(57)【要約】【課題】細胞増殖、骨修復及び骨成長に役立つエレクトロスピニングによる合成足場、その製造方法、およびその使用方法を提供する。【解決手段】ポリエステル、親水性ポリマー、および成長因子またはタンパク質を含む、エレクトロスピニングによる合成足場。【選択図】なし
2014510612.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエステル、親水性ポリマー、および成長因子またはタンパク質を含む、エレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項２】
バイオセラミックをさらに含む、請求項１に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項３】
前記ポリエステルが、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）、およびポリカプロラクトンからなる群から選択される、請求項１または２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項４】
前記ポリエステルがポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である、請求項３に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項５】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコサミノグリカン、キトサン、硫酸化デキストラン、硫酸化セルロースおよび硫酸ヘパリンからなる群から選択される、請求項１または２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項６】
前記親水性ポリマーが、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）である、請求項４のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項７】
前記成長因子が、組換え型ヒト血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、形質転換成長因子β（ｔｇｆ−ＢＥＴＡ）または骨誘導因子（ＢＭＰ）である、請求項１または２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項８】
前記タンパク質がリゾチームである、請求項１または２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項９】
前記バイオセラミックが、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムおよび生体活性ガラスからなる群から選択される、請求項２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１０】
前記バイオセラミックが２０／８０のヒドロキシアパタイト／β−リン酸三カルシウム（ΗΑ／β―ＴＣＰ）である、請求項９に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１１】
非イオン界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１２】
前記非イオン界面活性剤がＳｐａｎ（登録商標）８０である、請求項１２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１３】
陽イオン界面活性剤をさらに含む、請求項２に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１４】
前記陽イオン界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）である、請求項１３に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１５】
ＰＣＬ、二相セラミック、およびＰＤＧＦ−ＢＢを含む、エレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１６】
前記二相セラミックがＨＡ／β−ＴＣＰである、請求項１５に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１７】
約７０〜約１００％のＰＣＬ、および約０〜約３０％のＰＥＯを含む、エレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１８】
ＰＤＧＦ−ＢＢをさらに含む、請求項１７に記載のエレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項１９】
ＰＣＬに加え、約３０％（ｗ／ｗ）の８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡを含む、エレクトロスピニングによる合成足場。
【請求項２０】
ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、水溶性ポリマーおよび成長因子を含むエレクトロスピニングによる合成足場上でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞増殖および骨形成活性を支持する方法。
【請求項２１】
前記エレクトロスピニングによる合成足場が二相セラミックをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記水溶性ポリマーがポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記成長因子が、組換え型ヒト血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、または骨誘導因子（ＢＭＰ）である、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質が、リゾチームである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記二相セラミックが２０／８０のヒドロキシアパタイト／β−リン酸三カルシウム（ΗΑ／β―ＴＣＰ）である、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２６】
非イオン界面活性剤をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記非イオン界面活性剤がＳｐａｎ（登録商標）８０である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
陽イオン界面活性剤をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記陽イオン界面活性剤がセチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＣＬ、二相セラミックおよびＰＤＧＦ−ＢＢを含むエレクトロスピニングによる合成足場上でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞増殖および骨形成活性を支持する方法。
【請求項３１】
前記二相セラミックがＨＡ／β−ＴＣＰである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
約７０〜約１００％のＰＣＬおよび約０〜約３０％のＰＥＯを含むエレクトロスピニングによる合成足場上でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞増殖および骨形成活性を支持する方法。
【請求項３３】
ＰＤＧＦ−ＢＢをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３４】
約９ｗｔ％のＰＣＬと約３０％の８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡを含むエレクトロスピニングによる合成足場上でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞増殖および骨形成活性を支持する方法。
【請求項３５】
ｈＭＳＣｓと共に、またはｈＭＳＣｓなしで、ポリエステル、親水性ポリマー、および／または成長因子を含むエレクトロスピニングによるＰＣＬまたは合成足場を含む、骨成長を支持する方法。
【請求項３６】
ｈＭＳＣｓと共に、またはｈＭＳＣｓなしで、ポリエステル、親水性ポリマー、および／または成長因子を含むエレクトロスピニングによるＰＣＬまたは合成足場を含む、骨修復を支持する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
この発明は、細胞増殖、骨修復及び骨成長に役立つエレクトロスピニングによる合成足場、その製造方法、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋骨格系疾患はアメリカの人口の２５％近くに影響を及ぼし、人口の高齢化に伴いさらに増加することが予測されている。さらに、骨折はすべての外傷の中で過半数を占める。従来のこれらの疾患の治療の選択肢は、それぞれと自己の骨から収集される組織を使用した自家移植、また提供されたヒトの死体の骨から収集される組織を使用した同種移植であった。しかしながら、自家移植の場合、組織不足、供与部位の病的状態、その後の侵襲性の外科手術の問題があった。そして、同種移植の場合、ドナーの感染症の可能性があった。よって、これらの治療方法は、理想的とは言えない。さらに、無細胞同種移植は、治癒には限界がある。なぜならば、それらは骨間隙を満たすために機械的に適性のある足場を提供するにも関わらず、これらの移植片は、増殖因子、および未分化細胞を骨形成原細胞へ誘導を始めるプロセスである骨誘導を始めるための細胞のような現実的な生物学的成分が欠落しているためである。
