【事件の表示】
　特許第３１０５４９４号「蛋白質を安定化するための改良された方法」の請求項１ないし８に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３１０５４９４号の請求項１ないし６に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３１０５４９４号の請求項１ないし８に係る発明についての出願は、平成１０年１１月２４日（パリ条約による優先権主張１９９７年１１月２２日及び１９９８年２月１９日、欧州特許庁）の出願であって、平成１２年９月１日にその特許の設定登録がなされ、その後、西川武則より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１４年８月１２日に訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正請求
１．訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項１に係る「蛋白質」（４ヶ所）を「抗体」と訂正し、「溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上であるような方法。」との記載を「溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上であり、かつ該水性緩衝溶液がｐＨ６〜８の範囲に緩衝されるような方法。」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項５及び請求項８を削除し、以降の請求項数を繰り上げる。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　訂正事項(1)は、「蛋白質」を、下位概念の「抗体」と訂正し、「かつ該水性緩衝溶液がｐＨ６〜８の範囲に緩衝される」という記載を直列的に加入するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当し、訂正事項(2)は、請求項を削除するものであるから、同じく特許請求の範囲の減縮を目的とした明細書の訂正に該当する。
　また、これらの訂正は新規事項に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４、２項及び同条３項で準用する１２６条２項及び３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議の申立てについての判断
１．本件発明
　上記II．で示したように上記訂正が認められるから、本件の請求項１ないし６に係る発明（以下、「本件発明１ないし６」という。）は、上記訂正に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし６に記載された事項により特定される次のとおりのものである。
「【請求項１】　抗体の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される、抗体の薬学的組成物の再構成された凍結乾燥物における抗体凝集体の形成を防止するための改良された方法であって、抗体の水性緩衝溶液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上であり、かつ該水性緩衝溶液がｐＨ６〜８の範囲に緩衝されるような方法。
【請求項２】　区画中での緩衝液の濃度が１０mmol/１〜３００mmol/ｌの間である、請求項１記載の方法。
【請求項３】　区画が再構成された溶液の浸透圧が１００〜５００mOsmの間である、請求項１〜２記載の方法。
【請求項４】　区画が再構成された溶液の浸透圧が３００±５０mOsmの範囲にある、請求項３記載の方法。
【請求項５】  水性緩衝液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１〜４記載の方法。
【請求項６】　水性緩衝液が糖を１０〜１００mg/mlの濃度で含む、請求項１〜５記載の方法。」
　
２．特許異議申立書の理由の概要
　特許異議申立人は、下記の甲第１号証ないし甲第１１号証を提出し、訂正前の本件請求項１ないし８に係る発明は、甲第１号証ないし甲第１１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法２９条２項の規定により特許を受けることができないと主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　記
甲第１号証：Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　
　　　　　　ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｓｅｒｉｅｓ　Ｎｏ．５６７，
　　　　　　１３４−１４７，１９３−２０３頁
甲第２号証：根井外喜男編「凍結・乾燥と保護物質」（１９７２年３月
　　　　　　２０日東京大学出版会発行）２４〜３９頁
甲第３号証：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１４
　　　　　　（８），９６９−９７５頁
甲第４号証：ＣＲＹＯＢＩＯＬＯＧＹ　２５，２４４−２５５頁
甲第５号証：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６５，
　　　　　　６８−７６頁
甲第６号証：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１３，
　　　　　　５９０−５９６頁
甲第７号証：Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　
