(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、または
（２）前記（１）のペプチドと９０％以上の配列相同性を有するペプチド
を含む、ホルモン分泌を調節するための組成物であって、
前記ホルモンは、テストステロン、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
ただし、前記組成物は、癌の治療、改善または予防のために使用されない、
組成物。
【請求項２】
前記エストロゲンは、エストロン、エストラジオールまたはエストリオールであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ホルモンは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）であることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
薬学的に許容可能な添加剤をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記アジュバントは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ホルモンの過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防のために使用され、ここで前記ホルモンは、テストステロン、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記疾患は、月経過多症、子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫、女性または男性の不妊、小児性早熟症、前立腺肥大、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
１日１回投与することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物中のペプチドは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アナログとして作用する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物中のペプチドは、ＧｎＲＨアゴニストとして作用する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の効果を調節するために使用される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ホルモン分泌を調節するための医薬を製造するための、
（１）配列番号１のアミノ酸配列からなるペプチド、または
（２）前記（１）のペプチドと９０％以上の配列相同性を有するペプチド
の使用であって、
前記ホルモンは、テストステロン、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、
ただし前記医薬は、癌の治療、改善または予防のために使用されない、使用。
【請求項１４】
前記医薬は、ホルモンの過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防のために使用され、ここで前記ホルモンは、テストステロン、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記疾患は、月経過多症、子宮内膜症、子宮腺筋症、子宮筋腫、女性または男性の不妊、小児性早熟症、前立腺肥大、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）の効果を調節するために使用される、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１ないし１２のうちいずれか１項に記載の組成物と、説明書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、テロメラーゼに由来したペプチド、具体的には、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドを含むホルモン分泌調節剤に係り、また前記ホルモン分泌調節剤を含む薬学的組成物、及び薬学的組成物をホルモンの過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防のために使用する用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト生殖器官の発生、発達及び老化と係わるホルモンを性ホルモンといい、それには、代表的なものとして、テストステロン（testosterone）、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ：follicle-stimulating hormone、ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ：luteinizing hormone）及び性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ：gonadotrophin-releasing hormone）がある。
【０００３】
テストステロンは、男性及び女性のいずれもから発生し、体内で生成される主な性ホルモンのうち一つである。男性では、主に睾丸の間質組織細胞（leydig cells）で生成され、女性では、卵巣及び胎盤で生成される。また、男女共通には、副腎皮質で生成される。テストステロンは、周知の主な役割として、二次性徴、例えば、男性に対して、筋肉及び骨の質量、並びに体毛の質量をふやす属性を有している。
【０００４】
黄体形成ホルモンは、２個のサブユニットからなる糖タンパク質ホルモンである。αサブユニットは、濾胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ：human chorionic gonadotropin）及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ：thyroid-stimulating hormone）のものなどと類似している。βサブユニットは、他の糖タンパク質ホルモンのものとは異なり、生化学的特異性を付与する。黄体形成ホルモンは、脳下垂体前葉において、男性の場合、視床下部から分泌された性腺刺激ホルモン放出ホルモンに反応して分泌される。黄体形成ホルモンは、間質細胞刺激ホルモン（ＩＣＳＨ：interstitial-cell-stimulating hormone）とも呼ばれ、黄体形成ホルモン分泌は、視床下部−脳下垂体軸（hypohthalamic-pituitary axis)、生殖器官、脳下垂体並びに性ステロイドホルモンを含む陽性及び陰性のフィードバック作用メカニズムの均衡によって調節される。黄体形成ホルモンと異なる脳下垂体性腺刺激ホルモン及び濾胞刺激ホルモンは、男性及び女性の生殖システムの正常な機能維持に非常に重要な役割を行う。
【０００５】
濾胞刺激ホルモンは、２個のサブユニットからなる糖タンパク質ホルモンである。αサブユニットは、黄体形成ホルモン、ｈＣＧ、ＴＳＨのものと類似している。βサブユニットは、他の糖タンパク質と異なり、生化学的特異性を付与する。濾胞刺激ホルモンは、脳下垂体前葉において、視床下部から分泌された性腺刺激ホルモン放出ホルモンに反応して分泌される。男性及び女性のいずれにもおいて、濾胞刺激ホルモンの分泌は、視床下部−脳下垂体軸（hypohthalamic-pituitary axis）、生殖器官、脳下垂体並びに性ステロイドホルモンを含む陽性及び陰性のフィードバック作用メカニズムの均衡によって調節される。濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、他の脳下垂体性腺刺激ホルモン、及び濾胞刺激ホルモンは、男性及び女性の生殖システムの正常な機能維持に非常に重要な役割を行う。
【０００６】
エストロゲンは、女性ステロイドホルモンであって、ほとんどは、卵巣で生成され、少量が副腎皮質、胎盤、男性睾丸で生成される。エストロゲンは、思春期と係わる身体変化を含み、性的成熟の制御及び案内の一助となる。また、月経において、排卵周期、妊娠後授乳期間、感情の方向及び老化過程に影響を与える。エストロゲン生産は、自然と女性の寿命周期を転換させるが、思春期を始めとして（初経）、成人レベルに逹し、閉経開始直前まで、中年に行くほど減少する。エストロゲン欠乏は、月経の減少（月経不順）、閉経期関連の持続的な障害（例えば、躁鬱症及び膣乾き）、及び老年の骨多孔症を引き起こす。エストロゲン欠乏の場合、天然または合成されたエストロゲンの製剤が処方されもする。エストロゲンは、また多くの経口避姙薬の成分のうち一つである。男性において、エストロゲンの過剰は、乳房組織の拡大のような女性二次性徴（女性化）を引き起こす。
