(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織工学用の移植可能な軟骨材料を製造する方法であって、
前記方法は、ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、移植可能な軟骨材料を形成するのに十分な時間、３Ｄ培養で、軟骨形成細胞を培養する工程を含み、
前記ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１週間あたり約１、２、または３日、間欠的に添加され、前記約１、２、または３日の添加は、少なくとも２週間の培養、少なくとも３週間の培養または少なくとも４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される、前記方法。
【請求項２】
組織工学用の移植可能な軟骨材料を製造する方法であって、
前記方法は、ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、移植可能な軟骨材料を形成するのに十分な時間、３Ｄ培養で、軟骨形成細胞を培養する工程を含み、
前記ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１月あたり約１、２、または３日、間欠的に添加され、前記約１、２、または３日の添加は、少なくとも２月間の培養、少なくとも３月間の培養、または少なくとも４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される、前記方法。
【請求項３】
前記ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１週間あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２週間の培養、３週間の培養または４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１月あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２月間の培養、３月間の培養、または４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記軟骨形成細胞は、成熟組織に由来する軟骨細胞または間葉系幹細胞である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＦＧＦ−１８化合物は、
ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド；
ｂ）配列番号１の第２８〜１９６位の残基を含むかまたは該残基から成るポリペプチド；および
ｃ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチド；
から成る群より選択される、
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記軟骨形成細胞は、拡大または培養前に哺乳動物から採取または単離される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記軟骨形成細胞は、治療対象の哺乳動物または異なる哺乳動物から採取または単離される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物はヒトである、請求項７又は８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再生医療、特に、変形性関節症、軟骨損傷、および骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療に関する。より具体的には、本発明は、骨軟骨もしくは軟骨の移植、または自家軟骨細胞移植（autologous chondrocyte implantation:ACI）といった組織工学的手順およびグラフト手順に使用するためのＦＧＦ−１８化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
軟骨障害は、結合組織における代謝異常による変性により、疼痛、こわばり、患部の動きの制限といった症状が現れるという特徴を有する広範な疾患を指す。これらの障害には、病理、例えば、変形性関節症（ＯＡ）によるものや、あるいは外傷または損傷によるものがある。骨軟骨欠損（ＯＣＤ）、すなわち関節内の骨端を覆う軟骨の欠損は、外傷または損傷によることが多いが、病理によることもある。ＯＣＤは、ＯＡを引き起こすことがある。成熟した軟骨は、自己修復能力が限られている。これは、特に、血管が存在しないことと、成熟した軟骨細胞の増殖能力が非常に低いことによる。損傷または疾患による傷害を有する軟骨、特に関節軟骨を置換するのは、医師にとって多大なる挑戦であり、かつ利用できる外科的手順が予測できず、限られた時間のみ有効であると考えられている。従って、殆どの若い患者は、治療を希望しない、あるいは、治療をできるだけ長く延ばすよう助言される。治療が必要な場合、標準的な手順は年齢により、全関節置換、軟骨片の移植、または骨髄刺激法（例えば、マイクロフラクチャー法）など多岐に渡る。マイクロフラクチャー法は、骨髄由来幹細胞による軟骨の沈着を刺激するために軟骨下骨に孔を開ける安価で一般的な手順である。しかし、この技術では十分に軟骨欠損を修復できず、形成された新たな軟骨は主に線維軟骨なので、機能が不十分または変わってしまうことが示されている。実際、線維軟骨の耐久性は、硝子関節軟骨と同じではなく、周囲の硝子軟骨に対し適切に結合しないことがある。この理由のため、新たに形成された線維軟骨は、容易に破壊しやすい（予想寿命は５〜１０年）。
【０００３】
変形性関節症（ＯＡ）を有する患者に対する非外科的治療法としては、特に、物理療法、生活習慣の改善（例えば、活動の減少）、支持デバイス、経口薬または注射薬（例えば、非ステロイド性抗炎症薬）、医学的管理（しかし、軟骨傷害を修復する市販の治療薬はない（Lotz, 2010参照））などがある。これらの治療がうまくいかない場合、患者に残されている主な選択肢は、関節置換術（全置換または部分置換術）などの手術である。このようなオプションにより、症状は軽減するが、関節機能の低下につながることが多い。脛骨または大腿骨骨切り術（関節摩耗部のバランスを再調整するために骨を切断する手術）は、症状を軽減し、活動的な生活習慣を維持するのに役立ち、そして関節全置換術の必要を遅延させることができる。関節全置換は、進行した変形性関節症の症状を軽減できるものの、一般に患者の生活習慣および／または活動レベルを変化させることが必要なこともある。
【０００４】
現在の軟骨修復の手順として、関節全置換術、骨髄刺激（例えばマイクロフラクチャー術）、骨軟骨同種移植または自家移植、および培養軟骨移植（例えば、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）が挙げられる。これらの手順は、特に症候性軟骨損傷の患者に、治療の選択肢を与える。
【０００５】
骨軟骨同種移植または自家移植は、焦点関節欠損の治療の一般的な手順である。ドナー軟骨源、欠陥部位周辺の軟骨の健康状態、およびインテグレーションの質を含む複数の要因が、この手順の有効性に影響しやすい。残念ながら、骨軟骨移植手順によるインテグレーション結果が良くない場合が多い。
【０００６】
一般に、組織工学的アプローチでは、細胞を三次元（３Ｄ）マトリクス内で増殖させ、このマトリクスの各因子が、組織再生に重要な役割を果たす。軟骨形成に使用される幹細胞の主な種類は、ヒトＭＳＣ（ｈＭＳＣ）である（Zhang et al., 2013）。しかし、組織工学において、ＭＳＣの種類、足場、および他の要因が重要である。また、確実に均質な硝子軟骨様構造を再生することが、欠損部へ質の高いインテグレーションをするのに重要である。関節軟骨の組織工学におけるこのような形質を確実にしてそれを維持することは複雑であるが、肥大を阻害する因子を使用することによって好適化できる（Tang et al., 2012）。例えば、ＴＧＦ−β１の添加は、アグリカン、ＩＩ型コラーゲン、およびｈＭＳＣのＳｏｘ−９遺伝子発現を向上する。だが、新たに形成された軟骨は、硝子組織ではなく、主に繊維質の短時間しかもたない組織である（Zhang et al., 2013）。
【０００７】
他の種類の組織工学的手順として自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）などの軟骨移植術がある。ＡＣＩでは、軟骨が治療対象の患者の関節面の体重の負荷が低い領域から採取される。その後、軟骨細胞が単離され、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで、インビトロで培養される。培養し一定時間が経過した後、得られた軟骨細胞または３Ｄ構築物を欠損部を埋めるように移植する。残念ながら、特に単層培養における軟骨細胞の拡大は、線維芽細胞様の軟骨細胞を誘導することが知られている（Magill et al., 2011）。
【０００８】
線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）は、軟骨細胞および骨芽細胞の増殖因子である（Ellsworth et al., 2002;Shimoaka et al., 2002）。ＦＧＦ−１８は、軟骨障害、例えば、変形性関節症及び軟骨損傷等に対するＦＧＦ−１８の単独療法（ＷＯ２００８／０２３０６３）、又はヒアルロン酸との組み合わせ療法（ＷＯ２００４／０３２８４９）が提案されている。ＦＧＦ−１８を含有する凍結乾燥製剤は、関節内注射によりＯＡまたはＣＩの治療に有望な結果を示している。
【０００９】
