【事件の表示】
　特許第３３０９３５６号「超音波イメージング用造影剤としてのリポソーム」の請求項３１〜３６に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　本件特許異議の申立てを却下する。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許第３３０９３５６号の請求項１〜４３に係る発明は、平成２年１２月１９日に国際特許出願（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７５００、パリ条約による優先権主張１９８９年１２月１９日、１９９０年８月２日、米国）され、平成１４年５月２４日に特許権の設定の登録がされた後、請求項３１〜３６に係る発明の特許について、２件の特許異議の申立てがされ、当審による取消理由通知の意見書提出の指定期間内である平成１６年１月１３日に明細書の訂正請求がされたものである。
　
２．訂正請求について
（１）訂正の内容
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項３１〜３６を削除する。
　
訂正事項ｂ
　請求項３７〜４３の番号を３１〜３７に訂正し、これに対応して引用請求項の番号を訂正する。
　
（２）訂正の適否
　訂正事項ａは、請求項３１〜３６を削除するものであるので、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正である。
　訂正事項ｂは、訂正事項ａで請求項３１〜３６が削除されたことに伴って、その後の請求項の番号及び引用された請求項の番号を訂正するものであるので、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正である。
　そして、訂正事項ａ及びｂは、いずれも特許明細書に記載された事項の範囲内での訂正であって、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　
　したがって、本件訂正は、特許法第１２０条の４第２項並びに同条第３項において準用する同条第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、訂正を認める。
　 
３．特許異議の申立てについて
　特許異議の申立てがされた訂正請求前の請求項３１〜３６に係る発明の特許は、訂正請求により削除され、特許異議の申立ての対象が存在しないものとなったので、本件特許異議の申立ては、不適法な訂正であってその補正をすることができないものとなる。
　したがって、本件特許異議の申立ては、特許法第１２０条の６第１項で準用する同法第１３５条の規定によって却下すべきものである。
　
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年２月２日（２００４．２．２）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
超音波イメージング用造影剤としてのリポソーム
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　超音波造影剤として使用するためのリポソームを合成するための装置であって、該装置が（ａ）容器；
（ｂ）リポソームを含有する液体媒体を該容器内に入れる手段；
（ｃ）冷却気体が該液体媒体の中に導入されるまで該液体が入った該容器を圧縮する手段、それによって該気体の第１部分が該液体媒体に溶解する；
（ｄ）該気体の第２部分を放出させることにより該容器を急速に減圧する手段、それによって該リポソームに入った該溶解気体がその中で泡を形成する；及び
（ｅ）該泡が形成された該リポソームを該容器から回収する手段；
からなることを特徴とする装置。
　【請求項２】　さらに該リポソームを分粒する手段からなる請求項１記載の装置。
　【請求項３】　該リポソームを分粒する該手段がフィルターを介して該液体媒体を流す手段からなる請求項２記載の装置。
　【請求項４】　フィルターを介して該液体媒体を流す該手段がシリンジからなる請求項３記載の装置。
　【請求項５】　該液体媒体が非リポソーム固体を含有し、さらに該液体媒体から該非リポソーム固体を除去する手段からなる請求項１記載の装置。
　【請求項６】　該液体媒体から該非リポソーム固体を除去する該手段がフィルターを介して該液体媒体を流す手段からなる請求項５記載の装置。
　【請求項７】　リポソームを含有する該液体媒体を該容器内に入れる該手段がシリンジからなる請求項１記載の装置。
　【請求項８】　該泡が形成された該リポソームを該容器から回収する手段がシリンジからなる請求項１記載の装置。
　【請求項９】　該容器を急速に減圧する該手段が、該リポソームに外在する該液体媒体中で泡を形成させ、さらにリポソームを含有する該液体媒体をデキャビテーションする手段からなる請求項１記載の装置。
　【請求項１０】　リポソームを含有する該液体媒体をデキャビテーションする手段がフィルターを介して該液体媒体を流すことからなる請求項９記載の装置。
　【請求項１１】　該フィルターが約０．０１５ミクロンから約１０ミクロンの範囲内のポアサイズを有する請求項３または１０記載の装置。
　【請求項１２】　フィルターを介して該液体媒体を流す該手段が該液体媒体を該容器からシリンジへ放出する手段からなる請求項１０記載の装置。
　【請求項１３】　該リポソームがホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸からなる群から選択される１種またはそれ以上の脂質からなる請求項１記載の装置。
　【請求項１４】　該リポソームがさらに該リポソームの表面上のポリマーからなる請求項１３記載の装置。
　【請求項１５】　該ポリマーがポリエチレングリコールからなる請求項１４記載の装置。
　【請求項１６】　該泡が形成された該リポソームが単一層状のリポソーム、二層状のリポソーム及び多層状のリポソームからなる群から選択される請求項１記載の装置。
　【請求項１７】　該リポソームが１種またはそれ以上のホスホリピドからなる請求項１６記載の装置。
　【請求項１８】　該ホスホリピドが、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾリピド、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴリピド、グルコリピド、グリコリピド、スルファチド、エーテル及びエステル結合した脂肪酸を有する脂質、及び重合性脂質からなる群から選択される請求項１７記載の装置。
　【請求項１９】　該リポソームがさらにポリエチレングリコールからなる請求項１８記載の装置。
　【請求項２０】　超音波造影剤として使用するためのリポソームを合成するための方法であって、該方法が（ａ）気体を含有する水溶液をその中に内包したリポソームからなる液体媒体を提供し、および（ｂ）該溶解気体の泡をその中に内包するリポソームを生成するために該液体媒体を減圧することからなる方法。
　【請求項２１】　前記工程（ａ）の該液体媒体を低められた温度にまで冷却することからなる請求項２０記載の方法。
　【請求項２２】　該低められた温度が約１刧から約４刧である請求項２１記載の方法。
　【請求項２３】　該気体が窒素、酸素、二酸化炭素、キセノン、アルゴン、ネオン及びヘリウムからなる群から選択される請求項２０記載の方法。
　【請求項２４】　該リポソームが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸からなる群から選択された１種またはそれ以上の脂質からなる請求項２０記載の方法。
　【請求項２５】　該リポソームがさらに該リポソームの表面上のポリマーからなる請求項２４記載の方法。
　【請求項２６】　該ポリマーがポリエチレングリコールからなる請求項２５記載の方法。
　【請求項２７】　該リポソームが単一層状のリポソーム、二層状のリポソーム及び多層状のリポソームからなる群から選択される請求項２０記載の方法。
　【請求項２８】　該リポソームが１種またはそれ以上のホスホリピドからなる請求項２７記載の方法。
　【請求項２９】　該ホスホリピドが、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾリピド、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴリピド、グルコリピド、グリコリピド、スルファチド、エーテル及びエステル結合した脂肪酸を有する脂質、及び重合性脂質からなる群から選択される請求項２８記載の方法。
