(57)【要約】【課題】イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質、その生産方法及びこれを含有するシルク繊維製造用組成物を提供する。【解決手段】本発明は、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質、その生産方法及びこれを含むシルク繊維製造用組成物に関する。本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、クモとカイコ由来シルクタンパク質の遺伝情報と類似な配列的特徴を有し、形質転換体から多量のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産することができ、強度及び弾性力などの物性に優れている。したがって、本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、天然シルクタンパク質が適用されることができる多様な産業分野に有用に使用されることができると共に、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質特有の機械的物性に基づいて新規産業分野を創出することができるものと期待される。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を含むイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を含むイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質。
【請求項３】
上記アミノ酸配列は、配列番号２または配列番号３で記載されたアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項１または２に記載のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質。
【請求項４】
１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、及び
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階を含む、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法。
【請求項５】
上記アミノ酸配列は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項４に記載のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法。
【請求項６】
上記宿主細胞は、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞及び昆虫細胞よりなる群から選択された１種以上であることを特徴とする請求項４に記載のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法。
【請求項７】
上記３）段階で生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、配列番号２、３または４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項４に記載のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法。
【請求項８】
配列番号２、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列よりなる群から選択された１種以上のアミノ酸配列を含むシルク繊維製造用組成物。
【請求項９】
上記アミノ酸配列は、配列番号２、配列番号３及び配列番号４よりなる群から選択されたアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項８に記載のシルク繊維製造用組成物。
【請求項１０】
配列番号４で記載されたアミノ酸配列が１〜２００回連結されたポリペプチドを含むシルク繊維製造用組成物。
【請求項１１】
１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階、及び
５）上記精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸する段階を含む、シルク繊維の生産方法。
【請求項１２】
上記アミノ酸配列は、配列番号１で記載したアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項１１に記載のシルク繊維の生産方法。
【請求項１３】
上記５）段階で湿式紡糸条件は、精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質をリン酸、酢酸、ギ酸、塩酸、硫酸、硝酸、ＨＦＩＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ＨＦＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ＨＦＡ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びメチルイミダゾリウムクロライド（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）よりなる群から選択された１種以上の溶媒；または尿素、ＬｉＢｒ、ＮＭＭＯ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ）及びゾリウムクロライド（ｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｌｉｄｅ）よりなる群から選択された１種以上が溶解されたリン酸、酢酸、ギ酸、塩酸、硫酸、硝酸、ＨＦＩＰ、ＨＦＰ、ＨＦＡ、ＴＦＡ及びメチルイミダゾリウムクロライドよりなる群から選択された１種以上の溶媒に溶解させ、
上記イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質溶液をメタノール、イソプロパノール、アセトン、アンモニウムスルフェート（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）及び水よりなる群から選択された１種以上の凝固誘導溶媒に０．５〜２０ｍＬ／ｈｒの速度で湿式紡糸することを特徴とする請求項１１に記載のシルク繊維の生産方法。
【請求項１４】
上記方法は、紡糸が終わったシルクタンパク質をドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）する段階をさらに含む 請求項１１に記載のシルク繊維の生産方法。
【請求項１５】
１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階、及び
５）上記精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を電気紡糸する段階を含む、シルク繊維の生産方法。
【請求項１６】
上記アミノ酸配列は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする請求項１５に記載のシルク繊維の生産方法。
【請求項１７】
上記５）段階で電気紡糸条件は、精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質をリン酸、酢酸、ギ酸、塩酸、硫酸、硝酸、ＨＦＩＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ＨＦＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ＨＦＡ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）及びメチルイミダゾリウムクロライド（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）よりなる群から選択された１種以上の溶媒；または尿素、ＬｉＢｒ、ＮＭＭＯ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ）及びゾリウムクロライド（ｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｌｉｄｅ）よりなる群から選択された１種以上が溶解されたリン酸、酢酸、ギ酸、塩酸、硫酸、硝酸、ＨＦＩＰ、ＨＦＰ、ＨＦＡ、ＴＦＡ及びメチルイミダゾリウムクロライドよりなる群から選択された１種以上の溶媒に溶解させ、
上記イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質溶液に酢酸を添加した後、１０〜２０ｋＶの電圧下に電気紡糸を行うことを特徴とする請求項１５に記載のシルク繊維の生産方法。
【請求項１８】
請求項１１〜１４のいずれかに記載の方法によって生産されたシルク繊維。
【請求項１９】
