【事件の表示】
　特許第３０４４５６９号「ヒトＣ―ペプチドの測定方法」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０４４５６９号の請求項１に係る特許を取り消す。
【理　由】
１．手続の経緯
　特許第３０４４５６９号の請求項１に係る発明は、平成２年（１９９０年）１１月９日に出願され、平成１２年（２０００年）３月１７日に設定登録された。
　その後、申立人熊澤一、申立人小山久美子、及び申立人廣田雅紀より特許異議の申立てがあり、平成１３年３月８日付けで取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１３年５月２１日に訂正請求がなされるとともに意見書が提出された後、平成１３年６月２１日付けで再度取消理由通知がなされて、その指定期間内である平成１３年９月３日に意見書の提出がなされたものである。
　
２．訂正請求の適否
　平成１３年５月２１日付け訂正請求書による訂正請求（以下、本件訂正請求という）の適否について、以下検討する。
（１）訂正事項
　本件訂正請求は、つぎの訂正事項からなる。
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲の請求項１の「ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体（１）」を「ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する固相化抗体（１）」と訂正する。
＜訂正事項ｂ＞
　特許請求の範囲の請求項１の「抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体（２）」を「抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する標識化抗体（２）」と訂正する。
＜訂正事項ｃ＞
　特許請求の範囲の請求項１の「免疫反応生成物または未反応の抗体を定量する」を「免疫反応生成物または未反応の抗体を定量することにより、試料中のヒトＣ−ペプチドを０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定する」と訂正する。
(２)訂正事項の検討
　訂正事項ａは、本件明細書６頁１２行〜１５行（本件特許公報４欄４行〜６行）の記載に基づくものであり、「抗体（１）」を「固相化抗体（１）」に限定するものである。
　訂正事項ｂは、本件明細書明細書６頁１６行〜１８行（本件特許公報４欄７行〜９行）の記載に基づくものであり、「抗体（２）」を「標識化抗体（２）」に限定するものである。
　訂正事項ｃは、本件明細書明細書９頁１行〜２行（本件特許公報４欄４８行〜４９行）の記載に基づくものであり、本件特許の定量測定方法を「試料中のヒトＣ−ペプチドを０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定する」ものに限定するものである。
　そうすると、訂正事項ａ〜ｃは、本件明細書又は図面に記載した事項の範囲内の訂正であって、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。そして、訂正事項ａ〜ｃは、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
（３）訂正事項の検討結果
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き及び第２項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立てについての判断
（１）本件発明
  上記２．で示したように本件訂正請求は認められるから、本件特許の請求項１に係る発明（以下、「本件発明」という。）は、上記訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】
（ａ）・ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する固相化抗体（１）
　　・試料
