(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一塩基多型が存在する標的核酸に対して用いられる一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記標的核酸が、一塩基多型が存在する領域である第一の標的塩基配列と、前記第一の標的塩基配列の３’又は５’側に位置し、一塩基多型が存在しない領域である第二の標的塩基配列と、を含み、
前記プローブが、一塩基多型を検出するレポーター領域と、アンカー領域と、リンカー領域と、を含み、
前記レポーター領域が、前記第一の標的塩基配列に対して、一塩基多型のヌクレオチドが第一のヌクレオチドのときには完全マッチし、前記第一のヌクレオチド以外のときにはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、前記第一の標的塩基配列及び前記レポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素と、を有し、
前記アンカー領域が、前記第二の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
前記リンカー領域が、前記レポーター領域及び前記アンカー領域を連結しており、前記標的核酸における前記第一の標的塩基配列及び前記第二の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、
前記レポーター領域が、３〜６個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、
前記アンカー領域が、１０〜２０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、
前記リンカー領域が、３〜１１個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであり、
前記リンカー領域が、ユニバーサル塩基を含まない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、
前記リンカー領域が、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか１種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドであり、
レポーター領域のオリゴヌクレオチドにおいて、蛍光色素の結合部位から１〜３個以内に、第一の標的塩基配列中にグアニンが存在する、プローブ。
【請求項２】
一塩基多型を検出するための方法であって、
請求項１に記載のプローブ及び一塩基多型が存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、
前記混合液の蛍光強度を測定する工程と、
前記蛍光強度に基づき、前記標的核酸の一塩基多型の有無を検出する工程と、を備える方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブ及び一塩基多型検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ほ乳類等の多細胞生物、あるいは細菌、ウイルス等の生物の遺伝子レベルにおいて、一定の頻度で見出される核酸の塩基配列上の何らかの差異は、遺伝子変異と呼ばれている。核酸の塩基配列上での差異とは、置換、挿入、欠失あるいは組み換えによって生じる。その塩基配列上の差異のうち、ある集団内で１％以上の頻度で存在する変異は、特に遺伝子多型と呼ばれている。【０００３】
遺伝子多型の中でも、塩基配列上の一塩基の置換によって起きる多型は、特に一塩基多型（以下「ＳＮＰ（：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」と省略する場合もある）と呼ばれている。ＳＮＰは、ヒトゲノムにみられる変異の中で最も出現頻度が高いため注目されている。すなわち、遺伝子多型の位置と変動に関する情報を集積し、個体の遺伝子を通常の表現型を有している野生型の遺伝子と比較した場合に、多型の有無と表現型との関連性を解析することによって、多くの情報が得られる可能性があると期待されているからである。【０００４】
また、遺伝子多型は、一定の頻度で集団に広がっていることから、全く形質の変化を伴わないもの、あるいは、特に生存（生殖）に不利な形質ではなく、いわば体質といえる形質を左右しているものとして注目されている。例えば、糖尿病、高血圧症、肥満等の生活習慣病、リウマチ、アレルギー等の免疫疾患、あるいは癌等の疾患に対する罹りやすさは、多型によって左右されていることが知られている。更に、薬剤代謝（薬の効き方）及びヒト白血球組織適合型抗原等も多型によって支配されていると考えられている。また、ヒトに限らず細菌のいくつかの薬剤耐性は、特定の遺伝子中のＳＮＰによって決定されると考えられている。そのため、ＳＮＰ解析は、個人の遺伝子のタイプに応じた最適な薬剤を投与するオーダーメイド医療、及び近年問題になっている多剤耐性病原菌の同定に有用であるとして、期待されている。【０００５】
これまでに様々なＳＮＰの検出方法及び検出プローブが開発されている。検出方法としては、例えば、蛍光標識プローブ法が挙げられる。この方法は、蛍光標識プローブが標的とする核酸に対して、完全マッチ又はミスマッチするときのハイブリダイズ効率の差によって、標的とする核酸の塩基配列にＳＮＰが存在するか否かを判断する方法である。したがって、プローブが短いほどＳＮＰの検出感度は上昇するが、短くしすぎると標的となる塩基配列に対する結合力が低下し、ハイブリダイズしなくなるといった問題があった。このような問題を解決するために、ＳＮＰを検出するための領域と、ＳＮＰ付近の塩基配列を認識するための領域と、これら二つの領域をつなぐための領域と、を含む蛍光標識プローブがこれまでに開発されている（特許文献１及び２）。【０００６】
特許文献１には、オリゴヌクレオチドであって、以下：（ａ）標的核酸の核酸残基の第一の配列に相補的な核酸領域および（ｂ）少なくとも１つの架橋ドメインおよび少なくとも１つの結合ドメインを含むスイッチドメインであり、ここで、該領域（ａ）が、該標的核酸の核酸残基の該第一の配列と安定な二重鎖を形成する条件下で、該スイッチドメインが、（ｉ）該結合ドメインに相補的である該標的核酸の核酸残基の第二の配列と（ｉｉ）該結合ドメインに相補的ではない少なくとも１つの核酸残基を含む該標的核酸の核酸残基の第二の配列とを区別し得る、を含む、オリゴヌクレオチドが開示されている。また、特許文献１には、架橋ドメインが、ユニバーサル塩基もしくは非水素結合の天然塩基又はそれらのアナログ、あるいは、ユニバーサル塩基および非水素結合の天然塩基又はそれらのアナログの混合物を含むことが記載されている。【０００７】
