(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌サンプル中のメシチリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) を同定するための方法であって、
完全細菌細胞を、MALDI飛行時間型（MALDI-TOF）のマススペクトロメータのターゲットプレートに事前の抽出なしに直接配置する工程と、
前記完全細菌のMALDI-TOFマススペクトルを取得する工程と、
前記サンプル中の細菌を、前記MALDI-TOFマススペクトルを黄色ブドウ球菌の参照マススペクトルを少なくとも1つ含むライブラリの参照マススペクトルと比較することによって、黄色ブドウ球菌(SA) として分類する工程と、
前記MALDI-TOFマススペクトルにおけるm/z 3007またはm/z 3037に中心を持つ質量信号（第１の質量信号という）が存在するか否かを決定する工程と、
前記MALDI-TOFマススペクトルにおけるm/z 2415に中心を持つ質量信号（第２の質量信号という）が存在するか否かによって、フェノール可溶性モジュリンペプチド（ＰＳＭ−ｍｅｃ）もしくはその変異体が存在するか否かを決定する工程と、
前記第１の質量信号および前記第２の質量信号が存在する場合に前記細菌サンプル中の細菌をメシチリン耐性と判定し、前記第１の質量信号が存在しない場合もしくは前記第１の質量信号が存在して前記第２の質量信号が存在しない場合にメシチリン耐性であるかメシチリン感受性であるかを決定できないと判定する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記MALDI-TOFマススペクトルのm/z 2415に中心を持つ前記第２の質量信号が存在する場合に、前記細菌サンプル中に前記PSM-mecペプチドのホルミル化バージョンが存在すると判定する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記MALDI-TOFマススペクトル中にm/z 3007またはm/z 3037での前記第１の質量信号が存在するとき、δ毒素が該細菌サンプル中に存在すると判定する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌サンプルが、寒天プレート、液体栄養ブロス、スメア、体液、および血液培養のうち1つから得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
追加の抗生物質感受性試験を実施して、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌の同定を確認する、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記完全細菌細胞がターゲットプレートに塗布され、MALDIマトリックスに直接重ねられる、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記完全細菌細胞がターゲットプレートに堆積され、蟻酸/アセトニトリルで抽出され、MALDIマトリックスに重ねられる、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
蟻酸(70%)を加え、その次にアセトニトリルを加え、混合し、乾燥させる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記MALDIマトリックスは、α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸を含む、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はメシチリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) の同定に関するものであり、特にマススペクトルによる同定に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
黄色ブドウ球菌 (S. aureus) は人間の呼吸気道内および皮膚表面にしばしば見出されるバシラス目スタフィロコッカス科の細菌である。S. aureusは必ずしも病原性ではないが、皮膚感染症 (おできなど)、呼吸器疾患 (副鼻腔炎など)、及び食中毒の一般的な原因である。抗生剤に対する耐性を獲得する抜群の能力があることが判明している。メシチリン耐性S. aureus (MRSA) は1980年代に病院内に広がり始め、次いで院外感染性株(CA-MRSA) が広がり始めた。今も、院内感染で最も多い原因上位5つのうちの1つであり、しばしば、手術後の創傷感染の原因となっている。今日、MRSAは、世界中の多くの国々の病院内衛生の課題である。
【０００３】
メシチリンに対する耐性は、ブドウ球菌カセット染色体mec (SCCmec) の一部であるmecオペロンで媒介される。耐性はmecA遺伝子によりもたらされ、この遺伝子は、改変されたペニシリン結合タンパク質(例えばPBP2a) のコーディングを行う。このタンパク質は、β-ラクタム (ペニシリン、セファロスポリン、及びカルバペネム) に結合する親和性が低い。これにより、β-ラクタムの存在下でのトランスペプチダーゼ活性が可能になり、細胞壁合成阻害の作用が妨げられる。これまでに、いくつかのサブタイプ及び変異体を備えた11種類のSCCmecが検出されている。これらのカセットは配列の多様性が高く、可動性エレメントに組み込まれている。
【０００４】
臨床検査機関では、患者サンプルから得られた細菌の同定を行うのに、無傷細胞のマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型マススペクトル (MALDI-TOF MS) を使用することが増えている。MALDI-TOF MSにより細菌同定に利用される分析対象イオン (特にリボソームタンパク質イオン) は、ふつう一価であるため、単にイオンの質量mを参照することができる。しかしながら、より正確な表現は「質量電荷比」m/zであり、これが実際にマススペクトルで必要である。
【０００５】
いくつかの研究で、メシチリン感受性 (影響を受ける) S. aureus (MSSA) とMRSAとを区別するためのマススペクトル (特にMALDI-TOF MS) の可能性が分析されている：
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第8,293,496 B2号明細書
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Edwards-Jones V et al., J. Med.Microbiol., 2000, 49, 295-300: “Rapid discrimination between methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry”
【非特許文献２】Du Z. et al., Anal.Chem., 2002, 74, 5487-5491: “Identification of Staphylococcus aureus and determination of its methicillin resistance by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.”
