(57)【要約】肥満／脂肪症関連障害を治療するための診断、画像化または治療薬のターゲティングで使用するための方法および組成物が提供され、例えば、組成物および方法は、インビトロおよびインビボの両方でほ乳類において脂肪組織間質細胞を選択的に標的とするためのペプチドを同定し、使用する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むターゲティングペプチドであって、前記ペプチドが間質細胞と結合する、ターゲティングペプチド。
【請求項２】
前記ペプチドが、配列番号１３および配列番号１４のＷＡＴ７アミノ酸配列ＳＷＫＹＷＦＧＥを含む、請求項１記載のターゲティングペプチド。
【請求項３】
請求項１記載のターゲティングペプチドを含む、タンパク質組成物。
【請求項４】
請求項２記載のＷＡＴ７アミノ酸配列を含むタンパク質組成物。
【請求項５】
前記ターゲティングペプチドが完全にＤ−アミノ酸から構成される、請求項１記載のターゲティングペプチド。
【請求項６】
前記ＷＡＴ７がＤ−アミノ酸から構成され、前記組成物が脂肪組織、線維性組織または腫瘍組織中の間質細胞と結合する、請求項４記載のタンパク質組成物。
【請求項７】
前記ＷＡＴ７が、ＡＳＣ細胞の表面上のΔＤＣＮと選択的に結合する、請求項６記載のタンパク質組成物。
【請求項８】
前記ターゲティングペプチドが：造影剤；細胞毒性剤；プロアポトーシス剤；融合タンパク質；細胞増殖抑制剤；細胞破壊剤；放射性同位体；ＡＣＳ細胞分化誘導剤；分裂抑制剤、抗腫瘍剤；抗生物質製剤、酵素；化学療法剤；血管新生阻害剤またはそれらの組み合わせから選択されるエフェクター剤とカップリングする、請求項３記載のタンパク質組成物。
【請求項９】
前記ターゲティングペプチドおよびエフェクター剤がＤ−アミノ酸から構成される、請求項８記載のタンパク質組成物。
【請求項１０】
前記ターゲティングペプチドがＬ−アミノ酸から構成され、前記エフェクターがＤ−アミノ酸を含む、請求項８記載のタンパク質組成物。
【請求項１１】
前記ターゲティングペプチドがＬ−アミノ酸から構成され、前記エフェクターがＬ−アミノ酸を含む、請求項８記載のタンパク質組成物。
【請求項１２】
エフェクター剤とカップリングされ、白色脂肪組織を褐色脂肪組織に変える、請求項８記載のタンパク質組成物。
【請求項１３】
前記エフェクター剤が白色脂肪組織中のｂ３−アドレナリン受容体を活性化する、請求項１２記載のタンパク質組成物。
【請求項１４】
前記エフェクター剤がＤ−アミノ酸から構成されるペプチドである、請求項８記載のタンパク質組成物。
【請求項１５】
タンパク質組成物に脂肪組織を標的とさせる方法であって：
エフェクター剤をターゲティングペプチドとカップリングさせることを含み、前記ターゲティングペプチドは配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列から構成され；前記ターゲティングペプチドは細胞脂肪組織を選択的に標的とする、方法。
【請求項１６】
前記エフェクター剤およびターゲティングペプチドがＤ−アミノ酸から構成される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記エフェクターがＬ−アミノ酸から構成され；前記ターゲティングペプチドがＤ−アミノ酸から構成される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
カップリングが、前記エフェクター剤を、連結部分で前記ターゲティングペプチドと連結することを含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
前記連結部分が、アミノヘキサン酸；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；（ＣＨ２）７；（ＣＨ２）８またはそれらの組み合わせを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記エフェクター剤が、細胞毒性剤；プロアポトーシス剤；造影剤またはそれらの組み合わせを含む群から選択される、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
エフェクター剤を脂肪組織に送達する方法であって：
長さが１００アミノ酸未満の、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する脂肪組織ターゲティングペプチド部分を含むアミノ酸配列から構成されるペプチドとカップリングしたエフェクター剤を含むタンパク質組成物を；脂肪組織を含む細胞の集団に暴露すること
を含む、方法
【請求項２２】
前記タンパク質組成物がリンカーを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ターゲティングペプチドモチーフがＤ−アミノ酸から構成される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記エフェクター剤および前記ターゲティングペプチドがＤ−アミノ酸から構成される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が：細胞毒性剤；プロアポトーシス剤；造影剤またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
前記薬剤がＤ−アミノ酸から構成される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記暴露が：対象を前記タンパク質組成物に暴露して脂肪症関連障害を治療することを含み、前記障害が肥満；線維症；ガンまたはそれらの組み合わせを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
細胞集団がヒト対象中にある、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
細胞集団が組織の薄片である、請求項２１記載の方法。
【請求項３０】
前記脂肪組織に対するタンパク質組成物の前記選択的結合に基づいて、前記集団中の脂肪間質細胞を検出することを更に含む、請求項２１記載の方法。
【請求項３１】
前記脂肪症関連障害が、身体組成障害；体重障害；肥満；脂肪異栄養症；糖尿病；メタボリックシンドローム、線維症；ガンまたはそれらの組み合わせである、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１７〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドであって、肺組織と結合する、ペプチド。
【請求項３３】
請求項３２記載のペプチドを含む、タンパク質組成物。
【請求項３４】
前記タンパク質組成物がＤ−アミノ酸から構成される、請求項３２記載のタンパク質組成物。
【請求項３５】
前記ペプチドが造影剤；細胞毒性剤；プロアポトーシス剤またはそれらの組み合わせとカップリングする、請求項３２記載のタンパク質組成物。
【請求項３６】
ターゲティングペプチドおよびエフェクター剤を含むタンパク質組成物であって、前記エフェクター剤が：グラミシジン；マゲイニン；メリチン；デフェンシン；セクロピン；（ＫＦＡＫＦＡＫ）２、（ＫＦＸＡＫＦＸＡＫ）２；（ＫＨｅｘＡＫＨｅｘＡＫ）２（ＫＬＡＫＬＡＫ）２；（ＫＬＡＫＫＬＡ）２；（ＫＡＡＫＫＡＡ）２；（ＫＬＧＫＫＬＧ）３；アンギオテンシン；ラミニンペプチド；フィブロネクチンペプチド；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；組織メタロプロテイナーゼ阻害剤；インターフェロン；インターロイキン１２；血小板第４因子；ＩＰ−１０；Ｇｒｏ−β；トロンボスポンジン；２−メトキシオエストラジオール；プロリフェリン関連タンパク質；カルボキシトリアミドトリアゾール；ＣＭ１０１；マリマスタット；ポリ硫酸ペントサン；アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；インターフェロン−アルファ；ハービマイシンＡ；ＰＮＵ１４５１５６Ｅ；１６Ｋプロラクチンフラグメント；リノミド；サリドマイド；ペントキシフィリン；ゲニステイン；ＴＮＰ４７０；エンドスタチン；パクリタキセル；アキュチン；アンギオスタチン；シドフォビル；ビンクリスチン；ブレオマイシン；ＡＧＭ−１４７０；血小板第４因子またはミノサイクリン；５−フルオロウラシル；ブレオマイシン；ブスルファン；カンプトテシン；カルボプラチン；クロラムブシル；シスプラチン（ＣＤＤＰ）；シクロホスファミド；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エストロゲン受容体結合剤；エトポシド（ＶＰ１６）；ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ゲムシタビン；イホスファミド；メクロレタミン；メルファラン；マイトマイシン；ナベルビン；ニトロソウレア；プリコマイシン；プロカルバジン；ラロキシフェン；タモキシフェン；タキソール；テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）；トランスプラチナ；ビンブラスチンおよびメトトレキサート；ビンクリスチン；アルキル化剤；代謝拮抗物質；抗腫瘍抗生物質；コルチコステロイドホルモン；分裂抑制剤；ニトロソウレア；ホルモン剤；分裂抑制剤；抗腫瘍抗生物質；酵素；生体応答修飾物質；植物アルカロイド；ドセタキセル；エトポシド（ＶＰ１６）；テニポシド；パクリタキセル；タキソール；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ＰＰＡＲ−ガンマアゴニストチアゾリジンジオン；ロシグリタゾン；フルオロフォア；金属キレート錯体；放射性同位体；蛍光マーカー；ウレアーゼ；アルカリホスファターゼ；リポソーム；マイクロカプセル；微小粒子；ナノ粒子；磁性ビーズ；微小デバイス；ブレオマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドキソルビシン（アドリアマイシン）；プリカマイシン（ミトラマイシン）およびイダルビシン；白金配位錯体；アントラセンジオン；置換尿素；メチルヒドラジン誘導体；アムサクリン；Ｌ−アスパラギナーゼ；およびトレチノイン．カルボプラチン；シスプラチン（シス−ＤＤＰ）；ミトキサントロン；ヒドロキシウレア；プロカルバジン；ＩｇＦｃ融合タンパク質；酵素融合タンパク質；蛍光タンパク質；発光タンパク質またはそれらの組み合わせおよびアナログを含む、タンパク質組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的に関してその全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる、２０１１年３月３０日付で出願された米国特許仮出願番号第６１／４６９，３４５号の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、治療薬の送達を標的とするために使用することができる方法および組成物に関する。さらに詳細には、本開示は、ほ乳類においてインビトロおよびインビボの両方で脂肪組織を選択的に標的とするペプチドの同定および使用のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
幹細胞の移植は、前臨床試験で組織再生を促進する方法と認められ、この方策は臨床に変換される（Ｋｏｌｏｎｉｎ  ａｎｄ  Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２７，  ２５２―２５３，  ２００９）。幹細胞治療は、画像化または治療への応用のために特定の臓器における間葉性間質細胞（ＭＳＣ）を標的とする能力から大きな恩恵を受ける。ＭＳＣは、多能性成人前駆細胞を含む混合細胞集団である（Ｂｉａｎｃｏ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２，  ３１３―３１９，  ２００８）。これらの細胞は、骨芽細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞などの間葉系統に分化するそれらの能力のために、通常、間葉性幹細胞と呼ばれる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４，  １４３―１４７，  １９９９；  Ｐｒｏｃｋｏｐ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６，  ７１―７４，  １９９７）。最近の研究で、ＭＳＣは血管の完全性を保ちつつ血管周囲細胞（周皮細胞）として機能することが明らかになっている（Ｃｒｉｓａｎ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ３，  ３０１―３１３，  ２００８；  Ｔａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２２，  ５８３―５８６，  ２００８；  Ｔｒａｋｔｕｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  １０２，  ７７―８５，  ２００８）。
【０００４】
移植されたＭＳＣを用いた前臨床試験および臨床試験は、これらの細胞の治療可能性を裏付け、これらの細胞がさらに疾患の経過中に活性化されて組織修復および再生に関与することを示唆する。しかしながら、細胞療法のためのＭＳＣの臨床応用は、ガンを促進するそれらの可能性に関連する安全上の懸念のために、この創造的細胞集団を追跡し、制御できることが要求される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９，  ５２５９―５２６６，  ２００９）。
【０００５】
ＭＳＣは、最初は骨髄基質から単離され、それらの線維芽細胞様形態に基づいて線維芽細胞コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｆ）と呼ばれた（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｈａｅｍａｔｏｌ．  Ｂｌｏｏｄ．  Ｔｒａｎｓｆｕｓ．  ２５，  １９―２９，  １９８０）。それ以来、ＭＳＣは成人の臓器の大半で同定され、白色脂肪組織（ＷＡＴ）がＭＳＣの最大の貯蔵所であり、これらの細胞は、脂肪間質細胞（ＡＳＣ：Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  １００，  １２４９―１２６０，  ２００７；  Ｄａｑｕｉｎａｇ  ｅｔ  ａｌ,  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．  ２２，  １―８，  ２０１１）と称する。ＷＡＴは主に脂肪細胞から構成され、一方、ＡＳＣは、間質／血管部分（ＳＦＶ）中の大半の細胞を構成し、これは内皮細胞（ＥＣ）および浸潤性造血細胞も含む（Ｈａｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｖ．  ２，  ２３９―２５４，  ２００１）。ＡＳＣは、骨髄ＭＳＣに匹敵する多分化能および増殖能を示す多能性前駆細胞の豊富な供給源であり、その一方で、明かな独特の特徴を有することが明らかにされた（Ｒｏｄｅｈｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｅｌｌ  １３５，  ２４０―２４９，  ２００８；  Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ；  Ｚｕｋ  ｅｔ  ａｌ，  ２００１，  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．  ７，  ２１  １―２２８）。
【０００６】
ＭＳＣと他の組織成分との細胞間相互作用が組織改造を仲介するメカニズムの現時点での理解は、特異的ＭＳＣマーカーが無いことによって制限される。血小板由来の成長因子受容体−β（ＰＤＧＦＲβ）、ＣＤ１４６、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ２９、およびＳｔｒｏ−１を含む多数の細胞表面分子がＭＳＣの正の選択のために使用されるが、それら１つずつは、他の細胞型上でも発現される（Ｂｉａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ；  Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７，  ｉｂｉｄ；  Ｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６，  ２７３５―２７４５，  ２００８）。ＭＳＣ（ＷＡＴ由来のものを含む）は、汎白血球（ｐａｎ−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）マーカーＣＤ４５がないことに基づいて造血細胞から区別することができ、そして汎内皮（ｐａｎ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）マーカーＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１がないことに基づいて内皮細胞（ＥＣ）から区別することができる（Ｂｉａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  ｉｂｉｄ；  Ｒｏｄｅｈｅｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ）。ＣＤ３４はインビボでいくつかの臓器の血管周囲のＭＳＣ上で発現されるので、ＭＳＣを他の細胞から分離するためにＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ３１−免疫表現型が使用されてきた（Ｇｉｍｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７  ｉｂｉｄ；  Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  ｉｂｉｄ；  Ｔｒａｋｔｕｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  ｉｂｉｄ；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  ｉｂｉｄ）。しかしながら、このシグネチャーはＭＳＣを異なる組織に分化させないので、他の組織におけるＡＳＣおよびＭＳＣの有望な単離および追跡のための新規マーカーが至急必要とされ、幹細胞移植の分野を全体として限定している。
【０００７】
さらに、脂肪に関連する障害としては、限定されないが、肥満、体重および身体組成障害、例えば体脂肪および体重の調節をもたらす摂食および他の障害が挙げられ、全ての先進工業国で大きな健康問題となる。先進国での肥満の有病率は高い。例えば、２００２年までに、アメリカ人の約３０％は肥満であった（国民健康栄養調査）。肥満は、除脂肪体重と比較して過剰の体脂肪がある状態であり、３０ｋｇ／ｍ２より高い肥満指数（体重／身長２）として定義される（Ｋｏｐｅｌｍａｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：６３５―６４３，  ２０００）。肥満は、限定されないが、他の合併症のなかでも、２型糖尿病、脳卒中、高血圧、冠状動脈疾患、あるガン、ある組織での慢性線維症、脂肪肝疾患、慢性静脈不全、深在静脈血栓症、関節炎、呼吸障害、例えば閉塞性睡眠時無呼吸、および胆嚢疾患、例えば胆石症をはじめとする多くの重病を発症する危険性の増大と関連する（Ｗｉｌｌｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１  ：４２７―４３４，  １９９９）。
【０００８】
さらに注目すべきことに、間質細胞は、臓器の実質細胞の機能を支援する結合組織細胞である。線維症は、組織瘢痕化および細胞外マトリックスの過剰産生を含む、結合組織により組織損傷に対する反応として起こる病的過程である。融合性線維症（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は、原因となる臓器または組織の正常な構造および機能を除去する可能性がある。線維性障害としては、皮膚における病的瘢痕、例えば、コロイドおよび肥厚性瘢痕；肝臓および胆嚢の硬変、心臓、眼および腎臓、肺および骨髄における線維症、ガンと関連する胃腸管における線維症、例えば肉腫および血管周囲細胞腫ならびに強皮症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらなる線維性障害としては、なかでも、壊血病および自己免疫障害、例えば関節リウマチおよび全身性紅斑性狼瘡ならびに遺伝障害が挙げられ、その例としては、マルファン症候群、エーラー・ダンロス症候群、ロイス・ディーツ症候群、弾性線維性仮性黄色腫、骨形成不全症、進行性骨化性線維異形成症および自然気胸が挙げられる。
【０００９】
上述の疾病関連性は、なぜ肥満の経済的コストが１０００億ドルを超えると推定されるかを明らかにし（Ｄａｎｉｅｌｓ，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｎｕｒｓ．  １０６：４０―４９，  ２００６）、これは全医療費の７％にもなると推定される（Ｓｅｉｄｅｌｌ，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｍｅｔａｂ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  １９(Ｓｕｐｐｌ  ６)：Ｓ１３―Ｓ１６，  １９９５）。
【００１０】
ほ乳類における身体組成の調節は、食欲およびエネルギー消費の両方の調節を含む複雑なプロセスである。ヒト身体組成および体重恒常性は十分に理解されていない。肥満の疫学は、この障害が遺伝形質を提示することを強く示し、ヒト双胎児研究は身体組成および体重の制御における実質的な遺伝的基盤を強く示唆し、遺伝率の推定値は約８０〜９０パーセントである。ヒト肥満の遺伝学および動物モデルの研究は、肥満が、食物摂取の異常な調節、食物で誘発されるエネルギー消費、および脂質と除脂肪同化作用との間のバランスの複雑な相互作用から起こることを示す。したがって、肥満は、単に消極的な行為の結果、すなわち故意の過食の結果であるだけでなく、摂食パターン、代謝、および神経学的／代謝相互作用の差から起こる。これらの差は、多少、遺伝子産物のレベルまたは活性のいずれかにおける、遺伝子発現の差に起因するようである（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍａｍｍ．  Ｇｅｎｏｍｅ  １  ：  １３０―１４４，  １９９１）。
【００１１】
体重の制御のための現行手法には、食事療法および外科手術が含まれる。しかしながら、ダイエットは失敗に終わることが多く、フェンテルメン（Ｐｈｅｎｔｅｒｍｅｎ）、フェンフルラミン、メリディア、ゼルニカル（Ｘｅｒｎｉｃａｌ）、オルリスタット、アジペックス−Ｐ、ボントリルおよびイオノミン（Ｉｏｎｏｍｉｎ）などの米国食品医薬品局によって認可された少数の肥満治療薬は、許容できないかまたは危険な副作用を有し、これらの認可された少数のものは市場から排除された。減量のための外科手技、例えば脂肪吸引術、胃バイパスまたは緊縛手術は多くのリスクがある。体重管理のために現在利用可能な方法はいずれも満足できるものではなく、体重減少および管理の改善された方法が必要とされる。
【００１２】
ヒト集団における肥満の問題に加えて、イヌやネコなどのペットの肥満の問題もますます大きくなってきている（Ｇｅｒｍａｎ，  Ｊ．  Ｎｕｔｒ．  １３６：  １９４０Ｓ―１９４６Ｓ，  ２００６）。米国では、全てのイヌおよびネコの２５〜４０％が太りすぎまたは肥満と推定されている。ヒトと同様に、肥満はペットの健康や寿命に有害な影響を及ぼす可能性がある。さらに、市販の家畜飼料における身体組成および体重マニピュレーターの使用を減少または排除できることは、飼育者にとって節約になるだけでなく、消費者や社会全体にとっても節約になるという重大な有用性がる。したがって、身体組成や体重を操作することができ、ヒトやペットにおいて、限定されないが肥満をはじめとする身体組成障害を治療することができること、および家畜のサイズを増加させることができることは、幅広い有用性を有し、重大な機会を意味する。
【００１３】
糖尿病は、身体組成障害、特に肥満およびメタボリックシンドロームに関連する、長期にわたる現在治療不能の障害であり、不十分な血糖管理から生じる、さらなる病態を発症するリスクの大幅な増加と関連する。慢性の短期リスクには、限定されないが、低血糖、感染症、および高血糖に関連する障害、例えばケトアシドーシスが含まれる。糖尿病に起因する長期合併症としては、心臓疾患、脳卒中、高血圧、血管疾患、視覚障害、腎症、および神経障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。国立糖尿病・消化器・腎疾病研究所による２００５年の調査によると、米国で２０００万人を超える人が糖尿病であり、糖尿病にかかっている集団のパーセンテージは急速に増加している。米国では２００５年に、１５０万人が糖尿病と診断された。いくつかの研究は、２０２０年までに世界中で約２億５０００万人が糖尿病に苦しむであろうと見積もっている（Ｏ’Ｒａｈｉｌｌｙ，  ＢＭＪ，  ３１４：  ９５５―９５９，  １９９７）。この障害の最も一般的な形態は、インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭもしくはＩ型）およびインスリン非依存型糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩＩ型）である。糖尿病の高い発生率、および関連する合併症の多くを伴って生じる不可逆的損傷のために、治療コストは米国におけるその他のどの単一の疾患も上回る。２００２年では、１３２０億ドル以上が治療のための直接的または間接的費用に費やされ、そのうちの約９２０億ドルが直接医療費に回された（Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２６：９１７―９３２，  ２００３）。
【００１４】
