(57)【要約】  本発明は、インビトロならびにインビボにて、肝臓、好ましくは肝細胞への標識の特異的送達のための疎水性修飾ペプチドに関する。本発明は、該疎水性修飾ペプチドおよび肝臓に特異的に送達される標識を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、本発明の疎水性修飾ペプチドの診断的使用ならびに肝臓疾患または障害の診断のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
［Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｒｏ］Ａｐ
［式中、
Ｐは、アミノ酸配列ＮＰＬＧＦＸａａＰを有するペプチドであり、Ｘａａは任意のアミノ酸であり；
Ｘは、ｍ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列であり、ここで、１つ以上のアミノ酸は、好ましくはカルボン酸、脂肪酸、Ｃ８からＣ２２脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸での、アシル化、および、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環芳香族性化合物から選択される疎水性部分の付加から選択される疎水性修飾のための１つ以上の基を有し；ｍは少なくとも４であり；
Ｙは、ｎ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列であり、ｎは０または少なくとも１であり；
ｍ＋ｎは１１以上であり、
Ｒは、好ましくはアミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然および合成ポリマー、例えば、ＰＥＧ、グリカンから選択される分解から保護する部分である、該疎水性修飾ペプチドのＣ−末端修飾であり、ｏは０または少なくとも１であり、
Ａは、アンカー基であり、好ましくはエステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択され、ｐは、０または少なくとも１である］
で示される疎水性修飾ペプチドであって、ここで、１つ以上の標識が、Ｘの１つ以上のアミノ酸に結合されている、ペプチド。
【請求項２】
ｍが４から１９であり、そして／または、ｎが０から７８である、請求項１に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項３】
ＸａａがＦまたはＬ、好ましくはＦである、請求項１または２に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項４】
１つ以上の標識が、リンカーまたはスペーサーを介して、該ペプチドに連結されている、請求項１から３のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項５】
リンカーまたはスペーサーが、肝臓タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素により、疎水性修飾ペプチドから開裂される、請求項４に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項６】
リンカーまたはスペーサーが、シトクロム、例えば、シトクロムＰ４５０、エンドサイトーシス経路のプロテアーゼおよびリアーゼ、マトリックス−メタロ−プロテアーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２、好ましくはＭＭＰ７から選択される酵素により開裂される、請求項５に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項７】
リンカーまたはスペーサーが、ペプチド配列ＧＣＨＡＫまたはＲＰＬＡＬＷＲＳを含む、請求項６に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項８】
１つ以上の標識が、好ましくはリジン、α−アミノグリシン、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸から選択される、側鎖においてアミノ基を有するＸの１つ以上のアミノ酸と結合している、請求項１から７のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項９】
側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸がリジンである、請求項８に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１０】
側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸が、ＸのＮ−末端に位置している、請求項１から９のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１１】
１から１１個、好ましくは１から３個の側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸が、ＸのＮ−末端に位置している、請求項１０に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１２】
１つ以上の標識が、活性化エステルを使用することにより、側鎖においてアミノ基を有する該アミノ酸に結合している、請求項１１に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１３】
−アミンおよび活性化カルボン酸、好ましくはＮＨＳ−エステルまたはカルボジイミドの反応によるアミドの形成；
−ピリジルジスルフィドと特異的に反応する２つのチオールまたは１つのチオールを使用するジスルフィド結合；
−マレイミドまたはハロアセチルおよびチオール成分を使用するチオエーテル形成；
−イミドエステルおよびアミンを使用するアミジン形成；
−カルボニル（例えば、アルデヒド）およびヒドラジドを使用するヒドラジド結合；
−還元条件下でカルボニルおよびアミンを使用するアミン結合；
−ニトリルおよびアジドを使用するトリアゾール形成；
−イソチオシアネートおよびアミンを使用するチオウレア形成；
−アルコールおよび活性化カルボン酸、好ましくは酸塩化物またはカルボジイミドの反応によるエステルの形成；
−アルコールおよびハロゲン化アルキルの反応によるエーテルの形成
から選択される１つ以上の方法を使用することにより、標識が、該Ｘのアミノ酸と結合している、請求項１から１２のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１４】
疎水性修飾が、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択されるアシル化による、請求項１から１３のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１５】
疎水性修飾が、ミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化による、請求項１４に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１６】
疎水性修飾が、ステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化による、請求項１４に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１７】
好ましくはＨＢＶまたはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の遺伝子型またはそれらの変異体の、種々のウイルス種、株またはサブタイプのアミノ酸配列を有する配列番号２から１３の変異体を含む、請求項１から１６のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１８】
標識が、蛍光色素、蛍光放出アイソトープ、放射性同位体および造影剤から選択される、請求項１から１７のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項１９】
標識が、二価または三価金属カチオンとの複合体を形成するキレート化剤を含む、請求項１８に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２０】
キレート化剤が、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）および６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２１】
キレート化剤が１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である、請求項２０に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２２】
造影剤が常磁性剤を含む、請求項１８から２１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２３】
標識が、Ｇｄ、Ｅｕ、ＷおよびＭｎから選択される、請求項１８から２２のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２４】
放射性同位体／蛍光放出アイソトープが、アルファ放射線放出アイソトープ、ガンマ放射線放出アイソトープ、オージェ電子放出アイソトープ、Ｘ−線放出アイソトープ、蛍光放出アイソトープ、例えば、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ，８８Ｙ、９０Ｙ、１４９Ｐｍ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄ、２１２Ｂｉ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９７Ｒｕ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０１ｍ１５Ｒｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、１６９Ｅｕ、２０３Ｐｂ、２１２Ｐｂ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１９８Ａｕおよび１９９Ａｇからなる群から選択される、請求項１８から２１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２５】
蛍光色素が、以下の種類の蛍光色素：キサンテン(Xanthens)、アクリジン、オキサジン、シアニン、スチリル色素、クマリン、ポルフィン、金属−リガンド−複合体、蛍光タンパク質、ナノ結晶、ペリレンおよびフタロシアニンならびにこれらの種類の色素の抱合体および組合せからなる群から選択される、請求項１８から２１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２６】
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ、
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド、
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド、
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドからなる群から選択される、請求項１から２５のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれかに記載の少なくとも１つの疎水性修飾ペプチド；および、所望により薬学的に許容される担体および／または賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項２８】
肝臓への標識の特異的送達における使用のための、請求項１から２６のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
