(57)【要約】  ＮａＰｉ２Ｂ輸送体に対するヒト化モノクローナル抗体の相補性決定領域高頻度可変性ドメインアミノ酸配列に由来する新規の、単離された、または合成されたペプチドおよびその誘導体ならびに抗腫瘍ペプチドおよびその誘導体を使用して、腫瘍成長を阻害するか、または腫瘍を治療する、または癌を治療するための医薬組成物および方法が、本明細書に記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示されるアミノ酸配列またはその誘導体から本質的になる、単離された、または合成された抗腫瘍ペプチド。
【請求項２】
配列番号３に示されるアミノ酸配列の誘導体が、配列番号８、９および１４〜３３からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項１に記載の抗腫瘍ペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載の１種以上の抗腫瘍ペプチド（単数または複数）と、医薬上許容される担体または希釈液とを含む、医薬組成物。
【請求項４】
腫瘍成長を阻害する方法であって、有効量の請求項１または２に記載のペプチドを、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項５】
腫瘍が、黒色腫、結腸癌腫、肺癌腫、腎臓癌腫、乳房癌腫、頭頸部癌、胃および腸癌、前立腺癌、肝臓癌および膠芽腫からなる群から選択されるものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍または癌を治療する方法であって、有効量の請求項１または２に記載のペプチドを、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項７】
癌が、黒色腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、胃および腸癌、前立腺癌、肝臓癌および膠芽腫からなる群から選択されるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドが、腫瘍細胞の遊走および浸潤を阻害する、請求項５または７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍成長を阻害する方法であって、有効量の請求項３に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１０】
腫瘍または癌を治療する方法であって、有効量の請求項３に記載の医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
被験体において腫瘍または癌成長を阻害するための医薬組成物の製造のための、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項１２】
癌が、黒色腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、胃および腸癌、前立腺癌、肝臓癌および膠芽腫からなる群から選択されるものである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
被験体において腫瘍または癌を治療するための医薬組成物の製造のための、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項１４】
癌が、黒色腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、胃および腸癌、前立腺癌、肝臓癌および膠芽腫からなる群から選択されるものである、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
被験体において腫瘍または癌成長を阻害するための、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項１６】
癌が、黒色腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、胃および腸癌、前立腺癌、肝臓癌および膠芽腫からなる群から選択されるものである、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
被験体において腫瘍または癌を治療するための、請求項１または２に記載のペプチドの使用。
【請求項１８】
癌が、黒色腫、結腸癌、肺癌、腎臓癌、乳癌、脳癌、頭頸部癌、胃および腸癌、前立腺癌、肝臓癌および膠芽腫からなる群から選択されるものである、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的に活性なペプチドに関する。特に、本発明は、ＮａＰｉ２Ｂ輸送体に対するヒト化モノクローナル抗体の相補性決定領域に由来する新規抗腫瘍ペプチドならびに腫瘍または癌を阻害または治療するための医薬組成物および方法を提供する。本発明はさらに、抗腫瘍化合物、例えば、抗腫瘍ペプチドを同定するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界中で、数種の癌腫（癌）が、主要な死亡原因として突出しており、毎年、数百万人が癌により死亡する。
【０００３】
この疾患は、正常組織に由来する異常細胞または腫瘍性細胞の増殖、腫瘍塊の形成、これらの異常な細胞による隣接組織の浸潤および血液またはリンパ系を介して局所リンパ節および遠位部位に最終的に広がる（転移）悪性細胞の生成を特徴とする。ほとんど例外なく、癌腫に由来する転移性疾患は、致命的である。
【０００４】
現在の癌治療の再発率および副作用のために、腫瘍性細胞の成長を阻害できる新規治療薬が大いに必要である。この筋書きにおいて、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（ＩｇＭおよびＩｇＧの両方）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで差次的抗菌、抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を示し得る生理活性ペプチドの供給源として最近報告された（非特許文献１；非特許文献２）。このような生理活性アミノ酸配列の内部分布は、自然免疫の受容体において発現されるその他のペプチド配列のものと似ている（非特許文献３）。しかし、それらの間に構造的類似性はない。１０個のアミノ酸〜２０個のアミノ酸の範囲の大きさを有する生理活性ペプチドが、相補性決定領域（ＣＤＲ）高頻度可変性ドメインから、フレームワークおよびＣＤＲアミノ酸を含む配列から、さらにＩｇ定常領域から得られた。試験されるために、一般に、Ｃ末端アミノ酸においてアミド化されたペプチドの合成調製物が使用された。生理活性は、一般に、抗体特異性とは無関係であるが、ＶＨに由来するＣＤＲ３は、元の抗体の抗原結合特性を共有し得る。これは、抗原がペプチド配列である場合には特に当てはまり、炭水化物である場合にはあまり当てはまらない。元の抗体として機能する重鎖ＣＤＲ３ペプチドは、「マイクロ抗体（＝マイクロＡｂ」と呼ばれる。
【０００５】
ＶＨ  ＣＤＲ３（Ｈ３）ペプチドのコンホメーションは、非特許文献４によって総説された。Ｈ３ループは、その他の５種のＣＤＲ（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）の限界構造とは異なり、１０〜２２個のアミノ酸の拡張配列において、Ｋａｂａｔら（非特許文献５）番号付けによるＣ９２およびＧ１０４が両端に位置する種々の大きさを有する。
【０００６】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）中で同定された生理活性ＶＨ  ＣＤＲ３の例を、本明細書において以下に記載する。抗Ｂ１６Ｆ１０黒色腫ｍＡｂ  Ａ４（非特許文献６）を使用して、６種すべてのＣＤＲを、細胞傷害性について、合成ペプチドの形で試験した。直鎖および環状の拡張されたＨ３ペプチドが、腫瘍細胞と結合し、ｍＡｂ  Ａ４と結合について競合し、プロトカドヘリンβ−１３を発現する細胞において細胞傷害性であったが、それを発現しないＨＬ−６０白血病細胞においては細胞傷害性ではなかった（非特許文献７）。マイクロＡｂを使用することの利点は、構造−機能分析を実施することを容易にするその小さな大きさおよびその複雑な反応部位への接近しやすさにある。
【０００７】
免疫グロブリン（例えば、モノクローナル抗体）中の内部ペプチド配列は、定常領域および可変領域に属する。ＣＤＲまたは抗原認識配列は、高頻度可変性ドメインとして見なされているが、異なる免疫グロブリンまたは抗体によって個々に共有され得る。抗体間のこのような類似性は、ＶＨ  ＣＤＲ３を除くすべてのＣＤＲ（Ｉｇ分子のファミリー中の各１種）に関与し得る。このＣＤＲは、その元のＣ９２−Ｇ１０４配列において、所与の抗体に対してユニークである傾向がある。
【０００８】
Ｍａｔｔｅｓらは、１９８７年に、マウスを、４種の新鮮な卵巣癌腫試料の混合物を用いて免疫処置することによってＭＡｂ  ＭＸ３５と名づけられたモノクローナルマウスＩｇＧｌを得た。それは、ヒト卵巣上皮癌のおよそ９０％および限定された数の正常組織と反応性を示すと、免疫組織化学による決定により示された（非特許文献８）。ＭＸ３５  ＭＡｂはまた、肺および腎臓癌腫細胞株とも反応するが、ほとんどのその他の癌腫細胞株ならびに黒色腫、星状細胞腫、肉腫、奇形癌腫、絨毛癌および造血腫瘍に由来する細胞株とは反応しないことが示されている。免疫蛍光によって５／５の新鮮な卵巣癌腫腹水細胞の試料と、凍結切片の免疫ペルオキシダーゼ染色によって、３／６の良性嚢腫および１８／１８の固形組織癌腫と反応した（非特許文献８）。
【０００９】
続いて、第Ｉ相臨床試験において、卵巣癌腫の患者において放射標識されたマウス抗体の局在性および体内分布が研究された。ＭＡｂ  ＭＸ３５のＦ（ａｂ’）は、腹膜腔中の微小転移性卵巣癌腫沈着物に局在すると示された（非特許文献９）。α粒子放射核種２１１アスタチン（Ａｔ−ａ）で標識されたＭＡｂ  ＭＸ３５およびその断片は、ヒト卵巣癌のヌードマウスモデルにおける微小転移性腫瘍成長の治療において高い有効性を示した（非特許文献１０）。また、ＭＸ３５  ＭＡｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏで効率的な選択的腫瘍局在性を示すとＰＥＴ画像処理および組織学的検査によって示された。また、卵巣癌の患者における腫瘍を標的とし、重篤な有害事象が報告されることなかった（非特許文献１１）。
【００１０】
より最近、ＭＸ３５のヒト化型（ｈｕＭＸ３５またはＲｅｂＭａｂ２００と呼ばれる）が得られ、２００９年１月２９日に出願された国際特許出願（特許文献１）に記載されている。
【００１１】
本明細書を通じて、種々の科学的刊行物および特許または公開特許出願が参照される。本発明が関連する技術の現状をより十分に説明するために、これらの刊行物すべての開示内容は、その全文が参照により本明細書においてに組み込まれる。この節または本出願の任意のその他の部分における任意の参考文献の引例または同定は、このような参考文献が、本明細書における先行技術として利用可能であるということを承認するものと解釈されてはならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００５７６
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ３（６）：ｅ２３７１頁、２００８年
【非特許文献２】Ｍａｇｌｉａｎｉら、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６（１８）：２３０５〜２３頁、２００９年
【非特許文献３】Ｌｉｔｍａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５：８６６〜８７９頁、２００５年
【非特許文献４】Ｍｏｒｅａら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７５：２６９〜２９４頁、１９９８）
【非特許文献５】Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎ．Ｉ．Ｈ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＤＣ．、１９９１年
【非特許文献６】Ｄｏｂｒｏｆｆら、Ｈｙｂｒｉｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ  ２１：３２１〜３３１頁、２００２年
【非特許文献７】Ｄｏｂｒｏｆｆら、Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｏｎｃ．、３：２０４〜２１７頁、２０１０年
