【事件の表示】
　特許第２７９５７４８号「ヌクレオシドの製造法」の特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２７９５７４８号の請求項１ないし６に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ.手続の経緯
　本件特許第２７９５７４８号に係る発明についての出願は、平成２年２月２７日（優先権主張：平成１年２月２８日、平成１年８月４日；日本国）を国際出願日として出願され、に特願平２−５０３６５４号として出願され、平成１０年６月２６日にその特許の設定登録がなされ、その後、有機合成薬品工業株式会社より特許異議申立がなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１１年８月１０日に訂正請求がなされたものである。
　
II.訂正請求
１.訂正の内容
(1)特許請求の範囲の請求項５に係る記載「以下の性質を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ」を、「バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）の菌体に由来する、以下の性質を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ」と訂正する。
(2)特許請求の範囲の請求項６に係る記載「以下の性質を有するピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ」を、「バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）の菌体に由来する、以下の性質を有するピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ」と訂正する。
２.訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項(1)及び(2)は、「バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）の菌体に由来する」という語句を直列的に付加するものであるから特許請求の範囲の減縮に該当する。
　そして、上記いずれの訂正も新規事項に該当せず、また、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
３.独立特許要件
　当審が通知した取消理由の概要は、訂正前の請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから特許法２９条１項３号の規定により、同請求項１乃至６に係る発明は、甲第１及び２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから同２９条２項の規定により、同請求項５に係る発明は、甲第３号証に記載された発明と同一であるから同２９条の２の規定により、或いは、請求項１乃至６に係る発明は、同３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるので特許を受けることができないというものであるところ、訂正された請求項１乃至６に係る発明（以下、「本件発明１乃至６」という。）は、後述の「III.３.判断 」の項に記載のように理由がないものであるから、本件発明１乃至６は、特許出願の際独立して特許を受けることができるものである。
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法１２０条の４,２項、及び同条３項で準用する１２６条２項から４項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
III.特許異議申立
１.特許異議申立書の理由の概要
　訂正前の本件請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるから特許法２９条１項３号の規定により、同請求項１乃至６に係る発明は、甲第１乃至２号証に記載された発明に基づき当業者が容易に発明をすることができたものであるから同２９条２項の規定により、同請求項５に係る発明は、甲第３号証に記載された発明と同一であるから同２９条の２の規定により、或いは、請求項１乃至６に係る発明は、同３６条に規定する要件を満たしていない特許出願に対してなされたものであるから、請求項１乃至６に係る発明の特許は、同１１３条１項２或いは４号により取り消されるべきものである。
　　　　　　　　　　　　　　記
甲第１号証：Agricultural and Biological Chemistry第53巻第1号197-202頁(1989)
甲第２号証：Journal of Fermentation and Bioengineering 第73巻第4号326-328頁(1　　　　　　992)
甲第３号証：特願平１−４０２０８号の願書に最初に添付された明細書又は　　　　　　図面（特開平2-222677号公報）
２.甲各号証の記載内容
　甲第１号証には、
「６５℃で生育できる多種の好熱性菌が、リン酸と酵素源としてのそれら菌体の存在下で、イノシンとチミン（即ち５−メチルウラシル）から５−メチルウリジンを生成する能力があるかどうかが調べられた。バチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９が５−メチルウリジンを効率よく合成する菌株として選抜された。この反応は熱に安定なプリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの組合せにより行われると考えられた。これらの酵素のハーフライフは、６３℃ではそれぞれ７２００時間と４００時間であり、７０℃では１４８時間と１４時間であった。」（１９７頁８〜１３行）、
「酵素源として様々な菌株を４時間および１６時間培養した菌体を用いて、６５℃での５−メチルウリジン（５ＭＵ）合成能力を調べた。この調査では１７０の好熱性菌の菌株を調べた。１６時間培養菌体では１つの菌株も５−メチルウリジンを生成しなかった。４時間培養の菌体では６９菌株が酵素活性を示した。その中で、４菌株が５−メチルウリジン合成能力が高かった（表１）。スラッジから分離されたＪＴＳ８５９菌株を湿菌体で最も活性の高い菌株として選抜し、以降の研究に用いた。」（１９８頁右欄下から１２〜末行）、が記載され、「表１」（１９９頁）には、ＪＴＳ８５９菌株を用いた場合においては、湿菌体単位重量当たり１０５μmol/hrの５−メチルウリジンが得られたことが示されている。
　甲第２号証には、
「リン酸イオンの存在下で、イノシンとチミンからリボース転移反応により５−メチルウリジンを合成するために、好熱性菌バチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９の耐熱性酵素生産のための至適培養条件が検討された。攪拌速度を上げることと培地へイノシンを添加することが本酵素の生産を上げるのに効果があった。培養条件を至適化することによって、当初の結果に比べて、単位容量当たりの菌体生産量および酵素生産量がそれぞれ４．６倍と１０．１倍に上昇した。」（３２６頁１〜６行）が、
　甲第３号証の、特許請求の範囲には、
「１．次の理化学的性質を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ
(1)作用：プリンヌクレオシド＋Ｐｉ→(←)塩基＋リボース−１−リン酸
(2)基質特異性：アデニン、アデノシン以外のプリン系ヌクレオシドと塩基に対して作用する。
(3)至適pH及び安定pH
　至適pHはpH７〜１１．５
　pH７〜１０において８０℃の処理を３０分しても失活しない。
(4)至適温度及び作用適温の範囲
　至適温度は８０℃、pH７．０において５０〜８０℃では６０分処理しても安定
