【事件の表示】
　特許第３３０４２１４号「簡易測定方法及び簡易測定装置」の請求項１ないし３に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３０４２１４号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
I．手続の経緯
　本件特許第３３０４２１４号の請求項１ないし４に係る発明の出願は、平成６年９月２７日に出願され、平成１４年５月１０日にその発明について特許権の設定登録がなされた。
　その後、三島幸により特許異議の申立てがなされ、取消理由通知がなされ、その指定期間内である平成１５年６月２３日付けで訂正請求がなされ、さらに申立人に対して審尋がなされたが、その回答がなかったものである。
　
II．本件訂正の適否についての検討
　平成１５年６月２３日付け訂正請求書による訂正の適否について以下検討する。
１．訂正の内容
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲【請求項１】の、
「【請求項１】２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子を用いる免疫学的測定方法において、
ａ．あらかじめ、2種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子をインジケーター物質および1種類以上の免疫学的反応に授かる物質に各々別個に標識せしめ、
ｂ．一方、同一支持体上の異なる位置に少なくとも２種類以上からなる免疫学的に反応する能力のある物質を、あらかじめ固相化し、
ｃ．ついで上記ａ記載のインジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子および１種類以上の免疫学的反応に授かる物質を標識した着色ラテックス粒子からなる混合物と被検液中の特定の少なくとも１種類以上の免疫学的物質と反応せしめ、
ｄ．ついで、インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子と免疫学的に形成させた標識着色ラテックス複合体との混合物を、被検体を媒体として展開、移動せしめ、
ｅ．２種類以上の免疫学的に反応する能力を有する物質をあらかじめ固相化しておいた複数の位置に、それぞれ対応するインジケーター物質を標識せしめた着色ラテックス粒子と免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体によって、別々の色調で着色することを特徴とする免疫学的測定方法。」との記載を、
「【請求項１】２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子を用いるヒトヘモグロビンの免疫学的測定方法において、
ａ．あらかじめ、２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子をインジケーター物質および抗ヒトヘモグロビン抗体に各々別個に標識せしめ、
ｂ．一方、同一支持体上の異なる位置に該インジケーター物質に対する抗体および該抗ヒトヘモグロビン抗体を、あらかじめ固相化し、
ｃ．ついで上記ａ記載のインジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子および該抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子からなる混合物と被検液中のヒトヘモグロビンを反応せしめ、
ｄ．ついで、インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子と、該抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子と被検液中のヒトヘモグロビンとの間で免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体との混合物を、被検体を媒体として展開、移動せしめ、
ｅ．該インジケーター物質に対する抗体および該抗ヒトヘモグロビン抗体をあらかじめ固相化しておいた複数の位置に、それぞれ対応するインジケーター物質を標識せしめた着色ラテックス粒子と免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体によって、別々の色調で着色することを特徴とする免疫学的測定方法であって、
ｆ．インジケーター物質がウサギＩｇＧ又はマウスＩｇＧであり、及び