【０００７】
性腺刺激ホルモン放出ホルモン（gonadoliberin）は、生殖において、中心的な役割を行うペプチドファミリのうち一つである。性腺刺激ホルモン放出ホルモンの主機能は、脳下垂体に作用し、黄体形成ホルモン及び濾胞刺激ホルモンの合成及び分泌を刺激することであるが、性腺刺激ホルモン放出ホルモンは、脳、網膜、交感神経系、性腺、及び特定種の胎盤でも作用する。性腺刺激ホルモン放出ホルモンは、最小３種以上の多様な形態を有するものと見られる。第２の形態は、中脳で発現され、広く広がるものと見られる。第３の形態は、珍しく示され、魚類でのみ観察される。性腺刺激ホルモン放出ホルモンは、さらに大きい前駆体タンパク質に由来したＣ−末端アミド化デカペプチドである。１０個のうち４個の残基が、性腺刺激ホルモン放出ホルモンを配列化した全ての種において完璧に保存されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＵＳ２００２００４２４０１Ａ１
【特許文献２】ＵＳ２０１２０２７７２９０Ａ１
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Christoph Eisenegger et al., Trends in Cognitive Sciences June 2011, Vol. 15, No. 6
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一側面は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドを含むホルモン分泌調節剤を提供する。
【００１１】
本発明の他の一側面は、前記本発明によるホルモン分泌調節剤を含むホルモン分泌調節用薬学組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらに他の一側面は、ホルモン分泌調節用医薬を製造するための、前記本発明によるホルモン分泌調節剤の使用を提供する。
【００１３】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による薬学組成物と、説明書を含むホルモン分泌調節用キットとを提供する。
【００１４】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明によるホルモン分泌調節剤を、ホルモン調節治療を必要とする対象に有効量を投与することを含むホルモンレベル調節方法を提供する。
【００１５】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明によるホルモン分泌調節用薬学組成物を、ホルモン調節治療を必要とする対象に有効量を投与することを含むホルモンレベル調節方法を提供する。
【００１６】
本発明のさらに他の一側面は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドを含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アナログを提供する。
【００１７】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログの有効量を、ホルモン調節治療を必要とする対象に投与することを含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節方法を提供する。
【００１８】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログを含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節用薬学組成物を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の一側面は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節用医薬を製造するための、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログの使用を提供する。
【発明の効果】
【００２０】
本発明によるホルモン分泌の調節剤は、副作用がないか、あるいは微々たるものであるということが分かった。従って、本発明は、医薬分野において、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログとして、１）前立腺癌または乳房癌のようなホルモン敏感性癌の抗癌治療、２）月経過多、子宮内膜症、子宮筋腫、子宮線維嚢腫など女性のエストロゲン生産撹乱の治療、３）女性及び男性の不妊治療、４）児童性早熟症の治療、及び５）前立腺肥大症の治療及び改善に使用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】男性及び女性の生殖器官において、テストステロン、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び性腺刺激ホルモン放出ホルモンを含んだホルモンの調節ループを示すグラフである。
【図２】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雄ラットの血液において、テストステロンの濃度変化を示したグラフである。
【図３】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雌ラットの血液において、テストステロンの濃度変化を示したグラフである。
【図４】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雄ラットの血液において、エストラジオールＥ２の濃度変化を示したグラフである。
【図５】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雌ラットの血液において、エストラジオールＥ２の濃度変化を示したグラフである。
【図６】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雄ラットの血液において、濾胞刺激ホルモンの濃度変化を示したグラフである。
【図７】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雌ラットの血液において、濾胞刺激ホルモンの濃度変化を示したグラフである。
【図８】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雄ラットの血液において、黄体形成ホルモンの濃度変化を示したグラフである。
【図９】経時的にＰＥＰ−１を反復的に投与した雌ラットの血液において、黄体形成ホルモンの濃度変化を示したグラフである。
【図１０】ＰＥＰ−１を投与した後、雄ラットにおいて、相対的な性腺刺激ホルモン放出ホルモンのｍＲＮＡ発現程度を示したグラフである。
【図１１】ＰＥＰ−１を投与した後、雌ラットにおいて、相対的な性腺刺激ホルモン放出ホルモンのｍＲＮＡ発現程度を示したグラフである。
【図１２】ＰＥＰ−１（ＧＶ１００１）を処理した前立腺肥大症動物モデルの実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）において、細胞増殖の程度を示したグラフである。
【図１３】ＰＥＰ−１（ＧＶ１００１）を処理した前立腺肥大症動物モデルの上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）において、細胞増殖の程度を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、多様な変換を加えることができ、さまざまな実施例を有することができるが、以下、本発明について、実施例を基にしてさらに具体的に説明する。しかし、かような実施例は、本発明を特定の実施例について限定するものではなく、本発明は、特許請求の範囲に記載されたところを基にし、多様な実施例及び応用が可能であり、本発明の思想及び技術範囲に含まれる全ての変換、均等物ないし代替物を含むものであると理解されなければならない。本発明の説明において関連公知技術についての具体的な説明が、本発明の要旨を不明確にすると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００２３】
本発明は、一側面において、ホルモン分泌調節のための、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドを提供する。
【００２４】
本明細書に開示されたペプチドは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の配列相同性を有するペプチドを含んでもよい。また、本明細書で開示されたペプチドは、配列番号１を含むペプチドまたはその断片と、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸または７個以上のアミノ酸が変化したペプチドを含んでもよい。
