(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とするムンプスウイルスの弱毒化方法であって、
前記脈絡叢で高発現するmiRNAはmiR449であり、miR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又は前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とするムンプスウイルスの弱毒化方法。
【請求項２】
前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを３つ繋いだ配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とする請求項１記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
【請求項３】
前記ムンプスウイルスは、Odate株を含む野外分離株又は既存のワクチン株であることを特徴とする請求項１又は２に記載のムンプスウイルスの弱毒化方法。
【請求項４】
脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列が組み込まれて弱毒化されたムンプスウイルスであって、
前記脈絡叢で高発現するmiRNAはmiR449であり、miR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又は前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列が組み込まれて弱毒化されたムンプスウイルス。
【請求項５】
前記ACCAGCTAACAATACACTGCCAを３つ繋いだ配列が組み込まれて弱毒化された請求項４記載のムンプスウイルス。
【請求項６】
前記ムンプスウイルスは、Odate株を含む野外分離株又は既存のワクチン株であることを特徴とする請求項４又は５に記載のムンプスウイルス。
【請求項７】
請求項４乃至６の何れか１項に記載の弱毒化されたムンプスウイルスが凍結乾燥された生ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムンプスウイルスの弱毒化方法、その方法を使用して弱毒化したムンプスウイルス、及び、無菌性髄膜炎を起こさず且つ免疫原性を保持した新規のムンプスワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
流行性耳下腺炎（ムンプス、おたふくかぜ）はパラミクソウイルス科ルブラウイルス属に分類されるムンプスウイルス(MuV)によって引き起こされ、耳下腺のびまん性腫脹・疼痛、発熱を主症状とする感染症である。予後は一般に良好であるが、時に無菌性髄膜炎、脳炎、難聴、膵炎、精巣炎等の合併症を引き起こす。特にムンプス難聴は予後が悪く、発生頻度が予想外に高いことで注目されている。おたふくかぜに対する治療法は無く、病原性を減弱させた弱毒ウイルスを用いた生ワクチンによる予防が唯一の対策である。【０００３】
ムンプス生ワクチンは1966年のソ連におけるLeningrad-3 (L-3)株の開発に始まり、米国におけるJeryl Lynn (JL)株の開発等、10種類以上の弱毒株（星野株、鳥居株、L-3株の派生株であるL-Zagreb株等）を用いた生ワクチンが日本を含むいくつかの国で開発されている。しかしながら現行のムンプスワクチンには、MuVの特性に起因するいくつかの課題が残されている。その1つは、ワクチン接種後に副反応として発生する、重篤な無菌性髄膜炎である。例えば、ブルガリアで開発されたSofia-6株は無菌性髄膜炎が原因で、市場から撤退している。また、国産の占部株（阪大微研）では、この株を含むMMRワクチン（麻疹おたふくかぜ風疹3種混合ワクチン）導入後、占部株による無菌性髄膜炎が多発し、MMRワクチンが中止される事態に至っている。これ以降、日本国内のワクチン接種率は低迷し、おたふくかぜの流行はいまだに制御できていない。こうした国内の状況を受けて、無菌性髄膜炎を起こさない安全性の高いムンプスワクチンの提供が強く求められている（非特許文献１）。【０００４】
