(57)【要約】本発明は、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含む酵母細胞であって、該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており、かつ該細胞が、少なくともヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して原栄養性である、酵母細胞に関する。さらに、本発明は、1種または複数種のテルペンを生産するための前記細胞の使用にも関する。さらに、本発明は、前記細胞を作製する方法、ならびに1種または複数種のテルペン、および該テルペンを含む薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油の製造に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞であって、
a)該細胞が、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み;
b)該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており;かつ
c)該細胞が、少なくともヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して原栄養性であり、好ましくは、該細胞が、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して少なくとも原栄養性であり、特に、該細胞が、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である、
酵母細胞。
【請求項２】
ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である対応する細胞よりも好ましくは安定である、安定な細胞株の細胞である請求項1記載の細胞。
【請求項３】
遺伝子改変細胞である、請求項1または2記載の細胞。
【請求項４】
サッカロミセス属(Saccharomyces)細胞であり、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞であり、特に、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する、請求項1〜3の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項５】
可溶性HMG-CoA還元酵素が以下の点を特徴とする、請求項1〜4の少なくとも一項記載の細胞：
a)膜結合領域を欠く短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素タンパク質であること;
b)該細胞中で活性であるプロモーターの転写制御下のベクター上でコードされていること;および/または
c)構成的プロモーターの制御下、特に、強力な構成的プロモーターの制御下で発現されること。
【請求項６】
ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子がARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している、請求項1〜5の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項７】
細胞のテルペン生産力、好ましくはトリテルペン生産力、特にスクアレン生産力が、対応する野生型細胞、および/または、ヒスチジン、ロイシン、もしくはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、もしくはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である、対応する細胞と比べて、少なくとも等価であり、好ましくは上昇している、請求項1〜6の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項８】
ステリルアシルエステルの生産量が減少している、好ましくは、ステリルアシルエステルの産生が欠損している、請求項1〜7の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項９】
a)可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を酵母細胞中に挿入する段階;
b)該可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を含む細胞を選択する段階;
c)該細胞のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子を欠失させるか、または変異させる段階;
d)(i)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための1種もしくは複数種の酵素をコードする遺伝子カセットを挿入すること、ならびに/または
(ii)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための酵素をコードする1つもしくは複数の不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること
によって、
特に、ヒスチジンの産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること、ならびにロイシンおよびウラシルの産生のための酵素をコードする遺伝子カセットを挿入することによって、
ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシル、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシル、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞に該細胞を変換する段階;
e)ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して原栄養性である細胞、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞、特に、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である細胞を選択する段階;ならびに任意で
f)段階e)の細胞を培養する段階;ならびに任意で
g)段階e)または段階f)の細胞を単離し安定にさせる段階
を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞を作製する方法。
【請求項１０】
細胞がサッカロミセス属細胞であり、より好ましくは、該細胞がサッカロミセス・セレビシエ細胞であり、特に、該細胞がAH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
段階a)が、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードするベクターの挿入を含み、該可溶性HMG-CoA還元酵素の発現が、該細胞中で活性なプロモーター、好ましくは構成的プロモーター、特に、強力な構成的プロモーターの制御下にある、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子がARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している、請求項9〜11の少なくとも一項記載の方法。
【請求項１３】
1種または複数種のテルペンを生産するため、好ましくは、1種または複数種のトリテルペンを生産するため、特に、スクアレンを生産するための、請求項1〜8の少なくとも一項記載の細胞または請求項9〜12の少なくとも一項記載の方法によって作製された細胞の使用。
【請求項１４】
a)適切な培地中で、請求項1〜8のいずれかの少なくとも一項記載の細胞または請求項9〜12のいずれか一項の少なくとも一項記載の方法によって作製された細胞を培養する段階;および
b)段階a)の該細胞または該細胞培養物から、1種または複数種のテルペン、好ましくは1種または複数種のトリテルペン、さらに特にスクアレンを単離する段階
を含む、
1種または複数種のテルペン、好ましくはトリテルペン、さらに特にスクアレンを生産するための方法。
【請求項１５】
a)請求項14にしたがって1種または複数種のテルペンを生産する段階;および
b)該テルペンを薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油、特にワクチン組成物に混合する段階
を含む、
薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油を製造するため、特にワクチン組成物を製造するための方法であって、
該1種または複数種のテルペンは、任意で、1つまたは複数の水素添加段階にさらに供され、該1種または複数種のテルペンは、好ましくは、水素添加されたトリテルペン、特にスクアランである、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
現在の製薬産業、美容産業、および化学工業において、様々なテルペンの重要性が増している。テルペンは、例えば、薬学的組成物および美容的組成物中の添加物として、ワクチン中のアジュバントとして、皮膚の保湿剤(moistener)として、粘液溶解剤として、フェロモンとして、ホルモンとして、害虫駆除のために、湿潤剤として、芳香剤として、滑沢剤として、抗菌剤として、抗炎症剤として、食品添加物として、電気絶縁体として、変圧器油または変圧器油添加剤として、ならびに化学工業、製薬産業、および美容産業において有用な原料(raw)化学物質として、使用されている。テルペンは、化学的目的のための天然かつ持続性のある供給源として、さらに使用され得る。
【０００２】
化学的に、テルペンは、プレニル単位とも呼ばれる1つまたは複数のイソプレン単位に由来する。イソプレンは、式CH2=C(CH3)-CH=CH2を有する。さらに、例えば酸素または窒素などのヘテロ原子と結合することによって、テルペンは、イソプレノイドとしても公知であるテルペノイドに改変され得る。
【０００３】
自然界では、大半のテルペンは、植物、菌類、および動物における二次代謝産物として存在する。さらに、いくつかの細菌もテルペンを産生する。テルペンは、様々な数のイソプレン単位を含み得る。ヘミテルペンおよびその誘導体は、単一のイソプレン単位を含み、例えばプレノールおよびイソ吉草酸が含まれる。モノテルペンおよびその誘導体は、2つのイソプレン単位を含み、例えば、ゲラニオール、リモネン、およびテルピネオールが含まれる。セスキテルペンおよびその誘導体は、3つのイソプレン単位を含み、例えば、ファルネセン、ファルネソールが含まれる。ジテルペンおよびその誘導体は、4つのイソプレン単位から構成され(composed for)、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸、カフェストール、カーウェオール、センブレン、およびタキサジエン(タキソールの前駆物質)、レチノール、レチナール、およびフィトールが含まれる。セステルテルペンおよびその誘導体は、5つのイソプレン単位を含み、例えば、セステルテルペンにはゲラニルファルネソールが含まれる。トリテルペンは、6つのイソプレン単位を含み、例えば、スクアレン、ラノステロール、およびシクロアルテノールが含まれる。テトラテルペンには、例えば、環式リコペン、単環式γ-カロテン、ならびに二環式α-カロテンおよびβ-カロテンが含まれる。ポリテルペンは、多数のイソプレン単位からなる長い鎖からなり、例えば、天然ゴムおよびグッタペルカが含まれる。
【０００４】
テルペンの大多数は、酵素によって触媒されるメバロン酸経路に由来する。この点で、テルペンの形成はアセチル補酵素A(CoA)から始まる。2つのアセチルCoA分子が酵素によって触媒されて反応して、1つのアセトアセチルCoA分子になる。次の段階で、アセトアセチルCoAは別のアセチルCoA分子と反応して、3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoA(ヒドロキシメチルグルタリル-CoA;HMG-CoA)になる。次の段階で、HMG-CoAは還元されてメバロン酸になる。この反応は酵素HMG-CoA還元酵素によって触媒され、典型的には、テルペン生合成の律速段階である。したがって、HMG-CoA還元酵素は、メバロン酸経路の重要な酵素として公知である。
【０００５】
典型的には、メバロン酸は、2回リン酸化され、脱炭酸されて、イソペンテニルピロリン酸(IPP)になる。異性化、縮合、および脱水素の連続的段階を経て、IPPはゲラニルピロリン酸に変換され、ゲラニルピロリン酸は別のIPP単位と結合してファルネシルピロリン酸になる。ファルネシルピロリン酸の2分子が還元的に縮合してスクアレンになる。スクアレンは、コレステロールおよび任意のステロイドホルモン中で変換され得る。
【０００６】
あるいは、ゲラニルピロリン酸およびファルネシルピロリン酸は、さらに反応して、高級テルペン、ならびに例えばテトラテルペンおよびポリテルペンなどになることもできる。
【０００７】
重要性の高いテルペンは、トリテルペンのスクアレンである。世界中で、約2000トンのスクアレンが毎年製造されている。これは、約1億2500万米ドルの年間売上高を生じる。技術的には、スクアレンは好ましくは、栄養添加物として、化粧品において、および製薬産業において使用される。さらに、スクアレンは、生分解性滑沢剤として、および変圧器油としても使用される。スクアレンは抗酸化剤としての機能を果たすことができ、ワクチン中のアジュバントとしてさらによく使用される。
【０００８】
伝統的には、スクアレンは生物学的供給源、例えば魚油、特にサメ肝油などから得られる。次いで、スクアレンは、魚油の複合組成物から面倒な手順によって精製される。製薬分野において、認可されようとする製造物のトレーサビリティ(tracability)は、保健当局(Health Authorities)にとって非常に重要である。しかし、このトレーサビリティは、製造物が動物起源に由来する産物を含む場合、保証することが難しい。例えば、サメのような魚が、屠殺される前に何を食べたか(has been eaten)を正確に知ることは困難である。したがって、薬学的製品の場合、GMP遵守である原材料を使用することが重要であり、これは、それらのトレーサビリティを最初の時点から正確に得ることができることを意味する。さらに、いくつかのサメの種は、絶滅の危機に瀕している絶滅危惧種である。スクアレン以外のテルペンも同様に生物学的材料から得られ、面倒でしばしば危険な手順によって精製されなければならない。
【０００９】
したがって、スクアレンのようなテルペンを生産するための代替の方法が必要とされている。スクアレンを高収率で産生する遺伝子改変酵母株の使用が実証されている(EP0486290)。しかしながら、説明されている酵母株はさらに、例えばエルゴステロールのようなステロイドも多量に産生する。ステロイドが産生されると、スクアレンおよび他のテルペンの収率が低下する。さらに、ステロイド不純物が多量に存在すると、原材料からスクアレンおよび他のテルペンを精製するために複雑な方法が必要になる。
【００１０】
これまでのところ、当技術分野において公知の遺伝子改変生物(GMO)は、テルペンを効率的に工業生産するには低すぎる濃度で、かつ高すぎる不純度でテルペンを産生する。
【００１１】
さらに、遺伝子改変生物は、遺伝的に比較的不安定であることが一般に公知であり、典型的には、培養された場合に、対応する野生型細胞よりも低い生存能力および/または遅い増殖動態を有する。したがって、1バッチ分の該細胞を培養する間に、典型的には、該バッチの生産力は時間経過とともに急速に低下する。このことが、様々な工業生産方法において遺伝子改変生物の効率的な有用性をいつも妨げている。
【００１２】
さらに、1つまたは複数の外来遺伝子の挿入によって遺伝子改変生物を作製する場合、その生物の1つまたは複数の本来の遺伝子が、該外来遺伝子で置換される。これには、選択目的のために使用され得る特定の有機栄養素に関してそれらの細胞が栄養要求性になるという利点があり得る。さらに、特定の細胞培養条件下で、栄養要求性は、それらの細胞の生殖能(reproducibility)にとって有利になり得ることが公知である。特定の条件下で、原栄養性細胞は、対応する栄養要求性細胞によって駆逐されさえする。例として、アンモニア制限増殖条件下では、30世代に渡って培養された場合、ヒスチジン原栄養株hoΔ::HIS3酵母細胞は、対応するヒスチジン栄養要求性細胞HO his3によって駆逐された(competed out)ことが説明されている(Pronk, 2002)。したがって、遺伝子改変生物は、しばしば栄養要求性株として培養される。しかしながら、栄養要求性細胞の使用は、培地選択の自由を明らかに制限する。
【００１３】
上記を考慮して、遺伝的に十分に安定であり、工業的有用性のために十分な高さの濃度および純度でテルペンを産生する生物に対する必要性が依然として満たされていない。
【００１４】
したがって、本発明の基礎となる技術的課題は、テルペンの生産力が向上し、かつ遺伝的および表現型的安全性が向上した生物を提供することである。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、酵母細胞であって、該細胞が、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み;該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており;かつ該細胞が、少なくともヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して原栄養性である、酵母細胞に関する。さらに、本発明は、1種または複数種のテルペンを生産するための前記細胞の使用にも関する。さらに、本発明は、前記細胞を作製する方法、ならびに1種または複数種のテルペン、および該テルペンを含む薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油の製造に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ベクターpPTHTLのためのクローニング戦略を示す。pUC19-tHMG1に由来するHMG1断片をEcoR1およびBamHIによって切り出し、EcoR1およびBamHIを用いて切断したプラスミドpT2bに組み込む。LEU2遺伝子は、平滑末端断片としてクローニングされる。したがって、XhoIおよびSalIを用いてYEp13を切断し、粘着末端を平滑化した(filed)。pPT2b-tHMG1は、NruIによって開裂させた(opened)。
【図２】ベクターYEpH2の模式図(schematic depiction)を示す。EcoRV/NruI断片としてのpPT2b-tHMG1の発現カセットが、SphIを用いて開裂され平滑化されたYep13に連結された。
【図３】組込みベクターYDpUHK3のためのクローニング戦略を示す。YEpH2に由来するEcoRV/NruI断片としての発現カセットが、StuIを用いて切断されたYDpUに連結された。pUCTK23に由来するHindII断片が、SmaIを用いて切断されたYDpUH2/12と連結される。
【図４】座位URA3(陰影を付けた箇所)に組み込まれるtHMG1発現カセットの模式図を示す。EcoRVを用いて線状化したベクターYDpUHK3(A)が、染色体URA3遺伝子(B)中に組み込まれる。プラスミドは、単一の組込み物として(C)またはタンデムリピートとして統合される。相同組換えを介して、ベクター全体が失われるか(点線の矢印)、またはプラスミドの一部分が失われる(実線の矢印)。発現カセットが残存する場合は、Dに示す状況が、URA3座位で実行される。
【図５】AH22tH3ura8株の遺伝子ARE1、ARE2を欠失させるのに使用された手順の模式図を示す。
【図６】プラスミドpUG6(図6A)およびpSH47(図6B)の模式図を示す。
【図７】実験室規模の発酵槽(5リットル)におけるAH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株の培養の結果を示す。図7Aは、酵母増殖の推移を示す。発酵過程における細胞乾燥重量(CDW)(単位g/L)および光学濃度(OD600nm/mL)を示している。図7Bは、66時間後および72時間後のスクアレン生産力を示す。スクアレン産生量が、発酵過程における細胞乾燥重量当たりのパーセントおよび容積生産性(単位:発酵ブロス1L当たりのg数)で示されている。
【図８】酵母サッカロミセス・セレビシエの構築された変異株に由来する全脂質抽出物の薄層クロマトグラフィーを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
