(57)【要約】  本発明は、IL-1受容体アンタゴニスト化合物、その組成物および使用ならびにその調製のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)またはその類似体であり、脂肪酸または脂肪二酸を含むアシル化基を含む、IL-1Ra化合物。
【請求項２】
リンカーをさらに含む、請求項1に記載のIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)化合物。
【請求項３】
アシル化基を含むIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)化合物であって、前記アシル化基が、式Iの親油性置換基を含み、
Acy-Ln-*(式I)、
式中、nは、0または1〜10の範囲の整数であり、Acyは、約8〜約24の炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり、Lは、アミノ酸残基またはアルキレングリコール成分であり、*は、IL-1Raに対する付着部位を示す、IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)化合物。
【請求項４】
前記アシル化基が、31、34、118、および/または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)を介してIL-1Raに付着している、請求項1から3のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項５】
i)118位もしくは121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)におけるN-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミルによるモノアシル化またはii)31位、34位、118位、もしくは121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)でのN-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルによるモノアシル化またはiii)118位もしくは121位(hIL-1Raアイソフォームに対する位置)でのN-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルによるモノアシル化を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項６】
前記アシル化基が、N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル、N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル、N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル、およびN-ドコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルからなる群から選択される、請求項1から5のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項７】
前記アシル化基が、前記IL-1RaのLysアミノ酸残基のイプシロンアミノ基またはN末端アミノ残基のアミノ基を介してIL-1Raに付着している、請求項1から6のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項８】
前記IL-1Raが、置換K31R、K34R、K118R、および/またはK121R(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項９】
N-イプシロン118-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A1)、N-イプシロン121-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A2)、N-イプシロン118-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物B)、N-イプシロン31-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C1)、N-イプシロン34-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C2)、N-イプシロン118-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D1)、N-イプシロン121-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D2)、化合物A1およびA2の混合物、化合物C1およびC2の混合物、化合物B、C1、C2の混合物、または化合物D1およびD2の混合物からなる群から選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物および1つまたは複数の賦形剤を含む組成物。
【請求項１１】
医学で使用するための請求項1から10のいずれか一項に記載のIL-1Ra化合物。
【請求項１２】
構築物番号2、構築物番号3、構築物番号4、構築物番号5、構築物番号6、構築物番号7、および構築物番号8からなる群から選択される配列を含むヌクレオチド配列。
【請求項１３】
請求項11に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１４】
請求項11に記載のヌクレオチド配列または請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
18℃など25℃未満の温度での、請求項11に記載のヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列の組換え発現の工程を含む、IL-1Ra化合物の調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用ペプチド、特に長期IL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)ならびにそれらの調製の方法、組成物、および医学におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
IL-1は、炎症刺激に応じて身体によって産生され、炎症応答を媒介する。IL-1受容体を通して不適切に制御されたシグナル伝達は、関節リウマチおよび糖尿病を含むが、これらに限定されない重症の状態を促すことが知られている。
【０００３】
ヒトIL-1Raの組換え非グリコシル化類似体であるアナキンラ(商標Kineret)は、関節リウマチの治療用に市販されている。その利益にもかかわらず、アナキンラは、重大な限界を有する。第1に、アナキンラは、注射によって投与され、患者は、注射部位に、痛み、炎症、および紅斑を経験し、一部の不慣れな患者が療法を中断してしまう。第2に、アナキンラは、血漿において、比較的短い半減期(4〜6時間)を有し、そのため、1日当たり1回の注射(100mg)が典型的に必要とされる。
【０００４】
IL-1のレベルの上昇は、インスリン産生細胞に損傷を与え、破壊することが示されている。島IL-1β mRNAレベルは、2型糖尿病患者において上方制御されており、循環グルコースレベルの上昇は、上方制御の一因となるように思われる。最近の研究は、アナキンラによるIL-1の拮抗作用が、2型糖尿病の治療において、治療的潜在性がある可能性を有することを示し、その治療は、血糖症およびベータ細胞分泌機能を改善し、全身性の炎症のマーカーを低下させた。脂肪細胞の機能的な研究は、IL-1により、インスリンシグナル伝達が損なわれ得ることを支持した。
【０００５】