【０００３】
近年、材料科学、足場の作成および遺伝子組み換え技術の分野の進歩により、技術者は骨組織を再生するための再生医療用足場を発展させるためのツールを得た。再生医療骨移植片の望まれた結果は、新しい骨の成長により移植片がとって変わられることであり、それ故に、理想的な再生医療骨移植片は骨誘導性であり、生体吸収性であり、さらにホスト骨と機械的に互換性を有しているべきである。
【０００４】
骨は有機相および無機相、多様な細胞型、および成長因子から成る複合的な組織である。ナノスコピック（ｎａｎｏｓｃｏｐｉｃ）のレベルにおいて、骨の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、主に、繊維性Ｉ型コラーゲンの形式の有機相およびハイドロキシアパタイト［ＨＡ，  Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２］粒子の形式の無機相からなる。ＥＣＭは、骨芽細胞、骨細胞および破骨細胞のような周辺細胞型のための機械的および構造的な支持体を提供する。これらの細胞型の前駆体は間充織幹細胞（ＭＳＣｓ）に由来する骨芽細胞である。ＥＣＭは増殖因子のための貯蔵胞としての役割も持つ。
【０００５】
増殖因子は細胞増殖、分化、血管形成、アポトーシスおよび逆分化さえ誘導するシグナルタンパク質である。細胞質は細胞外マトリックスから硫酸グリコサミノグリカン（ヘパリンまたはヘパラン硫酸。）に潜在的な形状で結合する。ＥＣＭから放出されると同時に、増殖因子は骨を再生する機能を誘導するために、協調した一時的な方法で、相乗的に、そして拮抗的に働く。
【０００６】
タンパク質分解のために、増殖因子は短い半減期を持つ。半減期は生物活性を半減させる時間である。それ故に、骨折治癒の間において、増殖因子の全身搬送は効果的ではない。目的の場所への増殖因子の局所的な搬送が、増殖因子の管理のより効果的な方法である。近年、マイクロスフェア、ヒドロゲルおよびエレクトロスピニングによる足場のような薬物送達媒体の進歩により、増殖因子の局所的な管理が期待されている。
【０００７】
近年、エレクトロスピニングはナノメーターからミクロンのオーダーにおける繊維直径をもつ不織足場を作製するための足場作製技術としての組織工学の分野で活用されている。エレクトロスピニングの工程によって生じる繊維の高い表面積と体積の比は、薬物送達への応用のための理想的な媒体となる。エレクトロスピニングによる足場からの増殖因子の管理における主な課題は、結合した増殖因子の生体活性を保つことである。
【０００８】
増殖因子は、プレ−エレクトロスピニングによる取り込み（ｐｒｅ−ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、吸収作用（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）、またはポスト−エレクトロスピニングによる取り込みなど、発明に係るエレクトロスピニングによる複合物に対して様々なタイミングで取り込まれ得る。プレ−エレクトロスピニングの方法は、同軸のエレクトロスピニング、エマルジョン・エレクトロスピニング、およびマイクロスフェアに包まれたエレクトロスピニングの増殖因子のような他の代替可能な方法、および疎水性イオンの組合せのような公知の方法を含む。ポスト−エレクトロスピニングによる増殖因子の取り込み方法は、非共有結合性吸着と成長因子の固定化を含む。
【０００９】
創傷治癒、神経再生および筋骨格および整形外科への応用のようなエレクトロスピニングによる足場と成長因子の結合のための様々な組織工学の応用がある。
【００１０】
他の細胞型と同様に特定の誘導状況下において骨芽細胞に分化することができるＭＳＣｓを用いた筋骨格システム（骨、軟骨、骨格筋など）からの細胞の再生のための、エレクトロスピニングによる足場に取り込まれた増殖因子の発展についてかなりの研究がなされてきた。
【００１１】
エレクトロスピニングによる足場におけるＢＭＰ−２の取り込みは、ＭＳＣｓの骨形成分化において興味深い。骨形成のマーカーであるアルカリフォスワターゼ（ＡＰ）とオステオカルシン（ＯＣ）のヒトＭＳＣの遺伝子発現は、ＢＭＰ−２を持たないＰＬＬＡ足場に比べ、ＢＭＰ−２が結合したエレクトロスピニングによる足場に行おいて、増加した。
【００１２】
周知のとおり、ＢＭＰ−２は骨形成分化の中盤から後半のステージにおいて必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、持続的な方法で投与された場合、生体活性を持つＢＭＰ−２の拡散はもっとも有効である。公知のエレクトロスピニングによる足場は、ＢＭＰ−２の拡散率を操作するためにＰＥＯに結合したＢＭＰ−２を含んだコア溶液、およびＰＣＬや様々な濃度のＰＥＧの混合物を含んだシェル溶液による同軸のエレクトロスピニングによって作製されてきた。全体として、ＡＰ活性は、ＢＭＰ−２のない足場と比べて、ＢＭＰ−２を含んだ足場におけるｈＭＳＣｓにおいてより高かった。さらに、遅くＢＭＰ−２製剤を放出するように作製された足場のほうが、早くＢＭＰ−２を放出するように作製された足場よりもより高いＡＰ活性を誘導した。このｉｎ  ｖｉｖｏの分析は、頭蓋の欠陥における新しい骨形成が、ＢＭＰ−２と結合した足場（ＢＭＰ−２を早く放出する足場に比べ、より骨の形成を誘導するＢＭＰ−２をゆっくり放出する足場）によって強化されるということを示している。
【００１４】
多くの増殖因子と結合したエレクトロスピニングによる足場はポリマーを含む。セラミック成分のポリマーへの追加は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの骨の組成を反映するため、骨再生おいて理想的なモデルである。エレクトロスピニングによる足場を形成する増殖因子と結合するポリマーとセラミックの発展における調査は限られている。エマルジョン・エレクトロスピニングおよび非共有結合性の吸着によって作製されたＢＭＰ−２が結合したＰＬＧＡ／ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）複合物が調査されてきた。
【００１５】
エレクトロスピニングによる足場からのＢＭＰ−２の放出動態の特徴付けにより、非共有結合性の吸着によって作製された足場からのＢＭＰ−２の高い爆発的な放出が明らかとなった。
【００１６】
さらに、ＢＭＰ−２の放出におけるＨＡの濃度の違いによる影響が調査され、５％（ｗ／ｗ）から１０％（ｗ／ｗ）の複合物において、ＨＡの濃度を増加することが、ＨＡの親水性に起因すると考えられる、より高い爆発的な放出につながることが分かった。ポスト−エレクトロスピニングによりＢＭＰ−２を取り込んだ足場とＢＭＰ−２なしの足場と同様に、１０％（ｗ／ｗ）のＨＡを持つプレ−エレクトロスピニングによりＢＭＰ−２を取り込んだ足場におけるヒトＭＳＣｓの接着と生存能力は、５％（ｗ／ｗ）のＨＡを持つ足場に比べ、最も高かった。ＢＭＰ−２を有する足場は、マウス脛骨における重要な大きさの欠陥の治療を改善した。
【００１７】
ｈＭＳＣｓの増殖と骨分化において、エマルジョン・エレクトロスピニングにより、シルク（ｓｉｌｋ）、ＰＥＯ、ＨＡおよびＢＭＰ−２の組み合わせを持って作成されたエレクトロスピニングによる複合物に取り込まれたＢＭＰ−２の影響についても調査されている。ＢＭＰ−２を取り込んだシルク／ＰＥＯ／ＨＡ複合物上に播かれたヒトＭＳＣｓは、他の製剤により作製された足場に比べ、高いＢＭＰ−２遺伝子発現と同様に、カルシウム沈着を増加させる。これはＰＥＯとＨＡがＢＭＰ−２の生体活性を強調し、ヒトＭＳＣｓの骨分化を開始することを示している。
【００１８】
造血幹細胞（ＨＳＣｓ）は、骨内膜付近の成熟骨髄に存在する。確率論的及び決定論的状況下で、ＨＳＣｓはいろいろな血球（例えば好中球、単球/マクロファージ、好塩基球、好酸球、赤血球、血小板、肥満細胞、樹枝細胞、Ｂリンパ球とＴリンパ球）に分化する。血小板は、巨核球の分裂に由来する、非核細胞断片である。骨折治癒の間、トロンビン活性化により、血小板は細胞質においてα顆粒から血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を放出することを開始する。ＰＤＧＦは、ジスルフィド結合によって結合される２つのポリペプチド鎖から成る２５ｋＤａの二量体糖たんぱく質である。ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄは５つの異なる異性体を形成する。異性体は、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＣＣ、ＰＤＧＦ−ＤＤおよびＰＤＧＦＡＢである。骨折治癒の間、ＭＳＣｓおよび骨芽細胞はＰＤＧＦ受容体−β（ＰＤＧＦＲ−β）を発現する。前記受容体は、ＰＤＧＦ−ＢＢの異性体と結合し、シグナル伝達経路を活性化し、細胞増殖、走化性、およびある骨形成マーカーの発現上昇を誘導する。
【００１９】
