(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効な量のジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートの化合物またはその医薬的に許容される塩、および、医薬的に許容される担体、を含んで成る、炎症または疼痛の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
急性または慢性の腫れ、疼痛、または発赤という特徴を有する炎症の局所的な症状を軽減または緩和するための、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記炎症および／または疼痛が、筋骨格の捻挫、筋骨格の筋違え、腱障害、末梢神経根障害、変形性関節症、変性関節疾患、若年性関節炎、痛風、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、肋軟骨炎、腱炎、滑液包炎、顎関節症候群、および線維筋痛症、から成る群から選択される骨格または筋肉の疾患または状態に関連する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記炎症および／または疼痛が、関節、靱帯、腱、骨、筋肉、または筋膜に関連する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記炎症および／または疼痛が、炎症性皮膚疾患、皮膚炎または乾癬の障害に関連する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記皮膚炎が、アトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記医薬組成物は、局所製剤内にある、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物は、経口製剤内にある、請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬的に許容される担体、およびジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートまたはその医薬的に許容される塩を含んで成る医薬組成物に関する。本発明はまた、炎症または炎症関連障害および疼痛を治療するために前記化合物を使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症とは、微生物または組織の損傷により、種々な種類の細胞からサイトカインおよびケモカインの放出が誘発され、血管の透過性が増大し、内皮受容体の上方制御が起こり、これにより種々の先天的・後天的な免疫系細胞の放出が増大し、これらが周囲組織に侵入し、炎症のよくある症状、すなわち発赤、腫脹、発熱および疼痛を引き起こすプロセスである。
【０００３】
炎症は、種々な内因性および外因性の因子により惹起され得る、損傷に起因する生組織の局在性な反応である。外因性の因子としては、物理的、化学的および生物学的な因子が挙げられる。内因性の因子としては、炎症性メディエーター、抗原および抗体が挙げられる。内因性の因子は、外因性の損傷の影響を受けて生じることが多い。炎症反応は、細胞膜の構造や透過性の変化を伴うことが多い。メディエーターや抗原等の内因性の因子により、炎症反応の性質や種類、特に損傷領域における経過が決定される。組織の損傷によりメディエーターの発生しか起こらない場合、急性の炎症となる。また、免疫反応が、抗原、抗体、および自己抗原の相互作用を介してプロセスに関与している場合、長期的な炎症プロセスになるであろう。また、種々な外因性の要因、例えば感染、外傷、熱照射により、細胞膜が損傷されることにより生化学的な反応が開始され、分子レベルで一連の炎症プロセスがもたらされる。
【０００４】
物理的な要因に基づくと、疼痛は、侵害受容性タイプ、神経障害性タイプ、および混在タイプの三種に分けることができる。
【０００５】
侵害受容性疼痛（Nociceptive pain）とは、侵害受容体（nociceptors）により検出される疼痛を指す用語である。侵害受容体は、皮膚直下、腱、関節、および内部器官の中まで伸びる自由神経終末である。侵害受容性疼痛は、典型的に、オピオイドおよびNSAIDを用いる治療に良好に反応する。侵害受容性疼痛には、体性疼痛、内臓性疼痛、および皮膚疼痛など、いくつかのタイプが存在する。内臓性疼痛は内部の器官から起こる。深部体性疼痛は、靭帯、腱、骨、血管、筋膜、および筋肉における侵害受容体の刺激により起こり、だるい・うずくといった局在性に乏しい疼痛である。例として、捻挫および骨折が挙げられる。表面性疼痛は、皮膚その他の表面組織における侵害受容体の活性化により起こり、
鋭く・はっきりとした痛みで局在性が強い。表面体性疼痛を起こす外傷の例として、小さな創傷や小さな（第一級）火傷が挙げられる。侵害受容性疼痛は通常、持続期間が短く、損傷が回復すれば終了する。侵害受容性疼痛の例としては、術後疼痛、捻挫、骨折、火傷、打ち身、打撲、および炎症による侵害受容性疼痛が挙げられる。炎症性の侵害受容性疼痛は、組織の損傷およびその結果として生じる炎症プロセスに関連する。
【０００６】
神経障害性疼痛は、末梢および中枢神経系におけるニューロンの損傷により引き起こされ、これらの神経系が感作される。通常、根本的な病因が不可逆的なので、ほとんどの神経障害性疼痛は慢性的疼痛である。ほとんどの人々は、ずきずきする痛み、焼けるような感覚、ヒリヒリ感、刺すような痛み、電気ショック的な痛み、しびれ感、およびしつこい異痛として、神経障害性疼痛を訴える。神経障害性疼痛の命名は、病因を伴う開始神経部位、例えば、脳卒中後の中枢疼痛、糖尿病性末梢神経障害、ヘルペス後（または帯状疱疹後）の神経痛、末期癌の疼痛、幻肢痛に基づく。
【０００７】
混在タイプの疼痛は、侵害受容性と神経障害性の疼痛の両者が共存するという特徴を有する。例えば、筋肉疼痛により中枢や末梢神経が感作され、これにより慢性腰痛、偏頭痛、および筋膜疼痛がもたらされる。
