(57)【要約】  本発明は、パスツレラ科のメンバーにより引き起こされる感染に対する防御をもたらすワクチンであって、唯一の活性成分として外膜小胞を含み、前記外膜小胞がパスツレラ科の１以上の菌株から得られる（ただし、過剰に小胞形成する菌株は除外される）ことを特徴とする、ワクチンに関する。本発明はまた、そのようなワクチンを調製するための方法にも関する。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
唯一の活性成分として外膜小胞を含むワクチンであって、前記外膜小胞がパスツレラ科の１以上の菌株から得られる（ただし、過剰に小胞形成する菌株は除外される）ことを特徴とする、ワクチン。
【請求項２】
パスツレラ科の２以上の菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記ワクチンが、野生型株、遺伝子組み換え株、およびその組み合わせからなる群から選択される１以上の菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ワクチンが、ヘモフィルス、アクチノバチルス、パスツレラ、マンヘミア、またはその組み合わせの属の１以上の菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項１〜３のうちいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
前記ワクチンが、１以上のインフルエンザ菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記１以上のインフルエンザ菌株が、インフルエンザ菌の分類不能型菌株（ＮＴＨｉ）である、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
前記ワクチンが、１以上の軟性下疳菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項８】
前記ワクチンが、１以上のインフルエンザ菌株および１以上の軟性下疳菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項９】
前記ワクチンが、１以上の莢膜を有するインフルエンザ菌株、および１以上のインフルエンザ菌の分類不能型菌株（ＮＴＨｉ）、および１以上の軟性下疳菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記ワクチンが、１以上のＰ．ムルトシダ菌株、および／または１以上のＭ．ヘモリチカ菌株、および／または１以上のＨ．ソムナス菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項１１】
前記ワクチンが、１以上のＰ．ムルトシダ菌株、および１以上のＭ．ヘモリチカ菌株、および１以上のＨ．ソムナス菌株から得られた外膜小胞を含む、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
製薬上許容される希釈剤および／または担体を含む、請求項１〜１１のうちいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１３】
前記ワクチンがアジュバントを含んでいない、請求項１〜１２のうちいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１４】
前記ワクチンが、鼻腔内、経口、皮下および／または筋肉内投与用である、請求項１〜１３のうちいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１５】
ヒトおよび／または動物における使用のための、請求項１〜１４のうちいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１６】
請求項１〜１５のうちいずれか一項に記載のワクチンを調製する方法であって、
（ｉ）パスツレラ科の１以上の菌株の細胞を提供するステップ（ただし、過剰に小胞形成する菌株は除外される）と、
（ｉｉ）これらの細胞から生成された外膜小胞を単離するステップと、
（ｉｉｉ）外膜小胞が２以上の菌株由来の場合、前記外膜小胞は好適な割合で混合されることを特徴とする、唯一の活性成分として前記外膜小胞を含むワクチンを配合するステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パスツレラ科菌株から得られる外膜小胞を含む、パスツレラ科のメンバーにより引き起こされる感染に対する防御をもたらすワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
パスツレラ科は、片利共生生物、ならびにヒトおよび動物病原体をはじめとする、多くのグラム陰性プロテオバクテリアを含む。最も重要な属は、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アクチノバチルス（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、およびマンヘミア（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ）である。
【０００３】
アクチノバチルス、パスツレラ、およびマンヘミア種は、主として動物病原体である。例えば、近縁種であるパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、およびマンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）（以前のパスツレラ・ヘモリチカ  バイオタイプＡ）は、牛呼吸器病（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ：ＢＲＤ）に関連していることが多い。一般に、これらの細菌は、畜牛をはじめとする多くの家畜および野生動物の鼻咽頭における片利共生生物である。しかしながら、それらの細菌は、ストレス（例えば、輸送、離乳、過密状態）にさらされている動物において、重度の肺感染を引き起こし得る。ＢＲＤは、死亡喪失を引き起こし、薬剤コストおよび労働コストを増加させ、屠体の価値を低下させ、生産を減少させる、肉牛および酪農業者が直面する最も重要な健康問題のひとつである。ＢＲＤは、米国の家畜産業に毎年５億米ドルの損害を与えている可能性がある。オーストリアでは、２年前、養鶏場においてＰ．ムルトシダにより引き起こされた鳥類コレラ（家禽コレラ、鳥類パスツレラ病）が大発生し、６８００羽の動物が感染した。ヒトにおいて、パスツレラ属およびマンヘミア属により引き起こされる感染の主なタイプは、イヌ、ネコ、およびウマなどの動物による咬傷および引っ掻き傷に起因する創傷感染である。気道および侵襲的感染はあまり一般的ではないが、乳児および免疫不全患者において重度の合併症を引き起こす可能性がある。
【０００４】
パスツレラ科の中では、ヘモフィルス属は恐らく最も重要なヒト病原体を含む。例えば、性感染する軟性下疳菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）は生殖器潰瘍を引き起こし、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）は肺炎、髄膜炎、敗血症、中耳炎、副鼻腔炎、成人喉頭蓋炎、および産褥期感染症を引き起こす。インフルエンザ菌の分離株は、多糖体莢膜の有無により、莢膜株、および分類不能型（ＮＴＨｉ）と称される無莢膜株に分類される。莢膜は、侵襲性の菌株の主要な毒性因子である。莢膜株は、ａ〜ｆの血清型（ｂ型が最も毒性が強い）に属する。インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）に対しては有効なワクチンが導入されているため、現在はＮＴＨｉに注目が集まっている。ＮＴＨｉの鼻咽頭における定着は無症候性であるにもかかわらず、それらは中耳炎、慢性気管支炎、市中感染肺炎、および産褥期感染症に関連していることが多い。ＮＴＨｉは、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）ならびに気管支拡張症の悪化の最大の原因であり、また、嚢胞性繊維症の人々にも感染を引き起こす。２００７年におけるＷＨＯの最新の推定によれば、現在、２億１０００万人がＣＯＰＤに罹患しており、２００５年には３００万人がＣＯＰＤにより死亡した。さらに、ＣＯＰＤは２０３０年には世界の死亡原因の第３位、および身体障害の原因の第５位になると推定されている。
【０００５】
現在、パスツレラ科の大部分のメンバーにより引き起こされる感染防御のための有効なワクチンは不足している。ＢＲＤの場合は、Ｍ．ヘモリチカおよびＰ．ムルトシダの免疫製品が市販されているが、フィードロットプログラムにおいてすべてのワクチンが一貫して有益性を示しているわけではない。肺炎球菌多糖体Ｄタンパク質結合型ワクチン「Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘ」は、ＮＴＨｉ菌株のＤタンパク質を、様々な肺炎球菌多糖体のための担体として使用している。従って、Ｓｙｎｆｌｏｒｉｘを用いるワクチン接種は、Ｄタンパク質に対するあるレベルの抗体を誘導する。しかしながら、このワクチンが焦点を合わせるのは肺炎球菌感染の防御であり、ＮＴＨｉに対する有効率はおよそ３０％にすぎない。現在、ＢＲＤおよびＮＴＨｉにより引き起こされる感染症の原因病原体を標的とする多くの新しい改質製品が開発中であり、このことは、新しく、有効かつ安価なワクチン候補物質の必要性をはっきり示している。注目に値するひとつの例外は、Ｈｉｂにより引き起こされるヒト感染に対する莢膜多糖体結合型ワクチンである。９０年代初期のＨｉｂワクチンの導入以来、Ｈｉｂ感染は著しく減少し、その一方でＮＴＨｉにより引き起こされる感染症が増加している。ＮＴＨｉに対するワクチン開発におけるひとつの課題は、Ｈｉｂワクチンの主成分である莢膜がないことである。Ｈｉｂワクチンは、ＮＴＨｉに対して防御効果は持たない。さらに、ＮＴＨｉ菌株は、外膜（ＯＭ）タンパク質パターンがかなり多様であり、他のタンパク質も非常に多様性のある領域を有する。ＮＴＨｉのいくつかのＯＭ成分が、ワクチンの有力候補として提案されている。
【０００６】
「ブレブ（水疱）」とも呼ばれるＯＭＶは、小さな膜の球体であり、約１０〜３００ｎｍの直径を有する。ＯＭＶは、増殖の間にグラム陰性菌の外膜から自然に放出される。ＯＭＶは、研究室で細菌が増殖する際に培養培地中に蓄積し、精製および貯蔵することが可能である。ＯＭＶは非生物であり、外膜タンパク質、周辺質タンパク質、脂質、およびリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）などの多くの重要な防御抗原を含む。例えば、様々なＮＴＨｉ血清型の分類は、それらの個々のＬＯＳ構造に基づいている。
【０００７】
一部の病原体の精製されたＯＭＶは、ワクチン開発および抗生物質療法において有用であることが実証されている。外膜小胞（ＯＭＶ）に基づくワクチンは、当技術分野で公知である。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＯＭＶに関しては、工業生産へのアップスケールはすでに確立されており、血清型Ｂ株髄膜炎菌による髄膜炎の発生を阻止するために、ワクチンとして広く研究され、限られた方法で試験されている（非特許文献１）。
【０００８】
特許文献１は、担体菌株の細胞表面に膜小胞が組み込まれている、病原体に由来する膜小胞を含むワクチンを開示している。病原体は、インフルエンザ菌、Ｍ．ヘモリチカ、およびＰ．ムルトシダをはじめとするパスツレラ科のメンバーであり得る。実験データは、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌株から得られた膜小胞のみについて示されている。特許文献１の目的は、膜小胞を担体菌株に融合させることにより、免疫原性を強め、タンパク質誘導免疫応答を実現させることであった。一般に、主としてＬＰＳ（リポ多糖体）に対する多糖体誘導免疫応答は、種内変異体および血清型それぞれに対して交差防御はもたらさないため、これはグラム陰性菌に対するほとんどのワクチンに望まれることである。しかしながら、弱毒化または不活性化された担体菌株のいずれかを使用しなくてはならないため、担体菌株への膜小胞の融合はコスト効率および簡便なワクチン製造に関しては不利である。
【０００９】
