(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるリンフタロシアニン錯体、その塩又はその水和物
【化１】
0006489579.tif 000005
上式においてＲは、少なくとも１のスルホ基で置換された炭素数６〜１３のアリール基であり、
ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、炭素数１〜４のアルキレン基及び炭素数１〜４のオキシアルキレン基からなる群より選ばれる連結基であり、
ｎは互いに独立に０〜２の整数、但しｎの合計は２以上、である。
【請求項２】
該Ｒが、炭素数１〜４のアルキル基、炭素数１〜４のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、及びハロゲノ基からなる群より選ばれる少なくとも１つの基でさらに置換されている、請求項１記載のリンフタロシアニン錯体、その塩又はその水和物。
【請求項３】
Ｒが少なくとも１のスルホ基、及び炭素数１又は２のアルキル基で置換されたフェニル基である、請求項１又は２記載のリンフタロシアニン錯体、その塩又はそれらの水和物。
【請求項４】
Ｒが４’−スルホ−２’，６’−ジメチルフェニル基である、請求項３記載のリンフタロシアニン錯体、その塩又はそれらの水和物。
【請求項５】
ｚが−Ｏ−又は−Ｓ−である、請求項１〜４のいずれか１項記載のリンフタロシアニン錯体、その塩又はそれらの水和物。
【請求項６】
全てのｎが１である、請求項１〜５のいずれか１項記載のリンフタロシアニン錯体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項記載のリンフタロシアニン錯体、その塩又はそれらの水和物を含む、光線力学的診断法用の光感受性薬剤。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項記載のリンフタロシアニン錯体、その塩又はそれらの水和物を含む、ｐＨ指示薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はリンフタロシアニン錯体に関し、詳細には、中心元素がリンであり、軸配位子としてオキソ基（＝O）およびヒドロキシル基（−ＯＨ）を有し、さらにスルホ基を有するリンフタロシアニン錯体、その塩、及びそれらの水和物に関する。
【背景技術】
【０００２】
高齢化が進む我が国にあっては、癌疾病対策は必要不可欠かつ喫緊の課題である。癌疾病対策では、まず、微小な癌組織を精度良く検出することが必要である。微小な癌組織を精度良く検出する方法の一つに、ＰＥＴ法（positron emission tomography）がある。しかし、ＰＥＴ法では、加速器等の大型の機器・施設を必要とし、検出に時間と経費がかかり、医療現場での利用に多くの制約をもたらしている。
【０００３】
そこで、大規模施設等を必要としない癌組織検出方法が検討されており、例えば、光線力学的診断法（ＰＤＤ:Photodynamic Diagnosys）がある。ＰＤＤとは、ガン組織に集積された光感受性物質（有機色素等）をレーザー等の光で励起し、その蛍光をモニターする診断法である。ＰＤＤに用いられる光感受性物質として、無機系の量子ドット、及び有機色素がある。無機系の量子ドットはカドミウム、鉛、セレン等の生体に有害な元素を含むものが多いので、有機色素が開発の主流となっている。
【０００４】
有機色素の中でも、「生体の光の窓（therapeutic windowとも言う。）」の波長領域（可視〜近赤外光領域：波長６５０〜９００ｎｍ）に光吸収・発光を示す色素は特に有望である。これは、６５０ｎｍより短波長側の光は、筋肉・皮質、血液（デオキシ−及びオキシ−ヘモグロビン）、メラニン、シトクロム等の生体物質によって強く吸収され、９００ｎｍよりも長波長側の光は水や脂質等の倍音振動等により吸収されるからである（例えば、H.Kobayashi,et al.Chem.Rev.,110(2010)2620-2640）。
【０００５】