ｇ．該着色ラテックス標識ウサギＩｇＧ又はマウスＩｇＧ、及び着色ラテックス標識抗ヒトヘモグロビン抗体の標識時に、マスキング剤としてスキムミルクを使用すること、
を特徴とする免疫学的測定方法。」と訂正する。
　
＜訂正事項ｂ＞
　特許請求の範囲請求項２の、
「【請求項２】被検液中の特定の免疫学的物質がヘモグロビンである請求項１記載の方法。」との記載を、
「【請求項２】インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子が青色であり、抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子が赤色である請求項１記載の方法。」と訂正する。
　
２．訂正の目的、新規事項の有無、実質上の拡張、変更について
　上記訂正事項ａは、測定対象を「ヒトヘモグロビン」に、そしてインジケータ物質を「ウサギＩｇＧ又はマウスＩｇＧ」にそれぞれ限定し、それらの着色ラテックス標識の標識時にマスキング剤としてスキムミルクを使用することに限定するものであり、訂正事項ｂは、訂正事項ａの限定に加えてさらに着色ラテックス粒子の色をそれぞれ限定するものであるから、いずれも特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　そして、上記訂正事項ａ及びｂは、いずれも実施例の記載など、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであって、また、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　なお、請求項１又は２を引用する請求項３及び４も実質的に訂正されているが、これらの訂正は、いずれも特許請求の範囲の減縮を目的とし、願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内のものであって、また、実質上特許請求の範囲を拡張し又は変更するものでもない。
　
３．特許異議の申立てがなされていない請求項４についての独立特許要件の検討
　請求項４は、訂正後の請求項１又は２を引用する請求項３をさらに引用するものであり、後述するように、訂正後の本件請求項１ないし３に係る発明は、甲第１号証ないし甲第３号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明できたものということはできず、従って訂正後の本件請求項３を引用する請求項４は、訂正後の本件請求項１ないし３について検討したのと同様の理由により、甲第１号証ないし甲第３号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明できたものではない。
　
４．訂正の適否の結論
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、平成１５年法律改正前の特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立てについて
１．本件発明
　本件特許の請求項１ないし３に係る発明は、上記訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし３に記載された次のとおりのものである。（以下、それぞれ「訂正発明１」ないし「訂正発明３」という。）
　
「【請求項１】２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子を用いるヒトヘモグロビンの免疫学的測定方法において、
ａ．あらかじめ、２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子をインジケーター物質および抗ヒトヘモグロビン抗体に各々別個に標識せしめ、
ｂ．一方、同一支持体上の異なる位置に該インジケーター物質に対する抗体および該抗ヒトヘモグロビン抗体を、あらかじめ固相化し、
ｃ．ついで上記ａ記載のインジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子および該抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子からなる混合物と被検液中のヒトヘモグロビンを反応せしめ、
ｄ．ついで、インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子と、該抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子と被検液中のヒトヘモグロビンとの間で免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体との混合物を、被検体を媒体として展開、移動せしめ、
