【事件の表示】
　特許第２５８０４５８号「ヒアルロン酸の精製方法および眼科用の純粋なヒアルロン酸の分画」の請求項１〜４、９、１０、２３〜２６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２５８０４５８号の請求項１、２、２２〜２５に係る特許を取り消す。
　同請求項３、８、９に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２５８０４５８号発明は、平成４年４月１６日（パリ条約による優先権主張１９９１年４月１９日、イタリア共和国）に国際出願されたものであって、平成８年１１月２１日に特許権の設定の登録がされたものである。その後、(1)藤野清也、(2)参天製薬株式会社、(3)中野宗昭、(4)生化学工業株式会社、(5)東川哲郎及び(6)セイカガク　アメリカ　インコーポレーテッドにより特許異議の申立てがされ（以下、それぞれの異議申立を順に異議申立１〜６と記載する。）、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１０年７月２１日に訂正請求がされた後、訂正拒絶理由の通知、訂正拒絶理由の通知及び審尋がされ、それぞれに対して訂正請求の補正がされ、さらに取消理由を兼ねた訂正拒絶理由の通知がされ、意見書が提出された。　
　　
２．訂正請求について
（１） 訂正請求の補正について
　特許権者は、平成１１年４月２日に訂正請求書についての手続補正書を提出して、以下の補正をした。
補正事項１
　下記３．（１）に示す訂正後の請求項１の「７５０,０００Ｄ〜１,２３０,０００Ｄ……」の前に
「(i)ヒアルロン酸またはその塩を、その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質に接触させることによって、対応する４級アンモニウム塩に変換し；
(ii)該対応する４級アンモニウム塩を、そのようなアンモニウム塩を溶解することができる有機溶媒に溶解し；そして
(iii)この溶液を濾過し、ハロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸をナトリウム塩の形態で回収する；
ことを含む方法によって得られる、」を挿入する。
補正事項２
　訂正後の請求項１０（訂正前の請求項１１）の「(c)該処理したヒアルロン酸含有抽出物を４級アンモニウム塩の」を
「(c)該処理したヒアルロン酸含有抽出物を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩の」と補正する。
補正事項３
　下記３．（１） に示す訂正後の請求項２２に「請求項１に記載のヒアルロン酸分画」とあるのを、以下の語句で置き換える。
「７５０,０００Ｄ〜１,２３０,０００Ｄ の範囲の平均分子量を有し、以下の性質：
　(a)Ubbelhode吊下げ水平粘度計を用いてpＨ７.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ中にて２５℃で測定したときに、固有粘度数が１４.５〜２１dl／gの範囲内であること；
　(b)タンパク質含量がアルブミンで表して０.２％を越えないこと；
　(c)１％（w/v）水溶液で測定したときに、２５７nmおよび２８０nmのＵ.Ｖ.吸収が１.０Ａ.Ｕ.を越えないこと；
　(d)２０℃の温度で回転粘度計を用い、規定された剪断速度で、pＨ７.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ中の１％（w/v）溶液の動的粘度が以下の限界を越えないこと；
　　　　剪断速度 　　　　動的粘度（mＰａ.ｓ、２０℃）　
　　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−　
　　　　　１　秒-1　　　　２００００mＰａ.ｓを越えない 
　　　　１０　秒-1　　　　　２０００mＰａ.ｓを越えない 
　　　１００　秒-1　　　　　１０００mＰａ.ｓを越えない 
　　　３５０　秒-1　　　　　　５００mＰａ.ｓを越えない 　　
　　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−　　　　　　　
　(e) 硫酸化ムコ多糖含量がイオウとして０.０７％を越えないこと；
　(f) 鉄含量が１０ppmを越えないこと；および
　(g) 固有粘度数の評価によって測定して対応する平均分子量の減少で表したときに、自然放置および熱滅菌した分画の生理学的pＨの等張緩衝溶液の安定性が、以下の限界を越えないこと：
　　・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；
　　・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）；
　　・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；
　　・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）、
を有するヒアルロン酸分画またはその塩」
補正事項４
　下記３．(1) に示す訂正後の特許請求の範囲の請求項２３〜２５に「請求項１に記載のヒアルロン酸分画。」とあるのを以下の語句で置き換える。
「７５０,０００Ｄ〜１,２３０,０００Ｄ の範囲の平均分子量を有し、以下の性質を有するヒアルロン酸分画またはその塩：
　(a)Ubbelhode吊下げ水平粘度計を用いてpＨ７.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ中にて２５℃で測定したときに、固有粘度数が１４.５〜２１dl／gの範囲内であること；
　(b)タンパク質含量がアルブミンで表して０.２％を越えないこと；
　(c)１％（w/v）水溶液で測定したときに、２５７nmおよび２８０nmのＵ.Ｖ.吸収が１.０Ａ.Ｕ.を越えないこと；
　(d)２０℃の温度で回転粘度計を用い、規定された剪断速度で、pＨ７.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ中の１％（w/v）溶液の動的粘度が以下の限界を越えないこと；
　　　　剪断速度 　　　　動的粘度（mＰａ.ｓ、２０℃）　　
　　  −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
　　　　　１　秒-1　　　　２００００mＰａ.ｓを越えない 
　　　　１０　秒-1　　　　　２０００mＰａ.ｓを越えない 
　　　１００　秒-1　　　　　１０００mＰａ.ｓを越えない 
　　　３５０　秒-1　　　　　　５００mＰａ.ｓを越えない 　　　
　　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−　　　
　(e) 硫酸化ムコ多糖含量がイオウとして０.０７％を越えないこと；
　(f) 鉄含量が１０ppmを越えないこと；および
　(g) 固有粘度数の評価によって測定して対応する平均分子量の減少で表したときに、自然放置および熱滅菌した分画の生理学的pＨの等張緩衝溶液の安定性が、以下の限界を越えないこと：
　　・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；
　　・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）；
　　・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；
　　・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。」
　
　また、特許権者は平成１２年１月１１日にも訂正請求書についての手続補正書を提出し、以下の補正をした。
補正事項１
　平成１１年４月２日付け手続補正書による補正後の特許請求の範囲の請求項１に「その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基」とあるのを、
「その水溶液を、すべてのアルキル基が最大で６炭素原子を有する４級アンモニウム塩基」と補正する。
補正事項２
　平成１１年４月２日付け手続補正書による補正後の特許請求の範囲の請求項３の(a)に
「その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基」とあるのを、
「その水溶液を、すべてのアルキル基が最大で６炭素原子を有する４級アンモニウム塩基」と補正する。
補正事項３
　平成１１年４月２日付け手続補正書による補正後の特許請求の範囲の請求項１０に、「(c) 該処理したヒアルロン酸含有抽出物を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩」とあるのを、
「(c) 該処理したヒアルロン酸含有抽出物を、すべてのアルキル基が最大で６炭素原子を有する４級アンモニウム塩」と補正する。
　　　
　しかしながら、上記の各補正は、物性限定されていたヒアルロン酸分画について更に精製方法で限定するなど、訂正請求書による訂正内容を実質的に変更するものであるから、訂正請求書の要旨を変更するものである。
　したがって、これらの補正はいずれも採用できない。
　
（２） 訂正の内容
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１の(d) において、「１ｓ−１」、「１０ｓ−１」、「１００ｓ−１」及び「３５０ｓ−１」とあるのを、それぞれ「１秒-1」、「１０秒-1」、「１００秒-1」及び「３５０秒-1」と訂正する。
訂正事項ｂ
　請求項３の(a) に、「ヒアルロン酸またはその塩を対応する４級アンモニウム塩に変換し；」とあるのを、
「ヒアルロン酸またはその塩を、その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質に接触させることによって、対応する４級アンモニウム塩に変換し；」と訂正する。
訂正事項ｃ
　請求項４を削除する。
訂正事項ｄ
　請求項２３の末尾が「医薬調製物」とあるのを、「眼科手術において使用する医薬調製物」と訂正する。
訂正事項ｅ
　特許請求の範囲内に記載されている請求項５〜２６の番号をそれぞれ順に請求項４〜２５と訂正する。
訂正事項ｆ
　特許明細書の１２頁２３行、２８頁１０行及び３２頁４行の「１ｓ−１」、１２頁２４行及び３２頁５行の「１０ｓ−１」、１２頁２５行及び３２頁６行の「１００ｓ−１」並びに１２頁２６行、２８頁１０行及び３２頁７行の「３５０ｓ−１」を、それぞれ「１秒-1」、「１０秒-1」、「１００秒-1」及び「３５０秒-1」と訂正する。
　
（３） 訂正の適否
　訂正事項ａ及びｆは、剪断速度の単位が「ｓ−１」と表現され、剪断速度の単位として「秒-1」の誤記であることが明らかなものを「秒-1」と訂正したものであるから、誤記の訂正を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｂは、ヒアルロン酸またはその塩を対応する４級アンモニウム塩に変換する手段が限定されてなかったものを、「その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質に接触させることによって、」と４級アンモニウム塩へ変換する手段を限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
  訂正事項ｃは、請求項の削除であるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｄは、「医薬調製物」というそれ自体では不明瞭であった記載を明細書の記載からみてその意味するところが明らかであった「眼科手術において使用する医薬調製物」としたものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｅは、請求項の削除に伴って、請求項の番号を整合させるものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
　
　そして、訂正事項ａ〜ｆは、いずれも特許明細書に記載された事項の範囲内であって、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　　
（４） 独立特許要件
　訂正事項ｂは請求項３について特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正であるが、後述するとおり、訂正後の請求項３に係る発明は、独立して特許を受けることができるものである。
　　
　以上のとおりであるから、上記訂正は、平成１１年改正前の特許法第１２０条の４第２項並びに同条第３項で準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、訂正を認める。
　　　　　
３．特許異議の申立てについて　
(1) 本件特許発明
　本件特許について特許異議の申立てがされた請求項１〜４、９、１０及び２３〜２６に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜３、８、９及び２２〜２５に記載された下記のとおりのものである。
「１．７５０,０００Ｄ〜１,２３０,０００Ｄ の範囲の平均分子量を有し、以下の性質を有するヒアルロン酸分画またはその塩：
　(a)Ubbelhode吊下げ水平粘度計を用いてpＨ７.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ中にて２５℃で測定したときに、固有粘度数が１４.５〜２１dl／gの範囲内であること；
　(b)タンパク質含量がアルブミンで表して０.２％を越えないこと；
　(c)１％（w/v）水溶液で測定したときに、２５７nmおよび２８０nmのＵ.Ｖ.吸収が１.０Ａ.Ｕ.を越えないこと；
　(d)２０℃の温度で回転粘度計を用い、規定された剪断速度で、pＨ７.０の０.１５Ｍ ＮａＣｌ中の１％（w/v）溶液の動的粘度が以下の限界を越えないこと；
　　　　剪断速度 　　　　動的粘度（mＰａ.ｓ、２０℃）　　
　　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−
　　　　　１　秒-1　　　　２００００mＰａ.ｓを越えない 
　　　　１０　秒-1　　　　　２０００mＰａ.ｓを越えない 
　　　１００　秒-1　　　　　１０００mＰａ.ｓを越えない 
　　　３５０　秒-1　　　　　　５００mＰａ.ｓを越えない 　　
　　　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−　　　　
　(e) 硫酸化ムコ多糖含量がイオウとして０.０７％を越えないこと；
　(f) 鉄含量が１０ppmを越えないこと；および
　(g) 固有粘度数の評価によって測定して対応する平均分子量の減少で表したときに、自然放置および熱滅菌した分画の生理学的pＨの等張緩衝溶液の安定性が、以下の限界を越えないこと：
　　・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；
　　・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）；
