(57)【要約】  側鎖結合アミノ酸を有する生体適合性モノマー及び／又はポリマーを含む熱応答性ハイドロゲル。本ハイドロゲルは生理学的温度で熱応答性であり、薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子などの治療剤を含む、組み込む、又はカプセル化することができる。ハイドロゲルは、治療剤の送達に有用である。ハイドロゲルは、第１の物理化学的状態で哺乳動物に投与される。ハイドロゲルは哺乳動物の生理学的温度で熱応答性であり、第１の物理化学的状態より固い第２の物理化学的状態に変化する。第２の物理化学的状態で、熱応答性ハイドロゲルは治療剤を放出する。
2014510724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱応答性ハイドロゲルと、側鎖結合アミノ酸を含む生体適合性モノマー又はポリマーとを含む組成物であって、前記ハイドロゲルが生理学的温度で熱応答性である組成物。
【請求項２】
薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記生体適合性モノマー又はポリマーが、アクリル酸誘導体、マレイン酸誘導体、又はフタル酸誘導体に側鎖を介して結合したアミノ酸を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記アミノ酸が、リシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又はこれらの組み合わせ若しくは誘導体である、請求項１〜３の何れか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記熱応答性ハイドロゲルが、架橋剤と反応する親水性ポリマーを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記架橋剤が、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ビスアクリルアミド、又はジチオール官能化分子を含む、請求項５の何れかに記載の組成物。
【請求項７】
前記熱応答性ハイドロゲルがＮ−イソプロピルアクリルアミドを含み、前記生体適合性モノマー又はポリマーがリシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又はこれらの組み合わせ若しくは誘導体を含む、請求項１〜６の何れか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ビスアクリルアミド、又はジチオール官能化分子で架橋されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮｔＢＡＡｍ）を更に含む、請求項１〜８の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が創傷治療薬である、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
抗微生物剤を更に含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が眼局所治療薬である、請求項１〜９の何れか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
カプセル化薬物組成物を更に含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記カプセル化薬物組成物が、ナノスフェアカプセル化デキサメタゾンを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
熱応答性架橋アクリルアミドポリマーと；
側鎖結合アミノ酸を含む生体適合性モノマー又はポリマーと；
薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子と；
を含む、ハイドロゲル組成物。
【請求項１６】
前記熱応答性架橋ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートで架橋されたＮ−イソプロピルアクリルアミドを含む、請求項１５に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項１７】
前記生体適合性モノマー又はポリマーが、アクリル酸誘導体、マレイン酸誘導体、又はフタル酸誘導体に側鎖を介して結合したｌ−、ｄ−又はｄ，ｌ−アミノ酸を含む、請求項１５又は１６に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項１８】
前記アミノ酸が、リシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又はこれらの組み合わせ若しくは誘導体である、請求項１５〜１７の何れか一項に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項１９】
前記組成物が創傷治療薬であり、前記薬物組成物が抗微生物剤を含む、請求項１５〜１８の何れか一項に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項２０】
前記ハイドロゲル組成物が眼局所治療薬であり、前記薬物組成物がナノスフェア中にカプセル化されている、請求項１５〜１８の何れか一項に記載のハイドロゲル組成物。
【請求項２１】
治療剤の送達方法であって、
前記治療剤を含む熱応答性ハイドロゲルを提供する工程であって、前記ハイドロゲルが生理学的温度で熱応答性である工程；
哺乳動物に前記熱応答性ハイドロゲルを第１の物理化学的状態で投与する工程；
前記熱応答性ハイドロゲルが投与時に第２の物理化学的状態に変化する工程であって、前記第２の物理化学的状態が前記第１の物理化学的状態より固い工程；
を含む方法。
【請求項２２】
前記第２の物理化学的状態の熱応答性ハイドロゲルが前記治療剤を放出する工程を更に含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記熱応答性ハイドロゲルが、アクリルアミドポリマーと、側鎖結合アミノ酸を含む生体適合性モノマー又はポリマーとを含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記熱応答性ハイドロゲルの局所投与、全身投与、経皮投与、又は経角膜投与を更に含む、請求項２１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記熱応答性ハイドロゲルが目に投与される、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記熱応答性ハイドロゲルが創傷部又は患部組織又は器官に局所投与される、請求項２１〜２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記熱応答性ハイドロゲルが治療部位に局所投与される、請求項２１〜２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ハイドロゲルを使用する組織発生又は再生を更に含む、請求項２１〜２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般にハイドロゲルに関し、より詳細には、側鎖活性アミノ酸、即ち、側鎖結合アミノ酸を含む生体適合性モノマー、ポリマー、及び／又はコポリマーを含むハイドロゲル、並びに、これらのハイドロゲルの医療用の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは、親水性の水不溶性ポリマー鎖の網目構造である。ハイドロゲルは、組織治療や送達機構などの様々な生体医学用途に好適である。それらは含水率が高く、穏やかな反応条件下で形成できるため、細胞、及びタンパク質などの不安定な生体分子のカプセル化を含む用途に魅力的である。架橋ハイドロゲルは生体材料をカプセル化することができ、これにより、それらは免疫系の攻撃又はプロテアーゼによる分解を防止する半透性のハイドロゲルバリアで保護される。
【０００３】
熱応答性ハイドロゲルは、温度に応答して物理化学的特性が変化するため、低侵襲性の局所送達用途に最適である。熱応答性ハイドロゲルは液状のゲルとして投与することができ、体温に達すると注射部位で凝固する。熱応答性ハイドロゲルは、多糖類のキトサン、デキストラン及びセルロースなどの天然ポリマーを使用して、又はゼラチンなどのタンパク質を使用して合成することができる。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）をベースにするハイドロゲルは約３２℃で鮮明な下限臨界溶液温度挙動を示し、これは生体医学用途に好適となり得るため、関心を集めてきた。架橋材料では、この熱転移温度は体積相転移温度と称されることが多い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ハイドロゲルで所望の放出速度論を達成するには、特定の課題が伴い得る。更に、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ハイドロゲル材料は細胞接着性及び組織接着性が比較的低く、これは創傷治癒に重要である。従って、改善されたハイドロゲル材料、特に、医療に及び／又は治療薬送達システムとして使用される改善されたハイドロゲル材料が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の一般的目的は、望ましい放出速度論及び／又は細胞接着性及び組織接着性を有することなどの改善された生物学的特性を有し、本明細書で「熱応答性ハイドロゲル組成物」、「熱応答性ハイドロゲル」、又は単に「ハイドロゲル」とも称されるハイドロゲル組成物を提供することである。
【０００６】
