(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を標識するための第２蛍光物質と、により標識された細胞群から前記目的細胞を検出する方法であって、
前記細胞群に、前記第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第１工程と、
前記蛍光が検出された細胞に、前記第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第２工程と、
前記第１工程および前記第２工程の検出結果に基づいて、前記第１工程で検出された細胞が前記目的細胞であるかどうかを判定する第３工程と、
を有し、
前記第１工程では、走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞２個分以上の第１検出領域を走査させ、
前記第２工程では、前記走査方向および前記走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞１個分以下の第２検出領域を、前記蛍光が検出された細胞に移動させ、
前記第１工程および前記第３工程の間には、前記第１蛍光物質からの蛍光を検出して、細胞の位置情報を取得する他の工程を含まない、
細胞検出方法。
【請求項２】
前記第１工程は、前記第１検出領域を第１の方向および前記第１の方向に直交する方向である第２の方向に走査させて、前記蛍光が検出された細胞の前記第１の方向および前記第２の方向における位置情報を取得し、
前記第２工程は、前記第２検出領域を、前記第１工程で得られた前記第１の方向および前記第２の方向における位置情報に基づいて、前記蛍光が検出された細胞に移動させる、
請求項１に記載の細胞検出方法。
【請求項３】
前記第１工程は、前記第１検出領域を第１の方向に走査させて、前記蛍光が検出された細胞の前記第１の方向における位置情報を取得し、
前記第２工程は、前記第２検出領域を、前記第１工程で得られた前記第１の方向における位置情報に基づいて、前記第１の方向に直交する方向である第２の方向に走査させる、
請求項１に記載の細胞検出方法。
【請求項４】
前記第１工程は、前記第１検出領域を第１の方向に走査させて、前記蛍光が検出された細胞の前記第１の方向における位置情報を取得し、
前記第２工程は、前記第２検出領域を、前記第１工程で得られた前記第１の方向における位置情報に基づいて、前記第１の方向および前記第１の方向に直交する方向である第２の方向に走査させる、
請求項１に記載の細胞検出方法。
【請求項５】
前記第１検出領域は、矩形または楕円形であり、
前記第１検出領域の前記走査方向に直交する方向における長さは、１０〜２００μｍの範囲内であり、
前記第２検出領域は、円形または矩形であり、
前記第２検出領域の前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における長さは、５〜２５μｍの範囲内である、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
【請求項６】
前記第３工程で判定された前記目的細胞を撮像する第４工程をさらに有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞検出方法。
【請求項７】
目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を検出するための第２蛍光物質とにより標識された細胞群が細胞収容部に収容されているチップを保持するためのホルダーと、
前記チップに前記第１蛍光物質を励起するための励起光および前記第２蛍光物質を励起するための励起光を別個に照射する光照射部と、
前記光照射部から照射された励起光により前記第１蛍光物質からの蛍光および前記第２蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、
前記光検出部により検出した前記第１蛍光物質から蛍光を発した細胞および前記第２蛍光物質から蛍光を発した細胞の位置情報を取得する位置情報取得部と、
前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第１蛍光物質からの蛍光を検出するための第１検出領域を規定する第１検出領域規定部と、
前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第２蛍光物質からの蛍光を検出するための第２検出領域を規定する第２検出領域規定部と、
前記チップにおける前記第１検出領域および前記第２検出領域を、第１の方向および前記第１の方向に直交する第２の方向に走査させるために、前記ホルダーと、前記光照射部、前記第１検出領域規定部、前記第２検出領域規定部および前記光検出部とを相対的に移動させる移動部と、
を有し、
前記位置情報取得部は、第１工程として、前記第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光が検出された細胞の位置情報を取得し、第２工程として、前記蛍光が検出された細胞に、前記第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光が検出された細胞の位置情報を取得し、第３工程として、前記第１工程および前記第２工程の検出結果に基づいて、前記第１工程で検出された細胞が前記目的細胞であるかどうかを判定し、前記第１工程および前記第３工程の間には、前記第１蛍光物質からの蛍光を検出して、細胞の位置情報を取得する他の工程を含まず、
走査方向に直交する方向における前記第１検出領域の長さは、前記細胞群の細胞２個分以上であり、
前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における前記第２検出領域の長さは、前記細胞群の細胞１個分以下である、
細胞検出装置。
【請求項８】
前記第１検出領域は、矩形または楕円形であり、
前記第１検出領域の前記走査方向に直交する方向における長さは、１０〜２００μｍの範囲内であり、
前記第２検出領域は、円形または矩形であり、
前記第２検出領域の前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における長さは、５〜２５μｍの範囲内である、
請求項７に記載の細胞検出装置。
【請求項９】
前記光検出部による前記蛍光の検出結果および前記位置情報取得部による前記蛍光の前記位置情報に基づいて、前記第１蛍光物質から蛍光を発した細胞を撮像する撮像部をさらに有する、請求項７または請求項８に記載の細胞検出装置。
【請求項１０】
前記細胞収容部は、平板形状、マイクロチャンバー形状、または溝形状である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の細胞検出装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞検出方法およびこの細胞検出方法を行うための細胞検出装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、各種幹細胞など（以下「希少細胞」または「目的細胞」ともいう）は、病態に応じて血液中に極めて稀に存在する。このような希少細胞は、臨床的に有用であることは明らかであるが、検出が極めて難しい。近年、様々な細胞分離手法を応用して希少細胞の検出が試みられており、様々な検出装置が製品化されている。たとえば、非目的細胞を含む血液などの検体中に対象の希少細胞が存在するかどうかを検査する場合に、検体に由来する細胞懸濁液をデバイスに展開した後、展開された全細胞を解析することが提案されている。【０００３】
一般的に、希少細胞の検出は、顕微鏡を用いて行われている。この方法では、細胞懸濁液を平面状に展開した後、顕微鏡により全細胞を観察して、希少細胞を検出する。【０００４】