特許文献２には、検出可能に標識されたプローブであって、当該プローブがアンカー核酸ドメイン及びレポーター核酸ドメインを含むとともに、アンカーとレポータードメインとが非ヌクレオシドリンカーによって連結され、標的核酸の不在下ではアンカー及びレポータードメインはいずれもステムループを形成しないとともに、（ｉ）前記プローブはポリメラーゼによって伸長されず、（ｉｉ）前記リンカーはアンカードメインの３’末端の２個のヌクレオチド内でアンカードメインに結合され、且つレポータードメインの５’末端の２個のヌクレオチド内でレポータードメインに結合され、アンカードメインは検出可能な標識に結合されない、プローブが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表２００６−５２５０２７号公報
【特許文献２】特表２０１３−５０１５０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、特許文献１に記載のオリゴヌクレオチドは、所定の構造を形成するために架橋ドメインがユニバーサル塩基等を有することを必須とする。そのため、このオリゴヌクレオチドは、プローブ設計の自由度が低く、且つ、オリゴヌクレオチド合成の際に通常の塩基のみを用いた場合よりも高価になるといった問題があった。また、特許文献２に記載のプローブは、リンカーが非ヌクレオチドであるため、アンカー核酸ドメイン及びレポーター核酸ドメインとは別にリンカーを準備し、その後これらを合成しなければならず、プローブの合成に手間がかかるといった問題があった。【００１０】
そこで、本発明の目的は、合成が簡便且つ安価でありながら、ＳＮＰの存在を正確に感度よく検出することができる、一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブを提供することにある。本発明の目的はまた、上記オリゴヌクレオチドプローブを用いた一塩基多型を検出する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一塩基多型が存在する標的核酸に対して用いられる一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブであって、上記標的核酸が、一塩基多型が存在する領域である第一の標的塩基配列と、上記第一の標的塩基配列の３’又は５’側に位置し、一塩基多型が存在しない領域である第二の標的塩基配列と、を含み、上記プローブが、一塩基多型を検出するレポーター領域と、アンカー領域と、リンカー領域と、を含み、上記レポーター領域が、上記第一の標的塩基配列に対して、一塩基多型のヌクレオチドが第一のヌクレオチドのときには完全マッチし、上記第一のヌクレオチド以外のときにはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、上記第一の標的塩基配列及び前記レポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素と、を有し、上記アンカー領域が、上記第二の標的塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有し、上記リンカー領域が、上記レポーター領域及び上記アンカー領域を連結しており、上記標的核酸における上記第一の標的塩基配列及び上記第二の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する、プローブを提供する。【００１２】
本発明のプローブは、ＳＮＰを検出するためのレポーター領域とは別に、ＳＮＰの有無に係らず標的塩基配列に結合するアンカー領域を備えることでプローブの結合性が確保できる。そのため、本発明のプローブは、正確なＳＮＰの検出のためにレポーター領域を短く設計することができる。すなわち、本発明のプローブは、通常のプローブよりも正確に感度よくＳＮＰを検出することができる。また、本発明のプローブは、オリゴヌクレオチドからなるため、簡便且つ安価に合成することができる。【００１３】
上記レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、上記アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短いことが好ましい。このようにレポーター領域及びアンカー領域を設計することで、標的核酸に対する良好なプローブの結合性、並びに、ＳＮＰを検出する際の良好な正確性及び検出感度を両立することができる傾向にある。【００１４】
上記リンカー領域は、ユニバーサル塩基を含まない塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。リンカー領域にユニバーサル塩基を用いないことで、より安価にプローブを合成することができる。【００１５】
上記リンカー領域は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか１種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これにより、プローブのリンカー領域で標的核酸と結合する可能性が低下するため、レポーター領域の自由度が増し、ＳＮＰの検出能をより向上させることができる。また、リンカー領域を上記塩基のみで構成することで、より安価にプローブを合成することができる。【００１６】
上記リンカー領域は、３〜１１個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これにより、標的核酸に結合するアンカー領域とレポーター領域とが一定距離離れるため、レポーター領域の自由度が増し、ＳＮＰの検出能をより向上させることができる。【００１７】
本発明はまた、一塩基多型を検出するための方法であって、上記本発明のプローブ及び一塩基多型が存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、上記混合液の蛍光強度を測定する工程と、上記蛍光強度に基づき、上記標的核酸の一塩基多型の有無を検出する工程と、を備える方法を提供する。【００１８】
本発明の方法によれば、本発明のプローブを用いるため、その蛍光強度に基づいて、通常のプローブよりも正確に感度よくＳＮＰを検出することができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明によれば、合成が簡便且つ安価でありながら、ＳＮＰの存在を正確に感度よく検出することができる、一塩基多型検出用オリゴヌクレオチドプローブを提供することができる。本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドプローブを用いた一塩基多型を検出する方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明のプローブによるＳＮＰ検出のメカニズムの模式図である。
【図２】図２は、ＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときのＴｍ解析の結果を示す。