上記「生体の光の窓（可視〜近赤外光領域（波長６５０〜９００ｎｍ））」の波長領域に光吸収・発光を示す色素として、フタロシアニン系色素がある。フタロシアニン系色素は癌細胞に特異的に集積されるために、該色素からの蛍光によって癌の位置を特定できる。さらに励起状態の色素が活性酸素を生成して癌細胞を殺すことが知られており、光線力学的治療法（ＰＤＴ:photodynamic therapy）に使用される。
【０００６】
しかし、フタロシアニン系色素は、水はもちろん一般的な有機溶媒にも難溶性であるので、生体への適用が難しいという問題がある。さらに分子間の相互作用により会合体を形成し易く、生体の光の窓で蛍光が見られなくなるだけでなく、活性酸素が生成されなくなるという問題もある。
【０００７】
水溶性のフタロシアニン系色素として、IRDye700DX NHS ester（中心元素はケイ素；水溶液中で吸収極大６８９ｎｍ、モル吸光係数（ε）；１７万Ｍ−１ｃｍ−１；蛍光極大７００ｎｍ、量子収率（φ）１４％（非特許文献１））が実用化されている。しかし、蛍光量子収率が１０％台と低く、また合成も困難である。
【０００８】
また、水溶性を高めるために、フタロシアニン骨格の外側のベンゼン環の水素原子を親水性の基で置換することが知られている（非特許文献２）。さらに、分子会合を抑制するために、界面活性剤やアルコール等の添加物を加えることも知られている（非特許文献３、特許文献１、２）。
【０００９】
さらに、フタロシアニン骨格のベンゼン環がスルホフェノキシ基で置換され、軸配位子としてＯＨ基を備えるフタロシアニンのアンチモン錯体が知られている（非特許文献４、特許文献３）。該アンチモン錯体は光吸収極大波長が７３０ｎｍに位置し、比較的高濃度（〜１０−４Ｍ）で水に溶解し、且つ会合しない。しかし、アンチモンは毒性であり、その重原子効果により蛍光量子収率が１％未満と著しく低く、蛍光色素には適さないという問題がある。
【００１０】
生体に無害なフタロシアニン錯体としては、リン（Ｖ）フタロシアニン錯体が知られており、例えば本発明者らによるリン（Ｖ）テトラ（２’,６’−ジメチルフェノキシ）フタロシアニン（以下、[P(tppc)(OH)(O)]という）に関する報告がある（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０９８３５９号
【特許文献２】米国特許第８５２４８９０号明細書
【特許文献３】特許第５５８６０１０号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】L.A.Lavis and R.T.Raines,ACS Chem.Biol.,3(2008)142-155
【非特許文献２】F.Dumoulin,Coord.Chem.Rev.,254(2010)2792-2847
【非特許文献３】H.Isago,et al.,J.Inorg.Biochem.,111(2012)91-98
【非特許文献４】H.Isago,et al.,J.Inorg.Biochem.,117(2012)111-117
【非特許文献５】H.Isago,et al.,J.Porphyrins Phthalocyanines,17(2013)763-771
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかし、上記[P(tppc)(OH)(O)]は、界面活性剤の存在下で僅かに水に溶解するだけである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、本発明者らは該[P(tppc)(OH)(O)]の水溶性を高めるためにスルホ基を導入したところ、驚くことに、単に水溶性が向上しただけでなく、分子会合が著しく抑制され、蛍光量子効率が一桁高くなることを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は下記のものである。
下記式（１）で表されるリンフタロシアニン錯体、その塩又はその水和物
【化１】
0006489579.tif 000002
上式においてＲは、少なくとも１のスルホ基で置換された炭素数６〜１３のアリール基であり、
ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、炭素数１〜４のアルキレン基及び炭素数１〜４のオキシアルキレン基からなる群より選ばれる連結基であり、
