(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列
0006461800.tif 000096
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000097
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖
を有し、ヒトPD-L1に結合する、単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２】
1価または2価である、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
単鎖抗体である、請求項1または2に記載の抗体。
【請求項４】
SEQ ID NO:29を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:31を含むVLヌクレオチド配列を含む単鎖抗体。
【請求項５】
SEQ ID NO:30を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:32を含むVLアミノ酸配列を含む単鎖抗体。
【請求項６】
10-5 M〜10-12 Mの範囲内の結合親和性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する二重特異性抗体である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
腫瘍関連抗原がCAIXである、請求項7に記載の抗体。
【請求項９】
サイトカインがIL-10である、請求項7に記載の抗体。
【請求項１０】
細胞表面受容体がCCR4、IL21R、BTLA、HVEM、またはTIM3である、請求項7に記載の抗体。
【請求項１１】
治療剤に連結された、請求項1〜10のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
治療剤が、毒素、放射性標識、siRNA、低分子、またはサイトカインである、請求項11に記載の抗体。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体を産生する、細胞。
【請求項１４】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体を含む、腫瘍細胞を選択的に殺傷するための薬学的組成物。
【請求項１５】
選択的殺傷が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）によって起こる、請求項14に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
腫瘍細胞がPD-L1を発現する、請求項14または15に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体を含む、T細胞の疲弊を防止するまたは逆転させるための薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体を含む、抗原に対する免疫応答を増進するための薬学的組成物。
【請求項１９】
抗原がウイルス抗原、細菌抗原、または腫瘍関連抗原である、請求項18に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
ウイルス抗原がHIVである、請求項19に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
腫瘍関連抗原がCAIXである、請求項19に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
抗原への曝露の前または後に投与されることを特徴とする、請求項18に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
抗原特異的T細胞活性の増加をもたらす、請求項17または18に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
T細胞がエフェクターT細胞である、請求項23に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体を含む、癌の症状を処置または軽減するための薬学的組成物。
【請求項２６】
癌が、腎細胞癌または乳癌である、請求項25に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
癌が、PD-L1を過剰発現する癌である、請求項25に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
癌が、T細胞の疲弊を誘導する癌である、請求項25に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
請求項1〜12のいずれか一項に記載の抗体を含む、慢性ウイルス感染の症状を処置または軽減するための薬学的組成物。
【請求項３０】
慢性ウイルス感染がHIV感染である、請求項29に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
慢性ウイルス感染が、T細胞の疲弊を誘導するウイルス感染である、請求項29に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
SEQ ID NO:29および31の核酸配列を含む、核酸。
【請求項３３】
SEQ ID NO: 30および32のポリペプチドをコードする、核酸。
【請求項３４】
SEQ ID NO: 30および32のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項1〜7のいずれか一項記載の抗体をコードする、ベクターまたはベクタ―のセット。
【請求項３６】
請求項35に記載のベクターまたはベクターのセットを含む、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2012年10月4日に出願された米国仮出願第61/709,731号および2013年3月13日に出願された米国仮出願第61/779,969号の優先権および恩典を主張し、それらの内容は、その全体が各々参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、抗PD-L1（プログラム細胞死1リガンド1またはB7H1としても公知）抗体およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫系は、病原体を排除する効果的な応答と自己免疫疾患を防ぐ寛容の維持との間の均衡を達成しなければならない。T細胞は、この均衡を保つ上での中心的存在であり、それらの適切な調節は主としてB7-CD28ファミリーの分子によって調整されている。リガンドとして機能するB7ファミリーメンバーと受容体として機能するCD28ファミリーメンバーの間の相互作用は、T細胞応答を開始し、増進し、持続させるだけでなく、適当な場合にT細胞応答を制限する、終結させるおよび／または弱める鍵となる負のシグナルにも寄与する重要な正のシグナルを提供する。PD-1（プログラム細胞死1としても公知）と呼ばれるCD28ファミリーのメンバーは、活性化されたT細胞、B細胞および単球において上方調節される。PD-1は、PD-L1（BH71またはプログラム細胞死1リガンド1としても公知）およびPD-L2という2つの同定されたB7ファミリーのリガンドを有する。PD-L2の発現は、より限定的であり、主として活性化された抗原提示細胞（APC）において見られるのに対して、PD-L1の発現は、（活性化されたT細胞、B細胞、単球、樹状細胞およびマクロファージを含む）造血系ならびに（心臓、骨格、筋肉、胎盤、肺、腎臓および肝臓組織を含む）末梢非リンパ系組織の細胞を含む、より広域的なものである。PD-L1の広域的発現は、PD-1/PD-L1を介する末梢性寛容の調節における重要な役割を示唆している。
【０００４】
PD-L1とPD-1の間の結合は、T細胞応答の調節において大きな効果を有している。詳細には、PD-L1/PD-1相互作用は、T細胞の増殖ならびにT細胞の活性および免疫応答を媒介するエフェクターサイトカイン、例えばIL-2およびIFN-γの産生を阻害する。この負の調節機能は、T細胞を介する自己免疫および免疫病理の予防に重要である。しかし、PD-1/PD-L1軸はまた、負の調節機能により宿主の有害物に対するT細胞応答が阻害されるT細胞の疲弊において役割を果たしていることも示されている。T細胞の長期的または慢性的な抗原刺激は、抗原特異的応答を阻害し病原体の免疫回避をもたらす負の免疫学的フィードバック機構を誘導し得る。T細胞の疲弊はまた、抗原特異的T細胞自体の漸進的物理的な除去を引き起こし得る。PD-1のT細胞発現は、慢性的な抗原刺激の間に上方調節され、そのPD-L1に対する結合は、CD4+（Tヘルパー細胞）およびCD8+（細胞傷害性Tリンパ球またはCTL）の両方のT細胞においてエフェクター機能を遮断し、したがってPD-1/PD-L1相互作用はT細胞の疲弊の誘導に関連づけられている。
【０００５】
より最近になって、いくつかの慢性ウイルス感染および癌が、PD-1/PD-L1を介するT細胞疲弊を引き起こすことによってPD-1/PD-L1軸を特異的に利用する免疫回避術を発展させることが示された。多くのヒト腫瘍細胞および腫瘍関連抗原提示細胞は、高レベルのPD-L1を発現し、このことは、これらの腫瘍が抗腫瘍免疫応答を回避するためにT細胞の疲弊を誘導することを示唆している。慢性的なHIV感染の間に、HIV特異的CD8+ T細胞は機能的に故障し、低下したサイトカインおよびエフェクター分子産生能力ならびに弱まった増殖能力を示す。研究は、PD-1がHIV感染個体のHIV特異的CD8+ T細胞において高度に発現されることを示しており、このことはPD-1/PD-L1経路の遮断がHIV感染およびAIDS患者の処置に関して治療的可能性を有していることを示している。まとめると、PD-1/PD-L1経路を遮断する薬剤は、様々な癌、HIV感染ならびに／またはT細胞の疲弊に関連する他の疾患および状態に対する新規の治療アプローチを提供すると考えられる。したがって、PD-1/PD-L1相互作用を遮断または防止することができる薬剤に対する喫緊の要望がある。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、PD-L1に結合するモノクローナル抗体の発見に基づいている。このモノクローナル抗体は完全ヒトである。この抗体はPD-L1に結合する。この抗体は、本明細書で、huPD-L1抗体と称される。
【０００７】
PD-L1はまた、プログラム細胞死1リガンド1、プログラム死リガンド1、PDCD1リガンド1、PDCD1L1、PDL1、B7ホモログ1、B7H1、B7-H、CD274およびCD274抗原としても公知である。
【０００８】
本発明は、アミノ酸配列
0006461800.tif 000002
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000003
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000004
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000005
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000006
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000007
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000008
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000009
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000010
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000011
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000012
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000013
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000014
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000015
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000016
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000017
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000018
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000019
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000020
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000021
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000022
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000023
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000024
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000025
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；アミノ酸配列
0006461800.tif 000026
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000027
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；またはアミノ酸配列
0006461800.tif 000028
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000029
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖
を有し、ヒトPD-L1に結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
1つの局面において、抗体は1価または2価である。別の局面において、抗体は単鎖抗体である。
【００１０】
本発明は、SEQ ID NO:1を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:3を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:5を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:7を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:9を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:11を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:13を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:15を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:17を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:19を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:21を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:23を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:25を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:27を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:29を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:31を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:33を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:35を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:37を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:39を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:41を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:43を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:45を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:47を含むVLヌクレオチド配列；SEQ ID NO:49を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:51を含むVLヌクレオチド配列；またはSEQ ID NO:53を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:55を含むVLヌクレオチド配列を含む単鎖抗体を提供する。
【００１１】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:2を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:4を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:6を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:8を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:10を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:12を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:14を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:16を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:18を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:20を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:22を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:24を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:26を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:28を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:30を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:32を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:34を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:36を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:38を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:40を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:42を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:44を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:46を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:48を含むVLアミノ酸配列；SEQ ID NO:50を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:52を含むVLアミノ酸配列；またはSEQ ID NO:54を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:56を含むVLアミノ酸配列を含む単鎖抗体を提供する。