ｅ．該インジケーター物質に対する抗体および該抗ヒトヘモグロビン抗体をあらかじめ固相化しておいた複数の位置に、それぞれ対応するインジケーター物質を標識せしめた着色ラテックス粒子と免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体によって、別々の色調で着色することを特徴とする免疫学的測定方法であって、
ｆ．インジケーター物質がウサギ１ｇＧ又はマウス１ｇＧであり、及び
ｇ．該着色ラテックス標識ウサギ１ｇＧ又はマウス１ｇＧ、及び着色ラテックス標識抗ヒトヘモグロビン抗体の標識時に、マスキング剤としてスキムミルクを使用すること、
を特徴とする免疫学的測定方法。
【請求項２】インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子が青色であり、抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子が赤色である請求項1記載の方法。
【請求項３】請求項１又は請求項２記載の方法による試験片。」
　
２．申立ての理由の概要
　特許異議申立人三島幸は、証拠として本件出願日前に頒布されたことが明らかな刊行物である下記の甲第１号証ないし甲第３号証を提出し、訂正前の本件請求項１ないし３に係る発明は、甲第１号証ないし甲第３号証に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであり、従って訂正前の本件請求項１ないし３に係る特許は、特許法第１１３条第２号の規定により取り消すべきものであると主張している。
　　　　　　　　　　　　　　　　　記
　　甲第１号証：特開平６−１８０３２０号公報
　　甲第２号証：特表平６−５０４８４６号公報
　　甲第３号証：特表平５−５０８０２０号公報
　
　なお、当審において通知した取消の理由の趣旨は、上記異議申立人の主張と概略同じである。
　
３．引用刊行物の記載事項
（１）甲第１号証には、特異結合を伴う免疫学的検定法によって、使用者の側の熟練も手間もほとんど要することなく、試料中の検体を測定することのできる分析装置（段落【０００１】〜【０００２】参照）に関して、次の事項が記載されている。
（１ａ）分析試験装置
　「【請求項１】不透湿性固体材料からなる中空ケーシング中に乾燥多孔質キャリヤを収容しており、前記多孔質キャリヤに液体試料が適用され得るように多孔質キャリヤはケーシングの外部と連通しており、湿潤状態において多孔質キャリヤ内部を自由に移動し得る、検体に対して特異結合性の標識付き試薬と、キャリヤ材料上の検出区域に永久的に固定化されており、従って湿潤状態でも移動しない、同検体に対して特異結合性の無標識試薬とを含んであり、適用された液体試料が標識付き試薬を吸収した後に検出区域に浸透するように標識付き試薬と検出区域との位置関係が決定されており、さらに標識付き試薬が検出区域において結合された程度を観察できる手段を含む分析試験装置であって、多孔質キャリヤが、液体試料を受容し且つそれを多孔質キャリヤに放出させる液溜めとして作用し得る吸湿性の試料受容部材を介して装置の外部と間接的に連通していることを特徴とする前記分析試験装置。」
（１ｂ）対照区域
　「【００２０】「対照」区域が存在する場合、その区域は装置の動作が完了したことを使用者に示す信号のみを伝達するように構成することができる。例えば、第１区域からの標識付抗体と結合する抗体を対照区域に含ませることによって、試料が試験片に浸透したことを確認できる。この時の抗体は、例えば標識付抗体がネズミのハイブリドーマを用いて誘導したものである場合には「抗−ネズミ」抗体である。別の・・・場合もある。対照区域の目的が試験完了を使用者に知らせることにあるため、対照区域の場所は所望の試験結果の記録される第２区域より下流側にしなければならない。こうすることで使用者に対して試料が所要距離に亘って試験装置に浸透したことを確実に知らせるインジケータが得られる。」
（１ｃ）着色ラテックス粒子による標識
「【００２１】標識はその存在を容易に検出できるものであれば任意の物質として良い。好適には直接標識、すなわちその自然状態にある時に裸眼で見えるか、・・・例えば、染料ゾル、金属ゾル（金など）、着色ラテックス粒子のような微細な着色粒子は特に好適である。これらの中でも着色ラテックス粒子が最も好適である。」と記載されているとともに、【００８８】〜【００９２】には、牛血清アルブミンを標識時に使用する着色ラテックス粒子の調製法が記載されている。