【００２５】
本明細書において、「相同性（homology）」及び「配列相同性（sequence identity）」とは、相互変換可能に使用され、それは、２個のアミノ酸（または、類似したものとして、核酸）間での配列オーバーラップ程度を示す。
【００２６】
本明細書において、ペプチドや核酸について、「配列相同性」の他の用語を使用しないのであるならば、配列相同性は、（ｎｒｅｆ−ｎｄｉｆ）＊１００／ｎｒｅｆを使用して計算され、前記計算式において、２つの配列を整列し、最も多くの一致数が出るようにしたとき、ｎｄｉｆは、２配列間において、非一致残基の総個数を、ｎｒｅｆは、２配列において、短い配列の残基の総個数を意味する。例えば、ＤＮＡ配列ａｇｔｃａｇｔｃは、ａａｔｃａａｔｃの配列との配列相同性を前記式で求めれば、７５％である（ｎｒｅｆ＝８、ｎｄｉｆ＝２）。
【００２７】
本明細書の一側面で、配列相同性は、従来に知られた下記の方法で決定された。Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2: 482, by the search for similarity method of Pearson & Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, using the CLUSTAL W algorithm of Thompson et al. , 1994, Nucleic Acids Res 22: 467380, by computerized implementations of these algorithms(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wiscons in Genetics Software Package, Genetics Computer Group). The BLAST algorithm(Altschul et al. , 1990, Mol. Biol. 215: 403-10) for which software maybe obtained through the National Center for Biotechnology Information www.ncbi.nlm.nih.gov/) may also be used. When using any of the aforementioned algorithms, the default parameters for "Window" length, gap penalty, etc。
【００２８】
本発明の一具体例において、前記アミノ酸変化は、ペプチドの物理化学的特性を変更させる性質に属する。例えば、ペプチドの熱安定性を向上させ、基質特異性を変更させ、最適のｐＨを変化させるというようなアミノ酸変化が行われる。
【００２９】
また、前記本発明による配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドは、細胞内毒性が低く、生体内安全性が高いという長所を有する。
【００３０】
配列番号１：ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ
【００３１】
本発明の他の一側面は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドを含むホルモン分泌調節剤を提供する。
【００３２】
本発明の一具体例において、前記ホルモンは、性ホルモンであり、前記性ホルモンは、テストステロン（testosterone）、エストロゲン（estrogen）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ：follicle stimulating hormone）、黄体形成ホルモン（ＬＨ：luteinizing hormone）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ：gonadotropin-releasing hormone）、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択される。
【００３３】
本発明の一具体例において、前記ホルモンは、テストステロンである。
【００３４】
テストステロン（４アンドロステン１７β−ｏｌ−３−ｏｎｅ）は、Ｃ１９ステロイドホルモンであり、男性に重要なアンドロゲンである。脳下垂体ホルモンである黄体形成ホルモンによって調節される。黄体形成ホルモンは、テストステロンの生産を制御するために、脳下垂体前葉腺から分泌され、睾丸の間質組織の細胞に直接に作用する。テストステロンは、外部生殖器の成熟及び二次性徴、それに加え、顔、わき、生殖器周囲（股）の毛の成長などを刺激する役割を行う。
【００３５】
循環系において、黄体形成ホルモンとテストステロンとのレベル測定は、性腺機能減退を明らかにするのに有用である。低い濃度のテストステロンは、性腺機能減退、睾丸機能不全、高いプロラクチン（prolactin）レベル、脳下垂体機能低下、腎臓疾患または肝疾患などの理由から始まる。女性において、テストステロンは、男性よりはるかに低いレベルを示すが、女性における高テストステロン濃度は、多嚢性卵巣症侯群と副腎過形成とを発生させる。過剰テストステロンは、不妊、多毛症、無月経証または肥満を発生させたりする。
【００３６】
テストステロンは、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ：sex hormone-binding globulin）またはテストステロン−エストラジオール結合グロブリン（ＴｅＢＧ）などのプラズマタンパク質と非常に強く結合し、ＣＢＧ（cortisol-binding globulins）とアルブミンとは、弱い結合力を有する。２．５％未満のテストステロンだけが、非結合形態（free form）で体内で循環される。
【００３７】
本発明の一具体例において、前記ホルモンは、エストロゲンであり、前記エストロゲンは、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）またはエストリオール（Ｅ３）でもある。
【００３８】
女性において、自然に生成される３種の主要エストロゲンは、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）及びエストリオール（Ｅ３）である。エストラジオールは、絶対的血清レベルやエストロゲン活性度においても、生殖活動期間において、最も優勢なエストロゲンである。エストラジオール（Ｅ２）の測定は、卵巣機能の評価に使用され、体外受精などの医学的助けを借りる生殖プロトコルにおいて、濾胞成熟の観察に重要に使用される。Ｅ２は、女性生殖器の成長を促進し、二次性徴を活性化させ、月経周期に必須的な役割を行う。一般的に、不妊女性においてエストラジオールは、濾胞と顆粒細胞との相互作用によって、濾胞及び黄体の発達期間の間、ほとんど分泌される。妊娠期間の間、胎盤は、エストラジオールの最も主な分泌先になる。エストラジオールが血液に分泌されている間、１〜３％がいかなるタンパク質とも結合していない形態で存在し、約４０％がＳＨＢＧに結合した形態で存在し、残りは、アルブミンに結合した形態で存在する。エストラジオールの一次的な機能は、女性生殖器の成長と、二次性徴の促進とである。
【００３９】
エストラジオールは、女性の月経周期に必須的な役割を行う。抗体の生成開始周期において、エストラジオールは、低レベルに維持される。約７日が経った後、濾胞の成熟がエストラジオールのレベルによって調節され、レベルが上昇する。エストラジオールレベルの上昇は、黄体形成ホルモンレベルの急騰と、濾胞刺激ホルモンの抑制とを誘発する。正常排卵は、黄体形成ホルモン（レベル）の最高点において、１０〜１２時間ほどの後、エストラジオール（レベル）の最高点において、２４〜３６時間ほどの後に起こる。黄体期の間には、エストラジオールレベルが上昇し、排卵後８日目に、ピーク（最高点）となる。かようなエストラジオールレベルの上昇は、黄体の退行を示す。もし修正された卵子の着床が起こらない場合、エストラジオールは減少し、次の周期を始めよという信号になる。
【００４０】
エストラジオール６テストは、Ｅ２の６番目の結合サイトで起こる抗原抗体反応にその名称が由来し、テストの特異性が良好であり、テストによる結果は、多様な方法で使用される。
【００４１】
本発明の一具体例において、前記ホルモンは、濾胞刺激ホルモンである。濾胞刺激ホルモンは、糖タンパク質ホルモンとして、黄体形成ホルモン、甲状腺刺戟ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンと類似したαサブユニットと、濾胞刺激ホルモンの生化学的特性を示すβサブユニットとから構成され、黄体形成ホルモンと共に、男性及び女性のいずれにもおいて、正常な生殖系の機能維持に重要な役割を行う。濾胞刺激ホルモンは、脳下垂体前葉から放出され、視床下部から分泌された性腺刺激ホルモン放出ホルモンによって促進される。男女のいずれもにおいて、濾胞刺激ホルモンは、恒常性を維持するが、それは、視床下部−脳下垂体経路（hypohthalamic-pituitary pathway）、生殖器官、脳下垂体及び性ホルモンを含むフィードバック作用メカニズムによって調節される。
