(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補化合物が昆虫の一過性受容体電位V(TRPV)チャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法であって、
(a)昆虫TRPVチャネルを発現している第1の細胞を用意するステップ、
(b)第1の細胞を候補化合物と接触させるステップ、及び
(c)昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップであり、ここで、該調節が、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定するステップ
を含み、
ここで、アッセイするステップが、以下の:
(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は
(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ、又は
(3)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、又は
(4)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ、又は
(5)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TRPVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、又は
(6)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TRPVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、
前記方法。
【請求項２】
候補化合物が、第1の細胞におけるカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも20％調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
候補化合物が、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
候補化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
第1の細胞が、昆虫のNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率が約1：1である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
候補化合物が、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せから成る群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
(a)哺乳動物TRPVチャネルを発現する第2の細胞を用意するステップ、
(b)前記第2の細胞を候補化合物と接触させるステップ、
(c)哺乳動物TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップ、
(d)昆虫TRPVチャネルの調節と、哺乳動物TRPVチャネルの調節を比較するステップ
を更に含み、ここで、哺乳動物TRPVチャネルと比較して、昆虫TRPVチャネルの調節の増加は、昆虫TRPVチャネルの選択的調節因子として候補化合物を特定する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を、哺乳動物TRPVチャネルと比較して少なくとも10％調節する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
特定された候補化合物が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫において見出される昆虫TRPVチャネルの調節因子である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ類(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ類(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ類(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ類(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ類(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ類(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ類(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、2013年12月23日に出願された米国仮特許出願第61/920,201号の合衆国法典第35巻第119条(e)による出願日の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照により全体として本明細書に組み込まれる。このASCIIコピーは、2014年12月18日に作製され、13783-119_SL.txtと名称が付けられ、大きさは633,858バイトである。
【０００３】
本発明は、概して、細胞における昆虫の一過性受容体電位V(TRPV)チャネルの生物学的活性を調節する薬剤を決定するための方法に関する。また、本発明は、昆虫を防除するための組成物及び方法、並びに昆虫TRPVチャネルをコードするベクター及び昆虫TRPVチャネルを含む細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
ほとんど全ての作物、植物、及び商業的農業地帯は、植物害虫による攻撃を受けやすい。植物害虫は、世界の商業的に重要な農作物の損失の主な要因であり、農業従事者に対する経済的苦難と、世界の多くの地域での地域住民のための栄養欠乏の両方をもたらす。言い換えれば、害虫は、ヒトの農業、食料供給、収穫後の貯蔵、園芸、動物の健康及び公衆衛生に多大な損失及び損害の原因となる。
【０００５】
これらの昆虫の防除は進歩してきており、これらの昆虫は防除措置を採用し、回避することができるようになった。結果として、害虫の摂食及び他の行動の基礎となるメカニズムのより良い理解が依然として必要とされる。このような知識は、害虫による、全ての作物、植物、及び商業的農業分野に対する攻撃を介在又は防止するための薬剤及び戦略の設計を可能にする。
【０００６】
広範囲の化学殺有害生物剤及び殺虫剤が、農業に重大な植物害虫を防除又は根絶するために広く使用されてきた。しかしながら、有効な代替の殺虫剤の同定及び/又は開発にかなり関心がある。このように、新規な殺虫剤をスクリーニングするための有効な方法が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
次に、必要されるものは、昆虫の行動を調節する薬剤のスクリーニング、及びいくつかの場合において、殺虫剤として作用し得る薬剤のスクリーニングに使用可能である新規な方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態において、本発明は、候補化合物が、昆虫の一過性受容体電位V(TRPV)チャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法に関する。この方法は、昆虫TRPVチャネルを発現している第1の細胞を用意するステップ、第1の細胞を候補化合物と接触させるステップ、及び昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップであり、ここで、該調節が、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定するステップを含む。例えば、特定の実施形態において、アッセイするステップが、以下の:(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ、(3)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、(4)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ、(5)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、及び/又は(6)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップのうちの少なくとも1つを含んでもよい。好ましくは、候補化合物は、第1の細胞におけるカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも20%調節し得る。候補化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子であり得る。代替として、候補化合物は、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子であり得る。候補化合物は、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子であり得る。該方法において、第1の細胞は、好ましくは、昆虫のNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する。第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率は、好ましくは約3:1〜約1:3、より好ましくは約1:1、又は1:1である。候補化合物は、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せであり得る。該方法は、更に、追加のステップ:哺乳動物TRPVチャネルを発現している第2の細胞を用意するステップ、第2の細胞を候補化合物と接触させるステップ、哺乳動物TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップ、及び昆虫TRPVチャネルの調節と、哺乳動物TRPVチャネルの調節を比較するステップを含み得、ここで、哺乳動物のTRPVチャネルと比較して、昆虫TRPVチャネルの調節の増加は、昆虫TRPVチャネルの選択的調節因子として候補化合物を特定する。候補化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性を、哺乳動物TRPVチャネルと比較して少なくとも10%調節し得る。昆虫は、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫であり得る。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、上記の方法により選択された化合物に関する。化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子であり得る。化合物は、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子であり得る。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている方法により選択された化合物又は上記の方法によって選択された化合物を昆虫に適用することを含む、昆虫を防除するための方法に関する。化合物は、昆虫TRPVチャネルの阻害剤であり得る。化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性化因子であり得る。昆虫は、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫であり得る。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【００１２】
更に別の実施形態において、本発明は、Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子を含む第1の発現ベクター、及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む第2の発現ベクターを含む発現ベクターシステムに関する。第1及び第2の発現ベクターの細胞内で共発現されると、昆虫TRPVチャネルが形成される。第1及び第2の発現ベクターは、調整可能なプロモーターシステムを更に含み得、この場合、調整可能なプロモーターシステムは、少なくとも1つのTetリプレッサーの結合部位を含み得る。調整可能なプロモーターは、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターであり得る。プロモーターシステムは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調節され得る。第1及び第2の発現ベクターは、更にアデノウイルスのコア起点を含み得る。好ましくは、第1の核酸分子は、配列番号2の核酸配列を含む。好ましくは、第2の核酸分子は、配列番号28の核酸配列を含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む発現ベクターに関する。細胞内での発現により、昆虫TRPVチャネルが形成される。発現ベクターは、調整可能なプロモーターシステムを更に含んでもよく、ここで、調整可能なプロモーターシステムは、少なくとも1つのTetリプレッサーの結合部位を含み得る。調整可能なプロモーターは、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターであってもよい。プロモーターシステムは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調節され得る。発現ベクターは、アデノウイルスのコア起点を含み得る。
【００１４】
別の実施形態において、本発明は、発現ベクターシステムに関する。発現ベクターシステムは、TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号2を有する第1の核酸を含む第1の発現ベクター、及びTRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号28を有する第2の核酸を含む第2の発現ベクターを含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、アデノウイルスのコア起点、蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、エピトープタグをコードする核酸、及び調整可能なプロモーターシステムを更に含む。調整可能なプロモーターシステムは、TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結されたTetリプレッサー結合部位及び最小のサイトメガロウイルスプロモーターを含む。第1及び第2の発現ベクターは、哺乳動物発現用に最適化されている。
【００１５】
更に別の実施形態において、本発明は、Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む発現ベクターに関する。好ましくは、細胞における発現により、昆虫TRPVチャネルが形成される。発現ベクターは、調整可能なプロモーターシステムを更に含むことができる。調整可能なプロモーターシステムは、少なくとも1つのTetリプレッサーの結合部位を含んでもよい。調整可能なプロモーターは、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターであってもよい。プロモーターシステムは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能であり得る。ベクターは、アデノウイルスのコア起点を含んでもよい。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、アデノウイルスのコア起点、TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする第1の核酸及びTRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする第2の核酸を含む一過性受容体電位V(TRPV)チャネルコード領域、エピトープタグをコードする2つの核酸により隣接された蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、及びTetリプレッサー結合部位及びTRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターを含む調整可能なプロモーターシステムを含む発現ベクターに関する。好ましくは、コード領域全体が、哺乳動物発現用にコドン最適化されている。あるいは、コード領域は、哺乳動物発現用に最適化されていなくてもよい。
【００１７】
更に別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている発現ベクターを含む細胞に関する。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質を細胞株に共発現させてもよい。細胞株は、昆虫、マウス、ハムスター、ヒト細胞、又はNanchungタンパク質若しくはInactiveタンパク質を正常に発現しない任意の細胞株であってもよい。好ましくは、細胞株は、約3:1〜約1:3、より好ましくは約1:1の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する。
以下、本発明の実施形態を示す。
（１）候補化合物が昆虫の一過性受容体電位V(TRPV)チャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法であって、
(a)昆虫TRPVチャネルを発現している第1の細胞を用意するステップ、
(b)第1の細胞を候補化合物と接触させるステップ、及び
(c)昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップであり、ここで、該調節が、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定するステップ
を含む、前記方法。
（２）アッセイするステップが、以下の:
(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は
(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、（１）に記載の方法。
（３）アッセイをするステップが、以下の:
(1)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、又は
(2)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、（１）に記載の方法。
（４）アッセイをするステップが、以下の:
(1)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、又は
(2)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップ
のうちの少なくとも1つを含む、（１）に記載の方法。
（５）候補化合物が、第1の細胞におけるカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも20％調節する、（４）に記載の方法。
（６）候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（７）候補化合物が、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（８）候補化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、（１）〜（５）のいずれか１に記載の方法。
（９）第1の細胞が、昆虫のNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、（１）〜（８）のいずれか１に記載の方法。
（１０）第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率が約1：1である、（９）に記載の方法。
（１１）候補化合物が、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せから成る群から選択される、（１）〜（１０）のいずれか１に記載の方法。
（１２）(a)哺乳動物TRPVチャネルを発現する第2の細胞を用意するステップ、
(b)前記第2の細胞を候補化合物と接触させるステップ、
(c)哺乳動物TRPVチャネルの調節についてアッセイするステップ、
(d)昆虫TRPVチャネルの調節と、哺乳動物TRPVチャネルの調節を比較するステップ
を更に含み、ここで、哺乳動物TRPVチャネルと比較して、昆虫TRPVチャネルの調節の増加は、昆虫TRPVチャネルの選択的調節因子として候補化合物を特定する、（１）〜（１１）のいずれか１に記載の方法。
（１３）候補化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を、哺乳動物TRPVチャネルと比較して少なくとも10％調節する、（１２）に記載の方法。
（１４）昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫である、（１）〜（１３）のいずれか１に記載の方法。
（１５）農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ類(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ類(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ類(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ類(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ類(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ類(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ類(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、（１４）に記載の方法。
（１６）（１）〜（１５）のいずれか１に記載の方法によって選択される化合物。
（１７）前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である、（１５）に記載の化合物。
（１８）前記化合物が、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である、（１６）又は（１７）に記載の化合物。
（１９）（１）〜（１５）のいずれか１に記載の方法によって選択される化合物又は（１６）〜（１８）のいずれか１に記載の化合物を昆虫に適用することを含む昆虫を防除する方法。
（２０）前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの阻害剤である、（１９）に記載の方法。
（２１）前記化合物が、昆虫TRPVチャネルの活性化因子である、（１９）に記載の方法。
（２２）昆虫が、農業有害生物/園芸有害生物又は病害媒体物又は寄生虫である、（１９）〜（２１）のいずれか１に記載の方法。
（２３）農業有害生物が、アブラムシ(マメクロアブラムシ、ワタアブラムシ、リンゴアブラムシ、ジャガイモヒゲナガアブラムシ、ダイコンアブラムシ、ジサフィス・プランタギネア、チューリップヒゲナガアブラムシ、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ、モモアカアブラムシ、レタスヒゲナガアブラムシを含む);コナジラミ(アレウロデス属の種、ベミシア属の種、ジアレウロデス属の種、トリアレウロデス属の種を含む);ウンカ(ヒメトビウンカ、トビイロウンカ、シファンタ属の種、セジロウンカを含む);ヨコバイ(アムラスカ属の種、エンポアスカ属の種を含む);カイガラムシ(アスピディオトゥス属の種、アカホシマルカイガラムシ、ワタフキカイガラムシ、ニセヤノネカイガラムシを含む);コナカイガラムシ(マコネリコッカス属の種、パラコッカス属の種、プラノコッカス属の種を含む);花粉甲虫(カルポフィルス属の種、メリゲテス属の種を含む);アザミウマ(カリオトリプス属の種、フランクリニエラ属の種、シルトスリップス属の種、スリップス属の種を含む);及びキジラミ(バクテリセラ属の種、カコプシラ属の種、ミカンキジラミ、パラトリオザ・コケレリを含む)から成る群から選択される、（２２）に記載の方法。
（２４）昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子を含む発現ベクター。
（２５）(a)Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子を含む第1の発現ベクター、及び
(b)Inactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む第2の発現ベクター
を含む発現ベクターシステム。
（２６）細胞内で共発現されると、昆虫TRPVチャネルが形成される、（２５）に記載の発現ベクターシステム。
（２７）第1及び第2の発現ベクターが調整可能なプロモーターシステムを更に含む、（２５）又は（２６）に記載の発現ベクターシステム。
（２８）調整可能なプロモーターシステムが、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む、（２７）に記載の発現ベクターシステム。
（２９）調整可能なプロモーターが、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターである、（２７）又は（２８）に記載の発現ベクターシステム。
（３０）プロモーターシステムが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能である、（２７）〜（２９）のいずれか１に記載の発現ベクターシステム。
（３１）アデノウイルスのコア起点を更に含む、（２４）〜（３０）のいずれか１に記載の発現ベクターシステム。
（３２）第1の核酸分子が、配列番号３の核酸配列を含む、（２５）〜（３１）のいずれか１に記載の発現ベクターシステム。
（３３）第2の核酸分子が、配列番号２８の核酸配列を含む、（２５）〜（３１）のいずれか１に記載の発現ベクターシステム。
（３４）Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む発現ベクター。
（３５）細胞内での発現により、昆虫TRPVチャネルが形成される、（３４）に記載の発現ベクター。
（３６）調整可能なプロモーターシステムを更に含む、（３４）又は（３５）に記載の発現ベクター。
（３７）調整可能なプロモーターシステムが、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む、（３６）に記載の発現ベクター。
（３８）調整可能なプロモーターが、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターである、（３６）又は（３７）に記載の発現ベクター。
（３９）プロモーターシステムが、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能である、（３６）〜（３８）のいずれか１に記載の発現ベクター。
（４０）アデノウイルスのコア起点を更に含む、（３２）〜（３９）のいずれか１に記載の発現ベクター。
（４１）(a)TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号２を有する第1の核酸を含む第1の発現ベクター、
(b)TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号２８を有する第2の核酸を含む第2の発現ベクター
を含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、
(c)アデノウイルスのコア起点、
(d)蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、
(e)エピトープタグをコードする核酸、
(f)(1)Tetリプレッサー結合部位、
(2)TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーター
を含む調整可能なプロモーターシステム
を更に含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは、哺乳動物の発現用に最適化されている、発現ベクターシステム。
（４２）(a)アデノウイルスのコア起点、
(b)(1)TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする配列番号２を有する第1の核酸、
(2)TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする配列番号２８を有する第2の核酸
を含む一過性受容体電位V(TRPV)チャネルコード領域、
(c)蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、
d)エピトープタグをコードする核酸、
(d)(1)Tetリプレッサー結合部位、
(2)TRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーター
を含む調整可能なプロモーターシステム
を含み、ここで発現ベクターは、哺乳動物の発現用に最適化されている、発現ベクター。
（４３）（２４）〜（４２）のいずれか１に記載の発現ベクターを含む細胞。
（４４）Nanchungタンパク質とInactiveタンパク質が細胞において共発現される、（４３）に記載の細胞。
（４５）通常、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質を発現しない任意の細胞を含む、（４３）又は（４４）に記載の細胞。
（４６）細胞が、昆虫細胞、カエル(アフリカツメガエル)卵母細胞、マウス細胞、ハムスター細胞又はヒト細胞である、（４３）〜（４５）のいずれか１に記載の細胞。
（４７）細胞が、約1:1の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する、（４３）〜（４６）のいずれか１に記載の細胞。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アデノウイルスシャトルベクターにおける昆虫及び哺乳動物のTRPチャネルの発現カセットの概略図を示す図である。
【図２Ａ】ピメトロジン、ピリフルキナゾン及びそのN-脱アセチル化形態、代謝物Bの分子構造を示す図である。
【図２Ｂ−Ｄ】(B)Nanchung(Nan)単独、(C)Inactive(Iav)タンパク質単独を発現している、又は(D)Nan及びIavタンパク質を共発現しているCHO細胞におけるピリフルキナゾン及びそのN-脱アセチル化形態、代謝物BによりCa2+動員の活性化を示す図である。
【図３Ａ−Ｄ】異なる感染率及び異なるNav:Iav発現比でのピリフルキナゾン代謝物BによるCa2+動員の活性化を示す図である。
【図３Ｅ】共通のAcGFP1部分に対する抗体によって検出されるNan及びIavタンパク質の相対的発現を示すウェスタンブロットの写真を示す図である。
【図４Ａ−Ｄ】図４Ａ：ピリフルキナゾンの代謝物Bによる昆虫TRPVチャネルの活性化が、細胞外媒体中にCa2+の存在を要求することを実証していているグラフを示す図である。図４Ｂ：イオンチャネルブロッカーであるルテニウムレッドによる応答の阻害を実証するグラフを示す図である。図４Ｃ：Ca2+プローブ、FLUO4又は原形質膜電位プローブを用いて測定した、代謝物Bに対する昆虫TRPV発現細胞の応答を示すグラフを示す図である。(矢印は代謝物Bの注入を示す)。図４Ｄ：代謝物Bによって刺激され、Ca2+プローブ、FLUO4又は原形質膜電位プローブを用いて測定された昆虫TRPVチャネル発現細胞の用量応答を示すグラフを示す図である。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ：mTRPVチャネル発現レベルの同等化を示すウェスタンブロットの写真を示す図であり、Nan及びIav発現レベルに関する最適レベルを共通のAcGFP1部分に対する抗体によって検出した。図５Ｂ：哺乳動物のTRPV4アゴニストであるGSK1016790Aではなく、ピメトロジン及びピリフルキナゾン代謝物Bによる昆虫TRPVチャネルの活性化を示すグラフを示す図である。図５Ｃ：ピメトロジンによるものではなく、公知のTRPV4アゴニストであるGSK1016790AによるmTRPV4チャネルの強い活性化、及びピリフルキナゾン代謝物Bによる弱い活性化を示すグラフを示す図である。
【図６】図6〜32は、それぞれ配列番号1〜27に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanchung(Nan)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図７】図6の続きである。
【図８】図7の続きである。
【図９】図8の続きである。
【図１０】図9の続きである。
【図１１】図10の続きである。
【図１２】図11の続きである。
【図１３】図12の続きである。
【図１４】図13の続きである。
【図１５】図14の続きである。
【図１６】図15の続きである。
【図１７】図16の続きである。
【図１８】図17の続きである。
【図１９】図18の続きである。
【図２０】図19の続きである。
【図２１】図20の続きである。
【図２２】図21の続きである。
【図２３】図22の続きである。
【図２４】図23の続きである。
【図２５】図24の続きである。
【図２６】図25の続きである。
【図２７】図26の続きである。
【図２８】図27の続きである。
【図２９】図28の続きである。
【図３０】図29の続きである。
【図３１】図30の続きである。
【図３２】図31の続きである。
【図３３】図33〜59は、それぞれ配列番号54〜80に対応し、図中に特定される受託番号を有するNanタンパク質のアミノ酸配列を与える。
【図３４】図33の続きである。
【図３５】図34の続きである。
【図３６】図35の続きである。
【図３７】図36の続きである。
【図３８】図37の続きである。
【図３９】図38の続きである。
【図４０】図39の続きである。
【図４１】図40の続きである。
【図４２】図41の続きである。
【図４３】図42の続きである。
【図４４】図43の続きである。
【図４５】図44の続きである。
【図４６】図45の続きである。
【図４７】図46の続きである。
【図４８】図47の続きである。
【図４９】図48の続きである。
【図５０】図49の続きである。
【図５１】図50の続きである。
【図５２】図51の続きである。
【図５３】図52の続きである。
【図５４】図53の続きである。
【図５５】図54の続きである。
【図５６】図55の続きである。
【図５７】図56の続きである。
【図５８】図57の続きである。
【図５９】図58の続きである。
【図６０】図60〜85は、それぞれ配列番号28〜53に対応し、図中に特定される受託番号を有するInactive(Ian)遺伝子のヌクレオチド配列を与える。
【図６１】図60の続きである。
【図６２】図61の続きである。
【図６３】図62の続きである。
【図６４】図63の続きである。
【図６５】図64の続きである。
【図６６】図65の続きである。
【図６７】図66の続きである。
【図６８】図67の続きである。
【図６９】図68の続きである。
【図７０】図69の続きである。
【図７１】図70の続きである。
【図７２】図71の続きである。
【図７３】図72の続きである。
【図７４】図73の続きである。
【図７５】図74の続きである。
【図７６】図75の続きである。
【図７７】図76の続きである。
【図７８】図77の続きである。
【図７９】図78の続きである。
【図８０】図79の続きである。
【図８１】図80の続きである。
【図８２】図81の続きである。
【図８３】図82の続きである。
【図８４】図83の続きである。
【図８５】図84の続きである。
【図８６】図86〜111は、それぞれ配列番号81〜106に対応し、図中に特定される受託番号を有するIavタンパク質のアミノ酸配列を与える。
【図８７】図86の続きである。
【図８８】図87の続きである。
【図８９】図88の続きである。
【図９０】図89の続きである。
【図９１】図90の続きである。
【図９２】図91の続きである。
【図９３】図92の続きである。
【図９４】図93の続きである。
【図９５】図94の続きである。
【図９６】図95の続きである。
【図９７】図96の続きである。
【図９８】図97の続きである。
【図９９】図98の続きである。
【図１００】図99の続きである。
【図１０１】図100の続きである。
【図１０２】図101の続きである。
【図１０３】図102の続きである。
【図１０４】図103の続きである。
【図１０５】図104の続きである。
【図１０６】図105の続きである。
【図１０７】図106の続きである。
【図１０８】図107の続きである。
【図１０９】図108の続きである。
【図１１０】図109の続きである。
【図１１１】図110の続きである。
【図１１２−１】Nanタンパク質の配列アラインメントを示す図である(全てそれぞれに対応し、出現する順番に、配列番号59、60、63、58、57、56、54、74、73、75、66、70、110、68、及び111、配列番号64の残基1〜448と560〜900、並びに配列番号76、79、62、77、72、78、71、80、65、及び61)。
【図１１２−２】図１１２−１の続きである。
【図１１２−３】図１１２−２の続きである。
【図１１２−４】図１１２−３の続きである。
【図１１２−５】図１１２−４の続きである。
【図１１２−６】図１１２−５の続きである。
【図１１２−７】図１１２−６の続きである。