近年では、肥満は、進行ガンの進行の結果としてガン患者が死亡する可能性を増す因子の１つであることが明らかになった（例えば、Ｄａｑｕｉｎａｇ  ｅｔ  ａｌ，  Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ａｓ  ａｎ  ａｎｔｉ―ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．  ２２，  １―８，  ２０１１；  Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ  Ａｄｉｐｏｓｅ―ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ，  Ｗｏｒｌｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  (Ｔｏｐｉｃ  Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ)，  ２  （５）：  １０３―１１３，  ２０１０；  Ｂｅｌｌｏｗｓ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＢＭＩ  ｏｎ  Ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｏｂｅｓｉｔｙ，  ｏｎｌｉｎｅ；  Ｆｌｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ  Ｃａｕｓｅ―ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ  ｄｅａｔｈｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｕｎｄｅｒｗｅｉｇｈｔ，  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ，  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ．  ＪＡＭＡ．  ２９８，  ２０２８―２０３７，  ２００７；  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ：  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．  ６１：３０１―３１６，  ２０１０を参照のこと）。前立腺および乳ガン（ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓｉｓ）の患者の生存率は、他のガンについてよりも肥満によって減少した。ＷＡＴは、炎症やメタボリックシンドロームに関与する多くの可溶性アジポカインを分泌する強力な内分泌器官として（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｅｎｅｒｇｙ  ｂａｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ．  Ｎａｔｕｒｅ；  ＡＡＡ：  ８４７―８５３，  ２００６）、ガンの進行に対して直接影響を及ぼす（Ｖｏｎａ―Ｄａｖｉｓ，  ｅｔ  ａｌ，  Ａｄｉｐｏｓｉｔｙ，  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｖ；  ８：  ３９５―４０８，  ２００７）。インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、腫瘍細胞増殖を直接刺激することができるものの１つである。レプチン、インターロイキン−６、ならびに様々な他のホルモンおよび炎症性サイトカインも関与する可能性がある（Ｂａｉｌｌａｒｇｅｏｎ．  Ｏｂｅｓｔｉｔｙ  ａｄｉｐｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  （ｒｅｖｉｅｗ）．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ；  ２８：７３７―７４５  ２００６）。しかしながら、これらの因子のガンにおける役割を対象とする臨床および実験データは、まだ議論の余地がある。例えば、循環ＩＧＦ−１除去の動物モデルは、前立腺腫瘍成長に対して影響を及ぼさないことが示された（Ａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  Ｉｇｆｌ  ｉｎ  ＴＲＡＭＰ  ｍｉｃｅ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｄｒａｍａｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａ���ｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ―ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｘｉｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｒｅｄｕｃｅ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；  ６８(９)：３３４２―９,  ２００８）。したがって、代替機構を検討しなければならない。
【００１５】
その生理学的機能が余剰のエネルギーを貯蔵することであるＷＡＴとは対照的に、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）は、熱の形態でのエネルギー散逸の原因となる。ＷＡＴとＢＡＴとの間の微妙なバランスは、ターゲティング療法の設計で考慮する重要な問題である。齧歯類モデルからの多数の結果は、ＢＡＴが肥満の病理学的帰結に対して防護効果があることを示す。成人でＢＡＴを発見する重要性は、肥満および関連する障害の治療に対する有力な新規アプローチにある。ＡＳＣはＢＡＴを生じる前駆細胞の１つである（Ｅｌａｂｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｉｐｏｓｅ―ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７,  ２７５３―２７６０，  ２００９）。さらに重要なことには、白色脂肪細胞は培養およびインビボの両方でＢＡＴ様表現型に直接変わる可能性がある（Ｃｉｎｔｉ．  Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｏｒｇａｎ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ２９７，  ９７７―９８６，  ２００９）。マウスでは、ＷＡＴ内の残存するＢＡＴ「パッチ」の拡大は実質的に全ての脂肪蓄積に至る可能性があり、ＷＡＴを犠牲にしてＢＡＴ様になる。脂肪細胞生理学が血管系の状態に明かに依存することは、より生理的で安全な抗肥満治療として、組織を完全に破壊するよりはむしろ、ＷＡＴをＢＡＴに変えるために血管ターゲティング剤を設計することができることを示唆する。存在する残存ＢＡＴの増殖、血管新生および／または代謝を活性化するための薬理学的アプローチの開発は、理論的には、ＷＡＴ／ＢＡＴバランスを崩すことができ、肥満を治療するために使用することができる。
【００１６】
要約すれば、肥満および糖尿病などの脂肪関連身体組成および体重障害は深刻な健康問題である。脂肪関連体重障害の重篤度、有病率、および複雑さを考えると、身体組成および体重管理に関与する遺伝子およびタンパク質を特定すること、そして脂肪関連身体組成障害、肥満、メタボリックシンドローム、および糖尿病を治療するための新規薬物および療法を開発することが非常に必要とされている。脂肪組織（ＷＡＴおよびＢＡＴ）中の異なる種類の細胞、例えばＡＳＣに対するターゲティング治療および画像診断法は、肥満、ガンおよび線維症における生物医学的応用に有用である可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
ここで開示される方法および組成物は、一つには、ほ乳類において、限定されないが、身体組成障害、体重障害、糖尿病、肥満、またはメタボリックシンドロームなどの脂肪に関連する障害、ならびにガンおよび線維症の診断、予防、および／または治療を支援するために用いられるペプチドの発見および同定に基づく。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ここで、前記ペプチドは間質細胞と結合する。本発明の別の実施形態において、ターゲティングペプチドは配列番号１３および配列番号１４のＷＡＴ７アミノ酸配列ＳＷＫＹＷＦＧＥを含む。本明細書中に記載される他の実施形態において、タンパク質組成物はターゲティングペプチドを含み、さらなる実施形態において、タンパク質組成物はＷＡＴ７アミノ酸配列を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ターゲティングペプチドはＤ−アミノ酸のみから構成され、他の実施形態では、ターゲティングペプチドはＬ−アミノ酸のみから構成され、そしてさらなる実施形態では、ターゲティングペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸またはそれらの組み合わせを含んでもよい。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態において、タンパク質組成物はＷＡＴ７を含み、ここで、ＷＡＴ７はＤ−アミノ酸から構成され、前記組成物は、脂肪組織、線維性組織または腫瘍組織における間質細胞と結合する。タンパク質組成物のいくつかのさらなる実施形態において、ＷＡＴ７はＡＳＣ細胞の表面上のΔＤＣＮと選択的に結合する。
【００２１】
本発明のタンパク質組成物のいくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは：造影剤；細胞毒性剤；プロアポトーシス剤；融合タンパク質；細胞増殖抑制剤；細胞破壊剤（ｃｙｔｏｃｉｄａｌ  ａｇｅｎｔ）；放射性同位体；ＡＣＳ細胞分化誘導剤（ＡＣＳ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）；分裂抑制剤、抗腫瘍剤；抗生物質製剤、酵素；化学療法剤；血管新生阻害剤またはそれらの組み合わせを含む群から選択されるエフェクター剤とカップリングされる。タンパク質組成物のいくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドおよびエフェクター剤はＤ−アミノ酸から構成され；タンパク質組成物の他の実施形態において、ターゲティングペプチドはＬ−アミノ酸から構成され、そしてエフェクターはＤ−アミノ酸を含み；タンパク質組成物のさらなる実施形態において、ターゲティングペプチドはＬ−アミノ酸から構成され、エフェクターはＬ−アミノ酸を含む。
【００２２】
本明細書中で開示されるタンパク質組成物のいくつかの実施形態において、標的ペプチドはエフェクター剤とカップリングされ、白色脂肪組織を褐色脂肪組織に変化させる。さらなる実施形態では、エフェクター剤は白色脂肪組織においてｂ３−アドレナリン受容体を活性化させる。タンパク質組成物のいくつかの実施形態において、エフェクター剤はＤ−アミノ酸から構成されるペプチドである。
【００２３】
１つの実施形態において、脂肪組織を標的とするタンパク質組成物を作製する方法は：エフェクター剤をターゲティングペプチドとカップリングさせることを含み、ここで、ターゲティングペプチドは、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列から構成され；ここで前記ターゲティングペプチドは細胞脂肪組織を選択的に標的とする。さらなる実施形態では、エフェクター剤およびターゲティングペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。他の実施形態において、エフェクターはＬ−アミノ酸から構成され；そしてターゲティングペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。
【００２４】
本明細書中で開示されるタンパク質組成物を作製する方法のいくつかの実施形態において、カップリングは、前記エフェクター剤を、連結部分を有するターゲティングペプチドと連結することを含み；さらなる実施形態では、連結部分は、アミノヘキサン酸；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；（ＣＨ２）７；（ＣＨ２）８またはそれらの組み合わせを含む。本明細書中で開示されるタンパク質組成物を作製する方法のいくつかの実施形態において、エフェクター剤は、細胞毒性剤；プロアポトーシス剤；造影剤またはそれらの組み合わせを含む群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、エフェクター剤を脂肪組織に送達する方法は：ペプチドとカップリングしたエフェクター剤であって、ここでペプチドは長さが１００アミノ酸未満のアミノ酸から構成され、アミノ酸配列は配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する脂肪組織ターゲティングペプチド部分を含むエフェクター剤を；脂肪組織を含む細胞集団に暴露することを含む。さらなる実施形態では、タンパク質組成物はリンカーを含み、前記リンカーは、アミノヘキサン酸；（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；（ＣＨ２）７；（ＣＨ２）８またはそれらの組み合わせを含む可能性がある。いくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドモチーフはＤ−アミノ酸から構成される。他の実施形態では、エフェクター剤および前記ターゲティングペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。本明細書中で記載される、エフェクター剤を脂肪組織に送達する方法のいくつかの実施形態において、薬剤は：細胞毒性剤；プロアポトーシス剤；造影剤またはそれらの組み合わせを含み、さらなる実施形態では、薬剤はＤ−アミノ酸から構成される。
【００２６】
エフェクター剤を脂肪組織に送達する方法のいくつかの実施形態において、前記暴露は：対象を前記タンパク質組成物に暴露して脂肪症関連障害を治療することを含み、ここで、前記障害は、肥満；線維症；ガンまたはそれらの組み合わせを含み；さらなる実施形態では、前記細胞集団はほ乳類対象中にあり；さらなる実施形態において、細胞集団はヒト対象中にあり；いくつかの他の実施形態において、細胞集団は組織の薄片である。
【００２７】
エフェクター剤を脂肪組織に送達する方法のいくつかの実施形態は、タンパク質組成物の前記脂肪組織との前記選択的結合に基づいて前記集団で脂肪間質細胞を検出することを更に含む。エフェクター剤を脂肪組織に送達する方法の他の実施形態において、脂肪症関連障害は、身体組成障害；体重障害；肥満；脂肪異栄養症（ｌｙｐｏｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）；糖尿病；メタボリックシンドローム、線維症；ガンまたはそれらの組み合わせである。
【００２８】
１つの実施形態において、配列番号１７〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドが開示され、ここで、前記ペプチドは肺組織と結合する。さらなる実施形態では、配列番号１７〜２４から選択される配列またはそれらの組み合わせを含むペプチドを含むタンパク質組成物が開示される。さらなる実施形態では、タンパク質組成物はＤ−アミノ酸から構成される。タンパク質組成物のいくつかの実施形態において、ペプチドを、造影剤；細胞毒性剤；プロアポトーシス剤またはそれらの組み合わせとカップリングさせる。
【００２９】
本明細書中で開示されるタンパク質組成物のいくつかの実施形態において、組成物はターゲティングペプチドおよびエフェクター剤を含み、ここで、前記エフェクター剤は：グラミシジン；マゲイニン；メリチン；デフェンシン（ｄｅｆｅｉｎｓｉｎｇ）；セクロピン；（ＫＦＡＫＦＡＫ）２、（ＫＦＸＡＫＦＸＡＫ）２；（ＫＨｅｘＡＫＨｅｘＡＫ）２（ＫＬＡＫＬＡＫ）２；（ＫＬＡＫＫＬＡ）２；（ＫＡＡＫＫＡＡ）２；（ＫＬＧＫＫＬＧ）３；アンギオテンシン；ラミニンペプチド；フィブロネクチンペプチド；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；組織メタロプロテイナーゼ阻害剤；インターフェロン；インターロイキン１２；血小板第４因子；ＩＰ−１０；Ｇｒｏ−β；トロンボスポンジン；２−メトキシオエストラジオール（２−ｍｅｔｈｏｘｙｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ）；プロリフェリン関連タンパク質；カルボキシアミドトリアゾール（ｃａｒｂｏｘｉａｍｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅ）；ＣＭ１０１；マリマスタット；ポリ硫酸ペントサン；アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；インターフェロン−アルファ；ハービマイシンＡ；ＰＮＵ１４５１５６Ｅ；１６Ｋプロラクチンフラグメント；リノミド；サリドマイド；ペントキシフィリン；ゲニステイン；ＴＮＰ４７０；エンドスタチン；パクリタキセル；アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）；アンギオスタチン；シドフォビル；ビンクリスチン；ブレオマイシン；ＡＧＭ−１４７０；血小板第４因子またはミノサイクリン；５−フルオロウラシル；ブレオマイシン；ブスルファン；カンプトテシン；カルボプラチン；クロラムブシル；シスプラチン（ＣＤＤＰ）；シクロホスファミド；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドキソルビシン；エストロゲン受容体結合剤；エトポシド（ＶＰ１６）；ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ゲムシタビン；イホスファミド；メクロレタミン；メルファラン；マイトマイシン；ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）；ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）；プリコマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）；プロカルバジン；ラロキシフェン；タモキシフェン；タキソール；テマゾロミド（ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）（ＤＴＩＣの水性形態）；トランスプラチナ（ｔｒａｎｓｐｌａｔｉｎｕｍ）；ビンブラスチンおよびメトトレキサート；ビンクリスチン；アルキル化剤；代謝拮抗物質；抗腫瘍抗生物質；コルチコステロイドホルモン；分裂抑制剤；ニトロソウレア；ホルモン剤；分裂抑制剤；抗腫瘍抗生物質；酵素；生体応答修飾物質；植物アルカロイド；ドセタキセル；エトポシド（ＶＰ１６）；テニポシド；パクリタキセル；タキソール；ビンブラスチン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ＰＰＡＲ−ガンマアゴニストチアゾリジンジオン；ロシグリタゾン；フルオロフォア；金属キレート錯体；放射性同位体；蛍光マーカー；ウレアーゼ；アルカリホスファターゼ；リポソーム；マイクロカプセル；微小粒子；ナノ粒子；磁性ビーズ；微小デバイス；ブレオマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；ドキソルビシン（アドリアマイシン）；プリカマイシン（ミトラマイシン）およびイダルビシン；白金配位錯体；アントラセンジオン；置換尿素；メチルヒドラジン誘導体；アムサクリン；Ｌ���アスパラギナーゼ；およびトレチノイン、カルボプラチン；シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）；ミトキサントロン；ヒドロキシウレア；プロカルバジン；ＩｇＦｃ融合タンパク質；酵素融合タンパク質；蛍光タンパク質；発光タンパク質またはそれらの組み合わせおよびアナログを含む。
【００３０】
したがって、本明細書中に記載される実施形態は、脂肪に関連する障害の診断、予防、および／または治療の先行技術の方法に関連する様々な欠点に取り組むことを意図する特徴および利点の組み合わせを含む。上述の様々な特性、ならびに他の特徴は、以下の詳細な説明を読むと、また添付の図面を参照することによって、当業者には容易に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、ＭＳＣホーミングペプチドについてのスクリーンを表す。（Ａ）は、臓器特異的ＭＳＣ集団へホーミングするペプチドについてのスクリーンの概略図である。３つのファージ提示環状ペプチドライブラリの混合物を４ラウンドの同期多臓器バイオパニングに使用した。すべての選択ラウンドで、赤血球（ＴＥＲ１１９＋）、内皮（ＣＤ３１＋）および造血（ＣＤ４５＋）細胞を免疫枯渇させ、次いでＦＡＣＳを使用して、ＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞（ＭＳＣ）をＷＡＴ、肺、骨髄、および骨格筋から集めた。（Ｂ）ＷＡＴ  ＭＳＣ（ＡＳＣ）に結合したファージ−ペプチドを対照臓器のＭＳＣと結合したファージ−ペプチドと平行して定量化し、増幅し、プールし、そして次のラウンドのバイオパニングのために使用した。１連のラウンドでのファージ変換単位（ＴＵ）の回収の増加は、個々の標的臓器のＭＳＣへホーミングするファージ−ペプチドの濃縮を反映する。（Ｃ）ＷＡＴＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−上で回収されたＴＵ対肺ＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞上で回収されたＴＵの比としてマウスに別に注射された個々のファージペプチドクローンについて評価したＡＳＣホーミングの相対的特異性。Ｆｄ−Ｔｅｔ：対照の挿入のないファージ。示した値は３連の測定についての平均±ＳＤである。
【図２】図２は、ＡＳＣにホーミングする環状ＷＡＴ７ペプチド（配列番号１３）の検証を示す。パネルＡ〜Ｄは、ファージ提示ＷＡＴホーミングペプチドＷＡＴ７（配列番号１３および１４）または肺ホーミングペプチドＬＵ２（配列番号１９）を静脈内注射したマウス由来のホルマリン固定ＷＡＴおよび肺のパラフィン切片における共焦点抗ファージ（赤色）および抗ＣＤ３１（明緑色）免疫蛍光である。デジタルチャンネル融合に際しての赤色シグナルは、ＷＡＴ７（配列番号１３）についてはＷＡＴ（Ａ）で観察されるが、肺（Ｂ）では観察されず、そしてＬＵ２（配列番号１９）については肺（Ｄ）で観察されるが、ＷＡＴ（Ｃ）で観察されない非内皮血管周囲細胞上のファージの局在化（矢印）を意味する。パネルＥ〜Ｊは、ストレプトアビジン−Ｃｙ３（赤）を検出する共焦点顕微鏡法によって明らかにされ、免疫蛍光によって検出されたＰＤＧＦＲβ（赤）、ＣＤ３１（明緑色）またはＣＤ４５（緑）の組織発現と対比された、静脈内注射１時間後のビオチニル化ペプチドＷＡＴ７の生体内分布を示す。ＡＳＣ（Ｆ〜Ｇ）上で発現されたＰＤＧＦＲβとオーバーラップするパターンで血管周囲のＷＡＴ細胞（Ｅ）と特異的な環状ＷＡＴ７（配列番号１３）の結合（矢印）に注意。ＰＤＧＦＲβと同様に、ＷＡＴ７は、ＣＤ３１＋内皮細胞（Ｅ）またはＣＤ４５＋造血細胞（Ｈ）と結合しない。ＷＡＴ７は、豊富なＰＤＧＦＲβ＋ＬＳＣ（Ｊ）にもかかわらず、肺（Ｉ）では検出されなかった。核ＴＯＰＲＯ３染色は青色である。スケールバー：１００μΜ。
【図３】図３はＷＡＴ７結合タンパク質としてのデコリンの精製を表す。（Ａ）ＥＤＣセファロースと共有結合したシステイン−環化合成ペプチドＷＡＴ７（配列番号１３）およびＷＡＴ２（配列番号３：対照）を、マウスＡＳＣからの膜タンパク質抽出物とともにインキュベートした。洗浄後、ＷＡＴ７アフィニティカラムと結合したタンパク質は、ＷＡＴ２（フラクション１〜４）、ＷＡＴ７（フラクション５〜８）０．１ＭのグリシンｐＨ２．５（フラクション９〜１２）で連続して溶出された；ＷＡＴ２アフィニティカラムについては、ペプチド溶出の順序は逆転した。各フラクション中のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって測定し、ＯＤ５９５吸光度としてプロットした。（Ｂ）各フラクションからの脱塩タンパク質をプラスチック上にコーティングし、そしてファージ提示ＷＡＴ７またはＷＡＴ２．７／７：ＷＡＴ７親和性／ＷＡＴ７−ファージ；２／７：ＷＡＴ２親和性／ＷＡＴ７−ファージ；７／２：ＷＡＴ７親和性／ＷＡＴ２−ファージ；２／２：ＷＡＴ２親和性／ＷＡＴ２−ファージに暴露した。ファージ結合を宿主細菌感染症によるＴＵ回収に基づいて定量化した：ＷＡＴ７親和性フラクション５に対する増大したＷＡＴ７−ファージ結合は、ＷＡＴ７結合タンパク質の溶出を意味する。（Ｃ）ＷＡＴ７親和性フラクション１（対照）および５からのタンパク質を勾配４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分割した。ゲルのクーマシー染色は、４０ｋＤａバンド（矢印）がＷＡＴ７で特異的に溶出されることを示す。質量分析法は対応するタンパク質をＤＣＮとして同定した。
【図４】図４はＷＡＴにおけるデコリン過剰発現を表す。ＤＣＮ（矢印）およびＰＤＧＦＲβ（鏃型）の両方がＷＡＴにおいて血管周囲細胞（ＡＳＣ）上で発現される（Ａ、Ｄ）ことを示す、抗マウスＤＣＮまたは抗マウスＰＤＧＦＲβ抗体（赤）が内皮特異的抗ＣＤ３１抗体（明緑色）で対比染色された、ホルマリン固定パラフィン包埋マウス組織の共焦点免疫蛍光。ＤＣＮ発現は、ごく稀に肺（Ｂ）中の血管と関連して見出され、骨髄（Ｃ）では検出できないが、一方、ＰＤＧＦＲβは、肺間質（Ｅ）によって、そして骨髄（Ｆ）で偏在的に発現される。青色：核ＴＯＰＲＯ３染色。スケールバー：１００μΜ。
【図５】図５は、ＤＣＮ（ΔＤＣＮ）の切断フラグメントがＡＳＣ上のＷＡＴ７受容体であることを示す。（Ａ）ΔＤＣＮ（矢印）はＡＳＣによって特異的に発現されるが、脂肪細胞によっては特異的に発現されないことを示す、ＤＣＮ抗体でマウスＷＡＴの亜集団から抽出された膜結合および可溶性タンパク質のイムノブロッティング。アクチン抗体でのゲルの対照イムノブロッティングは、等しいタンパク質ローディングを示す。（Ｂ）マウス膜ＷＡＴ  ＳＶＦ抽出物からのΔＤＣＮのアフィニティ精製。ゲルのクーマシーブルー染色は、抗ＤＣＮＩｇＧの軽鎖および重鎖間の予想される４０ｋＤａバンド（矢印）を特定した。（Ｃ）完全長マウスおよびヒトＤＣＮと整列させた、（Ｂ）で単離されたΔＤＣＮのエドマン分解ミクロ配列。すでに報告されているプロテアーゼ切断部位であって、プロペプチドおよびコアＤＣＮのプロセッシングをもたらすものを表示する。ｍＤＣＮのアミノ酸５６〜２９５に対応する配列は図示されていない。（Ｄ）ＥＬＩＳＡによる、組換え細菌で精製された完全長コアマウスＤＣＮ（ｍＤＣＮ）、完全長グリコシル化マウスＤＣＮ（ｍＤＣＮ＊）、グリコシル化ウシＤＣＮ（ｂＤＣＮ＊）、およびＢＳＡと比較した、組換え細菌で精製されたマウスΔＤＣＮに対するＷＡＴ７結合の測定。ペプチド濃度の関数としてプロットされたＯＤ４５０吸光度は、用量に依存したΔＤＣＮ−ＷＡＴ７およびｍＤＣＮ−ＷＡＴ７結合を示す。３連のウェルについての平均±ＳＤを示す；＊Ｐ＜０．０５。（Ｅ）マウスＷＡＴ  ＳＶＦから抽出された全細胞および細胞膜結合タンパク質の抗ＤＣＮイムノブロッティングは、ΔＤＣＮ（矢印）が細胞膜と結合することを示す。（Ｆ）ビオチニル化試薬での細胞の処理によって評価されるマウスＡＳＣの表面上のΔＤＣＮの暴露。ビオチニル化されたタンパク質（ストレプトアビジンビーズで単離）を抗ＤＣＮイムノブロッティングに付し、ΔＤＣＮ（矢印）が新たに単離されたＡＳＣ上でビオチニル化されるが、培養されたＡＳＣ上ではビオチニル化されないことが明らかになった。（Ｇ）ＧＦＰを発現するレンチウイルス（ベクター）、完全長コアマウスＤＣＮ−ＧＦＰ融合物（ＤＣＮ）、またはマウスΔＤＣＮ−ＧＦＰ融合物（ΔＤＣＮ）を安定して形質導入された３Ｔ３−Ｌ１細胞。ＧＦＰ免疫蛍光はＧＦＰ−ΔＤＣＮ融合物の細胞表面局在化を示す。スケールバー：１０μΜ。
【図６】図６は、レジスチンを模倣することによるΔＤＣＮに対するＷＡＴ７結合を表す。（Ａ）上：ＧＳＴ（１）および組換えＧＳＴ融合ペプチドＷＡＴ１（２）、ＷＡＴ２（３）、ＷＡＴ７（４）、ＬＵ２（５）の精製を示すゲルのクーマシー染色であって、次の対照と平行して分析した：ＫＧＧＲＡＫＤペプチド（６）、プロヒビチンタンパク質（７）、およびＷＬＧＥＷＬＧペプチド。中：抗ＷＡＴ７抗体での同じゲルのイムノブロッティング。下：抗ＷＡＴ７抗体の生成のために使用したウサギ由来の免疫前血清での同じゲルのイムノブロッティング。（Ｂ）マウスの培養された３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞、培養されたＡＳＣ、培養されたＬＳＣから抽出された全タンパク質、ならびにＷＡＴ、骨髄、または肺から新たに単離された細胞の抗ＷＡＴ７抗体でのイムノブロッティングは特異的な１３ｋＤａタンパク質（鏃型）を検出する。（Ｃ）ＷＡＴ抽出物からの抗ＷＡＴ７抗体でのマウスタンパク質のアフィニティ精製。ゲルクーマシー染色によって、抗ＷＡＴ７ＩｇＧの軽（Ｌ）および重（Ｈ）鎖に対して、レジスチンとして同定される同じ１３ｋＤａタンパク質が明らかになった。（Ｄ）組換え細菌で精製された完全長コアマウスＤＣＮ（ｍＤＣＮ）、対照ｈｉｓ６標識されたタンパク質ＣＬＩＣ４（Ｃｔｒｌ−ｐｒｏｔ）、完全長グリコシル化マウスＤＣＮ（ｍＤＣＮ＊）、グリコシル化ウシＤＣＮ（ｂＤＣＮ＊）、およびＢＳＡと比較した、組換え細菌的に精製されたマウスΔＤＣＮに対するＦＬＡＧ標識されたレジスチンおよび対照タンパク質（ＢＡＰ）結合のＥＬＩＳＡによる測定。ＦＬＡＧ標識されたタンパク質濃度の関数としてプロットされたＯＤ４５０吸光度は、用量に依存したΔＤＣＮ／レジスチン結合を示す。
