(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
フェルラ酸からバニリンを製造するための生体触媒プロセスであって、
a)フェルラ酸をバニリンに変換する能力を有する遺伝子操作されたシュードモナス属の細菌菌株をフェルラ酸の存在下で培養し;そして
b)場合によっては、a)で形成されたバニリンを培養培地から単離し;
ここで前記の遺伝子操作された細菌菌株は唯一の炭素源としてのバニリンで増殖する能力が低下しており;かつ
ここで前記の遺伝子操作された菌株が、少なくとも以下の遺伝子改変：
i)ペリプラズム局在モリブデン酸結合タンパク質をコードする遺伝子(modA)をダウンレギュレートすることによる、細胞のモリブデン酸吸収のダウンレギュレーション;および
ii)バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子(vdh)によりコードされる酵素活性のダウンレギュレーション
を含有する、上記生体触媒プロセス。
【請求項２】
前記の細胞のモリブデン酸吸収が、modABCオペロンを含むヌクレオチド配列の欠失によりダウンレギュレートされている、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
以下iii)およびiv)：
iii)フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)および
iv)エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)
によりコードされる酵素活性のうちの少なくとも1つがアップレギュレートされている、請求項１または２に記載のプロセス。
【請求項４】
フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)の染色体上発現がアップレギュレートされている、請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)の発現が、強力な、場合によっては誘導可能な、プロモーターを、場合によってはlacIまたはlacIqと組み合わせた形で、含む調節エレメントの制御下にある、請求項４に記載のプロセス。
【請求項６】
前記の強力な、場合によっては誘導可能な、プロモーターが、強力なtacプロモーターである、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
追加的に、以下の遺伝子：
v)アルデヒドデヒドロゲナーゼPP_2680および／またはPP_0545
vi)ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼPP_1948
によりコードされる酵素活性のうちの少なくとも1つがダウンレギュレートされている、請求項1〜6のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項８】
追加的に、以下の遺伝子：
vii)β-ケトチオラーゼPP_3355(aat)
viii)アシル-CoAデヒドロゲナーゼPP_3354
によりコードされる酵素活性のうちの少なくとも1つがダウンレギュレートされている、請求項1〜7のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記の遺伝子操作される細菌菌株がシュードモナス・プチダの菌株である、請求項1〜8のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記のシュードモナス・プチダの菌株が、表面接着タンパク質遺伝子(lapA)によりコードされるタンパク質活性をダウンレギュレートすることにより遺伝子操作されている、請求項９に記載のプロセス。
【請求項１１】
好気的に、および／もしくは10〜40℃の範囲の温度で、および／もしくは6〜8の範囲のpHで実行し；かつ／または前記の(a)の遺伝子操作された細菌菌株の培養を1〜50 mMの初期フェルラ酸濃度で実行する、請求項1〜10のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記細菌菌株を遊離形態または固定化形態で適用する、請求項１〜１１のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１３】
連続的または非連続的に実施する、請求項１〜１２のいずれか1項に記載のプロセス。
【請求項１４】
遺伝子操作されたシュードモナス菌株であって、以下の遺伝子操作、
i) ペリプラズム局在モリブデン酸結合タンパク質をコードする遺伝子(modA)をダウンレギュレートすることによる、細胞のモリブデン酸吸収のダウンレギュレーション;および
ii)バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子(vdh)によりコードされる酵素活性のダウンレギュレーション
を含有する、前記遺伝子操作されたシュードモナス菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子操作されたシュードモナス(Pseudomonas)菌株を基にフェルラ酸からバニリンを製造するための改善された生体触媒プロセス、ならびに該シュードモナス菌株に関する。
【背景技術】
【０００２】
バニラ風味の感覚刺激性(organoleptic)化合物であるバニリン(4-ヒドロキシ-3-メトキシベンズアルデヒド)は、量的に世界中で最も多く使用されている香味剤の１つである。その需要は、その植物供給源であるバニラ・プラニフォリア(Vanilla planifolia)による供給量を長きにわたり上回っている。現在は、バニリンの大部分が化石原料に由来するグアヤコール、および木材パルプ工業で出る廃棄物の一成分であるリグニンから化学的に合成されている(Ramachandra RaoおよびRavishankar, 2000)。しかし、食品および飲料業界で主に使用されるこの「ネイチャーアイデンティカル」なバニリンに対する需要は、顧客の健康意識および栄養意識の高まりによって「天然」バニリンへと移行している。従って、「天然」バニリンの生物工学的製造がより一層重要となっている(KringsおよびBerger, 1998;Priefertら、2001に概説されている)。
【０００３】
in vitroで培養したバニラ・プラニフォリア細胞によりバニリンを産生させる努力が為されてきた(DavidonisおよびKnorr, 1991)。遺伝子改変酵母菌株を利用したde novo合成も行われた(Hansenら、2009)。しかし、その主な焦点は、単離された酵素または全細胞生体触媒としての種々の原核微生物を利用した生体内変化に置かれていた(Havkin-FrenkelおよびBelanger, 2008;Berger, 2009)。
【０００４】
リグニンおよびフェノールスチルベン(オイゲノールなど)以外では、フェルラ酸のバニリンへの生体内変化が、「天然」バニリンを製造するために最も集中的に研究されている方法である(Rosazzaら、1995;Priefertら、2001により概説されている)。ヒドロキシ桂皮酸である前駆物質フェルラ酸(3-(4-ヒドロキシ-3-メトキシ-フェニル)プロパ-2-エン酸)は、多くの植物細胞壁の構成成分であるため、非常に豊富な物質である(Ishikawaら、1963;Escott-WatsonおよびMarais, 1992;Ishii, 1997;Oosterveldら、2000)。大腸菌(E. coli)、シュードモナスssp.(Pseudomonas ssp.)、ロドコッカスssp.(Rhodococcus ssp.)、枯草菌(Bacillus subtilis)、黒色麹菌(Aspergillus niger)、ピクノポラス・シナバリナス(Pycnoporous cinnabarinus)、アミコラトプシスssp.(Amycolatopsis ssp.)およびストレプトミセスssp.(Streptomyces ssp.)の組換え菌株を含む数多くの異なる微生物が、フェルラ酸からのバニリンの産生について評価されている(Lesage-Meessenら、1996;OkekeおよびVenturi, 1999;MuheimおよびLerch, 1999;Achterholtら、2000;Overhageら、2003;Pengら、2003;Plaggenborgら、2006;Yoonら、2007;Barghiniら、2007;Huaら、2007;Di Gioiaら、2010;Tilayら、2010;Fleigeら、2013)。しかし、大抵の場合、バニリンの収率は低く、また生体内変化反応は遅かった。この低い収率は、主にバニリンの高い毒性によるものといえる(KringsおよびBerger, 1998)。吸着樹脂を用いる増強されたバニリン産生によりバニリン濃度は19.2 g L-1まで改善されたが、約43％というモル収率はむしろ低いものであった(Huaら、2007)。他の欠点は、非効率的な異種遺伝子発現とプラスミドの不安定性であった。また、バニリンのバニリルアルコールまたはバニリン酸へのさらなる分解の阻止にも焦点が置かれた(Stentelaireら、1997;Bonninら、1999;Oddouら、1999;Civolaniら、2000;Overhageら、2000)。
【０００５】
シュードモナス属由来の細菌は、それらが唯一の炭素源として広範な芳香族分子を利用しうるため、幅広い代謝多機能性を示す(Clarke, 1982)。シュードモナスsp.(Pseudomonas sp.)HR199株、P.フルオレッセンス(P. fluorescens)BF13およびP.プチダ(P. putida)KT2440におけるフェルラ酸の異化は、図1に示すように、補酵素A依存性の非β酸化的経路を介して生じる(NarbadおよびGasson, 1998;Gassonら、1998;Overhageら、1999b;Plaggenborgら、2003;Calistiら、2008)。まず第1に、フェルラ酸がフェルロイル-CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.34;fcsによりコードされている)により触媒されて活性化し、フェルロイル-CoAとなる。第2に、このCoAチオエステルがエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ(EC 4.2.1.101;echによりコードされている)により触媒されて水和し、その後開裂してバニリンおよびアセチル-CoAとなる。バニリンデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.67;vdhによりコードされている)は、バニリンを酸化してバニリン酸とし、これがさらにバニリン酸-O-デメチラーゼ(EC 1.14.13.82;vanABによりコードされている)により異化されてプロトカテク酸となる。Overhageら(1999b)は、PP_3355(aat)および恐らくはPP_3354によりコードされる酵素により触媒される、4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-β-ケトプロピオニル-CoAおよびバニリル-CoAに関する第2のルートも提唱した。
【０００６】
近年の研究では、フェルラ酸からのバニリンの製造のために、代謝的に操作されたP.フルオレッセンスの菌株が使用されている(Di Gioiaら、2010)。バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子vdhの欠失により、ならびに低-コピーベクターでの構造遺伝子fcsおよびechの過剰発現により、著者らは10 mMのフェルラ酸から最高8.41 mMのバニリンを産生させることができたが、これは今までにシュードモナス菌株を用いて産生された最も高い最終力価のバニリンであった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
バニリンの微生物生産のための先行技術の手法は、依然として次の欠点：フェルラ酸の低い変換率、バニリンの低いモル収率、有意な副生成物の形成、のうちの1つ以上を抱えている。
【０００８】
従って、本発明の根底にある課題は、上記欠点のうちの少なくとも1つを回避する方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
上記課題は、驚いたことに、補酵素A-依存性の非-β-酸化的経路を介したフェルラ酸のバニリンへの異化を触媒する能力を有する、シュードモナス属の細菌の遺伝子操作された菌株を提供することにより解決された。
【００１０】
特定の実施形態においては、非病原性で完全に配列決定されているシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)菌株KT2440(ATCC 47054)(Nelsonら、2002)を使用したが、これはバイオセーフティ菌株P.プチダmt-2 (Kojimaら、1967;WilliamsおよびMurray, 1974;Nakazawa, 2002)のプラスミド非保有誘導体である。遺伝子改変により、プラスミド非保有休止P.プチダ変異細胞を使用する、フェルラ酸のバニリンへの生体内変化のための非常に効率的な手段を確立することができた。特に、uppカウンターセレクション系(GrafおよびAltenbuchner, 2011)を利用したP.プチダKT2440の遺伝子操作により、最高で86％のモル収率、高い生産性およびごくわずかな副生成物の形成を伴いながらフェルラ酸をバニリンへと迅速に変換することができる細胞を得た。
【００１１】