【００４２】
濾胞刺激ホルモンの作用部位及び作用は、男女それぞれにおいて下記のように示される。
【表１】
0006495899.tif 000002
【００４３】
濾胞刺激ホルモンレベルの上昇は、女性において、閉経期と、一次的な性腺機能減退症とを示し、男性においても、一次的な性腺機能減退症に係わる。濾胞刺激ホルモンレベルの低下は、一次的な性腺機能減退症と関連性がある。多嚢性濾胞症侯群を病んでいる女性の場合、濾胞刺激ホルモンレベルが正常であったり低下したりしている。
【００４４】
本発明の一具体例において、前記ホルモンは、黄体形成ホルモン（ＬＨ）である。
【００４５】
黄体形成ホルモンは、２個のサブユニットからなる糖タンパク質ホルモンである。濾胞刺激ホルモン、甲状腺刺戟ホルモン、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモンと類似したαサブユニットと、黄体形成ホルモンの生化学的特性を示し、他の糖タンパク質ホルモンと異なるβサブユニットとから構成されている。黄体形成ホルモンは、脳下垂体前葉から分泌され、視床下部から分泌される性腺刺激ホルモン放出ホルモンの分泌によって促進される。男性の場合、黄体形成ホルモンは、たびたびＩＣＳＨと呼ばれる。男女いずれにおいても、黄体形成ホルモンレベルは、視床下部−脳下垂体経路（hypohthalamic-pituitary pathway）、生殖器官、脳下垂体及び性ホルモンなどを含むフィードバック作用メカニズムによって調節される。黄体形成ホルモンは、脳下垂体性腺、濾胞刺激ホルモンと同様に、男性及び女性の生殖系で重要な役割を受け持つ。
【００４６】
ＬＨの男性及び女性でのそれぞれの対象及びその作用は、下記表に示した。
【表２】
0006495899.tif 000003
【００４７】
黄体形成ホルモンの非正常的なレベルは、濾胞刺激ホルモン、エストロゲン、プロゲステロンレベルの上昇と関連がある。黄体形成ホルモン濃度の上昇は、女性の、閉経期、多嚢性卵巣症侯群、及び一次的な性腺機能減退を、男性の一次的な性腺機能減退を示す。反対に、黄体形成ホルモンの低下した濃度は、一次的な性腺機能亢進症を示す。
【００４８】
本発明の一具体例において、前記ホルモンは、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）である。
【００４９】
前記配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペブチドは、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログとして作用し、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログは、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト（agonist）またはアンタゴニスト（antagonist）として効果を有する。
【００５０】
前記性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログは、ステロイド関連疾病（例：前立腺癌、乳癌及び卵巣癌など）、性腺内分泌系の機能低下と係わる疾病（例：不規則的な月経、無月経、性早熟症及び性腺機能減退）、人工受精時の排卵周期の調節（例：性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニストあるいはアンタゴニストの投与によって、選択的に調節される排卵周期）、避妊（例：胚芽の成長及び着床率が、性交後性、腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニストの投与によって阻害されたり低下させられたりする）、魚類及び家畜の生産増加などに使用される。従って、本発明の医薬分野における潜在的使用は、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログによってなり、性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節に使用され、かような性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果の増進または低下を含み、例えば、かような効果調節によって、１）前立腺癌または乳癌のようなホルモン敏感性癌の抗癌治療、２）月経過多、子宮内膜症、子宮筋腫、子宮線維嚢腫など、女性のエストロゲン生産撹乱の治療、３）女性及び男性の不妊、４）児童性早熟症の治療、並びに５）前立腺肥大症の治療及び改善によってなる。
【００５１】
従って、本発明のさらに他の一側面は、配列番号１のアミノ酸配列、配列番号１と８０％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列、またはそれらの断片を含むペプチドを含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アナログを提供する。
【００５２】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明によるホルモン分泌調節剤を含むホルモン分泌調節用組成物を提供する。
【００５３】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による、ホルモン分泌調節剤、及び薬学的に許容可能な添加剤を含むホルモン分泌調節用薬学組成物を提供する。
【００５４】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）アナログを含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節用薬学組成物を提供する。
【００５５】
本発明の一具体例において、本発明の組成物は、０．１μｇ／ｍｇから１ｍｇ／ｍｇ、具体的には、１μｇ／ｍｇから０．５ｍｇ／ｍｇ、さらに具体的には、１０μｇ／ｍｇから０．１ｍｇ／ｍｇの、配列番号１のアミノ酸で構成されるか、前記配列番号１と８０％以上の相同性を有したアミノ酸で構成されるか、あるいは前述のところの断片であるペプチドを含む。ペプチドが前記範囲に含まれるとき、組成物の全ての安全性及び安全性は、費用−効率の側面で適切であって充足されたものになる。
【００５６】
本発明の一具体例において、本発明の組成物は、ヒト、犬、ニワトリ、豚、牛、羊、ギニアピッグまたは猿を含む全ての動物に投与される。
【００５７】
本発明の一具体例において、本発明の薬学的組成物は、有効成分として、配列番号１のアミノ酸によって構成されたペプチド、配列番号１のペプチドと８０％以上の相同性を有したペプチド、または配列番号１の断片ペプチドを含む。
【００５８】
本発明の一具体例において、本発明の薬学組成物は、経口、直腸、経皮、静脈内、筋肉内、腹腔内、骨髄内、硬膜内または皮下などに投与される。
【００５９】
本発明によるホルモン分泌調節剤は、前記性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログのような作用が可能であり、それを含む薬学的組成物は、本発明で開示された、病的症状を誘発するホルモンレベル、または病気や状態の進行に影響を与えたホルモンレベルに係わる病気や症状を有した対象（ヒトまたは他種）の治療に特に有用である。従って、前記本発明による薬学組成物は、ホルモン、特に、性ホルモンの過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防に使用される。一具体例において、前記ホルモンの過多または欠乏による疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、月経過多症（menorrhagia）、子宮内膜症（endometriosis）、子宮腺筋腫症（adenomyosis）、子宮線維瘍（uterine fibroids）、女性または男性の不妊（female or male infertility）、小児性早熟症（precocious puberty in children）、前立腺肥大、及びそれらの組み合わせのうちから選択されるが、それらに限定されるものではない。前記薬学組成物は、当該技術分野において公知されている一般的な薬剤学的剤形に製剤化される。前記医薬品は、経口投与製剤、注射剤、坐剤、経皮投与製剤及び経鼻投与製剤を含むが、それらに限定されず、任意の剤形に製剤化されて投与されるが、望ましくは、経口投与用剤形に製剤化される。
【００６０】