また、希少細胞の他の検出方法として、マイクロアレイスキャナーを用いた方法が開示されている（非特許文献１参照）。この方法では、複数のマイクロチャンバーを有するチップに細胞懸濁液を展開してマイクロチャンバー内に細胞を収容し、希少細胞を蛍光物質で標識する。そして、マイクロアレイスキャナーを用いて、細胞と同じ程度の大きさの照射スポットを走査して励起光を全細胞に照射し、希少細胞を標識した蛍光物質から放出された蛍光を検出することで、希少細胞を検出する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】S. Yatsushiro et al., "Rapid and Highly Sensitive Detection of Malaria-Infected Erythrocytes Using a Cell Microarray Chip", PLoS ONE, Vol. 5, Issue 10, e13179.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
顕微鏡を用いた希少細胞の検出方法では、例えば高い倍率で全細胞を観察すると、高感度で希少細胞を検出することができるが、視野が狭いため検出時間が長くなってしまう。一方、低い倍率で全細胞を観察すると、視野が広くなるため検出時間を短縮することができるが、検出感度が下がってしまい、一部の希少細胞を検出できないおそれがある。【０００７】
非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法では、細胞と同じ程度の大きさの照射スポットを走査して全細胞を解析するため、高感度で細胞を検出することができるが、検出時間が長くなってしまう。非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法において、多色（多種）の蛍光物質を検出する場合には、希少細胞以外（目的細胞以外）の全ての細胞を検出する必要がある。よって、非特許文献１に記載の希少細胞の検出方法では、希少細胞かどうかを判定することはできるが、測定時間が長くなってしまう。【０００８】
このように、従来の希少細胞の検出方法では、正確な検出、高い検出感度および検出時間の短縮の全てを満たすことができなかった。【０００９】
本発明の目的は、多数の細胞から目的細胞を正確に、高感度かつ短時間で検出することができる細胞検出方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、この細胞検出方法を行うための細胞検出装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る細胞検出方法は、目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を標識するための第２蛍光物質と、により標識された細胞群から前記目的細胞を検出する方法であって、前記細胞群に、前記第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第１工程と、前記蛍光が検出された細胞に、前記第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する第２工程と、前記第１工程および前記第２工程の検出結果に基づいて、前記第１工程で検出された細胞が前記目的細胞であるかどうかを判定する第３工程と、を有し、前記第１工程では、走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞２個分以上の第１検出領域を走査させ、前記第２工程では、前記走査方向および前記走査方向に直交する方向の長さが前記細胞群の細胞１個分以下の第２検出領域を、前記蛍光が検出された細胞に移動させる。【００１１】
また、上記課題を解決するため、本発明の一実施の形態に係る細胞検出装置は、目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を検出するための第２蛍光物質とにより標識された細胞群が細胞収容部に収容されているチップを保持するためのホルダーと、前記チップに前記第１蛍光物質を励起するための励起光および前記第２蛍光物質を励起するための励起光を別個に照射する光照射部と、前記光照射部から照射された励起光により前記第１蛍光物質からの蛍光および前記第２蛍光物質からの蛍光を検出する光検出部と、前記光検出部により検出した前記第１蛍光物質から蛍光を発した細胞および前記第２蛍光物質から蛍光を発した細胞の位置情報を取得する位置情報取得部と、前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第１蛍光物質からの蛍光を検出するための第１検出領域を規定する第１検出領域規定部と、前記光照射部と前記ホルダーとの間、または前記ホルダーと前記光検出部との間に配置され、前記第２蛍光物質からの蛍光を検出するための第２検出領域を規定する第２検出領域規定部と、前記チップにおける前記第１検出領域および前記第２検出領域を、第１の方向および前記第１の方向に直交する第２の方向に走査させるために、前記ホルダーと、前記光照射部、前記第１検出領域規定部、前記第２検出領域規定部および前記光検出部とを相対的に移動させる移動部と、を有し、走査方向に直交する方向における前記第１検出領域の長さは、前記細胞群の細胞２個分以上であり、前記走査方向および前記走査方向に直交する方向における前記第２検出領域の長さは、前記細胞群の細胞１個分以下である。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、撮像しなくても、細胞群中から目的細胞を正確に短時間で漏れなく検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、実施の形態１に係る細胞検出装置の模式図である。
【図２】図２Ａ，Ｂは、照射スポットと、検出領域との関係を説明するための模式図である。
【図３】図３Ａ，Ｂは、第１照射スポットの走査および移動を説明するための図である。
【図４】図４は、第２照射スポットの走査および移動を説明するための図である。
【図５】図５Ａ，Ｂは、細胞展開用デバイスの構成を示す図である。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、細胞展開用デバイスの構成を示す図である。
【図７】図７Ａ，Ｂは、細胞収容部の他の形態を示す図である。
【図８】図８Ａ〜Ｅは、実施の形態１に係る細胞検出方法を説明するための図である。
【図９】図９Ａ，Ｂは、実施の形態２に係る細胞検出方法を説明するための図である。
【図１０】図１０Ａ，Ｂは、実施の形態２に係る細胞検出方法を説明するための図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
【００１５】
［実施の形態１］
（細胞検出装置の構成）
本発明に係る細胞検出装置は、細胞展開用デバイスの細胞収容部内に収容された、第１蛍光物質で標識された目的細胞（希少細胞）および第２蛍光物質で標識された非目的細胞を含む細胞群に励起光を照射し、励起光の照射スポット内の検出領域から放出された蛍光を検出することで、細胞群中に含まれる目的細胞を検出するための装置である。
【００１６】
図１は、細胞検出装置１００の模式図である。図２は、照射スポットＳ１，Ｓ２と、検出領域Ａ１，Ａ２との関係を示す模式図である。図２Ａは、第１照射スポットＳ１と、第１検出領域Ａ１との関係を示す模式図であり、図２Ｂは、第２照射スポットＳ２と、第２検出領域Ａ２との関係を示す模式図である。
【００１７】
図１に示されるように、細胞検出装置１００は、ホルダー１１０と、光照射部１２０と、光検出部１３０と、第１検出領域規定部１４１および第２検出領域規定部１４２を有する検出領域規定部１４０と、移動部１５０と、図示しない制御部（位置情報取得部）とを有する。細胞検出装置１００には、チップ１６１を含む細胞展開用デバイス１６０が装着される。
【００１８】
