(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする、変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
【請求項２】
SEQ ID NO:2と70%またはそれ以上の配列同一性を有する、請求項1記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
【請求項３】
鎌状赤血球貧血またはβ-サラセミアの処置を必要としている対象において鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減するための、請求項1または2記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む細胞を含む薬学的組成物であって、前記細胞が、請求項1または2記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む改変レンチウイルスを用いてトランスフェクションされた自家造血幹細胞(HSC)であり、かつ前記細胞が対象へ移植するためのものである、前記薬学的組成物。
【請求項４】
対象がヒト対象である、請求項3記載の薬学的組成物。
【請求項５】
対象が、移植の前に強度軽減移植前処置(reduced intensity conditioning)で処置される、請求項3または4記載の薬学的組成物。
【請求項６】
改変レンチウイルスが、
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、請求項3〜5のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項７】
改変レンチウイルスが、1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項８】
改変レンチウイルスが、β-グロビン遺伝子座制御領域をさらに含む、請求項7記載の薬学的組成物。
【請求項９】
改変レンチウイルスが、赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項7または8記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
移植後、胎児ヘモグロビンが少なくとも20%を超える;
F細胞が循環血中赤血球の少なくとも2/3を構成する;
F細胞あたりの胎児ヘモグロビンが鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に相当する; および
少なくとも20%の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置する、
請求項3〜9のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項1または2記載の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減しうるレンチウイルス発現ベクター。
【請求項１２】
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、請求項11記載のレンチウイルス発現ベクター。
【請求項１３】
1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、請求項12記載のレンチウイルス発現ベクター。
【請求項１４】
ウイルス転写単位に対して逆方向にクローニングされたβ-グロビン遺伝子座制御領域の1つまたは複数のエレメントをさらに含む、請求項13記載のレンチウイルス発現ベクター。
【請求項１５】
赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項13または14記載のレンチウイルス発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府権利
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号HL070595、HL70135-01、HL073104およびHL06-008の下での政府支援によりなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2014年1月30日付で出願された米国仮特許出願第61/933,788号の米国特許法§ 119(e)下での優先権の恩典を主張するものであり、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００３】
発明の分野
本明細書において開示される本発明は広くは、特に、インビボモデルにおいて、造血疾患の是正のための最低限の造血幹細胞(HSC)キメラ現象および遺伝子投与量を明らかにする方法に関する。本発明はまた、ウイルス力価を増加させるための改変SINレンチウイルス発現ベクターおよびそのような力価を増加させるためのさまざまな方法、ならびにそのような力価を増強することができる発現ベクターにも関する。本発明はまた、組み込みベクターの安全性の向上を補助するための、および発現を増加させるためのCHS4クロマチンインスレーター由来の機能的インスレーター配列にも関する。本発明はまた、鎌状赤血球貧血およびβ-サラセミアのような、疾患の遺伝子的是正またはその症状の低減のための方法にも関する。本発明はさらに、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正可能な、またはその症状を低減可能なさまざまな発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
本明細書における全ての刊行物は、各個別の刊行物または特許出願が、参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されたかのように、同じ程度まで参照により組み入れられる。以下の記述は、本発明を理解するうえで有用でありうる情報を含む。本明細書において提供される情報のいずれかが本明細書で主張される発明に対する先行技術もしくは関連技術であること、または具体的もしくは黙示的に参照されるいずれかの刊行物が先行技術であることを認めるものではない。
【０００５】
遺伝子的是正およびベクターデザイン
造血幹細胞(HSC)によって媒介される、疾患の遺伝子的是正の成功は、安定、安全な、治療量の標的遺伝子発現に依る。発現ベクターは遺伝子的是正のプロセスの中核となり、その結果、多数の研究の主題となる。ベクターデザインの大幅な進歩が遺伝子治療の有効性を改善したとはいえ、鍵となるある種の障害が、成功裏の臨床応用への障壁として浮上した。それらの障害のなかで、本明細書において開示されるように、X-SCID試験の患者での遺伝子治療に関連した白血病の発生から明らかなように、ベクター遺伝毒性が最も厄介なことの一つである。結果として、γ-レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを、自己不活化(SIN)のデザインに改変して、長い末端反復配列(LTR)のU3領域における遍在的に活性なエンハンサーを欠失させた(本明細書において開示される通り)。SINデザインは、ベクター力価を増加させることによって改善された。導入遺伝子の発現を改善するいくつかの方法がその後、利用されている。
【０００６】
発現を安定化させる追加的な手段として、多くのベクターが現在では、クロマチン位置効果を低減させるクロマチン絶縁（insulating）エレメントでデザインされている。これらのインスレーターはある種のベクターの安全性および発現プロファイルを改善しうるが、時として、望ましくない副作用は、非絶縁型と比較した力価の低下である。力価を低下させずに最適な絶縁をもたらす、特注のインスレーターがデザインされている。
【０００７】
かくして、臨床的に意義のあるウイルス力価を維持しながら、導入遺伝子の発現を安全に安定化させることを目指して、改善された発現ベクターのデザインが当技術分野において必要とされている。
【０００８】
鎌状赤血球貧血における是正の重要パラメータの特定
実証されているように、膨大な量の胎児/抗鎌状赤血球化グロビンを発現させることで、疑う余地なく疾患が是正されるであろうが、しかし臨床の場で実際には可能ではない。例として、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症の初期遺伝子治療は、前処置を用いずに行われ、遺伝子標識幹細胞のわずかな生着があり、ADAの撤退に関して遺伝子修正リンパ球に対する選択的優位性が明白であったとはいえ、治療的ではなかった(本明細書において開示される通り)。後続試験において、4 mg/kgのブスルファンを前処置として、移植の前に用いた結果、十分な、遺伝子修正された幹細胞用量および遺伝子改変T細胞がもたらされた(本明細書において開示される通り)。かくして、臨床研究を開始する前に遺伝子修正のための閾値を特定する方法を確立することが当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書において記述される方法および組成物は、例として提供されるものであり、本発明の範囲を決して限定すべきものではない。
【００１０】
本発明の態様は、変異したヒトγ-グロビン遺伝子を包含する。いくつかの態様において、変異したヒトγ-グロビン遺伝子は、SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードしうる。いくつかの態様において、変異したヒトγ-グロビン遺伝子は、SEQ ID NO:2と70%またはそれ以上の配列同一性を有しうる。
【００１１】
本発明の態様はまた、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減するために、SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする変異したヒトγ-グロビン遺伝子を使用する方法であって、鎌状赤血球貧血またはβ-サラセミアの処置を必要としている対象を同定する段階; SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む改変レンチウイルスを用いて自家造血幹細胞(HSC)にトランスフェクションを行う段階; およびトランスフェクションされたHSCを対象へ移植する段階を含む前記方法も包含する。
【００１２】
いくつかの態様において、対象はヒト対象である。いくつかの態様において、対象は移植の前に強度軽減移植前処置(reduced intensity conditioning)で処置される。
【００１３】
いくつかの態様において、改変レンチウイルスは、標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列をさらに含む。いくつかの態様において、改変レンチウイルスは、1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む。いくつかの態様において、改変レンチウイルスは、β-グロビン遺伝子座制御領域をさらに含む。いくつかの態様において、改変レンチウイルスは、赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む。
【００１４】
いくつかの態様において、移植後、胎児ヘモグロビンは少なくとも20%を超える; F細胞は循環血中赤血球の少なくとも2/3でありうる; F細胞あたりの胎児ヘモグロビンは鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に対するものでありうる; および少なくとも20%の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置しうる。
【００１５】
本発明の態様はまた、SEQ ID NO:1におけるタンパク質をコードする変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減しうるレンチウイルス発現ベクターも包含する。いくつかの態様において、レンチウイルス発現ベクターは、標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列をさらに含む。いくつかの態様において、レンチウイルス発現ベクターは、1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む。いくつかの態様において、レンチウイルス発現ベクターは、ウイルス転写単位に対して逆方向にクローニングされたβ-グロビン遺伝子座制御領域の1つまたは複数のエレメントをさらに含む。いくつかの態様において、レンチウイルス発現ベクターは、赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む。
[本発明1001]
SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする、変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
[本発明1002]
SEQ ID NO:2と70%またはそれ以上の配列同一性を有する、変異したヒトγ-グロビン遺伝子。
[本発明1003]
鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減するために、本発明1001の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を使用する方法であって、
鎌状赤血球貧血またはβ-サラセミアの処置を必要としている対象を同定する段階;
本発明1001の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む改変レンチウイルスを用いて自家造血幹細胞(HSC)にトランスフェクションを行う段階; および
トランスフェクションされたHSCを対象へ移植する段階
を含む前記方法。
[本発明1004]
対象がヒト対象である、本発明1003の方法。
[本発明1005]
移植の前に強度軽減移植前処置(reduced intensity conditioning)で対象を処置する段階をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1006]
改変レンチウイルスが、
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1007]
改変レンチウイルスが、1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、本発明1006の方法。
[本発明1008]
改変レンチウイルスが、β-グロビン遺伝子座制御領域をさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1009]
改変レンチウイルスが、赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、本発明1007の方法。
[本発明1010]
移植後、胎児ヘモグロビンが少なくとも20%を超える;
F細胞が循環血中赤血球の少なくとも2/3を構成する;
F細胞あたりの胎児ヘモグロビンが鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に相当する; および
少なくとも20%の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置する、
本発明1003の方法。
[本発明1011]
本発明1001の変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するかまたはその症状を低減しうるレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1012]
標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3' LTR配列の下流の異種ポリAシグナル配列; および
標準SINレンチウイルスベクター骨格のU3欠失領域におけるSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のUSE配列
をさらに含む、本発明1011のレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1013]
1つまたは複数の隣接CHS4由来の低減された長さの機能的インスレーター配列をさらに含む、本発明1012のレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1014]
ウイルス転写単位に対して逆方向にクローニングされたβ-グロビン遺伝子座制御領域の1つまたは複数のエレメントをさらに含む、本発明1013のレンチウイルス発現ベクター。
[本発明1015]
赤血球系統特異的なエンハンサーエレメントをさらに含む、本発明1013のレンチウイルス発現ベクター。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
当業者は、以下に記述される、図面が単に説明のためであることを理解するであろう。図面は、どのような形であれ、本教示の範囲を限定するよう意図されるものではない。
【図１】標準およびヘルパー依存性(gutted) SIN-LVの力価を示す。(a) SINレンチプロウイルスの略図。sSIN-GFP、sBG-6およびsFIGは、それぞれGFP、β-グロビン遺伝子(BG)またはファンコニ貧血A cDNA,-IRES-GFPを保有しているSIN-LVである。dsSIN-GFP、sBG-1およびds-FIGはそのヘルパー依存性対応体である。SD=スプライスドナー。SA=スプライスアクセプター。Ψ パッケージング配列。cPPT: セントラルポリプリントラクト。gag (360 bp)およびRREを含んだenv断片(およそ850 bp)が示されている。(b) 「SIN」デザインのさまざまな反復での、MEL細胞の感染後に得られたウイルス、ならびにGFPおよびhβ-グロビン発現細胞に対する分析。力価はIU/mL濃縮上清として表現されている(n=3)。
【図２】BG SIN-LV構築体を示す。10種のSIN-レンチウイルスプロウイルス形態(sBG-1〜sBG-10)の略図。ベクターの全てがBG (LCRのHS2、3、および4エレメント、(β-プロモーターおよび遺伝子)ならびにcPPTを含む。Gag (630 bpまたは360 bp)、RRE、env断片が示されている。★は、SAを破壊する点突然変異を示す。
【図３】BG SIN-LVのウイルス力価を示す。(a) sBG-1〜sBG-10 SINレンチウイルスベクターのウイルス上清を1400倍濃縮し、フローサイトメトリーでβ-グロビン陽性細胞についてモニタリングすることによりMEL細胞について力価測定した(n=4)。(b) cis-エレメントを含めることでの力価の増加倍率。力価は、1と見なした完全ヘルパー依存性ベクター(sBG-1)の力価に対して正規化された。sBG-6のデザインは、力価の著しい増加を示した。
【図４】プロウイルス安定性および発現に及ぼすLV cis-エレメントの効果を示す。(a) プロウイルス完全性: sBG-127〜sBG-10で形質導入され、ウイルスLTR中で切断するAflIIで制限消化され、hβ-グロビン断片でプローブされたMEL細胞のサザンブロット分析。全てのSINベクターが安定に感染される。(b) MEL細胞におけるhβ-グロビンの発現: 1つの代表的実験からのsBG-1〜sBG-10形質導入MEL細胞のドットプロット分析; MFIをドットプロットの右上隅に示す。
【図５】パッケージング細胞におけるvRNA転写産物を示す。(A) SIN LVプラスミドでトランスフェクションされ、32P標識hβ-グロビン断片でプローブされた293Tパッケージング細胞由来の全RNAのノザンブロット分析。下側パネルは、負荷対照として18Sプローブとハイブリダイズされた同一のブロットを示す。予想されたサイズの全長バンドがベクターの全てで目に見える。＊は、SAが存在し、全長バンドとスプライスされたバンドの両方が目に見えるベクターを示す。Ψパッケージング配列; R: RRE; SA: env断片中のスプライスアクセプター; SG: 短いgag断片(360 bp); LG: ベクター中の長いgag断片(630 bp)を示すために、ベクターレーンの上方に、ベクターcis-配列の小さな略図を示す。(B) 細胞質へのvRNA輸送の効率を示す、パネルAにおいて示した同一実験からのRRE有りおよび無しのベクターに対する細胞質RNA。ホスホイメージャにより定量化された細胞質/全部の比率を図6Eに示す。
【図６Ａ】ウイルス粒子へのvRNAのパッケージングを示す。(a) vRNAの量が感染力価に比例することを示す、sBG系列のウイルス上清から抽出されたvRNAに対する代表的なドットブロット分析。ウイルスを全10種のベクターから作製し、上記の通り同じように濃縮し、ドットブロットをβ-グロビン断片でプローブした。NC=陰性対照。示した代表的実験において二つ組でベクターごとに異なる4種の希釈液を負荷した。計3回の実験を行った。
【図６Ｂ】ウイルス粒子へのvRNAのパッケージングを示す。(B) パネル(A)において示した28ドットブロットにて得られたホスホイメージャ計数。
【図６Ｃ】ウイルス粒子へのvRNAのパッケージングを示す。(C) 全3回の実験からのvRNAの相対定量化。
【図６Ｄ】ウイルス粒子へのvRNAのパッケージングを示す。(D) 全ベクター由来の濃縮ウイルスにおけるp24活性(n=2)。
【図６Ｅ】ウイルス粒子へのvRNAのパッケージングを示す。(E) 2回の独立した実験でのパッケージング細胞における2回のノザンブロット分析(NB)からの細胞質/全RNAの比率(細胞質RNA/全RNAの比率は、RREを欠く完全ヘルパー依存性ベクター(SBG-1)の値および18S RNA (負荷の場合)に対して正規化された)。容易な比較を可能にするためRRE有りおよび無しの類似ベクターをI、IIおよびIIIとして印を付けてある)。
【図７】ベクター構築体および実験デザインを示す。A. hβ-グロビン遺伝子ならびに遺伝子座制御領域のHS2、HS3およびHS4を保有する自己不活化(SIN)レンチウイルスベクターをsBGとして示してある。この骨格を用い、一連のベクターを作製して、cHS4 59 250 bpコア、コアの2つの縦列反復配列、5' 400 bpまたは59 800 bpのcHS4、および全長1.2 KbのcHS4インスレーターのいずれかを組み入れた。sBG400SおよびsBG800Sベクターは、コアに加えてlバクテリオファージ由来の不活性なDNAスペーサーを保有する。B. インビトロおよびインビボ分析の図解: MEL細胞にさまざまなベクターを形質導入して、単一コピーMELクローンを導出し、hβ-グロビン発現およびChIP分析を、分化したクローンにおいて行った。インビボ分析を、致死的な放射線を浴びたHbbth3/+レシピエントへ移植された、ベクター形質導入Hbbth3/+ドナーLSK細胞を用いて行い、移植後6ヶ月の時点で分析した。二次移植をCFU-S分析のために行った。C. 矢印で示した発現の変動係数(CV)を伴う、非絶縁(sBG, 緑色)および絶縁(sBG-I, 桃色)単一コピーMELクローンに対するhβ-グロビン発現細胞(% hβ+)を示す代表的なFACSプロット。
【図８】MELクローンにおけるヒトβ-グロビン発現細胞を示す。A. MELクローンにおけるhβ-グロビン発現細胞の比率(% hβ+)。各丸は個々の単一コピーMELクローンを表す。B. 各クローンのhβ-グロビン発現のCV値。平均は水平線で表されており、各ベクターについて、% hβ+ MEL細胞の平均6 SEMおよびhβ-グロビン発現のCVが上方の四角枠の中に示されている。黒丸はChIP分析のために採取された代表的なクローンを表す。＊ANOVAでP<0.05、sBGと比比較。
【図９】RBCにおけるヒトβ-グロビン発現および単一コピー二次CFU-Sを示す。A. (% hβ+ RBCがヒストグラム内に示される)ことを示す代表的なFACSヒストグラム。B. ベクターコピーに対して正規化されたhβ+ RBCの割合に関する累積データ。C. RBCにおけるhβ発現の変動係数(CV)。D. % hβ+ 細胞/CFU-Sに関する累積データ。各丸は個々の単一組み換え体CFU-Sを表す。E. 個々のCFU-Sにおけるhβ発現のCV。棒グラフの上方の数字は平均 6 SEMを表し、ANOVAで対照と有意差がある値は、星印で印が付けられている。＊ P<0.05; ＊＊ P<0.01。
【図１０】MEL細胞クローンにおけるhβプロモーターおよび5' 250 bp cHS4コア上の活性および抑制ヒストンマークを示すchIP分析を示す。A. ベクターのプロウイルス形態のマップ。矢印は、PCRおよびqPCRに用いたプライマー対の位置を示す; 直線はインスレーター断片を表す。B〜C. 対照IgG、acH3、acH4、H3K4-me2、H3K9-me3およびH3K27-me3に対する抗体によるChIPならびにβ-グロビンプロモーター領域に対する半定量的PCRプライマー。D〜F (図2Aに示した)プールされたクローン上のcHS4コア(左パネル)およびhβ-グロビンプロモーター(右パネル)を増幅させるプライマーを用いたqPCR が付随する、AcH3およびAcH4 (D)、H3K4-me2 (E); H3K9-me3およびH3K27-me3 (F)に対する抗体によるChIP。＊P<0.05; ＊＊P<0.01。
【図１１】マウスにおけるヒトβ-グロビン発現を示す。A. RBCパラメータ、網状赤血球およびベクターコピー。値は平均±SEMを表す。Hb = ヘモグロビン、MCV = 平均赤血球容積、MCHC = 平均赤血球ヘモグロビン濃度、ベクターコピー = qPCRによる白血球中のベクターコピー。B. 全ヘモグロビンの割合[hβ-mα/(hβ-mα + mβ-mα)]としての血液溶解物中のヒトβ-グロビンタンパク質のHPLC分析。データは白血球におけるベクターコピー/細胞に対し正規化されている。＊P<0.05; ＊＊P<0.01。
【図１２】cHS4インスレーターの3' 400 bp領域の効果を示す。A. sBG3' 400ベクターのベクターデザイン。比較のために全長cHS4を示す。B〜C. MELクローンにおける、hβ+細胞の比率(B)およびsBG3' 400のhβ発現の変動係数(C)。各丸は単一の組み込み体MELクローンを表す。平均は水平線で表されており、図中に平均±SEMが表されている。D〜E. マウスにおけるhβ-グロビン+ RBCの割合(D)、およびhβ発現のCV (E)。F〜G. 二次移植後の単一コピーCFU-Sにおける、hβ-グロビン発現細胞(F)およびhb発現のCV (G)。各丸は個々のCFU-Sを表す。平均±SEMおよびP値が示されている。＊ P<0.05; ＊＊P<0.01; ＊＊＊ P<0.001。
【図１３】cHS4インスレーターの3' 400 bp領域との5'コアの組み合わせの効果を示す。A. sBG650のベクターデザイン。比較のために全長cHS4を示す。B. hβ+細胞の比率およびC. sBG650 MELクローンにおけるhb-グロビン発現のCV。各丸は単一コピーMELクローンを表す。平均は水平線で表されており、各群の上方に平均±SEMが示されている。D. 移植マウスにおけるhbグロビン発現RBCの割合。E. 二次マウス由来の単一コピーCFU-Sにおけるhβ-グロビン発現細胞の割合。F〜G. cHS4コア領域またはhβ-グロビンプロモーター領域の半定量的PCR (F)またはqPCR (G)が付随する、ChIP活性および抑制クロマチン。
【図１４】3'400 bpにわたるクロマチンパターンおよび5'コア領域とのその相互作用を示す。A. 全長1.2 kbのインスレーターの場所およびChIP分析において用いたプライマーの位置を示す3'LTRのマップ。表示したコア領域で試験されたベクターをマップの下方に示す。B. sBG3'400、sBG650、sBG-Iプロウイルスでの3'400領域の半定量的PCR が付随する、AcH3およびAcH4、H3K4-me2およびH3K9-me3およびH3K27-me3に対する抗体によるChIP。C〜Dコア領域に対する半定量的PCR (C)またはqPCR (D)が付随する、USF-1およびCTCFに対する抗体によるChIP。E〜F 3つの単一コピーMELクローンのプールでのsBGC、sBG3'400、sBG650およびsBG-Iプロウイルスの3/ 400 bp領域に対する半定量的PCR (C)またはqPCR (D)が付随する、USF-1およびCTCFに対する抗体によるChIP。(G) 図S1 モック、sBG、sBGC、sBG2C、sBG400およびsBGI sBGI単一コピーCFU-Sでのhb発現細胞を示す代表的なヒストグラム(FACS)。ヒストグラム内にhβ+細胞%が示されている。(H) qPCRによるsBG、sBGC、sBG2C、sBG400およびsBG-Iの単一コピー二次CFU-Sでのヒトβ-グロビンメッセンジャーRNA (mRNA)発現。ネズミ科a-グロビン発現を内部対照とし、それに対してhβ-グロビン発現を正規化した。図中にP値を示す。＊＊は、P<0.01を示す。(I) クロマチン免疫沈降(ChIP)において用いたプライマーおよびプローブを示す。「F」はフォワードプライマーを表し、「R」はリバースプライマーを表す。(J) 非絶縁sBGベクターおよび絶縁sBG-Iベクターからの単一コピーMELクローンに対してhttp://genome.ucsc.eduによる遺伝子ヒットを用いた挿入部位分析。
【図１５】3'LTRへのインサートを有するレンチウイルスベクターのウイルス力価が、LTRインサートの長さに反比例していたことを示す。(A) レンチウイルスベクターの略図。全てのベクターはsBG、つまりβ-グロビン遺伝子、β-グロビンプロモーターならびに遺伝子座制御領域エレメントHS2、HS3およびHS4を保有しているSINレンチウイルスベクターに基づいていた。cHS4部位の異なる断片をsBG 3'LTRのU3領域中に挿入した(sBGベクターの上方に示した)。cHS4コア下流の領域をλファージDNA由来の不活性なDNAスペーサーと置き換えることにより、類似サイズのインサートを作製した(sBGベクターの下方に示した)。(B) 絶縁ベクターのウイルス力価は、インスレーターインサートの長さが増すにつれて減少した。力価は、各実験(n=4)で全てのベクターに対して同時に作製された濃縮ウイルスを反映する。全ての力価は、対照ベクターsBGの力価よりも有意に低かった(p<0.01; 1-way ANOVA)。(C) 力価は、コア下流の不活性なDNAスペーサーの長さを増加させる挿入とともに低下した。絶縁レンチウイルスベクターの力価(斜線を入れたバー)は、4回の独立した実験において、LTR中に不活性なDNAスペーサーを含んだもの(白色のバー)と類似している。400 bpのスペーサーを有するsBGの力価は、わずかに高かった(＊ p<0.05)。(D) 高頻度で組み込まれたcHS4コアの縦列反復配列を保有している、sBG2Cベクター。インタクトな場合、またはコアエレメントが1つもしくは2つのコアの喪失によって組み換えを行う場合の、ベクターsBG-IおよびsBG2Cプロウイルスの略図であり、プローブされる領域と、用いられる酵素(AflII)の制限部位とが示されている。予想されるバンドのサイズが各ベクター画の隣に示されている。右パネルはサザンブロット分析であり、sBG-I形質導入MEL細胞集団に対して予想される8 Kbの1本のバンド、および一方もしくは両方のコアの喪失のいずれかを有するsBG2Cに相当する、sBG2C形質導入MEL細胞集団における2本のバンドを示す。