前記経口投与のための剤形は、錠剤、丸剤、軟質または硬質のカプセル剤、顆粒剤、散剤、液剤または乳濁剤でもあるが、それらに制限されるものではない。非経口投与のための剤形は、投与剤、点滴剤、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、懸濁液剤、乳剤、坐剤、パッチまたは噴霧剤でもあるが、それらに制限されるものではない。
【００６１】
本発明の一具体例において、前記薬学組成物は、必要によっては、希釈剤、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、緩衝剤、分散剤、界面活性剤、着色剤、香料または甘味剤などの添加剤を含んでもよい。本発明の一側面による薬学組成物は、当業界の一般的な方法によって製造される。
【００６２】
本発明の一側面において、薬学的組成物の有効成分は、患者の年齢、性別、体重、病症及び状態、投与方法、処方者の判断などによって非常に多様である。具体的な投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には、０．１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、さらに一層具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、さらに一層具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日にもなる。本発明の一側面によれば、薬学的組成物の投与は、それらに制限されるものではなく、１日に１ないし３回でもある。
【００６３】
本発明のさらに他の一側面は、ホルモン調節のための食品組成物を提供する。食品組成物は、有効成分として、配列番号１のアミノ酸によって構成されるか、前記配列番号１と８０％以上の相同性を有したアミノ酸によって構成されるか、あるいは前述のところの断片であるペプチドを含んでもよい。
【００６４】
本発明の一具体例において、前記食品組成物は、形態に限られるものではなく、例えば、顆粒、パウダー、液体及び固体でもある。それぞれの形態は、一般的に、当業者によって適切に選択される成分と混合され、また有効成分にさらに追加することができ、他の成分との混合によって効果が増大される。
【００６５】
前記食品組成物の具体的な投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には、０．１μｇ／ｋｇ／日ないし１ｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日、一層具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日ないし１ｍｇ／ｋｇ／日、さらに一層具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日ないし１００μｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によって異なる。
【００６６】
一具体例において、本発明によるペプチドは、アジュバントと組み合わされて投与される。従って、前記本発明による組成物、薬学組成物及び食品組成物は、アジュバントを含んでもよい。かようなアジュバントは、当該技術分野に公知された任意の免疫学的アジュバントを含み、例えば、アルミニウム塩のような無機アジュバントと、オイル系、ビロソーム（virosome）、スクワランのような有機アジュバントとを含む。有機アジュバントは、エマルジョン、微生物由来、合成アジュバント、サイトカインなどがあるが、それらに限定されるものではない。サイトカイン・アジュバントは、９種が知られている。例えば、成熟した顆粒球及びマクロファージを活性化させる顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ：granulocyte-macrophage colony-stimulating factor）を有することができるが、それは、Ｂ型肝炎、ＨＩＶ、癌ワクチンに主に使用される［J Biomed Biotechnol. 2012; 2012: 831486. Published online Mar 13, 2012］。
【００６７】
本明細書において言及されたアジュバントの適切な投与量は、すでに当業界に周知されているので、各患者の状態によって、当業界に知られた基準によって投与することができる。具体的な投与量決定は、当業者のレベル内にあり、その１日投与用量は、例えば、具体的には、１μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｇ／ｋｇ／日、さらに具体的には、１０μｇ／ｋｇ／日ないし１００ｍｇ／ｋｇ／日、さらに一層具体的には、５０μｇ／ｋｇ／日ないし１０ｍｇ／ｋｇ／日にもなるが、それらに制限されるものではなく、投与する対象の年齢、健康状態、合併症など多様な要因によって異なる。
【００６８】
例えば、ＧＭ−ＣＳＦの場合、本明細書において開示されたペプチドの投与前、例えば、１分ないし１５０分前の時点、５ないし８０分前の時点、または１０ないし１５分前の時点に、成人基準７ないし７００ｍｇの投与量で皮内投与される。投与時間は、ペプチドの投与前１分以上前、３分以上前、５分以上前、７分以上前、８分以上前、９分以上前、または１０分以上前に投与される。また、１５０分以下前、１３０分以下前、１１０分以下前、１００分以下前、９０分以下前、８０分以下前、７０分以下前、６０分以下前、５０分以下前、４０分以下前、３０分以下前、２０分以下前または１５分以下前の時点に投与される。投与量は、７ｍｇ以上、１０ｍｇ以上、２０ｍｇ以上、３０ｍｇ以上、４０ｍｇ以上、５０ｍｇ以上、６０ｍｇ以上または７０ｍｇ以上である。また、投与量は、７００ｍｇ以下、６００ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、４００ｍｇ以下、３００ｍｇ以下、２００ｍｇ以下、１００ｍｇ以下、９０ｍｇ以下または８０ｍｇ以下である。
【００６９】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による薬学組成物と、説明書を含むホルモン分泌調節用キットとを提供する。
【００７０】
前記説明には、前記本発明による薬学組成物の活性成分、含量、性状、効能効果、用法用量、保存方法、使用期間、販売者、製造者、製造年月日、副作用及び／または禁忌事項を含んでもよい。
【００７１】
本発明のさらに他の一側面は、ホルモン分泌調節用医薬を製造するための、前記本発明によるホルモン分泌調節剤の使用を提供する。
【００７２】
前記ホルモン分泌調節用医薬の詳細は、前記本発明によるホルモン分泌調節用薬学組成物に係わる説明がそのまま適用される。
【００７３】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明によるホルモン分泌調節剤を、ホルモン調節治療を必要とする対象に有効量を投与することを含むホルモンレベル調節方法を提供する。
【００７４】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明によるホルモン分泌調節用薬学組成物を、ホルモン調節治療を必要とする対象に有効量を投与することを含むホルモンレベル調節方法を提供する。
【００７５】
前記ホルモンレベル調節方法の詳細は、前記本発明によるホルボン分泌調節剤及び薬学組成物に係わる説明がそのまま適用される。
【００７６】
前記ホルモンレベル調節方法は、正常状態に逹するため、またはホルモンによって誘発された疾病の治療、改善または予防のためのホルモンレベルの上昇または低下を含み、それは、ホルモンによって誘発された疾病の種類によって異なる。前記ホルモンレベル調節方法の対象ホルモンは、テストステロン（testosterone）、エストロゲン（estrogen）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、及びそれらの組み合わせからなる群のうちから選択される。
【００７７】
前記ホルモンレベル調節方法は、当業者が適切に決定し、一具体例としては、前記薬学組成物の投与方法が適用される。
【００７８】
前記レベル調節方法の一具体例は、前記ホルモン分泌調節剤またはホルモン分泌調節用薬学組成物を１日１回投与することができるというものである。
【００７９】
前記レベル調節方法としては、ホルモン、特に、性ホルモンの過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防を行うことができる。一具体例において、前記ホルモンの過多または欠乏による疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌月経過多症（menorrhagia）、子宮内膜症（endometriosis）、子宮腺筋腫症（adenomyosis）、子宮線維瘍（uterinefibroids）、女性または男性の不妊（female or male infertility）、小児性早熟症（precocious puberty in children）、前立腺肥大、及びそれらの組み合わせのうちから選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００８０】