【図１１２−８】図１１２−７の続きである。
【図１１２−９】図１１２−８の続きである。
【図１１２−１０】図１１２−９の続きである。
【図１１３−１】Iavタンパク質の配列アラインメントを示す図である(全てそれぞれに対応し、出現する順番に、配列番号84及び85、配列番号86の残基1〜916、954〜1102と1167〜1216、並びに配列番号83、82、81、101、104、100、99、92、98、93、90、89、94、95、88、102、112、103、105、106、96、87、及び91)。
【図１１３−２】図１１３−１の続きである。
【図１１３−３】図１１３−２の続きである。
【図１１３−４】図１１３−３の続きである。
【図１１３−５】図１１３−４の続きである。
【図１１３−６】図１１３−５の続きである。
【図１１３−７】図１１３−６の続きである。
【図１１３−８】図１１３−７の続きである。
【図１１３−９】図１１３−１０の続きである。
【図１１３−１０】図１１３−９の続きである。
【図１１３−１１】図１１３−１０の続きである。
【図１１３−１２】図１１３−１１の続きである。
【図１１３−１３】図１１３−１２の続きである。
【図１１３−１４】図１１３−１３の続きである。
【図１１３−１５】図１１３−１４の続きである。
【図１１３−１６】図１１３−１５の続きである。
【図１１４】Nanタンパク質に関するアラインメントツリーを示す図である。
【図１１５】Iavタンパク質に関するアラインメントツリーを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
図及び本発明の好ましい実施形態の詳細な説明
I.一般的考察
一過性受容体電位(TRP)チャネルは、細胞の恒常性の調節に関与する大規模かつ重要なクラスのチャネルを構成する。本発明は、少なくとも1つのTRPファミリーメンバー、すなわち、昆虫におけるTRPVチャネルを調節する方法及び組成物を提供する。
【００２０】
具体的に、本発明は、昆虫TRPVチャネルを調節するための方法及び組成物を提供する。昆虫TRPVチャネルの調節は、細胞内のカルシウム恒常性、ナトリウム恒常性、細胞内カルシウムレベル、膜分極(静止膜電位)、及び/又は陽イオンレベルを調節することであってもよい。1つ以上の昆虫TRPVチャネルを調節することができる化合物は、限定されないが、昆虫防除を含む多数の態様において有用である。
【００２１】
理論に束縛されることなしに、昆虫TRPVの調節は、昆虫の摂食行動を増加又は減少させ得る運動ニューロン調節を生じさせるシグナル伝達経路を誘発し、昆虫における昆虫TRPVのこのような調節(例えば、活性化)は、飢餓による昆虫の死をもたらすこのような昆虫の摂食行動の減少をもたらす場合がある。したがって、再び理論に束縛されることなしに、昆虫TRPVチャネルを調節する(例えば、活性化する)化合物は、殺虫剤として使用することができると考えられる。
【００２２】
TRPチャネルは、少なくとも6つのグループ:TRPC(短い)、TRPV(バニロイド)、TRPM(長い、メラスタチン)、TRPP(ポリシスチン類)、TRPML(ムコリピン類)、及びTRPA(ANKTM1)に分類されている。
【００２３】
TRPCグループは、配列相同性及び機能的類似性に基づいて、4つのサブファミリー(TRPC1、TRPC4,5、TRPC3,6,7及びTRPC2)に分けることができる。
【００２４】
現在、哺乳動物のTRPVファミリーは6つのメンバーを有する。TRPV5及びTRPV6は、TRPV1、TRPV2、TRPV3又はTRPV4に対するよりも、互いにより密接に関連付けられる。TRPA1は、TRPV3に最も密接に関連付けられ、TRPV5及びTRPV6に対するよりもTRPV1及びTRPV2により密接に関連付けられる。TRPVは非常に多数の生物において発現し、例えば、昆虫(ショウジョウバエ(Drosophila)属、トリボリウム(Tribolium)属、シラミ(Pediculus)属、イエカ(Culex)属、及びハマダラカ(Anopheles)属)及び哺乳動物(ヒト、マウス、ラット、サル及びチンパンジー)が挙げられる。
【００２５】
昆虫TRPVチャネルは、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質によって代表され、複合体を形成することが想定され、化学量論は未知であり、昆虫聴覚に関与している(Matsuuraら、2009)。
【００２６】
TRPMファミリーは8つのメンバーを有する。構成要素は、以下の設定時のメンバーであるTRPM1(メラスタチン又はLTRPC1)、TRPM3(KIAA1616又はLTRPC3)、TRPM7(TRP-PLIK、ChaK(1)、LTRPC7)、TRPM6(ChaK2)、TRPM2(TRPC7又はLTRPC2)、TRPM8(Trp-p8又はCMR1)、TRPM5(Mtr1又はLTRPC5)、及びTRPM4(FLJ20041又はLTRPC4)を含む。
【００２７】
TRPAファミリーの唯一の哺乳動物メンバーはANKTM1である。
【００２８】
TRPMLファミリーは、TRPML1(ムコリピン1)、TRPML2(ムコリピン2)、及びTRPML3(ムコリピン3)を含むムコリピン類からなる。
【００２９】
TRPPファミリーは、チャネルの2つのグループ:6個の膜貫通ドメインを有することが予測されるもの及び11個の膜貫通ドメインを有することが予測されるものからなる。TRPP2(PKD2)、TRPP3(PKD2L1)、TRPP5(PKD2L2)は全て、6個の膜貫通ドメインを有することが予測される。TRPP1(PKD1、PC1)、PKD-REJ及びPKD-1L1は全て、11個の膜貫通ドメインを有するものと考えられる。
【００３０】
本発明者らは、様々な化合物に応答して種特異的な差異を示し、その調節が、殺虫剤として機能し得る適切な化合物の特定をもたらし得ることを発見した。
【００３１】
II.定義:
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、当業者に一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法、装置及び材料は、本開示の主題の実施又は試験において使用可能であるが、代表的な方法、デバイス、及び材料をここに記載する。
【００３２】
用語「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「1つ以上」を指す。したがって、例えば、「1つの細胞」(例えば「1つの哺乳動物細胞」)への言及は、複数のこのような細胞(例えば、培養中の複数の哺乳動物細胞)を含む。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語「約」は、質量、重量、時間、体積、濃度若しくはパーセンテージの値又は量に言及するとき、特定の量から、いくつかの実施形態において±20%、いくつかの実施形態において±10%、いくつかの実施形態において±5%、いくつかの実施形態において±1%、いくつかの実施形態において±0.5%、及びいくつかの実施形態において±0.1%の変動を包含することが意図され、したがって、このような変動は、開示された方法を実施するのに適切である。
【００３４】
用語「昆虫」、「害虫」又は「植物害虫」は、植物と関連していることが公知であり、その関連の結果として、植物の健康及び活力に有害作用を引き起こす昆虫綱のクラスの多数の、通常は小さい節足動物のいずれか1つを指す。本明細書で使用される植物なる用語は、根、茎、葉及び種子などの植物全体及び植物の一部分、並びに該植物又は植物の一部分内の細胞及び組織を包含する。用語「昆虫」、「害虫」又は「植物害虫」は、本出願にわたり互換的に使用される。
【００３５】
用語「核酸」とは、糖、リン酸及びプリン又はピリミジンのいずれかである塩基を含有するモノマー(ヌクレオチド)から構成される、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかであるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定されない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸、保存的に修飾されているそれらの改変体、相補的配列、及び縮重されたコドン置換を包含する。
【００３６】
用語「核酸」又は「核酸分子」はまた、遺伝子、オープンリーディングフレーム(ORF)、cDNA、及び遺伝子、核酸分子、核酸断片、核酸セグメント又はポリヌクレオチドによってコードされるmRNAと互換的に使用され得る。
【００３７】
用語「遺伝子」は、幅広く使用され、生物学的機能と関連している核酸の任意のセグメントを指す。このようにして、遺伝子は、それらの発現に必要とされるコード配列及び/又は調節配列を含む。例えば、「遺伝子」とは、調節配列などの、mRNA、機能性RNA、又は特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「遺伝子」はまた、例えば、他のタンパク質について認識配列を形成する、非発現DNAセグメントを含む。「遺伝子」は、目的とする供給源からのクローニング又は公知若しくは予測される配列情報からの合成を含む、種々の供給源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでもよい。
【００３８】
用語「遺伝子送達」又は「遺伝子導入」とは、標的細胞に外来DNAを確実に挿入するための方法又はシステムを指し、形質導入、トランスフェクション及び形質転換を含む。このような方法は、遺伝子の一過性又は長期の発現をもたらすことができる。
【００３９】
用語「形質導入」は、例えば、アデノウイルスベクターなどの複製欠損ウイルスベクターを介して、インビボ又はインビトロのいずれかのレシピエント細胞へのDNA分子の送達を指す。
【００４０】
用語「トランスフェクション」は、哺乳動物細胞による外来DNAの取り込みを指すように使用される。外因性DNAが細胞の原形質膜を横切って導入された場合に、細胞は「トランスフェクト」されている。トランスフェクションは、適切な細胞に、プラスミドベクター及び他の核酸分子などの1つ以上の外因性DNA部分を導入するために使用することができる。この用語は、遺伝物質の安定な取り込みと一過性の取り込みの両方を指す。
【００４１】
用語「形質転換」とは、細胞に異種DNAを導入するためのプロセスを指す。形質転換細胞は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニック子孫もまた包含することが理解される。
【００４２】
用語「ベクター」とは、ヘルパーウイルスなどの、適正な制御要素と関連しているときに複製することができ、細胞間で遺伝子配列を移動させることができる、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝的要素を指す。このように、この用語は、クローニング及び発現媒体、並びに複製欠損ウイルスベクターを含む。
【００４３】
用語「発現ベクター」及び「発現カセット」とは、典型的には、終止シグナルに作動可能に連結された、目的とするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、適切な宿主細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を指向することができる核酸分子を指す。また、典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要とされる配列を含む。コード領域は、通常、目的とするポリペプチド(複数可)をコードするが、また、センス又はアンチセンス方向で、目的とする機能的RNA、例えばアンチセンスRNA又は非翻訳RNAをコードすることができる。目的とするヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラであり得、これは、その成分の少なくとも1つが他の成分の少なくとも1つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、天然に存在しているものであり得るが、異種発現に有用な組換え形態で得られたものであり得る。しかしながら、典型的には、発現カセットは宿主に対して異種である、すなわち、発現カセットの特定のDNA配列は、宿主細胞中に天然に存在せず、形質転換事象により宿主細胞又は宿主細胞の祖先に導入された。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下で、又は宿主細胞がある特定の外部刺激に暴露されたときにのみ、転写を開始する誘導性プロモーターの調節下にあり得る。植物などの多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織、器官、又は発生段階に特異的であり得る。
【００４４】
用語「アデノウイルス」とは、アデノウイルス血清型由来のベクターを指す。アデノウイルスは、分裂している及び分裂していない、広範囲の哺乳動物細胞を感染させることができる二本鎖DNAウイルスである。アデノウイルスDNAは約36,000bpの線状である。遺伝子送達のために最も広く使用されているアデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムのE1及びE3領域が欠失している複製欠損ベクターである。E1欠失ウイルスは、トランスでE1をコードしたタンパク質を提供する、HEK-293などの相補性細胞に伝播される。E1/E3欠失アデノウイルスは、最大7.5キロバイトの外来DNAを収容することができる。アデノウイルスゲノム中に外来DNAを組み込む古典的な方法は、哺乳動物細胞における相同組換えを伴う。本実施例において記載されるように、より効率的な方法は、アデノウイルスゲノムの大部分を含有する大きなプラスミドと小さなシャトルプラスミドの間での大腸菌(Escherichia coli)における相同組換えを伴う。シャトルプラスミドは、ウイルスゲノムにおいて標的とされるべき領域に相同な配列によって隣接される発現カセットを含有する。次に、組換えAdゲノムを制限消化により線状化し、E1相補性哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され、ウイルス粒子を生成する(Douglas JT.、Methods Mol Biol. 2004; V246:3〜14)。毒性遺伝子を含有するアデノウイルスを生成するために、特別なアデノウイルスベクターが開発され、ここでは、外来遺伝子の発現はウイルス生成中に抑制される。これらのシステムの1つは、SpeAd Ad-tetoシステムと呼ばれ、例えば、Welgen, Inc.によって提供される。
【００４５】
用語「テトラサイクリン制御トランス活性化因子」(tTA)は、ドキシサイクリン、テトラサイクリン及び関連化合物の存在下又は不存在下で、核酸発現を制御するために使用される融合タンパク質を指す。tTAは、転写を活性化することができる任意のドメインに融合したTetリプレッサー(TetR)を含む。tTAは、アデノウイルスのC末端部分に融合したTetRを含んでもよい。
【００４６】
用語「作動可能に連結された」とは、物理的又は機能的に関連している2つの核酸配列を指す。例えば、プロモーター又は調節DNA配列は、調節DNA配列がコードDNA配列又は構造DNA配列の発現レベルに影響を及ぼすように、2つの配列が位置付けられた場合、RNA又はポリペプチドをコードするDNA配列を「作動可能に連結される」と言われる。プロモーターはまた、RNAポリメラーゼが転写に十分な条件下でプロモーターに結合するときに、ヌクレオチド配列が転写される場合に、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されると言われる。
【００４７】
用語「単離された」とは、核酸又はポリペプチドに適用される場合、核酸又はポリペプチドが、天然の状態で関連付けられる他の細胞成分を本質的に含まないことを示す。乾式又は水溶液のいずれかであり得るが、均一な状態であり得る。均質性、及び分子が単離されるかどうかは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて決定することができる。調製物中に存在する優勢種であるポリペプチドは、実質的に単離される。用語「単離された」とは、核酸又はポリペプチドが、電気泳動ゲル中で本質的に1つのバンドを生じることを示す。具体的には、それは、核酸又はポリペプチドが、いくつかの実施形態において少なくとも約50%純粋、いくつかの実施形態において少なくとも約85%純粋、いくつかの実施形態において少なくとも約99%純粋であることを意味する。
【００４８】
用語「標識」及び「標識された」とは、分子への、分光、放射線学又はその他の方法により検出することができる部分の結合を指す。したがって、用語「標識」又は「標識された」とは、生体分子などの分子に、検出可能なマーカーの、場合より共有結合的若しくは非共有結合的、組み込み又は結合を指す。生体分子を標識する種々の方法は当該技術分野において公知であり、使用することができる。生体分子用の標識の例としては、限定されないが、以下の放射性同位体、蛍光標識、重原子、酵素標識又はレポーター遺伝子、化学発光基、及びビオチニル基が挙げられる。いくつかの実施形態において、標識は、潜在的な立体障害を減少させるために様々な長さのスペーサーアームによって結合される。利用することができる蛍光プローブとしては、限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート;フルオレセインジクロロトリアジン及びフルオレセインのフッ素化類似体;カルボン酸ナフトフルオロセイン及びそのスクシンイミジルエステル;カルボキシローダミン6G;ピリジルオキサゾール誘導体;CY2、3、3.5、5、5.5及び7;フィコエリトリン;フィコエリトリン-Cyコンジュゲート;スクシンイミジルエステル、カルボン酸、イソチオシアネート、塩化スルホニル及びダンシル塩化物の蛍光種、例えば、プロピオン酸スクシンイミジルエステル、及びペンタン酸スクシンイミジルエステル;カルボキシテトラメチルローダミンのスクシンイミジルエステル;ローダミンレッド-Xスクシンイミジルエステル;テキサスレッドスルホニルクロリド;テキサスレッド-Xスクシンイミジルエステル;テキサスレッド-Xナトリウムテトラフルオロフェノールエステル;レッド-X;テキサスレッド色素;テトラメチルローダミン;リサミンローダミンB;テトラメチルローダミン;テトラメチルローダミンイソチオシアネート;ナフトフルオレセイン;クマリン誘導体(例えば、ヒドロキシクマリン、アミノクマリン、及びメトキシクマリン);ピレン類;ピリジルオキサゾール誘導体;ダポキシル色素;カスケードブルー及びイエロー色素;ベンゾフランイソチオシアネート;ナトリウムテトラフルオロフェノール;4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a、4a-ジアザ-s-インダセン;アレクサ蛍光体(例えば、350、430、488、532、546、555、568、594、633、647、660、680、700及び750);緑色蛍光タンパク質;及び黄色蛍光タンパク質が挙げられる。ピーク励起波長及び発光波長は、これらの化合物について変化し、特定の用途のための特定の蛍光プローブの選択は、励起波長及び/又は発光波長に基づいて、部分的に行うことができる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「候補化合物」又は「試験化合物」とは、昆虫TRPVチャネルを調節するそれらの能力についてスクリーニングされるべきであり、互換的に使用され得る化合物の集合体を指す。候補化合物は、多数の種類の化学分子を包含し得、例えば、有機又は無機小分子、多糖、生物学的巨大分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及び誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体及び誘導体、細菌、植物、菌類、又は動物細胞若しくは組織から作製された抽出物、天然に存在する若しくは合成の組成物、又はこれらの組合せが挙げられる。一般的に、候補化合物は、約50〜500,000の分子量を有することができるが、これに限定されない。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「小分子」は、「天然物様」である化合物を指すが、しかし、用語「小分子」は、「天然産物様」化合物に限定されない。むしろ、小分子は、典型的には、いくつかの炭素-炭素結合を含有し、約50キロダルトンを超えるが、約5000ダルトン(5kD)未満の分子量を有することによって特徴付けられる。好ましくは、小分子は、3kD未満、更により好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。いくつかの場合において、小分子は、700ダルトンに等しい又はそれ未満の分子質量を有することが好ましい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、候補化合物は、合成分子であってもよい。用語「合成分子」とは天然に存在しない分子を指す。