したがって、長期間の血漿半減期を有するIL-1Raを提供することは望ましい。長期間の血漿半減期は、24時間を通してのより好適な適用範囲など、臨床上の利益をもたらし得、それほど頻繁でない投薬を可能にし得、それによって、また、注射部位反応を低下させもする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2005/012347
【特許文献２】WO2009/115469
【特許文献３】WO2006/084842
【特許文献４】WO2010/029159
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの実施形態では、本発明は、アシル化基を含むIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)化合物に関する。
【０００８】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるIL-1Ra化合物および1つまたは複数の賦形剤を含む組成物に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明は、医学で使用するための本明細書において定義されるIL-1Ra化合物に関する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、構築物番号2、構築物番号3、構築物番号4、構築物番号5、構築物番号6、構築物番号7、および構築物番号8からなる群から選択される配列を含むヌクレオチド配列に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるヌクレオチド配列を含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるヌクレオチド配列または本明細書において定義されるベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書において定義されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、18℃など25℃未満の温度での、本明細書において定義されるヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列の組換え発現の工程を含む、IL-1Ra化合物の調製のための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】ヌクレオチド最適化IL-1Raおよびその変異体の組換え発現のSDS-PAGE分析を示す図である。U:非誘発、S:可溶性タンパク質画分、P:不溶性タンパク質画分。3つの独立したクローンにおける37℃での構築物番号1の発現を示す図である。
【図１Ｂ】ヌクレオチド最適化IL-1Raおよびその変異体の組換え発現のSDS-PAGE分析を示す図である。U:非誘発、S:可溶性タンパク質画分、P:不溶性タンパク質画分。37℃での構築物番号4〜8の発現を示す図である。
【図１Ｃ】ヌクレオチド最適化IL-1Raおよびその変異体の組換え発現のSDS-PAGE分析を示す図である。U:非誘発、S:可溶性タンパク質画分、P:不溶性タンパク質画分。37℃対18℃での構築物番号4〜7の発現を示す図であり、構築物番号4および5は、3時間37℃で刺激し、構築物番号6および7は、一晩にわたって18℃で刺激した。
【図１Ｄ】ヌクレオチド最適化IL-1Raおよびその変異体の組換え発現のSDS-PAGE分析を示す図である。U:非誘発、S:可溶性タンパク質画分、P:不溶性タンパク質画分。0.4mM IPTGによって誘発し、一晩にわたって、18℃で培養した、800mL振盪フラスコ培養物における構築物番号2および3の発現を示す図である。I:誘発、M:マーカー(14、20、30、45、66、97kDa)。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、長時間作用性インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)化合物に関する。いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、アシル化基を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明のIL-1Ra化合物は、本明細書において記載されるアッセイ(I)またはアッセイ(II)による、ラットまたはミニブタへのi.v.投与の後に決定されるように、改善された血漿半減期を有する。
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、アナキンラにおける9つのLys残基の存在にもかかわらず、1つまたは2つのLys残基などのほんの少数のLys残基が、本明細書において使用されるアシル化化学作用により標的にされたことを発見した。たとえば実施例1および2を参照されたい。これは、副産物がより少ない、単一成分(monocomponent)Lysアシル化アナキンラの実現可能な産生を可能にする。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明の構築物番号1〜8などのヌクレオチド最適化構築物は、より高い収率の可溶性IL-1Ra化合物を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、25℃未満、20℃または18℃未満などの低い温度での、構築物番号1〜8などのヌクレオチド最適化構築物の発現が、より高い収率の可溶性IL-1Ra化合物を提供する。
【００１７】
IL-1Ra
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、ヒトIL-1Raまたはその類似体を含む。用語「ヒトIL-1Ra」、「hIL-1Ra」、または「hIL-1Raアイソフォーム1」は、区別なく本明細書において使用され、MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETICRPSGR KSSKMQAFRI WDVNQKTFYL RNNQLVAGYL QGPNVNLEEK IDVVPIEPHA LFLGIHGGKM CLSCVKSGDE TRLQLEAVNI TDLSENRKQD KRFAFIRSDS GPTTSFESAA CPGWFLCTAM EADQPVSLTN MPDEGVMVTK FYFQEDEを指しまたはUNIPROT受託番号P18510-1を指す。いくつかの実施形態では、hIL-1RaのN末端配列MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETICが欠失している。いくつかの実施形態では、hIL-1RaのN末端配列MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETIが欠失している。いくつかの実施形態では、hIL-1RaがN末端Metを含む。いくつかの実施形態では、hIL-1Raが25位にMetを含む(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)。特に指定のない限り、本明細書におけるIL-1Ra化合物における位置の言及は、hIL-1Raアイソフォーム1に関するものである。
【００１８】
いくつかの実施形態では、hIL-1RaのN末端配列MEICRGLRSH LITLLLFLFH Sが欠失しており、前記hIL-1Raが、N末端配列MALADLYEEG GGGGGEGEDN ADSKを含む(hIL-1Raアイソフォーム2 UNIPROT受託番号P18510-2)。
【００１９】
いくつかの実施形態では、hIL-1RaのN末端配列MEICRGLRSH LITLLLFLFH Sが欠失しており、前記hIL-1Raが、N末端配列MALを含む(hIL-1Raアイソフォーム3 UNIPROT受託番号P18510-3)。
【００２０】