請求項１５〜１７のいずれかに記載の方法によって生産されたシルク繊維。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質、その生産方法及びこれを含むシルク繊維製造用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然シルクタンパク質素材は、長い間代表的な衣類用素材に使用されて来ており、最近、天然シルクタンパク質の優れた生体適合性、優れた伸縮性と物理的強度、及び粉末、膜、多孔質体、ゲルのような多様な形態への成形が可能であるという点、天然タンパク質として化学的改質が可能であるという点などの特性に起因して、次世代高機能性産業用素材として活用される可能性が非常に高い。
【０００３】
現在までシルクタンパク質は、主にカイコとクモで生産されると知られている。
【０００４】
カイコシルクタンパク質の場合、カイコが養殖が可能であり、３００ｍ２の面積と約１５０万匹のカイコで５ｋｇの量まで生産が可能で、伝統的に織物製造に広く用いられてきた。また、天然カイコシルクタンパク質は、免疫反応やアレルギー反応がないため、人体親和的な素材であって、化粧品素材、酵素固定化担体、細胞培養用素材、人工皮膚などの産業用素材として利用される可能性が提示されている。しかし、カイコシルクタンパク質は、堅固性、すなわち強度側面で物性が少し不足で、まだ産業用素材として利用するには多少制約があり、現在カイコシルクタンパク質の物性を改善するための多様な研究が行われている。例えば、カイコシルクタンパク質の主構成成分である絹フィブロインの分子量別の分離及び機能性に関する研究、カイコシルクタンパク質の微細粉体の製造及び皮膚親和性に関する研究、カイコシルクタンパク質と化学的合成高分子のブレンディングを用いた物性向上研究、カイコシルクタンパク質と天然糖基盤の高分子化合物との混合研究などがある。
【０００５】
クモシルクタンパク質の場合、最近自然で得られたクモシルクタンパク質の物性が堅固性と伸縮性の側面で非常に優れているという事実が明らかにされた後、産業素材として利用するための研究が活発に進行されている。しかし、クモは、互いに食う特性があるため、養殖が不可能であり、クモで生産するシルクタンパク質の量が非常に少ないため、カイコシルクタンパク質のように天然タンパク質を分離及び生産して使用するには現実的に不可能なものと知られている。したがって、クモシルクタンパク質関連研究は、クモシルクタンパク質遺伝子を多様なタンパク質発現システムに導入し、組み換えタンパク質を生産しようとする研究が主に行われており、大腸菌、酵母、植物細胞、動物細胞、遺伝子移植動物などでクモシルクタンパク質を大量生産しようとする多様な試みが進行されている。全般的にクモシルクタンパク質に関連した研究は、主に２０００年代以後に集中的な研究及び投資によってある程度の優れた研究成果が最近報告されているが、クモシルクタンパク質遺伝子の繰り返し的なＤＮＡ配列とグリシン、アラニン、セリンのような特定アミノ酸配列の繰り返しのような独特な特性は、自然で存在するシルクタンパク質素材を組み換えして生産するのに限界として作用している。クモシルクタンパク質の特徴的な一部配列のみを発現し、大量生産する研究の場合も、生産された素材を糸のように作ることは可能であるが、得られた物性が自然上のクモシルクタンパク質と比較して顕著に不足な限界に現在直面していることが現況である。
【０００６】
したがって、天然カイコ及びクモシルクタンパク質自体の遺伝子的特性とタンパク質物性に対する理解から、このような配列特性を有するタンパク質を大量生産するための方案が考察されており、また、その理解を基礎に自然に存在する新しい天然シルクタンパク質素材を探索し、新しいシルクタンパク質素材に対する必須物質特許をまず確保しようとする努力が進行されている。このような側面で最近、蟻と蜂でもカイコやクモのシルクタンパク質と類似な遺伝子配列特性を有するシルクタンパク質が報告されており、天然シルクタンパク質の特性を有する遺伝子が再設計された新しいシルクタンパク質素材が設計されている。
【０００７】
一方、イソギンチャク（ｓｅａ  ａｎｅｍｏｎｅ）は、刺胞動物刺胞動物門花虫綱に属するイソギンチャク目動物の総称である。海で生活し、岩礁上で付着生活をするが、砂の中に埋まって生きるものもあり、足盤を利用して移動するものもある。また、足盤が管形状よりなり、浮遊生活をしたり、胴体や触手を動かして遊泳したりする。食性は、動物性であり、雑食をし、漂うプランクトンから自分の身より大きい魚まで食う。えさの捕捉は、触手にある多数の刺胞を利用する。刺胞では、テトラミンという毒性物質が放出される。イソギンチャクの種類としては、ウメボシイソギンチャク、サンゴイソギンチャクなどがある。身は、柔らかい筋肉質であり、円筒形状よりなる。身には、多数個の内部が空いた触手が付いていて、その真ん中に口が開かれている。身の長さは、１．５〜５ｃｍ程度であり、幅は多様である。身の色は、白色、緑色、青色、オレンジ色、赤色などである。大部分雌雄異体であり、有性生殖をする。一般的に海中で体外受精をするが、或る種では、卵胎生のものもある。イソギンチャクは、今まで世界的に約１，０００余種が知られており、特徴的にサンゴ類に属する他の動物との差異は、群体を作ることなく、単独で生活する。
【０００８】
現在までは、海洋で棲息する種の遺伝子とタンパク質水準での探索が低調で、これら海洋由来種からシルクタンパク質の生産に関する研究は、ほとんどないのが実情である。したがって、海洋に多く棲息しているイソギンチャクから組み換えシルクタンパク質を生産する方法について研究すれば、既存のクモとカイコにのみ依存したシルクタンパク質を代替することができるものと考えられる。したがって、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の開発の必要性が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、既存に知られたクモとカイコ由来シルクタンパク質の配列を分析し、これと同一の配列的特徴を有する新しい遺伝情報をイソギンチャクから得て、形質転換体を通じてイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を発現及び精製し、得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸または電気紡糸し、シルク繊維素材を確保し、イソギンチャクシルク繊維の強度及び弾性力に優れていることを確認することによって、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質、その生産方法及びこれを含有するシルク繊維製造用組成物を提供する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、クモとカイコ由来シルクタンパク質の遺伝情報と類似な配列的特徴を有し、形質転換体から多量のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産することができ、強度及び弾性力などの物性に優れている。したがって、本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、天然シルクタンパク質が適用されることができる多様な産業分野に有用に使用されることができると共に、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質特有の機械的物性に基づいて新規産業分野を創出することができるものと期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、イソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターの模式図である。
【図２】図２は、発現向上モチーフが添加されたイソギンチャクシルクタンパク質（３０ｋＤａ）の遺伝子を含む発現ベクターの模式図である。
【図３】図３は、イソギンチャクシルクタンパク質遺伝子を２回、３回及び４回繰り返して作られたシルクタンパク質６０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１２０ｋＤａをコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子の発現システム模式図である。
【図４】図４は、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで確認した図である。
【図５】図５は、発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで確認した図である。
【図６】図６は、モチーフが添加されたあるいは添加されないイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を３０ｋＤａ、６０ｋＤａ（２回繰り返し）、９０ｋＤａ（３回繰り返し）、１２０ｋＤａ（４回繰り返し）でサイズを増やして、その発現様態をウェスタンブロットで確認した図である。ＴｒＭ：モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質、Ｍ：モチーフが添加されないイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質、Ｓ１：３０ｋＤａイソギンチャク由来シルクタンパク質、Ｓ２：６０ｋＤａイソギンチャク由来シルクタンパク質（２回繰り返し）、Ｓ３：９０ｋＤａイソギンチャク由来シルクタンパク質（３回繰り返し）、Ｓ４：１２０ｋＤａイソギンチャク由来シルクタンパク質（４回繰り返し）