【０００８】
結合組織は、一定のストレスや傷害を連続的に受ける。急性または慢性的な影響を受けたり、種々の変性疾患が自然に進行すると、これらすべての場合、関節部分、例えば首、背中、腕、腰、足首および足に痛みを伴う炎症が生じる。それらの苦痛は一般的であり、そして消耗させることが多い。
【０００９】
炎症、炎症関連障害、および疼痛を治療するための組成物および方法の必要性がある。かかる組成物は製造において経済的かつ容易であるべきであり、方法は効果的かつ重度の副作用を起こしてはならない。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、医薬的に許容される担体、およびジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートまたはその医薬的に許容される塩もしくは溶媒和物を含んで成る医薬組成物に関する。化合物は、好ましくは少なくとも90％の純度（w／w）である。
【００１１】
本発明はまた、炎症、炎症関連障害、および疼痛の治療方法にも関する。本方法は、ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートまたは医薬的に許容されるその塩を、それを必要とする対象に投与する工程を含んで成る。活性化合物を含んで成る医薬組成物は、局所、経口、および非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下または直腸）を包含する何れかの許容される投与形態により適用され得る。局所投与および経口投与が好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、ビヒクル（水、経口投与）、試験化合物（30および100mg／kgの水溶液、経口投与）、およびモルヒネ（皮下投与）で処置したマウスのテールフリック試験の結果を示す。各群の待ち時間（latency time）を平均±SEMとして計算し、時間に対しプロットした。図中、＊は、ビヒクル処置マウスに対するp値＜0.05を示す。
【００１３】
【図２】図２は、ビヒクル（経口投与）、試験化合物（経口投与、100mg／kg）、およびモルヒネ（皮下投与）で処置したマウスのホルマリン試験の結果を示す。5分間あたりの舐め行動の回数（licking events per 5 minute interval）を平均±SEMとして計算し、ホルマリン注射後の経過時間に対しプロットした。
【００１４】
【図３】図３は、ビヒクル（局所投与）、試験化合物（局所投与、375mM）、およびモルヒネ（皮下投与）で処置したマウスのホルマリン試験の結果を示す。5分間あたりの舐め行動の回数を平均±SEMとして計算し、ホルマリン注射後の経過時間に対しプロットした。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
「医薬的に許容される塩」とは、本明細書において使用される場合、元の化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ望ましくない毒性効果を与えない塩である。医薬的に許容される塩の形態として、異なる塩の各種結晶性多形および非晶形も含まれる。医薬的に許容される塩は、金属または有機対イオンとともに形成されることもあり、以下のものも包含し得るが、これらに限定されない：アルカリ金属塩、例えばナトリウムまたはカリウム塩：アルカリ土類金属塩、例えば、マグネシウムまたはカルシウム塩；およびアンモニウムまたはテトラアルキルアンモニウム塩、すなわちNX4＋（式中、XはC1-4である）。
【００１６】
「溶媒和物」とは、本明細書において使用される場合、ある一定の割合で、当該化合物と許容される共溶媒とを組合わせた付加複合体である。共溶媒は、以下のものを包含し得るが、これらに限定されない：酢酸エチル、乳酸ラウリル、乳酸ミリスチル、乳酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、1−プロパノール、イソプロパノール、1−ブタノール、イソブタノール、tert−ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、およびジエチルエーテル。
【００１７】
ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネート
本発明者は、ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートまたはその医薬的に許容される塩もしくは溶媒和物が、炎症、炎症関連障害、および疼痛を治療するために有効であることを発見した。
【００１８】
【化１】
0006461961.tif 000002
【００１９】
ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネート、CAS番号10123−62−3（（2−シアノエチル）−ホスホン酸ジエチルエステルまたは3−（ジエチルホスホノ）プロピオニトリルという名称でも呼ばれる）は、191.16の分子量を有し、市場で入手可能である。ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートは、アクリロニトリルと亜リン酸ジエチルの塩基触媒縮合（Tetrahedron Letters, 50(22), 2620-2623; 2009）やリン酸トリエチルとクロロプロピオニトリルのアルブーゾフ反応（Synthetic Communications, 25(21), 3443-55; 1995）などの様々な方法によって合成することができる。
【００２０】
医薬組成物