ホルダー１１０は、細胞展開用デバイス１６０を所定の位置に保持する。ホルダー１１０は、細胞展開用デバイス１６０を保持した状態で、移動部１５０により水平方向に移動させられる。
【００１９】
光照射部１２０および光検出部１３０は、ホルダー１１０の上方に配置されている。光照射部１２０は、ホルダー１１０に保持された細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）に励起光を照射する。一方、光検出部１３０は、細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）から放出された蛍光を検出する。
【００２０】
光照射部１２０は、第１光照射装置１２１および第２光照射装置１２２を有する。第１光照射装置１２１は、第１蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を照射する。また、第２光照射装置１２２は、第２蛍光物質から蛍光を発生させるための励起光を照射する。第１光照射装置１２１および第２光照射装置１２２に含まれる励起光を照射するための光源を有する。光源の種類は、特に限定されず、使用する蛍光物質の種類などに応じて適宜選択すればよい。光源は、例えばレーザーダイオードである。また、光照射部１２０は、所定の波長を透過させるフィルターを有していてもよい。励起光の波長は、細胞展開用デバイス１６０の自家蛍光の影響を排除する観点からは、長波長であることが好ましい。第１光照射装置１２１から出射される励起光の波長は、例えば６００〜７８０ｎｍの範囲内である。また、第２光照射装置１２２から照射される励起光の波長は、例えば４７０〜５８０ｎｍの範囲内である。
【００２１】
光検出部１３０の種類は、微弱な蛍光を検出することが可能であれば特に限定されない。光検出部１３０の例には、光電子増倍管（ＰＭＴ：photo-multiplier tube）やフォトダイオードなどが含まれる。本実施の形態では、光検出部１３０は、光電子増倍管である。
【００２２】
第１光照射装置１２１から細胞展開用デバイス１６０までの励起光の光路上には、第１レンズ１３１、第１検出領域規定部１４１、第１ダイクロイックミラー１３２、第２レンズ１３３、第２ダイクロイックミラー１３４および対物レンズ１３５が、第１光照射装置１２１側から順番に配置されている。第１光照射装置１２１から出射された励起光は、第１レンズ１３１、第１検出領域規定部１４１、第１ダイクロイックミラー１３２および第２レンズ１３３を通過した後、第２ダイクロイックミラー１３４で細胞展開用デバイス１６０に向けて反射される。第２ダイクロイックミラー１３４で反射した励起光は、対物レンズ１３５により細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）の細胞収容部１６５の底面近傍に集光される。
【００２３】
また、第２光照射装置１２２から細胞展開用デバイス１６０までの励起光の光路上には、第４レンズ１３９、第２検出領域規定部１４２、第１ダイクロイックミラー１３２、第２レンズ１３３、第２ダイクロイックミラー１３４および対物レンズ１３５が、第２光照射装置１２２側から順番に配置されている。第２光照射装置１２２から出射された励起光は、第４レンズ１３９、第２検出領域規定部１４２、第１ダイクロイックミラー１３２および第２レンズ１３３を通過した後、第２ダイクロイックミラー１３４で細胞展開用デバイス１６０に向けて反射される。第２ダイクロイックミラー１３４で反射した励起光は、対物レンズ１３５により細胞展開用デバイス１６０（チップ１６１）の細胞収容部１６５の底面近傍に集光される。
【００２４】
一方、細胞展開用デバイス１６０から光検出部１３０までの蛍光の光路上には、対物レンズ１３５、第２ダイクロイックミラー１３４、フィルター１３６、第３レンズ１３８およびピンホール１３７が、細胞展開用デバイス１６０側から順番に配置されている。細胞展開用デバイス１６０から放出された蛍光は、対物レンズ１３５、第２ダイクロイックミラー１３４およびフィルター１３６を通過した後、第３レンズ１３８によりピンホール１３７を通過して光検出部１３０の受光面に結像させられる。フィルター１３６は、例えば励起光カットフィルターや減光フィルターなどである。励起光カットフィルターは、励起光や外光などを遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。減光フィルターは、蛍光強度を光検出部１３０に合わせて調整する。ピンホール１３７は、励起光の焦点（細胞収容部１６５の底面近傍）から放出された蛍光以外の光を遮断し、Ｓ／Ｎ比を向上させる。ピンホール１３７の形状は、特に限定されず、例えば円形や矩形などである。ピンホール１３７の大きさは、励起光の照射スポットの形状や使用する光学素子に応じて適宜設定される。
【００２５】
第１検出領域規定部１４１および第２検出領域規定部１４２は、光照射部１２０（第１光照射装置１２１および第２光照射装置１２２）と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間、または細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間にそれぞれ配置され、チップ１６１上の第１検出領域Ａ１および第２検出領域Ａ２をそれぞれ規定する。ここで「検出領域」とは、光検出部１３０により蛍光が検出される領域を意味する。通常、励起光の照射スポット（第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２）外からは検出すべき蛍光は放出されないため、検出領域（第１検出領域Ａ１および第２検出領域Ａ２）は、チップ１６１上の励起光の照射スポット内に設定される。検出領域は、励起光の照射スポットと一致していてもよいし、照射スポットの一部であってもよい。
【００２６】
第１検出領域規定部１４１は、第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置され、第１光照射装置１２１から出射された励起光のうち、第１検出領域Ａ１に照射する光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。また、第１検出領域規定部１４１は、細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間に配置され、励起光の第１照射スポットＳ１から放出された蛍光のうち、第１検出領域Ａ１から放出された蛍光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。図１に示されるように、本実施の形態では、第１検出領域規定部１４１は、第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置されている。
【００２７】
励起光の第１照射スポットＳ１の大きさは、第１検出領域Ａ１の大きさ以上であれば特に限定されない。また、励起光の第１照射スポットＳ１の形状も、特に限定されない。通常、第１照射スポットＳ１の形状は円形であるが、本実施の形態のように第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に第１検出領域規定部１４１が配置されている場合は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）の形状は、様々な形状を採りうる。
【００２８】
図２Ａに示されるように、第１検出領域Ａ１の走査方向（第１の方向Ｄ１）に直交する方向（第２の方向Ｄ２）における長さは、細胞群の細胞２個分の長さより長い。第２の方向Ｄ２における第１検出領域Ａ１の長さが、細胞群の細胞２個分の長さ未満の場合、検出時間が長くなってしまう。また、第１検出領域Ａ１の走査方向（第１の方向Ｄ１）における長さは、特に限定されず、例えば細胞群の細胞１個分程度の長さである。
【００２９】
