(57)【要約】細菌リボヌクレアーゼ（例えば、ＲｎｐＡ）の小分子阻害剤、ならびにそれらの合成および使用のための方法が本明細書で記載される。該化合物を使用する方法には、微生物感染の治療および予防ならびに細菌リボヌクレアーゼの阻害が含まれる。また、微生物感染の治療または予防のための化合物を特定する方法も本明細書で記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の微生物感染を治療または予防する方法であって、有効量の下記構造
【化１】
2014510717.tif 000023
のＲＮａｓｅ阻害剤、またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを対象に投与する段階を含む、方法：
式中、
【化２】
2014510717.tif 000024
は、単結合または二重結合であり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；
Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択され；
各Ｒ１、各Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルから独立に選択され；かつ
Ｒ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルであり、
Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、結合して置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールを形成してもよい。
【請求項２】
前記微生物感染が細菌感染である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌感染がグラム陽性細菌感染である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細菌感染がブドウ球菌感染である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記細菌感染が黄色ブドウ球菌感染である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記黄色ブドウ球菌感染が薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記黄色ブドウ球菌感染がバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤がＲｎｐＡ阻害剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮａｓｅ阻害剤が
【化３】
2014510717.tif 000025
である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
抗菌化合物である第２の化合物を投与する段階をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細菌リボヌクレアーゼを阻害する方法であって、細菌リボヌクレアーゼを有効量の下記構造
【化４】
2014510717.tif 000026
のＲＮａｓｅ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグと接触させる段階を含む、方法：
式中、
【化５】
2014510717.tif 000027
は、単結合または二重結合であり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；
Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択され；
各Ｒ１、各Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルから独立に選択され；かつ
Ｒ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルであり、
Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、結合して置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールを形成してもよい。
【請求項１２】
前記細菌リボヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｐである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌リボヌクレアーゼが黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  ＰがＲｎｐＡである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触させる段階がインビボで行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触させる段階がインビトロで行われる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
下記構造
【化６】
2014510717.tif 000028
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグ：
式中、
【化７】
2014510717.tif 000029
は、単結合または二重結合であり；
Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；
Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択され；
各Ｒ１、各Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルから独立に選択され；かつ
Ｒ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルであり、
Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、結合して置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールを形成してもよく；かつ
【化７】
2014510717.tif 000030
が二重結合であり、Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、およびＡ１０がＣＨであり、Ａ３が−ＣＣＯ２Ｈであり、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ８がそれぞれ水素であり、Ｒ５およびＲ６がメチルであり、かつＲ３がシアノである場合、Ａ９は、−ＣＢｒではない。
【請求項１７】
請求項１６に記載の化合物の１つまたは複数および薬学的に許容可能なキャリアを含む、組成物。
【請求項１８】
微生物感染の治療または予防のための化合物を特定する方法であって、
ａ）ＲＮＡ、ＲｎｐＡ、および蛍光染料を混合して混合物を形成する工程；
ｂ）該混合物を化合物と接触させる工程；ならびに
ｃ）蛍光を使って、細胞におけるＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解をモニタリングする工程であって、対照に比べて減少した蛍光がＲＮＡ分解を示す、工程
を含み、
対照に比べて、ＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解を減らす化合物が、該微生物感染の治療または予防のための化合物として特定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張出願への相互参照
本出願は、２０１１年１月２６日出願の米国特許仮出願第６１／４３６，３４２号の優先権を主張する。この特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本明細書で開示される内容は、一般的には、細菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の小分子阻害剤およびそれらの調製方法に関する。また、本明細書記載の内容は、一般的には、微生物感染の治療および予防のための本明細書記載の小分子阻害剤の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染は、高い罹患率および死亡率を伴う場合が多い（Ｓｈｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、３４：２５８８−２５９５（２００６）（非特許文献1）、を参照）。実際、報告によれば、米国では、２００５年、その生物体がＨＩＶ／ＡＩＤＳより多くの死亡の原因であったと推定されている（Ｂａｎｃｒｏｆｔ、Ｅ．Ａ．、Ｊａｍａ、２９８：１８０３−１８０４（２００７）（非特許文献2）；Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊａｍａ、２９８：１７６３−１７７１（２００７）（非特許文献3）、参照）。バンコマイシン耐性、メチシリン耐性、多剤耐性、および強毒性株の出現が、新規抗生物質の必要性をさらに高めた（Ａｐｐｅｌｂａｕｍ、Ｐ．Ｃ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ、３０：３９８−４０８（２００７）（非特許文献4）；Ｚｅｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、５：２７５−２８６（２００５）（非特許文献5）を参照）。細菌ＲＮＡの処理および分解は、抗菌剤発見に活用可能な必須細胞プロセスである。
【０００４】
細菌ＲＮＡ分解に関する理解の多くは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の調査から得られており、バルクｍＲＮＡの崩壊は、ホロ酵素複合体（ＲＮＡデグラドソーム）により触媒されると考えられている。この複合体は、少なくとも４つのサブユニット：ＲＮａｓｅ  Ｅ（ｒｎｅ）、ＲＮＡヘリカーゼ（ｒｈｌＢ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、およびＰＮＰａｓｅ（ｐｎｐＡ）から構成される（Ｃａｒｐｏｕｓｉｓ、Ａ．Ｊ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６１：７１−８７（２００７）（非特許文献6）、を参照）。ＲＮａｓｅ  Ｅは、必要不可欠なリボヌクレアーゼであり、デグラドソーム複合体の主要成分である。それは、ＲＮＡデグラドソームの他のメンバーの構築のための足場として機能し、基質分解の間の初期のエンドリボヌクレアーゼを使ったイベントを触媒する（Ｍａｃｋｉｅ、Ｇ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９５：７２０−７２３（１９９８）（非特許文献7）；Ｖａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１２：２７７０−２７８１（１９９８）（非特許文献8）を参照）。その本性に基づいて、ＲＮａｓｅ  Ｅは、抗生物質薬剤発見の適切な標的であると考えられる。しかし、黄色ブドウ球菌、等の多くのグラム陽性菌は、ＲＮａｓｅ  Ｅアミノ酸オーソログを欠いている（Ｃｏｎｄｏｎ、Ｃ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、６７：１５７−１７４（２００３）（非特許文献9）、を参照）。結果として、それらの分解成分およびｍＲＮＡ崩壊機序の理解はあまり進んでいない。
【０００５】
最近の調査では、少なくとも２つのリボヌクレアーゼ：ＲＮａｓｅ  Ｊ１およびＲＮａｓｅ  Ｙが、枯草菌、およびおそらく他のグラム陽性菌内のバルクｍＲＮＡ分解に関与するであろうことが示唆されている。枯草菌リボヌクレアーゼ、Ｊ１は、５'エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性を有する二官能性リボヌクレアーゼであり、ｍＲＮＡ分解をインビトロで媒介する（Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３：２１４１−２１５２（２００５）（非特許文献10）；Ｍａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２９：６８１−６９２（２００７）（非特許文献11）、を参照）。この酵素はまた、エノラーゼ（大腸菌ＲＮＡデグラドソームの成分）と相互作用することも見出されており、ＲＮａｓｅ  Ｊ１枯渇枯草菌株は、ｍＲＮＡ崩壊の中等度の減少を示し、これが大腸菌ＲＮａｓｅ  Ｅと機能的に等価である可能性があることを示唆している（非特許文献10；Ｃｏｍｍｉｃｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、８：１３５０−１３６０（２００９）（非特許文献12）；Ｍａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：１８３−１９６（２００８）（非特許文献13）、を参照）。しかし、ｍＲＮＡ代謝回転は、ＲＮａｓｅ  Ｊ１減少細胞中でも起こり、５'強力ヘアピン構造を含むＲＮＡ種が、酵素により効率的に分解されず、別の因子が枯草菌細胞のＲＮＡ分解に関与している可能性があることを示唆している（Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｎａ、１５：２３３１−２３３９（２００９）（非特許文献14）、を参照）。リボヌクレアーゼＹは、最近特定されたエンドヌクレアーゼであり、表面上は、ＲＮａｓｅ  Ｊ１に呼応して働き、バルクＲＮＡ崩壊を媒介できる。ＲＮａｓｅ  Ｙは、高次二次構造を有するｍＲＮＡ分子を切断でき、細胞内メッセンジャーＲＮＡ代謝回転に全体的影響を与える（Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥｍｂｏＪ、２８：３５２３−３５３３（２００９）（非特許文献15）、を参照）。ＲＮａｓｅ  Ｊ１およびＲＮａｓｅＹの両方とも、不可欠な酵素であり、その観点から、抗菌剤発見のための標的と見なすことができる（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００：４６７８−４６８３（２００３）（非特許文献16）、を参照）。しかし、ＲＮａｓｅ  Ｊ１、ＲＮａｓｅ  Ｙ、および／または以前に特徴付けられていないリボヌクレアーゼが、どのようにして、黄色ブドウ球菌内のｍＲＮＡ崩壊を調節するかは、まだ明らかになっていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ、３４：２５８８−２５９５（２００６）
【非特許文献２】Ｂａｎｃｒｏｆｔ、Ｅ．Ａ．、Ｊａｍａ、２９８：１８０３−１８０４（２００７）
【非特許文献３】Ｋｌｅｖｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊａｍａ、２９８：１７６３−１７７１（２００７）
【非特許文献４】Ａｐｐｅｌｂａｕｍ、Ｐ．Ｃ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ、３０：３９８−４０８（２００７）
【非特許文献５】Ｚｅｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ、５：２７５−２８６（２００５）
【非特許文献６】Ｃａｒｐｏｕｓｉｓ、Ａ．Ｊ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６１：７１−８７（２００７）
【非特許文献７】Ｍａｃｋｉｅ、Ｇ．Ａ．、Ｎａｔｕｒｅ、３９５：７２０−７２３（１９９８）
【非特許文献８】Ｖａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、１２：２７７０−２７８１（１９９８）
【非特許文献９】Ｃｏｎｄｏｎ、Ｃ．、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、６７：１５７−１７４（２００３）
【非特許文献１０】Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３：２１４１−２１５２（２００５）
【非特許文献１１】Ｍａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、１２９：６８１−６９２（２００７）
【非特許文献１２】Ｃｏｍｍｉｃｈａｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、８：１３５０−１３６０（２００９）
【非特許文献１３】Ｍａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：１８３−１９６（２００８）
【非特許文献１４】Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｒｎａ、１５：２３３１−２３３９（２００９）
【非特許文献１５】Ｓｈａｈｂａｂｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．、ＥｍｂｏＪ、２８：３５２３−３５３３（２００９）
【非特許文献１６】Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１００：４６７８−４６８３（２００３）
【発明の概要】
【０００７】
例示され、幅広く記載されている開示材料、化合物、組成物、キット、および方法の目的の通りに、開示内容は、主組成物、前記組成物を製造する方法、および前記組成物を使う方法に関する。さらに具体的には、細菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の阻害剤として使用される化合物および組成物が本明細書で提供される。ＲＮａｓｅ阻害剤の１つの種類には、下記構造
【化１】
2014510717.tif 000002
の化合物、ならびにその薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグが含まれる。これらの化合物において、
【化２】
2014510717.tif 000003
は、単結合または二重結合であり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択され；各Ｒ１、各Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、 置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルから独立に選択され；かつＲ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルである。Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、結合して置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールを形成してもよい。この種類の化合物で、
【化３】
