(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する遺伝子を含有する組換えベクターにより酵母を形質転換することにより得られる形質転換体であって、
前記Ｆｄ鎖又は前記Ｌ鎖は、Ｃ末端にＣｙｓ残基を有し、前記のＣ末端のＣｙｓ残基をコードする塩基配列の３’末端に、前記のＦａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列が結合しており、
Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列が、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ、又は上記のアミノ酸又はアミノ酸配列の中から複数のものを選択して組み合わせたものでアミノ酸の個数が２〜３０個であるアミノ酸配列（但し、複数個のＨｉｓからなるヒスチジンタグ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号７２）Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号７３）は除外する）である、形質転換体。
【請求項２】
前記組換えベクターが、以下の何れかである、請求項１に記載の形質転換体。
（ａ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子と、抗体のＬ鎖遺伝子とを含有する、組み換えベクター；
（ｂ）抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子と、抗体のＦｄ鎖遺伝子とを含有する、組み換えベクター；
（ｃ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子と、抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子とを含有する組み換えベクター；
（Ａ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターと、抗体のＬ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターとの組み合わせ；
（Ｂ）抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターと、抗体のＦｄ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターとの組み合わせ；及び
（Ｃ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターと、抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターとの組み合わせ：
【請求項３】
酵母がオガタエア属またはコマガタエラ属酵母である、請求項１又は２に記載の形質転換体。
【請求項４】
オガタエア属またはコマガタエラ属酵母が、オガタエア・ポリモルファまたはコマガタエラ・パストリスである、請求項３に記載の形質転換体。
【請求項５】
形質転換体を培養してＦａｂ型抗体を生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量が２．０ｍｇ／ｍＬ以上である、請求項１から４の何れか１項に記載の形質転換体。
【請求項６】
請求項１から５の何れか１項に記載の形質転換体を培養し、Ｆａｂ型抗体を回収する工程を含むＦａｂ型抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する、遺伝子に関する。本発明はさらに、前記鎖遺伝子を含む組み換えベクター、前記組み換えベクターを有する形質転換体、前記形質転換体を用いたＦａｂ型抗体の製造方法、並びに抗体のＦｄ鎖及び／又はＬ鎖のアミノ酸配列のＣ末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列を有する、Ｆａｂ型抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を用いてタンパク質を生産するためには、そのタンパク質の発現に適切な宿主が使用される。宿主としては、例えば、ＣＨＯ細胞等の動物細胞、カイコ等の昆虫及び昆虫細胞、ニワトリや牛などの動物、並びに大腸菌又は酵母などの微生物などが用いられている。上記の中でも酵母は、安価な培地で大規模な高密度培養が可能であり、タンパク質を低コストで生産することができる。また、分泌シグナルペプチド等を利用すれば培養液中への分泌生産も可能なため、タンパク質の精製も容易となる。上記したような宿主を用いて生産するタンパク質としては、次世代タンパク医薬品であるｓｃＦｖやＦａｂ型抗体等の低分子化抗体が注目されている。しかし、宿主として酵母を用いてこれらの低分子化抗体を発現させた場合、抗体の生産性が低いという問題があり、さらに炭素源によって生産物に影響を及ぼす場合があることが懸念されている。【０００３】
上記した問題を解消するための手段としては、炭素源による生産物への影響を回避するための宿主として、コマガタエラ（Komagataella）属酵母、オガタエア（Ogataea）属酵母及びキャンディダ(Candida）属酵母等のメタノール資化性酵母が用いることが報告されている。さらにタンパク質の生産性を向上させるために、通常のプロモーターと比較して数倍の活性を有するメタノールオキシダーゼ（Methanol oxidase）やアルコールオキシダーゼ（Alcohol oxidase）等のプロモーターの下流にＦａｂ型抗体をコードする塩基配列を配置して、Ｆａｂ型抗体を生産する方法が報告されている（非特許文献１）。しかしながら、上記のような強力なプロモーターを用いてＦａｂ型抗体のような高次構造を持つタンパク質を発現させた場合、立体構造が正しくホールディングされないＦａｂ型抗体が小胞体内で蓄積し、小胞体ストレスと呼ばれるストレスを菌体に与えるといった問題がある。【０００４】
上記した通り、宿主として酵母を用いてＦａｂ型抗体等の低分子化抗体を低コストで生産するためには、通常より活性の高いプロモーターを用いる方法が知られているが、小胞体ストレスを引き起こす等の問題がある。そのため、通常より活性の高いプロモーターを用いる方法は、高生産の観点から見て効率的であるとはいえず、問題は未だ解決されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Biotechnology and Bioengineering, vol94, 353-361, 2006
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、酵母を宿主として用いたＦａｂ型抗体等の低分子化抗体の製造方法において、低分子化抗体を高い生産性で製造できる方法を提供することを解決すべき課題とした。具体的には、本発明は、活性の高いプロモーターを用いることなく、酵母を宿主として用いてＦａｂ型抗体等の低分子化抗体を高い生産性で製造できる方法を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、Ｆｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に１〜１０残基のアミノ酸をコードする塩基配列を連結し、これを酵母において発現させることによって、Ｆａｂ型抗体の生産性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すわなち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する、遺伝子。
（２）  前記Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列が、１〜３０個のアミノ酸からなるものである、（１）に記載の遺伝子。
（３）  前記Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列が、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ、又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙの何れかである、（１）又は（２）に記載の遺伝子。【０００９】
（４）  （１）から（３）の何れかに記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
（５）  以下の何れかである、（４）に記載の組み換えベクター。
（ａ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子と、抗体のＬ鎖遺伝子とを含有する、組み換えベクター；
（ｂ）抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子と、抗体のＦｄ鎖遺伝子とを含有する、組み換えベクター；及び
（ｃ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子と、抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子とを含有する組み換えベクター。【００１０】