　　　　　　Ａｃｔａ，１０８０，１５５−１５９頁　
甲第８号証：Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　
　　　　　　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，８１，３１９−３２９頁
甲第９号証：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１
　　　　　　（５），７６４−７７１頁
甲第１０号証：遺伝子組換え天然型ヒト成長ホルモン製剤「ノルディトロ
　　　　　　　ピン注射用４１．Ｕ．」の添付文書
甲第１１号証：ＢＩＯＰＨＡＲＭ　ｏｃｔｏｂｅｒ　１９９０　２６−
　　　　　　　３０頁
　
３．対比・判断
（本件発明１について）
　甲第１号証には、「計画された凍結とは以下を含む。蛋白質は凍結保存され、エンドユーザーによって解凍される。凍結乾燥された蛋白質は、エンドユーザーによって再水和され、小分けされ凍結される。凍結保存とは、大きなロットの凍結乾燥をする前に蛋白質のバッチを保存する一時的な方法である。」（１３５頁１〜４行）、「すなわち、糖による凍結乾燥時および再水和時の蛋白質活性保持のメカニズムは凍結乾燥時のアンフォールディングを防ぐことによる。」（１４２頁６〜８行）、「アンフォールドしたモノマーは、その後、融解または再水和時に凝集する。このプロセスは、マルチマー蛋白質が溶液中で変性する際に起こる。解離−アンフォールディング−凝集の連続と似ている。」（１４５頁１５〜１８行）、及び「図１．凍結乾燥時の乳酸脱水素酵素の安定性へのポリエチレングリコールとショ糖の効果。酵素は１０mMリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５，２３℃）を用い、２．５μｇ／mlの濃度で調製した。サンプルは液体窒素に漬けることで凍結し、室温、空気中で溶解した。ショ糖のデータは参考文献１から示した。」（１３９頁Ｆｉｇｕｒｅ　１）と記載されている。
　上記の記載によると、甲第１号証には、蛋白質（酵素）が凍結され、解凍され、これらの区画が凍結乾燥される蛋白質の再構成された凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するための方法であって、蛋白質の水性緩衝溶液がリン酸カリウム緩衝液であり、凍結乾燥時の安定性を付与するためにポリエチレングリコール或いはショ糖を添加することが記載されているといえる。
　本件発明１と甲第１号証に記載された発明とを対比すると、両者は、蛋白質の再構成された凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するための方法において、蛋白質の水性緩衝溶液としてリン酸カリウム緩衝液を用いる点で一致し、（イ）前者では、蛋白質が「抗体」であるのに対し、後者では蛋白質が「酵素」である点、（ロ）前者では「溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上である」と限定しているのに対して、後者には、上記限定についての記載はないが、ポリエチレングリコール或いはショ糖を必須成分として添加する点、及び（ハ）前者では「水性緩衝溶液がｐＨ６〜８の範囲に緩衝される」のに対し、後者ではそのような規定がない点で相違する。
（なお、異議申立人は、特許異議申立書１７頁において、本件発明１と甲第１号証に記載された発明との相違点は「Ｄ．溶液中でのカリウムとナトリウムの比が１０：１またはそれ以上である」という点だけであるとしているが、これは、甲第１号証に係るポリエチレングリコール或いはショ糖の存在を無視したもので誤りである。）
  上記相違点（ロ）は、甲第１号証に係る発明では、ポリエチレングリコール或いはショ糖を必須成分として添加するが、本件発明１では、これらを添加することなく、緩衝液として「リン酸カリウム緩衝液」を使用し、かつ「溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上である」と限定することで凝集体の形成を防止するというものである。
　よって、先ず相違点（イ）及び（ロ）について検討するに、甲第２号証には、蛋白質の希釈溶液をアンプルやバイアルに分注し凍結乾燥して蛋白質製剤とすることが記載されているものの、これ以上本件発明１について教示するところはなく、甲第３号証には、蛋白質製剤における凝集物の生成を防止するため、非イオン性界面活性剤を使用することが記載されているが、リン酸カリウム緩衝液について言及するところはない。
　甲第４号証には、「図１」に、ブドウ糖、乳糖、ショ糖をそれぞれ存在させたリン酸カリウム緩衝液を用いたときの凍結融解後の乳酸脱水素酵素活性の回復率を比較した実験結果、及びショ糖を存在させたリン酸ナトリウム緩衝液を用いたときの凍結融解後の乳酸脱水素酵素活性の回復率を比較した実験結果が示され、「図５」に、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩化ナトリウムをそれぞれ存在させたときの凍結融解後の乳酸脱水素酵素活性の回復率を比較した実験結果が示されている。
　しかし、「図１」において、ショ糖存在による乳酸脱水素酵素活性の回復率は、リン酸カリウム緩衝液を用いた場合よりリン酸ナトリウム緩衝液を用いた場合のほうが高く、また、「図５」からは、ナトリウムイオンがカリウムイオンより乳酸脱水素酵素活性の回復率が劣るとはいえないから、甲第４号証の記載から、リン酸カリウム緩衝液の方がリン酸ナトリウム緩衝液に比べて凝集体の形成防止に有効であることが導き出せるとはいえない。