　　・抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する標識化抗体（２）
　とを接触させ、
（ｂ）免疫反応生成物と未反応の抗体を分離し、
（ｃ）免疫反応生成物または未反応の抗体を定量することにより、試料中のヒトＣ−ペプチドを０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定する
ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法。」
　
（２）引用刊行物に記載された発明
　刊行物１：ACTA ACADEMIA MEDICINAE SINICAE Vol．11，NO．1，Feb．，（1989）p.46−51
　刊行物２：中華医学雑誌1988年第68巻第10期557〜560頁
　刊行物３：特開平２−２９３５号公報
　刊行物４：Journal of Immunological Methods，118，245−250，1989
　刊行物５：Clinica Chimica Acta，175，11−18，1988
　刊行物６：Neuroscience and Biobehavioral Reviews，12，199−204，1988
　刊行物７：Experimental Gerontology，25，331−338，1990
　刊行物８：CLIN．CHEM．35／5，804−807，1989
　刊行物９：特開昭６２−１３２１７２号公報
　
　当審が平成１３年３月８日付けで通知した取消理由で引用した刊行物１〜９は、上記のとおりのものであって、各刊行物には、次の事項が記載されている。
（ａ）刊行物１
　「ヒトプロインシュリンＣペプチドモノクローナル抗体の研究」という表題の論文である刊行物１には、アミノ酸残基数３１のポリペプチドであるヒトＣ−ペプチドに対して特異的な、認識部位を異にする複数の抗体について、
（ａ１）要約（４６頁４〜９行）には、「キャリアーとしての回虫蛋白質はＢＳＡやマウス血清アルブミン蛋白質より、マウスにおける半抗原ヒトプロインシュリンＣペプチド（ＨＣＰ）の免疫原性がずっと高い。ＮＳ−１ミエローマと、ＨＣＰ−回虫蛋白質結合物で免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓細胞とを融合することにより１２種の抗ＨＣＰモノクローナル抗体を得た。その内の８種のモノクローナル抗体に対して、Ｉｇクラスとサブクラスや、親和力及び特異性等を詳しく調べてみた。異なったＨＣＰの断片を置換した反応結果から、抗ＨＣＰモノクローナル抗体の抗原決定基は、ＨＣＰ分子の２３〜３１、２２〜３１及び１〜２２のアミノ酸残基からなる領域であることが推定できる。２０例の健康成人の空腹時の血漿ＨＣＰ測定値は、モノクローナル抗体−１を用いたＲＩＡ（０．２９±０．１３ｐｍｏｌ／ｍｌ）より、血清に対するウサギポリクローナル抗体を用いたＲＩＡ（０．４７±０．１６ｐｍｏｌ／ｍｌ）の方が高かった。」と記載され、
（ａ２）先行研究との関係について、「ヒトプロインシュリンＣペプチド（ＨＣＰ）の基礎的な研究及びそのラジオイムノアツセイ（ＲＩＡ）の臨床応用は２１年の歴史があるが、ＨＣＰの生物活性、抗原決定基及び血漿中のＨＣＰの不均一性（Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅ ｉ ｔｙ）の原因と意義などについては今日まで不明である。抗ＨＣＰモノクローン抗体（ＭｃＡｂ）はそれらの問題の解明に有効な手段であるが、ＨＣＰがＢＡＬＢ／ｃマウスに対する免疫原性は極めて低いことから、これまで抗ＨＣＰモノクローナル抗体の作製が成功したとの報告はない。この報文においては、回虫蛋白を用いた場合に、ＨＣＰがＢＡＬＢ／ｃマウスに対する免疫原性を高めることができ、本研究室で調製された８種の抗ＨＣＰモノクローナル抗体の主要な特徴、抗原決定基が存在する部位及び血清に対するポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を用いて血漿ＨＣＰをＲＩＡにより測定した結果などを報告する。」と記載されており（４６頁１１〜１７行）、
（ａ３）得られたポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の抗原決定基について、