驚くべきことに、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み、ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が欠失しており、かつヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である酵母細胞が、細胞培養においてテルペンの高い生産力ならびに向上した遺伝的および表現型的安全性を有することが判明した。予想通り、ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失により、ステリルエステルのレベルが低下した。しかしながら、予想外に、ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失は、ステロールの蓄積をもたらさず、むしろ、スクアレンのようなテルペンの蓄積をもたらした。
【００１８】
これらの作製された細胞は、30世代より長く培養した場合、安定な細胞株を形成し、遺伝的に安定である。この点で、驚くべきことに、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である細胞が、対応する栄養要求性細胞よりも高い遺伝的および表現型的安全性を有することが判明した。
【００１９】
第1の局面において、本発明は、酵母細胞であって、
a)該細胞が、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み;
b)該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており;かつ
c)該細胞が、少なくともヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して原栄養性であり、好ましくは、該細胞が、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して少なくとも原栄養性であり、特に、該細胞が、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である、
酵母細胞に関する。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「酵母細胞」という用語は、酵母生物の任意の細胞として、最も広い意味で理解されてよい。好ましくは、酵母細胞は、サッカロミセス属(Saccharomyces)細胞、特に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・デルブリュッキイ(Saccharomyces delbruckii)、サッカロミセス・イタリクス(Saccharomyces italicus)、サッカロミセス・エリプソイデウス(Saccharomyces ellipsoideus)、サッカロミセス・ファーメンタチ(Saccharomyces fermentati)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・クルセイ(Saccharomyces krusei)、サッカロミセス・ラクティス(Saccharomyces lactis)、サッカロミセス・マルキシアヌス(Saccharomyces marxianus)、サッカロミセス・ミクロエリプソイデス(Saccharomyces microellipsoides)、サッカロミセス・モンタナス(Saccharomyces montanus)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、サッカロミセス・オレアセウス(Saccharomyces oleaceus)、サッカロミセス・パラドキサス(Saccharomyces paradoxus)、サッカロミセス・パストリアヌス(Saccharomyces pastorianus)、サッカロミセス・プレトリエンシス(Saccharomyces pretoriensis)、サッカロミセス・ロゼイ(Saccharomyces rosei)、サッカロミセス・ルキシー(Saccharomyces rouxii)、サッカロミセス・ウバラム(Saccharomyces uvarum)、サッカロミコデス・ルドウィギ(Saccharomycodes ludwigii)からなる群より選択されるサッカロミセス属細胞でよい。最も好ましくは、細胞は、サッカロミセス・セレビシエ細胞である。サッカロミセス・セレビシエ細胞は、任意の株の細胞、好ましくは、実施例において例示的に使用されるAH22株の細胞でよい。
【００２１】
あるいは、細胞は、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・マルキシアヌス・バー・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus var. marxianus)、クルイベロミセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans)、カンジダ・ユチリス(Candida utilis)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・リポティリカ(Candida lipolytica)、および(und)カンジダ・バーサチリス(Candida versatilis)、ピキア・スティピディス(Pichia stipidis)、ピキア・パストリス(Piachia pastoris)、およびピキア・ソルビトフィラ(Pichia sorbitophila)などのピキア属、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、デバロマイセス属(Debaromyces)、ハンゼヌラ属(Hansenula)、サッカロミセコプシス属(Saccharomycecopsis)、サッカロミコデス属(Saccharomycodes)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ウィッケルハミア属(Wickerhamia)、デバヨミセス属(Debayomyces)、ハンセニアスポラ属(Hanseniaspora)、クロエケラ属(Kloeckera)、ザイゴサッカロミセス属(Zygosaccharomyces)、オガタエア属(Ogataea)、クライシア属(Kuraishia)、コマガタエラ(Komagataella)、メチニコビア属(Metschnikowia)、ウィリオプシス属(Williopsis)、ナカザワエア属(Nakazawaea)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、トルラスポラ属(Torulaspora)、ブルエラ属(Bullera)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、ウィロプシス属(Willopsis)、またはスポロボロミセス属(Sporobolomyces)のものに由来する、サッカロミセス属ではない細胞でもよい。
【００２２】
本明細書において使用される場合、「機能的遺伝子」という用語は、その遺伝子が酵母細胞中で活性であることができることを意味する。したがって、適切な条件下で、この遺伝子は酵母細胞中で転写および翻訳され得、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素ポリペプチドが発現され得る。本発明の全体にわたって使用される場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、同義的に理解されてよい。
【００２３】
「可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素」という用語は、ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)のメバロン酸への還元を触媒する酵素の可溶型として、最も広い意味で理解されてよい。本明細書において使用される場合、「ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A」、「ヒドロキシメチルグルタリル-CoA」、「3-ヒドロキシ-3-メチル-グルタリル-CoA」、「3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA」、「β-ヒドロキシ-β-メチル-グルタリル-CoA」、「β-ヒドロキシ-β-メチルグルタリル-CoA」、「beta-ヒドロキシ-beta-メチル-グルタリル-CoA」、「beta-ヒドロキシ-beta-メチルグルタリル-CoA」、および「HMG-CoA」は、同義的に理解されてよい。
【００２４】
好ましくは、野生型HMG-CoA還元酵素とは異なり、本発明の可溶性HMG-CoA還元酵素は、例えば、メバロン酸、グルカゴン、コレステロール、L-ヒドロキシコレステロール、低密度リポタンパク質、および胆汁酸など野生型HMG-CoAの1種または複数種の阻害剤によって阻害されない場合がある。
【００２５】
最も好ましくは、可溶性HMG-CoA還元酵素は、実施例で例示的に使用される短縮型HMG-CoA還元酵素 (tHMG1)である。このtHMG1は、Bassonらによってさらに説明されており(Basson et al., 1988)、かつ/またはSEQ ID NO: 1のDNA配列にコードされる。
【００２６】
本発明の可溶性HMG-CoA還元酵素はまた、1つまたは複数の翻訳後修飾の産物であり得ることが理解され得る。翻訳後修飾は当技術分野において周知であり、脂質化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、短縮化、いくつかのアミノ酸部分の環化、ポリペプチド鎖の環化、酸化、還元、脱炭酸、アセチル化、アミド化、脱アミド、ジスルフィド結合形成、ピログルタミン酸形成、アミノ酸付加、補助因子付加(例えば、ビオチン標識、ヘム付加)、ならびに金属イオン、非金属イオン、ペプチド、または低分子との複合体形成(complexation of)、および鉄-硫黄クラスターの付加が含まれてよいが、それらに限定されなくてよい。明らかに、例えば、ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、NADPH+H+、金属イオン、陰イオン、脂質などの補助因子は、これらの補助因子の生物学的影響に関係なく、ポリペプチドに結合されてよい。
【００２７】
本明細書において使用される「可溶性」という用語は、膜結合特性が低減した形態の酵素を意味する。好ましくは、本発明の可溶性HMG-CoA分子の50％超が、膜に組み込まれても付着してもおらず、より好ましくは、本発明の可溶性HMG-CoA分子の60％超が、膜に組み込まれても付着してもおらず、さらにより好ましくは、本発明の可溶性HMG-CoA分子の70％超が、膜に組み込まれても付着してもおらず、さらにより好ましくは、本発明の可溶性HMG-CoA分子の80％超が、膜に組み込まれても付着してもおらず、さらにより好ましくは、本発明の可溶性HMG-CoA分子の90％超が、膜に組み込まれても付着してもおらず、最も好ましくは、本発明の可溶性HMG-CoA分子の95％超が、膜に組み込まれても付着してもいない。好ましくは、可溶性HMG-CoA還元酵素は、本発明の酵母細胞のサイトゾル中に存在する。
【００２８】
本明細書において使用される「ステリルアシルトランスフェラーゼ」という用語は、ステリルアシルエステルの形成を触媒する任意の酵素を意味する。ステリルアシルトランスフェラーゼは、ステロールO-アシルトランスフェラーゼでよい。本明細書において使用される場合、「ステロールO-アシルトランスフェラーゼ」、「ステロールエステル合成酵素」、および「アシル-CoA:ステロールアシルトランスフェラーゼ」という用語は、同義的に理解されてよい。本発明において、好ましくは、ステロールO-アシルトランスフェラーゼは、酵母ステロールO-アシルトランスフェラーゼ(EC2.3.1.26)である。より好ましくは、ステロールO-アシルトランスフェラーゼは、本発明の実施例において例示的に使用されるステロールO-アシルトランスフェラーゼの一方または両方、すなわち、酵母のARE1遺伝子および/またはARE2遺伝子の遺伝子産物である。
【００２９】
ARE1遺伝子は、SAT2遺伝子、順序づけられた遺伝子座名称(ordered locus name)YCR048W、またはORF名称YCR48Wとしても公知である。ARE2遺伝子は、SAT1遺伝子、順序づけられた遺伝子座名称YNR019W、またはORF名称N3206としても公知である。
【００３０】
本発明の酵母細胞において、ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子は、欠失しているか、または不完全である。本明細書において使用される場合、「欠失している」という用語は、その遺伝子またはその遺伝子の1つもしくは複数の部分が除去されていることを意味する。この遺伝子は転写されず、遺伝子産物、すなわち対応するポリペプチドは産生されない。必ずしも遺伝子全体がゲノムから除去されなければならないわけではないことが理解され得る。好ましくは遺伝子の50％超、より好ましくは遺伝子の60％超、さらにより好ましくは遺伝子の70％超、さらにより好ましくは遺伝子の80％超、さらにより好ましくは遺伝子の90％超、さらにより好ましくは遺伝子の95％超、および最も好ましくは遺伝子の100％が欠失している。欠失は、末端欠失または中間(intercalary)欠失でよい。これは、実験によって、または自然に引き起こされてよい。遺伝子は、当技術分野において公知の任意の手段によって欠失させることができる。例えば、交差によって、またはcreリコンビナーゼ手順を用いて(Guldener et al, 1996)、遺伝子を欠失させてよい。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「不完全である」という用語は、その遺伝子が転写されないこと、またはその遺伝子が、機能的ではない遺伝子産物、すなわちポリペプチドをコードすることのいずれかを意味する。ステリルアシルアシルトランスフェラーゼ遺伝子という文脈において、「機能的ではない」という用語は、対応する野生型ポリペプチドと比べて、アシル転移効率が50％未満、好ましくは40％未満、より好ましくは30％未満、さらにより好ましくは20％未満、さらにより好ましくは10％未満、さらにより好ましくは5％未満、さらにより好ましくは4％未満、さらにより好ましくは3％未満、さらにより好ましくは2％未満、および最も好ましくは1％未満であるポリペプチドを意味する。
【００３２】
実施例において例示的に示すように、好ましくは、ARE1遺伝子および/またはARE2遺伝子が欠失してよく、特に、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子が欠失している。遺伝子は、当技術分野において公知の任意の手段によって不完全にすることができる。例えば、遺伝子は、実験によってもしくは自然に引き起こされた(例えば、放射線照射、化学物質による、もしくは自然発生的な)非特異的変異誘発によって、または(例えばPCRによる)部位特異的変異誘発によって、不完全にすることができる。これは、フレームシフトまたは点変異(単一のヌクレオチド交換)によって引き起こすことができる。
【００３３】
本発明の全体を通して、「原栄養性の」という用語は、細胞増殖に必要とされる特定の有機化合物を合成する能力を有することとして、最も広い意味で理解されてよい。本発明において、酵母細胞は、ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して原栄養性であり得る。したがって、細胞は、それ自体でヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを合成することができ、したがって、ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを含まない培地中ならびにヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを含まない細胞培養プレート上で増殖することができる。酵母細胞はまた、他の栄養要素に関して原栄養性であってもよいことが理解され得る。
【００３４】
好ましい態様において、本発明の酵母細胞は、ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である対応する細胞よりも好ましくは安定である安定な細胞株の細胞である。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「安定な細胞株」という用語は、本発明において関連しているその表現型的特性を維持する細胞集団として理解されてよい。これらの関連する特性は、主に、生存能力、増殖、および/またはテルペン生産力、最も好ましくは、生存能力、増殖、およびテルペン生産力である。
【００３６】
安定な細胞株は、好ましくは遺伝的にも安定であることが、当業者によって理解されると考えられる。
【００３７】
30世代に渡って培養された場合、テルペン生産力に、30世代に渡る培養の前の酵母細胞と比べて、好ましくは50％以下の低下が起こり、より好ましくは30％以下、さらにより好ましくは20％以下、さらにより好ましくは10％以下、さらにより好ましくは8％以下、さらにより好ましくは6％以下、さらにより好ましくは4％以下、および最も好ましくは2％以下の低下が起こる。
【００３８】
さらに、30世代に渡って培養された場合、細胞増殖率に、30世代に渡る培養の前の酵母細胞と比べて、好ましくは50％以下、より好ましくは30％以下、さらにより好ましくは20％以下、さらにより好ましくは10％以下、さらにより好ましくは8％以下、さらにより好ましくは6％以下、さらにより好ましくは4％以下、および最も好ましくは2％以下の低下が起こる。
【００３９】
さらに、10世代より長く、20世代より長く、30世代より長く、40世代より長く、50世代より長く、60世代より長く、70世代より長く、80世代より長く、90世代より長く、100世代より長く、150世代より長く、または200世代より長く培養された場合、本発明の酵母細胞のテルペン生産力に、好ましくは、20％より大幅な低下が起こらない。
【００４０】
同様に、10世代より長く、20世代より長く、30世代より長く、40世代より長く、50世代より長く、60世代より長く、70世代より長く、80世代より長く、90世代より長く、100世代より長く、150世代より長く、または200世代より長く培養された場合、本発明の酵母細胞の細胞増殖率に、好ましくは、20％より大幅な低下が起こらない。
【００４１】
本発明の全体を通して、「栄養要求性の」という用語は、増殖に必要とされる特定の有機化合物を酵母細胞が合成する能力を持たないこととして、最も広い意味で理解されてよい。本発明において、酵母細胞は、ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して栄養要求性であり得る。したがって、細胞は、それ自体ではヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを合成することができず、したがって、ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを含まない培地中ならびにヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを含まない細胞培養プレート上で増殖することができない。栄養要求性酵母細胞は、培地へのヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルの個別の添加を必要とする。酵母細胞はまた、限定されるわけではないが、ビタミン、アミノ酸、糖、および脂質酸(lipid acid)からなる群の他の栄養要素に関して栄養要求性であってもよいことが理解され得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、「ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である対応する細胞」という用語は、本発明の細胞と同じ遺伝的起源の細胞を意味する。ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である対応する細胞はまた、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする機能的遺伝子も含む。さらに、該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失している。本発明の細胞とヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である対応する細胞との唯一の遺伝的差異は、後者がヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性であることである。好ましくは、細胞は、サッカロミセス属細胞、より好ましくはサッカロミセス・セレビシエ細胞、さらにより好ましくは、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞、さらにより好ましくは、AH22株に由来する酵母株AH22tH3が起源である細胞、より好ましくは、AH22tH3ura8株が起源である細胞、さらにより好ましくは、AH22tH3ura8Δare1株またはAH22tH3ura8Δare2株の内の1種が起源である細胞である。最も好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である対応する細胞は、実施例において例示的に示すAH22tH3ura8Δare1Δare2株の酵母細胞である。