　　・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；
　　・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。
２．平均分子量が９２５,０００〜１,２３０,０００ である請求項１に記載のヒアルロン酸分画。
３．(a) ヒアルロン酸またはその塩を、その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質に接触させることによって、対応する４級アンモニウム塩に変換し；
　(b) 該対応する４級アンモニウム塩を、そのようなアンモニウム塩を溶解することができる有機溶媒に溶解し；そして
　(c) この溶液を濾過し、ハロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸をナトリウム塩の形態で回収する；
ことからなるヒアルロン酸またはその塩の精製方法。
８．ヒアルロン酸の塩がナトリウム塩である請求項３〜７のいずれかに記載の方法。
９．ヒアルロン酸のアンモニウム塩の対応するナトリウム塩への変換が、有機溶媒中のヒアルロン酸のアンモニウム塩の溶液に臭化ナトリウムを添加することによって行われる請求項８に記載の方法。
２２．請求項１に記載のヒアルロン酸分画を活性成分として含有する眼科手術において使用する医薬調製物。
２３．眼科手術において使用するための請求項１に記載のヒアルロン酸分画。
２４．眼科学の分野で使用するための請求項１に記載のヒアルロン酸分画。
２５．白内障の手術または眼水晶体移植において使用するための請求項１に記載のヒアルロン酸分画。」
　
（２） 取消理由通知に引用した刊行物の記載（刊行物番号は、平成９年１２月１２日付けの取消理由通知中の番号による。））
（ア）「眼科手術補助剤　オペガン（審決注：登録商標）」　[インタビューフォーム]（昭和６２年発行）（異議申立５の甲第２号証：以下、刊行物２という。）には、次の事項が記載されている。
(i)商品名「オペガン」は、一般名：ヒアルロン酸ナトリウム、記号番号：ＤＥ-050（眼科用ＳＰＨ）（１頁）であって、平均分子量：６０万〜１２０万、極限粘度：１１.８〜１９.５（dl/g）、鶏冠から抽出・精製したもの（２頁）であること。
(ii)安定性について、「４０°以上の温度（粉末又は１％水溶液、無色アンプル、密封、しゃ光）又は曝光（粉末又は１％水溶液、無色又はかっ色アンプル、密封）、曝気（粉末、秤量びん、開封、しゃ光）下での保存において、極限粘度の低下傾向が認められ、吸光度の増加傾向が一部に認められたが、いずれの保存条件下でも上記以外の試験項目については変化は認められず、ＴＬＣで分解物も検出されなかった。長期保存試験（ガラス容器、気密、しゃ光、４２カ月間）の結果、室温保存で極限粘度のわずかな低下傾向が認められたが、その他の試験項目についてはほとんど変化は認められなかった。また、１５°保存ではすべての試験項目について、ほとんど変化は認められなかった。」（３頁）、加速変化試験による主な反応生成物について「粉末及び１％水溶液の苛酷試験ではＴＬＣで分解物が検出されなかったが、本品の１％水溶液をオートクレーブ処理（１２１°、５時間）した結果、平均分子量約１６,０００の低分子量ヒアルロン酸と微量のクロモーゲンI及びIII が認められている。」（４頁）と記載され、剤形として無色澄明の粘稠な眼科用水性注射剤（５頁）であること。
(iii) ラットの赤血球を用いて、溶血に及ぼす影響を検討した結果、いずれの濃度のヒアルロン酸ナトリウム溶液でも溶血作用は認められないこと（１２頁）。
(iv)前房置換による眼毒性試験、頻回点眼による眼毒性試験、及び硝子体内注入による抗原性試験においてはいずれも異常が認められず、また、抗原性も認められなかったこと（１２頁）。
(v) 効力を裏付ける試験成績（作用部位、作用機序）について、(1)高い粘弾性により、前房内の組織を押し広げ、前房深度を維持する、(2) 粘弾性により手術器具、人工水晶体等による機械的侵襲から眼内組織を保護する、(3) 眼内組織の間隙を満たし、術後の癒着を防止する、(4) 粘弾性を有するが、房水の排出に影響を与えないこと（８頁）。
(vi)注射剤の用法として、通常 ０.1〜０.５mlを前房内に注入するが症状に応じて適宜増減すること、例示1.には人工水晶体挿入術について、人工水晶体挿入前に本剤０．５ｍｌ以下を前房内に注入し、人工水晶体の光学部及びループにも塗布して挿入すること、例示2.には全層角膜移植術について、レシピエントの角膜片を除去後、ドナー角膜を８針前置縫合し、約０.１ml（０.２mlを越えてはならない）注入後、連続縫合すること（１４頁）、一般的注意として、1)過量の注入により、ときに術後一過性の眼圧上昇がみられることがあるので注意すること、2)過量に注入した場合は灌流または吸引により除去すること（１５頁）。
　　　
（イ）「関節機能改善剤　アルツ（審決注：登録商標）」[インタビューフォーム]（科研製薬株式会社、昭和６２年発行）（異議申立４の甲第３号証−１、異議申立６の甲第７号証：以下、刊行物３という。）には、
(vii) 商品名：アルツ、一般名：ヒアルロン酸ナトリウム、記号番号：ＳＰＨ（開発記号）（１頁）と記載され、分子量が８０万〜９０万、鶏冠から高純度に抽出、精製されたヒアルロン酸ナトリウムである旨（２頁）、吸光度（１％溶液）：２６０nm で０.２以下、極限粘度：１１.８〜１９.５dl/g（３頁）であることが記載されている。
　　　
（ウ）「機能性食品素材・食品由来の生理活性物質等における研究と開発」工業技術会、１９８９年発行、１９１〜２０７頁（異議申立４の甲第１号証、異議申立６の甲第１１号証：以下、刊行物１という。）には、次の事項が記載されている。
(viii)ヒアルロン酸ナトリウムの物理的性質として、極限粘度（dl/g）を[η]で表し、３０.０±０.１℃、溶媒０.２Ｍ ＮａＣｌの条件下で測定し、
　式　[η]＝３.９×１０-4×Ｍｗ0.77から算出した平均分子量Ｍｗと極限粘度との関係が、例えば、平均分子量が７６万、８４万、９６万、１１９万の場合の極限粘度は、それぞれ１３.６、１４.７、１５.７、１７.８(dl/g) であること。(１９５頁、表５)
(ix)ヒアルロン酸のような高分子量多糖では分子量と共にその分子量分布を測定することが重要であり、ＧＰＣ(Gel Permeation Chromatography )を用いて鶏冠由来のヒアルロン酸の分子量と分子量分布を測定して分子量分散度（重量平均分子量／数平均分子量）を求めた結果、１.８〜２.０であり、天然の高分子多糖としては分子量分散度は小さいと考えられること、及びヒアルロン酸溶液のみかけ粘度はずり速度が増加するに従い低下し、非ニュートン粘性を示し、この粘度の低下は分子量及び濃度が高いほど大きかったこと。（１９６頁）
(x)ヒアルロン酸は重金属、還元剤、紫外線及び放射線等により、簡単に分解されて低分子化する。また、他の高分子物質同様に剪断力により低分子化するのでヒアルロン酸溶液を取り扱うときは細心の注意が必要である。主な分解物は出発試料よりも分子量が低い低分子量のヒアルロン酸である。ヒアルロン酸標品を安定化するにはできるだけ低分子化を惹起する不純物を除去することが必要である。（１９６〜１９７頁）
(xi)鶏冠から抽出精製された高純度の高分子量ヒアルロン酸であるＳＰＨは極めて安全性が高い薬である。（２０１頁）
(xii) 変形性膝関節症の治療薬「アルツ」がＳＰＨ製剤であること、ヒトの前眼部手術に用いられる「オペガン」がＳＰＨの眼科用製剤であること（２０３及び２０５頁）
　　　
（エ）特開平２−１０３２０４号公報（異議申立１の甲第５号証、異議申立３の甲第６号証、異議申立６の甲第１７号証：以下、刊行物９という。）には、次の事項が記載されている。
(xiii)ヒアルロン酸を医薬品として用いるには発熱性物質、蛋白質、核酸、金属不純物等の少ない高純度のヒアルロン酸を製造しなければならない。（２頁左上欄）
(xiv)蛋白質含量０.６５％、核酸含量０.０５％、鉄含量１０００ppmであるヒアルロン酸ナトリウム溶液を精製すると、上記不純物含量が実施例１では、それぞれ０.０１％、検出せず、１ppm、実施例２では０.０８％、０.０２％、１０ppm、実施例３では３種の不純物は検出せずであったこと。(４〜５頁、表１及び表２)
　
（オ）「日本眼科紀要」第３８巻第７号、９２７〜９３５頁、１９８７年（異議申立１の甲第１１号証：以下、刊行物１４という。）には、次の事項が記載されている。
(xv)高分子量のヒアルロン酸を得るには、原料から温和な条件で抽出・精製することが必要である。この物質は加熱、酸、アルカリ処理、あるいは酸化剤、還元剤などにより容易に糖鎖が切断されて低分子化する。また、原料の鶏冠を細切してヒアルロン酸を抽出するとき、デルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸を分画して、ヒアルロン酸画分のみにすることが必要である。また、混入蛋白質などを完全に除去して、発熱、抗原性反応を防止することが必須である。（９２９頁右欄〜９３０頁左欄）
(xvi) 図２に分子量８５万のヒアルロン酸ナトリウムの粘度と剪断速度との関係のグラフが記載され、１％溶液では、剪断速度１０／sec では約３５０ｃｐ、１００／secでは約２１０ｃｐであることが示されている。(９３１頁左欄)
　　
（カ）「眼科手術」第１巻第１号、１２３〜１３４頁、１９８８年（異議申立１の甲第１２号証、異議申立２の甲第１号証：以下、刊行物１５という。）には、次の事項が記載されている。
(xvii)「オペガン」がヒアルロン酸ナトリウムを主成分とするものであって、分子量が１００〜１２０×１０4ダルトンであり、濃度が１％であることが表１に示され、分子量１１７万の１％溶液であるヒアルロン酸ナトリウムの剪断速度が１／sec、１０／secのときの粘性率はそれぞれ６０００ｃＰ、２５００ｃＰ程度であることが図１に示されている。
(xviii)分子量１１７万のヒアルロン酸ナトリウムの分子量分布が鋭い１つのピークをもっていること（１２９頁、図６Ａ）
(xix) 更に、粘弾性物質の眼科適用における留意点として、注射薬であることを前提に、1）十分な粘弾性をもつこと、2）純度が高く、無菌であり、抗原性がないこと、3）眼組織や眼内液に対する生体適合性に優れ、組織障害性がないこと、4）眼内や体内において蓄積しないことをあげている（１３２頁）。
　　
（キ）特表昭６２−５０１４７１号公報（異議申立１の甲第６号証、異議申立４の甲第４号証、異議申立６の甲第１６号証：以下、刊行物５という。）には、連鎖球菌の発酵による高分子量ヒアルロン酸ナトリウムの製造方法が記載され、「臨床用グレード」のヒアルロン酸ナトリウムの物性が次のように記載されている。
(xx)平均分子量：　７×１０5ドルトンより大きい。
　　　　タンパク質：　検出不能（０.０１％未満）
　　　　硫酸塩含量：　検出不能（０.００１％未満）
　　　　核酸：　　　　検出不能（０.０２％未満）
　　　　　　　　　　　　　　　　　（１０頁右下欄〜１１頁左上欄）
(xxi)約０.２５％の濃度のヒアルロン酸塩溶液に塩化セチルピリジニウムを加え、得られたヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩をデカンテーション及び遠心分離により分離し、１５％エタノールを含有する２Ｍ　ＮａＣｌ中に再溶解させ、約０.２％のヒアルロン酸塩溶液を得、1容量のイソプロパノールを添加することにより、ヒアルロン酸をナトリウム塩として沈降させる。(８頁右下欄)
　
（ク）特公昭６０−９０４２号公報（異議申立６の甲第１９号証：以下、刊行物１９という。）には、
(xxii)公知の方法に準じて蛋白質分解酵素を用いて消化、抽出し、不溶物を除去した後塩化セチルピリジニウムを加え、生じた沈殿を分取し、水洗後アルコールを含む食塩水に溶かし、……高純度のヒアルロン酸を収率よく得ることができる（３欄４０行〜４欄６行）
　　
（ケ）特開平１−２１０４０１号公報（異議申立１の甲第１５号証：以下、刊行物２１という。）には、
(xxiii) ヒアルロン酸溶液に第４級アンモニウム塩を側鎖に有する水不溶性高分子化合物を添加し、該高分子化合物とヒアルロン酸とで水不溶性複合体を形成せしめた後、該複合体を水性媒体より分離してヒアルロン酸を精製する方法（特許請求の範囲）が記載されている。
　
（コ）特公昭６１−２１２４１号公報（異議申立４の甲第７号証：以下、刊行物２３という。）には、
(xxiv)動物組織を第四級アンモニウム塩溶液中において加熱処理した後、プロテアーゼ処理してヒアルロン酸のみを分取し、次いで残渣を塩溶液またはアルカリ溶液で処理して、コンドロイチン硫酸を分取する酸性多糖体の分取法（特許請求の範囲）が記載されている。
　　
（サ）特開昭６４−４３５０２号公報（異議申立１の甲第１４号証：以下、刊行物２４という。）には、
(xxv) ヒアルロン酸またはその塩とカチオン界面活性剤との複合体とし、その複合体を水溶性有機溶剤に溶解した後、クロマトグラフィーにより分画し、次いで複合体を解離させ、分画されたヒアルロン酸またはその塩を得るヒアルロン酸の分画方法（特許請求の範囲）が記載されている。
　　　
（シ）江上不二夫監修「多糖生化学１−化学編−」昭和４４年、共立出版株式会社発行、７３〜８３頁（異議申立１の甲第１３号証：以下、刊行物２８という。）には、
(xxvi)陽イオン性の界面活性剤は酸性高分子化合物と結合して水に不溶性の塩を生ずること（７９頁７〜８行）、適当量の有機溶媒（エタノールなど）を加えて四級アンモニウム塩の溶解度を増すことがしばしば有利であること（８０頁１〜３行）、セチルピリジニウムクロリドによる沈殿をセルロースカラム中で行ない、慢性リウマチ患者の関節液ヒアルロン酸の多分散性が示された旨（８０頁末１２〜９行）が記載されている。
　　　
（３）　対比・判断
（ア）特許法第２９条第１項第２号及び第３号について
（ｉ）請求項１に係る発明について
　請求項１に係る発明と刊行物２に記載の眼科手術補助剤である「オペガン」とを対比する。なお、文中で引用する(i)〜（xxvi）は、上記（２）に記載した各刊行物の摘記箇所を示すものである。
　「オペガン」の平均分子量は６０万〜１２０万である(i)から、両者は平均分子量が７５万〜１２０万の範囲であるヒアルロン酸またはその塩（以下、単にヒアルロン酸ともいう。）の分画である点で一致し、前者はヒアルロン酸分画が(a)〜(g)の性質を有することを規定しているのに対して、後者は、これらの性質が明記されていない点で、一応相違している。
　そこで、後者のヒアルロン酸分画、つまり「オペガン」が(a)〜(g)の性質を有するものであるかどうかについて検討する。
　
(a)について
　固有粘度数と極限粘度は同義語であるが、前者はUbbelhode 吊下げ水平粘度計を用いてpＨ７．０の０．１５Ｍ ＮａＣｌ中２５℃と測定条件を明記して固有粘度数１４．５〜２１ｄｌ／ｇと規定しているのに対して、後者は単に極限粘度１１．８〜１９．５（ｄｌ／ｇ）との記載があるのみで測定条件が記載されていないため、その数値自体は重複しているものの直ちに同一であるとはいえない。しかし、固有粘度数と分子量とは、例えば、刊行物１に記載されている式で表わされるような対応関係にある(viii) から、ヒアルロン酸の平均分子量が同じであれば同じ極限粘度を示すこととなる。そして、両者の平均分子量は、上述したように７５万〜１２０万の範囲で一致しているのであるから、「オペガン」についての固有粘度数の測定条件は記載されていないにしても、同じ条件で測定すれば実質的に同一の固有粘度数の範囲になることは明らかである。