【非特許文献８】Ｍａｔｔｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４７：６７４１〜６７５０頁、１９８７年
【非特許文献９】Ｆｉｎｓｔａｄら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３（８）：１４３３〜１４４２頁、１９９７年
【非特許文献１０】Ｅｌｇｑｖｉｓｔら、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．  ４６（１１）：１９０７〜１５頁、２００５年
【非特許文献１１】Ｈｕｌｔｂｏｒｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２１：３７３〜３８１頁、２００６年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
癌細胞などの腫瘍性細胞の成長を阻害できるペプチドを同定し、提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
ＲｅｂＭａｂ２００ヒト化モノクローナル抗体（ｈｕＭＸ３５）に由来するペプチドが、いくつかのヒト腫瘍細胞株のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成長に影響を及ぼし、また、同系モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ  転移性成長も阻害することがわかった。ペプチドが、過度の接着（ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）から、細胞浸潤および転移の阻害にさらに翻訳される細胞遊走の阻害にわたる、重要な用量依存的反応刷り込む癌細胞を標的とすることがわかった。
【発明の効果】
【００１６】
したがって、本発明の一態様は、配列番号３に示されるアミノ酸配列またはその誘導体によって同定される、ヒト化モノクローナル抗体ＲｅｂＭａｂ２００の相補性決定領域に由来するアミノ酸配列を含む、単離された、または合成された抗腫瘍ペプチドを提供することである。配列番号３に示されるアミノ酸配列の誘導体は、配列番号８、９および１４〜３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。本ペプチドは、黒色腫などのｍＡｂ  ＭＸ３５と反応しない腫瘍細胞に対してでさえ抗腫瘍活性を示し、腫瘍成長を阻害するか、または腫瘍もしくは癌を治療するための医薬組成物または方法において活性物質として使用できる。
【００１７】
したがって、本発明の別の態様は、１種以上の抗腫瘍ペプチドと、医薬上許容される担体とを含む医薬組成物を提供することである。本発明のさらに別の態様は、必要とする被験体に、有効量の抗腫瘍ペプチドを投与するステップを含む、腫瘍成長を阻害する方法または癌を治療する方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１Ａは、マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２．１における細胞間接着に対するＲＢ９の効果のグラフである。図１Ｂは、マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２．１における細胞間接着に対するＲＢ１０の効果のグラフである。図１ＣはヒトＵ８７ＭＧ膠芽腫における細胞間接着に対するＲＢ９の効果のグラフである。図１Ｄは、ヒトＵ８７ＭＧ膠芽腫における細胞間接着に対するＲＢ１０の効果のグラフである。
【図２】図２Ａは、ヒトＳＫＢＲ３乳癌における細胞間接着に対するＲＢ９の効果のグラフである。図２Ｂは、ヒトＳＫＢＲ３乳癌における細胞間接着に対するＲＢ１０の効果のグラフである。図２Ｃは、ヒトＡ２０５８黒色腫における細胞間接着に対するＲＢ９の効果のグラフである。図２Ｄは、ヒトＡ２０５８黒色腫における細胞間接着に対するＲＢ１０の効果のグラフである。
【図３】図３Ａは、ヒトＳｉＨａ子宮頸部腫瘍細胞における細胞間接着に対するＲＢ９の効果のグラフである。図３Ｂは、ヒトＳｉＨａ子宮頸部腫瘍細胞における細胞間接着に対するＲＢ１０の効果のグラフである。
【図４】図４Ａは、ヒトＨＣＴ結腸腫瘍細胞における細胞間接着に対するＲＢ９の効果のグラフである。図４Ｂは、ヒトＨＣＴ結腸腫瘍細胞における細胞間接着に対するＲＢ１０の効果のグラフである。
【図５】図５は、対照、細胞傷害性抗黒色腫ｍＡｂ（Ａ４  Ｈ３）の真のマイクロ抗体、ＲＢ９およびＲＢ１０で処理した、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞に対するＲＢ９およびＲＢ１０のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果を示す図である。
【図６】図６は、対照およびＡ４  Ｈ３と比較した、ＲＢ９およびＲＢ１０の処理によって低減される肺黒色腫小結節のグラフである。
【図７】図７Ａは、トリパンブルーによって測定される、ヒト白血病ＨＬ−６０細胞に対するＲＢ９の軽度の細胞傷害性のグラフである。図７Ｂは、ＭＴＴアッセイによって測定される、ヒト白血病ＨＬ−６０細胞に対するＲＢ９の軽度の細胞傷害性のグラフである。
【図８】図８Ａは、トリパンブルーによって測定される、ヒトＯＶＣＡＲ−３卵巣腫瘍細胞に対するＲＢ９の細胞傷害性がないことを示すグラフである。図８Ｂは、ＭＴＴアッセイによって測定される、ヒトＯＶＣＡＲ−３卵巣腫瘍細胞に対するＲＢ９の細胞傷害性がないことを示すグラフである。
【図９】図９は、対照およびＲＢ１０と比較した、各１ｍＭ濃度の、アラニンスキャニングシリーズ：ＲＢ１０ａ、ＲＢ１０Ａｌ、ＲＢ１０Ａ３、ＲＢ１０Ａ４、ＲＢ１０Ａ５、ＲＢ１０Ａ６およびＲＢ１０Ａ８のＲＢ１０誘導体による細胞接着効果のグラフである。
【図１０】図１０Ａは、未処理Ｂ１６Ｆ１０−ＮＥｘ２腫瘍細胞（対照）におけるアニオンスーパーオキシドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成の写真である。図１０Ｂは、Ｈ２Ｏ２（陽性）で処理したＢ１６Ｆ１０−ＮＥｘ２腫瘍細胞におけるアニオンスーパーオキシドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成の写真である。図１０Ｃは、ＲＢ１０で処理したＢ１６Ｆ１０−ＮＥｘ２腫瘍細胞におけるアニオンスーパーオキシドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生成の写真である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＲＢ９半減期のＨＰＬＣ質量分析のグラフである。図１１Ａは、未処理のヒト血漿のＨＰＬＣ質量分析のグラフである。図１１Ｂは、０時間でＲＢ９を用いて処理したヒト血漿のＨＰＬＣ質量分析のグラフである。図１１Ｃは、２４時間でＲＢ９を用いて処理したヒト血漿のＨＰＣＬ質量分析のグラフである。
【図１２】図１２は、２時間後のヒト血漿におけるペプチドＲＢ９の５０％分解のグラフである。
【図１３Ａ】図１３Ａは、０時間（左）および２４時間（右）での、対照におけるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞の遊走の写真である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、０時間および２４時間での、ＲＢ１０  ５００μΜでの処理によって阻害された、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞の遊走の写真である。
【図１４】図１４は、マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞における遊走のＲＢ１０用量依存的阻害のグラフである。
【図１５】図１５は、１２時間のインキュベーション後の、マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞の成長のＲＢ１０部分阻害の写真である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＲＢ９によるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞遊走の完全阻害ならびにＲＢ９スクランブル、ＲＢ９Ｍ１、ＲＢ９Ｍ２、ＲＢ９Ｍ３およびＲＢ９Ｍ４による部分阻害のグラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＲＢ９によるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞遊走の完全阻害およびＲＢ９Ｍ５による部分阻害のグラフである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＲＢ９  Ｓｃ２およびＲｂ９  Ｓｃ３によるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１６Ｄ】図１６Ｄは、ＲＢ１０およびＲＢ１０  Ｍ３によるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞遊走の完全阻害ならびにＲＢ１０スクランブルおよびＲＢ１０  Ｍ４による部分阻害のグラフである。
【図１６Ｅ】図１６Ｅは、ＲＢ１０  ＡｌによるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞遊走の非阻害のグラフである。
【図１６Ｆ】図１６Ｆは、ＲＢ１０  Ｍ１、ＲＢ１０  Ａ３、ＲＢ１０  Ａ４、ＲＢ１０  Ａ６およびＲＢ１０  Ａ８によるＢ１６Ｆ１０−  Ｎｅｘ２細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＲＢ９によるヒト黒色腫Ａ２０５８細胞遊走の完全阻害のグラフである。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＲＢ９によるヒト膠芽腫Ｕ８７細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＲＢ９によるヒト結腸癌ＨＣＴ細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、ＲＢ９によるヒト子宮頸癌ＳｉＨａ細胞遊走の非阻害のグラフである。
【図１７Ｅ】図１７Ｅは、ＲＢ９によるヒト卵巣癌ＯＶＣＡＲ−３細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１７Ｆ】図１７Ｆは、ＲＢ９によるヒト乳癌ＳＫＢｒ−３細胞遊走の完全阻害のグラフである。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ＲＢ１０によるヒト膠芽腫Ｕ８７細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ＲＢ１０  Ｍ３によるヒト膠芽腫Ｕ８７細胞遊走の部分阻害のグラフである。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ＲＢ１０  Ｍ３によるヒト子宮頸癌ＳｉＨａ細胞遊走のほぼ完全阻害のグラフである。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、ＲＢ１０  Ｍ３によるヒト子宮頸癌ＨｅＬａ細胞遊走のほぼ完全阻害のグラフである。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＲＢ９による３Ｔ３マウス線維芽細胞の遊走の非阻害のグラフである。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＲＢ９によるＦｉｂｒｏＲＰ初代ヒト線維芽細胞の遊走の非阻害のグラフである。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＲＢ９によるＴ７５初代ヒト線維芽細胞の遊走の非阻害のグラフである。
【図２０】図２０は、マトリゲルによるマウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞浸潤のＲＢ９用量依存的阻害のグラフである。
【図２１】図２１は、ＲＢ１０  Ｍ３の非溶血性効果のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
以下の定義は、このような用語が与えられる範囲を含めた、明細書および特許請求の範囲の明確な、一貫した理解を提供するよう役立つ。
【００２０】