第１検出領域Ａ１の形状の例には、円形、楕円形および矩形が含まれる。第１検出領域Ａ１の形状は、検出感度を高める観点からは、楕円形または矩形であることが好ましい。本実施の形態では、第１検出領域Ａ１の形状は、走査方向：５〜２５μｍ×走査方向に直交する方向：１０〜２００μｍの矩形である。
【００３０】
第２検出領域規定部１４２は、第２光照射装置１２２と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置され、第２光照射装置１２２から出射された励起光のうち、第２検出領域Ａ２に照射する光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。また、第２検出領域規定部１４２は、細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）と光検出部１３０との間に配置され、励起光の第２照射スポットＳ２から放出された蛍光のうち、第２検出領域Ａ２から放出された蛍光のみを通過させる絞り（スリットやアパーチャーなど）であってもよい。図１に示されるように、本実施の形態では、第１検出領域規定部１４１は、第２光照射装置１２２と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に配置されている。
【００３１】
励起光の第２照射スポットＳ２の大きさは、第２検出領域Ａ２の大きさ以上であれば特に限定されない。また、励起光の第２照射スポットＳ２の形状も、特に限定されない。通常、第２照射スポットＳ２の形状は円形であるが、本実施の形態のように第１光照射装置１２１と細胞展開用デバイス１６０（ホルダー１１０）との間に第１検出領域規定部１４１が配置されている場合は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）の形状は、様々な形状を採りうる。
【００３２】
第２検出領域Ａ２の大きさは、所定の大きさに制限される。第２検出領域Ａ２の走査方向（第１の方向Ｄ１）および走査方向に直交する方向（第２の方向Ｄ２）における長さは、細胞群の細胞１個分以下の長さである。第２検出領域Ａ２の第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２の長さが、細胞群の細胞１個分超の長さである場合、第２蛍光物質で標識された複数の細胞からの蛍光を検出してしまうおそれがある。第２検出領域Ａ２の形状の例には、円形、楕円形および矩形が含まれる。本実施の形態では、第２検出領域Ａ２の形状は、走査方向：５〜２５μｍ×走査方向に直交する方向：５〜２５μｍの矩形である。
【００３３】
移動部１５０は、ホルダー１１０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、ホルダー１１０に保持された細胞展開用デバイス１６０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させる。光照射部１２０が励起光を細胞展開用デバイス１６０に照射している状態で、細胞展開用デバイス１６０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、励起光の第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２でチップ１６１を走査することができる。たとえば、移動部１５０は、ホルダー１１０をＸ軸方向（例えば第１の方向Ｄ１）に移動するＸ軸移動機構１５１と、ホルダー１１０をＹ軸方向（例えば第１の方向Ｄ１に直交する第２の方向Ｄ２）に移動するＹ軸移動機構１５２とを有する。移動部１５０は、Ｘ軸移動機構１５１およびＹ軸移動機構１５２を駆動させてホルダー１１０を任意の方向に移動させる。
【００３４】
図３および図４は、照射スポットＳ１，Ｓ２（検出領域Ａ１，Ａ２）の走査および移動を説明するための図である。図３Ａは、第１照射スポットＳ１の第１の方向Ｄ１への走査を説明するための図であり、図３Ｂは、第１照射スポットＳ１の第２の方向Ｄ２への走査を説明するための図である。図４は、第２照射スポットＳ２の移動を説明するための図である。
【００３５】
まず、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第１の方向Ｄ１に走査させる場合について説明する。図３Ａに示されるように、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、互いに隣接する第１走査領域ＳＡ１の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第１の方向Ｄ１に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる（図３Ａの実線矢印参照）。ここで、「第１走査領域」とは、第１照射スポットＳ１が第１の方向Ｄ１に１回走査するときに、第１光照射装置１２１が励起光を照射する領域をいう。
【００３６】
そして、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第２の方向Ｄ２に移動させる。具体的には、図３Ａに示されるように、１個目の第１走査領域ＳＡ１の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を、２個目の第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に移動させる（図３Ａの点線矢印参照）。このとき、第１光照射装置１２１は、励起光を照射し続けていてもよいし、照射していなくてもよい。このように、一度走査した第１走査領域ＳＡ１をもう一度走査しないように、かつ走査しない第１走査領域ＳＡ１が無いように、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を移動させる。これらの工程を、最後の第１走査領域ＳＡ１を走査し終わるまで繰り返す。
【００３７】
次に、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第２の方向Ｄ２に走査させる場合について説明する。第１照射スポットＳ１を第２の方向Ｄ２に走査させる場合、ガルバノミラーなどにより第１の方向Ｄ１の長さと第２の方向Ｄ２の長さ入れ替える。すなわち、走査方向に直交する方向の長さを長くする。図３Ｂに示されるように、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、互いに隣接する第２走査領域ＳＡ２の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第２の方向Ｄ２に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。ここで、「第２走査領域」とは、第１照射スポットＳ１が第２の方向Ｄ２に１回走査するときに、第１光照射装置１２１が励起光を照射する領域をいう。
【００３８】
そして、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を第１の方向Ｄ１に移動させる。具体的には、図３Ｂに示されるように、１個目の第２走査領域ＳＡ２の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を、２個目の第２走査領域ＳＡ２の移動開始位置に移動させる（図３Ｂの点線矢印参照）。このとき、第１光照射装置１２１は、励起光を照射し続けていてもよいし、照射していなくてもよい。このように、一度走査した走査領域をもう一度走査しないように、かつ走査しない走査領域が無いように、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を移動させる。これらの工程を、最後の第２走査領域ＳＡ２を走査し終わるまで繰り返す。
【００３９】