このような骨軟骨グラフトおよび培養軟骨移植（例えばＡＣＩ）などの軟骨修復手順が有望であるが、生成された軟骨のインテグレーション率や質を向上させなくてはならない。従って、生成された軟骨の良好なインテグレーションと優れた質（すなわち主に硝子軟骨）を可能にする手順のため改良された方法が必要である。実際に、硝子軟骨の生成は、治療のため、そして生体マトリクスの成分としての両者に価値がある（Getgood et al., 2010）。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の目的は、組織工学用の移植可能な軟骨材料または骨軟骨／軟骨グラフトを製造する方法であって、ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、移植可能な骨軟骨／軟骨材料を形成するのに十分な時間、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程、を含むまたは上記工程からなる前記方法を提供することである。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、移植の前、同時、または後のいずれかに、得られた骨軟骨／軟骨材料の移植部位に更に注入することもある。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、軟骨障害による関節欠損（例えば、軟骨欠損）部位の領域における哺乳動物の軟骨を再生する方法であって、（ａ）ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨または軟骨外植片を培養する工程；および（ｂ）工程（ａ）から得られた培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨外植片をそれを必要とする哺乳動物に投与する工程；を含むまたは上記工程からなる前記方法に関する。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、細胞／外植片の投与の前、同時、または後のいずれかに、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片が投与された部位に更に注入することもある。
【００１２】
代替的な実施形態において本明細書に開示するのは、軟骨障害による関節欠損（例えば、軟骨欠損）の領域における哺乳動物の軟骨を再生する方法であって、（ａ）培養培地内で、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程；（ｂ）工程（ａ）から得られた培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨外植片をそれを必要とする哺乳動物に投与する工程；並びに、（ｃ）ＦＧＦ−１８化合物を、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片が投与された部位に更に注入する工程；を含むまたは上記工程からなる前記方法に関する。工程（ｃ）は、細胞／外植片の投与の前、同時、または後で行うこともある。
【００１３】
第３の実施形態において、本発明は、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程、ここで前記培養は、ＦＧＦ−１８化合物を含む細胞培養培地内で行う；（ｂ）場合により、工程（ａ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨グラフトを含む移植材料を得る工程；並びに、（ｃ）工程（ｂ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；を含むかまたは上記工程からなる、前記ＦＧＦ−１８化合物に関する。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、移植の前、同時、または後のいずれかに、移植部位に更に注入することもある。
【００１４】
代替的な実施形態において本明細書に開示するのは、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程；（ｂ）場合により、工程（ａ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨外植片を含む移植材料を得る工程；（ｃ）工程（ｂ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；並びに、（ｄ）ＦＧＦ−１８化合物を移植部位に注入する工程；を含むかまたは上記工程からなる、前記ＦＧＦ−１８化合物である。工程（ｄ）は、移植の前、同時、または後のいずれかに行い得る。
【００１５】
第５の実施形態において本明細書で提供するのは、ＦＧＦ−１８化合物を含む培地中で培養された哺乳動物骨軟骨／軟骨外植片または哺乳動物の軟骨形成細胞を含む、それを必要とする哺乳動物における組織工学または骨軟骨／軟骨グラフトにおける使用のための組成物である。
【００１６】
本発明の文脈では全体として、軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、好ましくは、拡大または培養工程前に哺乳動物から採取または単離される。
【００１７】
本発明の文脈では全体として、軟骨細胞もしくは軟骨形成細胞の３Ｄ培養物または骨軟骨／軟骨外植片のため、ＦＧＦ−１８化合物は、好ましくは培養培地に１週間あたり約１、２、または３日、間欠的に添加され、前記約１、２、または３日の添加は、少なくとも２週間の培養、少なくとも３週間の培養または少なくとも４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される。好ましくは、ＦＧＦ−１８化合物は、培養培地に１週間あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２週間の培養、３週間の培養または４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される。代替的に、ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１月あたり約１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、少なくとも２月間の培養、少なくとも３月間の培養、または少なくとも４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される。好ましくは、ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１月あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２月間の培養、３月間の培養、または４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される。代替的に、ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に永続的に維持されることもある。軟骨細胞または軟骨形成細胞が単層で培養される場合、ＦＧＦ−１８化合物は好ましくは永続的に添加されるがこれに限定されない。
【００１８】
本発明の任意の一の実施形態では、軟骨障害は、変形性関節症、軟骨損傷、または骨軟骨欠損である。
【００１９】
本発明の文脈では全体として、ＦＧＦ−１８化合物は、好ましくは、：ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド、ｂ）配列番号１の第２８〜１９６位の残基を含むかまたは該残基から成るポリペプチド，またはｃ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチド、から成る群より選択される。
【００２０】
更に、本発明の文脈では全体として、外植片は好ましくは軟骨外植片であり、軟骨形成細胞は好ましくは成熟組織に由来する軟骨細胞または間葉系幹細胞である。必要に応じて、軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、治療対象の哺乳動物または異なる哺乳動物、好ましくは治療対象の哺乳動物と同じ種、から採取または単離される。治療対象の哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、代替的に、ウマ、ラクダ、ヒツジ、イヌ、あるいはネコ、ウサギ、ラットまたはマウスのような小さな哺乳動物であってもよいがこれらに限定されない。
【００２１】
定義
本明細書で使用する用語「ＦＧＦ−１８化合物」又は「ＦＧＦ−１８」は、ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物学的活性を少なくとも１つを保持するタンパク質であるという意図である。ＦＧＦ−１８は、天然型、その成熟型、組換え型、又は切断型であってもよい。ヒトＦＧＦ−１８タンパク質の生物学的活性としては、特に軟骨細胞または骨芽細胞の活性増加（ＷＯ９８／１６６４４）、あるいは軟骨形成の増強（ＷＯ２００８／０２３０６３）が挙げられる。天然又は野生型のヒトＦＧＦ−１８は、関節軟骨の軟骨細胞によって発現されるタンパク質である。ヒトＦＧＦ−１８は、当初ｚＦＧＦ−５と命名されＷＯ９８／１６６４４に詳述されている。配列番号１は、天然のヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列に相当し、アミノ酸残基１（Ｍｅｔ）〜２７（Ａｌａ）から成るシグナルペプチドを有する。ヒトＦＧＦ−１８の成熟型は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）のアミノ酸配列（１８０個のアミノ酸）に相当する。
【００２２】
本発明においてＦＧＦ−１８は、例えば、ＷＯ２００６／０６３３６２で教示される組み換え方法等によって産生することができる。本発明のＦＧＦ−１８は、発現系や条件により、開始メチオニン（Ｍｅｔ）残基または分泌のためのシグナル配列と共に、組み換え宿主細胞において発現される。原核生物の宿主、例えば、大腸菌（E. coli）等において発現される場合、ＦＧＦ−１８はその配列のＮ末端においてさらなるＭｅｔ残基を含む。例えば、ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、大腸菌（E. coli）で発現される場合、Ｎ末端（位置１）のＭｅｔ残基で開始し、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜残基２０７（Ａｌａ）がこれに続く。
【００２３】
本明細書で使用する用語ＦＧＦ−１８の「切断型」は、配列番号１の残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）を含むかまたは該残基から成るタンパク質を指す。好ましくは、ＦＧＦ−１８タンパク質の切断型は、「ｔｒＦＧＦ−１８」と命名されたポリペプチド（１７０個のアミノ酸、ｒｈＦＧＦ−１８またはｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎとしても知られる）であり、Ｍｅｔ残基（Ｎ末端）で開始し、野生型ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸残基２８（Ｇｌｕ）〜１９６（Ｌｙｓ）がこれに続く。ｔｒＦＧＦ−１８のアミノ酸配列は、配列番号２（配列番号２のアミノ酸残基２〜１７０は、配列番号１のアミノ酸残基２８〜１９６に相当する）に示す。ｔｒＦＧＦ−１８は、ヒトＦＧＦ−１８の組み換え切断型であり、大腸菌（E. coli）で産生される（ＷＯ２００６／０６３３６２）。ｔｒＦＧＦ−１８は、成熟ヒトＦＧＦ−１８と同様の活性を示し、例えば、様々な軟骨組織の修復及び再構築につながる軟骨細胞の増殖や軟骨の沈着を増強することが示されている（ＷＯ２００８／０２３０６３）。
