(57)【要約】ウイルス侵入を阻害する組成物および方法を本明細書に開示する。
2014510754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーによって作用強度増強カーゴに連結された、少なくとも１つのＤ−ペプチドを含む組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＤ−ペプチドがウイルス膜貫通タンパク質のＮ−三量体ポケットと結合可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＰＥＧリンカーが少なくとも１２のエチレングリコール反復単位を含み、前記少なくとも１つのＤ−ペプチドを前記作用強度増強カーゴに連結させる、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＥＧリンカーが、ＰＥＧ12， ＰＥＧ16，ＰＥＧ24，ＰＥＧ25，ＰＥＧ26，ＰＥＧ27，ＰＥＧ28，ＰＥＧ29，ＰＥＧ30，ＰＥＧ31，ＰＥＧ32，ＰＥＧ33，ＰＥＧ34，ＰＥＧ35またはＰＥＧ36のうちの１つである、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記作用強度増強カーゴが、ステロ−ル、アルブミン、ポリエチレングリコール、糖、マルトース結合タンパク質、血清アルブミン、コレステロール、ユビキチン、ストレプトアビジン、免疫グロブリンドメイン、キーホールリンペットヘモシアニン、マッコウクジラ  ミオ−オボアルブミン、ウシ膵臓トリプシン阻害剤、緑色蛍光タンパク質、金粒子、磁粉、アガロースビーズ、ラクトースビーズまたは脂肪酸のうちの少なくとも１つである、請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記作用強度増強カーゴがコレステロールまたはコレステロールの類似体である、請求項１〜５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記作用強度増強カーゴが脂肪酸である、請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記脂肪酸が少なくともＣ８脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸およびＣ１８脂肪酸である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記作用強度増強がアルカン鎖である、請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルカンはＣ６アルカン、Ｃ１６アルカンおよびＣ１８アルカンのうちの少なくとも１つである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのＤ−ペプチドは、配列ＩＤ番号：１〜２９のうちの少なくとも１つである、請求項１〜１０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのＤ−ペプチドは、ＰＩＥ７およびＰＩＥ１２のうちの少なくとも１つを含む、請求項１〜１１の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
少なくとも３つのＤ−ペプチドは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを有する多量体骨格に連結される、多量体骨格に連結した少なくとも３つのＤ−ペプチドを含む組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドは、ウイルス膜貫通タンパク質のＮ−三量体ポケットと結合可能である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＰＥＧリンカーは少なくとも２つのエチレングリコール反復単位を含む、請求項１４または１５の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ4またはＰＥＧ5のうちの１つである、請求項１４〜１６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記多量体骨格は３つのＮＨＳエステル基を含む三量体骨格である、請求項１４〜１７の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドは、前記ＮＨＳエステル基によって前記三量体骨格に連結される、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記多量体骨格は、トリス、ジリシン、ベンゼン環、リン酸またはペプチドコアを含む、請求項１４記載の組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドは同じＤ−ペプチドである、請求項１４〜２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドは少なくとも２つの異なるＤ−ペプチドを含む、請求項１４〜２０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドは配列ＩＤ番号：１〜２９のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４〜２２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドはＰＩＥ７およびＰＩＥ１２のうちの少なくとも１つを含む、請求項１４〜２３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
ＰＥＧ4−ＰＩＥ１２−三量体からなる請求項１４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドおよび多量体骨格に連結した少なくとも１つの作用強度増強カーゴを含む組成物。
【請求項２７】
前記多量体骨格は、３つのＮＨＳエステル基および第４直交基を含むヘテロ四量体骨格である、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドは、前記３つのＮＨＳエステル基を介してヘテロ四量体骨格に連結し、前記少なくとも１つの作用強度増強基は、前記第４直交基を介して前記ヘテロ四量体骨格に連結する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記少なくとも１つの作用強度増強基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーによって、前記第４直交基を介して前記ヘテロ四量体骨格に連結される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＰＥＧリンカーは少なくとも１２のエチレングリコール反復単位を含む、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
、前記ＰＥＧリンカーは、ＰＥＧ12，ＰＥＧ16，ＰＥＧ24，ＰＥＧ25，ＰＥＧ26，ＰＥＧ27，ＰＥＧ28，ＰＥＧ29，ＰＥＧ30， ＰＥＧ31，ＰＥＧ32，ＰＥＧ33，ＰＥＧ34，ＰＥＧ35，ＰＥＧ36，ＰＥＧ57，またはＰＥＧ132のうちの１つである、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記多量体骨格は、トリス、ジリシン、ベンゼン環、リン酸またはペプチドコアを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３３】
前記作用強度増強基は、マレイミド反応基を介して前記ヘテロ四量体骨格に連結される、請求項２６に記載の組成物。
【請求項３４】
前記作用強度増強カーゴが、ステロ−ル、アルブミン、 ポリエチレングリコール、糖、マルトース結合タンパク質、血清アルブミン、コレステロール、ユビキチン、ストレプトアビジン、免疫グロブリンドメイン、キーホールリンペットヘモシアニン、マッコウクジラ  ミオ−オボアルブミン、ウシ膵臓トリプシン阻害剤、緑色蛍光タンパク質、金粒子、磁粉、アガロースビーズ、ラクトースビーズまたは脂肪酸のうちの少なくとも１つである、請求項２６〜３３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記作用強度増強カーゴがコレステロールまたはコレステロールの類似体である、請求項２６〜３３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記作用強度増強カーゴが脂肪酸である、請求項２６〜３３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記脂肪酸は、Ｃ８脂肪酸、Ｃ１６脂肪酸およびＣ１８脂肪酸のうちの少なくとも１つである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記作用強度増強カーゴがアルカン鎖である、請求項２６〜３３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記アルカン鎖がＣ６アルカン、Ｃ１６アルカンおよびＣ１８アルカのうちの少なくとも１つである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドが、配列ＩＤ番号：１〜２９のうちの少なくとも１つを含む、請求項２６〜３９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記少なくとも３つのＤ−ペプチドが、ＰＩＥ７およびＰＩＥ１２のうちの少なくとも１つを含む、請求項２６〜４０の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
ｃｈｏｌ−ＰＥＧ12−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ16−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ36−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ− ＰＥＧ57−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ132−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ８脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ１６脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ１８脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ８アルカン−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ１６アルカン−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体およびＣ１８アルカン−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体のうちの少なくとも１つのからなる、請求項２６に記載の組成物。
【請求項４３】
前記組成物はウイルスの細胞内への侵入を阻害する、請求項１〜４２の何れか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項１〜４３の何れか一項に記載の組成物を含む薬学的組成物。
【請求項４５】
請求項１〜４２の何れか一項に記載の組成物にウイルスをさらし、ウイルスの細胞内への侵入を阻害するステップを含む、ウイルスの細胞内への侵入を阻害する方法。
【請求項４６】
前記ウイルスはＨＩＶである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１〜４２の何れか一項に記載の組成物の有効な量を該被験者に投与するステップを含む、被験者におけるウイルス感染を治療する方法。
【請求項４８】
前記ウイルスはＨＩＶである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記被験者に、ウイルス複製阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、ウイルス逆転写酵素阻害剤、ウイルス侵入阻害剤、ウイルスインテグラーゼ阻害剤、ウイルスＲｅｖ阻害剤、ウイルスＴａｔ阻害剤、ウイルスＮｅｆ阻害剤、ウイルスＶｐｒ阻害剤、ウイルスＶｐｕ阻害剤およびウイルスＶｉｆ阻害剤からなる群から選択した抗ウイルス剤を投与するステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦支援研究に関する記載）
この研究は国立保健研究機構（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（認可番号 ＡＩ  ＲＩ  ０７６１６８）による援助を一部受けたものである。合衆国政府は本開示に対する特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＩＶの侵入は、非共有会合表面（ｇｐ１２０）および膜貫通（ｇｐ４１）サブユニットを含むウイルスエンベロープ糖タンパク質によって媒介される。ｇｐ１２０は主に細胞受容体の認識に関係しているが、ｇｐ４１は膜融合を直接媒介する。ｇｐ４１Ｎ−およびＣ−ペプチド領域（Ｎ−およびＣ−ペプチド）から単離されたペプチドは、溶液に混合されると６ヘリックスバンドルを形成し、これは融合後のｇｐ４１構造を表す。3つのＮ−ペプチドは、両側に隣接するＮ−ペプチドの間の長い溝に横たわる３つの逆平行へリックスＣ−ペプチドによって囲まれた、中心が平行な三量体コイルドコイル（Ｎ−三量体）を形成する。この構造の重要性は、Ｎ−およびＣ−ペプチドによるＨＩＶ侵入のドミナントネガティブな阻害によって示される。
【０００３】
阻害および構造の有効なデータによって、ＨＩＶ膜融合のモデル（図１）が裏付けられる。先ず、ｇｐ１２０は細胞ＣＤ４およびケモカインコレセプター（典型的にはＣＸＣＲ４またはＣＣＲ５）と相互作用し、ｇｐ１２０に大きな構造変化が生じ、これはｇｐ４１とｇｐ１２０との界面を介してｇｐ４１に伝播する。その後ｇｐ４１は構造的再編成を行い、これによってそのＮ−末端融合ペプチドを開放し、これが標的細胞膜に入り込む。融合のこの段階で、ｇｐ４１は、ウイルス膜と細胞膜とを架橋する伸長した「プレヘアピン中間体」立体配座となり、Ｎ−三量体領域を露出する。この中間体は比較的長寿命（数分間）であるが、各ｇｐ４１単量体のＮ−およびＣ−ペプチドが会合してヘアピン構造を形成すると、最終的に崩壊する。３つのこのようなヘアピン（ヘアピンの三量体）は６へリックスバンドルを形成し、これはウイルス膜と細胞膜とを密接に付着させ、膜融合をもたらす。この構造はｇｐ４１の融合活性状態のコアに相当すると見られ、インフルエンザ、モロニ−マウス白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）およびエボラウイルスからのエンベロープ融合タンパク質の提唱される膜融合構成と類似している。
【０００４】
このモデルによれば、Ｎ−三量体に結合してヘアピン形成を妨げる阻害剤は、ウイルスの侵入を阻害することができる。このことはＮ−三量体に結合する多くのペプチド、タンパク質および小分子阻害剤によって十分に裏付けされてきた。Ｎ−三量体の特に興味深い特徴は、その１７のＣ−末端残基によって形成される深い疎水性の「ポケット」である。このポケットは阻害剤標的として下記の魅力的な特徴を有している：（１）大変高度に保存された配列、（２）ウイルス侵入における重要な役割、（３）短鎖ペプチドによる阻害に弱い小さな結合部位、および（４）数種類のペプチド設計（例えば、ポケット構造を忠実に模倣するＩＱＮ１７，ＩＺＮ１７，５へリックス、ＮCCGＮ１３）。当技術分野において必要なのは、ｇｐ４１の細胞内侵入を阻害することのできる、適切な薬物動態特性を有するペプチドである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国出願第１２／５２６，０７１号
【特許文献２】米国特許第３，６１０，７９５号
【特許文献３】米国特許第６，０３１，０７１号
【特許文献４】米国特許第５，８２４，５２０号
【特許文献５】米国特許第５，５９６，０７９号
【特許文献６】米国特許第５，５６５，３３２号
【特許文献７】米国特許第５，０８４，８２４号
【特許文献８】米国特許第５，２８８，５１４号
【特許文献９】米国特許第５，４４９，７５４号
【特許文献１０】米国特許第５，５０６，３３７号
【特許文献１１】米国特許第５，５３９，０８３号
【特許文献１２】米国特許第５，５４５，５６８号
【特許文献１３】米国特許第５，５５６，７６２号
【特許文献１４】米国特許第５，５６５，３２４号
【特許文献１５】米国特許第５，５６５，３３２号
【特許文献１６】米国特許第５，５７３，９０５号
【特許文献１７】米国特許第５，６１８，８２５号
【特許文献１８】米国特許第５，６１９，６８０号
【特許文献１９】米国特許第５，６２７，２１０号
【特許文献２０】米国特許第５，６４６，２８５号
【特許文献２１】米国特許第５，６６３，０４６号
【特許文献２２】米国特許第５，６７０，３２６号
【特許文献２３】米国特許第５，６７７，１９５号
【特許文献２４】米国特許第５，６８３，８９９号
【特許文献２５】米国特許第５，６８８，６９６号
【特許文献２６】米国特許第５，６８８，９９７号
【特許文献２７】米国特許第５，６９８，６８５号
【特許文献２８】米国特許第５，７１２，１４６号
【特許文献２９】米国特許第５，７２１，０９９号
【特許文献３０】米国特許第５，７２３，５９８号
【特許文献３１】米国特許第５，７４１，７１３号
【特許文献３２】米国特許第５，７９２，４３１号
【特許文献３３】米国特許第５，８０７，６８３号
【特許文献３４】米国特許第５，８０７，７５４号
【特許文献３５】米国特許第５，８２１，１３０号
【特許文献３６】米国特許第５，８３１，０１４号
【特許文献３７】米国特許第５，８３４，１９５号
【特許文献３８】米国特許第５，８３４，３１８号
【特許文献３９】米国特許第５，８３４，５８８号
【特許文献４０】米国特許第５，８４０，５００号
【特許文献４１】米国特許第５，８４７，１５０号
【特許文献４２】米国特許第５，８５６，１０７号
【特許文献４３】米国特許第５，８５６，４９６号
【特許文献４４】米国特許第５，８５９，１９０号
【特許文献４５】米国特許第５，８６４，０１０号
【特許文献４６】米国特許第５，８７４，４４３号
【特許文献４７】米国特許第５，８７７，２１４号
【特許文献４８】米国特許第５，８８０，９７２号
【特許文献４９】米国特許第５，８８６，１２６号
【特許文献５０】米国特許第５，８８６，１２７号
【特許文献５１】米国特許第５，８９１，７３７号
【特許文献５２】米国特許第５，９１６，８９９号
【特許文献５３】米国特許第５，９１９，９５５号
【特許文献５４】米国特許第５，９２５，５２７号
【特許文献５５】米国特許第５，９３９，２６８号
【特許文献５６】米国特許第５，９４２，３８７号
【特許文献５７】米国特許第５，９４５，０７０号
【特許文献５８】米国特許第５，９４８，６９６号
【特許文献５９】米国特許第５，９５８，７０２号
【特許文献６０】米国特許第５，９５８，７９２号
【特許文献６１】米国特許第５，９６２，３３７号
【特許文献６２】米国特許第５，９６５，７１９号
【特許文献６３】米国特許第５，９７２，７１９号
【特許文献６４】米国特許第５，９７６，８９４号
【特許文献６５】米国特許第５，９８０，７０４号
【特許文献６６】米国特許第５，９８５，３５６号
【特許文献６７】米国特許第５，９９９，０８６号
【特許文献６８】米国特許第６，００１，５７９号
【特許文献６９】米国特許第６，００４，６１７号
【特許文献７０】米国特許第６，００８，３２１号
【特許文献７１】米国特許第６，０１７，７６８号
【特許文献７２】米国特許第６，０２５，３７１号
【特許文献７３】米国特許第６，０３０，９１７号
【特許文献７４】米国特許第６，０４０，１９３号
【特許文献７５】米国特許第６，０４５，６７１号
【特許文献７６】米国特許第６，０４５，７５５号
【特許文献７７】米国特許第６，０６０，５９６号
【特許文献７８】米国特許第６，０６１，６３６号
【特許文献７９】米国特許第６，０２５，３７１号
【特許文献８０】米国特許第６，０１７，７６８号
【特許文献８１】米国特許第５，８２１，１３０号
【特許文献８２】米国特許第５，９７６，８９４号
【特許文献８３】米国特許第５，９７２，７１９号
【特許文献８４】米国特許第５，９６５，７１９号
【特許文献８５】米国特許第５，９６２，３３７号
【特許文献８６】米国特許第５，９５８，７９２号
【特許文献８７】米国特許第５，９４８，６９６号
【特許文献８８】米国特許第５，９４２，３８７号
【特許文献８９】米国特許第５，９２５，５２７号
【特許文献９０】米国特許第５，９１９，９５５号
【特許文献９１】米国特許第５，９１６，８９９号
【特許文献９２】米国特許第５，８５９，１９０号
【特許文献９３】米国特許第５，８５６，４９６号
【特許文献９４】米国特許第５，８５６，１０７号
【特許文献９５】米国特許第５，８４７，１５０号
【特許文献９６】米国特許第５，８４０，５００号
【特許文献９７】米国特許第５，８３１，０１４号
【特許文献９８】米国特許第５，７２１，０９９号
【特許文献９９】米国特許第５，７１２，１４６号
【特許文献１００】米国特許第５，６９８，６８５号
【特許文献１０１】米国特許第５，５０６，３３７号
【特許文献１０２】米国特許第５，６１８，８２５号
【特許文献１０３】米国特許第５，２８８，５１４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）， Ｚｏｌｌｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：３４８−３５４（１９９２）
【非特許文献２】Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５）
【非特許文献３】Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３ （１９８９）
【非特許文献４】Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）
【非特許文献５】ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）
【非特許文献６】Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ. Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  ｅｄｓ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．  ２６７（１９８３）
【非特許文献７】Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．，Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），  Ｖｏｌ．１，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ （ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）
【非特許文献８】Ｍｏｒｌｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  （１９８０）ｐｐ．４６３−４６８； Ｈｕｄｓｏｎ  Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９） （−−ＣＨ２ＮＨ−− ，ＣＨ２ＣＨ２−−）
【非特許文献９】Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８： １２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）
【非特許文献１０】Ｈａｎｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−，ｃｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ）
【非特許文献１１】Ａｌｍｑｕｉｓｔら、 Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：  １３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−）
