【事件の表示】
　特許第3135919号「超音波検査法のための強化剤としての安定性微小泡懸濁液」の請求項1〜23に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第3135919号の請求項1〜22に係る特許を維持する。
【理　由】
1.手続の経緯
　本件特許第3135919号の請求項1〜22に係る発明は、平成5年10月21日を国際出願日とする出願（パリ条約による優先権主張：平成4年（1992年）11月2日、(EP)欧州特許機構）であって、平成12年12月1日にその特許権の設定登録がされ、その後、ニイコムド・イメ−ジング・エーエス（後日、アメルシャム ヘルス アクスイェ セルスカプに名称変更）より特許異議の申立てがあり、当審により取消理由が通知され、その指定期間内である平成14年6月7日に訂正請求がなされ（後日取下げ）た後、再度取消の理由が通知され、その指定期間内である平成16年4月2日に訂正請求がなされたものである。
　
2.訂正請求について
(1)訂正の内容
　特許権者が求めている訂正の内容は以下のとおりである。
　
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項1を
「１ミリリッター当たり少なくとも107の微小泡を、そして両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス−液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、0.01重量％未満であることを特徴とし、そして上記懸濁液が以下のいずれかの方法：少なくとも１のフィルム形成性リン脂質界面活性剤を選び、その界面活性剤を粉末に変換し、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末界面活性剤を水性担体液と混合して懸濁液を形成することを含み、そしてその懸濁液を容器内に導入し、その容器の上部においてガス充填微小泡の層を形成させ、その形成された微小泡の層を分離し、そしてその微小泡をその微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを含む方法；又は薄層化フィルム形成性リン脂質界面活性剤、及び場合により他の添加物を、水性担体液中に、懸濁させ、そのリン脂質が、超音波応答を提供するために十分な微小泡の濃度がその懸濁液中で形成されるような条件下で、懸濁の前又は後においてそのガスと接触されており、そのリン脂質の一部がその泡の周りに安定化層を作り、そしてその後、上記微小泡ガスで飽和された水性溶液で上記微小泡を洗浄することにより、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを含む方法；により得られることを更に特徴とする、前記注射用懸濁液。」に、訂正する。
　
訂正事項ｂ
　請求項3を削除する。
　
訂正事項ｃ
　請求項7から、「ホスファチジルグリセロール、ホスファチド酸、」を削除する。
　
訂正事項d
　請求項8を「【請求項7】前記粉末の形態にあるリン脂質が凍結乾燥又はスプレー−ドライにより得られた粉末の形態にある、請求項1又は2に記載の注射用懸濁液。」と訂正する。
　
訂正事項e
　請求項10を「【請求項9】前記担体液が、脂肪酸、脂肪酸及び脂肪アルコールと、ポリアルキレン・グリコール、ポリアルキレン化糖及び他の炭水化物の如きポリオールを含むアルコールとのエステル及びエーテル、並びにポリアルキレン化グリセロールから選ばれる非薄層化界面活性剤を、前記フィルム形成性リン脂質界面活性剤に対して50重量％までので、さらに含む、請求項１に記載の注射用懸濁液。」
　
訂正事項f
　請求項12を「【請求項11】少なくとも１のフィルム形成性リン脂質界面活性剤を選び、その界面活性剤を粉末に変換し、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末界面活性剤を水性担体液と混合して懸濁液を形成することを含む、請求項１に記載の注射用懸濁液の製造方法であって、その懸濁液を容器内に導入し、その容器の上部においてガス充填微小泡の層を形成させ、その形成された微小泡の層を分離し、そしてその微小泡をその微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを特徴とする方法。」
　
訂正事項g
　請求項20を「【請求項19】１ミリリッター当たり少なくとも107の微小泡を、両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを、そして親水性安定剤を、含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス−液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、0.01重量％未満であることを特徴とする前記注射用懸濁液の製造方法であって、フィルム形成性リン脂質界面活性剤及び親水性安定剤を有機溶媒中に溶解させ、その溶液を凍結乾燥させて乾燥粉末を形成させ、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末をその水性担体と混合することを特徴とする、前記方法。」
と訂正する。
　
訂正事項h
　請求項23を
「【請求項22】請求項１に記載のガス充填微小泡の注射用懸濁液の製造方法であって、薄層化フィルム形成生リン脂質界面活性剤、及び場合により他の添加物を、水性担体液中に、懸濁させ、そのリン脂質が、超音波応答を提供するために十分な微小泡の濃度がその懸濁液中で形成されるような条件下で、懸濁の前又は後においてそのガスと接触されており、そのリン脂質の一部がその泡の周りに安定化層を作り、そしてその後、上記微小泡ガスで飽和された水性担体液で上記微小泡を洗浄することにより、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質の担体液を除去することを含む、前記方法。」
と訂正する。
　
訂正事項i
　請求項３の削除に伴い、請求項4以下の各請求項の項番を繰り上げる。
　
訂正事項j
　特許公報12欄31〜32行の「ホスファチジルグリセロール、ホスファチジル酸」を削除する。
　また、特許公報14欄の実施例1、同15欄の実施例2、同18欄の実施例4及び実施例5をそれぞれ、実施例（参考例）1、実施例（参考例）2、実施例（参考例）4、実施例（参考例）5と訂正する。
　
(2)訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張、変更の存否
　上記訂正事項ａは、請求項1に係る懸濁液について製法による限定を付すものであり、訂正事項ｂは、請求項の削除であるから、いずれも特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正である。
　また、他の訂正事項はいずれも明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正である。
　上記訂正は、いずれも願書に添付した明細書の範囲内のものであり、特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
(3)結び
　したがって、上記訂正は特許法第120条の4第2項但し書き及び同条第3項で準用する平成6年法律116号による改正前の特許法第126条第１項ただし書き、第2項及び第3項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
3.特許異議申立についての判断
(1) 異議申立の概要
　特許異議申立人は、甲第1号証〜甲第7号証を提出し、本件請求項1〜23に係る発明は、特許法第29条第1項第3号の規定に該当し、また、特許法第29条第2項の規定により特許を受けることができないものであるから、上記請求項に係る発明の特許は取り消されるべきものである旨主張している。
　
(2) 本件発明
　上記のとおり訂正が認められるから、本件請求項1〜22に係る発明は、上記訂正請求に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項に記載されたとおりのものであるところ、請求項1、11、19、22に係る発明は、以下のとおりである。
　