Ｘ−線、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、シングルフォトン核医学断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、Ｘ−線コンピューター断層撮影（ＣＴ）およびこれらの方法の組合せからなる群から選択される医学的イメージングにおける使用のための、請求項１から２６のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
手術中の視覚化における使用のための、請求項１から２６のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは請求項２７または２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
肝臓疾患または障害の診断または処置のモニタリングにおける使用のための、請求項１から３０のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３２】
肝臓疾患または障害が、肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、好ましくはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ型肝炎ウイルスにより引き起こされる肝炎、またはウイルスにより引き起こされる同時(concomitant)肝炎から選択される、請求項３１に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３３】
肝臓疾患または障害が、ウイルスまたは非ウイルス病原体の肝臓期に関わる疾患である、請求項３１に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３４】
肝臓疾患または障害が、熱帯病、マラリア、住血吸虫症、リーシュマニア症である、請求項３１に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３５】
肝臓疾患または障害が、肝腫瘍、好ましくは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項３１に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３６】
肝臓における疾患または障害が、好ましくは結腸直腸癌腫からの、肝臓転移である、請求項３１に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３７】
肝臓疾患または障害が、代謝疾患、好ましくは肥満、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）である、請求項３１に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３８】
疎水性修飾ペプチドが、１０ｐｍｏｌ／ｋｇから２０μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲の用量にて、患者に適用される、請求項２７から３７のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項３９】
疎水性修飾ペプチドが、１００ｎｍｏｌから２μｍｏｌの範囲の用量、好ましくは約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の用量にて、患者に適用される、請求項３８に記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物。
【請求項４０】
ＭＲＩにおける使用のための、３００ｎｍｏｌから８００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、好ましくは４００から６００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重が患者に適用される、請求項３９に記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項４１】
投与経路が、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐薬投与経路から選択される、請求項２８から４０のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチド。
【請求項４２】
肝臓疾患または障害の診断および／または処置のモニタリングのための医薬の製造のための、請求項１から４１のいずれかに記載の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の使用。
【請求項４３】
請求項１から４１のいずれかに定義されている診断有効量の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、肝臓疾患または障害の診断または肝臓疾患または障害の処置のモニタリングのための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インビトロならびにインビボにて、肝臓、好ましくは肝細胞への標的化合物（診断薬、以下「標識」）の特異的送達のための汎用ビヒクルであるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｐｒｅＳドメイン由来の疎水性修飾ペプチドに関する。任意の種の標識は、肝臓に特異的に標的化することができ、肝臓において濃縮される。該肝臓標的化は、さらに、肝臓疾患または障害、例えば、肝炎、マラリア、肝細胞癌腫（ＨＣＣ）、ならびにＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶおよび／またはＨＤＶ感染の標的化診断のために使用することができる。本発明は、該疎水性修飾ペプチドおよび肝臓に特異的に送達される標識を含む医薬組成物に関する。本発明はさらに、肝臓疾患または障害の診断および／または処置のモニタリングのための該疎水性修飾ペプチドを含む本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の使用；および、肝臓疾患または障害の診断および／または処置のモニタリングのための医薬の製造のための本発明の疎水性修飾ペプチドの使用；ならびに、肝臓疾患または障害の診断または肝臓疾患または障害の処置のモニタリングのための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
脊椎動物および他の動物に存在する臓器である肝臓は、代謝において主な役割を果たし、身体における多くの機能、例えば、グリコーゲン貯蔵、赤血球の分解、血漿タンパク質の合成および解毒を有する。肝臓はまた、人体において最も大きな腺である。肝臓は、腹部の胸郭部における横隔膜の下にある。肝臓は、脂質の乳化を介して、消化を助けるアルカリ化合物である胆汁を生産する。肝臓はまた、特殊組織を必要とする多種多様な大量の生化学的反応を行い、調節する。
【０００３】
肝細胞は、肝臓の細胞質塊の７０から８０％を構成している。肝細胞は、タンパク質合成、タンパク質貯蔵および炭水化物の変換、コレステロール、胆汁塩およびリン脂質の合成、ならびに外因性および内因性物質の解毒、修飾および排出に関与する。肝細胞はまた、胆汁の形成および分泌を開始する。
【０００４】
多数の既知の肝臓疾患、例えば：
−肝炎：主に種々のウイルスにより引き起こされるが、特定の毒、自己免疫または遺伝的状態によっても引き起こされる肝臓の炎症；
−肝硬変症：死滅肝細胞に置き換わる肝臓における線維組織の形成。肝細胞の死滅は、例えば、ウイルス肝炎、アルコール依存症または他の肝臓毒性化学物質との接触により引き起こされ得る；
−ヘモクロマトーシス：身体における鉄の蓄積を引き起こし、結局は肝臓損傷をもたらす遺伝的疾患；
−肝臓癌：通常、胃腸管の他の部分に由来する原発性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）または胆管癌腫および転移性癌；
−ウィルソン病：銅が身体に保持される遺伝的疾患；
−原発性硬化性胆管炎：事実上自己免疫性である胆管の炎症性疾患；
−原発性胆汁性肝硬変：小胆管の自己免疫疾患；
−バッド・キアリ症候群：肝静脈の閉塞；
−ジルベール症候群：集団の約５％に見られるビリルビン代謝の遺伝性障害；
−ＩＩ型糖原病：全身の進行性の筋衰弱（ミオパチー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系における種々の体内組織に影響を与えるグリコーゲンの蓄積
が存在する。
【０００５】
また、多数の小児肝疾患、例えば、胆道閉鎖症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群および進行性家族性肝内胆汁うっ滞；ならびに代謝疾患が存在する。
【０００６】
さらに、特に熱帯病の、いくつかの病原体および寄生生物は、そのライフサイクル中に肝臓段階を有する。例えば、マラリアは、最も一般的な感染症の１つであり、多大な公衆衛生問題である。マラリアは、プラスモジウム(Plasmodium)属の寄生原生動物により引き起こされる。疾患の最も重い型は、熱帯マラリア原虫(Plasmodium falciparum)および三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)により引き起こされるが、他の関連種（卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、およびときどき二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi）もまた、ヒトに感染することができる。
【０００７】
別の例は、Ｂ型肝炎の原因となるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）である。ＨＢＶは、哺乳動物および鳥類の小エンベロープＤＮＡウイルスのファミリーのプロトタイプである（１１）。ＨＢＶエンベロープは、Ｌ−（大型）、Ｍ−（中型）およびＳ−（小型）と称される３つのタンパク質を取り囲んでいる（図１参照）。それらは、４つの膜貫通領域を有するＣ−末端Ｓ−ドメインを共有する。Ｍ−およびＬ−タンパク質は、５５個のさらなるＮ−末端伸長、および、遺伝子型依存の１０７または１１８個のａａ（ｐｒｅＳ２−およびｐｒｅＳｌ）を有する。ビリオンにおいて、Ｌ、ＭおよびＳの化学量論比は、約１：１：４であるが、より豊富に分泌される非感染性サブウイルス粒子（ＳＶＰ）は、ほぼ例外なくＳ−タンパク質を含み、ほんの微量のＬ−タンパク質しか含まない（２）。合成中、ＬのｐｒｅＳｌ−ドメインは、ミリストイル化し、ＨＢＶライフサイクルのいくつかの時点で、ＥＲ由来膜を介して位置を変える。該修飾は、感染性に必須である（１３、１４）。ＨＢＶの顕著な特徴は、その肝臓指向性であり、すなわち、肝臓は、ＨＢＶの増殖を特異的に支持する組織である。
【０００８】
慢性ＨＢＶおよびＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）感染はまた、肝臓における腫瘍性変化物に対する主な原因である。原発性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）は、通常、特にウイルス肝炎の、慢性肝臓疾患の状況において発症する。ＨＣＣ診断は、通常、血清マーカーおよびイメージング様式ならびに生検後の組織学的確認の使用の必要とし、困難であり得る。
【０００９】
ＨＣＣは、世界的に１年あたり約１００万人の死をもたらし、診断後の中央生存期間が約６から２０月である（１１）。これの１つの理由は、病原症状および肝臓の大型機能性保存の非存在である（１２）。結果として、肝細胞癌腫と診断された大多数の患者は、外科的切除に適しておらず、他の治療法、例えば、肝臓移植、高周波アブレーション、肝動脈化学塞栓術、冷凍アブレーションまたは放射線療法を必要とする。これらの代替選択の全てが、一般的に診断時に大型の腫瘍サイズのため、限定された有効性となる。（１３）結果として、ＦＤＡ（連邦薬物機関）は、血清アルファ−フェトプロテインレベルの上昇を生じる基礎肝臓疾患（すなわち、肝硬変症、ウイルス肝炎）を有する患者において非常に強い診断イメージングを推奨している。（１２）診断イメージングは、通常、肝臓のＣＴスキャンおよび／または磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）により実施される。しかしながら、かかる「フォローアップ」イメージングが全患者の大多数において推奨されるため、高分解能イメージング方法を使用するときでさえ、最初の診断は、しばしば、困難である。（１４）新規肝臓特異的造影剤、例えば、本発明に記載されているものは、この問題を引き上げることを手助けし得る。