【図１６】類似した量のウイルスRNAがパッケージング細胞において絶縁および非絶縁ベクターから産生されたことを示す。sBGおよびsBG-Iベクターによるトランスフェクション後の293Tパッケージング細胞に対するノザンブロット分析から、予想された長さのウイルスRNAが示された。膜を32P標識p-グロビンプローブ(上パネル)および負荷対照として18S (下パネル)とハイブリダイズさせた。予想通り、7.3 Kbおよび8.5 Kbのバンドは、検出されたsBGおよびsBG-IウイルスRNAに対応する。18Sおよび28S rRNAはこのプローブで非特異的にプローブされた。どちらのベクターでも異質の組み換えバンドは検出されなかった。ホスホイメージャによって定量化された両ベクターのウイルスRNAおよび18S rRNAの比率は、レーンの下方に記載されており、2つのベクター間でv-RNAの量には差がないことを示している。
【図１７】ウイルス産生が3'LTRにおけるcHS4の挿入によって損なわれなかったことを示す。(A) sBGおよびsBG-Iウイルス上清中の逆転写酵素活性は同様である(23±5 vs. 27±3; n=3, p>0.5)。(B) 濃縮ウイルス調製物において検出されたp24レベルは、sBGおよびsBG-Iと同じである。(2.9±0.5×105 vs 1.7±0.5×105 ; n=3, p>0.1)。(C) sBGおよびsBG-Iウイルス上清から抽出されたウイルスRNAのドットブロット分析から、どちらのベクターでもウイルス粒子へパッケージングされた類似量のウイルスRNAを示す。この2つのベクターに対して二つ組でウイルスRNAの異なる4希釈液が負荷されたことに留意されたい。膜を32P標識p-グロビンプローブとハイブリダイズさせた。2つの代表的な実験のうちの1つだけが示されている。(D) 2つの独立した実験の、ホスホイメージャによる定量化のプロットを行い、それでsBGおよびsBG-Iウイルス粒子における類似した量のウイルスRNAが示された(1.9±0.7×106 vs. 1.9±0.6×106 n=2, p>0.5)。
【図１８−１】LTR中にインスレーターエレメントを保有しているレンチウイルスベクターにおける逆転写および核移行の動態を示す。パネル(A)において、レンチウイルス逆転写および核移行プロセスの図解が例示されている。右側 プロセスのいくつかの段階を分析するために行われたq-PCRアッセイ法の要約。薄線: RNA; 太線: DNA。白四角: ポリプリントラクト(PPT)。白丸: プライミング結合部位(PBS)。第1鎖移転ダイアグラムの中に3' LTR DNAインサートが例示されている。q-PCRアッセイ法の位置が示されている。sBGおよびsBG-Iウイルス感染後のMEL細胞由来のDNAを、感染後の異なる時点で回収し、qPCRによって分析した。
【図１８−２】LTR中にインスレーターエレメントを保有しているレンチウイルスベクターにおける逆転写および核移行の動態を示す。実線: sBG。破線: sBGI。(B) 第1鎖移転前(R/U5)の逆転写の動態は、2つのウイルス間に差異がないことを示す。(C〜D) 第1鎖移転後(U3/RおよびPsi)、インスレーターの存在下において逆転写効率の減少が認められる(n=3)。
【図１９】LTRにおけるcHS4の挿入がウイルス組み込みに影響を与えたことを示す。直鎖状ウイルスcDNAは環状化し、組み込みを行う形態である; 1-LTRおよび2-LTRサークルは、それぞれ、相同組み換えおよび非相同末端結合からの不完全な組み込み産物に相当する。1-LTRおよび2-LTRサークルは、それゆえ核移行のマーカーとして用いられる。(A) ウイルスの感染後の異なる時点で感染されたMEL細胞から抽出されたDNAに対してqPCRにより分析された、2-LTRサークルの低減が認められ、核移行または非相同末端結合の低減が示唆された。(B) 同量のsBGおよびsBG-Iウイルスの感染から72時間後のMEL細胞のサザンブロット分析。ゲノムDNAのStuI消化は、sBGおよびsBG-Iに対して1-LTRサークル、2-LTRサークル、直鎖状DNAおよび組み込まれたDNA (スメア)の同定を可能にする。両方のベクターに対して予想されたバンドのサイズが示されている。直鎖状、1-LTRおよび2-LTRサークルがsBGのレーンにおいて見られるが、sBG-Iのレーンにおいては直鎖状DNAまたは2-LTRサークルは検出されない。しかしながら、1-LTRサークルはsBGレーンの場合とほぼ同じくらい顕著である。直鎖状、1-LTRおよび2-LTRサークルの相対比率から、sBG-Iベクターで組み換えられた不完全な組み込み産物の増加、ゆえに非効率的な組み込みに終わることが示唆される。(C) sBGおよびsBGI形質導入MEL細胞は、インタクトなプロウイルス組み込み体(それぞれ7.5 Kbおよび8.0 Kb)を示す。2本のバンドのホスホイメージャによる計数で8倍の差異が認められた。細胞あたりのベクターコピー数もqPCRにより定量化されており、レーンの下方に描かれている。
【図２０】インスレーター配列がウイルス力価を減少させる機構の仮説を示す。野生型HIVにおいて、直鎖状cDNA分子は核へ移行し、そこでわずかな割合のものが組み換えおよび末端結合ライゲーションを起こして、それぞれ1-LTRおよび2-LTRサークルを形成させる。直鎖状の形態だけが組み込みプロウイルスの直接前駆体である。絶縁LVベクターの場合、相同組み換えの増加を促進しうる一層大きなU3配列の存在に起因する、1LTRサークル形成の増加が示されている。このプロセスは、本明細書において示されるように、組み込みのために利用可能なウイルスDNAの量および2-LTRサークル形成の量を激減させる。組み込みのために利用可能なDNA量の減少が、LTR中に大きなインサートを保有しているレンチウイルスベクターに関する力価の低下を説明し得る。(B) BGM-Iと名付けられた、BG-Iベクターへの1.2 KbのPGK-MGMT内部カセットのさらなる付加によって、力価がさらに低減されることはなかった。(C) ベクターデザインの最適化により、インスレーター活性の喪失なくして合理的なウイルス力価がもたらされる。構造機能分析を通じインスレーター活性について最適化された、cHS4の650 bpの配列。この650 bpの断片(sBG650)を含んだベクターは、非絶縁ベクターsBGよりもおよそ2倍低い力価を有することが分かった(n=3)。(D) 単一コピーMELクローンに由来するプロウイルスにおける3'LTRインサートの存在についてのPCRから、縦列反復配列として存在するものを除く全てのインサートの安定な感染が明らかである。MEL細胞は、5%以下の遺伝子導入でプールからクローニングされた。単一コピークローンを、β-グロビンプライマーを用いて検出し、Ψ領域に及ぶプライマーを用いてqPCRにより確認した。250 bpコアに及ぶプライマーを用いたPCRを、単一コピークローンにおいて行った。というのは、これらのコア配列が全てのベクターに共通していたからである。sBG-Iベクターにおける1.2 KbのcHS4インサートを、5'コアおよびcHS4の3'末端に及ぶPCRプライマーによってさらに確認した。(E) PCRプライマー。
【図２１】骨髄破壊的前処置後に移植を受けたsGbGマウスが、一次および二次マウスにおいて安定でありかつ維持される高いHbF産生を有することを示す。ドナーRBCについて完全にキメラであったsGbGマウスを異なる時点で分析した。それぞれ、イオン交換HPLCおよびFACS分析によって判定された、個々のマウスの血中HbF (A)およびF細胞(B)の比率を、一次および二次移植後の異なる時点で示した。(C) 血中HbFの量は、F細胞の比率と直接関係していた。(D) 産生されたHbFの量は、骨髄中のベクターコピー数に正比例していた。各記号は1匹のマウスに対応する(そしてパネルの全てで同じ特定のマウスを一貫して描いている)。(E) 骨髄破壊的前処置後に移植を受けたsGbGマウスの血液学的パラメータ。Hbはヘモグロビンを示す; MCV, 平均赤血球容積; MCH, 平均赤血球ヘモグロビン; RDW, 赤血球分布幅; Plt, 血小板; pri, 一次マウス; およびsec, 二次マウス。＊P値はsGbG群との一次モックマウスの比較を表す。分析の時点で1匹の二次モックマウスしか生きていなかったので、二次マウスの統計比較は行われなかった。
【図２２】骨髄破壊的前処置後に移植を受け、その結果、HbF発現と相関していた血液学的パラメータの是正をもたらしたsGbGマウスを示す。持続的な網状赤血球の低減(A)、ならびにヘマトクリット値の増加(B)およびRBC数の増加(C)が経時的に認められた。(D) 白血球増加がWBC計数の正常化とともに低下した。示したデータは、sGbGマウス(n = 5;●)およびモック移植を受けたマウス(n = 10; ○)の平均(±SEM)値を表す。星印は、sGbGおよびモック移植のHSCドナーであったBERKマウスでの平均値を表す。(E〜G) 網状赤血球の減少、ならびにヘマトクリット値およびRBC数の増加は、個々のマウスにおけるF細胞の比率と相関していた。(H) WBC計数は、F細胞が60%を超えた場合、減少し、しかし正常化した。自動分析装置にて数えられたWBC計数は、末梢スメアにごくたまにしか有核RBCが見られなかったので、循環血中白血球を表していた。パネルE〜H中の各データ点/記号は、1匹のsGbGマウスを表し、個々のマウスに対する記号は、個々のマウスを追跡するために一貫性を保たれた。星印は、sGbGおよびモック移植のHSCドナーであったBERKマウスでの平均値を表す。
【図２３】骨髄破壊的前処置後に移植を受け、その結果、一次および二次マウスにおいて機能的RBCパラメータの是正をもたらしたsGbGマウスを示す。(A) モック移植を受けたマウスにおける多数の不可逆性鎌状赤血球(ISC)およびsGbGマウスにおけるISCの少なさを示す末梢血スメア。(B) 移植を受けなかったBERKマウス(n = 5)、モックマウス(n = 3)、およびsGbGマウス(n = 5)の末梢血スメアにおけるISCの定量化。(＊P < .05; ＊＊P < .01)。(C) 血液の脱酸素化はモックマウスにおいてRBCの鎌状赤血球化を誘導する; 鎌状赤血球化はsGbGマウスにはほぼ存在していない。(D) モックマウス(○)と比較した、sGbGマウス(●)における(圧力測定での)段階的な低酸素状態による鎌状RBCの定量化。(E) 一次移植レシピエントにおいて18週の時点で分析されたsGbG、モックおよび正常マウス(C57, 中央にxのある丸)におけるLORCA分析によるRBC変形能。類似のデータが二次レシピエントにおいて見られた。低い(3 Pa)および高い(28 Pa)せん断応力での流れが網掛け部分で表されている。(F) 一次移植後のsGbGマウス、モック/BERKマウス、および正常マウスにおけるRBC半減期(インビボでのビオチン標識化によって特定した)。類似の結果が二次レシピエントにおいて見られた。(G) 骨髄破壊的前処置を伴う移植を受けたsGbGマウスにおける臓器病態の是正。2+ 肝梗塞は2〜3個の梗塞/切片を示す; 3+ 肝梗塞, 3個超の梗塞/切片; およびE-M, 髄外。脾臓構築の回復時に鎌状RBCを有する脾臓血管の穏やかなうっ血が見られる。脾臓構築が髄外造血で失われる場合、これに気付くことはない。脾臓赤血球過形成: 重度は脾臓濾胞の完全閉塞である; 中等度, 2個以上の濾胞の存在/切片; および軽度, 赤血球系の島(erythroid islands)の証拠がある濾胞の保持。骨髄: 正常赤血球生成はM/E= 5:2を示す; 軽度の赤血球過形成, M/E=2:1; 中等度の赤血球過形成, M/E =1:1; および重度の赤血球過形成, M/E =1:3。骨髄赤血球生成は骨髄球系-赤芽球系比(M/E)として表現された。括弧内の数字は、その群で分析されたマウスの数/マウスの総数において見られた組織学的特徴を示す。
【図２４】2群: 10%またはそれ以上のHbFを有するマウス(sGbG>10)および10%未満のHbFを有するマウス(sGbG<10)に分けて、強度軽減移植前処置後に移植を受けたsGbGマウスにおけるHbF発現および機能的是正を示す。(A) 強度軽減移植前処置の後、sGbG形質導入BERK HSCの移植から18週後の個々のBERKマウスにおけるHbF。(B〜C) 11ヶ月の時点で分析された長期生存体における安定かつ高度なHbF発現およびF細胞再配置。(D) sGbG<10およびsGbG>10のマウスにおけるベクターコピー数を示す箱髭図であり、直線は平均ベクターコピー数を示す。パネルA〜Cにおける記号はマウス群: ○ = モック(HbF 0%)、▼ = sGbG<10 (HbF < 10%)、および●= sGbG>10 (HbF > 10%)を表す。(E) ISCの比率は、モックマウスと比べて、sGbG<10のマウスにおいて低減されたが(P < .04)、しかしsGbG>10のマウスにおいては著しく低減された(P<.001)。(F) 圧力測定による段階的な脱酸素化から、sGbG>10のマウスにおける生理的に適切な酸素分圧(PO2)での鎌状赤血球化の顕著な低減が実証され、その一方でsGbG<10マウスのRBCは対照と同様に鎌状に変形した。(G〜H) RBC変形能から、sGbG<10のマウスにおける変形能の極めてバラツキのある改善が示された。対照的に、sGbG>10のマウスにおけるRBC変形能は、低いおよび高いせん断応力で極めて有意に改善された(P< .001)。記号はマウス群: ○, モック; ▼, sGbG<10; ●, sGbG>10; および(中央にxのある丸), 野生型マウス(C57BL/6)を表す。灰色の網掛けの長方形は、それぞれ、微小血管および大血管による低いおよび高いせん断応力を代表する。エラーバーはSEMを示す。
【図２５Ａ】強度軽減移植前処置の後に移植を受け、全生存性を改善したsGbG^10マウスにおける臓器病態の是正を示す。(A) 強度軽減移植前処置移植から48〜50週後のsGbG>10およびsGbG<10マウスならびに3ヶ月齢BERK対照の腎臓、肝臓および脾臓の代表的なヘマトキシリン-エオシン染色切片。画像収集情報は、補足データにおいて入手可能である。
【図２５Ｂ】強度軽減移植前処置の後に移植を受け、全生存性を改善したsGbG^10マウスにおける臓器病態の是正を示す。(B) カプラン・マイヤー生存曲線から、50週の時点でモック/sGbG<10マウスと比較した、sGbG>10マウスの、顕著に改善された生存性が明らかにされた。24週時点の生存性を垂直破線により示して、骨髄破壊的移植モデルにおけるsGbGマウスの生存性と比較している。
【図２５Ｃ】強度軽減移植前処置の後に移植を受け、全生存性を改善したsGbG^10マウスにおける臓器病態の是正を示す。(C) 強度軽減移植前処置の後に移植を受けたsGbGマウスの血液学的パラメータ。図中で述べられた通りの血液学的パラメータおよび略語。P値は12(＊)、18 (†)および24(‡)週時のモックマウスとsGbG≧10との比較を表す。
【図２５Ｄ】強度軽減移植前処置の後に移植を受け、全生存性を改善したsGbG^10マウスにおける臓器病態の是正を示す。(D) 強度軽減移植の後に移植を受けたsGbGマウスにおける臓器病態。E-Mは髄外を示す; および1 + 肝梗塞。1 梗塞/切片。＊血管うっ血および血管内の鎌状RBCの存在。とりわけ、うっ血した血管は、脾臓構築を生じさせる赤血球過形成が低減された場合にだけ脾臓中に見て取れた。臓器病態を定量化するために用いられた専門用語は、図中に記述されたのと同じである。
【図２６】RBC生存性および変形能の機能的改善に必要とされるHbF、F細胞およびHbF/F細胞の割合の効果を示す。(A) RBC半減期。左パネルは、FACSにより判定された、ビオチン標識されたF細胞(右上象限)および非F細胞(右下象限)でビオチン注射した代表的sGbGマウスを示す。右パネルは、sGbGマウス(n = 4); 野生型マウス(A); およびBerkeleyマウス(O)における非F細胞(中央に黒丸のある中空円)と比較した、F細胞(中央に黒丸のある中空正方形)の生存性を示す。(B) HbF/F細胞の割合に基づき、インビボでのRBC生存性について分析されたsGbGマウスのコホート。各記号はマウス群を表し、HbF割合およびマウス数が隣接の表説明文に記載されている。(C) RBC変形能について分析された全てのsGbGおよびモックマウス(n = 34)を、F細胞0%、1%〜33%、33%〜66%および66%超の比率に基づいて群に分け、これらのマウスにおける全RBCの変形能を低い(3 Pa, △)および高い(28 Pa, 上下逆の中空三角形)せん断応力でプロットした。モック対照と比べて有意に改善された変形能を、＊(P< .05)および＊＊(P< .01)によって示す。エラーバーはSEMを示す。
【図２７】sGbGマウスにおける形質導入HSCの比率を示す。骨髄破壊的(A)および強度軽減(B)移植モデルにおける比率を示す。sGbG形質導入HSCの比率をHbFおよびHbSでの細胞内染色により脾臓コロニー(30〜36個のコロニー/マウス)で割り出した。各バーは個々のマウスを表す。(A) 骨髄破壊的移植モデルにおいて、各バーの下方の記号(1匹のマウスを表す)は、ラベル付けされたマウスにおける記号と一致している。(B) 強度軽減群において、骨髄は24週の時点で8匹のマウスから成功裏に吸引され、マウスをさらに24週間、追跡調査した。24週時点の各マウスの、HPLCによる末梢血中HbF発現および骨髄コピー数が各バーの下にラベル付けされている。
【図２８】成功裏の遺伝子治療後のマウス生存性の改善を示す。
【図２９】sGbGベクターによるHbbth3/+マウスでのサラセミアの是正を示す。ヘモグロビン(図29A)およびヘマトクリット(図29B)は、およそ20%のHbF発現(図29C)により正常レベルに是正された。網状赤血球計数(図29D)も顕著に低下されており、赤血球系細胞の代謝回転の低減を示していた。
【図３０】sGbGMベクターの注釈付きのベクターマップを示す。
【図３１】sGbGMベクター配列を、配列のさまざまな領域とともに示す。
【図３２】sGbGMベクターからの優れたHbF発現を示す。Berkeley鎌状赤血球マウスにおけるsGbGMベクターからのHbF発現は、sGbGベクターと比べて、優れたHbF発現/ベクターコピーを示す(図32A)。sGbGMで形質導入された造血幹細胞を移植した鎌状赤血球マウスは、HbF産生に比例して網状赤血球計数の低減を示す(図32B)。sGbGMベクターから産生された30%またはそれ以上のHbFを有するマウスは、ほぼ正常な網状赤血球計数を有する。正常な網状赤血球値は網掛けの長方形によって描かれている。
【図３３】鎌状赤血球マウスにおける、sGbGベクターと比較した、sGbGMベクターからのHbF発現を示す。Berkeley鎌状赤血球マウス(図33A)およびノックインUAB鎌状赤血球マウス(図33B)におけるsGbGMベクターからのHbF発現は、sGbGベクターと比べて、優れたHbF発現/ベクターコピーを示す。sGbGMで形質導入された造血幹細胞を移植した鎌状赤血球マウスは、HbF産生に比例して優れた貧血の是正(図33C〜D)および網状赤血球増加の低減(図33E〜F)を示す。sGbGMベクターから産生された30%またはそれ以上のHbFを有するマウスは、ほぼ正常な網状赤血球計数および鎌状赤血球表現型の是正を有する。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の説明
本明細書において引用される全ての参考文献は、完全に記載されているかのように参照によりその全体が組み入れられる。参照によりその全体が本明細書に同様に組み入れられるものには、2010年12月6日付で出願された米国非仮特許出願第12/928,302号、および2009年12月4日付で出願された米国仮特許出願第61/267,008号が含まれる。参照によりその全体が本明細書に同様に組み入れられるものは、「A novel human gamma-globin gene vector for genetic correction of sickle cell anemia in a humanized mouse model: critical determinants for successful correction」. Blood (2009) 114: 1174-1185 Perumbeti A, Higashimoto T, Urbinati F, Franco R, Meiselman H et alに記述されているようにヒト化マウスモデルにおける鎌状赤血球貧血の遺伝子的是正のための新規のヒトγ-グロビン遺伝子ベクターおよびその成功裏の是正に不可欠な決定因子である。
【００１８】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられる技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同一の意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5th ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 2001); およびSambrook and Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001)は、当業者にとり、本出願において用いられている用語のうちの多くのものの一般的な手引きとなる。当業者は、本発明の実践において用いられうる、本明細書において記述されるものに類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際に、本発明は記述された方法および材料に決して限定されるものではない。
【００１９】
本明細書において用いられる場合、「SIN」という用語は、自己不活化の略語である。
【００２０】
本明細書において用いられる場合、「HIV」という用語はヒト免疫不全ウイルスの略語である。
【００２１】
本明細書において用いられる場合、「GFP」という用語は緑色蛍光タンパク質の略語である。
【００２２】
本明細書において用いられる場合、「cDNA」という用語は相補DNAの略語である。
【００２３】
本明細書において用いられる場合、「LTR」という用語は長い末端反復配列の略語である。
【００２４】
本明細書において用いられる場合、「USE配列」という用語は上流配列エレメントをいう。
【００２５】
本明細書において用いられる場合、「ポリA」という用語はポリアデニル化の略語である。
【００２６】
本明細書において用いられる場合、「cHS4」という用語はニワトリ高感受性部位-4エレメントの略語である。
【００２７】
本明細書において用いられる場合、「HSC」という用語は造血幹細胞の略語である。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「GOI」という用語は関心対象の遺伝子の略語である。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「HbF」という用語は胎児ヘモグロビンの略語である。
【００３０】
本明細書において用いられる場合、「RBC」という用語は赤血球の略語である。本明細書において用いられる場合、「IDUA」という用語はα-L-イズロニダーゼの略語である。
【００３１】
本明細書において用いられる場合、「LCR」という用語は遺伝子座制御領域の略語である。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「対象」という用語は動物界の任意の成員をいう。いくつかの態様において、対象はヒト患者である。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、特定の状態に関して「処置」、「処置している」、「処置する」、「是正する」などの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることをいう。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防ぐという点で予防的であることができ、ならびに/または疾患および/もしくはその疾患に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であることができる。本明細書において用いられる場合、「処置」は対象における、特にヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し、(a) 疾患にかかりやすい素因を持ちうるが、しかし疾患を有していると未だ診断されていない対象において疾患が生じるのを予防すること; (b) 疾患を阻害すること、すなわち、その進行を停止させること; ならびに(c) 疾患を緩和すること、すなわち、疾患の退行を引き起こすことおよび/または1つもしくは複数の疾患症状を緩和すること、を含む。「処置」は、疾患または状態がない場合でさえも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達または治療の投与を包含することもできる。「処置」という用語はいくつかの態様において、宿主において、好ましくは哺乳類対象において、より好ましくはヒトにおいて疾患または障害を和らげるための本発明の化合物の投与をいうように用いられる。したがって、「処置」という用語は、特に宿主が疾患にかかりやすい素因を持つが、しかし疾患と未だ診断されていない場合に、宿主において障害が発生するのを予防すること; 障害を抑えること; および/または障害を軽減もしくは好転させることを含むことができる。本発明の方法が障害を予防することを目的とする限りにおいて、「予防」という用語は、疾患状態が完全に阻止されることを要しないものと理解される(Webster's Ninth Collegiate Dictionary参照)。むしろ、本明細書において用いられる場合、予防するという用語は、本発明の化合物の投与を疾患の発症の前に行うことができるような、障害にかかりやすい集団を同定する当業者の能力をいう。この用語は、疾患状態が完全に回避されなければならないことを意味するものではない。
【００３４】
本明細書において用いられる場合、「変異した」、「変異」、「変異体」などの用語は、各配列の天然型、野生型、標準型または基準型、すなわち非変異配列からの、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列のような配列の変化をいう。これらの用語は、デオキシリボ核酸、リボ核酸などのような、1つもしくは複数の変異遺伝子、またはタンパク質のような、1つもしくは複数の変異遺伝子産物をいうことができる。変異遺伝子は、変異遺伝子産物を生じうる。変異遺伝子産物は、1つまたは複数のアミノ酸残基だけ非変異遺伝子産物とは異なるであろう。
【００３５】
いくつかの態様において、変異遺伝子産物をもたらす変異遺伝子は、対応する非変異ヌクレオチド配列と70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれを上回る配列同一性を有することができる。いくつかの態様において、変異遺伝子産物をもたらす変異遺伝子は、対応する非変異ヌクレオチド配列と96%、97%、98%、99%またはそれを上回る配列同一性を有することができる。本発明のいくつかの態様において、変異遺伝子は変異したヒトγ-グロビン遺伝子である。いくつかの態様において、変異したヒトγ-グロビン遺伝子は、SEQ ID NO:1を含むタンパク質をコードする。
【００３６】
いくつかの態様において、変異したヒトγ-グロビン遺伝子は、鎌状赤血球貧血またはβ-サラセミアの処置を必要としている対象を同定する段階; 変異したヒトγ-グロビン遺伝子を含む改変レンチウイルスを用いて自家造血幹細胞(HSC)にトランスフェクションを行う段階; およびトランスフェクションされたHSCを対象へ移植する段階を含めて、鎌状赤血球貧血もしくはβ-サラセミアを遺伝子的に是正するために、またはその症状を低減するために用いられる。
【００３７】
いくつかの態様において、移植後、胎児ヘモグロビンは少なくとも20%を超える; F細胞は循環血中赤血球の少なくとも2/3を構成する; F細胞あたりの胎児ヘモグロビンは鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に相当する; および少なくとも20%の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置する。いくつかの態様において、移植後、胎児ヘモグロビンは25%、30%、35%、40%、45%、50%またはそれ以上を超える。いくつかの態様において、移植後、胎児ヘモグロビンは55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上を超える。いくつかの態様において、F細胞は循環血中赤血球の少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上を構成する。いくつかの態様において、F細胞あたりの胎児ヘモグロビンは鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも1/3に相当する。いくつかの態様において、F細胞あたりの胎児ヘモグロビンは鎌状赤血球における全ヘモグロビンの少なくとも40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上に相当する。いくつかの態様において、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%またはそれ以上の遺伝子改変HSCが対象の骨髄に再配置する。
【００３８】
必須のCisエレメントおよびベクターデザインの最適化