【図３】図３は、リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときのＴｍ解析の結果を示す。
【図４】図４は、インターバルの長さ及びリンカーの長さを変えたリンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときの２５℃におけるＴｍ解析の結果を示す。
【図５】図５は、各種合成ＤＮＡに対してリンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いたときのＴｍ解析の結果を示す。
【図６】図６は、ＬＡＭＰ法における鋳型ＤＮＡの増幅効率を示す。
【図７】図７は、各種ＧＳＴ−ＱＰプローブを用いたときのＴｍ解析の結果を示す。
【図８】図８は、ＰＣＲ法における鋳型ＤＮＡの増幅効率を示す。
【図９】図９は、各種ＧＳＴ−ＱＰプローブを用いたときのＴｍ解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
本明細書において、「一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」とは、塩基配列上の一塩基の置換によって起きる多型のことである。
【００２３】
本明細書において、「標的核酸」とは、本実施形態のプローブを用いてＳＮＰの有無を確認するための対象となる核酸のことである。標的核酸は、ＳＮＰが存在する領域である第一の標的塩基配列と、第一の標的塩基配列とは重複せず、第一の標的塩基配列の３’又は５’側に位置し、ＳＮＰが存在しない領域である第二の標的塩基配列と、を含む。
【００２４】
本明細書において「完全マッチ」とは、標的核酸中の第一の標的塩基配列に対して、レポーター領域の塩基配列が完全に相補的な配列を有するため、第一の標的塩基配列とレポーター領域とがハイブリダイズすることをいう。これに対し、「ミスマッチ」とは、標的核酸中の第一の標的塩基配列に対して、レポーター領域の塩基配列が１塩基でも異なる配列を有するため、第一の標的塩基配列とレポーター領域とがハイブリダイズできないことをいう。
【００２５】
標的核酸は、第一の標的塩基配列と、第二の標的塩基配列とを含む。第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列は、ＳＮＰの存在が知られている核酸の塩基配列から事前に決めることができる。
【００２６】
第一の標的塩基配列は、ＳＮＰの存在が知られている核酸の塩基配列において、検出したいＳＮＰが入りうる塩基を含む３〜６個のヌクレオチドからなる領域が好ましい。第一の標的塩基配列は、３〜５個のヌクレオチドからなる領域がより好ましく、４個のヌクレオチドからなる領域が更に好ましい。第一の標的塩基配列において、ＳＮＰが入りうる塩基の位置は、特に限定されるものではないが、第一の標的塩基配列の中心付近が好ましい。
【００２７】
第二の標的塩基配列は、第一の標的塩基配列とは重複せず、第一の標的塩基配列の３’側又は５’側に位置し、ＳＮＰが存在しない領域において、１０〜２０個のヌクレオチドからなる領域が好ましい。第二の標的塩基配列は、１２〜１８個のヌクレオチドからなる領域がより好ましく、１５個のヌクレオチドからなる領域が更に好ましい。
【００２８】
第二の標的塩基配列が第一の標的塩基配列の３’側に位置する場合、第一の標的塩基配列の３’末端から第二の標的塩基配列の５’末端までのヌクレオチドの数（インターバル）は、０〜１５個が好ましく、３〜１２個がより好ましく、４〜１０個が更に好ましい。第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の間隔を、上記範囲に設定することで、本実施形態のプローブにおけるレポーター領域及びアンカー領域の間で適切な距離を保つことができるため、ＳＮＰの検出能が向上する傾向にある。また、第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の間隔に応じて、リンカー領域の長さを設定することができるため、余計なヌクレオチドを合成する必要がなく、経済的にも優れる傾向にある。第二の標的塩基配列が第一の標的塩基配列の５’側に位置する場合は、第一の標的塩基配列の５’末端から第二の標的塩基配列の３’末端までのヌクレオチドの数を上記範囲に設定することができる。
【００２９】
本実施形態における標的核酸としては、ＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられる。標的核酸の由来としては、ＤＮＡ又はＲＮＡを含むものであれば特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、菌類、微生物、ウイルス等が挙げられる。また、標的核酸の調製方法も、特に限定されるものではなく、生物体又はウイルスから直接調製してもよく、特定の組織から調製してもよく、テンプレートとなる核酸から人工的にクローニングして調製してもよく、ＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法による増幅産物を用いてもよい。
【００３０】
＜プローブ＞
本実施形態のプローブは、一塩基多型を検出するレポーター領域と、アンカー領域と、リンカー領域と、を含む。本実施形態のプローブにおいて、レポーター領域及びアンカー領域の位置関係は、標的核酸において設定した第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の位置関係に応じて、適宜設定することができる。例えば、第二の標的塩基配列が第一の標的塩基配列の３’側に位置するときは、アンカー領域はレポーター領域の５’側に配置される。
【００３１】
本実施形態のプローブは、ＳＮＰを検出するためのレポーター領域とは別に、ＳＮＰの有無に係らず標的塩基配列に結合するアンカー領域を備えることでプローブの結合性が確保できる。それにより、正確なＳＮＰの検出のためのレポーター領域を短く設計することができる。そのため、本実施形態のプローブは、通常のプローブよりも正確に感度よくＳＮＰを検出することができる。
【００３２】
本実施形態のプローブの製造方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、化学合成法を用いた通常のオリゴヌクレオチドの合成方法等が挙げられる。本実施形態のプローブは、通常のオリゴヌクレオチドからなるため複雑な合成方法がいらず、簡便且つ安価に製造することができる。
【００３３】
（レポーター領域）
レポーター領域は、ＳＮＰを検出するための領域である。レポーター領域は、第一の標的塩基配列に対して、一塩基多型のヌクレオチドが第一のヌクレオチドのときには完全マッチし、第一のヌクレオチド以外のときにはミスマッチとなる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドである。本明細書において、「第一のヌクレオチド」とは、標的核酸において、検出したいＳＮＰが入りうる塩基のことである。例えば、第一のヌクレオチドが、ＳＮＰがないときの標的核酸のヌクレオチドである場合、レポーター領域は第一の標的塩基配列に対して、ＳＮＰが存在しないときには完全マッチとなりハイブリダイズし、ＳＮＰが存在するときにはミスマッチとなりハイブリダイズしない。