前記の非病原性シュードモナス・プチダ菌株KT2440を、特定の様式でフェルラ酸をバニリンに変換するために遺伝的に最適化した。バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子(vdh)の欠失は、バニリンの分解を阻止するには十分ではなかった。トランスポゾン突然変異誘発により同定したモリブデン酸トランスポーターの追加の不活性化は、唯一の炭素源としてのバニリンで増殖できない菌株をもたらした。この生物変換を、強力なtacプロモーター系の導入によるフェルロイル-CoAシンテターゼ構造遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ構造遺伝子(ech)の増強された染色体上発現(chromosomal expression)によりさらに最適化した。さらなる遺伝子操作は、わずか3時間以内の高い初期変換速度および最高86％のバニリンモル収率をもたらし、それに伴う副生成物レベルは非常に低かった。これは、今までにシュードモナス菌株を用いて得られた最も高い生産性およびバニリンモル収率である。フェルラ酸に対するその高い耐性も合わせると、この新たに開発したプラスミド非保有シュードモナス菌株は、バニリンの生物工学的製造のための有望な候補物質である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、シュードモナス菌株におけるフェルラ酸のバニリンまでの異化について提唱されている経路を示したものである。4-ヒドロキシ-3-メトキシフェニル-β-ヒドロキシプロピオニル-CoAからバニリン酸までの代替経路を右側に示す(Overhageら、1999bで提唱された経路)。バニリンのバニリルアルコールへの還元は破線矢印で示す。クエスチョンマークは未知の酵素により触媒される反応を表している。
【図２】図2は、本発明において使用したP.プチダ変異菌株中の、エノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ構造遺伝子(ech)、フェルロイル-CoAシンテターゼ構造遺伝子(fcs)、およびバニリンデヒドロゲナーゼ構造遺伝子(vdh)、β-ケトチオラーゼ構造遺伝子(aat)およびアシル-CoAデヒドロゲナーゼ構造遺伝子(PP_3354)の構成を示したものである。lacオペレーターを含むtacプロモーター領域(Ptac)およびlacリプレッサー遺伝子(lacIq)の組込み部位が示されている。
【図３】図3は、種々の炭素源を含むM9最少培地におけるP.プチダ変異菌株GN23、GN235、GN275およびGN276の増殖を示したものである。菌株は、矢印で示した通り、0.05 OD600で接種した。増殖はOD600を測定することにより記録した。前記菌株が唯一の炭素源としてのグルコース、フェルラ酸、バニリン酸およびバニリン各々において増殖するその能力を示すために、30℃で24時間後のOD600を提示する。
【図４】図4は、フェルラ酸のバニリンへの生物変換アッセイを示したものである。5×109個の休止細胞 mL-1のP.プチダ菌株(a)GN23、(b)GN235、(c)GN276、(d)GN299、(e)GN347、(f)GN440、(g)GN441および(h)GN442を用いてフェルラ酸のバニリンへの生物変換を開始する前に、5 mMのIPTGを用いて6時間、代謝遺伝子echおよびfcsを誘導した。フェルラ酸(黒丸)、バニリン(白丸)、バニリルアルコール(黒三角)およびバニリン酸(白三角)の濃度をHPLCにより測定し、その後変換時間に対してプロットした。この図には、少なくとも3回独立して繰り返したアッセイの平均値が示されている。標準偏差は10％未満であった。
【図５】図5は、インデューサーIPTGの量がフェルラ酸のバニリンへの生物変換に与える影響を示したものである。P.プチダGN299の細胞を、5×109個の休止細胞 mL-1用いてフェルラ酸のバニリンへの生物変換を開始する前に、(a)1 mMのIPGTおよび(b)5 mMのIPTGを用いて6時間誘導した。フェルラ酸(黒丸)、バニリン(白丸)、バニリルアルコール(黒三角)およびバニリン酸(白三角)の濃度をHPLCにより測定し、その後変換時間に対してプロットした。この図には、少なくとも3回独立して繰り返したアッセイの平均値が示されている。標準偏差は10％未満であった。
【図６】図6は、(a)誘導時間および(b)P.プチダGN299の休止細胞の量がフェルラ酸のバニリンへの生物変換に与える影響を示したものである。(a)細胞を、5×109個の休止細胞 mL-1用いてフェルラ酸のバニリンへの生物変換を開始する前に、5 mMのIPTGを用いて2、4、および6時間誘導した。(b)細胞を、様々な量の休止細胞(5、10、および20×109個の細胞 mL-1)を用いてフェルラ酸のバニリンへの生物変換を開始する前に、5 mMのIPTGを用いて6時間誘導した。フェルラ酸(黒色バー)、バニリン(白色バー)、バニリルアルコール(暗灰色バー)およびバニリン酸(薄灰色バー)の濃度を生物変換アッセイの開始時(0時間)および終了時(18時間)にHPLCにより測定し、これを表示した。この図には、少なくとも3回独立して繰り返したアッセイの平均値が示されている。標準偏差はエラーバーで表す。
【図７】図7は、(a)フェルラ酸および(b)バニリンの濃度が生物変換に与える影響を示したものである。代謝遺伝子echおよびfcsを、5×109個の休止細胞 mL-1のP.プチダGN299を用いてフェルラ酸のバニリンへの生物変換を開始する前に、5 mMのIPTGを用いて6時間誘導した。(a)漸増濃度のフェルラ酸(10、20、30、および40 mM)をバニリンへの変換のために使用した。(b)漸増濃度のバニリン(0、10、15、20、および 30 mM)を、生物変換アッセイの開始時に10 mMのフェルラ酸と共に添加した。フェルラ酸(黒色バー)、バニリン(白色バー)、バニリルアルコール(暗灰色バー)およびバニリン酸(薄灰色バー)の濃度を生物変換アッセイの開始時(0時間)および終了時(18時間)にHPLCにより測定し、これを表示した。この図には、少なくとも3回の独立したアッセイの平均値が示されている。標準偏差はエラーバーで表す。
【図８】図8は、M9最少培地における種々の(a)フェルラ酸および(b)バニリンの濃度に対するP.プチダ変異菌株GN299の耐性を示したものである。0.4％グルコースと漸増濃度の(a)フェルラ酸および(b)バニリンとを含むM9最少培地への0.1 OD600での接種後、増殖を、OD600を測定することにより記録した。種々の濃度のフェルラ酸およびバニリン各々に対するGN299の耐性を示すために、30℃で24時間後のOD600を提示する。この図には、少なくとも3回の独立したアッセイの平均値が示されている。標準偏差はエラーバーで表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
A.一般的定義
「脱調節」は、その最も広い意味(アップレギュレーションまたはダウンレギュレーション、増幅またはアテニュエーション、活性／機能の増大または低下)で理解されねばならず、また当業者に周知の種々の手段による標的(例えば酵素(標的酵素)活性または他の代謝的に活性なタンパク質(標的タンパク質)活性など)の増大または減少または完全なスイッチオフもしくはスイッチオンを含む。
【００１４】
適切な操作は、アミノ酸配列またはアミノ酸残基を変更するタンパク質／酵素レベルで行ってもよく;あるいは、例えば遺伝情報または調節性遺伝要素を変更する核酸のレベルで行ってもよい。適切な方法には、例えば、遺伝子操作された生物における遺伝子のコピー数および／または酵素／タンパク質分子の増加または減少、あるいは酵素活性に影響を及ぼす該酵素またはそのタンパク質の生物学的活性(例えば代謝活性など)に影響を及ぼす該タンパク質の別の特徴の改変が含まれ、それらが後に対象とする代謝経路に所望の効果をもたらす。
【００１５】
適切な遺伝子操作としては、限定するものではないが、特定の遺伝子の発現に関連する調節配列または部位を(例えば、強力なプロモーター、誘導プロモーターまたは多重プロモーターを除去または導入することにより)変更または改変すること、特定の遺伝子の染色体位置を改変すること、特定の遺伝子に隣接する核酸配列(例えば、リボソーム結合部位または転写ターミネーター)を変更すること、特定の遺伝子のコピー数を減少または増加させること、特定の遺伝子の転写および／または特定の遺伝子産物の翻訳に関与するタンパク質(例えば、調節タンパク質、サプレッサー、エンハンサー、転写アクチベーターなど)を改変すること、あるいは当分野で慣用されている、特定の遺伝子の発現を脱調節する他のあらゆる従来手段(アンチセンス核酸分子の使用、または標的タンパク質の発現をノックアウトもしくは阻止するための他の方法を含むがこれらに限定されない)を挙げることができる。
【００１６】
より詳細には、「脱調節する」、「脱調節された」および「脱調節」とは、微生物における少なくとも1つの遺伝子の変更または改変を指し、その際、変更または改変により、微生物におけるバニリン産生の効率が、変更または改変の非存在下でのバニリン産生と比較して向上する。幾つかの実施形態においては、変更または改変される遺伝子は、微生物における生合成酵素のレベルもしくは活性が変更もしくは改変されるような、または輸送特異性もしくは効率が変更もしくは改変されるような、生合成経路内の酵素または輸送タンパク質をコードしている。幾つかの実施形態においては、生合成経路内の酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子を、該酵素のレベルまたは活性が、変更されていない該遺伝子または野生型遺伝子の存在下でのレベルと比較して増強されるかまたは増大するように、変更または改変する。脱調節には、例えばフィードバック耐性であるかまたはより高いかもしくは低い比活性を有する酵素を得るために1つ以上の遺伝子のコード領域を変更することも含まれる。同様に、脱調節にはさらに、酵素または輸送タンパク質をコードする遺伝子の発現を調節する転写因子(例えば、アクチベーター、リプレッサー)をコードする遺伝子の遺伝子的変更も包含される。より具体的には、脱調節は「低減された」酵素活性をもたらす場合があり、その際に得られる酵素活性は、非脱調節状態において観察される酵素活性の100％未満であるかまたは「スイッチオフされている(switched-off)」、すなわち、可逆的もしくは不可逆的に、既に存在しないかもしくは少なくとも酵素活性アッセイのような従来の分析ツールでは検出できない。
【００１７】
アップレギュレーション（上方調節）の特定の方法（あり方）は、特に、遺伝子活性を増大させる「アップ（上方）」-突然変異を実施することによる(例えば、タンパク質の酵素活性または代謝活性を増強するかまたは増大させる強力な発現シグナルおよび／または点突然変異を利用した遺伝子増幅による)標的遺伝子の増幅である。
【００１８】
ダウンレギュレーション（下方調節）の好適な方法（あり方）は、特に遺伝子活性を低減する「ダウン（下方）」-突然変異を実施することによる(例えば、タンパク質の酵素活性または代謝活性を破壊または低減する弱い発現シグナルおよび／または点突然変異を利用した遺伝子の欠失または破壊による)標的遺伝子のアテニュエーション（減弱化）である。
【００１９】
詳細には、遺伝子は、1つ以上のヌクレオチドが宿主生物の染色体から欠失するように操作することができる。遺伝子産物の低減された活性も同様に、該遺伝子産物の低減された活性をもたらす1つ以上の遺伝子変異を導入することで得ることができる。この低減された活性は、その酵素活性または他の代謝活性の、非変異もしくは非変更酵素活性からの＞50％の減少、または該活性の＞90％の減少、またはより好ましくは該活性の＞95％の減少、またはより好ましくは該活性の＞98％の減少、またはさらにより好ましくは該活性の＞99％の減少、またはさらにより好ましくは該活性の＞99.9％の減少でありうる。
【００２０】
遺伝子産物の増大した活性も同様に、該遺伝子産物の増大した活性をもたらす1つ以上の遺伝子変異を導入することで得ることができる。この増大した活性は、その酵素活性または他の代謝活性の、例えば、非変異もしくは非変更酵素活性の1〜1.000倍の増大、または該活性の2〜100倍の増大、またはより好ましくは該活性の5〜50倍もしくは10〜20倍の増大でありうる。
【００２１】
「異種の」または「外来性」という用語は、本明細書中で定義した遺伝的に操作された(遺伝子操作された)微生物により導入または産生され(転写もしくは翻訳され)、かつ該操作前の微生物は含有していないかまたは産生しない、本明細書中に記載のタンパク質、核酸および対応する配列を指す。詳細には、該操作前の該微生物は異種酵素活性を含まないかもしくは発現していなくてもよく、または異なるコード配列によりコードされているかもしくは異なるアミノ酸配列の酵素による、同等の活性もしくは特異性を示す内因性酵素を含有もしくは発現していてもよく、また該内因性酵素は前記の外来性酵素と同じ一基質または複数の基質を変換するものであってもよい。
【００２２】
「微生物」とは、真核生物および特に原核生物、およびより詳細には細菌を指す。
【００２３】
「親微生物に由来する」微生物とは、化学的技術、生化学的技術もしくは微生物技術、特に遺伝子操作技術から選択されるあらゆるタイプの操作、またはかかる操作の組み合わせにより改変された微生物を指す。後者の場合、それらを「遺伝子操作」または「遺伝子改変」微生物と称する。該操作により、親微生物の生物学的特徴のうちの少なくとも1つが変化する。一例としては、異種酵素のコード配列を該生物に導入してもよいし、または親微生物のコード配列を欠失させてもよい。その変化により、少なくとも1つの特徴が該親微生物に付加されるか、該親微生物において置き換えられるか、または該親微生物から失われる場合がある。該変化により、例えば、微生物の代謝的特徴が変更されてもよく、その結果、例えば、該微生物により発現される酵素の基質(該基質は、その親微生物には全く利用されていなかったか、もしくは異なる効率で利用されていたものである)が特徴的な形で(例えば、親微生物と比較した場合に異なる量、比率で、もしくは異なる効率で)代謝され、かつ／または代謝による最終もしくは中間生成物がその改変された微生物により特徴的な形で(例えば、親微生物と比較した場合に異なる量、比率で、もしくは異なる効率で)形成される。
【００２４】
微生物を物理的または環境的に「変更」または「改変」することにより、出発微生物による遺伝子産物の発現のレベルと比較して、増大したレベルまたはより低いレベルで該遺伝子産物を発現させることができる。例えば、微生物を、転写および／または翻訳が増大または減少するように、特定の遺伝子の転写および／もしくは翻訳ならびに／または特定の遺伝子産物の翻訳を増大または減少させることが知られているかまたはそう推測されている薬剤(化学物質もしくは遺伝的物質(genetic agent))で処理するかまたは該薬剤の存在下で培養することができる。あるいは、微生物を、転写および／または翻訳が増大または減少するように、特定の遺伝子の転写および／もしくは翻訳ならびに／または特定の遺伝子産物の翻訳を増大または減少させるために選択した温度で培養することができる。
【００２５】
「遺伝的に改変された」とは、例えば形質転換、突然変異、相同組換えなどの、当分野で利用可能な遺伝子操作技術により上記の意味で変更された微生物を指す。
【００２６】