【００５２】
特定の実施形態において、候補化合物は、天然に存在する分子であってもよい。このような天然に存在する分子は、精製又は未精製形態で、すなわち生物学的供給源から得られるように、使用されてもよい。用語「天然に存在する」とは、ヒトによって人工的に生産されたものとは区別されるように、天然において見出される実体(例えば、細胞、生体分子など)を指す。例えば、実験室でヒトによって意図的に変更又は単離されていない自然状態での生物に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は天然に存在している。このように、アミノ酸配列又は核酸配列が天然に見出されるアミノ酸配列又は核酸配列と同一であったとしても、ポリペプチド配列又はヌクレオチド配列は、組換え分子によってコードされる又はその中に存在する場合、「天然に存在しない」と考えられる。
【００５３】
実施される特定の実施形態に依存して、候補化合物は、溶液中に存在しないで提供されてもよく、又は担体、若しくは固体支持体、例えばビーズに結合されてもよい。多数の適切な固体支持体が、候補化合物の固定化に用いることができる。適切な固体支持体の例としては、アガロース、セルロース、デキストラン(すなわち、セファデックス、セファロースとして市販されている)、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、ろ紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテル、マレイン酸共重合体、ガラスビーズ、アミノ酸共重合体、エチレン-マレイン酸共重合体、ナイロン、シルクなどが挙げられる。更に、本明細書に記載される方法について、候補化合物は、個々に又はグループでスクリーニングされてもよい。グループスクリーニングは特に有用であり、この場合、有効な候補化合物のヒット率は、所与のグループについて1を超える肯定的な結果を期待しないように低いものであることが期待される。
【００５４】
可能性のある候補化合物は何百万もある。小分子、高分子及びゲノムに基づくライブラリーを開発するための方法は公知であり、例えば、Dingら、J. Am. Chem. Soc. 124: 1594〜1596 (2002)及びLynnら、J. Am. Chem. Soc. 123: 8155〜8156 (2001)に記載されている。多数の小分子ライブラリーが当該技術分野において公知であり、市販されている。市販の化合物ライブラリーは、例えば、ArQule、Pharmacopia、graffinity、PanVera、Vitas-M Lab、Biomol International及びOxfordから得ることができる。これらのライブラリーは、本明細書に記載されているスクリーニング方法を用いてスクリーニングすることができる。また、NIH Roadmap、Molecular Libraries Screening Centers Network (MLSCN)からの10,000個の化合物及び86,000個の化合物からのライブラリーなどの化合物ライブラリーを用いることができる。化合物ライブラリーの包括的なリストは、www.broad.harvard.edu/chembio/platform/screening/compound_libraries/index.htmで見出すことができる。化学物質ライブラリー又は化合物ライブラリーは、通常、ハイスループットスクリーニング又は工業生産に最終的に使用される格納された化学物質の集合体である。化学物質ライブラリーは、一連の格納された化学物質という簡単な言葉で構成することができるそれぞれの化学物質は、化学構造、純度、量、及び化合物の物理化学的特徴などの情報を使用してある種のデータベースに格納された関連する情報を有する。
【００５５】
用語「調節」とは、本発明のTRPV(例えば、昆虫TRPV)チャネルなどの生体分子の任意の又は全ての化学的及び/若しくは生物学的活性並びに/又は特性を増加、減少、又は他の変更を指す。したがって、用語「調節」とは、本明細書で使用するとき、このような活性又は特性のアップレギュレーション(すなわち、活性化又は刺激)とダウンレギュレーション(すなわち、阻害又は抑制)の両方を指す。当業者によって理解されるように、TRPVチャネルなどの生体分子の化学的及び/若しくは生物学的活性並びに/又は特性の調節は、細胞内における生体分子の発現の増加又は減少に起因し得る。したがって、用語「調節する」及びその文法的な変形は、直接的な調節(例えば、ポリペプチドに対する阻害剤の結合を介した、ポリペプチドの化学的活性及び/若しくは生物学的活性並びに/又は特性の阻害)と、並びに間接的な調節(例えば、TRPVチャネルなどのタンパク質の発現のアップレギュレーション若しくはダウンレギュレーション、又は生物学的効果を生じさせるために本開示の主題の生体分子とともに作用する生体分子の阻害若しくは刺激)の両方を包含することが意図される。
【００５６】
本明細書において互換的に使用される用語「ポリペプチド」、「タンパク質」及び「ペプチド」とは、その大きさや機能に関わらず、20種のタンパク質アミノ酸又はアミノ酸類似体のポリマーを指す。「タンパク質」は、多くの場合、相対的に大きなポリペプチドを参照して使用され、「ペプチド」は、多くの場合、小ポリペプチドを参照して使用されるが、当該技術分野におけるこれらの用語の使用は、重複し、変化する。特に断りのない限り、用語「ポリペプチド」とは、本明細書で使用するとき、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を指す。用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物に言及する場合、本明細書において互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドには、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片、及びこれらの他の同等物、改変体、及び類似体が含まれる。
【００５７】
III.スクリーニング法
本発明者らは、昆虫TRPVチャネルが、昆虫の摂食行動をブロックし、したがって、殺虫剤として有用である化合物を同定するために使用され得ることを発見した。このように、一実施形態において、本発明は、候補化合物が昆虫TRPVチャネルの調節因子であるか否かを決定するための方法に関する。本方法は、昆虫TRPVチャネルを発現する第1の細胞を用意し、第1の細胞を候補化合物と接触させ、及び昆虫TRPVチャネルの調節についてアッセイすることを含み、ここで、昆虫TRPVチャネルの調節は、昆虫TRPVチャネルの調節因子として候補化合物を特定する。TRPVチャネルの調節は、当業者に周知である従来のインビトロ法及びインビボ法を用いてアッセイされてもよい。例えば、特定の実施形態において、アッセイするステップは、(1)候補化合物に応答して第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を検出するステップ、又は(2)候補化合物に応答して第1の細胞における膜電位を検出するステップ、(3)候補化合物の不存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員を比較するステップ、(4)候補化合物の不存在下での第1の細胞における膜電位と、候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位を比較するステップ、(5)候補化合物の存在下での第1の細胞におけるカルシウムイオン動員と、TPRVチャネルの調節を示さないカルシウムイオン動員の参照レベルを比較するステップ、及び/又は(6)候補化合物の存在下での第1の細胞における膜電位と、TPRVチャネルの調節を示さない膜電位の参照レベルを比較するステップを含んでもよい。例えば、カルシウムフラックスは、Ca2+の取り込みの評価により、又はFura-2などの蛍光色素若しくはGFPなどの蛍光タンパク質を用いて測定することができる。
【００５８】
好ましくは、候補化合物は、第1の細胞においてカルシウムイオン動員又は膜電位を、参照レベルと比較して少なくとも10%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも20%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも30%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも40%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも50%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも60%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも70%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも75%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも80%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも85%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも90%、より好ましくは参照レベルと比較して少なくとも95%調節することができる。
【００５９】
更に、TRPVチャネルの活性化は、イオンフラックスの変化を測定する様々な他の従来のアッセイを用いてアッセイすることができ、例えば、限定されないが、パッチクランプ技術、全細胞電流の測定、放射標識したイオンフラックスアッセイ、及び電位感受性色素を用いた蛍光アッセイ(Zhengら、2004)などが挙げられる。
【００６０】
また、昆虫TRPVチャネルの調節は、機能的、化学的及び物理的効果を決定するための様々な他のインビトロアッセイ及びインビボアッセイを用いて評価することができ、例えば、ペプチド、有機小分子及び脂質などの他の分子への昆虫の結合を測定すること、昆虫TRPVタンパク質及び/又はmRNAレベルを測定すること、又は昆虫TRPVポリペプチドの他の態様、例えば、転写レベル若しくは生理学的変化を測定することが挙げられる。
【００６１】
先に述べたように、候補化合物は、有機小分子、無機小分子、多糖、ペプチド、タンパク質、核酸、細菌、植物、菌類、動物細胞、動物組織などの生体材料から作製された抽出物、及びこれらの任意の組合せであってもよい。
【００６２】
一般的に、候補化合物は、適切な期間にわたって、昆虫TRPVチャネルの活性を調節することができる任意の濃度で試験され得る。いくつかの実施形態において、候補化合物は、約0.1nM〜1000mMの範囲の濃度で試験されてもよい。特定の他の実施形態において、化合物は、約100μM〜約1000μMの範囲で試験されてもよい。特定のさらなる実施形態において、候補化合物は、0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.0mM、又は2mMで試験されてもよい。候補化合物の他の範囲及び濃度もまた適切であり得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、候補化合物は、2つ以上の異なる濃度で試験されてもよい。好ましくは、試験される最高濃度は、用いられる最低濃度と比較して、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも75倍、少なくとも100倍、少なくとも200倍、少なくとも250倍高い。例えば、候補化合物は、0.1mM、0.5mM、及び1mMで試験されてもよい。
【００６４】
一般的に、昆虫TRPVチャネルは、昆虫TRPVチャネルの活性を測定する前に、任意の適切な時間、候補化合物と接触されてもよい。例えば、昆虫TRPVチャネルは、昆虫TRPVの活性を測定する前に、少なくとも5秒間、少なくとも10秒間、少なくとも15秒間、少なくとも30秒間、少なくとも45秒間、少なくとも1分間、少なくとも2分間、少なくとも3分間、少なくとも4分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも60分間、又はそれを超えて候補化合物と接触されてもよい。いくつかの実施形態において、昆虫TRPVを候補化合物と接触させた瞬間に、活性を測定することができる。
【００６５】
いくつかの実施形態において、昆虫TRPVチャネルの活性をある期間にわたって測定することができる。例えば、活性は、少なくとも5秒間、少なくとも10秒間、少なくとも15秒間、少なくとも30秒間、少なくとも45秒間、少なくとも1分間、少なくとも2分間間、少なくとも3分間、少なくとも4分間、少なくとも5分間、少なくとも10分間、少なくとも15分間、少なくとも30分間、少なくとも60分間、又はそれを超えて測定され得る。測定は、昆虫のTPRVチャネルが候補化合物と接触する前に、昆虫TRPVが最初に候補化合物と接触した瞬間に開始することができ、又は昆虫TRPVが最初に候補化合物と接触した後、一定期間後に開始することができる。昆虫TRPVは、活性を測定しながら、候補化合物と連続的に、接触させてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、候補化合物は、昆虫特異的なTRPVチャネルの活性化について、500nM未満又はそれに等しい、250nM未満又はそれに等しい、100nM未満又はそれに等しい、50nM未満又はそれに等しい、10nM未満又はそれに等しい、1nM未満又はそれに等しい、0.1nM未満又はそれに等しい、0.01nM未満又はそれに等しい、又は0.001nM未満又はそれに等しいEC50を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、候補化合物は、昆虫特異的なTRPVチャネルの阻害について、500nM未満又はそれに等しい、250nM未満又はそれに等しい、100nM未満又はそれに等しい、50nM未満又はそれに等しい、10nM未満又はそれに等しい、1nM未満又はそれに等しい、0.1nM未満又はそれに等しい、0.01nM未満又はそれに等しい、又は0.001nM未満又はそれに等しいIC50を有する。
【００６８】
特定の実施形態において、候補化合物は、昆虫TRPVチャネルの活性を阻害する調節因子である。
【００６９】
特定の他の実施形態において、候補化合物は、昆虫TRPVチャネルを活性化する調節因子である。
【００７０】
好ましくは、候補化合物は、昆虫の摂食行動を阻害する調節因子である。
【００７１】
特定の実施形態において、候補化合物が優先的に哺乳動物特異的なTRPVチャネルと比較して、昆虫特異的なTRPVチャネルを調節するかどうかを決定するために、本方法は、哺乳動物のTRPVチャネルを発現する第2の細胞を提供することを更に含んでもよい。第2の細胞は、候補化合物と接触されてもよく、哺乳動物のTRPVチャネルの調節は、上記でも記載された、当該技術分野において公知の方法によってアッセイすることができる。アッセイするステップの後、昆虫TRPVチャネルの調節は、哺乳動物のTRPVチャネルの調節と比較されてもよく、哺乳動物のTRPチャネルと比較して、昆虫特異的なTRPVチャネルの調節の増加を示す候補化合物は、昆虫TRPVチャネルの選択的調節因子として候補化合物を特定する。
【００７２】
用語「優先的な調節」とは、昆虫特異的なTRPVの活性又は他の特性が、参照レベル又は哺乳動物特異的なTRPVチャネルと比較して、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも100%調節されることが意図されている。
【００７３】
特定の他の実施形態において、TRPVチャネルの非選択的調節因子を特定することができる。TRPVチャネルの調節因子に接続した「非選択的」なる用語は、化合物が、異なる生物においてTRPV又はTRPチャネルを調節することができ、例えば、化合物が、昆虫と哺乳動物のTRPVチャネルの両方を調節することができることを意味する。
【００７４】
特定の他の実施形態において、候補化合物は、昆虫特異的なTRPチャネル調節因子であり、哺乳類特異なTRPの活性を調節せず、例えば、試験化合物は、哺乳動物特異なTRPVチャネルに対して有意な効果を及ぼさない。
【００７５】
特定の実施形態において、昆虫TRPVチャネルは生体細胞にある。いくつかの実施形態において、哺乳動物のTRPVチャネルは生体細胞にある。用語「生物細胞」又は「細胞」は、本明細書で使用するとき、一般的に理解される意味を有する。細胞内で、TRPVチャネルは、細胞中の内因性遺伝子から、又は細胞にトランスフェクトされた少なくとも1つのベクターから発現させることができる。好ましくは、TRPVチャネルタンパク質、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質は、細胞内で共発現される。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質は、様々な比率で共発現され得、好ましくは第1の細胞において共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率は、約3:1〜約1:3、より好ましくは約1:1である。
【００７６】