(5)：pH、温度などによる失活の条件：pH７．０．９０℃で処理したとき２０分で失活する。
(6)阻害、活性化および安定化
　特別な活性化剤や安定化剤を必要としない。
　塩化第二水銀、パラクロロメルクリベンゾエイトにより阻害を受ける。
(7)分子量：６８０００（ＴＳＫゲルＧ−３０００ＳＷによるゲル濾過法）
(8)サブユニットの分子量
　３４０００（ＳＤＳ電気泳動法）　」（特許請求の範囲の項）が、また、
「本発明において用いられる該酵素生産菌の好ましい例として本発明者らによって土壌中より分離されたバチルス・ステアロサーモフィルスＪＴＳ８５９がある。この菌株は、通商産業省工業技術院微生物工業研究所に寄託されており、その寄託番号は、微工研菌寄第９６６６号（ＦＥＲＭ Ｐ−９６６６）である。」（２頁左下欄１５行〜右下欄１行）が、それぞれ記載されている。
３.判断
Ａ．特許法２９条１項３号について
　甲第１号証には、バチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９の菌体を酵素源とし、リン酸とイノシンとチミンから５−メチルウリジンを生成すること、そしてこの反応は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの組合せにより行われると考えられると記載されている。
　しかるに、本件特許権者が提出した平成１１年７月２６日付「実験成績証明書」によると、チミジンの合成活性は、バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株は、２０．５４Ｕ／ｍｌであるのに対し、バチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９株は、０．７４０Ｕ／ｍｌであるから、本件発明に係るバチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株は、甲第１号証に係るバチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９株より約２８倍の合成能力を有することがわかる。
　そうすると、本件発明に係る微生物と甲第１号証に係る微生物は、同一の「種」に属するものの、「株」のレベルでは、上記チミジンの合成活性の違いを考慮すると、全く別異の微生物であるということができる。
　してみれば、本件請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明であるとは到底いうことができない。
Ｂ．特許法２９条２項について
　上述のように、本件発明に係るバチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株は、甲第１号証に係るバチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９株よりチミジンの合成能力が、約２８倍高いものであるから、甲第１号証に記載された事項から予測される域を超えた効果を奏するといえる。
　そうすると、本件請求項１乃至４に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づき、当業者が容易に想到し得たとはいえない。
　なお、特許異議申立人は、甲第２号証を提出しているが、この刊行物は、本件出願後に頒布されたものであるから、特許法２９条２項の判断にあたっては考慮されるものではない。
Ｃ．特許法２９条の２について
　特願平１−４０２０８号の願書に最初に添付された明細書又は図面（特開平2-222677号公報；甲第３号証）に係る微生物も、甲第１号証に係る微生物と同じバチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９株であり、上記「Ａ」で検討したように、本件発明に係るバチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株と全く別異の微生物である。
　そうすると、本件請求項５に係る発明は、特願平１−４０２０８号の願書に最初に添付された明細書又は図面に記載された発明と同一であるとはいえない。
Ｄ．特許法３６条について
　特許異議申立人の主張は、(1)酵素活性の測定法としてイノシン又はウリジンから生成する分解物を定量することにより行っており、かかる測定値からはヌクレオシドの酵素的製造における酵素活性が高いか否かは不明であるため、新菌株の特徴が明確に記載されているとはいえない、(2)菌体の培養条件である酸素供給条件が明確に記されていない、(3)単量体の場合を除いては分子量を表さず、サブユニットの分子量を示すに過ぎない、及び(4)酵素の阻害及び活性化因子に関する記載がない、というものである。
　しかし、(1)について、特許権者の提出した参考資料２及び参考資料３によると、バチルス・ステアロサーモフィラスＪＴＳ８５９株のヌクレオシドホスホリラーゼの活性測定は、イノシン或いはウリジンから生成する分解物を定量することにより行っているから、本件発明に係るバチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２株のヌクレオシドホスホリラーゼの活性測定を、イノシン或いはウリジンから生成する分解物を定量することにより行うことは、適切な測定法によっているといえる。
　(2)について、本件明細書「実施例８」には、「・・・これを種培養として全量を上記培地３ｌを含む５ｌ容のジャー・ファーメンターに加え、５０℃、回転数３５０r.p.m.、通気量１．０v.v.m.の条件にて１８時間培養した。」（特許公報１０頁２０欄４９行〜１１頁２１欄２行）との記載があり、この記載により、菌体の培養条件である酸素供給条件は、明確であるというべきである。
　(3)について、本件明細書には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの分子量として、「ＳＤＳ−ポリアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約３１０００である。」（６頁１２欄２〜３行）が、また、ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの分子量として、「ＳＤＳ−ポリアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約４５０００である。」（６頁１２欄４１〜４２行）が記載されている。
　そうすると、本件明細書には、本件発明に係る酵素の「分子量」が、明示されているというべきである。
　(4)について、請求項５乃至請求項６においては、酵素を、作用、基質特異性、至適ｐＨおよびｐＨ安定性、温度安定性、分子量、及び比活性の６の項目について記載されているから、たとえ「酵素の阻害及び活性化因子」に関する記載がないとしても、他の酵素とは、十分に区別して特定されているといえる。
　したがって、本件明細書の記載に不備なところはない。
３.まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１２年４月１３日（２０００．４．１３）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ヌクレオシドの製造法
【発明の詳細な説明】
　　　技　術　分　野
　本発明は、バチルス属に属する好熱菌由来のヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物を用いたヌクレオシドの製造法に関するものである。
　　　背　景　技　術