特許文献２は、１以上のｔｏｌ遺伝子の発現を下方制御することにより、またはペプチドグリカン関連部位を含むタンパク質をコードする１以上の遺伝子の突然変異によりペプチドグリカン結合活性を弱めることにより、「過剰にブレブ形成する（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂ）」ように遺伝子組み換えがなされている、グラム陰性菌株に関する。「過剰にブレブ形成する（Ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ）」菌株（「過剰に小胞形成する（ｈｙｐｅｒｖｅｓｉｃｕｌａｔｉｎｇ）」菌株とも称される）では、ＯＭＶの放出レベルが上昇する。特に、特許文献２はまた、ＮＴＨｉをはじめとするインフルエンザ菌株にも言及している。特許文献２によれば、過剰にブレブ形成（過剰に小胞形成）しない菌株から、有効な、安定した外膜小胞調製物を得る、又は調製することは困難である。しかしながら、文献からの科学的なデータは、過剰なブレブ形成は外膜の完全性が乱れた結果であることを実証している。特許文献２に教示されているように、Ｔｏｌ／ＰａｌおよびＰ５／ＯｍｐＡ突然変異は、一般の膜を不安定にし、外膜およびＯＭＶのタンパク質含量の差異ならびに構造的な障害をもたらすことが報告されている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。過剰にブレブ形成（過剰に小胞形成）する変異株の使用は、ＯＭＶの中に望ましくない生成物が増加する原因となる。さらに過剰なブレブ形成は、不適切なタンパク質折り畳みを引き起こし、それにより、それらの未変型コンホメーションにおける抗原が提示されない可能性がある。さらに、外膜タンパク質Ａ（ＯｍｐＡ）は、血清耐性および病原性のために重要である（非特許文献１０）。結果として、ＯｍｐＡに対する免疫応答を誘導するワクチンは有利であるが、特許文献２により教示されるＯｍｐＡ変異株には当てはまらない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第２００２／００２８２１５Ａ１号明細書
【特許文献２】米国特許第２００４／０１１６６６５Ａ１号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇｉｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４６９２−４７００
【非特許文献２】Ｋｕｌｐ  ａｎｄ  Ｋｕｅｈｎ，  ２０１０，  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：  １６３−８４
【非特許文献３】Ｌａｚｚａｒｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ  １７７：１９１−７
【非特許文献４】Ｌｌａｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８２：４７６７−７２
【非特許文献５】Ｄｅａｔｈｅｒａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７２：１３９５−４０５
【非特許文献６】ＭｃＢｒｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：５３８５−９２
【非特許文献７】Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０：１００−１１
【非特許文献８】Ｓｅｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６４：１３９１−４０３
【非特許文献９】Ｓｏｎｎｔａｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １３６：２８０−５
【非特許文献１０】Ｗｅｉｓｅｒ  ａｎｄ  Ｇｏｔｓｃｈｌｉｃｈ，  １９９１，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５９：２２５２−８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、ヒトおよび動物においてパスツレラ科のメンバーにより引き起こされる感染に対する防御をもたらすワクチンに対する高い需要に応えることである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、周知のパスツレラ科ワクチンの上記の不利益を持たない、有効で、安価であり、かつ広域性スペクトルを有する、パスツレラ科感染に対するワクチンを提供することである。具体的に言えば、有効かつ広域性スペクトルを有するＮＴＨｉに対するワクチンが提供されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
この目的は、唯一の活性成分として外膜小胞を含むワクチンにより達成され、外膜小胞は、パスツレラ科の１以上の菌株から得られる（ただし、過剰に小胞形成する菌株は除外される）。
【００１５】
驚くことに、本発明によるワクチンが、強力な免疫応答ならびに他のパスツレラ科のメンバーに対する予期せぬ顕著な交差防御を誘導することが見出されている。交差防御の増強は、保存されている外膜抗原の存在により説明され得る。この程度までの交差防御は、現在までに、パスツレラ科に対するいずれのワクチンについても認められていない。これらの結果は、予測不可能であり、切実な要求をかなえるものであった。
【００１６】
米国特許第２００２／００２８２１５号は、担体菌株を使用しない膜小胞の使用が多糖体誘導免疫応答をもたらすことを示唆している。そのために、この文書においては、ＯＭＶを唯一の活性成分として含むワクチンは、求められておらず、開示も示唆もされていない。米国特許第２００２／００２８２１５号の教示は、本発明によるワクチンから離れている。本発明によるワクチンでは、ＯＭＶは唯一の活性成分に相当し、本明細書で使用するとき、用語「唯一の活性成分」とは、ＯＭＶが被験体において免疫原性応答を誘発する能力を有するワクチンにおける唯一の成分であることを示すために使用される用語である。
【００１７】
米国特許第２００４／０１１６６６５Ａ１号に開示されているような、過剰に小胞形成する（過剰にブレブ形成する）菌株は、上述の周知の不利益のために明らかに除外される。そのため、用語「過剰にブレブ形成する菌株」「過剰に小胞形成する菌株」は、本明細書で使用するとき、同義的に、小胞排出特性が高まっている、すなわち、遺伝子操作されていない菌株の排出量と比較して、細菌細胞あたりの外膜小胞排出量が増加しているパスツレラ科のグラム陰性菌株をさす。この除外は、全ての種類の過剰に小胞形成する菌株、例えば、過剰に小胞形成する菌株を作製するために、明確な変異原性またはランダムな変異原性により過剰な小胞形成が誘発された菌株をさす。
【００１８】
国際公開第０３／０５１３７９Ａ１号は、少なくとも２つの異なる起源のグラム陰性細菌から得られた外膜小胞を含む組成物を開示しており、これらの起源のうち少なくとも１つは基本的に非病原体の種であることが求められている。国際公開第０３／０５１３７９Ａ１号によれば、非病原体のＯＭＶを含むワクチン組成物は、病原体のＯＭＶを含む組成物よりも副作用を引き起こしにくいと考えられている。開示では、インフルエンザ菌について言及しているが、大部分はナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）からのＯＭＶの調製を対象としている。さらに、示されている実施例はナイセリアからのＯＭＶ調製、および付随する電子顕微鏡写真について言及しているのみである。これらの調製物の免疫付与データ、または有効性を実証するデータ、防御免疫応答のいずれも示されてはいない。
【００１９】
国際公開第０１／０９３５０号は、インフルエンザ菌由来のＯＭＶを開示しており、Ｈｉｂにのみ適用されるデータが不当にＮＴＨｉに関連付けられている。最近の研究では、既存のＨｉｂワクチンは明らかにＮＴＨｉおよび他のパスツレラ科のメンバーに対して交差防御効果を持たないことが実証されている（Ｈｏｔｏｍｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ２３（１０）：１２９４−３００；  Ｉｔｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  １７（４）：  ５５９−６２）。さらに、この開示はパスツレラ科に関連する実験データを示していない。結果として、国際公開第０１／０９３５０号を鑑みて、当業者は本発明による交差防御ワクチンを調製するためにインフルエンザ菌由来または他のパスツレラ科のメンバー由来のＯＭＶを使用するための動機をもたない。
【００２０】
Ｕｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．は、ワクチン接種目的のためにいくつかの細菌種から得られたＯＭＶを開示している（Ｃａｎ  Ｍ  Ｕｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．  １２  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１０）。髄膜炎菌由来のＯＭＶに基づくワクチンは、以前に記載されている（Ｄｒａｂｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１６０−１７２；  Ｓａｎｄｂｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．  １４，  Ｎｏ．  ９：１０６２−１０６９；  Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：５０５７−５０６７；  Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２７  Ｓｕｐｐｌ．  ２：Ｂ３−Ｂ１２）。コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来の、ＯＭＶに基づくワクチンは公知である（Ｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｖｏｌ．  ７６，  Ｎｏ．  １０：  ４５５４−４５６３）。国際公開第２００９／０４９０１３号は、コレラ菌に対するＯＭＶワクチン組成物について記載し、いくつかの実施形態では、下痢を引き起こす他の病原体について記載している。これらの文書はいずれも、パスツレラ科由来のＯＭＶに基づくワクチンを開示または示唆していない。
【００２１】
他のグラム陰性菌、例えば髄膜炎菌およびコレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）に基づくＯＭＶから得られた概念および発見が、必ずしもパスツレラ科由来のＯＭＶの指標となるものではないことは、当業者に明らかである。ナイセリアとは対照的に、ＮＴＨｉは莢膜を持っていない。ＯＭＶを産生する他の生物は、パスツレラ科のメンバーとは異なる疾患パターンを誘発し、異なるＬＯＳおよび外膜タンパク質を有する。本発明によるＯＭＶワクチンの利点およびそれとともに得られた結果は、発明者にとって驚くべきものであり、全く予測できるものではなかった。さらに、国際公開第２００９／０４９０１３号に記載のコレラ菌ＯＭＶ単離法として知られている方法が、同様の方法でパスツレラ科に適用され得ることは予想されなかった。
【００２２】
本発明によるワクチンは、以下のような利点を有する：
−パスツレラ科由来のＯＭＶを、単純で確立された精製ステップにより単離することができる。
−パスツレラ科由来の単離ＯＭＶは、安定である（３７℃においてさえも）。従って、本発明のパスツレラ科ワクチンの配送および管理に低温流通体系は必要とされない。
−非侵襲性の鼻腔内、またはもう一つの方法として経口免疫経路が可能であり、アジュバントは必要ではない。ＯＭＶは非生物であり、増殖しない粒子である。従って、弱毒化生ワクチン候補物質で知られている重度の副作用のリスクが低く、製造コストを低く抑えることが可能である。
−ＯＭＶは自然に放出され、そのため細菌外膜の表面構造が、その天然のコンホメーションを表す。これは外膜の精製タンパク質に基づくワクチン候補物質と比較して大きな強みである。そのような精製タンパク質に基づくワクチンは、製造コストが高いために、通常、非常に高価である。加えて、タンパク質は精製ステップ中に変性する可能性がある。従って、最終ワクチンに存在する精製タンパク質は、天然の状態と比較して、コンホメーションが変化し抗原性プロファイルが異なっている可能性がある。この問題は、本発明により克服される。
−以下の実施例に示された結果から明らかになるように、発明者らは、パスツレラ科由来のＯＭＶは免疫原性が強く、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｃｅ）なしで強力な防御免疫応答を誘導することを実証できた。
−本発明のワクチンは、パスツレラ科の他のメンバーに対して有意な交差防御をもたらすことが見出された。パスツレラ科のいくつかの菌株由来の精製ＯＭＶは、多種多様の免疫応答を示す複合体を得るために混合することができる。そのようなＯＭＶ混合物は、菌株の異質性を反映する、抗原の広域スペクトルを与えるために、好適な割合で配合することができる。そのような混合物は、多種多様な抗原に対して複雑な免疫応答を誘導し、結果として、本明細書に開示された実施例において実証されるように、顕著に増強された交差防御が得られる。
【００２３】