「利用することができる」という用語は、本発明の微生物が基質(例えばフェルラ酸など)を少なくとも1種の構造的および／または立体的に異なる化学的生成物に変換するその能力を指す。
【００２７】
「フェルラ酸のバニリンへの発酵変換に関与するかまたは関連する酵素活性」とは、本明細書中で以下に定義した一連のパラメーターのうちのいずれか1つにより判定しうる、フェルラ酸のバニリンおよび／または副生成物への変換に影響を与える酵素のあらゆる触媒活性または調節活性を意味する。
【００２８】
種々の収率パラメーター(「収率」もしくは「YP／S」;「比生産性収率(Specific Productivity Yield)」;または空時収率(STY))が当分野で周知であり、またこれらは例えば、SongおよびLee, 2006により記載された通りに決定される。
【００２９】
「収率」および「YP／S」(それぞれ産生された生成物の質量／消費された物質の質量で表される)は、本明細書中では同義語として使用する。
【００３０】
前記比生産性収率とは、バイオマス1 g当たり、1時間および発酵ブロス1 L当たりに産生される、バニリンのような生成物の量を表したものである。WCWと記述される湿細胞重量の量とは、生化学反応における生物学的に活性な微生物の量を表したものである。その値は、1時間当たり、WCW 1 g当たりの生成物g(すなわち、g／g WCW-1h-1)として与えられる。
【００３１】
「発酵生産」または「発酵」という用語は、細胞培養において、インキュベーション時に添加される少なくとも1種の炭素源を利用して微生物が化学化合物を産生するその能力(該微生物に含有されているかまたは該微生物により生み出される酵素活性により促進される)を指す。
【００３２】
「発酵ブロス」という用語は、発酵プロセスに基づくものであり、かつ例えば、本明細書中に記載したような、ワークアップしていないかまたはワークアップした水溶液を意味するものと理解される。
【００３３】
「組換え宿主」は、クローニングベクターまたは発現ベクターを含有するいずれの原核または真核細胞であってもよい。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローン化遺伝子(複数可)を含有するよう遺伝子操作された前記の原核または真核細胞を含むことも意図される。
【００３４】
「組換え微生物」という用語には、該組換え微生物が由来する天然に存在する微生物または「親」微生物と比較して変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型を呈する(例えば、その遺伝子改変が微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合)ように、遺伝的に変更、改変または操作されている(例えば、遺伝子操作されている)微生物(例えば、細菌、酵母、真菌など)または微生物菌株(例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞など)が含まれる。
【００３５】
本発明の基礎を成すバニリン生合成経路に関与する特定の酵素には、以下の酵素：
フェルロイル-CoAシンテターゼ(EC 6.2.1.34;fcsによりコードされている)
エノイル-CoAヒドラターゼ／アルドラーゼ(EC 4.2.1.101;echによりコードされている)
バニリンデヒドロゲナーゼ(EC 1.2.1.67;vdhによりコードされている)
β-ケトチオラーゼ(EC 2.3.1.16；aatによりコードされている)
アシル-CoA-ヒドロラーゼ(EC 3.1.2.20；PP_3354によりコードされている)
モリブデン酸トランスポーター(modABCによりコードされている)
が含まれる。
【００３６】
B.特定の実施形態
本発明は特に、以下の実施形態を指すものである。
1.フェルラ酸からバニリンを製造するための生体触媒プロセス（方法）であって、
a)フェルラ酸をバニリンに変換する能力を有する遺伝子操作されたシュードモナス属の細菌菌株をフェルラ酸の存在下で培養し;そして
b)場合によっては、それにより形成されたバニリンを培養培地から単離し;ここで、前記の遺伝子操作された細菌菌株は唯一の炭素源としてのバニリンで増殖する能力が低下、減退している、
上記プロセス。唯一の炭素源としてのバニリンでの増殖は、遺伝子操作された菌株については観察されないことが好ましい。
2.前記の遺伝子操作された菌株が、少なくとも以下の遺伝子改変：
i)好ましくは前記のバニリンで増殖する能力の低下をもたらす、細胞のモリブデン酸吸収のダウンレギュレーション、特に完全または定量的阻害、
を含む、実施形態1によるプロセス。
3.前記の遺伝子操作された菌株が、追加的に以下の遺伝子改変：
ii)バニリンデヒドロゲナーゼ活性、特にその対応遺伝子(vdh)の(例えば、対応する遺伝情報の部分的または完全な欠失による)ダウンレギュレーション
を含む、実施形態2によるプロセス。
4.前記の細胞のモリブデン酸吸収が、ペリプラズム局在モリブデン酸結合タンパク質(periplasmatic molybdate binding protein)(modA)を(例えば、対応する遺伝情報の部分的または完全な欠失により)ダウンレギュレートすることによりダウンレギュレートされている、実施形態1〜3のうちの1つのプロセス。
5.前記の細胞のモリブデン酸吸収がmodABCオペロンの欠失によりダウンレギュレートされている、実施形態1〜4のうちのいずれか1つによるプロセス。
6.以下の酵素活性iii)およびiv)：
iii)フェルロイル-CoAシンテターゼおよび
iv)エノイル-CoAヒドラターゼ
ならびに特に該酵素の遺伝子のうちの少なくとも1つがアップレギュレートされている、前述の実施形態のうちのいずれか1つによるプロセス。アップレギュレーションは、例えば、染色体的にかかる遺伝子のコピー数を増加させることにより、またはその遺伝情報を運ぶ組換え発現ベクターを導入することにより、またはその遺伝子発現を(特に、強力なプロモーターを使用して)改変することにより、達成してもよい。
7.フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)の染色体上発現がアップレギュレートされている、実施形態6によるプロセス。
8.フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)の発現が、強力な(場合によっては誘導可能な)プロモーター(特に、強力なtacプロモーター)を、場合によってはlacIまたはlacIqと組み合わせた形で(特に、強力なtacプロモーターをlacIqエレメントと組み合わせた形で)含む調節エレメントの制御下にある、実施形態7によるプロセス。
9.追加的に、以下の酵素活性：
v)アルデヒドデヒドロゲナーゼPP_2680および／またはPP_0545
vi)ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼPP_1948
のうちの少なくとも1つ、特にその対応遺伝子のうちの少なくとも1つがダウンレギュレートされている、前述の実施形態のうちの1つによるプロセス。特に、ダウンレギュレーションは、対応する遺伝情報の部分的または完全な染色体欠失により達成してもよい。
10.追加的に、以下の酵素活性：
vii)β-ケトチオラーゼPP_3355(aat)
viii)アシル-CoAデヒドロゲナーゼPP_3354
のうちの少なくとも1つ、特にその対応遺伝子のうちの少なくとも1つがダウンレギュレートされている、前述の実施形態のうちのいずれか1つによるプロセス。特に、ダウンレギュレーションは、対応する遺伝情報の部分的または完全な染色体欠失により達成してもよい。
11.遺伝子操作される微生物菌株がシュードモナス・プチダの菌株である、前述の実施形態のうちのいずれか1つによるプロセス。
12.前記のシュードモナス・プチダの菌株が、表面接着タンパク質(lapA)をダウンレギュレートすることにより、特に、その対応遺伝子のダウンレギュレーションにより遺伝子操作されている、前述の実施形態のうちのいずれか1つによるプロセス。特に、ダウンレギュレーションは、対応する遺伝情報の部分的または完全な欠失により達成してもよい。
13.好気的に、および／または10〜40℃、もしくは20〜30℃の範囲の温度で、および／または6〜8もしくは6.5〜7.5の範囲のpHで実施する、前述の実施形態のうちの1つのプロセス。
14.前記の反応を、好ましくは水性媒体中、1〜50 mM、特に5〜15または8〜12 mM、約10 mMなどの初期フェルラ酸濃度で実行する、前述の実施形態のうちの1つのプロセス。
15.前記の反応を、前記細菌菌株の全細胞またはその細胞ホモジネートまたは該ホモジネートから取得した画分において実施する、前述の実施形態のうちの1つのプロセス。
16.前記細菌菌株を遊離形態または固定化形態で適用する、前述の実施形態のうちのいずれか1つのプロセス。
17.連続的または非連続的に実施する、前述の実施形態のうちの1つのプロセス。
18. 実施形態(請求項)1〜12のいずれか1項に記載の遺伝子操作されたシュードモナス菌株。
19.シュードモナス・プチダの遺伝子操作により、特にシュードモナス・プチダKT2440から取得され、その遺伝子操作された菌株が好ましくはプラスミドを保有していない、実施形態(請求項)18の遺伝子操作されたシュードモナス菌株。
20.GN23、GN235、GN237、GN275、GN276、GN299、GN347、GN440、GN441ならびにGN442;あるいはフェルラ酸をバニリンに変換する能力を保持する、および／または唯一の炭素源としてのバニリンで増殖しない、および／またはそのモリブデン酸吸収がダウンレギュレートされている、その機能的異型(functional variant)または変異体の菌株から選択される、実施形態(請求項)19の遺伝子操作されたシュードモナス菌株。
21.別の実施形態においては、本発明の(例えば、P.プチダGN442を用いる)生物変換系は、生成物であるバニリンの毒性を低下させるための適切な吸着樹脂を含んでいてもよい。
【００３７】
C.本発明の他の実施形態
C.1  さらなる遺伝子の脱調節
本明細書中に記載した組換えシュードモナス菌株を用いるバニリンの発酵生産は、添付図1に示すように、非β酸化的フェルラ酸異化経路に関与する少なくとも1つのさらなる遺伝子の脱調節と組み合わせると、さらに改善することができる。
【００３８】
C.2  本発明によるタンパク質
本発明の好適な実施形態は、遺伝子配列の欠失により、および／または特定の酵素の発現率を増加させることにより酵素またはタンパク質の活性を脱調節した手法に基づいているが、本発明はそれらに限定されるものではない。
【００３９】
さらには、本明細書中で同定した1つ以上のアミノ酸配列中に適切な突然変異を実施することによる酵素／タンパク質活性のダウンレギュレーションにより、同様の改善を得ることも可能であろう。アップレギュレーションは、改善された活性を有するタンパク質／酵素変異体を作製することにより実施してもよい。
【００４０】
従って本発明は、この文脈においては、具体的に記載した酵素／タンパク質の「機能的等価物(functional equivalents)」または「類似体」または「機能的突然変異」にも関する。
【００４１】
例えば、「機能的等価物」とは、酵素活性に関して利用される試験において、本明細書中で定義した酵素の少なくとも1〜10％、または少なくとも20％、または少なくとも50％、または少なくとも75％、または少なくとも90％高いかまたは低い活性を示す酵素を意味する。
【００４２】
「機能的等価物」は、本発明によれば、特に、上記アミノ酸配列の少なくとも1つの配列位置に、具体的に記述したものとは異なるアミノ酸を有するが、それでもなお前述の生物学的活性のうちの1つを保有する変異体も意味する。従って、「機能的等価物」には、1個以上の、例えば1〜20、1〜15または5〜10個のアミノ酸付加、置換、欠失および／または逆位により取得可能な変異体が含まれ、ここで、記述した変化は、それらが本発明による特性のプロフィールを有する突然変異をもたらす場合に限り、あらゆる配列位置で生じうるものとする。機能的等価性は、特に、反応性パターンが変異体と未変化ポリペプチドとの間で質的に一致する場合、すなわち例えば同じ基質が異なる速度で変換される場合にも与えられる。適切なアミノ酸置換の具体例を下記表に示す：
0006509215.tif 000002
上記の意味での「機能的等価物」は、記載したポリペプチドの「前駆体」、ならびに該ポリペプチドの「機能的誘導体」および「塩」でもある。
【００４３】
「前駆体」は、前記の場合、所望の生物学的活性を有するかまたは有していない、前記ポリペプチドの天然または合成の前駆体である。
【００４４】
「塩」という表現は、本発明によるタンパク質分子のカルボキシル基の塩ならびにアミノ基の酸付加の塩を意味する。カルボキシル基の塩は、公知の方法で製造することが可能であり、またこれには無機塩(例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄および亜鉛の塩)、ならびに有機塩基(例えば、トリエタノールアミンなどのアミン、アルギニン、リシン、ピペリジンなど)との塩が含まれる。酸付加の塩、例えば、無機酸(塩酸または硫酸など)との塩、ならびに有機酸(酢酸およびシュウ酸など)との塩もまた本発明に含まれる。
【００４５】
本発明によるポリペプチドの「機能的誘導体」もまた、公知技術を利用して官能性アミノ酸側鎖上またはそれらのN-末端もしくはC-末端に作製することができる。かかる誘導体には、例えば、カルボン酸基の脂肪族エステル、アンモニアまたは第一級もしくは第二級アミンとの反応により取得可能なカルボン酸基のアミド;アシル基との反応により生成する遊離アミノ基のN-アシル誘導体;あるいはアシル基との反応により生成する遊離ヒドロキシ基のO-アシル誘導体が含まれる。
【００４６】
「機能的等価物」には、当然ながら、他の生物から取得できるポリペプチド、ならびに天然に存在する異型(variants)も含まれる。例えば、相同配列領域の範囲は配列比較により明示することが可能であり、また等価な酵素は本発明の具体的なパラメーターを基に判定することができる。
【００４７】
「機能的等価物」には、例えば所望の生物学的機能を示す、本発明によるポリペプチドの断片、好ましくは個々のドメインまたは配列モチーフも含まれる。
【００４８】
「機能的等価物」は、さらに、上記ポリペプチド配列のうちの1つまたは該配列に由来する機能的等価物と、少なくとも1つのさらなる機能的に異なる異種配列とを、機能的N-末端またはC-末端結合の形で(すなわち、これらの融合タンパク質部分の実質的な相互の機能的損傷なしに)有する融合タンパク質である。これらの異種配列の非限定的具体例は、例えば、シグナルペプチド、ヒスチジンアンカーまたは酵素である。
