(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドからなり、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有する、アプタマーであって、
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造を有し、前記ループ構造に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を更に有する、アプタマー。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜２個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項２】
前記ループ構造が塩基数２８〜４０のポリヌクレオチド鎖からなる、請求項１に記載のアプタマー。
【請求項３】
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドがグアニン四重鎖構造を形成する、請求項１又は２に記載のアプタマー。
【請求項４】
以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが２つ以上連結されたマルチ構造を有し、ＨＧＦ受容体に結合してＨＧＦ受容体活性化作用を有する、アプタマー。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜２個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と９０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
【請求項５】
前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有する、請求項４に記載のアプタマー。
【請求項６】
２つ以上の前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドはリンカーによって連結され、前記リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基分以下の長さである、請求項４又は５に記載のアプタマー。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含有する、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含有する、がん細胞の転移抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを有効成分として含有する、細胞培養用組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを含む培地で、ＨＧＦ受容体を発現している細胞を培養することを含む、細胞培養方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の分化抑制方法。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の増殖抑制方法。
【請求項１４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の遊走抑制方法。
【請求項１５】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、ＨＧＦ受容体の活性化方法。
【請求項１６】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の分化誘導方法。
【請求項１７】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の増殖促進方法。
【請求項１８】
請求項４〜６のいずれか一項に記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の遊走促進方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アプタマー、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤、がん細胞の転移抑制剤、細胞培養用組成物、細胞培養方法、結合阻害方法、細胞の分化抑制方法、細胞の増殖抑制方法、細胞の遊走抑制方法、ＨＧＦ受容体の活性化方法、細胞の分化誘導方法、細胞の増殖促進方法、及び細胞の遊走促進方法に関する。
本願は、２０１４年９月９日に、米国に仮出願されたＵＳ６２／０４７，７４７に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
受容体シグナリングでは、細胞が細胞膜上の受容体でリガンドを受容すると、細胞内にシグナルが伝達され、細胞の分化や増殖等が制御されることが知られている。シグナル分子の受容により、細胞は周囲の環境や状況を検知できる。【０００３】
ｃ−Ｍｅｔはチロシンキナーゼ型ＨＧＦ受容体であり、肝細胞増殖因子（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ：ＨＧＦ）は、ｃ−Ｍｅｔのリガンドである。ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔに結合すると、ｃ−Ｍｅｔの２量体が形成され、ｃ−Ｍｅｔ細胞内ドメインがリン酸化され、細胞内シグナル伝達が開始される。ＨＧＦとの結合によりｃ−Ｍｅｔは活性化する。
ｃ−Ｍｅｔの活性化は、肝細胞の増殖や分化誘導をもたらすことが知られている。また、ｃ−Ｍｅｔシグナリングの異常亢進が、がん細胞の転移に関係することが指摘されている（非特許文献１）。したがって、ｃ−Ｍｅｔ活性の制御可能な分子ツールが求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｌ．Ｔｒｕｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ．，  ２，２８９−３００．（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ＨＧＦ受容体に結合する分子としてＨＧＦが製造されている。しかし、ＨＧＦを製造する際には、一般的に発現系を利用しなくてはならず、提供されるＨＧＦは高価格となってしまう。また、ＨＧＦタンパク質は、品質管理が煩雑であるという問題がある。
本発明は上記事情に鑑み、ＨＧＦ受容体に結合するアプタマーを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一実施態様は、下記（１）〜（２０）を提供するものである。
（１）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを有し、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有する、アプタマー。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
（２）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造を有する、前記（１）に記載のアプタマー。
（３）  前記ループ構造に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有する、前記（２）に記載のアプタマー。
（４）  前記ループ構造が塩基数２８〜４０のポリヌクレオチド鎖からなる、前記（２）又は（３）に記載のアプタマー。
（５）  前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドがグアニン四重鎖構造を形成する、前記（１）〜（４）のいずれか一つに記載のアプタマー。
（６）  以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが２つ以上連結されたマルチ構造を有し、ＨＧＦ受容体に結合してＨＧＦ受容体活性化作用を有する、アプタマー。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
（７）  前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有する、前記（６）に記載のアプタマー。
（８）  ２つ以上の前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドはリンカーによって連結され、前記リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基分以下の長さである、前記（６）又は（７）に記載のアプタマー。
（９）  前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを有効成分として含有する、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤。
（１０）  前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを有効成分として含有する、がん細胞の転移抑制剤。
（１１）  前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを有効成分として含有する、細胞培養用組成物。
（１２）  前記（１）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを含む培地で、ＨＧＦ受容体を発現している細胞を培養することを含む、細胞培養方法。
（１３）  前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害方法。
（１４）  前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の分化抑制方法。
（１５）  前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の増殖抑制方法。
（１６）  前記（１）〜（５）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の遊走抑制方法。
（１７）  前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、ＨＧＦ受容体の活性化方法。
（１８）  前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の分化誘導方法。
（１９）  前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の増殖促進方法。
