(57)【要約】  本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療及び／又は予防において抗ウイルス剤として使用するための、式Ｉ（式中、Ｒ３、Ｒ５及び／又はＲ７は、式ＩＩを有する基であるか、又はＲ１及びＲ２は、両方ともＯＨ基である）を有するフラボノイド化合物又は薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つに関する。本発明はまた、式（Ｉ）を有する化合物と当該Ｃ型肝炎ウイルスを接触させる工程を含む、ＨＣＶの感染力を減少させるための又はＨＣＶを不活化するための、エキソビボ方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染の治療及び／又は予防において、抗ウイルス剤として使用するための、式（Ｉ）
【化１】
2014510740.tif 000021
〔式中：
・ａが単結合である場合、ＸはＯであるか、ａが二重結合である場合、ＸはＯ＋であり、
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）：
【化２】
2014510740.tif 000022
を有する基であり
・Ｒ４及びＲ６は、互いに独立して、水素原子又はＯＨ基であり、
・Ｒ４’は水素原子であるか、又は、ａが単結合である場合、Ｒ４’は、Ｒ４及びそれらに結合する炭素原子と一緒になって、Ｃ＝Ｏ基であるか、若しくは、ａが二重結合である場合、Ｒ４’は存在せず、
・ａ及びｂは、同一又は異なって、単結合又は二重結合のいずれかであるが、
但し、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基の少なくとも１つは、式（ＩＩ）を有する基である、及び／又は、Ｒ１及びＲ２は両方ともＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであって、式（Ｉ）を有する当該化合物は、純粋な立体異性体の形態であるか、又は、ラセミ混合物を含む、エナンチオマー及び／又はジアステレオマーの混合物の形態である。
【請求項２】
前記化合物が、ＨＣＶへの宿主細胞の感染、及び／又は、感染した宿主細胞から別の宿主細胞へのＨＣＶの伝播、を阻害するための抗ウイルス剤であることを特徴とする、請求項１に記載されるその使用のための化合物。
【請求項３】
前記化合物が、Ｃ型肝炎ウイルスが宿主細胞中に侵入することを阻害するための抗ウイルス剤であることを特徴とする、請求項２に記載されるその使用のための化合物。
【請求項４】
前記化合物が、Ｃ型肝炎ウイルス又はＣ型肝炎ウイルスに感染した宿主細胞の、感染していない宿主細胞の膜への付着を阻害するための抗ウイルス剤であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項５】
前記宿主細胞が肝細胞であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項６】
前記化合物が、ＨＣＶの表面糖タンパク質と宿主細胞中の少なくとも１つの標的タンパク質との相互作用を阻害するための抗ウイルス剤であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項７】
前記化合物が、ＨＣＶの糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２と宿主細胞の少なくとも１つの標的タンパク質との相互作用を阻害するための抗ウイルス剤であることを特徴とする、請求項６に記載されるその使用のための化合物。
【請求項８】
Ｃ型肝炎ウイルスによる感染の治療及び／又は予防が、免疫調節剤及び／又はウイルス代謝のインヒビターによるＨＣＶ感染の治療に対して耐性又は不耐性である患者を対象とすることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項９】
本発明の化合物が、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2014510740.tif 000023
〔式中：
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル、又は式（ＩＩ）
【化４】
2014510740.tif 000024
を有する基であり、
・Ｒ６は、水素原子又はＯＨ基であり、
Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基の少なくとも１つが、式（ＩＩ）を有する基であるか、又は、Ｒ１及びＲ２が両方ともＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載される使用のための化合物。
【請求項１０】
本発明の化合物が、式（ＩＶ）
【化５】
2014510740.tif 000025
〔式中：
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３は、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）
【化６】
2014510740.tif 000026
を有する基であり、
・Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル、又は式（ＩＩ）を有する基であり、
・Ｒ６は、水素原子又はＯＨ基であり、
Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基の少なくとも１つが、式（ＩＩ）を有する基であるか、又は、Ｒ１及びＲ２は、両方ともＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１１】
本発明の化合物が、式（Ｖ）
【化７】
2014510740.tif 000027
〔式中：
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３は、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル、又は式（ＩＩ）
【化８】
2014510740.tif 000028
を有する基であり、
・Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル、又は式（ＩＩ）を有する基であり、
Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基の少なくとも１つが、式（ＩＩ）を有する基であるか、又は、Ｒ１及びＲ２は両方ともＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１２】
本発明の化合物が、式（Ｉ）
【化９】
2014510740.tif 000029
〔式中：
・ａが単結合である場合、ＸはＯであるか、又は、ａが二重結合である場合、ＸはＯ＋であり、ａ及びｂは、同一又は異なって、単結合又は二重結合のいずれかであり、
・Ｒ１、Ｒ５及びＲ７基は、水酸基であり、
・Ｒ２は、水酸基又は水素原子であり、
・Ｒ３は、水酸基、水素原子、又は式（ＩＩ）
【化１０】
2014510740.tif 000030
を有するガロイル基であり、
・ａが単結合の場合、Ｒ４’は水素原子であるか、又は、ａが二重結合の場合、Ｒ４’は存在せず、
・Ｒ６は、水素原子である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１３】
前記化合物が、アントシアニジン、アントシアニン、フラボノール、及びフラバン−３−オールからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１４】
前記化合物が、デルフィニジン、プルチェリジン若しくはトリセチニジンからなる群から選択されるアントシアニジン；又は、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）からなる群から選ばれるフラバン−３−オール、薬学的に許容可能なそれらの塩及びエステル、並びにそれらの混合物であることを特徴とする、請求項１〜９及び１１〜１３のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１５】
前記化合物が、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、デルフィニジン、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであることを特徴とする、請求項１〜９及び１１〜１４のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、ＨＣＶ感染の治療及び／又は予防への使用が意図される更なる剤と一緒に投与されることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１７】
前記化合物が、ＨＣＶウイルスによる感染の治療及び／又は予防において投与される唯一の抗ウイルス剤であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載されるその使用のための化合物。
【請求項１８】
Ｃ型肝炎ウイルスを、式（Ｉ）：
【化１１】
2014510740.tif 000031
〔式中：
・ａが単結合である場合、ＸはＯであるか、又は、ａが二重結合である場合、ＸはＯ＋であり、
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル、又は式（ＩＩ）：
【化１２】
2014510740.tif 000032
を有する基であり、
・Ｒ４及びＲ６は、互いに独立して、水素原子又はＯＨ基であり、
・Ｒ４’は水素原子であるか、又は、ａが単結合である場合、Ｒ４’は、Ｒ４及びそれらに結合する炭素原子と一緒になって、Ｃ＝Ｏ基であるか、ａが二重結合である場合、Ｒ４’は存在せず、
・ａ及びｂは、同一又は異なって、単結合又は二重結合のいずれかであり、
但し、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基の少なくとも１つは、式（ＩＩ）を有する基である、及び／又は、Ｒ１及びＲ２は両方ともＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つであって、式（Ｉ）を有する化合物は、純粋な立体異性体の形態であるか、又は、ラセミ混合物を含む、エナンチオマー及び／若しくはジアステレオマーの混合物の形態である、と接触させる工程を含む、
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の、感染力を減少させるか又は不活化するためのエキソビボの方法。
【請求項１９】
前記ＨＣＶが生物学的サンプルに存在する、請求項１８に記載の不活化のエキソビボ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染の治療及び／又は予防において抗ウイルス剤として使用するための、フラボノイド化合物或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つに関する。本発明はまた、Ｃ型肝炎ウイルスを、フラボノイド化合物或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルと接触させる工程を含む、ＨＣＶを不活化するためのエキソビボ方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、世界人口の約３％を冒す、慢性肝疾患の主原因である。感染した患者は、肝臓移植の使用を必要とする硬変又は肝細胞ガンを発症する高いリスクを有する。
【０００３】
Ｃ型肝炎ウイルスは、Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属のＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーに属する、線状の一本鎖ＲＮＡ及び正極性を有するウイルスである。このウイルスは、Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ属の唯一の公知のメンバーである。
【０００４】
６つの主なＨＣＶ遺伝子型及び地理的に異なって分布している５０を超えるサブタイプが存在する。目安の目的で、ＨＣＶ遺伝子型１は、ヨーロッパ及び米国で優勢であり、遺伝子型４は、中東及びアフリカで優勢である。ウイルスが変異する強い傾向に関連があるＨＣＶの高い遺伝的多様性は、重要な臨床的及び診断的関わりを有し、ワクチンの開発の困難性及び現在の治療への反応の欠如を説明し得る。
【０００５】
実際、参考の治療、即ち、ＰＥＧ化されたインターフェロン（ＩＦＮ）アルファ（ＰＥＧインターフェロンアルファ）とリバビリン等の抗ウイルス剤との組み合わせは、非特異的であり、中程度に効果がある。したがって、関心があるウイルス遺伝子型に基いて、感染した４０％〜８０％の患者において、寛解が見られる（遺伝子型１が、利用可能な治療法に最も耐性がある）。その限られた有効性に加えて、この組み合わせ療法は、著しい副作用を有する。最も頻繁に観察されるＩＦＮ療法の副作用には、発熱、筋肉又は関節の痛み或いは体重減少等のインフルエンザに似た症状が挙げられる。さらに、精神病における気分変動及び希死念慮さえを含む、精神神経系の副作用が記載される。ＰＥＧ化インターフェロンも、自己免疫疾患を生じ得るし、又は、既存の自己免疫障害を悪化さえし得る。リバビリンを用いてしばしば観察される共通の副作用は、貧血（特に、治療の間に血液のパラメーターを継続的にモニターする必要がある溶血性貧血）である。
【０００６】