【００２４】
本明細書で使用する用語「軟骨障害」とは、外傷などの損傷による傷害に起因する障害、軟骨疾患、および関節炎を包含する。そのような障害は、欠損、より好ましくは軟骨欠損をもたらすものである。本明細書に記載のＦＧＦ−１８製剤の投与によって治療し得る軟骨障害の例としては、変形性関節症等の関節炎、軟骨損傷、および骨軟骨欠損などが挙げられるが、これらに限定されない。軟骨石灰化症、多発性軟骨炎、再発性多発性軟骨炎、強直性脊椎炎、または肋軟骨炎などの軟骨または関節の変性疾患や障害もこの文言に包含される。国際軟骨修復学会（ＩＣＲＳ）は、軟骨欠損の重症度を評価するための関節鏡による評価システムを以下のように提案している。グレード：０（通常）健康な軟骨。グレード１：軟骨にソフトスポットや水疱を有する。グレード２：軟骨に目に見える小さな裂け目を有する。グレード３：病変に深い裂け目（軟骨層の５０％超）を有する。グレード４：軟骨が裂け、下の骨（軟骨下骨）が露出している。（ICRS publication:http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf、page 13を参照のこと）。
【００２５】
本明細書で使用する用語「関節炎」は、変形性関節症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、感染性関節炎、乾癬性関節炎、スティル病（若年性関節リウマチの発症）、または離断性骨軟骨炎等の障害を包含する。好ましくは、軟骨が傷害を受けているまたは下にある骨から剥離している疾患または障害を含む。
【００２６】
用語「変形性関節症」は、関節炎の最も一般的な形態を意図するのに使用される。用語「変形性関節症」は、原発性変形性関節症および二次性変形性関節症（例えば、The Merck Manual, 17th edition, page 449参照）のいずれも包含する軟骨障害であると考えられている。変形性関節症は、軟骨の破壊によって引き起こされることがある。軟骨が細かく破壊され骨間の関節に疼痛や腫れを引き起こすことがある。時間が経つにつれて、軟骨が完全に摩耗し、骨同士がぶつかってしまう。変形性関節症は、あらゆる関節に影響するが、通常は、手、肩、そして股関節、膝関節、脚、背骨といった体重を支える関節に関連する。好ましい例では、変形性関節症は、変形性膝関節症または変形性股関節症である。この用語は、特に、ＯＡＲＳＩ分類システムによりステージ１〜ステージ４またはグレード１〜グレード６に分類される変形性関節症の形態を包含する。当業者は、当該技術分野で使用されている変形性関節症の分類、特にＯＡＲＳＩ評価システムを良く認識している（ＯＯＣＨＡＳとも称される；例えば、Custers et al., 2007参照）。変形性関節症は、本発明のＦＧＦ−１８化合物を投与することによって治療できる好ましい軟骨障害の一つである。
【００２７】
本明細書で使用する用語「軟骨損傷」とは、特に外傷から生じる、軟骨の障害または軟骨の損傷である。軟骨損傷は、外傷による物理的な破壊の結果として、特に事故または手術（例えば、マイクロフラクチャー法による手術）後に生じることがある。用語「軟骨損傷」は、軟骨または骨軟骨骨折および半月板の損傷をも含む。関節組織のスポーツによる損傷又はスポーツによる摩耗もまたこの用語の定義内と考えられる。また、この用語は、微小な障害または鈍的な外傷、軟骨骨折、骨軟骨骨折、または半月板損傷をも含む。
【００２８】
用語「骨軟骨欠損（osteochondral defects：ＯＣＤ）」は、軟骨の欠損が関節内の骨の端を覆う軟骨障害である。これらの欠損は、外傷または損傷に起因する場合が多いが、病理に起因することもある。ＯＣＤは、ＯＡを引き起こすことがある。ＯＣＤは、一般に、軟骨のみでなく、骨の一部も関与することを意味する。軟骨しか関与していない場合、用語「軟骨損傷」（上記参照）称することが好ましいだろう。
【００２９】
用語「組織工学」は、自家軟骨細胞移植（ＡＣＩ）をも包含する。また、用語「組織工学」は、再生医療としても知られている。細胞または組織は、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで培養することができる。このような手順の目的は、組織の一部または全体を修復または交換することである。
【００３０】
用語「グラフト」は、移植（トランスプランテーションまたはインプランテーション）に関連する。この手順は、再生医療の一部でもある。この用語は、骨軟骨／軟骨の自家移植片または骨軟骨／軟骨の同種移植片の移植（トランスプランテーション／インプランテーション）などの骨軟骨または軟骨（また、本明細書では骨軟骨／軟骨とも称する）の移植（トランスプランテーション／インプランテーション）をも含む。グラフトでは、外植片は、治療対象の哺乳動物（すなわち自家移植）または別の哺乳動物（好ましくは同種、同種移植）から採取される。通常、そのような移植片は、健康な軟骨切片、または健康な骨軟骨組織から採取される。このようなグラフトは、好ましくは、軟骨欠損のレベルで行われる。
【００３１】
用語「移植可能な軟骨材料」または「移植可能な材料」は互換可能に使用される。これらは、軟骨細胞といった軟骨形成細胞、または、それを必要とする哺乳動物に移植（トランスプラントまたはインプラント）するために調製された骨軟骨／軟骨外植片を指す。このような移植可能な材料は、好ましくは、軟骨欠損のレベルで移植（トランスプラントまたはインプラント）される。
【００３２】
本発明の文脈では、治療の「効果」は、軟骨の厚さ、例えば、関節部の関節軟骨の厚さの変化に基づいて測定できる。この厚さは、例えば、Ｘ線コンピュータ断層撮影法、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、また超音波測定により評価できる。
【００３３】
「約２４、４８、または７２時間」または「約１日、２日または３日」の文脈で使用される用語「約」は、ＦＧＦ−１８化合物の補充後２４、４８、または７２時間の間隔で培養培地を交換する、あるいはＦＧＦ−１８化合物の補充後２４、４８、または７２時間＋／−数時間（例えば、＋／−１、２、３または４時間）の変動をもって培養培地を交換することを包含する。同様に、「約７日」「約１週間」、「約４週間」または「約１月」の文脈で使用される用語「約」は、添加と添加の間がそれぞれ７日、１週間、４週間（すなわち２８日）または１月離れているとき、その添加と添加の間がそれぞれ７日＋／−１または２日、１週間＋／−１または２日、４週間＋／−数日（例えば、＋／−１、２、３、４日）または１月＋／−数日（例えば、＋／−１、２、３、４日）の変動をもって離れていることを包含する。実際、特に実用的な観点から、培養培地の交換またはＦＧＦ−１８化合物の次回の補充は、例えば、培養培地の交換がＦＧＦ−１８化合物の補充からぴったり２４、４８、または７２時間後、あるいは前回の補充から日単位でぴったり４週間（２８日）といった、正確な間隔で行うことが常にできるわけではない、ということを理解すべきである。従って、本発明の文脈では、４週間は、前回の添加から２８日を意味するが、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２日であってもよい。本発明の文脈では、用語「４週間」は、用語「１月」に類似し、交換可能に使用できる。使用される用語「４週間」は、好ましくは、「日数（ｄａｙｓ）」について言及するもの（例えば、１回目の補充が月曜日なら、次の補充は４週間後の月曜日）として使用されるべきであり、「月」は、好ましくは、「日付（ｄａｔｅ）」について言及するもの（例えば、１回目の補充が８月１日なら、次の補充は９月１日）として使用されるべきである。
【００３４】
用語「サイクル」は、補充のサイクルを意味する。本発明の文脈では、１週間ごとのサイクル（または７日ごとのサイクル）は、約１週間（約７日）のうち１日の間、培養培地をＦＧＦ−１８化合物で補充することを意味する。よって、前記サイクルは、補充された培地で１日培養し、補充されていない培地（すなわちＦＧＦ−１８なし）で約６日培養することを含む。同様に４週間ごとのサイクルは、約４週間のうち１日の間、培養培地が、ＦＧＦ−１８化合物で補充されることを意味する。よって、前記サイクルは、補充された培地で１日培養し、補充されていない培地（すなわちＦＧＦ−１８なし）で約４週間培養することを含む。同じことが、月ごとのサイクルでも当てはまる。つまり、月ごとのサイクルは、約１月のうち１日の間、培養培地をＦＧＦ−１８化合物で補充することを意味する。よって、前記サイクルは、補充された培地で１日培養し、補充されていない培地（すなわちＦＧＦ−１８なし）で約１月培養することを含む。サイクルは繰り返してもよい。
【００３５】
骨軟骨／軟骨グラフト、および培養軟骨移植（例えばＡＣＩ）などの軟骨修復手順が有望であるが、生成軟骨のインテグレーション率や質を向上させなくてはならない。従って、生成された軟骨の良好なインテグレーションと優れた質（すなわち主に硝子軟骨）を可能にする手順のため改良された方法が必要である。驚くことに、ＦＧＦ−１８を再生医療（組織工学手順またはグラフト手順等）において使用すると、生成された軟骨の質が向上し、細胞／外植片の欠損部に対するインテグレーションが良好になることが発見された。
【００３６】