「ＨＣＰ（ヒトＣ−ペプチド）の抗原決定基の数及び組成は、これまで不明であった。異なったＨＣＰ断片による置換反応と競合性抑制曲線の結果、次のことが判明した。
（１）ポリクローナル抗体Ｒ２３０３とＭ２は、Ｎ及びＣ末端、その中間領域に対する抗体を含む。Ｒ２３０３はＮ末端と中間領域に対する抗体が主であり、Ｍ２はＮとＣ末端の抗体を主に含有する。
（２）モノクローナル抗体１〜３については、125Ｉ−Ｔｙｒ−ＨＣＰに対する異なったＨＣＰ断片の置換反応の強さは、強から弱の順で、Ｆ（１３〜３１）＞Ｆ（２０〜３１）＞Ｆ（２３〜３１）＞Ｆ（１０〜２２）＝Ｆ（１〜２２）であり、これは抗原決定部位がＨＣＰのＣ末端の２２〜３１アミノ酸領域にあることを示す。
（３）モノクローナル抗体４〜６については、Ｆ（１〜２２）及びＦ（１０〜２２）と反応せず、抗原決定部位がＨＣＰのＣ末端２３〜３１アミノ酸領域にあることを示す。
（４）モノクローナル抗体７，８については、ＨＣＰのＮ末端１〜２０アミノ酸領域に抗原決定部位があり、このためＨＣＰのＣ末端２０〜３１及び２３〜３１には全く反応しない。」と記載されている（４９頁２３〜３１行、なお丸数字は括弧内数字に書き換えてある。）とともに、
（ａ４）得られた抗体を使用したＲＩＡでの測定感度について、図３の結果から特異性抗体であるモノクローナル抗体−１とポリクローナル抗体Ｒ２３０３との標準曲線はほぼ平行しており、モノクローナル抗体測定の感度（０．０５ｐｍｏｌ／ｍｌ）はポリクローナル抗体（０．０３ｐｍｏｌ／ｍｌ）よりやや低いことが記載されている（４９頁７〜８行、図３）。
　
（ｂ）刊行物２
　刊行物２は、「抗プロインシュリン　インシュリンとＣペプチドモノクローナル抗体の特徴及び応用」と題する論文であって、そこには、８種の抗ＨＣＰモノクローナル抗体とポリクローナル抗体（Ｒ２３０３）について、そのエピトープ部位、ＲＩＡでの標準曲線等、刊行物１と同様の記載がある。
　
（ｃ）刊行物３〜刊行物８
　刊行物３には、従前、競合法を利用したＲＩＡにおいて測定されていて、モノクローナル抗体によるサンドイッチ法が確立されていない（第２頁右上欄１２〜１６行）、アミノ酸残基数７〜１０のペプチドであるアンジオテンシンを測定する方法において、アンジオテンシンを認識し、認識部位の相異なる２種類のモノクローナル抗体を用いて、サンドイッチ法により免疫測定法を行うことが記載され（特許請求の範囲等）、サンドイッチ法により、従来よりも高感度、簡便、迅速、安価にアンジオテンシンを測定することができることが記載されている（第３頁右上欄末行〜左下欄７行）。
　刊行物４は、「ヒトエンドセリン用高感度サンドイッチ酵素免疫測定法」と題する論文であって、刊行物４には、２１アミノ酸からなるヒトエンドセリンを、２種類の異なる捕獲用及び検出用抗エンドセリン抗体を用いたサンドイッチ法に基づいて測定すること、エンドセリンＣ−末端へプタペプチドに反応しなかった抗エンドセリンモノクローナル抗体ＡＷＥＴＮ４０を、固定抗体として、エンドセリンＣ末端へプタペプチドに対するウサギ抗体のＦａｂ′ 断片を、ホースラディッシュベルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合させ、酵素標識検出用抗体として使用したこと、このアッセイには、０．２ｐｇ／ウエル（８０ａｍｏｌ／ウエル）のような少量のエンドセリンを検出しうる充分な感度があることが記載されている（要約等）。
　刊行物５は、「α−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチドの酵素免疫分析−血漿レベルでの直接測定」と題する論文であって、刊行物５には、分子内にＳ−Ｓ結合を有する２８アミノ酸からなるポリペプチドであるα−ヒト心房性ナトリウム利尿ポリペプチド（α−ｈＡＮＰ）のサンドイッチ酵素免疫測定法として、ポリスチレンボールをα−ｈＡＮＰのリング構造のＮ末端側半分に特異的なモノクローナルＩｇＧ１でコートし、α−ｈＡＮＰのＣ末端（１７−２８）に特異的なウサギＦａｂ’をホースラディッシュペルオキシダーゼと結合させ、上記ポリスチレンボールを、α−ｈＡＮＰスタンダード、又は血漿とインキユベートし、次に上記結合物とインキュベートして、ペルオキシダーゼの結合活性を測定する方法が記載され（要約等）、α−ｈＡＮＰの測定限界は、３０ｆｇ（ｌ０ａｍｏｌ）／チューブ（図２）で、５０μｌの血漿使用時には血漿α−ｈＡＮＰの最低検出レベルは０．６ｎｇ（０．２ｐｍｏｌ）／ｌだったことが記載されている（第１５頁１〜５行）。
