(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体であって、前記変異体の配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とし、前記変異体がｅＮＯＳの活性及び／又はＮＯの産生を増大させる活性を有する、前記変異体を含む医薬組成物であって、（ｉ）動脈性高血圧（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、炎症性疾患、及び静脈不全から選択される病状の予防、リスクの低減、改善若しくは処置における；又は（ｉｉ）筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善のための、若しくは血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤としての、使用のための前記医薬組成物。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を特定の臓器又は組織を標的とさせるのに有用な配列と連結した、請求項１又は２に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体のアミノ酸配列から成る配列を有するタンパク質を含む、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体であって、前記変異体の配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とし、前記変異体がｅＮＯＳの活性及び／又はＮＯの産生を増大させる活性を有する、前記変異体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む医薬組成物であって、（ｉ）動脈性高血圧（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、炎症性疾患、及び静脈不全から選択される病状の予防、リスクの低減、改善若しくは処置における；又は（ｉｉ）筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善のための、若しくは血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤としての、使用のための前記医薬組成物。
【請求項５】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体であって、前記変異体の配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とし、前記変異体がｅＮＯＳの活性及び／又はＮＯの産生を増大させる活性を有する、前記変異体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであって、機能可能なように発現制御配列に連結された前記ポリヌクレオチドを含むベクターを含む医薬組成物であって、（ｉ）動脈性高血圧（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、炎症性疾患、及び静脈不全から選択される病状の予防、リスクの低減、改善又は処置における；又は（ｉｉ）筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善のための、若しくは血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤としての、使用のための前記医薬組成物。
【請求項６】
ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体が、ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を特定の臓器又は組織を標的とさせるのに有用な配列と連結した、請求項５又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ベクターが、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １のバリン２２９、トレオニン２８１、フェニルアラニン４８８及びトレオニン４９４をコードするヌクレオチドを含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ベクターが、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ベクターがウイルスベクターである、請求項５〜９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ベクターがＡＡＶ血清型１−９ベクターから選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体の使用であって、前記変異体の配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とし、そして前記変異体がｅＮＯＳの活性及び／又はＮＯの産生を増大させる活性を有する、（ｉ）動脈性高血圧（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、炎症性疾患、及び静脈不全から選択される病状の予防、リスクの低減、改善若しくは処置；又は（ｉｉ）筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善、若しくは血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤として、のための医薬品の製造における、前記タンパク質変異体の使用。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドの使用であって、前記変異体の配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とし、そして前記変異体がｅＮＯＳの活性及び／又はＮＯの産生を増大させる活性を有する、（ｉ）動脈性高血圧（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、炎症性疾患、及び静脈不全から選択される病状の予防、リスクの低減、改善若しくは処置；又は（ｉｉ）筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善、若しくは血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤として、のための医薬品の製造における、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項１５】
ＳＥＱ ＩＤＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの使用であって、前記変異体の配列が、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とし、そして前記変異体がｅＮＯＳの活性及び／又はＮＯの産生を増大させる活性を有する、（ｉ）動脈性高血圧（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、炎症性疾患、及び静脈不全から選択される病状の予防、リスクの低減、改善若しくは処置；又は（ｉｉ）筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善、若しくは血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤として、のための医薬品の製造における、前記タンパク質変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野.
本発明は、ＢＰＩＦＢ４タンパク質（Bactericidal/Permeability increasing protein family B, member 4）の変異体（variant）、並びに、正常に機能しなくなったｅＮＯＳ及びＮＯが仲介する血管拡張（vasodilatation）が原因の、内皮機能不全（endothelial dysfunction）に関連している病状の処置のためのその使用、に関する
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ヒトＢＰＩＦＢ４（Ｃ２０ｏｒｆ１８６、ＲＹ２Ｇ５又はＬＰＬＵＮＣ４としても知られている）は、ＢＰＩ／ＬＢＰ／ＰＬＵＮＣ様タンパク質ファミリーの分泌タンパク質メンバーであり、バクテリアに対する宿主の防衛プロセスに関わっている。該タンパク質は、５７５（アクセッション番号Ｐ−５９８２７−２）及び６１３（アクセッション番号ＥＡＷ７６３３７．１）のアミノ酸配列を持つ長さの異なる二つの異なるアイソフォームとして存在する（Bingle CD et al., Biochem Soc Trans. (2011) 39 (4): 977-83; Andrault J.-B et al, Genomics (2003) 82: 172-184; Bingle C.D et al., Hum. Mol. Genet. (2002) 11: 937-943; Bingle C.D et al, Protein Sci. (2004) 13:422-430）。
【０００３】
複数の一塩基多型が、５７５アミノ酸配列への参照で示される以下の部位（ｒｓ２０７０３２５−Ｉｌｅ１２２９Ｖａｌ、ｒｓ５７１３９１−Ａｓｎ２８１Ｔｈｒ、ｒｓ７５８３５２９Ｐｈｅ４８８Ｌｅｕ及びｒｓ２８５０９７−Ｔｈｒ４９４Ｉｌｅ）で、このタンパク質について報告されており、該タンパク質の複数の異なる変異体の生成をもたらしている可能性がある。本発明者らは、複数のＢＰＩＦＢ４の変異体を同定し、特性を明らかにしている。上記の四つの一塩基多型のハプロタイプフェーズ（すなわち、アリルの組合せ）の注意深い解析の後、本発明者らは、最もよく起こるハプロタイプ（解析された染色体の６５％）がＩｌｅ２２９／Ａｓｎ２８１／Ｌｅｕ４８８／Ｉｌｅ４９４（ＩＮＬＩ）のアミノ酸をコードするＡＡＣＴの組合せであり、２番目に頻度の高いハプロタイプがＶａｌ２２９／Ｔｈｒ２８１／Ｐｈｅ４８８／Ｔｈｒ４９４（ＶＴＦＴ）のアミノ酸をコードするＧＣＴＣ（３０％の染色体がこのハプロタイプを包含する）の組合せであり、そしてＩｌｅ２２９／Ａｓｎ２８１／Ｐｈｅ４８８／Ｔｈｒ４９４（ＩＮＦＴ）をコードするＡＡＴＣの組合せは、白色人種（Caucasian）のヒト染色体の２％に現われるにすぎない。
【０００４】
血管の内皮は血管腔と血管の平滑筋細胞の間に位置する細胞の層によって形成される。これらの細胞は、継続的に一酸化窒素（ＮＯ）（血管内皮型の一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）によって合成される可溶性ガス）を産生する。この物質は、血管緊張の調節、局所の細胞増殖の制御、並びに、血液を循環する血小板及び細胞による傷害性の結果からの血管の保護などの血管のホメオオスタシス（homeostasis）及び内皮機能において重要な役割を有している。
【０００５】