一方で、MuVには継代培養によって容易にその免疫性を失う過弱毒化という問題が存在する。過弱毒化のメカニズムは、人体内におけるワクチンウイルスの増殖能の低下によって十分な免疫誘導ができなくなることにあると考えられる。例えばスイスで開発されたRubini株やBBM-18株、国内で最初に開発されたTowata株は過弱毒化が原因で実用化に至らなかった。また、無菌性髄膜炎の発生頻度が非常に低く、世界中で最も広く使用されているJL株においても、2回のワクチン接種率が90％以上に維持されている国々で、おたふくかぜの大規模流行が頻発しており、その免疫原性に疑義が生じている（非特許文献２）。【０００５】
加えて、JL株の場合には流行株との抗原性の齟齬という固有の問題点もある。MuVの系統学的分類では、JL株やRubini株は遺伝子型Aに分類される。そしてこの遺伝子型はこれまでに検出されている他の遺伝子型から唯一、系統学的に大きく乖離していることが知られている。従って、ワクチン株と異なる遺伝子型の流行が起こった場合、遺伝子型Aのワクチン株では交差免疫が機能しにくく、相対的に防御効果が低下することが想定される。従って、ワクチン株には遺伝子型A以外のウイルスを用いることが望ましい。【０００６】
従来、生ワクチンに用いられる弱毒株は培養細胞又はニワトリ胚中で野外株の継代培養を繰り返し、偶然に出現した弱毒株をワクチンとしてきた。しかし、前述したように従来の作出方法では有効性と安全性を両立させたワクチンウイルスを得ることはきわめて難しい（非特許文献３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】庵原俊昭, 臨床とウイルス 38: 386-392, 2010
【非特許文献２】Plotkin SA, Pediatr Infect Dis J 32: 381-382, 2013
【非特許文献３】小児感染免疫 vol.21 No.3 263-273, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明はかかる問題点に鑑みてなされたものであって、偶然に頼ることなく、有効性（ウイルスの増殖能）を維持しつつ、中枢神経病原性が軽減されたムンプス生ワクチンを確実に作出するための弱毒化方法と、それによって作出された有効性と安全性を両立したムンプスウイルス及び生ワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明にかかるムンプスウイルスの弱毒化方法は、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込むことを特徴とする。【００１０】
また本発明にかかる弱毒化されたムンプスウイルスは、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列が組み込まれて弱毒化されたものである。【００１１】
また本発明にかかる生ワクチンは、前述の弱毒化されたムンプスウイルスが凍結乾燥されたものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、継代培養による不確実な作出ではなく、miRNA相補配列の導入による確実な手法により、有効性（ウイルスの増殖能）を維持しつつ、中枢神経病原性が軽減されたムンプス生ワクチンが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】プラスミドpMuV-Odate作製の流れを説明する図である。
【図２】プラスミドpMuV-Odate/miR449作製の流れを説明する図である。
【図３】組換えムンプスウイルス回収法の概略を説明する図である。
【図４】Vero細胞における増殖曲線を示す図である。
【図５】ラット脳内における増殖能を示す図であり、そのうち(A)はラット脳内のウイルスゲノムRNA量であり、(B)はラット脳内の感染性ウイルス力価である。
【図６】ラットの脳室拡張を指標とした神経病原性の評価を示す図であり、そのうち(A)はMRI画像であり、(B)はNVTスコアである。
【図７】カニクイザルに、Jeryl-Lynn(JL)株及びrOdate/miR449株をそれぞれ皮下接種した場合における免疫原性の評価を示す図である。
【図８】マーモセットに、rOdate株及びrOdate/miR449株をそれぞれ静脈内接種した場合における免疫原性の評価を示す図である。
【図９】マーモセットに、rOdate株及びrOdate/miR449株をそれぞれ静脈内接種した場合における病原性の評価を示す図であり、そのうち(a)はrOdate株の評価であり、(b)はrOdate/miR449株の評価である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、添付の図面を参照して本発明の実施形態について具体的に説明するが、当該実施形態は本発明の原理の理解を容易にするためのものであり、本発明の範囲は、下記の実施形態に限られるものではなく、当業者が以下の実施形態の構成を適宜置換した他の実施形態も、本発明の範囲に含まれる。
