(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を有する、製造したアレイ上の化合物をスクリーニングする方法であって、
細胞とＵＶ硬化性ヒドロゲルマトリックスの混合物を提供すること、
Ｎ×Ｎマトリックスアレイ状のある体積の前記混合物を特定の形状で支持体に塗布すること、
前記支持体をＵＶ光に曝露して前記アレイ中の各体積を硬化し、細胞を生存させる条件下で前記アレイを定温放置すること、
前記アレイにおける細胞の各体積を、超音波霧化法を用いて、ナノリットルの体積の１種類以上の化合物と接触させること、及び
前記１種類以上の化合物が前記細胞に影響を与えるか否かを検出すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞が心筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞がｉＰＳＣである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が分化細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記支持体が剛性支持体である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記支持体が軟性支持体である、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記支持体がガラス製、セラミック製、又は重合体製のシート又はフィルムを備える、請求項１から４の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アレイが接着性重合体で被覆されている、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記の特定の形状が型によって提供される、請求項１から８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記の特定の形状が前記アレイ中の微細構造体によって提供される、請求項１から９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体が透明である、請求項１から１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記重合体がポリエステルフィルムであるか、又はポリカーボネートを含む、請求項７から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記支持体が多孔性である、請求項１から１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記基材が特定の形状を与える微細構造体を有するエンボス加工済みフィルム基材を含み、前記微細構造体が１種類以上の細胞接着性重合体で被覆され、
前記支持体がマイクロプレートに貼り付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がＲＢ＋培地又はロックインヒビターの存在下で培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記の細胞の体積が支持体に塗布され、次いで、Ｎ×Ｎアレイ状の予め規定された微小幾何パターンを有する型押しマスターツールに差し込まれる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は２０１４年８月２８日に出願された米国特許出願番号第６２／０７０５０８号の利益を主張し、その開示を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
背景
人工多能性幹細胞ｉＰＳＣは、胚性幹細胞を規定する特性を維持するために重要な遺伝子及び因子を発現するようにされることで胚性幹細胞様状態に遺伝的に再プログラム化されている成体細胞である。これらの細胞は多能性幹細胞の規定基準に合致するが、ｉＰＳＣと胚性幹細胞が臨床的に有意に異なっているのかは分かっていない。マウスｉＰＳＣは２００６年に最初に報告され、ヒトｉＰＳＣは２００７年後半に最初に報告された。マウスｉＰＳＣは、幹細胞マーカーを発現すること、３種類全ての胚葉の細胞を含む腫瘍を形成すること、及び非常に初期の発生段階のマウス胚に注入されたときに多種多様な組織の一部と成ることができることといった多能性幹細胞の重要な特徴を示す。ヒトｉＰＳＣも幹細胞マーカーを発現し、且つ、３種類全ての胚葉に特徴的な細胞を生成することができる。
