(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
超音波イメージング微粒子組成物であって、中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を備える微粒子を含み、且つ、前記コア微粒子構造が
（ｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルコリン脂質である、ホスファチジルコリン脂質、
（ｉｉ）１５００と２５００の間の分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含む炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質である、少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質であって、前記少なくとも１つのマレイミド部分が前記ポリエチレングリコール鎖に結合している、少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質、および
（ｉｉｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ポリエチレングリコール脂肪酸エステルである、アルコキシル化脂肪酸
をそれぞれ７０〜８０：５〜１５：１０〜２０のモル比で含む前記微粒子組成物。
【請求項２】
前記コア微粒子構造のシェルに共有結合している少なくとも１つの分子結合要素をさらに含む、請求項１に記載の微粒子組成物。
【請求項３】
前記少なくとも１つの分子結合要素が前記少なくとも１つのマレイミド部分を介して前記コア微粒子構造に共有結合している、請求項２に記載の微粒子組成物。
【請求項４】
前記コア微粒子構造がミセル状である、請求項１から３のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項５】
前記コア微粒子構造が標識部分をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項６】
前記微粒子組成物における前記標識部分のモル比が０．２〜５０である、請求項５に記載の微粒子組成物。
【請求項７】
前記微粒子組成物における前記標識部分のモル比が０．５〜５である、請求項６に記載の微粒子組成物。
【請求項８】
前記標識部分が蛍光色素である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項９】
前記標識部分が１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（ＤｉＩ）である、請求項８に記載の微粒子組成物。
【請求項１０】
前記コア微粒子構造がホスファチジルエタノールアミン脂質をさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項１１】
前記ホスファチジルエタノールアミン脂質が炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質である、請求項１０に記載の微粒子組成物。
【請求項１２】
前記ホスファチジルエタノールアミン脂質がジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である、請求項１１に記載の微粒子組成物。
【請求項１３】
前記微粒子組成物における前記ホスファチジルエタノールアミン脂質のモル比が０．５〜５である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項１４】
前記コア微粒子構造の中央領域が液体媒質を含有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項１５】
前記液体媒質が生理的に許容可能なガスを含む、請求項１４に記載の微粒子組成物。
【請求項１６】
前記生理的に許容可能なガスが空気、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタジエン、オクタフルオロ−２−ブテン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、パーフルオロシクロペンタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンから選択される、請求項１５に記載の微粒子組成物。
【請求項１７】
前記生理的に許容可能なガスがオクタフルオロプロパンを含む、請求項１５または１６に記載の微粒子組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの分子結合要素がタンパク質、ペプチド、または低分子有機部分を含む、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの分子結合要素が抗体である、請求項１８に記載の微粒子組成物。
【請求項２０】
成分（ｉｉ）に対する前記少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が１対１以上である、請求項２〜１９のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項２１】
成分（ｉｉ）に対する前記少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が５対１以上である、請求項２０に記載の微粒子組成物。
【請求項２２】
前記微粒子が微粒子当たり少なくとも約１×１０５個の分子結合要素を有する、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項２３】
前記ホスファチジルコリン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホス
フォコリンである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項２５】
前記ポリエチレングリコール脂肪酸エステルがステアリン酸ＰＥＧ４０である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項２６】
前記微粒子の平均直径が０．５〜５μｍの範囲にある、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項２７】
超音波イメージング微粒子組成物の製造のための中間微粒子組成物であって、
（ｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルコリン脂質である、ホスファチジルコリン脂質、
（ｉｉ）１５００と２５００の間の分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含む炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質である、少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質であって、前記少なくとも１つのマレイミド部分が前記ポリエチレングリコール鎖に結合している、少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質、および
（ｉｉｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ポリエチレングリコール脂肪酸エステルである、アルコキシル化脂肪酸
をそれぞれ７０〜８０：５〜１５：１０〜２０のモル比で含む前記中間微粒子組成物。
【請求項２８】
少なくとも１つの分子結合要素をさらに含む請求項２７に記載の中間微粒子組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの分子結合要素が前記少なくとも１つのマレイミド部分に共有結合している、請求項２８に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３０】
標識部分をさらに含む請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３１】
前記中間微粒子組成物における前記標識部分のモル比が０．２〜５０である、請求項３０に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３２】
前記中間微粒子組成物における前記標識部分のモル比が０．５〜５である、請求項３１に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３３】
前記標識部分が蛍光色素である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３４】
前記標識部分が１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（ＤｉＩ）である、請求項３３に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３５】
ホスファチジルエタノールアミン脂質をさらに含む請求項２７〜３４のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３６】
前記ホスファチジルエタノールアミン脂質が炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質である、請求項３５に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３７】
前記ホスファチジルエタノールアミン脂質がジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である、請求項３６に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３８】
前記中間微粒子組成物における前記ホスファチジルエタノールアミン脂質のモル比が０．５〜５である、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項３９】
前記少なくとも１つの分子結合要素がタンパク質、ペプチド、または低分子有機部分を含む、請求項２８〜３８のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも１つの分子結合要素が抗体である、請求項３９に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４１】
成分（ｉｉ）に対する前記少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が１対１以上である、請求項２８〜４０のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４２】
成分（ｉｉ）に対する前記少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が５対１以上である、請求項４１に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４３】
前記ホスファチジルコリン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリンである、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質が１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］である、請求項２７〜４３のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４５】
前記ポリエチレングリコール脂肪酸エステルがステアリン酸ＰＥＧ４０である、請求項２７〜４４のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４６】
前記組成物が凍結乾燥物である、請求項２７〜４５のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４７】
前記組成物が水性分散液である、請求項２７〜４５のいずれか一項に記載の中間微粒子組成物。
【請求項４８】
請求項２７〜４７のいずれか一項に記載の中間組成物、および生理的に許容可能なガスを含む液体媒質の供給源を含むキット。
【請求項４９】
前記生理的に許容可能なガスが空気、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタジエン、オクタフルオロ−２−ブテン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、パーフルオロシクロペンタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンから選択される、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記生理的に許容可能なガスがオクタフルオロプロパンを含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の微粒子組成物の調製方法であって、
（ｉ）成分（ｉ）から（ｉｉｉ）を含む中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を形成すること
を含む前記調製方法。
【請求項５２】
請求項５１に記載の微粒子組成物の調製方法であって、
（ｉｉ）前記コア微粒子構造のシェルに少なくとも１つの分子結合要素を共有結合すること
をさらに含む前記調製方法。
【請求項５３】
生理的に許容可能なガスの存在下でステップ（ｉ）が実行される、請求項５１または５２に記載の微粒子組成物の調製方法。
【請求項５４】
ステップ（ｉ）における成分（ｉｉ）に対する前記少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が１対１以上である、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の微粒子組成物の調製方法。
【請求項５５】
ステップ（ｉ）における成分（ｉｉ）に対する前記少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が５対１以上である、請求項５４に記載の微粒子組成物の調製方法。
【請求項５６】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の微粒子組成物、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項５７】
超音波イメージングにおける造影剤として使用される請求項５６に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
超音波イメージングにおける造影剤として使用される請求項１〜２６のいずれか一項に記載の微粒子組成物。
【請求項５９】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の微粒子組成物、または請求項５６に記載の医薬組成物を投与された被験者において少なくとも１つの撮像技術を用いて前記被験者を撮像すること
を含む撮像方法。
【請求項６０】
前記撮像技術が超音波撮像法（ＵＳ）を含む、請求項５９に記載の撮像方法。
【請求項６１】
前記撮像技術が磁気共鳴撮像法（ＭＲＩ）を含む、請求項５９に記載の撮像方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は微粒子組成物に関する。とりわけ、本発明は、限定されないが、選択した分子部分の超音波撮像法に適切な微粒子組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
超音波診断（超音波検査）は、可能性がある病態または病変について腱、筋肉、関節、血管および内臓を含む組織を視覚化するために使用される超音波ベースの診断撮像技術である。一般的な例は産科学的超音波診断であり、それは妊娠期に慣用的に使用されている。しかしながら、これまで超音波撮像法は解剖学的構造と運動、および血流の明確化に限定されてきた。
【０００３】
他方、超音波分子イメージングは、粒子シェル上に標的化リガンド（分子欠尾具要素）を含む標的化マイクロバブルにより所与の分子部分／目的の部分（発現）の画像化を容易にする１。この方法は標的化マイクロバブルの静脈内（ｉｖ）投与により作用し、それらの標的化マイクロバブルはその後に循環し、目的の分子を発現する領域に蓄積する。それらのマイクロバブルの蓄積は超音波画像上にそれらの分子の局在を示す明るいシグナルの領域として示され得る。
【０００４】
この技術により動物モデルにおけるインビボ分子イメージングが可能となった。しかしながら、超音波分子イメージングは部分的にはその安全性と有効性に関する不確実性のためにヒトでは未だに実施されておらず、それらの不確実性には、
（１）標的化リガンド（分子結合要素）をマイクロバブルシェルに結合させるためのビオチン−（ストレプト）アビジン結合化学の伝統的使用。ストレプトアビジンとアビジンは免疫原性のタンパク質であり、ヒトでの使用は避けた方が良い；
（２）安全性についての懸念をもたらす３、「瞬時の」粒子破壊を伴う高超音波出力撮像技術の伝統的使用１、２。さらに、その技術はリアルタイムでの分子標的（目的の分子部分）のベッドサイドでの可視化を困難なものとし、マイクロバブルの一回のボーラスを用いて心臓の鼓動を評価するための連続撮像、または多平面撮像を不可能にする、および
（３）臨床診断ツールとしてのその有用性を低下させる、超音波分子イメージングの低い定量程度
が含まれる。
【０００５】
よって、非免疫原性であり、したがってヒト被験者ならびに動物の超音波分子イメージングでの使用に適切である微粒子組成物を提供することが目的である。さらに、１種類以上の組織／器官における目的の分子部分の非常に定量的であり、且つ、リアルタイムの超音波分子イメージングに特異的であり、且つ、インビボで有効である微粒子組成物を提供することが目的である。そのように作製された微粒子は、限定されないが、無毒であること、一回のボーラス微粒子投与による連続撮像および／または多平面撮像にとって充分に安定であること、目的の分子部分の非常に定量的な分析にとって有利な動態と音響応答を有すること、目的の分子部分に対して充分に高い標的化特異性と標的化効率を有すること、および目的の分子部分（標的分子）を発現しない組織（体内での微粒子排出の通常の経路である肝臓および脾臓などの網内皮系（ＲＥＳ）組織を除く）における非特異的結合／残留を有しないことを含む、１つ以上の有利なインビボの特徴を有し得る。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の１つの態様では、分子イメージングに適切な微粒子組成物であって、中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を備える微粒子を含み、且つ、前記コア微粒子構造が（
ｉ）ホスファチジルコリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質、および（ｉｉｉ）アルコキシル化脂肪酸を含む前記組成物を提供する。
【０００７】
この組成物は、選択された分子標的（目的の分子部分／複数の分子部分）の撮像に適切であるように修飾され得る未変性の微粒子構造を提供する。したがって、それらの微粒子は前記コア微粒子構造のシェルに共有結合している少なくとも１つの分子結合要素をさらに含み得る。
【０００８】
撮像に関して、その特定の組成物は充分にエコー源性であり、且つ、安定な微粒子を産生することがわかっており、それらの微粒子は非特異的結合を欠き、且つ、インビボで即座の有害作用を引き起こさない。それらの微粒子はそのコア構造のシェルに結合している分子結合要素によって流動条件下で効率的な標的結合を促進もする。それらの微粒子の有利な動態と音響応答によって、非常に定量的であり、且つ、リアルタイムの超音波分子イメージングがインビボで可能になる。
【０００９】
「分子イメージング」という用語は、限定されないが、分子、細胞、または粒子（人工材／移植材上に存在するもの、例えば、冠動脈ステント、人工心臓弁または閉塞装置上の金属、重合体、または薬物を含む）などの分子部分の撮像を指す。したがって、「分子イメージング」という用語はそれらの分子部分のうちの１つ、または組合せをそれらの微粒子により標的化することによる表現型の撮像（分子部分の存在、不在および／または程度の検出）を指すために使用され得る。表現型の例には生理学的状態、病理学的状態、病態生理学的状態、疾患状態、または運用状態（例えば、装置の）が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｅ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）（炎症における内皮活性化時に発現する内皮接着分子）を標的にする微粒子を使用する分子イメージングをＥｓｅｌ発現の画像検出とその程度の評価、ならびに内皮活性化および／または炎症の画像検出とその程度の評価に用いることができる。無関係の分子結合要素を含む微粒子、または全く分子結合要素を含まない微粒子などの非標的化微粒子は分子イメージングにおいて、多くの場合に陰性対照として、または組織／器官／被験者／系における非特異的な微粒子の結合／接着／保持の程度の評価のために、または撮像シグナルの校正（例えば、微粒子濃度に対する微粒子超音波撮像シグナル強度の校正）のための作用剤として、または灌流の評価もしくは血液と組織の境界の線引きのためなどに使用され得る。