【００１０】
肝臓における腫瘍性変化物に関する別の供給源は、他の臓器の原発性腫瘍の転移拡散、非常に顕著に結腸直腸癌腫（ＣＲＣ）の転移拡散である。ＣＲＣは、世界中で癌関連死の３番目に一般的な原因である。約１２５万人の患者が毎年、結腸直腸癌を発症し；６００．０００人以上の患者が毎年死ぬ。（ソース：GLOBOCAN 2008, globocan.iarc.fr）。ＣＲＣの病因は、現在までにほとんど明らかになっており、ＦＤＡは５０歳から全ての人々に対して定期健康診断推奨しているが、発生率は、１９９７から２００８にほんの穏やかに減少しているのみである（１５、１６）。
【００１１】
一次診断後、全ての患者の約８０％は、あらゆる検出可能な転移なしを示し、該患者に対して、外科的切除は最も良い治療選択肢である。切除したにもかかわらず、ＴＭＮ分類ＩＩ／ＩＩＩと診断された全ての患者の４０％以上は、肝臓における転移を発症する（１７−２１）。一次切除後の非常に強い高分解能イメージングがＴＭＮ  ＩＩ／ＩＩＩに分類された患者の生存時間を有意に延長することができることが示されている。肝臓における小転移の早期診断は、慣用のケアと比較したとき、４０％で、部分肝切除後に生存時間を５年延長することができる。しかしながら、肝臓の非晶構造のため、早期診断は、しばしば、不可能である（２２）。造影剤、例えば、本明細書に記載されているものは、早期に肝臓転移を診断する手助けとなり得、無病生存を延長するための該手助けにより外科的介入を可能にする。
【００１２】
理想的には、薬物標的化は、以下の基準：１）要求される作用部位への薬物（例えば、標識）の排他的送達；２）残りの組織に対する最小の効果；３）薬理学的に不活性なベクターの使用を満たすべきである。
【００１３】
特定の組織へ標的を送達するために、種々の戦略が追究されている。これらは、例えば薬理学的に活性な部分が組織特異的酵素により標的組織に放出されるプロドラッグの使用である。さらなる可能性は、有効な非組織特異的薬物を組織特異的であるが薬理学的に不活性な担体システム、例えば、受容体−アフィンペプチドまたはコロイド粒子に結合させることである。
【００１４】
種々の薬物担体が、薬物の肝臓標的化を増強するために使用されている。直接的なアプローチは、薬物、特に担体、例えば、リポソームおよびミクロスフェアを送達することによる肝臓における細網内皮系の活性な食作用に基づく。例えば、ｉ．ｖ．（静脈内）注射の後に、薬物が組み込まれた微粒子担体が主に肝臓における細網内皮系により捕捉され、肝臓の薬物標的化がもたらされることが示されている（５）。他方では、正に荷電した水溶性ポリマーでの薬物の肝臓標的化は、肝臓の血管系からのほとんどの水溶性物質の自由溢出ならびに肝臓細胞表面上の負電荷の基づく（６）。したがって、ポリマーは、肝臓のこのような解剖学的および生化学的特性に基づいて、薬物を肝臓に標的化させる担体として使用されている。肝臓のより特異的な薬物標的化は、肝細胞のアシアロ糖タンパク質受容体を使用することにより試みられている。アシアロ糖タンパク質受容体（ガラクトース受容体）は、高密度で肝細胞上に存在する。加えて、リガンドがガラクトース受容体に結合すると、リガンド−受容体複合体は、内在化し、ガラクトシル化リガンドの細胞摂取を可能にする（７）。ナノ粒子を使用するさらなる送達アプローチは、例えば、両親媒性(amphilic)ポリマーおよびウイルスベクターにより実施されている（８）。また、薬物および遺伝物質の送達は、バイオナノカプセル（ＢＮＣ）の使用を介して実施されている。ＢＮＣは、「バイオテクノロジー技術により生産されたタンパク質からなるナノスケールのカプセル」として示され、臓器特異的薬物送達のための送達系として使用することができる（９）。
【００１５】
ＵＳ  ７，００１，７６０  Ｂ２は、遺伝子治療、例えば、肝細胞への治療遺伝子の送達および肝細胞における異種遺伝子の発現のために使用することができる、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来の組換えベクターを記載している。
【００１６】
出典明示によりその全体を本明細書に包含させるＷＯ２００９／０９２６１２は、ＨＢＶの疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチド、および肝臓への化合物の特異的送達のためのビヒクルとしてのその使用を記載している。該文献において、ＨＢＶの疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチドは、好ましくは疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチドの「Ｃ−末端」である任意のアンカー基（Ａ）を介して診断または治療活性剤と結合され得る。
【００１７】
本発明は、Ｘにより示されるペプチドのＮ−末端アミノ酸配列と結合している１つ以上の標識に結合された疎水性修飾ペプチドを提供し、肝臓特異性を維持しているより短いペプチドを作製することを可能にする。驚くべきことに、肝臓指向性を排除することなく疎水性部分をペプチドへ結合させることができるようになった。さらに、Ｎ−末端部位へのカップリング標識は、細胞膜を介して活性化合物のより良い送達を可能にし、また、細胞膜上で活性である標識を、作用部位に直接的に指向することができる。図３において、肝細胞の表面への疎水性修飾ペプチドの結合の分子メカニズムが、概略的に説明されている。
【発明の概要】
【００１８】
発明の概要
本発明において、該目的は、疎水性修飾ペプチドを提供することにより解決される。図２において、本発明の疎水性修飾ペプチドの構築は、概略的に説明されている。該疎水性修飾ペプチドは、一般式：［Ｘ−Ｐ−Ｙ−Ｒｏ］Ａｐ、［式中、Ｐは、アミノ酸配列ＮＰＬＧＦＸａａＰ（１文字コード；ここで、Ｘａａは任意のアミノ酸、好ましくはＦまたはＬ、さらに好ましくはＦである）を有する］ペプチドである。Ｘは、ｍ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列であり、ここで、Ｘの１つ以上のアミノ酸は、好ましくはカルボン酸、飽和および不飽和脂肪酸、Ｃ８からＣ２２脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸での、アシル化、および、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環芳香族性化合物から選択される疎水性部分の付加から選択される疎水性修飾のための１つ以上の基を有し、ｍは少なくとも４（ｍは４以上である）である。好ましい態様において、疎水性修飾は、好ましくはミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）から選択されるアシル部分でのアシル化、さらに好ましくはミリストイル（Ｃ１４）でのアシル化またはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化により引き起こされる。Ｙは、ｎ個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸配列である（ｎは０または少なくとも１である）。上記一般式において、ｍ＋ｎは少なくとも１１であり、すなわち、本発明の疎水性修飾ペプチドは、全体において少なくとも１８個のアミノ酸（ａａ）の長さを有する。Ｒは、好ましくはアミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然および合成ポリマー、例えば、ＰＥＧ、グリカンから選択される分解から保護する部分である、該疎水性修飾ペプチドのＣ−末端修飾である（ｏは０または少なくとも１である）。Ａは、アンカー基であり、好ましくはエステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択され、ｐは、０または少なくとも１である。好ましい態様において、ｍは４から１９であり、そして／または、ｎは０から７８である。１つ以上の標識は、Ｘの１つ以上のアミノ酸に結合されている。標識は、１つの物質からなるか、または２つ以上の物質を含み得、これは、任意の種類の化学的または物理的結合、例えば、共有結合、イオン結合などにより互いに連結しているか、または標識は、複合体の形態である。
【００１９】
本発明の好ましい態様において、１つ以上の標識は、リンカーまたはスペーサーを介して、該ペプチドに連結されており、リンカーまたはスペーサーは、好ましくは肝臓タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素により、疎水性修飾ペプチドから開裂され、該肝細胞タンパク質分解酵素は、シトクロム、例えば、シトクロムＰ４５０、エンドサイトーシス経路のプロテアーゼおよびリアーゼ（例えばエステラーゼ）、マトリックス−メタロ−プロテアーゼＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２、好ましくはＭＭＰ７から選択され得る。この場合において、リンカーまたはスペーサーは、好ましくはペプチド配列ＧＣＨＡＫまたはＲＰＬＡＬＷＲＳを含む。
【００２０】
さらなる好ましい態様において、１つ以上の標識は、好ましくはリジン、α−アミノグリシン、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸、さらに好ましくはリジンから選択される側鎖においてアミノ基を有するＸの１つ以上のアミノ酸と結合している。側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸は、好ましくはＸのＮ−末端に位置しており、ここで、好ましくは１から１１個、さらに好ましくは１から３個の側鎖においてアミノ基を有するアミノ酸は、ＸのＮ−末端に位置している。
【００２１】
本発明において、該目的は、本明細書に定義されている少なくとも１つの疎水性修飾ペプチド、および本明細書に定義されている肝臓、好ましくは肝細胞に特異的に送達されるべき少なくとも１つの標的、および所望により、薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供することによりさらに解決される。好ましい態様において、疎水性修飾ペプチドおよび／または医薬組成物は、好ましくは肝臓疾患または障害の診断または処置のモニタリング、さらに好ましくは手術中の視覚化における使用のための、肝臓への標識の特異的送達において使用される。
【００２２】
本発明において、目的は、本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の使用、および診断のための医薬の製造のための疎水性修飾ペプチドの使用、および／または肝臓疾患または障害の処置のモニタリングを提供することによりさらに解決される。
【００２３】
本発明において、目的は、診断有効量の本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物を対象に投与することを含む、肝臓疾患または障害の診断のための方法または肝臓疾患または障害の処置のモニタリングのための方法を提供することによりさらに解決される。
【００２４】
本発明のさらなる好ましい態様は、従属する請求項に定義されている。
【００２５】
本発明の好ましい態様の記載
本発明を以下でより詳細に記載する前に、本発明は、様々であり得るため、本明細書に記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないと理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は、特定の態様を記載する目的のためだけであり、特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないと理解すべきである。他に定義されていない限り、本明細書において使用される全ての専門および科学用語は、当業者により一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本発明の目的のために、本明細書に引用されている全ての文献を、その全体において出典明示により包含させる。
【００２６】
疎水性修飾ペプチド