【図７】図７は、前脂肪細胞に対するΔＤＣＮ発現の影響を示す。機能アッセイを、ＧＦＰを発現するレンチウイルス（ベクター）、完全長コアマウスＤＣＮ−ＧＦＰ融合物（ＤＣＮ）、またはマウスΔＤＣＮ−ＧＦＰ融合物（ΔＤＣＮ）を安定に形質導入された３Ｔ３−Ｌ１細胞に関して実施した。（Ａ）表示された時点での５，０００個の接着細胞の増殖を、ＭＴＴアッセイによって測定した。３連のウェルの平均±ＳＤを示す；＊Ｐ＜０．０５。（Ｂ）トランスウェルアッセイによって測定された、５μΜの孔を通った１０％ＦＢＳへの２５，０００個の飢餓前細胞の移動。１２時間後、トランスウェルの底部の細胞を固定し、染色し、そして計数した。示した値は３連のウェルの平均±ＳＤである；＊Ｐ＜０．０５。（Ｃ）下：脂肪生成の誘発の１０日後に位相差顕微鏡法で検出された脂質滴蓄積によって測定される脂肪細胞分化。スケールバー：１０μΜ。
【図８Ａ】図８Ａは、同期インビボファージ提示スクリーニングの概略図説明である。すべての選択ラウンドで、ファージを静脈内投与し、同時に標的組織から回収し、増幅し、プールし、次の選択ラウンドのために使用した。後のラウンドでのファージ変換単位（ＴＵ）の回収の増加は、標的臓器へ優先的にホーミングするペプチドの選択を反映する。
【図８Ｂ】図８Ｂは、フローサイトメトリーによるＭＳＣの同定を表す。代表的な皮下ＷＡＴ分析を示す。ＣＤ３４＋を発現する生存細胞に関するゲーティング（左の散布図）を次いでＣＤ３１およびＣＤ４５発現に基づいてゲーティングし（右の散布図）、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ３１−ＡＳＣはＱ３で紫色の事象として特定された。Ｑ１中の紫色の事象は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ３１＋内皮細胞に対応する。Ｑ２およびＱ４における事象はＣＤ４５＋造血細胞に対応する。
【図９Ａ】図９Ａは、ファージ提示スクリーンで単離されたいくつかのペプチドの選択性を、ファージセル結合アッセイを用いて評価したことを示す。ペプチドＷＡＴ１（配列番号１および２）、ＷＡＴ２（配列番号３および４）、ＷＡＴ７（配列番号１３および１４）、ＬＵ２（配列番号１９および２０）、ｍＰｅｐ（配列番号３５および３６）または挿入物のないファージ（Ｆｄ−Ｔｅｔ）を発現するファージを：（１）４Ｔ１．２細胞、ヒト乳ガン由来の内皮細胞（２）マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（脂肪細胞様表現型に分化する可能性がある前脂肪細胞系）；（３）ＷＡＴ由来の一次マウスＳＶＦ細胞；（４）肺由来の一次マウスＳＶＦ細胞、および；（５）ＷＡＴ由来のヒトＡＳＣ細胞の継代４に関する結合について分析した（棒グラフの左から右へ）。表示されたペプチド−ファージを挿入物のないＦｄ−ｔｅｔ対照ファージとともに１時間３７℃で添加した（１０８ＴＵ）。ＲＰＭＩ／１％ＢＳＡで３回洗浄後、細胞をホモジナイザーでダウジングした。回収されたファージを使用して、Ｋ９１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を感染させ、テトラサイクリン選択により、コロニーを計数して、平均変換単位（ＴＵ）を定量化した。３回の個々のプレーティング＋ＳＥＭ（エラーバー）の平均値を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ファージ提示スクリーンで単離されるいくつかのペプチドの選択性を、ファージ細胞結合アッセイを用いて評価したことを示す。ペプチドＷＡＴ１（配列番号１）、ＷＡＴ２（配列番号３）、ＷＡＴ７（配列番号１３）、ＬＵ２（配列番号１９）、ｍＰｅｐ（配列番号３５）を発現するファージまたは挿入物のないファージ（Ｆｄ−Ｔｅｔ）を、継代されていないヒトＷＡＴ  ＳＶＦに関して結合について分析した。表示されたペプチド−ファージを挿入物のないＦｄ−ｔｅｔ対照ファージとともに１時間３７℃で添加した（１０８ＴＵ）。３回ＲＰＭＩ／１％ＢＳＡで洗浄した後、細胞をホモジナイザーでダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）した。回収されたファージを使用して、Ｋ９１大腸菌を感染させ、テトラサイクリン選択によって、コロニーを計数して、平均変換単位（ＴＵ）を定量化した。３つの個々のプレーティング＋ＳＥＭ（エラーバー）についての平均値を示す。
【図１０】図１０は、ホーミングまたはターゲティング環状ペプチドがリンカーによって細胞毒性／プロアポトーシスペプチドとカップリングする、キメラ標的化細胞毒性ペプチドの構造を示す。
【図１１】図１１は、トリパンブルー排除を用いて視覚化される、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）（全Ｄ−ペプチド（０．０１ｍＭ、０．０５ｍＭおよび０．１０ｍＭ）の用量に依存したインビトロ殺活性、したがってＷＡＴ７と称するＡＳＣホーミングペプチド（配列番号１３）の培養における初代マウスＡＳＣの標的の有効な死滅させる能力を示す。
【図１２】図１２は、アポトーシスがＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄ−ペプチドで処理された細胞における死の原因であったことの検証を示す。ＡＰＯ−ＴＲＡＣＥ試薬（Ｓｉｇｍａ）およびフローサイトメトリーを使用して、処理された細胞におけるアポトーシス誘導を検出して、細胞死のメカニズムとしてのアポトーシスを検証した。非標的アポトーシスペプチドで処理された細胞およびＷＡＴ７標的化アポトーシスペプチドで処理された細胞を示す。
【図１３】図１３は、２ｍｇの対照または標的化細胞毒性ペプチド、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄ−ペプチドでの治療の４８時間後の肥満マウスを示す。標的化細胞毒性ペプチド、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３から配列番号３１）全Ｄ−ペプチドで治療されたマウスは、脂肪組織の量が減少したことがわかる。
【図１４】図１４は、標的細胞毒性ペプチド、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄ−ペプチドでの処置が、皮下ＷＡＴ中に存在するＡＳＣを枯渇させた（パネルＦ対Ｅ）が、腹腔内ＷＡＴに対する効果は有意に大きく（パネルＨ対Ｇ）、また腫瘍壊死をもたらす（パネルＢ対ＡおよびパネルＤ対Ｃで示すとおり）ことを示す。
【図１５】図１５は、細胞毒性ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄ−ペプチドでの処置によって誘発されたアポトーシスが標的組織に限定されることを示す。ＡＰＯ−ＴＲＡＣＥ試薬（Ｓｉｇｍａ）およびフローサイトメトリーを用いて、皮下および腹腔内ＷＡＴ細胞の両方においてアポトーシス誘導を検出したが、腎臓または末梢血からの細胞においては検出しなかった。非標的アポトーシスがないことは、細胞毒性キメラペプチドがタンパク質分解に対して耐性であることを示す。
【図１６】図１６は、（Ａ）マウスＷＡＴ、肺および骨髄（Ｂ．Ｍ．）からマウスＤＣＮに対する抗体で抽出された膜結合および可溶性タンパク質のイムノブロッティングを示す。非グリコシル化コアＤＣＮ（鏃型）、およびＷＡＴ特異的イソ型（矢印）の移動が示される。ゲルのＡＮＸ２Ａ抗体での対照イムノブロッティングは等しい膜タンパク質ローディングを示す。（Ｂ）組換えコアマウスＤＣＮ（ｍＤＣＮ）、グリコシル化ウシＤＣＮ（ｂＤＣＮ＊）およびＢＳＡに対する  ＷＡＴ７（上）およびＷＡＴ２対照（下）ペプチド結合のＥＬＩＳＡによる測定。ペプチド濃度の関数としてプロットしたＯＤ４５０吸光度は用量に依存したｍＤＣＮ−ＷＡＴ７結合を示す。  配列表の簡単な説明
【００３２】
配列表は、ほ乳類脂肪組織および肺組織と結合するペプチドのアミノ酸配列を提供する。白色脂肪組織（ＷＡＴ１〜８）と結合するシステイン−環化ペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５で提示する。対応する非システイン−環化ペプチドを配列番号２、４、６、８、１０、１２および１４で提示する。
【００３３】
肺組織（ＬＵ１〜４）と結合するシステイン−環化ペプチドのアミノ酸配列を配列番号１７、１９、２１および２３で提示し、対応する非システイン−環化ペプチドを配列番号１８、２０、２２および２４で提示する。
【００３４】
以前に開示された脂肪結合ペプチド（システイン−環化）のアミノ酸配列を配列番号２５として提示し、対応する非システイン−環化ペプチド配列を配列番号２６として提示する。
【００３５】
様々な対照ペプチドのアミノ酸配列は配列番号２７および２９でシステイン−環化ペプチドとして表され、対応する非システイン−環化対照ペプチドは配列番号２８および３０で提示される。様々な公知細胞毒性および／またはプロアポトーシスペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３１および３３でシステイン−環化ペプチドとして表され、対応する非システイン−環化ペプチドは、配列番号３２、および３４で表される。
【００３６】
ｍＰｅｐとして知られるペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３５でシステイン−環化ペプチドとして提示され、対応する非システイン−環化ペプチドは配列番号３６で提示される。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
定義
本開示では、特に別段の定めのない限り、単数の使用は複数を含み、「ａ」または「ａｎ」という語は「少なくとも１つ」を意味し、そして「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形態、例えば「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」および「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」の使用は限定的でない。さらに、「要素」または「成分」などの用語は、特に別段の定めのない限り、１つの単位を含む要素および成分および１より多い単位を含む要素または成分の両方を包含する。
【００３８】
本明細書中で用いられる節の見だしは、組織化目的のためだけであり、記載される対象を制限するものと解釈されるべきではない。特許、特許出願、論説、書籍、および論文を含むが、これらに限定されない本出願で引用されるすべての文書、または文書の一部は、任意の目的のためにそれらの全体で参照することによって本明細書中に明らかに組み込まれる。組み込まれた文献および類似の資料が本出願における用語の定義と矛盾する様な方法で用語を定義する場合には、本出願が支配する。
【００３９】
本明細書中で用いられる場合、そして特に明記しない限り、脂肪に関連する障害という用語は、白色または褐色脂肪組織の障害、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば限定されないが、体重に関連する障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、メタボリックシンドローム、ならびに体重増加、体重減少の維持、体重減少後の体重の再増加の危険性、および関連する血糖障害に関連する状態、糖尿病、高血圧、線維症状態、およびガンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本明細書中で用いられる場合、そして特に明記しない限り、「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｍｅｎｔおよびｔｈｅｒａｐｙ）」という用語は、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症、およびガンなどの１以上の症状または影響の重篤度を軽減する、患者が白色脂肪関連障害に罹っている時に起こる作用を想定する。状況が許す場合、「治療（ｔｒｅａｔ、ｔｒｅａｔｉｎｇ、およびｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語はさらに、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの危険性が高い個体が脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの発症前に適切な外科手術および／または他の医療行為を受けることができることを保証するために取られる処置を指す。本明細書中で用いられる場合、そして特に明記しない限り、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔ、ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ、およびｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、患者が、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンに苦しみ始める前に行われる処置であって、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの発症を遅らせる、および／もしくは阻害する、またはその重篤度を軽減する処置を想定する。
【００４１】
本明細書中で用いられる場合、そして特に明記しない限り、「管理（ｍａｎａｇｅ、ｍａｎａｇｉｎｇ、およびｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）」という用語は、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの再発の重篤度を、そのような疾患、障害または状態にすでに苦しんでいる患者において、予防、遅延、または軽減することを包含する。この用語は、脂肪関連身体組成もしくは体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病もしくはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの閾値、発生、および／または期間を調節すること、あるいは脂肪関連身体組成または体重障害に対して患者が反応する方法を変更することを包含する。
【００４２】
本明細書中で用いられる場合、そして特別の定めのない限り、化合物の「治療有効量」は、脂肪関連身体組成もしくは体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病もしくはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの治療または管理で任意の治療的有用性を提供するため、あるいは脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンに関連する１以上の症状を遅延または最小化するために十分な量である。化合物の治療有効量は、単独あるいは、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの治療または管理で任意の治療的有用性を提供する１以上の他の治療および／もしくは治療薬と組み合わせた化合物の量を意味する。「治療有効量」という用語は、脂肪関連身体組成もしくは体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病もしくはメタボリックシンドローム、線維症およびガンを軽減する量、脂肪関連身体組成もしくは体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病もしくはメタボリックシンドローム、線維症およびガンを改善もしくは縮小する量、全体的な治療を改善する量、または別の治療薬の治療効果を増強する量を包含する可能性がある。
【００４３】
本明細書中で用いられる場合、そして特別の定めのない限り、化合物の「予防有効量」は、脂肪関連身体組成もしくは体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病もしくはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの発症、または脂肪関連身体組成もしくは体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病もしくはメタボリックシンドローム、線維症およびガンに関連する症状を予防または遅延するため、あるいはその再発を予防または遅延するために十分な量である。化合物の予防有効量は、単独あるいは、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの予防で予防効果をもたらす１以上の他の治療および／または予防薬と組み合わせた化合物の量を意味する。「予防有効量」という用語は、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンを予防する量、全体的な予防を改善する量、または別の予防薬の予防効果を増強する量を包含する。「予防有効量」は、例えば、脂肪組織関連障害の発生の前に処方することができる。
【００４４】
本明細書中で用いられる場合、「患者」または「対象」は、本明細書中に記載される脂肪組織関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンにかかる可能性がある生体、例えばヒトおよび非ヒトほ乳類を含む。好ましいヒト動物には、ヒト対象が含まれる。本明細書中で用いられる「非ヒトほ乳類」という用語は、あらゆるほ乳類、例えば齧歯類、マウス、ラットなど、および非ヒト霊長類、ペットおよび家畜、例えばヒツジ、イヌ、ウシ、ウマなどを含む。
【００４５】
本明細書中で用いられる場合、「ターゲティングペプチド」は、アミノ酸の連続配列を含むペプチドであり、これは臓器、組織または細胞型に対する選択的局在化によって特徴づけられる。選択的局在化は、例えば、推定ターゲティングペプチド配列がファージの外表面上で提示されるタンパク質中に組み込まれる、以下で開示する方法によって決定することができる。異なるアミノ酸配列の多数のそのようなターゲティングペプチドを発現するように遺伝子操作されたそのようなファージのライブラリを対象に投与し、続いて１以上の臓器、組織または細胞型を対象から集め、その臓器、組織または細胞型で見出されるファージを同定する。ターゲティングペプチド配列を発現するファージは、対照組織または臓器と比較して、ある組織または臓器でより大きな結合を示す場合、その組織または臓器に選択的に局在化されると考えられる。好ましくは、ターゲティングペプチドの選択的局在化によって、対照臓器、組織または細胞型と比較して、標的臓器、組織または細胞型でファージが２倍以上濃縮されるはずである。対照臓器、組織または細胞型と比較して標的臓器で少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍またはそれ以上の濃縮をもたらす選択的局在化がさらに好ましい。別法として、選択的局在化を示すターゲティングペプチド配列を発現するファージは、好ましくは、別のラウンドのスクリーニングのために第２の宿主に標的臓器から回収されたファージが再注射される場合に、対照臓器と比較して標的臓器で増大した濃縮を示す。さらなる濃縮は、第３ラウンドのスクリーニング後に示される可能性がある。選択的局在化を確認するための別の代替手段は、非特異的ペプチドを発現するか、または任意の推定標的ペプチドを発現するように遺伝子操作されていない対照ファージと比較して、標的臓器で好ましくは２倍、更に好ましくは３倍またはそれ以上の濃縮を示す推定標的ペプチドを発現するファージである。「ターゲティングペプチド」および「ホーミングペプチド」は本明細書中では同義的に使用される。
【００４６】
本明細書中で用いられる場合、「ファージ提示ライブラリ」は、それらの外表面上で１組の推定ターゲティングペプチドを発現するように遺伝子操作されたファージの集合を意味する。好ましい実施形態において、推定ターゲティングペプチドをコード化するＤＮＡ配列が、ファージカプセルタンパク質をコード化する遺伝子中にフレーム内で挿入される。他の好ましい実施形態では、推定ターゲティングペプチド配列は、全２０のアミノ酸の部分的にランダムな混合物であり、部分的に非ランダムである。ある好ましい実施形態において、ファージ提示ライブラリの推定ターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定された場所で１以上のシステイン残基を示す。システインは、例えば、環状ペプチドを作製するために用いることができる。
【００４７】
「高分子複合体」は、それらの配列がランダム、規則的または部分に規則的であり得る分子の集合を指す。その用語は、生物学的生体、例えばバクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生体、多細胞病原性生体および原核または真核細胞を包含する。その用語はさらに、分子の非生物集団、例えばリポソーム、マイクロカプセル、微小粒子、ナノ粒子、磁性ビーズおよび微小デバイスも包含する。唯一の要件は、複合体が１より多い分子を含むことである。分子は互いに同一であってもよいし、または異なっていてもよい。
【００４８】
ターゲティングペプチドの「受容体」としては、ターゲティングペプチドと結合する任意の分子または高分子複合体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。受容体の非限定的例としては、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、炭水化物、多分子構造、１以上の分子の特定のコンフォメーションおよび形態解剖学的実体（ｍｏｒｐｈｏａｎａｔｏｍｉｃ  ｅｎｔｉｔｙ）が挙げられる。好ましい実施形態において、「受容体」は、標的臓器、組織または細胞型内で血管を形成する細胞のルーメン表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。
【００４９】
選択的ターゲティングペプチドの生成に使用される組成物および方法が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１３および１４、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を含むがこれらに限定されない、脂肪組織について選択的または特異的な特定のターゲティングペプチドが提供され、更に別の実施形態では、脂肪組織について選択的なターゲティングペプチドを使用して、脂肪組織などの標的組織に治療薬を選択的または特異的に送達することができる。ある実施形態において、方法は、所定の標的細胞、組織、または臓器、例えば脂肪について選択的または特異的なターゲティングペプチドの調製または同定に関する。脂肪ターゲティングペプチドとしては、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣ（配列番号２５、配列番号２６、および配列番号１〜１６）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。対照ペプチドとしては、ＣＡＲＡＣ（配列番号２７および２８）、またはＣＧＤＫＡＫＧＲＣ（配列番号２９および３０）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
白色脂肪は、腫瘍のように、急速に増殖し拡大する、独特の組織である（Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，  Ｉｎ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ,  ｅｄｓ．  Ｒｅｎｏｌｄ  ａｎｄ  Ｃａｈｉｌｌ，  ｐｐ．  ８７―１００，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １９６５；  Ｃｉｎｔｉ，  Ｅａｔ．  Ｗｅｉｇｈｔ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ５：  １３２―１４２，  ２０００）。脂肪組織の研究によって、高度に血管新生されていることが明らかになる。複数の毛細血管は全ての脂肪細胞と接触し、このことは血管系の脂肪塊の維持に関する重要性を示唆する（Ｃｒａｎｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ,  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ４：２１  １―２３２，  １９９７）。脂肪組織増殖は、腫瘍と同様に血管形成に依存する可能性がある。もしそうならば、脂肪新生血管系の破壊は肥満の発生を防止する可能性があり、一方、既存の脂肪血管のターゲティングは潜在的に脂肪退縮をもたらす可能性がある。脂肪ターゲティングペプチドの使用方法には、体重減少の誘発、肥満または他の脂肪に関連する障害の治療、例えば限定されないがガンおよび線維症の画像化または治療が含まれる可能性がある。
【００５１】
ファージ提示インビボ技術（例えば、とりわけ、米国特許出願第ＵＳ２００９０１０４１１７号、第ＵＳ２００６００９４６７２号、第ＵＳ２００６０２３９９６８号、第ＵＳ２００９０２２１５０５号、第ＵＳ２００８０１７６７９２号、第ＵＳ２００８０１２４２７７号、第ＵＳ２０１００１７２８６４号、第ＵＳ２００４０１７０９５５号、第ＵＳ２００１００４６４９８号およびＫｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ；  １０，  ６２５―３２，  ２００４で開示されているもの）と、関心のある臓器中の細胞の選択的集団へホーミングするペプチドを単離するための蛍光−活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）との組み合わせが開示されている。このインビボ選択系は、臓器、組織または細胞型−ターゲティングペプチドを同定するためにファージ提示ライブラリと組み合わせて使用された。バクテリオファージの表面上でトランスジェニックペプチドを発現するファージ提示ライブラリは、ランダムオリゴヌクレオチドを、ファージ表面タンパク質をコード化するｃＤＮＡ中に挿入し、多くの並べ替えで特有のペプチドを提示するファージ粒子の収集物を生成させることによって、生成させることができる。ファージ提示は、ファージライブラリーが、例えば、１組の、ファージコートタンパク質中に組み入れられた所定の長さランダムペプチド配列を発現する技術であり、標的分子、細胞、組織、例えば脂肪組織または臓器と結合するペプチド配列は、ファージ提示ライブラリを標的とともにインキュベートし、そして結合ペプチドについて選択することによって同定された。未結合ファージを洗い流し、結合ファージを溶出させ、集める。収集されたファージを増幅し、さらなる結合／増幅サイクルに取り込んで、標的と選択的および／または特異的に結合するものについてペプチドのプールを濃縮することができる。各サイクルで、関心のある標的のターゲティングペプチドを含むプール中のファージの割合が濃縮される。数サイクル後、個々のファージクローンは、ターゲティングペプチド配列を同定するためのＤＮＡ配列決定によって特徴づけることができる（バイオパニング、例えば、ＵＳ２００５０１８７１６１ならびにＰａｓｑｕａｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４―６６，  １９９６；  Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７―８０，  １９９８を参照のこと）。