【００１２】
いくつかの局面において、抗体は、10-5 M〜10-12 Mの範囲内の結合親和性を有する。
【００１３】
別の局面において、抗体は、腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する二重特異性抗体である。例えば、腫瘍関連抗原はCAIXである。例えば、サイトカインはIL-10である。例えば、細胞表面受容体は、CCR4、IL21R、BTLA、HVEM、またはTIM3である。
【００１４】
本発明は、治療剤に連結された抗体を提供する。例えば、治療剤は、毒素、放射性標識、siRNA、低分子、またはサイトカインである。
【００１５】
本発明は、上記抗体のいずれかを産生する細胞を提供する。
【００１６】
本発明はまた、腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法であって、該細胞を、上記抗体のいずれかと接触させる工程を含む方法を提供する。1つの局面において、選択的殺傷は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）によって起こる。別の局面において、腫瘍細胞はPD-L1を発現する。
【００１７】
本発明はまた、T細胞の疲弊を防止するまたは逆転させる方法であって、それを必要とする対象に上記抗体のいずれかを含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、抗原に対する免疫応答を増進する方法であって、それを必要とする対象に上記抗体のいずれかを含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。1つの局面において、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、または腫瘍関連抗原である。別の局面において、ウイルス抗原はHIVである。さらなる局面において、腫瘍関連抗原はCAIXである。別の局面において、抗体は、抗原への曝露の前または後に投与される。別の局面において、抗体の投与は、抗原特異的なT細胞活性を増加させる。別の局面において、T細胞はエフェクターT細胞である。
【００１９】
本発明はまた、癌の症状を処置または軽減する方法であって、それを必要とする対象に上記抗体のいずれかを含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。例えば、癌は、腎細胞癌または乳癌である。例えば、癌は、PD-L1を過剰発現する癌である。別の例において、癌は、T細胞の疲弊を誘導する癌である。
【００２０】
本発明はまた、慢性ウイルス感染の症状を処置または軽減する方法であって、それを必要とする対象に上記抗体のいずれか含む組成物を投与する工程を含む方法を提供する。例えば、慢性ウイルス感染はHIV感染である。例えば、慢性ウイルス感染は、T細胞の疲弊を誘導するウイルス感染である。
【００２１】
本発明は、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、または55の核酸配列を含む核酸配列を提供する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、または56のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００２３】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、または56のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。
【００２４】
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、または55の核酸配列を含むベクターを提供する。本発明は、SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、または56の核酸配列を含むベクターを提供する。本発明はさらに、上記ベクターのいずれか1つを含む細胞を提供する。
【００２５】
投与経路は、この開示の任意の方法において、非経口（例えば、静脈内）、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
対象は、この開示の任意の方法において、例えば、哺乳動物である。哺乳動物は、例えば、ヒトである。
【００２７】
[本発明1001]
a.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000030
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000031
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
b.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000032
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000033
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
c.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000034
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000035
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
d.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000036
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000037
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
e.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000038
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000039
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
f.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000040
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000041
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
g.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000042
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000043
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
h.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000044
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000045
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
i.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000046
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000047
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
j.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000048
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000049
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
k.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000050
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000051
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
l.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000052
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000053
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；
m.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000054
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000055
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖；または
n.  アミノ酸配列
0006461800.tif 000056
をそれぞれ含む3つのCDRを有する重鎖ならびにアミノ酸配列
0006461800.tif 000057
をそれぞれ含む3つのCDRを有する軽鎖
を有し、ヒトPD-L1に結合する、単離されたヒト化モノクローナル抗体。
[本発明1002]
1価または2価である、本発明1001の抗体。
[本発明1003]
単鎖抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1004]
a.  SEQ ID NO:1を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:3を含むVLヌクレオチド配列；
b.  SEQ ID NO:5を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:7を含むVLヌクレオチド配列；
c.  SEQ ID NO:9を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:11を含むVLヌクレオチド配列；
d.  SEQ ID NO:13を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:15を含むVLヌクレオチド配列；
e.  SEQ ID NO:17を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:19を含むVLヌクレオチド配列；
f.  SEQ ID NO:21を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:23を含むVLヌクレオチド配列；
g.  SEQ ID NO:25を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:27を含むVLヌクレオチド配列；
h.  SEQ ID NO:29を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:31を含むVLヌクレオチド配列；
i.  SEQ ID NO:33を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:35を含むVLヌクレオチド配列；
j.  SEQ ID NO:37を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:39を含むVLヌクレオチド配列；
k.  SEQ ID NO:41を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:43を含むVLヌクレオチド配列；
l.  SEQ ID NO:45を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:47を含むVLヌクレオチド配列；
m.  SEQ ID NO:49を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:51を含むVLヌクレオチド配列；または
n.  SEQ ID NO:53を含むVHヌクレオチド配列およびSEQ ID NO:55を含むVLヌクレオチド配列
を含む単鎖抗体。
[本発明1005]
a.  SEQ ID NO:2を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:4を含むVLアミノ酸配列；
b.  SEQ ID NO:6を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:8を含むVLアミノ酸配列；
c.  SEQ ID NO:10を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:12を含むVLアミノ酸配列；
d.  SEQ ID NO:14を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:16を含むVLアミノ酸配列；
e.  SEQ ID NO:18を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:20を含むVLアミノ酸配列；
f.  SEQ ID NO:22を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:24を含むVLアミノ酸配列；
g.  SEQ ID NO:26を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:28を含むVLアミノ酸配列；
h.  SEQ ID NO:30を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:32を含むVLアミノ酸配列；
i.  SEQ ID NO:34を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:36を含むVLアミノ酸配列；
j.  SEQ ID NO:38を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:40を含むVLアミノ酸配列；
k.  SEQ ID NO:42を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:44を含むVLアミノ酸配列；
l.  SEQ ID NO:46を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:48を含むVLアミノ酸配列；
m.  SEQ ID NO:50を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:52を含むVLアミノ酸配列；または
n.  SEQ ID NO:54を含むVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO:56を含むVLアミノ酸配列
を含む単鎖抗体。
[本発明1006]
10-5 M〜10-12 Mの範囲内の結合親和性を有する、本発明1001の抗体。
[本発明1007]
腫瘍関連抗原、サイトカイン、または細胞表面受容体にも結合する二重特異性抗体である、本発明1001の抗体。
[本発明1008]
腫瘍関連抗原がCAIXである、本発明1007の抗体。
[本発明1009]
サイトカインがIL-10である、本発明1007の抗体。
[本発明1010]
細胞表面受容体がCCR4、IL21R、BTLA、HVEM、またはTIM3である、本発明1007の抗体。
[本発明1011]
治療剤に連結された、本発明1001〜1008のいずれかの抗体。
[本発明1012]
治療剤が、毒素、放射性標識、siRNA、低分子、またはサイトカインである、本発明1009の抗体。
[本発明1013]
本発明1001〜1012のいずれかの抗体を産生する、細胞。
[本発明1014]
腫瘍細胞を選択的に殺傷する方法であって、該細胞を、本発明1001〜1012のいずれかの抗体と接触させる工程を含む、方法。
[本発明1015]
選択的殺傷が、抗体依存性細胞傷害（ADCC）、補体依存性細胞傷害（CDC）、抗体依存性細胞貪食（ADCP）によって起こる、本発明1014の方法。
[本発明1016]
腫瘍細胞がPD-L1を発現する、本発明1014の方法。
[本発明1017]
T細胞の疲弊を防止するまたは逆転させる方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1012のいずれかの抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1018]
抗原に対する免疫応答を増進する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1012のいずれかの抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1019]
抗原がウイルス抗原、細菌抗原、または腫瘍関連抗原である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
ウイルス抗原がHIVである、本発明1019の方法。
[本発明1021]
腫瘍関連抗原がCAIXである、本発明1019の方法。
[本発明1022]
抗体が、抗原への曝露の前または後に投与される、本発明1018の方法。
[本発明1023]
抗体の投与が、抗原特異的T細胞活性の増加をもたらす、本発明1017または1018の方法。
[本発明1024]
T細胞がエフェクターT細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
癌の症状を処置または軽減する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1012のいずれかの抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1026]
癌が、腎細胞癌または乳癌である、本発明1025の方法。
[本発明1027]
癌が、PD-L1を過剰発現する癌である、本発明1025の方法。
[本発明1028]
癌が、T細胞の疲弊を誘導する癌である、本発明1025の方法。
[本発明1029]
慢性ウイルス感染の症状を処置または軽減する方法であって、それを必要とする対象に、本発明1001〜1012のいずれかの抗体を含む組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1030]
慢性ウイルス感染がHIV感染である、本発明1029の方法。
[本発明1031]
慢性ウイルス感染が、T細胞の疲弊を誘導するウイルス感染である、本発明1029の方法。
[本発明1032]
SEQ ID NO;1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、または55の核酸配列を含む、核酸配列。
[本発明1033]
SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、または56のポリペプチドをコードする、核酸配列。