語句「腫瘍細胞細胞傷害性」によって、成長阻害、細胞周期停止、細胞運動の阻害、細胞接着の増大、マトリックス基質による細胞浸潤の阻害、受容体によって誘導される細胞死、老化または死滅につながる細胞代謝およびシグナル伝達経路の干渉を含めた種々の効果が言及される。これらの効果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで研究され得る。
【００２１】
本明細書において用語「ペプチド」とは、１個のアミノ酸のアミノ基および次のアミノ酸のカルボキシル基からのＨ２Ｏの分子の排除によって形成される共有結合によって接続される２個以上のアミノ酸で構成されている化合物を意味する。本発明の目的上、ペプチドは、アミノ酸残基の直鎖アレイであっても、環状アレイであってもよく、すなわち、直鎖ペプチドの末端またはペプチド内のアミノ酸の側鎖が、例えば、化学結合によって接続され得る。
【００２２】
本発明の目的上、用語「単離された」とは、その元の環境（天然に存在する環境）から取り出された生体物質（例えば、核酸、ペプチドまたはタンパク質）の状態または物質が元の環境からは別個に存在する状態を指す。例えば、植物または動物中に天然の状態で存在するペプチドは、単離されていないが、それが天然に存在する隣接するアミノ酸から離れている同じペプチドは、「単離された」と考えられる。本発明の目的上、用語「単離されたペプチド」は、天然ペプチドに対応するよう、公知の方法によって調製または合成されたものを含み得る。
【００２３】
本発明の目的上、語句「合成ペプチド」とは、公知のアミノ酸の化学反応によって、または上記のような生体物質の単離および精製によって調製されたペプチドを指す。
【００２４】
語句「に対応する」とは、本明細書において、正確な位置が、類似性または相同性が測定される分子と同一であるかまたは異なっているかに関わらず、類似のまたは相同な配列を指すよう使用される。核酸またはアミノ酸配列アラインメントは、スペースを含み得る。したがって、用語「に対応する」とは、配列類似性を指すものであって、アミノ酸残基またはヌクレオチド塩基の番号付けを指すものではない。
【００２５】
用語、本明細書において使用されるペプチドの「誘導体（単数または複数）」とは、参照ペプチドに関して行われた、例えば、そのアミノ酸配列における、修飾、置換、欠失および／または付加の変動を含むベプチドであって、参照ペプチドとの同定可能な関係を保持するペプチドを指す。修飾は、例えば、グリコシル化、ペグ化、ＰＥＧアルキル化、アルキル化、アセチル化、アミド化、グリコシル−ホスファチジルイノシタリゼーション（ｐｈｏｓｐｈａｄｙｌｉｎｏｓｉｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）、ファルネシル化、ＡＤＰ−リボシル化、硫酸化、脂質付着、水酸化および／またはリン酸化による化学修飾を含み得る。この用語は、用語「機能的類似体」と交換可能であると理解される。
【００２６】
本明細書において、用語「投与すること」、「投与」および同様の用語は、妥当な医療において、目下提供される組成物を、治療効果を提供するような方法で被験体に送達する任意の方法を指す。本発明の一態様は、本組成物の治療上有効な量の、それを必要とする患者への静脈内投与を提供する。
【００２７】
本明細書において、用語「治療すること」は、腫瘍または癌を発生する傾向を有する患者または被験体におけるこのような腫瘍または癌の予防、および一度罹患した場合には、発生した腫瘍または癌の寛解もしくは排除またはこのような癌の特徴的な症状の軽減を含む。
【００２８】
本明細書において、用語「腫瘍」または「癌」とは、腫瘍または癌のすべての種類を指す。いくつかの実施形態では、用語「腫瘍」とは、卵巣、肺、腎臓または結腸の癌腫、膠芽腫、黒色腫、星状細胞腫、肉腫、奇形癌腫、絨毛癌または造血器腫瘍を指す。同様に、用語「癌」とは、卵巣癌、肺癌、腎臓癌、皮膚癌、脳癌、子宮癌、乳癌、結腸癌、前立腺癌、肝臓癌、腸癌、食道および胃癌、頭頸部癌または白血病を指す。用語「腫瘍」および「癌」は、互いに交換可能であり得る。
【００２９】
本明細書において、用語「被験体」とは、そのための診断、予後または治療が望まれる任意の被験体、特に、哺乳動物被験体、例えば、ヒトを指す。この用語は、「患者」を指すよう使用される場合もある。
【００３０】
本明細書において、用語「担体」、「賦形剤」または「希釈剤」とは、原薬ではない医薬組成物の任意の構成成分を指す。したがって、用語「医薬上許容される担体」とは、非毒性の、不活性の固体、半固体液体増量剤、希釈液、カプセル化物質、任意の種類の製剤補助物質または簡単に、生理食塩水などの滅菌水性媒体を指す。医薬上許容される担体として役立ち得る物質の一部の例として、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、ピーナッツオイル、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブオイル、コーンオイルおよびダイズ油などのオイル、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張性生理食塩水、リンガー溶液、エチルアルコールおよびリン酸バッファー溶液ならびに医薬製剤において使用されるその他の非毒性の適合性物質が挙げられる。
【００３１】
活性薬剤は、有効量で投与されることが好ましい。本明細書において、語句「有効量」とは、目下記載される方法で使用される場合に、合理的なベネフィット／リスク比に相応の、過度の有害な副作用（毒性、刺激作用またはアレルギー反応など）を伴わずに所望の治療反応をもたらすのに十分である構成成分の量を指す。例えば、「治療上有効な量」は、任意の医学的治療に適用可能な合理的なベネフィット／リスク比で、腫瘍の退縮または腫瘍形成および転移の少なくとも部分的な停止を引き起こすための活性薬剤の十分な量であり得る。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間的経過は、治療されている状態の性質および重篤度に応じて変わる。治療の処方、例えば、投与量、タイミングなどの決定は、一般開業医または専門医の責務の範囲内であり、通常、治療される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に公知のその他の因子を考慮する。技術およびプロトコールの例は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見出すことができる。
【００３２】
本願を通じて、種々の実施形態の記載で「含む」という用語を使用するが、一部の特定の例では、実施形態が、代わりに「本質的にからなる」または「からなる」という言葉を使用して記載され得ることは当業者ならば理解されよう。
【００３３】
別段に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、目下記載される対象が関連する技術分野における当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００３４】
本教示をより理解するためであって、決して、教示の範囲を制限するものではないが、別段の指示のない限り、本明細書および特許請求の範囲中で使用される量、パーセンテージまたは割合を表すすべての数字およびその他の数値は、用語「約」によって、すべての例において変更されていると理解されるべきである。したがって、反対の指示のない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲において示される数的パラメーターは、得られるよう探し求められる所望の特性に応じて変わり得る近似値である。最低限でも、各数的パラメーターは、報告された有効桁の数字を踏まえて、また通常の四捨五入技術を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
【００３５】
ペプチドの調製
目下記載される、３０または２５個未満のアミノ酸の範囲の大きさを有する生理活性ペプチド（配列番号１〜６）は、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００５７６に記載されるＲｅｂＭａｂ  ２００  （ｈｕＭＸ３５）の相補性決定領域（ＣＤＲ）高頻度可変性ドメインから、生理活性ペプチドを単離、分離および精製するための公知の方法を用いて単離または分離してもよく、それらをさらに修飾することもできる。目下記載されるペプチドはまた、化学合成または組換えＤＮＡ技術を使用する製造によって調製してもよい。例えば、ペプチドは、当技術分野で公知のような、アジド、酸塩化物、酸無水物、化合物酸無水物、ＤＣＣ、活性化エステル、ウッドワード試薬Ｋ、カルボニルイミダゾール、デオキシディクセイション（ｄｅｏｘｉｄｉｘａｔｉｏｎ）、ＤＣＣ／ＨＯＮＢ、ＢＯＰ試薬などを使用する方法によって得ることができる。また、それらは、自動ペプチド合成装置を使用する化学合成によって調製できる。
【００３６】
このような化学反応後に、公知の精製法によってペプチドを分離および精製してもよい。このような精製法の一例として、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶化などの組合せを挙げることができる。
【００３７】
さらに、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における組換え発現系を使用して、目下記載されるペプチドを、特定の酵素切断部位、例えば、エンテロキナーゼを有する融合タンパク質として発現させてもよい。次いで、細菌を破壊し、遠心分離すると、得られたスープは融合タンパク質を含有する。次いで、融合タンパク質を、特定の親和性カラム、例えば、Ｎｉ２＋またはグルタチオンカラムに載せ、溶出してもよい。溶出後、精製された融合タンパク質を、特定の酵素切断反応に付す。次いで、ＨＰＬＣまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、ペプチドを得られた混合物から精製する。従来の、分析化学、分子生物学的技術および細胞生物学的技術が関係する方法は、本明細書に列挙されるものを含めて多数の公知の参考文献において詳細に記載されている。
【００３８】
本発明は、癌を患っている被験体の治療のための医薬組成物の製造のための、３０または２５個のアミノ酸より小さいペプチドの使用を提供する。本発明の医薬組成物中に含めるための抗腫瘍ペプチドの好ましい大きさは、最大で３０または２５個のアミノ酸、好ましくは、最大で２０個のアミノ酸であり、１０、９、８、７、６または５個のアミノ酸の長さを有するより小さい分子が特に有効である。
【００３９】
誘導体、体内分布および薬物動態
ペプチドの誘導体（または機能的類似体）は、例えば、Ｌ−アミノ酸残基のＤ−アミノ酸残基またはその他の非天然残基での置換によって調製してもよい。元のアミノ酸配列の多数の位置誘導体を作製することおよび特定の活性についてスクリーニングすることによって、例えば、Ｄ−アミノ酸を含む改善されたペプチドを同定し、本発明に従って使用することができる。
【００４０】
誘導体または機能的類似体は、出発点と見なされる元のペプチドに機能的または構造的に似ているが、例えば、天然に存在しないアミノ酸またはポリアミドからなるペプチドミメティック化合物であり得る。「保存的アミノ酸置換」では、あるアミノ酸残基が、全般的に類似した特性（大きさ、疎水性および／または電荷）を有する別の残基で置換され、その結果、このような置換を有するペプチド配列の全体的な機能は、重大に影響を受けない可能性が高い。「非保存的アミノ酸置換」では、あるアミノ酸残基が、全般的に異なる特性（大きさ、疎水性および／または電荷）を有する別の残基で置換され、その結果、このような置換を有するペプチド配列の全体的な機能は、重大に影響を受け得る。誘導体はまた、参照ペプチドの少なくとも１個のアミノ酸を体系的に変更することによって提供することもできる。これは、例えば、アラニンスキャニング（Ａｌａスキャン）および／または各アミノ酸が、１９種（またはセレノシステインおよびピロリジン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）が含まれる場合には２１種）のその他のアミノ酸のうちの１種で順に置換される置換ネット分析（ｒｅｐｌａｓｅｍｅｎｔ  ｎｅｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって行うことができる。これらの方法を用いて、元のアミノ酸配列に基づいているが、各々、少なくとも１個のアミノ酸残基の変化または置換を含有する、多数の異なるペプチドを作製できる。このように、元のアミノ酸配列の多数の位置変異体が合成および／または酵素的に調製される。
【００４１】
ペプチドミメティックは、元のアミノ酸間のペプチド結合の代替物を有するプソイドペプチドをさらに含む（例えば、米国特許第６，６８９，７５３号明細書参照のこと）。このようなペプチド結合の代替物として、それだけには限らないが、ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、ＣＨ２ＮＨ、ＣＯＣＨ２、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２Ｓ０２およびＮＨＣＯが挙げられる。