（６）  以下の何れかである、組換えベクターの組み合わせ。
（Ａ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターと、抗体のＬ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターとの組み合わせ；
（Ｂ）抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターと、抗体のＦｄ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターとの組み合わせ；及び
（Ｃ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターと、抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子を含有する組み換えベクターとの組み合わせ：【００１１】
（７）  （４）又は（５）に記載の組換えベクター又は（６）に記載の組換えベクターの組み合わせにより宿主を形質転換することにより得られる形質転換体。
（８）  宿主が酵母である、（７）に記載の形質転換体。
（９）  酵母がオガタエア属またはコマガタエラ属酵母である、（７）又は（８）に記載の形質転換体。【００１２】
（１０）  オガタエア属またはコマガタエラ属酵母が、オガタエア・ポリモルファまたはコマガタエラ・パストリスである、（９）に記載の形質転換体。
（１１）  形質転換体を培養してＦａｂ型抗体を生産させた場合の、培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量が２．０ｍｇ／ｍＬ以上である、（７）から（１０）の何れかに記載の形質転換体。
（１２）  （７）から（１１）の何れかに記載の形質転換体を培養し、Ｆａｂ型抗体を回収する工程を含むＦａｂ型抗体の製造方法。【００１３】
（１３）  抗体のＦｄ鎖及び／又はＬ鎖のアミノ酸配列のＣ末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列を有する、Ｆａｂ型抗体。
（１４）  前記Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列が、１〜１０個のアミノ酸からなるものである、（１３）に記載のＦａｂ型抗体．
（１５）  前記Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列が、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ、又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙの何れかである、（１３）又は（１４）に記載のＦａｂ型抗体。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結させるだけで、Ｆａｂ型抗体の生産性を向上させることができる。本発明によれば、通常より活性の高いプロモーターを用いる必要がないことにより、小胞体ストレスを菌体に与えるという懸念がない。また、本発明によるＦａｂ型抗体の製造方法においては、高密度培養が可能な酵母を宿主として用いることが可能であることから抗体の製造コストを削減できる。本発明は、抗体医薬の開発に有用である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態についてさらに詳細に説明する。
本発明における抗体のＦｄ鎖とは、ＩｇＧ抗体のＨ鎖からヒンジ部位とＦｃ領域を除いた部分であり、Ｈ鎖のＮ末端から、Ｌ鎖のＣ末端のシステインとＳ-Ｓ結合するシステイン残基までの部分を指す。
【００１６】
本発明におけるＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列とは、Ｆｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片であれば特に限定されない。
【００１７】
本発明で用いるＦｄ鎖又はＬ鎖が由来する抗体の種類は、特に限定されず、例えばヒト抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、イヌ抗体、ネコ抗体、ウマ抗体、ウシ抗体、ブタ抗体、ニワトリ抗体、又はこれらを融合したキメラ抗体などが挙げられる。
【００１８】
本発明で用いるＦｄ鎖又はＬ鎖が由来する抗体が結合する抗原も特に限定されないが、好ましくは創薬のターゲットとして知られるＣＤ２０、ＨＥＲ２、ＩＬ２Ｒ、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦ、ＣＤ３、ＣＤ２５、ＴＮＦα、ＣＤ１１、ＩｇＥ、ＣＤ２、α４ｉｎｔｅｇｒｉｎ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ６Ｒ、Ｃ５ａ、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＲＳＶＦ Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＧＭ−ＣＳＦなどの抗原が挙げられる。
【００１９】
Ｆｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の具体例としては、配列番号１６又は配列番号６０に示す塩基配列である。
【００２０】
本発明におけるＬ鎖遺伝子とは、Ｆｄ鎖遺伝子と共に発現させた場合にＦａｂ型抗体が生産されるものであればよく、ＩｇＧ抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列である。Ｌ鎖遺伝子の具体例としては、配列番号１７又は配列番号５９に示す塩基配列である。
【００２１】
本発明の遺伝子においては、抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する。
Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列としては、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるという作用を発揮する限り、特に限定されず、アミノ酸の個数も特に限定されないが、好ましくは１〜３０個であり、より好ましくは１〜１０個又は１〜５個である。
【００２２】
Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列の具体例としては、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号１）、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号６９）、又はＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（配列番号７４）の何れかである。また、上記のアミノ酸又はアミノ酸配列の中から複数のものを選択して、組み合わせたものでもよい。但し、複数個（例えば６〜１０個程度など）のＨｉｓからなるヒスチジンタグをコードする塩基配列を、抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に含む態様は、本発明から除外される。同様に、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ（配列番号７２）Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ（配列番号７３）をコードする塩基配列を、抗体のＦｄ鎖又はＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に含む態様も、本発明から除外される。
【００２３】
上記したＦａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列は、各アミノ酸コドンをコードする塩基配列を組み合わせて成るが、各アミノ酸コドンは、Ｆｄ鎖遺伝子又はＬ鎖遺伝子を発現させる宿主内で利用できるコドンの中から任意で選ぶことができる。具体的には、Ａｓｐの場合は、ｇａｃ、Ａｓｐ−Ｌｙｓの場合は、ｇａｃａａｇ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒの場合は、ｇａｃａａｇａｃｃ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号１）の場合は、ｇａｃａａｇａｃｃｃａｃ（配列番号３）、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）の場合は、ｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃ（配列番号４）の塩基配列、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号６９）の場合は、ｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃ（配列番号７０）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ（配列番号７４）の場合は、ｇｇａｇｇｔｇｇｃｇｇａｔｃｃａｔｇｇｔｇａｇｃａａｇｇｇｃｇａｇｇａｇｃｔｇｔｔｃａｃｃｇｇｇｇｔｇｇｔｇｃｃｃａｔｃｃｔｇｇｔｃｇａｇｃｔｇｇａｃｇｇｃｇａｃｇｔａａａｃｇｇｃ（配列番号７５）が挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２４】