【０００３】
追加の研究が必要ではあるが、ｉＰＳＣは既に薬品の開発と疾患のモデル化にとって有用なツールであり、科学者たちは移植医学にｉＰＳＣを使用することを望んでいる。最初のプロトコルでは成体細胞に再プログラム化因子を導入するためにウイルスを使用した。動物実験ではそれらの幹細胞因子を導入するために使用されるウイルスは癌の原因になるときがある。今、研究者たちは、癌を発生させる機会が少ないと考えられている非ウイルス性の送達ストラテジーを開発しているところである。
【０００４】
ｉＰＳＣというこの飛躍的発見は、発生運命が決定されているとそれまでに考えられていた細胞を「脱分化」させるための強力な新規方法を編み出した。さらに、ｉＰＳＣに由来する組織は細胞ドナーとほぼ完全に適合し、したがっておそらくは免疫系による拒絶を回避することになる。ヒトの身体中の損傷組織を修復するために細胞を再プログラム化する方法を研究者が学ぶことに役立つ多能性幹細胞が、他の種類の多能性幹細胞についての研究と併せてｉＰＳＣストラテジーによって作製される。
【０００５】
しかしながら、環境因子、利用可能な栄養、製造技術、操作、汚染混入及び脱水に対するｉＰＳＣの感受性、並びに細胞のすぐ傍の三次元マクロ構造環境、及びナノリットル量の目的の分子を特定のアレイ位置に分注するために必要な精密機器に起因して、ハイスループット薬品スクリーニング向けの大規模生存ｉＰＳＣアレイの作製には問題がある。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示は、細胞内代謝の有効性を検査するために後にナノリットル量の化合物に曝露される生細胞、例えば幹細胞の大規模アレイを作製する製造方法を提供する。１つの例では人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞を紫外線硬化性ヒドロゲルマトリックスと混合し、支持体又は基材上に被覆し、その後でＮが１から１００００までの範囲であり得るＮ×Ｎマトリックスアレイ状の予め規定された微小幾何パターンを有する型押しマスターツールに差し込み、前記ゲルを硬化するためにＵＶ光に曝露し、前記型押しツールを取り除き、そして細胞の増殖及び生存を向上させるためにそのパターンを押されたゲル、細胞、支持体からなる構造体を恒温チャンバーに移す。その後、Ｎ×Ｎマトリックスの中の任意のＮの場所を指定し、ナノリットル量の薬品化合物を目的の位置に分注することができる薬品化合物送達システムに生細胞のＮ×Ｎマトリックスを曝露する。
【０００７】
１つの実施形態では本開示は、細胞アレイ、例えばｉＰＳＣマトリックスアレイ内の個々の場所を目的の薬品候補の送達のために指定することができるナノリットル分注システムと組み合わせてマイクロエンボス加工製造技術を使用することによってハイスループット薬品スクリーニング向けの大規模マトリックスアレイを提供する。
【０００８】
１つの実施形態では本開示は、分散された幹細胞又はｉＰＳＣなどの細胞を含む紫外線硬化性ゲルのマイクロエンボス加工を用いることによるアレイ製造方法を提供する。
【０００９】
１つの実施形態では本開示は、分散された細胞を含む独特な三次元微細構造体を作製するマイクロエンボス加工を用いることによる細胞アレイ製造方法を提供する。
【００１０】
１つの実施形態では本開示は、Ｎが１から１００００までの範囲であり得るＮ×Ｎパターンでアレイマトリックスを形成するマイクロエンボス加工を用いることによる細胞アレイ製造方法を提供する。
【００１１】