上記で概説されるとおり、本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のｐｒｅＳドメイン（「ｐｒｅＳ−ペプチド」とも称される）に由来する疎水性修飾ペプチドを提供する。ＨＢＶのエンベロープは、Ｌ（大型）、Ｍ（中型）およびＳ（小型）と称される３つのタンパク質を取り囲んでいる（図１参照）。それらは、４つの膜貫通領域を有するＣ−末端Ｓ−ドメインを共有する。Ｍ−およびＬ−タンパク質は、５５個のさらなるＮ−末端伸長、および、遺伝子型依存の１０７または１１８個のアミノ酸（ｐｒｅＳ２−およびｐｒｅＳｌ）を有する。
【００２７】
したがって、本発明のペプチドは、好ましくは遺伝子型ＡからＨならびにウーリーモンキー（ＷＭＨＢＶ）、オランウータン、チンパンジーおよびゴリラＢ型肝炎ウイルスの、ＨＢＶのＬ−タンパク質、ｐｒｅＳｌのＮ−末端伸長に対応するか、またはそれらに基づくアミノ酸配列を有するペプチドを示すが、それらの変異体、好ましくはＣ−末端切断変異体、アミノ酸置換変異体も示す。必須の配列として、配列番号：１（ＮＰＬＧＦＸＰ）において示される、ＨＢＶの疎水性修飾ｐｒｅＳ由来のペプチドの肝臓指向性のために重要であるアミノ酸残基が、本発明の疎水性修飾ペプチドのアミノ酸配列に存在する。特に、本発明の疎水性修飾ペプチドは、以下の配列（１文字コードにおけるアミノ酸；必須のドメインは下線が引かれている）に基づく。
【００２８】
疎水性修飾ペプチドの必須のドメイン（配列番号：１）：
ＮＰＬＧＦＸＰ（Ｘは任意のアミノ酸、好ましくはＦまたはＬ、さらに好ましくはＦである）
【００２９】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ａ（ＩＤ：Ｍ５７６６３；配列番号：２）：
【表１】
2014510050.tif 000002
【００３０】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｂ（ＩＤ：Ｄ００３２９、配列番号：３）
【表２】
2014510050.tif 000003
【００３１】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｃ（ＩＤ：ＡＢ０４８７０４、配列番号：４）
【表３】
2014510050.tif 000004
【００３２】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−チンパンジー（ＩＤ：ＡＢ０３２４３２、配列番号：５）
【表４】
2014510050.tif 000005
【００３３】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｄ（ＩＤ：ＡＢ０４８７０２、配列番号：６）
【表５】
2014510050.tif 000006
【００３４】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｅ（ＩＤ：Ｘ６５６５７、配列番号：７）
【表６】
2014510050.tif 000007
【００３５】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｆ（ＩＤ：Ｘ６９７９８＠８、配列番号：８）
【表７】
2014510050.tif 000008
【００３６】
ｐｒｅＳ  ＨＢＶ−Ｇ（ＩＤ：ＡＦ１６０５０１、配列番号：９）
【表８】
2014510050.tif 000009
【００３７】
ＨＢＶ  Ｇｉｂｂｏｎ（ＩＤ：ＡＪ１３１５７２、配列番号：１０）
【表９】
2014510050.tif 000010
【００３８】
ＨＢＶ−Ｈ（ＩＤ：Ｑ８ＪＭＹ６、配列番号：１１）
【表１０】
2014510050.tif 000011
【００３９】
ＨＢＶオランウータン（ＩＤ：ＡＦ１９３８６４、配列番号：１２）
【表１１】
2014510050.tif 000012
【００４０】
ＨＢＶウーリーモンキー（ＩＤ：ＮＣ＿００１８９６、配列番号：１３）
【表１２】
2014510050.tif 000013
【００４１】
「変異体」は、好ましくは、疎水性修飾を有する配列番号：２−１３の配列のＮ−末端および／またはＣ−末端切断変異体、アミノ酸置換または欠失変異体、または伸長変異体であり、ここに、１つ以上の標識が該疎水性修飾ペプチドの必須のドメインの１つ以上のＮ−末端でアミノ酸に結合している。変異体はさらに、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模擬物またはペプチド骨格／構造を模倣することができるさらなる化合物を含むアミノ酸配列を含む。好ましくは、変異体は、配列番号２から１３のＣ−末端切断変異体；アミノ酸置換または欠失変異体；修飾アミノ酸、非天然アミノ酸もしくはペプチド模擬物またはペプチド骨格／構造を模倣することができるさらなる化合物を含む変異体から選択される。
【００４２】
本発明において、疎水性修飾ペプチドの変異体は、配列番号：１の配列を有するアミノ酸を少なくとも含み、上記配列番号：２から１３の１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８または１１９個のアミノ酸、またはそれらの変異体からなり得る。
【００４３】
Ｎ−末端および／またはＣ−末端切断変異体は、好ましくは、配列番号２から１３の少なくとも１８個の連続アミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１９個の連続アミノ酸、よりさらに好ましくは少なくとも２０個、よりさらに好ましくは少なくとも２１個の連続アミノ酸、またはそれらの変異体を含む。
【００４４】
ｍ個のアミノ酸の長さを有する疎水性修飾ペプチドの−末端配列（Ｘ）は、少なくとも４つのアミノ酸（すなわちｍ＝４）を含む。好ましくは、疎水性修飾ペプチドのＮ−末端配列（Ｘ）は、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８または１９個のアミノ酸からなり得る。すなわち、ｍは４から１９であり得る。
【００４５】
好ましい態様において、Ｘの１つ以上のアミノ酸は、好ましくはリジン、α−アミノグリシン、α，γ−ジアミノ酪酸、オルニチン、α，β−ジアミノプロピオン酸から選択され、さらに好ましくはリジンである、側鎖においてアミノ基を有する。側鎖においてアミノ基を有するＸのアミノ酸は、好ましくは、ＸのＮ−末端に位置し、側鎖においてアミノ基を有する１から１１（１−１１）、好ましくは１から３（１−３）個のアミノ酸が、ＸのＮ−末端に位置する。
【００４６】
好ましい態様において、疎水性修飾ペプチドのＮ−末端配列（Ｘ）は、好ましくは配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３（配列番号：１６）を含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は任意のアミノ酸であり得る。好ましくは、配列番号：１６のＸ１はＬ、ＩまたはＱ、さらに好ましくはＬである。好ましくは、配列番号：１６のＸ２はＴ、Ｖ、Ａであるか、または存在せず、好ましくはＴまたはＶ、さらに好ましくはＴである。好ましくは、配列番号：１６のＸ３はＰ、Ｓ、ＴまたはＦ、さらに好ましくはＰまたはＳ、よりさらに好ましくはＳである。好ましくは、配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３（配列番号：１６）は、ペプチドＰ（配列番号：１；ＮＰＬＧＦＸａａＰ）のＮ−末端に直接結合し、配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３ＮＰＬＧＦＸａａＰを含むペプチドとなり、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３およびＸａａは上記で定義のとおりである。
【００４７】
ｎ個のアミノ酸の長さを有する疎水性修飾ペプチドのＣ−末端配列（Ｙ）は、０または少なくとも１つのアミノ酸（すなわちｎ≧０）を含む。好ましくは、疎水性修飾ペプチドの−末端配列（Ｙ）は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２または９３個のアミノ酸からなり得る。すなわち、ｎは０から９３であり得る。
【００４８】
好ましい態様において、疎水性修飾ペプチドのＣ−末端配列（Ｙ）は、少なくとも４つのアミノ酸（ｎ＝４）からなり、好ましくは配列Ｘ４ＨＱＬＤＰ（配列番号：１７）を有し、ここで、Ｘ４は任意のアミノ酸である。好ましくは、配列番号：１７のＸ４は、Ｄ、ＥまたはＳ、さらに好ましくはＤまたはＥ、よりさらに好ましくはＤである。好ましくは、配列Ｘ４ＨＱＬＤＰ（配列番号：１７）は、ペプチドＰ（配列番号：１；ＮＰＬＧＦＸａａＰ）のＮ−末端に直接結合し、配列ＮＰＬＧＦＸａａＰＸ４ＨＱＬＤＰを含むペプチドとなり、ここで、Ｘ４およびＸａａは上記で定義のとおりである。
【００４９】
好ましい態様において、本発明の疎水性修飾ペプチドは、アミノ酸配列ＮＸ１ＳＸ２Ｘ３ＮＰＬＧＦＸａａＰＸ４ＨＱＬＤＰ（配列番号：１８）によってコードされるペプチドを含み、ここで、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４およびＸａａは上記で定義のとおりである。
【００５０】
「変異体」なる用語はまた、肝炎ウイルス属、例えば、ＨＢＶ株アルファ、ＨＢＶ株ＬＳＨ（チンパンジー単離）、ウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の種々のウイルス種、株またはサブタイプ、またはＨＢＶ遺伝子型ＡからＨ（配列番号：２−１３参照）からなる群から選択される株において見られる同種配列を示す。
【００５１】
「変異体」なる用語はまた、不変異体ＮＰＬＧＦＸａａＰ−ドメイン、および配列番号２−１３の隣接配列または本明細書に記載されている任意の他のアミノ酸配列を含むアミノ酸配列と少なくとも５０％配列同一性、好ましくは７０％、さらに好ましくは８０％、よりさらに好ましくは９０％または９５％配列同一性を示す同種配列を示す。
【００５２】
したがって、本発明の好ましい疎水性修飾ペプチドは、好ましくはＨＢＶまたはウーリーモンキーＨＢＶ（ＷＭＨＢＶ）の遺伝子型またはそれらの変異体の、種々のウイルス種、株またはサブタイプのアミノ酸配列を有する配列番号２から１３の変異体を含む。
【００５３】
配列番号２から１３の「変異体」はまた、配列が肝臓指向性を示す、好ましくは注射された用量の１０％以上が静脈内注射１時間後に肝臓組織に蓄積する限り、アミノ酸欠失、アミノ酸置換、例えば、他のアミノ酸または均等物（タンパク質アミノ酸と密接に構造的および空間的類似性を有する修飾アミノ酸）による保存的または非保存的置換、アミノ酸付加または均等物付加を含む変異体または「類似体」を含む。疎水性修飾ペプチドまたはその「変異体」の肝臓指向性は、好ましくは１時間後に注射された用量／ｇ肝臓組織の８０％以上、さらに好ましくは１時間後に注射された用量／ｇ肝臓組織の９０％以上、より好ましくは１時間後に注射された用量／ｇ肝臓組織の９５％以上である。
【００５４】
保存的アミノ酸置換は、一般的に、同じくクラスのアミノ酸中の置換に関する。これらのクラスは、例えば、
−非荷電極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシン；
−塩基性側鎖を有するアミノ酸、例えば、リジン、アルギニンおよびヒスチジン；
−酸性側鎖を有するアミノ酸、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸；および、
−非極性側鎖を有するアミノ酸、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンおよびシステイン
を含む。
【００５５】
「Ｎ−末端」は、ＸのＮ−末端、すなわちそれぞれの第１のアミノ酸残基を示すが、Ｎ−末端に極めて接近、例えば、それぞれのアミノ酸残基（−４）、（−３）、（−２）、（−１）、１、２または３または４での疎水性修飾も含む。したがって、標識および疎水性修飾の結合は、さらに、ＸのＮ−末端に近い部位で標識および疎水性部分の結合により得ることができる。
【００５６】
本発明の該疎水性修飾ペプチドの疎水性修飾は、ペプチドへ疎水性部分を付加する。
【００５７】
Ｘは、少なくとも１つの疎水性部分または基で修飾される。本発明の好ましい態様において、Ｘは、１、２、３、４またはそれ以上の疎水性部分または基で修飾される。すなわち、Ｘは、２つ以上、例えば２つの疎水性部分または基で修飾することができる。疎水性部分または基は、互いに同じか、または異なっていてもよい。本発明の該ペプチドの疎水性修飾は：
−アシル化；
−疎水性部分の付加