　したがって、(a) の固有粘度数は、刊行物２に記載の「オペガン」についても平均分子量７５０,０００Ｄ〜１,２００,０００Ｄに対応する範囲で一致するものであると認められる。
　　　　
(b)、(c)、(e)及び(f)について
　刊行物２には、「オペガン」製剤中の蛋白質含量、核酸、硫酸ムコ多糖及び鉄含量については直接的に記載されていないが、１％溶液又は粉末での安定性がよいこと(ii)、溶血性がないこと(iii)、抗原性がないこと(iv) が記載されている。
　一方、本件特許の優先権主張日前の技術水準として、上記刊行物１、３、５、９、１４及び１５の記載から、「オペガン」は高純度の高分子量ヒアルロン酸で極めて安全性が高い薬であること (xi及びxii)、ヒアルロン酸を医薬品として用いるには、発熱性物質、蛋白質、核酸、金属不純物等の少ない高純度のヒアルロン酸を製造しなければならないこと(xiii)、蛋白質含量が ０.０１％以下、核酸含量が０.０２％以下、鉄含量が１０ppm以下のヒアルロン酸ナトリウム液を得ていること(xiv 及びxx)、ヒアルロン酸ナトリウム製剤で関節機能改善剤である「アルツ」では２６０nmでの吸光度が０.２以下であること(vii)、硫酸塩含量が０.００１％未満（イオウとして換算すると０.０００３％未満）であること(xx)、高分子量のヒアルロン酸を得るには、デルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸を分画して、ヒアルロン酸画分のみにすることが必要であって、混入蛋白質などを完全に除去して、発熱、抗原性反応を防止することが必須であること(xv)、粘弾性物質の眼科適用における留意点として純度が高く、無菌であり、抗原性がないこと、眼組織や眼内液に対する生体適合性に優れ、組織障害性がないこと(xix)が認められる。さらに、鶏冠に含まれている硫酸化ムコ多糖は抗凝固作用、溶血作用をもつことも、特許権者が提出した平成１０年７月２１日付け特許異議意見書に添付された参考資料４〜５の記載から、本件特許の出願前の技術水準であったと認められる。
　これらの事実は、医薬品として用いるヒアルロン酸は、発熱物質、タンパク質、核酸、金属不純物が少ないもの、具体的には、タンパク質含量が ０.０１％以下、核酸含量が０.０２％以下(又は１％溶液の２６０nmでの吸光度が０.２以下)、鉄含量が１０ppm 以下、溶血作用をもつ硫酸ムコ多糖であるデルマタン硫酸やコンドロイチン硫酸を完全に除去する程度のものであることが本件特許の優先権主張日前の技術水準であることを示している。
　そうすると、ヒアルロン酸の医薬品である「オペガン」について記載されている刊行物２の(ii)〜(iv)の記載は、これらの不純物含量が上記の技術水準程度、すなわち、蛋白質含量が０.０１％以下、核酸含量が１％溶液の２６０nm での吸光度０.２以下、イオウとして０.０００３％未満、鉄含量が１０ppm 以下程度のものであることを実質的に示しているということができる。
　したがって、刊行物２に記載された「オペガン」は、請求項１に規定する(b)、(c)、(e)及び(f)の要件を満足するものであると認められる。
　
(d)について
　特許権者は、平成１５年３月２０日付け意見書５〜６頁に、請求項１の(d) に規定する動的粘度はヒアルロン酸の分子量分布に制限を設けているものであること及び製法により分子量分布が異なることを主張している。
　
　そこで、まず通常のヒアルロン酸分画の分子量分布及び動的粘度について検討する。
　ヒアルロン酸分画の分子量分布については、例えば、刊行物１５に１１７万の分子量の分子量分布を示すグラフが示され、このグラフは１つのピークを有している (xviii)。そして、刊行物１４及び１５には、ヒアルロン酸の製法について何等言及することなく平均分子量と動的粘度の関係を示す図が示されており(xvi及びxvii）、刊行物１には、鶏冠由来のヒアルロン酸の分子量分散度は天然の高分子多糖としては小さいこと、ヒアルロン酸水溶液の見かけ粘度の低下は分子量及び濃度が高いほど大きいこと（ix）が記載され、動的粘度が分子量と相関関係にあることを示している。
　これらの記載をみると、通常ヒアルロン酸分画は一つのピークを持つ分子量分布を示すものとして得られ、そのようなものであれば、動的粘度は平均分子量と連関し、平均分子量により動的粘度がほぼ定まることを示していると解される。そして、刊行物２の「オペガン」についても、鶏冠由来のヒアルロン酸分画として通常の分子量分布を持ち、それに対応した動的粘度を示すものと認められる。
　次に、請求項１に係るヒアルロン酸分画が、通常の分子量分布のものかどうかを検討する。
　訂正明細書（以下、単に明細書という。）には、本件特許のヒアルロン酸の分画方法について、次のように記載されている。
　・「（５）異なる分子量を有するヒアルロン多糖分画またはそれぞれの塩の分離、または所望ではない分画の除去（例えば、限界域分子量を有する分画、即ち指定した分子量範囲から離れすぎている分画の除去）：この操作は分子の限外濾過によって行なうのが好ましい（例えば、既知の方法で）」（６頁１３〜１６行）
　・「所望により、殺菌後に得られた溶液を巨大分子濾過にかけてもよい。次いで、所望ではないヒアルロン多糖分画の全てを捨て、ヒアルロン酸ナトリウムの所望の分画を自体既知の方法で単離する。」（７頁２４〜２７行）
　・「分子の限外濾過は自体既知の方法で行なう。即ち、例えば ２００,０００以上の比較的高い分子量を有する分画を捕捉する膜を使用し、所望により、この分離した分画を濾過した生成物および膜の両方から回収することができる。本発明の方法を実施する際の特に重要な方法は、低分子量のヒアルロン分画を排除する分子限外濾過と上記の化学的な精製操作を組合せることである。」（９頁７〜１１行）
　・「本発明の別の好ましい目的は、精製操作の細部の組合せに関するものであり、所望の部分において、分子限外濾過を行なって低分子量分子分画、特に３０,０００ 以下の分子量を有する分画を排除する上記方法である。」（９頁１５〜１７行）
　・「次いで、得られた溶液を３０,０００ の分子排除限界を有する膜による分子限外濾過に付し、０.３３Ｍ塩化ナトリウム溶液を添加しながら元の容量の３倍を限外濾過する。……このようにして得た生成物（ＨＡ−１分画）は、７５０,０００Ｄ〜１,２３０,０００Ｄ（好ましくは、９２５,０００〜１,２３０,０００）の範囲の平均分子量を有する。……上記の方法によって得られる最終産物は次の性質を有している：
　・分子量：１,０００,０００Ｄ」（実施例１の中、３０頁末〜３１頁１５行）
　・「透明な液体を１つの容器に集め、３０,０００ ダルトンの分子排除カットオフを有する膜による分子限外濾過に付し、最初の容量の１／３まで濃縮する。
　　　　　　　　　　　　　…………
　このようにして製造した生成物は、１,１８０,０００の分子量を有する。」（３６頁末２行〜３７頁末５行）
　明細書の上記の記載事項をみると、ヒアルロン酸を精製後又は精製途中に所望でない分画、特に３０,０００ 以下の分子量を有する分画を除去する他は特別の分画操作を行なっていないことから、請求項１に係るヒアルロン酸分画は、３０,０００ 以下の分子量分画を除いたそれ以上の分子量のものについては、通常の分子量分布をもつ平均分子量が７５０,０００Ｄ〜１,２３０,０００Ｄのヒアルロン酸分画であり得ることは明らかである。（製法によって分子量分布が異なる旨の特許権者の主張は、本件特許のヒアルロン酸の分画方法が特別な方法を採用するのであれば格別、明細書にはそのような特別な方法を採用することは開示されていないのであるから、本件特許のヒアルロン酸分画が通常のヒアルロン酸分画と異なる特異な分子量分布のものであるとする根拠として意味があるとはいえない。）
　
　そうすると、請求項１に係るヒアルロン酸分画と刊行物２に記載された「オペガン」とは、平均分子量が一致し、分子量分布も通常のヒアルロン酸分画にみられるような同様のものであるから、両者が動的粘度の点で格別に異なった値を示すとはいえない。
　したがって、請求項１の(d)で規定する要件は、刊行物２に記載された「オペガン」についても満たされる範囲のものと認められる。
　　　
(g) について
　刊行物２には、(g)に規定する条件と同一条件下での安定性は記載されていない。
　しかし、「オペガン」の安定性について、「４０°以上の温度（粉末又は１％水溶液、無色アンプル、密封、しゃ光）又は曝光（粉末又は１％水溶液、無色又はかっ色アンプル、密封）、曝気（粉末、秤量びん、開封、しゃ光）下での保存において、極限粘度の低下傾向が認められ、吸光度の増加傾向が一部認められたが、いずれの保存条件下でも上記以外の試験項目については変化は認められず、ＴＬＣで分解物も検出されなかった。長期保存試験（ガラス容器、気密、しゃ光、４２カ月間）の結果、室温保存で極限粘度のわずかな低下傾向が認められたが、その他の試験項目についてほとんど変化は認められなかった。」と記載され、また加速試験による主な反応生成物の項には「粉末及び１％水溶液の苛酷試験ではＴＬＣで分解物が検出されなかったが、本品の１％水溶液をオートクレーブ処理（１２１°、５時間）した結果、平均分子量約１６,０００ の低分子量ヒアルロン酸と微量のクロモーゲンＩ及びIII が認められている。」(ii)と記載されているとおり、(g) に規定する条件より苛酷な試験も行って安定性を確認している。
　そうすると、「オペガン」を(g)に規定する条件で試験・測定すれば、(g)に規定する程度の安定性を示すことは明らかであるといえる。
　したがって、「オペガン」は、(g) に規定する安定性についても満足するものと認められる。
　　　　
　以上のとおり、刊行物２に記載された「オペガン」は、請求項１の(a)〜(g)に規定された物性値を満足するものである。
　　
　したがって、請求項１に係る発明は、刊行物２に記載されたものであるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当する。また、「オペガン」は本件優先権主張日前に市販されていたことは明らかであり、公然実施をされたものであるから、同法第２９条第１項第２号の規定にも該当する。
　　　
　なお、特許権者は、参考資料２［「発明」vol.92,no.7,p106(1995)］及び参考資料３［「平成７年度全国発明表彰　受賞者功績概要」社団法人発明協会発行、p32〜33］ を提出して、「オペガン」は特公昭６１−２１２４１号公報に記載された方法によって製造されたものであるとして、この公報の記載に基づいて追試した結果を参考資料１として提出し、「オペガン」は請求項１に係る発明で規定する不純物含量の上限をはるかに越えるものである旨主張している。
　しかし、この公報に記載の方法が「オペガン」の製法の一部ではあるとしても、医薬品である眼科補助剤「オペガン」の製法全体を示すものとはいえない。
　上述したように、「オペガン」は安定性に優れたもの（上記摘示事項(ii)）であって、医薬品として市販されているのであるから、鉄含量をはじめとして他の不純物が少ないことは明らかである。ところが、特許権者が提出した追試結果のヒアルロン酸分画は鉄含有量、硫酸ムコ多糖含量が極端に多く、このように不純物が多ければ到底医薬品にはなり得ないものである。このことからみても、追試されたヒアルロン酸分画が市販された「オペガン」に相当するものでないことは明白である。
　したがって、参考資料１をもって、「オペガン」の分析結果とはいえないので、特許権者の主張は採用できない。
　　
（ii）請求項２に係る発明について
　請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明のうち平均分子量が ９２５,０００〜１,２３０,０００のものであるから、刊行物２に記載されている平均分子量６０万〜１２０万の範囲内のものと重複する。
　したがって、請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明と同様に、刊行物２に記載された発明であり、また刊行物２に記載の「オペガン」は本件優先権主張日前に眼科用の用途で市販されていたことが明らかであり、公然実施をされた発明であるから、特許法第２９条第１項第２号及び第３号の規定に該当する。
　　
（iii）請求項２２〜２５に係る発明について
　刊行物２には、「オペガン」が眼科手術補助剤、人工水晶体挿入術、全層角膜移植術に用いられること（(v)及び(vi)）が記載されており、人工水晶体挿入術は白内障の手術であるから、刊行物２には、眼科手術、白内障の手術または眼水晶体移植において「オペガン」を使用することが記載されている。そして、請求項１に係るヒアルロン酸分画は、上記３．（３）（ア）（ｉ）に述べた理由により、刊行物２に記載された「オペガン」と同一のものである。
　また、「オペガン」は本件優先権主張日前に刊行物２に記載の用途で市販され、公然実施をされたものである。
　したがって、請求項２２〜２５に係る発明は特許法第２９条第１項第２号及び第３号の規定に該当する。
　
（イ）特許法第２９条第２項について
（ｉ）請求項１、２及び２２〜２５に係る発明について
　刊行物２には「オペガン」の(b)〜(g)の物性が明記されていないので、上記請求項に係る発明と刊行物２に記載された発明は、この点で形式的には相違する。しかし、以下に示すとおり、この点を相違点とした上で検討しても、上記請求項に係る発明は、刊行物２及び１、３、５、９、１４、及び１５に記載された発明に基づいて当業者が容易に想到できるものである。
　すなわち、一般に医薬品に用いる物質は、高純度であること、できれば不純物がないことが望まれているものであるから、ヒアルロン酸分画において、不純物として知られている成分(b)、(c)、(e)及び(f) の含有量を、医薬グレードの公知のヒアルロン酸分画の不純物の規定量以下、すなわち、タンパク質含量が ０.０１％以下、核酸含量が２６０nmでの吸光度が０.２以下、イオウとして０.０００３％未満、鉄含量が１０ppm以下とすること(xiv及び xx) は、単に通常望まれている程度の数値で限定したものに過ぎないから当業者が容易に想到できるものである。
　また、刊行物１、１４及び１５には、測定条件が明らかでないとしても、本件発明において規定する範囲内の分子量のヒアルロン酸の動的粘度が記載され、ヒアルロン酸の動的粘度がヒアルロン酸分画における意義のある物性であることを示しているのである(viii,xvi及びxvii) から、これらの公知のヒアルロン酸分画を動的粘度で特定することは当業者が容易に想到し得るものである。そして、動的粘度の数値は、通常の方法で分画した、すなわち通常の分子量分布を有する、平均分子量が７５万〜１２０万程度のヒアルロン酸に対応する動的粘度を持つものと認められるから、請求項１に係る発明における(d) は、平均分子量が７５万〜１２０万程度のヒアルロン酸の動的粘度を、測定条件とその測定値に基づいて特定したものであり、当業者が適宜に設定し得る程度のものである。
　この点に関し、特許権者は、ヒアルロン酸分画の動的粘度を限定することにより、水晶体置換手術において注入したヒアルロン酸を除去しなくともよいという効果を有する旨を主張するが、以下に述べるように、この点をもって顕著な効果とはいえない。