ｎは互いに独立に０〜２の整数、但しｎの合計は２以上、である。
また、本発明は、上記リンフタロシアニン錯体、その塩又はそれらの水和物を含む、光線力学的診断法用の光感受性薬剤又は光感受性薬剤にも関する。
【発明の効果】
【００１５】
上記本発明の錯体、塩又は水和物（以下、まとめて「錯体等」という場合がある）は、生体に安全であり、水性溶媒に溶解し、且つ６５０〜８００ｎｍに強い光吸収及び高輝度の蛍光を示す。該錯体等はＰＰＤ用及びＰＤＴ用の光感受性薬剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１（ａ）〜（ｃ）は式（１）のリンフタロシアニン錯体の構造例を示す。
【図２】本発明のリンフタロシアニン錯体由来のイオンの構造例を示す。
【図３】本発明のリンフタロシアニン錯体の製造法の一例を示すフローチャートである。
【図４】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体の二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）スペクトルである。
【図５】図４のＳＩＭＳスペクトルにおける分子イオンピーク近傍の拡大図と同位体分布に基づく理論的ＳＩＭＳスペクトルである。
【図６】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体の水溶液中における蛍光スペクトル（実線：励起波長６００ｎｍ）、励起スペクトル（破線：観測波長７３０ｎｍ）、吸収スペクトル（灰実線）である。
【図７】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体の水溶液中、蟻酸溶液中、又は炭酸水素ナトリウム溶液中の吸収スペクトルの変化（上段）と、磁気円偏光二色性スペクトル（下段）である。
【図８−１】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体水溶液の、TRIS（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液でｐHを調整した際の吸収スペクトルの変化（ａ）、各ｐＨでの６７６ｎｍにおける吸光度をプロットしたもの（ｂ）である。
【図８−２】図８−１に示すスペクトル変化のｐＫａを求めたグラフ（ｃ）及び該変化に関与する水素イオンの数を求めたグラフ（ｄ）である。
【図９】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体水溶液の、炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを変更した際の吸収スペクトルの変化である。
【図１０】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体のルチジン水溶液中の蛍光スペクトル、励起スペクトル、及び吸収スペクトルである。
【図１１】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体の水酸化ナトリウム水溶液中の蛍光スペクトル、励起スペクトル、及び吸収スペクトルである。
【図１２】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体の水溶液中における吸収スペクトルの濃度による変化を示す図である。
【図１３】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体の、異なるｐＨにおける濃度に対する吸収強度の変化を示すグラフである。
【図１４】実施例で調製したリンフタロシアニン錯体、無金属類縁体及び銅錯体の水溶液中における吸収スペクトルを比較したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
（リンフタロシアニン錯体）
本発明のリンフタロシアニン錯体（以下、単に「錯体」という場合がある）は、下記式（１）で表される。
【化２】
0006489579.tif 000003
