】
　【表４】
　【０１２８】
　【表５】
　【０１２９】
　【表６】
　【０１３０】
　【表７】
　【０１３１】
　【表８】
　【０１３２】
　これらデータは、ＣＤ４０とそのリガンドとの相互作用が、抗原特異性抗体産生及びポリクローナルＩｇ分泌の両方へのＢ細胞成長及び分化のＴ細胞接触依存性誘発を司る主要な分子性相互作用であることを示している。そういうことであるから、これらデータは、可溶性ＣＤ４０、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質及びできるだけ可溶性のＣＤ４０−Ｌ（モノマー）によるこの相互作用のアンタゴニストが、抗体応答の発生を有意に防げることを示唆している。従って、ＣＤ４０、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質及び可溶性ＣＤ４０−ＬがＣＤ４０アンタゴニストとして有用な臨床的状況には、アレルギー、狼瘡、慢性間接リウマチ、インシュリン依存真性糖尿病、及び自己免疫抗体又は抗原／抗体複合体がその疾患の臨床病理学上の原因である他のあらゆる疾患が含まれる。更に、膜結合ＣＤ４０−Ｌ又はオリゴマー可溶性ＣＤ４０−Ｌは、Ｂ細胞増殖及び抗体産生を刺激するのに有用であろう。そういうことであるから、ＣＤ４０−Ｌのこれら形態は、ワクチンアジュバントに及びハイブリドーマ細胞からのｍＡｂ分泌のための刺激剤として最も有用である。
　【０１３３】
　　　
実施例１３
　この実施例は、末梢血単核細胞（Ｅ−）の増殖及びそれからのＩｇＥ分泌への膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用を説明するものである。実施例１０に記載した操作に従ってＥ−細胞を得て、空ベクター又はｍＣＤ４０−ＬｃＤＮＡで形質移入されたＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の存在下で７又は１０日間インキュベートした。更に、ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質（実施例１に記載）又はＴＮＦレセプター／Ｆｃ融合タンパク質（ＷＯ９１／０３５５３に記載）を図１４に示した幾つかの試料に添加した。ＩｇＥ分泌は実施例８に記載した操作に従って測定し、Ｂ細胞増殖は実施例１０に記載した操作に従って測定した。
　【０１３４】
　Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌についての結果を、形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞の５種の異なる濃度について図１４に示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌの存在下で、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌の両方が増加した。ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質の添加は、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌の両方を失わせた。ＴＮＦレセプター／Ｆｃ融合タンパク質は何の作用も有さなかった。ＩｇＥ分泌についての比較として、コントロール物質（形質移入ＣＶ１−ＥＢＮＡ細胞なし）としてのＩＬ−４の添加はこの分析でＩｇＥを産生せず、ＩＬ−４プラスＧ２８−５抗ＣＤ４０ｍＡｂの添加は、この分析で２９．７ｎｇ／ｍｌのＩｇＥをもたらした。
　【０１３５】
　　　
実施例１４
　この実施例は、ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２構築体という可溶性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ／ＦｃＤＮＡ構築体の構築を説明するものである。ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２をコードするＤＮＡは、リーダー（又はシグナル）ペプチド、ホップ（Ｈｏｐｐ）ら（ホップら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４，１９８８）により記載された８アミノ酸の親水性配列（Ｆｌａｇ（登録商標）という）、イムノグロブリンの適当なＦｃ領域、〔Ｇｌｙ４Ｓｅｒ〕３繰り返し配列（参照によりここに組み入れられる米国特許第５，０７３，６２７号に記載）又は他の適当なリンカー配列、及びアミノ酸５０からアミノ酸２６１（配列番号：１１）のヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域をコードする配列を含む。リーダー配列、Ｆｌａｇ（登録商標）、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃをコードする断片の酵素切断及び連結の慣用法を用いて、リーダー配列、Ｆｌａｇ（登録商標）、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃを含有するｐＤＣ４０６発現ベクターを調製し、Ｎｓｉ１及びＮｏｔ１で消化した。
　【０１３６】