ｅＮＯＳによる合成が正常に機能しなくなったか又は過度の酸化的分解のどちらかが原因の、動脈壁による一酸化窒素の放出の減少に、ますます多くの病態が関連付けられてきている（American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism 2012 Mar 1; 302(5) and Current Vascular Pharmacology 2012 Jan; 10(1): pages 4-18）。これらの病態の大部分は、加齢と関連している。例えば、一酸化窒素シグナリングの障害は、冠攣縮性狭心症（coronary spastic angina）（Miyamoto Y et al. Hum Mol Genet. 2000 Nov 1; 9(18): pages 2629-37）、血栓症（thrombosis）（Losclzo J, Circulation Research. 2001; 88, pages 756-762）、肺高血圧症（Pulmonary hypertensition）（D’Uscio LD., Cardiovasc Res 2011, 92 (3), pages 359-360）、子癇前症（pre-eclampsia）（The Lancet, Volume 361, 9368, Pages 1511-1517）、脈管炎（vasculites）（Kanwar JR et al., Curr Med Chem. 2009; 16(19): 2373-2394）、癌（cancer）（Kanwar JR et al. Curr Med Chem. 2009; 16(19): pages 2373-2394）、炎症性疾患（inflammatory disorders）（Kanwar JR et al., Curr Med Chem. 2009; 16(19): pages 2373-2394）、静脈不全（venus insufficiency）（Forstermann U et al. Circulation. 2006; 113: pages 1708-1714）、ｅＮＯＳの活性及びＮＯの産生が減少する遺伝病（genetic diseases）、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子の変異（Lemarie CA et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol 2011, vol. 300: H745-53）、動脈性高血圧（症）（arterial hypertension)（Sparacino-Watkins CE et al, Circulation., 2012; vol 125(23), pages 2824-6; Boger RH et al, Circulation. 2009, vol 119(12), pages 1592-600）、アテローム性動脈硬化（症）（atherosclerosis）、（真正）糖尿病（diabetes mellitus）、脂質異常症（dyslipidemia）、腎不全（renal failure）（Jiang B et al, Hum Gene Ther. 2012; 23(11), pages 1166-75 Ponnuswamy Pet al. PLoS One. 2012; 7(1):e30193; Vita JA et al, Circulation. 2011, Vol 124(25), pages 906-12; Li ZL et al., PLoS One. 2012, Vol 7(6):e38787）、メタボリック・シンドローム（metabolic syndrome）（Quyyumi AA et al., Circulation. 1995, Vol 92: pages 320-326）、脳卒中（stroke）（Madden JA., Neurology. 2012 Sep 25; 79(13 Suppl 1):S58-62）、心筋梗塞（症）（myocardial Infarction）（Nakata S et al, Circulation. 2008 Apr 29; Vol 117(17): pages 2211-23）、勃起機能不全（erectile dysfunction）（Bianca Rd et., PLoS One. 2012, Vol 7(2):e31019）、神経変性病（neurodegenerative diseases）及び多発性硬化（症）（multiple sclerosis）（Faraci FM., Circulation Research. 2006, Volume 99, pages 1029-1030; Wu M, et al, Glia. 2009, Vol 57(11), pages 1204-15）、認知障害（cognitive disorders）（Rayatnia et al, Eur J Pharmacol. 2011, Vol 666(1-3), pages 122-30; Paydar et al, Brain Res. 2011; Vol 1386, pages 89-99）、網膜変性（retinal degeneration）、ぶどう膜網膜炎（uveoretinitis）、血管性網膜症（vascular retinopathy）、白内障（cataract）及び緑内障（glaucoma）（Chiou g et al. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. April 2001, 17(2): pages 189-198, Li Q et al, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 Oct, 51(10):pages 5240-6, Kwak H J et al, Mol Cells. 2011 Oct 31; 12(2):pages 178-84）において、報告されている。
【０００６】
ＮＯの産生の減少及びその結果として起こる内皮機能における不均衡は、上記の病理的状態の原因である鍵となる要因の一つとして同定されている。したがって、内皮細胞からの一酸化窒素の放出を増進させることで、内皮機能不全を回復に向かわせる可能性のある治療の候補を同定するために、当技術分野において努力が重ねられてきている。
【０００７】
さらに、ｅＮＯＳの活性／ＮＯの産生の増大は、筋ジストロフィー患者における運動後の疲労において（Nature. 2008 Nov 27; 456, pages 511--515）、及び血管閉塞のためのステントの移植において（Sharif F, et al. Mol Ther. 2008 Oct; 16(10):pages 1674-80.）有益であることが論証されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Bingle C.D. et al., Biochem. Soc. Trans. (2011) 39 (4): 977-83
【非特許文献２】Andrault J.-B. et al., Genomics (2003) 82: 172-184
【非特許文献３】Bingle C.D. et al., Hum. Mol. Genet. (2002) 11: 937-943
【非特許文献４】Bingle C.D. et al., Protein Sci. (2004) 13: 422-430
【非特許文献５】Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. (2012, Mar 1) 302(5)
【非特許文献６】Curr. Vasc. Pharmacol. (2012, Jan) 10(1): 4-18
【非特許文献７】Miyamoto Y. et al., Hum. Mol. Genet. (2000) 9(18): 2629-37
【非特許文献８】Losclzo J, Circ. Res. (2001) 88: 756-762
【非特許文献９】D’Uscio L.D., Cardiovasc. Res. (2011) 92 (3): 359-360
【非特許文献１０】The Lancet 361(9368): 1511-1517
【非特許文献１１】Kanwar J.R. et al., Curr. Med. Chem. (2009) 16(19): 2373-2394
【非特許文献１２】Forstermann U. et al., Circulation (2006) 113: pages 1708-1714
【非特許文献１３】Lemarie C.A. et al., Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (2011) 300: H745-53
【非特許文献１４】Sparacino-Watkins C.E. et al., Circulation (2012) 125(23): 2824-2826
【非特許文献１５】Boger R.H. et al., Circulation (2009) 119(12): 1592-1600
【非特許文献１６】Jiang B. et al., Hum. Gene Ther. (2012) 23(11): 1166-75
【非特許文献１７】Ponnuswamy Pet et al., PLoS One (2012) 7(1):e30193
【非特許文献１８】Vita J.A. et al., Circulation (2011) 124(25): 906-12
【非特許文献１９】Li Z.L. et al., PLoS One (2012) 7(6): e38787
【非特許文献２０】Quyyumi A.A. et al., Circulation (1995) 92: 320-326
【非特許文献２１】Madden J.A., Neurology (2012) 79(13 Suppl 1): S58-62
【非特許文献２２】Nakata S. et al., Circulation (2008) 117(17): 2211-2223
【非特許文献２３】Bianca R.d. et al., PLoS One (2012) 7(2): e31019
【非特許文献２４】Faraci F.M., Circ. Res. (2006) 99: 1029-1030
【非特許文献２５】Wu M., et al., Glia (2009) 57(11): 1204-15
【非特許文献２６】Rayatnia et al., Eur. J. Pharmacol. (2011) 666(1-3): 122-30
【非特許文献２７】Paydar et al., Brain Res. (2011) 1386: 89-99
【非特許文献２８】Chiou G. et al., J. Ocul. Pharmacol. Ther. (2001) 17(2): 189-198
【非特許文献２９】Li Q. et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. (2010) 51(10): 5240-6
【非特許文献３０】Kwak H. J. et al., Mol. Cells (2011, Oct 31) 12(2): 178-84
【非特許文献３１】Nature (2008) 456: 511-515
【非特許文献３２】Sharif F., et al., Mol. Ther. (2008) 16(10): 1674-80
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、今回驚くべきことに、ＢＰＩＦＢ４タンパク質の特定の変異体が例外的な長寿に関連していることを同定している。本発明者らはさらに、同定された該変異体が、驚くべきことに内皮細胞におけるｅＮＯＳの活性及びＮＯの産生を増大させ得ることを発見している。これらの生物学的特性は、２２９、２８１、４８８及び４９４の位置の四つの特定のアミノ酸が該タンパク質中に存在することに依存しており、これらの位置のどれでも異なるアミノ酸に置換すると該タンパク質の活性の喪失につながる。
【００１０】
本発明の概要
よって、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質の変異体であるタンパク質を提供する。ここにおいて、前記配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含む。
【００１１】