本発明のスクリーニングアッセイにおいて使用される昆虫TRPVチャネルは、任意の昆虫TRPVチャネル若しくはホモログ又はその保存的改変体であってもよいです。例えば、TRPVチャネルが、ショウジョウバエTRPVチャネルであってもよい。また、TRPVチャネルの他の供給源は、本発明の方法に係る使用に適切であり得る。
【００７７】
昆虫TRPVチャネルは、Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質と結合すると考えられている。スクリーニングアッセイにおいて使用される哺乳動物のTRPVチャネルは、任意の哺乳動物TRPV又はそのホモログ、好ましくは昆虫TRPVチャネルに類似したTRPVチャネルであってもよい。いくつかの実施形態において、Nanchung核酸配列は、a)配列番号1〜27(図6〜32)からなる群から選択される配列を有する核酸分子を含むポリヌクレオチド分子、b)配列番号1〜27(図6〜32)の配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチド分子の断片からなる群から選択されてもよい。このような断片は、UTR、コアプロモーター、イントロン、エンハンサー、シスエレメント、又は任意の他の調節要素であり得る。
【００７８】
いくつかの実施形態において、Inactive核酸配列は、a)配列番号28〜53(図60〜85)からなる群から選択される配列を有する核酸分子を含むポリヌクレオチド分子、b)配列番号28〜53(図60〜85)の配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチド分子の断片からなる群から選択されてもよい。このような断片は、UTR、コアプロモーター、イントロン、エンハンサー、シスエレメント、又は任意の他の調節要素であり得る。
【００７９】
ヒト、マウス、ラット、若しくはハムスターのTRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPV5又はTRPV6
【００８０】
開示されているポリヌクレオチドは、宿主細胞においてNanchungタンパク質及びInactiveタンパク質の発現を提供することができる。
【００８１】
特定の実施形態において、Nanchungタンパク質配列は、a)配列番号54〜80(図33〜59)からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、b)配列番号54〜80(図33〜59)に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチドの断片又は保存的改変体からなる群から選択されてもよい。
【００８２】
特定の実施形態において、Inactiveタンパク質配列は、a)配列番号81〜106(図86〜111)からなる群から選択される配列を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、b)配列番号81〜106(図86〜111)に対して少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチド、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチドの断片又は保存的改変体からなる群から選択されてもよい。
【００８３】
Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質の配列アラインメントをそれぞれ図112及び113に示す。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質のファミリー分布ツリーをそれぞれ図114及び115に示す。
【００８４】
本明細書で使用するとき、「パーセント配列同一性」は、最適なアラインメントがなされた2つの配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定され、この場合、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部分又はポリペプチド配列は、2つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列(付加も欠失も含まない)と比較して、付加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含んでよい。このパーセンテージは、両方の配列に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して、一致する位置の数を求め、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で除算し、その結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出される。同一性のパーセンテージを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、BLASTなどの一般的に利用可能なコンピュータソフトウェアを用いて、当業者の範囲内にある種々の方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって、最適なアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００８５】
本明細書で使用するとき、用語「保存的改変体」とは、第1のアミノ酸が、例えば、同様のサイズ、電荷、疎水性又は水素結合能力であり得る、少なくとも1つの類似した生化学的特性を有する第2のアミノ酸又はアミノ酸類似体によって置き換えられるアミノ酸配列を指す。例えば、第1の疎水性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン又はそれらの類似体などの第二(同一でない)の疎水性アミノ酸で保存的に置換することができる。同様に、第1の塩基性アミノ酸は、アルギニン若しくはリジンなどの第2の(同一でない)塩基性アミノ酸、又はその類似体で保存的に置換され得る。同様に、第1の酸性アミノ酸は、アスパラギン酸若しくはグルタミン酸などの第2の(同一でない)酸性アミノ酸で保存的に置換され得、又はフェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸は、第2の芳香族アミノ酸若しくはそのアミノ酸類似体、例えばチロシンで保存的に置換され得る。いくつかの実施形態において、ペプチドは、少なくとも1つのアミノ酸、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個又はそれを超えるアミノ酸の保存的改変置換を含む。典型的に、保存的改変体は、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれを超える、野生型ペプチド配列の活性を保持する。
【００８６】
例示的な保存的改変置換としては、限定されないが、D-ala、Gly、Aib、β-Ala、Acp、L-Cys又はD-Cysによるアラニン(A)の置き換え、D-Arg、Lys、D-Lys、ホモ-Arg、D-ホモ-Arg、Met、Be、D-Met又はD-Ileによるアルギニン(R)の置き換え、D-Asn、Asp、D-Asp、Glu、D-Glu、Gln又はD-Glnによるアスパラギン(N)の置き換え、D-Asp、D-Asn、Asn、Glu、D-Glu、Gln又はD-Glnによるアスパラギン酸(D)の置き換え、D-Cys、S-Me-Cys、Met、D-Met、Thr又はD-Thrによるシステイン(C)の置き換え、D-Gln、Asn、D-Asn、Glu、D-Glu、Asp又はD-Aspによるグルタミン(Q)の置き換え、D-Glu、D-Asp、Asp、Asn、D-Asn、Gln又はD-Glnによるグルタミン酸(E)の置き換え、Ala、D-Ala、Pro、D-Pro、Aib、β-Ala又はAcpによるグリシン(G)の置き換え、D-Ile、Val、D-Val、AdaA、AdaG、Leu、D-Leu、Met又はD-Metによるイソロイシン(I)の置き換え、D-Leu、Val、D-Val、AdaA、AdaG、Leu、D-Leu、Met又はD-Metによるロイシン(L)の置き換え、D-Lys、Arg、D-Arg、ホモ-Arg、D-ホモ-Arg、Met、D-Met、Ile、D-Ile、Orn又はD-Ornによるリジン(K)の置き換え、D-Met、S-Me-Cys、Be、D-Ile、Leu、D-Leu、Val又はD-Valによるメチオニン(M)の置き換え、D-Phe、Tyr、D-Thr、L-Dopa、His、D-His、Trp、D-Trp、トランス-3,4若しくは5-フェニルプロリン、AdaA、AdaG、シス-3,4若しくは5-フェニルプロリン、Bpa、又はD-Bpaによるフェニルアラニン(F)の置き換え、D-Pro、L-I-チオアゾリジン-4-カルボン酸、又はD-若しくは-L-1-オキサゾリジン-4-カルボン酸(米国特許第4,511,390号)によるプロリン(P)の置き換え、D-Ser、Thr、D-Thr、アロ-Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、L-Cys、又はD-Cysによるセリン(S)の置き換え、D-Thr、Ser、D-Ser、アロ-Thr、Met、D-Met、Met(O)、D-Met(O)、Val、又はD-Valなどのスレオニン(T)の置き換え、D-Tyr、Phe、D-Phe、L-Dopa、His、又はD-Hisによるチロシン(T)の置き換え、及びD-Val、Leu、D-Leu、Ile、D-Ile、Met、D-Met、AdaA、又はAdaGによるバリン(V)の置き換えが挙げられる。
【００８７】
昆虫又は哺乳動物のTRPVチャネルの保存的改変体は、当該技術分野において公知のペプチド配列を改変するための方法に従って調製することができ、このような方法を集めている参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、J. Sambrookら編、第2版、Cold Spring Harbor、又はCurrent Protocols in Molecular Biology、F. M. Ausubelら編、John Wiley & Sons, Inc. New Yorkにおいて見出すことができるものを含み得る。
【００８８】
また、TRPVチャネルの保存的改変体は、TRPVポリペプチドをコードする核酸の改変によって作製されてもよい。
【００８９】
特定の実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、ハイスループットスクリーニングであってもよい。ハイスループットスクリーニング(HTS)とは、ロボット工学、データ処理及び制御ソフトウェア、液体操作デバイス、及び感度の良い検出器を使用する科学実験のための方法を指す。ハイスループットスクリーニング又はHTSは、研究者に数百万個の生化学的、遺伝的又は薬理学的な試験を迅速に行うことを可能にする。HTSは、当該技術分野において、例えば、米国特許第5,976,813号、第6,472,144号、第6,692,856号、第6,824,982号、及び第7,091,048号において周知である。
【００９０】
HTSは、候補化合物のライブラリーに対してアッセイのスクリーニングを実行するために、自動化を使用する。アッセイは、特異的な活性についての試験であり、通常、生化学的又は生物学的メカニズムの阻害又は刺激である。具体的には、アッセイは、昆虫TRPVチャネルの阻害又は刺激のためのスクリーニングである。典型的なHTSスクリーニングライブラリー又は「デッキ」は、100,000個から2,000,000個の化合物を含有することができる。
【００９１】
HTSの主な実験器具又は試験容器は、小さな容器であるマイクロタイタープレートであり、通常、使い捨てであり、ウェルと呼ばれる小さな、オープンディボットのグリッドを特徴とするプラスチックで作製されている。HTS用の現在のマイクロプレートは、一般的に、384ウェル、1536ウェル又は3456ウェルのいずれかを有する。これらは全て96の倍数であり、元の96ウェルマイクロプレートを反映し、8×12.9mm間隔のウェルを有する。
【００９２】
アッセイ用に準備するために、研究者は、彼らが実験を行うことを望む適切な試薬を用いて、プレートの各ウェルを満たす。ウェル中で化合物を吸収し、化合物に結合し、又は他には化合物と反応する(又は反応しない)のを可能にするためにいくらかのインキュベーション時間が経過した後、手動又は機械のいずれかにより、全てのプレートのウェルにわって測定が行われる。研究者が、(例えば)コンピュータが容易に自ら決定することができない変化を求めるために顕微鏡を用いている場合に、手動測定が多くの場合必要である。そうでなければ、特殊化された自動化分析機械は、電流測定又は電圧測定、比色測定、放射能カウントなどの、ウェル上で多数の実験を行うことができる。この場合において、機械は、数値のグリッドとして各々の実験の結果を出力し、各数値が単一ウェルから得られた値に対してマッピングする。大容量の分析機械は、このように数分間隔で数十のプレートを測定することができ、非常に迅速に数千の実験データ点を生じさせる。
【００９３】
IV.製剤、応用及び使用
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択された化合物を提供する。本明細書に記載されているスクリーニングアッセイにより選択された化合物の類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩並びに選択された化合物を含む製剤はまた、本明細書に含まれることを理解するべきである。
【００９４】
本発明の方法によって決定若しくは特定される化合物又は化合物群は、例えば、昆虫の摂食行動を調節することによって、昆虫を防除する方法に使用することができる。特定されたその化合物、類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩はまた、本明細書において「活性剤」又は「有効成分」と呼ばれる。
【００９５】
いくつかの実施形態において、化合物は、昆虫の摂食行動を調節する。本明細書で使用するとき、用語「摂食行動」とは、昆虫などの生物が食物を得るプロセスを指す。理論に束縛されることなしに、昆虫TRPVの調節は、昆虫の摂食行動を減少させ得る運動ニューロン調節を生じさせるシグナル伝達経路を誘発し、昆虫における昆虫TRPVチャネルのこのような調節は、飢餓による昆虫の死をもたらすこのような昆虫の摂食行動の減少をもたらす場合がある。したがって、再び理論に束縛されることなしに、昆虫TRPVチャネルを調節する(例えば、活性化又は阻害する)化合物は、殺虫剤として使用することができると考えられる。摂食行動の減少は、特定の場所で昆虫を破壊し、したがって、このような昆虫を制御するために使用することができる。このようにして、いくつかの実施形態において、本方法は、本明細書に記載されているスクリーニング方法によって特定された化合物を用いて、昆虫におけるTRPVイオンチャネル又はファミリーメンバーの調節を含む。
【００９６】
したがって、特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているスクリーニング方法によって特定された化合物を用いて、昆虫における摂食行動を調節することにより昆虫を防除(制御)する方法を提供する。昆虫を制御するための方法との関連で使用される場合、本明細書に記載されているスクリーニング方法により特定された化合物は、このような化合物の類似体、誘導体、異性体、及び医薬として許容される塩を含む。
【００９７】
一実施形態において、本明細書に記載されている方法及び活性剤は、農業有害生物又は園芸有害生物である昆虫に利用可能である。
【００９８】
農業有害生物の例としては、限定されないが、アブラムシ(Aphids)(マメクロアブラムシ(Aphis fabae)、ワタアブラムシ(Aphis gossypii)、リンゴアブラムシ(Aphis pomi)、ジャガイモヒゲナガアブラムシ(Aulacorthum solani)、ダイコンアブラムシ(Brevicoryne brassicae)、ジサフィス・プランタギネア(Dysaphis plantaginea)、チューリップヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum euphorbiae)、チューリップヒゲナガアブラムシ、イバラヒゲナガアブラムシ(Macrosiphum rosae)、モモアカアブラムシ(Myzus persicae)、レタスヒゲナガアブラムシ(Nasonovia ribisnigri)を含む);コナジラミ(アレウロデス属の種(Aleurodes spp.)、ベミシア属の種(Bemisia spp.)、ジアレウロデス属の種(Dialeurodes spp.)、トリアレウロデス属の種(Trialeurodes spp.)を含む);ウンカ(ヒメトビウンカ(Laodelphax striatellus)、トビイロウンカ(Nilaparvata lugens)、シファンタ属の種(Siphanta spp.)、セジロウンカ(Sogatella furcifera)を含む);ヨコバイ(アムラスカ属の種(Amrasca spp.)、エンポアスカ属の種(Empoasca spp.)を含む);カイガラムシ(アスピディオトゥス属の種(Aspidiotus spp.)、アカホシマルカイガラムシ(Chrysomphalus aonidum)、ワタフキカイガラムシ(Icerya purchase)、ニセヤノネカイガラムシ(Unaspis citri)を含む);コナカイガラムシ(マコネリコッカス属の種(Maconellicoccus spp.,)、パラコッカス属の種(Paracoccus spp.)、プラノコッカス属の種(Planococcus spp.)を含む);花粉甲虫(Pollen beetle)(カルポフィルス属の種(Carpophilus spp.)、メリゲテス属の種(Meligethes spp.)を含む);アザミウマ(カリオトリプス属の種(Caliothrips spp.)、フランクリニエラ属の種(Frankliniella spp.)、シルトスリップス属の種(Scirtothrips spp.)、スリップス属の種(Thrips spp.)を含む);及びキジラミ(バクテリセラ属の種(Bactericera spp.)、カコプシラ属の種(Cacopsylla spp.)、ミカンキジラミ(Diaphorina citri)、パラトリオザ・コケレリ(Paratrioza cockerelli)を含む)が挙げられる。
【００９９】
例えば、野菜及びアブラナ作物は、以下の害虫:アブラムシ、トビイロウンカ(brown plant hopper)、アルファルファシャクトリムシ、アワヨトウ幼虫、シロイチモジヨトウ(beet armyworm)、アーティチョークのトリバガ(plume moth)、キャベツ青虫(cabbage budworm)、キャベツシャクトリムシ、ハイマダラノメイガ(cabbage webworm)、アメリカタバコガ幼虫(corn earworm)、セロリ葉を食べる昆虫(celery leafeater)、クロスストリップトキャベツワーム(cross-striped cabbageworm)、セイヨウアワノメイガ(european corn borer)、コナガ(diamondback moth)、グリーンクローバーワーム(green cloverworm)、外来種の青虫、メロンワーム(melonworm)、雑食性ハマキムシ、メイガ科幼虫、リンドワーム群(rindworm complex)、キシタクロテンヒトリ(saltmarsh caterpillar)、ダイズシャクトリムシ、オオタバコガ幼虫、トマトフルーツワーム(tomato fruitworm)、トマトホーンワーム(tomato hornworm)、トマトのギョウチュウ、ヤガ科幼虫(velvetbean caterpillar)、及びイエローストリップトアーミーウォーム(yellowstriped armyworm)の1つ以上による病虫害に感受性である。