次いで、第２照射スポットＳ２（第２検出領域Ａ２）を移動させる場合について説明する。図４に示されるように、移動部１５０は、第２照射スポットＳ２（第２検出領域Ａ２）を、第１照射スポットＳ１の走査による結果に基づいて、第３走査領域ＳＡ３に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる（図４の実線矢印参照）。ここで、「第３走査領域」とは、第２光照射装置１２２が励起光を照射する領域をいう。また、複数の第３走査領域ＳＡ３がある場合には、移動部１５０は、第２照射スポットＳ２を複数の第３走査領域ＳＡ３に連続して移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。
【００４０】
特に図示しないが、制御部（位置情報取得部）は、光照射部１２０、光検出部１３０および移動部１５０と接続されており、細胞検出装置１００を統括的に制御する。
【００４１】
また、細胞検出装置１００は、検出された目的細胞を撮像するための撮像装置（図示省略）を有していてもよい。このとき、撮像装置は、細胞展開用デバイス１６０を上側から臨むように配置される。
【００４２】
（細胞展開用デバイスの構成）
図５および図６は、細胞展開用デバイス１６０の構成を示す図である。図５Ａは、細胞展開用デバイス１６０の平面図であり、図５Ｂは、図５Ａに示されるＡ−Ａ線の断面図である。
【００４３】
図５Ａに示されるように、細胞展開用デバイス１６０は、チップ１６１、枠体１６２および天板１６３を有する。図６Ａは、チップ１６１の平面図であり、図６Ｂは、枠体１６２の平面図であり、図６Ｃは、天板１６３の平面図である。
【００４４】
図５および図６に示されるように、チップ１６１は、一方の面に複数の細胞を展開するための細胞収容部１６５を有する。細胞収容部１６５の構造は、特に限定されない。細胞収容部１６５の構造の例には、平面状、有底のマイクロチャンバー状、溝状などが含まれる。本実施の形態では、細胞収容部１６５は、平面形状である。ここで、「細胞収容部」とは、複数の細胞を含む細胞群を収容し、保持するための部位を意味する。また、「細胞を保持する」とは、細胞収容部１６５に収容された細胞が、後述する流路１６４内に液体を流したときに細胞収容部１６５外に出難くすることを意味する。チップ１６１の細胞収容部１６５が形成されている面は、細胞展開用デバイス１６０の流路１６４の底面となる。
【００４５】
枠体１６２は、チップ１６１と天板１６３との間に配置された、貫通孔を有する薄板である（図５Ｂ参照）。この貫通孔は、検体に由来する細胞懸濁液を流すための流路１６４となる。流路１６４（貫通孔）の形状は、細胞収容部１６５上に細胞懸濁液を流すことが可能であれば、特に限定されず、用途に応じて適宜選択されうる。また、枠体１６２の厚みは、特に限定されず、所望の流路の高さ（深さ）に応じて適宜設定される。たとえば、枠体１６２の厚みは、５０〜５００μｍの範囲内であり、流路の高さは、５０〜５００μｍの範囲内である。枠体１６２の素材は、特に限定されず、公知のマイクロプレートなどと同じ素材であってもよい。枠体１６２の素材の例には、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルメタクリレート、環状オレフィンコポリマーなどの樹脂が含まれる。
【００４６】
天板１６３は、枠体１６２の上に配置された、２つの貫通孔を有する薄板である（図６Ｃ参照）。これらの貫通孔は、それぞれ、流路１６４内に液体（例えば細胞懸濁液や洗浄液、染色液など）を導入するための導入口１６６と、流路１６４内から液体を排出するための排出口１６７となる。通常、導入口１６６は、流路１６４の一端に連通し、排出口１６７は、流路１６４の他端に連通する。導入口１６６および排出口１６７の形状は、特に限定されない。また、天板１６３の厚みも、必要な強度を確保できれば特に限定されない。天板１６３の素材は、特に限定されないが、細胞検出装置１００により照射される励起光を透過する観点からは、光透過性を有する素材であることが好ましい。天板１６３の素材としては、枠体１６２と同じ樹脂を使用することができる。
【００４７】
チップ１６１、枠体１６２および天板１６３は、この順番で積層され、互いに固定されている。これらを固定する方法は特に限定されないが、観察やメンテナンスの観点からは、互いに取り外し可能に固定されることが好ましい。固定方法の例には、係合による固定、螺子を用いた固定、粘着剤を用いた固定が含まれる。
【００４８】
図５Ｂに示されるように、細胞展開用デバイス１６０内に形成された流路１６４は、導入口１６６および排出口１６７を介して外部に連通している。導入口１６６から液体（例えば細胞懸濁液）を導入することで、流路１６４内に液体を満たすことができる。このとき、液体は、導入口１６６から排出口１６７に向かって流路１６４内を流れる。細胞懸濁液で流路１６４内を満たした場合、細胞はチップ１６１上に沈降し、細胞収容部１６５の底面に付着する。すなわち、細胞は、細胞収容部１６５内に収容される。この後、洗浄や染色などを行い、外部から細胞収容部１６５内に収容されている細胞を、細胞検出装置１００などを用いて観察することで、各種分析を行うことができる。
【００４９】
（チップの構成）
図５Ｂに示されるように、チップ１６１の一方の面には、細胞収容部１６５が形成されている。チップ１６１の素材は、特に限定されないが、天板１６３と同様に光透過性を有する素材であることが好ましい。チップ１６１の素材は、枠体１６２および天板１６３と同じ樹脂を使用することができる。チップ１６１の厚みは、必要な強度を確保できれば特に限定されない。
【００５０】
なお、本実施の形態では、流路１６４を有する閉鎖系の細胞展開用デバイス１６０を使用したが、流路１６４を有さない開放系の細胞展開用デバイスを使用してもよい。すなわち、チップ１６１を細胞展開用デバイスとしても使用することもできる。
【００５１】
また、本実施の形態では、平面形状の細胞収容部１６５について説明したが、細胞収容部１６５の構造は、平面形状に限定されない。図７は、他の細胞収容部の構造を示す図である。図７Ａに示されるように、細胞収容部１６５は、複数のマイクロチャンバー１６８を有していてもよい。「マイクロチャンバー」とは、１個または２個以上の細胞を収容し、保持するための微細な有底の凹部（マイクロウェル）を意味する。マイクロチャンバー１６８の開口部の形状は、特に限定されず、円形、楕円形および多角形が含まれる。また、マイクロチャンバー１６８の開口部の大きさは、特に限定されず、収容する細胞の種類や１個のマイクロチャンバー１６８に収容する細胞の数などに応じて適宜設定されうる。通常は、開口部の大きさは、マイクロチャンバー１６８の底面に１０〜１５個程度の細胞が付着できる大きさであることが好ましい。また、図７Ｂに示されるように、細胞収容部１６５は、複数の溝１６９を有していてもよい。溝１６９の幅方向の断面面形状は、特に限定されず、Ｖ溝、Ｕ溝などが含まれる。溝１６９の幅は、特に限定されないが、細胞１個が収容される長さであることが好ましい。
【００５２】
（細胞検出方法）
次に、細胞検出装置１００を用いて、目的細胞を標識するための第１蛍光物質と、非目的細胞を標識するための第２蛍光物質と、により標識された細胞群中から目的細胞を検出する方法について説明する。ここでは、説明を簡略にするため、細胞群中に１個の目的細胞が含まれている場合を例に挙げて説明する。
【００５３】
図８は、実施の形態１に係る細胞検出方法を説明するための図である。図８Ａは、第１工程および第２工程を説明するための図であり、図８Ｂは、第１照射スポットを第１の方向Ｄ１に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフであり、図８Ｃは、第１照射スポットを第１の方向Ｄ１に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出されなかった場合のシグナルを示すグラフであり、図８Ｄは、第２照射スポットを第２の方向に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフであり、図８Ｅは、第２照射スポットを第２の方向に走査したときに、第１蛍光物質からの蛍光が検出されなかった場合のシグナルを示すグラフである。