【００４９】
本発明によると同様に含まれる「機能的等価物」は、具体的に開示したタンパク質の相同体である。これらは上記のパーセント同一性値を有する。該値は具体的に開示したアミノ酸配列との同一性を指すものであり、またPearsonおよびLipman, (1988)のアルゴリズムに従って算出することができる。
【００５０】
前記の同一性％値は、BLASTアライメント、アルゴリズムblastp(protein-protein BLAST)から、または以下に示すClustal設定を適用することにより算出することもできる。
【００５１】
本発明による相同ポリペプチドのパーセンテージ同一性とは、特に、本明細書中に具体的に記載したアミノ酸配列のうちの1つの全長と比較した際のそのアミノ酸残基のパーセンテージ同一性を意味する。
【００５２】
考えうるタンパク質グリコシル化に関して言えば、本発明による「機能的等価物」には、脱グリコシル化またはグリコシル化形態ならびにグリコシル化パターンを変更することで取得可能な修飾形態の、上記タイプのタンパク質が含まれる。
【００５３】
本発明によるタンパク質またはポリペプチドのかかる機能的等価物または相同体は、突然変異誘発により、例えば点突然変異、タンパク質の伸長または短縮により作製することができる。
【００５４】
本発明によるタンパク質のかかる機能的等価物または相同体は、変異体、例えば短縮変異体のコンビナトリアル・データベースをスクリーニングすることにより同定できる。例えば、タンパク質異型の変化に富むデータベースは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物の酵素的ライゲーションにより作製することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からの潜在的相同体のデータベースの作製のために利用できる方法は非常に多く存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は自動DNA合成装置で実行することが可能であり、またその合成遺伝子はその後適切な発現ベクターに連結することができる。縮重ゲノムの使用により、潜在的タンパク質配列の所望のセットをコードする全ての配列を混合状態で供給することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドの合成の方法は当業者に公知である(例えばNarang, S.A. (1983);Itakuraら(1984) (a);Itakuraら、(1984) (b);Ikeら(1983))。
【００５５】
先行技術においては、点突然変異または短縮により作製したコンビナトリアル・データベースの遺伝子産物のスクリーニングのための技術、および選択した特性を有する遺伝子産物に対するcDNAライブラリーのスクリーニングのための技術が幾つか知られている。これらの技術は、本発明による相同体のコンビナトリアル突然変異誘発により作製した遺伝子バンクの迅速なスクリーニングに適合させることができる。ハイスループット解析に基づく、大容量遺伝子バンクのスクリーニングの際に最も頻繁に利用される技術には、複製可能な発現ベクターへの該遺伝子バンクのクローニング、その結果得られたベクターデータベースを用いた適切な細胞の形質転換、および所望の活性の検出によりその産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易となる条件でのコンビナトリアル遺伝子の発現が含まれる。リカーシブ・アンサンブル突然変異誘発(Recursive Ensemble Mutagenesis)(REM)はデータベース中の機能的変異体の出現頻度を増加させる技術であり、相同体を同定するためにスクリーニング試験と組み合わせて利用することができる(ArkinおよびYourvan (1992);Delgraveら(1993))。
【００５６】
C.3  コード核酸配列
本発明は、本明細書中で定義した酵素／タンパク質をコードし、かつ所要の遺伝子操作を実施するために適用しうる核酸配列にも関する。
【００５７】
本発明は、本明細書中に具体的に開示した配列に対して一定の程度の「同一性」を有する核酸にも関する。2つの核酸の間の「同一性」とは、いずれの場合もその核酸の全長にわたるヌクレオチドの同一性を意味している。
【００５８】
例えば、同一性は、下記設定：
多重アラインメントパラメータ：
ギャップ開始ペナルティ              10
ギャップ伸長ペナルティ              10
ギャップ分離ペナルティ範囲          8
ギャップ分離ペナルティ              オフ
アラインメント遅延(alignment delay)に対する同一性％  40
残基特異的ギャップ                  オフ
親水性残基ギャップ                  オフ
トランジション重み付け              0
ペアワイズアラインメントパラメータ：
FASTアルゴリズム          オン
K-タプルサイズ            1
ギャップペナルティ        3
ウィンドウサイズ          5
最適対角線数              5
でClustal Method(Higgins DG, Sharp PM. ((1989)))を採用して、Informax社(USA)のVector NTI Suite 7.1プログラムにより算出してもよい。
【００５９】
あるいは、同一性は、Chenna,ら(2003)、ウェブページ：http：//www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#および下記設定：
DNAギャップ開始ペナルティ        15.0
DNAギャップ伸長ペナルティ        6.66
DNAマトリックス                  同一性
タンパク質ギャップ開始ペナルティ  10.0
タンパク質ギャップ伸長ペナルティ  0.2
タンパク質マトリックス            Gonnet
タンパク質／DNA ENDGAP            -1
タンパク質／DNA GAPDIST            4
に従って決定してもよい。
【００６０】
本明細書中で言及した全ての核酸配列(一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA)は、ヌクレオチド構成単位から化学合成により、例えば二重らせんの個々の重複する相補的核酸構成単位の断片縮合により、公知の方法で作製することができる。オリゴヌクレオチドの化学合成は、例えば、ホスホロアミダイト法(Voet, Voet, 第2版、Wiley Press, New York, 第896〜897頁)により公知の方法で実施することができる。合成オリゴヌクレオチドの蓄積、およびDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントと連結反応によるギャップのフィリング、ならびに一般的なクローニング技術は、Sambrookら(1989)(下記参照)に記載されている。
【００６１】
また本発明は、例えば人工ヌクレオチド類似体を使用して取得できる、上記タンパク質／酵素およびそれらの機能的等価物のうちの1つをコードする核酸配列(一本鎖および二本鎖のDNAおよびRNA配列、例えばcDNAおよびmRNA)にも関する。
【００６２】
本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはタンパク質または生物学的に活性なそのセグメントをコードする単離された核酸分子と、例えば本発明によるコード核酸を同定または増幅するためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとして使用できる核酸断片の両方に関する。
【００６３】
本発明による核酸分子にはさらに、コード遺伝子領域の3'および／または5’末端から得た非翻訳配列を含有させることができる。
【００６４】
本発明はさらに、具体的に記載したヌクレオチド配列またはそのセグメントに相補的な核酸分子に関する。
【００６５】
本発明によるヌクレオチド配列により、他の細胞型および生物における相同配列の同定および／またはクローニングのために使用できるプローブおよびプライマーの作製が可能となる。かかるプローブまたはプライマーは、一般的に、本発明による核酸配列のセンス鎖または対応するアンチセンス鎖の、少なくとも約12個、好ましくは少なくとも約25個、例えば約40、50または75個の連続したヌクレオチドに「ストリンジェントな」条件(下記参照)下でハイブリダイズするヌクレオチド配列領域を含む。
【００６６】
「単離された」核酸分子は、その核酸の天然供給源に存在する他の核酸分子から分離されており、またさらには、「単離された」核酸分子を組換え技術により作製する場合には実質的に他の細胞性物質もしくは培養培地を実質的に含まない状態としうるか、または「単離された」核酸分子を化学的に合成する場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を含まない状態としうる。
【００６７】
本発明による核酸分子は、分子生物学の標準的な技術および本発明によって提供される配列情報により単離することができる。例えば、cDNAは、具体的に開示されている完全配列のうちの1つまたはそのセグメントをハイブリダイゼーションプローブとして使用し、かつ標準的なハイブリダイゼーション技術(例えばSambrook, (1989)に記載されている技術)を利用して、適切なcDNAライブラリーから単離することができる。加えて、開示されている配列のうちの１つまたはそのセグメントを含む核酸分子は、この配列を基に構築したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により単離することができる。このようにして増幅した核酸は、適切なベクターにクローニングすることが可能であり、またDNA配列決定により特徴付けすることが可能である。本発明によるオリゴヌクレオチドもまた、標準的な合成方法により、例えば自動DNA合成装置を利用して作製することができる。
【００６８】
本発明による核酸配列もしくはその誘導体、相同体またはこれらの配列の一部分は、例えば、通常のハイブリダイゼーション技術またはPCR技術により他の細菌から、例えばゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーを介して単離することができる。これらのDNA配列は、標準的な条件において本発明による配列とハイブリダイズする。
【００６９】
「ハイブリダイズする」とは、標準的な条件においてポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがほぼ相補的な配列に結合するその能力を意味するが、これらの条件においては非相補的パートナー間の非特異的結合は生じない。このため、該配列は90〜100％相補的でありうる。相補的配列の互いに特異的に結合できるというその特性は、例えば、ノーザンブロット法もしくはサザンブロット法またはPCRもしくはRT-PCRにおけるプライマー結合に利用されている。
【００７０】
保存領域の短いオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションのために有利に使用される。しかし、本発明による核酸のより長い断片または完全配列をハイブリダイゼーションのために使用することも可能である。これらの標準的な条件は、使用する核酸(オリゴヌクレオチド、より長い断片もしくは完全配列)に応じて、またはどちらのタイプの核酸-DNAもしくはRNA-をハイブリダイゼーションのために使用するかに応じて変わる。例えば、DNA：DNAハイブリッドの融解温度は、同じ長さのDNA：RNAハイブリッドの融解温度よりも約10℃低い。
【００７１】
例えば、特定の核酸によっては、標準的な条件とは、0.1〜5×SSC(1×SSC = 0.15 M NaCl、15 mMクエン酸ナトリウム、pH 7.2)の濃度を有する水性緩衝溶液中または追加的に50％ホルムアミドの存在下で42〜58℃の温度、例えば5×SSC、50％ホルムアミド中42℃を意味する。有利には、DNA：DNAハイブリッドのためのハイブリダイゼーション条件は、0.1×SSCおよび約20℃〜45℃、好ましくは約30℃〜45℃の温度である。DNA：RNAハイブリッドに関しては、ハイブリダイゼーション条件は、有利には0.1×SSCおよび約30℃〜55℃、好ましくは約45℃〜55℃の温度である。ハイブリダイゼーションのためのこれらの明示した温度は、ホルムアミドの非存在下で約100個のヌクレオチド長と50％のG + C含量を有する核酸のための計算上の融解温度値の具体例である。DNAハイブリダイゼーションのための実験条件は関連のある遺伝学教科書(例えばSambrookら、1989)に記載されており、また当業者に公知の式を利用し、例えば核酸の長さ、ハイブリッドのタイプまたはG + C含量に応じて算出することができる。当業者であれば、以下の教科書：Ausubelら(編)、(1985)、Brown(編)(1991)からハイブリダイゼーションに関するさらなる情報を取得することができる。
【００７２】
「ハイブリダイゼーション」は、特に、ストリンジェントな条件下で実行することができる。かかるハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrook (1989)、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6に記載されている。
【００７３】
「ストリンジェントな」ハイブリダイゼーション条件とは、特に以下の条件：50％ホルムアミド、5×SSC(750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH 7.6)、5×デンハルト溶液、10％デキストラン硫酸および20 g／mLの変性、断片化処理済みサケ精子DNAからなる溶液中42℃で一晩のインキュベーションとその後の0.1×SSCによる65℃でのフィルターの洗浄、を意味する。
【００７４】
また本発明は、具体的に開示されているかまたは誘導可能な核酸配列の誘導体にも関する。
【００７５】