【図７】図７は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析方法を利用して得た精製された３０ｋＤａと６０ｋＤａサイズを有するイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の質量分析結果を示す図である。
【図８】図８は、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析方法を利用して得た発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の質量分析結果を示す図である。
【図９】図９は、発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成分析結果を示す図である。
【図１０】図１０は、湿式紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維の様態を示す図である。
【図１１】図１１は、湿式紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維を電子走査顕微鏡で観察した図である。
【図１２】図１２は、電気紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維を電子走査顕微鏡で観察した図である。（上）リン酸を利用した電気紡糸、（下）ギ酸を利用した電気紡糸
【図１３】図１３は、Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａ  ｖｅｃｔｅｎｓｉｓの免疫組織化学法を用いた抗原抗体反応を確認した図である。（上）ＩｇＧ抗体を利用した免疫組織化学法、（下）イソギンチャク由来シルクタンパク質抗体を利用した免疫組織化学法
【図１４】図１４は、湿式紡糸後に得られたカラム精製された３０ｋＤａのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の引張強度実験結果である。
【図１５】図１５は、湿式紡糸後に得られたカラム精製６０ｋＤａのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の引張強度実験結果である。
【図１６】図１６は、カラム精製された３０ｋＤａのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の乾燥条件と湿式紡糸に使用される有機溶媒内でのドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）後の引張強度実験結果である。
【図１７】図１７は、熱衝撃と酸抽出による精製方法で得られた３０ｋＤａのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の引張強度実験結果である。
【図１８】図１８は、熱衝撃と酸抽出による精製方法で得られた６０ｋＤａのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の引張強度実験結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、配列番号２または３のアミノ酸配列を含むイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を提供する。
【００１４】
また、本発明は、配列番号２または配列番号３で記載されたアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性を有することを特徴とするイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を提供する。好ましくは、上記配列番号２または配列番号３で記載されたアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性を有することを特徴とするイソギンチャク由来組み換えシルクンタンパク質を提供する。
【００１５】
また、本発明は、
１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、及び
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階を含む、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法を提供する。
【００１６】
また、本発明は、
１）配列番号１で記載されたアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性、好ましくは、９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、アミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、及び
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階を含む、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列よりなる群から選択された１種以上のアミノ酸配列を含むシルク繊維製造用組成物を提供する。
【００１８】
また、本発明は、
１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階、及び
５）上記精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸する段階を含む、シルク繊維の生産方法を提供する。
【００１９】
また、本発明は、
１）配列番号１で記載されたアミノ酸配列と８０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、アミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階、及び
５）上記精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸する段階を含む、シルク繊維の生産方法を提供する。
【００２０】
また、本発明は、
１）配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階、及び
５）上記精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を電気紡糸する段階を含む、シルク繊維の生産方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、
１）配列番号１で記載されたアミノ酸配列と９０％以上の配列相同性、好ましくは９０％以上の配列相同性を有することを特徴とする、アミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造する段階、
２）上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造する段階、
３）上記形質転換体からイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する段階、
４）上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する段階、及び
５）上記精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を電気紡糸する段階を含む、シルク繊維の生産方法を提供する。
【００２２】
また、本発明は上記シルク繊維の生産方法によって生産されたシルク繊維を提供する。以下、本発明について詳しく説明する。
【００２３】
本発明のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質のｍＲＮＡ配列のうち一部のコドン配列を再配置して最適化した後、最適化されたイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターを製造し、上記発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造した後、形質転換体から生産されることを特徴とする。
【００２４】
上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、配列番号２、３または４のアミノ酸配列を有し、配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列Ｃ−末端に６個のヒスチジンが連結（６×ｈｉｓ精製ｔａｇ配列；ＨＨＨＨＨＨ）されており、配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列Ｃ−末端に６個のヒスチジンが連結されており、Ｎ−末端に発現向上モチーフ配列（ＭＫＡＩＦＶＬＫＤＤＤＤＫ）が連結されており、配列番号４のアミノ酸配列は、１０個のアミノ酸配列またはその変形された形態のアミノ酸配列である。上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列が１回以上連結されたポリペプチド、好ましくは、１〜２００回の間で連結されたポリペプチド、さらに好ましくは、１〜１２０回の間で連結されたポリペプチドであることができる。また、上記１〜２００回または１〜１２０回の間に他のアミノ酸配列が含まれて連結されたポリペプチドであることができる。
【００２５】