から選択される。
【００５８】
アシル化は、好ましくは、カルボン酸、脂肪酸、親油性側鎖を有するアミノ酸でのアシル化から選択される。好ましい脂肪酸は、好ましくは８から２２個の炭素原子（Ｃ８からＣ２２）を有する飽和または不飽和脂肪酸、分岐または非分岐脂肪酸である。さらに好ましくは、アシル化による疎水性修飾は、ミリストイル（Ｃ１４）、パルミトイル（Ｃ１６）またはステアロイル（Ｃ１８）でのアシル化から選択される。ミリストイル化による修飾は、より安全性が高い、例えばステアロイル基の副作用（先天性免疫応答など）を示さないため、インビボおよび医薬用途に好ましい。疎水性部分の付加は、コレステロール、コレステロールの誘導体、リン脂質、糖脂質、グリセロールエステル、ステロイド、セラミド、イソプレン誘導体、アダマンタン、ファルネソール、脂肪族基、多環芳香族性化合物の付加から選択されるのが好ましい。疎水性部分の結合は共有結合によるのが好ましく、この結合は、カルバメート、アミド、エーテル、ジスルフィド、当業者の技術内である任意の他の結合を介してなし遂げることができる。したがって、本発明の疎水性修飾された、好ましくはアシル化ペプチドは、Ｎ−末端において親油性または疎水性基／部分があるためリポペプチドであるのが好ましい。
【００５９】
ＹのＣ−末端修飾（Ｒ）は、好ましくは、分解、例えば、インビボ分解から保護する部分での修飾である。
【００６０】
「Ｃ−末端」は、Ｃ−末端、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基での修飾を示すが、Ｃ−末端に極めて近くの、例えば、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目のアミノ酸残基または最後から３番目以上のアミノ酸残基での修飾（例えば、例えばカルボキシペプチダーゼの作用による、酵素分解から担体を保護する１つのＤ−アミノ酸の導入）も含む。当業者は、それぞれの用途に依存して、それぞれの適当な部分を選択することができる。分解から保護する好ましい部分は、アミド、Ｄ−アミノ酸、修飾アミノ酸、環状アミノ酸、アルブミン、天然および合成ポリマー、例えば、ＰＥＧ、グリカンから選択される。さらに、ｏは０または少なくとも１であり、すなわちＣ−末端修飾（Ｒ）は任意である。好ましくは、ｏは１である。本発明のさらなる態様において、ｏは１、２、３、４またはそれ以上である。すなわち、疎水性修飾ペプチドのＣ−末端またはその近くは、２つ以上の部分または基、例えば２つで修飾することができる。部分または基は、互いに同じか、または異なっていてもよい。
【００６１】
本発明の態様において、疎水性修飾および／またはＲは、リンカーまたはスペーサーを介してペプチドに連結される。リンカーまたはスペーサー、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、（ＣＨａ）ｎ基は、当業者に知られている。したがって、当業者は、それぞれの適用に依存して、それぞれの適当なリンカーまたはスペーサーを選択することができる。
【００６２】
任意のアンカー基（Ａ）は、化合物、タグ、標識に対する結合点として働き、Ｙのアミノ酸に位置する。すなわち、少なくとも１つのアンカー基（Ａ）が存在（すなわちｐ≧１）する場合、Ｙも、少なくとも１つ（すなわちｎ≧１）のアミノ酸を含む。好ましい態様において、アンカー基は、Ｙの「Ｃ−末端」であり、「Ｃ−末端」は、Ｃ−末端、すなわちそれぞれの最後のアミノ酸残基での修飾を示すが、Ｃ−末端の極めて近く、例えば、最後から２番目のアミノ酸残基、最後から３番目のアミノ酸残基または最後から３番目以上のアミノ酸残基も含む。この場合、ｏは０であり得、したがって他のＣ−末端修飾Ｒが存在しないこともある。アンカー基Ａは、Ｙのアミノ酸側鎖にあるか、またはＹのアミノ酸側鎖自体であってよく、すなわちＡは、側鎖自体または修飾側鎖であり得る。アンカー基はまた、アンカー基として働くようにＹのアミノ酸配列に導入された修飾アミノ酸残基であり得る。本発明の他の態様において、アンカー基Ａは、Ｘの疎水性修飾および／またはＣ−末端修飾Ｒに結合される。好ましいアンカー基は、エステル、エーテル、ジスルフィド、アミド、チオール、チオエステルから選択される。当業者は、結合されるそれぞれの化合物、タグ、標識などに依存して、それぞれの適当なアンカー基を選択することができる。アンカー基はさらに、例えば、ビオチン／アビジン、ポリアルギニン／オリゴヌクレオチド（例えばｓｉＲＮＡ）複合体の、複合体形成成分に結合させるために適当であり得る。さらに、ｏは０または少なくとも１であり、すなわちアンカー基（Ａ）は任意である。好ましくは、ｏは１である。本発明のさらなる態様において、ｏは１、２、３、４またはそれ以上である。すなわち、２つ以上のアンカー基、例えば、２つが存在する。アンカー基は、互いに同じか、または異なっていてもよく、いくつかの化合物、例えば、標識または異なる標識の結合を可能にする。
【００６３】
疎水性修飾ペプチドの合成
本発明のペプチドは、当業者に容易に知られている種々の処理、一般的に合成化学処理および／または遺伝子操作処理により、調製することができる。合成化学処理はさらに特に、固相逐次およびブロック(block)合成（Erickson and Merrifield, 1976）を含む。より詳細は、ＷＯ２００９／０９２６１２から得ることができる。
【００６４】
固相逐次処理は、例えば、自動ペプチドシンセサイザーの使用により、確立された自動方法を使用して行うことができる。この処理において、［アルファ］−アミノ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合させる。使用される樹脂支持体は、（ポリ）ペプチドの固相調製のための当分野で慣用に使用される任意の適当な樹脂、好ましくはポリオキシエチレンでコポリマー化され、最初に導入されるｏ−アミノ保護アミノ酸でのエステル形成のための部位を提供するポリスチレンであり得る。本発明者らにより適用されたこの最適な方法は、明白に記載されている（例えば１２参照）。アミノ酸を一つずつ（段階的に）導入する。１つのアミノ酸の導入に対応するそれぞれの合成サイクルは、脱保護工程、連続洗浄工程、アミノ酸の活性化でのカップリング工程、および後の洗浄工程を含む。これらの工程のそれぞれに続いて濾過を行う。カップリングのための反応剤は、（ポリ）ペプチド合成のための従来反応剤、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヒドロキシベンゾトリアゾール、ベンゾトリアジル−１−イル−オキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、およびジフェニルホスホリルアジドである。樹脂上でのポリペプチドの合成後、ポリペプチドは、アニソール、エタンジチオールまたは２−メチルインドールの存在下で、強酸、例えば、トリフルオロ酢酸での処理により樹脂から分離される。次に、化合物を、精製の従来技術、特にＨＰＬＣの手段により精製する。
【００６５】
本発明のペプチドはまた、選択的に保護される（ポリ）ペプチドフラグメントをカップリングすることにより得ることができ、このカップリングは例えば溶液中で行われる。ペプチドはさらに、当業者に知られている遺伝子操作技術により生産することができる。真核発現系、例えば、バキュロウイルス系が、特に適当である。この処理によって、タンパク質は、異種タンパク質をコードする核酸配列および調節核酸配列、例えば、プロモーターを含む組換えバキュロウイルスに感染した昆虫細胞において発現させる。いくつかの細胞株、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＣＲＬ  １７１１）から利用できる細胞系Ｓｆ−９を、組換えバキュロウイルスでの感染のために利用できる。原核生物発現系、例えば、大腸菌における発現もまた、特に適当である。
【００６６】
ペプチドへの疎水性部分の導入は、当業者に容易に知られている種々の処理、例えば、合成および遺伝子操作処理により成し遂げることができる。
【００６７】
あるいは、ペプチドおよび／または融合ペプチド（すなわち、疎水性修飾ペプチド）は、安定にトランスフェクトされた真核細胞系、例えば、ＣＨＯおよび当分野で知られており、ワクチンを作製するために通常使用される他の細胞系などにより生産することができる。Ｎ−末端の４７−ｐｒｅＳｌアミノ酸がミリストイル化タンパク質／ペプチドの分泌を促進する内因性特性のために、生物学的に活性な疎水性修飾ペプチドは、細胞培養上清から抽出することができる。
【００６８】
肝臓標的化のためのベクターおよびシャトル
上記で概説されているとおり、本発明は、本明細書に記載されている疎水性修飾ペプチドと結合されている化合物（標識）の肝臓への特異的送達のためのビヒクルまたはシャトルとしての疎水性修飾ペプチドの使用を提供する。
【００６９】
本発明による肝臓への化合物の特異的送達のための「ビヒクル」または「シャトル」は、本発明者らにより見出され、本明細書に記載されている疎水性修飾ペプチドの肝臓指向性または肝指向性、すなわち肝臓に選択的に蓄積する、好ましくは肝細胞の細胞膜に選択的に蓄積する、ならびに肝細胞に選択的に入る能力を示す。本発明は、本発明者らによる、高度に特異的な肝臓蓄積の発見およびＨＢＶのｐｒｅＳ  １配列におけるＨＢＶの肝臓指向性の決定因子の同定に基づく。したがって、本発明は、特異的な肝臓標的化または送達それぞれのための普遍的なビヒクルまたはシャトルの設計のために、肝臓指向性の決定因子についての知識を使用する。本発明の疎水性修飾ペプチドは、肝臓に化合物を特異的に送達させるための汎用ビヒクルまたはシャトルである。
【００７０】
好ましくは、肝臓への化合物の特異的送達は、肝細胞への化合物の特異的送達である。さらに、化合物は、インビトロならびにインビボで肝細胞に特異的に送達することができる。好ましくは化合物は、動物、好ましくは哺乳動物またはヒト、または鳥類の肝臓に特異的に送達される。
【００７１】
送達される標識
本発明において肝臓に特異的に送達される標識は、診断目的のために適当であるあらゆる種の化合物であり得る。好ましくは、標識は、二価または三価金属カチオンとの複合体を形成するキレート化剤を含む。
【００７２】
本発明の好ましい態様において、標識は、蛍光色素、放射性同位体および造影剤から選択される。本発明にしたがって、造影剤は、体内の異常地域を示す手助けをする色素または他の物質である。
【００７３】
好ましい放射性同位体／蛍光放出アイソトープは、アルファ放射線放出アイソトープ、ガンマ放射線放出アイソトープ、オージェ電子放出アイソトープ、Ｘ−線放出アイソトープ、蛍光放出アイソトープ、例えば、１８Ｆ、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ，８８Ｙ、９０Ｙ、１４９Ｐｍ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄ、２１２Ｂｉ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９７Ｒｕ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０１ｍ１５Ｒｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１３１Ｉ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、１６９Ｅｕ、２０３Ｐｂ、２１２Ｐｂ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１９８Ａｕおよび１９９Ａｇからなる群から選択される。
【００７４】
好ましい蛍光色素は、以下の種類の色素：キサンテン(Xanthens)（例えば、フルオレセイン）、アクリジン（例えば、アクリジンイエロー）、オキサジン（例えば、オキサジン１）、シアニン（例えば、Ｃｙ７／Ｃｙ３）、スチリル色素（例えば、Ｄｙｅ−２８）、クマリン（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０）、ポルフィン（例えば、クロロフィルＢ）、金属−リガンド−複合体（例えば、ＰｔＯＥＰＫ）、蛍光タンパク質（例えば、ＡＰＣ、Ｒ−フィコエリトリン）、ナノ結晶（例えば、ＱｕａｎｔｕｍＤｏｔ  ７０５）、ペリレン（例えば、Ｌｕｍｏｇｅｎ  Ｒｅｄ  Ｆ３００）およびフタロシアニン（例えば、ＩＲＤＹＥＴＭ７００ＤＸ）ならびにこれらの種類の色素の抱合体および組合せから選択される。好ましい造影剤は、好ましくはキレート化剤と複合体化されている、常磁性剤、例えば、Ｇｄ、Ｅｕ、ＷおよびＭｎから選択される。さらなる選択肢は、超磁性鉄（Ｆｅ）錯体および粒子、コンピュータートモグラフィー（ＣＴ）のための高い原子番号の原子、すなわちヨウ素を含む化合物、これらの造影剤を含むマイクロバブルおよび担体、例えば、リポソームである。