いくつかの実施形態では、hIL-1RaのN末端配列MEICRGLRSH LITLLLFLFH SETICRPSGR KSSKが欠失している(hIL-1Raアイソフォーム4 UNIPROT受託番号P18510-4)。
【００２１】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、アナキンラまたはその類似体を含む。本明細書において使用されるように、「アナキンラ」は、[Met25]hIL-1Ra(25〜177)またはMRPSGRKSSK MQAFRIWDVN QKTFYLRNNQ LVAGYLQGPN VNLEEKIDVV PIEPHALFLG IHGGKMCLSC VKSGDETRLQ LEAVNITDLS ENRKQDKRFA FIRSDSGPTT SFESAACPGW FLCTAMEADQ PVSLTNMPDE GVMVTKFYFQ EDEを指し、Cys70およびCys117は、ジスルフィド結合によって連結していてもよい。
【００２２】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、1つまたは複数のグリコシル化を含む。
【００２３】
ペプチドを指す、本明細書において使用される用語「類似体」は、ペプチドの1つもしくは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ/またはペプチドの1つもしくは複数のアミノ酸残基がペプチドから欠失しており、かつ/またはペプチドの1つもしくは複数のアミノ酸残基がペプチドに付加されている改変ペプチドを意味する。アミノ酸残基のそのような置換は、ペプチドの任意の位置において、たとえば31、34、118、および/または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)において起こってもよい。アミノ酸残基のそのような付加または欠失は、ペプチドのN末端および/またはペプチドのC末端で起こってもよい。単純なシステムが、類似体を記載するために使用され、たとえば、[Met25]hIL-1Ra(25〜177)は、hIL-1Raアイソフォーム1類似体を示し、hIL-1Raアイソフォーム1の1〜24位におけるアミノ酸配列「MEICRGLRSHLITLLLFLFHSETI」が欠失しており、25位における天然に存在するCysはMetと置換されている。
【００２４】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、N末端位置および/またはLys残基においてアシル化されている。
【００２５】
ヒトIL-1Raにおける9つのLys残基のいずれも、ヒトIL-1R1受容体エレメントに対して密接に接触せず、したがって、これらはすべて、受容体に対する親和性について予想される損失を伴うことなく、アシル化のための可能性のある標的となり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、Argに置換された1つまたは複数のLys残基を含む。いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、置換K31R、K34R、K118R、および/またはK121Rを含む(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)。
【００２７】
アシル化基
本発明のIL-1Ra化合物は、アシル化基を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本発明による化合物のアシル基は、脂肪酸または脂肪二酸を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本発明による化合物のアシル基は、脂肪酸または脂肪二酸および任意選択でリンカーを含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本発明による化合物のアシル基は、脂肪酸または脂肪二酸およびリンカーを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明によるアシル基の脂肪酸または脂肪二酸は、14、16、18、20、または22アミノ酸を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明によるアシル基の脂肪酸または脂肪二酸は、16、18、または20アミノ酸を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明によるアシル基の脂肪酸または脂肪二酸は、16、18、または22アミノ酸を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、脂肪酸置換基である。「脂肪酸置換基」は、リシンまたはN末端アミノ酸などのアミノ酸位置において、任意選択でリンカーを介して親IL-1Raに付着している、脂肪酸または脂肪二酸からなる側鎖として本明細書において理解される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、親IL-Raに付着している「脂肪酸置換基」は、一般式:
Acy-Ln-* (式I)
を有し、
式中、nは、0または1〜10の範囲の整数であり、Acyは、約14〜約22の炭素原子を含む脂肪酸または脂肪二酸であり、Lは、アミノ酸残基またはアルキレングリコール成分であり、(*)が、IL-1Raに対する付着部位を示す。
【００３６】
いくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基の脂肪酸または脂肪二酸は、14、16、18、20、または22アミノ酸を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基の脂肪酸または脂肪二酸は、16、18、または20アミノ酸を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基の脂肪酸または脂肪二酸は、16、18、または22アミノ酸を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、ヘキサデカンジオイル、オクタデカンジオイル、エイコサンジオイル、およびドコサンジオイルからなる群から選択されるカルボン酸誘導体を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、式(I)による脂肪酸置換基を含み、Acyが、ヘキサデカンジオイル、オクタデカンジオイル、エイコサンジオイル、およびドコサンジオイルからなる群から選択される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、ガンマ-L-グルタメートを含む。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態では、式(I)のAA1は、リンカーである。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態では、式(I)のAA1は、水素原子および/またはヒドロキシル基が除去されているD-γGlu、L-γGluからなる群から選択されるリンカーである。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明によるリンカーは、水素原子および/またはヒドロキシル基が除去されているD-γGlu、L-γGluからなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルなど、1つまたは複数の連続する[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルを含む。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基は、ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメートである。