【非特許文献３】Lu JJ.Et al., Anal.Chem., 2012, 84, 5685-5692: “Peptide biomarker discovery for identification of methicillin-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF”
【非特許文献４】Bernardo K. et al., Proteomics, 2002, 2, 747-753: “Identification and discrimination of Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry”
【非特許文献５】Majcherczyk PA et al., FEMS Microbiol.Lett, 2006, 255, 233-239: “The discriminatory power of MALDI-TOF mass spectrometry to differentiate between isogenic teicoplanin-susceptible and teicoplanin-resistant strains of methicillin resistant Staphylococcus aureus.”
【非特許文献６】Sun et al., Wei Sheng Yan Jiu, 2011, 40, 375-378:“Rapid method study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry”
【非特許文献７】van Bar (FEMS Microbiology Reviews, 24, 2000, 193-219: “Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry”)
【非特許文献８】Jarman et al. (Analytical Chemistry, 72(6), 2002, 1217-1223: “An Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry”)
【非特許文献９】Chatterjee et al.: “Distribution and regulation of the mobile genetic element-encoded phenol-soluble modulin PSM-mec in methicillin-resistant Staphylococcus aureus”, 2011, PLoS One, 6:e28781
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、細菌サンプル中のメシチリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA) を同定するための方法を提供し、この方法は、サンプル中の細菌を黄色ブドウ球菌(SA) として分類する工程と、フェノール可溶性モジュリンペプチドまたはその変異体の存在または不在を判定する工程とを含み、ここにおいてPSM-mecペプチドまたはその変異体が存在する場合は、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌があることを示す。この変異体は好ましくは、単プロトン化状態において質量電荷比が2415である、PSM-mecペプチドのホルミル化バージョンである。
【０００９】
PSM-mecペプチドまたはその変異体の存在は、完全 (無傷) 細菌細胞のマススペクトルを取得する工程と、そのマススペクトル中に、m/zが2404〜2420である少なくとも1つの質量信号が存在すること、特にm/zが2415の値を中心とした質量信号が存在することにより、判定する工程とによって決定することができる。PSM-mecペプチドまたはその変異体の存在は、更に、溶媒 (例えばエタノールなどの有機溶媒) を細菌サンプルに適用する工程と、結果として得られた上清のマススペクトルを取得する工程と、そのマススペクトル中に、m/zが2404〜2420である少なくとも1つの質量信号が存在すること、特にm/zが2415の値を中心とした質量信号が存在することにより、判定する工程とによって決定することができる。更に、PSM-mecペプチドまたはその変異体の存在は、m/zが2404〜2420である親イオン選択物 (特にm/zが2415の値を中心とした親イオンによる) を含む、細菌サンプルのタンデムマススペクトルにより決定することができる。
【００１０】
細菌は好ましくは、細菌のサンプルマススペクトルを取得する工程と、そのサンプルマススペクトルを、黄色ブドウ球菌の参照マススペクトルを少なくとも1つ含むライブラリの参照マススペクトルと比較する工程とによって、黄色ブドウ球菌として分類される。