【００１０】
「微粒子」という用語は、輸送と物性に関して統一的な単位として挙動し、且つ、典型的には０．１〜１０μｍ（好ましくは１〜５μｍ）の範囲にある平均粒径（例えば、顕微鏡観察、エレクトロゾーンセンシング、またはレーザー回折技術により決定される）を示す小粒子を指す。「マイクロバブル」という用語は「微粒子」という用語と同義的に使用され得る。リポソームは、脂質二層から構成される人工的に調製された小胞として見なしてよい、例となる種類の微粒子である。同様に、ミセルは、親水性シェルと疎水性中央部から構成される人工的に調製された粒子として見なしてよいある種の微粒子である。
【００１１】
本発明の微粒子は中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を備える。そのコア微粒子構造は主に脂質ベースの組成物からなり、（ｉ）ホスファチジルコリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質、および（ｉｉｉ）アルコキシル化脂肪酸を含む。これらの成分は容易に自己集合して安定な微粒子コア構造を形成する。
【００１２】
それぞれ成分（ｉ）と成分（ｉｉ）に従う本発明のホスファチジルコリン脂質とホスファチジルエタノールアミン脂質は通常は中性リン脂質である。したがって、それらはホスフェート基を含む親水性頭部と疎水性のテール部を含む脂質である。本明細書において使
用される場合、「中性」という用語は、選択されたｐＨにおいて帯電していない、または中性の双性イオン体で存在する物質を指す。適切なｐＨは、例えば、７．４±０．５であり得る。
【００１３】
さらに、それぞれ成分（ｉ）と成分（ｉｉ）に従う本発明のホスファチジルコリン脂質とホスファチジルエタノールアミン脂質は飽和型または不飽和型である親水性頭部を修飾する疎水性テール部を通常は有する。それらの親水性テール部は飽和型脂肪酸基またはそれらの誘導体であることが好ましい。「脂肪酸」という用語は直鎖状または分岐状であり、飽和型または不飽和型の炭素数７〜２４の炭素鎖を含むカルボン酸またはそれらの誘導体を指す。典型的には、飽和型脂肪酸は炭素数１０〜２４の炭素鎖、またはより好ましくは炭素数１０〜２０の炭素鎖を含む。
【００１４】
成分（ｉ）のホスファチジルコリン脂質は好ましくは炭素数７〜２４の脂肪酸鎖、より好ましくは炭素数８〜２２の脂肪酸鎖、最も好ましくは炭素数１０〜２０の脂肪酸鎖を含むホスファチジルコリン脂質である。そのような脂質の具体例には、例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、およびジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）が挙げられる。そのような脂質の脂肪酸鎖が炭素数１０から２０の範囲にあるときにより安定な微粒子が形成されると考えられている。成分（ｉ）のホスファチジルコリン脂質が炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルコリン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン）であることが最も好ましい。
【００１５】
成分（ｉｉ）のホスファチジルエタノールアミン脂質は好ましくは炭素数７〜２４の脂肪酸鎖、より好ましくは炭素数８〜２２の脂肪酸鎖、最も好ましくは炭素数１０〜２０の脂肪酸鎖を含むホスファチジルエタノールアミン脂質を含む。そのような脂質は、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に基づく構造を含む。そのような脂質の脂肪酸鎖が炭素数１０から２０の範囲にあるときにより安定な微粒子が形成されると考えられている。成分（ｉｉ）のホスファチジルエタノールアミン脂質が炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質、例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を含むものであることが最も好ましい。
【００１６】
本発明の好ましい態様では、成分（ｉｉ）のホスファチジルエタノールアミン脂質はＰＥＧ化される。「ＰＥＧ化」という用語は物体、通常は重合体ベースまたは脂質ベースの物質であって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）高分子鎖に共有結合しているものを指す。ＰＥＧ鎖はＣ２ｎＨ４ｎ＋２Ｏｎ＋１の分子式と２０，０００ｇ／モル未満の分子量を有する。この場合、そのＰＥＧ高分子鎖にマレイミド部分が結合していてよく、より好ましくはそのＰＥＧ高分子鎖はマレイミド部分とホスファチジルエタノールアミン脂質部分との間に共有結合をもたらす。
【００１７】
よって、成分（ｉｉ）のホスファチジルエタノールアミン脂質が少なくとも５００の分子量、例えば、少なくとも１０００、１５００、または２０００の分子量を有するポリエチレングリコール鎖を含むことが好ましい。自己集合に関して、１５００と２５００の間の分子量を有するポリエチレングリコール鎖が好ましい。
【００１８】
成分（ｉｉ）のホスファチジルエタノールアミン脂質は少なくとも１つのマレイミド部分を含む。マレイミド部分は一般式Ｈ２Ｃ２（ＣＯ）２ＮＨを有する化学物質であり、次の構造によって表され得る。
【化１】
0006495828.tif 000002
【００１９】
成分（ｉｉ）のマレイミド部分のＮＨ基が可能性としてはＰＥＧ高分子鎖を介してホスファチジルエタノールアミン部分に共有結合することが好ましい。
【００２０】
本微粒子組成物の特に好ましいホスファチジルエタノールアミン脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌと省略される）である。
【００２１】
とりわけ、分子結合要素用のハンドルとしてのマレイミド部分の使用はそのような粒子の調製に伝統的に使用される免疫原性の（ストレプト）アビジン−ビオチン結合化学からの離脱である。他の結合化学を用いることもできるが、驚くことに、マレイミドリンカーによって低レベルの免疫原性を有する微粒子が産生されることがわかった。さらに、マレイミド結合のｐＨ安定性が分子結合要素の分解の回避に関して有利であり、したがって調製時にそれらの微粒子の分解の回避に関して有利であり、且つ、インビボで微粒子シェルからの分子結合要素の脱離を防止することにより分子結合要素、微粒子の分解の回避に関して有利であることがわかった。
【００２２】
本発明の成分（ｉｉｉ）に従うアルコキシル化脂肪酸は、直鎖状または分岐状であり、飽和型または不飽和型である脂肪酸基を含み得る。さらに、その脂肪酸鎖は炭素数７〜２４の鎖、より好ましくは炭素数８〜２２の鎖、最も好ましくは炭素数１０〜２０の鎖であり得る。したがって、直鎖状で飽和型または不飽和型（好ましくは飽和型）の炭素数１０〜２０の鎖を含む脂肪酸鎖が好ましい。そのアルコキシ基（すなわち、前記脂肪酸基と共にエステルを形成する基）は前記脂肪酸の酸素に単独で結合している直鎖状または分岐状のアルキル基（好ましくはＣ１〜５０アルキルまたはＣ１〜２４アルキル）、アルケニル基（好ましくはＣ１〜５０アルケニルまたはＣ１〜２４アルケニル）、またはポリエチレングリコール基であり得る。
【００２３】
「Ｃｘ〜ｙアルキル」という用語は、本明細書において使用される場合、ｘ個からｙ個までの炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の飽和型炭化水素基を指す。例えば、Ｃ１〜５０アルキルは１個から５０個までの炭素原子を含有する直鎖状または分岐状の飽和型炭化水素基を指す。Ｃ１〜５０アルキル基の例にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル、イコシル、トリアコンチル、テトラコンチル、およびペンタコンチルが挙げられる。
【００２４】
「Ｃｘ〜ｙアルケニル」という用語は、本明細書において使用される場合、１個以上の炭素間二重結合を含有し、且つ、ｘ個からｙ個までの炭素原子を有する直鎖状または分岐状の炭化水素基を指す。Ｃ１〜５０アルケニル基の例にはエテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、２−メチル−１−プロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４
−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−ヘキセニル、３−ヘキセニル、５−ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニル、ウンデセニル、ドデセニル、トリデセニル、ペンタデセニル、およびヘキセデセニルが挙げられる。
【００２５】
「炭化水素」という用語は水素と炭素のみからなる物質を指す。そのような物質は飽和型または不飽和型で分岐状または直鎖状であり得る。
【００２６】
好ましい態様では、前記アルコキシル化脂肪酸はポリエチレングリコール脂肪酸である。したがって、適切なアルコキシル化脂肪酸は、例えば、炭素数１０〜２０の飽和型ポリエチレングリコール脂肪酸エステルであり得る。微粒子安定性に関して、特に好ましいポリエチレングリコール脂肪酸エステルはステアリン酸ＰＥＧ４０である。
【００２７】
別途示されない限り、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）または本明細書において言及されるあらゆる追加の成分は塩形態ならびに遊離（酸または塩基）形態で存在し得る。
【００２８】
本発明による微粒子組成物は、前記コア微粒子構造のシェルに共有結合する少なくとも１つの分子結合要素を含み得る。このように選択した分子部分（発現）に特異的である、例えば、選択した分子部分に特異的に結合する標的化微粒子が作製される。１つの好ましい実施形態では、それらの少なくとも１つの分子結合要素が少なくとも１つのマレイミド部分を介してそのコア微粒子構造に共有結合している。さらに、本微粒子組成物は１つ以上の分子部分（発現）を標的にするために１つ以上の異なる分子結合要素を含み得る。
【００２９】
分子結合要素は相補的な分子部分に結合することができるあらゆる無機分子または有機分子であり得る。分子結合要素の適正な素性と性質は、本微粒子によって認識され、且つ、撮像される目的の分子部分に依存する。例えば、その分子部分は、人工材または移植材上に存在するものを含む分子、タンパク質、受容体、粒子または細胞であり得る。その分子部分は細胞の表面に存在し得る。分子結合要素は目的の分子部分に結合することができるあらゆる適切な要素であり得る。分子結合要素は目的の分子部分に特異的に結合するはずであり、それにより他の分子部分に結合しない。したがって、適切な分子結合要素は、限定されないが、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質、無機部分、または低分子有機部分（例えば、薬物分子）を含み得る。幾つかの実施形態では、分子結合部分は金属（例えば、ニッケル、コバルト、マンガン、または亜鉛のイオン。それらはヒスチジンタグに結合する）であり得る４。特定の実施形態では、分子結合要素は結合タンパク質、アフィボディ、または抗体分子であり得る。
【００３０】
「結合タンパク質」という用語はある分子（これ以降「結合パートナー」と呼ぶ）に特異的に結合することができるあらゆるタンパク質を指す。特異的な結合タンパク質は、その結合タンパク質がその結合パートナーに結合する結合部位を有する。結合タンパク質は一般にこの部位においてその結合パートナーおよびその結合パートナーとよく似た構造を有する他の分子に高い親和性で結合するだけである。結合パートナーに似ていない分子は結合したとしても低い親和性で結合する。結合タンパク質は当業者に周知である。結合タンパク質の例にはＴ細胞受容体、ＨＬＡタンパク質、細胞表面受容体および酵素が含まれるが、これらに限定されない５。結合タンパク質という用語はこれらの分子または特異的に結合することができるあらゆる他の分子の機能性断片も含む。機能性断片は結合タンパク質の一部であって、それでも結合タンパク質の結合パートナーと高い親和性で特異的に結合することができるものである。
【００３１】
「アフィボディ」という用語は、スタフィロコッカスプロテインＡのＩｇＧ結合性ドメインのうちの１つに由来する５８アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく小分子を指す。これらのドメインは小分子（例えば、特許引用文献の国際公開第９５／１９２７４号
Ａ１パンフレットを参照のこと）に対する特異的な親和性を有するように選択され得る６〜８。
【００３２】
「抗体」または「抗体分子」という用語はあらゆるアイソタイプのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合断片、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片および単鎖Ｆｖ断片を指す。抗体分子は組換え抗体分子、例えば、キメラ抗体分子、ＣＤＲグラフト抗体分子（ヒト化抗体分子としても知られる）またはそれらの断片であり得る。そのような抗体とそれらの抗体の製作方法は当技術分野で周知である。抗体分子はあらゆる適切な方法で、例えば、ハイブリドーマまたはファージ技術を使用して製作され得る。当業者であれば小分子に対して特異的な結合親和性を有する抗体の製作方法を知っているであろう８。抗体分子はあらゆる適切な生物から、例えば、ヒツジ、マウス、ウサギ、ヤギ、ロバ、ラクダ、ラマ、またはサメから産生され得る。抗体分子がヒト抗体分子、ヒト化抗体分子、キメラ抗体分子またはげっ歯類抗体分子であることが好ましい。
【００３３】
「特異的に結合する」という用語は生理的条件下で比較的に安定な複合体を形成する２つの分子の間での相互作用を指す。その相互作用は、通常は低い親和性を有する非特異的結合と区別される高い親和性を特徴とする。
【００３４】
分子結合要素は好ましくは抗体分子である。この場合、抗体分子はペンダントチオール基（例えば、−ＳＨ）によってマレイミド基に共有結合し、それによってチオエーテル結合（例えば、−Ｓ−）を形成することができる。
【００３５】
適切な分子結合要素の具体例はＥ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）に対する抗体である。Ｅｓｅｌは内皮接着分子であり、古典的には活性化内皮細胞においてのみ発現する（休止内皮細胞での基礎的発現が無い）９。とりわけ、その抗体は内皮活性化または炎症の特異的な検出に使用され得る１０、１１。したがって、本発明の１つの実施形態によって超音波を用いて初めて心臓および腎臓におけるＥｓｅｌの特異的な撮像が可能になった。
【００３６】
種々の疾患の様々な病態生理学的過程に関与し、且つ、分子結合要素の標的であり得る他の血管内分子／細胞には次のものが含まれるが、それらに限定されない。
（ｉ）大動脈、心臓、骨格筋、腎臓、脳、腸および前立腺癌（後肢移植）などの組織でのアテローム性硬化症、虚血再灌流傷害、急性心筋梗塞と初期血管形成術、慢性虚血、心臓移植拒絶、脳脊髄炎、クローン病および腫瘍照射の炎症過程におけるＰ−セレクチン（Ｐｓｅｌ）、非選択的なセレクチン類（すなわち、非選択的なＥｓｅｌ、Ｐｓｅｌ、Ｌｓｅｌの組合せ）、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、粘膜アドレシン細胞接着分子−１（ＭＡｄＣＡＭ−１）およびβ１，β３含有インテグリン（例えば、α５β１、ανβ３、αＩＩｂβ３（糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体）））
（ｉｉ）（ａ）脳、膵臓、乳房脂肪体、後肢、側腹部または鼠径部に位置する腫瘍（乳癌、前立腺癌、卵巣癌、結腸癌、膵臓癌、黒色腫、血管肉腫、繊維肉腫および神経膠腫）、（ｂ）慢性虚血（後肢骨格筋）、および（ｃ）マトリゲルプラグ血管形成の血管形成における血管内皮細胞増殖因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、β１，β３含有インテグリンまたはαｖ含有インテグリン（例えば、α５β１、αｖβ３）およびエンドグリン
（ｉｉｉ）心臓発作または血栓塞栓性疾患における頸動脈、左心耳、下大静脈および腹大動脈での血栓形成（血液凝固）におけるαＩＩｂβ３（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体）
（ｉｖ）リンパ節におけるＬ−セレクチン（Ｌｓｅｌ）
（ｖ）例えば、内皮始原細胞療法における形質移入された骨髄由来内皮始原細胞上にある主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ  Ｈ−２Ｋｋタンパク質などのレポーター分子
（ｖｉ）心臓または腎臓での虚血再灌流傷害、急性心筋梗塞と初期血管形成術、および
心臓移植拒絶におけるもののような活性化白血球（限定されないが、電荷相互作用および補体介在性結合を含む、あり得る機構を介して活性化白血球を標的にする分子結合要素としてホスファチジルセリンが使用され得る）
【００３７】
幾つかの実施形態では、次の表から分子結合要素が選択され得る。
【００３８】
【表１−１】
0006495828.tif 000003
【表１−２】
0006495828.tif 000004
【表１−３】
0006495828.tif 000005
【表１−４】
0006495828.tif 000006
【表１−５】
0006495828.tif 000007
【表１−６】
0006495828.tif 000008
【表１−７】
0006495828.tif 000009
【表１−８】
0006495828.tif 000010
表１：インビボ超音波分子イメージング
ａ．「シクロ」に「ｃ」の接頭文字を用いる標準的な一文字命名法でのペプチド配列。ｂ．白血球とのホスファチジルセリンの相互作用は電荷相互作用と活性化白血球上の補体受容体（未定義）を含む。ｃ．実際の分子標的は不明である。略語：ＤＳＰＳ（ジステアロイルホスファチジルセリン）、Ａｂ（抗体）。
【００３９】
実施形態では、分子結合要素が成分（ｉｉ）のマレイミド部分に結合しているか否かに関わらず、本微粒子または成分（ｉｉ）上のあらゆるマレイミド部分（すなわち、活性マレイミド機能を含むもの）は、例えば、加水分解により、または過剰なチオールとの反応により不活性化され得る。とりわけ、分子当たり一つのチオール基を有する適切な分子、例えば、Ｌ−システインを使用することが好ましくあり得る（反応物質からのそれらの微粒子または成分の精製が後で必要とされ得る）。
【００４０】
分子結合要素が微粒子に結合しているとき、その結合反応において使用される結合反応比率は好ましくは微粒子当たり少なくとも２×１０６個の分子結合要素（例えば、抗体分子）である。幾つかの実施形態では、その結合反応比率は微粒子当たり少なくとも３×１０６個の分子結合要素であり得る。さらに、その結合反応比率は微粒子当たり少なくとも４×１０６個の分子結合要素であり得る。この程度の反応比率を使用すると、流動条件下ならびに静止条件下で充分に結合することができる微粒子が作製される。レベルが低いほど（例えば、粒子当たり約１×１０６個の分子結合要素）静止条件下で標的化することができるだけの微粒子が作製される。
【００４１】
別の表現をして、且つ、成分（ｉｉ）の全てが本微粒子のシェルに組み込まれていると仮定すると、分子結合要素を微粒子に結合させる反応に使用される結合反応比率は、成分（ｉｉ）に対する少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が１対１以上であるような比率である。他の場合では、成分（ｉｉ）に対する少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比は５対１以上であり得る。さらに、その結合反応モル比は８対１以上、９
対１以上、または１０対１以上であり得る。幾つかの実施形態では、その結合反応モル比は約１０対１であり得る。
【００４２】
幾つかの実施形態では、本微粒子は微粒子当たり少なくとも約０．３×１０５個の分子結合要素（例えば、抗体分子）を有する。これにより、それらの微粒子は流動条件下ならびに静止条件下で充分に結合することができることになる。幾つかの実施形態では、本微粒子は微粒子当たり少なくとも約１×１０５個の分子結合要素（例えば、抗体分子）を有する。本微粒子は微粒子当たり少なくとも約２×１０５個の分子結合要素（例えば、抗体分子）を有し得る。さらに、本微粒子は微粒子当たり少なくとも約３×１０５個の分子結合要素（例えば、抗体分子）を有し得る。特定の実施形態では、本微粒子は微粒子当たり約３×１０５個と約４×１０５個の間の分子結合要素（例えば、抗体分子）を有し得る。
【００４３】
本微粒子はμｍ２微粒子表面積当たり少なくとも約２５００個の複合体化した分子結合要素（例えば、抗体分子）を有し得る。さらに、本微粒子はμｍ２微粒子表面積当たり少なくとも約５０００個の複合体化した分子結合要素（例えば、抗体分子）を有し得る。幾つかの実施形態では、本微粒子はμｍ２微粒子表面積当たり少なくとも約７５００個の複合体化した分子結合要素（例えば、抗体分子）を有し得る。