2014510717.tif 000004
が二重結合であり、Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、およびＡ１０がＣＨであり、Ａ３が−ＣＣＯ２Ｈであり、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ８が、それぞれ水素であり、Ｒ５およびＲ６がメチルであり、かつＲ３がシアノである場合、Ａ９は−ＣＢｒではない。
【０００８】
また、本明細書で提供されるのは、上述の化合物の１つまたは複数および薬学的に許容可能なキャリアを含む組成物である。
【０００９】
さらに、本明細書で提供されるのは、対象の微生物感染を治療または予防する方法である。一部の実施形態では、方法は、有効量の下記構造
【化４】
2014510717.tif 000005
のＲＮａｓｅ阻害剤またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグを対象に投与する段階を含む。これらの化合物において、
【化５】
2014510717.tif 000006
は、単結合または二重結合であり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択され；各Ｒ１、各Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルから独立に選択され；かつＲ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルである。Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、結合して置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールを形成してもよい。一部の例では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、
【化６】
2014510717.tif 000007
である。
【００１０】
一部の実施形態では、微生物感染は、細菌感染である。細菌感染は、例えば、グラム陽性細菌感染であってもよい。任意選択で、細菌感染は、例えば、黄色ブドウ球菌感染、等のブドウ球菌感染である。黄色ブドウ球菌感染は、薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染またはバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染であってもよい。一部の例では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、ＲｎｐＡ阻害剤である。任意選択で、方法は、第２の化合物を対象に投与する段階をさらに含み、この場合、第２の化合物は、抗菌化合物である。
【００１１】
また、本明細書で提供されるのは、細菌リボヌクレアーゼを阻害する方法であり、細菌リボヌクレアーゼに、有効量のＲＮａｓｅ阻害剤を接触させる段階を含む。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ阻害剤は、下記構造
【化７】
2014510717.tif 000008
の化合物またはその薬学的に許容可能な塩もしくはプロドラッグである。これらの化合物において、
【化８】
2014510717.tif 000009
は、単結合または二重結合であり；Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択され；Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択され；各Ｒ１、各Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシルから独立に選択され；かつＲ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルである。Ｒ６およびＲ７は、任意選択で、結合して置換もしくは未置換アリールまたは置換もしくは未置換ヘテロアリールを形成してもよい。
【００１２】
任意選択で、細菌リボヌクレアーゼは黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｐ（例えば、ＲｎｐＡ）の、タンパク質成分であってもよい。接触させる段階は、例えば、インビボまたはインビトロで行われてもよい。
【００１３】
本明細書でさらに提供されるのは、微生物感染の治療または予防のための化合物を特定する方法である。方法は、ＲＮＡ、ＲｎｐＡ、および蛍光染料を混合して混合物を形成する工程；該混合物を化合物と接触させる工程；ならびに蛍光を使って、細胞におけるＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解をモニタリングする工程を含み、ここで、対照に比べて減少した蛍光が、ＲＮＡ分解を示す。この方法では、対照に比べて、ＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解を減らす化合物が、微生物感染の治療または予防のための化合物として特定される。
【００１４】
追加の利点は、以下で説明され、その記載により明らかとなろう。あるいは、以下に記載の態様の実施により理解されよう。下記の利点は、特に、添付の特許請求の範囲で示される要素および組み合わせの手段により実現され、達成されるであろう。前出の一般的説明および以下の詳細説明の両方は、代表としての例示のみの目的であり、限定するものではないことは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】対数期および／または定常期増殖（Ｘ−軸）の間の、２．５、５、１５、３０分以下、または３０分を超える半減期を有する検出可能なｍＲＮＡ種の割合（Ｙ−軸）を示すグラフである。
【図２】黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがｒＲＮＡおよびｍＲＮＡ消化を触媒することを示す。パネルＡは、精製された組換え黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥであり；示されているのは、分子マーカー（レーンＭ）、２．５μｇおよび２５μｇ溶出産物（それぞれレーン１および２）である。パネルＢは、１Ｘ反応緩衝液（２ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．０）中の５０ｐｍｏｌの各推定上のリボヌクレアーゼ（示されている）の非存在（−）または存在（＋）下における６０分インキュベーション後の１μｇの全黄色ブドウ球菌ＲＮＡのゲル移動を示す。パネルＣは、１Ｘ反応緩衝液中の示した量のＲｎｐＡタンパク質の非存在（０ｐｍｏｌ）または存在下で６０分のインキュベーション後に、インビトロで転写された０．５ｐｍｏｌ  ｓｐａ  ｍＲＮＡの移動を示す。分子量マーカー（Ｍ）が示されている。パネルＤは、５０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡまたはＲＮａｓｅ  Ｊ１の非存在（−）もしくは存在（＋）下で、および非存在（血清単独）または１、２．５、５、１０、もしくは２０μｇ  ＲｎｐＡポリクローナル抗体の存在下の、２μｇのインビトロ転写ｓｐａ  ｍＲＮＡの逆転写媒介ＰＣＲ産物を示す。パネルＥは、転写後０分（Ｘ−軸）および１０分（Ｙ−軸）停止時のＧｅｎｅＣｈｉｐ上で測定された全ｍＲＮＡ種に対する測定値のプロットを示す。灰色点線は、各試料に対する感度の下限値を示す。
【図３】パネルＡは、代表的な選別操作の結果を示す。パネルＢは、２０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡの非存在（−）または存在（＋）下の分子量マーカー、ｓｐａ  ｍＲＮＡのゲル移動、およびＲＮＰＡ１０００の濃度を増加させた場合のＲｎｐＡ媒介ｓｐａ  ｍＲＮＡ分解を示すアガロースゲルベースアッセイである。パネルＣは、ＲｎｐＡ阻害分子ＲＮＰＡ１０００の構造を示す。
【図４】パネルＡは、化合物溶媒（ＤＭＳＯ；陰性対照）、マイトマイシンＣ（陽性対照）、および表示量のＲＮＰＡ１０００に曝されたＨｅｐＧ２細胞のＭＴＴ細胞傷害性アッセイ結果を示す。パネルＢは、処理なし（中実菱形；陰性対照）、バンコマイシン処理（中実正方形；１ｍｇ／ｋｇ；陽性対照）、またはＲＮＰＡ１０００処理；６４ｍｇ／ｋｇ（中空丸）；１２８ｍｇ／ｋｇ（中空正方形）、２５６ｍｇ／ｋｇ（中空三角形）後の、毎日（Ｘ−軸）の生存動物の平均パーセント（Ｙ−軸）を示す。パネルＣは、抗菌処理なし（未処理；ＵＴ）、またはＲＮＰＡ１０００のＭＩＣの５、１０、もしくは２０倍への暴露の１、２、または３日後の、カテーテル関連黄色ブドウ球菌の数を示す。ボックスは、２５と７５パーセントの間の区間を規定する。上方に伸びるバーは、７５パーセントよりも１．５倍高い値で規定される境界を示し、一方、下向きに伸びるバーは、２５パーセントより１．５倍低い値により規定される境界を示す。中実円は、これら２つの極値を外れる個別の値を示す。
【図５】転写後０および５分の停止時のＧｅｎｅＣｈｉｐ検出全転写物レベルのプロットを示す。灰色点線は、各試料に対する感度の下限値を示す。パネルＡは、ＤＭＳＯ処置細胞のｍＲＮＡレベルの比較（左パネル）、およびＲｎｐＡ阻害剤の阻害濃度以下の濃度で刺激された細胞のｍＲＮＡレベルの比較（右パネル）を示す。パネルＢは、２．５μＭのＣｄＣｌ２の存在下で増殖させた場合の、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０  ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．（ＲｎｐＡ枯渇細胞；上段パネル）、ＲＮ４２２０ｐ  ＲＮＰＡ（ＲｎｐＡ過剰発現細胞；中段パネル）およびＲＮ４２２０  ｐＣＮ５１（ベクター；下段パネル）に対する表示濃度のＲＮＰＡ１０００（最上部）のインビトロ抗菌効果を示すマイクロタイタープレートアッセイである。全株は、２回評価した。矢印はＭＩＣ値を示す。
【図６】パネルＡは、１０μＭのＣｄＣｌ２の存在下で増殖させた場合の、ベクター（ｐＣＮ５１；菱形）、ｒｎｐＡセンスＲＮＡ（ｐＲＮＰＡ−Ｓ；三角形）およびｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡ（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．；正方形）含有黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０の増殖特性（光学密度；Ｙ−軸）のプロットを示す。パネルＢは、２．５μＭのＣｄＣｌ２の存在下で増殖させた黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０  ｐＣＮ５１（ベクター）、ＲＮ４２２０ｐＲＮＰＡ（過剰発現体）、およびＲＮ４２２０  ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．（ＲｎｐＡ枯渇）細胞のウェスタンブロッティング結果を示す。
【図７】黄色ブドウ球菌時間−殺菌アッセイ結果を示す。パネルＡは、ＭＩＣの０．２５、０．５、１、２、または４倍のＲＮＰＡ１０００で処理した黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１細胞の中間対数期を示す。プロットは、試験各薬剤濃度に対しＲＮＰＡ１０００添加後０、２、４、８、および２４時間の平均ｃｆｕ／ｍｌ（ｎ＝３）である。標準偏差も示した。パネルＢは、中間対数期細胞のオキサシリン処理（ＭＩＣの０．２５、０．５、２、または４倍；ｎ＝３）後２、４、８、および２４時間の平均ｃｆｕ／ｍｌを示す。パネルＣは、中間対数期細胞が、ＭＩＣの０．５倍のＲＮＰＡ１０００、オキサシリン、または両方（ＲＮＰＡ１０００とオキサシリン）で処理されたことを示す。処理後２、４、８、および２４時間（ｎ＝３）の中間対数期の平均ｃｆｕ／ｍｌを示す。標準偏差も示した。
【図８】デフォルトパラメータのＧｒａｍＡｌｉｇｎを使った、ＲｎｐＡアミノ酸配列の整列化を示す表である。保存アミノ酸は、ボックスで囲っている。黄色ブドウ球菌の配列は、配列番号１；表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）は配列番号２；肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）は配列番号３；化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は配列番号４；フェカリス菌（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）は配列番号５；大腸菌は配列番号６；およびアシネトバクター・バウマンニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）は配列番号７である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書で提供されるのは、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）活性関連細菌性ＲｎｐＡの小分子阻害剤、それらの調製方法、および微生物感染の治療および予防における使用方法である。小分子阻害剤は、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡの消化を触媒する不可欠のタンパク質、ＲｎｐＡ、を含む黄色ブドウ球菌、等の微生物感染治療の新規機序を開拓する。この機序は、今まで、既知でなく、または開発されていなかった。この活性の開拓にあたり、高スループットで二次的な選別アッセイを採用し、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤の特定を行った。これらの薬剤は、細胞性ｍＲＮＡ分解を制限し、いくつかの微生物に対する抗菌活性を示した。これらの微生物には、米国中に出回っている主なメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）系統、バンコマイシン中程度感受性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）および高ＲｎｐＡアミノ酸保存の他のグラム陽性細菌病原体が含まれる（ＭｃＤｏｕｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：５１１３−５１２０（２００３）、を参照）。本明細書で提供されるように、ＲｎｐＡ阻害剤は、全身性マウス感染モデルでの疾患を制限し、バイオフィルム関連黄色ブドウ球菌に対し抗菌活性がある。まとめると、これらの知見は、ＲｎｐＡが黄色ブドウ球菌のＲＮＡ分解で重要な役割を果たすことを示し、高スループット選別を使ってｍＲＮＡ代謝回転阻害剤を特定できることを立証し、ＲＮＡ異化反応に基づく抗菌療法の原理に対する証明を与える。
【００１７】
本明細書記載の材料、化合物、組成物、製品、および方法は、開示内容およびその中の実施例の下記の特定の態様の詳細説明を参照することにより、容易に理解されよう。
【００１８】
本材料、化合物、組成物、キット、および方法が開示および記載される前に、以下に記載の態様は、当然変わってもよいので、特定の合成方法または特定の試薬に限定されないことは理解されよう。また、本明細書で使用される用語は、特定の態様のみの説明の目的のためであり、限定する意図はないことも理解されよう。
【００１９】
また、この明細書の全体を通して、種々の出版物が引用される。これらの出版物の開示は、その全体が、開示内容が関係する最先端技術をより完全に説明するために、参照によって本出願に組み込まれる。開示された文献は、また、文中で考察されるその文献の内容のために、個別に、具体的に参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２０】
一般的定義
本明細書および添付の特許請求の範囲では、多くの用語に言及されるが、これらは、下記の意味を持つものとする：
【００２１】
本明細書の説明および添付の特許請求の範囲の全体にわたり、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および単語の他の形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、限定されないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）を意味し、例えば、他の添加物、成分、整数、または工程、を排除する意図はない。
【００２２】
この説明および添付の特許請求の範囲で使われるように、単数形「１つの」、「ある」、および「その」は、文意が明確に別義を示さない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、「組成物（ａ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及は、２つ以上のこのような組成物の混合物を含み、「化合物（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、２つ以上のこのような組成物の混合物を含む、等。
【００２３】
「任意選択の（Ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「任意選択で（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に続くイベントまたは状況が起こっても起こらなくてもよく、また、その説明がイベントまたは状況が起こる場合、および起こらない場合を含むことを意味する。
【００２４】
本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までのように表現できる。このような範囲が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／またはもう一つの特定の値まで含む。同様に、値が近似値として、先行詞「約」によって表される場合は、特定の値は、別の態様を形成すると理解されるであろう。それぞれの範囲の終点は、他方の終点に関連して、および、他方の終点とは無関係に、意味があることもさらに理解されよう。本明細書でいくつかの値が開示され、それぞれの値は、また、本明細書では、値それ自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。値が開示されると、「以下の（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｏｒ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ）」値、「以上の値（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ  ｏｒ  ｅｑｕａｌ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ）」、および値の間の可能な範囲もまた、当業者には適切に理解されるように、開示されることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」ならびに「１０以上」もまた、開示される。出願全体を通し、データがいくつかの異なるフォーマットで提供され、このデータが終点および始点ならびにデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解されよう。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示される場合、１０と１５より大きい、以上、未満、以下およびこれらに等しい、ならびに１０および１５の間、が開示されていると見なされることが理解されよう。また、２つの特定のユニットの間のそれぞれのユニットも開示されていると理解されよう。例えば、１０と１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も開示される。