本発明による新規のパスツレラ科ワクチンの有効性は、パスツレラ科全体の代表として異種ＮＴＨｉ菌株およびＰ．ムルトシダ由来のＯＭＶを含む免疫混合物を用いて、マウスにおいて実証されている（以下の実施例を参照のこと）。実施例に示されている結果は、例えば、ＮＴＨｉ感染に対するワクチンを得るために異種ＮＴＨｉ菌株由来のＯＭＶを組み合わせたり、牛呼吸器病（ＢＲＤ）および鳥類コレラの最も多い原因に対するワクチンを得るためにＰ．ムルトシダ由来のＯＭＶを組み合わせるなど、免疫混合物中で組み合わせたＯＭＶに応じて、パスツレラ科の中の様々なメンバーに対する、適応性および広域性スペクトルを有するワクチンの、大いなる可能性を示している。
【００２４】
好ましくはＯＭＶおよび製薬上許容される希釈剤および／または担体を含む免疫原性組成物であるワクチンは、患者において免疫応答を引き起こすことが可能であり、その免疫応答はＯＭＶ中に提示された抗原に向けられている。
【００２５】
ひとつの態様において、ワクチンは、１種のパスツレラ科菌株のみから得られた外膜小胞を含む。
【００２６】
もうひとつの態様において、ワクチンは、２種以上のパスツレラ科菌株から得られた外膜小胞を含む。パスツレラ科のいくつかの菌株由来の精製ＯＭＶを混合することができる。そのようなＯＭＶ混合物は、菌株の異質性を反映する、抗原の広域スペクトルを与えるために、好適な割合で配合することができる。そのような混合物は、多種多様な抗原に対して複雑な免疫応答を誘導し、結果として、顕著に増強された交差防御が得られる。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「好適な割合」は、一般にそれぞれのＯＭＶ試料のタンパク質量に基づいて等量混合されたもの、または最も有効な免疫応答を得るための他の適切な割合の混合物をさす。好適な割合は、例えば所定の試験など、当業者に公知の方法により決定されてよい。
【００２８】
さらにもうひとつの態様において、本発明のワクチンは、野生型株、遺伝子組み換え株、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１種以上の菌株から得られた外膜小胞を含み得る。言い換えれば、ワクチンは（ｉ）１種の野生型株、または（ｉｉ）１種の遺伝子組み換え株から得られたＯＭＶを含んでよく、あるいは、（ｉｉｉ）２種もしくはそれ以上の野生型株、（ｖｉ）２種もしくはそれ以上の遺伝子組み換え株、または（ｖ）少なくとも１種の野生型株および少なくとも１種の遺伝子組み換え株から得られたＯＭＶの混合物を含んでよい。
【００２９】
本明細書で使用するとき、用語「野生型株」とは、天然に存在する菌株、すなわち天然に存在する起源から単離された（例えば、この菌株に感染した被験体から単離された）非変異株の、遺伝子型または表現型特性を有する、所与のパスツレラ科菌株をさす。
【００３０】
対照的に、本明細書で同義的に使用される用語「遺伝子組み換え」、「変異株」、または「組み換え型」とは、その遺伝子型に改変を有し、結果として野生型株と比較した場合に突然変異および変化した特性および／または変化した表現型を示す所与のパスツレラ科菌株をさす。菌株は、例えば、遺伝子工学技術による標的化法で遺伝子を組み換えられるか、または誘発突然変異によりランダムに遺伝子を組み換えられてよい。さらに、用語「遺伝子組み換え」はまた、天然起源から単離され、それぞれの野生型株と比較してそれらの変化した特性によって同定され得る、天然に存在する変異株もさす。天然に存在する変異株の例としては、自然発生の抗生物質耐性株、安定性または病原性の変化した菌株、ならびに莢膜発現もしくは外膜タンパク質の組成およびアミノ酸配列、または多糖体構造の組成および発現が変化している相変異体が挙げられる。加えて、より高水準のナチュラルコンピテンスを有する変異株（例えば、ｔｆｏｘ）が存在する。
【００３１】
以下に示す、非制限的な遺伝子組み換えパスツレラ科菌株の例が本発明に包含される：
−組み換え株は、モニタリング、検出、選択および対抗選択を可能にする選択マーカーを担持している（例えば、抗生物質耐性カセット、重金属耐性、スクロース感受性、温度感受性、栄養要求株マーカーなど）。
−組み換え株はそれ自体、またはそれから単離されたＯＭＶについても適応度が向上している（例えば、安定性の向上、寿命の延長など）。例えば、ＮａｄＶを発現する菌株は、ニコチンアミドを第Ｖ因子の唯一の供給源として増殖可能であり、ｓｘｙ／ｔｆｏｘ突然変異は結果として増殖速度を増加させる（Ｓａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４８：４５３２−４５４１；  Ｒｅｄｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３：５６１２−５６１８）。
−組み換え株は、もはや不利益となる構造（例えば、細菌毒素）を有していない。例としては、パスツレラ毒素を持たない変異株、脂質Ａの毒性が低減された変異株、外膜表面近くに位置する抗原の免疫系による検出を容易にする莢膜変異株などがある（Ｌａｂａｎｄｅｉｒａ−Ｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７８：４７７９−４７９１；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ５：１１８５−１２０１；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９：１２７１−１２７９）。
【００３２】
所与の組み換え株の外膜の構造（および、結果として、外膜小胞の構造）は、それぞれ野生型株の外膜構造および野生型株のＯＭＶと比較して、大きく変わらないことが好ましく、全く変わらないことがより好ましい。従って、野生型株の構造を示すＯＭＶは、自然のままの状態を反映する抗原性プロファイルをもたらす、天然の細菌外膜コンホメーションの表面構造を最もよく表すために、特に好ましい。
【００３３】
さらに、上記で定義および記載した、過剰に小胞形成する（過剰にブレブ形成する）表現型を有する野生型株または遺伝子組み換え株は、上述の理由のために、除外されることが明確に強調される。
【００３４】
本発明によるワクチンは、ヒトおよび／または動物用の用途に好適である。
【００３５】
本明細書で使用するとき、用語「患者」および「被験体」は同義的にヒトまたは動物をさす。多くの態様において、被験体はヒトである。例えば、パスツレラ科の中では、ヘモフィルス属は、分類可能および分類不能型インフルエンザ菌および軟性下疳菌などの、恐らく最も重要なヒト病原体を含む。他の態様においては、被験体は、例えばウシ、ウマ、家禽、ネコまたはイヌなどの家畜または飼育動物である。しかしながら、ワクチンは野生動物に適用されてもよい。例えば、アクチノバチルス属、パスツレラ属、およびマンヘミア属は、主として動物病原体である。ヒトにおいて、パスツレラ属およびマンヘミア属により引き起こされる感染の主なタイプは、イヌ、ネコ、およびウマなどの動物による咬傷および引っ掻き傷に起因する創傷感染である。
【００３６】
本発明によるワクチンは、最も好ましくはパスツレラ科の１以上の病原性株から得られたＯＭＶのみを含み、ここで、本明細書で使用するとき、用語「病原性株」とは、疾患または疾患の症状と関連するパスツレラ科のメンバーである菌株をさす。これはまた、例えばある条件下でのみ、または他の感染との組み合わせで（例えば、ストレス、免疫抑制など）疾患または症状を引き起こし、それ以外は無症候性の、片利共生生物である菌株などの細菌株も含む。病原性株の代表的な例は、本明細書に記載のヘモフィルス属、アクチノバチルス属、パスツレラ属およびマンヘミア属の菌株である。
【００３７】
本発明によるワクチンは、パスツレラ科感染を防ぐために防御的であってもよいし、または感染後の病状を治療するために治療的であってもよい。一般にワクチンは、防御的治療、すなわち誘導された免疫応答が好ましくは防御されるということを目的としている。
【００３８】
そのため、本発明によるワクチンは、パスツレラ科のメンバー、一般に病原性を有するメンバー、特に、ヘモフィルス属、アクチノバチルス属、パスツレラ属、およびマンヘミア属の菌株により引き起こされる感染および疾患の治療または防御に有用である。現在のデータは、ワクチン中に存在しないパスツレラ科の他のメンバーに対する強力な免疫応答および強化された交差防御を実証している。
【００３９】
ある実施形態において、ワクチンは、１以上のインフルエンザ菌株から得られた外膜小胞を含む。上記ですでに説明したように、インフルエンザ菌分離株は、多糖類莢膜の有無によって莢膜株および無莢膜株に分類することができる。無莢膜株は、分類不能型菌株（ＮＴＨｉ）と呼ばれる。そのため、本明細書で使用するとき、用語「インフルエンザ菌」とは、莢膜株および無莢膜株の両方をさす。ある好ましい実施形態において、１以上のインフルエンザ菌株は、ＮＴＨｉである。完全に網羅されているわけではないが、例として、配列決定された菌株（例えば、ＮＴＨｉ８６−０２８ＮＰ）、総合的に特性づけられ、それらの表面組成については高い異質性が実証されている臨床分離株（例えば、ＮＴＨｉ菌株９２７４、７５０２、５６５７、３１９８、２０１９、１４７９）、および侵襲性疾患を引き起こし得る菌株が挙げられる（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８７：４６２７−４６３６；  Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４０４７−４０５３；  Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５０：１５−２１；  Ｅｒｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７３：５８５３−５８６３）。
【００４０】
ある実施形態において、ワクチンは、１以上の軟性下疳菌株から得られた外膜小胞を含む。軟性下疳菌は、ヒトにおいて生殖器潰瘍を引き起こす。軟性下疳菌株の有利な例は、配列決定された菌株３５０００ＨＰ（Ｆｕｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７８：３７６３−３７７２）であり、ヒトにおける研究から得られたデータが利用可能である。
【００４１】
ある実施形態において、ワクチンは、１以上のインフルエンザ菌株および１以上の軟性下疳菌株から得られた外膜小胞を含む。特定の実施形態において、ワクチンは１以上の莢膜を有するインフルエンザ菌株および１以上のインフルエンザ菌の分類不能型菌株（ＮＴＨｉ）および１以上の軟性下疳菌株から得られた外膜小胞を含む。これらの実施形態は、特にヒトにおける使用が意図されている。
【００４２】
ある実施形態において、ワクチンは、１以上のＰ．ムルトシダ菌株、および／または１以上のＭ．ヘモリチカ菌株、および／または１以上のヘモフィルス・ソムナス（Ｈ．ｓｏｍｎｕｓ）菌株から得られた外膜小胞を含む。まず第一に、これらの実施形態は、牛呼吸器病（ＢＲＤ）および鳥類コレラに対する防御をもたらすなど、動物における使用が意図されている。完全に網羅されているわけではないが、例として、配列決定された菌株（例えば、Ｐ．ムルトシダＰｍ７０およびＭ．ヘモリチカＢＡＡ−４１０）、感染動物から得られた臨床分離株（例えば、Ｐ．ムルトシダＰｍ７０またはＰ４８８１およびＭ．ヘモリチカＢＡＡ−４１０）が挙げられる（Ｒｉｍｌｅｒ，  １９９６，  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｐａｔｈｏｌ  １１４：３４７−３６０；  Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  ＰＮＡＳ  ８９：３４６０−３４６５；  Ｇｉｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：７２５７−７２６６）。Ｈ．ソムナスはまた、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｉ：Ｈ．ｓｏｍｎｉ）とも呼ばれ、主として畜牛において一般的な動物病原体である。Ｈ．ソムナス菌株の有利な例は、Ｈ．ソムナス２３３６である（Ｓａｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８９：８１７９−８１８５）。特定の実施形態において、ワクチンは、１以上のＰ．ムルトシダ菌株、および１以上のＭ．ヘモリチカ菌株、および１以上のＨ．
ソムナス菌株から得られた外膜小胞を含む。
【００４３】
もうひとつの態様において、免疫学的に有効な量のＯＭＶを本発明によるワクチンの形態で被験体に投与することを含む、被験体において免疫応答を誘導する方法が、本明細書に開示されている。本発明の一実施形態において、被験体はヒトである。もうひとつの実施形態では、被験体は、家畜、飼育動物、または野生動物である。
【００４４】