　ヌクレオシド、リボース‐１‐リン酸等の糖残基供与体と塩基供与体とを酵素的に反応させてヌクレオシドを製造する方法としては、例えば、各種プリンヌクレオシドの製造法（特公昭４３−２４４７５号、特公昭４３−２８９５４号、特公昭４３−２８９５５号、特公昭４３−２８９５６号、特公昭４５−１１１１６号、特公昭４８−１４９５７号、特開昭５５−７１４９５号、特開昭５６−１８５９９号、特開昭５６−１４２２９３号、特開昭５６−１６４７９３号、特開昭５６−１６６１９９号、特開昭５８−６３３９３号、特開昭５８−９４３９６号、特開昭５８−１７０４９３号など）、各種ピリミジンヌクレオシドの製造法（特公昭３５−１６４７８号、特開昭５６−１０２７９４号、特開昭５９−２１３３９７号、特開昭６０−２３９４９５号、特開昭６０−２３９４９５号など）、その他各種のヌクレオシドの製造法（特開昭５０−２９７２０号、特開昭５７−１４６５９３号、特開昭５８−１９０３９６号、特開昭５８−２１６６９６号、特開昭５９−１４３５９９号、特開昭５９−１７９０９４号、特開昭５９−２１３３９７号、特開昭６０−１２０９８１号、特開昭６０−１３３８９６号、特開昭６３−３１０９３号、特開昭６３−１７７７９７号など）などが報告されている。
　しかしながら、これらの酵素的なヌクレオシドの製造法は、酵素反応特有の基質特異性、立体選択性などの点において化学的合成法と比較して優れたものであるが、酵素の能力が十分でなく収率および収量の点では必ずしも満足できるものではなかった。
　また、常温で反応を行なえば、雑菌による汚染が原因と考えられる収率の低下も観察され、汚染を回避するために高温（例えば４５℃以上）で反応を行なうと酵素が徐々に失活してしまい、結果的に収率が著しく低下するという問題点もあった。
　一般に、化合物の合成は生成反応と分解反応との平衡が生成反応に傾くことによってもたらされるものである。このため、化合物の収率および収量を高めるためには、生成反応を促進し、かつ分解反応を抑制することが肝要であり、この原則は酵素的な化合物の製造法においても例外ではない。
　また、反応温度を高くすれば、反応速度が速くなり、短時間のうちに反応が終了し、かつ基質の溶解性も高まることから、目的化合物を収率よく製造できる可能性を有している。
　ヌクレオシドホスホリラーゼを用いてヌクレオシドを製造する場合、ヌクレオシドの生成反応を促進するためには、触媒として使用する酵素自体の能力および反応条件の２つの点から考慮しなければならない。反応条件の選定は使用する酵素の能力を引き出すための補助的な手段にすぎず、生成反応を促進し、目的化合物の収率を高めるための抜本的な方法は優れた能力を有するヌクレオシドホスホリラーゼを用いることである。
　ヌクレオシドの製造に使用されている従来のヌクレオシドホスホリラーゼは、調製の容易な微生物から調製したものが大多数である。しかし、反応の効率、比活性、耐熱性、目的化合物の収率などから酵素の能力を検討した場合、従来使用されているものは必ずしも満足できるものではなかった。
　一方、製造したヌクレオシドの分解反応に関与すると考えられる酵素、例えばヌクレオシダーゼに関しては光硬化樹脂を用いた固定化法によるヌクレオシダーゼの抑制法が報告されている（特開昭６２−２５３３９３号）。該方法は優れた方法であるが、酵素調製物として微生物菌体を使用する場合には微生物によっては固定化しにくいものもあり、汎用性に欠ける方法であった。
　本発明者らは、ヌクレオシドの酵素的製造に使用できる能力の優れた酵素を発見するため種々の微生物をスクリーニングした結果、バチルス属に属する好熱菌の中に極めて比活性が高く、耐熱性のあるヌクレオシドホスホリラーゼを多量に含有し、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性が高い微生物群を発見した。
　従来、バチルス属に属する好熱菌であるバチルス・ステアロサーモフィスからヌクレオシドホリホリラーゼが単離精製されて、その酵素的性質が検討報告されている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４４
５３
５３
５３
　　　発明の開示
　発明者らは、前述の本発明者らの発見した比活性が高く、耐熱性のあるヌクレオシドホスホリラーゼを多量に含有し、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性の高い微生物群に関してさらに研究を重ねた結果、▲１▼これらの微生物群は、比活性が高く、耐熱性のあるプリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼを合わせ持ち、かつヌクレオシダーゼを含有していないか、含有していてもヌクレオシドを製造する際の反応温度（３５〜８０℃）においては極く微弱な活性しか示さないものであること、および▲２▼この微生物群の１種もしくは２種以上の微生物の菌体由来のヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物をヌクレオシドの酵素的製造に使用すればわずかな酵素量で短時間に収率よくヌクレオシドを製造することができることを知見して本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は塩基供与体、糖残基供与体およびリン酸供与体をヌクレオシドホスホリラーゼ調製物を用いて反応させ、塩基供与体の塩基部分と糖残基供与体の糖部分との間にＮ‐グリコシド結合を形成させてヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物として、バチルス属に属する好熱菌のうち、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性の高い微生物群の１種または２種以上の微生物の菌体に由来するものを用いることを特徴とするヌクレオシドの製造法に関するものである。
　なお、本明細書において「ヌクレオシド」とは、ウリジン、チミジン、シチジン、アデノシン、グアノシンなどの天然に存在するヌクレオシドのほか各種のヌクレオシドアナログをも包含する範囲を指称するものである。
　また、本発明は、上記酵素調製物自体、該酵素調製物を調製するために使用する新規な微生物、該微生物から調製され、ヌクレオシドの製造にも使用できる新規なヌクレオシドホスホリラーゼに関するものである。
　　　図面の簡単な説明
　第１図は本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を示したものである。
　第２図は本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼの至適温度および安定温度範囲を示したものである。
　第３図は本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲を示したものである。
　第４図は本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの至適温度および安定温度範囲を示したものである。
　第５図は、バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２とブレビバクテリウム・アセチリカムＡＴ６−７とを酵素源として使用して１−β−Ｄ−リボフラノシル−１，２，４−トリアゾール−３−カルボキサミド（リバビリン）を製造した時の反応時間におけるリバビリンの生成率を比較したものである。
　　　発明を実施するための最良の形態
Ｉ　ヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物
　本発明の「ヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物」（以下、「酵素調製物」と称する）とは、プリンヌクレオシドホスホリラーゼまたはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの少なくとも一方、好ましくは両方のヌクレオシドホスホリラーゼを含有するものを指称する。
　また、「酵素の精製度合」とは、総蛋白量に占める酵素蛋白量の割合を意味する。