　刊行物２には、ヒアルロン酸ナトリウム製剤である「オペガン」について、眼科手術には通常 ０.1〜０.５mlを前房内に注入するが症状に応じて適宜増減すること及び過量に注入した場合は灌流または吸引により除去することが記載され、例示の手術例からみても眼科手術後ヒアルロン酸を除去せずに残すことを前提として、過量に注入した場合などは除去する旨が指示されている。そして、刊行物２に記載されているように、注入量は眼科手術の種類により異なり、また症状に応じて適宜増減するものであるので、本件臨床試験での注入量が多いことをもって、請求項１に規定する動的粘度に特定したことによる格別の効果であるとは認められない。
　また、「オペガン」は十分な安定性を有するものである(ii)から、請求項１に係る発明の(g) のような範囲で医薬品の安定性試験での条件の一つを採用して安定性を特定する程度のことは、当業者が適宜なし得るものである。
　したがって、請求項１に係る発明は、刊行物２並びに１、３、５、９、１４及び１５に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明をすることができたものであり、また、請求項２及び２２〜２５に係る発明も、同様に当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　
（ii）請求項３に係る発明について
　異議申立１では訂正前の請求項３及び４、異議申立４及び異議申立６では訂正前の請求項３及びこれを引用する訂正前の請求項９、１０に対して異議申立がされているので、以下に検討する。
　上記２．で述べたとおり訂正が認められ、請求項３は訂正前の請求項４の要件を加え、さらに使用する「４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質」を「最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質」に限定したものに相当するものとなった。　そこで、請求項３に係る発明と刊行物５（異議申立１の甲第６号証、異議申立４の甲第４号証、異議申立６の甲第１６号証）に記載の精製方法とを対比する。
　刊行物５に記載の方法は、ヒアルロン酸塩溶液に塩化セチルピリジニウムを加え、ヒアルロン酸のセチルピリジニウム塩をデカンテーション及び遠心分離により分離している(xxi)から、該セチルピリジニウム塩は水に不溶性である。
　一方、請求項３に係る発明は、ヒアルロン酸水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化されたイオン交換物質に接触させることによって、対応する４級アンモニウム塩に変換（(a) 工程）しており、この変換された４級アンモニウム塩は、明細書に、「４級アンモニウム塩へのヒアルロン成分の変換は、例えば、他の塩（特に、ＮａＣｌなど）を含むナトリウム塩の水溶液を、……４級アンモニウム塩基で塩化された形態の巨大分子スルホン酸イオン交換物質（…）を含むカラムまたは反応器を用いて処理することにより行なうことができる。アンモニウム塩が溶出液中に通過し、イオン交換物質により水で完全に溶離する。」（５頁２〜９行）、「この溶液（……）を低級 (Ｃ1-6)脂肪族基との４級アンモニウム塩の１つの形態にある巨大分子スルホン酸樹脂からなるイオン交換器に通す……次いで、このイオン交換器から得た溶出液を乾燥し、ヒアルロン酸およびその分画の４級アンモニウム塩を溶解しうる有機溶媒中に溶解する。」（７頁１６〜２０行）と記載されているように、イオン交換物質から溶出されるものであり、水溶性である。
　そうすると、両者は、ヒアルロン酸水溶液と４級アンモニウム塩とを接触させて、ヒアルロン酸の４級アンモニウム塩に変換する工程をもつ点で一致しているが、この変換する処理が、前者は最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩で塩化された酸イオン交換物質に接触させ、水溶性のヒアルロン酸の４級アンモニウム塩に変換しているのに対して、後者は炭素原子１６のアルキル基をもつ４級アンモニウム塩であるセチルピリジニウム塩で処理して、水不溶性のヒアルロン酸の４級アンモニウム塩に変換している点で、少なくとも相違する。
　そこで、この相違点を検討すると、刊行物１９（異議申立６の甲第１９号証）、刊行物２４及び２３（異議申立１の甲第１４及び１３号証）、いずれも炭素原子数の多い長鎖のアルキル基をもつ４級アンモニウム塩であるカチオン界面活性剤とヒアルロン酸水溶液を接触させ、その４級アンモニウム塩を沈殿させ、すなわち、水不溶性の４級アンモニウム塩に変換させる方法(xxii、xxv及びxxvi)が記載されているに過ぎず、水溶性のヒアルロン酸のアンモニウム塩に変換する処理については何等記載されていない。また、刊行物２１（異議申立１の甲第１５号証）には、４級アンモニウム塩を側鎖に有する水不溶性高分子化合物とヒアルロン酸とで水不溶性複合体を形成させるヒアルロン酸の精製方法(xxiii) が記載されているものの、水溶性の４級アンモニウム塩への変換については何等記載されていない。刊行物２３には４級アンモニウム塩を用いること(xxiv)が記載されているが、処理対象は動物組織であって、動物組織中のコンドロイチン硫酸とヒアルロン酸とを分取する方法における処理であるから、高純度のヒアルロン酸を得るための精製方法に適用できるものではない。
　そして、請求項３に係る発明は、さらに得た水溶性のアンモニウム塩を有機溶媒に溶解し、溶解した塩のみをハロゲン化ナトリウムで処理するという２段階で処理するものであり、このような２段階処理についても上記各刊行物には何等記載されていない。
　したがって、請求項３に係る方法は異議申立人が提出した上記刊行物に記載された発明に基づいて容易に発明をすることができたものとはいえない。
　
（iii）請求項８及び９に係る発明について
　上記各発明は、請求項３に係る発明を引用して、請求項３に係る発明をさらに技術的に限定したものであるから、同様に上記刊行物に基づいて当業者が容易に発明できたものではない。
　
（ウ）特許法第３６条第４項及び第５項について
　異議申立３、異議申立４及び異議申立６においては、本件特許明細書には以下の(i)〜(v)の点で不備があるため、本件特許は特許法第３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してされたものである旨の主張がされているので、次に検討する。
（ｉ）ヒアルロン酸分画又はその塩は新規物質ではなく、発明の詳細な説明の欄には眼科手術補助剤としての有用性しか記載されていないから、請求項１に係る発明は、「眼科手術補助剤用のヒアルロン酸分画またはその塩」と限定すべきである。　　
（ii）特許明細書に記載内容からみて、「分子限外濾過による３０,０００ 以下の分子量を有する分画の排除」は、本件特許発明の必須要件であるから、請求項１に「分子限外濾過を行なって３０,０００ 以下の分子量を有する分画が排除されたもの」であることを限定すべきである。
（iii）発明の詳細な説明の欄に眼科手術関係が開示されているに過ぎないのに、請求項２３には「医薬調製物」と記載され、医薬用途が記載されていない。
（iv）実施例には、ヒアルロン酸分画の物性について実際に測定して得た数値が記載されていないので、具体的な発明の開示が不十分である。
（ｖ）実施例１中の記載中、「６０g/分で生成物を撹拌しながら」との意味が不明で、当業者が容易に実施できる程度に記載されていない。
　
（ｉ）について
　請求項１には、化学物質に係る発明として「ヒアルロン酸分画またはその塩」が記載されているのであるから、用途の限定がないことをもって特許請求の範囲の記載が不備であるとはいえない。
　
（ii）について
　請求項１に係る発明は、上記（ｉ）で述べたように「ヒアルロン酸分画またはその塩」に係る発明であり、「分子限外濾過による３０,０００ 以下の分子量を有する分画の排除」することが記載されてないことのみで、特許請求の範囲の記載が不備であるとはいえない。
　
（iii）について
　請求項２３の記載は、用途が不明瞭であった「医薬調製物」から「眼科手術において使用する医薬調製物」に訂正されたので、異議申立人の主張する不備は解消した。
　                              
（iv）について
　実施例１及び２には、ヒアルロン酸分画の具体的な製造条件及び最終生成物のヒアルロン酸分画の分子量１,０００,０００及び１,１８０,０００が記載されている。さらに、最終産物の物性値として固有粘度数、タンパク質含量、Ｕ.Ｖ.吸光度、動的粘度、硫酸化されたムコ多糖含量、鉄含量が一定の範囲の数値が記載されている。そして、明細書に記載されている程度の製造条件で処理し、ヒアルロン酸の分子量を測定すれば、(a)〜(g)に規定されている他の物性は、規定されている範囲内に入るものと認められるから、実施例における生成物の物性がないことをもって明細書の記載が不備であるとはいえない。
　
（ｖ）について
　「６０g/分で生成物を撹拌しながら」との記載は、「撹拌しながら」と記載されていることからみて、その前に記載された数値が撹拌速度を意味していることが理解できるから、６０回／分の誤記であることは明らかである。
　したがって、このような明らかな誤記をもって明細書の記載が不備であるとはいえない。
　　
４．むすび
　以上のとおり、本件請求項１、２、及び２２〜２５に係る発明の特許は、特許法第２９条に違反して特許されたものであるから、特許法第１１３条第１項第２号の規定により取り消すべきものである。
　また、本件請求項３、８，及び９に係る発明の特許については、異議申立による理由及び証拠によっては取り消すことはできない。
　
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年９月１７日（２００３．９．１７）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ヒアルロン酸の精製方法および眼科用の純粋なヒアルロン酸の分画
【発明の詳細な説明】
　　　
発明の背景および分野
　本発明は、高純度のヒアルロン酸の分画およびその塩を製造するための新規な方法に関する。さらに、本発明は、該方法によって得られ、特定の範囲内の平均分子量を有するヒアルロン酸の特定の分画およびその塩（特に、ナトリウム塩）を包含するものである。
　ヒアルロン酸（ＨＡ）は、グリコサミノグリカン（ムコ多糖）として知られている一群の生物学的巨大分子の典型的かつ重要な代表例である。ＨＡは脊椎生物の全ての結合組織中に同一の分子構造を伴って存在する生物学的ポリマーであり、そこでＨＡは、その局所レベルが損傷の際の組織修復、栄養および緊張と厳密に関係しているという意味において、構造的および生物学的役割を演じている。これら生物学的物質の生理学的役割についての総説は、Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．に記載されている［Ｃｏｍｐｅｒ　Ｗ．Ｄ．，Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｔ．Ｃ．：結合組織多糖の生理学的機能：Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．５８，（１），２５５−３１５，１９７８］。ＨＡの化学的−物理的性質は、分子量が最大８，０００，０００ダルトンまで変化する長い非分岐型の分子鎖を形成する、交互にポリマー化された糖の生物ポリマー（Ｄ−グルクロン酸およびＮ−アセチルグリコサミン）のものである［Ｍｅｙｅｒ　Ｋ．：ヒアルロン酸の化学構造：Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃｅｅｄ．１７，１０７５，１９５８；Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｔ．Ｃ．：細胞内マトリックスの化学および分子生物学：７０３−７３２，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎ．Ｙ．，１９７０］。この生物ポリマーの水溶液中での挙動が、ある種の生物学的液体（滑液や硝子体液など）に典型的な特定の粘稠性（粘弾性と称される）を担保する（ここでは、ＨＡは０．１２〜０．２４％の濃度で存在する）［Ｂａｌａｚｓ　Ｅ．Ａ．ら：ヒアルロン酸ならびに硝子体液および水性体液の置換：Ｍｏｄ．Ｐｒｏｂｌ．Ｏｐｈｔｈａｌ．１０，３−２１，１９７２］。また、ヒト由来の水性体液は、１．１４ｍｃｇ／ｇの平均濃度でＨＡを含有していることがわかっている［Ｌａｕｒｅｎｔ　Ｕ．Ｂ．Ｇ．：ヒト水性体液中のヒアルロネート：Ａｒｃｈ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１０１，１２９−１３０，１９８３］。
　一連の公表された証拠が蓄積されており、外性ＨＡの局所供給が、極めて多種の結合および上皮組織の病理学的症状において異なった治療的および保護的な利点を有していることが示されている。これらは、例えば次のものである：
　・非治癒皮膚潰瘍における損傷を受けた組織の再生；
　・関節結合組織の関節退化；
　・眼科手術。
　手術中に損傷を受ける危険にさらされる組織を被覆しうるというＨＡの粘弾性によって付与される可能性が特に有用である。ＨＡを使用した全ての外科医によれば、損傷を与える偶発的な接触にさらされることが最も多い角膜などの組織上に外性ＨＡの粘稠な層が存在すると、保護的な影響力が発揮され、これが手術の成功裏の結果の極めて大きな部分を与える。
　角膜上の外性ＨＡによって発揮される組織修復に対する促進作用および保護効果は、実験動物［Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄ．ら：ウサギの眼内水晶体移植時のヒアルロン酸ナトリウムの使用：Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　８，（６），５８−６１，１９７７；Ｍｉｌｌｅｒ　Ｄ．ら：ウサギの自己角膜移植時のヒアルロン酸ナトリウムの使用：Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　１１，（１），１９−２１，１９８０；Ｇｒａｕｅ　Ｅ．Ｌ．ら：角膜内皮に対するヒアルロン酸ナトリウムの保護作用：Ｅｘｐ．Ｅｙｅ　Ｒｅｓ．３１，１１９−１２７，１９８０；Ｏｚａｋｉ　Ｌ．ら：角膜内皮上のＨｅａｌｏｎ被覆した眼内水晶体の保護作用：Ｆｏｌｉａ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ　Ｊａｐｏｎｉｃａ　３２，１３０１−１３０５，１９８１］、およびヒト［Ｎｏｒｍ　Ｍ．：角膜および結膜の手術前の保護：Ａｃｔａ　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ　５９，５８７−５９４，１９８１；Ｐｏｌａｃｋ　Ｆ．Ｍ．ら：角膜移植およびＩＯＬ移植時のヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｅａｌｏｎ）：Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ　８８，４２５−４３１，１９８１］の両方において示されている。