【請求項1】１ミリリッター当たり少なくとも107の微小泡を、そして両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス−液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、0.01重量％未満であることを特徴とし、そして上記懸濁液が以下のいずれかの方法：少なくとも１のフィルム形成性リン脂質界面活性剤を選び、その界面活性剤を粉末に変換し、その粉末界面活性剤を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末界面活性剤を水性担体液と混合して懸濁液を形成することを含み、そして、その懸濁液を容器内に導入し、その容器の上部においてガス充填微小泡の層を形成させ、その形成された微小泡の層を分離し、そしてその微小泡をその微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを含む方法； 又は薄層化フィルム形成性リン脂質界面活性剤、及び場合により他の添加物を、水性担体液中に、懸濁させ、そのリン脂質が、超音波応答を提供するために十分な微小泡の濃度がその懸濁液中で形成されるような条件下で、懸濁の前又は後においてそのガスと接触されており、そのリン脂質の一部がその泡の周りに安定化層を作り、そしてその後、上記微小泡ガスで飽和された水性溶液で上記微小泡を洗浄することにより、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを含む方法； により得られることを更に特徴とする、前記注射用懸濁液。（以下、本件発明1という。）
　
【請求項11】少なくとも１のフィルム形成性リン脂質界面活性剤を選び、その界面活性剤を粉末に変換し、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末界面活性剤を水性担体液と混合して懸濁液を形成することを含む、請求項１に記載の注射用懸濁液の製造方法であって、その懸濁液を容器内に導入し、その容器の上部においてガス充填微小泡の層を形成させ、その形成された微小泡の層を分離し、そしてその微小泡をその微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを特徴とする方法。（以下、本件発明2という。）
　
【請求項19】１ミリリッター当たり少なくとも107の微小泡を、両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを、そして親水性安定剤を、含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス−液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、0.01重量％未満であることを特徴とする前記注射用懸濁液の製造方法であって、フィルム形成性リン脂質界面活性剤及びその親水性安定剤を有機溶媒中に溶解させ、その溶液を凍結乾燥させて乾燥粉末を形成させ、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末をその水性担体と混合することを特徴とする、前記方法。
　（以下、本件発明3という。）
　
【請求項22】請求項１に記載のガス充填微小泡の注射用懸濁液の製造方法であって、薄層化フィルム形成生リン脂質界面活性剤、及び場合により他の添加物を、水性担体液中に、懸濁させ、そのリン脂質が、超音波応答を提供するために十分な微小泡の濃度がその懸濁液中で形成されるような条件下で、懸濁の前又は後においてそのガスと接触されており、そのリン脂質の一部がその泡の周りに安定化層を作り、そしてその後、上記微小泡ガスで飽和された水性担体液で上記微小泡を洗浄することにより、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質の担体液を除去することを含む、前記方法。
　（以下、本件発明4という。）
　
(3)刊行物の記載事項
　特許異議申立人が提出した甲第1号証〜7号証及びそれらに記載された事項は以下のとおりである。
　
　３.1国際公開WO91/15244号公報
　　（甲第1号証の1。以下、刊行物1という。訳文として特表平4-506670号公報が甲第1号証の2として提出されている。）
　3.1.1「1．例えば超音波検査の目的での、生体の血流および体腔中への注入に適する組成物であって、約0.01〜約20重量％の1または複数の溶解または懸濁された界面活性剤を含んで成る生理学的に許容される水性液体担体相中の空気または気体の微小泡の懸濁液から成り、前記界面活性剤の少なくとも１つが、少なくとも部分的にラメラ形または積層形において該組成物中に存在する皮膜形成性界面活性剤であることを特徴とする懸濁液。」
　（請求項1）
　3.1.2「６．0.5〜10μmサイズの約108〜109気泡/mlを含有し．．．．、請求項１に記載の懸濁液。」　（請求項6）
　3.1.3「７．前記界面活性剤がレシチンを含むリン脂質、例えばホスファチジル酸．．．．から選択されることを含む請求項1の組成物」
　（請求項7）
　3.1.4「10．前記界面活性剤が、脂肪酸、脂肪酸のエステルおよびエーテル並びにアルコールから選択された非積層界面活性剤を50重量％まで含んで成る、請求項１〜７のいずれか１項に記載の懸濁液。」
　（請求項10）
　
3.2　欧州特許出願公開458745号明細書
　（甲第2号証の1。以下、刊行物2という。訳文として特開平4-226923号公報が甲第2号証の2として提出されている。）
　3.2.1「【請求項１】治療又は診断用途のために、たとえば超音波検査用イメージングの目的のために動物又はヒト患者に投与される、液体キャリヤー中、懸濁液の形で適切な空気又はガスにより充填された、
ポリマー膜
　3.2.2「マイクロバルーンの濃度は２×109 /mLであった」
　
3.3　欧州特許出願公開324938号明細書
（甲第3号証の1。以下、刊行物3という。訳文として特開平1-203337号公報が甲第3号証の2として提出されている。）
　3.3.1「１．主に直径10ミクロン以下の微小球の分散体を含む非経口的に投与可能な水性媒体よりなり且つ該微小球が水不溶化処理された生物親和性物質により封入されたガス微小気泡よりなることを特徴とする、1ml当たり微小球を100×106個以上の均一に分散された濃度をもち且つ20〜25℃の温度で４週間以上該濃度を保持できる、濃縮された室温で安定な超音波造影剤。」(請求項1）
3.3.2「主に直径1〜9ミクロン以下の．．．．該微小球が水不溶化処理された
ヒト血清アルブミンにより封入されたガス微小球
　（請求項2）
3.3.3微小球の上昇へのこの浮遊分離により、透明な溶液の区分の微小球の下から除去し、それによってより高い微小球濃度の分散体を得ることができる。（4頁39〜50行；訳文4頁右下欄）
　
3.4　欧州特許出願公開324938号明細書
（甲第4号証の1。以下、刊行物4という。訳文として特開平2-115037号公報が甲第4号証の2として提出されている。）
　3.4.1連続超音波処理及び分離／濃縮を組み合わせることにより製造される造影剤は1ml当たり微小球100〜1200×106個（１〜12×108個）のような22×106個以上の均一に分散された濃度をもつことができる。
　3.4.2「１．(a)熱変性可能な水溶性生物適合性蛋白質の希釈水溶液を調製し；．．．．安定な
蛋白質で封入された微小球
　
3.5　国際公開WO95/16467号
　（甲第5号証の1。以下、刊行物5という。訳文として特表平10-5068284号公報が甲第5号証の2として提出されている。）
　
3.6　Biomaterials，1990年，第11巻11月号、713〜717頁
　（甲第6号証　以下、刊行物6という。）
3.6.1　「
ポリマー被覆マイクロバブル
　
3.7　国際公開WO92/17212号公報
（甲第7号証の1。以下、刊行物7という。訳文として特表平6-507884号公報が甲第7号証の2として提出されている。）
3.7.1 「
架橋または重合された非タンパク質の両親媒生部分により、カプセル化封入されたガスまたはガス前駆体の微小気泡
3.7.2 「ガスは微細気泡内で自由形態を有してよく、また、ガスが充填されたマイクロバルーンの形態をとるのが有利である。」（4頁13〜15行）
　
(4)対比判断
　
　刊行物1には、超音波検査のために有用な生理的に許容される水性担体相中の気液界面により囲まれている空気又は気体の微小泡の注射可能な懸濁液であって、約0.01〜約20重量％の溶解した又は分散した界面活性剤を含んで成り、該界面活性剤の少なくとも１種は少なくとも部分的にラメラ形又は積層形において懸濁液中に存在する皮膜形成性リン脂質であるものが記載されており（上記3.1.1、3.1.3）、泡濃度は107〜108気泡/ml（上記3.1.2）である。
　
　本件発明1のものと刊行物1に記載のものとを比較すると、両者は、１ミリリッター当たり少なくとも107の微小泡を、そして両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液である点で一致し、リン脂質の濃度が前者では、ガス−液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、0.01重量％未満であるのに対し、後者では約0.01〜約20重量％である点、及び、前者は微小泡をその微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することによって製造されるのに対し、後者はそのような処理について記載されていない点で相違がある。