【０１００】
同様に、アルファルファ、牧草及びサイレージなどの穀物飼料及び干し草作物は、多くの場合、ヨトウムシ、シロイチモジヨトウ(beef annyworm)、アルファルファキャタピラー(alfalfa caterpillar)、ヨーロピアンスキッパー(European skipper)、様々なシャクトリムシとウェブワーム、並びにイエローストリップトアーミーウォームなどの有害生物によって攻撃される。
【０１０１】
果樹及びつる植物の作物は、多くの場合、アケマスフィンクスモス(achema sphinx moth)、アモルビア(amorbia)、ヨトウムシ、柑橘類のネキリムシ、バナナセセリ(banana skipper)、クロネハイイロハマキ幼虫(blackheaded fireworm)、ブルーベリーリーフローラー(blueberry leafroller)、エダシャクトリ、チェリーフルーツワーム(cherry fruitworm)、柑橘類のネキリムシ、クランベリーガードラー(cranberry girdler)、東テンマクケムシ(eastern tent caterpillar)、アメリカシロヒトリ、アメリカシロヒトリ、ハシバミのハマキムシ、ハシバミのウェブワーム、果樹のハマキムシ、ブドウホソハマキ(grape berry moth)、グレープリーフフォールダー(grape leaffolder)、グレープリーフスケルトナイザー(skeletonizer)、グリーンフルーツワーム(green fruitworm)、ガモソスバトラチェドラコモサエ(gummosos-batrachedra commosae)、マイマイガ、ヒッコリーシュックワーム(hickory shuckworm)、ホーンワーム(hornworm)、シャクトリムシ、ネーベルオレンジワーム(navel orangeworm)、オブリキバンデッドリーフローラー(obliquebanded leafroller)、雑食性ハマキムシ(orrinivorous leafroller)、雑食性シャクトリムシ、オレンジのハマキガ、オレンジドッグ(orangedog)、ナシヒメシンクイ(oriental fruit moth)、パンデミスのハマキムシ(pandemis leafroller)、キバガ科幼虫(peach twig borer)、ピカンナットケースベアラー(pecan nut casebearer)、レッドバンディドのハマキムシ(redbanded leafroller)、レッドハンプトキャタピラー(redhumped caterpillar)、ルーグリスキンドネキリムシ(roughskinned cutworm)、キシタクロテンヒトリ、スパンワーム(spanworm)、テンマクケムシ(tent caterpillar)、テクラテクラバシリデス(thecla-thecla basilides)、オオタバコガ幼虫、ハマキガ(tortrix moth)、タフティドアップルバドモス(tufted apple budmoth)、バリアゲイティドリーフローラー(variegated leafroller)、ウォルナットキャタピラー(walnut caterpillar)、西テンマクケムシ(western tent caterpillar)、及びイエローストリップトアーミーウォーム(yellowstriped annyworm)による攻撃及び立ち枯れ(defoliation)の影響を受けやすい。
【０１０２】
キャノーラ/菜種、マツヨイグサ、メドウフォーム、トウモロコシ(飼料用トウモロコシ、スイートコーン、ポップコーン)、ワタ、ホップ、ホホバ、ピーナッツ、イネ、ベニバナ、小粒穀物(オオムギ、オートムギ、ライムギ、コムギなど)、モロコシ、ダイズ、ヒマワリ、及びタバコなどの作物は、多くの場合、ヨトウムシ、アジアンコーンボーラー(asian corn borer)及び他のコーンボーラー、バンディドサンフラワーモス(banded sunflower moth)、シロイチモジヨトウ、ボールワーム(bollworm)、キャベツシャクトリムシ、コーンルートワーム(corn rootworm)(サザン種及びウエスタン種を含む)、コットンリーフパーフォレイター(cotton leaf perforator)、コナガ、セイヨウアワノメイガ(european corn borer)、グリーンクローバーワーム、ヘッドモス(headmoth)、ヘッドワーム(headworm)、外来種の青虫、シャクトリムシ(アナカンプトデス属の種(Anacamptodes spp.)を含む)、オブリキバンデッドリーフローラー、雑食性リーフタイヤー(omnivorous leaftier)、ポッドワーム(podworm)、キシタクロテンヒトリ、サウスウエスタンコーンボーラー(southwestern corn borer)、ダイズシャクトリムシ、スポッティドネキリムシ(spotted cutworm)、サンフラワーモス(sunflower moth)、オオタバコガ幼虫、タバコスズメガ幼虫、ヤガ科幼虫を含む昆虫による病虫害の標的となる。花壇用植物、花、観賞植物、野菜、及びコンテナ苗(container stock)は、しばしば、ヨトウムシ、アザレアモス(azalea moth)、シロイチモジヨトウ、コナガ、エロモス(ello moth)(スズメガ幼虫)、フロリダファーンキャタピラー(Florida fern caterpillar)、イオメダマヤママユ(Io moth)、シャクトリムシ、オレアンダーモス(oleander moth)、雑食性ハマキムシ(omnivorous leafroller)、雑食性シャクトリムシ、及びタバコなどの多数の害虫の餌とされる。林木、果樹、観賞用樹木、及び実のなっている樹木(nut-bearing tree)、並びに低木類、及びその他の苗木は、多くの場合、ミノムシ、クロネハイイロハマキ幼虫(blackheaded budworm)、シロバネドクガ、カリフォルニアオークワーム(California oakworm)、ベイマツドクガ(douglas fir tussock moth)、エルムスパンワーム(elm spanworm)、アメリカシロヒトリ、果樹のハマキムシ(fruit tree leafroller)、グリーンストリップトメイプルワーム(greenstriped mapleworm)、マイマイガ、ジャックパイン青虫、ミモザウェブワーム、パインバタフライ(pine butterfly)、レッドハンプトキャタピラー(redhumped caterpillar)、サドルバックキャタピラー(saddleback caterpillar)、サドルプロミネントキャタピラー(saddle prominent caterpillar)、春期及び秋期に発生するエダシャクトリ(spring and fall cankerworm)、トウヒノシントメハマキ幼虫(spruce budworm)、テンマクケムシ、ハマキガ、並びに西洋ドクガ(western tussock moth)などの種々の害虫からの攻撃を受けやすい。
【０１０３】
同様に、芝草は、多くの場合、ヨトウムシ、ソドウェブワーム(sod webworm)、及びトロピカルソドウェブワーム(tropical sod webworm)などの有害生物による攻撃を受ける。
【０１０４】
本明細書に記載されている方法はまた、有害生物防除に適用可能であり、ここで、有害生物は、昆虫ではなく、むしろ、例えば、線虫、ナメクジ又はカタツムリであることが想定される。
【０１０５】
一実施形態では、本明細書に記載されている方法はまた、寄生虫である昆虫に適用可能である。いくつかの昆虫寄生虫の例としては、アオムシサムライコマユバチ、コマユバチ(Braconidae)科;ヒメバチ類(Ichneumonid Wasps)、ヒメバチ(Ichneumonidae)科;コバチ類(Chalcid Wasps)、コバチ科(Chalcidae);ヤドリバエ類(Tachinid Flies)、ヤドリバエ(Tachonidae)科が挙げられる。
【０１０６】
特定の他の実施形態において、本明細書に記載されている方法はまた、病害媒体物である昆虫に適用可能であってもよい。ベクターは、感染又は疾患を引き起こすために、宿主生物に細菌又はウイルスなどの病原体を導入することができる生物である。例示的な病害媒体物には、限定されないが、蚊、ダニ、ノミ目(ノミ)、双翅目(ハエ)、シラミ目(シラミ)及び半翅目(半翅類の昆虫)が含まれる。
【０１０７】
殺虫剤使用に適した化合物が特定されると、有効成分又はそれらを含む製剤は、標的昆虫(すなわち、幼虫、蛹及び/又は成体)に、又は昆虫がいる場所(locus)に直接適用されてもよい。一実施形態において、有効成分又は有効成分を含有する製剤は、成体昆虫に直接適用される。一実施形態において、活性剤は、標的昆虫の幼虫及び蛹に直接適用される。別の実施形態において、有効成分は、昆虫がいる場所に適用される。
【０１０８】
疎水性部分を組み込んだ化合物が昆虫の上皮に浸透するため、活性剤は疎水性部分とコンジュゲートされ得る。疎水性部分としては、限定されないが、脂質及びステロールが挙げられる。
【０１０９】
一実施形態において、有効成分又は有効成分を含む製剤は、スプレーとして適用されてもよい。例えば、有効成分は、農薬の空中散布における農業用スプレー、刺咬昆虫を防除するための環境スプレー、又は刺咬昆虫の局在化防除のための局所的スプレーとして適用され得る。有効成分は、エアロゾル製剤としてスプレー適用の目的で製剤化することができる。スプレー塗布は、スプレーポンプを用いて成し遂げることができる。有効成分はまた、顆粒製剤中のデンプン、小麦粉及びグルテンなどの材料内にカプセル化されてもよい。
【０１１０】
特定の実施形態において、有効成分又は有効成分を含む製剤は、農業及び/又は環境の昆虫防除に使用される場合、有機リン酸、合成ピレスロイド、カルバメート類、塩素化炭化水素などの他の殺虫剤及び/又は殺有害生物剤と併せて適用することができる。
【０１１１】
有効成分は、ルーチン試験によって決定される所望の応答を誘導するのに有効な量で投与することができる。実際の有効量は、当然に、特定の有効成分、標的昆虫及びその発育段階、適用技術、塗布技術、所望の効果、及び効果の持続時間に応じて変化し、当業者によって容易に決定することができる。「有効成分の有効量」とは、昆虫TRPVチャネルを調節する(活性化する又は阻害する)、例えば、所望の昆虫防除を達成するために昆虫の摂食行動を調節する、有効成分の量を指す。
【０１１２】
製剤方法は、当業者に周知であり、また、参照により全体として本明細書に組み込まれるKnowles, D A (1998) Chemistry and technology of agricultural formulations. Kluwer Academic、Londonに見出される。当業者は、当然に、適用の処方及び様式が、所与の適用における有効成分の活性に影響を及ぼし得ることを認識する。したがって、農業用及び/又は園芸用使用に関して、TRPV阻害剤及び/又はアゴニストは、適用の所望の様式に応じて、相対的に大きな粒子サイズ(例えば、8/16若しくは4/8USメッシュ)の顆粒として、水溶性若しくは水分散性の顆粒として、粉末状ダストとして、水和剤として、乳化可能な濃縮物として、水性エマルジョンとして、溶液として、懸濁濃縮物として、カプセル懸濁液として、可溶性(液体)濃縮物として、可溶性粉末として、他の公知のタイプの農業的に有用な製剤のいずれかとして製剤化されてもよい。本明細書において特定された量は、あたかも「約」という用語が、特定された量の前に置かれているかのように、近似であることだけが意図されることを理解するべきである。
【０１１３】
これらの製剤は、昆虫防除が望まれる領域において、水希釈スプレー、又はダスト、又は顆粒のいずれかとして適用することができる。製剤は、有効成分、例えば昆虫TRPV阻害剤の0.1重量%、0.2重量%又は0.5重量%程度に少ないものから95%以上に多いものまでを含有してもよい。
【０１１４】
「ダスト」は、有効成分と、タルク、天然粘土、珪藻土、クルミの殻及び綿実粉などの粉末、並びに毒物の分散剤及び担体として作用する他の有機固体及び無機固体などの微粉固体との自由流動性混合物である、これらの微粉固体は50ミクロン未満の平均粒径を有する。本明細書に有用な典型的なダスト製剤は、90部、80部、70部、60部、50部、40部、30部、20部、好ましくは10部又はそれ未満の有効成分、例えば昆虫TRPV阻害剤又は昆虫TRPVアゴニストを含有するものである。一実施形態において、ダスト製剤は、有効成分の1部以下、及びタルクの99部以上を含んでもよい。
【０１１５】
製剤として有用である水和剤は、水又は他の分散剤中に容易に分散する、微粉粒子の形態である。水和剤は、最終的に、昆虫防除が、乾燥ダストとして、又は水若しくは他の液体中のエマルジョンとしてのいずれかで必要とされる場所に適用される。水和剤用の典型的な担体には、フラー土、カオリン粘土、シリカ、及び他の吸収性が高く、容易に湿らせる無機希釈剤が含まれる。水和剤は、典型的には、担体の吸収性に応じて、有効成分の5〜80%を含有するように調製され、通常、分散を容易にするために、少量の湿潤剤、分散剤又は乳化剤を含有する。例えば、有用な水和剤の製剤は、80.0部の有効成分、17.9部のパルメット粘土、及び1.0部のリグノスルホン酸ナトリウム、並びに湿潤剤として0.3部のスルホン化脂肪族ポリエステルを含有する。追加の湿潤剤及び/又は油は、植物の葉の分散を容易にするためにタンクミックスに添加してもよい。
【０１１６】
他の有用な製剤は、水又は他の分散液中に分散可能な均一な液体組成物である乳化可能な濃縮物(EC)であり、全体として、有効成分、及び液体若しくは固体の乳化剤からなっていてもよく、又はキシレン、重質芳香族ナフサ、イソホロン、若しくは他の非揮発性有機溶媒などの液体担体も含有してもよい。殺虫剤適用に関して、これらの濃縮物は、水又は他の液体担体中に分散され、通常、処理されるべき領域にスプレーとして適用される。本質的な有効成分の重量%は、組成物が適用される方式に応じて異なってもよいが、一般的には、殺虫剤組成物に対して、0.5〜95重量%の有効成分を含む。
【０１１７】
流動性製剤は、有効成分が液体担体に、一般的には水に懸濁していることを除いて、ECと同様である。ECなどの流動性剤は、少量の界面活性剤を含んでもよく、典型的には、組成物の、0.5〜95重量%の範囲で、しばしば10〜50%の範囲で有効成分を含有する。殺虫剤適用に関して、流動性剤は、水又は他の液体ビヒクル中に希釈してもよく、典型的には、スプレーとして適用される。
【０１１８】
農業用及び/又は園芸用製剤に使用される典型的な湿潤剤、分散剤又は乳化剤としては、限定されないが、アルキル及びアルキルアリールスルホン酸塩及び硫酸塩並びにそれらのナトリウム塩;アルキルアリールポリエーテルアルコール;硫酸化高級アルコール;ポリエチレンオキシド;スルホン化動物油及び植物油;スルホン化石油;多価アルコールの脂肪酸エステル及びこのようなエステルのエチレンオキシド付加生成物;及び長鎖メルカプタン及びエチレンオキシドの付加生成物を含んでもよい。有用な表面活性剤の多数の他のタイプは、商業的に利用可能である。表面活性剤は、使用時に、典型的には、組成物の1〜15重量%を含む。
【０１１９】
他の有用な製剤には、水、コーンオイル、灯油、プロピレングリコール、又は他の適切な溶媒などの比較的不揮発性な溶媒中の有効成分の懸濁液が含まれる。
【０１２０】
特定の実施形態において、殺虫剤適用のための製剤としては、アセトン、アルキル化ナフタレン、キシレン、又は他の有機溶媒などの、所望の濃度で完全に溶解する、溶媒中の有効成分という単純な溶液を含んでもよい。
【０１２１】
有効成分を相対的な粗い粒子上に有する顆粒製剤は、空中散布用又はカバークロップキャノピーの浸透用に特に有用である。また、加圧されたスプレー、典型的には、有効成分が、低沸点分散溶媒担体の気化の結果として微粉形態に分散されているエアロゾルを使用してもよい。水溶性又は水分散性顆粒は、自由流動性、ほこりっぽくなく、容易な水溶性又は水混和性である。田畑での農業従事者による使用では、顆粒製剤、乳化可能な濃縮物、流動性濃縮物、水性エマルジョン、溶液などは、およそ0.1%又は0.2%〜1.5%又は2%の範囲で有効成分の濃度を与えるために水で希釈されてもよい。
【０１２２】
非常に最も頻繁に使用されるのは、水と混合し、次にスプレーとして適用するための水混和性製剤である。水混和性のより古い製剤としては、乳化可能な濃縮物、水和剤、水溶性(液体)濃縮物、及び可溶性粉末が含まれる。減少又は全く有害でない溶媒と改善された安定性を有する、より新しい非粉末製剤としては、懸濁濃縮物、カプセル懸濁液、及び顆粒水和剤が含まれる。このような製剤は、好ましくは、溶液及び懸濁液、例えば、水性懸濁液及び溶液、エタノール性懸濁液及び溶液、水性/エタノール性懸濁液及び溶液、生理食塩水、及びコロイド状懸濁液である。
【０１２３】
代替として、スプレー可能なワックスエマルジョン製剤を用いることができる。製剤は、約0.01重量%〜75重量%の量で有効成分を含有する。水性ワックスエマルジョンは、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第6,001,346号に広く記載されている。本明細書に記載されている方法のTRPV阻害剤は、空中スプレー又はバックパックスプレー適用における使用に適した粘度を有することができる。
【０１２４】
生分解性ワックス担体は、製剤の少なくとも約10重量%を含む。生分解性ワックス担体は、パラフィン、ミツロウ、植物系ワックス、例えば大豆ワックス(大豆系)、炭化水素系ワックス、例えばGulf Wax Householdパラフィンワックス;パラフィンワックス、平均融点53℃(ヘキサデカン)、高分子量炭化水素)、カルナウバワックス、ラノリン、シェラックワックス、ヤマモモワックス、サトウキビワックス、微結晶、オゾケライト、セレシン、モンタン、キャンデリラワックス、及びこれらの組合せからなる群から選択される。
【０１２５】