上式において、Ｒは少なくとも１のスルホ基（ＳＯ３Ｈ）で置換された、炭素数６〜１３のアリール基である。ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、及び炭素数１〜４のアルキレン基及び炭素数１〜４のオキシアルキレン基からなる群より選ばれる連結基であり、ｎは互いに独立に０〜２の整数、但しｎの合計は２以上、である。
【００１８】
炭素数６〜１３のアリール基としては、フェニル基、インデニル基、ナフチル基、及びアズレニル基等が挙げられ、これらのうちフェニル基及びナフチル基が好ましい。
【００１９】
各アリール基は、少なくとも１のスルホ基（ＳＯ３Ｈ）で置換されている。該スルホ基の数の上限は特にないが、該アリール基がフェニル基の場合には、合成上の制約から実際上３である。スルホ基以外の極性基、例えばカルボキシ基、ホスホリル基（−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）２）、アミノ基等も水溶性向上の目的で使用することができるが、極性が高く且つ合成上の制御が容易である点でスルホ基が最も好ましい。該スルホ基は、水性媒体中ではプロトンが解離したスルホネート（−ＳＯ３−）の形態で存在し得る。
【００２０】
各Ｒは、スルホ基に加えて他の置換基を有していてよい。該置換基としては、スルホン化反応を困難にしない基が好ましく、例えばメチル基、エチル基等の炭素数１〜４のアルキル基、メトキシ基等の炭素数１〜４のアルコキシ基、シアノ基、ニトロ基、及び、フロロ基等のハロゲノ基が挙げられる。好ましくは炭素数１〜４のアルキル基、及び炭素数１〜４のアルコキシ基であり、より好ましくは炭素数１又は２のアルキル基である。
【００２１】
各Ｒにおけるスルホ基の置換位置は任意であってよい。後述の実施例で調製したリンフタロシアニン錯体では連結基−Ｏ−のパラ位であるが、これは構造解析のために、位置異性体が無いものを便宜上選んだだけのことであり、他の置換位置であってもフタロシアニン骨格への影響はほとんど無く蛍光特性には影響しない。
【００２２】
ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、炭素数１〜４のアルキレン基、及び炭素数１〜４のオキシアルキレン基からなる群より選ばれる連結基である。炭素数１〜４のアルキレン基としてはメチレン基、エチレン基が、炭素数１〜４のオキシアルキレン基としてはエチレンオキシ基、プロピレンオキシ基が挙げられる。これらのうち、−Ｏ−、及び−Ｓ−が好ましい。
【００２３】
好ましいＲとして、少なくとも１のスルホ基、及び炭素数１又は２のアルキルで置換されたフェニル基、例えばスルホメチルフェニル基、スルホジメチルフェニル基、４’−スルホ−２’，６’−ジメチルフェニル基が挙げられる。
【００２４】
Ｒの位置は、フタロシアニン骨格中の周辺ベンゼン環のα位及びβ位の少なくとも一方である。フタロシアニンの軸配位子をより活性化する点でβ位が好ましい。
【００２５】
ｎは、互いに独立に０〜２の整数であり、但しｎの合計は２以上である。ｎが２未満の場合には、所望の水溶性を達成するのが困難となる場合がある。好ましくは、ｎの合計は３以上であり、より好ましくは４以上であり、例えば各ｎが全て１である。図１（ａ）〜（ｃ）に、式（１）でｎの合計が５等のリンフタロシアニン錯体の構造例を示す。これらの図において、化合物名称中の「リン」は略してある。
【００２６】
該錯体は、軸配位子、即ち、フタロシアニン骨格をｘｙ方向とした場合のｚ方向の配位子、としてオキソ基（＝Ｏ）と水酸基（−ＯＨ）を有する。これらの配位子は、後述するように水性媒体中ではプロトンが付加した−ＯＨ＋もしくは解離された−Ｏ−で存在し得、該錯体の水への溶解性を高めるだけでなく、分子会合性を低下する効果をも奏することが見出された。
【００２７】
本発明は、上記錯体の塩にも関する。該塩は上記錯体由来のイオンと対イオンを含み、さらに水和水を含んでいてもよい。該錯体由来のイオンは、少なくとも１つのスルホネート基、軸配位子のオキソ基にプロトンが付加した−ＯＨ＋基、及び水酸基がイオン化した−Ｏ−基のいずれかを含み、例えば図２に示す構造を有することが磁気円偏光二色性スペクトルによって確認された。このイオン化は、プロトン移動によって起こる迅速かつ可逆な反応であることも確認された。各イオン化の解離定数（ｐＫａ）はＲ、ｚ等に依存して異なり得るが、図２の構造の場合、夫々、３〜５及び７〜９程度である。