アミノ酸配列における前記相同性は、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９９％である。
【００１２】
特に好ましい態様によれば、本発明のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列を有する。
【００１３】
別の好ましい態様によれば、本発明のタンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １に相当するアミノ酸配列を有しており、ここにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の２２９、２８１、４８８及び４９４の位置とは異なる位置の一つ以上のアミノ酸が、保存されているアミノ酸によって置換されている。「保存されているアミノ酸」とは、元のアミノ酸と機能的に同等の物理化学的特性を持つアミノ酸を意味する。
【００１４】
さらに、本発明は、上記のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、及び発現制御配列に機能可能なように連結された前記ポリヌクレオチドを包含するベクターを提供する。好ましい態様においては、前記ポリヌクレオチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２の配列を有する。
【００１５】
上記のベクターで形質転換されており、本発明のタンパク質を発現可能な宿主細胞も提供する。
【００１６】
本発明は、治療における使用のための、上記のタンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターも提供する。
【００１７】
具体的には、本発明の目的は、ｅＮＯＳの活性及び／若しくはＮＯの産生の減少が原因の内皮機能不全、又はｅＮＯＳの活性及び／若しくはＮＯの産生を増大させることが有益である病状若しくは状態の、予防、リスクの低減、改善及び／又は処置における使用のための、上記のタンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターである。好ましい態様によれば、上記のタンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターは、動脈性高血圧（症）、アテローム性動脈硬化（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）及び認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障及び緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、癌、炎症性疾患、静脈不全、ｅＮＯＳの活性及びＮＯの産生が減少する遺伝病、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子の変異、筋ジストロフィー患者における運動後の疲労から選択される病状若しくは状態の、予防、リスクの低減、改善又は処置における使用のためのものである。さらに好ましい態様によれば、上記のタンパク質、ポリヌクレオチド又はベクターは、血管閉塞のための一つ以上のステント（好ましくは薬剤の入った）の移植における補助剤としての使用のためのものである。
【００１８】
最後に、本発明は、医薬的に許容可能な担体及び賦形剤と組み合わせた本発明のタンパク質又はポリヌクレオチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明の他の特徴及び長所は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
図の簡潔な説明
【図１】図１は、実施例３で用いられたＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）をコードしているｐＲＫ５ベクターの配列を示す。ＢＰＩＦＢ４タンパク質の配列に下線を引いており、ＥＧＦＰの配列を斜体で示す。
【図２】図２は、実施例３における、ＩＮＦＴ ＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミド（左のパネル）又は対照の空のｐＲＫ５プラスミド（右のパネル）で生体外（ex vivo）で灌流された腸間膜血管（mesenteric vessels）における、緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein）の検出を示す。
【図３】図３は、空のベクター（ＥＶ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミドで灌流された腸間膜血管における、ＢＰＩＦＢ４タンパク質の発現及びｅＮＯＳの活性化を表す。パネルａは、７回のプールされた実験のウエスタンブロット及びＢＰＩＦＢ４（上）及びｐ−ｅＮＯＳ Ｓ１１７７（中）の検出を示す。パネルｂは、ＢＰＩＦＢ４の発現の定量を示しており、パネルｃはｅＮＯＳのセリン１１７７でのリン酸化の定量を示す。
【図４】図４、図５及び図６： パネル４ａ、５ａ、６ａは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ａ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ａ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ａ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、ＫＣｌで誘導された血管収縮（vasoconstriction）を表す。パネル４ｂ、５ｂ及び６ｂは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ｂ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ｂ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ｂ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、フェニレフリン（Phenylephrine）で誘導された血管収縮を表す。パネル４ｃ、５ｃ及び６ｃは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ｃ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ｃ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ｃ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、アセチルコリン（acetylcholine）で誘導された血管収縮を表す。灌流された腸間膜血管における、ＫＣｌで誘導された血管収縮、フェニレフリンで誘導された血管収縮又はアセチルコリンで誘導された血管収縮、において観察されたＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、ＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）、ＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）及びＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）をコードしているプラスミドで観察された結果は、空のベクターで得られた結果と重ね合わせることができる（データは示されていない）。
【図５】図４、図５及び図６： パネル４ａ、５ａ、６ａは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ａ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ａ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ａ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、ＫＣｌで誘導された血管収縮を表す。パネル４ｂ、５ｂ及び６ｂは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ｂ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ｂ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ｂ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、フェニレフリンで誘導された血管収縮を表す。パネル４ｃ、５ｃ及び６ｃは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ｃ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ｃ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ｃ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、アセチルコリンで誘導された血管収縮を表す。灌流された腸間膜血管における、ＫＣｌで誘導された血管収縮、フェニレフリンで誘導された血管収縮又はアセチルコリンで誘導された血管収縮、において観察されたＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、ＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）、ＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）及びＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）をコードしているプラスミドで観察された結果は、空のベクターで得られた結果と重ね合わせることができる（データは示されていない）。
【図６】図４、図５及び図６： パネル４ａ、５ａ、６ａは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ａ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ａ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ａ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、ＫＣｌで誘導された血管収縮を表す。パネル４ｂ、５ｂ及び６ｂは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ｂ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ｂ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ｂ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、フェニレフリンで誘導された血管収縮を表す。パネル４ｃ、５ｃ及び６ｃは、空のプラスミドのｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図４ｃ）、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＩＮＦＴ／図５ｃ）、又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図６ｃ）で生体外で灌流された腸間膜血管で実施例３において観察された、アセチルコリンで誘導された血管収縮を表す。灌流された腸間膜血管における、ＫＣｌで誘導された血管収縮、フェニレフリンで誘導された血管収縮又はアセチルコリンで誘導された血管収縮、において観察されたＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）、ＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）、ＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）及びＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）をコードしているプラスミドで観察された結果は、空のベクターで得られた結果と重ね合わせることができる（データは示されていない）。