本発明は、一つまたは複数の医薬的に許容される担体、およびジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートの活性化合物またはその医薬的に許容される塩もしくは溶媒和物を含んで成る医薬組成物を提供する。当該医薬組成物中の活性化合物またはその医薬的に許容される塩もしくは溶媒和物は一般的に、局所用製剤では、約0.01〜20％、または0.05〜20％、または0.1〜20％、または0.2〜15％、または0.5〜10％、または1〜5％（w／w）；注射用製剤では、約0.1〜5％；パッチ製剤のためには0.1〜5％；錠剤製剤では約1〜90％；およびカプセル製剤では1〜100％の量で存在する。当該医薬組成物中の活性化合物は一般的に、少なくとも90％、好ましくは95％、または98％、または99％（w／w）の純度で存在する。
【００２１】
一の実施形態では、活性化合物は、任意の許容される担体、例えばクリーム、ゲル、ローション、または当該活性化合物を安定化可能でかつ局所投与することで患部に送達可能な他の種類の懸濁液中に組込まれる。別の実施形態では、医薬組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、細粒剤、粉末、シロップ、座薬、注射用溶液、パッチ、等の剤形であり得る。上記医薬組成物は、従来の方法により調製され得る。
【００２２】
不活性成分である医薬的に許容される担体は、従来の基準を用いて、当業者により選択され得る。医薬的に許容される担体として、非水性基剤の溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミセル溶液、ゲルおよび軟膏が挙げられるがこれらに限定されない。また、医薬的に許容される担体として以下ものものも挙げられるがこれらに限定されない：生理食塩水および水性電解質溶液；イオン性および非イオン性浸透剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、およびデキストロース；pH調整剤および緩衝剤、例えば水酸化物、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩；およびトロラミン；酸化防止剤、例えば亜硫酸水素、亜硫酸塩、メタ重亜硫酸、チオ硫酸、アスコルビン酸、アセチルシステイン、システイン、グルタチオン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、トコフェロール、およびパルミチン酸アスコルビルの塩、酸および／または塩基；界面活性剤、例えばレシチン、リン脂質、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルイノシトール（但し、それらだけには限定されない）；ポロキサマーおよびポロキサミン、ポリソルベート、例えばポリソルベート80、ポリソルベート60、ポリソルベート20、ポリエーテル、例えばポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール；ポリビニル、例えばポリビニルアルコールおよびポビドン；セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびそれらの塩；石油誘導体、例えば鉱油および白色ワセリン；油脂、例えばラノリン、ピーナッツ油、パーム油、大豆油；モノ−、ジ−、およびトリグリセリド；アクリル酸のポリマー、例えばカルボキシポリメチレンゲル、および疎水性的に改質された架橋されたアクリル系コポリマー；多糖類、例えばデキストランおよびグリコサミノグリカン、例えばヒアルロン酸ナトリウム。かかる医薬的に許容される担体は、公知の保存剤を用いて、細菌汚染に対し保存することができる。公知の保存剤としては、塩化ベンザルコニウム、エチレンジアミン四酢酸、およびその塩、塩化ベンゼトニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、メチルパラベン、チメロサール、およびフェニルエチルアルコールが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは上記の医薬的に許容される担体は、単回または複数回使用のための非保存製剤として製剤化し得る。
【００２３】
例えば、当該活性化合物の錠剤製剤またはカプセル製剤は、生物活性を有さず、かつ当該活性化合物と反応しない他の賦形剤を含んでもよい。錠剤中の賦形剤として、充填剤、結合剤、滑沢剤および流動促進剤、崩壊剤、湿潤剤、および放出速度調節剤が挙げられる。結合剤は、製剤の粒子の接着を増強するもので、錠剤製剤のために重要である。結合剤の例として以下ものが挙げられるが、これらには限定されない：カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、カラヤガム、デンプン、デンプン、およびトラガカントゴム、ポリ（アクリル酸）、およびポリビニルピロリドン。
【００２４】
例えば、当該活性化合物のパッチ製剤は、いくつかの不活性成分、例えば1，3−ブチレングリコール、ジヒドロキシアルミニウムアミノアセテート、エデト酸二ナトリウム、D−ソルビトール、ゼラチン、カオリン、メチルパラベン、ポリソルベート80、ポビドン（ポリビニルピロリドン）、プロピレングリコール、プロピルパラベン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、酒石酸、二酸化チタン、および精製水を含みうる。また、パッチ製剤は、皮膚透過性増強剤、例えば乳酸エステル（例えば、乳酸ラクリル）またはジエチレングリコールモノエチルエーテルも含んでもよい。
【００２５】
当該活性化合物を含む局所用製剤は、ゲル、クリーム、ローション、液体、エマルジョン、軟膏、スプレー、溶液、および懸濁液の形態であり得る。局所用製剤中の不活性成分は、例えば以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：乳酸ラウリル（軟化剤（emollient）／浸透促進剤（permeation enhancer））、ジエチレングリコールモノエチルエーテル（軟化剤／浸透促進剤）、DMSO（溶解性促進剤）、シリコーンエラストマー（レオロジー／テクスチャ改質剤）、カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド、（軟化剤）、オクチサレート、（皮膚軟化剤／UVフィルター）、シリコーンオイル（皮膚軟化剤／希釈剤）、スクアレン（エモリエント）、ヒマワリ油（皮膚軟化剤）、および二酸化ケイ素（増粘剤）。