これらの様々な副作用は、患者により治療が拒否される主な理由である。したがって、より効果的、実用的及びより許容される治療の選択肢への要求が存在する。
【０００７】
先行技術で開発された抗ＨＣＶ抗ウイルス療法の大半は、ウイルスの遺伝子型に又はウイルスのサブタイプにさえ、依存している。それは、ウイルス代謝のウイルスプロテアーゼ又はポリメラーゼの特異的インヒビターの場合である。したがって、ＨＣＶのウイルス遺伝子型に依存しないインヒビターの要求が存在する。
【０００８】
従来技術のこれらの問題を解決するために、本発明者らは、式
【０００９】
【化１】
2014510740.tif 000002
【００１０】
を有する３，４，５−トリヒドロキシ−フェニル基を含むフラボノイド、より詳細には、特定のカテキンが、そのウイルス遺伝型に関わらず、特異的ＨＣＶ抗ウイルス作用を有することを示した。
【００１１】
フラボノイド化合物は、植物中の、特に、ほとんどの果物及び野菜中の、天然物質である。これらは、花及び果実の様々な色の原因となり、食物中の食事の抗酸化剤の重要な供給源の代表である。これらは、ポリフェノールのサブクラスを構成する。多くのフラボノイド化合物は、治療的特性を有し、血管新生及び転移の形成のプロセスを阻害する点で、優れた可能性を有していることが周知である。フラボノイドのなかでも、より詳細には、３−ヒドロキシフラボノイドのなかでも、フラボノール、アントシアニン、ロイコアントシアニン及びカテキンは、サブクラスとして区別される。カテキンは、最も研究されたフラボノイド化合物と考えられる。
【００１２】
カテキン、その誘導体、又はそれらの分解生成物は、多様な治療特性を有する。それらの治療作用は、単離されたカテキンの形態であろうと、それらのほとんどが由来する緑茶の抽出物の形態であろうと、広く記述されてきた。単に例示の根拠であるが、カテキン、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（−）−エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）及びエピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）が引用され得る。それ自体、カテキンは、肥満又はアテローム性動脈硬化等の循環器疾患に対して予防効果を有するとしてそのように記述されている。これらはまた、抗菌抗酸化剤、抗ガン性又は抗ウイルス作用を有するとして記載されている（非特許文献１）。
【００１３】
これらのカテキンの作用様式は多様である。したがって、乳ガン又は前立腺ガンの場合のその抗発ガン性は、ガン細胞に対するＥＧＣＧの細胞毒性作用に関連している（非特許文献２）。カテキンの抗ウイルス作用は、様々な代謝経路を通過すると考えられている。インフルエンザ又はＢ型肝炎ウイルスの場合、ＥＧＣＧ及び／又はＥＣＧは、ウイルスの複製及び／又は転写を阻害すると考えられている（非特許文献３、非特許文献４）。インフルエンザウイルス又はヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に関して、ＥＧＣＧは、これらのそれぞれの宿主細胞への結合を阻害する（非特許文献５、非特許文献６）。単純ヘルペスウイルス（１型及び２型）の場合、ＥＧＣＧは、エンベロープ糖タンパク質への結合に反応して、孔を作ることにより、ウイルスの死を誘導する（非特許文献７）。
【００１４】
肝臓に関して、カテキンは、特にその抗酸化特性により、肝保護剤として記述されている。さらに、それらはしばしば、肝疾患のための治療療法に関連づけられる。したがって、カテキンは、ウイルス性肝炎Ｂ型又はＣ型の治療において、細胞の壊死を減少させるとして、記述されている（非特許文献８）。この作用は、ウイルス感染自体とは独立しているが、それに関連する肝臓の壊死性の感染の減少を可能にする。
【００１５】
カテキンは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）により媒介される免疫抑制の経路に関与する疾患、なかでも、Ｃ型肝炎を含むウイルス感染のような特定のガン、の治療について提案されてきた（特許文献１）。したがって、治療のこの経路は、非特異的であり、免疫調節による治療を伴う間接的なものである。
【００１６】
先行技術はまた、細胞性プロテアソームのインヒビターと組み合わせて抗ウイルス剤を使用することによってＣ型肝炎を治療することを記載している。言及された細胞性プロテアソームインヒビターのなかでも、ＥＧＣＧはまた注目される。しかしながら、この治療におけるプロテアソームインヒビターの作用機序及び利点は、記載されていないままである（特許文献２）。
【００１７】
カテキンはまた、多量体型（ｆｏｒｍｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｑｕｅ）のＣ型肝炎の治療において言及されている（特許文献３）。このポリフェノールポリマーは、少なくとも３つのモノマーを含む条件に供してＨＣＶウイルスの複製を阻害することによって、抗ウイルス活性を示すものとして記載されている。多数のポリフェノールが、さらに特にカテキンのすべてが、可能性のあるモノマーと考えられている。しかしながら、この研究経過の間、遺伝子型１ｂレプリコンのみが非特許文献９によって記載されており、当該著者によって使用されてきた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】国際公開第２００８／１１５８０４号
【特許文献２】国際公開第２０１１／００９９６１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１０／００５５０６５号明細書
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Ｋｈａｎ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２００７  ８１，  １９−３３
【非特許文献２】Ｓｔｕａｒｔ  ＥＣ  ｅｔ  ａｌ，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ２００６，  ７９：  ２３２９−３６
【非特許文献３】Ｓｏｎｇ  Ｊ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５  ６８  ６６−７４
【非特許文献４】Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２００７
【非特許文献５】Ｓｏｎｇ  Ｊ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００５  ６８  ６６−７４
【非特許文献６】Ｎａｎｃｅ  ＣＬ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９  １２３：４５９−６５
【非特許文献７】Ｉｓａａｃｓ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ２００８  ５２：９６２−７０
【非特許文献８】Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｌｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  Ｒｅｖ．  １９９９  Ａｕｇ；  ４（４）：２２０−３８
【非特許文献９】Ｌｏｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
しかしながら、先行技術文献のいずれにも、ほとんど又は全く副作用を治療される患者に生じないと同時に効果があり、関与するウイルスの遺伝子型に関係なくＣ型肝炎ウイルスに特異的である、ＨＣＶ特異的抗ウイルス作用を有する分子は記載されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
先行技術の問題のすべてに対応するため、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）による感染の治療及び／又は予防において抗ウイルス剤として使用するための、式（Ｉ）
【００２２】
【化２】
2014510740.tif 000003
【００２３】
〔式中、
・ａが単結合である場合、ＸはＯであるか、又は、ａが二重結合である場合、ＸはＯ＋であり、
・Ｒ１及びＲ２が、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、水酸基（ＯＨ）、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）：
【００２４】
【化３】
2014510740.tif 000004
【００２５】
を有する基であり、
・Ｒ４及びＲ６は、互いに独立して、水素原子又はＯＨ基であり、
・Ｒ４’は、水素原子であるか、或いは、ａが単結合である場合、Ｒ４’は、Ｒ４及びこれらが結合する炭素原子と一緒に、Ｃ＝Ｏ基であるか、又は、ａが二重結合である場合、Ｒ４’は存在せず、
・ａ及びｂは、同一又は異なって、単結合又は二重結合のいずれかであり、
但し、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基のうちの少なくとも１つが、式（ＩＩ）を有する基である、及び／又は、Ｒ１及びＲ２は両方とも、ヒドロキシル（ＯＨ）基である。〕
を有する化合物、或いは、薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルのうちの一つ（該式（Ｉ）を有する化合物は、純粋な立体異性体の形態であるか、ラセミ混合物を包含する、エナンチオマー及び／又はジアステレオマーの形態である。）に関する。
【００２６】
式（Ｉ）を有する化合物に基づき、ａ及びｂは、単結合又は二重結合のいずれかであり、かつ、ａ及びｂは、同時に二重結合ではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】５０μＭの（＋）−カテキン（Ｃ）、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）及びＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標）（ＥＧＣＧ  ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標））又はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）（ＥＧＣＧ−ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））により販売されている（−）−エピガロカテキン−３−ガレート、或いはＤＭＳＯ、の存在下に基づく、ＪＦＨ１−ＲｌｕｃウイルスによるＨｕｈ−７細胞の相対的ウイルス感染の図示。
【図２】感染の間、培地中ＥＧＣＧ濃度（０、０．５、５、５０μＭ）、又は、感染工程の前、５０μＭのＥＧＣＧを含むウイルスの前処置に基づく、ＪＦＨ１−ＲｌｕｃウイルスによるＨｕｈ−７細胞の相対的ウイルス感染の図示。
【図３】感染培地中、ＥＧＣＧ（５０μＭ）又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在に基づく、その表面上に遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５又は６のＨＣＶウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２を発現する感染性ウイルス様粒子（ＨＣＶｐｐ）に感染させた、或いは、ＶＳＶのエンベロープタンパク質を発現する水疱性口内炎ウイルスＶＳＶのウイルス様粒子（ＶＳＶｐｐ）に感染させた、Ｈｕｈ−７細胞の相対的ウイルス感染の図示。
【図４】感染培地中、ＥＧＣＧ（５０μＭ）又はＤＭＳＯの存在に基づく、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）又はシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）に感染させたＨｕｈ−７細胞、或いは、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）に感染させたＭａｒｄｉｎ  Ｄａｒｂｙウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞の相対的ウイルス感染の図示。
【図５】ＥＧＣＧ（５０μＭで）の存在下又は非存在下、ＪＦＨ１ウイルスによるＨｕｈ−７細胞のウイルス感染についての感染部位あたりの細胞数の図示。
【図６】感染培地をＤＭＳＯ又はＥＧＣＧで処理した後の継体Ｐ０〜Ｐ４の間の細胞上澄に感染させた細胞の割合の図示。
【図７Ａ】ＨＣＶ侵入（サンプル５）、より詳細には付着工程（サンプル２）、宿主細胞のレセプターとの相互作用（サンプル３）、並びに、ウイルス及び細胞の膜のエンドサイトーシス及び融合の工程（サンプル４）、に対するＥＧＣＧの阻害作用の研究の実験条件を示す図である。ＤＭＳＯをコントロールとして使用した（サンプル１）。
【図７Ｂ】サンプル１〜５における、ＤＭＳＯ又はＥＧＣＧ（５０μＭで）の存在に基づく、ＪＦＨ１−ＲｌｕｃウイルスによるＨｕｈ−７細胞の相対的ウイルス感染の図示。
【図８】（増大する濃度での）ＥＧＣＧ又はデルフィニジンの存在に基づく、ＨＣＶｃｃウイルスによるＨｕｈ−７細胞の相対的ウイルス感染の図示。このグラフは、独立して行った３つの実験を代表する実験を示している。