【図７】図７及び図８: パネル７ａ及びパネル８ａは、アセチルコリンで誘導された、空のｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図７ａ）又は変異ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図７ａ）で生体外で灌流された血管の弛緩へのｅＮＯＳ阻害剤のＬ−ＮＡＭＥの影響を表す。パネル８ｂは、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素（methylenetetrahydrofolate reductase）ノックアウトマウス（Mthfr+/-）、対照マウス（Mthfr+/+）、及び、空のｐＲＫ５プラスミド（Mthfr+/--EV）（図７ｂ）又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫプラスミド（Mthfr+/--M）（図８ｂ）のどちらかで処置されたノックアウトマウスからの、管の血管弛緩の回復を表す。
【図８】図７及び図８: パネル７ａ及びパネル８ａは、アセチルコリンで誘導された、空のｐＲＫ５プラスミド（ＥＶ／図７ａ）又は変異ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫ５プラスミド（ＶＴＦＴ／図７ａ）で生体外で灌流された血管の弛緩へのｅＮＯＳ阻害剤のＬ−ＮＡＭＥの影響を表す。パネル８ｂは、メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素ノックアウトマウス（Mthfr+/-）、対照マウス（Mthfr+/+）、及び、空のｐＲＫ５プラスミド（Mthfr+/--EV）（図７ｂ）又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているｐＲＫプラスミド（Mthfr+/--M）（図８ｂ）のどちらかで処置されたノックアウトマウスからの、管の血管弛緩の回復を表す。
【図９】図９： パネルａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｈ２Ｏ２によってＢＰＩＦＢ４の発現が誘導されることを明示しているＲＴ−ＰＣＲを示す。パネルｂは、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＶＴＦＴ）及びＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を過剰発現している細胞（ＩＮＦＴ）、又は空のベクター（ＥＶ）に曝露されたそれらの細胞における、Ｓｅｒ１１７７でのｅＮＯＳのリン酸化のウエスタンブロットを示す。パネルｃの上は、βアクチンで標準化されたＯＤを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の詳細な説明
本発明の第１の目的は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性のあるアミノ酸配列を有しており、前記配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン（以下バリン２２９と称する）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン（以下トレオニン２８１と称する）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン（以下フェニルアラニン４８８と称する）及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン（以下トレオニン４９４と称する）を含むことを特徴とするＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体である。
【００２２】
前記相同性は、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である。
【００２３】
本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体のアミノ酸配列は、付加、欠失又はさらなる置換の存在のため、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列とは異なる。
【００２４】
しかし、本発明の変異体の本質的な特徴は、上記の四つのアミノ酸を包含することである。アミノ酸の欠失又は付加のためにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １とは異なるホモログの場合、上記の四つのアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １での元の位置に相当する位置に存在する。アミノ酸の置換のためにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １とは異なるホモログの場合、上記の四つのアミノ酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と同じ位置に存在する。好ましい態様によれば、本発明のタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に相当するアミノ酸配列を有しており、ここにおいてＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １の２２９、２８１、４８８及び４９４の位置とは異なる位置の一つ以上のアミノ酸が、保存されているアミノ酸によって置換されている。「保存されているアミノ酸」とは、元のアミノ酸と機能的に同等の物理化学的特性を持つアミノ酸を意味する。
【００２５】
本発明による特に好ましいタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニンを含むように改変されている、ヒト（Homo Sapiens）（アクセッション番号 ＮＰ−５９８２７．２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はアクセッション番号ＮＰ−８７２３２５．２、より長いアイソフォームに相当する）、イエネコ（Felis Catus）（アクセッション番号 ＸＰ００３９８３６６５．１）、チンパンジー（Pan Troglodytes）（アクセッション番号 ＸＰ５２５３０３）、ボリビアリスザル（Samiri boliviensis boliviensis）（アクセッション番号 ＸＰ−００３９３２１１３．１）、アカゲザル（Macaca Mulatta）（アクセッション番号 ＮＰ−００１２３０１９２．１）、ボノボ（Pan paniscus）（アクセッション番号 ＸＰ−００３８１４７７６．１）、オオガラゴ（Otolemur garnettii）（アクセッション番号 ＸＰ＿００３７８８１４８．１）、スマトラオランウータン（Pongo abelii）（アクセッション番号 ＸＰ−００３７８０６４９．１.）、タスマニアデビル（Sarcophilus harrisii）（アクセッション番号 ＸＰ−００３７５８９８７．１）、ドブネズミ（Rattus norvegicus）（アクセッション番号 ＮＰ−００１１０２６７９．２）、コモンマーモセット（Callithrix jacchus）（アクセッション番号 ＸＰ−００３７３２８４１．１）、ハツカネズミ（Mus musculus）（アクセッション番号 ＮＰ−００１０３００４７．２）、ウシ（Bos Taurus）（アクセッション番号 ＸＰ−００３５８６８６１．１）、イヌ（Canis lupus familiaris）（アクセッション番号 ＸＰ−５３４３８３．３）、イノシシ（Sus scrofa）（アクセッション番号 ＸＰ−００３１３４４４８．３）、ニワトリ（Gallus gallus）（アクセッション番号 ＸＰ−４２５７１８）、キタオポッサム（Didelphis virginiana）（ＬＯＣ１０００３２８８０）又はアフリカツメガエル（Xenopus）（ＬＯＣ１００４８５７７６）において同定された、知られているＢＰＩＦＢ４タンパク質のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
特に好ましい態様によれば、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の配列を有する。このような配列を有するタンパク質を、以下ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４と称する。
【００２７】
本発明の第２の目的は、タンパク質に特に有利な特性を与え得る付加的なアミノ酸配列と連結した、本発明によるＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体のアミノ酸配列から成る配列を有するタンパク質である。好ましくは、前記付加的なアミノ酸配列は、本発明によるＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を同定するために、又は、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を特定の臓器若しくは組織を標的とさせるのに有用である。好ましくは、前記タンパク質はキメラタンパク質である。
【００２８】
実験のセクションで詳細に記述されるように、本発明者らは、驚くべきことに、上記のＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４が三つの独立した集団において、例外的な長寿に関連していることを発見した。本発明者らは、さらに該変異体タンパク質の平均余命への有益な効果が、加齢に関連している血管機能不全を調節するその能力の結果であることを示している。実験のセクションで示されるように、この調節は、本発明のＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４におけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の２２９、２８１、４８８及び４９４の位置に相当する位置の特定の四つのアミノ酸に依存している。
【００２９】