【００２６】
一の実施形態では、乳酸ラウリルが、例えば、約0.1〜10％、または約0.2〜5％、または約0.5〜5％で、局所用ゲル製剤に含まれる。乳酸ラウリルは、局所投与に安全であると考えられている。乳酸ラウリルは、医薬および化粧品としてヒトに使用するのに適正である。乳酸ラウリルは、局所用製剤に使用される場合、化合物の透過性を高める。好ましくは、乳酸ラウリルは、90%以上、好ましくは95％以上の純度を達成するよう精製される。高純度だと加水分解および酸化剤の存在を軽減する。更に、製剤中に0.1〜20％、または0.5〜10％（w／w）のDMSOがあると、当該活性化合物の溶解度が適切になる。
【００２７】
別の実施形態では、ジエチレングリコールモノエチルエーテルが、局所用ゲル製剤に含まれる。
【００２８】
使用法
炎症は、先天的・後天的な免疫系成分の活性化や活性が続くことによる組織の病理学的なプロセスや状態のことである。細胞間の相互作用におけるアラキドン酸カスケードやサイトカインの生成および作用は、免疫の活性化および応答に必須の要素であり、これにより炎症が誘発される。アラキドン酸は、多くの細胞膜に存在する。アラキドン酸が膜から切除されると、炎症誘発性物質（pro-inflammatory entities）として知られる、プロスタグランジンやロイコトリエンといった既知のエイコサノイドを多く生成することができる。
【００２９】
活性化合物は、リポ多糖類と共にラットに経口投与してインビボでチャレンジした場合、炎症誘発性サイトカイン（例えば、IL−6、TNFα、IFNγ、MIP−2、およびRANTES）の放出の阻害に有効である。活性化合物は、炎症がアラキドン酸により誘発されている、マウスの耳腫脹モデルに局所投与される場合、抗炎症性がある。
【００３０】
また、本発明は、炎症および／または疼痛の治療方法にも関する。ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートは、そのまま使用してもよく、あるいは追加の医薬的に許容される担体を含む医薬組成物の形態で投与してもよい。当該方法は、まず炎症および／または疼痛を有する対象を同定する工程、および前記対象に、当該活性化合物を、炎症および／または疼痛を治療するのに有効な量で投与する工程を含んで成る。「有効量」とは、本明細書において使用される場合、病理状態を寛解するか、または疾患の症状を軽減することにより疾患を治療するのに有効な量である。
【００３１】
一の実施形態では、本方法は、炎症に関連する症状を低減するかまたは軽減する。本発明は、急性または慢性的な腫れ、疼痛、発赤、体温上昇、または場合によっては機能低下（loss of function）という特徴を有する炎症の局所的な症状を治療するための方法を提供する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、疼痛の原因に関係なく、疼痛の症状を軽減するための方法を提供する。本発明の方法により治療され得る一般的な用語「疼痛」は、侵害受容性、神経障害性、および混在型の疼痛を包含する。本発明は、種々な重症度の疼痛、すなわち軽度、中程度、および重度の疼痛や、急性および慢性の疼痛を軽減する。本発明は、関節痛、筋肉痛、腱の疼痛、火傷による疼痛、および炎症により引き起こされる疼痛、例えば関節リウマチの治療に有効である。
【００３３】
一実施形態によれば、本発明は、筋骨格系または皮膚に関連する炎症および／または疼痛の治療に有用である。高度に神経支配された筋骨格系および皮膚系は、疼痛を発生する可能性が高い。更に、筋骨格系は、組織が腫れる可能性が高く、皮膚は、発赤、腫れ、および発熱する可能性が高い。筋骨格系および皮膚系においては、組織の損傷の度合いとそれによって生ずる炎症応答の度合いが比例しないことが多い。例えば、皮膚では、単に強くこすった程度でも、サイトカイン、IL−1、およびTNFの放出が引き起こされる。
【００３４】
本発明は、炎症性の骨格または筋肉の疾患または状態に関連する炎症および／または疼痛を治療するための方法を提供する。本方法は、それを必要とする対象を同定する工程、および前記対象に、活性化合物を、炎症および／または疼痛を治療するのに有効な量で投与する工程を含んで成る。骨格または筋肉の疾患または状態としては、筋骨格の捻挫、筋骨格の筋違え（musculoskeletal strains）、腱障害（tendonopathy）、末梢神経根障害、変形性関節炎、変形性関節疾患、リウマチ性多発筋痛、若年性関節炎、痛風、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス、肋軟骨炎、腱炎、滑液包炎、例えば一般的外側上顆炎（テニスエルボー）、内側上顆炎（ピッチャーエルボー）および転子滑液包炎、顎関節症候群、および線維筋痛症が挙げられる。
【００３５】
皮膚は、環境的な刺激に対し高い反応性があり、角化細胞の表皮成分は、アラキドン酸と炎症誘発性サイトカイン（IL−1およびTNF）の両者が非常に富んでいる。皮膚の樹状細胞であるランゲルハンス細胞は、種々のリンパ球による更なる免疫応答のため、抗原を認識して処理する。これらの細胞は全て、主に特異的細胞表面受容体を介してサイトカインにより調節される。
【００３６】
アラキドン酸誘発性の炎症の阻害および炎症誘発性サイトカインの放出の阻害に有効なジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートは、炎症性皮膚疾患に関連する炎症および／または疼痛の治療に有効である。
【００３７】