【００２５】
本明細書で使われる「対象」は、個体を意味する。従って、「対象」は、家畜化動物（例えば、ネコ、イヌ、等）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、等）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、等）、および鳥類、を含むことができる。対象は、また、哺乳動物、例えば、霊長類またはヒトを含むことができる。
【００２６】
「減らす（ｒｅｄｕｃｅ）」またはこの語の他の形、例えば、「減少（ｒｅｄｕｃｉｎｇ）」または「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」は、イベントまたは特性（例えば、細菌感染）を低下させることを意味する。典型的な例では、いくつかの標準的または予測値に対するものであり、換言すれば、相対的であるが、必ずしもいつも参照される標準的な値または比較する値が必要ではないことは理解されよう。例えば、「細菌感染を減らす」は、標準または対照に比べて細菌感染の蔓延を減らすことを意味する。
【００２７】
「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」またはこの語の他の形、例えば、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」または「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」は、特定のイベントまたは特性を停止させ、特定のイベントまたは特性の発生または進行を固定または遅らせること、または特定のイベントまたは特性が発生する機会を最小化することを意味する。例えば、減らす（ｒｅｄｕｃｅ）より絶対的であるので、典型的な例では、防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）は、対照に対する比較を必要としない。本明細書で使用されるように、減らすことはできるが防止できないものもあれば、減らすことができ、さらに防止も可能なものもある。同様に、あるものは防止できるが減らすことができないが、あるものは防止され、さらに減らすことも可能である。減らすまたは防ぐが使用される場合は、特に別義が指定されない限り、もう一方の語の使用も明示的に開示されることは理解されよう。
【００２８】
「治療（ｔｒｅａｔ）」またはこの語の他の形、例えば、「治療された（ｔｒｅａｔｅｄ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、特定の特性またはイベント（例えば、細菌感染）を減らす、防ぐ、抑制する、または取り除くために、組成物を投与すること、またはある方法を実行することを意味する。用語「制御する（ｃｏｎｔｒｏｌ）」は、用語「治療（ｔｒｅａｔ）」と同義に使用される。
【００２９】
「抗菌」は、任意の濃度で微生物の増殖を治療または制御する（例えば、減らす、防ぐ、抑制する、または除く）能力を意味する。同様に、用語「抗菌性」は、任意の濃度で細胞性細菌増殖を治療または制御する能力を意味する。
【００３０】
本明細書の全体を通して、識別子「第１の」および「第２の」は、開示内容の種々の要素および工程を区別するのを助けるためのみの目的で使用されることは理解されよう。識別子「第１の」および「第２の」が、これらの用語で修飾される要素または工程に対し、特定の順番、量、優先度、または重要性を意味することは、まったく意図されていない。
【００３１】
化学上の定義
本明細書で使用される用語「置換」は、全ての許容される有機化合物の置換基を含むことが意図されている。広範な態様では、許容可能な置換基には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環式およびヘテロ環式、ならびに芳香族および非芳香族有機化合物置換基が含まれる。置換基の例には、例えば、下記に記載のものが含まれる。許容可能な置換基は、適切な有機化合物の、１つまたは複数の置換基であっても、同じでまたは異なる置換基であってもよい。本開示の目的のためには、窒素、等のヘテロ原子は、水素置換基および／または本明細書記載のヘテロ原子の原子価に適合するいずれかの許容可能な有機化合物置換基を持つことができる。本開示は、どのような形であれ、許容可能な有機化合物置換基を制限する意図はない。また、用語「置換」または「で置換」は、このような置換は、置換原子および置換基の許容された原子価に一致し、また、置換は、安定な化合物を生じ、例えば、化合物は、例えば、転移、環化、離脱、等により自然に変換を受けないという暗黙の条件を含む。
【００３２】
「Ｚ１」、「Ｚ２」、「Ｚ３」、および「Ｚ４」は、本明細書で一般的記号として種々の特定の置換基を表すために使用される。これらの記号は、任意の置換基でよく、本明細書で開示のものに限定されない。また、それらが、１つの例で特定の置換基であると定義される場合は、それらは、別の例では、いくつかの他の置換基として定義できる。
【００３３】
本明細書で使われる用語「脂肪族」は、非芳香族炭化水素基を意味し、分岐および非分岐、アルキル、アルケニル、またはアルキニル基を含む。
【００３４】
本明細書で使われる用語「アルキル」は、１〜２４炭素原子の分岐または非分岐飽和炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル、等である。アルキル基は、また、置換されていても未置換であってもよい。アルキル基は、限定されないが、下記に記載されるように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００３５】
明細書全体を通して、「アルキル」は、一般的に、未置換アルキル基および置換アルキル基の両方を指すのに使われるが、本明細書では、置換アルキル基は、また、具体的に、アルキル基上の特定の置換基を特定することを意味する。例えば、用語「ハロゲン化アルキル」は、１つまたは複数のハロゲン化物、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素で置換されるアルキル基を具体的に指す。用語「アルコキシアルキル」は、以降で記載する１つまたは複数のアルコキシ基で置換されるアルキル基を具体的に指す。用語「アルキルアミノ」は、以降で記載する１つまたは複数のアミノ基で置換されるアルキル基を具体的に指す、等。「アルキル」が、１つの例で使われ、特定の用語、例えば、「アルキルアルコール」が別の例で使われる場合、用語「アルキル」が、特定の用語、例えば、「アルキルアルコール」、等もまた指さないことを暗示するようには意図されていない。
【００３６】
この手法は、本明細書記載の他の基にも使用される。すなわち、「シクロアルキル」等の用語は、未置換および置換シクロアルキル成分の両方を意味するが、置換成分は、さらに、本明細書で具体的に特定でき、例えば、特定の置換シクロアルキルは、例えば、「アルキルシクロアルキル」と呼ぶことができる。同様に、置換アルコキシは、具体的に、例えば、「ハロゲン化アルコキシ」と、また、特定の置換アルケニルは、例えば、「アルケニルアルコール」、と呼ぶことができる、等。繰り返すが、一般用語、例えば、「シクロアルキル」および特定の用語、例えば、「アルキルシクロアルキル」を使う手法は、一般用語が、特定の用語もまた含まないことを暗示するようには意図されていない。
【００３７】
本明細書で使われる用語「アルコキシ」は、単一の、末端エーテル結合を介して結合したアルキル基であり、すなわち、「アルコキシ」基は、−ＯＺ１として定義できる。ここでＺ１は、上で定義のアルキルである。
【００３８】
本明細書で使われる用語「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式を有する２〜２４炭素原子の炭化水素基である。非対称の構造、例えば、（Ｚ１Ｚ２）Ｃ＝Ｃ（Ｚ３Ｚ４）は、ＥおよびＺ異性体の両方を含むことが意図されている。これは、非対称のアルケンが存在する本明細書の構造式で推定できるか、または明示的に結合記号Ｃ＝Ｃにより示されうる。アルケニル基は、限定されないが、以降で記載のように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００３９】
本明細書で使われる用語「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む構造式を有する２〜２４炭素原子の炭化水素基である。アルキニル基は、以降で記載のように、限定されないが、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４０】
本明細書で使われる用語「アリール」は、限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼン、等のいずれかの炭素ベース芳香族基を含む基である。用語「ヘテロアリール」は、芳香族基の環中に組み込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基を含む基として定義される。ヘテロ原子の例には限定されないが、窒素、酸素、硫黄、およびリンが含まれる。用語「アリール」に包含される用語「非ヘテロアリール」は、ヘテロ原子を含まない芳香族基を含む基であると定義される。アリールまたはヘテロアリール基は、置換されていても未置換であってもよい。アリールまたはヘテロアリール基は、限定されないが、本明細書記載の、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。用語「ビアリール」は、アリール基の特定のタイプで、アリール定義に含まれる。ビアリールは、ナフタレンの場合のように、縮合環構造を介して一緒に結合された、またはビフェニルの場合のように、１つまたは複数の炭素−炭素結合を介して結合された２つのアリール基を意味する。
【００４１】
本明細書で使われる用語「シクロアルキル」は、少なくとも３つの炭素原子からなる非芳香族炭素ベース環である。シクロアルキル基の例には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、等が含まれる。用語「ヘテロシクロアルキル」は、環の少なくとも１つの炭素原子が、ヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンで置換されている上記で定義のシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換されていても未置換でもよい。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、限定されないが、本明細書記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオールを含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４２】
本明細書で使われる用語「シクロアルケニル」は、少なくとも３つの炭素原子からなる非芳香族炭素ベース環であり、少なくとも１つの二重結合、すなわち、Ｃ＝Ｃを含む。シクロアルケニル基の例には、限定されないが、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサジエニル、等が含まれる。用語「ヘテロシクロアルケニル」は、上記で定義のシクロアルケニル基の１つのタイプであり、環の少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子、例えば、限定されないが、窒素、酸素、硫黄、またはリンで置換される場合の、用語「シクロアルケニル」の意味に包含される。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、置換されていても未置換であってもよい。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、限定されないが、本明細書記載のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハロゲン化物、ヒドロキシ、ケトン、ニトロ、シリル、スルフォオキソ、スルホニル、スルホン、スルフォキシド、またはチオール、を含む１つまたは複数の基で置換できる。
【００４３】
用語「環式基」は、本明細書では、アリール基、非アリール基（すなわち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基）、または両方を指すために使用される。環式基は、置換されていても未置換でもよい１つまたは複数の環系を有する。環式基は、１つまたは複数のアリール基、１つまたは複数の非アリール基、または１つまたは複数のアリール基と１つまたは複数の非アリール基を含むことができる。
【００４４】
本明細書で使われる用語「アルデヒド」は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｈで表される。この明細書全体を通して、「Ｃ（Ｏ）」または「ＣＯ」は、Ｃ＝Ｏの略式表記である。
【００４５】
本明細書で使われる用語「アミン」または「アミノ」は、式：−ＮＺ１Ｚ２で表され、Ｚ１およびＺ２は、それぞれ、本明細書記載の置換基、例えば、上述の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００４６】
本明細書で使われる用語「カルボン酸」は、式：−Ｃ（Ｏ）ＯＨで表される。本明細書で使われる「カルボキシラート」または「カルボキシル」基は、式：−Ｃ（Ｏ）Ｏ−で表される。
【００４７】
本明細書で使われる用語「エステル」は、式：−ＯＣ（Ｏ）Ｚ１または−Ｃ（Ｏ）ＯＺ１で表され、Ｚ１は、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００４８】
本明細書で使われる用語「エーテル」は、式：Ａ１ＯＡ２で表され、Ａ１およびＡ２は、独立に、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００４９】
本明細書で使われる用語「ケトン」は、式：Ｚ１Ｃ（Ｏ）Ｚ２で表され、Ｚ１およびＺ２は、独立に、上述のアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５０】
本明細書で使われる用語「ハロゲン化物」または「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を意味する。
【００５１】
本明細書で使われる用語「ヒドロキシル」は、式：−ＯＨで表される。
【００５２】
本明細書で使われる用語「ニトロ」は、式：−ＮＯ２で表される。
【００５３】
本明細書で使われる用語「シリル」は、式：−ＳｉＺ１Ｚ２Ｚ３で表され、Ｚ１、Ｚ２、およびＺ３は、独立に、上述の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５４】
用語「スルホニル」は、本明細書では、式：−Ｓ（Ｏ）２Ｚ１で表されるスルフォオキソ基を意味し、Ｚ１は、上述の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい。
【００５５】
本明細書で使われる用語「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」は、式：−Ｓ（Ｏ）２ＮＨ−で表される。
【００５６】
本明細書で使われる用語「チオール」は、式：−ＳＨで表される。
【００５７】
本明細書で使われる用語「チオ」は、式：−Ｓ−で表される。
【００５８】
本明細書で使われる「Ｒ１」、「Ｒ２」、「Ｒ３」、「Ｒｎ」、等（ｎはある整数）は、独立に、上に挙げた１つまたは複数の基を持つことができる。例えば、Ｒ１が直鎖アルキル基の場合、アルキル基の１つの水素原子は、任意選択で、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アミン基、アルキル基、ハロゲン化物、等で置換できる。選択された基に応じて、第１の基は、第２の基中に組み込むことができ、または、代わりに、第１の基は、第２の基にぶら下げても（すなわち、結合しても）よい。例えば、語句「アミノ基を含むアルキル基」で、アミノ基は、アルキル基の骨格内に組み込むことができる。あるいは、アミノ基は、アルキル基の骨格に結合できる。選択された基の性質が、第１の基が第２の基に埋め込まれるか、または結合するかを決定するであろう。
【００５９】
そうでないとの記述がない限り、化学結合が楔または点線としてではなく、実線のみとして示された式は、それぞれ、可能な異性体、例えば、それぞれ、鏡像異性体、ジアステレオマー、およびメソ化合物、ならびに異性体の混合物、例えば、ラセミまたはスケールミック混合物が意図されている。
【００６０】
以降で、開示物質、化合物、組成物、製品、および方法の特定の態様に対し詳細な言及がなされ、それらの例が、付随する実施例中で説明される。
【００６１】
化合物
本明細書記載の細菌リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）の小分子阻害剤は、式Ｉ：
【化９】
2014510717.tif 000010
で表される化合物ならびにその薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグを含む。
【００６２】
式Ｉで、
【化１０】
2014510717.tif 000011
は、単結合または二重結合である。
【００６３】
また、式Ｉで、Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５は、ＮまたはＣＲ１からそれぞれ独立に選択される。各Ｒ１は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシル、から独立に選択できる。任意選択で、１つまたは複数のＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５がＣＨであってもよい。一部の実施形態では、Ａ３は、−ＣＣＯ２Ｈである。
【００６４】
さらに、式Ｉで、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０は、ＮまたはＣＲ２からそれぞれ独立に選択される。各Ｒ２は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシル、から独立に選択できる。任意選択で、１つまたは複数のＡ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０がＣＨであってもよい。一部の実施形態では、Ａ９はＣＢｒである。一部の実施形態では、Ａ８はＣＢｒである。