【非特許文献１２】Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３ ：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−−）
【非特許文献１３】Ｓｚｅｌｋｅら、 Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ  （１９８２）： ９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）
【非特許文献１４】Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．  Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）
【非特許文献１５】Ｈｒｕｂｙ，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−−Ｓ−−）
【非特許文献１６】Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５
【非特許文献１７】Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７，１５９〜１６６；Ｒｉｐｋａ，  Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７  （Ｊｕｎｅ  １６，１９８８）
【非特許文献１８】ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．  ２９、１１１〜１２２
【非特許文献１９】ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ，  ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ，  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．  １８９〜１９３ （Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８９
【非特許文献２０】ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ，１９８９  Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．２３６，１２５〜１４０および１４１〜１６２
【非特許文献２１】Ａｓｋｅｗら、１９８９  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １ｌｌ，１０８２〜１０９０
【非特許文献２２】Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２） ＳｙｎｔｈｅｔｉＣ−Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，  Ｎ．Ｙ．  （１９９２）
【非特許文献２３】Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．，  Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ
【非特許文献２４】Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１）
【非特許文献２５】Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＬｉＧＡｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６６：７７６７７９（１９９４）
【非特許文献２６】Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１
【非特許文献２７】ＣｌａｒｋＬｅｗｉｓ  Ｉら，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）
【非特許文献２８】ＣｌａｒｋＬｅｗｉｓ  Ｉら、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３０：３１２８  （１９９１）
【非特許文献２９】Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３〜３０（１９９４）
【非特許文献３０】Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２）
【非特許文献３１】ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２５７〜２６７（１９９２）
【非特許文献３２】Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｉｒｒｏｒ−ｉｍａｇｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９６  Ｍａｒ  ２９；２７１（５２５７）：１８５４〜１８５７
【非特許文献３３】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ，７４：１１２８５（１９９７）
【非特許文献３４】Ｍ．Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２９０：１０３１（１９９９）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
開示する方法および組成物のために使用することのできる、もしくはそれらと共に使用することのできる、またはそれらの調製において使用することのできる、あるいは開示する方法および組成物の製造物である材料、組成物および成分を開示する。これらの材料およびその他の材料を本明細書に開示するが、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などの開示の際に、これらの化合物の種々の個別的および集合的な組み合わせ、ならびにこれらの化合物の順序が明白に開示されていない可能性があるが、各々が具体的に企図され、本明細書に記載されていると理解されたい。例えば、ポリペプチドが開示および考察され、ポリペプチドを含む多くの分子に対して多くの修飾が考察される場合、それとは反対のことが特に明記されていない限り、ポリペプチドのあらゆる組み合わせおよび順序ならびに可能な修飾が具体的に企図されている。よって、分子クラスＡ，Ｂ，Ｃおよび分子クラスＤ，Ｅ，Ｆが開示され、ならびに組み合わせ分子の例Ａ−Ｄが開示されている場合、各々が個別に記載されていなくても、各々は個別および集合的に企図されている。よってこの例においては、Ａ−Ｅ，Ａ−Ｆ，Ｂ−Ｄ，Ｂ−Ｅ，Ｂ−Ｆ，Ｃ−Ｄ，Ｃ−Ｅ，Ｃ−Ｆの組み合わせの各々が、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ，Ｅ，Ｆの開示ならびにＡ−Ｄの組み合わせ例から具体的に企図されているものと理解されたい。同様に、これらのクラスのサブセットまたは組み合わせも具体的に企図、開示されている。従って、例えばＡ−Ｅ，Ｂ−ＦおよびＣ−Ｅのサブグループは具体的に企図されたものであり、Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ，Ｅ，Ｆの開示ならびにＡ−Ｄの組み合わせ例から開示されていると見なされるべきである。この概念は、開示された組成物の製造および使用に関する方法のステップが含まれるが、これに限定されないアプリケーションの全ての態様に適用される。よって実行することのできる種々の追加のステップがある場合、これらの追加ステップの各々は、開示された方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせによって実行でき、各々のこのような組み合わせは具体的に企図され、開示されていると見なされるべきであることを理解されたい。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載する方法および組成物の特定の実施形態の多くの同等物を認識、または確認することができるだろう。尚、これらは変わる可能性があるので、開示された方法および組成物は、記載された特定の方法論、実施要綱および試薬に制限されるものではないと理解されたい。また、本明細書において使用される用語は特定の実施形態を説明する目的のみに使用され、添付の請求項によってのみ制限される本発明の範囲を制限することを意図したものではないと理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、記載と共に、開示した組成物および方法の特定の実施形態を説明するものである。
【００１０】
【図１】ＨＩＶの侵入経路の実施形態を示し、ｇｐ４１融合ペプチドおよび膜貫通ドメインも示している。明確さのために、ｇｐ１２０をプレヘアピン中間体から削除している。
【図２】Ｎ−三量体ポケット領域（Ｄ−ペプチド結合部位）と標的細胞膜との間の予測距離を示している。
【図３】図３ａは、本明細書に開示するホモ三量体ＰＥＧ骨格の一実施形態を示している。図３ｂは、本明細書に開示するヘテロ四量体ＰＥＧ骨格の一実施形態を示している。
【図４】図４ａは、ＰＥＧリンカー長のｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体作用強度（ポテンシー）への観測効果を示している。図４ｂは、種々のアルカン長のＣ８／Ｃ１６／Ｃ１８−ＰＩＥ１２−三量体作用強度への観測効果を示している。
【図５】ＰＩＥ１２−三量体の一実施形態と比較した、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体の一実施形態の増強された薬物動態特性を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（Ａ．定義）
特に定義されていない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、本明細書の文脈において、当業者によって一般的に理解される意味を有している。
【００１２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈において明確に指示のない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ａ  ｃａｒｒｉｅｒ」についての言及は、２つ以上のこのようなキャリアの混合物などを含む。
【００１３】
本明細書において、範囲は、「約（ａｂｏｕｔ）」ある特定の値から、および／または「約」他の特定の値までとして表現されることができる。このような範囲が示される場合、他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって、値を近似値として示す場合、その特定の値は別の実施形態を形成することを理解することができる。更に各範囲の終点は、他の終点との関連において、および他の終点と独立して、どちらにおいても重要であることが更に理解され得る。本明細書では多くの値が開示されているが、各値は、その値自体に加えて、本明細書においては「約」その特定の値としても開示されているものと理解されたい。例えば「１０」という値が開示されている場合、「約１０」も開示されている。また、当業者によって適切に理解されるように、ある値が開示されている場合、その値「以下または同等」の値、その値「以上または同等」の値、および複数の値の間の潜在的な範囲も開示されているものと理解されたい。例えば、「１０」とう値が開示されている場合、「１０以下」および「１０以上」も開示されている。また、本明細書を通して、データが多くの異なる形式で提供されていること、そしてこのデータは終点および開始点、ならびにこれらのデータ点の任意の組み合わせの範囲を表しているものと理解されたい。例えば、特定のデータ点「１０」および「１５」が開示されている場合、それらを超える、以上、未満および以下、ならびに１０と１５の間も開示されていると理解されたい。また、２つの特定の値の間の各々の値も開示されていると理解されたい。例えば、１０および１５が開示されている場合、１１、１２、１３および１４も開示されている。
【００１４】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲では、下記に示す意味を有すると規定される、多くの用語に関して述べられている。
【００１５】
「任意選択の」または「任意選択で」とは、続いて記載される事象または状況が起こるまたは起こらないことを意味しており、この記載はその事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含んでいる。
【００１６】
本明細書全体において種々の文献が参照されている。これらの文献の開示全体を参照としてこの明細書に援用し、これが属する技術分野をより完全に記載している。開示された文献はまた、文献が依拠される文章で論じられる、当該文献に含まれる資料のために、本明細書において個別的かつ具体的に援用される。
【００１７】
（Ｂ．組成物）
開示された組成物の調製に使用される成分および本明細書に開示する方法において使用される組成物自体について開示する。
【００１８】
ＤＰ１７８およびＣ３４などの合成Ｃ−ペプチド（Ｃヘリックスに対応するペプチド）は、ＨＩＶ−１膜融合の強力な阻害剤であり、実験室馴化株および初代分離株に対して有効である。ｇｐ４１コアの構造的特性に基づき、これらのペプチドは、外因性Ｃ−ペプチドがｇｐ４１の中央コイルドコイルと結合してその不活性化を導く、ドミナントネガティブ機構を介して作用すると考えられている。これらのペプチドは、天然のｇｐ４１構造（すなわち、遊離ビリオンに存在する非融合性立体構造）がｇｐ１２０／ＣＤ４／共受容体の相互作用よって撹乱される場合に形成される、ｇｐ４１のプレヘアピン中間体に作用する可能性がある。このプレヘアピン中間体は露出されたＮ−コイルドコイルを有しており、これによって融合活性のヘアピン構造が形成される前に、Ｃ−ペプチドに結合してｇｐ４１を不活性化することができる。従って、このキャビティと高い親和力で結合して通常のＮ−およびＣ−ヘリックス対形成を阻止する化合物は、有効なＨＩＶ−１阻害剤である。さらにキャビティ内の残基は多様なＨＩＶ−１分離株間で高度に保存される。この高い構造的な保存性のため、この部位を標的とする薬物は、多様なＨＩＶ−１分離株に対して広い活性度を有していると考えられる。
【００１９】
本明細書に記載するような、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質ｇｐ４１サブユニットのＮ−ヘリックスコイルドコイル表面上のポケットは、薬物標的である。同様に、ＡＩＤＳを引き起こす可能性のあるその他の病原体（例えばＨＩＶ−２）または非ヒト哺乳動物にＡＩＤＳの様な症状を引き起こす病原体（例えばＳＩＶ）上のキャビティもまた薬物標的である。有効な方法（例えば、鏡像ファージディスプレイ法、コンビナトリアルケミストリー、計算的手法およびその他の薬物スクリーニングならびに医化学的方法）を、十分な親和性でＨＩＶ−１（および／またはＨＩＶ−２）のコイルドコイルキャビティに結合させ、ウイルスの細胞内侵入を妨いでウイルス感染を阻害する多量体を含むペプチドおよびＤ−ペプチドならびにペプチド模倣薬および小分子の同定に使用することができる。鏡像ファージディスプレイは、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル表面上のキャビティに結合するＤ−ペプチドの同定に使用されてきた。
【００２０】
本明細書では、ウイルス膜貫通タンパク質のＮ−三量体ポケットと相互に作用するＤ−ペプチドを含む組成物を開示する。例えば、Ｄ−ペプチドはＨＩＶエンベロープ糖タンパクｇｐ４１（例えば、ＨＩＶ−１，ＨＩＶ−２）のＮ−ヘリックスコイルドコイルにおける表面のキャビティと結合することができる。このようなＤ−ペプチドは、それらがＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティとウイルスｇｐ４１のＣ−ペプチド領域のアミノ酸残基の相互作用を干渉し、ウイルスの細胞内侵入を阻止する、または阻害するようにキャビティに結合するための十分な長さであれば、どんな長さでもよい。例えば、ペプチドは長さが少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９または１０のコアアミノ酸残基を含むことができる。本明細書に記載するように、アミノ酸残基は、自然または非自然に発生させるか、または修飾することができる。ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−三量体に結合するペプチドの例は米国出願第１２／５２６，０７１号に記載されており、その全体を本明細書に参照として援用する。
【００２１】
Ｄ−ペプチドの掌体は、自然に発生するペプチドの掌体の反対である。従ってＤ−ペプチドは酵素に対して効率的な基質として機能しないので、Ｌ−ペプチドほどすぐに分解されない。さらに、Ｄ−ペプチドを標的とする周知の有効な免疫応答がないため、それらはＬアミノ酸ペプチドによって誘発されるものに匹敵するような免疫応答を誘発しない。さらに、Ｄ−ペプチドにはＬ−ペプチドより優れた以下の潜在的な利点がある：（１）Ｄ−ペプチドはプロテアーゼに耐性があり、セラムの半減期を劇的に増大させる特性を有している、（２）Ｌ−ペプチドは消化を避けるために注入されなければならないが、短鎖Ｄ−ペプチドは経口投与して全身に吸収される、（３）Ｄ−ペプチドは、Ｌ−ペプチドにはできない、独特な界面幾何学形状を有する標的に結合することができるため、豊富な構造多様性を有している。
【００２２】
本明細書に記載されるようにして同定されるＤ−ペプチドの例を下記に示す。特定の実施形態において、Ｄ−ペプチドはポケット特異的侵入阻害剤（ＰＩＥ：Ｐｏｃｋｅｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｅｎｔｒｙ）と称される。このようなＤ−ペプチド阻害剤の例としてＰＩＥ７があり、これは配列ＡＣ−ＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡ−ＮＨ２（配列ＩＤ番号：６）で表される。特定の実施形態において、１つまたは複数のＮ−末端リジン残基をＤ−ペプチドに加え、水溶性を高めることができる。本明細書に開示するＤ−ペプチドの特定の実施形態は、アミノ酸配列前のリンカー配列「ＰＥＧ」で示すことができる。
【００２３】
表１には、本明細書に開示する方法および組成物に使用することのできるＤ−ペプチドの種々の例を示す：
【００２４】
Ｄ−ペプチドの結合および中和
【表１】
2014510754.tif 000003
【００２５】
本明細書で使用する「Ｄ−アミノ酸残基」という用語は、Ｄ−グリセルアルデヒドと同じ絶対配置を有するαアミノ酸残基を指す。
【００２６】
本明細書に開示する組成物の実施形態は、ＨＩＶの細胞内侵入の阻害剤として使用することのできるペプチド、ペプチドの一部分およびペプチドの変異体／誘導体を含んでいる。コイルドコイルのＣ−末端端部における疎水性ポケットに十分に適合し、Ｃ−ペプチド領域のｇｐ４１のＮ−ペプチド領域との相互作用を阻止する、本明細書に開示するペプチドまたはそのようなペプチドの一部の特定の実施形態は、ＨＩＶ感染の阻害に有益であろう。説明する任意のペプチドの一部またはその誘導体の大きさは、２〜２０（２〜２０の任意の数の残基）のアミノ酸残基とすることができる。特定の実施形態において、コンセンサス配列ＥＷＸＷＬ（配列ＩＤ番号：３０）または配列ＷＸＷＬ（配列ＩＤ番号：３１）を少なくとも含むＤ−ペプチドを使用することができる。本明細書に記載するＤ−ペプチドがコンセンサス配列に加えてアミノ酸残基を含む場合、付加されたアミノ酸残基およびＤ−ペプチドの大きさは、本明細書に記載されるペプチドを参照して選択するか、またはこれらのペプチドとは関係なく設計することができる。ただしこの場合、ペプチドは疎水性ポケットに適合して阻害剤として作用することのできるものとする。付加アミノ酸残基は本明細書に記載するＤ−ペプチドのＮ−末端、Ｃ−末端またはそのどちらにも存在することができ、より大きなペプチドを製造する。あるいは、結合親和性を増強させるために、他のアミノ酸残基を選択することができる。例えば、このようなペプチドは保存されたアミノ酸残基を含むことができ、これらの残基は、本明細書に開示するペプチドで発生するものと同じ場所に位置することができる。いくつかの実施形態において、ペプチドはコア配列「ＷＸＷＬ」（配列ＩＤ番号：３１）を含むことができる。
【００２７】
本明細書に開示するペプチドのいくつかの実施形態において、ペプチドは、本明細書に開示する任意のペプチドにおけるこれらの位置のアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基を含むことができ（例えば、本明細書に開示するペプチドに発現しないイソロイシンもしくはアスパラギン、またはその他のアミノ酸残基であってもよい）、または、別のペプチドの特定の位置にあるアミノ酸残基によって置換することができる。天然タンパク質に見られる２０Ｌ−アミノ酸のＤ型以外のアミノ酸残基を使用してもよい。このような変更は、例えば、ペプチドの生物学的利用能、結合親和性またはその他の特徴を高めるために行うことができる。Ｄ−ペプチドは本明細書に開示するペプチドに存在する、保存されたアミノ酸残基を含むことができるが、これらは表１に示す、介在するアミノ酸残基の数よりも少ない（または多い）アミノ酸残基で分離することができる。例えば、５未満のアミノ酸残基は、コンセンサス配列内の第１システインとグルタミン酸との間に存在することができる。あるいは、これら２つの残基は５以上のアミノ酸残基で分離することができる。内部修飾も行うことができる（例えば、結合を高める、またはペプチドの溶解度を増大させるため）。例えば、Ｄ１０ｐ５の第１ロイシンはアルギニンと置換して溶解度を増大させることができる。Ｄ−ペプチドはそのＮ−末端に付加部分（moiety）またはアミノ酸を有することができる。例えば、Ｎ−末端に存在するＮ−末端をブロックする、または電荷を取り除く部分を付加することができる。その部分は、例えば、グリシン（Ｇ）に直接連結したアセチル基などのブロック部分、または１つまたは複数のリジン残基に連結し、それがＮ−末端Ｇに連結するアセチル基のような、ＧのＮ−末端に連結する１つまたは複数の付加アミノ酸残基に連結するアセチル基であってもよい。
【００２８】
本明細書に開示するペプチドの一実施形態において、２つのリジン残基をＮ−末端Ｇ（ＫＫＧＡＣ．．．，配列ＩＤ番号：３２）に連結させて、例えばペプチドの溶解度を増大させ、その後アセチル基のようなブロック部分を末端リジン（アセチル基−ＫＫＧＡＣ．．．， 配列ＩＤ番号：３２）に連結させることができる。他の実施形態では、４つのリジン残基をＮ−末端Ｇに連結させる。さらにＤ−ペプチドは、付加および／または変化部分またはアミノ酸をそのＣ−末端に有することができる。例えば、Ｃ−末端のアラニン残基のうちの１つまたは両方を変化させ、および／または１つまたは複数の残基をＣ−末端に付加し、例えば結合を増強させることができる。あるいは、アミノ酸残基以外の官能（化学）基を含有させて、本明細書に開示する実施形態における阻害剤を製造することができる。例えば、これらの付加的な化学基は、Ｎ−末端およびＣ−末端の末端または内部の何れにも存在することができる。
【００２９】
２つ以上のＤ−ペプチドを適切なリンカー（例えばアミノ酸残基またはその他の化学部分のリンカー）で連結して、阻害の有効性を増大させることができる。あるいは、１つまたは複数のＤ−ペプチドを適切なリンカーを介して、ＨＩＶ  ｇｐ１２０，ＣＤ４，ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４またはＨＩＶ  ｇｐ４１の非ポケット領域に結合する分子（薬物）に連結させ、阻害の有効性を増大させることができる。
【００３０】