上述のＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓはそれぞれ、アスパラギン酸残基、グリシン残基、アラニン残基、バリン残基、ロイシン残基、イソロシシン残基、システイン残基、メチオニン残基、セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基、フェニルアラニン残基、トリプトファン残基、プロリン残基、グルタミン酸残基、アスパラギン残基、グルタミン残基、リジン残基、アルギニン残基、およびヒスチジン残基を指す。また、塩基配列を示すＴはチミン、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを指す。
【００２５】
上述のＦｄ鎖のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする塩基配列の３'末端に、ｇａｃ、ｇａｃａａｇ、ｇａｃａａｇａｃｃ、ｇａｃａａｇａｃｃｃａｃ（配列番号３）、又はｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃ（配列番号４）のいずれかを含有し、さらにその３'末端に終止コドンとしてｔａａ、ｔｇａおよびｔａｇからなる塩基配列を含有してもよい。
【００２６】
配列番号５は配列番号１６の塩基配列の３'末端に、ｇａｃの塩基配列と終止コドンｔａａの塩基配列を連結させた遺伝子である、
配列番号６は配列番号１６の塩基配列の３'末端に、ｇａｃａａｇの塩基配列と終止コドンｔａａの塩基配列を連結させた遺伝子である。
配列番号７は配列番号１６の塩基配列の３'末端に、ｇａｃａａｇａｃｃの塩基配列と終止コドンｔａａの塩基配列を連結させた遺伝子である。
配列番号８は配列番号１６の塩基配列の３'末端に、ｇａｃａａｇａｃｃｃａｃ（配列番号３）の塩基配列と終止コドンｔａａの塩基配列を連結させた遺伝子である。
配列番号９は配列番号１６の塩基配列３'末端に、ｇａｃａａｇａｃｃｃａｃａｃｃ（配列番号４）の塩基配列と終止コドンｔａａの塩基配列を連結させた遺伝子である。
【００２７】
本発明における組換えベクターとは、形質転換後の宿主細胞において、上記したＦｄ鎖遺伝子が発現する機能を有する核酸分子のことを意味する。組み換えベクターは、発現カセットに加えて、組み込み相同領域、栄養要求性相補遺伝子または薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子、自律複製配列などを有していてもよい。
【００２８】
本発明において宿主に形質転換された後のベクターは、形質転換体の染色体に組み込まれている状態でも良く、自律複製型として存在している状態でも良い。自律複製型ベクターの例としては、ＹＥｐベクター、ＹＲｐベクター、ＹＣｐベクターなどが挙げられる。コマガタエラ属の場合はｐＰＩＣＨＯＬＩ、ｐＨＩＰ、ｐＨＲＰ、ｐＨＡＲＳなどが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明における「発現カセット」とは、プロモーターおよび発現する目的タンパク質遺伝子より構成され、ターミネーター遺伝子を含んでも良く、例えば、ｐＵＣ１９等のプラスミド上に構築することもできるし、ＰＣＲ法によっても作成することができる。
【００３０】
本発明における組み込み相同領域とは、本発明の組換えベクターが形質転換後の宿主細胞の染色体上に相同組換えで組み込まれるための領域を指す。本領域は、宿主細胞の染色体の一部を任意で利用できるが、栄養要求性相補遺伝子や、発現カセット内のプロモーターやターミネーターなどを利用することもできる。
【００３１】
本発明における栄養要求性相補遺伝子は、宿主細胞のアミノ酸や核酸などの栄養要求性を相補する遺伝子であれば特に限定されない。具体的な例としては、ＵＲＡ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ４遺伝子などが挙げられ、それぞれウラシル、ロイシン、アデニン、ヒスチジンの栄養要求性株において原栄養株表現型の回復により選択することができる。
【００３２】
本発明における薬剤耐性遺伝子などの選択マーマー遺伝子は、宿主細胞が保有していない薬剤耐性を付与する遺伝子であれば特に限定されない。具体的な例としては、G418耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子などが挙げられ、それぞれＧ４１８、ゼオシン、ハイグロマイシンを含む培地上における耐性により選択することができる。なお、酵母宿主を作成するときに用いた栄養要求性選択マーカーは、該選択マーカーが破壊されていない場合は、用いることができない。この場合、該選択マーカーを回復させればよく、方法は当業者において公知の方法を用いることができる。
【００３３】
本発明における自律複製配列とは、宿主細胞において、本発明の組換えベクターの複製起点として作用し、自律的な複製を可能とする配列のことを指す。
【００３４】
本発明の組み換えベクターは、本明細書に記載した本発明のＦｄ鎖遺伝子又はＬ鎖遺伝子を含有する組換えベクターであるが、好ましくは、Ｆｄ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の両方を含むものである。本発明の組み換えベクターの具体例としては、
（ａ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子と、抗体のＬ鎖遺伝子とを含有する、組み換えベクター；
（ｂ）抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子と、抗体のＦｄ鎖遺伝子とを含有する、組み換えベクター；及び
（ｃ）抗体のＦｄ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子と、抗体のＬ鎖のアミノ酸配列をコードする塩基配列の３’末端に、Ｆａｂ型抗体の分泌量を増大できるアミノ酸又はアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子とを含有する組み換えベクター；
を挙げることができる。
【００３５】
本発明の組み換えベクターに含まれる各構成要素の５'側から３'側への並び方について好ましい例を以下に挙げる。
（１）第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｆｄ鎖遺伝子−ターミネーター配列；
（２）第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｆｄ鎖遺伝子−第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−ターミネーター配列；
（３）（第１のプロモーター配列−第１のシグナル配列−Ｌ鎖遺伝子−第１のターミネーター配列）を含む発現ベクターと、（第２のプロモーター配列−第２のシグナル配列−Ｆｄ鎖遺伝子−第２のターミネーター配列）を含む発現ベクターとの組み合わせ；
【００３６】
（１）〜（３）において、第１のプロモーターと第２のプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のプロモーターは、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファ（好ましくは宿主であるハンゼヌラ・ポリモルファ）のＭＯＸプロモーター又はＧＡＰプロモーターである。
【００３７】
（１）〜（３）において、第１のシグナル配列と第２のシグナル配列は同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のシグナル配列は、好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエのＭａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ α（ＭＦα）プレプロシグナルである。
【００３８】
（３）において、第１のターミネーター配列と第２のターミネーター配列は同一であっても異なっていてもよい。第１及び第２のターミネーター配列は、好ましくは、ハンゼヌラ・ポリモルファのＭＯＸ遺伝子のターミネーター配列である。
【００３９】