【００５２】
ファージ提示ライブラリのマウスへの静脈内（Ｉ．Ｖ．）投与に続いて、個々の臓器からのファージを回収した。ファージの外表面上で発現された特異的なターゲティングペプチド配列に基づいて、脂肪組織への選択的ホーミングが可能であるファージを回収した。様々な臓器および腫瘍ホーミングペプチドは、この方法によって同定されている（例えば米国特許文書：ＵＳ２００６００９４６７２、ＵＳ２００８０１２４２７７、ＵＳ２００９０１０４１１７、ＵＳ２００９０２２１５０５およびＵＳ２０１００１７２８６４を参照のこと）。
【００５３】
以下の具体例は、白色脂肪（脂肪）組織（ＷＡＴ）に適用される場合のそのようなアプローチの妥当性を証明するが、当業者は、この技術を褐色脂肪組織（ＢＡＴ）に適用することができ、種々の組織や臓器からの他の細胞型にさえも適用することができることに気づくであろう。ＷＡＴは、間葉性幹細胞（ＭＳＣ）のクラスに属する血管周囲脂肪間質細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｉｃ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）（ＡＳＣ）を豊富に含む。ＭＳＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５細胞表面シグネチャーを有する。ＭＳＣおよびＡＳＣの多能性特性、ならびにそれらの高い増殖率および移行能力は、それらが有益かつ病原性である可能性があることを意味する。ＡＳＣは、肥満における脂肪組織の拡大の原因であることを示されているが、ガン進行およびおそらくは線維症が付随する他の疾患を促進することも示されている（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６９：  ５２５９―５２６６，  ２００９）。
【００５４】
ファージ提示インビボ技術およびＦＡＣＳスクリーニングアプローチのこの組み合わせの成功を証明するために、ＡＳＣのマーカーのペプチドライブラリを生きているマウスにおいてスクリーニングした。環状ＣＸ７Ｃ、ＣＸ８Ｃ、およびＣＸ９Ｃを含むランダムペプチドライブラリの混合物（ここで、Ｃはシステインを表し、Ｘは任意の残基を表す）をスクリーニングした。ファージ−ペプチドライブラリを動物に注射し、４ラウンドの同期多臓器インビボバイオパニングを実施して、ＷＡＴホーミングペプチドを濃縮する。すべての選択ラウンドで、ファージをＩ．Ｖ．投与し、ＷＡＴおよび対照臓器の間質血管細胞フラクション（ＳＶＦ）から回収し、増幅し、プールし、そして次のラウンドのために使用する。ＦＡＣＳを、内皮（ＣＤ３１＋）および造血（ＣＤ４５＋）細胞に結合したファージ−ペプチドを枯渇させるため、そしてＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−ＡＳＣに結合したファージ−ペプチドを集めるために使用した。ファージ濃縮は、全てのその後のラウンドでのファージ変換単位（ＴＵ）の増大した回収によって証明され、ＷＡＴおよび他の標的臓器のＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞へのファージ−ペプチドホーミングの選択を反映する。
【００５５】
結果として、インビボで注射された場合、ＡＳＣにホーミングするが、ＭＳＣにはホーミングしないペプチドが、対抗選択のために含められる対照臓器を用いて同定された。スクリーニングされた臓器は、肺、骨、骨髄、および骨格筋を含んでいた。ＷＡＴ７（配列ＣＳＷＫＹＷＦＧＥＣおよびＳＷＫＹＷＦＧＥ：それぞれ配列番号１３および１４）として指定される１つの特定のペプチドは、最も確実なＡＳＣ−ターゲティングパターンを示し、一方、ペプチドＬＵ−２（配列ＣＥＳＧＦＰＴＶＧＣ：配列番号１９および２０）は、肺でＭＳＣを標的とする対照ペプチドとして選択された。
【００５６】
個々のファージ−ペプチドクローンについてのＷＡＴのＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞へのホーミングの特異性は、マウスに注射することによって示された。ＷＡＴ−７ペプチドを有するファージの結合は、肺ＭＳＣの結合と比較してＡＳＣ上で高度に濃縮された（図１Ｃを参照のこと）。対照的に、α５β１ホーミングペプチドｍＰｅｐ（Ｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ）および試験した他の対照ペプチドは、ＷＡＴ特異性を示さなかった。
【００５７】
ＷＡＴ７は、全身投与された場合に、ＡＳＣにホーミングするが、他の臓器中のＭＳＣにはホーミングしない、環状オクタペプチド（アミノ酸配列ＣＳＷＫＹＷＦＧＥＣおよびＳＷＫＹＷＦＧＥ（配列番号１３および１４）である。ＷＡＴ７は、末端ＣＹＳ部分によって環化させることができる。ＷＡＴ−７は対応するＡＳＣ表面受容体を生化学的に精製するためにおとり（ｂａｉｔ）として使用され、これは、デコリン（ＤＣＮ）タンパク質の以前は見落とされたイソ型、グリコシル化部位が欠損したタンパク質分解切断フラグメントとして同定された。このトランケートされたＤＣＮ（デルタ−ＤＣＮ（ΔＤＣＮ）と称する）は、ＡＳＣによって過剰発現され、細胞表面上で露出することが確認され、かくして新規マーカーが提供される。加えて、ＷＡＴ−７を模倣するタンパク質についての概念およびスクリーニングを逆転させることによって、レジスチンはＷＡＴ中のΔＤＣＮの内因性リガンドとして特定された。前脂肪細胞におけるΔＤＣＮの異所性発現は、レジスチンに関して以前に報告されているものと一致した表現型を誘導し、レジスチン−ΔＤＣＮ相互作用が、ＡＳＣの運命を支配するシグナリングカスケードを制御するという結論を裏付ける。選択的細胞集団を枯渇させるために、開示されたペプチドを全身的に注射することができる。下記実施例において、白色脂肪（脂肪）組織（ＷＡＴ）で脂肪幹細胞を標的とするペプチド（ＡＳＣ）を詳細に記載する。ＡＳＣターゲティングは肥満、ガンおよび線維症の療法として有用である可能性がある。
【００５８】
ペプチドのターゲティングペプチドとしての、そして脂肪組織を含むがこれに限定されない標的細胞の選択的および／または特異的結合を示すプロアポトーシスハイブリッドペプチドとカップリングしたインビボ細胞ターゲティングハイブリッドペプチドを生成させるための使用は、以前に報告されている（例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００９０１０４１１７号、同第ＵＳ２００６００９４６７２号、同第ＵＳ２００６０２３９９６８号、同第ＵＳ２００９０２２１５０５号、同第ＵＳ２００８０１７６７９２号、同第ＵＳ２００８０１２４２７７号および同第ＵＳ２０１００１７２８６４号を参照のこと）。そのようなハイブリッドペプチドは、２つの機能的ドメイン：関心のある細胞上で異なって発現される受容体と結合するホーミング（細胞ターゲティング）ドメインと、ペプチドを内在化させる細胞のアポトーシス死を引き起こす細胞毒性ドメインとから構成される合成ペプチドである。ホーミングペプチドは、典型的には７〜８アミノ酸長であり、環状である（２つジスルフィド結合したシステインによりによって制約される）。細胞毒性ドメインは、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２と称される両親媒性ペプチド配列ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号３１）であり、これは受容体介在性細胞内在化によってミトコンドリア膜を破壊し、プログラムされた細胞死（アポトーシス）を引き起こす。そのような細胞毒性ペプチドはさらに、（ＦＸＲ）ｎ（式中、ｎ＝４、６、８および１０であり、Ｆはフェニルアラニンであり、Ｆｘはシクロヘキシル−アラニンであり、Ｈｅｘは６−炭素アルキル鎖残基である）（例は（ＫＦＡＫＦＡＫ）２、（ＫＦＸＡＫＦＸＡＫ）２および（ＫＨｅｘＡＫＨｅｘＡＫ）２である）の式を有するもの、ならびに例えば、Ｈｏｒｔｏｎ，  ＫＬ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｙ，  ＳＯ．  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ａｐｏｔｏｓｉｓ―Ｉｎｄｕｃｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｃｙ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ５２，  ３２９３―３２９９，  ２００９；  Ｙｏｕｓｉｆ，  Ｌ．  Ｆ．，  Ｓｔｅｗａｒｔ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｈｏｒｔｏｎ，  Ｋ．  Ｌ．  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｙ，  Ｓ．  Ｏ．  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ―Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｎｄ  Ｍｏｄｅｌ  Ｃａｒｇｏ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ．  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，  １０：  ２０８１―２０８８，  ２００９；  Ｋｅｌｌｅｙ  ＳＯ，  Ｓｔｅｗａｒｔ  ＫＭ，  Ｍｏｕｒｔａｄａ  Ｒ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｆｅａｔｕｒｉｎｇ  ｄｅｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｃａｔｉｏｎｓ．  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．  Ｎｏｖ；  ２８(１１)：２８０８―１９，  ２０１１．  Ｅｐｕｂ  ２０１  １  Ａｕｇ  １１；  Ｈｏｒｔｏｎ，  ＫＬ，  Ｐｅｒｅｉｒａｌ，  ＭＰ，  Ｓｔｅｗａｒｔ，  ＫＭ，  Ｆｏｎｓｅｃａ  ＳＢ  ａｎｄ  Ｋｅｌｌｅｙ，  ＳＯ．  Ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ―Ｐｅｎｅｔｒ���ｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｒ  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ，  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，  １３(３), ４７６―１８５，  ２０１２．Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ：  １１  ＪＡＮ  ２０１２で記載されているものを含むものも包含する。
【００５９】
しかしながら、これらのハイブリッドペプチドの成功は、以前は限定され、毒性と関連する可能性がある。なぜなら、ホーミングドメインおよび公開されたＧｌｙ−Ｇｌｙリンカーは、伝統的にインビボでタンパク質分解に供することができるＬ−アミノ酸から構成されていたからである。タンパク質分解は活性なハイブリッドペプチドを破壊し、最終的に様々なサブペプチドを放出させる可能性があり、その一部はハイブリッドペプチドのターゲティングまたはエフェクター部分に相当する可能性がある。エフェクターペプチド、例えば限定されないが、プロアポトーシスペプチド、例えばターゲティングペプチドのないＤＫＬＡＫＬＡＫ２，（配列番号３１）の起こり得る放出は、有害反応、例えば腎臓毒性をもたらす可能性がある。加えて、タンパク質分解による不安定性のために、治療レベルを得るための注射に必要なペプチドの量は増加する。したがって、先行技術のエフェクターペプチドの臨床有効性および安全性は制限される。
【００６０】
さらに、先に記載されたリンカー領域を構成するグリシンはＤ形態として存在しないので、全Ｄプロアポトーシスペプチドの合成は、本明細書中で記載されるように、リンカーがアミノヘキサン酸で置換されるまでは、以前は可能ではなかった。加えて、（ペプチドが最初に単離された）Ｌ形態からＤ形態への変換はコンフォメーションの変化をもたらす可能性があり、その結果、標的受容体との不適合性および認識の喪失、ならびに対応するホーミングの喪失となるという懸念のために、Ｄ形態アミノ酸からのホーミング／ターゲティングペプチドドメインの構築は以前は試みられなかった。しかしながら、本明細書中で記載されるように、先行技術のＬペプチドと同様に、そのような全Ｄペプチドは標的細胞にホーミングすることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、組成物は、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸を含む単離されたペプチドを含み、ここで、ペプチドは脂肪組織と結合する。いくつかの実施形態では、タンパク質組成物は、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、いくつかの実施形態では、タンパク質組成物は完全にＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの他の実施形態において、タンパク質組成物は、造影剤とカップリングしたペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは、細胞毒性またはプロアポトーシス剤とカップリングする。いくつかの実施形態において、タンパク質組成物は、白色脂肪組織を褐色脂肪組織に変える薬剤とカップリングしたペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドをリンカーによって薬剤または他のペプチドとカップリングさせる。いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、（ＣＨ２）４；（ＣＨ２）５；（ＣＨ２）６；（ＣＨ２）７；（ＣＨ２）８またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、白色脂肪組織上のｂ３−アドレナリン受容体を活性化する。いくつかの実施形態において、薬剤はペプチドであり、いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドをリンカーによって薬剤または他のペプチドとカップリングさせる。いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。
【００６２】
いくつかの他の実施形態において、単離された核酸組成物は、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、組換え宿主細胞は単離された核酸分子を含み、いくつかのさらなる実施形態において、発現ベクターは単離された核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、宿主細胞は発現ベクターを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、細胞毒性、アポトーシス、トランス発生的（ｔｒａｎｓｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ）または画像化ペプチドを脂肪組織に送達する方法は、（ａ）配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するターゲティングペプチドとカップリングさせることを含み、この場合、ターゲティングペプチドは脂肪細胞と選択的に結合する。いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドはリンカーペプチドによりカップリングし、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。
【００６４】
いくつかの他の実施形態において、化合物または薬剤を脂肪組織に送達する方法は：ａ）脂肪組織と選択的に結合するペプチドを得、ここで、このペプチドは長さが１００アミノ酸未満であり、配列番号１〜１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する脂肪組織ターゲティングモチーフを含み、ここで、ペプチドは脂肪組織を標的とすることを望む化合物または薬剤とカップリングされる；そしてｂ）脂肪組織を含むと思われる細胞集団にペプチドを暴露することを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカーを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドおよび薬剤はどちらもＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、カップリングはリンカーペプチドによって起こり、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞毒性またはプロアポトーシスペプチドを含む。いくつかの実施形態において、薬剤は造影剤を含む。いくつかの実施形態において、（ｂ）は、対象をペプチドに暴露して、脂肪に関連する障害を治療することを含む。いくつかの実施形態において、細胞集団はヒト対象中にある。いくつかの実施形態において、細胞集団は組織の薄片である。他の実施形態では、方法は、前記集団で脂肪幹細胞を検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、脂肪に関連する障害は、身体組成障害、体重障害、肥満、脂肪異栄養症、糖尿病、メタボリックシンドローム、線維症またはガンである。
【００６５】
他の実施形態には、配列番号１７〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたペプチドがあり、ここで、前記ペプチドは肺組織と結合する。いくつかの実施形態では、配列番号１７〜２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質組成物、そしていくつかの実施形態では、タンパク質組成物は完全にＤ−アミノ酸から構成される。他の実施形態には、ペプチドが造影剤とカップリングしたタンパク質組成物がある。いくつかの実施形態において、ペプチドが細胞毒性またはプロアポトーシス剤とカップリングしたタンパク質。いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、カップリングはリンカーペプチドによって起こり、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。
【００６６】
キメラ細胞毒性ペプチド組成物の例示的組成物では、両ドメイン中の全てのアミノ酸は、Ｄ−エナンチオマーから構成され、したがって、インビボのタンパク質分解に対して耐性であり、全身投与によりペプチドの長期効果を可能にする。２つのドメインを接続するリンカーはアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）：ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯであり、これもインビボでプロテアーゼにより切断されない。下記実施例で使用するために、キメラペプチドは（例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、またはＣｅｌｔｅｋによって）商業的に製造され、通常のペプチド化学（「メリフィールド合成」によって合成された。
【００６７】
Ｃｅｌｔｅｋ（Ｃｅｌｔｅｋ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，  ＴＮ  ３７２１０）によって合成されたＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄペプチドの細胞障害活性は、以下の実施例で記載されるように、処置および未処置初代マウスＡＳＣ培養のトリパンブルー染色を使用してインビトロでまず示された。Ａｐｏ−Ｔｒａｃｅ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）およびフローサイトメトリー分析を使用して、ＷＡＴ７標的化プロアポトーシスペプチドは、処理されたＡＳＣ細胞においてアポトーシスおよび細胞死を実際に誘発したことが証明された（下記実施例８を参照のこと）。ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄ−ペプチドのインビボ活性および有効性を証明するために、２ｍｇのペプチドをマウスに注射し、細胞死が、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号１３〜配列番号３１）全Ｄ−ペプチドでの処理後４８時間でＷＡＴにおいて検出された。腎臓または末梢血では細胞死は確認されず、ペプチド用量を（１００ｍｇ／ｋｇ体重まで）増加させても、ＭＴＤは達成されなかった。これらの知見は、開示された方法を用いて同定されるターゲティングペプチドを使用して細胞毒性ドメインの脂肪組織へのターゲティング有効性を明らかに証明し、このドメインは全Ｄアミノ酸組成物のために安定性が増大していた。いくつかの実施形態において、脂肪組織における新生血管系（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）について選択的なターゲティングペプチドは、肥満関連障害を治療するため、例えば減量のため、または体重増加を予防するために使用することができる。抗血管新生または毒性部分を脂肪ターゲティングペプチドに結合させることによって、新しい脂肪組織を供給する血管を選択的に阻害することができ、脂肪の新規沈着物の成長を予防し、そして潜在的に既存の脂肪沈着物を消滅させる。褐色脂肪組織はより多く血管が新生されるので、血管系に基づくターゲティングアプローチは、この組織の活性化のために治療薬をＢＡＴへ送達するのに非常に有効である。
【００６８】
ある実施形態では、別の治療薬を、例えば、白色脂肪組織への選択的な送達のために、ターゲティングペプチドまたは融合タンパク質と結合させることができる。使用に適した薬剤または因子には、アポトーシス、細胞死、細胞停滞（ｃｅｌｌ  ｓｔａｓｉｓ）および／または抗血管形成を誘発する任意の化合物が含まれる可能性がある。アポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死は、正常な胚発生のため、成人組織における恒常性の維持、および発がんの抑制に必須プロセスである。そのようなペプチドのカップリングおよび使用の例としては、米国特許出願第ＵＳ２００９０１０４１１７号、同第ＵＳ２００６００９４６７２号、同第ＵＳ２００６０２３９９６８号、同第ＵＳ２００９０２２１５０５号、同第ＵＳ２００８０１７６７９２号および同第ＵＳ２００８０１２４２７７号が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本開示の範囲内で想定されるプロアポトーシス剤の非限定的な例としては、グラミシジン、マゲイニン、メリチン、デフェンシン、セクロピン、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号３１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２（配列番号３２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２（配列番号３３）または（ＫＬＧＫＫＬＧ）３（配列番号３４）が挙げられる。
【００６９】
ある実施形態では、血管新生阻害剤、例えばアンギオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板第４因子、ＩＰ−１０，Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシオエストラジオール、プロリフェリン関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット，ポリ硫酸ペントサン、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、インターフェロン−アルファ、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチンフラグメント、リノミド，サリドマイド，ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン、アンギオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板第４因子またはミノサイクリンと結合したターゲティングペプチドの投与が含まれる。
【００７０】
ある実施形態において、細胞毒性剤と結合したターゲティングペプチドの投与。そのような細胞毒性化学療法剤としては、５−フルオロウラシル、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エストロゲン受容体結合剤、エトポシド（ＶＰ１６）、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ゲムシタビン、イホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、マイトマイシン、ナベルビン、ニトロソウレア、プリコマイシン、プロカルバジン、ラロキシフェン、タモキシフェン、タキソール、テマゾロミド（ＤＴＩＣの水性形態）、トランスプラチナ、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、ビンクリスチン、または前記のものの任意のアナログもしくは誘導体変異体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ほとんどの化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗腫瘍抗生物質、コルチコステロイドホルモン、分裂抑制剤、およびニトロソウレア、ホルモン剤、天然産物、ミセル剤（ｍｉｓｃｅｌｌａｎｅｏｕｓ  ａｇｅｎｔ）、およびそれらの任意のアナログまたは誘導体変異体の範疇に分類される。
【００７１】
天然産物は一般的に、本来は天然源から単離され、薬理活性を有すると認定された化合物を指す。そのような化合物、それらのアナログおよび誘導体は、当業者に公知の任意の技術によって、天然源から単離することができる、化学的に合成することができる、または組換えにより産生することができる。天然産物には、分裂抑制剤、抗腫瘍抗生物質、酵素および生体応答修飾物質のような範疇が含まれる。そのような天然産物の例としては、細胞分裂に必要とされるタンパク質合成または有糸分裂に必要とされるタンパク質合成のいずれかを阻害することができる植物アルカロイドおよび他の天然剤、例えばドセタキセル、エトポシド（ＶＰ１６）、テニポシド、パクリタキセル、タキソール、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