（１ｄ）分析対象物質
「【００４６】上記の原理に基く検定法を用いると、適当な特異結合試薬を選択することによって広範囲の検体を測定することができる。検体は例えば蛋白質、ハプテン、・・・使用される。
【００４７】試料の中に１種類以上の検体が存在すること（もし存在すれば）を判定できれば、臨床的に非常に有用である。例えば・・・同様に、グリケート化ヘモグロビン（ＨｂＡ）対非グリケート化ヘモグロビン（ＨｂＡｏ）または完全ヘモグロビン（Ｈｂ）の濃度比は糖尿病の管理に役立つ。」
（１ｅ）固相材料及び着色標識粒子のブロッキング
　第１０欄の【００３０】に「検出区域に抗体を塗布した後、多孔質固相材料の残りの部分を処理して残留結合部位を他から遮断しなければならない。遮断は蛋白質（例えば牛の血清アルブミン、乳蛋白質等）、ポリビニルアルコールまたはエタノールアミン、あるいはこれらの組合せ等を用いて処理することで達成される。」と記載されていると共に、直接標識の一例である、染料ゾルの標識時について、第２２欄の【００９３】に次の記載もある。
「（Ａ）抗− hＣＧ−染料ゾルの製法
　蛋白質と染料ゾルの結合は受動吸着を伴う工程で行うことができる。蛋白質として例えば燐酸塩緩衝食塩水ｐＨ７．４に２ｍｇ／ｍｌの割合で調製した抗−αヒト絨毛ゴナドトロフィン（抗−αｈＣＧ）のような抗体製剤を用いる。１００μｌの抗体溶液と、２ｍｌの染料ゾルと、２ｍｌの０．１Ｍ燐酸塩緩衝液ｐＨ５．８と、１５．９ｍｌの蒸留水とを含む反応混合液を作成する。この混合液をゆっくりと混合した後、配合物を室温で１５分間放置する。牛の血清アルブミン等を添加して、余分の結合部位を遮断しても良い。５ｍＭＮａＣｌ　ｐＨ７．４の中に１５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを入れた液４ｍｌを反応混合液に加え、室温で１５分間放置した後、溶液を３０００ｇで１０分間遠心分離する。・・・中に再懸濁する。この抗体と染料ゾルの配合体は、凍結乾燥状態で保存するのが最も良い。」
　
（２）甲第２号証には、（ａ）試料受取ゾーン、（ｂ）標識ゾーン、（ｃ）捕捉ゾーン、（ｄ）吸収ゾーンを含む、試料中の分析目的物の存在又は欠如を検出するためのアッセイ装置(請求の範囲第１項)に関して、次の事項が記載されている。
（２ａ)可視標識
　「標識ゾーンは、捕捉ゾーンに蓄積すれば検出され得る可視部分を含む。可視部分は、・・・染色ラテックスビーズ、・・・などの粒子であることが好まれる。」（第５頁左下欄第１７〜２２行）
（２ｂ）対照可視部分
　「標識ゾーンはまた、「対照」可視部分を含み得る。これは、特異的結合剤または分析目的物の競合物を含有せず、そしてこれはまた液体流によって捕捉ゾーンの対照領域に搬入される。これらの対照可視部分は、対照試薬に特異的な捕捉相手と結合する対照試薬と結合し、そして次に捕捉ゾーンの別の「対照」部分に捕捉して液体の流が予想された通りであることを確認し得る。対照で用いる可視部分は、試験部分に用いるものと同じかまたは異なる色であり得る。異なる色が用いられるときは、結果の読み取り易さは増強される。」（第６頁左上欄第５〜１３行）
（２ｃ）標識対照ビーズとその結合部分
　「標識対照ビーズはストレプトアビジンを含み、そして捕捉ゾーン内のそれらの対照バンド部分はアビジンと特異的に結合するビオチンを含む。他の「無関係な（ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）」結合対にはまた、分析目的物に関連しない抗原／抗体反応なども、用いられ得る。」（第６頁右上欄第１２〜１６行）
（２ｄ）ブロッキング剤
　（i）支持体の好ましいブロッキング剤として、ウシ血清アルブミンの本質またはメチル化またはスクシニル化型のいずれか、ウマ血清またはウシ胎児血清などの全動物血清、および他の血液タンパク質、カゼインおよび脱脂乾燥乳が挙げられている（第４頁右下欄下から７行〜第５頁左上欄５行参照）とともに、（ii）「ブロッキング剤およびブロッキング組成物の処方物の選択は重要である。なぜならブロッキングは非吸収性流をもたらすために十分でなければならず、しかし修飾された表面が分析目的物−標識−捕捉の相互作用を妨害してはならないからである。」（第５頁左上欄下から８〜５行）と記載され、（iii）実施例１において、試料受取ゾーンと捕捉ゾーンがメチル化ウシ血清アルブミン（メチル化ＢＳＡ）でブロックキングされることが記載されている（第７頁右上欄第１２〜１３行、第８頁左上欄第１２〜１４行参照）。
（２ｅ）実施例１の標識化ビーズ