本明細書に開示するペプチドの命名法に関しては、ペプチドの異なるファミリ−をｘ−ｍｅｒと称し、この場合、ｘはシステイン残基間の残基数とみなす。ｘ−ｍｅｒは「コアペプチド」と称される。例えば、配列ＩＤ番号：６（ＫＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡ）は１５の残基で構成され、よって従来技術では１５−ｍｅｒと称される。しかしながら、本明細書に開示する特定の実施形態では、システイン（Ｃ）間の残基長は８であり、よって８−ｍｅｒと考えられ（そして８つのコア残基を有するものと称され）、明細書全体でそのように称される。特定の実施形態では、２つのシステイン残基以外のアミノ酸は「フランキング配列」と称される。この命名法では、２つのシステイン残基において残基数の異なるペプチドに異なるファミリ−が可能になるが、全体のペプチド長は、フランキング配列の違いにより、区別するために変えることができる。例えば、配列ＩＤ番号：６（ＫＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡ）は１５残基長であり、８−ｍｅｒペプチドファミリ−のメンバーである（８つのコア残基を持っているため）、そしてＫＧＡのＮ−末端フランキング配列とＡＡのＣ−末端フランキング配列とを有している。比較すると、配列ＩＤ番号：２（ＫＫＧＡＣＥＳＰＥＷＲＷＬＣＡＡ）は１６残基のペプチド全長を有しているが、８−ｍｅｒペプチドファミリ−のメンバーでもあり、ＫＫＧＡのＮ−末端フランキング配列とＡＡのＣ−末端フランキング配列とを含んでいる。本明細書に開示するペプチドに存在するコア残基およびフランキング残基に加え、本明細書に開示する全てのペプチドは、ブロックされたＮ−末端およびＣ−末端を含んでおり、Ｎ−末端はアセチル基（Ａｃ）によってブロックされ、Ｃ−末端はアミノ基（ＮＨ2）によってブロックされている。
【００３１】
本明細書に記載するように、本開示によるＤ−ペプチドは、Ｄ−ペプチドを同定するために使用されるライブラリーの設計において、Ｎ−末端でＧＡに、Ｃ−末端でＡＡに隣接させることができる。これらのアミノ酸残基のうちのいくつかまたは全ては、例えば、吸収、分配、代謝および／または排出を変えることによって、変更、置換または除去することができる。一実施形態では、Ｃ−末端アミド化の直前にグリシン残基を付加することによって、Ｃ−末端を修飾する。別の実施形態では、ほとんどのＣ−末端Ａを、異なるアミノ酸残基によって改変／修飾または置換する、または除去する。さらなる実施形態では、アミノ酸をＣ−末端および／またはＮ−末端に付加する。よって本明細書では、Ｎ−末端ＧＡおよびＣ−末端ＡＡの両方を置換または付加的に隣接させて作用強度を増強することを企図している。例えば、１つまたは２つのリジンをＣ−末端ＡＡに付加して、特定のＰＩＥの単一または二重のリジン変異体を製造することができる。また、例えば、Ｎ−末端リジンを修飾して、Ｎ−末端がＨＰを含有するようにすることもできる。
【００３２】
本開示によって企図されるＤ−ペプチドの１つの配列は、ＡＣ−ＨＰＣＤＹＰＥＷＱ  ＬＣＥＬＧＫ−ＮＨ２（配列ＩＤ番号：２６）であり、これはＰＩＥ１２とも称される。別の実施形態では、Ｄ−ペプチドは配列ＡＣ−ＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡＧＫ−ＮＨ２（配列ＩＤ番号：２３）を有するＰＩＥ７−ＧＫであってもよい。このペプチドは、リジンがＣ−末端に移動しているのを除き、ＰＩＥ７と同じである。この移動により、僅かに作用強度が高まり、それらのＣ−末端を介したペプチドの架橋が可能となる。ＰＩＥ７変異体の別の例には、ＰＩＥ７−ＧＫＫ（ＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡＧＫＫ，配列ＩＤ番号：２４）がある。これはＰＩＥ７−ＧＫの二重リジン変異体であり、三量体ＰＩＥ７（中心のＰＩＥ７−ＧＫＫは２つの両側に隣接するＰＩＥ７−ＧＫペプチドに連結される）の特定の実施形態において中心ペプチドとして機能する。これらの連結は全てＣ−末端を介するものである。また、Ｋ−ＰＩＥ７−ＧＫ（ＫＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡＧ，配列ＩＤ番号：２５）も開示する。ＰＩＥ７−ＧＫのこの二重リジン変異体は、三量体ＰＩＥ７のその他の実施形態の特定の実施形態において中心ペプチドとして機能する（中心Ｋ−ＰＩＥ７−ＧＫは２つの両側に隣接するペプチド、ＰＩＥ７−ＧＫおよびＰＩＥ７に連結される）。これらの連結によって、Ｎ−端末を両側に隣接するペプチドのＣ−端末に連結する。本明細書に開示するペプチド変異体のさらなる例は下記のＰＩＥ１２変異体である：ＰＩＥ１３，ＨＰＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＫＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２７）；ＰＩＥ１４， ＨＰＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＲＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２８）；およびＰＩＥ１５，ＨＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＥＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２９）。
【００３３】
特定の実施形態において、本明細書に開示するペプチドは、二量体または三量体のような多量体として存在することもできる。例えば、多量体が二量体の場合、この二量体は２つの同一のペプチドまたは２つの異なるペプチドから構成することができる。あるいは、多量体は三量体であってもよい。多量体が三量体の場合、この三量体は２つの同一のペプチドと１つの異なるペプチド、３つの同一のペプチドまたは３つの異なるペプチドであってもよく、その各々を相互に区別できるペプチドで構成することができる。
（１．多量体）
【００３４】
本明細書にペプチドの多量体を開示する。特定の実施形態において、本明細書に開示する多量体は少なくとも１つのＤ−ペプチドを含むことができ、これはウイルス膜貫通タンパク質のＮ−三量体ポケットと相互作用する。多量体は二量体、三量体または四量体などのより高次の多量体とすることができるが、５，６，７，８，９，１０，１１または１２のＤ−ペプチドを有する多量体を含むこともできる。よって本明細書で開示するのは、１つまたは複数のＤ−ペプチドポケットに特有の侵入阻害剤（ＰＩＥ）を含む多量体を含有する組成物である。
【００３５】
本明細書では、開示するＤ−ペプチドを架橋して多量体が形成されると理解され、そしてそれが企図されている。特定の実施形態において、多量体は多量体骨格を使用して架橋してもよい。架橋剤の例として、ＮＨＳ−エステル（リジンに反応する）またはマレイミド（システインに反応する）で誘導化されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。他の実施形態において、架橋剤は２つの別個の連結ケミストリー（例えば片方はＮＨＳ−エステルでもう片方はマレイミド）を含むこともできる。特定の実施形態において、Ｄ−ペプチドは２つのシステイン残基間の直接ジスルフィド結合形成によって連結することもできる。
【００３６】
特定の実施形態例において、多量体骨格は３つのＮＨＳエステル基を含む三量体骨格とすることができる。特定の実施形態において、多量体骨格はホモ三量体骨格または３つのＮＨＳエステル基を含むヘテロ三量体骨格であってもよい。さらに他の実施形態において、多量体骨格は３つのＮＨＳエステル基と４つめの直交基とを含む四量体骨格であってもよい。このような実施形態において、多量体骨格は、３つのＮＨＳエステル基と４つめの直交基とを含むヘテロ四量体骨格であってもよい。さらに特定の実施形態において、開示する架橋剤および多量体骨格は、トリス（tris）、ジリシン、ベンゼン環、リン酸またはペプチドコアを含むことができる。開示する組成物に使用することのできる、本明細書に開示するその他の架橋剤には、チオール反応性基、例えば、ハロアセチル（ヨ−ド酢酸）、ピリジルジスルフィド（例えばＨＰＤＰ）およびその他のチオールがある。
【００３７】
連結するＤ−ペプチドは本明細書に開示するもののうちの任意のものとすることができ、Ｄ−ペプチドは互いに同一のものまたは異なるものであってもよい。二量体が存在する場合、両方のＤ−ペプチドのＮ−末端を相互に架橋することができる。あるいは、Ｄ−ペプチドのＣ−末端を架橋することができる。また、片方のＤ−ペプチドのＮ−末端およびもう片方のＤ−ペプチドのＣ−末端を架橋する三量体が存在する場合、Ｄ−ペプチドのＮ−末端およびＣ−末端はどのような組み合わせにも連結させることができる。例えば、これらは下記の配置のうちの何れかに連結させることができる：Ｎ−Ｎ／Ｃ−Ｃ−ペプチド１のＮ−末端をペプチド２のＮ−末端に連結；ペプチド２のＣ−末端をペプチド３のＣ−末端に連結。この命名を使用すると、１６の可能な三量体系列がある、つまり、Ｘ／Ｙであり、この場合、ＸおよびＹ＝Ｎ−Ｎ，Ｎ−Ｃ，Ｃ−Ｎ−またはＣ−Ｃである。Ｄ−ペプチドは、Ｎ−またはＣ−末端、内部場所またはこれらの組み合わせによって中心骨格にも連結させることができる。よって例えば本明細書では、１つまたは複数のＤ−ペプチドを、末端架橋よりも、内部残基で架橋することが企図されている。さらに三量体において、内部架橋剤を一組のペプチド（例えば、ペプチド１とペプチド２）に使用し、末端架橋剤（Ｎ−またはＣ−末端）をペプチド２とペプチド３の架橋に使用することが企図されている。
【００３８】
本明細書で使用するように、多量体の命名法は、ペプチドが連結される方法を示している。例えば、Ｃ５Ｃ−ＰＩＥ７−三量体は、３つのＰＩＥ７ペプチドが、Ｃを介して、ＰＥＧ5スペーサを使ってＣ−末端に連結されることを意味している。Ｎ９Ｃ−ＰＩＥ７−三量体は、３つのＰＩＥ７ペプチドが、Ｎ−を介して、ＰＥＧ9スペーサを使用してＣ−末端に結合されることを意味している。二量体のいくつかの例として、Ｎ９Ｃ−ＰＩＥ７−二量体、Ｃ９Ｃ−ＰＩＥ７−二量体、Ｎ５Ｎ−ＰＩＥ７−二量体、Ｎ５Ｃ−ＰＩＥ７−二量体、Ｃ５Ｃ−ＰＩＥ７−二量体、Ｎ０Ｎ−ＰＩＥ７−二量体、Ｎ０Ｃ−ＰＩＥ７−二量体およびＣ０Ｃ−ＰＩＥ７−二量体がある。尚、長さゼロスペーサは、任意の種々の短架橋剤（例えば、ＢＳ３，ＤＳＧまたはＤＳＴ）とすることができる。ＤＳＧの構造は以下の通りである：
【００３９】
【化１】
2014510754.tif 000004
【００４０】
本明細書に開示する組成物のいくつかの実施形態において、Ｃ５Ｃ連結幾何学形状は、二量体および三量体を製造する結合として使用することができる。このような二量体の例には、Ｃ５Ｃ−ＰＩＥ１２−二量体およびＰＥＧ5−ＰＩＥ１３−二量体（このペプチドは内部リジン残基を有し、従って、二量体はこの内部リジンを介した架橋によって製造することができる）がある。特定の実施形態において、例えばＰＥＧリンカーを使用することができる。三量体の例には、Ｃ５Ｃ−ＰＩＥ７−三量体、Ｃ５Ｃ−ＰＩＥ１２−三量体およびＣ０Ｃ−ＰＩＥ７−三量体がある。
【００４１】
本明細書において使用する「ＰＩＥ１２−三量体」という用語は多量体の総称であり、これは、３つのＰＩＥ１２単量体が種々の架橋戦略によって連結される、僅かに異なる化学組成物を有する分子の数を表している。特定の実施形態において、ＰＩＥ１２−三量体の１つのクラスは、中心骨格を使用せず、種々の長さのＰＥＧ架橋剤を使って単量体を連結することによって構成することができる。このような実施形態において、三量体は例えば、ＣｘＣ−ＰＩＥ１２−三量体として示してもよく、この場合、「ＣｘＣ」はリジン側鎖の唯一の第一級アミンを介するＰＩＥ１２単量体の結合を表しており、リジン残基はペプチド単量体のＣ−末端にある。他の実施形態において、ＮｘＮ−ＰＩＥ１２−三量体は、Ｎ−末端にあるリジンによる結合を表している。「ｘ」はこの文脈において、個々の単量体を連結する架橋剤におけるＰＥＧの数を表している。特定の実施形態において、２つのリジンを含む中心単量体をこの種の三量体の製造に使用することができる。この種の三量体の別の名称として、例えばＣ５Ｃ（ＰＩＥ１２）3があり、この場合、「３」は三量体を示している。
【００４２】
本明細書に記載するＰＩＥ１２−三量体のいくつかの実施形態は、ＰＩＥ１２単量体を三量体に連結させる種々の長さの３つのＰＥＧリンカーまたは「アーム」を有する３価原子（すなわち窒素）をコアに含有する、中心多量体骨格を使用して構成することができる。他の実施形態において、中心多量体骨格は、個々の単量体に連結する、例えば種々の長さの３つのＰＥＧリンカーを有する４価原子を、多量体骨格（すなわち炭素）のコアに含有することができる。
【００４３】
特定の実施形態において、作用強度を増強させたＰＩＥ１２−三量体は、作用強度増強カーゴ（積み荷）部分が４価骨格の第４アームを使用してＰＩＥ１２−三量体に付着された、炭素コア骨格を用いて構築することができる。このような実施形態において、種々の長さ（すなわち２〜１３２）のＰＥＧユニットを、第４アームの種々の部分への連結に使用することができる。ＰＩＥ１２−三量体の１つの例としてｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体があり、この場合、「ｃｈｏｌ」はチオコレステロールの省略形であり、「ＰＥＧ24」は第４アームに含まれるＰＥＧユニットの数を指している。特定の実施形態において、作用強度増強カーゴは、マレイミドケミストリーを含む種々の化学反応により、第４アームＰＥＧに付着させることができる。この三量体化の命名法は、本明細書に記載する他のＤ−ペプチド（例えば、ＰＩＥ７またはＰＩＥ７−ＧＫ）に適用される。
【００４４】
本明細書に開示する多量体は、表１に開示するものを含むペプチドまたはそれらの変異体の任意の組合せにより、多量体がウイルスの細胞内侵入を阻害するように製造することができる。特定の実施形態において、多量体は、本明細書に開示するペプチドのうちの１つ、２つ、または３つ以上によって製造することができる。このような実施形態において、全てのペプチドは同一のものとすることができる、または開示されている、または具体的に開示されていないペプチドの組合せとすることができる。特定の実施形態において、ペプチドのうちの少なくとも１つは配列ＷＸＷＬ（配列ＩＤ番号：３１）を含むことができる。他の実施形態において、本明細書に開示する多量体は、少なくとも１つのＤ−ペプチド、２つ以上の異なるＤ−ペプチド、またはその他の成分によっても製造することができる。
ａ）多量体骨格
【００４５】
多量体を製造する別の戦略として、中心多量体骨格を、１つまたは複数のＤ−ペプチドの付着に使用することができる。特定の実施形態において、本明細書に開示する多量体骨格は、ＴＳＡＴのような中心三官能架橋剤トリス（スクシンイミジル）アミノトリアセテ−トを含むことができ、これは３つのＮ−ヒドロキシこはく酸イミド（ＮＨＳ）エステル基を含んでいる。いくつかの実施形態において、この幾何学形状は「爪」と称される、というのも、構造が鷲の爪と似ているからである。この戦略の２つの例として、（１）短い爪（ＴＳＡＴをペプチドに直接連結させる） および（２）長い爪（ＴＳＡＴとペプチドとの間に、６つの付加原子スペーサを含む、ＴＳＡＴ（ＬＣ−ＴＳＡＴ）の延長形を使用）がある。その他のスペーサ長さまたは組成物（例えばＰＥＧ）も使用することができる。様々な爪の構成には、ＰＩＥ７−ＧＫ（長い爪）およびＰＩＥ７−ＧＫ（短い爪）が含まれる。
【００４６】
以下にＬＣ−ＴＳＡＴの代表例を示す：
【００４７】
【化２】
2014510754.tif 000005
【００４８】
また、下記にＴＳＡＴの代表例を示す：
【００４９】
【化３】
2014510754.tif 000006
【００５０】
未来型のＤ−ペプチドを「超設計（Over-engineering）する」とは、作用強度の限界に達した後も親和性を改善されることを意味している。このような阻害剤は改善されたインビトロの抗ウイルス作用強度を示さないが、潜在的な耐性変異（すなわち、結合親和性に穏やかに影響を与える耐性変異は、作用強度に影響を与えない）を防ぐ「耐性キャパシタ（resistance capacitor）」として作用する結合エネルギー（親和性）の蓄えを有している。この「耐性コンデンサ」の特性は、耐性を与えるために結合する僅かな多重突然変異の段階的な蓄積を防止することである。個々の突然変異は阻害剤の作用強度に影響を与えず、阻害剤の存在に増殖優位性を与えない。この「耐性コンデンサ」は三量体Ｄ−ペプチド阻害剤に特に有益である、というのも、耐性突然変異は３つのポケット全てに同時に影響を与えるからである。特定の実施形態において、耐性発現へのさらなる防御として、本明細書に開示する三量体Ｄ−ペプチドを、各々がはっきりとした耐性プロファイルを有する、３つの異なるＤ−ペプチド配列を使って構成することもできる。このようなヘテロ三量体は耐性発現に対して顕著な付加的バリヤーを示すだろう。
ｂ）ヘテロ四量体
【００５１】
本明細書に開示するように、ＰＩＥ１２−三量体はＨＩＶ侵入の強力な阻害剤である。本明細書に開示する組成物の特定の実施形態において、以下のさらなる修飾が企図される、その修飾は、ＰＩＥ１２が、１）より簡単かつ高い収率で合成できるような修飾；２）増強された薬物動態特性を有する（例えば、腎糸球体ろ過分画分子量よりも小さいため、腎臓ろ過を減少させることによる）ような修飾；および３）ＨＩＶ侵入の発生する細胞の表面へ局所的に集中し、キネティックポテンシーの限界を克服することにより、作用強度が改善されるような修飾、である。特定の実施形態において、これらの改善された特性のうちのいくつか、またはそれらを全て有するＰＩＥ１２−三量体変異体を製造するために、カスタム設計のヘテロ四量体ＰＥＧ骨格を用いることができる。この骨格は典型的には、ＰＩＥ  Ｄ−ペプチドを付着させるための、一種類の反応基（例えばＮＨＳエステル）を持つ３つのアームを有している。典型的にはより長いＰＥＧアームを有する第４アームは、他の３つのアーム（例えば、３つのアームがＮＨＳエステルを有している場合はマレイミド）に直交する反応基を有している。この分子ヘテロ四量体骨格設計により、任意のＰＥＧアームの直接的な修飾が可能となり、三量体ＰＩＥの、付加された作用強度増強カーゴとの合成が著しく簡素化される。以下に本説明によるヘテロ四量体ＰＥＧ骨格の例を示す。
【００５２】
【化４】
2014510754.tif 000007
【００５３】
特定の実施形態において、開示する組成物はヘテロ四量体骨格などの多量体骨格を含んでおり、これは作用強度増強カーゴを含むように修飾することができる。本明細書において、作用強度増強カーゴとは、本明細書に開示する組成物の作用強度を増強させるカーゴである。いくつかの実施形態において、作用強度増強カーゴは薬物動態増強特性を有するカーゴを含んでいる。他の実施形態において、作用強度増強カーゴは、膜局在化特性を有するカーゴを含んでいる。特定の実施形態において、作用強度増強カーゴは、ペプチドのクリアランスを減少させる任意の基を含む薬物動態増強カーゴを含むことができる。例えば、本明細書では、作用強度増強カーゴを有する多量体骨格を含む組成物を開示しており、この場合、作用強度増強カーゴは、ステロ−ル（例えばコレステロール）、アルブミン、 ポリエチレングリコール、糖、マルトース結合タンパク質、血清アルブミン、ユビキチン、ストレプトアビジン、免疫グロブリンドメイン、キーホールリンペットヘモシアニン、マッコウクジラ  ミオ−オボアルブミン（myoovalbumin）、ウシ膵臓トリプシン阻害剤、緑色蛍光タンパク質、金粒子、磁粉、アガロースビーズ、ラクトースビーズまたは脂肪酸である。他の実施形態において、作用強度増強カーゴは、（分子量を増やし、腎臓ろ過を減らすための）複数の三量体の連結などの、複数の多量体の結合であってもよい。よって、例えば， 本明細書では、１つまたは複数のＤ−ペプチドポケット特異的侵入阻害剤（ＰＩＥ）、多量体骨格および作用強度増強カーゴを含む組成物を開示し、この場合、作用強度増強カーゴはコレステロールまたはその類似体である。
【００５４】
特定の実施形態において、本明細書に開示する組成物は、以下に例示する薬物動態増強カーゴを有するＰＩＥ１２−三量体を含んでいる：
【００５５】
【化５】
2014510754.tif 000008
【００５６】
また本明細書ではＰＥＧリンカーも開示する。特定の実施形態において、多量体を製造するＰＥＧ化により、ＰＥＧリンカーの長さが様々となる。特定の実施形態において、このようなＰＥＧリンカーの使用により、作用強度増強カーゴとＤ−ペプチドポケット標的侵入阻害剤との間に空間が提供される。ＰＥＧリンカーの長さは、ＩＣ50および組成物の半減期を改善することができると理解され、本明細書ではそれが企図されている。しかしながらリンカーがかさ高くなりすぎると有害な影響を与えることもある。よって本明細書に開示する組成物において、ＰＥＧリンカーは、１２〜４８のエチレングリコール反復単位を含む、作用強度増強カーゴとＤ−ペプチドポケット標的侵入阻害剤との間のリンカーである。従って本明細書では、それぞれＰＥＧ12，ＰＥＧ13，ＰＥＧ14，ＰＥＧ15，ＰＥＧ16，ＰＥＧ17，ＰＥＧ18，ＰＥＧ19，ＰＥＧ20，ＰＥＧ21，ＰＥＧ22，ＰＥＧ23，ＰＥＧ24，ＰＥＧ25，ＰＥＧ26，ＰＥＧ27，ＰＥＧ28，ＰＥＧ29，ＰＥＧ30，ＰＥＧ3I，ＰＥＧ32，ＰＥＧ33，ＰＥＧ34，ＰＥＧ35，ＰＥＧ36，ＰＥＧ37，ＰＥＧ38，ＰＥＧ39，ＰＥＧ40，ＰＥＧ41，ＰＥＧ42，ＰＥＧ43， ＰＥＧ44，ＰＥＧ45，ＰＥＧ46，ＰＥＧ47，ＰＥＧ48と称される、１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７および４８のエチレングリコール反復単位を含むＰＥＧリンカーを開示する。
【００５７】
ＰＥＧリンカーはＰＩＥアームを骨格に連結するために使用されることも理解されたい。特定の実施形態では、Ｄ−ペプチドポケット標的侵入阻害剤の骨格への連結において、ＰＥＧリンカーは２，３，４，５，６，７または８のエチレングリコール反復単位を含むことができる。
【００５８】
よって開示する組成物は、１つまたは複数のＤ−ペプチド、多量体骨格、作用強度増強カーゴ、Ｄ−ペプチドの隣接領域の修飾およびＰＥＧリンカーなどの、本明細書に開示する全ての特徴を含んでいると理解されたい。従って、本明細書には、１つまたは複数のＤ−ペプチドおよび作用強度増強カーゴを含む組成物を開示し、この１つまたは複数のＤ−ペプチドは多量体骨格で連結され、この多量体骨格はＤ−ペプチドにＰＥＧリンカーを介して連結され、この作用強度増強カーゴは多量体骨格にＰＥＧリンカーを介して連結される。
【００５９】
本明細書に開示する多量体骨格は、多量体Ｄ−ペプチド薬物最適化（ペプチドの幾何学的形状および共役局在化カーゴを介した活性化部位への局在化の両方）のための多量体骨格ベースの設計方法に使用してもよい。特定の実施形態において、多量体骨格ベースの設計により、種々のカーゴおよびケミストリー（例えば「クリック」ケミストリー）ならびにＰＥＧアーム長さの迅速な最適化に対応するための骨格の変化が可能になる。例えばＨＩＶやエボラのような、エンドソーム内で膜融合を行うウイルスに関しては、本明細書に開示する多量体骨格ベースの戦略を用いて、エンドソーム標的部分を同定して付着させ、阻害剤をウイルス部位に局在化させて阻害剤作用強度を増大させることができる。さらに、本明細書に開示する多量体骨格ベース戦略の特定の実施形態では、種々の作用強度増強カーゴの同定および種々の作用強度増強カーゴへの抱合による薬物動態特性（例えば、大きく分岐したＰＥＧ、アルブミンまたはアルブミン結合ペプチド）の調節、および膜の局在化が可能である。
ｃ）多量体の結合活性
【００６０】
本明細書には、本明細書に開示する多量体およびＮ−三量体分子を含む組成物を開示し、多量体はＮ−三量体分子と会合されると、Ｎ−三量体分子の単一のペプチドまたは対照（コントロール）ペプチドの親和性と比べて増大されたＮ−三量体分子への親和性を有している。単一のペプチドまたは対照ペプチドは、多量体の成分のうちの１つと同一であってもよい、または単一のペプチドは、多量体に含まれていない異なるペプチドであってもよい。
【００６１】
多量体は、多量体のみの成分のうちの１つの親和性と比較した場合、約２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２５倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍または１０，０００倍の、Ｎ−三量体への親和性の増加を呈することができる。
【００６２】
多量体は、本明細書に開示する特徴または特性の何れかを有することができる。本明細書に開示する多量体は何れも、本明細書に記載するような結合活性を有することができ、 それらのうちの何れも、本明細書に開示するウイルス侵入の阻害を増大させる方法を用いて、使用することができる。
ｄ）ペプチド変異体
【００６３】
また本明細書には、本明細書に記載および本明細書において企図される、ペプチドの変異体も開示する。ペプチド変異体および誘導体は当業者に十分理解されており、アミノ酸配列修飾を含むことができる。ウイルス侵入の阻害に使用することのできる、本明細書に開示するペプチドは、そのようなアミノ酸配列修飾を含むことができる。当業者であれば、ペプチドの活性を保持するためにどの修飾を行えばよいのかすぐに決定することができるだろう。
【００６４】