【００６５】
また、式Ｉで、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシル、から独立に選択される。任意選択で、Ｒ３は、シアノであってもよい。一部の実施形態では、Ｒ５およびＲ６は、メチルである。
【００６６】
さらに、式Ｉで、Ｒ４は、水素、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、または置換もしくは未置換ヘテロアルキルである。
【００６７】
式Ｉで、隣接Ｒ基、例えば、Ｒ６およびＲ７を結合させて、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換シクロアルキル、置換もしくは未置換シクロアルケニル、置換もしくは未置換シクロアルキニル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキル、置換もしくは未置換ヘテロシクロアルケニル、または置換もしくは未置換ヘテロシクロアルキニルを形成できる。例えば、Ｒ６は、置換または未置換エチレン基であってよく、Ｒ７は、置換または未置換プロピレン基であってよく、これらが結合して置換または未置換フェニルを形成する。これらの例では、Ｒ６とＲ７が結合して、構造Ｉ−Ａ、すなわち、インドール実施形態：
【化１１】
2014510717.tif 000012
を形成する。
【００６８】
任意選択で、構造Ｉ−Ａ中のインドールのフェニル環を、Ｒ９で置換してもよい。構造Ｉ−Ａで、Ｒ９は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、置換もしくは未置換アミノ、置換もしくは未置換アルキル、置換もしくは未置換ヘテロアルキル、置換もしくは未置換アルケニル、置換もしくは未置換ヘテロアルケニル、置換もしくは未置換アルキニル、置換もしくは未置換ヘテロアルキニル、置換もしくは未置換アリール、置換もしくは未置換ヘテロアリール、置換もしくは未置換アルコキシル、置換もしくは未置換アリールオキシル、または置換もしくは未置換カルボキシル、から選択される。
【００６９】
式Ｉの一部の例では、各Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、およびＡ５はＣＨで、構造Ｉ−Ｂを形成する。式Ｉの別の例では、各Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はＣＨで、構造Ｉ−Ｃを形成する。式Ｉのさらに別の例では、各Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、Ａ９、およびＡ１０はＣＨで、構造Ｉ−Ｄを形成する。
【化１２】
2014510717.tif 000013
【００７０】
任意選択で、式Ｉの化合物は、エノンを含み、構造Ｉ−Ｅの化合物となる。一部の実施形態では、エノンが還元され、構造Ｉ−Ｆの化合物を形成する。
【化１３】
2014510717.tif 000014
【００７１】
一部の実施形態では、式Ｉ中のＡ３は、構造Ｉ−Ｇ：
【化１４】
2014510717.tif 000015
に示されるように−ＣＣＯ２Ｈである。
【００７２】
式Ｉの一部の例では、
【化１５】
2014510717.tif 000016
が二重結合であり、Ａ１、Ａ２、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ７、Ａ８、およびＡ１０が、ＣＨであり、Ａ３が−ＣＣＯ２Ｈであり、Ｒ４、Ｒ７、およびＲ８が、それぞれ水素であり、Ｒ５およびＲ６がメチルであり、かつＲ３がシアノである場合、Ａ９は−ＣＢｒではない。
【００７３】
式Ｉの特定の例は、化合物ＲＮＰＡ−１０００
【化１６】
2014510717.tif 000017
である。
【００７４】
医薬組成物
本明細書記載の化合物またはその誘導体は、医薬組成物として提供できる。目的とする投与モードに応じて、医薬組成物は、好ましくは、正確な投与量の一回投与に適する単位剤形の固体、半固形または液体剤形、例えば、錠剤、坐剤、ピル、カプセル剤、粉剤、液剤、または懸濁剤の形態であってよい。組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと組み合わせて、治療有効量の本明細書記載の化合物またはその誘導体を含み、さらに、他の薬剤、医薬品、キャリア、または希釈剤を含んでもよい。薬学的に許容可能とは、生物学的でもなく、その他の理由で望ましくないものでもない材料を意味し、これは、容認できない生物学的影響、または医薬組成物中に含まれるほかの成分との有害な相互作用を生じることなく、選択化合物と一緒に個体に投与できる。
【００７５】
本明細書で使用される用語のキャリアは、賦形剤、希釈剤、フィラー、塩、緩衝液、安定剤、溶解剤、脂質、安定剤、または当技術分野で製剤での使用によく知られた他の物質のいずれかを包含する。組成物中での使用のためのキャリアの選択は、組成物のための目的の投与経路に依存する。これらの物質を含む薬学的に許容可能なキャリアおよび製剤の調製は、例えば、レミントンの薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、２１ｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｐａ．、２００５、に記載されている。生理学的に受容可能なキャリアの例には、下記が含まれる：緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、および他の有機酸を含む緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性高分子、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類、およびブドウ糖、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）（ＩＣＩ、Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）（ＢＡＳＦ；Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）。
【００７６】
非経口の注射用に適する本明細書記載の化合物またはその誘導体を含む組成物は、生理学的に受容可能な無菌の水性または非水性溶液、分散液、懸濁液または乳剤、および無菌の注射可能溶液または分散液中への再構成用の無菌粉末を含むことができる。適切な水性および非水性キャリア、希釈剤、溶剤またはビークルの例には、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、等）、それらの適切な混合物、植物油（例えば、オリーブ油）および注射可能有機エステル、例えば、エチルオレアート、が含まれる。適切な流動度は、例えば、レシチン等のコーティングの使用により、分散液の場合には必要粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持できる。
【００７７】
これらの組成物は、また、アジュバント、例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤を含むことができる。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、等により推進できる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム、等もまた、含めることができる。注射可能剤型の持続的吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン等の使用により実現できる。
【００７８】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の経口投与用固形剤形には、カプセル剤、錠剤、ピル、粉剤、および粒剤が含まれる。固形剤形では、本明細書記載の化合物またはその誘導体が、不活性の通常の賦形剤（またはキャリア）、例えば、ナトリウムクエン酸塩もしくはジリン酸カルシウムまたは（ａ）充填剤もしくは増量剤、例えば、デンプン、ラクトース、ショ糖、ブドウ糖、マンニトール、およびケイ酸、（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、およびアラビアゴム、（ｃ）軟釈剤、例えば、グリセリン、（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤、例えば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、例えば、４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコール、およびグリセリンモノステアラート、（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンおよびベントナイト、ならびに（ｉ）潤滑剤、例えば、滑石、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、またはこれらの混合物、の内の少なくとも１つと混合される。カプセル剤、錠剤、およびピルの場合には、剤形は、また、緩衝剤を含むことができる。
【００７９】
類似のタイプの固形組成物は、また、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール、等の賦形剤を使って、軟および硬ゼラチンカプセル剤中のフィラーとして使用可能である。
【００８０】
錠剤、糖衣錠、カプセル剤、ピル、および粒剤、等の固形剤形は、腸溶コーティングおよび当技術分野で既知のもの、等のコーティングおよびシェルを使って調製できる。これらは、乳白剤を含んでもよく、また、腸管のある部位で、遅延方式で、活性化合物または複数活性化合物を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例は、高分子物質および蝋である。活性化合物は、また、適切であれば１つまたは複数の上記賦形剤と一緒に、マイクロカプセル剤形に入れてもよい。
【００８１】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の経口投与用液体剤形には、薬学的に許容可能な乳剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物の他に、液体剤形は、当技術分野で通常使われる不活性希釈剤、例えば、水または他の溶剤、可溶化剤、および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチル炭酸塩、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル、特に、綿実油、ピーナッツオイル、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの混合物、等を含んでもよい。
【００８２】
また、このような不活性希釈剤に加えて、組成物は、追加の薬剤、例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味料、調味料、または賦香剤を含んでもよい。
【００８３】
活性化合物の他に、懸濁剤は、追加の薬剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガント、またはこれらの物質の混合物、等を含んでもよい。
【００８４】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の直腸投与用組成物は、任意選択の坐剤で、これは、化合物を、適切な非刺激性賦形剤またはキャリア、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ろうと混合することにより調製できる。これらの賦形剤またはキャリアは、常温で固体であるが、体温では液体であり、従って、直腸または腟腔中で溶解し、活性成分を放出する。
【００８５】
本明細書記載の化合物またはその誘導体の局所投与用剤形には、軟膏、粉剤、噴霧剤、および吸入剤が含まれる。本明細書記載の化合物またはその誘導体は無菌条件下で、生理学的に受容可能なキャリアおよび、必要に応じ、いずれかの防腐剤、緩衝剤、または噴霧剤と混合される。眼製剤、軟膏、粉剤、および溶液剤は、また、組成物の範囲内にあることが意図されている。
【００８６】
組成物は、１つまたは複数の本明細書記載の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含むことができる。本明細書で使われる用語の薬学的に許容可能な塩は、本明細書記載の化合物またはその誘導体の、健全な医学判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等なしに、対象の組織と接触させる使用に適し、合理的な便益／リスク比に見合った、目的の使用に有効な塩、ならびに、可能であれば、本明細書記載の化合物の双性イオン型、を意味する。用語の塩は、本明細書記載の化合物の相対的に非毒性の、無機および有機酸付加塩を意味する。これらの塩は、化合物の単離および精製の間にインサイチューで、または遊離塩基型の精製化合物を適切な有機または無機酸と別々に反応させ、それにより生成した塩を単離することにより、調製することができる。代表的塩には、下記が含まれる：臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレアート、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、ベンゾアート、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸エステル、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチラートメシラート、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、メタンスルホン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩、等。これらは、アルカリおよびアルカリ土類金属に属するカチオン、例えば、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、等、ならびに限定されないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、等を含む非毒性アンモニウム、４級アンモニウム、およびアミンカチオン、を含むことができる（Ｓ．Ｍ．Ｂａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９７７）６６、１、を参照。この文献は、参照により少なくとも本明細書で教示された組成物に関して、その全体が、本明細書に組み込まれる）。
【００８７】
本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩の対象への投与は、本明細書記載のように、治療有効量の本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩を使って、障害を治療するのに効果的な期間、実施できる。
【００８８】
本明細書記載の化合物および組成物または本明細書記載のその薬学的に許容可能な塩の有効量は、当業者によって決定でき、たとえば哺乳動物に対する例示的投与量が１日当たり約０．５〜約２００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物であり、これは、単回用量または個別分割量の形で、例えば、１〜４回／日投与できる。あるいは、投与量は、１日当たり約０．５〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜約７５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約０．５〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約２０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、１日当たり約１０ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、または１日当たり約５ｍｇ／ｋｇ体重の活性化合物、であってもよい。方法中で化合物の量の記載に使われる場合、有効量の表現は、所望の薬理学的効果または他の効果を達成する化合物の量、例えば、細菌酵素抑制をもたらす量を意味する。
【００８９】
当業者なら、特定の用量レベルおよびいずれかの特定の対象に対する投与頻度は、変化してもよく、これらは、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、種、年齢、体重、総体的な健康、性別および対象の食事、投与モードおよび時間、排出速度、薬剤の組み合わせ、および特定の状態の重症度、等の種々の因子に依存することは理解できよう。
【００９０】
化合物の作製方法
本明細書記載の化合物は、有機合成の当業者に既知の種々の方法、または当業者により認められているそれの変形法を使って調製できる。本明細書記載の化合物は、容易に入手可能な出発物質から調製できる。最適反応条件は、特定の反応物または使用される溶剤により変化してもよいが、この条件は、当業者により決定されうる。
【００９１】
式Ｉの変形には、追加、除去、または各化合物で記載されるような種々の成分の移動が含まれる。同様に、分子中に１つまたは複数のキラル中心が存在する場合、分子のキラリティーを変えることができる。さらに、化合物合成では、種々の化学基の保護および脱保護を含むことができる。保護および脱保護の使用、および適切な保護基の選択は、当業者により決定できる。保護基の化学については、例えば、Ｗｕｔｓ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、４ｔｈ  Ｅｄ．、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、２００６、で見つけることができる。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