【００１５】
本発明にかかるムンプスウイルス(以下「MuV」とする。)の弱毒化方法は、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をムンプスウイルスに組み込む。本発明者は、マーモセットやラットの感染動物モデルによるMuVの病原性発現機構の解析を通して、MuVの中枢神経系における主たる標的組織が神経細胞では無く、脳室内部の表面に存在する脈絡叢上衣細胞であることをつきとめた。そこで、脈絡叢でのみ選択的に増殖できないウイルスを作成できれば、ウイルスのヒト体内での増殖能を大きく損なうことなく、無菌性髄膜炎を起こさない、つまりワクチンとしての有効性を損なうことなく、安全性の高いワクチン株を作出できると考えた。
【００１６】
一方で本発明者は、MuVの遺伝子組換え技術であるリバースジェネティクス(RG)法を独自に確立しており、脈絡叢で特異的に発現されるマイクロRNA(miRNA)に着目した。miRNAは細胞内で発現される低分子RNAで、特定のメッセンジャーRNA(mRNA)に結合することにより、mRNAの蛋白質への翻訳を抑制することにより、分化や細胞分裂等の細胞の機能発現の制御に関わっている。ヒトのゲノム上には1000種類以上のmiRNAコード領域が存在し、組織特異的に発現するmiRNAの存在も知られている。脈絡叢で特異的に発現されているmiRNAに相補的な配列をMuVの遺伝子内に組み込むことによって、脈絡叢でのウイルス蛋白質の合成を阻害し、脈絡叢内でのウイルス増殖を抑制できれば、結果的にそのウイルスは無菌性髄膜炎を起こさなくなることが期待でき、一方で、脈絡叢以外の組織におけるウイルスの増殖は抑制されないため、高い免疫誘導が期待できる。
【００１７】
脈絡叢で高発現するmiRNAは、特に限定されるものではないが、例えばmiR449、miR204又はmiR224である。
【００１８】
miR204に相補的な配列は、miR-204-5pではAGGCATAGGATGACAAAGGGAAであり、miR-204-3pではACGTCCCTTTGCCTTCCCAGCである。miR204に相補的な配列であるAGGCATAGGATGACAAAGGGAA又はこのAGGCATAGGATGACAAAGGGAAを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。また、miR204に相補的な配列であるACGTCCCTTTGCCTTCCCAGC又はこのACGTCCCTTTGCCTTCCCAGCを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。
【００１９】
miR224に相補的な配列は、miR-224-5pではAACGGAACCACTAGTGACTTGであり、miR-224-3pではTGTAGTCACTAGGGCACCATTTTである。miR224に相補的な配列であるAACGGAACCACTAGTGACTTG又はこのAACGGAACCACTAGTGACTTGを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。また、miR224に相補的な配列であるTGTAGTCACTAGGGCACCATTTT又はこのTGTAGTCACTAGGGCACCATTTTを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることが可能である。
【００２０】
好ましくはmiR449に相補的な配列であるACCAGCTAACAATACACTGCCA又はこのACCAGCTAACAATACACTGCCAを少なくとも２つ繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とする。
【００２１】
なお、miR449に相補的な配列、miR204に相補的な配列、及び、miR224に相補的な配列の中から少なくとも２つを組み合わせて繋いだ配列をMuVに組み込むことにより弱毒ウイルス株とすることも可能である。また、ムンプスウイルスに組み込まれる配列には、その配列の一部が欠失、置換若しくは付加された配列も含まれるものと規定する。
【００２２】