　治療に、例えば上記した治療において使用される精製されたヒアルロン酸および高純度の特定分画を製造するために、いくつかの方法が知られている。
　有機体原料（例えば、メンドリの冠）の抽出によって直接得られる全ヒアルロン酸の分子分画は、広範囲に変化しうる分子量を有している（例えば、全ヒアルロン酸の分子量の約９０％〜８０％から０．２％まで、好ましくは５％〜０．２％の範囲）。これら分画は、全ヒアルロン酸から、加水分解または酸化または酵素化学試薬または物理的方法（例えば、機械的もしくは照射）により得ることができる。従って、多くの場合、これら精製方法において原始抽出物が生成する［例えば、「美容品および化粧品」（イタリア版Ｎｏ．５／８４，８−１７頁）中のＢａｌａｚｓらの論文を参照］。得られた分子分画の分離および精製は既知の方法により行われている。
　例えば、米国特許Ｎｏ．４，１４１，９７３には、少なくとも７５０，０００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸を製造するための方法が記載されている。このヒアルロン酸は、それらの特に高い純度および炎症作用がないことから、目の手術に使用しうるものである。この方法は、出発物質からＨＡナトリウム塩を抽出し、使用した動物器官に由来する血液残留物を除去し、こうして得た抽出物の脱タンパク質化を行ない、炎症性不純物を除去し、この生成物を水溶液中において滅菌剤で処理し、そして有機溶媒を用いて水溶液からヒアルロン酸の塩を沈澱させることからなる。血液残留物はエタノールで除去し、ナトリウム塩の形態にあるＨＡ（これが出発物質中に見い出される形態である）は水で抽出し、脱タンパク質化は希酸による処理とクロロホルムによる加水分解された部分の同時抽出によって（または、タンパク質加水分解酵素を用いて）行ない、有害な炎症性物質はｐＨ６〜７でのクロロホルムによる抽出によって除去し、そして滅菌は塩化セチルピリジニウムによる処理によって行なう。この方法によると、得られる唯一のヒアルロン酸分画は、この特許において１，５８６，０００ダルトンの分子量を有すると具体的に記載されている分画である。その化学的、物理的および生物学的性質に基づくと、このヒアルロン酸の分子分画は、商標「ＨＥＡＬＯＮ」で知られている市販製品に一致するようである。
　分子の限外濾過などの新しい技術が開発されている。この精製手段によると、分子量範囲の上限または下限の分子量を有するＨＡ分画を排除することができる。例えば、ＥＰＯ特許Ｎｏ．０１２３８５７２（１９９０年７月２５日認可）には、２５０，０００〜３５０，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムの分画を得るための方法が記載されている。この方法は、有機体原料の抽出とそれに続くパパインによる酵素脱タンパク質化によって直接得た生成物を３０，０００の分子カットオフを有する膜（即ち、３０，０００を越える分子量を有する分画だけを捕捉する膜）による２回の分子限外濾過を用いる。この分画操作は炎症性の２次作用のない生成物を得るのに重要であると考えられるが、その理由は、このような作用の原因となる分画が低分子量（例えば、約３０，０００ダルトン）分画であるためである。２００，０００の排除限界を有する膜（即ち、２００，０００ダルトンを越える分子量を有する分画を捕捉する膜）を用いてさらに分子濾過を行なった後には、得られた濾過された生成物は５０，０００〜１００，０００ダルトンの平均分子量を有する分画（この特許ではＨＹＡＬＡＳＴＩＮＥと称されている）であり、一方、膜上に残った部分は５００，０００〜７３０，０００の平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム分画（この分画はＨＹＡＬＥＣＴＩＮと称されている）である。
　　　
発明の要約
　本発明は、高純度かつ特定の分子量範囲を有するヒアルロン酸の分画を製造するための別法を提供するものである。この分画は眼科手術において興味ある適用性を有している。即ち、この生成物は極めて許容性が高く、炎症性ではなく、そして手術後の合併症を引き起こすことがない。さらに、この生成物は、手術後の合併症（特に、高すぎる眼圧など）を引き起こすことなく手術後にそのまま残しておくことができるという大きな利点を与え、従って、現在までの慣例であったその除去中の取扱いに関係した危険を減少させる。ナトリウム塩の形態にあるこの純粋なヒアルロン酸の新規な分画を、以下の記述においては「ＨＡ−１」の名称で呼ぶ。
　　　
発明の詳細な説明
　本発明の発見によれば、全ヒアルロン酸またはそれらの塩（特に、ナトリウム塩などのアルカリ塩）を精製する方法において、そのような酸または塩を特定の型の４級アンモニウム塩に変換する操作を有利に介在させることができる。この塩化は、精製工程のいずれかの段階で行なうことができる。これら４級アンモニウム塩はある種の有機溶媒（非プロトン性溶媒などであり、特にＮ−メチルピロリドンなど）に容易に溶解するので、このような溶媒を用いて該塩を水相から抽出することができ、従って、従来技術に記載されている方法と比較すると特別かつ追加の精製法を与える（工程の最後に得られる生成物の純度に影響するのが明らかな操作）。４級アンモニウム塩へのヒアルロン成分の変換は、例えば、他の塩（特に、ＮａＣｌなど）を含むナトリウム塩の水溶液を、４級水酸化アンモニウム（例えば、水酸化テトラブチルアンモニウム）でスルホン酸樹脂を処理することにより得られる４級アンモニウム塩基で塩化された形態の巨大分子スルホン酸イオン交換物質（例えば、テトラブチルアンモニウム塩の形態で調製されたＤＯＷＥＸ　Ｍ−１５樹脂）を含むカラムまたは反応器を用いて処理することにより行なうことができる。アンモニウム塩が溶出液中に通過し、イオン交換物質により水で完全に溶離する。この水性抽出物を蒸発乾固させ、多糖のアンモニウム塩からなる残留物を上記溶媒のいずれかに溶解し、次いで不溶性の固体部分を濾過する。
　従って、本発明の方法は、そのより一般的な態様においては、ヒアルロン酸またはその分子分画のいずれかまたはそれらの塩のいずれかを、低級（Ｃ１−６）脂肪族ヒドロカルビル置換基を有する対応する４級アンモニウム塩に変換することによって酸または酸分画またはそれらの塩を精製することを特徴とする。
　第２に、本方法は、ヒアルロン酸またはその分子分画のいずれかの４級アンモニウム塩を、そのような塩を溶解することができる有機溶媒中に集めること、濾過した溶液から金属塩の形態のヒアルロン酸またはその分子分画を回収すること、および所望により、このようにして得た塩を、例えば自体既知の方法でさらに精製することを特徴とする。
　即ち、本発明は、動物器官および全抽出物から多糖を抽出する方法において（ここで、本発明の精製法は、分子分画の分断および分離を行なう操作を含む工程の任意の適切な段階で行なうことができる）、そのような分画をさらに加工する際に、ならびに、既に単離した分画（純粋または不純、新規または既知）をさらに精製する際に、ヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を利用することに関する。
　先に記述したように、ヒアルロン多糖の変換は精製工程の任意の適切な段階で行なうことができ、当業者なら、選択した種々の既知工程の特定の組合せによって決まる基準に従ってそれぞれの特定の場合に選択することができるであろう。これらの通常かつ既知の工程には、基本的に、および一般的に言って次の工程が含まれる：
　（１）予め細断およびホモジナイズした動物器官からの多糖の抽出（そのナトリウム塩の状態であるのが一般的かつ普通である）：通常、これは水と混合しうる有機溶媒（例えば、エタノールまたはアセトンなどの脂肪族アルコールまたは低級Ｃ１−６脂肪族ケトン）を用いて行なう；
　（２）適当な溶媒による抽出、または緩衝剤（例えば、塩酸システイン−リン酸）の存在下でのタンパク質加水分解酵素（例えば、パパイン、ペプシン、トリプシンまたはプロナーゼ）による（１）で得た抽出物の水溶液の消化によるタンパク質物質の除去；
　（３）（１）または（２）に従って得た抽出物の透析；
　（４）既知の殺菌剤（例えば、塩化ナトリウム溶液中の塩化セチルピリジニウム）による上記段階のいずれかで得た溶液の滅菌：通常、この操作は数回繰返す；
　（５）異なる分子量を有するヒアルロン多糖分画またはそれぞれの塩の分離、または所望ではない分画の除去（例えば、限界域分子量を有する分画、即ち指定した分子量範囲から離れすぎている分画の除去）：この操作は分子の限外濾過によって行なうのが好ましい（例えば、既知の方法で）；
　（６）適当な有機溶媒（例えば、アルコール）を用いる沈澱による水溶液からの精製分画またはそれぞれの塩（例えば、ナトリウム塩）の単離。
　これら工程の順序、そして恐らくは、従来技術で既に使用されている他の工程または当分野の専門家によって設計された他の工程の順序も大きく変化することができる。本発明の特徴的な工程、即ち、４級アンモニウムイオンの塩化は、最大の技術的効果が期待されるときに任意かつ好都合に挿入することができる。
　多糖成分のアンモニウム塩は、このような塩を溶解しうる上記の溶媒（例えば、具体的に後記する溶媒）を用いてイオン交換樹脂から直接取ることができるが、このアンモニウム塩を最初は水で抽出し、蒸発乾固させるのが好ましい。このようにして単離したアンモニウム塩を上記の溶媒中に集め、次いでこの溶液を濾過する。
　本発明の方法を実施する１つの具体的な方法は、上記順序の上記操作の組合せの工程（２）と（３）の間に挿入を行なうことによって得られる。既知の精製方法および本発明の特徴的な工程（即ち、ヒアルロン酸の金属塩の４級アンモニウム塩への変換）はさておき、本発明の別の具体的な態様によれば鉄イオンのキレート化試薬を好ましくは上記の抽出工程（１）において使用することが可能である。実際のところ、最初のヒアルロン酸抽出物中に常に存在する鉄イオン（使用した動物器官の血液残留物に由来する）が多糖鎖の脱ポリマー化過程の原因であることが知られている。金属イオンの除去は比較的高分子量のヒアルロン分画を得る際に極めて有用であることがわかっており、これをキレート化によって行なうことができる。この方法を採用することによって、高分子量のヒアルロン酸またはその塩を得ることが恐らくは可能であるだけではなく、上記の鉄イオンが全く存在しないが故に水溶液中で安定な特に純粋な生成物を得ることも可能である。
　従って、本発明の好ましい目的は、ヒアルロン酸および／またはその塩のいずれかを含む動物器官を鉄イオンのキレート化剤の存在下に水と混合しうる有機溶媒で抽出し、もはや鉄イオンが存在しなくなるまでこの操作を繰返し、これら洗液の予め乾燥した残留物をタンパク質加水分解試薬と適当な緩衝液の存在下の水性溶媒中に集め、この溶液（全ての固体残留物を予め除去しておく）を低級（Ｃ１−６）脂肪族基との４級アンモニウム塩の１つの形態にある巨大分子スルホン酸樹脂からなるイオン交換器に通すことを特徴とする方法からなる。次いで、このイオン交換器から得た溶出液を乾燥し、ヒアルロン酸およびその分画の４級アンモニウム塩を溶解しうる有機溶媒中に溶解する。次いで、この有機溶液にハロゲン化ナトリウム（塩化ナトリウムまたは臭化ナトリウムなど）の水溶液を添加することによってアンモニウム塩をナトリウム塩に転換する。次いで、このようにして得たナトリウム塩の水溶液を水と混合しえない有機溶媒で抽出し、所望により、透析を繰返す。次いで、得られた溶液を殺菌剤で処理し、所望により、殺菌後に得られた溶液を巨大分子濾過にかけてもよい。次いで、所望ではないヒアルロン多糖分画の全てを捨て、ヒアルロン酸ナトリウムの所望の分画を自体既知の方法で単離する。
　本発明に従って４級アンモニウム塩を溶解するために用いる溶媒は、非プロトン性溶媒、例えばＮ−アルキルピロリドン、特にＮ−メチルピロリドン、ジアルキルスルホキシド、ジアルキルカルボキシアミド、例えば低級（Ｃ１−６）ジアルキルスルホキシド、特にジメチルスルホキシド、および低級（Ｃ１−６）脂肪族酸の低級（Ｃ１−６）ジアルキルアミド、例えばジメチルもしくはジエチルホルムアミドまたはジメチルもしくはジアセチルアセトアミドである。
　イオン交換樹脂を調製するために使用され、従って本発明の特徴的なヒアルロン酸アンモニウム塩を調製するために使用されるテトラアルキルアンモニウム塩基は低級脂肪族基を有する塩基、好ましくは１〜６個の炭素原子を有するアルキルを有する塩基である。テトラブチルアンモニウムイオンで塩化された樹脂を用いるのが最も好ましい。
　ヒアルロン酸、その分子分画およびその塩の抽出、精製および単離の工程に用いる上記の組合せにおいて、特に本発明の好ましい方法を構成する上記組合せにおいて、以下の試薬を用いるのが好ましい。
　（ａ）動物器官からなる出発原料の抽出用として：エタノールまたはアセトン；
　（ｂ）鉄イオンのキレート化剤として：１，１０−フェナントロリンまたはジメチル誘導体；
　（ｃ）タンパク質加水分解試薬として：既に挙げたもの；
　（ｄ）４級アンモニウム塩の溶媒として：Ｎ−メチルピロリドンまたはジメチルスルホキシド；
　（ｅ）アンモニウム塩の有機溶液から得たナトリウム塩の水性抽出物の精製用の溶媒として：塩化メチレン、酢酸エチル；
　（ｆ）殺菌剤として：リン酸緩衝剤の存在下の塩化セチルピリジニウム；
　（ｇ）恐らくは限外濾過の後に、精製された水溶液からナトリウム塩を沈澱させるための有機溶媒：エタノール。
　上記の工程において、一層純粋な最終産物を成功裏に得る際にさらに使用しうる変法を導入することもできる。例えば、上記した種類の殺菌剤［即ち、複素環式核を有し、長鎖のアルキル（例えば、セチル）を含む４級アンモニウム塩、例えば先に挙げた塩化セチルピリジニウム］の使用は、ヒアルロン酸ナトリウムの溶液にこれらを添加するとヒアルロン酸のイオンとで対応するアンモニウム塩を生成するので、同時に精製工程として作用することができる。これらの塩は水溶液中で沈澱し、従ってこの処理は、その後の再沈澱の繰返しと沈澱の洗浄および次いで行なうＮａＣｌ溶液中への溶解によって、超精製された生成物を単離するためのヒアルロン酸ナトリウムの溶液を得ることを可能にする。これらの生成物は眼科手術の際に使用するのに特に適している。
　分子の限外濾過は自体既知の方法で行なう。即ち、例えば２００，０００以上の比較的高い分子量を有する分画を捕捉する膜を使用し、所望により、この分離した分画を濾過した生成物および膜の両方から回収することができる。本発明の方法を実施する際の特に重要な方法は、低分子量のヒアルロン分画を排除する分子限外濾過と上記の化学的な精製操作を組合せることである。このような分画は、上記のＥＰＯ特許Ｎｏ．０１３８５７２（１９９０年７月２５日認可）に記載されている分画について報告されているように、治療用の産物における炎症作用の開始の原因であることが認められている。
　従って、本発明の別の好ましい目的は、精製操作の細部の組合せに関するものであり、所望の部分において、分子限外濾過を行なって低分子量分子分画、特に３０，０００以下の分子量を有する分画を排除する上記方法である。この方法により、より正確には例示の実施例１および２に記載した詳細に従うことにより、治療学的な見地から極めて有用であり、かつ最初に言及したようにＨＡ−１の名称を有する、ヒアルロン酸ナトリウムの分画が得られる。これを眼科手術に用いるのが特に重要である。
眼科手術の際の生成物の使用