　
　刊行物1の懸濁液では、請求項1（上記3.1.1）においては、界面活性剤の量が約0.01〜約20重量％であると規定されており、実施例におけるリン脂質の界面活性剤は0.5重量％以上であって、刊行物1に記載された懸濁液では皮膜形成性リン脂質が微小気泡の安定化に寄与しているものであるから、事実上リン脂質が0.01重量％以下であっても必要な気泡濃度（107/ml）を得られるか否かは明らかでない。
　しかも、生成した懸濁液の気泡を微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することにより、リン脂質の量を0.01重量％以下にすることは刊行物1には何ら記載されていない。
　
　したがって、本願発明1が甲第１号証に記載された発明であるということはできず、また、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものでもない。
　
　本件発明2及び4は、いずれも、生成した気泡を含む溶液から微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することにより、本願発明1の懸濁液を製造する方法の発明であって、かかる方法については、上記のとおり、刊行物1に記載されていない。
　
　フィルム形成性リン脂質界面活性剤及びその親水性安定剤を有機溶媒中に溶解させ、その溶液を凍結乾燥させて乾燥粉末を形成させ、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末をその水性担体と混合することにより、リン脂質濃度が0.01重量％以下のものを得る方法については、刊行物1には何ら記載されていない。
　
　刊行物1には、懸濁液に含まれるリン脂質の量をさらに減らす手段については何ら記載されておらず、また、刊行物2〜4、6、7に記載された超音波造影剤はいずれも、合成ポリマーまたはタンパク質（アルブミン等）で被覆された所謂「マイクロバルーン」であって、本願発明のように、界面活性剤により安定化されたマイクロバブルではない。そして、刊行物5は本願出願日の後に頒布された刊行物である。
　
　したがって、本願発明1〜4が、刊行物1〜7に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
　そして、請求項2〜10に係る発明は、請求項1に係る本願発明1について、請求項12〜18に係る発明は本件発明2について、請求項12〜18は本願発明3について、それぞれ更に限定を付した発明であるから、上記と同様の理由で刊行物1〜7に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
５．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立人が主張する理由及び提出された証拠によって本件特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件特許を取り消すべき理由を発見しない。
　
　よって、結論のとおり、決定する。
【異議決定日】
平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
超音波検査法のための強化剤としての安定性微小泡懸濁液
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　１ミリリッター当たり少なくとも１０７の微小泡を、そして両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス‐液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、０．０１重量％未満であることを特徴と
し、そして上記懸濁液が、以下のいずれかの方法：少なくとも１のフィルム形成性リン脂質界面活性剤を選び、その界面活性剤を粉末に変換し、その粉末を空気又は他のガスと接触させ、そしてその粉末界面活性剤を水性担体液と混合して懸濁液を形成することを含み、そしてその懸濁液を容器内に導入し、その容器上部においてガス充填微小泡の層を形成させ、その形成された微小泡の層を分離し、そしてその微小泡をその微小泡ガスで飽和された水性溶液により洗浄して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを含む方法；又は薄層化フィルム形成性リン脂質界面活性剤、及び場合により他の添加物を、水性担体液中に、懸濁させ、そのリン脂質が、超音波応答を提供するために十分な微小泡の濃度がその懸濁液中で形成される条件下で、懸濁の前又は後においてそのガスと接触されており、そのリン脂質の一部がその泡の周りに安定化層を作り、そしてその後、上記微小泡ガスで飽和された水性担体液で上記微小泡を洗浄することにより、微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去することを含む方法；により得られることをさらに特徴とする、前記注射用懸濁液。
　【請求項２】　１ミリリッター当たりの微小泡の濃度が１０８と１０１０の間にある、請求項１に記載の注射用懸濁液。
　【請求項３】　前記担体液が、安定剤として水溶性の多糖類及びオリゴ糖類、糖及び親水性ポリマーをさらに含む、請求項１
又は２
　【請求項４】　前記親水性ポリマーがポリエチレン・グリコールである、請求項
３
　【請求項５】　前記リン脂質が少なくとも部分的にラメラ又は薄層の形態であり、ホスファチド酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、カルジオリピン及びスフィンゴミエリンから選ばれる、請求項１〜
４
　【請求項６】　ジセチルホスフェート、コレステロール、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、プロピルガレート、アスコルビル・パルミテート及びブチル化ヒドロキシ・トルエンから選ばれるリン脂質の性質に影響を及ぼす物質をさらに含む、請求項
４
５
　【請求項７】　前記
粉末の形態にある
又は
　【請求項８】　１ミリリッター当たり１０８−１０９微小泡を含み、その微小泡のサイズが０．５−１０μｍ間にあり、保存下で僅かに変化し又は全く変化しない、請求項１に記載の注射用懸濁液。
　【請求項９】　前記担体液が、脂肪酸、脂肪酸
及び脂肪アルコールと
の如きポリオールを含むアルコールとの、
、前記フィルム形成性リン脂質界面活性剤に対して５０重量％までの量で、
　【請求項１０】　前記微小泡がＳＦ６、ＣＦ４、フレオン又は空気で充填された、請求項１〜
９
　【請求項１１】　少なくとも１のフィルム形成性
リン脂質
注射用
して、上記微小泡の安定化に関与しない過剰のリン脂質を除去する
　【請求項１２】　粉末への変換に先立って、フィルム形成性界面活性剤が少なくとも部分的にラメラ化される、請求項
１１
　【請求項１３】　空気又は他のガスによる接触に先立って、前記の部分的にラメラ化された界面活性剤が水性担体液と混合される、請求項
１２
　【請求項１４】　前記担体液が、水溶性蛋白、ポリペプチド、糖、多糖類及びオリゴ糖類並びに親水性ポリマーから選ばれた安定化化合物をさらに含む、請求項
１２
１３
　【請求項１５】　前記界面活性剤を可溶性又は不溶性材料の粒子上にコーティングし、そのコートされた粒子をしばらくの間、空気又はガスの下で放置し、そしてそのコートされた粒子を水性担体液と混合することにより、前記変換が行われる、請求項
１２
　【請求項１６】　前記変換が、高圧下、フィルム形成性脂質の水溶液を音波処理又は均質化することにより行われ、少なくとも部分的に、この操作がリポソームの形成を導く、請求項
１２
　【請求項１７】　少なくとも部分的にラメラ化された界面活性剤を空気又は他のガスと接触させることに先立って、前記リポソーム含有溶液が凍結乾燥される、請求項
１６
　【請求項１８】　前記フィルム形成性脂質の水溶液が、含有脂質に比較して１０：１と１０００：１の間の重量比において親水性ポリマー及び炭水化物から選ばれた増粘剤又は安定剤をさらに含む、請求項
１６又は１７
　【請求項１９】　
１ミリリッター当たり少なくとも１０７の微小泡を、両親媒性化合物であってその中の少なくとも１が崩壊に対する微小泡のリン脂質安定剤であるものを、そして親水性安定剤を、含んで成る、超音波検査法における造影剤として使用される、水性担体液中のガス充填微小泡の注射用懸濁液であって、上記担体液中のリン脂質濃度が、ガス‐液の界面を上記リン脂質が取り囲むために必要な濃度以上、かつ、０．０１重量％未満であることを特徴とする、前記注射用懸濁液の