自然に存在するイソギンチャクシルクタンパク質（ａｎｅｒｏｉｎ）は、既存のクモ由来シルクタンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ）として知られた５個のアミノ酸の繰り返し構造［ＧＰＧＸＸ（Ｘ＝Ａ、Ｖ、Ｓ、Ｙ）］を有し、これと類似なアミノ酸配列を有するタンパク質（配列番号１のアミノ酸配列）であって、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＸＰ＿００１６２１０８５．１）の情報を利用した。ＮＣＢＩ検索を通じて得たイソギンチャクシルクタンパク質は、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来シルクタンパク質と４９．５％の同一性及び６０．２％の相同性を有し、クモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）由来シルクタンパク質とは、４３．２％の同一性及び６４％の相同性を有する。
【００２６】
本発明のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、外部遺伝子を発現することができる用途に製作された通常のベクターに発現可能になるように挿入し、遺伝工学的な方法で大量生産することができる。本発明のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法について詳しく説明すれば、次の通りである。
【００２７】
まず、イソギンチャクシルクタンパク質のｍＲＮＡ配列のうち一部のコドン配列を再配置して最適化する。イソギンチャクシルクタンパク質のＤＮＡ配列は、宿主細胞で主に使用するコドンに変形されるか、またはＤＮＡコドン配列の重複及び繰り返しを回避するための他のコドン配列に変形されて使用されることができる。上記最適化されたイソギンチャクシルクタンパク質のＤＮＡを両端にＮｄｅ１、Ｘｈｏ１の制限酵素サイトに添加し、発現用プロモーターＴ７（ｐＴ７）を含む発現ベクターｐＥＴ２３ｂ（＋）にクローニングして発現ベクターを製造する。上記製造された発現ベクターは、ベクター内のＣ−末端にヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）が含まれるようにし［６×ｈｉｓ精製ｔａｇ配列；ＨＨＨＨＨＨ］、別にイソギンチャクシルクタンパク質の発現量を増加させるために、ＴｒｐＬモチーフ（ｍｏｔｉｆ）をイソギンチャクシルクタンパク質のＮ−末端に導入する［発現向上モチーフ配列；ＭＫＡＩＦＶＬＫＤＤＤＤＫ］。上記発現ベクターは、タンパク質を生産するための宿主細胞の種類及び特性によって適切に選択するか、または新しく製造することができる。
【００２８】
発現ベクターを宿主細胞に挿入し、形質転換体を製造するか、または形質転換体から組み換えタンパク質を生産する方法は、通常の方法を利用して容易に行うことができる。本発明において使用された宿主細胞としては、大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞または昆虫細胞などを含むが、これに限定されない。以下では、宿主細胞として大腸菌を使用して形質転換体の製造及びこれからイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の生産方法について詳しく説明する。
【００２９】
上記製造された発現ベクターを４２℃で２分間放置する熱衝撃方法で宿主細胞に挿入し、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する形質転換体を製造する。
【００３０】
上記形質転換体をＬＢ培地、好ましくはアンピシリンが添加されたＬＢ培地に接種し、振とう培養する。イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現を誘導するために、培養液の吸光度（ＯＤ６００）が６００で０．４〜１．０、好ましくは０．８〜０．９になったとき、タンパク質発現誘導物質であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を０．１〜１０ｍＭで添加し、さらに１６〜３７℃で３〜２４時間振とう培養する。培養された細胞を遠心分離した後、上澄み液を除去し、細胞を回収した後、回収された細胞を溶解溶液に浮遊させ、超音波粉砕機または高圧ホモジナイザーを利用して破砕する。破砕された細胞の一部を全細胞破砕液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）、水溶性画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）及び不溶性画分（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分け、残りの全細胞破砕液は、遠心分離し、上澄み液のみを回収する。回収された上澄み液は、ヒス−タグカラム（Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｃｏｌｕｍｎ）を利用して水溶性画分で発現されるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製する。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、５％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、０．２５％ブロモフェノールブルー）に希釈した後、１００℃で５分またはそれ以上の間に沸かして変性させた後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、分子量別に分離し、ウェスタンブロットを通じてイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現を確認する。
【００３１】
次に、宿主細胞で生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、ニッケルレジンが充填されたカラムを利用した通常の親和度クロマトグラフィーを実施し、カラムに結合したタンパク質を４０ｍＭ〜５Ｍのイミダゾールで精製する。好ましくは、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質が含まれた破砕された細胞の水溶性画分をニッケル−ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）カラムに注入し、洗浄溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）でカラムに結合しないタンパク質を洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）でタンパク質をカラムで分離し、精製する。
【００３２】
また、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、熱衝撃と酸抽出を通じて精製することができる。好ましくは、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質が含まれた破砕された細胞の水溶性画分を４０〜１００℃で熱衝撃を加え、この際、生成された不溶性画分を遠心分離を通じて分離し、分離した不溶性画分を酸溶液（例えば、リン酸またはギ酸など）に溶かして、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を抽出して得ることができる。
【００３３】
上記の親和度クロマトグラフィー法や、熱衝撃と酸抽出を通じて精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、水を利用した透析を通じてタンパク質水溶液に残っている水とタンパク質以外の成分を除去し、最終的に凍結乾燥を通じて粉末形態に精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を得る。上記生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、配列番号２または３のアミノ酸配列を有する。
【００３４】
一般的にイソギンチャクシルクタンパク質は、約３０ｋＤａのサイズであるが、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）時に多量のタンパク質が３０ｋＤａではない６０ｋＤａ以上の位置で発見される。これは、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸配列の特性上、電気泳動下で移動が正確に行われないことから発生する現象と考えられる。カイコやクモで得られたシルクタンパク質の電気泳動時にも、このような現象が確認された。したがって、正確なサイズのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析を通じてイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の分子量が約３０ｋＤａ付近で現われることを確認した。また、計算を通じて予測することができるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成と実際精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成値を比較し、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の精製をさらに明確に確認することができる。