本発明の一般的目的は、少なくとも一部、アミノ酸側鎖を有する（即ち、アミノ酸がモノマー又はポリマーの残部に側鎖を介して結合している）生体適合性モノマー及び／又はポリマーを含む熱応答性ハイドロゲルにより達成することができる。ハイドロゲルは、望ましくは、生理学的温度で熱応答性であり、薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子などの治療剤を含む、組み込む、及び／又はカプセル化することができる。
【０００７】
任意選択により、本発明の任意の実施形態では、生体適合性モノマー又はポリマーは、アクリル酸誘導体、マレイン酸誘導体、又はフタル酸誘導体に側鎖を介して結合したアミノ酸を含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、アミノ酸は、リシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又は、これらの組み合わせ若しくは誘導体である。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、熱応答性ハイドロゲルは、架橋剤と反応した親水性ポリマーを含む。任意選択により、架橋剤は、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ビスアクリルアミド、又はジチオール官能化分子を含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、熱応答性ハイドロゲルは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドは、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート、ビスアクリルアミド、又はジチオール官能化分子で架橋されている。一実施形態では、熱応答性ハイドロゲルは、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを含み、生体適合性モノマー又はポリマーは、リシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又はこれらの組み合わせ若しくは誘導体を含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物は、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮｔＢＡＡｍ）を更に含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物は創傷治療薬である。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物は抗微生物剤を更に含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物は眼局所治療薬である。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物はカプセル化薬物組成物を更に含む。任意選択により、カプセル化薬物組成物は、ナノスフェア中にカプセル化されている。任意選択により、カプセル化薬物組成物は、ナノスフェアカプセル化デキサメタゾンを含む。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、熱応答性架橋アクリルアミドポリマーと；側鎖結合アミノ酸を含む生体適合性モノマー又はポリマーと；薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子とを含む、ハイドロゲル組成物を提供する。任意選択により、熱応答性架橋ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートで架橋されたＮ−イソプロピルアクリルアミドを含む。任意選択により、アミノ酸は、リシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又はこれらの組み合わせ若しくは誘導体である。
【０００９】
任意選択により、本発明の任意の実施形態では、生体適合性モノマー又はポリマーは、アクリル酸誘導体、マレイン酸誘導体、又はフタル酸誘導体に側鎖を介して結合したｌ−、ｄ−又はｄ，ｌ−アミノ酸を含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物は創傷治療薬であり、薬物組成物は抗微生物剤を含む。任意選択により、本発明の任意の実施形態では、組成物は眼局所治療薬であり、薬物組成物はナノスフェア中にカプセル化されている。
【００１０】
本発明は、治療剤の送達方法を更に含む。本方法は、治療剤を含む熱応答性ハイドロゲルを提供する工程であって、ハイドロゲルが生理学的温度で熱応答性である工程；熱応答性ハイドロゲルを第１の物理化学的状態で哺乳動物に投与する工程；及び、熱応答性ハイドロゲルが投与時に第２の物理化学的状態に変化する工程であって、第２の物理化学的状態が第１の物理化学的状態より固い工程を含む。第２の物理化学的状態で、熱応答性ハイドロゲルは治療剤を放出する。
【００１１】
本発明は、また、医療における及び／又は治療薬送達システム（例えば、創傷、眼病、又は眼症状などの治療用）としての本発明の組成物の使用も包含する。
【００１２】
他の目的及び利点は、以下の詳細な説明を添付の特許請求の範囲及び図面と併せて理解することにより当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】室温での架橋熱応答性ハイドロゲルを含むバイアルの画像である。
【図２】３７℃での架橋熱応答性ハイドロゲルを含むバイアルの画像である。
【図３】図１の架橋熱応答性ハイドロゲルの明視野像である。
【図４】図２の架橋熱応答性ハイドロゲルのゲル縁部の明視野像である。
【図５】ＰＮＩＰＡＡｍ単独及び架橋ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲルの下限臨界溶液温度のグラフである。
【図６】カプセル化されたＢＳＡを有する架橋熱応答性ＰＥＧ−ＤＡ／ＮＩＰＡＡｍハイドロゲルを形成する反応スキームを示す図である。
【図７】スワブ法（ｓｗａｂ  ｔｅｓｔ）による表面感染評価のグラフである。＊はｐ＜０．０５を示す。各時間で（手術後）、最も左側の棒は対照を示し、中央の棒はＰＢＳを有する水素を示し、最も右側の棒は０．１％ＰＨＭＢ＋０．５％ＣＨＸを有する水素を示す。
【図８】４日目、８日目及び１２日目の深部感染評価のグラフである。線は、創傷感染の閾値細菌数を示す。各時間で（手術後）、最も左側の棒は対照を示し、中央の棒はＰＢＳを有する水素を示し、最も右側の棒は０．１％ＰＨＭＢ＋０．５％ＣＨＸを有する水素を示す。
【図９】純粋なハイドロゲル、遊離ナノスフェア、及びナノスフェア装填（ｌｏａｄｅｄ）ハイドロゲルからのｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＳＰ放出活性を示す図である。ＰＢＳは対照として使用した。各時点で（手術後）、最も左側の棒は対照を示し、左から２番目の棒は純粋なハイドロゲルを示し、左から３番目の棒は遊離ナノスフェアを示し、最も右側の棒はナノスフェア装填ハイドロゲルを示す。
【図１０】ＤＳＰ−ナノスフェア−ハイドロゲルの場合のブドウ膜炎の進行の画像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前のＩＲ画像、Ｂ）注射２４時間後のＩＲ画像、Ｃ）注射４８時間後／処置２４時間後のＩＲ画像、Ｄ）注射７２時間後／処置４８時間後のＩＲ画像、及びＥ）注射９６時間後／処置７２時間後のＩＲ画像。
【図１１】ＤＳＰ溶液の場合のブドウ膜炎の進行の画像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前のＩＲ画像、Ｂ）注射２４時間後のＩＲ画像、Ｃ）注射４８時間後／処置２４時間後のＩＲ画像、Ｄ）注射７２時間後／処置４８時間後のＩＲ画像、及びＥ）注射９６時間後／処置７２時間後のＩＲ画像。
【図１２】無処置の場合のブドウ膜炎の進行の画像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前のＩＲ画像、Ｂ）注射２４時間後のＩＲ画像、Ｃ）注射４８時間後のＩＲ画像、Ｄ）注射７２時間後のＩＲ画像、及びＥ）注射９６時間後のＩＲ画像。
【図１３】ＤＳＰ−ナノスフェア装填ハイドロゲルで処置された図１０の目の前眼部像（ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｉｍａｇｅｓ）を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前、Ｂ）注射２４時間後、Ｃ）注射４８時間後／処置２４時間後、Ｄ）注射７２時間後／処置４８時間後、及びＥ）注射９６時間後／処置７２時間後。
【図１４】ＤＳＰ溶液で処置された図１１の目の前眼部像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前、Ｂ）注射２４時間後、Ｃ）注射４８時間後／処置２４時間後、Ｄ）注射７２時間後／処置４８時間後、及びＥ）注射９６時間後／処置７２時間後。
【図１５】処置を受けない図１２の目の前眼部像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前、Ｂ）注射２４時間後、Ｃ）注射４８時間後、Ｄ）注射７２時間後、及びＥ）注射９６時間後。
【図１６】段階評価方式（尺度：０〜４）に基づく、実施例の処置１での炎症の評価を要約する図である。
【図１７】段階評価方式（尺度：０〜４）に基づく、実施例の処置２での炎症の評価を要約する図である。