実施例３に示されるように、マウスの腸間膜血管を、空のプラスミド若しくはＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミド又は四つの関係のあるアミノ酸で様々な置換を示すという点においてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるタンパク質： ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（それぞれ２２９及び２８１の位置にイソロイシン及びアスパラギンを包含するという点においてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列を有する）、ＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（２８１の位置にアスパラギンを包含するという点においてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のアミノ酸配列を有する）、ＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４（２２９の位置にイソロイシンを包含するという点においてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５のアミノ酸配列を有する）、ＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（４８８の位置にロイシン及び４９４の位置にイソロイシンを包含するという点においてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６のアミノ酸配列を有する）、ＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４（２２９の位置にイソロイシン、２８１の位置にアスパラギン、４８８の位置にロイシン及び４９４の位置にイソロイシンを包含するという点においてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のアミノ酸配列を有する）、で生体外で灌流した。ＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、ＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、ＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４及びＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４が血管機能への何の効果も示さず、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４が血管収縮と血管拡張の両方を阻害してあらゆる血管機能を強く抑制する一方で、ＶＴＦＴ ＢＰＩＦＢ４タンパク質は血管収縮への弱い効果及び血管拡張の著しい増進を示した。この効果は、セリン１１７７のリン酸化を通じたｅＮＯＳの活性化によって仲介されることが示されており、それ故に内皮細胞によるＮＯの放出における増大に関系している。ｅＮＯＳの活性化を誘導するＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の能力は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株で裏付けられている（実施例５）。
【００３０】
上記のデータは、さらに正常に機能しなくなったＮＯ産生と関係がある血管系の病気の動物モデル（ヘテロ接合体のＭｔｈｆｒノックアウトマウス、ここにおいてＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４タンパク質のトランスフェクションはＮＯの放出及び内皮細胞依存性の血管拡張反応を回復させることが示されている（実施例４））において確認されてもいる。
【００３１】
本発明の第３の目的は、上記の前記バリン２２９、トレオニン２８１、フェニルアラニン４８８及びトレオニン４９４を含む配列を有する、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体の断片である。
【００３２】
上記の本発明の前記ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片は、それらの生物活性のおかげで、ＮＯの産生若しくはｅＮＯＳの活性が減少することが原因の内皮細胞の病態又はｅＮＯＳの活性及び／若しくはＮＯの産生を増大させることが有益である病状若しくは状態の、予防、リスクの低減、改善及び／又は処置において、有利に使用される可能性がある。
【００３３】
したがって、本発明の第４の目的は、上記の前記ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質、及び断片の治療における使用である。
【００３４】
好ましくは、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片は、内皮細胞からの生理学的レベルより低いＮＯの放出若しくはｅＮＯＳの活性の減少が原因の内皮機能不全の、予防、リスクの低減、改善及び／又は処置における、あるいはｅＮＯＳの活性の増大を得ることが有益である臨床的症状における、使用のためのものである。本発明の好ましい態様によれば、本発明の前記ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、前記タンパク質又は前記断片は、動脈性高血圧（症）、アテローム性動脈硬化（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障及び緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、癌、炎症性疾患、静脈不全、ｅＮＯＳの活性及びＮＯの産生が減少する遺伝病、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子の変異から選択される病状の予防、リスクの低減、改善又は処置における、使用のためのものである。
【００３５】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体は、筋ジストロフィー患者における運動後の疲労の改善のための、及び血管閉塞のための１つ以上のステント（好ましくは薬剤の入った）の移植における補助剤としての、使用のためのものである。
【００３６】
本発明によるＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片は、それを必要としているか、上記の病状の一つによって冒されているか、又は上記の臨床的状態にある対象者へ、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、眼の局所（topical-ocular）投与、眼内（intra-ocular）投与又は眼球奥（retro-ocular）投与によって、投与される可能性がある。
【００３７】
よって、本発明の第５の目的は、医薬組成物であり、好ましくは経口投与、経鼻投与、静脈内投与、眼の局所投与、眼内投与又は眼球奥投与に適しており、医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混合された本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片を含む。本発明の医薬組成物に適切な製剤は、当技術分野においてよく知られており、例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，ｌａｓt）又は「Ｂａｂｉｚｈａｙｅｖ ＭＡ．，Ｄｒｕｇ Ｔｅｓｔｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４，Ｉｓｓｕｅ ６，ｐａｇｅｓ ４６８-４８５, Ｊｕｎｅ ２０１２）」に記載されている。
【００３８】
本発明によるＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片の投与に特に適切な医薬製剤は、ポリアミノ酸及び多糖構造を用いた合成コポリマーに基づいており、ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又はその断片と、静電的相互作用、疎水的相互作用又は他の物理的相互作用によって、可逆的な物理的複合体を形成し得て、そしてナノ凝集体（nano-aggregates）を生成し、そこから投与後に断片のタンパク質が完全な形態で放出される（Diaz-Fernandez YA et al, Biosens Bioelectron. 2010 Sep 15;26(1):29-35）。
【００３９】
本発明の第６の目的は、ポリヌクレオチドであり、好ましくは本発明によるＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡポリヌクレオチドである。好ましい態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２、又は上記の前記バリン２２９、トレオニン２８１、フェニルアラニン４８８及びトレオニン４９４をコードするヌクレオチドを含むその断片の配列、を含む配列か又はそれらに存在する（consists in）配列を有する。
【００４０】
上記のポリヌクレオチドは、変異タンパク質又はポリヌクレオチドを含む適切な発現ベクターの手段によって、宿主細胞においてインビトロ（in vitro）、生体外（ex vivo）又はインビボ（in vivo）で、変異タンパク質又はポリヌクレオチドの発現を得るために用いられる可能性がある。
【００４１】
よって、本発明の第７の目的は、発現制御配列に機能可能なように連結された上記の本発明の前記ポリヌクレオチドを包含するベクターである。
【００４２】
好ましい態様によれば、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片は、上記の前記ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞において、組み換え技術によって製造される。この態様によれば、好ましい一態様の本発明のベクターは、該タンパク質又はポリヌクレオチドの高収率の製造に適切である。例えば、ｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯベクターを、一過的なトランスフェクションの後に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘ ＣＨＯ及びＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｍａｘ ２９３システムを用い、接着性の哺乳類の組織培養細胞において、本発明のタンパク質の高レベルの発現、又は分泌タンパク質の高レベルの発現に用いることが可能である。
【００４３】
よって、本発明の第８の目的は、上記の本発明の前記ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞である。
【００４４】
本発明の第９の目的は、ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片の発現をさせる条件下、上記の前記宿主細胞を培養し、前記ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片を回収することを含む、本発明によるＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片を組み換え技術によって製造する方法である。
【００４５】
それ自体として直接投与する代わりに、好ましくは静脈内、皮下、眼内又は眼球奥の経路を経由して、本発明によるベクターを、それを必要としている対象者へ投与した後に、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片を標的組織で発現させる可能性があり、それは該変異タンパク質又はポリペプチドの前記標的組織における発現を誘導するのに適切である。標的組織は処置すべき病状によって異なり、例えば内皮組織、肝臓組織、心臓組織、腎臓組織、眼組織、筋肉組織の可能性がある。