　５’（上流）及び３’（下流）オリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲ法（サルキ（Ｓａｒｋｉ）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７，１９８８）を利用して、ヒトＣＤ４０−Ｌ（ＡＴＣＣ６８８７３；配列番号：１１）を含有するクローニングベクターからのＣＤ４０細胞外リガンド結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を増幅し、ＰＣＲ断片を形成した。上流オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１３）は、リンカー配列（〔Ｇｌｙ４Ｓｅｒ〕３ＳｅｒＳｅｒ）から上流にＮｓｉ１部位を導入し、この後にＣＤ４０−Ｌの細胞外領域の２１ヌクレオチド（配列番号：１１のアミノ酸５１から５７まで）が続いた。下流オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号：１４）は、ＣＤ４０−Ｌの終止コドンのすぐ下流にＮｏｔ１部位を導入した。次いで、リーダー配列、Ｆｌａｇ（登録商標）、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃを含有するｐＤＣ４０６発現ベクター内に該ＰＣＲ断片を連結した。そのヌクレオチド配列及びＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２の推定アミノ酸配列を配列番号：１５及び配列番号：１６に示した。生成したＤＮＡ構築体（ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２）をサル腎臓細胞系ＣＶ１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。該構築体は、ＣＤ４０に結合できる可溶性ＣＤ４０−Ｌをコードした。このことは、ＣＤ４０を発現する細胞を用いる蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析で認められる結合により証明された。
　【０１３７】
　ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２をコードする構築体で形質移入したヒト胚性腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）の大規模培養物を成育させて、ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２を含有する上澄み液を蓄積した。２９３細胞系、つまりヒトアデノウィルス５ＤＮＡにより形質転換された一次ヒト胚性腎臓の永久系は、ｐＤＣ４０６ベクター内に連結された組換えタンパク質の発現を可能にする。上澄み液中のＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２融合タンパク質をアフィニティ精製により精製した。簡単に説明すると、哺乳動物細胞上澄み液を濾過（例えば、０．４５μフィルターで）し、ストレプトアビジン−アガロース（ピアスケミカル，ロックフォード，ＩＬ，ＵＳＡ）に結合したビオチニル化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ社，ウェストグローブ，ＰＡ，ＵＳＡ）を含む抗体アフィニティカラムに濾液を４℃で１．５ｃｍ×１２．０ｃｍカラムについて約６０〜８０ｍｌ／ｈの流速で適用することによって、ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ融合タンパク質を含有する培養上澄み液を精製した。フリーのタンパク質が洗浄緩衝液中に検出されなくなるまで、カラムの約２０倍容量のＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）でカラムを洗浄した。結合した融合タンパク質をｐＨ２．８の１２．５ｍＭクエン酸緩衝液，７５ｍＭ　ＮａＣｌでカラムから溶出させ、ｐＨ９．１の５００ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液でｐＨ７にした。精製したオリゴマーＣＤ４０−Ｌ／ＦＣペプチドは、協同刺激物質の不存在下でヒトＢ細胞増殖を誘発し、（適当なサイトカインと協力して）膜結合ＣＤ４０−Ｌについて実施例１２に記載したようにＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＭの産生をもたらした。
　【０１３８】
　　　
実施例１５
　この実施例は、トリマーＣＤ４０−Ｌという可溶性ＣＤ４０−Ｌ融合タンパク質を発現するＣＤ４０−Ｌ　ＤＮＡ構築体の構築を説明するものである。トリマーＣＤ４０−Ｌは、リーダー配列、“ロイシンジッパー”という３３アミノ酸配列（配列番号：１７）、及びホップら（ホップら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６：１２０４，１９８８）により記載された８アミノ酸の親水性配列（Ｆｌａｇ（登録商標）という）、続いてアミノ酸５０からアミノ酸２６１のヒトＣＤ４０−Ｌ（配列番号：１１）の細胞外領域を含有する。リーダー配列及びＦｌａｇ（登録商標）配列の有用性は、詳細な説明の欄に記載した。配列番号：１７で示される３３アミノ酸配列は、溶液中で自然に三量化する。かくして、この３３アミノ酸を含む融合タンパク質は、自然にトリマー又はマルチマーを形成すると考えられる。
　【０１３９】
　リーダー配列、上記の３３アミノ酸配列、及びＦｌａｇ配列に対応するオリゴヌクレオチドを合成し、次いで実施例１４に記載したようにして調製した配列番号：１１のアミノ酸５１からアミノ酸２６１をコードするＤＮＡ断片に該最終産物を連結することにより、該構築体を調製する。
　【０１４０】
　発現ベクターｐＤＣ４０６内の生成連結産物をサル腎臓細胞系ＣＶ１／ＥＢＮＡ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１０４７８）内に形質移入した。ｐＤＣ４０６プラスミドは、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びエプスタイン・バー・ウィルス（ＥＢＶ）由来の調節配列を含む。ＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系は、エプスタイン・バー・ウィルス核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ヒトＣＭＶ即時−初期（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）エンハンサー／プロモーター由来のＥＢＮＡ−１を構成的に発現する遺伝子で、ＣＶ−１細胞系を形質移入することにより得られた。ＥＢＮＡ−１遺伝子は、ｐＤＣ４０６の如きＥＢＶ複製起点を含有する発現ベクターのエピソーム複製を可能にする。