【図１８】段階評価方式（尺度：０〜４）に基づく、無処置での炎症の評価を要約する図である。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図１９】Ｐｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎアッセイの蛍光読み取り値を示す図である。ブランク：ＰＢＳ緩衝液；バックグラウンド：細胞を有していないハイドロゲル；０％〜５％Ａ−リシン：対応するＡ−リシン濃度を有し、細胞が播種されたハイドロゲル。
【図２０】調製されたナノスフェアからのデキサメタゾン放出を要約する図である。
【図２１】ナノスフェア及びマイクロスフェアからのリン酸デキサメタゾンナトリウムの放出を要約する図である。
【図２２】対照ＬＰＳモデル画像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前のＳＬＯ画像；Ｂ）対照ハイドロゲル（薬物非含有）の注射２４時間後；及びＣ）ＬＰＳ注射後６日目。
【図２３】処置方法を比較した画像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前の対照画像；Ｂ）２日目（デキサメタゾン処置２４時間後）；Ｃ）デキサメタゾン処置の６日目）；Ｄ）ＬＰＳ注射前の対照画像；Ｅ）２日目（デキサメタゾンハイドロゲル処置２４時間後）；及び、Ｆ）デキサメタゾンハイドロゲル処置の６日目の画像。
【図２４】熱応答性ハイドロゲルの結膜下注射の画像を含む図である：Ａ）ＬＰＳ注射前の対照画像；Ｂ）結膜下注射後２日目；及び、Ｃ）６日目。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、熱応答性ハイドロゲルと、アミノ酸側鎖を含む（即ち、アミノ酸がモノマー又はポリマーの残部に側鎖を介して結合している）生体適合性モノマー又はポリマーとを含む組成物を提供する。本発明の一実施形態では、ハイドロゲルは生理学的温度で熱応答性であり、そのため約３２℃以上、一般に約３２℃〜約３９℃、より好ましくは約３２℃〜約３７℃などの通常の体温付近で物理化学的変化が生じる。生理学的温度で熱応答性挙動を有する本発明の組成物は、注射用局所製剤として、特に、局所薬物送達、創傷治療薬及び被覆材、組織工学、歯科用途、軟骨再生、失禁治療用充填剤、並びに、再建手術及び美容外科手術用の組織補填材などの生体医学用途に有用であるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本発明の一実施形態では、熱応答性ハイドロゲルは、室温で流体様の稠度を有し、生理学的温度に達すると、粘弾性固体に変化する。熱応答性ハイドロゲルは、モノマー及び／又はポリマー、望ましくは親水性モノマー又はポリマーを架橋することにより形成される。任意の好適な材料を使用して、本発明の熱応答性ハイドロゲルを形成することができる。本発明の例示的な熱応答性ハイドロゲルは、１種以上の架橋アクリルアミドポリマーから形成される。好ましいアクリルアミドは、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）ハイドロゲルの形成に使用されるＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）である。好適なハイドロゲル合成方法は、Ｎ，Ｎ−メチレンビスアクリルアミド（ＭＢＩＳ）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ビスアクリルアミド、マイケル付加反応及び／又は他の共有結合性、イオン性、疎水性相互作用により架橋することができるジチオール官能化分子などの架橋剤を用いたフリーラジカル共重合による方法である。架橋は、ハイドロゲル前駆体の架橋を生じさせる、縮合、フリーラジカル、還元及び酸化反応でも起こり得る。他の好適なＰＮＩＰＡＡｍ架橋方法には、相互侵入網目構造ポリマーの形成、デキストランなどの多糖類、又はマルチアームＰＥＧ−ＤＡ架橋剤が含まれるが、これらの方法は比較的複雑な場合が多い。
【００１６】
ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲルは、独特の生体適合性及び重合性を有する、特に望ましいポリマーである。ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲルは水に可溶であり、身体により容易に取り除かれる。ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲルは、化学的に又は物理的に固定することができ、非常にタンパク質吸着及び細胞接着し難く、免疫系に容易に認識されない。アクリレートは非常に迅速に光重合するため、末端基として使用される。重合プロセスで、ＰＥＧ−ＤＡをＰＮＩＰＡＡｍと結合させることにより、非分解性製剤が達成される。図１及び図２は、室温及び３７℃の生理学的温度におけるＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲルの試料画像を示す。図１に示す、室温（約２０℃）では、ハイドロゲルは液体ゲル状の相で存在した。温度を３７℃に上昇させると、ハイドロゲルは迅速に（１分以内に）固体ゲルを迅速に形成した。図３及び図４のゲル表面及び縁部の明視野像は、架橋プロセスによって形成される比較的均一な孔表面を示す。
【００１７】
温度に対するハイドロゲルの平均吸光度を測定することにより得られた、ＰＮＩＰＡＡｍ単独及び架橋ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡの下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）を図５に示す（ＰＮＩＰＡＡｍ単独は吸光度１で比較的低い温度を有する線であり、ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡは吸光度１で比較的高い温度を有する線である）。ＰＮＩＰＡＡｍ単独のハイドロゲルは約３１℃で相変化した（ＬＣＳＴ）。ＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲルは約３２℃で相変化した。ＰＥＧ−ＤＡで架橋することにより、ＬＣＳＴは、おそらく親水性の増加のため、約１℃シフトしたが、依然として最適な注射範囲内にある。
【００１８】
前述のように、生理学的温度で起こる熱応答性ハイドロゲル材料の物理化学的変化は、生体医学用途に特に有用である。しかし、これらのハイドロゲル材料は、通常、細胞接着性及び組織接着性が低い。アミノ酸側鎖、即ち、側鎖結合アミノ酸を含む生体適合性モノマー及び／又はポリマーをハイドロゲル材料に導入すると、ハイドロゲルの細胞相互作用が向上すると共に、依然として熱応答性が維持されることが分かった。本発明の熱応答性ハイドロゲル組成物に使用される好適な生体適合性モノマー及び／又はポリマーは、国際特許出願ＰＣＴ／ＩＢ２００６／１００１７２２号明細書（国際公開第２００６／１２６０９５号パンフレット）に開示されており、この文献は参照により本明細書に援用される。
【００１９】
本発明の一実施形態では、生体適合性モノマー又はポリマーは、α−アミノカルボキシ官能基以外の側鎖を介してアクリル酸誘導体、マレイン酸誘導体、又はフタル酸誘導体に結合したアミノ酸を含む。好適な望ましいアミノ酸としては、リシン、チロシン、セリン、システイン、プロリン、又はこれらの組み合わせ若しくは誘導体が挙げられる。例示的な生体適合性モノマーとしては、アクリル酸誘導体、マレイン酸誘導体、又はフタル酸誘導体に側鎖結合した二官能性ｌ−、ｄ−又はｄ，ｌ−アミノ酸が挙げられる。例示的な生体適合性モノマーとしては、アクリロイル−リシン；アクリロイル−チロシン；アクリロイル−セリン；アクリロイル−システイン；アクリロイル−プロリン；メタクリロイル−リシン；メタクリロイル−チロシン；メタクリロイル−セリン；メタクリロイル−システイン；メタクリロイル−プロリン；マレイン酸−、２−メチルマレイン酸−、２，３−ジメチルマレイン酸−、又は、フタル酸−Ｎ−リシン−アミド；マレイン酸−、２−メチルマレイン酸−、２，３−ジメチルマレイン酸−、又はフタル酸−Ｏ−チロシン−エステル；マレイン酸−、２−メチルマレイン酸−、２，３−ジメチルマレイン酸−、又はフタル酸−Ｏ−セリン−エステル；マレイン酸−、２−メチルマレイン酸−、２，３−ジメチルマレイン酸−、又はフタル酸−Ｓ−システイン−チオエステル；及び／又はマレイン酸−、２−メチルマレイン酸−、２，３−ジメチルマレイン酸−、又はフタル酸−Ｏ−プロリン−エステルが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の一実施形態では、必要に応じて、熱応答性ハイドロゲル組成物のＬＣＳＴを変化させる又は高く又は低く「調節する」ことができる。ＬＣＳＴは、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮｔＢＡＡｍ）、連鎖移動剤、及び／又は、ハイドロゲルの親水性／疎水性に影響を及ぼし得るモノマーを組み込むことにより変化させることができる。本発明の別の実施形態では、生理学的温度で可溶性の分解生成物が得られ、それによりハイドロゲルの分解時に身体から容易に取り除かれるように、ハイドロゲル分解生成物のＬＣＳＴを変化させることができる。
【００２１】