【００７５】
キレート化剤
肝細胞に特異的に送達される標識は、それぞれの標識との複合体を形成することができるキレート化剤との複合体の形成において疎水性修飾ペプチドに結合され得る。本発明の好ましい態様において、キレート化剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、トリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）、イミノ二酢酸、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’’−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）および６−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸（ＨＹＮＩＣ）からなる群から選択されるが、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）が特に好ましい。
【００７６】
疎水性修飾ペプチドへの標識のカップリング
Ｘのそれぞれのアミノ酸への標識のカップリングは、当業者に知られている任意の適当な方法により行われ得る。
【００７７】
本発明の好ましい態様において、標識は、活性化エステルを使用することによりＸのそれぞれのアミノ酸と結合される。特に、側鎖においてアミノ基を有するＸのアミノ酸へ標識をカップリングする場合、この方法を使用することができる。あるいは、非常に要約されている以下のカップリング方法を、Ｘのそれぞれのアミノ酸へ１つ以上の標識をカップリングするために使用することができる。リンカー有または無での、アミノ酸への標識のカップリングを達成するための特定の反応条件は、化学者により容易に決定することができる。
【００７８】
−アミンおよび活性化カルボン酸、好ましくはＮＨＳ−エステルまたはカルボジイミドの反応によるアミドの形成；カルボジイミドは、第一級アミンへのカルボキシルの直接結合を促進する完全架橋剤である。ＮＨＳエステルは、カルボキシレート基を含む分子のカルボジイミド活性化により形成される反応基である。
【００７９】
−ピリジルジスルフィドと特異的に反応する２つのチオールまたは１つのチオールを使用するジスルフィド結合；ピリジルジスルフィドは、広範なｐＨ範囲にわたって（最適はｐＨ４−５である）スルフヒドリル基と反応し、ジスルフィド結合を形成する。該反応中、ジスルフィド結合が、分子のＳＨ基および２−ピリジルジチオール基間で起こる。結果として、ピリジン−２−チオンが放出される。
【００８０】
−マレイミドまたはハロアセチルおよびチオール成分を使用するチオエーテル形成；ハロアセチルは、生理学的ｐＨでスルフヒドリル基と反応する。ヨードアセチル基の反応は、スルフヒドリル基由来の硫黄原子でのヨウ素の求核置換により進行し、安定なチオエーテル結合をもたらす。マレイミド基は、反応混合物のｐＨがｐＨ６．５から７．５であるとき、スルフヒドリル基と特異的に反応し、可逆性ではない安定なチオエーテル結合を形成する。
【００８１】
−イミドエステルおよびアミンを使用するアミジン形成；イミドエステル架橋剤は、アルカリ性ｐＨでアミンと迅速に反応するが、短い半減期を有する。ｐＨがさらにアルカリ性になるとき、半減期およびアミンとの反応性は増加される；したがって、架橋は、ｐＨ１０で行われるとき、ｐＨ８よりもさらに効率的である。ｐＨ１０未満の反応条件は、副反応をもたらし得、アミジン形成はｐＨ８−１０が好ましい。
【００８２】
−カルボニル（例えば、アルデヒド）およびヒドラジドを使用するヒドラジド結合；カルボニル（アルデヒドおよびケトン）は、ｐＨ５−７でヒドラジドおよびアミンと反応する。カルボニルは、タンパク質中に容易に存在しない；しかしながら、メタ過ヨウ素酸ナトリウムを使用する糖グリコールの穏やかな酸化は、隣接ヒドロキシルをアルデヒドまたはケトンへ変換する。ヒドラジドでの後の反応は、ヒドラゾン結合の形成をもたらす。
【００８３】
−還元条件下でカルボニルおよびアミンを使用するアミン結合；還元的アミノ化（還元的アルキル化としても知られている）は、中間体イミンを介するカルボニル基のアミンへの変換を含むアミノ化の型である。カルボニル基は、最も一般的にはケトンまたはアルデヒドである。
【００８４】
−ニトリルおよびアジドを使用する銅触媒トリアゾール形成。アジドおよび末端または内部アルキン間のヒュスゲン型１，３−双極性環状付加を使用して、安定な１，２，３−トリアゾールを得る。
【００８５】
−イソチオシアネートおよびアミンを使用するイソチオウレア形成；イソチオシアネートおよびアミン間の反応、すなわちリジンのε−アミノ基は、安定なイソチオウレア結合をもたらす。
【００８６】
−アルコールおよび活性化カルボン酸、好ましくは酸塩化物またはカルボジイミドの反応によるエステルの形成；高い温度反応は、アルコールおよびカルボン酸間の直接的反応を可能にし、安定なエステル、あるいはカルボン酸を形成し、酸性または塩基性触媒条件下で活性化される。
【００８７】
−アルコールおよびハロゲン化アルキルの反応によるエーテルの形成。ハロアルカンは、求核反応性である。それらは極性分子であり：ハロゲンが結合する炭素は、わずかに陽性であり、ハロゲンはわずかに電気陰性である。これは、必然的に求核原子を引きつける電子不足（求電子）炭素をもたらす。
【００８８】
標識のためのリンカー／スペーサー
本発明の疎水性修飾ペプチド、特に抱合体は、好ましくは、肝臓中に、肝臓にシャトルされる標識を濃縮するために使用される。好ましくは、標識を、特にインビボで肝臓中で、肝臓タンパク質、好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素により、疎水性修飾ペプチドから開裂させる。標識および疎水性修飾ペプチドは抱合体を形成する。好ましくは、標識および疎水性修飾ペプチドの抱合体は、共有結合または複合体形成により形成される。結合の形態は、標識の型に依存する。
【００８９】
Ｘのそれぞれのアミノ酸への標識のカップリングは、スペーサーまたはリンカーを使用することにより行われ得る。リンカーまたはスペーサー、例えば、ポリアラニン、ポリグリシン、炭水化物、（ＣＨ２）ｎ基またはアミノ酸配列は、当業者に知られている。したがって、当業者は、それぞれの適用に依存してそれぞれの適当なリンカーまたはスペーサーを選択することができる。好ましくは、スペーサーまたはリンカーは、好ましくは肝臓または腫瘍特異的タンパク質により認識される、肝細胞特異的活性化のための認識部位を含む。認識部位は、好ましくはタンパク質分解切断部位である。したがって、肝臓タンパク質は、好ましくは肝細胞タンパク質、さらに好ましくは肝細胞タンパク質分解酵素または腫瘍において過剰発現されるタンパク質分解酵素、例えばＭＭＰ７である。したがって、抱合体は、対象に投与することができ、身体中、例えば、体液中に、開裂されることなく輸送される。しかしながら、抱合体が標的、肝臓または肝細胞それぞれに到達するとすぐに、肝臓タンパク質、例えば、肝細胞タンパク質分解酵素はタンパク質分解切断部位を開裂し、シャトル、すなわち疎水性修飾ペプチドから標識を放出する。
【００９０】
さらに好ましい肝臓タンパク質は、シトクロム、例えば、シトクロムＰ４５０またはエンドサイトーシス経路のリアーゼである。アデフォビルまたはプラデフォビル(Pradevofir)において使用されるＨｅｐＤｉｒｅｃｔ（Ｒ）技術（Metabasis Technologies, Inc.）もまた、本発明のために適当である。
【００９１】
癌腫、例えば、大腸癌腫の転移による腫瘍性変化のような腫瘍疾患の診断および予後に特に重要なのは、悪性組織および周囲組織間の交流である。健常上皮細胞の活性化および／または原発性腫瘍の遠隔転移の形成のための必要条件である免疫細胞の動員の必要性がある。組織分析は、マトリックス−メタロ−プロテアーゼ（ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９およびＭＭＰ１２）の腫瘍特異的ｍＲＮＡ発現レベルが、腫瘍患者の悪い予後と関連することが示されている（Gentner Bら Anticancer Res. 2009 Jan; 29(1) :67-74）。これらのプロテアーゼから、とりわけＭＭＰ７は、腫瘍細胞により主に発現されるため、非常に興味がある。ＭＭＰ７（例えば、短いペプチド配列ＧＣＨＡＫまたはＲＰＬＡＬＷＲＳ）、また全ての他のＭＭＰ７基質（例えば、フィブロネクチン、エラスチン、カゼインまたは他のもの）に対する特異的なタンパク質分解結合部位を含むリンカー配列を介する記載のペプチド配列への標識のカップリングは、上記手段により元のペプチドの修飾を介して肝臓に不活性な標識を送達することを可能にさせる。肝臓において、次に、修飾ペプチドは、腫瘍組織の周囲で優先的に開裂され、不活性な標識を活性化させる。上記ＭＭＰの１つを過剰発現する肝臓における肝臓標的化原発性肝細胞癌腫または転移（例えば、大腸癌腫転移）への標識送達のこの方法は、腫瘍組織への標識の標的化の新規方法を示す。
【００９２】
１つの態様において、標識および疎水性修飾由来ペプチドの抱合体は、複合体形成により形成される。本発明において有用な好ましい複合体は、ビオチン／アビジン、ポリアルギニン／オリゴヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）である。当業者は、適当な複合体成分を決定すること、および化合物および疎水性修飾ペプチドを設計することができる。
【００９３】
肝臓疾患の診断
好ましい態様において、本発明の上記疎水性修飾ペプチド、特に標的とその抱合体は、肝臓疾患または障害の診断のために提供される。
【００９４】
診断される肝臓疾患または障害に依存して、それぞれの標的は、選択され、選択的に、肝臓に特異的に送達される。本発明の「肝臓疾患」または「肝臓障害」は、肝臓、肝臓組織または肝細胞に影響する、またはこれらに関与するあらゆる疾患または障害を示す。
【００９５】
肝臓疾患の例は：
−肝臓癌：通常、胃腸管の他の部分に由来する原発性肝細胞癌腫（ＨＣＣ）または胆管癌腫および転移性癌；優先的に結腸直腸癌腫、
−肝炎：主に種々のウイルスにより引き起こされるが、特定の毒、自己免疫または遺伝的状態によっても引き起こされる肝臓の炎症；
−肝硬変症：死滅肝細胞に置き換わる肝臓における線維組織の形成。肝細胞の死滅は、例えば、ウイルス肝炎、アルコール依存症または他の肝臓毒性化学物質との接触により引き起こされ得る；
−ヘモクロマトーシス：身体における鉄の蓄積を引き起こし、結局は肝臓損傷をもたらす遺伝的疾患；
−ウィルソン病：銅が身体に保持される遺伝的疾患；
−原発性硬化性胆管炎：事実上自己免疫性である胆管の炎症性疾患；
−原発性胆汁性肝硬変：小胆管の自己免疫疾患；
−バッド・キアリ症候群：肝静脈の閉塞；
−ジルベール症候群：集団の約５％に見られるビリルビン代謝の遺伝性障害；
−ＩＩ型糖原病：全身の進行性の筋衰弱（ミオパチー）を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系における種々の体内組織に影響を与えるグリコーゲンの蓄積；
−小児肝疾患、例えば、胆道閉鎖症、アルファ−１−アンチトリプシン欠乏症、アラジール症候群、および進行性家族性肝内胆汁うっ滞；
−代謝疾患
である。
【００９６】
さらに、動物、例えば、ペットまたは家畜の肝臓疾患はまた、特に動物に伝播し得る疾患、例えば、トキソプラズマ症を含む。
【００９７】
診断される肝臓疾患または障害は、好ましくは原発性肝細胞癌腫、他の腫瘍の転移、肝炎、肝硬変症、ヘモクロマトーシス、好ましくはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ型の肝炎ウイルスにより引き起こされる肝炎から選択される。診断される肝臓疾患または障害はまた、ウイルス、例えば、ヘルペスウイルス科のウイルス、例えばヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）により、また水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、コクサッキーウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルスにより引き起こされる同時肝炎であり得る。