【００４７】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメートである。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基は、オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００４９】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基は、オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００５１】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基は、エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００５３】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、ドコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明による脂肪酸置換基は、ドコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルである。
【００５５】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、IL-1RaのN末端アミノ基またはLysアミノ酸残基を介してIL-1Raに付着している。いくつかの実施形態では、アシル化基は、IL-1Ra化合物のLysアミノ酸残基のイプシロンアミノ基を介してIL-1Raに付着している。
【００５６】
いくつかの実施形態では、アシル化基は、31、34、118、および/または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)を介してIL-1Raに付着している。いくつかの実施形態では、アシル化基は、118および/または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)を介してIL-1Raに付着している。
【００５７】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、118または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)におけるヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメートによるモノアシル化を含む。本明細書において使用されるように、IL-1Ra化合物との関連における用語「モノアシル化」は、前記IL-1Ra化合物上の単一のアシル化を指す。
【００５８】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、31、34、118、または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)におけるオクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルによるモノアシル化を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、118または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)におけるエイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルによるモノアシル化を含む。
【００６０】
アシル化基は、WO2005/012347、WO2009/115469、またはWO2006/084842において記載されるように、調製することができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、K118またはK121位においてN-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメートを有するhIL-1Raアイソフォーム1(化合物A)を含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、K118位においてN-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメートを有するhIL-1Raアイソフォーム1である(化合物B)。
【００６３】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、K118位においてN-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル]を有するhIL-1Raアイソフォーム1である(化合物B)。
【００６４】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、K31またはK34位においてN-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル]を有するhIL-1Raアイソフォーム1である(化合物C)。
【００６５】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、K118またはK121位においてN-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル]を有するhIL-1Raアイソフォーム1である(化合物D)。
【００６６】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、
N-イプシロン118-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A1)、N-イプシロン121-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A2)、またはその混合物からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、
N-イプシロン118-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物B)、N-イプシロン31-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C1)、N-イプシロン34-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C2)、またはその混合物からなる群から選択される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、N-イプシロン118-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D1)、N-イプシロン121-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D2)、またはその混合物からなる群から選択される。
【００６９】
機能的な特徴
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、アナキンラの半減期の少なくとも2または少なくとも3倍など、少なくとも1.5倍のin vivoにおける血漿半減期を有する。いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、アナキンラの半減期の少なくとも10倍など、少なくとも5倍のin vivoにおける血漿半減期を有する。特に指定のない限り、本明細書において使用される「in vivoにおける血漿半減期」は、本明細書において記載されるアッセイ(I)またはアッセイ(II)によって決定される、in vivoにおける血漿半減期を意味する。