本明細書において記述されるように、実験を行って、レンチウイルス非コード化cis配列がRNA輸送、パッケージングまたはβ-グロビン発現において特別な役割を果たすかどうか判定した。β-グロビン遺伝子および遺伝子座制御領域(BG)、またはGFP cDNAを保有している自己不活化(SIN)-レンチウイルスにおいて、ベクターライフサイクルを研究した。SIN-LV骨格に含めるのに最適なcis-エレメントを同定するため、パッケージング領域しか保有していない完全「ヘルパー依存性」の最小SIN-レンチウイルス; および漸増するHIV cis-エレメントを含んだSIN-レンチウイルスを用いて、SIN-γ-レトロウイルスと併せ、系統的分析を始めた。sSIN-GFPベクターをクローニングするため、本明細書において記述されるように、以前に用いられた標準的なSIN-LV骨格の3'LTRを改変して、転写産物の終結を改善させた。具体的には、β-成長ホルモンポリアデニル化シグナルを3'LTRの下流に付加し、SV40後期ポリアデニル化シグナルに由来するUSE配列をU3欠失中に付加した。
【００３９】
本明細書においてさらに記述されるように、GFPをコードするヘルパー依存性/最小SIN-レンチウイルスまたはSIN-γ-レトロウイルスは高い力価を生じ、高いGFP発現を媒介した。しかしながら、BGもしくは類似したサイズの大きな導入遺伝子のどちらかをコードするヘルパー依存性SIN-レンチウイルスまたはSIN-γ-レトロウイルスは、cis-エレメントを保有しているSIN-レンチウイルスと比べてほとんど検出できない力価を有していた。cis-エレメントの系統的付加から、mRNA輸送ではなく、レンチウイルス粒子の効率的なアッセンブリ/パッケージングのためには、Rev/RREが最も不可欠であり、それにgagおよびenvスプライスアクセプター配列が続くことが実証された。しかしながら、これらのHIV cis配列は一層小さな導入遺伝子の場合には不必要であった。これらの研究は、鍵となるレンチウイルスcis-エレメントと、それらが、大きなインサートを保有しているベクターにおいて果たす役割とを同定し、遺伝子治療に重要な意味を持つ。
【００４０】
1つの態様において、本発明は、標準SINレンチウイルス発現ベクターと比べて改変SINレンチウイルス発現ベクターの力価を増加させる方法を提供する。別の態様において、SINレンチウイルス発現ベクターは、標準SINレンチウイルスベクター骨格におけるウイルス3'末端反復配列から下流側に異種ポリアデニル化(ポリA)シグナル配列を挿入することによって改変される。別の態様において、ポリAシグナルはウシ成長ホルモンポリAシグナル配列である。別の態様において、SINレンチウイルスベクターは、標準SINレンチウイルスベクター骨格の3'LTRへ上流ポリA-エンハンサー配列(USE配列)の1つまたは複数を挿入することによって改変される。別の態様において、USE配列はSV40後期ポリAシグナルに由来する。別の態様において、USE配列の2〜3コピーが標準SINレンチウイルスベクター骨格の3'LTRへ挿入される。別の態様において、USE配列の2〜10コピーが標準SINレンチウイルスベクター骨格の3'LTRへ挿入される。別の態様において、USE配列の3〜5コピーが標準SINレンチウイルスベクター骨格の3'LTRへ挿入される。別の態様において、1つまたは複数のコピーのUSE配列がU3領域へ挿入される。別の態様において、β-成長ホルモンポリAシグナルおよびSV40後期ポリAシグナルに由来する1つまたは複数のコピーのUSE配列がともに発現ベクターへ組み入れられる。別の態様において、発現ベクターは関心対象の遺伝子(GOI)を含む。別の態様において、遺伝子はプロモーターに機能的に連結される。別の態様において、プロモーターは系統特異的プロモーターである。別の態様において、プロモーターは赤血球系特異的プロモーターである。別の態様において、GOIはβ-グロビンである。別の態様において、GOIはγ-グロビンである。本発明の別の態様において、γ-グロビン遺伝子はβ-グロビン調節エレメントの制御下である。別の態様において、ベクターは遺伝子治療によって鎌状赤血球貧血を処置するために用いられる。別の態様において、ベクターは、鎌状赤血球貧血を処置するために強度軽減移植前処置と併せて用いられる。別の態様において、SINレンチウイルスは、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ/ヤギまたは霊長類由来の種々のレンチウイルスを含む。別の態様において、SINレンチウイルスは、HIV由来のSINレンチウイルスである。別の態様において、改変SINレンチウイルスベクターはトランスフェクションにより真核細胞へ導入される。
【００４１】
1つの態様において、本発明は、効率のために広範なCisエレメントを要しない小さな治療用導入遺伝子の発現のためのヘルパー依存性/最小の、したがってより低い組み換え誘導性かつ高安全性のSINレンチウイルスベクターをデザインする方法を提供する。別の態様において、小さな治療用導入遺伝子は、サイズが等しいか、または緑色蛍光タンパク質(GFP)よりも小さい。別の態様において、小さな治療用導入遺伝子はヒトβ-グロビンよりも小さい。
【００４２】
クロマチンインスレーターエレメント
本明細書において記述されるように、クロマチンインスレーターエレメントはヘテロクロマチンのまん延および遺伝子のサイレンシングを抑止し、クロマチン位置効果を低減し、エンハンサー遮断活性を有する。これらの特性は、無作為組み込みベクターでの一貫性のある予測可能な発現および安全な導入遺伝子送達には望ましい。クロマチン位置効果を克服することで、治療効果に必要とされるコピー数を減らすことができ、ベクターの遺伝毒性のリスクを減らすことができる。ベクター遺伝毒性は、X-SCIDの治験の患者における遺伝子治療に関連した白血病の発生以来、集中的な研究領域となった。γ-レトロウイルスベクターおよびレンチウイルスベクターを、自己不活化(SIN)のデザインに改変して、長い末端反復配列(LTR)のU3領域における遍在的に活性なエンハンサーを欠失させた。ニワトリp-グロビン遺伝子座由来の1.2 Kb DNAse高感受性部位-4 (cHS4)を3'LTRに挿入して、γ-レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターにおける5'LTRへのその複製を可能にした。絶縁ベクターは、低減されたクロマチン位置効果を有し、一貫性のある、それゆえ、改善された全体的発現をもたらす。hβ-グロビンおよび遺伝子座制御領域を保有しているcHS4絶縁および非絶縁レンチウイルスベクターの対照比較を行い、絶縁ベクターが、分化した後代の造血幹細胞における組み込み部位にかかわらず、一貫性のある、予測可能な発現を示し、2〜4倍高い全体的発現を引き起こすという発見を結果的にもたらした。また、最新の証拠から、cHS4絶縁レンチウイルスベクターが細胞性がん遺伝子の、挿入による活性化のリスクを低減しうることが示唆される。絶縁ベクターの有益な効果にもかかわらず、それらはまた、レンチウイルスベクターの3'LTRにおける全長1.2 KbのcHS4インスレーターエレメントの挿入によって力価の顕著な低減をもたらす。3'LTR中の挿入を含んだγ-レトロウイルスベクターによるウイルス力価の低下または不安定な伝染に関する類似の報告が存在している。この力価の低減は、事実上、インスレーターエレメントがなくても力価が中等度である、特にヒトβ-グロビン遺伝子(hβ)および遺伝子座制御領域(LCR)のような、比較的大きい発現カセットを保有しているベクターによっては、臨床試験用のベクター産生の規模拡大に対する制限になる。
【００４３】
ウイルスライフサイクルに及ぼすLTRへの外因性断片の挿入の効果については、取り組まれていない。ウイルス3'LTRにおけるcHS4、または他のインサートの挿入がレンチウイルスベクターの力価を低下させる機構について、それゆえ研究した。大きなLTRインサートは逆転写における侵入後制限消化、およびウイルスcDNAのLTRにおける相同組み換えの増加を介して力価を低下させ、かくして、組み込みのために利用可能なウイルスDNAの量を低減させる。これらの結果は、臨床的遺伝子治療用のベクターのデザインに重要な意味を持つ。原型のインスレーターであるニワトリ高感受性部位-4 (cHS4)エレメントに関する研究から、エンハンサー遮断活性をもたらし、位置効果を低減する、「コア」と名付けられた、cHS4の近位250 bp中のCTCFおよびUSF-1/2モチーフが同定された。しかしながら、コアだけでウイルスベクターが効果的に絶縁されるものではない。全長cHS4は優れた絶縁特性を有するが、その大きなサイズによってベクター力価が著しく損なわれてしまう。cHS4隣接レンチウイルス・ベクターの構造-機能分析を行い、クローン性の造血幹細胞後代における導入遺伝子発現ならびにcHS4および導入遺伝子プロモーターの後成的変化について分析した。
【００４４】
本明細書においてさらに記述されるように、コアはクローンによる発現の多様性を低減させただけであった。独特のインスレーター活性が遠位400 bpのcHS4配列内にあり、これはコアと組み合わされると、完全なインスレーター活性およびオープンなクロマチンのマークを導入遺伝子プロモーターおよびインスレーターにわたって回復した。これらのデータは、コアと類似の特性を有する新規の3'側400 bpのエレメントによって標準的5'コアの既知の絶縁活性を確固たるものとする。同時に、それらは優れた絶縁特性およびウイルス力価を有する。このデータは、インスレーター機能の分子基盤の理解および遺伝子治療ベクターのデザインに関して重要な意味を持つ。
【００４５】
1つの態様において、本発明は、全長クロマチンインスレーターの機能的部分を含んだ1つまたは複数の低減された長さのクロマチンインスレーターを組み入れることによってレンチウイルスベクターの力価を増加させる方法を提供する。別の態様において、機能的部分は単一型の全長クロマチンインスレーターに由来する。別の態様において、低減された長さの機能的インスレーターは、2つまたはそれ以上の別個の種々のクロマチンインスレーターの機能的部分を含む。別の態様において、機能的な低減された長さのクロマチンインスレーターは、ニワトリ高感受性部位-4 (cHS4)エレメントに由来する。別の態様において、機能的な低減された長さのインスレーターは、650塩基対以下のcHS4由来インスレーターである。別の態様において、1つまたは複数の低減された長さのcHS4由来インスレーターは、力価を増加させ、導入遺伝子発現の安定性を改善させるためにSINレンチウイルス発現ベクターに対する他の改変と組み合わされる。別の態様において、1つまたは複数の低減された長さのcHS4由来インスレーターは、ウイルス3'LTRの下流の異種ポリアデニル化(ポリA)シグナル配列およびU3欠失におけるUSE配列を含んだベクターに付加される。
【００４６】
鎌状赤血球病
鎌状赤血球病(SCD)は、β-グロビン遺伝子に影響を与え、最も一般的な遺伝的欠陥のうちの1つであり、欠損した鎌状グロビン(α2βS2として示される、2本の正常αグロビンおよび2本のβ鎌状グロビン分子から構成されるHbS)の産生を引き起こす。HbSは脱酸素によって重合し、円盤状の赤血球(RBC)の形状を異様な鎌状/かぎ形の形状へ変化させる。鎌状RBCは微小血管系を閉塞させて、有痛性の急性臓器虚血事象および慢性臓器障害を引き起こし、SCD患者の寿命を45歳まで短縮する。この疾患は110,000超の米国人に影響を与え、SCDを有する新生児1000人が毎年生まれており、アフリカでは毎年この疾患を持って1000人近くの乳児が生まれている。
【００４７】
SCDの治療選択肢は極めて限られており、骨髄造血幹細胞移植(HCT)を伴う。HCTは、一致した健常同胞ドナーがいる患者の10〜15%に対してのみ利用可能であり、重篤な免疫副作用を伴うことが多い。胎児ヘモグロビン(αおよびγグロビンα2γ2から構成されるHbF)は、胎児期および最初の6〜9ヶ月齢の間に産生され、強力な抗鎌状化特性を有し、生後1年で鎌状赤血球化から幼児を防御する。実際、SCDを有する遺伝性高HbF血症の個体は、無症候性である。HbFを増加させる化学療法薬ヒドロキシウレアは、SCDの症状を改善するためにFDAの承認が得られている。しかしながら、ヒドロキシウレアは、全ての患者に効くわけではなく、日々の生涯摂取のため、低コンプライアンスと関連している。ゆえに、より良好な治療選択肢がSCDのために必要とされる。
【００４８】
γ-グロビン遺伝子をコードするレンチウイルスベクターによる自家骨髄幹細胞(造血幹細胞)の遺伝子修正は、抗鎌状赤血球化HbFの産生を永続的に引き起こし、それによってRBC鎌状赤血球化を抑止することができよう。この方法は、全ての患者、特に一致した同胞ドナーを持たない者に対するその利用可能性と、それが1回限りの処置であって、生涯にわたる是正をもたらし、いずれの免疫副作用もないという事実とを含むため、現在利用可能な治療法よりも有利である。有効な遺伝子治療法は、SCDが処置されるやり方に大変革をもたらし、この壊滅的障害を有する患者の転帰を改善するであろう。
【００４９】
疾患是正-鎌状赤血球貧血の重要パラメータの特定
本明細書において開示されるように、HSCにおけるβ-グロビン調節制御エレメント下のヒトγ-グロビンの、レンチウイルスによる送達は、マウスにおいてSCAを是正するのに十分な出産後HbF発現をもたらす。HbFおよび形質導入HSCの量を次に、強度軽減移植前処置およびさまざまな感染多重度(MOI)を用いて脱スケール化し、是正に必要とされる重要パラメータを評価した。機能的および血液学的RBC指数、臓器病態、ならびに寿命の系統的定量化は、鎌状赤血球表現型を好転させるために必要とされるHbF、F細胞、HbF/F細胞および遺伝子改変HSCの最少量を特定するために重要であった。
【００５０】
本明細書においてさらに開示されるように、HbFが10%を超え、F細胞が循環血中RBCの3分の2を構成し、HbF/F細胞がRBC中の全ヘモグロビンの3分の1であった場合; およびおよそ20%のsGbG改変HSCが髄質に再配置した場合、疾患の改善が起きた。遺伝子修正は、長期追跡調査された一次または二次移植レシピエントにおいて維持された。本研究は、細胞用量および前処置レジメンのデザインに寄与し、ヒト臨床試験において等価な遺伝子的に是正されたHSCを達成するであろう、インビボモデルでの造血疾患の是正のための最低限のHSCキメラ現象を判定する方法について記述する。さらに、本研究は、遺伝的欠陥の是正に必要とされる遺伝子投与量および遺伝子改変された造血幹細胞投与量に対処する。
【００５１】
1つの態様において、本発明は、インビボモデルでの造血疾患の是正のための最低限のHSCキメラ現象を判定する方法を提供する。別の態様において、HSCキメラ現象を変化させる方法として移植前の強度軽減移植前処置が用いられる。別の態様において、MOI (30〜100)の範囲で細胞を形質導入することにより、形質導入されたHSCおよびベクターコピー/細胞の比率が変化される。別の態様において、MOIは20〜120である。別の態様において、最低限の判定されたキメラ現象および遺伝子投与量を用いて、細胞用量および前処置レジメンをデザインし、ヒト臨床試験において等価な遺伝子的に是正されたHSCを達成することができる。別の態様において、強度軽減移植前処置を臨床現場での移植の前に用いて、移植に関連した罹患率を低減させる。別の態様において、造血疾患は鎌状赤血球貧血である。別の態様において、造血疾患はβ-サラセミアである。
【００５２】
変異体γグロビンを介した鎌状赤血球病の遺伝子治療
本明細書において開示されるように、改善された変異体γ-グロビン遺伝子は、レンチウイルスベクターsGbGMから操作されている。このベクターはHbFを形成させる一層高い傾向を有し、改善された抗鎌状化特性を有し、ストリンジェントなホモ接合性SCDマウスモデルにおいて優れたSCD是正をもたらす。操作されたγ-グロビン遺伝子は、その機能を変化させることなくα-グロビンを結合する親和性の増大を有し、それによってRBC中のHbF形成の効率を大いに改善し、はるかに効率的な抗鎌状化効果をもたらし、SCD表現型を是正すると考えられる。
【００５３】
本明細書においてさらに開示されるように、操作されたsGbGMベクターは、sGbGベクターからの天然γ-グロビン遺伝子よりもHbFを形成させる傾向が2倍高く、効率的にUAB鎌状赤血球マウスを容易に是正する。両ベクターともBerkeley鎌状赤血球マウスにおいてSCDを是正する。かくして、sGbGMベクターはsGbGベクターと比べて、鎌状赤血球マウスでベクターコピーあたり2倍のHbF量を提供する。HbF量の増加をもたらすことに加えて、sGbGMベクターから産生された変異体HbFはまた、鎌状赤血球化の低減のため、天然HbFと比べてはるかに長い寿命を鎌状RBCに付与する。したがって、このベクターはヒト患者においてSCDを効率的に是正することができる。
【００５４】
当業者は、本発明の実践において用いられうる、本明細書において記述されているものと類似または同等の多くの方法および材料を認識するであろう。実際には、本発明は、記述される方法および材料にいかようにも限定されない。本発明のために、以下の用語が下記で定義される。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、主張される発明をよりよく説明するために提供されており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。具体的な材料が言及される限りにおいて、それは単に説明のためであり、本発明を限定するよう意図されるものではない。当業者は、発明力の実践なしに、および本発明の範囲から逸脱することなしに同等の手段または反応物質を開発しうる。
【００５６】
実施例1 β-グロビンのような大きな導入遺伝子カセットの効率的なパッケージングに必要とされるレンチウイルスCisエレメント
本研究は、レンチウイルス非コード化cis配列がRNA輸送、パッケージングまたはβ-グロビン発現において特別な役割を果たすかどうか調べた。β-グロビン遺伝子および遺伝子座制御領域(BG)、またはGFP cDNAを保有している自己不活化(SIN)-レンチウイルスにおいて、ベクターライフサイクルを研究した。パッケージング領域しか保有していない完全「ヘルパー依存性」の最小SIN-レンチウイルス; および漸増するHIV cis-エレメントを含んだSIN-レンチウイルスを用いて、SIN-γ-レトロウイルスと併せ、系統的分析を始めた。(i) GFPをコードするヘルパー依存性/最小SIN-レンチウイルスまたはSIN-γ-レトロウイルスは高い力価を生じ、高いGFP発現を媒介することが発見された。(ii) しかしながら、BGもしくは類似したサイズの大きな導入遺伝子のどちらかをコードするヘルパー依存性SIN-レンチウイルスまたはSIN-γ-レトロウイルスは、cis-エレメントを保有しているSIN-レンチウイルスと比べてほとんど検出できない力価を有していた。(iii) cis-エレメントの系統的付加から、mRNA輸送ではなく、レンチウイルス粒子の効率的なアッセンブリ/パッケージングのためには、Rev/RREが最も不可欠であり、それにgagおよびenvスプライスアクセプター配列が続くことが実証された。しかしながら、これらのHIV cis配列は一層小さな導入遺伝子の場合には不必要であった。これらの研究は、鍵となるレンチウイルスcis-エレメントと、それらが、大きなインサートを保有しているベクターにおいて果たす役割とを同定し、遺伝子治療に重要な意味を持つ。
【００５７】
実施例2 ヘルパー依存性SIN-γRVからのBG発現
γRVは、強力なγRV LTRプロモーター/エンハンサーエレメントと内部LCRエンハンサーとの間の転写干渉のためhβ-グロビンを成功裏に発現することができないものと仮定されている。SRS11.SFは、内部脾臓フォーカス形成ウイルス(SFFV)プロモーター/エンハンサーの制御下にGFP cDNAをコードするSIN-γRVである。SRS11.SFにおけるSFFV-GFPを、サラセミアで治療用ヒトβ-グロビン発現を達成するために標準的SIN-LVにおいて成功裏に利用された発現カセットBGと置き換えて、SRS11.BGを作製した。β-グロビンγRVの悪評にもかかわらず、SRS.11を用いる根本的な理由は、以下であった: (i) SRS.11は最小のパッケージング領域(Ψ)を含み、gag配列を欠き、より大きなベクター負荷量を運ぶことができ、それにもかかわらず極めて高い力価を保持している; (ii) SRS.11はSIN-LVにおける欠失に匹敵する、3'LTRの、大きな400 bpのU3欠失を保有している。(iii) 大きなLCRエレメントはベクター負荷量に対する制約のため、γRVにおいて一度も試験されていない。
【００５８】
SRS11.BGおよびSRS11.SF γRVベクターの感染力価および発現を、ネズミ科赤白血病(MEL)細胞株にて比較した。ヒトp-グロビンタンパク質発現は、SRS.11 SFを形質導入した細胞でのGFPの高発現とは対照的に、SRS11.BG形質導入MEL細胞からはほとんど検出不能であった。SRS11 BGベクター vs SRS11.SFベクターの非濃縮ウイルス力価は、6.8±5×103 IU/mL vs 4±0.2×106 IU/mLであった。ウイルスRNA (vRNA)転写産物は、ノザンブロット分析を介してSRS11.BGによる293T細胞において辛うじて検出可能であった(データは示されていない)。それゆえ、BG vRNAおよびウイルス粒子のγRVからの産生は、SINデザインおよび高いベクター負荷量について最適化されたものでさえ、ひどく損なわれた。
【００５９】
実施例3 標準的またはヘルパー依存性/最小LVからの大きな/小さな導入遺伝子の発現
本明細書において用いられるSIN-γRVとは対照的に、一般的に用いられる「標準的な」SIN-LVは、HIVゲノムの約20〜25%に達する比較的大きな部分のウイルス配列を保持する。これらのcisエレメントは以下である: LTR (wt HIV LTRの場合634 bpまたはSIN-LV LTRの場合235 bp)、パッケージングシグナルΨ(150 bp)、gag遺伝子の5'部分(300または600 bp)、rev応答エレメントを含むenv配列(RRE, 840 bp)およびpol遺伝子由来セントラルflap/ポリプリントラクト(cPPT) (120 bp)。
【００６０】
GFP vs BGに対するcis-配列の要件について調べるため、CMV-GFPカセットを、a) 上記のcis配列を含んだ「標準的な」SIN-LV (sSIN-GFP)、ならびにb) gag、RREおよびenv配列の残部が欠失され、Ψ領域だけが保持された「ヘルパー依存性」の最小SIN-LV (dsSIN-GFP; 図1A)にクローニングした。最小dsSIN-GFP LVの力価は、「標準的な」LV sSIN-GFPの力価よりも2倍低いだけであった 図1B; p<0.01; n=3。GFPベクターとはかなり対照的に、類似の標準的およびヘルパー依存性BG SIN-LV、sBG-6およびsBG-1ベクターの力価の差異は、1100倍 p<0.01; n=4; (図1B)であった。明らかに、LV非コード配列はLV粒子の産生のためにおよび/またはβ-グロビン発現のために必要であり; ならびにこれらの配列は、β-グロビン遺伝子をコードするLVの感染力価に顕著な効果を及ぼすが、しかしGFPをコードするものではそうでない。次に、「標準的な」(sFIG)またはヘルパー依存性(dsFIG) SIN LVにおけるsBG (図1A)として類似サイズの導入遺伝子カセットCMV-FANCA-IRES-GFP (FIG)を用いベクターを構築した。LV cis配列に対するFIGの同一の依存性: dsFIGベクターの力価は、観察されたsFIGのものよりも3桁低かった(図1B)。それゆえ、LV cisエレメントは小さなインサートには不必要であるが、しかし大きなインサートの高力価のためには必要である。
【００６１】
実施例4 cis配列の役割を研究するためにデザインされたLV構築体
どの特定のLV cis配列がこの効果に重要であったか、およびそれらが影響を与えたのはベクターライフサイクルのどの段階かを研究するため、一連の10種のSIN-LVベクターをクローニングした; それらのどれもBGカセットを保有していたが、しかし異なるレンチウイルス非コードcisエレメントを保有していた(図2)。BGとの関連で特定のenv (RREおよびSA)ならびにgag配列を研究する論理的根拠は、(i) 「標準的な」LVにおけるenv断片中のRREエレメントがRevタンパク質との結合後に核からの非スプライス/単一スプライス転写産物の輸送を促進することであった。(ii) envスプライス部位はvRNAの安定性およびパッケージングに対するその利用可能性において根本的な役割を果たし、既知の下流スプライスアクセプター(SA)配列がないことでcis作用性リプレッサー配列(CRS)活性がもたらされ、これによりHIV-1 RNAの細胞質蓄積が妨げられる。(iii) gag遺伝子の一部分はベクターに保持されて、vRNAパッケージングを補助する。Gag配列はパッケージングシグナルのRNA二次構造の折り畳みを促進し、粒子形成中のGagタンパク質とのvRNAの相互作用を容易にし、vRNAの二量体化に重要である。5'スプライスドナー部位およびgag遺伝子の最初の360 bpにマップされる配列は、非スプライスおよび単一スプライスウイルスmRNAを特定の核内区画へ向かわせ、そこからそのmRNAがRev/RREの助けで輸送される。
【００６２】
最初のベクター(sBG-1)は、パッケージングシグナル(5'スプライシングドナー部位を含む)およびcPPT/flapしか維持していなかった(図2)。このベクターから出発して、RRE、SAを含んだenv断片の残部、ならびに2つの異なるサイズのgag断片(360 bpおよび630 bp)を順次、sBG-2、sBG-3、sBG-5およびsBG-6へクローニングした。スプライシングアクセプター(SA)の活性を検証するため、env断片中の配列をPCR部位特異的突然変異誘発によって変異させた(sBG-4)。最後の4つのベクターでは、RREを含むenv断片全体を最初に除去し、長いおよび短い種類のgag断片だけを残した(sBG-9, sBG-10); またはさらに長いおよび短いgag断片の下流にRREを付加した(sBG-7, sBG-8)。
【００６３】
実施例5 異なるHIV cis配列の包含によるウイルス力価
RREエレメントのないベクター(sBG-1、sBG-9およびsBG-10)は、5.5±2.1×105 IU/mLから1.7±1.4×106 IU/mLに及ぶ濃縮力価を有していたが、これは、RRE配列を保有するベクター(sBG-2〜sBG-8; p<0.01)よりも2〜3桁低かった。実際に、RRE配列だけをsBG-1に付加してsBG-2を作製した場合、力価は100倍超だけ増した(5.5±2.1×105 IU/mL vs 8.7±6.5×107 IU/mL; p<0.01; 図3)。
【００６４】
SA部位を含んだenv断片の付加は、ウイルス力価を3〜5倍増加させた: sBG-3の場合2.9±0.9×108 IU/mL vs sBG-2の場合8.7±0.7×107 IU/mL(p<0.01)。この効果はSAに特異的であった。というのは、変異SAを有するenv配列を含む、sBG-4ベクターの力価は、1.1±0.61×108 IU/mLであり、RREしか保有していないsBG-2の力価に類似していたからである(sBG4 vs. sBG-3 p<0.01)。それぞれ、env (RREおよびSA)を含んだベクターsBG-5およびsBG-6への長いおよび短いgag断片の付加により、およそ4〜5倍だけの力価のさらなる増加が示され、sBG-6由来の力価は6.3×108 IU/mLに達していた(sBG-4 vs. sBG-5およびsBG-6 p<0.01)。このデータから、より長いgag部分は高いBG力価に必要とされないことが示唆された。しかしながら、RREおよびenv SA無しで、短い/長いgag断片だけを保有しているベクターの力価は、同様にRREを含んでいるもの(sBG-7およびsBG-8; p<0.01)と比べて、低かった(sBG-9およびsBG-10)。sBG-7、8、9および10の力価は、9.4±4.7×105 IU/mLから1.4±0.4×108 IU/mLに及んだ。力価はenv SAを含めることで3〜5倍だけさらに改善した。かくして、gag断片は単独で、または組み合わせgag/RREは、BGベクターに最適な力価を付与するには十分でなかったことから、HIV-1 cis配列が協調的に働くことが示唆された。
【００６５】
ウイルス力価に及ぼすRREの強力な効果がRev依存性であったかどうか研究するため、sBG-6ベクターをRev有りおよび無しでパッケージングした。これらの実験において、パッケージング系は3-プラスミド系から4-プラスミド系まで変えられ、ここでRevおよびGag-Polは異なるプラスミドから提供された。sBG-6の力価は、Revタンパク質無し(9.4×±5.8×104 IU/ml; p<0.01)よりもRev有り(3.8±0.3×107 IU/mL)でおよそ400倍高く、高力価にはRREとのRevの相互作用が必要であることが明らかにされた。
【００６６】
総合すれば、これらのデータから、HIV-1 Rev/RRE、gagおよびenv SAは、小さなGFPに基づくカセットには不必要であるが、BGまたはFIGなどの大きな積荷を保有しているLVの高力価のためには重要であったことが示唆される。
【００６７】
実施例6 ベクターライフサイクルにおけるLV cis-エレメントの役割
プロウイルス安定性および発現におけるLV cis-エレメントの役割を評価するために、形質導入されたMEL細胞に対するゲノムサザンブロット分析を行った。
【００６８】
hβ-グロビン含有γRVのゲノム再編成の過去の困難さを考えると、驚いたことに、予想されたサイズの1本のプロウイルスバンドのみがLVの大部分において検出された 図4A。いくつかの低力価ベクターは、サザンブロットの感度レベルで検出不能であった。パッケージング細胞におけるその後のノザンブロット分析から、予想された全長vRNA転写産物が全てのLVから作製されたことが確認され(図5A)、大きなBGカセットを保有しているLVが安定な感染のためにcis-配列を要しないことが確認された。
【００６９】
LV cis-配列が組み込みBGプロウイルスの発現のレベルに影響を与えたかどうか判定するために、ある範囲の感染多重度でMEL細胞にベクターsBG-1〜sBG-10を形質導入した。わずかな割合の遺伝子移入しか達成することができなかった、低力価のベクターの場合を除き、類似した割合のhβ-グロビン発現細胞(15〜20%)を有するMEL細胞プールにおいて平均蛍光強度(MFI)を比較した。形質導入されたMEL細胞集団のMFIは、低力価ベクターのものを含めて、全てのベクター間で同等で(62から110任意単位まで)あった(図4B)。かくして、LV cis-エレメントはBG発現の調節において主要な役割を果たしていなかった。
【００７０】
vRNA産生および細胞質輸送におけるRRE、gagおよびenv SAの役割を突き止めるために、パッケージング細胞における全長vRNAの作製、その後の細胞質輸送、アッセンブリおよびベクター粒子へのパッケージングを損ないうるベクターライフサイクルの段階について研究した。
【００７１】