本明細書に開示するペプチドの類似体もまた企図される。これらの類似体には、ペプチド構造の１つまたは複数のＤ−アミノ酸が含まれ、これらは、本来のペプチドの特性が維持されるように、同族アミノ酸と置換される。特定の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基において、保存アミノ酸置換を行うことができる。「保存アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似した側鎖を有するアミノ酸残基と交換されることである。類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリ−には、当技術分野では、基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非電極側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）があると定義されている。本明細書に開示するペプチドのペプチド構造において行うことのできる同族置換の非限定的例には、Ｄ−フェニルアラニンのＤ−チロシン、Ｄ−ピリジルアラニンまたはＤ−ホモフェニルアラニンとの置換、Ｄ−ロイシンのＤ−バリンまたはその他の脂肪族側鎖を有する天然または非天然アミノ酸との置換、および／またはＤ−バリンの脂肪族側鎖を有するＤ−ロイシンまたはその他の天然または非天然アミノ酸との置換が含まれる。これは例として示すものであり、制限することを意図するものではない。当業者であれば、Ｄ−ペプチドへの保存的置換を行うことができるだろう。
【００６５】
本明細書に開示する各々のＤ−ペプチドは、ｇｐ４１のＮ−三量体領域における深い溝のポケットと接触する特定の残基を含むと理解されたい。例えば、残基２，３，４，８，９，１１，１２および１５はＰＩＥ７の接触残基であり、残基２，３，７，８，１０，１１および１４はＰＩＥ１２の接触残基である。ＰＩＥ７およびＰＩＥ１２の両方において、Ｅ，ＷならびにＷおよびＬに対応する残基はコア配列ＥＷＸＷＬ（配列ＩＤ番号：３０）を形成し、内部で最も接触する残基（internal most contact residues）（ＰＩＥ７には残基８，９，１１，１２およびＰＩＥ１２には残基７，８，１０，１１）が含まれている。本明細書では、接触残基で置換が行われると、深い溝に対するＤ−ペプチドの結合親和性に大きな影響を与えることができると企図されている。変化をより受け入れることのできる残基は、非接触残基ならびにペプチドのＣ−末端およびＮ−末端の接触残基である。
【００６６】
記載する保存性突然変異および相同性は、変異体が保存性突然変異である特定の配列に対する少なくとも７０％の相同性を有する実施形態のように、任意に組み合わせることができると理解されたい。
【００６７】
自然に発生するペプチドの反対の立体異性体およびペプチド類似体の立体異性体を開示する。これらのアミノ酸は、最適なアミノ酸をｔＲＮＡ分子に担持させること、およびアミノ酸類似体をペプチド鎖に部位特異的な方法で挿入するために、例えばアンバーコドンを用いる遺伝的構築体を操作することにより、ポリペプチドに容易に取り込ませることができる（Ｔｈｏｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３（１９９１）， Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３ ：３４８−３５４（１９９２）；Ｉｂｂａ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６（１９９５）， Ｃａｈｉｌｌら、ＴＩＢＳ，１４（１０）：４００−４０３ （１９８９）；Ｂｅｎｎｅｒ，ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ，１２：１５８−１６３（１９９４）；ＩｂｂａおよびＨｅｎｎｅｃｋｅ，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：６７８−６８２（１９９４）これらは全て、少なくともアミノ酸類似体関連材料に関して、参照として本明細書に援用する）。
【００６８】
ペプチドに似せた分子であるが、天然のペプチド結合を介して連結されないものを製造することができる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類似体への結合には、ＣＨ２ＮＨ−，−−ＣＨ２Ｓ−，−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−，−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス），−−ＣＯＣＨ２−−，−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−および−−ＣＨＨ２ＳＯ−がある（これらの結合およびその他の結合は、下記に見つけることができる：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ.Ｆ．ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｂ．  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，  ｅｄｓ．，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．  ２６７（１９８３）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ. Ｆ．，Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ（Ｍａｒｃｈ  １９８３），  Ｖｏｌ．１，  Ｉｓｓｕｅ  ３，  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ （ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｖｉｅｗ）； Ｍｏｒｌｅｙ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  （１９８０）ｐｐ．４６３−４６８；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５（１９７９）（−−ＣＨ２ＮＨ−−，ＣＨ２ＣＨ２−−）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−−ＣＨ  Ｈ２−−Ｓ）；Ｈａｎｎ  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．１３０７−３１４（１９８２）（−−ＣＨ−−ＣＨ−−，ｃｉｃ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓ）；Ａｌｍｑｕｉｓｔら、Ｊ．  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：  １３９２−１３９８（１９８０）（−−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−−）；Ｓｚｅｌｋｅら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｐｐｌｎ，ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ  （１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；Ｈｏｌｌａｄａｙら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４（１９８３）（−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）；および Ｈｒｕｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９（１９８２）（−ＣＨ２−−Ｓ−）。これらはそれぞれ参照として本明細書に援用する。代替的な非ペプチド結合は −−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチド類似体は結合原子の間に、ｂ−アラニン、ｇ−アミノブチル酸など、２以上の原子を有していると理解されたい。
【００６９】
大抵のアミノ酸類似体およびペプチド類似体は、より経済的な製造、より大きな化学安定性、増強された薬理作用（半減期、吸収、作用強度， 有効性など）、変化した特異性（例えば、生物活性の広いスペクトル）、低減された抗原性などの、増強された、または所望の特性を有している。
２．医薬担体/医薬品の送達
【００７０】
本明細書に開示するペプチドおよび多量体（あるいは組成物と称する）は、薬学的に許容可能な担体にインビボで投与することもできる。「薬学的に許容可能な」とは、生物学的に、またはその他の意味において望ましくない材料でない材料のことである。すなわち、そのような材料は、望ましくない生物学的効果を何れも引き起こすことなく、その材料が含まれる医薬組成物のその他の成分の何れとも有害に相互作用することなく、本明細書に開示するペプチドと共に被験者に投与することのできる材料である。当事者に周知のように、このような担体は、有効成分の分解を最小限に抑え、被験者の副作用を最小限に抑えるように、自然に選択される。
【００７１】
組成物は、局所鼻腔内投与、吸入による投与を含む経口、非経口（例えば静脈注射）、筋肉注射、腹腔内注射、皮下注射、経皮的、体外的、局所的投与によって投与することができる。本明細書において使用する、「局所鼻腔内投与」とは、鼻孔の片方または両方を通して組成物を鼻および鼻腔に送達することであり、噴霧機構もしくは滴下機構またはエアロゾル化によるものを含んでいる。組成物の吸入による投与は、噴霧または滴下機構によって鼻または口に送達する。送達はまた、挿管を介して呼吸器系（例えば肺）などの部分にも直接行うことができる。必要とされる組成物の正確な量は、被験者の種、年齢、体重および全身状態、疾患の重症度、投与様式などにより、被験者によって異なる。よってあらゆる組成物について正確な量を特定するのは不可能である。しかしながら当業者は、本明細書に教示する日常的な実験を使って、適量を決定することができる。
【００７２】
組成物の非経口投与は、一般的に注射によって行われる特徴がある。注入材料は、溶液または懸濁液、注射前の液体内の懸濁液に適切な固形、または乳濁液として、従来の形式によって調製することができる。近年見直された非経口投与の手法には、一定の用量が保たれるような、緩効性または徐放性のシステム（すなわちデポー（持効性製剤））の使用が含まれている。本明細書に参照として援用する米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
ａ）薬学的に許容可能な担体
【００７３】
ペプチドおよびその多量体を含む組成物は、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて治療的に使用することができる。
【００７４】
適切な担体およびそれらの製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．  Ａ．Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適量の薬学的に許容可能な塩を製剤に使用して、製剤を等張にする。薬学的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンゲル液およびブドウ糖液があるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは約５〜約８、あるいは約７〜約７．５である。さらなる担体は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの持続放出製剤を含んでおり、そのマトリックスは例えば、フィルム、リポソ−ムまたは微粒子などの成形体の形状である。当業者にとって、例えば、投与ル−トおよび投与される組成物の濃度により、特定の担体がより好適となることは明らかであろう。
【００７５】
薬学的担体は当業者には周知である。最も典型的には、これらはヒトへ薬物投与を行うための標準的な担体であり、無菌水、生理食塩水および生理的ｐＨの緩衝液が含まれる。組成物は、筋肉注射または皮下注射によって投与することができる。その他の化合物は当業者によって使用される標準的な手順に沿って投与される。
【００７６】
薬学的組成物は、最適な分子に加え、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤などを含むことができる。薬学的組成物はまた、抗菌剤、消炎剤、麻酔剤などの１つまたは複数の有効成分も含むことができる。
【００７７】
薬学的組成物は、局所的な処置が所望されるのか、全体的な処方が所望されるのか、または処置の行われる部分により、多くの方法で投与することができる。投与は、局所的（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口、吸入または点滴、皮下注射、腹腔内注入または筋肉注射などの非経口によって行うことができる。開示するペプチドおよびその多量体は、静脈注射、腹腔内注射または筋肉注射により、皮下、腔内または経皮で投与することができる。
【００７８】
非経口投与の製剤として、無菌水または非水溶液、懸濁液および乳濁液がある。非水溶液の例には、プロビレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルがある。水性担体として、生理食塩水および緩衝化媒体を含む、水、アルコール／水溶液、乳濁液および懸濁液がある。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンガー・デキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液または固定油がある。静脈内媒体には、流動体および栄養補給、電解質補給（リンガー・デキストロースに基づくもののような）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、照合剤、不活性ガスなどの防腐剤およびその他の添加剤も存在させることができる。
【００７９】
局所投与の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、点滴剤、座薬、噴霧、液体および粉末が含まれる。従来の薬学的担体、水溶液、粉末または油性基剤、増粘剤などは必要または望ましい
【００８０】
経口投与の組成物には、粉末または顆粒、懸濁液または水溶液、非水性媒体、カプセル、小袋または錠剤がある。増粘剤、香料、希釈液、乳化剤、分散補助剤または結合剤は望ましい。さらに本明細書において、経口投与のために設計された組成物は、消化管透過剤をさらに含むことができると企図されている。
【００８１】
組成物の中には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸およびリン酸などの無機酸および／またはぎ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸およびフマル酸のような有機酸の反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムおよび／またはモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンのような有機塩基との反応によって形成される、薬学的許容可能な酸または塩基付加塩として投与される可能性のあるものがある。
ｂ）治療上の使用
【００８２】
本明細書に開示するペプチドおよびペプチドの多量体を含む、本明細書に開示する組成物を投与する場合の効果的な投与量および投与スケジュールは経験的に決定され、このような決定は、当業者が備えている技能の範囲内で決定されることができる。組成物の投与量の範囲は、症状／疾患が影響を受ける望ましい効果の製造に十分な範囲である。投与量は、好ましくない交差反応、アナフィラキシー反応のような副作用を引き起こすほど多量であってはならない。一般に投与量は患者の年齢、状態、性別および疾患の広がり、投与経路または投薬スケジュールに他の薬物が含まれているか否かによって変えられ、当事者によって決定されることができる。投与量は、禁忌の場合には、各医師によって調節することができる。投与量は変更でき、日々一回または複数回の投与を一日または数日間行うことができる。ガイダンスは、特定のクラスの医薬品、特にＤ−ペプチドの適切な投与量の文献に見つけることができる。このようなガイダンスの例は、文献全体に見つけることができる。例えば、ＦＤＡ認証ペプチドＦＵＺＥＯＮ（登録商標）は、本明細書に開示するペプチドに必要とされる投与量のガイドとして使用することができる。一実施形態では、単独で使用されるペプチドまたはペプチドの多量体の典型的な一日の投与量は、上述の要因により、体重の約１μＧＫｇ〜１００ｍＧＫｇである。さらに、本明細書に開示するペプチドは、被験者の状態、治療のその他の方法などにより、一日、一週間、一ヶ月または一年に数回投与することができる。当業者であれば、適切な投与スケジュールが容易にわかるであろう。
【００８３】
ＨＩＶなどのウイルス感染の治療、阻害または防止のための、ペプチドなどの開示する組成物の投与に続き、ペプチドまたはペプチドの多量体の有効性を、当業者に周知の種々の方法によって評価することができる。例えば当事者は、本明細書に開示するＤ−ペプチドなどの組成物がウイルス感染の治療または阻害に有効であることを、その組成物がウイルス侵入を阻害することを観察することによって理解するだろう。開示する組成物の投与の有効性は、感染した被験者内における感染していない細胞の数を測定することによっても決定することができる。被験者または患者における感染していない細胞の初期における、またはその後の減少を阻害する治療、または、例えばＨＩＶ陽性被験者における、未感染細胞数の増加となる治療は、有効な治療である。予防治療（すなわち予防薬）の有効性も、ＣＤ４+細胞カウント、抗ウイルス抗体レベルおよびウイルスＲＮＡレベルを検出するＰＣＲなどの、間接的な感染測定によっても評価することができる。
【００８４】
本明細書に開示するウイルス侵入を阻害する組成物、すなわち殺菌剤は、ＨＩＶなどのウイルスにさらされるリスクのある、またはＨＩＶに新たにさらされた患者または被験者に予防的に投与することができる、ＨＩＶなどのウイルスに新たにさらされたが、ウイルスの存在が血液中またはその他の体液中にまだ表れていない（ウイルス検出用のＰＣＴまたはその他のアッセイでの測定による）被験者における、ペプチドまたはペプチドの多量体による治療には、本明細書に記載する組成物、ペプチドまたは多量体の治療的に有効な投与量を被験者に投与して、細胞に感染するウイルスの能力を部分的または完全に阻害することが含まれる。
【００８５】
開示するペプチドは、ウイルス膜貫通タンパク質を阻害することによって、ウイルス侵入を阻害するために使用することができる。「ウイルス膜貫通タンパク質の阻害」という用語は、細胞内に侵入することのできるウイルス粒子数の低減を指している。これは完全な阻害を意味し、換言すれば、細胞に侵入することのできるウイルス粒子がないことであり、また、部分的な阻害を意味する。つまり、あるシステムにおいて、治療されていない、またはコントロール（対照）システムと比較して、細胞に侵入することのできるウイルス粒子数が低減した、または抑制されたことを意味する。細胞に侵入することのできるウイルス粒子数の低減には、１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，５１，５２，５３，５４，５５，５６，５７，５８，５９，６０，６１，６２，６３，６４，６５，６６，６７，６８，６９，７０，７１，７２，７３，７４，７５，７６，７７，７８，７９，８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９または１００％低減、あるいはこれらの量以上、以下またはこれらの量の間の量がある。さらに「ウイルス侵入を阻害する」とは、ウイルスの細胞への融合および侵入の低減を意味する。
３.チップおよびマイクロアレイ
【００８６】
少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示する任意のペプチド配列に規定された配列または配列の一部であるチップを開示する。
【００８７】
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書に開示する任意のペプチド配列に規定された配列の変異体または配列の一部であるチップも開示する。
４．コンピュータ読み取り可能な媒体
【００８８】
開示するペプチドは、アミノ酸で構成される配列として表示されることができることを理解されたい。これらの配列を表示する種々の様式があり、例えばアミノ酸バリンはＶａｌまたはＶで表すことができる。当業者は、存在する種々の様式の何れかで任意のペプチド配列をどのように表示すればよいかを理解し、その各々は本明細書において考慮される。本明細書では特に、市販のフロッピーディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスクおよびビデオディスク、またはその他のコンピュータ読み取り可能な媒体などにおけるこれらの配列の表示について検討する。また、開示する配列の２進コードによる表示も開示する。当業者であればコンピュータ読み取り可能な媒体が何れであるかを理解するだろう。よってコンピュータ読み取り可能媒体にはペプチド配列が記録、格納または保存される。
５．開示する組成物によるスクリーニングによって同定される組成物
ａ）コンビナトリアルケミストリー
【００８９】
開示するペプチドは、所望の様式で、開示する組成物と相互作用する分子または高分子分子を同定する、任意のコンビナトリアル技術の標的として使用することができる。本明細書に開示するペプチドおよび関連分子は、コンビナトリアル手法の標的として使用することができる。また、例えば配列ＩＤ番号：１〜３６に開示される組成物またはその一部分が、コンビナトリアルまたはスクリーニングプロトコルにおいて鋳型として使用される、コンビナトリアル技術またはスクリーニング技術プロトコルによって同定される組成物も開示する。
【００９０】
開示する組成物をコンビナトリアル技術またはスクリーニング方法で使用する場合、高分子分子などの分子は、ｇｐ４１相互作用の阻害または刺激などの特定の望ましい特性を有するものとして同定される。その他のペプチドなどの、開示する組成物を使って同定、単離される分子も開示する。よって、コンビナトリアル手法またはスクリーニング手法を使って製造される、ペプチドなどの開示する組成物を含む製造物も、本明細書において考慮される。
ｂ）コンピュータを使った薬物設計
【００９１】
開示するペプチドおよびペプチドの多量体は、任意の分子モデリング技術の標的として、開示するペプチドまたは多量体の何れかの構造の同定、または所望の様式で開示する組成物と相互作用する、小分子のような潜在的または実際の分子を同定するために使用することができる。本明細書に開示するペプチドおよび関連分子は、任意の分子モデリングプログラムまたは手法において標的として使用することができる。
【００９２】
開示する組成物をモデリング技術で使用する場合、高分子分子などの分子は、ウイルス阻害などの特定の特徴を有するものとして同定されることを理解されたい。ペプチドおよびペプチドの多量体などの、開示する組成物を使って同定および単離される分子も開示する。よって、開示する組成物を含む分子モデリング手法を使って製造される製造物も、本明細書に開示されると考えられる。
【００９３】
一般に、最適な分子に結合する分子を単離する１つの方法は、合理的設計によるものである。これは、構造情報およびコンピュータモデリングによって達成される。コンピュータのモデリング技術により、選択された分子の三次元原子構造が可視化され、分子と相互作用する新しい化合物の合理的な設計が可能となる。三次元構造は、典型的には選択された分子のＸ線結晶学分析またはＮＭＲ分析からのデータに依存する。分子動力学シミュレ−ションは、力場データを必要とする。コンピュータグラフィックスシステムにより、新規化合物がどのように標的分子に連結するのかの予測が可能となり、結合特異性を完全なものにするために、化合物および標的分子の構造の実験的操作が可能となる。片方または両方において小さな変化が作製される場合の分子／化合物間の相互作用の予測には、通常、分子設計プログラムとユーザとの間の、ユーザーフレンドリーなメニュー方式のインターフェースと連結される、分子力学ソフトウエアおよび演算集約的コンピュータが必要である。
【００９４】
分子モデリングシステムの例として、ＣＨＡＲＭｍおよびＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）がある。ＣＨＡＲＭｍはエネルギーの最小化および分子動力学の機能を行う。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構成、グラフィックモデリングおよび分析を行う。ＱＵＡＮＴＡは双方向性構築、改変、可視化および相互の分子挙動の分析を可能にする。