【００７０】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、本明細書において記載されるアッセイ(III)によって決定されるように、IL-1β活性から保護する。
【００７１】
調製の方法
いくつかの実施形態では、IL-1Ra化合物は、実施例5において記載されるように、組換え発現によって調製することができる。18℃などのより低い温度で誘発された組換え発現は、より高い収率の組換えIL-1Raをもたらした。18℃などのより低い温度で誘発された組換え発現は、可溶性組換えIL-1Raをもたらした。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、18℃など25℃未満の温度での、請求項11において定義されるヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列の組換え発現の工程を含む、IL-1Ra化合物の調製のための方法に関する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本発明は、構築物番号2、構築物番号3、構築物番号4、構築物番号5、構築物番号6、構築物番号7、および構築物番号8からなる群から選択される配列を含むヌクレオチド配列に関する。
【００７３】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヌクレオチド配列または本発明のベクターを含む宿主細胞に関する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列に関する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、本発明は、
a)ヌクレオチド配列最適化、
b)発現プラスミドの調製、
c)宿主細胞の中への形質転換、
d)発現プラスミドを含む発現宿主細胞の培養、ならびに
e)組換えIL-1Ra化合物の続く捕捉および精製
の工程を含むIL-1Ra化合物の調製のための方法に関する。
【００７７】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本発明は、IL-1Ra化合物および1つまたは複数の薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、2つのIL-1Ra化合物など、1つまたは複数のIL-1Ra化合物を含む。
【００７８】
医薬適応症
本発明の化合物は、医学において使用することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、糖尿病、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎(SJIA)、心血管疾患、痛風、炎症性腸感染(IBD)、エリテマトーデス(SLE)、アルツハイマー病、多発性硬化症、IL1受容体アンタゴニスト(DIRA)の欠損、またはマックル-ウェルズ症候群の治療のためのIL-1Ra化合物に関する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本発明は、糖尿病、関節リウマチ、全身性若年性特発性関節炎(SJIA)、心血管疾患、痛風、炎症性腸感染(IBD)、エリテマトーデス(SLE)、アルツハイマー病、多発性硬化症、IL1受容体アンタゴニスト(DIRA)の欠損、マックル-ウェルズ症候群、または他の状態の治療のための方法に関し、IL-1シグナル伝達の調節が、本発明による化合物の投与によって、本発明の化合物の投与によって、臨床上の利益を有する。
【００８０】
定義
本明細書において使用される用語「ヒトIL-1Ra類似体」は、IL-1Raの1つもしくは複数のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されており、かつ/または1つもしくは複数のアミノ酸残基がIL-1Raから欠失しており、かつ/または1つもしくは複数のアミノ酸残基がIL-1Raに付加および/もしくは挿入されている改変ヒトIL-1Raを意味する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、IL-1Ra類似体は、IL-1Raに比べて10未満のアミノ酸改変(置換、欠失、付加(挿入を含む)、およびその任意の組み合わせ)、あるいはIL-1Raに比べて9、8、7、6、5、4、3、2、または1未満の改変を含む。
【００８２】
本明細書において、用語「アミノ酸残基」は、形式的にはヒドロキシ基がカルボキシ基から除去されたアミノ酸、および/または形式的には水素原子がアミノ基から除去されたアミノ酸である。
【００８３】
本明細書において使用される用語「IL-1Ra誘導体」は、化学的に修飾された親IL-1Raまたはその類似体を意味し、修飾は、アミド、炭水化物、アルキル基、アシル基、エステル、PEG化などが付着した形態をしている。
【００８４】
本発明による「IL-1Ra」は、ヒトIL-1Raまたはブタなどの他の種由来のIL-1Raまたはウシインスリンとして本明細書において理解されるべきである。
【００８５】
本明細書において使用される用語「IL-1Raペプチド」は、ヒトIL-1Raまたはインスリン活性を有するその類似体もしくは誘導体のいずれかであるペプチドを意味する。
【００８６】
本明細書において使用される用語「親IL-1Ra」は、本発明による任意の修飾が適用される前のIL-1Raを意味するように意図される。
【００８７】
投与様式
本明細書において、用語「アシル化IL-1Ra」は、任意選択でIL-1Raペプチドに対するリンカーを介しての1つまたは複数の脂肪酸置換基の付着によるIL-1Raの修飾を包含する。
【００８８】
一態様では、本発明による組成物において使用されるインスリンペプチドは、N末端で修飾され、インスリンのN末端のうちの1つ以外の位置において脂肪酸置換基によりさらに置換され、脂肪酸置換基が、任意選択でリンカーを介してインスリンに付着している脂肪酸またはジ脂肪酸からなる。リンカーは、脂肪酸または脂肪二酸およびインスリンに付着した点の中間の任意の適した部分であってもよく、この部分はまた、リンカー成分、スペーサーなどと呼ぶこともできる。
【００８９】
用語「治療」は、参照される疾患、障害、または状態の予防および最小化をどちらも含むように意図される(すなわち、「治療」は、特に指定のない限りまたは文脈によって明らかに否定されない限り、IL-1Ra誘導体またはIL-1Ra誘導体を含む組成物の予防的および治療的投与をどちらも指す)。
【００９０】
投与経路は、非経口的、たとえば、皮下、筋肉内、または静脈内など、身体における所望のまたは適切な場所に本発明の化合物を有効に輸送する任意の経路であってもよい。あるいは、本発明の化合物は、経口的に、肺に、直腸に、経皮的に、頬側に、舌下に、または経鼻的に投与することができる。
【００９１】
非経口的な投与については、本発明の化合物は、知られているインスリンの製剤と同様に製剤される。さらに、非経口的な投与について、本発明の化合物は、知られているインスリンの投与と同様に投与され、医師は、この手順に精通している。
【００９２】
本明細書において、用語「脂肪酸」は、少なくとも2つの炭素原子を有し、飽和または不飽和の直線状または分岐脂肪族カルボン酸を包含する。脂肪酸の非限定的な例は、ミリスチン酸、パルミチン酸、およびステアリン酸である。
【００９３】
本明細書において、用語「脂肪二酸」は、少なくとも2つの炭素原子を有し、飽和または不飽和の直線状または分岐脂肪族ジカルボン酸を包含する。脂肪二酸の非限定的な例は、ヘキサン二酸、オクタン二酸、デカン二酸、ドデカン二酸、テトラデカン二酸、ヘキサデカン二酸、ヘプタデカン二酸、オクタデカン二酸、およびエイコサン二酸である。
【００９４】
本明細書において使用される用語「約」は、プラスまたはマイナス10%など、指定の数値の適切な前後の値を意味する。
【００９５】
(実施例)
中間体の合成