【００３５】
また、本発明は、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のアミノ酸配列よりなる群から選択された１種以上のアミノ酸配列を含むシルク繊維製造用組成物を提供する。
【００３６】
上記イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質において配列番号２のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列Ｃ−末端に６個のヒスチジンが連結（６×ｈｉｓ精製ｔａｇ配列；ＨＨＨＨＨＨ）された配列よりなり、配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列Ｃ−末端に６個のヒスチジンがタグされており、Ｎ−末端に発現向上モチーフ配列（ＭＫＡＩＦＶＬＫＤＤＤＤＫ）が連結されており、配列番号４のアミノ酸配列は、１０個のアミノ酸配列またはその変形された形態のアミノ酸配列である。
【００３７】
また、本発明は、配列番号４で記載されたアミノ酸配列が１〜２００回連結されたポリペプチドを含むシルク繊維製造用組成物を提供する。また、上記１〜２００回または１〜１２０回の間に他のアミノ酸配列が含まれて連結されたポリペプチドであることができる。
【００３８】
本発明によるシルク繊維は、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸法または電気紡糸法を利用して製造されることができる。
【００３９】
具体的には、上記粉末形態に精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を（１）酸性溶媒または有機溶媒の単独、またはこれらの混合溶媒；または（２）尿素、ＬｉＢｒ、ＮＭＭＯ（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ−Ｎ−ｏｘｉｄｅ）及びゾリウムクロライド（ｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｒｏｌｉｄｅ）よりなる群から選択された１種以上が溶解された酸性溶媒または有機溶媒の単独、またはこれらの混合溶媒に溶解させる。
【００４０】
上記酸性溶媒は、リン酸、酢酸、ギ酸、塩酸、硫酸、硝酸などを含むが、これに限定されない。上記有機溶媒は、ＨＦＩＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ＨＦＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、ＨＦＡ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｏｎｅ）、ＴＦＡ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃａｃｉｄ）、メチルイミダゾリウムクロライド（ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）などを含むが、これに限定されない。本発明では、ＨＦＩＰが好ましい。この際、上記溶媒に溶解されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の濃度は、３〜２５％（ｗ／ｖ）、好ましくは５〜１５％（ｗ／ｖ）である。もし、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の濃度が上記範囲を脱する場合、湿式紡糸または電気紡糸が起きないこともある。
【００４１】
湿式紡糸法を利用してシルク繊維を製造する場合、上記溶媒に溶解されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を、凝固誘導溶媒がある凝固水槽に０．５〜２０ｍＬ／ｈｒ、好ましくは、１０ｍＬ／ｈｒの速度で湿式紡糸する。上記凝固誘導溶媒は、メタノール、イソプロパノール、アセトン、アンモニウムスルフェート（ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ）、水などを含むが、これに限定されない。本発明では、メタノールとイソプロパノールが好ましく、メタノールとイソプロパノールを１：１の体積比率で混合した混合溶媒がさらに好ましい。上記のような湿式紡糸によって３０〜１２０μｍの均一な直径、好ましくは４０〜８０μｍの均一な直径を有し、欠陥がない均一な繊維糸形態のシルク繊維を得ることができる。
【００４２】
上記得られた繊維糸形態のシルク繊維は、凝固誘導溶媒内で数分〜数時間の間に保管する。これは、繊維糸の物性に影響を与える過程の１つである紡糸後（ｐｏｓｔ−ｓｐｉｎｎｉｎｇ）過程であって、重要な過程である。すなわち、上記得られた繊維糸形態のシルク繊維を上記凝固誘導溶媒を変えながら溶媒中に保管し、繊維の物性を向上させることができる。好ましくは、１０分〜３０分間隔で２回〜７回で溶媒条件を変える。この際、交換する溶媒に一種の架橋剤としてＤＭＳＯ、Ｈ２Ｏ２、リン酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、カリウムシアン化第２鉄（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｆｅｒｒｉｃｙａｎｉｄｅ）、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒ  ａｌｄｅｈｙｄｅ）よりなる群から選択された１種以上の物質を添加させて、タンパク質の物性変化を誘導することができる。好ましくは、ＤＭＳＯを１０％（ｖ／ｖ）〜６０％（ｖ／ｖ）で添加することができ、さらに好ましくは、約２０％のＤＭＳＯを添加することができる。上記紡糸後過程を進行した後に得られた繊維糸は、ドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）過程を選択的に行うことができ、好ましくは１．５〜１０倍の長さ、さらに好ましくは、２倍の長さでドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）することができる。湿式紡糸を通じて得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維を光学顕微鏡と走査電子顕微鏡で観察した結果、上記シルク繊維は、均一な直径を有し、欠陥がないタンパク質よりなることを確認することができる。最終的に湿式紡糸されたシルク繊維は、乾燥過程を経て保管し、ｎａｎｏ  ＵＴＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ）を利用して応力−ひずみ曲線 （ｓｔｒｅｓｓ−ｓｔｒａｉｎ  ｃｕｒｖｅ）を得ることができる。
【００４３】
また、電気紡糸法を利用してシルク繊維を製造する場合、上記溶媒に溶解されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質に酢酸、好ましくはイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質溶液の５〜１５体積に該当する酢酸を添加した後、１０〜２０ｋＶの電圧下に電気紡糸を行う。電気紡糸によって円形の細い繊維形態のシルク繊維を得ることができる。
【００４４】
電気紡糸法によって得られたシルク繊維は、架橋剤としてＤＭＳＯ、Ｈ２Ｏ２、リン酸カルシウム、カリウムシアン化第２鉄、グルタルアルデヒドよりなる群から選択された１種以上の物質を蒸気または溶液の形態で添加させてシルク繊維の強度を高めることができる。
【００４５】
また、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、高分子化合物と混合して電気紡糸させることができる。上記高分子化合物としては、ＰＥＯ（ｐｏｌｙ−ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）、ＰＤＯ（ｐｏｌｙｄｉｏｘａｎｏｎｅ）、ＰＣＬ（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）、ＰＬＧＡ（ｐｏｌｙ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＬＬＡ（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ  ａｃｉｄ）、キトサン、コラーゲンなどを含むが、これに限定されない。
【００４６】
前述したように、本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、クモとカイコ由来シルクタンパク質の遺伝情報と類似な配列的特徴を有し、イソギンチャクの外表面組職と触手に主に位置するタンパク質である。これは、Ｎｅｍａｔｏｓｔｅｌｌａ  ｖｅｃｔｅｎｓｉｓ種を利用した免疫組織化学法を通じて確認された。組み換えタンパク質は、形質転換体から多量のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産することができ、強度及び弾性力などの物性に優れている。したがって、本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、天然シルクタンパク質が適用されることができる多様な産業分野に有用に使用されることができると共に、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質特有の機械的物性に基づいて新規産業分野を創出することができるものと期待される。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００４８】