本発明のさらに他の一側面は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節用医薬を製造するための、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログの使用を提供する。
【００８１】
前記性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節用医薬の詳細は、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節用薬学組成物に係わる説明がそのまま適用される。
【００８２】
本発明のさらに他の一側面は、前記本発明による性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログの有効量を、ホルモン調節治療を必要とする対象に投与することを含む性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節方法を提供する。
【００８３】
前記性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節方法は、正常状態に逹するため、またはホルモンによって誘発された疾病の治療、改善または予防のための性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果の増進または低下を含み、それは、ホルモンによって誘発された疾病の種類によって異なる。
【００８４】
前記性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節方法の一具体例は、前記性腺刺激ホルモン放出ホルモンアナログ、またはそのアナログを含む薬学組成物を１日１回投与するものである。
【００８５】
前記性腺刺激ホルモン放出ホルモン効果調節方法は、性ホルモンの過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防を行うものである。一具体例において、前記ホルモンの過多または欠乏による疾患は、前立腺癌、乳癌、卵巣癌月経過多症（menorrhagia）、子宮内膜症（endometriosis）、子宮腺筋腫症（adenomyosis）、子宮線維瘍（uterinefibroids）、女性または男性の不妊（female or male infertility）、小児性早熟症（precocious puberty in children）、前立腺肥大、及びそれらの組み合わせのうちから選択されるが、それらに限定されるものではない。
【００８６】
本明細書において使用された用語は、特定具体例について説明するための目的だけに意図されたものであり、本発明を限定する意図ではない。名詞の前に個数が省略された用語は、数量を制限するものではなく、言及された名詞物品が一つ以上存在するということを示すものである。用語「含む」、「有する」及び「含有する」というのは、開かれた用語として解釈される（すなわち、「含むが、それに限定されるものではない」という意味）。
【００８７】
数値範囲の言及は、単にその範囲内に属するそれぞれの別個の数値を個別的に言及することの代わりをする容易な方法であるために、そうではないということが明示されていない限り、各別個の数値は、まさしく個別的に明細書に言及されているように、本明細書に統合される。全範囲の終値は、その範囲内に含まれ、独立して組み合わせ可能である。
【００８８】
本明細書に言及された全ての方法は、取り立てて明示されているか、あるいは文脈によって明白に矛盾しない限り、適切な手順によって遂行される。ある一実施例及び全ての実施例、または例示的言語（例えば、「〜のような」）の使用は、特許請求の範囲に含まれていない限り、単に本発明をさらに良好に記述するためものであり、本発明の範囲を制限するものではない。明細書のいかなる言語も、いかなる非請求構成要素を、本発明の実施に必須なものであると解釈されることがあってはならない。取り立てての定義がない限り、本明細書に使用される技術的及び科学的な用語は、本発明が属する技術分野で当業者によって、一般的に理解されるような意味を有する。
【００８９】
本発明の望ましい具体例は、本発明を実施するために発明者に知られた最適のモードを含む。望ましい具体例の変動は、先行する記載に触れれば、当業者に明白になるであろう。本発明者らは、当業者がかような変動を適切に利用するということを期待し、本発明者らは、本明細書の記載と異なる方式で本発明が実施されるということを期待する。従って、本発明は、特許法によって許容されているように、特許請求の範囲で言及された発明の要旨の均等物及び全ての変形を含む。さらに、全ての可能な変動内で、前述の構成要素のいかなる組み合わせも、ここで異なって明示されるか、あるいは文脈上明白に矛盾しない限り、本発明に含まれるものである。本発明は、例示的な具体例を参照して具体的に示されて記述されたが、当業者は、特許請求の範囲によって定義される発明の精神及び範囲を外れずとも、形態及びディテールにおいて、多様な変化が行われるということを十分に理解するであろう。
【実施例】
【００９０】
Ｉ．ペプチドの合成方法及び分析方法
実施例１：ペプチドの合成
配列番号１を含むペプチド、前記ペプチド配列と８０％以上の配列相同性を有するペプチド、またはそれらの断片であるペプチドを、従来に知られた固相ペプチド合成法によって製造した。具体的には、ペプチドは、ＡＳＰ４８Ｓ（Peptron、Ｉｎｃ．，大韓民国・大田）を利用して、Ｆｍｏｃ固相合成法（ＳＰＰＳ：solid phase peptide synthesis）を介して、Ｃ末端からアミノ酸一つずつをカップリングすることによって合成した。次のように、ペプチドのＣ末端の最初のアミノ酸が樹脂に付着されたものを使用した。例えば、次の通りである：
【００９１】
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ2−Ａｌａ−２−chloro−Trityl Resin
ＮＨ2−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−２−chloro−Trityl Resin
【００９２】
ペプチド合成に使用した全てのアミノ酸原料は、Ｎ−termがＦｍｏｃで保護（protection）され、残基は、いずれも酸で除去される、Ｔｒｔ、Ｂｏｃ、ｔ−Ｂｕ（ｔ−butyl ester）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−pentamethyl dihydro−benzofuran−５−sulfonyl）などで保護されたものを使用した。例えば、次の通りである：
【００９３】
Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｈｘ−ＯＨ、Ｔｒｔ−Mercaptoacetic acid。
【００９４】
カップリング試薬（coupling reagent）としては、ＨＢＴＵ［２−（１Ｈ−Benzotriazole−１−yl）−１，１，３，３−tetamethylaminium hexafluorophosphate］／ＨＯＢｔ［Ｎ−Hydroxybenzotriazole］／ＮＭＭ［４−Methylmorpholine］を使用した。Ｆｍｏｃ除去は、２０％のＤＭＦ内で、ピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を利用した。合成されたペプチドをResinから分離し、残基の保護基除去には、切断カクテル（cleavage cocktail）［ＴＦＡ（trifluoroacetic acid）／ＴＩＳ（triisopropylsilane）／ＥＤＴ（ethanedithiol）／Ｈ2Ｏ＝９２．５／２．５／２．５／２．５］を使用した。
【００９５】
アミノ酸保護基が結合された出発アミノ酸が固相支持体に結合されている状態を利用して、そこに当該アミノ酸をそれぞれ反応させ、溶媒で洗浄した後、脱保護する過程を反復することにより、各ペプチドを合成した。合成されたペプチドを樹脂から切り取った後、ＨＰＬＣで精製し、合成いかんをＭＳで確認して凍結乾燥させた。
【００９６】
配列番号１から構成されたＰＥＰ １（ＥＡＲＰＡＬＬＴＳＲＬＲＦＩＰＫ）を例に挙げ、具体的な過程について説明すれば、次の通りである。
【００９７】
１）カップリング
ＮＨ2−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resinで保護されたアミノ酸（８当量）と、カップリング試薬ＨＢＴＵ（８当量）／ＨＯＢｔ（８当量）／ＮＭＭ（１６当量）とをＤＭＦに溶解させて添加した後、常温で２時間反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