【００４６】
この態様によれば、本発明のベクターは、好ましくは静脈内投与後の対象の標的組織の細胞のトランスフェクションに適切であるベクターである。
【００４７】
特に好ましい態様によれば、前記ベクターはウイルスベクターであり、好ましくはアデノウイルスベクターであり、より好ましくは、対象の標的組織への特異性に基づいて、ＡＡＶ血清型１−９ベクターである（Varadi K, et al, Gene Ther. (2012);19 (8):800-9;  Zincarelli C et al, Mol Ther. (2008), 16(6): 1073-80, Diaz-Fernandez YA et al, Oligonucleotides. 2010; 20(4): 191-8.）。
【００４８】
よって、本発明の第１０の目的は、治療における使用のための、上記の本発明の前記ポリヌクレオチド又はベクターである。好ましくは、前記ポリヌクレオチド又ベクターは、内皮細胞からの生理学的レベルより低いＮＯの放出若しくはｅＮＯＳの活性の減少が原因の内皮機能不全の、予防、リスクの低減、改善又は処置における、又はｅＮＯＳの活性の増大を得ることが有益である状態における、使用のためのものである。本発明の好ましい態様によれば、前記ポリヌクレオチド又はベクターは、動脈性高血圧（症）、アテローム性動脈硬化（症）、高血圧、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、癌、炎症性疾患、静脈不全、ｅＮＯＳの活性及びＮＯの産生が減少する遺伝病、例えばＭＴＨＦＲ遺伝子の変異、から選択される病状若しくは状態の、予防、リスクの低減、改善又は処置における使用のためのものである。
【００４９】
本発明の別の好ましい態様によれば、前記ポリヌクレオチド又はベクターは、筋ジストロフィー患者における運動後の疲労の改善のための、及び血管閉塞のための１つ以上のステント（好ましくは薬剤の入った）の移植における補助剤としての、使用のためのものである。
【００５０】
本発明の第１１の目的は、好ましくは静脈内投与、皮下投与、眼内投与、眼球奥投与に適切であり、医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混合された本発明によるベクターを含む医薬組成物である。本発明の医薬組成物に適切な製剤は、当技術分野においてよく知られている。例として、ポリマー系ナノシステム又は多重錯化合物（polycomplex）のナノシステムが、本発明のベクターを輸送するのに用いられる可能性がある（Murano E et al, Nat Prod Commun. (2011), 6(4):555-72, Moustafine RI et al, Int J Pharm. 2012 Oct3）。
【００５１】
本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質又は断片の１日平均用量は、病気の深刻さ及び患者の状態（年齢、性別及び体重）のような、様々な要因による。当業者は、正しい投与量及びそれぞれの具体的な病態における最適な処置を確実にするレジーム（regime）を見つけるために、当技術分野においてよく知られている技術的手段を用いる可能性がある。
【００５２】
本発明は、続く実施例によってさらに良く説明されるが、本発明の制限であると解釈されることはない。
【実施例】
【００５３】
実施例１：三つの独立した集団におけるＶＴＦＴ ｈＢＰＴＦＢ４タンパク質の同定
南イタリアの１００歳以上の人（ＳＩＣ）の集団を対象に、最近実施された全ゲノム関連解析（ＧＷＡＳ）によって、長寿の個体に関連している複数の遺伝的変異体が同定されている（Malovini et al, Rejuvenation Research 2011; Vol. 14(3), pages 283-291）。
【００５４】
その研究において報告された上位四つの変異（ｐ＜１×１０−４）を検証するために、ドイツの１００歳以上の人の研究（Keidorp et al; Aging Cell 2011; Vol 10, pages 622-8）で採用された、１４４７人の長寿の個体（ＬＬＩｓ）（年齢範囲９５−１１０歳、平均年齢９８．８歳）及び１０２９人のより若い対照（年齢範囲６０−７５歳、平均年齢６６．８歳）を含む、第１の再現コホート（replication cohort）において、再現の試みを実行した。よって、二つの同義ではない一塩基多型（ＳＮＰｓ）、ｒｓ２０７０３２５及びｒｓ５７１３９１、並びに二つのイントロンのマーカー、ｒｓ７５８３５２９及びｒｓ２８５０９７（機能的変異体であるｒｓ７９１７及びｒｓ１６９５５０１にタグを付ける）を、Ｔａｑｍａｎ解析によってテストしている。
【００５５】
詳しくは、個体のＤＮＡを末梢血から抽出し（ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ｂｌｏｏｄ ｍｉｄｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）、ＴａｑＭａｎプローブを用いてＡＢＩ ７９００ＨＴ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で遺伝子型を調べた。スクリーニングには、以下のプローブ：
ｒｓ２０７０３２５にはｈＣＶ２５７５７８２７；
ｒｓ５７１３９１にはｈＣＶ９５８８８７；
ｒｓ７５８３５２９にはｈＣＶ２８９９３３３１；そして
ｒｓ２８５０９７にはｈＣＶ３０７３０２３
を用いた。
【００５６】
データ解析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。
【００５７】
全ゲノムスキャンで得られたデータの解析に適用された統計的方法及び手順（procedures）は、「Ｍａｌｏｖｉｎｉ Ａ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｊｕｖｅｎａｔｉｏｎ Ｒｅｓ．２０１１，Ｖｏｌ．１４，ｐａｇｅｓ ２８３−９１」に記載されている。
【００５８】
テストした四つの変異体の内、ＢＰＩＦＢ４においてＩｌｅ２２９Ｖａｌのアミノ酸の変換をもたらすｒｓ２０７０３２５のみが、このＬＬＩｓのセット（ＯＲ＝１．４２、９５％ ＣＩ＝１．１２−１．８０、ｐ＝５．３×１０−３、ボンフェローニ調整（Bonferroni adjusted）ｐ＝０．０２１）において劣性の遺伝モデル（ＯＲ＝２．４２、９５％ Ｃｌ＝１．５６−３．７７、ｐ＝５．９８×１０−５）の下、ＳＩＣコホートにおいて観察された関連性を再現した。
【００５９】
この変異体を、アメリカをベースにした１４６１人のＬＬＩｓ（年齢範囲９１−１１９歳、平均年齢１００．８歳）及び５２６人の対照（年齢範囲０−３５歳、平均年齢２８．２歳）のコレクションによって表される第２のセットにおける関連性のために、Ｔａｑｍａｎ解析によって上記のとおりテストした。ロジスティック回帰によって、この第２の再現セット（ＯＲ＝１．６２、９５％ Ｃｌ＝１．１５−２．２７、ｐ＝３．７×１０−３）においても上記のＳＮＰの関連性を確認した。
【００６０】
関連性の結果のメタアナリシス（Meta-analysis）は、Ｒ（http://cran.r-project.org/web/packages/meta/index.html）により実行される「メタ」パッケージで行った。同定されたＳＮＰｓの位置的及び機能的アノテーション（annotation）は、オンラインのＳＮＰＮｅｘｕｓのリソースで行った。
【００６１】
ドイツ及びアメリカの再現セットにおけるこのマーカーの評価で得られた関連性の統計量を組み合わせたメタアナリシスからの結果、二つの集団で見積もられたＯＲｓの間に統計的に有意な異質性（heterogeneity）が無いことが明らかとなった（Ｑ統計量（Q-statistic）、ｐ＞０．０５； 異質性指数（heterogeneity index）、Ｉ２＝０％）。これらの観察によって、関連性の統計量を組み合わせて固定効果モデルを想定した（ＯＲ＝１．４９； ９５％ ＣＩ＝１．２２−１．８１； ｐ＜１×１０−４）。
【００６２】
実施例２：ＢＰＩＦＢ４の遺伝子座のハプロタイプ解析
ハプロタイプ解析により、ＢＰＩＦＢ４のゲノム遺伝子座内の強い連鎖不均衡（ＬＤ）のパターンが明らかとなり、非同義ＳＮＰｓに高度に富む領域の境界が定められた（補足の付属書（Supplementary Appendix）の図Ｓ１）。ＢＰＩＦＢ４のｒｓ２０７０３２５の変異（Ｉｌｅ２２９Ｖａｌ）は、ｒｓ２８８９７３２（Ａｓｎ２８８Ｔｈｒ）、ｒｓ１１６９９００９（Ｌｅｕ４８８Ｐｈｅ）、及びｒｓ１１６９６３０７（Ｉｌｅ４９４Ｔｈｒ）をタグ付けする。
【００６３】
ヒトのＢＰＩＦＢ４の３次元構造が、ＰＤＢからのＢＰＩ（コード１ＥＷＦ）を鋳型タンパク質に用いて、Ｉ−ＴＡＳＳＥＲプログラムで相同性モデリングによって予測された（参照: Ambrish Roy, Alper Kucukural, Yang Zhang. I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction.Nature Protocols, vol 5, 725-738 (2010)）。全てのモデルは、「ＰｙＭＯＬ Ｖｅｒｓｉｏｎ １．２ｒ３ｐｒｅ，Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，ＬＬＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａr Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍ）」プログラムで行われた視覚的構造解析（visual structural analysis）において考察された。上記の解析によって、Ｉｌｅ２６８Ｖａｌ及びＡｓｎ３２０Ｔｈｒの両方が、推定のタンパク質−タンパク質相互作用部位に位置することが明らかとなった。変異の影響の評価をするため、相同性モデリングによって、野生型（ＷＴ）及び変異（Ｉｌｅ２２９Ｖａｌ、Ａｓｎ２８１Ｔｈｒ、Ｌｅｕ４８８Ｐｈｅ、Ｉｌｅ４９４Ｔｈｒ）ＢＰＩＦＢ４タンパク質の構造を予測した。ＢＰＩＦＢ４は、実験的構造が利用可能なＢＰＩ及びＣＥＴＰと構造的に非常に類似しており、それらの構造的類似性のために、ＢＰＩＦＢ４が他の二つのタンパク質と類似している領域においてリポ多糖類を結合する、と予期することは合理的であると考えられた。我々の構造解析により、Ｌｅｕ４８８Ｐｈｅは脂質結合ポケットに位置することが明らかとなり、変異の結果としてポケットのサイズが減少することが予測された。Ｉｌｅ４９４Ｔｈｒの変異は第２の脂質結合ポケットに位置しており、置換によってポケットの疎水性が減少する。両方の場合において、該変異は脂質への結合能の減少をもたらす可能性がある。
【００６４】
対照的に、Ｉｌｅ２２９Ｖａｌ及びＡｓｎ２８１Ｔｈｒは、構造的に相同なタンパク質の脂質結合部位からは離れて位置しており、恐らく脂質の結合よりはむしろ他のタンパク質との相互作用のような機能に影響を与えるのであろう。
【００６５】
実施例３：ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４及びＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４への生体外での血管の反応性