【００１１】
参照マススペクトルは、周知の細菌株の測定マススペクトルであってよく、または、細菌株の遺伝子配列に由来するものであってもよい。サンプルマススペクトルは好ましくは、完全(無傷) 細菌細胞のMALDI飛行時間型マススペクトルである。マススペクトルを使用した細菌の分類 (分類/同定) は、非特許文献７および非特許文献８で周知である。PSM-mecペプチドまたはその変異体の存在は好ましくは、サンプルマススペクトル中にm/zが2404〜2420の少なくとも1つの質量信号が存在すること、特にm/zが2415の値を中心とした質量信号が存在することにより、決定され、ここにおいて、サンプルマススペクトルも分類に使用される。
【００１２】
本発明による方法には更に、黄色ブドウ球菌のagr (アクセサリー遺伝子調節因子) 系の状態 (例えば、黄色ブドウ球菌がagr陽性かagr陰性か) を判定する工程が含まれ得る。agr系が存在しかつPSM-mecペプチドまたはその変異体が存在することは、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌であることを示し、一方、agr系が存在しかつPSM-mecペプチドまたはその変異体が存在しないことは、メシチリン感受性黄色ブドウ球菌であることを示す。agr系の状態は、δ毒素の存在または不在によって判定することができ、ここにおいてδ毒素の存在は、agr系の存在 (agr陽性) を示す。δ毒素はマススペクトルで決定することができ、ここにおいて細菌サンプルのマススペクトル(最も好ましくは分類同定のために利用されるサンプルマススペクトル) 中にm/zが3007またはm/zが3037を中心とした質量信号が存在する場合は、δ毒素が存在することを示し、よってagr陽性の黄色ブドウ球菌が存在することを示す。agr陰性状態の場合、その黄色ブドウ球菌は、MRSAおよびMSSAに関して未決定として割当てられる。 
【００１３】
細菌サンプルは、寒天プレート培養、栄養ブロス若しくは血液培養、スメア若しくは体液から直接、得ることができる。細菌は、寒天プレートのゼラチン状培地上で成長したコロニーから採取することができる。液体栄養ブロスまたは血液培地で培養された細菌は、遠心分離または濾過により分離され得る。後者の場合、好ましくは、血液細胞を破壊してから分離される。スメアおよび血液などの他のサンプルについても、非細菌細胞を破壊する必要がある場合がある。
【００１４】
PSM-mecペプチドまたはその変異体の存在を判定した後、メシチリン耐性黄色ブドウ球菌の存在を更に確認するために、追加の抗生物質感受性試験(AST) を実施することができる。追加の抗生物質感受性試験は従来型の試験であってよく、ここにおいて、抗生物質の影響下、栄養ブロスまたは寒天プレートにおける細胞の成長が判定される。これは、栄養ブロスの濁度または寒天プレートの成長ゾーンを光学的に測定することによって判定される。他の抗生物質感受性試験は、マススペクトルに基づくものであってよく、例えば特許文献１(Goverun et al.: “Mass spectrometric measurement of microbial resistances”) ならびに欧州特許出願第13002450.8号(K. Sparbier et al.: “Mass spectrometric determination of microbial resistances”) および同第13002699.0号 (K. Sparbier et al.: “Determining the bacterial resistance by mass spectrometric measurement of the bacterial growth”) に記述されている。
【００１５】
市販の装置のうち、リニアモードのマトリックス支援レーザー脱離およびイオン化飛行時間型(MALDI-TOF) 質量分析計は、細菌などの微生物のマススペクトル同定の実践において十分に確立されている。けれども、本発明により、マトリックス支援レーザー脱離によるイオン化に加え、他のタイプのイオン化も、マススペクトルを取得するのに好適であり、例えばエレクトロスプレーイオン化(ESI)、または脱離手法の後に化学的イオン化を行う方法 (CI) が挙げられる。更に、様々なタイプの質量分析計を使用することができ、例えば、直交イオン射出を伴う飛行時間型質量分析計、イオントラップ質量分析計、または四重極フィルターが挙げられる。特に、四重極フィルター装置を使用して、例えば選択的反応モニタリングにより、m/zが2415の質量信号の存在または不在を判定することができる。
【００１６】