[本発明1034]
SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、または56のアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
[本発明1035]
本発明1032または1033の核酸を含む、ベクター。
[本発明1036]
本発明1035のベクターを含む、細胞。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかとなり、かつそれらは以下の詳細な説明および特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】抗PD-L1 scFv-ファージクローン（14クローン）のアミノ酸配列。フレームワーク領域1〜4（FW 1〜4）、相補性決定領域1〜3（CDR 1〜3）およびIGHVならびにIGLV/IGKVの両方についてのファミリー表示が示されている。Kabat番号が使用されている。記号：「．」はコンセンサスに対するアミノ酸の一致、「X」は非コンセンサスアミノ酸、および「-」はスペース（すなわち、アミノ酸なし）である。
【図２】FACSによるヒトPD-L1（hPD-L1）発現細胞に対するhuPD-L1抗体の結合分析。親細胞株300.9およびhPD-L1、hPD-L2またはヒトC型レクチンドメインファミリー2メンバー（hCLEC2D）でトランスフェクトされた300.9細胞を含む、4つのタイプの細胞を試験した。GF1538は、hPD-L1に対するヒト化Abである。GF1757は、hPD-L2に対するヒト化Abである。2次抗体は、PEヤギ抗ヒトIgGである。
【図３】競合FACS分析における抗PD-L1ファージ抗体によるhPD-L1に対するhPD-1の結合の阻害。ファージ-scFv形態のすべての抗hPD-L1 Abを、hPD-L1発現293T細胞に対するhPD1-hFc融合タンパク質の結合の阻害について試験した。1012 pfuのファージ-scFvを、約0.25μg/mLの可溶性hPD1-hFcと混合し、hPD-L1発現プラスミドでトランスフェクトされた293T細胞に添加した。洗浄後、細胞をFITC-抗ヒトIgG抗体と共にインキュベートし、細胞表面上のhPD-L1に対するhPD1-hFcの結合を測定した。
【図４】競合FACS分析における抗PD-L1可溶性抗体によるhPD-L1に対するhPD-1の結合の阻害。すべての抗hPD-L1 Abを、指定された濃度で30分間、hPD-L1発現プラスミドでトランスフェクトされた300.9細胞と共にプレインキュベートし、次いで0.125μgのhPD-1マウスIgG2aを各反応に添加し、さらに30分間インキュベートした。洗浄後、PE-ヤギ抗マウスIgG2a Abを添加し、その後に洗浄およびFACS分析を行った。GF1538は、hPD-L1に対するヒト化Abである。GF1757は、hPD-L2に対するヒト化Abである。
【図５】二重特異性抗体の設計および形成。
【図６】2特性抗体（bsAb）コンストラクトの決定。A）CAIXおよびPD-L1を認識する二重特異性抗体ならびにCH3ドメインを連結する「ノブ・イントゥー・ホール（knob into hole）」アプローチの概略表示。B）CH2ドメインにADCC活性を変化させる異なる変異を有する3つのタイプのbsAbコンストラクトの概略表示。
【図７】二重特異性抗体の作製およびその機能。A）コンジュゲートされた（非還元型の）対照IgG、親のG37（WT）および二重特異性（G37 KIHA + PD-L1 KIHB）抗体との比較で還元条件下での人工（G37 KIHA）抗体の解離を示すタンパク質ゲル。B）対照IgG、親のPDL-1（WT）および二重特異性（G37 KIHA + PD-L1 KIHB）抗体との比較で還元条件下での人工（PD-L1 KIHB）抗体の解離を示すタンパク質ゲル。C）フローサイトメトリーによるCAIX+PDL-1- SKRC-52細胞に対する二重特異性抗体の結合の分析。
【図８】PD-L1特異的mAb42の機能的特徴づけ。4体の健常なドナー（D1〜D4）由来のPBMCを、0.1μg/ml SEBで48時間刺激したαPDL1（mAb42）または対照アイソタイプ抗体の存在下で培養し、TNFα産生をMSD単位で測定した。データは、3回の平均として表されており＊、p＜0.0005である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明は、B7H1としても公知のPD-L1に特異的なヒト化モノクローナル抗体を提供する。この抗体は、ライブラリ選択標的としてプロテオリポソーム結合PD-L1を用いるファージディスプレイ抗体ライブラリ選択法によって同定された。これらの抗体は、PD-L1に対する新規のクラスのヒトモノクローナル抗体である。
【００３０】
これらの抗PD-L1ヒトモノクローナル抗体は、本明細書で、「huPD-L1抗体」と称される。
【００３１】
PD-1に対するPD-L1の結合は、T細胞の抗原特異的応答を負に調節し、これは自己免疫および免疫病理の寛容および予防に重要である。しかし、慢性的な抗原刺激によって引き起こされ得る過剰なPD-L1/PD-1の相互作用は、T細胞の疲弊の特徴であるT細胞の抗原特異的応答の阻害およびT細胞の喪失をもたらし得る。T細胞の疲弊は、慢性感染および癌において発生し得るT細胞の機能不全の状態である。それは、乏しいエフェクター機能、抑制性受容体の持続的発現および機能的なエフェクターまたはメモリーT細胞のそれからの転写状態の逸脱によって定義される。疲弊は、感染および腫瘍の進行の管理を妨げる。
【００３２】
PD-L1の過剰発現は、異なる癌において検出されている。例えば、乳癌において、PD-L1は過剰発現され、高リスク予後因子と関連する。腎細胞癌において、PD-L1は上方調節され、PD-1の発現増加は腫瘍浸潤白血球においても見出されている。抗PD-L1および抗PD-1抗体は、腎細胞癌に対する第I相試験において一定の臨床効果を実証している。PD-1またはPD-L1に結合することができる治療剤は、腫瘍細胞を特異的に標的とするために有用であり得る。PD-1/PD-L1の相互作用を遮断することができる薬剤は、抗腫瘍T細胞活性を回避するためにT細胞の疲弊を誘導した癌を処置する上でさらに有用であり得る。そのような薬剤の、単独でのまたは他の抗癌治療剤と組み合わせての使用は、PD-L1を過剰発現する腫瘍細胞を効果的に標的とし、抗腫瘍T細胞活性を増加させ、それによって標的腫瘍細胞に対する免疫応答を増進し得る。
【００３３】
PD-1およびPD-L1はまた、例えば慢性感染による、慢性的な抗原刺激後にT細胞によって上方調節され得る。慢性HIV感染の間に、HIV特異的なCD8+ T細胞は機能的に故障し、低下したサイトカインおよびエフェクター分子産生能力ならびに弱まった増殖能力を示す。PD-1は、HIVに感染した個体のHIV特異的なCD8+ T細胞において高度に発現される。したがって、この経路の遮断は、HIV特異的なT細胞がHIVペプチドによる刺激に応答して増殖およびサイトカインを産生する能力を増強し、それによってHIVに対する免疫応答を増進し得る。他の慢性感染、例えば慢性ウイルス、細菌または寄生虫感染もまた、PD-1/PD-L1遮断剤の使用からの利益を享受し得る。
【００３４】
本発明は、PD-L1タンパク質に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を提供する。PD-L1への本発明の抗体の結合は、その受容体であるPD1に結合するリガンドの能力を妨害する。様々な機構によって、huPD-L1抗体は、T細胞応答を阻害する負のフィードバック機構を防ぐ。いくつかの例において、huPD-L1抗体は、T細胞の疲弊を防止する、阻害する、または逆転させる。huPD-L1抗体の投与は、T細胞増殖を高め、抗原特異的なT細胞活性を高め、そしてエフェクターサイトカインの産生を高め得る。いくつかの例において、huPD-L1抗体は、抗原特異的な免疫応答を促進または増進する。この免疫応答は、エフェクターT細胞によって媒介され得る。
【００３５】
huPD-L1抗体は、1価または2価であり、1本または2本の鎖を含む。機能的に、huPD-L1抗体の結合親和性は、10-5 M〜10-12 Mの範囲である。例えば、huPD-L1抗体の結合親和性は、10-6 M〜10-12 M、10-7 M〜10-12 M、10-8 M〜10-12 M、10-9 M〜10-12 M、10-5 M〜10-11 M、10-6 M〜10-11 M、10-7 M〜10-11 M、10-8 M〜10-11 M、10-9 M〜10-11 M、10-10 M〜10-11 M、10-5 M〜10-10 M、10-6 M〜10-10 M、10-7 M〜10-10 M、10-8 M〜10-10 M、10-9 M〜10-10 M、10-5 M〜10-9 M、10-6 M〜10-9 M、10-7 M〜10-9 M、10-8 M〜10-9 M、10-5 M〜10-8 M、10-6 M〜10-8 M、10-7 M〜10-8 M、10-5 M〜10-7 M、10-6 M〜10-7 Mまたは10-5 M〜10-6 Mである。
【００３６】
さらに、本発明の抗体は、毒素、放射性標識、siRNAまたはサイトカインを含むがこれらに限定されない治療剤を含む。
【００３７】
huPD-L1は、細胞死を誘導することができる。細胞死は、直接的または間接的のいずれかの機構によって誘導される。例えば、huPD-L1抗体によるPD-L1結合は、補体依存性細胞傷害（CDC）を誘導し得る。あるいは、huPD-L1抗体はPD-L1に結合し、PD-L14発現標的細胞を殺傷する第2の細胞型の動員を誘導する。huPD-L1抗体が第2の細胞型の動員によって細胞死を媒介する例示的な機構は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）を含むがこれらに限定されない。標的PD-L1発現細胞型は、腫瘍およびT細胞、例えば活性化されたT細胞を含む。
【００３８】
14個の特有のモノクローナルhuPD-L1抗体が同定された。これらは、Ab-14、Ab-16、Ab-22、Ab-30、Ab-31、Ab-32、Ab-38、Ab-42、Ab-46、Ab-50、Ab-52、Ab-55、Ab-56およびAb-65を含む。
【００３９】
モノクローナルhuPD-L1抗体の核酸およびアミノ酸配列を以下に提供する。
【００４０】
（表１Ａ）Ab-14の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000058
【００４１】
（表１Ｂ）Ab-14の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000059
【００４２】
（表２Ａ）Ab-16の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000060
【００４３】
（表２Ｂ）Ab-16の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000061
【００４４】
（表３Ａ）Ab-22の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000062
【００４５】
（表３Ｂ）Ab-22の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000063
【００４６】
（表４Ａ）Ab-30の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000064
【００４７】
（表４Ｂ）Ab-30の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000065
【００４８】
（表５Ａ）Ab-31の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000066
【００４９】
（表５Ｂ）Ab-31の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000067
【００５０】
（表６Ａ）Ab-32の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000068
【００５１】
（表６Ｂ）Ab-32の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000069
【００５２】
（表７Ａ）Ab-38の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000070
【００５３】
（表７Ｂ）Ab-38の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000071
【００５４】
（表８Ａ）Ab-42の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000072
【００５５】
（表８Ｂ）Ab-42の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000073
【００５６】
（表９Ａ）Ab-46の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000074
【００５７】
（表９Ｂ）Ab-46の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000075
【００５８】
（表１０Ａ）Ab-50の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000076
【００５９】
（表１０Ｂ）Ab-50の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000077
【００６０】
（表１１Ａ）Ab-52の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000078
【００６１】
（表１１Ｂ）Ab-52の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000079
【００６２】
（表１２Ａ）Ab-55の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000080
【００６３】
（表１２Ｂ）Ab-55の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000081
【００６４】
（表１３Ａ）Ab-56の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000082
【００６５】
（表１３Ｂ）Ab-56の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000083
【００６６】
（表１４Ａ）Ab-65の可変領域の核酸配列
0006461800.tif 000084
【００６７】
（表１４Ｂ）Ab-65の可変領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000085
【００６８】
huPD-L1抗体の重および軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列を、以下の表15Aおよび15Bに示す。
【００６９】
（表１５Ａ）重鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000086
【００７０】
（表１５Ｂ）軽鎖の相補性決定領域のアミノ酸配列
0006461800.tif 000087
【００７１】
本明細書に記載されるhuPD-L1抗体は、PD-L1に結合する。1つの局面において、huPD-L1抗体は、PD-L1に対して高い親和性および高い特異性を有する。別の局面において、huPD-L1抗体は、PD-1受容体に結合し、そしてリガンドであるPD-L1がその受容体であるPD-1に結合するのを防ぎ、阻害しまたは遮断し得る。いくつかの例において、huPD-L1抗体は、PD-L2に対して一定の交差反応性を有し得る。いくつかの例において、huPD-L1抗体は、PD-L2に対して交差反応性を示さない。いくつかの例において、huPD-L1抗体は、PD-L2に対するよりも高い親和性および／または高い特異性でPD-L1に結合する。
【００７２】
本発明はまた、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体のアミノ酸またはヌクレオチド配列に対して特定比率の同一性または類似性を有する抗体を特徴とする。例えば、抗体は、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体の任意の1つの特定領域または全長と比較して、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれより高い同一性を有し得る。本発明の核酸およびタンパク質に対する配列同一性または類似性は、当技術分野で公知の方法による配列比較および／またはアラインメントによって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、BLASTまたはBLAST 2.0）、手作業によるアラインメントまたは目視検査が、本発明の核酸およびタンパク質とのパーセント配列同一性または類似性を決定するために利用され得る。
【００７３】
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列内の単一のアミノ酸または小比率のアミノ酸を変更、付加、欠失または置換する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加が、本明細書で集合的に「保存的修飾変種」と称されることを直ちに理解するであろう。いくつかの態様において、その変更は、あるアミノ酸を化学的に類似するアミノ酸で置換する。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野で周知である。本明細書に開示されるhuPD-L1抗体のそのような保存的修飾変種は、未修飾のhuPD-L1抗体と比較して、PD-L2に対して増加した交差反応性を示し得る。
【００７４】
抗体
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン（Ig）分子の免疫学的に活性な一部分、すなわち、抗原に特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を表す。「〜に特異的に結合する」または「〜と免疫反応する」は、その抗体が所望の抗原の1つまたは複数の抗原性決定基と反応し他のポリペプチドと反応しないことを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、dAb（ドメイン抗体）、単鎖、Fab、Fab'およびF(ab')2フラグメント、scFvおよびFab発現ライブラリを含むがこれらに限定されない。
【００７５】
単鎖Fv（「scFv」）ポリペプチド分子は、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたVHおよびVLをコードする遺伝子を含む遺伝子融合体から発現され得る、共有結合により連結されたVH:VLヘテロ2量体である（Huston et al. (1988) Proc Nat Acad Sci USA 85(16):5879-5883を参照のこと）。自然界では一体となっているが化学的には別々の、抗体V領域由来の軽および重ポリペプチド鎖をscFv分子に変換し、これを抗原結合部位の構造に実質的に類似する3次元構造に折りたたむための化学構造を識別する多くの方法が記載されている。例えば、米国特許第5,091,513号；同第5,132,405号；および同第4,946,778号を参照のこと。
【００７６】
多くの標的分子に対する再構成された抗体遺伝子の大きな供給源を提供するために、非常に大きなナイーブヒトscFvライブラリが作製されておりかつ作製され得る。よりも小さなライブラリは、疾患特異的な抗体を単離するために、感染疾患を有する個体から構築され得る（Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9339-43(1992); Zebedee et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3175-79 (1992)を参照のこと）。
【００７７】