実施例１：イソギンチャクシルクタンパク質の発現ベクターの製造
１．イソギンチャクシルクタンパク質のＤＮＡ配列の最適化
本実験に使用されたイソギンチャクシルクタンパク質は、仮説のタンパク質（ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）で、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＸＰ＿００１６２１０８５．１）の情報を利用した。
【００４９】
上記イソギンチャクシルクタンパク質は、グリシン（３５％）とプロリン（１８％）が主に存在する総３１９個のアミノ酸よりなるタンパク質であって、１０個のアミノ酸（ＧＰＧＮＴＧＹＰＧＱ）が３０回以上繰り返される特異な構造の配列を有しており、配列の中間または前方の１つまたは２つのアミノ酸が少し異なる形態で存在したりする［イソギンチャクシルクタンパク質の繰り返し配列（変形されたものを含む）−（Ｇ／Ｄ）（Ｐ／Ｓ）（Ｇ／Ｓ）ＮＴＧ（Ｙ／Ｃ）Ｐ（Ｇ／Ｗ）Ｑ；主にＧＰＧＮＴＧＹＰＧＱ、ＤＰＧＮＴＧＹＰＧＱまたはＧＰＳＮＴＧＹＰＷＱなど］。同じアミノ酸配列の繰り返しのためのＤＮＡ配列は、大腸菌内で容易に削除される場合があるので、ＤＮＡ水準で配列の繰り返しを防止し、タンパク質の発現を容易にするために、イソギンチャクシルクタンパク質のｍＲＮＡ配列のうち一部のコドン配列を再配置して最適化した。
【００５０】
また、転写を調節する配列の場合、転写物の２次構造の形成に大きく関与し、これは、転写の停止と持続を左右するので、２次構造の形成が不十分になる繰り返し配列の一部をイソギンチャクシルクタンパク質の前方部に配置し、これによる問題点を最小化しようとした。
【００５１】
自然に存在するイソギンチャクシルクタンパク質のアミノ酸配列（理論ｐＩ：３．９８、理論分子量：２９．３５ｋＤａ）は、配列番号１で示した。
【００５２】
２．イソギンチャクシルクタンパク質の発現ベクターの製造
上記１で最適化したイソギンチャクシルクタンパク質のＤＮＡを両端にＮｄｅ１、Ｘｈｏ１の制限酵素サイトに添加し、発現ベクターであるｐＥＴ２３ｂ（＋）にクローニングした。ｐＥＴ２３ｂ（＋）ベクター内のＣ−末端にヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）が含まれるようにした［６×ｈｉｓ精製ｔａｇ配列；ＨＨＨＨＨＨ］。また、別にイソギンチャクシルクタンパク質の発現量を増加させるために、ＴｒｐＬモチーフ（ｍｏｔｉｆ）をイソギンチャクシルクタンパク質のＮ−末端にエンテロキナーゼ切断（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ）配列を利用して連結した［発現向上モチーフ配列；ＭＫＡＩＦＶＬＫＤＤＤＤＫ］。上記製造された発現ベクターは、大腸菌発現用プロモーターＴ７（ｐＴ７）を含む。
【００５３】
イソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターの模式図は、図１に示し、発現向上モチーフが添加されたイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子を含む発現ベクターの模式図は、図２に示した。
【００５４】
繰り返し配列を増やして、６０ｋＤａのタンパク質を作るための発現ベクターの場合、上記発現ベクター（図１、図２）でＢｇ１１、Ｓａ１１を処理して得た２つの断片のうち目的タンパク質が位置する断片と上記発現ベクター（図１、図２）でＢｇ１１、Ｘｈｏ１を処理して得た２つの断片のうち目的タンパク質が位置する断片をさらに結合させて作った。イソギンチャクシルクタンパク質遺伝子を２回、３回及び４回繰り返して作られたシルクタンパク質６０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１２０ｋＤａのタンパク質をコーディングするイソギンチャクシルクタンパク質の遺伝子の発現ベクター模式図は、図３に示した。
【００５５】
実施例２：イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を生産する形質転換された大腸菌の製造
通常、クローニングに多く使用される大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とタンパク質発現用に使用される大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をＣａＣｌ２緩衝液を使用して反応性を有する細胞を作った。次に、上記実施例１で製造した発現ベクターを４２℃で２分間放置する熱衝撃方法で大腸菌に挿入し、形質転換された大腸菌を製造した。
【００５６】
実施例３：イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現確認及び精製
１．イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現
上記実施例２で形質転換された大腸菌を５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリンが添加されたＬＢ培地に接種し、５Ｌ容量の培養器で１０時間３７℃で振とう培養した。イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現を誘導するために、培養液の吸光度（ＯＤ６００）が６００ｎｍで０．８〜０．９程度になったとき、誘導物質であるＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、１ｍＭ）を添加した。培養された細胞を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液を除去し、細胞を回収した。回収された細胞を溶解溶液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）に浮遊させた後、超音波粉砕機（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）または高圧ホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を利用して破砕した。イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現可否をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で確認するために、破砕された細胞の一部を全細胞破砕液（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ）、水溶性画分（ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）及び不溶性画分（ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）に分けた。残りの全細胞破砕液は、９０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上澄み液のみを回収した。
【００５７】
２．イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の精製
２−１．ヒス−タグカラム（Ｈｉｓ−ｔａｇ  ｃｏｌｕｍｎ）を利用した精製方法
回収された上澄み液は、ヒス−タグカラムを利用して水溶性画分で発現されるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製した。水溶性画分のタンパク質をニッケル−ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）カラムに注入し、タンパク質がカラムと結合する時間を充分に与えた。次に、カラムに結合しないタンパク質を洗浄溶液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄し、溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）でタンパク質をカラムから分離し、精製した。
【００５８】
２−２．熱衝撃と酸抽出による精製方法
イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のさらに他の分離及び精製方法として、熱衝撃と酸抽出による方法を利用して精製した。具体的には、破砕された細胞から水溶性画分のみを回収し、これにさらに約４２℃で熱衝撃を加えた。この過程で形成された不溶性画分を遠心分離を通じて分離し、分離した不溶性画分のみをさらにリン酸に充分に溶かした。この溶液をさらに遠心分離過程を経て上澄み液のみを取った後、酸に完全に溶けたタンパク質のみを分離し、水を利用した透析を一晩行い、タンパク質水溶液に残っている水とタンパク質以外の成分を除去した。透析が終わったタンパク質を凍結乾燥し、粉末形態のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を得た。