本発明の目的は、組織工学用の移植可能な軟骨材料または骨軟骨／軟骨グラフトを製造する方法であって、ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、移植可能な骨軟骨／軟骨材料を形成するのに十分な時間、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程、を含むまたは上記工程からなる前記方法を提供することである。前記移植可能な軟骨材料は、変形性関節症、軟骨損傷（軟骨欠損を含む）または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療に有用であり得る。好ましくは，軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、拡大または培養工程前に哺乳動物から採取または単離される。従って、代替的に、本発明の目的は、組織工学用の移植可能な軟骨材料または骨軟骨／軟骨グラフトを製造する方法であって、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から採取または単離する工程；および（ｂ）ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、移植可能な骨軟骨／軟骨材料を形成するのに十分な時間、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程、を含むまたは上記工程からなる前記方法を提供することである。前記移植可能な軟骨材料は、変形性関節症、軟骨損傷、または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療に有用であり得る。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、移植の前、同時、または後のいずれかに、得られた軟骨材料または骨軟骨／軟骨外植片の移植部位に更に注入することもある。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、軟骨障害による関節軟骨の欠損領域における哺乳動物の軟骨を再生する方法であって、（ａ）ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程；および（ｂ）工程（ａ）から得られた培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をそれを必要とする哺乳動物に投与する工程；を含むまたは上記工程からなる前記方法に関する。前記軟骨を再生する方法は、変形性関節症、軟骨損傷、または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療に有用であり得る。好ましくは，軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、培養工程前に哺乳動物から採取または単離される。従って、代替的に、本発明は、軟骨障害による関節軟骨の欠損領域における哺乳動物の軟骨を再生する方法であって、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から採取または単離する工程；（ｂ）ＦＧＦ−１８化合物を含有する培養培地内で、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程；並びに、（ｃ）工程（ｂ）から得た培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、それを必要とする哺乳動物へ投与する工程；を含むまたは上記工程からなる前記方法に関する。前記方法は、変形性関節症、軟骨損傷、または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療に有用であり得る。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、細胞／外植片の投与の前、同時、または後のいずれかに、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片が投与された部位に更に注入することもある。
【００３８】
代替的な実施形態において本明細書に開示するのは、軟骨障害による関節軟骨の欠損領域における哺乳動物の軟骨を再生する方法であって、（ａ）培養培地内で、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程；（ｂ）工程（ａ）から得た培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、これを必要とする哺乳動物へ投与する工程；並びに、（ｃ）ＦＧＦ−１８化合物を、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片が投与された部位に注入する工程、を含むまたは上記工程からなる前記方法である。工程（ｃ）は、細胞／外植片の投与の前、同時、または後で行うこともある。別の実施形態では、本発明は、軟骨障害による関節軟骨の欠損領域における哺乳動物の軟骨を再生する方法であって、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から採取または単離する工程；（ｂ）培養培地内で、単層培養または３Ｄ培養のいずれかで軟骨形成細胞を培養する、あるいは骨軟骨／軟骨外植片を培養する工程；（ｃ）工程（ｂ）から得た培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、それを必要とする哺乳動物へ投与する工程；並びに、（ｄ）ＦＧＦ−１８化合物を、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片が投与された部位に注入する工程；を含むまたは上記工程からなる前記方法に関する。工程（ｄ）は、細胞／外植片の投与の前、同時、または後のいずれかに行い得る。
【００３９】
第４の実施形態において、本発明は、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程、ここで前記培養は、ＦＧＦ−１８化合物を含む細胞培養培地で行われる；（ｂ）場合により、工程（ａ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨外植片を含む移植材料を得る工程；並びに、（ｃ）工程（ｂ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；を含むかまたは上記工程からなる、前記ＦＧＦ−１８化合物に関する。好ましくは、軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、拡大または培養工程前に哺乳動物から採取または単離される。従って、代替的に、本発明は、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から単離する工程；（ｂ）前記軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程、ここで前記培養は、ＦＧＦ−１８化合物を含む細胞培養培地で行われる；（ｃ）場合により、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨外植片を含む移植材料を得る工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ｂ）および工程（ｃ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；を含むかまたは上記工程からなる、前記ＦＧＦ−１８化合物に関する。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、移植の前、同時、または後のいずれかに、移植部位に更に注入することもある。
【００４０】
代替的な実施形態において本明細書に開示するのは、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程；（ｂ）場合により、工程（ａ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または培養骨軟骨／軟骨外植片を含む移植材料を得る工程；（ｃ）工程（ｂ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ａ）および工程（ｂ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；並びに、（ｄ）ＦＧＦ−１８化合物を移植部位に注入する工程；を含むかまたは上記工程からなる、前記ＦＧＦ−１８化合物である。工程（ｄ）は、移植の前、同時、または後のいずれかに行い得る。更なる代替では、本発明は、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法に使用するためのＦＧＦ−１８化合物であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から単離する工程；（ｂ）前記軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程、ここで前記培養は、ＦＧＦ−１８化合物を含む細胞培養培地で行われる；（ｃ）場合により、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を含む移植材料を得る工程；（ｄ）工程（ｃ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ｂ）および工程（ｃ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；並びに、（ｅ）ＦＧＦ−１８化合物を移植部位に注入する工程．；を含むかまたは上記工程からなる、前記ＦＧＦ−１８化合物に関する。工程（ｅ）は、移植の前、同時、または後のいずれかに行い得る。
【００４１】
代替的に、本発明は、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から単離する工程；（ｂ）前記軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程、ここで前記培養は、ＦＧＦ−１８化合物を含む細胞培養培地で行われる；（ｃ）場合により、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を含む移植材料を得る工程；並びに、（ｄ）工程（ｃ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ｂ）および工程（ｃ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；を含むかまたは上記工程からなる、前記方法に関する。場合により、ＦＧＦ−１８化合物を、移植の前、同時、または後のいずれかに、移植部位に更に注入することもある。
【００４２】
代替的な実施形態において本明細書に開示するのは、哺乳動物の軟骨組織における欠損を治療する方法であって、ここで、前記軟骨欠損は軟骨障害によるものであり、該方法は、（ａ）軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片を、哺乳動物から単離する工程；（ｂ）前記軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片をインビトロまたはイクスビボで培養する工程、ここで前記培養は、細胞培養培地で行われる；（ｃ）場合により、工程（ａ）および（ｂ）を繰り返して、培養軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨グラフトを含む移植材料を得る工程；（ｄ）工程（ｃ）の移植材料を、前記治療を必要とする哺乳動物の欠損部へ移植する工程、ここで、工程（ｂ）および工程（ｃ）の間、軟骨形成細胞は、単層培養または３Ｄ培養のいずれで培養してもよい；並びに、（ｅ）ＦＧＦ−１８化合物を移植部位に注入する工程；を含むかまたは上記工程からなる、前記方法である。工程（ｅ）は、移植の前、同時、または後のいずれかに行い得る。
【００４３】