同定された特定のＢＰＩＦＢ４変異体の血管機能に関する役割を決定するために、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４又は四つの関連するアミノ酸で様々な置換を示すことでＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４とは異なるタンパク質： イソロイシン及びアスパラギンを２２９及び２８１の位置にそれぞれ包含することでＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４のそれと異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３のアミノ酸配列を有するＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、アスパラギンを２８１の位置に包含することでＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４のそれと異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４のアミノ酸配列を有するＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、イソロイシンを２２９の位置に包含することでＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４のそれと異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５のアミノ酸配列を有するＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、ロイシンを４８８の位置及びイソロイシンを４９４の位置に包含することでＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４のそれと異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６のアミノ酸配列を有するＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４、並びにイソロイシンを２２９の位置、アスパラギンを２８１の位置、ロイシンを４８８の位置及びイソロイシンを２９４の位置に包含することでＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４のそれと異なる、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７のアミノ酸配列を有するＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４、をコードしているｐＲＫ５ベクターを用いたマウスの腸間膜血管の、生体外でのトランスフェクションの効果を研究した。用いたｐＲＫ５ベクターの配列は図１に報告されている（ａ 野生型ＢＰＩＦＢ４及びＧＦＰをコードするベクターの配列、並びにｂ ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４及びＧＦＰをコードするベクターの配列）。
【００６６】
Ｃ５７ＢＬ６マウスの腸間膜の動脈樹の二次分岐を、以前に説明されているようにトランスフェクトさせた（Vecchione C et al., J Exp Med 2005; Vol. 201, pages 1217-28）。
【００６７】
簡潔には、血管（ｎ＝７）を、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４のどちらかをコードしている２０μｇのｐＲＫ５ベクターを加えたクレブス液で満たしたＭｕｌｖａｎｙの圧力システムに静置した。空のプラスミドを陰性対照として用いた。血管を１００ｍｍＨｇで１時間、その後６０ｍｍＨｇで５時間灌流した。
【００６８】
トランスフェクションの効率を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の共発現の存在（図２）及びウエスタンブロッティングによって評価した。
【００６９】
詳しくは、ウエスタンブロット解析を、トランスフェクトした灌流した血管からのタンパク質抽出物について行った（それぞれのベクターあたりｎ＝７）。タンパク質抽出物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１００Ｖで１時間、又は４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１００Ｖで２時間分離し、その後ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜へ転写した。該膜を次の一次抗体：抗リン酸化Ｓｅｒ１１７７ ｅＮＯＳ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ウサギ・モノクローナル抗体、１：１０００）、抗ＢＰＩＦＢ４（Ａｂｃａｍ、ウサギ・ポリクローナル抗体、１：２００）、及び抗βアクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、マウス・モノクローナル抗体、１：３０００）で、一晩インキュベートした。該膜を３回洗浄し、その後、１：３０００に希釈した二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ，Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で１又は２時間インキュベートした。その後、該膜を４回洗浄し、特定のタンパク質のバンドをＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で検出した。ウエスタンブロットのデータを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所のＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄにより開発された）を用いて解析し、バンドの光学的濃度（ＯＤ）を決定した。負荷量における変動を相殺するため、ＯＤの測定値をβアクチンで標準化した。
【００７０】
図３に示されるように、ＢＰＩＦＢ４タンパク質は、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミド又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミドで灌流した後の血管で豊富に検出され、野生型及びＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の両方が同等の量で発現していた。これに対し、空のプラスミドに曝露した血管は、低レベルの本来のＢＰＩＦＢ４タンパク質を発現した。
【００７１】
加えて、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を発現しているが、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を発現していない血管は、ｅＮＯＳの活性部位であるセリン１１７７のリン酸化の強力な誘導を示した。
【００７２】
血管収縮を、ＫＣｌ（８０ｍＭ）及び増大するフェニレフリンの用量（１０−９Ｍから１０−６Ｍ）で、投薬後の内腔の直径の変化のパーセンテージとして評価した。血管反応を、トランスフェクションの前後でテストした。それぞれの輪（ring）において同様のレベルの収縮を得るのに必要な用量のフェニレフリンであらかじめ収縮（当初のＫＣｌ誘導性の収縮の８０％）させた血管において、累積した濃度のアセチルコリン（１０−９Ｍから１０−５Ｍまで）及びニトログリセリン（１０−９Ｍから１０−５Ｍまで）に対する腸間膜の動脈の拡張反応を測定することによって、内皮依存及び内皮非依存の弛緩を評価した。フェニレフリンによって引き起こされた最大の収縮は、続いて引き起こされた血管弛緩のベースラインと考えられた。内皮の損傷を回避するために注意が払われ、機能的統合性はアセチルコリン（１０−６Ｍ）への反応に反映された。
【００７３】
ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の過剰発現は、プラスミドへの曝露の前に誘発され得たＫＣｌ及びフェニレフリン誘導性の血管収縮をほぼ消滅させる（図５ａ）。顕著な血管収縮の不存在は、続く血管弛緩の評価を妨げた。対照的に、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の発現は、ＫＣｌ及びフェニレフリン誘導性の血管収縮に対してＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４によって発揮される阻害効果をレスキューする： 実際、アゴニストによって引き起こされた血管反応は、灌流の前に観察された反応と比較した場合に減少していたが、消滅してはいなかった（図６ａ−６ｂ）。加えて、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の発現の直後に、トランスフェクションの前に観察されたアセチルコリン誘導性の血管拡張と比較して、血管拡張に著しい増進があった（図６ｃ）が、ニトログリセリンで引き起こされた平滑筋の弛緩に差はなく（データは示されていない）、この効果が内皮機能の増進が原因であることを示している。血管機能への効果は、ＶＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、ＩＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４、ＶＴＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４及びＩＮＬＩ ｈＢＰＩＦＢ４では観察されなかった。
【００７４】
我々は、空のベクター（図７、パネルａ、ＥＶ）又はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミド（図８、パネルａ、ＶＴＦＴ）でトランスフェクトされた血管への、ｅＮＯＳ阻害剤Ｌ−ＮＡＭＥの影響を調べた。予想通りに、Ｌ−ＮＡＭＥは、空のプラスミドで灌流した血管においてアセチルコリンの血管拡張効果を鈍らせ、この影響はＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を発現している血管においてより明白であり、この後者の条件におけるより多くのＮＯの存在を示している。
【００７５】
実施例４：ＮＯの放出の障害が原因の血管系の病気のインビボモデルに対するＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の効果
上記の実験を、Ｌｅｍｉａｒｉｅ Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１１）Ｖｏｌ．３００：Ｈ７４５−５３に記載のとおり、ヘテロ接合体のｍｔｈｆｒマウス及びそれらの対照からの腸間膜血管について行った。Ｍｔｈｆｒ＋／−マウスは、長寿因子ｓｕｒｔｕｉｎ １の下方制御に関連しているｅＮＯＳの機能不全を示す。したがって、我々は、これらのマウスの腸間膜血管に対するＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４の効果を詳しく調査した。予想通りに、アセチルコリン誘導性の血管弛緩は、Ｍｔｈｆｒ＋／−マウスにおいてＭｔｈｆｒ＋／＋の同腹子（littermates）と比較して、ＥＶへの曝露の後で顕著に減少していたが（図７、パネルｂ）、ニトログリセリンで引き起こされた血管反応において差は観察されなかった（データは示されていない）。ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４をコードしているプラスミドＭｔｈｆｒ＋／−−ＶＴＦＴへの曝露の後、Ｍｔｈｆｒ＋／−の血管の内皮の弛緩が顕著に改善され、Ｍｔｈｆｒ＋／＋で観察された弛緩と同等となっていた（図８ｂ）。これは、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４が血管機能不全との戦いにおいて、強力な治療効果を有する可能性があることを示す。
【００７６】