　また、実施例１の「標識ゾーンの調製」の欄（第７頁右上欄最下行〜右下欄第２０行参照）には、青色ラテックスビーズで標識化した対照ビーズと赤色ラテックスビーズで標識化した試験ビーズが標識時にメチル化ＢＳＡで処理され（第７頁左下欄第６〜８行、同頁右下欄第２〜４行参照）、該ビーズ混合物を含むメチル化ＢＳＡ液で該ゾーン膜を処理して（同欄第１１〜１５行参照）、混合ビーズを標識ゾーンに含有させることが記載されており、特に、第７頁左下欄第２３〜２４行には、「対照および試験ビーズは異なる色であることが好ましい」と記載されている。
（２ｆ）図１、２
　図１〜図２には、捕捉ゾーン膜１、可視標識を含むパッド２、試料受け取りパッド３、吸収パッド４を、粘着性透明細片５上に設置してなる、試験細片が示され、捕捉ゾーン１には、ｈＣＧ捕捉バンドとして、ウサギ抗ｈＣＧが分配されており、対照ビーズ上のストレプトアビジンと反応性の線として、ビオチニル化ＲｇＧ（ビオチニル化したウサギのガンマグロブリン）が分配されている（７頁右下欄下から３行〜８頁左上欄「捕捉ゾーン膜の調製」参照）。
　
（３）甲第３号証には、免疫クロマトグラフィー法を使用した非蛋白質抗原の競争検定のための分析テスト装置に関して、次の事項が記載されている。
（３ａ）着色標識ラテックス球
　「クロマトグラフィー膜支持体に含浸させられる第３の構成要素は、着色された微細な・・・ラテックス球の領域である。ラテックス球は、非蛋白質、すなわち、濫用薬、又はその代謝物質のための抗体、及び、第２プローブ又は蛋白質プローブのための抗体の検出のために、感作（ｓｅｎｓｉｔｉｚｅ）、すなわち、コーティングされる。ラテックス球は、直径を約０．１乃至１ミクロンとすることができる。ラテックス球は、赤、青又は緑のような所望の色で着色することができる。」（第６頁右下欄第２３行〜第７頁第６行）
（３ｂ）インジケータ
　「２番目に不動化された免疫反応プローブは、薬複合プローブの下流側において膜に設けられる。第２免疫反応プローブは蛋白質抗原であり、第２プローブは、分析テスト装置が作動することを示すもの、すなわち、インジケータとして機能する。」（第６頁右下欄第１５〜１９行）
（３ｃ）参照的反応プローブ
　「参照的反応プローブ、すなわち伝達媒体（ｃｏｍｍｕｎｉｃａｎｔ）を予め定めた部位の下流に流れるようにクロマトグラフィー支持体に加えることができる。そうすれば、色終点の外観は、使用者に分析が終了したことと、テスト素材の安定性又は使用可能性を教えることになる。この参照的反応プローブ、すなわち伝達用媒体の線は、例えば、第２の抗体／抗原反応、又は、その他のもの、例えば、アジディン／ビオチン作用でつくることができる。」（第８頁左上欄第１０〜１８行）
　
４．訂正発明１と甲第２号証記載の発明との対比・検討
（１）一致点・相違点
　訂正発明１における「マスキング剤」と、甲第２号証に記載された「ブロッキング剤」とは、特許権者も特許異議意見書において認めている如く、相違するものではないので、甲第２号証には、異なる色調の着色ラテックスビーズでのインジケーター物質および測定対象物質に対する抗体の標識時に、マスキング剤を使用することが記載されている（上記記載（２ｄ）、（２ｅ）参照）。
　そこで、訂正発明１と甲第２号証に記載された免疫学的測定方法を対比すると、両者は、
（一致点）
　「２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子を用いる免疫学的測定方法において、
ａ’．あらかじめ、2種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子をインジケーター物質および測定対象物質に対する抗体に各々別個に標識せしめ、
ｂ’．一方、同一支持体上の異なる位置に該インジケーター物質と特異的結合をする物質および測定対象物質に対する抗体を、あらかじめ固相化し、
ｃ’．ついで上記ａ記載のインジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子および測定対象物質に対する抗体を標識した着色ラテックス粒子からなる混合物と被検液中の測定対象物質を反応せしめ、
ｄ’．ついで、インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子と、測定対象物質に対する抗体を標識した着色ラテックス粒子と被検液中の測定対象物質との間で免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体との混合物を、被検体を媒体として展開、移動せしめ、