ＢＭＰｓは形質転換成長因子（ＴＧＦ−β）ファミリーの一員である。２６ｋＤａのホモ二量体糖たんぱく質であるＢＭＰ−２の投与は、異所性化骨を誘発し、胚の肢芽形成と骨折治癒に結びつけられる。骨折治癒の間、ＢＭＰｓはＥＣＭから放出され、ＭＳＣｓ上でＢＭＰ受容体（ＢＭＰＲ−ＩとＢＭＰＲ−ＩＩ）に結合する。これは、Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化を含むシグナル伝達のカスケードを開始する。Ｓｍａｄ−１、Ｓｍａｄ−５及びＳｍａｄ−８は、核においてＳｍａｄ−４と複合体を形成し、細胞増殖と骨分化のための遺伝子発現を活性化する。ＢＭＰ−２は、ｈＭＳＣｓの骨分化の持続を通して、不可欠であり、骨芽細胞の成熟段階で、特異的に発現する。
【００２０】
しかしながら、骨修復に影響を及ぼす有効な方法において、増殖因子を投与するための信頼できるシステムの開発に対する要求は依然として残っている。特に、可能性がある医療機器の実装を重視しながら、増殖因子の生物活性を維持するための新しい方法をさらに開発し、そして調査されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の要約
潜在的な骨再生と修復の適応のために、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および関連する骨形成前駆の骨形成分化を改善することができる、成長因子取り込みのための構造とシステムが開発された。より詳しくは、発明は、ポリエステル、親水性ポリマー、および成長因子またはタンパク質を含むエレクトロスピニングによる合成足場に係る。発明に係る足場は、骨修復または成長のアプリケーションのために単独で用いることもできる。任意で、エレクトロスピニングによる合成足場は、さらにバイオセラミックを更に含み得る。
【００２２】
発明の一実施態様は、エレクトロスピニングによる合成足場は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、酸化ポリエチレン（ＰＥＯ）、および組換え型ヒト血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）を含む。
【００２３】
発明の他の一実施態様は、発明は、ポリエステル、親水性ポリマー、および成長因子またはタンパク質を含むエレクトロスピニングによる合成足場上で、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞の増殖と骨形成の活性を支えるための工程に関する。
【００２４】
発明の他の一実施態様は、骨修復のアプリケーションにおける発明のエレクトロスピニングによる合成足場の使用、および骨成長を支えることに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
当業者は、開示されたシステムおよび方法の作製方法および使用方法のより深い理解を得る為に、添付の図面を参照する。
【図１ａ】図１ａは、エレクトロスピニングによる合成足場からのＰＤＧＦ−ＢＢの放出を示す。Ｓｐａｎ（登録商標）８０なし、およびソニケーションなしで、１μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む、９  ｗｔ％  ３／７  ＰＥＯ／ＰＣＬから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢ：青；Ｓｐａｎ（登録商標）８０あり、およびソニケーションあり、１μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを含む、９  ｗｔ％  ３／７  ＰＥＯ／ＰＣＬから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢ：紫
【図１ｂ】図１ｂは、Ｓｐａｎ（登録商標）８０を含む９  ｗｔ％  ３／７  ＰＥＯ／ＰＣＬからのＰＤＧＦ−ＢＢの累積的な放出の割合（％）を示している。
【図２】図２はポリマー／セラミックのエレクトロスピニングによるマットから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢを示す。
【図３】図３は、ＣＴＡＢで修飾されたポリマー／セラミックのエレクトロスピニングによるマットから放出されるＰＤＧＦ−ＢＢを示す。
【図４】図４は、エレクトロスピニングによるマットから７日間で放出されるＰＤＧＦ−ＢＢの総量を示す。
【図５】図５はｈＭＳＣの７日目の細胞数を示している。図中、アスタリスクは５％  ＦＢＳ  ＯＳ  ＤＭＥＭにおける他の足場に比べ、９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＰＤＧＦ−ＢＢと９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡと、５％  ＦＢＳ  ＯＳ  ＤＭＥＭ中の９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ間の統計的有意差を示している。
【図６】図６は、ｈＭＳＣｓのＡＰ活性を示す。図中、アスタリスクは、１０％  ＦＢＳ  ＯＳ  ＤＭＥＭ中の、１１日間の、９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＰＤＧＦ−ＢＢと、９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ間の統計的有意差を示している（ｐ＜０．０５）。
【図７】図７は１４日目のｈＭＳＣのオステオポンチン発現を示す。図中、１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中の９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡと９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ間の統計的有意差を示している。
【図８】図８は、１４日目のｈＭＳＣのオステオポンチン発現を示す。図中、１０％  ＦＢＳ  ＯＳ  ＤＭＥＭ中の９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡと９ｗｔ％  ＰＣＬ＋３０％  （ｗ／ｗ）  ８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＰＤＧＦ−ＢＢ間の統計的有意差を示している。
【００２６】
発明に係るエレクトロスピニングによる合成足場は、一般的にポリエステル（ポリアルファヒドロキシルエステル）、水溶性ポリマーおよび増殖因子またはタンパク質を含む。
【００２７】
発明に係るポリエステルは、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙｌａｃｔｉｃ  ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）を含み、特定の目的に応じ、部分的の分解の速度によって選ばれる。発明のある実施態様としては、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含むことが好ましい。
【００２８】
発明に係る水溶性ポリマーは例えば、酸化ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、グリコサミノグリカン、キトサン、硫酸化デキストラン、硫酸化セルロースおよび硫酸ヘパリンからなる群から選択される。発明のある実施態様としては、酸化ポリエチレン（ＰＥＯ）を含むことが好ましい。
【００２９】
この発明に用いられる増殖因子は、例えば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂｅｔａ）を含む。
【００３０】
選択的に、発明にかかるエレクトロスピニングによる合成足場はさらに、バイオセラミックを含んでもよい。バイオセラミックとしては、たとえば、ヒドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、二相リン酸カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸カルシウムおよび生体活性ガラスが挙げられる。また二相性バイオセラミックは、例えば、２０／８０のヒドロキシアパタイト／ｐ−リン酸三カルシウム（ΗＡ／β―ＴＣＰ）を含む。
【００３１】
ＰＣＬおよびＨＡのみ、またはベータＴＣＰのみを含む、エレクトロスピニングによる複合物は、２０／８０  ＨＡ／ＴＣＰを含むＰＣＬのために描かれたような同様の条件を使用することで、形成されうる。ＨＡは安定したセラミックであり、ベータＴＣＰは可溶性／比較的早い分解されるセラミックであるため、前記複合物におけるこれらのセラミックのいずれかの使用は、２０／８０  ＨＡ／ＴＣＰを含むＰＣＬと比べて、複合物の全体的な分解および生体活性を変える。ＨＡはベータＴＣＰよりもより安定しているため、ＨＡのみを含む複合物は、より安定的な複合物の材料の生産のために有利でありうる。ここでセラミック組成物は長期間複合物中に残る。ベータＴＣＰのみを含む複合物にとって、これは早く分解されるセラミック組成物という結果となる。このセラミック組成物は、周囲の溶液がカルシウムとリン酸塩イオンで飽和するので、全体の生体活性における影響を持ち、および複合物におけるアパタイトの形成を強調し得る。
【００３２】
足場は、さらに、非イオン界面活性剤（例えばＳｐａｎ（登録商標）８０のような）または、陽イオン界面活性剤（例えば、セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）のような）を含みうる。
【００３３】
発明のさらなる一実施態様としては、エレクトロスピニングによる合成足場は、例えばＳｐａｎ（登録商標）８０のような非イオン界面活性剤を含む。
【００３４】