従って、本発明によるさらなる核酸配列は、本明細書中に具体的に開示した配列から誘導することが可能であり、また1個または数個のヌクレオチドの付加、置換、挿入または欠失により該配列と異なっている可能性があり、そしてさらには所望の特性プロフィールを有するポリペプチドをコードしている。
【００７６】
また本発明は、いわゆるサイレント突然変異を含むか、または特殊な起源もしくは宿主生物のコドン使用頻度に従って、具体的に明示した配列と比較して変更されている核酸配列、ならびにその天然に存在する異型、例えばスプライシング異型または対立遺伝子異型も包含する。
【００７７】
また本発明は、保存的ヌクレオチド置換(すなわち、対象とするアミノ酸を同じ電荷、サイズ、極性および／または溶解度のアミノ酸に置き換えること)により取得できる配列にも関する。
【００７８】
また本発明は、具体的に開示されている核酸から配列多型により誘導される分子にも関する。これらの遺伝的多型は、自然変異であるため一集団内の個体間に存在する可能性がある。これらの自然変異は通常、遺伝子のヌクレオチド配列に1〜5％の変異をもたらす。
【００７９】
本発明による核酸配列の誘導体とは、例えば、その全配列範囲にわたり、誘導されたアミノ酸のレベルで少なくとも60％の相同性、好ましくは少なくとも80％の相同性、特に非常に好ましくは少なくとも90％の相同性を有する対立遺伝子異型を意味する(アミノ酸レベルでの相同性に関しては、ポリペプチドについて先に記載した詳細事項を参照されたい)。該相同性が配列の一部の領域にわたってより高い可能性があると有利である。
【００８０】
さらに、誘導体は、本発明による核酸配列の相同体、例えば、そのコードおよび非コードDNA配列の動物、植物、真菌もしくは細菌相同体、短縮配列、一本鎖DNAまたはRNAであることも理解されたい。例えば、相同体は、本明細書中に具体的に開示した配列に記載の全DNA領域にわたり、DNAレベルで、少なくとも40％、好ましくは少なくとも60％、特に好ましくは少なくとも70％、特に非常に好ましくは少なくとも80％の相同性を有する。
【００８１】
さらに、誘導体は、例えば、プロモーターとの融合体であると理解されたい。明示したヌクレオチド配列に付加するプロモーターは、該プロモーターの機能性または効率を減じることなく、少なくとも1つのヌクレオチド交換、少なくとも1つの挿入、逆位および／または欠失により改変することができる。さらに、プロモーターの効率は、それらの配列を変更することにより高めることができるか、またはより有効なプロモーターと(それが異なる属の生物のものでも)完全に交換することができる。
【００８２】
C.4  本発明による構築物
本発明は、調節核酸配列の遺伝的制御下で、本発明に適用可能なポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸配列を含有する、発現構築物のような構築物;ならびにこれらの構築物のうちの少なくとも1つを含むベクターにも関する。
【００８３】
「発現ユニット」とは、本発明によれば、本明細書中で定義したプロモーターを含み、かつ発現される核酸または遺伝子との機能的結合(functional association)後にその発現(すなわち、この核酸またはこの遺伝子の転写および翻訳)を調節する、発現活性を有する核酸を意味する。従って、この文脈においては、発現ユニットは「調節核酸配列」とも称される。前記プロモーターに加えて、他の調節エレメント、例えばエンハンサーが存在していてもよい。
【００８４】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、本発明によれば、発現される核酸または発現される遺伝子と機能的に結合している発現ユニットを意味する。従って、発現ユニットとは対照的に、発現カセットは転写および翻訳を調節する核酸配列だけでなく、その転写および翻訳の結果タンパク質として発現される核酸配列も含む。
【００８５】
「発現」または「過剰発現」という用語は、本発明に関しては、対応するDNAによりコードされている、微生物における1種以上の酵素の細胞内活性の産生または増大を説明するものである。このため、例えば、遺伝子を生物に挿入すること、既存の遺伝子を別の遺伝子に置き換えること、一遺伝子もしくは複数遺伝子のコピーの数を増加させること、強力なプロモーターを使用すること、または高い活性を有する対応酵素をコードする遺伝子を使用することが可能であり、また場合によっては、これらの手段を組み合わせることができる。
【００８６】
好ましくは、本発明によるかかる構築物は、各コード配列から5’-上流にプロモーター、および3'-下流にターミネーター配列、および場合によってはさらなる通常の調節エレメントを含み、いずれも該コード配列と機能的に結合している。
【００８７】
「プロモーター」、「プロモーター活性を有する核酸」または「プロモーター配列」とは、本発明によれば、転写される核酸と機能的に結合している、この核酸の転写を調節する核酸を意味する。
【００８８】
「機能的」または「作動可能な(operative)」結合とは、この文脈においては、例えば、核酸配列の転写時に各々の調節エレメントがその機能を発揮できるような、プロモーター活性を有する核酸のうちの1つと、転写される核酸配列と、場合によってはさらなる調節エレメント(例えば、核酸の転写を可能にする核酸配列、および例えばターミネーター)の連続的配置を意味する。これは、化学的な意味での直接的な結合を必ずしも必要としない。エンハンサー配列などの遺伝子制御配列もまた、より離れた位置から、または他のDNA分子からでさえ、その機能を標的配列に対して発揮することができる。転写される核酸配列がプロモーター配列の後ろに(すなわち3'末端に)位置しており、その結果それら2つの配列が互いに共有結合している配置が好ましい。プロモーター配列と、遺伝子組換えにより発現される核酸配列との距離は、200 bp(塩基対)未満、または100 bp未満または50 bp未満とすることができる。
【００８９】
プロモーターおよびターミネーターとは別に、言及しうる他の調節エレメントの具体例は、ターゲティング配列、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、選択可能なマーカー、増幅シグナル、複製起点などである。適切な調節配列は、例えばGoeddel (1990)に記載されている。
【００９０】
本発明による核酸構築物は、特に、本明細書中で具体的に言及した配列またはその誘導体および相同体、ならびに本明細書中で具体的に言及したアミノ酸配列から誘導できる核酸配列から選択される配列を含み、該配列は、有利には遺伝子発現を制御する(例えば、増大させる)ための1つ以上の調節シグナルと作動可能に、または機能的に結合している。
【００９１】
これらの調節配列に加えて、これらの配列の天然の調節が実際の構造遺伝子の前に依然として存在している可能性があり、また場合によっては、天然の調節がスイッチオフされて該遺伝子の発現が増加するようにこの天然の調節が遺伝的に変更されている可能性がある。前記核酸構築物は、より単純な設計のもの、すなわちコード配列の前に追加の調節シグナルが一切挿入されていないもの、および天然のプロモーターがその調節と共に除去されていないものでもありうる。その代わり、調節が以後行われず、かつ遺伝子発現が増加するように、天然の調節配列をサイレント化する。
【００９２】
好適な核酸構築物は、有利には、その核酸配列の発現の増加を可能にする、プロモーターと機能的に結合した、前述のエンハンサー配列のうちの1つ以上もまた含有する。他の調節エレメントまたはターミネーターなどの追加の有利な配列をDNA配列の3’末端に挿入することもできる。本発明による核酸の1つ以上のコピーを該構築物に含めることができる。該構築物は、場合によっては該構築物に対する選択のために、抗生物質耐性遺伝子または栄養要求性相補遺伝子などの他のマーカーもまた含有しうる。
【００９３】
適切な調節配列の具体例は、プロモーター(例えば、cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaPBAD)SP6-、lambda-PR-またはlambda-PLプロモーター)に含まれており、グラム陰性細菌において有利に用途が見出される。他の有利な調節配列は、例えば、グラム陽性プロモーターace、amyおよびSPO2、酵母または真菌プロモーターADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADHに含まれている。人工プロモーターもまた調節のために使用することができる。
【００９４】
発現のためには、前記核酸構築物を、有利には宿主における遺伝子の最適な発現を可能にするベクター(例えば、プラスミドまたはファージ)の形で宿主生物に挿入する。プラスミドおよびファージに加えて、ベクターとはさらに、当業者に公知の全ての他のベクター、例えば、ウイルス(例えば、SV40、CMV、バキュロウイルスおよびアデノウイルス)、トランスポゾン、ISエレメント、ファスミド、コスミド、ならびに直鎖状または環状DNAを意味するものと理解されたい。これらのベクターは、宿主生物内で自立的に複製することができるか、または染色体として複製することができる。これらのベクターは本発明のさらなる実施形態である。
【００９５】
適切なプラスミドは、例えば、大腸菌の場合、pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11もしくはpBdCI;ノカルジオホルム・アクチノミセテス(nocardioform actinomycetes)の場合、pJAM2;ストレプトミセスの場合、pIJ101、pIJ364、pIJ702もしくはpIJ361;バシラスの場合、pUB110、pC194もしくはpBD214;コリネバクテリウムの場合、pSA77もしくはpAJ667;真菌の場合、pALS1、pIL2もしくはpBB116;酵母の場合、2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13もしくはpEMBLYe23、または植物の場合、pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004またはpDH51である。前述のプラスミドは、考えうるプラスミドの一部の抜粋である。他のプラスミドは当業者には周知であり、また例えば、書籍Cloning Vectors(Pouwels P.H.ら編) 1985に見出される。
【００９６】
前記ベクターのさらなる実施形態においては、本発明による核酸構築物または本発明による核酸を含有するベクターを、有利には直鎖状DNAの形態で微生物に挿入し、さらに異種または相同組換えにより宿主生物のゲノムに組み込むことができる。この直鎖状DNAには、線状化したベクター(例えば、プラスミド)、または本発明による核酸構築物もしくは核酸だけを含めることができる。
【００９７】
生物における異種遺伝子の最適な発現のためには、該生物で利用されている特有のコドン使用頻度に従って核酸配列を変更すると有利である。該コドン使用頻度は、対象とする生物の他の既知遺伝子のコンピューター評価に基づいて容易に決定することができる。
【００９８】
本発明による発現カセットの作製は、適切なプロモーターと適切なコードヌクレオチド配列およびターミネーターシグナルまたはポリアデニル化シグナルとの融合に基づいている。通常の組換え技術およびクローニング技術をこのために、例えば、J. Sambrook (1989)ならびにT.J. Silhavyら(1984)およびAusubel, F.M.ら、(1987)に記載されている通りに利用する。
【００９９】
組換え核酸構築物または遺伝子構築物を、有利には、適切な宿主生物における発現のために宿主特異的ベクターに有利に挿入することにより、宿主における遺伝子の最適な発現を可能にする。ベクターは当業者に周知であり、また例えば「Cloning Vectors」Pouwels P.H.ら、(1985)に見出される。
【０１００】
C.5  本発明に従って使用できる宿主
文脈に応じて、「微生物」という用語は、出発微生物(野生型)もしくは本発明による遺伝子改変微生物、またはその両方を意味する。
【０１０１】
遺伝子操作された宿主細胞は、染色体レベルでのみ改変されていてもよく、ベクター(例えば、所要の遺伝情報を運ぶプラスミドなど)を含有していてもよく、またはその両方の組み合わせにより改変されていてもよい。
【０１０２】
各発現系における核酸の発現を確実にするために、当業者に馴染みの深い通常のクローニングおよびトランスフェクション方法(例えば、共沈、プロトプラスト融合法、電気穿孔法、レトロウイルスによるトランスフェクションなど)を利用する。適切な系は、例えば、F. Ausubelら、(1997)、またはSambrookら、(1989)に記載されている。
【０１０３】
親微生物は、典型的には、バニリンをフェルラ酸から産生する能力を有するものである。典型的には、これらはシュードモナス属の細菌である。
【０１０４】
適切なシュードモナス属の菌株の非限定的具体例は、以下：
P.プチダKT2440 ATCC 47054シュードモナスsp.HR199株、および
P.フルオレッセンスBF13
のような、上記遺伝子echおよびfcsを運ぶものである。
【０１０５】
ATCCはAmerican type strain culture collectionを表しており、FERM BPは工業技術院生命工学研究所の機関(the collection of National institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan)を表している。
【０１０６】
C.6  バニリンの発酵生産
本発明は、バニリンの発酵生産のための方法にも関する。
【０１０７】
本発明に従って利用する発酵は、例えば、攪拌型発酵槽、気泡塔およびループ型反応器で実施することができる。考えうる方法のタイプ(例えば、攪拌機の型および幾何学的設計)の包括的概観は、「Chmiel： Bioprozesstechnik： Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik, Band 1」に見出すことができる。本発明のプロセスにおいては、利用できる典型的な変法は、当業者に公知であるかまたは例えば「Chmiel, HammesおよびBailey：Biochemical Engineering」で説明されている以下の変法、例えば、バイオマスの再利用を伴うかまたは伴わない回分、流加、反復流加または連続発酵である。産生菌株に応じて、優れた収率(YP／S)を達成するために、空気、酸素、二酸化炭素、水素、窒素または適当な気体混合物を用いるスパージングを行ってもよい。