　【請求項３０】　該リポソームがさらにポリエチレングリコールからなる請求項２９記載の方法。
　【請求項３１】　超音波造影剤として使用するための脂質小胞を製造するための方法であって、該方法が、（ａ）気体を含有する水溶液をその中に内包した脂質小胞からなる液体媒体を提供し、および（ｂ）該溶解気体の泡をその中に内包する脂質小胞を生成するために該液体媒体を減圧することからなる方法。
　【請求項３２】　該脂質小胞がリポソームからなる請求項３１記載の方法。
　【請求項３３】　該脂質小胞がさらにポリエチレングリコールからなる請求項３１記載の方法。
　【請求項３４】　該リポソームが単一層状のリポソーム、二層状のリポソーム及び多層状のリポソームからなる群から選択される請求項３２記載の方法。
　【請求項３５】　該脂質がホスホリピドである請求項３１記載の方法。
　【請求項３６】　該ホスホリピドがコレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、リゾリピド、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴリピド、グルコリピド、グリコリピド、スルファチド、エーテル及びエステル結合した脂肪酸を有する脂質、及び重合性脂質からなる群から選択される請求項３５記載の方法。
　【請求項３７】　前記水溶液が温度活性化気状前駆体を含有する請求項２０または３１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
関係した出願
　本出願は、１９８９年１２月２２日登録の一連の継続出願ＵＳＳＮ第４５５，７０７号の一部である。
発明の背景
発明の分野
　本発明は、超音波イメージング（ｉｍａｇｉｎｇ）の分野、よりくわしくは、超音波イメージング処理におけるリポソームの使用に関する。
発明の背景
　動物とヒトにおける疾患を検出及び診断するのに用いられてきた多様なイメージング技術がある。診断用イメージングに用いた最初の技術のひとつがＸ線である。この技術により得られるイメージは、結像される対象の電子密度を映し出す。多様な構造間の造影が増すようにＸ線を減ずるか遮断するために、バリウム又はヨウ素等の造影剤を用いる。たとえば、腸管腔を明確にさせたり腸の粘膜表面を可視化するために、バリウムを消化管検査に用いる。ヨウ素造影剤を、動脈の可視化のために血管内に用いるのが、これは血管造影法と呼ばれる。しかし、Ｘ線は危険なことがわかっている。Ｘ線に用いる放射線はイオン化を起こし、イオン化放射線の有害な影響は蓄積する。
　磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）はもう１つの重要なイメージング技術であるが、費用の点で、そして手軽な検査法として使えないという欠点がある。さらに、ＭＲＩは多くの医療施設では利用できない。
　核医学に用いる放射性核種は、別のイメージング技術をもたらす。この技術を用いる際には、テクネチウムで標識化した化合物等の放射線核種を患者に注射して、ガンマカメラでイメージを得る。しかし、核医学技術は空間的解像度がとぼしいという難点があり、動物又は患者を放射線の有害な影響にさらす。さらに、放射線核種の取扱いと処分の問題がある。
　別の診断用イメージング技術である超音波は、核医学やＸ線と異なり、イオン化する放射線の有害な影響に患者をさらさない。さらに、磁気共鳴イメージングと異なり、超音波は比較的高価でなく、手軽な試験法として実施できる。超音波技術を用いる際には、音はトランスデューサーによって患者又は動物の内部に伝わる。音波が身体を伝わる際に組織と流動体の界面にぶつかる。身体内の組織と流動体の反射率と音響特性に従がって、超音波は反射するか吸収される。音波が界面で反射すると、トランスデューサーの受信機で検知されてイメージを形成するように処理される。体内の組織と流動体の音響特性が、生じるイメージにあらわれる造影を左右する。
　超音波技術において近年進歩がみられた。しかし、それらの多様な技術の向上にもかかわらず、超音波は多くの点で、とりわけ肝臓、脾臓、腎臓、血管系の疾患の検出と血流の測定の点で、いまだに不完全な手段である。これらのものの検出及び測定能力は、血液又は他の組織と周辺組織間の音響特性の違いに依存する。その結果、血流測定の向上のためには血液と周辺組織間の、あるいは、疾患検知の向上のためには肝臓と腫瘍間の如き１つの組織と他の組織間の音響的差異を増大させる造影剤が求められてきた。
　超音波におけるイメージ形成が基づく原理により、研究者は造影剤のこのような追求を目ざしてきた。超音波からの音波が物体を通過する時、その物体の音響特性は、音速とその物体の密度に左右される。物体の音響特性又は音響インピーダンスの変化は、密度又は音響インピーダンスの大きくちがう異なった物体の界面、とくに固体、液体及び気体間の界面で著しい。超音波がこのような界面にぶつかると、音響インピーダンスの変化の結果、音波のより強度の反射と超音波イメージのより強度な信号が生じる。
　超音波用に今日まで開発された多くの従来技術の造影剤は、ゼラチン又はサッカリンで被包された微小泡のガスを含む液体から成っていた。それら微小泡とゼラチン／サッカリンの構成はもっともしばしば、振とう技術を用いて調製される。他の従来技術は、タンパク質を伴なった気泡、又はアルブミンあるいはコラーゲンいずれかより成る微小球に取り込まれた気泡に関する試みに向けられている。さらに、重金属粒子が超音波造影剤として評価されている。又、ガスあるいは気状前駆体を内部に包被した超音波用に利用できるリポソームについて述べたいつくかの報告がある。
　従来技術は、超音波に反響し易く（ｅｃｈｏｇｅｕｉｃ）、すなわち、造影が増強した信号を与える。いくつかの超音波造影剤を生み出したが、これまで開発された造影剤は様々な問題を持っている。タンパク質を基礎にした気泡システムは、抗原性のある、そして毒性を有するかもしれない外来タンパク質を用いているという欠点がある。リポソームの造影剤は、不均一な粒度分布と乏しい安定性という問題がある。又、リポソームを含む気状前駆体は、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で造影の増強ガスを形成するその能力が不十分である。さらにいくつかの典型的従来技術による造影剤が経肺性血管造影剤としてエコー源性効果を示す一方で、これら多くの薬剤は、たとえば肝臓又は脾臓での腫瘍のイメージング向上に十分な効果を示さない。さらに、これら超音波造影剤、特にガス被包リポソーム、の調製法の多くは、不十分で高価であるか、さもなければ不満足なものである。本発明はこれら及び他の重要な要求に応えることに向けられている。
発明の要約
　一実施例において、本発明は内部にｐＨ活性化気状前駆体を被包するイオノホア含有リポソームから成る超音波イメージング用造影剤に向けられる。
　別の実施例において、本発明は内部に光活性化気状前駆体を被包するリポソームから成る超音波イメージング用造影剤に向けられる。
　第３の実施例において、本発明は内部に温度活性化気状前駆体を被包するリポソームから成る超音波イメージング用造影剤に向けられる。
　さらなる実施例において、本発明は、内部に固体又は液体造影増強剤を被包するリポソームから成る超音波イメージング用造影剤に向けられる。
　さらに本発明の実施例は、本発明のリポソームを患者に投与して超音波を用いて患者をスキャンすることから成る、超音波を用いた患者のイメージング方法に向けられる。
　さらなる実施例において、本発明は、超音波イメージング用造影剤を製造するためにリポソームの内部空間内にガスを被包する新規な方法から成る。