本発明における宿主とは、本発明のＦｄ鎖遺伝子及び／又はＬ鎖遺伝子を含有する組換えベクターを導入し、Ｆａｂ型抗体を生産できれば、特に限定されないが、好ましくは酵母、カビ、動物細胞、トランスジェニック動物、大腸菌、無細胞タンパク質合成系などが挙げられる。中でも酵母が好ましく、メタノール資化性酵母がより好ましく、オガタエア属（Ｏｇａｔａｅａ）やコマガタエラ属(Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ)に属するメタノール資化性酵母がさらに好ましい。オガタエア属に属するメタノール資化性酵母の中でも、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、オガタエア・ミニュータ（Ｏｇａｔａｅａ ｍｉｎｕｔａ）が好ましく、コマガタエラ属に属するメタノール資化性酵母では、コマガタエア・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が好ましい。
【００４０】
本発明における形質転換体とは、本発明の組換えベクターが宿主に導入されたものを意味する。本発明の形質転換体は、組換えベクターに含まれる栄養要求性相補遺伝子や薬剤耐性遺伝子により得られる表現型を指標にして、選択的に得ることができる。
【００４１】
本発明のＦａｂ型抗体の製造方法としては、上記した形質転換体を培養して、生産したＦａｂ型抗体を回収することで得られる。生産する方法としては、上記の形質転換体を培養し、その培養上清中に蓄積させる分泌方法等が挙げられる。
【００４２】
本発明における分泌生産とは、形質転換体を液体培養して、菌体内部でなく培養上清にＦａｂ型抗体を蓄積させることを指す。分泌生産は、Ｆａｂ型抗体のＦｄ鎖および/またはＬ鎖を、分泌シグナルを融合したタンパク質として発現させることにより行う。分泌シグナルの融合としては、例えば、Ｆａｂ型抗体のＦｄ鎖および/またはＬ鎖をコードする塩基配列の５’末端にシグナル配列をコードする塩基配列を導入することにより行うことができる。
【００４３】
本発明におけるシグナル配列をコードする塩基配列は、宿主細胞がＦａｂ型抗体を分泌発現できるシグナル配列であれば特に限定されないが、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＭａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  α（ＭＦα）や、オガタエア・ポリモルファやコマガタエラ・パストリスの酸ホスファターゼ（ＰＨＯ１）、サッカロマイセス・セレビシアエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）、サッカロマイセス・セレビシアエのＰＬＢ１、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、免疫グロブリンのシグナル配列をコードする塩基配列等が挙げられる。
【００４４】
本発明における形質転換体の培地は、通常宿主細胞が資化する栄養源を含む培地であれば何でも使用でき、上記栄養源としては、グルコース、シュークロース、マルトース等の糖類、乳酸、酢酸、クエン酸、プロピオン酸等の有機酸類、メタノール、エタノール、グリセロール等のアルコール類、パラフィン等の炭化水素類、大豆油、菜種油等の油脂類、またはこれらの混合物等の炭素源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、尿素、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、コーンスチープリカー等の窒素源、更に、その他の無機塩、ビタミン類等の栄養源を適宜混合・配合した通常の培地を用いることができるが、特にグリセロールやメタノールを炭素源として用いることが好ましい。また、培養方法としてバッチ培養、連続培養またはドーム型培養のいずれでも培養可能である。
【００４５】
培養は通常一般の条件により行なうことができ、例えば、ｐＨ２．５〜１０．０、温度範囲１０℃〜４８℃の範囲で、好気的に１０時間〜１０日間培養することにより行うことができる。
【００４６】
本発明の形質転換体は、好ましくは、形質転換体を培養してＦａｂ型抗体を生産させた場合の培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量が２．０ｍｇ／ｍＬ以上（さらに好ましくは２．５ｍｇ／ｍＬ以上）である。形質転換体を培養してＦａｂ型抗体を生産させた場合の培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量が２．０ｍｇ／ｍＬ以上（さらに好ましくは２．５ｍｇ／ｍＬ以上）である形質転換体とは、実施例１に示したＦａｂ型抗体の遺伝子を含む発現ベクターを用い、それを実施例２に示す方法で酵母に形質転換し、得られた形質転換体を、実施例３及び４に示す方法で、培養して得られた培養上清中のＦａｂ型抗体分泌生産量を解析した場合に、そのＦａｂ型抗体の濃度が２．０ｍｇ／Ｌ以上（又は２．５ｍｇ／ｍＬ以上）になる形質転換体を意味する。
【００４７】
本発明のＦａｂ型抗体を回収する方法は、分泌生産の場合、培養液から遠心分離等で培養上清を調製する工程や、培養上清から任意の方法でＦａｂ型抗体を単離精製する工程を含む。培養上清からの単離精製は、公知のタンパク質精製法を適当に組み合わせて用いることにより実施できる。例えば、形質転換体を適当な培地で培養し、培養液の遠心分離、あるいは、濾過処理により培養上清から菌体を除き、得られた培養上清を、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分画沈殿法）、透析、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等の手法で、該培養上清からＦａｂ型抗体を回収することができる。上記回収したＦａｂ型抗体は、そのまま使用することもできるが、その後ＰＥＧ化等の薬理学的な変化をもたらす修飾、酵素やアイソトープ等の機能を付加する修飾を加えて使用することもできる。また、各種の製剤化処理を使用しても良い。
【実施例】
【００４８】
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。なお、以下の実施例において用いた組換えＤＮＡ技術に関する詳細な操作方法などは、次の成書に記載されている：Molecular Cloning 2nd Edition（Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）、Current Protocols in Molecular Biology（Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience）。【００４９】
また、以下の実施例において取得したプラスミドは、大腸菌E. coli DH5αコンピテントセル（タカラバイオ社製）を用いて、これに記載の条件で行うことにより取得した形質転換体を用いて増幅している。【００５０】
ＰＣＲにはPrime STAR HS DNA Polymerase（タカラバイオ社製）を用い、反応条件は添付のマニュアルに記載の方法で行った。【００５１】
（実施例１）ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍの構築
抗体発現ベクターの構築において利用した、ＭＯＸプロモーター（配列番号１８）、ＭＯＸターミネーター（配列番号１９）、ＬＥＵ２遺伝子（配列番号２０）はハンゼヌラ・ポリモルファ ８Ｖ株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。Ｍａｔｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒαプレプロシグナル（ＭＦα、配列番号２１）は、サッカロマイセス・セレビシアエＳ２８８ｃ株のゲノムＤＮＡをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。抗体遺伝子は、完全ヒト型化抗ＴＮＦ−α抗体（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ；ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））の公開配列情報に基づいて、Ｌ鎖（配列番号２２）、Ｈ鎖（配列番号２３）を化学合成した（特開２００９−０８２０３３）ものをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。【００５２】
ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩ−ＢｇｌＩＩ−ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩのサイトをもつ遺伝子断片（配列番号２４）を全合成し、これをｐＵＣ１９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩサイトに挿入してｐＵＣ−１を調製した。ＬＥＵ２遺伝子の両側にＨｉｎｄＩＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１および２（配列番号２５および２６）を用いたＰＣＲにより調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理後にｐＵＣ−１のＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−ＬＥＵ２）。次に、ＭＯＸプロモーターの両側にＢａｍＨＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー３および４（配列番号２７および２８）を用いたＰＣＲにより調製し、ＢａｍＨＩ処理後にｐＵＣ−ＬＥＵ２のＢａｍＨＩサイトへ挿入した（ｐＵＣ−ＬＥＵ２−Ｐｍ）。ＭＦαの5'側にSpeIサイトを、3'側にBglIIサイトつけた遺伝子断片をプライマー５および６（配列番号２９および３０）を用いたＰＣＲにより調製し、SpeIおよびBglII処理後にｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍのSpeI-BglIIサイトへ挿入した（ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆ）。ＭＯＸターミネーターの両側にＸｂａＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー７および８（配列番号３１および３２）を用いたＰＣＲにより調製し、ＸｂａＩ処理後にｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆのＸｂａＩサイトに挿入した（ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍ）。【００５３】
（比較例１）Ｆａｂ型抗体発現組換えベクターの構築
Ｌ鎖の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー９および１０（配列番号３３および３４）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍを構築した。Ｆｄ鎖の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１１および１２（配列番号３５および３６）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＦＴｍを構築した。ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４（配列番号３７および３８）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＦＴｍのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＦＴｍ−ＰｍＭｆＬｔｍを構築した。本発現ベクターは、Ｆａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がそれぞれ別々のＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。【００５４】
（比較例２）形質転換体の取得
比較例１で構築したFab型抗体発現ベクターをＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を実施例３記載の方法を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換した。【００５５】
（比較例３）形質転換体の培養および培養上清の調製
比較例２で取得したＦａｂ型抗体発現ベクター導入株の培養上清の調製は実施例４に記載の方法と同様に実施した。【００５６】
（比較例４）Ｆａｂ型抗体の定量
比較例３で取得した培養上清中のＦａｂ型抗体の分泌生産量は、実施例５と同様にサンドイッチELISA（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay）法により解析した。【００５７】
本発明の各Ｆｄ鎖遺伝子（配列番号５〜９）は、上記のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＦＴｍをテンプレートにしてＰＣＲにより調製した。【００５８】
（実施例２）各Ｆａｂ型抗体発現組換えベクターの構築
Ｆｄ鎖をコードする塩基配列、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＨｉｓおよびＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒの何れかのアミノ酸配列をコードする塩基配列、終止コドンをコードする塩基配列を融合させた断片は、ＰＣＲにより調製した。【００５９】
Ａｓｐをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー１５（配列番号１０）とプライマー１６（配列番号１１）を、Ａｓｐ−Ｌｙｓをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー１７（配列番号１２）を、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1とプライマー１８(配列番号１３)を、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号１）をコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー１９（配列番号１４）を、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）をコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー１５とプライマー２０（配列番号１５）を、それぞれ用いてＰＣＲを行い、各断片を得た。各断片をBglII処理して、実施例１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入して、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号１）およびＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）の何れかをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各プラスミドを構築した。ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４（配列番号３７および３８）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、上述のＡｓｐ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号１）およびＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）の何れかをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号１）およびＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号２）の何れかをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各Ｆａｂ型抗体発現ベクターを構築した。【００６０】
（実施例３）形質転換体の取得
実施例２で構築した各種のＦａｂ型抗体発現組換えベクターを、ＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換した。具体的には、オガタエア・ポリモルファBY4329（NCYC495由来、leu1-1）を３ｍｌのYPD培地（1% yeast extract bacto（Difco社製），2% tryptone bacto（Difco社製），2% glucose）に接種し、３７℃で一晩振とう培養して、前培養液を得た。得られた前培養液５００μｌを５０ｍｌのＹＰＤ培地に接種し、ＯＤ６００が１〜１．５になるまで３０℃で振とう培養後、集菌（3000×g、10分、20℃）した。菌体を１０ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウムバッファー(２５ｍＭ DTTを含む、 ｐＨ７．５)に懸濁し、懸濁液を３７℃で１５分インキュベートした。集菌（3000×g、10分、4℃）した後、氷冷した５０ｍｌのＳＴＭバッファー（２７０ｍＭスクロース, １０ｍＭ Tris-HCl, １ｍＭ塩化マグネシウム, ｐＨ７．５）で菌体を再懸濁した。集菌（3000×g、10分、4℃）後、菌体を２５ｍｌの氷冷したＳＴＭバッファーで再懸濁した。集菌（3000×g、10分、4℃）した後、菌体を２５０μｌの氷冷したＳＴＭバッファーに懸濁し、これをコンピテントセル溶液とした。このコンピテントセル溶液６０μｌと直鎖状の各プラスミド溶液３μｌ（ＤＮＡ量０．５〜１μｇ）を混合し、エレクトロポレーション用キュベット（ディスポキュベット電極，電極間隔２ｍｍ；ビーエム機器社製）に移し入れ、7.5kV／cm、１０μF、９００Ωの条件でエレクトロポレーションした。その後、菌体をYPD培地１ｍｌで懸濁し、３７℃で１時間静置した。集菌（3000×g、5分、室温）し、１ｍｌの生理食塩水で菌体を洗浄し、再度集菌（3000×g、5分、室温）した。菌体を適当量の生理食塩水で懸濁後、SD培地寒天プレート（0.67% yeast nitrogen base（Difco社製），1% glucose）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、各種Fab型抗体発現株を取得した。【００６１】