　文献に記載されており、眼の手術への使用が推奨されているヒアルロン酸は、絶対的な完全性の基準を満たさない。その理由は、高すぎる分子量の、従って高すぎる粘度の炎症性物質および成分の両残留物または痕跡物が存在するために、それらヒアルロン酸を手術（例えば、白内障の手術）の後にその場所に残すことができないためである。さらに、これらは先に言及したように望ましくない危険な眼圧の上昇を引き起こすことがある。
　手術中に前眼房に導入した外性のＨＡは、手術後の眼内圧にネガティブな作用を発揮することがなく、また、眼内環境において炎症性の結果を誘発しないはずである。この前者の悪い作用は、極めて粘度の高い非常に高分子量のＨＡを使用した後に、文献に繰返し記載されていた［Ｂｉｎｋｈｏｒｓｔ　Ｃ．Ｄ．：眼内水晶体手術にＨｅａｌｏｎを使用した後の炎症および眼内圧：Ａｍ．Ｉｎｔｒａ−Ｏｃｕｌａｒ　Ｉｍｐｌａｎｔ．Ｓｏｃ．，６，（４），３４０−３４１，１９８０；Ｐａｐｅ　Ｌ．Ｇ．：Ｈｅａｌｏｎを用いる水晶体移植のカプセル内およびカプセル外法：Ａｍ．Ｉｎｔｒａ−Ｏｃｕｌａｒ　Ｉｍｐｌａｎｔ．Ｓｏｃ．，６，（４），３４２−３４３，１９８０；Ｐａｓｓｏ　Ｍ．Ｓ．ら：Ｈｅａｌｏｎを用いる白内障手術の後の眼内圧：ＡＲＶＯ　ａｂｓｔｒａｃｔｓ，１０，１０：４５，１９８１；Ｐｅｒｃｉｖａｌ　Ｐ．：Ｂｏｂｅｒｇ　Ａｎｓ水晶体とヒアルロン酸ナトリウム（Ｈｅａｌｏｎｉｄ）を用いる実験：Ｔｒａｎｓ．Ｏｐｈｔｈａｌ．Ｓｏｃ．ＵＫ，１０２，（２），２９４−２９７，１９８２；ＭｃＲａｅ　Ｓ．Ｍ．ら：角膜内皮および眼内圧に及ぼすヒアルロン酸ナトリウム、硫酸コンドロイチンおよびメチルセルロースの作用：Ａｎｎ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９５，３３２−３４１，１９８３］。
　この経験により、手術後に生理学的食塩水ですすぐことによって物質を除去することが推奨される結果になった。Ｂｅｒｓｏｎら［Ｂｅｒｓｏｎ　Ｆ．Ｇ．ら：摘出したヒトの目のヒアルロン酸ナトリウムによる水流の遮断：Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．９５，６６８−６７２，１９８３］は、死後摘出したヒトの目においてこの望ましくない現象の機序を研究し、導入した物質の極めて高い粘度による、前眼房における生理学的な排水の促進の機械的遮断が基本的な原因であることを示唆した。
　Ｂａｌａｚｓの米国特許（Ｎｏ．４，１４１，９７３；第１３欄を参照）に記載されている１，５８６，０００の分子量を有するヒアルロン酸ナトリウム分画は、その表示された物理化学的および生物学的性質に鑑みると、市販されている最良の眼用製品のようである。これは「Ｈｅａｌｏｎ」の名称で知られているものであり、上記の不都合を免れているものではない。即ち、その分子量は本質的に高すぎ、従って、ある種の目の手術用には不適切な粘度を有している。
　上記の特許において消炎作用を測定するために用いられている試験は良好なデータを与えているが、Ｈｅａｌｏｎは眼圧の上昇などの手術後の合併症を引き起こすので、例えば白内障の手術などの後にその場所に残すことができない。
　Ｄａｌｅ　Ｐ．Ｄｅ　Ｖｏｒｅの米国特許Ｎｏ．４，９２０，１０４（Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．Ａｃｔｏｎ，Ｍａｓｓ．に譲渡）には、４５，０００〜６４，０００ｃＳｔの運動粘度を有し、１，０００，０００〜２，０００，０００ダルトンの範囲の平均分子量を有するヒアルロン酸ナトリウムを含有する、生理学的食塩溶液中のヒアルロン酸ナトリウムの粘弾溶液が記載され、特許請求されている。この産物も目の手術に使用することが挙げられており、手術後の副作用が少ないことから、特に手術後の眼圧の上昇が抑制されることから、他の調製物よりもさらに有利に使用することができると記載されている。
　しかし、この特許の表１はこの産物をそのまま残したときに手術後の眼圧の上昇が存在することを示しており、第４欄の表２および３からわかるように、この産物も手術後に除去しなければならない。
　眼科において使用するための別のヒアルロン酸ナトリウム分画が欧州特許Ｎｏ．０１３８５７２に記載されているが、これは５００，０００〜７３０，０００ダルトンの平均分子量を有している（ＨＹＡＬＥＣＴＩＮ）。これは球内液の置換用に好都合に用いることができ、また、白内障や眼移植などの目の手術にも使用される。しかし、手術後に除去することなく、手術中の前眼房内の正しい間隙を保つことができ、硝子体の反応に釣り合うことができ、眼内構造に対して有効な保護作用を持つことができるさらに大きな粘弾性を有する産物が必要とされていた。我々が調べたところによると、文献に記載され、上記した目の手術に使用される高分子量の産物は常に手術後に除去しなければならなかった。本発明の利点は、抽出溶液に鉄イオンのキレート化剤を添加し、こうして低分子量の分画に脱ポリマー化することを妨げることによって得られる、生物に残存させることを不可能にする分画または不純物を含まない、比較的高分子量のヒアルロン酸ナトリウムの分画を得るために元の方法に工夫が加えられたことにある。従って、本発明の新規な分画ＨＡ−１は当分野において新規であり、大きな進歩を示すものである。
　実施例１および２に記載した方法によって得ることができる本発明の分画「ＨＡ−１」は次の性質を有している。
　
粘度
　
タンパク質含量
　
Ｕ．Ｖ．
　
動的粘度
　
硫酸化されたムコ多糖
　
鉄
　
安定性
　・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；
　・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）；
　・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；
　・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。
　本発明のヒアルロン酸分画ＨＡ−１の優れた性質を以下の実験により示すことができる：
　サルにおけるＨＡ−１分画の眼内許容性
　　　
目　的
　この試験は、ＨＡ−１を眼の硝子体へ注射した後のサルにおける眼の許容性を評価するために行なった。
　　　
材料および方法
１．
試験種
　６匹の若年成体雌性カニクイザル［マカク属ファシクラリス（Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）］を本実験のために使用した。これらは健康であり、検出可能な眼の病変はなかった。
　眼の手術に用いられる粘弾性の生成物の眼許容性の実験に最も良い種であると考えられるため、霊長類を本実験のために選択した。
　眼許容性実験に以前用いていたヨザルは現在絶滅の危機に瀕した種であり法的な保護を受けているため、カニクイザルを選択した。
２．
実験群および関連の処置
群の指定および投与量
　以下の計画に従ってサルを１度処置した：
３．
化合物の調製および投与
　手術の日にペントバルビタールナトリウムを追加した塩酸ケタミンでサルを麻酔した。次いで局所用の１．０％トロピカミド（Ｍｙｄｒｉａｃｙｌ，Ａｌｃｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で瞳孔を散大させた。虹彩、結膜、付属器および前方部分をスリット−ランプ生体顕微鏡で検査し、後方部分を倒像検眼鏡で検査した。０．５％ポビドンヨードおよび滅菌食塩水で２度洗浄して洗い流すことにより眼瞼周囲の皮膚を手術のために準備した。滅菌布および眼瞼鏡を設置し、小歯鉗子で眼球を安定させた。鋭利なおよび鈍い切開により、上縁から約１０ｍｍの部分を上縁に平行して、約１０〜１５ｍｍの長さで、縁を基部とする結膜皮弁を開いた。結膜およびテノン嚢を通って上強膜までこの切開を行った。縁へ前方に切開することにより皮弁を調製し、毛様体輪を覆っている、下に横たわる強膜を露出した。縁から約５〜６ｍｍを約３ｍｍ間隔の傷で、７−０Ｖｉｃｙｒｌ（Ｅｔｈｉｃｏｎ）の強膜内さし縫い縫合をした。
　２５−ゲージの針を用いて０．５ｍｌの硝子液を吸引し（２匹の動物においては０．４ｍｌだけ吸引し得た）；硝子体を等量のＨＡ−１（１２ｍｇ／ｍｌ）または滅菌食塩水で置換した。漏出を防ぐためにさし縫い縫合をしっかり締めて結膜皮弁を戻した。抗生物質の軟膏を局所的に塗った。投与の前および投与約４８時間後に血球計を用いて、吸引した硝子体について硝子体細胞のカウントを行った。
４．
観察および記録
　手術の約４８時間後に、動物を麻酔して眼内部の検査を行った。既述のように麻酔、散大および検査を行った。問題の眼がＨＡ−１を注射されたものか対照物質を注射されたものかについては盲検法により検査を行った。以下の眼の評価スケールのための標準記号で示されるように眼のパラメーターを等級付けた。
　結膜の浮腫、充血および分泌物；
角膜の浮腫、ヘム、細胞および発赤：
　　　０＝正常
　　＋１＝軽度
　　＋２＝中度
　　＋３＝重度または大規模
硝子体の透明度：
　　　０＝透明
　　　１＝かすかな濁り−基底部が見える
　　　２＝中度の濁り−基底部がわずかに見える
　　　３＝濁り−赤い基底部の像
　　　４＝濁り−灰色の基底部の像
　　　５＝基底部が見えない
　既述のようにポピドンヨード溶液を用いて吸引のために眼を調製した。眼瞼鏡を設置し、眼球を小歯持針器で安定させた。硝子体（０．１〜０．２ｍｌ）を、上側頭四分円の縁から６ｍｍを結膜および強膜を通して直接吸引した。元の手術部位を避けるように注意した。血球計を用いて炎症性細胞をカウントした。局所用の抗生物質軟膏を再び塗った。
　　　
結　果
　結果（表１）は、対照物質（食塩水）に比較した場合にＨＡ−１が非常に良く許容され、顕著な眼の炎症を生じなかったことを示している。
　食塩水群の２匹の動物は軽度の水性細胞の浸潤および発赤を示した。対照の硝子体の白色細胞数はｍｍ３当たり１０〜６０細胞の範囲にあった。ＨＡ−１を注射したある眼においては、軽度の水性細胞の浸潤および発赤が示された。硝子体白色細胞数は試験眼においてｍｍ３当たり０〜３０細胞の範囲にあった。
　従って、食塩水の対照に比較して、ＨＡ−１は硝子体内置換の後の眼組織により非常に良く許容されることが結論付けられる。
　後眼房眼内水晶体移植を伴う水晶体嚢外白内障摘出のための手術においてＨｅａｌｏｎとＨＡ−１の効力を評価するための臨床実験を以下に示す。
　　　
目　的
　以降に記載する実験により、２つの臨床実験における白内障摘出および眼内水晶体移植において主たる市販品である粘弾性物質（Ｈｅａｌｏｎ）に比較したＨＡ−１の効力および安全性を評価した。第一の臨床実験において、同じ実験条件（両方とも手術後に吸引）でＨＡ−１およびＨｅａｌｏｎを試験した。第二の実験は、特に手術後の眼内圧および内皮細胞数の上昇に関するＨＡ−１の安全性に焦点を当てた：この第二の実験（両粘弾性物質を手術後に吸引した第一の実験とは異なる）においてＨＡ−１は、眼から吸引したＨｅａｌｏｎとは異なり、手術が終了した時点で除去しなかった。
　　　
材料および方法
１．
実験計画
　両実験のための計画は、無作為化、並行群、覆面の観察者（別々の研究者が追跡調査を行った）、後眼房眼内水晶体移植を伴う水晶体嚢外白内障摘出におけるＨｅａｌｏｎに対するＨＡ−１の評価により行った。各実験において、老人性白内障の一次診断を受けた患者および１８歳以上のものを適格であるとした。
　具体的には以下の通りである：
・第一実験において、２１７名の患者を集め、約３：１（ＨＡ−１：患者１６１名、Ｈｅａｌｏｎ：患者５６名）の比に従い無作為化を行った。
両粘弾性物質を手術後に吸引した。
実験期間は、手術前の評価、手術の進行および手術直後の追跡調査期間を含んだ。本実験において、眼内圧を手術後３時間および手術の１、７および３０日後に追跡調査で測定した。
・第二臨床実験において９１名の患者を集め、約１：１の比に従いＨＡ−１（４５）またはＨｅａｌｏｎ（４６）に無作為化した。
本実験において、第一実験と同様に吸引したＨｅａｌｏｎとは異なり、ＨＡ−１は手術後に吸引しなかった。
実験期間（およびＨＡ−１に対する関連の実験物質）は第一実験で既述したものと同じである。
本実験において、手術後の眼内圧を手術の１、３、６よび９時間後（第一実験よりも頻繁）および手術の１、７、３０およびさらに９０日後の追跡調査で測定した。本実験には始点および手術の９０日後の顕微鏡観察も含めた。
２．
データの分析および統計学的方法
　中央および処置群の比較可能性（α＝０．１０）および安全性および効力（α＝０．０５）を評価するために統計学的分析を行った。フィッシャーの完全検定、ｔ−検定、記述統計値を用いてデータを評価した。
３．
実験集団および特性
　合計３０８名の患者について実験を行った。それらを以下に示す：
　ほとんどの人口統計学的、医療または白内障の特性に関して、各実験における２つの処置群の間にはいかなる実質的な差異もなかった。
４．
手術
　調製および方法：後眼房眼内水晶体移植を行う、併発症を伴わない老人性／成人水晶体嚢外白内障摘出に対する研究者の標準的な手術法により手術を行った。手術前（予防的）薬物療法、麻酔および他の手術中の投薬は研究者の標準的な方法に従い行ったが、眼用抗高血圧薬の使用はしなかった。切開前の眼内圧はホーナン（Ｈｏｎａｎ）眼内圧降下器、”Ｓｕｐｅｒ　Ｐｉｎｋｙ”または手による圧力を用いてできるだけ低下させた。粘弾性物質（ＨＡ−１およびＨｅａｌｏｎ）を以降に記載するように用いた。
　第二臨床実験において用いられるＨＡ−１をその場所に入れたままにしておく以外は、薬物を手術後に除去した。
　手術の進行を容易にし、眼組織を保護するなどのためにＨＡ−１およびＨｅａｌｏｎの両方を後眼房に挿入した。具体的には次の通りである：
第一実験
・用いたＨＡ−１の平均量（１２ｍｇ／ｍｌの濃度で０．５６８ｍｌ）は用いたＨｅａｌｏｎの量（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で０．４３９）よりも顕著に多かったが、その差はわずか０．１２９ｍｌであった。
第二実験
・用いた粘弾性物質の平均量には有意差はなかった：本実験において平均量は０．９５７（ＨＡ−１）および０．８３３（Ｈｅａｌｏｎ）であった。
５．
評価
　手術前、手術中および手術後に以下の試験を実施した：
　ａ）手術前の評価、例えば以下の事項を評価した。
・視力（最も良く現れる）、眼圧測定、厚度測定法（角膜の厚さについて）およびスリットランプおよび検眼鏡検査による発見
・顕微鏡観察（第二実験のみ）：１０の選択された中央の角膜の位置で顕微鏡観察により内皮細胞をカウントした。各々のカウントを適当な因子により調整し、１平方ミリメートル当たりの細胞数を得、平均して１平方ミリメーター当たりの典型的な細胞数を得た。
　ｂ）手術後の評価、例えば：
・眼内圧（眼圧測定による）を以下の時点で計測した：
・手術後３時間（第一実験）
・手術後１−３−６−９時間（第二実験）
・検眼鏡およびスリットランプによる検査、厚度測定、眼圧測定、顕微鏡観察（この最後のものは内皮細胞カウントのため第二実験についてのみ行った）および視力の測定（追跡調査で）を以下の時点で実施した：
・第一実験においては１−７−３０日
・第二実験においては１−７−３０−９０日
　　　
結　果
１．
手術の評価−用いた粘弾性物質の取り扱い特性
　両臨床実験における各処置群の大きな割合において粘弾性物質は水晶体移植を容易にするものと評価された。
２．
手術後の合併症