【００９８】
２）Ｆｍｏｃ脱保護
２０％のＤＭＦ中のピペリジン（piperidine in ＤＭＦ）を加え、常温で５分間２回反応させ、ＤＭＦ、ＭｅＯＨ、ＤＭＦの順に洗浄した。
【００９９】
３）１及び２の反応を反復して行い、ペプチド基本骨格ＮＨ2−Ｅ（ＯｔＢｕ）−Ａ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｔ（ｔＢｕ）−Ｓ（ｔＢｕ）−Ｒ（Ｐｂｆ）Ｌ−Ｒ（Ｐｂｆ）−Ｆ−Ｉ−Ｐ−Ｋ（Ｂｏｃ）−２−chloro−Trityl Resin）を作った。
【０１００】
４）切断（Cleavage）：合成が完了したペプチドResinに、切断カクテル（Cleavage Cocktail）を加え、ペプチドをResinから分離した。
【０１０１】
５）得られた混合物に、Cooling diethyl etherを加えた後、遠心分離して得られたペプチドを沈澱させる。
【０１０２】
６）Ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣで精製した後、ＬＣ／ＭＳで分子量を確認して凍結させ、パウダーに製造した。
【０１０３】
実施例２：材料の準備及び分析方法
（１）テスト薬物、ＰＥＰ−１の準備
ＰＥＰ−１（配列番号１のペプチド）は、ＰＥＰ−１の補正係数を考慮し（純度：９４．１３％、含量：９２．３６％、補正係数：１．１５）、前記実施例１で言及された方法によって、凍結乾燥ホワイトパウダー状態で得たものを、０．９％サリンに溶解させた。５０ｍｇ／ｍＬ保存溶液は、さらにそれぞれ２０ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ及び１ｍｇ／ｍＬに０．９％サリンを含んで希釈され、４℃で使用されるまで一週間保管された。
【０１０４】
（２）材料の準備
該実施例の目的は、血中性ホルモンの変化を確認するためであり、配列番号１のペプチドＰＥＰ−１を７日間毎日反復的に投与させられたＳＤラットで行われた。該実験は、ＫＡＭＳＩ Ｉｎｃ．（Korea Animal Medical Science Institue）で指定した動物実験規定に従った。また、該実験は、Ｎｏｎ−ＧＬＰ実験であって、ＭＦＤＳ（Ministry of Food and Drug Safety）指示；Agent ２０１３−４０（２０１３年４月５日）、Principles of Good Laboratory Practice（１９９７）を参考にした。
【０１０５】
ＳＰＦラット（Ｃｒｌｊ：ＣＤ（ＳＤ））は、ORIENTBio Ｉｎｃ．（大韓民国京畿道加平郡北面沐洞里所在）から購買した。７５個体の雄（生後６．５週、１９０〜２１０ｇ）ラット、及び７５個体の雌（生後６．５週、１６０〜１８０ｇ）ラットを４日間観察し、雄及び雌それぞれ６４個体が実験対象に選定された。生育条件は、次の通りである：２３±３℃の温度、５±１５％の相対湿度、１０−２０回／時間の空気交換、１２時間（午前８時〜午後８時）の照度１５０〜３００ルクス強度の照明時間。
【０１０６】
動物施設の環境、例えば、温度−湿度、空気交換回数及び光の強度が定期的に測定された。動物のえさは、（Cargill Agri PurinaＩｎｃ．で生産される）DreamBios Ｃｏ．，Ｌｔｄ（大韓民国ソウル特別市広津区クワンナルロ５０７所在）から購入し、ラットが自由に食べられるえさ供給システムを使用した。浄水された水は、ポリカーボネート水入れを使用して与えられ、ラット飼育場の寝具は、SaeronBio Ｉｎｃ．（大韓民国京畿道義王市清渓洞８００−１７所在）から購入した。最大５匹のラットは、適応期間、検査期間、投与手続きの期間の間、それぞれポリカーボネート飼育場（Ｗ１７０ｘＬ２３５ｘＨ１２５ｍｍサイズ）で飼育された。水、寝具及び飼育場は、週１回以上交替された。
【０１０７】
（３）動物グループ及び投与経路
６４個体の雄ラット及び雌ラット（前述のところ）は、８グループに分けられた。投与療法は、例えば、薬物、経路、投与量、体積などは、以下の通りである。
【表３】
0006495899.tif 000004
【０１０８】
詳細な投与療法は、以下の通りである：１日１回、１日２回そして１週２回は、それぞれの実験グループである。投与は、毎日午前１０時に始め、それぞれのラットは、それぞれ１分間隔で投与された。グループ９，１０，１３，１４のラットは、１週間に２回投与された。高用量の投与は、低用量の投与より先行された。投与のボリュームは、最も最近測定されたラットの重さを使用して計算し、それは、５ｍＬ／ｋｇである。皮下投与は、次のように施行された：補助者がラットの背を上に向けるようにつかめば、実験者がラットの背を７０％アルコールで消毒し、テスト薬物を、２６Ｇ注射器を使用して皮下投与した。
【０１０９】
（４）採血
１．４ｍＬの血液サンプル（０．７ｍＬの血清）が、体重測定（day ０）後に収集された。翌日（day １）、１．４ｍＬの血液サンプル（０．７ｍＬの血清）が、テスト薬物の投与後（それぞれ、テスト薬物投与の４時間後及び８時間後）、２回収集された。その後、６日間（day ２〜day ７）、１．４ｍＬの血液が毎日１回（テスト薬物投与４時間後）収集された。テスト薬物の投与量とボリュームは、それぞれ表３で提示された通りであり、投与時間帯も、毎日同じ時間に行ったものである。血液は、頚静脈から抽出され、３０分間室温で保管された。血清は、遠心分離機（５分当たり１０，０００ｒｐｍ）で分離し、−７０±５℃のディップフリーザで使用直前まで保管された。採血は、それぞれの対象から毎日同じ時間帯に行われた。
【０１１０】
（５）ホルモン分析方法
ＣＬＩＡ（chemi-luminescence immune assay）キットが、テストステロン、エストラジオールＥ２、濾胞刺激ホルモン及び黄体形成ホルモンの分析に使用された。分析は、採血後４８時間以内に完了され（中央大学校病院内実験医薬部署）、詳細な方法は、以下の通りである：ＰＥＰ−１とビヒクル（vehicle）との比較分別、及びＰＥＰ−１投与量間の分別は、One-way ANOVAを使用し、Duncanテストは、パラメータテスト用として使用され、Dunnett’sテストは、非パラメータテスト用として使用された。ｐ＜０．０５は、統計学的有意性を示し、全ての統計分析は、ＳＰＳＳ １０．１を介して導き出された。
【０１１１】
II．ホルモンに対する分析
実施例３：テストステロンの分析
テストステロンは、実施例２で準備されたサンプルを使用して分析された。１５μＬの血清が分析に使用された。分析の基礎は、競争的な免疫分析法であり、直接的な化学蛍光法を基本にした。実施例２において言及したように、テストステロン分析には、ＣＬＩＡキットが使用され、製造社の規約に従った。結果は、次の通りである：ＰＥＰ−１あるいはビヒクルを注入する前に、全てのグループのテストステロンレベルは、１−３ｎｇ／ｄＬであった。１日目、テストステロンレベルは、６−１０ｎｇ／ｄＬまでビヒクルを注入したグループを除いた全てのグループで増加した。２日目、テストステロンレベルは、Ｇ３，Ｇ５，Ｇ１１及びＧ１５グループで最も高く示され、それらグループは、１日１回注入療法が施行されたグループであった。３日後、テストステロンレベルは低下し、ＰＥＰ−１及びビヒクルを注入したグループ間の明らかな差はなく、正常レベルに戻った。雌グループにおいて、テストステロンのベースラインは、特異点を見い出せないほど低かった。さらに、雄グループと異なり、雌グループは、テストステロンレベルが、ＰＥＰ−１あるいはビヒクルの注入前、０．２ｎｇ／ｄＬ以下であり、ＰＥＰ−１の注入後、０．０５ｎｇ／ｄＬまで続けて低下し、３日目に正常レベルに戻った。それによれば、ＰＥＰ−１は、雌ラットのテストステロンレベルには、明らかな効果がないものと見られる（表４、並びに図２及び図３を参照）。
【表４】
0006495899.tif 000005
【０１１２】
実施例４：エストラジオールＥ２の分析
エストラジオールＥ２は、実施例２で準備されたサンプルを利用して分析された。７５μＬの血清が分析に使用された。分析の基礎は、競争的な免疫分析法であり、直接的な化学蛍光法を基本にした。実施例２で言及したように、分析には、ＣＬＩＡキットが使用され、製造社の規約に従った。雄グループにおいて、エストラジオールＥ２の血中平均レベルは、雌より低く、エストラジオールＥ２の初期レベル（ＰＥＰ−１の注入前）は、１５−２０ｐｇ／ｍＬに７日目まで維持され、ＰＥＰ−１は、エストラジオールＥ２のレベルに影響を及ぼさないことが分かった。しかし、一日目、雌グループにおいて、エストラジオールＥ２が、２０−５０ｐｇ／ｍＬ（ベースライン）から１６−３０ｐｇ／ｍＬに、全てのＰＥＰ１を注入されたグループで低下した。かようなレベルは、３日目まで一定に維持され、４日目から、エストラジオールＥ２のレベルが、Ｇ４、Ｇ１０及びビヒクルグループで、４０−５０ｐｇ／ｍＬまで上昇していて、正常レベルに戻ることが分かった（表５、並びに図４、図５を参照）。結論として、ＰＥＰ−１は、雌グループのエストラジオールＥ２レベルを初期に阻害するが、３−４日目からそのレベルが回復され、特に、注入回数及びテスト薬物の投与量が、エストラジオールＥ２レベルの阻害に係わるように見えた。