【０１０８】
使用される培養培地は、特定の菌株の要件を適当な様式で満たしていなければならない。様々な微生物のための培養培地に関する説明は、ハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」(American Society for Bacteriology(Washington D. C., USA, 1981))に記載されている。
【０１０９】
本発明に従って使用できるこれらの培地は、1種以上の炭素の供給源、窒素の供給源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含んでいてもよい。
【０１１０】
好適な炭素の供給源は、単糖、二糖、または多糖などの糖である。非常に優れた炭素の供給源は、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプンまたはセルロースである。糖は、複合化合物(例えば、糖蜜、または精糖で得られる他の副生成物)を経て培地に添加することもできる。様々な炭素の供給源の混合物を添加することが有利な場合もある。他の考えうる炭素の供給源は、油および脂肪(例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油およびヤシ油)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸またはリノール酸)、アルコール(例えば、グリセロール、メタノールまたはエタノール)ならびに有機酸(例えば、酢酸または乳酸)である。
【０１１１】
窒素の供給源は、通常、有機もしくは無機窒素化合物またはこれらの化合物を含有する物質である。窒素の供給源の具体例としては、アンモニアガスまたはアンモニア塩(例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムもしくは硝酸アンモニウム)、硝酸塩、尿素、アミノ酸あるいは窒素の複合供給源(例えば、コーンスティープリカー、大豆粉、大豆タンパク質、酵母エキス、肉エキスおよびその他のもの)が挙げられる。窒素の供給源は個別に、または混合物として使用することができる。
【０１１２】
培地中に存在しうる無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅および鉄の塩化物、リン酸塩または硫酸塩が含まれる。
【０１１３】
無機含硫化合物(例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、亜ジチオン酸塩、テトラチオン酸塩、チオ硫酸塩、硫化物)、ならびに有機硫黄化合物(例えば、メルカプタンおよびチオール)は、硫黄の供給源として使用することができる。
【０１１４】
リン酸、リン酸二水素カリウムもしくはリン酸水素二カリウムまたは対応するナトリウム含有塩は、リンの供給源として使用することができる。
【０１１５】
金属イオンを溶液中に保持するために、キレート剤を培地に添加することができる。特に適切なキレート剤には、ジヒドロキシフェノール(例えば、カテコールもしくはプロトカテク酸塩)、または有機酸(例えば、クエン酸)が含まれる。
【０１１６】
本発明に従って使用する発酵培地はまた、例えばビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテン酸塩およびピリドキシンを含む他の増殖因子(例えば、ビタミンまたは増殖プロモーター)を含有していてもよい。増殖因子および塩は、多くの場合、培地の複合成分(例えば、酵母エキス、糖蜜、コーンスティープリカーなど)に由来する。加えて、適切な前駆体を培養培地に添加することもできる。培地中の化合物の正確な組成は特定の実験に強く依存するものであり、またそれぞれの具体的な状況に合わせて個別に決定されなければならない。培地最適化に関する情報は、テキスト「Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach」(1997)に見出すことができる。Standard 1(Merck)またはBHI(Brain heart infusion, DIFCO)などの増殖培地は、商業的供給業者から入手することもできる。
【０１１７】
培地の成分は全て、加熱(1.5バールおよび121℃で20分)により、または滅菌ろ過により滅菌する。該成分は一緒に、または必要に応じて別々に滅菌することができる。培地の成分は全て、増殖の開始時に存在していてもよく、または場合によっては連続的に、もしくは流加(batch feed)により添加してもよい。
【０１１８】
培養の温度は、通常、15℃〜45℃、好ましくは25℃〜40℃であり、また実験中は一定に保つことができるか、または変更することができる。培地のpH値は5〜8.5の範囲内、好ましくは7.0前後とすべきである。増殖のためのpH値は、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアもしくはアンモニア水)または酸性化合物(例えば、リン酸もしくは硫酸)を添加することにより、増殖中に制御することができる。消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを、発泡を制御するために使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択作用を有する適切な物質、例えば抗生物質を培地に添加することができる。酸素または酸素含有気体混合物、例えば周囲空気を、好気条件を維持するために培養物に送り込む。培養の温度は、通常は20℃〜45℃である。培養は、所望の生成物が最大限形成されるまで継続する。これは通常は1時間〜160時間以内に達成される。
【０１１９】
細胞は、場合によっては、高周波超音波により、高圧により、例えばフレンチプレス細胞破砕機で、浸透圧溶解(osmolysis)により、界面活性剤、溶菌酵素もしくは有機溶媒の作用により、ホモジナイザーを利用して、またはここに列挙した方法のうちの幾つかの組み合わせにより、破壊することができる。
【０１２０】
特定の組成物を、発酵に適用する微生物のタイプに適合させてもよい。シュードモナス菌株に基づく発酵にとって有用な培地組成物は当分野で公知である。例えばLB培地は、かかる菌株に適用できる典型的な培地である。
【０１２１】
3.6  バニリンの単離
本発明の方法は、バニリンを回収する段階をさらに含みうる。「回収する」という用語は、培養培地から化合物を抽出するか、採取するか、単離するかまたは精製することを含む。化合物の回収は、従来の樹脂(例えば、アニオンまたはカチオン交換樹脂、非イオン性吸着樹脂など)による処理、従来の吸着剤(例えば、活性炭、ケイ酸、シリカゲル、セルロース、アルミナなど)による処理、pHの変更、溶媒抽出(例えば、アルコール、酢酸エチル、ヘキサンなどの従来の溶媒による抽出)、蒸留、透析、ろ過、濃縮、結晶化、再結晶、pH調整、凍結乾燥などを含むがこれらに限定されない、当分野で公知のあらゆる従来の単離または精製方法に従って実施することができる。
【０１２２】
意図する単離の前に、ブロスのバイオマスを除去することができる。バイオマスを除去するためのプロセス、例えば、ろ過、沈殿および浮上分離(flotation)は当業者に公知である。従って、該バイオマスは、例えば、遠心分離機、分離装置、デカンター、フィルターを用いて、または浮上分離装置で除去することができる。価値のある生成物の最大限の回収のためには、例えば透析ろ過の形でのバイオマスの洗浄が望ましいことが多い。この方法の選択は、発酵槽ブロス中のバイオマス含量およびバイオマスの特性、ならびにバイオマスと価値のある生成物との相互作用に依存する。
【０１２３】
一実施形態においては、発酵ブロスを滅菌または低温殺菌することができる。さらなる実施形態においては、発酵ブロスを濃縮する。要件に応じて、この濃縮をバッチ式で、または連続的に行うことができる。圧力および温度範囲は、第1に生成物の損傷が生じず、かつ第2に装置およびエネルギーの最小限の利用が必要となるように選択すべきである。圧多段蒸発のための力および温度レベルの上手な選択により、特にエネルギーの節約が可能となる。
【０１２４】
下記実施例は、本発明を例示するためだけのものである。本明細書中に提供した開示内容を考慮すると当業者には直ちに明らかとなるであろう数多くの考えうる変更もまた、本発明の範囲内にある。
【０１２５】
実験の部
A)材料および方法
プラスミド、細菌菌株および増殖条件
本発明において使用した細菌菌株およびプラスミドを表1に示す。P.プチダ菌株はLB培地(Bertani, 1951)中30℃で、また大腸菌 JM109 (Yanisch-Perronら、1985)は37℃で増殖させた。プラスミドの選択のため、50μg mL-1のカナマイシン(Kan)を添加した。欠失処置中および耐性試験の際は、0.2％グルコース、1 mM MgSO4、0.1 mM CaCl2、6μM 塩酸チアミンおよび20μg mL-1 5-フルオロウラシル(5-FU;ジメチルスルホキシド[DMSO]中100 mg mL-1の原液として調製したもの)を補ったM9最少培地(48 mM Na2HPO4×7 H2O、22 mM KH2PO4、8.6 mM NaCl、18.7 mM NH4Cl)をP.プチダ菌株の増殖のために使用した。
【０１２６】
【表１】
0006509215.tif 000003
0006509215.tif 000004
化学物質および他の材料
本発明において使用した化学物質は分析等級のものであり、Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany)、Sigma-Aldrich Corporation (Taufkrichen, Germany)およびMerck KGaA (Darmstadt, Germany)から購入した。特に、5-FU、フェルラ酸、バニリン、バニリン酸およびバニリルアルコールは、Sigma-Aldrichから購入した。合成DNAオリゴヌクレオチド(表2a)はEurofins MWG Operon GmbH (Ebersberg, Germany)から購入した。制限酵素およびDNA修飾酵素はRoche Diagnostics Deutschland GmbH (Mannheim, Germany)、New England Biolabs GmbH (Frankfurt am Main, Germany)およびFermentas GmbH(Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot, Germanyの一部門)から購入した。PCRは、Biometra GmbH (Goettingen, Gemany)から入手したTPersonal Thermocyclerで、Fermentas GmbHから入手したHigh Fidelity PCR Enzyme Mixを用いて行った。
【０１２７】
【表２ａ】
0006509215.tif 000005
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a制限部位は太字で示されている。
【０１２８】
【表２ｂ】
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ベクターの構築およびP.プチダ菌株の遺伝子操作
クローニング段階は、標準的な組換えDNA技術(Sambrookら、1989)を利用し大腸菌JM109(Yanisch-Perronら、1985)を用いて実施した。プラスミドDNAによる大腸菌の形質転換は、TSS(形質転換および保存用溶液(Transformation and Storage Solution))法(Chungら、1989)により行なった。P.プチダ菌株は、プラスミドDNAを用いて電気穿孔法(Sambrookら、1989)により形質転換した。プラスミドおよび菌株の構築について表3に要約した。
【０１２９】
【表３】
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P.プチダKT2440における染色体欠失および組込みのために、upp／5-FUカウンターセレクション系を以前に記載された通りに使用した(GrafおよびAltenbuchner, 2011)。最初に、標的遺伝子の開始および停止コドンを含む上流域および下流域を、鋳型としてP.プチダKT2440(GenBankアクセッション番号AE015451)の染色体DNAを使用してPCR増幅した。これらの断片を3断片ライゲーション(3-fragment ligation)によりpJOE6261.2にクローニングした。得られた組込みベクターを、その後P.プチダΔUPP4または他のupp欠失菌株の電気穿孔のために使用した。取得したKanr 5-FUsクローンのうちの1つを、振とう条件(200 rpm)下30℃で24時間、LB培地でインキュベートした。その後、種々の希釈物を、20μg mL-1 5-FUおよび0.2％グルコースを含有するミニマルプレートに蒔いた。10個の5-FUrおよびKansクローンを、欠失させる遺伝子の上流配列および下流配列へのオリゴヌクレオチド結合を利用してコロニーPCRにより確認した。
【０１３０】
lacIq-Ptac組込みベクターpNG283.5の構築は、オリゴヌクレオチドプライマーs6936／s6937および鋳型としてのP.プチダKT2440の染色体DNAを使用するechのPCR増幅から開始した。精製したPCR断片(897塩基対)を、NdeI／BamHIを介してpJOE5304.1にクローニングし、lacIq-Ptac-echカセットを有するベクターであるpNG281.1を得た。次に、このカセットを、s6936／s6965を用いてPCR増幅した(断片A;2376塩基対)。同様に、echの上流域をs6938／s6939を用いてPCR増幅した(断片B;952塩基対)。断片AおよびBをそれぞれBamHI／MfeIおよびEcoRI／BamHIを用いて切断し、さらに3断片ライゲーションによりBamHI切断済みpJOE6261.2にクローニングすることでpNG283.5を得た。
【０１３１】
接合およびトランスポゾン突然変異誘発