　２ａ）第一臨床実験
　表２からわかるように：
・最も高い合併症の百分率（全患者の７．９％）は手術と１日目の間に発生し、一方でより少ない割合が７日および３０日に報告された。
・手術後１日目に合併症を患っているＨｅａｌｏｎで処置した患者の割合（１４．３％）は、ＨＡ−１で処置した患者の割合（５．７％）より２．５倍高かった。この差異は統計学的に有意である（フィッシャーの両側完全検定によりｐ＝０．０７９ｙ）。７日および３０日における差異は統計学的に有意ではなかった（フィッシャーの両側完全検定によりｐ＞０．６）。
合併症には、眼内圧の３０ｍｍＨｇまたはそれ以上への上昇（７／１５８＝ＨＡ−１処置患者の４．４％、５／５６＝Ｈｅａｌｏｎ処置患者の８．９％）および角膜浮腫、虹彩炎、結膜炎、前房出血、黄斑浮腫、創傷の漏出、毛様体炎膜および結膜下出血が含まれた。
　手術前および手術後（３時間および１−７−３０日）に得られた眼圧測定によるデータをまとめた表３からわかるように：
・処置群間で平均眼内圧におけるいかなる有意な差異も生じなかった；しかし、Ｈｅａｌｏｎ処置患者は３時間および１日でより大きな平均眼内圧の上昇があり、１日ではＨＡ−１処置患者より有意に大きな眼内圧の標準偏差を有した。
　スリットランプ、厚度測定（角膜の厚さに対する）および検眼鏡検査により２つの群の間にいかなる差異も現れなかった。
　２ｂ）第二臨床実験
・ＨＡ−１処置患者（２８．６％）よりもわずかに高い割合のＨｅａｌｏｎ処置患者（３７．０％）について、手術後の合併症が報告された（表４）。
合併症には、眼内圧の上昇（５／４２＝ＨＡ−１処置患者の１１．９％、１１／４６＝Ｈｅａｌｏｎ処置患者の２３．９％）および前房出血、創傷の漏出、硝子体出血、後嚢混濁化、脈絡膜剥離、虹彩萎縮および黄斑浮腫が含まれる。
・始点または１日から９０日までのどの時点においても、平均眼内圧または眼内圧の変化性のいずれについても２つの処置群は統計学的に差異がなかった（表５）。手術後最初の９時間で、Ｈｅａｌｏｎ（眼から除去）およびＨＡ−１（そのまま残存）が標準偏差に関して主に異なる手術後の眼内圧分布を生じたことが明らかである。Ｈｅａｌｏｎ処置患者は手術１時間後により大きな標準偏差および有意に高い平均値を有し、ＨＡ−１処置患者は手術の６時間および９時間後に比較的大きいがごくわずかに有意な標準偏差を有していた。手術の１時間後に、Ｈｅａｌｏｎ処置患者の２２．７％およびＨＡ−１処置患者の１０％が２１ｍｍＨｇまたはそれ以上の眼内圧を有していた。手術の６時間および９時間後に、ＨＡ−１処置患者の大きな割合（６時間で７３．２％および９時間で６５．０％）およびＨｅａｌｏｎ処置患者（６時間で６８．２％および９時間で７１．４％）が２１ｍｍＨｇまたはそれ以上の圧力値を有していた。
・第一実験で報告された観察に関して２群間に他のいかなる差異も示されなかった。同様に、顕微鏡観察（内皮細胞カウント）によっていかなる有意な差異も示されなかった（表６）。
３．
量的な結果
　視力の評価により、２つの粘弾性物質の効力は匹敵することが示された。具体的には：
・第一臨床実験：
３０日で視力が２０／４０に達したＨｅａｌｏｎ処置患者（７７．８％）およびＨＡ−１処置患者（８４．７％）の割合の間に有意差はなかった。
・第二臨床実験：
３０日で視力が２０／４０またはそれ以上に達したＨｅａｌｏｎ処置患者（７３．９％）およびＨＡ−１処置患者（７１．４％）の割合の間に有意差はなかった。９０日でその割合はほとんど同一となった。
　　　
結　論
　本明細書中に記載された２つの臨床実験の結果により、白内障摘出および眼内水晶体移植におけるＨＡ−１の使用の有用な効力が示されている。特に、ＨＡ−１は良く許容されることが示された。事実、この生成物により惹起される手術後の合併症は、手術後に物質の除去を行うという（第一臨床実験で記載したように）同じ実験条件で試験したＨｅａｌｏｎよりも少ない（約２．５倍少ない）。手術後の合併症のうち、眼内圧の上昇は特に考慮すべきである。
　両実験において、ＨＡ−１で処置した患者およびＨｅａｌｏｎで処置した患者の手術後の経過が眼内圧に関して差異があったことに注目すべきである。ＨＡ−１およびＨｅａｌｏｎの両方を手術後に除去した第一実験において、ＨＡ−１処置患者に比較して、Ｈｅａｌｏｎ処置患者のより高い割合で１日目に２１ｍｍＨｇ以上の眼内圧の上昇が示された。Ｈｅａｌｏｎとは異なり手術後にＨＡ−１が除去されなかった第二実験において、ＨＡ−１の手術後の眼内圧特性は同等であった。
　従って、２つの粘弾性生成物のいくつかの側面は同等であったが、手術後の合併症に関してこれらは異なることが結論付けられる：眼から除去されたＨＡ−１よりも眼から除去されたＨｅａｌｏｎは眼内圧のより大きな上昇と関連しているようであり、その場所に残されたＨＡ−１は手術後に除去されたＨｅａｌｏｎに匹敵する手術後の眼内圧特性を示す。
　これらの結果に基づき、手術後の合併症を誘導することなくＨＡ−１をその場所に残しうることに注目することが重要である。この可能性は、以下の有用な利点を提供する。
　１．手術後にこの産物を抜取る工程が割愛されるので手術を簡単にする。
　２．操作による、即ち吸引中の合併症の危険を減少させる。このような危険の例は、手術過程に基づく外傷およびその対応する結果である。
　また、本発明は活性成分として、ナトリウム塩の形態のヒアルロン酸の新規な分子分画ＨＡ−１を含有する医薬調製物（特に、中性ｐＨの食塩水溶液の形態にある　）に関する。選択されるＨＡ−１の濃度は、所望の粘度、例えば約３００ｍＰａ　ｘ　ｓ（３５０
秒−１
秒−１
　さらに、本発明は、目の手術、特に白内障の手術または水晶体移植において新規なヒアルロン酸ナトリウム分画ＨＡ−１を使用することに関する。
　以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する。
　
実施例１
　メンドリの冠（新鮮または凍結品）（３０００ｇ）をひき肉機で細かく刻み、次いで機械的ホモジナイザーで注意深くホモジナイズする。得られたペーストを、０．１％（ｗ／ｖ）の特定の鉄キレート化剤を含む無水アセトンまたはエタノール（１０容量）を入れたガラス容器に移す。
　１，１０−フェナントロリン（Ｃ．Ａ．Ｒ．Ｎ．６６−７１−７）またはそのジメチル誘導体が有用なキレート化剤の例である。ガラス容器と特定の鉄キレート化剤は、ヒアルロン酸のナトリウム塩の脱ポリマー化過程を避けるために用いる（この過程は、他の方法によると、鋼鉄製容器または血液残留物に由来する鉄イオンによって引き起こされることがある）。
　鉄イオンが完全に抽出されるまでメンドリの冠を処理する［装置の対照：最大吸収波長での１ｃｍセル中のアセトンまたはエタノール相におけるコンプレックス鉄−キレート化剤の吸光度（１，１０−フェナントロリンの場合には５１０ｎｍ；０．００５Ａ．Ｕ．を越えない）］。
　同容量の無水アセトンまたはエタノールを用いてさらに洗浄操作を行なって残留する全てのキレート化剤を除去する。この処理は、以下の試験「Ａ」の結果がネガティブになるまで行なう。
　試験「Ａ」：アセトンまたはエタノールの相（５ｍｌ）を中くらいの窒素流によって蒸発させる。この残留物を水（５ｍｌ）に溶解し、キレート化剤の最大吸収の波長で吸光度を測定する。
　吸光度が０．１Ａ．Ｕ．以下であるときにこの試験はネガティブであるとみなされる。
　最終的な反応生成物を５０ｒｐｍの速度で６時間撹拌し、１２時間分離させ、次いで溶媒を吸い上げ、これを廃棄した。
　この抽出過程は、廃棄される溶媒が適切な水分レベルに到達するまで繰り返す（Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｃｈｅｒ法）。
　次いで、得られた物質を遠心し、適切な温度で５〜８時間、真空乾燥する。この過程の収量は乾燥粉末が約５００〜６００ｇである。
　次いで、この乾燥粉末（３００ｇ）を、乾燥粉末に対して２０：０．０１〜２０：１の比を与える量の塩酸システインを用い、リン酸緩衝剤の緩衝化水性媒体により、適当なタンパク質加水分解試薬（パパイン、ペプシン、トリプシンまたはプロナーゼ）（０．２ｇ）による酵素消化過程に付す。次いで、この混合物を６０〜６５℃の一定温度で２４時間、６０ｒｐｍで撹拌する。ＣｅｌｉｔｅＲ（６０ｇ）を加えて全体を２５℃まで冷却し、撹拌をさらに１時間続ける。
　透明な液体が得られるまで得られた混合物を濾過する。
　蒸留水で２ｍｇ／ｍｌまで希釈した上記の水溶液を、水酸化テトラブチルアンモニウムで処理することによりテトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ＋）形態で得られる巨大分子イオン交換樹脂ＤＯＷＥＸ　Ｍ−１５を充填したカラムに導入する。
　カラムから溶出した溶液を蒸発させ、乾燥残留物を適当な容量のＮ−メチルピロリドン（または、ジメチルスルホキシド）に溶解して２ｍｇ／ｍｌの濃度にする。
　得られた溶液を濾過し、４℃まで冷却し、水（等容量）を加える。次いで、塩化メチレンを用いて３回の洗浄工程を行ない、それぞれについて低い方の相を捨てる。次いで、高い方の相を臭化ナトリウム（ＮａＢｒはヒアルロン酸に対して３：１のモル比で用いる）を用いて４℃で処理し、この水溶液をエタノール（３容量）の添加によって沈澱させ、この沈澱をエタノールで数回洗浄する。
　この沈澱を水に溶解し、得られた溶液を透析にかける。塩化ナトリウムを加えることによってこの溶液を０．１Ｍにし、温度を５０℃にする。６０ｇ／分で生成物を撹拌しながら、塩化セチルピリジニウム（４５ｇ）を加える。この混合物を６０分間撹拌し、次いでＣｅｌｉｔｅＲ（５０ｇ）を加える。撹拌を続けると生成物の温度が２５℃まで下がり、生成した沈澱を遠心によって集める。このようにして得た沈澱を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．０１Ｍ塩化ナトリウム溶液（５Ｌ）に懸濁させる。これを５０℃でさらに６０分間撹拌する。温度を２５℃まで低下させ、沈澱を遠心する。
　次いで、この洗浄過程を３回繰返し、最後にこの沈澱を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．０５Ｍ塩化ナトリウム溶液（３Ｌ）を入れた容器中に集める。これを６０ｇ／分で６０分間撹拌し、２５℃の一定温度に２時間保った。この上清を遠心によって除去する。
　この過程を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いて数回繰返す。この混合物を遠心し、その上清を捨てる。この沈澱を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．３０Ｍ塩化ナトリウム溶液に分散させる（３：１）。
　この混合物を撹拌し、沈澱と透明液の両方を集める。沈澱に対する抽出をさらに３回繰返す［それぞれに同じ水溶液（０．５Ｌ）を用いる］。
　残留した沈澱を取り、透明な液体を１つの容器に集める。この液体の温度を、撹拌しながら５０℃まで上昇させる。次いで、この液体を塩化ナトリウムで０．２３Ｍにする。塩化セチルピリジニウム（１ｇ）を加え、撹拌を１２時間維持する。この混合物を２５℃まで冷却し、次いで、最初はＣｅｌｉｔｅＲパックで続いてフィルター（１ｕ）で濾過する。
　次いで、得られた溶液を３０，０００の分子排除限界を有する膜による分子限外濾過に付し、０．３３Ｍ塩化ナトリウム溶液を添加しながら元の容量の３倍を限外濾過する。塩化ナトリウム溶液の添加を中断し、液体の容量を元の容量の１／４まで減少させる。
　このようにして濃縮した溶液を、９５％エタノール（３容量）を用いて２５℃の温度で撹拌（６０ｇ／分）しながら沈澱させる。この沈澱を遠心して集め、その上清を捨てる。この沈澱を０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液（１Ｌ）に溶解し、９５％エタノール（３容量）を用いてこの沈澱操作を繰返す。
　この沈澱を集め、そして、最初は７５％エタノール（３回）で、次いで無水エタノール（３回）で、３番目には無水アセトン（３回）で洗浄する。
　このようにして得た生成物（ＨＡ−１分画）は、７５０，０００Ｄ〜１，２３０，０００Ｄ（好ましくは、９２５，０００〜１，２３０，０００）の範囲の平均分子量を有する。
　このヒアルロン酸の収率は、元の新鮮な組織の０．６％に等しい。
　上記の方法によって得られる最終産物は次の性質を有している：
・
分子量
・
固有粘度数
・
タンパク質含量
・
Ｕ．Ｖ．吸光度
・
動的粘度
・
硫酸化されたムコ多糖含量
・
鉄含量
　鉄含量について、ＨＡ−１分画と市販品から入手した他のヒアルロン酸ナトリウム塩の溶液の間で比較試験を行なった。
　得られた結果（表７）は明らかに異なった鉄含量を示している：ＨＡ−１分画は他の産物の鉄含量よりもはるかに低い鉄含量を有している。
・
安定性
　・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；
　・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）；
　・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；
　・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。
　ＨＡ−１の生理学的ｐＨの等張緩衝溶液と市販品から入手した類似のヒアルロン酸溶液の間で比較試験を行なって、次の条件での安定性を測定した：
・自然放置（室温で６カ月保存）；
・種々の条件での熱滅菌。
　医薬用の原料および記載した目的に信頼できることが既に証明されている装置を用いた。
　具体的には、これらは次の通りである：
・以下の性質を有する無色のガラス製バイアル：
　・ガラス：タイプ−１の硼ケイ酸ガラス（Ｐｈ．Ｅｕｒ．ＩＩ版）；
　・最小ガラス厚み：０．９０ｍｍ；
　・最大ガラス厚み：１．００ｍｍ；
・以下の性質を有するハロゲン化ブチルゴムで調製された栓：
　・エラストマーの種類：クロロブチル；
　・不活性充填剤：カオリン；
　・顔料：二酸化チタンおよびカーボンブラック；
　・加硫剤：酸化亜鉛；
　・放出性：Ｐｈ．Ｅｕｒ．ＩＩ版　ＶＩ．２．３．１に準じる；
　・アルミニウム製の取りはがし密閉；
　・注射用水（Ｐｈ．Ｅｕｒ．ＩＩ版に準じる）。
　使用した試薬は分析グレードのものであった。
　滅菌には、Ｆｅｄｅｇａｒｉオートクレーブ（ＦＯＦ５　Ｓｕｐｅｒｓｐｅｃｔｒａ型）を用いた。
　固有粘度数は、吊下げ水平Ｕｂｂｅｌｈｏｄｅ型粘度計を用い、ｐＨ７．０の０．１５Ｍ　ＮａＣｌ中、２５℃で測定した。
　対応する平均分子量は、Ｍａｒｋ−Ｈｏｕｗｉｎｋの式によって計算した［Ｈ．Ｍａｒｋ：Ｚ．Ｅｌｅｋｔｒｏｃｈｅｍｉｅ　４０，４９９，１９３４；Ｒ．Ｈｏｕｗｉｎｋ：Ｊ．Ｐｒａｋｔ．Ｃｈｅｍ．１５７，１５，１９４０］。
　平均分子量の値は、脱ポリマー化の傾向をより適切に評価するために最初の値の百分率（％）で表した。得られた結果（表８および表９）から、ＨＡ−１は、ＨＡ−１よりも有意に高い鉄含量を有する参照試料（表７を参照）よりも大きな安定性（少なくとも２倍大きい）を有していることがわかる。
　上記の表８および表９において、試料Ａ、ＢおよびＣは鉄含量の測定に用いたものと同じであり、０．００２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中の０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液中の約１０ｍｇ／ｍｌのそれぞれの産物の溶液を次の試験に付した：