本発明は、炎症性皮膚疾患、例えば、乾癬、にきび、酒さ、および皮膚炎、特に、接触性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎に関連する炎症および／または疼痛を治療するための方法を提供する。本方法は、それを必要とする対象を同定する工程、および前記対象に、活性化合物を、炎症および／または疼痛を治療するのに有効な量で投与する工程を含んで成る。
【００３８】
本発明の医薬組成物は、部分投与（local administration）および全身投与により適用できる。部分投与は、局所投与（topical administration）を包含する。全身投与は、経口、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下または直腸）、および他の全身経路による投与を包含する。全身投与では、活性化合物は、まず血漿に達し、その後標的組織中に分散する。局所投与および経口投与が、本発明に好ましい投与経路である。
【００３９】
組成物の用量は、損傷の程度や各患者個別の反応に基づき変更し得る。全身投与では、送達される活性化合物の血漿濃度は変更し得るが、一般的に、1×10-10〜1×10-4モル／l、好ましくは、1×10-8〜1×10-5モル／lである。
【００４０】
一の実施形態では、組成物は、患部に局所投与され、その患部に擦りこまれる。組成物は、医療上の問題や、慢性または急性の疾患の病態に応じて、1日少なくとも1回または2回、または1日3〜4回、局所投与される。一般的に、局所用組成物は、約0.01〜20％、または0.05〜20％、または0.1〜20％、または0.2〜15％、または0.5〜10％、または1〜5％（w／w）の活性化合物を含む。例えば、局所用組成物は、約1または5％（w／w）の活性化合物を含む。患部の大きさに応じて、0.2〜85ml、典型的には0.2〜10mlの局所用組成物が、個人に一回当たり適用される。活性化合物は、皮膚に浸透し、不快感を伴う部位に送達される。
【００４１】
一の実施形態では、医薬組成物は、対象に経口投与される。経口投与についての用量は、一般的に少なくとも0.1mg／kg／日かつ100mg／kg／日未満である。例えば、経口投与についての用量は、0.1〜100または0.5〜50mg／kg／日、好ましくは1〜20または1〜10mg／kg／日である。
【００４２】
一の実施形態では、医薬組成物は、対象に皮下投与される。皮下投与についての用量は一般的に、0.3〜20、好ましくは0.3〜3mg／kg／日である。
【００４３】
当業者は、広範囲にわたる種類の送達機構が本発明に適切であることを理解するであろう。
【００４４】
本発明は、哺乳類の対象、例えばヒト、ウマ、およびイヌの治療に有効である。本発明は、ヒトの治療において特に有用である。
【００４５】
次の実施例は本発明を更に例示する。それらの実施例は、本発明を単に例示するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００４６】
実施例１．ゲル製剤１
表１は、ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートを含むゲル製剤の一例を示す。
【００４７】
【表１】
0006461961.tif 000003
【００４８】
実施例２．ゲル製剤２
表２は、ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートを含むゲル製剤の別の一例を示す。
【００４９】
【表２】
0006461961.tif 000004
【００５０】
実施例３．マウスを用いた局所投与による活性化合物の抗炎症作用
ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートはSigma−Aldrichから入手して本実験に使用した。試験化合物であるインドメタシン（陽性対照）およびビヒクル（アセトン：エタノール／1：1）を、局所アラキドン酸誘発性の耳腫脹マウスモデルにおける抗炎症作用について評価した。
【００５１】
22±2gの体重の雄ICRマウスを用い、試験化合物群とビヒクル対照群に各群10匹ずつ、そしてインドメタシン群に5匹の3群にランダムに分けた。アラキドン酸（20μlのアセトン：エタノール（1：1）中0.5mg）を、各マウスの右耳の前面および後面に局所投与した。表３に示す試験化合物（ビヒクル中に含有される）およびビヒクルを、アラギドン酸適用の30分前および15分後に同様に適用した。右耳および左耳の厚さを測定し、それらの差異を、右耳における炎症の指標として計算した。また、炎症の指標として、耳の腫れを、アラキドン酸適用の60および90分後にDyerモデルのマイクロメーターゲージにより測定した。阻害率％を、式：Ic−It／Ic×100（式中、IcおよびItは、それぞれ、対照および処置マウスの耳の厚さ（mm）の増加を示す）に従って計算した。ANOVAおよびDunnettのt検定を用いて（p＜0.05）、ビヒクル対照群と試験化合物処置群との間の有意差を計算した。１対１比較のStudentのt検定を用いて、インドメタシン群と対照群との間の差を計算した。有意差はP＜0.05レベルに設定した。アラキドン酸適用の90分後に測定した結果を表３に要約する。
【００５２】
【表３】
0006461961.tif 000005
【００５３】
マウスに試験化合物を局所投与すると、アラキドン酸誘発性の耳の腫れがビヒクル対照群に比べ55％も阻害された。試験化合物処置群と対照群間の差異は、統計学的に有意であることが確認された。
【００５４】
実施例４．マウスを用いた腹腔内投与による活性化合物の抗炎症作用
本実験のプロトコルは、以下の違いを除き実施例３と同様であった。試験物質ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートをPBSに溶解し、1、3、および10mg／mLの試験溶液を生成した。10mL／kgのビヒクルおよび10mL／kgのジエチル（2−シアノエチル）ホスホネート（10、30、および100mg／kg）を、アラキドン酸（0.5mg／耳）チャレンジの1時間前そして再び15分前に腹腔内投与した。陽性対照であるデキサメタゾンは、アラキドン酸投与の3時間前に経口投与した。