（２０）  前記（６）〜（８）のいずれか一つに記載のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の遊走促進方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】一実施形態におけるアプタマーの模式図である。
【図２】一実施形態におけるマルチ構造アプタマーの模式図である。
【図３】一実施形態におけるマルチ構造アプタマーの模式図である。
【図４】一実施形態におけるマルチ構造アプタマーの模式図である。
【図５】一実施形態におけるマルチ構造アプタマーの模式図である。
【図６】一実施形態におけるアプタマー固定担体の模式図である。
【図７】実施例において作製された、ＳＬ１（アプタマー）の構造を示す図である。
【図８】実施例において作製された、ＦＩＴＣ標識されたＳＬ１の構造を示す模式図である。
【図９】実施例において得られた、ＳＬ１のＨＧＦ受容体への結合能を示す結果の図である。
【図１０】実施例において得られた、ＳＬ１のＨＧＦ受容体への結合能を示す結果の図である。
【図１１】実施例において得られた、ＳＬ１のグアニン四重鎖構造の存在を示す結果の図である。
【図１２】ＳＬ１のループ領域におけるグアニンの位置を示す模式図である。
【図１３】実施例において得られた、ＳＬ１による、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化の阻害を示す結果の図である。
【図１４】実施例において得られた、ＳＬ１による、がん細胞の遊走抑制を示す結果の図である。
【図１５】実施例において製造された、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒの形成を示す模式図である。
【図１６】実施例において得られた、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ等の形成を示す結果の図である。
【図１７】実施例において得られた、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒによって、ｃ−Ｍｅｔの活性化が誘起された結果を示す図である。
【図１８】実施例において製造された、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒを示す模式図である。
【図１９】実施例において得られた、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒによるｃ−Ｍｅｔのリン酸化結果を示す図である。
【図２０】実施例において得られた、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒによるｃ−Ｍｅｔのリン酸化結果を示す図である。
【図２１】実施例において得られた、ＳＬ１間の長さ等による、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化に与える影響の比較結果を示すグラフである。
【図２２】実施例において得られた、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒによる、がん細胞の遊走促進を示す結果の図である。
【図２３】実施例において得られた、ＳＬ１  ｍｕｔａｎｔの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
≪アプタマー≫
本発明の一実施形態のアプタマーは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを有し、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有する。
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
【０００９】
「アプタマー」とは、標的分子に結合可能な分子であり、核酸やペプチドが知られている。本実施形態のアプタマーは、ＨＧＦ受容体に結合する核酸アプタマーである。
本明細書中において、核酸は、ＤＮＡやＲＮＡ等の天然の核酸であってもよく、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）やＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）等の人工核酸であってもよく、核酸と同等の機能を有するものであれば、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等のペプチド核酸に代表される核酸類縁体であってもよい。アプタマーを構成する核酸は、ＤＮＡとＬＮＡの組合せ等、複数種の核酸を組合せることが可能である。
【００１０】
ＨＧＦ受容体は、ＨＧＦと結合可能なタンパク質であり、ＨＧＦ受容体としては、受容体型チロシンキナーゼの一種のｃ−Ｍｅｔが知られている。受容体型チロシンキナーゼは、細胞膜貫通型のタンパク質として知られ、細胞外側にリガンド結合ドメインを有し、細胞質側に細胞内ドメインを有する。リガンド結合ドメインはリガンドと結合可能である。細胞内ドメインは、キナーゼ活性を有する。
受容体型チロシンキナーゼは、リガンドの結合によって２量体を形成することが知られている。２量体が形成されると、２量体の細胞内ドメインのチロシン残基が互いにリン酸化される。本実施形態のアプタマーが結合するＨＧＦ受容体は、単量体であってもよく、２量体以上の複合体であってもよい。
【００１１】
ＨＧＦ受容体を発現している細胞としては、例えば、肝細胞、上皮細胞、角化細胞、神経細胞、心筋細胞等が挙げられる。
【００１２】
図１に一実施形態に係るアプタマーの模式図を示す。アプタマー１は、ポリヌクレオチドからなり、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド１０を有する。
【００１３】
後述の実施例において説明するように、発明者らは、（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを有する核酸が、ＨＧＦ受容体への結合能を有することを見出した。
したがって、一実施形態に係るアプタマーは、以下の（ａ）のポリヌクレオチドを有するものである。（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１４】
一般的に、ポリヌクレオチドから１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加されたポリヌクレオチドも、元のポリヌクレオチドと同様の機能を有することが知られている。また、後述の実施例において説明するように、発明者らは、（ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列が一部改変されたポリヌクレオチドを有する核酸であっても、（ａ）のポリヌクレオチドと同様にＨＧＦ受容体への結合能を有することを見出した。
したがって、一実施形態に係るアプタマーは、以下の（ｂ）のポリヌクレオチドを有するものである。（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【００１５】
（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、「１〜数個」の塩基とは、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜３個、１〜２個、又は１個であってもよい。
（ｂ）のポリヌクレオチドにおいて、「塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列」とは、配列番号１に示される塩基配列に対して、塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列の意味を包含し、配列番号１に示される塩基配列に対して、塩基が欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列の意味を包含し、あるいは、欠失、置換、挿入及び付加からなる群から選ばれる少なくとも一種の改変又は変異により、改変前の配列番号１に示される塩基配列に対して、１〜数個の塩基の相違が生じたものであってもよい。
【００１６】
一般的に、ポリヌクレオチドとの配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドも、元のポリヌクレオチドと同様の機能を有する場合がある。また、後述の実施例において説明するように、発明者らは、（ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列が一部改変されたポリヌクレオチドを有する核酸であっても、（ａ）のポリヌクレオチドと同様にＨＧＦ受容体への結合能を有することを見出した。
したがって、一実施形態に係るアプタマーは、以下の（ｃ）のポリヌクレオチドを有するものである。（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に示される塩基配列との配列同一性は、８０％以上１００％未満であり、例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上であってもよい。
塩基配列同士の配列同一性は、公知のシーケンスアライメントのアルゴリズムであるＢＬＡＳＴ  （Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）やｂｌａｓｔｎを用いて算出可能である。
【００１７】
前記（ｂ）及び（ｃ）のポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、２８〜３５塩基であってもよく、３０〜３３塩基であってもよく、３２塩基であってもよい。
【００１８】
本実施形態のアプタマーは、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有する。
アプタマーが、ＨＧＦ受容体に結合するかどうかは、公知の結合測定方法により確認できる。例えば、適当な標識により標識された標識アプタマーを用意する。固相にＨＧＦ受容体を固定化し、標識アプタマーを含む試料液と固相とを接触させた後、試料液を固相上から除去して固相を洗浄液で洗浄し、アプタマーの存在を示す標識が固相上に検出されるかどうかを確認すればよい。標識が検出された場合、アプタマーはＨＧＦ受容体に結合しており、当該アプタマーはＨＧＦ受容体に対する結合能を有すると判断できる。なお、アプタマーがＨＧＦ受容体に対する結合能を有するかを判断する方法は、上記方法に限定されない。