第５の実施形態において本明細書で提供するのは、ＦＧＦ−１８化合物を含む培地中で培養された哺乳動物骨軟骨／軟骨外植片または哺乳動物の軟骨形成細胞を含む、それを必要とする哺乳動物における組織工学または骨軟骨／軟骨グラフトといった再生医療における使用のための組成物である。好ましくは、それを必要とする哺乳動物は、軟骨障害を有する。好ましくは、軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、好ましくは、拡大または培養工程前に哺乳動物から採取または単離される。
【００４４】
別の実施形態において本明細書で開示するのは、変形性関節症や軟骨損傷（軟骨欠損を含む）または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療における使用のためのＦＧＦ−１８化合物であって、軟骨修復手順の枠組みにおいて培養培地に投与される上記ＦＧＦ−１８化合物である。代替的に本明細書で開示するのは、変形性関節症や軟骨損傷（軟骨欠損を含む）または骨軟骨欠損といった軟骨障害の治療方法であって、ＦＧＦ−１８化合物が、軟骨修復手順の枠組みにおいて培養培地に投与される上記方法である。特に、前記軟骨修復手順は、軟骨組織工学、自家軟骨細胞移植、または骨軟骨グラフトから成る群より選択される。
【００４５】
第１の実施形態により得られた移植可能な軟骨材料または第２の実施形態により再生された軟骨は、軟骨障害の治療に使用するためのものであることが理解されるべきである。
【００４６】
本発明の文脈では全体として、ＦＧＦ−１８化合物は、好ましくは、：ａ）配列番号１の第２８〜２０７位の残基を含むヒトＦＧＦ−１８成熟型を含むまたは該成熟型から成るポリペプチド、ｂ）配列番号１の第２８〜１９６位の残基を含むかまたは該残基から成るポリペプチド、またはｃ）配列番号２を含むかまたは配列番号２から成るポリペプチドから成る群より選択される。特に、本化合物は、ヒト野生型成熟ＦＧＦ−１８またはｔｒＦＧＦ−１８より選択される。
【００４７】
本明細書に開示するのは、１ミリリットル（ｍＬ）の培養培地あたり、１ナノグラム（ｎｇ）〜５０マイクログラム（μｇまたはｍｃｇ）、好ましくは５ｎｇ〜５μｇ、または好ましくは５ｎｇ〜１μｇ、またはより好ましくは１０ｎｇ〜５００μｇ、または更により好ましくは１０ｎｇ〜１００ｎｇの濃度で培養培地に添加（すなわち培地補充）されるＦＧＦ−１８化合物である。好ましい実施形態では、培地は、１ｍＬの培養培地あたり、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００または１０００ｎｇの濃度でＦＧＦ−１８化合物が補充される。好ましい濃度は、１ｍＬの培養培地あたり、１０、２０、３０、４０、５０、１００、１５０または２００ｎｇである。
【００４８】
本発明の文脈では全体として、ＦＧＦ−１８を、軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片が培養される培地に添加する。好ましくは、前記ＦＧＦ−１８化合物は、培養培地に１週間（約１週間）あたり約１、２、または３日、間欠的に添加され、前記約１、２、または３日の添加は、少なくとも２週間の培養、少なくとも３週間の培養または少なくとも４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される。好ましくは、前記ＦＧＦ−１８化合物は、培養培地に１週間あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２週間の培養、３週間の培養または４週間の培養の間、各週ごとに繰り返される。１日は好ましくは約２４時間（すなわち２４時間＋／−４時間）であると理解され、２日は好ましくは約４８時間（すなわち４８時間＋／−４時間）であると理解され、３日は好ましくは約７２時間（すなわち７２時間＋／−４時間）であると理解される。補充された培地で１日培養した後、その後、ＦＧＦ−１８化合物なしで６日間培養を行い、補充された培地で２日培養した後、その後、ＦＧＦ−１８化合物なしで５日間培養を行い、そして補充された培地で３日培養した後、その後、ＦＧＦ−１８化合物なしで４日間培養を行うということである。前記スキームは１週間ごとのサイクルに対応する。例えば、１日の培養の場合、ＦＧＦ−１８化合物を培養培地に火曜日に添加する場合、前記培養培地は、前記補充から１日後、すなわち水曜日に前記培養培地から除去される。その後、次回の補充は、第１回目のＦＧＦ−１８化合物の添加の次の火曜日に行う。同じスキーム（すなわち、前回の補充がら１週間後）の場合、培養補充は毎週（例えば毎週火曜日）繰り返すことができる。より利便性を高めるために、ＦＧＦ−１８化合物の補充は、前回の補充から約１週間後、すなわち１週間（または７日）＋／−１または２日後であってもよい。例えば前回の補充が前の火曜日に行われた場合、次の補充は、月曜日または水曜日に行ってもよい。
【００４９】
代替的に、ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１月あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、少なくとも２月間の培養、少なくとも３月間の培養、または少なくとも４月間の培養の間、各月ごとに繰り返されるものでもよい。軟骨形成細胞の３Ｄ培養の場合、好ましくは、前記ＦＧＦ−１８化合物は培養培地に１月あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２月間の培養、３月間の培養、または４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される。１日は好ましくは約２４時間（すなわち２４時間＋／−４時間）であると理解される。補充された培地で１、２、または３日培養した後、ＦＧＦ−１８化合物なしで１月間培養を行う。前記スキームは１月ごとのサイクルに対応する。例えば、１日の培養の場合、ＦＧＦ−１８化合物を培養培地に８月１日に添加する場合、前記培養培地は、前記補充から１日後、すなわち８月２日に前記培養培地から除去される。その後、次回の補充は、９月１日に行う。同じスキーム（すなわち、前回の補充がら１月後）の場合、培養補充は毎月繰り返すことができる。より利便性を高めるために、ＦＧＦ−１８化合物の補充は、前回の補充から約１月後、すなわち１月＋／−１、２、３または４日後であってもよい。例えば前回の補充が８月１日に行われた場合、次の補充は、８月３１日または９月３日に行ってもよい。
【００５０】
上記で定義したように、「４週間」および「月ごと」または「１月」は交換可能である。従って、本発明によれば、ＦＧＦ−１８化合物は培養または培地に約４週間ごとに１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、少なくとも２サイクルの補充、少なくとも３サイクルの補充、または少なくとも４サイクルの補充で、４週間ごとに繰り返されるものでもよい。好ましくは、前記ＦＧＦ−１８化合物は培養または培地に１月あたり１、２、または３日、間欠的に添加され、前記１、２、または３日の添加は、２月間の培養、３月間の培養、または４月間の培養の間、各月ごとに繰り返される。１日は好ましくは約２４時間（すなわち２４時間＋／−４時間）であると理解される。補充された培地で１、２、または３日培養した後、ＦＧＦ−１８化合物なしで４週間培養を行う。前記スキームは４週間ごとのサイクルに対応する。例えば、１日の培養の場合、ＦＧＦ−１８化合物を培養培地に火曜日に添加する場合、前記培養培地は、前記補充から１日後、すなわち水曜日に前記培養培地から除去される。その後、次回の補充は、第１回目の添加から４週間後の火曜日に行う。同じスキーム（すなわち、前回の補充がら１月後）の場合、培養補充は４週間ごとに繰り返すことができる。より利便性を高めるために、ＦＧＦ−１８化合物の補充は、前回の補充から約４週間後、すなわち４週間＋／−１、２、３または４日後であってもよい。例えば前回の補充が１０月１日の火曜日に行われた場合、次の補充は、１０月２８日の月曜日または１０月３１日の木曜日に行ってもよい。
【００５１】
軟骨細胞または軟骨形成細胞が単層で培養される場合ＦＧＦ−１８化合物は好ましくは永続的に添加されるがこれに限定されない。反対に、軟骨細胞または軟骨形成細胞が３Ｄ培養で培養される場合、または骨軟骨／軟骨外植片の場合、ＦＧＦ−１８化合物は好ましくは間欠的に添加されるがこれに限定されない。
【００５２】
本願に記載の、ｔｒＦＧＦ−１８のようなＦＧＦ−１８化合物、及びＦＧＦ−１８化合物を含有する組成物（「ＦＧＦ−１８組成物」）、プロセス、使用、および方法は、軟骨障害を治療するのに有用である。特に、例えば、加齢による表面の線維化による滑膜関節における関節軟骨の欠損、変形性関節症による軟骨変性、そして損傷または疾患による軟骨または骨軟骨の欠損を治療をするのに有用であり得る。また、これらは、離断性骨軟骨症および変性関節疾患による関節疾患の治療をするに有用であり得る。再建および整形手術の分野で、本発明にかかるＦＧＦ−１８化合物、ＦＧＦ−１８組成物、プロセス、および方法は、大規模な組織欠損再建のための自家または同種軟骨拡大および移植に有用であろう。ＦＧＦ−１８組成物は、関節の洗浄、骨髄の刺激、摩耗した関節の形成術、軟骨下穿孔、または軟骨下骨のマイクロフラクチャー術に関連する軟骨損傷を修復するために使用できる。
【００５３】
好ましい実施形態では、本発明による治療対象の軟骨障害は、変形性膝関節症または変形性股関節症などの変形性関節症である。治療対象の変形性関節症は、例えば、一次性変形性関節症または二次性変形性関節症、ＯＡＲＳＩ分類システムによりステージ１〜ステージ４またはグレード１〜グレード６に分類される変形性関節症であり得るが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の文脈では全体として、ＦＧＦ−１８化合物を移植部位に添加する場合、該添加は、移植の前、同時、または後のいずれかに行い得る。添加を移植の前または後に行う場合、好ましくは移植の数時間前または数時間後以内（例えば、前後１、２、３または４時間だがそれらに限定されない）に行う。前記注入は、移植の数日前または数日後以内（例えば、前後１、２、３または４日だがそれらに限定されない）に行い得る。かかる添加が移植と同時に行なわれなくても患者に有害ではない。実際、ＦＧＦ−１８化合物の注射は、外科手術、または他の非侵襲的手順を必要としない。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、本発明の治療対象の軟骨障害は、微小骨折または軟骨欠損、または骨軟骨欠損を含む軟骨損傷である。
【００５６】