【００５４】
上述した細胞検出装置１００を用いて、細胞群から目的細胞を検出するには、まず、第１蛍光物質からの蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する（第１工程）。次いで、第２蛍光物質からの蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する（第２工程）。そして、第１工程および第２工程の検出結果に基づいて、目的細胞か否かを判定する（第３工程）。また、目的細胞の検出方法は、第３工程の後、撮像装置を用いて、判定した目的細胞を観察してもよい（第４工程）。
【００５５】
まず、細胞収容部１６５に細胞群が収容されたチップ１６１（細胞展開用デバイス１６０）を準備する。たとえば、流路１６４内を細胞懸濁液（例えば、血液またはその希釈液）で満たした後、細胞懸濁液中の細胞がわずかに移動するように細胞懸濁液を吸引することを２０回繰り返して（１回の吸引後に１０秒間停止）、細胞収容部１６５内に細胞を収容する。そして、細胞収容部１６５の開口部が上側を向くように、細胞が収容されたチップ１６１（細胞展開用デバイス１６０）をホルダー１１０に保持させる。なお、検出対象となる目的細胞の種類は、特に限定されない。検出対象の細胞の例には、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）や循環血管内皮細胞（ＣＥＣ）、循環血管内皮前駆細胞（ＣＥＰ）、循環胎児細胞、抗原特異的Ｔ細胞、各種幹細胞などが含まれる。
【００５６】
図８Ａ〜Ｃに示されるように、第１工程では、細胞群に、第１蛍光物質を励起するための励起光を照射して、第１蛍光物質からの蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞の位置情報を取得する。まず、移動部１５０は、励起光の第１照射スポットＳ１が第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に位置するように、ホルダー１１０を介して細胞展開用デバイス１６０を移動させる。そして、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置から移動終了位置まで移動するように、細胞展開用デバイス１６０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動させる。
【００５７】
このとき、第１光照射装置１２１は、移動部１５０がホルダー１１０を第１の方向Ｄ１と１８０°逆方向に移動させている間、所定の波長の励起光を出射し続ける。すなわち、第１光照射装置１２１は、チャンバー列に含まれる細胞収容部１６５に収容された細胞（蛍光物質）に対して連続して励起光を照射する。蛍光物質は、励起光が照射されると同時に蛍光を発する。光検出部１３０は、このように放出される蛍光を連続して検出すると共に、蛍光が検出された細胞の第１の方向Ｄ１における位置情報を取得する。図８Ｂに示されるように、第１蛍光物質で標識された細胞が１個の場合、第１照射スポットＳ１の走査により、１つのピークが観察される。位置情報取得部は、蛍光の位置情報を基準位置に対するホルダー１１０（細胞展開用デバイス１６０）の移動距離として取得する。一方、第１走査領域ＳＡ１に第１蛍光物質がなかった場合には、図８Ｃに示されるように、ピークが観察されない。
【００５８】
次いで、移動部１５０は、励起光の第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）が、次に互いに隣接する第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。以上の第１照射スポットＳ１の走査および移動を繰り返しながら、チップ１６１に励起光を照射しながら蛍光を検出するとともに、検出された蛍光が発した細胞の第１の方向Ｄ１における位置情報を取得する。
【００５９】
図８Ａ，Ｄ，Ｅに示されるように、同様に、移動部１５０は、励起光の第１照射スポットＳ１が第２走査領域ＳＡ２を走査するように、ホルダー１１０を介して細胞展開用デバイス１６０を移動させて、検出された蛍光の第２の方向Ｄ２における位置情報を取得する。
【００６０】
第２工程では、蛍光が検出された細胞に、第２蛍光物質を励起するための励起光を照射して、第２蛍光物質からの蛍光を検出する。移動部１５０は、第１工程で検出された蛍光の第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２における位置情報に基づいて、励起光の第２照射スポットＳ２を第３走査領域ＳＡ３に移動する。このとき、光照射部１２０は、第１工程で蛍光を発した細胞（蛍光物質）に対して励起光を照射する。第２蛍光物質は、励起光が照射されると同時に蛍光を発する。光検出部１３０は、このように放出される蛍光を検出する。
【００６１】
第３工程では、第１工程および第２工程の結果に基づいて、第１工程で検出された細胞が目的細胞であるかどうかを判定する。具体的には、第１工程で蛍光が検出された位置（細胞）において、第２工程で蛍光が検出されるか否かを調べる。たとえば、第１工程で蛍光が検出されたが、第２工程で蛍光が検出されなかった場合、細胞は、第１蛍光物質のみによって、適切に標識されたものとなる。すなわち、第１工程で蛍光が検出されたが、第２工程で蛍光が検出されなかった細胞は、目的細胞であるということがわかる。一方、第１工程および第２工程で蛍光が検出された場合、細胞は、第１蛍光物質によって非特異的に標識されたものとなる。すなわち、第１工程および第２工程で蛍光が検出された細胞は、非目的細胞であるということがわかる。
【００６２】
また、細胞を検出する方法は、目的細胞か否かを判定した後、検出された細胞を撮像して、細胞の詳細な形態などを観察してもよい（第４工程）。第４工程では、第１工程および第２工程で検出された細胞の位置情報に基づいて、移動部１５０により撮像部を移動させて目的細胞を撮像する。
【００６３】
以上の手順により、多数の細胞から目的の希少細胞を正確に、高感度、かつ短時間で検出することができる。
【００６４】
なお、本実施の形態では、各検出領域Ａ１，Ａ２について照射スポットＳ１，Ｓ２が１回走査する例について説明したが、各検出領域Ａ１，Ａ２について照射スポットＳ１，Ｓ２が２回走査するようにしてもよい。このようにすることで、より確実に希少細胞（目的細胞）を検出することができる。
【００６５】
また、特に図示しないが、互いに隣接する第１走査領域ＳＡ１（または第２走査領域ＳＡ２）において、移動開始位置および移動終了位置は、互いに逆の位置に設定されていてもよい。この場合、移動部１５０は、第１照射スポットＳ１（第２照射スポットＳ２）が、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の一方の端部（移動開始位置）から他方の端部（移動終了位置）まで第１の方向Ｄ１（第２の方向Ｄ２）に向かって移動するように、細胞展開用デバイス１６０を移動させる。次いで、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の他方の端部の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第２照射スポットＳ２）を、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置に移動させる。このとき、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置は、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動終了位置に隣接して位置する端部である。最後に、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置に到達した第１照射スポットＳ１（第２照射スポットＳ２）を、その第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の他方の端部に位置する移動終了位置に移動させる。このとき、次の第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動終了位置は、第１走査領域ＳＡ１（第２走査領域ＳＡ２）の移動開始位置に隣接して位置する端部である。これらの工程を、最後の走査領域を走査し終わるまで繰り返す。