【００５９】
形質転換された大腸菌から生産されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸配列（理論ｐＩ：５．２８、理論分子量：３０．４９ｋＤａ）及び発現向上モチーフが添加された組み換えイソギンチャクシルクタンパク質のアミノ酸配列（理論ｐＩ：５．１１、理論分子量：３１．８８ｋＤａ）は、それぞれ配列番号２及び配列番号３で示した。
【００６０】
実施例４：精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の確認
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットを利用した精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の確認
上記実施例３で得た各画分と精製されたサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ用緩衝液（０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、５％ＳＤＳ、５％β−メルカプトエタノール、０．２５％ブロモフェノールブルー）に希釈した後、１００℃で５分間沸かして変性させた。この試料を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに電気泳動し、分子量別に分離した。また、ウェスタンブロットを通じてイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現を確認した。
【００６１】
イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで確認した結果は、図４に示し、発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の発現程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロットで確認した結果は、図５に示した。
【００６２】
図４及び図５に示されたように、イソギンチャクシルクタンパク質は、約３０ｋＤａのサイズであるが、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）時に多量のタンパク質が３０ｋＤａではない６０ｋＤａ以上の位置で発見される。これは、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸配列の特性上、電気泳動下で移動が正確に行われないことから発生する現象と考えられる。このような現象は、イソギンチャクシルクタンパク質遺伝子を２回、３回及び４回繰り返して作られたシルクタンパク質６０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１２０ｋＤａのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の場合も同様であり、これは、図５に示した。
【００６３】
２．精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の質量分析
上記ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で正確なサイズのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の確認が難しかったので、正確なサイズのイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を確認するために、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）分析方法を利用した。マトリックス（ｍａｔｒｉｘ）は、ａ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ａ−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（７ｍｇ／１ｍＬ：５０％ＡＣＮ、５０％Ｄ．Ｗ．、０．１％ＴＦＡ））を利用し、Ｃ４  Ｚｉｐｔｉｐを利用して濃縮と脱塩を行った。その後、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質約０．７〜１．０μＬをマトリックスで溶離した。結果は、線形モード（ｌｉｎｅａｒ  ｍｏｄｅ）で条件を取って誘導した。
【００６４】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析方法を利用して得たイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質及び発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の質量分析結果は、それぞれ図７及び図８に示した。
【００６５】
図７及び図８に示されたように、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質及び発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の質量が約３０ｋＤａ付近で現われることを確認した。
【００６６】
３．精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成分析
イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の精製をさらに明確にするために、精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成分析を行った。
【００６７】
具体的には、精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を蒸留水に溶かし、アミノ酸定量分析キット（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｈ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を利用してアミノ酸組成分析を行った。
【００６８】
発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成分析結果は、図９に示し、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質のアミノ酸組成分析結果の測定値を理論値と比較した値は、表１に示した。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
図９及び表１に示されたように、発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を分離及び精製した後、トリプトファンを除いた１９個のアミノ酸が分析されたことを確認した。
【００７１】
実施例５：イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の溶解溶媒と凝固誘導溶媒による湿式紡糸様態確認
１．凝固誘導溶媒の決定
シルクタンパク質は、どんな溶媒に溶かすかによって、またはどんな液体に湿式紡糸するかによって、凝固様態が大きく異なるようになる。したがって、繊維糸形態のシルクタンパク質を得るためには、タンパク質が凝固浴で広がらずに、一定の厚さの糸形態を示すことができる程度に速い凝固能力が要求される。したがって、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の溶解度を確認するために、既存のシルクタンパク質の溶解度関連実験情報に基づいてＨＦＩＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）、緩衝液Ａ（１６０ｍＭウレア、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ５）、２０ｍＭ  ＮａＣｌ）、イソプロピルアルコール、酢酸、水、８Ｍリチウムブロマイド、ギ酸のような多様な溶媒を利用して溶解度実験を行った。
【００７２】
実験結果、酢酸、イソプロピルアルコール及び８Ｍリチウムブロマイドの場合、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の溶解能が非常に不足であることを確認した。しかし、ＨＦＩＰまたは７０％以上のＨＦＩＰを含有する溶媒の場合、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の溶解度が最も優れていることを確認した。したがって、タンパク質の溶解能の側面においてＨＦＩＰが最も優れたタンパク質溶解能を有することが分かる。
【００７３】