一般に、ヒトから得られる抗体分子は、IgG、IgM、IgA、IgEおよびIgDのクラスのいずれかに関連し、これらは分子中に存在する重鎖の性質によって互いと異なっている。特定のクラスはサブクラス、例えばIgG1、IgG2等も有する。さらに、ヒトにおいて、軽鎖は、カッパ鎖またはラムダ鎖であり得る。「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を表す。抗原結合部位は、重（「H」）および軽（「L」）鎖のN末端可変（「V」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と称される、重および軽鎖のV領域内の3つの高多様性ストレッチが、「フレームワーク領域」または「FR」として公知のより保存されている隣接ストレッチの間に介在している。したがって、「FR」という用語は、自然界において、免疫グロブリンの超可変領域の間にまたは超可変領域に隣接して見られるアミノ酸配列を表す。抗体分子においては、軽鎖の3つの超可変領域および重鎖の3つの超可変領域が抗原結合表面を形成するよう3次元空間で相互に配置される。この抗原結合表面は、結合する抗原の3次元表面と相補的であり、重および軽鎖の各々の3つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」と称される。scFv抗体のVHおよびVL領域のCDRは、図2に示されている。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン、scFvまたはT細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、化学的に活性な表面分子群、例えばアミノ酸または糖側鎖からなり、そして通常、特定の3次元構造的特徴および特定の電荷的特徴を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのN末端またはC末端ペプチドに対して惹起され得る。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的相互作用を表す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、その相互作用の解離定数（Kd）の観点で表され得、より小さなKdはより大きな親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量され得る。1つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度（rate）の測定を必要とするものであり、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性および両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメータに依存する。このようにして、「オンレート定数」（Kon）および「オフレート定数」（Koff）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度の計算によって決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Koff/Konの比は、親和性に関連しないすべてのパラメータの消去を可能にし、そしてそれは解離定数Kdに等しい（概要について、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の同様のアッセイによって測定される平衡結合定数（Kd）が≦10μM、好ましくは≦10 nM、より好ましくは≦10 nM、最も好ましくは≦100 pM〜約1 pMの場合にPD-L1エピトープに特異的に結合すると言われる。
【００８０】
本発明のPD-L1タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の作製において免疫原として使用され得る。プロテオリポソームと結合したPD-L1タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログ、ホモログもしくはオルソログは、これらのタンパク質成分に免疫特異的に結合する抗体の作製において免疫原として使用され得る。
【００８１】
当業者は、過度の実験を要することなく、ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ特異性を有するかどうかを、前者が後者のPD-L1結合を妨げるかどうかを評価することによって決定することができることを理解しているであろう。試験されるヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場合、その2つのモノクローナル抗体は同じまたは関係の近いエピトープに結合することが考えられる。
【００８２】
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定する別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を通常それと反応するPD-L1タンパク質と共にプレインキュベートし、次いで試験されるヒトモノクローナル抗体を添加して、試験されるヒトモノクローナル抗体がPD-L1結合能力に関して阻害されるかどうかを決定することである。試験されるヒトモノクローナル抗体が阻害される場合、それはほぼ確実に本発明のモノクローナル抗体と同じまたは機能的に等価なエピトープ特異性を有する。本発明のヒトモノクローナル抗体のスクリーニングはまた、PD-L1を使用し、試験モノクローナル抗体がPD-L1を中和することができるかどうかを決定することによって実施され得る。
【００８３】
当技術分野で公知の様々な手順が、本発明のタンパク質に対するまたはその誘導体、フラグメント、アナログホモログもしくはオルソログに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の製造に使用され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと）。
【００８４】
抗体は、周知技術、例えば、主として免疫血清のIgGフラクションを提供するプロテインAまたはプロテインGを用いる親和性クロマトグラフィーによって精製され得る。その後にまたはその代わりに、探索対象の免疫グロブリンの標的である特定の抗原またはそのエピトープが、免疫親和性クロマトグラフィーによって免疫特異的な抗体を精製するためにカラムに固定され得る。免疫グロブリンの精製は、例えば、D.Wilkinson（The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No.8 (April 17, 2000), pp.25-28）によって議論されている。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」または「MAb」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、特有の軽鎖遺伝子産物および特有の重鎖遺伝子産物からなる単一分子種である抗体分子を含む抗体分子の集団を表す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（CDR）は、その集団の分子のすべてで同一である。MAbは、それに対する特有の結合親和性によって特徴づけられる抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００８６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載される方法を用いて調製され得る。ハイブリドーマ法においては、典型的に、マウス、ハムスターまたはその他の適切な宿主動物を免疫剤で免疫し、その免疫剤に特異的に結合する抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球が生成される。あるいは、リンパ球が、インビトロで免疫され得る。
【００８７】
免疫剤は、典型的には、タンパク質抗原、そのフラグメントまたはその融合タンパク質を含む。通常、ヒト起源の細胞が望まれる場合に末梢血リンパ球が使用されるか、または非ヒト哺乳動物供給源が望まれる場合に脾細胞もしくはリンパ節が使用されるかのいずれかである。リンパ球は、次いで、適当な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103）。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特にげっ歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは未融合の不死化細胞の成長または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含む適当な培養培地中で培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠いている場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む（「HAT培地」）。
【００８８】
好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベル発現を支援し、そして培地、例えばHAT培地に対する感受性を有するものである。より好ましい不死化細胞株は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, CaliforniaおよびAmerican Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから入手できるマウス骨髄腫株である。ヒトモノクローナル抗体の産生に関しては、ヒト骨髄腫およびマウス-ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York (1987) pp.51-63を参照のこと）。
【００８９】
ハイブリドーマ細胞を培養する培養培地は、その後、抗原に対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性が、免疫沈降によってまたはインビトロ結合アッセイ、例えば放射免疫アッセイ（RIA）もしくは酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）によって決定される。そのような技術およびアッセイは、当技術分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のScatchard分析によって決定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療適用においては、標的抗原に対する高い程度の特異性および高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【００９０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、そのクローンが限外希釈手順によってサブクローニングされ、そして標準的な方法によって生育され得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103を参照のこと）。この目的に適した培養培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびRPMI-1640培地を含む。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物の腹水としてインビボで生育され得る。
【００９１】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、従来的な免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析または親和性クロマトグラフィーによって培養培地または腹水液から単離または精製され得る。
【００９２】
モノクローナル抗体はまた、組み換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載される方法によって作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来的な手順を用いて（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定され得る。本発明のハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい供給源となる。単離後、DNAは発現ベクターに入れられ、次いでこれがそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞または骨髄腫細胞にトランスフェクトされ、その組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体が合成される。DNAはまた、例えば、ヒト重および軽鎖定常ドメインのコード配列をそれと相同なマウス配列と置換することによって（米国特許第4,816,567号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照のこと）または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合により接続することによって、修飾され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得、またはキメラ2価抗体を作製するために本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインと置換され得る。
【００９３】
完全ヒト抗体は、CDRを含む軽鎖および重鎖の両方の全配列がヒト遺伝子から得られたものである抗体分子である。そのような抗体は、本明細書で、「ヒト化抗体」、「ヒト抗体」または「完全ヒト抗体」と称される。ヒトモノクローナル抗体は、トリオーマ技術；ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと）；およびヒトモノクローナル抗体を製造するEBVハイブリドーマ技術（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96を参照のこと）を使用して調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、ヒトハイブリドーマを用いることによって（Cole, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照のこと）またはインビトロでヒトB細胞をエプスタインバーウイルスで形質転換することによって（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96を参照のこと）使用され得、製造され得る。
【００９４】
加えて、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリを含むさらなる技術を用いて製造され得る（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)を参照のこと）。同様に、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されたトランスジェニック動物、例えばマウスに導入することによって作製され得る。チャレンジの後、遺伝子の再構成、構築および抗体レパートリーを含むすべての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似するヒト抗体産生が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号およびMarks et al., Bio/Technology, 10, 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996)；およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【００９５】
ヒト抗体は、加えて、抗原によるチャレンジに応じてその動物の内因性抗体ではなく完全ヒト抗体を産生するよう修飾されたトランスジェニック非ヒト動物を用いて製造され得る（PCT公開WO94/02602を参照のこと）。非ヒト宿主の重および軽免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子は無力化され、ヒト重および軽鎖免疫グロブリンをコードする活性な遺伝子座が宿主のゲノムに挿入される。ヒト遺伝子は、例えば、必要なヒトDNAセグメントを含む酵母人工染色体を用いて組み込まれる。その後、望まれる修飾のすべてを提供する動物が、修飾の補完性が完全でない中間トランスジェニック動物を交雑することにより子孫として取得される。そのような非ヒト動物の好ましい態様はマウスであり、PCT公開WO 96/33735およびWO 96/34096に開示されるようにXenomouse（商標）と呼ばれる。この動物は、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するB細胞を産生する。抗体は、関心対象の免疫原を用いた免疫後に動物から直接的に、例えばポリクローナル抗体調製物として、あるいはその動物由来の不死化B細胞、例えばモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから、入手され得る。加えて、ヒト可変領域を有する免疫グロブリンをコードする遺伝子が、抗体を直接入手するために回収および発現され得、または抗体のアナログ、例えば単鎖Fv（scFv）分子を入手するためにさらに修飾され得る。
【００９６】
内因性免疫グロブリン重鎖の発現を欠失している、マウスとして例示される、非ヒト宿主を作製する方法の例は、米国特許第5,939,598号に開示されている。それは、胚性幹細胞の少なくとも1つの内因性重鎖遺伝子座からJセグメント遺伝子を除去してその遺伝子座の再構成を防止するおよび再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の転写物の形成を防止する方法、選択マーカーをコードする遺伝子を含む標的指向ベクターにより欠失を行う方法；ならびにその体細胞および生殖細胞が選択マーカーをコードする遺伝子を含むトランスジェニックマウスを胚性幹細胞から作製する方法、を含む方法によって入手され得る。
【００９７】
関心対象の抗体、例えばヒト抗体を作製する1つの方法は、米国特許第5,916,771号に開示されている。この方法は、重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを培養下の1つの哺乳動物宿主細胞に導入し、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを別の哺乳動物宿主細胞に導入し、そして2つの細胞を融合させてハイブリッド細胞を形成することを含む。このハイブリッド細胞は、重鎖および軽鎖を含む抗体を発現する。
【００９８】
この手順のさらなる改善として、免疫原上の臨床的に関連するエピトープを同定する方法および該関連エピトープに高親和性で免疫特異的に結合する抗体を選択する関連法が、PCT公開WO 99/53049に開示されている。
【００９９】
抗体は、上記の単鎖抗体をコードするDNAセグメントを含むベクターによって発現され得る。
【０１００】
これらは、ベクター、リポソーム、ネイキッドDNA、アジュバントアシストDNA、遺伝子銃、カテーテル等を含み得る。ベクターは、化学コンジュゲート体、例えば標的指向部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）および核酸結合部分（例えば、ポリリジン）を有するWO 93/64701に記載されるもの、ウイルスベクター（例えば、DNAまたはRNAウイルスベクター）、融合タンパク質、例えば標的部分（例えば、標的細胞に特異的な抗体）および核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質であるPCT/US 95/02140（WO 95/22618）に記載されるもの、プラスミド、ファージ等を含む。ベクターは、染色体、非染色体または合成であり得る。
【０１０１】