【表５】
0006495899.tif 000006
【０１１３】
実施例５：濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分析
濾胞刺激ホルモンは、実施例２で準備されたサンプルを利用して分析された。１００μＬの血清が分析に使用された。分析の基礎は、２サイトサンドイッチ免疫分析法であり、直接的な化学蛍光法を基本にした。実施例２で言及したように、分析には、ＣＬＩＡキットが使用され、製造社の規約に従った。
【０１１４】
分析結果において、ＰＥＰ−１が投与された雌及び雄のいずれもから、ベースライン（注入前）と比べるとき、特に、高用量が投与されれば（Ｇ１１からＧ１６のグループ）、小幅上昇（１日目、投与の４時間後及び８時間後）することが分かった（表６、図６、図７を参照）。１日目、Ｇ６及びＧ１４のグループの濾胞刺激ホルモンレベルがビヒクルグル−ムと比べるとき、上昇することが分かった。
【表６】
0006495899.tif 000007
【０１１５】
実施例６：黄体形成ホルモン（ＬＨ）分析
ＬＨは、実施例２で準備されたサンプルを利用して分析された。５０μＬの血清が分析に使用された。分析の基礎は、２サイトサンドイッチ免疫分析法であり、直接的な化学蛍光法を基本にした。実施例２で言及したように、分析には、ＣＬＩＡキットが使用され、製造社の規約に従った。
【０１１６】
分析結果において、ＰＥＰ−１は、雄及び雌のいずれからも黄体形成ホルモン分泌を促進するということが分かり、特に、高い投与量及び頻繁な注入の場合において、黄体形成ホルモンのレベルが上昇するということが分かった。雄ラットの黄体形成ホルモンレベルは、ＰＥＰ−１投与前、０．１ｍＩＵ／ｍＬであり、ビヒクルを除いた全てのグループにおいて、４時間後、０．５−１．５ｍＩＵ／ｍＬまで上昇した。黄体形成ホルモンのレベルは、毎日投与療法を実施したＧ５、Ｇ１１、及びＧ１５において最も高かった。８時間後、黄体形成ホルモンのレベルは、急激に低下し、終了時まで正常レベルに維持された。雌ラットにおいて、黄体形成ホルモンレベルは、再び４時間後に上昇したが、高い投与量療法のＧ１２，Ｇ１４及びＧ１６グループから上昇幅が大きく落ちていなかった。さらに、８時間後、黄体形成ホルモンレベルは、正常レベルに戻った（表７及び図８、図９を参照）。
【表７】
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【０１１７】
実施例７：性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）分析
（１）ラットにＰＥＰ−１を注入
Orient Bio（大韓民国京畿道所在）から得たＳＤ（Spargue-Dawley）ラットのうち、生後７週のラットが研究に使用された。ラットは、４グループ（Ｇ１−Ｇ４）に分けられ、表８に示されている。ラットは、７日の研究期間の間、ＰＥＰ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）を皮下投与で２回（１日目及び７日目）注入される。血液サンプル（１．４ｍＬ）は、０日目（ＰＥＰ−１投与前）、１日目（注入４時間後及び８時間後）そして７日目（注入４時間後）に収集された。血清サンプルは、血から得て実験に使用された。血清サンプルは、１日目（注入４時間後）に収集された血液から収集され、実験に使用された。動物の処置及び進行過程は、ＫＡＭＳＩのＩＡＣＵＣの規定によって承認された。
【表８】
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【０１１８】
（２）Real−Time ｑＰＣＲ
ＲＮＡ分離及びｃＤＮＡ合成は、血清サンプルから実施した。外部コントロールで、ｍｉＲＮeasy Serum／Plasma Spike-In Controlが、各血清サンプルにＲＮＡ抽出施行前に追加され、総合ＲＮＡが血清サンプルから抽出されて精製され、そこに、ｍｉＲＮeasy Serum／Plasma Kit（Qiagen、米国・カリフォルニア州バレンシア所在）を使用し、製造社の指示に従った。ｃＤＮＡサンプルの第１鎖は、総合ＲＮＡから合成され、Reverse Transcription System（Promega、米国・ウィスコンシン州マディソン所在）を使用した。
【０１１９】
（３）Real−Time ｑＰＣＲ実験
Real−Time ｑＰＣＲｄｍｓ ＲＴ２ ＳＹＢＲ Green ｑＰＣＲ Mastermix kit（Qiagen）とＣＦＸ９６ Real−Time System（Bio-Rad、米国・カリフォルニア州ハーキュリーズ所在）が使用された。データは、ＣＦＸ Manager Software Ｖ３．０がΔΔＣｔ方法を使用したものを利用して分析された。
【表９】
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【０１２０】
（４）性腺刺激ホルモン放出ホルモンの血清レベル
実験１日目、ＰＥＰ−１（１００ｍｇ／ｋｇ）の注入４時間後、血液サンプルから得たラット血清サンプルが、性腺刺激ホルモン放出ホルモンのｍＲＮＡ発現分析に利用された。図１０及び図１１から分かるように、雄ラット及び雌ラットのいずれにおいても、ＰＥＰ−１投与による相対的な性腺刺激ホルモン放出ホルモンｍＲＮＡの発現上昇が示された。性腺刺激ホルモン放出ホルモンレベルの上昇は、血清サンプルで観察され、それは、図６から図９から分かるように、１日目注入４時間後、最初の初期黄体形成ホルモン及び初期濾胞刺激ホルモンの急増と関連がある。結果は、ＰＥＰ−１の性腺刺激ホルモン放出ホルモンｍＲＮＡレベルの上向き調節（up-regulate）を示し、それは、ＰＥＰ−１が性腺刺激ホルモン放出ホルモンのアゴニストあるいはアナログとしての薬剤学的適用の可能性を指示している。
【０１２１】
かようなホルモンに対する分析を介して、本発明の性ホルモン調節剤は、テストステロン、エストロゲン、濾胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び性腺刺激放出ホルモンを含んだ性ホルモンを調節するのに効果があるということが分かる。
【０１２２】
III ．ホルモン調節剤による前立腺肥大症治療効果
実施例８：テストステロンの前立腺細胞株内での分析
テストステロンは、体内に注入されれば、５α還元酵素によって、ＤＨＴ（dehydrotestosterone）の形態になって前立腺細胞増殖を促進し、それにより、前立腺肥大症（ＢＰＨ）を誘発する。該事実に基づいて、次のように、前立腺細胞株の細胞増殖抑制効果に対するＰＥＰ−１（ＧＶ１００１）投与実験が進められた。細胞株は、前立腺肥大動物モデルで得た前立腺の実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）と、上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）とを使用した。実験方法は、ＷＰＭＹ−１（２．５×１０3cells）とＲＷＰＥ−１（１×１０4cells）とを、９６ウェルにシーディング（seeding）し、表１０のような実験群を対象に増殖変化を確認した。増殖変化確認は、培養液吸入（suction）後、ＣＣＫ−８溶液を、各ウェルに１０μＬずつ入れた後、１−４ｈｒの間、４５０ｎｍで光学密度（optical density）を測定する方式で進めた。
【０１２３】
ＤＨＴを処理していないグループ（１−３グループ）の間には、ＰＥＰ−１（ＧＶ１００１）を投与していないグループ（１グループ）と、投与した（２及び３グループ）グループとにおいて、目立つ違いが、実質細胞株（ＷＰＭＹ−１）及び上皮細胞株（ＲＷＰＥ−１）のいずれにおいても見られないということが分かった。ＤＨＴを処理したグループ（４−６グループ）の間には、ＰＥＰ−１（ＧＶ１００１）を投与していないグループ（４グループ）と投与した（５及び６グループ）グループとで、有意的違いを示し、ＰＥＰ−１（ＧＶ１００１）を処理したグループにおいて、確実な増殖抑制効果があるということが分かった（表１０及び図１２、１３参照）。従って、ＤＨＴによる前立腺肥大症に影響を与える前立腺細胞増殖抑制に、ＰＥＰ−１が効果があると見られる。
【表１０】
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【０１２４】
かようなホルモン調節剤の細胞実験を介して、本発明の性ホルモン調節剤は、前立腺肥大症のようなホルモン過多または欠乏による疾患の治療、改善または予防のための使用に効果があるということが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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