開示化合物および組成物の調製に使用される出発物質および試薬は、市販品供給業者、例えば、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ（Ｍｏｒｒｉｓ  Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈ  Ｋｌｉｎｅ（Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）、Ｍｅｒｃｋ（Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、ＮＪ）、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、ＮＪ）、Ａｖｅｎｔｉｓ（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ＮＪ）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｗｙｅｔｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＮＪ）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ（ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ）、Ｒｏｃｈｅ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｌｉｌｌｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、Ａｂｂｏｔｔ（Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、もしくはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能であるか、または、文献、例えば、フィーザー・アンド・フィーザーの有機合成試薬（Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ'ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−１７（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９１）；Ｒｏｄｄの炭素化合物の科学（Ｒｏｄｄ'ｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−５  ａｎｄ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９８９）；有機反応（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）、Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４０（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９１）；Ｍａｒｃｈの最新有機化学（Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；およびＬａｒｏｃｋの総合有機変換（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．、１９８９）、で説明されている方法に従って当業者に既知の方法により調製される。他の物質、例えば、本明細書で開示の医薬品キャリアは、市販品供給業者から入手可能である。
【００９３】
本明細書記載の化合物を生成する反応は、溶剤中で行うことができ、これらの溶剤は、有機合成の当業者により選択されうる。溶剤は、反応が行われる条件、すなわち、温度および圧力下で、出発物質（反応物）、中間体、または生成物と実質的に非反応性である。反応は、１つの溶媒中、または２つ以上の溶媒の混合物中で行うことができる。生成物または中間体形成は、当技術分野で既知のいずれかの適切な方法に従ってモニタリングできる。例えば、生成物形成は、分光学的手段、例えば、核磁気共鳴分光法（例えば、１Ｈまたは１３Ｃ）、赤外分光法、分光光度法［（例えば、ＵＶ−可視）、もしくは質量分析法により、またはクロマトグラフィー、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィーによりモニタリングできる。
【００９４】
種々の多様な基を有するＲＮＡＰ１０００の類似体が、スキーム１に示す反応工程を含むいくつかの既知の合成スキームを使って調製できる（Ｊｅｎｄｒａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３３（１）：６１−７０（１９９０））。工程１に示す縮合は、マイクロ波技術を使って加速できる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、７：１１５０−１１５７（２０１１））。スキーム１に示すＲ１位置へのブロモ等の脱離基の組込みは、遷移金属触媒化学、例えば、鈴木およびＢｕｃｈｗａｌｄ縮合を介したさらなるホモログ化を可能とする。工程３で示されるＫｎｏｅｖｅｎａｇａｌ反応から、立体異性体の混合物が予測される可能性があるが、該異性体はクロマトグラフィーにより分離可能であり、対応する（Ｚ）および（Ｅ）異性体は、別々に最終目的化合物に変換でき、これにより多様性セットを拡大する。
【化１７】
2014510717.tif 000018
【００９５】
さらなる多様性は、一般スキーム中の試薬を変えることにより得ることができる。プロパン−２，５−ジオンの相同ジオンによる置換は、ピロールコアに隣接する追加の結合相互作用の探査を可能とする（スキーム２）。Ｖｉｌｓｍｅｉｅｒ−Ｈａａｃｋホルミル化により、位置異性体の混合物を得ることができ、これは、クロマトグラフィーにより分離でき（Ｍａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ、１（９）：９７３−９８９（２００６））、別々に最終目的化合物に変換できる。インドール類似体は、類似のスキームを使って既知のインドール−３−カルボアルデヒドから調製できる（Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１６（５）：９９７−９９９（１９７９））。
【化１８】
2014510717.tif 000019
【００９６】
ニトリルの役割は、マロノニトリルを、アミノ基転移に対し抵抗性の保護マロン酸ジエステル、例えば、スキーム３に示すｔ−ブチルエステルで置換することにより調査できる。脱保護により、中間体の酸が得られ、これは、分子のその領域周辺のＳＡＲを調査するためにさらに精錬できる。最終的に、Ｋｎｏｅｖｅｎａｇａｌ反応から得た付加物の二重結合の還元（例えば、スキーム３、工程３）により、エノン成分を有する類似体、およびこれを有しない類似体が得られる。ラセミ混合物は、キラルＨＰＬＣ、およびその後の分離により試験可能である。
【化１９】
2014510717.tif 000020
【００９７】
活性アッセイ
本明細書で提供されるのは、微生物感染の治療または予防のための化合物を特定する方法である。方法は、本明細書記載の化合物または組成物を調製し、ＲＮａｓｅ  Ｐ等の細菌リボヌクレアーゼに対する化合物または組成物の阻害活性をアッセイする段階を含む。ＲＮａｓｅ  Ｐは、ｔＲＮＡ前駆体の５'末端の成熟を触媒する広範に分布する酵素である（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、６７：１５３−１８０（１９９８）；Ｋａｚａｎｔｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４：７２９−７４０（２００６）；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、４１：７７−１０２（２００６）、を参照）。この酵素は、単一のリボザイムＲＮＡ分子および少なくとも１つのタンパク質成分を含むリボ核タンパク質複合体であるという事実により、ユニークである。細菌内で、リボザイム（ｒｎｐＢ）およびタンパク質（ＲｎｐＡ）成分の両方が細胞生存にとって必須である；ｒｎｐＢは、ｔＲＮＡのインビトロ処理を媒介するが、一方、ＲｎｐＡの機能は、明確に確立されていない（Ｇｏｓｓｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６８１６−６８２３（２００６）；Ｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、７０：２０９１−２０９５（１９７３）；Ｗａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７２：６３１６−６３２２（１９９０）、を参照）。ドメイン探索（Ｌｅｔｕｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３４：Ｄ２５７−２６０（２００６）；Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９５：５８５７−５８６４（１９９８）、を参照）により、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ残基４０〜１１１は、リボヌクレアーゼ様モチーフに最もよく一致することが明らかになった。さらに、いくつかのＲＮＡ結合部位は、この領域内に包埋されている（Ｓｐｉｔｚｆａｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２９５：１０５−１１５（２０００）、を参照）。大腸菌および枯草菌ＲＮａｓｅ  Ｐは、特定の二重鎖ＲＮＡテンプレート、例えば、ガイドＲＮＡおよび４．５ｓ  ＲＮＡを消化することが明らかになっている（Ｌｕｎｄｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０５：２３５４−２３５７（２００８）、を参照）。これらのテンプレートの切断は、必ずＲｎｐＡを必要とする（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｅｌｌ、７７：１０９３−１１００（１９９４）；Ｍａｒｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０８：１２４４−１２５１（２００９）、を参照）。本明細書で提供されるように、ＲＮａｓｅ  Ｐ媒介ＲＮＡ消化は、ｒｎｐＢ、ＲｎｐＡ、または両方に依存する可能性がある。従って、ＲｎｐＡは、黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解を調節する。
【００９８】
ＲＮＡ分解は、細菌リボヌクレアーゼの阻害に適した、従って、微生物感染の治療または予防に適した化合物を特定するために使用できる。一部の実施形態では、蛍光ベースアッセイを使用して、化合物を特定できる。この方法は、ＲＮＡ、ＲｎｐＡ、および蛍光染料を混合して混合物を形成する工程、該混合物を化合物と接触させる工程、ならびに、蛍光を使って、細胞におけるＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解をモニタリングする工程を含むことができる。対照に比べて減少した蛍光は、ＲＮＡ分解を示す。本明細書で使われる蛍光の減少とは、対照に比べて、少なくとも約１％の蛍光の減少を意味する。例えば、蛍光の減少は、対照に比べて、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の蛍光の減少であってもよい。対照に比べて、ＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解を減らす化合物は、微生物感染の治療または予防のための化合物として特定できる。本明細書記載の方法で使用するための適切な蛍光染料には、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）が含まれる。
【００９９】
一部の例では、化合物は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＭＩＣ微量液体希釈法（ｂｒｏｔｈ  ｍｉｃｒｏｄｉｌｕｔｉｏｎ）プロトコル（Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ、以前のＮＣＣＬＳ）、７ｔｈ  ｅｄ．、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００６、２６（２）、Ｍ７−Ａ７中の、好気的成長細菌用の希釈抗菌感受性試験法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｌｕｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  Ｔｈａｔ  Ｇｒｏｗ  Ａｅｒｏｂｉｃａｌｌｙ）；承認標準、を参照されたい；また、Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ、以前のＮＣＣＬＳ）、Ｊａｎｕａｒｙ  ２００８、２８（１）、Ｍ１００−Ｓ１８中の、抗菌感受性試験実施基準（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ）；Ｅｉｇｈｔｅｅｎｔｈ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、も参照されたい）により指定されているＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）ブロス抗菌アッセイを使ってさらにアッセイできる。
【０１００】
本明細書で提供される化合物および組成物の細菌ＲＮａｓｅの阻害剤としての活性は、標準的アッセイ、例えば、ＨＰＬＣアッセイで測定できる。化合物は、細菌ＲＮａｓｅ酵素アッセイを使って細菌ＲＮａｓｅの阻害剤として試験できる。細菌ＲＮａｓｅ阻害剤として特定される化合物は、微生物感染の治療または予防に有用である。このアッセイを使って決定された化合物および組成物の活性は、ＩＣ５０として報告できる。本明細書で使われるＩＣ５０は、このような応答を測定するアッセイにおける最大応答の５０％抑制を実現する特定の試験化合物の量、濃度、または投与量を意味する。
【０１０１】
ある態様では、開示化合物および組成物は、実際に合成する必要はなく、その代わりに、いずれかの分子モデリング技術に対する標的として使って、細菌ＲＮａｓｅとの相互作用を予測し、特徴付けることができる。これは、構造的情報およびコンピュータモデリングにより実現される。コンピュータモデリング技術は、選択分子の３次元原子構造の可視化および酵素と相互作用する新規化合物の合理的な設計を可能とする。典型的な例では、酵素の３次元構築は、選択分子のＸ線結晶学分析またはＮＭＲ画像処理由来のデータに依存する。このデータは、細菌ＲＮａｓｅ用に入手可能である。分子動力学には、力場データ（例えば、Ｍｅｒｃｋ分子力場）が必要である。コンピュータグラフィックスシステムは、新規化合物がどのように酵素に連結するかの予測を可能とし、化合物の構造の実験操作により結合特異性を完成させる。一方または両方で小さな変化が生ずる場合に起こる相互作用を予測するには、分子力学ソフトウェアおよび、通常、分子設計プログラムとユーザーの間のユーザーフレンドリーな、メニュー形式のインターフェースを備えた計算能力の高いコンピュータが必要である。
【０１０２】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍは、エネルギー最小化および分子動力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子構造の構築、グラフィックモデリングおよび解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは、分子の相互挙動のインタラクティブな構築、修正、可視化、および解析を可能とする。コンピュータ上で、所望の方法で細菌ＲＮａｓｅと相互作用する化合物が特定されるとすぐ、本明細書で開示のように、実際の化合物を合成し、アッセイできる。
【０１０３】
使用方法
本明細書で提供されるのは、対象の微生物感染を治療する、予防する、または制限する方法である。この方法は、有効量の１つまたは複数の本明細書記載の化合物または組成物、またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与する段階を含む。本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩は、ヒト、例えば、小児および高齢者集団、および動物、例えば、獣医学分野での微生物感染および癌の治療に有用である。微生物感染には、例えば、細菌および真菌感染が含まれる。細菌感染には、桿菌、球菌、スピロヘータ、およびビブリオ属細菌が原因の感染が含まれる。一部の例では、微生物感染は、細菌感染（例えば、グラム陽性細菌感染）である。一部の例では、細菌感染は、例えば、黄色ブドウ球菌等のブドウ球菌感染である。本明細書記載の化合物および組成物は、薬剤耐性黄色ブドウ球菌感染およびバイオフィルム関連黄色ブドウ球菌感染を含む種々の黄色ブドウ球菌感染の治療に有用である。一部の実施形態では、黄色ブドウ球菌感染は、メトシリン耐性黄色ブドウ球菌（黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ）感染である。他の実施形態では、黄色ブドウ球菌感染は、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌である。任意選択で、黄色ブドウ球菌感染は、多剤耐性である。一部の例では、本明細書記載の化合物および組成物を使って、バチルス感染（例えば、炭疽菌およびセレウス菌感染）、連鎖球菌感染（例えば、肺炎球菌および化膿性連鎖球菌感染）、および腸球菌感染（例えば、フェカリス菌およびバンコマイシン耐性腸球菌感染）を治療できる。
【０１０４】