【００４４】
各分子結合要素上の結合部位を最小に保ち（例えば、１つの鎖間ジスルフィド結合だけを還元して抗体当たり２つの−ＳＨ基を作製し）、且つ、粒子複合体化の後にあらゆる未反応基を不活化することにより（例えば、未反応の−ＳＨ基のアルキル化により）、架橋に起因する著しい粒子凝集を回避することができることがわかった。
【００４５】
分子結合要素は、本微粒子の形成の前または後のどちらかに本微粒子組成物の成分（ｉｉ）に共有結合し得る。結合要素が本微粒子の形成前に成分（ｉｉ）に共有結合するとき、生じる成分のモル比は５〜１５である。
【００４６】
本微粒子の構造的形態は多少なりとも限定されず、且つ、それらの粒子はリポソーム構造またはミセル構造を示してよい。幾つかの実施形態では、コア微粒子構造はミセル状である。コア微粒子構造がミセル状であるとき、構成脂質の親水性頭部がそのコア構造のシェルを形成し、一方で疎水性テールが内側に向かってそのコアの中央領域にまで延びる。他の実施形態では、コア微粒子構造はリポソーム状である。
【００４７】
本発明の好ましい態様では、本微粒子組成物はコア微粒子構造の中央領域に液体媒質を含有する。その液体媒質はあらゆる生理的に許容可能な媒質であり得、その媒質は分子結合要素によって特異的に標的とされる部位への送達にとって有効な成分を含んでも含まなくてもよい。その液体媒質は生理的に許容可能なガスを含むことが好ましい。適切な生理的に許容可能なガスには空気、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタジエン、オクタフルオロ−２−ブテン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、パーフルオロシクロペンタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンが含まれる。実際的観点から、且つ、患者の安全性の点で空気、窒素、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンが好ましい。幾つかの実施形態では、その生理的に
許容可能なガスは空気、窒素、六フッ化硫黄、オクタフルオロプロパン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンから選択される。他の実施形態では、その生理的に許容可能なガスは六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンから選択され得る。さらに、その生理的に許容可能なガスは六フッ化硫黄、オクタフルオロプロパン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンから選択され得る。特定の実施形態では、その生理的に許容可能なガスはオクタフルオロプロパンである。
【００４８】
本微粒子は０．１〜１０μｍ、０．２〜１０μｍまたは０．５〜１０μｍの範囲にある平均直径（例えば、顕微鏡観察、エレクトロゾーンセンシング、またはレーザー回折技術により決定される）を有し得る。幾つかの実施形態では、本微粒子は０．５〜８μｍ、０．５〜７μｍ、または０．８〜６μｍの範囲にある平均直径を有し得る。特定の実施形態では、本微粒子は１〜５μｍの範囲にある平均直径を有し得る。本微粒子は主に球状の形態を有し得る。さらに、粒子径分布は、少なくとも９０％または少なくとも９５％の粒子の直径が１０μｍ未満（好ましくは６μｍ未満）であるようなものであり得る。特定の実施形態では、全てのそれらの微粒子が１０μｍ未満の直径を有する。その他の実施形態では、少なくとも９５％のそれらの微粒子が６μｍ未満の直径を有する。このサイズの微粒子は例えば全身的に（例えば、ｉｖ）投与されると肺毛細血管床を含む微小血管または微小循環中を制限なく横断することができる。電荷に関して、本粒子は中性に近い電荷を有してよく、本微粒子の組込まれていないシェル成分からのそれらの微粒子を精製して／精製せずに測定すると−３０ｍＶ超から＋３０ｍＶ未満の範囲のゼータ電位を有してよい。そのゼータ電位は好ましくは−２０ｍＶ超〜＋２０ｍＶ未満の範囲、より好ましくは−２０ｍＶ超〜＋１０ｍＶ未満の範囲にあり得る。分子結合要素として抗体を含む微粒子の具体例はｐＨ７．４において１ｍＭのＫＣｌ中で約５ｍＶのゼータ電位を有する。
【００４９】
微粒子はあらゆる適切な経路により投与されてよく、例にはｉｖ注射／投与、動脈内注射／投与、筋肉内注射／投与、リンパ管内注射／投与、または組織もしくは組織腔／空間への直接的注射／投与が含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の１つの特に好ましい態様では、本微粒子は（ｉ）〜（ｉｉｉ）のモル比が次の範囲：（ｉ）７０〜８０、（ｉｉ）５〜１５、および（ｉｉｉ）１０〜２０を満たす組成物を有する。明示されたモル比でのこの具体的な成分組成により、効果的で定量的であり、且つ、リアルタイムの超音波分子イメージングにインビボで（特にヒトで）機能的であり、且つ、存続能力がある標的化微粒子を作成することができることが有利なことがわかった。
【００５１】
本微粒子の組成はそれらの微粒子を形成するために使用される成分混合物（例えば、中間微粒子組成物）の組成と同義的に使用され得る。
【００５２】
本微粒子製剤は１つ以上の標識部分、または薬学的に許容可能なそれらの塩を含んでもよい。標識部分は撮像技術によるそれらの微粒子の可視化を補助する物質である。本組成物における標識部分のモル比は０．２〜５０、好ましくは０．５〜５であり得る。
【００５３】
標識部分の一例は蛍光色素であり、その蛍光色素は可視化ツールとして使用され得る。蛍光色素の例には１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−（５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホニル、１，２−ジオレオイル−ｓ
ｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−（１−ピレンスルホニル）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−（カルボキシフルオレセイン）、１−オレオイル−２−［６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォ−Ｌ−セリン、２５−［Ｎ−［（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）−メチル］アミノ］−２７−ノルコレステロール、オレオイル−２−［６−［（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）アミノ］ヘキサノイル］−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）、ローダミンジヘキサデカノイルホスフォエタノールアミン、３，３’−ジオクタデシルオキサカルボシアニンパーコレート（ＤｉＯ）、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ蛍光プローブ、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−カルボキシフルオレセイン、および１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（ＤｉＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい蛍光色素は１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（ＤｉＩ）である。本組成物における蛍光色素のモル比は０．５〜５、好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１．５〜３であり得る。本微粒子組成物は１つより多くの蛍光色素を含み得る。
【００５４】
それらの標識部分は成分（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）、分子結合要素、またはその他の成分（例えば、別の脂質成分）のうちの１つ以上への結合を介して本微粒子組成物に組み込まれ得る。その標識部分が既存の微粒子成分を介して付加される場合、標識されていない成分のモル比（例えば、成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または分子結合要素の結合比率）は変わらなくてもよく、または標識された特定の成分と標識されていないその特定の成分の総モル比が変わらずにいるように比例して減少してよい。例えば、７５／９／１４のモル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含む成分組成に対して２のモル比でＦＩＴＣがＦＩＴＣ−ＤＳＰＣとして成分（ｉ）を介して導入される場合、その最終成分組成は２／７５／９／１４または２／７３／９／１４のどちらかのモル比でＤＳＰＣ−ＦＩＴＣ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含み得る。別の実施形態では、その他の成分を介して（例えば、別の脂質としてＤＳＰＥを介して）標識が付加される場合、他の微粒子成分のモル比は変わらずにいてよい。例えば、（ＤＳＰＥを含む）ＤｉＩが７５／９／１４のモル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含む成分組成に対して２のモル比で導入される場合、その最終成分組成は２／７５／９／１４のモル比でＤｉＩ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含み得る。上記と同じ原理を用いて１種類より多くの標識部分を所与の微粒子に使用してよい。
【００５５】
代替的標識部分には様々な撮像技術、例えば、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、シンチグラフィー、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、Ｘ線撮像／透視撮影法、蛍光撮像、生物発光撮像、顕微鏡観察、光学的方法、超音波撮像法、またはそれらのマルチモード変法において使用される、当技術分野において知られているものが含まれる。そのような標識部分の例には、限定されないが、常磁性粒子、超常磁性粒子、または超超常磁性粒子（例えば、ガドリニウム（Ｇｄ）、酸化鉄、鉄、プラチナ、マンガン）、放射性核種（例えば、テクネチウム−９９ｍ、タリウム−２０１、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、ガリウム−６７、インジウム−１１１、フッ素−１８、炭素−１１、窒素−１３、酸素−１５、ルビジウム−８２）、放射線不透過性粒子（例えば、ヨウ素、バリウム、金属）、フルオロフォアまたは蛍光色素（例えば、上述のもの）、酵素基質（例えば、ルシフェラーゼの基質）、および金ナノ粒子が挙げられ得る。標識のその他の例には、限定されないが、Ｇ
ｄ−ＤＴＰＡ−ビス（ステアリルアミド）（Ｇｄ−ＢＳＡ）；Ｇｄ−ＤＴＰＡ−ビス（ミリシチルアミド）（ＧｄＤＴＰＡ−ＢＭＡ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミンジエチレン−トリアミンペンタアセテート：Ｇｄ３＋（ＤＭＰＥＤＴＰＡ：Ｇｄ３＋）；Ｄ３５−１，２−ジヘキサノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン；ガドリニウム（ＩＩＩ）２−［４，７−ビス−カルボキシメチル−１０−［（Ｎ，Ｎ−ジステアリルアミドメチル−Ｎ”−アミド−メチル］−１，４，７，１０−テトラ−アザシクロドデカ−１−イル］−酢酸（Ｇｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＡ）；ガドリニウム（ＩＩＩ）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ１−コレステリルオキシ−３−カルボニル−１，２−ジアミノエタン）アミド（Ｇｄ．ＤＯＴＡ．Ｃｈｏｌ）；ガドリニウム（ＩＩＩ）１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ１−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）アミド（Ｇｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＰＥ）およびガドリニウム（ＩＩＩ）ジエチレントリアミン−１，１，４，７，１０−ペンタ（酢酸）−１０−酢酸モノ（Ｎ１−コレステリルオキシ−３−カルボニル−１，２−ジアミノエタン）アミド（Ｇｄ．ＤＴＰＡ．Ｃｈｏｌ）が挙げられ得る。
【００５６】
これらの標識部分は微粒子成分（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）、分子結合要素を介して、またはその他の成分（例えば、別の脂質成分）を介して本微粒子に組み込まれ得る。標識部分が既存の微粒子成分を介して付加される場合、標識されていない成分のモル比（例えば、成分（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、または分子結合要素の結合比率）は変わらずにいてよく、または標識された特定の成分と標識されていないその特定の成分の総モル比が変わらずにいるように比例して減少してよい。例えば、Ｇｄ標識が７５／９／１４のモル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含む成分組成に対して２０のモル比でＧｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＰＣとして成分（ｉ）を介して導入される場合、その最終成分組成は２０／７５／９／１４または２０／５５／９／１４のどちらかのモル比でＧｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＰＣ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含み得る。別の実施形態では、標識がその他の成分を介して（例えば、別の脂質としてＤＰＰＥを介して）付加される場合、他の微粒子成分のモル比は変わらずにいてよい。例えば、Ｇｄ標識が７５／９／１４のモル比でＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含む成分組成に対して２０のモル比でＧｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＰＥとしてその他の脂質ＤＳＰＥを介して導入される場合、その最終成分組成は２０／７５／９／１４／２のモル比でＧｄ．ＤＯＴＡ．ＤＳＰＥ／ＤＳＰＣ／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ／ステアリン酸ＰＥＧ４０を含み得る。ほとんどの場合に標識は微粒子製剤全体のわずかなモル含量を形成するが、意図される撮像方法の検出感度にふさわしい充分な量のモル含量を形成する。例えば、ＰＥＴ検出のためのフッ素−１８標識または蛍光顕微鏡検出のためのＤｉＩ標識よりも多くのガドリニウム標識がＭＲＩ検出のためには必要とされるだろう。上記と同じ原理を用いて１種類より多くの標識を所与の微粒子に使用してよい。
【００５７】
本微粒子製剤はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）などのその他の脂質成分を含んでもよい。そのような脂質がＤＳＰＥであるときに本組成物中のＤＳＰＥのモル比は０．５〜５、好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１．５〜３であり得る。とりわけ、標識（例えば、ＤｉＩなどの蛍光色素）が存在しないときにＤＳＰＥが本微粒子組成物に存在することが好ましい。
【００５８】
本発明のその他の実施形態では、本微粒子製剤は腫瘍標識化作用剤をさらに含み得る。腫瘍標識化作用剤を含む本発明の微粒子は通常は、哺乳類動物の非腫瘍組織の細胞中のある受容体の発現と比べて腫瘍細胞中で過剰発現している前記受容体のリガンドを含む。幾つかの実施形態では、分子結合要素は腫瘍標識化作用剤である。
【００５９】
そのような腫瘍標識化作用剤の一例は葉酸部分を含む作用剤である。本発明の好ましい態様では、その腫瘍標識化作用剤はリン脂質−ポリエチレングリコール−フォレート化合物である。より好ましくはそのリン脂質−ポリエチレングリコール−フォレート化合物はＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−フォレート［ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（２０００）−フォレート］である。
【００６０】
適切な場合、前記コア微粒子構造の中央領域は気体性標識を含んでよく、例にはキセノン−１３３、クリプトン−８１ｍ、窒素−１３、テクネチウム−９９ｍＤＴＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
超音波撮像法に加え、標識を含有しない微粒子はＭＲＩ、ＣＴ、Ｘ線撮像または顕微鏡観察にも適切であり得る５１、５２。さらに、磁気共鳴撮像法および核磁気共鳴撮像法を改善するためのその他の脂質を含んでよい。
【００６２】
適切な場合、治療目的または研究目的のために本微粒子製剤は活性物質、治療物質、またはタグ物質を含んでもよい（例には（ｉ）前記コア微粒子構造の中央領域中、（ｉｉ）前記コア微粒子シェル中／上、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方のいずれかの場合の抗体、ペプチド、薬品、放射性核種含有化合物、放射性医薬品、放射活性ガス、または遺伝物質が挙げられるが、これらに限定されない５３。
【００６３】
特に好ましい実施形態では、本微粒子組成物は中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を備える微粒子、およびそのコア微粒子構造のシェルに共有結合する少なくとも１つの分子結合要素を含み、そのコア微粒子構造は（ｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルコリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１０００の分子量を有するポリエチレングリコール鎖と少なくとも１つのマレイミド部分を含む炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質、および（ｉｉｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ポリエチレングリコール脂肪酸エステルを含み、それらの微粒子は（ｉ）〜（ｉｉｉ）のモル比が次の範囲：（ｉ）７０〜８０、（ｉｉ）５〜１５、および（ｉｉｉ）１０〜２０を満たす組成物であって、そのコア微粒子構造の中央領域が空気、窒素、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタンジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、テトラデカフルオロヘキサンおよびオクタフルオロプロパンから選択される生理的に許容可能なガスを含む前記組成物を有する。この実施形態では、ポリエチレングリコール鎖によってマレイミド部分が炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質に結合しており、且つ、分子結合要素が抗体分子である場合に本微粒子組成物はさらにより有利である。
【００６４】
さらに、上記の実施形態では、前記コア微粒子構造は（ｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルコリン脂質としてＤＳＰＣを、（ｉｉ）少なくとも１０００の分子量を有するポリエチレングリコール鎖と少なくとも１つのマレイミド部分を含む炭素数１０〜２０の飽和型ホスファチジルエタノールアミン脂質としてＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌを、および（ｉｉｉ）炭素数１０〜２０の飽和型ポリエチレングリコール脂肪酸エステルとしてステアリン酸ＰＥＧ４０を含み得る。
【００６５】
上記の実施形態では、成分（ｉ）〜成分（ｉｉｉ）のモル比は次の範囲：（ｉ）７２〜７８、（ｉｉ）７〜１２、および（ｉｉｉ）１２〜１８を満たし得る。
【００６６】
本発明の別の非常に好ましい実施形態では、本微粒子組成物は中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を備える微粒子、および前記コア微粒子構造のシェルに共有結合する少