　（ａ）自然放置：室温（２５℃）の暗所で６カ月間保存し、３カ月毎にチェックする（表８を参照）；
　（ｂ）以下の条件によりオートクレーブで滅菌し、それぞれの条件の開始時と終了時にチェックする：
　・１１８℃で３２分間（Ｉ　ｃ．と表示）；
　・１２１℃で１６分間（ＩＩ　ｃ．と表示）；
　・１２４℃で８分間（ＩＩＩ　ｃ．と表示）。
　
実施例２
　メンドリの冠（新鮮または凍結品）（３０００ｇ）をひき肉機で細かく刻み、次いで機械的ホモジナイザーで注意深くホモジナイズする。得られたペーストを、０．１％（ｗ／ｖ）の特定の鉄キレート化剤を含む９５％エタノール（４容量）を入れたガラス容器中で処理する。
　１，１０−フェナントロリン（Ｃ．Ａ．Ｒ．Ｎ．６６−７１−７）またはそのジメチル誘導体が有用なキレート化剤の例である。
　ガラス容器と特定の鉄キレート化剤は、ヒアルロン酸のナトリウム塩の脱ポリマー化過程を避けるために用いる（他の方法によると、この過程が、鋼鉄製容器または血液残留物に由来する鉄イオンによって引き起こされることがある）。
　鉄イオンが完全に抽出されるまでメンドリの冠を処理する［装置の対照：最大吸収波長での１ｃｍセル中のアセトンまたはエタノール相におけるコンプレックス鉄−キレート化剤の吸光度（１，１０−フェナントロリンの場合には５１０ｎｍ；０．００５Ａ．Ｕ．を越えない）］。
　同容量の無水アセトンまたはエタノールを用いてさらに洗浄操作を行なって残留する全てのキレート化剤を除去する。この処理は、以下の試験「Ａ」の結果がネガティブになるまで行なう。
　試験「Ａ」：アセトンまたはエタノールの相（５ｍｌ）を中くらいの窒素流によって蒸発させる。この残留物を水（５ｍｌ）に溶解し、キレート化剤の最大吸収の波長で吸光度を測定する。
　吸光度が０．１Ａ．Ｕ．以下であるときにこの試験はネガティブであるとみなされる。
　最終的な反応生成物を５０ｒｐｍの速度で６時間撹拌し、１２時間分離させ、次いで溶媒を吸い上げ、これを廃棄した。
　この抽出過程は、廃棄される溶媒が適切な水分レベルに到達するまで繰り返す（Ｋａｒｌ−Ｆｉｓｃｈｅｒ法）。
　次いで、得られた物質を遠心し、適切な温度で少なくとも８時間、真空乾燥する。この過程の収量は乾燥粉末が約５００〜６００ｇである。
　次いで、この乾燥粉末（３００ｇ）を、乾燥粉末に対して２０：０．０１〜２０：１の比を与える量の塩酸システインを用い、リン酸緩衝剤の緩衝化水性媒体により、適当なタンパク質加水分解試薬（パパイン、ペプシン、トリプシンまたはプロナーゼ）（０．２ｇ）による酵素消化過程に付す。次いで、この混合物を６０〜６５℃の一定温度で２４時間、６０ｒｐｍで撹拌する。反応終了時にＣｅｌｉｔｅＲ（６０ｇ）を加え、全体をさらに１時間撹拌する。得られた混合物を、透明な液体が得られるまで濾過する。
　塩化セチルピリジニウム（４５ｇ）を、６０ｒｐｍで撹拌しながら加える。この混合物を６０分間撹拌し、次いでＣｅｌｉｔｅＲ（５０ｇ）を加える。
　このようにして生成させた沈澱を遠心によって集め、０．０５％セチルピリジニウムを含む０．０１Ｍ　ＮａＣｌ溶液（５Ｌ）に懸濁させる。
　これを５０℃で６０分間撹拌し、次いで温度を２５℃にし、沈澱を遠心する。
　この洗浄工程を３回繰返す。この沈澱を、０．５％塩化セチルピリジニウムを含む０．０５Ｍ塩化ナトリウム溶液（３Ｌ）を入れた容器中に集める。
　これを６０ｒｐｍで６０分間撹拌し、２５℃の一定温度に２時間保った。透明な上相を遠心して除去する。
　この工程を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．１Ｍ塩化ナトリウム溶液を用いて２回繰返す。この混合物を遠心し、その上清を捨てる。この沈澱を、０．０５％塩化セチルピリジニウムを含む０．３０Ｍ塩化ナトリウム溶液（３Ｌ）に分散させる。
　この混合物を撹拌し、沈澱と透明液の両方を集める。同じ水溶液（１．５Ｌ）を用いて沈澱を２回抽出する。
　透明な液体を１つの容器に集め、３０，０００ダルトンの分子排除カットオフを有する膜による分子限外濾過に付し、最初の容量の１／３まで濃縮する。
　この濃縮した溶液を、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ＋）の形態で得られるＤｏｗｅｘＲＭ−１５イオン交換巨大分子樹脂で処理し、一晩撹拌する。
　この懸濁液に、７０／３０（ｖ／ｖ）のＮＭＰ−Ｈ２Ｏ比が得られるまでＮ−メチルピロリドン（適当な量）を加える。次いで、この混合物を濾過し、樹脂を除去する。
　次いで、ＮａＣｌ（適当な量）をこの溶液に加え、１Ｍ　ＮａＯＨによりｐＨ＞７．５にする。次いで、この溶液を塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）で２回洗浄し、それぞれにおいて下の方の相を捨てる。上の方の相を、９５％エタノール（３容量）を用いて２５℃の温度および６０ｒｐｍで撹拌しながら沈澱させる。
　この沈澱を遠心して集め、上相を捨てる。
　この沈澱を集め、最初は７５％エタノールで、次いで無水エタノールで、そして最後にアセトンで洗浄する。
　次いで、この洗浄した生成物を２５℃の温度で少なくとも２０時間、真空乾燥する。この乾燥した生成物を、＞１ｍｇ／ｍｌの溶液が得られるように逆浸透によって水に溶解する。適切量の塩化ナトリウムを加えて０．１〜０．４のモル濃度を得、次いでこの溶液を１Ｍ　ＮａＯＨでアルカリ性にする。次いで、この溶液を滅菌フィルターで濾過する。
　この溶液を、９５％エタノール（３容量）を用いて２５℃の温度で撹拌（６０ｒｐｍ）しながら沈澱させる。
　この沈澱を遠心して集め、上相を捨てる。
　この沈澱を集め、最初は７５％エタノールで、次いで無水エタノールで、そして最後にアセトンで洗浄する。
　この洗浄した生成物を２５℃の温度で少なくとも５０時間、真空乾燥する。
　このようにして製造した生成物は、１，１８０，０００の分子量を有する。
　　　
医薬調製物の例
　以下に例を挙げて、分画ＨＡ−１の可能性ある治療用医薬調製物を説明する。これらは説明のためだけに挙げるものである。
　
製剤１
　それぞれのアンプルは次の成分を含有する：
　　ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　　　　　　　　２４．０　　ｍｇ
　　一塩基性リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　０．１　　ｍｇ
　　二塩基性リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　１．２　　ｍｇ
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１７．０　　ｍｇ
　　注射用の水（この量まで）　　　　　　　　　　　　　　　２．０　　ｍｌ
　
製剤２
　それぞれの注射器は次の成分を含有する：
　　ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　　　　　　　　２０．０　　ｍｇ
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９．３５０ｍｇ
　　一塩基性リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　０．０５５ｍｇ
　　二塩基性リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　０．６６０ｍｇ
　　注射用の水（この量まで）　　　　　　　　　　　　　　　１．１　　ｍｌ
　
製剤３
　それぞれの容器は次の成分を含有する：
　　ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　　　　　　　４００．０　　ｍｇ
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　４４０．０　　ｍｇ
　　一塩基性リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　５．０　　ｍｇ
　　二塩基性リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　６０．０　　ｍｇ
　　注射用の水（この量まで）　　　　　　　　　　　　　１００．０　　ｍｌ
　
製剤４
　それぞれの容器は次の成分を含有する：
　　ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　　　　　　　２００．０　　ｍｇ
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　６７０．０　　ｍｇ
　　塩化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０．０　　ｍｇ
　　一塩基性リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　５．０　　ｍｇ
　　二塩基性リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　６０．０　　ｍｇ
　　注射用の水（この量まで）　　　　　　　　　　　　　１００．０　　ｍｌ
　
製剤５
　それぞれのファルコンは次の成分を含有する：
　　ヒアルロン酸ナトリウム塩（ＨＡ−１）　　　　　　　２００．０　　ｍｇ
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　６７０．０　　ｍｇ
　　塩化カリウム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０．０　　ｍｇ
　　一塩基性リン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　５．０　　ｍｇ
　　二塩基性リン酸ナトリウム・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　６０．０　　ｍｇ
　　エチル−マーキュリチオサリチル酸ナトリウム　　　　　　５．０　　ｍｇ
　　注射用の水（この量まで）　　　　　　　　　　　　　１００．０　　ｍｌ
　ここまでに本発明を説明したが、これを多くの方法で変化させうることは明らかであろう。このような変法は本発明の思想および範囲から逸脱するものとみなすべきではなく、当業者に自明であるこのような変化の全ては以下の請求の範囲内に含まれるものとする。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．７５０，０００Ｄ〜１，２３０，０００Ｄの範囲の平均分子量を有し、以下の性質を有するヒアルロン酸分画またはその塩：
　（ａ）Ｕｂｂｅｌｈｏｄｅ吊下げ水平粘度計を用いてｐＨ７．０の０．１５Ｍ　ＮａＣｌ中にて２５℃で測定したときに、固有粘度数が１４．５〜２１ｄｌ／ｇの範囲内であること；
　（ｂ）タンパク質含量がアルブミンで表して０．２％を越えないこと；
　（ｃ）１％（ｗ／ｖ）水溶液で測定したときに、２５７ｎｍおよび２８０ｎｍのＵ．Ｖ．吸収が１．０Ａ．Ｕ．を越えないこと；
　（ｄ）２０℃の温度で回転粘度計を用い、規定された剪断速度で、ｐＨ７．０の０．１５Ｍ　ＮａＣｌ中の１％（ｗ／ｖ）溶液の動的粘度が以下の限界を越えないこと；
　（ｅ）硫酸化ムコ多糖含量がイオウとして０．０７％を越えないこと；
　（ｆ）鉄含量が１０ｐｐｍを越えないこと；および
　（ｇ）固有粘度数の評価によって測定して対応する平均分子量の減少で表したときに、自然放置および熱滅菌した分画の生理学的ｐＨの等張緩衝溶液の安定性が、以下の限界を越えないこと：
　・初期値の９７％（２５℃で６カ月保存）；
　・初期値の７５％（１１８℃で３２分間滅菌）；
　・初期値の８０％（１２１℃で１６分間滅菌）；
　・初期値の９０％（１２４℃で８分間滅菌）。
　２．平均分子量が９２５，０００〜１，２３０，０００である請求項１に記載のヒアルロン酸分画。
　３．（ａ）ヒアルロン酸またはその塩を
、その水溶液を最大６炭素原子のアルキル基を有する４級アンモニウム塩基で塩化された酸イオン交換物質に接触させることによって、
　（ｂ）該対応する４級アンモニウム塩を、そのようなアンモニウム塩を溶解することができる有機溶媒に溶解し；そして
　（ｃ）この溶液を濾過し、ハロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸をナトリウム塩の形態で回収する；
ことからなるヒアルロン酸またはその塩の精製方法。
　
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　（ｂ）該ヒアルロン酸含有抽出物をタンパク質加水分解試薬で処理し；
　（ｃ）該処理したヒアルロン酸含有抽出物を４級アンモニウム塩の形態にある酸イオン交換物質と接触させ；
　（ｄ）該イオン交換物質からの抽出物を、ヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を溶解することができる第２の有機溶媒に溶解し；
　（ｅ）工程（ｄ）の混合物をハロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸の４級アンモニウム塩を対応するナトリウム塩に変換し；そして
　（ｆ）ヒアルロン酸の所望のナトリウム塩を単離する；
ことからなるヒアルロン酸分画の製造方法。
　
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　（ｂ）該抽出物を、パパイン、ペプシン、トリプシン、プロナーゼおよび塩酸システインからなる群から選ばれるタンパク質加水分解試薬で処理し；
　（ｃ）該処理した抽出物を、テトラブチルアンモニウム塩の形態のスルホン酸樹脂を充填したカラムと接触させ；
　（ｄ）該カラムを溶離してヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩を含む溶液を得；
　（ｅ）該溶液を乾燥してヒアルロン酸のテトラブチルアンモニウム塩からなる残留物を得；
　（ｆ）該残留物を非プロトン性溶媒に溶解し；
　（ｇ）工程（ｆ）の溶液を濾過し；
　（ｈ）工程（ｇ）の溶液を塩化メチレンで洗浄し；
　（ｉ）工程（ｈ）の溶液をハロゲン化ナトリウムで処理してヒアルロン酸ナトリウムを得；
　（ｊ）該ヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させ；
　（ｋ）該沈澱を水に溶解し、この溶液を透析に付し；
　（ｌ）該透析した溶液を処理してヒアルロン酸ナトリウムを沈澱させ；
　（ｍ）該沈澱を３０，０００Ｄの分子排除限界を有する膜による分子濾過に付して、７５０，０００〜１，２３０，０００の分子量を有するヒアルロン酸のナトリウム塩を含む溶液を得る；
ことからなるヒアルロン酸ナトリウム分画の製造方法。
　
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眼科手術において使用する
　
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