ムンプスウイルスは、特に限定されるものではないが、例えばOdate株を含む野外分離株又は既存のワクチン株である。野外分離株には例えば02-49株も含まれる。既存のワクチン株には、例えばJery-Lynn、RIT-4385、Rubini、Urabe-AM9、Torii、Hoshino-L32、Miyahara、NK M-46、Leningrad-3、L-Zagreb、Sofia-6、S-12、BBM-18等が含まれる。
【００２３】
パラミクソウイルス科のウイルスのうちルブラウイルス属に含まれるムンプスウイルスのゲノムは、NP、V/P、Ｍ、Ｆ、SH、HN、Ｌの７つの遺伝子から構成されるが、miRNA相補配列を組み込む遺伝子に関しては、特に限定されるものではなく、どの部位にでも挿入可能である。好ましくは、L遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列挿入する。より好ましくは、RG法により、高病原性株Odate-3のL遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列を３つ繋いだ配列を挿入する。miR449は脈絡叢の分化や機能発現に関与しているほか、細胞分裂や繊毛上皮細胞の繊毛形成にも関与することが報告されている。
【００２４】
なお、本発明の概念はパラミクソウイルス科ウイルスの弱毒化方法として応用可能であり、脈絡叢で高発現するmiRNAに相補的な配列をパラミクソウイルス科ウイルスに組み込む。パラミクソウイルス科ウイルスは上記のルブラウイルス属以外にレスピロウイルス属、モルビリウイルス属が含まれる。レスピロウイルス属のウイルスのゲノムは、Ｎ、P/C/V、Ｍ、Ｆ、HN、Ｌの遺伝子から構成されるが、miRNA相補配列を組み込む遺伝子に関しては、特に限定されるものではなく、どの部位にでも挿入可能である。好ましくは、L遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列挿入する。モルビリウイルス属のウイルスのゲノムは、N、P/C/V、Ｍ、Ｆ、Ｈ、Ｌの遺伝子から構成されるが、miRNA相補配列を組み込む遺伝子に関しては、特に限定されるものではなく、どの部位にでも挿入可能である。好ましくは、L遺伝子の末尾にmiR449に相補的な配列挿入する。
【００２５】
本実施形態にかかる生ワクチンは、弱毒ウイルス株を含む凍結乾燥状態のワクチン製剤であり、使用時に溶解して注射により投与される。
【００２６】
生ワクチンの製造方法については当業者に汎用される方法を適宜採用することができ、例えば、賦形剤、pH調節剤、安定化剤、溶解補助剤、無痛化剤等の製剤用添加物を１種又は２種以上使用することができる。１バイアル中に溶解時感染価が10,000 CCID50/ml以上となるように凍結乾燥ウイルスを充填することが好ましい。
【００２７】
本発明のワクチンの使用方法は特に限定されるものではなく、投与量及び投与方法はワクチンの使用目的や患者の年齢、体重等に応じて適宜選択できるが、例えば用時に注射用蒸留水等を添加し、溶解して調製したワクチン溶液を0.5ml程度上腕伸側に皮下注射することが可能である。
【実施例】
【００２８】
次に、本発明を実施例により具体的に説明する。【００２９】
[実施例１  MuV Odate株の全ゲノムcDNAのクローニング]
MuV Odate株感染マーモセットの脳乳剤より抽出したRNAよりランダムヘキサマーとPrimeScript II High Fidelity RT-PCR Kit (TaKaRa社)を用いてcDNAを合成した。このcDNAより、まずプライマーrOdate-Not-F1 (5’-taa tac gac tca cta taacca agg ggaaaa tgg agat-3’)、rOdate-Not-F (5’-gaa gcg gtggcg gcc gctaat acg act cac tat a-3’)及びrOdate-Nru-R (5’-ttg ggacag gcc tcg cga gtt cat ccaaat-3’)を用いて5’末端にT7 プロモーターを付加したフラグメント(1-2955領域)(フラグメント1)を作製し、NotI及びNruI処理したpMuV-Y213にIn Fusion(登録商標,Clontech社)を用いてクローニングした(pMuV-Odate-1)。【００３０】