【図９】ＤＭＳＯ、ＥＧＣＧ（５０μＭ）、塩酸デルフィニジン（５０μＭ）、ヘパリン（５００μｇ／ｍＬ）の存在に基づく、Ｈｕｈ７細胞へのＨＣＶｃｃウイルスの相対的ウイルス付着の図示。当該相対的付着を、コントロール（ＤＭＳＯ）（１００％の値を任意に割り当てた）の割合として示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書中で使用される用語「薬学的に許容可能な」及びそれに関する文法上の変化物は、組成物、キャリア、希釈物及び試薬を示し、これらは相互交換可能な態様で使用され、悪心、めまい、胃障害等といった生理学的副作用を引き起こすことなく哺乳動物に投与され得る。
【００２９】
用語「薬学的に許容可能なエステル又は塩」は、本発明の化合物の、無機及び有機の相対的に非毒性の酸付加塩又はエステルを示し、これらは、一般的に、遊離酸を、適切な有機又は無機の塩基と反応させることによって調製される。そのような塩又はエステルは、化合物の最終的な単離及び精製の間に、インサイチュで調製され得る。特に、酸付加塩は、精製された形態の精製された化合物を、有機又は無機の酸と、別々に反応させて、そのようにして形成された塩を単離することによって、調製され得る。酸付加塩の例の中で考えられるのは、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート、メシレート、グルコヘプタネート、ラクトビオネート、スルファメート、マロネート、サリチレート、プロピオネート、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトエート、ゲンチシン酸、イセチオネート、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファメート、及び、キナ酸ラウリルスルホン酸塩などがある。（例えば、Ｓ  Ｍ  Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ  “Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ”  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ，  ６６：  ｐ  １  −１９  （１９７７）参照。これは、本明細書中に参照により援用される）。
【００３０】
本発明の化合物は、一本鎖ＲＮＡウイルス内で、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーの単一メンバー：ＨＣＶのみを阻害する点で、ＨＣＶの特異的インヒビターである。さらに、多くの抗ＨＣＶウイルスインヒビターとは違い、本発明の化合物は、ＨＣＶのすべての遺伝子型に対して有効な抗ウイルス効果を有し、慣用の抗ウイルス剤に最も耐性があると考えられている遺伝子型に対してでさえ同等である。これは、ＨＣＶ遺伝子型１の場合にでさえ当てはまる。これは、それを目的のインヒビターとする。
【００３１】
さらに、本発明者らは、フラボノイドファミリーの分子のなかでも、３，４，５−トリヒドロキシ−フェニル基を有する分子のみが、ＨＣＶに対して抗ウイルス効果を有することを示した。したがって、３，４，５−トリヒドロキシ−フェニル基の存在は、本発明の化合物の抗ウイルス活性に必須である。この構造は、式（ＩＩ）を有するガロイル基、並びにＲ１及びＲ２が水酸基である場合の中央のヘテロ環（クロマン複素環）のＣ２に見られる。
【００３２】
本発明の化合物の一改変物に基づけば、Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基のうちのいずれか１つは、式（ＩＩ）を有する基であり、かつＲ１及びＲ２基は両方ともＯＨ基である。
【００３３】
本発明の化合物の第二の改変物に基づけば、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基のうちの少なくとも２つが、式（ＩＩ）を有する基である。
【００３４】
本発明者らは、式（Ｉ）を有する化合物の抗ウイルス特性に対する、３，４，５−トリヒドロキシ−フェニル基の付加的効果を示した。その結果、２つの３，４，５−トリヒドロキシ−フェニル基を含む式（Ｉ）を有する化合物の抗ウイルス効果は、１つの基しか有していない化合物のものよりもずっと高い。
【００３５】
有利には、本発明の化合物は、式（Ｉ）〔式中、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基は、互いに独立して、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−プロピル基からなる群から選択されるＯ−アルキル基である〕を有する化合物である。
【００３６】
用語「Ｏ−グリコシル基」は、少なくとも１つの糖を含む１つ以上の炭素鎖、すなわち、式（Ｉ）を有する化合物のＯＨ基に結合した単糖又はオリゴ糖（該単糖又はオリゴ糖は、Ｃ１〜Ｃ６アルキル基により又はフェノール基により置換され得る）を意味すると理解される。
【００３７】
典型的には、Ｏ−グリコシル基は、グルコース、ガラクトース、ラムノース及びアラビノースからなる群から選択される少なくとも１つの単糖を含む。好ましくは、該グリコシル基は、単糖、二糖又は三糖からなる群から選択される。
【００３８】
有利には、本発明の化合物は、アグリコン（ａｇｌｙｃａｎｅ）である。
【００３９】
本発明はまた、式（Ｉ）〔式中、
【００４０】
【化４】
2014510740.tif 000005
【００４１】
・ａが単結合である場合、ＸはＯであるか、ａが二重結合である場合、ＸはＯ＋であり、ａ及びｂは、同一又は異なって、単結合又は二重結合のいずれかであり、
・Ｒ１、Ｒ５及びＲ７基は、水酸基であり、
・Ｒ２は、水酸基又は水素原子であり、
・Ｒ３は、水酸基、水素原子又は式（ＩＩ）
【００４２】
【化５】
2014510740.tif 000006
【００４３】
を有するガロイル基であり、
・ａが単結合である場合、Ｒ４’は水素原子であるか、ａが二重結合である場合、Ｒ４’は存在せず、
・Ｒ６は、水素原子である。〕
を有する化合物、或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルのうちの一つに関する。
【００４４】
第一の改変物によれば、本発明の化合物は、式（ＩＩＩ）
【００４５】
【化６】
2014510740.tif 000007
【００４６】
〔式中、
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）
【００４７】
【化７】
2014510740.tif 000008
【００４８】
を有する基であり、
・Ｒ６は、水素原子又はＯＨ基であり、
Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基のうちの少なくとも１つは、式（ＩＩ）を有する基であるか、或いはＲ１及びＲ２は両方とも、ＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つである。
【００４９】
好ましくは、該化合物は、アントシアニジン又はアントシアニンである。典型的には、本発明の化合物は、式（ＩＩＩ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、ＯＨ基であり、Ｒ６は、水素原子である。〕を有する化合物である。式（ＩＩＩ）を有するそのような化合物は、デルフィニジン（３，３’，４’，５，５’，７−ヘキサヒドロキシフラビリウムクロライド、ＣＡＳ番号５２８−５３−０）である。デルフィニジンは、Ｒ３、Ｒ５及び／又はＲ７基におけるグリコシル化により修飾されていてもよい。デルフィニジンは、塩酸デルフィニジン等の塩の形態であってもよい。
【００５０】
典型的には、本発明の化合物は、式（ＩＩＩ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ７は、ＯＨ基であり、Ｒ３及びＲ６は水素原子である。〕を有する化合物である。式（ＩＩＩ）を有するそのような化合物は、トリセチニジン（３’，４’，５，５’，７−ペンタヒドロキシフラビリウムクロライド、ＣＡＳ番号６５６１８−２１−５）である。該トリセチニジンは、Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基においてグリコシル化により修飾されていてもよい。トリセチニジンは、茶中に見られ、エピガロカテキンガレートＥＧＣＧの酸化的脱ガロイル化による分解産物であろう。
【００５１】
典型的には、本発明の化合物は、式（ＩＩＩ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ７は、ＯＨ基であり、Ｒ６は、水素原子であり、Ｒ５は、Ｏ−メチル基である。〕を有する化合物である。式（ＩＩＩ）を有するそのような化合物は、プルチェリジン（３，７，３’，４’，５’−ペンタヒドロキシ−５−メトキシフラビリウム、ＣＡＳ番号１９０７７−８６−２）である。プルチェリジンは、Ｒ３及びＲ７基におけるグリコシル化により修飾されていてもよい。
【００５２】
【化８】
2014510740.tif 000009
【００５３】
第二の改変物に基づけば、本発明の化合物は、式（ＩＶ）
【００５４】
【化９】
2014510740.tif 000010
【００５５】
〔式中、
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３は、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）
【００５６】
【化１０】
2014510740.tif 000011
【００５７】
を有する基であり、
・Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）を有する基であり、
・Ｒ６は、水素原子又はＯＨ基であり、
Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基のうちの少なくとも１つは、式（ＩＩ）を有する基であるか、或いは、Ｒ１及びＲ２は両方とも、ＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つである。
【００５８】
好ましくは、本発明の化合物は、フラボノール（３−ヒドロキシ−２−フェニルクロメン−４−オン）である。
【００５９】
典型的には、本発明の化合物は、式（ＩＶ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、ＯＨ基であり、Ｒ６は、水素原子である。〕を有する化合物である。式（ＩＶ）を有するそのような化合物は、ミリセチン（すなわち、３，３’，４’，５’，５，７−ヘキサヒドロキシ−２−フェニルクロメン−４−オン、ＣＡＳ番号５２９−４４−２）である。ミリセチンは、特にＲ３基におけるグリコシル化により修飾されていてもよい。
【００６０】
【化１１】
2014510740.tif 000012
【００６１】
第三の改変物によれば、本発明の化合物は、式（Ｖ）
【００６２】
【化１２】
2014510740.tif 000013
【００６３】
〔式中、
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３は、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）
【００６４】
【化１３】
2014510740.tif 000014
【００６５】
を有する基であり、
・Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）を有する基であり、
Ｒ３、Ｒ５又はＲ７基のうちの少なくとも１つは、式（ＩＩ）を有する基であるか、或いはＲ１及びＲ２の両方とも、ＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つである。
【００６６】
好ましくは、本発明の化合物は、フラバン−３−オール（フラバノール又はカテキン）である。
【００６７】
カテキンは、フラボノイドのサブファミリーであり、その構造は、２−フェニル−３−クロマノに基づいている。
【００６８】
典型的には、本発明の化合物は、式（Ｖ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、ＯＨ基である。〕を有する化合物であり、本発明の化合物は、中央のヘテロ環（クロマンヘテロ環）のＣ２及びＣ３基がｃｉｓ位にある場合、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）（（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）クロマン−３，５，７−トリオール、ＣＡＳ番号９７０−７４−１）と呼ばれ、中央のヘテロ環（クロマンヘテロ環）のＣ２及びＣ３基がｔｒａｎｓ位にある場合、（−）−ガロカテキン（（２Ｓ，３Ｒ）−３，４−ジヒドロ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール、ＣＡＳ番号３３７１−２７−５）又は（＋）−ガロカテキン（ＧＣ）（（２Ｒ，３Ｓ）−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール、ＣＡＳ番号９７０−７３−０）と呼ばれる。
【００６９】
【化１４】
2014510740.tif 000015
【００７０】
典型的には、本発明の化合物は、式（Ｖ）〔式中、Ｒ１、Ｒ５及びＲ７は、ＯＨ基であり、Ｒ２は、水素原子であり、Ｒ３は、式（ＩＩ）を有するガロイル基である。〕を有する化合物であり、該本発明の化合物は、中央のヘテロ環（クロマンへテロ環）のＣ２及びＣ３基がｃｉｓ位である場合、（−）−エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）（（２Ｒ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール  ３−（３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート）、ＣＡＳ番号１２５７−０８−５）として知られており、中央のヘテロ環（クロマンへテロ環）のＣ２及びＣ３基がｔｒａｎｓ位にある場合、カテキン−３−ガレート（ＣＧ）（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール  ３−（３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート）、ＣＡＳ番号１３０４０５−４０−２）と呼ばれる。