　刊行物６は、「固相としてニトロセルロースを用いた新規ツー−サイト放射免疫測定法」と題する論文であって、刊行物６には、無処理の脳組織検体のアセチル化していないβ−エンドルフイン（βｈ−ＥＰ）に対する高度に特異的な直接定量に利用でき、１０ｆｍｏｌ／ウエルの測定限度を有するツー−サイト（ｔｗｏ−ｓｉｔｅ）放射免疫測定法を開発したこと、その測定法には，明確な特異性を有する異なる２抗体を用い、βｈ−ＥＰの中心とＣ末端の間に結合するウサギのポリクローナル抗βｈ−ＥＰ抗体を、高タンパク質結合能を有する固相であるニトロセルロースメンブレンディスク上に固定し、次に２段階のインキュベーション，まずβｈ−ＥＰを含む無処理の組織抽出物、あるいはβｈ−ＥＰスタンダード、を加え、更にβｈ−ＥＰのＮ末端に対して機能するモノクローナル３−Ｅ７マウス抗体を125Ｉで標識して加えて、行ったことが記載されており（要約等）、βｈ−ＥＰはアミノ酸残基数３１のポリペプチドである。
　刊行物７は、「カルシトニンの生物活性及びその評価」と題する論文であって、プレートをモノクローナル抗体１で被覆し固相抗体とし、アナライトであるカルシトニンを加えその第１のサイトで固相抗体と結合させ、次にアルカリホスホターゼで標識したモノクローナル抗体２を加えて結合アナライト上の２番目のサイトで結合させることにより、アナライト濃度に正比例する結合した標識化抗体量を標識酵素の活性測定により測定するｔｗｏ−ｓ ｉ ｔｅサンドイッチ測定法が説明図と共に記載され（３３５頁３〜１０行、図４）、この方法を用いたヒトカルシトニンのｔｗｏ−ｓ ｉ ｔｅモノクローナル抗体測定は、その特異性、感度、測定速度において、従来のＲＩＡより格段に優れており、このことは、他のペプチドにも当てはまることとも記載されており（３３５頁１０〜１２行）、ヒトカルシトニンは、アミノ酸残基数３２のポリペプチドである。
　刊行物８は、「アビジン−ビオチン分離を用いたコルチコトロピンの放射免疫測定法」と題する論文であって、刊行物８には、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）に対する測定限界２ｎｇ／Ｌのサンドイッチ型放射免疫測定法を開発したこと、その方法には、以下の２つの抗体；（ｉ）ＡＣＴＨ［１−１７］に対するマウスのモノクローナル抗体を125Ｉで標識したもの、（ii）ＡＣＴＨ［３４−３９］に対するヤギの純粋ポリクローナル抗体をビオチン化したもの、を使用し、ＡＣＴＨとの結合しない125Ｉで標識した抗体から、ＡＣＴＨに結合する125Ｉで標識した抗体を、アビジン−ビオチン・ブリッジ（アビジンはポリスチレンボールと結合するもの）を用いて分離することに成功したことが記載されており（要約等）、ＡＣＴＨはアミノ酸残基３９のポリペプチドである。
　
（ｄ）刊行物９
　刊行物９には、「不溶性担体に保有させたアミノ基と、ヒトプロインシュリンＣ−ペプチドに特異的なイムノグロブリン由来の部分還元抗体が保有するチオール基とが、ヘテロ二官能性架橋剤残基を介して結合していることを特徴とする固相化抗体」（特許請求の範囲第１項）を使用して、いわゆる競合法による常法のＲＩＡで０．０４９ｎｇ／ｍｌから１２ｎｇ／ｍｌを越える範囲でＣ−ペプチド濃度を測定した標準曲線が記載されている（第４頁右下欄９行〜第５頁左欄４行、図面）。
　
（３）本件発明の進歩性についての検討
イ）本件特許出願前には、免疫測定法のうちの「サンドイッチ法」として、
『（Ａ）・試料中の被測定物質を特異的に認識する固相化抗体（１）
　　・試料
　　・抗体（１）とは異なる部位で被測定物質を特異的に認識する標識化抗体（２）
　とを接触させ、
（Ｂ）免疫反応生成物と未反応の抗体を分離し、
（Ｃ）免疫反応生成物または未反応の抗体を定量することにより、試料中の被測定物質測定する被測定物質の測定方法。』が周知である。