【００６６】
また、移動部１５０は、光照射部１２０、第１検出領域規定部１４１、第２検出領域規定部１４２および光検出部１３０を移動させてもよい。具体的には、ホルダー１１０を固定した状態で、第１検出領域規定部１４１、第２検出領域規定部１４２および光検出部１３０を水平方向（ＸＹ方向）に移動させることで、励起光の第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２でチップ１６１を走査してもよい。
【００６７】
［実施の形態２］
実施の形態２に係る細胞検出装置は、第１照射スポットＳ１の走査方法が実施の形態１に係る細胞検出装置と異なる。そこで、実施の形態１での第１照射スポットＳ１の走査方法と異なる部分について、主として説明する。なお、実施の形態２の細胞検出装置は、実施の形態１に係る細胞検出装置１００を用いて行うため、その説明を省略する。
【００６８】
実施の形態２では、第１照射スポットＳ１は、第１走査領域ＳＡ１のみを走査する。具体的には、第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を１個目の第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置から移動終了位置へ移動させ、１個目の第１走査領域ＳＡ１の移動終了位置に到達した第１照射スポットＳ１（第１検出領域Ａ１）を、２個目の第１走査領域ＳＡ１の移動開始位置に移動させる。この工程を、最後の第１走査領域ＳＡ１を走査し終わるまで繰り返す。すなわち、実施の形態２では、第１照射スポットＳ１の第２走査領域ＳＡ２の走査は、行わない。
【００６９】
図９は、実施の形態２における第２照射スポットＳ２の走査を説明するための図である。図１０Ａは、第２蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフであり、図１０Ｂは、第２蛍光物質からの蛍光が検出された場合のシグナルを示すグラフである。
【００７０】
図９Ａに示されるように、実施の形態２では、第３走査領域ＳＡ３は、第２の方向Ｄ２に延在していてもよい。このとき、第３走査領域ＳＡ３の第１の方向Ｄ１における位置は、第１照射スポットＳ１の走査時に得られた細胞の位置情報に基づいて決定される。そして、第２照射スポットＳ２を第３走査領域ＳＡ３の移動開始位置から移動終了位置まで、第２の方向Ｄ２に直線的に走査する。このとき、図１０Ａに示されるように、第２照射スポットＳ２の走査では、第２蛍光物質が多くの非目的細胞を標識しているため、ほとんどの第３走査領域ＳＡ３の領域で蛍光が検出され、目的細胞に相当する位置では、１つのマイナスのピークが観察される。一方、第２走査領域ＳＡ２に第１蛍光物質がなかった場合には、図１０Ｂに示されるように、マイナスのピークが観察されない。
【００７１】
また、図９Ｂに示されるように、第３走査領域ＳＡ３は、第２の方向に複数配置されていてもよい。このとき、第３走査領域ＳＡ３の移動開始位置は第１の方向Ｄ１において、第１蛍光物質からの蛍光が検出された位置より走査方向の手前側であり、移動終了位置は第１の方向Ｄ１において、第１蛍光物質からの蛍光が検出された位置より走査方向の奥側である。具体的には、第３走査領域ＳＡ３の第１の方向Ｄ１における長さは、特に限定されず、例えば１細胞の長さ程度であってもよい。そして、実施の形態１と同様に、１個目の第３走査領域ＳＡ３から最後の第３走査領域ＳＡ３まで走査する。
【００７２】
（細胞検出方法）
実施の形態２に係る細胞を検出する方法の第１工程では、第１検出領域Ａ１を第１の方向Ｄ１に走査させて、蛍光が検出された細胞の第１の方向Ｄ１における位置情報を取得する。
【００７３】
第２工程では、第１工程で得られた第１の方向Ｄ１における位置情報に基づいて、第２検出領域Ａ２を第１の方向Ｄ１または第２の方向Ｄ２に走査させ励起光を照射し、第２蛍光物質からの蛍光を検出する。このとき、第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２における第２照射スポットＳ２の長さは、１細胞以下であるため、適切に第２蛍光物質からの蛍光を検出することができる。
【００７４】
以上のように、実施の形態２に係る細胞検出装置１００は、実施の形態１に係る細胞検出装置１００と同様の効果を有する。
【００７５】
以下、本発明の実施例を参照して詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。
【実施例】
【００７６】
［実施例１］
１．細胞懸濁液の調製
がん患者から採血した末梢血をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈して血液の希釈液を得た。次いで、血液の希釈液１ｍＬにパラホルムアルデヒド（和光純薬工業株式会社）を４質量％の濃度となるように添加した後、緩やかに混和して、室温暗所にて１５分間反応させた。さらにＰＢＳを十分量添加して混和した後、懸濁液を遠心分離器により遠心分離した。遠心分離後の沈澱物に０．１質量％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳを１ｍＬ、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）標識用にAlexa Fluor 647で標識した抗ＣＫ抗体（Micromet社）溶液１０μＬおよび白血球標識用にAlexa Fluor 488（ライフテクノロジーズ・ジャパン株式会社）で標識した抗ＣＤ４５抗体１０μＬをそれぞれ添加した。混合溶液を緩やかに混和しながら、室温暗所にて２５分間反応させた。さらに、細胞核染色用にＤＡＰＩ溶液（同仁化学研究所）を１０μＬ添加して、緩やかに混和しながら、室温暗所にて５分間反応させた。そして、遠心分離後に上澄み液とともに、細胞に結合していない抗体および蛍光色素を除去した。沈澱物にＰＢＳを添加して再び懸濁させて、細胞懸濁液を得た。なお、この細胞懸濁液に含まれている血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の数は、他の検出方法により特定されている。本実施例では、血液循環癌細胞：１００個、血液循環癌細胞を除く全細胞（白血球）：１．０×１０６個、当該白血球のうち、非特異的に標識された白血球：２００個であった。【００７７】
２．細胞の収容（平面に展開した細胞）
縦：２５ｍｍ、横：５ｍｍの細胞収容部１６５（図６）を有するチップ１６１の上に、細胞懸濁液を滴下した後、枠体１６２および天板１６３を配置して、細胞展開用デバイス１６０を作製した。【００７８】
３．細胞の検出
細胞検出装置１００（図１）を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。励起光は、ＣＴＣを標識したAlexa Fluor 647を励起するＨｅ−Ｎｅレーザー光（波長６３５ｎｍ）およびＣＤ４５を標識したAlexa Fluor 488を励起する半導体レーザー（波長４８８ｎｍ）を使用した。第１検出領域規定部１４１として光照射部１２０側に円形スリットを配置することで、第１照射スポットＳ１の形状を１００μｍφの円形とした。本実施例では、第１照射スポットＳ１および第１検出領域Ａ１は、一致している。【００７９】