【００４３】
好ましい態様において、前記細胞は、遺伝子改変細胞である。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「遺伝子改変細胞」という用語は、遺伝子改変生物(GMO)とも呼ばれる、当技術分野において公知の任意の手段によってゲノムが改変された細胞として、最も広い意味で理解されてよい。細胞それ自体が改変されてもよく、または遺伝子改変された細胞の子孫であってもよい。典型的には、GMOは、放射線(例えば、紫外線(UV)照射、X線照射、放射性(radioactive)/核放射線(例えば、α線照射、β線照射、もしくはγ線照射)、もしくは宇宙放射線)または1種もしくは複数種の変異誘発物質(例えば、核酸塩基に対するアルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタード(例えば、シクロホスファミド、メクロレタミンもしくはムスチン(HN2)、ウラムスチンもしくはウラシルマスタード、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド)、ニトロソ尿素(例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン)、スルホン酸アルキル(例えば、ブスルファン)、チオテパおよびその類似体、白金誘導体(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン)、プロカルバジン、アルトレタミン、アフラトキシンおよびアフラトキシンならびにその代謝産物および誘導体、ニトライト(nitrite)、アニリンならびにその代謝産物および誘導体、ベンゼンならびにその代謝産物および誘導体、多環芳香族ならびにその代謝産物および誘導体)、ニトロソアミン、ヒ素、アスベスト、ベリリウムおよびその化合物、エチレンオキシド、六価クロム(VI)化合物、ラドン、塩化ビニル、タバコの煙(smoking)など)を用いた非特異的変異誘発または特異的変異誘発などのヒトによる実験作業によって作製される。しかしながら、変異はまた、自然発生的に発生してもよい。
【００４５】
好ましい態様において、前記細胞はサッカロミセス属細胞であり、より好ましくは、前記細胞はサッカロミセス・セレビシエ細胞であり、特に、前記細胞は、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する。
【００４６】
AH22株の酵母細胞は、ATCC番号38626という名称で、American Type Culture Collection(ATCC)から商業的に得ることができる。もともと、leu2-二重変異を有し遺伝子型a' leu2-3 leu2-112 his4-519 can1であるAH22株は、野生型株S288cに由来した(Hinnen et al., 1978)。S288c株(Mortimer et al., 1985)もまた、ATCC番号26108という名称で市販されている。好ましくは、本発明の酵母細胞は、AH22株の細胞に由来するAH22tH3株が起源である、より好ましくは、AH22tH3ura8株が起源である、さらにより好ましくは、AH22tH3ura8Δare1株、AH22tH3ura8Δare2株、またはAH22tH3ura8Δare1Δare2株の内の1種が起源である、さらにより好ましくは、AH22tH3ura8Δare1Δare2株が起源である、さらにより好ましくは、AH22tH3ura8Δare1Δare2H株、AH22tH3ura8Δare1Δare2U株、またはAH22tH3ura8Δare1Δare2L株の内の1種が起源である、サッカロミセス・セレビシエ細胞である。最も好ましくは、本発明の酵母細胞は、実施例において例示的に示すAH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株の酵母細胞である。
【００４７】
さらに好ましい態様において、可溶性HMG-CoA還元酵素は、以下の点を特徴とする
a)膜結合領域を欠く短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素タンパク質である;
b)前記細胞中で活性であるプロモーターの転写制御下のベクター上でコードされている;および/または
c)構成的プロモーターの制御下、特に、強力な構成的プロモーターの制御下で発現される。
【００４８】
本発明において、「短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素タンパク質」という用語は、構成的アミノ酸鎖の長さに関して、野生型HMG-CoA還元酵素タンパク質より長さが短いHMG-CoA還元酵素タンパク質を意味する。好ましくは、HMG-CoA還元酵素タンパク質は、野生型タンパク質の膜結合領域を欠く。
【００４９】
本明細書において使用される場合、「膜結合領域」という用語は、膜への組込みまたは膜への付着に関連する、ポリペプチド鎖中の領域を意味する。HMG-CoA還元酵素のアミノ末端のアミノ酸525個の大部分は膜に組み込まれていることが当技術分野において公知である(Basson et al., 1988)。
【００５０】
したがって、本発明において、好ましくは、約450〜500、約500〜510、約510〜520、約520〜530、約530〜540、約540〜550、約550〜560、約560〜570、または約570〜600アミノ酸の範囲の間の(in between)アミノ酸位置までのアミノ末端アミノ酸が切断されてよい。例示的には、アミノ酸552番目までのアミノ酸、すなわち、アミノ酸1〜552が切断されてよい(Polakowski et al., 1998)。最も好ましくは、短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素は、Bassonらによって説明されているtHMG1である(Basson et al., 1988)。tHMG1は、SEQ ID NO: 1のDNA配列にコードされている。
【００５１】
野生型HMG-CoA還元酵素とは異なり、本発明の短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素は、例えば、メバロン酸、グルカゴン、コレステロール、L-ヒドロキシコレステロール、低密度リポタンパク質、および胆汁酸など野生型HMG-CoAの1種または複数種の阻害剤によって阻害されない場合がある。
【００５２】
最も好ましくは、可溶性HMG-CoA還元酵素は、実施例で例示的に使用される短縮型HMG-CoA還元酵素tHMG1である。このtHMG1は、Bassonらによってさらに説明されており(Basson et al., 1988)、かつ/またはSEQ ID NO: 1のDNA配列にコードされている。
【００５３】
先に示したように、本発明の可溶性HMG-CoA還元酵素はまた、1つまたは複数の翻訳後修飾の産物であり得ることが理解され得る。翻訳後修飾は当技術分野において周知であり、脂質化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、短縮化、いくつかのアミノ酸部分の環化、ポリペプチド鎖の環化、酸化、還元、脱炭酸、アセチル化、アミド化、脱アミド、ジスルフィド結合形成、ピログルタミン酸形成、アミノ酸付加、補助因子付加(例えば、ビオチン標識、ヘム付加)、ならびに金属イオン、非金属イオン、ペプチド、または低分子との複合体形成、および鉄-硫黄クラスターの付加が含まれてよいが、それらに限定されなくてよい。明らかに、例えば、ATP、ADP、NAD+、NADH+H+、NADP+、NADPH+H+、金属イオン、陰イオン、脂質などの補助因子は、これらの補助因子の生物学的影響に関係なく、ポリペプチドに結合されてよい。
【００５４】
本発明において使用される場合、「ベクター」という用語は、酵母細胞に遺伝情報を伝達する任意の構成物(composition)を意味してよい。遺伝情報は、デオキシリボ核酸(DNA)(二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖DNA(ssDNA))、リボ核酸(RNA)(一本鎖RNA(ssRNA)、二本鎖RNA(dsRNA))として、またはDNA類似体、例えば、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノ、グリコール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、もしくはメチル化DNAなどとして、コードされ得る。好ましくは、遺伝情報は、DNAとしてコードされる。ベクターは、例えば、直鎖ベクター、環状ベクター、ウイルスベクター、または細菌ベクターなど当技術分野において公知の任意のベクターでよい。好ましくは、ベクターは、直鎖DNAまたは環状DNA、より好ましくは環状DNA、特にプラスミドを含む。ベクターは、当技術分野において公知の任意の手段によって細胞中に挿入されてよく、トランスフェクション剤(例えば、酢酸リチウム、ポリエチレンイミン(PEI)、フゲン(fugene)、LT-1、JetPEI、トランスフェクタミン(transfectamine)、リポフェクタミン、UptiFectin、PromoFectin、GenePORTER、Hilymax、カーボンナノファイバー、カーボンナノチューブ、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)、リポソーム、DEAE-デキストラン、デンドリマー)と組み合わせてもしくは組み合わせずに、エレクトロポレーションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、または遺伝子銃と組み合わせてもしくは組み合わせずに、光学的トランスフェクションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、遺伝子エレクトロトランスファーと組み合わせてもしくは組み合わせずに、インペールフェクション(impalefection)と組み合わせてもしくは組み合わせずに、マグネトフェクションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、および/または磁石を利用したトランスフェクション(magnet assisted transfection)と組み合わせてもしくは組み合わせずに、使用されてよい。好ましくは、ベクターは環状DNAベクターであり、より好ましくは、ベクターはプラスミドである。プラスミドは、例えば、YEpH2プラスミドまたはpUC19プラスミドなど当技術分野において公知の任意のプラスミドでよい。また、ベクターは、標的細胞のゲノムに組み込まれることもあればないこともある、直線状の発現カセットでもよい。しかしながら、他のすべてのベクターもまた使用され得ることが理解され得る。
【００５５】
「転写制御下」という用語は、プロモーターが遺伝子の転写速度を調節することを意味する。転写速度とは、ベクターDNAのアンチセンス鎖のセグメントに相補的なメッセンジャーRNA(mRNA)の時間間隔あたりの生成速度である。
【００５６】
本明細書において使用される場合、「プロモーター」という用語は、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子の転写を促進するDNA領域として、最も広い意味で理解されてよい。プロモーターは、遺伝子の近くに位置してよく、同じ鎖かつ上流に位置してよい。上流とは、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードするセンス鎖の5'領域の方に位置していることを意味する。プロモーターは、同種プロモーターまたは異種プロモーターでよい。最も好ましくは、実施例において例示的に示すプロモーターが使用される。
【００５７】
「発現される」という用語は、遺伝情報をポリペプチド鎖に変換することとして、最も広い意味で理解されてよい。
【００５８】
「構成的プロモーター」という用語は、それが関連する遺伝子の頻繁な転写を可能にする、ほとんど制御されない(extensively unregulated)プロモーターとして理解されてよい。「強力な構成的プロモーター」という用語は、速い転写速度を有するプロモーターを意味する。
【００５９】
さらに、好ましい態様において、ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子は、ARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している。
【００６０】
さらにまたはその代わりに、ステリルアシルエステルの形成に影響を与える他の遺伝子が、不完全であるか、または欠失していてもよい。
【００６１】
好ましい態様において、前記細胞のテルペン生産力、好ましくはトリテルペン生産力、特にスクアレン生産力は、対応する野生型細胞、および/またはヒスチジン、ロイシン、もしくはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、もしくはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である、対応する細胞と比べて、少なくとも等価であり、好ましくは、上昇している。
【００６２】
「テルペン」という用語は、イソプレンに構造的に由来する任意の分子として、最も広い意味で理解されてよい。好ましくは、本発明のテルペンは、少なくとも2つのイソプレン単位を含むテルペンであり、より好ましくは、テルペンは、少なくとも3つのイソプレン単位を含み、さらにより好ましくは、テルペンは、少なくとも4つのイソプレン単位を含み、さらにより好ましくは、テルペンは、少なくとも5つのイソプレン単位を含み、さらにより好ましくは、テルペンは、6つのイソプレン単位を含み、特に、テルペンはトリテルペンである。
【００６３】
好ましくは、テルペンは、メバロン酸経路に由来するテルペンである。これらのテルペンには、スクアレン、カロテン(例えば、α-カロテン、β-カロテン、γ-カロテン、δ-カロテン、ε-カロテン、ζ-カロテン)、カロテノイド、レチノアート、レチノイン酸複合体、レチニルエステル、レチナール(オールトランス型レチナール、11-cis-レチナール)、レチノール(ビタミンA、オールトランス型レチノール、11-cis-レチノール)、ファルネセン、ファルネソール、ゲラネン(geranene)、ゲラノール、イソペンテン、キノノール(例えば、フィロキノノール、プラストキノノール、ユビキノノール、メナキノノール)、フィテン、フィテノール、ゲラニルゲラネン(geranylgeranene)、ゲラニルゲラネオール(geranylgeranenol)、キサントフィル(例えば、ビオラキサンチン、ゼアキサンチン)、イソペントール(isopentol)、リモネン、リモノール、ピネン、ピノール、幼若ホルモンIII、ウンデカプレン(undecaprene)、ウンデカプレノール、ウンデカプレニル糖、カウレン、カウレノール、フィトアレキシン、カプシジオール、グアイアアズレン(guaiaazulene)、ジベリリン(giberillin)、ゴム、トコプメロール(tocopmerol)、クロロフィル、キノン(例えば、フィロキノン、プラストキノン、ユビキノン、メナキノン)、ドリコール、ドレチル(dolechyl)糖、プレフィトエン、フィトエン、フィトエノール(phytoenol)、フィトフルエン、フィトフルエノール(phytofluenol)、ノイロスポレン、リコペン、リコペノール(lycopenol)、リコプレン(lycoprene)、およびリコプレノール(lycoprenol)、カフェストール、カーウェオール、センブレン、カンブレノール(cambrenol)、タキサジエン、パクリタキセル、タキソール、セスタテルペン、シクロアルテノール、天然ゴム、またはグッタペルカが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００６４】
テルペンは、1つまたは複数のヘテロ原子、好ましくは酸素および/または窒素を含んでもよく、または含まなくてもよい。1つまたは複数のヒドロキシル基を含むテルペンはまた、例えば、リン酸、ピロリン酸、1つもしくは複数の脂肪酸、1つもしくは複数のアミノ酸、1つもしくは複数のポリペプチド、および/または1つもしくは複数の短いペプチドによってエステル化されてもよいことが理解される。さらに、1つまたは複数のアミノ基を含むテルペンは、例えば、リン酸、ピロリン酸、1つもしくは複数の脂肪酸、1つもしくは複数のアミノ酸、1つもしくは複数のポリペプチド、および/または1つもしくは複数の短いペプチドによってアミド化されてもよい。さらに、1つまたは複数のカルボキシル基を含むテルペンは、例えば、1つもしくは複数のアミノ酸、1つもしくは複数のポリペプチド、および/または1つもしくは複数の短いペプチドでアミド化されてよく、かつ/または例えば、1つもしくは複数の補酵素(例えば補酵素A(CoA))、1つもしくは複数の糖、1つもしくは複数のアミノ酸、1つもしくは複数のポリペプチド、および/または1つもしくは複数の短いペプチドによってエステル化されてもよい。好ましくは、テルペンは、結合されていないか、またはリン酸、ピロリン酸、および/もしくはCoAでエステル化されている。より好ましくは、テルペンは、結合されていない。最も好ましくは、テルペンは、実施例において例示的に示すスクアレンである。
【００６５】
「テルペン生産力」という用語は、酵母細胞による任意のテルペンの生産力として理解されてよい。好ましくは、テルペン生産力は、メバロン酸経路のテルペンの生産力、より好ましくは、スクアレン生産力を意味する。
【００６６】
本発明の全体を通して使用される場合、「生産力」という用語は、特定の分子を産生する本発明の細胞の能力として、最も広い意味で理解されてよい。生産力は、一定の時間間隔に細胞が産生する該分子の量として定量され得る。したがって、生産力は、ある期間に渡る特定の分子の産生量として理解され得る。好ましくは、1バッチ分の細胞の生産力は、培養ブロスの体積当たりの特定分子の質量として、細胞当たりの該分子の質量として、または細胞乾燥質量当たりの重量パーセント(percent per weight)(％(w/w))として、定量され得る。例えば、対応する野生型株に対する本発明の株など2種の株の生産力を互いと比較する場合、相対的生産力は、テルペン産生量の増加または減少として(単位:重量パーセント)定量され得る。
【００６７】
本発明において使用される場合、「野生型細胞」という用語は、遺伝子改変されていない、同じ種の酵母細胞を意味する。好ましくは、野生型細胞は、本発明の酵母細胞が由来するのと同じ鎖(strand)のものでよい。より好ましくは、野生型細胞は、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする機能的遺伝子を含まず、かつ/または該野生型細胞は、機能的なARE1遺伝子および/もしくは機能的なARE2遺伝子を含む。野生型細胞は、天然に存在する細胞でよく、かつ/または例えばAmerican Type Culture Collection(ATCC)のような細胞バンクから得ることができるものでもよい。
【００６８】
「対応する野生型細胞」という用語は、本発明の細胞と同じ遺伝的起源に由来するが、1つまたは複数の遺伝子変異が存在しない野生型細胞を意味する。対応する野生型細胞は、本発明の酵母細胞と同じ種のものであり、同じ株に由来する。さらに、好ましくは、対応する野生型細胞は、ARE1遺伝子および/またはARE2遺伝子中、特にARE1遺伝子およびARE2遺伝子中に欠陥の欠失(deletion of deficiency)を有していなくてよい。好ましくは、野生型細胞は、酵母細胞、より好ましくはサッカロミセス属細胞、さらにより好ましくはサッカロミセス・セレビシエ細胞、さらにより好ましくは、市販されている株のサッカロミセス・セレビシエ細胞、さらにより好ましくは、AH22株またはS288c株のサッカロミセス・セレビシエ細胞である。最も好ましくは、野生型細胞は、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞である。