アプタマーが、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有するかどうかは、公知の結合測定方法により確認できる。例えば、適当な標識により標識された標識ＨＧＦを用意する。標識ＨＧＦを含みアプタマーを含まない試料液Ａと、標識ＨＧＦ及びアプタマーを含む試料液Ｂとを用意する。固相にＨＧＦ受容体を固定化し、試料液Ａ又は試料液Ｂと固相とを接触させた後、試料液を固相上から除去して洗浄液で洗浄し、試料液Ａの処理と試料液Ｂの処理とで、固相上の標識を検出した値を比較すればよい。比較実験は比較可能な同条件のもと行われるものとする。標識を検出した値はＨＧＦとＨＧＦ受容体との結合を示す。標識を検出した値が、試料液Ａと接触させた固相よりも、試料液Ｂと接触させた固相において低下していた場合、当該アプタマーが、ＨＧＦとＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有すると判断できる。なお、アプタマーがＨＧＦとＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有すると判断する方法は、上記方法に限られない。
【００１９】
一実施形態に係るアプタマーは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造を有するものである。
本明細書中において、「ループ構造」とは、鎖状の化合物の１か所以上が互いに結合して形成された環状の構造をいう。例えば、ループ構造は、１本鎖核酸において、１組以上の相補的な塩基同士が塩基対を形成して形成された環状の構造であってもよい。ループ構造は、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが一部を形成していてもよく、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドのみから形成されていてもよい。ループ構造を形成するための結合の手段は、塩基対の形成によるものに限られず、例えば、核酸の５’末端と３’末端とのライゲーションによるものや、その他任意の架橋構造によるものであってもよい。なお、「ループ構造」と「ループ領域」は同じ意味で用いられる。
【００２０】
図１に一実施形態に係るアプタマーの模式図を示す。アプタマー２は、ポリヌクレオチドからなり、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド１０が、少なくとも一部を形成するループ構造２０を有する。
【００２１】
アプタマーがループ構造を有することにより、ＨＧＦ受容体への結合能が向上する。
【００２２】
一実施形態に係るアプタマーは、前記ループ構造に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有していてもよい。
本明細書中において、「ステム構造」とは、鎖状の化合物の２か所以上が互いに結合して形成された鎖状の構造をいう。例えば、ステム構造は、１本鎖核酸において、１組以上の相補的な塩基同士が塩基対を形成して形成された鎖状の構造であってもよい。ステム構造を形成するための結合の手段は、塩基対の形成によるものに限られず、その他任意の架橋構造によるものであってもよい。
ループ構造にステム構造が連結する形態は特に限定されないが、ループ構造及びステム構造が一続きのポリヌクレオチドから形成された形態を例示できる。このような核酸の形態は一般に「ステム・ループ構造」と呼ばれる構造であり、ｔＲＮＡ等に見出される。ステム構造は、互いに相補的な塩基同士が対合して形成された二本鎖ポリヌクレオチドに代表される。なお、「ステム構造」と「ステム領域」は同じ意味で用いられる。
【００２３】
図１に一実施形態に係るアプタマーの模式図を示す。アプタマー３は、ポリヌクレオチドからなり、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０と、ループ構造２０に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造３０とを有する。アプタマーが有するループ構造は、ループ構造２０のみであってもよい。
【００２４】
アプタマーが二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有することにより、容易にループ構造を形成可能であり、ＨＧＦ受容体への結合能が向上する。
【００２５】
ループ構造は、ポリヌクレオチド鎖のみから構成されていてもよい。その場合、ループ構造は、塩基数２８〜４０のポリヌクレオチド鎖からなるものであってもよく、塩基数３０〜３８のポリヌクレオチド鎖からなるものであってもよく、塩基数３３〜３７のポリヌクレオチド鎖からなるものであってもよく、塩基数３６のポリヌクレオチド鎖からなるものであってもよい。
【００２６】
ステム構造は、２本鎖ポリヌクレオチドのみから構成されていてもよい。その場合、２本鎖ポリヌクレオチドを形成する片方の一本鎖ポリヌクレオチドは、塩基数２〜５０のポリヌクレオチド鎖であってよく、塩基数４〜３０のポリヌクレオチド鎖であってもよく、塩基数５〜１５のポリヌクレオチド鎖であってもよい。
【００２７】
一実施形態に係るアプタマーは、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが、グアニン四重鎖構造を形成する。グアニン四重鎖構造は、標的に結合能を有する核酸において確認される場合がある。グアニン四重鎖という名称のとおり、グアニン四重鎖構造は、４組のＧ配列により形成される特定の立体構造である（Ｙ．Ｎｏｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２５，２１５−２２５（２０１０）参照）。
グアニン四重鎖はそのトポロジーから「並行型」「逆並行型」に分類可能である。ここで、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが形成するグアニン四重鎖構造は、並行型であってもよく、逆並行型であってもよい。
ポリヌクレオチドがグアニン四重鎖構造を形成するかどうかは、公知の方法により確認できる。並行型グアニン四重鎖構造の存在は、例えば、ＣＤスペクトル測定によって、２４５ ｎｍ付近の負のピークと、２６５ ｎｍ付近の正のピークが検出されることにより確認できる。また、グアニン四重鎖構造の形成はＫ＋イオンを要求するので、例えば、Ｋ＋イオンを含む溶液中でのポリヌクレオチドと、Ｋ＋イオンを含まない溶液中でのポリヌクレオチドに対する、ＣＤスペクトル測定結果を比較することで、グアニン四重鎖構造の確認を、より信頼性高く行うことができる。
【００２８】
ポリヌクレオチドがグアニン四重鎖構造を形成するという観点から、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、連続する２つ以上のＧの配列を４組以上含むものであってもよい。
一実施形態に係るアプタマーがループ構造を有する場合、前記ループ構造を形成するポリヌクレオチドは、連続する２つ以上のＧの配列を４組以上含むものであってもよい。連続する２つ以上のＧの配列を４組以上含むポリヌクレオチドとしては、上記（ａ）のポリヌクレオチドを例示できる。
【００２９】
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に示される塩基配列の３番目の塩基に対応する塩基がＴ又はＵであることが好ましい。
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に示される塩基配列の２９番目の塩基に対応する塩基がＡ、Ｔ又はＵであることが好ましい。
前記（ｂ）及び（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に示される塩基配列の２９番目の塩基に対応する塩基がＴ又はＵであることが好ましい。
ここで、「対応する塩基」とは、配列番号１に示される塩基に対する、欠失、置換、挿入及び付加を考慮して定めるものとし、当業者であれば配列同士の比較により適宜決定することが可能である。
【００３０】
発明者らは、後述する実施例において示すように、配列番号１に示される塩基配列の上記の位置の塩基を、上記の特定の塩基とすることにより、アプタマーのＨＧＦ受容体に対する結合活性が高められることを見出した。
【００３１】
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に示される塩基配列の３番目の塩基に対応する塩基がＴ又はＵであり、且つ前記（ｂ）及び（ｃ）のポリヌクレオチドにおいて、配列番号１に示される塩基配列の２９番目の塩基に対応する塩基がＴ又はＵであることが特に好ましい。
ここで、３番目の塩基を有するヌクレオチドがデオキリシリボヌクレオチドである場合、３番目の塩基に対応する塩基はＴが選択される。２９番目の塩基を有するヌクレオチドがデオキリシリボヌクレオチドである場合、２９番目の塩基に対応する塩基はＴが選択される。
【００３２】
前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、少なくとも一部にＤＮＡを含むものであってもよく、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡのみであってもよい。
前記ループ構造を形成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。ループ構造を構成するヌクレオチドは、少なくとも一部にＤＮＡを含むものであってもよく、ループ構造を構成するヌクレオチドは、ＤＮＡのみであってもよい。
一実施形態のアプタマーを形成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。一実施形態のアプタマーを構成するヌクレオチドは、少なくとも一部にＤＮＡを含むものであってもよく、一実施形態のアプタマーを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡのみであってもよい。
【００３３】
一実施形態に係るアプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、５００塩基以下であってもよく、２５０塩基以下であってもよく、１５０塩基以下であってもよく、８０塩基以下であってもよく、７０塩基以下であってもよく、６０塩基以下であってもよく、５５塩基以下であってもよい。
一実施形態に係るアプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、２８塩基以上であってもよく、３５塩基以上であってもよく、４０塩基以上であってもよく、４５塩基以上であってもよい。