　【０１４１】
　一旦、該融合構築体を発現する細胞を同定すると、形質移入細胞の大規模培養を行ってトリマーＣＤ４０−Ｌを発現する細胞からの上澄み液を蓄積する。実質的に米国特許第５，０１１，９１２号に記載されたアフィニティ精製により、上澄み液中のトリマーＣＤ４０−Ｌ融合タンパク質を精製する。溶出したＣＤ４０−Ｌ融合タンパク質の銀染色ＳＤＳゲルを調製して純度を測定することができる。
　【０１４２】
　【配列表】
　【０１４３】
　【０１４４】
　【０１４５】
　【０１４６】
　【０１４７】
　【０１４８】
　【０１４９】
　【０１５０】
　【０１５１】
　【０１５２】
　【０１５３】
　【０１５４】
　【０１５５】
　【０１５６】
　【０１５７】
　【０１５８】
　【０１５９】
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　図１は、マウスＣＤ４０−Ｌに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、その細胞内ドメインとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫通領域、及び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ドメインを有するタイプＩＩポリペプチドである。細胞内ドメイン及び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞外ドメインは、１つのＮ結合グリコシル化部位及び４つのシステイン（Ｃｙｓ）残基から見て２つのジスルフィド結合を含有し得る。
　【図２】
　図２は、ヒトＣＤ４０−Ｌに対応するヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。このタンパク質は、その細胞内ドメインとしてそのＮ−末端、それに続く膜貫通領域、及び該ポリペプチドのＣ−末端において細胞外ドメインを有するタイプＩＩポリペプチドである。細胞内ドメイン及び膜貫通領域のいずれよりも長い細胞外ドメインは、１つのＮ結合グリコシル化部位及び５つのシステイン（Ｃｙｓ）残基から見て２つのジスルフィド結合を含有し得る。
　【図３】
　図３は、アミノ酸レベルで７７．７％相同性を示すヒト及びマウスＣＤ４０−Ｌのタンパク質配列の比較を示す。
　【図４】
　図４は、完全長マウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡ（配列番号：１）で形質移入したＣＶ１細胞と共にインキュベーションすることによって生じたＴ細胞除去ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖を示す。このＣＶ１細胞は、空ベクター（ＨＡＶＥＯ）で形質移入したＣＶ１細胞と比較した場合に結合型ＣＤ４０−Ｌ（ＣＤ４０−Ｌ＋ＣＶ１細胞）を発現するが結合型マウスＣＤ４０−Ｌを発現しない。７日増殖結果は、ＣＤ４０−Ｌ＋ＣＶ１細胞が、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の存在下又は不存在下で、Ｔ細胞除去ＰＢＭＣの増殖を有意に高めることを示している。
　【図５】
　図５は、結合型マウスＣＤ４０−Ｌ及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を添加したＴ細胞除去ＰＢＭＣ増殖の二次測定値を示す。これらデータは、ＩＬ−４は協同分裂促進作用（ｃｏ−ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔ）がないが、結合型ＣＤ４０−Ｌは強力な分裂促進作用を維持することを示している。
　【図６】
　図６は、結合型ＣＤ４０−ＬがＩｇＥ分泌を増加させることを示す。
　【図７】
　図７は、ＩＬ−４の存在下で膜結合ＣＤ４０−ＬがＣＤ２３脱落を刺激することを示す。
　【図８】
　図８は、膜結合マウスＣＤ４０−Ｌ又はヘルパーＴ細胞クローンである７Ａ１細胞により生ずるマウス脾臓Ｂ細胞の増殖を示す。
　【図９】
　図９は、抗ヒツジ赤血球（ＳＣＢＣ）によるプラーク形成細胞（ＰＦＣ）により示される抗原特異性応答の誘発についてのマウスＥＬ−４０．９細胞、つまりマウスＣＤ４０−Ｌの発現に基づいて選別した選別細胞系とＴ細胞７Ａ１との比較を示す。
　【図１０】
　図１０は、膜結合ＣＤ４０−Ｌと、異なるｃＤＮＡで形質移入された他の細胞タイプとのＢ細胞増殖活性の比較を示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌは、ヘルパー細胞クローン又は他のコントロール細胞よりも有意に大きいＢ細胞増殖活性を示した。
　【図１１】
　図１１は、７Ｃ２細胞（ヘルパーＴ細胞クローン）及びマウスＣＤ４０−ＬｃＤＮＡで形質移入されたＣＶ１細胞が、抗ＳＣＢＣプラーク形成細胞を誘発することを示す。
　【図１２】
　図１２は、マウスＢ細胞増殖の誘発についての、２つのヘルパーＴ細胞クローンと膜結合ＣＤ４０−Ｌを発現する細胞との比較を示す。
　【図１３】
　図１３は、添加したインターロイキン−２（ＩＬ−２）の存在下又は不存在下での膜結合ＣＤ４０−Ｌ及びヘルパーＴ細胞クローンによる抗原特異性プラーク形成細胞の誘発を示す。
　【図１４】
　図１４は、Ｂ細胞増殖及びＩｇＥ分泌を刺激する膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用を示す。膜結合ＣＤ４０−Ｌの作用はＴＮＦレセプターによってではなくＣＤ４０レセプターによって阻害された。