【００６９】
「等価な」という用語は、+/-20％の誤差範囲内、より好ましくは+/-10％の誤差範囲内、さらにより好ましくは+/-10％未満の誤差範囲内の、上記に定義した対応する野生型細胞および/または対応する栄養要求性細胞と同一であるテルペン生産力を意味する。
【００７０】
好ましい態様において、前記細胞は、ステリルアシルエステルの産生量が減少しており、好ましくは、前記細胞は、ステリルアシルエステルの産生が欠損している。
【００７１】
本明細書において使用される場合、「量が減少」という用語は、より少量のステリルエステルの産生を意味する。産生量減少とは、対応する野生型細胞によって産生される量の100％未満、50％未満、40％未満、30％未満、20％未満、10％未満、8％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満、またはさらに1％未満のステリルアシルエステル生産力を意味し得る。例示的には、対応する野生型細胞は、AH22株の酵母細胞またはS288c株の酵母細胞、特にAH22株の細胞でよい。
【００７２】
「ステリルアシルエステルの産生が欠損」という用語は、ステリルエステルの形成が著しく不足していること(extensive absence)として理解され得る。生物系において、基礎レベルの非特異的活性は常にあると考えられることが理解される。したがって、本明細書において使用される場合、「著しい不足」という用語は、対応する野生型細胞において見出される濃度の5％未満、好ましくは1％未満、より好ましくは0.5％未満、さらにより好ましくは0.1％未満の濃度を意味し得る。
【００７３】
本発明の第2の局面は、
a)可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を酵母細胞中に挿入する段階;
b)該可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を含む細胞を選択する段階;
c)該細胞のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子を欠失させるか、または変異させる段階;
d)(i)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための1種もしくは複数種の酵素をコードする遺伝子カセットを挿入すること、ならびに/または
(ii)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための酵素をコードする1つもしくは複数の不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること(revertant mutagenesis)
によって、
特に、ヒスチジンの産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること、ならびにロイシンおよびウラシルの産生のための酵素をコードする遺伝子カセットを挿入することによって、
ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシル、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシル、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞に該細胞を変換する段階;
e)ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して原栄養性である細胞、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞、特に、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である細胞を選択する段階;ならびに任意で;
f)段階e)の細胞を培養する段階;ならびに任意で
g)段階e)または段階f)の細胞を単離し安定にさせる段階
を含む、本発明の細胞を作製する方法に関する。
【００７４】
酵母細胞およびその機能的特徴は、上記に詳述した。その中で明確にされた特徴は、本発明の方法によって作製される細胞にも当てはまることが理解される。
【００７５】
本明細書において使用される場合、「細胞を作製する」という用語は、本発明の細胞の提供として、最も広い意味で理解されてよい。親細胞は任意の酵母細胞でよいことが理解される。好ましくは、細胞は、野生型株の細胞である。例示的には、上記に詳述したように、野生型株は、AH22株またはS288c株、好ましくはAH22株でよい。最も好ましくは、細胞は、実施例において例示的に示すように作製される。
【００７６】
「遺伝子を挿入する」という用語は、酵母細胞中に遺伝子を組み入れる任意の手段を意味する。遺伝子は、例えば、DNA(二本鎖DNA(dsDNA)、一本鎖DNA(ssDNA))、RNA(一本鎖RNA(ssRNA)、二本鎖RNA(dsRNA))、DNA類似体、例えば、ペプチド核酸(PNA)、モルホリノ、グリコール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、もしくはメチル化DNA、またはそのハイブリッドなど遺伝情報の任意の担体上でコードされてよい。好ましくは、遺伝子は、DNA、より好ましくは二本鎖DNA、特に、環状二本鎖DNA鎖、特にプラスミド上でコードされる。プラスミドは、当技術分野において公知の任意のプラスミドでよい。例示的に、プラスミドは、YEpH2プラスミドまたはpUCプラスミドでよい。最も好ましくは、1つまたは複数の遺伝子は、実施例において例示的に示すように挿入されてよい。
【００７７】
遺伝情報は、ベクターとして細胞中に挿入されてよい。上記に詳述したように、ベクターは、例えば、直鎖ベクター、環状ベクター、ウイルスベクター、または細菌ベクターなど当技術分野において公知の任意のベクターでよい。好ましくは、ベクターは、直鎖DNAまたは環状DNA、より好ましくは環状DNA、特にプラスミドを含む。ベクターは、当技術分野において公知の任意の手段によって細胞中に挿入されてよく、トランスフェクション剤(例えば、ポリエチレンイミン(PEI)、フゲン(Fugene)、LT-1、JetPEI、トランスフェクタミン、リポフェクタミン、UptiFectin、PromoFectin、GenePORTER、Hilymax、カーボンナノファイバー、カーボンナノチューブ、細胞透過性ペプチド(CPP)、タンパク質形質導入ドメイン(PTD)、リポソーム、DEAE-デキストラン、デンドリマー)と組み合わせてもしくは組み合わせずに、エレクトロポレーションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、または遺伝子銃と組み合わせてもしくは組み合わせずに、光学的トランスフェクションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、遺伝子エレクトロトランスファーと組み合わせてもしくは組み合わせずに、インペールフェクションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、マグネトフェクションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、および/または磁石を利用したトランスフェクションと組み合わせてもしくは組み合わせずに、使用されてよい。好ましくは、ベクターは環状DNAベクターであり、より好ましくは、ベクターはプラスミドである。プラスミドは、例えば、YEpH2プラスミドまたはpUC19プラスミドなど当技術分野において公知の任意のプラスミドでよい。しかしながら、他のすべてのベクターもまた使用され得ることが理解され得る。
【００７８】
挿入された遺伝子は、細胞中で活性または不活性でよい。好ましくは、挿入された遺伝子は、細胞中で活発に転写され発現される。遺伝子は、核外プラスミドとして、核内プラスミドとして、核外直鎖ベクターとして、核内直鎖ベクターとして活発に転写され発現されてよく、または酵母細胞のゲノム中に挿入されてよい。本明細書において使用される場合、「ゲノム」という用語は、酵母細胞中の遺伝情報の実体を意味する。好ましくは、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子が、該酵母細胞のゲノム中に挿入される。任意で、HMG-CoA還元酵素は、別の遺伝子、例えば、ウラシル原栄養性のための遺伝子、例えばura3遺伝子などを置換してよい。その場合、結果として生じる細胞は、ウラシルに関して栄養要求性である。
【００７９】
好ましくは、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする前記遺伝子は、酵母細胞中で発現され、したがって、可溶性HMG-CoA還元酵素が該細胞によって産生される。
【００８０】
本発明の全体を通して使用される場合、「細胞を選択する」という用語は、細胞集団の所望の画分の富化(enrichment)を意味する。最も好ましくは、細胞は、実施例において例示的に示すように選択される。
【００８１】
前記可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を含む細胞という文脈において、該遺伝子を含む細胞は、その集団において富化される。細胞の選択は、懸濁培養液中で、または例えば寒天プレートのような固形材料を入れた培養プレート上で実施され得る。細胞を希釈し、それらを画線して単一の細胞のみに由来するコロニーを生じさせることによって、細胞を選択することができる。好ましくは、前記可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子の存在について、これらのコロニーを続いて試験する。あるいは、テルペンの生産力を測定することによって、細胞を機能的に試験してもよい。あるいはまたはさらに、選択圧下に細胞を置くことによって、細胞を選択することもできる。この選択圧は、所望の細胞集団のみが耐性である抗生物質でもよく、または所望の集団が好む増殖条件でもよい。前記可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を含む細胞を選択するという文脈において、これらの細胞は、該遺伝子を含む細胞が好む培地上または培地中で増殖させてよい。例示的に、酵母細胞のゲノム中に前記可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を組み入れることによってウラシル原栄養性のための遺伝子を置換する場合、細胞培養培地は、ウラシル栄養要求性酵母の選択を促進する5-FOA(5-fluoroorotic acid)(Boeke et al., 1987)を含んでよい。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「遺伝子を欠失させる」という用語は、遺伝子または該遺伝子の1つもしくは複数の部分の除去として理解され得る。その場合、この遺伝子は転写されず、遺伝子産物、すなわち対応するポリペプチドは産生されない。必ずしも遺伝子全体がゲノムから除去されなければならないわけではないことが理解され得る。好ましくは遺伝子の50％超、より好ましくは遺伝子の60％超、さらにより好ましくは遺伝子の70％超、さらにより好ましくは遺伝子の80％超、さらにより好ましくは遺伝子の90％超、さらにより好ましくは遺伝子の95％超、および最も好ましくは遺伝子の100％が欠失している。欠失は、末端欠失または中間欠失でよい。これは、実験によって、または自然に引き起こされてよい。遺伝子は、当技術分野において公知の任意の手段によって欠失させることができる。例えば、交差によって、またはcreリコンビナーゼ手順を用いて(Guldener et al, 1996)、遺伝子を欠失させてよい。最も好ましくは、1つまたは複数の遺伝子は、実施例において例示的に示すように欠失させてよい。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「遺伝子を変異させる」という用語は、該遺伝子の核酸配列の変更として、最も広い意味で理解されてよい。結果として生じる変異は、単一のヌクレオチド交換(点変異)でよく、またはフレームシフト変異でよい。好ましくは、遺伝子は、遺伝子産物、すなわちポリペプチドも、野生型ポリペプチドと比べて活性が低下しているポリペプチドももたらさないように、変異させられる。変異は、当技術分野において公知の任意の手段によって(例えば、放射線照射もしくは化学物質によって)、または(例えばPCRによる)部位特異的変異誘発によって、引き起こすことができる。変異はまた、天然に存在する突然変異率により、自然発生的に発生してもよい。変異は、フレームシフト変異または点(単一のヌクレオチド)変異を引き起こしてよい。例えば、変異は、実験によってまたは自然に引き起こされる非特異的変異誘発によって得られてよい。最も好ましくは、1つまたは複数の遺伝子は、実施例において例示的に示すように変異させられてよい。
【００８４】
変異は、例えば、放射線(例えば、紫外線(UV)照射、X線照射、放射性/核放射線(例えば、α線照射、β線照射、もしくはγ線照射)、もしくは宇宙放射線)または1種もしくは複数種の変異誘発物質(例えば、核酸塩基に対するアルキル化剤(例えば、ナイトロジェンマスタード(例えば、シクロホスファミド、メクロレタミンもしくはムスチン(HN2)、ウラムスチンもしくはウラシルマスタード、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド)、ニトロソ尿素(例えば、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン)、スルホン酸アルキル(例えば、ブスルファン)、チオテパおよびその類似体、白金誘導体(例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、四硝酸トリプラチン)、プロカルバジン、アルトレタミン、アフラトキシンおよびアフラトキシンならびにその代謝産物および誘導体、ニトライト、アニリンならびにその代謝産物および誘導体、ベンゼンならびにその代謝産物および誘導体、多環芳香族ならびにその代謝産物および誘導体)、ニトロソアミン、ヒ素、アスベスト、ベリリウムおよびその化合物、エチレンオキシド、六価クロム(VI)化合物、ラドン、塩化ビニル、タバコの煙など)によって引き起こされ得る。変異はまた、自然発生的に発生してもよい。
【００８５】
好ましくは、ステリルアシルトランスフェラーゼは、ARE1および/またはARE2である。好ましくは、ARE1遺伝子および/またはARE2遺伝子が欠失しており、より好ましくは、ARE1遺伝子およびARE2遺伝子が欠失している。
【００８６】
「変換する」という用語は、細胞の遺伝的特性を変更することとして、最も広い意味で理解されてよい。ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための1種もしくは複数種の酵素をコードする1つもしくは複数の遺伝子カセットを細胞中に挿入してよく、またはヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための酵素をコードする1つもしくは複数の不完全な遺伝子の復帰変異体への変異誘発による。最も好ましくは、細胞は、実施例において例示的に示すように変換される。
【００８７】
本明細書において使用される場合、「遺伝子カセット」という用語は、単一の生化学的機能のための1つまたは複数の遺伝子をコードするDNA配列構成単位(modular)として、最も広い意味で理解されてよい。これは、関心対象の1つまたは複数の遺伝子を有し、1つまたは複数の該遺伝子を発現することができる操作可能なDNA断片を意味してよく、制限部位の1つまたは複数のセットをさらに含んでもよい。好ましくは、1つまたは複数の遺伝子は、2つまたはそれ以上の制限部位の間に位置する。任意で、遺伝子カセットは、(通常はベクター上の)1つのDNA配列からゲノムへ移入され、本発明の細胞のゲノムのDNA配列を置換し得る。最も好ましくは、遺伝子カセットは、実施例において例示的に示すように欠失させられてよい。
【００８８】
本発明において、「復帰変異体への変異誘発」という用語は、以前の遺伝子型または特定の表現型的特徴に関して対応する野生型細胞の元の表現型を回復させる変異を意味する。その場合、好ましくは、不完全な遺伝子が修復される。例示的に、ヒスチジン栄養要求性細胞において、ヒスチジン産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子を復帰変異体に変異させると、ヒスチジン原栄養性細胞が生じ得る。最も好ましくは、復帰変異体への変異誘発は、実施例において例示的に示すように実施されてよい。
【００８９】
ヒスチジン産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子は、遺伝子カセットを挿入することによって、または復帰変異体への変異誘発によって修復され得る。好ましくは、遺伝子は、復帰変異体への変異誘発によって、より好ましくは、HIS4遺伝子の復帰変異体への変異誘発によって、修復される。
【００９０】
ロイシン産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子は、遺伝子カセットを挿入することによって、または復帰変異体への変異誘発によって修復され得る。好ましくは、遺伝子は、無傷の形態の該遺伝子を含む遺伝子カセットを挿入することによって、より好ましくは、LEU2遺伝子をコードする遺伝子カセットを挿入することによって、修復される。
【００９１】
ウラシル産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子は、遺伝子カセットを挿入することによって、または復帰変異体への変異誘発によって修復され得る。好ましくは、遺伝子は、無傷の形態の該遺伝子を含む遺伝子カセットを挿入することによって、より好ましくは、URA3遺伝子をコードする遺伝子カセットを挿入することによって、修復される。
【００９２】
ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して原栄養性である細胞という文脈において、原栄養性である細胞は、その集団において富化される。細胞の選択は、懸濁培養液中で、または例えば寒天プレートのような固形材料を入れた培養プレート上で実施され得る。細胞を希釈し、それらを画線して単一の細胞のみに由来するコロニーを生じさせることによって、細胞を選択することができる。続いて、各遺伝子の存在について、または表現型特性に基づいて、これらのコロニーを試験してよい。あるいはまたはさらに、選択圧下に細胞を置くことによって、細胞を選択することもできる。この選択圧は、各化合物を欠く培地もしくは所望の細胞集団のみが耐性である抗生物質を含む培地でもよく、または所望の集団が好む増殖条件でもよい。好ましくは、培地は、ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルを欠き、より好ましくは、該培地は、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルを欠き、特に、該培地は、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルを欠く。本明細書において使用される場合、「欠く」という用語は、該化合物が存在しないか、または微量しか存在しない濃度を意味する。
【００９３】
「細胞を培養する」という用語は、細胞を生存能力がある状態で維持することとして、最も広い意味で理解されてよい。細胞は、酵母細胞に適した条件で培養され得る。例示的に、酵母細胞は、懸濁培養で、または例えば寒天プレートのようなプレート上で培養され得る。懸濁培地または寒天は、酵母細胞に適した栄養素、例えば、1種もしくは複数種のアミノ酸、1種もしくは複数種のペプチド、1種もしくは複数種の脂質、1種もしくは複数種のビタミン、微量元素、および/または塩、1種もしくは複数種の増殖因子、ならびに1種もしくは複数種の緩衝剤などを含んでよい。細胞は、好気条件または嫌気条件で培養され得る。温度は、当業者に公知の細胞に適した範囲にあってよい。例示的に、酵母の場合、温度は典型的には、18℃〜40℃の間の範囲、好ましくは20℃〜37℃の間、より好ましくは、20℃〜30℃の間の範囲、さらにより好ましくは25℃〜30℃、最も好ましくは30℃でよい。培地のpH値は、酵母細胞に適した範囲にあってよい。大半の酵母細胞にとって、適切なpHは、中性または若干塩基性のpHである。最も好ましくは、細胞は、実施例において例示的に示すように培養される。
【００９４】