【００７１】
【化１５】
2014510740.tif 000016
【００７２】
典型的には、本発明の化合物は、式（Ｖ）〔式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５及びＲ７は、ＯＨ基であり、Ｒ３は、式（ＩＩ）を有するガロイル基である。〕を有する化合物であり、該本発明の化合物は、中央のヘテロ環（クロマンヘテロ環）のＣ２及びＣ３基がｃｉｓ位にある場合、（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ）（（２Ｒ，３Ｒ）−５，７−ジヒドロキシ−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−クロメン−３−イル  ３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート、ＣＡＳ番号９８９−５１−５）として知られ、中央のヘテロ環（クロマンへテロ環）のＣ２及びＣ３基がｔｒａｎｓ位にある場合、（−）−ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）（（２Ｓ，３Ｒ）−２−（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）−３，４−ジヒドロ−１（２Ｈ）−ベンゾピラン−３，５，７−トリオール  ３−（３，４，５−トリヒドロキシベンゾエート）、ＣＡＳ番号４２３３−９６−９）と呼ばれる。
【００７３】
【化１６】
2014510740.tif 000017
【００７４】
好ましくは、本発明の化合物は、デルフィニジン、ミリセチン、トリセチニジン、プルチェリジン、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、薬学的に許容可能なそれらの塩及びエステル、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００７５】
有利な態様において、当該本発明の化合物は、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、薬学的に許容可能なそれらの塩及びエステル、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。
【００７６】
好ましくは、当該本発明の化合物は、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つである。
【００７７】
本発明のフラボノイド化合物は、植物中及び特にたいていの果物及び野菜中に天然に生じる物質であるから、これらは、精製により得られ得る。例として、カテキンは、米国特許６，３８３，３９２号明細書又はＥＰ１０７７２１１に記載されるような、様々なろ過工程を経て、緑茶又は黒茶からの抽出によって得られ得る。アントシアニンはまた、技術水準を示す文献、特に米国特許出願公開第２０１０／０４１８７７号明細書又は米国特許出願公開２００３／１４７９８０号明細書に記載されるように、植物からの精製によって得られ得る。そのようなフラボノイド化合物は、商業経路で見られ得る。
【００７８】
当該フラボノイド化合物はまた、特に固相合成法のような当業者に公知の方法を実行することによって、化学合成により得られ得る。そのようなフラボノイド化合物は、商業経路で見られ得る。
【００７９】
本発明に関して、用語「Ｃ型肝炎ウイルス」又は「ＨＣＶ」は、Ｃ型肝炎ウイルスのすべての遺伝子型、既に記載されているかもしれないし記載されていないかもしれない遺伝子型、特に、１〜６の番号付けがされた遺伝子型、及びそれらのサブタイプ、特に、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５及び６、を示すものとして理解されるべきである。この用語は、宿主（例えば、対象の標的細胞）を感染可能な組換え又は非組換えＨＣＶウイルスを示すものとして理解されるべきである。用語「標的細胞（単数又は複数）」或いは「ＨＣＶ標的細胞（単数又は複数）」、「宿主細胞（単数又は複数）」或いは「ＨＣＶ宿主細胞（単数又は複数）」は、ＨＣＶにより感染される疑いのある細胞を示すものと理解されるべきである。本発明による宿主細胞又は標的細胞は、肝細胞である。
【００８０】
用語「抗ウイルス剤」は、ＨＣＶウイルスと又は１つ以上のその構成物と直接的に相互作用可能であり、ウイルスの侵入、ウイルスの複製若しくは病原性、又は宿主細胞において生じる任意の他の事象、或いはそれらの組み合わせの、減少又は消滅のいずれかを介して、ＨＣＶ感染の阻害を誘導する試薬を示すために使用される。抗ウイルス剤のこの直接作用は、ＨＣＶ感染の治療において使用される化合物の間接作用及び例えば免疫系を増強することによる作用と大いに異なっている。
【００８１】
用語「ＨＣＶウイルスによる感染」又はＨＣＶに関連する「ウイルス感染」は、ＨＣＶウイルスにより感染した対象又は患者の状態を示す。ＨＣＶウイルスによる感染は、発症のそれらのステージにかかわらず、無症候期の又は慢性のいずれのＨＣＶ感染をも示す。この用語はまた、宿主細胞におけるＨＣＶウイルスの病原性に関与する、侵入、複製又は任意の他の事象及びプロセスを示す。したがって、感染は、宿主（例えば、対象の標的細胞）を感染可能な組換え又は非組換えＨＣＶウイルス等の感染因子の導入を含む。
【００８２】
ＨＣＶ感染に関して現在用いられる用語「予防」は、ウイルス感染のリスクの減少又は発症の阻害に関連する。感染の初期のステージを阻害可能な本発明の化合物は、ＨＣＶ感染の予防に特に有利である。
【００８３】
現在用いられる用語「治療」は、特に、ウイルスの阻害、その成長の停止、患者のウイルス負荷の減少又はウイルスの根絶による、例えばＨＣＶ感染に関連する疾患又は病態の兆候又は症状の改善を通常示す。ＨＣＶの進行の軽減、減少、阻害、或いはＨＣＶ感染又はこの感染の一つ以上の症状の予防を引き起こす手段について、そのような参照がなされる。
【００８４】
当該本発明の化合物は、特に、Ｃ型肝炎ウイルスによる標的細胞（例えば、肝細胞）の感染及び／又は２つの標的細胞間でのＣ型肝炎ウイルスの伝播を阻害するための、抗ウイルス剤である。例えば、感染した肝細胞から感染していない肝細胞への。
【００８５】
本発明の化合物は、ウイルス感染の２つの主な態様、すなわち、単離されたウイルスによる健常な標的細胞（例えば、感染していない肝細胞）の感染、及び第２の態様、細胞から細胞へのウイルスの転移、換言すれば、感染した標的細胞による感染していない標的細胞の感染、を阻害する。この後者の感染の態様は、特定のファミリーのエンベロープされたウイルスについての主なインビボ経路であることが疑われることから重要である。
【００８６】
好ましくは、当該化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスの侵入を阻害するための抗ウイルス剤である。ウイルスの侵入のインヒビターの用途は、移植された肝臓の感染を予防するために、肝移植の場合に特に有利であり得る。感染性ウイルス様粒子である目的のウイルスエンベロープ糖タンパク質の発現を可能にするレファレンス研究モデルを使用することによって、本発明者らは、そのような阻害方法を示した。
【００８７】
したがって、本発明によれば、用語「ウイルスの侵入の阻害」又は「ウイルス侵入の阻害」は、個別化されたウイルスの粒子により媒介される感染を含んでいようと、感染していない宿主細胞の感染を導く任意の他のメカニズムを含んでいようと、宿主細胞の外側から内側へのウイルスゲノムの経路の阻害として、理解されるべきである。この用語はまた、宿主細胞の細胞質におけるウイルスゲノムの放出の前に、ウイルスの感染の工程のいずれかを阻害することを示すと理解され得る。放出前のこれらの工程は、ｉ）第２の宿主細胞（典型的には、感染していない宿主細胞）の表面へのウイルス又は感染した宿主細胞の接着又は付着、ｉｉ）特異的なウイルスレセプター（単数又は複数）との相互作用、及びｉｉｉ）感染した細胞の細胞質中へのウイルスゲノムの導入を可能にする細胞膜（原形質又はエンドソーム）へのウイルス粒子のウイルス脂質エンベロープの融合、である。本発明者らは、宿主細胞中へのＨＣＶの侵入のメカニズムを３つの構成工程に分ける目的の実験を行い、それによって、式（Ｉ）を有する化合物（例えば、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣ又はデルフィニジン）によって、付着の工程のみが阻害されることを示している。付着の工程は、ウイルスの侵入のメカニズムに関与する最も初期の工程である。このような結果は、「接着」に関する実験、並びに細胞に付着してウイルスＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲによる定量又はカプシドタンパク質の定量によって、補強され得る。
【００８８】
好ましくは、当該化合物は、感染していない宿主細胞中へのウイルスゲノムの侵入に関する工程の間にその機能においてＨＣＶの表面糖タンパク質を阻害するための抗ウイルス剤である。これは、プルダウン又はマイクロカロリメトリー試験及び表面プラズモン共鳴分析（Ｂｉａｃｏｒｅ）により確認され得る。
【００８９】
有利には、本発明の化合物は、感染していない宿主細胞の膜への、Ｃ型肝炎ウイルスの又はＣ型肝炎に感染した宿主細胞の付着を阻害するための抗ウイルス剤である。
【００９０】
好ましくは、当該化合物は、ＨＣＶの表面糖タンパク質と、宿主細胞の少なくとも１つの標的タンパク質との相互作用を阻害するための、より詳細には、Ｅ１及び／又はＥ２糖タンパク質等のＨＣＶの糖タンパク質（特に、遺伝子型１ａのＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＡＢ６７０３７、配列番号１）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＡＢ６７０３７、配列番号２）、遺伝子型１ｂのＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９７６、配列番号３）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９７６、配列番号４）、遺伝子型２ａのＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＢ０４７６３９、配列番号５）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＢ０４７６３９、配列番号６）、遺伝子型２ｂのＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９８２、配列番号７）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９８２、配列番号８）、遺伝子型３ａのＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９８４、配列番号９）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９８４、配列番号１０）、遺伝子型４のＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９８６、配列番号１１）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＹ７３４９８６、配列番号１２）、遺伝子型５のＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＹ７８５２８３、配列番号１３）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＹ７８５２８３、配列番号１４）、遺伝子型６のＨＣＶのＥ１タンパク質（受託番号ＡＹ７３６１９４、配列番号１５）又はＥ２タンパク質（受託番号ＡＹ７３６１９４、配列番号１６））を阻害するための、抗ウイルス剤である。
【００９１】
用語「ＨＣＶの表面糖タンパク質の相互作用の阻害」又は「ＨＣＶの表面糖タンパク質の結合の阻害」又は「糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２の相互作用の阻害」は、ＨＣＶの表面糖タンパク質の少なくとも１つ、特に、糖タンパク質Ｅ１又はＥ２の１つと、標的宿主細胞の少なくとも１つのタンパク質又は糖タンパク質との特異的な結合を阻害することを意味すると理解される。例えば、糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２と肝細胞のグリコサミノグリカンとの間の結合の阻害。ＨＣＶの表面糖タンパク質は、ウイルス粒子の表面に見られ得るが、感染していない標的細胞の表面にも結合する。ＨＣＶの標的糖タンパク質、特に、糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２の標的タンパク質への結合は、ＨＣＶの標的細胞への付着又は接着の工程、又は感染した標的細胞のその他の標的細胞への付着又は接着の工程の間に起きる。
【００９２】