全RNA、細胞質RNAおよび核RNAを、sBG-1〜sBG-10でトランスフェクションされた293Tパッケージング細胞から分画した。図5Aは、hβ-グロビンプローブでプローブされた全RNAに対するノザンブロット分析を示す。RRE無しのベクターを含めて、全てのベクター由来のインタクトなvRNAの正確なサイズのハンドを判定した(sBG-1、sBG-9およびSBG-10)。スプライスおよび非スプライスvRNA転写産物は、ベクターsBG-3、sBG-5およびsBG-6の場合に存在しているだけであった。というのは、これらのベクターがenv SA部位を保有しているからである。かくして、感知されるほどの異常なスプライシングはLV骨格のいずれでも起こらず、hβ-グロビン遺伝子およびLCRエレメントの組み換えの欠如を裏づけるものであり、γRVで報告された結果の対照をなすものであった。
【００７２】
意義深いことに、RREを含まないsBG-1、sBG-9およびsBG-10を含めて、非常に低い力価を有する全てのベクターが、最も高い力価のベクター(sBG-5およびsBG-6)に匹敵するか、またはそれよりも高い量でvRNAを産生した。この所見は予想外であったので、別の実験において、全RNAおよび細胞質RNAの分画有りで、ノザンブロットを繰り返し、同一の結果を得た。
【００７３】
Rev/RREは、細胞質への全長vRNAの輸送について最もよく特徴付けられている。それゆえ、次の段階は、RREがvRNA輸送を介して高力価に寄与したかを判定することであった。ノザンブロット分析から、RRE無しまたは有りの類似ベクターの細胞質中での同じような量のvRNAが明らかにされた(sBG-1 vs sBG-2、sBG10 vs sBG-8およびsBG-9 vs sBG-7; 図5B)。2回の別実験からのノザンブロットにおける細胞質RNAと全RNAとの比率を6Eに示してある。細胞質vRNA転写産物は、sBG-1と比べて、sBG-2において2倍高いだけであった。その逆はsBG-10およびsBG-9ベクターで見られ、この場合には細胞質vRNA転写産物は、RREを含んでいた類似ベクターsBG-8およびsBG-7よりもおよそ2倍高かった。RRE有りおよび無しのベクター間の力価の差異は2〜3桁であったので、RREは、これらのベクターによるvRNA転写産物の核輸送の増大において最小限の役割を果たしていた可能性が高い。
【００７４】
実施例7 RREを含む、LV cis-エレメントはパッケージングを改善する
パッケージング効率に及ぼすcis配列の効果を次に、同じように処理された全10種のベクターから精製されたウイルス粒子においてvRNA、p24レベルおよびウイルスに関連した逆転写酵素(RT)を分析することにより判定した。図6Aは、sBG1〜sBG-10 LVの代表的なドットブロット分析を示す。検出されたvRNAの量は、ホスホイメージャ分析によって判定した場合、ベクターの大部分ではベクター力価に比例しており、cis-配列を欠くベクターにおけるパッケージング効率の妨げを示している(図6B〜C)。
【００７５】
cis配列が標的細胞侵入後の段階に若干の影響を及ぼしうることを示唆した若干の例外が認められた; 293T細胞中のRNAならびにsBG-2およびsBG-4の感染力価は、sBG-4 vRNAが4倍高かったとはいえ、同等であった。sBG-4 vRNAは、より効率的にパッケージングされる場合でさえも、RNAを安定化することが知られているenv SAが存在しないため、標的細胞侵入後に安定ではない可能性があるように思われる。sBG-6およびsBG-7は同量のvRNAを有していたが、しかしsBG-7の力価は4〜5倍低かった; 繰り返して言うがsBG-7はenv SAを有していなかった。gagの阻害領域を含んだ、sBG-5は、高いvRNAを有していたが、しかし低い力価を有していた。
【００７６】
全体として、ウイルス粒子中にパッケージングされたBG vRNAの量は、全10種のベクターによりパッケージング細胞において産生された高レベルのmRNAにもかかわらず、標的細胞における形質導入/感染力価と相関していた。p24活性は濃縮されたウイルス調製物の全てで類似しており(図6D)、ウイルス様粒子(vRNAを含んでいない)が全てのベクターで効率的に形成されたことを示唆している。
【００７７】
実施例8 γRVおよびLVサイズ、負荷量および力価
BGを保有している標準的なLVの力価は最初に低く、かなりの濃縮を必要とする。しかしながら、LV cis-エレメントの除去によって力価は急激に(3桁だけ)落ちる。おそらく、これらのLV配列はアッセンブリを促進しながらパッケージング細胞において大きなvRNAを分解から防御するが、短いGFP vRNAはそのような要件がなくても効率的にパッケージングされる。ヘルパー依存性BG LVの低い力価は、293T細胞において5'LTR vRNA転写産物に対し逆方向で挿入されたβ-グロビン遺伝子プロモーターから生じるアンチセンスRNAからのものではない。ベクターのいずれでもノザンブロットにおいてアンチセンス転写産物は認められなかった。加えて、β-グロビン転写産物は赤血球特異的であり、293T細胞において産生されない。さらに、サイズがBGに類似していたが、しかしセンス方向であったFIGカセットも、力価に対しBGと同じ効果を有していた。
【００７８】
実施例9 Cisエレメントおよびベクターライフサイクル
いくつかのユニークな、いささか予想外の結果が本研究から浮かび上がった: (i) パッケージング細胞において、BG γRVで辛うじて検出可能なRNAとは対照的に、全てのBG LVで多量の転写産物が産生された。1つの可能性は、LV最小配列(R、U5およびΨ領域)が特定の細胞内区画においてBG vRNAに安定性を付与するということである。それゆえ、BG γRVとは根本的な違いのある、ヘルパー依存性LVからでさえも293T細胞において多量のvRNAが見られる。(ii) BG vRNAは予想されたサイズのものであって、Rev/RREの非存在下でさえも細胞質へ効率的に輸送されたことから、LVにおける「ガンマ遺伝子」の成功が、スプライシングおよびvRNA輸送を抑止するRREの典型的機能によって二次的に起きたものであるという考えに矛盾している。(iv) vRNAは、ヘルパー依存性LVがGFPのような小さな導入遺伝子をコードした場合にウイルス粒子へ効率的にパッケージングされた。このデータから、最小のパッケージング配列以外の、LV cis-配列は小さな導入遺伝子の場合には不必要であることが裏づけられる。
【００７９】
実施例10 パッケージングにおけるRREの役割
Rev/RRE相互作用はパッケージングおよび高力価ウイルス産生には最も重要であったが、ゲノムvRNAの輸送およびスプライシングされたメッセージの抑制において確立されたRev/RREの機能はBG LVにおいて顕著ではなかった。野生型HIVウイルスにおいて、Rev/RREの存在は、RREを含んだmRNAの安定化、正しい細胞内局在性および効率的な翻訳のために、mRNA輸送および利用経路の全体にわたって必要とされる。本明細書で提示されるデータは、RREが細胞質vRNAレベルに軽微な効果を及ぼしたが、しかしウイルス力価をおよそ100倍低減したことを示す最近の研究を裏づけるものであり、それを広げるものである。Rev/RRE要件は大きな導入遺伝子に特異的であるが、しかし小さな発現カセットには不必要であることがさらに明らかである。文献中の以前の報告とは異なり、本研究では、vRNA安定化におけるRREの役割を確かめなかった。というのは、RREのないベクターで等量またはさらに多量のvRNAが見られたからである。可能性の高い機構は、RREがウイルスアッセンブリおよびパッケージングに関与する能力である。
【００８０】
実施例11 env SAおよびgag配列の役割
env SAの存在は、ウイルスゲノムを安定化させ、より高いウイルス産生をもたらすことが明らかにされている。SAの存在はまた、env SAなしのいくつかのベクターが、env SAを有する類似のベクターと比較した場合、標的細胞において同じv-RNAを有していたが、しかしより低い形質導入/力価を有していたので、侵入後のレベルでvRNAを安定化しうる。gagタンパク質の翻訳を防ぐために開始コドン変異を有する、gag配列は、ウイルスパッケージング中のLVの産生に役立つ。本研究において、この要件が大きな導入遺伝子カセットに特有であることが分かった。gagを含んだRNAの安定性を低下させることが以前に明らかにされているgag遺伝子414 bp〜631 bpに存在する阻害配列の除去が、力価を3.5倍だけ増加させたことも実証された。
【００８１】
結論として、本研究は、LVが大きな導入遺伝子カセットをコードする場合に非コードcis配列によって影響を受けるウイルスライフサイクルにおける段階; およびGFPのような一層小さな導入遺伝子に対するその非必須性について記述する。これらの結果は、LVベクターのデザインにおいて新しい知見を提供する。小さな治療用導入遺伝子のためにヘルパー依存性/最小LVをデザインすることが可能であり得、これは遺伝子治療の用途においてより低い組み換え誘導性かつ高安全性であろう。
【００８２】
実施例12 ウイルスベクターデザイン
LV: sSIN-GFPベクターをクローニングするために、以前に用いられた標準的なSIN-LV骨格の3'LTRを改変して、転写産物の終結を改善させた: β-成長ホルモンポリアデニル化シグナルを3'LTRの下流に付加し、SV40後期ポリアデニル化シグナルに由来するUSE配列をU3欠失中に付加した。sSIN-GFPプラスミドからClaI-NruI断片を除去することにより、dsSIN-GFPを得た。マルチクローニング部位
0006509884.tif 000002
をsSINのClaIおよびEcoRI部位にクローニングした。β-グロビン-LCR (BG)カセットをXhoIおよびSmaI部位へ逆方向にクローニングし、この親構築体をsSIN-BGと名付けた。sBG-0は、Eco47IIIとNruIとの間の領域を除去し、sSIN-BG由来5'LTRの後にHIV-1パッケージング配列(Ψ)だけを残すことによって得た。cPPTをsBG-0 ClaI部位へクローニングした(sBG-1)。RRE、RRE-env、短いgag (360 bp)、長いgag (630 bp)に対するPCR断片をXhoI平滑化末端にクローニングし、これらのベクターをそれぞれ、sBG-2、sBG-3、sBG-10、sBG-9と名付けた。プライマー配列（Fはフォワードプライマーを意味し、Rはリバースプライマーを意味する）は以下の通り。
0006509884.tif 000003
【００８３】
gag ATGの中にジヌクレオチドCAを挿入するプライマーGag Fを用い、gag開始部位を無効にするためgagの5'配列において開始コドンにフレームシフト変異を挿入した。長いgagおよび短いgag PCR断片をsBG-2のXhoI部位へクローニングすることにより、ベクターsBG-7およびsBG-8を得た。env配列中のSA部位を破壊するための点突然変異を、
0006509884.tif 000004
プライマーを用いて行い、sBG-4を作製した(Env断片内のwt SA配列CAGはCGAへ変異導入された)。長いgag PCR断片をsBG-3のXhoI部位へクローニングすることにより、sBG-5を得た。γRV: SRS11.SF γRVプラスミドは、Axel Schambach博士およびChristopher Baum博士(Hannover, Germany)から厚意により提供していただいた。SRS11.BGベクターにおいて、ヒトβ-グロビン-LCR (BG)をSRS11.SFレトロウイルスベクタープラスミドのPstI部位へ逆方向にクローニングした。全ベクターの画が図2に描かれている。
【００８４】
実施例13 ウイルス産生
LVは、ベクタープラスミド、パッケージング(Δ8.9)およびエンベロープ(VSV-G)プラスミドを用いて既述のように、293T細胞の一過性コトランスフェクションにより産生された; ウイルスを含有する上清を、トランスフェクションから60時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。実験中の全ベクターが同時にパッケージングされ、25,000 rpmでの超遠心分離により全てのウイルス上清から1400倍にウイルスが濃縮された。既述のように、マウス赤白血病(MEL)細胞またはHT1080細胞に濃縮ウイルスの連続希釈液を感染させ、それらを分化させ、それらを蛍光活性化細胞ソーター(FACS)によりHbAまたはGFP発現について分析することにより、ウイルス力価を測定した。γRVは同様に産生されたが、しかし濃縮されなかった。全てのトランスフェクションおよびその後の力価測定は、三つ組で行われた。Rev有りおよび無しの、ベクターのパッケージングは、パッケージングプラスミドΔ8.9をpMDLg/pRREおよびpRSV-Revと置き換えたことを除き、同様の方法にしたがい行った。ベクタープラスミド:pMDLg/pRRE:pRSV-Rev:VSV-Gの比率は、4:4:3:1であった。
【００８５】
実施例14 細胞株
ネズミ科赤白血病細胞(MEL)株および293T細胞は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS) (U.S. Bio-technologies, Inc, Parker Ford, PA)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Mediatech, Inc., Herndon, VA)中で維持された。MEL細胞は、当技術分野において既述されているように、20% FBSおよび5 mM N,N'-ヘキサメチレンビスアセタミド(Sigma)を含有するDMEM中で分化するように誘導された。
【００８６】
実施例15 HbA染色およびFACS分析
抗ヒトHbA抗体を用いてヒトβ-グロビンを標識するために用いられた方法論は、既述の通りであった。手短に言えば、細胞を室温で60分間4%パラホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、ペレットを5分間100%メタノールに再懸濁させた。固定された細胞を次に、PBSで洗浄し、非特異抗体(Ab)結合を室温で10分間、5%スキムミルクを用いてブロッキングした。その後、細胞をPBS中で洗浄し、ペレット化し、透過処理した。細胞を2本のチューブに分け、暗所中にて室温で30分間、陰性対照として抗ζグロビン-フルオレセインイソチオシアネート(FITC) Ab (1 μg/106個の細胞)または抗HbA-FITC Ab (0.1 μg/106個の細胞) (Perkin Elmer, Waltham, MA)のいずれかで染色した。未結合のAbをPBSでの最終の洗浄により除去した後に、それらをFACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)にて分析した。
【００８７】
実施例16 全RNAおよび細胞質RNAノザンブロット
トランスフェクションから72時間後に293T細胞を回収し、PBS中で洗浄した。核RNAおよび細胞質RNAの単離は、氷上でNEB緩衝液(10 Mm Tris-HCl pH 7.4; 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2; 5% IGEPAL)とともに7分のインキュベーションで得られる。遠心分離後、RNA-STAT (Tel-Test, INC, Texas)を、細胞質RNAを含有する上清に添加し、製造元の使用説明書にしたがってRNA抽出を進めた。RNA-STATを用いて293T細胞から全RNAを抽出した。ノザンブロットを次に、標準的なプロトコルにしたがって行った。ブロットを32P標識β-グロビンプローブとハイブリダイズさせた。RNAの負荷を正規化するため、膜を次いでストリップにし、32P標識18Sプローブで再プローブした。細胞質RNAの純度を試験するため、膜をストリップにし、細胞質調製物においてイントロン転写産物を検出しなかったGAPDHイントロンプローブに特異的な32P標識プローブで再プローブした。
【００８８】
実施例17 ゲノムサザンブロット
ゲノムDNAを形質導入MEL細胞から単離されたDNAに対して行い、ゲノムDNA 10 μgをAflII酵素で消化し、標準的なプロトコルにしたがってサザンブロットを行った。ブロットをβ-グロビンLCRプローブのHS2断片とハイブリダイズさせた。QIAamp vRNA Mini Kit (Qiagen)を製造元の使用説明書にしたがって用い、同じ量の濃縮ウイルスからRNAドットブロットvRNAを抽出した。手短に言えば、ウイルスを高い変性条件の下で溶解させ、その後、シリカゲルに基づく膜に結合させた。2回の洗浄段階により混入物が効率的に洗い流され、vRNAがDEPC-水30 μl中に溶出された。溶出後、vRNAをDNAse Iにより室温で20分間処理し、サンプルを65℃でインキュベートすることにより増幅品質等級のDNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA)を不活化させた。vRNAを次に、65℃で15分間、3容量の変性用緩衝液(65%ホルムアミド、8%ホルムアルデヒド、MOPS 1×)中で変性させた。変性後、2容量の氷冷20×SSCを添加し、ドットブロット装置を通じた吸引によってナイロン膜にRNAを結合させた。ブロットを32P標識β-グロビン特異的プローブとハイブリダイズさせ、X線フィルムを終夜感光させた。
【００８９】
実施例18 クロマチンインスレーター - 概要
クロマチンインスレーターは、活性な転写ドメインを分離し、ゲノムにおけるヘテロクロマチンのまん延をブロックする。原型のインスレーターであるニワトリ高感受性部位-4 (cHS4)エレメントに関する研究から、エンハンサー遮断活性をもたらし、位置効果を低減する、「コア」と名付けられた、cHS4の近位250 bp中のCTCFおよびUSF-1/2モチーフが同定された。しかしながら、コアだけでウイルスベクターが効果的に絶縁されるものではない。全長cHS4は優れた絶縁特性を有するが、しかしその大きなサイズによってベクター力価が著しく損なわれてしまう。cHS4隣接レンチウイルス・ベクターの構造-機能分析を行い、クローン性の造血幹細胞後代における導入遺伝子発現ならびにcHS4および導入遺伝子プロモーターの後成的変化について分析した。コアはクローンによる発現の多様性を低減させただけであった。独特のインスレーター活性が遠位400 bpのcHS4配列内にあり、これはコアと組み合わされると、完全なインスレーター活性およびオープンなクロマチンのマークを導入遺伝子プロモーターおよびインスレーターにわたって回復した。これらのデータは、コアと類似の特性を有する新規の3'側400 bpのエレメントによって標準的5'コアの既知の絶縁活性を確固たるものとする。同時に、それらは優れた絶縁特性およびウイルス力価を有する。このデータは、インスレーター機能の分子基盤の理解および遺伝子治療ベクターのデザインに関して重要な意味を持つ。
【００９０】
実施例19 ベクター構築体および実験デザイン
5' 250 bpの「コア」(sBGC)、コアの2つの縦列反復配列(sBG2C)、5' 400 bp (sBG400)、5' 800 bp (sBG800)または全長1.2 KbのcHS4インスレーター(sBG-I)のいずれかを組み入れるように自己不活化レンチウイルスベクターをデザインした。全てのベクターはヒト(h)β-グロビン遺伝子およびプロモーターならびに遺伝子座制御領域エンハンサーを保有していた。逆転写により、標的細胞中の組み込みプロウイルスは絶縁3' LTRが5'LTRにコピーされ、両端でhβ-グロビン発現カセットに隣接するように、異なるインスレーター断片を3' LTRのU3領域へ順方向にクローニングした。5' 250 bpコアの外側のエレメントが空間的な足場を単に提供しただけかどうかを評価するため、コアの下流に不活性なDNAスペーサーを有するベクターsBG400SおよびsBG800Sについても試験した。全てのベクターを非絶縁対照sBGと比較した(図7A)。
【００９１】
最初に、MEL細胞にレンチウイルスベクターの各々を感染させ、単一の組み換え体MELクローンを同定した(図7B)。全ての分析は、hβ-グロビンを保有し、PCRによってインタクトなインスレーター配列を有するものと検証され、ベクターコピー数についてqPCRに供された単一コピーMELクローンに対してだけ行われた; FACSによりhβ-グロビン発現を分析した: 1) hβ-グロビン発現細胞の割合(% hβ+細胞)を用いて、染色体位置効果を判定し、2) 変動係数(CV)によって判定された、クローン内の細胞におけるhβ-グロビン発現に関する発現のバラツキを用いて、クローンによる発現の多様性を判定した(図7C)。ChIP分析を異なるプロウイルスにおいてインスレーター領域およびhβ-グロビン遺伝子プロモーターにわたるヒストンに対して行い、後成的修飾について研究した。これらのベクターのクロマチン位置効果をインビボで、移植から24週後にベクター形質導入HSCを移植したHbbth3/+サラセミアマウスのRBCにおいて確認した。その後、二次移植を行い、移植後の単一組み換え体CFU-Sをhβ-グロビンタンパク質およびmRNAについて分析した。マウスにおいて、血液学的分析、およびhβ-グロビンタンパク質に対するHPLCをさらに行って、発現を定量化した。
【００９２】
実施例20 クロマチン位置効果から防御するために必要なcHS4の領域
以前の結果と一致して、非常に高い%のhβ+細胞が、対照sBGクローンと比べ、sBG-I単一組み込み体クローンに存在していた(P<0.01); sBGC、sBG2C、sBG400およびsBG800クローンにおけるhβ+細胞の%は、sBG対照クローンと有意差がなかった(図8A)。LTRにおけるcHS4の存在が組み込みを偏らせなかったこと、および分析が異なるクローンに対して行われたことを確実にするために、無作為に選択された10個のsBGまたはsBG-I MELクローンに対するLM PCRおよび組み込み部位配列決定によった。明白な偏りなく、非絶縁クローンと絶縁クローンとの間で異なる遺伝子の近く/中で挿入が行われた。cHS4コア(sBGC)、または最大800 bpまでの、コア下流のインスレーターの伸長配列の存在は、% hβ+細胞をさらには増加させなかった;プラスミドに基づく系においてエンハンサー遮断効果を付与することが明らかにされているとはいえ、コア配列の縦列反復配列でも同様であった。
【００９３】
導入遺伝子発現で見られた別の現象は、同じ組み込み部位を有する娘細胞においてさまざまなレベルの発現として規定された、クローンによる多様性である。クローンによる多様性を判定するための定量的方法は、形質導入クローンのFACS分析およびクローンにおける導入遺伝子の平均発現あたりの導入遺伝子の発現の変動係数(CV)の計算によるものである。CVは、サンプル標準偏差(SD)とサンプル平均との間の比率として計算されたバラツキの、単位のない尺度である。高いCVは、非絶縁sBGクローンにおいて観察された(図2B)。CVは、5' 250 bpコアを含んだベクターの全てで顕著に低減された。これらの結果が、コアの下流に不活性なDNAスペーサーを保有していたベクター: sBG400SおよびsBG800Sに由来するクローンにおいて確認されたことから、CVの低減がインスレーターコアに特有であり、全長インスレーターが存在することを要した、% hβ+細胞に関するデータとは対照的であることが示された。
【００９４】
特筆すべきは、sBG2Cプロウイルスにおいてのみインスレーター配列がないことがインスレーター配列に対するPCRから明らかであり、MELクローン24クローンのうちの6つ(25%)が両LTRから欠失されたコアの両コピーを有していたことであった。その他全てのベクターからのクローンにおけるインスレーター配列の欠失は観察されなかった。sBG2C MELプールのサザンブロット分析から、細胞の大部分でのコアの一方/両方のコピーの欠失が確認された。レトロウイルスベクターにおいて組み換え事象を引き起こすことが知られた、反復配列の逆転写から、反復コア配列を有するベクターの不安定な感染が引き起こされた可能性が高い。全長cHS4と対比してコアのこの効果はサラセミアマウスにおいて、インビボで確認された。移植から6ヶ月後にhβ-グロビン発現について末梢血RBCを分析した。sBG、sBGC、sBG2C、sBG400およびsBG-I群のマウス由来RBCにおけるFACS分析(図9Aに示された代表的なプロット)から、MEL細胞におけるデータと同様に、sBG群のマウスと比べて、sBG-I群のマウスにおいてのみ% hβ+ RBCが有意に高かった; およびコアを保有していた全てのベクターにおいてCVが有意に低かった(P<0.01; 図9B〜C)ことが明らかである。総合すれば、このデータから、染色体位置効果を遮断するためには全長cHS4が必要とされることが示唆される。
【００９５】
実施例21 二次移植後のネズミ科HSCのクローン性後代におけるクロマチン位置効果
クロマチン位置効果を次に、単一コピー二次CFU-Sにおいて確認した。二次コロニー形成単位-脾臓(CFU-S)アッセイ法は、造血幹細胞に由来する細胞におけるクロマチンインスレーターエレメントの後成的効果を研究するための「究極の判断基準」となる最もストリンジェントなアッセイ法であると考えられている。とりわけ、赤血球特異的SINレンチウイルスベクターによる導入遺伝子サイレンシングの欠如に関して報告された結果に一致して、ベクター特異的配列に対するPCRにより陽性とされ、FACSによりhβ-グロビンを発現していなかった、形質導入CFU-Sは観察されなかった。(1) % hβ+細胞および(2) TER-119陽性の赤芽球に対するFACS分析から、異なるベクター群の間でTER-119+細胞の割合に差異のないことが明らかにされた(示されていない)。しかしながら、有意に高いhβ+細胞%は、sBG-Iベクターによる二次CFU-Sにおいて存在していただけであった。かさねて、非絶縁sBGを形質導入したCFU-Sと比べて、コアを保有している全てのベクターで形質導入されたCFU-SにおいてCVは有意に低かった(図3D〜E)。各マウス群から無作為に選択された6つのCFU-Sに対するリアルタイムRT-PCR分析から、sBGベクターと比べて、sBG-I CFU-SからのmRNA発現がおよそ2倍高いことが明らかにされた。しかしながら、sBGC、sBG2CおよびsBG400を形質導入したCFU-Sからの発現は、sBG CFU-Sのものとは有意差がなかった。総合すれば、これらのデータから、sBGC、sBG400、sBG400S、sBG800およびsBG800Sにおける5' 250 bpのコア配列がhβ-グロビン発現の、クローンによる多様性を特異的に低減させたことが示唆される。しかしながら、異なる組み込み事象からの発現の可能性の改善には、全長cHS4エレメントが必要とされた。
【００９６】
実施例22 絶縁ベクターにおけるコア領域およびβ-グロビンプロモーター領域中でのヒストンアセチル化およびメチル化のパターン
次に、さまざまなインスレーター領域で見られた特異的効果に付随する後成的修飾を、MELクローンにおける異なるプロウイルスの間で活性ヒストンマークacH3、acH4およびH3K4me2と抑制ヒストンマークH3K9me3およびH3K27me3の相対レベルを比較することにより判定した。ChIP分析を半定量的PCR (図10B〜C)およびリアルタイムPCR (図10D〜F)により、ベクターごとに一緒にプールされた3つの代表的なクローン(選択されたクローンは図8A中で黒丸として示されている)においてcHS4コアに対し行った。sBG-Iベクター組み込み体を保有しているクローンは、「コア」を保有していた3つのベクターsBGC、sBG400およびsBG800と比べて、cHS4「コア」断片にわたり、活性クロマチンマークのおよそ6倍の富化を示し、抑制クロマチンマークを減らした。
【００９７】
ヒストン修飾を、非絶縁ベクター(sBG)および「コア」を保有していたその他全てのベクターにおいてhβ-グロビンプロモーターにわたり分析して、ベクターにおける導入遺伝子プロモーター全体のヒストンパターンの差異がクローンによる多様性の低減に寄与しえたかどうか評価した。非絶縁sBGプロウイルスと比べて、sBGC、sBG400およびsBG800プロウイルスによる抑制クロマチンパターンH3K27me3のわずかな、しかし有意な低減が認められた(図10F, 右パネル)。しかしながら、最大のインスレーター活性が存在していたsBG-Iプロウイルスにより、hβ-グロビンプロモーター領域は抑制クロマチンパターンを顕著に低減させた。
【００９８】
これらのデータから、「コア」配列とcHS4の5' 800 bpまでのコアの伸長が、導入遺伝子プロモーターにわたって活性化マークをわずかに低減させたことが明らかである。しかしながら、cHS4および導入遺伝子プロモーター領域にわたる抑制ヒストン修飾の大幅な低減は、cHS4の遠位3'側400 bpの配列がさらに存在していた場合に起きただけであった。
【００９９】
実施例23 非絶縁ベクターおよび絶縁ベクターで形質導入されたHSCを移植したサラセミアマウスにおける血液学的パラメータ
貧血、網状赤血球増加および他のRBC指数は、非絶縁hβ-グロビンレンチウイルスベクターで刊行された報告と一致して、sBGベクターでさえも改善された(図11A)。モック移植マウスのヘモグロビンは7.7±0.2 gm/dLであり、sBG群のマウスは10.4±0.7 gm/dLであり、細胞あたり1.2個のベクターコピーであった。sBG-I群のマウスは、sBG群のマウスと比べて細胞あたりのベクターコピーが半分であったにもかかわらず、さらに高いヘモグロビンおよびさらに低い網状赤血球計数を有していたこと(ヘモグロビン11±0.2 gm/dL; 細胞あたり0.6個のベクターコピー)は注目に値するものであった。形質導入の効率について正規化した場合、これは、sBGマウスにおけるベクターコピーあたりヘモグロビン2.3 gmの増加とは対照的に、モックマウスと比べて、sBG-Iマウスにおけるベクターコピーあたりヘモグロビン5.2 gmの増加になる。実験マウスからのRBCパラメータから、顕著な改善が明らかにされた(図11A; これらのデータはベクターコピー数について正規化されていないことに留意されたい)。これらの指数の改善は、ベクターコピーについて正規化されていなければ有意差がなかったとはいえ、sBG-Iマウスで最も高かった。
【０１００】
血中hβ-グロビンタンパク質に対するHPLC分析から、sBG-Iマウスにおいてのみ顕著に高いhβ-グロビン発現が確認された: sBGマウスでの19±6%と比べて、sBG-IマウスではRBC中の全ヘモグロビンの43±3%がhβ-グロビン(hβ2mα2)に由来したが、sBGC、sBG400およびsBG2C群のマウスでのそれは対照と有意差がなかった(図11B)。sBG2C群のマウスにおけるヒトhβ-グロビン発現および血液学的パラメータは、非絶縁対照群において見られたものと同様であった。
【０１０１】
実施例24 3'400 cHS4領域におけるインスレーター活性