　本発明内で実施される造影剤はエコー源性である、すなわち、超音波を反射して超音波イメージの信号強度を増強することができる。とくに血管内造影剤として意図されたある製造物において、本造影剤は、肺循環の毛細管を通過できるほどに微小であり、心臓、動脈系及び静脈系において良い造影増強をもたらす効果がある。他の組織又は体腔内に注射するように意図した他の製造物において、小胞はエコー源性を最大にするためにより大きく、非常に効果的な造影増強をもたらす。本発明によれば、ガス、気状前駆体及び／又は固体あるいは液体造影増強剤を内部に被包したリポソームは、決まった再生産可能な大きさで製造することができる。本発明は血管系、肝臓、脾臓及び腎臓等の特定の部位に造影剤を標的化及び輸送することもできる。本発明は、気泡を被包する外来タンパク質の使用に伴う毒性がなく、また血栓症の発生しやすさを最小にする。さらに、本発明のリポソームは長期保存できる。加えて、本発明のリポソーム内部空間内にガスを被包する新規な方法は、非常に効果的であり行なうのにあまり費用がかからない。本発明のリポソームの超音波造影剤は、以前には考えられないような方法で器官と組織の進んだイメージングを可能にする。リポソーム膜を血液プール又は循環半減期に関して最適化することができるので、効果的環流及び血液プール造影剤が入手可能となる。これは、心臓において、たとえば虚血の診断に、他の器官において血流の減少やシャント（ｓｈｕｎｔ）の診断に有用である。海綿状血管腫等の血液プール障害において、これら薬剤は正確な診断をするのに有用である。これらの薬剤を肝臓や脾臓等の器官の健康な細胞による取り込みに関して最適化できるので、造影剤はこれらの器官の腫瘍の超音波検出と特徴づけを容易にする。本発明のこれらの、及び他の特徴、そしてその利点は、以下の図と記述でさらに説明される。
図の簡単な説明
　図１Ａ。この図で、小胞内のｐＨの変化に対応してガスを形成するように気状前駆体が反応する一般的方法が説明される。ここに示す実施例では、炭酸水素塩が小胞の内部水性空間に取り込まれ、たとえばｐ−トリフルオロメトキシ−カルボニルシアニドフェニルヒドラジン等のイオノフォアがリポソーム膜基質内に存在してリポソーム膜を通過する水素イオン流を高める。イオノフォアにより小胞内部のｐＨ変化が容易になった結果、非常にエコー源性な二酸化炭素ガスが形成する。
　図１Ｂ。この図で、ＵＶ光に露光するとガスを形成するように気状前駆体が反応する一般的方法が説明される。示された特定の実施例では、脂質小胞内に取り込まれたジアゾニウム化合物がＵＶ露光の結果として非常にエコー源性な窒素ガスを形成する。
　図１Ｃ。この図で、温度の上昇に対応して気状前駆体がガスを形成する一般的な方法が示される。いったん患者に注射すると、たとえばメチル酢酸（ｍｅｔｈｙｌａｃｔａｔｅ）は、室温から生体温度へ温度が上昇する結果、液体から非常にエコー源性なガスに変わる。
　図１Ｄ。この図で、磁鉄鉱等の粒子状固体造影増強剤をリポソーム内部に取り込む一つの方法が説明される。ここに示す方法では、第１図及び第２鉄塩の混合物が、リポソームの水性核内部に取り込まれる。膜を通過する陽子流速を増大させるためにリポソームの基質内にバリノマイシン等のイオノフォアを取り入れる。使用前又は使用中に、次に、適当なアルカリを加えて小胞の外部でｐＨを高めて、その結果リポソーム内部のｐＨを高くする。すると、ｐＨの増大が塩基の触媒作用を高める結果、リポソーム内で非常にエコー源性な磁鉄鉱をその場で形成する。前形成した磁鉄鉱等の前形成固体造影増強剤をリポソームに取り込むのも同様に可能である。
　図２。この図で、ガス、気状前駆体及び／又は固体あるいは液体造影増強剤を取り込んだリポソームの浄化値及び生体分布速度の調整が可能なように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーでリポソームの表面を修飾する一つの方法が示される。
　図３。この図は、本発明のいくつかの装置における基本的加圧及び減圧の様子とガスを含んだリポソームの製造方法を示す。まず、リポソームを容器に加え、次に容器をガスで加圧する。加圧下に、ガスを溶液に入れ、リポソーム膜を通過させる。圧力を取り除くと、ガス泡がリポソーム内に形成される。
　図４。この図は、内部にガスを被包したリポソームを合成するための本発明の一つの装置を示す。この装置は、リポソームを含んだ液体媒質を容器内に入れて用いる。次に圧力密閉するように、キャップを容器の口にねじ込む。二酸化炭素等のガスの入ったカートリッジを導入口にはめこむことにより容器を加圧する。カートリッジは、容器内へとはめこまれたチューブの上端の中へその内容物を放出する。ガスはチューブを通して流れて容器の底に入るチューブのより下の端へ出る。ガスを容器に導入した後、今度は容器から液体を吐出して減圧する。
　図５。この図は、内部にガスを被包したリポソームを合成するための本発明の別の装置を示す。リポソームが中に置かれたシリンジは、いろいろな孔サイズの１つ以上のフィルターを介して圧力容器の導入／排出口とバルブに連結している。次にシリンジをフィルター、導入／排出口及びバルブを通して、容器の底へと注ぎ空にする。もしくは、シリンジ及び／又はフィルター及び／又は導入／排出口とバルブを用いずに、容器に直接リポソームを入れてもよい。次に容器をガスで加圧した結果、ガスを含んだリポソーム構成物が生じる。次に、容器のガス含有リポソーム内容物を、導入／排出口とバルブとフィルター部品を通して排出して、シリンジへ空ける。もしくは、フィルター及び／又は導入／排出口とバルブを通さずにリポソームを直接に取り除いて、そして／又はシリンジ内に空けてもよい。
　図６。この図は、内部にガスを被包したリポソームを合成するための本発明のさらなる装置を示す。リポソームを含む液体媒質を中に入れた容器に、導入口を通してガスが入り、チューブを通って流れて、容器の底に排出される。容器の底から、液体中をガスが上方へ発泡する。とりはずし排出口にあるバルブを開いて減圧を完了すると、チューブを通じて容器の底から液体が吐出する。
　図７。この図は、内部にガスを被包したリポソームを合成するための別の装置を示す。この図が示すように、本発明の方法を行なうのに必要な装置は、加圧したガスとリポソームを導入及び排出するための口のある簡単な容器でさえあればよい。
　図８。この図は、内部にガスを被包したリポソームを合成するための別の装置を示す。この装置は、リポソームを含む液体媒質を、冷却材がその中を循環する箱（ｃｈａｍｂｅｒ）によっておおわれた容器の中に入れて用いる。高周波音波発生機が容器に付けられている。使用の際、ガス口より導入したガスを用いて容器を加圧する。音波発生機は電気エネルギーを機械的振動に変えて、容器内部にのびるホーン（ｈｏｒｎ）を通してこの振動を液体中に伝える。この機械的力の結果リポソームがばらばらになって再構成する時、リポソームは溶解しているガスをその内部水性核内に被包する。音波処理後に容器を減圧して被包したガスが泡を形成すると、リポソームがガスを含有したリポソームに変わる。
発明の詳細な説明
　１つの実施例において、本発明は、内部にｐＨ活性化気状前駆体を被包するイオノフォア含有リポソームから成る超音波イメージ用造影剤を提供する。
　ここに用いられる「イオノフォア含有リポソーム」という表現は、その膜内にイオノフォアを取り込んでいるリポソームを意味する。「イオノフォア」という語は、ここで用いる時は、リポソーム膜を通過する水素イオン又は水酸化物イオンの輸送を容易にしてリポソーム膜内部のｐＨ変化を起こすことのできる化合物を意味し、一般にプロトンキャリアーそしてチャンネルフォーマー（ｃｈａｎｎｅｌ　ｆｏｒｍｅｒ）と呼ばれる化合物を含む。適当なイオノフォアには、ニトロ化、ハロゲン化及び酸素化フェノール、そしてカルボニルシアニドフェニルヒドラゾン等のプロトンキャリアーが含まれる。このようなプロトンキャリアーのうち好ましいものは、カルボニルシアニド、ｐ−トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（ＦＣＣＰ）、ルボニルシアニドＭ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、カルボニルシアニドフェニルヒドラジン（ＣＣＰ）、テトラクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾール（ＴＴＦＢ）、５，６−ジクロロ−２−トリフルオロメチルベンズイミダゾール（ＤＴＦＢ）、及びアンカプラ（Ｕｎｃｏｕｐｌｅｒ）１７９９である。適当なチャンネルフォーマーには、グラミシジン、アラメチシン、フィリピン、エトルスコマイシン、ナイスタチン、ピマリシン及びアンホテリシンが含まれる。他の適当なプロトンキャリアーには、好ましくはカチオンに対して好ましくは選択性を示し同時にプロトン及び／又は水酸化物イオンの輸送もする以下の化合物が含まれる。