化学療法剤および投与方法、投薬量などは当業者に周知であり（例えば、関連する部分で参照することにより本明細書中に組み込まれる、“Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ”，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’s  “Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”および“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  １５th  ｅｄ．，  ｐｐ  １０３５―１０３８  ａｎｄ  １５７０―１５８０を参照のこと）、本明細書中の開示を考慮して開示された組成物と組み合わせることができる。投薬量において多少の変動が治療される対象の状態に応じて必然的に起こるであろう。投与の責任を負う人物は、いずれの場合も、個々の対象に適切な用量を決定する。特定の化学療法剤および用法の例も本明細書中に記載されている。もちろん、本明細書中に記載されるこれらの投薬量および薬剤の全ては限定的というよりはむしろ例示的であり、特定の患者または応用のために当業者は他の用量または薬剤を使用することができる。これらの点の中間の任意の投薬量、または誘導できる範囲も、ある実施形態に含まれると予想される。
【００７３】
いくつかの実施形態において、標的ＷＡＴを標的とするペプチドは、ＡＳＣ細胞をＢＡＴに分化させる、またはＷＡＴをＢＡＴ化させる化合物または薬剤を送達するために使用することができる。ＡＳＣは、ＰＰＡＲ−ガンマアゴニストで褐色脂肪細胞に分化させることができる（Ｅｌａｂｄ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂｒｏｗｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７，  ２７５３−２７６０，  ２００９）。したがって、いくつかの実施形態において、化合物または薬剤、例えば限定されないが、チアゾリジンジオンクラスの薬物、例えばロシグリタゾンもまた、記載されたターゲティングペプチドとカップリングさせることができ、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンを治療または予防するために脂肪精製の調節のために使用することができる。
【００７４】
白色脂肪細胞はさらに、培養中およびインビボの両方でＢＡＴ様表現型に直接変換された（Ｃｉｎｔｉ．  Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｏｒｇａｎ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．  ２９７，  ９７７−９８６，  ２００９）。この変換は、例えば、低温およびＷＡＴにおけるｂ３−アドレナリン受容体の活性化によって誘発されるシグナル変換カスケードなどの交感神経系刺激によって引き起こされる。したがって、いくつかの実施形態において、アドレナリン作用を活性化する化合物または薬剤を、ＢＡＴへの変換のためにＷＡＴを標的とするために記載されたペプチドとカップリングさせることができ、かくして脂肪関連身体組成または体重障害、たとえば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンを治療または予防するために使用することができる。
【００７５】
いくつかの実施形態において、開示されたペプチドまたはタンパク質は、様々な罹病臓器、組織または細胞型の画像化または診断のために役立つ造影剤に結合させることができる。ペプチドまたはタンパク質を造影剤として使用されるフルオロフォアまたは放射性追跡子で標識または共役させる。多くの適切な造影剤は、比色分析マーカー（例えば、限定されないが、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（ホースラディッシュ）水素ペルオキシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ）を用いてその存在を検出することができる金属キレート錯体、放射性同位体、蛍光マーカー、または酵素を用いた、それらのタンパク質またはペプチドへの結合のための方法と同様に、当該技術分野で公知である。
【００７６】
いくつかの実施形態において、画像化複合物はさらに、核アプローチによって画像化を組み合わせ、独特の環状構造にし、結合親和性および薬物動態学に最適化するために、放射性同位体で二重標識される。そのような薬剤は、限定されないが、経口投与、吸入、皮下（ｓｕｂ−ｑ）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、腹腔内（ＬＰ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、またはクモ膜下腔注射を含む、任意の数の当業者に公知の方法によって、または以下で更に詳細に記載するように投与することができる。いくつかの実施形態において、本明細書中で記載される方法および組成物は、単独または、脂肪に関連する障害を診断、アクセスおよびモニターするための他の技術ならびに脂肪に関連する障害の直接療法と組み合わせて用いることができる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは、限定されないが、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびイダルビシンをはじめとする、抗菌活性および細胞毒性活性の両方を有する抗生物質を含むかまたはカップリングした、リポソーム、マイクロカプセル、微小粒子、ナノ粒子、磁性ビーズおよび微小デバイスなどの分子の非生物集団を、単独または組み合わせて送達するために使用することができる。開示されたターゲティングペプチドを用いて送達することができるさらなる種類の細胞毒性剤としては、白金配位錯体、アントラセンジオン、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、アムサクリン、Ｌ−アスパラギナーゼ、およびトレチノインが挙げられるが、これらに限定されるものではない。白金配位錯体としては、カルボプラチンおよびシスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）などの化合物が挙げられる。例示的なアントラセンジオンはミトキサントロンである。例示的な置換尿素はヒドロキシウレアである。例示的なメチルヒドラジン誘導体はプロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）である。これらの例は限定されず、任意の公知細胞毒性、細胞増殖抑制剤または細胞破壊剤を、本開示のターゲティングペプチドと結合させることができ、標的臓器、組織または細胞型に投与することができることが想定される。本明細書中で記載されるアミノ酸配列、ならびに類似体および誘導体を含む、様々な実施形態で使用することができる、所望のターゲティング、細胞毒性またはハイブリッドペプチドアミノ酸配列。実際には、いくつかの実施形態において、所望のペプチドアミノ酸配列の全部、または任意の部分をコード化する任意のポリヌクレオチド配列の使用と同様に、特定のヌクレオチド配列によってコード化される任意の所望のペプチドアミノ酸配列を使用することができる。遺伝子コードの縮重性は周知であり、したがって、各ターゲティング、細胞毒性またはハイブリッドペプチドアミノ酸コード化ヌクレオチド配列は一般的に周知の核酸「トリプレット」コドンに代表的であるか、または多く場合、アミノ酸をコード化することができるコドンである。このように、本明細書中で想定されるように、本明細書中で記載されるターゲティング、細胞毒性またはハイブリッドペプチドアミノ酸配列は、遺伝子コードと一緒になった場合（たとえば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｔａｂｌｅ  ４−１  ａｔ  ｐａｇｅ  １０９  （Ｄａｒｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８６）を参照のこと）、そのようなアミノ酸配列をコード化することができる核酸配列のすべての様々な並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）および組み合わせの代表的なものである。
【００７８】
そのような機能的に同等なターゲティング、細胞毒性、画像化またはハイブリッドペプチドアミノ酸配列としては、限定されないが、ヌクレオチド配列によってコード化されるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の付加または置換であって、その結果、サイレント変化（ｓｉｌｅｎｔ  ｃｈａｎｇｅ）が起こり、かくして機能的に同等な遺伝子産物を生成するものが挙げられる。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性の類似性に基づいて作成することができる。たとえば：非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン、およびヒスチジンが挙げられ；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００７９】
アミノ酸置換は、あるいはアミノ酸のヒドロパシー指数に基づいておこなってもよい。各アミノ酸はその疎水性および電荷特性に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられている。それらは次のとおりである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を付与する際のヒドロパシーアミノ酸指数の使用は当該技術分野で理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：  １０５−１３２，  １９８２）。ある場合において、あるアミノ酸を、類似したヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換してもよく、それでもなお類似した生物学的活性を保持する。ヒドロパシー指数に基づいた変化を生じさせる際、ある実施形態では、そのヒドロパシー指数が±２内であるアミノ酸の置換が含まれ、一方、他の実施形態では、±１内であるアミノ酸置換が含まれ、さらに他の実施形態では、±０．５内のアミノ酸置換が含まれる。
【００８０】
アミノ酸置換は、別法として、特にそれによって作成される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが免疫学的実施形態での使用を意図される場合、親水性値に基づいておこなうことができる。ある実施形態において、タンパク質の最大の局所的平均親水性値は、その隣接するアミノ酸の親水性によって影響を受け、その免疫原性および抗原性と、即ち、タンパク質の生物学的特性と相関する。以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられる：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて変化させる際、ある実施形態では、その親水性値が±２内にあるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態では、±１内にあるものが含まれ、そしてある実施形態では、±０．５内にあるものが含まれる。親水性値に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。
【００８１】
完全長ポリペプチドもしくはペプチド、またはペプチドのトランケートもしくは変異体バージョンが、無関係なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと融合され、本明細書中で記載される核酸および／またはアミノ酸配列をコードする所望のペプチドに基づいて設計することができる融合タンパク質の使用。そのような融合タンパク質としては：タンパク質またはペプチドを安定化させ、インビボ半減期を延長するＩｇＦｃ融合物；融合タンパク質が細胞膜に固定されるのを可能にする任意のアミノ酸配列との融合物；またはマーカー機能を提供する酵素、蛍光タンパク質、もしくは発光タンパク質との融合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ターゲティングペプチドは、リポソームまたは脂質複合体に基づく送達系に結合させることができる。そのような技術の例は、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  （Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｉｇ，  ｅｄｓ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，  ２００３）、および米国特許第４，５９４，５９５号、同第５，４５９号、同第１２７号、同第５，９４８，７６７号および同第６，１１０，４９０号で記載されている。
【００８３】
ある実施形態において、融合タンパク質は、発現される融合タンパク質と選択的に結合する抗体を利用することによって、容易に精製することができる。別の実施形態において、融合タンパク質は、核酸配列をコード化するペプチドを組換えプラスミド、またはその一部にサブクローニングすることによって精製することができ、６個のヒスチジン残基からなるアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ末端（Ｃ末端）タグと翻訳的に融合させる（「Ｈｉｓ−タグ」；例えば、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８：８９７２−８９７６，  １９９１を参照のこと）。そのような構築物を発現する細胞からの抽出物をＮｉ２＋ニトロ酢酸−アガロースカラム上にロードし、ヒスチジン標識されたタンパク質をイミダゾール含有緩衝液で選択的に溶出させる。
【００８４】
記載された所望のペプチドアミノ酸配列は化学的に合成することができるが（例えば、“Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ”  （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  ｅｄ．，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８４）を参照のこと）、大きなポリペプチド配列は有利には、所望のペプチドをコード化する核酸配列を含む核酸を発現するための当該技術分野で周知の技術を用いて組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。そのような方法を用いて、ペプチドコード化ヌクレオチド配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる（例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  ｓｕｐｒａ，  および“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  ｓｕｐｒａを参照のこと）。別法として、所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列をコード化するＲＮＡおよび／またはＤＮＡは、例えば合成器を用いて化学的に合成することができる（例えば、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  （Ｇａｉｔ，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，  １９８４）を参照のこと）。
【００８５】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、ペプチドコード化ヌクレオチド配列を発現することができる。所望のペプチドもしくはポリペプチドが可溶性、または可溶性誘導体である場合、ペプチドまたはポリペプチドは、宿主細胞培養から、即ち、ペプチドまたはポリペプチドが分泌されない場合は宿主細胞から、そしてペプチドまたはポリペプチドが宿主細胞によって分泌される場合には培養培地から、回収することができる。しかしながら、好適な発現系はさらに、細胞膜に固定された所望のポリペプチド、ペプチドまたは機能的等価物を発現する操作された宿主細胞も包含する。そのような発現系からの所望のペプチドの精製また濃縮は、適切な界面活性剤および脂質ミセル、ならびに当業者に周知の方法を用いて達成することができる。さらに、そのような操作された宿主細胞自体を、ペプチドの構造的および機能的特性を保持するだけでなく、例えばある薬物スクリーニングアッセイにおいて、生物学的活性を評価することが望ましい状況で使用することができる。
【００８６】
ある応用では、一時的発現系が望ましい。しかしながら、組換えタンパク質またはペプチドの長期高収率産生のためには、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、所望のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または融合タンパク質を安定して発現する細胞系を操作することができる。複製のウイルス起源を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモータ、エンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡ、および選択可能なマーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、改変細胞を強化培地中で約１〜２日間成長させ、次いで選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、かつ細胞が、プラスミドをその染色体に安定して組み込み、かつ成長して遺伝子座を形成することを可能にし、この遺伝子座を次にクローンし細胞系に拡大させる。この方法を有利に使用して、所望の遺伝子産物またはそれらの部分を発現する細胞系を操作することができる。そのような改変細胞系は、所望のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの内因性活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用である可能性がある。
【００８７】
限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  １１  ：２２３−２３２，  １９７７）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ａｎｄ  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：２０２６−２０３４，  １９６２）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−８２３，  １９８０）遺伝子を含む多数の選択系を使用することができ、これらをｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞でそれぞれ用いることができる。代謝拮抗物質耐性はさらに、以下の遺伝子についての選択の基礎として用いることができる：メトトレキサートに対する耐性を付与する、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７：３５６７−３５７０，  １９８０、およびＯ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：  １５２７−１５３１，  １９８１）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与する、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８：２０７２−２０７６，  １９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０：  １−１４，  １９８１）；およびハイグロマイシンに対する耐性を付与する、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｔ）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  ３０：  １４７−１５６，  １９８４）。
【００８８】
開示された方法で使用される組成物を提供する目的で使用することができる宿主細胞／発現系としては、微生物、例えば、所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミッドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））；所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、メタノール資化酵母（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ））；所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換され、所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列を含む植物細胞系；または所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列およびほ乳類細胞のゲノム由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）もしくはほ乳類ウイルスからのプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含む組換え発現構築物を有するほ乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
細菌系において、発現される所望の遺伝子産物について意図される使用に応じて、多数の異なる発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、所望のペプチドを含む医薬組成物の生成のために、またはタンパク質に対する抗体を産生するために大量のそのようなタンパク質が産生される場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を行うベクターが望ましい可能性がある。そのようなベクターとしては：融合タンパク質が産生されるように、所望のペプチドコード化配列が個別にベクター中にフレーム内でｌａｃＺコーディング領域とライゲートされる、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２：  １７９１−１７９４，  １９８３）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｙｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３  ：３１０１−３１  １０，  １９８５、およびＶａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６４：５５０３−５５０９，  １９８９）；などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ｐＧＥＸベクター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）も、所望のペプチド部分をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現するために使用することができる。一般的に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、続いて遊離グルタチオンの存在下で溶出させることによって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローンされた所望のペプチドコード化遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。いくつかの実施形態では、Ｄ−アミノ酸が好ましいので、特に、Ｐａｒｋ，  ｅｔ  ａｌ，  （Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ｓｅｐａｒａｔｅｌｙ  ａｎｄ  ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ｄ−ｈｙｄａｎｔｏｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｎ−ｃａｒｂａｍｏｙｌａｓｅ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  Ｊｕｌ−Ａｕｇ；  １６（４）：５６４−７０，  ２０００）で記載されるものなどの方法。
【００９０】
例示的な昆虫系では、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、所望のペプチドコード化配列を発現するベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞中で成長する。所望のペプチドコード化配列は個々にウイルスの非必須領域（例えば、ポリへドリン遺伝子）にクローンすることができ、ＡｃＮＰＶプロモータ（例えばポリへドリンプロモータ）の制御下に置くことができる。所望のペプチドコード化配列の挿入が成功すると、ポリへドリン遺伝子が失活し、非閉塞組換えウイルス（すなわち、ポリへドリン遺伝子によってコードされるタンパク性コートがないウイルス）が産生されるであろう。組換えウイルスを次に使用して、ヨトウガ細胞を感染させ、ここで、挿入されたポリヌクレオチドが発現される（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４６：５８４−５９３，  １９８３、および米国特許第４，２１５，０５１を参照のこと）。
【００９１】
ほ乳類宿主細胞では、多数のウイルス系発現系を利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモータおよび３連リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）とライゲートすることができる。このキメラ配列を次いでインビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノム（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）の非必須領域中の挿入は、感染した宿主で生存でき、所望のペプチド産物を発現することができる組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１  ：３６５５−３６５９，  １９８４を参照のこと）。特定の開始シグナルも、挿入された所望のペプチドコード化ヌクレオチド配列の効率的な翻訳に必要である可能性がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。場合によっては、おそらく、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを提供することができる。さらに、開始コドンは、全挿入物の翻訳を確実にするために、所望のペプチドコード化コーディング配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって増強することができる（例えば、Ｎｅｖｉｎｓ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １９：３０７−３２２，  １９８６を参照のこと）。
【００９２】