　甲第５号証には、ジフテリアトキシンを凍結した場合、その構造に相互変換が起こること、そしてこの相互変換は、リン酸ナトリウム緩衝液等では顕著であるがリン酸カリウム緩衝液中では基本的には認められないことが記載されているが、相互変換とは、ジフテリア毒素が単量体→２量体→多量体となることのみならず、多量体→２量体→単量体となることも意味するから、甲第５号証の記載をもって、直ちに凝集体の形成防止にリン酸カリウム緩衝液が有効であることが教示されているとはいえない。
　しかも、甲第５号証には「ジフテリア毒素には様々な状態の凝集体が見出されている。」（６９頁３行）との記載があり、この記載によるとジフテリア毒素は通常でも凝集体を形成すると解されるから、この点からも、ジフテリア毒素と抗体について同じように論ずることは不適切であるというべきである。
　甲第６号証には、「アニーリング中のα−ヘリックス含量の低下は、ＮａＣｌに代えてＫＣｌを用いた緩衝液Ｂによる製剤処方では生じなかった。事実、検討したアニーリングタイムの全域に渡り、ＫＣｌ含有サンプルのα−ヘリックス含量は一切変化しなかった。」（５９３頁右欄下から８〜５３行）との記載はあるものの、これに続けて「ポリマーがない場合（すなわち、リン酸バッファーおよび塩の中で凍結乾燥したヘモグロビン）では、乾燥させた蛋白質の構造をＦＴＩＲにより決定したところ，ＮａＣｌをＫＣｌに替えても本質的に何の変化もない」との記載があり、この記載に照らし、甲第６号証からは、カリウムイオンのほうが、ナトイウムイオンよりも蛋白質の構造を変化させないとは到底いえない。
　甲第７号証は、「リン酸緩衝液中で凍結濃縮に曝されるときのカルボニルヘモグロビン及びカルボニルミオグロビンの構造異性体の組成に与えるアルカリ陽イオンの影響」に係り、リン酸ナトリウム緩衝液を用いて凍結した場合、カルボニルヘモグロビンはコンフォーマーIIIからコンフォーマーIVに変化すること、並びに、リン酸カリウムを用いて調製された緩衝液の場合、コンフォーマーIIIからIVへの変化は殆ど生じなかったことが記載されているが、抗体とカルボヘモグロビン或いはカルボミオグロビンとは全く別異の物質であり、しかも、凝集とコンフォーマーとは異なる現象であるから、甲第７号証の記載を根拠に、本件発明１の進歩性を論ずることはできない。
　甲第８号証は、「ｐＨあるいはリン酸ナトリウム／リン酸カリウムの組成に対する凍結の影響」に係り、リン酸１ナトリウムとリン酸２ナトリウム混合溶液のｐＨは、凍結中、劇的に変化すること、リン酸１カリウムとリン酸２カリウムの混合溶液の場合は、氷結のみによるｐＨ変化はナトリウム塩の場合ほど顕著ではないことが記載されているが、蛋白質溶液を用いた場合はどのようになるかについて開示するところは全くない。
　甲第９号証は、「ヒト・マウスのキメラ抗体（Ｌ６）の物理的、化学的安定性」に係り、「リン酸ナトリウムの凍結における挙動は、観察された差異に寄与しているかもしれない。（リン酸緩衝液の）凍結中のｐＨ変化は極めて顕著であるが（３ｐＨユニットにも及ぶ）、これはリン酸２ナトリウムが凍結中に晶析することによるし、この効果の程度は塩濃度に依存すると思われる。このように、ｐＨ変化、相変化、水の凍結（氷結晶形成）、タンパク質の凍結時濃縮などは、（抗体）タンパク質のコンフォーメーション変化や凝集体形成を引き起こす潜在的な要因である。」（７６９頁左欄２０〜２７行）との記載があるところ、この記載によると、リン酸ナトリウム緩衝液を使用すると凍結中のｐＨ低下により凝集体が形成されることが示唆されている可能性を否定することはできない。しかし、甲第９号証には、「高いｐＨ値においては、・・・凍結融解による凝集が大きくなる」（７７１頁左欄）との記載があり、この記載に接した当業者は、凝集体の形成防止のためにはｐＨを低くする方が好ましいと解するかもしれず、先の見解と相反することとなる。
　そうすると、甲第９号証は、その記載自体が相矛盾するものであり、しかも、カリウムについて言及するところは全くないのであるから、甲第９号証の記載から、凍結乾燥物における抗体の凝集を防止するためにリン酸カリウム緩衝液を用いることを想到することは、当業者といえども困難である。
　甲第１０号証には、遺伝子組換え天然型ヒト成長ホルモン製剤は、浸透圧比（生理食塩液に対する比）が０．９〜１．２であることが記載されているのみであり、また、甲第１１号証には、等張溶液にするために塩化ナトリウム等の塩を加えることが記載されているのみである。
　以上のように、甲第１号証ないし甲第１１号証には、ポリエチレングリコール或いはショ糖を添加することなく、緩衝液として「リン酸カリウム緩衝液」を使用し、かつ「溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上である」と限定することで凍結乾燥物における抗体凝集体の形成を防止することについて教示するところは全くなく、また甲各号証を組み合わせてもかかる構成を導き出すことはできない。
　そして、緩衝液としてリン酸カリウム緩衝液を使用し、かつ「溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上である」と限定する
ことにより、本件発明の所期の効果を奏するものであるから、相違点（ハ）について検討するまでもなく、本件発明１は、甲第１号証ないし甲第１１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものとはいえない。
　
（本件発明２ないし６について）
　本件発明２ないし６は、本件発明１を引用するものであるから、上記本件発明１についての判断と同じ理由により、甲第１号証ないし甲第１１号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　