すなわち、バリノマイシン、エンニアチン（タイプＡ、Ｂ又はＣ）、ボーベリシン、モノマイシン、ノナクチン、モナクチン、ジナクチン、トリナクチン、テトラナクチン、アンタマニド、ナイジェリシン、モネンシン、サリノマイシン、ナリシン、ムタロマイシン、カリオマイシン、ジアネマイシン、セプタマイシン、Ａ−２０４Ａ、Ｘ−２０６、Ｘ−５３７Ａ（ラサロシド）、Ａ−２３１８７及びジシクロヘキシル−１８−クラウン−６。このようなイオノフォアはこの分野で周知であり、たとえば、ジェイン（Ｊａｉｎ）ら、イントロダクション　トゥ　バイオロジカル　メンブレンズ（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）（Ｊ．ワイリー　アンド　サンズ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ）、Ｎ．Ｙ．１９８０）、とくにｐｐ１９２−２３１、及びＨ．サイゲル（Ｓｙｇｅｌ）編、メチルイオンズ　イン　バイオロジカル　システムズ（Ｍｅｔｈｙｌ　Ｉｏｎｓ　Ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍ）、Ｖｏｌ．１９、「アンチバイオティクス　アンド　ゼア　コンプレクシズ」（“Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　Ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ”）、（デッカー（Ｄｅｋｋｅｒ）、Ｎ．Ｙ．１９８５）に述べられているが、これらの各開示は、その全体がここに引用され取り入れられている。イオノフォアは、単独でも互いに組み合わせても用いることができる。
　リポソームはプロトン又は水酸化物イオンに対し不透過性ではないが、リポソームの透過率は一般に非常に低いのでｐＨ勾配をなくすのにしばしば何週間も何か月もかかることが知られている。ｐＨ調節した気状前駆体を活性化するために、リポソーム膜を通過する水素イオン又は水酸化物イオンのより速い輸送をもたらすことが必要である。本発明によれば、リポソーム膜内へのイオノフォアの取り込みが、活性化イオンの輸送に必要な手段を提供する。リポソーム膜を通過する水素イオン又は水酸化物イオン流速を増大させることによって、このようなイオノフォアは、リポソーム内のｐＨ活性化気状前駆体からのガスの形成速度を増大させる。この現象を図１Ａに図式的に表わす。
　ここに用いる「ｐＨ活性化気状前駆体」という表現は、ｐＨの低下に出会うとガスを形成する固体又は液体状態の化合物を意味する。前記のように、この考え方は図１Ａで説明される。このような化合物には、アルカリ金属の炭酸塩及び炭酸水素塩、アルカリ土類金属の炭酸塩及び炭酸水素塩、そしてそれらの混合物等の金属炭酸塩と金属炭酸水素塩が含まれるが、これらに制限されない。このような化合物の例としては、炭酸リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素マグネシウム、その他がある。又、有用なガスを発生する化合物は、炭酸アンモニウム、炭酸水素アンモニウム、アンモニウムセスケ炭酸塩、ナトリウムセスケ炭酸塩、その他である。これらの化合物は水に溶かすと約７をこえるｐＨ、通常約８ないし約１２のｐＨを示す。他のｐＨ活性化気状前駆体には、水に溶かすと一般に約５ないし６のｐＨを示すアミノマロン酸塩が含まれる。アミノマロン酸塩のｐＫａ１は３．３２であり、ｐＫａ２は９．８３である。アミノマロン酸塩はこの分野で周知であり、その製造は、たとえばタンナシ（Ｔｈａｎａｓｓｉ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｖｏｌ．９、ｎｏ．３、ｐｐ．５２５−５３２（１９７０）、フィッツパトリック（Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ）ら、インオーガニックケミストリー（Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、Ｖｏｌ．１３、ｎｏ．３、ｐｐ．５６８−５７４（１９７４）、ステルマソック（Ｓｔｅｌｍａｓｈｏｋ）ら、コオディナーツイオナーヤ　キミア（Ｋｏｏｒｄｉｎａｔｓｉｏｎｎａｙａ　Ｋｈｉｍｉｙａ）Ｖｏｌ．３、ｎｏ．４、ｐｐ．５２４−５２７（１９７７）に述べられている。他の適当なｐＨ活性化気状前駆体は、当業者には明らかであろう。
　当業者には理解されるように、このような化合物は、望ましければ、投与前に活性化できる。もちろん、適当なｐＫａの気状前駆体を選ぶことにより、当業者は、静脈注射又は体腔内注射後にリポソーム内でガスが形成するリポソームを製造できる。適当なｐＨにさらすのを投与前に行なった場合でさえ、気状前駆体を伴なったリポソームは内部にガスを被包した状態で保存しておいたリポソームよりもっと安定な物質であるという点において、利点がある。したがって、ｐＨ活性化気状前駆体を被包したリポソームを用いることにより、より高い保存性が明らかに得られる。又、イオノフォアを使用することにより、ｐＨ活性化気状前駆体を取り込んだリポソームをｐＨ勾配にふれさせた時に効果的にガスを発生させることができるということがわかった。こうして得られたガス含有リポソームは、周辺の生体構成物や器官と比べてより低い密度であるために、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で容易に検出することが可能である。
　本発明の第２の実施例においては、内部に光活性化気状前駆体を被包するリポソームから成る超音波イメージング用造影剤を提供する。ここで用いる「光活性化気状前駆体」という表現は、露光後にガスを形成する感光性化学物質を意味する。この考え方を図１Ｂに示す。適当な感光性化合物には、紫外線に露光した後に分解して窒素ガスを形成するジアゾニウム化合物が含まれる。他の適当な化合物はアミノマロン酸塩である。当業者には理解されるように、露光後にガスを形成する他の気状前駆体を選んでもよい。適用法によっては、このような露光がインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の投与の前に必要かもしれないし、ある場合には、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の投与につづいて行なうこともできる。適当な光へさらすことが投与前に行なわれた場合でさえ、気状前駆体を伴なったリポソームは内部にガスを被包した状態で保存しておいたリポソームよりもっと安定した物質であるという点で利点がある。したがって、光活性化気状前駆体を被包するリポソームを用いることにより、より高い保存性が明らかに得られる。こうして得たガス含有リポソームは、周辺の生体構成物や器官に比べてより低い密度であるためにインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で容易に検出できる。
　第３の実施例では、本発明は、内部に温度活性化気状前駆体を被包するリポソームから成る超音波イメージング用造影剤に向けられている。ここに用いる「温度活性化気状前駆体」という表現は、温度変化につづいてガスを形成する化合物を意味する。この考え方を図１Ｃに示す。適当な温度活性化気状前駆体は当業者には周知であり、たとえば、常温では液相であるが生体温度でガスを形成する化合物であるメチル酢酸（ｍｅｔｈｙｌａｃｔａｔｅ）がこれに含まれる。当業者にはわかるように、このような化合物を投与前に活性化してもよいし、又、メチル酢酸（ｍｅｔｈｙｌａｃｔａｔｅ）の場合のように、患者への注射とともに活性化してもよい。適当な温度にさらすことが投与前に行なわれた場合でさえ、気状前駆体を伴なったリポソームは、内部にガスを被包した状態で保存していたリポソームよりもっと安定された物質であるという点で、利点がある。したがって、温度活性化気状前駆体を被包するリポソームを用いることによってより高い保存性が明らかに得られる。こうして得たガス含有リポソームは、周辺の生体構成物や器官と比べてより低い密度であるために、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で容易に検出できる。さらに、当業者にはわかるように、このような温度感受性のガスを形成するリポソームは、インビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）の温度の指示薬として用いることができる。