発明の他の一実施態様としては、エレクトロスピニングによる複合物は２層セラミックを含む場合、例えばセチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）のような陽イオン界面活性剤も含み得る。
【００３５】
発明の他の一実施態様は、約７０〜約１００％のＰＣＬおよび約０〜約３０％のＰＥＯ含むエレクトロスピニングによる合成足場上でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞増殖と骨形成活性を支持する方法に関する。
【００３６】
発明の他の一実施態様は、約９ｗｔ％のＰＣＬと約３０％の８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡを含むエレクトロスピニングによる合成足場上でヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を培養することを含む、細胞増殖と骨形成活性を支持する方法に関する。
【００３７】
特に、発明は、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）および二相性セラミックを含む、エレクトロスピニングによる合成足場に関する：８０／２０のβ−リン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト（β―ＴＣＰ／ΗＡ）は骨組織の成長を促進するための増殖因子のデリバリーのために使用され得る。ＰＣＬと生体活性セラミックを含んだ合成足場は、骨再生の適応のための米国特許出願１２／１４１，３４０に開示されている。
【００３８】
増殖因子のデリバリーのために、ＰＣＬは、水溶性の増殖因子／タンパク質の取り込みを強調するために、約０〜約３０％のＰＥＯ、および約７０〜約１００％のＰＣＬの間の割合で、水溶性ポリマーである酸化ポリエチレン（ＰＥＯ）と組み合わされた。前記増殖因子のデリバリーはセラミックの添加あり、または添加なしで成すことができる。しかしながら、加えたセラミックがバイオセラミックである場合、８０／２０のβ−リン酸三カルシウム／ヒドロキシアパタイト（β―ＴＣＰ／ΗＡ）は、クロロホルム中のポリマー量については３０％（ｗ／ｗ）の濃度で、約９ｗｔ％〜約１７％ｗｔのＰＣＬと約９ｗｔ％〜約１７％ｗｔ  ０−３０／７０−１００  ＰＥＯ／ＰＣＬの間のポリマー溶液に加えられる。２５ｋＤａのミト遺伝子成長因子である組換え型ヒト血小板由来増殖因子ＢＢ（ＰＤＧＦ−ＢＢ）は、ポリマーのみの溶液に、およびポリマーとセラミックの分散において、取り込まれる。初めの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける放出の研究は、ＰＤＧＦ−ＢＢに類似した電荷特性があるモデルタンパク質のリゾチームを使用した、ＰＤＧＦ−ＢＢの放出運動と生体活性を予測するために実施された。形質転換成長因子の分類に属するどの成長因子も、ＰＤＧＦ−ＢＢの代わりに利用することができた。骨誘導因子（ＢＭＰ）を含むトランスフォーミング成長因子の種類のどんな成長因子でも、ＰＤＧＦ−ＢＢの代わりに利用することができた。
【００３９】
この発明に係るいくつかの実施態様は、セラミック組成物なしで、ポリマーのみを利用することができる。
【００４０】
エレクトロスピニングによる足場からのＰＤＧＦ−ＢＢの放出に関する研究において、７日間以上で、ＰＣＬから放出されたＰＤＧＦ−ＢＢの量は、３０／７０  ＰＥＯ／ＰＣＬから放出されるＰＤＧＦ−ＢＢと比べて、とるに足らないものであった。ＰＤＧＦ−ＢＢの放出を必要とする多くのアプリケーションのために、ＰＣＬとＰＣＬの有効な割合は３０／７０のＰＥＯ／ＰＣＬであることが、さらに判明した。
【００４１】
さらに、この発明に係るいくつかの実施態様において、エレクトロスピニング前のウルトラソニケーションの有無にかかわらず、あとに続くポリマー溶液への非イオン性界面活性剤であるＳｐａｎ（登録商標）８０の添加は、足場からのＰＤＧＦ−ＢＢの放出をＳｐａｎ（登録商標）８０なしでは１日だけ維持したのに対し、Ｓｐａｎ（登録商標）８０では少なくとも４日間維持することが判明した（図１ａまたはｂ）。
【００４２】
この発明のある実施態様のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける放出の研究は、ＰＤＧＦ−ＢＢに類似した電荷特性があるモデルタンパク質のリゾチームを使用した、ＰＤＧＦ−ＢＢの放出運動と生体活性を予測するために実施された。
【００４３】
β−ＴＣＰ／ＨＡなしのエレクトロスピニングによるポリマーの足場と比べ、二層のセラミックβ−ＴＣＰ／ＨＡは、エレクトロスピニングによるポリマー／セラミック足場からの取り込まれたリゾチームの放出運動と生体活性に多大な影響を及ぼす。さらには、ＣＴＡＢの添加は、ならびに表面上へ吸着されるリゾチームの第二の構造形態の一部を保持するのと同様に、放出運動を変え、さらにリゾチームから放出されたリゾチームの活性を維持する。
【００４４】
したがって、この発明の他の一実施態様においては、ＰＤＧＦ−ＢＢは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）を含むエレクトロスピニングによるポリマー／セラミック合成物およびｐ−リン酸三カルシウム（β―ＴＣＰ）とヒドロキシアパタイト（ΗＡ）のナノ粒子に取り込まれ、そしてヒトＭＳＣｓの成長と骨形成分化によって定義づけられる放出と生体活性を評価した。。ＰＤＧＦ−ＢＢは、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）の添加することによって、および陽イオン性界面活性剤を取り入れる新しい技術を検討することで、相分離を使用して取り込まれた。
【００４５】
ＰＤＧＦ−ＢＢは、セラミックにおけるリン酸イオンに対する静電吸着、および合成物からの放出を妨げ得る、１１．１の等電点を持つ。それゆえに、次々にＰＤＧＦ−ＢＢと二相セラミックの間の静電吸着を低減させ、エレクトロスピニングによる足場からＰＤＧＦ−ＢＢの放出を誘導するこの発明のある実施形態においては、陽イオン界面活性剤であるセチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ）は、リン酸イオンと複合体を形成するために添加される。
【００４６】
この発明の一実施態様においては、ＰＤＧＦ−ＢＢはポリマー／セラミックのエレクトロスピニングによる足場へ取り込まれるが、セラミックなしで作成された実施形態に対してＰＤＧＦ−ＢＢの放出がきわめて少ないことが明らかになった（図２）。これは、表面が陽性に帯電したＰＤＧＦ−ＢＢ分子と、セラミック中のマイナスに帯電したリン酸イオン（ＰＯ４）の間の静電吸着によるものであると考えられる。この様に、ポリマー／セラミックのエレクトロスピニングによる足場からのＰＤＧＦ−ＢＢの放出は抑制される。β−ＴＣＰ／ＨＡは、陽イオン界面活性剤（分子比が１  ＣＴＡＢ：  １  ＰＯ４３−から１  ＣＴＡＢ：  ６  ＰＯ４３−であるセチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ））と複合体を形成する。これによって、部分的にリン酸塩イオンを中和して、それによって、リン酸塩イオンとタンパク質の間で静電吸引を減少させる。
【００４７】
β−ＴＣＰ／ＨＡへのＣＴＡＢの複合体形成は、ＣＴＡＢなしのポリマー／セラミックの足場と比較して、足場から放出されるＰＤＧＦ−ＢＢの量を強化することが示された。（図３および４）
この発明の実施態様は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）を使用した、細胞増殖と骨形成活性を支持する能力によって特徴づけられる。ＣＴＡＢと共に作製されたＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだ足場を含む実施形態において、より高い細胞増殖を示した（図５）。ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだ９ｗｔ％  ３／７  ＰＥＯ／ＰＣＬによって作製された足場の実施形態では、ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んでいない足場と比べ、より高いアルカリフォスファターゼ活性を示した。一つの好ましい形態においては、ｈＭＳＣｓの有利な骨形成分化を示したＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだ９ｗｔ％ＰＣＬ＋３０％（ｗ／ｗ）（ＣＴＡＢなしで作製）を利用する。アルカリフォスファターゼ活性はＰＤＧＦ−ＢＢなしの９ｗｔ％ＰＣＬ＋３０％（ｗ／ｗ）８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡと比べ、ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだ９ｗｔ％ＰＣＬ＋３０％（ｗ／ｗ）８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ上で培養したｈＭＳＣｓの実施形態において高かった（図６）。さらには、ある骨形成遺伝子、オステオポンチンとオステオカルシンの発現は、ＰＤＧＦ−ＢＢなしの９ｗｔ％ＰＣＬ＋３０％（ｗ／ｗ）８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡと比べ、ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだ９ｗｔ％ＰＣＬ＋３０％（ｗ／ｗ）８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ上で培養したｈＭＳＣｓにおいて強化されていた（図７および８）。