なくとも１つの分子結合要素を含み、そのコア微粒子構造は（ｉ）ＤＳＰＣ、（ｉｉ）ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ、および（ｉｉｉ）ステアリン酸ＰＥＧ４０を含み、それらの微粒子は（ｉ）〜（ｉｉｉ）のモル比が次の範囲：（ｉ）７２〜７８、（ｉｉ）７〜１２、および（ｉｉｉ）１２〜１８を満たす組成物であって、そのコア微粒子構造の中央領域が空気、窒素、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタンジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、デカフルオロブタン、ドデカフルオロペンタン、テトラデカフルオロヘキサンおよびオクタフルオロプロパン（好ましくはオクタフルオロプロパン）から選択される生理的に許容可能なガスを含み、且つ、分子結合要素が抗体分子である前記組成物を有する。この実施形態は好ましくは０．５〜５、好ましくは１〜４、さらにより好ましくは１．５〜３のモル比でその他のホスファチジルエタノールアミン脂質も含む。この追加のホスファチジルエタノールアミン脂質はまた、好ましくは炭素数７〜２４の脂肪酸鎖、好ましくは炭素数８〜２２の脂肪酸鎖、より好ましくは炭素数１０〜２０の脂肪酸鎖、さらにより好ましくは炭素数１０〜２０の飽和型脂肪酸鎖を含み、最も好ましくはそのホスファチジルエタノールアミン脂質はジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である。
【００６７】
所望の生理的に許容可能なガスを含有する本微粒子は形成後即座に、例えば、−８０℃で水溶液中に凍結させることにより貯蔵され得る。これを達成するため、それらの粒子は（例えば、組込まれなかった微粒子成分または断片を除去するために事前の洗浄精製を行って、または行わずに）液体窒素中で瞬間凍結され得る。その後、必要時にそれらの粒子を使用するため、（例えば、手で）ゆるやかに温度を上げることによりそれらの粒子を温めてよい。これはシェルの表面に結合した分子結合要素を有する、または有しない微粒子に当てはまる。
【００６８】
形成された微粒子（例えば、組込まれなかった微粒子成分または断片を除去するために事前の洗浄精製を行って、または行わずに）は凍結乾燥物（乾燥粉末）として貯蔵されてもよい。例えば、その凍結乾燥物（粉末）は、封止したバイアル瓶であって、そのバイアル瓶のヘッドスペースに所望の生理的に許容可能なガスを含有するそのバイアル瓶の中に貯蔵され得る。その後、必要なときにそれらの粒子を使用するため、適切な水ベースの溶液（例えば、通常生理食塩水、５％ブドウ糖、５％グルコース、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入し、続いて剪断混合すること（例えば、手または機械で振盪すること）によりそれらの粒子を再構成することができる４、５４。
【００６９】
適切な水ベースの溶液（例には通常生理食塩水、５％ブドウ糖、５％グルコース、ＰＢＳが挙げられるが、これらに限定されない）は適切な添加剤を含んでよく、後者の例にはマトリックス剤（糖、マルトースなどの炭水化物）；抗凍結剤（プロピレングリコール、グリセロールなど）、緩衝物質（リン酸一ナトリウム一水和物、リン酸二ナトリウム七水和物）、薬学的に許容可能な担体／賦形剤、またはそれらの組合せがあげられるが、これらに限定されない。
【００７０】
本発明は分子イメージング微粒子組成物の製造に適切な中間微粒子組成物であって、（ｉ）ホスファチジルコリン脂質、（ｉｉ）少なくとも１つのマレイミド部分を含むホスファチジルエタノールアミン脂質、および（ｉｉｉ）アルコキシル化脂肪酸を含む前記中間組成物にも関する。そのような組成物は微粒子の形成または再形成の土台として使用され得る安定な中間製剤を意味し、容易に貯蔵、輸送され、その後に（適切な場合は必要とされる分子結合要素と共に）再製剤化され得る。例には（限定されないが）、
（ａ）前もって適切な有機溶媒に混合および溶解された微粒子成分の凍結乾燥物（乾燥粉末）、
（ｂ）前もって適切な水ベースの溶液に懸濁された（ａ）の凍結乾燥物（乾燥粉末）、
（ｃ）前もって適切な水ベースの溶液中に形成された微粒子の凍結乾燥物（乾燥粉末）、および
（ｄ）適切な水ベースの溶液中の上記の凍結乾燥物（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）の水性懸濁液（溶液）
が挙げられる。
【００７１】
とりわけ、本中間微粒子組成物は次の範囲：（ｉ）７０〜８０、（ｉｉ）５〜１５、および（ｉｉｉ）１０〜２０を満たす（ｉ）〜（ｉｉｉ）のモル比を有し得る。
【００７２】
本中間微粒子組成物は少なくとも１つの分子結合要素をさらに含み得る。この場合、その少なくとも１つの分子結合要素は少なくとも１つのマレイミド部分に共有結合し得る。
【００７３】
好ましい実施形態では、本中間微粒子組成物は凍結乾燥物である。例えば、中間組成物は上で明示されたモル比で成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む混合物を提供することにより調製され得る。それらの成分は適切な溶媒（例えば、クロロホルム）に溶解することにより混合され、凍結乾燥により貯蔵用に調製され得る。
【００７４】
本中間組成物は分子イメージングに適切な本微粒子組成物に関して上述された特徴のうちのいずれかを共有してよい。したがって、本中間組成物は同一の脂質とその他の成分を含んでよい。
【００７５】
本中間組成物は上で明示されたモル比で成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）を含む混合物を提供することにより調製され得る。それらの成分は適切な溶媒（例えば、１：２の比率のシクロヘキサン：クロロホルム）に溶解することにより混合され、凍結乾燥により貯蔵用に調製され得る。
【００７６】
凍結乾燥は適切な水ベースの溶液への溶媒の交換を可能にし得る。その後、所望の生理的に許容可能なガスが存在する中での本中間組成物の（例えば、超音波処理、機械撹拌、または手動撹拌を用いる）剪断混合により微粒子が形成され得る。その後、形成された微粒子は、例えば、組込まれなかった微粒子成分または断片を除去するために事前の洗浄精製を行って、または行わずに凍結乾燥により乾燥粉末として貯蔵用に調製され得る。
【００７７】
本中間微粒子組成物は（例えば、組込まれなかった微粒子成分または断片を除去するために事前の洗浄精製を行って、または行わずに）凍結乾燥物（乾燥粉末）として貯蔵され得る。例えば、その凍結乾燥物（粉末）は、封止したバイアル瓶であって、そのバイアル瓶のヘッドスペースに所望の生理的に許容可能なガスを含有するそのバイアル瓶の中に貯蔵され得る。その後、必要なときにそれらの粒子を使用するため、適切な水ベースの溶液を注入し、続いて剪断混合すること（例えば、手または機械で振盪すること）によりそれらの粒子を再構成することができる。
【００７８】
さらに、本発明による中間微粒子組成物、および生理的に許容可能なガスを含む液体媒質の供給源を含むキットが提供される。とりわけ、その生理的に許容可能なガスは空気、窒素、二酸化炭素、キセノン、クリプトン、六フッ化硫黄、クロロトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ブロモトリフルオロメタン、ブロモクロロジフルオロメタン、テトラフルオロメタン、ジブロモジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、クロロペンタフルオロエタン、ヘキサフルオロエタン、ヘキサフルオロプロピレン、オクタフルオロプロパン、ヘキサフルオロブタジエン、オクタフルオロ−２−ブテン、オクタフルオロシクロブタン、デカフルオロブタン、パーフルオロシクロペンタン、ドデカフルオロペンタン、およびテトラデカフルオロヘキサンから選択され得る。例えば、本キット
は、水性（好ましくはミセル状）脂質分散液（例えば、適切な水ベースの溶液中の凍結乾燥物の懸濁液）を含有する封止したバイアル瓶であって、そのバイアル瓶のヘッドスペース中に生理的に許容可能なガスを共に含有する前記バイアル瓶を含み得る。
【００７９】
あるいは、本キットは、凍結乾燥物（乾燥粉末）としての本中間微粒子組成物を含有する封止したバイアル瓶であって、そのバイアル瓶のヘッドスペース中に生理的に許容可能なガスを共に含有する前記バイアル瓶を含み得る。必要な時にそれらの微粒子は、適切な水ベースの溶液を注入し、続いて剪断混合すること（例えば、手または機械で振盪すること）により再構成され得る。
【００８０】
その他の態様では、本発明による微粒子組成物を調製する方法であって、成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）から中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を形成することを含む前記方法が提供される。その方法は少なくとも１つの分子結合要素をそのコア微粒子構造のシェルに共有結合することをさらに含み得る。
【００８１】
中央領域とシェルを有する前記コア微粒子構造はあらゆる適切な方法で形成され得る。微粒子の製造に一般的に使用される方法は、例えば、シェル形成成分を含有する水性媒体の超音波処理などの高剪断混合を伴う。その溶液（脂質の場合は水性ミセル状分散液）は、その溶液にガスを注入している間にプローブ型超音波発生器で超音波処理され得る。ガスは超音波誘起剪断力によって水相中に分散される。微粒子ガス粒子は気体液体界面に直ぐに置かれたシェル成分によって安定化される。超音波処理の代わりに、例えば、歯科用アマルガム処理におけるときのように手動撹拌または高速混合を用いることができる。ヘッドスペースに水性ミセル状脂質分散液とガスを有する封止されたバイアル瓶をアマルガム機に設置することができる。短期（例えば、１分未満）の（例えば、約２０００〜４０００ｒｐｍでの）混合の後に微粒子の使用準備が完了している。あるいは、乾燥前駆物質（凍結乾燥物）として微粒子シェル成分または微粒子を調製することができる。微粒子シェル成分または微粒子は適切なマトリックス剤（例えば、炭水化物）と共に／無しで適切な溶液中にそれぞれ共溶解または懸濁され、バイアル瓶の中に配置され、そして冷凍乾燥（凍結乾燥）される。その後、バイアル瓶に所望のガスを充填し、密封してよい。凍結乾燥物（乾燥粉末）を有するバイアル瓶は貯蔵の点で非常に安定である。使用の直前に適切な溶液（例えば、５％デキストロース、または５％グルコース、または通常生理食塩水）を用いて微粒子を再構成し、剪断混合して（例えば、手または機械による混合）本微粒子を形成することができる４、５４、５５。
【００８２】
本発明による微粒子組成物を調製する方法であって、（ｉ）中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を形成するための成分（ｉ）〜（ｉｉｉ）の懸濁液の（例えば、上記のような超音波処理、または機械撹拌／手動撹拌による）剪断混合、および（ｉｉ）そのコア微粒子構造のシェルへの少なくとも１つの分子結合要素の共有結合を含む前記方法も提供される。
【００８３】
本微粒子の中央領域に生理的に許容可能なガスがカプセル化される実施形態について、その生理的に許容可能なガスは上記の方法のステップ（ｉ）において好ましくはそのガスの存在下でそのステップを実施することによって組み込まれ得る。
【００８４】
より具体的には、本微粒子は上述の中間微粒子組成物から調製され得る。したがって、前記凍結乾燥物（粉末）を適切な水ベースの溶液で再懸濁してよい。その後、超音波処理、手動撹拌、または機械撹拌（例えば、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ  Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ（米国、イリノイ州）またはＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（ドイツ、Ｅｓｐｅ）を使用する、例えば、４５〜６０秒間の、例えば、２０００〜４０００ｒｐｍでの例えば歯科用アマルガム機）により所望のガス（例えば、Ｃ３Ｆ８）の存在下で剪断混合アプローチを
用いてそれらの粒子を形成することができる。その後、分子結合要素との複合体化の前に形成された粒子を洗浄してよい。複合体化の後に生理学的に適切な水ベースの溶液と浮上分離液を交換する回転浮揚によりそれらの粒子を洗浄して（精製して）複合体化しなかった分子結合要素／バブル断片などを除去することができる。
【００８５】
分子結合要素が結合した、または結合していない以前に形成された微粒子の凍結乾燥物（粉末）から微粒子を再生してもよい。したがって、その以前に形成された微粒子の凍結乾燥物（粉末）を適切な水ベースの溶液に再懸濁してよい。その後、超音波処理、手動撹拌、または機械撹拌（例えば、Ｗｉｇ−Ｌ−Ｂｕｇ  Ｃｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｅｎｔａｌ（米国、イリノイ州）またはＥｓｐｅ  Ｃａｐｍｉｘ（ドイツ、Ｅｓｐｅ）を使用する、例えば、４５〜６０秒間の、例えば、２０００〜４０００ｒｐｍでの例えば歯科用アマルガム機）により所望のガス（例えば、Ｃ３Ｆ８）の存在下で剪断混合アプローチを用いてそれらの粒子を再生することができる。
【００８６】
分子結合要素が結合していない微粒子の場合ではその再生された微粒子を精製して組込まれなかった微粒子成分または断片などを使用前または貯蔵前に除去することが好ましい。分子結合要素との複合体化の前にそれらの微粒子を精製してよい。結合反応の後に本微粒子を精製して複合体化しなかった分子結合要素／バブル断片などを貯蔵前に除去することが好ましい。使用（例えば、被験者への投与）するために本微粒子をまず精製することが好ましい。
【００８７】
分子結合要素が結合している微粒子の場合では凍結乾燥物から再形成された微粒子は使用前に精製されても精製されなくてもよい。微粒子の精製にはあらゆる適切な方法を用いることができる。例えば、適切な溶液または生理学的に適切な水ベースの溶液と浮上分離液を交換する回転浮揚による洗浄。
【００８８】
本微粒子は次の方法のいずれかに従って貯蔵され得る。
貯蔵法１：形成された（洗浄済み、または未洗浄の）（分子結合要素が結合した、または結合していない）微粒子の凍結。これには瞬間凍結と容器のヘッドスペース中の所望のガスとの／無しでの−８０℃でのそれらの微粒子の貯蔵が含まれる。
貯蔵法２：形成された（洗浄済み、または未洗浄の）（分子結合要素が結合した、または結合していない）微粒子の凍結乾燥。形成された微粒子に対して凍結乾燥前にマトリックス剤（例えば、炭水化物）を添加しても添加しなくてもよい。それらの微粒子を再形成するため、適切な水ベースの溶液を添加し、その後に所望のガスの存在下で剪断混合（超音波処理または好ましくは手動／機械振盪）してよい。
貯蔵法３：分子結合要素が結合した、または結合していない微粒子のための有機溶媒中の脂質混合物の凍結乾燥（そうして最初の凍結乾燥物を作製する）。それらの成分を有機溶媒（例えば、シクロヘキサン：クロロホルム）に溶解および混合する。その後、凍結乾燥前にマトリックス剤（例えば、炭水化物）を添加しても添加しなくてもよい。それらの微粒子を形成するため、その凍結乾燥物を適切な水ベースの溶液に溶解し、その後にその溶液を所望のガスの存在下で剪断混合前にその混合物中の脂質の鎖融点（Ｔｃ）より上（例えば、６０〜６５℃）まで昇温しても昇温しなくてもよい。
【００８９】
本微粒子は上記のステップ（ｉ）および（ｉｉ）をどの順序で実施しても作製され得ること、すなわち、その調製方法はステップ（ｉ）の後にステップ（ｉｉ）を実施することに限定されないことが理解される。ステップ（ｉ）をまず実施し、続いてステップ（ｉｉ）を実施してよい。あるいは、ステップ（ｉｉ）をまず実施し、続いてステップ（ｉ）を実施してよい。したがって、分子結合要素は粒子形成の前に成分（ｉｉ）を介して前記コア微粒子構造のシェルに複合体化され得る。このために成分（ｉｉ）または成分（ｉｉ）を含む成分の脂質混合物と分子結合要素を混合してよい。どちらの場合でも複合体化しな
かった分子結合要素を除去することが好ましい。例えば、分子結合要素を含有する複合体化された成分（ｉｉ）を使用前に精製してよい。また、成分（ｉｉ）上の残留マレイミド部分（すなわち、活性マレイミド機能を含有する部分）は、例えば、加水分解または過剰なチオールとの反応により不活性化され得る。とりわけ、分子当たり一つのチオール基を有する適切な分子、例えば、Ｌ−システインを使用することが好ましくあり得る（未反応チオールを除去するための精製が後で必要とされ得る）。精製のためのあらゆる適切な方法、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いることができる。複合体化した成分の検証はあらゆる適切な方法、例えば、マススペクトロメトリー、核磁気共鳴、およびアミノ酸分析（分子結合要素および／または反応物質の性質に依存する）によるものであり得る。
【００９０】
分子結合要素を前記コア微粒子構造のシェルに共有結合するために使用される結合反応はその結合反応において使用される結合反応比率が微粒子当たり少なくとも２×１０６個の分子結合要素（例えば、抗体分子）であるときに特に有効であることがわかった。幾つかの実施形態では、その結合反応比率は微粒子当たり少なくとも３×１０６個の分子結合要素であり得る。さらに、その結合反応比率は微粒子当たり少なくとも４×１０６個の分子結合要素であり得る。この程度の反応比率を使用すると、流動条件下ならびに静止条件下で充分に結合することができる微粒子が作製される。レベルが低いほど（例えば、粒子当たり約１×１０６個の分子結合要素）静止条件下で標的化することができるだけの微粒子が作製される。
【００９１】
別の表現をして、且つ、成分（ｉｉ）の全てが本微粒子のシェルに組み込まれていると仮定すると、分子結合要素を微粒子に結合させるための反応において使用される結合反応比率は成分（ｉｉ）に対する少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比が１対１以上であるようなものである。他の場合では、成分（ｉｉ）に対する少なくとも１つの分子結合要素の結合反応モル比は５対１以上であり得る。さらに、その結合反応モル比は８対１以上、９対１以上、または１０対１以上であり得る。幾つかの実施形態では、その結合反応モル比は約１０対１であり得る。
【００９２】
各リガンド上の結合部位を最小に保つことによって、例えば、１つの鎖間ジスルフィド結合だけを還元して抗体当たり２つのＳＨ基を作製することによって架橋に起因する著しい粒子凝集を回避することができることもわかった。これは粒子複合体化の後にあらゆる未反応の−ＳＨ基を不活化することにより（例えば、未反応の−ＳＨ基のアルキル化により）さらに強化され得る。
【００９３】
上記の組成物の他の特徴は上記の方法に適用可能でもあるので、当業者はこれらの特徴はその方法の特徴でもあり得ることを理解する。
【００９４】
さらに、本発明による微粒子組成物、および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む医薬組成物が提供される。そのような組成物は、例えば、（ｉ）微粒子の表面に結合した一種類の分子結合要素を有する微粒子、（ｉｉ）微粒子の表面に結合した一種類より多くの分子結合要素を有する微粒子、または（ｉｉｉ）微粒子の表面に結合した異なる分子結合要素をそれぞれ有する微粒子の混合物を含み得る。
【００９５】
前記医薬組成物に使用され得る薬学的に許容可能な担体（アジュバントまたはベヒクル）にはイオン交換体、アルミナ、アルミニウムステアレート、レシチン、ヒト血清アルブミンなどの血清タンパク質、ホスフェートなどの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和型植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系
物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン・ポリオキシプロピレンブロック重合体、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本明細書に記載されるように、本発明の微粒子組成物またはその医薬組成物は分子イメージング、例えば、超音波撮像法、ＭＲＩ、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、Ｘ線撮像／透視撮影法、蛍光撮像、生物発光撮像、顕微鏡観察、光学的方法、またはそれらのマルチモード変法における造影剤としての使用に適切である。この場合、その特定の微粒子組成物は（ｉ）全身投与またはｉｖ投与後の目的の分子部分／複数の分子部分（標的分子）を発現しない遠位非ＲＥＳ組織における最小の非特異的保持、（ｉｉ）有効なリアルタイム超音波分子イメージング、および（ｉｉｉ）高い定量程度まで目的の分子部分／複数の分子部分の音響学的定量を容易にする。さらに、本発明は既存の臨床的超音波システムの使用を可能にし、それによって低い超音波出力の非線形（微粒子特異的）撮像モード（開発済みの臨床的超音波システムで利用可能）を使用することができる。その撮像技術の低出力でリアルタイムの性質は生物安全性と得られる優れた画像化情報の点で特に有利である。一回の微粒子ボーラス投与による連続的多平面または三次元撮像もこの技術で実現可能である。
【００９７】
どんな形であれ、本微粒子または本中間組成物は当技術分野において用いられる適切な方法によって、例えば、紫外線照射またはガンマ線照射によって滅菌され得る。
【００９８】
本発明の微粒子組成物またはその医薬組成物を被験者に投与すること、および撮像技術を用いて前記被験者を撮像することを含む撮像方法も提供される。上述したように、その撮像技術は当技術分野において広く知られているもの、例えば、超音波撮像法、ＭＲＩ、シンチグラフィー、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴ、Ｘ線撮像／透視撮影法、蛍光撮像、生物発光撮像、顕微鏡観察、光学的方法、またはそれらのマルチモード変法であり得る。