本発明によるワクチンは、任意の適切な、治療上有効かつ安全な用量および投与計画で、被験体に投与されてよい。用量および投与計画は、例えば所定の試験など、当業者に公知の方法により決定されてよい。ワクチンは、免疫学的に有効な量の、ただ１種のパスツレラ科菌株から得られたＯＭＶ、または２種もしくはそれ以上のパスツレラ科菌株から得られたＯＭＶを含むＯＭＶ混合物を含む。用語「免疫学的に有効な量」は、単回免疫用量、または一連の免疫付与の一部としての、個人へのその量の投与がパスツレラ科感染に対する防御のために有効であることを意味する。免疫学的有効量は、免疫付与される被験体（例えば、ヒト、動物の分類群）、所望の防御レベル、被験体の年齢、体重、性別、医学的および身体的状態、抗体産生能力、および当業者に公知の他の関連するパラメータによって異なる。投与計画は、１回の単回免疫用量、または、例えば一次免疫後に１回以上の追加免疫用量を投与する反復免疫を含み得る。
【００４５】
被験体の、本発明によるパスツレラ科ワクチンに対する免疫原性応答は、例えば、病原性を持つ野生型株を用いて抗原投与した後に、抗体力価測定、リンパ球増殖アッセイ、または徴候および症状のモニタリングを行うことにより判定してよい。ワクチンにより与えられた防御免疫は、例えば、死亡率、罹患率、ならびに被験体の身体的状態および健康全般などの臨床パラメータにおける軽減の測定により判定することができる。
【００４６】
本発明によるワクチンは、粘膜への免疫付与に特に適している。粘膜投与経路としては、経口、鼻腔内、胃内、肺内、膣内、直腸内、腸内、および眼内経路が挙げられ得る。鼻腔内または経口投与が好ましく、鼻腔内投与が特に好ましい。さらに、ワクチンを非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、腹膜内、皮下、皮内）投与することも可能である。
【００４７】
ワクチンが鼻腔内投与用である場合は、鼻腔用スプレー、点鼻薬、粒子ミスト、またはゲルなどの形態であってよい。ワクチンが経口投与用である場合は、錠剤、丸薬、カプセル剤、またはトローチ剤の形態であってよいが、例えば、トニック剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、または滴剤などの液状の形態であってもよい。
【００４８】
経口、皮下、筋肉内、または鼻腔内投与は、ヒトおよび動物両方において特に好ましい。
【００４９】
本発明の意味において、「製薬上許容される希釈剤および／または担体」は、ワクチン調製に用いられ、それ自体抗体産生を誘導しない任意の物質であり、限定されるものではないが、コーティング剤、フィルム形成剤、増量剤、崩壊剤、放出調節剤、担体剤、希釈剤、結合剤、アジュバント、およびワクチンの配合に使用される他の物質であってよい。そのような担体は、当業者に周知である。本発明によるワクチンは、アジュバントを含んでよい。例えば、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩、油性製剤およびエマルジョンなどの好適なアジュバントは当技術分野で公知である。例えば、アジュバント物質は、コレラ毒素のＢサブユニット、モンタナイド、ウイルス用粒子、およびサポニンであり得る（Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０：２３−３２）。
【００５０】
ひとつの態様において、本発明によるワクチンは、溶液または例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水溶液などのバッファーに再懸濁されたＯＭＶを含み、好ましくは、他の成分を含まない。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明によるワクチンは、アジュバントを含まない。パスツレラ科由来のＯＭＶは、アジュバントを含まない本発明によるワクチンを用いて免疫付与されたマウスにおいて、強力な免疫応答および高レベルの防御を誘導することが示された。
【００５２】
本発明のさらなる態様は、
（ｉ）パスツレラ科の１以上の菌株の細胞を提供するステップ（ただし、過剰に小胞形成する菌株は除外される）と、
（ｉｉ）これらの細胞から生成された外膜小胞を単離するステップと、
（ｉｉｉ）外膜小胞が２以上の菌株由来の場合、前記外膜小胞は好適な割合で混合されることを特徴とする、唯一の活性成分として外膜小胞を含むワクチンを配合するステップ
を含む、本発明によるワクチンを調製する方法に関する。
【００５３】
パスツレラ科由来のＯＭＶは、単純な精製ステップで単離することができる。髄膜炎菌由来のＯＭＶに関しては、工業生産へのアップスケールは、すでに確立されている（Ｇｉｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４：４６９２−４７００）。２以上の菌株から得られたＯＭＶの混合物を含むワクチンの場合、用語「好適な割合」の意味は、上述の通りである。パスツレラ科菌株からのＯＭＶの単離、および本発明によるワクチン配合のプロトコールは、実施例に詳細に説明されている。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は、パスツレラ科メンバーの産生するＯＭＶの図である。  ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１（Ａ）、３１９８−Ｒ１（Ｂ）、１４７９−Ｒ１（Ｃ）、９２７４−Ｒ３（Ｄ）、５６５７（Ｅ）、および７５０２−Ｒ１（Ｆ）、Ｐ．ムルトシダ菌株Ｐ４８８１（Ｇ）ならびにＭ．ヘモリチカＳＨ７８９（Ｈ）由来のＯＭＶ（レーン１）およびＯＭ（レーン２）タンパク質プロファイルの比較。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｋａｎｇ染色液で染色した。左側の線は標準タンパク質の分子量をｋＤａで示す。
【図２】図２は、ＯＭＶの安定性を示す図である。  レーン１、２および３は、それぞれ−７０℃、２５℃および３７℃で９日間貯蔵された２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶタンパク質を示す。試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｋａｎｇ染色液で染色した。左側の線は標準タンパク質の分子量をｋＤａで示す。
【図３】図３は、ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１（ＩＭ１およびＩＭ２に存在）由来のＯＭＶに対する免疫グロブリン力価を示す図である。  ＩＭ１（実線）およびＩＭ２（破線）で鼻腔内免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置の未感作マウス（点線）（各群ｎ＝２０）の、血清中のＯＭＶに対するＩｇＡ（Ａ）、ＩｇＧ１（Ｂ）、ＩｇＭ（Ｃ）抗体の経時的な力価の中央値が示されている。エラーバーは、各測定時点に対する各データセットの四分位範囲を示す。
【図４】図４は、ＮＴＨｉ菌株３１９８−Ｒ１（ＩＭ１およびＩＭ２には存在しない）由来のＯＭＶに対する免疫グロブリン力価を示す図である。  ＩＭ１（実線）およびＩＭ２（破線）で鼻腔内免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置の未感作マウス（点線）（各群ｎ＝２０）の、血清中のＯＭＶに対するＩｇＡ（Ａ）、ＩｇＧ１（Ｂ）、ＩｇＭ（Ｃ）抗体の経時的な力価の中央値が示されている。エラーバーは、各測定時点に対する各データセットの四分位範囲を示す。
【図５】図５は、ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１および３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対するマウス糞塊中の免疫グロブリン力価を示す図である。  ＩＭ１およびＩＭ２で鼻腔内免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置の未感作マウス（対照、ｃｏ）（各群ｎ＝１０）から３９日目に採取された糞塊から抽出された、ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１（Ａ）および３１９８−Ｒ１（Ｂ）由来のＯＭＶに対するＩｇＡ抗体の力価の中央値が示されている。エラーバーは、各データセットの四分位範囲を示す。
【図６】図６は、いくつかのＮＴＨｉ菌株およびＰ．ムルトシダ由来のＯＭＶに対するマウス血清中の免疫グロブリン総力価の最大半量を示す図である。  ＩＭ１およびＩＭ２で鼻腔内免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置の未感作マウス（対照、ｃｏ）（各群ｎ＝２０）から３９日目に採取された血清について、ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１（Ａ）、３１９８−Ｒ１（Ｂ）、５６５７（Ｃ）、および７５０２−Ｒ１（Ｄ）、ならびにＰ．ムルトシダＰ４８８１（Ｅ）に対する免疫グロブリン総力価の最大半量の中央値が示されている。エラーバーは、各データセットの四分位範囲を示す。
【図７】図７は、ＩＭ１およびＩＭ２免疫マウス由来の血清におけるＩｇＧ反応性のイムノブロット解析を示す図である。  ＩＭ１（Ａ）およびＩＭ２（Ｂ）およびＰＢＳ処置の未感作マウス（Ｃ）で鼻腔内免疫付与されたマウスから３９日目に採取された血清と共にインキュベートされた、代表的なイムノブロットが示されている。すべてのイムノブロットは、以下に示すようにロードされた：２０１９−Ｒ１のＯＭＶ（１）、２０１９−Ｒ１のＯＭ（２）、および２０１９−Ｒ１のＷＣＬ（３）；３１９８−Ｒ１のＯＭＶ（４）、３１９８−Ｒ１のＯＭ（５）、および３１９８−Ｒ１のＷＣＬ（６）；Ｐ．ムルトシダＰ４８８１のＯＭＶ（７）、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１のＯＭ（８）、およびＰ．ムルトシダＰ４８８１のＷＣＬ（９）。左側の線は標準タンパク質の分子量をｋＤａで示す。
【図８】図８は、ＩＭ１で免疫付与されたマウス由来のプール血清を用いる免疫沈降を示す図である。  Ｋａｎｇ染色されたゲルは、Ｇタンパク質と結合させたＤｙｎａｂｅａｄｓ上に固定化されている、非ワクチン接種対照マウス（ｃｏ）由来の血清抗体、またはＩＭ−１（ＩＰ）で免疫付与されたマウスの血清抗体と、免疫共沈降したＯＭＰを示している。質量分析によりＩＰ試料から同定されたタンパク質は、それらのそれぞれのゲル上の位置、タンパク質のアイデンティティ、および右側に受け入れ番号が示されている。
【図９】図９は、ＮＴＨｉ由来のＯＭＶで免疫付与されたマウスの誘導免疫応答が、鼻咽頭への抗原投与に対して防御されたことを示す図である。  ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１（Ａ）または３１９８−Ｒ１（Ｂ）を用いて抗原投与した、ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置の未感作マウス（対照、ｃｏ）の鼻咽頭から採取されたＣＦＵ／鼻咽頭が示されている。それぞれの円は、１匹のマウスから採取されたＣＦＵを表す。水平のバーは、各データセットの中央値を示す。細菌が採取されなかった場合は、ＣＦＵは検出限界である１０ＣＦＵ／鼻咽頭とした（点線で示す）。感染用量のＣＦＵは、ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１では３．３×１０５〜６．０×１０５ＣＦＵ／マウス、ＮＴＨｉ菌株３１８９−Ｒ１では４．１×１０５〜４．３×１０５ＣＦＵ／マウスであった。
【図１０】図１０は、ＩＭ３免疫マウス由来の血清中のＩｇＧ反応性のイムノブロット解析を示す図である。  ＩＭ３で鼻腔内免疫付与されたマウス（Ａ）およびＰＢＳ処置の未感作マウス（Ｂ）から３９日目に採取された血清と共にインキュベートされた代表的なイムノブロットが示されている。イムノブロットでは、それぞれのレーンに上記のＰ４８８１−Ｒ１のＯＭＶまたはＳＨ７８９のＯＭＶをロードした。左側の線は標準タンパク質の分子量をｋＤａで示す。
【図１１】図１１は、Ｐ．ムルトシダ由来のＯＭＶで免疫付与されたマウスの誘導免疫応答が、鼻咽頭への抗原投与に対して防御されたことを示す図である。  Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１（１０８ＣＦＵ／マウス）を用いて抗原投与した、ＩＭ３で免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置の未感作マウス（対照、ｃｏ）の鼻咽頭から採取されたＣＦＵ／鼻咽頭が示されている。それぞれの円は、１匹のマウスから採取されたＣＦＵを表す。水平のバーは、各データセットの中央値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に実証および説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５６】
１以上のＮＴＨｉ菌株から得られたＯＭＶを含むワクチン
【００５７】
実験の概要