フェノール可溶性モジュリンペプチド (PSM-mec) またはその変異体の存在は、更に、MALDI-TOF MSまたは四重極フィルター装置などの質量分析計を使用して (特に校正用物質を用いて)、定量的に測定することができる。PSM-mecペプチドが定量的に測定され、細菌サンプル中の細菌の初期濃度が既知である場合、その耐性の強さは、測定されたPSM-mecペプチドの量から決定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】黄色ブドウ球菌株USA100およびこの菌株のクローン (PSM-mecの発現が、アンチセンスRNAの発現によって下方制御され得る) のMALDI-TOF測定マススペクトルを示す。
【図２】本発明による好ましい方法のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
〈マススペクトルによる細菌の分類 〉
マススペクトルによる細菌の分類は一般に、ペトリ皿中のゼラチン状培地の上で明瞭に分離されたコロニー(分離株) の培養から始まる。小さいスワブ (木製のつまようじなど) でごく少量の細菌をコロニーから採取し、これをマススペクトル用サンプルプレート上に塗布する。細胞は周知の方法で溶解させ、マトリックス材料の溶液を加えてから乾燥させ、このサンプルプレートを、マトリックス支援レーザー脱離(MALDI) によるイオン化を用いる飛行時間型質量分析計 (TOF) のイオン源に挿入する。イオンはパルス状のレーザー射出により生成され、その飛行時間が測定される。通常、何百もの単スペクトルを足し合わせて、信号対ノイズ比を改善させる。MALDI-TOF質量分析計により取得される、用語「細菌のマススペクトル」または「サンプルのマススペクトル」は、通常、数多くの単マススペクトルを足し合わせた合計スペクトルを指す。
【００１９】
マススペクトルによる細菌同定は、非特許文献７に詳しく示されている。この同定は例えば、細菌サンプルのマススペクトルと、ライブラリに保存されている既知の細菌株を測定した参照マススペクトルとの間で類似性分析を行うことで実施される。参照マススペクトルとの類似性比較それぞれについて、類似性値が計算される。細菌が同定されたと見なすことができるのは、特定の参照マススペクトルに対する類似値が、他のすべての参照スペクトルの類似値に比べて明らかに良好な類似値を示し、かつそれに加えて、あらかじめ選択された類似値閾値よりも良好な値を示した場合である。分類同定は多くの場合、それぞれの種の代表的な参照マススペクトルの数に応じて、種レベルまで特定することが可能である。非特許文献８において、参照マススペクトルの自動生成、および、検査対象サンプルのマススペクトルと自動生成された参照マススペクトルとの類似性分析を行うための、コンピューター支援手法が報告されている。
【００２０】
〈m/zが2415の値で測定される細菌化合物の同定〉
いくつかの研究で、メシチリン感受性 (影響を受ける) 黄色ブドウ球菌(MSSA) とMRSAとを区別するためのMALDI-TOF MSの可能性が分析されている。特に、MRSA菌株とその同質遺伝子MSSA突然変異体(保存中にSCCmecを失っている) との比較により、細胞抽出物のスペクトルには違いがないこと、すなわち、mecA、PBP2aまたはその他の抵抗性変異体によりコーディングされたタンパク質は、大きすぎるか(76 kDa)、または通常の測定中に細胞抽出物のMALDI-TOF MSにより検出するには存在量が少なすぎることが示されている。
【００２１】
無傷のMRSAおよびMSSA細胞 (すなわち、事前の抽出なしにターゲットに直接配置された完全細胞) を使用して、Rhine-Hesseクローン (配列タイプ (ST) 225、クローン複合体 (CC) 5) のMRSA菌株において、m/zが2415での質量信号が検出されている。m/zが2145での質量信号は、これらの菌株の細胞抽出物では観察されない。この質量信号は、フェノール可溶性モジュリン(PSM) PSM-mecのホルミル化バージョンの単価 (プロトン化) イオンの算出質量に対応する。 
【００２２】
m/zが2415での質量信号がPSM-mecペプチドにより生じているものであることを証明するために、PSM-mecの発現がアンチセンスRNAの発現によって下方制御され得るクローンが構築されている。よって、オリゴヌクレオチドpsmmecfor (aattcgcctgaatgcaagtcttgattaaatcaat-aatgcttgtaataacaccagtt) およびpsmmecrev (ctagaactggtgttattacaagcattattgatttaatcaagacttgcattca-ggcg) は、互いにアニールされ、EcoRI/Xbal消化済みベクターpEPSA5に直接結合されて、pEPSA5-psm-mecが得られる。結果として得られるクローンは、キシロース誘導性プロモーターの向こう側のアンチセンス方向に、50 bpのpsm-mecフラグメントを含む。プラスミドはST5 USA100分離株 (NRS382) に転換され、これはクラスAのmec遺伝子複合体を含む。