【００４２】
腫瘍細胞を直接的に標的とするペプチドの場合には、長期の血液循環が必要であり、したがって、安定性の増大のために誘導体および／またはコンジュゲートが合成される。本発明の一実施形態では、ペプチドは、安定化されたペプチドを得るためにさらに修飾またはコンジュゲートされる場合もある。Ｄ−アミノ酸またはプソイドアミノ酸の導入およびペプチド環化は、ペプチド安定性を増大するための最も一般的な戦略である（ＡｄｅｓｓｉおよびＳｏｔｏ、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．９（９）：９６３〜７８頁、２００２年）。一般的な修飾は、Ｃ−Ｃ環状ペプチドのもの（配列番号３のＲＢ１０ａにおいて実施され、配列番号８のＲＢ９を生じさせたような）であり、これは、特定のファージディスプレイライブラリーでも発現される。ペプチドは、エンドペプチダーゼおよびエキソペプチダーゼによる分解を防ぐためのその他の方法で変更されてもよい。これらとして、Ｎ末端（アセチル化、グリコシル化）またはＣ末端（アミド化）修飾およびペプチド内の特に不安定な部位での非天然アミノ酸（例えば、β−アミノおよびα−トリフルオロメチルアミノ酸）の使用が挙げられる。
【００４３】
Ａｒａｐら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７７〜３８０頁、１９９８年）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで発達中の腫瘍へファージを標的化する３種の主なペプチドモチーフを同定した。ＣＤＣＲＧＤＣＦＣモチーフを保持するファージは、高度に選択的な方法で、癌腫、肉腫および黒色腫を含めたいくつかの腫瘍の種類にホーミングし、ホーミングは、同族ペプチドによって特異的に阻害される。ファージの脳および腎臓血管への選択的局在性を媒介できるペプチドが同定されており、これらの臓器に対して最大１３倍の選択性を示している。脳に局在するファージによってディスプレイされるペプチドのうち１種を合成したところ、相同ファージの脳への局在性を特異的に阻害することがわかった（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４〜３６６頁、１９９６年；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２〜５４６頁、１９９７年）。これらの実験もまた、ファージ認識のための腫瘍組織上の特異的標的を同定することとは別に、全身投与された同族ペプチドが、同じ標的を認識することを示し、これはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏでの十分な安定性を意味する。実際に、ペプチドは、グルタルアルデヒドで固定された赤血球上にコーティングされた場合に、静脈内注射された細胞の標的組織への選択的局在性を引き起こした。
【００４４】
本発明の一実施形態では、より高い安定性および改善された薬物動態を可能にする、臨床試験において使用するためのペプチド誘導体および／またはコンジュゲートが提供される。このような誘導体および／またはコンジュゲートは、配列番号１〜６、特に、配列番号３に示されるペプチド配列に基づいて合成してもよい。このような誘導体および／またはコンジュゲートを、腫瘍細胞細胞傷害性および遊走および転移の腫瘍細胞阻害について試験する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期の増大および抗腫瘍活性に基づいて、一度、誘導体を選択すると、患者において試験される候補となる。抗転移性ペプチドの場合には、原発腫瘍が切除されたか、またはリンパ節転移のステージにあるか、または局所転移を有する限定された腫瘍発達を有するか、または化学療法を受けている患者のための臨床試験において有効または有用であることを期待できる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を有する選択されたペプチドは、並行して、ｉｎ  ｖｉｖｏ体内分布およびペプチド薬物動態について評価される必要がある。
【００４５】
本発明の一実施形態では、目下記載されるペプチドを、その体内分布およびその薬物動態について評価できる。これらの研究のためには、ペプチドを、ビオチン、放射能または別の都合のよいタグを用いて適切に標識しなくてはならない。ビオチン化ペプチドは、ＥＬＩＳＡプレート上でストレプトアビジンによって、または体液および組織ホモジネートとともにインキュベートされたセファロース−ストレプトアビジンビーズとの結合によって認識され得る。７０％アセトニトリル、０．５％ギ酸、１ｍＭビオチン水溶液によって達成され得るストレプトアビジンでコーティングされたマルチウェルプレートと堅く結合されたビオチン化ペプチドを溶出し、ペプチドをＬＣ−ＭＳによって同定する。例えば、ＲｅｂＭａｂ２００  ＣＤＲ  Ｈ３の場合には、それがチロシン（Ｙ）残基を有するので１２５Ｉを用いて容易に標識できる。また、Ｐｉｅｒｃｅ試薬を使用するビオチン化のためにＮ末端システイン残基を使用できる。生理活性ペプチドの構造に応じてその他の適した方法を使用してもよい。
【００４６】
体内分布および特異的腫瘍細胞結合を評価するための別のアプローチは、発現ベクターとしてのバクテリオファージＭｌ３の使用である。したがって、本発明の一実施形態では、目下記載されるペプチドをバクテリオファージＭ１３を使用してその体内分布および特異的標的腫瘍細胞結合について評価できる。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）におけるトランスフェクションの際にファージを生成するプラスミドを、ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドが、ファージタンパク質をコードするものに融合されるよう操作できる。ファージによって発現される一連の類似ペプチドも、種々のオリゴヌクレオチドを使用して構築できる。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるファージ分布は、ウイルス力価測定によってたどることができる。
【００４７】
腫瘍および正常組織における、ペプチドの薬物動態、体内分布および結果として起こる取り込みは、分子の大きさおよびリガンド特異性の両方によって変更することができ、分子の大きさは、薬物動態および臓器取り込みに、予測可能な方法で影響を及ぼす。分子の大きさの増大は、ペプチドのポリエチレングリコール（ペグ化）または血清アルブミンとのコンジュゲーションによって達成できる。本発明の一実施形態では、ペプチドをコンジュゲートできる。大きいタンパク質（＞５０ｋＤａ）は、腎臓によって濾過されないので、ＰＥＧが、ペプチドコンジュゲートの流体力学半径を増大し、その腎クリアランスを防ぐのに役立ち得る。両方の場合において、コンジュゲートされたペプチドの活性を試験することは重要である。求核性アミノ酸（例えば、システインまたは非天然アミノ酸）を使用して、ＰＥＧもペプチド配列内に結合することができ、ペプチド機能を阻害しない場合には、特に不安定な内部残基を分解することからエンドペプチダーゼも排除してもよい。一実施形態では、目下記載されるペプチドは、融合タンパク質を形成できる。
【００４８】
非共有結合相互作用も可能である。２０個のアミノ酸配列の、抗組織因子ＦａｂのＣ末端への融合によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでアルブミンとの非共有結合が可能となり、ウサギにおいてＦａｂの半減期を約４０倍増大した（ＭｃＦａｒｌａｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７（１）：２５４〜６１頁、２００７年）。同様の構築物は、エフェクターペプチドの半減期を増大するようアルブミンと結合されるペプチドＱＲＬＭＥＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷＥＤＤＦと、Ｃ末端で融合されたＩｇ−ＣＤＲを使用して試験できる。ペプチドの、ヒトγ免疫グロブリン（ＩｇＧ）のＦｃドメインとの遺伝子融合は、ペプチド分子の大きさを増大するための代替法である。Ｆｃ融合は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）のＩｇＧ保護機能を利用する。血清アルブミンは、腎クリアランスを逃れることに加えて、ＩｇＧとは異なる受容体の表面との結合によってＦｃＲｎを介して再循環される。アルブミンのアミノ酸位置３４での遊離システインとの共有結合によるペプチドのアルブミンとの化学的コンジュゲーションも、治療用ペプチドの半減期を延長するのに効果的である。血漿中滞在時間を延長するために、さまざまな戦略が開発されている。
【００４９】
直接腫瘍細胞傷害性のために選択されるペプチドは、免疫原性であってはならず、したがって、強い中和抗体反応を誘発できないか、または細胞免疫反応性のためもしくは過敏症反応の媒介のためにＭＨＣによって提示され得ない。ペプチド構造へＤ−アミノ酸も組み込むことは、ペプチドのタンパク質分解切断および免疫反応性の両方を減少させなくてはならない。その他の種類の誘導体化も同様に、免疫原性について調べられなければならない。
【００５０】
生物活性
本発明との関連で「生物活性」は、ペプチドの、「治療上有効な量」の定義に関連して本明細書に列挙された１種以上の細胞傷害性効果を呼び起こす能力を指すよう使用される。特定の実施形態では、「生物活性」は、腫瘍性細胞成長または増殖を阻害する能力である。好ましい生物活性は、標的腫瘍（例えば、癌）細胞の成長の遅延または完全停止を含めた阻害である。別の好ましい生物活性として、標的腫瘍（例えば、癌）細胞の死滅をもたらす細胞傷害性活性がある。さらに別の好ましい生物活性は、腫瘍性細胞の細胞接着の増大である。
【００５１】
本発明は、一態様では、例えば、ペプチドの活性を調べるためにペプチドをスクリーニングすること、結果を分析することおよび／または抗腫瘍活性を有する１種以上のペプチドを同定することを含む、１種以上のペプチドを同定するための方法および／または１種以上のペプチドの生物活性を調べるための方法を提供する。特定の腫瘍種に対するペプチドの有効性は、例えば、Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３（６）：ｅ２３７１頁、２００８年）およびＤｏｂｒｏｆｆら（Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｏｎｃ．、３：  ２０４〜２１７頁、２０１０年）に記載されるように、例えば、腫瘍に由来する細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでペプチドの存在または不在に付すことによって、または腫瘍を投与されたマウスを処理し、腫瘍を経時的にモニタリングすることによってｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで調べることができる。いくつかの実施形態では、抗腫瘍ペプチドは、ＲｅｂＭａｂ２００に由来するもの、特に、ＲｅｂＭａｂ２００  ＣＤＲに由来するもの、特に、配列番号８、９および１４〜３３に示されるＣＤＲ  Ｈ３（配列番号３）に由来するものである。好ましくは、ペプチドは、配列番号３（ＲＢ１０ａ）、配列番号８（ＲＢ９）、配列番号９（ＲＢ１０）、配列番号１６（ＲＢ９  Ｍ３）、配列番号２４（ＲＢ１０Ａ４）、配列番号２６（ＲＢ１０  Ａ６）および配列番号３１（ＲＢ１０  Ｍ３）に示されるものである。
【００５２】
細胞成長の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏいずれかでの、標的細胞、特に、癌細胞の大幅な減少を指す。さらなる情報は、Ｍｕｒａｋａｍｉら（ＷＢ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５年）による、「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｏｎｃｏｇｅｎｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」と題された、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、ＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎおよびＩｓｒａｅｌ編、第１章、特に、１３頁に見出すことができる。
【００５３】