ＮＴＨｉ菌株由来のＯＭＶは、マウスを用いる実験での抗原投与に対して、高レベルの防御をもたらす。具体的に言えば、成熟雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに鼻腔内経路を介してワクチン接種し、初回免疫後、２週間目および再度４週間目に追加免疫を行った。マウスを、以下に示す３群に分類した：第１群は免疫混合物１（ＩＭ１）を投与され、第２群は免疫混合物２（ＩＭ２）を投与され、第３群はワクチン未接種のＰＢＳ処置対照群（未感作）としての役割を果たした。免疫混合物１（ＩＭ１）は単に１種のＮＴＨｉ菌株由来のＯＭＶのみからなるのに対して、免疫混合物２（ＩＭ２）は、ＮＴＨｉ菌株ならびにパスツレラ科のメンバー間の異質性を反映している、３種の多様なＮＴＨｉ菌株由来のＯＭＶ混合物を含有していた。すべての免疫に、アジュバントは使用しなかった。ＯＭＶ抗原に対する血清抗体は、免疫付与されたマウスならびにワクチン未接種の未感作マウスのそれぞれ追加免疫時に酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）およびイムノブロットにより分析した。一般に、両方の免疫群は同程度の強力な免疫応答を誘導したのに対して、未感作マウスは免疫グロブリン力価の増加を示さなかった。両方の免疫群の誘導された免疫応答の程度は同等であったが、イムノブロット解析では特異性のわずかな違いが観察された。ＩＭ２を投与されたマウスは、ＩＭ１を投与されたマウスと比較して、より複雑で多種多様な免疫応答を誘導した。最終追加免疫から１０日後、未感作および免疫マウスの鼻咽頭細菌定着に関して、２種の異なる毒性のＮＴＨｉ菌株を鼻腔内接種により抗原投与した。１つのＮＴＨｉ菌株は、ＩＭ１および部分的にＩＭ２で使用されたＯＭＶのドナー株であるのに対して、もう一方のＮＴＨｉ菌株はＩＭ１またはＩＭ２においてＯＭＶのドナー株としては使用されなかった。従って、免疫マウスの免疫系にとって、第１の菌株は「既知の」抗原を有する菌株を反映し、第２の菌株は「外来」抗原を有する菌株を反映する。すべての鼻腔内免疫マウスが防御された。すなわち、使用されたＮＴＨｉ菌株によって異なるが、中央値は、それぞれの鼻咽頭中１０〜１１５細菌であり、検出可能な細菌定着がないか低レベルであった。これとは対照的に、１００％のワクチン未接種マウスに安定した細菌定着が認められ、中央値は、それぞれの鼻咽頭中３９，０００および４９，５００細菌であった。
【００５８】
材料および方法
細菌株
それぞれＮＴＨｉ菌株２０１９、３１９８、１４７９、９２７４、および７５０２の自然発生ストレプトマイシン耐性（ＳｍＲ）誘導体である２０１９−Ｒ１、３１９８−Ｒ１、１４７９−Ｒ１、９２７４−Ｒ３、および７５０２−Ｒ１、ならびに５６５７を野生型株（ｗｔ）として使用した（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６４：４０４７−５３；  Ｍｕｒｐｈｙ  ａｎｄ  Ａｐｉｃｅｌｌａ，  １９８５，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５０：１５−２１）。これらはすべて、ヒト患者の痰または中耳から単離された臨床株である。ＳｍＲ誘導体は、ストレプトマイシンを添加したＢＨＩ寒天上にそれぞれの菌株の一晩（Ｏ／Ｎ）培養物を植え付けることにより作製した。ＳｍＲ誘導体の使用により、抗原投与実験を含む試験期間中を通して、正の選択が可能であった。各ＳｍＲ誘導体およびそれぞれのドナー株は、それらの外膜およびＯＭＶタンパク質プロファイルを比較したが、明らかな違いは認められなかった（データは示さず）。さらに、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１（ＳｍＲ誘導体  Ｐ４８８１−Ｒ１）を、ウシ肺炎の症例から単離し（Ｒｉｍｌｅｒ，  １９９６，  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｐａｔｈｏｌ  １１４：３４７−６０）、Ｍ．ヘモリチカＳＨ７８９（ＡＴＣＣ：ＢＡＡ−４１０）を、子ウシの肺炎の肺から単離した（テキサス州ヒューストン  ７７０３０、ベイラー医科大学分子ウイルス学および微生物学部  Ｓａｒａｈ  Ｋ．  Ｈｉｇｈｌａｎｄｅｒ氏より親切にも提供）。特に断りのない限り、細菌は、ＮＡＤおよびヘミン溶液（ヘミン、Ｌ−ヒスチジン、およびトリエタノールアミン混合物を含む原液）を添加したＢａｃｔｏ（登録商標）ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ，ＢＤ）培養液または寒天中で、３７℃にて通気しながら増殖させた。添加物は、以下に示す終濃度で用いた：それぞれＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍｌ、ヘミン（Ｆｌｕｋａ）２０μｇ／ｍｌ、Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）２０μｇ／ｍｌ、トリエタノールアミン（Ｍｅｒｃｋ）０．０８％、およびストレプトマイシン（Ｓｍ，Ｓｉｇｍａ）１００μｇ／ｍｌ。
【００５９】
外膜（ＯＭ）、外膜小胞（ＯＭＶ）、および全細胞溶解物（ＷＣＬ）の単離
ＮＴＨｉ菌株またはＰ．ムルトシダから産生されたＯＭＶ、ならびにそれらのＯＭおよびＷＣＬを単離するために、細菌培養液（５００ｍｌのＢＨＩ培養液）に５ｍｌのＢＨＩ静止期一晩培養物を植菌し、後期指数増殖期まで１３時間増殖させた。
【００６０】
ＯＭは、以下に示すように、５００ｍｌの培養物の１０ｍｌから単離した。細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ５８１０Ｒ遠心分離機およびＡ−４−８１ローターを用いて、遠心分離（４０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により採取した。ペレットは、Ｈｅｐｅｓバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ）中で１回洗浄し、最終的には、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ、コンプリート、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル、１錠剤／５０ｍｌ）と共に、１ｍｌのＨｅｐｅｓバッファーに再懸濁させた。Ｂｒａｎｓｏｎソニファイアー２５０を用いて、６×１０秒間の超音波処理により細胞を破壊した。破壊されなかった細胞は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４１５Ｒ（２分間、１３０００ｒｐｍ、４℃）で遠心分離により除去し、ＯＭタンパク質を含む上清を新しいチューブに移して、再度遠心分離を行った（３０分間、１３０００ｒｐｍ、４℃）。ペレットは、１％サルコシルを含有する０．８ｍｌのＨｅｐｅｓバッファーに再懸濁し、３０分間インキュベートした。遠心分離後（３０分間、１３０００ｒｐｍ、４℃）、ペレットは、０．５ｍｌのＨｅｐｅｓバッファー中で１回洗浄し、最終的には、５０μｌのＨｅｐｅｓバッファー中に再懸濁した。
【００６１】
並行して、上記のＯＭの単離と同様に超音波処理により、ＷＣＬを調製した。破壊されなかった細胞を遠心分離により除去後、残った上清をＷＣＬとして供した。
【００６２】
ＯＭＶは、残りの５００ｍｌの培養物から単離した。細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｖａｎｔｉ  Ｊ−２６  ＸＰ遠心分離機およびＪＡ−１０ローターを用いて、２つの連続する遠心分離ステップ（６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃および９５００ｒｐｍ、６分間、４℃）によりペレットとした。上清は、０．４５μｍおよび０．２μｍ孔径のフィルター（Ｎａｌ−ｇｅｎｅ、１５６−４０４５および１５６−４０２０）を用いて連続して濾過し、残存する細菌を完全に除去した。生存細菌の不在を確認するために、２００μｌの濾液をＢＨＩ寒天プレートに植菌し、３７℃にて４８時間インキュベートして、コロニーを調べた。コロニーは観察されなかった。この濾液を４℃にて貯蔵した。それから２日間のうちに、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｏｐｔｉｍａ  Ｌ−１００ＸＰ超遠心分離機およびＳＷ３２Ｔｉローターを用いる超遠心分離（４時間、２９０００ｒｐｍ、４℃）により、濾液からＯＭＶを精製し、約１５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた。
【００６３】
ＯＭ、ＯＭＶおよびＷＣＬのタンパク質濃度は、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ７３０分光光度計とＴｒａｙＣｅｌｌ（Ｈｅｌｌｍａ）を組み合わせた２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの吸光度の光度測定、およびＷａｒｂｕｒｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎの方程式を用いて決定した。ＯＭＶ溶液は、ＰＢＳを用いて２．５μｇ／μｌに調整し、−７０℃にて貯蔵した。
【００６４】
ＯＭおよびＯＭＶタンパク質の比較
ＯＭＶのタンパク質含量がある程度はＯＭのタンパク質含量を反映しているかを判定するために、我々はＮＴＨｉ菌株およびＰ．ムルトシダ由来のＯＭおよびＯＭＶのタンパク質プロファイルを比較した。ＯＭタンパク質またはＯＭＶは、上記のように単離した。それぞれＯＭＶまたはＯＭ試料４μｇに等しい容量を、２μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（５５ｍｇ／ｍｌ  ＳＤＳ、２０．５ｍｇ／ｍｌ  ＥＤＴＡ、８．５ｍｇ／ｍｌ  ＮａＨ２ＰＯ４×２Ｈ２Ｏ、９２．５ｍｇ／ｍｌ  ＤＴＴ、２５％グリセロール、０．１％ブロムフェノールブルー、ｐＨ７．２）と混合し、それぞれＯＭＶの場合はＰＢＳ、ＯＭの場合はＨｅｐｅｓを用いて１０μｌに調整した。次に試料を１０分間ボイルし、最終的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％）にロードして電気泳動により分離した（Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  Ｔｅｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｒａｄ）。染色済み広範囲タンパク質マーカー（ＮＥＢ）を分子量標準とした。タンパク質バンドは、Ｋａｎｇ染色液（０．０２％クーマシーブルーＧ−２５０、５％硫酸アルミニウム、１０％ＥｔＯＨ、２％リン酸）で可視化した。
【００６５】
ＯＭＶの安定性
精製されたＯＭＶ中のタンパク質の安定性を試験するために、１５μｌのＯＭＶを−７０℃、＋２５℃、または＋３７℃でインキュベートした。９日後、各試料４μｇに等しい容量を、２μｌの５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファーと混合し、ＰＢＳを用いて１０μｌに調整し、１０分間ボイルし、最終的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードして電気泳動により分離した（Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ  Ｔｅｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｉｏｒａｄ）。タンパク質バンドは、Ｋａｎｇ染色液で可視化した。
【００６６】
ＯＭＶを用いる免疫付与
すべての実験においてＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。すべての免疫付与前に、マウスを２．５％イソフルランガス吸入により麻酔した。９週齢の雌性マウスを、０、１４および２８日目に、鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路を介して、すべての免疫付与に関して１０μｌのＰＢＳ中２５μｇ（５μｌ／鼻孔）のＯＭＶで免疫付与した。対照的に、非ワクチン接種対照マウス（未感作）は、実験期間中を通して、単にＰＢＳのみを投与し、ワクチン接種マウスと並行して収容した。血液は、片側尾静脈の切り傷から０、１４、および２８日目に採取し、３９日目には心臓穿刺により採取した。加えて、糞塊は３９日に採取した。
【００６７】
血清および糞塊抽出物ならびに調製
血清を得る目的で、採取した血液を室温にて３０分間放置して凝固させ、その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４１５Ｄ（１０分間、４５００ｒｐｍ）で遠心分離して血塊を除去し、血清を単離した。上清を除去し、ＰＢＳ中で４倍希釈した。終濃度０．０２％となるようにアジ化ナトリウムを添加した後、血清を−７０℃にて貯蔵した。
【００６８】