アシル化基、たとえばN-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミルスクシンイミジルエステル、N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルスクシンイミジルエステル、およびN-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルスクシンイミジルエステルは、WO2005/012347、WO2009/115469、またはWO2010/029159において記載されるように調製することができる。
【００９６】
(実施例1)
K118またはK121位においてN-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメートを有する[Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A):
N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミルスクシンイミジルエステルによる[Met25]hIL-1Ra(25〜177)の誘導体化(化学物質1)。
【００９７】
【化１】
2014510516.tif 000002
【００９８】
Kineret(660μL、5.8nmolアナキンラ、Amgenから市販で入手可能)は、5% NaHCO3、pH8(1340μL)により希釈し、混合物のpHを7とした。N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミルスクシンイミジルエステル(4.8mg、5.8nmol)を、DMF(300μL)中に溶解し、そのタンパク質溶液に添加した。15分後のLCMS分析は、1963Da[M+9H]9+、1359Da[M+13]13+、1262Da[M+14H]14+である産物の形成を示した。アシル化タンパク質は、Source 30Q陰イオン交換カラム上で精製し(20mM Tris pH8.0、20カラム容量を超える50〜200mM NaCl)、4℃で保存した。
【００９９】
驚くべきことに、陰イオン交換クロマトグラフィー精製産物は、K118またはK121でモノアシル化された[Met25]hIL-1Ra(25〜177)であった(化合物A)。MALDI-TOF MSまたはLCMS分析が後続するタンパク分解性のAsp-N分解は、この産物が、
N-イプシロン118-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A1)および
N-イプシロン121-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A2)の混合物であることを示した。
【０１００】
(実施例2)
K118位(化合物B)においてまたはK31もしくはK34位(化合物C)においてN-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルを有する[Met25]hIL-1Ra(25〜177):
N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルスクシンイミジルエステルによる[Met25]hIL-1Ra(25〜177)の誘導体化(化学物質2)
【０１０１】
【化２】
2014510516.tif 000003
【０１０２】
Kineret(660μL、5.8nmolアナキンラ、Amgenから市販で入手可能)は、5% NaHCO3、pH8(1340μL)により希釈し、混合物のpHを7とした。N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルスクシンイミジルエステル(4.8mg、5.8nmol)をDMF(300μL)中に溶解し、そのタンパク質溶液に添加した。15分後のLCMS分析は、1998Da[M+9H]9+、1799Da[M+10H]10+、1635Da[M+11H]11+、1499Da[M+12H]12+、1383Da[M+13]13+である産物の形成を示した。アシル化タンパク質は、Source 30Q陰イオン交換カラム上で精製し(20mM Tris pH8.0、20カラム容量を超える50〜200mM NaCl)、4℃で保存した。
【０１０３】
驚くべきことに、陰イオン交換クロマトグラフィーによる分離により、[Met25]hIL-1Ra(25〜177)のK118位においてアシル化されることがAsp-N分解およびLCMSによって示された主なアシル化産物(化合物B)(このクロマトグラフィープールにおける産物の>80%)および[Met25]hIL-1Ra(25〜177)のK31またはK34位においてモノアシル化されたわずかなアシル化産物(化合物C)がもたらされた。産物は、
N-イプシロン118-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物B)、N-イプシロン31-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C1)、およびN-イプシロン34-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C2)の混合物であった。
【０１０４】
(実施例3)
K118またはK121位(化合物D)においてN-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルを有する[Met25]hIL-1Ra(25〜177):
N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルスクシンイミジルエステルによる[Met25]hIL-1Ra(25〜177)の誘導体化(化学物質3)。
【０１０５】
【化３】
2014510516.tif 000004
【０１０６】
Kineret(1.32mL、11.6nmolアナキンラ、Amgenから市販で入手可能)は、0.1M NaHCO3、pH8(6.65mL)により希釈し、混合物のpHを7.4とした。N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルスクシンイミジルエステル(10.0mg、11.6nmol)をDMF(1.5mL)中に溶解し、そのタンパク質溶液に添加した。15分後のLCMS分析は、アシル化産物、[M+12H]+=1501.2Da、計算値1501.0Daの形成を示し、これは、化合物A〜Cについて記載される方法によって精製した。
【０１０７】
精製産物は、モノアシル化[Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D)であった。MALDI-TOF MSまたはLCMS分析が後続するタンパク分解性のAsp-N分解により、化合物Dが、2つの主な産物、
N-イプシロン118-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D1)および
N-イプシロン121-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタメート-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D2)の混合物であることが示された。
【０１０８】
生物学的アッセイ
アッセイ(I):ラットにおいて決定された血漿半減期
以下のアッセイは、ラットにおける薬物動態を評価するのに有用である。ラットは、スパースサンプリング研究計画において静脈内(IV)投与によって投薬した。体重がおよそ250gであるオスSprague-Dawleyラット(Taconic)に、動物当たり、Gibco DPBS w/o Ca and Mg(GIBCOカタログ番号14190)中に溶解した1〜10μgの試験物質をIV投薬した。動物は、飼料および水を自由に摂取し、研究に入る前に少なくとも1週間順応させた。血液(650μl)は、たとえば、投薬の5分後、15分後、30分後、1時間後、2時間後、4時間後、8時間後、および24時間後に、麻酔なしで、舌下静脈(舌)からサンプリングした。ラットはそれぞれ、4回サンプリングし、最後のサンプリングの後に、ラットを屠殺した。血液は、EDTAを含有するチューブ中に収集した。サンプルは、氷上に保ち、遠心分離した(5分、4℃、8000rpm)。2×150μLの血漿サンプルを、各時点について、micronicチューブに移し、分析まで-20℃に保った。血漿サンプルは、下記に記載されるアッセイ(A)によって分析した。