製剤はまた、約1重量%〜約10重量%の量の乳化剤を含有してもよい。適切な乳化剤には、レシチン及び変性レシチン、モノ及びジグリセリド、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、脂肪酸、脂質などを含む。乳化剤は、組成物の乳化特性を与え又は改善する。乳化剤は、当該技術分野において周知である多数の製造物から選択することができ、限定されないが、ソルビタンモノラウレート(無水ソルビトールステアレート、分子式C24H46O6)、ARLACEL 60、ARMOTAN MS、CRILL 3、CRILL K3、DREWSORB 60、DURTAN 60、EMSORB 2505、GLYCOMUL S、HODAG SMS、IONET S 60、LIPOSORB S、LIPOSORB S-20、MONTANE 60、MS 33、MS33F、NEWCOL 60、NIKKOL SS 30、NISSAN NONION SP 60、NONION SP 60、NONION SP 60R、RIKEMAL S 250、ソルビタンc、ソルビタンステアレート、SORBON 60、SORGEN 50、SPAN 55、及びSPAN 60が挙げられる;使用され得る他のソルビタン脂肪酸エステルは、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステアレート、ソルビタントリステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタンセスキオレエート、ソルビタントリオレエート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタントリオレエートを含む。
【０１２６】
特定の実施形態において、製剤は、摂食刺激物質(phagostimulant)、例えば、コーン油、糖蜜、グリセロール、又はコーンシロップ、タンパク質性物質(タンパク質又は加水分解されたタンパク質)、スクロースのような糖、又は食品ベース構成成分、例えば、トリメチルアミン、プトレシン、細菌又は酵母菌の揮発性物質又は代謝産物、酢酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、又は他のアンモニア放出化合物を含むことができる。酢酸蒸気は、揮発酢酸、例えば、酢酸水溶液、氷酢酸、氷(濃縮)酢酸、又はアンモニア生成化合物、例えば、制限されないが、水酸化アンモニウム、炭酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどを生成する化合物によって提供され得る。
【０１２７】
特定の実施形態において、有効成分を製剤化することができ、及び/又は1つ以上の第2の化合物とともに適用することができる。例えば、TRPV阻害剤及びTRPVアゴニストの種々の組合せはより大きな利点を得るために使用することができる。例えば、TRPV阻害剤とTRPVアゴニストの両方を同時に適用してもよい。このように、一実施形態において、本明細書に記載されている製剤は、TRPV阻害剤とTRPVアゴニストの両方を含むことができる。一実施形態において、2つ以上の活性剤を一緒に製剤化することができる。代替の実施形態において、一緒に製剤化される2つ以上の活性剤は、すべてがTRPV阻害剤である又はすべてがTRPVアゴニストである。このような組合せは、特定の利点を与えることができ、例えば、限定されないが、昆虫又は非害虫のより大きな防除に相乗効果を発揮し、適用率を下げ、それにより環境及び作業者の安全性に何らかの影響を最小限にし、より広範囲の昆虫及び非害虫を防除し、哺乳動物及び魚類などの非有害生物種による寛容を改善することが挙げられる。他の第2の化合物としては、限定されないが、殺虫剤、殺有害生物剤、植物生長調節剤、肥料、土壌改良、又は他の農園芸化学物質が含まれる。製剤は、組成物の約0.002重量%〜約25重量%の量でこのような第2の化合物を含んでもよい。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明の製剤は、視覚誘因物質、例えば食品着色剤を含有してよい。
【０１２９】
種々の添加剤もまた、製剤に組み込むことができる。これらの添加剤は、典型的には、担体材料の物理的特徴を変化及び/又は増強させ、したがって、有効成分の放出速度及び量、気候条件からのワックス組成物の保護などの特定の要件を有する組成物を設計するのに適している。これらの添加剤は、典型的には、約0.001重量%〜約10重量%、より典型的には1〜6重量%の量で添加される、とりわけ、可塑剤、揮発抑制剤、酸化防止剤、脂質、種々の紫外線遮断剤及び吸収剤、又は抗菌剤である。
【０１３０】
可塑剤、例えば、グリセリン又は大豆油は、組成物の物理的特性に影響を及ぼし、環境破壊への耐性を広げることができる。
【０１３１】
酸化防止剤、例えば、ビタミンE、BHA(ブチル化ヒドロキシアニソール)、BHT(ブチル化ヒドロキシトルエン)、及び分解からの生物活性剤を保護する他の酸化防止剤は、約0.1重量%〜約3重量%の量で添加されてもよい。
【０１３２】
β-カロテン、リグニン又はp-アミノ安息香酸などの紫外線遮断剤は、光分解から生物活性剤を保護し、約1重量%〜約3重量%の量で添加することができる。
【０１３３】
ソルビン酸カリウム、硝酸塩、亜硝酸塩、及びプロピレンオキシドなどの抗菌剤は、微生物による破壊から生物活性剤を保護し、約0.1重量%〜約2重量%の量で添加されてもよい。
【０１３４】
また、アジュバントを製剤に添加することができる。「アジュバント」は、殺虫剤の性能を改善する殺虫製剤とは別に、スプレータンクに添加される任意の物質として広く定義される。これらは、限定されないが、湿潤-散布剤、ステッカー、浸透剤、相溶性剤、緩衝剤などを含むことができる。
【０１３５】
他の化合物及び材料もまた添加することができるが、ただし、それらは、有効成分の活性を実質的に妨害しない。添加剤が有効成分の活性を実質的に妨害するか否かは、標準的な試験形式によって決定することができ、化合物が添加されていない有効成分の組成物の効力と、化合物が添加された有効成分の組成物の効力を直接比較することを伴う。
【０１３６】
昆虫は、TRPVチャネル活性化化合物を摂取した後に食べるのを止めることが発見された。例えば、TRPVイオン依存性チャネルアゴニストの摂取は、昆虫に食べるのを止めさせる可能性がある。したがって、一実施形態において、化合物は、昆虫用の食物源を用いて製剤化されてもよく、例えば、昆虫の食餌に化合物を製剤化させてもよい。別の実施形態において、化合物は、スクロースを用いて製剤化することができる。理論に束縛されることなしに、昆虫は、このような混合物を餌にし、食べるのを止める。
【０１３７】
特定の実施形態において、活性剤は、昆虫の摂食場所に適用されてもよい。これは、昆虫の飢餓をもたらす昆虫摂食を阻害する。一実施形態において、活性剤は、昆虫がいる場所、例えば、摂食場所にスプレーとして適用される。
【０１３８】
一実施形態において、活性剤は、捕虫器に適用されてもよい。例えば、捕虫器は活性剤で被覆されてもよく、又は活性剤を含む昆虫食を入れておいてもよい。
【０１３９】
V.調整可能な発現ベクター及びシステム
特定の実施形態において、本発明は、昆虫TRPVチャネルをコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。
【０１４０】
一実施形態において、発現ベクターは、Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子、及びInactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む。好ましくは、細胞内でのNanchungタンパク質及びInactiveタンパク質の発現により、機能性昆虫TRPVチャネルが形成される。
【０１４１】
特定の他の実施形態において、本発明は、第1の核酸分子を含む第1の調整可能な発現ベクター、及び第2の核酸分子を含む第2の調整可能な発現ベクターを含む発現ベクターに関する。発現ベクターは、昆虫TRPVチャネルをコードする。
【０１４２】
一実施形態において、第1の発現ベクターは、Nanchungタンパク質をコードする第1の核酸分子を含み、第2の発現ベクターは、Inactiveタンパク質をコードする第2の核酸分子を含む。
【０１４３】
例えば、第1の核酸分子は、a)配列番号1〜27からなる群から選択される配列を有する核酸分子を含むポリヌクレオチド分子、b)配列番号1〜27の配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチド分子の断片からなる群から選択される。
【０１４４】
例えば、第2の核酸分子は、a)配列番号28〜53からなる群から選択される配列を有する核酸分子を含むポリヌクレオチド分子、b)配列番号28〜53の配列に対して少なくとも約70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド分子、及びc)a)又はb)のポリヌクレオチド分子の断片からなる群から選択される。
【０１４５】
好ましくは、細胞内でのNanchungタンパク質及びInactiveタンパク質の発現により、機能性昆虫TRPVチャネルが形成される。
【０１４６】
TRPVチャネルのNanchungサブユニット及びInactiveサブユニットの核酸配列、並びに対応するアミノ酸配列、それらの起源及び受託番号(可能な場合)は、以下の表1にまとめられる。
【０１４７】
【表１】
0006509230.tif 000002
0006509230.tif 000003
0006509230.tif 000004
【０１４８】
発現ベクター及びシステムは、更に、調整可能なプロモーターシステムを含むことができる。調整可能な遺伝子発現システムのために開発されたプロモーターシステムの例としては、テトラサイクリン応答(Tet)、RU-486誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが含まれる。
【０１４９】
他のタンパク質のトランス活性化ドメインに融合したハイブリッドTetリプレッサーを使用する、一般的に使用されるtet-on又はtet-offシステムとは異なり、本発明の発現ベクター及びシステムは、非ハイブリッドの天然Tetリプレッサーを用いる。非ハイブリッドの天然Tetリプレッサーを用いることによって、アデノウイルスパッケージング細胞によるNan、Iav又はmTRPV4の産生は抑制され得る。独占的に抑制する。このように、本発明の方法によれば、アデノウイルスは、非ハイブリッドの天然Tetリプレッサーを構成的に発現する、修飾されたHEK293細胞によってパッケージングされた。Tetリプレッサーは、テトラサイクリンなしに修飾されたCMVプロモーター内のtetオペレーターに結合し、プロモーターをシャットダウンする。それは、パッケージング細胞が、毒性の導入遺伝子によって被毒されない理由である。ウイルスパッケージング中に導入遺伝子の発現を抑えるための他の方法を用いてもよい。
【０１５０】
具体的には、本発明の特定の実施形態によれば、Tetシステムは、昆虫TRPVチャネルのNanchung及びInactiveタンパク質の核酸の発現を調整するために使用されてもよい。
【０１５１】
本発明の特定の実施形態において、調整可能なプロモーターシステムは、少なくとも1つのTetリプレッサー結合部位を含む。好ましくは、調整可能なプロモーターシステムは、2つ以上のTetリプレッサー結合部位を含む。最も好ましくは、調整可能なプロモーターシステムは、2つのTetリプレッサー結合部位を含む。Tet応答要素に基づくシステムが十分に特徴付けされ、以前にGossen及びBujuard(Proc Nat Acad Sci USA、89:5547〜5551、1992)によって記載された。
【０１５２】
特定の実施形態において、調整可能なプロモーターは、目的とする遺伝子に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターであってもよい。プロモーターシステムは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンによって調整可能であり得る。
【０１５３】
特定の実施形態において、発現ベクターは、組換えアデノウイルスコアを更に含む。
【０１５４】
一実施形態において、アデノウイルスシャトルベクターであるpENTCMV1-TetOを使用することができる。当業者は、代替的のプロモーター、エンハンサー、他の調節要素、及び核酸が、本発明のtet-調整可能なpENTCMV1-TetOベクターの構築に用いられ得ることを理解する。図1に示すように、細胞においてアデノウイルス発現がないパッケージングのために、Tetリプレッサー結合部位を含む修飾されたサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、TRPVチャネルのNanchung又はInactiveタンパク質のいずれかのための核酸配列を含むTRPチャネルコード領域、2つのFLAGエピトープタグによって隣接された、AcGFP1などの蛍光タンパク質の核酸配列を含む。
【０１５５】
このようにして、特定の実施形態において、本発明は、アデノウイルスのコア起点、一過性受容体電位V(TRPV)チャネルコード領域、エピトープタグをコードする2つの核酸により隣接された蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、及び調整可能なプロモーターシステムを含む発現ベクターに関する。TRPVコード領域は、Nanchung及びInactiveの核酸配列が哺乳動物発現のために最適化されているTRPVチャネルのNanchungタンパク質のコード領域、すなわち、第1の核酸(例えば、配列番号2、NCBI参照配列:NM_001274904.1)又はInactiveタンパク質のコード領域、すなわち、第2の核酸(例えば、配列番号28、NCBI参照配列:NM_132125.1)を含む。それはまた、マウスTRPV4チャネル(例えば、配列番号2、NCBI参照配列:NM_001274904.1)のコード領域を含む。調整可能なプロモーターシステムは、少なくとも1つであるが、好ましくは2つ以上のTetリプレッサー結合部位、及びTRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターを含む。
【０１５６】
特定の他の実施形態において、本発明は、配列番号1〜27から選択される核酸配列を含み、TRPVチャネルのNanchungタンパク質をコードする第1のポリヌクレオチド分子を含む第1の発現ベクター、配列番号28〜53から選択される核酸を含み、TRPVチャネルのInactiveタンパク質をコードする第2のポリヌクレオチド分子を含む第2の発現ベクターを含む発現ベクターシステムに関する。第1及び第2の発現ベクターは、更に、アデノウイルスのコア起点、蛍光タンパク質をコードする第3の核酸、エピトープタグをコードする核酸、Tetリプレッサー結合部位を含む調整可能なプロモーターシステム、及びTRPVチャネルのコード領域に作動可能に連結された最小のサイトメガロウイルスプロモーターを含み、ここで、第1及び第2の発現ベクターは哺乳動物発現のために最適化される。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、pENTCMV1-TetOベクターは、TRPV核酸の発現を容易にするためのKozak様コンセンサス配列を含んでもよい。(例えば、Kozak, M、J. Biol. Chem.、266(30): 19867〜19870、1991を参照されたい)。任意のKozak様コンセンサス配列は、本発明のベクターに含まれてもよい。
【０１５８】
VI.アデノビリオン産生
アデノビリオンは、本発明のアデノウイルス発現ベクターを含み、以下の方法を用いて産生することができる。
【０１５９】
本方法は、概して、目的とする遺伝子(例えば、Nan又はIav)及びアデノウイルスコード領域(すなわち、アデノウイルス発現ベクター)を含有するベクターを、産生細胞(例えば、大腸菌細胞)において発現し得る産生細胞に導入するステップを伴う。アデノウイルス発現ベクターは、当業者に公知の標準的なトランスフェクション技術を用いて産生細胞に導入されてもよい。(Zoltukhinら、Gene Therapy、6:973〜985、1999)。
【０１６０】
具体的には、本発明の一実施形態によれば、タグ化されたNanchung、Inactive又はTRPV4発現構築物を含有するpENTCMV1-TetOベクター(Welgen、MA)は、LRクロナーゼII(Life Technologies、Grand Island、NY)で処理され、残りのアデノウイルスゲノムを含有しているpAdREPプラスミド(Welgen、MA)にライゲートされた。組換え産物を大腸菌細胞に形質転換し、陽性クローンを選択し、コスミドDNAを精製した。精製されたコスミドDNAは、アデノウイルスパッケージング細胞によってTRPVチャネルの発現を防止するTetリプレッサーを生成するHEK293-TetR細胞にトランスフェクトされた。
【０１６１】
次に、アデノビリオンは、トランスフェクトされたHEK293-TetR細胞の上清から収穫される。アデノビリオンは、当該技術分野において公知の方法により精製され、濃縮され得る。増幅された組換えアデノウイルスは、2つの連続した塩化セシウム勾配により精製され、続いて、緩衝液(PBS、10%グリセロール、pH7.4)を用いて透析し、塩濃度を減少させた。
【０１６２】
Tet調整可能なアデノウイルスベクターから形成されたアデノビリオンは、目的とするタンパク質を発現し得る細胞株に送達され得る。
【０１６３】
VII.細胞
本発明はまた、本明細書に記載されている発現ベクター又はシステムを含む細胞に関する。
【０１６４】
好ましくは、昆虫TRPVチャネルのNanchungタンパク質及びInactiveタンパク質を細胞内で共発現する。Nanchungタンパク質及びInactiveタンパク質は、様々な比率で共発現されてもよく、好ましくは、第1の細胞内で共発現されるNanchungタンパク質とInactiveタンパク質の比率は、約3:1〜約1:3であり、より好ましくは約1:1である。
【０１６５】
好ましくは、アデノビリオンは、特定の標的細胞に適切な標準的な形質導入法に従って、感染の適切な多重度で細胞に添加される。投与するアデノビリオンの力価は、標的細胞の種類及び特定のウイルスベクターに依存して変化することができ、過度の実験を行うことなしに当業者によって決定され得る。アデノビリオンは、生理学的に許容される担体中で投与することができる。一般的に、「生理学的に許容される担体」とは、細胞株に毒性がなく又は過度に有害ではないものである。例示的な生理学的に許容される担体には、滅菌された、発熱物質を含まない、リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。生理学的に許容される担体は、医薬として許容される担体を含む。
【０１６６】
細胞株は、昆虫の細胞株、例えば、SG9(ATCC番号CRL-1711)若しくはSchneider 2(S2)細胞(Life Technologies、番号R690-07)、カエル(アフリカツメガエル)卵母細胞、又は哺乳動物細胞株、例えば、マウス、ハムスター、ヒト細胞株、又は通常、Nanchingタンパク質及びInactiveタンパク質を発現しない任意の他の細胞株であってもよい。本発明のベクター発現系を用いた使用に適した哺乳動物細胞株の一例としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO-K1)細胞(ATCC番号CCL-61)が含まれる。
【０１６７】