（実施例４）形質転換体の培養および培養上清の調製
培養上清の調製は以下のように実施した。即ち、実施例３で得られた各Ｆａｂ型抗体発現株を２ｍｌのBMGMY培地（1% yeast extract bacto，2% peptone，1.34% yeast nitrogen base，0.4mg/l Biotin，100mMリン酸カリウム(pH6.0)，1% Glycerol, 1% Methanol）に植菌し、３０℃で７２時間振とう培養後、遠心分離（15,000rpm、1分、4℃）により培養上清を調製した。【００６２】
（実施例５）Ｆａｂ型抗体の定量
Ｆａｂ型抗体の培養上清への分泌生産量は、サンドイッチELISA（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay）法により解析した。
サンドイッチELISAは、ELISA用プレート（マキシソープ；NUNC社製）に固定化バッファー（0.1M 炭酸ナトリウムバッファー、pH9.6）にて２５００倍希釈したAnti IgG(Ｆｄ) ,Human (Sheep)（The Binding Site Group社製）を５０μｌ/ウェルで添加し、終夜で４℃インキュベートした。インキュベート後、ウェル中の溶液を除去し、５倍希釈したイムノブロック（大日本住友製薬社製）を２５０μｌ/ウェルで加え、室温で１時間静置し、ブロッキングした。各ウェルをPBST（PBS(タカラバイオ社製)+0.1% Tween20）で３回洗浄後、系列希釈した標準Fab型抗体（Anti-Human IgGFab；rockland社製）と培養上清の希釈液を５０μｌ/ウェルで加え、室温で1時間反応した。ウェル中の溶液を除去し、PBSTで２回洗浄後、PBSTIB（PBST + 2% イムノブロック）溶液にて８０００倍希釈したAnti-Human IgG（Fab SPECIFIC）PEROXIDASE CONJUGATE Antibody developed in Goat Affinity Isolated Antibody（SIGMA社製）を５０μｌ/ウェルで加え、室温で１時間反応させた。ウェル中の溶液を除去し、PBSTで４回洗浄後、TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate，SureBlue（KPL社製）を１００μｌ/ウェルで添加し、室温で２０分静置した。TMB Stop Solution（KPL社製）を１００μｌ/ウェルで添加して反応を停止させた後、マイクロプレートリーダー（BenchMark Plus；Bio-Rad社製）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。培養上清中のＦａｂ型抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った結果を表１に示す。表1の通り、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＨｉｓおよびＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒの何れかを融合したＦａｂ型抗体の生産量は、融合していないＦａｂ型抗体の５倍程度向上していることが明らかとなった。【００６３】
【表１】
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【００６４】
（実施例６）各Ｆａｂ型抗体発現ベクターの構築２
Ｆｄ鎖をコードする塩基配列、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの何れかのアミノ酸をコードする塩基配列、終止コドンをコードする塩基配列を融合させた断片は、ＰＣＲにより調製した。【００６５】
Ｇｌｙをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２１（配列番号３９）を、Ａｌａをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２２（配列番号４０）を、Ｖａｌをコードする塩基配列を融合したFd鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２３(配列番号４１)を、Ｌｅｕをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２４（配列番号４２）を、Ｉｌｅをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２５（配列番号４３）を、Ｃｙｓをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２６（配列番号４４）を、Ｍｅｔをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２７（配列番号４５）を、Ｓｅｒをコードする塩基配列を融合したFd鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２８(配列番号４６)を、Ｔｈｒをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー２９（配列番号４７）を、Ｔｙｒをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３０（配列番号４８）を、Ｐｈｅをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３１（配列番号４９）を、Ｔｒｐをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３２（配列番号５０）を、Ｐｒｏをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３３(配列番号５１)を、Ｇｌｕをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３４（配列番号５２）を、Ａｓｎをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３５（配列番号５３）を、Ｇｌｎをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３６（配列番号５４）を、Ｌｙｓをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３７（配列番号５５）を、Ａｒｇをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３８(配列番号５６)を、Ｈｉｓをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー３９（配列番号５７）を、それぞれ用いてＰＣＲを行い、各断片を得た。各断片をBglII処理して、実施例１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのBglIIサイトに挿入して、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの何れかをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各プラスミドを構築した。ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４（配列番号３７および３８）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、上述のＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、��ｒｇ、Ｈｉｓの何れかをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各プラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの何れかをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各Ｆａｂ型抗体発現ベクターを構築した。【００６６】
（実施例７）各Ｆａｂ型抗体発現ベクターの構築３
Ｌ鎖をコードする塩基配列、Ａｓｐののアミノ酸をコードする塩基配列、終止コドンをコードする塩基配列を融合させた断片は、ＰＣＲにより調製した。