それぞれのマウスの、３〜５個の排泄したての糞塊を、Ｓａｖａｎｔ  ＳｐｅｅｄＶａｃ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒを用いて１０分間真空乾燥し、それらの重量を記録した。糞便１００ｍｇあたり１ｍｌの抽出バッファー（ＰＢＳ、０．０１％アジ化ナトリウム、５％ウシ胎仔血清、コンプリート、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）１錠／１０ｍｌ）を加え、その試料を４℃にて１５分間ボルテックスすることにより、Ｉｇを抽出した。固形物は遠心分離（２分間、１３,０００ｒｐｍ、４℃）により分離し、上清を−７０℃で貯蔵した。
【００６９】
ＥＬＩＳＡによる、誘導された免疫応答の量の解析
２０１９−Ｒ１および３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対するＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＭアイソタイプ抗体を、基本的に従前に記載されたように、９６ウェルＥＬＩＳＡマイクロプレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を用いてＥＬＩＳＡにより測定した（Ｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７：４７２−８４；  Ｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：４５５４−６３）。プレートは、ＯＭＶと共に（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）４℃にて一晩インキュベートすることにより、コーティングした。各アイソタイプについて標準曲線を作成するために、プレートを、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌから始まる、適切に精製されたマウスＩｇアイソタイプ標準（ＩｇＡ、ＩｇＧ１、またはＩｇＭ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の２倍希釈液を用いて、ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅでコーティングした。ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）を用いて４回洗浄した後、非特異的結合部位をＰＢＳ中１０％加熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（ＰＢＳ−Ｆ）で室温にて１時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｆ中１：１００（糞塊抽出物）または１：４００（血清）から始まる被験試料の適切な５倍希釈液を、ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅでＯＭＶ被覆ウェルに注ぎ、一方、ＰＢＳ−Ｆはアイソタイプ標準でコーティングしたウェルに使用した。
【００７０】
プレートを室温にて１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した。次に、プレートを、マウスＩｇＡ（α鎖特異的、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＩｇＧ１（γ１鎖特異的、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはＩｇＭ（μ鎖特異的、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に対する適当なセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄した後、使用説明書に従って、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて発色させ、１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を停止液として用いた。４５０ｎｍにおいて、Ｆｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｍｅｇａプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）で光学濃度を読み取った。力価は、被験試料の適当な希釈液の値、およびアイソタイプ標準の少なくとも４つの希釈液から計算したｌｏｇ−ｌｏｇ回帰を用いて計算した。
【００７１】
２０１９−Ｒ１、３１９８−Ｒ１、５６５７、および７５０２−Ｒ１、ならびにＰ．ムルトシダＰ４８８１由来のＯＭＶに対する総Ｉｇ力価（ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）の最大半量は、上記のようにＥＬＩＳＡにより決定したが、例外としてマウス（ＩｇＭ＋ＩｇＧ＋ＩｇＡ、Ｈ＋Ｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）に対するセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合アフィニティー精製ヤギ抗体を二次抗体として用い、Ｉｇ標準は使用せず、力価を計算するために１：１００から開始して少なくとも４回の５倍希釈を用いた。最大半量力価は、最大光学濃度の２分の１を与える逆数を決定するために、マウス血清の希釈倍数の逆数のｌｏｇのプロットのＳ字状ラインの解と、得られた吸光度を用いて計算した。
【００７２】
イムノブロットによる、誘導された免疫応答の質の解析
ワクチン接種マウスおよび未感作マウスの抗体応答を、ＴＥ  ２２  Ｍｉｇｈｔｙ  Ｓｍａｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｈｏｒ電気泳動ユニット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるイムノブロットにより解析した。ＯＭＶおよびＯＭ試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥを上記のように行い、続いてＣＡＰＳバッファー（１０ｍＭ  ＣＡＰＳ、１０％メタノール、ｐＨ１１）を用いてＨｙｂｏｎｄ（登録商標）−Ｃニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にタンパク質を転写した。転写後、膜をＴＢＳ（１Ｌ中、２０ｍｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、３０ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ）中で２回１０分間洗浄し、次にＴＢＳ中１０％粉乳（Ｒｏｔｈ）の中で室温にて２時間インキュベートすることにより、膜をブロッキングした。一次抗体として使用するために、ＴＢＳ中１０％粉乳でマウス血清を１：５００希釈した。希釈血清を膜に添加し、４℃にて一晩、ロッカー上でインキュベートした。この膜を、ＴＢＳ−ＴＴ（１Ｌ中、２０ｍｌ  １Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１００ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍｌ  Ｔｒｉｔｏｎ、５００μｌ  Ｔｗｅｅｎ−２０）中で２回、およびＴＢＳ中で１回、それぞれ１０分間ずつ洗浄した。洗浄後、この膜をＴＢＳ中１０％粉乳中ヤギ由来のセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｄｉａｎｏｖａ）を用いて、二次抗体溶液中で１時間インキュベートした。その膜をＴＢＳ−ＴＴ中で４回、およびＴＢＳ中で１回、それぞれ１０分間ずつ洗浄した。Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ（登録商標）ＷｅｓｔｅｒｎＣ（登録商標）キット（Ｂｉｏｒａｄ）、およびＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアと組み合わせたＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳシステム（Ｂｉｏｒａｄ）中での暴露を用いて化学発光検出を行った。
【００７３】
免疫沈降
免疫沈降は、使用説明書に従い、ダイナビーズ（登録商標）Ｇタンパク質免疫沈降キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行った。マウスに特異的なばらつきを避けるために、ＩＭ−１で免疫付与された１０匹のマウスから３９日目に採取した血清をプールし、この混合物の１６μｌをビーズへの抗体の結合のために用いた。１０匹の非ワクチン接種対照マウスから３９日目に採取したプール血清の１６μｌを、陰性対照とした。菌株２０１９−Ｒ１由来の１００μｌのＯＭＰ調製物（２μｇ／μｌ）を抗原として使用した。免疫沈降物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、質量分析により分析した。
【００７４】
抗原投与による防御誘導免疫応答の解析
最初に、安定した鼻咽頭細菌定着を得るために必要な感染用量を決定する目的で、純粋なコロニーを得るためにそれぞれのＮＴＨｉ菌株（２０１９−Ｒ１または３１９８−Ｒ１）をＢＨＩ寒天プレート上に画線し、３７℃にて一晩増殖させた。約６０個のコロニーをＢＨＩ培養液に再懸濁し、一晩増殖させた。翌日、この前培養物を４９０ｎｍの最終光学濃度（ＯＤ４９０）が０．１となるよう３ｍｌの新鮮なＢＨＩ培養液中に逆希釈（ｂａｃｋｄｉｌｕｔｅｄ）し、ＯＤ４９０＝１となるまで約４〜５時間増殖させた。細胞はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機５４１５Ｄ（５分間、５０００ｒｐｍ）を用いて採取し、ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＯＤ４９０＝１．１（約１×１０９ＣＦＵ／ｍｌに相当）に調整した。
【００７５】
次に、ＰＢＳ中１：１０希釈液を調製した。第１の１：１０希釈液をＰＢＳと１：１で混合し、感染混合物を得た（約５×１０７ＣＦＵ／ｍｌ）。並行して、ストレプトマイシンを添加したＢＨＩプレートに適当な希釈物を植菌し、３７℃で２日間インキュベートして、最初の懸濁液および感染混合物を逆算することによりＣＦＵ／ｍｌを決定した。
【００７６】
２．５％イソフルランガス吸入によりマウスを麻酔し、感染混合物１０μｌ（５μｌ／鼻孔）を用いて、約５×１０５ＣＦＵを鼻腔内接種した。
【００７７】
２４時間後、欧州委員会第１１総局の安楽死のための勧告（Ｃｌｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｕｔｈａｎａｓｉａ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｉｍａｌｓ：  Ｐａｒｔ  １．  ＤＧＸＩ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  ３０：２９３−３１６；  Ｃｌｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｅｕｔｈａｎａｓｉａ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｎｉｍａｌｓ：  Ｐａｒｔ  ２．  ＤＧＸＴ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ．  Ｌａｂ  Ａｎｉｍ  ３１：１−３２）および「科学・研究省（Ｂｕｎｄｅｓｍｉｎｉｓｔｅｒｉｕｍ  ｆｕｒ  Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ  ｕｎｄ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ）」ＲｅｆＩＩ／１０ｂにより承認された、付随する動物プロトコール（３９／１５８  ｅｘ  ２０００／１０）に従い、苦痛を最小限にする方法でマウスを屠殺した。各マウスの鼻咽頭を解剖により切除し、機械的にホモジナイズした（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅａｒｏｒ，Ｂｉｏｓｐｅｃ）。ホモジナイズされた鼻咽頭の適当な１：１０希釈液をＢＨＩ培養液中で作製し、ＢＨＩ＋ストレプトマイシンプレート上でのコロニー計数のために植菌した。すべてのマウスは飼料および水を自由摂取できるよう収容し、受け入れ機関の部門の規則に従い、専従職員の保護下においた。
【００７８】
結果