リン脂質
　【請求項２０】　前記親水性安定剤が、ポリエチレン・グリコール、ポリビニル・ピロリドン、ポリビニル・アルコール、グリコール酸、リンゴ酸、又はマルトールである、請求項
１９
　【請求項２１】　前記有機溶媒が、第三ブタノール、２−メチル−２−ブタノール又はＣ２Ｃｌ４Ｆ２である、請求項
１９
２０
　【請求項２２】　請求項１に記載のガス充填微小泡の注射用懸濁液の製造方法であって、
薄層化フィルム形成性リン脂質界面活性剤
り
上記微小泡ガスで飽和された水性担体液で上記微小泡を洗浄することにより、
与
除去する
【発明の詳細な説明】
技術分野
　本発明は、その中の少なくとも１つが時間及び圧力による崩壊に対するリン脂質安定剤である両親媒性化合物を含んで成る水性担体中のガス充填微小泡（ｍｉｃｒｏ　ｂｕｂｂｌｅｓ）の注射可能な懸濁液に関する。このリン脂質安定剤は、ラメラ又は薄層の形態であることができる。また、本発明は、超音波検査法（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ　ｅｃｈｏｇｒａｐｈｙ）における造影剤（ｃｏｎｔｒａｓｔ　ａｇｅｎｔｓ）として使用することができる微小泡の安定した懸濁液の製造方法をも含んで成る。
発明の背景
　効果的な超音波反射体（ｒｅｆｌｅｃｔｏｒｓ）としての担体液体中のガス微小泡の懸濁液の使用は、本分野においてよく知られている。超音波画像形成の強化のためのエコー医薬（ｅｃｈｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）としての微小泡懸濁液の開発は、速い静脈内の注射が、可溶化ガスが泡形成溶液から放出することを生じさせることができるという初期の観察の後に生じた。血液に比較しての音波妨害（ａｃｏｕｓｔｉｃ　ｉｍｐｅｄａｎｃｅ）におけるそれらの実質的な差異のために、これらの静脈ガス泡は、超音波の優れた反射体であるであることが見つかっている。担体液体中のガス微小泡の懸濁液の生きた生物の血流中への注射は、超音波検査法画像形成を強く増強し、これ故、内部の臓器の可視化を増強する。臓器及び深所（ｄｅｅｐ　ｓｅａｔｅｄ）組織の画像形成が医学的診断においては不可欠なものであることができるので、高く濃縮されたガス微小泡であって同時に調製及び投与が簡単であり、不活性核種の最小量を含み、長期間保存及び簡単な分配が可能であるような微小泡の安定した懸濁液の開発に多くの努力が捧げられている。これらの限界を満足するであろう溶液に向けての多くに企てが行われてきたが、いずれも、完全に満足する結果を提供していない。
　ガス微小泡の懸濁液が界面活性剤の水溶液と安定剤としての増粘剤の溶液との混合により作られることができることは、ＥＰ−Ａ−０　０７７　７５２（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ）から公知である。このガス泡は、小孔を通して試薬と空気との混合物を押し出すことにより、その混合物に導入される。ＣＯ２微小泡の懸濁液は、界面活性剤及び２炭酸ナトリウムを含んで成る溶液並びに増粘剤の溶液から得られた混合物に酸を添加することにより得られることができる。しかしながら、その成分の混合は、使用直前に行われるべきであり、そしてその溶液は、ちょうど調製の間に消費／注射されるべきである。開示された界面活性剤（ｔｅｎｓｉｄｅｓ）は、レシチン；ソルビトール、グリコール及びグリセロール、コレステロールのようなポリオキシエチレン及びポリオキシエチル化ポリオールと脂肪酸及び脂肪アルコールとのエステル及びエーテル；及びポリオキシ‐エチレン‐ポリオキシプロピレン・ポリマーを、含んで成る。懸濁液中のｔｅｎｓｉｄｅｓの開示された濃度は、０．０１重量％と１０重量％との間にあり、そして好ましい範囲が０．５％〜５％間と請求されている。増粘及び安定化合物は、例えば、単及び多糖類（グルコース、ラクトース、シュクロース、デキストラン、ソルビトール）；ポリオール、例えば、グリセロール、ポリグリコール；及び蛋白、ゼラチン、オキシポリゼラチン、血漿蛋白糖のようなポリペプチドを、含む。増粘剤の全体量は、０．５及び５０％に制限されている。増粘剤としてのポリオキシプロピレン‐ポリオキシエチレン・ポリマー（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８）の使用も、開示されていた。好ましい例においては、ｔｅｎｓｉｄｅ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８（ポリオキシプロピレン‐ポリオキシエチレン・コポリマー）の０．５重量％溶液、増粘剤（１０％ラクトース溶液）の等容量を、無菌条件下一緒に激しく振とうし、微小泡の懸濁液を提供する。得られた懸濁液は、２分間以上にわたり持続し、そして５０μｍ未満のサイズをもつ泡の５０％近くまで含んでいた。上記書面に従えば、界面活性剤及び／又は増粘剤の５０％を超えるものが使用されることがでえきるが、特定の例は、約１％と４％との間のＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８を使用している。
　超音波検査法における画像形成剤として使用することができる簡単に製造できる水性懸濁液は、ＷＯ−９１／１５２４４（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　ｅｔ．ａｌ．）中に開示されている。この懸濁液は、薄層及び／又はラメラ形態におけるフィルム形成界面活性剤を、そして場合により、親水性安定剤を含む。薄層化界面活性剤は、リポソーム、すなわち、一般的には球状の微小な小胞、の形態で存在することができる。これらの小胞は、普通には、両親媒性化合物、すなわち、親水性と疎水性の部分をもつ化合物の１以上の同心円状に整列された２分子層から、形成される。この２層内の分子は、その疎水性部分が向かい合った関係にあり、その親水性部分がその水相に向かって突き出す、ように組織化されている。この懸濁液は、水相との混合に先立ち又はその後に空気又はガスにその薄層化界面活性剤を晒すことにより得られる。フィルム形成界面活性剤のラメラ形態への変換は、高圧均質化又は音波又は超音波周波数下での音波処理を含む様々なリポソーム形成技術に従って行われる。請求されたリン脂質の濃度は、０．０１％と２０％との間であり、そして微小泡の濃度は、１０８と１０９泡／ｍｌとの間である。この微小球懸濁液は、数カ月間安定して残存する。実施例１中のリン脂質の濃度は、０．５％である。
　安定したエコー原性（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）懸濁液に向けての企ては、ＷＯ−９２／１１８７３（Ｂｅｌｌｅｒ　ｅｔ．ａｌ．）中に開示されている。超音波造影剤としての使用のための微小泡を吸収し且つ安定化するように設計された水性調製物は、ポリキシエチレン／ポリキシプロピレン・ポリマー及び負電荷のリン脂質、例えば、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、並びにそれらの溶解形態（ｌｙｓｏｆｏｒｍｓ）により、作られている。この調製物中のリン脂質の濃度範囲は、０．０１容量又は重量％と５容量又は重量％との間であることができるが、１％のジパルミトイルホスファチジル・グリセロール（ＤＰＰＧ）を含む調製物が特に開示されそして請求されている。負電荷のリン脂質に加えて、この組成物は、０．１％と１０％との間のポリマー材料（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８）を含まなければならない。この調製物中の溶質の全体量は、５．１％と１０．４％との間である。微小泡の濃度は、報告されていないが、与えられた結果に従って、約１０７泡／ｍｌであると推定することができる。この懸濁液の安定性は、ＥＰ−Ａ−０　０７７　７５２のものよりも良好であることが報告されている。
　従来技術の組成物は利点をもっているけれども、それらは、未だ、それらの実際の使用をじゃまする幾つかの欠点に悩まされている。第一に、幾つかの従来技術の組成物は、比較的短い寿命をもち、そして第二に、それらは、例えば、１０４と１０５との間の、比較的低い初期泡計数をもつ。これは、このような組成物により行われる超音波テストの再現性及び分析を、かなり困難にしている。さらに、幾つかの技術は、特定の用途（例えば、左心の超音波検査）における超音波検査剤としてのそれらの使用を妨害する（５０μｍまでの）広いレンジの直径において泡を作る。
　血流中の圧力変動に耐え、そして良好な保存寿命をもつであろう微小泡の安定した配合物についての必要性が、幾つかの最高技術水準の貧しい安定性により、さらに増幅されている。それらの分配及び保存が問題を提供しない微小泡配合物が、特に重要である。