次にプライマーrOdate-Nru-F (5’-att tgg atg aac tcgcga ggc ctgtcc cca-3’)及びrOdate-Ngo-R (5’-gga ggt tgg atcgcc ggc atagtg cta cggcag gg-3’)を用いて(2926-6287領域)(フラグメント2)を増幅し、NruI及びNgoMIV処理したpMuV-Odate-1にIn Fusionを用いてクローニングした(pMuV-Odate-1/2)。続いて、プライマーrOdate-Ngo-F (5’-ccg ttg cac tat gcc ggc gat ccaacc tcc-3’)及びrOdate-Xho-R(5’-tct tgt cct gctcga gat ctg gta aac aaa-3’)を用いて(6258-8898領域)(フラグメント3)を増幅し、NgoMIV及びXhoI処理したpMuV-Odate-1/2にIn Fusionを用いてクローニングした(pMuV-Odate-1/3)。 同様に、プライマーrOdate-Xho-F (5’-ttt acc aga tctcga gca ggacaa gac gca-3’)及びrOdate-Dra-R (5’-tta gaa ctc tat cac tga gtgtga gtt ggc-3’)を用いて(8872-13277領域) (フラグメント4)を増幅し、XhoI及びDraIII処理したpMuV-Odate-1/3にIn Fusionを用いてクローニングした(pMuV-Odate-1/4)。最後にプライマーrOdate-Dra-F (5’-aaa gcc aac tca cactca gtg atagag ttc-3’)、rOdate-Rsr-R1 (5’-agg tggaga tgc cat gcc gac ccacca agg ggagaa agt aaaa-3’)及びrOdate-Rsr-R (5’-atg ccc aggtcg gac cgcgag gag gtg gag atg cca t-3’)を用いて3’末端にT7転写終止シグナル配列及びD型肝炎ウイルスのリボザイム配列を付加したフラグメント5(13245-15384領域)を作製し、DraIII及びRsrII処理したpMuV-Odate-1/4にIn Fusionを用いてクローニングし、Odate株の全ゲノムcDNAを保持するプラスミドDNAを作製した(pMuV-Odate)。(図1)
[実施例２  pMuV-OdateへのmiR449相補配列の挿入]
PCRによってL遺伝子の3’UTR領域に、脈絡叢で特異的に発現するmiRNAであるmiR449に相補的な配列を3つつないだフラグメントを作製した(図2)。プライマーにはrOdate-Spe-F(5’-aag cac gaa aac tag tgtcga gta cat tat-3’), rOdate-L-R(5’-ttg tta gct ggt gcttaa att atgtcc ccg-3’), miR449-F(5’-cgg ggacat aat tta agc acc agctaa caa-3’), miR449-R(5’-gtc tttagc tga tttaat ggc agtgta ttg-3’), rOdate-UTR-F(5’-caa tac act gcc att aaa tcagct aaa ga-3’)及びrOdate-Rsr-R2(5’-atg ccc agg tcg gac cgcgag gag gtg gag-3’)を用いた。このフラグメントを制限酵素SpeI及びRsrIIで処理したpMuV-Odateに、In Fusionを用いて導入した(pMuV-Odate/miR449)。挿入配列はシークエンスによって確認した。【００３１】
[実施例３  組換えムンプスウイルスの回収]
pMuV-OdateまたはpMuV-Odate/miR449 5 μg、pCR2.1-N 300 ng、pCR2.1-P 50 ng及びpCR2.1-L 200 ngをTrasIT LT1 (Mirus社) 16 μlと共に625 μlのOpti-MEM (Gibco社)に混合し、20分室温で静置した。6 well plateに80%コンフルエントに培養されたT7ポリメラーゼを恒常的に発現するBHK細胞(BHK/T7-9細胞)(岐阜大学・伊藤直人先生より分与)の培地を抗生物質を含まない培地に交換し、DNA溶液を加え、37℃で培養した。48時間後に、細胞をトリプシン処理で剥がし、同じ細胞数のVero細胞と共に10 cmディッシュでさらに培養を続けた(図3)。多核巨細胞を特徴とするCPEがディッシュ全体に観察されたら、培養上清を回収し、低速遠心で細胞片を除去した後、-80℃で保存しストックウイルスとした。回収されたウイルスをそれぞれrOdate及びrOdate/miR449とした。rOdate/miR449の挿入配列をシークエンスによって確認した。【００３２】