　固体及び液体造影増強剤を被包するリポソームも当該発明の範囲に含まれる。ここで用いる「固体造影増強剤」及び「液体造影増強剤」という用語は、それぞれ超音波に対してエコー源性である固体粒子物質、及び可溶性あるいは液体の物質を意味する。適当な固体造影増強剤は、いったん本開示を手にした当業者には自明であり、これには磁鉄鉱（Ｆｅ３Ｏ４）、ヨージパミドエチルエステルから形成した粒子及びイオン性ヨウ素化造影剤を計って入れた水に不溶性の誘導体を沈殿させることにより形成した粒子等の固体ヨウ素粒子が含まれる。適当な液体造影増強剤は、いったん本開示を手にした当業者には自明であり、これには可溶ヨウ素化造影剤が含まれる。後者は、血流を可視化する目的で血管内造影剤として用いるのが好ましいが、肝臓と脾臓の腫瘍を検知するのにも非常に効果的である。
　本開示を読んだ当業者にはわかるように、いくつかの固体及び液体造影増強剤はその場で（ｉｎ　ｓｉｔｕ）形成することができる。たとえば磁鉄鉱の場合、鉄の塩を低いｐＨ（たとえばｐＨ２）で被包して外部の溶液の外部ｐＨを高めることができる。そして酸化鉄が小胞内に沈殿して磁鉄鉱を形成する。小胞内への水酸化物イオンの輸送を容易にするために、バリノマイシン等のイオノフォアをリポソーム膜内に取り込む。これは、今回の場合は、ｐＨを低くするのではなくて高くすることをのぞいては、図１Ｄに示す状態と同様である。
　本発明に用いるリポソームは、従来のいろいろなリポソーム製造技術のいずれを用いても製造できる。当業者には自明なように、そのような従来技術には、音波処理、キレート透析、ホモジナイズ化、押出しと組み合わせた溶媒浸透、凍結−解凍押出し、微小乳化、さらにその他のものが含まれる。これらの技術は、その他のものも含めて、たとえば米国特許第４，７２８，５７８号、英国特許出願Ｇ．Ｂ．２１９３０９５Ａ、米国特許第４，７２８，５７５号、米国特許第４，７３７，３２３号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１、メイヤー（Ｍａｙｅｒ）ら、ビオケミカ　エ　ビオフィシカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）、ｖｏｌ．８５８、ｐｐ．１６１−１６８（１９８６）、ホープ（Ｈｏｐｅ）ら、ビオケミカ　エビオフィシカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）、ｖｏｌ．８１２、ｐｐ．５５−６５（１９８５）、米国特許第４，５３３，２５４号、マヘウ（Ｍａｈｅｗ）ら、メソッズ　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）ｖｏｌ．１４９、ｐｐ．６４−７７（１９８７）、マヘウ（Ｍａｈｅｗ）ら、ビオケミカ　エ　ビオフィシカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ）、Ｖｏｌ．７５、ｐｐ．１６９−１７４（１９８４）、そしてチェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、インベスティゲイティブ、ラディオロジィ（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ　Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．２２、ｐｐ．４７−５５（１９８７）、及びＵＳＳＮ第４２８，３３９号１９８９年１０月２７日登録の中で論じられている。以上の各外来特許、公報及び特許出願の開示は、そのすべてがここに引用されていることで組み込まれている。好ましい技術として、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８５／０１１６１又は１９８９年１０月２７日登録のＵＳＳＮ第４２８，３３９号が記述するものと同様の溶媒を用いないシステムが、リポソーム構成物の製造に用いられる。これらの方法にしたがえば、内部に気状前駆体又は固体あるいは液体造影増強剤を被包したリポソームを製造できる。
　本発明のリポソームを製造するのに用いてよい物質には、リポソームの構成に適当であることが当業者に知られているいずれの物質又はそれらの組み合わせも含まれる。用いる脂質は、天然又は合成起源のいずれでもよい。このような物質には、コレステロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、ホモファチジルイノシトール、リソ脂質、脂肪酸、スフィンゴミエリン、グリコスフィンゴリピド、グルコリピド、グリコリピド、スルファチド、エーテル及びエステル結合した脂肪酸を持つ脂質、重合可能な脂質及びそれらの組み合わせの如き脂質を含むが、それらに限定されない。当業者にはわかるように、リポソームは、従来技術を用いて、取り込まれるグリコリピド、複合炭水化物、タンパク質、又は合成ポリマーの不在又は存在下で合成できる。又、リポソームの表面を、当業者には自明の方法を用いて、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリマーで修飾してもよい。これを図２に示す。脂質又は組み合わせた脂質と脂質構造内に取り込まれる一緒にした物質が生理的に適当な条件下で２層状態を形成しなければならないという唯一の条件をのぞいて、どんな種類の脂質を用いてもよい。当業者にはわかるように、得られるリポソームの生体分布と浄化値特性を調節するためにリポソームの組成を変えてもよい。
　リポソーム膜内にイオノフォアを取り込むには、親油性のイオノフォアをただ脂質混合物に加えて、通常のやり方でリポソームを製造する。
　さらに、小胞のサイズは、濾過、音波処理、ホモジナイズ化、及び同様の方法を含むいろいろな方法によって、リポソームの生体分布と浄化値を調節するために調整できる。内部水性取り込み体積を増大するために、小胞を凍結と解凍の繰返しのサイクルで処理できる。
　本発明のリポソームは多様なサイズであってよいが、好ましくは約３０ナノメーターから約１０ミクロンの間の平均外径を持つ。当業者が知るように、小胞のサイズは生体分布に影響するので、異なったサイズの小胞が多様な目的のために選ばれる。たとえば血管内に用いるには、小胞のサイズは一般に平均外径にして大きくて約２ミクロン、そして一般に小さくて約３０ナノメーターである。２〜３ミクロンの範囲のサイズでは、小胞はその性質上、多層状である。この範囲内では、短い血管内半減期を有するリポソーマル造影剤のエコー源性を最大にするために、より大きな小胞、例えば、平均外径で約１から約２ミクロン、を選択する。環流等の持続的な血液プールイメージング用には、たとえば平均外径約１００ナノメーターないし数百ナノメーターの間のより小さい小胞が用いられる。肝臓等の器官の超音波増強をもたらして正常組織と腫瘍の識別を行なうためには、毛細管の穴を通過して肝臓に入り、肝による取り込みを増加させる平均外径約３０ｎｍと約１００ｎｍの間より小さい小胞を用いることができる。体腔のイメージングと非血管注射のためには、約２ないし約１０ミクロンの平均外径のより大きな小胞を用いて取り込まれた気体のエコー源性を最大にすることができる。
　製剤に用いる脂質は個々の診断に用いるのに最適であり、毒性を最小にして、生成物の保存性を最大にするように選択する。ホスファチジルコリンとコレステロールから成る中性小胞は、ガス、磁鉄鉱、固体ヨウ素粒子及び可溶性ヨウ素化造影剤を取り込む血管内造影剤として非常によく機能する。細網内皮系（ＲＥＳ）等の細胞による取り込みを向上させるために、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン又は同様な物質等の陰性に電荷した脂質を加える。血液プールの半減期を長くするために、ジパミトイルホスファチジルコリン等の生体温度でゲル状である高度に飽和した脂質を用いる。さらに大きな小胞の安定性と血液プール半減期の延長のためには、重合可能な脂質を用いてリポソームを重合させたり、又は血清タンパク質から小胞の表面を保護するようにポリエチレングリコール等のポリマーで小胞の表面をコートしたり、又はＧＭ１等のガングリオシドを脂質構造内部に取り込むことができる。
　従来のプロトコールに従がって、ｐＨ活性化気状前駆体、光活性化気状前駆体、温度活性化気状前駆体及び／又は固体あるいは液体造影増強剤を、リポソームがその中で形成する媒質に加えることによって、リポソーム内に取り込むことができる。