　本件発明は、ヒトＣ−ペプチドの測定に、このサンドイッチ法を適用した方法の発明に相当し、「試料中のヒトＣ−ペプチドを０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定する」ことを特徴とするものである。
　
ロ）サンドイッチ法を適用するためには、異なる認識部位で被測定物質を特異的に認識する２種類の抗体が、固相化抗体と標識化抗体として必要となるが、ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体については、上記刊行物１〜２に記載されているように、ヒトＣ−ペプチドの異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する複数のモノクローナル抗体およびポリクロール抗体が得られることが、本件特許発明の出願前に公知である。そして、従来、競合法であるＲＩＡで免疫分析されていた、ヒトＣ−ペプチドと同様に比較的分子量の小さい（アミノ酸残基数７〜３９）種々のポリペプチドを、サンドイッチ法により測定することにより、ＲＩＡよりも測定感度や特異性などの点で優れた測定方法が得られることが刊行物３〜８に記載されているように公知であるから、刊行物９にも記載のように、従来、ヒトＣ−ペプチドに対する１種類の抗体しか必要としないＲＩＡで測定されていたヒトＣ−ペプチドを、異なる認識部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する２種類の抗体を利用して、サンドイッチ法により測定してみようとすることは、当業者が容易に想到し得ることである。
　
ハ）なお、特許権者は、刊行物１，２では、ヒトＣ−ペプチドの認識部位を異にする複数種のモノクローナル抗体を取得しながらも、それらを競合法に使用することを開示するだけであり、刊行物３〜８にはヒトＣ−ペプチドでのサンドイッチ測定法については何ら開示、示唆はないし、刊行物９記載の競合法は本件発明のサンドイッチ法とは測定原理の異なる全くの別法で、刊行物９にはサンドイッチ法を用いる動機付けもない旨主張し、ヒトＣ−ペプチドのサンドイッチ法による測定について、（ｉ）よりインタクト（全長）に近いヒトＣ−ペプチドをできる、（ii）ヒトＣ−ペプチド低濃度領域、とりわけ０．１ｎｇ／ｍｌ付近を、競合法より正確に測定でき、より正確な診断ができる、という利点があることを挙げている（平成１３年５月２１日提出意見書）。
　なるほど、刊行物１，２には認識部位を異にする複数種のモノクローナル抗体のサンドイッチ法への利用について言及する記載はないが、血液や尿中に極微量存在する物質を分析する免疫測定法の分野において、認識部位を異にする２種類の抗体を用い、免疫反応物と未反応の抗体を分離するサンドイッチ法は、その測定原理からして、競合法に比べて、特許権者の挙げる利点のような、より正確な測定が可能なことは技術常識であり、特許権者自身も認めているところである（前記意見書第６頁下から５〜１行）。
　そうすると、従来ＲＩＡしか行われていない被測定物質であっても、サンドイッチ法に必要な認識部位を異にする２種類の抗体が入手可能であれば、サンドイッチ法による測定を行ってみるようなことは、当業者が普通に行ってみる範囲内の事項であって、認識部位を異にする複数種の抗体の入手方法に関する刊行物にサンドイッチ法への利用が記載されていないことが、直ちに、記載された方法で入手される複数種の抗体を利用してサンドイッチ法による測定を行ってみることを阻害する要因となるものではない。
　
ニ）また、「試料中のヒトＣ−ペプチドを０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定する」点についても、ヒトＣ−ペプチドの測定に周知のサンドイッチ法を適用するために、本件発明において、例えば使用する抗体の作成、入手方法やその分析手法等に特別な技術的工夫がなされたとの記載も、本件特許明細書にはないし、特許権者も、本件発明において使用される２種のヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体は、特定の入手方法によって得られる抗体や、特定の製造方法により得られる抗体を使用することによって得られたものではなく、特許明細書の発明の詳細な説明に記載されているように、モノクローナル抗体については、Ｋｏｈｌｅｒらの公知の方法に準じて製造できるものであり、ポリクローナル抗体としてはヒトＣ−ペプチドに対する抗血清またはモノクロナール抗体の混合物を用いるものである旨主張しているものである（平成１３年９月３日付け意見書（２−１）項）から、同様にＫｏｈｌｅｒらの公知方法に準じて製造されている刊行物１，２に記載の方法で製造されたモノクローナル抗体やヒトＣ−ペプチドに対する抗血清であるポリクローナル抗体を使用したサンドイッチ法においても、同様に得られる測定感度と認められるものである。