特定の実施形態において、細胞株は、3:1、2:1、1:1、1:2、及び1:3の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する。好ましくは、細胞株は、1:1の比率でNanchungタンパク質とInactiveタンパク質を共発現する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、TRPVチャネルをコードする組換え核酸配列を発現する細胞は、限定されないが、本明細書に開示されているTRPVチャネルタンパク質などの昆虫TRPVチャネルをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされた細胞である。当業者に公知である細胞を形質転換するための方法としては、限定されないが、ウイルスベクター、リポフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、及びトランスフェクションを用いた感染が挙げられる。代表的な方法に関する詳細な手法は、Sambrook & Russell、2001及びそこに引用された参考文献に見出すことができる。有用な発現ベクター、このようなベクターを細胞内に導入する方法又はコードされたポリペプチドの発現はまた、当業者に公知である。例えば、プラスミド発現ベクターは、カルシウム-リン酸を媒介としたトランスフェクション、DEAE-デキストランを媒介としたトランスフェクション、リポフェクション、ポリブレン若しくはポリリジンを媒介としたトランスフェクション、エレクトロポレーションによって、又は抗体、グラマシジンS、人工的なウイルスエンベロープ若しくは他の細胞内担体へのコンジュゲーションによって、細胞内に導入することができる。ウイルス発現ベクターは、感染又は形質導入によって、例えば、又はリポソーム中にカプセル化することによって、発現可能な形態で細胞内に導入され得る。
【０１６９】
昆虫TRPVチャネル遺伝子産物をコードする組換え核酸配列を発現する細胞が生成された場合、これらの細胞は、次に、TRPVチャネルを介して細胞内で陽イオン輸送を調節する能力について候補化合物を試験するのに用いることができる。細胞内で陽イオン輸送を試験するための例示的な方法は、上述され、及び以下の実施例の部おいて示された。他の適用可能な方法は、本開示を考慮すれば、当業者に公知である。
【実施例】
【０１７０】
以下の実施例は、例証的な実施形態を提供する。本開示及び当業者の一般的レベルに照らして、当業者は、以下の実施例が例示のみを意図しており、多数の変化、修飾及び変更は、本開示の主題の範囲から逸脱することなく用いることができることを理解する。
【０１７１】
実施例で用いられる実験材料及び手法
I.試験化合物
ルテニウムレッドをCalbiochemから購入した。ピメトロジンとGSK10116790AをSigma(St. Lois、MO)から購入し、ピリフルキナゾンをChemService Inc.、(West Chester、 PA)、ピリフルキナゾン代謝物BをWako Pure Chemical Industries, LTD (Richmond、VA)から購入した。
【０１７２】
II.発現構築物/ベクター構築
本発明の構築物を生成するために、ショウジョウバエNanchungタンパク質(NCBI NM_001274904.1、配列番号2)及びInactiveタンパク質(NCBI NM_132125.1、配列番号28)をコードする相補性DNA(cDNA)をLife Technologies(Grand Island、NY)により合成し、NanchungとInactiveの両方のC末端でFLAG抗体タグ(DYKDDDDK、配列番号107)をコードする配列を加えた。
【０１７３】
FLAGエピトープをコードする配列を含有するマウスTRPV4(mTRPV4)タンパク質(NCBI NM_001274904.1)についての相補的DNAをOrigene(Rockville、MD)から購入した。昆虫のcDNAを哺乳動物発現用にコドン最適化した。
【０１７４】
AcGFP部分のC末端でFLAGを含有する、修飾されたpAcGFP1-Hyg-N1ベクター(Clontech、京都、日本)のBglIIとHindIII部位に、Nanchung-FLAG cDNA及びInactive-FLAG cDNAをサブクローニングした。
【０１７５】
VP1.5Fプライマー(5'-GGACTTTCCAAAATGTCG-3'、配列番号108)とmTRPV4_Hind3Rプライマー(5'-CCGGCCGTTTATCACTACAGAATTCGAAGCTTAACCTTATCGTCGTCATCCTTGTA-3'、配列番号109)を用いてmTRPV4-FLAG cDNAをPCR増幅し、BglIIとHindIII部位で消化し、pAcGFP1-Hyg-N1-FLAGベクターにサブクローニングした。
【０１７６】
pAcGFPN1_Hygrovectorは、AcGFPのC末端でFLAGタグを含有した。
【０１７７】
pAcGFPN1_HygroベクターにはAcGFP部分のC末端でFLAGタグが含有するため、これらのクローニング手法は、Nanchung、InactiveとmTRPV4の両方のカルボキシル末端に2つのFLAGエピトープタグにより隣接されたAcGFPタンパク質を添加した。
【０１７８】
エピトープタグ化された発現構築物は、Welgen, Inc.(Worceter、MA)によって提供されているアデノウイルスシャトルベクターpENTCMV1-TetO中にPCRクローニングされた。
【０１７９】
pENTCMV1-TetOベクターは、Tetリプレッサーを発現する細胞株において目的とする遺伝子の転写を抑える修飾されたCMVプロモーター内に2つのTetリプレッサー結合部位を含有した。
【０１８０】
III.組換えアデノウイルスの生成
タグ化されたNanchung、Inactive及びTRPV4発現構築物を含有するpENTCMV1-TetOベクターは、LR Clonase II(Life Technologies、Grand Island、NY)で処理され、残りのアデノウイルスゲノムを含有するpAdREPプラスミド(Welgenによって提供されている)にライゲートされた。
【０１８１】
組換え産物を大腸菌細胞に形質転換し、陽性クローンを選択し、コスミドDNAを精製した。精製されたコスミドDNAをPAC Iで消化し、次に、アデノウイルスパッケージング細胞によってTRPVチャネルの発現を防止するTetリプレッサーを産生するHEK293-TetR細胞にトランスフェクトした。細胞をダルベッコ改変イーグル培地中で増殖させた。アデノウイルスプラークは、トランスフェクションの7日後に観察された。アデノウイルスは、CellSTACK培養チャンバー(Corning Inc.、Lowell、MA)上で増殖させた大規模な培養物から精製された。
【０１８２】
ウイルス粒子の濃度を決定するために、10μlのウイルス試料を990μlの0.1%SDSと混合し、室温で15分間インキュベートした。試料の光学密度を260nm(A260)で測定し、式:ウイルス粒子/ml=A260×1.1×1014からウイルス力価を算出した。
【０１８３】
IV.Ca2+動員及び膜電位アッセイ
昆虫及びマウスのTRPVチャネル活性における試験化合物の効果は、タグ化されたNan、Iav又はmTRPV4タンパク質を発現するアデノウイルスを用いて形質導入されたハムスターCHO-K1細胞(ATCC番号1 CCL-61)で試験された。細胞あたり指示量のウイルス粒子を用いて細胞を形質導入し、100μlの培地中、40,000細胞/ウェル密度で、ポリ-D-リジン被覆された96ウェルプレート(Greiner Bio-One、Frickenhausen、Germany)上に播種した。細胞を37℃で一晩維持し、続いて、3日間、25℃で維持した。播種後、2日目に培地を交換した。
【０１８４】
Ca2+動員と膜電位の変化は、FLIPR-TETRA装置(Molecular Devices、Sunnyvale、
CA)を用いて測定された。
【０１８５】
Ca2+動員は、FLUO4蛍光プローブ(Life Technologies、Grand Island、NY)を用いて測定された。細胞は、4μM fluo-4AM、5mMプロベネシド及び0.02%プルロニックを含有する、50μlのハンクス緩衝塩溶液(HBSS)とともに、2時間、25℃で充填された。次に、色素を捨て、50μlのHBSSを各ウェルに添加し、プレート蛍光測定値を、製造業者の指示書に従って、470〜495nm/515〜575nmの励起/発光にてFLIPR装置で読み取った。試験化合物をDMSOに溶解させ、50μl HBSSに細胞を添加した。DMSOの最終濃度は0.2%であった。10分間、1秒間隔で蛍光をモニターした。
【０１８６】
同様の手法を用いて膜電位の変化を測定したが、HBSS緩衝液中の専用の膜電位色素(Molecular Devices、カタログ番号R8042)とともに細胞を充填し、510〜545nm/565〜625nmの励起/発光で蛍光をモニターしたことは除く。
【０１８７】
V.ウェスタンブロット
アデノウイルスを形質導入された細胞を35mmディッシュに播種した。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、プロテアーゼインヒビターカクテル(Sigma Aldrich)及びTurboDNAse(Ambion)を補足した300μlのNuPAGE LDS試料緩衝液(Life Technologies)に溶解した。NuPaGe 4〜12% Bis-Tris Pre-Castゲルシステム(Life Technologies、Grand Island、NY)を用いて試料を電気泳動し、ニトロセルロースフィルターに移動させた。AcGFP部分(Clontech、Mountain View、CA)に対する抗体を用いてTRPタンパク質を検出し、ブロットをECL試薬(Thermo Scientific)を用いて発色させた。
【０１８８】
[実施例I]
昆虫TRPVチャネルが、昆虫の摂食ブロッキング化合物の直接的な標的であるという仮説を試験するために、CHO-K1細胞株においてTRPVチャネルタンパク質、Nan及びIavサブユニットを単独で、又は図1に示されるように、AcGFPと、カルボキシ末端上の2つのFLAG抗体エピトープタグを含有する融合タンパク質として組み合わせて発現させた。
【０１８９】
タグ化されたショウジョウバエのNan及びIavを発現するアデノウイルスを用いてCHO-K1細胞を形質導入した。目的とする遺伝子の発現を可能にするアデノウイルス媒介性遺伝子送達は、サブユニットの発現レベル及び化学量論、並びに室温でウイルス感染させた細胞を保持することによるNan及びIavの毒性効果の防止を最適化する。
【０１９０】
アデノウイルス産生段階中にNanとIavの毒性を防止するために、修正されたCMVプロモーター内のTetリプレッサー結合部位を含有するアデノウイルス構築物(図1)を用いた。Tetリプレッサー結合部位の存在は、Tetリプレッサーを産生するアデノウイルスパッケージング細胞中で目的とする遺伝子の発現を阻害する。
【０１９１】
ショウジョウバエのNan及びIavを単独で又は組み合わせて発現するCHO細胞を、2つの市販の殺虫剤である、弦音器官に影響を及ぼすことが示されているピメトロジン(Ausbornら、2005)、構造的に関連した化合物である、ピリフルキナゾン及び代謝物Bと呼ばれるピリフルキナゾンの脱アセチル化形態で処理した。試験化合物の分子構造を図2に示す。
【０１９２】
哺乳動物のTRPチャネルがCa2+を含むいくつかの陽イオンに対して透過性であることを考慮すると、細胞応答は、Ca2+感受性蛍光プローブFLUO4を用いてCa2+動員をモニターすることによって測定された。
【０１９３】
ピリフルキナゾン(図2)とピメトロジン(データ示さず)の両方は、NanとIavを共発現している細胞においてCa2+動員を引き起こしたが(図2D)、これらのタンパク質を単独で発現している細胞においては引き起こさなかった(図2C)。これは、NanとIavの両方が、機能的な昆虫TRPVチャネルを形成するために必要とされるという遺伝的及び形態学的な証拠を確実にした。
【０１９４】
注目すべきことは、ピリフルキナゾンの脱アセチル化形態(代謝物B)は、親化合物と比較して約100倍を超えて強力であった。
【０１９５】
[実施例II]
Nan及びIavの最適な化学量論を画定するために、Nan:Iavアデノウイルス(1:0、3:1、1:1、1:3、0:1)の比率を4つの異なる感染率、すなわち、細胞あたりのウイルス粒子(VP)レベル(2,000VP/細胞、4,000VP/細胞、8,000VP/細胞、及び16,000VP/細胞)で変化させた。
【０１９６】
図3A〜Dにより明らかなように、最強の応答は、Nan:Ianウイルス粒子が1:1の比率で観察された。
【０１９７】
アデノウイルスの1:1の比率で、NanとIavタンパク質が同レベルで存在することを直接確認するために、本発明者らは、ウェスタンブロットによりこれらのタンパク質の発現レベルを検証した(図3E)。AcGFP構築物と融合したNanとIavは、分子量が124kDa(Nan)と152kDa(Iav)であるタンパク質を生成することが予測された。電気泳動移動度の差異は、共通のAcGFPタグに対する抗体を用いることにより、同じブロット上でNanとIavタンパク質の両方の検出を可能にした。
【０１９８】
図3Eに示されるように、1:1の比率のアデノウイルスで、Nan及びIavサブユニットは、およそ同レベルで確かに発現された。応答の振幅は、細胞あたり4000個のウイルス粒子で最大に到達し、次に減少した。これは、非常に高すぎるTRPVチャネル密度は有害であることを示した。
【０１９９】
[実施例III]
証拠となるいくつかの系統は、試験化合物が細胞表面上の昆虫TRPVチャネルを活性化することを示す。第一に、ピリフルキナゾンに対する細胞の応答は、細胞外媒体中のCa2+の存在に完全に依存していた(図4A)。
【０２００】
第二に、昆虫TRPVチャネルの刺激は、細胞不浸透性イオンチャネルブロッカーであるルテニウムレッドによって阻害された(図4B)。第三に、並行実験において、本発明者らは、細胞不浸透性成分を利用する、Ca2+プローブFLUO4又は専門の膜電位キット(Molecular Devices)のいずれかを用いて応答を測定した。図4Cと4Dにより明らかなように、これらの両者の方法は、類似した時間及び用量依存性の曲線を生じさせた。
【０２０１】
[実施例IV]
観察された応答の選択性を確認するために、ピメトロジンとピリフルキナゾンの代謝物Bの両方をTRPV4チャネルに対して試験した。このTRPV4は、IavとNanの近縁の哺乳動物のホモログである。TRPV4は、GSK1016790A(Thorneloeら、2008)などのいくつかのアゴニストにより活性化され得る。
【０２０２】
様々なアデノウイルス構築物が異なるレベルの発現を生じさせ得るため、共通のAcGFP部分に対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを用いて、Nan及びIavの発現によりmTRPV4の発現を等しくさせた(図5A)。
【０２０３】
図5Bにより明らかなように、GSK1016790Aではなく、ピメトロジンとピリフルキナゾンの代謝物Bの両方は、昆虫TRPVチャネルを発現している細胞においてCa2+動員を引き起こした。
【０２０４】
対照的に、mTRPV4を発現している細胞において、GSK1016790Aは、強力なCa2+動員応答を誘導したが、一方、ピメトロジンは効果がなかった(図5C)。ピリフルキナゾンの代謝物Bは、mTRPV4発現細胞においてCa2+動員を引き起こしたが、それは、ショウジョウバエのTRPVチャネルに対するものよりもマウスTRPV4に対して作用が約100倍小さかった。
【０２０５】
[実施例V]
より厳密にアッセイの選択性を試験するために、公知の分子標的を含む、表2において提供された19個の薬理活性化合物を試験のために選んだ。
【０２０６】
化合物は、昆虫TRPV、mTRRPV4又は親のCHO-K1細胞のいずれかを発現しているCHO-K1細胞上で1回の高用量(20μM)で試験された。
【０２０７】
以下の表2に示されるように、試験された化合物のうち3つが、ピリフルキナゾン代謝物Bによって刺激された昆虫TRPV細胞において観察された応答に等しい又はその25%を超えた応答を引き起こした。しかしながら、これらの3つの化合物は、親CHO-K1細胞において更に強力な応答を引き起こした。これは、観察された効果が、昆虫TRPVチャネルに関連していないことを示した。
【０２０８】
このようにして、昆虫TRPV、関連した哺乳動物のTRPVチャネル及び親細胞を発現している細胞の組合せを用いると、非特異的な活性化因子を除去することができ、この方法を利用して、昆虫TRPVチャネルの新規な調節因子についてスクリーニングすることができる。
【０２０９】
【表２】
0006509230.tif 000005
【０２１０】
したがって、上記の詳細な説明は、限定するというよりはむしろ例証とみなされることが意図され、本発明の精神及び範囲を定義することを意図している、全ての同等物を含む、以下の特許請求の範囲であることが理解される。
【０２１１】
参考文献
0006509230.tif 000006
【図１】
0006509230.tif 000007
【図２Ａ】
0006509230.tif 000008
【図２Ｂ−Ｄ】
0006509230.tif 000009
【図３Ａ−Ｄ】
0006509230.tif 000010
【図３Ｅ】
0006509230.tif 000011
【図４Ａ−Ｄ】
0006509230.tif 000012
【図５Ａ−Ｃ】
0006509230.tif 000013
【図６】
0006509230.tif 000014
【図７】
0006509230.tif 000015
【図８】
0006509230.tif 000016
【図９】
0006509230.tif 000017
【図１０】
0006509230.tif 000018
【図１１】
0006509230.tif 000019
【図１２】
0006509230.tif 000020
【図１３】
0006509230.tif 000021
【図１４】
0006509230.tif 000022
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
0006509230.tif 000029
【図２２】
0006509230.tif 000030
【図２３】
0006509230.tif 000031
【図２４】
0006509230.tif 000032
【図２５】
0006509230.tif 000033
【図２６】
0006509230.tif 000034
【図２７】
0006509230.tif 000035
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図５０】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５９】
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【図６０】
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【図８０】
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【図１００】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１３−１６】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【配列表】
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