【００９９】
この方法により、目的の分子部分に結合している分子結合要素の結果としてその分子部分に結合している本微粒子の撮像が可能になる。例えば、本微粒子の分子結合要素がＥｓｅｌ抗体であるとき、投与後にそれらの微粒子は被験者中のＥｓｅｌ（炎症時に活性化内皮上に発現する内皮接着分子）に結合し、それによりその被験者におけるＥｓｅｌ発現の存在／不在および位置についての画像検出、ならびにＥｓｅｌ発現（および内皮活性化または炎症）の程度の画像定量がその撮像方法によって可能になる。
【０１００】
その方法は分子イメージングの陰性対照または校正として作用する微粒子の撮像も可能にする。例えば、分子結合要素が存在しないとき、または陰性対照もしくは不適切な抗体であるとき、投与後にそれらの微粒子は被験者中の目的の分子部分に結合せず、それによりその被験者における非特異的微粒子保持の存在／不在、位置および程度の画像化がその撮像方法によって可能になり、またはその撮像方法が撮像解釈のための陰性対照として作用し、または撮像シグナルの校正因子として作用する（例えば、シグナル強度対投与された微粒子の既知の量または濃度）。
【０１０１】
前記被験者はあらゆる適切な被験者であり得る。好ましくは、前記被験者はヒトなどの哺乳類被験者である。
【０１０２】
本発明の別の態様では、分子イメージングに適切な微粒子組成物であって、中央領域とシェルを有するコア微粒子構造を備える微粒子を含み、且つ、前記コア微粒子構造が（ｉ）ホスファチジルコリン脂質、（ｉｉ）ホスファチジルエタノールアミン脂質、および（ｉｉｉ）アルコキシル化脂肪酸を含む前記組成物が提供される。
【０１０３】
理解されるように、本発明のこの態様は本発明の第一の態様に関して上述された特徴のいずれかを含み得る。したがって、本微粒子組成物の成分（ｉｉ）は少なくとも１つのマレイミド部分を含んでよく、その組成物は分子結合要素をさらに含んでよく、その組成物の成分は上に記載されたようにさらに規定され得る。各成分の相対的割合は本発明のこの態様に関して等しく適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
次に本発明を単なる例として次の図面を参照してより詳細に説明する。
【図１】マウス心臓の凍結切片免疫組織化学を示す図である。リポ多糖（ＬＰＳ）前処置から６時間後のマウスの代表例である。倍率：２００倍。低出力倍率（低倍率）：４０倍。
【図２ａ】Ｅ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）標的化微粒子とインビトロでの確認を示す図である。Ｅｓｅｌ標的化粒子の模式図を示す図である。
【図２ｂ】Ｅ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）標的化微粒子とインビトロでの確認を示す図である。Ｅｓｅｌ標的化粒子の形態を示す図である。
【図２ｃ】Ｅ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）標的化微粒子とインビトロでの確認を示す図である。Ｅｓｅｌ標的化粒子の粒度分布を示す図である。各バーはｎ＝独立した機会に調製された５バッチの粒子の平均値±ＳＥＭを表す。
【図２ｄ】Ｅ−セレクチン（Ｅｓｅｌ）標的化微粒子とインビトロでの確認を示す図である。Ｅｓｅｌ標的化粒子のインビトロでの確認を示す図である。各バーはディッシュＥ上のＥｓｅｌ標的化粒子の密度と比較した結合粒子密度の平均値±ＳＥＭを表す。
【図３ａ】Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビボでの確認を示す図である。マウス精巣挙筋におけるＥｓｅｌ標的化粒子の生体内顕微鏡観察（ＩＶＭ）を示す図である。野生型（ＷＴ）群とＥｓｅｌノックアウト（ＫＯ）群のマウスにおける経時的な循環粒子排出を示す図である。データポイントは平均値±ＳＤを表す。
【図３ｂ】Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビボでの確認を示す図である。５匹のＷＴマウスと５匹のＥｓｅｌ  ＫＯマウスにおける結合した粒子の経時的な蓄積を示す図である。
【図３ｃ】Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビボでの確認を示す図である。ＷＴマウス（ｉ）とＥｓｅｌ  ＫＯマウス（ｉｉ）における結合した粒子のシリコン電子倍増ターゲット（ＳＩＴ）管カメラの画像（蛍光顕微鏡観察、倍率：２００倍）を示す図である。
【図３ｄ】Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビボでの確認を示す図である。精巣挙筋細静脈壁上の結合した粒子の定量を示す図である。各ポイントは１匹の動物を表す。バーは群平均値±ＳＥＭを表す。
【図３ｅ】Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビボでの確認を示す図である。マウス精巣挙筋細静脈におけるＥｓｅｌ標的化粒子の共焦点顕微鏡観察を示す図である。Ｅｓｅｌは緑色であり（ｉ、ｉｉ）、粒子は赤色であり（ｉｉｉ、ｉｖ）、内皮（ＰＥＣＡＭ−１）は灰色である（ｖ、ｖｉ）。３成分全てを組み合わせている（ｖｉｉ、ｖｉｉｉ）。
【図４ａ】マウス心臓におけるＥｓｅｌ発現のリアルタイム超音波（ＵＳ）分子イメージングを示す図である。それぞれＬＰＳで前処置された（１）ＷＴマウスと（２）Ｅｓｅｌ  ＫＯマウスにおける拡張終期胸骨傍短軸（ＰＳＡ）断面の心臓の連続的１４ＭＨｚコントラストパルスシーケンシング（ＣＰＳ）画像を示す図である。それぞれの動物のＬＶ内腔（目的の領域（ＲＯＩ）Ｃ）と心筋（ＲＯＩ  Ｍ）のＴＩＣが下に示されている。各データポイントはバックグラウンドを差し引いた平均シグナル強度（Ｉ）±ＳＤを表す。時間シグナル強度曲線（ＴＩＣ）の示唆されたボーラス（Ｂ）、分布（Ｄ）および排出相（Ｅ）が示されている。
【図４ｂ】マウス心臓におけるＥｓｅｌ発現のリアルタイム超音波（ＵＳ）分子イメージングを示す図である。粒子投与から２０分を超えた時点（自由循環粒子が血液プール（左心室（ＬＶ）内腔）から排出されたとき）での１４および７ＭＨｚのＣＰＳにおける心臓のＰＳＡ断面、胸骨傍長軸（ＰＬＡ）断面および心尖部四腔（Ａ４Ｃ）断面。動物、ゲインおよびＭＩは両方の周波数で同じであった。矢印は中部前壁中隔壁を示す。粒子投与前のベースライン像が図６に示されている。
【図５ａ】図５ａは、マウス腹部におけるＥｓｅｌ発現のリアルタイムＵＳ分子イメージングを示す図である。粒子投与前（ｉ、ｉｉ、ｖ、ｖｉ）と粒子投与から約３０分後（ｉｉｉ、ｉｖ、ｖｉｉ、ｖｉｉｉ）の１４ＭＨｚでの「ＣＰＳコントラストのみ」の像と「Ｂモード画像」の複合画像を示す図である。腎臓（Ｋ）、肝臓（Ｌ）、脾臓（Ｓ）。
【図５ｂ】図５ｂは、マウス下腹部におけるＥｓｅｌ発現のリアルタイムＵＳ分子イメージングを示す図である。粒子投与前（ｉｘ、ｘ、ｘｉｉｉ、ｘｉｖ）と粒子投与から約３０分後（ｘｉ、ｘｉｉ、ｘｖ、ｖｘｉ）の別々の１４ＭＨｚでの「ＣＰＳコントラストのみ」の像と「Ｂモード画像」を示す図である。腎臓（Ｋ）、脾臓（Ｓ）。
【図６】図４ｂのベースライン像（粒子投与前）を示す図である。
【図７】マウス心臓におけるＥｓｅｌの経時的発現を示す図である。図７ａは、Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡを示す図である。各データポイントは１匹の動物を表す。最良適合±９５％信頼区間（ＣＩ）の指数曲線が示されている。図７ｂは、Ｅｓｅｌ細胞表面タンパク質を示す図である。各データポイントは３時間、５時間、８時間、２４時間のＬＰＳ時間における、それぞれ、５匹、５匹、４匹、５匹のマウスの平均値±９５％ＣＩを表す。最良適合±９５％ＣＩの指数曲線が示されている。図７ｃは、Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡ対Ｅｓｅｌ細胞表面タンパク質を示す図である。
【図８】マウス心臓におけるＥｓｅｌ発現の音響学的定量を示す図である。ピアソンの相関係数（ｒ）：（ａ）ＷＴ＝−０．８７、ＫＯ＝−０．０８；（ｂ）ＷＴ＝０．８４、ＫＯ＝適用不可；（ｃ）ＷＴ＝−０．７８、ＫＯ＝−０．０５；（ｄ）ＷＴ＝０．８１、ＫＯ＝適用不可。黒色の丸＝ＷＴ、白色の四角＝Ｅｓｅｌ  ＫＯ。エラーバーはＳＤを表す。
【実施例】
【０１０５】
実験の詳細
抗体
マウスＥｓｅｌに対するラットＩｇＧ２ａ，κであるＭＥＳ−１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１０およびそのＦ（ａｂ’）２断片（ＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２）はＤ  Ｂｒｏｗｎ博士（ＵＣＢ  Ｃｅｌｌｔｅｃｈ、英国）によって提供された。ＡＦ４８８−ＭＥＳ−１（７分子のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８蛍光色素で標識されたＭＥＳ−１）と還元型ＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド（ＴＣＥＰ）還元によりＦ（ａｂ’）２当たり２つのチオール（ＳＨ）基）を以下に記載されるように調製した。マウスＰＥＣＡＭ−１に対するラットＩｇＧ２ａ，κであるＭＥＣ１３．３  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。マウスＰＥＣＡＭ−１に対するアロフィコシアニン標識ｍＡｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。ラットＩｇＧ２ａ，κアイソタイプ陰性対照ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ラットＩｇＧ２ａに対するビオチン化ウサギｍＡｂ（二次抗体）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【０１０６】
（ａ）微粒子複合体化のためのＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２の還元
４モル過剰のＴＣＥＰ（シグマアルドリッチ）を使用してＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２を還元した。交換緩衝液（５０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（シグマアルドリッチ）、２ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸（シグマアルドリッチ）、ｐＨ６）中のＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２（８３．３μΜ、８．３ｍｇ／ｍｌ）とＴＣＥＰ（３３３．３μΜ、０．０９６ｍｇ／ｍｌ）を一定速度で撹拌しながら３７℃で１時間保温した。その反応体積は１〜１．６ｍｌの範囲であった。氷上においてその反応を停止し、製造業者（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）の指示に従って４℃で５ｍｌ−Ｚｅｂａ脱塩スピンカラム（サイズ排除限界：１，０００Ｄａ）を使用するスピンカラムゲル濾過クロマトグラフィーにより還元したＦ（ａｂ’）２を直ぐに精製した。そのスピンカラムは事前に冷交換緩衝液で平衡化された。次の改変と共に製造業者の指示に従ってエルマン試薬（
Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するエルマン試験を用いてそのＦ（ａｂ’）２の還元の程度（Ｆ（ａｂ’）２当たりのＳＨの数）を分光光度的に決定した。２．５μｌのエルマン試薬（１０ｍＭ、４ｍｇ／ｍｌ）、７．５μｌの交換緩衝液および９０μｌの交換緩衝液中の精製した還元型Ｆ（ａｂ’）２からなるエルマン反応を、光の曝露を最小限にするためにアルミホイルで覆って室温で（ｒｔ）保温した。エルマン反応の開始から２４分の時点で４１２ｎｍでの吸光度（Ａ４１２）を測定し、交換緩衝液（ｐＨ６）中の既知の濃度のＳＨ含有化合物であるＬ−システイン塩酸（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用するエルマン反応の検量線を参照してその還元型Ｆ（ａｂ’）２試料中のＳＨの濃度を決定した。その還元型Ｆ（ａｂ’）２の代わりに交換緩衝液を添加した二つ一組のエルマン「ブランク」反応を検査試料からのＡ４１２のベースライン減算のために使用した。還元型Ｆ（ａｂ’）２の濃度を（交換緩衝液を使用してゼロを合わせた分光光度計を用いて）、エルマン試薬がＡ２８０に干渉するのでエルマン試薬が存在しない中でＡ２８０から決定した。Ｆ（ａｂ’）２還元の程度をＦ（ａｂ’）２当たりのＳＨ＝［ＳＨ（μＭ）］／［Ｆ（ａｂ’）２（μΜ）］として計算した。その還元型Ｆ（ａｂ’）２はＦ（ａｂ’）２の分子当たり２つのＳＨ基を含有した。その精製された還元型Ｆ（ａｂ’）２をその後の微粒子への複合体化のために交換緩衝液中に約８ｍｇ／ｍｌ（８０μΜ）の濃度で保持した。
【０１０７】
（ｂ）共焦点顕微鏡観察のためのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）蛍光色素によるＭＥＳ−１  ｍＡｂの標識
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８カルボン酸、２，３，５，６−テトラフルオロフェニルエステル、５−異性体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用してＭＥＳ−１を次のように標識した。５０μΜのＭＥＳ−１  ｍＡｂ（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．５中に１９４μΜまたは２９．１ｍｇ／ｍｌの濃度で２５．７μｌ）、７５０μΜのＡＦ４８８（水の中に１１．３ｍＭまたは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で６．６μｌ）、２．６μｌ（添加されたＭＥＳ−１  ｍＡｂの１０分の１の体積）の１ＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．５および６５．１μｌの蒸留水からなる１００μｌの標識反応混合物を手でやさしく３０分撹拌して室温で１時間保温した。対照は色素またはＭＥＳ−１  ｍＡｂを含まなかった。次に６ｋＤａのサイズ排除限界を有するゲル濾過クロマトグラフィースピンカラム（ＳＳＣパッキング緩衝液を含むバイオスピンＰ−６カラム、ＢｉｏＲａｄ）を次の特定の条件で製造業者の指示に従って使用してＡＦ４８８標識ＭＥＳ−１をその反応混合物から精製し、ＰＢＳ（ｐＨ７．５）中に懸濁した。３回の洗浄サイクルを用いてまずバイオスピンカラムをＰＢＳで緩衝液交換した。全ての遠心分離を２０℃で実行した。分光光度計を使用してＡＦ４８８標識ＭＥＳ−１の濃度と標識の程度を決定した。試料をＰＢＳ中に１００μｌの体積まで希釈して二つ一組に揃え、吸光度を２８０ｎｍ（Ａ２８０）および４９５ｎｍ（Ａ４９５）で測定した。標識されたｍＡｂの濃度を次のように計算した。［ｍＡｂ（ｍｇ／ｍｌ）］＝［Ａ２８０−（Ａ４９５×０．１１）］／１．４×希釈係数であり、０．１１はＡ２８０へのＡＦ４８８の寄与に対する補正率である。［ｍＡｂ（μＭ）］＝［ｍＡｂ（ｍｇ／ｍｌ）］／１５００００×１０６を用いてｍｇ／ｍｌ単位のｍＡｂの濃度がμΜに換算された。その式で１５００００はｍＡｂのＤａ単位の分子量であり、１０６はＭをμΜに変換するための増倍率である。ＡＦ４８８の濃度を次のように計算した。［ＡＦ４８８（μＭ）］＝Ａ４９５／７１０００×希釈係数×１０６であり、その式で７１０００は４９４ｎｍでのＡＦ４８８色素のおおよそのモル吸光係数（ｃｍ−１Ｍ−１単位）であり、１０６はＭをμΜに変換するための増倍率である。最後に、標識の程度を次のように計算した。標識の程度＝［ＡＦ４８８（μＭ）］／［ｍＡｂ（μΜ）］。光の曝露を最小限にするために全てのステージでアルミホイルを使用した。このプロトコルの下で未反応ＡＦ４８８がカラム中に保持され、「ＭＥＳ−１ｍＡｂ無し」対照反応によって確認された。１５対１（ＡＦ４８８：ＭＥＳ−１）の標識反応モル比がそれぞれ７分子のＡＦ４８８で標識されたＭＥＳ−１を４６％の標識効率、約８９％の収率で産生した。精製されたＡＦ４８８標識−ＭＥＳ−１（６．７４８ｍｇ／ｍｌ、
４４．９８４μΜ）を分割し、アルミホイルで覆い、そして使用するまで−２０℃で貯蔵した。ＡＦ４８８標識ＭＥＳ−１のＥｓｅｌに対する感度と特異度の保存はリポ多糖（ＬＰＳ）で前処置された野生型（ＷＴ）マウスとＥｓｅｌノックアウト（ＫＯ）マウスの凍結心臓切片に対する免疫組織化学を用いて確認された。
【０１０８】
微粒子の調製
未変性の（複合体化されていない）マレイミド官能化脂質の殻で覆われたオクタフルオロプロパン（Ｃ３Ｆ８）微粒子は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ、アラバマ州）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフォエタノールアミン−Ｎ−（マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ；Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、モノ−ステアレートポリ（エチレン）グリコール（ステアリン酸ＰＥＧ４０；シグマアルドリッチ）、および蛍光色素１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチルインドカルボシアニンパーコレート（ＤｉＩ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を７５：９：１４：２のモル比で含む水性懸濁液のＣ３Ｆ８の存在下での超音波処理により調製された。Ｅｓｅｌ標的化粒子を作成するためにＦ（ａｂ’）２当たり２つのＳＨ基を含有するＴＣＥＰ還元ＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２をマレイミド・チオール複合体化によりこれらの未変性粒子のシェル外表面にグラフトした。その結合反応比率は粒子当たり４．３３８×１０６個のＦ（ａｂ’）２分子（１０９粒子当たり７．２ｎｍｏｌのＦ（ａｂ’）２）であった。（注意：水性懸濁液中のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ分子の総数／その水性懸濁液から作製された未洗浄粒子の総数＝４．３３８×１０６である。その水性懸濁液中の成分の１０％以下が粒子シェルに組み込まれ、且つ、そのシェル上の成分のモル比が最初の水性懸濁液の成分のモル比に近いままである場合５６、集団平均サイズを有する粒子は４．３３８×１０５以下のマレイミド分子を含有し、推定されるＦ（ａｂ’）２：マレイミドの結合反応モル比は１０対１以上である。）その結合反応は一定速度でやさしく撹拌しながらＣ３Ｆ８雰囲気下、中性に近いｐＨで４℃において３０分間実施された。あらゆる未反応ＳＨの反応を停止するために過剰なＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を添加して反応を停止した。組込まれなかった成分と粒子断片を除去するために粒子複合体化の前後にＣ３Ｆ８雰囲気下において４℃で複数のサイクルの遠心分離浮揚を用いて粒子を脱気した冷通常生理食塩水により洗浄した。新しく調製された粒子を直ぐに２０〜５０μｌのアリコットに分割し、キャップをし、パラフィルム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎ）で密封し、その後に液体窒素中で瞬間凍結し、そして使用するまで−８０℃で貯蔵した。後に融解されたＥｓｅｌ標的化粒子の濃度は異なる時期に調製された５バッチの間で１〜３×１０９粒子／ｍｌの範囲であった。
【０１０９】
詳細な実験条件は次の通りである。５０ｍｌの丸底フラスコ中の少量のシクロヘキサン：クロロホルム溶媒（１：２）の中に７５：９：１４：２のモル比でＤＳＰＣ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ、ステアリン酸ＰＥＧ４０およびＤｉＩを分散することにより未変性の（複合体化されていない）微粒子を調製した。気体窒素流を用いて過剰な溶媒を抽出した。その後、その脂質を凍結乾燥機に移し、減圧雰囲気（例えば、１．３×１０４Ｐａ）下において−７８．５℃で（ドライアイスジャケットを使用）完全に乾燥するまで凍結乾燥した。その後、その乾燥粉末（凍結乾燥物）を４ｍｇ／ｍｌの濃度まで適切な水ベースの溶液（例えば、通常生理食塩水または０．０１％プロピレングリコールを含有する通常生理食塩水（ＰＧＮＳ：プロピレングリコール１０３．５ｍｇ／ｍｌ、グリセロール１２６．２ｍｇ／ｍｌ、ＮａＣｌ６．８ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ約７．４））中に懸濁し、６０〜６５℃の超音波槽中で透明になるまで超音波処理により均質化した。一旦、完全に溶解したところでその溶液にＣ３Ｆ８ガス（Ｆ２  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を穏やかに注入した。その後、超音波発生装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ  ３０００、ＱＳｏｎｉｃａ、コネチカット州）を使用するＣ３Ｆ８の超音波分散による剪断混合アプローチを用いて微粒子を形成