　本発明の酵素調製物は、バチルス属に属する好熱菌、具体的にはバチルス・アシドカルダリアス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シェレエゲリ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｃｈｌｅｇｅｌｉ）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの中等度好熱菌に属する微生物のうち、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性が高い微生物群の微生物（以下、本発明の微生物という）より調製することができる。
　微生物を選定するためのヌクレオシドホスホリラーゼ活性は、例えば、以下の値が一応の目安となる。
　・プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
　　１０Ｕ／ｇ湿菌体以上、好ましくは１２Ｕ／ｇ湿菌体以上
　・ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
　　１０Ｕ／ｇ湿菌体以上、好ましくは１５Ｕ／ｇ湿菌体以上
　これらの２つの条件のうち一方を満足するものは本発明方法に使用する酵素調製物の調製源として使用することができ、上記の２つの条件を同時に満足するものは酵素調製物の調製源として好適である。
　そのような条件を満足する好適な微生物を具体的に例示すれば、バチルス・ステアロサーモフィラス　ＴＨ６−２、同Ｐ−２１、同Ｐ−２３など（いずれもヤマサ醤油（株）敷地内の土壌より分離した土壌分離菌株）を例示することができる。その菌株群の中の最も代表的な菌株であるＴＨ６−２株の菌学的性質を以下に示す。
　
ＴＨ６−２の菌学的性質
（Ａ）形　態
　　▲１▼　細胞の形および大きさ
　　　　　短桿状（Ｒｏｄ）、０．６〜１．１×２〜７μｍ
　　▲２▼　胞子の有無　　有
　　▲３▼　胞子のうの膨化の有無　　有
　　▲４▼　細胞内の胞子の部位および大きさ
　　　　　末端部または中央部、０．８×０．８〜１．０μｍ
　　▲５▼　グラム染色性
　　　　　グラムバリアブル（培養初期はグラム陽性）
（Ｂ）各培地での生育状態
　　▲１▼　肉汁寒天斜面培地
　　　　　生育の様相：生育旺盛、表面平滑、不透明、培地変化なし
　　▲２▼　肉汁寒天平板培地
　　　　　生育の様相：円形コロニー形成、薄く広がる、粘性を示す、不透明、周縁波状
　　▲３▼　リトマス・ミルク培地
　　　　　生育せず
（Ｃ）生理的性質
　　▲１▼　酸素存在下での生育：生育する
　　▲２▼　酸素非存在下での生育：生育せず
　　▲３▼　カタラーゼ：陽性
　　▲４▼　Ｖ−Ｐテスト：陰性
　　▲５▼　メチルレッドテスト（ｐＨ　ｉｎ　Ｖ−Ｐ　ｂｒｏｔｈ）：＜ｐＨ６
　　▲６▼　加水分解能　カゼイン：陰性
　　　　　　　　　　　　ゼラチン：陽性
　　　　　　　　　　　　デンプン：陽性
　　▲７▼　クエン酸の利用：陽性
　　▲８▼　硝酸塩の還元：陽性
　　▲９▼　インドールの生成：陰性
　　▲１０▼　塩化ナトリウムまたは
　　　　　　　　塩化カリウムの要求性：陰性
　　▲１１▼　糖質からの酸の生成
　　　　　　　陽性：グルコース、アラビノース、キシロース、フラクトース、マルトース
　　　　　　　陰性：デンプン、グリセロール、ショ糖、ラフィノース
　　▲１２▼　各ｐＨによる生育
　　　　　　　６．８で生育、５．７で生育せず
　　▲１３▼　塩化ナトリウム存在下での生育
　　　　　　　２％ＮａＣｌ存在下：生育する
　　　　　　　５％ＮａＣｌ存在下：生育せず
　　▲１４▼　生育範囲
　　　　　　　生育ｐＨ範囲：６．５〜９．０
　　　　　　　生育温度範囲：３５〜６５℃
　　▲１６▼　グルコース存在下での生育
　　　　　　　グルコース０．５％以上の存在下で生育せず
　これらの菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ´ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（第８版）の分類基準と照合したところ、本分離菌はバチルス・ステアロサーモフィラスに属するものであることが判明し、バチルス・ステアロサーモフィラス　ＴＨ６−２と命名した。またＰ−２１、Ｐ−２３も同じ菌学的性質を示した。なお、ＴＨ６−２は工業技術院微生物工業技術研究所にブタペスト条約に基づいて寄託されており、受託番号として微工研条寄第２７５８号が与えられている。この国際寄託は、１９８９年２月４日に上記寄託機関に国内寄託された微工研菌寄第１０５２６号より１９９０年２月１６日に移管したものである。
　ＴＨ６−２、Ｐ−２１、Ｐ−２３はいずれもバチルス・ステアロサーモフィラスに属するものであるが、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性が非常に高く、かつヌクレオシダーゼを実質的に含有していない点で公知の微生物とは明確に区別される。例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に保存されている公知のバチルス・ステアロサーモフィラスに属する微生物と、上記本分離菌とを用いて菌体単位重量当りのピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼおよびプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性を比較検討したところ、その結果は第１表の通りであった。第１表から、ＴＨ６−２、Ｐ−２１およびＰ−２３の菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性は、従来公知の菌株の保有する酵素活性と比較してプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性で２倍弱およびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性で６倍強程度それぞれの活性が高いことがわかる。具体的には、上記の本分離菌は、菌体単位重量当りのプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性およびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性はそれぞれ１３〜１５Ｕ／ｇ湿菌体および２０〜２２Ｕ／ｇ湿菌体の値を示すものであった。
　したがって、本分離菌は前述したヌクレオシドホスホリラーゼ活性の選定基準を十分に満足するものであり、ヌクレオシドを製造するために使用する酵素調製物の調製源として有用である。
　このことを証明するために、リバビリンを製造し、目的化合物の生成率を公知菌株と比較してみた。その結果、第２表に示すように、本発明微生物群に属する微生物を使用した場合にはいずれも９０％以上の生成率を示すのに対して、公知の微生物は最高でも４０％の生成率しか示さず、本発明の微生物群に属する微生物はヌクレオシドの製造のための酵素源として極めて有用であることを確認した。
　なお、上記の比較試験において、微生物の菌体は後述の実施例１と同様にして調製し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性およびピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定は後述の力価の測定法に準じて行った。また、リバビリンは、基質溶液（４０ｍＭ　１，２，４‐トリアゾール‐３‐カルボキサミド、６０ｍＭウリジン、４０ｍＭリン酸二水素カリウムを含有するｐＨ６．０の水溶液）１０ｍｌに菌体重量をそろえた菌体懸濁液１０ｍｌ（湿菌体として２００ｍｇを含有）を添加して５０℃で２４時間攪拌することにより製造した。上記反応後、反応液を遠心分離し、上清を５０〜１００倍に希釈して、これをＨＰＬＣ法（カラム：ＹＭＣ　Ａ−３１２（（株）山村化学研究所製）、溶出剤：０．１５Ｍリン酸二水素カリウム溶液、検出：２２０ｎｍの吸収）でリバビリンの生成量を測定した。