【００９５】
多くの論文が、特定のタンパク質と相互作用するコンピュータモデリングについて記載しており、例えば、Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７，  １５９〜１６６；Ｒｉｐｋａ，  Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４〜５７  （Ｊｕｎｅ  １６，  １９８８）； ＭｃＫｉｎａｌｙおよびＲｏｓｓｍａｎｎ、１９８９  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．  ２９、１１１〜１２２；ＰｅｒｒｙおよびＤａｖｉｅｓ，  ＱＳＡＲ：Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ，  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｐｐ．１８９〜１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．  １９８９）；ＬｅｗｉｓおよびＤｅａｎ，１９８９  Ｐｒｏｃ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  ２３６，１２５〜１４０および１４１〜１６２があり、核酸成分のモデル酵素に関しては、Ａｓｋｅｗら、１９８９  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １ｌｌ，１０８２〜１０９０がある。化学薬品をスクリーニングし、グラフィック描写するその他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｐａｓａｄｅｎａ，  ＣＡＡｌｌｅｌｉｘ，  Ｉｎｃ，ＭｉｓｓｉｓｓａｕＧＡ，  Ｏｎｔａｒｉｏ，  ＣａｎａｄａおよびＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  Ｏｎｔａｒｉｏから入手可能である。
【００９６】
結合を変化させ得る化合物の設計および製造に関して説明したが、天然物または合成化学薬品およびタンパク質を含む生物活性材料を含む、周知の化合物を含む化合物ライブラリーをスクリーニングすることができる。
６．キット
【００９７】
本明細書に開示する方法の実施に使用することのできる試薬に引き込むキットを開示する。これらのキットは、本明細書に論じるか、または開示する方法に必要とされるまたは有益であると理解される任意の試薬または試薬の組み合わせを含むことができる。例えば、これらのキットは、本明細書に開示するペプチドまたはペプチドの多量体を含む薬学的組成物を含むことができる。例えば、本明細書に開示するペプチドまたはペプチドの多量体を含む薬学的組成物を含む、ＨＩＶ治療用のキット開示する。
７．類似の機能を有する組成物
【００９８】
本明細書に開示するペプチドは、ウイルス侵入の阻害など、特定の機能を有することを理解されたい。本明細書に開示するのは、開示する機能を行う特定の構造的要求事項であり、開示する構造に関連する同じ機能を行うことのできる種々の構造があり、これらの構造は、例えばウイルス侵入阻害など、最終的に同じ結果を達成することを理解されたい。
Ｃ．組成物の作製方法
【００９９】
本明細書に開示する組成物および方法を行うために必要な組成物は、特に指定のない限り、その特定の試薬または化合物に関する、当業者に周知の方法によって作製することができる。
１．ペプチド合成
【０１００】
本明細書に開示するペプチドは、例えばジスルフィド架橋結合によって結合することができる。例えば、本明細書に開示するＤ−ペプチドは、ペプチドを環状化させてより小さく構成されたペプチドを製造するジスルフィド結合によって結合された、２つのシステイン残基を有している。このジスルフィドは、増強された抗ウイルス特性を有していることが知られている。当業者に周知の、ペプチドを環状化する代替方法が多数ある。例えば、ペプチドはラクタムまたはその他の化学架橋、ＰＥＧまたはその他の化学架橋剤、ペプチドライゲーションまたファージセレン結合（セレノシステイン間）を使って環状化することができる。
【０１０１】
２つ以上のペプチドまたはポリペプチドは、タンパク質化学技術によって結合することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基）またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基）を使った、現在利用可能な実験室設備を使って化学的に合成することができる（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）。当事者は、例えば開示するタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成されることを容易に理解することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは合成することができ、その合成樹脂から開裂することはできないが、他のペプチドまたはタンパク質の断片は合成することができ、よって樹脂から開裂され、その結果、他の断片において機能的にブロックされている末端基をさらす。ペプチド縮合反応により、これらの２つの断片は、ペプチド結合によってそれらのカルボキシルおよびアミノ末端のそれぞれにおいて共有結合され、抗体またはその断片を形成することができる（Ｇｒａｎｔ  ＧＡ（１９９２） ＳｙｎｔｈｅｔｉＣ−Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．（１９９２）；Ｂｏｄａｎｓｋｙ  ＭおよびＴｒｏｓｔ  Ｂ．，Ｅｄ．（１９９３）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，ＮＹ、これらを少なくともペプチド合成に関する資料として、参照のため、本明細書に援用する）。一旦単離されると、同様のペプチド縮合反応により、これらの独立したペプチドまたはポリペプチドを連結して、ペプチドまたはその断片を形成することができる。
【０１０２】
例えば、クローン化または合成されたペプチドセグメントの酵素ライゲーションにより、比較的短いペプチドセグメントを結合させ、大きなペプチドセグメント、ポリペプチドまたは全タンパク質ドメインの製造が可能になる（Ａｂｒａｈｍｓｅｎ  Ｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：４１５１（１９９１））。あるいは、合成ペプチドの天然化学ライゲーションを利用して、短いペプチドセグメントから大きなペプチドまたはポリペプチドを合成的構築することができる。この方法は、２つのステップの化学反応より構成される（Ｄａｗｓｏｎら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：７７６７７９（１９９４））。第１ステップでは、無保護の合成ペプチドチオエステルとアミノ末端システイン残基を含む別の無保護のペプチドセグメントとの官能基選択的反応により、最初の共有性製造物として、チオエステル結合中間体を製造する。反応条件の変更を行わずに、この中間体は自発性迅速分子内反応を経て、連結部位において本来のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ  Ｍら、（１９９２）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０７：９７〜１０１；ＣｌａｒｋＬｅｗｉｓ  Ｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１６０７５（１９９４）；ＣｌａｒｋＬｅｗｉｓ  Ｉら、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：３１２８（１９９１）；  Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ  Ｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６６２３〜３０（１９９４））。
【０１０３】
あるいは、化学ライゲーションの結果として、ペプチドセグメント間に形成される結合が非天然（非ペプチド）結合である場合は、無保護のペプチドセグメントを化学的に連結させる（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，  Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：２２１（１９９２））。この技術は、タンパク質ドメインの類似体、および十分な生物学的活性を有する大量の比較的に純粋なタンパク質の合成に用いられてきた（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎ  ＲＣら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．２５７〜２６７（１９９２））。
【０１０４】
鏡像ファージディスプレイを使用して、Ｎ−三量体ポケットと結合してＨＩＶ侵入を穏やかな作用強度で阻害するＤ−ペプチドを発見することができる。例えば、Ｄ−ペプチドのスクリーニングにおける鏡像ファージディスプレイの使用において、第１Ｄ−ペプチドを、ＨＩＶ糖タンパク質由来の第１Ｌ−ペプチドから合成することができる。この第１Ｌ−ペプチドは、自然発生するＬ−ペプチド、または設計されたペプチド配列および天然ペプチド配列のキメラとすることができる。この方法はさらに、第１Ｄ−ペプチドと特異的に結合する第２Ｌ−ペプチドのスクリーニングを含むことができ、その後第２Ｌ−ペプチドの鏡像である第２Ｄ−ペプチドを合成することができる。本明細書に記載するＤ−ペプチドスクリーニング方法の一態様では、Ｎ−三量体標的を先ずＤ−アミノ酸と合成させて、天然Ｌ−Ｎ−三量体標的の鏡像を製造する。Ｄ−Ｎ−三量体標的は、ファージディスプレイ、リボゾ−ムディスプレイおよび／またはＣＩＳディスプレイなどの標準ペプチドベーススクリーンに使用して、Ｄ−Ｎ−三量体に結合するＬ−ペプチドを同定することができる。それから同定されたＬ−ペプチドはＤ−アミノ酸と合成させることができる。対称律により、結果として生じるＤ−ペプチドは天然のＬ−Ｎ−三量体と結合させ、ＨＩＶプレヘアピン中間体のＮ−三量体領域を標的とし、これによってＨＩＶ感染の治療または阻害を行う。このスクリーニング法は、Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒらによる、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｉｒｒｏｒ−ｉｍａｇｅ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９６  Ｍａｒ  ２９；２７１（５２５７）：１８５４〜１８５７にも記載されており、この全体を本明細書において参照として援用する。
Ｄ．組成物の使用方法
１．組成物を研究ツ−ルとして使用する方法
【０１０５】
本明細書に、１０未満のコアの残基長のペプチドを含む組成物の能力を、細胞へのウイルス侵入阻害能力について評価する方法を開示し、この方法には、当該成分が相互作用するのに十分な条件において、組成物および細胞をインキュベ−ションするステップ；当該成分をウイルスと接触させるステップ；およびウイルスの細胞内侵入を阻害する組成物の能力を評価するステップを含んでいる。ペプチドは、７，８，９または１０未満のコアアミノ酸残基を含むことができる。ペプチドは上述の開示のように、多量体として存在することができる。組成物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１などのウイルス貫通膜タンパク質と相互作用することにより、ウイルスの侵入を阻害することができる。ペプチドはＤ−ペプチドとすることができる。さらに、ウイルス侵入を阻害する組成物の能力の評価は、レポーター手段の検出によって行うことができる。このようなレポーター手段の例として、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤または酵素があるが、これらに限定されない。ウイルス侵入を阻害する組成物の能力の評価は、その結合部位（ｇｐ４１ Ｎ−三量体ポケット）から他の化合物（例えば、ペプチド、小分子、核酸、天然物）によって転位される組成物の能力を評価することによって行うことができる。「転位される」とは、組成物が結合を阻害される、または結合部位とのその相互作用を妨害されることを意味する。これは、結合部位から試験組成物の５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５または１００％転位において発生し得る。
【０１０６】
ウイルス侵入を阻害する組成物の能力は、ウイルス侵入アッセイまたは細胞間融合アッセイを使用して測定することができる。ウイルス侵入アッセイは、細胞間融合アッセイとして当事者に周知である。当事者は、試験組成物を他の結合部位から転位することのできる、その他の化合物を含む転位アッセイを使用することができる。例として、ペプチド、小分子、核酸または天然物が含まれるが、これらに限定されない。このような転位アッセイは当業者に周知である。
【０１０７】
また、単一ペプチドのうちの１つの親和性と比較して、Ｎ−三量体分子のために増大された親和性を有する多量体を同定する方法も開示し、この方法は、多量体およびＮ−三量体分子をインキュベ−ションするステップ；Ｎ−三量体分子の多量体の親和性を測定するステップ；およびＮ−三量体分子の多量体の親和性を単一ペプチドのＮ−三量体分子の親和性と比較するステップを含む。
【０１０８】
さらに、単一ペプチドの抗ウイルス活性と比べてＮ−三量体分子の増強された抗ウイルス活性を有する多量体を同定する方法を開示し、この方法は、多量体を細胞でインキュベ−ションするステップ；ステップ（ａ）の成分をウイルスと接触させるステップ；多量体の抗ウイルス活性を測定するステップ；および多量体の抗ウイルス活性を単一ペプチドの抗ウイルス活性と比較するステップを含んでいる。単一ペプチドは多量体の成分のうちの１つと同じであってもよいし異なってもよい。多量体はウイルスｇｐ４１のＮ−三量体ポケットと相互作用する、少なくとも１つのペプチドを含むことができる。
【０１０９】
ｇｐ４１の複合体形成の阻害は、蛍光アッセイ（例えばＦＲＥＴ）などの手段により、複合体の２つのメンバーの結合の発生する程度を決定することによって評価することができる。この手段において、Ｃ３４およびＮ３６はそれぞれ、一組のドナーアクセプター分子のメンバーによって標識化される、またはペプチドのうちの１つのペプチドの片方の端部（例えば、Ｃ３４のＮ−末端）がそのような対（ＥＤＡＮＳ）のうちの片方によって標識化される、そしてＮ３６ペプチドに存在する天然の蛍光性トリプトファンが、ドナー／アクセプター対のもう片方のメンバーによって標識化される。Ｃ３４とＮ３６との結合は、アクセプターモデルから発光が生じる程度、および／または放出された光の波長スペクトルが変化する程度によって評価される。候補薬物による結合の阻止により、発光の程度が変化する、および／またはＣ３４とＮ３６の結合が発生した場合における波長の変化が阻止される。あるいは、Ｃ３４は（例えば、キナーゼまたは放射性ＡＴＰで標識化することのできるキナーゼ認識部位を有する変異体Ｃ３４を合成することにより）放射標識などの検出可能な標識によって標識化することができる。放射標識化されたＣ３４および候補薬物は、固体面（例えば、ビーズまたはプラスチックウェル）に固定化されたＮ３６と合わせて、このようにして試験試料を製造する。標識化されたＣ３４と固定化されたＮ３６との結合発生の程度を決定し、候補薬物（対照試料内において）は存在しないが、試験試料が受ける条件と同じ条件下で、標識化されたＣ３４の固定化されたＮ３６との結合が生じる程度と比較する。典型的には、この評価は、Ｃ３４とＮ３６の結合が生じる適切な条件下で試料を十分な時間保持し、その後結合していないＣ３４および薬物候補を洗浄して除去した後に行う。試験試料において、固定化されたＮ３６に結合した放射標識が対照試料よりも少ないことによって明らかなように、試験試料において、結合が対照試料よりも少ない程度で生じた場合、その候補薬物はＣ３４とＮ３６の結合の阻害剤である。あるいは、Ｃ３４における標識またはタグを結合対のメンバーとすることができ、もう片方のメンバーをＮ３６への結合を検出するために使用することができる。例えば、Ｃ３４はビオチンデータグ付けすることができ（例えば、標準的な固相ペプチド合成によって）、これを候補薬物（試験試料）と共に、または候補薬物（対照薬物）を欠いた状態においてＮ３６と合わせる。このＮ３６は溶液状態であってもよいし、あるいはビーズ、ウェルまたは平坦／平面状の表面などの固体表面に結合させてもよい。Ｃ３４のＮ３６への結合は、標識化されたストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジン−−ＨＲＰ，ストレプトアビジン−−ＡＰまたはヨウ素化ストレプトアビジン）を使用することにより、Ｎ３６に会合するビオチンの存在を検出することによって評価することがでる。ストレプトアビジンはＣ３４上のビオチンをに結合し、それ自身その標識化によて検出される。結合が候補薬物（試験試料）の存在する場合の方が候補薬物（対照試料）の存在しない場合よりも少なく生じた場合、試験試料内の方が対照試料内よりもＮ３６に検出されるビオチンが少ないことによって示されるように、その候補薬物はＣ３４／Ｎ３６結合の阻害剤である。このような候補薬物は、例えば合成有機化合物またはランダムなペプチド配列のライブラリーから得ることができ、合成的に、または組換え技術によって製造することができる。
【０１１０】
同様に、Ｃ３４／Ｎ３６の結合を破壊する候補薬物の能力を評価して、Ｃ３４／Ｎ３６の阻害剤、よってＨＩＶ感染の阻害剤を同定することができる。本実施形態では、予め形成するＣ３４／Ｎ３６複合体を候補薬物と結合させ、これに関してこの結合を破壊する能力について評価し、そうすることによって試験試料を製造する。対照試料は試験試料と同じであるが、対照試料は候補薬物を含んでおらず、試験試料と同じ様に処理する。Ｃ３４／Ｎ３６結合が候補薬物の存在下で破壊され、対照試料の存在下では破壊されない場合、または複合物の破壊が対照試料内よりも試験試料内において多く発生する場合、その候補薬物はＣ３４／Ｎ３６の阻害剤（破壊剤）である。Ｃ３４／Ｎ３６結合の検出／阻止／妨害を検出するための結合破壊の検出は、上述の様に行うことができる（例えばＦＲＥＴまたは蛍光アッセイ、放射標識またはビオチンなどその他の検出可能標識の検出により）。
【０１１１】
別の実施形態において、本発明は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する薬物を同定する方法に関するものである。この場合も、アッセイは結合の欠失または減少の評価に基づくものであるが、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックス領域によって形成される溝の任意の部分との相互作用を含む、または検出するより一般的なアッセイである、上述のＣ３４／Ｎ３６複合体アッセイとは異なり、本実施形態ではＨＩＶ  ｇｐ４１疎水性ポケット（Ｎ−ヘリックスコイルドコイルキャビティ）に注目している。本実施形態において、この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する能力について評価する候補薬物を、タンパク質のコイルドコイル領域の三量体形態およびＨＩＶ  ｇｐ４１キャビティを含むのに十分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド部分を含む融合タンパク質と、ペプチドまたはその他の分子による結合のためにＨＩＶ  ｇｐ４１キャビティを提示するのに適切な条件下において合わせるステップ；およびその候補薬物が融合タンパク質に結合するかどうかを決定するステップ（例えば、高処理スクリーニングによって）を含んでいる。結合が生じる場合、その候補薬物は「ヒット（ｈｉｔ）」であり、この候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する薬物である可能性がある。結合が生じる場合、その候補薬物はＮ−ヘリックスコイルドコイルと結合しており、コイルドコイルキャビティと結合していると決定することができる。このような「ヒット」は、細胞間融合アッセイおよびＨＩＶ感染性アッセイなどの二次アッセイでスクリーニングを行い、その候補薬物が薬物となるかどうかを決定する。あるいは、またはさらに、このような「ヒット」は、ポケット結合分子が結合しない他の融合タンパク質（またはペプチド）を用いた対照スクリーニングによって、さらに評価することができる。
【０１１２】
さらなる実施形態では競合アッセイを実行する。本実施形態では、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合するペプチドまたはタンパク質を、候補薬物および融合タンパク質と合わせ、その候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１キャビティに結合するかどうかを、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドキャビティと結合するペプチドの存在下で決定する。その候補薬物が融合タンパク質と結合する場合、それはＨＩＶ  ｇｐ４１キャビティに結合する薬物である。例えば、ＧＣＮ４の三量体形態のコイルドコイル領域と、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルキャビティを含むＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドのＣ−末端とを含む融合タンパク質（ＩＱＮ１７）を、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルキャビティと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する能力を評価される候補薬物と結合する「参照」Ｄ−ペプチド（例えば、本明細書に記載する任意のＤ−ペプチドまたはその変異体）と合わせて試験試料を製造し、これをＤ−ペプチドのキャビティへの結合に適切な条件で維持する。候補薬物を除いて試験試料と同じ成分を含み、試験試料と同様に取り扱われる対照試料も評価する。両方の試料において、参照Ｄ−ペプチドの結合を評価する。参照Ｄ−ペプチドの結合が、候補薬物（試験試料内）の存在する方が、それが存在しない（対照試料内）よりも少なく発生する場合、その候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する薬物である。結合の検出は、例えば本開示のＣ３４／Ｎ３６実施形態として上記に示すものと同じ様に評価する。例えば、Ｄ−ペプチドは放射標識または結合対の第１メンバー（例えばビオチン）などの検出可能な標識によって標識化し、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルキャビティが標識化されている範囲（参照Ｄ−ペプチドのキャビティへの結合に適切な条件下で試料を維持した後に）を決定する。放射標識化を使用する場合、融合タンパク質が放射標識化されている範囲を試験試料内で評価し、対照試料において融合タンパク質が放射標識化されている範囲と比較する。検出可能な標識が結合対の第１メンバー（例えばビオチン）である場合、その対の第２メンバー（結合パートナー）を試料に加え、融合タンパク質が参照Ｄ−ペプチドに結合されている範囲を検出する。これは直接的または間接的に行うことができる（例えば、結合対の第２メンバーに結合する抗体またはその他の部分などの分子を付加することによって）。その候補薬物がＤ−ペプチドのキャビティへの結合を阻害する（全体的または部分的に）場合、融合タンパク質（Ｎ−ヘリックスコイルドコイルキャビティ）上にはより小さな範囲の標識が存在する。対照試料（候補薬物が存在しない）内よりも試験試料 （候補薬物が存在する）内の方が少ない範囲で結合が起こる場合、その候補薬物はＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する薬物である。
【０１１３】