本発明の文脈では全体として、外植片は好ましくは軟骨外植片であり、軟骨形成細胞は好ましくは軟骨細胞、成熟組織に由来する軟骨細胞または間葉系幹細胞である。必要に応じて、軟骨形成細胞または骨軟骨／軟骨外植片は、治療対象の哺乳動物（すなわち治療を必要とする哺乳動物）または異なる哺乳動物（好ましくは同じ種）から採取される。前記哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、代替的に、ウマ、ラクダ、ヒツジ、イヌ、あるいはネコ、ウサギ、ラットまたはマウスのような小さな哺乳動物であってもよいがこれらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、軟骨欠損修復モデルの調製を示す：（Ａ）８ｍｍの軟骨プラグ、（Ｂ）中央の４ｍｍの欠損部の作成、（Ｃ）欠陥部への軟骨の挿入、および（Ｄ）修復構造体の長期培養。ＯＤは外径を意味し、そしてＩＤは内径を意味する。
【００５８】
【図２】図２Ａ−Ｃは、異なる処理による３ＤμＣＴ再構成の横断面を示す。図２Ｄは、対照から１＋３０処理および１＋６処理へと頻度が上昇するに伴う、修復された欠損部のインテグレーション強度を示す。図２Ｅは、押出し試験リグの実験設定を示す。エラーバーはＳＥＭである。
【００５９】
【図３】図３は、軟骨−軟骨修復構造体のμＣＴスキャンを示す。左側：代表的なサンプルの第一のμＣＴスキャン切片。中央：三次元再構成。右側：再構成の断面。μＣＴスキャンにより、対照から１＋３０、１＋６処理へとインテグレーションが増強することが実証される。
【００６０】
【図４】図４は、ｒｈＦＧＦ１８によるＣＴＡの処理を示す。
【００６１】
【図５】図５は、ｒｈＦＧＦ１８なしでの（ＣＴＲ）、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で（ｐｅｒｍ）、ｒｈＦＧＦ１８による、最初の週のみ（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）で、４週間処理を行った後のＤＮＡ含有量／ＣＴＡから推定される細胞含有量／ＣＴＡを示す。ｒｈＦＧＦ１８は、１０又は１００ｎｇ／ｍｌで使用した。Ｎ＝４．＊／＊＊＊は、それぞれ、対照に対しｐ＜０．０５及び０．００１での有意な差異を意味する。
【００６２】
【図６】図６は、ｒｈＦＧＦ１８なしでの（ＣＴＲ）、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で（ｐｅｒｍ）、ｒｈＦＧＦ１８による、最初の週のみ（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）で、４週間処理を行った後のＧＡＧ／ＣＴＡ及びＨＰｒｏ／ＣＴＡ含有量を示す。ｒｈＦＧＦ１８は、１０又は１００ｎｇ／ｍｌで使用した。Ｎ＝４．＊／＊＊／＊＊＊／は、それぞれ、対照に対しｐ＜０．０５、０．０１及び０．００１での有意な差異を意味する。
【００６３】
【図７】図７は、ｒｈＦＧＦ１８なしでの（ＣＴＲ）、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で（ｐｅｒｍ）、ｒｈＦＧＦ１８による、最初の週のみ（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）で、４週間処理を行った後のＣＴＡで評価された、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びＳｏｘ９発現、並びにコラーゲンＩＩ／Ｉ比率を示す。ｒｈＦＧＦ１８は、１０又は１００ｎｇ／ｍｌで使用した。Ｎ＝４．＊／＊＊／＊＊＊／は、それぞれ、対照に対しｐ＜０．０５、０．０１及び０．００１での有意な差異を意味する。
【００６４】
【図８】図８は、ｒｈＦＧＦ１８（１００ｎｇ／ｍｌ）不在下（ＣＴＲ）又は永続的な存在下における単層で１又は２週間培養されたウシ初代軟骨細胞を示す。細胞濃度は、Ｎ＝６で決定された。Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びＳｏｘ９発現（Ｎ＝４）は、定量的リアルタイムＰＣＲにより測定された。
【００６５】
【図９】図９は、ｒｈＦＧＦ１８なしでの（ＣＴＲ）、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で（ｐｅｒｍ）、ｒｈＦＧＦ１８による、最初の週のみ（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）で、４週間処理を行った後のＤＮＡ含有量／ＣＴＡから推定された細胞含有量／ＣＴＡを示す。＊は、対照に対しｐ＜０．０５での有意な差異を意味する。
【００６６】
【図１０】図１０は、ｒｈＦＧＦ１８なしでの（ＣＴＲ）、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で（ｐｅｒｍ）、ｒｈＦＧＦ１８による、最初の週のみ（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）で、４週間処理を行った後のＧＡＧ含有量を示す。＊は、対照に対しｐ＜０．０５での有意な差異を意味する。
【００６７】
【図１１】図１１は、ｒｈＦＧＦ１８なしでの（ＣＴＲ）、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で（ｐｅｒｍ）、ｒｈＦＧＦ１８による、最初の週のみ（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）で、４週間処理を行った後のＣＴＡで評価した、Ｉコラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、及びＳｏｘ９発現、並びにコラーゲンＩＩ／Ｉ比率を示す。＊は、対照に対しｐ＜０．０５での有意な差異を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
配列番号１：天然ヒトＦＧＦ−１８のアミノ酸配列。
【００６９】
配列番号２：組み換え切断型ＦＧＦ−１８（ｔｒＦＧＦ−１８）のアミノ酸配列。
【実施例】
【００７０】
材料：
本実施例の組み換え切断型ＦＧＦ−１８（ｒｈｒＦＧＦ１８）は、ＷＯ２００６／０６３３６２に記載される技術に従い大腸菌における発現により調製した。以下の実施例において、ｒｈｒＦＧＦ１８、ＦＧＦ−１８、及びｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎは、互換的に使用される。
【００７１】
実施例１：
方法：
新鮮な硝子軟骨を若いウシ膝（生後３〜６ヶ月）の滑車溝から採取した。８ｍｍの円筒状外植片（図１Ａ）を、生検パンチにより取り出し、完全培地（ＤＭＥＭ４．５ｇ／Ｌ、Ｄ−グルコース及びＬ−グルタミン、１０％ＦＢＳ、１％ＰＳＦ、１％ファンギゾン、１％ＭＥＭ  ビタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ）において一晩、培養した。試料は、骨をトリミングし、欠損部（４ｍｍの直径）を作成し、コア及び環状修復構造体（図１Ｂ）を形成した。内部コア及び外環の両者を２４時間、別々に培養し、その後、欠損部に、元のコアを充填した。次に、試料を完全培地において培養するか、又はＳｐｒｉｆｅｒｍｉｎ（ｒｈＦＧＦ１８、１００ｎｇ／ｍｌ）により処理した。処理は、週に１回ｒｈＦＧＦ１８を２４時間添加するか（１＋６）（毎週繰り返す）、又は２４時間の処理を１回行った後、完全培地において１ヶ月培養した（１＋３０日）。試料を、４週間の培養の後、採取した。押出し機械的試験（ｎ＝４〜６）を、カスタム試験リグ（図２Ｅ、［３］）を用いて実施した（Instron 5848, Instron, Norwood, MA）。ピークの力をインテグレーション領域で除算することによりインテグレーション強度を計算した。３Ｄ可視化のために、試料（ｎ＝６）を、改変ルゴール溶液（蒸留水中、２．５％Ｉ２及び５％ＫＩ）に２４時間浸し［４］、５５ｋＶのエネルギーレベル及び１４５μＡの強度で、６μｍ及び１０．５μｍのボクセルサイズのμＣＴ（μCT 35及びvivaCT 40、SCANCO Medical, Wayne, PA）によりスキャンした。スキャンを、製造業者のソフトウェアを用いて、分析し、再構成し、そして断面を用いて、欠損部のインテグレーションを評価した。追加試料（ｎ＝３）を、４％ＰＦＡにおいて一晩固定し、細胞及びその界面でのマトリクス沈着について、組織学的分析した。
【００７２】
結果：
対照試料のインテグレーション強度（図２Ｄ）は最も低く（２．５±１．４ｋＰａ）、１＋３０（毎月のサイクル）（５．０±２．４ｋＰａ）及び１＋６（毎週のサイクル）（１０．２±３．７ｋＰａ）処理の順で、次第に上昇した。その結果は、研究において可能な再生数で対照及び処理群を比較すると顕著であったが、統計学的有意性はなかった。対照構造体のμＣＴ分析（図３、上部左側）は、明確な暗色の円状部を示し、外環と内部コア間の分離、つまり、インテグレーションが不良であることが示唆される。１＋３０処理（図３、中央左側）は、あまり明確でない円状部を示し、分離度が小さく、インテグレーションが高いことを示唆し、そして１＋６処理（図３、底部左側）は、界面を通して非常に均質なμＣＴシグナルを示し、インテグレーションの度合いが最高であることが示す。インテグレーションがこのように向上するという証拠は、試料全体の垂直断面及び横断面の両者で明らかであった。
【００７３】
軟骨修復の成功には、（人工又は天然の）修復材料が、周囲の軟骨にうまくインテグレーションされ、負荷が確実に界面を通して連続的に伝達されること（そして応力が集中しないこと）が必要である。この研究において、本発明者は、良好に形成されたエクスビボ（外植）軟骨修復モデルにおいて軟骨のインテグレーションを増強するＳｐｒｉｆｅｒｍｉｎの能力を調べた。Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎは、軟骨細胞で前増殖性効果を有することが確立され、この生物学的薬剤への一時的（２４時間）な暴露が非常に優れた反応をもたらす（Elthworth et al., 2002）。本発明の知見により、Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎが界面でのインテグレーション強度及びマトリクス沈着を改善する（ＧＡＧ含有プロテオグリカンの上昇により、より均等な減衰を示す造影μＣＴにより明らか）ことが実証される。この研究において、１週間に１回２４時間添加することを４週間行うことは、１ヶ月のあいだ２４時間処理を１回しかしない場合よりも全体的に良好な結果を招く。また、この添加計画は、１週間に１回のサイクルの添加計画ほど良好ではないが、対照構造体（すなわち、Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎ処理の不在下）に比べ、驚くべき改善性を提供するので、有用である。この研究は、生物学的薬剤（及び特に、ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎ）が、臨床学的に関連する修復モデルにおいて軟骨表面のインテグレーションを改善したことを始めて実証する。