本発明の熱応答性ハイドロゲル組成物は、治療剤をカプセル化する、又は他の方法で含有する若しくは組み込むことができる。本明細書で使用する場合、「治療剤」は、身体上又は身体内に送達される任意の物質又は組成物を指す。例示的な治療剤としては、薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子が挙げられる。必要に応じて、様々な代替の薬物組成物、生体分子、及びナノ粒子をハイドロゲル組成物に使用することができる。薬物組成物は、Ｃｏｓｍｏｃｉｌ  ＣＱ−２０％ポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）などの抗微生物剤、又は、他の公知の薬物組成物、例えば、プロドラッグ；アミノグリコシド系（ゲンタマイシン、ネオマイシン、及びトブラマイシン）、マクロライド系（エリスロマイシン）、フルオロキノロン系（シプロフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、及びモキシフロキサシン）、並びに、クロラムフェニコール及びナタマイシンを含む他のものなどの抗生物質；デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）、フルオロメトロン、及び酢酸プレドニゾロンなどのステロイド及び抗炎症性分子及び薬剤；成長因子；内分泌及びパラ分泌シグナル；並びに、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ペガプタニブ、及びＶＥＧＦトラップなどの抗ＶＥＧＦ剤であってもよいが、これらに限定されるものではない。薬物組成物は、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）ナノスフェア／ナノ粒子などのナノ粒子又はナノスフェア中にカプセル化することができる。これらのハイドロゲルに、リポソーム、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅｓ）、ナノ粒子、ミセル系、デンドリマー、生体活性ポリマー、及びプロドラッグ結晶などの追加の薬物送達担体システムを組み込むことができるが、これらに限定されるものではない。例示的な生体分子としては、タンパク質、酵素、酵素阻害剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、内分泌及びパラ分泌シグナル、及び／又は治療用細胞若しくは因子、例えば、組織（四肢／心筋）虚血治療用のものが挙げられる。
【００２２】
薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子などの治療剤をハイドロゲル組成物に、室温又はハイドロゲルのＬＣＳＴより低温で、重合の前又は後に装填することができる。図６は、タンパク質であるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をカプセル化する例示的反応スキームを示す。図６の反応は、脱気ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２５ｍｇ／ｍｌＢＳＡ溶液で開始した。ハイドロゲル組成物は、ＰＥＧ−ＤＡ（所望のハイドロゲル稠度により、濃度４ｍＭ、８ｍＭ、１２ｍＭ又は１６ｍＭ）をＢＳＡ溶液又はＰＢＳの何れかに溶解することにより調製することができる。架橋濃度は、小径の皮下注射針でハイドロゲルを注射できるように選択することができる（即ち、ハイドロゲルは流体様の稠度を有していなければならなかった）。ＰＥＧ−ＤＡが１６ｍＭより高濃度の場合、ハイドロゲルは、通常、小ゲージの針を使用して注射するには硬くなり過ぎる。ＰＥＧ−ＤＡが４ｍＭ未満の場合、ハイドロゲルは、架橋性が低いため、操作が困難になり得る。モノマーＮＩＰＡＡｍを、最終濃度０．３５Ｍとなるように溶液中に溶解させる。ＮＩＰＡＡｍが完全に溶解した後、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）（例えば、１３ｍＭ）及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（例えば、１６８ｍＭ）を添加することによりハイドロゲルの重合を開始する。この方法によりフリーラジカル重合が起こり、これを４℃で１２時間行うと、カプセル化ＢＳＡを含有する架橋熱応答性ハイドロゲル組成物が形成される。
【００２３】
１２時間の重合時間の後、望ましくは、ハイドロゲルをＰＢＳ緩衝液中で２０分間穏やかに撹拌して抽出することにより、未反応のモノマー及び開始剤を除去する。開始剤及び未反応のモノマーは毒性を引き起こし得るため、これらの成分の抽出は細胞毒性を最小限に抑えるために不可欠である。５回の洗浄で残留物が十分に除去され、細胞毒性を示さない材料が得られることが分かった。また、本発明のハイドロゲル組成物をエチレンオキサイドガスで滅菌し、熱応答性挙動を維持することもできる。ハイドロゲル形成前に前駆体を滅菌状態に維持することもでき、ハイドロゲル合成を滅菌環境中で行うことができる。
【００２４】
本発明は、また、治療剤の送達方法における熱応答性ハイドロゲルの使用も含む。薬物組成物、生体分子、及び／又はナノ粒子などの所望の治療剤がハイドロゲルに組み込まれる又は埋め込まれる。ハイドロゲルは、望ましくは、例えば、局所適用による、又は、局所注射、全身注射、経皮注射、若しくは経角膜注射による適用では、第１の物理化学的状態で投与される。眼治療薬、例えば、ナノスフェアを有するものと有していないものは両方とも、点眼薬又は眼瞼下挿入物、テノン嚢下（ｓｕｂｔｅｎｏｎ）注射、結膜下注射、及び／又は硝子体内注射などにより局所送達することができる。哺乳動物への投与時に、ハイドロゲルは生理学的温度に接し、それにより熱応答性ハイドロゲルは投与時に第２の物理化学的状態に変化する。第２の物理化学的状態は、前述し、図１〜図４に示すように第１の物理化学的状態より固い。第２の物理化学的状態で、ハイドロゲルは治療剤を放出する。一実施形態では、ハイドロゲルが分解する時、放出が起こる。
【００２５】
体温に達するとより固い状態に物理化学的に変化するため、比較的流動性があり、適用又は投与後に凝固するゲル状の材料が効率的に適用される。前述のように、本発明のハイドロゲル組成物は、カプセル化デキサメタゾン又はリン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）などの抗炎症剤、眼腫瘍治療薬、抗ＶＥＧＦ剤、及び／又は、他の薬物、例えば、抗生物質、成長因子、ステロイド、酵素、酵素阻害剤の送達などの眼科用途に特に有用である。本発明のハイドロゲル組成物は、創傷被覆材及び／又は皮膚再生にも特に有用である。局所ハイドロゲル創傷被覆材を貼付し、必要に応じて、例えば、毎日又は毎週、交換することができる。局所ハイドロゲルは、治療剤、例えば、抗生物質及び／又は再生用薬物及び／又は生体材料を含むことができる。他の用途としては、組織（四肢／心筋）虚血の治療のための治療用細胞又は因子の送達；腫瘍治療用の抗血管形成薬の送達；組織工学用の足場の提供；歯科用途、例えば、抜歯用；抗微生物及び再生軟骨再生；失禁治療用充填剤；並びに、再建手術及び美容外科手術用の組織補填材が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本発明の実施に含まれる様々な態様を例証する又は模擬する以下の実施例に関して本発明をより詳細に説明する。本発明の趣旨に入る変更は全て保護されるべきであり、従って、本発明はこれらの実施例により限定されるものと解釈されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【００２７】
以下の実施例から、熱応答性を維持しつつ、本発明により熱応答性ハイドロゲルをアクリロイル−リシン（Ａ−リシン）と結合できることが分かった。
【００２８】
実施例１−創傷及び眼科用途
材料
ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）５０：５０（ＰＬＧＡ  ５０：５０；平均Ｍｗ７，０００〜１７，０００、エステル末端）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；平均Ｍｗ３０，０００〜７０，０００）、ポリエチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ−ＤＡ；平均Ｍｎ＝５７５）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）９７％、ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮｔＢＡＡｍ）９７％、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）、及びジグルコン酸クロルヘキシジン溶液（２０％水溶液）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。ジクロロメタン及びメタノールは、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＨＰＬＣ用を入手した。Ｄｉｆｃｏ（商標）普通ブイヨン及びＢａｃｔｏ（商標）寒天はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ａ−リシン（Ｎ６−アクリロイルリシン）は、ＣＩＳ  Ｐｈａｒｍａ（Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により提供された。Ｃｏｓｍｏｃｉｌ  ＣＱ（２０％ポリヘキサメチレンビグアナイド溶液）はＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｒｅａｔｉｏｎｓから入手した。デキサメタゾン２１−リン酸二ナトリウム塩＞９８％は、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから入手した。
【００２９】
皮膚用ハイドロゲルの調製
Ａ−リシン及びＮｔＢＡＡｍを有するポリ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＰＥＧハイドロゲルは、３ｍｇ／ｍｌ  ＡＰＳを開始剤として、及び３０μｌ／ｍｌ  ＴＥＭＥＤを促進剤として使用し、氷浴中で１時間フリーラジカル重合を行うことにより合成した。具体的には、眼用に５％Ａ−リシン及び１５％ＮｔＢＡＡｍ（ｗ／ｗ  ＮＩＰＡＡｍ）を有するハイドロゲルを合成し；皮膚用に５％Ａ−リシン及び２０％ＮｔＢＡＡｍ（ｗ／ｗ  ＮＩＰＡＡｍ）を有するハイドロゲルを合成した。ハイドロゲルの合成後、ＰＢＳ中で５回、２０分毎に新しいＰＢＳに交換して洗浄することにより未反応のモノマー及び開始剤を抽出した。
【００３０】