細胞株の細胞接着は、陰性対照との比較において、細胞培養および種々の濃度のペプチドとともにインキュベーションした後に、細胞付着の増強が観察される場合にペプチド処理によって「増大した」といわれる。
【００５４】
一実施形態では、用量依存性効果が観察される。すなわち、低用量のペプチドでは、細胞は、ペプチド濃度に反比例した速度でトリプシン／ＥＤＴＡで剥がれる。
【００５５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで特定の腫瘍細胞種に対する有効性についてペプチドを試験することに加えて、またはその代わりに、臨床医がｉｎ  ｖｉｖｏでペプチドの抗腫瘍効果を試験することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のために、腫瘍種に由来する細胞を、マウスなどの実験動物に注射する。次いで、動物をモニタリングして、腫瘍が、動物において注射の部位で生じたか、または別の場所で生じたかを調べる。腫瘍細胞接種後にペプチドを用いて処理された実験動物は、通常、腫瘍を発生しないか、または腫瘍形成を大幅に低減する。
【００５６】
医薬組成物
本明細書に記載された有効量のペプチドを含有する組成物を、治療を必要とする被験体に投与できる。組成物は、非経口的に、静脈内に、局所に、経口的に、頬側に、経鼻的に、経直腸的に、皮下に、筋肉内に、または腹膜内に投与できる。
【００５７】
治療の組成物は、投与経路に適合するよう製剤できる。組成物は、錠剤、カプセル剤、溶液、散剤、吸入薬、ローション、チンキ、トローチ剤、坐剤または経皮パッチとして製剤できる。
【００５８】
非経口、皮内または皮下投与のための溶液は、例えば、水、生理食塩水、グリセリン、硬化油、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールまたはその他の合成溶剤などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化薬；キレート化剤；酢酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤を含み得る。溶液は、アンプル、ディスポーザブルシリンジまたはプラスチックもしくはガラスバイアル中に貯蔵できる。
【００５９】
注射または静脈内投与用の製剤は、溶媒または分散媒である担体を含み得る。適した担体として、水、生理食塩水、静菌性水、クレモホールＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、グリコール、プロピレングリコールなど）およびそれらの混合物が挙げられる。これらの組成物は、注射を可能にするために、無菌で、流体でなくてはならない。流動性は、レシチンまたは界面活性剤などのコーティングを用いて維持できる。微生物混入は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールなどの抗菌剤および抗真菌剤を含むことによって防ぐことができる。組成物の等張性を維持するために、マンニトール、ソルビトールなどの糖および多価アルコールおよび塩化ナトリウムを使用してもよい。
【００６０】
無菌性は、溶液の濾過滅菌によって確実にすることができる。あるいは、溶液を、個々に濾過滅菌された構成成分から製造してもよい。濾過滅菌された構成成分を真空乾燥または凍結乾燥させて、滅菌散剤を製造できる。このような散剤を、滅菌担体溶液を用いて注射の前に再水和してもよい。
【００６１】
経口組成物として、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ剤、懸濁液および溶液が挙げられる。組成物は、不活性希釈液または食用担体を用いて形作ってもよい。カプセル剤は、適当な希釈液を、ペプチドまたはその製剤と組み合わせることおよびカプセルを混合物で充填することによって製剤できる。一般的な希釈剤として、粉末セルロースなどのデンプン、スクロース、フルクトースもしくはマンニトールなどの糖がある。錠剤は、湿式または乾式造粒によって、打錠によって、またはその他の公知の方法によって製造できる。錠剤のための組成物は、所望のペプチド／化合物に加えて、例えば、微晶質セルロースまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンなどの賦形剤；糖（例えば、ラクトース、フルクトース、グルコース、メチルセルロース、エチルセルロース）；ゴム（例えば、トラガカントゴム、アラビアガム）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）またはコーンスターチ）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはステロート（Ｓｔｅｒｏｔｅｓ））；磨砕剤（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）；矯味剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料）；または同様の性質の任意の化合物を含み得る。組成物の放出を遅延させるために、ポリ−Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリドまたはポリグリコリドなどの生分解性ポリマーをマトリックスとして使用してもよい。
【００６２】
吸入による投与のためには、化合物を、例えば、適した噴射剤、例えば、ガスを含有する加圧容器ディスペンサーからのエアゾールスプレーの形態で、またはその他の公知の方法によって送達してもよい。例えば、投与はまた、例えば、鼻腔スプレーまたは坐剤を用いる経粘膜であってもよく、または例えば、軟膏（ｓａｌｖｅ）、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、ゲルまたはクリームのような経皮手段によるものであってもよい。このような投与様式は、例えば、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む製剤を使用し得る。
【００６３】
徐放性製剤も調製できる。徐放性製剤の適した例として、ペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例として、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射用マイクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマーおよびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日にわたる分子の放出を可能にするが、特定のハイドロゲルは、タンパク質をより短い期間放出する。
【００６４】
また、癌、好ましくは、転移性癌腫の治療のための医薬組成物の製造のための、抗腫瘍ペプチド、好ましくは、ＲｅｂＭａｂ２００に由来するものの使用も提供される。
【００６５】
投与様式および治療方法
本明細書に記載されたペプチドは、例えば、ボーラス注射によって、例えば、硬膜外領域との接触を延長するために連続注入によって、またはその他の公知の方法によって投与できる。ペプチドは、任意の時間、注入できる。投与量および投与のタイミングは、特定の被験体の必要に従って、例えば、疼痛を治療するための標準的な臨床プロトコールの枠組み内で変更できる。ペプチドはまた、くも膜下腔内経路による送達、および血流中への送達が可能である。さらに、埋め込み可能な、または身体に取り付け可能なポンプを使用して、本明細書に記載されたペプチドを制御された速度で送達することもできる。あるいは、技術分野で公知のデポー製剤または徐放性製剤によって長期投与を達成できる。
【００６６】
ペプチド組成物の単回または複数回投与が実施でき、用量レベルおよびパターンは、治療医師によって選択される。いずれにしても、医薬製剤は、患者を効率的に治療するのに十分なペプチドの量を提供しなければならない。投与は、望ましくない細胞増殖の最初の現れで、または診断の少し後に始め、症状が実質的に減少するまで、およびその後の期間、継続しなくてはならない。癌のよく確立された症例では、負荷投与量とそれに続く維持量が必要となる。
【００６７】
さらに、このような治療を必要とする被験体に、配列番号１〜３３によって表されるアミノ酸配列を含むか、またはからなる少なくとも１種の抗腫瘍ペプチドまたはその誘導体または機能的類似体の有効量を、医薬上許容される希釈剤と一緒に被験体に投与することを含む、腫瘍成長を治療または阻害する方法が提供される。本発明の医薬組成物中に含めるための抗腫瘍ペプチドの好ましい大きさは、最大で３０個のアミノ酸、好ましくは、最大で２０個のアミノ酸であるが、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６または５個のアミノ酸の長さのより小さい分子も特に有効であり得る。
【００６８】
その他の治療計画を、本発明の抗腫瘍ペプチドの投与と組み合わせてもよい。例えば、このような抗腫瘍ペプチドを用いて治療される予定の患者がまた、放射線療法を受けてもよい。あるいは、またはさらに、患者に化学療法薬を投与してもよい。このような化学療法薬の調製および投薬スケジュールは、製造業者の使用説明書に従ってか、または熟練した開業医によって経験的に決定されるように使用され得る。このような化学療法のための調製および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ編、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ（１９９２年）に記載されている。化学療法薬は、本発明の抗腫瘍剤の投与に先立っても、それに続いてもよく、またはそれと同時に投与されてもよい。
【００６９】
ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４または血管内皮因子（ＶＥＧＦ）と結合する抗体などの腫瘍関連抗原にも対する抗体を投与することもまた、望ましいことであり得る。あるいは、またはさらに、同じものまたは２種以上の異なる癌関連抗原と結合する２種以上の抗体も、患者に同時投与してもよい。時には、１種以上のサイトカインを患者に投与することも有益であり得る。好ましい実施形態では、本明細書において、抗癌剤を、成長阻害剤と同時投与する。例えば、成長阻害剤を最初に投与し、続いて、本発明の抗腫瘍ペプチドを投与してもよい。同時投与または最初に、抗腫瘍ペプチドを投与することも考慮される。成長阻害剤の適した投与量は、目下使用されるものであり、成長阻害剤および本明細書におけるペプチドの組み合わされた作用（相乗効果）によって低下する場合もある。
【００７０】
投与量
治療のための適当な投与量は、決定されなくてはならない。個々の被験体を治療するのに必要な量または用量の決定は、当業者、例えば、開業医、薬剤師または研究者には日常的なものである。
【００７１】
疾患の予防または治療のための、本明細書における抗腫瘍ペプチドの適当な投与量は、上記で定義されるような治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、薬剤が予防目的で投与されるか、または治療目的で投与されるか、これまでの治療、患者の病歴および薬剤に対する応答ならびに主治医の裁量に応じて変わる。ペプチドは、一度に、または一連の治療にわたって、患者に適宜投与される。動物実験は、ヒト治療のための有効用量の決定のための信頼性のある指針を提供する。有効用量の種間スケーリングは、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｙａｃｏｂｉら編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９年、４２〜９６頁中、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．およびＣｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」によって定められた原則に従って実施できる。
【００７２】
ペプチドおよび／またはペプチド製剤の毒性および治療効力もまた、決定できる。非ヒト動物において、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するためには、日常的なプロトコールが利用可能である。治療係数は、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として測定される。適した比として、例えば、約２、５、１０、５０または１００を超える比が挙げられる。高い治療指数を有する、化合物、製剤および投与方法を決定できるが、これは、このような治療が、高い有効性を提供する投与量でほとんど毒性を有さないからである。非罹患組織、例えば、内皮組織への損傷を最小にしながら、化合物を罹患組織に送達するための手段が利用可能である場合には、毒性または望ましくない副作用を有する化合物を使用してもよい。一実施形態では、目下記載されるペプチドは、約９２０〜９３０μΜのＥＤ５０値を示す（図７参照のこと）。