【００３４】
また、レポーター領域は、第一の標的塩基配列及びレポーター領域がハイブリダイズしたときに消光する蛍光色素を有する。レポーター領域がこのような蛍光色素を有することにより、その蛍光強度を測定することで、ＳＮＰの検出を簡便に行うことができる。このような特徴を有する蛍光色素としては、例えば、ＱＰｒｏｂｅシリーズ（日鉄住金環境社製）が挙げられる。ＱＰｒｏｂｅは、ハイブリダイズした際に蛍光色素を修飾した塩基に相補する塩基の近傍にグアニンがあるとき、蛍光共鳴エネルギー移動が生じ、蛍光が消光する。ＱＰｒｏｂｅが有する蛍光色素としては、具体的には、ＦＩＴＣ、ＴＭＲ、６−ｊｏｅ、Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬ／Ｃ６、Ｂｏｄｉｐｙ−ＦＬ／Ｃ３等が挙げられる。このような蛍光色素を用いることで、レポーター領域及び第一の標的塩基配列がハイブリダイズするか否かによって蛍光特性が変化する。そのため、本実施形態のプローブは、蛍光色素を有するプローブを用いた通常のＳＮＰの検出方法のように消光剤を添加する必要がなく、経済的に優れる。蛍光色素は、レポーター領域において、リンカー領域とは反対側の末端に結合させることが好ましい。
【００３５】
レポーター領域のオリゴヌクレオチドは、第一のヌクレオチドに対応するヌクレオチド以外は第一の標的塩基配列と相補的な塩基配列からなるヌクレオチドである。第一のヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、本実施形態のプローブを用いた際に、ＳＮＰがあるときに消光するプローブが好ましいか、あるいはＳＮＰがないときに消光するプローブが好ましいかによって、適宜使用者が設定できる。ＳＮＰがあるときに消光するプローブが好ましい場合、第一のヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、ＳＮＰがあるときの第一のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを選択すればよい。また、ＳＮＰがないときに消光するプローブが好ましい場合、第一のヌクレオチドに対応するヌクレオチドは、ＳＮＰがないときの第一のヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを選択すればよい。
【００３６】
ＳＮＰの検出能をより高める観点から、レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、３〜６個のヌクレオチドが好ましく、３〜５個のヌクレオチドがより好ましく、４個のヌクレオチドが更に好ましい。また、本実施形態のプローブにおける、良好な標的核酸への結合性及びＳＮＰの検出能を両立する観点から、レポーター領域のオリゴヌクレオチドの長さは、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さよりも短いことが好ましい。レポーター領域が標的核酸にハイブリダイズし、蛍光色素の蛍光を消光させる観点から、レポーター領域のオリゴヌクレオチドは、蛍光色素の結合部位から１〜３個以内に、第一の標的塩基配列中にグアニンが存在するように設計することが好ましい。
【００３７】
（アンカー領域）
アンカー領域は、標的核酸においてＳＮＰの有無に係らず、プローブが標的核酸に結合するための領域である。アンカー領域は、第二の標的塩基配列に対して、相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。第二の標的塩基配列に対して良好な結合性を得る観点から、アンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、１０〜２０個のヌクレオチドが好ましく、１２〜１８個のヌクレオチドがより好ましく、１５個のヌクレオチドが更に好ましい。
【００３８】
（リンカー領域）
リンカー領域は、プローブの自由度を増加させるための領域である。リンカー領域は、レポーター領域及びアンカー領域を連結している。リンカー領域は、標的核酸における第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の間の塩基配列に対して、非相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを有する。
【００３９】
プローブをより安価に合成できるという観点から、リンカー領域は、ユニバーサル塩基を含まないことが好ましい。ユニバーサル塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミン及びウラシル以外の塩基であるユニバーサル塩基、又はそのアナログ等が挙げられる。ユニバーサル塩基又はそのアナログとしては、例えば、５−ニトロインドール、デオキシリボシド、３−ニトロピロールデオキシリボシド、４−ニトロベンゾイミダゾールデオキシリボシド、デオキシネブラリン、デオキシイノシン、２’−ＯＭｅイノシン、２’−ＯＭｅ５−ニトロインドールリボシド、２’−ＯＭｅ３−ニトロピロールリボシド、２’−Ｆイノシンリボシド、２’−Ｆネブラリン、２’−Ｆ５−ニトロインドールリボシド、２’−Ｆ４−ニトロベンゾイミダゾールリボシド、２’−Ｆ３−ニトロピロールリボシド、ＰＮＡ−５−ニトロインドール（ｉｎｔｒｏｉｎｄｏｌｅ）、ＰＮＡ−ネブラリン、ＰＮＡ−イノシン、ＰＮＡ−４−ニトロベンゾイミダゾール、ＰＮＡ−３−ニトロピロール、モルホリノ−５−ニトロインドール、モルホリノ−ネブラリン、モルホリノ−イノシン、モルホリノ−４−ニトロベンゾイミダゾール、モルホリノ−３−ニトロピロール、ホスホラミダイト−５−ニトロインドール、ホスホラミダイト−ネブラリン、ホスホラミダイト−イノシン、ホスホラミダイト−４−ニトロベンゾイミダゾール、ホスホラミダイト−３−ニトロピロール、２’−Ｏ−メトキシエチルイノシン、２’−Ｏ−メトキシエチルネブラリン、２’−Ｏ−メトキシエチル５−ニトロインドールリボシド、２’−Ｏ−メトキシエチル４−ニトロ−ベンゾイミダゾールリボシド、２’−Ｏ−メトキシエチル３−ニトロピロールリボシド、デオキシＲＰＭＰ−５−ニトロインドールダイマー２’−ＯＭｅＲＰＭＰ−５−ニトロインドールダイマー等が挙げられる。
【００４０】
リンカー領域は、アデニン、グアニン、シトシン、又はチミンのいずれか１種の塩基のみからなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。これにより、リンカー領域で標的核酸に結合する可能性が低下するため、レポーター領域の自由度が増し、ＳＮＰの検出能を向上させやすい。また、リンカー領域を上記塩基のみで構成することで、より安価にプローブを合成することができる傾向にある。