した。プローブの先端を溶液の中に約２ｍｍの位置に配置し、約６０℃の初期温度、約１２０Ｗの音響出力で高強度超音波ホーン（２０〜２１ｋＨｚ）により超音波処理を３０〜６０秒間実施した。より多くのＣ３Ｆ８ガスをそのマイクロバブル分散液に注入し、その容器にキャップをして直ぐに氷冷水の中に入れて（３分）超音波処理過程中に生じた熱を消散させた。作製した微粒子は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｌｌｅｇｒａ  Ｘ−１５Ｒ遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、１，０００ｇ、４℃で１５〜２５分間の遠心分離浮揚により洗浄（精製）された。遠心分離後に粒子は試料バイアル瓶の上部に浮遊する。浮上分離液を取出し、同量の脱気した冷通常生理食塩水（ｐＨ７．４）と交換した。その洗浄ステップを７回繰り返して組込まれなかったシェル成分と粒子断片を除去した。Ｅｓｅｌ標的化微粒子を作製するため、これらの洗浄済み未変性微粒子を還元型ＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２に混合しながら添加した（各還元型Ｆ（ａｂ’）２分子は上記のように調製され、２つのＳＨ基を含有する）。上出来のＥｓｅｌ標的化粒子を作製するために使用された結合反応比率は粒子当たり４．３３８×１０６個のＦ（ａｂ’）２分子であった。その結合反応混合物中の粒子とＦ（ａｂ’）２の濃度はそれぞれ５〜８×１０９／ｍｌと３５〜６０ｕＭ（３．５〜６ｍｇ／ｍｌ）の範囲であった。その反応混合物はその還元型Ｆ（ａｂ’）２由来の約３分の２の体積の交換緩衝液（ｐＨ６）と洗浄済み粒子由来の約３分の１の体積の通常生理食塩水（ｐＨ７．４）を含む。その結合反応を４℃で３０分間保温し、垂直に傾いた回転ホイール上で穏やかに連続的に混合した。２０モル過剰の乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、シグマアルドリッチ）に溶解した８０ｍＭのＮＥＭ（シグマアルドリッチ）をＦ（ａｂ’）２に添加することにより粒子複合体化を停止した。その反応混合物を回転機上において４℃で３０〜６０分間保温した。典型的には、その反応混合物中のＮＥＭとＤＭＳＯの濃度はそれぞれ約１ｍＭと１．７％（体積／体積）以下であった。その後、それらの粒子を上記のように１６０ｇ、４℃で５分間の遠心分離浮揚により冷通常生理食塩水で４回洗浄した。これにより組込まれなかったＦ（ａｂ’）２、未反応ＮＥＭ、ＤＭＳＯおよび粒子断片を除去した。粒子の喪失を最小にするために全ての洗浄と保温は（それらの粒子からのＣ３Ｆ８ガスの拡散に適した濃度勾配を減少させるために）Ｃ３Ｆ８雰囲気下おいて、且つ、（ガス拡散速度を低下させるために）４℃で粒子濃度を高く保って（１×１０９粒子／ｍｌ超）実施された。それらの粒子ＤｉＩ蛍光色素を保存するためにＤｉＩ化合物、凍結乾燥物または粒子を光から保護した。
【０１１０】
微粒子形態、濃度、粒度分布および荷電分析
例えば冷通常生理食塩水中に１：２００に希釈して粒子を血球計算板（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ明線金属化血球計算板、Ｈａｕｓｓｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルバニア州）に配置して粒子の完全性（球状の形態、凝集の不在）を顕微鏡観察で検討した。粒子濃度と粒度分布を３０μｍ径開口部計数チューブが装着されたＣｏｕｌｔｅｒ  Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ＩＩｅ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ）での製造業者の指示に従うエレクトロセンシングにより決定した。その構成により０．７２〜１８μｍのサイズ検出範囲と０．０９μｍの解像度が可能になった。粒子荷電分析について、それらの粒子を１ｍｌの１ｍＭのＫＣｌ（ｐＨ７．４）に約１０７粒子／ｍｌの濃度で分散した。その正味の電荷をＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）での製造業者の指示に従う光分散によりゼータ電位として測定した。
【０１１１】
インビトロ標的化微粒子結合アッセイ 
１００μｌの２．５×１０７粒子／ｍｌの濃度のＥｓｅｌ標的化粒子または非標的化（未変性）粒子を２００μｌの７ｎＭの濃度の組換えホモ二量体マウスＥｓｅｌタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆された逆向きのポリスチレン製ペトリディッシュ（ディッシュＥ）に、または５００μｌの６７ｎＭの濃度の過剰なＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２で事前にブロックされたＥｓｅｌ被覆ディッシュ（ディッシュＢ）に、またはディッシュの被覆にＥｓｅｌの代わりにリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．５（ＰＢＳ）が使用された
非被覆ディッシュ（ディッシュＰ）に配置した。１分後に結合しなかった粒子をやさしく洗い流した。その後、液浸対物レンズを装着した正立型光学顕微鏡での即時の検査のためにそれらのディッシュに脱気した冷ＰＢＳを再充填した。各ディッシュに結合した粒子の数を計数し、１０箇所のランダムな光学場（ＯＦ）から平均を求めて結合粒子密度を決定した。
【０１１２】
詳細な方法は次の通りである。ポリスチレンペトリディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３５ｍｍ非ＴＣ処理培養ディッシュ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｒｔで１時間２００μｌの１．２５μｇ／ｍｌ（７ｎＭ、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．５（ＰＢＳ）に希釈）の濃度の組換えホモ二量体マウスＥｓｅｌタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で被覆した（ディッシュＥ）。「ブランク」陰性対照としてＥｓｅｌの代わりにＰＢＳを使用した（ディッシュＰ）。その後、４ｍｌのＰＢＳ中の２．５％（重量／体積）の濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、シグマアルドリッチ）をｒｔで２時間用いて非特異的な結合部位をブロックした。その後、ＢＳＡを捨て、それらのディッシュをＰＢＳで洗浄した。過剰なＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２でブロックされたＥｓｅｌ被覆ディッシュ（ディッシュＢ）を調製するため、５００μｌの６．６７μｇ／ｍｌ（６７ｎＭ）の濃度のＭＥＳ−１  Ｆ（ａｂ’）２をディッシュＥ中にｒｔで３０分間配置し、次にＰＢＳで洗浄した。それらの粒子の浮力のため、それらのディッシュを粒子とのｒｔで１分間の保温のために逆さにした。１００μｌの２．５×１０７粒子／ｍｌ（脱気した冷ＰＢＳに希釈）の濃度のＥｓｅｌ標的化粒子または非標的化（未変性）粒子を使用した。その後、結合しなかった粒子をやさしく洗い流し、液浸対物レンズを装着し、カメラとモニターを連結した正立型光学顕微鏡を使用する即時の検査のためにそれらのディッシュを脱気した冷ＰＢＳで再充填した。各ディッシュに結合した粒子の数を計数し、モニターディスプレイ上の１０箇所のランダムな光学場（ＯＦ）から平均を求め、対物ミクロメータを使用して後者の表面積を決定した。そうして結合粒子密度を決定した。
【０１１３】
動物
野生型（ＷＴ）マウス：成熟オスＣ５７Ｂ１６／Ｊａｘ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、英国）。Ｅｓｅｌノックアウト（ＫＯ）マウス：Ｋ  Ｎｏｒｍａｎ博士とＰ  Ｈｅｌｌｅｗｅｌｌ教授（シェフィールド大学、英国）から寄贈されたマウスからその地域で繁殖させたＣ５７Ｂ１６バックグラウンドの成熟オスＥｓｅｌホモ接合性ＫＯ５７。全ての動物作業は１９８６年の動物（科学的処置）法を受けて内務省により許可されたプロジェクトライセンスとパーソナルライセンスの下で実施された。地域の倫理審査委員会から倫理的な許可をさらに得た。
【０１１４】
リポ多糖（ＬＰＳ）マウスモデル（実験的内毒素血症）
ＷＴマウスとＥｓｅｌ  ＫＯマウスを通常生理食塩水中に２００μｌの体積にまでした５０μｇの大腸菌０１１１：Ｂ４株由来のＬＰＳ（シグマアルドリッチ）で腹腔内（ｉｐ）注射により前処置して全身性炎症を誘導した。ｉｐ注射によるＬＰＳの全身性投与により全身性炎症が引き起こされ、その全身性炎症には心臓と腎臓を含む複数の器官におけるＥｓｅｌ発現の誘導が含まれる５８、５９。この動物モデルは、（ｉ）その動物モデルが外科的外傷または血液凝固などの交絡変数を導入し得る外科的処置を必要としない点、（ｉｉ）それらの粒子が標的とする分子が複数の器官に存在し（たった１つではない）、ユニークにも標的化粒子特異度の評価を複数の器官において同時に可能にし、且つ、他の組織による「粒子窃盗」が存在する中で目的の組織において標的分子を検出する撮像技術の能力を評価する点、および（ｉｉｉ）心筋における標的分子発現が基本的に全体的で均一であり、ユニークなことに標的とされた粒子シグナルの減衰の検討を可能にする点で粒子標的化において使用される他のモデル（例えば、虚血再灌流傷害、心臓移植拒絶、血栓形成、慢性虚血／腫瘍血管形成の動物モデル）と異なる。さらに、活性化内皮細胞上で単独で発現しているＥｓｅｌとＬＰＳ前処置マウスの心筋における基本的に全体的で均一なＥ
ｓｅｌの発現の組合せがそのＬＰＳマウスモデルとＥｓｅｌの組合せを、分子発現の音響学的定量を試験するための理想的なインビボモデルにする。
【０１１５】
免疫組織化学
免疫組織化学を新しく採取したＷＴ（ＬＰＳ前処置有り／無し）マウスとＥｓｅｌ  ＫＯ（ＬＰＳで前処置済み）マウスの心臓のアセトン固定凍結切片に対して実施した。１００μｌの１：１０００ウサギ血清（シグマアルドリッチ）を用いて室温（ｒｔ）で１時間（ｈ）非特異的結合部位をブロックした後に１００μｌの０．０１ｍｇ／ｍｌの濃度の一次抗体：ＭＥＳ−１（Ｅｓｅｌ用）、ＭＥＣ１３．３（ＰＥＣＡＭ−１用、内皮マーカー）またはアイソタイプ陰性対照と切片をｒｔで１時間保温した。その後、各切片を１００μｌの０．００５ｍｇ／ｍｌの濃度のビオチン化二次抗体とｒｔで６０分間保温した。０．３％のΗ２Ｏ２メタノールをｒｔで２０〜３０分間用いて内在性ペルオキシダーゼをブロックした後にホースラディッシュペルオキシダーゼベースの検出系であるＶｅｃｔａｓｔａｉｎ  ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を発色基質としての３，３’−ジアミノベンジジン溶液（ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴ（商標）ＤＡＢタブレット、シグマアルドリッチ）と共に使用した。ハリス改変ヘマトキシリン溶液（シグマアルドリッチ）と１％のＮａＨＣＯ３を使用して切片を対比染色し、その後に７０〜１００％のエタノールにより脱水し、乾燥し、そしてＨｉｓｔｏｍｏｕｎｔ（ＶＷＲ）を載せ、そして光学顕微鏡観察により検査した。ＬＰＳ前処置の時間と即時の組織採取のための動物の殺処理との間の期間をＬＰＳ時間として表した。
【０１１６】
逆転写酵素−リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
ＷＴマウスを上記のようにＬＰＳで前処置した。ＬＰＳ前処置の時間と即時の組織採取のための動物の殺処理との間の期間をＬＰＳ時間として表した。新しく採取された組織をＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）溶液（Ａｍｂｉｏｎ）中に保持してリボ核酸（ＲＮＡ）をインサイチュで保存した。製造業者の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを後に抽出した。その後、Ｑｉａｇｅｎ  Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の指示に従って使用してファーストストランド相補性デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）合成を実施した。これに続いてＥｓｅｌとヒポキサンチンホスフォリボシルトランスフェラーゼ−Ｉ（ＨＰＲＴ−Ｉ）についてのＳＹＢＲ（登録商標）グリーン検出法を用いるリアルタイムｑＰＣＲをｉＣｙｃｌｅｒ（商標）（ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱリアルタイムＰＣＲ検出システム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中の９６ウェルプレート上で製造業者の指示に従って実施した。全てのＰＣＲ反応を同じプレートの三つ一組のウェルで実施した。プライマー配列は：Ｅｓｅｌフォワードプライマー５’−ＣＴＣＡＴＴＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＴＧＡＴＧ−３’、Ｅｓｅｌリバースプライマー５’−ＧＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＴＧ−３’、ＨＰＲＴ−Ｉフォワードプライマー５’−ＡＴＴＡＧＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧ−３’、ＨＰＲＴ−Ｉリバースプライマー５’−ＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴ−３’であった。データ分析のためにｉＣｙｃｌｅｒ（商標）ｉＱオプティカルシステム・ソフトウェア・バージョン３．０ａ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して増幅プロットから閾値サイクル（Ｃｔ）を決定した。ＥｓｅｌプライマーペアとＨＰＲＴ−ＩプライマーペアのＰＣＲ効率が５％以下しか異ならなかった（それぞれ９３±４％と９２±３％（平均値±ＳＤ）；ｎ＝４ずつ）ので比較Ｃｔ方法を使用して次の式を使用してＨＰＲＴ−Ｉのメッセンジャーと比較したＥｓｅｌメッセンジャー（ｍＲＮＡ）の量を推定した：
【０１１７】
Esel mRNA(%HPRT-I) = 2-ΔCt
式中、
ΔCt = Ct Esel - Ct HPRT-I
であり、下付き文字は目的の遺伝子を指す。複製物の平均値を使用し、各動物についてＬＰＳ時間に対してプロットした。
【０１１８】
その方法のさらなる詳細は次の通りである。マウス心臓からの総ＲＮＡの収量は通常は１ｍｇの組織当たり約１μｇの純粋なＲＮＡであり、分子グレード（無ＲＮａｓｅ）Ｈ２Ｏ（シグマアルドリッチ）中に約１ｍｇ／ｍｌを超える濃度で保持した。ファーストストランドｃＤＮＡ合成のためのＲＴ反応混合物は１μｇの総ＲＮＡ、２μｌの１０×緩衝液ＲＴ、２μｌのデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）ミックス（５ｍＭずつの２’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート（ｄＡＴＰ）、２’−デオキシシチジン５’−トリホスフェート（ｄＣＴＰ）、２’−デオキシグアノシン５’−トリホスフェート（ｄＧＴＰ）、２’−デオキシチミジン５’−トリホスフェート（ｄＴＴＰ）、１μ（４ユニット）のＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、２μｌ（１μｇ）のオリゴ（ｄＴ）１２〜１８プライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および分子グレードのＨ２Ｏから構成され、２０μｌの総反応体積にされ、３７℃で１時間保温された。オプティカルクオリティ・シーリングテープ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で覆われた９６ウェル０．２ｍｌ薄壁ＰＣＲプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の各ウェルの中の２５μｌの反応体積中でｑＰＣＲを実施した。そのｑＰＣＲ反応混合物は５μｌのｃＤＮＡテンプレート（最終ＲＴ反応物を１：５０で水に希釈したもの）、各遺伝子用の０．５μｌ（１０μΜ）ずつのフォワードプライマーとリバースプライマー（プライマー配列については本文を参照のこと；それらのプライマーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから特別注文で得た）、６．５μｌの分子グレードのＨ２Ｏおよび１２．５μｌのｉＱ（商標）ＳＹＢＲ（登録商標）グリーンスーパーミックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）から構成された。ｑＰＣＲサイクル条件は最初に３分の９５℃の変性ステップ（最初の９０秒においてウェル・ファクター分析）；次に４０サイクルの９５℃で１５秒と５６℃で１分であり、０．５℃ずつのステップでの融解曲線分析（９５℃で１分の変性、５６℃で１分のリセット、その後、各サイクルにつき０．５℃増加する８０サイクルの６０℃で１０秒）；最後に４℃での冷却ステップであった。各動物についてＥｓｅｌとＨＰＲＴ−Ｉを同じプレート上で増幅した。両方のプライマーペアについてのｃＤＮＡテンプレートの代わりに分子グレードのＨ２Ｏを使用する無テンプレート陰性対照が全てのプレートに含められた。データ分析のために異常な増幅プロットまたは融解曲線を有するウェルを排除した。
【０１１９】
生体内顕微鏡観察（ＩＶＭ）設定
外科手術の２時間前にＷＴマウスとＥｓｅｌ  ＫＯマウスにおいて５０ｎｇの組換えＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の陰嚢内注射することにより精巣挙筋の炎症を引き起こした。２４Ｇの０．７×１９ｍｍ静脈内（ｉｖ）カテーテル（空所、約５０μｌ）（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）で尾静脈をカニューレ処置した。通常生理食塩水中に１ｍｇ／ｍｌキシラジン（Ｒｏｍｐｕｍ、バイエル）と１０ｍｇ／ｍｌケタミン塩酸（Ｋｅｔａｌａｒ、Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）を含む２００〜３００μｌの混合物の腹腔内（ｉｐ）注射を用いて長期間の麻酔を達成した。注文製作した温度管理（３７℃）ＩＶＭステージ上に動物を配置した。解剖顕微鏡下で陰嚢切開により右または左の精巣をやさしく露出させた。精巣挙筋に沿って長軸方向の切開を行い、次にその精巣挙筋を広げて半透明の顕微鏡観察ステージにピンで留めた。露出させた筋肉は温度管理されたタイロード塩緩衝液溶液（９．６ｇタイロード塩（シグマアルドリッチ）＋１ｇ炭酸水素ナトリウム、滅菌蒸留水で１Ｌにした）の連続灌流により維持された。明視野顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察用に２０倍および４０倍の液浸対物レンズ（Ｗａｔｅｒ  Ａｃｈｒｏｐｌａｎ、カールツァイス）、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（コントローラー付きカラー冷却３ＣＣＤカメラ、浜松ホトニクス）、シリコン電子倍増ターゲット（ＳＩＴ）管カメラ（Ｃ−２４００−０８、浜松ホトニクス）、モニター（Ｔｒｉｔｏｎ、ソニー）、Ｓ−ＶＨＳレコーダー（モデルＡＧ６７３０  ＳＶＨＳ  ６２５、パナソニック）およびパーソナルコンピューターが装備された正立顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ、カールツァイス）を使用して観察と記録を行った。粒子結合に対する剪断速度をＷＴ動物とＥｓｅｌ  ＫＯ動物の間で比較するために光学ドップラー流速計（微小循環研究所、テキサスＡ＆Ｍ大学、テキサス）を使用して
ＷＴマウスとＫＯマウスの２０〜４０μｍの直径の細静脈における微小血管中心線赤血球流速（Ｖｒｂｃ）を粒子の注射前に測定した。動物当たり５つのランダムな血管部分を測定した。
【０１２０】
マウス精巣挙筋におけるＥｓｅｌ標的化微粒子のＩＶＭ