第１照射スポットＳ１を第１の方向（Ｘ軸方向）Ｄ１に走査して、波長６３５ｎｍの励起光を照射するとともに、Alexa Fluor 647からの蛍光を検出し、蛍光が検出された細胞のＸ座標（位置情報）を取得した。次いで、第１照射スポットＳ１を第１の方向Ｄ１に直交する第２の方向Ｄ２（Ｙ軸方向）に走査して、波長６３５ｎｍの励起光を照射するとともに、Alexa Fluor 647からの蛍光を検出し、検出された細胞のＹ座標（位置情報）を取得した（第１工程）。このとき、第１照射スポットＳ１の第１の方向Ｄ１および第２の方向Ｄ２へ走査（励起光の照射、蛍光の検出および位置情報の取得）および第１走査領域ＳＡ１間の第１照射スポットＳ１の移動に要した合計時間は、約３分であった。【００８０】
次いで、第２照射スポットＳ２を、第１工程で得られた座標（位置情報）上に移動させて、波長４８８ｎｍの励起光を照射するとともに、Alexa Fluor 488からの蛍光を検出した（第２工程）。このとき、第２照射スポットＳ２の移動（励起光の照射および蛍光の検出）に要した合計時間は、約５分であった。【００８１】
最後に、第１工程および第２工程における蛍光の検出結果に基づいて、検出された細胞が目的細胞（血液循環癌細胞）か、非目的細胞（白血球）か、を判定した。【００８２】
４．結果
実施の形態１に係る細胞検出方法により、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）を正確に、高感度かつ短時間（合計約８分間）に検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。【００８３】
［実施例２］
１．チャンバーの前処理および細胞の収容
深さ：５０μｍ、直径：１００μｍのマイクロチャンバー（図７Ａ）を２００００個有するチップ１６１の上に、枠体１６２および天板１６３を配置して、流路１６４を有する細胞展開用デバイス１６０を作製した。流路１６４内にブロッキング溶液（３質量％ＢＳＡを含むＰＢＳ）を１６ｍＬ／ｍｉｎで送液した。その後、ＰＢＳを流路１６４内に送液することで、余分なブロッキング液を流路１６４内から除去した。ブロッキング液を除去した流路１６４内に１６ｍＬ／ｍｉｎの流速で上記の細胞懸濁液を１０μＬ送液し、１０秒間静止した。細胞懸濁液の送液および静止を繰り返すことで、細胞収容部１６５内にすべての細胞を収容した。【００８４】
２．細胞の検出
実施例２でも、実施の形態１に係る細胞検出装置１００（図１）を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。検出領域規定部１４０は、本実施例でも、光照射部１２０側に配置した。検出領域規定部１４０としては、矩形スリットを使用した。第１照射スポットＳ１は、短辺：２０μｍ、長辺１００μｍの矩形である。また、第２照射スポットＳ２は、１０μｍφの円形とした。第１照射スポットＳ１および第２照射スポットＳ２の走査は、実施例１と同様に行った。【００８５】
３．結果
このとき、第１照射スポットＳ１のＸ軸方向およびＹ軸方向へ走査（励起光の照射、蛍光の検出および位置情報の取得）および第１走査領域ＳＡ１間の第１照射スポットＳ１の移動に要した合計時間は、約２分であった。また、第２照射スポットＳ２の移動（励起光の照射および蛍光の検出）に要した合計時間は、約２５分であった。実施例２においても、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。【００８６】
［実施例３］
１．チャンバーの前処理および細胞の収容
溝幅：１０μｍ、溝深さ：２０μｍの溝が全面に形成された細胞収容部１６５（図７Ｂ）を有するチップ１６１に細胞懸濁液を滴下して、細胞収容部１６５内にすべての細胞を収容した。【００８７】
２．細胞の検出
実施例３でも、実施の形態１に係る細胞検出装置１００（図１）を用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。検出領域規定部１４０は、本実施例でも、光照射部１２０側に配置した。検出領域規定部１４０としては、矩形スリットを使用した。第１照射スポットＳ１は、短辺：１０μｍ、長辺２００μｍの矩形である。また、第２照射スポットＳ２は、１０μｍφの円形とした。第１工程は、第１照射スポットＳ１を１個目の第１走査領域ＳＡ１から最後の第１走査領域ＳＡ１まで第１の方向Ｄ１に走査させた。すなわち、第１工程では、第１照射スポットＳ１は、第２走査領域ＳＡ２を走査させていない。第２工程は、第２照射スポットＳ２を第２の方向Ｄ２に直線的に走査させることで行った。【００８８】
３．結果
第１照射スポットＳ１のＸ軸方向へ走査（励起光の照射、蛍光の検出および位置情報の取得）および第１走査領域ＳＡ１間の第１照射スポットＳ１の移動に要した合計時間は、約１分であった。また、第２照射スポットＳ２の移動（励起光の照射および蛍光の検出）に要した合計時間は、約５分であった。実施例３に置いても、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数と完全に一致した（１００％）。【００８９】
［比較例］
１．細胞の検出
比較例では、マイクロアレイスキャナーを用いて、血液循環癌細胞（ＣＴＣ）の検出を行った。比較例では、細胞展開用デバイス１６０の代わりに、平面基板上に細胞懸濁液を展開した。照射スポットの形状は、直径５μｍの円形である。基板全面（２５ｍｍ×７５ｍｍ）における蛍光の検出に要した時間は、約４０分であった。【００９０】
２．結果
比較例においても、実施例１〜実施例３と同様に、ＣＴＣを検出することができた。また、検出したＣＴＣの数は、細胞展開用デバイス１６０内に導入したＣＴＣの数とほぼ一致した（９８％）。しかし、照射スポットが直径５μｍのマイクロアレイスキャナーを用いた検出のため、検出時間が約４０分と非常に長くなってしまった。【００９１】
以上の結果から、本発明に係る細胞検出装置およびこの細胞検出装置を用いた細胞検出方法は、照射スポットが直径５μｍ程度のマイクロアレイスキャナーを用いた細胞検出と同程度以上の感度で、かつ短時間に希少細胞を検出することができることがわかる。【００９２】
本出願は、２０１３年１２月１６日出願の特願２０１３−２５９２２４に基づく優先権を主張する。当該出願明細書および図面に記載された内容は、すべて本願明細書に援用される。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明の細胞検出方法および細胞検出装置は、正確に、高感度かつ短時間で希少細胞を検出することができるため、例えば疾患の検査などに有用である。
【符号の説明】
【００９４】
１００  細胞検出装置
１１０  ホルダー
１２０  光照射部
１２１  第１光照射装置
１２２  第２光照射装置
１３０  光検出部
１３１  第１レンズ
１３２  第１ダイクロイックミラー
１３３  第２レンズ
１３４  第２ダイクロイックミラー
１３５  対物レンズ
１３６  フィルター
１３７  ピンホール
１３８  第３レンズ
１３９  第４レンズ
１４０  検出領域規定部
１４１  第１検出領域規定部
１４２  第２検出領域規定部
１５０  移動部
１５１  Ｘ軸移動機構
１５２  Ｙ軸移動機構
１６０  細胞展開用デバイス
１６１  チップ
１６２  枠体
１６３  天板
１６４  流路
１６５  細胞収容部
１６６  導入口
１６７  排出口
１６８  マイクロチャンバー
１６９  溝
Ａ１  第１検出領域
Ａ２  第２検出領域
Ｓ１  第１照射スポット
Ｓ２  第２照射スポット
ＳＡ１  第１走査領域
ＳＡ２  第２走査領域
ＳＡ３  第３走査領域
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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