Ｄ−エナンチオマーにおけるＩＱＮ１７またはその変異体は、ライブラリーまたはコレクションのメンバーであり、ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合する分子または化合物の同定に有益である。例えば、ファージディスプレイライブラリーなどの分子または化合物のライブラリーもしくはコレクションは、Ｄ−エナンチオマーにおいてＩＱＮ１７でスクリーニングを行い、ポケットに結合するメンバーを同定することができる。これは本明細書に記載するように問題なく行われる。ＩＱＮ１７の鏡像またはその変異体は、標識分子として使用する。本明細書で使用する「ポリペプチのＤ−エナンチオマー」および「Ｄ−ペプチド」という用語は、天然の掌体における分子の正確な鏡像を指す。よって、ＩｌｅおよびＴｈｒなどの第２キラル中心を含むアミノ酸残基において、自然に発生するアミノ酸残基の正確な鏡像は、ポリペプチドのＤ形態の製造に使用される。また本明細書で使用する「Ｄ−アミノ酸」および「Ｌ−アミノ酸」という用語は、どちらも非キラルアミノ酸グリシンを含むことを意味する。Ｄ−ＩＱＮ１７は、結合対の片方のメンバー（例えばビオチン）をそれに付加し、さらに対のもう片方のメンバー（例えばストレプトアビジン）を固体表面に付加することなどにより、固体表面に固定化することができる。これら２つのメンバーの結合により、ファージパンニングなどのための、Ｄ−ＩＱＮ１７の固定面へ固定化される。酵素認識部位（例えば、Ｌ−リジン残基が使用されるＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙなどのアミノ酸リンカー）であるリンカーを、Ｄ−ＩＱＮ１７配列と結合対メンバーとの間（ビオチンとＤ−ＩＱＮ１７との間）に配置して、酵素認識部位 （この場合はトリプシン認識部位）を提供し、結合ファージを酸添加などの非特定溶出よりも、トリプシン消化によって溶出するようにする。ファージディスプレイライブラリーは、適切なファージ遺伝子に融合された任意の適切な長さのＬ−アミノ酸ペプチドのライブラリーとすることができる。一実施形態において、これはＭ１３ファージのｇＩＩＩ遺伝子に融合されるＬ−アミノ酸ペプチドのファージディスプレイライブラリーである。一実施形態において、ペプチドは、システインまたはセリンガー両側に隣接する１０のランダムにコード化されたアミノ酸残基を含んでいる。典型的には、一連のパンニングを数回行う。Ｄ−ＩＱＮ１７特異的結合ファージを同定する。Ｄ−ＩＱＮ１７のｇｐ４１領域のみに結合するファージは、抗原を欠くウェルに対するスクリーニング、および分子のパネルに対するさらなる試験などの、パンニング後の評価によって同定することができる。例えば、特異的なポケットに結合するファージには、Ｄ−ＩＱＮ１７には結合するが、Ｄ−ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ（ＩＱＮ１７と同様に３つの表面突然変異がある）または疎水性ポケットに点突然変異のあるＤ−ＩＱＮ１７の形態、グリシン３９がトリプトファンに突然変異し、ポケット内へ大きく突出してしまうＤ−ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）とは結合しないものが含まれる。このようにして同定されるＤ−ペプチドは、細胞間融合アッセイおよびＨＩＶ感染性アッセイなどの周知のアッセイを使用して、ＨＩＶ  ｇｐ４１を阻害する能力について評価することができる。本明細書に記載する鏡像ファージディスプレイ法は、ＩＱＮ１７およびＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）、ならびにそれらのＤ−エナンチオマーの、ｇｐ４１ポケットに結合するＨＩＶ−１侵入阻害剤を同定する価値を実証した。同定された９つの特異的なポケット結合ファージ配列（Ｄ−ＩＱＮ１７には結合するがＤ−ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）には結合しないファージ）のうち、８つはコンセンサスＥＷＸＷＬ配列を含んでおり、Ｄ−ペプチドとして試験した際に、ＨＩＶ−１ ｇｐ４１により誘導されるシンシチウム形成を阻害する。９番目のペプチドは細胞に有毒であったため、さらなる試験は行わなかった。
【０１１４】
ＩＱＮ１７およびＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）のＤ形態を、天然酵素による酵素的分解を受けない他のポケット結合分子を発見するために、他の生物学的にコード化されたライブラリーと同様の方法で使用することができる。例えば、他のファージディスプレイライブラリーを使用して、新しいＤ−ペプチド阻害剤（例えば、両側に隣接するシステイン残基間で異なる数の残基を有するもの、および／またはシステイン残基の両側に隣接する領域の外にランダムにコード化されたアミノ酸残基を有するもの、および／または２つ以上のシステイン残基を有するもの）を同定することができる。ファージを使用せずにペプチドライブラリーをコード化するための戦略（例えば、コード化するｍＲＮＡをペプチドに付着させる）を、Ｄ−ペプチド阻害剤の同定に使用することができる。ＲＮＡまたはＤＮＡライブラリーを使用して（例えばＳＥＬＥＸ法により）、疎水性ポケットには結合するが、天然のヌクレアーゼの基質には結合しないＬ−リボ−スまたはＬ−デオキシリボース塩基ＲＮＡまたはＤＮＡアプタマーをそれぞれ同定することができる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、ＰＮＡＳ，７４：１１２８５（１９９７）参照のこと）。
【０１１５】
天然のＬ−掌体にあるＩＱＮ１７およびＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）の形態も同様に、生物学的にコード化されたライブラリーと共に使用することができるが、最も可能性のある適用は、他の非生物学的にコード化されたライブラリーとの使用であろう。例えば、（１ビーズに１化合物の多様性を有する）ビーズにおける化学的なコンビナトリアルライブラリーを、（例えば、放射性または発色基により）標識化されたＩＱＮ１７を用いてスクリーニングを行い、ＩＱＮ１７に結合する分子を含むビーズを同定することができる。この例において、ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）を対抗スクリーニングとして使用し、ビーズ上の分子がＩＱＮ１７のポケットに結合するかどうかを決定することができる（分子がＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）に結合した場合、それらはポケット結合分子であるとは考えられない）。別の例として、ＩＱＮ１７が予め結合しているビーズを、潜在的なポケット結合分子の混合物（例えば、化学材料または天然抽出物の混合物）とインキュベーションすることができる。その後（ビーズに結合している）ＩＱＮ１７を混合物から分離し、洗浄し、次いで、ビーズ上のＩＱＮ１７に結合している分子を溶出させる条件（例えば、有機溶媒、低ｐＨ、高温度）に供することができる。溶出された分子（すなわち潜在的なポケット結合分子）を分析化学的方法（例えば、ＨＰＬＣ、質量分析法）によって同定することができる。ＩＱＮ１７（Ｇ３９Ｗ）を用いた対抗スクリーニングは、真のポケット結合分子の同定を助けるために有用である。
【０１１６】
上述の方法によって同定された薬物を、その後、ＨＩＶ  ｇｐ４１の機能（膜融合）、すなわち細胞内侵入を（完全または部分的に）阻害するその能力についてさらに試験する。これは、本明細書中に記載するシンシチウムアッセイおよび／または感染性アッセイあるいは当業者に周知であるその他のアッセイなどのインビトロアッセイ、および／または適切な動物モデルもしくはヒトにおけるインビボアッセイをさらに使用して行う。
【０１１７】
本発明の一実施形態は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル、特にＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに結合する薬物を同定する方法である。この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットを結合する能力についての評価対象の候補薬物と、可溶性三量体のコイルドコイル、およびＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットを含むために充分なＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチド部分を含むペプチドとを、分子または化合物（例えば薬物）による結合に関して、ＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットの提示に適切な条件下で合わせるステップ；および、その候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットに結合するかどうかを決定するステップを含む。候補薬物とＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットとの結合が生じた場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合する薬物である。任意選択により、候補薬物の結合は、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルポケットに結合するペプチド（ポケットに結合するペプチドとして以前に同定されたペプチド）を候補薬物およびペプチドと合わせることを除き、上記に記載するアッセイで評価することができる。このような競合アッセイにおいて、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに対する候補薬物の結合を、周知の結合部分（ポケットに結合する分子または化合物）の存在下で評価する。候補薬物の結合がその周知の結合部分の存在下で生じた場合、その候補薬物は、周知の結合部分と充分に競合する充分な親和性でＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する薬物である。この実施形態において使用する融合タンパク質は、可溶性三量体形態のコイルドコイル、例えば、タンパク質の可溶性三量体形態のコイルドコイル領域と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のキャビティを含むのに充分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドとを含む。あるいは、本明細書中に示すＨＩＶ  ｇｐ４１の配列変異体、ヒトウイルスの別の株（例えば、ＨＩＶ−２）に由来する配列、または別の種（例えば、ＳＩＶ、ネコ免疫不全症ウイルス、Ｖｉｓｎａウイルス（Ｍ．Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、２９０：１０３１（１９９９））に由来する配列を、融合タンパク質または可溶性モデルにおいて使用することができる。融合タンパク質は、任意のタンパク質の可溶性の三量体状のコイルドコイルを含むことができる。ただしそれがＨＩＶ成分を有する融合タンパク質にある場合、ＨＩＶキャビティは結合が得られるような方法で提供される。これは例えば、ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ、ＧＣＮ４−ｐＩＩ、モロニ−マウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）またはＡＢＣヘテロ三量体の融合タンパク質であり得る。一実施形態において、融合タンパク質はＤ型のＩＱＮ１７である。別の実施形態において、融合タンパク質は天然のＬ掌体のＩＱＮ１７である。
【０１１８】
競合アッセイ形式において、Ｎ−ヘリックスコイルドコイルのキャビティに結合することが知られているペプチドはどれも、周知の結合部分として使用することができる。例えば、本明細書中に記載するペプチドの何れか、あるいはその変異体またはその一部を使用することができる。また、ペプチドでない任意のポケット結合分子を競合アッセイ形式において使用することができる。競合アッセイは溶液中、ビーズ上または固体表面で実行することができる。
【０１１９】
一実施形態において、候補薬物を検出可能に標識化し、候補薬物のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルへの結合を、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイル上の検出可能な標識の存在を検出することによって決定する（標識化された候補薬物のＮ−ヘリックスコイルドコイルへの結合の結果として）。可溶性モデルのヘリックスコイルドコイルポケット上の標識の検出により、候補薬物のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットへの結合が示され、候補薬物がＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する薬物であることが示される。標識化された候補薬物が融合タンパク質上で検出された場合、その候補薬物はＮ−ヘリックスコイルドコイルのキャビティに結合する薬物である。
【０１２０】
ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する薬物を同定する方法の別の実施形態において、薬物による結合に利用できるような方法で、ポケットを提示する可溶性モデルを候補薬物と合わせ、候補薬物と可溶性モデルのＮ−ヘリックスコイルドコイルとの結合が生じるかどうかを決定する。結合が生じる場合、その候補薬物は、ポケットに結合する薬物である。この場合もまた、競合アッセイ形式を使用することができる。競合アッセイの成分（例えば、ＩＱＮ１７およびＤ−ペプチド）を、蛍光基／消光基の組み合わせを含む様々な検出可能な標識のうちの何れかによって標識化することができる。候補薬物を、上述の様に、様々な検出可能な標識のうちの何れかで標識化することができる。この実施形態において使用する可溶性モデル（融合タンパク質）の成分、および競合アッセイ形式において使用する競合部分もまた、上述の通りとすることができる。
【０１２１】
本発明はまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに結合する薬物を製造する方法に関するものである。一実施形態において、この方法を下記のように行う；ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを提示する可溶性モデル、または可溶性の三量体コイルドコイルを含む融合タンパク質を、薬物による結合のためのＨＩＶ  ｇｐ４１ポケットの提示に適切な条件下で、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットと結合させ、細胞内への侵入を阻害するその能力について評価される候補薬物と合わせる。その候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットと結合するかどうかを決定し、この場合、候補薬物のＨＩＶ  ｇｐ４１におけるＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットへの結合が生じる場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する薬物である。本実施形態において、融合タンパク質として、可溶性三量体コイルドコイルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを含むのに充分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドとを含む、本明細書中に記載するＩＱＮ１７をこの方法において使用することができる；ＩＱＮ１７のＤエナンチオマーもまた、（例えば、鏡像ファージ適用において）使用することができる。ＨＩＶの細胞内侵入を阻害するために製造された薬物の能力は、本明細書中に記載するように、例えば、シンシチウムアッセイおよび／または感染性アッセイにて評価する。そのような能力は、適切な動物モデル、またはヒトにおいてさらに評価することができる。
【０１２２】
本発明はまた、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する薬物を製造する方法に関するものである。この方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの可溶性モデルを製造、または得るステップ；ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合するその能力について評価する候補薬物（分子または化合物）と、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの可溶性モデルとを合わせるステップ；およびその候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合するかどうかを決定するステップを含む。その候補薬物がＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合する薬物である。その結果、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルキャビティに結合する薬物を製造する。本実施形態において使用する融合タンパク質は本明細書中に記載されており、例えば、ＩＱＮ１７、ＩＱＮ１７のＤエナンチオマー、またはその変異体であり得る。あるいは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物は、下記のステップを含む方法によって製造することができる：本明細書中に記載する、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットの可溶性モデルを製造、または得るステップ；この可溶性モデルと、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットを結合するその能力について評価される候補薬物とを合わせるステップ；その候補薬物が可溶性モデル（融合タンパク質）のＮ−ヘリックスコイルドコイルのポケットに結合するかどうかを決定するステップ、この場合、結合が生じる場合、その候補薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合する薬物である；およびＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合してＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物の能力を評価するステップ、この場合、その薬物がＨＩＶの細胞内侵入を阻害する場合、その薬物は、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに結合してＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物である。ＨＩＶの細胞内侵入を阻害するその能力は、（例えば、シンシチウムアッセイ、感染性アッセイにおいて）インビトロで、あるいは（例えば、適切な動物モデルまたはヒトにおいて）インビボで評価することができる。可溶性モデルは、タンパク質の可溶性三量体コイルドコイルなどの可溶性三量体コイルドコイルおよび、ＨＩＶ  ｇｐ４１のポケットを含むのに十分な部分のＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ペプチドを含むペプチドであり得る。
【０１２３】
本明細書中に記載する方法および他の方法によって同定または製造される薬物であって、ＨＩＶ  ｇｐ４１の特定のＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合してＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物もまた本発明の課題である。
【０１２４】
本明細書中に記載する方法および他の方法によって同定または製造される薬物であって、ＨＩＶ  ｇｐ４１の２つ以上のＮ−ヘリックスコイルドコイルに結合して、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する薬物もまた本発明の課題である。そのような薬物は、阻害の有効性を増大させるために、例えば、適切なリンカー（例えば、アミノ酸残基または他の化学的部分）を介して、２つ以上のポケット結合分子（薬物）を連結することによって得ることができる。連結されるポケット結合分子は同じであっても、異なっていてもよい。本明細書中に記載する方法または他の方法によって同定または製造される薬物であって、ＨＩＶ  ｇｐ１２０，ＣＤ４，ＣＣＲ５，ＣＸＣＲ４，またはＨＩＶ  ｇｐ４１の非ポケット領域への結合に加え、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮ−ヘリックスコイルドコイルポケットに結合する薬物もまた本発明の課題である。
【０１２５】
ＨＩＶ  ｇｐ４１を阻害する薬物はまた、本明細書中に示すＩＱＮ１７と２Ｋ−ＰＩＥ１との複合体のＸ線結晶構造を参照して設計または改善することができる。あるいは、またはさらに、ＨＩＶ  ｇｐ４１を阻害する薬物は、本明細書中に示す、遊離ＩＱＮ１７のＸ線結晶構造を参照して設計または改善することができる。
【０１２６】
本明細書中に記載するようにして同定された化合物および分子（薬物）は、ＨＩＶの細胞内侵入を（部分的または完全に）阻害し、よって、未感染個体（ヒト）および感染個体において、（例えば、未感染個体における感染を防止または低減するために、感染個体におけるさらなる感染を低減または予防するために）治療的に有用であり、そして、ｇｐ４１により誘導される膜融合の機構を研究するための研究用試薬、および個体によるウイルスクリアランス速度を評価するための研究用試薬の両方として有用であり、また、ＨＩＶの細胞内侵入を阻害する他の化合物および分子（薬物）を発見または開発するための試薬として有用である。本明細書中に記載するるＤ−ペプチド（例えば、Ｄ１０ｐｅｐ５，Ｄ１０ｐｅｐ１）は、本明細書中に記載するる感染性アッセイにより、細胞の感染を阻害することが分かっている。その他のＤ−ペプチドは、感染性を阻害するその能力について同様に評価することができる。
【０１２７】
上述の様に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を使って推定阻害剤を同定し、相互作用を迅速に同定することができる。この技術の根底にある理論は、２つの分子が空間的に接近している場合、すなわち、自然に存在するよりも近いレベルで相互作用する場合、信号が製造される、または信号をクエンチすることができるというものである。そして、例えば推定阻害剤の添加を含む、種々の実験を行うことができる。その阻害剤が２つの信号分子間の相互作用と競合する場合、それらの信号を空間で相互に取り除き、そうすることにより、使用する信号の種類に応じて信号が増減する。このような信号の増減は、推定阻害剤の存在または不在と関連づけることができる。任意の信号手段を使用することができる。例えば、開示する任意の２つの分子間の相互作用の阻害剤を特定する方法を開示する。この方法は下記のステップを含む；推定阻害剤の存在下で、第１分子と第２分子とを接触させるステップであって、第１分子または第２分子は蛍光ドナーを含み、ドナーを含まない第１分子または第２分子は、典型的には蛍光アクセプターを含むステップ；および、推定阻害剤の存在する場合と存在しない場合において蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を測定するステップ。このステップにおいて、推定阻害剤が存在する場合のＦＲＥＴの減少は、それが存在しない場合のＦＲＥＴ測定と比べて、推定阻害剤が２つの分子間の結合を阻害することを示している。このような方法は、細胞システムにおいても行うことができる。
【０１２８】
新規(ｄｅ  ｎｏｖｏ)活性化または修飾活性化を有するタンパク質を単離させる多くの方法がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーは、特定の標的と相互作用する多数のペプチドを単離させるために使用されてきた。（例えば米国特許第６，０３１，０７１号、５，８２４，５２０号、５，５９６，０７９号および５，５６５，３３２号参照のこと。これらを、少なくともファージディスプレイ関連材料およびコンビナトリアルケミストリーに関する方法に関して、本明細書に参照として援用する。）
【０１２９】
当業者に周知である方法論を用い、種々のコンビナトリアルなライブラリーと併せて、所望の標的と結合または相互作用する小分子を単離し、特徴づけることができる。当業者に周知の競合的な結合研究を使って、これらの化合物の相対的結合親和性を比較し、最適な化合物を同定することができる。
【０１３０】