一実施形態に係るアプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、２８〜５００塩基であってもよく、３５〜２５０塩基であってもよく、４０〜１５０塩基であってもよく、４０〜１５０塩基であってもよく、４０〜８０塩基であってもよく、４０〜７０塩基であってもよく、４０〜６０塩基であってもよく、４５〜５５塩基であってもよい。
【００３４】
上記に説明した実施形態のアプタマーは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドに更にいかなる物質が付加されたものであっても、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを有し、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害作用を有するものであれば、本実施形態のアプタマーに包含される。例えば生体内での安定性を高めるための種々の修飾や、色素等の標識が付加されたものであってもよい。
【００３５】
なお、上記の実施形態のアプタマーは、配列番号１に示される塩基配列に基づいて定義されるものであったが、塩基配列１に代えて、塩基配列２、塩基配列３又は塩基配列４に基づいて定義されてもよい。
【００３６】
実施形態のアプタマーは、公知の手法により製造可能である。核酸合成の手法やその修飾の方法は、生命科学分野において広く用いられている。
【００３７】
≪マルチ構造アプタマー≫
本実施形態に係るマルチ構造アプタマーは、上記≪アプタマー≫で説明した実施形態のアプタマーを１単位として、その１単位のアプタマーが２つ以上連結されたマルチ構造を有するものである。本明細書中、このマルチ構造を有するアプタマーを「マルチ構造アプタマー」ということがある。マルチ構造アプタマーとしては、例えば、１単位のアプタマーが２つ連結されたダイマーを例示できる。
なお、連結されたアプタマー同士は、互いに同一でもよく、異なっていてもよい。以下、上記≪アプタマー≫で説明した内容と重複する内容について、説明を省略する。
【００３８】
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーは、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが２つ以上連結されたマルチ構造を有し、ＨＧＦ受容体に結合してＨＧＦ受容体活性化作用を有する。（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、置換、挿入及び／又は付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列と８０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
【００３９】
（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドは、上記≪アプタマー≫において説明したものと同じであるため説明を省く。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーにおいて、前記ループ構造に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有していてもよい。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーにおいて、前記ループ構造が塩基数２８〜４０のポリヌクレオチド鎖からなるものであってもよい。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーにおいて、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドがグアニン四重鎖構造を有していてもよい。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーにおいて、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドが、連続する２つ以上のＧの配列を４組以上含んでいてもよい。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーにおいて、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドがＤＮＡであってもよい。
【００４０】
図２に一実施形態に係るマルチ構造アプタマーの模式図を示す。マルチ構造アプタマー４は、ポリヌクレオチドからなり、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド１０が２つ以上連結されたマルチ構造を有する。マルチ構造アプタマー４は、１単位のアプタマー１が、２つ連結されたものである。
ポリヌクレオチド１０同士は同一の塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、ポリヌクレオチド１０は、２つとも前記（ａ）のポリヌクレオチドであってもよい。
又は、ポリヌクレオチド１０同士は、それぞれ異なる塩基配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。例えば、２つのポリヌクレオチド１０のうち、１つは前記（ａ）のポリヌクレオチドであり、もう１つは前記（ｂ）のポリヌクレオチドであってもよい。
【００４１】
本実施形態のマルチ構造アプタマーは、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦ受容体活性化作用を有する。
アプタマーが、ＨＧＦ受容体に結合するかどうかは、上記≪アプタマー≫において説明したため説明を省く。
ＨＧＦ受容体の活性化状態は、公知の検出方法により確認できる。ＨＧＦ受容体の活性化は、例えば、ＨＧＦ受容体のリン酸化を検出することで検出可能である。ＨＧＦ受容体のリン酸化は、ＨＧＦ受容体のリン酸化を特異的に検出可能な公知の抗体を用いて、検出可能である。
アプタマーが、ＨＧＦ受容体活性化作用を有するかどうかは、公知の検出方法により確認可能である。例えば、ＨＧＦ受容体を発現している細胞を含みアプタマーを含まない試料液Ｃと、ＨＧＦ受容体を発現している細胞及びアプタマーを含む試料液Ｄとを用意する。各試料液中で細胞を培養した後、試料液Ｃ処理と試料液Ｄ処理とで、ＨＧＦ受容体のリン酸化を示す値を比較すればよい。比較実験は比較可能な同条件のもと行われるものとする。試料液ＤにおけるＨＧＦ受容体のリン酸化を示す値が、試料液ＣにおけるＨＧＦ受容体のリン酸化を示す値と比べ、高い値であった場合、当該アプタマーが、ＨＧＦ受容体活性化作用を有すると判断できる。なお、アプタマーが、ＨＧＦ受容体活性化作用を有すると判断する方法は、上記方法に限られない。
【００４２】
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーは、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが少なくとも一部を形成するループ構造が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有していてもよい。
【００４３】
ループ構造については、上記≪アプタマー≫において説明したため説明を省略する。
【００４４】
図２に一実施形態に係るマルチ構造アプタマーの模式図を示す。マルチ構造アプタマー５は、ポリヌクレオチドからなり、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有する。このように、マルチ構造アプタマー５は、ループ構造２０を有する１単位のアプタマー２が、２つ連結されたものである。
【００４５】
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーは、前記ループ構造に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造を有する。
【００４６】
図２に一実施形態に係るマルチ構造アプタマーの模式図を示す。マルチ構造アプタマー６は、ポリヌクレオチドからなり、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチド１０が少なくとも一部を形成するループ構造２０と、ループ構造２０に連結する二本鎖ポリヌクレオチドからなるステム構造３０とを有する構造が、２つ以上連結されたマルチループ構造を有する。
このように、マルチ構造アプタマー６は、ループ構造２０と、ステム構造３０とを有する１単位のアプタマー３が、２つ連結されたものである。
このような、分子内にステム構造を複数有する場合、各ステム構造を形成する塩基配列は互いに異なる配列としてもよい。分子内に２つ以上同一のステム構造を形成する塩基配列が存在する場合、相補鎖形成する相手のヌクレオチド鎖が入れ替わる可能性がある。この点、各ステム構造を形成する塩基配列を互いに異なる配列とすることにより、相補鎖形成する相手のヌクレオチド鎖が入れ替わることが防止される。なお、かかる改変は必須ではなく、完全に同一のステム構造や、完全に同一のアプタマー配列を連続させたマルチ構造アプタマーであっても、機能可能である。
【００４７】
図３〜４にマルチ構造アプタマーの形態の一例を、模式的に示す。図３に示すマルチ構造アプタマー７は、１単位のアプタマー３が、並列に３つ以上連結されたものである。図４に示すマルチ構造アプタマー８ａ，８ｂは、１単位のアプタマー３が、放射状に３つ以上連結されたものである。
【００４８】
一実施形態のマルチ構造アプタマーを形成するポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもよい。一実施形態のマルチ構造アプタマーを構成するヌクレオチドは、少なくとも一部にＤＮＡを含むものであってもよく、一実施形態のマルチ構造アプタマーを構成するヌクレオチドは、ＤＮＡのみであってもよい。
【００４９】
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーは、２つ以上の前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチドがリンカーによって連結され、前記リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基分以下の長さであってもよい。
【００５０】