【００４１】
また、リンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、３〜１１個のヌクレオチドが好ましく、３〜９個のヌクレオチドがより好ましい。リンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さを上記範囲とすることで、標的核酸に結合するアンカー領域とレポーター領域とが一定距離離れるため、レポーター領域の自由度が増し、ＳＮＰの検出能が向上する傾向にある。また、標的核酸と本実施形態のプローブとがハイブリダイズする際に、立体構造上の自由度を得る観点から、リンカー領域のオリゴヌクレオチドの長さは、上述した第一の標的塩基配列及び第二の標的塩基配列の間隔（インターバル）に対して、−５〜＋５個が好ましく、−３〜＋３個がより好ましい。
【００４２】
＜プローブを用いた一塩基多型の検出方法＞
本実施形態のプローブは、ＳＮＰを検出するレポーター領域に蛍光色素を有するため、その蛍光強度に基づいて、標的核酸におけるＳＮＰの有無を検出することができる。
【００４３】
ＳＮＰを検出するための方法の一実施形態としては、本実施形態のプローブ及びＳＮＰが存在する標的核酸を混合し、混合液を調製する工程と、この混合液の蛍光強度を測定する工程と、測定した蛍光強度に基づき、標的核酸のＳＮＰ（一塩基多型）の有無を検出する工程と、を備える方法が挙げられる。
【００４４】
図１は、本実施形態のプローブと標的核酸とを混合したときの両者の状態を模式的に表した図である。アンカー領域において、プローブは標的核酸とハイブリダイズする。そして、レポーター領域が第一の標的塩基配列に対して相補的な配列を有し、完全マッチする場合、レポーター領域が第一の標的塩基配列とハイブリダイズするため、蛍光色素の蛍光は消光する（図１（ａ））。一方、レポーター領域が第一の標的塩基配列に対して相補的な配列を有さず、ミスマッチとなる場合、レポーター領域は第一の標的塩基配列とハイブリダイズできないため、蛍光色素の蛍光は発光し続ける（図１（ｂ））。本実施形態のプローブは、レポーター領域が標的核酸とハイブリダイズしないときは蛍光を発している。したがって、例えば、第一のヌクレオチドをＳＮＰがないときの標的核酸のヌクレオチドとした場合、プローブ及び標的核酸を混合した際に、混合前に比べてその混合液の蛍光強度が減少するときには、標的核酸にはＳＮＰがないと判断することができる。また、同様に、第一のヌクレオチドを、ＳＮＰがあるときの標的核酸のヌクレオチドとした場合、プローブと標的核酸とを混合した際に、混合前に比べてその混合液の蛍光強度が減少するときには、標的核酸にはＳＮＰがあると判断することができる。本実施形態の方法によれば、ＳＮＰの有無を室温（２５℃付近）で測定できるため、効率的なＳＮＰ解析を行うことができる。
【００４５】
ＳＮＰを検出するための方法の別の実施形態としては、Ｔｍ（融解温度：Ｍｅｌｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）解析を行う方法が挙げられる。Ｔｍ解析は、当業者が通常用いる方法で行うことができる。Ｔｍ解析としては、例えば、プローブ及び標的核酸を混合し、この混合液の温度を下降させつつ、そのときの混合液の蛍光強度を測定する方法が挙げられる。レポーター領域が第一の標的塩基配列に対してミスマッチとなる場合、完全マッチする場合と比較してプローブ及び標的核酸の複合体の熱安定性が低いため、より低い温度でレポーター領域が標的核酸に結合し、蛍光の消光が測定される。この時の温度を消光開始温度と呼ぶ。一方、レポーター領域が第一の標的塩基配列に対して完全マッチとなる場合、ミスマッチする場合と比較してプローブ及び標的核酸の複合体の熱安定性が強いため、より高い温度でもレポーター領域が標的核酸と結合し、蛍光の消光が測定される。したがって、例えば、ＳＮＰがないときに完全マッチするようにレポーター領域を設計した場合、ＳＮＰがあるときの標的核酸の消光開始温度を測定し、この値よりも消光開始温度が高温であるときは、測定に用いた標的核酸にはＳＮＰがないと判断することができる。
【００４６】
本実施形態のプローブは、アンカー領域で標的核酸にハイブリダイズしているため、ＳＮＰを検出するレポーター領域のヌクレオチドの長さを非常に短くすることができる。そのため、レポーター領域の特異性が高くなり、室温のような温度が低い条件下でも、レポーター領域はミスマッチの配列に対してハイブリダイズしにくくなる。その結果、ミスマッチの際の室温付近における混合液の蛍光強度は、消光開始温度のときの蛍光強度と比較しても、顕著には低下しない。一方で、レポーター領域が完全マッチするとき、レポーター領域は室温付近で標的核酸とハイブリダイズする。したがって、完全マッチの際の室温付近における混合液の蛍光強度は、消光開始温度のときの蛍光強度と比較して、顕著に減少し、およそ６０％以下になる。したがって、例えば、Ｔｍ解析を用いたＳＮＰの検出方法において、ＳＮＰがないときに完全マッチするようにレポーター領域を設計した場合、室温付近における混合液の蛍光強度が、消光開始温度のときの蛍光強度の６０％以下になるとき、標的核酸にはＳＮＰがないと判断することもできる。
【００４７】
本実施形態のＳＮＰの検出方法において、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法等の方法により増幅された増幅産物を標的核酸として用いてもよい。
【実施例】
【００４８】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、ＰＭは完全マッチを意味し、ＭＭはミスマッチを意味する。【００４９】
［実施例１：リンカー領域を付加することの効果］
レポーター領域及びアンカー領域をリンカー領域で介することで得られる効果について、検証を行った。検出系には、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＴｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのｒｐｏＢ遺伝子中の５１６番目のＡｓｐ（ＧＡＣ）がＶａｌ（ＧＴＣ）に置換するミスセンス変異を検出する系を用いた。長さを段階的に変えたＳＮＰ−オリゴＤＮＡ又はリンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡと、ＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡとのハイブリダイズによる蛍光値の変化について解析した。ＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡはＳＮＰを有しているため、ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ又はリンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡは、完全マッチとなるときにＳＮＰを検出でき、ミスマッチとなるときにＳＮＰを検出できない系を用いた。【００５０】