【００７３】
ヒトにおいて使用するための投与量範囲の策定では、例えば、以下に記載されるような実験動物を用いる研究から、ペプチド調製物の有効用量を推定できる。例えば、細胞培養アッセイにおける治療上有効な投与量として、例えば、約０．１ｍＭ〜１ｍＭ、好ましくは、０．２５ｍＭ〜１ｍＭのペプチドおよびその間の範囲が挙げられる。用量は、動物において、この範囲に入る阻害剤の循環血漿濃度を達成するよう策定できる。例示的用量は、細胞培養アッセイにおいて決定されるような、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する試験化合物の濃度）を超える血漿濃度をもたらす。循環血漿濃度は、例えば、血液サンプルを得ることによって、また抗体ベースの特異的ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、または高性能液体クロマトグラフィーまたはマススペクトロスコピーを用いてサンプルを分析することによって決定できる。
【００７４】
あるいは、用量は、以下に記載されるように、動物モデルにおける試験から推定できる。症状の軽減は、マウスが少なくとも約１μｇ／ｋｇから最大１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ペプチドまたは医薬組成物を投与される場合に観察される。例えば、用量は、遊離の、誘導体化されていないまたはコンジュゲートされていない、血漿加水分解および腎クリアランスに対して感受性であるペプチドについて、６ｍｇ／ｋｇであり得る。動物およびヒトの投与量の相互関係（身体表面の平方メートルあたりのミリグラムに基づく）は、例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．１９６６年、５０、２１９によって記載されている。身体表面積は、患者の身長および体重からおよそ決定できる。例えば、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｔａｂｌｅｓ、Ｇｅｉｇｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ａｒｄｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７０年、５３７頁を参照のこと。ヒト患者を治療するための有効用量は、使用されるペプチド誘導体の安定性およびその薬物動態に応じて変わるので、目下のところ推定できない。ペプチドは、被験体において疼痛を低減するのに有効な局所濃度を維持するために、一定の頻度で、または連続して投与できる。
【００７５】
適当な用量は、投与方法に応じて、例えば、約１μｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日で変わり得る。また、小さいペプチドの低い免疫原性を考慮すると、小さいペプチドを用いる最大１００ｍｇ／ｋｇの投薬が可能であり、治療を必要とする被験体の状態を考慮して、治療の必要性が緊急であると決定される一部の症例では、最大２００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇまたはさらには１ｇ／ｋｇでさえの投薬も可能であろう。
【００７６】
患者の用量は、患者が、医師、薬剤師または研究者の保護下にある間、最適化できる。例えば、記載されたペプチドの比較的低用量を、最初に投与できる。患者を、以下に記載するように症状および疼痛の感覚についてモニタリングできる。用量は、適当な反応が得られるまで増大できる。さらに、任意の特定の被験体のための特定の用量レベルは、被験体の年齢、体重、全身の健康、性別および食事、投与の回数、投与経路、排泄速度および組み合わせて提供されるその他の薬物に応じて変わり得る。
【００７７】
以下の実施例は、例示のために提供されるのであって、特許請求の範囲を制限しようとするものではない。
【実施例】
【００７８】
材料および方法
腫瘍細胞株の調製および細胞培養
マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２．１黒色腫細胞を、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｕｎｉｔ、Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ  （ＵＮＩＦＥＳＰ）でクローニングした。ヒト黒色腫（Ａ２０５８）、ヒト結腸癌腫（ＨＣＴ−８）、ヒト乳房癌腫（ＭＣＦ−７、ＭＤＡおよびＳＫＢＲ３）、ヒト子宮頸癌（ＳｉＨａ）および卵巣癌腫（ＯＶＣＡＲ−３）細胞は、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｓａｏ  Ｐａｕｌｏ，  Ｂｒａｚｉｌによって提供された。すべての細胞株を、１０ｍＭのＮ−２−ヒドロキシエチル−ピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２４ｍＭの炭酸水素ナトリウム、４０ｍｇ／Ｌのゲンタマイシン、ｐＨ７．２および１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地中で、加湿雰囲気および５％  ＣＯ２下、３７℃で培養した。ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌）は、Ｄｒ．Ｈｕｇｏ  Ｐ．  Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ＵＮＩＦＥＳＰによって提供され、Ｕ８７−ＭＧ細胞（膠芽腫）は、Ｄｒ．  Ｏｓｖａｌｄｏ  Ｋ．Ｏｋａｍｏｔｏ、  ＵＳＰによって提供された。ＨｅＬａおよびＵ８７−ＭＧ細胞は、上記で示したように補給したＤＭＥＭ培地中で維持した。
【００７９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞成長
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腫瘍細胞成長、細胞傷害性試験、生存細胞の決定およびマウス転移性モデルにおけるＢ１６Ｆ１０細胞を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ保護実験の詳細は、Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３（６）：ｅ２３７１頁、２００８年）およびＤｏｂｒｏｆｆら（Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｏｎｃ．、３：２０４〜２１７頁、２０１０年）に記載されている。
【００８０】
細胞遊走アッセイ
遊走研究のために、５×１０５または１０６個細胞を、６ウェルプレート上に分配し、それらを３７℃／５％  ＣＯ２で２時間接着させた。培養培地を交換し、ペプチドを５００μΜで一晩加えた。細胞単層をＰ１０００チップで「傷つけ」、２４時間インキュベートした。未処理細胞（対照）およびペプチド処理細胞の画像をＪＥＮＯＰＴＩＫカメラで撮った。Ｐｉｘｃａｖａｔｏｒソフトウェアバージョン５．０を使用して細胞数（核）を決定した。
【００８１】
［実施例１］
ペプチドの同定および調製
可変領域のＲｅｂＭａｂ２００（ｈｕＭＸ３５）配列（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０００５７６）を、ＣＤＲドメインについて研究し、対応するペプチドをペプチド合成のために選択した。
【００８２】
高（＞９５％）純度（Ｐｅｐｔｉｄｅ２．０Ｉｎｃ．Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ、ＵＳＡから購入）を用いて、７（７）種のペプチドを合成した。
ＲＢ８  ＡＩＹＰＧＮＧＤＴＳＹＫＱＫＦＲＧ−ＮＨ２（Ｈ２）（配列番号７）
ＲＢ９  ＣＡＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧＣ−ＮＨ２（Ｈ３）（配列番号８）
ＲＢ１０  ＣＡＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（Ｈ３）（配列番号９）
ＲＢ１０ａ  ＣＡＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ（Ｈ３）（配列番号３）
ＲＢ１１  ＧＹＴＦＴＧＹＮＩＨ−ＮＨ２（Ｈ１）（配列番号１０）
ＲＢ１２  ＳＡＳＱＤＩＧＮＦＬＮ−ＮＨ２（Ｌ１）（配列番号１１）
ＲＢ１３  ＹＴＳＳＬＹＳ−ＮＨ２（Ｌ２）（配列番号１２）
ＲＢ１４  ＱＱＹＳＫＬＰＬＴ−ＮＨ２（Ｌ３）（配列番号１３）
【００８３】
以下の配列に対応する、５（５）のＲＢ９誘導体化ペプチドを合成した。Ｄ−異性体アミノ酸、Ｄ−アラニン（ｄＡ）、Ｄ−シトルリン（ｄＣｉｔ）、Ｄ−フェニルアラニン（ｄＦ）およびＤ−アルギニン（ｄＲ）を、ＲＢ９およびＲＢ１０誘導体化ペプチドの両方に導入した。
ＲＢ９  Ｍ１  Ｃ（ｄＡ）ＲＧＥＴＡ（ｄＣｉｔ）ＡＴＦＡＹＷＧＱ（ｄＡ）Ｃ−ＮＨ２（配列番号１４）
ＲＢ９  Ｍ２  Ｃ（ｄＡ）ＲＧＥＴＡ（ｄＣｉｔ）ＡＴ（ｄＦ）ＡＹＷＧＱ（ｄＡ）Ｃ−ＮＨ２（配列番号１５）
ＲＢ９  Ｍ３  Ｃ（ｄＡ）ＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＣ−ＮＨ２（配列番号１６）
ＲＢ９  Ｍ４  ＣＡＲＧＥＴＡ（ｄＣｉｔ）ＡＴＦＡＹＷＧＱＧＣ−ＮＨ２（配列番号１７）
ＲＢ９  Ｍ５  Ｃ（ｄＡ）ＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧＣ−ＮＨ２（配列番号１８）
【００８４】
以下の配列に対応する、３（３）種のＲＢ９スクランブルペプチドを合成した：
ＲＢ９スクランブル  ＣＧＴＦＥＹＲＡＱＡＧＷＡＧＲＴＡＣ−ＮＨ２（配列番号１９）
ＲＢ９Ｓｃ２  ＹＷＣＲＡＡＦＴＴＥＡＧＲＡＣＱＧＧ−ＮＨ２（配列番号２０）
ＲＢ９Ｓｃ３  ＣＦＴＡＲＡＧＷＹＡＴＥＡＲＧＧＱＣ−ＮＨ２（配列番号２１）
【００８５】
以下の配列を有するＲＢ１０のアラニンスキャニングシリーズに対応する６（６）種のその他のペプチドを合成した：
ＲＢ１０  Ａ１  ＡＡＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２２）
ＲＢ１０  Ａ３  ＣＡＡＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２３）
ＲＢ１０  Ａ４  ＣＡＲＡＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２４）
ＲＢ１０  Ａ５  ＣＡＲＧＡＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２５）
ＲＢ１０  Ａ６  ＣＡＲＧＥＡＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２６）
ＲＢ１０  Ａ８  ＣＡＲＧＥＴＡＡＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２７）
【００８６】
以下の配列を有するＲＢ１０のＣ末端ペプチド（断片ＷＧＱＧを除く）も合成した：
ＲＢ１０  Ｃ−ｔ  ＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号２８）
【００８７】
配列に対応する４（４）種のＲＢ１０誘導体化ペプチドを合成した：
ＲＢ１０  Ｍ１  ＣＡＲＧＥＴＡ（ｄＣｉｔ）ＡＴ（ｄＦ）ＡＹＷＧＱ（ｄＡ）−ＮＨ２（配列番号２９）
ＲＢ１０  Ｍ２  ＣＡ（ｄＲ）ＧＥＴＡ（ｄＲ）ＡＴ（ｄＦ）ＡＹＷＧＱ（ｄＡ）−ＮＨ２（配列番号３０）
ＲＢ１０  Ｍ３  Ｃ（ｄＡ）ＲＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹＷＧＱＧ−ＮＨ２（配列番号３１）
ＲＢ１０  Ｍ４  Ｃ（ｄＡ）ＲＧＥＴＡ（ｄＣｉｔ）ＡＴＦＡＹＷＧＱ（ｄＡ）−ＮＨ２（配列番号３２）
【００８８】
配列に対応する１（１）種のＲＢ１０スクランブルペプチドを合成した：
ＲＢ１０スクランブル  ＣＧＴＦＥＹＲＡＱＡＧＷＡＧＲＴＡ−ＮＨ２（配列番号３３）
【００８９】