図５では、マルチ構造アプタマー６を例に、マルチ構造アプタマーのリンカーについて説明する。リンカー４０は、前記（ａ）〜（ｃ）のポリヌクレオチド１０の末端間の領域である。アプタマーがステム構造３０を有する場合、ステム構造もリンカーの一部に含めるものとする。リンカーの長さがポリヌクレオチド換算で８０塩基分以下の長さであってもよい。リンカーはポリヌクレオチド以外の材料で形成されていてもよい。例えば、ポリヌクレオチド以外の材料としては例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ、ＰＥＧ）が挙げられる。リンカーがポリヌクレオチド以外の材料で形成されていている場合、リンカーの長さは、ポリヌクレオチドの長さを基準に算出するものとする。基準となるポリヌクレオチドの長さは、二重らせん構造のＤＮＡにおける塩基対間距離３．４オングストロームに基づいて算出するものとする。１オングストロームは、０．１ｎｍである。
【００５１】
リンカーの長さは、ポリヌクレオチド換算で０〜８０塩基分の長さであってよく、５〜７０塩基分の長さであってよく、１０〜６０塩基分の長さであってよく、１５〜５０塩基分の長さであってよく、１５〜３０塩基分の長さであってよく、１６〜２０塩基分の長さであってもよい。
【００５２】
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーは、前記アプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数が、１０００塩基以下であってもよく、７００塩基以下であってもよく、５００塩基以下であってもよく、２５０塩基以下であってもよく、１５０塩基以下であってもよく、１００塩基以下であってもよく、８０塩基以下であってもよく、６０塩基以下であってもよい。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、５６塩基以上であってもよく、６０塩基以上であってもよく、８０塩基以上であってもよく、１００塩基以上であってもよく、２００塩基以上であってもよい。
一実施形態に係るマルチ構造アプタマーが有するポリヌクレオチドの塩基数は、例えば、５６〜１０００塩基であってもよく、６０〜７００塩基であってもよく、８０〜５００塩基であってもよく、９０〜２５０塩基であってもよく、９０〜１５０塩基であってもよく、９０〜１００塩基であってもよい。
【００５３】
上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーは、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが２つ以上連結されたマルチ構造に更にいかなる物質が付加されたものであっても、前記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが２つ以上連結されたマルチ構造を有し、ＨＧＦ受容体に結合してＨＧＦ受容体活性化作用を有するものであれば、本実施形態のマルチ構造アプタマーに包含される。例えば生体内での安定性を高めるための種々の修飾や、色素等の標識が付加されたものであってもよい。
【００５４】
実施形態のマルチ構造アプタマーは、公知の手法により製造可能である。核酸合成の手法やその修飾の方法は、生命科学分野において広く用いられている。
【００５５】
≪アプタマー固定担体≫
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーが、固相担体表面に固定化された、アプタマー固定担体を例示できる。
固相担体としては、シート状、板状、円柱状、球状等、種々の形状のものを採用可能である。担体材料は、プラスチック、金属、ガラス等が例示でき、アプタマーを固定化可能な材料であれば、いかなるものであっても採用可能である。
【００５６】
図６にアプタマー固定担体の形態の一例を、模式的に示す。アプタマー固定担体１００は、シート状の固相担体１１０の表面に、アプタマー３が固定化されたものである。アプタマー固定担体１０１は、円柱状の固相担体１２０の表面に、アプタマー３が固定化されたものである。
【００５７】
固相上に（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドが２つ以上連結され、ＨＧＦ受容体に結合してＨＧＦ受容体活性化作用を有するアプタマー固定担体については、前記のマルチ構造アプタマーとして扱われてもよい。
【００５８】
≪製剤・組成物≫
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーを有効成分として含有する、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤を提供する。
上記実施形態に係るアプタマーを生体に投与することにより、ＨＧＦ受容体シグナリングを制御することができる。その結果、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患を治療又は予防できる。ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患とは、例えば、がん等が挙げられる。
【００５９】
一実施形態において、本発明は、上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーの有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療方法又は予防方法を提供する。
【００６０】
一実施形態において、本発明は、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療又は予防のための、上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーを提供する。
【００６１】
一実施形態において、本発明は、ＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤を製造するための上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーの使用を提供する。
【００６２】
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーを有効成分として含有する、がん細胞の転移抑制剤を提供する。
後述する実施例に示すように、発明者らはＳＬ１  ｄｉｍｅｒ（マルチ構造アプタマー）によってがん細胞の遊走抑制が可能であることを見出した。マルチ構造アプタマーがん細胞の遊走抑制が可能であるということから、本発明の一実施形態のマルチ構造アプタマーは、がん細胞の転移抑制作用を有すると理解される。
【００６３】
一実施形態において、本発明は、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーの有効量を、治療を必要とする患者又は患畜に投与する工程を備える、がん細胞の転移抑制方法を提供する。
【００６４】
一実施形態において、本発明は、がん細胞の転移抑制のための、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーを提供する。
【００６５】
一実施形態において、本発明は、がん細胞の転移抑制剤を製造するための上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーの使用を提供する。
【００６６】
上述したＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤、がん細胞の転移抑制剤は、それ自体を投与されてもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として、錠剤、カプセル剤、顆粒剤等の製剤として経口的に、又は、注射剤、坐剤等の製剤として非経口的に投与されてもよい。
【００６７】
これらの製剤は、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、乳化剤、安定剤、希釈剤、注射剤用溶剤等の添加剤を用いて、周知の方法で製造することができる。
【００６８】
賦形剤としては、有機系賦形剤、無機系賦形剤等が挙げられる。有機系賦形剤としては、乳糖、白糖等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース等のセルロース誘導体；アラビアゴム等が挙げられる。無機系賦形剤としては、硫酸カルシウム等の硫酸塩が挙げられる。
【００６９】
結合剤としては、上記の賦形剤、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【００７０】
崩壊剤としては、上記の賦形剤；クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等のデンプン又はセルロースの誘導体；架橋ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【００７１】
滑沢剤としては、タルク；ステアリン酸；コロイドシリカ；ビーズワックス、ゲイロウ等のワックス類；硫酸ナトリウム等の硫酸塩；ラウリル硫酸ナトリウム等のラウリル硫酸塩；上記の賦形剤におけるデンプン誘導体等が挙げられる。
【００７２】
乳化剤としては、ベントナイト、ビーガム等のコロイド性粘土；ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤；塩化ベンザルコニウム等の陽イオン界面活性剤；ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤等が挙げられる。
【００７３】
安定剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラヒドロキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール等のアルコール類；フェノール、クレゾール等のフェノール類が挙げられる。
【００７４】
希釈剤としては、水、エタノール、プロピレングリコール等が挙げられる。
注射剤用溶剤としては、水、エタノール、グリセリン等が挙げられる。
【００７５】
上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーの投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．１〜１００ｍｇ程度が挙げられる。
【００７６】
非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり、例えば０．０１〜３０ｍｇ程度を静脈注射又は局所注射により投与することが挙げられる。
【００７７】
上述したＨＧＦ受容体シグナリング関連疾患の治療剤又は予防剤、がん細胞の転移抑制剤に含有される上記実施形態のアプタマーは、これらアプタマーを発現可能なベクターの状態であってもよい。
【００７８】
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーを含有する細胞培養用組成物を提供する。