ｅ’．インジケーター物質と特異的結合をする物質および該測定対象物質に対する抗体をあらかじめ固相化しておいた複数の位置に、それぞれ対応するインジケーター物質を標識せしめた着色ラテックス粒子と免疫学的に形成せしめた標識着色ラテックス複合体によって、別々の色調で着色することを特徴とする免疫学的測定方法であって、
ｇ’．該着色ラテックス標識インジケータ物質、及び着色ラテックス標識抗−測定対象物抗体の標識時に、マスキング剤を使用する免疫学的測定方法。」、               
である点で一致するが、次の点で相違する。
　（相違点１）
  測定対象物質について、訂正発明１では、「ヒトヘモグロビン」に限定されているのに対し、甲第２号証には、ヒトヘモグロビンを測定することが記載されていない点。
　（相違点２）
　インジケータ物質について、訂正発明１では、「インジケーター物質がウサギＩｇＧ又はマウスＩｇＧであり」、固相化されているインジケーター物質と特異的結合をする物質も、該インジケーター物質に対する抗体であるのに対して、甲第２号証には、インジケータ物質に「分析目的物に関連しない抗原／抗体反応なども、用いられ得る」とは記載されているものの（前記記載（２ｃ）参照）、アビジンとビオチンとの特異的結合関係を利用する実施例しか記載されていない点。
（相違点３）
　着色ラテックス標識時に使用するマスキング剤について、訂正発明１では、「スキムミルク」を使用するのに対し、甲第２号証には、支持体のマスキング（ブロッキング）に脱脂粉乳を使用することは記載されているが（前記記載（２ｄ）（i）参照）、着色ラテックス標識時にスキムミルクを使用することについては記載されていない点。
　
（２）相違点についての検討
　そこで、これらの相違点について検討する。
　測定が完了したことを示すインジケータ物質と測定対象物質に対する抗体を同一支持体上の異なる位置に固相化し、被検体を媒体として免疫学的な標識着色ラテックス複合体等を展開、移動せしめて固相化位置での着色状況により測定対象物を測定する免疫学的測定方法の測定対象物質として、「ヒトヘモグロビン」を選択することは、甲第１号証に記載されている（前記記載（１ｄ）参照）。
　また、インジケータ物質についても、アビジンとビオチンとの特異的結合関係を利用するだけでなく、「分析目的物に関連しない抗原／抗体反応なども、用いられ得る」と甲第２号証に記載され（前記記載（２ｃ）参照）、本件特許明細書の比較例２と同様、同一色調のインジケータラインでしかないものの、インジケータ物質として、ネズミ、すなわちマウスのモノクローナル抗体と抗−マウス抗体との反応を利用することも、甲第１号証に記載されている（前記記載（１ｂ）参照）。
　抗体としては、ＩｇＧが最も代表的なものであり、測定対象物質に対する抗体とインジケータ物質とを異なる色調の着色ラテックス粒子で標識し、インジケータラインと検出すべき物質のラインを異なる色調としたい以上、測定対象物質に対する抗体を産生する動物と同じ動物の抗体、例えばＩｇＧを使用することを避けることは、甲第１号証の記載からも当業者であれば、容易に想到し得るといいうるものである。
　しかしながら、訂正発明１は、測定対象物質を「ヒトヘモグロビン」と特定し、かつ着色ラテックス粒子のインジケーター物質および抗ヒトヘモグロビン抗体への標識時にマスキング剤として「スキムミルク」を選択して使用するという、相違点１、３の構成を採用したものである。
　マスキング剤（ブロッキング剤）の選択については、甲第２号証に「ブロッキング剤およびブロッキング組成物の処方物の選択は重要である。なぜならブロッキングは非吸収性流をもたらすために十分でなければならず、しかし修飾された表面が分析目的物−標識−捕捉の相互作用を妨害してはならないからである。」（前記記載（２ｄ）（ii）参照）と記載され、特許異議意見書添付の参考資料２（特開平６−１３００６２号公報）の【０００３】にも、「一般に、このためのブロッキング剤としては、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ゼラチン、スキムミルク、卵白アルブミン等が使用されている。しかし、測定対象や使用する標識抗体によっては、前記物質にも吸着したり、目的とする反応を阻害するものもあるので、その選定や処理方法には、事前に多様な予備試験を行って、確認しておく必要があった。また、製品である分析用ストリップの製造工程においても、ブロッキング処理には慎重で煩雑な操作が要求されていた。」とあるように、マスキング剤はどれを使用しても同一の結果が得られるというものではなく、その選定には慎重で煩雑な操作を要求されることであったことが認められる。