【００９８】
診断される肝臓疾患または障害はまた、例えば、多くの熱帯病における、ウイルスまたは非ウイルス病原体の肝臓期に関わる疾患であり得る。いくつかの病原体の肝臓期が初期であるため、それぞれの感染は、このような初期に選択的に、特異的に処置することができる。このようなウイルスは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ型の肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスである。
【００９９】
このような非ウイルス病原体は、細菌、寄生生物および／または虫である。寄生生物は、例えば、マラリアを引き起こすプラスモジウム（Plasmodium）属の寄生原生動物、例えば、熱帯マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、および関連種（例えば、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowles)）である。このような虫は、例えば、住血吸虫症またはビルハルツ住血吸虫症を引き起こすシストソーマ（Schistosoma）属の扁形動物、例えば、マンソン住血吸虫（Schistosoma mansoni）、インターカラタム住血吸虫（Schistosoma intercalatum）、ヘマトビウム住血吸虫（Schistosoma haematobium）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）およびメコン住血吸虫（Schistosoma mekongi）である。このような寄生生物はまた、例えば、リーシュマニア症に関与するサンショウバエ（Phlebotomus）属およびルツォミヤ（Lutzomyia）属のリーシュマニアトリパノソーマ（Leishmania trypanosome）原生生物である。したがって、マラリア、住血吸虫症（ビルハルツ住血吸虫症）、および／またはリーシュマニア症は、本発明の手段により診断することができる。したがって、特定の熱帯病は、本発明の手段により診断することができる。
【０１００】
診断される肝臓疾患または障害は、好ましくは肝腫瘍、好ましくは肝細胞癌腫（ＨＣＣ）または固形腫瘍、例えば結腸直腸癌腫である。
【０１０１】
本発明の好ましい態様において、上記疎水性修飾ペプチドは、肝臓の原発性腫瘍性病変、例えば、早期肝細胞癌腫の早期診断および分類のために使用される。
【０１０２】
本発明の別の好ましい態様は、肝臓における早期転移性病変、例えば、結腸直腸癌腫（ＣＲＣ）の転移の診断のための上記疎水性修飾ペプチドの使用である。
【０１０３】
診断される肝臓疾患または障害はまた、代謝疾患、例えば、糖尿病、脂質異常症、メタボリック・シンドロームおよび肥満、慢性高血糖、メタボリック・シンドローム、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であり得る（（９）も参照）。
【０１０４】
本発明の好ましい態様において、上記疎水性修飾、好ましくはアシル化由来ペプチド、特に標識とのそれらの抱合体は、肝臓疾患または障害の診断のための医薬の製造のために使用することができる。
【０１０５】
医学的イメージング
本発明の疎水性修飾ペプチドは、当業者に知られている医学的イメージングにおいて使用することができる。適当な方法は、Ｘ−線イメージング、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、シングルフォトン放出コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、Ｘ−線コンピューター断層撮影（ＣＴ）およびこれらの方法の組合せ（例えば、ＰＥＴ−ＣＴ、ＣＴ−ＭＲＩ）である。これらの医学的イメージング方法を実施するための特定の条件は、当業者に知られている。
【０１０６】
医薬組成物
上記で概説されているとおり、本発明は、本明細書に定義されている少なくとも１つの疎水性修飾ペプチドおよび本明細書に定義されている肝臓に特異的に送達される少なくとも１つの化合物、および所望により薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１０７】
本発明の医薬組成物は、
−上記定義の少なくとも１つの疎水性修飾ペプチド；
および
−所望により薬学的に許容される担体および／または賦形剤
を含む。
【０１０８】
本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されている全ての使用および方法に非常に適している。
【０１０９】
「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、本発明の医薬またはワクチン組成物が製剤化され得るあらゆるビヒクル、または本発明の医薬またはワクチン組成物と共に製剤化され得るあらゆるビヒクルを示す。それは、塩水、例えば、リン酸緩衝生理食塩水、クエン酸バッファー、ＮａＣｌ、オクチルグルコシドおよび／またはポロキサマーを含む。一般的に、希釈剤または担体は、投与様式および経路、ならびに標準医薬経験に基づいて選択される。
【０１１０】
診断方法
さらに、上記で概説されているとおり、本発明は、本発明の上記疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物を利用することによる、肝臓疾患または障害の予防および／または処置のための方法を提供する。
【０１１１】
本発明はまた、本明細書に定義されている疎水性修飾由来ペプチドおよび標識または医薬組成物を対象に投与することによる、肝臓疾患または障害の診断のための方法を提供する。本発明の肝臓疾患または障害の診断のための方法は、診断有効量において、
（ａ）本明細書に定義されている疎水性修飾ペプチドおよび本明細書に定義されている少なくとも１つの標識、または
（ｂ）本明細書に定義されている医薬組成物
を対象に投与することを含む。
【０１１２】
投与経路
好ましくは、特に処置方法における、本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の投与経路は、皮下、静脈内、経口、経鼻、筋肉内、経皮、吸入、坐薬投与経路から選択される。経鼻投与または適用のための好ましい態様は、鼻腔用スプレーである。
【０１１３】
さらなる好ましい態様において、標識を含む本発明の疎水性修飾ペプチドは、患者からの血清に溶解されるか、または、注射を介して適用される。
【０１１４】
診断有効量
本発明の疎水性修飾ペプチドまたは医薬組成物の「診断有効量」は、それぞれの肝臓疾患または障害を診断するために十分である量を示す。好ましい診断有効量は、送達され、それぞれの診断可能性のあるそれぞれの化合物に依存する。当業者は、適当な診断有効量を決定することができる。好ましい態様において、診断有効量は、１０ｐｍｏｌ／ｋｇから２０μｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲である。診断薬（すなわち、標識が疎水性修飾ペプチドと結合されている）としての使用のための、患者に適用される量は、好ましくは１００ｎｍｏｌから２μｍｏｌの範囲、さらに好ましくは約５００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である。医学的イメージング方法としてＭＲＩを使用するとき、それぞれの疎水性修飾ペプチドは、好ましくは、３００ｎｍｏｌから８００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重、さらに好ましくは４００から６００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の範囲の量において患者に適用される。
【０１１５】
本発明の好ましい疎水性修飾ペプチド
以下において、本発明の好ましい疎水性修飾ペプチドを挙げる。これらの疎水性修飾ペプチドは、アミノ酸配列ＫＫＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ（配列番号．１４）またはＫＫＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（配列番号．１５）に基づき、１または２つのＮ−末端リジン（Ｋ）が欠失されていてもよく、または別のアミノ酸に置換されていてもよい。典型的な好ましい疎水性修飾ペプチドは、以下の化学構造を有する：
【化１】
2014510050.tif 000014
【０１１６】
上記の例示された化学構造を有する化合物のアミノ酸配列は：
３つのキレート化剤、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ，Ｎ’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）複合体、Ｇｄカチオンのそれぞれが、３つのＮ−末端リジン（ＫＫＫ）のそれぞれに結合されており、第１のＮ−末端リジンが疎水性ステアロイル基でさらに修飾されているステアロイル−Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）ＮＬＳＴＳＮＰＧＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドである。この結合において、上記の例示された疎水性修飾ペプチドも示すことができるように、本発明の疎水性修飾ペプチドの式は、簡略化されていることに注意すること。
「ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド」
【０１１７】
以下において、本発明の好ましい疎水性修飾ペプチドならびに肝臓の疾患または障害の診断におけるこれらの特定の使用を挙げる：
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ−アミド
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ−アミド
−ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＰＤ−アミド
【０１１８】
表１  好ましい疎水性修飾ペプチド
【表１３】
2014510050.tif 000015
ステアロイルは、Ｎ−末端のステアロイル化を示す
【０１１９】
以下の実施例および図面は、本発明を説明するが、しかしながら、それらに限定しない。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】ＨＢＶ粒子およびＨＢＶ  Ｌ−、Ｍ−およびＳ−タンパク質の略図。部分的に二本鎖のＤＮＡは、末端タンパク質、（ＴＰ）、逆転写酵素（ＲＴ）およびＲＮａｓｅＨからなるウイルスポリメラーゼ複合体と共有結合する。ゲノムは、１２０個のコアタンパク質二量体から構成される２０面体シェルによりカプセル化される。３つのＨＢＶ表面タンパク質Ｌ−、Ｍ−およびＳ−は、ＥＲ由来脂質二重層に組み込まれている。Ｌ−およびＭ−タンパク質は、膜アンカーとして働く完全Ｓ−ドメインを含む。ＨＢＶの部分的に二本鎖のＤＮＡゲノムの略図；Ｃ＝ウイルスカプシドを形成するコアタンパク質；Ｘ＝Ｘタンパク質、未定義の機能を有する多面的転写活性化因子；Ｐ＝ウイルスポリメラーゼ；ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ組合せの形態、大型（ｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ）ＨＢＶ表面タンパク質（Ｌタンパク質）、中型（ｐｒｅＳ２／Ｓ）ＨＢＶ表面タンパク質および小型（Ｓ）ＨＢＶ表面タンパク質。
【０１２１】
【図２】本発明の疎水性修飾ペプチドおよび本発明の疎水性修飾ペプチドの一例の一般式の接続図。
【０１２２】
【図３】肝細胞の表面への本発明の疎水性修飾ペプチドの結合の接続図。
【０１２３】
【図４】腫瘍を有するラットのＰＥＴイメージ。図４Ａ、ｉ．ｖ．注射５分後のＷＡＧ／Ｒｊｉラットの肝臓における４００ｎｍｏｌ／ｋｇのステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドの特異的濃縮。図４Ｂ、最初の測定２４時間後に１８Ｆ−ＦＤＧを使用する対比染色。１８Ｆ−ＦＤＧは、多い量のグルコースを消費する臓器において豊富であり、図において心臓（上側のグレー色の塊）および腫瘍は、グルコースが豊富である（脳において豊富な１８Ｆ−ＦＤＧは、技術的理由のために示されない）。図４Ｃ、腫瘍組織ではなく肝臓組織のみだけの、ペプチド染色の特異性を証明する両方のイメージの合併。