【００４８】
ＰＤＧＦ−ＢＢがポリマー／セラミック合成物から無視できるほどの量で放出されていることが判明したが、データはＰＤＧＦ−ＢＢが静電相互作用によって、この発明のある実施形態の足場に固定化されることを示唆している。前述の固定化されたＰＤＧＦ−ＢＢはｈＭＳＣｓの高められた骨形成活性により決定されたように生体活性を有している。
【００４９】
結論として、ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだ新規な生分解性のエレクトロスピニングによる足場を含んむ、この発明に係る一連の実施態様は、骨再生のための可能な足場として使用されるために開発され、実施された。前記ＰＥＯを含んだ足場は、この発明に係るある例示的な実施形態において、ＰＤＧＦ−ＢＢの放出を強化する。ＣＴＡＢを含んだ足場は、ポリマーとセラミックによって作製されたエレクトロスピニングによる足場から放出されるＰＤＧＦ−ＢＢの量を劇的に増やす。ある例示的な実施態様においては早期の細胞増殖を強化し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの状況で骨形成の活性を示すために最も好ましいのはＰＥＯおよびＣＴＡＢの使用のない、増殖因子を含んだ合成足場である。
【００５０】
材料と方法
ＰＤＧＦ−ＢＢは、プロスペックバイオ（Ｐｒｏｓｐｅｃ  Ｂｉｏ）およびインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から購入した。血清飢餓についての研究は、プロスペックバイオおよびインビトロゲンから購入したＰＤＧＦ−ＢＢの生体活性を決定することで行われた。細胞増殖に関する研究は、インビトロゲンからのＰＤＧＦ−ＢＢがプロスペックバイオからのＰＤＧＦ−ＢＢよりも高い活性をもつことを示した。それ故に、インビトロゲンから購入したＰＤＧＦ−ＢＢを以下の研究では用いた。
【００５１】
ＰＤＧＦ−ＢＢの直接添加。ＰＤＧＦ−ＢＢの直接添加は、乳化されていないポリマー溶液へのＰＤＧＦ−ＢＢの取り込みを参考にした。エレクトロスピニングによるマットからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出におけるＰＥＯの影響を決定するために、ＰＤＧＦ−ＢＢは非乳化ポリマー溶液に取り込まれた。ポリマー溶液は表１中の組成で、クロロホルム中で作成された。凍結乾燥した組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢは、１００ｍＭの酢酸中で再生され、０．５ｍｇ／ｍＬの溶液にした。０．５ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を２μＬ、総合のＰＤＧＦ−ＢＢ添加量が1μｇになるように、それぞれのポリマー溶液に加えた。ポリマー溶液はエレクトロスピニングの前におよそ２０分間、磁気スティラープレート（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｔｉｒ  ｐｌａｔｅ）上で混合した。
【００５２】
【表１】
2014510612.tif 000003
【００５３】
ウルトラソニケーションによる乳化。エレクトロスピニングによるマットからのＰＤＧＦ−ＢＢの放出においてＳｐａｎ（登録商標）８０の取り込みとソニケーションの影響の決定をするために様々な乳化の準備条件を調査した。０．４％（ｖ／ｖ）のＳｐａｎ（登録商標）８０を取り込んだ９ｗｔ％  ３０／７０  ＰＥＯ／ＰＣＬの乳状液から２４時間に放出されるリゾチームの生体活性が、ソニケーションされて、他の条件により作製された乳状液よりも統計的に高いことを示した。
【００５４】
凍結乾燥した組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（インビトロゲン）は０．１％ＢＳＡを含む１００ｍＭの酢酸中で再生し、０．５ｍｇ／ｍＬの溶液とした。０．５ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、０．１％ＢＳＡを含んだＰＢＳ中、または０．１％ＢＳＡを含むＤＩ水中にさらに溶解し、最終濃度を１０μｇ／ｍＬとした。これらの乳状液は表２の条件で、Ｓｐａｎ（登録商標）８０（Ｓｐａｎ（登録商標）８０が取り込まれる条件のために）クロロホルム中にピペット操作によって作製した。そのあと、ポリマーを添加する前に、クロロホルム中へＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を滴下で添加した。およそ１時間、磁気スティラープレート上で混合した後、ポリマー溶液は、プローブウルトラソニケーター（ｐｒｏｂｅ  ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｔｏｒ）を用いて、氷上でソニケーションするか、ソニケーションしないまま放置した。
【００５５】
血清飢餓についての研究のための足場は、放出されて細胞増殖を理論的に誘発する量のＰＤＧＦ−ＢＢを添加したポリマー溶液で作製された。
【００５６】
これらの足場のために、０．１％ＢＳＡを含んだＤＩ水中１００μｇ／ｍＬの濃度のＰＤＧＦ−ＢＢを、１グラムのポリマー溶液あたり１．１μｇのＰＤＧＦ−ＢＢが含まれるように、また正確に、９グラムのポリマー溶液あたり１０μｇのＰＤＧＦ−ＢＢが含まれるようにポリマー溶液へ添加した。
【００５７】
【表２】
2014510612.tif 000004
【００５８】
エレクトロスピニング。ポリマー溶液／乳状液は温度２１℃〜２３℃、相対湿度１７％〜２６％の環境のチャンバーでエレクトロスピニングした。ポリマー溶液／乳状液は１０ｍＬの注射器に入れられ、注射器ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を使って３．０  ｍＬ／時間で、鋭くない２０ゲージのステンレス針を通された。針の先端への印加電圧は、２０ｋＶであった。針の先端から固定された収集プレートまでの距離は、ポリマー液によって、２０〜５０ｃｍであった。エレクトロスピニングによるマットは、収集プレートから剥がされ、研究開始までデシケーターで保管した。
【００５９】
いくつかのポリマー／セラミック懸濁液は、湿度管理がない非封入のエレクトロスピニング装置も用いてエレクトロスピニングされた。なぜなら、封入チャンバー内でのエレクトロスピニングは、残留した溶媒蒸気に起因するかもしれない好ましくない繊維形態を生産することが確認されたからである。
【００６０】
ポリマー／セラミック懸濁液は、１０ｍＬの注射器に入れられ、注射器ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を使って３．０  ｍＬ／時間で、鋭くない２０ゲージのステンレス針を通された。針の先端への印加電圧は、２０ｋＶであった。針の先端から固定された収集プレートまでの距離は、ポリマー液によって、３０〜６０ｃｍであった。
【００６１】
夏期中、エレクトロスピニングの大半が実行されたとき、高い相対湿度（６０％を超える）は予期せぬ繊維と足場形態という結果になった。
【００６２】
修正されたエレクトロスピニングユニットにおいて、大気中の水蒸気は、液体に凝縮されて、冷却プローブに凍って付着した。そして、除湿された空気をエレクトロスピニングチャンバーに残した。さらに、出口拡散区画（ｅｘｉｔ  ｄｉｆｆｕｓｅｒ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）はエレクトロスピニングチャンバー内の、溶剤蒸気を減らすための排気管を提供した。エレクトロスピニングチャンバー内の相対湿度は、望ましい繊維形態の結果を示した５０％以下で維持した。注射器ポンプ率（ｓｙｒｉｎｇｅ  ｐｕｍｐ  ｒａｔｅ）、電圧および針の先端と収集プレートの間の距離は、非封入チャンバーにおけるエレクトロスピニングのための条件と類似していた。エレクトロスピニングマットは収集プレートからはがされて、研究の開始まで、デシケーターに保管された。
【００６３】
非封入エレクトロスピニングユニットにおいてリゾチームを取り込んだポリマー／セラミック懸濁液をエレクトロスピニングした。ポリマー／セラミック懸濁液を、１０ｍＬの注射器に入れ、注射器ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社製）を使って３．０  ｍＬ／時間で、鋭くない２０ゲージのステンレス針へ通した。針の先端への印加電圧は、２０ｋＶであった。針の先端から固定された収集プレートまでの距離は、ポリマー液によって、３０〜６０ｃｍであった。
【００６４】
ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだポリマー／セラミック乳状液は、上で概説される類似したパラメーターによる修正された封入のエレクトロスピニングユニットにおいて、エレクトロスピニングした。ＣＴＡＢありのＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだポリマー／セラミック乳状液は、前のセクションにおいて概説した類似パラメーターによる非封入エレクトロスピニングユニットにおいてエレクトロスピニングした。
【００６５】