【００２８】
対イオンは特に限定されない。対カチオンとしては、Ｎａ＋等のアルカリ金属イオン、Ｃａ２＋等のアルカリ土類金属イオン、アンモニウムイオン、テトラメチルアンモニウムイオン等のテトラアルキルアンモニウムイオン、トリスヒドロキシメチルアンモニウム等のヒドロキシアンモニウムイオン、Ｎ−メチルピリジニウム等のピリジニウムイオン、ピコリニウムイオン、ルチジニウムイオン、Ｎ，Ｎ−ジメチルイミダゾリニウム等のイミダゾリニウムイオンが挙げられる。対アニオンとしてはＣｌ−等のハロゲンイオン、シアン化物イオン、硝酸イオン、炭酸水素イオン、炭酸イオン、蟻酸イオン、酢酸イオン等の有機酸イオンが挙げられる。
【００２９】
上記錯体または塩は、夫々、水和物であってよい。水和水の数は、錯体又は塩の乾燥の程度に依存して異なり得るが、通常、４〜１０程度の水和物で得られることが多い。
【００３０】
上記本発明の錯体等の構造は、元素分析、二次イオン質量分析及びＮＭＲにより特定することができる。
【００３１】
上記本発明の錯体等は、ＰＤＤ及びＰＤＴの光感受性物質として有用である。特に、軸配位子が−ＯＨ＋もしくは解離された−Ｏ−である形態のものは、分子会合の程度が顕著に低く、ＰＤＴの光感受性物質として大変有用である。例えば後述する実施例で調製したリン（Ｖ）テトラ（４’−スルホン酸−２’,６’−ジメチルフェノキシ）フタロシアニン（以下、［P(H4tsppc)(O)(OH)］と表記する場合がある）は、上記いずれかの軸配位子を有する場合、１０−４Ｍの濃度でも吸光度はLambert-Beer則に従い、濃度に比例する。特に−Ｏ−を有するものは強い蛍光を放ち、テトラ‐ｔ‐ブチルフタロシアニンのＴＨＦ溶液の量子収率を基準とした蛍光量子収率で表すと、４６〜４９％と、市販の水溶性フタロシアニン系色素であるIRDye700DX NHS esterの量子収率１４％に比べて顕著に高い。
なお、本出願において、蛍光量子収率（φ）とは、発光（蛍光）した分子の個数ｍと、吸収された光子の個数ｎとの比ｍ／ｎのことである。量子収率４６％とは、光を吸収して励起された分子が１００個あったとすると、そのうちの４６個が蛍光を出すことを意味する。蛍光の輝度は、モル吸光係数（ε）×蛍光量子収率（φ）に比例する。
【００３２】
（リンフタロシアニン錯体の製造方法）
本発明の錯体は、例えば図３に示すフローチャートに従い作ることができる。該製造方法は、スルホン化工程と、精製工程とに大きく分けることができる。
【００３３】
（固体生成物作成工程Ｓ１）
これは、スルホン化工程である。出発物質として、例えばリン２，６−ジメチルフェノキシフタロシアニン（[PPc(O)(OH)]）を非特許文献５に記載の方法で用意する。
【００３４】
次に、[PPc(O)(OH)]をスルホン化する。スルホン化剤は特に限定されず、例えば発煙硫酸、濃硫酸等の硫酸、クロロスルホン酸等を使用することができる。好ましくは反応溶媒を兼ねて、出発物質を溶解するのに十分な量の濃硫酸が使用される。スルホン化の温度は、０℃（氷冷下）〜室温、好ましくは１０℃以下である。該スルホン化は迅速に起こり、出発物質を濃硫酸に溶解して未反応物をろ過で除去している間に完結していると考えられる。出発物質の溶解からろ過迄の全工程を含めて約５分〜３０分程度、典型的には１０分以下で、スルホン化物を得ることができる。
【００３５】
反応終了後、反応物を濾過して、濾液を集める。濾過残渣の固体は廃棄する。出発物質が十分に精製されていれば、固体はほとんど残らない。濾液を氷水中に滴下してスルホン化物を沈殿させた後、濾過して粗スルホン化物を得る。
【００３６】
得られた粗スルホン化物を以下の再沈及び分離工程により精製し、最後に乾燥する。
（タール状生成物作成工程Ｓ２）
固体生成物を冷水に溶解してから、濾過して、濾液を集め、濾液にアルコールを加えてから、ロータリーエバポレーター（ＲＥ）等を用いて濃縮して、タール状生成物を得る。
【００３７】
（皮膜状生成物作成工程Ｓ３）