上記実施形態に係るアプタマーを含有する培地（細胞培養用組成物）で細胞を培養することで、細胞の分化、増殖、遊走等、ＨＧＦ受容体シグナリングに関わる各種の細胞の状態を制御可能である。
【００７９】
細胞培養用組成物は、アプタマーそのものが細胞の培地に添加されるものであってもよいし、アプタマーと適宜の希釈剤とが混合された組成物として、細胞に与えられてもよい。希釈剤としては、水、バッファー、各種培地等が挙げられる。
【００８０】
細胞培養用組成物中に含まれるアプタマーの濃度は、例えば、０．０１ｎＭ〜１０μＭ、０．１ｎＭ〜５μＭ、１ｎＭ〜５μＭ、５０ｎＭ〜３μＭ、１００ｎＭ〜２μＭ等の濃度を例示でき、０．１ｎＭ以上が好ましい。なおＭはｍｏｌ／Ｌを表す。
【００８１】
≪方法≫
（検出方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマーをＨＧＦ受容体に結合させ、ＨＧＦ受容体を検出することを含む、ＨＧＦ受容体の検出方法を提供する。
ここで、アプタマーは標識物質で標識されていてもよく、標識物質を検出することで、ＨＧＦ受容体を検出してもよい。標識物質としては、例えば、色素、蛍光色素、ラジオアイソトープ、抗体、抗原、酵素等が挙げられる。蛍光色素としては、ＦＩＴＣ等が挙げられる。
【００８２】
（細胞培養方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマー、又は実施形態のマルチ構造アプタマーを含む培地で、ＨＧＦ受容体を発現している細胞を培養することを含む、細胞培養方法を提供する。
細胞培養は、上記細胞培養用組成物を用いることができ、上記細胞培養用組成物中で、ＨＧＦ受容体を発現している細胞を培養してもよい。
【００８３】
（結合阻害方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、ＨＧＦと前記ＨＧＦ受容体との結合阻害方法を提供する。
アプタマーがＨＧＦとＨＧＦ受容体との結合を阻害しているかどうかは、例えば、アプタマーが接触された細胞と、アプタマーが接触されていない細胞を比較し、アプタマーが接触された細胞のほうが、ＨＧＦとＨＧＦ受容体との結合の程度が低下している場合、アプタマーがＨＧＦとＨＧＦ受容体との結合を阻害していると判断できる。
【００８４】
（分化抑制方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の分化抑制方法を提供する。
アプタマーが細胞の分化を抑制しているかどうかは、例えば、アプタマーが接触された細胞と、アプタマーが接触されていない細胞を比較し、アプタマーが接触された細胞のほうが、細胞の分化状態の変化が小さい場合、アプタマーが細胞の分化を抑制していると判断できる。
【００８５】
（増殖抑制方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の増殖抑制方法を提供する。
アプタマーが細胞の増殖を抑制しているかどうかは、例えば、アプタマーが接触された細胞と、アプタマーが接触されていない細胞を比較し、アプタマーが接触された細胞のほうが、細胞増殖の程度が小さい場合、アプタマーが細胞の増殖を抑制していると判断できる。
【００８６】
（遊走抑制方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のアプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の遊走抑制方法を提供する。
アプタマーが細胞の遊走を抑制しているかどうかは、例えば、アプタマーが接触された細胞と、アプタマーが接触されていない細胞を比較し、アプタマーが接触された細胞のほうが、細胞遊走の程度が小さい場合、アプタマーが細胞の遊走を抑制していると判断できる。
【００８７】
（ＨＧＦ受容体の活性化方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、ＨＧＦ受容体の活性化方法を提供する。
マルチ構造アプタマーがＨＧＦ受容体を活性化しているかどうかは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触された細胞と、マルチ構造アプタマーが接触されていない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触された細胞のほうが、ＨＧＦ受容体のリン酸化の程度が大きい場合、アプタマーがＨＧＦ受容体を活性化していると判断できる。
【００８８】
（分化誘導方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の分化誘導方法を提供する。
マルチ構造アプタマーが細胞の分化を誘導しているかどうかは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触された細胞と、マルチ構造アプタマーが接触されていない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触された細胞のほうが、細胞の分化状態の変化が大きい場合、アプタマーが細胞の分化を誘導していると判断できる。
【００８９】
（増殖促進方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の増殖促進方法を提供する。
マルチ構造アプタマーが細胞の増殖を促進しているかどうかは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触された細胞と、マルチ構造アプタマーが接触されていない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触された細胞のほうが、細胞増殖の程度が大きい場合、アプタマーが細胞の増殖を促進していると判断できる。
【００９０】
（遊走促進方法）
本発明の一実施形態として、上記に説明した実施形態のマルチ構造アプタマーを、ＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させることを含む、細胞の遊走促進方法を提供する。
マルチ構造アプタマーが細胞の遊走を促進しているかどうかは、例えば、マルチ構造アプタマーが接触された細胞と、マルチ構造アプタマーが接触されていない細胞を比較し、マルチ構造アプタマーが接触された細胞のほうが、細胞遊走の程度が大きい場合、アプタマーが細胞の遊走を促進していると判断できる。
【００９１】
アプタマーとＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させると、アプタマーがＨＧＦ受容体に結合されることとなる。
ここで、アプタマーとＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させる方法は、特に制限されず、種々の方法を用いることができる。例えば、アプタマーを含む培地で細胞を培養することによって、アプタマーと細胞とを接触させる方法や、同一の液中にアプタマー及び細胞を共に含有させることによって、アプタマーと細胞とを接触させる方法、細胞にアプタマーを含む組成物を滴下する方法、等が挙げられる。
【００９２】
アプタマーとＨＧＦ受容体を発現している細胞と接触させる方法は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において行われるのであっても、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において行われるものであってもよく、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）において行われることが好ましい。
【００９３】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９４】
（ＳＬ１）
配列番号１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号５に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号６に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成した。
配列番号１に係るポリヌクレオチドは、図７に示すＧ−ｌｏｏｐを形成する。
配列番号５に係るポリヌクレオチドは、図７に示すＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１を形成する。
配列番号６に係るポリヌクレオチドは、前記Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１の逆配列であるＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１逆配列であり、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌとして用意した。【００９５】
上記Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１、Ｇ−ｌｏｏｐ、Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１逆配列の各ポリヌクレオチドを、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識した（図８）。ＦＩＴＣ修飾されたポリヌクレオチドは、ファスマック社への委託合成によって入手した。【００９６】
ＳＮＵ−５細胞を、ＦＩＴＣ標識されたＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１を１００ｎＭの濃度で含む液に浸し、２１℃で１５分間反応させた。ＳＮＵ−５細胞はｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）発現株である。また、ＦＩＴＣ標識されたＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１に代えて、ＦＩＴＣ標識されたＧ−ｌｏｏｐ、又はＦＩＴＣ標識されたＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１逆配列を用いた系についても、同様に実施した。別のコントロールとして、上記のＦＩＴＣ標識されたポリヌクレオチドのいずれでも処理されていないＳＮＵ−５細胞を用意した。このコントロールは、後述の図３において単にＣｅｌｌと表記している。その後、フローサイトメーターを用いて、各系の細胞におけるＦＩＴＣの蛍光強度を計測した。【００９７】