４．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１ないし６についての特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明１ないし６についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年６月７日（２００４．６．７）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
蛋白質を安定化するための改良された方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　抗体の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される、抗体の薬学的組成物の再構成された凍結乾燥物における抗体凝集体の形成を防止するための改良された方法であって、抗体の水性緩衝溶液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上であり、かつ該水性緩衝溶液がｐＨ６〜８の範囲に緩衝されるような方法。
　【請求項２】　区画中での緩衝液の濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌ〜３００ｍｍｏｌ／ｌの間である、請求項１記載の方法。
　【請求項３】　区画が再構成された溶液の浸透圧が１００〜５００ｍＯｓｍの間である、請求項１〜２記載の方法。
　【請求項４】　区画が再構成された溶液の浸透圧が３００±５０ｍＯｓｍの範囲にある、請求項３記載の方法。
　【請求項５】　水性緩衝液が非イオン性界面活性剤を含む、請求項１〜４記載の方法。
　【請求項６】　水性緩衝液が糖を１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１〜５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は、凍結もしくは凍結乾燥の工程において、または低温での保存中に、蛋白質を安定化するための改良された方法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　酵素または抗体ないしそれらの断片などの蛋白質は不安定であり、水性溶液中および低温（０℃未満）での保存時、特に凍結および解凍を反復する工程において活性消失ならびに／または可溶性もしくは不溶性の凝集体が形成されやすく、これらの凝集体は粒子を形成して混濁を生じることによって明らかとなる。しかし、蛋白質の薬学的組成物にとっては、このような凝集体および／もしくは粒子形成は認容することができない、または少なくとも痕跡量のみである必要がある。薬学的組成物は清澄な溶液である必要があり、それが凍結乾燥物として存在する場合には、それを再構成した際にも、可溶性の蛋白質凝集体を含まない清澄で粒子を含まない溶液として得られる必要がある。
　【０００３】
　溶液中の蛋白質を安定化するための方法および添加物は数多く知られている。例えば、ＨＳＰ２５などの熱ショック蛋白質の添加による蛋白質の安定化は、例えばＥＰ−Ａ　０　５９９　３４４に記載されている。ポリオキシプロピレンおよびポリオキシ−エチレンからなるブロックポリマー（ｂｌｏｃｋ　ｐｏｌｙｍｅｒ）の添加、ならびにリン脂質による抗体の安定化は、ＥＰ−Ａ　０　３１８　０８１に記載されている。ＥＰ−Ａ　０　０２５　２７５には、アルギニン、グアニジンまたはイミダゾールなどの窒素を含む塩基性物質の塩を添加することによる免疫グロブリンの安定化が記載されている。安定化のためのその他の適した添加物には、ポリエーテル（ＥＰ−Ａ　０　０１８　６０９）、グリセリン、アルブミンおよび硫酸デキストラン（米国特許第４，８０８，７０５号）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ＤＥ　２６　５２　６３６、ＧＢ　８５１４３４９）などの界面活性剤、ＧｒｏＥｌ（Ｍｅｎｄｏｚａ，Ｊ．Ａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｅｃｈ．１０（１９９１）５３５〜５４０）などのシャペロン、クエン酸緩衝液（国際公開公報第９３／２２３３５号）またはキレート剤（国際公開公報第９１／１５５０９号）がある。これらの添加物は、蛋白質を水性溶液中である程度安定化させることができる。しかし、先行技術において知られている方法には、再解凍中、０℃未満の温度での保存中、または凍結乾燥後の溶液の再構成時に、可溶性もしくは不溶性の凝集体がまったく形成されないか、または治療的目的からみて無視しうる量のみが形成されるような、凍結および解凍の反復工程の間に蛋白質を安定化するために適したものがまったくないことが明らかになった。
　【０００４】
　ＥＰ−Ａ　０　３１４　０９５では、緩衝性物質としてヒスチジン緩衝液、添加物として塩化カルシウムを含み、高いイオン強度（０．３５〜１．２ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ）中に存在する、第ＶＩＩＩ因子などの血漿蛋白の凍結乾燥物が記載されている。
　【０００５】
　０．５〜１５ｍｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、０．０１〜１０ｍｍｏｌ／ｌの塩化水素リジン、および緩衝性イオンとして０．２〜５ｍｍｏｌ／ｌのヒスチジンを含む、第ＶＩＩＩ因子などの血漿蛋白の凍結乾燥物は、ＥＰ−Ａ　０　３１５　９６８に記載されている。しかし、ヒスチジン緩衝液は、蛋白質の凍結乾燥物が再構成される場合には、蛋白質の安定化ならびに凝集体および粒子の形成防止のためには適していない。
　【０００６】
　【発明が解決しようとする課題】
　したがって、本発明の目的は、蛋白質の薬学的組成物の凍結乾燥物が再構成される際に凝集体および粒子の形成を実質的に防止することができる方法を提供することである。
　【０００７】