好ましくは、細胞の培養は、細胞の増殖をもたらす。増殖は、酵母細胞の細胞分裂、酵母細胞の出芽、胞子の形成、1つもしくは複数の配偶子の形成、および/または有性生殖から起こり得る。より好ましくは、酵母細胞の増殖は、細胞分裂または出芽である。
【００９５】
細胞の培養は、実験室規模の培養、すなわち、いくつかの培養プレートまたは数ミリリットルから最高で数リットルまでの培養ブロスからなる懸濁培養液の培養を含み得る。さらに、細胞の培養は、準技術的(semi-technical)規模の培養、すなわち、数リットルの培養ブロスからなる懸濁培養液の培養および工業規模の培養、すなわち、数リットルまたはさらに数平方メートルの培養ブロスからなる懸濁培養液の培養を含み得る。本明細書において使用される場合、「培養ブロス」という用語は、細胞および培地を含む。任意で、懸濁培養液は、撹拌または振盪されてよい。任意で、懸濁培養液は、通気、換気、および/または脱気されてよい。細胞は適切な圧力下で培養されてよく、圧力は、大気圧、大気圧より高い圧力(excess pressure)、または大気圧より低い圧力(underpressure)でよい。典型的には、細胞は、大気圧または大気圧より少し高い圧力で培養され得る。
【００９６】
テルペン生産のために、細胞は、任意の期間、好ましくは少なくとも30分、少なくとも2時間、少なくとも10時間、少なくとも24時間、少なくとも48時間、少なくとも72時間、またはさらに最長1週間、最長1ヶ月、もしくは最長数ヶ月、培養され得る。細胞は、数世代に渡って培養され得る。細胞は、1世代より長く、5世代より長く、10世代より長く、15世代より長く、20世代より長く、25世代より長く、30世代より長く、35世代より長く、50世代より長く、100世代より長く、またはさらに長く、培養され得る。
【００９７】
本発明において使用される場合、細胞という文脈における「単離する」という用語は、本発明の細胞の濃縮を最も広い意味で意味する。細胞は、採取され得る。細胞は、当技術分野において公知の任意の手段、例えば、遠心分離、ろ過、クロスフローろ過、クロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー)、または固体表面もしくは培養プレートの表面剥離(abrasion)もしくは拭き取り(swabbing off)によって単離することができる。あるいは、細胞は、時間とともに沈降する(decent)場合もあり、または該細胞を含む容器へのガス供給(gassing)により浮く場合もある。あるいは、細胞は単離されないが、細胞および培地が、その後一緒に処理される。
【００９８】
単離された細胞は、適切な緩衝液または培地でさらに洗浄されてよい。好ましくは、細胞は、遠心分離、ろ過、クロスフローろ過、またはクロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー)によって洗浄することができる。単離された細胞は、当技術分野において公知の任意の手段によって解析することができる。単離された細胞は、粉砕されるか、培養プレート上に画線されるか、懸濁培養液中に接種されてよく、または安定化されてよい。最も好ましくは、細胞は、実施例において例示的に示すように単離される。
【００９９】
本発明において使用される場合、細胞という文脈における「安定化する」という用語は、細胞を保護する任意の手段を意味する。好ましくは、細胞は、比較的長い期間保存されることができ、生細胞培養物を後で形成させるのに使用できるように、安定化される。
【０１００】
細胞は、凍結、凍結乾燥、または乾燥によって安定化され得る。好ましくは、細胞は凍結される。細胞は、-20℃、-80℃、ドライアイス上、または液体窒素中で凍結され得る。好ましくは、細胞は、酵母細胞を凍結するのに適した媒体中で凍結され得る。この媒体は、グリセロールを含んでよい。好ましくは、細胞は、2％(v/v)超、5％(v/v)超、10％(v/v)超、20％(v/v)超、30％(v/v)超、40％(v/v)超、または50％(v/v)超のグリセロールを添加した水性緩衝液または水中で安定化され得る。例示的に、酵母細胞は、水中に50％(v/v)グリセロールを含む媒体中で凍結され得る。本発明の全体を通して使用される場合、略語v/vは、体積/体積を意味する。グリセロール溶液中で安定化された1バッチ分の細胞は、グリセロールストックと名付けられてよい。あるいは、酵母細胞は、好ましくは、例えばクエン酸など(citric aci.e.er)のような乳化剤を添加することによって、乾燥または凍結乾燥されてよい。乾燥された細胞または凍結乾燥された細胞は、任意の温度で、例えば、室温、周囲温度、-4℃、-20℃、-80℃などで、ドライアイス上で、または液体窒素中で、乾燥条件下で保存され得る。最も好ましくは、細胞は、実施例において例示的に示すように安定化される。
【０１０１】
安定化された細胞は、少なくとも1日より長く、好ましくは5日より長く、より好ましくは1週間より長く、さらにより好ましくは1ヶ月より長く、およびさらにより好ましくは1年より長く、安定であり得る。先に示したように、「安定な」とは、保存期間後に生細胞培養物を形成させるのに細胞を使用できることを意味する。
【０１０２】
あるいは、細胞は単離されないが、細胞および培地が、その後一緒に処理される。
【０１０３】
好ましい態様において、本発明の方法で使用される細胞は酵母細胞であり、好ましくは、該細胞はサッカロミセス属細胞であり、より好ましくは、該細胞はサッカロミセス・セレビシエ細胞であり、特に、該細胞は、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する。
【０１０４】
本発明の好ましい細胞は、上記に詳細に特徴付けた。
【０１０５】
さらに好ましい態様において、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を酵母細胞中に挿入する段階は、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードするベクターの挿入を含み、該可溶性HMG-CoA還元酵素の発現は、該細胞中で活性なプロモーター、好ましくは構成的プロモーター、特に、強力な構成的プロモーターの制御下にある。
【０１０６】
さらに好ましい態様において、ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子は、ARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している。
【０１０７】
本発明の第3の局面は、1種または複数種のテルペンを生産するため、好ましくは、1種または複数種のトリテルペンを生産するため、特に、スクアレンを生産するための、本発明の細胞の使用に関する。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、「生産」という用語は、テルペンを得るための任意の手段を意味し得る。生産は、任意の規模の生産を含み得る。生産は、実験室規模の生産、すなわち、数マイクログラム、数ミリグラム、または数グラムのテルペンの生産を含み得る。生産は、準技術的規模の生産、すなわち、数グラムまたは数キログラムのテルペンの生産を含み得る。さらに(Further)、生産は、工業規模の生産、すなわち、数キログラムまたは数トンのテルペンの生産を含み得る。生産は、テルペンを精製または保護するための1つまたは複数のさらなる技術的段階をさらに含んでよい。
【０１０９】
大半のテルペンは疎水性が高いため、典型的にはテルペンは細胞中に蓄積される。第1の段階において、当技術分野の任意の手段、例えば、遠心分離、ろ過、クロスフローろ過、クロマトグラフィー(例えば、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー)、または固体表面もしくは培養プレートからの表面剥離もしくは拭き取りなどによって、細胞を採取することができる。次に、任意の手段、好ましくは、遠心分離、ろ過、またはクロスフローろ過によって、細胞沈殿物を得ることができる。あるいは、細胞は、時間とともに沈降する場合もあり、または該細胞を含む容器へのガス供給により浮く場合もある。任意で、細胞は、当技術分野において公知の任意の手段、例えば、遠心分離、ろ過、またはクロスフローろ過によって洗浄される。細胞沈殿物は、乾燥させてもよく、または乾燥させなくてもよい。細胞は、当技術分野において公知の任意の手段によって溶解することができる。細胞は、機械的力によって(例えば、ホモジナイゼーションによって(例えば、PotterホモジナイザーもしくはDownsホモジナイザーによって)、例えばフレンチプレスのような細胞プレスによって)、界面活性剤によって、超音波処理によって、または溶解性ファージによって、溶解させることができる。任意で、テルペンは、例えば有機溶媒を用いた溶媒抽出によって抽出されてよい。任意で、有機溶媒は、その後に蒸発させてよい。あるいはまたはさらに、テルペンは、個々の化学的性質に応じて、クロマトグラフィーによる方法(例えば、相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高圧液体クロマトグラフィー(UPLC)、高速タンパク質クロマトグラフィー(FPLC))によって、電気泳動、キャピラリー電気泳動(CE)によって、または蒸留によって、単離され得る。
【０１１０】
本発明のさらなる局面は、
a)適切な培地中で本発明の細胞を培養する段階;および
b)段階a)の細胞または細胞培養物から、1種または複数種のテルペン、好ましくは1種または複数種のトリテルペン、さらに特にスクアレンを単離する段階を含む、
1種または複数種のテルペン、好ましくはトリテルペン、さらに特にスクアレンを生産するための方法に関する。
【０１１１】
テルペンの効率的な生産のために、細胞は、少なくとも数時間、好ましくは、少なくとも12時間、より好ましくは少なくとも24時間、さらにより好ましくは少なくとも48時間、もしくは少なくとも72時間、またはさらに長く、培養されなければならないことが、当業者には理解されると考えられる。細胞は、数世代に渡って培養され得る。細胞は、5世代より長く、10世代より長く、15世代より長く、20世代より長く、25世代より長く、30世代より長く、35世代より長く、50世代より長く、100世代より長く、またはさらに長く、培養され得る。懸濁培養液は、撹拌または振盪されてよい。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、「1種または複数種のテルペンを単離する」という用語は、培養ブロスからのテルペンの精製として、最も広い意味で理解されてよい。テルペンは、細胞中に蓄積される場合があり、または細胞によって分泌され、したがって、培地中に存在する場合がある。
【０１１３】
前述したようにして細胞は採取され、任意で洗浄される。続いて、細胞は、当技術分野において公知であり、上記に示した任意の手段によって溶解されてよい。任意で、テルペンは、例えば有機溶媒を用いた溶媒抽出によって抽出されてよい。任意で、有機溶媒は、その後に蒸発させてよい。あるいはまたはさらに、テルペンは、個々の化学的性質に応じて、クロマトグラフィーによる方法(例えば、相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、超高圧液体クロマトグラフィー(UPLC)、高速タンパク質クロマトグラフィー(FPLC))によって、電気泳動、キャピラリー電気泳動(CE)によって、または蒸留によって、単離され得る。
【０１１４】
本発明のさらなる局面は、
a)本発明による1種または複数種のテルペンを生産する段階;および
b)該テルペンを薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油、特にワクチン組成物に混合する段階;
を含む、薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油を製造するため、特にワクチン組成物を製造するための方法であって、
該1種または複数種のテルペンは、任意で、1つまたは複数の水素添加段階にさらに供され、該1種または複数種のテルペンは、好ましくは、水素添加されたトリテルペン、特にスクアランである、
方法に関する。
【０１１５】
「混合する」という用語は、関心対象の組成物へのテルペンの添加として、最も広い意味で理解されてよい。
【０１１６】
薬学的組成物とは、本発明の細胞によって得ることができるテルペンを含む任意の薬学的組成物を意味し得る。薬学的組成物において、テルペンは、好ましくは、アジュバントとして、皮膚の保湿剤として、粘液溶解剤として、ホルモンとして、芳香剤として、滑沢剤として、抗菌剤として、抗炎症剤として、または抗酸化剤として、使用されてよい。
【０１１７】
美容的組成物とは、本発明の細胞によって得ることができるテルペンを含む任意の美容的組成物を意味し得る。美容的組成物において、テルペンは、好ましくは、皮膚の保湿剤として、芳香剤として、または抗酸化剤として、使用されてよい。テルペンはまた、食品添加物としても使用され得る。さらに、テルペンは、フェロモンとして(例えば、害虫駆除のための昆虫フェロモン)、ホルモンとして(例えば、害虫駆除のための昆虫フェロモン)、滑沢剤として、電気絶縁体として、変圧器油または変圧器油添加剤として、ならびに化学工業、製薬産業、および美容産業における原料化学物質としても、使用され得る。
【０１１８】
好ましくは、本発明の方法によって得られるテルペンは、スクアレンである。スクアレンは、好ましくは、薬学的組成物および美容的組成物中の添加剤として、皮膚の保湿剤として、滑沢剤として、変圧器油または変圧器油添加剤として、および化学工業における原料化学物質として、使用され得る。より好ましくは、本発明の方法によって得られるスクアレンは、薬学的組成物および美容的組成物中で、特に、ワクチンアジュバントとして使用され得るエマルジョンの調製において、使用され得る。
【０１１９】
テルペンは、1種または複数種の水素添加テルペン、好ましくは、1種または複数種の水素添加トリテルペンの生産のために使用され得る。特に、スクアレンは、スクアランの生産のために使用され得る。この目的のために、スクアレンは、当技術分野において公知の任意の手段による1つまたは複数の水素添加段階に供されてよい。
【０１２０】
本明細書において使用される場合、「水素添加する段階」という用語は、水素の添加による、1つまたは複数の二重結合または三重結合、好ましくは、1つまたは複数の二重結合、特に、テルペンの炭素原子間の1つまたは複数の二重結合の水素添加を意味する。例示的に、テルペンは、触媒的コンバーター(catalytic converter)(例えば、白金ベース、パラジウムベース、ロジウムベース、ニッケルベース、イリジウムベース、および/もしくはルテニウムベースの触媒)、水素もしくは水素を含有する気体混合物のガス供給、例えば水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤との反応、酵素的プロセス(例えば、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)変換酵素および/もしくはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸(NADPH)変換酵素による)、またはこれらの2つもしくは複数の組合せによって、水素添加され得る。また、NADH変換酵素および/またはNADPH変換酵素は、本発明の細胞のゲノム中にクローニングされてもよい。好ましくは、水素添加されたテルペンにおいて、テルペン分子の大半またはさらにはすべての二重結合および/または三重結合が水素添加され、より好ましくは、テルペン分子のすべての二重結合および/または三重結合が水素添加される。好ましくは、水素添加されたテルペンは、水素添加されたトリテルペン、より好ましくは、水素添加されたスクアレンである。最も好ましくは、水素添加されたテルペンは、スクアランである。スクアランは、好ましくは、美容的組成物または薬学的組成物、特に、美容的製品において使用され得る。
【実施例】
【０１２１】
以下の実施例ならびに添付図面は、説明される本発明の例示的な態様および本明細書における特許請求の範囲を提供することを意図する。これらの実施例は、発明された主題の範囲にいかなる限定を与えることも意図しない。
【０１２２】
実施例1
AH22tH3ura8Δare1Δare2株の構築
1.1  土台となる(Basis)AH22tH3ura8株(Polakowski et al., 1998)
AH22tH3ura8は、S288c(Mortimer and Johnston, 1986)の派生株であるAH22株(Hinnen et al., 1978)に基づいている。S288c株およびAH22株は、American Type Culture Collection(ATCC)から得ることができる。S288c株は、ATCC番号26108という名称でATCCから得ることができる。AH22株は、ATCC番号38626という名称でATCCから得ることができる。
【０１２３】
AH22は以下のように特徴付けられている:
遺伝子型:MATa leu2-3 leu2-112 his4-519 can1
表現型:leu2、his4
【０１２４】
酵母サッカロミセス・セレビシエのAH22株は、安全なものとして通常認識されている微生物群に属する(バイオセーフティレベル1)。AH22株のグリセロールストックを調製した。
【０１２５】
URA3座位にtHMG1発現カセットを組み込むことによって、AH22tH3ura8株を構築した(Polakowski et al., 1998)。この発現カセットは、短縮された構成的なタイプのADH1プロモーター、短縮されたタイプのHMG1遺伝子、およびTRP1ターミネーターを含む(構築の詳細については下記を参照されたい)。
【０１２６】
AH22tH3ura8株は以下のように特徴付けられている:
遺伝子型:MATa leu2-3 leu2-112 his4-519 can1 ura3::tHMG1
表現型:ura3、leu2、his4
【０１２７】
1.2  URA3座位へのtHMG1発現カセットの組込み(クローニング戦略および組込み)
ベクターpPTHTLのためのクローニング戦略
標準的方法を用いて、サッカロミセス・セレビシエ株S288c(Mortimer and Johnston, 1986)のゲノムDNAから、tHMG1のDNA配列(Basson et al., 1988)をPCRによって増幅させた。この目的のために使用したプライマーは、DNAオリゴマーtHMG-5'およびtHMG-3'である(表1)。得られたDNA断片(SEQ ID NO: 2)を、クレノウ処理後にクローニングベクターpUC19(Yanisch-Perron et al., 1985)のSmaI部位に導入し、ベクターpUC19-tHMG1を生じさせた(図1を参照されたい)。
【０１２８】
プラスミド単離ならびにエンドヌクレアーゼEcoR1およびBamH1によるpUC19-tHMG1の制限処理(restriction)の後、得られた断片を、同様にEcoR1およびBamH1で処理した酵母発現ベクターpPT2b(Lang and Looman, 1995)に導入した。得られたプラスミドpPT2b-tHMG1は、短縮型ADH1プロモーター(Bennetzen and Hall, 1982)およびTRP1ターミネーター(Tschumper and Carbon, 1980)、ならびにその間のtHMG1コード領域を含む。XhoIおよびSalIを用いて酵母ベクターYEp13(Parent et al., 1985)からLEU2遺伝子を切り出し、Nru1を用いて制限処理したベクターpPT2b-tHMG1(いわゆる中程度の長さのADH1プロモーター、tHMG1遺伝子、およびTRP1ターミネーターを含む)に平滑末端を連結して、ベクターpPTHTLを得た(図1を参照されたい)。
【０１２９】
ベクターYEpH2のためのクローニング戦略
(SphIによって)線状化したベクターYEp13とEcoRVおよびNruIを用いてベクターpPT2b-tHMG1(図1)から切り出したtHMG1発現カセット(短くされた形態のADH1プロモーター;EcoRV部位の下流、Bennetzen and Hall, 1982)とを平滑末端連結することによって、ベクターYEpH2(図2を参照されたい)を構築した。
【０１３０】
組込みベクターYDpUHK3のためのクローニング戦略