手短には、ＲｅｂＭａｂ２００  ＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３およびＨ１について、抗腫瘍活性は見られなかった。アミド化されたＲｅｂＭａｂ２００  ＣＤＲ  Ｈ２（配列番号７）は、種々の特異性のいくつかのマウス抗体に由来する同様のＨ２断片と、最大１６（１６）個の同一アミノ酸を共有する。しかし、異なる特異性を有し、アポトーシスおよび血管新生阻害によって黒色腫細胞を死滅させたｍＡｂ  Ｃ７（ＩｇＭ）に由来するＣＤＲ  Ｈ２については、先に記載された強力な活性とは対照的に、抗腫瘍効果を示さなかった（Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３（６）：ｅ２３７１）。
【００９０】
保存された配列ＷＧＸＧを含有する、拡張した形態のＲｅｂＭａｂ２００のＣＤＲ  Ｈ３（配列番号３）は、数種のその他の抗体に由来するＨ３配列と最大８２％の同一のアミノ酸を共有する。しかし、Ｋａｂａｔのものに基づくＨ３配列ＧＥＴＡＲＡＴＦＡＹは、多様な供給源に由来する、主に原核生物に由来するいくつかのタンパク質と部分（８〜９／１０）または完全同一性（９／９）を示し、Ｉｇ配列とはほとんど関連しない。驚くべきことに、拡張されたＲｅｂＭａｂ  ２００のＨ３配列は、ｍＡｂ  ＭＸ３５と反応しない腫瘍細胞（例えば、黒色腫）に対してでさえ抗腫瘍効果を示し、これは、マイクロ抗体として作用せず、腫瘍細胞との結合のために、おそらくは別の細胞表面受容体を使用することを示唆する。
【００９１】
［実施例２］
細胞接着アッセイ
ペプチドＲＢ９、ＲＢ１０およびＲＢ１０ａ（それぞれ、配列番号８、９および３）を用いる腫瘍細胞の処理によって、基板との接着の用量依存性増大を示す細胞が提供された（９６ウェルプレート、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ培養培地）。１ｍＭのペプチド濃度で、ほとんどの腫瘍細胞は、過度の接着（ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）を示し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いる長期間の処理によってでさえ懸濁され得なかった。低用量では、細胞は、ペプチド濃度に反比例した速度でトリプシン／ＥＤＴＡで剥がれる。おそらく、ペプチドＲＢ９およびＲＢ１０は、細胞の細胞骨格動態に影響を及ぼし、そのようにして、細胞接着の増大をシグナル伝達した。このような反応は、マウスＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２．１黒色腫、ヒトＵ８７ＭＧ膠芽腫、Ａ５０２８黒色腫、ＳＫＢＲ３乳癌、ＳｉＨａ子宮頸癌およびＨＣＴ結腸癌細胞において見られた（図１、２、３および４）。
【００９２】
懸濁細胞および接着細胞の両方が生存していたと、トリパンブルー染色およびＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド；黄色テトラゾール］アッセイによって示され、これは、ペプチドが、直接的に細胞傷害性ではないが、腫瘍細胞の遊走および浸潤を阻害できる方法で細胞接着を強力に刺激することを示す。Ｈ１（ＲＢ１１、配列番号１０）、Ｈ２（ＲＢ８、配列番号７）、Ｌ１（ＲＢ１２、配列番号１１）、Ｌ２（ＲＢ１３、配列番号１２）、Ｌ３（ＲＢ１４、配列番号１３）ペプチドは、抗腫瘍活性を示さず、陰性対照として使用した。
【００９３】
［実施例３］
マウス黒色腫およびヒト膠芽腫細胞に対するペプチドＲＢ９およびＲＢ１０の効果
Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２．１細胞（５×１０３個）およびＵ８７−ＭＧ細胞（１×１０４個）を、９６ウェルプレートにおいて培養し、０．０１〜１ｍＭ（すなわち、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２．１細胞に対しては、０．０１、０．０５、０．１、０．２５、０．７、０．８および１ｍＭのＲＢ９およびＲＢ１０；ならびにＵ８７−ＭＧ細胞に対しては０．２５、０．５、０．７５および１ｍＭのＲＢ９およびＲＢ１０）の種々の濃度のＲＢ９（配列番号８）およびＲＢ１０（配列番号９）とともにインキュベートした。１８時間インキュベートした後、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥がれた生存細胞を、トリパンブルー排除染色を使用してカウントした。すべてのアッセイは、２回の独立実験において３連で実施した。結果は、図１Ａから１Ｄに示されている。
【００９４】
［実施例４］
ヒト乳癌ＳＫＢＲ３および黒色腫Ａ２０５８細胞に対するＲＢ９およびＲＢ１０の効果
ＳＫＢＲ３細胞（１×１０４個）を、９６ウェルプレートにおいて培養し、ＲＢ９（配列番号８）およびＲＢ１０（配列番号９）とともにインキュベートした。１８時間インキュベートした後、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥がれた生存細胞を、トリパンブルー排除染色を使用してカウントした。アッセイは、２回の独立実験において３連で実施した。Ａ２０５８ヒト黒色腫細胞（１×１０４個）を、５％ＣＯ２を含む加湿チャンバー中、３７℃で４時間インキュベートした。ウェルに、０〜１ｍＭの範囲（すなわち、０、０．２５、０．５および１ｍＭ）の種々のペプチドの濃度のＲＢ９およびＲＢ１０を含有する新鮮培地を加え、２４時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、３７℃で、３０μｌ／ウェルのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を５分間剥がし、生存細胞を、トリパンブルーを使用し、Ｎｅｕｂａｕｅｒチャンバー中でカウントした。図２Ａ〜２Ｄに示されるように、それぞれ、６３０および６１０μΜのＲＢ９およびＲＢ１０で、細胞の５０％がトリプシン−ＥＤＴＡ耐性であった。
【００９５】
［実施例５］
ペプチド処理された過度に接着性の（Ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）ＳｉＨａ細胞の検出
生存ＳｉＨａ細胞（１×１０４個）／ウェルを、９６ウェル培養プレート上に分配し、５％  ＣＯ２を含む加湿チャンバー中、３７℃で４時間インキュベートした。ウェルに、０〜１ｍＭの範囲（すなわち、０、０．２５、０．５および１ｍＭ）の種々のペプチドの濃度のＲＢ９（配列番号８）およびＲＢ１０（配列番号９）を含有する新鮮培地を加え、２４時間インキュベートした。次いで、培地を吸引し、３０μｌ／ウェルのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて細胞を３７℃で５分間剥がし、ＰＢＳを用いて穏やかに洗浄した。過度に接着性の（Ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）細胞を、新鮮培地中の、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］とともに４時間インキュベートし、１容量の１０％  ＳＤＳ溶液を一晩添加してホルマザン結晶を可溶化した。５７０ｎｍでプレートリーダーを使用して強度を測定した。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、ＲＢ１０は、ＳｉＨａ細胞株に対してＲＢ９よりもより効果的であり、５００μΜで、腫瘍細胞のそれぞれ、８０％および３０％をトリプシン処理に対して耐性にさせた。
【００９６】
［実施例６］
ペプチド処理された過度に接着性の（Ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）ＨＣＴ細胞の検出
生存ＨＣＴ細胞（１×１０４個）／ウェルを、実施例５の同一プロトコールに従って、９６ウェル培養プレート上に分配し、４時間インキュベートした。図４Ａおよび４Ｂに示されるように、ＨＣＴ細胞株では、ＲＢ１０（配列番号９）の効果は、ＲＢ９（配列番号８）と同様であり、これでは、細胞の８０％が、５００μΜのペプチドでトリプシン処理に対して耐性であった。
【００９７】
［実施例７］
ＲＢ９およびＲＢ１０のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果
ペプチドＲＢ９およびＲＢ１０を、アポトーシスペプチドＡ４Ｈ３、細胞傷害性抗黒色腫ｍＡｂ（Ａ４）の真のマイクロ抗体（Ｄｏｂｒｏｆｆら、Ｔｒａｎｓｌａｔ．Ｏｎｃ．、３：２０４〜２１７頁、２０１０年）とともに、Ｃ５７Ｂ１／６マウス（６匹の動物／群）に静脈内に注射されたＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞（２×１０５個）による肺コロニー形成に対するその保護効果について試験した。ペプチドを、腫瘍細胞投与の１、３、５、７、９、１１日後に腹膜内投与した（２５０μｇ  ｉ．ｐ．）。腫瘍投与の２２日後のペプチド処理された動物の肺が、図５に示されている。ペプチド処理は、動物屠殺の１０日前に中断した。
【００９８】
ペプチドＲＢ９（配列番号８）およびＲＢ１０（配列番号９）は、転移性黒色腫に対して成功裏に保護し、肺コロニー形成を大幅に低減した。Ｃ５７Ｂ１／６マウス（６匹の動物／群）において静脈内に注射されたＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞（２×ｌ０５個）による肺コロニー形成に対するペプチドＲＢ９およびＲＢ１０によるｉｎ  ｖｉｖｏ保護（およびＡ４Ｈ３対照）は、図６に示されている。ＲｅｂＭａｂ２００のその他の５種のＣＤＲ（配列番号７、１０、１１、１２、１３）は、ｉｎ  ｖｉｖｏで非保護性であった。ペプチドを、上記と同じ方法で投与し、肺小結節の数を決定した。
【００９９】
ＲＢ９およびＲＢ１０による保護は、ペプチド処理が動物屠殺の１０日前に中断された場合にさえ、見られ、これは、腫瘍細胞遊走および浸潤に対する早期効果を示唆する。これらの結果は、ｈｕＭＸ３５について確立されたものを超える、これらのペプチドの反応性の広い範囲を示す。
【０１００】
ペプチドＲＢ９およびＲＢ１０は、懸濁液中で成長するヒト白血病ＨＬ−６０細胞に対して軽度に細胞傷害性であり（図７）、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞に対して不活性であった（図８）。ペプチド処理した卵巣癌細胞は、試験されたその他の腫瘍細胞とは異なり、普通、トリプシン／ＥＤＴＡで剥がれ、これは、これらの細胞において両ペプチドが効果がないことを示唆する。ｈｕＭＸ３５は、結合するが、ＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞に対して直接的に細胞傷害性ではないので（示されていないデータ）、この実験は、ＲＢ９およびＲＢ１０が、元のｍＡｂと機能的に関連するマイクロ抗体に相当し得るという証拠を提供しない。競合実験は、細胞ＥＬＩＳＡを使用して行ったが、ＲＢ１０は、二次抗体（すなわち、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製の抗ヒトＩｇＧ）と反応し、したがって、この問題に答えるには異なる方法が必要となる。それにもかかわらず、ペプチドＲＢ９およびＲＢ１０は、腫瘍細胞上に発現された受容体と反応し、基板との細胞骨格依存性細胞間接着に強く影響を及ぼした。このような接着の増大は、ペプチド処理した黒色腫細胞による肺コロニー形成の阻害と一致して、転移を阻害すると思われる。
【０１０１】
［実施例８］
ヒト白血病細胞に対するＲＢ９の効果
生存ＨＬ−６０細胞（１×１０４個）／ウェルを、９６ウェル培養プレート上に分配し、４時間インキュベートし、０〜１ｍＭの範囲の種々の濃度のＲＢ９（配列番号８）とともに２４時間インキュベートした。細胞生存力は、トリパンブルーを用いてＮｅｕｂａｕｅｒチャンバー中でカウントすることによって直接的に測定するか、または比色定量ＭＴＴアッセイによって推定した。図７Ａおよび７Ｂに示されるように、ＲＢ９は、９２０〜９３０μΜで細胞生存力を５０％低減した。
【０１０２】
［実施例９］
卵巣癌腫細胞に対するＲＢ９の効果
生存ＯＶＣＡＲ−３細胞（１×１０４個）／ウェルを、９６ウェル培養プレート上に分配し、４時間インキュベートし、０〜１ｍＭの範囲の種々の濃度のＲＢ９（配列番号８）とともに２４時間インキュベートした。細胞を、３０μｌ／ウェルのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて３７℃で５分間剥がし、トリパンブルーを用いてＮｅｕｂａｕｅｒチャンバー中でカウントするか、または比色定量ＭＴＴアッセイによって推定した。図８に示されるように、ＲＢ９は、この系統に対して低い効果を有しており、ＭＴＴアッセイでは生存力の大幅な低下はなかった。図１〜４に示されるように、１ｍＭのＲＢ９では、ほとんどの細胞が、過度の接着性（ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｔ）の効果によって影響を受けなかった。