【００７４】
結論：
この研究は、Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎが、軟骨修復モデルにおいて軟骨表面のインテグレーションを改善可能であることを実証する。この発見は、軟骨様の生体材料が、臨床学的な好結果を達成するために、天然の軟骨と正常にインテグレーションする必要があるような例えばＯＡＴＳといった手術手順、及び組織工学アプローチにおいて、有用性がある可能性を示す。
【００７５】
実施例２：
方法：
初代変形性関節症の軟骨細胞を、膝関節全置換術を受けた患者の軟骨から単離した。処置前に、細胞を、まず、単層培養下で数日間培養し、そして次に、足場のない３Ｄ培養下で１週間培養した。処理は、合計４週間にわたり、永続的に又は１日／週、ｒｈＦＧＦ１８［１００ｎｇ／ｍｌ］を用いたインキュベーションをおこなった。結果を、Ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎを含まない対照培地と比較した。生化学的アッセイ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）及び組織学的アッセイを用いて、３Ｄ構造体を特徴づけた。
【００７６】
結果（データは示さず）：
確実に表現型を維持するために、３Ｄ足場のない培養を用いて、ｈＣＡ軟骨細胞に対する効果を試験した。この設定においては、ｒｈＦＧＦ１８［１日／週］が、細胞含有量に対して有益な効果を有し、そして３Ｄ構造体のサイズ及びマトリクス含有量（ＧＡＧ及びＨＰｒｏ含有量）を非常に高めることが見出された。また、ｒｈＦＧＦ１８は、未処理の細胞に比べて、Ｉ型コラーゲンの発現が低減することも見出された。
【００７７】
結論：
ウシ及びブタ軟骨細胞に関してのこれまでの研究において見られるように、ｓｐｒｉｆｅｒｍｉｎがｈＯＡ軟骨細胞において同化活性を有することが見出された。この発見は、軟骨様の生体材料が、臨床学的な好結果を達成するために、天然の軟骨と正常にインテグレーションする必要がある組織工学アプローチにおいて有用性がある可能性を示す。
【００７８】
実施例３：
方法：
ブタ軟骨細胞を、ブタ股関節の大腿骨頭の軟骨から単離した。関節の切断後、軟骨を採取し、０．２５％のコラゲナーゼ（２．５％のコラゲナーゼＮＢＧ４を含むＨＡＭ’ｓ  Ｆ１２の１／１０希釈液）を用いて室温で４５分消化した。分離した細胞を廃棄し、軟骨を０．１％のコラゲナーゼを用いて一晩更に消化し、軟骨細胞を抽出した。ブタ軟骨細胞を、ＣＴＡ（軟骨組織類似体）として懸濁液内で培養した。培養は、第１週は何れの処理もなしに、続いて次の処理の１つを行った：１）１０又は１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下での４週の培養、２）１０又は１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の存在下での１週間の培養に続いて、ｒｈＦＧＦ１８なしでの３週間の培養、３）１週間に１日、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の添加（すなわち２４時間の暴露に続きｒｈＦＧＦ１８なしでの６日の培養）による３週間の培養に続いて、ｒｈＦＧＦ１８なしでの１週間の培養、又は４）対照としてのｒｈＦＧＦ１８の非存在下での４週間の培養（図４）。培養期間の最後にＣＴＡを採取し、それらのＧＡＧ、ヒドロキシプロリン及び細胞含有量について分析した。Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン及びＳｏｘ９についての遺伝子発現を評価し、そしてサフラニンＯ、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンについての組織学的検査も実施した。
【００７９】
結果：ＣＴＡにおける細胞増殖に対する、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な又は間欠的な暴露の効果：
各培養条件で、ＣＴＡを溶解し、そしてＤＮＡ含有量を評価し、ＣＴＡ当たりの細胞数を計算した（図５）。対照培養（ｒｈＦＧＦ１８なし）においては、細胞数（１２０万個）は摂取密度（１００万個の細胞／ＣＴＡ）と同様で、増殖は観察されなかった。しかしながら、予想通り、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在により、軟骨細胞の増殖が増加した（それぞれ１０及び１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８によりそれぞれ２２０万個の細胞／ＣＴＡ及び２４９万個の細胞／ＣＴＡ）。ｒｈＦＧＦが１週のみ添加され、軟骨細胞がさらにｒｈＦＧＦ１８なしで３週間培養される場合（１ｗ）、対照に比べて増殖の増加は、観察されなかった。逆に、ｒｈＦＧＦ１８が１週間に１日添加される場合（１ｄ／ｗ）、ｒｈＦＧＦ１８は、対照と比べて増殖を刺激し、永続的な暴露に比べても増殖を刺激した。ＣＴＡ当たりの細胞含有量は、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の１日／週添加により、４００万個の細胞／ＣＴＡに達した。これに比べて、ｒｈＦＧＦ１８の不在下では１２０万個の細胞／ＣＴＡ、又は１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下では２４９万個の細胞／ＣＴＡであった。
【００８０】
結果：ＣＴＡにおけるマトリクス生成に対する、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な又は間欠的な暴露の効果：
各培養条件で、ＣＴＡをプロティナーゼＫにより消化し、そしてＧＡＧ及びヒドロキシプロリン含有量を評価した（図６）。ＧＡＧはプロテオグリカン含有量を反映し、ヒドロキシプロリンはＣＴＡのコラーゲン含有量を反映する。前に観察されたように、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在は、ＧＡＧ含有量／ＣＴＡを低減し（対照に比較して、２．６倍低い）、またヒドロキシプロリン含有量／ＣＴＡも低減した（対照に比較して、２．１倍低い）。逆に、ｒｈＦＧＦ１８を間欠的に（１／週または１日／週）添加する場合、ＧＡＧ及びヒドロキシプロリン含有量は増加した。例えば、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８を１週間あたり１日添加する場合、対照に比較して、ＧＡＧ含有率は２．６７倍高く、ヒドロキシプロリン含有量は２．１３倍高かった。
【００８１】
結果：ＣＴＡにおける軟骨細胞表現型に対する、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な又は間欠的な暴露の効果：
各培養条件で、ＲＮＡをＣＴＡから単離し、そしてＩ型、ＩＩ型、Ｘ型コラーゲン、及びＳｏｘ９発現を、定量的ＰＣＲにより分析した（図７）。Ｓｏｘ９及びＩＩ型コラーゲンの高発現は、軟骨細胞表現型のマーカーであり、Ｉ型コラーゲンは、脱分化のマーカーであり、そしてＸ型コラーゲンは、軟骨細胞肥大のマーカーである。コラーゲンＩＩ／Ｉの比率も計算した。この比率は通常、培養における軟骨細胞の表現型の維持（高い比率）又は表現型の損失（低い比率）を示すために使用される。ｒｈＦＧＦ１８を用いたすべての条件において、１０又は１００ｎｇ／ｍｌでの永続的な又は間欠的な暴露により、Ｉ型コラーゲンは低減した。この低減は、ｒｈＦＧＦ１８が１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、１週間に１日添加される場合に最も強かった。例として、Ｉ型コラーゲンの発現は、対照に比較して、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８を永続的に添加する場合は４倍、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８を１週間に１日添加する場合は１２３倍低減した。ＩＩ型コラーゲンは、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で低減することが発見されたが、１週（１ｗ）又は１週間に１日（１ｄ／ｗ）添加されるｒｈＦＧＦ１８の存在下ではほとんど不変であった。Ｓｏｘ９発現においては重大な変化は観察されなかった。Ｓｏｘ９発現は、１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧｆ１８を１週間（１ｗ）添加する場合のみ、有意に増加した（２．２倍）。最終的に、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な投与は、コラーゲンＩＩ／Ｉの比率に対しては効果がないことが見出されたが、しかしｒｈＦＧＦ１８が１週間に１日添加される場合、この比率は、対照に比較して、それぞれ１０及び１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８により１９倍及び１３８倍増加した。また、Ｘ型コラーゲンも軟骨細胞肥大のマーカーとして評価され、本培養条件下でｒｈＦＧＦ１８により影響されないことが見出された。
【００８２】
結果：ＣＴＡの形態及びＩ型、ＩＩ型コラーゲンの含有量に対する、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な又は間欠的な暴露の効果：
様々なｒｈＦＧＦ１８暴露による４週間の処理の後、ＣＴＡの組織学的分析により、ｒｈＦＧＦ１８が永続的に存在すると、他の条件に比較して、ＣＴＡはより薄くなり、サフラニンＯ染色は薄くなることが示された。さらに、ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下で、細胞密度が高く細胞外マトリクスがない増殖ゾーンが、その構造体の周囲で観察されることがある。一方、ｒｈＦＧＦ１８を間欠的に暴露すると、対照に比較して、構造体の厚さが増すことも観察され得る。すべての条件下で、Ｉ型コラーゲンは検出できなかったが（示さず）、すべてのＣＴＡでＩＩ型コラーゲンの染色が強かった。
【００８３】
結論：
ｒｈＦＧＦ１８の永続的な暴露は軟骨細胞の増殖を刺激したが、ＣＴＡ中のマトリクス含有量は低減した（ＧＡＧ及びヒドロキシプロリンの低減）。同様に、Ｉ及びＩＩ型コラーゲンの両者の発現も対照に比較して低減した。１０又は１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１への永続的な暴露の有意な効果は、４週の処理の後のＳｏｘ９では観察されなかった。この組織学的分析により、ＣＴＡが小さいことが明らかになり、そしてＣＴＡの周囲でＥＣＭを欠いた増殖ゾーンが示された。すべてのそれらの結果をまとめると、ｒｈＦＧＦ１８が永続的に存在すると、マトリクス産生よりも増殖のようが有利になることが示唆される。