酵母では、構成的または誘導プロモータを含む多くのベクターを使用することができる。調査のために、例えば“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  ｓｕｐｒａ，  Ｃｈ．  １３，  Ｂｉｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３  ：５１６−５４４，  １９８７，  “ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｖｏｌ．  ＩＩ，  Ｃｈ．  ３  （Ｇｌｏｖｅｒ，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １９８６）；  Ｂｉｔｔｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５２：６７３−６８４，  １９８７，  “Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：  Ｌｉｆｅ  Ｃｙｃｌｅ  ａｎｄ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”  （Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８１）、および“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ：  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”  （Ｓｔｒａｔｈｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ，  ｅｄｓ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  １９８２）を参照のこと。
【００９３】
植物では、様々な異なる植物発現ベクターを使用することができ、所望のペプチドコード化配列の発現は、多数のプロモータのいずれかによって引き起こされる可能性がある。例えば、ウイルスプロモータ、たとえばＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡもしくは１９ＳＲＮＡプロモータ（Ｂｒｉｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：５１  １−５１４，  １９８４）、またはＴＭＶのコートタンパク質プロモータ（Ｔａｋａｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：３０７−３１１，  １９８７）を用いることができる。別法として、植物プロモータ、たとえばＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモータ（Ｃｏｒｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ３：  １６７１−１６７９，  １９８４、およびＢｒｏｇｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４：８３８−８４３，  １９８４）、または熱ショックプロモータ、たとえばダイズｈｓｐｌ７．５−Ｅもしくはｈｓｐｌ７．３−Ｂ（Ｇｕｒｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ６：５５９−５６５，  １９８６）を用いることができる。これらの構築物は、例えば、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションを用いて植物細胞に導入することができる。そのような技術の概説については、たとえば、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，  ｉｎ  “Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｓｅｃｔｉｏｎ  ＶＩＩＩ  （Ｓｃｈｕｌｅｒ  ａｎｄ  Ｚｉｅｌｉｎｓｋｉ，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９８８）、および“Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｈ．  ７−９  （Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｖｅｙ，  ｅｄｓ．，  Ｂｌａｃｋｉｅ  ＆  Ｓｏｎ，  Ｌｔｄ．，  Ｇｌａｓｇｏｗ，  Ｓｃｏｔｌａｎｄ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，  １９８８）を参照のこと。
【００９４】
加えて、挿入された所望のペプチドコード化配列の発現を調節する、または所望のペプチドコード化核酸配列を所望の方法で修飾し、処理する、宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質のある機能に影響を及ぼす可能性がある。異なる宿主細胞は、タンパク質およびペプチドの翻訳後プロセッシングならびに修飾について特徴的かつ特異的メカニズムを有する。発現される所望のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの正しいかまたは望ましい修飾およびプロセッシングを確実にするために、適切な細胞系または宿主系を選択することができる。このために、一次転写産物の所望のプロセッシング、所望のペプチドコード化核酸配列のグリコシル化および／またはリン酸化のための細胞メカニズムを有する真核宿主細胞が使用される。そのようなほ乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＶＥＲＯ、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、サル腎臓（ＣＯＳ）、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ヒト肝細胞癌（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、およびＵ９３７細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９５】
ある実施形態において、本開示の組成物は、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの治療で使用される。
【００９６】
ある実施形態において、本開示の組成物を、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの治療、管理、および／または予防のために、１以上のさらなる化合物または薬剤（「さらなる活性剤」）と組み合わせて投与することができる。そのような療法は、脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンを治療または改善するために、患者に治療有効量で投与することができる。治療有効量とは、任意の病徴の発症の遅延、改善、または遅延をもたらすために十分な化合物の量を指す。
【００９７】
いくつかの実施形態には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドがあり、前記ペプチドはインビボで間質細胞と結合する。いくつかの実施形態において、間質細胞は脂肪組織、線維性病変または腫瘍に位置する。
【００９８】
いくつかの実施形態には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を有するペプチドを含むタンパク質組成物が含まれる。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物は完全にＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物は、造影剤をカップリングさせる。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物を、細胞毒性またはプロアポトーシス剤とカップリングさせる。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物を、白色脂肪組織の褐色脂肪組織への変換を誘発する薬剤とカップリングさせる。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物を、白色脂肪組織においてｂ３−アドレナリン受容体を活性化する薬剤とカップリングさせる。いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｄ−アミノ酸から構成されるペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドはリンカーによってカップリングし、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。
【００９９】
他の実施形態では、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドがあり、前記ペプチドはインビボで間質細胞と結合する。いくつかの実施形態において、間質細胞は肺組織、線維性病変または腫瘍中に位置する。
【０１００】
いくつかの実施形態において、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のアミノ酸配列を有するペプチドを含むタンパク質組成物がある。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物は完全にＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物を、造影剤とカップリングさせる。いくつかの実施形態において、ペプチドまたはタンパク質組成物を、細胞毒性またはプロアポトーシス剤とカップリングさせる。いくつかの実施形態において、薬剤は、Ｄ−アミノ酸から構成されるペプチドである。いくつかの実施形態において、ペプチドはリンカーによってカップリングされ、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、タンパク質組成物は完全にＤ−アミノ酸から構成され、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、組成物は、例えば、インビボで脂肪組織、線維性組織または腫瘍組織中に位置する間質細胞と結合する。いくつかの実施形態において、ペプチドを造影剤、細胞毒性、プロアポトーシス剤とカップリングさせる。いくつかの実施形態において、ペプチドを、白色脂肪組織を褐色脂肪組織に変化させる薬剤、例えば限定されないが、白色脂肪組織中のｂ３−アドレナリン受容体を活性化する薬剤とカップリングさせる。
【０１０２】
いくつかの実施形態には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子がある。いくつかの実施形態には、これらの核酸分子を含む発現ベクター、および発現ベクターを含む宿主細胞ある。
【０１０３】
いくつかの実施形態には、細胞毒性、プロアポトーシス、トランス発生的または画像化ペプチドを脂肪組織に送達する方法があり、前記方法は：（ａ）細胞毒性、プロアポトーシス、トランス発生的または画像化ペプチドを、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するターゲティングペプチドとカップリングさせること；および（ｂ）カップリングしたターゲティングペプチドを脂肪細胞と選択的に結合させることを含む。いくつかの実施形態においてペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドをリンカーによってカップリングさせ、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。
【０１０４】
他の実施形態には、化合物または薬剤を脂肪組織に送達する方法があり、この方法は：化合物または薬剤とカップリングしたペプチドを、脂肪組織を含むと考えられる細胞の集団に暴露することを含み、ここで、前記化合物または薬剤とカップリングしたペプチドは、脂肪組織と選択的に結合するペプチドとカップリングした化合物または薬剤を含み、ここで、ペプチドは、１００アミノ酸未満の長さであり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する脂肪組織ターゲティングモチーフを含む。いくつかの実施形態においてペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、ペプチドはリンカーによってカップリングされ、いくつかの実施形態において、リンカーはアミノヘキサン酸を含む。いくつかの実施形態において、ペプチドおよび薬剤はどちらもＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、薬剤は、細胞毒性またはプロアポトーシスペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ペプチドはＤ−アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態において、薬剤は造影剤を含む。いくつかの実施形態において、暴露は、対象を、薬剤とカップリングすることができるペプチドに暴露して、脂肪症関連障害、例えば限定されないが、肥満、線維症またはガンを治療することを含む。いくつかの実施形態において、細胞集団はヒト対象由来であるか、またはヒト対象中にある。いくつかの実施形態において、細胞集団は家畜対象由来であるか、または家畜対象中にある。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、細胞は、組織の薄片と同様に、エクスビボの細胞の集団中にある。いくつかの実施形態には、化合物または薬剤とカップリングしたペプチドの前記脂肪組織との前記選択的結合に基づいて異種細胞集団中の脂肪間質細胞を検出する方法がある。いくつかの実施形態には、限定されないが細胞毒性またはプロアポトーシス剤などの化合物または薬剤とカップリングしたペプチド標的化ペプチドでの治療から恩恵を受ける患者を同定する際に脂肪間質細胞を検出する方法がある。患者の例としては、身体組成障害、体重障害、肥満、脂肪異栄養症、糖尿病、メタボリックシンドローム、線維症またはガンにかかっているヒトまたは獣医学的患者が挙げられる。
【０１０６】
ＷＡＴ７ペプチド（配列番号１３および１４）の単離および特性化に関する具体的詳細が提供されるが、開示された方法の一般的適用可能性を示すさらなるＷＡＴターゲティング（配列番号１〜１６）および肺ターゲティングペプチド（配列番号１７〜２４）も提供される。
【０１０７】
そのような組成物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％で治療上有効な用量）を測定するために、細胞培養または実験動物において標準的医薬処置によって測定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表される治療指数である。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。ある実施形態では、毒性副作用を示す化合物を用いることができるが、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を軽減するために、そのような組成物に罹患組織部位を優先的に標的とさせる送達系を設計するためには通常注意しなければならない。
【０１０８】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータを、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を公式化するために用いることができる。そのような組成物の投薬量は、毒性が低いかまたは毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される投与形態および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変化する可能性がある。任意の組成物について、治療有効量は、最初は細胞培養アッセイから推定することができる。用量を動物モデルで公式化して、細胞培養で決定されるＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する試験粗性物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を得ることができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量を更に正確に測定することができる。血漿中レベルを、例えば、高性能液体クロマトグラフィーによって測定することができる。
【０１０９】
脂肪関連身体組成または体重障害、例えば肥満、脂肪異栄養症、糖尿病またはメタボリックシンドローム、線維症およびガンの治療薬物療法が想定される場合、適切な投薬量は、試験対象の体重１キログラムあたりの生物活性剤の最大耐量、すなわちＭＴＤを決定するための動物実験を用いて決定することもできる。一般的に、試験される少なくとも１つの動物種はほ乳類である。当業者は、規則どおり用量を有効性について外挿し、ヒトをはじめとする他の種に対する毒性を回避する。有効性のヒト実験をおこなう前に、第１相臨床研究は安全な用量を確立するのに役立つ。
【０１１０】
さらに、生物活性剤を、例えば、生物活性剤の安定性を増強するか、または他の方法でその薬理学的特性を増強する（例えば、インビボ半減期を増加させる、毒性を減少させる、など）様々な確立された組成物または構造とカップリングまたは複合化させることができる。
【０１１１】
そのような治療薬を、以下でさらに詳細に記載するように、限定されないが、吸入、皮下（ｓｕｂ−ｑ）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、腹腔内（ＬＰ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）、もしくはクモ膜下腔注射をはじめとする当業者に公知の任意の数の方法により投与することができるか、または局所的に塗布することができる（経皮、軟膏、クリーム、塗剤、点眼剤など）。
【０１１２】
ここで記載される組成にしたがって使用するための医薬組成物は、通常の方法で、１以上の生理学的に許容される担体または賦形剤を用いて処方することができる。
【０１１３】
医薬組成物は、例えば、ｐＨ、オスモル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭い、無菌、安定性、溶解または放出速度、組成物の吸着または透過を修飾、維持、または保存するための処方材料を含むことができる。好適な処方材料としては：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンおよびリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムおよび亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩および他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールおよびグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、およびヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；フィラー；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースおよびデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンおよびイムノグロブリン）；着色剤、矯味矯臭剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ペプチド；塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸および過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールおよびソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０およびポリソルベート８０）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、およびチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性増強剤（例えば、スクロースおよびソルビトール）；張性増強剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物（例えば、塩化ナトリウムまたはカリウム）、マンニトール、およびソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤；および補助薬が挙げられるが、これらに限定されるものではない（“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  （Ｇｅｎｎａｒｏ，  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９９０））。
【０１１４】
さらに、記載された治療用ペプチドを半減期延長ビヒクルと連結させることができる。ある例示的な半減期延長ビヒクルは当該技術分野で公知であり、Ｆｃドメイン、ポリエチレングリコール、およびデキストランが挙げられるが、これらに限定されるものではない（例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ９９／２５０４４号を参照のこと）。
【０１１５】
これらの薬剤は、注射、たとえばボーラス注射または持続注入による非経口投与用に処方することができる。注射用処方は、単位投与形態で、例えばアンプル中または多回投与容器中で、防腐剤を添加して提供することができる。組成物は、油性もしくは水性ビヒクル中懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態をとってもよく、懸濁化剤、安定剤および／または分散剤などの処方剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔ）を含んでもよい。別法として、活性成分は、例えば無菌パイロジェンフリー水などの好適なビヒクルで使用前に構成するための粉末形態であってよい。
【０１１６】
薬剤はさらに、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの通常の坐剤基剤を含む坐剤または停留浣腸などの直腸投与用組成物として処方することもできる。
【０１１７】
先に記載された処方に加えて、薬剤はさらに、デポー製剤として処方することもできる。そのような長時間作用型処方は移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。例えば、薬剤は、好適なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容される油中エマルジョンとして）、イオン交換樹脂と、または難溶性誘導体として、例えば、難溶性塩として処方することができる。組成物は、所望により、活性成分を含む１以上の単位投与形態を含んでもよいパックまたはディスペンサー装置中で提供することができる。パックは、例えば金属またはプラスチックホイル、例えばブリスターパックを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための使用説明書を添付してもよい。
【０１１８】
活性組成物は、当業者に周知である制御放出手段または送達装置によって投与することができる。例としては、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８号、同第１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、および同第５，７３３，５６６号で記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧系、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはそれらの組み合わせを用いて、１以上の活性成分の徐放または制御放出を提供するためにそのような投与形態を使用して、様々な割合で所望の放出プロフィールを提供することができる。例示的持続放出性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第ＥＰ０５８，４８１号を参照のこと）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（例えば、Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６，  １９８３を参照のこと）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（たとえば、Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  １５：  １６７−２７７，  １９８１、およびＬａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  １２：９８−１０５，  １９８２を参照のこと）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，  ｓｕｐｒａ）、およびポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第ＥＰ１３３，９８８号）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。持続放出組成物はリポソームを含んでもよく、これは当該技術分野で公知のいくつかの方法によって調製することができる（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：３６８８−３６９２，  １９８５、ならびに欧州特許出願公開第ＥＰ０３６，６７６号、同第ＥＰ０８８，０４６号、および同第ＥＰ１４３，９４９号を参照のこと）。本明細書中に記載されるものをはじめとする当業者に公知の好適な制御放出処方は、本発明で開示される組成物と使用するために容易に選択することができる．ある実施形態は、限定されないが、制御放出のために適応される錠剤、カプセル、ジェルキャップ、およびカプレットなどの経口投与のために好適な単一単位投与形態を含む。
【０１１９】
全ての制御放出製剤は、それらの制御されていないカウンターパートによって達成されるよりも治療を改善するという共通の目標を有する。理想的には、薬物治療における最適に設計された制御放出製剤の使用は、状態を治癒または制御するために最少の製剤原料が最小時間で使用されることによって特徴づけられる。制御放出処方の利点としては、薬物活性の拡大、投薬頻度の減少、および患者コンプライアンスの増大が挙げられる。加えて、制御放出処方を用いて、作用の開始時間または他の特性、例えば薬物の血中レベルに影響を及ぼすことができ、かくして副（例えば、有害）作用の発生に影響を及ぼすことができる。
【０１２０】
ほとんどの制御放出処方は、所望の治療効果を速やかにもたらす活性成分の量をまず放出し、長期間にわたってこのレベルの治療または予防効果を維持するための活性成分の他の量を徐々にそして継続的に放出するように設計される。活性成分のこの比較的一定なレベルを体内で維持するために、薬物は、代謝され、身体から排出される活性成分の量を置換する速度で投与形態から放出されなければならない。活性成分の制御放出は、ｐＨ、温度，酵素、水、または他の生理的条件もしくは組成物を含むがこれらに限定されない様々な条件によって刺激される可能性がある。
【０１２１】