　他の欠点は、これまでに知られた組成物の多くが高い量の様々な溶質、例えば、ポリマー、リン脂質、電解質、及びそれらの実際の使用をさらに困難にする他のものを含むということである。例えば、特定の患者によるポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン・ポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））の使用が不所望の副作用を引き起こすことができることが知られている（例えば、Ｇ．Ｍ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔｔｉ　ｅｔ．ａｌ．Ｂｌｏｏｄ（１９８２）５９，１２９９を参照のこと。）。特定の場合において高いリン脂質含量をもつ調製物も、不所望のものであることができる。いずれにしても、高程度の様々な溶質を含む組成物が、しぶしぶ投与され、そしてそれらの広範な使用は、望ましいものでないと考えられるようになっている。実際に、医薬産業における傾向は、様々な医薬配合物中の活性及び不活性成分の濃度をそれらの可能な限り最も低いレベルに減少させ、そして必要でないすべてのものをその調製物から取り除くことである。他の方法を見つけ、そしてより有効な組成物を配合することが引き続き重要である。これは、超音波検査において使用される微小泡懸濁液においては特にそうである。なぜなら、ここで、その成分が治療的効果を全くもたず、そして結果後可能な限り低くもっていかれるべきであるからである。しかしながら、先に述べたように、１重量％と４重量％のレンジ内の典型的な濃度をもつ最高技術水準の調製物及び従来技術の教示は、リン脂質及び他の非リン脂質添加物の減少された量の使用を思いとどまらせる。この思いとどまらせることについての理由は、最もおそらくは、日常的な実験の経過において成分の濃度におけるさらなる減少がいずれかの実際の用途をもち又は公知のレンジのより低い終点をさらにいじくりまわすことを助長するのに十分に安定である懸濁液を全く作り出さないという事実の内に、潜んでいる。
発明の要約
　本発明は、少なくとも１ミリリッター当たり１０７微小泡を含んで成るガス充填微小泡の非常に安定した懸濁液がたとえそれらの非常に低い濃度が使用される場合でさえも安定剤としてリン脂質を使用して得られることができるという予想外の発見に基づいている。超音波検査法における造影剤として使用することができる懸濁液は、時間及び圧力による崩壊に対する微小泡の安定剤として少なくとも１のリン脂質を水性担体中に懸濁させることにより、得られ、そのリン脂質の濃度は０．０１重量％未満であるが、そのリン脂質分子が単にそのガス微小泡‐液体界面において存在する場合はそれ以上である。
　ごく僅かな量のリン脂質としてここに含まれる（単独で又は比較的小部分の他の両親媒性物質と共に使用される）界面活性剤が微小泡を効果的に安定化するということの発見は、全く予想外のことであった。他の両親媒性化合物（例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））の存在中で、安定剤分子間の相互付着が減少し、そして単分子リン脂質フィルムの形成が阻害されるということが、仮定される。しかしながら、多量の他の両親媒性剤の非存在中では、リン脂質分子間の非妨害性結合力（静電引力又は水素結合）は、崩壊又は合着（ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ）に対してその泡を安定化する安定フィルム‐様構造の形成を確保するのに十分なものである。
　本発明に従って、高い微小泡濃度、高安定性、長期間保存能力及び調製の容易性の、懸濁液が、懸濁液中の界面活性剤及び他の添加物の濃度が最高技術水準の配合において使用されるレベルよりもかなり低く保たれる場合にさえ、得られることができる。本発明の組成物中で使用されるリン脂質の量は、その懸濁液中の泡の濃度を１ミリリッター当たり１０７を超える微小泡を維持しながら、そのガス微小泡の周りに界面活性剤の単一の単層を形成するために必要なものとほとんど同程度に低くあることができる。本発明においては、界面活性剤のリポソーム‐様二重層をもつ微小泡（ガス充填リポソーム）は、存在しないようであり、そして観察されていない。
　比較的高い安定性及び長期間の保存能力を有する高い微小泡濃度、例えば、１０９と１０１０泡／ｍｌとの間をもつ懸濁液は、たとえそのリン脂質界面活性剤の濃度が本分野における公知レベルをかなり下回って保たれたときでさえ、調製されることができる。ｍｌ当たり１μｇのリン脂質と同程度に少ない懸濁液は、使用される界面活性剤の量がそのガス微小泡の周りのその脂質の単一単層の形成に必要なものを下回る限り、そしてそれらが、本明細書中で開示する方法の中の１つに従って作られる限り、調製されることができる。
　その微小泡のサイズ分布に依存する１０８泡／ｍｌの泡濃度については、この濃度は、１μｇ／ｍｌ又は０．０００１％と同程度に低くあることができるが、０．０００２％と０．０１％までとの間のリン脂質濃度が好ましいという計算が、示されている。より好ましくは、本発明の微小泡の安定した懸濁液中のリン脂質の濃度は、０．００１％と０．００９％との間にある。その懸濁液中のリン脂質の量のさらなる減少が可能であるけれども、０．０００１重量％未満により調製された懸濁液は、不安定であり、それらの全泡計数は、低く、そしてそれらの注射の間の超音波応答は、満足できるものではない。他方において、注射の間０．０１％を超えるリン脂質により調製された懸濁液は、より良好には働かない、すなわち、それらの安定性及び超音波応答は、その濃度によりさらに良くならない。したがって、より高い濃度は、従来技術の討議において述べられたような不所望の副作用の可能性を増加させるだけである。ラメラ又は薄層形態にある界面活性剤のセグメントのみがその泡を適当に安定化するために組織化された分子を効果的に放出することができるということが、仮説として仮定される。これは、なぜ界面活性剤の濃度がガス泡の安定性を弱めることなく非常に低くなることができるかについて説明することができる。本発明の懸濁液は、その低いリン脂質含量によるだけではなく注射された溶質、すなわち、脂質及び／又は合成ポリマー及び他の添加物の全量が今までよりも１，０００と５０，０００倍との間にあるということにより、従来技術の組成物を超える重要な利点を提供する。これは、微小泡濃度、すなわち、その生成物のエコー原性又は安定性のいかなる損失を伴わずに達成される。溶質の非常に低い濃度に加えて、本発明は、超音波検査シグナルへのその貢献が比較的大きなものである微小泡のみを含むことができる懸濁液、すなわち、画像形成過程に活性に参加しない微小泡のいずれをも含まない懸濁液を、提供する。
　本発明の注射可能な組成物中の溶質のこのように低い濃度により、不所望の副作用の可能性はかなり減少され、そしてその注射剤の除去は、かなり改善されていることは、言うまでもないことである。
　本発明の低いリン脂質含量をもつ微小泡懸濁液は、便利なやり方で、例えば、好適な溶媒中の粗リン脂質の溶液を凍結乾燥又はスプレー・ドライすることにより、それらの構造が修飾されているフィルム形成リン脂質から調製されることができる。水性担体中の分散による懸濁液の形成に先立って、凍結乾燥又はスプレー・ドライされたリン脂質粉末を、空気又は他のガスと接触させる。水性担体と接触するとき、その構造が破壊されている粉末リン脂質は、その中に分散されたガスの微小泡を安定化させるであろうラメラ又は薄層のセグメントを形成するであろう。便利には、本発明の低いリン脂質含量をもつ懸濁液は、空気又は他のガスとのそれらの接触に先立ってラメラ化又は薄層化されたリン脂質により調製されることもできる。これ故、空気又は他のガスとリン脂質を接触させることは、そのリン脂質が乾燥粉末形態又は水性担体中の薄層リン脂質の分散形態にあるときに、行われることができる。
　用語、ラメラ又は薄層形態は、その界面活性剤が１以上の分子層を含む薄いフィルム又はシートの形態にあることを示している。この形態においては、構造物内に組織化された界面活性剤分子は、リポソーム小胞内に存在するものと類似している。ＷＯ−Ａ−９１／１５２４４中に記載するように、フィルム形成界面活性剤のラメラ形態への変換は、リポソーム形成法のいずれかにより、例えば、高圧均質化又は音波又は超音波周波数下の音波処理により、容易に行われることができる。ラメラ形態への変換は、リン脂質により水溶性担体固体（ＮａＣｌ、シュクロース、ラクトース又は他の炭水化物）の微粒子（１０μｍ以下）をコーティングし、次に、水相中にそのコート担体を溶解させることにより、行われることもできる。同様に、不溶性粒子、例えば、ガラス又は樹脂のマイクロビーズは、有機溶媒中のリン脂質の溶液中で湿らせ、その後、その溶媒を蒸発させることにより、コートされることができる。脂質コートされたマイクロビーズは、その後、水性担体相と接触され、これにより、リポソーム小胞が、その担体相中に形成されるであろう。また、リン脂質は、限界温度（ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｔｃ））を僅かに上に加熱し、そして穏やかに攪拌することにより、ラメラ化されることができる。この限界温度は、そのリン脂質のゲル〜液体の転移の温度である。