　本発明のリポソームは超音波イメージングに有用である。
　さらなる実施例において、本発明は、リポソームの内部空間内にガスを被包する新規な装置と方法から成る。このように生成したリポソームは又、超音波イメージングに有用である。
　一般的に言って、本発明の装置を用いて方法を実行する際に、リポソームを容器に加えて、次に容器をガスで加圧する。加圧下に、ガスは溶液に入り込んでリポソーム膜を通過する。圧力を放出すると、ガス泡がリポソーム内で形成する。図３に本発明の一般的加圧と減圧の状態を示す。
　本発明の加圧装置を用いて加圧方法を実施する際に、膜の一部としてステロールを含まないリポソームを用いるのが好ましい。リポソーム膜内にコレステロール等のステロールが存在すると、特に、かなりの量、つまり体積にして膜の約５％以上存在すると、リポソーム膜を通過する二酸化炭素等のある種の可溶性ガスの流れをほとんど阻害する傾向がある。又、膜が多く飽和脂質から成る場合、すなわち約８０％以上が飽和脂質の場合、二酸化炭素等のある種の可溶性ガスの流れをやはりほとんど阻害する。
　リポソームは、加圧容器内に入れる前に前もって大きさをそろえてもよいし、そうしなくてもよい。前もって大きさをそろえる場合、音波処理、ゲル濾過、ポリスチレン又はポリカルボネートフィルター、あるいは他の適当な物質のフィルターを通過させる濾過フレンチプレス又は微小乳化法を含めたいろいろな手段でこれを行なうことができるが、これら手段に制限されるものではない。
　図４に、内部にガスを被包したリポソームの合成用装置を示す。この装置は、本質的には、ソーダ　サイフォン　ボトル（ｓｏｄａ　ｓｅｌｔｚｅｒ　ｂｏｔｔｌｅ）に手を加えたものである。この装置は、リポソームを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液の如き液体媒質を容器１内に入れて用いる。通常、リポソームは、卵ホスファチジルコリンから成るが、前記のように、リポソームの製造に他の脂質を用いてもよい。次にキャップ１０を容器口１１にねじこんで圧力密閉する。二酸化炭素等のガス又はガスを組み合わせたものを含むカートリッジ９を導入口８にはめ込んで容器を加圧する。容器はガラスやアクリル等のどのような適当な材質で作ることもできるし、望ましければ使いすてにしてもよい。容器１内に取り付けられた好ましくはポリエチレンチューブであるチューブの上端６に、カートリッジは内容物を排出する。ガス流はチューブを通って、チューブの下端４に出てくる。次のガスは、液体媒質中を上向に発泡して、少なくともガスの一部がこの液体媒質に溶解するようにする。一般に、この加圧装置、他の加圧装置、そしてここに開示される方法において、ガス圧は、約２乃至約４００ｐｓｉの間である。好ましい実施例において、容器を５０〜１２０ｐｓｉの範囲内で加圧する。この範囲内では、窒素等のある種のガスに対しては一般により高圧が好ましく、二酸化炭素等の他のものに対しては徐々の低い圧力が要求される。必要ならば、さらにカートリッジを用いてもよい。圧力計２９は容器内圧力を示す。
　リポソーム膜は加圧ガスに対して透過性がある。したがって、ガスが液体媒質中で発泡すると、溶解したガスの一部がリポソームの内部水性環境内に被包される。液体へのガスの溶解を高めるために、ガスと液体の混合をよく行なうことが望ましいが、これには液体内でガスを発泡させることが役立つ。好ましい実施例においては、この混合を、容器内側に突出した突出状底部２を有する容器を用いてさらに高める。チューブ下端は、突出状底部のもっとも内側の部分５に近いところでガスを放出する。
　ガスを容器１に導入した後、そこから液体を吐出して容器を減圧する。吐出は、キャップ１０の排出レバー１２を働らかせて行なう。排出レバーを操作すると排出口７が開いて、ガス圧で液体はチューブ３の下端側４に入って、チューブを上方へ流れて、排出口から容器外へ出る。チューブを通して液体を押し出すと、さらにガスと液体の混合が促進される。減圧すると、リポソームに被包された溶解したガスは溶液外に出てきて、リポソーム内で泡を形成し、そうして内部にガスを被包するリポソームを形成する。
　別の方法としては、前記の方法を図５に示す装置を用いて行なうこともできる。望ましいならば、リポソームをシリンジ３３から１つ以上のフィルター３０、導入／排出口３５そしてバルブ３９を通して、そして次にチューブ３８を通して容器３４に注入することによって、前もってサイズをそろえてもよい。もしくは、リポソームを単に容器３４に入れる。容器３４にはバルブ３９、導入／排出口３５、導入／排出口３６及びチューブ３８が取り付けられている。容器３４は、バルブ又は導入口３６と、ガス管、タンク又は使いすてカートリッジであってよい外部圧力源によって、二酸化炭素、酸素、窒素、キセノン、アルゴン、ネオン及びヘリウム等のガスあるいはこれらガスの組み合わせによって加圧できるように組み立てられている。バルブ３９は、リポソームを排出せずに余分な圧力を外に出すことができるように作るのがよい。容器はガラス又はアクリル等のどのような適当な材質で作ってもよいし、望ましければ使いすてであってもよい。
　使用時には、まず、リポソームを含んだ溶液を、望ましければフィルター３０をつけた、又はつけないシリンジ３３を用いて容器３４に入れる。次に、ガスを導入口３６を通し、バルブ３９及びチューブ３８を通して容器３４に入れる外部圧力源３７を用いて、容器をガスで加圧する。加圧下に、ガスは溶液に入りこんでリポソーム膜を通過する。圧力をゆるめると、リポソーム内でガス泡が形成する。圧力容器３４には、１つ以上のフィルター３０を付けることのできる導入／排出口３５がついている。図５で、圧力容器３４、フィルター３０及びシリンジ３３を連結する手段の例として、ルアー（Ｌｕｅｒ）ロックフィッティング３１及び３２の使用を示す。しかし、装置を結合するどのような適当な手段を用いてもよい。適当なフィルターの径のサイズは約０．０１５ミクロンと約１０ミクロンの間で大きく変わり得る。望ましいならば、１つ以上のフィルターを一連の接続において用いてよい。フィルター３０の役目は３つある。：ガス被包リポソーム調製後にリポソーム外部に形成したすべての泡のデキャビテーションを促進すること；ガスの被包の前又は後のいずれかのリポソームの大きさをそろえるのを促進すること；及び懸濁液から非リポソーム固体を取り除くこと。さらに、フィルター３０をシリンジ３３に連結してもよい。容器にリポソームをつめるとき、シリンジ３３からフィルター３０と導入／排出口３５とバルブ３９を通して圧力容易３４内に導入してもよい。さらに、容器３４の内容物を、容器の排出バルブ３５によって放出する時、この排出流をフィルター３０を通してシリンジ３３内に導びいてよい。望ましければ、導入／排出口３５とバルブ３９、フィルター３０及び／又はシリンジ３３を通さずに、容器３４に直接入れたり出したりしてもよい。この方法の利点は、装置を独立型のすぐに使用できる滅菌ユニットとして前もってパッケージできることである。フィルター又はシリンジのどちらも前述のように用いる必要がないこと、たとえば、装置の排出流を、たとえば注射用シリンジ内へ取り入れる前に分離したコンテナに直接に導入してもよいということも又、注意すべきことである。
　又、前述の方法は、図６に示す装置を用いて行なえるが、ここではリポソームを含んだ液体媒質を入れた容器１３に、導入口１４を通してガスが入り、チューブ１５を通って流れて容器の底部内へ排出する。容器はガラス又はアクリル等のどんな適当な材質で構成してもよく、望ましければ使いすてにしてもよい。容器の底からガスが液体中を上方へ発泡する。排出口１６についている不図示のバルブをあけて減圧を行なうと、チューブ１７を通って容器の底から液体が吐出する。
　図７について述べると、このような方法を行なうのに必要な装置は、リポソームを導入してガスを加圧して排出するための口２８がついた簡単な容器２７でありさえすればよい。容器はガラスやアクリル等のいずれの適当な材質で作ってもよく、望ましければ使いすてでもよい。
　発明者らは、二酸化炭素等のあるガスについては、ガスを溶解するためにガスを液体中で発泡させるのが役立つということを発見した。又、窒素等のあるガスについては、液体をおよそ１−４刧の範囲に冷却するとよい。加圧を行なう場合、約２乃至約４００ｐｓｉの間の圧力、好ましくは約３０乃至約１００ｐｓｉの圧力を用いるべきである。又、発明者らは、減圧を数秒以下かけてすばやく行なうのが好ましいことを発見した。