Ａｓｐをコードする塩基配列を融合したＬ鎖遺伝子断片はプライマー９とプライマー４０（配列番号５８）を用いてＰＣＲを行い、断片を得た。本断片をＢｇｌＩＩ処理して、実施例１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、Ａｓｐをコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子を含むベクターを構築した。本ベクターをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、Ａｓｐをコードする塩基配列を含有するＬ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４（配列番号３７および３８）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、実施例２記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＦＴｍのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ａｓｐをコードする塩基配列を含有するＬ鎖遺伝子を含む各Ｆａｂ型抗体発現ベクターを構築した。【００６７】
（実施例８）形質転換体の培養および培養上清の調製
実施例６および７で構築した各種のＦａｂ型抗体発現組換えベクターを、ＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を実施例２に記載の方法を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換し、各種Fab型抗体発現株を取得した。【００６８】
（実施例９）形質転換体の培養および培養上清の調製
実施例８で得られた各種Fab型抗体発現株の培養上清の調製は実施例3と同様に実施して取得した。【００６９】
（実施例１０）Ｆａｂ型抗体の定量
実施例９で取得したＦａｂ型抗体の培養上清への分泌生産量は、実施例４に記載の方法により解析した。【００７０】
培養上清中のＦａｂ型抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った結果を表２に示す。表２の通り、Ｆｄ鎖にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓの何れかを融合したＦａｂ型抗体の生産量、Ｌ鎖にＡｓｐを融合したＦａｂ型抗体の生産量は、融合していないＦａｂ型抗体の４〜６倍程度向上していることが明らかとなった。【００７１】
【表２】
0006465794.tif 000003
【００７２】
（比較例５）レミケード由来のＦａｂ型抗体発現ベクターの構築
レミケード由来のFab型抗体遺伝子は、レミケード（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ；Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標））の公開配列情報に基づいて、Ｌ鎖（配列番号５９）、Ｆｄ鎖（配列番号６０）を化学合成し、これをテンプレートにしてＰＣＲで調製した。【００７３】
レミケード由来Ｌ鎖の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー４１および４２（配列番号６１および６２）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、実施例１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆｒＬＴｍを構築した。レミケード由来Ｆｄ鎖の両側にＢｇｌＩＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー４３および４４（配列番号６３および６４）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＢｇｌＩＩ処理後、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのＢｇｌＩＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆｒＦＴｍを構築した。ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆｒＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、レミケード由来Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４（配列番号３７および３８）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆｒＦＴｍのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆｒＦＴｍ−ＰｍＭｆｒＬｔｍを構築した。本発現ベクターは、レミケード由来のＦａｂ型抗体のＬ鎖およびＦｄ鎖がそれぞれ別々のＭＯＸプロモーター制御下で発現するように設計されている。【００７４】
（比較例６）形質転換体の取得
比較例５で構築したレミケード由来Ｆａｂ型抗体発現ベクターをＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を実施例３記載の方法を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換した。【００７５】
（比較例７）形質転換体の培養および培養上清の調製
比較例６で取得したレミケード由来Ｆａｂ型抗体発現ベクター導入株の培養上清の調製は実施例１３に記載の方法と同様に実施した。【００７６】
（比較例８）Ｆａｂ型抗体の定量
比較例７で取得した培養上清中のＦａｂ型抗体の分泌生産量は、実施例５と同様にサンドイッチELISA（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay）法により解析した。結果を表３に示す。【００７７】
（実施例１１）レミケード由来各Ｆａｂ型抗体発現ベクターの構築
Ａｓｐをコードする塩基配列を融合したレミケード由来Ｆｄ鎖遺伝子断片はプライマー４３とプライマー４５（配列番号６５）を用いてＰＣＲを行い、断片を得た。本断片をBglII処理して、実施１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのBglIIサイトに挿入して、Ａｓｐをコードする塩基配列を含有するレミケード由来Ｆｄ鎖遺伝子を含むベクターを構築した。比較例２記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆｒＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、レミケード由来Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４（配列番号３７および３８）を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、上述のＡｓｐをコードする塩基配列を含有するレミケード由来Ｆｄ鎖遺伝子を含むベクターのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ａｓｐをコードする塩基配列を含有するレミケード由来Ｆｄ鎖遺伝子を含むレミケード由来Ｆａｂ型抗体発現組換えベクターを構築した。【００７８】
（実施例１２）形質転換体の取得
実施例１１で構築したレミケード由来Ｆａｂ型抗体発現組換えベクターを、ＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を実施例２に記載の方法を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換し、レミケード由来Fab型抗体発現株を取得した。【００７９】
（実施例１３）形質転換体の培養および培養上清の調製
培養上清の調製は以下のように実施した。即ち、実施例１２で得られたレミケード由来Ｆａｂ型抗体発現株を２ｍｌのBMGMY培地（1% yeast extract bacto，2% peptone，1.34% yeast nitrogen base，0.4mg/l Biotin，100mMリン酸カリウム(pH6.0)，1% Glycerol, 1% Methanol）に植菌し、３０℃で６０時間振とう培養後、Methanolを20mg添加し、さらに３０℃で２４時間振とう培養した。その後、遠心分離（15,000rpm、1分、4℃）により培養上清を調製した。【００８０】
（実施例１４）Ｆａｂ型抗体の定量
実施例１３で取得したレミケード由来Ｆａｂ型抗体の培養上清への分泌生産量は、実施例４に記載の方法により解析した。
培養上清中のレミケード由来Ｆａｂ型抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った結果を表３に示す。表３の通り、Ｆｄ鎖にＡｓｐを融合したレミケード由来Ｆａｂ型抗体の生産量は、融合していないレミケード由来Ｆａｂ型抗体の５倍程度向上しており、Ｆａｂ型抗体の種類に因らず、効果があることが明らかとなった。【００８１】
【表３】
0006465794.tif 000004
【００８２】
（比較例９）ピキア用Ｆａｂ型抗体ベクターの構築
実施例２記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍ−ＰｍＭｆＦｔｍをＨｉｎｄＩＩＩで処理した後に、Ｆａｂ型抗体遺伝子を含むベクター断片をアガロースゲルから精製した。その後、本ベクター断片のＨｉｎｄＩＩＩサイトに、実施例１５に記載のＧ４１８耐性遺伝子を挿入し、ｐＵＣ−Ｇ４１８−ＰｍＭｆＬＴｍ−ＰｍＭｆＦｔｍを構築した。【００８３】