皮膚用に、ＰＢＳ溶液中のポリヘキサメチレンビグアナイド（ＰＨＭＢ）０．１％及びジグルコン酸クロルヘキシジン０．５％（ｗ／ｖ）をハイドロゲルに装填したが、これは、混合薬物溶液を終夜平衡化させることにより行った。ハイドロゲル合成及び薬物装填後、ハイドロゲルを４℃に保って保存した。ハイドロゲルは全て、滅菌条件下で調製した。
【００３１】
創傷感染動物実験
緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ♯１９６６０）を０．８％Ｄｉｆｃｏ（商標）普通ブイヨン培地中、３７℃、２７５ｒｐｍで絶えず振盪しながら終夜培養した。継代培養を５０ｍｌの管に移し、４０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心分離した。得られた細菌ペレットを２回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、接種前に氷冷した。１００μｌの試料の細菌濃度をまず分光測光法により波長６２０ｎｍで、配合濃度（ｃｆｕ／ｍｌ）＝ＯＤ６２０×２．５×ｌ０８を使用して推定した。次いで、１％Ｂａｃｔｏ（商標）寒天プレート上にて０．８％Ｄｉｆｃｏ（商標）普通ブイヨン培地で段階希釈し、３７℃、周囲空気で終夜培養した後、コロニー計数することにより細菌濃度を確認した。
【００３２】
成体雄性スプレーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット（体重２００〜２５０ｇ）を使用した。動物を麻酔し、剃毛し、消毒し、８ｍｍ穿刺生検器具を使用して、剃毛した背側皮膚の中央に２つの円形全層皮膚創傷を形成した。ドーナツ形のシリコーン副子を創傷の中心に配置し、シアノアクリレート接着剤及び断続４−０ナイロン縫合糸を使用して固定した。動物の手術直後に細菌の接種を行った。細菌は滅菌ＰＢＳで１０９ＣＦＵ／ｍｌに希釈し、マイクロピペットを使用して細菌懸濁液１００μｌを各創床に添加した。接種後、半閉塞性ドレッシング（Ｔｅｇａｄｅｒｍ；３Ｍ）を２層にして貼付し、創傷を被覆した。手術及び接種の１日後、０．１％ＰＨＭＢ及び０．５％ジグルコン酸クロルヘキシジンを装填したハイドロゲル２００μｌを、個々の創傷部位に適用した。
【００３３】
創傷感染分析
手術後４日目、８日目、及び１２日目に動物（ラット９匹）を麻酔し、スワブ法培養を使用して感染を評価した。ＢＤ  Ｅ−Ｓｗａｂキットの綿棒を使用して、表面創傷液及び組織破片の試料を採取した。次いで、ＢＤ  Ｅ−Ｓｗａｂ採取キットを使用して試料を適切な希釈剤に移した。次いで、懸濁液を滅菌ブイヨン培地で１：１０３〜１：１０１２に段階希釈し、希釈物をブイヨン−寒天プレート上で平板培養し、細菌濃度を定量した。スワブ法の後、ＣＯ２吸入で動物を犠牲にし、創傷全体を含む皮膚を隣接する正常な皮膚と共に２．５ｃｍ×２．５ｃｍの正方形として切除した。採取した正方形の皮膚組織をそれぞれ２つに分割した。一方の半分は、組織学的分析のため１０％ホルムアルデヒド緩衝溶液で固定し、他方は、深部感染分析のため氷冷した。感染分析用組織試料の重量を測定し、滅菌乳鉢及び乳棒を使用してホモジナイズし、その後、ホモジナイズした組織を滅菌ＰＢＳ２ｍｌに懸濁した。懸濁液を滅菌ブイヨン培地で１：１０３〜１：１０１２に段階希釈し、ブイヨン−寒天プレート上で、周囲空気中、３７℃で２４時間平板培養した。細菌数は、組織１グラム当たりの細菌コロニー形成単位数（ｃｆｕ／ｇ）として表した。通常、＞１０５ｃｆｕ／ｇは感染していると見なされる。
【００３４】
眼用ナノスフェア装填ハイドロゲルの調製
ＰＬＧＡ（５０ｍｇ）をジクロロメタン（１ｍｌ）に溶解した後、ＤＳＰメタノール溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌを添加した。透明な有機混合物を外水相（５ｍｌ、２％ｗ／ｖ  ＰＶＡ）に２０秒間ボルテックスミキサーで撹拌して乳化した後、氷冷して５５Ｗで５分間音波処理した。得られたエマルションを２５０ｒｐｍで３．５時間以上撹拌し、有機溶媒を蒸発させ、ナノスフェアを沈殿させた。１６，０００ｇで１０分間超遠心分離することによりナノスフェアを回収し、その後、得られたペレットを音波処理によりＤＩ水に再懸濁させ、ＤＩ水で２回洗浄した。薬物のカプセル化を定量するために、ＰＬＧＡナノスフェアを１Ｎ  ＮａＯＨ溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、完全にＰＬＧＡを分解した。得られた溶液のＤＳＰ濃度を２４０ｎｍで分光測光法により読み取った。動的光散（ＤＬＳ）を使用して、ナノスフェアの粒径の特性評価を行った。熱応答性ハイドロゲル中でのナノスフェアのカプセル化について調べるため、ＴＥＭＥＤを添加して重合を開始する前にナノスフェアをハイドロゲル前駆体溶液に０ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、及び１０ｍｇ／ｍｌで添加した。次いで、ナノスフェアを有していないハイドロゲルについて記載したように、ハイドロゲルをＰＢＳで５回、２０分毎に洗浄した。様々な濃度のナノスフェアを有するハイドロゲルについて室温と体温の両方で膨潤比を試験した。
【００３５】
ナノスフェア装填ハイドロゲルからのＩｎ  ｖｉｔｒｏＤＳＰ放出活性
ＤＳＰを有するＰＬＧＡナノスフェアを熱応答性ハイドロゲルに１０ｍｇ／ｍｌで装填した。薬物放出はＰＢＳ中、３７℃で行った。比較として、ハイドロゲルに直接装填されたＤＳＰ及び遊離ナノスフェアも、３７℃での薬物放出を行うためにＰＢＳ中に入れた。薬物放出試料は所定の時間間隔で採取し、前述のように線維芽細胞ＭＴＳアッセイで抗増殖活性を試験した。簡潔に言えば、３Ｔ３線維芽細胞を９６ウェルのプレートに５０００細胞／ウェルとして播種した。細胞が半コンフルエントの状態まで増殖した後、プレートをＰＢＳで洗浄し、その後、ＤＭＥＭ、０．５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン混合物を有する低血清培地を添加することにより増殖を停止させた。増殖停止を２４時間維持した。次いで、増殖培地に戻すことにより、Ｇｌ相に入るように細胞周期同調細胞を再刺激した。血清再刺激時に、異なる送達システムからのＤＳＰ放出試料を細胞に添加した。対照群としてＰＢＳを増殖培地に添加した。ＤＳＰ暴露の２日後に、ＭＴＳアッセイを使用して細胞増殖を測定した。
【００３６】
内毒素誘導ブドウ膜炎ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
成体雄性ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラット（体重約１７５〜２５０グラム）を内毒素誘導ブドウ膜炎（ＥＩＵ）動物モデルに使用した。注射直前にネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＰＢＳと混合した。後述の様々な治療計画で動物の目を処置した：
処置１：０時間にＬＰＳを硝子体内注射。ＬＰＳ２４時間後、及び９６時間まで毎日、ＤＳＰカプセル化ナノスフェア及びハイドロゲル（４ｍｇ／ｍｌ）約２０μｌを眼瞼下に配置；
処置２：０時間にＬＰＳを硝子体内注射。ＬＰＳ２４時間後、及び９６時間まで毎日、ＤＳＰ溶液（４ｍｇ／ｍｌ）約２０μｌを角膜上に直接配置（模擬点眼薬）；及び
無処置：０時間にＬＰＳを硝子体内注射、及び９６時間まで毎日経過観察。
【００３７】
ＬＰＳ誘導前、並びにＬＰＳ注射（及び処置）２４時間後、４８時間後、７２時間後及び９６時間後に、網膜の走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）画像（図１０〜図１５）並びに角膜及び虹彩のデジタル顕微鏡画像を得た。
【００３８】
統計解析
統計データは全て、平均及びＳＥＭとして表した。データは、ＳｉｇｍａＳｔａｔを使用し、一元配置ＡＮＯＶＡで解析した。ｐ＜０．０５の値は有意と見なした。
【００３９】
創傷感染動物試験の結果
前相試験から、０．１％及び１％ＰＨＭＢを装填した熱応答性ハイドロゲルにより、手術及び細菌接種後８日目及び１２日目に表面細菌数が有意に減少することが分かった。しかし、深部皮膚試料中の細菌数は有意に減少しなかった。この試験では、２種の抗菌剤、０．１％ＰＨＭＢ及び０．５％ジグルコン酸クロルヘキシジン（ＣＨＸ）の組み合わせを熱応答性ハイドロゲルに装填し、感染創傷モデルの処置に使用した。図７に要約するように、表面細菌数はＰＨＭＢ単独に関して記載したのと類似の結果を示し、対照群と比較して８日目及び１２日目に細菌数の有意な減少があった。４日目に、ＰＢＳを有するハイドロゲルでは細菌数の増加があったが、これはおそらく創傷部位の水分の増加によるものと考えられ、２種の消毒剤を用いた群では細菌数の増加は見られなかった。
【００４０】
図８に要約するように、深部感染評価は、依然として、対照と比較して細菌濃度の統計学的に有意な減少を示さなかったが、これは主として対照群からの標準偏差が高かったことによる。しかし、０．１％ＰＨＭＢ及び０．５％ＣＨＸで処置した群の細菌数は、８日目及び１２日目に対照群と比較して＞９０％低かった。また、０．１％ＰＨＭＢ及び０．５％ＣＨＸで処置した群は、１２日目に１０５ｃｆｕ／ｇ未満に達し、これは「感染創傷」（Ｍａｒｔｉｎ，ＬＫら、２００６年）と定義されるレベル未満であると見なされる。
【００４１】
ＤＳＰ−ＰＬＧＡナノスフェア装填熱応答性ハイドロゲルの結果
ＤＳＰ−ＰＬＧＡナノスフェアの粒径を動的光散乱（ＤＬＳ）で特性評価し、平均直径は１９０ｎｍであり、多分散指数は低かった（ＰＩ＝０．１４６）。以前測定したように、ナノスフェア中の薬物カプセル化効率は３９±４％であった。ナノスフェアを熱応答性ハイドロゲルに様々な濃度で組み込み、膨潤比を室温と体温の両方で試験した。表１に記載のように、ナノスフェアを組み込んだハイドロゲルの膨潤挙動に有意差は見られなかった。室温と体温では膨潤比の差が１０倍より大きいため、ナノスフェアを組み込んだハイドロゲルは、依然として熱応答性挙動を維持した。しかし、室温ではナノスフェアの存在が吸光度測定に干渉するため、ＬＣＳＴを分光測光法により測定することは困難であった。