本発明において、「標的タンパク質」又は「宿主細胞の標的タンパク質」は、膜貫通タンパク質又は糖タンパク質であるか、宿主細胞の細胞膜の表面にアンカーされた、表面タンパク質又は糖タンパク質であり、これらのタンパク質は、ＨＣＶの表面糖タンパク質、特に、糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２により特異的に認識される。標的細胞（例えば、肝細胞）のグリコサミノグリカンが、例として記載され得る。
【００９３】
このようにして、本発明者らは、式（Ｉ）を有する化合物（例えば、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣ又はデルフィニジン）による阻害が、糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２に特異的に関与することを示している。本発明の化合物は、ＨＣＶのＥ１及び／又はＥ２タンパク質と標的タンパク質（例えば、肝細胞のグリコサミノグリカン）との間の相互作用を阻害する。さらに、本発明者らは、式（Ｉ）を有する化合物（例えば、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣ又はデルフィニジン）により媒介されるウイルス侵入に対する阻害効果が、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質にその保存領域で直接的に関与することを明確に示している。実際、本発明者らは、式（Ｉ）を有する化合物（例えば、ＥＧＣＧ、ＥＣＧ、ＥＧＣ又はデルフィニジン）の阻害効果が、本発明による分子と糖タンパク質Ｅ１及び／又はＥ２との結合が、後者の高度に保存された領域で行われることを示す、ＨＣＶのすべてのウイルス遺伝子型、すなわち、遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５及び６で観察されたことを示している。
【００９４】
本発明によれば、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染の治療及び／又は予防は、免疫調節剤及び／又はウイルス代謝のインヒビターによるＨＣＶ感染の治療に耐性又は不耐性の患者について意図される。
【００９５】
ＨＣＶの遺伝子型１は、現在の治療に最も耐性がある。それは、米国、日本、西ヨーロッパのＣ型肝炎の公知のケースの７０％の原因となっている。しかしながら、患者の５０％未満が、現在の処置に対して持続的なウイルス学的反応を達成している。本発明の化合物は、記載したすべての遺伝子型のＨＣＶウイルス、より詳細には、非常に強い抗ウイルス能を示す遺伝子型１のＨＣＶ、による感染の阻害を提供する。
【００９６】
「ウイルスインヒビター」は、以下の３つのグループに定義され得る。
【００９７】
第１のグループには、ウイルス代謝のインヒビターが挙げられる。用語「ウイルス代謝のインヒビター」は、ｉ）翻訳のインヒビター、特に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）インヒビター、リボザイム、又はｓｉＲＮＡ、ｉｉ）タンパク質成熟のインヒビター（例えば、プロテアーゼインヒビター（ＮＳ３／ＮＳ４ａプロテアーゼ）、ｉｉｉ）ウイルスゲノムの複製のインヒビター、特に、ウイルスのＲＮＡとポリメラーゼＲＮＡとの間の結合のインヒビター又はヌクレオシド若しくは非ヌクレオシドのインヒビターであり得るＮＳ５Ｂポリメラーゼのインヒビター或いはヘリカーゼのインヒビター、ｖｉ）ウイルス構築のインヒビター（例えば、グリコシレーションのインヒビター）を示すものと理解される。
【００９８】
インヒビターの第２のグループには、肝細胞内への「ウイルスの侵入のインヒビター」が挙げられる。そのように考えられるものは、全体的であれ部分的であれ、個々のウイルス粒子による又は感染した宿主細胞の膜による宿主細胞の認識の工程、或いは感染していない宿主細胞の細胞表面へのウイルス又は感染した宿主細胞の膜の付着の工程、或いは、宿主細胞によるウイルス粒子のエンドサイトーシスの工程、或いは、ウイルス膜とエンドソーム膜との融合の工程、を阻害する能力のある任意の分子を含む。
【００９９】
第３のグループには、「免疫調節剤」が挙げられる。用語「免疫調節剤」は、ウイルスの感染の間の哺乳動物における免疫応答の開始又は増強を助ける合成又は天然起源の分子を示すものとして理解される。免疫調節剤の例として、１型インターフェロン（例えば、インターフェロンアルファ（ＩＦＮ−α）、ベータ（ＩＦＮ−β）又はオメガ（ＩＦＮ−ω））、２型インターフェロン（例えば、ガンマインターフェロンＩＦＮ−γ）及びペグ化されたインターフェロンが挙げられ得る。
【０１００】
第１の好ましい改変物によれば、本発明の化合物は、ＨＣＶ感染の治療及び／又は予防において使用する意図の更なる剤と一緒に投与される。該更なる剤は、好ましくは、本明細書において上で定義したようなウイルスインヒビターである。
【０１０１】
複数のインヒビターをそのようなに組み合わせて使用することにより、高い変異率を有するウイルスの治療においてしばしば観察されるウイルス耐性に関するリスクを低減することが可能である。
【０１０２】
有利には、該更なる剤は、免疫調節剤又はＨＣＶのウイルス代謝のインヒビターである。
【０１０３】
第２の好ましい改変物によれば、当該化合物は、Ｃ型肝炎ウイルスへの感染の治療及び／又は予防で投与される唯一の抗ウイルス剤である。
【０１０４】
有利には、当該化合物は、医薬組成物の形態で処方される。典型的には、当該医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体及び本発明の化合物を含む。
【０１０５】
用語「薬学的に許容可能な担体」は、ヒト又は動物において、二次反応、例えば、アレルギー反応を生じない任意の溶媒、分散媒体、吸収遅延剤等を示すものとして理解される。薬学的に許容可能な担体は、当業者に周知であり、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＵＳＡ，  １９８５）に記載されるものが挙げられる。特に薬学的に許容可能な担体は、投与経路（例えば、それは、経口、舌下、経鼻、バッカル、経皮、静脈内、皮下、筋肉内及び／又は直腸であり得る。）に特に依存して選択される。用量は、問題の活性成分、投与の態様、治療指標、患者の年齢、体重及び状態等の因子に依存する。
【０１０６】
本発明はまた、治療的に有効な量の、式（Ｉ）を有する化合物、薬学的に許容可能なその塩及びエステル又はそれらの混合物を、その必要がある個体に投与することを含む、ＨＣＶ感染の治療又は予防の方法に関し、当該式（Ｉ）を有する化合物は、純粋な立体異性体の形態又はエナンチオマー及び／又はジアステレオマーの混合物の形態（ラセミ混合物を含む）であり、好ましくは、当該式（Ｉ）を有する化合物は、デルフィニジン、ミリセチン、トリセチニジン、プルチェリジン、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、ガロカテキン（ＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、薬学的に許容可能なそれらの塩及びエステル、並びにそれらの混合物からなる群から選択される。個体は、好ましくは、哺乳動物、より詳細にはヒトである。治療的に有効な量は、当業者により容易に決定され得る。
【０１０７】
本明細書中で使用される用語「治療的に有効な量」又は「治療的に有効な用量」は、組織、動物又はヒトの生物学的システムに生物学的又は医学的反応（これは、ウイルスの阻害、その成長の停止、患者のウイルス負荷の減少又はウイルスの根絶に主に起因する、ＨＣＶ感染の症状の緩和を含む）を生じる、抗ウイルス剤（例えば、式（Ｉ）を有するフラボノイド化合物又はそれらの誘導体）の量を示す。予防の目的のためには、治療的に有効な量はまた、活性剤の「予防量」として考えられ得る。
【０１０８】
用語「患者」又は「その必要がある患者」は、ＨＣＶにより冒された又は冒されたかもしれないヒト又は非ヒト哺乳動物を示すものとして理解される。好ましい実施態様では、患者は、ヒトである。別の実施態様では、患者はチンパンジーである。
【０１０９】
本発明の目的はまた、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染力を減少又は不活化するための、好ましくはエキソビボの方法に関し、当該方法は、該Ｃ型肝炎ウイルスを、式（Ｉ）：
【０１１０】
【化１７】
2014510740.tif 000018
【０１１１】
〔式中、
・ａが単結合である場合、ＸはＯであるか、ａが二重結合である場合、ＸはＯ＋であり、
・Ｒ１及びＲ２は、互いに独立して、水素原子、水酸基又はメトキシル基であり、
・Ｒ３、Ｒ５及びＲ７は、互いに独立して、水素原子、ＯＨ基、Ｏ−グリコシル基、（Ｃ１〜Ｃ１８）アルコキシル又は式（ＩＩ）：
【０１１２】
【化１８】
2014510740.tif 000019
【０１１３】
を有する基であり、
・Ｒ４及びＲ６は、互いに独立して、水素原子又はＯＨ基であり、
・Ｒ４’は水素原子であるか、ａが単結合である場合、Ｒ４’は、Ｒ４及びそれらに結合する炭素原子と一緒に、Ｃ＝Ｏ基を形成するか、又はａが二重結合である場合、Ｒ４’は存在せず、
・ａ及びｂは、同一又は異なって、単結合又は二重結合のいずれかであり、
但し、Ｒ３、Ｒ５及びＲ７基のうちの少なくとも１つが、式（ＩＩ）を有する基であるか、並びに／又はＲ１及びＲ２が両方ともＯＨ基である。〕
を有する化合物、或いは薬学的に許容可能なそれらの塩又はエステルの一つを接触させる工程を含み、該式（Ｉ）を有する化合物は、純粋な立体異性体の形態であるか、或いは、エナンチオマー及び／又はジアステレオマーの混合物の形態（ラセミ混合物を含む）である。
【０１１４】
ＨＣＶを、部分的であれ完全であれウイルスの不活化又は阻害を達成するために十分な期間及び条件下、式（Ｉ）を有する化合物と接触させる。本発明によれば、ＨＣＶを、感染工程の前又は間、式（Ｉ）を有する化合物と接触させる。感染工程は、その標的細胞又は細胞群とウイルスが接触する工程である。
【０１１５】
用語「感染力」は、本発明の意味（特に、標的細胞内に侵入するウイルスの能力における減少、好ましくは、標的細胞に付着するその能力の減少）内においてウイルス感染を生じるウイルスの能力であるウイルスの感染性の性質を示すことが理解される。
【０１１６】
有利には、本発明によるエキソビボ方法は、ＨＣＶウイルスを含み得るサンプルと式（Ｉ）を有する化合物とを、液体又は半液体の培地で接触させることによって実行され得、式（Ｉ）を有する化合物は、好ましくは、０．５μＭ〜１００μＭの濃度で、有利には１０μＭ〜８０μＭ又は２０μＭから７０μＭまでの濃度で、適用される。典型的には、式（Ｉ）を有する化合物は、５０μＭの濃度で適用される。当該方法は、４℃〜３７℃、好ましくは４℃から１０℃まで又は２０℃から３７℃までの温度で実行され得る。
【０１１７】
本発明の化合物は、１５〜９０分、好ましくは３０から４５分の期間、当該ウイルスと接触され得る。
【０１１８】
好ましくは、ＨＣＶの感染力を減少又は不活化するためのエキソビボ方法によれば、当該Ｃ型肝炎ウイルスは、生物学的サンプル中に存在する。
【０１１９】
用語「生物学的サンプル」は、生物学的起源の、或いは器官、組織、細胞、細胞の集団、生物学的液体、精製されたタンパク質若しくはペプチド等の生物学的生物体又は実体から得られる、サンプルを示す。限定なしで、それらの例には、生物学的起源の液体サンプル（例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、リンパ液又は細胞ライセート）、固体サンプル（例えば、特に移植用途が意図される器官、移植関連用途が意図され得る組織又は細胞培養物）が挙げられる。
【０１２０】
有利な改変物によれば、本発明によるＨＣＶの感染力を減少する又は不活化するエキソビボ方法は、生物学的サンプルを洗浄する更なる工程を含む。この工程により、当該生物学的サンプルからの式（Ｉ）を有する化合物の減少又は除去が可能となる。洗浄工程は、当該生物学的サンプル中で式（Ｉ）を有する化合物の混合物をインキュベーションする工程に先行され得る。
【０１２１】
本発明によるエキソビボの方法はまた、生物学的サンプルの感染力をチェック及びモニタリングする更なる工程を含み得る。そのような工程は、生物学的サンプルと式（Ｉ）を有する化合物との別の接触サイクルを考慮すべきかどうかを決定するために、式（Ｉ）を有する化合物を生物学的サンプルと接触させる工程の前、又は、接触後に、考慮され得る。そのようなチェック及びモニタリングする工程は、特にＨＣＶ感染の初期検出を可能にする任意の手段により行われ得る。したがって、ＨＣＶの特異的マーカーの検出は例えば、ウイルスタンパク質特異的抗体を使用することにより、又は、ＨＣＶ  ＲＮＡのＰＣＲ解析を用いた検出により、行われ得る。
【実施例】
【０１２２】
物質及び方法
試薬