１つの実施形態では本開示は高精度ナノリットル分注システムにアレイ、例えばフィルム又はマイクロウェルプレートのどちらかの上に形成されたアレイを曝露することを提供する。１つの実施形態では本開示はＮ×Ｎ  ｉＰＳＣアレイ上の個々の場所を指定することができる高精度ナノリットル分注システムにアレイを曝露することを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】直鎖状硬化ゲルマトリックス中に分散されたｉＰＳＣを示している本発明の１つの実施形態の断面図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
１つの実施形態では図１は、支持体１０上に被着した紫外線感受性ヒドロゲル２０中に分散され、硬化されているｉＰＳＣ心筋細胞３０を使用する本発明の１つの例の断面図を示している。その支持体１０は金属製、ガラス製、セラミック製、重合体製のシート又はフィルムのような多数の種類の材料から構成されてよく、その支持体は所望により剛性支持体であってもよい。その支持体の厚みは約１２ミクロンから約１０ミリメートルまでの範囲であり得、１つの実施形態では約０．２から約１ミリメートルまでの範囲であり得る。大半の場合ではその基材は、表面上に製造されたアレイの内容物の目視検査を可能にするために、又はヒドロゲル細胞混合物を表面上に硬化するためにＵＶ光にその材料を通過させるために透明である。１つの実施形態では熱安定化ポリエステルフィルム、ポリカーボネート、又は１ｍｍのガラスのような高分子基材が用いられる。さらに、微細エンボス加工済み２０ヒドロゲルアレイの底に水及び栄養を分散させるために前記基材が多孔性であることが望ましくあり得る。使用可能な幾つかの多孔性材料はコーニング社製のバイコールガラス、オープンセル発泡フィルム及びシート、又は複数の供給業者から容易に入手可能である微多孔性ポリマーフィルムである。
【００１４】
１つの実施形態ではメタクリレートを有するヒドロゲル、例えばゼラチンメタクリレートのようなヒドロゲルであって、ゲル体積中にｉＰＳＣを分散させている前記ヒドロゲル２０が前記支持体１０に被覆され、その後でそのゲルが所望の幾何学的形状に硬化される。図１の例ではその形は約１．５ｍｍ×１．５ｍｍ×０．２５ｍｍの寸法の直鎖状アレイである。その直鎖状アレイ形状はマスクレス直描フォトリソグラフィによって作製可能であり、又はその直鎖状アレイ形状は、ダイヤモンド彫刻、レーザーアブレーション、又はフォトリソグラフィにより逆パターンが作製されており、前記ゲル、及びシリコーン若しくはガラスなどの透明なマイクロエンボス型又は透明な重合体製若しくはガラス製の支持体１０を通過したＵＶ光で硬化された前記ゲルに押されるマイクロエンボス型を使用することによって作製され得る。個別の幾何学的形状の数が２から数百万超までの範囲であり得るＮ×Ｎアレイをその支持体に形成することができる。Ｎは１から１００００までの整数の値を有し得るが、実際的な目的のためにはＮ＝５０であるＮ×Ｎが充分であり、且つ、実際的である。本実施例では１×１６直鎖状アレイが製造された。
【００１５】
前述の方法の加えて当業者は、図１のように製造された微細構造体を有し、その後で所望によりフィブロネクチン、ゼラチン、ヒアルロン酸、カラギーナン、セルロース、ポリリシン、ポリビニルプリリドン（ｐｏｌｙｖｉｎｙｉｐｒｙｌｉｄｏｎｅ）、コラーゲン、ポリビニルアルコール、又はポリエチレンオキシド又は前述の分子の重合体を含む前述の分子の混合物などの接着促進剤を表面に塗布した事前エンボス加工フィルムを利用することもできる。その後、分化させたｉＰＳＣをエンボス加工済みフィルムに配置し、Ｎが１から１００００までの範囲であり得るＮ×Ｎのマイクロプレートに貼り付けてアレイを形成することができる。
【００１６】
ｉＰＳＣアレイを製造した後、５％の二酸化炭素ガス雰囲気を含む３７℃の恒温チャンバーの中にそのデバイスを配置する。細胞に栄養分を与え、成熟前の細胞死から細胞を守るために当技術分野においてよく知られているＲＢ＋及びロックインヒビターなどの多数の添加剤を栄養液に添加する。それらの細胞は薬品投与処置に曝される前に３日以上にわたって培養及び栄養補給されてもよい。
【００１７】