cHS4の5' 800 bpはCVを低減させただけであったが、完全なインスレーター活性が全長1.2 Kbのインスレーターで回復された。cHS4 (sBG3'400)由来MELクローンの遠位/3' 400 bpの領域だけを保有しているベクターを作製し、マウスにsBG3'400形質導入LSK細胞を移植した。先に記述したベクターとは異なり、このベクターは5'250 bpの「コア」配列を含まないことに留意されたい(図12A)。sBG3'400ベクターはMELクローンにおけるhβ+細胞%またはマウスにおけるhβ+ RBC%に及ぼす効果がなく(図6B,D)、sBGクローン、または5' 250 bpの「コア」を保有しているもの(sBGC)と同程度の効果であった。しかしながら、5'コアを保有している全てのベクターと同様に、sBG3'400はMELクローンにおいておよびRBCにおいてhβ-グロビン発現のCVを顕著に低減させた(図12C,E)。
【０１０２】
HPLC分析によって測定された、sBG3'400マウスにおけるhβ-グロビンタンパク質の量は、sBGと有意差がなかった(17.5±3% vs 19.5±5.6%)が、しかしsBG-Iマウスにおいて見られたものよりも少なくとも2倍低かった(43±3%; P<0.01) (図12F)。全体として、cHS4の3' 400 bpは、5' 250 bpコアと極めてよく似た活性を有していた(図9): それはクローンによる多様性を低減させ、MELクローンでのおよびRBCでのhβ-グロビン発現のCVの低減に反映されたが、しかしhβ-グロビン発現赤血球の比率に効果を及ぼさなかった。個々の単一コピーの二次CFU-Sにおける3' 400 bpの「コア様」効果(図12G〜H)が確認され、結果はsBGCベクターによるものと同様であった(図9D〜E)。3' 400領域はCTCFまたはUSF-1に対する既知のコンセンサス配列を有しておらず、この領域はこれまでに分析されていなかった。5'コアも3' 400 bpも、単独で存在した場合、組み込み体の発現の可能性を改善させること/位置効果から防御することができないのは注目に値するものであった。
【０１０３】
実施例25 3' 400 bpと組み合わされた5'「コア」のインスレーター活性
cHS4インスレーターの5' 250 bpコアおよび3' 400 bp配列(sBG650ベクター; 図13A)が組み合わされた場合、このベクターはMELクローンにおいて、移植されたマウスのRBCにおいておよび二次CFU-Sにおいて、sBG-Iベクターと同じように働いた。sBG650 MELクローンおよびRBCにおけるhβ-グロビン発現細胞の比率(図13B〜D)は、sBGクローンと比べて有意に高く(P<0.001)、sBG-Iクローンに類似していた。同様に、sBG650クローンのCVはsBG-Iクローンに匹敵していた(図13C)。一次マウスのRBCにおけるhβ-グロビン発現は、sBG-Iマウスに匹敵していた(図13D)。HPLC分析によって測定された、sBG650マウスにおけるhβ-グロビンタンパク質の量は、sBG-Iマウスと有意差がなかった(それぞれ41±2.6% vs 43±3%)が、しかしsBGマウスにおいて見られたもの(19±6%; P<0.01)よりも少なくとも2倍高かった。移植から5ヶ月後に、二次移植を行ってCFU-Sを作製し、これによってsBG650ベクターがsBG-Iベクターで見られたものに類似のインスレーター活性を回復することが確認された(図13E)。sBG650プロウイルスにおけるコア全体のクロマチン配置(図13F)から、インスレーターコアおよびβ-グロビンプロモーターの両方にわたり、sBG-Iプロウイルスにおいて見られたものと同一の、オープンクロマチンパターンの回復が明らかにされた(図10)。
【０１０４】
実施例26 cHS4の3'400 bp領域における後成的修飾およびコアとのその相互作用
cHS4の遠位3' 400 bp部分のクロマチン配置は、これまでに研究されていない。ヒストンパターンは当初、3' 400 bp領域(sBG3'400)にわたり、単独で存在する場合(sBG3'400)で、または5'コアと組み合わせて存在する場合(sBG650およびsBG-Iにおいて)で分析された(図14)。sBG3'400プロウイルスの3'400領域におけるヒストンのアセチル化およびメチル化パターン(図14B)は、sBGCプロウイルスにおける250 bpのコア領域において見られたものに類似していた(図10)。しかしながら、sBG650およびsBG-Iプロウイルスにおいて、3' 400 bpの配列はアセチル化マークを増加させ、抑制マークを低減させたことから、再度、cHS4の近位および遠位末端の組み合わせがオープンクロマチンパターンに必要であることが明らかにされた。この効果は、sBG-I (図10DおよびF)またはsBG650 (図13FおよびG)における5'コア領域またはβ-グロビンプロモーター領域にわたるChIP分析を連想させるものであった。総合すれば、遺伝学的および後成的分析から、インスレーターおよびプロモーター上でクロマチンの後成的修飾のために相互作用して十分なインスレーター活性を損なう2つのコアとして、インスレーターの5'および3'末端が機能していたことが示唆された。
【０１０５】
しかしながら、3' 400 bp領域は、cHS4に対しそれぞれがエンハンサー遮断およびバリア活性を損なうことが明らかにされた既知のCTCFまたはUSF-1モチーフを有していない。しかしながら、CTCFおよび/またはUSF-1はおそらく、3'400領域へ動員されうるものと考えられる。USF-1およびCTCFに対する抗体を用いて、クロマチンをMELクローン由来のsBGC、sBG3'400、sBG650およびsBG-Iプロウイルスから免疫沈降させた。半定量的PCRおよびqPCRを用いてChIP分析を行った。コア領域に対するプライマーを用いてChIP産物を増幅させた場合、予想通りおよび先に示した通り、5'コア領域へのCTCFおよびUSF-1の動員が明白であった(図14C〜D)。興味深いことに、3'400領域のプライマーを用いてChIP産物を増幅させた場合、コア領域の全体で見られたものよりも若干低いレベルではあるが、sBG3'400プロウイルスはCTCFの富化を示した。しかしながら、より顕著には、sBG650およびsBG-Iプロウイルスは3' 400 bp領域での両方のUSF-1の富化、つまり近位コアおよび遠位400 bp配列の両方が存在していた場合に見られた効果を示した。3' 400 bp領域は、sBG3'400において単独で存在する場合、USF-1を結合しなかった(図14E〜F)。これらのデータは、3' 400 bp領域がCCCTCコンセンサスの欠如にもかかわらずCTCFと相互作用することを示唆しており、これは、この領域における「コア様」活性を説明しうるものであり、(sBG-IまたはsBG650における) cHS4インスレーターの5'コア領域と3' 400領域との間の相互作用はUSF-1を介して起こる可能性が高い。
【０１０６】
実施例27 650 bpのcHS4インスレーターでのベクター力価
1.2 KbのcHS4はSIN-レンチウイルスベクターの力価を顕著に低下させ、対ヒト臨床試験のための大規模ウイルス産生を制限する。力価の低減の機構は、とりわけ、3'LTRにおけるインサートの長さに起因することが最近になって明らかにされている。sBGと比べて、sBG650は、sBG-Iの10.4±2倍低い力価とは対照的に、sBGよりも2.5±0.9倍だけ低い極めて理にかなった力価(n = 3)を有していた。それゆえ、最適化されたこのインスレーターを、均一な、それゆえさらに高い発現をもたらし、大規模産生へ拡張可能であろう一層安全な遺伝子治療ベクターのデザインのために用いることができる。
【０１０７】
全長cHS4インスレーターは本発明者らによりおよび他者らにより、染色体位置効果からウイルスベクターを防御することがこれまでに明らかにされている。しかしながら、ウイルス力価に及ぼす重大な有害効果が、その有用性を妨げてきた。インスレーターのコアであると特徴付けられた、cHS4の5' 250 bpだけを用いようとする試みは、プラスミドに基づく系におけるコアの顕著な活性、およびこれらの領域での変異によるインスレーター活性の喪失にもかかわらず、ウイルスベクターにおいて失敗した。
【０１０８】
cHS4インスレーターおよびβ-グロビンプロモーターを取り囲む領域は、天然の位置における構成的に一層高い活性クロマチンマークであることが明らかにされている。cHS4は、隣接するヘテロクロマチンドメインが高抑制ヒストンマークH3K9me3およびH3K27me3を有する場合でさえも、β-グロビンドメインへのヘテロクロマチンの広がりを防ぐ。sBG-Iベクター組み込み体を保有しているクローンは、これらの後成的マークの有意差が観察されなかった、sBGC、sBG400およびsBG800ベクターと比べてcHS4コアの全体で活性クロマチンマークの富化および抑制クロマチンマークの著しい減少を示した。
【０１０９】
機構的に、インスレーターにおけるUSF-1/2エレメントは、ヒストン修飾酵素をコアに動員し、ヒストンリジンメチル転移酵素SET7/9およびp300/CREB結合タンパク質関連因子(PCAF)と相互作用し、かくして活性クロマチンマークを増加させることが明らかにされている。しかしながら、コアまたは3' 400bpにわたってacH3、acH4およびH3K4me2において、それらがsBGC、sBG400、sBG800およびsBG3'400ベクターにて導入遺伝子に隣接していた場合は、そのような増加は観察されなかった。この効果には、全長cHS4を保有しているベクター(sBG-I, 図10および14)またはコアと3'400bpの両方を組み合わせたsBG650ベクター(図13および14)が必要とされた。hβ-グロビンプロモーター全体のChIP分析は、非絶縁ベクターと比べて、コア単独で、ある程度プロモーター全体の抑制クロマチンマークが低減されることを明らかにした(図10F)。これによってコアを保有しているベクターによるCVの低減を説明することができる。しかしながら、コアは3' 400 bpの領域に依存しており、逆に、3' 400 bpの領域は、これらの領域の両方にわたる高度のヒストンアセチル化および無から最小の抑制マークのためにコアに依存していた。
【０１１０】
周囲のクロマチンに及ぼすcHS4の効果を説明するために提唱されたモデルには、メチル-CpG-結合タンパク質の排除による、導入遺伝子サイレンシングに対する防御が含まれる; 実際に、cHS4はレトロウイルスベクターによるサイレンシングをブロックすることが明らかにされている。非絶縁ベクターでさえもマウス、または培養下で最大6ヶ月まで維持されたMELクローンにおいて経時的なβ-グロビン発現の消滅は観察されなかった(データは示されていない)。これは、HS2およびβ-グロビン遺伝子プロモーターに位置するE-ボックスエレメントと相互作用することが明らかにされているβ-グロビンLCR高感受性部位におけるいくつかのUSF-1エレメントに起因するものでありうる。LCRにより付与されたサイレンシングに対するこの抵抗性は、cHS4コアで見られたいずれの活性も無効にしうるものと考えられる。これらの結果は、HIV-1に由来するものを含むレトロウイルスが、トランスジェニックマウスにおいて関連遺伝子座制御領域(LCR)β-グロビンレポーター遺伝子を優性に沈黙化させるというPanellらによる結果と対照をなす。メチル化を分析し、インビボで、一次および二次レシピエントで赤血球特異的SIN-レンチウイルスベクターによるCpGメチル化の欠如および発現の消滅が認められることがその後に報告された。このデータから、他の場合はプロモーターメチル化によるサイレンシングの影響を受けにくい赤血球ベクターにおいて、全長cHS4が、導入遺伝子プロモーターに対して、およびそれ自体に対してヒストンパターンを改変し、位置効果を低減することが可能であったことが示唆される。
【０１１１】
興味深いことに、3' 400 bp領域のインシリコ分析から、CTCFまたはUSF1結合部位ではなく、複数の既知の転写因子に対する部位が明らかにされた。これらの転写因子のいずれか、またはおそらく新規のタンパク質が、CTCFおよび/またはUSF-1との相互作用パートナーでありうる。CTCFはコヒーシン複合体への結合を介して活性クロマチンマークと抑制クロマチンマークとの間の均衡を直接調節する。このデータは、3' 400 bp領域がまた、CTCFと相互作用しうることを明らかにしている: とはいえ、sBG3'400プロウイルスから3'400 bpおよびCTCFを共免疫沈降させること(図14C〜F)は、不成功であった。
【０１１２】
興味深いことに、3'400 bpは、5'コア配列がさらに存在していた場合にだけUSF-1抗体で共免疫沈降され、USF-1がcHS4の5'末端と3'末端との間で架橋を形成して、位置効果を低減させる可能性が高いことが示唆された。3' 400 bp内のエレメントが、USF-1またはコヒーシンおよび/もしくはヌクレオフォスミン複合体を結合するヒストンアセチル化酵素を動員して、位置効果に影響を与えるかどうかは、判定することが重要であろう。
【０１１３】
最終的に、インビトロでのおよびインビボでのcHS4のインスレーター活性の系統だった遺伝的および後成的分析を行い、3' 400 bpにおける新規の「コア様」活性が同定された。USFまたはCTCFに対するコンセンサス部位を含んでいない、cHS4の3' 400 bpは、それにもかかわらずCTCFを結合するが、USF-1はcHS4の5'コアおよび3' 400 bpを結合かつ架橋するように思われる。最適化された「650 bp」のcHS4配列が隣接する新しいベクター系は、ウイルス力価のさしたる喪失もなく導入遺伝子の優れた絶縁をもたらし、遺伝子治療にとって重要な安全性かつ有効性という意味合いを持ちうる。
【０１１４】
実施例28 材料および方法 - レンチウイルスベクター
全てのベクターは、記述のように、レンチウイルスプラスミドのU3 3'LTR領域中のNheI/EcoRV部位へ異なるインスレーター断片をクローニングすることによって得られた。このプラスミドは、ヒト(h) β-グロビン遺伝子およびその調節エレメント(BG)を保有していた。全てのインスレーター断片は、記述のように、インスレータープラスミドpJCI3-1 (Gary Felsenfeld博士, NIH, MDから厚意により提供していただいた)を用いてPCRにより増幅され、配列決定により検証された。1.2 kbのcHS4インスレーター有りおよび無しのhβ-グロビンベクターのクローニングは、既述されている。sBG1Cベクターは、EcoRI/XbaI 250 bpコアインスレーターPCR産物を、pBSプラスミドのBamHI/EcoRI制限部位へsBGに挿入することによってクローニングされた。250 bpコアの第2のコピーを次に、pBS 1-コアプラスミドにEcoRI/KpnI部位へ付加し、かくしてpBS 2-コアプラスミドを得た。250 bpコアの2つの縦列コピーを次に、KpnI/XbaIでpBS-2コアプラスミドを消化することによって単離し、その後、sBGベクターへクローニングし、sBG2Cを得た。sBG400およびsBG800ベクターは、2つのPCR産物をsBG NheI/EcoRV部位へクローニングすることによって得られた。DNAスペーサーを含んだベクターは、次のプライマーの組み合わせ: スペーサーF1およびスペーサーR1、スペーサーF1およびスペーサーR2、を用いて異なるλ-ファージDNA部位を増幅させ、それぞれ、150 bp、550 bpのλ-DNAを増幅させることによって得られた。ClaI/EcoRI消化されたPCR断片をpBS-1コアプラスミド中のEcoRI/ClaI部位へライゲーションし、pBS-1コアプラスミドからの400 bpおよび800 bpの断片を、それぞれ、HincII/XbaIおよびXbaI/XhoIで制限消化し、sBGのNheI/EcoRV部位へクローニングした。ウイルスは、293T細胞の一過性コトランスフェクションにより産生され、MEL細胞にて力価測定された。
【０１１５】
実施例29 材料および方法 - 細胞株
MEL細胞および293T細胞は記述のように、10%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS; U.S. Bio-technologies, Inc.)を補充したDMEM (Mediatech, Inc)中で維持され、分化された。MEL細胞は、試験かつクローニングされたベクターの各々について5%未満の形質導入効率を達成するように形質導入された。各ベクターからの3回の独立した形質導入に由来する、およそ400個のクローンをhβ-グロビン遺伝子についてPCRによりスクリーニングした; インタクトなインスレーター領域について陽性のクローンをスクリーニングした。このようにして同定されたクローンを次に、単一の組み込み体についてqPCRに供し、増幅させ、凍結保存した。クローンのセット全部を融解し、分化させ、FACSによって同時に分析した。
【０１１６】
実施例30 材料および方法 - ネズミ科造血幹細胞の形質導入および移植
Hbbth3/+サラセミアマウスを移植のために用いた。全ての動物実験は、施設における動物の使用と管理に関する委員会(Institutional Animal Use and Care Committee)により承認されたプロトコルを用いて行われた。系統Sca-1+c-kit+ (LSK)の造血幹細胞/前駆細胞の濃縮は、骨髄の単個細胞懸濁液に対して免疫磁気分離およびFACS選別により行われた(補足の材料および方法S1における詳細)。LSK細胞を既述の通り12時間の間隔で2回、MOI 10にて濃縮されたベクター上清によりStem Span (Stem Cell Technologies Inc, Vancouver, BC)中で形質導入した。形質導入された10,000個のLSK細胞を、10.75 Gyの放射線照射を受けたサラセミア・レシピエントへ2×105個のLK細胞とともに同時移植した。CFU-Sアッセイ法: 個別の脾臓コロニー形成単位(CFU-S)を先に記述したように、移植後24週の一次マウスからの骨髄細胞の移植後12日の時点で調査した。
【０１１７】
実施例31 材料および方法 - hβ-グロビン発現の分析
全血球算定は、Hemavet (Drew Scientific, Inc, Oxford, CT, USA)にて行われた。網状赤血球算定数は、全血1 μlをRetic-COUNT試薬(BD Biosciences, CA) 200 μlで染色することにより分析され、FACSCalibur (BD)にて数え上げられた。RBC中のhβ-グロビンタンパク質の定量分析は、既述のように高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)によって血液の溶血血液に対し行われ、mRNA分析は、正規化用のネズミ科α-グロビンを用い、hβ-グロビンに特異的な検証済みのプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムRT-PCR (ABI Biosystems)により行われた。hβ-グロビンの細胞内染色後のFACS分析は、既述のように行われた。
【０１１８】
実施例32 材料および方法 - クロマチン免疫沈降(ChIP)
ChIP分析は、若干の変更を加えて記述のようにMELクローンに対して行われた。手短に言えば、インプットおよび抗体結合クロマチン画分からのDNAサンプルを、三つ組でプライマーセットを用いSYBRグリーン(Applied Biosystems)を使ってqPCRにより分析し、データを既述のように分析した。濃縮比を、DNA-ChIPのDNAインプットに対する比を計算することによって割り出し、ヒストン修飾データを、「抗体なし」(IgG)対照ならびにネクジン5'領域およびプロモーター領域に対応するプライマーに対し、抑制されたクロマチンの対照として正規化して、免疫沈降の効率を正規化した。全てのDNA-ChIP 対 DNA-インプット比は、[希釈率(ChIP)/希釈率(インプット)]で除した2[Ct (インプット) - Ct (ChIP)]として計算された。全てのPCR産物のCt値は、SDS 1.2ソフトウェア(Applied Biosystems)によって特定された。平均およびSEM値を倍相違、および対応のある両側t検定について特定し、統計的有意性(p<0.05)の判定を行った。
【０１１９】
実施例33 材料および方法 - 組み込み部位分析
ライゲーション媒介性(LM)ポリメラーゼ連鎖反応を、Modlichらにより記述されているように行って、記述したプライマーおよび条件を用い組み込み部位をマッピングした(Arumugam, Mol Ther 2009, 近刊で引用)。
【０１２０】
実施例34 材料および方法 - 統計分析
ベクターをsBGベクターと比較した; スチューデントの「t」検定(対応のないおよび両側)。多重比較のために群間でANOVA (ダネット型多重比較検定)も行われた。データは平均±SEMとして表現された。P<0.05を有意と見なした。
【０１２１】
実施例35 1.2 Kbニワトリ高感受性部位-4インスレーターエレメント(cHS4)が隣接する自己不活化レンチウイルスは、導入遺伝子の、一貫した、改善された発現を提供するが、しかし著しく低い力価を有する
1.2 Kbニワトリ高感受性部位-4インスレーターエレメント(cHS4)が隣接する自己不活化レンチウイルスは、導入遺伝子の、一貫した、改善された発現を提供するが、しかし著しく低い力価を有する。内部カセットでさらに1.2 Kbだけレンチウイルス導入遺伝子カセットを長くしても、さらなる力価の低減は引き起こされなかった。しかしながら、cHS4配列またはサイズを増加させる不活性なDNAスペーサーを3'LTRの中に配置した場合、感染力価はインサートの長さに比例して減少した。大きなcHS4 3'LTRインサートを保有するベクターによって影響を受けるベクターライフサイクルのステージを、対照ベクターと比較した: 3'LTR中の1.2 Kb cHS4の挿入によって読み過し転写の増加は認められなかった。等量の全長ウイルスmRNAがパッケージング細胞において産生され、ウイルスアッセンブリ/パッケージングが影響されることはなく、どちらのベクターによっても同じ量のインタクトなウイルス粒子が産生された。しかしながら、3'LTR中のcHS4を保有しているレンチウイルスは、標的細胞への侵入後に非効率的にプロセッシングされ、逆転写および組み込み効率が低く、ゆえに形質導入の力価は一層低かった。それゆえ、3'LTR中に大きな挿入を有するベクターは、効率的に転写されパッケージングされるが、しかしLTRインサートはウイルスRNAプロセッシングおよび標的細胞の形質導入を妨げる。これらの研究は、組み込みベクターのデザインにおいて重要な意味合いを持つ。
【０１２２】
実施例36 1.2 Kbだけのベクターゲノムの長さの増加はウイルス力価に影響を与えない
本研究の1つの目的は、cHS4による力価の低減が、他の点では大きなhp-LCR (BG)レンチウイルスベクターにおけるウイルスゲノムのさらなる延長のため二次的に起きたものかを判定することであった。大きなウイルスRNAゲノムは、組み込みベクターにおいて低い効率でパッケージングされることが知られている。複製可能なγ-レトロウイルスは、付加された配列を取り除き、再結合させて、その当初のウイルスサイズに戻す。ウイルスの天然サイズを超えるγ-レトロウイルスベクターにおいて、力価の低減はウイルスライフサイクルの複数の段階 - 全長ゲノムの作製、ウイルスキャプシド形成/放出および侵入後の組み換え事象で起こる。とりわけ、BGレンチウイルスはおよそ7 Kbの導入遺伝子インサートを含み、それゆえ野生型HIV-1ウイルスの天然サイズ/パッケージング能よりも大きなウイルス-RNAゲノムを産生しない。しかしながら、レンチウイルスベクターにおいて、導入遺伝子インサート6 Kbまたはそれ以上に由来するウイルス力価の低下が、パッケージング効率の低減の結果起きることが示されている。
【０１２３】
非絶縁ベクターBGおよびBGMが最近、位置効果について類似の絶縁ベクターBG-IおよびBGM-Iと比較された。BGレンチウイルスベクターはhβおよびLCRを保有しているが、類似のベクターBGMは、hp-LCRの下流にPGKプロモーター駆動性のメチルグアニンメチル転移酵素(P140K) cDNA (PGK-MGMT)インサートをさらに保有している。PGK-MGMTカセットはサイズが1.2 Kbである。BG-IおよびBGM-Iベクターは、加えて3'LTR中に1.2 KbのcHS4インスレーターを保有する。既述のように、ウイルスを全4つのベクターから同じように産生およびプロセッシングさせ、感染力価を測定した。濃縮BGベクターの力価は2±0.5×108 IU/mLであったが、さらに1.2 Kbの内部カセットを保有している、BGMの力価は5±0.8×108 IU/mL (n=4)で、わずかに高かった。対照的に、BG-Iと名付けられた、BGベクターに対する3'LTR中1.2 KbのcHS4の付加によって、3.8±0.8×107 IU/mLへの、ほぼ6倍の力価の低減がもたらされた。BGM-Iと名付けられた、BG-Iベクターに対する1.2 KbのPGK-MGMT内部カセットのさらなる付加は、それ以上、力価を低減させなかった(図20B)。これらのデータから、全体的なウイルスゲノムサイズではなく、LTRへのcHS4の挿入によりウイルス力価が低減されたことが示唆される。Ramezaniらは、比較的小さい導入遺伝子発現カセット(サイズが2 Kb以下)をコードするレンチウイルスベクターに1.2 KbのcHS4が挿入された場合に、レンチウイルス力価の3倍の低減を観察した。本データは、それらの結果と一致しているが、cHS4の付加による力価の6〜10倍の低減を示唆している。ウイルスゲノムのサイズの増大に依存しない異なる機構により、LTRにおけるインスレーターエレメントの挿入での力価の低減が起きたことが本研究においてさらに観察された。
【０１２４】
実施例37 3'LTR中のインサートのサイズは力価の低減に関与している
用いたLVベクターはHIV-1ウイルスの天然サイズを超えていなかったが、cHS4インサートのサイズ(1.2 Kb)は野生型LTRの天然サイズを超えていた(注目すべきはwt LTRが付加的な400 bpのU3エンハンサーを保有することであり、これは自己不活化3'LTRからは欠失される)。実験を行って、ウイルス力価の低下がその天然の最大限度(400 bp)を超えるSIN LTRの延長によるものであったかどうか、またはウイルス-RNAの折り畳み/細胞タンパク質への結合に影響を与え、かくしてパッケージングを制限する可能性のある、インスレーター中の特異的配列によって力価が低くなったかどうかを判定した。自己不活化レンチウイルス骨格sSINにおいて、3'LTRの中に異なる長さのcHS4断片: コアとも呼んだ、インスレーターの最初の250 bp、3' SIN LTR中のU3プロモーター/エンハンサー欠失のサイズに適合している、400 bpのcHS4断片、および800 bpのcHS4断片、を保有している、一連のp-グロビンベクターを構築し(図15a)、それぞれ、sBGc、sBG400、sBG800ベクターを作製した。これらのベクターを、類似の「非絶縁」ベクターsBG、および全長1.2 Kbのインスレーターを保有しているベクターsBG-Iと比較した。加えて、縦列反復配列(250 bp×2)としての2コピーのコアを伴ってベクターをクローニングした（sBG2C）。cHS4コアは全長(1.2 Kb)インスレーターのエンハンサー遮断活性の50%を有することが明らかにされている; コアの効果はコピー数に依存することが明らかにされており、cHS4コアの縦列反復配列が全長1.2 KbのcHS4と同じ絶縁性能を有することが報告されている。
【０１２５】
記述のように、ウイルスを同時的な一過性トランスフェクションおよび濃縮によってsBG、sBGc、sBG400、sBG2C、sBG800、sBG-Iプラスミドから作製し、ウイルスの連続希釈液を感染させたマウス赤白血病(MEL)細胞のフローサイトメトリーによって力価測定した。MEL細胞は成人型グロビン産生を支持する。各実験は4回反復された。
【０１２６】
3'LTR中のcHS4インサートのサイズが増すにつれて、ウイルス力価が落ちることが分かった(図15b)。250 bpおよび400 bpのインサートでわずかな、しかし統計的に有意な力価の低減が認められた。しかしながら、インスレーター断片の長さに比例して、力価がその後、急落した(図15b)。1.2 Kbの全長cHS4インスレーターを有するベクターsBG-Iの力価は、非絶縁対照ベクターsBGよりも1桁低かった。注目すべきは、2つのcHS4コア配列の縦列反復配列(500 bpのインサート)を有するsBG2Cベクターは、sBG800と類似の力価を有していた。
【０１２７】
力価の低減が特異的cHS4配列に由来するものではなく、LTRインサートのサイズの効果によるものであったことを確実にするため、さらに3つのベクターsBG400-s、sBG800-sおよびsBG1200-sを構築した。これらのベクターは、cHS4コアの下流にλファージDNA由来のスペーサーエレメントを含み、それぞれ400 bp、800 bpおよび1.2 Kbの3' LTRインサートを作製したことを除き、sBG400、sBG800およびsBG-Iに類似していた(図15a)。コアcHS4配列は、力価の低減がコアで最小限であった(また、初期実験では観察されなかった)ので、保持された; そしてコアの下流の付加配列が最適なインスレーター活性に必要であるかどうかを判定することが重要であった。DNAスペーサーを含んだベクターの力価は、類似サイズのcHS4断片を含んだものと同一であり、3'LTR中の断片のサイズの増加とともに減少した(図15d)。これらのデータから、3'LTRの延長が力価を低下させ、この効果がcHS4中の特異配列に由来するものではなかったことが明らかである。HIV-1 RTは強プロセッシブポリメラーゼではないことが報告されている; HIV-1 RTは頻繁にその鋳型から解離し、ウイルスDNAは比較的短いセグメントとして合成される。それゆえ、U3 LTR中のインサートのサイズが増すにつれて、3' LTRを通じて累進的な低減が認められた可能性が高い。
【０１２８】
実施例38 組み換えは3'LTR中の反復エレメントで行われる