【０１２４】
【図５】図５は、６００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重のステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰの注射前（図５Ａ）ならびに注射２０分後（図５Ｂ）および注射３０分後（図５Ｃ）のラットの典型的なＭＲＩイメージシリーズを示す。
【０１２５】
【図６】図６は、肝臓、筋肉組織および心臓におけるＭＲＩ測定により測定された対照増強を示す。
【０１２６】
【図７】等モル量（１ｍＭ）においてＰＢＳに溶解されたペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｘ）、ＰｒｉｍｏｖｉｓｔＴＭ、ＭａｇｎｅｖｉｓｔＴＭおよびＶａｓｏｖｉｓｔＴＭのＲ１緩和能。
【０１２７】
【図８】等モル量（１ｍＭ）においてＰＢＳに溶解されたペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｘ）、ＰｒｉｍｏｖｉｓｔＴＭ、ＭａｇｎｅｖｉｓｔＴＭおよびＶａｓｏｖｉｓｔＴＭのＲ２緩和能。
【０１２８】
【図９】マウスにおける１１１Ｉｎ標識疎水性修飾ペプチドの臓器分布。
【０１２９】
【図１０】非−不活性ヒト血清中のステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドの安定性。
【実施例】
【０１３０】
以下の実施例において、ＤＯＴＡと複合体化された標識としてＧｄ、６８Ｇａまたは１１１Ｉｎを有する疎水性ペプチド（ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド、ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドまたはステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［１１１Ｉｎ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド）を、本発明の典型的な生産物として使用した。他に記載がない限り、種々の医学的イメージング方法を使用するインビボ実験は、ＷＡＧ／Ｒｉｊラットを使用することにより実施されている。
【０１３１】
実施例１
疎水性修飾ペプチドの合成
ペプチドの合成を、(10) Gripon, Pら J Virol 79, 1613-1622 (2005)に記載されているＦｍｏｃ方法を使用することにより行った。
【０１３２】
ＤＯＴＡ−ＤＦＰ合成
ジイソプロピルカルボジイミド（５ｍｍｏｌ、６３１ｍｇ、７７４μｌ）を、ピリジン（１５ｍｌ）に溶解し、水（６０ｍｌ）中のＤＯＴＡ（５ｍｍｏｌ、２．０２ｇ）およびジフルオロフェノール（５ｍｍｏｌ、６５０ｍｇ）の溶液に１０分間にわたって撹拌しながら滴下した。添加３０分後、反応混合物をジクロロメタンで３回抽出し、回転エバボレーターを使用することにより、水相を蒸発させ乾燥させた。粗生産物を水（１１ｍｌ）およびアセトニトリル（３ｍｌ）の混合物に溶解し、分取ＲＰ−ＨＰＬＣを介して精製した。生産物を含むＨＰＬＣ画分を、凍結乾燥により濃縮した。収量：１．０６３３ｇ（４１％）。
【０１３３】
ペプチドへのカップリング
ペプチドステアロイル−ＫＫＫＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド（１４０ｍｇ、０．０５５ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＤＭＦに溶解した。ＤＯＴＡ−ＤＦＰ（１２９ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を加え、さらに、ＤＩＰＥＡ（４１０μｌ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０℃で一晩撹拌した。ジエチルエーテルを沈殿するまで加えた；沈殿を遠心を使用することにより分離し、ジエチルエーテルで２回洗浄した。粗生産物をＲＰ−ＨＰＬＣを使用することにより精製した。精製を、両方とも０，１％のトリフルオロ酢酸を含む水およびアセトニトリルの勾配を使用することにより行った。生産物を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥により濃縮した。収量：１１２ｍｇ（５５％）。
【０１３４】
Ｇｄ３＋の複合体化
ペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド（１１２ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を０．４Ｍの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）に溶解し、ＧｄＣｌ３＊６  Ｈ２Ｏ（３３５ｍｇ、０．９０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を撹拌しながら水浴中で１時間加熱した。生産物の得られた混合物を、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用することにより精製した。精製を、両方とも０，１％のトリフルオロ酢酸を含む水およびアセトニトリルの勾配を使用することにより行った。生産物（ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミド）を含むＨＰＬＣ画分を凍結乾燥により濃縮した。収量：９４ｍｇ（７７％）。
【０１３５】
実施例２
ＰＥＴにおけるイメージング
ペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドをクエン酸バッファー（ｐＨ８．０）＋４％  ＢＳＡ中に溶解させ、腫瘍を有するラットの尾の静脈にｉ．ｖ．注射した。測定の１０日前に、ラットに１ｘ１０６個の同系大腸癌腫細胞（ＣＣ５３１細胞）を同所性に注入した。測定の日に、ラットに４００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の濃度においてペプチドを与えた。実験中、ラットをイソフルランにより麻酔し、３７℃で維持した。ＰＥＴイメージングを、ＳｉｅｍｅｎｓからのＩｎｖｅｏｎ小動物ＰＥＴを使用して行い、イメージングをステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドを使用する最初の測定２４時間後にペプチドのｉ．ｖ．注射後即座に開始し、ラットに、コントロールとして５ミリキュリーの濃度において１８Ｆ−ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース（１８Ｆ）を注入した。図４Ａ−Ｃは、腫瘍を有するラットの典型的なＰＥＴイメージを示す。図４Ａ、ｉ．ｖ．注射５分後のＷＡＧ／Ｒｊｉラットの肝臓における４００ｎｍｏｌ／ｋｇのステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドの特異的濃縮。図４Ｂ、最初の測定２４時間後に１８Ｆ−ＦＤＧを使用する対比染色。１８Ｆ−ＦＤＧは、多い量のグルコースを消費する臓器において豊富であり、図において心臓（上側のグレー色の塊）および腫瘍は、グルコースが豊富である（脳において豊富な１８Ｆ−ＦＤＧは、技術的理由のために示されない）。図４Ｃ、腫瘍組織ではなく肝臓組織のみだけの、ペプチド染色の特異性を証明する両方のイメージの合併。
【０１３６】
実施例３
ＭＲＩにおけるイメージング
ペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドをクエン酸バッファー（ｐＨ８．０）＋４％  ＢＳＡ中に溶解させ、６００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の濃度においてラットの尾の静脈にｉ．ｖ．注射した。実験中、ラットをイソフルランにより麻酔した。ペプチドの適用時に、ラットを、Ｔ１対照高感度配列（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＶｉＢＥ（登録商標））でＭＲＩにおいて実験した。測定は、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ａｖａｎｔｏ  １．５  Ｔ  ＭＲＩ  Ｓｃａｎｎｅｒにおいて実施した。図５は、ｉ．ｖ．注射前、ならびに注射２０および３０分後の健常ラットの典型的なイメージを示す。
【０１３７】
実施例４
用量漸増
イソフルランで麻酔されたラットに、ｉ．ｖ．注射後に、増加する量のステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドを与えた。後の注射の間隔は、２０分であった。２つの注射の間の時間において、Ｔ１対照高感度配列（Ｓｉｅｍｅｎｓ  ＶｉＢＥ（登録商標））での肝臓の継続ＭＲＩ測定を行い、肝臓、筋肉組織および心臓における対照の増強を決定した。並行して、ＰｒｉｍｏｖｉｓｔＴＭの臨床関連用量の対照値を決定した。結果は、図６に示される。
【０１３８】
実施例５
ＮＭＲによるＲ１／Ｒ２緩和能決定
ペプチドステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［Ｇｄ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ（「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｘ」；１ｍＭ）、ＰｒｉｍｏｖｉｓｔＴＭ（１ｍＭ）、ＭａｇｎｅｖｉｓｔＴＭ（１ｍＭ）ならびにＶａｓｏｖｉｓｔＴＭ（１ｍＭ）を、室温で等モル量においてＰＢＳに溶解し、Ｒ１／ｒ２緩和能を、Ｖａｒｉａｎ  ３００Ｍｈｚ  ＮＭＲにおいて測定した。Ｆｏｕｒｉｅｒ形質転換を使用することにより、単一の対照値は、実験から得られるデータから決定した。結果は、図７および図８に示される。
【０１３９】
実施例６
臓器分布試験
臓器分布を試験するために、１１１Ｉｎ標識ペプチドステアロイル−［Ｋ（１１１Ｉｎ  ＤＯＴＡ）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰをクエン酸バッファー（ｐＨ８．０）＋４％  ＢＳＡ中に溶解させ、４００ｎｍｏｌ／ｋｇ体重の濃度においてマウスの尾の静脈にｉ．ｖ．注射した。マウスを所定の時点で安楽死させ、血液および臓器を取り出した。それぞれの臓器の放射性シグナルを、ガンマカウンターを使用することにより決定した。結果は、図９に示される。
【０１４０】
実施例７
血清中の安定性
ステアロイル−［Ｋ（ＤＯＴＡ［６８Ｇａ］）］３−ＮＬＳＴＳＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰ−アミドを、示された期間にわたって健常ボランティアドナー由来の非−不活性ヒト血清中で３７℃でインキュベートした。分解産物の検出をＨＰＬＣアフィニティークロマトグラフィーを使用することによるペプチドの精製により行い、後の放射能決定は、示された時点でガンマカウンターにて行った。カラムから溶離された放射性ピーク画分の正確な量を、質量分析により確認した（データは示していない）。結果は、図１０に示される。開裂ではなく放射性崩壊のみが観察された。
【０１４１】
前記、特許請求の範囲および／または図面に記載されている特徴は、別々にまたはそれらを組み合わせて、種々の形態における本発明を理解するための材料であり得る。
【０１４２】
参考文献
【表１４】
2014510050.tif 000016
【表１５】
2014510050.tif 000017
【表１６】
2014510050.tif 000018
【図１】
2014510050.tif 000019
【図２】
2014510050.tif 000020
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2014510050.tif 000025
【図８】
2014510050.tif 000026
【図９】
2014510050.tif 000027
【図１０】
2014510050.tif 000028
【配列表】
2014510050000001.xml
【国際調査報告】
2014510050.tif 000038
2014510050.tif 000039
2014510050.tif 000040