（材料）
ＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡ：配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡにＱＰｒｏｂｅ−３Ｇ（日鉄住金環境社製）を結合させたもの。
ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ：配列番号２〜１１のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡ。
リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ：配列番号１２〜２１のいずれかの塩基配列を有するＤＮＡ。リンカーはアデニンを用いた。
ハイブリダイズ用バッファー：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０。【００５１】
ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ及びリンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡの特徴を表１及び２に示す。【００５２】
【表１】
0006495333.tif 000002
【００５３】
【表２】
0006495333.tif 000003
【００５４】
（方法）
１０μＭ  ＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡ０．１μＬ、１０μＭ  ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ又は１０μＭ  リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ３．２μＬ、及びバイブリダイズ用バッファー１６．７μＬを混合し、８連チューブに２０μＬずつ分注し、サンプルを調製した。サンプルを、Ｍｘ３００５Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（アジレントテクノロジー社製）を用いてＴｍ解析を行い、９９℃から２５℃までの降温時の蛍光強度を測定した。降温速度は−２℃／３０秒で行った。【００５５】
（結果）
ＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときの結果を図２に示す。６塩基の長さを持つ配列番号２及び３のＳＮＰ−オリゴＤＮＡは、完全マッチ／ミスマッチのいずれの配列についてもＱＰｒｏｂｅの消光がみられなかった（図２（ａ））。これはＳＮＰ−オリゴＤＮＡのＴｍ値が低くすぎたため、この測定条件ではＳＮＰ−オリゴＤＮＡとＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡとのハイブリダイズを検出できなかったと考えられる。一方、９〜１０塩基の長さを持つ配列番号８〜１１のＳＮＰ−オリゴＤＮＡの場合は、完全マッチ／ミスマッチのいずれの配列についてもＱＰｒｏｂｅの消光がみられた（図２（ｄ）、（ｅ））。これは、逆にＳＮＰ−オリゴＤＮＡのＴｍ値が高く、一塩基置換の差ではＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡとＳＮＰ−オリゴＤＮＡとのハイブリダイズの起こりやすさに影響を与えなかったためであると考えられる。７又は８塩基の長さを持つ配列番号４〜７のＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときには、完全マッチの配列を有するＳＮＰ−オリゴＤＮＡに対してのみＱＰｒｏｂｅの消光がみられた（図２（ｂ）、（ｃ））。このようなプローブであれば、一塩基の違いを認識できることになる。しかしながら、このプローブは完全マッチのときに消光し始める温度が４０℃と低く、実験環境によっては消光が観察されない可能性も考えられた。【００５６】
リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときの結果を図３に示す。ＳＮＰ認識部位が６塩基以下の通常のオリゴＤＮＡの場合、Ｔｍ値が低すぎて、オリゴＤＮＡはＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡとハイブリダイズしなかった（図２（ａ））。一方で、リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡは、４塩基のレポーター領域しか持たなくとも、１５塩基のアンカー領域と長さが１塩基以上のリンカー領域とを有することで、ＳＮＰ認識能を落とさずに、蛍光消光が観察された（図３（ａ）〜（ｅ））。【００５７】
更に詳細にリンカー付加の効果を調べるため、各ＳＮＰ−オリゴＤＮＡとＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションによるＱＰｒｏｂｅの消光が起きる温度について解析を行った。徐々に温度を下げたときにＱＰｒｏｂｅの蛍光強度が減少し始める温度、すなわち図２及び図３のグラフの傾きが負になる温度を消光開始温度とした（図２、３中矢印）。この温度についてまとめたものを、表３に示す。表中、ＮＤは検出されなかったことを意味し、Δ℃はＰＭのときの消光開始温度とＭＭのときの消光開始温度との差を意味する。【００５８】
【表３】
0006495333.tif 000004
【００５９】
ＳＮＰ−オリゴＤＮＡでは、長さが７又は８塩基のときに、完全マッチとミスマッチにおける消光温度差（Δ℃）は最大となり、その値は４０．０５℃だった。一方で、リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡでは、リンカー領域の長さを７塩基としたときに消光温度差が最大となり、その値は５５．７２℃だった。リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡの方がＳＮＰ−オリゴＤＮＡよりも、完全マッチしたときに高い温度で消光の開始が見られた。つまり、リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡの方がリンカー領域のないオリゴＤＮＡよりも、低温領域におけるＳＮＰの判別能に優れる結果となった。これは、アンカー領域による高いハイブリダイズ能の結果と考えられる。【００６０】
実施例１の結果より、リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡは、高いハイブリダイズ効率及びＳＮＰ判別能を有していた。【００６１】