本明細書記載の治療または予防方法は、１つまたは複数の追加の薬剤（例えば、抗菌剤）を使った治療をさらに含むことができる。１つまたは複数の追加の薬剤ならびに本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩は、同時投与、ならびに数日間の間隔までの時間的に間をおいた順番を含む、どのような順番でも投与できる。方法は、また、１つまたは複数の追加の薬剤、および／または化合物および本明細書記載の組成物またはその薬学的に許容可能な塩の単回よりも多い投与を含んでもよい。１つまたは複数の追加の薬剤および本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩の投与は、同じ経路でも、異なる経路でもよい。１つまたは複数の追加の薬剤を共に使って治療する場合は、本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩は、１つまたは複数の追加の薬剤を含む医薬組成物として組み合わせてもよい。例えば、本明細書記載の化合物または組成物またはその薬学的に許容可能な塩を、例えば、下記の追加の抗菌剤と組み合わせて、医薬組成物とすることができる：アセダプソン；アセトスルホンナトリウム；アラメシン；アレキシジン；アムジノシリン；アムジノシリンピボキシル；アミシクリン；アミフロキサシン；アミフロキサシンメシレート；アミカシン；アミカシン硫酸塩；アミノサリチル酸；アミノサリチル酸ナトリウム；アモキシシリン；アンホマイシン；アンピシリン；アンピシリンナトリウム；アパルシリンナトリウム；アプラマイシン；アスパルトシン；アストロマイシン硫酸塩；アビラマイシン；アボパルシン；アジスロマイシン；アズロシリン；アズロシリンナトリウム；バカンピシリン塩酸塩；バシトラシン；バシトラシンメチレンジサリチル酸；バシトラシン亜鉛；バンベルマイシン；ベンゾイルパスカルシウム；ベリスロマイシン；ベタマイシン硫酸塩；ビアペネム；ビニラマイシン；ビフェナミン塩酸塩；ビスピリチオンマグスルフェクス；ブチカシン；ブチロシン硫酸塩；カプレオマイシン硫酸塩；カルバドクス；カルベニシリン二ナトリウム；カルベニシリンインダニルナトリウム；カルベニシリンフェニルナトリウム；カルベニシリンカリウム；カルモナムナトリウム；セファクロル；セファドロキシル；セファマンドール；セファマンドールナファート；セファマンドールナトリウム；セファパロール；セファトリジン；セファザフルナトリウム；セファゾリン；セファゾリンナトリウム；セフブペラゾン；セフジニル；セフェピム；セフェピム塩酸塩；セフェテコール；セフィキシム；セフメノキシム塩酸塩；セフメタゾール；セフメタゾールナトリウム；セフォニシド一ナトリウム；セフォニシドナトリウム；セフォペラゾンナトリウム；セフォラニド；セフォタキシムナトリウム；セフォテタン；セフォテタン二ナトリウム；セフォチアム塩酸塩；セフォキシチン；セフォキシチンナトリウム；セフピミゾール；セフピミゾールナトリウム；セフピラミド；セフピラミドナトリウム；セフピロム硫酸塩；セフポドキシムプロキセチル；セフプロジル；セフロキサジン；セフスロジンナトリウム；セフタジジム；セフチブテン；セフチゾキシムナトリウム；セフトリアキソンナトリウム；セフロキシム；セフロキシムアキセチル；セセフロキシムピボキセチル；セフロキシムナトリウム；セファセトリルナトリウム；セファレキシン；セファレキシン塩酸塩；セファログリシン；セファロリジン；セファロチンナトリウム；セファピリンナトリウム；セフラジン；セトサイクリン塩酸塩；セトフェニコール；クロラムフェニコール；クロラムフェニコールパルミチン酸塩；クロラムフェニコールパントテナート複合体；クロラムフェニコールナトリウムスクシナート；クロルヘキシジンホスファニル酸塩；クロロキシレノール；クロルテトラサイクリン重硫酸塩；塩酸クロルテトラサイクリン；シノキサシン；シプロフロキサシン；塩酸シプロフロキサシン；シロレマイシン；クラリスロマイシン；クリナフロキサシン塩酸塩；クリンダマイシン；クリンダマイシン塩酸塩；塩酸パルミチン酸クリンダマイシン；クリンダマイシンリン酸塩；クロファジミン；クロキサシリンベンザチン；クロキサシリンナトリウム；クロキシキン；メタンスルホン酸コリスチンナトリウム；コリスチン硫酸塩；クーママイシン；クーママイシンナトリウム；シクラシリン；サイクロセリン；ダルホプリスチン；ダプソン；ダプトマイシン；デメクロサイクリン；デメクロサイクリン塩酸塩；デメサイクリン；デノフンギン；ジアベリジン；ジクロキサシリン；ジクロキサシリンナトリウム；ジヒドロストレプトマイシン硫酸塩；ジピリチオン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；ドキシサイクリンカルシウム；ドキシサイクリンフォスファテックス；ドキシサイクリン塩酸塩；ドロキサシンナトリウム；エノキサシン；エピシリン；エピテトラサイクリン塩酸塩；エリスロマイシン；エリスロマイシンアシストラート；エリスロマイシンエストラート；エリスロマイシンエチルコハク酸塩；エリスロマイシングルセプタート；エリスロマイシンラクトビオン酸塩；エリスロマイシンプロピオン酸塩；エリスロマイシンステアリン酸塩；エタンブトール塩酸塩；エチオナミド；フレロキサシン；フロキサシリン；フルダラニン；フルメキン；ホスホマイシン；ホスホマイシントロメタミン；フモキシシリン；塩化フラゾリウム；フラゾリウム酒石酸塩；フシジン酸ナトリウム；フシジン酸；ゲンタマイシン硫酸塩；グロキシモナム；グラミシジン；ハロプロジン；ヘタシリン；ヘタシリンカリウム；ヘキセジン；イバフロキサシン；イミペネム；イソコナゾール；イセパマイシン；イソニアジド；ジョサマイシン；カナマイシン硫酸塩；キタサマイシン；レボフラルタドン；レボプロピルシリンカリウム；レキシスロマイシン；リンコマイシン；リンコマイシン塩酸塩；ロメフロキサシン；塩酸ロメフロキサシン；ロメフロキサシンメシレート；ロラカルベフ；マフェニド；メクロサイクリン；メクロサイクリンスルホサリチル酸塩；メガロマイシンカリウムリン酸塩；メキドクス；メロペネム；メタサイクリン；塩酸メタサイクリン；メテナミン；ヒプル酸メテナミン；メテナミンマンデル酸塩；メチシリンナトリウム；メチオプリム；メトロニダゾール塩酸塩；メトロニダゾールリン酸塩；メズロシリン；メズロシリンナトリウム；ミノサイクリン；ミノサイクリン塩酸塩；ミリンカマイシン塩酸塩；モネンシン；モネンシンナトリウム；ナフシリンナトリウム；ナリジキシ酸ナトリウム；ナリジクス酸；ナタマイシン；ネブラマイシン；ネオマイシンパルミチン酸塩；ネオマイシン硫酸塩；ネオマイシンウンデシレン酸塩；ネチルマイシン硫酸塩；ニュートラマイシン；ニフイラデン（ｎｉｆｕｉｒａｄｅｎｅ）；ニフラルデゾン；ニフラテル；ニフラトロン；ニフルダジル；ニフリミド；ニフィウピリノール（ｎｉｆｉｕｐｉｒｉｎｏｌ）；ニフラキナゾール；ニフルチアゾール；ニトロサイクリン；ニトロフラントイン；ニトロミド；ノルフロキサシン；ノボビオシンナトリウム；オフロキサシン；オネトプリム（ｏｎｎｅｔｏｐｒｉｍ）；オキサシリン；オキサシリンナトリウム；オキシモナム；オキシモナムナトリウム；オキソリン酸；オキシテトラサイクリン；オキシテトラサイクリンカルシウム；オキシテトラサイクリン塩酸塩；パルジマイシン；パラクロロフェノール；パウロマイシン；ペフロキサシン；ペフロキサシンメシレート；ペナメシリン；ペニシリンＧベンザチン；ペニシリンＧカリウム；ペニシリンＧプロカイン；ペニシリンＧナトリウム；ペニシリンＶ；ペニシリンＶベンザチン；ペニシリンＶヒドラバミン；ペニシリンＶカリウム；ペンチジドンナトリウム；フェニルアミノサリチル酸塩；ピペラシリンナトリウム；ピルベニシリンナトリウム；ピリジシリンナトリウム；ピルリマイシン塩酸塩；ピバンピシリン塩酸塩；ピバンピシリンパモエート；ピバンピシリンプロベナート；ポリミキシンＢ硫酸塩；ポルフィロマイシン；プロピカシン；ピラジナミド；ピリチオン亜鉛；キンデカミン酢酸塩；キヌプリスチン；ラセフェニコール；ラモプラニン；レイニーマイシン；レロマイシン（ｒｅｌｏｍｙｃｉｎ）；レプロマイシン；リファブチン；リファメタン；リファメキシル；リファミド；リファンピン；リファペンチン；リファキシミン；ロリテトラサイクリン；硝酸ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン；ロサラマイシン酪酸塩；ロサラマイシンプロピオン酸塩；ロサラマイシンナトリウムリン酸塩；ロサラマイシンステアリン酸塩；ロソキサシン；ロキサルソン；ロキシスロマイシン；サンサイクリン；サンフェトリネムナトリウム；サルモキシシリン；サルピシリン；スコパフンギン；シソマイシン；シソマイシン硫酸塩；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン塩酸塩；スピラマイシン；スタリマイシン（ｓｔａｌｌｉｍｙｃｉｎ）塩酸塩；ステフィマイシン；ストレプトマイシン硫酸塩；ストレプトニコジド（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｃｏｚｉｄ）；スルファベンズ；スルファベンズアミド；スルファセタミド；スルファセタミドナトリウム；スルファシチン；スルファジアジン；スルファジアジンナトリウム；スルファドキシン；スルファレン；スルファメラジン；スルファメーテル；スルファメタジン；スルファメチゾール；スルファメトキサゾール；スルファモノメトキシン；スルファモキソール；スルファニル酸亜鉛；スルファニトラン；スルファサラジン；スルファソミゾール；スルファチアゾール；スルファザメト；スルフイソキサゾール；スルフイソキサゾールアセチル；スルフイソキサゾールジオラミン；スルホミキシン；スロペネム；スルタミシリン；サンシリンナトリウム；タランピシリン塩酸塩；テイコプラニン；テマフロキサシン塩酸塩；テモシリン；テトラサイクリン；テトラサイクリン塩酸塩；テトラサイクリンリン酸塩複合体；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チフェンシリンカリウム；チカルシリンクレシルナトリウム；チカルシリン二ナトリウム；チカルシリン一ナトリウム；チクラトン；塩化チオドニウム；トブラマイシン；トブラマイシン硫酸塩；トスフロキサシン；トリメトプリム；トリメトプリム硫酸塩；トリスルファピリミジン；トロレアンドマイシン；トロスペクトマイシン硫酸塩；チロスリシン；バンコマイシン；バンコマイシン塩酸塩；ヴァージニアマイシン；またはゾルバマイシン。
【０１０５】
本明細書でさらに提供されるのは、細菌リボヌクレアーゼ、例えば、黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｐのタンパク質成分を阻害する方法である。一部の実施形態では、細菌リボヌクレアーゼは、ＲｎｐＡである。方法は、細菌リボヌクレアーゼを有効量の本明細書記載の１つまたは複数の化合物または組成物と接触させる段階を含む。このような量は、インビボまたはインビトロで、組成物の化合物または活性成分の治療に有効な濃度を実現するのに十分な量である。
【０１０６】
本明細書記載の方法および化合物は、予防および治療処理の両方に有用である。本明細書で使われる用語の治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）または治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）は、予防；発症の開始の遅延；発症後の徴候または症状の悪化の減少、根絶、または遅延；および再発の防止を含む。予防のための使用では、治療有効量の本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩が、発症の前に（例えば、細菌感染の明らかな徴候の前に）、早期発症の間に（例えば、細菌感染の初期徴候および症状時に）、または細菌感染の炎症反応または発生が確定した後で、対象に投与される。予防投与は、感染症状の顕在化の前の数日から数年の間、行うことができる。予防投与は、例えば、黄色ブドウ球菌に曝された対象の予防処置に使用できる。治療処置は、細菌感染が診断された後で、治療有効量の本明細書記載の化合物および組成物またはその薬学的に許容可能な塩を対象に投与する段階を含む。
【０１０７】
キット
また、本明細書で提供されるのは、対象の炎症または癌を治療または予防するためのキットである。キットには、いずれかの明細書記載の化合物または組成物を含むことができる。例えば、キットは、式Ｉの化合物を含むことができる。キットは、１つまたは複数の抗菌剤（例えば、オキサシリン）をさらに含むことができる。キットは、本明細書記載のいずれかの化合物または組成物の経口製剤を含むことができる。さらに、キットは、キットを使用するための使用法（例えば、対象を治療するための説明書）を含むことができる。
【０１０８】
以下の実施例は、本明細書記載の方法および化合物の特定の態様をさらに例示することを意図しており、添付の特許請求の範囲を限定する意図はない。
【実施例】
【０１０９】
黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解因子は、経験的に特定され、また、下記に示すように、有望な抗菌剤開発標的であることが明らかになった。これを行うために、黄色ブドウ球菌が感染を起こす能力は（その多くが研究室培養条件では細胞密度依存的に調節されている）広範なレパートリーの病原因子の一時的発現に部分的に起因しているという事実を利用した（Ｎｏｖｉｃｋ、Ｒ．Ｐ．、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４８：１４２９−１４４９（２００３）、を参照）。次いで、黄色ブドウ球菌病原因子発現における増殖期調節による変化が、ｍＲＮＡ分解のレベルで発生するか否か、およびこのプロセスに関与するタンパク質が生物体のＲＮＡ分解機構のメンバーを含みうるか否かを判定する調査を行った。そのために、ＧｅｎｅＣｈｉｐｓを使って、明確に特徴付けられた黄色ブドウ球菌病原因子の、対数期および定常期増殖の間の、ｍＲＮＡ崩壊速度を比較した。
【０１１０】
結果は、多くの黄色ブドウ球菌病原因子転写物のｍＲＮＡ代謝回転特性は、２つの増殖期の間で異なることを示した。さらに、対数期および定常期細胞の全体的ｍＲＮＡ崩壊特性が、劇的に異なることが明らかになった；８８４種の黄色ブドウ球菌ｍＲＮＡは、定常期増殖の間、安定化された。発現がｍＲＮＡ崩壊と相関する遺伝子の中にリボヌクレアーゼＰのタンパク質成分であるＲｎｐＡが含まれており、これが、バルクｍＲＮＡ代謝回転における何らかの役割を果たしている可能性があることが示唆される。その可能性と一致して、組換え黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡがインビトロでリボヌクレアーゼ活性を示し、ＲｎｐＡ枯渇細胞がｍＲＮＡ分解の減少を示すことが実証された。ＲｎｐＡは、哺乳類タンパク質とのアミノ酸保存性が低い必須黄色ブドウ球菌酵素であるため、それは、抗菌剤発見のための適切な標的である。このため、高スループットおよび二次選別アッセイを使って、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤を特定した。これらの薬剤の１つは、黄色ブドウ球菌ｍＲＮＡ代謝回転を阻害することを示し、高いＲｎｐＡ保存を伴って、ＭＲＳＡ、ＶＩＳＡ、およびＶＲＳＡ、ならびに他のグラム陽性病原体に対する抗菌活性を示し、かつ、マウス感染急性致死モデルにおける病原性は僅かであった。まとめると、これらの結果は、ＲｎｐＡが、今まで特性が明らかにされていない黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解機構のメンバーであることを示し、抗菌剤発見の標的としてのその有用性を確実なものとする。
【０１１１】
実施例１：黄色ブドウ球菌代謝回転の増殖期依存変化
半減期の測定のために、黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１、ＲＮ４２２０（ｐＣＮ５１；ＣｄＣｌ２誘導性プロモーターを含むプラスミド）、ＲＮ４２２０（ｐＲＮＰＡ；完全長ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡを産生できるｐＣＮ５１）、またはＲＮ４２２０（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．；ｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡを産生できるｐＣＮ５１）を中間対数期または定常期まで増殖させ、リファンピン（２００μｇ／ｍｌ）の添加により転写を停止させた。株ＵＡＭＳ−１に対し、転写停止後０、２．５、５、１５および３０分で一定量を回収した。試薬を保存するため、ＲＮ４２２０誘導体に対しては、転写停止後０および１０分に、一定量を回収した。平板培養の徹底により培養物は、リファンピン耐性を発生しなかった。４回評価したＲＮ４２２０ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．細胞以外は、各株および／または増殖期を２回評価した。ＲＮＡを各一定分量から単離し、標識し、黄色ブドウ球菌ＧｅｎｅＣｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）にハイブリダイズし、２回測定値を平均して、以前記載のように、全ｍＲＮＡ種のｍＲＮＡ半減期を測定した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。ＲＮＰＡ１０００暴露細胞のｍＲＮＡ代謝回転特性を測定するために、対数期黄色ブドウ球菌を、０．５Ｘ  ＭＩＣのＲｎｐＡ阻害剤または等容量の化合物溶媒（ＤＭＳＯ）で３０分間処理した。次に、転写物合成を停止し、転写停止後０および５分にｍＲＮＡ種の転写物力価を測定した（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。
【０１１２】
結果は、多くの（４１％）病原因子転写物のｍＲＮＡ代謝回転特性は、２つの増殖期の間で異なることを示し、ｍＲＮＡ代謝回転の調節された変化がそれらの発現に影響を与えることができることを示唆した。さらに、該生物体が、定常期特異的な少なくとも５つの小さな安定ＲＮＡ（ＳＳＲ）、すなわち仮定クラスの調節性ノンコーディングＲＮＡ分子を産生したことが観察された（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。さらに、対数期および定常期細胞の全体ｍＲＮＡ代謝回転特性は、かなり異なっていた。以前の測定値と一致して、大部分（９０％）の対数期転写物は、急速に分解し（５分以下の半減期）、９％は、中間的安定性を示し（５分を超え、３０分以下の半減期）、また１％は、安定である（３０分以上の半減期）ことが明らかになった（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：６７３９−６７５６（２００６）；Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８８：２５９３−２６０３（２００６）、を参照）。しかし、定常期増殖の間に、７６％、２１％、および３％のｍＲＮＡ種が、それぞれ、短期、中間的、および安定な半減期を示す（図１）。ＲＮａｓｅ  Ｊ１もＲＮａｓｅ  Ｙも、増殖期依存形式での異なった発現は認められなかった。定常期増殖の間に抑制された３６７遺伝子中に、リボヌクレアーゼＰのタンパク質成分をコードするｒｎｐＡが含まれていた。
【０１１３】
実施例２：黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡは、リボヌクレアーゼ活性を示し、細胞性ｍＲＮＡ分解に影響する
タンパク質精製
それぞれの推定上の黄色ブドウ球菌リボヌクレアーゼの予測読み枠を、ＰＣＲ増幅し、プラスミドｐＥＴ−３０Ｅｋ／ＬＩＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）の連結反応非依存性クローニング部位に挿入した。シーケンシングにより、これは、プラスミドのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性プロモーターの制御下で、ヘキサヒスチジンタグを各タンパク質のＮ末端に融合したことが確認された。形質転換の後で、各タンパク質は、ＩＰＴＧの存在下で増殖（４時間）させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から、Ｎｉ＋２親和性クロマトグラフィーにより精製された。さらに具体的には、１０ｇの細胞ペレットを、コンプリート、ミニ、ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤錠剤（Ｒｏｃｈｅ；Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）および２０ｍＭイミダゾールを含む５０ｍｌの緩衝液Ａ（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．４）中に懸濁した。１５，０００ｐｓｉでＥｍｕｌｓｉｆｅｘ−Ｃ３マイクロフルイダイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  Ｉｎｃ．；Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を７回通すことにより細胞を破砕した。１２，０００ｘｇで３０分間の遠心分離により細胞壊死組織片を取り除き、上清液をＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）の５ｍＬ  Ｎｉ−ＮＴＡ  ＦＦ−粗製アフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）に装填した。タンパク質は、緩衝液Ａ中の線形イミダゾール勾配（８０ｍＭ〜５００ｍＭ）で単一ピークとして溶出した。各タンパク質の存在を、Ｃｏｏｍａｓｉｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析分光法（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）により評価した。