場合によっては、開示された方法および組成物の活性成分は、好ましくは患者に同時に、または同じ投与経路で投与されない。したがって、いくつかの実施形態では、開業医によって使用される場合、適切な量の活性成分の患者への投与を簡素化することができるキットがある。
【０１２２】
典型的なキットは、開示された１以上の治療薬の１つの単位投与形態を、単独または開示された組成物と組み合わせて用いることができる他の薬剤の１つの単位投与形態と組み合わせて含む。開示されたキットは、活性成分を投与するために用いられるデバイスをさらに含むことができる。そのようなデバイスの例としては、シリンジ、ドリップバッグ、パッチ、および吸入器が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１２３】
開示されたキットは、１以上の活性成分を投与するために使用できる薬剤的に許容されるビヒクルをさらに含むことができる。例えば、活性成分が非経口投与のために再構成されなければならない固体形態で提供される場合、キットは、活性成分を溶解させて、非経口投与に好適な、微粒子のない無菌溶液を形成することができる、好適なビヒクルの密封容器を含むことができる。薬剤的に許容されるビヒクルの例としては：注射ＵＳＰ用水；水性ビヒクル、たとえば限定されないが、塩化ナトリウム注射、リンガー注射、デキストロース注射液、デキストロースおよび塩化ナトリウム注射液、ならびに乳酸加リンガー注射液；水混和性ビヒクル、たとえば限定されないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール；ならびに非水性ビヒクル、たとえば限定されないが、コーン油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、および安息香酸ベンジルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。しかしながら、特定の実施形態において、開示された処方は、アルコールもしくは他の共溶媒、油またはタンパク質を含まない。
【０１２４】
以下の段落は、様々な実施形態の実施例に関するさらなる詳細を提供する。以下の実施例で開示される技術は、本発明者らによって十分に機能することが見出された技術および／または組成物であることは当業者によって理解されなければならない。しかしながら、当業者は、開示を考慮して、開示された特定の実施形態において多くの変更をなすことができ、それでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることが理解するはずである。これらの実施例は、本明細書中に記載する方法および系の説明であり、本発明の範囲を限定することは意図されない。具体的な詳細をＷＡＴ７ペプチド（配列番号１３および１４）の単離および特性化に関して提供するが、開示された方法の一般的な適用可能性を示すさらなるＷＡＴターゲティング（配列番号１〜１６）よび肺ターゲティングペプチド（配列番号１７〜２４）も提供される。
実施例
【０１２５】
細胞単離および培養：メスＣ５７ＢＬ／６マウスをペプチドライブラリのスクリーニングのために使用した。系統／性に特異的な変数を除外するために、メスＣＤｌマウスをペプチドホーミング検証およびその後の細胞単離のために使用した。全ての研究についてマウスをＡｖｅｒｔｉｎで麻酔した。
【０１２６】
皮下および腹腔内ＷＡＴならびに対照臓器由来の細胞のＷＡＴ細胞亜集団を米国特許出願第２００９０１０４１１７号ならびに、例えば、Ｔｒａｋｔｕｅｖ，  ｅｔ．  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄおよびＺｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００９，  ｉｂｉｄですでに記載されているようにして分離した。細かく刻まれた膿（Ｍｉｎｃｅｄ  ｉｓｓｕｅｓ）をディスパーゼ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）／コラゲナーゼＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）中で消化させた。脂肪細胞を２００ｇ遠心分離後に浮遊する細胞フラクションとして分離した。対照臓器からのＳＶＦフラクションおよび細胞を、７０μｍのＮｉｔｅｘメッシュを通してろ過した。単離された細胞を、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と以下のＩｇＧクローンを用いて個々の細胞集団に分離した：ＰＥ結合抗ＣＤ３４ＭＥＣ１４．７、ＡＰＣ結合抗ＣＤ３１ＭＥＣ１３．３、およびＡＰＣ−Ｃｙ７結合ＣＤ４５  ３０−Ｆ１１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。必要な場合には、細胞を、コーティングされていないプラスチック上、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ中で成長させた。プラスチックに一晩付着させたのち、間質細胞培養物から記載される汚染細胞集団を洗い流した（Ｔｒａｋｔｕｅｖ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９，  ｉｂｉｄ）。培養された細胞集団の純度は、ＬＳＲ  ＩＩおよびＦａｃｓＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＣＤ３１およびＣＤ４５抗体でのフローサイトメトリーによって確認した。
【０１２７】
ファージライブラリースクリーニング：ｐＩＩＩタンパク質上に挿入物ＣＸ７Ｃ、ＣＸ８Ｃ、およびＣＸ９Ｃを提示するＭｌ３由来のバクテリオファージベクターｆＵＳＥ５に基づくランダムペプチドライブラリを、尾静脈注射によるインビボでの同期バイオパニングに基づいて実施されたスクリーンのために、合わせた１０１０ＴＵの混合ライブラリと混合（１：１：１）した（例えば、ＵＳ２００５００７４７４７およびＡｒａｐ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：  １２１−１２７，  ２００２；  Ｋｏｌｏｎｉｎ，  ｅｔ  ａｌ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０：  ９７９−９８１，  ２００６を参照のこと）。
【０１２８】
競合ホーミング実験のために、１１の選択されたファージクローンのそれぞれについて５×ｌ０９ＴＵを混合し、合わせた５．５×ｌ０１０ＴＵを注射した。個々のクローの検証のために、各ファージクローンについて１×１０１０ＴＵを注射した。１時間の循環および１０ｍｌのリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）での心臓潅流後、ＷＡＴ、脛骨／大腿骨、骨関連骨格筋、および肺を集めた。脛骨／大腿骨をフラッシュすることによって骨髄を単離した。造血および内皮細胞を、抗ＴＥＲ１１９、抗ＣＤ３１、および抗ＣＤ４５抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって各臓器の細胞懸濁液から除去し、その後、残存する細胞をＦＡＣＳによって処理して、ＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞を精製した。Ｋ９１大腸菌を感染させることによって、結合ファージを回収し、ファージ変換単位（ＴＵ）計数によって定量化し、Ａｒａｐ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２，  ｉｂｉｄ  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｎｉｎ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  ｉｂｉｄで記載されているようにしてペプチドコーディングＤＮＡの配列決定のために処理した。保存されたペプチドモチーフの同定のために、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェアを使用した。
【０１２９】
マウス組織および免疫蛍光による細胞分析：化学的に合成され、それらのＮ末端システインおよびＣ末端システインによって環化され、少なくとも９５％純度まで精製され（Ｇｅｎｅｍｅｄ）、そしてビオチニル化されたペプチドを尾静脈から注射し（５００μｇ）、そして１時間循環させた。全組織分析に関して、臓器を、１０ｍｌのＰＢＳで心臓潅流した後の麻酔下のマウスから回収した。抗原の免疫学的局在決定を、すでに記載されているようにして、ＥＤＴＡに基づく抗原回復（ＤＡＫＯ）によって、０．３％トリトンＸ−１００で洗浄し、そして無血清タンパク質ブロック（ＤＡＫＯ）中でブロックして、ホルマリン固定された組織のパラフィン切片で実施した（Ａｒａｐ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  ｉｂｉｄ  ａｎｄ  Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  ｉｂｉｄ）。ストレプトアビジン−Ｃｙ３（Ｚｙｍｅｄ、１：２０）または一次抗体（４℃、１２〜１６時間）および二次抗体（ＲＴ、１時間）をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中に適用した。以下の一次抗体を使用した：Ｓｉｇｍａから得られるウサギ抗ファージ抗体（１：５００）、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから得られるヤギ抗マウスＣＤ３１（１：１５０）、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるラット抗マウスCD45(1:1５０）、Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓから得られるウサギ抗マウスＰＤＧＦＲ抗体（１：１５０）、およびＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから得られるヤギ抗マウスＤＣＮ抗体（１：２００）。二次ロバＡｌｅｘａ４８８−結合およびＣｙ３結合ＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈからのものであった。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８またはＴＯＰＲＯ３で染色した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。チャンバースライド中で培養した細胞（Ｌａｂ−Ｔｅｋ  ＩＩ；  Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を、Ｇｅｎｅｔｅｘから得た抗ＧＦＰ抗体（１：１００）を用いた免疫蛍光法に付した。免疫染色された組織切片または細胞調製物をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  １Ｘ７０倒立蛍光顕微鏡／Ｍａｇｎａｆｉｒｅソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）で蛍光画像を取得した。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５顕微鏡／ＬＡＳ  ＡＦソフトウェアで共焦点画像を取得した。
【０１３０】
親和性クロマトグラフィーによるタンパク質の単離：０．２ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド／Ｒｏｃｈｅ  ＰＩカクテルを含むＰＢＳ中、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いることによって細胞を破壊した；遠心分離（４℃にて３０分間１５，０００ｇ）を使用して、可溶性タンパク質を膜ペレットから分離した。可溶化  ｏｆ細胞膜タンパク質の可溶化は、米国特許出願第２００９０１０４１１７号およびＮｉｅ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００８  （Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２６：  ２７３５−２７４５）で以前に記載されているようにして実施した。手短に言うと、膜ペレットを、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのｎ−オクチル−ベータ−Ｄ−グルコピラノシド、０．２ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド／Ｒｏｃｈｅ  ＰＩカクテル（カラム緩衝液）を含有するＰＢＳ中で一晩４℃にてインキュベートし、そして遠心分離（４℃にて３０分間１５，０００ｇ）を実施して不溶性デブリを除去した。ＷＡＴ７受容体精製に関しては、５ｍｇのシステイン−環化ペプチド（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｍｔｈｅｓｉｓ）を０．２５ｍｌのＥＤＣセファロース（Ｐｉｅｒｃｅ）上に（Ｃ末端により）カップリングさせ、１％トリトンＸ−１００を含むカラム緩衝液でカラムを平衡化した。ペプチド結合樹脂を４０ｍｇの膜抽出物とともにインキュベートし、カラム緩衝液で重力流によって十分に洗浄した。溶出（０．５ｍｌフラクション）は、１．０ｍＭペプチド、続いて０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）を用いて実施した。溶出液に関するパニングについては、１０５ＴＵの表示されたファージクローン２０μｌを、プラスチック上で固定されたＭｉｃｒｏｃｏｎフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩された各フラクション２ｍｌとともに一晩４度にてインキュベートした。非結合ファージをＰＢＳで十分に洗い流し、次いで結合ファージを宿主Ｋ９１大腸菌を直接プレート上で感染させることによって定量化した。残存するＷＡＴ７−ファージ結合フラクションをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥに付した；ＷＡＴ７特異的バンドにおける質量分析法タンパク質同定をＰｒｏｔＴｅｃｈによって実施した。ΔＤＣＮの精製に関しては、２０ｍｇの抗ＤＣＮ抗体をタンパク質Ａ／Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）上で固定し、そして４０ｍｇの膜抽出物とともにインキュベートした。タンパク質Ａ／Ｇ結合緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で洗浄したら、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって同定された４０ｋＤａバンドをベイラー医科大学プロテオミクス施設でＮ末端マイクロシーケンシングに付した。レジスチンの精製に関しては、環化ＫＬＨ結合システイン−環化ＷＡＴ７に対して産生した免疫前および免疫後ウサギ抗血清（Ｇｅｎｅｍｅｄ  Ｓｙｍｔｈｅｓｉｓ）を使用した。抗体特異性を検証するために、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）標識されたペプチドを、ＧＳＴタグを有するＣＸ７Ｃアミノ酸をフレーム内でコード化するフラグメントをｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターにクローンし、そしてＧＳＴ  Ｂｉｎｄ  キット  （Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用することによって産生した。ＧＳＴ結合ペプチド  ＫＧＧＲＡＫＤ（配列番号２５および２６）およびプロヒビチン、ならびにペプチドｍＰｅｐ  ＷＬＧＥＷＬＧ（配列番号３５および３６）はすでに記載されている。Ｎｉｅ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ。
【０１３１】
ＷＡＴ７特異的抗体に対するタンパク質結合を、前述の様に全マウスＷＡＴ  ＳＶＦ抽出物から取り出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、そしてＰｒｏｔＴｅｃｈによって質量分析により同定した。ビオチニル化ＡＳＣタンパク質の単離に関しては、ストレプトアビジン結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２７０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。原形質膜タンパク質の分析に関しては、原形質膜濃縮フラクションを、Ｑｐｒｏｔｅｏｍｅ  ＰＭ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて調製した。細胞表面タンパク質ビオチニル化は、Ｋｏｌｏｎｉｎ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １０：  ６２５−６３２，  ２００４）で記載されているようにして、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて実施した。
【０１３２】
イムノブロッティングおよび結合アッセイ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割したタンパク質調製物をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＦＬ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上にブロットし、Ｏｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でブロックし、そしてヤギ抗ＤＣＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：１，０００）、ウサギ抗ＡＮＸ２Ａ（Aviva、１：１，０００）、ウサギ抗マウスｂ−アクチン（Ａｂｅａｍ、１：１０，０００）抗体、または表示されたようなＷＡＴ７に対する免疫前および免疫後抗血清（１：１，０００）でプローブした（ＰＢＳ／０．０５％トリトンＸ−１００中）。抗ヤギＩＲＤｙｅ８００ＣＷまたは抗ウサギＩＲＤｙｅ  ６８０（どちらもＬｉｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）を用いたＯｄｙｓｓｅｙ画像化システムによってシグナルを検出した。ウシＤＣＮはＳｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、ＮＳＯ由来のマウスＤＣＮはＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。マウスＤＣＮｃＤＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＷＡＴ全ＲＮＡから生成させた。細菌発現に関しては、マウスＤＣＮｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）またはＣＬＩＣ４ｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）のアミノ酸１〜３５４および４５〜３５４をコード化するフラグメントをフレーム内でＨｉｓ６ＴａｇとｐＥＴ２８ａベクターにそれぞれクローンすることによって、完全長マウスコアＤＣＮおよびΔＤＣＮイソ型を産生させた。Ｈｉｓ６標識されたタンパク質をＨｉｓ−Ｔａｇキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製した。ＥＬＩＳＡ結合アッセイに関しては、１００μｌの１０μｇ／ｍｌの表示されたｉＨｉｓ６−ＤＣＮ調製物、Ｈｉｓ６−ＣＬＩＣ４（対照Ｈｉｓ６−タンパク質）、ＮＳ０細胞発現マウスＤＣＮ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、精製ウシＤＣＮ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはＢＳＡを、Ｍａｘｉｓｏｒｂ  Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅｓ（９６ウェル；ＮＵＮＣ）上に一晩４℃にてコーティングし、固定し、続いて３％ＢＳＡでブロックし、次いで１００μｌの表示された濃度のＷＡＴ７または対照ＷＡＴ２ペプチドとともにインキュベートした。アジポカイン結合アッセイに関しては、ＨＥＫ２９３細胞中で産生されたＦＬＡＧ標識されたマウスレジスチン（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または対照ＦＬＡＧ−ＢＡＰタンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を表示された濃度でインキュベートした。結合したペプチドまたはＦＬＡＧ−レジスチンを対応するウサギ抗ペプチドＧｅｎｅｍｅｄ抗体（１：２，０００）またはウサギ抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、１：２，０００）、続いて二次ヤギ抗ウサギＨＲＰ−結合抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１：５，０００）でプローブし、Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）基質でシグナル検出し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１３３】
機能アッセイ：安定に形質導入された細胞系を生成させるために、完全長マウスコアＤＣＮおよびΔＤＣＮイソ型をコードするｃＤＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ）フラグメントをｐＬＶＸ−ＡｃＧＦＰ−Ｃｌベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローンした。製造御者のプロトコルにしたがってＬｅｎｔｉ−Ｘ  ＨＴＸパッケージングシステムを用いてＬｅｎｔｉ−Ｘ２９３Ｔ細胞中でレンチウイルスを産生させた。ｚベクターだけを有するレンチウイルス、ＤＣＮ、またはΔＤＣＮを使用して、ＮＩＨ３Ｔ３−Ｌ１細胞（ＡＴＣＣ）を形質導入した。７２時間後、細胞を２μｇ／ｍｌのピューロマイシンで４〜５日間処理して、安定な細胞系について選択し、これをその後、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含む培地中で維持した。ＭＴＴアッセイによって細胞増殖を測定するために、等しい数（５，０００細胞ｓ）の  初期継代レンチウイルス形質導入株（Ｐ２）を９６ウェルプレート上に蒔いた。表示された時点で、細胞をＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で４時間３７℃にて処理し、その後、蛍光を５６０発光および５９０励起波長で測定した。記載されるようなトランスウェルアッセイによって細胞移動を測定するために（Ｎｉｅ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ）、細胞をＤＭＥＭ／０．１％ＦＢＳ中で２時間欠乏させ、次いで２５，０００細胞をトランスウェル挿入物（５μΜ孔サイズ）上で同じ培地中に播種した。挿入物を、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを含む下のチャンバーの最上部に置き、細胞をトランスウェルの底部まで１２時間移動させ、固定し、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、計数した。３Ｔ３−Ｌ１安定細胞系（６０，０００細胞／ウェル）を１２ウェルプレート上に蒔いた。Ｎｉｅ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄで記載されているようにして脂肪生成を誘導し、コンフルエンス後２日で、０．５ｍＭのＩＢ  ＭＸ、１．７ｍＭのインスリン、１ｕＭのデキサメタゾンおよび０．２ｍＭのインドメタシンを含有するＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを添加し、７２時間後、２日ごとにリフレッシュされる１．７ｍＭのインスリンを含有するＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳで置換した。
【０１３４】
統計分析：スチューデントｔ試験を用いることによって実施し、有意性はＰ＜０．０５に割り当てられる。
実施例１：ＡＳＣホーミングペプチドの同定
【０１３５】
Ｃ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−免疫表現型（図８Ｂ）に基づく臓器細胞懸濁液からの蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によるＭＳＣの単離方法をファージ提示と組み合わせ、ＡＳＣについて最適化した。（Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  ｉｂｉｄ）のすでに記載された「同期インビボバイオパニング」法を適応することによって、環状ＣＸ７Ｃ、ＣＸ８Ｃ、およびＣＸ９Ｃ（Ｃ：ジスルフィド結合したシステイン；Ｘ：任意のアミノ酸）ランダムペプチドライブラリの混合物をスクリーンした（図１Ａ）。このアプローチによって、ＭＳＣプローブを、１０１１を超えるコンビナトリアルペプチドのプールから選択することができた。スクリーン全体にわたって、ＷＡＴ由来のＭＳＣ上で回収されたファージ粒子、ならびに選択された対照臓器：肺、骨髄、および骨格筋（図ＩＢ）の数の漸進的濃縮が観察された。
【０１３６】
ペプチド挿入物をコードするＤＮＡの配列決定によって、ＣＸ７ＣおよびＣＸ８Ｃライブラリ由来のクローンの選択が明らかになり、一方、ＣＸ９Ｃライブラリ由来のクローンは、おそらくは更に大きなペプチド挿入物をｐＩＩＩタンパク質中に含むファージの繁殖の欠点のために主に失われた。
【０１３７】
４ラウンドの同期インビボバイオパニング後に、ＡＳＣから１％を超える頻度で繰り返し回収された８ＣＸ７ＣおよびＣＸ８Ｃ配列が同定され、これをＷＡＴ１〜ＷＡＴ８と称した（下記表１を参照のこと）。平行して、合致した数の肺間質細胞（ＬＳＣ）へホーミングするペプチド挿入物を対照として配列化した。ＷＡＴホーミングペプチドはどれも肺で濃縮されなかった。肺で１％を超える頻度で繰り返し回収された４つの配列は、ＬＵ１〜ＬＵ４と呼ばれる（下記表１を参照のこと）。インビボでの個々のファージクローンの比較分析により、ＡＳＣについて最高の特異性を有するペプチドとして、ＬＳＣよりも１０００倍高いＡＳＣへホーミングするＷＡＴ７が明らかになった（図１Ｃ）。クローンＷＡＴ８は、ＳＰＡＲＣを模倣するすでに特性化されたペプチドであるｍＰｅｐと類似したレベルのＬＳＣと比較して、ＡＳＣについて若干の選好を示した（Ｎｉｅ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ）。この観察結果と一致して、ＷＡＴ８ペプチドの配列（ＣＧＱＷＬＧＮＷＬＣ：配列番号１５）はｍＰｅｐ（ＣＷＬＧＥＷＬＧＣ：配列番号３５）と類似していることが見出され、このことは、ＷＡＴ８ペプチドの見込みのある受容体としてのＭＳＣのすでに確立されたマーカーであるインテグリンβ１を示す。この研究の焦点はＷＡＴ特異的ＭＳＣであるので、このクローンをさらなる分析から除外した。最高の結合特異性を有するものを同定するために、他の選択されたペプチドをインビボ競合アッセイに付した。ペプチドＷＡＴ１〜ＷＡＴ７（配列番号１〜１４）およびＬＵ１〜ＬＵ４（配列番号１７〜２４）を示す１１のクローンについて等しい量のファージを混合し、マウスに注射した。ＷＡＴまたは肺のいずれかから単離されたＣ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞に関して選択された各ペプチドをコードするファージの頻度を定量化することによって、各クローンのホーミング特異性を評価した。上記データと一致して（図１Ｃ）、ペプチドＷＡＴ７は、ＷＡＴ細胞へリホーミングするその著しい能力に基づいて突出していた：それはＷＡＴから回収されたクローンの８７．４％であり、肺から回収されたクローンのわずか５．８％であった。相互に、クローンＬＵ−１およびＬＵ−２は肺へのリホーミング（それぞれ５２．２％および４０．２％）を示したが、ＷＡＴへのリホーミングは示さなかった（下記表１を参照のこと）。