［実施例２：リンカー領域の検討］
ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを設計するに当たり、プローブと標的核酸とをハイブリダイズするためのアンカー領域の配列、及びリンカー領域の長さを検討した。【００６２】
（材料）
ＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡ：配列番号２２の塩基配列を有するＤＮＡにＱＰｒｏｂｅを結合させたもの。
リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡ：４塩基からなるレポーター領域と、２０塩基からなるアンカー領域とを含むオリゴＤＮＡであり、配列番号２３又は２４の塩基配列を有するＤＮＡをベースとして、様々な長さのインターバル及びリンカーを有する。レポーター領域は、配列番号２３又は２４における３７〜４０番の塩基配列であり、アンカー領域は、レポーター領域からインターバルの塩基数の分だけ、５’側にある２０塩基である。ここでいうインターバルとは、配列番号２３又は２４の塩基配列を有するＤＮＡにおいて、レポーター領域及びアンカー領域を設定する際のレポーター領域の５’末端からアンカー領域の３’末端までの塩基数をいう。リンカーはアデニンを用いた。
ハイブリダイズ用バッファー：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０。【００６３】
（方法）
各種合成ＤＮＡ及びリンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いたこと以外は、実施例１に記載の方法と同様に行った。【００６４】
（結果）
ＱＰｒｏｂｅ結合ＤＮＡ及び各種リンカー型ＳＮＰ−オリゴＤＮＡを用いたときのＴｍ解析の結果のうち、２５℃において、完全マッチ及びミスマッチ間の蛍光強度の差が大きいオリゴＤＮＡをスクリーニングし、その測定結果をまとめたものを図４に示す。この結果から、インターバルの長さ及びリンカーの長さは、０よりも長い方がＳＮＰの判別能に優れるが、長すぎても判別能が低下することがわかった。つまりインターバルの長さ及びリンカーの長さのうち片方のみを設定するのではなく、両者の長さのバランスをとることが重要であることが示された。中でも、リンカーの長さに対し、−３〜＋３ほどの長さのインターバルを設定することで、完全マッチ／ミスマッチ間の蛍光強度の差が大きくなり、ＳＮＰの判別能に優れることが明らかになった。【００６５】
［実施例３：リンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いた合成ＤＮＡとのハイブリダイゼーション］
実施例２の結果を受けて設計したリンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いて、各種合成ＤＮＡとハイブリダイゼーションを行い、ＳＮＰの判別能を検討した。【００６６】
（材料）
合成ＤＮＡ：配列番号２３、２５、２７又は２９の塩基配列を有し、リンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブと完全マッチするＤＮＡ、あるいは配列番号２４、２６、２８又は３０の塩基配列を有し、リンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブとミスマッチするＤＮＡ。
リンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブ：配列番号３１〜３４のいずれかの塩基配列を有するヌクレオチドにＱＰｒｏｂｅを結合させたプローブ。
ハイブリダイズ用バッファー：５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０。【００６７】
リンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブの特徴を表４に示す。表中の配列において、下線が付してある箇所が、対象となる合成ＤＮＡにＳＮＰが入りうる塩基に対応する。【００６８】
【表４】
0006495333.tif 000005
【００６９】
（方法）
各種合成ＤＮＡ及びリンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いたこと以外は、実施例１に記載の方法と同様に行った。【００７０】
（結果）
試験結果を図５に示す。すべてのリンカー型ＱＰｒｏｂｅ結合プローブは、２５℃付近において、対応する合成ＤＮＡに対する完全マッチ及びミスマッチの蛍光強度に顕著な差が生じた。特に、ＧＳＴ  Ａ１遺伝子を用いたときに完全マッチ及びミスマッチの蛍光強度の差が大きく、ＳＮＰの判別能が高かった。そのため、今後の実験系ではＧＳＴ  Ａ１遺伝子を用いることにした（図５（ｂ））。【００７１】
［実施例４：ＬＡＭＰ法を用いたＳＮＰの検出］
短い塩基配列を有するＱＰｒｏｂｅ結合プローブ（ＧＳＴ−ＱＰ−ｓｈｏｒｔ）、長い塩基配列を有するＱＰｒｏｂｅ結合プローブ（ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｏｎｇ）、リンカー領域を有するＱＰｒｏｂｅ（ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒ）をそれぞれ作製し、ＧＳＴ遺伝子に対するＳＮＰの判別能を、ＬＡＭＰ法を用いて測定した。【００７２】
（材料）
鋳型ＧＳＴ−ＤＮＡ：配列番号３５の塩基配列を有するＤＮＡ（ＧＳＴ−ＰＭ）又は配列番号３６の塩基配列を有するＤＮＡ（ＧＳＴ−ＭＭ）。
ＱＰｒｏｂｅ結合プローブ：ＧＳＴ−ＱＰ−ｓｈｏｒｔ、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｏｎｇ、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒ。
ＬＡＭＰ用プライマー：配列番号３７〜４０のいずれかの塩基配列を有するプライマー。
ＬＡＭＰ用マスターミックス：５０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．８）、１．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、８ｍＭ  Ｍｇ２ＳＯ４、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．２μＭ  ＧＳＴ−Ｆ３  ｐｒｉｍｅｒ  、０．２μＭ  ＧＳＴ−Ｂ３  ｐｒｉｍｅｒ、２．４μＭ  ＧＳＴ−ＦＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ、０．８μＭ  ＧＳＴ−ＢＩＰ  ｐｒｉｍｅｒ、１６Ｕ  Ｂｓｔ  ｐｏｌ．。【００７３】
実施例４で用いるＱＰｒｏｂｅ結合プローブの特徴を表５に示す。下線が付してある箇所が、対象となる合成ＤＮＡにＳＮＰが入りうる塩基に対応する。【００７４】