　【課題を解決するための手段】
　このため、本発明は、蛋白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注射可能な量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥されるような、凍結乾燥物から再構成される蛋白質、好ましくは抗体の、薬学的組成物の溶液中での蛋白質凝集体の形成を防止するための改良された方法であって、その蛋白質の水性緩衝液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムおよびナトリウムのイオンの比が１０：１またはそれ以上であるような方法に関する。この水性緩衝溶液は、好ましくはナトリウムイオンを本質的にまったく含まない。
　【０００８】
　本発明により、蛋白質、特に抗体などの二量体化または多量体化しようとする傾向のある蛋白質の薬学的組成物を、中性ｐＨの範囲（ｐＨ６〜８、好ましくは６．５〜７．５）において安定な薬学的組成物に処方することが可能となる。抗体などの蛋白質は、特に、溶液が１回またはそれ以上の回数にわたって凍結され（選択的には凍結乾燥され）、再び解凍されると、中性ｐＨの範囲では凝集する傾向がある。
　【０００９】
　薬学的組成物は、ｐＨが６から８までの範囲にあって、緩衝液濃度が１０から３００ｍｍｏｌ／ｌまでの間、好ましくは５０から２５０ｍｍｏｌ／ｌまでの間であり、その薬学的組成物の中に可能な限り少ない数のナトリウムイオンしか存在せずに、リン酸カリウム緩衝液中にあることが特に有利である。カリウムおよびナトリウムのイオンの好適な比は１０：１またはそれ以上である。リン酸カリウム緩衝液が薬学的組成物における緩衝性物質として単独で用いられ、ナトリウム塩（塩化ナトリウムなど）はまったく添加されないことが特に好ましい。このような場合には、薬学的組成物中にはナトリウムイオンはほとんど存在しないか、または反復性の凍結もしくは解凍の間に蛋白質の凝集体の形成を引き起こさないような少量のみが含まれる。
　【００１０】
　リン酸カリウム緩衝液を緩衝性物質として用いた場合には、製造方法において少なくとも１回凍結された蛋白質溶液の凍結乾燥物を、混濁を実質的に形成することなく後に再構成できることが判明した。リン酸ナトリウム緩衝液、ヒスチジン緩衝液またはクエン酸緩衝液などの一般的な緩衝液は、このような方法において主に蛋白質からなる凝集体の形成をもたらし、このためにかなりの程度の混濁をももたらす。凍結された蛋白質溶液の共融点は約−１５℃よりも高いため、約−１５℃よりも低温ではすでに完全に凍結しており、このためすでにこの温度でも、またはより低い温度、好ましくは例えば−２０℃での保存が可能である。溶液は共融点よりも低温になってはじめて完全に凍結するため、このことは、ナトリウムイオンを含むリン酸緩衝液中の蛋白質は、凍結保存中（通常は−２０℃）および凍結／解凍工程の間に、ナトリウムイオンを含まない緩衝液中またはナトリウムイオン濃度が非常に低い緩衝液中にある場合よりも高いストレスを受けることを意味する。本発明によれば、このストレスは上記の製剤形態では回避され、その結果、凝集体および粒子の形成が抑制される。この製剤形態は、蛋白質溶液を−２０℃で安定的に保存することを可能にし、これはコスト削減につながる。リン酸カリウム緩衝液は、リン酸ナトリウム緩衝液とは対照的に、凍結工程の間のｐＨ変化（ｐＨ　ｓｈｉｆｔ）が極めてわずかである（好ましくは最大で±１ｐＨ単位、特に好ましくは最大で±０．５ｐＨ単位）。
　【００１１】
　粒子形成を効果的に防止するためには、リン酸緩衝液の濃度は少なくとも１０ｍｍｏｌ／ｌ、好ましくは約５０ｍｍｏｌ／ｌまたはそれ以上である必要があることが判明した。薬学的組成物（すなわち、好ましくは再構成された溶液）における浸透圧は過度に高くない必要があるため（これは生理的範囲、好ましくは再構成後に約３００ｍＯｓｍ（±２０ｍＯｓｍ、１００ｍＯｓｍ〜５００ｍＯｓｍの範囲も適している）であることが有利である）、緩衝性物質、または選択的には緩衝性物質および塩の合計の濃度は、２５０〜３００ｍｍｏｌ／ｌを上回るべきではない。緩衝液の濃度は、好ましくは区画中で５０から２５０ｍｍｏｌ／ｌまでの間である。しかし、区画を作成するために用いられる溶液（バルク）の生産には、より高い濃度の緩衝性物質および／または塩も認容されうる。
　【００１２】
　特にイオン強度を調整するために、薬学的組成物中に塩添加物があることが望ましい場合には、本発明によれば、同じくナトリウム塩を用いないこと、またはカリウムイオンの濃度よりもかなり低いナトリウムイオン濃度を選択することが有利である。したがって、通常は一般的である塩化ナトリウムの代わりに、塩化カリウムなどのカリウム塩を添加することが好都合である。しかし、カリウムイオンとナトリウムイオンとの比が１０：１またはそれ以上であれば、少量のナトリウム塩（例えば約１０ｍｍｏｌ／ｌまたはそれ未満）は妨げにならないことが判明している。リン酸カルシウムはそのような添加によって沈殿し、このために望ましくない混濁が形成されることに加えて、本発明によるリン酸カルシウムの緩衝効果も消失するため、例えば塩化カルシウムなどのカルシウム塩を添加することはできない。
　【００１３】
　本発明に係る方法においてその形成を防止する必要のある不溶性凝集体は、そのサイズが通常は少なくとも１μｍである蛋白質凝集体と本質的には理解されているが、１０μｍを上回る範囲でもありうる。粒子は、例えばＰＳＳ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）社の粒子算定装置ＡｃｃｕＳｉｚｅｒ７００などの市販の粒子算定装置を用いる適切な粒子算定法によって計測することができる。本発明によれば、方法の改良は、２〜４００μｍ／ｍｌの粒子の数が３０００個未満であるか、または１０〜４００μｍ／ｍｌの粒子の数が２０００個またはそれ未満である場合に達成される。ＵＳＰ（米国薬局方）によれば、薬学的製剤の１回の注入量当たりで、１０μｍを上回る範囲では最大６０００個の粒子、２５μｍを上回る範囲では最大６００個の粒子が許容される。これは、本発明によれば、蛋白質の治療的組成物に関する単純な様式において達成されうる。