結果を図９に示す。ＦＩＴＣ標識されたＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１逆配列で処理されたＳＮＵ−５細胞（Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１逆配列）は、コントロールのＳＮＵ−５細胞（Ｃｅｌｌ）と同様の蛍光強度の分布を示した。このことから、Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１逆配列は、ＨＧＦ受容体に結合しないか、ほとんど結合しないことが示唆された。ＦＩＴＣ標識されたＧ−ｌｏｏｐで処理されたＳＮＵ−５細胞（Ｇ−ｌｏｏｐ）は、コントロールのＳＮＵ−５細胞（Ｃｅｌｌ）よりも高い値の蛍光強度の分布を示した。このことから、Ｇ−ｌｏｏｐはＨＧＦ受容体への結合能を有することが示唆された。ＦＩＴＣ標識されたＳｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１で処理されたＳＮＵ−５細胞（Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１）は、ＦＩＴＣ標識されたＧ−ｌｏｏｐで処理されたＳＮＵ−５細胞（Ｇ−ｌｏｏｐ）よりも高い値の蛍光強度の分布を示した。このことから、Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１は、ＨＧＦ受容体に対し、Ｇ−ｌｏｏｐよりも高い結合能を有することが示唆された。【００９８】
次に、Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１（本明細書中「ＳＬ１」と略すことがある。）について、より詳しく解析した。ＳＮＵ−５細胞を、ＦＩＴＣ標識されたＳＬ１を以下の各濃度（０ｎＭ（Ｃｅｌｌ），２．５ｎＭ，１０ｎＭ，２５ｎＭ，１００ｎＭ，２５０ｎＭ、又は１０００ｎＭ）で含む液に浸し、２１℃で１５分間反応させ、反応後の細胞の蛍光強度を計測した。【００９９】
結果を図１０に示す。液中のＳＬ１濃度が高くなるにつれ、ＳＮＵ−５細胞の蛍光強度分布が高い値となり、１０００ｎＭの値でほぼ横ばいとなった。【０１００】
ＳＬ１が、グアニン四重鎖構造を有するかについて検証した。グアニン四重鎖構造の形成条件として、２つ以上の連続したＧが少なくとも４組必要であることが知られている。並行型グアニン四重鎖構造の存在は、ＣＤスペクトル測定によって、２４５ｎｍ付近の負のピークと、２６４ｎｍ付近の正のピークが検出されることにより証明できる。また、グアニン四重鎖構造の形成はＫ＋イオンを要求する。
５μＭのＳＬ１を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファー（ＳＬ１）と、５μＭのＳＬ１及び５ｍＭのＫＣｌを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファー（ＳＬ１＋５ｍＭ  ＫＣｌ）に対し、ＣＤスペクトル解析を行った。【０１０１】
結果を図１１に示す。ＳＬ１＋５ｍＭ  ＫＣｌの系で、２４５ｎｍ付近の負のピークと、２６４ｎｍ付近の正のピークが検出された。ＫＣｌを含まないＳＬ１の系では、顕著なピークは検出されなかった。このことから、ＳＬ１が、グアニン四重鎖構造を有することが示唆された。ＳＬ１のループ領域におけるグアニンの位置を図１２に示す。【０１０２】
ＳＬ１がｃ−Ｍｅｔシグナリングを阻害するかどうかについて検証した。
無血清培で２４時間培養した後のＡ５４９細胞を、以下の濃度でＨＧＦ及びＳＬ１を含む液に浸し、１５分間反応させた。図１３に示すとおり、液中のＨＧＦの濃度は１１０ｐＭとし、液中のＳＬ１の濃度は、０ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、又は１０００ｎＭとした。Ａ５４９細胞はｃ−Ｍｅｔ（ＨＧＦ受容体）発現株である。反応後のＡ５４９細胞を可溶化して得られたタンパク質試料をウェスタンブロッティングにより解析した。ウェスタンブロッティングの一次抗体にはＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  社のリン酸化ｃ−Ｍｅｔ検出抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｍｅｔ  （Ｔｙｒ１２３４／１２３５）  （Ｄ２６）  ＸＰ（登録商標）  Ｒａｂｂｉｔ  ｍＡｂ  ＃３０７７）を使用し、リン酸化されたｃ−Ｍｅｔ（Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｃ−Ｍｅｔ）を検出した。以下、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化は、当該一次抗体に結合するＤａｋｏ社のＨＲＰ標識二次抗体（Ｒａｂｂｉｔ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ  Ｐ０４４８  パーオキシダーゼ標識、アフィニティー精製）を用いて検出した。【０１０３】
結果を図１３に示す。Ａ５４９細胞に接触させたＳＬ１濃度が高くなるにつれ、Ｐｈｏｓｐｈｏ  ｃ−Ｍｅｔの存在を示すシグナルが低下することが確認された。このことから、ＳＬ１は、ＨＧＦによるｃ−Ｍｅｔのリン酸化を阻害することが示された。【０１０４】
ＳＬ１ががん細胞の遊走を抑制するかどうかについて検証した。
ＳＵＩＴ−２細胞を３日間培養してコロニーを形成させた。その後、ＨＧＦもＳＬ１も加えていない培地で培養した系（Ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、１１０ｐＭのＨＧＦが添加された培地で培養した系（＋ＨＧＦ）、１１０ｐＭのＨＧＦ及び１μＭのＳＬ１が添加された培地で培養した系（＋ＨＧＦ，ＳＬ１）、又は１１０ｐＭのＨＧＦ及び１μＭのＳＬ１逆配列が添加された培地で培養した系（＋ＨＧＦ，ＳＬ１  Ｒｅｖｅｒｓｅ）の各系にて、ＳＵＩＴ−２細胞を培養し、添加から１８時間後細胞の様子を観察した。【０１０５】
結果を図１４に示す。ＨＧＦ及びＳＬ１が添加されたＳＵＩＴ−２細胞では、ＨＧＦが添加されＳＬ１が添加されていないＳＵＩＴ−２細胞に比べ、細胞の遊走が抑制されていた。このことから、ＳＬ１によってがん細胞の遊走抑制が可能であることが示された。【０１０６】
（ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ）
配列番号７に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号８に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、配列番号９に示す塩基配列からなるポリヌクレオチド、及び配列番号１０に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成した。
配列番号７に係るポリヌクレオチドは、図１５に示すＳＬ１＿Ａを形成する。
配列番号８に係るポリヌクレオチドは、図１５に示すＳＬ１＿Ｂを形成する。
ＳＬ１＿Ａは、ＳＬ１の５’末端側にダイマー形成のための配列が付加されたものである。同じく、ＳＬ１＿Ｂは、ＳＬ１の５’末端側にダイマー形成のための配列が付加されたものである。ＳＬ１＿Ａの５’末端側の配列と、ＳＬ１＿Ｂの５’末端側の配列とは、互いに相補的な配列である。ＳＬ１＿ＡとＳＬ１＿Ｂの相補的な配列同士のハイブリダイゼーションにより、図１５に示すように、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒが形成される。【０１０７】
配列番号９に係るポリヌクレオチドは、図１５に示すＣｏｍｐ＿Ａを形成する。
配列番号１０に係るポリヌクレオチドは、図１５に示すＣｏｍｐ＿Ｂを形成する。
Ｃｏｍｐ＿Ａは、ダイマー形成のため、上記ＳＬ１＿Ｂの５’末端側に付加された配列と、同一の核酸配列からなるポリヌクレオチドである。Ｃｏｍｐ＿Ｂは、ダイマー形成のため、上記ＳＬ１＿Ａの５’末端側に付加された配列と、同一の核酸配列からなるポリヌクレオチドである。
図１５に示すように、Ｃｏｍｐ＿Ａが、ＳＬ１＿Ｂの代わりにＳＬ１＿Ａとハイブリダイズすることで、ＳＬ１＿Ａのダイマー形成が阻害される。また、Ｃｏｍｐ＿Ｂが、ＳＬ１＿Ａの代わりにＳＬ１＿Ｂとハイブリダイズすることで、ＳＬ１＿Ｂのダイマー形成が阻害される。【０１０８】
ＳＬ１＿Ａ、ＳＬ１＿Ｂ、Ｃｏｍｐ＿Ａ、Ｃｏｍｐ＿Ｂの各ポリヌクレオチドの配合の有無について、図１６に示す７組の組み合わせで、該当のポリヌクレオチドを含むＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ）の反応液を準備した。図１６中の「＋」は、反応液中に該当のポリヌクレオチドが配合されたことを示す。図１６中の「−」は、反応液中に該当のポリヌクレオチドが配合され無いことを示す。各反応液を９５℃５分間反応させた後、−０．１℃／ｓｅｃの降温速度で２５℃にまで冷却し、６％ポリアクリルアミドゲルで  Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥを行った。【０１０９】
結果を図１６に示す。ＳＬ１＿Ａ及びＳＬ１＿Ｂを含み、且つＣｏｍｐ＿Ａ及びＣｏｍｐ＿Ｂを含まない反応液でのみ、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒが形成されたことが確認された。【０１１０】
Ａ５４９細胞を飢餓条件で２４時間培養した後、ＳＬ１＿Ａ、ＳＬ１＿Ｂ、Ｃｏｍｐ＿Ａ、Ｃｏｍｐ＿Ｂの各ポリヌクレオチドの添加の有無について、図１７に示す６組の組み合わせで、該当の培養液にポリヌクレオチドを添加した。図１７中の「＋」は、培地中に該当のポリヌクレオチドが添加されたことを示す。図１７中の「−」は、培地中に該当のポリヌクレオチドが添加され無いことを示す。ポリヌクレオチドの添加後、各培地を１５分間反応させた。反応後のＡ５４９細胞を可溶化して得られたタンパク質試料を、ウェスタンブロッティングにより、リン酸化されたｃ−Ｍｅｔ（Ｐ−Ｍｅｔ）を検出した。【０１１１】
結果を図１７に示す。ＳＬ１＿Ａ及びＳＬ１＿Ｂを含み、且つＣｏｍｐ＿Ａ及びＣｏｍｐ＿Ｂを含まない培地で培養した細胞から得られたタンパク質試料でのみ、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化が確認された。このことから、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ形成によって、ｃ−Ｍｅｔの活性化が誘起されたことが示された。【０１１２】
ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ間をつなぐリンカー長が、ｃ−Ｍｅｔの活性化に影響するかについて調べた。
配列番号１１に示す塩基配列からなるポリヌクレオチドを合成した。