また、１種の固相化抗体を使用する刊行物９記載の方法においても、可能な測定感度であり、刊行物４，５記載のヒトＣ−ペプチドとそれほど変わらない分子量のポリペプチドのサンドイッチ法による測定感度からみても、上記の範囲内で測定できることが、当業者の予測できない格別の効果であるとも認められない。
　
４．以上のとおりであるから、本件発明は、周知技術および上記刊行物１〜９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　したがって、本件発明についての特許は拒絶の査定をしなければならない特許出願に対してされたものと認める。
　よって、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第１４条の規定に基づく、特許法等の一部を改正する法律の施行に伴う経過措置を定める政令（平成７年政令第２０５号）第４条第２項の規定ににより、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１４年５月１６日（２００２．５．１６）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ヒトＣ−ペプチドの測定方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】
（ａ）・ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する固相化抗体（１）
　　　・試料
　　　・抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する標識化抗体（２）
　とを接触させ、
（ｂ）免疫反応生成物と未反応の抗体を分離し、
（ｃ）免疫反応生成物または未反応の抗体を定量することにより、試料中のヒトＣ−ペプチドを０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定する
ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法。
【発明の詳細な説明】
　（産業上の利用分野）
　本発明はヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体を使用したヒトＣ−ペプチドの測定方法に関するものである。
　ヒトＣ−ペプチドは、インスリンの生合成の過程においてプロインスリンの分解によって生じる３１個のアミノ酸からなるペプチドである。ヒトＣ−ペプチドは、膵β細胞内にインスリンと等モル存在し、刺激に応じて血中に分泌されている。したがって、インスリンとＣ−ペプチドの分泌動態には、ある程度の相関関係がある。そこで、血中や尿中のヒトＣ−ペプチドを測定することにより、インスリン依存性糖尿病やインスリン非依存性糖尿病、インスリノーマやインスリン自己免疫症候群の診断を行うことが出来る。さらに血中のインスリンの測定を共に行うことにより、より信頼性の高い診断が可能になる。
　（従来の技術）
　ヒトＣ−ペプチドの測定法としては、ポリクロ−ナル抗体を用いた競合法による放射免疫測定法（特開昭５２−２５７６７，特開昭５７−３７５８６，特開昭６２−１３２１７２など）、ポリクロ−ナル抗体を用いた競合法による酵素免疫測定法（特開平１−１６５９６２）が知られている。
　（発明が解決しようとする課題）
　従来知られている放射免疫測定法においては、放射性同位元素を用いるため、取扱い者の安全性や、廃棄処理の問題、さらに放射性物質を取り扱うための特殊な施設や特別な測定装置を用意する必要がある。
　またポリクローナル抗体を用いる方法は、常に一定の性能を持った抗血清を作製するのが容易でなく、ポリクローナル抗体の品質管理に不便な点がある。