図１に、様々なＮＴＨｉ菌株ならびにＰ．ムルトシダＰ４８８１由来のＯＭＶおよびＯＭのタンパク質プロファイル解析の結果を示す。精製されたＯＭＶと同じ菌株から単離されたそれぞれのＯＭのタンパク質レベルでの直接的な比較から、解析されたすべての菌株に関して、同様のパターンが明らかとなった。このことは、ＯＭに豊富に含まれるタンパク質はまた、ＯＭＶにも存在することを示している。ＯＭＶの一部のバンドは、ＯＭと比較して圧倒的に多いか、または圧倒的に少ない。そのような濃縮または排除は、これまで他の細菌でも観察されており、少なくとも一部のタンパク質に関する選別メカニズムを示唆している（Ｋｕｅｈｎ  ａｎｄ  Ｋｅｓｔｙ，  ２００５，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １９：２６４５−５５；  Ｍａｓｈｂｕｒｎ−Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅｌｅｙ，  ２００６，  Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６１：８３９−４６）。さらに、ＯＭＶはまた、外膜タンパク質とともに周辺質タンパク質も含む。従って、ＯＭと比較してＯＭＶにおいてより多くのタンパク質が検出されるのは当然のことである。要約すると、試験したすべての菌株はかなりの量のＯＭＶを培養上清中に放出する。これらのＯＭＶは、遠心分離および濾過による前述の確立されたプロトコールを用いて単離することができる。
【００７９】
精製されたＯＭＶ中のタンパク質の安定性を試験するために、発明者らはＯＭＶを−７０℃、＋２５℃、または＋３７℃でインキュベートした。パスツレラ科ＯＭＶの代表として、菌株２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶを再度選択した。９日後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでＫａｎｇ染色による可視化を行った。図２に示されるように、すべての３つの試料のタンパク質バンドはパターンおよび強度が同等であり、これは９日間試験したすべての条件下で安定であることを意味している。明らかな分解は観察されなかった。従って、単離されたＯＭＶは非常に安定であり、パスツレラ科ＯＭＶに基づくワクチンの貯蔵、配送、および管理のための低温流通体系は必要とされないであろう。
【００８０】
同じ菌株由来のＯＭＶおよびＯＭのタンパク質プロファイルは非常に類似しているにもかかわらず、様々なＮＴＨｉ菌株のＯＭＶおよびＯＭのタンパク質プロファイルの比較から、タンパク質組成の異質性が明らかとなった（図１）。この多様性はまた、他の研究者によっても実証され、ＮＴＨｉ菌株の血清型決定システムの基礎として用いられた（Ｍｕｒｐｈｙ  ａｎｄ  Ａｐｉｃｅｌｌａ，  １９８５，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ５０：１５−２１）。複数のＮＴＨｉ菌株に対する広域性スペクトルワクチンの開発のためには、観察された抗原性の異質性は未解決の課題である。これまで、理想のワクチン候補物質の特定には、ＮＴＨｉ菌株の大多数に存在する、保存されたタンパク質の探索および使用に焦点を当ててきた。本発明におけるアプローチは異なっている。本発明のアイデアは、全細菌表面を免疫系に提示することにより、ＮＴＨｉ異質性の複雑さを模倣することである。発明者らは、免疫混合物１（ＩＭ１）で使用されるＯＭＶの唯一のドナー株として菌株２０１９−Ｒ１を選択した。この分離株は、公知のＬＯＳ構造を有する、最もよく特徴付けられているＮＴＨｉ菌株のひとつであり、様々な試験において広範囲にわたり用いられている（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３５：１−１０；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３：８１８−２４；  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：４５１５−２６；  Ｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６８：４５９３−７）。異種ＮＴＨｉ菌株由来のＯＭＶをさらに混合すれば、ワクチンの抗原−複雑性を増加させることができる。従って、発明者らは３つのＮＴＨｉ菌株を、免疫混合物２（ＩＭ２）で使用するＯＭＶのドナーとして選択した。ドナー株は、ＩＭ１にも使用された菌株２０１９−Ｒ１、ならびに菌株１４７９−Ｒ１および９２７４−Ｒ３であった。すべての３つの菌株由来の精製ＯＭＶを等量混合してＩＭ２を調製した。要約すると、ＩＭ１はＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１だけのＯＭＶを含有する一方で、ＩＭ２は２０１９−Ｒ１、１４７９−Ｒ１、および９２７４−Ｒ３由来のＯＭＶの混合物を含有していた。発明者らは、材料および方法に記載のとおり、ＩＭ１またはＩＭ２を鼻腔内投与してマウスに免疫を付与した。実験期間中を通して、ＰＢＳ処置対照群（未感作）を並行して収容した。血清中の抗体力価は、免疫付与期間前（０日目）、期間中（１４および２８日目）、および期間後（３９日目）の４つの時点でモニターした。２０１９−Ｒ１または３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対する各免疫付与群の一時的なＩｇＡ、ＩｇＧ１、およびＩｇＭの応答を、それぞれ図３および４に示す。２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶはＩＭ１およびＩＭ２に存在しているために、これは両方の免疫群における「既知の」抗原に対する免疫応答を反映している。対照的に、ＮＴＨｉ菌株３１９８−Ｒ１またはそのＯＭＶのいずれもが免疫マウスに提示されたことがないために、これは「外来」抗原に対する免疫応答を反映している。０日目において、２０１９−Ｒ１および３１９８−���１由来のＯＭＶに対するアイソタイプ特異的抗体力価の中央値は、全てのマウスにおいて同等に低レベルであった。０日目および３９日目に、ＰＢＳ処置対照マウス（未感作）の血清中の抗体力価をモニターしたが、この群において、全試験期間中、試験したすべてのアイソタイプに関して、力価に有意な変化はなかった。両方の免疫群に関して、ＩｇＡおよびＩｇＧ１の抗体力価の中央値はワクチン接種期間中に増加し、２８日目または３９日目に最も高レベルとなった。いずれの免疫付与群においても、ＩｇＡまたはＩｇＧ１力価の中央値の有意な減少は認められなかった。ＩｇＭ力価の中央値は、１４日目または２８日目にすべての免疫付与群でピークに達し、その後に続いてわずかに減少し、これはアイソタイプスイッチングによる可能性が最も高い。ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与されたマウスは、２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶに対するＩｇＧ１およびＩｇＭに関して同等の免疫応答を示した（図３のＢおよびＣ）。２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶに対するＩｇＡ力価のみは、２８日目および３９日目においてＩＭ２群と比較してＩＭ１群が高レベルとなり、両方の免疫群間で有意差がみられた（図３Ａ、ｐ値＜０．０５、両方の時点に対してＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を使用）。対照的に、すべての３種のアイソタイプの３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対する誘導レベルは、１４日目から実験終了時まで、ＩＭ１と比較してＩＭ２群で有意に高かった（図４Ａ−Ｃ、ｐ値＜０．０５、すべての時点に対してＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を使用）。
【００８１】
さらに、誘導された粘膜免疫応答について調べた。一般に、ＮＴＨｉに対して分泌された抗体の濃度は、ＰＢＳを用いる鼻腔洗浄、または唾液分泌を引き起こすピロカルピンの注射後の唾液採取のいずれかにより得られる体液から分析する（Ｂｅｒｔｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４，  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  １８９：１３０４−１２；  Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３，  ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３５：１−１０）。しかしながら、後に明らかになるように、すべてのマウスは抗原投与実験に使用され、ＮＴＨｉを鼻腔内接種されていた。おそらく、もし鼻腔洗浄およびピロカルピン注射を行えば、鼻咽頭細菌定着が妨げられるであろう。粘膜免疫応答を反映するＩｇＡ抗体はまた、糞便中にも見出され得ること、および糞便中のＩｇＡレベルは唾液中のそれと相関することが以前からわかっている（Ｈｉｒａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  １０７：１３１−９；  Ｓｃｈｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７７：４７２−８４；  Ｖｅｔｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２１５：１６３−７２）。従って発明者らは、誘導された粘膜免疫応答を測定するために、両方の免疫群およびＰＢＳ処置対照マウスから、３９日目に糞塊を採取し、分泌された抗体を抽出した。ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置対照マウス由来の糞便抽出物中のＩｇＡ力価を、図５ＡおよびＢに示す。対照マウスの糞便試料中からは、２０１９−Ｒ１および３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対して分泌されたＩｇＡは、低レベルでしか検出されなかった。両方の免疫群は、対照マウスと比較して、２０１９−Ｒ１および３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対する糞便ＩｇＡ力価の中央値がより高かった。２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶに対するＩｇＡ力価の最も高い中央値は、ＩＭ１で免疫付与されたマウスにおいて検出され、一方、ＩＭ２で免疫付与されたマウスは３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対し、最も高いＩｇＡ力価中央値を示した。この傾向は、図３および４に示されたアイソタイプ特異的抗体力価の結果と一致している。
【００８２】
さらに、両方の免疫群のマウスおよびＰＢＳ処置対照マウスから３９日目に採取された血清中の総Ｉｇ力価の最大半量（図６）を測定した。これは、種々の多様なＮＴＨｉ菌株（図６Ａ〜Ｄ）ならびにＰ．ムルトシダ（図６Ｅ）由来のＯＭＶに対して誘導された免疫応答の解析を可能にする。すべての場合において、ＩＭ１またはＩＭ２で免疫付与されたマウスの総Ｉｇ力価の最大半量は、ＰＢＳ処置対照マウスよりも有意に高かった（ｐ値＜０．０５、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定およびＤｕｎｎの多重比較（事後検定）を使用）。アッセイで抗原として用いられたＯＭＶの起源によって、免疫マウスの総Ｉｇ力価の最大半量レベルは、対照群と比較して、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１の１０倍から最大で２０１９−Ｒ１または３１８９−Ｒ１の１０００倍の範囲であった。アイソタイプ特異的免疫応答で観察されたように、２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶに対する総Ｉｇ力価の最大半量は、ＩＭ１で免疫付与されたマウスにおいてわずかに高い一方、ＩＭ２で免疫付与されたマウスは、３１９８−Ｒ１由来のＯＭＶに対して有意に高い力価を示した。ＩＭ２中の２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶ総量は、ＩＭ１と比較して３分の１であったことを忘れてはならない。従って、ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与された（ｉｍｍｕｎｉｃｅｄ）マウスの、２０１９−Ｒ１由来のＯＭＶによりもたらされた「既知の」抗原に対する総Ｉｇ力価の最大半量がほとんど同じであることは、ＯＭＶ混合物の投与が、抗原認識および免疫応答の誘導のために不利にはならないことを明らかに実証している。ＩＭ１またはＩＭ２で免疫付与されたマウスの、ＮＴＨｉ菌株５６５７および７５０２−Ｒ１ならびにＰ．ムルトシダＰ４８８１由来のＯＭＶに対する総Ｉｇ力価の最大半量は同等であった。