【００４２】
【表１】
2014510724.tif 000003
【００４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏＤＳＰ放出試料活性
リン酸デキサメタゾンナトリウム（ＤＳＰ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでデキサメタゾンに変換される水溶性無機プロドラッグである。ＤＳＰは、骨髄幹細胞、白血球、線維芽細胞、平滑筋細胞、及び他のものを含む様々な種類の細胞に対して抗増殖活性を有する。以前の試験から、ＤＳＰは、マウス線維芽細胞に対して用量依存的な抗増殖活性を有することが知られていた。異なる薬物送達システムからの放出試料の活性を調べるため、線維芽細胞増殖アッセイを再度行った。異なる薬物送達システムからの放出試料を各時間に完全に取り出し、新しいＰＢＳ緩衝液と交換した。以前の試験から、純粋な熱応答性ハイドロゲルからのＤＳＰ放出は、最初の２時間以内に約９０％放出に達し、その後の放出は１０％未満であることが知られていた。遊離ナノスフェア及びナノスフェア装填ハイドロゲルからのＤＳＰ放出は、２４時間にわたり徐放を維持した。図９に示すように、異なる時間間隔で採取したＤＳＰ放出試料の活性試験により薬物放出データを更に確認した。純粋なハイドロゲルからの放出試料だけが有意な抗増殖活性を示し、最初の２時間で細胞生存度が減少したが、遊離ナノスフェア及びナノスフェア装填ハイドロゲルからの放出試料は、２時間後及び６時間後も依然として抗増殖活性を維持した。
【００４４】
眼科用途の動物モデル
ＳＬＯ画像：
調査した３群について、ＬＰＳ注射前、及びＬＰＳ注射９６時間後まで毎日、赤外線（ＩＲ）画像を取得した。ＩＲ画像は、網膜血管系全体を示し、画像を使用して血管径を測定した。異なる処置でのブドウ膜炎の進行を図１０〜図１２に示す。硝子体の不透明度及び血管の拡張で分かるように、全体的に、３つの条件全てについて、ＬＰＳ注射２４時間後及び４８時間後までに網膜に対する重大な影響が認められた。処置１及び処置２では、ＬＰＳ注射の９６時間後（及び３回治療薬適用）までに、無処置（図１２Ｅ）と比較して、網膜血管系に何らかの改善が認められた（図１０Ｅ及び１１Ｅ）。しかし、網膜血管系における改善は、炎症の重症度に幾分依存する。例えば、図１１に示す動物（ＤＳＰ溶液処置群）の画像は、図１０のＤＳＰ−ナノスフェア−ハイドロゲル動物より炎症の重症度が低い。
【００４５】
前眼部像：
目の前部（角膜、虹彩）の画像をＳＬＯ画像と同じ時点でデジタル顕微鏡を用いて撮影した。局所治療薬は前部領域に優先的に影響を及ぼす可能性があるため、これらの画像の目的は、ＬＰＳ誘導炎症が目の前部と後部の両方に同様に影響を及ぼすかどうかを判定することであった。図１３は、実験中のＤＳＰ−ナノスフェア装填ハイドロゲルで処置された図１０の目の前眼部像を示す。図１４は、ＤＳＰ溶液で処置された図１１の目の前眼部像を示す。図１５は、処置を受けなかった図１２の目の前眼部像を示す。前部と後部に見られる炎症レベルの間には強い相関があった。ＬＰＳは虹彩血管の拡張を引き起こし、それは網膜血管の拡張と類似の傾向があった。
【００４６】
炎症の段階評価：
０〜４の尺度に基づいて展開される段階評価方式で炎症の重症度を判定したが、段階０は鮮明な画像及び正常な血管を指し、段階４は重度の血管拡張及び暗い画像を示す。１人の研究者が様々な時点及び処置の画像を無作為化し、画像の処置及び時点について知らない他の２人の研究者が画像を段階評価した。全体的に、試験した３つの処置は、調査した時間枠全体を通して顕著な炎症を示した；しかし、処置２は、ＬＰＳ注射７２時間後（２回治療薬適用後）までに炎症の低減を示すように見えたが、無処置の目の炎症は継続し、ＬＰＳ７２時間後に増加するように見えた。処置１群の炎症は、９６時間の時点で、ＬＰＳのみの群及び処置２群よりわずかに高かった。図１６に見られるように、ＤＳＰ−ナノスフェア装填ハイドロゲル処置群では、誘導炎症は７２時間及び９６時間（それぞれ２回及び３回治療薬適用）までに減少した（ｎ＝５個の目）。炎症の減少はあったが、図１７に示すように、減少の程度はＤＳＰ溶液局所処置より低かった。処置２群では、ＤＳＰ溶液処置２４時間後までに炎症の低減があり、これは９６時間まで継続した（図１７）。図１８に示すように、無処置ＬＰＳの目では、調査した時間枠にわたり、網膜の顕著な炎症が認められた（ｎ＝４個の目）。炎症改善レベルは、ＬＰＳ注射２４時間後の炎症の初期重症度に依存することに留意することが重要である。
【００４７】
炎症段階の重症度は、ＤＳＰ溶液処置が処置４８時間後の炎症の低減を助けたことを示す。溶液処置群では処置４８時間後に炎症の平均重症度が減少したが、ＬＰＳのみの群の炎症は同時点で重症化した。溶液処置群に炎症の低減が見られたことから、ＤＳＰは目に浸透することができたように見える。現在のデータから、ＤＳＰ−ナノスフェア装填ハイドロゲル処置は炎症の最小限の減少を示したことが分かる。ハイドロゲル処置群は、ＬＰＳ注射９６時間後に、ＬＰＳのみの群より僅かに高い炎症重症度を示した。しかし、ＬＰＳ炎症の初期重症度は、他の処置群と比較してこの群では平均して高かった。初期重症度と治療結果には正の相関があるように見えた。また、ハイドロゲル治療薬の適用が部分的にこれに直接又は間接的に寄与した可能性もあった。非生分解性であるため、ハイドロゲル残留物は、硝子体の曇りと同様にＳＬＯ画像を暗くし得る持続性の薄膜を角膜上に形成し、炎症と間違えられた可能性があった。適用後、目を緩衝液で洗い流さなかった（ヒトへの適用では、おそらく一定時間後に目を洗浄すべきである）。また、麻酔による角膜の乾燥で画像が暗くなった可能性もある。ハイドロゲル処置群の動物を固定して、ハイドロゲル適用後約１時間、眼瞼下での瞬きを防止し、ゲルが瞬きにより直ぐに除去されないようにした。角膜が湿潤状態に保たれるように、この時間中、湿り気を与える涙滴を少量塗布したが、過剰の涙滴液がハイドロゲルと混合することを防止するために、塗布した涙滴の量は通常よりずっと少なかった。治療効果がなかったことの理由として考えられるのは、眼内でのハイドロゲルの滞留時間が不十分だったことである。処置後１時間麻酔下に置かれた後、ハイドロゲルで処置された動物はすぐに覚醒し、瞬きし始めた。瞬き運動によりハイドロゲルは眼瞼下から移動した。処置２４時間後に目のどこにもハイドロゲルは認められなかったが、これは、麻酔から回復した直後に、ハイドロゲルが目から完全に排除されたことを示す。ハイドロゲルは２４時間にわたり放出するように設計されたため、滞留時間が短いということは、目に入るＤＳＰが想定より著しく少ないことを意味する可能性がある。臨床用途では、これは重大な問題ではない可能性がある。理想的な治療は、夜間治療するように点眼薬を適用し、朝、残留するハイドロゲルを洗い流すようにすることである。点眼薬は角膜に直接適用されず、眼瞼下に堆積するが、それを小型の齧歯類の目で達成するのは困難であった。
【００４８】
結果の要約
創傷感染用に０．１％ＰＨＭＢ及び０．５％ジグルコン酸クロルヘキシジンを熱応答性ハイドロゲルに組み込むと、創傷表面と深部皮膚の両方で細菌数が減少した。熱応答性ハイドロゲルに組み込まれたＰＬＧＡナノスフェアにより、ハイドロゲルの膨潤性は変化しなかった。ハイドロゲルはナノスフェアの存在下で熱応答性挙動を維持した。ナノスフェア装填ハイドロゲルから放出されるＤＳＰは抗増殖活性を維持し、ハイドロゲル放出単独と比較して、より持続的な抗増殖活性を有した。毎日局所適用されるＤＳＰ−ＰＬＧＡナノスフェアカプセル化熱応答性ハイドロゲルは、ＬＰＳ誘導炎症を有意に改善しなかった。しかし、炎症の初期重症度が結果の成功を支配する重要な要因となる可能性がある。
【００４９】
実施例２−眼科用途
この実施例は、デキサメタゾン及び／又はリン酸デキサメタゾンナトリウムを組み込むハイドロゲルの硝子体内及び結膜下注射を実証する。
【００５０】
材料
ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）５０：５０（ＰＬＧＡ  ５０：５０；平均Ｍｗ５，０００〜１５，０００）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ；平均Ｍｗ３０，０００〜７０，０００）、ポリエチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧ−ＤＡ；平均Ｍｎ＝５７５）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＡｍ）９７％、ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮｔＢＡＡｍ）９７％、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、デキサメタゾン≧９７％、デキサメタゾン２１−リン酸二ナトリウム塩＞９８％、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手した。硫酸アンモニウムはＡｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから入手した。塩化メチレン及びメタノールは、Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＨＰＬＣ用を入手した。アクリロイル−リシン又はＡ−リシン（Ｎ６−アクリロイルリシン）は、ＣＩＳ  Ｐｈａｒｍａから入手した。［１，２，４−３Ｈ］デキサメタゾンは、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。リン酸デキサメタゾンナトリウム溶液（４ｍｇ／ｍｌ、Ｒｘのみ）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔから入手した。