【００５５】
ANOVAおよびDunnettのt検定を用いて（p＜0.05）、ビヒクル対照群と処置群との間の有意差を計算した。有意差はP＜0.05レベルに設定した。アラキドン酸適用の90分後に測定した結果を表４に要約する。
【００５６】
ANOVAおよびDunnettのt検定を用いて（p＜0.05）、ビヒクル対照群と試験化合物処置群との間の有意差を計算した。１対１比較のStudentのt検定を用いて、デキサメタゾン群と対照群との間の差を計算した。有意差はP＜0.05レベルに設定した。アラキドン酸適用の90分後に測定した結果を表４に要約する。
【００５７】
【表４】
0006461961.tif 000006
【００５８】
マウスに試験化合物を100mg／kgで腹腔内投与すると、アラキドン酸誘発性の耳の腫れがビヒクル対照群に比べ37％も阻害された。（100mg／kgで）処置したマウスと対照マウス間の差異は、統計学的に有意であることが確認された。マウスの腹腔内投与は他の非経口の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）による薬物動態プロファイルを代表する良い例である。従って、この結果は、対象へ試験化合物を非経口的に投与するのは、炎症の症状を低減するのに有効であり得ることを示唆する。
【００５９】
実施例５．マウスにおける経口投与による活性化合物の鎮痛活性（テールフリックモデル）
テールフリック試験は、動物における疼痛反応の試験である。テールフリック試験は、基本的な痛みの研究で使用され、動物における熱に対するテールフリック反応を観察することにより、鎮痛剤の効果を測定する。この試験は、局部的な痛みの刺激に対する侵害受容性応答およびこの応答を阻害する薬剤の能力を評価する。
【００６０】
ビヒクル対照（水）および試験化合物であるジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートの水溶液を、第１テールフリック測定の60分前および15分前の二回、10mL／kgの容量でマウスに強制経口投与した。試験化合物は、水に含有させて10、30、または100mg／kgの用量で投与した。陽性対照化合物であるモルヒネは、第１テールフリック測定の15分前、8mg／kgで8mL／kgの容量で皮下注射により投与した。各群10匹のマウスを有していた。
【００６１】
熱刺激に対するマウスの応答は、49℃の水浴からテールフリックするまでの時間（テールフリック待ち時間）を測定することにより評価した。簡単にいうと、動物は、尾が垂下している状態で拘束具に配置した。尾を約2インチ、ビーカーに入った38±1℃の水に約30秒間浸漬し、これを2回行って動物をこの手順に順応させた。
【００６２】
続いて、約2インチの尾を、ビーカーに入った49±1℃の水に浸漬し、この時点でタイマーを開始した。不快感の最初のサイン（全身の動き、尾の曲がりや急速な動き）があるまで、あるいは動物が応答しなかった場合は30秒で、タイマーを停止させ、待ち時間を記録し、尾を水から取り出した。
【００６３】
テールフリック測定は、試験化合物の最初の投与から60、80、100、120分後に行った。ANOVAおよびDunnettのt検定を用いて（p＜0.05）、ビヒクル対照群と試験化合物処置群との間の有意差を計算した。１対１比較のStudentのt検定を用いて、モルヒネ群と対照群との間の差を計算した。各群のテールフリック応答の結果を平均±SEM（標準誤差）として計算した。p値＜0.05の場合、有意差があるとした。
【００６４】
図１は、ビヒクル（水、経口投与）、試験化合物（30および100mg／kgの水溶液、経口投与）およびモルヒネ（皮下投与）で処置したマウスのテールフリック試験の結果を示す。各群の待ち時間を平均±SEMとして計算し、時間に対しプロットした。図中、＊は、ビヒクル処置マウスに対するp値＜0.05を示す。
【００６５】
図１に示すように、モルヒネ処置マウス（皮下注射）は、ビヒクル処置マウスと比較していずれの測定時点においても統計的に有意なテールフリック潜時を示す。30mg／kgの経口投与による試験化合物の処置マウスは、ビヒクル処置マウスと比較して60分および80分の時点で統計的に有意なテールフリック潜時を示す。100mg／kgの試験化合物の処置マウスは、ビヒクル処置マウスと比較して60分および100分の時点で統計的に有意なテールフリック潜時を示す。上記の結果は、この試験化合物を経口投与すると、動物における侵害受容性疼痛を治療するのに有効であるという証明となる。
【００６６】
実施例６．マウスにおける経口投与による活性化合物の鎮痛活性（ホルマリンモデル）
ホルマリン試験は、ホルマリン誘発性の組織損傷に起因する持続痛のモデルである。侵害受容性および炎症性の疼痛は、希ホルマリン溶液を足に注射するによって誘導し、これにより足の引っ込め（paw flinching）を含む侵害防御行動が起こる。ホルマリンモデルは、疼痛の炎症性、神経性、および中枢性の機構を包含する。初期（約0〜約10分）の疼痛は侵害受容性の機構によるもので、後期（10〜40分）の疼痛は、炎症性疼痛および侵害受容性機構の組み合わせによるものである。疼痛行動は、手動の足舐め測定を用いて評価する。研究のエンドポイントは足舐め行動の数である（Hunskaar et al., Pain, 30:103-114, 1987; Li et al., Molecular Pain, 6:11, 2010）。
【００６７】
本研究では約34gの雄CD−1マウスを使用した。マウスに食物と水を自由に摂取させ、本研究の全体にわたり、12時間の明／暗サイクルで維持し、柔らかな寝具を備えたゲージあたり5匹ずつ収容した。
【００６８】