【００８３】
要約すると、ＥＬＩＳＡの結果から、両方の免疫群において、パスツレラ科のメンバーに対する強力かつ複雑な、液性および粘膜免疫応答の誘導が実証された。様々な分離株由来のＯＭＶの複雑な混合物を、単一のドナー由来のＯＭＶと比較した場合、誘導された免疫応答の量には負の効果は認められなかった。
【００８４】
抗体応答の特異性を試験するために、ＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１および３１９８−Ｒ１ならびにＰ．ムルトシダＰ４８８１由来のＯＭＶ、ＯＭおよびＷＣＬを抗原として用いるイムノブロットを行った。図７は、ＩＭ１（図７Ａ）、ＩＭ２（図７Ｂ）で免疫付与された、またはＰＢＳ処置対照群の（図７Ｃ）、１匹のマウスから３９日目に採取した血清を用いる代表的なイムノブロットを示す。ＰＢＳ処置対照マウスの血清を用いるイムノブロット上では、バンドは検出されなかったが、免疫付与されたマウスの血清では、試験されたすべての菌株のＯＭＶ、ＯＭおよびＷＣＬタンパク質プロファイルにおいて様々なバンドが検出された。これは、免疫付与のためのＩＭ１およびＩＭ２において用いられているＯＭＶは抗原として機能し得る多くのタンパク質を含んでいることを明らかに実証している。一般に、最も反応性の高いバンドは、ＮＴＨｉでは約５０、３５、２５、および１５ｋＤａ、ならびにＰ．ムルトシダでは３５および２５ｋＤａに位置している。ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与されたマウスにおいて誘導された免疫応答の様々な特異性は、様々な菌株由来のＯＭＶをロードしたレーンの比較により明らかとなる（図７ＡおよびＢ、レーン１、４、および７）。これらのレーンは、各菌株の、表面に露出された抗原を反映している。ＯＭＶ混合物を含有するＩＭ２で免疫付与されたマウス由来の血清を用いてインキュベートされたイムノブロットを示すパネルＢでは、より多くのバンドが可視化されている。このことは、ＩＭ１で免疫付与されたマウスと比較して、ＩＭ２で免疫付与されたマウスにおける多種多様な異種抗原に対する、より複雑な免疫応答を示唆している。従って、様々な異種抗原をもたらす様々な分離株由来のＯＭＶの混合物は、広域性スペクトルのワクチンの開発に有利である。総Ｉｇ力価の最大半量の結果と一致して、両方の免疫群の免疫マウスはまた、パスツレラ科の他のメンバー、例えばＰ．ムルトシダなどに対する免疫応答も誘導した。当然ながら、Ｐ．ムルトシダに対して誘導された免疫応答は、ＮＴＨｉに対する応答と比較して弱く、より単純であるが、この制限は、免疫混合物の中にＰ．ムルトシダ由来のＯＭＶを含めることで克服することが可能である。
【００８５】
ＮＴＨｉのＯＭＶのいくつかの免疫原性タンパク質を同定するために、発明者らはＩＭ１免疫マウスから３９日目に採取された血清を抗体として、またＮＴＨｉ菌株２０１９−Ｒ１のＯＭ調製物を標的化抗原として免疫沈降解析を行った。非ワクチン接種対照マウスの血清を陰性対照とした。免疫沈降の相当するＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを図９に示す。約５０ｋＤａにおける重鎖マウス免疫グロブリン移動を除いては、すべての他のタンパク質バンドは、非ワクチン接種対照マウスと比較して、免疫マウス由来の血清を用いる免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉａｔｉｏｎ）において、より強い強度で出現した。最も強度の強いタンパク質バンドを切り取り、質量分析に供した。この分析により、図８に示されたゲル中にそれぞれの位置が示されている、７つの免疫原性タンパク質が解明された。とりわけ、防御表面抗原Ｄ１５ならびにＯＭＰであるＰ２、Ｐ５およびＰ６が、ＯＭＶに基づくこのＮＴＨｉワクチン候補物質の重要な抗原であると同定された。
【００８６】
ＮＴＨｉを用いる細菌定着に対して、ＯＭＶを用いる免疫付与がそれを防御するかどうかを判定するために、免疫マウスの鼻腔内に抗原投与を行い、２４時間後の鼻咽頭における細菌定着の程度により、防御レベルを測定した。発明者らは、「既知の」抗原を有する菌株の代表である２０１９−Ｒ１、および「外来」抗原を有する菌株の代表である３１９８−Ｒ１を再度使用した。以前の実験では、約１０４ＣＦＵの感染用量の両方のＮＴＨｉ菌株は、安定した細菌定着をもたらすことがすでに実証されている（データは示さず）。ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与されたマウスならびにＰＢＳ処置対照マウスに、感染用量よりも５０倍高い約５×１０５ＣＦＵ／マウスを用いて抗原投与した。２０１９−Ｒ１および３１８９−Ｒ１を用いる抗原投与の結果を、図９Ａおよび９Ｂにそれぞれ示す。すべてのＰＢＳ処置対照マウスは、安定に細菌定着し、細菌定着中央値は約４×１０４ＣＦＵ／鼻咽頭であった。対照的に、両方の免疫群の鼻腔内免疫マウスは、細菌定着の減少またはＣＦＵ回収不能により示される、有意な防御を示した。すべての例において、免疫マウスの細菌定着中央値は１．２×１０２より低く、対照マウスと比較して少なくとも３００分の１であった。従って、ＩＭ１およびＩＭ２で免疫付与されたマウスは、ＮＴＨｉ感染に対する防御免疫応答を誘導した。
【００８７】
要約すると、パスツレラ科のメンバーはＯＭＶを放出し、様々な分離株由来のＯＭＶは、ＩＭ２を投与されたマウスの非常に有効な免疫付与により実証されるように、不利益なく免疫付与のために組み合わせることができる。
【実施例２】
【００８８】
Ｐ．ムルトシダから得られたＯＭＶを含むワクチン
【００８９】
材料および方法
細菌株
パスツレラ科のメンバー由来のＯＭＶの、免疫原性の可能性をさらに確認するために、Ｐ．ムルトシダ菌株Ｐ４８８１の自然発生ストレプトマイシン耐性（ＳｍＲ）誘導体であるＰ４８８１−Ｒ１を使用した（Ｒｉｍｌｅｒ，  １９９６，  Ｊ  Ｃｏｍｐ  Ｐａｔｈｏｌ  １１４：３４７−６０；  Ｅｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １１４：３０４−３１７）。Ｐ４８８１はウシ肺炎の症例から単離された臨床株である。
【００９０】
実施例１に記載のように、ＳｍＲ誘導体は、ストレプトマイシンを添加したＢａｃｔｏ（登録商標）ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ，ＢＤ）寒天上にそれぞれの菌株の一晩（Ｏ／Ｎ）培養物を植え付けることにより作製し、試験を通して正の選択をできるようにした。ＳｍＲ誘導体およびそれぞれのドナー株の外膜およびＯＭＶタンパク質プロファイルを比較し、自然発生ストレプトマイシン耐性分離株の作製による明らかな差異がないことを確認した（データは示さず）。加えて、交差反応性免疫応答を判定するために、Ｍ．ヘモリチカ菌株ＳＨ７８９を使用した（Ｇｉｏｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８８：７２５７−７２６６）。Ｐ．ムルトシダおよびＭ．ヘモリチカは、ＮＡＤ（Ｓｉｇｍａ）１０μｇ／ｍｌ、およびヘミン（Ｆｌｕｋａ）２０μｇ／ｍｌを添加したＢＨＩ培養液またはＢＨＩ寒天中で、３７℃にて通気しながら増殖させた。
【００９１】
外膜（ＯＭ）、外膜小胞（ＯＭＶ）、および全細胞溶解物（ＷＣＬ）の単離、ならびにＯＭおよびＯＭＶタンパク質の比較
Ｍ．ヘモリチカからのＯＭＶ、ＯＭおよびＷＣＬの単離、ならびにＳＤＳ−Ｐａｇｅを用いるそれらの比較を、ＮＴＨｉおよびＰ．ムルトシダ菌株のための実施例１に記載の通りに行った。
【００９２】
ＯＭＶを用いる免疫付与
ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｕｌｚｆｅｌｄ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いる免疫付与試験は、基本的に、ＮＴＨｉ菌株由来のＯＭＶを用いる免疫付与のための実施例１に記載の通りに行った。９週齢の雌性マウスを、０、１４および２８日目に、すべての免疫付与に関して１０μｌのＰＢＳ中２５μｇ（５μｌ／鼻孔）のＰ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１由来のＯＭＶで、鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路を介して免疫付与した。対照的に、非ワクチン接種対照マウス（未感作）には、実験期間中を通して単にＰＢＳのみを投与し、ワクチン接種マウスと並行して収容した。血液は、片側尾静脈の切り傷から０、１４、および２８日目に採取し、３９日目には心臓穿刺により採取した。
【００９３】
血清の調製
血清試料は、実施例１に記載の通りに調製した。
【００９４】
イムノブロットによる、誘導された免疫応答の質の解析
イムノブロット解析は、実施例１に記載の通りに行った。
【００９５】
抗原投与による防御誘導免疫応答の解析
実施例１に記載の通り、感染混合物１０μｌ（５μｌ／鼻孔）を用いて、マウスに約１０８ＣＦＵのＰ．ムルトシダを鼻腔内接種した。抗原投与実験、鼻咽頭（ｎａｓｏｐａｈｒｙｎｘ）の調製、および細菌定着の検出を、実施例１に記載の通りに行った。
【００９６】
結果
精製されたＯＭＶと、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１およびＭ．ヘモリチカから単離されたそれぞれのＯＭのタンパク質レベルでの直接的な比較から、解析された両方の菌株に関して、同様のパターンが明らかとなった。上述したように、試験した両方の菌株は培養上清中にかなりの量のＯＭＶを放出し、それらは遠心分離および濾過による前述の確立されたプロトコールを用いて単離することができる。Ｐ．ムルトシダのＯＭＶによる免疫付与が、強力な免疫応答の誘導ももたらすかどうかを試験するために、発明者らは免疫付与混合物ＩＭ３に使用されるＯＭＶのドナーとしてＰ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１を選択した。
【００９７】
発明者らは、これらのマウスから３９日目に採取した血清の、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１およびＭ．ヘモリチカＳＨ７８９由来のＯＭＶに対する免疫応答を、イムノブロットにより解析した。Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１由来のＯＭＶは、ＩＭ３中に存在し、「既知の」抗原に対する免疫応答を反映している。対照的に、Ｍ．ヘモリチカ由来のＯＭＶは免疫マウスに提示されたことがなく、「外来」抗原に対する免疫応答を反映している。図１０は、ＩＭ３で免疫付与した（図１０Ａ）、またはＰＢＳ処置対照群の（図１０Ｂ）、１匹のマウスから３９日目に採取した血清を用いる代表的なイムノブロットを示す。ＰＢＳ処置対照マウスの血清を用いるイムノブロットでは、バンドは検出されなかった。対照的に、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１のＯＭＶタンパク質プロファイルでは様々なバンドが、またはＭ．ヘモリチカＳＨ７８９菌株のＯＭＶタンパク質プロファイルでは少なくとも１つの主要なバンドが検出される。このことは、免疫付与のためにＩＭ３で使用されているＯＭＶが、Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１およびＭ．ヘモリチカＳＨ７８９のＯＭＶに存在する抗原との交差反応性を誘導することを実証している。
【００９８】
Ｐ．ムルトシダＰ４８８１−Ｒ１の細菌定着に対して、ＩＭ３を用いる免疫付与がそれを防御するかどうかを判定するために、免疫マウスおよびＰＢＳ処置マウスの鼻腔内に抗原投与を行い、２４時間後の鼻咽頭における細菌定着の程度により、防御レベルを測定した。抗原投与の結果をそれぞれ図１１に示す。すべてのＰＢＳ処置対照マウスは安定に細菌定着し、細菌定着中央値は約１０５ＣＦＵ／鼻咽頭であった。対照的に、両方の免疫群の鼻腔内免疫マウスは、細菌定着中央値が１０３より低いという細菌定着の減少により示される、有意な防御を示した。従って、免疫マウスは対照マウスと比較して少なくとも１００分の１より低い細菌定着を示し、これはＰ．ムルトシダに対する防御免疫応答が誘導されたことを示している。
【００９９】
要約すると、イムノブロットおよび抗原投与実験の結果から、パスツレラ属およびマンヘミア属に関して本明細書に実証されている、パスツレラ科のメンバーに対する強力かつ防御的な免疫応答の誘導が確認された．
【０１００】
ＩＭ３実験のデータは、ＮＴＨｉ由来のＯＭＶを用いる免疫付与試験で得られた観察結果を確認し、強化するものであり、免疫付与混合物中で組み合わせるＯＭＶ次第では、パスツレラ科の様々なメンバーに向けられた広域性スペクトルワクチンの大いなる可能性を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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