好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質および化学コンジュゲート体を含む。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスを含む。DNAウイルスベクターが好ましい。これらのベクターは、ポックスベクター、例えばオルソポックスまたは鳥ポックスベクター、ヘルペスウイルスベクター、例えば単純ヘルペスIウイルス（HSV）ベクター（Geller, A.I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed (Oxford Univ. Press, Oxford England)(1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A.I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)を参照のこと）、アデノウイルスベクター（LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)を参照のこと）およびアデノ随伴ウイルスベクター（Kaplitt, M.G.. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)を参照のこと）を含む。
【０１０２】
ポックスウイルスベクターは、遺伝子を細胞の細胞質に導入する。鳥ポックスウイルスベクターは、核酸の短期間の発現のみをもたらす。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよび単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクターは、神経細胞への核酸の導入に好ましい。アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（約4ヶ月）よりも短期間の発現（約2ヶ月）をもたらし、これはHSVベクターよりも短い。選択される個々のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存すると考えられる。導入は、標準的技術、例えば感染、トランスフェクション、形質導入または形質転換によるものであり得る。遺伝子移入の様式の例は、例えば、ネイキッドDNA、、CaPO4沈降、DEAEデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクションおよびウイルスベクターを含む。
【０１０３】
ベクターは、本質的に任意の所望の標的細胞を標的とするために使用され得る。例えば、定位注射が、ベクター（例えば、アデノウイルス、HSV）を所望の場所に送るために使用され得る。加えて、粒子は、ミニポンプ注入システム、例えばSynchroMed Infusion Systemを用いる脳室内（icv）注入によって送達され得る。対流と呼ばれるバルクフローに基づく方法も、大型の分子を脳の広い領域に送達するのに効果的であることが証明されており、ベクターを標的細胞に送達するのに有用であり得る（Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照のこと）。使用することができる他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内および皮下注射、ならびに経口またはその他の公知の投与経路を含む。
【０１０４】
これらのベクターは、様々な目的で、例えばサンプルにおけるPD-L1の存在を検出するために使用され得る抗体を多量に発現させるために使用され得る。抗体はまた、PD-L1に結合しPD-L1活性を妨害する試みを行うために使用され得る。
【０１０５】
技術は、本発明の抗原性タンパク質に特異的な単鎖抗体の製造のために適合させることができる（例えば、米国特許第4,946,778号を参照のこと）。加えて、方法は、タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの高速かつ効率的な同定を可能にするFab発現ライブラリの構築のために適合させることができる（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281を参照のこと）。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、（i）抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2フラグメント；（ii）F(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成されるFabフラグメント；（iii）パパインおよび還元剤による抗体分子の処置によって生成されるFabフラグメント；ならびに（iv）Fvフラグメントを含むがこれらに限定されない当技術分野で公知の技術によって作製され得る。
【０１０６】
ヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲に包含される。ヘテロコンジュゲート抗体は、2つの共有結合により接続された抗体から構成される。そのような抗体は、例えば、免疫系細胞を望ましくない細胞に標的指向させるため（米国特許第4,676,980号を参照のこと）およびHIV感染の処置のため（WO 91/00360；WO 92/200373；EP 03089を参照のこと）に提案されている。抗体が、架橋剤を利用するものを含む合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製され得ることも想定されている。例えば、免疫毒素が、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成することによって構築され得る。この目的に適した試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートならびに例えば米国特許第4,676,980号に開示されるものを含む。
【０１０７】
本発明の抗体を、例えば癌の処置における該抗体の効果を増強するために、エフェクター機能に関して修飾することが望ましいことがある。例えば、システイン残基がFc領域に導入され、それによってこの領域に鎖間ジスルフィド結合が形成され得る。そのようにして作製されるホモ2量体抗体は、改善されたインターナライゼーション能力ならびに／または増大した補体媒介細胞殺傷性および抗体依存性細胞傷害性（ADCC）を有し得る（Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992)およびShopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと）。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するよう、そしてそれによって増強された補体溶解およびADCC能力を有し得るよう改造され得る（Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)を参照のこと）。
【０１０８】
本発明はまた、細胞傷害剤、例えば毒素（例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源の酵素活性を有する毒素またはそのフラグメント）または放射性同位体（すなわち、放射性コンジュゲート体）にコンジュゲートされた抗体を含む免疫コンジュゲート体に関する。
【０１０９】
使用することができる酵素活性を有する毒素およびそのフラグメントは、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性フラグメント、外毒素A鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ（momordica charantia）阻害物質、クルシン、クロチン、サボンソウ（sapaonaria officinalis）阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。様々な放射性核種が、放射性コンジュゲート抗体の作製に利用可能である。例は、212Bi、131I、131In、90Yおよび186Reを含む。
【０１１０】
抗体および細胞傷害剤のコンジュゲート体は、様々な2官能性タンパク質カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの2官能性誘導体（例えば、ジメチルアジプイミデートHCL）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン2,6-ジイソシアネート（tolyene 2,6-diisocyanate））、および二活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）を用いて作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載されるようにして調製され得る。炭素14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸（MX-DTPA）は、抗体への放射性ヌクレオチドのコンジュゲーションにおける例示的なキレート剤である（WO94/11026を参照のこと）。
【０１１１】
当業者は、本発明の得られる抗体または他の分子に非常に多様な候補部分をカップリングさせることができることを理解しているであろう（例えば、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる"Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと）。
【０１１２】
カップリングは、抗体および他の部分がそれら各々の活性を保持する限リ、2つの分子を結合させる任意の化学反応によって達成され得る。この連結は、多くの化学メカニズム、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合および錯体化を含み得る。しかし、好ましい結合は共有結合である。共有結合は、既存の側鎖の直接的縮合によってまたは外部架橋分子の組み込みによってのいずれかによって達成され得る。多くの2価または多価連結剤が、タンパク質分子、例えば本発明の抗体、の他の分子へのカップリングに有用である。例えば、代表的なカップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼンおよびヘキサメチレンジアミンを含み得る。このリストは、当技術分野で公知の様々なクラスのカップリング剤を網羅することを意図したものではなく、より一般的なカップリング剤の例示にすぎない（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); およびVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。好ましいリンカーは、文献に記載されている（例えば、MBS（M-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）の使用について記載するRamakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。オリゴペプチドリンカーによって抗体にカップリングされたハロゲン化アセチルヒドラジド誘導体の使用について記載する米国特許第5,030,719号も参照のこと。特に好ましいリンカーは：（i）EDC（1-エチル-3-(3-ジメチルアミノ-プロピル)カルボジイミドヒドロクロリド）；（ii）SMPT（4-スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジル（pridyl）-ジチオ)-トルエン）（Pierce Chem. Co., Cat.(21558G)）；（iii）SPDP（スクシンイミジル-6[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem. Co., Cat #21651G）；（iv）スルホ-LC-SPDP（スルホスクシンイミジル 6 [3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオンアミド]ヘキサノエート）（Pierce Chem. Co., Cat. #2165-G）；および（v）EDCにコンジュゲートされたスルホ-NHS（N-ヒドロキシスルホ-スクシンイミド：Pierce Chem. Co., Cat. #24510）を含む。
【０１１３】
上記のリンカーは、異なる特質を有する要素を含み、それによって生理化学的特性が異なるコンジュゲートが生成される。例えば、アルキルカルボン酸のスルホ-NHSエステルは、芳香族カルボン酸のスルホ-NHSエステルよりも安定である。NHS-エステル含有リンカーは、スルホ-NHSエステルよりも溶解性が低い。さらに、リンカーSMPTは、立体的に妨げられたジスルフィド結合を含み、高い安定性のコンジュゲートを形成することができる。ジスルフィド連結は、一般に、インビトロで切断されるため他の連結よりも安定性が低く、コンジュゲートの利用性を低下させるものである。スルホ-NHSは、特に、カルボジイミドカップリングの安定性を増強し得る。カルボジイミドカップリング（例えば、EDC）は、スルホ-NHSと組み合わせて使用される場合、カルボジイミドカップリング反応単独よりも加水分解に対する抵抗性が高いエステルを形成する。
【０１１４】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。該抗体を含むリポソームは、当技術分野で公知の方法、例えばEsptein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980)；ならびに米国特許第4,485,045号および同第4,544,545号に記載される方法、によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
【０１１５】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（PEG-PE）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生成するよう定義された孔サイズのフィルターを通じて押出される。本発明の抗体のFab'フラグメントは、Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載されるようにジスルフィド交換反応を通じてリポソームにコンジュゲートされ得る。
【０１１６】
PD-L1に対する抗体の使用
本発明のPD-L1タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は、癌または他の増殖障害の処置のために投与され得る。多くの癌はPD-L1を過剰発現し、PD-L1の上方調節は高リスク予後因子に関連する。腫瘍細胞におけるPD-L1の過剰発現もまた、腫瘍細胞が例えばT細胞の疲弊の誘導によって抗腫瘍免疫を回避する機構を示し得る。そのような癌は、腎細胞癌および乳癌を含む。他の例示的な癌は、T細胞の疲弊に関連するまたは抗腫瘍T細胞活性を回避するためにT細胞の疲弊を利用する癌である。本発明の抗体の使用は、腫瘍抗原特異的なT細胞が腫瘍抗原ペプチドによる刺激に応答して増殖しおよびサイトカインを産生する能力を増強し、それによってT細胞活性または抗腫瘍免疫応答を増進することができる。
【０１１７】
本発明のPD-L1タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は、慢性感染の処置のために投与され得る。そのような慢性感染は、例えば、ウイルス、細菌および寄生虫感染を含む。例示的な慢性ウイルス感染は、HIVである。慢性HIV感染の間に、HIV特異的なCD8+ T細胞は機能的に故障し、低下したサイトカインおよびエフェクター分子産生能力ならびに弱まった増殖能力を示す。PD-1は、HIVに感染した個体のHIV特異的なCD8+ T細胞において高度に発現される。本発明の抗体の使用は、HIV特異的なT細胞がHIVペプチドによる刺激に応答して増殖しおよびサイトカインを産生する能力を増強し、それによってT細胞活性または抗ウイルス免疫応答を増進することができる。
【０１１８】
二重特異性、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全ヒト抗体を含む本発明の抗体は、治療剤として使用され得る。そのような薬剤は、通常、対象において癌を処置もしくは予防するために、ワクチン効力を増大させるためにまたは自然免疫応答を増進するために使用される。抗体調製物、好ましくはその標的抗原に対して高い特異性および高い親和性を有するもの、が対象に投与され、そして通常、その標的に対する結合によって効果を生ずる。抗体の投与は、PD-L1タンパク質の活性を無効化または阻害または妨害し得る。
【０１１９】
本発明の抗体は、細胞死を誘導することができる。細胞死は、直接的または間接的のいずれかの機構によって誘導される。例えば、huPD-L1抗体によるPD-L1結合は、補体依存性細胞傷害（CDC）を誘導し得る。あるいは、huPD-L1抗体はPD-L1に結合し、PD-L14発現標的細胞を殺傷する第2の細胞型の動員を誘導する。huPD-L1抗体が第2の細胞型の動員によって細胞死を媒介する例示的な機構は、抗体依存性細胞傷害（ADCC）および抗体依存性細胞貪食（ADCP）を含むがこれらに限定されない。標的PD-L1を発現する細胞型は、腫瘍およびT細胞、例えば活性化されたT細胞を含む。
【０１２０】
本発明のPD-L1タンパク質またはそのフラグメントに特異的に結合する抗体は、薬学的組成物の形態で癌または慢性感染の処置のために投与され得る。該抗体を含む治療組成物の調製に関する原理および考察ならびに成分の選択の手引は、例えば、Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; およびPeptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供されている。
【０１２１】
本発明の抗体の治療有効量は、通常、治療目的を達成するために必要とされる量に関連する。上記のように、これは、抗体とその標的抗原との間の、特定の例では標的の機能を妨害する結合相互作用であり得る。投与に必要とされる量はさらに、その特異的抗原に対する抗体の結合親和性に依存するであろうし、また投与された抗体がそれを投与された対象の自由空間（free volume）から消失する速度にも依存するであろう。本発明の抗体または抗体フラグメントの治療有効投与量の一般的範囲は、非限定的な例であるが、約0.1 mg/kg体重〜約50 mg/kg体重であり得る。一般的投与頻度は、例えば、1日に2回〜1週間に1回の範囲であり得る。
【０１２２】
抗体フラグメントが使用される場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小の阻害性フラグメントが好ましい。例えば、抗体の可変領域の配列に基づき、標的タンパク質配列に結合する能力を保持しているペプチド分子が設計され得る。そのようなペプチドは、化学的に合成および／または組み換えDNA技術により作製され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。処方物はまた、処置される特定の兆候に必要となる場合、1つより多い活性化合物、好ましくは互いに対して悪影響を及ぼさない補完的活性を有するもの、を含み得る。あるいはまたは加えて、組成物は、その機能を増強する剤、例えば、細胞傷害剤、サイトカイン、化学療法剤または成長阻害剤を含み得る。そのような分子は、意図されている目的に有効な量で適当に組み合わされる。
【０１２３】
活性成分はまた、例えば液滴技術によってまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルジョンにおける、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル、の中に捕捉され得る。
【０１２４】
インビボ投与に使用される処方物は、無菌性でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成され得る。
【０１２５】
持続放出調製物が、調製され得る。持続放出調製物の適当な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、このマトリクスは、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形式である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリラクチド（米国特許第3,773,919号）、L-グルタミン酸およびγエチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸-グルコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT（商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから構成される注射可能なマイクロスフィア）ならびにポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を含む。ポリマー、例えばエチレン-酢酸ビニルおよび乳酸-グリコール酸は100日を超える分子の放出を実現するのに対して、特定のヒドロゲルは、それより短い期間でタンパク質を放出する。