【０１１４】
プラスミド
プラスミドｐＲＮＰＡ−ＳおよびｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．は、黄色ブドウ球菌シャトルベクターｐＣＮ５１の誘導性ＣｄＣｌ２の制御下の、それぞれセンスおよびアンチセンス配向の予測Ｓｈｉｎｅ−Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列を含む推定上のｒｎｐＡ転写ユニットを含む（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：６０７６−６０８５（２００４）、を参照）。簡単に説明すると、それぞれ、５'末端ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限酵素部位（下線部）を含むプライマー５'ＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＡＴＡＡＡＡＡＣＧＡＴＡＡＡＴＡＡＧＣＧＡＧＴＧＡＴＧＴＴＡ（順方向）（配列番号８）および５'ＧＧＴＡＣＣＴＴＡＣＴＴＡＡＴＣＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＡ（逆方向）（配列番号９）、または制限酵素配列が逆転されたプライマーを使って、ｒｎｐＡ読み枠および３４ｎｔ上流配列を黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１からＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターに連結し、増殖用に大腸菌ＩＮＶαＦ'細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中に形質転換した。その後、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使って精製した後、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化し、プラスミド挿入断片を遊離させ、これを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使ってゲル精製して、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ消化ｐＣＮ５１に連結した。ＤＮＡシーケンシングにより、プラスミドｐＲＮＰＡ−ＳおよびｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓの健全性を確認した。
【０１１５】
ウェスタンブロッティング
アフィニティー精製したＰｏｌｙＱｕｉｋウサギ黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡポリクローナル抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において生成した。２．５μＭ  ＣｄＣｌ２（ＲＮＡ発現誘導用）および１０μｇ／ｍｌエリスロマイシン（プラスミド維持用）を補充したＴＳＢ培地中で３０分間増殖後、全細菌タンパク質を、プラスミドベクター（ｐＣＮ５１）、ＲｎｐＡ過剰発現プラスミド（ｐＲＮＰＡ−Ｓ）またはＲｎｐＡアンチセンスＲＮＡプラスミド（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．）を含むＲＮ４２２０細胞から単離した。結果的なタンパク質濃度を、従来のＢｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定し、２．０μｇの各タンパク質試料または精製された黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ポリビニリデンフッ化物膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に移した。膜を１０％ミルクでブロッキングし、洗浄後、ウサギＲｎｐＡ抗体（１：１０００希釈）と共にインキュベートし、洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギ抗体（１：１０００希釈；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と共にインキュベートし、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬウェスタンブロッティングシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使って、メーカーの推奨に従い、処理した。
【０１１６】
結果
組換え黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡは、ｒＲＮＡおよびブドウ球菌性タンパク質Ａ（ｓｐａ）ｍＲＮＡ、ならびに試験した３つの他のｍＲＮＡ種の消化を触媒することが明らかになった（図２Ｂおよび２Ｃ）。他の推定上のＲＮａｓｅ  ＩＩＩを含む黄色ブドウ球菌リボヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩ、ＲＮａｓｅ  ＨＩＩＩ、ＲＮａｓｅ  Ｙ、ＲＮａｓｅ  Ｊ１、およびＢＮは、これらのアッセイ条件の間、等価のＲＮＡ分解活性を示さなかった（図２Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）分析により、観察されたリボヌクレアーゼ活性は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡの存在に関連していることが確認された（図２Ａ）。図２Ａで、約１７．２ｋＤａのバンド（実線矢印；バンド２）は、タンデム型質量分析（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）により、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡであると確認され、一方、少量の混入物の上位データ（点線矢印）は、大腸菌５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３（バンド１）またはアミノ酸１１〜１０７（バンド３および４）または１２〜１０７（バンド５）に対応する黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡポリペプチド断片であると判定された。にもかかわらず、上述のリボヌクレアーゼアッセイで使用された約１０００倍過剰（２５μｇ）なＲｎｐＡ精製産物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価は、タンパク質調製物内の微量の４つの追加のポリペプチドを示し、ＲｎｐＡ産物と一緒に大腸菌リボヌクレアーゼの混入が存在する可能性が提起された。ＭＡＬＤＩ分析は、これらのタンパク質の素性が、大腸菌リボソームタンパク質Ｌ３、および３つの黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ断片（これは、成熟選択的翻訳産物とは対照的に、タンパク質調製の間の完全長ＲｎｐＡのタンパク質分解を反映していると思われる）であることを示した。大腸菌リボヌクレアーゼは検出されず、タンパク質調製物のリボ核酸分解活性の原因は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡである可能性があることを示唆している。さらに、逆転写酵素媒介ＰＣＲは、大腸菌ｒｎｐＢが、調製物中に検出できなかったことを示し、ＲｎｐＡリボヌクレアーゼ活性は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡおよび大腸菌ｒｎｐＢ  ＲＮＡを含むキメラＲＮａｓｅ  Ｐ分子の形成に起因するものではないことを確証した。実際、インビトロ合成大腸菌ｒｎｐＢは、標準的および高Ｍｇ＋２反応条件の両方下で、黄色ブドウ球菌ＲＮＡ分解（単独）を触媒もせず、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ消化活性に影響もしなかった。
【０１１７】
黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｊ１は、ここで使用した反応条件下で低リボ核酸分解活性を示したが、その後の調査で、それは異なる条件下では強力なリボヌクレアーゼであることが示され（Ｅｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３３：２１４１−２１５２（２００５）、を参照）、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡの推定上のインビトロリボヌクレアーゼ活性をさらに評価するための対照としての使用が可能であった。さらに具体的には、ＲｎｐＡ媒介ｓｐａ  ｍＲＮＡ分解が、アフィニティー精製ウサギポリクローナル黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ抗体の添加により阻害できるか否かを評価した。最初の調査では、抗体は、ＲｎｐＡのおよびＲＮａｓｅ  Ｊ１のリボ核酸分解活性を制限することは示されなかった。しかし、免疫グロブリン混合物内の抗体のサブセットのみが、酵素の活性に影響を与えるＲｎｐＡエピトープを認識できるということを予測して、該抗体がＲｎｐＡ媒介転写物分解に対しどのような効果を及ぼすか（もしあれば）をモニタリングするためのより感度の高い手段としてｓｐａ消化産物の逆転写ＰＣＲ増幅を使った。結果から、抗体添加は、実際に、完全長ｓｐａｍ  ＲＮＡのＲｎｐＡ媒介分解を弱く阻害するが、ＲＮａｓｅ  Ｊ１活性に対しては効果を示さないことがわかった（図２Ｄ）。等量の免疫前の血清は、ＲｎｐＡ活性に効果を与えなかった。まとめると、これらのデータは、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡの今まで認識されていなかった機能とはＲＮＡ消化の機能であることを示唆している。
【０１１８】
必須の細菌ＲＮＡ代謝回転タンパク質の小分子阻害剤は、細菌増殖を妨害し、新規クラスの抗菌剤であることが期待される。この点について、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡは、必須酵素であることが報告され（Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１０：２９１（２００９）；Ｊｉｅｔａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９３：２２６６−２２６９（２００１）、参照）、従って、化学療法開発の標的と見なすことができる。実際、−３４〜＋３５３ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡ翻訳開始部位に相補的であると予測されるアンチセンスＲＮＡ分子の誘導が（プラスミドｐＣＮ５１の塩化カドミウム誘導性プロモーターの制御下で（Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、７０：６０７６−６０８５（２００４）、参照）、１０μＭ誘導因子の存在下の黄色ブドウ球菌増殖を制限した。逆に、対応するセンス鎖ＲＮＡ分子、または誘導因子の非存在下で、アンチセンスプラスミド株を発現している細胞では、増殖欠陥は観察されなかった（図６）。これらの結果は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡが、必須タンパク質であることを示す。さらに、このｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡ系を使って、ＲｎｐＡが黄色ブドウ球菌の細胞性ｍＲＮＡ代謝回転に影響を与えるか否かを評価した。このため、ＲＮＡ分解特性を、２．５μＭ  ＣｄＣｌ２の存在下で増殖の間に、プラスミドベクターのみを保有する細胞、または、ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡもしくはｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡプラスミド由来コピーを含む細胞について測定した。図６に示すように、それぞれｒｎｐＡ  ｍＲＮＡまたはｒｎｐＡアンチセンス発現株内で増加したまたは減少したＲｎｐＡ産生を可能とするがアンチセンスＲＮＡ産生株の細菌増殖を制限しない最適濃度を、経験的に、２．５μＭの塩化カドミウム濃度に決定した。結果的に、ＲＮＡ代謝回転分析は、低減したＲｎｐＡレベルが、多くのｍＲＮＡ種の安定化に相関することを示し、酵素が、バルク細胞性ＲＮＡ分解に寄与することを示唆した。さらに具体的には、ＲｎｐＡ高発現およびベクター含有細胞中で産生された全対数期転写物のそれぞれ、８８％および８７％が、１０分未満の半減期を示すことが明らかになった。ＲｎｐＡ過剰発現が細胞性ＲＮＡ分解を加速しなかったという知見は、そのタンパク質のＲＮＡ分解活性が、野性型レベルのまま残っているコファクターに依存するか、またはタンパク質が、ＲＮＡ代謝回転を有効に増加させる濃度に達しなかったことを示す可能性がある。それにも関わらず、ＲｎｐＡ欠損細胞中で産生された転写物の６３％が、１０分未満の半減期を示し、そのタンパク質が黄色ブドウ球菌ｍＲＮＡ代謝回転に寄与していることを示唆する（図５Ａ）。
【０１１９】
実施例３：ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤の特定
上記結果は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡが、インビトロでリボヌクレアーゼ活性を示し、細胞性ＲＮＡ分解に寄与する必須酵素であることを示す。さらに、このタンパク質は、グラム陽性細菌全体にわたりよく保存されているが、哺乳類タンパク質に対するアミノ酸保存性に欠け、このことにより新規抗生物質薬剤開発のための魅力的な標的となっている。そのために、蛍光ベース高スループットアッセイを使って、２９，０６６市販化合物（ＡｃｔｉＰｒｏｂｅ−２５Ｋおよび天然物ライブラリー；Ｔｉｍｔｅｃ；Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）に対し、ＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解の小分子阻害剤の選別を行った（図３Ａ）。
【０１２０】
具体的には、ＡｃｔｉＰｒｏｂｅ−２５Ｋおよび天然物ライブラリー（合計２９，９４０化合物；ＴｉｍＴｅｃ  Ｉｎｃ．；Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ）のメンバーに対し、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ媒介全細菌ＲＮＡ分解の小分子阻害剤を選別した。全ての反応（５０μｌ）を９６ウエル形式で行い、１Ｘ反応緩衝液（２ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ６．０）中の２０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡ、２００ｎｇ黄色ブドウ球菌全ＲＮＡ、および約５μＭの各化合物を含めた。混合物を３７℃で２０分間インキュベートし、この時点で、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（１００μｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、残っているＲＮＡ基質の量を定量した。パーセント酵素抑制を残余基質／開始基質＊１００として計算した。阻害用量設定アッセイとして、２０ｐｍｏｌ  ＲｎｐＡ単独（陽性対照）と共に、または漸増量（０、２５、５０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、および５００μＭ）のＲＮＰ１０００の存在下で、１ｐｍｏｌのｓｐａ  ｍＲＮＡを３７℃で１時間インキュベートした。この後、２０μｌの各反応混合物を、１．２％ホルムアルデヒド含有アガロースゲルの電気泳動に供し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【０１２１】
全体で１４個の分子が、酵素のＲＮＡ代謝回転活性を５０％以上阻害した。ゲルベース二次アッセイにより、これらの分子の内、５つが本物のＲｎｐＡ媒介ＲＮＡ分解阻害剤であることを確認した（図３Ｂ）。これらの化合物の内の１つであるＲＮＰＡ１０００（図３Ｃ；ＩＣ５０＝１００〜１２５μＭ）は、どの試験濃度（０〜７５０μＭ）でも、市販の大腸菌ＲＮａｓｅ  ＨＩ、ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ  Ｉまたは社内精製黄色ブドウ球菌ＲＮａｓｅ  Ｊ１の活性に影響を与えなかったが、穏やかに大腸菌ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ活性を阻害した（ＩＣ５０＝５００〜７５０μＭ；データは示さず）。これらおよび他のデータ（下記参照）により、ＲＮＰＡ１０００は黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡに対し特異性を有する可能性があることが示唆されるが、本発明者らは、全ての小分子と同様に、この薬剤が他の黄色ブドウ球菌酵素にも影響を与え得る可能性を排除することはできない。ＲｎｐＡ阻害剤が抗菌剤として潜在性を示すか否かを評価するために、一連の実験を行い、ＲＮＰＡ１０００が黄色ブドウ球菌増殖を阻害し、全身性感染モデルで黄色ブドウ球菌発病を制限できるか否かを評価した。
【０１２２】
実施例４：抗菌感受性試験