ダルベッコ改変培地（ダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））、ダルベッコ最小必須培地（最小必須培地イーグルＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ（登録商標））、生理食塩水リン酸緩衝液（リン酸緩衝化生理食塩水ＰＢＳ）、低血清培地（ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標））、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ（商標））、ヤギ血清、ウマ血清、及びウシ胎仔血清（ＦＣＳ）は、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）により販売されている製品である。４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標）から得た。（−）−エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ  ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））及びポリビニルアルコール（ＭＯＷＩＯＬ（登録商標）３−８８）は、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）により販売されている。インビボトランスフェクション試薬ＥｘＧｅｎ５００（登録商標）は、ＥＵＲＯＭＥＤＥＸ（登録商標）により販売されている。（＋）−カテキン、（−）−エピカテキン、（−）−エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）及び（−）−エピガロカテキン−３−ガレート（ＥＧＣＧ  Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（登録商標））は、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（登録商標）社（Ｌｙｏｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）により販売されている。塩酸デルフィニジンは、Ｅｘｔｒａｓｙｎｔｈｅｓｅ（Ｌｙｏｎ，  Ｆｒａｎｃｅ）により製造されている。その他の試薬は、ＳＩＧＭＡ（登録商標）社により販売されている。
【０１２３】
抗体
ＭＡｂ  ２Ｄ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８９）として参照される、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）のエンベロープタンパク質（Ｅ）に対して作られたマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、及び、ＮＳ３  ＭＡｂ  Ｏｓｃ−２３（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，  １９９１．  ７：  ｐ．  １１９５−１１９８）として参照される、ウシウイルス性下痢ウイルスのＮＳ３タンパク質に対して作られたマウスモノクローナル抗体（抗ＢＶＤＶ）は、ＭｉｎｉＰｅｒｍ（登録商標）（ＨＥＲＡＥＵＳ（登録商標））装置を用いることにより、製造業者の推奨に従って、インビトロで製造した。ＭＡｂ  ５Ａ６（Ｏｒｅｎ，  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，  １９９０．  １０（８）：  ｐ  ４００７−１５）として参照されるマウスモノクローナル抗体抗ＣＤ８１は、Ｓ  Ｌｅｖｙ（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に提供して頂き、モノクローナル抗体抗ＣＤ８１（ＭＡｂ  ＪＳ−８１として参照）は、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標）により販売されている。Ｃｙ３ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体コンジュゲートは、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ（登録商標）により販売されている。
【０１２４】
細胞株及び細胞培養条件
ヒト肝細胞株Ｈｕｈ−７（Ｎａｋａｂａｙａｓｈｉ，  Ｈ  ｅｔ  ａｌ  ；  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，  １９８２．  ４２（９）  ｐ３８５８−６３）及びＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ（商標））及び１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））で培養した。Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ  ＭＤＢＫ）は、１０％ウマ血清を含むＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ（商標））で補充したＤＭＥＭ培地で培養した。ＢＨＫ−２１細胞は、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ（商標））及び１０％ウシ胎仔血清で補充したＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））で培養した。
【０１２５】
ＨＣＶｃｃ
単離物ＪＦＨ１（遺伝子型２ａ、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＢ２３７８３７）のゲノムをコードするプラスミドの改変バージョンは、Ｔ  Ｗａｋｉｔａ氏（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）（Ｗａｋｉｔａ，  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ２００５．  １１（７）：  ｐ  ７９１−６）から頂戴した。改変ＪＦＨ１ウイルスクローンは、ウイルス負荷の増大を減少することが示されている以下のアミノ酸変化Ｆ１７２Ｃ及びＰ１７３Ｓ  Ｎ５３４Ｋを生じる変異を含んでいる（Ｄｅｌｇｒａｎｇｅ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００７．  ８８（Ｐｔ  ９）：  ｐ  ２４９５−５０３）。さらに、先行技術の文献（Ｇｏｕｅｓｌａｉｎ，  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２０１０．  ８４  （２）：  ｐ  ７７３−８７）に記載されるように、ＨＣＶのＥ１糖タンパク質のエピトープＡ４（ＳＳＧＬＹＨＶＴＮＤＣ）（Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ，  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  １９９４．  ６８（１０）：  ｐ  ６１４７−６０）を再構築するために、１９６ＴＳＳＳＹＭＶＴＮＤＣ残基をコードするＥ１配列を改変した。プラスミドＪＦＨ−Ｌｕｃは、レポーター遺伝子として、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）に対する遺伝子を含み、プラスミドＪＦＨ−ΔＥ１Ｅ２−Ｌｕｃは、先行技術（Ｇｏｕｅｓｌａｉｎ，  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２０１０．  ８４  （２）：  ｐ  ７７３−８７  及び  Ｒｏｃｈａ−Ｐｅｒｕｇｉｎｉ，  Ｖ，  ｅｔ  ａｌ，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，  ２００８．  ３（４）：  ｐ  ｅ１８６６）に記載されるように、Ｅ１Ｅ２領域内のリーディングクレームのシフトを生じない欠失を含む（Ｗａｋｉｔａ，  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，  ２００５．  １１（７）：  ｐ  ７９１−６）。
【０１２６】
ＨＣＶのゲノムＲＮＡ作成するために、ＸｂａＩ制限部位で切断することにより、ＨＣＶ  ｃＤＮＡの３’末端で、プラスミドを線状にした。マングビーンヌクレアーゼでの処理に続いて、線状ＤＮＡを、次いで、ＡＭＢＩＯＮ（登録商標）により販売されているＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（登録商標）キットを用いたインビトロ転写のテンプレートとして使用する。先行技術（Ｋａｔｏ，  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，  ２００３．  １２５（６）：  ｐ  １８０８−１８１７）に記載されるように、エレクトロポレーションにより、インビトロで転写されたＲＮＡをＨｕｈ−７細胞にトランスフェクトした。先行技術（Ｄｅｌｇｒａｎｇｅ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００７．  ８８（Ｐｔ  ９）：  ｐ  ２４９５−５０３）に記載されるようにして、ウイルス抽出物を得た。
【０１２７】
ＨＣＶｃｃウイルスでの感染の試験については、Ｈｕｈ−７細胞を２４穴培養プレートで培養し、そこで、３７℃で２時間にわたり、感染を行った。ＥＧＣＧを用いた試験については、特段の記載がない限り、感染前４５分間ＥＧＣＧの存在下で及び／又は反応の終了まで培養培地を用いた感染の間にＥＧＣＧを添加して、ウイルスをプレインキュベートした。特定の試験の間、異なる期間（感染後２４、４８又は７２時間）にわたる感染工程の後に、ＥＧＣＧを添加した。ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）により販売されているウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステムキットを用いて、細胞ライセートにおける感染工程後４８時間のルシフェラーゼ活性を測定することによるか、又は、感染後４８時間又は７２時間の抗Ｅ１抗体（Ａ４）を用いた免疫蛍光法により、感染率を評価する。
【０１２８】
ＨＣＶ擬粒子（Ｐｓｅｕｄｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）（ＨＣＶｐｐ）
擬型レトロウイルス粒子は、先行技術（Ｂａｒｔｏｓｃｈ，  Ｂ，  Ｊ  Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆ  Ｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３．  １９７（５）：  ｐ  ６３３−４２）に記載されている。手短に言えば、２９３Ｔ細胞を、ルシフェラーゼをコードするマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来のトランスフェクションベクター（Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋ，  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００４．  ７８（６）：  ｐ  ２９９４−３００２）、マウス白血病ウイルスのＧａｇ−Ｐｏｌ遺伝子構築物を含むベクター、及び、エンベロープ糖タンパク質を発現するベクターを用いてコトランスフェクトした。当該コトランスフェクションは、トランスフェクション試薬Ｅｘｇｅｎ（登録商標）５００を用いて、供給者の推奨する条件下、実行した。以下の遺伝子型１ｂ−ＵＫＮ１ｂ−５．２３（ＡＹ７３４９７６）、遺伝子型２ｂ−ＵＫＮ２ｂ−１．１（ＡＹ７３４９８２）、遺伝子型３ａ−ＵＫＮ３ａ−１．２８（ＡＹ７３４９８４）、遺伝子型４−ＵＫＮ４−１１．１（ＡＹ７３４９８６）、遺伝子型５−ＵＫＮ５−１４．４（ＡＹ７８５２８３）、遺伝子型６−ＵＫＮ６−５．３４０（ＡＹ７３６１９４）のＨＣＶのウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドは、Ｊ  Ｂａｌｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，  ＵＫ）（Ｌａｖｉｌｌｅｔｔｅ，  Ｄ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ２００５．  ４１（２）：  ｐ  ２６５−７４）に頂戴した。遺伝子型１ａ−Ｈ７７（３つのアミノ酸Ｒ５６４Ｃ、Ｖ５６６Ａ、Ｇ６５０Ｅを改変する変異を有するＡＡＢ６７０３７）のプラスミドは、先行技術（Ｂａｒｔｏｓｃｈ，  Ｂ，  Ｊ  Ｄｕｂｕｉｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｆ  Ｌ，  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００３．  １９７（５）：  ｐ  ６３３−４２）に記載されており、遺伝子型２ａ−ＪＦＨ−１（ＡＢ０４７６３９）のプラスミドは、Ｒ  ．  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に頂戴した。水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ  Ｇ）をコードする発現ベクターｐｈＣＭＶ−Ｇは、マウス白血病ウイルスに対応する中心にＶＳＶ  Ｇエンベロープ糖タンパク質を有する擬型レトロウイルス粒子（ＶＳＶｐｐ）を制御して製造するために使用されている。ルシフェラーゼを発現するＨＣＶｐｐによるトランスフェクション反応は、文献（Ｏｐ  Ｄｅ  Ｂｅｅｃｋ，  Ａ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００４．  ７８（６）：  ｐ  ２９９４−３００２）に記載されている。
【０１２９】
他のウイルス
ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）のＮＡＤＬ株及び黄熱ウイルス（ＹＦＶ）の１７Ｄ株を、コントロールとして使用した。ＢＶＤＶは、以前記載されたように製造した（Ｌｅｃｏｔ，  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００５．  ７９（１６）：  ｐ  １０８２６−９）。ＭＤＢＫ細胞を、２４穴プレートのカバースリップに播種し、２４時間超感染させた。ＥＧＣＧの存在下、３７℃で１時間、感染多重度（ＭＩ）約１で、ＢＶＤＶで細胞を感染させ、次いで、これらを１５時間培養する。感染した細胞及びコントロール細胞を、ＰＢＳ緩衝液でリンスし、次いで、抗体抗ＮＳ３  ＭＡｂ（モノクローナル抗体）（Ｏｓｃ−２３）による免疫蛍光染色を行うために、３％パラホルムアルデヒドで固定した。ＹＦＶ感染に関しては、Ｈｕｈ−７細胞を２４穴プレートのカバースリップに播種し、２４時間超感染させた。ＥＧＣＧの存在下、３７℃で１時間、ＭＩ約１で、ＹＦＶウイルスで細胞を感染させ、次いで、これらを、２３時間培養した。感染した細胞及びコントロール細胞を、ＰＢＳ緩衝液でリンスし、３％パラホルムアルデヒドで固定した。免疫蛍光反応を、抗体抗Ｅ  ＭＡｂ  ２Ｄ１２を用いて行う。Ｔｏｔｏ１１０１／Ｌｕｃサンプル（Ｂｉｃｋ，  Ｍ  Ｊ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２００３．  ７７（２１）：  ｐ  １１５５５−６２）及びルシフェラーゼを発現するシンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）（ホタルルシフェラーゼシステム）（ＭａｃＤｏｎａｌｄ氏，  Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ＮＹ，  ＵＳＡに頂戴した）を、インビトロで転写されたＲＮＡからのＢＨＫ−２１細胞のエレクトロポレーションにより得た。手短に言えば、１５μｇのＲＮＡを、４×１０６のＢＨＫ−２１細胞と混合し、次いで、方形波エレクトロポレーターを用いて、２５μＦ及び１４０Ｖのエレクトロポレーション工程に供した。上澄を、４８時間後に回収した。
【０１３０】
間接的免疫蛍光顕微鏡法
感染した細胞において発現する免疫蛍光ウイルスタンパク質の検出の手順を、文献（Ｒｏｕｉｌｌｅ，  Ｙ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，  ２００６．  ８０（６）：  ｐ  ２８３２−４１）に記載されているように実行する。１μｇ／ｍｌの４’，６’−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＰＢＳ緩衝液中で、５分間インキュベーションすることにより、核を染色する。カバースリップを、封入剤Ｍｏｗｉｏ（登録商標）（１０％  Ｍｏｗｉｏｌ、２５％グリセロール、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．５）を用いて、ガラススライド上にマウントし、次いで、１０×及び２０×の拡大率を備え、対象物の開口数が０．５であるＺＥＩＳＳ（登録商標）ＡＸＩＯＰＨＯＴ蛍光顕微鏡により、観察する。カメラＣｏｏｌｓｎａｐ  ＥＳ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ）により、具体的には、蛍光励起及び発光フィルターを使用して、蛍光シグナルを集める。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標）ソフトフェアを使用して、イメージをまとめ、加工する。定量の工程に関しては、ランダムに取得した各カバースリップの面積のイメージを記録する。抗体抗Ｅ  ＭＡｂ  Ａ４、抗ＢＶＤＶ  ＮＳ３又は抗ＹＦＶ  Ｅで標識された細胞を、カウントし、感染した細胞として記録する。細胞の合計数を、ＤＡＰＩを用いた核染色によってカウントした。感染は、細胞の総数に対する感染した細胞の比率として定義する。
【０１３１】
ＨＣＶｃｃウイルスの細胞から細胞への伝播についての試験
２４穴プレートで培養したＨｕｈ−７細胞を、２時間にわたり、ＨＣＶｃｃで感染させる。接種物を除去し、ＥＧＣＧ（５０μＭ）又はコントロールとして当容量のジメチルスルホキシド  （ＤＭＳＯ）を含む、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（登録商標）−Ｉ、１０％ＦＣＳ及び１％低融点アガロースゲル（ＬＯＮＺＡ（登録商標）により販売されているＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）Ａｇａｒｏｓｅ）を補充したＤＭＥＭ培地により置き換えた。細胞を３７℃で３日間にわたりインキュベートし、その最後に、アガロースを除去し、感染部位を、先に記載したような、ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質に対する間接的免疫蛍光を用いて検出する。
【０１３２】
結合に関する実験方法
ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧの存在下、４℃で１時間（付着／結合工程）、ＪＦＨ−ＬｕｃウイルスでＨｕｈ−７細胞を感染させた。細胞をＰＢＳで洗浄し、次いで、ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧの存在下、４℃で１時間（宿主細胞レセプターへの後付着／結合工程）、再びインキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、ＥＧＣＧ又はＤＭＳＯを除去し、ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧの存在下、３７℃で１時間インキュベートした（エンドサイトーシス／融合の工程）。最後に、細胞を洗浄し、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ（商標））及び１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））で、３７℃で４８時間培養した。ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）により販売されているウミシイタケルシフェラーゼアッセイシステムキットを用いて、細胞ライセート中のルシフェラーゼ活性を測定することによって、感染のレベルを計算した。
【０１３３】
定量的「結合」試験
ＨＣＶｃｃ。定量的「結合」実験のために、ＨＣＶｃｃウイルスを大量生産し、イオジキサノールのグラジエントで濃度及び分離により精製した。感染した細胞の上澄を、８％のＰＥＧ６０００で４℃で一晩沈殿させ、２５分間１００００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを１ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁し、連続したイオジキサノールグラジエント（１０〜４０％）にロードし、４℃で１６時間、３６０００ｒｐｍで遠心分離した。５００μＬの分画を収集し、各分画の力価を評価した。実験を行うために、最も感染性の分画を合わせた。
【０１３４】
定量的「結合」試験。ＥＧＣＧ（５０μＭ）、塩酸デルフィニジン（５０μＭ）又はブタ腸ヘパリン（５００μｇ／ｍＬ）の存在下、４℃で１時間、ＨＣＶｃｃウイルスをＨｕｈ−７細胞と接触させた。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，  Ｄｕｒｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全ＲＮＡ（ウイルス及び細胞）を抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｃａｓｔｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  ２００４）によりＨＣＶ  ＲＮＡを定量した。ヘパリンをコントロールとしてパラレルで使用した。
【０１３５】
実施例１
ＨＣＶウイルス感染に対する異なる緑茶カテキンの効果の試験
ＤＭＳＯ又は５０μＭの異なるカテキン、すなわち、（＋）−カテキン（Ｃ）、（−）−エピカテキン（ＥＣ）、（−）−エピカテキン−３−ガレート（ＥＣＧ）、（−）−エピガロカテキン（ＥＧＣ）及びＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標）（ＥＧＣＧ  ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標））により又はＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）（ＥＧＣＧ  ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標））により販売されている（−）−エピガロカテキン−３−ガレートの存在下、２時間、Ｈｕｈ−７細胞をＪＦＨ１−Ｒｌｕｃウイルスで感染させた。ＥＧＣＧのこれらの組成物は、純度が異なる（ＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標）＞９９％、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）＞９５％）。ＤＭＳＯを様々なカテキンの溶媒として使用し、それはコントロール試験としての機能を果たす。
【０１３６】
【化１９】
2014510740.tif 000020
【０１３７】
細胞を感染後４８時間溶解し、ルシフェラーゼの発現を定量した。
【０１３８】
感染中に培地に存在するカテキンに基づくＪＦＨ１−ＲｌｕｃウイルスでのＨｕｈ７細胞の相対的ウイルス感染の測定により（図１）、（＋）−カテキン及び（−）−エピカテキンのいずれでも、ＨＣＶウイルスによるウイルス感染の阻害は生じないことが明確に示されている。実際、相対的ウイルス感染の測定は、ＤＭＳＯについて観察されたものと同じである。
【０１３９】
しかしながら、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）又はＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標）により販売されているＥＧＣＧは、９５％超のウイルス感染を阻害する有意な抗ウイルス効果を示すことに留意すべきである。しかしながら、ＥＣＧ及びＥＧＣ分子に関しては、それぞれ約４０％及び８０％のオーダーのウイルス感染のより低い阻害率の抗ウイルス効果も見られる。
【０１４０】
ＥＧＣＧと比較した、ＥＣＧ又はＥＧＣの存在下での、相対的ウイルス感染の測定は、クロマン複素環のＣ２−３，４，５−トリヒドロキシ−フェニル基及びクロマン複素環のＣ３ガロイル基に見られるこの同一の構造の、ＥＧＣＧの抗ウイルスの役割に対する付加的な効果を示唆している。
【０１４１】
ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）により供給されたものであれＥＸＴＲＡＳＹＮＴＨＥＳＥ（登録商標）により供給されたものであれＥＧＣＧ分子がＨＣＶ感染の阻害について同じ効果を有することを考慮すれば、ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）により供給されたＥＧＣＧのみ、以下のセクションで例示する。
【０１４２】
実施例２
増大量のＥＧＣＧ（０、０．５、５、５０μＭ）の存在下ＪＦＨ１−ＲＬｕｃウイルスで、又は、４５分間ＥＧＣＧ（５０μＭ）と予めインキュベートしたウイルスで、インビトロで培養したＨｕｈ−７細胞を２時間感染させた。感染後、１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培養培地で細胞を洗浄し、同じ培地でインキュベートした。感染後４８時間で、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質と２０μＬの細胞ライセートをインキュベーションした後、ウミシイタケルシフェラーゼ活性をルミノメーターにより定量した。
【０１４３】
図２は、ＥＧＣＧによるウイルス感染の阻害が用量依存的であることを示す。
【０１４４】
５０μＭのＥＧＣＧで、培養したＨｕｈ−７細胞のウイルス感染は、１０を超える因数で（ＩＣ５０＝５μＭ）減少する。しかしながら、ウイルス複製は、ＥＧＣＧにより影響を受けない（結果示さず）。したがって、ＥＧＣＧは、ウイルス感染の初期段階、すなわち、ウイルスの細胞内への侵入を可能にする工程、を阻害する。
【０１４５】
反対に、感染していない細胞を感染前又は感染後の分子で処理しても、ＥＧＣＧのウイルス侵入に対する効果は全く観察されない。したがって、ＥＧＣＧにより誘導される阻害は、宿主細胞ではなくウイルスに直接作用する。この仮説は、感染前の分子（前処理５０μＭ）とウイルスをインキュベートした場合、ＥＧＣＧの阻害効果における増大が観察されることにより支持される。
【０１４６】
実施例３
ウイルスエンベロープタンパク質は、ウイルスの侵入において非常に重要な役割を果たす。実際、宿主細胞のレセプター（単数又は複数）との相互作用を可能にするのに加えて、これらのタンパク質は、ウイルス及び細胞のエンベロープ間の融合を誘導することを可能にする。ＨＣＶウイルスによる感染の最初の段階に対するＥＧＣＧの効果を研究するために、目的のウイルスエンベロープ糖タンパク質の発現を可能にするレファレンス研究モデルを使用した：これらは、感染性ウイルス様粒子である。
【０１４７】
ＨＣＶウイルスの異なる遺伝子型が、世界人口において存在する。したがって、ＨＣＶのウイルス遺伝子型に関するＥＧＣＧの阻害効果の特異性を評価するために、ＨＣＶウイルスのエンベロープ糖タンパク質の異なる遺伝子型Ｅ１及びＥ２を研究した。遺伝子型１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３、４、５及び６のＨＣＶウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ１及びＥ２をその表面に発現する感染性ウイルス様粒子（ＨＣＶｐｐ）、並びに、コントロールとして、エンベロープタンパク質ＶＳＶを発現するＶＳＶウイルスのウイルス様粒子（ＶＳＶｐｐ）を製造した。製造した様々なウイルス様粒子は、感染を定量するためのルシフェラーゼを発現する。