組み換え事象がLTR中の2コピーのコアまたは異なるサイズの断片の挿入の結果LTR中で行われるかどうか検出するために、絶縁ベクターの系列の全て(sBGC、sBG400、sBG2C、sBG800およびsBG-I)で形質導入されたおよそ12〜20個のMEL細胞クローンを作製した。組み込まれたプロウイルスの単一コピーを持った全てのクローンを、既述のように、qPCRを用いて同定した。各クローンのゲノムDNA由来の250 bpのコアを次いで、標準的なPCRにより増幅させた。インスレーターコア配列は、sBG2C形質導入細胞に由来するものを除き、全てのベクターに由来するクローンから増幅させることができた。sBG2C MELクローンにおいて、インスレーターコアはPCRにより24個中6個(25%)の単一コピークローンにおいて検出不能であったことから、プロウイルスの5'および3' LTR中のcHS4コア配列の縦列反復配列の両方の欠失が示唆された(図20D)。組み換えプロウイルスの頻度をさらに分析するため、sBG2C形質導入MEL細胞プールに対するゲノムサザンブロット分析を行った。sBG2CおよびsBG-I MEL細胞集団由来のゲノムDNAは、LTR内で切断する酵素によって制限消化された。図15Eは、sBG2Cベクターおよび対照として用いたsBG-Iベクターで、予想された長さのプロウイルスを示す。sBG-I形質導入MEL細胞において単一のプロウイルスバンドが見られたが、MEL細胞中のsBG2CプロウイルスはcHS4コア配列の一方または両方のコピーの喪失を示した。実際に、2つのインタクトなコアコピーを含んだプロウイルスのバンドは、サザンブロット分析の感度のレベルでは検出されなかった。これらのデータから、sBG2C中の縦列反復配列が高い頻度で組み換えられることが明らかである。sBG2Cベクターは、それゆえ、LTRインサートのサイズではなく、逆転写中の組み換え事象によって一層低いウイルス力価を有していた。これらの結果は、γ-レトロウイルスおよびレンチウイルスベクター内の反復エレメントが頻繁に組み換えを行うことが明らかにされていたので、予想外というわけではなかった。
【０１２９】
実施例39 3'LTRへの大きなインサートによって影響を受けるベクターライフサイクルにおける段階
RNAベクター中の大きなウイルスゲノムは、RNAパッケージングのレベルで制限されることが明らかにされている。本研究において、1.2 Kbまでウイルス負荷量を増加させても力価に及ぼす効果は認められなかったが、LTR中のインサートの長さを増加させることで力価が減少した。次に、これがウイルス力価に影響を与えた機構について探索した。ウイルスライフサイクル中の以下の段階について研究した: 1) パッケージング細胞中で産生されたウイルス-RNAの特徴、2) ウイルス粒子産生、3) 侵入後の段階: 逆転写、核移行、組み込みおよびプロウイルス完全性。これらの研究の全てで、最大のインサートを有するベクターsBG-Iを、インスレーターのないベクターsBGと比較した。
【０１３０】
実施例40 3'LTR中のcHS4の挿入は、パッケージング細胞中のウイルス-RNAの量または質を変化させない
パッケージングプラスミド(D8.9およびVSV-G)とともにsBG、sBG-Iベクタープラスミドを用いた一過性トランスフェクション後の293Tパッケージング細胞に由来するRNAに対してノザンブロット分析を行った。ブロットをhp断片でプローブした。図16は、sBGおよびsBG-Iベクターの、予想された長さの類似した強度のウイルス-RNA転写産物を示す。プローブは28Sおよび18S RNAを非特異的にプローブした。それにもかかわらず、予想された長さの全長ウイルスRNA以外のさらなるバンドは認められず、インスレーターの挿入によって組み換えまたは異常なスプライシングが行われなかったことが示唆された。かくして、ウイルス-RNAはLTR中のインサートの存在に関係なく、パッケージング細胞において効率的に産生された。
【０１３１】
実施例41 3'LTR中のcHS4の挿入は読み過し転写を増加させない
実験を行って、LTR中のウイルスポリアデニル化シグナル上流のcHS4インサートがウイルスRNAの転写産物終結を損ないうるかどうか判定した。読み過し転写産物は、キャプシド形成から排除されることが明らかにされており、ウイルス力価を低下させうる。図16中のノザンブロットから、予想されるサイズのウイルス-RNAバンドと、外来の転写産物のないことが示されたが、転写の読み過しは、γ-レトロウイルスベクターと比べて、レンチウイルスベクターでははるかに低く、ノザンブロットを介して容易に検出できないかもしれないことが示された。それゆえ、感受性酵素に基づくアッセイ法を用いて、読み過し転写を研究した。
【０１３２】
野生型HIV-1 LTR、(それぞれsBG-IまたはsBGベクター由来)インスレーター有りまたは無しのSIN HIV-1 3'LTRをEF1-αプロモーターの下流に配置したプラスミド構築体をクローニングした。LTRからの転写の読み過しからしかcre発現が行われないように、プロモーター無しのIRES-creカセットをLTRの下流に配置した。EF1a-IRES-creプラスミドを陽性対照とした。これらのプラスミドの等量を、cre発現に比例してβ-ガラクトシダーゼを発現するレポーター細胞株TE26へトランスフェクションした。GFPプラスミドを読み過しプラスミド構築体とともにコトランスフェクションして、トランスフェクション効率のためにβ-ガラクトシダーゼ活性を正規化した。トランケートされたラット神経成長因子受容体を保有しているプラスミドを、陰性対照とした。細胞へトランスフェクションされた陽性対照IRES-creプラスミドの量と、分光光度計によって測定されたβ-ガラクトシダーゼ活性の線形相関を示す、標準曲線を作成した。cHS4インスレーター無しのSIN LTRを保有しているものと比べて、絶縁SINレンチウイルスLTRを含んだトランスフェクション構築体からのβ-ガラクトシダーゼ活性において顕著な増加は観察されなかった。β-ガラクトシダーゼアッセイ法からの結果は、カバーガラス上にプレーティングされたTE26細胞のLac-Z染色によって確認された場合に、同一であった。これらの結果から、ウイルスポリアデニル化シグナル上流にcHS4エレメントを挿入することでは、LTRからの読み過し転写が増加されないことが明らかにされた。
【０１３３】
実施例42 ウイルスゲノムを含んだウイルス粒子の産生は、cHS4によって影響を受けない
ウイルス-RNAがウイルス粒子へ効果的にキャプシド形成されたかどうか判定するため、p24レベル、ウイルスに関連した逆転写酵素(RT)活性およびウイルス-RNAレベル(図17a〜c)を測定した。ウイルスを2つのベクターで同時に同一の方法で作製し、3回の別実験において同様に濃縮した。ウイルス調製物の純度が高いことおよびタンパク質またはプラスミド混入が無いことを確実にするため、ウイルスをスクロースのクッション上でペレット化し、これらの実験のためにDNAse消化に供した。プラスミド骨格中に存在するアンピシリン耐性遺伝子に対するqPCRにより、プラスミド混入の欠如を確認した。同じ量のウイルス調製物を次いで、p24 ELISAおよびウイルスに関連したRTのアッセイ法に供した; ウイルス-RNAをドットブロット分析のために抽出した。図17aは、2つのベクター間でウイルス関連RTの量に差異がなかったことを示している。また、sBGおよびsBG-Iウイルス調製物中のp24レベルも類似していた(図17b)。sBG-Iウイルス粒子がウイルスゲノムを含有し、空のウイルス様粒子ではないことを確実にするため、ウイルスをRNAドットブロット分析に供した。図17c〜dは、2つの代表的実験のうちの1つを示す。sBGおよびsBG-I由来のウイルスRNAを4つの異なるp24希釈液に二つ組で負荷した(図17c); ドットの強度をホスホイメージャによって定量化した(図17d)。どちらのベクターからキャプシド形成されたウイルスmRNAの量も同様であった。これらのデータから、LTR中1.2 Kbの断片の挿入がウイルスmRNAのパッケージング効率またはウイルス粒子の産生に影響を与えなかったことが示唆される。
【０１３４】
LTRへの大きなインサートによる本結果は、延長された内部導入遺伝子カセットを有するレンチウイルスベクターがウイルス粒子へ非効率的にパッケージングされるというSuttonおよび同僚らによる結果と対照的である。sBGおよびsBG-Iベクターからは等量のウイルス粒子が産生されたが、しかし顕著に低い感染/形質導入の力価から、組み込みの低い単位の原因となる、大きなLTRインサートを担持するウイルスの侵入後ブロックが示唆される。
【０１３５】
実施例43 大きなLTRインサートは逆転写およびウイルスcDNAの組み込みに影響を与える
逆転写、核移行、組み込みおよびプロウイルス完全性を含む、侵入後の段階について調べた。逆転写: 逆転写の段階、qPCRプライマーおよびプローブの位置ならびにウイルスDNA産物が図18aに要約されている。逆転写はゲノムRNAの5'末端近くのプライマー結合部位から開始し、マイナス鎖合成がゲノムの5'末端へ進行する(マイナス鎖強力停止DNA (-sssDNA))。新たに形成された-sssDNAは、ゲノムの3'R領域とアニールし(第1鎖移転)、ウイルスRNA鋳型のRNase H消化を伴って、マイナス鎖DNA合成が再開する。逆転写プロセスが効率的であるためには、3'末端のウイルスRNAの二次構造が、-sssDNA移転の重要な決定因子であることが明らかにされている。それゆえ、3'LTRのU3領域中のインスレーター/インサートの存在が、この複雑なプロセスに関与する領域の二次構造を変化させ、逆転写効率の全体的な減少を引き起こす可能性が高い。
【０１３６】
逆転写効率を評価するため、MEL細胞に、p24レベルに基づいて、等量のsBGおよびsBG-Iウイルス粒子を感染させ、細胞を感染後の異なる時点で回収した。プラスミド骨格中に存在するアンピシリン耐性遺伝子に対するqPCRにより、プラスミド混入がないことを確認した(データは示されていない)。R/U5領域に及ぶプライマーおよびプローブを用いて、初期逆転写(-sssDNA産生)の動態を研究した(図18b)。予想通り、sBGまたはsBG-IウイルスRNAの5'末端は同一であったので、2つのウイルス間で、動態において検出された差異はなかった。それにもかかわらず、データから、qPCRがウイルス逆転写を正確に判定することが実証された。
【０１３７】
しかしながら、RTが鋳型をスイッチ(マイナス鎖ジャンプ)して3'LTRを逆転写する場合、U3領域中のインサートの存在による二次構造の変化が逆転写産物を低減させるものと考えられる。U3/RおよびΨ領域を増幅させる定量的PCRを行って、それぞれ、sBGおよびsBG-Iベクターを感染させた細胞における中期および後期逆転写ウイルスcDNAの量を定量化した(図18c〜d)。第1鎖移転直後のRT効率が損なわれたことが発見された。とりわけ、U3/Rプライマーによって、インスレーター配列の前で逆転写されたウイルスDNAが増幅されたことから、3'LTR中のインサートが3'LTRを変化させまたは3'LTRの「働きを抑制する(poisoning)」ことで逆転写に影響を与えたことが示唆された。実際に、中期RT産物形成の非効率性は、後期RT産物で見られたものに類似していた。両分析において、ウイルスcDNAの組み込み、および過去に報告されていた逆転写の動態と一致して、ウイルスcDNA合成のピークは非絶縁ベクターsBGの場合には12時間の時点で起こり、その後、徐々に減少した。絶縁ベクターsBG-IからのウイルスDNAの量は全ての時点で、早ければ標的細胞侵入から6時間後に、約2倍だけsBGと比べて侵入後に低くなった。これらのデータから、マイナス鎖ジャンプ後の逆転写がsBG-Iベクターでは律速であったことが強く示唆される。
【０１３８】
核移行: ウイルスDNAは細胞質中で合成された後に、感染細胞の核内へ移行され、そこでは直鎖状DNAまたは環状DNA (1-LTRおよび2-LTRサークル)として見出すことができる(図18a)。直鎖状の形態はLTRの位置で環状化され、組み込みプロセスの直接の前駆体である; 1-LTRおよび2-LTRは、そうではなく、それぞれ相同組み換えおよび非相同DNA末端結合の不完全(abortive)な産物である。しかしながら、1LTRおよび2LTRサークルは核内に特異的に局在化され、核移行のマーカーとして用いられる。レンチウイルスのLTR中のインサートの存在は、組み込み前複合体(PIC)の形成を妨げる可能性があり、ウイルスDNAの核移行が形質導入の力価を低下させうる。PIC複合体が細胞質中でHIV LTRを結合し、それらが核への輸送および感染細胞のゲノムへのcDNAの組み込みに関与していることが実際に明らかにされている。
【０１３９】
核移行を検出するために、両ベクターにおける2-LTRサークルの量を、sBG vs sBG-I感染細胞において異なる時点で感染MEL細胞由来DNAに対するqPCRを用いて分析した。図19aに示されるように、2-LTRサークルの量は初期の時点で2つのベクター間で有意差がなかった。しかしながら、感染後48時間、2-LTRサークルが通常検出されるピークで、2-LTRサークルはsBG感染細胞で6.7倍高かったが、しかしsBG-I感染細胞では辛うじて検出限界にあった。後の時点(72および96時間)についても分析したが、絶縁ベクターでの2LTRサークル形成の動態において遅延は確認されなかった。実際に、2-LTRサークルは24時間後にsBG-I感染細胞においてqPCRにより辛うじて検出可能であった。これらのデータから、核移行は大きなU3インサートの存在によって低減される可能性が高いことが示唆された。
【０１４０】
組み込み: しかしながら、2コピーの大きなU3インサートは相同組み換えのための鋳型を提供し、組み込み前の2つのLTR間の相同組み換えの比率が増加し、より多くの1-LTRサークルおよび低減された2-LTRサークルをもたらすことも考えられる(図20中の画において提唱される通り)。これは、組み込みのために利用可能な鋳型の量を減少させるであろう。絶縁および非絶縁ベクターで逆転写されたウイルスcDNAの性質のため、1LTRサークルをPCRに基づく技法によって定量化することはできない。それゆえ、サザンブロット分析を行って、(p24レベルを用いて定量化された)等量のsBGおよびsBG-Iによる感染から72時間後に直鎖状ウイルスcDNA、1-LTRおよび2-LTRサークルを検出した(図19b)。サザンブロット分析から、(i) 逆転写されたウイルスcDNAの直鎖状の形態、つまり組み込まれる形態は、サザンブロット分析の感度ではsBG-Iレーンにおいて検出不能であるが、sBGレーンにおいては容易に検出可能であることが示された。(ii) また、2-LTRサークルはサザン分析でsBG-Iレーンにおいて検出不能であったが、しかしsBGレーンにおいては検出可能であり、2-LTRサークルに関するqPCRデータを裏付けるものであった。(iii) しかしながら、大量の1-LTRサークルがsBG-Iレーンには存在し、sBGレーンにおいて見られたものと量が類似していた。sBG vs sBG-Iレーンにおける直鎖状、1-サークルおよび2-LTRサークルの相対比から、sBG-IウイルスDNAの相同組み換えの増大が認められることが示唆された。実際に、これらのデータから、核移行は、U3インサートによって大きな程度までには影響されないことが示唆された。しかし、逆転写されたcDNAが核に侵入した後に、不完全な組み換え組み込み産物に相当する増加した1-LTRサークルが大きなLTRインサートに起因して形成され、それゆえ、組み込みが低減された。
【０１４１】
組み込み機構はまた、LTR中の外来配列の存在によって直接影響を受けるものと考えられる。それゆえ、逆転写に及ぼすインスレーターの効果、核移行、および1LTRサークル形成を組み込みとは独立して研究できるように、組み込み酵素を欠損したパッケージングプラスミドを用いてsBGおよびsBG-Iウイルスをパッケージングした。活性な組み込み酵素を含有するウイルスを用いたものと同じ分析である以下を行った: (psiプライマーを用いた)後期逆転写産物、2LTRサークルを研究するためのq-PCR、ならびに1LTRサークルおよび他の形態のウイルスcDNAを定量するためのゲノムサザンブロット分析。これらの結果は、(図19bに示された)活性な組み込み酵素でパッケージングされたsBGおよびsBG-Iで見られたものと同一であった: 同じ低減が後期RT産物および2LTRサークルでqPCRにより観察されたが、増加した1LTRサークルがゲノムサザンブロット分析により観察された(データは示されていない)。それゆえ、レンチウイルスLTRへ挿入された配列は、組み込み酵素の機構とは無関係な機序によって逆転写プロセスを主に妨げ、相同組み換えの頻度を増加させた。
【０１４２】
最後に、組み込まれたsBGおよびsBG-Iプロウイルスを伝染の安定性および組み込みの効率について分析した。図19bにおけるサザンブロット分析から、sBG-IレーンよりもsBGレーンにおいて高い強度のものであるスメアとしての組み込みDNAが明らかである。組み込みを確認および定量化するために、MEL細胞に同量のp24レベルのsBGまたはsBG-Iウイルスを形質導入し、21日間培養し、qPCRおよびサザンブロット分析を行って、プロウイルスの組み込み効率および安定性を比較した(図19c)。qPCRではsBG MEL細胞集団において細胞あたり6.2個のプロウイルスコピーが存在したが、sBG-I MEL細胞においては0.8個のプロウイルスコピーしか検出されず、2つのベクター間の形質導入の力価において見られた差異と一致する7.8倍の差異があった。次に、LTR内で切断する酵素Afl-IIでDNAを制限消化した(図19c, 左パネル)。形質導入の力価およびqPCRと一致して、組み込まれたsBG-Iプロウイルスの量は、ホスホイメージャによるサザンブロットのバンドの定量化によって示されるように、sBGよりも8倍少なかった(図19c)。予想されたサイズの、単一のプロウイルスバンドによって示されるように、sBG-Iベクターは組み換えをしなかった。次に、sBG-I形質導入MEL細胞の全ての単一コピークローンにおいて、PCRにより全長インスレーターが検出された(図20D)。それゆえ、直鎖状sBG-I cDNAが、非効率的に形成されたとはいえ、インタクトなプロウイルスとして組み込まれた。
【０１４３】
全体的なウイルス組み込みの低減は主に、組み込みのためのプロウイルスDNAの利用可能性を妨害する非効率的な逆転写と相同組み換えの増加との組み合わせによるものであった。インスレーターは、安全であり、かつ一貫性のある予測可能な発現をもたらすようなウイルスベクターを作製するために重要であるので、絶縁ウイルスでの低いウイルス力価の問題に対する解決策を見つけることが重要である。この問題を克服するための1つの方法は、内部カセットのさらなる延長によっても力価が減少しなかったので、cHS4のどちらかの端部に内部発現カセットを隣接させることであろう。しかしながら、この手法は試されなかった。というのは、レトロウイルス内の反復エレメントは組み換えを起こすことが知られているからである。HIV RTは低い伸長能（processivity）を有し、頻繁にその鋳型から解離することが知られているので、ウイルス粒子あたりに送達されるRTの量を増加させる試みを行って、それにより大きなLTRインサートからの逆転写が改善されるかどうか評価した。RTをvpr-RT融合タンパク質としてウイルス粒子内に共パッケージングさせた。ウイルス粒子内に一層多くのRTを与えても力価の有意な増加は観察されなかった。次の段階は、同じ戦略を用いてウイルス粒子あたりの組み込み酵素(IN)、およびウイルス粒子内の共パッケージングされたRT-IN-vpr融合タンパク質を増加させることであった。ウイルス粒子内にRT-INを与えることで力価のわずかな増加が認められたが、しかし差異は有意ではなかった。
【０１４４】
次に、1.2 KbのcHS4インスレーターの詳細な構造-機能分析を行い、規定された650 bpの配列が、完全な絶縁効果に最低限必要な配列として特定された。sBG650の力価は、sBGおよびsBG-Iベクターの8.2×108 IU/mLおよび9.8×107 IU/mLの力価と比べて、3.6×108 IU/mLであった(図20C)。650 bpのインサートを有するベクターは、インスレーター活性の喪失なく非常に妥当なウイルス力価(sBG-Iでの9〜10倍低い力価と比べると、非絶縁ベクターsBGよりも2.2倍低い力価)を有していた。
【０１４５】
最終的に、低い形質導入の力価は、プロウイルスのサイズの増加によるのではなく、3'LTRの長さの増加によることが分かった。産生されたウイルスRNAゲノムの量および質は影響を受けず、ウイルス-RNAキャプシド形成/パッケージングは、1.2 KbのLTRインサート有りおよび無しのベクターで同等であった。ウイルス力価の低減は、侵入後の段階から起き、組み込みのために利用可能なウイルスDNAを少なくさせる、非効率的な逆転写、ウイルスDNAのLTRにおける相同組み換えの増大から起きた。最適なインスレーター活性に必要な必須エレメントを含んだ、一層小さなインスレーターインサートを含めることにより、ベクターデザインの改善が成された。
【０１４６】
本研究は、クロマチンインスレーターエレメント、カスタマイズされた系統特異的LTRベクターまたは二重コピーベクターの有用性を考慮すると、3'LTR内にインサートを有するベクターの将来のデザインに重要な意味を持つ。
【０１４７】
実施例44 ベクター構築体
BG、BGM、BG-IおよびBGM-Iベクターのクローニングは、既述されている。その他全てのベクターは、sSIN骨格へクローニングされた(詳細はUrbinati F、Xia PおよびMalik P, 検討中の原稿に提供されている)。ベクターは全て、既述のように、ヒトβ-グロビン遺伝子ならびに高感受性部位2、3および4断片を保有した、sSIN LVベクタープラスミドのU3 3'LTR領域に挿入された固有のNhe I/EcoR V部位へ異なるインスレーター断片をクローニングすることによって得られた。鋳型としてインスレータープラスミドpJCI3-1を用いてPCRにより、インスレーター断片を増幅させた。全ての単位複製配列はPCRの後、および3'LTRへの挿入後に配列決定された。非絶縁β-グロビンベクターおよび全長1.2 KbのcHS4インスレーターを保有しているもののクローニングは、既述されている。手短に言えば、1.2 Kbのインスレーター断片は、pJCI3-1プラスミドをXba Iで消化することにより得られ、sBGのNhe I/EcoR V制限部位へクローニングされた。sBGCは、pBS 1コアプラスミドからの250 bpコアを含んだEcoR I/Xba I断片を、sBGベクターへ挿入することによりクローニングされた。後者は、(本明細書において記述されるように、Core 1FおよびCore 1Rプライマーを用いて) 250 bpのコアインスレーターPCR産物をpBSプラスミドのBamH I/EcoR I制限部位へクローニングすることにより得られた。250 bpコアの第2のコピーを次に、pBS 1コアプラスミドにEcoR I/Kpn I部位へPCR産物(Core 2FおよびCore 2R)をクローニングすることによって付加し、pBS 2コアプラスミドを得た。250 bpコアの2つの縦列コピーを次に、Kpn I/Xba Iで後者のプラスミドを消化することによって単離し、その後、sBGベクターへクローニングし、sBG2Cを得た。sBG400およびsBG800ベクターは、2つのPCR産物を(それぞれ、InsFおよびIns400RプライマーならびにInsFおよびIns800Rプライマーを用いて) sBG Nhe I/EcoR V部位へクローニングすることによって得られた。sBG650ベクターは、sBG1cベクターのEcoRV/BspEI部位にインスレーターの3' 400断片をクローニングすることによって得られた。3' 400断片は、以下のプライマー: 3' 400 R (BspEI)および3' 400 F (EcoRV)を用いてプラスミドpJCI3-1からPCR増幅された。
【０１４８】
λ DNAスペーサーを含んだベクターは、以下のプライマーの組み合わせ: スペーサーF1およびスペーサーR1、スペーサーF1およびスペーサーR2ならびにスペーサーF1およびスペーサーR3、を用いて異なるサイズのλファージDNAを増幅させ、それぞれ、150 bp、550 bpおよび950 bpのλ DNA断片を増幅させることによって得られた。この3つのPCR断片をCla IおよびEcoR I制限酵素で消化し、pBS-1コアプラスミド中のEcoR I/Cla I部位へライゲーションした。400 bp、800 bpおよび1200 bpの断片をpBS-1コアプラスミドから、400 bpの断片の場合にはHincIIおよびXbaIで消化し、残りの2つの断片の場合にはXba IおよびXho Iで消化し、sBGベクター中のEcoR V/Nhe I制限部位へクローニングした。クローニングされたベクターは全て、配列決定により確認された。プライマーの全てのリストが、(図20E)において入手可能である。
【０１４９】
実施例45 細胞株
ネズミ科赤白血病細胞(MEL)株および293T細胞は、10%の熱不活化ウシ胎仔血清(FBS) (U.S. Bio-technologies, Inc.)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Mediatech, Inc)中で維持された。MEL細胞は、既述のように、20% FBSおよび5 mM N,N'-ヘキサメチレンビスアセタミド(Sigma)を含有するDMEM中で分化するように誘導された。単一の組み込み体クローンを導出するため、形質導入されたMEL細胞をクローニングし、クローンをPCRによりβ-グロビン配列についてスクリーニングし、形質導入されたクローンを同定した。単一のコピークローンをqPCRによりレンチウイルスy-配列について同定し、cHS4コア配列に対するPCRを単一の組み込み体クローンに対し行って、プロウイルスにおけるインスレーター配列の存在を確認した。
【０１５０】
実施例46 HbA染色およびFACS分析
抗ヒトHbA抗体を用いた染色は、既述されている通りであった。手短に言えば、細胞を室温で60分間4%パラホルムアルデヒド中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄し、ペレットを5分間100%メタノールに再懸濁させた。固定された細胞を次に、PBSで洗浄し、非特異抗体(Ab)結合を室温で10分間、5%スキムミルクを用いてブロッキングした。その後、細胞をPBS中で洗浄し、ペレット化し、透過処理した。細胞を2本のチューブに分け、暗所中にて室温で30分間、陰性対照として抗ζグロビン-フルオレセインイソチオシアネート(FITC) (1 μg/106個の細胞)または抗HbA-FITC (0.1 μg/106個の細胞) (Perkin Elmer)のいずれかで染色した。未結合のAbをPBSでの最終の洗浄により除去した後に、それらをFACS Calibur (Becton Dickinson)にて分析した。
【０１５１】
実施例47 ウイルス産生
ベクタープラスミド、パッケージング(それぞれ活性または不活性組み込み酵素用のΔ8.9またはΔ8.2)プラスミドおよびVSV-Gエンベローププラスミドを用いて、既述のように、293T細胞の一過性コトランスフェクションによりウイルスを産生させた; ウイルスを含有する上清を、トランスフェクションから60時間後に回収し、超遠心分離によって濃縮した。実験中の全ベクターが同時にパッケージングされた。ウイルスをDNaseおよび/またはDpnIで処理して、プラスミドDNAの混入を取り除き、20%スクロースのクッション上に重層して、結果の中に示されたベクターライフサイクルに関する特定の実験用に精製されたウイルス粒子を得た。90分間25,000 rpmでの超遠心分離後に全てのウイルス上清から1400倍にウイルスが濃縮された。マウス赤白血病(MEL)細胞に濃縮ウイルスの連続希釈液を感染させ、それらを分化させ、それらを蛍光活性化細胞ソータースキャナ(FACS)によりHbA発現について分析することにより、ウイルス力価を測定した。
【０１５２】
実施例48 ノザンブロット
トランスフェクションから72時間後に、RNA-STAT (Tel-Test, INC, Texas)を用いて293T細胞から全RNAを抽出した。ノザンブロットを次に、標準的なプロトコルにしたがって行った。ブロットを32-P標識β-グロビンプローブとハイブリダイズさせた。
【０１５３】
実施例49 RNAドットブロット
QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA)を製造元の使用説明書にしたがって用い、同じ量の濃縮ウイルスからウイルス-RNAを抽出した。手短に言えば、ウイルスを高い変性条件の下で溶解させ、その後、シリカゲルに基づく膜に結合させた。2回の洗浄段階により混入物が効率的に洗い流され、v-RNAがDEPC-H2O 30 μl中に溶出された。溶出後、ウイルス-RNAを増幅品質等級のDNAse I (Invitrogen)により室温で20分間処理した。サンプルを65℃でインキュベートすることにより、DNaseを不活化させた。ウイルスRNAを次に、65℃で15分間、3容量の変性用緩衝液(65%ホルムアミド、8%ホルムアルデヒド、MOPS 1×)中で変性させた。変性後、2容量の氷冷20×SSCを添加し、ドットブロット装置を通じた吸引によってナイロン膜にRNAを結合させた。ブロットを32-P標識β-グロビン特異的プローブとハイブリダイズさせ、フィルムを終夜感光させた。ドットの定量化は、ホスホイメージャ(Biorad, Hercules, CA)で行った。
【０１５４】
実施例50 逆転写酵素アッセイ法
濃縮ウイルス(1 μL)、および連続希釈液(10分の1、100分の1、1000分の1)を溶解させ、「Reverse transcriptase (RT) assay, colorimetric」Kit (Roche)のプロトコルにしたがって処理した。手短に言えば、濃縮ウイルス粒子を溶解用緩衝液で溶解させ、ジゴキシゲニンおよびビオチン標識ヌクレオチドを用いてウイルス-RNAを逆転写させた。RT活性のパラメータとしての合成DNAの検出および定量化は、サンドイッチELISAプロトコルにしたがった: ストレプトアビジンで予めコーティングされたマイクロプレートモジュールの表面にビオチン標識DNAを結合させた。次の段階で、ペルオキシダーゼに結合された、ジゴキシゲニンに対する抗体(抗DIG-POD)を、ジゴキシゲニン標識DNAに結合させた。最終の段階で、ペルオキシダーゼ基質ABTSを添加し、この結果、有色の反応生成物が生じ、これを405 nmの波長で、ELISA読み取り機を用いて定量化した。有色生成物の量は、サンプル中のRT活性のレベルと直接的に相関があった。
【０１５５】
実施例51 P24アッセイ法
P24抗原濃度をHIV-1 p24 Antigen EIA Kit (Beckman Coulter)によって測定した。手短に言えば、連続的に希釈されたウイルスを溶解させ、p24抗原でコーティングされたマイクロウェル上でインキュベートし、製造元のプロトコルにしたがって洗浄した。分光光度計を用い450 nmの波長で色吸光度を測定した。p24アッセイ法は二つ組で行われた。
【０１５６】
実施例52 サザンブロット
プロウイルスの完全性を分析するため、本発明者らはMEL細胞に感染させ、それらを21日間増殖させ、Qiagen Blood and Cell culture DNA Mini Kit (Qiagen)を用いてDNAを抽出した。LTR中で切断をする酵素Afl IIを用いてDNA 10 μgを消化した。ウイルス線状DNAの存在を判定するため、ゲノムDNAをMEL細胞の感染から72時間後に抽出し、プロウイルス内で2回切断をする酵素Stu Iで制限消化した。DNAを0.8%アガロースゲル上で分離し、ナイロン膜に転写し、β-グロビン断片で終夜プローブした。