【００２３】
このクローンは、50 mMのキシロース存在下または非存在下で、選択試薬として34 mg/lのクロラムフェニコールを含むLB寒天培地上で一晩成長させた。細胞物質をMALDI-TOF MSグラウンドスチールターゲットプレートに直接配置し、細胞の融合層を生成する。次のステップで、1 μlの蟻酸 (70%) を細菌層に加え、次に1 μlのアセトニトリルを加え、注意深く混合し、乾燥させた。次に、各サンプルに2 μlのマトリックス (50%アセトニトリル/2.5%トリフルオロ酢酸中の、α-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸) を重ね、再び室温で空気乾燥させた。このサンプルを、MALDI-TOF MSで分析し、正リニアモードで測定した。
【００２４】
図1は、菌株USA100 (図1A)、キシロース存在下でpEPSA5-psm-mecを擁する菌株USA100 (図1B)、及び、キシロース不在で pEPSA5-psm-mecを擁する菌株USA100 (図1C) の測定スペクトルを示す。m/zが3007での質量信号はδ毒素により生じているものであり、m/zが2415の質量信号 (PSM-mecペプチドに対応する) は、キシロースの存在下で発現しているアンチセンスRNAによって抑制されている。結果として、m/zが2415での信号は、組み換えpEPSA5ベクターを擁するクローンにキシロースを添加した後、大幅に減少したことが示されている。このことは、この方法によりm/z 2415で観察された信号が、実際にPSM-mecであることを証明するものである。
【００２５】
〈クラスA mec遺伝子複合体を備えたMRSAの同定〉
PSM-mecは小さな分泌ペプチドであり、クラスA mec遺伝子複合体を含む3つのSCCmecカセット (タイプII、IIIおよびVIII) にコーディングされている (非特許文献９)。すべてのPSMの産生はagr系により調節されており、このagr系は、黄色ブドウ球菌におけるクオラムセンシングに関与し、AgrAのリン酸エステル化形態を介して直接、δ毒素とPSMの発現を調節する。よって、ある菌株のagr状態は、δ毒素の発現から判断することができ (m/z 3007 (ほとんどのCC)、またはm/z 3037 (CC1菌株))、これはしばしば、完全細胞のスペクトルで最も強い信号として現れる。黄色ブドウ球菌Mu50などのagr陰性タイプ菌株は、δ毒素とPSM-mecの産生を示さず、同様に、δ毒素陰性タイプの菌株や臨床分離株には、PSM-mecは観察されない。
【００２６】
しかしながら、クラスA mec遺伝子複合体は、いくつかの病院に関連するMRSA系統に発生しており、例えば、米国、東アジアおよびヨーロッパ ST5 SCCmecタイプIIの病院関連MRSA (ニューヨーク/日本クローンまたはUSA100)、および、近い関係のST225 SCCmecタイプII MRSAに発生している。ST225菌株は中央ヨーロッパの病院に蔓延しており、昨年の当地域のMRSA分離株の70%以上に相当する。更に、このグループには、オーストラリア、アジア、南北アメリカ、東ヨーロッパで流行しているST239 SCCmecタイプIII菌株 (ブラジル型/ハンガリー型クローン) と、ヨーロッパ、オーストラリアおよび米国で単離されているEMRSA-16 (USA200) に代表されるST36 SCCmecタイプII MRSA、ならびに、ST45菌株USA600が含まれる。
【００２７】
【表１】
0006620099.tif 000002
【００２８】
更なる実験で、タイプ菌株の採取物と、十分に特性付けられた通常の臨床MRSAおよびMSSA分離株について、PSM-mecの存在が試験されている (表1)。
【００２９】
菌株は、それぞれのクローン複合体 (CC) に従ってグループ分けされている。クラスA mec遺伝子複合体の存在に関して疑いがある場合は、マルチプレックスPCRによりSCCmecカセットタイピングが行われる。予想外に陰性または陽性の測定値が出た場合は、更に、PSM-mecの存在がPCRにより試験され、これにより、SCCmecまたはSCCmecの一部が低温保管中に失われていないことを確認し、あるいは、そのペプチドがMSSA中に存在するかもしれない可能性を除外した。
【００３０】