カナマイシン含有およびカナマイシン不含LBでそれぞれ増殖させた大腸菌S17.1／pCro2a(mini-Tn5495含有)(Onacaら、2007)およびP.プチダGN235の一夜培養物を均等に混合し(各200μL)、その混合物のうちの100μLを抗生物質不含LB寒天プレートに滴下した。30℃で24時間のインキュベーション後、増殖させた細胞を、3 mLのLB液体培地を用いて該プレートから掻き取った。いずれの場合も100μLの10-2希釈物(約50〜100個のコロニーを与える)を、50μg mL-1カナマイシンおよびμg mL-1μMナリジクス酸(大腸菌ドナーのカウンターセレクション用)を含有する計50枚のLB寒天プレートに蒔いた。該プレートを次に30℃で40時間インキュベートした。各プレートからコロニーをM9最少寒天プレート(1つは0.2％(w／v)グルコースを含むもの、もう1つは0.1％(w／v)バニリンを含むもの)にレプリカ平板法により移した。インキュベーションを30℃で一晩行った。グルコース含有M9プレートで増殖したがバニリン含有M9プレートでは増殖しなかったコロニーを、50μg mL-1カナマイシンおよびg mL-1ナリジクス酸含有LB寒天プレート、0.1％バニリン含有M9寒天プレートならびに0.1％バニリン酸含有M9寒天プレートに爪楊枝で移し、その後30℃で一晩インキュベートした。LBkan／nalおよびバニリン酸含有M9で増殖したがバニリン含有M9では増殖しなかったクローンから得た染色体DNAを単離し(DNeasy Blood and Tissue Kit, Qiagen, Hilden, Germany)、その後それぞれ制限酵素BsrGI、EcoRIおよびSalIを用いて消化した。染色体断片を精製し(NucleoSpin Extract II Kit, Macherey-Nagel, Duren, Germany)、4℃で一晩ライゲーションを行ない、氷上で2時間イソプロパノールを用いて沈殿させて、エタノールで洗浄した後に10μL H2O(bidest.)に再懸濁した。大腸菌JM109を、連結させた染色体断片を用いて形質転換した。選択は、50μg mL-1カナマイシンを含有するLB寒天プレートで行なった。プラスミドをカナマイシン耐性クローンから単離し、その後制限酵素消化により調べた。プライマーs4052およびs4037(Onacaら、2007)(GATC Biotech, Constance, Germany)を用いてのプラスミドの塩基配列決定後、取得した配列を最後にBLASTサーチにかけた。
【０１３２】
フェルラ酸のバニリンへの生物変換アッセイ
P.プチダ菌株の一夜培養物を新鮮なLB培地で1：50に希釈し、その後振とうフラスコ(200 rpm)中30℃で2時間増殖させた。フェルラ酸代謝遺伝子の誘導は、菌株に応じて5 mMフェルラ酸または5 mM IPTGを添加することにより行なった。振とう条件下30℃で6時間のさらなる増殖後、25×109個の細胞を遠心分離(10分、3,500 g、室温)により収穫し、洗浄してから5 mLの50 mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.2)に再懸濁した。計10 mMのフェルラ酸(DMSO中1 M原液)をこの細胞懸濁液に添加した。生物変換は、振とう条件下(200 rpm)30℃で、長いガラス培養管中で行なった。200μLの試料を1、2、3、4、5および18時間の変換時間後に採取した。細胞をペレット化するための遠心分離段階(10分、16,000 g、室温)後、その上清のうちの100μLを回収し、その後HPLCによる分析まで-70℃で保存した。
【０１３３】
分析方法
前記生物変換アッセイで得た試料を、HPLCの適用前に0.2％酢酸を用いて1：10に希釈した。フェルラ酸、バニリン、バニリン酸およびバニリルアルコールは、RP Purospher(登録商標)-Star RP-18eカラム(250 mm×4.6 mm、5μm)、LiChroCART(登録商標)ガードカラム(4 mm×4 mm、5μm)、L7612脱ガス装置、L6200Aグラジエントポンプ、D6000Aインターフェースモジュール、L4200 UV-可視検出器、100-μLサンプルループ付Rheodyne注入バルブ7125、およびD7000 HPLC System Managerソフトウェアを備えたMerck-Hitachi HPLCシステム(Merck, Darmstadt, Germany)を用いて定量化した。測定のために改変手順を以前に記載された通りに利用した(Sinhaら、2007)：メタノール、アセトニトリルおよび0.2％酢酸(3：3：14)を移動相として使用した。流速は1 mL 分-1とし、また吸光度は231 nmで20分間測定した。7種の濃度(0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5および1 mM)を有するフェルラ酸、バニリン、バニリン酸およびバニリルアルコールの溶液を較正のために使用した。
B.  実験
【実施例１】
【０１３４】
実施例1：唯一の炭素源としてのバニリンで増殖できないP.プチダKT2440変異体の構築および特徴付け
以前に報告されたように(Overhageら、1999b;Plaggenborgら、2003)、P.プチダKT2440は唯一の炭素源としてのフェルラ酸で増殖することができる。フェルラ酸はフェルロイル-CoA-シンテターゼ(PP_3356、fcs)およびエノイル-CoA-ヒドラターゼ／アルドラーゼ(PP_3358、ech)により触媒され、数段階でバニリンへと代謝される。バニリンは次いでバニリンデヒドロゲナーゼ(PP_3357、vdh)によりバニリン酸へとさらに分解される。バニリンの蓄積が望ましい場合、この最終段階を阻止しなければならない。P.プチダKT2440および本発明において構築した他の菌株におけるこれらの遺伝子の染色体構成を図2に示す。
【０１３５】
産業への応用に関しては、本発明者らは、表面接着タンパク質遺伝子(PP_0168、lapA)を含むlapABCオペロンを欠失させたP.プチダ菌株GN23を、以前に記載されたuppカウンターセレクション法(GrafおよびAltenbuchner, 2011)を利用して構築した。該表面接着タンパク質は、別のP.プチダKT2440ΔlapA変異菌株について以前に示された(GrafおよびAltenbuchner, 2011)ように、バイオフィルムの形成の原因であり、かつその形成に必須である。
【０１３６】
第2の段階では、P.プチダGN23の染色体vdh遺伝子を欠失させてvdhの開始および停止コドンだけを残した(図2)。得られた菌株(GN235と命名)は依然として唯一の炭素源としてのフェルラ酸で増殖することが可能であり、このことはfcsの機能的発現を示していた。GN235もまたバニリンおよびバニリン酸で増殖する能力を保持していた(図3)。
【０１３７】
GN235のトランスポゾン突然変異誘発を利用して、本発明者らは、唯一の炭素源としてのフェルラ酸またはバニリンで増殖できない変異体(GN275)を見出した。しかし、バニリン酸での増殖は保持されていた(図3)。トランスポゾンにより破壊された遺伝子の同定により、ペリプラズム局在モリブデン酸-結合タンパク質をコードしており、モリブデン酸ABCトランスポーターの一部であるmodA(PP_3828)が明らかとなった。modABC(PP_3827 - PP_3832)を含むオペロン全体を、uppカウンターセレクション法を利用してマーカーを用いずに(markerlessly)欠失させることにより、菌株GN276を得た。この菌株の表現型はトランスポゾン変異体と同じであった(図3)。
【実施例２】
【０１３８】
実施例2：菌株GN23、GN235およびGN276の生物変換アッセイ
菌株GN23およびGN235の休止細胞を生物変換アッセイに使用した。10 mMのフェルラ酸を該休止細胞に添加し、その後フェルラ酸、バニリン、バニリルアルコールおよびバニリン酸の濃度を、反応時間中に一定の間隔で試料を採取しながらHPLCにより測定した。このアッセイを18時間の変換時間後に終了した。両菌株GN23およびGN235は、最初の5時間はバニリン酸の一時的な蓄積を伴うフェルラ酸の迅速な変換を示した(図4a、b)。その上、バニリン、バニリルアルコールおよびバニリン酸の蓄積は、それらのいずれにおいても観察することができなかった。
【０１３９】
GN276を用いたフェルラ酸の生物変換アッセイ(図4c)により、フェルラ酸の低下した変換速度が示された。GN23を用いると適用したフェルラ酸全て(10 mM)が18時間後に変換されたが、GN276を使用すると依然として2.4 mM測定することが可能であった。GN23およびGN235とは対照的に、GN276では5時間の変換時間後に4.8 mMのバニリンが蓄積した。バニリン濃度は、さらなる13時間の変換後には5.2 mMまでわずかに上昇した。変換の終了時(18時間)には、同様に、バニリルアルコールおよびバニリン酸がそれぞれ最高で1.5 mMおよび0.3 mM蓄積した。フェルラ酸変換速度を改善するには、さらなる段階が必要であった。
【実施例３】
【０１４０】
実施例3：染色体ech-fcs発現の増加は高変換速度および高バニリンモル収率をもたらす
フェルロイル-CoA-シンテターゼ(fcs)およびエノイル-CoA-ヒドラターゼ／アルドラーゼ(ech)はフェルラ酸のバニリンへの変換を触媒する。本発明者らは、所要の補因子(ATPおよびCoA-SH)が過剰に利用可能であるかまたは再生される場合、フェルラ酸の変換速度は細胞内のこれら2種の代謝酵素の数に正比例すると仮定した。uppカウンターセレクション系を利用して、強力なtacプロモーター(Ptac)およびlacIqをGN276の染色体中のechおよびfcsのすぐ上流に組み入れることにより、これらの2種の遺伝子の発現を制御した(図2)。
【０１４１】
得られた菌株をGN299と命名した。echおよびfcs発現のIPTGによる誘導後、この菌株を用いて生物変換アッセイを行なった。5時間後、10 mMのフェルラ酸のほぼ全てが1.1 mMのバニリルアルコール、0.2 mMのバニリン酸および8.3 mMのバニリン(83％のモル収率に相当)に変換された(図4d)。18時間の変換後、バニリン濃度は7.6 mMまでわずかに低下し、それに伴ってバニリルアルコールおよびバニリン酸がそれぞれ1.6 mMおよび0.4 mMまで増加した。
【実施例４】
【０１４２】
実施例4：生物変換アッセイの最適化によりバニリンの閾値が判明した
P.プチダGN299の休止細胞を生物変換実験に使用した。高い初期変換速度を併せ持つ高くかつ再現性のある生成物収率を目指して、幾つかのパラメーターを変更した。
【０１４３】
最初に、本発明者らは、フェルラ酸のバニリンへの生物変換に必要とされる代謝酵素の発現に対するインデューサー濃度(1および5 mMのIPTG)の影響ならびに誘導時間(2、4、および6時間)の影響について分析した(図5＋6a)。本発明者らは、5 mM未満のIPTGを使用するとフェルラ酸の変換が非常に遅いことを見出した(図5)。しかし、18時間の変換時間後のバニリン収率は同様であった(図示せず)。誘導時間の影響に関しては(図6a)、最高の変換速度およびバニリン収率は、代謝酵素の6時間の誘導後に見られた。
【０１４４】
さらに、前記休止細胞の量も変更した(5、10、および20×109個の細胞 mL-1)。5×109個の細胞 mL-1という最低濃度を用いて最高の結果を目指した(図6b)。より高い細胞濃度は、長期変換(18時間)後に、バニリンモル収率の低下を伴うバニリルアルコールおよびバニリン酸のレベルの上昇をもたらした。
【０１４５】
本発明において、本発明者らは、バニリン産生に閾値があることを見出した。誘導した休止細胞を、生物変換ブロス中で漸増量のフェルラ酸(10、20、30、および40 mM)と共にインキュベートした。30 mMまでのフェルラ酸を使用しても、菌株は13.5 mMを超えるバニリンを産生しなかった(図7a)。40 mMのフェルラ酸を用いると、バニリンは全く産生されなかった。最高収率は、生物変換アッセイのために10 mMのフェルラ酸を使用して達成された。グルコースおよび漸増量のフェルラ酸(0〜50 mM)を含む緩衝M9最少培地(pH 7.0)におけるP.プチダKT2440変異菌株の増殖動態は、フェルラ酸濃度の影響がないことを示した(図8a)。
【０１４６】
10 mMのフェルラ酸および追加の漸増量のバニリン(10、15、20および30 mM)と共に休止細胞をインキュベーショトすることにより、バニリン閾値効果が確認された。追加の10 mMのバニリンと共にインキュベートした細胞は、18時間後にさらに3.2 mMのバニリンを産生するのみであった(図7b)。一方、より多量のバニリンは、バニリン濃度のわずかな低下とバニリルアルコールおよびバニリン酸濃度の上昇をもたらした。グルコースおよび漸増量のバニリン(0〜25 mM)を含むM9最少培地におけるP.プチダKT2440変異菌株の増殖動態は、バニリン濃度の有意な影響を示した(図8b)。12.5 mMまでのバニリンを用いると、菌株は中程度の増殖を示した。15 mMを超えるバニリンを用いると、増殖が強く損なわれた。
【実施例５】
【０１４７】
実施例5：さらなる遺伝子の欠失ならびにバニリン産生および副生成物形成に関する結果
GN299を用いて行なった生物変換アッセイにより、必然的に生成物収率を低下させるバニリルアルコールおよびバニリン酸の形成が示された。そのため、フェルラ酸代謝に潜在的に関与する幾つかの遺伝子の不活性化の効果を分析した。この分析的手法のために選択した遺伝子は、PP_3354(β-ケトチオラーゼ)およびPP_3355(アシル-CoAデヒドロゲナーゼ)、PP_2680およびPP_0545(アルデヒドデヒドロゲナーゼ)、ならびにPP_1948(ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ)であった。
【０１４８】
最初に、(Overhageら、1999b)により提唱されたフェルラ酸からバニリン酸への第2経路(図1)を、菌株GN299において、図2に示すようにアシル-CoAデヒドロゲナーゼおよびβ-ケトチオラーゼ(aat)をコードするPP_3354およびPP_3355の複合欠失により遮断した。得られた菌株GN347を生物変換アッセイのために使用した(図4e)。5時間後、9 mMのフェルラ酸が7.7 mMのバニリン、1 mMのバニリルアルコールおよび0.2 mMのバニリン酸に変換された。18時間後には、さらに0.5 mMのフェルラ酸が変換された。バニリン濃度は7.5 mMまで低下したが、バニリルアルコールおよびバニリン酸はそれぞれ1.4 mMおよび0.3 mMまでわずかに上昇した。GN299と比較すると、最初の5時間以内の変換速度およびバニリン収率は低下した。
【０１４９】