上記タール状生成物をアルコールに再溶解してから、ＲＥで濃縮して、皮膜状生成物を作成する。
【００３８】
（細かい固体生成物作成工程Ｓ４）
上記皮膜状生成物をアルコールに再溶解してから、エーテル中に滴下して、母液中に細かい固体生成物を再沈する。  
【００３９】
（遠心分離工程Ｓ５）
遠心分離工程Ｓ５は、遠心分離する工程である。最初の遠心分離工程Ｓ５−１、溶液滴下工程Ｓ５−２、別の遠心分離工程Ｓ５−３を含む。
【００４０】
（最初の遠心分離工程Ｓ５−１）
Ｓ４で得られた細かい固体生成物のアルコール／エーテル分散液を遠心分離する。細かい固体生成物が母液から分離され、タール状物質に変化する。
【００４１】
（溶液滴下工程Ｓ５−２）
タール状物質をアルコールに溶解してから、タール状物質溶液をエーテル中に滴下して、母液中に細かい固体生成物を作成する。  
【００４２】
（別の遠心分離工程Ｓ５−３）
細かい固体生成物のアルコール／エーテル溶液を遠心分離する。遠心分離により、細かい固体生成物が母液から分離され、タール状物質に変化した場合は、溶液滴下工程Ｓ５−２、別の遠心分離工程Ｓ５−３を繰り返す。繰り返し工程では、アルコール／エーテルの混合比を変えることが好ましい。
遠心分離により、細かい固体生成物が母液から分離され、タール状物質に変化せず、固体が得られた場合、真空乾燥工程Ｓ６へ進む。
【００４３】
（真空乾燥工程Ｓ６）
固体を、真空乾燥して、リンフタロシアニン錯体が得られる。
【００４４】
リンフタロシアニン錯体の塩は、該錯体を水性溶媒に溶解し、対イオンを含む酸もしくは塩基を添加し、水性溶媒を除去することによって調製することができる。後述するように該錯体の酸もしくは塩基の添加による構造変化は可逆的であり、且つ、該酸もしくは塩基の拡散速度が律速となるほど迅速である。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜合成＞
非特許文献５に記載の方法に従って、下記式で表されるリンフタロシアニン錯体[P(tppc)(O)(OH)]・4H2O（以下、[P(tppc)(O)(OH)]と表す）を合成した。
【化３】
0006489579.tif 000004
【００４６】
[P(tppc)(O)(OH)]は、エタノール溶液中、励起波長５３２ｎｍ（１ｍＷ）により、赤色の蛍光を発した。この化合物は僅かに水溶性であるが、１０−６Ｍ未満の濃度であっても界面活性剤の存在下でなければ著しく会合する（非特許文献５）。
【００４７】
２００ｇ（０．１９ｍｍｏｌ）の[P(tppc)(O)(OH)]を、氷冷した濃硫酸２１ｍｌに溶解して、１０分間攪拌してスルホン化した後、濾過して、得られた濾液を約１７ｇの氷中に滴下して、緑色の固体スルホン化物を析出させた。
【００４８】
次に、濾過して、緑色の固体を集めた。次に、集めた緑色の固体を冷水４０ｍｌに溶かして、もう一度濾過した。濾過により得られた固体は廃棄した。原料が十分に精製されていたので、固体はほとんど残らなかった。次に、濾液に２０ｍｌのエタノールを加えてから、ロータリーエバポレーターを用い、約４０℃で濃縮して、タール状の生成物を得た。
【００４９】
次に、このタール状の生成物を約５ｍｌのエタノールに溶解してから、ロータリーエバポレーターを用い、５０℃以下で濃縮した。この操作を繰り返して、二回目に乾いた皮膜状の生成物を得た。
【００５０】
次に、この乾いた皮膜状の生成物を１０ｍｌのメタノールに溶かしてから、約４０ｍｌのエーテルに滴下して、緑色の細かい固体を沈殿させた。
次に、この緑色の細かい固体を母液から遠心分離した。さらに、メタノール５ｍｌ／エーテル４５ｍｌで２回、メタノール２ｍｌ／エーテル４８ｍｌで１回、溶解及び再沈の操作を繰り返して精製することによって、緑色の固体を得た。
得られた緑色の固体を１２時間、真空中、４０℃で乾燥させて、最終生成物であるリン（Ｖ）テトラ（４’−スルホン酸−２’,６’−ジメチルフェノキシ）フタロシアニン（［P(H4tsppc)(O)(OH)］）を７５ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）得た。収率は２５％であった。
【００５１】
＜構造解析＞