【０１２６】
本発明にしたがう抗体は、サンプル中のPD-L1（またはタンパク質もしくはそのタンパク質フラグメント）の存在を検出するための剤として使用され得る。好ましくは、抗体は、検出可能な標識を含む。抗体は、ポリクローナル、またはより好ましくはモノクローナルであり得る。インタクトな抗体またはそのフラグメント（例えば、Fab、scFvまたはF(ab)2）が使用され得る。プローブまたは抗体に関する「標識」という用語は、プローブまたは抗体への検出可能物質のカップリング（すなわち、物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接的標識および直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することが意図されている。間接的標識の例は、蛍光標識された2次抗体を用いる1次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るビオチンによるDNAプローブの末端標識を含む。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図されている。したがって、血液ならびに血清、血漿またはリンパ液を含む血液のフラクションまたは成分が、「生物学的サンプル」という用語の用法に含まれる。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中の分析物であるmRNA、タンパク質またはゲノムDNAを検出するために使用され得る。例えば、分析物mRNAの検出のためのインビトロ技術は、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイチューハイブリダイゼーションを含む。分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技術は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。分析物ゲノムDNAの検出のためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを含む。免疫アッセイを実施する手順は、例えば、"ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J.R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T.Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; および"Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載されている。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技術は、標識された抗分析物タンパク質抗体の対象への投入を含む。例えば、抗体は、標準的な画像化技術によって対象内でのその存在および場所が検出できる放射性マーカーで標識され得る。
【０１２７】
PD-L1タンパク質（またはそのフラグメント）に対する抗体は、PD-L1タンパク質の局在化および／または定量に関して当技術分野で公知の方法において使用され得る（例えば、適当な生理学的サンプル中のPD-L1タンパク質のレベルの測定において使用するために、診断法において使用するために、タンパク質の画像化において使用するために等）。所定の態様において、抗体由来抗原結合ドメインを含む、PD-L1タンパク質に特異的な抗体またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログは、薬学的に活性な化合物（本明細書の以降で「治療剤」と称される）として使用される。
【０１２８】
本発明のPD-L1タンパク質に特異的な抗体は、標準的技術、例えば免疫親和性、クロマトグラフィーまたは免疫沈降によりPD-L1ポリペプチドを単離するために使用され得る。PD-L1タンパク質（またはそのフラグメント）に対する抗体は、臨床試験手順の一部として、例えば所定の処置計画の効果を決定するため、組織内のタンパク質レベルをモニターするために診断的に使用され得る。検出は、該抗体を検出可能物質にカップリング（すなわち、物理的に連結）することによって行われ得る。検出可能物質の例は、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質および放射性物質を含む。適当な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを含み；適当な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含み；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含み；発光物質の例は、ルミノールを含み；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを含み、そして適当な放射性物質の例は、125I、131I、35Sまたは3Hを含む。
【０１２９】
薬学的組成物
本発明の抗体または剤（本明細書で「活性化合物」とも称される）およびそれらの誘導体、フラグメント、アナログおよびホモログは、投与に適した薬学的組成物に組み込まれ得る。そのような組成物は、典型的に、該抗体または剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、薬学的投与に適合する任意かつすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤等を含むことが意図されている。適当な担体は、参照により本明細書に組み入れられる、この分野の標準的参考文献であるRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版に記載されている。そのような担体または希釈剤の好ましい例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および5％ヒト血清アルブミンを含むがこれらに限定されない。リポソームおよび非水性ビヒクル、例えば固定油も使用され得る。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来的な媒体または剤が活性化合物と不適合である場合を除いて、該組成物におけるその使用が想定されている。補助的な活性化合物も組成物に組み込まれ得る。
【０１３０】
本発明の薬学的組成物は、意図されている投与経路に適合するよう処方される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下適用で使用される溶液または懸濁物は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤、例えば注射用水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化物質、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（EDTA）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、および浸透圧調節剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース。pHは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジまたは多用量バイアルに収納され得る。
【０１３１】
注射用途に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌注射溶液または分散物を即時準備するための滅菌粉末を含む。静脈内投与に適した担体は、生理学的食塩水、静菌水、Cremophor EL（商標）（BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含む。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、注射容易性（easy syringeability）が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および保管の条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の混入行動に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）ならびにそれらの適当な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散物の場合は必要な粒子サイズの維持によっておよび表面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の行動の防止は、様々な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成され得る。多くの場合において、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによってもたらされ得る。
【０１３２】
注射可能な滅菌溶液は、上記の成分の1つまたは組み合わせを含む適当な溶媒に必要量の活性化合物を添加し、必要な場合、その後に濾過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散物は、基本分散媒および上記のうちの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに活性化合物を添加することによって調製される。注射可能な滅菌溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末を事前に滅菌濾過されたその溶液から生成する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１３３】
経口組成物は、通常、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに収容されるかまたは錠剤に圧縮され得る。経口治療投与の目的で、活性化合物は賦形剤と共に添加され、そして錠剤、トローチまたはカプセルの形式で使用され得る。経口組成物はまた、口内洗浄液として使用するために流体担体を用いて調製され得、この場合、流体担体中の化合物が経口的に適用され、そしてうがいされ吐き出されるかまたは飲み込まれる。薬学的に適合する結合剤および／またはアジュバント物質が、組成物の一部分として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分のいずれかまたは類似の性質を有する化合物を含み得る：結合剤、例えば微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンもしくはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、Primogelもしくはトウモロコシデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸塩（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリン；またはフレーバー剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジフレーバー。
【０１３４】
吸入による投与の場合、化合物は、適当な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧容器もしくはディスペンサーまたはネブライザーからのエアゾール噴霧の形式で送達される。
【０１３５】
全身投与はまた、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与の場合、透過したい障壁に適した浸透剤が処方物で使用される。そのような浸透剤は、一般に当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与の場合、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐薬の使用を通じて達成され得る。経皮投与の場合、活性化合物は、一般に当技術分野で公知のように軟膏、サルヴェ（salve）、ゲルまたはクリームにより処方され得る。
【０１３６】
化合物はまた、直腸送達のために（例えば、従来的な坐薬基剤、例えばココアバターおよびその他のグリセリドを含む）坐薬または停留浣腸剤の形式で調製され得る。
【０１３７】
1つの態様において、活性化合物は、体内からの迅速な排除から該化合物を保護する担体、例えば、インプラントおよびマイクロカプセル送達システムを含む制御放出処方物、を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が使用され得る。そのような処方物を調製する方法は、当業者に明らかであろう。これらの物質は、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することもできる。リポソーム懸濁物（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体によって感染細胞に標的指向化されたリポソームを含む）もまた、薬学的に活性な担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の方法にしたがい、例えば米国特許第4,522,811号に記載されるようにして調製され得る。
【０１３８】
投与の容易さおよび用量の均一さのために経口または非経口組成物を単位剤形で処方することが特に有益である。本明細書で使用される単位剤形は、処置される対象に対する単回の投薬に適した物理的に隔離されている単位であって；各単位が、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を生ずるよう計算された既定量の活性化合物を含むものを表す。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特徴および達成したい特定の治療効果ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物の配合の分野に特有の制約により決定づけられ、かつそれらに直接的に依存する。
【０１３９】
薬学的組成物は、投与のための指示書と共に、容器、袋またはディスペンサーに含まれ得る。
【０１４０】
診断アッセイ
本発明のhuPD-L1抗体は、検出可能部分に接続された場合、「癌性組織」または異常な細胞増殖にさらされている組織、したがって癌の危険を検出する手段を提供する。インサイチュー新生物により癌化する組織に加えて、例えば、抗体-検出可能部分コンジュゲートはまた、末端器官および／または組織に存在する癌性転移性組織を検出する方法を提供する。したがってそのような組織は、癌性であることが疑われる組織と抗体-検出可能部分を、検出可能部分を癌性組織において検出しそれによって癌性組織の存在を検出するのに適した条件下で接触させることによって検出され得る。
【０１４１】
本発明のhuPD-L1抗体は、検出可能な部分に接続されることで、癌または慢性感染を患った対象においてT細胞の疲弊を検出する手段を提供する。例えば、huPD-L1抗体は、対象においてPD-L1のレベルを検出するために使用され得、そのレベルは、参照レベルとの比較で、対象がT細胞の疲弊を患っているかどうかを示し得る。したがって、この方法はまた、T細胞の疲弊を逆転させるまたは阻止することにより免疫応答を増進するためにhuPD-L1抗体を用いる処置が対象にとって有益かどうかを決定するために使用され得る。
【０１４２】
検出可能部分は、抗体もしくはフラグメントに直接的にまたは例えば蛍光性の2次抗体を用いて間接的にコンジュゲートされ得る。直接的なコンジュゲーションは、例えば抗体もしくは抗体フラグメントに対するフルオロフォアの標準的化学カップリングによってまたは遺伝子操作を通じて達成され得る。蛍光または生物発光タンパク質にカップリングされた抗体または抗体フラグメントを含むキメラまたは融合タンパク質が構築され得る。例えば、Casadeiらは、エクオリンおよび抗体遺伝子の融合タンパク質を哺乳動物細胞内で発現させることができるベクターコンストラクトを作製する方法を記載している。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、プローブまたは抗体に関する「標識」という用語は、プローブまたは抗体への検出可能物質のカップリング（すなわち、物理的連結）によるプローブまたは抗体の直接的標識および直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することが意図されている。間接的標識の例は、蛍光標識された2次抗体を用いる1次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンを用いて検出され得るビオチンによるDNAプローブの末端標識を含む。「生物学的サンプル」という用語は、対象（例えば、生検）から単離された組織、細胞および生物学的流体ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含むことが意図されている。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロおよびインビボで生物学的サンプル中の癌、癌細胞または癌関連細胞（例えば、腫瘍もしくは癌細胞に関連する間質細胞）を検出するために使用され得る。例えば、PD-L1の検出のためのインビトロ技術は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を含む。さらに、PD-L1の検出のためのインビボ技術は、対象への標識抗PD-L1抗体の投入を含む。例えば、抗体は、標準的な画像化技術によって対象内でのその存在および場所が検出できる放射性マーカーで標識され得る。複数の態様において、本発明は、対象において腫瘍または癌細胞を検出する非浸潤方法を提供する。対象に、本発明の抗体またはscFv抗体が投与され、抗体は検出可能部分（すなわち、例えば蛍光、化学、化学発光、放射活性または当技術分野で公知のその他の手段によって検出できる任意の部分）に連結され、抗体は腫瘍に局在化され、そして検出可能部分の観察により検出される。
【０１４４】
「標的指向化」されたコンジュゲート、すなわち、そのコンジュゲートを対象または動物内の特定部位または部位群に局在化させるよう設計された分子または特徴である標的指向部分を含むコンジュゲートの場合、局在化は、対象内で、固定されている「局在化」した物体と固定されていない「遊離」の状態の物体との間の平衡が本質的に達成されている状態を表す。そのような平衡が達成される速度は、投与経路に依存する。例えば、血栓に局在化するよう静脈内注射により投与されたコンジュゲートは、注射から数分以内に、血栓への局在化または蓄積を達成し得る。他方、腸内の感染部位に局在化するよう経口投与されたコンジュゲートは、局在化を達成するのに数時間を要し得る。あるいは、局在化は、単に、その物体が投与された後の選択された期間における対象または動物内でのその物体の場所を表し得る。別の例として、局在化は、その部分が投与後に分散されたときに達成される。
【０１４５】
上記のすべての場合において、局在化を達成する時間の合理的な見積もりが当業者により行われ得る。さらに、時間の関数としての局在化の状態は、本発明の方法にしたがう、例えば光検出デバイスを用いる検出可能部分（例えば、発光性コンジュゲート）の画像化によって追跡され得る。使用される「光検出デバイス」は、哺乳動物内からのかすかな光の画像化を合理的な時間内に実現するのにおよびそのようなデバイスからのシグナルを画像の構築に使用するのに十分高い感度を有する必要がある。
【０１４６】
極めて明るい光発生部分を使用することおよび／または画像化される対象もしくは動物の表面付近に局在化された光発生融合タンパク質を検出することが可能な場合、「暗視」ゴーグルまたは標準的な高感度ビデオカメラ、例えばSilicon Intensified Tube (SIT)カメラ（例えば、Hammamatsu Photonic Systems, Bridgewater, N.J.製）が使用され得る。しかし、より典型的には、より好感度の光検出法が必要とされる。