　【００１４】
　蛋白質（ポリペプチド）は、本発明の認識においては、蛋白質または蛋白質の断片ないしは化学的修飾を受けた蛋白質と理解される。薬学的組成物に関して望ましい安定化がなされた蛋白質は、好ましくは抗体、免疫毒素などの抗体融合蛋白質、酵素、およびエリスロポエチン、ソマトスタチン、インスリン、サイトカイン類、インターフェロン類またはプラスミノーゲン活性化因子などの蛋白質ホルモンである。
　【００１５】
　本発明の概念に含まれる区画は、選択的にさらなる加工（薬学的に許容されうる物質のさらなる添加）を経た後に、好ましくは患者に注射するための、薬学的組成物として適した蛋白質水溶液のアリコートであると理解される。
　【００１６】
　薬学的組成物がリン酸カリウム緩衝液によって安定化されるｐＨの範囲は、好ましくは弱酸性、中性または弱アルカリ性の範囲（約ｐＨ６〜８、好ましくは約ｐＨ７）である。
　【００１７】
　本発明によれば、ポリソルベート（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）８０など）などの非イオン性界面活性剤を、好ましくは重量にして最大０．１％、少なくとも重量にして０．０１％の濃度で添加することが好ましい。
　【００１８】
　さらに、非還元糖（好ましくはショ糖またはトレハロース）などの凍結保護剤またはガラス質形成剤（ｇｌａｓｓ　ｆｏｒｍｅｒ）を、有利には少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約３０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で添加することが好ましい。
　【００１９】
　したがって、本発明のさらなる主題事項は、本質的に非晶質性であって蛋白質および主要な緩衝性物質としてのリン酸カリウム緩衝液の凍結溶液からなり、溶液中のカリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なくとも１０：１である、蛋白質の低凝集性で融解可能な固形保存形態である。
　【００２０】
　カリウムイオンの濃度およびナトリウムイオンの残留量とは無関係に、カリウムとナトリウムイオンの比は少なくとも１０：１、好ましくは少なくとも５０：１である。本質的にナトリウムイオンを含まないカリウム緩衝液を用いることが特に好ましい。
　【００２１】
　本発明のさらに好ましい態様において、薬学的組成物は、インビトロ細胞培養物（例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系の組換え生産または培養）によって生産された蛋白質を含む。この場合には、カリウム塩および／またはリン酸カリウム緩衝液を第１の塩および／または緩衝液の添加とともに添加するか、または後の単離および精製方法において再緩衝することが適切である。これによって、ポリペプチド製剤を０℃未満で暫定的に安定的に保存することが可能となる。再緩衝とは、例えば透析などによるイオンの交換として理解される。これらの組成物は治療的には用いられないため、蛋白質の精製および単離の方法における緩衝液または塩の濃度は、実際には区画化の前では５０〜１００ｍｍｏｌ／ｌより高くてもよい。しかし、区画化の前には注入可能な組成物に適した浸透圧に調整されることが不可欠である。
　【００２２】
　本発明に係る方法においては、（１）蛋白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される、蛋白質の薬学的組成物の再構成された凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するための改良された方法であって、蛋白質の水性緩衝溶液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムとナトリウムとの比が１０：１またはそれ以上であるような方法であることを特徴とする。
　【００２３】
　また、本発明に係る方法においては、（２）区画中での緩衝液の濃度が１０ｍｍｏｌ／ｌ〜３００ｍｍｏｌ／ｌの間である、上記［１］記載の方法であることを特徴とする。
　【００２４】
　また、本発明に係る方法においては、（３）区画が再構成された溶液の浸透圧が好ましくは１００〜５００ｍＯｓｍの間、好ましくは３００±５０ｍＯｓｍの範囲にある、上記［１］〜［２］記載の方法であることを特徴とする。
　【００２５】
　また、本発明に係る方法においては、（４）水性緩衝液がｐＨ６〜８の範囲に緩衝される、上記［１］〜［３］記載の方法であることを特徴とする。
　【００２６】
　また、本発明に係る方法においては、（５）水性緩衝液が非イオン性界面活性剤を含む、上記［１］〜［４］記載の方法であることを特徴とする。
　【００２７】
　また、本発明に係る方法においては、（６）水性緩衝液が糖を１０〜１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含む、上記［１］〜［５］記載の方法であることを特徴とする。
　【００２８】
　また、本発明に係る方法においては、（７）蛋白質が抗体である、上記［１］〜［６］記載の方法であることを特徴とする。
　【００２９】
　また、本発明に係る形態においては、（８）本質的に非晶質であり、蛋白質の凍結された溶液を緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液とともに含み、カリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なくとも１０：１である、蛋白質の低凝集性で融解可能な固形保存形態であることを特徴とする。