試験の直前（0時点）にマウスを布に拘束し、左後足の背面に20μLの5％ホルマリン溶液を皮下注入した。ビヒクル対照（n＝10、水）および試験化合物ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネート（n＝9、水溶液）を、10mL／kgの容量でマウスに強制経口投与した。試験化合物の量は、1投与あたり10、30、または100mg／kgであった。
【００６９】
陽性対照化合物であるモルヒネは、4mg／kgの量を4mL／kgの容量で皮下注射によりマウス（n＝10）に投与した。各群10匹のマウスを有していた。陽性対照皮下モルヒネ群の主な目的は、アッセイが一貫していることを確認するという品質管理のためである。モルヒネの目的は、試験化合物との比較としての役割ではない。
【００７０】
モルヒネは、ホルマリン注射の15分前に一回皮下投与した。試験化合物およびビヒクル対照は、ホルマリン注射の60分前および15分前の二回（BID）経口投与した。
【００７１】
ホルマリン注射後、動物を個々のケージに入れ、目視で60分間観察した。舐め行動を5分毎の間隔で記録することを連続して合計60分間行った。
【００７２】
10または30mg／kgの試験化合物では、対照に対し統計的に有意な差を示さなかった。
【００７３】
ホルマリン注射後の各時点における、ビヒクル対照、モルヒネ処置（100mg／kg）、および試験化合物処置マウスの舐め行動の回数を、5分毎の間隔で図２にプロットした。
【００７４】
1分当たりの舐め行動の回数を、ビヒクル、陽性対照、および試験化合物について、0〜10分および10〜40分の間で計算した。ANOVAおよびDunnettのt検定を用いて（p＜0.05）、ビヒクル対照群と試験化合物処置群との間の有意差を計算した。１対１比較のStudentのt検定を用いて、モルヒネ群と対照群との間の差を計算した。有意差はP＜0.05レベルに設定した。結果を表５に要約する。
【００７５】
【表５】
0006461961.tif 000007
【００７６】
モルヒネを4mg／kgで皮下投与すると、0〜10分の初期および10〜40分の後期における舐め行動の回数は、統計学的に有意に（p＜0.05）減少したが、薬剤のクリアランスにより効果は40分以降は持続しなかった。
【００７７】
100mg／kgの二回投与（BID）では、10〜40分の間の後期における舐め行動の回数が統計学的に有意な（p＜0.05）減少を示すことにより、試験化合物の効果が実証されたが、その効果は40分以降は持続しなかった。0〜10分の初期では、試験化合物と対照間に統計学的に有意な差が見られなかった。結果は、試験化合物が、炎症性侵害受容性疼痛の治療に有効であることを示している。
【００７８】
実施例７．マウスにおける局所投与による活性化合物の鎮痛活性（ホルマリンモデル）
動物および処置プロトコルは、以下を除き実施例６で説明したのと同様であった。
【００７９】
マウスの左後足を、試験化合物ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネート（ビヒクル中に375mM、n＝16）およびビヒクル対照（アセトン：エタノール＝1：1、n＝16）の各溶液に約30秒間浸漬することによって局所的に投与した。その後足を出して、皮膚の過剰な乾燥を避けつつティッシュで拭った。
【００８０】
陽性対照であるモルヒネは、4mg／kgの量を4mL／kgの容量で皮下注射によりマウス（n＝16）に投与した。
【００８１】
モルヒネは、ホルマリン注射の15分前に一回皮下投与した。試験化合物およびビヒクル対照は、ホルマリン注射の90分前および15分前の二回（BID）局所投与した。
【００８２】
ホルマリン注射後、動物は個々のケージに入れ、目視で60分間観察した。舐め行動を5分毎の間隔で記録することを連続して合計40分間行った。
【００８３】
ホルマリン注射後の各時点における、ビヒクル対照、モルヒネ処置、および試験化合物処置マウスの舐め行動の回数を、図３にプロットした。
【００８４】
1分当たりの舐め行動の回数を、ビヒクル、陽性対照、および試験化合物について、0〜10分および10〜40分の間で計算した。2標本t検定を用いて、ビヒクル群と試験化合物群を比較した。有意差はP＜0.05レベルに設定した。同じ統計処理をビヒクル群と陽性対照群についても実施し比較した。結果を表６に要約する。
【００８５】
【表６】
0006461961.tif 000008
【００８６】
モルヒネを4mg／kgで皮下投与すると、0〜10分の初期および10〜40分の後期における舐め行動の回数は、統計学的に有意に（p＜0.05）減少した。
【００８７】
375mMでは、10〜40分の間の後期における舐め行動の回数が統計学的に有意な（p＜0.05）減少を示すことにより、試験化合物の効果が実証された。0〜10分の初期では、試験化合物と対照間に統計学的に有意な差が見られなかった。ホルマリン注射をせず、試験化合物の局所投与のみでは、脚の舐め行動の回数は無視できる程度であった。
【００８８】
結果は、局所投与により、試験化合物が炎症性侵害受容性疼痛の治療に有効であることを示している。
【００８９】
実施例８．慢性狭窄損傷モデルにおける活性化合物の鎮痛活性（予測例）
末梢神経の病変は、自発的に起こる疼痛の他に、軽く触れられてもその応答が誇張される（接触性アロディニア）等の症状を生ずることがある。慢性狭窄損傷モデルは、神経障害性疼痛モデルである。
【００９０】
180±20gの体重を有する雄のSprague Dawleyラットを使用する。ペントバルビタール（50mg／kg、5ml／kg、腹腔内）麻酔下で、坐骨神経を大腿の中央部あたりで露出させる。約1mm離して四結紮糸（4−0クロムガット）をゆるく神経の周りに結ぶ。次に、動物を、試験前の7日間、柔らかな寝具を備えたゲージに個別に収容する。坐骨神経の収縮により神経損傷および一側性の神経障害性疼痛が生じる。
【００９１】
実験日当日、動物は、試験前日の一晩は食物を与えない。ラットをワイヤメッシュラック上に反転プレキシガラスのケージ下に置き、20〜30分間順応させる。左後肢の足底表面に対してフォン・フレイ・フィラメントを用いて、Chaplanアップ／ダウン法により機械的アロディニアを評価する。Chaplan, et al. J. Neuroscience Methods, 53: 55-63, 1994参照のこと。