（比較例１０）ピキアの形質転換体の取得
比較例９で構築したベクターを、ピキア酵母野生株Ｙ−１１４３０株に形質転換した。方法は実施例１６に記載の方法にて実施した。【００８４】
（比較例１１）形質転換体の培養および培養上清の調製
比較例１０で取得したＦａｂ型抗体発現ベクター導入ピキア株の培養上清の調製は実施例４に記載の方法と同様に実施した。【００８５】
（比較例１２）Ｆａｂ型抗体の定量
比較例１１で取得した培養上清中のＦａｂ型抗体の分泌生産量は、実施例５と同様にサンドイッチELISA（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay）法により解析した。結果を表４に示す。【００８６】
（実施例１５）ピキア用Ｆａｂ型抗体ベクターの構築
オガタエア・ポリモルファ酵母のＧＡＰプロモーター制御下で発現するように設計したＧ４１８耐性遺伝子（配列番号６６）を全合成し、ＰＣＲのテンプレートとした。このＧ４１８耐性遺伝子の両側にＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した遺伝子断片を、プライマー４６および４７（配列番号６７および６８）用いてＰＣＲで調製し、ＨｉｎｄＩＩＩ処理をした。実施例２記載のＡｓｐをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各Ｆａｂ型抗体発現ベクターをＨｉｎｄＩＩＩで処理した後に、Ｆａｂ型抗体遺伝子を含むベクター断片をアガロースゲルから精製した。その後、本ベクター断片のＨｉｎｄＩＩＩサイトに上述のＧ４１８耐性遺伝子を挿入し、Ｇ４１８耐性遺伝子を選択マーカーとするＡｓｐをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各Ｆａｂ型抗体発現ベクターを構築した。【００８７】
（実施例１６）ピキアの形質転換体の取得
実施例１５で構築したＧ４１８耐性遺伝子を選択マーカーとするＡｓｐをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含む各Ｆａｂ型抗体発現ベクターを、ピキア酵母野生株Ｙ−１１４３０株に形質転換した。方法は実施例３に記載の方法において、ハンゼヌラ酵母をピキア酵母に変更して実施した。
形質転換後の菌体をＧ４１８含有のSD培地寒天プレート（0.17% Bacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco社製），0.1% sodium glutamate, 1% glucose, 0.25g/L G418）に塗布し、３０℃、３日間の静置培養で生育する株を選択し、Fab型抗体発現株を取得した。【００８８】
（実施例１７）形質転換体の培養および培養上清の調製
実施例１６で取得したピキア酵母のＦａｂ型抗体発現ベクター導入株の培養上清の調製は実施例４に記載の方法と同様に実施した。【００８９】
（実施例１８）Ｆａｂ型抗体の定量
実施例１７で取得した培養上清中のＦａｂ型抗体の分泌生産量は、実施例５と同様にサンドイッチELISA（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay）法により解析した。【００９０】
培養上清中のＦａｂ型抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った結果を表４に示す。表４の通り、Fd鎖にＡｓｐを融合したＦａｂ型抗体の生産量は、融合していないＦａｂ型抗体の２倍程度向上しており、複数の酵母種において、効果があることが明らかとなった。【００９１】
【表４】
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【００９２】
（実施例１９）各Ｆａｂ型抗体発現ベクターの構築３
Ｆｄ鎖をコードする塩基配列、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号６９）のペプチドをコードする塩基配列（配列番号７０）、終止コドンをコードする塩基配列を融合させた断片は、ＰＣＲにより調製した。Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片はプライマー1５とプライマー４８（配列番号７１）を用いて、実施例２にて調製したＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含むＦａｂ型抗体発現ベクターをテンプレートに用いてＰＣＲを行い、断片を得た。本断片をBglII処理して、実施例１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのBglIIサイトに挿入して、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含むプラスミドを構築した。ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含むプラスミドのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含むＦａｂ型抗体発現ベクターを構築した。【００９３】
（実施例２０）形質転換体の取得
実施例１９で構築したＦａｂ型抗体発現組換えベクターを、ＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を実施例２に記載の方法を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換し、Fab型抗体発現株を取得した。【００９４】
（実施例２１）形質転換体の培養および培養上清の調製
実施例２０で得られたFab型抗体発現株の培養上清の調製は実施例3と同様に実施して取得した。【００９５】
（実施例２２）Ｆａｂ型抗体の定量
実施例２１で取得したＦａｂ型抗体の培養上清への分泌生産量は、実施例４に記載の方法により解析した。
培養上清中のＦａｂ型抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った結果を表５に示す。表５の通り、Ｆｄ鎖に１０残基のペプチドを融合したＦａｂ型抗体の生産量は、融合していないＦａｂ型抗体の５倍程度向上していることが明らかとなった。【００９６】
【表５】
0006465794.tif 000006
【００９７】
（実施例２３）Ｆａｂ型抗体発現ベクターの構築４
Ｆｄ鎖をコードする塩基配列、３０残基のペプチド（配列番号７４）をコードする塩基配列（配列番号７５）、終止コドンをコードする塩基配列を融合させた断片は、ＰＣＲにより調製した。
配列番号７４のペプチドをコードする塩基配列を融合したＦｄ鎖遺伝子断片は、プライマー４９（配列番号７６）とプライマー５０（配列番号７７）を用いてpEGFP-F（クローンテック社製）などをテンプレートに用いてＰＣＲを行い、断片を得た。本断片をBglIIおよびBamHI処理して、実施例１記載のｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＴｍのBglIIサイトに挿入し、配列番号７４のペプチドをコードする塩基配列の一部を含むプラスミドを得た。次に、プライマー1５とプライマー５１（配列番号７８）を用いてＰＣＲを行い、Fd鎖遺伝子断片を得た。本断片をBglIIおよびBamHI処理し、上述の配列番号７４のペプチドをコードする塩基配列の一部を含むプラスミドのBglIIサイトに挿入して、配列番号７４のペプチドをコードする塩基配列を融合したFd鎖遺伝子を含むベクターを構築した。ｐＵＣ−ＬＥＵ２−ＰｍＭｆＬＴｍをテンプレートにして、ＭＯＸプロモーター、ＭＦα、Ｌ鎖、ＭＯＸターミネーターの一部が連結した遺伝子断片の両側にＥｃｏＲＩサイトをつけた遺伝子断片を、プライマー１３および１４を用いたＰＣＲにより調製した。本遺伝子断片をＥｃｏＲＩ処理後、配列番号７４のペプチドをコードする塩基配列を融合したFd鎖遺伝子を含むベクターのＥｃｏＲＩサイトに挿入し、配列番号７４のペプチドをコードする塩基配列を含有するＦｄ鎖遺伝子を含むＦａｂ型抗体発現ベクターを構築した。【００９８】
（実施例２４）形質転換体の取得
実施例２３で構築したＦａｂ型抗体発現組換えベクターを、ＭＯＸターミネーター内のEcoRVサイトで切断して直鎖状にした。本断片を実施例２に記載の方法を用いてオガタエア・ポリモルファを形質転換し、Fab型抗体発現株を取得した。【００９９】
（実施例２５）形質転換体の培養および培養上清の調製
実施例２４で得られたFab型抗体発現株の培養上清の調製は実施例3と同様に実施して取得した。【０１００】
（実施例２６）Ｆａｂ型抗体の定量
実施例２５で取得したＦａｂ型抗体の培養上清への分泌生産量は、実施例４に記載の方法により解析した。
培養上清中のＦａｂ型抗体の定量は、標準タンパク質の検量線を用いて行った結果を表６に示す。表６の通り、Ｆｄ鎖に３０残基のペプチドを融合したＦａｂ型抗体の生産量は、融合していないＦａｂ型抗体の4倍程度向上していることが明らかとなった。【０１０１】
【表６】
0006465794.tif 000007
【配列表】
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