vdhの欠失ではバニリンのバニリン酸への分解を阻止できなかったことから、他のアルデヒドデヒドロゲナーゼがこの反応を触媒している可能性がある。プロテオミクス手法により、2種のアルデヒドデヒドロゲナーゼ(PP_2680およびPP_0545によりコードされている)ならびにベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ(PP_1948)はバニリンで増殖中のP.プチダKT2440においてアップレギュレートされることが示された(Simon, PfannstielおよびHuber、未発表の生データ、投稿準備中)。マーカーレス欠失によるGN299におけるPP_2680およびPP_0545の連続的不活性化により、それぞれ菌株GN440およびGN441を得た。ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼもまたバニリンを基質として受け入れる場合があるが、これはバニリンがベンズアルデヒドの誘導体だからである。そこで、その対応遺伝子(PP_1948)をGN441において欠失させて菌株GN442を得た。変異菌株GN440、GN441およびGN442を生物変換アッセイに使用した(図4f〜h)。該菌株は非常によく似た結果を示した。4時間後、GN440およびGN441の休止細胞に関しては約9.5 mMのフェルラ酸が8.6 mMのバニリンに変換された。測定されたバニリルアルコールおよびバニリン酸濃度はそれぞれ約0.8 mMおよび0.1 mMであった。菌株GN442は同じ結果を示したものの、3時間の変換後には既に達成されていた。18時間の変換後、3種の菌株全てに関してほぼ全てのフェルラ酸が変換された。この場合もやはり、バニリン濃度は7.9 mMまで低下したが、バニリルアルコールおよびバニリン酸はそれぞれ約1.5 mMおよび0.4 mMまで上昇した。
【０１５０】
B.  実験の考察
P.フルオレッセンスAN103株およびBF13株(Martinez-Cuestaら、2005;Di Gioiaら、2010)とは対照的に、P.プチダGN235に関する本発明者らの知見は、vdhの単純な不活性化ではバニリンの分解を阻止するには不十分であるということを裏付けるものである。このことは、シュードモナスsp.HR199株のvdhノックアウト変異体およびシュードモナスKT2440vdhΩKm変異体に関して以前に報告されている(Overhageら、1999a;Plaggenborgら、2003)。KT2440vdhΩKmおよびGN235は依然として唯一の炭素源としてのバニリンで増殖することが可能であった。しかし、主な違いは、P.プチダGN235はvdhの隣接遺伝子(すなわち、echおよびfcs)の機能的発現によりフェルラ酸で増殖することも可能だということである。vdhを完全に欠失させてもechおよびfcsの発現は維持されており、これはKT2440vdhΩKm変異体には最も当てはまりそうにない事実である。GN235を用いて行なったランダムトランスポゾン突然変異誘発により、ペリプラズム局在モリブデン酸-結合タンパク質をコードするmodAの遺伝子座にトランスポゾンを有する変異体が明らかとなった。モリブデン酸イオンは、シュードモナス種においてオキシドレダクターゼの補因子としての役割を果たすことが知られている(KoenigおよびAndreesen, 1990;Blaschkeら、1991;Frunzkeら、1993)。ΔmodABC菌株GN276は唯一の炭素源としてのバニリンで増殖できないため、未知のモリブデン酸依存性オキシドレダクターゼがバニリンを基質として受け入れてvdh不活性化を補完している可能性があると仮定することができる。モリブデン酸吸収の阻害によりこれらの酵素を不活性化することができ、またバニリンはバニリン酸へと酸化されず、さらに分解される。フェルラ酸はGN276を用いると完全には変換されないため、さらなる改善が必要であった。
【０１５１】
vdh陰性P.フルオレッセンス菌株における低-コピープラスミドでの構造遺伝子echおよびfcsの同時発現は、振とうフラスコ実験からの休止細胞を使用すると5時間以内に63％、また攪拌槽型反応器からの休止細胞を使用すると24時間以内に最高で84％のバニリンモル収率をもたらした(Di Gioiaら、2010)。プラスミドの不安定性および抗生物質の使用という考えうる問題を回避するため、強力なtacプロモーターをP.プチダGN276の染色体に導入することによりechおよびfcsの発現を制御した(GN299)。これにより、バニリンモル収率が丁度5時間で83％まで改善された。本発明者らは、IPTGによる誘導を介してechおよびfcsの発現率を高めることで、それらがコードする代謝酵素の濃度が本来のプロモーター系を使用する場合よりも高くなると仮定した。フェルラ酸とは対照的に、インデューサーIPTGは代謝されず、また発現率は高いレベルのままでありうる。インデューサーの量を減少させると生成物収率および生産性が低下するが、これはより低い酵素濃度により説明がつく。本発明者らが誘導時間の効果についても調べたところ、6時間未満では、恐らくはより低い酵素レベルが原因で生成物収率が低下することが示された。より長い誘導時間についても調べたが、生成物収率は改善されなかった(データは示さず)。アッセイ中の細胞濃度を高めると、副生成物であるバニリン酸およびバニリルアルコールのレベルが高くなり、また変換時間が加速されることはなかった。本発明者らは、より高い細胞密度はより高レベルの還元等価体(reduction equivalents)を伴い、これが今度はバニリルアルコールの形成を促進している可能性があると仮定した。
【０１５２】
変換プロセスのさらなる改善により、10 mMより高い濃度のフェルラ酸を使用する場合、生物変換ブロス中のフェルラ酸の濃度を高めるとバニリンモル収率が低下することが示された。40 mMというフェルラ酸濃度でさえ、バニリンへのあらゆる変換を阻害した。しかし、50 mMまでの漸増量のフェルラ酸を用いた増殖実験により示されたように、フェルラ酸の毒性作用は排除することができた。
【０１５３】
一方、P.プチダGN299は、生物変換アッセイにおいて約13.5 mMのバニリン閾値を示した。バニリン濃度をこの閾値より高くすると、より多くのバニリルアルコールおよびバニリン酸が形成され、かつフェルラ酸の変換が阻害された。かかる生成物阻害は、フェルラ酸をバニリンに変換する組換え大腸菌菌株についても観察されている(Overhageら、2003)。バニリンの有毒特性を漸増バニリン濃度の存在下でP.プチダGN299の増殖実験により確認し、その際12.5 mMまでのバニリンに限り耐性が認められた。しかし、フェルラ酸濃度を5 mMから12.5 mMまで増加させることによりモル収率の98％の低下を示したP.フルオレッセンスBF13(Di Gioiaら、2010)とは対照的に、P.プチダはそうした著しい低下は示さなかった。それどころか、P.プチダGN442の休止細胞は18時間の変換後に再利用することが可能であった。10 mMのフェルラ酸を含む新しい緩衝液に細胞を再懸濁することによるバニリンの分離(distracting)と30℃で18時間のさらなるインキュベーションにより、5 mMのバニリンが産生された(4.5 mMのフェルラ酸、0.5 mMのバニリルアルコール、0 mMのバニリン酸)。従って、吸着樹脂による毒性生成物バニリンの即時分離(immediate distraction)により、以前に他の系について示されたように(Yoonら、2007;Huaら、2007;Leeら、2009)、P.プチダ細胞はより多くのフェルラ酸を変換できるようになるであろう。
【０１５４】
Overhageら(1999b)により提唱されたフェルラ酸からバニリン酸への代替経路の、GN299におけるPP_3355(aat)およびPP_3354の欠失による不活化は、副生成物であるバニリルアルコールおよびバニリン酸の望ましくない形成に対して正の効果を与えなかった。変換速度までもが低下することが観察された。この挙動についての考えうる説明は、前記の2種の遺伝子の欠失により誘発されたmRNAのより短い半減期、ひいては代謝酵素の減少したレベルでありうる。しかし、GN299における、PP_2680およびPP_0545によりコードされているアップレギュレートされたアルデヒドデヒドロゲナーゼならびにベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ(PP_1948)の不活性化は、より高い初期変換速度と高いモル収率をもたらした。この菌株(GN442)についての結果は、今までの文献に見出されるフェルラ酸のバニリンへの生物変換におけるシュードモナス菌株の最も高い生産性を示している。しかし、これらの欠失は、GN299と比較して、副生成物の形成に対して有意な効果を与えなかった。攪拌槽型反応器実験においては、化学的酸化プロセスを除き、溶存酸素濃度を高めてもより多くのバニリン酸の形成にはつながらないことが以前に示された(Di Gioiaら、2010)。他の広い基質特異性を示すデヒドロゲナーゼが未だ特定されていないシュードモナス菌株において作用しうることが提唱された(Overhageら、1999b)。
【０１５５】
本発明者らの全ての生物変換実験により、最長18時間までの延長された生物変換時間は、副生成物の形成が原因でバニリンモル収率を低下させることが示された。従って、最初の数時間の間の、フェルラ酸のバニリンへのできるだけ高速かつ完全な変換が望ましい。バニリンのバニリルアルコールへの還元は、フェルラ酸をバニリンに変換する組換え大腸菌細胞についても観察された(Overhageら、2003)ような解毒機構であると思われる。バニリルアルコールの形成を減少させるための別の手法は、組換え大腸菌に対して提唱されたように(Leeら、2009)、イソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子PP_4011およびPP_4012の欠失によりNADH2の量を減少させることであった。
【０１５６】
本発明に従って観察された、(Di Gioiaら、2010)の結果と比較して驚くほど改善された(高速かつほぼ完全な)フェルラ酸の変換を、次の表4に要約した生産性データにより例示する：
【０１５７】
【表４】
0006509215.tif 000009
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本明細書中で言及した文書は参照により組み込まれるものとする。
本発明は以下の実施形態を包含する：
[１]  フェルラ酸からバニリンを製造するための生体触媒プロセスであって、
a)フェルラ酸をバニリンに変換する能力を有する遺伝子操作されたシュードモナス属の細菌菌株をフェルラ酸の存在下で培養し;そして
b)場合によっては、a)で形成されたバニリンを培養培地から単離し;
ここで前記の遺伝子操作された細菌菌株は唯一の炭素源としてのバニリンで増殖する能力が低下しており;かつ
ここで前記の遺伝子操作された菌株が、少なくとも以下の遺伝子改変：
i)細胞のモリブデン酸吸収のダウンレギュレーション;および
ii)バニリンデヒドロゲナーゼ遺伝子(vdh)によりコードされる酵素活性のダウンレギュレーション
を含有する、上記生体触媒プロセス。
[２]  前記の細胞のモリブデン酸吸収が、ペリプラズム局在モリブデン酸結合タンパク質をコードする遺伝子(modA)をダウンレギュレートすることによりダウンレギュレートされている、実施形態1記載のプロセス。
[３]  前記の細胞のモリブデン酸吸収が、modABCオペロンを含むヌクレオチド配列の欠失によりダウンレギュレートされている、実施形態1および2のいずれかに記載のプロセス。
[４]  以下iii)およびiv)：
iii)フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)および
iv)エノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)
によりコードされる酵素活性のうちの少なくとも1つがアップレギュレートされている、実施形態1〜3のいずれかに記載のプロセス。
[５]  フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)の染色体上発現がアップレギュレートされている、実施形態4記載のプロセス。
[６]  フェルロイル-CoAシンテターゼ遺伝子(fcs)およびエノイル-CoAヒドラターゼ遺伝子(ech)の発現が、強力な、場合によっては誘導可能な、プロモーター、特に強力なtacプロモーターを、場合によってはlacIまたはlacIqと組み合わせた形で、含む調節エレメントの制御下にある、実施形態5記載のプロセス。
[７]  追加的に、以下の遺伝子：
v)アルデヒドデヒドロゲナーゼPP_2680および／またはPP_0545
vi)ベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼPP_1948
によりコードされる酵素活性のうちの少なくとも1つがダウンレギュレートされている、実施形態1〜6のいずれかに記載のプロセス。
[８]  追加的に、以下の遺伝子：
vii)β-ケトチオラーゼPP_3355(aat)
viii)アシル-CoAデヒドロゲナーゼPP_3354
によりコードされる酵素活性のうちの少なくとも1つがダウンレギュレートされている、実施形態1〜7のいずれかに記載のプロセス。
[９]  前記の遺伝子操作される微生物菌株がシュードモナス・プチダの菌株である、実施形態1〜8のいずれかに記載のプロセス。
[１０]  前記のシュードモナス・プチダの菌株が、表面接着タンパク質遺伝子(lapA)によりコードされるタンパク質活性をダウンレギュレートすることにより遺伝子操作されている、実施形態1〜9のいずれかに記載のプロセス。
[１１]  好気的に、および／もしくは10〜40℃の範囲の温度で、および／もしくは6〜8の範囲のpHで実行し；かつ／または前記の反応を1〜50 mMの初期フェルラ酸濃度で実行する、実施形態1〜10のいずれかに記載のプロセス。
[１２]  前記の反応を、前記細菌菌株の全細胞またはその細胞ホモジネートまたは該ホモジネートから取得された画分において実施する、実施形態1〜11のいずれかに記載のプロセス。
[１３]  前記細菌菌株を遊離形態または固定化形態で適用する、実施形態1〜12のいずれかに記載のプロセス。
[１４]  連続的または非連続的に実施する、実施形態1〜13のいずれかに記載のプロセス。
[１５]  実施形態1〜10のいずれかに記載の遺伝子操作されたシュードモナス菌株。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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