【０１４８】
これを行うために、５０μＭのＥＧＣＧ又はＤＭＳＯの存在下で、試験した様々な異なる遺伝子型のＨＣＶｐｐウイルス様粒子で、又は、ＶＳＶｐｐウイルス様粒子で、２時間、Ｈｕｈ−７細胞を感染させた。ＤＭＳＯはＥＧＣＧの溶媒であるので、それをコントロールとして使用する。感染後４８時間で、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ基質と２０μＬの細胞ライセートをインキュベーションした後、ルミノメーターによりルシフェラーゼ活性を定量した。
【０１４９】
ＶＳＶｐｐによる感染には全く影響がないが、ＥＧＣＧ（５０μＭで）は、試験したすべての遺伝子型のＨＣＶｐｐによる感染に阻害効果を有する（図３）。
【０１５０】
したがって、ＥＧＣＧの阻害効果は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質に直接関与する。したがって、ＥＧＣＧにより媒介されるウイルス侵入の阻害は、宿主細胞レセプター（単数又は複数）との最初の相互作用である付着工程の阻害又はウイルス及び細胞のエンベロープ間の融合の工程の阻害のいずれか、或いはこれら２つの工程の両方に起因する。
【０１５１】
さらに、異なるウイルス遺伝子型のウイルス糖タンパク質を発現するＨＣＶｐｐの使用は、試験した遺伝子型に関わらず、ＥＧＣＧが、ＨＣＶの効果的な抗ウイルス剤であることを示す。遺伝子型１ｂ、２ａ、２ｂ及び４のＨＣＶｐｐによる感染時、ＥＧＣＧの存在下で実質的に相対的感染は皆無であることが観察され得る。観察される相対的感染は、遺伝子型１ａ、３ａ、５及び６について非常に低く、それは、５％と１３％との間である。したがって、ＶＳＶｐｐによる感染は、ＥＧＣＧの存在下で、８５％の相対的感染率の測定を誘導するが、関与する遺伝子型がいずれであろうと、ＨＣＶｐｐによる感染は、ＥＧＣＧの存在下で、１３％から０％の間の相対的感染率の測定を誘導する。これらの結果は、関与するウイルスの遺伝子型がいずれであろうと、Ｃ型肝炎の治療における抗ウイルス剤としてのＥＧＣＧの強い可能性を示す。さらに、現在の治療に最も耐性があり、ヨーロッパ及び米国の人口において大部分の遺伝子型であるＨＣＶ遺伝子型１もまた、ＥＧＣＧにより阻害されることに留意することが重要である。
【０１５２】
実施例４
実施例２は、その遺伝子型に関わらず、ＨＣＶに関するＥＧＣＧの抗ウイルス性を示す。さらに、実施例２は、ＥＧＣＧがＶＳＶ感染を阻害しないので、この効果がＨＣＶに特異的であることを示す。しかしながら、ＨＣＶは、正極性の１本鎖ＲＮＡゲノムを有するウイルスであるが、ＶＳＶは、セグメント化されていない負のセンスＲＮＡウイルスである。
【０１５３】
したがって、さらに１本鎖正ＲＮＡウイルスにおけるＥＧＣＧの特異性のレベルを評価するために、ＥＧＣＧの存在下における感染実験を、他のＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーを用いて行った。
【０１５４】
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）及びウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）において、試験を行った。感染は、ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧの存在下のいずれかで行った。これらの様々なウイルスで感染させた細胞は、ＹＦＶ又はＳＩＮＶについてはＨｕｈ−７であり、ＢＶＤＶについてはＭＤＢＫ細胞であった。感染させた細胞を、ＹＦＶウイルスについては抗Ｅ（２Ｄ１２）抗体、ＢＶＤＶウイルスについては抗ＮＳ３（ｏｓｃ２３）抗体で標識後、免疫蛍光により感染の定量を行った。次いで、Ｃｙ３標識した第２抗体による検出の工程を行う。ＳＩＮＶについては、後の発現するルシフェラーゼを用いて、相対的感染の測定を、ルシフェラーゼの定量によって行った。
【０１５５】
ＹＦＶ、ＢＶＤＶ及びＳＩＮＶウイルスによる細胞の感染の間の培地中のＥＧＣＧ又はＤＭＳＯの存在に基づく感染の定量は（図４）、これらのウイルスのいずれによる細胞感染に対しても、ＥＧＣＧが阻害効果を有していないことを明確に示している。
【０１５６】
結果として、ＥＧＣＧは、したがって、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅファミリーのその他のメンバーに対する抗ウイルス剤ではない。ＥＧＣＧの抗ウイルス効果は、ＨＣＶに特異的である。
【０１５７】
実施例５
本明細書で上述した結果は、ＥＧＣＧが培養した細胞内へのウイルスの侵入を阻害することを示す。ウイルス感染の第２の態様は、細胞から細胞へのウイルスの伝播である。ＥＧＣＧがまた、細胞から細胞へのウイルスの広がりを阻害するか否かを評価するために、Ｈｕｈ−７細胞を、２時間、ＪＦＨ１ウイルスに感染させ、次いで、ＥＧＣＧ（５０μＭの）の存在又は非存在下、１％アガロースを含有する培地でインキュベートした。アガロースは、培地中へ分泌されるウイルスによる細胞の感染を防止し、それにより、それらの間で接触している細胞によって、ウイルスの細胞から細胞への伝播を観察することを可能にする。
【０１５８】
感染後７２時間で、細胞を固定し、抗Ｅ１抗体で標識後、感染を免疫蛍光により検出した。次いで、検出工程を、Ｃｙ３を連結した第２の抗体を用いて行う。核を、ＤＡＰＩ染色により染色する。感染部位あたりの細胞の数を定量した（図５）。ＥＧＣＧの存在下、感染部位は、ずっと小さい。これらは、細胞を感染した後、ウイルスが伝播していないことを示す、平均３〜４個の感染した細胞を含んでいる。反対に、コントロール部位は、平均４５個の感染した細胞を含む。上述の点から、ＥＧＣＧは、ＨＣＶウイルスの細胞から細胞への伝播のインヒビターである。
【０１５９】
したがって、ＥＧＣＧは、感染した患者における健常な肝臓の移植後の健常な肝臓の再感染を防ぐ抗ウイルス剤として良好な候補物であり得る。
【０１６０】
実施例６
感染した細胞の上澄の病原性に対するＥＧＣＧの効果及び感染した細胞上澄からウイルスを根絶する能力を試験するために、感染した細胞上澄からの、ＥＧＣＧの存在又は非存在下での連続的感染を含む実験を行った。Ｈｕｈ−７細胞を、ウイルスＨＣＶ  ＪＦＨ１に感染させた（Ｐ０）。ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧを、感染後に、添加した。培養上澄を、４８時間後に収集し、次いで、ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧの存在下で、健常な細胞を感染させるために使用した（Ｐ１）。この培養物の上澄（Ｐ１）を、次いで、４８時間後に収集し、健常な細胞を再感染させるために使用した（Ｐ２）。この手順を、さらに２回（Ｐ４まで）再現する。感染した細胞の数を、ウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ１（Ａ４）抗体に対して検出される抗体を用いて細胞を標識した後、免疫蛍光により、各継体で定量した。細胞の総数を、ＤＡＰＩマーキングにより染色した後の核をカウントすることにより定量する。
【０１６１】
ＥＧＣＧ又はＤＭＳＯの添加に依存するある培養物から別の培養物への上澄の各継体における感染した細胞の割合の研究は（図６）、ＥＧＣＧが、第３継体以降からの細胞上澄からのＨＣＶの除去及び第４継体における完全な除去を可能にすることを示す。これは、ＥＧＣＧが、ＨＣＶに感染した患者における治療的分子としての良好な候補物であるという結論を支持する。
【０１６２】
実施例７
宿主細胞中へのＨＣＶウイルスの侵入は、３つの工程から構成される：ｉ）感染していない宿主細胞の表面へのウイルス又は感染した宿主細胞の付着、ｉｉ）特定のウイルスレセプター（単数又は複数）との相互作用、及びｉｉｉ）感染した細胞の細胞質におけるウイルスゲノムの導入を可能にする、ウイルスの脂質エンベロープと感染した宿主細胞（エンドソーマル又は細胞膜）との融合。これらの工程のいずれがＥＧＣＧにより阻害されるかを決定するために、ウイルスの侵入を、これらの工程の各々に対するＥＧＣＧの阻害活性を別々に研究するための様式に分けた（図７Ａ参照）。
【０１６３】
細胞へのウイルス粒子の付着の工程は、細胞をウイルスと接触させて、次いで、４℃で１時間インキュベーションすることにより、達成される。第２の工程は、ウイルスの接種物を除去した後、細胞を４℃で１時間インキュベートし、それにより、付着したウイルスを、それらのレセプターへのその結合を強化することによって、行われる。４℃で、エンドサイトーシスのプロセスをブロックする。したがって、第３工程のエンドサイトーシス及びウイルスと細胞の膜との融合を、３７℃で１時間行う。
【０１６４】
図（図７Ａ）に示す関連するサンプルにしたがい、ＤＭＳＯ又は５０μＭのＥＧＣＧを異なる工程の間に添加する。したがって、サンプル１は、第１工程でＤＭＳＯを受けるコントロールサンプルである。その他のサンプルは、付着の工程の間（サンプル２）、宿主細胞上のレセプターとの相互作用（サンプル３）、ウイルスの脂質エンベロープと感染した宿主細胞とのエンドサイトーシス及び融合（サンプル４）、又はウイルス侵入の３つのすべての工程の間（サンプル５）における、５０μＭのＥＧＣＧの添加に相当する。
【０１６５】
その後、細胞を、３７℃で４５時間インキュベートし、次いで、ルシフェラーゼ活性を定量するために、溶解する。感染は、ＥＧＣＧなしで測定したルシフェラーゼ活性の割合として表される。実験を三連で行い、得られる値は、これら３つの異なる試験の平均値に対応する。
【０１６６】
図７Ｂに示すように、感染の有意な減少が、ＥＧＣＧを、付着の工程から添加した場合（サンプル２及び５）に、観察される。他方、ＥＧＣＧは、宿主細胞レセプターとの相互作用の工程（サンプル３）或いはエンドサイトーシス又は融合の工程の間（サンプル４）には、何ら影響を与えないようである。まとめると、これらすべての結果は、ＥＧＣＧが、宿主細胞の細胞膜にＨＣＶが結合する初期の工程、すなわち、ＨＣＶウイルスが宿主細胞へと付着する工程、を阻害することを示している。
【０１６７】
実施例８
増大量のＥＧＣＧ又は塩酸デルフィニジンの存在下、２時間、Ｈｕｈ−７細胞をＨＣＶｃｃで感染させた。抗Ｅ１抗体（Ａ４）、次いで、蛍光色素Ｃｙ３をコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ第２抗体を用いた、免疫蛍光によりエンベロープタンパク質Ｅ１を検出することにより、感染率を播種後３４時間評価した。この実験は、塩酸デルフィニジン（ＥＧＣＧに類似）が、用量依存的様式でＨＣＶｃｃによる細胞の感染を阻害することを示す（図８）。半数阻害濃度（５０％の感染を阻害する濃度−ＩＣ５０）を、これらの実験で決定した。ＥＧＣＧのＩＣ５０は、約１１μＭであると計算され、一方、塩酸デルフィニジンのＩＣ５０は約３．５μＭである。
【０１６８】
これらの結果は、一方では、塩酸デルフィニジンが細胞へのＨＣＶの侵入の新規なインヒビターであること、他方では、この分子は、抗ＨＣＶ抗ウイルス剤としてのＥＧＣＧと比較して、より高い有効性を有することを示す。
【０１６９】
実施例９
実施例３は、ＥＧＣＧが、ＨＣＶの表面糖タンパク質により媒介される細胞内へのＨＣＶの侵入の初期工程を阻害することを示す。
【０１７０】
細胞表面への付着の工程が、ＥＧＣＧにより阻害されるか否かを決定するために、定量的「結合」（又は付着）試験を行った。塩酸デルフィニジンの作用をパラレルで試験した。ヘパリン（細胞表面へのＨＣＶ付着の公知のインヒビター）をポジティブコントロールとして使用した。ＤＭＳＯ、５０μＭのＥＧＣＧ、５０μＭの塩酸デルフィニジン又は５００μｇ／ｍＬのヘパリンの存在下、感染多重度１０に精製したＨＣＶｃｃと、細胞を４℃で１時間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、全ＲＮＡを抽出した。固定されたウイルスの量を、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりウイルスゲノムＲＮＡを定量することによって、決定した。予測どおり、ヘパリン存在下での細胞の表面へのウイルスの付着は、非常に低減される（図９）。同様にして、ＥＧＣＧ又は塩酸デルフィニジンの存在下、細胞表面へのウイルスの付着の大きな減少も観察される。これらの結果はすべて、ＥＧＣＧ及び塩酸デルフィニジンの両方が、おそらくウイルス粒子に直接作用することによって、細胞表面でＨＣＶｃｃの付着を防止することによってウイルスの侵入を阻害することを示す。
【図１】
2014510740.tif 000033
【図２】
2014510740.tif 000034
【図３】
2014510740.tif 000035
【図４】
2014510740.tif 000036
【図５】
2014510740.tif 000037
【図６】
2014510740.tif 000038
【図７Ａ】
2014510740.tif 000039
【図７Ｂ】
2014510740.tif 000040
【図８】
2014510740.tif 000041
【図９】
2014510740.tif 000042
【配列表】
2014510740000001.app
【国際調査報告】
2014510740.tif 000043
2014510740.tif 000044
2014510740.tif 000045
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