実施例５：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＢＰＩＦＢ４によるｅＮＯＳの調節の評価
ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清及び１％の非必須アミノ酸を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ２雰囲気中３７％で培養した。細胞を、ウェルあたり０．２５×１０６個で６ウェルプレートに播種し、播種後２４時間して１０μｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び４μｇのプラスミドを用いてトランスフェクトさせた。２４時間後、細胞を２４時間の血清飢餓とした。血清飢餓の間、トランスフェクトさせた細胞を４００μＭのＨ２Ｏ２で２４時間処理した。ＴＲＩｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を用いた細胞からの全ＲＮＡの抽出、逆転写（retrotranscription）（ｉＳｃｒｉｐｔ，ＢｉｏＲａｄ）によって、ＢＰＩＦＢ４の転写を検出した。ｃＤＮＡを、ＢＰＩＦＢ４に特異的なプライマー（Ｆｗ：ＣＴＣＴＣＣＣＣＡＡＡＡＴＣＣＴＣＡＡＣＡ、Ｒｅｖ：ＡＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＴＣ）及びＧＡＰＤＨに特異的なプライマー（Ｆｗ：ＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ、Ｒｅｖ：ＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＴＧ）で増幅した。
【００７７】
ＢＰＩＦＢ４の転写は、Ｈ２Ｏ２への曝露の直後にＨＥＫ２９３Ｔにおいて誘導され得た。これはＢＰＩＦＢ４のストレス反応における役割を明示している（図９、パネルａ）。したがって、我々は、ストレスによって媒介されるセリン１１７７でのｅＮＯＳのリン酸化に、ＢＰＩＦＢ４がどのように影響を及ぼすのかを詳しく調べた。
【００７８】
ヒト胚性腎臓細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ）を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清及び１％の非必須アミノ酸を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で培養した。細胞を、ウェルあたり０．２５×１０６個で６ウェルプレートに播種し、播種後２４時間して１０μｌのリポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び４μｇのプラスミドを用いてトランスフェクトさせた。２４時間後、細胞を２４時間の血清飢餓とした。血清飢餓の間、トランスフェクトさせた細胞を４００μＭのＨ２Ｏ２で２４時間処理した。タンパク質抽出物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１００Ｖで１時間、又は４−１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で１００Ｖで２時間分離し、その後ニトロセルロース膜又はＰＶＤＦ膜へ転写した。該膜を次の一次抗体：抗リン酸化ｅＮＯＳ Ｓｅｒ１１７７（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ウサギ・モノクローナル抗体，１：１０００）、及び抗βアクチン（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，マウス・モノクローナル抗体，１：３０００）で、一晩インキュベートした。該膜を３回洗浄し、その後、二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，西洋ワサビペルオキシダーゼ連結抗ウサギＩｇＧ又は抗マウスＩｇＧ、１：３０００）で１又は２時間インキュベートした。その後、該膜を４回洗浄し、特定のタンパク質のバンドをＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ化学発光試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で検出した。ウエスタンブロットのデータを、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（アメリカ国立衛生研究所のＷａｙｎｅ Ｒａｓｂａｎｄにより開発された）を用いて解析し、バンドの光学的濃度（ＯＤ）を決定した。負荷量における変動を相殺するため、ＯＤの測定値をβアクチンで標準化した。
【００７９】
図９、パネルｂ及びｃに示されるように、ＩＮＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を過剰発現している細胞と比較して、ＶＴＦＴ ｈＢＰＩＦＢ４を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、Ｈ２Ｏ２への曝露の直後にｅＮＯＳがより活性化された状態となった。この結果は、生体外での血管の灌流でｅＮＯＳの活性化について得られた結果を補強した。
本明細書は以下の発明の開示を包含する：
［１］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列と少なくとも８５％の相同性のあるアミノ酸配列を有するＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体であって、前記配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置のバリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置のトレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱ ＩＤＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置のトレオニン、を含むことを特徴とする、前記変異体。
［２］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １のアミノ酸配列を有する、［１］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体。
［３］本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を同定するために、又は、本発明のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体を特定の臓器若しくは組織を標的とさせるのに有用な配列と連結した、ＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体のアミノ酸配列から成る配列を有する、［１］又は［２］に記載のタンパク質。
［４］キメラタンパク質である、［３］に記載のタンパク質。
［５］［１］又は［２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体の断片であって、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １の２２９の位置に相当する位置の前記バリン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１の位置に相当する位置の前記トレオニン、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の４８８の位置に相当する位置のフェニルアラニン及びＳＥＱ ＩＤＮＯ： １の４９４の位置に相当する位置の前記トレオニンを含む配列を有する、前記断片。
［６］［１］若しくは［２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、［３］若しくは［４］に記載のタンパク質、又は［５］に記載の断片のアミノ酸配列、をコードするポリヌクレオチド。
［７］［６］に記載のポリヌクレオチドであって、ＳＥＱＩＤ ＮＯ： １のバリン２２９、トレオニン２８１、フェニルアラニン４８８及びトレオニン４９４をコードするヌクレオチドを含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列又はその断片を含む、前記ポリヌクレオチド。
［８］ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
［９］発現制御配列に機能可能なように連結された［６］〜［８］に記載のポリヌクレオチドを包含するベクター。
［１０］ウイルスベクターである、［９］に記載のベクター。
［１１］治療における使用のための、［１］若しくは［２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、［３］若しくは［４］に記載のタンパク質、［５］に記載の断片、［６］〜［８］に記載のポリヌクレオチド又は［９］若しくは［１０］に記載のベクター。
［１２］内皮細胞からの生理学的レベルより低いＮＯの放出若しくはｅＮＯＳの活性の減少が原因の内皮機能不全の処置における、又はｅＮＯＳの活性の増大を得ることが有益である臨床的症状における、使用のための、［１１］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質、断片、ポリヌクレオチド又はベクター。
［１３］動脈性高血圧（症）、アテローム性動脈硬化（症）、（真正）糖尿病、脂質異常症、腎不全、メタボリック・シンドローム、脳卒中、心筋梗塞（症）、勃起機能不全、神経変性病、多発性硬化（症）、認知障害、網膜変性、ぶどう膜網膜炎、血管性網膜症、白内障、緑内障、冠攣縮性狭心症、血栓症、肺高血圧症、子癇前症、脈管炎、癌、炎症性疾患、静脈不全、ｅＮＯＳの活性及びＮＯの産生が減少する遺伝病、ＭＴＨＦＲ遺伝子の変異から選択される病状の予防、リスクの低減、改善又は処置における使用のための、［１１］又は［１２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質、断片、ポリヌクレオチド又はベクター。
［１４］筋ジストロフィーにおける運動後の疲労の改善のための、及び血管閉塞のための一つ以上のステントの移植における補助剤としての、使用のための、［１１］又は［１２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、タンパク質、断片、ポリヌクレオチド又はベクター。
［１５］［９］又は［１０］に記載のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞。
［１６］変異体のＢＰＩＦＢ４タンパク質、タンパク質又は断片の発現をさせる条件下、［１５］の宿主細胞を培養し、前記ＢＰＩＦＢ４タンパク質、タンパク質又は断片を回収することを含む、［１］、［２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、［３］若しくは［４］に記載のタンパク質又は［５］に記載の断片、を組み換え技術によって製造する方法。
［１７］医薬的に許容可能な担体及び／又は賦形剤と混合された、［１］若しくは［２］に記載のＢＰＩＦＢ４タンパク質変異体、［３］若しくは［４］に記載のタンパク質、［５］に記載の断片又は［９］若しくは［１０］に記載のベクター、を含む医薬組成物。
【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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