　生成率は次式により求めた。
　本発明の酵素調製物は、本発明の微生物群に属する微生物を培養し、培養して得られた菌体を使用目的に応じた使用態様に適宜処理加工することにより調製することができる。
　微生物を培養するための培地としては、これらの微生物が資化可能な炭素源および窒素源を適当量含有し、必要に応じて金属塩、微量発育促進物質、消泡剤などを添加したものが使用される。具体的には、培地成分としては糖類（グルコース、サッカロースなど）、天然炭水化物（糖蜜、廃糖蜜、澱粉、麦、ふすま、米など）、アルコール類、脂肪酸類、炭化水素類など、窒素源としては、肉エキス、酵母エキス、大豆加水分解物、カザミノ酸、各種アミノ酸、尿素など、無機塩としては亜鉛、鉄、マグネシウム、ナトリウム、カルシウム、カリウムなどの金属のりん酸塩、塩酸塩、硫酸塩など、微量発育促進物質としてはビタミンＢ１、ビタミンＢ２、パントテン酸、ビオチンなどが例示される。
　培養は、通常の液体培養法（振盪培養、通気攪拌培養、静置培養、連続培養など）によって行えばよい。
　培養条件は、微生物および培地の種類によって異なり、特定することはできない。通常は、培養開始のｐＨを６．５〜９．０に調整し、約３５〜６５℃の温度条件下で目的とする酵素活性が十分得られるまで、具体的には５〜５０時間程度培養する。
　このようにして得られる生菌体を含有する培養液（以下、培養物という）を用いて調製する酵素調製物の態様は特に制限されるものではなく、例えば、微生物の培養物自体、培養物から通常の分離手段（遠心分離、沈澱分離、凝集分離、洗浄など）によって分離された生菌体、またはその菌体処理物を例示することができる。
　生菌体の菌体処理物をさらに具体的に例示すれば、生菌体を機械的破壊（ワーリング・ブレンダー、フレンチ・プレス、ホモジナイザー、乳鉢などによる）、凍結融解、乾燥（凍結乾燥、風乾、アセトン乾燥などによる）、自己消化（トルエン、酢酸エチルなどの溶媒処理による）、酵素処理（リゾチームなどの細胞壁溶解酵素による）、超音波処理、浸透圧ショック法、化学的処理（塩類溶液、酸性溶液、アルカリ性溶液、界面活性剤、キレート剤などによる）などの一般的処理法に従って処理して得た生菌体の破壊物または生菌体の細胞壁もしくは／および細胞膜を変性させたもの、あるいは酵素活性を有する画分を抽出し、さらに、必要に応じて酵素活性を有する抽出画分を一般的な酵素精製法（塩析処理、等電点沈澱処理、有機溶媒沈澱処理、各種クロマトグラフィー処理、透析処理などによる）に従って処理して本発明の目的とする酵素活性を有する画分を分画することによって得られる粗酵素または精製酵素を挙げることができる。
　このような培養物、生菌体および菌体処理物は固定化処理を施さない遊離の状態で使用してもよく、また包括法、架橋法、吸着法など通常の方法により固定化処理を施した固定化物として使用してもよい。
　菌体処理物の一態様である精製酵素に関し、具体的例を挙げ説明すれば、本発明微生物群に属するバチルス・ステアロサーモフィラス　ＴＨ６−２より抽出精製して得られたヌクレオシドホスホリラーゼは以下の酵素学的性質を有する。
（Ａ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
（１）作　用
　本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、上記の加リン酸分解反応を触媒する。このため、国際酵素分類のＥ．Ｃ．２．４．２．１に属する。
（２）基質特異性
　各種のプリンヌクレオシドを基質に加リン酸分解反応を行わせた結果を第３表に示す。
　第３表より、本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼは、試験した範囲内においてはイノシン、２′‐デオキシイノシン、グアノシンおよび２′‐デオキシグアノシンに特異的である。
（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
　至適ｐＨはｐＨ７〜８、安定ｐＨ範囲はｐＨ５〜９である（第１図参照）。
（４）至適温度および温度安定性
　至適温度は６０〜８０℃、安定温度範囲６０℃までである（第２図参照）。
（５）分子量
　ＳＤＳ‐ポアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約３１０００である。
（６）力価（比活性）
　８０％の酵素の精製度合で比活性が４００（Ｕ／ｍｇ）以上を示し、９０％の酵素の精製度合で４５０（Ｕ／ｍｇ）を示す。
（Ｂ）ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ
（１）作　用
　本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、上記の加リン酸分解反応を触媒する。このため、国際酵素分類のＥ．Ｃ．２．４．２．２に属する。
（２）基質特異性
　各種のピリミジンヌクレオシドを基質に加リン酸分解反応を行わせた結果を第４表に示す。
　第４表より、本発明のピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼは、試験した範囲内においてはウリジン、２′‐デオキシウリジン、リボフラノシルチミン、チミジンに特異的である。
（３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性
　至適ｐＨはｐＨ７〜９、安定ｐＨ範囲はｐＨ５〜９である（第３図参照）。
（４）至適温度および温度安定性
　至適温度は６０〜７０℃、安定温度範囲６０℃までである（第４図参照）。
（５）分子量
　ＳＤＳ‐ポリアクリルアミド電気泳動法で測定した分子量が約４５０００である。
（６）力価（比活性）
　８０％の酵素の精製度合で比活性が２５０（Ｕ／ｍｇ）以上を示し、９０％の酵素の精製度合で２９７（Ｕ／ｍｇ）を示す。
　なお、上記の酵素的性質は以下に示す方法で測定した。
　▲１▼　力価の測定
　
プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
　基質溶液（２０ｍＭイノシンおよび０．１Ｍリン酸二水素カリウムを含有するｐＨ８．０の水溶液）１．０ｍｌに酵素溶液（精製酵素として１μｇを含有する５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０））２０μｌを加えて５０℃で１０分間反応させた後、塩酸を最終濃度で０．１Ｎになるように加えて反応停止させるとともに０℃で１０分間冷却する。次に、反応液を遠心分離し、得られた上清をＨＰＬＣ法（カラム：ＹＭＣ　Ａ−３１２（（株）山村化学研究所製）、溶出剤：アセトニトリル５．０％含有２０ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、検出：２６０ｎｍ）で生成するヒポキサンチンを定量する。１分間に１μｍｏｌのヒポキサンチンを生成する酵素量を１単位（「Ｕ」）とする。
　
ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性
　基質溶液中のイノシンの代わりにウリジンを使用し、ＨＰＬＣ法でウラシルを定量する以外は上記のプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。１分間に１μｍｏｌのウラシルを生成する酵素量を１単位とする。
　▲２▼　基質特異性
　基質溶液として１０ｍＭの各種ヌクレオシドおよび５０ｍＭのリン酸二水素カリウムを含有するｐＨ８．０の水溶液を使用し、５０℃で１０分間反応させ、反応後、ＨＰＬＣ法で各種ヌクレオシドの塩基を定量する以外はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。
　▲３▼　至適ｐＨ