所望の標的に結合する分子を単離させるためのコンビナトリアルなライブラリーの作製およびコンビナトリアルなライブラリーのスクリーニング技術は当業者に周知である。代表的な技術および方法は、下記の米国特許に見つけることができるが、それらに限定されない；米国特許第５，０８４，８２４号、５，２８８，５１４号、５，４４９，７５４号、５，５０６，３３７号、５，５３９，０８３号、５，５４５，５６８号、５，５５６，７６２号、５，５６５，３２４号、５，５６５，３３２号、５，５７３，９０５号、５，６１８，８２５号、 ５，６１９，６８０号、 ５，６２７，２１０号、５，６４６，２８５号、５，６６３，０４６号、５，６７０，３２６号、５，６７７，１９５号、５，６８３，８９９号、５，６８８，６９６号、５，６８８，９９７号、５，６９８，６８５号、５，７１２，  １４６号、 ５，７２１  ，０９９号、 ５，７２３，５９８号、 ５，７４１，７１３号、５，７９２，４３１号、５，８０７，６８３号、５，８０７，７５４号、 ５，８２１  ，１３０号、５，８３１  ，０１４号、 ５，８３４，１９５号、 ５，８３４，３１８号、 ５，８３４，５８８号、 ５，８４０，５００号、 ５，８４７，１５０号、 ５，８５６，１０７号、 ５，８５６，４９６号、 ５，８５９，１９０号、５，８６４，０１０号、５，８７４，４４３号、 ５，８７７，２１４号、 ５，８８０，９７２号、 ５，８８６，１２６号、５，８８６，１２７号、５，８９１，７３７号、５，９１６，８９９号、 ５，９１９，９５５号、５，９２５，５２７号、５，９３９，２６８号、 ５，９４２，３８７号、５，９４５，０７０号、５，９４８，６９６号、５，９５８，７０２号、 ５，９５８，７９２号、 ５，９６２，３３７号、５，９６５，７１９号、 ５，９７２，７１９号、５，９７６，８９４号、５，９８０，７０４号、 ５，９８５，３５６号、 ５，９９９，０８６号、６，００１，５７９号、 ６，００４，６１７号、６，００８，３２１号、 ６，０１７，７６８号、６，０２５，３７１号、 ６，０３０，９１７号、 ６，０４０，１９３号、 ６，０４５，６７１号、６，０４５，７５５号、 ６，０６０，５９６号および６，０６１，６３６号。
【０１３１】
コンビナトリアルなライブラリーは、多くの様々な合成技術を使って、多岐にわたる分子から作製することができる。例えば、融合２，４−ピリミジンジオン（米国特許第６，０２５，３７１号）、ジヒドロベンゾピラン（米国特許第６，０１７，７６８号および第５，８２１，１３０号）、アミドアルコール（米国特許第５，９７６，８９４号）、ヒドロキシアミノ酸アミド（米国特許第５，９７２，７１９号）、炭水化物（米国特許第５，９６５，７１９号）、ｌ，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオン（米国特許第５，９６２，３３７号）、サイクリック（米国特許第５，９５８，７９２号）、ビアリールアミノ酸アミド（米国特許第５，９４８，６９６号）、チオフェン（米国特許第５，９４２，３８７号）、三環式テトラヒドロキノリン（米国特許第５，９２５，５２７号）、ベンゾフラン（米国特許第５，９１９，９５５号）、イソキノリン（米国特許第５，９１６，８９９号）、ヒダントインおよびチオヒダントイン（米国特許第５，８５９，１９０号）、インドール（米国特許第 ５，８５６，４９６号）、イミダゾールピリドインドールおよびイミダゾールピリドベンゾチオフェン（米国特許第５，８５６，１０７号）置換２−メチレン２，３−ジヒドロチアゾール（米国特許第 ５，８４７，１５０号）、キノリン（米国特許第５，８４０，５００号）、ＰＮＡ（米国特許第５，８３１，０１４号）、含有タグ（米国特許第５，７２１，０９９号）、ポリケタイド（米国特許第 ５，７１２，１４６号）、モルフォリノーサブユニット（米国特許第５，６９８，６８５号および第５，５０６，３３７号）、スルファミド（米国特許第５，６１８，８２５号）およびベンゾジアゼピン（米国特許第 ５，２８８，５１４号）を含むライブラリーがある。
【０１３２】
本明細書では、コンビナトリアルな方法およびライブラリーを含む従来のスクリーニング法およびライブラリー、ならびに反復ステップにおいて使用される方法およびライブラリーを使用する。本発明によるペプチドは、研究ツールとして種々の様式で使用することができる。例えば、配列ＩＤ番号：１〜２２などの本発明によるペプチドは、例えば、ウイルス侵入またはタンパク質の適切な折り畳みの阻害剤として作用することにより、ｇｐ４１の研究に使用することができる。
２．ウイルス侵入阻害方法
【０１３３】
本明細書に、ウイルスの細胞への感染を阻害する方法、またはウイルス侵入を阻害する方法を開示し、これらの方法には、ウイルスを本明細書に開示する組成物、ペプチドまたは多量体にさらし、そうすることによってウイルスの細胞への感染を阻害するステップを含んでいる。ウイルスはＨＩＶであり得る。ペプチドまたは多量体は薬学的組成物に含有させることができる。また、本明細書に記載する薬学的組成物を投与する方法も開示する。
【０１３４】
特定の実施形態において、本明細書に開示する、ウイルスの細胞への感染を阻害する方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーで作用強度増強カーゴに連結する、少なくとも１つのＤ−ペプチドを含む組成物を投与するステップを含む。特定の実施形態において、この方法は、少なくとも１つのＤ−ペプチドおよび作用強度増強カーゴを含む組成物を投与するステップを含んでおり、この少なくとも１つのＤ−ペプチドは配列ＩＤ番号：１〜２９のうちの少なくとも１つであり、作用強度増強カーゴは、コレステロール、脂肪酸およびアルカン鎖のうちの少なくとも１つである。このような一実施形態において、この方法はｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２を含む組成物を投与するステップを含んでいる。
【０１３５】
他の実施形態において、本明細書に開示する、ウイルスの細胞への感染を阻害する方法は、多量体骨格に連結する少なくとも３つのＤ−ペプチドを含む組成物を投与するステップを含んでおり、この少なくとも３つのＤ−ペプチドはＰＥＧリンカーで多量体骨格に連結している。このような特定の実施形態において、この方法は、多量体骨格に連結する少なくとも３つのＤ−ペプチドを含む組成物を投与するステップを含んでおり、この少なくとも３つのＤ−ペプチドは、配列ＩＤ番号：１〜２９のうちの少なくとも１つを含んでいる。このような一実施形態において、これらの方法は、ＰＥＧ4−ＰＩＥ１２−三量体を含む組成物を投与するステップを含んでいる。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示する、ウイルスの細胞への感染を阻害する方法は、多量体骨格に連結する少なくとも３つのＤ−ペプチドおよび少なくとも１つの作用強度増強カーゴを含む組成物を投与するステップを含んでいる。いくつかの特定の実施形態において、これらの方法は、多量体骨格に連結する少なくとも３つのＤ−ペプチドおよび少なくとも１つの作用強度増強カーゴを含む組成物を投与するステップを含んでおり、この場合、多量体骨格は、３つのＮＨＳエステル基および４つめの直交基を含むヘテロ四量体骨格である。さらに別の実施形態において、これらの方法は、多量体骨格に連結する少なくとも３つのＤ−ペプチドおよび少なくとも１つの作用強度増強カーゴを含む組成物を投与するステップを含んでおり、ここで、少なくとも１つの作用強度増強基は、４つめの直交基を介して、ＰＥＧリンカーによって多量体骨格に連結している。いくつかの特定の実施形態において、これらの方法は、多量体骨格に連結する少なくとも３つのＤ−ペプチドおよび少なくとも１つの作用強度増強カーゴを含む組成物を投与するステップを含んでおり、ここで、少なくとも１つの作用強度増強基は、コレステロール、脂肪酸またはアルカン鎖である。このような実施形態において、これらの方法は、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ12−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ16−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ36−ＰｌＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ57−ＰＩＥ１２−三量体、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ132−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ８脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ１６脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ１８脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ８アルカン−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃ１６アルカンＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体およびＣ１８アルカン−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体のうちの少なくとも１つを含む組成物を投与するステップを含んでいる。
【０１３７】
本明細書に開示する方法は、他のウイルス療法すなわち抗ウイルス剤と併せて使用することができる。これらの抗ウイルス剤のうちの１つまたは複数を使用することができ、それらは本明細書に開示する組成物による治療の前、治療中または治療後に投与することができる。例えば、治療中、被験者には、本明細書に記載する組成物を他の処置と一緒に投与することができる、つまり他の処置は、本発明の組成物による処置の約４８時間、２４時間、１２時間、８時間、４時間、２時間、１時間、３０分、２０分、１０分、５分または１分前に投与することができる。他の方法の処置も、本明細書に開示する組成物で処置を行う前に投与することができる。「治療前」とは、現在の治療の前に、別の形態による処置が与えられ、そして中止されることを意味する、または、現在の抗ウイルス剤の直前に与え、後から再度投与することも意味する。この場合、他の方法による抗ウイルス治療は、数年、数ヶ月、数週間、数日、数時間または数分前に行うことができる。他の方法による処置も、本明細書に開示する組成物による処置後に与えることもできる。「処置後」とは、現在の治療が行われた後に別の形態の処置を行うこと、または、現在の治療前に行い、後に再度行うことを意味する。この追加の抗ウイルス剤は、現在の治療後、数年、数ヶ月、数週間、数日、数時間または数分後に与えることができる。
【０１３８】
さらなる抗ウイルス剤はウイルス複製阻害剤、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、ウイルス逆転写酵素阻害剤、ウイルス侵入阻害剤、ウイルスインテグラーゼ阻害剤、ウイルスＲｅｖ阻害剤、ウイルスＴａｔ阻害剤、ウイルスＮｅｆ阻害剤、ウイルスＶｐｒ阻害剤、ウイルスＶｐｕ阻害剤およびウイルスＶｉｆ阻害剤からなる群より選択することができる。
【０１３９】
抗ウイルス化合物のさらなる例として、インフルエンザおよびその関連症状の治療に用いられる、アマンタジン、リマンタジンおよびオセルタミビル（タミフル）があるが、これらに限定されない。ＨＩＶの治療に有益な抗ウイルス化合物には、Ｃｏｍｂｉｖｉｒ（登録商標）（ラミブジン／ジドブジン）、ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）（インジナビル）、ＥＭＴＲＩＶＡ（登録商標）（エムトリシタビン）、ＥＰＩＶＩＲ（登録商標）（ラミブジン）、ＦＯＲＴＯＶＡＳＥ（登録商標）（サキナビル−ｓｇ）、ＨＩＶＩＤ（登録商標）（ザルシタビン）、ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）（サキナビル−ｈｇ）、ＫＡＬＥＴＲＡ（登録商標）（ロピナビル／リトナビル）、ＬＥＸＩＶＡ（商標）（ホスアンプレナビル）、ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）（リトナビル）、ＲＩＴＲＯＶＩＲ（登録商標）（ジドブジン）、ＳＵＳＴＩＶＡ（登録商標）（エファビレンツ）、ＶＥＤＥＸ  ＥＣ（登録商標）（ジダノシン）、ＶＩＤＥＸ（登録商標）（ジダノシン）、ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）（ネルファナビル）、ＶＩＲＡＭＵＮＥ（登録商標）（ネビラピン）、ＺＥＲＩＴ（登録商標）（スタブジン）、ＺＩＡＧＥＮ（登録商標）（アバカビル）、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）（エンフビルチド）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（登録商標）（デラビルジン）、ＲＥＹＡＴＡＺ（登録商標）（アタザナビル）、ＴＲＩＺＩＶＩＲ（登録商標）（アバカビル／ラミブジン／ジドブジン）、ＶＩＲＥＡＤ（登録商標）（テノホビルジソプロキシルフマル酸塩）、ＩＳＥＮＴＲＥＳＳ（登録商標）（ラルテグラビル）、ＳＥＬＺＥＮＴＲＹ（登録商標）（マラビロク）およびＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標）（アンプレナビル）がある。
【０１４０】
ウイルス感染の例には、（マイナス鎖ＲＮＡウイルス、プラス鎖ＲＮＡウイルス、二重鎖ＲＮＡウイルスおよびレトロウイルスを含む）あらゆるＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスによって生じる感染があるが、これらに限定されない。ウイルスの例には、（ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２を含む）ＨＩＶ、パルボウイルス、パピロ−マウイルス、麻疹、フィロウイルス（例えば、エボラ、マールブルク）、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、ハンタウイルス、インフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ，ＢおよびＣウイルス）、肝炎ウイルスＡ〜Ｇ、カリシウイルス、アストロウイルス、レオウイルス、コロナウイルス（例えば、ヒト呼吸器多核体ウイルスおよびＳＡＲＳ多核体ウイルス （ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、ピコルナウイルス（例えば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス（例えば、帯状疱疹を含むＨＳＶ−１−９、 エプスタインバ−およびヒトサイトメガロウイルス）、口蹄疫ウイルス、ヒトアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、天然痘ウイルス（痘瘡）、牛痘、サル痘、ワクシニア、ポリオ、ウイルス性髄膜炎およびハンタウイルスがあるが、これらに限定されない。
【０１４１】
動物に関しては、ウイルスには、任意の上述のヒトウイルスの動物対応ウイルス、トリインフルエンザ （例えば、Ｈ５Ｎ１，Ｈ５Ｎ２，Ｈ７Ｎ１，Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２株）およびサル免疫不全ウイルス、トリ免疫不全ウイルス、偽牛痘、ウシ免疫不全ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルスなどの動物レトロウイルスがあるが、これらに限定されない。
Ｅ．実施例
【０１４２】
下記の例は、本明細書に記載する化合物、組成物、物品、装置および／または方法をいかに作製して評価するかを当業者に提供するものであり、純粋に例示的な提示を意図し、開示を制限することを意図していない。数字（例えば、数量、温度など）に関する正確性を確保するための努力を行ったが、多少の誤記や誤差は考慮されるべきである。他に記載のない限り、部分とは重量部のことであり、温度は周囲温度（℃）であり、圧力は大気圧または大気圧近傍である。
例１：阻害Ｄ−ペプチド
ａ）ペプチド合成
【０１４３】
本実施例では、全ての合成ペプチドをＮ−末端アセチル基とＣ−末端アミド基とでキャップし、それらの質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦで確認した。粗ペプチドをＣ１８カラム（Ｖｙｄａｃ）上で逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって洗浄し、凍結乾燥した。Ｄ−ペプチド阻害剤を（≦０．４ｍｇ／ｍＬ）で一晩、３７℃、５０ｍＭトリス中、ｐＨ８．０、２％ＤＭＳＯで酸化し、ＲＰ−ＨＰＬＣを使って再洗浄した。
【０１４４】
ＰＥＧ−（ＰＤＥ７）2を、新鮮に調製した架橋剤（Ｂｉｓ−ｄＰＥＧ９（商標）、ＮＨＳエステル、Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，＃１０２４６）で、１：０．６（ペプチド：ＰＥＧ）のモル比で、５０ｍＭのＮａＨＰＯ４中で、ｐＨ７．室温で０、２時間、ＰＩＥ７（〜２ｍＭ）をインキュベ−ションして作製した。ＰＥＧ−（ＰＩＥ２−ＡＡＡ）2を同様のプロトコルを使って製造した。ＰＥＧ−ＰＩＥ７を、同様のプロトコルで、ＮＨＳ−ｍ−ｄＰＥＧ（商標）（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，＃１０２６０）を使い、モル比１：２（ペプチド：ＰＥＧ）で作製した。
ｂ）ウイルス感染性アッセイ：
【０１４５】
この研究にはＨＩＶ  ＨＸＢ株およびＨＩＶ  ＪＲＦＬ株の使用が含まれる。ウイルス感染性は主に先に記載されているように（Ｈａｍｂｕｒｇｅｒ  ２００５）、いくつかの修飾によって測定した。全てのアッセイにおいて、８μｇ／ｍＬのＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎを融合促進剤として使用した。感染後２２〜２６時間で媒体を変えた。正規化データを次の式：ｙ＝１／（１＋［阻害剤］／ＩＣ５０）に適合させてＩＣ５０値を計算した。フィットを、最低許容誤差を１％に設定した４点からの絶対ｓｅｍによりウェイトした。溶解にＤＭＳＯを必要とする試料（Ｄ１０−ｐ５，ＰＥＧ−（ＰＩＥ２−ＡＡＡ）２，ＰＥＧ−（ＰＩＥ７）２およびＰＥＧ−ＰＩＥ７）を、１％の最終ＤＭＳＯ濃度で試験し、１％ＤＭＳＯを含む非阻害のコントロールに正規化した。下記の試薬をＮＩＨ（アメリカ国立衛生研究所）、ＮＩＡＩＤ（国立アレルギ−感染症研究所）、ＡＩＤＳ部門、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍより、そしてＴＡ  ７７９およびＴ−２０（ＦＵＺＥＯＮ（登録商標））を、ＮＩＡＩＤ  ａｎｄ  Ｒｏｃｈｅよりそれぞれ調達した。
ｃ）結果と考察
【０１４６】
本明細書で考察するペプチドは、ポケット特異的侵入阻害剤（ＰＩＥ）のＤ−ペプチドである。例として、ＰＩＥ７−ＧＫ（ＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡＧＫ、配列ＩＤ番号：２３）がある。このペプチドは、リジンがＣ−末端に移動しているのを除き、ＰＩＥ７と同じである。この移動により、作用強度が僅かに増強され、それらのＣ−末端を介したペプチドの架橋が可能になる。
【０１４７】
ＰＩＥ７−ＧＫＫ（ＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡＧＫＫ，配列ＩＤ番号：２４）：これはＰＩＥ７−ＧＫの二重リジン変異体であり、三量体ＰＩＥ７において中心ペプチドとして機能する（中心ＰＩＥ７−ＧＫＫは２つの両側に隣接するＰＩＥ７−ＧＫペプチドに結合される）。これらの結合は全てＣ−末端を介して行われる。
【０１４８】
Ｋ−ＰＩＥ７−ＧＫ（ＫＧＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＡＡＧＫ，配列ＩＤ番号：２５）：これはＰＩＥ７−ＧＫの二重リジン変異体であり、三量体ＰＩＥ７において中心ペプチドとして機能する（中心Ｋ−ＰＩＥ７−ＧＫは両側に隣接するペプチドＰＩＥ７−ＧＫおよびＰＩＥ７に結合される）。これらの結合により、Ｎ−末端は両側に隣接するペプチドのＣ−末端に連結する。
【０１４９】
ＰＩＥ７−ＧＫ−ＰＥＧ４（ＰＥＧ4の付着したＰＩＥ７−ＧＫ）：このペプチドは、ＰＥＧの付加により、Ｄ−ペプチドのＣ−末端においてどれくらい耐えるかを決定するためのコントロール（対照）である。このペプチドから、このような付加により耐性が向上することがわかった。
【０１５０】
新しいペプチドの下記のグループは、隣接配列の最適化によって発生した：
ＨＰＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＥＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２６）
ＨＰＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＫＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２７）
ＨＰＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＲＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２８）
ＨＡＣＤＹＰＥＷＱＷＬＣＥＬＧＫ（配列ＩＤ番号：２９）
【０１５１】
本明細書に開示する多量体は結合活性を有することがわかった。より詳細には、二量体阻害剤ＰＥＧ−（ＰＩＥ−ＡＡＡ）２およびＰＥＧ−（ＰＩＥ７）２は、２１ｎＭおよび１．９ｎＭのＩＣ５０ｓをそれぞれ有している（表２）。これらの値は対応する単量体よりも７０〜３２５倍の改善を示している。これらのデータはまた、ファージディスプレイにおいてもみられるように、単量体阻害剤の作用強度の穏やかな改善が、二量体の結合活性によって拡大されたことを示している。 ＰＥＧ−（ＰＩＥ７）2の作用強度はＦＵＺＥＯＮ（登録商標）（表２）に匹敵するものである。改善された二量体の作用強度は、ＰＥＧのウイルス、細胞またはＤ−ペプチドとの相互作用に起因するものではなく、Ｎ−三量体に結合する２つのＤ−ペプチドによって生じる本物の結合活性である。
【０１５２】
ＨＸＢ２およびＪＲＦＬ偽ウイルス侵入に対するＤ−ペプチドの阻害能力
【表２】
2014510754.tif 000009
【０１５３】
本明細書に開示するペプチドの使用は、同じＰＩＥ構造を利用して、ＨＩＶクレ−ド全体に大きな効果をもたらした。例えば、ＰＩＥ１２−三量体は、１０μＭまでの投与量に対して無毒性を維持しながら、エンベロープサブタイプＡ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，ＦおよびＧをカバ−する複製可能なＨＩＶ株に対して、１０ｎＭ以下のＩＣ５０を示した（表３）。比較すると、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）のＩＣ５０は、３つのみの株（クレードＢ，Ｅのみ）において、１０ｎＭ以下であり、これらの場合、ＰＩＥ１２−三量体より６〜１００倍強度が低かった。実際、ＦＵＺＥＯＮ（登録商標）は、ＨＩＶサブタイプＡウイルスに対して、１００倍少ない阻害性を持ち、サブタイプＢウイルスに対しては、６〜２５０倍少なく、サブタイプＣウイルスに対しては６０倍少なく、サブタイプＤウイルスに対しては４０〜１００倍少なく、サブタイプＦ株に対しては２５〜１５０倍少なく、サブタイプＧ株対しては２０〜１００倍少なかった。
【０１５４】
複製能を有するウイルスおよびＰＢＭＣ標的細胞に対する阻害幅
【表３】
2014510754.tif 000010
【０１５５】
例２：コレステロールカーゴ
ａ）Ｄ−ペプチドのコレステロールカーゴとの合成
【０１５６】