ポストエレクトロスピニングされたＰＤＧＦ−ＢＢの取り込み。ポリマー溶液はクロロホルム中で作成し、上記の条件を使用してエレクトロスピニングした。エレクトロスピニングによるマットは１９ｍｍのディスクにカットし、低接着表面２４ウェルプレート（コスター社製）へ入れた。ＰＤＧＦ−ＢＢ（インビトロゲン社製）の４０μｇ／ｍＬの溶液はＰＢＳ溶液中で作成した。それぞれの足場に、１ｍＬの４０μｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦ−ＢＢ溶液を加え、３７℃、５％ＣＯ２、オーバーナイトでインキュベートした。オーバーナイトインキュベーションの後、ディスクはＰＢＳで３回リンスし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける放出研究の開始まで、ディスクを乾燥させるために、およそ７時間、ラミナーエアーフード（ｌａｍｉｎａｒ  ａｉｒ  ｈｏｏｄ）に放置した。
【００６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける放出研究。ＰＤＧＦ−ＢＢを含んだエレクトロスピニングによる足場は１９ｍｍのディスク（ｎ＝３）にカットし、低接着表面２４ウェルプレートへ入れた。いくつかの研究のために、足場は６ｍｍのディスクにカットし、９６ウェルのポリプロピレンプレートに入れた。放出研究の最初に、ＵＶ光によってプレートを滅菌し、その後、２４ウェルプレート中の０．５ｍＬのＰＢＳおよび９６ウェルプレート中の１５０〜３００μＬへ添加し、および３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に放置した。研究の間の所定の時点に、放出媒体は、新しいＰＢＳを補充されたそれぞれのウェルから集めた。いくつかの研究のために、エレクトロスピニングによるディスクはラミナーエアーフード下で乾燥し、そして残りのＰＤＧＦ−ＢＢを抜き取るためにＰＢＳを添加したクロロホルムに溶解した。他の研究のために、サキヤマ−エルバートらによって記述されたプロトコールを使用して、残留のＰＤＧＦ−ＢＢは抽出された。簡潔に言うと、乾燥した足場をＰＢＳ中、１％ＢＳＡ、２Ｍ塩化ナトリウム、０．０１  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘに４℃、７２時間放置し、その後、上澄みをＰＤＧＦ−ＢＢ  ＥＬＩＳＡのために集められた。
【００６７】
ＰＤＧＦ−ＢＢの定量。放出媒体および残留したＰＤＧＦ−ＢＢのサンプルはＰＤＧＦ−ＢＢ  ＥＬＩＳＡ（ぺプロテック社製）を使用したＰＤＧＦ−ＢＢの定量まで、−２０℃で保存した。簡潔に言うと、１００μＬの放出媒体はＰＤＧＦ−ＢＢ抗体でコートされた免疫プレートへ加えた。ＰＤＧＦ−ＢＢの存在は吸光度プレートリーダーを用いて４１０ｎｍで検出される酵素の基質の変色を通して検出した。既知のＰＤＧＦ−ＢＢの濃度を利用した検量線は、放出媒体中の不明な濃度を決定するために使用した。
【００６８】
パーセント重量変化。エレクトロスピニングされたマット（ｎ＝３）はインキュベーションの前に計量され、２４ウェルプレートのウェルに入れられた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの放出研究の後、エレクトロスピニングされたマットを乾燥および計量した。最後の時点の質量を使用し、質量の減少パーセントを方程式２．４（Ｅｑｕａｔｉｏｎ  ２．４）を用いて計算した。
【００６９】
エレクトロスピニングによる繊維中のＰＤＧＦ−ＢＢまたはリゾチームの視覚化。免疫蛍光を使用して、エレクトロスピニングによるマットに取り込まれたＰＤＧＦ−ＢＢを視覚化した。簡潔に言うと、エレクトロスピニングによる足場を６ｍｍのディスクにカットし、およそ１時間、１％ＢＳＡを含んだＰＢＳを用いてブロックした。
【００７０】
ＰＢＳでリンスした後、それぞれのマットにＢＳＡを１％含むＰＢＳ中の２μｇ／ｍＬＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄシステムズ社製）溶液１００μＬをおよそ１時間加えた。他のリンスの後、１％のＢＳＡを含んだＰＢＳ中の、１μｇ／ｍＬのフルオレセイン複合ラビットアンチゴート二次抗体（ピアス社製）をそれぞれのマットに加えた。ネガティブコントロールのために、エレクトロスピニングによるマットを非特異的な染色の存在を検出するために、１％のＢＳＡを含んだＰＢＳ中に二次抗体のみを含んだ状態で染色した。マットは、自発蛍光するエレクトロスピニングされた繊維を見る為に４８８ｎｍ励起／５１５ｎｍ発光で、および二次抗体による染色を見る為に４８８ｎｍ励起／５１５ｎｍ発光で、共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【００７１】
エレクトロスピニングされたマットに取り込まれたリゾチームのために、エレクトロスピニングによる足場は１％のＢＳＡを含んだＰＢＳ中、２μｇ／ｍＬの抗リゾチーム一次抗体、および１％のＢＳＡを含んだＰＢＳ中、１μｇ／ｍＬのアレクサフルーア（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ）４８８  ロバ抗ウサギＩｇＧ二次抗体を使って染色した。ネガティブコントロールのために、設計されたエレクトロスピニングによるマットは非特異的な染色の存在を検出するために、１％のＢＳＡを含んだＰＢＳ中に二次抗体のみを含んだ状態で染色した。マットは、自発蛍光するエレクトロスピニングされた繊維を見る為に４８８ｎｍ励起／５１５ｎｍ発光で、および二次抗体による染色を見る為に４８８ｎｍ励起／５１５ｎｍ発光で、共焦点顕微鏡を用いて観察した。
【００７２】
統計的分析。定量されたデータは量をはかられたデータは、平均＋標準偏差として表した。。ステューデントのｔ検定は、有意性をｐ＜０．０５に設定して、各時点の２つのグループの比較のために実施した。１要因分散分析は１時点において集められた２以上のグループを持ったデータセットにおいて実施した。チューキー（Ｔｕｋｅｙ）のポストホック検定は、組間の違い（ｐ＜０．０５）を決定するために実施した。ＣＴＡＢの細胞障害性の研究のため、ＴＣＰＳは統計分析に含まなかった。時間の相関関係として表されたデータについて、２要因反復測定分散分析は、時間による材料とＰＤＧＦ−ＢＢの影響を決定するために実行した。
【００７３】
セラミックの作製。重量比が８０／２０のβ−ＴＣＰとＨＡは、間葉系幹細胞の骨形成分化を誘導する理想的な比率として決定した。８０／２０のβ−ＴＣＰ／ＨＡ懸濁液はクロロホルム中で作製し、２分間ウォーターバスソニケーター（ＶＷＲ、アクアソニック７５Ｔ）に入れた。クロロホルム中に作製されたポリマー溶液は、最終セラミック濃度が、ポリマー量に関して９％（ｗ／ｗ）、１７％（ｗ／ｗ）、２３％（ｗ／ｗ）または３０％（ｗ／ｗ）になるように、セラミック懸濁液に加えた。
【００７４】
ＤＭＳＯ中における分解を介したネイティブリゾチームの取り込み。ネイティブリゾチームはＤＭＳＯで分解し、表３に示した条件にしたがって、ポリマー／セラミック懸濁液へ加えた。そして磁気スティラープレート上で一晩混合し、その後エレクトロスピニングした。
【００７５】
【表３】
2014510612.tif 000005
【００７６】
ウルトラソニックによる乳化。ネイティブリゾチームの溶液はＤＩ水中で作製した。研究ＢまたはＣにおいて、Ｓｐａｎ(登録商標)  ８０および水性リゾチーム溶液は、表４に記載の条件で、ポリマー／セラミック懸濁液へ加えた。
【００７７】
【表４】
2014510612.tif 000006
【００７８】
ポストエレクトロスピニングされたリゾチームを取り込まれたポリマー／セラミック足場の作製。
エレクトロスピニングより前に、セラミックのナノ粒子を分散させるために、２分間のパルスモード（１秒オン、１秒オフ）の２０％の振幅で、ポリマー／セラミック懸濁液はプローブウルトラソニケーター（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）Ｓ４５０−Ｄ，Ｂｒａｎｓｏｎ社製）を用いてソニケーションした。エレクトロスピニングによるマットは１９ｍｍディスクにカットされ、低接着性２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）へ入れた。エレクトロスピニングによるマットはおよそ３０分間ＵＶ光により滅菌し、その後、ディスクを含むそれぞれのウェルへＰＢＳ中０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチーム溶液を５００μＬ添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内にオーバーナイトで放置した。
【００７９】
オーバーナイトのインキュベーションの後、ディスクはＰＢＳで３回リンスし、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏでのリゾチーム放出研究の開始まで、ディスクを乾燥するために、ナミナーエアーフード中に放置した。
【００８０】
ＣＴＡＢで修飾されたポリマー／セラミック合成足場の作製。セチルトリメチルアンモニウム臭化物（ＣＴＡＢ、シグマ社製）は、分子比率は８０／２０のβ−ＴＣＰ／ＨＡにおいては１ＣＴＡＢと１リン酸イオン（ＰＯ４３−）から８０／２０のβ−ＴＣＰ／ＨＡにおいては１ＣＴＡＢと６リン酸イオン（ＰＯ４３−）に対応するように取り込まれた。
ＣＴＡＢおよび８０／２０のβ−ＴＣＰ／ＨＡはクロロホルム中で、磁気スティラープレート上でおよそ１時間混ぜられ、その後、ＣＴＡＢ：ＰＯ４３−が１：１の２３％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ、別名２３％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢ（高）；およびＣＴＡＢ：ＰＯ４３−が１：６の２３％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢ、別名２３％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢ（低）どちらかの一方のセラミックの最終濃度になるように加えた。