１つの例では、Ｌａｂｃｙｔｅ  Ｅｃｈｏモデル５５５ナノリットル音波式分注システムを使用して製造したアレイに抗不整脈薬のサトロールと一酸化窒素生成化合物のイソプロテレノールという２種類の心臓病薬を送達した。脱水を防止するためにそれらの薬品は細胞培養栄養液中に２．２５ｕＭの濃度まで希釈された。Ｅｃｈｏ  ５５５リキッドハンドラーは音響エネルギーによって液体の取扱いに大改革をもたらしている。正確に量られた液滴が音波によって供給源からその供給源の上に保持されているマイクロプレート、スライド又は他の面上に排出される。この製品はチップ、ピンツール、又はノズルを使用せず、その機械と液体との間の接触を完全に排除している。液体はナノリットル単位の増分で移される。より大きな体積は１秒当たり数百の液滴の割合で移される。この非接触方法を用いることにより、他の分注方法に見られるような細胞に損傷を与える可能性、又は細胞を殺す可能性があるあらゆる接触が最小限になる。その方法は非常に少ない量を使用することも可能にし、したがって使用者が希少である分子、又は製造困難な分子をスクリーニングすることを可能にし、したがって費用を減少させることを可能にする。さらに、目的のＮ×Ｎアレイ位置の上に分注ヘッドのＸ及びＹの位置を正確に位置合わせすることができ、それによって異なる位置に目的の薬品を投与させることができる。
【００１８】
次の非限定的な実施例によって本発明を説明する。
【実施例１】
【００１９】
人工多能性幹細胞
Ｈ９胚性幹細胞由来拍動性心筋細胞を分化の２５日目に使用した。解離後に１ｍＬの懸濁液を含むバイアルを作製した。その懸濁液の濃度はｍＬ当たり１．３８×１０6個の全細胞であった。それらの細胞のうち、８．３８×１０5個の生存細胞が存在することがトリパンブルーによって決定された。ゲル封入後の細胞へ供給された食糧溶液はＲＢ＋培地（Ｂ２７とインスリンを添加されたＲＰＭＩ）の５０ｍＬアリコットであった。その栄養液に１滴のロックインヒビターを添加した。この薬品は、細胞が基材に付着されることをそれらの細胞が感知するまで細胞死を回避するために使用される。そのバイアルを１０ｍＭの濃度で使用した。それらの細胞を遠心分離し、ＧｅｌＭａ  ａ  ＵＶ硬化性マトリックスと混合し、そして３７℃に保った。その後、そのＧｅｌＭａ細胞混合物をガラス支持体上に配置し、疎水性テープによってその領域の境界を明確にした。その後、約１０秒かかる約１．５ｍｍ×１．５ｍｍに０．２５ｍｍの高さの１×１６直鎖状アレイを直描するために３７０ｎｍのピーク周波数を有するＵＶ光と組み合わせてＴＩ  ＤＬＰミラーチップを使用した。硬化していないＧｅｌＭａを洗い流した。その支持体及びアレイをペトリディッシュ内に配置し、栄養液で満たし、そして５％のＣＯ2雰囲気を含む３７℃の恒温器内に配置した。最大で３日間にわたって栄養液を新しい培地と毎日交換した。３日後にそれらのアレイは力強い拍動を示しており、薬品投与にすぐに使えた。アレイをＬａｂｃｙｔｅ  ５５５音波式分注機中に設置し、それらの拍動中の細胞の上に薬品分子を正確に分注した。この過程の間にＬｕｍｅｎｅｒａ  ＣａｍｅｒａとＩｎｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｐｔｕｒｅソフトウェアを用いてそれらの細胞を観察して薬品投与中に拍動する細胞を撮像した。
【００２０】
１０ｎＭのサトロールの投与中に拍動する心臓細胞の３０〜４０％の増加が観察された。イソプロテレノールを使用する投与の間では、幾つかの不規則的に拍動する心臓細胞の不応期（拍動の停止）がその薬品によって取り除かれることが観察された。
【００２１】
本明細書中の発明が実施例によって説明されており、その発明を実施する１つの特定の方法が説明されてきた。しかしながら、本明細書において請求されているその発明は、その特定の実施形態がそれらとの使用に限定されないということに限定されず、その発明は別々に、又は本明細書において開示された他の実施形態と併せて使用され得る。例えば、薬品の効果を観察するために視覚カメラを使用する代わりに電子的方法、磁気的方法、蛍光方法、又は光ファイバー方法を使用して薬品投与に対する細胞の応答を調査することができる。以下で請求されているような記載と等価であるものが本特許の保護範囲内にあると考えられる。細胞マイクロアレイの製造とその後の薬品投与の方法についての特定の実施形態が説明されてきたが、次の特許請求の範囲において示されているようなより広範囲の態様で本発明から逸脱することなく変更及び改変をそれらの実施形態に行ってよいことが当業者によって理解される。
【図１】
0006510649.tif 000002