【０１４７】
極めて低い光レベルでは、単位面積あたりのフォトンフラックスが非常に低くなり、画像化される光景はもはや連続的なものではなくなる。代わりに、それは、時間的および空間的の両面で相互に異なる個々のフォトンによって表される。モニター上で見ると、そのような画像は、各々が単一の検出されたフォトンを表す光のシンチレーション点のように見える。これらの検出されたフォトンを経時的にデジタル画像プロセッサに蓄積することによって、画像が取得および構築され得る。各像点のシグナルが強度値を割り当てられる従来のカメラと異なり、フォトン計数式の画像化においては、シグナルの大きさは重要ではない。目的は単に、シグナル（フォトン）の存在を検出することおよびその位置に関するシグナルの発生を経時的に計数することである。
【０１４８】
以下に記載される少なくとも2つのタイプの光検出デバイスが、個々のフォトンを検出し、画像プロセッサによって分析できるシグナルを生成することができる。ノイズ軽減型光検出デバイスは、フォトンシグナルを増幅するのとは反対に、フォトン検出器におけるバックグラウンドノイズを軽減することによって高感度を達成するものである。ノイズは、主として検出器アレイを冷却することによって軽減される。このデバイスは、「裏面薄膜化（backthinned）」冷却CCDカメラと称される電荷結合素子（CCD）カメラを含む。より高感度の機器において、冷却は、例えば、CCDアレイの温度をおよそ-120℃まで下げる液体窒素を用いて達成される。「裏面薄膜化」は、検出されるフォトンが通る光路長を短縮し、それによって量子効率を増大させる極薄バックプレートを表す。特に高感度の裏面薄膜化低温CCDカメラは、Photometrics, Ltd.（Tucson, Ariz.）から入手可能な「TECH 512」、シリーズ200カメラである。
【０１４９】
「フォトン増幅デバイス」は、検出スクリーンに衝突する前にフォトンを増幅する。このクラスは、増倍器、例えばマイクロチャネル増倍器を有するCCDカメラを含む。マイクロチャネル増倍器は、典型的に、カメラの検出スクリーンに対して垂直でありかつカメラの検出スクリーンと同一の広がりをもつチャネルの金属アレイを含む。マイクロチャネルアレイは、画像化されるサンプル、対象または動物とカメラの間に設置される。このアレイのチャネルに進入したフォトンの大部分は、励起前にチャネルの側面と接触する。このアレイ全体に適用される電圧が、各フォトン衝突から多くの電子を放出させる。そのような衝突から得られた電子は、「ショットガン」パターンでそれらの元のチャネルから出て、そしてカメラによって検出される。
【０１５０】
さらに高い感度は、第1段階で電子が生成され第2段階で電子のシグナルが増幅されるように増倍マイクロチャネルアレイを連続して設置することによって達成され得る。しかし、感度の向上は、空間分解能を犠牲にして達成され、空間分解能は各々の追加の増幅段階ごとに減少していく。例示的なマイクロチャネル増倍器ベースの単一フォトン検出デバイスは、Hamamatsuから入手可能なC2400シリーズである。
【０１５１】
画像プロセッサは、フォトンを計数する光検出デバイスによって生成されたシグナルを処理し、例えばモニターに表示することができるまたはビデオプリンターでプリントすることができる画像を構築する。そのような画像プロセッサは、典型的に、上記の高感度フォトン計測カメラを含むシステムの一部として売られており、したがって同じ供給源から入手可能である。画像プロセッサは、通常、購入した画像化システムの一部として含まれる場合または含まれない場合があるパーソナルコンピュータ、例えばIBM互換PCまたはApple Macintosh（Apple Computer, Cupertino, Calif.）に接続される。画像が電子ファイル形式の場合、それらは様々な画像処理プログラム（例えば、「ADOBE PHOTOSHOP」, Adobe Systems, Adobe Systems, Mt. View, Calif.）によって操作され印刷され得る。
【０１５２】
1つの態様において、生物学的サンプルは、試験対象由来のタンパク質分子を含む。1つの好ましい生物学的サンプルは、従来手段によって対象から単離された末梢血白血球サンプルである。
【０１５３】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいてPD-L1またはPD-L1発現細胞の存在を検出するためのキットを包含する。例えば、キットは：生物学的サンプル中の癌または腫瘍細胞を検出することができる標識された化合物または剤（例えば、抗PD-L1 scFvまたはモノクローナル抗体）；サンプル中のPD-L1の量を決定するための手段；およびサンプル中のPD-L1の量を標準と比較するための手段、を含み得る。標準は、いくつかの態様において、非癌細胞またはその細胞抽出物である。化合物または剤は、適当な容器に収納され得る。キットはさらに、該キットを用いてサンプル中の癌を検出するための指示書を含み得る。
【０１５４】
二重特異性抗体
二重特異性抗体（bsAb）は、得られる抗体が2つの異なる抗原を認識するよう2つの可変ドメインまたはscFvユニットを含む抗体である。本発明は、PD-L1および第2の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。例示的な第2の抗原は、腫瘍関連抗原、サイトカインおよび細胞表面受容体を含む。いくつかの態様において、第2の抗原は、CAIX（炭酸脱水酵素IX、またはG250）、IL-10またはCCR4であり得る。いくつかの態様において、第2の抗原は、CCR4、IL21R、BTLA、HVEM、またはTIM3である細胞表面受容体であり得る。
【０１５５】
本発明の二重特異性抗体は、本明細書に開示されるhuPD-L1抗体の重鎖および軽鎖の組み合わせまたはscFvを含む。
【０１５６】
二重特異性抗体の構築
本発明の二重特異性抗体は、当技術分野で公知の方法を用いて構築され得る。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、2つのscFvフラグメントが、抗体を形成するよう2つのscFvユニット間の分子内会合を実現するのに十分な長さの長いリンカーポリペプチドにより接続されている単一ポリペプチドである。他の態様において、二重特異性抗体は、共有または非共有結合により連結された1つより多いポリペプチドである。
【０１５７】
別の態様において、二重特異性抗体は、「ノブ・イントゥー・ホール（knob into hole）」法を用いて構築される（Ridgway et al., Protein Eng 7:617-621 (1996)）。この方法では、2つの異なる可変ドメインのIg重鎖が、重-軽鎖対を維持しつつ重鎖対を選択的に開裂するよう還元される。2つの異なる抗原を認識する2つの重-軽鎖ヘテロ2量体は、図5および6Aに示されているように、CH3ドメインの人工「ノブ・イントゥー・ホール」を介したヘテロライゲーション対形成が行われるよう混合される。
【０１５８】
別の態様において、二重特異性抗体は、2つまたはそれ以上の異なる抗体由来の重-軽鎖2量体の交換により、第1の重-軽鎖2量体がPD-L1を認識し第2の重-軽鎖2量体が第2の抗原を認識するハイブリッド抗体を生成することによって構築され得る。重-軽鎖2量体についてのメカニズムは、これも二重特異性分子として機能するヒトIgG4の形成に類似するものである。IgG重鎖の2量体化は、分子内力、例えば各重鎖のCH3ドメインの対形成およびジスルフィド架橋によってもたらされる。CH3ドメインにおける特定アミノ酸（R409）の存在は、2量体交換およびIgG4分子の構築を促進することが示されている。重鎖対はまた、抗体のヒンジ領域における重鎖間ジスルフィド架橋によってさらに安定化される。特に、IgG4では、ヒンジ領域が、アミノ酸226〜230に（配列Cys-Pro-Pro-Cysを含む安定なIgG1のヒンジ領域に対して）アミノ酸配列Cys-Pro-Ser-Cysを含んでいる。この229位のセリンの配列の違いは、IgG4がそのヒンジ領域において新たな鎖内ジスルフィドを形成する傾向と関連付けられている（Van der Neut Kolfschoten, M. et al., 2007, Science 317:1554-1557およびLabrijn, A.F. et al, 2011, Journal of immunol 187:3238-3246）。
【０１５９】
したがって、本発明の二重特異性抗体は、PD-L1を認識する1つの重-軽鎖2量体および本明細書に開示される任意の抗原である第2の抗原を認識する第2の重-軽鎖2量体を有する抗体分子を生じるよう重-軽鎖2量体が交換されるよう、CH3ドメインにおけるR409残基の導入およびPD-L1または第2の抗原を認識する抗体のヒンジ領域におけるCys-Pro-Ser-Cys配列の導入を通じて作製され得る。好ましくは、二重特異性抗体は、実施例3および4で考察されているように、1つの抗CAIX（炭酸脱水酵素IX、または250）重-軽鎖2量体とコンジュゲートした1つの抗PD-L1重-軽鎖2量体を含む。重-軽鎖2量体の交換はまた、還元剤、例えば還元型グルタチオンの添加によって交換を促進することによって強化され得る。既知のIgG4分子もまた、本明細書に開示されるように重および軽鎖がPD-L1または第2の抗原を認識するよう変更され得る。本発明の二重特異性抗体の構築におけるこの方法の使用は、そのFc領域が、免疫応答のエフェクター系、例えば補体および特定の白血球細胞によって発現されるFc受容体とほとんど相互作用しない点で他のIgGサブタイプと相違するというIgG4分子の固有の特徴のために有益であり得る。この特定の性質ゆえに、これらのIgG4ベースの二重特異性抗体は、抗体が標的に結合しその標的に関連するシグナル伝達経路を機能的に変更させることを要求されるがエフェクター活性を誘発することは要求されない治療適用において魅力的なのである。
【０１６０】
いくつかの態様において、bsAbの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）活性が変化するよう、bsAbの定常領域に変異が導入される。そのような例は図6Bに示されている。例えば、変異は、CH2ドメインにおけるLALA変異である。1つの局面において、bsAbは、ヘテロ2量体bsAbの一方のscFvユニット上に、ADCC活性を減少させる変異を含む。別の局面において、bsAbは、ヘテロ2量体bsAbの両方の鎖上に、ADCC活性を完全に取り除く変異を含む。例えば、bsAbの一方または両方のscFvユニットに導入される変異は、CH2ドメインにおけるLALA変異である。これらの様々なADCC活性を有するbsAbは、bsAbがそのbsAbにより認識される1つの抗原を発現する細胞に対して最大限の選択的殺傷性を示すが、そのbsAbにより認識される第2の抗原に対しては最小限の殺傷性を示すよう、最適化され得る。
【０１６１】
例示的な第2の抗原
本発明は、PD-L1および第2の抗原を認識する二重特異性抗体を提供する。
【０１６２】
いくつかの態様において、第2の抗原は、腫瘍関連抗原である。いくつかの態様において、腫瘍関連抗原は、炭酸脱水酵素IX（CAIX）である。例えば、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体の1つ重鎖および1つの軽鎖の組み合わせならびにCAIXを認識する1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせを含むCAIX/PD-L1二重特異性抗体が構築され得る（図5A）。CAIXは、疾患の進行の予後マーカーおよびIL-2を用いる免疫療法の標的として記載されている。CAIXは、癌、例えば腎細胞癌において高度に発現される腫瘍関連抗原である。いくつかの例において、腫瘍細胞によるPD1/PD-L1軸の活性化は、特定の腫瘍特異的抗原、例えばCAIXに対するT細胞の疲弊を誘導し得、それによってCAIXを発現する腫瘍細胞は免疫系による認識を回避する。CAIXおよびPD-L1の両方を標的とするbsAbは、新規の癌治療剤として機能する。CAIX/PD-L1 bsAbによる処置は、CAIXに対するPD-1/PD-L1媒介T細胞疲弊を阻止しまたは逆転させ、かつCAIX発現腫瘍細胞に対する腫瘍監視および免疫応答を促進する。例えば、CAIX/PD-L1 bsAbによる処置は、標的とされる抗原がCAIXである腫瘍細胞に対する抗原特異的な免疫応答を促進すると考えられる。
【０１６３】
いくつかの例において、ADCC活性を減少させるために、CAIXまたはPD-L1鎖の定常領域（例えば、CH2ドメイン）に変異が導入され得る（図5B）。いくつかの例において、ADCC活性を完全に除去するために、CAIXおよびPD-L1鎖の両方の定常領域に変異が導入され得る。様々なADCC活性を有する変異型bsAbは、腫瘍細胞を殺傷するそれらの特異性について、当技術分野で公知の方法によってアッセイされ得る。好ましくは、CAIX/PD-L1 bsAbは、CAIX発現腫瘍細胞に対して最大の選択的殺傷を示すが、PD-L1発現内因性末梢血単核細胞（PBMC）に対しては最小の殺傷しか示さないと考えられる。
【０１６４】
いくつかの態様において、第2の抗原は細胞表面受容体であり、細胞表面受容体はインターロイキン21受容体（IL21R）である。例えば、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体の1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせならびにIL21Rとアゴニスト様式で結合する1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせを含むIL21R/PD-L1二重特異性抗体が構築され得る。サイトカインIL21は、CD4+ Tヘルパー細胞によって分泌され、IL21Rに結合して様々な免疫活性化経路を促進する、特にCTLの抗原特異的細胞傷害ならびにNK細胞の成熟、増殖および細胞傷害を促進する（Sondergaard, H et al., 2009 Tissue antigens 74: 467-479; Kasaian, M.T. et al, 2002 Immunity 16: 559-569; およびCoquet, J.M. et al, 2008 J Immunol 178: 2827-2834）。特に、IL21は、メラノーマ抗原に対する活性化および細胞傷害性を促進することが示されている（Li, Y. et al, 2005, J Immunol 175: 2261-2269）。IL21の全身投与が、癌の処置における使用に関して調査され、一定の効果を示している（Schmidt, H. et al, 2010 Clinical cancer research, 16: 5321-5319）が、いくつかのデータは、有害かつ望ましくない副作用も示している（Grunwald, V. et al, 2011, Acta Oncol 50: 121-126）。
【０１６５】
本発明のIL21R/PD-L1 bsAbは、アゴニスト様式でIL21Rに結合し、それによってサイトカインIL21の模倣体または代理として作用する。IL21R/PD-L1 bsAbによる結合は、IL21Rを介する経路を活性化し、そしてその後にPD-L1を介するT細胞の疲弊を誘導した腫瘍細胞に対する抗原特異的細胞傷害性免疫応答を促進し得る。本発明の二重特異性抗体による処置の1つの特定の利益は、PD-1/PD-L1を介するT細胞の疲弊が起こった領域への、例えば、抗腫瘍免疫応答を回避するためにT細胞の疲弊を誘導した例えば腫瘍付近または腫瘍内の腫瘍微小環境への、IL21Rの活性化の局在化である。この様式で、ILR/PD-L1 bsAbは、1）PD-1/PD-L1を介するT細胞の疲弊を逆転させるまたは阻止することによって、および2）細胞傷害性免疫応答のIL21/IL21Rを介する活性化を促進し、それによって抗原特異的または抗腫瘍免疫応答および細胞傷害を誘導することによって、の2つの枝分かれした機構で、抗腫瘍免疫応答を促進する。
【０１６６】
IL21R/PD-L1二重特異性抗体はまた、対象のワクチン接種のためのワクチンにおいてまたはワクチンアジュバントとして使用され得る。持続的な免疫保護および以前に遭遇した外来抗原に対する迅速な再現応答を保証する高親和性抗体分泌プラズマ細胞およびメモリーB細胞が産生される胚中心反応（GCR）において、PD1は濾胞性Tヘルパー細胞（TFH）により発現され、PDL1は胚中心B細胞により発現される（Crotty, S. et al, 2011, Annual review of Immunology, 29: 621-623）。PD1またはPD-L1の過剰発現は、抗体産生性B細胞の増加を阻害する。抗体のPD-L1部分がPD1/PD-L1軸を阻害するIL21R/PD-L1二重特異性抗体の使用は、高親和性抗体のみの優先的な増加をもたらすと考えられる。IL-21は抗原特異的B細胞から抗体分泌プラズマ細胞への移行ならびにTFH活性の形成および持続を強く促進するので（Crotty, S. et al, 2011, Annual review of Immunology, 29: 621-623）、IL21の代理またはアゴニスト活性を有するPDL1に対するbsAbは、特定の抗原、例えばワクチンを通じて投与された抗原または感染因子の抗原に対する高親和性抗体の産生を促進するGCR特異的アジュバントとして機能し得る。
【０１６７】
いくつかの態様において、第2の抗原は、BTLA（BおよびTリンパ球アテニュエータータンパク質）またはHVEM（ヘルペスウイルスエントリーメディエーター、TNFRSF14としても公知）である。例えば、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体の1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせならびにBTLAに結合する1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせを含むBTLA/PD-L1二重特異性抗体が構築され得る。例えば、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体の1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせならびにHVEMに、好ましくは、BTLAとの結合を媒介するHVEMの領域に結合する1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせを含むHVEM/PD-L1二重特異性抗体が構築され得る。BTLAのHVEMへの結合は、PD1/PD-L1の相互作用と類似のT細胞阻害をもたらす。本発明のBTLA/PD-L1またはHVEM/PD-L1二重特異性抗体は、BTLAとHVEMの間の会合を阻害または防止し、BTLA/HVEを介するT細胞の阻害を防止する。BTLAの阻害は、腫瘍特異的なT細胞応答を促進する。したがって、本発明の二重特異性抗体による処置は、T細胞活性を制限する2つの別個の阻害経路を同時遮断する。
【０１６８】
いくつかの例において、HVEM/PD-L1 bsAb抗体はまた、HVEMと、B細胞慢性リンパ性白血病（BCLL）細胞の生存に関してアゴニストであることが示されており、CD4+ T細胞の活性化および機能を強く阻害する別のHVEMリガンドであるCD160との間の会合を防止すると考えられる。本発明のHVEM/CD160結合も防止するHVEM/PD-L1二重特異性抗体による処置は、T細胞の活性を制限する2つの阻害経路を同時遮断し、かつCD160を介する腫瘍生存経路を阻害する。
【０１６９】
いくつかの態様において、第2の抗原は、TIM3（T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン3）である。例えば、本明細書に記載されるhuPD-L1抗体の1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせならびにTIM3に結合する1つの重鎖および1つの軽鎖の組み合わせを含むTIM3/PD-L1二重特異性抗体が構築され得る。1つの局面において、本発明の抗体は、ガレクチン-9（GAL9）に対するTIM3の結合を防止または阻害する。TIM3とGAL9の間の相互作用は、T細胞の機能およびマクロファージの活性化を阻害する（Sakuishi, K. et al, 2010, The Journal of experimental medicine, 207: 2187-2194およびZhang, Y. et al, 2012, Journal of leukocyte biology, 91: 189-196）。TIM3はまた、骨髄由来サプレッサー細胞（MDSC）の活性を促進することが示されている（Dardalhon, V. et al., 2012 Journal of leukocyte biology, 185: 1383-1392）。したがって、本発明の二重特異性抗体、例えばTIM3/PD-L1 bsAbによる処置は、T細胞の疲弊を逆転させおよび防止し、腫瘍監視を促進し、MDSCの生成を阻害すると考えられる。TIM3/PD-L1 bsAbの使用は、TIM3に多型を有する癌、例えば腎細胞癌および転移性腎細胞癌を患った対象の処置において特に有益であり得る。