【０１０９】
アッセイ(II):ブタにおいて決定された血漿半減期
以下のアッセイは、ブタにおける薬物動態を評価するのに有用である。ブタに、静脈内(IV)投与によって投薬した。およそ15〜30kgの体重のオスGottingenミニブタ(Ellegaard Gottingen Minipigs A/S、Denmark)に、耳静脈に挿入したベンフロンを介してIV投薬した。血液は、頚静脈からサンプリングした。試験物質は、Gibco DPBS w/o Ca and Mg(GIBCOカタログ番号14190)中に溶解し、用量は、動物当たり0.2mgとした。血液サンプルは、たとえば以下の時点で採取した:投薬前、投薬の5分後、15分後、30分後、45分後、1時間後、1.5時間後、2時間後、3時間後、4時間後、6時間後、8時間後、10時間後、24時間後、48時間後、72時間後、96時間後、120時間後、168時間後、192時間後、216時間後、240時間後、264時間後、および288時間。血液サンプル(0.8mL)は、安定化のためにEDTA緩衝剤を含有する試験チューブの中に収集し、遠心分離前に最大20分間、氷上に保った。血漿を分離するための遠心分離手順は、10分間、4℃およびおよそ2500gでもよい。血漿は、収集し、Micronicチューブに直ちに移し(2×200μL)、アッセイまで-20℃で保存した。血漿サンプルは、下記に記載されるアッセイ(A)によって分析した。
【０１１０】
アッセイ(A):血漿サンプルについての定量的アッセイ
血漿サンプルについての定量的アッセイ:血漿中のIL-1Ra化合物の測定は、ヒトインターロイキン1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)について市販で入手可能なELISAキット(R&D SystemsからのQuantikineキット)を使用して行った。ELISAは、1つのモノクローナル抗体および1つのポリクローナル抗体に基づくサンドイッチイムノアッセイとした。1)キット標準物質をコントロールとして使用し、2)それぞれのIL-1Ra化合物の標準物質を、サンプル(ラットまたはミニブタ)と一致する種の血漿中で調製し、3)サンプルの希釈を種の血漿中で行った以外は、常に、R&D Systemsのアッセイ手順に従った。プロトコールは、手短に言えば、IL-1Raに対して特異的なモノクローナル抗体を、マイクロプレート上にあらかじめコーティングした。それぞれのIL-1Ra化合物の標準物質を、血漿中で調製し、キット標準物質およびサンプルをウェルの中にピペットで移し、存在するあらゆるIL-1Raに、固定された抗体が結合した。非結合物質を洗浄した後に、IL-1Raに対して特異的な酵素結合ポリクローナル抗体をウェルに添加した。あらゆる非結合抗体-酵素試薬を除去するための洗浄後に、基質溶液をウェルに添加し、最初の工程で結合したIL-1Raの量に比例して発色させた。発色を停止させ、色の強度を測定した。
【０１１１】
ノンコンパートメント解析(NCA):血漿濃度-時間プロファイルは、WinNonlin(Pharsight Inc.、Mountain View、CA、USA)を使用して、ノンコンパートメント薬物動態分析(NCA)によって分析した。NCAは、それぞれの動物からの個々の血漿濃度-時間プロファイルを使用して実行した。
【０１１２】
アッセイ(III):NOの産生
INS-1細胞は、ラットインスリノーマに由来し、ベータ細胞に関する研究において広く使用されている。INS-1細胞は、IL-1受容体を発現し、IL-1βによるこの受容体の活性化は、iNOS発現の増加および続いて、一酸化窒素(NO)の放出に至る。NOは、非常に不安定であり、より安定した副産物である硝酸および亜硝酸に速やかに分解される。培地中の亜硝酸レベルは、Griess法を使用して容易に測定することができ、したがって、NO産生の間接的な尺度となる。本発明の実験では、INS-1細胞を、96ウェルプレートに接種し、37℃でインキュベートした。後日、150pg/ml IL-1βおよび増加性の濃度のIL-1受容体アンタゴニスト化合物を細胞に添加し、プレートを48時間、37℃でインキュベートする。インキュベーション後に、培地を、Griess法を使用してNOについて分析した。
【０１１３】
(実施例4)
IL-1Ra化合物の血漿半減期
アナキンラならびに化合物A、B、およびCの血漿半減期を、アッセイ(I)およびアッセイ(II)を使用して決定した。ラットに対する投薬量は、1μg(アナキンラ)、5μg(化合物BおよびC)、または10μg(化合物A)とした。ミニブタに対する投薬量は、200μgアナキンラ、化合物A、B、またはCとした。結果をTable 1(表1)に示す。
【０１１４】
【表１】
2014510516.tif 000005
【０１１５】
結果は、アシル化が、67分から222分までもラット血漿半減期(化合物C)を、また、80分から840分までもラット血漿半減期(化合物B)を改善したことを示した。
【０１１６】
(実施例5)
IL-1Ra化合物からのNO産生
IL-1Ra化合物のNO産生は、アッセイ(III)によって決定した。測定は、四連で行った。結果をTable 2(表2)に示す。
【０１１７】
【表２】
2014510516.tif 000006
【０１１８】
アッセイ(IV):マウスにおける炎症マーカーの放出に対する短期の阻害効果
6〜7週齢のC57bl/メスマウス(すべての群についてn=6)に、-1/2時間にアナキンラ(10もしくは100mg/kg;注射容量5ml/kg)または-1時間に化合物C(10、30、もしくは100mg/kg;注射容量5ml/kg)を、hIL-1(1ng/g、R&D Systems;皮下注射容量10ml/kg)による0時間での治療前に腹腔内投与した。2時間たった時に、マウスはすべて、イソフルランにより麻酔をかけ、血液を腹大動脈から収集した。炎症マーカーIL-6およびMCP-1の血漿レベルをxMAP multiplex assay(Luminex)を使用して測定した。結果をTable 3(表3)に示す。
【０１１９】
【表３】
2014510516.tif 000007
【０１２０】
調製の方法
(実施例6)
E. coliにおけるIL-1Raまたはその変異体の組換え発現およびコードDNA配列の構築
組換えIL-1Ra発現系を改善するために、IL-1Raおよび組換えIL-1Ra変異体をコードするDNAをヌクレオチド最適化した。ヌクレオチド最適化IL-1RaおよびIL-1Ra変異体をTable 3(表4)に示す。
【０１２１】
IL-1RaコードDNA断片は、ヌクレオチド最適化IL-1RaまたはIL-1Ra変異体コードDNA断片からNdeI+BamHIで単離し、NdeI+BamHI制限pET11aにサブクローニングした。
【０１２２】
発現のために、IL-1Ra_pET11a構築物を、BL21(DE3)に形質転換し、発現は、0.4mM IPTGの添加によって誘発し、37℃で3時間または18℃で一晩、継続した。予想された分子量は、およそ17kDaであった。37℃では、可溶性組換えIL-1Ra変異体の発現は少なかったが、一晩、18℃での誘発後に著しくより多量の可溶性IL-1Ra画分が観察された。
【０１２３】