【００９２】
神経結紮（前処理）後から7〜14日の間の疼痛閾値に達する力が、神経結紮（前結紮）の前の個々の肢の反応よりも10g低下する、すなわちアロディニアが明確に存在する場合のみ、実験用のラットを予備選択する。
【００９３】
活性化合物であるジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートを実施例２に従ってゲル製剤に調製する。
【００９４】
活性化合物（1〜5％）を含むゲル製剤、活性化合物を含む1％のTween80、モルヒネ（陽性対照、経口用、20mg／kg）、局所用ビヒクル（活性化合物を有さないゲル製剤）、および経口ビヒクル（1％Tween80水溶液）を評価する。
【００９５】
検査物質またはビヒクルの何れかを、経口（30〜100mg／kg）または左後肢の足底表面に局所（1〜5％のゲル製剤）投与する。機械的アロディニア試験を、検査物質またはビヒクルの単回投与の30分前（処置前）および1時間後と3時間後（処置後）に実施する。対照および検査物質の場合の肢の逃避反応閾値を測定する。
【００９６】
実施例９．局所投与による膝疼痛の治療（予測例）
目的：標準的なNSAID治療の一時停止後、変形性関節症に関連する軽度〜重度の膝疼痛を有するヒト患者において、局所用ゲル製剤中の活性化合物の有効性を調べること。この研究の焦点は、疼痛を伴う関節炎により引き起こされる症状である。この臨床試験は、他の筋骨格系障害について十分に確立されたパラダイムとして膝の変形性関節症を利用する。
【００９７】
局所用製剤：活性化合物ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートを、1％および5％で含むゲル製剤（実施例２）をこの実施例に使用する。プラセボは、活性化合物を含まない以外は同じゲルを含む。
【００９８】
方法論：ランダムな二重盲検で、プラセボを対照とし、複数施設で処置を並行して行う臨床的な活性試験である。
【００９９】
少なくとも2ヶ月間の標準的NSAID療法による安定的な治療により制御されている痛みを伴う膝の変形性関節症の患者は、休薬期間として7日間NSAIDの使用を中止する。その後、患者を、1：1：1の比率（1％活性ゲル：5％活性ゲル：プラセボ）でランダムに分ける。合計150人以内の患者が参加する。
【０１００】
活性ゲルまたはプラセボを、起きている間4〜6時間ごとに1日3回膝患部への適用を12週間行い、合計252回投与する。
【０１０１】
患者は、12週間治療し、その後4週間追跡する。NSAIDは、12週目の訪問後から再開する。
【０１０２】
評価についての基準：
安全性：
・研究を通しての有害事象（Adverse Events、AE）。
・参加時の身体検査（NSAIDの休薬期間の開始時である試験7日前）、ベースライン（1日目の治療開始時）、12週目および16週目。
・参加時のバイタルサイン（NSAIDの休薬期間の開始時である試験7日前）、ベースライン（1日目の治療開始時）、および2、4、6、12、16週目。
・臨床実験室において、ベースライン（1日目）、および4、8、12、16週目の測定。
【０１０３】
臨床活性：
一次臨床活性パラメーターは、視覚的アナログ尺度（Visual Analog Scale：VAS）、およびWestern Ontario and McMaster University（WOMAC）指数の疼痛サブスケールにより定量化されるような、標的関節部位における疼痛の測定値である。膝の腫れ、圧痛、および炎症に対する治療の効果を記録し、また、治療後の疼痛の低減または根絶までの時間も記録する。
【０１０４】
研究エンドポイント：
一次臨床活性エンドポイントは、以下の通りである。
・ベースライン（1日目）から12週目までのWOMAC機能障害指数の疼痛サブスケールの変化（尺度0−20）
二次臨床活性エンドポイントは、以下の通りである。
・ベースライン（1日目）から12週目までのWOMAC機能障害指数のサブスケールの変化（尺度0−20）
・凝り（尺度0−8）
・身体機能（尺度0−68）
・ベースライン（1日目）から12週目までのVAS疼痛スコアの変化（尺度0−100）
・ベースライン（1日目）から2週目までのVAS疼痛スコアの変化（尺度0−100）
・ベースライン（1日目）および1日目に初回投与してからから4週目および12週目における腫れ、圧痛、および炎症の評価の変化。
・活性ゲルまたはプラセボゲルそれぞれを局所投与後の疼痛の低減または根絶までの時間。
・レスキュー薬（APAP）の使用。
【０１０５】
実施例１０．経口投与による膝疼痛の治療（予測例）
本実験の設計およびプロトコルは、活性化合物およびプラセボを経口経路で投与すること以外は実施例９で説明したのと同様である。
【０１０６】
経口製剤：本実施例では、10、100、または1000mgの活性化合物ジエチル（2−シアノエチル）ホスホネートを含有する錠剤製剤を使用する。プラセボは、活性化合物を含有しないこと以外は同じ錠剤製剤である。
【０１０７】
方法論：
患者を、1：1：1：1の比率（10mg：100mg：1000mg：プラセボ）でランダムに分ける。合計200人以内の患者が参加する。
【０１０８】
活性錠剤またはプラセボを、起きている間12時間ごとに1日2回各患者への経口投与を12週間行い、合計168回投与する。患者は、12週間治療し、その後4週間追跡する。
【０１０９】
評価基準は、実施例９で説明した通りである。
【０１１０】
前述の記載は本発明の好ましい実施形態についであること、そして特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく変更を行いうることを理解されるべきである。
【図１】
0006461961.tif 000009
【図２】
0006461961.tif 000010
【図３】
0006461961.tif 000011