　ヌクレオシド（２０ｍＭのイノシンまたはウリジン）および０．１Ｍのリン酸二水素カリウムを溶解させ、希塩酸または希水酸化ナトリウムの各水溶液でｐＨ４〜１０に調整した基質溶液を使用した以外はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。
　▲４▼　安定ｐＨ
　０．２Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ３．５〜６）およびトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）中で３７℃で１６時間保持した酵素溶液を使用した以外は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性またはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。
　▲５▼　至適温度
　反応を３０〜８０℃の各温度で行う以外はプリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性またはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。
　▲６▼　安定温度範囲
　３０〜８０℃で１５分間加熱した酵素溶液を使用する以外は、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性またはピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性の測定法と同様にして行う。
　上述の本発明微生物群中の微生物から得られた酵素の特徴は、比較的高温に至適温度と安定温度範囲を持ち、かつ比活性が著しく高いところにある。したがって、このような特徴を有する酵素を含有する調製物をヌクレオシドの製造に使用すれば、反応に使用する酵素調製物の量が少なくてすみ、わずかな酵素量でヌクレオシドを収率よく製造することができる。さらに、反応を比較的高温（４５℃以上）で行えるので雑菌微生物による汚染を防止することもできる。
ＩＩ　ヌクレオシドの製造
　上述の酵素調製物を用いるヌクレオシドの製造は、反応容器内において後述の塩基供与体、糖残基供与体およびリン酸供与体と酵素調製物を接触反応させることにより実施することができる。
▲１▼　塩基供与体
　本発明方法で使用する塩基供与体は反応系に塩基を供給するものである。使用する塩基供与体は目的とするヌクレオシドに応じて選択すればよく、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用によって糖残基供与体の糖部分とＮ‐グリコシド結合を形成しうる複素環塩基またはその誘導体を例示することができる。複素環塩基の具体例は、例えば、プリンおよびその誘導体、ピリミジンおよびその誘導体、トリアゾールおよびその誘導体、イミダゾールおよびその誘導体、デアザプリンおよびその誘導体、アザプリンおよびその誘導体、アザピリミジンおよびその誘導体またはピリジンおよびその誘導体などである。また、塩基供与体としては、複素環塩基そのものはもとより、該複素環塩基を有するヌクレオシド、ヌクレオチドなどであってもよい。
　具体的には、プリン塩基の１位、２位、６位または８位の１または２以上の位置に置換基（例えば、アミノ基、置換アミノ基、水酸基、オキソ基、メルカプト基、アシル基、アルキル基、置換アルキル基、アルコキシル基、ハロゲノ原子など）を有するプリン誘導体、例えばアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、６‐メルカプトプリン、６‐チオグアニン、Ｎ６‐アルキルもしくはアシルアデニン、２‐アルコキシアデニン、２‐チオアデニン、２，６‐ジアミノプリンなど；ピリミジンの２位、４位または５位の１または２以上の位置に前記と同様の置換基を有するピリミジン誘導体、例えば、シトシン、ウラシル、チミン、５‐ハロゲノウラシル（５‐フルオロウラシル、５‐ヨードウラシルなど）、５‐ハロゲノシトシン（５‐フルオロシトシンなど）、５‐トリハロゲノメチルウラシル（５‐トリフルオロメチルウラシルなど）、２‐チオシトシン、４‐チオウラシル、Ｎ４‐アシルシトシン、５‐ハロゲノビニルウラシルなど；１，２，４‐トリアゾールの３位に置換基を有する１，２，４‐トリアゾール誘導体、例えば１，２，４‐トリアゾール‐３‐カルボキサミド、１，２，４‐トリアゾール‐３‐カルボン酸、１，２，４‐トリアゾール‐３‐カルボン酸アルキルエステルなど；イミダゾールの４位および５位に置換基を有するイミダゾール誘導体、例えば５‐アミノ‐４‐イミダゾールカルボキサミド、４‐カルバモイル‐イミダゾリウム‐５‐オレート、ベンズイミダゾールなど；プリンの１位、３位もしくは７位におけるデアザプリン誘導体、例えば１‐デアザアデニン、３‐デアザアデニン、３‐デアザグアニン、７‐デアザアデニン、７‐デアザグアニンもしくはこれらに前記プリン誘導体と同様の置換基を有する化合物など；８‐アザアデニン、７‐デアザ‐８‐アザヒポキサンチン（アロプリノール）などのアザプリン誘導体；５‐アザチミン、５‐アザシトシン、６‐アザウラシルなどのアザピリミジン誘導体；３‐デアザウラシル、ニコチン酸、ニコチン酸アミドなどのピリジン誘導体などが例示される。
▲２▼　糖残基供与体
　糖残基供与体は反応系に糖残基を供給するものである。すなわち、糖残基供与体としては目的とするヌクレオシドに応じて選択すればよく、ヌクレオシドホスホリラーゼの作用により塩基供与体の塩基部分とＮ‐グリコシド結合を形成しうるリボース化合物、デオキシリボース化合物を例示することができる。リボース化合物としては、イノシン、グアノシン、ウリジン、リボフラノシルチミンなどのリボヌクレオシドおよびリボース‐１‐リン酸を、デオキシリボース化合物としては、２′‐デオキシイノシン、２′‐デオキシグアノシン、２′‐デオキシウリジン、チミジン、２′，３′‐ジデオキシイノシン、２′，３′‐ジデオキシグアノシン、２′，３′‐ジデオキシウリジン、３′‐デオキシチミジンなどのデオキシヌクレオシド、および２‐デオキシリボース‐１‐リン酸、２，３‐ジデオキシリボース‐１‐リン酸などをそれぞれ例示することができる。
　また、酵素調製物として精製酵素以外のものを使用する場合には、上記の糖残基供与体に加えて、さらにアデノシン、シチジン、キサントシンなどのリボース化合物、および２′‐デオキシアデノシン、２′‐デオキシシチジン、２′‐デオキシキサントシンなどのデオキシリボース化合物も使用しうる可能性を有する。
▲３▼　リン酸供与体
　リン酸供与体としては、反応液中でリン酸イオンに解離しうるもののいずれを用いてもよく、例えば遊離型のリン酸またはリン酸塩（例えば、ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属塩、アンモニウム塩など）が好適に使用される。また、リン酸供与体としては、反応液中でリン酸イオンを遊離しうる系、例えば各種リン酸エステル誘導体とホスファターゼの組合せ、ヌクレオチドとヌクレオチダーゼの組合せなどを利用することもできる。
▲４▼　反応条件
　反応液としては、塩基供与体、糖残基供与体およびリン酸供与体が水または緩衝液に溶解または懸濁したものを用い、この反応液と前述の酵素調製物と接触させて、使用した塩基供与体に対応するヌクレオシドを酵素的に製造する。
　塩基供与体、糖残基供与体、リン酸供与体の使用濃度は、０．１〜５００ｍＭの範囲から適宜選定すればよい。
　反応は通常、３５〜８０℃の範囲で効率よく進行するが、特に４０〜７０℃程度の反応温度が好ましい。反応温度が３５℃以下のときは反応速度が遅く、反応効率がよくない。また、８０℃以上の反応温度ではヌクレオシドホスホリラーゼ活性を低下させるおそれがある。
　反応液のｐＨは通常ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ５〜９の範囲に保たれればよい。反応中にｐＨが変動するときは酸またはアルカリを用いて好ましいｐＨ範囲に補正すればよい。