発現は、SDS-PAGEによって分析し、結果を図1に示す。図1Aは、3つの独立したクローンにおける37℃での構築物番号1の発現を示す。図1Bは、37℃での構築物番号4〜8の発現を示す。図1Cは、37℃対18℃での構築物番号4〜7の発現を示し、構築物番号4および5は、3時間37℃で刺激し、構築物番号6および7は、一晩にわたって18℃で刺激した。図1Dは、0.4mM IPTGによって誘発し、一晩にわたって、18℃で培養した、800mL振盪フラスコ培養物における構築物番号2および3の発現を示す。I;誘発、M:マーカー(14、20、30、45、66、97kDa)。
【０１２４】
5mLバッチ培養における収率は、構築物番号1を使用して、120〜160mg/リットルの可溶性組換えIL-1Raであった。
【０１２５】
ヌクレオチド最適化コードDNA配列が、E. coliにおいて最適な組換えIL1RA発現レベルをもたらしたことが分かった。特に、発現レベルが非常に増加しただけではなく、可溶性タンパク質の収率もまた増加した。さらに、いくつかの構築物について、18℃などのより低い温度で誘発した発現がより高い収率の組換えIL-1Raをもたらし、組換えIL-1Raを可溶性に維持したことが分かった。
【０１２６】
【表４Ａ】
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【０１２７】
【表４Ｂ】
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【０１２８】
【表４Ｃ】
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【０１２９】
【表４Ｄ】
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【０１３０】
【表４Ｅ】
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【０１３１】
【表４Ｆ】
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【０１３２】
本発明のある種の特徴が本明細書において示され、記載されたが、当業者らは、今や、多くの改変、置換、変化、および等価物を思いつくであろう。そのため、添付の特許請求の範囲は、そのような改変および変化がすべて、本発明の真の精神の範囲内にあるとして包含するように意図されることが理解されるべきである。
【０１３３】
以下は、本発明の範囲内にさらに含まれる態様の非限定的なリストである:
1.アシル化基を含むIL-1受容体アンタゴニスト(IL-1Ra)化合物。
2.前記アシル化基が、31、34、118、および/または121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)を介してIL-1Raに付着している、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
3.i)118位もしくは121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)におけるN-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミルによるモノアシル化またはii)31位、34位、118位、もしくは121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)でのN-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルによるモノアシル化、またはiii)118位もしくは121位(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)でのN-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルによるモノアシル化を含む、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
4.前記アシル化基が、N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル、N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル、N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル、およびN-ドコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチルからなる群から選択される、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
5.前記IL-1Raが、ヒトIL-1Raまたはその類似体である、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
6.前記アシル化基が、前記IL-1RaのLysアミノ酸残基のイプシロンアミノ基を介してIL-1Raに付着している、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
7.前記IL-1Raが、置換K31R、K34R、K118R、および/またはK121R(hIL-1Raアイソフォーム1に対する位置)を含む、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
8. N-イプシロン118-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A1)、N-イプシロン121-[N-ヘキサデカンジオイル-ガンマ-L-グルタメート][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物A2)、化合物A1およびA2の混合物、N-イプシロン118-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物B)、N-イプシロン31-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C1)、N-イプシロン34-[N-オクタデカンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物C2)、N-イプシロン118-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D1)、N-イプシロン118-[N-エイコサンジオイル-ガンマ-L-グルタミル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル-[2-(2-アミノ-エトキシ)-エトキシ]-アセチル][Met25]hIL-1Ra(25〜177)(化合物D2)、化合物C1およびC2の混合物、化合物B、C1、およびC2の混合物、または化合物D1およびD2の混合物からなる群から選択される、先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
9.先の態様のいずれか1つにおいて定義されるIL-1Ra化合物および1つまたは複数の賦形剤を含む組成物。
10.医学で使用するための先の態様のいずれか1つに記載のIL-1Ra化合物。
11.構築物番号2、構築物番号3、構築物番号4、構築物番号5、構築物番号6、構築物番号7、および構築物番号8からなる群から選択される配列を含むヌクレオチド配列。
12.態様11において定義されるヌクレオチド配列を含むベクター。
13.態様11において定義されるヌクレオチド配列または態様12において定義されるベクターを含む宿主細胞。
14.態様11において定義されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列。
15.18℃など25℃未満の温度での、態様11において定義されるヌクレオチド配列などのヌクレオチド配列の組換え発現の工程を含む、IL-1Ra化合物の調製のための方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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