【００５１】
ハイドロゲルの調製
Ａ−リシン及びＮｔＢＡＡｍを有するポリ（ＮＩＰＡＡｍ）−ＰＥＧハイドロゲルは、フリーラジカル重合により合成した。具体的には、眼用に５％Ａ−リシン及び１５％ＮｔＢＡＡｍ（ｗ／ｗ  ＮＩＰＡＡｍ）を有するハイドロゲルを合成した。ハイドロゲルの合成後、ＰＢＳ中で５回、２０分毎に新しいＰＢＳに交換して洗浄することにより未反応のモノマー及び開始剤を除去した。眼用に、ハイドロゲルを薬物溶液中で終夜平衡化させることにより、異なる濃度（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔの薬物では４ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの薬物では１０ｍｇ／ｍｌ）のリン酸デキサメタゾンナトリウムを装填した。ハイドロゲル合成及び薬物装填後、ハイドロゲルを４℃に保って保存した。細胞実験及び動物実験用に製造したハイドロゲルは全て、滅菌条件下で調製した。
【００５２】
デキサメタゾン放出用ナノスフェアの調製
水中油型エマルション（Ｏ／Ｗ）、溶媒蒸発法を使用し、室温でナノスフェアを形成した。簡潔には、ＰＬＧＡ（３０ｍｇ）及びデキサメタゾン（６ｍｇ）を塩化メチレン及びメタノール混合物（９：１、ｖ．／ｖ．）１ｍｌに溶解した。次いで、デキサメタゾン濃度の定量を可能にするために、［１，２，４−３Ｈ］デキサメタゾン（１ｍＣｉ／ｍｌエタノール溶液）１０μｌをＰＬＧＡ−デキサメタゾン油相に添加した。次いで、混合物を２％ＰＶＡ水溶液２０ｍｌに添加した後、１分間ボルテックスミキサーで撹拌し、氷冷して５５Ｗで５分間音波処理した。得られたエマルションを１２５０ｒｐｍで３．５時間撹拌し、有機溶媒を蒸発させ、ナノスフェアを沈殿させた。
【００５３】
ナノスフェアの粒径分布を定量するため、懸濁液の試料を採取し、０．４５μｍ、０．２２μｍ、及び０．１μｍのフィルタで段階的に濾過した。各濾過後の薬物濃度を定量し、各ナノスフェア粒径分布内で算出した。直径＞１００ｎｍの粒径を有するナノスフェアを限外濾過及び遠心分離により回収した。回収したナノスフェアをＤＩ水で２回洗浄し、過剰のＰＶＡを除去した。得られたナノスフェア懸濁液を３７℃の新しいＰＢＳに浸漬し、放出を開始した。１００％カプセル化を測定するために、同量を３７℃の１Ｎ  ＮａＯＨ溶液中でインキュベートし、ＰＬＧＡを完全に分解した。放出試料を１日間連続的に採取した。シンチレーション計数器を使用して全試料の３Ｈ濃度を定量した。実験はそれぞれトリプリケートで行った。
【００５４】
リン酸デキサメタゾンナトリウムのカプセル化及び放出
ＰＬＧＡ（４５ｍｇ）を塩化メチレン（０．４５ｍｌ）に溶解した後、リン酸デキサメタゾンナトリウムメタノール溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）０．０５ｍｌを添加した。２０秒間ボルテックスミキサーで撹拌して、透明な有機混合物を外水相（５ｍｌ、０．２５％ｗ／ｖ  ＰＶＡ、０．５Ｎ  ＮａＣｌを有する）に乳化させた。次いで、得られたＯ／Ｗ型エマルションを直ぐに、０．５Ｎ  ＮａＣｌ溶液を有する０．２５％ＰＶＡ１００ｍｌに注ぎ入れ、室温で３．５時間、マグネチックスターラーで連続撹拌した。４０００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより固体微粒子を外水相から分離した。次いで、マイクロスフェアをＤＩ水５０ｍｌで２回洗浄した。洗浄後、マイクロスフェアをＤＩ水５ｍｌに懸濁した。
【００５５】
ＰＬＧＡ−デキサメタゾンナノスフェアから変更したプロトコルを使用して、リン酸デキサメタゾンナトリウムを有するＰＬＧＡナノスフェアを形成した。簡潔に言えば、ＰＬＧＡ（３０ｍｇ）を塩化メチレン（０．９ｍｌ）に溶解した後、メタノール溶液（０．１ｍｌ）に溶解したリン酸デキサメタゾンナトリウム（３ｍｇ）を添加した。次いで、透明な有機混合物を、０．２５Ｎ硫酸アンモニウムを有する２％ＰＶＡ水溶液２０ｍｌに添加した後、１分間ボルテックスミキサーで撹拌し、氷冷して５５Ｗで５分間音波処理した。次いで、得られたエマルション系を１２５０ｒｐｍで３．５時間、室温で撹拌した。遠心分離した後、ＤＩ水で２回洗浄することによりナノスフェアを回収した。洗浄後、ナノスフェアをＤＩ水３ｍｌに懸濁した。
【００５６】
カプセル化効率を試験するために、ＰＬＧＡマイクロスフェア及びナノスフェア懸濁液１ｍｌを３７℃の１Ｎ  ＮａＯＨ溶液中で終夜インキュベートし、ＰＬＧＡを完全に分解して、ＰＬＧＳ中にカプセル化された全量を測定した。薬物濃度は、２４０ｎｍで分光測光法により測定した。ＰＬＧＡはこの波長では干渉しなかった。カプセル化効率は、（装填された実際の薬物／使用した全薬物）×１００％として算出した。
【００５７】
リン酸デキサメタゾンナトリウムの放出プロファイルを得るために、マイクロスフェア又はナノスフェア懸濁液１ｍｌを、３７℃の新しいＰＢＳ（ｐＨ約７．４）５ｍｌに添加した。最初の２４時間、試料を連続的に採取した。薬物濃度は、２４０ｎｍで分光測光法により測定した。
【００５８】
内毒素誘導ブドウ膜炎ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
成体雄性ルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラット（体重３１０〜３５０ｇ）を内毒素誘導ブドウ膜炎（ＥＩＵ）動物モデルとして使用した。注射直前にネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）由来のＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）をＰＢＳと混合した。動物を次のように分けた：
対照：０日目にＬＰＳを硝子体内注射。ＬＰＳ誘導２４時間後（１日目）に、対照ゲル（デキサメタゾンなし）を約５μｌ硝子体内注射；
処置対照：０日目にＬＰＳを硝子体内注射。ＬＰＳ誘導２４時間後に、デキサメタゾン（１０ｍｇ／ｍｌ用量、Ｓｉｇｍａ）を約５μｌ硝子体内注射；
処置１：０日目にＬＰＳを硝子体内注射。ＬＰＳ誘導２４時間後に、デキサメタゾンハイドロゲル（１０ｍｇ／ｍｌ用量、Ｓｉｇｍａ）を約５μｌ硝子体内注射；及び
処置２：０日目にＬＰＳを硝子体内注射。ＬＰＳ誘導２４時間後に、デキサメタゾンハイドロゲル（１０ｍｇ／ｍｌ用量、Ｓｉｇｍａ）を約５μｌ結膜下注射。
【００５９】
ハイドロゲル０．１ｍｌをデキサメタゾン薬物溶液２ｍｌ中で平衡化させることにより、デキサメタゾンを装填した。ＬＰＳ誘導前、ＬＰＳ（及び、デキサメテアゾン処置）１日後、２日後、３日後、及び６日後に、ＳＬＯ画像及び血流測定を得た。更に、１匹の動物で、熱−ハイドロゲル（対照）を角膜に直接適用した（模擬点眼薬）。
【００６０】
統計解析
統計データは全て、平均及びＳＥＭとして表した。データは、ＳｉｇｍａＳｔａｔを使用し、ステューデントｔ検定で解析した。ｐ＜０．０５の値は有意と見なした。
【００６１】
結果
ＰＬＧＡナノスフェアからのデキサメタゾンの放出プロファイル
低分子量ＰＬＧＡマイクロスフェアからの放出は、高分子量ＰＬＧＡ（８５：１５，Ｍｗ５０ｋ〜７５ｋ）マイクロスフェアと比較して速い放出を示し、最初の２４時間以内に約４０％放出した。ポリマーからの放出速度を増加するために、乳化プロトコルを変更することにより、粒径をナノスケールまで更に小さくした。１００ｎｍより大きい粒径を有するナノスフェアを全て一緒に回収し、放出は３７℃でＰＢＳ（ｐＨ約７．４）中、トリプリケートで行った（ｎ＝３）。図２０の放出プロファイルから、最初の２０時間以内にデキサメタゾンが約９０％放出に達したことが分かる。ナノスフェアからの放出の方がマイクロスフェアからの放出より速いのは、直径が小さいためであると考えられる。
【００６２】
ＰＬＧＡ系へのリン酸デキサメタゾンナトリウムの組み込み
リン酸デキサメタゾンナトリウムはデキサメタゾンのプロドラッグであり、ｉｎ  ｖｉｖｏでデキサメタゾンに変換される。水に対する溶解度が高いため（＞５０ｍｇ／ｍｌ）、リン酸デキサメタゾンナトリウムの方が、抗炎症薬として臨床用途ではより広く使用されている。
【００６３】
油／水（Ｏ／Ｗ）共溶媒プロトコルを使用して、リン酸デキサメタゾンナトリウムを有するＰＬＧＡマイクロスフェアを形成した。マイクロスフェア形成後、デジタル画像を撮影し、粒径を分析した。リン酸デキサメタゾンナトリウムを有するＰＬＧＡ（５０：５０、Ｍｗ５ｋ〜１５ｋ）マイクロスフェアの直径は、１４．８±６．０μｍであった。３７℃でのリン酸デキサメタゾンナトリウムの放出を、２４０ｎｍで分光測光法により定量した。図２１に示すように、薬物の約４０％が２４時間以内に放出されることが分かった。リン酸デキサメタゾンナトリウムを有する次のＰＬＧＡナノスフェアの形成は、異なるプロトコルから変更して試みた。放出は、リン酸デキサメタゾンナトリウムを有するマイクロスフェアと同様に行った。ナノスフェアからの薬物放出は２４時間以内に＞９０％に達することが分かった（図２１）が、これは夜間適用するのに理想的である。
【００６４】
カプセル化効率
以前の試験では、デキサメタゾン−ＰＬＧＡマイクロスフェア合成のカプセル化効率は低かった（約２．５％）。［１，２，４−３Ｈ］デキサメタゾンの分布の研究から、薬物の大部分（約８０％）は乳化中に水相の中に失われ、他の１０％は乳化後の２回の洗浄中に失われることが確認された。残部は、幾つかの容器、マイクロピペット先端部などの中に失われた。カプセル化効率は、主として油相（Ｏ）及び水相（Ｗ）中の溶質の相対的分配に関連すると考えられている。塩化メチレン−メタノール（Ｏ）及び０．２％ＰＶＡ溶液（Ｗ）中の［１，２，４−３Ｈ］デキサメタゾンの分配の研究から、Ｐ＝［ｄｅｘ］ｏ／［ｄｅｘ］ｗ＝２．９３である（ここで、ＯとＷの体積は等しい）ことが分かった。しかし、マイクロスフェアを形成したとき、所望の粒径に達するのに使用した水相の体積は油相より４０倍多かった。しかし、水の体積の増加により、水相への薬物の分布の増加が起こり、これは以前の試験でカプセル化効率が低かったことを説明する。この問題は、水相の体積を減少して薬物分布を少なくすること、又は、薬物の量を増加して乳化中に水相が飽和に達するようにすることにより解決できる可能性がある。前者は粒径の増加を引き起こし、それにより薬物の放出が遅くなるため、後者を試みた。水相中のデキサメタゾンを１：１０（ｗ／ｗ）ＰＬＧＡから１：２（ｗ／ｗ）ＰＬＧＡに増加させると、分配係数が２．５％から７．５％に増加した。