　（課題を解決するための手段）
　本発明者らは従来技術の問題点を解決するべく、操作が簡単で測定制度の高いヒトＣ−ペプチドの測定方法について鋭意検討したところ、これらの問題点を解決できることを見出だし、本発明を完成させた。すなわち本発明は、
（１）
（ａ）ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体（１）
　　　試料
　　　抗体（１）とは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを特異的に認識する抗体（２）
　とを接触させ、
（ｂ）免疫反応生成物と未反応の抗体を分離し、
（ｃ）免疫反応生成物または未反応の抗体を定量する
ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法
および
（２）
（ａ）ヒトＣ−ペプチドを特異的に認識するモノクロ−ナル抗体
　　　試料
　　　標識されたヒトＣ−ペプチド
　を接触させ、
（ｂ）免疫反応生成物と未反応の標識されたヒトＣ−ペプチドを分離し、
（ｃ）免疫反応生成物または未反応の標識されたヒトＣ−ペプチドを検出する
ことを特徴とする試料中のヒトＣ−ペプチドの測定方法
である。以下、本発明をさらに詳細に説明する。
　まず第１のサンドイッチ法について説明する。本発明方法において、モノクロ−ナル抗体を用いる場合は、それ自体公知である方法（Ｇ．Ｋｏｈｌｅｒ，Ｃ．Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，
２５６
　本発明方法に用いられる抗体を固相に固定化する場合、その方法は、公知の方法を採用でき、固相としては例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカ−ボネ−ト、セファロ−ス粒子、ラテックス、アガロ−ス、セルロ−ス、ポリメタアクリレ−トなどが使用される。本発明では免疫反応後に反応生成物と未反応物とを分離するため、抗体（１）は、以上のような固相に固定化することが好ましい。
　一方、抗体（２）は、免疫反応後の免疫反応物または未反応の抗体（２）の検出を行いやすくするため、標識化されていることが好ましい。抗体の標識化の方法とその検出方法もなんら限定されるものでなく、公知の方法により標識化および検出することができる。標識として酵素を用いる場合、標識物質としては例えば、ペルオキシダ−ゼ、β−Ｄ−ガラクトシダ−ゼ、アルカリホスファタ−ゼ、ウレア−ゼ、カタラ−ゼ、β−グルクロニダ−ゼなどが使われる。標識として放射性物質を用いる場合、３Ｈ，１２５Ｉ，または１３１Ｉ等が、蛍光物質を使用する場合は、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンチオシアネ−ト、テトラロ−ダミンイソチオシアネ−ト（ＴＲＩＴＣ）等が常法によりモノクロ−ナル抗体に結合される。しかしながら、標識物質は上記物質に何ら限定されるべきものではない。
　また、抗体（２）を標識しなかった場合は、免疫反応生成物または抗体（２）を特異的に認識する標識された第３の抗体を用いて、反応生成物または未反応物を検出すればよい。
　以上のような試薬を用いてサンドイッチ法を行えばよい。その際、試薬の試料との接触順序にはとくに限定はなく、順次接触させてもよく、また、一度に反応させてもよい。このとき抗体（２）が、標識化されていない場合、先程の第３の抗体をも反応させる。最後に、免疫反応生成物と未反応物を分離し、免疫反応生成物、未反応の抗体（２）またはそれらと反応した第３の抗体の標識を検出すればよい。
　次に競合法について説明する。競合法においては、用いられる抗体はモノクローナル抗体であり、固相化されることが好ましい。一方、標識化されたヒトＣ−ペプチドを用い、これと試料中のヒトＣ−ペプチドをモノクローナル抗体に対し、競合的に反応を行わせ、反応生成物を未反応の標識化ヒトＣ−ペプチドと分離し、どちらか一方の標識を検出すればよい。競合法に用いられる固相およびその方法、標識およびその方法などは、サンドイッチ法に用いられるものと実質的に同様である。
　測定に使用される試薬は、上記物質以外にも、基質、溶解剤、緩衝剤、洗浄剤、反応停止剤等の公知の試薬が用いられる。