　反応後、反応液と酵素組成物とを分離し、目的とするヌクレオシドを分離精製工程に供する。
　生成したヌクレオシドは公知の方法またはこれを応用した方法によって分離精製することができる。例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル槇過法など各種のクロマトグラフィー、向流分配、向流抽出など二液相間の分配を利用する方法、濃縮、冷却、有機溶媒添加など溶解度の差を利用する方法などのヌクレオシドの分離精製で使用されている一般的な分離精製法を単独で、あるいは適宜に組合せて行えばよい。
〔実施例〕
　以下、実施例および比較例によって本発明を具体的に説明する。
実施例１
　酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、ペプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）１．０％、肉エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．７％および食塩０．３％を含む殺菌済みの培地（ｐＨ７．０）５００ｍｌにバチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）を植菌し、５０℃で１８時間振盪培養した。
　得られた培養液を遠心分離して菌体を集菌し、洗浄後、殺菌水を加えて２５０ｍｌの菌体懸濁液を調製した。この菌体懸濁液を１０ｍｌずつ分取し、４０ｍＭ塩基供与体、４０ｍＭ糖残基供与体および４０ｍＭリン酸二水素カリウムを含有する基質溶液（ｐＨ６．０）１０ｍｌを添加して４０〜６０℃で、攪拌条件下反応させた。
　反応後、各種ヌクレオシドの生成量は、高速液体クロマトグラフィー（カラム：ＹＭＣ　Ａ−３１２（（株）山村化学研究所製）、溶出剤：２．５〜５％アセトニトリル含有２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、検出：２５０〜２６０ｎｍにおける吸収）を用いて測定した。
　ヌクレオシドの生成率は下記式により求めた。
その結果を第５表に示す。
実施例２
　塩基供与体としてアロプリノール２０ｍＭ、糖残基供与体としてウリジン３０ｍＭおよびリン酸二水素カリウム７５ｍＭを含有する基質溶液（ｐＨ６．０）を用いて実施例１と同様にして６０℃で８時間反応させてアルプリノールのリボフラノシル体を９５％の収率（対アルプリノール比）で製造した。
実施例３
　塩基供与体（アロプリノール、ベンズイミダゾール、６‐メルカプトプリン、プリン、６‐チオグアニン）２０ｍＭ、糖残基供与体（ウリジン、２′‐デオキシウリジン）３０ｍＭおよびリン酸二水素カリウム３０ｍＭを用いて実施例１と同様にして５０℃で８時間反応させて各種塩基供与体を塩基として保有するリボフラノシル体または２′‐デオキシリボフラノシル体を製造した。その結果を第６表に示す。
実施例４
　塩基供与体として４０ｍＭ　１，２，４‐トリアゾール‐３‐カルボキサミド（以下、「トリアゾール」という）、糖残基供与体として４０ｍＭのウリジン、イノシン、シチジン、アデノシンもしくはグアノシン、４０ｍＭリン酸二水素カリウムを含有する基質溶液（ｐＨ６．０）を用いて実施例１と同様にしてリバビリンを製造した。その結果を第７表に示す。
　なお、シチジン、アデノシンに関しては本発明のヌクレオシドホスホリラーゼは基質として認識しないため、共存するデアミナーゼによりそれぞれウリジン、イノシンに変換された後、基質として利用されていると考えられる。
実施例５
　塩基供与体としてトリアゾール４０ｍＭ、糖残基供与体としてイノシン６０ｍＭ、およびリン酸二水素カリウム４０ｍＭを含有する基質溶液（ｐＨ６．０）を用い、実施例１と同様に各反応温度（４０〜７０℃）で２４時間反応させてリバビリンを製造した。その結果を第８表に示す。
実施例６
　実施例１と同様に培養して得られた培養物を遠心分離して生菌体を得た。次に、生菌体２．０ｇを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍｌに懸濁し、別に作製した光硬化性樹脂（ＥＮＴ−２０００；関西ペイント（株）製）８．０ｇに光重合開始剤としてベンゾインエチルエーテル０．０８ｇを加えた樹脂液に上記菌体懸濁液を添加し、十分に混合した後、透明フィルム上に流し込み、３６０ｎｍ前後の光線をフィルム面の表裏に同時に３分間照射して光重合物を得た。
　この固定化物より菌体量として０．２ｇを含む部分を取り、細断して４０ｍＭトリアゾール、４０ｍＭウリジンおよび６０ｍＭリン酸二水素カリウムを含む基質溶液（ｐＨ６．０）１０ｍｌに上記固定化物を投入し、６０℃で８時間攪拌しながらリバビリンを製造した。
　前述のＨＰＬＣ法で生成率を測定した結果、リバビリンの生成率は対トリアゾール比で９０％であった。
　さらに、この反応を１０回連続して行ったが、リバビリンの生成率は９０％を維持し、酵素活性の低下は見られなかった。
実施例７
　実施例１と同様にして得られた培養物にトリアゾール、ウリジンまたはイノシン、リン酸二水素カリウムをそれぞれ最終濃度で４０ｍＭになるように加え、５０℃（ウリジンを用いた場合）または６５℃（イノシンを用いた場合）でさらに２４時間振盪培養を行った。培養後、遠心上清をＨＰＬＣ法によりリバビリンの生成率を測定した結果、ウリジンを用いた場合のリバビリンの生成率は対トリアゾール比で９１．９％、イノシンを用いた場合は６５．９％の生成率であった。
実施例８
　
精製酵素の調製
　バチルス・ステアロサーモフィラス　ＴＨ６−２をブイヨンスラントよりペプトン１．０％、肉汁０．７％、酵母エキス０．５％、食塩０．３％を含みｐＨ７．２に調整した培地１０ｍｌを入れた大型試験管に植菌し、５０℃で一夜培養した。得られた培養物を同組成、同ｐＨの培地３０ｍｌを含む３００ｍｌ容積のフラスコに移し、５０℃で８時間培養し、これを種培養として全量を上記培地３ｌを含む５ｌ容のジャー・ファーメンターに加え、５０℃、回転数３５０ｒ．ｐ．ｍ．，通気量１．０ｖ．ｖ．ｍ．の条件にて１８時間培養した。こうして得られた培養液から遠心分離により約３０ｇの湿菌体を得、これを１．５ｌの０．１％トライトンＸ−１００（シグマ社製）、５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）に懸濁し、７５０ｍｇのリゾチーム（シグマ社製）を加え、３７℃に１時間保持した。溶菌液を８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて遠心分離し、菌体残渣を除去した後、２Ｎ塩酸を加えてｐＨ６．０に調整し、５０℃にて５分間加熱処理し、８，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて遠心分離して上清を粗酵素液として得た。
　この粗酵素液を硫酸アンモニウムを用いて塩析による分画を行い、４０％−９０％飽和で得られた蛋白沈澱を５０ｍＭ酢酸‐酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させ、大量の同緩衝液に対して一夜透析し、得られた内液を遠心分離して透析中に生成した沈澱を除去した。上清を上記の酢酸緩衝液（以下バッファーＡと記す）で平衡化したＤＥＡＥトヨパール（東ソー（株）製）カラム（２．２×６０ｃｍ）に通し、吸着した蛋白を０〜０．５Ｍ食塩のリニアグラジエント法（バッファーＡ使用）で溶出し、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ画分とピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ画分をそれぞれ回収した。それぞれの活性画分をバッファーＡに対して透析後、２５ｍｌ容注射筒（テルモ（株）製）に充填した２０ｍｌＤＥＡＥトヨパール樹脂を用いて上記と同じ操作によりカラムクロマトグラフィーを行い、それぞれの活性画分を回収した。次にこれらの活性画分をそれぞれバッファーＡで平衡化したトヨパールＨＷ−５５Ｓ（東ソー（株）製）カラム（２．４×８０ｃｍ）を用いてゲル槇過して両酵素をほぼ均一な精製標品として回収した。