　【００３０】
　また、本発明に係る形態においては、（９）凍結乾燥の手段によってその保存形態が調製される、上記［８］記載の蛋白質の固形保存形態であることを特徴とする。
　【００３１】
　また、本発明に係る形態においては、（１０）蛋白質が抗体である、上記［８］または［９］記載の蛋白質の保存形態であることを特徴とする。
　【００３２】
　また、本発明に係る組成物においては、（１１）ｐＨが６〜８の間の範囲にある水性緩衝液中の蛋白質の薬学的組成物であって、その溶液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、かつ
　【００３３】
　ａ）溶液中のカリウムとナトリウムイオンとの比が１０：１またはそれ以上であり、
　【００３４】
　ｂ）緩衝液の濃度が１０〜３００ｍｍｏｌ／ｌの間にある、
薬学的組成物であることを特徴とする。
　【００３５】
　また、本発明に係る組成物においては、（１２）蛋白質が抗体である、上記［１１］記載の薬学的組成物であることを特徴とする。
　【００３６】
　【発明の実施の形態】
　以下の実施例、刊行物および図面は、本発明と、特許請求の範囲に基づいて保護される範囲をさらに説明するものである。記載された方法は、変更が加えられた後も本発明の主題に依然として含まれる記載例であると理解される必要がある。
　【００３７】
　【実施例】
　実施例１．
種々の緩衝液および塩溶液の共融温度
　【００３８】
　図１からは、ＮａＣｌを含む緩衝液の共融温度が、ＮａＣｌを含まない緩衝液またはＮａＣｌの代わりにＫＣｌを含む溶液のそれよりも約１０℃低いことが明らかである。溶液は共融温度よりも低温ではじめて完全に凍結するため、このことは凍結保存の間（通常は−２０℃）および凍結／解凍工程の間に、ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液はＮａＣｌを含まない緩衝液よりも高度のストレスを受けることを意味する。本発明によれば、このストレスは、凝集体および粒子の形成を抑制する上記の製剤形態では回避される。この製剤形態は、コスト削減が達成されるような手段によって−２０℃で蛋白質溶液を安定的に保存することを可能とする。
　【００３９】
　実施例２．
リン酸緩衝液の凍結の間のｐＨ値の変化
　【００４０】
　図２からは、ＮａＣｌを含むリン酸緩衝液におけるｐＨ値が、リン酸水素二ナトリウムの沈殿によって凍結工程の間に大きく低下することが明らかである。ＮａＣｌを含まないリン酸カリウム緩衝液中では、ｐＨ値はほとんど一定に保たれる。
　【００４１】
　実施例３．
剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた後の蛋白質溶液における粒子形成
　種々の緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）中でのヒト化ＩｇＧ（Ｌ−セレクチンに対する抗体）の溶液に対して粒子含有量に関する分析を行った（Ａｃｃｕ　Ｓｉｚｅｒ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）：
　Ａ）１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ７におけるＡＢ
　Ｂ）１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、ｐＨ７．２におけるＡＢ
　Ｃ）１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、重量にして０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．２におけるＡＢ。
　ａ）遠心処理したもの（開始材料）
　ｂ）剪断応力を加えた後（３０秒間のボルテックス処理）
　ｃ）６時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（−２０℃）。
　図３におけるデータはそれぞれ試料０．７ｍｌに関するものである。
　図３から、本発明に従い、ナトリウムを含まないリン酸カリウム緩衝液を用いることにより、粒子形成が抑制されることがわかる。この効果は、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、重量にして０．０１％）の添加によって増強することができる。
　【００４２】
　実施例４．
剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた後の蛋白質溶液における粒子形成
　種々の緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）中でＨＢＶに対する抗体の溶液に対して粒子含有量に関する分析を行った（Ａｃｃｕ　Ｓｉｚｅｒ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）：
　Ａ）１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、３０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．５におけるＡＢ
　Ｂ）１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、ｐＨ７．２におけるＡＢ
　Ｃ）１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、重量にして０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．２におけるＡＢ。