　前記方法は、ガスに対し比較的透過性である膜を持つリポソームに対する使用に特に適用されるということに注意すべきである。しかし、発明者らは、リポソームを含む液体媒質を後述のように高周波数音波にあてることにより、比較的不透過性の膜構成を容易に利用できることを見い出した。一般に、そして前述のように、かなりの量のステロールから成るか大部分が飽和脂質から成る膜は、二酸化炭素等のある種のガスに対し比較的不透過性であるが、たとえば卵ホスファチジルコリンは非常に透過性である。
　図８に音波処理を用いるガスを含有したリポソーム合成用の装置を示す。この装置は、リポソームを含んだ液体媒質を容器１８に入れて用いる。高周波音波発生器２５、これはヒートシステム−ウルトラソニックス社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍ−Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）から入手できるソニケーター（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）（ｃｒ）であってもよいが、を容器の導入口と発生器の外側に形成したあわせネジ２４を用いて容器に取り付ける。次にガス口２２から導入したガスを用いて容器を加圧する。好ましい実施例においては、容器を約３０ないし約１２０ｐｓｉに二酸化炭素等のガスを用いて加圧し、およそ１〜４刧の範囲に冷却してガスが液体媒質に溶解するのを促進する。音波処理を行なうあいだ好ましくは約１刧から約４刧の間に液体温度を保つために導入及び排出口２０、２１をそれぞれ介して液体あるいは気状の冷却材２６がその中を循環するチャンバー１９で包まれた容器を以下に説明する。
　音波発生機２５は圧電結晶を振動させることにより、電気エネルギーを、周波数およそ２０ＫＨＺで振幅およそ３０〜１２０μｍの範囲の機械的エネルギーに変換する。これらの振動は容器１８内に延びるホーン（ｈｏｒｎ）２３を通して液体内に伝わり集中して、液体中を伝わる高周波音波を生じる。音波は液体中にキャビテーション、すなわち、微小泡の高周波数の形成と崩壊を生じる。高周波音波によるキャビテーションの誘発方法は、音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）と呼ばれる。キャビテーションは液体中に切断と破断作用を引き起こして、大きな多層のリポソームを裂いてより小さい二層リポソームに再構成し、最後には、音波処理の接続時間と強度に従がって、単層リポソームが生じる。リポソームが壊れて再構成するとき、その内部水性核内に溶解したガスが被包される。
　音波処理後、容器を減圧して被包したガスが泡を形成すると、前述のようにリポソームがガス含有リポソームに変わる。しかし、音波処理によってリポソームが壊れている間にガスがリポソーム内に導入されるので、比較的不透過性の膜を有するリポソームを使うことができる。このような膜を用いることにより、安定性においてさらに利点を得られる、すなわち、ガス泡は他の方法や膜の様に容易に膜を通過して発散してもどらない。したがって、音波処理方法は、より安定なガス含有リポソームの形成を可能にする。発明者らは、一般にコレステロールをベースにしたリポソーム膜が比較的不透過性であることを発見した。音波処理に加えて、内部にガスを被包したリポソームを合成するのに用いることができる他の技術には、微小乳化、押出し、微小流動化、ホモジナイズ化、その他が含まれるが、必要なのは合成過程が加圧下に、好ましくは低温で行なわれることである。
　ガス含有リポソーム製造用の前記各方法において、リポソーム製造物は好ましくは溶液中にガスを伴なって加圧下に保存するか、又はガスの加圧と減圧工程を使用時又はほぼ使用時に行なう。
　本発明のリポソーム及び本発明の装置と方法で製造したリポソームは、超音波を用いた患者のイメージングに有用である。本発明は一般に患者のイメージング、及び／又は特に患者の疾患組織の存在の診断に有用である。患者はあらゆる種の哺乳類であってよいが、最っとも好ましくはヒトである。本発明の方法は血管系、すなわち、動脈系、静脈系及び心臓の診断に特に有用である。これは又、患者の肝臓、脾臓又は腎臓のイメージを与えるのに特に有用である。
　本発明のイメージング方法を行なうには、本発明のリポソーム、すなわち、内部にｐＨ活性化気状前駆体を被包したイオノフォア含有リポソーム、内部に光活性化気状前駆体を被包したリポソーム、内部に温度活性化気状前駆体を被包したリポソーム、及び／又は固体又は液体造影増強剤を内部に被包したリポソームから成る群から選んだリポソームを、患者に投与した後、患者の内部領域及び／又はその領域内のあらゆる疾患組織の物理的（ｐｈｙｓｉｃｏｌ）イメージを得るために超音波イメージングを用いて患者をスキャンすればよい。患者の領域とは、患者全体又は患者の特定の区域（ａｒｅａ）あるいは部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）を意味する。
　本発明を実施する際にいろいろなタイプの超音波イメージング装置のどれを用いてもよく、特定のタイプ又はモデルの装置は本発明の方法に重要な意味を持つのではない。
　血管内に用いる場合、一般に造影剤を静脈内に注射するが、動脈内に注射してもよい。注射を行なうと、超音波スキャナーによって超音波イメージが得られる。血管内注射の場合、リポソームの造影剤は一般に、約２ないし約３ミクロンより小さい（肺循環を通過するほど十分に小さい）平均外径を持つ。他の非血管の適用において、リポソームの造影剤を直接にスキャンする領域、たとえば洞管又は子宮腔等の部位に注射してファロピアン（ｆａｌｌｏｐｉａｎ）等の開放を調べることができる。非血管注射の場合、リポソームの造影剤の直径は、肺微小血管を通過する必要性によって制限されない。したがって、より大きいリポソームを用いてエコー源性を最大にすることができる。
　本発明のリポソームを投与するとき、服用量は通常低いレベルからはじめて、患者に望ましい造影増強が得られるまでふやしてゆく。本発明の方法を行なうとき、リポソームを単独で、それぞれ他のものと組み合わせて、あるいは他の診断用及び／又は治療用薬剤と組み合わせて用いることができる。好ましい投与経路は、当業者には自明である。当業者にはわかるように、服用量や好ましい投与経路等の特質は、年齢、体重、診断する哺乳類、使用する特定のタイプのリポソーム、そしてもっとも重要なものとして、スキャンする患者の特定の領域によって変わってくる。
　以下の実施例は単に本発明を説明するものであって、どんな意味でもこの発明の範囲を制限するものと考えてはならない。これらの実施例及びそれと同様なものは、本開示とそれに付した請求項を考慮すると、この分野に通じる者にはいっそう明らかになるであろう。
実施例
実施例１
　卵ホスファチジルコリン１グラムを室温で生理食塩水１００ｃｃ中に懸濁して多層リポソーム小胞の分散系を形成した。次にリポソームを図５の容器に入れた。次に容器の排出バルブを密閉して系を３０ないし５０ｐｓｉのＣＯ２ガスで加圧した。次に懸濁液をフラスコにあけて被包されないＣＯ２ガスをにがした。小胞内に取り込まれたＣＯ２ガスは取り込まれたままだった。驚くべきことに、ガスをつめた小胞は浮かばずに溶液中に均等に分布した。得られたガスをつめたリポソームは超音波に対し強度にエコー源性であることがわかった。
実施例２
　小胞形成を炭酸水素塩とイオノフォアＡ２３１８７の存在下に行なって、イオノフォアを含む炭酸水素塩で被包したリポソームを生じるということを除いて、実施例１で述べたように小胞を形成した。小胞内のｐＨを低下させるために外部水性相に酸を加えた。小胞内に取り込まれた炭酸水素塩はＣＯ２ガスと水を形成することがわかった。
実施例３〜１８
Ａ．リポソームの調製