　両酵素の精製過程での活性画分の蛋白量、総活性および精製度合を第９表に示す。
　なお、精製度合は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により得られた泳動パターンをデンシトメーターを用いて各バンドの相対割合を測定する方法によった。
比較例　１
　ブレビバクテリウム・アセチリカム　ＡＴ６−７（ＡＴＣＣ　３９３１１）およびバチルス・ステアロサーモフィラス　ＴＨ６−２の各スラントより培地（ペプトン１％、肉エキス０．７％、食塩０．３％、酵母エキス０．５％含有、ｐＨ７．２）１０ｍｌを含む大型試験管植菌し、それぞれ２８℃（ＡＴ６−７の場合）および５０℃（ＴＨ６−２の場合）で１８時間振盪培養した。培養後、それぞれの培養液を遠心分離して菌体を分離した。洗浄後、同湿重量の菌体をそれぞれ１０ｍｌの脱イオン水に懸濁した。
　この菌体懸濁液それぞれに０．４ｍＭトリアゾール、０．４ｍＭウリジンおよび０．４ｍＭリン酸二水素カリウムを含有する基質溶液（ＡＴ６−７の場合はｐＨ７．０、ＴＨ６−２の場合はｐＨ６．０に調整）１０ｍｌを添加し、密閉系で４５℃または６５℃で攪拌しながら反応させ、定期的にサンプリングして前述のＨＰＬＣ法にてリバビリンの生成率を測定した。
　その結果を第５図に示す。第５図から明らかなように、本発明の微生物から調製した酵素調製物を用いた場合、従来、極めて優れた酵素調製源であったＡＴ６−７よりもさらに短時間に目的化合物を製造することができ、酵素調製物の使用量も少量ですませることができることが明らかとなった。
　以上のように、本発明のヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物は、比活性が高く、耐熱性のあるヌクレオシドホスホリラーゼを多量に含有し、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性が高いバチルス属の好熱菌に属する微生物群の１種もしくは２種以上の微生物の菌体に由来するものであり、このような酵素調製物をヌクレオシドの製造に使用すれば、以下の特徴を有し、実用性に富んだ極めて有用な方法である。
　▲１▼　比活性の高いヌクレオシドホスホリラーゼを多量に含有しており、ヌクレオシドの製造に使用した場合には少量の酵素量で収率よくヌクレオシドを製造することができる。
　▲２▼　至適温度および安定温度範囲が比較的高温域にあるヌクレオシドホスホリラーゼを含有している。このため、反応を高温で行うことができ、雑菌の汚染による酵素の失活、反応生成物の分解等を抑制することができる。
　▲３▼　ヌクレオシドホスホリラーゼとしてプリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの両方の酵素を含有する調製物を得ることもでき、このような調製物をヌクレオシド製造に使用すれば、例えば下記の反応式に示されたごとく、２つの酵素が共同して作用するため、１種類のヌクレオシドホスホリラーゼしか含有しない酵素調製物と比較して２倍以上の速度でヌクレオシドを製造することができる。
　また、本発明の微生物は比較的高温で生育して生育速度も速く、培養して得られた菌体には前述のようなヌクレオシドの製造に適した酵素を多量に含有しているためヌクレオシド製造に使用するための酵素調製物またはその調製源として極めて有用である。
　さらに、本発明の酵素調製物として微生物の培養物を用いれば菌体の自己消化を防止することもできる。
　また、上記本発明の微生物から得られるヌクレオシドホスホリラーゼは、高い比活性を有し、かつ比較的高温域に至適温度と安定温度範囲を有するという特徴から公知のヌクレオシドホスホリラーゼとは明確に区別されるものである。また、このような酵素をヌクレオシドの製造に使用すれば、上述の▲１▼および▲２▼の効果を有する。また、本発明のプリンヌクレオシドホスホリラーゼとピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼの両方の酵素を使用すれば、当然上述の▲３▼の効果を奏する。
　　　産業上の利用可能性
　本発明のヌクレオシドの製造法は、バチルス属の好熱菌に属す比活性が高く、耐熱性のあるヌクレオシドホスホリラーゼを大量含有し、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性の高い微生物群の微生物菌体に由来する酵素調製物をヌクレオシド製造のための酵素源として使用しており、わずかな酵素量で収率よく目的とするヌクレオシドを製造することができ、極めて実用的な方法である。
（５７）【特許請求の範囲】
　１．　塩基供与体、糖残基供与体およびリン酸供与体をヌクレオシドホスホリラーゼ（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ）を含有する酵素調製物を用いて反応させて塩基供与体の塩基部分と糖残基供与体の糖部分との間でＮ‐グリコシド結合を形成させてヌクレオシドを製造する方法において、ヌクレオシドホスホリラーゼを含有する酵素調製物として、バチルス・ステアロサーモフィラス　ＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）の菌体に由来するものを用いることを特徴とするヌクレオシドの製造法。
　２．　実質的にヌクレオシダーゼ活性を有さず、菌体単位重量当りのヌクレオシドホスホリラーゼ活性が局いバチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ−２（微工研条寄第２７５８号）。
　３．　プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が１０Ｕ／ｇ湿菌体以上である、請求項２に記載の微生物。
　４．　ピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ活性が１０Ｕ／ｇ湿菌体以上である、請求項２に記載の微生物。
　５．　バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）の菌体に由来する、以下の性質を有するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
　▲１▼　作　用：　
の加リン酸分解反応を触媒
　▲２▼　基質特異性：
　イノシン、２′‐デオキシイノシン、グアノシンおよび２′‐デオキシグアノシンに特異的
　▲３▼　至適ｐＨおよびｐＨ安定性：
　至適ＰＨはｐＨ７〜８、安定ｐＨ範囲はｐＨ５〜９
　▲４▼　温度安定性：６０℃、１５分間の加熱処理においても安定
　▲５▼　分子量：
　ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約３１０００
　▲６▼　比　活　性：８０％の酵素の精製度合で４００（Ｕ／ｍｇ）以上
　６．　バチルス・ステアロサーモフィラスＴＨ６−２（微工研条寄第２７５８号）の菌体に由来する、以下の性質を有するピリミジンヌクレオシドホスホリラーゼ。
　▲１▼　作　用：
の加リン酸分解反応を触媒
　▲２▼　基質特異性：
　ウリジン、２′‐デオキシウリジン、リボフラノシルチミン、チミジンに特異的
　▲３▼　至適ｐＨおよびｐＨ安定性：
　至適ｐＨはｐＨ７〜９、安定ｐＨ範囲はｐＨ５〜９
　▲４▼　温度安定性：６０℃、１５分間の加熱処理においても安定
　▲５▼　分子量：
　ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定した分子量が約４５０００
　▲６▼　比　活　性：８０％の酵素の精製度合で２５０（Ｕ／ｍｇ）以上