　実際には、本発明に従って低いリン脂質含量の微小泡の懸濁液を作るためえに、ある者は、そのリポソーム小胞が″充填されていない（ｕｎｌｏａｄｅｄ）″、すなわち、それらが、その溶液の水相それ自体を除き外来物質のいずれをもその中に包み込んでいない限り、公知技術のいずれかにより調製されたリポソーム懸濁液又は溶液から開始することができる。
　リポソーム溶液中への空気又はガスの導入は、普通の手段、インジェクト、すなわち、そのリポソーム溶液中に小さなオリフィスを通して空気又はガスを送り込み、又は圧力を加えそして次にその圧力を解放することにより溶液中にガスを単に溶解させることにより、行われることができる。他の方法は、空気又は他の生理学的に許容されるガスの存在中でリポソーム溶液を攪拌又は音波処理することである。また、ある者は、リポソームの溶液それ自体の中で、例えば、ガス放出化学反応、例えば、酸により溶解された炭酸塩又は２炭酸塩を分解することにより、ガス形成を作りだすことができる。
　薄層の界面活性剤が水溶液担体中に懸濁され、そして空気又は他のガスが微小泡を提供するために導入されるとき、その微小泡は、リポソーム小胞の場合におけるような二重層ではなく界面活性剤分子の単分子層により、だんだんに取り囲まれ、そして安定化される。この界面活性剤分子の構造的再配置は、機械的に（攪拌により）又は熱的に活性化されることができる。必要なエネルギーは、合着解放剤、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の存在中で、より低くなる。他方においては、その微小泡配合物中の合着解放剤の存在は、リン脂質分子間の自然のアフィニティーを減少させ、これは、直接の結果として外圧（例えば、２０−３０Ｔｏｒｒ超え）に対する微小泡の減少された安定性をもつ。
　既に述べたように、リン脂質溶液の代わりに、本発明の低いリン脂質含量の懸濁液を調製するために、ある者は、ラメラ化され又はされないことができる乾燥リン脂質から出発することができる。ラメラ化されるとき、このようなリン脂質は、例えば、リポソーム、すなわち、水溶液の形態において慣用の技術により正常には調製され、そしてその後普通の手段により脱水されたリポソームを脱水することにより得られることができる。リポソームを脱水する方法の中の１つは、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ））であり、すなわち、好ましくは親水性化合物を含むリポソーム溶液を、凍結し、そして減圧下で蒸発（昇華）させることにより乾燥させる。
　他のアプローチにおいては、非ラメラ化又は非薄層化リン脂質は、有機溶媒中のリン脂質を溶解させ、そしてリポソーム形成を経ずにその溶液を乾燥させることにより、得られることができる。言い換えれば、これは、親水性安定剤物質、例えば、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ＰＥＧ等のようなポリマー、又は有機溶媒及び水中の両方に可溶性の化合物と一緒に好適な有機溶媒中でリン脂質を溶解させ、そしてその溶液を凍結乾燥又はスプレー・ドライすることにより、行われることができる。水及び有機溶媒中に可溶性の親水性安定剤化合物のさらなる例は、リンゴ酸、グリコール酸、マルトール等である。好適な有機溶媒のいずれかが、その沸点が十分に低く、そしてその融点がその後の乾燥を容易にするのに十分に高い限り、使用されることができる。典型的な有機溶媒は、例えば、ジオキサン、シクロヘキサノール、第三ブタノール、テトラクロロジフルオロ・エチレン（Ｃ２Ｃｌ４Ｆ２）又は２−メチル−２−ブタノールであろうが、第三ブタノール、２−メチル−２−ブタノール及びＣ２Ｃｌ４Ｆ２が好ましい。この変法においては、親水性安定剤の選択のために使用される限界は、選ばれた有機溶媒中のその溶解度である。微小泡の懸濁液は、薄層化リン脂質の粉末によるのと同じ段階を使用してこのような粉末から製造される。
　同様に、前ラメラ化又は前薄層化リン脂質溶液の凍結乾燥の実施に先立ち、親水性安定剤化合物を、その溶液中に溶解させる。しかしながら、ここで、この親水性安定剤の選択は、非常に大きい。なぜなら、ラクトース又はシュクロースのような炭水化物並びにデキストラン、澱粉、ＰＶＰ、ＰＶＡ、ＰＥＧ等のような親水性ポリマーを使用することができるからである。これは、本発明において有用である。なぜなら、このような親水性化合物は、また、その微小泡サイズの均一化において助け、そして保存下の安定性を強化するからである。例えば、ポリエチレングリコール対脂質の１０：１〜１０００：１重量比により安定化された凍結乾燥リン脂質の非常の希釈された水溶液（０．０００１−０．０１重要％）の実際の製造は、長期間保存されるときでさえ、有意な観察され得る変化を伴わない、安定した水性微小泡懸濁液計数１０９−１０１０泡／ｍｌ（主に０．５−１０μｍのサイズ分布）を作り出すことを可能にする。これは、振とう又はいかなる激しい攪拌を伴わずに保存乾燥薄層リン脂質を単に溶解させることにより、得られる。減圧下の凍結乾燥技術は、非常に有用である。なぜなら、それは、生理学的に許容されるガス、すなわち、窒素、ＣＯ２、アルゴン、メタン、フレオン、ＳＦ６、ＣＦ４、等のいずれかにより乾燥粉末上の圧力を回復させ、それによりそのような条件下で処理されたリン脂質の再分散の後に、上記ガスを含む微小泡の懸濁液を得ることを可能にするからである。
　本発明において便利な界面活性剤は、水及びガスの存在中で安定したフィルムを形成することができる両親媒性化合物から選ばれることができる。好ましい界面活性剤は、レシチン（ホスファチジルコリン）及び他のリン脂質、とりわけ、ホスファチド酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、カルジオリピン（ＣＬ）、スフィンゴミエリンを含む。好適なリン脂質の例は、天然又は合成のレシチン、例えば、卵又は大豆のレシチン、又は飽和の合成レシチン、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン又はジアラキドイルホスファチジルコリン又は不飽和の合成レシチン、例えば、ジオレイルホスファチジルコリン又はジリノレイルホスファチジルコリンであり、飽和のレシチンが好ましい。
　コレステロール及び他の物質のような添加物が、０から５０重量％までの範囲の割合で先に述べた１以上の脂質に添加されることができる。このような添加物は、フィルム形成界面活性剤との混合において使用されることができ、そしてそれらのほとんどが公知である他の非リン脂質界面活性剤を含むことができる。例えば、ポリオキシプロピレン・グリコール及びポリオキシエチレン・グリコール並びにそれらの様々なコポリマー、ジセチルホスフェート、脂肪酸、エルゴステロール、フィトステロール、シトステロール、ラノステロール、トコフェロール、プロピル・ガレート（ｐｒｏｐｙｌ　ｇａｌｌａｔｅ）、アスコルビル・パルミテート及びブチル化ヒドロキシ‐トルエンのような化合物である。これらの非フィルム形成界面活性剤の量は、普通には、界面活性剤の全量の５０重量％までであるが、好ましくは０と３０％との間にある。更に、これは、本発明の低リン脂質含有懸濁液中の様々な添加物の濃度が今までの公知の組成物におけるよりも１００倍を超える程少ない０−０．０５％の範囲内にあるということを意味している。
　本発明の懸濁液の他の特徴がその微小泡の比較的″高い″ガス捕獲能力、すなわち、界面活性剤の量と捕獲されたガスの全量との間の高い比であるということも、述べられるべきである。これ故、微小泡が１〜５μｍレンジにおけるサイズをもつ懸濁液により、ガス泡‐液体界面活性剤において存在するリン脂質対標準条件下で捕獲されたガスの容量の重量比が０．１ｍｇ／ｍｌと１００ｍｇ／ｍｌとの間であることが、仮説として推定される。
　実際に、また、すべての注射可能な組成物は、血液と可能な限り等張性であるべきである。これ故、注射前に、少量の等張性剤を、本発明の懸濁液に添加することもできる。この等張性剤は、医薬において一般的に使用される生理学的な溶液であり、そしてそれらは、生理食塩水溶液（０．９％ＮａＣｌ）、２．６％グリセロール溶液、５％デキストロース溶液等を含んで成る。