　（発明の効果）
　以上の説明から明らかなように本発明によれば、
（１）試料中のヒトＣ−ペプチド濃度は、０．１〜５０ｎｇ／ｍｌの範囲内で測定することができ、
（２）従来法に比べて極めて簡便な操作で、安全に、短期間にかつ感度よく多数の検体の測定が可能である。
　（実施例）
　以下に本発明の詳細な実施例を説明する。しかし、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
　実施例１
　２種類のモノクローナル抗体を用いたヒトＣ−ペプチドヒトの測定
　（Ａ）抗ヒトＣ−ペプチド抗体の固定化
　未処理マイクロタイタ−プレ−ト（９６ウエル・ヌンクプレ−ト、インタ−メッド社製）の各ウエルに０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）に溶解した１０μｇ／ｍｌのマウス由来の抗ヒトＣ−ペプチド抗体（名称Ａ）の溶液１００μｌを加えて、４℃一夜インキュベ−トした。
　次に、各ウエルの溶液を除去し、リン酸緩衝化生理食塩水（０．８５％ＮａＣｌ含有０．０１％リン酸緩衝液、ｐＨ７．２：以下ＰＢＳ）に０．０４％ツイ−ン（ｔｗｅｅｎ）−２０を含んだ溶液（以下ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、１．０％ウシ血清アルブミン（以下ＢＳＡ）を溶解したＰＢＳ−Ｔ溶液３００μｌを各ウエルに加えて、４℃でブロッキング処理しそのまま保存した。
　（Ｂ）アルカリフォスファターゼ（以下ＡＰ）標識抗体の調製
　ＰＢＳに溶解したＡＰ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）にＮ−サクシンイミジル−３−（２’−ピリジルジチオ）プロピオネートのエタノ−ル溶液を加え、室温にて１時間反応させた後、ＰＢＳで透析した。また、ＰＢＳに溶解した１ｍｇのマウス由来抗ヒトＣ−ペプチドモノクロ−ナル抗体（Ａとは異なる部位でヒトＣ−ペプチドを認識するもの）溶液にＳ−アセチルメルカプト無水コハク酸の１，４ジオキサン溶液を加えて３０℃で１時間反応させた後、ＰＢＳで透析した。次に、ＡＰ溶液とマウス由来抗ヒトＣ−ペプチドモノクロ−ナル抗体溶液を混合し、１Ｍヒドロキシルアミン溶液を加えて４℃中で一晩放置した。この後、上記反応溶液からＴＳＫ−ゲルＧ−３０００ＳＷ（東ソ−株式会社製、商品名）を用いる高速液体クロマトグラフィ−により、ＡＰ標識抗ヒトＣ−ペプチドモノクロ−ナル抗体を精製した。
　（Ｃ）試料中のヒトＣ−ペプチドの定量
　本実施例中の（Ａ）で記述した方法で作製したマイクロタイタ−プレ−トを室温にもどし、ＰＢＳ−Ｔ溶液で洗浄した後、ヒトＣ−ペプチドを含む標準試料（０〜５０ｎｇ／ｍｌ）を各ウエルにそれぞれ５０μｌ加えた。つぎに本実施例（Ｂ）で得たＡＰ標識抗体をＰＢＳ−Ｔ溶液で希釈し、各ウエルに５０μｌずつ添加した。そのまま室温で２時間インキュベ−トした後、溶液を除去しＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。それに、３ｍｇ／ｍｌ　Ｐ−ニトロフェニルフォスフェート３ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ塩化マグネシウムを含有する５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）から成る基質溶液を各ウエルに１００μｌ添加し、室温で３０分間酵素反応させた後、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を１００μｌ加えて酵素反応を停止させた。上記マイクロタイタ−プレ−トを各ウエルについて、波長４０５ｎｍ、対照波長４９２ｎｍの吸光強度を自動マイクロタイタ−プレ−トリ−ダ（東ソー株式会社製、ＭＰＲ−Ａ４、商品名）で測定した。結果を表１に示した。
　実施例２
　ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を用いるヒトＣ−ペプチドの測定固定化抗体として、ラビット由来の抗ヒトＣ−ペプチド抗体溶液を用いた以外は実施例１と同様にして実験を行った。結果を表２に示す。