EcoRVおよびNruIを用いてベクターYEpH2(図2を参照されたい)から切り出したtHMG1発現カセットを、Stulで処理したベクターYDpU(Berben et al., 1991)に導入(連結)した。得られたベクターYDpUH2/12(図3を参照されたい)をエンドヌクレアーゼSma1で処理し、カナマイシン耐性をコードするベクターpUCTK23のHindII断片と連結した(Webster and Dickson, 1983)。作製される構築物(YDpUHK3、図3を参照されたい)を、酵母形質転換の前にEcoRVで処理した。Gietzらによって説明されている酢酸リチウム法(Gietz, D., et al., 1992)により、この構築物を用いて酵母株サッカロミセス・セレビシエAH22(Hinnen et al., 1978)を形質転換した。この線状化ベクターによる酵母の形質転換の結果、URA3遺伝子座にベクター全体(total vector)の染色体組込みが起こる(図4を参照されたい)。発現カセットの部分ではない、組み込まれたベクターに由来する領域(大腸菌(E. coli)複製起点、大腸菌アンピシリン耐性遺伝子、TEFプロモーター、およびカナマイシン耐性遺伝子)を除去するために、ウラシル栄養要求性酵母の生育を促進する(promotes)5-FOAによる選択圧(Boeke et al., 1987)に形質転換酵母をかけた。5-FOAを含むプレート上で選択されたウラシル栄養要求性株(AH22tH3ura8)は、URA3座位への染色体組込みとしてのtHMG1発現カセットを示す(図4を参照されたい)。
【０１３１】
SEQ ID NO: 3は、(URA3コード領域を含む(図4Dを参照されたい))AH22tH3ura8株のURA3座位に組み込まれたtHMG1発現カセットの配列を表す。
【０１３２】
1.3.  AH22tH3ura8株における遺伝子ARE1、ARE2の欠失
標的座位ARE1およびARE2に相同である短いフランキング配列を導入するプライマー(それぞれ、are1creloxフォワード(fw)、are1creloxリバース(rev)、およびare2crelox fw、are2crelox rev;表1)を用いて、kanMXマーカー遺伝子(ジェニチシン(geniticin)耐性をコードする)を有する欠失カセットをプラスミドpUG6(Guldener et al., 1996)(図6を参照されたい)から増幅させた(図5を参照されたい)。Gietzらによって説明されている酢酸リチウム法(Gietz, D., et al., 1992)により、欠失カセット(SEQ ID NO: 4およびSEQ ID NO: 5の配列)を酵母に形質転換した。
【０１３３】
対応する遺伝子の消失をもたらす、標的座位へのカセットの組込みの後、その後の染色体欠失または染色体組込みそれぞれのためにこのマーカーを再使用できるようにするために、creリコンビナーゼ手順(Guldener et al., 1996)によって、マーカー遺伝子kanMXを回復させた。
【０１３４】
creリコンビナーゼ手順は、酵素creリコンビナーゼのための遺伝子を有するプラスミドpSH47(図6を参照されたい)による酵母株の形質転換を必要とする。この酵素は、kanMX耐性遺伝子に隣接する2つのloxP部位を組み換えることができる。この組換え事象は、このマーカー遺伝子の消失を招いて、標的座位に1つのloxP部位を残す。
【０１３５】
プラスミドpSH47を失ったコロニーを、5-フルオロオロチン酸を含むプレート上での対抗選択によって同定し(Guldener et al., 1996)、さらに構築するために、または最終的な株として採取した。
【０１３６】
（表１）AH22tH3ura8Δare1Δare2株を構築するために使用されたオリゴヌクレオチド(プライマー)
2014510524.tif 000002
【０１３７】
AH22tH3ura8Δare1Δare2株のグリセロールストック10個を調製した。表1の大文字は、各組込み遺伝子カセットが組み込まれる/組み込まれた、標的座位の相同領域を表す。これらの領域は、(相同組換えによる;例えば、それぞれARE1およびARE2)標的座位への遺伝子カセットの染色体組込みに関与し得る。したがって、これらの領域は、組込みカセットの最初の部分および最後の部分に位置し得る。
【０１３８】
実施例2
構築された株の中性脂質組成物および遊離ステロールを薄層クロマトグラフィー(TLC)によって評価した。すべての脂質の抽出および薄層クロマトグラフィーを以下のプロトコールに従って実施した。
【０１３９】
TLC(thin layer chromatography)解析:
培養手順
TLC解析のための酵母サッカロミセス・セレビシエ株の培養手順は以下のとおりであった:
前培養:100ml容振盪フラスコに入れたWMVIII培地20mlに、対応するグリセロールストック50μlを接種し、30℃および150rpmで48時間、培養する。
本培養:250ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れたWMVIII培地50mlに、1％の前培養物を接種し、30℃および150rpmで72時間、培養する。
【０１４０】
試料調製:
3×0.5mLの培養ブロスをエッペンドルフチューブに採取し(三つ組)、4000rpm、5分の遠心分離によって沈殿させた。上清を廃棄する。酵母沈殿物をTE緩衝液(pH=8.0)200μLに再懸濁した。ガラスビーズ200μLおよびクロロホルム/メタノール(80:20(体積％))200μLを添加した。
【０１４１】
試料を1分間、5回ボルテックスした(各回の間に(in between)氷上で冷却する)。エッペンドルフチューブの底に針で穴を開けた。反応チューブを別の1.5ml容エッペンドルフチューブに入れ、遠心分離した(1000g、2分間)。ガラスビーズを含む上側のエッペンドルフチューブを廃棄した。下側のエッペンドルフチューブを閉じ、遠心分離した(13,000g、15分)。遠心分離の間に、沈殿物の上側および下側の相が形成される。下側の有機化合物(organic)を1.5ml容エッペンドルフチューブに移し、薄層クロマトグラフィーによって解析した。
【０１４２】
TLC(thin layer chromatography):
固定相:シリカゲル60 F254、10×20cm、シリカ層の厚さ0.2mm。
移動相:石油エーテル:ジエチルエーテル:酢酸(90:10:1(体積％))
試料の量:10μL
実行時間:プレートの上端から1cm下に至るまで。
検出:ヨウ素蒸気による染色(スクアレン(squalen)、トリアシルグリセロール、ステロール、およびステリルエステルの検出)。
【０１４３】
結果:
図8は、野生型株AH22ura3、調節解除されたHMG-CoA還元酵素を有する株AH22tH3ura8、および二重欠失株AH22tH3ura8Δare1Δare2の全/中性脂質組成物を示す。図8は、調節解除されたHMG−CoA還元酵素を発現し、多量のスクアレンを産生するレーン3〜6の株と比較すると、野生型株(AH22ura3、レーン1および2)は極めて少量のスクアレンしか産生しなかったことを示す。ステリルエステルの形成に関与する酵素をコードする遺伝子(ARE1、ARE2)の欠失は、対応する株におけるこれらの成分の完全な欠乏をもたらした(レーン5〜6の上側の黒い四角で示す)。ステリルエステルの形成に関与する酵素をコードする遺伝子(ARE1、ARE2)の欠失は、遊離ステロールの蓄積を招かなかった(レーン3および4をレーン5および6と比較されたい;下側の黒い四角で示す)。ステリルエステルとしてステロールを貯蔵する能力を欠く株では遊離ステロールの含有量が増加すると予想されていたため、これは意外であった。
【０１４４】
脂質成分は、スクアレン、コレステリルオレアート、トリオレアート、オレアート、およびエルゴステロールの標準物質(示さず)を用いて同定した。
【０１４５】
実施例3
AH22tH3ura8Δare1Δare2株-原栄養性(最終株1)の構築ならびに細胞バンクの作製(manufacture)および保管
3.1.  株構築の詳細、プライマー、および配列決定
AH22tH3ura8Δare1Δare2H株(中間株1)の構築:
接種用ループを用いてAH22tH3ura8Δare1Δare2の液体培養物を画線した後に、ヒスチジンを欠くプレート上で、AH22tH3ura8Δare1Δare2株のHIS4原栄養性クローン(復帰変異体)を選択した(下記を参照されたい)。
【０１４６】
AH22tH3ura8Δare1Δare2HL株(中間株2)の構築:
プライマー1およびプライマー2(プライマー配列については表2を参照されたい)を用いて、S288c株のゲノムDNAから、遺伝子LEU2のコード領域を増幅させた。得られた遺伝子カセットをAH22tH3ura8Δare1Δare2H株に形質転換した。プライマー3およびプライマー2(LEU2座位の5'UTR領域およびLEU2コード領域にアニールする;プライマー配列については表2を参照されたい)を用いたPCR解析により、相同組換えを介して標的座位LEU2(YCL018W)に正確に組み込まれたかを確認した。
【０１４７】
AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株(最終株1)の構築:
標的組込み座位に相同である5'および3'のオーバーハング配列(長さ40bp)を導入するプライマープライマー4およびプライマー5を用いて、S288c株のゲノムDNAから、遺伝子URA3の完全な天然の発現カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)を増幅させた。遺伝子URA3の天然の座位は、tHMG発現カセットがAH22tH3ura8Δare1Δare2HL株のこの座位に組み込まれるため、標的座位として使用しなかった。代替の染色体発現座位として、HO座位を選択した。天然のURA3発現カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)を、AH22tH3ura8Δare1Δare2HL株に形質転換した。プライマー6およびプライマー7(HO座位の5'UTR領域および3'UTR領域にアニールする;プライマー配列については表2を参照されたい)を用いたPCR解析により、相同組換えを介して標的座位HO(YDL227C)に正確に組み込まれたかを確認した。
【０１４８】
配列決定:
変異his4-519(フレームシフト変異、野生型5'-CCC-3'グリシンコドンの代わりに5'-GGGG-3'mRNA配列をもたらす塩基挿入を含む(Gaber and Culbertson, 1982))の復帰変異は、PCR増幅産物を配列決定することによって証明した。このPCR増幅産物は、プライマー8およびプライマー9(HIS4コード領域の中央およびHIS4座位の3'UTR領域にアニールする;プライマー配列については表2を参照されたい)を用いて、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のゲノムDNAから対応するHIS3コード配列を増幅させることによって、生じさせた。
【０１４９】
結果:配列は正確である(http://www.yeastgenome.orgに寄託されているS288cの配列に対応する)。変異his4-519の復帰変異が起こっていた。his4-519変異の場合、ヒスチジン栄養要求性表現型の復帰変異はまた、グリシンtRNAにおける遺伝子外抑圧変異を介しても起こり得る(Gaber and Culbertson, 1982)。
【０１５０】
PCR増幅産物を配列決定することによって、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のLEU2座位(YCL018W)におけるLEU2コード領域の配列が正しいことを証明した。このPCR増幅産物は、プライマー3およびプライマー2(プライマー配列については表2を参照されたい)を用いて、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のゲノムDNAからLEU2座位の5'UTRの一部分を含むLEU2コード配列全体を増幅させることによって生じさせた。
【０１５１】
結果:
配列は正確である(http://www.yeastgenome.orgに寄託されているS288cの配列に対応する)。
【０１５２】
PCR増幅産物を配列決定することによって、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のHO座位(YDL227C)に組み込まれた遺伝子URA3の天然の発現カセット(天然のプロモーターおよびターミネーターを含む)の配列が正しいことを証明した。このPCR増幅産物は、プライマー6およびプライマー7(HO座位の5'UTR領域および3'UTR領域にアニールする;プライマー配列については表2を参照されたい)を用いて、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のゲノムDNAから遺伝子URA3の発現カセットを増幅させることによって生じさせた。
【０１５３】
結果:
配列は正確である(http://www.yeastgenome.orgに寄託されているS288cの配列に対応する)。
【０１５４】
（表２）AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株を構築するために使用されたオリゴヌクレオチド(プライマー)
2014510524.tif 000003
【０１５５】
3.2  中間株1のAH22tH3ura8Δare1Δare2Hのグリセロールストックの調製
LangおよびLoomanによって示されているようにして、WMVIII培地を調製した(Lang and Loomann, 1995)。
【０１５６】
100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたウラシル(100mg/L)およびロイシン(400mg/L)添加WMVIII培地20mlにおいて、AH22tH3ura8Δare1Δare2株をグリセロールストック50μlで接種し、30℃および150rpmで72時間、インキュベートした(接種材料0)。
【０１５７】
接種材料0は、ウラシル(100mg/L)およびロイシン(400mg/L)を添加したWMVIII寒天プレート(ヒスチジン無し)上に、接種用ループを用いてを画線し、30℃で72時間、これをインキュベートした(プレート1)。コロニーの数(復帰変異体の数)は測定しなかった。
【０１５８】
接種材料1は、100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたウラシル(100mg/L)およびロイシン(400mg/L)添加WMVIII培地20mLにおいて、プレート1から採取したコロニーを接種し、30℃および150rpmで72時間、インキュベートした(接種材料1)。
【０１５９】
接種材料2は、100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたウラシル(100mg/L)およびロイシン(400mg/L)添加WMVIII培地35mLにおいて、350μLの接種材料1を接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(接種材料2)。
【０１６０】
接種材料2を用いて、中間株1(AH22tH3ura8Δare1Δare2H)のグリセロールストックを調製した。0.5mLの接種材料2をグリセロール溶液(50％(v/v)グリセロール水溶液)0.5mLと混合することによって、グリセロールストックを調製した。中間株1(AH22tH3ura8Δare1Δare2H)のグリセロールストック10個をドライアイス上で輸送することができた。
【０１６１】
接種材料2の試験:
a)接種材料2の光学濃度:
OD600/mL:39.44
【０１６２】
b)接種材料2の細胞の生存能力(グリセロールストックの調製前):
コロニー形成単位を細胞数で割り、100を掛ける(×100)ことによって、接種材料2の細胞の生存能力(単位:％)を算出した。細胞数は、ト―マ(Thoma)計数チャンバー中で計数することによって測定した。ウラシル(100mg/L)およびロイシン(400mg/L)を添加したWMVIII寒天プレート上に、接種材料2の適切な希釈物を画線することによって、コロニー形成単位を測定した。
【０１６３】
c)トーマ計数チャンバー:接種材料2の1:10希釈物
計数1:34;31;38;32;39
計数2:31;37;31;33;31
33.7細胞×1.25×106×10=4.2×108細胞/mL接種材料2
【０１６４】
d)プレート上のコロニー:
接種材料2の10-5倍希釈物50μlがWMVIIIプレート上に播種される
計数:207コロニー×105×20=4.14×108コロニー/mL接種材料2
生存能力:4.1×108×100/4.2×108→98.6％
【０１６５】
接種材料2の細胞の生存能力:98.6％
【０１６６】
e)純度および表現型:
【０１６７】
（表３）接種材料2(指定したように、水で10-5倍まで希釈したものまたは希釈していないもの)50μlを指定のプレートに画線し、指定の温度で48時間インキュベートして、純度および表現型(栄養要求株)を決定した
2014510524.tif 000004
【０１６８】
また、顕微鏡下で、細菌汚染について接種材料2を検査した→細菌汚染を検出することはできなかった。
【０１６９】
3.3  中間株2の構築および中間株2のAH22tH3ura8Δare1Δare2HLのグリセロールストックの調製
構築(技術的手順):
形質転換およびLEU2座位へのLEU2発現カセットの正確な組込みに関するPCRによる証明は、当技術分野において周知であり、後述する手段によって実施する。
【０１７０】
酵母形質転換の結果:
Gietzらによって説明されているようにして、形質転換を実施した(Gietz, D., et al., 1992)。形質転換効率(組込み形質転換)は、DNA 1μg当たり形質転換体102〜103個の間を変動した。
【０１７１】
対照プレート上で培養した試料1(AH22tH3ura8Δare1Δare2HおよびDNA無し)は、コロニーの増殖をもたらさない。AH22tH3ura8Δare1Δare2H+LEU2カセットを挿入された試料2を培養すると、検出可能な異なるコロニーが生じる。
【０１７２】
15個のコロニーを新しいWMVlllプレート上に採取し、30℃で72時間インキュベートした。PCRによって、5個のコロニーを検査した。グリセロールストックを調製するために、最も大きなコロニーを選択した。5個のコロニーを実験によって評価したところ、5個のコロニーすべてが使用可能であることが明らかになった。5つの試料はいずれも、解析したDNAがLEU2遺伝子を含むことを示した。
【０１７３】
PCR:
鋳型は、酵母形質転換のコロニーから、新しい寒天プレート上の2接種（the 2. inoculation）から、得た。PuRe Taq Ready To Go-Beads(GE Healthcare:ロット番号:384777)を、体積25μl中でTaq-ポリメラーゼとして使用する。
【０１７４】
これは、無菌HPLC-H2O 23μl中に溶解したビーズをもたらし、フォワード/リバース(fw/rev)の各プライマー1μlを添加した(表を参照されたい)。使用するPCR機器は、Flex Cycle Analytik, Jenaから入手した。
【０１７５】
PCRプログラム
ステップ1:94℃  3分
ステップ2:94℃  30秒
ステップ3:53℃  30秒
ステップ4:72℃  2分からステップ2までを40サイクル(to step 2 40 cycles)
ステップ5:72℃  3分
ステップ6:4℃
【０１７６】
AH22tH3ura8Δare1Δare2HLのコロニー1、2、3、4、および5ならびにプライマー5'LEU2 fwおよびLEU2 revのプライマー各1μL(10pmol/μl希釈物)を用いて、PCRを実施した。増幅産物の長さは、約1185bpである。
【０１７７】
1％アガロースゲル上での電気泳動:
100mL容振盪フラスコに入れたBiozym社製Seakem LE Agarose 0.5g＋1×TAE緩衝液50mL
1kbラダー(NEB)6μL(500ng/レーン)を1つのレーンに載せた。さらに、10μLの各増幅物(amplificate)試料を6×ローディング緩衝液2μLと混合し、混合物をアガロースゲル上に載せた。1×TAE緩衝液中、120Vで45分間、ゲルを泳動させた。続いて、ゲルを臭化エチジウム(EtBr)溶液入り容器中で20分間インキュベートした(EtBr濃度  ストック:10mg/mL、溶液入り容器:30μL/300mL 1×TAE緩衝液)。最後に、写真記録によってゲルを解析した(Alpha innotech: OrgBal 48;オプション設定値:露光(exp.)0.12秒、ビン(bin)1×1、b:0、w:66、g:0.95)。
【０１７８】
結果:
試料を載せた5つのレーンすべてが、その株がAH22tH3ura8Δare1Δare2HL株であることを示した。5つのコロニーは、約1200bpの増幅産物を示した。ゲル電気泳動によれば、解析した5つのコロニーすべての結果は、正確な挿入物を含む。したがって、LEU2遺伝子の増幅は、AH22tH3ura8Δare1Δare2HL株の5つのコロニーすべてにおいて、陽性の結果をもたらした。
【０１７９】
AH22tH3ura8Δare1Δare2HL株のグリセロールストックの調製