　本発明は、超音波検査法における造影剤として使用することができる請求項１に記載の微小泡の安定した懸濁液の製造方法に関する。基本的には、本方法は、請求の範囲の中で述べる限定内の選択された値に、上記リン脂質により安定化された微小泡の懸濁液中のリン脂質の濃度を合わせることを含んで成る。普通には、ある者は、所望の値よりも多くのリン脂質を含む微小泡懸濁液から出発するであろうし、そしてある者は、エコー生成泡の計数を実質的に減少させずにその微小泡内に捕獲されたガス又は空気の容量に比較してそのリン脂質の量を減少させるであろう。これは、例えば、空気／液体界面において直接に含まれないリン脂質を含む担体液体の部分を除去し、そしてより多くの新たな担体液体によりその懸濁液を希釈することにより、行われることができる。これを行うために、ある者は、その懸濁液内に、エコー生成泡が集まるであろう領域（ａ）及びその泡が強く希釈されている領域（ｂ）を作りだすことができる。次に、領域（ｂ）内の液体を、普通の手段（デカンテーション、サイホン処理（ｓｉｐｈｏｎｉｎｇ）等）により分離することにより取り出すことができ、そして新たな担体液体の相当容量を、その懸濁液に補給するために供給する。この操作は、１回以上繰り返されることができ、これにより、その泡の安定化において直接係わらないリン脂質の含量を、だんだんと減少させる。
　泡ガス／液体界面に存在しないリン脂質分子の完全な除去を達成することは、平衡からの幾つかの不均衡が生じることができるとき、一般的には望ましくない。すなわち、消耗がかなり進められた場合に、そのガス／液体界面におけるいくらかの界面活性剤分子がその結果として起こる泡の脱安定化により解放されることができる。実験は、担体液体中のリン脂質の濃度が、性質における有意な変化及び逆の効果を伴わずに請求項中に述べられた、より低い限界の傍の内まで減少されることができることを、示した。これは、実際には、（与えられた限界内の）最適なリン脂質濃度が、適用のタイプにより、むしろ命ぜられるであろうということを、すなわち、比較的高いリン脂質濃度が許容される場合に、理想的な濃度値がそのレンジの上限近くになるであろうということを、意味している。他方において、診断されるべき患者の症状に依存する場合には、リン脂質の絶対値は、されに減少されなけらばならず、これは、微小泡計数及びエコー原性効果に関する逆効果をともなわずに行われることができる。
　本法の１つの態様は、フィルム形成界面活性剤を選択し、そして場合により、それを、本分野において公知であり又はこれまでに開示した方法の中の１つを使用して、ラメラに変換することを含んで成る。次に、界面活性剤を、空気又は他のガスと接触させ、そして密閉容器中で水溶液担体と混合し、これにより、微小泡の懸濁液が形成されるであろう。この懸濁液は、しばらく放置され、そして形成されたガス充填微小泡の層は、その容器の上方に昇らせる。この母液の下方部分を、次に除去し、そして微小泡の上澄層を、微小泡の調製において使用したガスで飽和した水溶液により洗浄する。この洗浄を、実質的にすべての未使用又は遊離の界面活性剤分子を除去するまで、数回繰り返すことができる。未使用又は遊離の分子は、そのガス微小泡の周りの単分子層を安定化する配合に参加しないすべての界面活性剤分子を意味する。
　低リン脂質含量懸濁液を提供することに加えて、この洗浄技術は、それが、すなわち、注射された懸濁液の超音波検査応答に対するその貢献が比較的小さいすべての又はほとんどすべての微小泡の除去により、本発明の懸濁液のさらなる精製を可能にするという、追加の利点を提供する。これ故、この精製は、積極的に選択された微小泡、すなわち、超音波検査シグナルの反射において注射の間に等しく参加するであろう微小泡だけを含んで成る懸濁液を提供する。これは、非常に低い濃度のリン脂質及び他の添加物だけを含み、さらにその画像形成過程において活性には参加しない微小泡のいずれをも含んでいない懸濁液を導く。
　本方法の別法においては、場合によりラメラ形態であることができる界面活性剤が、空気又は他のガスとの接触に先立って水溶液担体と混合される。
　本発明の懸濁液及び本発明の低リン脂質含量懸濁液の製造方法を、以下の実施例によりさらに説明する：
実施例
（参考例）
　多ラメラ小胞（ＭＬＶｓ）を、５０ｍｌのヘキサン／エタノール（８／２，ｖ／ｖ）中に２４０ｍｇのジアラキドイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ　ＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓからのＤＡＰＣ）及び１０ｍｇのジパルミトイル‐ホスファチド酸（（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　ＬｉｐｉｄｓからのＤＰＰＡ酸）を溶解させ、次にロータリー・エバポレーターを使用して丸底フラスコ中で乾燥するまでその溶媒を蒸発させることにより、調製した。この残渣脂質フィルムを、真空デシケーター中で乾燥させた。水（５ｍｌ）の添加の後、その懸濁液を、攪拌下、９０℃において３０分間インキュベートした。得られたＭＬＶｓを、０．８μｍのポリカーボネート・フィルター（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ（登録商標））を通して８５℃において押し出した。２．６ｍｌの得られたＭＬＶ調製物を、水中のデキストラン１０’０００ＭＷ（Ｆｌｕｋａ）の１６７ｍｇ／ｍｌ溶液の４７．４ｍｌに添加した。得られた溶液を、よく混合し、５００ｍｌの丸底フラスコ中に移し、−４５℃において凍結し、そして０．１Ｔｏｒｒ下で凍結乾燥した。その氷の完全な昇華物を、一夜で得た。その後、空気圧を、真空容器内で回復させた。得られた粉末の様々な量を、ガラス・バイアル（表を参照のこと）内に導入し、そしてそのバイアルを、ゴム栓により蓋をした。真空を、その栓を通して針を介して適用し、そしてその空気を、バイアルから除去した。脱気の間、その粉末を、６フッ化硫黄ガスＳＦ６に晒した。
　泡懸濁液を、それぞれのバイアル内に１０ｍｌの、水中の３％グリセロール溶液を（栓を通して）注射することにより得て、その後、穏やかに混合した。得られた微小泡懸濁液を、血球計を使用して計数した。その平均泡サイズ（容量）は、２．２μｍであった。
　【表１】
　調製物を、ウサギに（頸静脈を介して）並びにミニ豚（耳静脈を介して）、１ｍｌ／５ｋｇの投与量において注射した。インビボにおいて、超音波検査法を、Ａｃｕｓｏｎ　ＸＰ１２８超音波装置（Ａｃｕｓｏｎ　Ｃｏｒｐ．ＵＳＡ）及び７ＭＨｚセクター変換器を使用して行った。この動物を、麻酔し、そしてその変換器を、配置し、そして次に、その胸の左側上の場所内に固定し、ウサギの場合には、心臓の右及び左の心室の視界を、そしてミニ豚の場合には、長さ方向の４つの室の視界を、提供した。０．５ｍｇ／ｍｌの乾燥重量を含む調製物は、ウサギ及びミニ豚における右並びに左の心室の僅かな不透明度を与えた。しかしながら、この不透明度は、１、５及び１０ｍｇ／調製物ｍｌにより、より優れていた。
実施例
（参考例）
　凍結乾燥物を、気相中の（ＳＦ６の代わりの）空気により、実施例１中に記載したように調製した。次に、この凍結乾燥物を、（３％グリセロール溶液の代わりに）０．９％生理食塩水中に懸濁させた。類似の泡濃縮物を得た。しかしながら、ウサギ又はミニ豚の注射の後、その効果の持続性は、例えば、１２０秒間の代わりに１０−２０秒間、より短かかった。その上、ミニ豚においては、左心室の不透明度は、１０ｍｇ／調製物ｍｌによってさえも、貧弱であった。
実施例３
　ＭＬＶリポソームを、２４０ｍｇのＰＡＰＣ及び１０ｍｇのＤＰＰＡ（モル比９５：５）を使用して実施例１中に記載したように調製した。２ミリリッターのこの調製物を、２０ｍｌのポリエチレングリコール（ＰＥＧ２’０００）溶液（８２．５ｍｇ／ｍｌ）に添加した。室温において１０分間混合後、得られた溶液を、−４５℃において５分間凍結させ、そして０．２ｍｂａｒにおいて５時間凍結乾燥させた。得られた粉末（１．６ｇ）を、ゴム栓を備えたガラス・バイアル中に移した。粉末を、（実施例１中に記載したように）ＳＦ６に晒し、そして次に、２０ｍｌの蒸留水中に溶解させた。得られた懸濁液は、５．５μｍの容量平均直径をもつ１ｍｌ当たり５ｘ１０９泡の泡濃度を示した。この懸濁液を、２０ｍｌのシリンジ中に導入し、そのシリンジを、密封し、そして２４時間水平の位置において放置した。その液相の大部分（〜１６−１８ｍｌ）を、抜き取り、一方、そのシリンジを、水平の位置において維持し、そして等容量の新たなＳＦ６‐飽和水を、導入した。このシリンジを、次に、その泡をその水相中で均一化するためにしばらくの間、振とうした。第二デカンテーションを、８時間後同一条件下で行い、その後、さらに３回のデカンテーションを４時間間隔において行った。最後の泡相（バッチＰ１４５）を、３ｍｌの蒸留水中に懸濁させた。それは、１ｍｌ当たり１．８ｘ１０９泡を含み、容量平均直径は６．２μｍであった。この懸濁液（２ｍｌ）のアリコットを、０．２ｍｂａｒにおいて６時間、凍結乾燥させた。得られた粉末を、０．２ｍｌのテトラヒドロフラン／水（９／１ｖ／ｖ）中に溶解させ、そしてこの溶液中に存在するリン脂質を、光散乱検出器を使用してＨＰＬＣにより分析した。この溶液は、１ｍｌ当たり０．７ｍｇのＤＡＰＣを含み、それ故、１０８泡当たり３．９μｇのリン脂質に対応する。バッチＰ１４５中の実際の泡サイズ分布のＣｏｕｌｔｅｒカウンター分析は、１０８泡当たり４．６ｘ１０７μｍ２の全表面積を与えた。ＤＡＰＣの１分子は、５０Å２の表面を占有するであろうと推定され、ある者は、１０８泡当たり１．３のＤＡＰＣがそれぞれの泡の周りの単層のリン脂質を形成するのに必要であろうことを計算することができる。懸濁液Ｐ１４５を、次に４℃において放置し、そしてガス泡の濃度を、規定に基づき測定した。１０日後、その生成物は、その調製後と同様に良好に見られ、そして未だ１ｍｌ当たり１−１．２ｘ１０９泡を含んでいた。この例外的な安定性は、その懸濁液中の非常に低い量のリン脂質を考慮すれば非常に驚くべきことが見つかった。