【０１５７】
実施例53 RT産物および2LTRサークルのリアルタイムPCR
同量のp24を用いて、8 μg/mLのポリブレンの存在下、DMEM培地中で、MEL細胞にsBGおよびsBG-Iベクターを形質導入した。異なる時点(0.5時間、3時間、6時間、8時間、12時間、24時間、48時間、72時間)で細胞を収集し、Qiagen Blood and Cell culture DNA Mini Kit (Qiagen)を用いてDNAを抽出した。単一コピーMELクローン(単一の組み込み体についてサザンにより確認された)からのゲノムDNA (50 ng)を非形質導入DNAで希釈して、コピー数の標準(1〜0.016コピー/細胞)を作製した。RT産物用のプライマーおよびプローブは、Applied Biosystems, Foster City, CAのPrimer Express Softwareを用いてデザインされた。初期RT産物(R/U5) qPCRアッセイ法のためのプライマーおよびプローブ配列は、フォワードプライマー:
0006509884.tif 000005
、リバースプライマー:
0006509884.tif 000006
である。反応はTaqMan MGB Probe:
0006509884.tif 000007
を用いて行った。中間体RT産物(U3/R) qPCRアッセイ法のためのプライマーおよびプローブ配列は、フォワードプライマー:
0006509884.tif 000008
、リバースプライマー:
0006509884.tif 000009
である。反応はTaqMan MGB Probe:
0006509884.tif 000010
を用いて行った。後期RT産物アッセイ法(psi)の場合、プライマーはプロウイルスのΨ領域を認識するようにデザインされた: フォワードプライマー:
0006509884.tif 000011
、リバースプライマー:
0006509884.tif 000012
。反応はTAMRA色素をクエンチャとしTaqMan Probe:
0006509884.tif 000013
を用いて行った。負荷の正規化は、マウスアポB遺伝子対照を用いて行った。サイクリング条件は、50℃で2分および95℃で10分、その後、40サイクル×15秒間95℃および1分間60℃であった。2LTRサークル用のプライマーおよびプローブは、既述されている通りであった。Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time PCR System Base Unit中で96ウェルプレート用サーマルサイクラ・プロトコルにしたがいPCR混合物をサーモサイクリングさせた。
【０１５８】
実施例54 概要
鎌状赤血球貧血(SCA)は、鎌状ヘモグロビン(HbS)を結果的にもたらす、グロビン遺伝子(βS)における点突然変異から生じる。HbSは脱酸素によって重合し、微小血管系を閉塞させる鎌状形RBCを結果的にもたらす。SCAを有する患者は、急性間欠性血管閉塞および累積臓器障害を有し、寿命を42〜58.5年まで減らす。鎌状赤血球化の他に、溶血亢進および慢性炎症状態が存在する。SCA患者は1年あたり入院およそ75,000回分を占め、米国だけで12億ドルの予想年間支出額を生じる。世界中で、SCAは単一遺伝子病の発症率でサラセミアに次ぎ第2位であり、アフリカでは毎年200,000超の小児が生まれている。
【０１５９】
現行の治療法には、一時的な鎌状赤血球化の対症療法、鉄キレート化を伴う長期輸血、および胎児ヘモグロビン(HbF)を誘導するためのヒドロキシウレアが含まれる。これらの治療法は疾患罹患率に影響を与えるが、しかしその有効性は変化しやすく、無期限の処置レジメンのコンプライアンスに依存している。一致する同種造血幹細胞(HSC)の移植は、治癒的であるが、しかし一致する関連ドナー5の利用可能性により制限され、重篤な合併症の可能性を有する。187例のSCA移植のメタ分析から、レシピエントにおける6%〜7%の、前処置に関連した移植前後の死亡率、7%〜10%の急性拒絶反応、および13%〜20%の慢性移植片対宿主病(GVHD)が明らかである。
【０１６０】
移植に先立つ自家HSCの遺伝子治療は、一度限りの治療を可能とし、有害な免疫学的帰結の回避を可能とし、ドナーの利用可能性によって制限される可能性がなかった; それはまた、骨髄破壊的前処置レジメンを要せず、その結果毒性がさらに低い可能性がある。導入遺伝子を介してSCAを是正するために必要とされるHbF/抗鎌状赤血球化グロビンの量は、不明である。
【０１６１】
生後HbFの発現は、新生児鎌状RBCでの、ならびにHbFおよびSCAの遺残症を有する患者でのHbFの防護効果から明らかなように、治療的でありうる。病態生理を是正する、遺伝子操作されたHSCの比率、外因的に発現されたHbFの量、およびF細胞の比率は、不明である。β-グロビン遺伝子および遺伝子座制御領域(LCR)エレメントを保有するレンチウイルスベクターを用いて、インビトロで、および異種移植マウスにおいてインビボで、ヒトサラセミアメジャーを完全に是正することが実証されている。この報告のなかで、このβ-グロビンレンチウイルスベクターは、γ-グロビンエクソンをコードするように改変され、ネズミ科鎌状HSCに形質導入された。是正のパラメータを規定する鎌状 対 正常移植、および高HbF産生を用いてRBC鎌状赤血球化、半減期、および変形能を慎重かつ詳細に定量化することにより、機能的な是正をまず初めに特徴付けた。次に、強度軽減移植前処置を用い、形質導入HSCの割合を変化させて、顕著な臓器障害を有する鎌状赤血球マウスに対し移植を行って、SCAでの鎌状RBCの是正および臓器障害の改善に必要とされる、(1) 遺伝子的に是正されたHSC、(2) HbFおよび(3) F細胞の比率、ならびに(4) HbF/F細胞の割合を実証した。
【０１６２】
実施例55 ベクター
レンチウイルスベクターを保有するβ-γ-グロビンハイブリッド遺伝子I8H β/γW,11は、「成体様」グロビンを発現している赤血球系細胞において高いγ-グロビンmRNAを発現することが実証されている。全てのβ-グロビンコード配列を部位特異的突然変異誘発法によりγ-グロビンに変化させ、γ-β-グロビンハイブリッド遺伝子、およびLCRエレメントをウイルス転写単位へ逆方向にクローニングして、sGbGレンチウイルスベクターを作製した。ウイルスは293T細胞のコトランスフェクションで作製された。
【０１６３】
実施例56 ネズミ科HSC濃縮
6〜20週齢BERK鎌状赤血球マウス由来の骨髄を集め、ビオチン化CD5、CD8、B220、Mac-1、CD11b、Gr-1、およびTER-119抗体ならびに磁気ビーズで系統枯渇させた。無ビーズ細胞をSca-1、c-kitに対する抗体で染色した。7-AAD-、系統-、c-kit+次いでSca-1+であった細胞(LSK細胞)をFACSVantage (BDBiosciences)にて選別した。Berkeleyトランスジェニック鎌状赤血球マウスおよびC57/BL6マウスを用いた全ての実験は、Cincinnati Children's Hospital Medical Centerにより承認されたプロトコルにしたがって行われた。
【０１６４】
実施例57 遺伝子移入および骨髄移植
移植の容易さおよび正常レシピエント(9.5 +/- 0.6週齢)の入手しやすさのためにBERK3C57Bl/6マウスから、11.75 Gyの放射線照射後に骨髄破壊的移植が行われた。放射線照射対照実験から、8〜9 Gyの放射線照射を受けているBERKマウスは、LSK細胞を受けないで生存することが示された; 致死量はC57Bl/6マウスにおけるよりも低かった。10.5 Gy超を受けているBERKマウスは、LSK細胞が投与されない場合には死亡した; LSKのレスキューを受けたものは長期生存した。BERKマウスは所与の時点で大量に飼育することが難しく、それゆえ、致死未満量を特定するために放射線量レベル当たりマウス2匹とした。全BERKレシピエント(12.9 +/- 0.4週齢)が移植前後3回のRBC輸血を受けた(1〜7日目)。移植から1年後のBERKレシピエントにおける臓器病態を、移植を受けなかった12週齢BERKマウスと比較した。かなりの程度のドナーHSCキメラ現象を可能とするために、放射線照射は4 Gyの、古典的な強度軽減放射線量よりも高かった。ある範囲のMOIを用いて、移植片中の形質導入ドナーHSCの比率を変化させた。LSK細胞を終夜予備刺激し、BERK3C57BL/6移植の場合にはMOI 30で、およびBERK→BERK移植の場合にはMOI 30〜100で22〜24時間2回形質導入した; 10,000〜24,000個のLSK細胞および非形質導入LK細胞を、レシピエントC57BL/6またはBERKマウスへ同時移植した。
【０１６５】
実施例58 コピー数分析
コピー数分析は、既述したプライマーおよびプローブを用いてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によりゲノムDNAに対して行われた。
【０１６６】
実施例59 血液分析
血液分析は、マウスの設定の下でHemavet 950FS (Drew Scientific)にて得られた。網状赤血球分析は次のように行った: 血液0.1 μLおよびBD Retic-COUNT Reagent 200 μLを混合し(Becton Dickinson)、30分間室温でインキュベートし、蛍光活性化細胞選別(FACS)によって分析した。
【０１６７】
実施例60 ヘモグロビン分析
既述のように、酢酸セルロースプレート上でヘモグロビン電気泳動を行った。PolyCATAカラム(品目番号3.54CT0510; Poly LC Inc)を用いAlliance 2690 HPLC機器(Waters)でイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)を行った。
【０１６８】
実施例61 赤血球機能分析
連続視野内500個のRBCをスコア化することにより、不可逆性鎌状赤血球(ISC)を数え上げた。段階的な脱酸素化は、圧力測定を用いて行われた。レーザー支援光学的回転細胞分析装置(LORCA; RR Mechatronics)を用いて、RBC変形能を判定した。
【０１６９】
実施例62 RBC半減期
マウスに1時間差で別々2回の注射としてPBS 300 μL中3 mgのSulfo-NHSビオチン(Sigma)を注射した; 一連の時点で2〜5μL採血し、APC-Cy7結合ストレプトアビジンで染色した。
【０１７０】
実施例63 組織診断
脾臓、肝臓、骨、脳、および腎臓を収集し、10%ホルマリン5 mL中に入れた。パラフィンブロックを切片にし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１７１】
実施例64 遺伝子治療および骨髄破壊的移植後の高いHbFはSCAを是正する
sGbGベクターは、γ-グロビンエクソンならびにβ-グロビン非コード領域および調節領域を保有する。高レベルのヒトβ-グロビンを発現する、以前に研究されたsBGベクターに基づき、Berkeley鎌状(BERK)マウス由来の13 sGbG形質導入LSK細胞を、致死的な放射線を浴びた(骨髄破壊された)正常C57Bl/6Jマウスへ移植した(sGbGマウスと名付けた)。移植に先立ち同じ骨髄プール由来のBERK LSK細胞に対するモック形質導入により、SCAを有するマウスが得られた。sGbGマウスにおけるRBCの大部分は、HbFを発現していた。電気泳動およびHPLCによる残存レシピエントネズミ科ヘモグロビンの証拠のない、100%ドナー(HbS+) RBCを有するsGbGマウスだけを、血液学的、機能的、および病理学的分析のために分析した。少ない割合のレシピエントネズミ科RBCを有するsGbGマウスは、HbF/ベクターコピーおよび形質導入HSCの頻度を評価するためにだけ用いられた。FACSにより定量化された、血中HbF (HbF/HbS+HbF)の割合は、6ヶ月間追跡された一次マウスにおいて、および7.5ヶ月間追跡された二次レシピエントにおいておよそ40%であった(図21A)。3分の2のRBCがF細胞であった; その比率はまた、一次および二次レシピエントにおいて安定していた(図21B)。F細胞の比率およびベクターコピーは、HbFと相関していた(図21C〜D)。総合すれば、これらのデータから、RBCの大部分において安定な長期発現でsGbGベクターからの顕著なHbF発現が明らかである。
【０１７２】
実施例65 高レベルのHbFは持続性の血液学的是正をもたらす
図21EはsGbGマウスにおける血液学的パラメータの改善を示す。網状赤血球の比率は、モックマウスでのおよそ50%からsGbGマウスでのおよそ15%まで減少した(P < .005; 図22A)。12週までに貧血の是正が認められ、これは移植後の期間中、持続した(図22B〜C)。
【０１７３】
SCAを有するヒトおよびBERKマウスにおける高い白血球(WBC)計数は、この疾患におけるベースラインの炎症を反映している。WBCはsGbGマウスにおいて正常レベルに戻った(図22D; 図21E)。
【０１７４】
とりわけ、WBC計数は、移植を受けなかったBERKマウスと比べてモックマウスで低かったが、これはおそらく前者では、鎌状HSCが正常「非炎症」C57/BL6のバックグラウンドへ移植されたからであった。実際に、移植後6週間、モック群のマウスにおけるWBC計数はほぼ正常であり、その後、SCAにおいて見られた高いレベルに徐々に上昇していった(図22D)。全体として、血液学的パラメータは、正常に近いレベルへの顕著な改善を示し、改善は一次および二次sGbGマウスにおいて長期にわたり安定していた。是正の程度は、F細胞(図22E〜H)およびHbF (データは示されていない)の比率と相関していた。高レベルのHbFは鎌状赤血球マウスにおいてRBCの機能的パラメータを改善する。(1) 鎌状赤血球化: 不可逆性鎌状赤血球(ISC)は、BERK対照での12%±0.8%およびモックマウスでの10.2%±0.3%と比べて、sGbGマウスで2.3%±0.7%まで顕著に減った(図23A〜B)。代表的sGbGマウスの血液の脱酸素化から、鎌状赤血球化の劇的な低減が明らかである(図23C)。体系的な定量化から、低酸素状態の増大に伴いsGbGマウスにおいて鎌状RBCの比率の著しい減少が示された(図23D)。(2) RBC膜変形能: 正常RBCは、小血管内のせん断応力を代表する、低いせん断応力(3パスカル[Pa])で容易に変形する。鎌状RBCは比較的硬い膜を有し、高いせん断応力(28 Pa; 大血管内のせん断応力を代表する)でさえも変形能が著しく低い。正常レベルを達成することはなかったが、sGbGマウスのRBCの変形能は顕著に改善された(図23E)。これは、HbFを含有していなかった循環血中RBCの比率を反映しうる。(3) RBC生存性: ヒト鎌状RBCの生存性は、正常RBCよりも1桁小さい。sGbGおよびモック/BERK鎌状赤血球マウスにおける50%低減までの時間(半減期)を測定した。sGbG RBCの全生存性が顕著に改善され、50%低減までの時間はBERKまたはモックマウスと比べてsGbGマウス由来のRBCではおよそ4倍長かった(図23F)。(4) RBC溶血: 血中の乳酸脱水素酵素(LDH)を測定することによって検出されたRBC溶血は、モックマウスでの2706±148 mg/dLからsGbGマウスでの1286±345 mg/mLまで低減された(n=5; P<.004)。
【０１７５】
実施例66 高レベルのHbFはSCAに関連した長期臓器障害を防ぐ
24週時の骨髄、脾臓、肝臓、および腎臓から臓器病態の完全予防が示された。モックマウスでの重症赤血球過形成からの閉塞濾胞構造と比較すると、骨髄および脾臓中の赤血球過形成の低減、脾臓サイズの減少、ならびに脾臓濾胞構造の保存が認められた。モックマウスにおいて見られた巣状尿細管萎縮および分節状糸球体梗塞は、sGbGマウスの腎臓には存在していなかった。モックマウスの肝臓において見られた梗塞および髄外造血は、sGbGマウスの肝臓には存在していなかった(図23Gは全マウス群におけるデータを要約している)。全体として、軽度の赤血球過形成を除き、sGbGマウスでは臓器病態は観察されなかった。
【０１７６】
実施例67 高HbF発現は鎌状赤血球マウスの生存性を改善する
BERK鎌状赤血球マウスの寿命は最近の処置法前の、SCAを有するヒトと同様、顕著に低減される。カプラン・マイヤー生存曲線から、モックマウスでの20%生存とは対照的に、24週の時点でsGbGマウスの100%生存が示された(n=14, P<.001)。
【０１７７】
実施例68 SCAの是正に必要とされる最小パラメータ
骨髄破壊的前処置は遺伝子修正されたドナーHSCの非競合的再生を可能にし、高い導入遺伝子改変HSCの生着および導入遺伝子発現をもたらす。骨髄破壊的前処置により達成された高レベルγ-グロブリン発現は、是正には必要ではない可能性があり、もしそうなら、移植に関連した罹患率を低減するものと仮定された。
【０１７８】
強度軽減移植は、遺伝子改変BERK LSK細胞を、亜致死線量照射された、しかしかなり高い放射線量で照射された、BERKマウスへ移植することにより達成された。移植片中の形質導入HSCおよびベクターコピー/細胞の比率は、ある範囲のMOI (30〜100)でLSK細胞を形質導入することにより変化した。BERK RBCの半減期は1.5〜2日であった(図24G〜H)ので、マウスを移植前後の期間に輸血し、12週後に分析した。1年間追跡調査したマウスで3回の連続実験を行った。sGbGマウスを、18週時のHbFの割合に基づいて3群に分けて分析した: HbF= 0% (モック, n=4)、HbF 10%未満(sGbG<10と名付けた; n=17)、およびHbF 10%以上(sGbG≧10と名付けた; n=9); (図24A)。10% HbFでのカットオフは、これが、疾患の是正を反映していたHbFの閾値レベルであるように思われたので、選択された: sGbG<10マウスは、以下の項で記述されるsGbG≧10と比べて、高い死亡率および一貫性のない血液学的是正を示した。群内のマウス数は、無/低HbFのマウスにおけるSCAに関連した死亡率の増大に主に起因して経時的に変化した。sGbG≧10群のマウスは、12、18および24週の時点で、それぞれ、16% (±1.2%)、17% (±1.8%)、および21% (±2.3%)のHbFを有していたのに対し、sGbG<10群のマウスは5% (±1.4%)、4% (±0.6%)および4% (±0.5%)のHbFを有し、それは最大1年まで安定していた(図24B)。F細胞再生はsGbG<10マウス(30%±9.4%)と比べてsGbG≧10マウス(65% ±14%)において顕著に高かった; (図24C)。sGbG≧10マウスは2〜2.5ベクターコピー/細胞を有していたのに対し、sGbG<10群のマウスは1.4コピー/細胞を有していた(図24D)。
【０１７９】
実施例69 血液学的改善は強度軽減移植で起きた
血液学的パラメータは、移植後初期の期間における持続輸血RBCによって、18週の時点で安定化した。sGbG<10マウスでの小さくて一貫性のない改善とは対照的に、sGbG≧10群のマウスでは血液学的パラメータの顕著な改善が認められた(図23G)。
【０１８０】
実施例70 RBC機能の改善は強度軽減移植で起きる
鎌状赤血球化: sGbG≧10マウスではISCのかなり有意な低減(P<.005)が、およびsGbG<10マウスではISCの小さいが、しかし有意な低減が、モック/BERK対照と比べて認められた(P<.05, 図24E)。sGbG≧10マウス由来RBCは、sGbG<10またはモック/BERKマウス由来RBCと比較したところ、段階的な低酸素状態に曝露された場合に鎌状赤血球化の低減を示した(n=20, P<.01; 図24F)。対照的に、sGbG<10マウスとモック/BERKマウスとの間には鎌状赤血球化の有意差はなかった。(2) RBC膜変形能: 驚いたことに、sGbG<10マウスおよびモック/BERKマウス由来のRBCでの低酸素状態による同程度の鎌状赤血球化にもかかわらず、sGbG<10マウスではRBC変形能のわずかな改善が認められた。しかしながら、これらの差異は、高いバラツキのためモック/BERKマウスとは統計的に有意なものではなかった(図24G)。対照的に、sGbG≧10マウスではRBC変形能の、一貫して有意な改善が認められた(P<.001, 図24H)。変形能のパターンから、大血管および微小血管を通るRBC流の改善が示唆された。(3) RBC生存性: BERKマウスのRBC半減期は1.5日であった。1%、3%および7%のHbFを有するsGbGマウスのRBCは、顕著に高い半減期(2日)を有していた。18% HbFを有する2匹のsGbGマウスは、骨髄破壊的移植モデルにおいて40% HbFを保有するマウスで見られたものと同様の、4倍増となる、6日のRBC半減期を示した。
【０１８１】
総合すれば、sGbGベクターは、HbF産生が全ヘモグロビンの10%を超えた場合に、SCAの顕著なかつ一貫した血液学的および機能的是正をもたらした。とりわけ、表現型の改善は、強度軽減移植前処置で達成されたものと同程度であった。
【０１８２】
実施例71 HbF濃度が10%を超える場合の臓器病態の顕著な改善
このBERK→BERK移植モデルの1つの独自の特徴は、(移植を受けた時のレシピエントマウスと比較可能な年齢のBERK対照を用いて判定された)移植時のレシピエントにおける顕著な鎌状赤血球病態の存在であった。それゆえ、遺伝子治療後の臓器病態の好転の可能性を評価することができた。移植後およそ50週の時点の生存マウスにおける臓器病態を、移植を受けなかった3ヶ月齢のBERKマウスと比較した(図25A; 図25C)。sGbG<10群のマウスは、臓器病態のわずかな改善を示した: 脾臓重量のわずかな低減が認められた(sGbG<10マウスで717±162 mg vs BERK/モックマウスで870±71 mg; P値, NS)。骨髄および脾臓は中等度から重度の赤血球過形成を示した; 肝臓には梗塞および髄外造血が有った; 腎臓は偶発巣状分節性病変、巣状尿細管萎縮、および血管うっ血を示した(図25D)。対照的に、臓器病態の劇的な好転がsGbG≧10マウスで見られた: 363±85 mgへの脾臓重量の50%低減、脾濾胞の保存、ならびに骨髄および脾臓における軽度の赤血球過形成が認められた。注目すべきことに、巣状尿細管萎縮の単病巣を有するマウス1匹を除いて、肝梗塞も腎臓病態も検出されなかった。全体として、sGbG≧10マウスは臓器病態の是正を示した。3ヵ月齢のBERK対照と比べて15ヵ月齢時のsGbGマウスにおいて臓器病態が無いことから、強度軽減移植という設定でのsGbGベクターによる遺伝子治療がさらなる臓器障害を防ぎ、移植時に既存する臓器障害がおそらく再生から好転することが実証される。
【０１８３】
実施例72 生存性
sGbG<10マウスまたはモックマウスと比較してsGbG≧10マウスにおいて全生存性の有意な改善が認められた(図25B; P<.05)。実際に、24週の時点で、sGbG≧10マウスの生存性は、24週間追跡調査された骨髄破壊的移植モデルでおよそ40%のHbFを有するマウスでの生存性と同程度であった。モックマウスと比較してsGbG<10マウスでの初期生存性のいくらかの改善が認められた(P<.05)。しかしながら、1年までに、モックマウスと比べてsGbG<10マウスの生存性の差異は認められなかった。
【０１８４】
実施例73 RBC生存性およびSCA是正の改善に不可欠なF細胞およびHbF/F細胞
ビオチン表面標識化および細胞内HbF染色を用いて、F細胞および非F細胞の生存性を同じ動物で研究し、これによって鎌状RBC生存性および変形能の改善に必要なHbF/F細胞の定量化が可能となった。F細胞は、予想通り、選択的な長期生存性を示した(図26A)。BERK3C57Bl/6モデルでのsGbGマウスにおける平均HbF/F細胞20は、64%であった(これらのマウスにおいて、HbFは41%±5%であり、F細胞は64%±6%であった)。強度軽減移植モデルにおいて、sGbG 10マウスは32%のHbF/F細胞を有し(これらのマウスにおいてHbFは21%±2%であり、F細胞は65%±14%であった)、sGbG<10マウスは13%のHbF/F細胞を有していた(HbF, 4%±0.1%; F細胞, 30%±9.4%)。留意すべきは骨髄破壊的モデルにおけるsGbGマウスおよびsGbG≧10マウスが類似のF細胞再生(64%〜65%)を有し、鎌状赤血球表現型を是正するのに32%のHbF/F細胞で十分なことが示唆された。しかしながら、13%のHbF/Fおよび30%のF細胞を有するsGbG<10マウスは、疾患表現型の改善が一貫性なくほんのわずかであった。
【０１８５】
それゆえ、マウスにおけるF細胞の半減期を特定し、HbF/F細胞の割合によって分類した。低い(16%; n=2)、中間(33%; n=4)の、および非常に高い(89%; n=2) HbF/F細胞を有するsGbGマウスにビオチンを注射し、その後に定期的血液サンプリングを行った。低いHbF/F細胞を有するマウスにはBERK対照と比べてRBC半減期の改善がなく(図26B)、33%のHbF/F細胞を有するマウスには半減期の3〜4倍の改善があり、非常に多量のHbF/F細胞を有するマウスは正常マウスと類似のRBC生存性を示すことが確認された。これらのデータから、鎌状RBC内のヘモグロビンの3分の1がHbFであれば、RBC生存性の顕著な改善が認められることが実証される。これらのレベルのHbF/F細胞を有するマウスは、HbF 10%超の、およそ65%のF細胞を示した。
【０１８６】
全RBC変形能に及ぼす循環血中F細胞の割合の影響を確認するため、骨髄破壊的実験および強度軽減実験の両方からのマウス(n=34)を3群: 33%未満の循環血中F細胞を有するマウス、33%〜65%のF細胞を有するマウス、および66%またはそれ以上のF細胞を有するマウス、に分類し、RBC変形能を測定した。低い(3 Pa)および高い(28 Pa)せん断率からのデータだけが図26Cにプロットされている。66%超のF細胞を有するマウスは、高いせん断応力および低いせん断応力の両方でRBC変形能の非常に顕著な改善を有していた(P<.01)。33%〜66%のF細胞を有するマウスは、高いせん断応力でのみ顕著に改善されたRBC変形能を有していた(P<.05)。33%未満のF細胞を有するマウスは、低いまたは高いせん断応力でRBC変形能の、一貫性のない改善を示し、これはモック対照と有意差がなかった。これらのデータから、鎌状赤血球病の是正に必要な、HbF/F細胞の臨界量、F細胞の比率、および全HbFが定量化される。
【０１８７】
実施例74 表現型の是正に必要とされる形質導入HSCの比率
sGbGマウスにおいてsGbGで形質導入されたHSCの比率を、両モデルにおいて6ヶ月の時点で行われた二次的な脾臓コロニー形成単位(CFU-S)アッセイ法により分析した(図27A〜B)。骨髄吸引を、1年間追跡調査したBERK→BERKマウスにおいて6ヶ月の時点で行った。形質導入されたCFU-S'sの比率をHbF発現によって割り出した。全てのベクター陽性CFUが、β-グロビンをコードする同一のベクターにおいて導入遺伝子を発現することが以前に示されている。骨髄破壊的前処置群におけるsGbGマウスは、16%〜87%のsGbG形質導入CFU-S'sを有し(平均HSC形質導入はおよそ50%であった)、強度軽減群におけるものは5%〜60%の形質導入HSCを有していた(平均HSC形質導入はおよそ30%であった)。強度軽減モデルでは、最初の6ヶ月中のsGbG<10%マウスの一層高い死亡率のために二次的に、HSC形質導入が過大評価されることに注意すべきである。
【０１８８】
重要なことには、16%、20%、および22%の形質導入CFU-S'sを有する3匹のマウスは、10%超のHbFを有し(HbFは、それぞれ、20%、11%、および18%であった)、完全な表現型是正を示した。それぞれ、骨髄破壊的前処置モデルおよび強度軽減前処置モデルを用い移植を受けたsGbGマウスにおいてベクターコピー数の分析を骨髄細胞に対し24週の時点で同時に行ったところ、1〜3コピー/細胞および1〜2.5コピー/細胞を示した。HSC形質導入に対して是正された場合には、1.5〜5ベクターコピー/細胞が存在していた。
【０１８９】
実施例75 ヒトCD34+細胞の形質導入
有効な遺伝子治療に必要な遺伝子改変HSCの割合は、この疾患において重要である。SCA骨髄に関するインビトロでの研究は、小規模でのみ行うことができ、HSCではなく、前駆細胞での是正を読み取るものであろう。HSCの是正が長期分析によりSCAのヒト化モデルで示された。ヒトサラセミア骨髄CD34+細胞の注射により産生されるRBCの数が極端に限られていることは、鎌状赤血球化に関する研究を抑制するものである。それゆえ、GFPレンチウイルスベクターおよび重症複合免疫不全(SCID)-再配置アッセイ法を用いて、臨床前の規模拡大のために正常ヒトCD34+細胞へのレンチウイルスの形質導入を最適化した。GFPレンチウイルスベクターで形質導入された顆粒球コロニー刺激因子-動員末梢血CD34+細胞を非肥満糖尿病(NOD)/LtSz-scid IL2Rγヌル(NSG)マウスへ移植した。ここで、モックマウスは、生着およびクローン形成能に及ぼす形質導入の効果の対照として、選別直後に非形質導入CD34+細胞の移植を受けたものであった。6週の時点で、CFUをNSGマウスに由来する骨髄からプレーティングし、36個の個別のCFU/マウスを遺伝子標識コロニーの割合について分析した。18時間の形質導入は、生着またはクローン形成能に影響を与えなかった(データは示されていない)。ヒトサラセミアCD34+細胞での以前のデータと同様に、平均で77%の遺伝子移入がSCID-再配置細胞アッセイ法において観察された。
【０１９０】
この研究からのデータは、HSCにおけるβ-グロビン調節制御エレメント下のヒトγ-グロビンの、レンチウイルスによる送達が、マウスにおいてSCAを是正するのに十分な出生後HbF発現をもたらすことを示している。HbFおよび形質導入HSCの量を次に、強度軽減移植前処置およびさまざまなMOIを用いて脱スケール化し、是正に必要とされる重要パラメータを評価した。機能的および血液学的RBC指数、臓器病態、ならびに寿命の系統的定量化は、鎌状赤血球表現型を好転させるために必要とされるHbF、F細胞、HbF/F細胞および遺伝子改変HSCの最少量を特定するために重要であった。
【０１９１】
結果から以下のことが示される: (1) HbFが10%を超え、F細胞が循環血中RBCの3分の2を構成し、HbF/F細胞がRBC中の全ヘモグロビンの3分の1であった場合; およびおよそ20%のsGbG改変HSCが髄質に再配置した場合、疾患の改善が起きた。(2) 遺伝子修正は、長期追跡調査された一次または二次移植レシピエントにおいて維持された。(3) 細胞用量および前処置レジメンのデザインに寄与し、ヒト臨床試験において等価な遺伝子的に是正されたHSCを達成するであろう、インビボモデルでの造血疾患の是正のための最低限のHSCキメラ現象を判定する方法が提供される。
【０１９２】