【００８１】
ＣＴＡＢは、８０／２０のβ−ＴＣＰ／ＨＡ中、６  ＰＯ４３−に対して、１  ＣＴＡＢの分子比となるように取り込まれた。ＣＴＡＢとβ−ＴＣＰ／ＨＡは、クロロホルム中で、磁気スティラープレート上でおよそ１時間混合し、その後、ＣＴＡＢ：ＰＯ４  ３−が１：６である３０％（ｗ／ｗ）８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢ、別名３０％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢのセラミック最終濃度になるようにポリマーを加えた。
【００８２】
ＣＴＡＢ細胞障害性研究。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標登録）ｄｓ  ＤＮＡ定量分析（インビトロゲン）は足場を含むＣＴＡＢ上に播かれた細胞が生存能力を維持したかどうかを決定するために実施した。
【００８３】
細胞培養研究。２３％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢ（高）、および２３％（ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ＋ＣＴＡＢ（低）のエレクトロスピニングによるマットは６ｍｍのディスク（ｎ＝３）にカットし、ポリプロピレン９６ウェルプレートに入れた。足場は、ＰＣＬ、３０／７０  ＰＥＯ／ＰＣＬ、ＰＣＬ＋２３％  （ｗ／ｗ）β−ＴＣＰ／ＨＡ、および３０／７０  ＰＥＯ／ＰＣＬ＋２３％  （ｗ／ｗ）  β−ＴＣＰ／ＨＡと比較し、また細胞培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）をコントロールとして用いた。すべての足場はＵＶ光で３０分間滅菌した（ｈＭＳＣ単離についての詳細な説明、セクション５．１．１．１を参照）。ｈＭＳＣｓの１つのバイアル、ドナー７、パッセージ３を解凍し、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含んでいる、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）へ添加した。細胞の密度は１２，５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２、１ウェルあたり３５００の細胞数で播いた。細胞は３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされて、３日後および７日後に、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析のために採取した、細胞のライセートは、足場上の細胞と０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中のＴＣＰＳを溶解することによって作製した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬は、検量線を用いて細胞数に創刊する２重鎖ＤＮＡに蛍光でラベルする。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬は細胞ライセートに添加され、蛍光は４８５ｎｍ励起／５２８ｎｍ放出で検出された。
【００８４】
セラミックの作製。８０／２０  β−ＴＣＰ／ＨＡの懸濁液は、クロロホルム中で作製し、２分間、ウォーターバスソニケーターに入れた。クロロホルム中で作成したポリマー溶液は、セラミック懸濁液に加え、ポリマー量に対する最終濃度が３０％になるようにした。
【００８５】
ＣＴＡＢ修飾セラミックの作製。ＰＤＧＦ−ＢＢの取り込み。ＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだポリマー／セラミック足場は、表５のパラメーターにしたがって、ウルトラソニックによる乳化によって作製した。簡潔に言うと、凍結乾燥された組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（インビトロゲン）は、０．１％ＢＳＡを含んだ１００ｍＭ酢酸中で再生し、０．５ｍｇ／ｍＬの溶液とした。０．５ｍｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢ溶液は、さらに０．１％ＢＳＡを含んだＤＩ水中に溶解し、１マットあたり１μｇ添加されるように１０μｇ／ｍＬ、または１マットあたり１０μｇの治療的添加のために１００μｇ／ｍＬの最終濃度にした（１．１μｇのＰＤＧＦ−ＢＢ／ポリマー／セラミック乳状液のグラム）。
【００８６】
【表５】
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【００８７】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＰＤＧＦ−ＢＢ放出研究。ＰＤＧＦ−ＢＢが取り込まれたエレクトロスピニングによる足場は１９ｍｍのディスク状にカットし、２４ウェルの低接着性プレートに入れた。いくつかの研究のために、エレクトロスピニングによるマットは６ｍｍのディスク状にカットし、９６ウェルのポリプロピレンプレート（Ｎｕｎｃ社製）へ入れた。放出研究の開始時に、プレートをＵＶ光で滅菌し、その後、研究Ａ−Ｂのために０．５ｍＬのＰＢＳ、研究Ｃのために１５０μＬのＰＢＳを加え、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。研究の間の所定の時点に、放出媒体は、新しいＰＢＳを補充されたそれぞれのウェルから集めた。
【００８８】
間葉系幹細胞のヒト単離および培養。ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ）は商業的に得られる（Ｃａｍｂｒｅｘ社）男性のドナーの骨盤の上腸骨稜から集められる骨髄液から単離した。ハイネルウォース（Ｈａｙｎｅｓｗｏｒｔｈ）によって詳述された単離方法は、ＰＢＳで骨髄を洗浄することを含む工程の後、２０分間、１３，０００ｇで７０％の密度勾配溶液で遠心分離する。ｈＭＳＣフラクションを集め、その後、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）および１％抗真菌抗生物質（インビトロゲン）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を入れた組織培養ポリスチレンフラスコ（Ｎｕｎｃ社製）へ播種した：その後、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭを３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに移した。平均して、ｈＭＳＣｓの培養密度は、１２−１６日以内に達成された。培養密度付近の時点で、細胞を０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロゲン）で、基板から分離した。細胞は１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中に再度懸濁されて、５分間９００ｇで遠心分離した。その後、細胞を収集し、新しい組織培養フラスコへ播種した。この手順は連続継代、または継代培養と呼ばれ、最大４継代した。継代の後、細胞は９０％のＦＢＳと１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む培地を冷凍することで低温保存した。低温保存された細胞は、研究の開始まで液体窒素のタンク中に保存した。
【００８９】
ＰＤＧＦ−ＢＢと細胞培養培地の準備。この研究の開始時点は、任意に−２日目と呼ばれ、ｈＭＳＣの小瓶は解凍し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭに再度懸濁し、そして９６ウェルＴＣＰＳプレートに、１２，５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２または４０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種した。−１日目において、最初の播種の後２４時間、ウェル中の培地は様々なＦＢＳの濃度（表６）で作製されたＤＭＥＭと変えた。０日目では、様々な濃度のＰＤＧＦ−ＢＢ（プロスペックバイオ社製またはインビトロゲン社製）を加えた培地を追加した。ＰＤＧＦ−ＢＢの累加は、０日目に一度行われ、または７日目まで４８−７２時間毎に継続的に行われた。
【００９０】
【表６】
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【００９１】
細胞増殖。増殖因子誘導の後、４日目または７日目において、細胞は細胞増殖分析のために収集した。簡潔に言うと、細胞のライセート（培地およびＰＤＧＦ−ＢＢ条件ごとにｎ＝３）は、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で細胞を溶解することによって作製した。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬は、検量線を用いた細胞数に相関する２重鎖ＤＮＡに蛍光でラベルする。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬は細胞ライセートに添加され、蛍光は４８５ｎｍ励起／５２８ｎｍ放出で検出した。