得られた錯体の構造を、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）及び元素分析により解析した。
［ＳＩＭＳ］
日本電子製ＪＥＯＬ−ＪＭＳ−Ｔ１００ＬＣを用いた。図４は、該錯体のＳＩＭＳスペクトルと、主なピークの帰属を示す。分子イオンピークは、プロトン化した形（ｍ／ｚ＝１３７７［Ｍ＋Ｈ＋］）で検出された。図５は上記分子イオンピーク近傍の拡大図であり、挿入図は同位体分布に基づく理論的ＳＩＭＳスペクトルである。図４と５の大変良い一致から、帰属の正しさが確認された。
他の主なピークは以下のとおりである：
ｍ／ｚ＝１３５９：［Ｍ−ＯＨ］、イオン化の際に軸配位子ＯＨを１個失ったもの。
ｍ／ｚ＝１３１４：［Ｍ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）＋２Ｈ］、中心元素及び軸配位子が失われて水素が２つ付加したもの、即ち中心元素が無いフタロシアニン。
非常に弱いが、非プロトン型の分子イオンピークも検出された（ｍ／ｚ＝１３７６［Ｍ］）。
【００５２】
［元素分析］
元素分析の結果は、炭素４９．２２％；水素４．１１％；窒素７．２２％であった。ここから、［P(H4tsppc)(OH)(O)］・10H2O（C64H69N8O28PS4）（理論値：炭素４９．３５％；水素４．４７％；窒素７．１９％）であることが確認された。
【００５３】
＜吸収及び蛍光スペクトル＞
上記［P(H4tsppc)(OH)(O)］・10H2Oの水溶液の蛍光及び励起スペクトルを、日立製Ｆ−２５００蛍光測定装置を用いて測定した。また、水溶液の吸収スペクトルを、島津社製ＵＶ−１８００分光光度計を用いて測定した。
図６に、蛍光スペクトル（実線：励起波長６００ｎｍ）、励起スペクトル（破線：観測波長７３０ｎｍ）、及び吸収スペクトル（灰実線）を合わせて示す。同図において、蛍光スペクトル及び励起スペクトルの強度は任意スケールであり、吸収スペクトルとの比較のために規格化されている。
同図から、［P(H4tsppc)(OH)(O)］・10H2Oは「生体の光の窓」の波長領域に強い吸収と、該吸収に基づく高輝度の蛍光を示すことが分かる。
テトラ‐ｔ‐ブチルフタロシアニンのＴＨＦ溶液の量子収率を基準とした蛍光量子収率は、０．３２６（約３３％）であった（方法の詳細はN.Kobayashi,Chem.Lett.,(1994)
1813-1816を参照されたい）。
また、６９２ｎｍに極大を有する吸収帯のモル吸光係数は１６万Ｍ−１ｃｍ−１であった。
上記蛍光量子収率は、市販の水溶性フタロシアニン系色素、IRDye700DX NHS ester（中心元素はケイ素；水溶液中で吸収極大６８９ｎｍ、モル吸光係数；１７万Ｍ−１ｃｍ−１；蛍光極大７００ｎｍ、量子収率１４％（非特許文献１）と比較して倍以上であり、モル吸光係数はほぼ同等である。
【００５４】
＜イオン形態による吸収スペクトルの変化＞
既に述べたとおり、本発明の錯体は水性媒体中のｐＨ変化に応じて迅速にイオン化し、それに伴うスペクトル変化を示す。図７は、［P(H4tsppc)(O)(OH)］の水溶液中（２．５ｘ１０−６  Ｍ、実線）、０．１３  Ｍ蟻酸溶液中（濃度８．６ｘ１０−６  Ｍ、破線）および２４ｍＭ炭酸水素ナトリウム溶液中（濃度6.8x10-6 M、一点破線）の吸収スペクトル（上段）の変化と、磁気円偏光二色性スペクトル（下段）である。吸収極大が、弱塩基性下で短波長シフトし、弱酸性下で長波長シフトする。これらの吸収極大波長は、磁気円偏光二色性スペクトルのΔε（左右の円偏光の吸光係数の差）がゼロである波長と一致していることから、［P(H4tsppc)(O)(OH)］分子のＣ４対称性が維持されており、ｐＨによる構造変化が軸配位子上で起きていることが確認された。
【００５５】
図８−１は、ＴＲＩＳ（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）緩衝液でｐＨを調整した際の吸収スペクトルの変化（ａ）と、各ｐＨでの６７６ｎｍにおける吸光度をプロットしたもの（ｂ）である。ｐＨが高くなるにつれピークがシャープに且つ強くなり、吸収極大が短波長シフトする。図（ａ）に示すように、６８０ｎｍ付近に等吸収点があることから、平衡反応が起きていることが分かった。