【表５】
0006495333.tif 000006
【００７５】
（方法）
ＬＡＭＰ用マスターミックス１９．７５μＬと１０μＭの各種ＱＰｒｏｂｅ結合プローブ０．２５μＬを混合し、８連チューブに２０μＬずつ分注した。８連チューブにコントロール用ＤＮＡを５．０μＬ添加した。配列番号３５又は３６の鋳型ＤＮＡを９５℃で５分間処理し、変性させた。変性させた配列番号３５又は３６の鋳型ＤＮＡを１０５ｃｐｓ／ｔｅｓｔ又は１０３ｃｐｓ／ｔｅｓｔになるように８連チューブに添加した。リアルタイム濁度計測器ＬＡ−２００（テラメックス社製）を用いて、８連チューブを６５℃、１時間インキュベートさせてＬＡＭＰ法を行った。反応中、濁度をリアルタイムに測定し、Ｔｔ値を求めた。Ｔｔ値は、各検体が濁度０．１に到達するまでの時間（分）を示す。【００７６】
増幅反応後のＬＡＭＰ産物についてＭｘ３００５Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＴｍ解析を行い、９９℃から２５℃までの降温時の蛍光強度を測定した。降温速度は−２℃／３０秒で行った。【００７７】
（結果）
ＧＳＴ−ＰＭ又はＧＳＴ−ＭＭを鋳型とした場合、リアルタイム濁度測定におけるＴｔ値には差がないことを確認した（図６）。したがって、ＧＳＴ−ＰＭ及びＧＳＴ−ＭＭを用いたＬＡＭＰ法による増幅効率には、差がないことが分かった。【００７８】
Ｔｍ解析を行った際の蛍光強度の変化を図７に示す。４ヌクレオチドのレポーター領域からなるＧＳＴ−ＱＰ−ｓｈｏｒｔを用いた場合には、ＧＳＴ−ＰＭ及びＧＳＴ−ＭＭの双方に対してハイブリダイズせず、ＱＰｒｏｂｅの消光は見られなかった（図７（ｂ））。また、リンカー領域を持たないＧＳＴ−ＱＰ−ｌｏｎｇを用いた場合には、ＧＳＴ−ＰＭ及びＧＳＴ−ＭＭの双方に対し、ほぼ同じ温度でハイブリダイズし、ＱＰｒｏｂｅの消光が見られたため、ＳＮＰの解析が困難であった（図７（ｃ））。一方で、リンカー領域を有するＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒを用いた場合には、ＧＳＴ−ＰＭに対し、１０５ｃｐｓ／ｔｅｓｔでも１０３ｃｐｓ／ｔｅｓｔでも大きな消光が観測された。一方、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒの蛍光は、ミスマッチを鋳型としたＧＳＴ−ＭＭではコントロール用ＤＮＡと同様に全く消光することはなかった（図７（ａ））。したがって、リンカー領域を有するＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いることで、リンカー領域のないプローブでは検出が困難であったＬＡＭＰ産物についても、特定の配列へのハイブリダイズ効率を保ちながら、ＳＮＰを特異的に検出することができた。【００７９】
［実施例５：ＰＣＲ法を用いたＳＮＰの検出］
リンカー領域を有するＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いて、ＰＣＲ法によるＳＮＰの検出を行った。【００８０】
（材料）
鋳型ＧＳＴ−ＤＮＡ：配列番号３５の塩基配列を有するＤＮＡ（ＧＳＴ−ＰＭ）又は配列番号３６の塩基配列を有するＤＮＡ（ＧＳＴ−ＭＭ）。
ＱＰｒｏｂｅ結合プローブ：ＧＳＴ−ＱＰ−ｓｈｏｒｔ、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｏｎｇ、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒ。
ＰＣＲ用プライマー：配列番号４３又は４４の塩基配列を有するプライマー。
ＰＣＲ用バッファー：１×Ｐｗｏ  Ｓｕｐｅｒ  ｙｉｅｌｄ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１Ｕ  Ｐｗｏ  Ｓｕｐｅｒ  ｙｉｅｌｄ  ｐｏｌ．、０．５×Ｇｅｌｇｒｅｅｎ。【００８１】
（方法）
各種ＰＣＲ用プライマー０．２μＬ、及びＰＣＲ用バッファー１４．８μＬを混合し、８連チューブに１５μＬずつ分注した。８連チューブにコントロール用ＤＮＡを５．０μＬ添加した。配列番号３５又は３６の鋳型ＤＮＡを１０３ｃｐｓ／ｔｅｓｔになるように８連チューブに添加した。Ｍｘ３００５Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて、下記の条件で反応を行った。（１）９５℃、２分、（２）９５℃、１５秒、（３）５３℃、３０秒、（４）７２℃、４５秒で反応を行い、（２）〜（４）の工程は５０サイクル繰り返した。反応後のＰＣＲ産物に、０．２５μＭの各種ＱＰｒｏｂｅ結合プローブを５．０μＬ添加し、Ｍｘ３００５Ｐ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてＴｍ解析を行った。Ｔｍ解析は、９９℃から２５℃までの降温時の蛍光強度を測定した。降温速度は−２℃／３０秒で行った。【００８２】
（結果）
蛍光インターカレーターである０．５×Ｇｅｌｇｒｅｅｎを用いて、鋳型ＤＮＡの増幅を測定した（図８）。その結果、ＧＳＴ−ＰＭ又はＧＳＴ−ＭＭを鋳型にしたＰＣＲ法による増幅効率は、差がないことが分かった。【００８３】
Ｔｍ解析を行った際の蛍光強度の変化を図９に示す。実施例４と同様に、ＧＳＴ−ＱＰ−ｓｈｏｒｔを用いた場合には、ＧＳＴ−ＰＭ及びＧＳＴ−ＭＭの双方に対してハイブリダイズせず、ＱＰｒｏｂｅの消光は見られなかった（図９（ｂ））。リンカー領域を持たないＧＳＴ−ＱＰ−ｌｏｎｇを用いた場合には、蛍光強度が消光開始温度付近では違うものの室温付近ではほぼ変わらなかった。また、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｏｎｇは、ＧＳＴ−ＰＭ及びＧＳＴ−ＭＭの双方に対し、ほぼ同じ温度でハイブリダイズし、ＱＰｒｏｂｅの消光が見られた（図９（ｃ））。リンカー領域を有するＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒを用いた場合には、ＧＳＴ−ＰＭに対し、大きな消光が観測された。それに対して、ＧＳＴ−ＱＰ−ｌｉｎｋｅｒを用いた場合には、ミスマッチを鋳型としたＧＳＴ−ＭＭに対し、コントロール用ＤＮＡと同様に消光することはなかった（図９（ａ））。したがって、リンカー領域を有するＱＰｒｏｂｅ結合プローブを用いることで、ＬＡＭＰ法だけでなく、ＰＣＲ法を用いた場合でもＳＮＰを特異的に検出することができた。
【図１】
0006495333.tif 000007
【図２】
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【図３】
0006495333.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
0006495333.tif 000015
【配列表】
0006495333000001.app