麻酔した（キシラジン／ケタミン混合物、ｉｐ）ＷＴマウスとＥｓｅｌ  ＫＯマウスの精巣挙筋における生体内顕微鏡観察評価のため、尾静脈カテーテルを介した急速ｉｖボーラスとして１００μｌの通常生理食塩水中に１．５×１０７個のＥｓｅｌ標的化粒子を投与し、続いて直ぐに１００μｌの通常生理食塩水洗浄液を投与した。その筋肉の露出の２時間前に全ての動物を５０ｎｇの組換えＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の陰嚢内投与で前処置して精巣挙筋炎症を誘導した。明視野顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察用に２０倍および４０倍の液浸対物レンズ、ＣＣＤカメラおよびＳＩＴ管カメラが装備された正立顕微鏡を使用して観察を行った。粒子結合に対する剪断速度を決定するために光学ドップラー流速計を使用して動物当たり５つのランダムな血管部分に由来する２０〜４０μｍの直径の細静脈においてＶｒｂｃを粒子の注射前に測定した。Ｓ−ＶＨＳレコーダーおよびパーソナルコンピューターを使用して全ての記録を行った。実験の最後に全ての動物を殺処理した。設定の詳細については上記を参照のこと。多数の異なる血管を包含する幾つかのＯＦについて、血流と粒子を明視野顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察で評価した。モニター上の一つのＯＦにおける自由循環粒子の数を５分、７分、１０分±１５分の時点で蛍光顕微鏡観察により１０秒にわたって計数した。一つのＯＦ場における結合した粒子の蓄積（３秒を超えて動かないものと定義される）を粒子の注射から１５分後までについて評価した。動物当たり２〜６本の細静脈で細静脈当たり１〜５か所の４００μｍ長の部分から、２０〜４０μｍの直径の細静脈に結合した粒子の数を（自由循環粒子が存在しなかった／最小であった）粒子の注射から約１５分後の時点で計数した。数匹の動物では、断続的な明視野顕微鏡観察および蛍光顕微鏡観察の組合せを用いて同じＯＦ中にある結合した粒子を最大で９０分間追跡し、組織間質への移動または細胞内移行の存在／不在について調査した。分析に関して、結合した粒子の密度を血管表面積（ＶＳＡ）当たりの粒子数で表し、ＶＳＡ（ｍｍ２）＝πＤ（ｍｍ）×Ｌ（ｍｍ）であり、ＤとＬはそれぞれ血管部分の直径と長さであった。各細静脈の結合粒子密度はその細静脈の部分の平均とし、各動物の結合粒子密度はその動物の細静脈の平均とした。次のようにＶｒｂｃから剪断速度を推定した。剪断速度（ｓ−１）＝８×Ｖｂ（ｃｍ／ｓ）／Ｄ（ｃｍ）であり、その式で、Ｖｂ（ｃｍ／ｓ）＝Ｖｒｂｃ（ｃｍ／ｓ）／αであり、Ｖｂは平均バルク速度であり、αはＶｒｂｃをＶｂに変換する計数であり、静脈におけるポアズイユの流れに１．６が採用される６０。各動物の剪断速度は試料とされた５箇所のランダムな細静脈部分の平均とした。
【０１２１】
マウス精巣挙筋におけるＥｓｅｌ標的化微粒子の共焦点顕微鏡観察
５０ｎｇのＩＬ−１βの陰嚢内投与により２．５時間前に前処置されたＷＴマウスとＥｓｅｌ  ＫＯマウスに、上記のＩＶＭについて説明された方法を用いて１．５×１０７個のＥｓｅｌ標的化粒子を投与した。１５分後に通常生理食塩水中に５０μｇのＡＦ４８８−ＭＥＳ−１（Ｅｓｅｌ用）と２５μｇのマウスＰＥＣＡＭ−１（内皮マーカー）に対するアロフィコシアニン標識ｍＡｂを含む１５０μｌのカクテルの急速ｉｖボーラスをｉｖ投与し、続いて１００μｌの通常生理食塩水洗浄液を投与した。さらに１５〜２０分後にキシラジン／ケタミン混合物のｉｖボーラスを用いて動物に終末麻酔を施し、続いてＰＢＳの灌流により循環中の結合しなかった粒子とｍＡｂを除去した。その直後に精巣挙筋を採取し、共焦点顕微鏡観察（ｚスタック作製）用に４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ中に固定した。４０倍の液浸対物レンズを有する正立共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５
ＰＡＳＣＡＬ、カールツァイス）を使用して３種類の異なる蛍光であるＤｉＩ（粒子）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ｅｓｅｌ）およびアロフィコシアニン（ＰＥＣＡＭ−１）を各深度でｚ軸の次の深度に移動する前に連続して走査した。Ｚｅｉｓ
ｓ  ＬＳＭ  ５イメージブラウザー・ソフトウェアを使用して画像を処理した。
【０１２２】
その方法のさらなる詳細は次の通りである。Ｅｓｅｌ標的化粒子およびＡＦ４８８−ＭＥＳ−１とマウスＰＥＣＡＭ−１に対するアロフィコシアニン標識ｍＡｂを含む抗体カクテルのｉｖ投与の後にＰＢＳを用いる灌流により循環中の結合しなかった粒子とｍＡｂを除去した。解剖により心臓と上腹部を露出させることによりこの灌流を達成した。その後、右心房にハサミによる切開を行い、続いて２０ｍｌの注射筒に連結した針を使用してＬＶ内腔にＰＢＳを注入した。これによってＰＢＳが体に灌流し、そのＰＢＳと血液が右心房の切開を介して循環から流出した。ＰＢＳによる血液の置換のために肝臓が青ざめたときにＰＢＳの灌流が充分であるとした。その後、精巣挙筋を直ぐに採取し、広げて４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液中にｒｔで３０分間固定し、その後に４℃の冷ＰＢＳ中に５分間放置した。その組織への光の曝露を最小限にするためにアルミホイルを使用した。４０倍の液浸対物レンズ（Ｗａｔｅｒ  Ａｃｈｒｏｐｌａｎ、カールツァイス）を有する正立共焦点レーザー走査顕微鏡（ＬＳＭ  ５  ＰＡＳＣＡＬ、カールツァイス）を使用して新鮮な組織を共焦点顕微鏡観察（ｚスタック作製）により直ぐに検査した。３種類の異なる蛍光である粒子用のＤｉＩ（５４３ｎｍで励起、５６０〜６１５ｎｍで検出）、Ｅｓｅｌ用のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（４８８ｎｍで励起、５０５〜５３０ｎｍで検出）およびＰＥＣＡＭ−１用のアロフィコシアニン（６３３ｎｍで励起、６５０ｎｍで検出）を各深度でｚ軸の次の深度に移動する前に連続して走査した。Ｚｅｉｓｓ
ＬＳＭ  ５イメージブラウザー・ソフトウェアを使用して画像を処理した。
【０１２３】
超音波（ＵＳ）撮像
ＷＴマウスとＥｓｅｌ  ＫＯマウスを全てＬＰＳで前処置し、上記のように尾静脈をカニューレ処置し、キシラジン／ケタミン混合物で麻酔した。その後、胸部、腹部および骨盤部の毛刈りを行い、動物を仰向けに配置した。ＥＣＧ電極パッド（Ａｍｂｕ（登録商標）ブルーセンサーＰ、Ａｍｂｕ）を足に取り付け、「小動物ＥＣＧフィルター」が装備されたＵＳ機械（Ａｃｕｓｏｎ  Ｓｅｑｕｏｉａ（登録商標）５１２ＵＳシステム、シーメンス、カリフォルニア州）に接続した。一層の温かいゲル（超音波および電気伝達用ゲル、Ｈｅｎｌｅｙｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ）が皮膚とＵＳ変換機（１５Ｌ８−ｓ直線配列変換機、２６ｍｍのフットプリント、シーメンス）の間に連結された。使用したＵＳの設定は１４ＭＨｚ（Ｐ１４ＭＨｚ、空間分解能：約０．２ｍｍ）のコントラストパルスシーケンシング（ＣＰＳ）モード、スキャナーにより推定される０．２２〜０．２６の低メカニカルインデックス（ＭＩ）を生じる９ｄＢの送信力、５５ｄＢのダイナミックレンジ、０％のタイムゲイン、８のＣＰＳゲイン、１５ｄＢの基礎２Ｄゲイン、カラーマップＭ：３（粒子シグナルがヒートオブジェクトスケール（「ＣＰＳコントラストのみ」画像）で提示され、組織シグナルがグレースケール（「Ｂ−モード」画像）で提示される）であり、ＴＥＱは使用されなかった。粒子の注射前にベースラインの心臓の胸骨傍短軸（ＰＳＡ）断面を乳頭筋レベルで３秒のデジタルクリップとして記録し、「領域拡大選択」（ＲＥＳ；解像度が上昇した拡大画像を生じる）を行い、且つ、行わずに心臓の胸骨傍長軸（ＰＬＡ）断面と心尖部四腔（Ａ４Ｃ）断面を３秒のデジタルクリップとして記録した。その後、自由直立クランプを使用して所定の位置に固定された前記変換機を用いて撮像をＰＳＡ断面に保持した。その後、ストップウォッチをスタートし、１×１０８個のＥｓｅｌ標的化粒子（通常生理食塩水で調節された１００μｌの体積中）を１０秒の時点で尾静脈カテーテルを介して急速ｉｖボーラスとして１〜２秒にわたって注入し、続いて２０秒の時点で１００μｌの通常生理食塩水洗浄液を１〜２秒にわたって注入した。ストップウォッチで０〜１分２３秒まで中断することなく連続的ＵＳ超音波照射を行い、その後に中断し、その後にデジタル画像の取得のたびに３秒間だけ超音波照射を再開した。数回の連続的心周期を含む心臓の３秒のデジタルクリップ（ＲＥＳ活性化）をストップウォッチ上で１０秒と１３秒の時点で記録し、その後に１０秒の間隔で２０秒から１分２０秒まで記録し、その後に１分の間隔で２分２０秒から１０分２０秒まで記録し、その後に２分の間隔で１２分
２０秒〜３０分２０秒まで記録し、その後に５分の間隔で６０分２０秒まで記録した（左心室（ＬＶ）内腔（中央血液プール）内の粒子コントラスト強調が見られなくなった場合にはそれらより早く画像取得を停止した）。ＰＳＡ断面の心臓および周囲の組織を含む胸部の拡大されていない（非ＲＥＳ）画像を約５分の間隔で記録した。心臓の他の断面（ＰＬＡ断面およびＡ４Ｃ断面）を最後に取得した。数匹の動物では０．２２のＭＩで撮像する７ＭＨｚ（Ｐ７ＭＨｚ、空間分解能：約０．４ｍｍ）ＣＰＳ（ゲインと他の設定は１４ＭＨｚでの撮像と同じに維持された）もベースライン時と１４ＭＨｚ撮像検査の最後に取得された。１４ＭＨｚのＣＰＳ撮像から７ＭＨｚのＣＰＳ撮像に切り換えるときにＵＳ周波数を低下させる前に送信出力を最初に−９ｄＢから−１９ｄＢまで低下させて不注意な粒子破壊を引き起こすＭＩの上昇（約０．７まで）を回避した。数匹の動物では、胸部、腹部および骨盤部の他の組織の撮像を前後方向撮影法でベースライン時と心臓撮像検査の最後に実施して心臓外組織における粒子保持を調査した。これを行うためにプローブを横方向に配置し、３秒毎の画像取得の間に首の真下から骨盤部まで尾方向にゆっくりと動かした。１４ＭＨｚのＣＰＳと７ＭＨｚのＣＰＳでの非ＲＥＳ画像を取得した。以前の粒子投与からの持ち越し効果（例えば、Ｅｓｅｌ結合部位のブロッキング）を回避するために全ての動物は１用量だけの粒子を受容した。撮像の最後に動物を殺処理し、凍結切片免疫組織化学とｑＲＴ−ＰＣＲのために上記のように組織を直ぐに採取した。
【０１２４】
時間シグナル強度曲線（ＴＩＣ）の作製
ＹＡＢＣＯ（著作権）ソフトウェア（ＬＬＣシャーロッツビル、バージニア州）を使用するビデオ濃度測定法を用いてオフラインの粒子シグナル強度を定量した。ＰＳＡ断面の心臓の拡張末期画像フレーム（「ＣＰＳコントラストのみ」画像）を選択して整列し、（例えば、人為的な大きな動きのために）整列させることができない画像フレームを除外した。図４ａに示されるように心筋の中部前壁（Ｍ）とＬＶ内腔中の隣接する領域（Ｃ）に目的の領域（ＲＯＩ）を設置した。これらの領域では全ての動物において一貫してＵＳ減衰の影響が最低または最小であったので、それらの領域を選択した。ビデオシグナル強度（ＶＩ）を次の式を使用する対数展開により「線形化」した：
【０１２５】
【数１】
0006495828.tif 000011
式中、ｄＢはダイナミックレンジ（この検査では５５ｄＢ）である。線形化ＶＩ（Ｉ）は任意音響単位（ＡＵ）で表される。各時点での３秒の記録時間内の幾つかの拡張末期画像フレームのＩを平均し、次にそれぞれの動物におけるベースライン像（粒子投与前の画像）の平均Ｉを差し引くことによりバックグラウンドノイズについて補正した。心筋とＬＶ内腔のバックグラウンドを差し引いたＩをそれぞれ粒子投与後の時間に対してプロットすることにより心筋（組織）およびＬＶ内腔（中央血液プール）のＴＩＣを構築した。
【０１２６】
Ｅｓｅｌ発現と粒子のインビボ半減期の音響学的定量
上のＴＩＣに従って得られた、微粒子投与から２０分１０秒後の時点での心筋におけるベースラインを差し引いたバブルシグナル強度（Ｒ２０）を分析に使用した。ＴＩＣの定量的分析に基づく代替的な新しい方法（ＴＩＣベースの方法）もＥｓｅｌ発現のレベルを定量するために使用した。そのＴＩＣベースの方法は、インビボでの保持微粒子半減期と循環微粒子半減期を含む他の変数が同時に決定されることも可能にした。ＵＳ分子イメージングのためのＬＰＳ時間はＬＰＳ前処置の時間と標的化微粒子の投与との間の期間とした。各動物の平均心拍数（ＨＲ）は心臓撮像中の様々な時点で記録された全てのＨＲから計算された。
【０１２７】
統計
ピアソンの相関、線形回帰分析または非線形回帰分析を示されるように実施した。示される場合にはスチューデントのｔ検定またはテューキーのポストホック分析付きＡＮＯＶＡを有意性検定のためにｐ＜０．０５を有意として使用した。
【０１２８】
結果
Ｅｓｅｌ発現
凍結切片免疫組織化学により、ＥｓｅｌはＬＰＳで前処置された全てのＷＴマウスの心臓（ｎ＝３５、ＬＰＳ時間＝４〜９時間）において発現することが示された。空間分布は基本的に心筋を通して均一であったが後毛細管細静脈と毛細管に限定された。Ｅｓｅｌは陰性対照であるＬＰＳで処置されなかったＷＴマウス（ｎ＝５）、およびＬＰＳで前処置されたＥｓｅｌ  ＫＯマウス（ｎ＝１０、ＬＰＳ時間＝４〜７時間）では検出されなかった（図１）。
【０１２９】
ｑＲＴ−ＰＣＲによるＥｓｅｌ発現の定量
ＲＴ−ｑＰＣＲにより、ＬＰＳ前処置から約３時間後に心臓におけるＥｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度は時間と共に指数関数的に低下し、約９時間（ｎ＝４２、ＬＰＳ時間＝３．２〜１５．７時間）までに非常に低いレベルに達することが示された（図７ａ）。この傾向は、Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒら５８によってｉｖ投与放射性標識ｍＡｂを使用して、同じマウス（ｎ＝１９）の系統、性別、および年齢、ならびに同じＬＰＳ投与の用量および経路を用いて決定された細胞表面Ｅｓｅｌタンパク質濃度（注射用量の放射活性に対する％／ｇ組織（％ＩＤ／ｇ組織）として表される）の傾向と類似していた（図７ｂ）。
【０１３０】
共通の要素としてＬＰＳ時間を使用するＬＰＳ時間に対するＥｓｅｌ  ｍＲＮＡ濃度の最良適合曲線
【０１３１】
【数２】
0006495828.tif 000012
とＬＰＳ時間に対するＥｓｅｌ細胞表面タンパク質濃度の最良適合曲線
【０１３２】
【数３】
0006495828.tif 000013
から、Ｅｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度と細胞表面タンパク質の濃度との間の関係を説明する経験的な式を次のように得ることができた：
【０１３３】
【数４】
0006495828.tif 000014
（図７ｃ）。したがって、Ｅｓｅｌ細胞表面タンパク質濃度はこのＬＰＳマウスモデルにおいて心臓におけるＥｓｅｌのｍＲＮＡ濃度から予測可能であった。この試験におけるＥｓｅｌ発現のＵＳ定量（後続を参照のこと）に使用されたｍＲＮＡ濃度範囲またはタンパク質濃度範囲（それぞれ、ＨＰＲＴ−Ｉの５５〜２３８％または０．６３〜０．８０％ＩＤ／ｇ組織）の内側でｍＲＮＡの濃度と細胞表面タンパク質の濃度の間の関係はほぼ線形であり、ｍＲＮＡ濃度を細胞表面タンパク質濃度の代用数量詞として直接使用することを可能にした（後者は標的化微粒子の実際の標的である）。
【０１３４】
Ｅｓｅｌ標的化微粒子
設計されたＥｓｅｌ標的化粒子の図式が図２ａに示されている。これらの粒子は球状の形態を示し、粒子間凝集または架橋は最小限であった（図２ｂ）。粒子径分布は独立した機会に調製された５バッチの間で再現性を有し、粒子直径＝２．２（平均値）±０．２（ＳＥＭ）μｍであり、それらの粒子の９８．６％または１００％の直径がそれぞれ６μｍまたは１０μｍより下であった（図２ｃ）。それらの粒子（洗浄済み）は中性に近い電荷を有し、ゼータ電位はｐＨ７．４で約５ｍＶであった。
【０１３５】
それらの粒子は充分にエコー源性であり、安定であり、非特異的結合を起こさず、インビボで即座の有害作用を引き起こさなかった。他の組成物を使用して作製された粒子はこれらの望ましい特性の全てを示さなかった。それらの適切な未変性粒子は、流動条件下での効率的な標的結合に充分な標的化要素を粒子表面に複合体化するための充分なマレイミド基も含有した。上出来のＥｓｅｌ標的化粒子を作製するために使用された結合反応比率は粒子当たり４．３３８×１０６個のＦ（ａｂ’）２分子であった。１×１０６：１というＦ（ａｂ’）２：粒子の比較的に低い反応比率により、静止条件下で標的に結合することができるだけの微粒子が作製された。各結合要素上の複合体化部位を最小に保ち（例えば、１つの鎖間ジスルフィド結合だけを還元してＦ（ａｂ’）２当たり２つのＳＨを作製する）、且つ、粒子複合体化後にあらゆる未反応の複合体化部位を不活化すること（例えば、未反応ＳＨのアルキル化）により、架橋に起因する著しい粒子凝集を回避することができることもわかった。適切な標的化リガンドとの交換により同じ方法で他の分子を標的とする粒子を容易に作製することができる。この事例ではｍＡｂ全体の代わりにＦ（ａｂ’）２を使用してあらゆるＦｃ介在性非特異的相互作用または免疫原性副作用を排除した。
【０１３６】
本明細書に記載される粒子への標的化リガンドの部位特異的マレイミド・チオール複合体化は標的化粒子の調製に伝統的に使用される免疫原性の（ストレプト）アビジン−ビオチン結合化学からの離脱である。他の結合化学を使用することができるが、部位特異的マレイミド・チオール複合体化方法はその低い免疫原性、中性近くのｐＨでの強力で急速のチオエーテル結合形成（ナノニュートン単位の結合力；０．８〜１×１０４Ｍ−１ｓ−１の二次速度定数）のために有利であった。中性近くのｐＨは調製時の結合要素と粒子に対する悪影響を回避する点で有利であった。それはインビボでの粒子シェルからの結合要素の解離を防止する。粒子組立前のリン脂質種への標的化リガンドの非共有結合的複合体化を含む同様の結合化学に基づく標的化粒子が存在するが、わずかなものしかインビボ超音波分子イメージングに進んでおらず４４〜４７、６１〜６４、それらの標的化粒子を我々の微粒子から区別する次の望ましい特性：（ｉ）標的分子を発現しない遠位非ＲＥＳ組織におけるｉｖ投与後の最小の非特異的保持が示された高い標的結合特異度、（ｉｉ）リアルタイムＵＳ分子イメージングへの有効性、および（ｉｉｉ）非常に定量的な分子標的の音響学的定量への有効性の全てを示すものは無かった。
【０１３７】
Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビトロ検証
Ｅｓｅｌ標的化粒子は被覆ディッシュ上のＥｓｅｌに結合した（ディッシュＥ）：２０６０（平均値）±１０７０（ＳＥＭ）粒子／ｍｍ、ｎ＝５（図２ｄ）。Ｅｓｅｌに対する標的化粒子の特異度は過剰な抗Ｅｓｅｌ抗体で事前にブロックされたＥｓｅｌへのそれらの標的化粒子の最小の結合により実証された（ディッシュＢ）：ディッシュＥ上の標的化粒子の８（平均値）±４（ＳＥＭ）％、ｎ＝５。Ｅｓｅｌで被覆されていないディッシュ（ディッシュＰ）に対して標的化粒子または非標的化（未変性）粒子を使用する、またはディッシュＥおよびＢに対して非標的化粒子を使用する追加の陰性対照により同様の低レベルの粒子結合が示された：ディッシュＰに対する標的化粒子（９±３％、ｎ＝５）、ディッシュＥに対する非標的化粒子（１０±９％、ｎ＝２）、ディッシュＢに対する非標的
化粒子（７±７％、ｎ＝２）およびディッシュＰに対する非標的化粒子（７±７％、ｎ＝２）。テューキーのポストホック分析付きＡＮＯＶＡによりディッシュＥ上の標的化粒子と陰性対照との間に結合した粒子の相対密度について有意差（ｐ＜０．０００１）が示された。陰性対照間では有意差は観察されなかった。
【０１３８】
Ｅｓｅｌ標的化微粒子のインビボ検証
Ｅｓｅｌ標的化粒子を５匹のＷＴマウス（体重：２５（平均値）±２（ＳＤ）ｇ、範囲：２３〜２７ｇ））と５匹のＥｓｅｌ  ＫＯマウス（２４±２ｇ、範囲：２２〜２７ｇ）にそれぞれＩＬ−１β前処置から３時間０６分〜４時間０３分および３時間１７分〜４時間３０分の時点で投与した。尾静脈を介したｉｖボーラス投与から約７〜１７秒後にそれらの粒子が循環し、精巣挙筋に到達することが観察された。自由循環粒子の数は時間と共に減少し、血液プールからのそれらの排出がＫＯよりもＷＴで早く起こった（図３ａ）。粒子投与後１０分を越えると血液プール中の自由循環粒子の数は全ての動物において最小か、または検出不可能であった。それらの粒子はＷＴ動物の精巣挙筋細静脈壁に結合および蓄積した（３７０（平均値）±４６（ＳＥＭ）粒子／ｍｍ２  ＶＳＡ、ｎ＝５動物）。これはＫＯ動物では最小であった（１１±３、ｎ＝５）、ｐ＜０．０００１（スチューデントのｔ検定）（図３ｃ〜ｄ）。精巣挙筋血管壁上の粒子蓄積は粒子ボーラス投与後直ぐにプラトーに達した（図３ｂ）。蓄積した粒子は血液プールからの自由循環粒子の排出を越えて持続した。ごく少数の粒子においてローリングが観察された。結合した粒子の完全な脱離はまれにしか見られなかった。粒子による血管内閉塞は観察されなかった。最大で９０分間断続的に観察すると、結合した粒子の組織間質への移動または細胞内移行は検出されなかった。共焦点顕微鏡観察により、結合した粒子はＷＴ精巣挙筋細静脈（ｎ＝３動物、体重：２１．８〜２４ｇ）の内皮細胞表面上で発現したＥｓｅｌと共局在することが示された。ＫＯ動物（ｎ＝２、２５．７〜２８．４ｇ）ではＥｓｅｌ発現は検出できなかった（図３ｅ）。
【０１３９】
３匹のＷＴマウス（体重：２６（平均値）±２（ＳＤ）ｇ、範囲：２５〜２８ｇ）と３匹のＫＯマウス（２７±１ｇ、範囲：２６〜２９ｇ）から決定された２０〜４０μｍの直径の細静脈における剪断速度は、おそらくは前者で試料とされた血管の直径がより小さかったため（ＷＴ：３０（平均値）±３（ＳＥＭ）μｍ、ｎ＝３；ＫＯ：３４±１μｍ、ｎ＝３）、ＫＯ群（２１１±３７ｓ−１、ｎ＝３）よりもＷＴ群（３２９（平均値）±４６（ＳＥＭ）ｓ−１、ｎ＝３）で高かった。しかしながら、これらの差は剪断速度と血管直径群をそれぞれ比較すると統計学的に有意ではなかった（ｐ＝０．３０および０．１２、スチューデントのｔ検定）。