図８−１（ｂ）に示すＳ字状の曲線は、各ｐＨでの６７６ｎｍにおける吸光度（Ａ）、初期吸光度（Ａ０）、ｐＨ変化終点の吸光度（Ａｆ）及び解離定数（ｐＫａ＝７．８７）を用いて得られたものであり、該ｐＫａは図８−２（ｃ）に示すグラフから求めた。これらの結果から、同図における吸収スペクトルの変化には１つの水素イオン（図８−２（ｄ）でｎ＝１．２２）が関与していることが分かった。酸性側についても同様の現象が観察された。
【００５６】
ＴＲＩＳに代えて、炭酸水素ナトリウムを用いてｐＨを変更した際にも、同様の吸収スペクトルの変化が見られた（図９）。
【００５７】
上記ｐＨ変化に応じたイオン形態及びスペクトルの変化は非常に速く、対イオンを含む酸もしくは塩基を添加した瞬間に起こる。酸性側では蛍光が近赤外領域となるため目視では確認できなくなり、中性及び塩基性側では強い赤色の蛍光が確認できる。この現象を利用すれば、生理的環境のｐＨを示す高感度の指示薬として用いることができる。
【００５８】
上述のとおり、本発明の錯体は塩基性側で強い吸収を示し、蛍光も強くなる。塩基をルチジンにした場合を図１０に、水酸化ナトリウムにした場合を図１１にそれぞれ示す。中性での蛍光量子収率が約３３％であったのに対し、ルチジン存在下では４９％、水酸化ナトリウム存在下では４６％であった。ここから、本発明の錯体をルチジニウム塩、ナトリウム塩等の形態にして、又は炭酸水素ナトリウム等の塩基と共に生体に投与する等によって弱塩基性の生理的環境を作ることによって、優れた蛍光用色素となることが期待される。
【００５９】
［吸収スペクトルの濃度依存性］
分子会合の有無を調べるために、［P(H4tsppc)(O)(OH)］の吸収スペクトル強度の濃度依存性を調べた。会合が起きていても、Lambert-Beer則に従う吸光度の直線性が維持される場合があるが、一般に直線性から外れた場合には会合が起きていると云える。
図１２は、水中における吸収スペクトルの濃度による変化を示す。同様の実験を異なるｐＨにおいても行い、濃度に対する単位光路長当たりの吸光度の変化をプロットした（図１３）。
図１３から分かるように、水中（○）では、０．１×１０−４Ｍを過ぎると直線から外れ始めるが、ＮａＯＨ溶液（●）及びＨＣｌ（△）中では１×１０−４Ｍまで良好な直線性を示し、酸性及び塩基性下では中性下より少なくとも一桁高い１×１０−４Ｍまでは、分子会合の影響は無視できることが分かった。ここからも、本発明の錯体等は、優れたＰＤＴ用色素となることが期待される。
【００６０】
＜既存の色素との比較＞
図１４は、［P(H4tsppc)(O)(OH)］と、無金属類縁体及び銅錯体の水溶液中における吸収スペクトル（非特許文献４）を比較したものである。［P(H4tsppc)(O)(OH)］の吸収スペクトルピーク値は、無金属類縁体及び銅錯体の水溶液中における吸収スペクトルピーク値に比べて、顕著に高かった。該無金属類縁体および銅錯体は、界面活性剤やアルコールが存在しない条件では、水溶液中で強く会合した。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明のリンフタロシアニン錯体は、ＰＤＤ用、ＰＤＴ用の光感受性薬剤として、またｐＨ指示薬として有用である。
【図１】
0006489579.tif 000006
【図２】
0006489579.tif 000007
【図３】
0006489579.tif 000008
【図４】
0006489579.tif 000009
【図５】
0006489579.tif 000010
【図６】
0006489579.tif 000011
【図７】
0006489579.tif 000012
【図８−１】
0006489579.tif 000013
【図８−２】
0006489579.tif 000014
【図９】
0006489579.tif 000015
【図１０】
0006489579.tif 000016
【図１１】
0006489579.tif 000017
【図１２】
0006489579.tif 000018
【図１３】
0006489579.tif 000019
【図１４】
0006489579.tif 000020