本研究の1つの新規の局面は、それが、初めて、遺伝的欠陥の是正に必要とされる遺伝子投与量および遺伝子改変された造血幹細胞投与量に取り組むということである。他でも明らかにされているように、膨大な量の胎児/抗鎌状赤血球化グロビンを発現させることで、疑う余地なく疾患が是正されるであろうが、しかし臨床の場で実際には可能ではない。例として、アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症の初期遺伝子治療は、前処置を用いずに行われ、遺伝子標識幹細胞のわずかな生着があり、ADAの撤退に関して遺伝子修正リンパ球に対する選択的優位性が明白であったとはいえ、治療的ではなかった。後続試験において、4 mg/kgのブスルファンを前処置として、移植の前に用いた結果、十分な、遺伝子修正された幹細胞用量および遺伝子改変T細胞がもたらされた。これらの先駆的研究から本発明者らは貴重な情報を得たが、それらは、臨床研究を開始する前に遺伝子修正のための閾値を特定することの決定的な重要性を強調している。
【０１９３】
疾患は1〜3コピー/細胞で是正されたが、本研究から、致死線量照射/移植に関するこの設定での形質導入幹細胞の割合が非常に高い(ストリンジェントな二次CFU-Sアッセイ法によって分析された場合、形質導入された平均HSCは50%である)ことが示唆される。このHSC形質導入レベルは、骨髄破壊が行われない限り、臨床の場で達成されない可能性が高いであろう。
【０１９４】
それゆえ、新規のモデル(BERK間の移植)を開発して、必要とされる最低限の遺伝子移入について取り組み、生後12週の時点で顕著な鎌状赤血球病態を有するマウスでのSCAの是正の問題に応えた(図25)。とりわけ、SCDの是正を示す、他群が用いた、鎌状-正常骨髄破壊的移植は、疾患予防モデルであり、この場合には移植の時点で基礎病理は存在していなかった。本研究は、遺伝子修正が10%超のHbFをもたらすなら、既存の病態の修復が行われうることを示す。
【０１９５】
BERKマウスはある程度のサラセミアを有する。それゆえ、鎌状赤血球貧血の遺伝子治療研究のためにこのモデルを用いる際の1つの懸念は、サラセミアの是正がHbFの抗鎌状化効果によってなされた改善を不明瞭にするということである。驚いたことに、89%もの高さのHbF/F細胞を有するマウスを含めて、sGbG <10またはsGbG≧10のマウスにおけるMCHの有意な変化は見られなかった(本明細書において開示されるように)。これらの結果は驚くべきであったが、しかしMCHの増加が4%またはそれ以上のHbFの増加で見られた、ネズミ科サラセミアモデルにおいて見られたように、RBCにおける鎌状赤血球化の是正がサラセミアの是正に続発するものではないことを明らかにした。考えられる限りでは、HbFはHbSを犠牲にして産生される。
【０１９６】
BERKマウスはヒトヘモグロビンを排他的に保有するが、マウスRBC中の全ヘモグロビンはヒトRBCの3分の1である。それゆえ、HbFおよびHbF/F細胞は、ネズミ科データをヒトと最良に比較するため、絶対量ではなく、割合として表現された。3.6%から13.6%へのHbFの増加は、デシタビンで患者における急性鎌状事象を低減することが明らかにされている。鎌状事象の類似の改善は、ヒドロキシウレアに応答した患者において25%またはそれ以上のHbF/F細胞で起きる。33%のHbF/F細胞での改善を示唆している、本明細書で提示されたデータは、これらの報告と一致しているが、しかし10〜12ヶ月時点で3分の1未満のHbF/F細胞が細胞内鎌状変形重合(intracellular sickle polymerization)の閾値と見なされる、SCAを有する乳児におけるRBCに一層酷似している。sGbGベクターによるγ-グロビン産生の最も注目すべき効果は、HbFが10%を超えた場合の鎌状赤血球マウスの生存性の改善および慢性臓器障害の劇的な欠如であった。高いHbFを有する患者は、ヒドロキシウレアでの多施設研究により確認された、生存性の改善を有する。sGbGベクターから発現されたHbFは、有効なヒドロキシウレア処置と同程度であったか、またはそれよりもさらに良好であった。ヒドロキシウレアに対する応答性および生涯にわたる毎日の投与のコンプライアンスが制限要因とはならない、1回限りの是正の可能性は、遺伝子治療のとてつもない利点であろう。実際に、(1) 本発明者らはSS RBCにHbFを課していたが、全てのRBCが同量のHbFを有する、トランスジェニックマウス; (2) 正常な量のHbA産生RBC (AA RBC)がSS RBCs17,37,38と混ぜられて存在する、キメラ移植; または(3) ヒドロキシウレアにより誘導された大赤血球症がHbSを希薄化し、鎌状赤血球化の閾値を低減しうる、ヒドロキシウレアに対してのSCD患者、に関する集約的な知識から導出されたように、本発明者らは、本発明者らが遺伝子治療で同じ結論を得られるとは期待していなかった。HbFは、正常な量のHbSを有する鎌状細胞へ外因的に課されたので、F細胞再配置およびSCA表現型の是正に必要な、遺伝子的に是正された鎌状HSCの閾値はずっと高いことが予想された。とりわけ、トランスジェニック/キメラにおけるこれらの明白な差異にもかかわらず、結論は外因性γ-グロビン発現と同様であった: 実際に33%から89%もの高さまでの濃度でRBC中にて外因性HbFを発現することで、MCVまたはMCHの有意な増加は起きなかったが、しかし鎌状赤血球化が是正された。このデータから、HbFの遺伝子送達が内因性HbSを減少させることが示唆される。
【０１９７】
致死線量照射/移植に関する設定においての形質導入HSCの割合は、非常に高く(24週の時点でストリンジェントな二次CFU-Sアッセイ法によって分析された場合、平均で50%)、つまり臨床の場で達成することが困難であろう数字である。しかしながら、BERK→BERK移植モデルは、20%の自家HSC是正が鎌状赤血球化、臓器障害および生存性の顕著な改善に十分でありうることを示す。しかしながら、有効な遺伝子治療に必要な遺伝子改変HSCのこの割合が達成可能であるかどうかを判定することは重要である。というのは、この疾患では遺伝子改変HSCに対する生存性の利点がないと認められているからである。高いヒトHSC形質導入が、従来のγレトロウイルスベクターによる遺伝子治療の制約になっていた。レンチウイルスベクターはこの障害を克服することができる: 20%の長期形質導入がレンチウイルスベクターにより副腎白質ジストロフィーにおいて明らかにされている。SCID-再配置細胞アッセイ法を用いてヒトCD34+細胞へのレンチウイルス形質導入を最適化し、免疫不全マウスへの移植から3〜4ヶ月後に70%の形質導入が認められた、ヒトサラセミアCD34+細胞における以前のデータと同様に、SCID-再配置細胞において、平均で、およそ75%の遺伝子移入を達成した。とりわけ、SCIDマウスにおけるこの遺伝子移入レベルは、明るい材料であり、実際に、前臨床研究において副腎白質ジストロフィーレンチウイルスベクターを用いNOD-SCIDマウスにおいて観察された遺伝子移入よりも高い。
【０１９８】
この手法を用いた遺伝子治療はまた、従来の同種骨髄移植/強度軽減移植の有害性および免疫学的帰結を克服できよう。ネズミ科移植における正常骨髄および鎌状骨髄(sickle marrow)の不適合な混合キメラ現象から、ほぼ完全なキメラ現象が、通常、臓器障害の是正には必要であることが明らかである。臨床シリーズにおいて、SCA患者でのフルダラビンとともに8 mg/kgのブスルファン、抗胸腺細胞グロブリンおよび全身リンパ組織放射線照射による強度軽減移植前処置(RIC)移植で、SCA表現型の是正とともに、移植から2〜8.5年後に78%の平均同種生着が示されたことは明るい材料である。免疫拒絶が起こりうる、同種RICという状況でさえも高いこのドナーキメラ現象のレベルから、RICに先立つ自家CD34+細胞への高い遺伝子移入効率が、骨髄破壊的前処置に代わって潜在的に一層安全でありうることが示唆される。ヒト幹/前駆細胞における77%の遺伝子移入効率が、NOD-SCID再配置細胞アッセイ法、ならびに1.3〜1.5コピー/細胞を使用したマウスでの表現型の是正およびおよそ20%の遺伝子標識CFU-Sを用いて実証された(図27)。
【０１９９】
意義深いことに、是正は細胞あたり1〜3個のベクターコピー、つまり臨床的に達成可能な目標で行われた。sGbGウイルスにクロマチンインスレーターを隣接させることは、HbF/ベクターコピーを2〜4倍だけ増加させるものと予想される。実験モデルにおいて、インスレーターエレメントが挿入による発がんのリスクを低下させるかどうかは不明であるが、インスレーターはクローンの優性を低減するものと思われる。無作為に組み込みを行うベクターで観察された挿入による発がんのリスクは、γレトロウイルスベクターよりもレンチウイルスベクターで低いことが明らかにされている。それは、拘束された赤血球系統においてのみエンハンサーエレメントが活性である場合、さらに低下されよう。
【０２００】
実施例76 鎌状赤血球病の遺伝子治療
HbFは、最も高い抗鎌状化効果を有するヘモグロビンであるので、正常ヒトγ-グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターsGbGを用いて、Berkeley鎌状赤血球マウスにおいてHbFを産生させた。本明細書において開示されるように、γ-グロビンエクソンならびにβ-グロビン非コード領域および調節エレメントを組み入れているレンチウイルスベクターsGbGをデザインした。このベクターは、HSCへのsGbGベクターの移入および骨髄破壊的移植の後にBerkeley鎌状赤血球マウスにおいて鎌状赤血球表現型の完全な是正を示した(実施例65、図23A〜D、図28および表1)。図23AおよびBは、マウスの血液中の不可逆性鎌状赤血球の低減を示し、図23CおよびDはマウスから実験的に誘導されたRBC鎌状化および鎌状細胞の比率を示し、図28は成功裏の遺伝子治療後のマウス生存性の改善を示す。
【０２０１】
（表１）血液学的是正はBerkeley鎌状赤血球マウスのsGbG群において得られる; 是正は一次および二次移植において長期的に維持される。
0006509884.tif 000014
マウスの血液パラメータの分析をsGbGまたはモック形質導入した系統(-)、Sca (+)およびKit (+)細胞の一次(Prim.)および二次(Sec.)移植後18週で示す。
【０２０２】
次に、強度軽減移植を用いてSCA病態生理を是正するために必要な重要パラメータを特定した。血液学的および機能的RBCパラメータ、炎症、ならびに臓器病態の完全な是正が、骨髄破壊的前処置および移植後のSCDマウスにおいて観察された。是正は一次および二次移植レシピエントにおいて長期的に維持された。強度軽減移植を用いてSCA病態生理を是正するために必要な重要パラメータについても特定した。モック移植Berkeley鎌状赤血球マウスの20%生存と比べて、遺伝子的に是正されたBerkeley鎌状赤血球マウスの100%の6ヶ月生存が認められた。
【０２０３】
自家移植の強度軽減移植前処置・模擬条件を用いて、異なる比率の遺伝子改変Berkeley鎌状HSCを、亜致死線量照射されたBerkeley鎌状赤血球マウスへ移植した。次に、鎌状赤血球貧血の是正に必要とされる遺伝子的に是正されたHSC、HbF、HbFを含んだRBC (F細胞)およびHbF/F細胞の最小比率を規定した。Berkeley鎌状赤血球マウス骨髄に再配置している15〜20%の遺伝子改変HSC、細胞あたりおよそ2個のベクターコピー、10%以上のHbF、および66%超のF細胞により、臓器病態および生存性を含む、鎌状赤血球表現型の完全な是正が認められた。Berkeley鎌状赤血球マウス骨髄に再配置している15〜20%の遺伝子改変HSC、細胞あたりおよそ2個のベクターコピー、10%以上のHbF、および66%超のF細胞により、臓器病態および生存性を含む、鎌状赤血球表現型の完全な是正が認められた。
【０２０４】
実施例77 βサラセミアの遺伝子治療
ヒトγ-グロビン遺伝子を保有するレンチウイルスベクターを介したHbFの発現が、これまでに示されている(Persons et al. Blood 10:2175-83 (2003); Pestina et al. Mol. Ther. 17:245-52 (2009))。β-サラセミアを是正するsGbGベクターの能力を確認するために、鎌状赤血球トランスジェニックマウスにおいて用いられたのと同じ手法を用いてサラセミアマウス(Hbbth3/+)を処置した。サラセミアマウスに、約8時間おいてsGbGを2回形質導入(2×20のMOI)したサラセミア幹/前駆細胞(Lin- Sca+ Kit+ [LSK]細胞)を移植した。対照(モック)動物を培地のみで同時に処置した。およそ10,000個の形質導入LSK+細胞を、致死線量照射されたサラセミアレシピエントマウス(700+375ラドの分割線量)へ200,000個の放射線照射Lin-Sca-Kit-細胞とともに注射/同時移植した。一次動物を7〜8ヶ月の期間にわたってモニターし、その後18ヶ月の全追跡調査の間に二次移植を行った。
【０２０５】
ベクターは22 ± 3% (平均+SEM)へのHbFの増加をもたらした; これによってサラセミア表現型が是正された(図29)。モック移植マウスにおける8.8 ± 0.2 g/dLの平均からsGbG移植マウスにおける12.5 ± 0.5 g/dLへのヘモグロビンの上昇が認められた(図29A); ヘマトクリットは31.8 ± 0.3から42.1 ± 1.07へ上昇した(図29B)。これには、20.8 ± 0.3%から8.7 ± 1.4%への網状赤血球増加の降下が付随して起きた(図29D)。38.1 ± 0.3から45.3 ± 1.7 flへのMCVの増加に伴って、サラセミアにおいて見られた小赤血球症も是正された。この是正は経時的に安定であって、一次および二次マウスにおいて維持された。
【０２０６】
実施例78 優れた抗鎌状化特性を有する改善されたHbF発現ベクター
上記のように、10%超のHbFの産生はマウスモデルにおいてSCD表現型を是正することが明らかにされた。sGbGベクターはBerkeley鎌状赤血球マウスモデルにおいて表現型を効率的に是正した(実施例65, 図23A〜D, 図28; Perumbeti et al., Blood 114: 1174-85 (2009))が、細胞あたりに非常に高いベクターコピーが存在していなければ、ノックイン鎌状赤血球マウスモデル(UABマウス)においてsGbGベクターは有効性がすっと低かった。
【０２０７】
Berkeley鎌状赤血球マウスはヒトα-およびβS-グロビン導入遺伝子についてトランスジェニックであり、マウスグロビンのノックアウトおよびヒト導入遺伝子が不均衡なグロビン鎖産生をもたらす。Berkeley鎌状赤血球マウスは、βSグロビン鎖と比べて、比較的過剰のヒトαグロビン鎖を有し、同様にα-グロビンを結合してHbS (α2βS2)を形成させるβSグロビンの存在下で、sGbGベクターにより産生されたγ-グロビンが容易にHbF (α2γ2)を形成させることを可能にする。UABマウスは、その一方で、マウスαグロビンの代わりにヒトαグロビンおよびマウスβ主グロビン遺伝子の代わりにヒトβSグロビン遺伝子についてノックインであり、マウスグロビンの代わりにヒトグロビンを産生する。これらのマウスは、それゆえ、完全に均衡のとれたヒトαおよびβS鎖を有し、ホモ接合性の鎌状赤血球貧血(Hb SS疾患)を有する患者に似ている。ホモ接合性のSCDを有する患者(およびUABノックイン鎌状赤血球マウスモデル)は、均衡のとれた(等量の)αおよびβS分子を有し、遺伝的に導入されたγ-グロビンはα-グロビンについてβSと競合しなければならない。ゆえに、βSグロビンを打ち負かしてHbFを形成させるためには、かなり過剰のγ-グロビンが必要とされる。
【０２０８】
したがって、Berkeley鎌状赤血球マウスにおいて、このベクターにより産生されたγ-グロビンは、αグロビンと結合してHbSを形成させるβSグロビンとの多くの競合なしに、過剰のαグロビンを効果的に結合してHbFを形成させる。ゆえに、Berkeley鎌状赤血球マウスにおいて、臨床的に達成可能なベクターコピーで疾患の是正が観察される。しかしながら、UABマウスにおいて、αグロビン鎖は等量の競合βSグロビン鎖のため、律速になる。それゆえ、βSグロビンを打ち負かしてHbFを形成させることができるためには、高レベル/過剰のベクター由来γグロビンが必要とされる。
【０２０９】
これに対処するため、遺伝子移入プロトコルおよび戦略にいくつかの変更を加えた。γ-グロビン遺伝子を第1エクソン中bp 50の位置でG→A点突然変異により改変した。この改変は、その機能特性を変化させることなくα-グロビンに対するその親和性を改善するために、アミノ酸グリシン(GGC)をアスパラギン酸(GAC)に変化させ、その結果HbFがRBC中でHbSよりも高い効率で形成される。オリジナルのγグロビンベクター(sGbG)の能力を次に、鎌状赤血球マウスにおいてγグロビンコード配列(sGbGM)中に点突然変異を有するものと比較した。sGbGMに対する注釈付きのベクターマップが図30に描かれており、図30および31においてはさまざまな配列領域が同定されている。sGbGM配列は図31に示されている。
【０２１０】
sGbG有効性研究について既述されている(Perumbeti et al., Blood 114:1174-85 (2009))ように、sGbGベクターとsGbGMベクターとの間の比較研究をBerkeley鎌状赤血球マウスおよびUAB鎌状赤血球マウスにおいて行ったが、ここでは造血幹細胞中で高濃縮されている、系統枯渇された、Sca+ Kit+ (LSK)細胞を、培地のみ(モック)、sGbGベクターまたはsGbGMベクターで形質導入し、亜致死線量照射されたBerkeleyまたはUAB鎌状赤血球レシピエントマウスへ移植した。マウスを移植後6、12および24週の時点で採血して血液学的パラメータおよびHbF発現を評価し、群ごとに6〜8匹のマウスをその後6〜12ヶ月間、追跡調査した。Berkeley鎌状赤血球マウスにおける12週のデータが図32に示されており、これにより、sGbGMベクターからの優れたHbF産生/ベクターコピーおよび網状赤血球増加の改善が実証される。
【０２１１】
Berkeley鎌状赤血球マウスとノックインUAB鎌状赤血球マウスとの間の比較結果が図33に示されている。示されたデータは、6ヶ月分析からの結果である。sGbGおよびsGbGMベクターからベクターコピーあたりに産生されたHbFの量が、Berkeley鎌状赤血球マウス(図33A)およびUABノックイン鎌状赤血球マウス(図33B)において示されている。sGbGMマウスは両タイプの鎌状赤血球マウスにおいてsGbGベクターと比較して、ほぼ1.5〜2倍優れたHbF形成能を示した。特筆すべきは、sGbGMベクターのコピーあたりに産生されたHbFの量が、sGbGMベクターでのUABマウスと比較して、Berkeleyマウスにおいてほぼ2倍であり、過剰のα-グロビン鎖が存在する場合にHbF四量体が生じる容易さ、およびα-グロビン鎖が律速である場合にこれらの四量体を形成させる困難さを示している。
【０２１２】
sGbGMベクターから作製されたHbFは、両タイプの鎌状赤血球マウスにおいて鎌状赤血球化の是正、網状赤血球増加の優れた低減、およびヘモグロビンの増加を示し、機能的であった。sGbGMベクターで移植されたUABマウスでは貧血の是正が観察されたが、しかしsGbGベクターではそうでなかった。これらのマウスのうちいくつかのものは、現在、ほぼ1年間追跡調査されており、発現は安定である。RBC半減期およびRBC膜変形能の、はるかに良好な是正もまた、HbFレベルが同じである場合にsGbGベクターと比べて、sGbGMの使用で観察された。図32において、sGbGベクターでの30〜35%のHbFレベルにもかかわらず(黒菱形, 図32B)、マウスはおよそ15%の平均網状赤血球計数を有していたが、網状赤血球計数は、同様のHbFレベルを有するsGbGMマウスで5%であったこと(白菱形)が示しめされる。これは、変異がまた、同様のHbFレベルにもかかわらず、鎌状赤血球化を低減させることにより、RBCの寿命を改善させたことを実証する。かくして、遺伝子操作された変異γグロビンベクターはまた、優れた抗鎌状赤血球化HbFを産生し、RBCの質および寿命を改善させる。HbFのこの予想外の有利な特性の背後にある機構を判定するため臓器障害、RBC膜変形能、RBC半減期に及ぼす効果、および正常HbFと比べて変異体HbFの酸素親和性に関する研究が進行中である。
【０２１３】
これらの結果は、sGbGMベクター中の点突然変異γ-グロビン遺伝子が鎌状赤血球化を抑止し、それゆえ、鎌状RBC半減期を引き延ばし、一層低い網状赤血球計数をもたらすことを実証する(図33)。この一層高いHbF産生および網状赤血球増加の低減は、ヘモグロビンの比例的上昇および鎌状赤血球表現型の血液学的是正を引き起こす。sGbGMベクターはベクター骨格または転写調節エレメントのいずれの変化も有していない。
【０２１４】
上記のさまざまな方法および技法は、本発明を行うためのいくつかの方法を提供する。もちろん、記述される全ての目的または利点が必ずしも、本明細書において記述される任意の特定の態様にしたがって達成されうるとは限らないことが理解されるべきである。したがって、例えば、当業者は、上記方法が、本明細書において教示または示唆されうるように、他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書において教示されるような1つの利点または利点の群を達成または最適化するやり方で実施されうることを認識するであろう。種々の有利および不利な代替物が本明細書において言及される。いくつかの好ましい態様は、1つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含む一方で、その他は、1つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に排除すると同時に、なおその他のものは、1つの、別の、またはいくつかの有利な特徴の包含によって、現在の不利な特徴を具体的に軽減することが理解されるべきである。
【０２１５】
さらに、当業者は、異なる態様からさまざまな特徴の適用可能性を認識するであろう。同様に、上記で考察されるさまざまな要素、特徴および段階、ならびにこのような各要素、特徴または段階の他の公知の等価物は、本明細書において記述される原理にしたがって方法を実施するために、当業者によって混合および適合されうる。さまざまな要素、特徴、および段階の中でも、いくつかは、具体的に含められ、他のものは、多様な態様において具体的に排除されるであろう。
【０２１６】
本発明はある種の態様および実施例との関連で開示されたが、本発明の態様は具体的に開示された態様を超えて、その他の代替の態様および/または使用ならびにその変更および等価物にまで及ぶことが当業者によって理解されるであろう。
【０２１７】
多くの変形および代替要素が本発明の態様のなかで開示された。なおさらなる変形および代替要素が当業者には明らかであろう。これらの変形のなかには、非限定的に、治療用生成物によって標的化される具体的な遺伝子数、遺伝子のタイプ、遺伝的疾患または欠損のタイプ、および特定される遺伝子がある。本発明のさまざまな態様は、これらの変形または要素のいずれかを特に含むまたは除外しうる。
【０２１８】
いくつかの態様において、本発明のある種の態様を記述および主張するために用いられる、成分の量、分子量、反応条件などのような特性を表す数字は、いくつかの場合には「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、いくつかの態様において、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、特定の態様によって得られるよう求められた所望の特性に応じて変化しうる近似値である。いくつかの態様において、数値パラメータは、報告されている有効桁の数を考慮して、および通常の四捨五入法を適用することによって解釈されるべきである。広範にわたる本発明のいくつかの態様を説明する数値範囲およびパラメータは近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載の数値は実践可能なよう正確に報告されている。本発明のいくつかの態様において提示される数値は、それらの各試験測定値において見出される標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を含みうる。
【０２１９】
いくつかの態様において、「1つの(a)」および「1つの(an)」および「その(the)」という用語、ならびに本発明の特定の態様を記述する文脈において(特に以下のある特定の特許請求の範囲の文脈において)用いられる同様の言及は、単数および複数の両方を包含するよう解釈することができる。本明細書における値の範囲の詳説は単に、その範囲に含まれる別々の各値に個別に言及する簡単な方法として働くよう意図されているものである。本明細書において特に示されない限り、個別の各値は、それが本明細書に個々に列挙されたかのように本明細書に組み入れられる。本明細書において記述される全ての方法は、本明細書において特に示されない限り、または文脈で明確に矛盾しない限り、任意の適当な順序で行うことができる。本明細書におけるある種の態様に対して提供される、任意のおよび全ての実施例、または例示的な言い回し(例えば「のような」)の使用は、単に本発明をより良く説明することが意図されており、別のやり方で主張される本発明の範囲の制限を提起するものではない。本明細書における言い回しはいずれも、本発明の実践に不可欠な、主張されない任意の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０２２０】
本明細書において開示される本発明の代替の要素または態様のグループ分けは、限定と解釈されるべきではない。各群の成員は、群の他の成員もしくは本明細書において見出される他の要素をいうことができ、かつ個々にまたはそれらとの任意の組み合わせで主張することができる。群の1つまたは複数の成員は、便宜および/または特許性の理由で群に含まれても、またはそこから削除されてもよい。そのような任意の包含または削除が行われる場合、本明細書は変更された群を含み、かくして添付の特許請求の範囲において用いられている全てのマーカッシュ群の、書面による明細を満たすものと見なされる。
【０２２１】
本発明を行うために発明者らに公知の最良の様式を含めて、本発明の好ましい態様が本明細書において記述される。それらの好ましい態様の変形は、先の記述を読むことで当業者には明らかとなるであろう。熟練した技術者はそのような変形を必要に応じて利用することができ、本明細書において具体的に記述されている以外に本発明を実践できるものと企図される。したがって、本発明の多くの態様には、準拠法により許可されるように、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙される主題の全ての変更および等価物が含まれる。さらに、全ての可能性のある変形における上記要素の任意の組み合わせは、本明細書において特に示されない限り、または文脈で明確に矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０２２２】
本明細書において参照される全ての特許、特許出願、特許出願の刊行物、ならびに文献、本、明細書、刊行物、資料、物事、および/または同等物のような他の材料は、これらに関連するいずれの審査ファイル履歴、本明細書と一致しない、もしくは矛盾するこれらのうちのいずれか、または現在もしくは後に本明細書に関連する請求項の最も広い範囲に関して影響の制限を有しうるこれらのうちのいずれかを除き、本明細書において、全ての目的に関してその全体がこの参照により本明細書に組み入れられる。例として、組み入れられた材料のいずれかと関連する用語の記述、定義、および/または使用と本明細書に関連するものとの間にいずれの不一致または矛盾がある場合、本明細書における用語の記述、定義、および/または使用が優先されるべきである。
【０２２３】
最後に、本明細書において開示される本発明の態様は本発明の原理の例示であることが理解されるべきである。利用できる他の変更は本発明の範囲内でありうる。したがって、例として、非限定的に、本発明の代替的構成を本明細書における教示にしたがって利用することができる。したがって、本発明の態様は示され、記述される通りの正確なものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１４Ｇ】
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【図１４Ｈ】
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【図１４Ｉ】
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【図１４Ｊ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−０１】
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【図３１−０２】
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【図３１−０３】
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【図３１−０４】
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【図３１−０５】
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【図３１−０６】
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【図３１−０７】
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【図３１−０８】
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【図３１−０９】
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【図３１−１０】
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【図３１−１１】
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【図３１−１２】
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【図３１−１３】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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