また、湿式紡糸のための凝固浴にＨＦＩＰに溶解されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸し、タンパク質の凝固形態を観察した。すなわち、イソプロピルアルコールを凝固浴に満たし、ＨＦＩＰに溶解されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸した場合、薄くて、柔らかい形態であるが、硬度が弱いタンパク質が紡糸されたが、メタノール溶液を凝固浴に満たし、ＨＦＩＰに溶解されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を湿式紡糸した場合、表面が荒くて、さらに厚い形態のタンパク質繊維が紡糸され、手で扱いやすい程度の硬度を有する凝固された繊維糸形態のタンパク質であることを確認した。したがって、イソプロパノールとメタノールを混合した溶媒を最適の湿式紡糸機の凝固誘導溶媒条件として決定した。これは、所望のタンパク質の表面様態、厚さ、凝固程度によって多様な組成の溶媒条件が可能であり、本研究では、イソプロパノールとメタノールを同量で混合し、その後、実験を進行した。
【００７４】
酸抽出を利用して精製されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の場合も、上記の条件による。
【００７５】
２．イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の凝固誘導溶媒による湿式紡糸様態確認
本発明のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、ヒスチジンタグ（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）があるので、これをニッケル−ＮＴＡ（ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）カラムを利用して分離及び精製した。得られた高純度のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質をＨＦＩＰに溶解させ、メタノールとイソプロパノール（１：１の体積比率で混合）の混合溶媒に１０〜１５ｍＬ／ｈｒ速度で湿式紡糸させて、比較的均一な直径を有する繊維糸形態のタンパク質を得た。得られた繊維糸形態のタンパク質を混合凝固溶媒内で２０〜３０分間保管した後、さらにメタノールと水に２０分間隔で３回浸漬し、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の物性変化を誘導した。次に、繊維糸形態のタンパク質を相対湿度５０％の条件下で約一晩乾燥した。乾燥したイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維を電子走査顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。
【００７６】
湿式紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維の様態及び電子走査顕微鏡の観察結果は、それぞれ図１０及び図１１に示した。
【００７７】
図１０及び図１１に示されたように、湿式紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、３０〜１００μｍの直径を有する繊維糸形態のタンパク質であることを確認した。また、湿式紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維を走査電子顕微鏡で観察した結果、欠陥がない均一な繊維糸であることを確認した。
【００７８】
３．イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の湿式紡糸後にドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）を行う段階
熱衝撃と酸抽出による精製方法で得られた発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の場合、紡糸条件は、上記のような方法によるが、紡糸された繊維タンパク質は、２つの方法を異ならしめて試験片を準備した。一番目の方法は、紡糸が終わった繊維タンパク質をすぐ取り出して、空気上で２〜５倍まで長さを増やすドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）過程を行うことであり、二番目の方法は、得られた繊維タンパク質をすぐ湿式紡糸が行われる有機溶媒に浸漬し、２〜５倍までドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）を行う方法である。但し、本発明に使用される有機溶媒の種類には制限がない。ドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）の結果については、図１６に示し、引張強度測定による各物性の値は、表２に提示された。
【００７９】
実施例６：イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の電気紡糸様態確認
シルクタンパク質は、どんな溶媒に溶かすかによって、電気紡糸の可能性可否と生成繊維の模様及び厚さなどが決定される。したがって、電気紡糸を用いた繊維糸形態のシルクタンパク質を得るためには、タンパク質が適切な粘性を有しながら完全に溶解されなければならないし、一定の範囲の厚さで固まり現象がなく、電気紡糸が行わなければならない。上記湿式紡糸で利用したＨＦＩＰ（ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）の場合、タンパク質を良好に溶解したが、ＨＦＩＰに溶解させたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を電気紡糸し、繊維の模様を走査電子顕微鏡で観察した結果、約１〜３μｍの厚さを有するリボン形態の平たい繊維の様態が確認された。
【００８０】
したがって、ＨＦＩＰに溶解させたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質に、ＨＦＩＰに溶解させたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の１０％体積に該当する原液の酢酸を添加し、１６ｋＶの電圧下に電気紡糸を行った後、シルク繊維を電子走査顕微鏡で観察した。
【００８１】
電気紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維を電子走査顕微鏡で観察した結果は、図１２に示した。
【００８２】
図１２に示されたように、電気紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、最大０．２μｍ（２００ｎｍ）を超えない水準の円形の細い繊維に形成されることを確認した。
【００８３】
実施例７：イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の引張強度測定
上記実施例５及び６で得た繊維糸形態のイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維をｎａｎｏ  ＵＴＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ）実験を行い、引張強度を測定し、これにより、応力−ひずみ曲線 （ｓｔｒｅｓｓ−ｓｔｒａｉｎ  ｃｕｒｖｅ）を得た。また、これにより、強度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）、弾力性（ｅｘｔｅｎｓｉｂｉｌｉｔｙ）、硬度（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）、靭性（ｔｏｕｇｈｎｅｓｓ）などの物性を測定した。湿式紡糸後に得られたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質を含有するシルク繊維の引張強度測定結果は、図１４と図１５に示し、熱衝撃と酸抽出による精製方法で得られた発現向上モチーフが添加されたイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質の湿式、乾燥ドローイング（ｄｒａｗｉｎｇ）の引張強度測定値は、図１７、図１８に示した。この引張強度測定値の結果は、表２に示した。
【００８４】
引張強度分析を通じて得られる応力−ひずみ曲線 （ｓｔｒｅｓｓ−ｓｔｒａｉｎ  ｃｕｒｖｅ）で繊維の物性を確認することができる。繊維の両端を次第に引っぱる場合、ある瞬間、繊維の破断が起きるが、この際のｓｔｒａｉｎが弾力性を意味し、この際のｓｔｒｅｓｓが強度を意味する。靭性は、繊維の破断が起きるために必要なエネルギーであって、グラフでは、下端の面積がこれに該当する。硬度は、グラフの初期傾きで示されることができ、これに対する計算値を表２に提示した。
【００８５】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明によるイソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質は、天然シルクタンパク質が適用されることができる多様な産業分野に有用に使用されることができると共に、イソギンチャク由来組み換えシルクタンパク質特有の機械的物性に基づいて新規産業分野を創出することができるものと期待される。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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