ＲＮ４２２０誘導体を除いて、ＲＮＰＡ１０００の細菌に対するインビトロ活性を、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従い、陽イオン調節Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスまたは５％溶解ウマ血液を補充したＭＨブロス（連鎖球菌属の試験用）を使って、ブロス微量希釈法により測定した。ＲＮＰＡ１０００の系列希釈（０、４、８、１６、３２、６４、および１２８μｇ／ｍｌ）を含むマイクロタイタープレートに、１０５コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）／ｍｌを播種し、３７℃で１８時間、インキュベートした。各単離物に対するＭＩＣを、裸眼で検出される生物体の増殖の完全阻害を示すＲＮＰＡ１０００の最小濃度として定義した。マイクロタイターウエルが、最初に増殖を完全阻害しなかった最小濃度（１６μｇ／ｍｌ）から増殖を完全阻害した濃度（３２μｇ／ｍｌ）までの範囲のＲＮＰＡ１０００の濃度の１μｇ／ｍｌの漸増を含むこと以外は同じ条件で、上述の手続きに従った繰り返し試験を行うことによって、各黄色ブドウ球菌株に対するＭＩＣをさらにリファインした。各黄色ブドウ球菌株に対するＭＩＣ値を繰り返し測定値（ｎ＝５）の中央値スコアとして決定した。ＭＩＣ以上のＲＮＰＡ１０００濃度を含むウエルを、最小殺菌量測定用に播種した。可能な場合は、ＶＲＳＡ株を有する実験を層流フード中で行い、生じうる設備混入を最小限にした。プラスミドベクター（ｐＣＮ５１）、ＲｎｐＡ過剰産生プラスミド（ｐＲＮＰＡ−Ｓ）またはＲｎｐＡ過少産生プラスミド（ｐＲＮＰＡ−Ａ．Ｓ．）を含むＲＮ４２２０細胞に対し、ＲＮＰＡ１０００のインビトロ抗菌活性測定を、２．５μＭ  ＣｄＣｌ２および０、１、２、４、８、１６、３２、６４、または１２８μｇ／ｍｌ  ＲＮＰＡ１０００を補充したトリプチックソイブロス培地中で細胞増殖させたこと以外は、上述の微量希釈法により行った。また、時間−殺菌アッセイを行い、黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１に対するＲＮＰＡ１０００の抗菌特性を、その株のＭＩＣの０．２５、０．５、２、および４倍量の非存在および存在下で、オキサシリン（１μｇ／ｍｌ）、リファンピシン（０．５μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（２μｇ／ｍｌ）、またはダプトマイシン（１μｇ／ｍｌ）に対し、モニタリングした。ＲＮＰＡ１０００および／または市販抗生物質の示した量を中間対数期（２Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌ）黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１細胞に添加し、３７℃でインキュベートした。抗菌剤暴露後０、２、４、８、および２４時間で一定量を取り出し、系列希釈し、得られたｃｆｕ／ｍｌを数えるために播種した。全ての時間−殺菌アッセイを少なくとも３回繰り返した。結果を表１に示す。
【０１２３】
【表１】
2014510717.tif 000021
a 生物体および関連抗生物質耐性表現型が提供される（括弧中）；メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）；バンコマイシン中程度感受性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）；バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）；多剤耐性肺炎球菌（ＭＤＲ）；バンコマイシン耐性フェシウム菌（ＶＲＥ）。
b黄色ブドウ球菌およびストレプトコッカス・ボビスを除いて、全ての株は、臨床血液単離物であった；ＵＳＡ型（Ｕ．Ｓ．ＭＲＳＡ系列）は、米国疾病予防管理センターから入手；黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１は、臨床骨髄炎単離物；単離物ＮＲＳ１、ＮＲＳ３、ＶＲＳ１およびＶＲＳ１０は、黄色ブドウ球菌（ＮＡＲＳＡ）抗菌剤耐性ネットワーク（Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  Ａｎｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＮＡＲＳＡ））から入手；ストレプトコッカス・ボビス株ＡＴＣＣ４９１４７は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手。
c 各黄色ブドウ球菌単離物は、５回試験した；他の生物体は、２回試験した。
d最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）の抗菌薬感受性試験のガイドラインに従って測定した。黄色ブドウ球菌ＭＲＳＡ単離物は、後でより正確に測定した。
【０１２４】
表１に示すように、ＲＮＰＡ１０００は、特徴が十分明らかにされた２つの遺伝子型の異なる黄色ブドウ球菌単離物のＵＡＭＳ−１（臨床的骨髄炎単離物；ＭＩＣ  ２６μｇ／ｍｌ）およびＵＳＡ３００−０１１４［米国市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染（ＭＲＳＡ）の主原因；ＭＩＣ  ２３μｇ／ｍｌ］、ならびに米国中に蔓延している代表的な他の主要ＭＲＳＡ系統（ＭｃＤｏｕｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４１：５１１３−５１２０（２００３）、参照）、に対し中等度の抗菌活性を示した。同様に、ＲＮＰＡ１０００は、バンコマイシン中程度感受性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）およびバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）に対しても、抗菌活性を示した。時間−殺菌アッセイは、ＲＮＰＡ１０００が静菌剤として作用し（図７、パネルＡ）、バンコマイシン、ダプトマイシン、またはリファンピシン、等の他の抗ブドウ球菌薬剤の抗菌活性には影響を与えないが（データは示さず）、オキサシリンの効力を少々増加させる（図７、パネルＢおよびＣ）ことを示した。ＲｎｐＡ阻害剤は、また、表皮ブドウ球菌、抗生物質感受性および多剤耐性の肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、ストレプトコッカス・アガラクチア、およびセレウス菌に対し抗菌活性を示した。ＲＮＰＡ１０００は、また、フェカリス菌、フェシウム菌およびバンコマイシン耐性フェシウム菌（ＶＲＥ）に対し少しの活性を示したが、大腸菌またはアシネトバクター・バウマンニの増殖に影響を与えなかった（表１）。後者は予測されていたが、これは、大腸菌とアシネトバクター・バウマンニのＲｎｐＡが、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡに対して、限定されたアミノ酸同一性（それぞれ、２４％と２６％）を有している（図８）ことが理由である。さらに、本発明者らのアッセイ条件では、精製されたアシネトバクター・バウマンニＲｎｐＡは、リボ核酸分解活性を示さなかった（データは示さず）。ＲＮＰＡ１０００に対する腸球菌の感受性は、エフラックスポンプ阻害薬レセルピンの存在下、ＭＩＣ  ６４μｇ／ｍｌから３２μｇ／ｍｌまで高まり、腸球菌が、ＲｎｐＡ阻害剤に対し本質的に感受性があることを示唆している。逆に、エフラック阻害薬は、アシネトバクター・バウマンニＲＮＰＡ１０００感受性に対し効果を及ぼさなかった（表１）。まとめると、これらの結果は、細菌のＲＮＰＡ１０００感受性は、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡに対するアミノ酸類似性および酵素のＲＮＡ分解活性に相関することを示す。
【０１２５】
黄色ブドウ球菌のＲＮＰＡ１０００に対する感受性が、細胞性ＲｎｐＡの抑制に起因するか否かを評価するために、阻害濃度以下のＲｎｐＡ阻害剤（０．５Ｘ  ＭＩＣ）に暴露された黄色ブドウ球菌のｍＲＮＡ代謝回転特性を直接測定した。処理の３０分後、モック処理された細胞に比較して、ＲＮＰＡ１０００は、黄色ブドウ球菌細胞のｍＲＮＡ分解速度を低減させた（図５Ａ）。従って、ＲｎｐＡ阻害化合物は、おそらく、酵素の細胞機能を制限することにより、細胞性ｍＲＮＡ分解を低減させると思われる。ＲＮＰＡ１０００処理細胞のｍＲＮＡ代謝回転特性は、ＲｎｐＡ枯渇細胞に似ており（図２Ｅ）、薬剤が酵素に影響を与えることができることを示唆する。ＲＮＰＡ１０００の抗菌効果が、ＲｎｐＡの細胞阻害により媒介されるか否かをより直接決定するために、黄色ブドウ球菌ＲｎｐＡ過剰産生および過少産生細胞のＲＮＰＡ１０００感受性を評価した。黄色ブドウ球菌含有ベクター、またはＣｄＣｌ２誘導性プロモーター制御下の野性型ｒｎｐＡ  ｍＲＮＡもしくはｒｎｐＡアンチセンスＲＮＡのプラスミドコピーを、２．５μＭの誘導因子および漸増濃度のＲＮＰＡ１０００の存在下、増殖させた。上述のように、この濃度の塩化カドミウムは、ＲｎｐＡタンパク質の発現の緩やかな変化（ＲｎｐＡ過剰産生または過少産生）を誘導するが、十分に緩やかなので、細胞増殖は影響を受けない。図５Ｂに示すように、ベクター含有細胞およびＲｎｐＡ過剰産生細胞の両方は、３２μｇｍｌ−１のＭＩＣを示し、他方、ＲｎｐＡ過少産生細胞のＭＩＣは、８μｇｍｌ−１であった。後者は、黄色ブドウ球菌のＲＮＰＡ１０００感受性が、細胞性ＲｎｐＡレベルに相関し、薬剤の抗菌作用様式は、一部は、ＲｎｐＡ依存性であることを示す。
【０１２６】
実施例５：細胞傷害性アッセイ
次に、効果的細菌ＭＩＣ値（１０〜５０μｇ／ｍｌ）に対応するＲｎｐＡ阻害剤濃度が、ヒトの細胞傷害を誘導するか否かを評価した。ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞（１０５細胞）を、マイクロタイタープレートの個別ウエルに播種し、５％二酸化炭素下、１０％胎仔ウシ血清を補充したダルベッコ変法イーグル培地中で、３７℃で１６時間、インキュベートした。細胞をマイトマイシンＣ（５μｇ／ｍｌ；陽性対照）または、０、２５、もしくは５０μｇ／ｍｌ  ＲＮＰＡ１０００に、２４もしくは４８時間、暴露した。メーカーの推奨（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関；Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）に従い、代謝的に活性な細胞内でのテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）の添加、および続けて還元後、分光測定（５７０ｎｍ）により細胞生存率を測定した。
【０１２７】
ＭＴＴ細胞増殖アッセイ測定により、２４時間のＲｎｐＡ阻害剤暴露は、試験したいずれの濃度でも、ヒトＨｅｐＧ２細胞毒性を引き起こさなかったことが示された（データは示さず）。しかし、長期ＲＮＰ１０００暴露（４８時間）は、２５μｇ／ｍｌの濃度で緩やかな細胞傷害性を誘発し、この値は、大部分のＭＲＳＡ系統の最小阻害濃度に匹敵し（図４Ａ）、さらに高い濃度は、毒性増加を示した（データは示さず）。
【０１２８】
実施例６：バイオフィルム関連細菌に対するＲｎｐＡ阻害剤の抗菌性有効性
黄色ブドウ球菌の細菌病原体としての成功は、移植された医用装置表面でのバイオフィルム形成能力に部分的に起因しており、おそらく、これが二次宿主部位への細菌転移のための病巣を提供するのであろう。バイオフィルム関連感染の治療における複雑な問題の１つは、バイオフィルム産生細菌は、抗生物質治療に対し本質的に抵抗性である事である。例えば、１つの最近のインビトロ調査では、本来各抗生物質に対し感受性であった株を使ったにもかかわらず、５Ｘ  ＭＩＣのダプトマイシン、リネゾリド、またはバンコマイシンは、２４時間処理後にバイオフィルム関連細菌を２ｌｏｇ未満に減らすことしかできず、３日間にわたり２０Ｘ  ＭＩＣを投与した場合でも、これらの抗生物質のいずれも、バイオフィルム関連黄色ブドウ球菌を除去できなかったことを示した（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、５３：２４７５−２４８２（２００９）、参照）。転写プロファイリング調査により、生理学的にユニークであるにもかかわらず、バイオフィルム関連黄色ブドウ球菌は、プランクトン様の定常期細胞に似ていることを示した（Ｂｅｅｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１８６：４６６５−４６８４（２００４）、参照）。実際、定常期細菌と同様に、ｒｎｐＡ発現は、対数期細胞に比べて、黄色ブドウ球菌バイオフィルム関連細菌およびバイオフィルム離脱細菌において、それぞれ、４．３および６．２倍減少した（Ｄｕｎｍａｎ  ａｎｄ  Ｈｏｒｓｗｉｌｌ、未発表）。低レベルのＲｎｐＡは、バイオフィルム関連細菌内に存在する可能性があるので、より少ないＲｎｐＡ阻害分子で、タンパク質の機能、従って、抗菌活性を妨害するのに充分である可能性がある。従って、バイオフィルム関連黄色ブドウ球菌は、ＲＮＰＡ１０００等のＲｎｐＡ阻害剤に対しかなりの感受性を示す可能性がある。
【０１２９】
これを確定するために、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、５３：２４７５−２４８２（２００９）に記載のように、インビトロバイオフィルムアッセイを行った。簡単に述べれば、１４ゲージのフッ素化エチレンプロピレンＩｎｔｒｏｃａｎ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｃａｔｈｅｔｅｒｓ（Ｂ．Ｂｒａｕｎ、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡ）の１ｃｍの断片をヒト血漿でコートし、２ｍｌのバイオフィルム培地および０．０５の最終ＯＤ６００ｎｍの黄色ブドウ球菌株ＵＡＭＳ−１を含む１２ウエルマイクロタイタープレートの個別ウエル中に置いた。３７℃で一晩インキュベーション後、カテーテルを取り出し、燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、黄色ブドウ球菌に対するＭＩＣの０、５、１０、または２０倍のＲＮＰＡ１０００を含む新しいバイオフィルム培地に移した。各用量（ｎ＝３）に暴露されたカテーテルを、毎日置換された培地と一緒に、３日間にわたり毎日回収した。各回収時点後に、カテーテルをＰＢＳで洗浄し、付着細菌を超音波処理および平板培養により数えた。対数変換細菌計算データの分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使って、ＲＮＰＡ１０００暴露の効果を評価した。
【０１３０】
図４Ｃに示すように、バイオフィルム関連黄色ブドウ球菌の５Ｘ  ＭＩＣのＲＮＰＡ１０００による２４時間処理により、細菌負荷量の３ｌｏｇの減少が生じ、短期暴露の間、この薬剤は、より強力とはいわないまでも、ダプトマイシン、バンコマイシン、またはリネゾリドと同等であることを示唆している。さらに、細菌の除去は実現されなかったものの、暴露時間を延ばすかまたはＲＮＰＡ１０００濃度を増やすことにより、抗菌活性が高められた。最大ＲＮＰＡ１０００抗菌効力（バイオフィルム関連細菌が５ｌｏｇ減少）は、同じモデルと条件で評価した市販の抗生物質の活性（６ｌｏｇ減少のダプトマイシン、５ｌｏｇ減少のリネゾリド；４ｌｏｇ減少のバンコマイシン）と遜色無かった（Ｗｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、５３：２４７５−２４８２（２００９）、参照）。まとめると、これらの結果は、ＲｎｐＡが、黄色ブドウ球菌バイオフィルム維持において重要な生物学的役割を果たしていること、および対応する阻害剤は、バイオフィルム関連感染の治療に幅広い治療的有用性を有する可能性があることを示唆している。
【０１３１】
実施例７：急性致死感染モデル
ＲＮＰＡ１０００は、短期ＨｅｐＧ２暴露で無毒性であり、長期ＨｅｐＧ２暴露でほんのわずかな毒性であったために、ＲｎｐＡ阻害分子が全身性マウス感染モデルに有効であるか否かを評価するための適切なツールとして使用可能である。雌５〜６週齢のＣＤ−１マウスに、野性型黄色ブドウ球菌株Ｓｍｉｔｈを腹腔内の注射（０．５ｍｌ）により投与し、４．５５Ｘ１０５コロニー形成単位／動物の最終的接種（１０−１００ＬＤ５０sに等価）が得られ、接種後２４時間以内に非処理対照動物（Ｎ＝５）の死亡を生じた。ＲＮＰＡ１０００をＤＭＳＯおよびＰＥＧ４００の１：１混合物中に可溶化し；バンコマイシンを水で調製した。動物（５匹／用量群）に、感染の３０分後、皮下注射（０．２ｍｌ）により、それぞれ１６、６４、および２５６ｍｇ／ｋｇまたは０．２５、１、４、および１６ｍｇ／ｋｇの、ＲＮＰＡ１０００またはバンコマイシンを投与した。全調査期間（５日）にわたり、未処置、単一用量のバンコマイシンを受けた、またはＲｎｐＡ阻害剤を受けた動物のパーセント生存を毎日記録した。結果を表２および図４Ｂに示す。
【０１３２】
【表２】
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【０１３３】
パーセント生存は、腹腔内の黄色ブドウ球菌注射およびＲＮＰＡ１０００投与の５日後の生存動物を意味する。括弧内の数字は、実験の繰り返し回数を示す。非処理対照マウスの各メンバーは、細菌接種２４時間以内に死亡した（０ｍｇ／ｋｇ）。バンコマイシンは、陽性対照として使った。
【０１３４】
図４Ｂに示すように、ＲＮＰＡ１０００の皮下注射は、ＣＤ−１マウスの腹腔内へ注射（４．５５Ｘ１０５ｃｆｕ／動物）した野性型黄色ブドウ球菌の致死の効果を制限した。この細菌接種（１０−１００ＬＤ５０sに等価）は、非処理対照動物の２４時間以内の１００％死亡を生じたが、ＲＮＰＡ１０００は、用量依存性方式で保護を提供した。最大ＲｎｐＡ阻害剤用量（２５６ｍｇ／ｋｇ）の投与は、再現性よく、５０％生存を生じ、一方、１２８ｍｇ／ｋｇおよび６４ｍｇ／ｋｇは、全調査期間にわたり、それぞれ３０％および２０％の生存を生じた（図４Ｂ；表２）。特に、化合物（単独）の投与計画は、いずれの試験濃度でも動物生存に影響を与えなかった（３２ｍｇ／ｋｇ、６４ｍｇ／ｋｇ、１２８ｍｇ／ｋｇ、２５６ｍｇ／ｋｇ；表２）。まとめると、これらの結果は、ＲＮＰＡ１０００は、６４〜２５６ｍｇ／ｋｇの中程度の有効量（ＥＤ５０）で、黄色ブドウ球菌感染の急性致死モデル中の細菌の病原性を制限することを示唆している。従って、ＲＮＰＡ１０００が、より強力な誘導体の医薬化学に基づく生成用のプラットフォームと見なすことができよう。これらの結果は、また、ＲｎｐＡ阻害薬剤が全身性マウス感染モデルに有効であるというコンセプト、およびＲＮＰＡ１０００が、感染プロセスに対するＲｎｐＡの寄与に関する研究のツールであるというコンセプトに証拠を提供する。
【０１３５】
添付の特許請求の範囲の化合物および方法は、本明細書記載の特定の化合物および方法により範囲を限定されることはなく、これらは、添付の特許請求の範囲の少数の態様の例示として意図されており、また、機能的に等価ないずれの化合物および方法も、本開示の範囲内にある。示されたおよび本明細書記載のものに加えて、化合物および方法の種々の改変も、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。さらに、ある代表的な化合物、方法、およびこれらの化合物の態様および方法のみが、具体的に記載されているが、他の化合物および方法ならびに化合物および方法の種々の特徴の組み合わせも、たとえ、具体的に説明されていなくても、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。従って、工程、要素、成分、または構成部分の組み合わせは、本明細書で明示的に述べることができるが、たとえ明示的に述べられていなくても、他の全ての工程、要素、成分、または構成部分の組み合わせも、含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年9月27日(2013.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2014510717.tif 000039
2014510717.tif 000040
2014510717.tif 000041