【００８４】
永続的な暴露とは異なり、１０又は１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８を用いて１週間、続いて、ｒｈＦＧＦ１８なしで３週間ＣＴＡを培養した場合、増殖の刺激は観察されなかった。しかしながら、ＧＡＧ及びヒドロキシプロリン含有量は、対照よりも高いことが見出された。Ｉ型コラーゲンの発現は低減したが、ＩＩ型コラーゲンの発現は対照に比べて変化しなかったか、又は、わずかに増加した（１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８について）。結果、コラーゲンＩＩ／Ｉの比率は増加し、表現型の維持がより良好であることが示唆される。同様に、Ｓｏｘ９も、対照に比べてわずかに増加した（１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８のみについて有意）。組織学的分析により、ＣＴＡが、対照ＣＴＡと同様に、サフラニンＯ及びＩＩ型コラーゲン陽性マトリクスから構成されることが示された。対照と比較して、ＧＡＧ及びヒドロキシプロリンの含有量が高くなるにつれ、ＣＴＡの厚さは大きくなった。
【００８５】
１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦを１週間に１日添加する場合に、増殖及びマトリクス含有量に関し最良の結果が得られた。この条件で、Ｉ型コラーゲンは最も低く、そしてコラーゲンＩＩ／Ｉの比率は最も高かった。しかしながら、ＩＩ型コラーゲン及びＳｏｘ９発現は、対照に比較して変化がなかった。ＣＴＡは、サフラニンＯ及びＩＩ型コラーゲン陽性であった。同様に、１週間の処理に関し、対照に比較してＣＴＡが厚く、ＧＡＧ及びヒドロキシプロリンの含有量が高いことが示される。
【００８６】
結論として、間欠的な暴露により、ｒｈＦＧＦ１８の効果を増強し、そして増殖およびＥＣＭ産生の増加の達成を可能にし、そして１日／週＞１週＞対照＞永続的な暴露の順に、培養下で軟骨細胞表現型が促進される。それらの結果は、ＯＡ治療に対するｒｈＦＧＦ１８の周期的な投与の裏付けとなる。
【００８７】
実施例４：
方法：
ウシ軟骨細胞を、実施例２及び３に記載するように入手した。それらを、永続的に存在する、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８と共に（ＦＧＦ１８）、又は対照としてＦＧＦ１８の不在下（ＣＴＲ）で、１又は２週間、培養した。培養後、細胞を採取し、計数し、溶解してＲＮＡ単離及び遺伝子発現を解析した。Ｓｏｘ９、Ｉ型、ＩＩ型コラーゲン発現を、定量的ＰＣＲにより評価した。
【００８８】
結果：
永続的なＦＧＦ１８を用いた２週間の培養の後、細胞濃度は対照群よりも高かった。Ｉ型コラーゲンの発現はｒｈＦＧＦ１８の存在下で強く抑制されたが、ＩＩ型コラーゲン及びＳｏｘ９の発現は増加した（図８）。
【００８９】
結論：
軟骨細胞が単層で培養される場合、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の永続的な暴露により、細胞増殖の増加が可能になり、良好な表現型の維持も可能になる（ＩＩ型コラーゲン及びＳｏｘ９の発現が高まり、そしてＩ型コラーゲンの発現は低下した）。
【００９０】
実施例５：
方法：
膝関節全置換術を受けた２人のＯＡ患者から得た軟骨を使用した。軟骨細胞を、実施例３に記載のようにして単離し、そしてまず、単層下で高密度で３〜４日間、培養した。続いて、軟骨細胞を採取し、そして９６ウェルプレートに、１×１０６個の細胞／２００μｌで接種し、何れの処理もせず１週間、凝集させＣＴＡを形成させた。続いて、１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８の不在又は存在下の以下の処理の１つを行い、さらに４週間培養した：１）ｒｈＦＧＦ１８の不在下での４週間の培養（対照）、２）ｒｈＦＧＦ１８の永続的な存在下での４週間の培養（ｐｅｒｍ）、及び３）１週間に１日ｒｈＦＧＦ１８の添加（すなわち、２４時間の暴露に続きｒｈＦＧＦ１８なしでの６日の培養）による４週間の培養（１ｄ／ｗ）（図４）。培養期間の後にＣＴＡを採取し、それらのＧＡＧ、ヒドロキシプロリン及び細胞含有量について分析した。患者２から入手されたＣＴＡに関しては、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲン及びＳｏｘ９についての遺伝子発現を評価し、そしてサフラニンＯ、Ｉ型及びＩＩ型コラーゲンについての組織学的検査も実施した。
【００９１】
結果：
細胞増殖：
１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８により、３Ｄ培養でヒト変形性関節症の軟骨細胞の増殖が増大した（図９を参照）。患者１から得た軟骨細胞については、対照のＣＴＡ当たりの細胞数は、初期細胞数よりも少なく（接種密度は１００万個の細胞／ＣＴＡであった）、このことは、多くの細胞が死滅したことを示唆する。しかしながら、永続的又は１日／週のｒｈＦＧＦ１８の存在下では、１５０万個の細胞／ＣＴＡが見られ、このことは、細胞が死滅しないで増殖したことを示唆する。患者２から得た軟骨細胞においては、細胞数のわずかな増加（ＣＴＡ当たり１００万〜１３０万個の細胞）が、未処理のＣＴＡにおいて観察され得る。さらに、永続的なｒｈＦＧＦ１８の存在下で細胞数が増加した（ＣＴＡ当たり、１００万〜１９０万個の細胞）。
【００９２】
結果：
マトリクス産生：
１００ｎｇ／ｍｌのｒｈＦＧＦ１８により、３Ｄ培養でヒト変形性関節症の軟骨細胞によるＧＡＧ産生が増大した（図１０を参照）。永続的な及び１日／週のｒｈＦＧＦ１８を受けた患者１、ならびに永続的なＦＧＦ１８を受けた患者２においては、有意に多くのＧＡＧがＣＴＡに存在した。
【００９３】
結果：
遺伝子発現：
軟骨細胞表現型は、Ｉ型コラーゲン発現の低減又は不存在、そしてＳｏｘ９及びＩＩ型コラーゲン発現の増加という特徴を有する。この発現パターンは、変形性関節症の軟骨細胞において異なっていた（図１１を参照）。実際、未処理のＣＴＡにおいて、Ｉ型コラーゲンの発現はＩＩ型コラーゲンの発現よりも高かった（それぞれ、０．６７及び０．０４の相対存在量）。ｒｈＦＧＦ１８はＩ型コラーゲンの発現を低減し、ＩＩ型コラーゲンの発現を増加できた。結果として、コラーゲンＩＩ／Ｉの比率は、ｒｈＦＧＦ１８の存在下で、１１〜１３倍に上昇した。さらに、ｒｈＦＧＦ１８は、Ｓｏｘ９、すなわち軟骨細胞表現型のマーカーの発現を増加した。
【００９４】
結果：
組織学的検査（データは示さず）：
対照と比較して、１日／週又は永続的なｒｈＦＧＦ１８を用いて培養したＣＴＡは、サフランＯ染色の増強を示し、このことは、それらがよりＧＡＧを含むことを示唆する。これは、図１０に提供される結果と一致する。Ｉ型コラーゲン染色はｒｈＦＧＦ１８処理された細胞において低減し、これは図１１の遺伝子発現結果に良好に一致する。ＩＩ型コラーゲン染色は対照培養物において見られず、このことはヒト変形性関節症（ｈＯＡ）軟骨細胞が軟骨様マトリクスを生成できないことを示唆する。しかしながら、１日／週及び永続的なｒｈＦＧＦ１８は両者とも、ＩＩ型コラーゲンを産生するｈＯＡ軟骨細胞の能力を回復できた。
【００９５】
結論：
ヒト変形性関節症の軟骨から単離された軟骨細胞により得られた結果により、ｒｈＦＧＦ１８が細胞増殖を促進でき、硝子様軟骨マトリクス産生を増強でき、そして軟骨細胞の表現型に好適であることが示された。この実験において、永続的及び１日／週でのｒｈＦＧＦ１８は、いくつかのパラメーターに関しては同等であった。しかし、マトリクス産生に関して、１日／週でのｒｈＦＧＦ１８のほうがやや良好であった（患者１においてはＧＡＧ蓄積が増大し、患者２においては、コラーゲンＩＩの発現が増大した）。
【００９６】
References
1. Magill et al., 2011, J. orthopaedic Surg. 19(1):93-98
2. Zhang et al., 2013, Expert Opin. Biol. Ther. 13(4):527-540
3. Tang et al., 2012, Expert Opin. Biol. Ther., 12(10):1361-1382
4. Ellsworth et al., 2002, Osteoarthritis and Cartilage, 10: 308-320
5. Shimoaka et al., 2002 , JBC 277(9):7493-7500
6. WO2008023063
7. WO2004032849
8. WO9816644
9. WO2006063362
10. Custers et al., 2007, Osteoarthritis and Cartilage, 15:1241-1248
11. Lotz, 2010, Arthritis research therapy, 12:211
12. The Merck manual, 17th edition, 1999
13. Getgood et al., 2010, P116, ICRS Meeting 2010, Barcelona.
14. ICRS publication: http://www.cartilage.org/_files/contentmanagement/ICRS_evaluation.pdf, page 13
15. Bian et al., 2010, Am. J. Sports. Med, 38(1):78-85.
16. Gennero et al., 2013, Cell Biochem Funct 31 (3) 214-227
17. M auck et al., 2006, Osteoarthritis and Cartilage, 14(2):179-189
18. Bian et al., 2008 J.Biomech., 41(6) :1153-1159
【図１】
0006495934.tif 000002
【図２】
0006495934.tif 000003
【図３】
0006495934.tif 000004
【図４】
0006495934.tif 000005
【図５】
0006495934.tif 000006
【図６】
0006495934.tif 000007
【図７】
0006495934.tif 000008
【図８】
0006495934.tif 000009
【図９】
0006495934.tif 000010
【図１０】
0006495934.tif 000011
【図１１】
0006495934.tif 000012
【配列表】
0006495934000001.app