実施例２：ＷＡＴ７（配列ＣＳＷＫＹＷＦＧＥＣおよびＳＷＫＹＷＦＧＥ（配列番号１３および１４））のペプチドターゲティングＡＳＣとしての検証
【０１３８】
組み合わせたホーミングデータに基づいて、最も明確なＡＳＣ−ターゲティングを示すペプチドＷＡＴ７（配列ＣＳＷＫＹＷＦＧＥＣ：配列番号１３）をさらなる分析のために選択した。ペプチドＬＵ２（配列ＣＥＳＧＦＰＴＶＧＣ配列番号１９）は肺において対照ペプチドターゲティングＭＳＣとして選択されたが、ＷＡＴにおいては選択されなかった。ＷＡＴ７のホーミングは、静脈内注射によってマウス組織におけるＷＡＴ７提示ファージの生体内分布を分析することによって検証した。マウス組織切片における免疫蛍光は、ファージ蓄積はＷＡＴの間質／血管系と関連するが（図２Ａ）、肺（図２Ｂ）または他の対照臓器の間質／血管系とは関連しないことを示した。相互に、ＬＵ２蓄積は、肺の間質／血管系と関連するが（図２Ｄ）、ＷＡＴの間質／血管系とは関連しなかった（図２Ｃ）。ペプチドがファージ背景（ｃｏｎｔｅｘｔ）の外側にホーミングする能力を検証するために、ジスルフィド結合したシステインが横に並んだ、化学的に合成された環状ＷＡＴ７およびＬＵ２をビオチニル化した。各ペプチドをマウスに静脈内投与し、続いてストレプトアビジン結合フルオロフォアでの組織の免疫蛍光分析によって、ＷＡＴについてのＷＡＴ７の選択性が再現された（図２）。内皮細胞および周皮細胞をそれぞれ同定するＣＤ３１特異的およびＰＤＧＦＲ特異的抗体での同時染色を実施して、標的細胞集団を同定した。共焦点画像化によって、ＰＤＧＦＲ＋細胞と関連したＷＡＴ７の血管周囲の局在化が明らかになり（図２Ｅ−Ｇ）、これはＡＳＣとしてすでに確立された（Ｔｒａｋｔｕｅｖ，  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄを参照のこと）。重要なことには、ＷＡＴ７は、ＷＡＴに浸潤する内皮細胞（図３Ｅ）またはＣＤ４５＋造血細胞（図２Ｈ）のいずれとも同時局在化しなかった。ファージ生体内分布に関するデータと一致して、ＷＡＴ７ペプチドは、ＰＤＧＦＲ免疫蛍光によって明らかにされる多量のＭＳＣにも関わらず（図２Ｊ）、注射された動物の肺では検出されなかった（図２１）。インビボホーミングデータと一致して、ファージ提示ＷＡＴ７は、一次非継代ＡＳＣに対して高レベルの特異的結合を示したが、同じ動物から単離されたＬＳＣに対して、または３Ｔ３−Ｌ１マウス前脂肪細胞および４Ｔ１．２マウス  腺ガン細胞に対しては示さなかった（図９）。
実施例３：ＷＡＴ７受容体の単離
【０１３９】
ＡＳＣホーミングペプチドＷＡＴ７の受容体を同定するために、アフィニティクロマトグラフ法を使用した。膜タンパク質をマウスＷＡＴのＳＶＦから抽出し、そのカルボキシル末端によって樹脂と共有結合したシステイン−環化合成ＷＡＴ７に適用した。ＷＡＴ２ペプチド（配列ＣＹＫＮＶＤＳＧＧＣ：配列番号３）での溶出は、最初は非特異的に結合したタンパク質を除去するために使用された（図３Ａ）。特異的に結合したタンパク質を次いでＷＡＴ７で溶出させ、フラクションの独立したサブセット中に現れた。ＷＡＴ２ペプチドアフィニティカラムを平行して使用して、アフィニティ精製されたンパク質の特異性を確認した。プラスチック上にコーティングされ脱塩溶出液をファージ−ペプチド結合について試験することによって、これらのフラクションが、ＷＡＴ７提示ファージに結合するが、対照ＷＡＴ２提示ファージに結合しないタンパク質を含むことが確認された（図３Ｂ）。ＷＡＴ２をロードし、同じ膜タンパク質抽出物に暴露された対照アフィニティカラムからＷＡＴ７で溶出されたフラクションはＷＡＴ７提示ファージによって結合しなかった（図３Ｂ）。ＷＡＴ７で引き下ろされ、特異的に溶出されたタンパク質を含むフラクション５は、最高レベルのＷＡＴ７提示ファージによる結合を示し、受容体精製について選択された。このフラクション中に溶出されたタンパク質を濃縮し、変性剤濃度勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって分割された。ＷＡＴ７で特異的に溶出されるが、対照ペプチドで溶出されないバンドは、約４０ｋＤａで移動した（図３Ｃ）。このバンドの質量分光分析によって、デコリン（ＤＣＮ）を含むことが明らかになった，  あるいはプロテオグリカンＩＩとして知られる。
【０１４０】
ＤＣＮは広く研究された、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）中に分泌される分子であり、いくつかの生理的プロセスを制御するからである。その偏在性ｍＲＮＡ発現はＷＡＴにおけるＡＳＣへのＷＡＴ７ホーミングと合致しないようであった。したがって、マウス臓器部位におけるＤＣＮタンパク質レベルを分析するために、マウス組織切片のパネルを、完全長グリコシル化マウスＤＣＮに対して産生させた市販の抗体とともに共焦点免疫蛍光に付した。Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８による以前の研究（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｂｅｓ．  ３２：  １１  １３−１１２１，  ２００８）と一致して、ＤＣＮタンパク質は多くの臓器中で検出可能であったが、肺および骨髄と比較してＷＡＴで特に非常に豊富であった（図４Ａ〜Ｃ）。これは、平行して同じ節で評価されるように、全臓器で匹敵するＰＤＧＦＲの発現と著しい対照をなした（図４Ｄ〜Ｆ）。ＷＡＴにおけるＤＣＮおよびＰＤＧＦＲのパターンは区別できず、ＣＤ３１陽性内皮を取り巻く血管周囲細胞に対する各タンパク質の局在化は、ＷＡＴ中のＤＣＮのほとんどはＡＳＣによって産生されることを示した（図４Ａおよび４Ｄ）。しかしながら、肺（図５Ｂ）中およびいくつかの他の臓器（データは不掲載）中の血管のサブセットの血管周囲細胞によるＤＣＮ発現の検出は、ＭＳＣの異なる亜集団によるＤＣＮ発現レベルの差はＡＳＣへのＷＡＴ７ホーミングの原因となるには十分でない可能性があることを示唆した。
【０１４１】
ＷＡＴにおける非グリコシル化ＤＣＮの発現を特性化するために、マウス組織からのタンパク質抽出物を完全長マウスＤＣＮに対して産生されたポリクローナル抗体でのイムノブロッティングに付した（図５Ａ）。ＷＡＴのＳＶＦフラクション、ならびに肺および骨髄からの細胞質タンパク質の分析は、これらの臓器中の高分子量グリコシル化ＤＣＮイソ型の同等の発現を示した。対照的に、ＷＡＴは、約４０ｋＤａのデルマタン／コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖のない非グリコシル化コアＤＣＮの発現の増加を示した（図５Ａ）。興味深いことに、３つの臓器からの膜タンパク質のイムノブロット分析によって、他の臓器において、すでに特性化された非グリコシル化コアＤＣＮの分子量よりも低い分子量を有するＤＣＮイソ型のＷＡＴ特異的発現が明らかになった（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３２２  （  Ｐｔ  ３），  ８０９−８１４，  １９９７；  Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ  ３１８  （Ｐｔ  ３）：  ７７９−７８４，  １９９６）。肺および骨髄においてこのＤＣＮイソ型発現が存在しないことは、対照膜タンパク質であるアネキシンＩＩ（ＡＮＸ２Ａ）に対する抗体でプローブされた同じブロットから明らかであり、これを用いてタンパク質ローディングを制御した（図５Ａ）。イムノブロッティングをさらに、ＷＡＴにおけるどの細胞が低分子量ＤＣＮイソ型を発現するかを特徴付けるために使用した。これらの知見は、それが排他的にＡＳＣの膜（細胞質とは関連しない）フラクションと関連するが、分化脂肪細胞とは関連しないことを示す。図１６Ａ。
実施例４：新しいＤＣＮイソ型はＣＳＷＫＹＷＦＧＥＣ（配列番号１３）受容体である
【０１４２】
ΔＤＣＮと称するＷＡＴ特異的ＤＣＮイソ型の同一性を確立するために、ＤＣＮ抗体を使用して、ＷＡＴから単離されたＳＶＦのマウス膜抽出物からＤＣＮを精製した。ＰＡＧＥを変性させることによる免疫沈降したタンパク質の分析によって、ΔＤＣＮに対応する、予想される４０ｋＤａバンドが明らかになった（図５Ｂ）。バンドから切り取られたタンパク質のエドマン分解マイクロシーケンシングによって、このＤＣＮフラグメントはＬｅｕ−４５で開始し（図５Ｃ）、したがって、プロペプチド切断後に生成した、すでに記載された成熟コアＤＣＮよりも１４アミノ酸短いことが明らかになった（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ，  １９９７，  ｉｂｉｄ；  Ｒｏｕｇｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，  １９９６，  ｉｂｉｄ）。したがって、ΔＤＣＮは、コアＤＣＮ中に存在するＧＡＧ付着部位ＳｅｒＧｌｙ（図５Ｃ）が欠けているために、グリコシル化され得ない（Ｓｃｈｏｌｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：  ２８２７０−２８２８１，  １９９４）。ΔＤＣＮにないコアＤＣＮ配列でメチオニンが無いことは、ΔＤＣＮが選択的スプライシングによるよりはむしろ、タンパク質分解による切断によって生成することを示す。
【０１４３】
ＤＣＮをＷＡＴ７の標的として検証するために、Ｈｉｓ６標識されたタンパク質を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用した。これらのインビトロ結合研究は、ＷＡＴ７の組換え細菌的に精製されたマウスＤＣＮに対する明かな用量依存性結合を示し、一方、対照ペプチドＷＡＴ２はＤＣＮ結合を示さなかった。図１６Ｂ。興味深いことに、ＷＡＴ７は市販のグリコシル化ウシＤＣＮと、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）について観察されるバックグラウンドを超えるレベルで結合しなかった。ΔＤＣＮを含むさらなる分析は、ＷＡＴ７がΔＤＣＮ、ならびに細菌で発現（したがって、非グリコシル化）させたＤＣＮコアタンパク質と結合することを示した（図５Ｄ）。ウシまたはマウスグリコシル化ＤＣＮのいずれかとバックグラウンドＢＳＡ結合を超えるＷＡＴ７結合が無いこと（図５Ｄ）は、成熟ＤＣＮ上のＧＡＧ鎖がＷＡＴ７結合を防止することを示す。この発見は、なぜＷＡＴ以外の臓器中のＥＣＭへのグリコシル化ＤＣＮの偏在性分泌（Ｒｅｅｄ  ａｎｄ  Ｉｏｚｚｏ，  Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．  １９：  ２４９−２５５，  ２００２）がＷＡＴ７ペプチドのＷＡＴホーミングを妨害しないかを明かにすることができる。
【０１４４】
ＷＡＴ７の受容体としての役割を果たすために、ΔＤＣＮはＡＳＣの表面上に露出していなければならない。ＳＶＦの膜調製物全体から細胞膜タンパク質フラクションを単離することによって、ΔＤＣＮがＡＳＣの細胞膜と関連することが示された（図５Ｅ）。加えて、ΔＤＣＮがＡＳＣ上で提示されることを確認するための代替的アプローチを用いて、新たに単離されたＷＡＴ  ＳＶＦ細胞の表面タンパク質を記載されているようにしてビオチニル化し（Ｋｏｌｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４，  ｉｂｉｄ）、その後、ビオチニル化されたタンパク質を、ストレプトアビジンビーズを使用することによって単離し、抗ＤＣＮイムノブロッティングに付した。予想どおり、ΔＤＣＮが単離され、このことは、その細胞表面との関連を意味する（図５Ｆ）。興味深いことに、ＷＡＴ  ＳＶＦ細胞をプラスチック上で、ＭＳＣ／ＡＳＣ増殖のために典型的に使用される条件で一晩培養すると、細胞表面タンパク質のプールからΔＤＣＮが消滅した（図５Ｆ）。このことは、インビボで起こる細胞表面上のΔＤＣＮの暴露が、細胞培養で保持されないことを意味する。最終的に、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞で発現された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と組換えにより融合したΔＤＣＮの細胞局在化は、レンチウイルスを用いることによって証明された（図５Ｇ）。対照ベクターで形質導入された細胞は主に核ＧＦＰシグナルを示し、これは完全長ＤＣＮ−ＧＦＰ融合を発現する細胞中の細胞質に再分配された。対照的に、ΔＤＣＮ−ＧＦＰを発現する細胞は、細胞表面結合ＳＰＡＲＣの局在化パターンと似た非常に明かな局在化パターンを示し（Ｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，  ｉｂｉｄ）、これは細胞膜ΔＤＣＮ局在化を確認する。
実施例５：ΔＤＣＮのＡＳＣ相互作用物質としてのレジスチン
【０１４５】
本発明者らによる以前の研究結果から、ペプチドは受容体の生物学的リガンドの受容体結合ドメインを模倣することによって細胞表面受容体を認識する傾向があることが示された。したがって、ＷＡＴ７−ΔＤＣＮ結合の背後の生物学的相互作用を特徴づけるため、そしてΔＤＣＮの生物学的リガンドを同定するために、ウサギをＫＬＨ−ペプチド複合物で免疫化することによって、ＷＡＴ７によって模倣されるマウスタンパク質の結合エピトープを認識することが予想される抗体がＷＡＴ７に対して誘発された。図６Ａは、生成したＷＡＴ７抗体がＷＡＴ７について高特異性を有し、スクリーンで単離された他のＡＳＣホーミングペプチドのいずれも認識しないことを示す。マウスタンパク質抽出物のイムノブロッティングは、ＷＡＴ７抗体によって認識される約１３ｋＤａタンパク質を同定した（図６Ｂ）。このタンパク質は、ＷＡＴ組織から新たに単離されたＳＶＦでは非常に多いが、肺または骨髄では多くない。興味深いことに、ＭＳＣ／ＡＳＣ増殖のために典型的に用いられる条件で、プラスチック上でＡＳＣを一晩培養すると、その発現は失われた（図６Ｂ）。この損失は、培養中のΔＤＣＮ細胞表面発現の損失と同時に起こり（図５Ｆ）、このことはＡＳＣ上のΔＤＣＮ暴露がそのリガンドの発現と関連することを示唆する。
【０１４６】
ΔＤＣＮリガンドを単離するため、そしてＳＦＶタンパク質抽出物に関する親和性クロマトグラフィーのためにタンパク質Ａ／Ｇビーズ上の固定された抗ＷＡＴ７イムノグロブリン（ＩｇＧ）を使用した。親和性−捕獲の生成物をＰＡＧＥによって分割し（図６Ｃ）、その後、約１３ｋＤａバンドを切り取った。質量分析によって、そのタンパク質は、ＷＡＴ分泌アジポカインとして機能することが知られているレジスチン（ＡＤＳＦ）として同定された（Ｓｔｅｐｐａｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：  ３０７−３１２，  ２００１；  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６：  １  １２５２−１  １２５６，  ２００１）。レジスチンのＤＣＮとの相互作用は以前には報告されていないので、ΔＤＣＮとの相互作用を直接確認するために、インビトロ結合アッセイをＦＬＡＧ標識されたマウスレジスチンで実施した。ＦＬＡＧ標識されたウシアルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）は負の対照としての役割を果たす（図６Ｄ）。レジスチンは、完全長ＤＣＮよりも１００倍低いモル濃度でΔＤＣＮと結合することが見出された。興味深いことに、相当するバックグラウンドＢＳＡおよびＢＡＰ結合から明かなように、それはグリコシル化マウスまたはウシＤＣＮとの結合で完全に非効率的であった。これらの結果は、レジスチンがΔＤＣＮのリガンドとしての役割を果たすことを意味する。
【０１４７】
３Ｔ３−Ｌ１細胞系由来の細胞は、脂肪細胞の生物学を研究するための広く認められたモデルである。ΔＤＣＮの機能を特徴づけるために前駆細胞を使用した。確立された３Ｔ３−Ｌ１培養にレンチウイルスによりΔＤＣＮ−ＧＦＰまたは完全長ＤＣＮ−ＧＦＰ融合を形質導入した；ＧＦＰベクター単独を対象として使用した（図５Ｇ）。ＭＴＴアッセイを用いた培養中２４時間後よいｂ４８時間後の細胞数の増加の分析によって、ＧＦＰまたは完全長ＤＣＮ−ＧＦＰを発現する細胞と比較して、ΔＤＣＮを発現する細胞の増殖の増加が示された（図７Ａ）。Ｂｏｙｄｅｎチャンバートランスウェルアッセイを使用することによる細胞移動の分析によって、ΔＤＣＮ発現細胞の侵襲性において有意な増加が示され、一方、完全長ＤＣＮを発現する細胞は、ＧＦＰを発現する細胞と比べて反対の傾向を示した（図７Ｂ）。これらの結果は、インビトロ掻創アッセイによって確認された（データは不掲載）。最終的に、細胞を脂肪生成誘導に付して、細胞分化に対する影響を試験した（図７Ｃ）。
実施例６：さらなるペプチドおよびヒト組織に対する結合の証拠
【０１４８】
ファージ提示によるマウス臓器のＭＳＣへホーミングするペプチドの選択を図８Ａに示し、この図は、同期インビボファージ提示スクリーニングプロセスの概略的説明を含む。すべての選択ラウンドで、ファージをｉ．ｖ．投与し、同時に標的組織から回収し、増幅させ、次いでプールし、そして選択の次のラウンドで使用した。後のラウンドで増大したファージ変換単位（ＴＵ）の回収は、標的臓器へ優先的にホーミングするペプチドの選択を反映する。
【０１４９】
図８Ｂは、フローサイトメトリーを用いたＭＳの同定を示す。代表的な皮下ＷＡＴ分析を示す。ＣＤ３４＋について陽性であった生存細胞のゲーティング(ｇａｔｉｎｇ）（左の散布図）をまず行い、次いでＣＤ３１およびＣＤ４５の発現に基づいて（右の散布図）、ＡＳＣ細胞と組み合わせて、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ３１−細胞として同定し、これは、もとの散布図のＱ３において稀な紫色事象（ｐｕｒｐｌｅ  ｅｖｅｎｔ）として現れた。Ｑ１で現れる紫色事象は、ＣＤ３４＋ＣＤ４５−ＣＤ３１＋上皮細胞（ＥＣ）に対応する。Ｑ２およびＱ４で現れる事象は、ＣＤ４５＋造血細胞に対応する。
【０１５０】
一連のペプチドクローンを同定し、下記表１で記載するような脂肪幹細胞（ＡＳＣ）および肺幹細胞（ＬＳＣ）上でのファージ提示スクリーンを用いて濃縮した。
【表１】
2014510758.tif 000003
【０１５１】
上記表１に示すのは、ＣＤ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞上で同期インビボバイオパニング４ラウンド後のＷＡＴ（ＷＡＴ中％）または肺（肺中％）内に存在する表示されたＷＡＴまたはＬＵ挿入物を有していた、配列決定されたファージクローンのパーセント（％）である。
【０１５２】
各クローンの選択性を示すために、クローンＷＡＴ１、ＷＡＴ２、ＷＡＴ３、ＷＡＴ４、ＷＡＴ５、ＷＡＴ６、ＷＡＴ７、ＬＵ１、ＬＵ２、ＬＵ３およびＬＵ４について等しい量のファージを混合し、混合し、そしてマウスに注射して、何パーセントが戻った（リホーミング）したかを測定し、（ＷＡＴへのリホーミング（％））または肺（肺へのリホーミング（％））のいずれかから単離されたＣ３４＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−細胞上に表示されたＷＡＴまたはＬＵ挿入物を有する配列決定されたファージクローンのパーセント（％）を示す。
【０１５３】
ファージ提示スクリーンで単離されたペプチドのいくつかの選択性を、ファージセル結合アッセイを用いて評価した。ペプチドＷＡＴ１、ＷＡＴ２、ＷＡＴ７、ＬＵ２、ｍＰｅｐまたはＦｄ−Ｔｅｔを発現するファージを：（１）４Ｔ１．２細胞、ヒト乳ガン由来の内皮細胞（２）マウス３Ｔ３−Ｌ１細胞（脂肪細胞様表現型に分化することができる前脂肪細胞系）；（３）ＷＡＴ由来の一次マウスＳＶＦ細胞；（４）肺由来の一次マウスＳＶＦ細胞、および；（５）ＷＡＴ由来のヒトＡＳＣ細胞の４代継代（本来は脂肪吸引術中に入手に関する）上の結合について分析した。標的細胞を２．５ｍＭのＥＤＴＡで分離させ、１００，０００細胞を、１％ＢＳＡを含む０．２ｍｌのＲＰＭＩ中に再懸濁させた。表示されたペプチド発現ファージをファージ対象（挿入物なし）Ｆｄ−ｔｅｔとともに１時間３７℃にて添加した（１０８ＴＵ）。１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩで３回洗浄後、細胞をホモジナイザーでダウンスした。回収されたファージを用いてＫ９１大腸菌を感染させ、そしてテトラサイクリン選択後に、コロニーを数えて、平均変換単位（ＴＵ）を定量化した。図９Ａに示したのは、３回の個別のプレーティングの平均値＋ＳＥＭ（エラーバー）である。図９Ａで提示した知見を得るために使用したヒトＡＳＣは、これらの細胞に対するＷＡＴ７結合を示すために使用される場合は４継代を受けていた。ΔＤＣＮは新たに単離されたマウスＡＳＣと結合し、繰り返し継代されたマウスＡＳＣとは十分に結合しないので、ΔＤＣＮ／ＷＡＴ７ターゲティング系におけるこの優先性は保存される可能性があると仮定した。
【０１５４】
実際にＷＡＴ７が非継代ヒトＡＳＣと結合することを証明するために、新鮮なヒトＡＳＣを標的組織として使用した（ファージ発現ペプチドのそれぞれの結合を図９Ｂで示す。したがって、非継代ヒトＡＳＣはＷＡＴ１およびＷＡＴ２ペプチドよりも良好に結合することが示された。この活性は、新たに単離されたマウスＡＳＣに対するＷＡＴホーミングペプチドのパターンを反映し、これは、ＤＣＮ生物学が保存され、デルタ−ＤＣＮ／ＷＡＴ７ターゲティング系は、ヒトを含む他のほ乳類対照で使用することができることを示唆する。
実施例７：細胞毒性ペプチドおよびペプチド組成物のインビボ活性の証拠
【０１５５】
標的化アミノヘキサン酸結合細胞毒性タンパク質分解耐性全Ｄ−エナンチオマーペプチドは、関心のある細胞集団の選択的インビボ枯渇のために設計された。これらのペプチドは合成であり、２つの機能的：関心のある細胞上で異なって発現された受容体に結合するホーミング（細胞ターゲティング）ドメイン（この特定の例では、環状ＷＡＴ７（配列番号１３））および細胞毒性ドメインから構成されて、ペプチドを内在化させる細胞のアポトーシス死を誘発した。ホーミングペプチドは、典型的には７〜８アミノ酸長であり、環状（２つのジスルフィド結合したシステインによって拘束される）である。細胞毒性ドメインは、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２と称される両親媒性ペプチド配列ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ（配列番号３１）であり、これは受容体媒介細胞内在化によってミトコンドリア膜を破壊し、プログラムされた細胞死（アポトーシス）を引き起こした。両ドメイン中の全アミノ酸はＤ−エナンチオマーであり、これはインビボでのタンパク質分解に対して耐性であり、したがって、全身投与によるペプチドの長期効果を可能にする。２つのドメインを接続するリンカーはアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）：ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯであり、これもインビボでのプロテアーゼによる切断に対して耐性である。結果として得られるキメラペプチド（図１０で図示される）は、Ｃｅｌｔｅｋによって製造された、ＷＡＴ７（配列番号１３）−ＫＬＡＫＬＡＫ２（配列番号３１）タンパク質組成物である。細胞毒性ペプチド組成物が細胞集団を選択的に枯渇させる作用を証明するために、本明細書中で導入された組成物設計に基づいて設計され、製造されたペプチドをマウスに全身的に注射した。この技術は、白色脂肪（脂肪）組織（ＷＡＴ）における脂肪間質／幹細胞（ＡＳＣ）を標的とするペプチドを用いて検証された。図１１で示されるように、初代マウスＡＳＣは、トリパンブルー色素排除染色を用いて実証されるように、濃度に依存した方法で、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ．２での治療によって効率的に殺滅された（図１１）。フローサイトメトリーおよびＡＰＯ−ＴＲＡＣＥ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して、細胞毒性ペプチド暴露によって誘導される細胞死メカニズムとしてのアポトーシスを立証するアポトーシスの誘発の証拠が確立された（図１２）。
【０１５６】
図１３で示されるマウスによって証明されるように、２ｍｇのＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ．２全Ｄ−ペプチドを肥満マウスに注射すると、腹腔内脂肪組織が明らかに減少した。この減少は、注射後４８時間で明示されるアポトーシス細胞死によるＡＳＣの標的化枯渇によるものであった（図１４を参照のこと）。皮下ＷＡＴ中に存在するＡＳＣの量（パネルＥ対Ｆ）は、標的化細胞毒性ペプチド、ＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２全Ｄ−ペプチドでの治療によって減少し、腹腔内ＷＡＴ中に存在するＡＳＣの量は、さらに大幅に減少し（パネルＧ対Ｈ）、これはさらに、上のパネル（パネルＡ対Ｂ）で示されるか、または蛍光で示される腫瘍（パネルＣ対Ｄ）の減少によって立証される、腫瘍壊死をもたらす。図１５は、標的化細胞毒性ペプチドであるＷＡＴ７−ＫＬＡＫＬＡＫ２全Ｄ−ペプチドでの治療の結果、皮下および腹腔内脂肪組織の両方に存在するＡＳＣに関与するアポトーシス細胞が生じたことを示す（左横パネル）。対照的に、処置マウスの腎臓または末梢血から得られた細胞でアポトーシス細胞死は確認されず（図１５の右側のパネル）、アポトーシス誘発ペプチドは、キメラ標的化ペプチドタンパク質組成物のターゲティング部分からタンパク質分解によって放出されなかったことを示す。ペプチド用量を増加させてもＭＴＤに達しなかった。このことは、記載された方法によって構築される細胞毒性標的化ペプチドがタンパク質分解による切断に対して耐性であり、ＡＳＣを首尾よく標的とし、殺滅させ、そして脂肪組織を減少させるためにインビボで使用できることを意味する。
【０１５７】
更に努力することなく、当業者は、本明細書中の説明を用いて、本発明の方法を最大限利用することができると考えられる。本明細書中に記載される実施形態は例示的であって、開示の残りを決して限定するものではないと解釈されるべきである。好ましい実施形態を示し、記載してきたが、ここで開示される方法の精神および教唆から逸脱することなく当業者はこれらの多くの変形および変更をなすことができる。したがって、保護の範囲は、前述の記載によって限定されないが、特許請求の範囲の対象物のあらゆる等価物を含む特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書中で飲用される全ての特許、特許出願および刊行物の開示は、本明細書中で記載されるものと一致し、補足的である手順または他の詳細を提供する範囲で、参照することによって本明細書中に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ−Ｆ】
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【図２Ｇ−Ｊ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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