【００６５】
分配係数を増加させる別の方法は、油相と水相に使用される溶媒の変更である。ＰＶＡ濃度を０．２％から２％に増加させると、デキサメタゾンとリン酸デキサメタゾンナトリウムの分配係数が両方とも３〜５倍増加する（表２）。水相への塩の添加も、溶解度を変化させることにより分配係数を増加させるのに適用される。しかし、この方法は、デキサメタゾンよりリン酸デキサメタゾンナトリウムに対して、より効果が高いことが認められた。硫酸アンモニウムは、塩化ナトリウムより効果が高い塩であるように見えた（表２）。
【００６６】
【表２】
2014510724.tif 000004
【００６７】
現在のプロトコルを使用したマイクロスフェア及びナノスフェア中のデキサメタゾンとリン酸デキサメタゾンナトリウムのカプセル化効率を表３に記載する。
【００６８】
【表３】
2014510724.tif 000005
【００６９】
眼科用途の動物モデル
熱応答性ハイドロゲルによるデキサメタゾン処置について調べた。図２２は、対照群のＳＬＯ画像を示す。対照群では、ＬＰＳ誘導後、対照ハイドロゲル（薬物なし）を硝子体に注射した。重度の炎症のため、ＬＰＳ注射２４時間後までＳＬＯ画像を得ることができなかった。ＬＰＳ注射後２日目（対照ハイドロゲル注射１日後）に、画像は不良であった。６日目までに、画像の品質は改善したが、測定を得ることは困難であった。
【００７０】
炎症の改善レベルを、デキサメタゾンの直接注射及びデキサメタゾン装填熱応答性ハイドロゲルで比較し（ｎ＝５匹のラット）、得られた画像を図２３に示す。ＬＰＳ注射により、網膜血管が約４５％拡張した。デキサメタゾン処置２４時間後までに（どちらの処置方法でも）画像の品質は改善したが、血管の拡張は存在した。しかし、拡張の程度は約１５％に低減した。６日目までに、網膜血管の緊張（ｖａｓｏｔｏｎｅ）はほぼ正常に戻った。ハイドロゲルから放出されたデキサメタゾンは、ＬＰＳ炎症に良い影響を及ぼした。改善レベルは、デキサメタゾンの直接処置と同等であった。しかし、Ｓｉｇｍａ製のデキサメタゾンは臨床リン酸デキサメタゾンナトリウムより効力が低く、用量濃度が増加する（１０ｍｇ／ｍｌ対４ｍｇ／ｍｌ）ことが分かった。
【００７１】
熱応答性ハイドロゲルも結膜下注射し、図２４に示すようなＳＬＯ画像が得られた。結膜下注射で改善があったが；ＬＰＳ注射後の炎症レベルは、血管拡張の程度（約１２％）で測定した場合、この動物では重度ではなかった。
【００７２】
要約
デキサメタゾンとリン酸デキサメタゾンナトリウムは両方ともＰＬＧＡナノスフェアへの組み込みが成功し、それらの２４時間内の放出は約９０％に達した。カプセル化効率は１０％超であった。硝子体内に注射されたデキサメタゾン装填熱応答性ハイドロゲルは炎症に対して良い影響を及ぼし、ハイドロゲル処置の効果はデキサメタゾンの直接注射の効果と類似していた。結膜下注射の予備試験から、結膜下注射も好適な送達方法であることが示唆された。
【００７３】
実施例３−細胞接着
熱応答性ハイドロゲルをフリーラジカル開始重合に基づいて合成した。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）と過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）との組み合わせを開始剤として使用した。重合は０℃で１時間行った。モノマーＡ−リシンを組み込みむと、その親水性のためハイドロゲルのＬＣＳＴが増加したが、より疎水性の高いモノマーであるＮ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド（ＮｔＢＡＡｍ）を組み込むことにより、それを所望の値に更に調節した。ＰＥＧ−ＤＡ−５７５をハイドロゲルの架橋剤として使用した。架橋剤の密度はハイドロゲルの機械的特性に重要である。ハイドロゲルを約２７Ｇの針で注射できるようにするため、２ｍＭ  ＰＥＧ−ＤＡを使用した。熱応答性ハイドロゲル合成の正確な組成を表４に要約する。ＴＥＭＥＤを添加すると直ぐにハイドロゲルの重合が起こるため、ＴＥＭＥＤはハイドロゲル前駆体に添加する最後の成分とすべきであることに留意されたい。また、この物質は非常に温度に敏感であるため、反応中の温度は最終的なハイドロゲルの特性に重要である。重合により発生する熱を吸収し、反応を一定温度に保つため、反応を氷冷して行うことが推奨される。
【００７４】
【表４】
2014510724.tif 000006
【００７５】
ハイドロゲルの洗浄
ハイドロゲルの開始剤及び未反応のモノマーは幾分毒性を示すため、ハイドロゲルを適用する前に除去されなければならない。重合後、多量のＰＢＳで繰り返し抽出する（ハイドロゲル１ｍｌ対ＰＢＳ２５ｍｌ、２０分間撹拌する）ことにより、残留分子を抽出した。５回抽出した後、周囲溶液のｐＨは約１０から７．４に低下した。毒性残留物の除去に必要な抽出回数を特定するために、線維芽細胞培養モデルを使用してハイドロゲル抽出物の毒性を調べた。ＭＴＳアッセイは、１回目と２回目の抽出溶液試料に暴露した後だけ、生細胞数の減少を示した。この結果から、３回抽出を行った後、どちらの用途に合成されたハイドロゲルも細胞毒性を示さないことが分かった。確実な標準プロトコルとして、５回の抽出を使用した。
【００７６】
ハイドロゲルの滅菌
医療用にハイドロゲルの滅菌が必要である。前駆体及び開始剤を滅菌濾過し、全ての工程を層流フード内で滅菌環境下にて行うことによりハイドロゲルを滅菌した。この方法は小規模な研究実験には現実的であるが、ハイドロゲルの大量生産には時間と労力がかかる可能性がある。医学研究分野では、オートクレーブ、ガス滅菌、及びγ線照射が滅菌方法として最も広く使用されている。ハイドロゲルを滅菌する代替の方法として、まずオートクレーブ処理（１２１℃、２０分）を調べた。しかし、おそらくオートクレーブ処滅菌中に分子構造が破壊されたことにより、ハイドロゲルは、オートクレーブ処理後、熱応答性を失った。次いで、エチレンオキサイドガス滅菌を、ハイドロゲルの滅菌に関して調べた。ガス滅菌を経た湿潤ハイドロゲルは、本来の熱応答性挙動を維持し、ＬＣＳＴ又は膨潤比に有意な変化がなかったため、将来の医療用ハイドロゲルの製造にはエチレンオキサイドガス滅菌の使用が推奨される。
【００７７】
試験及び結果
Ａ−リシンの架橋ＰＥＧ−ＤＡゲルへの組み込みにより、生体適合性及び細胞相互作用が改善されると期待される。５％Ａ−リシン及び２０％ＮｔＢＡＡｍを有する架橋ハイドロゲル、及びＡ−リシンを有していないゲルに線維芽細胞を播種した。広がった細胞のコロニーがＡ−リシン含有ゲルの表面全体に見出された。細胞は、Ａ−リシンを有していないハイドロゲルには接着しなかった。図１９に示すように様々なＡ−リシン濃度を有するハイドロゲルへの細胞接着も試験した。異なるハイドロゲル上のＤＮＡ濃度を試験するため、Ｐｉｃｏ−Ｇｒｅｅｎアッセイキットを使用して定量を行った。結果を図１９に要約する。５％Ａ−リシンを有するハイドロゲルだけ、純粋なＰＮＩＰＡＡｍ−ＰＥＧ−ＤＡハイドロゲル（０％Ａ−リシンを有する）と比較してＤＮＡ濃度が有意に（ｐ＜０．０５）高かったが、これは撮影した細胞接着の画像と一致した。
【００７８】
従って、本発明は、改善された生物学的特性を有する、例えば、望ましい放出速度論及び／又は細胞及び組織相互作用、生体適合性及び／又は接着性を有する、熱応答性ハイドロゲルを提供する。ハイドロゲル組成物は、様々な治療剤の何れかを含むことができ、注射用局所製剤に好適である。
【００７９】
説明のために本明細書に開示される本発明は、本明細書に明確に開示されていない任意の要素、部品、工程、構成成分、又は成分がなくても好適に実施することができる。
【００８０】
前述の詳細な説明で本発明を特定の好ましい実施形態に関して説明し、説明の目的で多くの詳細を記載してきたが、本発明には追加の実施形態が可能であり、本明細書に記載する詳細のうち特定のものは、本発明の基本的原理から逸脱することなく変更できることが当業者には明らかであろう。
【図１】
2014510724.tif 000007
【図２】
2014510724.tif 000008
【図３】
2014510724.tif 000009
【図４】
2014510724.tif 000010
【図５】
2014510724.tif 000011
【図６】
2014510724.tif 000012
【図７】
2014510724.tif 000013
【図８】
2014510724.tif 000014
【図９】
2014510724.tif 000015
【図１０】
2014510724.tif 000016
【図１１】
2014510724.tif 000017
【図１２】
2014510724.tif 000018
【図１３】
2014510724.tif 000019
【図１４】
2014510724.tif 000020
【図１５】
2014510724.tif 000021
【図１６】
2014510724.tif 000022
【図１７】
2014510724.tif 000023
【図１８】
2014510724.tif 000024
【図１９】
2014510724.tif 000025
【図２０】
2014510724.tif 000026
【図２１】
2014510724.tif 000027
【図２２】
2014510724.tif 000028
【図２３】
2014510724.tif 000029
【図２４】
2014510724.tif 000030
【国際調査報告】
2014510724.tif 000031
2014510724.tif 000032