[実施例４  培養細胞における増殖能の評価]
24 well plateに培養されたVero細胞にMOI=0.01でrOdateまたはrOdate/miR449を100 μl接種し、37℃で1時間吸着させた。吸着後、細胞をMEMで3回洗った後、37℃で培養した。ウイルス感染後、24、48、72及び96時間後に培養上清を回収し、その感染性ウイルス力価を測定し、それぞれのウイルスのVero細胞における増殖能を評価した。その結果、両ウイルスとも高い増殖能を示し、両者間に明確な増殖能の差は認められなかった(図4)。【００３３】
[実施例５  新生ラット脳内における増殖能及び神経病原性の評価]
生後24時間以内の新生Lewisラットの脳内に104 PFU/mlに調製したウイルスを10 μl(102 PFU/head)接種した。接種は冠状縫合とラムダ縫合の中間で、矢状縫合から左側に2 mm離れた部位に専用の二段針マイクロシリンジを用いて行った。各ウイルス接種群につき、2腹(産仔数は1腹あたり約10匹)ずつ実施した。【００３４】
接種3日後に、各群から3匹ずつ脳を採材した。採材した脳は液体窒素下で凍結破砕し粉末にした。凍結脳粉末は一部をリアルタイムRCR 用RNAの抽出に、一部をウイルス力価測定用に供した。RNA抽出はRNeasy Mini Kitを用いて、逆転写反応はPrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time)(TaKaRa社)を用いて行った。逆転写プライマーには、ゲノムRNA特異的なプライマー(MuV-1s; 5’-acc aag ggg aaaatg aag atgg-3’)を用いた。得られたcDNAより、N遺伝子領域を標的としたプライマー(MuNP1398s; 5’-ttc ctc cag ttc aac agc aa-3’、及び MuNP1474as; 5’-acc gtc gtc atctga ttc ct-3’)及びUniversal Probe library #62 (Roche社)を用いて、リアルタイムRCRによる脳内のウイルスゲノムRNAの定量を行った。リアルタイムPCRにはLightCycler480 Probes Master試薬(Roche社)及びLightCycler 480 system(Roche社)を用いた。結果、rOdateを接種したラット脳内のウイルスゲノム量の平均が1.05 x 105 copy/mgであったのに対し、rOdate/miR449を接種したラット脳内のウイルスゲノム量は3匹すべてで検出限界以下であった(図5A)。【００３５】
さらに脳内における感染性ウイルスの力価を測定した。凍結脳粉末にMEM培地を加え、10%乳剤を作製し、ウイルス力価を測定した。結果、rOdate接種ラットの脳内の感染性ウイルス力価は平均6.57 x 106 PFU/gであったのに対し、rOdate/miR449接種群では1匹のみ1.11 x 102 PFU/gのウイルスが検出されたが、残りの2匹では検出限界以下であった(図5B)。【００３６】
残る接種ラットについて、ウイルス接種から約1ヶ月後にMRIを用いて、脳室拡張を観察した。MRI撮像はラットをイソフルランによる深麻酔下で、MRmini SA (DS Pharma Biomedical社)を用いて、実施した。神経病原性の評価は、得られた矢状断画像より、ImageJsoftware(National Institutes of Health, USA)を用いて、大脳全体の面積に占める脳室拡張面積の割合をNeurovirulencetest(NVT)スコアとして算出した。結果、rOdate接種ラットでは重度の脳室拡張（平均NVTスコア：25％）が観察されたのに対し、rOdate/miR449接種ラットでは脳室拡張は非常に軽度であった（平均NVTスコア：2％）(図6A, 6B)。両群のNVTスコアの差は統計学的に有意であった(p<0.0001)(図6B)。【００３７】
rOdate/miR449 株のベースとなったOdate-3株は、1993年に大館市で発生したアウトブレイクの際に分離された高病原性株である。Odate-3株は、当時の無菌性髄膜炎発生率が70％以上と極めて高かったことから、ヒトでの病原性が担保されている株である。また、モデル動物（新生ラット及びマーモセット）においても同様に極めて高い病原性を示す。上述の図5及び図6に示されたように、本発明によってOdate-3株で弱毒株の作出が可能なのだから、その他のムンプスウイルス株の弱毒株化は、当然、可能である。