【０１０３】
［実施例１０］
アラニンスキャニングシリーズおよび細胞間接着アッセイ
ペプチドＲＢ１０（配列番号９）を、Ａｌａ−スキャン法を使用して各アミノ酸をアラニンによって置換し、このようにして、生物学的効果に対する、具体的には、１ｍＭペプチドを用いて観察された過度の接着（ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）に対する各アミノ酸の役割を評価するのに役立つよう操作した。
【０１０４】
この目的上、生存黒色腫Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞（１×１０４個）／ウェルを、９６ウェル培養プレート上に分配し、４時間インキュベートした。１ｍＭのＲＢ１０のアラニンスキャニングシリーズを含有する新鮮培地を添加し、２４時間インキュベートした。処理された細胞を、３０μｌ／ウェルのトリプシン−ＥＤＴＡを用いて３７℃で５分間剥がし、ＰＢＳを用いて穏やかに洗浄した。細胞を、新鮮培地中の、０．５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ［３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド］とともに４時間インキュベートし、１容量の１０％  ＳＤＳ溶液を一晩添加してホルマザン結晶を可溶化した。５７０ｎｍでプレートリーダーを使用して強度を測定した。図９に示されるように、誘導体ＲＢ１０  Ａ４（配列番号２４）およびＲＢ１０  Ａ６（配列番号２６）ならびにペプチドＲＢ１０ａ（カルボキシ末端を有する）（配列番号３）は、ペプチドＲＢ１０（配列番号９）が行ったように作用し、高いトリプシン／ＥＤＴＡ耐性細胞接着を誘導した。アラニン置換された誘導体ＲＢ１０  Ａ１（配列番号２２）、Ａ３（配列番号２３）、Ａ８（配列番号２７）およびあまり効率的ではないＡ５（配列番号２５）は、ＲＢ１０とは異なり、１ｍＭペプチドを用いて処理された場合に、普通は剥がれる細胞を提供した。各ペプチドの１００％の値は、トリプシン処理されていない処理された細胞に相当した。
【０１０５】
［実施例１１］
腫瘍細胞浸潤の阻害
５００μｌのＲＰＭＩ中の、２×１０５個のＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞の懸濁液を、０．５ｍＭのＲＢ９とともにインキュベートし、マトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてプレコーティングされた８μｌのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の上部チャンバーに添加した。ｔｒａｎｓｗｅｌｌ下部チャンバーにおいて、化学誘引物質として、ＲＰＭＩ中、１０％のＦＣＳを使用した。５％  ＣＯ２を含む加湿雰囲気下、３７℃で２４時間後、非浸潤細胞をスワブを用いて排除し、膜を越えた細胞をメタノールを用いて固定し、Ｇｉｅｍｓａを用いて染色した。細胞を各ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンにおいてカウントし、浸潤細胞の数がパーセンテージとして表されている。ＲＢ９（配列番号８）ペプチドは、ｔｒａｎｓｗｅｌｌシステムにおいてマトリゲルの腫瘍細胞浸潤を阻害できた。ＲＢ９によるＢ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞浸潤の阻害は、用量依存性であり、２５μＭのＲＢ９で６０％阻害した（図２０）。
【０１０６】
［実施例１２］
ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）アッセイにおいて示されるスーパーオキシドアニオン生成の増強
マウス黒色腫の転移性同系モデルにおいて腹膜内に投与された場合に、保護効果が示され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験において示された処理された細胞の著しい過度の接着（ｈｙｐｅｒ−ａｄｈｅｒｅｎｃｅ）は、ＲＢ９（配列番号８）およびＲＢ１０（配列番号９）ペプチドが、細胞の細胞骨格動態に影響を及ぼすことによって、細胞遊走および浸潤を干渉することを示唆する。腫瘍細胞中のアクチンおよびペルオキシドなどの構成成分の内部相互作用に基づいて、さらにアポトーシスにつながる、ＲＢ１０で処理された腫瘍細胞中のアニオンスーパーオキシドの生成を、ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）アッセイによって調べた。
【０１０７】
１ｍＭのＲＢ１０を用いて１８時間または５ｍＭのＨ２Ｏ２を用いて２０分間、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞を処理した。次いで、ペプチドまたはＨ２Ｏ２を用いて処理された細胞および未処理細胞を、ＤＨＥとともにインキュベートした。蛍光顕微鏡（Ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ６００Ｘ）を使用して、酸化によるＤＨＥのエチジウムへの変換が観察された。
【０１０８】
ジヒドロエチジウムを用いる反応は、これらの細胞において陽性であった（図１０）。
【０１０９】
［実施例１３］
ペプチド安定性−ヒト血漿によるペプチドＲＢ９分解
ペプチドは、タンパク質分解活性および腎濾過のために血漿中で可変の半減期を有し、これは、薬物候補の薬物動態における関連態様である。これらの態様を研究するために、ＲＢ１０（配列番号９）よりも可溶性であるペプチドＲＢ９（２ｍｇ）（配列番号８）を、２００μＬのＭｉｌｌｉＱ水中に溶解し、３７℃で１ｍＬのヒト血漿とともにインキュベートし、全ペプチドが分解された場合の分解の動態学を最大２４時間たどった。
【０１１０】
ＨＰＬＣおよび質量スペクトルにおいてペプチドを分析するために、２００μＬのアリコートを、新しいエッペンドルフチューブに移し、タンパク質を２０μＬのトリフルオロ酢酸を用いて４℃で５分間沈殿させた。１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、ＬＣ  ＥＳＩ−ＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ）において上清を分析した。図１１Ａ〜１１Ｃは、ＨＰＬＣおよび質量スペクトルペプチドピーク（０時間）および２４時間後のその総分解を示す。
【０１１１】
ＲＢ９ペプチドの経時的血漿分解を調べるためのアッセイに関しては、ヒト血漿によるペプチド分解を、上記のようにＨＰＬＣおよび質量スペクトルにおいて３０分毎にモニタリングした（図１２）。３７℃で２時間のインキュベーション後に約５０％のＲＢ９が切断された。
【０１１２】
比較のために、ＲＢ８を、血漿中で同様にインキュベートした。その半減期は、１時間未満であった。同じ方法を使用して、誘導体化手順後に血漿タンパク質分解に対するペプチド耐性をモニタリングしてもよい。ＲＢ９の半減期は、上記で研究されたその他のＣＤＲ由来のペプチドの半減期に匹敵するが（Ｐｏｌｏｎｅｌｌｉら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．３（６）：ｅ２３７１、２００８年）、やはり、マウス転移性モデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏ保護効果を有するよう、腫瘍細胞における十分な曝露を可能にした。
【０１１３】
［実施例１４］
腫瘍細胞遊走−創傷治癒アッセイ
生存Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞（５×１０５個）／ウェルを、６ウェル培養プレート上に分配し、５％ＣＯ２を含む加湿チャンバー中、３７℃で一晩インキュベートした。細胞単層を傷つけるためにＰ１０００チップを使用し、カメラ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ）を使用し、ソフトウェアＰｒｏｇｒｅｓ２．８を用いて画像を直ちに撮った（０時間）。２４時間後、同一視野の新規画像を得、記録した（２４時間）。
【０１１４】
２４時間後、未処理対照Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞は、遊走して、単層を再構成した（図１３Ａ）。５００μΜの濃度でのペプチドＲＢ１０（配列番号９）を用いて処理すると、１×１０６個の腫瘍細胞の遊走の１００％阻害が起こった（図１３Ｂ）。
【０１１５】
５００μＭのＲＢ９（配列番号８）およびＲＢ１０を用いて、またはＲＢ１０Ｍ３（ｄＡｌａ２Ａｌａ置換、配列番号１６）を用いて、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２黒色腫細胞の遊走の総阻害が観察された。アラニンスキャニングシリーズにおけるもののようなその他の置換およびその他の誘導体化およびスクランブルペプチドは、部分遊走阻害を示したか、または効果がなかった（図１６）。この反応は、Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞の遊走阻害に対するＨ３ペプチドの著しい特異性を示す。
【０１１６】
ペプチドＲＢ９は、Ａ２０５８ヒト黒色腫、ＨＣＴ結腸癌腫およびＳＫＢｒ３乳癌細胞の遊走を完全に阻害した。Ｏｖｃａｒ−３細胞遊走を半阻害し、Ｕ８７膠芽腫腫瘍細胞は不十分にしか阻害しなかった。ＳｉＨａ子宮頸癌細胞に対しては、効果を示さなかった（図１７）。
【０１１７】
ペプチドＲＢ１０またはＲＢ１０Ｍ３（配列番号３１）は、Ｕ８７膠芽腫細胞の部分遊走阻害ならびにＨｅＬａおよびＳｉＨａ子宮頸癌細胞の完全またはほぼ完全な阻害を示した（図１８）。
【０１１８】
ペプチドＲＢ９は、正常な非腫瘍化細胞、マウス線維芽細胞細胞株（３Ｔ３）および２種の初代ヒト線維芽細胞の遊走には影響を及ぼさなかった（図１９）。
【０１１９】
［実施例１５］
ペプチドＲＢ１０による腫瘍細胞遊走の用量依存的阻害
生存Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞（３×１０５個）／ウェルを、１２ウェル培養プレート上に分配し、５％ＣＯ２を含む加湿チャンバー中、３７℃で４時間インキュベートした。ウェルに、種々の濃度のＲＢ１０（配列番号９）を含有する新鮮培地を添加し、再度４時間インキュベートした。単層創傷を、実施例１２において記載したように実施し、それに応じて画像を得た。２４時間後、同一視野における新規画像を得、記録した（２４時間）。図１４に示されるように、遊走阻害は、用量依存的であり、ＲＢ１０は、低濃度（３０μΜ）でさえ、遊走を３０％超阻害できた。図１４に示されるように、５００μΜでは、細胞遊走の１００％を阻害した。倍率×１００。
【０１２０】
［実施例１６］
ＲＢ１０成長阻害
生存Ｂ１６Ｆ１０−Ｎｅｘ２細胞（５×１０５個）／ウェルを、６ウェルの培養プレート上に分配し、４時間インキュベートした。ウェルに、０または５００μΜのＲＢ１０（配列番号１０）を含有する新鮮培地を添加し、１２時間インキュベートした。カメラ（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ）を使用し、ソフトウェアＰｒｏｇｒｅｓ２．８を用いて画像を撮った。ソフトウェアｐｉｘｃａｖａｔｏｒ（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｐｅｒｃｅｐｔｉｏｎ）を使用して細胞数を検出した。０．５ｍＭのＲＢ１０を用いて１２時間後、黒色腫細胞は、３９％少ない細胞を有していた（図１５）。これらの細胞は、依然として、増殖できたが、遊走できなかった。ＲＢ１０のこれらの効果によって、何故ペプチドが、ともに感受性マウスにおける、黒色腫の転移性モデルに対して保護的であるが、皮下モデルにおける原発腫瘍の発生に対してはそうではないのかが説明されると思われる。倍率×１００。
【０１２１】
［実施例１７］
Ｉｎ  ｖｉｖｏペプチド毒性評価
マウスにＲＢ９（配列番号８）を連続７日間注射し（ｉ．ｐ．によって３００μｇ）、組織病理学のために、その後、屠殺した。肝臓、肺、心臓、腎臓および脾臓において、毒性の徴候または形態学的変化は観察されなかった。また、ペプチドは、ＲＢ１０Ｍ３（配列番号３１）について図２１に示されるように、溶血性ではなかった。
【０１２２】
本発明が関連する技術分野における当業者ならば、その本質的な性質から逸脱することなく種々の改変を行うことができることは理解されよう。添付の特許請求の範囲内に、すべてのこのような改変を包含するよう意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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