　先に記載した実験を、好ましくはより大きな泡（バッチＰ１３２）を回収するために、より短いデカンテーション時間を使用して微小泡の第二バッチについて繰り返した。得られた容量平均直径は、８．８μｍであり、そしてＣｏｕｌｔｅｒカウンターにより測定された全表面は、１０８泡当たり２２ｘ１０８μｍ２であった。その計算は、１０８泡のための６μｇのＤＡＰＣがＤＡＰＣの単層によりその泡集団を被覆するために必要であろうことを、示した。ＨＰＬＣにより測定されたＤＡＰＣの実際量は、１０８泡当たり２０μｇであった。その泡集団の全表面の正確な推定を得ることの困難性を考慮すれば、実験誤差内において、得られた結果が１のリン脂質層によるその微小泡の被覆と矛盾しないようである。
　様々な洗浄された泡調製物により行われた超音波検査測定は、分離の間、下相が、上相又は新たに調製されたサンプルよりもかなり弱い超音波シグナルを与えることを示した。一見すると、これは、正常に見えた。なぜなら、そのシリンジの頂上の上の白色層がいずれにしてもそのガス微小泡の大部分を含んでいたからである。しかしながら、図１中に示すように、泡計数は、下層中にもかなり高い微小球の集団を示した。Ｃｏｕｌｔｅｒ測定にのみ基づき、その微小泡が０．５μｍ以下のサイズをもつことが明らかとなり、それは、高い濃度にあるときさえ小さな泡により、超音波シグナルの適当な反射が全くないことを示唆している。
　３％グリセロール溶液中の調製物Ｐ１３２の４倍希釈物を、ミニ豚（０．２ｍｌ／ｋｇ）中に注射した。１ｍｌ当たり２．５ｘ１０７泡を含む洗浄泡及び１ｍｌ当たり５μｇのリン脂質の調製物は、際立った心臓内の縁取り描写により左及び右心室における素晴らしい不透明度を提供した。また、良好な不透明度を、１ｋｇ当たり０．２μｇのリン脂質に対応する（３％グリセロール中に希釈した）調製物Ｐ１４５のアリコットをミニ豚に注射することにより得た。コントラストは、さらに、０．０２μｇ／ｋｇの注射後に左心室内で検出可能であった。その上、腎臓動脈において、造影効果の存在は、０．００５μｇ／ｋｇと同様に低いリン脂質投与量におけるパルス化Ｄｏｐｐｌｅｒにより検出されることができるであろう。
　薄層化リン脂質がガス微小泡の周りの単一の単層において整列される限り、作られた懸濁液は、適当な安定性をもつであろう。これ故、現在予想しない発見についての説明を提供し、そしてリン脂質の量がその懸濁液中に存在する微小泡の周りの単層の形成に必要なものよりも大きくなってはならないということを、証明している。
実施例
（参考例）
　ヘキサン／エタノール８／２（ｖ／ｖ）中に４８ｍｇのＤＡＰＣ及び２ｍｇのＤＰＰＡを含む溶液を、調製し、そしてその溶媒を、乾燥するまで（実施例１中に記載するように）蒸発させた。５ｍｇの得られた粉末及び３７５ｍｇのポリエチレングリコールを、６０℃において５ｇのｔｅｒｔ‐ブタノール中に溶解させた。次に、透明溶液を、−４５℃まで急速に冷却し、そして凍結乾燥させた。８０ｍｇの凍結乾燥物を、ガラス・バイアル中に導入し、そして粉末を、ＳＦ６に晒した（実施例１を参照のこと）。次に、３％のグリセロール溶液（１０ｍｌ）を、そのバイアル中に導入し、そしてその凍結乾燥物を、穏やかにかき混ぜることにより、溶解させた。得られた懸濁液は、１ｍｌ当たり１．５ｘ１０８泡をもち、（容量における）平均直径は９．５μｍであった。この溶液を、ウサギに注射し、右及び左心室のハッキリした視界を提供した。この懸濁液の１０倍希釈さえ、強い造影強化を示した。
実施例
（参考例）
　実施例４の手順を、繰り返した。但し、ヘキサン／エタノール溶液中のリン脂質の最初の溶解を、省略した。言い換えれば、粗リン脂質を、第三ブタノール中のポリエチレン・グリコールと一緒に溶解させ、そしてその溶液を、凍結乾燥させ；その後、その残渣を、水に懸濁させた。幾つかのリン脂質及び他の脂質とリン脂質との組み合わせを、これらの実験において調査した。次の表中に示す結果において、リン脂質を、１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ２’０００を含む第三ブタノール溶液中に溶解させた。凍結乾燥後に得られた残渣を、ＳＦ６により飽和させ（実施例１を参照のこと）、次に、１ｍｌ当たり１００ｍｇ乾燥重量の濃度において蒸留水中に溶解させた。
　【表２】
凡例
　　ＤＡＰＣ＝ジアラキドイルホスファチジル・コリン
　　ＤＳＰＣ＝ジステアロイルホスファチジル・コリン
　　ＤＰＰＧ＝ジパルミトイルホスファチジル・コリン
　　ＤＰＰＡ＝ジパルミトイルホスファチド酸
　　Ｃｈｏｌ＝コレステロール
　　Ｐａｌｍ．ａｃ．＝パルミチン酸
　　ＰｌｕｒＦ６８＝Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−６８
＊本実験においては、ＣＦ４を、ＳＦ６の代わりにガスとして使用した。
　すべての場合において、得られた懸濁液は、高い微小泡濃度を示し、これは、リポソーム中へのリン脂質の最初の変換が必要でなかったことを示していた。これの懸濁液を、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ中で希釈し、そして実施例３中に記載したようにミニ豚に注射した。すべての場合において、右及び左の心室の際立った不透明度並びに心臓内の縁取りの良好な描写を、体重当たり１０−５０μｇ以下の投与量において得た。
実施例６
　ＰＥＧ−２０００（２ｇ）、ＤＡＰＣ（９．６ｍｇ）及びＤＰＰＡ（０．４ｍｇ）を、２０ｍｌの第三ブタノール中に溶解させ、そしてその溶液を、０．２ｍｂａｒにおいて一夜凍結乾燥した。得られた粉末を、ＳＦ６に晒し、そして次に２０ｍｌの蒸留水中に溶解させた。（血球計により測定されるような）１ｍｌ当たり１．４ｘ１０９泡を含む懸濁液を、２０ｍｌのシリンジ中に導入し、これを、密封し、そして１６時間、水平位置に放置した。泡の白色層を、その溶液の頂上の上に見ることができた。その下相（１６−１８ｍｌ）を、廃棄し、一方、そのシリンジを水平に維持した。新たなＳＦ６−飽和蒸留水の等容量を、そのシリンジ中に吸引し、そしてその泡を、攪拌により、その水相中で均一化した。微小泡の２つの異なる集団、すなわち、大きなサイズと中間のサイズを、短期間にわたる反復デカンテーションにより、得て、その大きな泡を、デカンテーションのほんの１０−１５分後に回収し、そしてその中間サイズの泡を３０−４５分後に回収した。これらのデカンテーションを、２つのタイプの集団のついての狭い泡サイズ分布を得て、そしてその微小泡と関係しないすべてのリン脂質を取り除くために、１０回、繰り返した。大きな泡を含むすべての相を、プールした（″大きなサイズの泡″）。同様に、中間サイズの泡を含む画分を、合わせた（″中間サイズの泡″）。２つの泡集団のアリコットを、凍結乾燥し、そして次に、それぞれの画分中に存在するリン脂質の量を測定するために、ＨＰＬＣにより分析した。大きなサイズの泡画分は、１ｍｌ当たり２．５ｘ１０７泡を含み、数平均直径が１１．３μｍであり、そして１０７泡当たり１３．７μｇのリン脂質であった。この結果は、それぞれの泡の周りの単層のリン脂質及びリン脂質分子当たり５０Åの表面を仮定して、その理論量、１０７泡当たり１１．５μｇと素晴らしく一致して、計算された。この中間サイズの泡画分は、１ｍｌ当たり８．８ｘ１０８泡を含み、数平均直径は３．１μｍであり、そして１０７泡当たり１．６μｇのリン脂質であった。後者の値は、再び、理論的な量、１０７泡当たり１．３５μｇと素晴らしく一致している。これらの結果は、本明細書中で開示した微小泡の安定性が、もっともおそらくは、その微小泡の周りのリン脂質の単層の形成を原因とすることを、さらに示している。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　図１は、本発明に従って新たに調製された懸濁液についての微小泡濃度の関数としての超音波検査応答のグラフ表示である。