[実施例6  カニクイザルに対する免疫原性の評価]
カニクイザル(♂、約10歳齢) 各群3頭に、Jeryl-Lynn(JL)株、及びrOdate/miR449 株をそれぞれ105 PFU/頭ずつ皮下接種した。【００３８】
接種後0,4,7,10,14,21,28,35日に塩酸ケタミンによる麻酔下で約5 ml採血し、900×g、20分、室温で遠心して血漿を分離した。56℃で30分非働化処理した血漿を4-1から4-5倍まで段階希釈し、半分量の攻撃用ムンプスウイルス液(野外分離株Y01、遺伝子型G)と半分量の100倍希釈モルモット補体(デンカ生研)を加えて、十分に混和した。37℃、2時間インキュベーションした後、12 well plateに培養したVero細胞に接種し、37℃で1時間吸着した。吸着後、0.5%アガロースを含むイーグル培地を重層し、4日間培養した。ニュートラルレッドで生細胞を染色し、プラーク数をカウントした。プラーク数を50%減じる血漿の希釈倍率を中和抗体価として算出した。【００３９】
その結果、JL接種群及びrOdate/miR449接種群どちらの群も接種後14日から中和抗体価の上昇が認められ、28日でピークに達した(図7)。ピーク時の平均中和抗体価は、JL群で41.5、rOdate/miR449群で43.73で、rOdate/miR449群が有意に高値であった。
[実施例7  マーモセットにおける免疫原性及び病原性の評価]
コモンマーモセット(♂、14箇月齢) 5頭にrOdate株、及び4頭にrOdate/miR449 株をそれぞれ106 PFU/頭ずつ静脈内接種した。接種後0,4,7,10,14日目に麻酔下で約1 ml採血した。接種後20日目に塩酸ケタミンによる過麻酔下で全採血を行った後、病理解剖によって、中枢神経系組織、リンパ系組織、耳下腺、膵臓、精巣及びその他主要臓器を採材した。【００４０】
末梢血は、2,000×g、10分、4℃で遠心して血漿を分離した後、血漿中の中和抗体価測定を実施例6の方法に準じて行った。結果、rOdate接種群及びrOdate/miR449接種群どちらの群も接種後7日から中和抗体価の上昇が認められ、接種20日後がピークであった(図８)。ピーク時の平均中和抗体価は、rOdate群で44.88、rOdate/miR449群で45.06で、両群で有意な差は認められなかった。【００４１】
採材した各種臓器は、イーグルMEMを用いて10%乳剤を調製し、実施例5の方法に準じてウイルスRNA量を測定した(図９(a)(b))。結果、図９(a)に示されるように、rOdate接種群5頭のうち、2頭から中枢神経系組織にウイルス RNAが検出された。その内の1頭(個体#5235)では採材したすべての中枢神経系組織からウイルスRNAが検出され、他の1頭(個体#5230)では橋からウイルスRNAが検出された。一方、図９(b)に示されるように、rOdate/miR449接種群ではいずれの個体からも中枢神経系組織からウイルスRNAは検出されなかった。また、ムンプスウイルスの別の標的組織である腺組織については、図９(a)に示されるように、rOdate接種群では、耳下腺から2頭、膵臓から3頭ウイルスRNAが検出されたのに対し、図９(b)に示されるように、rOdate/miR449接種群では、膵臓から1頭、ウイルスRNAが検出されたのみであった。【００４２】
以上の結果から、rOdate/miR449の免疫原性が弱毒化によって減弱していないことが示された。また、rOdate/miR449の中枢神経病原性、及び腺組織に対する病原性が減弱していることが、マーモセットにおいても証明された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
流行性耳下腺炎の治療に利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【００４４】
配列番号１〜５：miRNA
配列番号６〜２６：プライマー
【図１】
0006620294.tif 000002
【図２】
0006620294.tif 000003
【図３】
0006620294.tif 000004
【図４】
0006620294.tif 000005
【図５】
0006620294.tif 000006
【図６】
0006620294.tif 000007
【図７】
0006620294.tif 000008
【図８】
0006620294.tif 000009
【図９】
0006620294.tif 000010