　多層小胞（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＬＶ’ｓ）を調製するために、アバンチ　ポーラー　リピズ（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ）（バーミンガム（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）、アラバマ（Ａｌａｂａｍａ））から入手した純粋な卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）をリン酸で緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁して、手で攪拌した。他の場合では、特定のサイズの小胞を前もって凍結−解凍過程をともなって、又はともなわずに、押出しの方法で調製した。２つの異なった脂質混合物、純粋なＥＰＣ又は８０モルパーセントのＥＰＣと２０モルパーセントのコレステロールの混合物、を試験した。通常ＥＰＣ／コレステロール小胞については、２５０ｍｌ丸底フラスコの中で３．６ｍｍｏｌ（２．８３ｇ）のＥＰＣと１．２ｍｍｏｌ（０．４８ｇ）のコレステロールを一緒に最小容積のクロロホルムに溶解する。減圧下に回転蒸発させてクロロホルムを取り除きフラスコ壁に薄膜を残した；次に内容物を減圧下（０．１ｍｍＨｇ未満）に少なくとも２時間保って残りの溶媒を取り除いた。純粋なＥＰＣ混合物に関しては、クロロホルムへの懸濁工程を省略した。純粋なＥＰＣと乾燥したＥＰＣ／コレステロールの膜の両方について、脂質を激しく攪拌して中性ｐＨに緩衝した生理食塩水（ＰＢＳ）２０ｃｃに分散させた。
　凍結−解凍して調製した小胞としないで調製した小胞の両方を合成した。凍結−解凍した小胞については、分散時に形成した多層小胞を凍結バイアルに移した後に、液体窒素中で凍結冷却した。その後、凍結バイアルを脂質懸濁液が完全に解凍するまで温水につけた。この凍結と解凍のサイクルをさらに４回繰返した。次に凍結−解凍した小胞と凍結−解凍しない小胞の両方を窒素圧力下（およそ１００ｐｓｉ）に押出し機（リペックス　バイオメンブレンズ（Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ）、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア、カナダ）を用いて２枚重ねた２ミクロンのフィルター（ヌクレオポア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）、プレストン、カリフォルニア）を１０回通過させて大きさをそろえた。この大きさをそろえた調製物の一部を今度は２枚重ねた０．４ミクロンのフィルターに１０回通して、次にこの一部を０．２ミクロンのフィルターにさらに１０回通して、最終的に、この一部を０．０３０ミクロンのフィルターに１０回通した。前記をＥＰＣ／コレステロール小胞に行なったが、純粋なＥＰＣから成る小胞に対しては、０．４及び０．２ミクロンのサイズのフィルターだけをテストした。得られた小胞のサイズをニコンプ（Ｎｉｃｏｍｐ）（ゴレタ、カリフォルニア）モデル２７０粒子粒度計を用いて、標準的キュミュラント分析によって６３４．２ｎｍで操作を行なって準弾性光散乱により決定した。
Ｂ．加圧
　リポソーム溶液及びＰＢＳのコントロールの加圧は、二酸化炭素カートリッジを用いたソーダサイフォンボトル（図４）を用いて行なった。すべての実施例において、リポソーム及びコントロールの希釈には脱気したＰＢＳ溶液のみを用いた。すべての液体は用いる直前に脱気した。溶液の脱気は、真空下に減圧して行なった。すべての溶液の加圧の際には、５０ｃｃの液体をサイホンボトルに注ぎ入れてから系を密閉した。次にＣＯ２カートリッジをボトルにはめ込んで加圧を実行した。１分後、容器の圧力をゆるめて、溶液をボトルから注ぎ出した。サイホンボトルには圧力計が付いていて、各実施例を行なう間圧力を測定した。ガス化を行なった溶液には、異なった大きさのリポソームと純粋なＰＢＳの様々な希釈物が含まれていた。
Ｃ．超音波イメージング
　超音波イメージングを、７．５メガヘルツリニアアレイトランスデューサーを用いてアクソン（Ａｃｕｓｏｎ）１２８スキャナー（ミルピタス、カリフォルニア）で行なった。後処理したものの関数は前処理したものと０にセットして２に持続してリニアな関係だった。種々の濃度で一定の容積と深さのファントム（ｐｈａｎｔｏｍ）溶液（コントロール及びリポソーム剤）を薄いプラスチック容器に入れて３０ないし６０ｄＢの利得となるようにセットしてスキャンした。フレーム率が減少したマルチフォーカルゾーンをほとんどのイメージに用いた。定量測定のために、トランスデューサーの２ｃｍ下方の位置に、イメージ上に１ｃｍの円を位置させて、円内部の反射数を計数した。音の反射を測定する際に、造影剤とコントロールのどちらが調べられているのかに関する情報を超音波技術者が知らないようにした。
Ｄ．結果
　得られた小胞の大きさとそれらの超音波に対するエコー源性を表ＩとＩＩに示す。小胞のサイズは押出し工程で用いたフィルターで調整する。押出しをしないで調製したＭＬＶ’ｓでは、大きさの範囲が非常に様々である。押出し工程を行なった小胞については、大きさの範囲がかなり狭い。
異なった造影剤を含むファントムの超音波イメージング実験では、超音波造影剤を加圧してからプラスチックのファントム皿に注いだ後、はじめの１分又は２分間３０ｄＢで大きな反射が見られた。これらの大きな反射は、しかし、すぐに衰えて、数分後には見えなかった。最初の２ないし３分間を経過して持続する反射は、もっとずっと小さいサイズのものであり、現われ方がより規則的だった。
　異なった溶液における直径１ｃｍの円内で計数した反射の数の時間経過を表ＩとＩＩに示す。押出しを行なったが凍結−解凍せずに合成した純粋なＥＰＣから成る０．４ミクロンの小胞は、加圧を行なった後に最大のエコー源性を持ち、エコー源性は加圧工程後２時間持続した。加圧を行なわない同じくらいの濃度の同一な小胞を含むファントムを比較すると、ファントムに注ぎ入れた後３０分たって、全く内部エコーがなかった。純粋ＥＰＣで合成したＭＶＬ’ｓは、次に高いエコー源性を有していた。コレステロールを含むすべての小胞は、純粋なＥＰＣから成る小胞より低いエコー源性を有していた。加圧を行なったがリポソームを含まないＰＢＳのコントロール溶液は、最初の１分又は２分間エコーを有していたが、数分後にはこれらのエコーは急速に衰えてゼロになった（表ＩＩ）。
　押出しをしたが凍結−解凍しなかった純粋なＥＰＣから成る０．４ミクロンの小胞において、最大のエコー源性が見られた。凍結−解凍した同じサイズの小胞はより小さいエコー源性であった。このサイズの凍結−解凍を行なわない小胞が二層であるのに対して、このサイズの凍結−解凍を行なった小胞は単層である。
　　＊上記のデータは、イメージ上のトランスデューサーから２ｃｍの位置にある直径１ｃｍの円内の反射の数を計数したものであって、７．５ｍＨｚリニアアレイトランスデューサーを用いて超音波造影剤の溶液４００ｃｃをスキャンして得た。実施例３から６までのリポソームは、５２ないし５４ｐｓｉのＣＯ２ガスで加圧した。実施例３、４及び５のリポソームは、明記したようにフィルターを１０回通して押出ししており、実施例４と５では、つづいてリポソームを凍結−解凍の５サイクルにかけたが、実施例３ではイオノフォアを凍結−解凍しなかった。実施例６のリポソームは、単に卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）を混合しただけで調製した多層小胞（ＭＬＶ’ｓ）に関わる。実施例７のリポソームはさらに高い９４ｐｓｉの圧力をかけた。実施例８と９のリポソームは小胞のコントロール試料であり、実施例８のものはＭＬＶ’ｓに関わり、実施例９のものはガス処理しない（凍結−解凍しない）０．４μの小胞である。実施例１０において、試料は、ガス処理しないリン酸で緩衝した正常食塩水（ＰＢＳ）である。すべての小胞調製物において、最終脂質濃度は１．２５マイクロモル／ｍｌである。符号（−）は反射の数が測定されなかったことを示す。
　　＊上記において脂質濃度は、１ｍｌあたり脂質０．２２５マイクロモルである。実施例１２と１３のリポソームは純粋なＥＰＣであり、実施例１３のリポソームはＭＬＶ’ｓであるのは表Ｉのとおりであり、実施例１２のリポソームは表１の実施例５で用いたものを希釈したものである。実施例１２、１４、１５及び１６は、明記したような径の大きさのフィルターを通して押出しにより生じたものであり、実施例１４、１５及び１６は８０％ＥＰＣ／２０％コレステロールを含む。
　以上のように本発明を説明してきたので、生体分布やイメージングに関して望ましい効果を得るためにリポソームのサイズや膜組成等の種々な特質を選択することは当業者には明らかであろう。
　以上の説明によって当業者には、ここに示したり説明したものに加えて、本発明の様々な改修は明らかであろう。そのような改修も又、添付の請求の範囲に入るものとする。