　ａ）遠心処理したもの（開始材料）
　ｂ）剪断応力を加えた後（３０秒間のボルテックス処理）
　ｃ）６時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（−２０℃）。
　図４におけるデータはそれぞれ試料０．７ｍｌに関するものである。
　図４から、本発明に従い、ナトリウムを含まないリン酸カリウム緩衝液を用いることにより、粒子形成が抑制されることがわかる。この効果は、非イオン性界面活性剤の添加によって増強することができる。
　【００４３】
　実施例５．
０℃未満の温度での蛋白質溶液（実施例３によるヒト化ＩｇＧ）の保存中の、可溶性凝集体の形成防止
　【００４４】
　蛋白質溶液を、Ａ）１０ｍＭ　リン酸カリウム、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、およびＢ）１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．２において、数週間にわたって−２０℃で保存した。サイズ排除ＨＰＬＣによって、可溶性凝集体および天然型蛋白質に関する分析を行った（図５）。本発明に係るＮａＣｌを含まない緩衝液中の蛋白質凝集体は、ＮａＣｌを含む緩衝液におけるものと比べて大幅に少なかった。これは特に、ＮａＣｌを含まない緩衝液中ではｐＨの変化が実質的に防止され、保存温度が共融温度よりもかなり低いという上記事実による。（実施例１および２も参照されたい）
　【００４５】
　実施例６．
凍結／解凍ストレスを加えた後の蛋白質溶液における粒子形成
　【００４６】
　種々の緩衝液中でのＭＡＢ　Ｌ−セレクチン、ＭＡＢ　ＨＢＶ、ＭＡＢ　ＰＤＧＦ−ＲおよびＭＡＢ　ＬＮＧＦ−Ｒの各抗体について、凍結／解凍ストレス（６×凍結／解凍）を加える前後で、粒子含有量に関して分析した（Ａｃｃｕ　Ｓｉｚｅｒ，Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｓｉｚｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）（結果は表１参照、Ｃｐｒｏｔ：蛋白質濃度）。１ｍｌ当たりの２〜４００μｍのサイズの粒子数を明記している。
　【００４７】
　ナトリウムを含まないリン酸カリウム緩衝液（ＫＰ）を用いることにより、本発明に従い、粒子形成が抑制されたことが明らかである。この効果は非イオン性界面活性剤を添加することによって増強することができる。
　【表１】
　【００４８】
　【発明の効果】
　蛋白質の水性緩衝溶液が凍結され、解凍され、注入可能な量の区画に分けられて、これらの区画が凍結乾燥される、蛋白質の薬学的組成物の再構成された凍結乾燥物における蛋白質凝集体の形成を防止するための改良された方法であって、蛋白質の水性緩衝溶液が緩衝性物質としてリン酸カリウム緩衝液を含み、溶液中でのカリウムイオンとナトリウムイオンとの比が少なくとも１０：１であることを特徴とする方法を、薬学的組成物の安定な凍結乾燥物を製造するために有利に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　種々の緩衝液および塩溶液の共融点の決定を示す図である。
　【図２】　リン酸緩衝液の凍結中のｐＨ値の変化を示す図である。
　【図３】　剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた後の、種々の緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）中での抗体（Ｌ−セレクチンに対するもの）溶液の粒子形成を示す図である。
　Ａ：１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ７におけるＡＢ；
　Ｂ：１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、ｐＨ７．２におけるＡＢ；
　Ｃ：１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、重量にして０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．２におけるＡＢ。
　ａ：遠心処理したもの（開始材料）；
　ｂ：剪断応力を加えた後（３０秒間のボルテックス処理）；
　ｃ：６時間の凍結／解凍サイクルを加えた後（−２０℃）。
　【図４】　剪断応力または凍結／解凍ストレスを加えた後の、種々の緩衝液（Ａ、Ｂ、Ｃ）中でのＨＢＶに対する抗体の溶液の粒子形成を示す図である。
　Ａ：１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、３０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ６．５におけるＡＢ；
　Ｂ：１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、ｐＨ７．２におけるＡＢ；
　Ｃ：１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、重量にして０．０１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ｐＨ７．２におけるＡＢ。
　【図５】　０℃未満の温度で保存した後の蛋白質溶液（実施例３によるヒト化ＩｇＧ）における可溶性凝集体のサイズ排除ＨＰＬＣ分析を示す図である。
　Ａ：１０ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０におけるＡＢ；
　Ｂ：１００ｍｍｏｌ／ｌ　ＫＰ、ｐＨ７．２におけるＡＢ。