配列番号１１に係るポリヌクレオチドは、図１８に示すＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５を形成する。
配列番号１１に示す塩基配列の１〜５０番目の塩基配列と、５６〜１０５番目の塩基配列は、上記Ｓｔｅｍ−Ｌｏｏｐ１（ＳＬ１）を形成するポリヌクレオチドの配列である。配列番号１１に示す塩基配列の５１〜５５番目の塩基配列は、５つのＴが連続するポリｄＴの配列であり、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒをつなぐリンカーを形成する。なお、５’末端から数えて一つ目のＳＬ１のステム構造の配列は、二つ目のＳＬ１のステム構造の配列とは異なる。
このように、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５は、２つのＳＬ１の間をつなぐ５塩基のポリｄＴを有する。
Ｌ１  ｄｉｍｅｒ＿５の他に、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５において、ポリｄＴの塩基数を５から２０へと代えたＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿２０、ポリｄＴの塩基数を５から４０へと代えたＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿４０もそれぞれ合成した。【０１１３】
無血清培で２４時間培養した後のＡ５４９細胞を、以下の濃度でＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿５を含む液に浸し、１５分間反応させた。液中のＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿５の濃度は、０ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、２５０ｐＭ、５００ｐＭ、又は１０００ｐＭとした。反応後のＡ５４９細胞を可溶化して得られたタンパク質試料をウェスタンブロッティングにより解析し、リン酸化されたｃ−Ｍｅｔ（ｐ−Ｍｅｔ）を検出した。また、ＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿５に代えてＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿２０を用いて同様にリン酸化されたｃ−Ｍｅｔ（ｐ−Ｍｅｔ）を検出した。ＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿５に代えてＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿４０を用いて同様にリン酸化されたｃ−Ｍｅｔ（ｐ−Ｍｅｔ）を検出した。ＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿５に代えてＨＧＦを用いて同様にリン酸化されたｃ−Ｍｅｔ（ｐ−Ｍｅｔ）を検出した。【０１１４】
結果を図１９及び図２０に示す。ウェスタンブロッティングではＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿５、ＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿２０、及びＳＬ１＿ｄｉｍｅｒ＿４０のいずれでも、１００ｐＭ以上のＳＬ１＿ｄｉｍｅｒの濃度で処理した場合に、ｐ−Ｍｅｔが検出された。【０１１５】
ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ間をつなぐリンカー長のｃ−Ｍｅｔ活性化に与える影響を、さらに詳細に解析した。
上記ＳＬ１＿Ａ及びＳＬ１＿Ｂにおいて、５’末端側のダイマー形成のための配列を、２０塩基分のポリヌクレオチドとしたｄｓ−２０を製造した。同様に、５’末端側のダイマー形成のための配列をそれぞれ、３０、４０、６０とした、ｄｓ３０、ｄｓ４０、ｄｓ６０を製造した。ｄｓは二本鎖ＤＮＡを意味する。
ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５において、ポリｄＴの塩基数を５から０へと代えたＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿０を製造し、ｓｓ０と名付けた。ポリｄＴの塩基数を５から１０へと代えたＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿１０を製造し、ｓｓ１０と名付けた。上記で製造したＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿２０を使用し、ｓｓ２０と名付けた。ｓｓは一本鎖ＤＮＡを意味する。【０１１６】
Ａ５４９細胞を、各１０ｎMの濃度のＳＳ０、ＳＳ１０、ｓｓ２０、ｄｓ２０、ｄｓ３０、ｄｓ４０、ｄｓ６０のそれぞれで処理してＥＬＩＳＡ  ａｓｓａｙを行い、リン酸化レベルの相対値を求めた。
結果を図２１に示す。図２１において、ＮＴはリガンド非添加のネガティブコントロールを表す。図２１のグラフから理解されるように、リンカー長さが短いほど、ｃ−Ｍｅｔが活性化されることが明らかとなった。同一の長さの１本鎖ＤＮＡのリンカーと、２本鎖ＤＮＡのリンカーとの比較では、１本鎖ＤＮＡのリンカーのほうが、２本鎖ＤＮＡのリンカーよりも効果的にｃ−Ｍｅｔを活性化していた。【０１１７】
ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５が細胞遊走を誘起するかどうかについて検証した。
ＤＵ１４５細胞を３日間培養してコロニーを形成させた。その後、ＨＧＦもＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５も加えていない培地で培養した系（Ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、５００ｐＭのＨＧＦが添加された培地で培養した系（＋ＨＧＦ）、５００ｐＭのＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５が添加された培地で培養した系（＋ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５）、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５のＳＬ１とリンカーとが切り離されたものが添加された培地で培養した系（＋  Ｓｐｌｉｔ  ｄｉｍｅｒ）の各系にて、ＤＵ１４５細胞を培養し、添加から２４時間後細胞の様子を観察した。【０１１８】
結果を図２２に示す。ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５が添加されたＤＵ１４５細胞では、ＨＧＦが添加されたＤＵ１４５細胞と同様に、細胞の遊走が観察された。このことから、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒ＿５により細胞の遊走促進が可能であることが示された。【０１１９】
ＳＬ１  ｄｉｍｅｒが細胞増殖を促進するかどうかについて検証した。
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＨＧＦ、ｓｓ０、ｓｓ０逆配列、又はコントロールの溶媒を含む培地で６日間培養し、細胞数の増加を計測した。
コントロールの溶媒で処理された場合と比較して、１ｎＭのＨＧＦで処理されたＨＵＶＥＣは細胞増殖促進効果を示した。０．１ｎＭ、０．５ｎＭ又は５ｎＭのｓｓ０で処理されたＨＵＶＥＣも、コントロールの溶媒で処理された場合と比較して、濃度依存的な細胞増殖促進効果を示した。【０１２０】
ＳＬ１の配列を改変し、ｃ−Ｍｅｔへの結合への影響を検証した。
図２３にそれらＳＬ１  ｍｕｔａｎｔの模式図を示す。
ＳＬ１＿３Ｔは、配列番号１で示されるＳＬ１のＧ−ｌｏｏｐの配列に変えて、配列番号２で示される塩基配列を有する。ＳＬ１＿３Ｔは、配列番号１で示される塩基配列の３番目のＡが、Ｔに置換されている。
ＳＬ１＿２９Ａは、配列番号１で示されるＳＬ１のＧ−ｌｏｏｐの配列に変えて、配列番号３で示される塩基配列を有する。ＳＬ１＿２９Ａは、配列番号１で示される塩基配列の２９番目のＴが、Ａに置換されている。
ＳＬ１＿３Ｔ２９Ａは、配列番号１で示されるＳＬ１のＧ−ｌｏｏｐの配列に変えて、配列番号４で示される塩基配列を有する。ＳＬ１＿３Ｔ２９Ａは、配列番号１で示される塩基配列の３番目のＡが、Ｔに置換され、更に２９番目のＴが、Ａに置換されている。【０１２１】
これらＳＬ１、ＳＬ１＿３Ｔ、ＳＬ１＿２９Ａ、ＳＬ１＿３Ｔ２９Ａについて、リンカーが１本鎖のｓｓ−０（０塩基）であるダイマーを製造した。【０１２２】
Ａ５４９細胞を飢餓条件で２４時間培養した後、各１ｎＭのＳＬ１  ｄｉｍｅｒ、ＳＬ１＿３Ｔ  ｄｉｍｅｒ、ＳＬ１＿２９Ａ  ｄｉｍｅｒ、ＳＬ１＿３Ｔ２９Ａ  ｄｉｍｅｒ、又はコントロールの溶媒を加えて３７℃で反応させ、細胞を可溶化して、得られたタンパク質試料に対してＥＬＩＳＡアッセイ及びＢＣＡアッセイにより、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化レベルを測定した。【０１２３】
ＳＬ１＿３Ｔ  ｄｉｍｅｒでは、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒに比べて、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化が促進されていた。ＳＬ１＿２９Ａ  ｄｉｍｅｒでは、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒとほぼ同様のレベルで、ｃ−Ｍｅｔのリン酸化が促進されていた。ＳＬ１＿３Ｔ２９Ａ  ｄｉｍｅｒでは、ＳＬ１  ｄｉｍｅｒとほぼ同様のレベルでｃ−Ｍｅｔがリン酸化されていた。【０１２４】
各実施形態における各構成及びそれらの組み合わせ等は一例であり、本発明の趣旨から逸脱しない範囲内で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は実施形態によって限定されることはなく、クレームの範囲によってのみ限定される。
【符号の説明】
【０１２５】
１，２，３…アプタマー、４，５，６，７，８ａ，８ｂ…マルチ構造アプタマー、１０…ポリヌクレオチド、２０…ループ構造、３０…ステム構造、４０…リンカー、１００，１０１…アプタマー固定担体、１１０，１２０…固相担体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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