コレステロール作用強度増強カーゴを有するＤ−ペプチド単量体を、ヘテロ二官能性ＰＥＧ  ＮＨＳエステル／マレイミド架橋剤を使って製造し、チオコレステロール（そのヒドロキシ基を置換したチオールを有するコレステロール）をＰＩＥ１２−ＧＫの末端リジン（この場合、ＰＥＧはポリエチレングリコールで、ＮＨＳはＮ−ヒドロキシスクシンイミド；Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，カタログ番号１０９９４）に抱合する。Ｄ−ペプチド三量体の作用強度増強コレステロールカーゴとの合成に関しては、ＰＩＥ１２−ＧＫ（１１  ｍＭ）をＦｍｏＣ−Ｎ−アミド−ｄＰＥＧ4−ＮＨＳエステルと１．０５：１（ペプチド：ＰＥＧ）のモル比で、トリエチルアミンで緩衝したジメチルアセトアミド（ＴＥＡ，２００ｍＭ）内において、４０分間、室温（ＲＴ）で反応させた。製造物をＣ１８逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣで洗浄し、凍結乾燥させた。次いでこの製造物を２０％ピペリジン（ジメチルアセトアミド内）で再懸濁してＦｍｏｃ保護基を取り除き、脱保護された製造物をＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣで洗浄した。この材料（ＰＩＥ１２−ＧＫ−ＰＥＧ４−ＮＨ２，１０ｍＭ）をＭａｌ−ｄＰＥＧ１２−Ｔｒｉｓ（ＮＨＳ）3（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ、カタログ番号１０６７６）と、３．２：１（ペプチド：骨格）のモル比で、トリエチルアミン２００ｍＭで緩衝したジメチルアセトアミド内において、ＲＴで４０分間反応させた。反応進行をＲＰ−ＨＰＬＣで監視した。この反応物に対して、チオコレステロール（ジメチルアセトアミド９０％、クロロホルム１０％、ＴＥＡ２００ｍＭ中の２５ｍＭストック溶液）を最終濃度４ｍＭになるように添加した。最終製造物をＲＰ−ＨＰＬＣによって洗浄し、凍結乾燥させ、そのアイデンティテイ−を質量分析（ｍａｓｓ  ８０６１．８１  Ｄａ）によって確認した。
【０１５７】
３つのＮＨＳエステルアーム（ＰＩＥ結合のために使用）の長さは、ＦｍｏＣ−Ｎ−ａｍｉｄｏ−ｄＰＥＧｘ−ＮＨＳエステルを使って修飾することができ、この場合、ｘは１〜３６（離散的ＰＥＧ長として）またはそれより長くすることができる（特定の平均長さを有する多分散ＰＥＧとして）。ＰＥＧは連続分子として合成してもよいし、またはより小さなＰＥＧを使って縫合してもよい。例えば、ＰＥＧ１２アーム上のマレイミド基をシステイン残基と反応させると、マレイミドが一級アミンに変換され、これをＮＨＳエステルＰＥＧ−マレイミドと使用して、ＰＥＧアーム長を伸ばし、マレイミド基をその末端に戻すことができる。 これは表４において星印を付したＰＥＧの製造に使用する戦略である。
ｂ）結果
【０１５８】
表４は、ＨＸＢ２およびＪＲＦＬの２つのＨＩＶ株による膜侵入阻害における、コレステロールカーゴのＰＩＥ１２単量体またはＰＩＥ１２三量体への抱合の結果を示す。ＰＩＥ１２単量体に関しては、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ2の添加は著しく弱い阻害剤をもたらしたが、ＰＥＧ１２リンカーは作用強度の３倍近い増強をもたらした。予測外に、ＰＥＧ２４リンカーはＰＩＥ１２単量体の作用強度を１００倍増強させた。ＰＥＧ２４のＰＩＥ１２三量体への適用は、さらに大きな作用強度の増強（〜２５０倍）をもたらした。表４において、星印は、２つのより小さなＰＥＧ鎖（例えば、ＰＥＧ２４*＝直列結合された２つのＰＥＧ１２鎖）を結合することによって組みつけられたＰＥＧ鎖を指す。
【０１５９】
コレステロール作用強度増強カーゴを用いた場合の、ＨＸＢ２およびＪＲＦＬ偽ウイルス侵入に対するＤ−ペプチドの阻害的作用強度
【表４】
2014510754.tif 000011
【０１６０】
図１および図２に示すように、ｇｐ４１ポケット領域は細胞表面からおよそ５７Å〜６０Å離れている。従って、比較的長いリンカーを使って、膜とＰＩＥ（例えば図２のＰＩＥ１２）との間のこの距離を架橋することができる。本発明の試験を行う前は、このように長いリンカーアームがコレステロールの局所的な濃縮効果を減少させる可能性があると考えていたが、驚くことにそうではなかった。表４からわかるように、長いＰＥＧアーム（例えば、５７Åを架橋するのに十分な長さであると予測される２４または２６ユニット）によって単量体ＰＩＥ１２または三量体ＰＩＥ１２に結合されるコレステロールによって、１００倍以上に増強された作用強度を有する阻害剤が製造された。
【０１６１】
表４はまた、ＰＩＥ７−二量体（Ｅ５６０Ｋ／Ｖ５７０Ｉ）およびＰＩＥ１２−三量体（Ｑ５７７Ｒ）について発見された２つの耐性突然変異を示している。この耐性突然変異はコレステロール連結ＰＩＥ１２−三量体に同様の比較影響を与えるが、コレステロール連結ペプチドの大幅に増強された作用強度により、これらのペプチドは、これらの耐性株に対してさえも優れた阻害活性を維持することができる。
例３： モジュラーホモ三量体骨格
【０１６２】
ホモ三量体骨格は、単一容器反応におけるＤ−ペプチドへの抱合のために、３つのＮＨＳエステルアーム（三量体トリメチルエステルｔｒｉＮＨＳ）を含有して設計された。種々の長さのＰＥＧリンカーは、Ｄ−ペプチドに付加され、様々なＰＥＧ長さのＤ−ペプチド三量体の簡易な製造が可能となる。
ａ）ペプチド合成
【０１６３】
ペプチドをＰＴＩ  ＰＳ３ペプチドシンセサイザーまたはＲＳ合成によって合成し、ＰＩＥ１２−ＧＫまたは△ＨＰ−ＰＩＥ１２−ＧＫ（２つのＮ−末端残基、Ｄ−ＨｉｓおよびＤ−Ｐｒｏが欠如しているもの）を製造した（Ｗｅｌｃｈ，２００７および２０１０）。ＰＩＥ１２−ｄＰＥＧ４／５−ＮＨ2（ＰＩＥ１２−三量体合成の前駆材料）を下記のように合成した：ＰＩＥ１２−ＧＫ（ジメチルアセトアミドＤＭＡＣ内に１０ｍＭ）を２５０ｍＭのＦｍｏＣ−Ｎ−ａｍｉｄｏ−ｄＰＥＧ４／５−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  １０９９４および１００５３）と、乾燥ＤＭＡＣ（Ａｃｒｏｓ  ＯｒＧＡｎｉｃｓ，分子ふるいでシ−ルされた中隔）において、１：１のモル比で、トリエチルアミン（２００ｍＭ，ｐＨ７．５）で緩衝し、６０分間、ＲＴで反応させた。この反応物を酢酸を加えて５％にクエンチし、Ｗａｔｅｒｓ  ＢＥＨ  Ｘ−Ｂｒｉｄｇｅ １０μｍ、３００Å Ｃ18カラム（ＲＰ−ＨＰＬＣ）上で、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡにおいて水／アセトニトリル勾配）で洗浄した。洗浄した製造物を凍結乾燥させ、ＤＭＡＣ内において２０％ピペリジンで２０分間再懸濁してＦｍｏｃを取り除いてＰＩＥ１２−ＰＥＧ４／５−ＮＨ2を製造し、次いでこれをＲＰ−ＨＰＬＣで洗浄した。
ｂ）三量体合成
【０１６４】
ＰＩＥ１２−ＰＥＧ４／５−ＮＨ2（１０ｍＭ）を、トリメチロールエタン−ｔｒｉＮＨＳエステル（図３ａ、Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  １０６７４）２５０ｍＭと、トリエチルアミン（２００ｍＭ，ｐＨ７．５）で緩衝したＤＭＡＣ内で、３．３：１（ペプチド：骨格）のモル比で、６０分間、ＲＴで反応させた。製造物をＲＰ−ＨＰＬＣで洗浄した。全ての質量をＥＳＩ−ＭＳ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−３０００）によって確認した。
【０１６５】
コレステロールＰＩＥ１２−三量体およびアルキル−ＰＩＥ１２−三量体を下記のように合成した：ＰＩＥ１２−ＰＥＧ４−ＮＨ２（１０ｍＭ）をマレイミド−ＰＥＧ２４−ｔｒｉＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  １０６７６，ＤＭＡＣ内で２５０ｍＭ） またはマレイミド−ＰＥＧ２４−ｔｒｉＮＨＳエステル（図３ｂ， Ｑｕａｎｔａ  ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  １０６８０，ＤＭＡＣ内で２５０ｍＭ）と、３．３：１（ペプチド：骨格）の比で、トリエチルアミン（２００ｍＭ，ｐＨ７．５）で緩衝したＤＭＡＣ内で、４５分間、ＲＴで、それぞれ炭素中心多量体骨格を用いて反応させた。次いでチオコレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，１３６１１５，クロロホルム内２５０ｍＭ）、１−オクタンチオール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，４７１８３６）、１−ヘキサデカンチオール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，５２２７０）または１−オクタデカンチオール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，０１８５８）を添加して最終濃度を４．５ｍＭとし、さらに６０分反応させた。ＰＥＧ１６に関しては、ＰＩＥ１２−ＰＥＧ４−ＮＨ２をＤ−システイン（５ｍＭ）と反応させた後、最初にＭａｌ−ＰＥＧ１２−ｔｒｉＮＨＳエステルと反応させ、（ＰＩＥ１２−ＰＥＧ４）３−ＰＥＧ１２−Ｃｙｓを製造した。この製造物は次いで、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体の製造に使用するものと同じ条件下において、マレイミド−ＰＥＧ４−ＮＨＳとチオコレステロールとの逐次反応前に、ＲＰ−ＨＰＬＣによって洗浄した。ＰＥＧ３６、ＰＥＧ５７およびＰＥＧ１３２−三量体は、ＰＩＥＩ２−ＰＥＧ４−ＮＨ２のマレイミド−ＰＥＧ24−ｔｒｉＮＨＳエステルへの抱合後、Ｄ−システインを添加することによって製造した。次いでこの中間体は、Ｍａｌ−ＰＥＧ１２−ＮＨＳエステル（Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，１０２８４）、Ｍａｌ−ＰＥＧ2K−ＮＨＳエステル（Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＰＥＧＷｏｒｋｓ，ＰＨＢ−９５０，〜１２０ＰＥＧユニット）またはＭａｌ−ＰＥＧ5K−ＮＨＳエステル（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ， ＰＨＢ−９５２，〜１２０ＰＥＧユニット）と抱合させて、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ36−ＰＩＥ１２−三量体、Ｃｈｏｌ−ＰＥＧ５７−ＰＩＥ１２−三量体およびＣｈｏｌ−ＰＥＧ１３２−ＰＩＥ１２−三量体をそれぞれ製造した。この反応は、ＲＰ−ＨＰＬＣによる洗浄前に、酢酸を加えることによって５％にクエンチした。
ｃ）ウイルス感染性アッセイ
【０１６６】
偽ウイルス感染性アッセイを、ＨＩＶ ＨＸＢ２株およびＨＩＶ ＪＲＦＬ株、ルシフェラーゼレポーター偽ウイルス（ＮＬ４−３株）ならびにＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＸＣＲ４（ＨＸＢ２用）またはＨＯＳ−ＣＤ４−ＣＣＲ５（ＪＲＦＬ用）標的細胞（Ｗｅｌｃｈ，２００７および２０１０）を使用して行った。４通りで測定した６つの濃度点を使って阻害曲線を作成し、ルシフェラーゼのカウントを非阻害のコントロールに正規化した。ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ（商標）（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使い、阻害曲線を標準ＩＣ５０方程式（１−ｃ／（ＩＣ５０＋ｃ））を用いて、各濃度点をその標準エラ−によってで加重して適合させた。報告されたＩＣ５０の値は少なくとも２つの独立したアッセイの平均値である。
ｄ）結果
【０１６７】
Ｄ−ペプチド単量体間のＰＥＧ結合を最適化しつつ、ホモ三量体骨格を使ってＤ−ペプチド三量体の合成を成功させる結果となった。以前は、ＰＩＥ１２−ＧＫにｂｉｓ−ＮＨＳエステルＰＥＧ５スペーサを付着することによってＰＩＥ１２−三量体を合成していた。洗浄後、これらのペグ化された単量体のうちの２つを中心ＰＩＥ１２−ＧＫＫ単量体（２つの一級アミン）と反応させててＰＩＥ１２−三量体を製造した（Ｗｅｌｃｈ，２０１０）。この方法は大規模な製造にとっては厄介である、というのもこれには三量体を組み立てるための２つの別個のＤ−ペプチドの合成と、連続したＨＰＬＣによる洗浄が必要であり、産出量が低くなるからである。さらにＰＩＥ１２の結晶構造は、ＰＥＧリンカーが短くなると、両側に隣接するポケットと適切に架橋し、結合活性が増強されることを示している。この方法による欠点を克服するために、ＰＩＥ１２−ＧＫ（図３ａ）との抱合などの、単一容器反応においてＤ−ペプチド単量体に抱合するための３つのＮＨＳエステルアームを含むホモ三量体骨格を設計した。種々の長さのＰＥＧリンカーをＰＩＥ１２−ＧＫペプチドに付加することにより、様々なＰＥＧ長さを有するＰＩＥ１２−三量体の簡易な製造が可能になる。
【０１６８】
Ｎ−三量体のＰＩＥ１２−三量体の推定ｓｕｂ−ｆＭ親和性は、直接的な比較のためのＫＤ測定（例えば、表面プラスモン共鳴による）をやりがいあるものにする。抗ウイルス作用強度は親和性の作用強度の代用として使用することができるが、ＰＩＥ１２−三量体プラト−は親和性の大きな変化さえもマスクすることができる。この問題を克服するために、ＰＩＥ１２変異体を弱めた親和性で設計し、阻害剤作用強度を測定することによる異なる三量体の幾何学的形状の比較的な評価を可能にした。ＰＩＥ１２の２つのＮ−末端残基は、Ｎ−三量体と重要な接触を行い、これは、これらの残基（Ｄ−ＨｉｓおよびＤ−Ｐｒｏ）の欠失が、ｇｐ４１ポケットに結合しているＰＩＥ１２の全体的な配向、またはＣ−末端ＰＥＧ連結部位の局所的な構造を破壊せずに、結合親和性を著しく減少させると考えた。△ＨＰ−ＰＩＥ１２はＰＩＥ１２（表５）よりも８４倍弱い。ホモ三量体骨格において、ＰＥＧ5リンカーを介して結合される△ＨＰ−ＰＩＥ１２は、ＨＸＢ２（標準的なラボ適応株）に対して３８０ｎＭのＩＣ５０を有しており、従って、作用強度プラトー（ＨＸＢ２は〜５００ｐＭ）外である。ＡＨＰ−ＰＩＥ１２−三量体を使用すると、親和性を僅かに変えるリンカーの変化により、作用強度の変化を検出することができよう。
【０１６９】
Ｄ−ペプチド阻害データ
【表５】
2014510754.tif 000012
【０１７０】
例４：モジュラーヘテロ四量体骨格およびＰＥＧリンカーの最適化
【０１７１】
作用強度増強カーゴ基のＰＩＥ１２−三量体への抱合を可能にするために、ヘテロ四量体骨格を設計した。このヘテロ四量体骨格は、ＰＩＥＩ２−ＰＥＧ4−ＮＨ2を付加するためのＮＨＳエステル基を有する３つのより短いＰＥＧアーム、炭素中心、および作用強度増強カーゴ（すなわち薬物動態増強および／または膜局在化カーゴ（図３ｂ））を付加するために、マレイミド、直交反応基と官能性を持つ、様々な長さの第４のＰＥＧアームで構成される。
【０１７２】
ヘテロ四量体骨格について研究する作用強度増強カーゴの１つは、コレステロールである。本明細書で開示するのは、ＰＩＥ１２Ｄ−ペプチドを有するコレステロールカーゴを使って、Ｃ−ペプチドのＮ−末端を膜に隣接させながらＰＩＥ１２は細胞膜から６０Å以内の距離にあるポケットを標的とする考察である（例えば図１参照）。この距離に架かるために、様々な長さの可動性ＰＥＧリンカーを使用した。ＰＥＧ１２は、ピンと張られた状態では十分に長いが、典型的に、ＰＥＧの平均的な長さはその完全に延びた長さの約半分の長さである。
【０１７３】
Ｄ−ペプチドへのコレステロール（ｃｈｏｌ）抱合の作用強度効果を調べるため、そしてコレステロールとＤ−ペプチド間のＰＥＧリンカーの長さの最適化のために、単量体ＰＩＥ１２を使用した、これは作用強度プラトーではないので、最適なＰＥＧリンカー長さの高感度のレポーターであるはずである。Ｃｈｏｌ−ＰＥＧx−ＰＩＥ１２抱合は、ヘテロ二官能性ＰＥＧ２，ＰＥＧ１２およびＰＥＧ24ＮＨＳエステル／マレイミド架橋剤を使用して生成し、チオコレステロール（チオールをそのヒドロキシル基と置換したコレステロール）をＰＩＥ１２のＣ−末端リジン（その唯一の一級アミン）に抱合するために製造した。ｃｈｏｌ−ＰＥＧ2−ＰＩＥ１２抱合は短すぎて、膜とポケットの間の距離を架橋できず、抱合されていないＰＩＥ１２と比較すると、２倍の作用強度（ＨＸＢ２株）の損失が発生したことがわかった（表５）。反対にｃｈｏｌ−ＰＥＧ１２−ＰＩＥ１２は、３倍に増強された作用強度を示したが、一方でｃｈｏｌ−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２は、ＰＩＥ１２のみの場合と比較して、さらに大きな５８倍の作用強度の増大を示した（表５）。
【０１７４】
比較のために、種々の長さのＣ−ペプチド（Ｃ３４）コレステロール抱合体を合成した（表５）。結果は、短いＰＥＧ2リンカーを使った場合、４０倍に増強された作用強度となったが、驚くことに、より長いリンカー（ＰＥＧ１１）はさらに２倍の作用強度の増強を提供し、さらに長いリンカー（ＰＥＧ８０）は同じ作用強度（ＨＸＢ２株）を維持した。同様のパタ−ンはＪＲＦＬ株でも見られたが、大変長いＰＥＧリンカー長さでは著しい減衰が生じた（最適なＰＥＧ長さの４倍劣る）。
【０１７５】
これらの作用強度の増大に基づき、本明細書に開示するヘテロ四量体骨格を使って、ＰＩＥ１２−三量体をコレステロールに抱合した。３つのＮＨＳエステル（ＰＩＥ１２）アームのために予め決定した最適のＰＥＧ4リンカーを使って、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体を種々の第４アーム（マレイミド）長さで合成し、単量体で見られたＰＥＧ長さと作用強度との関係を確認した。この感度は期待されたものであった、というのも、膜局在化は、親和性の変化よりも会合速度に影響を与えるからである （耐性コンデンサによるマスク）。第４アームの長さは１２〜１３２ＰＥＧユニットの間で変化し、６０〜４８０Å（全長）をカバ−した。
【０１７６】
コレステロール抱合は、ＨＸＢ２およびＪＲＦＬ侵入に対するＰＥＧ4−ＰＩＥ１２−三量体の作用強度を劇的に増強させた（１６０倍まで、表５）。ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体の種々の第４アーム長さを比較することにより、ＰＥＧ24〜ＰＥＧ５７の最適の範囲で阻害剤作用強度が穏やかに変化したことが示された。図４ａに示すように、短いＰＥＧ１２リンカーはＰＥＧ２４およびＰＥＧ３６リンカーよりも弱い。最長（ＰＥＧ１３２）のリンカー（図示せず）では、作用強度の僅かな減少がみられただけだった。その合成のしやすさと単分散ＰＥＧ24が可能なことにより、ｃｈｏｌ−ＰＥＧ２４−ＰＩＥ１２−三量体をさらなる研究のために選択した。さらに、単分散ＰＥＧ24骨格により、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体の純度、代謝、薬物動態および安定性の前臨床研究がより容易になるだろう。重要なことは、コレステロール抱合により、高い水溶解度（ｍＭ）が保持されることである。
【０１７７】
作用強度の増強とＤ−ペプチド阻害剤の膜への局在化における別の戦略として、第４アームに脂肪酸カーゴを有するヘテロ四量体骨格の使用がある。本明細書に記載するものと同じヘテロ四量体骨格戦略を利用して、ＰＩＥ１２−三量体を合成し、第４アームで、８，１６または１８炭素の何れかの脂肪族鎖を有する脂肪族カーゴ（Ｃ８／Ｃ１６／Ｃ１８脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体）に抱合した。Ｃ８脂肪酸抱合はＰＩＥ１２−三量体作用強度にほぼ影響を与えなかったが、Ｃ１６脂肪酸およびＣ１８脂肪酸はどちらも作用強度の増強を与えた。ただしコレステロールで見られたものよりは小さかった（図４ｂおよび表５）。Ｃ１８脂肪酸−ＰＥＧ24−ＰＩＥ１２−三量体は、Ｃ１６脂肪酸−ＰＥＧ２４−ＰＩＥ１２−三量体より僅かに強力だった（図４ｂ）。
【０１７８】
これらの結果は、モジュラー多量体骨格に基づく設計のペプチド薬物最適化への適用がうまくいったことを示すものである（ペプチド幾何学的形状および抱合膜局在化カーゴを介した作用部位への局在化のどちらにおいても）。この手法により、種々のカーゴおよびケミストリー（例えば、「クリック」ケミストリー）への適応のための骨格の変更およびリンカー長さの迅速な最適化が可能になる。エボラなど、エンドソーム内で膜融合するウイルスにこの戦略を用いてエンドソーム標的部分を接着して、阻害剤をウイルス侵入部位に局在化させ、阻害作用強度を増強することができよう。さらに、多量体骨格は種々のカーゴへのＤ−ペプチド抱合を可能にし、作用強度、薬物動態特性（例えば大きな分岐ＰＥＧ、アルブミンまたはアルブミン結合ペプチド）を調節して膜の局在化を可能にする。
実施例５：膜局在化の耐性コンデンサへの影響
【０１７９】
薬剤耐性は、ＨＩＶ阻害剤の効果にとって絶え間ない脅威である。ＰＩＥ１２−三量体およびその変異体は、一部は魅力的な薬物候補である、というのも、耐性コンデンサが強く、そのため耐性への高度な遺伝的バリアを提供するからである（Ｗｅｌｃｈ，２０１０）。耐性コンデンサは、ＰＩＥ１２−三量体のｇｐ４１との結合の拡散制限会合速度に依存する。本明細書に記載するコレステロールとＣ１６／１８アルカン鎖との抱合戦略は、この速度の障壁を、ウイルス侵入部位への阻害剤の局在化によって突破する（すなわち、有効な阻害剤濃度を増やし、拡散速度の制限を克服する）。理論上、この作用強度の増強は耐性コンデンサを弱めるという犠牲を伴う。この可能性を試験するために、以前同定した耐性突然変異に対して、ｃｈｏｌ−およびＣ１６／Ｃ１８アルカン鎖に抱合したＰＩＥ１２−三量体の作用強度を測定した（Ｗｅｌｃｈ，２０１０）。
【０１８０】
ＰＩＥ７−二量体（Ｄ−ペプチド阻害剤の前の世代）への耐性に対する以前の選択においては、Ｅ５６０Ｋ／Ｖ５７０Ｉを製造し、これはＰＴＥ１２−三量体の作用強度に最小限の影響を与えたが、ＰＩＥ７−二量体の作用強度を劇的に減少させた。ＰＩＥ１２−三量体への耐性の選択にはウイルス継代に一年以上を要したが、最終的にはＱ５７７Ｒ突然変異となり、これによってＰＩＥ１２−三量体の作用強度が１０００倍以上減少した（Ｗｅｌｃｈ，２０１０）。ｃｈｏｌおよびＣ１６／１８アルカン鎖−ＰＩＥ１２−三量体作用強度に関するこれらの耐性の突然変異の効果を表６に示す。両方の耐性突然変異の相対的有効性は、ＰＩＥ１２−三量体およびコレステロール／アルカン抱合ＰＩＥ１２−三量体と類似している。しかしながら、抱合ＰＤＥ１２−三量体の著しく増強された作用強度により、これらの阻害剤は、深刻なＱ５７７Ｒ耐性突然変異に対してもｎＭ作用強度を維持する。さほど深刻でないＥ５６０Ｋ／Ｖ５７０Ｉ耐性突然変異の影響は、全ての抱合ＰＩＥ１２−三量体および通常のＰＩＥ１２−三量体によって吸収される。これらのデータは、Ｃ１６／Ｃ１８アルカン鎖およびコレステロール抱合による作用強度の増強により、有効な耐性コンデンサを維持するための十分に過剰な結合エネルギーが保持されることを示している。
【０１８１】
耐性株に対する抗ウイルス作用強度
【表６】
2014510754.tif 000013
【０１８２】
例６：Ｄ−ペプチド阻害剤の薬物動態特性
【０１８３】
作用強度増強カーゴを有していないＰＩＥ１２−三量体は所望の抗ウイルス特性を有しているが、それは比較的小さい（〜８ｋＤ）ため、腎臓ろ過による短い血清半減期をもたらす。これらの作用強度増強効果に加え、コレステロールおよびアルキル抱合のどちらも、腎クリアランスを遅くする細胞膜およびアルブミンとの相互作用を介して、これらのＤ−ペプチド阻害剤の薬物動態（ＰＫ）特性または薬物動態の増強を導くと仮定される。アルブミンはコレステロールおよび脂肪酸の両方の担体として機能し、腎臓ろ過の速度を低下させる。膜表面への付着も皮下腔内からのＤ−ペプチド阻害剤の吸収を遅くし、徐放貯蔵効果によって、持続的な投薬が可能になる。このタイプの投薬は、非分解性のＤ−ペプチドには特に魅力的であろう。
【０１８４】
コレステロール抱合Ｄ−ペプチドのＰＫ特性を評価するために、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体およびＰＩＥ１２−三量体をラットに皮下投与（１ｍＧＫｇ）した。皮下投与後、ＰＥＧ２４リンカーによって抱合されたコレステロールを有するｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体は、ＰＩＥ１２−三量体よりも優れたプラズマ半減期を示した。より具体的には、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体の半減期は３．７時間で、ＰＩＥ１２−三量体の２．７時間よりも長かった。さらに、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体は、ＰＩＥ１２−三量体のクリアランス５７２ｍＬ／ｈｒ／ｋｇよりも少ないクリアランス２４ｍＬ／時間／ｋｇを示した。図５に示すように、ｃｈｏｌ−ＰＩＥ１２−三量体は、ラットへの皮下投与後、ＰＩＥ１２−三量体と比べて改善された結合時間プロファイルを示した。
【０１８５】
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【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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