100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたウラシル(100mg/L)添加WMVIII培地20mlにおいて、AH22tH3ura8Δare1Δare2HL株に、ウラシル(100mg/L)を添加したWMVIII寒天プレート(プレート1;下記を参照されたい;形質転換プレートと同じではない)から採取したコロニーを接種し、30℃および150rpmで72時間、インキュベートした(接種材料1)。
【０１８０】
プレート1は、LEU2コ―ド配列を含むDNA断片を用いてAH22tH3ura8Δare1Δare2H株を形質転換させることによって作製した形質転換プレート(図1を参照されたい)から単一コロニーを採取することによって作製した。形質転換プレートではなくプレート1を、その後の手順のために使用した。
【０１８１】
100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたウラシル(100mg/L)添加WMVIII培地35mLにおいて、接種材料2に350μLの接種材料1を接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(接種材料2)。
【０１８２】
接種材料2を用いて、中間株2(AH22tH3ura8Δare1Δare2HL)のグリセロールストックを調製した。0.5mLの接種材料2をグリセロール溶液(50％(v/v)グリセロール水溶液)0.5mLと混合することによって、グリセロールストックを調製した。グリセロールストック10個をドライアイス上で輸送することができた。
【０１８３】
接種材料2の試験:
a)接種材料2の光学濃度:
OD600/ml:37.04
【０１８４】
b)接種材料2の細胞の生存能力(グリセロールストックの調製前):
コロニー形成単位を細胞数で割り、100を掛ける(×100)ことによって、接種材料2の細胞の生存能力(単位:％)を算出した。細胞数は、ト―マ計数チャンバー中で計数することによって測定した。ウラシル(100mg/L)を添加したWMVIII寒天プレート上に、接種材料2の適切な希釈物を画線することによって、コロニー形成単位を測定した。
【０１８５】
c)トーマ計数チャンバー:接種材料2の1:10希釈物
計数1:33;36;32;37;39
計数2:28;37;41;33;31
34.7細胞×1.25×106×10=4.3×108細胞/mL接種材料2
【０１８６】
d)プレート上のコロニー:
WMVIIIプレートに播種された接種材料2の10-5倍希釈物50μlから以下の結果が得られた:
計数:142コロニー×105×20=2.8×108コロニー/mL接種材料2
生存能力:2.8×108×100/4.3×108、その結果65.1％となる。
【０１８７】
接種材料2の細胞の生存能力:65.1％
【０１８８】
e)純度および表現型:
【０１８９】
（表４）接種材料2(指定したように、水で10-5倍に希釈したものまたは希釈していないもの)50μlを指定のプレートに画線し、指定の温度で48時間インキュベートして、純度および表現型(栄養要求株)を決定した。
2014510524.tif 000005
【０１９０】
また、顕微鏡下で、細菌汚染について接種材料2を検査した。細菌汚染を検出することはできなかった。
【０１９１】
3.4  最終株1の構築および最終株1のAH22tH3ura8Δare1Δare2HULのグリセロールストックの調製
構築(技術的手順):
形質転換およびHO座位へのURA3発現カセットの正確な組込みに関するPCRによる証明。
【０１９２】
酵母形質転換の結果:
Gietzらによって説明されているようにして、形質転換を実施した(Gietz, D., et al., 1992)。形質転換効率(組込み形質転換)は、DNA 1μg当たり形質転換体102〜103個の間を変動した。
【０１９３】
試料1の培養は、コロニー増殖のない対照プレート(AH22tH3ura8Δare1Δare2HLおよびDNA無し)をもたらすのに対し、AH22tH3ura8Δare1Δare2HL+URA3カセットを有する細胞を含む試料2は、異なるコロニーの形成をもたらす。
【０１９４】
15個のコロニーを採取し、新しいWMVlllプレート上に播種し、30℃で72時間インキュベートした。陽性形質転換体をグリセロールストック調製に使用した(コロニー6および8)。大きなコロニーを選択し、別のプレート上に採取し、PCRによって検査し、グリセロールストックの調製に使用した。
【０１９５】
PCR:
鋳型:酵母形質転換のコロニー
酵母株:AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL
【０１９６】
PuRe Taq Ready To Go-Beads(GE Healthcare:ロット番号:384777)を、体積25μl中でTAQ-ポリメラーゼとして使用した。無菌HPLC-H2O 23μl中にビーズを溶解し、フォワード/リバース(fw/rev)の各プライマー(表6を参照されたい)1μlを添加した。使用するPCR機器は、Flex Cycle Analytik, Jenaから入手した。
【０１９７】
PCRプログラム
ステップ1:94℃  3分
ステップ2:94℃  30秒
ステップ3:51℃  30秒、新しいアニーリング温度
ステップ4:72℃  2分 ステップ2へ 40サイクル
ステップ5:72℃  3分
ステップ6:4℃
【０１９８】
(表５)PCRの実行
2014510524.tif 000006
【０１９９】
1％アガロースゲルを調製した:
250mL容振盪フラスコに入れたBiozym社製Seakem LE Agarose 1.0g＋100mL 1×TAE緩衝液。1kbラダー(NEB)6μL(500ng/レーン)を1つのレーンに載せた。さらに、10μLの各増幅物試料を6×ローディング緩衝液2μLと混合し、混合物をアガロースゲル上に載せた。1×TAE緩衝液中、120Vで45分間、ゲルを泳動させた。続いて、ゲルを臭化エチジウム(EtBr)溶液入り容器中で20分間インキュベートした(EtBr濃度  ストック:10mg/mL、溶液入り容器:30μL/300mL  1×TAE緩衝液)。最後に、写真記録によってゲルを解析した。
【０２００】
結果:
約1435bpという正確なサイズを有する増幅産物をさらに使用した。
【０２０１】
AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のグリセロールストックの調製
100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたWMVIII培地20mL(添加物無し)において、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株に、WMVIII寒天プレートから採取したコロニーを接種し(コロニー6、図4および図5を参照されたい;プレート1;下記を参照されたい;形質転換プレートと同じではない、添加物無し)、30℃および150rpmで72時間、インキュベートした(接種材料1)。
【０２０２】
プレート1は、天然のURA3発現カセット含むDNA断片を用いてAH22tH3ura8Δare1Δare2HL株を形質転換させることによって作製した形質転換プレート(図4を参照されたい)から単一コロニーを採取することによって作製した。形質転換プレートではなくプレート1を、その後の手順のために使用した。
【０２０３】
100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたWMVIII培地(添加物無し)35mLにおいて、接種材料2に350μLの接種材料1を接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(接種材料2)。
【０２０４】
接種材料2を用いて、最終株1(AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL)のグリセロールストックを調製した。0.5mLの接種材料2をグリセロール溶液(50％(v/v)グリセロール水溶液)0.5mLと混合することによって、グリセロールストックを調製した。グリセロールストック10個をドライアイス上で輸送することができた。
【０２０５】
接種材料2の試験:
a)接種材料2の光学濃度:
OD600/ml:42.68
【０２０６】
b)接種材料2の細胞の生存能力(グリセロールストックの調製前):
コロニー形成単位を細胞数で割り、100を掛ける(×100)ことによって、接種材料2の細胞の生存能力(単位:％)を算出した。細胞数は、ト―マ計数チャンバー中で計数することによって測定した。ウラシル(100mg/L)を添加したWMVIII寒天プレート上に、接種材料2の適切な希釈物を画線することによって、コロニー形成単位を測定した。
【０２０７】
c)トーマ計数チャンバー:接種材料2の1:10希釈物
計数1:26;29;37;30;229
計数2:39;36;28;27;33
31.4細胞×1.25×106×15=5.9×108細胞/mL接種材料2
【０２０８】
d)プレート上のコロニー:
WMVIIIプレートに播種された接種材料2の10-5倍希釈物50μl
計数:280コロニー×105×20=5.6×108コロニー/mL接種材料2
生存能力:5.6×108×100/5.9×108。この結果、94.9％となる。
【０２０９】
接種材料2の細胞の生存能力:94.9％
【０２１０】
e)純度および表現型:
（表６）接種材料2(指定したように、水で10-5倍に希釈したものまたは希釈していないもの)50μlを指定のプレートに画線し、指定の温度で48時間インキュベートして、純度および表現型(栄養要求株)を決定した。
2014510524.tif 000007
【０２１１】
また、顕微鏡下で、細菌汚染について接種材料2を検査した。細菌汚染を検出することはできなかった。
【０２１２】
3.5  結論
組み込まれた断片(LEU2およびURA3発現カセット)が正確なサイズであり、対応する標的座位(LEU2およびHO)に正確に組込まれているかをPCRによって確認した。PCRの結果から、断片のサイズが正確であることおよび正確に組み込まれたことが示された。
【０２１３】
最終株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULのゲノムDNAの組込み座位(LEU2およびHO)から増幅させた組み込まれた断片(LEU2およびURA3発現カセット)の配列決定の結果から、配列が正確である(これらは、http://www.yeastgenome.orgに寄託されているS288cの配列に対応する)ことが示された。また、最終株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULにおいて前述したようにこの配列を確認したところ、変異his4-519の復帰変異が起こっていた。最終株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULは、正確な表現型(原栄養性)を示す。原栄養性最終株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの構築は、成功裡に完了した。
【０２１４】
この株は、異種遺伝子を使わずに成功裡に構築された。したがって、異種遺伝子を有する株が使用される場合と比べて、工業的実施を容易にする。
【０２１５】
実施例4
栄養要求性酵母株AH22tH3ura8Δare1Δare2と比較した、原栄養性酵母株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの増殖およびスクアレン生産力の評価
以下の実施例において、原栄養性株の増殖能力およびスクアレン生産力を栄養要求性株と比較して評価した。
【０２１６】
さらに、生産サイクルの期間中の増殖能力およびスクアレン生産力に関して2種の株の安定性も評価した。それに対して(Thereto)、(最初のグリセロールストック:プレストック(prae stock)を接種した)培養物から、グリセロールストックを調製し(ポストストック(post stocks))、少なくとも30世代に渡ってこれを維持した。30世代は、1回の生産サイクル(工業規模の発酵槽中での培養)に相当する。30世代に渡って培養した後、試料を再び試験した(ポストストック)。少なくとも30世代に渡る培養の間の増殖および生産力の安定性は、工業生産に適した株が示すべき好ましい特徴である。安定性を評価するために、プレストックおよびポストストックを接種した培養物を同時に評価した。
【０２１７】
CDW(Cell Dry Weight)-測定:
3×6mLの培養ブロスを、計量済みの15mL容ファルコンチューブに採取し(三つ組)、4000rpm、5分の遠心分離によって沈殿させた。上清を廃棄し、沈殿物をその後の解析に使用した。水5mLで2回、沈殿物を洗浄した。洗浄した沈殿物を80℃で24時間乾燥させ、計量する前に乾燥器中で冷却した。
【０２１８】
抽出およびGC-MS解析によるスクアレンの定量的測定:
抽出:
培養ブロス250μlをエッペンドルフチューブに移した。ブロスを最速スピードで数秒間ボルテックス(振盪)した(Vortex-Genie 2、Scientific Industries)。ガラスビーズ250μl(450μm〜500μmの直径範囲、Sartorius BBI-8541701)を添加した。続いて、クロロホルム:メタノール(80:20;体積比)400μlを添加した。この溶液を最速スピードで5分間ボルテックスした(Vortex-Genie 2、Scientific Industries)後、13,200rpmで5分間、遠心分離した(Hettich Mikro 200 R laboratiory centrifuge)。下側の有機層50μlを窒素流下で乾燥させ、残留物をアセトニトリル(acetonitril)1.5ml中で可溶化した。アセトニトリル溶液1mlをGCバイアルに移し、注入した。
【０２１９】
定量のための外部標準の調製:
スクアレン10mg(Sigma、S3626、最低限98％の純度)を15ml容Greiner社製チューブに入れた。アセトニトリル10mlを添加し(スクアレンストック溶液、1mg/ml)、下記に示すように様々な濃度を調製した:
1.  5μg/mLスクアレン:スクアレンストック溶液5μLをアセトニトリル995μLにピペットで分注する
2.  10μg/mLスクアレン:スクアレンストック溶液10μLをアセトニトリル990μLにピペットで分注する
3.  20μg/mLスクアレン:スクアレンストック溶液20μLをアセトニトリル980μLにピペットで分注する
4.  40μg/mLスクアレン:スクアレンストック溶液40μLをアセトニトリル960μLにピペットで分注する
3.  80μg/mLスクアレン:スクアレンストック溶液80μLをアセトニトリル920μLにピペットで分注する
【０２２０】
GC-MS解析:
Agilent 5975B VL MSD四重極質量選択検出器と連結されたAgilent 6890N GCシステムを用いてGC-MS解析を実施した。この解析のために使用したカラムは、Agilent HP-5MSであった。スキャンモード(4分後に開始、質量範囲29〜500原子質量単位(a.m.u)、3.1スキャン/秒)でMSを動作させた。温度は、最初の0.5分間、70℃で維持し、次いで、20℃/分の勾配で120℃まで上昇させ、続いて、10℃/分の勾配で325℃まで上昇させ、この温度を20分間維持した。カラムを通過する流量は、1ml He/分で一定に保った。注入体積は1μlであった(スプリットレスモード)。入口温度およびインターフェースの温度は、280℃であった。
【０２２１】
4.1少なくとも30世代に渡って培養した後のグリセロールプレストックからのグリセロールポストストックの作製
a)培養手順
【０２２２】
(表７)ポストストックの作製のために使用された株
2014510524.tif 000008
【０２２３】
接種材料1は、100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたWMVIII培地20mLにおいて、グリセロールストック(100μl)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２２４】
接種材料2は、100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたWMVIII培地20mLにおいて、接種材料1(1％)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２２５】
接種材料3は、250ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れたWMVIII培地50mLにおいて、接種材料2(1％)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２２６】
接種材料4は、250ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れたWMVIII培地50mLにおいて、接種材料3(1％)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２２７】
接種材料5は、250ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れたWMVIII培地50mLにおいて、接種材料4(1％)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２２８】
接種材料6は、250ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れたWMVIII培地50mLにおいて、接種材料5(1％)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２２９】
b)世代数を決定するための細胞計数:
【０２３０】
（表８）0時間(t=0h;接種後)および培養48時間目(t=48h)における培養物(接種材料1〜6)1mL当たりの細胞数
2014510524.tif 000009
【０２３１】
合計世代数:
接種材料1〜5:約5.5世代
接種材料6:約6.0世代
合計:約33.5世代
【０２３２】
c)作製後(post-production)グリセロールストックの調製:
(表7に記載した株の)48時間培養後の0.5mLの接種材料6をグリセロール溶液(50％(v/v)グリセロール水溶液)0.5mLと混合することによって、作製後グリセロールストックを調製した。
【０２３３】
(表９)作製後細胞のグリセロールストックの名称
2014510524.tif 000010
【０２３４】
作製後グリセロールストックは、安定性解析のために培養する前に、-80℃で最低24時間保存した。
【０２３５】
4.2  株安定性(作製前および作製後)解析
a)培養手順
100ml容のバッフル無し振盪フラスコに入れたWMVIII培地20mLにおいて、接種材料1を、表7および表3に挙げたグリセロールストック(100μl)(2種の株の作製前細胞および作製後細胞=4種のストック)から接種し、30℃および150rpmで48時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
250ml容のバッフル付き振盪フラスコに入れたWMVIII培地50mLにおいて、接種材料2を接種材料1(1％)から接種し、30℃および150rpmで72時間、インキュベートした(表7に記載したアミノ酸を添加)。
【０２３６】
（表１０）増殖およびスクアレン生産力の解析のために使用された株
2014510524.tif 000011
【０２３７】
b)結果
72時間後に細胞(接種材料2)を採取し、増殖および生産力に関して評価した。この目的のために、細胞乾燥重量(CDW)を測定した:
【０２３８】
3×6mLの培養ブロスを、計量済みの15mL容ファルコンチューブに採取し(三つ組)、4000rpm、5分の遠心分離によって沈殿させた。上清を廃棄し、沈殿物をその後の解析に使用した。水5mLで2回、沈殿物を洗浄した。洗浄した沈殿物を80℃で24時間乾燥させ、計量する前に乾燥器中で冷却した。
【０２３９】
細胞乾燥重量(CDW)の測定を三つ組で実施し、抽出およびスクアレン解析を三つ組で実施した。
【０２４０】
表10に示す株の600nmでの光学濃度(OD600nm)の測定により、原栄養性株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの方が栄養要求性株AH22tH3ura8Δare1Δare2より安定であったことが示される。72時間後、以下の結果が得られた:
【０２４１】
（表１１）インキュベーション後の株の増殖
2014510524.tif 000012
【０２４２】
表10に示す株の細胞乾燥重量(CDW)の測定により、原栄養性株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの方が栄養要求性株AH22tH3ura8Δare1Δare2より安定であったことが示される。72時間後、以下の結果が得られた:
【０２４３】
（表１２）インキュベーション後の細胞乾燥重量(CDW)
2014510524.tif 000013
【０２４４】
表10に示す株のスクアレン生産力の測定により、原栄養性株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの方が栄養要求性株AH22tH3ura8Δare1Δare2より安定であったことおよび多量のスクアレンを産生することが示される。72時間後、以下の結果が得られた:
【０２４５】
（表１３）インキュベーション後の細胞乾燥重量(CDW)
2014510524.tif 000014
【０２４６】
4.3  結論
収量体積、収量の比(specific yield)、および全収率に関して、原栄養性株AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの方が、栄養要求性株AH22tH3ura8Δare1Δare2と比べて多量のスクアレンを産生した。さらに、培養の最終時点での原栄養性株の細胞乾燥重量は、栄養要求性株と比べて大きかった。栄養要求性株と対照的に、原栄養性株は、少なくとも33世代に渡って、増殖能力およびスクアレン生産力に関して安定であった。
【０２４７】
実施例5
AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの評価
5.1  AH22tH3ura8Δare1Δare2HULの実験室規模の発酵
株:サッカロミセス・セレビシエAH22tH3ura8Δare1Δare2HUL
培地:滅菌ろ過した(0.22μm)微量元素およびビタミンを添加した、滅菌済みWMVIII基本培地(20分/121℃)
【０２４８】
前培養:
接種材料1:WMVIII培地20ml(バッフル付き100容三角フラスコ)にAH22tH3ura8Δare1Δare2HUL株のグリセロールストック20μlを接種した。
インキュベーション:48時間/30℃/150rpm
接種材料2:WMVIII培地150ml(バッフル付き500mL容三角フラスコ)に1.5mL(1％)の接種材料1を接種した。
インキュベーション:48時間/30℃/150rpm
【０２４９】
主培養:
WMVIII培地3L(5L容Applikon社製発酵槽)に100mL(3.33％)の接種材料2を接種し、30℃および250〜585rpmで72時間インキュベートした。pH調節は行わなかった。10L/hの圧縮空気を用いて、インキュベーターの排気を行った(vented)。
【０２５０】
撹拌:pO2制御(pO2値が25％未満である場合、撹拌を最高700rpmまで連続的に上昇させた)。
【０２５１】
発酵
第39暦週(2010)に、AH22tH3ura8Δare1Δare2HUL細胞を発酵させた。
【０２５２】
記録されたパラメーター:インキュベーション開始時のpHおよびpO2
開始時間:0時間
pH:5.24
pO2:99%
撹拌速度:250rpm
換気:10L/h圧縮空気
【０２５３】
インキュベーションの間、化学的解析および光学濃度測定のための試料を解析した。試料採取時間は、0時間後、11時間後、15時間後、19時間後、22時間後、37時間後、40時間後、44時間後、62時間後、66時間後、および(1nd)72時間後であった。
【０２５４】
記録されたパラメーター:インキュベーション終了時のpHおよびpO2
終了時間:72時間
pH:5.26
pO2:59％
撹拌速度:250rpm
換気:10L/h圧縮空気
【０２５５】
結果
これらの結果を図7に示す。増殖動態は、60時間を超えるインキュベーションの間、広範囲にわたって直線的であった。培養物のスクアレン生産力は、60時間まで上昇した。スクアレン生産力は、72時間の発酵時間の後、それぞれ1.07gL-1(力価)および7.8％(スクアレン/CDW)であった。
【０２５６】
参考文献
2014510524.tif 000015
2014510524.tif 000016
【図１】
2014510524.tif 000017
【図２】
2014510524.tif 000018
【図３】
2014510524.tif 000019
【図４】
2014510524.tif 000020
【図５】
2014510524.tif 000021
【図６】
2014510524.tif 000022
【図７】
2014510524.tif 000023
【図８】
2014510524.tif 000024
【配列表】
2014510524000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年11月11日(2013.11.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母細胞であって、
a)該細胞が、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み;
b)該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており;かつ
c)該細胞が、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である、
酵母細胞。
【請求項２】
ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である対応する細胞よりも好ましくは安定である、安定な細胞株の細胞である請求項1記載の細胞。
【請求項３】
遺伝子改変細胞である、請求項1または2記載の細胞。
【請求項４】
サッカロミセス属(Saccharomyces)細胞であり、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞であり、特に、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する、請求項1〜3の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項５】
可溶性HMG-CoA還元酵素が以下の点を特徴とする、請求項1〜4の少なくとも一項記載の細胞：
a)膜結合領域を欠く短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素タンパク質であること;
b)該細胞中で活性であるプロモーターの転写制御下のベクター上でコードされていること;および/または
c)構成的プロモーターの制御下、特に、強力な構成的プロモーターの制御下で発現されること。
【請求項６】
ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子がARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している、請求項1〜5の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項７】
細胞のテルペン生産力、好ましくはトリテルペン生産力、特にスクアレン生産力が、対応する野生型細胞、および/または、ヒスチジン、ロイシン、もしくはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、もしくはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である、対応する細胞と比べて、少なくとも等価であり、好ましくは上昇している、請求項1〜6の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項８】
ステリルアシルエステルの生産量が減少している、好ましくは、ステリルアシルエステルの産生が欠損している、請求項1〜7の少なくとも一項記載の細胞。
【請求項９】
a)可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を酵母細胞中に挿入する段階;
b)該可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を含む細胞を選択する段階;
c)該細胞のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子を欠失させるか、または変異させる段階;
d)(i)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための1種もしくは複数種の酵素をコードする遺伝子カセットを挿入すること、ならびに/または
(ii)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための酵素をコードする1つもしくは複数の不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること
によって、
特に、ヒスチジンの産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること、ならびにロイシンおよびウラシルの産生のための酵素をコードする遺伝子カセットを挿入することによって、
ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞に該細胞を変換する段階;
e)ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である細胞を選択する段階;ならびに任意で
f)段階e)の細胞を培養する段階;ならびに任意で
g)段階e)または段階f)の細胞を単離し安定にさせる段階
を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の細胞を作製する方法。
【請求項１０】
細胞がサッカロミセス属細胞であり、より好ましくは、該細胞がサッカロミセス・セレビシエ細胞であり、特に、該細胞がAH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
段階a)が、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードするベクターの挿入を含み、該可溶性HMG-CoA還元酵素の発現が、該細胞中で活性なプロモーター、好ましくは構成的プロモーター、特に、強力な構成的プロモーターの制御下にある、請求項9または10記載の方法。
【請求項１２】
ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子がARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している、請求項9〜11の少なくとも一項記載の方法。
【請求項１３】
1種または複数種のテルペンを生産するため、好ましくは、1種または複数種のトリテルペンを生産するため、特に、スクアレンを生産するための、請求項1〜8の少なくとも一項記載の細胞または請求項9〜12の少なくとも一項記載の方法によって作製された細胞の使用。
【請求項１４】
a)適切な培地中で、請求項1〜8のいずれかの少なくとも一項記載の細胞または請求項9〜12のいずれか一項の少なくとも一項記載の方法によって作製された細胞を培養する段階;および
b)段階a)の該細胞または該細胞培養物から、1種または複数種のテルペン、好ましくは1種または複数種のトリテルペン、さらに特にスクアレンを単離する段階
を含む、
1種または複数種のテルペン、好ましくはトリテルペン、さらに特にスクアレンを生産するための方法。
【請求項１５】
a)請求項14にしたがって1種または複数種のテルペンを生産する段階;および
b)該テルペンを薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油、特にワクチン組成物に混合する段階
を含む、
薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油を製造するため、特にワクチン組成物を製造するための方法であって、
該1種または複数種のテルペンは、任意で、1つまたは複数の水素添加段階にさらに供され、該1種または複数種のテルペンは、好ましくは、水素添加されたトリテルペン、特にスクアランである、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明は、酵母細胞であって、該細胞が、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み;該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており;かつ該細胞が、少なくともヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して原栄養性である、酵母細胞に関する。さらに、本発明は、1種または複数種のテルペンを生産するための前記細胞の使用にも関する。さらに、本発明は、前記細胞を作製する方法、ならびに1種または複数種のテルペン、および該テルペンを含む薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油の製造に関する。
[本発明1001]
酵母細胞であって、
a)該細胞が、可溶性ヒドロキシメチルグルタリル補酵素A(HMG-CoA)還元酵素をコードする機能的遺伝子を含み;
b)該細胞中のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子が不完全であるか、または欠失しており;かつ
c)該細胞が、少なくともヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して原栄養性であり、好ましくは、該細胞が、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して少なくとも原栄養性であり、特に、該細胞が、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である、
酵母細胞。
[本発明1002]
ヒスチジン、ロイシン、またはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である対応する細胞よりも好ましくは安定である、安定な細胞株の細胞である本発明1001の細胞。
[本発明1003]
遺伝子改変細胞である、本発明1001または1002の細胞。
[本発明1004]
サッカロミセス属(Saccharomyces)細胞であり、より好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞であり、特に、AH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する、本発明1001〜1003の少なくとも一つの細胞。
[本発明1005]
可溶性HMG-CoA還元酵素が以下の点を特徴とする、本発明1001〜1004の少なくとも一つの細胞：
a)膜結合領域を欠く短縮型可溶性HMG-CoA還元酵素タンパク質であること;
b)該細胞中で活性であるプロモーターの転写制御下のベクター上でコードされていること;および/または
c)構成的プロモーターの制御下、特に、強力な構成的プロモーターの制御下で発現されること。
[本発明1006]
ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子がARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している、本発明1001〜1005の少なくとも一つの細胞。
[本発明1007]
細胞のテルペン生産力、好ましくはトリテルペン生産力、特にスクアレン生産力が、対応する野生型細胞、および/または、ヒスチジン、ロイシン、もしくはウラシルに関して少なくとも栄養要求性である、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、もしくはロイシンおよびウラシルに関して栄養要求性である、より好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して栄養要求性である、対応する細胞と比べて、少なくとも等価であり、好ましくは上昇している、本発明1001〜1006の少なくとも一つの細胞。
[本発明1008]
ステリルアシルエステルの生産量が減少している、好ましくは、ステリルアシルエステルの産生が欠損している、本発明1001〜1007の少なくとも一つの細胞。
[本発明1009]
a)可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を酵母細胞中に挿入する段階;
b)該可溶性HMG-CoA還元酵素をコードする遺伝子を含む細胞を選択する段階;
c)該細胞のステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子を欠失させるか、または変異させる段階;
d)(i)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための1種もしくは複数種の酵素をコードする遺伝子カセットを挿入すること、ならびに/または
(ii)ヒスチジン、ロイシン、および/もしくはウラシルの産生のための酵素をコードする1つもしくは複数の不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること
によって、
特に、ヒスチジンの産生のための酵素をコードする不完全な遺伝子を復帰変異体に変異誘発すること、ならびにロイシンおよびウラシルの産生のための酵素をコードする遺伝子カセットを挿入することによって、
ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシル、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシル、さらにより好ましくは、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞に該細胞を変換する段階;
e)ヒスチジン、ロイシン、および/またはウラシルに関して原栄養性である細胞、好ましくは、ヒスチジンおよびロイシン、ヒスチジンおよびウラシル、またはロイシンおよびウラシルに関して少なくとも原栄養性である細胞、特に、ヒスチジン、ロイシン、およびウラシルに関して原栄養性である細胞を選択する段階;ならびに任意で
f)段階e)の細胞を培養する段階;ならびに任意で
g)段階e)または段階f)の細胞を単離し安定にさせる段階
を含む、本発明1001〜1008のいずれかの細胞を作製する方法。
[本発明1010]
細胞がサッカロミセス属細胞であり、より好ましくは、該細胞がサッカロミセス・セレビシエ細胞であり、特に、該細胞がAH22株のサッカロミセス・セレビシエ細胞に由来する、本発明1009の方法。
[本発明1011]
段階a)が、可溶性HMG-CoA還元酵素をコードするベクターの挿入を含み、該可溶性HMG-CoA還元酵素の発現が、該細胞中で活性なプロモーター、好ましくは構成的プロモーター、特に、強力な構成的プロモーターの制御下にある、本発明1009または1010の方法。
[本発明1012]
ステリルアシルトランスフェラーゼをコードする1つまたは複数の遺伝子がARE1および/またはARE2であり、好ましくは、両方の遺伝子ARE1およびARE2が不完全であるか、または欠失している、本発明1009〜1011の少なくとも一つの方法。
[本発明1013]
1種または複数種のテルペンを生産するため、好ましくは、1種または複数種のトリテルペンを生産するため、特に、スクアレンを生産するための、本発明1001〜1008の少なくとも一つの細胞または本発明1009〜1012の少なくとも一つの方法によって作製された細胞の使用。
[本発明1014]
a)適切な培地中で、本発明1001〜1008のいずれかの少なくとも一つの細胞または本発明1009〜1012のいずれか一つの少なくとも一つの方法によって作製された細胞を培養する段階;および
b)段階a)の該細胞または該細胞培養物から、1種または複数種のテルペン、好ましくは1種または複数種のトリテルペン、さらに特にスクアレンを単離する段階
を含む、
1種または複数種のテルペン、好ましくはトリテルペン、さらに特にスクアレンを生産するための方法。
[本発明1015]
a)本発明1014にしたがって1種または複数種のテルペンを生産する段階;および
b)該テルペンを薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油、特にワクチン組成物に混合する段階
を含む、
薬学的組成物もしくは美容的組成物、滑沢剤、または変圧器油を製造するため、特にワクチン組成物を製造するための方法であって、
該1種または複数種のテルペンは、任意で、1つまたは複数の水素添加段階にさらに供され、該1種または複数種のテルペンは、好ましくは、水素添加されたトリテルペン、特にスクアランである、方法。
【国際調査報告】
2014510524.tif 000025
2014510524.tif 000026
2014510524.tif 000027
2014510524.tif 000028