【００９２】
アルカリフォスファターゼ活性。アルカリフォスファターゼの活性は、パラ−ニトロフェノール（ｐ−Ｎｐ）に対するパラーニトロフェニルフォスフェート（ｐ−Ｎｐｐ）の転換率を定量化することにより決定した。既知のｐ−Ｎｐ濃度の標準は、フォスファターゼバッファで作製した。細胞ライセートは、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中で作製し、標準はウォーターバス中で３０分間３７℃でインキュベートした。サンプルと標準の吸光度は、吸光度プレートリーダーを用いて４０５ｎｍで読んだ。ＡＰ活性はＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析（ｎｍｏｌ  ｐ−Ｎｐ／分／細胞）から決定された細胞数に正常化した。
【００９３】
トランスウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）膜上への細胞播種。トランスウェル生体活性のデザインは、血清飢餓研究にならって作製された。−２日目では、ドナー７、２継代目のｈＭＳＣｓの小瓶は、解凍し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中に再度懸濁された。細胞を、低接着性の２４ウェルプレートに入れた０．４μｍトランスウェル膜インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）上の１００μＬ中１２，５００ｃｅｌｌ／ｃｍ２または４０００ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で、播種した。−１日目では、所定のウェル中の培地は５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭと取り換え、コントロールのため他の所定のウェルは１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭを残した。０日目、エレクトロスピニングによる足場：ポリマー溶液１グラムに対し１．１μｇのＰＤＧＦ−ＢＢを取り込んだＰＥＯ／ＰＣＬ、を１９ｍｍのディスク状（ｎ＝３）にカットして、５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭを５００μＬお加えた所定のウェルの底に入れた。トランスウェル膜インサートは足場を含んだウェルの上部に入れた。ポジティブコントロールのために１０ｎｇ／ｍＬのＰＤＧＦ−ＢＢをを５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で培養した細胞に加えた。
【００９４】
増殖因子誘導後、４、７および１１日目に、全セクションで述べた方法にしたがって、細胞をＰｉｃｏＧｒｅｅｎ分析のために０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でインサートから収集した。
【００９５】
細胞播種。細胞／足場研究に使用されたエレクトロスピニングによる足場のリストは表７に示した。
【００９６】
【表７】
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【００９７】
エレクトロスピニングによる足場は６ｍｍのディスク状にカットし、９６ウェルポリプロピレンプレートに入れた。研究の開始時点、０日目において、足場はおよそ３０分間ＵＶ光で滅菌した。研究Ａのため、凍結保存されたｈＭＳＣ（ドナー７、第二継代）を解凍し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中、４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で足場上へ播種した。最初のｈＭＳＣ播種から２４時間後、足場を含むウェル中の培地を、５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭまたは、５％ＦＢＳ  ＯＳ  ＤＭＥＭ（骨形成分化を誘導するため１０ｍＭ  ベータグリセロリン酸（シグマ社製）、５０μＭ  Ｌ−アスコルビン酸リン酸（和光社製）および１００ｎＭのデキサメタゾン（シグマ社製）を追加された５％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）と取り換えた。
【００９８】
他の研究のために凍結されたｈＭＳＣは解凍し、１０％ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中、４０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で足場上へ播種した。５％ＦＢＳ  ＤＭＥＭの代わりに、足場を含むウェル中の培地は、１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ、または５％ＦＢＳ  ＯＳ  ＤＭＥＭ（骨形成組成物を追加した１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ）のいずれかの中に保たれた。細胞は４８−７２時間前に新しい培地で満たした。
【００９９】
コントロールのグループのために、ｈＭＳＣｓは９６ウェルＴＣＰＳプレートに播種し、１０％  ＦＢＳ  ＤＭＥＭ中で培養された。最初の播種から２４時間後、ウェル中の培地は、基底のＤＭＥＭ（５％ＦＢＳ、または１０％ＦＢＳ）、または適切なＯＳ  ＤＭＥＭ（５％ＦＢＳまたは１０％ＦＢＳ）に取り換えた。ポジティブコントロールグループのために、ｈＭＳＣｓは９６ウェルＴＣＰＳプレートに播種し、基底のＤＭＥＭ中で培養した。最初の播種から２４時間後、培地は基底の、または１０ｎｇ／ｍＬ  ＰＤＧＦＢＢを加えたＯＳ  ＤＭＥＭのいずれかと取り換えた。
【０１００】
全ての研究において、１２日目に、ＯＳ  ＤＭＥＭのための所定のウェル中の培地は、基礎的な培地に、オステオカルシンの生成を誘発する２１日の研究の期間、１０ｎＭ  ビタミンＤ３、１０ｍＭ  β−ＧＰおよび５μＭ  アスコルビン酸を追加した培地と取り換えた。
【０１０１】
細胞増殖。２１日の研究の様々な時点、４、７、１１、１４および２１日において、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いてＰｉｃｏｇｒｅｅｎ  ＤＮＡ分析のために細胞を足場から収集した。
【０１０２】
オステオカルシン分析。研究Ｂから、１４日目および２１日目に集められた細胞のライセートは、ヒトオステオカルシンＥＬＩＳＡキット（インビトロゲン）も用いて、オステオカルシンの産生を分析した。簡潔に言うと、細胞ライセートのアリコートは、免疫プレートに加えた。オステオカルシンは吸光度プレートリーダーも用いて４５０ｎｍで酵素の基質の変色により検出される。既知のオステオカルシン濃度の検量線を用いて、ライセート中のオステオカルシンの濃度を特定した。
【０１０３】
遺伝子発現。研究ＢおよびＣのために、足場およびＴＣＰＳ上に播種された細胞は、遺伝子発現研究のために回収された。０、７および１４日目に、細胞はＲＮｅａｓｙ（登録商標）マイクロキット（Ｑｉａｇｅｎ社製，バレンシア，カリフォルニア）を使用したＲＮＡの単離のために収集された。簡潔に言うと、ＲＮＡは基質から収集されるホモジナイズされた細胞から、ＲＮＡは抽出した。それぞれのターゲットまたはハウスキーピング遺伝子のために、Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）から、プライマーと試薬を含んだマスターミックスを説明書に従い作製し、そして単離したＲＮＡに加えた。ＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡの重合はサーマルサイクラ―（ＭＸ３０００Ｐ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて行った。サイクル条件は以下の通りである：５０℃で３０分、９５℃で１５分、その後９４℃で１５秒、５５℃および７２℃で３０秒を４０サイクル、その後９５℃で１分、５５℃で４１サイクル。この研究で調査するターゲット遺伝子は、オステオカルシン（ＯＣＮ）、オステオポンチン（ＯＰＮ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ  Ｉ）、Ｓｏｘ２、Ｒｕｎｘ２である。グループ毎に３サンプルの複製の相対的な定量化は、Ｑ−ｇｅｎｅのソフトウェアを使用して、ハウスキーピング遺伝子（リボソーム大タンパク質）の発現に対して、それぞれのターゲット遺伝子の発現を正常化することで得られる。融解曲線は、増幅したｃＤＮＡの完全性を評価するのに用い、そして、プライマーダイマーの存在のため妥協した融解曲線によるサンプルは分析のために使用しなかった。
【０１０４】
この開示のシステムおよび方法は、典型的な実施例に関して記述したが、この発明はこれらに制限される物ではない。実際、典型的な実施例は開示されたシステムの実施であり、および方法は実例となる、および非限定的な目的のために提供される。開示されたシステムおよび方法に対する変更、修正、強調および／または改良は、この発明の精神と範囲から逸脱することなく作製される。したがって、そのような変化、修正、強調および／または改良は、現在の発明の範囲内に含まれる。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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