【０１７０】
本明細書に開示される二重特異性抗体は、疾患または医学的状態、例えば癌の処置において有用であり得る。本発明の二重特異性抗体は、T細胞の疲弊に関連する疾患または医学的状態において特に有用であり得る。いくつかの例において、本明細書に開示される二重特異性抗体は、抗原特異的免疫応答を促進するためのワクチンとして使用され得る。本発明の二重特異性抗体は、T細胞の疲弊を誘導する腫瘍を標的とすると考えられる。
【０１７１】
処置の方法
本発明は、癌または他の細胞増殖関連疾患もしくは障害の危険がある（またはそれらにかかりやすい）対象を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。そのような疾患または障害は、例えば、PD-L1の異常な発現に関連する疾患または障害を含むがこれらに限定されない。例えば、この方法は、腎細胞癌または乳癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。あるいは、この方法は、PD-L1がT細胞応答に関して負の調節的役割を果たしている癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。あるいは、この方法は、固形腫瘍、例えば乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳癌、肝癌、膵癌または胃癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。あるいは、この方法は、転移した癌の症状を処置、予防または軽減するために使用される。
【０１７２】
本発明は、慢性ウイルス、細菌または寄生虫感染の危険がある（またはそれらにかかりやすい）対象を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。特に、本発明は、HIV感染またはAIDSの危険がある（またはそれらにかかりやすい）対象を処置する予防的および治療的の両方の方法を提供する。
【０１７３】
本発明はまた、T細胞の疲弊に関連する疾患もしくは障害もしくは状態の危険またはT細胞の疲弊を発症する危険がある対象を処置する予防的および治療的の両方の方法のための治療的方法を提供する。本発明はまた、T細胞の疲弊に関連する疾患もしくは障害もしくは状態の危険またはT細胞の疲弊を発症する危険がある対象を処置する予防的および治療的の両方の方法のための治療的方法を提供する。そのような疾患または障害は、HIV、AIDSならびに慢性細菌、ウイルスまたは寄生虫感染を含むがこれらに限定されない。他のそのような慢性感染は、例えば、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HCV）、単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）、H.ピロリ（H.pylori）またはトキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）によって引き起こされるものを含む。
【０１７４】
したがって、1つの局面において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはscFv抗体を対象に投与することによって対象における癌または細胞増殖疾患もしくは障害の症状を予防、処置または軽減する方法を提供する。例えば、huPD-L1抗体が、治療有効量で投与され得る。
【０１７５】
癌または細胞増殖関連疾患もしくは障害の危険がある対象は、癌の家族歴を有する患者または発癌性が知られているもしくは疑われる物質に曝露された対象を含む。予防的薬剤の投与は、疾患が予防されるようにあるいはその進行が遅れるように、癌の発現の前に行われ得る。
【０１７６】
別の局面において、本発明のPD-L1抗体を細胞と接触させることによって、腫瘍細胞の成長が阻害されるまたはサプレッサーT細胞の活性化が減少する。細胞は、PD-L1を発現する任意の細胞である。例えば、細胞はT細胞である。
【０１７７】
抗原に対する免疫応答を増加または増強する方法も、本発明に含まれる。免疫応答は、本発明のモノクローナル抗体またはscFv抗体を対象に投与することによって増加または増強される。免疫応答は、例えば抗原特異的なTエフェクター機能を増進することによって増進される。抗原は、ウイルス（例えば、HIV）、細菌、寄生虫または腫瘍抗原である。免疫応答は自然免疫応答である。自然免疫応答によって、感染の結果である免疫応答が意味される。感染は慢性感染である。抗原に対する免疫応答の増加または増強は、当技術分野で公知の多くの方法によって測定され得る。例えば、免疫応答は、以下のいずれか1つを測定することによって測定され得る：T細胞の活性、T細胞の増殖、T細胞の活性化、エフェクターサイトカインの産生およびT細胞の転写プロフィール。
【０１７８】
あるいは、免疫応答は、ワクチン摂取により誘導される応答である。したがって、別の局面において、本発明は、本発明のモノクローナル抗体またはscFv抗体およびワクチンを対象に投与することによってワクチン効果を増大させる方法を提供する。抗体およびワクチンは、順次または同時に投与される。ワクチンは、腫瘍ワクチン、細菌ワクチンまたはウイルスワクチンである。
【０１７９】
併用法
本発明は、PD-L1タンパク質の同一エピトープあるいはPD-L1タンパク質の2つの異なるエピトープに結合する2つの抗体を投与することによる患者の癌の処置を提供する。あるいは、癌は、PD-L1に結合する第1の抗体およびPD-L1以外のタンパク質に結合する第2の抗体を投与することにより処置される。例えば、PD-L1以外の他のタンパク質は、CAIX、CCR4およびIL-10を含み得るがこれらに限定されない。例えば、PD-L1以外の他のタンパク質は、腫瘍関連抗原である。
【０１８０】
いくつかの態様において、本発明は、単独でのまたはPD-L1以外の別のタンパク質を認識する追加抗体と組み合わせての、免疫応答をもたらすまたは増進することができる細胞と組み合わせての、huPD-L1抗体の投与を提供する。例えば、これらの細胞は、末梢血単核細胞（PBMC）またはPBMCにおいて見出される任意の細胞型、例えば細胞傷害性T細胞、マクロファージおよびナチュラルキラー（NK）細胞であり得る。
【０１８１】
加えて、本発明は、PD-L1タンパク質に結合する抗体および抗新生物剤、例えば低分子、成長因子、サイトカイン、または生分子、例えばペプチド、ペプチド模倣体、ペプトイド、ポリヌクレオチド、脂質由来メディエーター、小さな生体アミン、ホルモン、神経ペプチドおよびプロテアーゼを含む他の治療剤の投与を提供する。低分子は、無機分子および小さな有機分子を含むがこれらに限定されない。適切な成長因子またはサイトカインは、IL-2、GM-CSF、IL-12およびTNF-αを含む。低分子ライブラリは、当技術分野で公知である（Lam, Anticancer Drug Des., 12:145, 1997を参照のこと）。
【０１８２】
本発明は、以下の実施例においてさらに説明されるが、これは特許請求の範囲に記載の発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１８３】
実施例1：PD-L1に対するヒトmAbの作製
ヒトPD-L1に対するヒトmAbは、270億のメンバーのヒトscFvファージディスプレイライブラリに対してパンニングを行うことによって作製した。ライブラリへの提示のためのPD-L1の細胞外ドメインの適切な配向を保証する常磁性プロテオリポソーム（PMPL）の形態の全長PD-L1を用いて、PD-L1に結合する14個の特有のscFvファージを同定した。これらの14個の特有のscFvファージに関してヒトIgGコンストラクトを構築した：Ab-14、Ab-16、Ab-22、Ab-30、Ab-31、Ab-32、Ab-38、Ab-42、Ab-46、Ab-50、Ab-52、Ab-55、Ab-56およびAb-65。
【０１８４】
実施例2：PD-L1に対するhuPD-L1 mAbの結合の特徴づけ
huPD-L1抗体の結合分析を、PD-L1発現細胞を用いて行った。親細胞株300.19ならびにヒトPD-L1（hPD-L1）、ヒトPD-L2（HPD-L2）およびヒトC型レクチンドメインファミリー2メンバー（hCLEC2D）を発現するトランスフェクトされた細胞株を含む、4つのタイプの細胞を試験した。結合アッセイは、2連で行い、その結果を以下の表16〜19および図2にまとめた。抗体の親和性を、4つの抗体濃度：10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/mlおよび0.01μg/mlを用いて試験した。GF1538およびGF1757抗体を対照として使用した：GF1538はhPD-L1に対するヒト化Abであり、GF1757はhPD-L2に対するヒト化Abである。使用した2次抗体は、PEヤギ抗ヒトIgGであった。すべての値は、FACs分析によって検出された平均蛍光強度（GMFI）を表している。
【０１８５】
結合アッセイの結果は、試験したhuPD-L1抗体がPD-L1への結合に関して高い親和性および特異性を示すことを示している。ヒトPD-L1を発現しない親細胞株300.19の、対照としての使用は、基準または非特異的蛍光を規定した（表16および図2、左上）。huPD-L1抗体を用いたトランスフェクションによりヒトPD-L1を発現する300.19細胞の染色は、有意に高い平均蛍光強度（MFI）を示し、これらの抗体がPD-L1に結合できることを実証した。有意なFMI値は、最薄希釈物である0.01μg/mlの抗体の場合でさえも、PD-L1タンパク質への結合に関するhuPD-L1の高い親和性を示した（表17A、17Bおよび図2、右上）。表18A、18B、19A、19Bおよび図2、下2つのグラフに示されるように、huPD-L1抗体は、300.19細胞において発現させたヒトPD-L2またはCLEC2Dに結合する能力をある程度示した。しかし、PD-L2およびCLE2Dの染色に関して得られたMFI値は、PD-L1に関して得られた値ほど高くなかった。さらに、より薄い希釈物において、MFI値は基準レベルよりも有意に高くなく、huPD-L1抗体がPD-L2またはCLE2Dに対して高い親和性または特異性を有さないことを示した。いくつかのhuPD-L1抗体、例えばAb-42は、PD-L2に対する交差反応性をある程度示したが、この抗体は、PD-L1に対してそれよりも有意に高い親和性および特異性を有している。
【０１８６】
（表１６）huPD-L1を用いた未トランスフェクト300.19細胞に対する染色
0006461800.tif 000088
【０１８７】
（表１７Ａ）huPD-L1を用いたhPD-L1トランスフェクト300.19細胞に対する染色、アッセイ1の結果
0006461800.tif 000089
【０１８８】
（表１７Ｂ）huPD-L1を用いたhPD-L1トランスフェクト300.19細胞に対する染色、アッセイ2の結果
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【０１８９】
（表１８Ａ）huPD-L1を用いたhPD-L2トランスフェクト300.19細胞に対する染色、アッセイ1の結果
0006461800.tif 000091
【０１９０】
（表１８Ｂ）huPD-L1を用いたhPD-L2トランスフェクト300.19細胞に対する染色、アッセイ2の結果
0006461800.tif 000092
【０１９１】
（表１９Ａ）huPD-L1を用いたhCLEC2Dトランスフェクト300.19細胞に対する染色、アッセイ1
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【０１９２】
（表１９Ｂ）huPD-L1を用いたhCLEC2トランスフェクト300.19細胞に対する染色、アッセイ2
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【０１９３】
実施例2：PD/PD-L1結合を遮断する抗PD-L1ファージ抗体の特徴づけ
抗PD-L1ファージ抗体によるhPD-L1に対するhPD1結合の阻害を特徴づけるために、競合FACS分析を行った。すべての抗hPD-L1抗体が、ファージ-scFv形態であった。293T細胞を、hPD-L1-Fcの発現のために、ヒトFc領域に融合されたヒトPD-L1をコードするベクターでトランスフェクトした。このアッセイにおいて、1012プラーク形成単位（pfu）のファージ-scFvを、約0.25mg/mlの可溶性hPD-1-hFc融合タンパク質と混合し、次いでhPD-L1発現293T細胞に添加した。洗浄後、細胞をFITC-抗ヒトIgG抗体と共にインキュベートし、そして細胞表面上のhPD-L1に対するhPD1-hFcの結合を測定するためにFACSにより分析した。
【０１９４】
FACS分析により蛍光値を得、これを使用してhPD-L1+細胞に対するhPD-1の結合の阻害率を算出した。これらの値が図3に示されている。ほぼすべての抗PD-L1ファージscFvが、hPD-L1に対するhPD-1の結合を阻害する能力をある程度示した。特に、Ab-14、Ab-16、Ab-30、Ab-31、Ab-42、Ab-50、Ab-52およびAb-55ファージ-scFvは、有意なhPD-1/hPD-L1結合阻害を示した。
【０１９５】
実施例3：PD/PD-L1結合を遮断するhuPD-L1可溶性mAbの特徴づけ
本発明の可溶性huPD-L1抗体によるhPD-L1に対するhPD1結合の阻害を特徴づけるために、競合FACS分析を行った。すべてのhuPD-L1抗体を、hPD-L1を発現する300.19細胞に対するhPD1-IgG融合タンパク質の結合を阻害する能力について試験した。このアッセイにおいて、50,000個のhPD-L1発現細胞を、以下の濃度のhuPD-L1または対照抗体と共に30分間プレインキュベートした：10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/mlおよび0.01μg/ml。プレインキュベートの後、0.125μgのマウスIgG2αに融合されたヒトPD1を細胞に添加し、さらに30分間インキュベートした。この細胞を2回洗浄し、次いで0.125μgのヤギ抗マウスIgG2α-PE抗体を細胞に添加した。30分間のインキュベート後、細胞を2回洗浄し、次いでFACSによって分析した。FACS分析から得られた値が、平均蛍光強度単位（MFI）として表されており、これが表20にまとめられている。表20のMFI値を使用し、hPD-L1+細胞に対するhPD1結合のパーセント阻害を図4で算出した。本明細書に示されているように、試験したhuPD-L1可溶性抗体のすべてが、10μg/mlで、hPD-L1に対するhPD1結合のほぼ完全な阻害を示した。連続的に低くなる濃度で、可溶性抗体の大部分がなおも、特にAb-42およびAb-50が、非常に良好なPD1/PD-L1結合阻害を示した。
【０１９６】
（表２０）huPD-L1を用いたPD-1結合の遮断の結果
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【０１９７】
実施例4：二重特異性抗体の形成
IgG4分子のハーフモノマー（half-monomer）の作製におけるヒンジの役割に基づき、ヒトIgG1のヒンジ領域に荷電変異を導入することがハーフモノマーの交換を促進するだけでなく潜在的に二重特異性分子を安定化させ得るという仮説をたてた。この実施例では、ヒンジおよびCH3の変異の組み合わせが二重特異性抗体の形成を促進することを実証する。
【０１９８】
ヘテロダイマーの形成をさらに安定化させるために、これは「ノブ・イントゥー・ホール」のコンセプトであるが、CH3ドメインにおいて反対に荷電した変異をさらに置き換えた。二重特異性抗体の形成は、以下の工程により達成した。第1に、二重特異性の変異を有する2つの親抗体を別々に発現させ精製した。次いで、これらの抗体を、穏やかな還元剤の存在下で混合した。抗体の穏やかな還元により、これらの抗体が、各々可変重および軽鎖を有する2つのモノマーに解離した。次いでこれらのモノマーを混合し、その後に二重特異性抗体分子を形成させる酸化工程に供した。
【０１９９】
PD-L1およびG250（炭酸脱水酵素IX）を認識する二重特異性抗体を作製した。抗G250親（G37野生型、G37WT）および人工（G37 KIHA）抗体を、2つの独立したベクターによって生成および精製した。「ノブ・イン・ホール」コンセプトにしたがいかつ二重特異性の変異を保持していたG37 KIHAは、免疫グロブリンヒンジ領域の配列において改変された。
【０２００】
G37 KIHAの解離活性を理解するため、抗体を、異なる濃度のグルタチオン（GSH）によって抗体モノマーの形成を妨げる穏やかな還元剤の存在下で混合した（図1A）。図1Aにおいて低分子量種のレベルの増加によって示されるように、漸増濃度の還元剤（GSH）の添加によって、抗体がモノマーに解離した。
【０２０１】
同様に、抗PD-L1親（PD-L1野生型、PDL-1WT）および人工（PD-L1 KIHB）抗体を、2つの独立したベクターによって生成および精製した。異なる濃度のGSHを用いて、抗PD-L1モノマーを得るのに適した条件を検証した（図7B）。最適なGSH濃度条件を選択しそして得られた抗PD-L1モノマーをG37 KIHAモノマーと共にインキュベートした。二重特異性抗体の形成は、野生型IgGと同じサイズで観察され、このことは1つがPD-L1特異的モノマーであり1つがG250特異的モノマーである2つの重-軽鎖モノマーを含む抗体が作製されたことを示している。
【０２０２】
実施例5：二重特異性抗体の機能
次に、実施例3で作製された二重特異性抗体を、両方の抗原、例えばPD-L1およびG250を認識するそれらの能力について試験した。PD-L1およびG250二重特異性抗体の機能は、フローサイトメトリーを用いて試験した。CAIX+PD-L1- SKRC-52はCAIX（250）を発現するがPD-L1を発現せず、したがって細胞は抗CAIX抗体G37のみによって認識され、PD-L1では認識されないと予想した。抗体結合の飽和を回避するために，抗体の濃度を下げ、低用量様式にした。実際、親の抗G37はSKRC-52細胞を認識し、親の抗PD-L1はしなかった（対照と同じレベル）。コンジュゲートされた抗G37および抗PD-L1モノマーを含む二重特異性抗体は、親のG37抗体と比較して半分の低濃度でSKRC-52細胞を認識し、それによりこの方法を用いて作製された二重特異性抗体および本明細書に記載される抗体の機能が実証された。
【０２０３】
実施例6：mAb42の機能的特徴づけ
PD-L1に対するモノクローナル抗体（mAb42）のさらなる機能的特徴づけを行った。末梢血単核細胞（PBMC）を、4体の異なる健常ドナー（D1〜D4）から培養した。PBMCを、mAb42の存在下または対照アイソタイプIgG抗体の存在下のいずれかで培養した。PMBCを0.1μg/ml SEB（ブドウ球菌エンテロトキシンB）で刺激し、MSD（中規模送達）を用いてTNFα産生を測定した。サンプル分析は3連で行った。
【０２０４】
図8に示されるように、mAb42の存在下でのPBMCの培養は、4つすべてのドナーサンプルにおいて、対照抗体と比較して抗PD-L1抗体（mAb42）の存在下で培養された場合に、SEBに応じたTNFα産生を増加させた。さらに、TNFα産生の増加は、p＜0.0005で、統計的に有意であった。したがって、抗PD-L1抗体による処置は、ヒトにおける抗原または感染に応じた免疫応答を増進する。
【０２０５】
他の態様
本発明はその詳細な説明に関連して説明されてきたが、上記の説明は例示を意図したものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって定義される。他の局面、利点および改変も、添付の特許請求の範囲に包含される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ−１】
0006461800.tif 000107
【図７Ｃ−２】
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【図８】
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【配列表】
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