MALDIサンプルの調製には、2つの異なる方法が使用された。新鮮なコロニー全体をスメア採取してターゲットプレートに塗布し、MALDIに直接重ねる方法、あるいは、上述のようにターゲットに塗布した直後に、細胞を蟻酸/アセトニトリルで抽出する方法である。
【００３１】
上述のように、agr陰性タイプ菌株は、δ毒素とPSM-mecの産生を示さず、同様に、δ毒素陰性タイプの菌株や臨床分離株には、PSM-mecは観察されない。よって、δ毒素信号を示さなかったプロファイルはすべて、表2の評価から除外されている (スメアサンプルの12%、抽出サンプルの11.5%)。
【００３２】
【表２】
0006620099.tif 000003
【００３３】
第1のタイプの評価において、強度を問わずm/z 2404〜2420に現れるすべての信号が含まれ、ターゲット上の抽出を用いた場合、全体の感度は0.94、特異性は約0.96となっている。ターゲット上に配置した後にサンプルを直接マトリックスと重ねた場合、感度は若干高くなったが、測定の特異性は0.8を下回っている。偽陽性菌株 (psm-mec PCR陰性) は、わずかに少ない質量で (m/z ≦ 2411)、弱いピークを示している。
【００３４】
第2のタイプの評価において、m/z値 ≦ 2411にある比較的弱い信号すべて (例えば強度 < 100任意単位) が除外され、m/z ≧ 2411にある比較的強い信号すべて (例えば強度 > 100任意単位) が陽性としてカウントされる。よって、すべての偽陽性菌株が排除されているため特異性が大幅に増大され(表2)、このことは、psm-mecが、利用された菌株コレクションにおいて、SCCmecとの関連においてのみ生じることを示している。偽陰性菌株の検出はおそらく、PSM-mecペプチドの発現が低いことによるものである。 
【００３５】
盲検実験 (「ターゲット上で抽出」方法が135サンプル、ターゲット上に直接スメア塗布が60サンプル) の評価には、主に、タイプII SCCmecカセット (ST5、ST225) を擁するCC5 MRSAに、他のCC (CC22、CC8、CC398) のMRSAならびに10のMSSA菌株と混合したものが含まれ、これらは以前の細胞抽出物を用いた研究ではCC5 MRSAとは区別できなかったが、ここではすべてのagr陽性CC5 MRSAのうち95%が同定されている。
【００３６】
実験結果は、クラスA mec遺伝子複合体を擁するagr陽性MRSAをMALDI-TOF MSによって同定することが可能であることを示している。クラスター分析によってMRSAを同定しようという以前の試みとは対照的に、本発明では、PSM-mecペプチドが固有マーカーとして使用される。マーカーの識別は既知であり、いくつかのSCCmecカセットにコーディングされている。ペプチドは陰イオン性であり、細胞の表面にあるため、完全細胞測定中に検出されるが、細胞がエタノールで洗浄されると(これは従来の細胞抽出物調製の第1段階である) おそらくは細胞表面から失われる。クラスA mec遺伝子複合体は、いくつかの病院関連MRSA系統に生じている。しかしながら、SCCmecタイプIVカセットを擁している、CA-MRSA菌株USA300、家畜関連MRSA、または病院関連CC22菌株(例えばEMRSA-15) は、この方法ではMSSAと区別することはできない。
【００３７】
図2は、好ましい方法のフローチャートを示し、これは次の工程：(a) 分析対象のサンプルを寒天プレート上で培養する工程と、(b) 寒天プレートの少なくとも1つの細菌コロニーを、細菌サンプルとして選択する工程と、(c) その少なくとも1つの細菌コロニーから得た細菌の完全細胞のMALDI-TOFマススペクトルを取得する工程と、(d) そのMALDI-TOFマススペクトルを、黄色ブドウ球菌の参照マススペクトルを少なくとも1つ含むライブラリの参照マススペクトルと比較することによって、細菌を分類する工程と、(e) MALDI-TOFマススペクトルの第1および第2質量信号の存在または不在を判定する工程であって、ここにおいて第1質量信号はm/z 3007またはm/z 3037を中心とし、第2質量信号はm/z 2415を中心とする、工程と、を含み、ここにおいて、第1および第2質量信号が存在するとき、少なくとも1つのコロニーの細菌がメシチリン耐性として同定され、また、第1質量信号が存在するが第2質量信号は不在のとき、少なくとも1つのコロニーの細菌が、メシチリン感受性として同定される。
【００３８】
多くの臨床検査機関において、黄色ブドウ球菌の分類学的種同定中に、MRSの主なサブグループの検出のために必要なデータが得られるため、本発明による細菌サンプルのマススペクトル分析は、院内感染MRSA菌株の少なくとも一部を早期に検出し、入院患者を早期に隔離するのに役立ち得る。
【図１】
0006620099.tif 000004
【図２】
0006620099.tif 000005