【０１４０】
超音波分子イメージング
（１）動物
１５匹のＷＴマウス（年齢：５．７（平均値）±０．２（ＳＤ）週、範囲：５．１〜６．１週；体重１９．５（平均値）±１．５（ＳＤ）ｇ、範囲：１７〜２２ｇ）と８匹のＥｓｅｌ  ＫＯマウス（年齢：７．９±３．２週、範囲：５〜１３．６週；体重２２．３±３．７ｇ、範囲：１７〜２８ｇ）を撮像した。ＬＰＳ注射と標的化粒子の投与との間の期間（ＬＰＳ時間）はＷＴ群について３時間２６分〜５時間５９分であり、ＫＯ群について４時間２７分〜５時間３９分であった。
【０１４１】
（２）心臓の撮像
粒子投与の前後の両方に存在する非線形ＣＰＳの人為的シグナル（オレンジ色）をＷＴ動物とＥｓｅｌ  ＫＯ動物の両方で見ることができた。これらの人為的シグナルは小さく、心筋の外側に存在した（図４ａ（フレーム０：１０）、図４ａ２（フレーム２０：２０））。ｉｖ粒子ボーラス投与の後に粒子シグナルがまず４回の心臓の拍動（約１秒）の間に右心室において検出され、シグナル強度が急速に上昇した。これに続いて粒子が肺循環
から戻ってきて左心室に粒子シグナルが現れた。ＬＶ内腔と心筋における粒子シグナルの強度はそれぞれ粒子投与後から６〜７回の心臓の拍動（約１．５〜２秒）と９〜１２回の心臓の拍動（約２〜３秒）の間にピークを迎えた。その後、粒子シグナル強度は時間と共に心室と心筋において低下した（図４ａ）。高い粒子濃度に起因する著しいＵＳ減衰が粒子ボーラス投与後の早い時期にＵＳ経路の遠位に位置する心臓の領域（例えば、ＰＳＡ断面の心筋と隣接するＬＶ内腔の５〜１０時の位置、図４ａ）内のシグナルの大幅な喪失と共に起こった。血液プール（ＬＶ内腔）内の循環粒子濃度が時間と共に低下すると、その減衰は少なくなるが（フレーム０：３０と６：２０を比較されたい、図４ａ）、消失することはなかった（フレーム２０：２０、図４ａ１）。それは、上に被さる骨、肺の中の空気および保持されている粒子によって引き起こされる減衰が最も可能性のある原因である。重要なことに、心筋におけるＥｓｅｌ発現はリアルタイムで可視化され、血液プール（ＬＶ内腔）内の自由循環粒子が時間と共に減少および消失するとＷＴ心筋内での粒子シグナルの残留が示された。ＫＯ心筋では、粒子シグナルの残留は低く／最少であり、心筋における低い／最少の程度の非特異的粒子保持と一致した（図４ａ〜ｂ）。ＵＳ経路の近位に位置する上に被さる骨、肺の中の空気および保持されている粒子によって引き起こされるＵＳ減衰が撮像走査平面に応じて心筋のある特定の部分に影響を及ぼした。これによりＷＴ動物におけるＥｓｅｌの標的結合粒子シグナルの擬似的な喪失が引き起こされた（例えば、１４ＭＨｚのＣＰＳ撮像によるＰＳＡ断面のＬＶの中部後壁、中部下壁、中部中隔後壁、中部中隔前壁（それぞれ、反時計回りに５〜１０時の位置）における保持された粒子シグナルの人為的喪失が存在した）。しかしながら、上に被さる物体の相対位置を変えるために走査平面を（例えば、ＰＳＡ断面からＰＬＡ断面またはＡ４Ｃ断面へ）変化させることにより、またはＵＳの透過深度を増加させるためにＵＳ周波数を（例えば、１４ＭＨｚから７ＭＨｚへ）減少させることにより、保持されている粒子シグナルを良く回復してこれらの減衰効果を克服することができた（図４ｂ）。こうしてＷＴ心筋におけるＥｓｅｌの全体的発現がＵＳ撮像で実証され、免疫組織化学データと一致した。
【０１４２】
上記の状況ではＵＳ経路の近位に位置する上に被さる骨／空気および保持されている粒子に由来する後期遠位減衰によって分子標的のＵＳ検出が制限された。しかしながら、比較的に低い周波数のＵＳ（より高い透過深度）または異なる撮像角度を使用することによりそのような減衰を克服できることがわかった。比較的に低い周波数のＵＳ（例えば、３〜７ＭＨｚ）の使用と多平面撮像が通常の状態であり、変換機のフットプリントが体の大きさと比べてかなり小さい（プローブの位置／角度を最適にするのを容易にし、上に被さる骨／空気を避けるのを容易にする）ヒトでの撮像の観点から、これらの減衰の問題はあまり重要ではないようである。それでも機械の減衰補正アルゴリズムの改良により減衰に関する人為的シグナルをさらに少なくすることができる。
【０１４３】
（３）他の組織の撮像
ベースライン像（粒子投与前）を参照したＷＴ動物とＥｓｅｌ  ＫＯ動物との間の胸部、腹部、および骨盤部の走査像の比較により、非ＲＥＳ組織における標的化粒子の非特異的保持が低い／最少であることが示された。ＷＴの腎皮質でＥｓｅｌ発現が検出されたが、ＫＯ動物では検出されなかった（図５ａおよび５ｂ）。免疫組織化学と共焦点顕微鏡観察によりＥｓｅｌは主に腎糸球体の内皮細胞で発現しており、後者が腎臓に集中していることが確認された。予想通り、標的化粒子はＷＴ動物とＫＯ動物の両方で、粒子排出に係る主要なＲＥＳ組織である脾臓と肝臓によって取り込まれた（図５ａおよび５ｂ）。
【０１４４】
（４）有害作用
Ｅｓｅｌ標的化粒子に起因する死または顕著な有害事象は観察されなかった。局所的な心臓壁運動異常として現れる局所的な心筋血流の喪失を引き起こす、心筋中の顕著な粒子介在性血管内閉塞は検出されなかった。
【０１４５】
心筋（組織）とＬＶ内腔（中央血液プール）の超音波ＴＩＣ
標的化粒子のｉｖボーラス投与後のＴＩＣから異なる特徴を有する三相が認められた（図４ａ）。
【０１４６】
（１）ボーラス相（Ｂ）：数秒継続。ピークに到達する粒子シグナル強度の最初の急激な上昇またはボーラス注射の数秒内の飽和／減衰レベル（粒子濃度が上昇したときの）を特徴とする。
【０１４７】
（２）分布相（Ｄ）：最大で１〜２分継続（完了するのに数回の循環サイクルの時間がかかる）。混合と組織への分布によって粒子が希釈されるときの粒子シグナル強度の短期間での急激な減少を特徴とする。高い粒子濃度により再循環ピークを弱めるシグナルの飽和／減衰が生じた。粒子濃度が時間と共にさらに低下すると、減衰の減少につれて粒子投与の０．５〜１分の間の第二のより低いピーク（図４ａの挿入図内の矢印）を生じる粒子シグナル強度の逆説的な上昇がしばしば観察された。
【０１４８】
（３）排出相（Ｅ）：数分継続。粒子シグナル強度の長期にわたるゆるやかな低下を特徴とする。Ｅｓｅｌ  ＫＯ動物よりもＷＴ動物で早くＬＶ内腔内の粒子シグナル強度（中央血液プール内の自由循環粒子濃度を表す）が検出されなくなった。両方の群で粒子投与から２０分後まで粒子シグナル強度が基本的に検出されなかった。心筋ではＷＴ動物の粒子シグナル強度はＫＯ動物の粒子シグナル強度よりもゆっくりと低下し、ＬＶ内腔における粒子シグナルの消失よりも長く持続した。ＫＯ動物では心筋における粒子シグナルは、検出可能な程度の非特異的粒子保持が存在するときを除いてＬＶ内腔における粒子シグナルの消失よりも前に検出されなくなった（相対的心筋血液量（ｒＭＢＶ）について２４％以下と予想されたように）。
【０１４９】
Ｅｓｅｌ発現の音響学的定量
（１）動物
１２匹のＷＴマウス（年齢：５．７（平均値）±０．３（ＳＤ）週、範囲：５．１〜６．１週；体重１９．７（平均値）±１．４（ＳＤ）ｇ、範囲：１８〜２２ｇ）と８匹のＥｓｅｌ  ＫＯマウス（年齢：７．９±３．２週、範囲：５〜１３．６週；体重２２．３±３．７ｇ、範囲：１７〜２８ｇ）を使用した。ＬＰＳ時間はＷＴ群について３時間５３分〜５時間５９分の範囲であり、ＫＯ群について４時間２７分〜５時間３９分の範囲であった。３匹のＷＴ動物が（ｉ）微粒子の誤投与（１匹の動物）、（ｉｉ）Ｅｓｅｌ発現レベルに関する不確実性（２匹の動物）、および（ｉｉｉ）これらの３匹の動物のうちの１匹がおそらくは減衰に関する重大な人為的シグナルのために適切に定量できなかったＴＩＣを有していることから定量分析から除外された。
【０１５０】
（２）単一後期時点ベースの方法
ＷＴ群とＥｓｅｌ  ＫＯ群の両方で血液プール（ＬＶ内腔）内の自由循環粒子シグナルは１０８個の粒子のｉｖボーラス投与から約２０分後まで存在しなかった／最少であった。したがって、バブル投与から２０分１０秒後の時点までに残留しているあらゆる自由循環粒子のシグナルへの寄与は中央血液プールにおけるそれらの粒子の低い濃度（ＬＶ内腔におけるシグナル強度）のために無視できるものであったので、この時点での心筋におけるバックグラウンドを差し引いたＩ（Ｒ２０）を使用してその保持された粒子だけの強度を表した。例えば、ＬＶ内腔内の０．１ＡＵは心筋内のわずかに０．００５〜０．０２４ＡＵに寄与し、それは相対的心筋血液量（血液である心筋の％）の約５〜２４％であった６５〜６７。Ｒ２０はＫＯ動物（０．０６±０．０３、−０．０１〜０．２４、ｎ＝８）よりもＷＴ動物（０．４６±０．１６（ＳＥＭ）、範囲：０．０１〜１．６１、ｎ＝１２）において有意に（ｐ＜０．０５）高かった。Ｒ２０はＷＴマウス（ｒ＝−０．７８、ｐ＜０．０５、ｎ＝１２）においてＬＰＳ時間と強力に相関したがＫＯマウス（ｒ＝−０．
０５、ｐ＝０．９、ｎ＝８）では相関しなかった（図８ｃ）。Ｒ２０はＥｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度とも強力に相関した（ｒ＝０．８１、ｐ＜０．００５、ｎ＝１２）（図８ｄ）。
【０１５１】
（３）ＴＩＣベースの方法
心筋における最大保持粒子シグナル強度ＡｒはＥｓｅｌ  ＫＯ動物（０．４±０．１、０〜１、ｎ＝８）よりもＷＴ動物（２．３±０．４（ＳＥＭ）、範囲：０．８〜４．２、ｎ＝１２）において有意に（ｐ＜０．００５）高かった。ＫＯ動物における低いＡｒ値は低い程度の非特異的粒子保持を示唆した。ＡｒはＷＴマウス（ｒ＝−０．８７、ｐ＜０．０００５、ｎ＝１２）ではＬＰＳ時間と強力に相関したが、ＫＯマウス（ｒ＝−０．０８、ｐ＝０．８６、ｎ＝８）では相関しなかった（図８ａ）。図７ａの曲線を使用してＬＰＳ時間をＥｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度に変換することにより、ＡｒがＥｓｅｌ  ｍＲＮＡの濃度と強力に相関する（ｒ＝０．８４、ｐ＜０．００１、ｎ＝１２）ことが図８ｂにより示され、その範囲の後者は細胞表面Ｅｓｅｌタンパク質の濃度とほぼ線形的に関係した（図７ｃ）。
【０１５２】
インビボ粒子半減期の（ＴＩＣベースの方法を使用する）音響学的定量 
自由循環粒子のインビボ半減期はＷＴ（ｎ＝１２）動物とＫＯ（ｎ＝８）動物について約２（平均値）±１（ＳＤ）分であり、１〜５分の範囲であった。これはほとんどの市販の非標的化マイクロバブル（範囲：約１〜３分）と同等であり、作製された微粒子が商業レベルの品質以上であることを示した。心筋における保持粒子の排出は心筋内の保持粒子の最大濃度の上昇と共に低下した。その関係は非線形的であり、指数関数またはシグモイド関数にその関係を経験的に適合させることができた。これにより、最大保持粒子濃度が低いほど保持粒子の半減期が短くなった。これらの群の動物の心筋における音響学的に有効な保持粒子のインビボ半減期はＫＯ動物（ｎ＝８）における４±４分、１〜１４分の範囲と対照的にＷＴ動物（ｎ＝１２）では約７（平均値）±５（ＳＤ）分で３〜１８分の範囲であった。
【０１５３】
標的面に対する標的化微粒子薬物動態学および蓄積カイネティクス
標的面への結合した微粒子の蓄積は基本的に粒子ボーラス投与後直ぐに完了した。保持された標的化微粒子と自由循環標的化微粒子の排出がインビボで一次カイネティクスに従うことが新しいＴＩＣベースの方法を用いてわかった。
【０１５４】
これらの結果から前記の標的化微粒子は１種類以上の器官の非常に定量的なリアルタイム超音波分子イメージングにとってインビボで特異的であり、効果的であることが示される。それらの微粒子は限定されないが、無毒であること、一回のボーラス微粒子投与による連続撮像および多平面撮像にとって充分に安定であること、目的の分子部分の非常に定量的な分析にとって有利なカイネティクスと音響応答を有することを含む有利なインビボの特徴を有する。それらの微粒子はインビボで目的の分子部分に対する十分に高い標的化特異度と効率を有し、且つ、目的の分子部分を発現しない組織（体内での微粒子排出の通常の経路である肝臓および脾臓を除く）における非特異的結合／残留を有しない。結論として、これらの標的化微粒子は先行技術と異なっており、先行技術よりも優れている。
【０１５５】
参照文献
1   J. R. Lindner, et al., Circulation 2001, 104, 2107-2112.
2   J. R. Lindner, et al., Circulation 2000, 102, 2745-2750.
3   J. B. Fowlkes, J Ultrasound Med 2008, 27, 503-15.
4   R. Lukac, et al., Langmuir 2011, 27, 4829-37.
5   P. J. Bjorkman, P. Parham, Annu Rev Biochem 1990, 59, 253-88.
6   K. Nord, et al., Nat Biotechnol 1997, 15, 772-7.
7   K. Nord, et al., Biotechnol 2000, 80, 45-54.
8   E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual. Editor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1988, pp. 726.
9   G. Kansas, in Physiology of inflammation, ed. by K. Ley, Oxford University Press, Oxford, 2001, pp. 222-241.
10   P. R. Reynolds, et al., Radiology 2006, 241, 469-76.
11   F. Jamar, et al., Rheumatology 2002, 41, 53-61.
12   B. A. Kaufmann, et al., Eur Heart J 2007, 28, 2011-7.
13   S. Andonian, et al., J Endourol 2009, 23, 373-8.
14   B. A. Kaufmann, et al., J Am Soc Echocardiogr 2010, 23, 79-85.
15   P. Hauff, et al., Radiology 2004, 231, 667-73.
16   F. S. Villanueva, et al., Circulation 2007, 115, 345-52.
17   G. E. Weller, et al., Circulation 2003, 108, 218-224.
18   R. A. Linker, et al., J Autoimmun 2005, 25, 199-205.
19   M. Reinhardt, et al., Neuroimage 2005, 27, 267-78.
20   B. A. Kaufmann, et al., Circulation 2007, 116, 276-84.
21   C. Z. Behm, et al., Circulation 2008, 117, 2902-11.
22   C. Bachmann, et al., Gastroenterology 2006, 130, 8-16.
23   J. W. Xuan, et al., Mol Imaging 2009, 8, 209-20.
24   A. Lyshchik, et al., J Ultrasound Med 2007, 26, 1575-86.
25   D. J. Lee, et al., J Ultrasound Med 2008, 27, 855-66.
26   J. K. Willmann, et al, Radiology 2008, 249, 212-9.
27   J. J. Rychak, et al., Mol Imaging 2007, 6, 289-96.
28   M. A. Pysz, et al., Radiology 2010, 256, 519-527.
29   S. Pochon, et al., Invest Radiol 2010, 45, 89-95.
30   R. Pillai, et al., Bioconjug Chem 2010, 21, 556-562.
31   G. Korpanty, et al., Clin Cancer Res 2007, 13, 323-30.
32   J. K. Willmann, et al., Radiology 2008, 248, 936-44.
33   M. Palmowski, et al., Mol Cancer Ther 2008, 7, 101-9.
34   M. Palmowski, et al., Neoplasia 2009, 11, 856-63.
35   H. Y. Jun, et al., Acad Radiol 2010, 17, 54-60.
36   J. K. Willmann, et al, J Nucl Med 2010, 51, 433-40.
37   H. Leong-Poi, et al., Circulation 2003, 107, 455-460.
38   H. Leong-Poi, et al., Circulation 2005, 111, 3248-54.
39   D. B. Ellegala, et al., Circulation 2003, 108, 336-341.
40   S. M. Stieger, et al., Contrast Media Mol Imaging 2008, 3, 9-18.
41   G. E. Weller, et al., Cancer Res 2005, 65, 533-9.
42   M. A. Kuliszewski, et al., Cardiovasc Res 2009, 83, 653-62.
43   T. Sakuma, et al., Cardiovasc Res 2005, 66, 552-61.
44   A. Alonso, et al., Stroke 2007, 38, 1508-14.
45   I. Tardy, et al., Acad Radiol 2002, 9 Suppl 2, S294-6.
46   M. Takeuchi, et al., J.Am.Soc.Echocardiogr. 1999, 12, 1015-1021.
47   B. Wang, et al., Acad Radiol 2006, 13, 428-33.
48   X. X. Jing, et al., Clin Imaging 2008, 32, 178-82.
49   J. P. Christiansen, et al., Circulation 2002, 105, 1764-1767.
50   I. Kondo, et al., Circulation 2004, 109, 1056-1061.
51   J. S. Cheung, et al., Neuroimage 2009, 46, 658-64.
52   R. Tang, et al., Phys Med Biol 2011, 56, 3503-12.
53   F. Yan, et al., Ultrasound Med Biol 2011, 37, 768-79.
54   A. Delia Martina, et al., Eur J Pharm Biopharm 2008, 68, 555-64.
55   S. Unnikrishnan, A. L. Klibanov, AJR Am J Roentgenol 2012, 199, 292-9.
56   A. L. Klibanov, et al., Proceed Int'l Symp Control Rel Bioact Mater 1999, 26, 230.
57   M. A. Labow, et al., Immunity. 1994, 1, 709-720.
58   M. J. Eppihimer, et al., Circ. Res. 1996, 79, 560-569.
59   J. W. Fries, et al., Am J Pathol 1993, 143, 725-37.
60   M. J. Hickey, et al., J Immunol 1999, 162, 1137-43.
61   C. R. Anderson, et al., Invest Radiol 2010, 45, 579-85.
62   C. R. Anderson, et al., Invest Radiol 2011, 46, 215-24.
63   G. Hu, et al., Thromb Haemost 2012, 107, 172-83.
64   J. Bzyl, et al., Eur Radiol 2011, 21, 1988-95.
65   J. U. Streif, et al., Magn Reson Med 2005, 53, 584-92.
66   C. Waller, et al, Radiology 2000, 215, 189-97.
67   R. Coulden, in Functional Computed Tomography, ed. by K. Miles, et al., ISIS Medical Media, Oxford, 1997, pp. 133-156.
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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