　これに対して、甲第１号証ないし甲第３号証には、支持体に対するマスキング剤としてのスキムミルクの使用を教示するものの、標識時に使用するマスキング剤としてスキムミルクを選択することについて何ら教示も示唆もするところはなく、上記相違点１、３の構成の組合せを甲第１号証ないし甲第３号証の記載から導き出すことはできない。
　そして、訂正発明１は、上記の測定対象物質の特定と標識時の特定のマスキング剤の選択という相違点１、３に係る構成を採用することにより、特許異議意見書にも記載のように、他のマスキング剤を使用した場合に比べて、優れた分散性や展開性の効果が得られるものである。
  したがって、訂正発明１は、甲第１号証ないし甲第３号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明できたものということはできない。
　
（３）訂正発明２及び訂正発明３についての検討
  訂正後の請求項２ないし３は、いずれも訂正後の請求項１を引用するものであり、訂正発明２及び訂正発明３は、訂正発明１について前述したのと同様の理由により、甲第１号証ないし甲第３号証に記載された発明に基いて、当業者が容易に発明できたものということはできない。
　
IV．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由及び証拠によっては、本件請求項１ないし３に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１ないし３に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、本件請求項１ないし３に係る発明についての特許は、拒絶の査定をしなければならない特許出願に対してされたものと認めないから、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年６月８日（２００４．６．８）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
簡易測定方法及び簡易測定装置
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子を用いる
ヒトヘモグロビンの
ａ．あらかじめ、２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子をインジケーター物質および
抗ヒトヘモグロビン抗体
ｂ．一方、同一支持体上の異なる位置に
該インジケーター物質に対する抗体および該抗ヒトヘモグロビン抗体
ｃ．ついで上記ａ記載のインジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子および
該抗ヒトヘモグロビン抗体
ヒトヘモグロビンを
ｄ．ついで、インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子と、
該抗ヒトヘモグロビン抗体
ヒトヘモグロビンとの間で
ｅ．
該インジケーター物質に対する抗体および該抗ヒトヘモグロビン抗体
であって、
ｆ．
インジケーター物質がウサギＩｇＧ又はマウスＩｇＧであり、及び
ｇ．該着色ラテックス標識ウサギＩｇＧ又はマウスＩｇＧ、及び着色ラテックス標識抗ヒトヘモグロビン抗体の標識時に、マスキング剤としてスキムミルクを使用すること、
を特徴とする免疫学的測定方法。
　【請求項２】　
インジケーター物質を標識した着色ラテックス粒子が青色であり、抗ヒトヘモグロビン抗体を標識した着色ラテックス粒子が赤色である
　【請求項３】　請求項１又は請求項２記載の方法による試験片。
　【請求項４】　検体溶解部、検体採取部および検出部の３機能部からなり、必要に応じて各機能部を一体化あるいは連結できる簡易測定装置であって、
ａ．採取が検体採取部と検出部の連結によって達成され、
ｂ．採取後の検体の溶解と溶解液の一定量のサンプリングおよび免疫学的反応が検体溶解部、検体採取部および検出部の一体化または連結によって達成され、
ｃ．免疫学的最終反応終了後、検出部を切り離すことのできる簡易測定装置。ここにおいて、上記検出部は請求項３記載の試験片を内蔵するものである。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は簡易な測定方法および簡易な測定装置に関し、詳しくは試料中の標的の存在の有無を決定する特異的な結合反応を用いる分析方法を応用して分析対象物を簡便かつ迅速に測定する方法および装置に関する。本発明の対象とされる試料としては、例えば、血清、血漿、全血、尿、糞便などすべての生物学的流体およびその産物である。
　【０００２】
　【従来の技術】
　従来、微粒子を用いたイムノクロマトグラフ法にはコロイド状金属粒子、コロイド状金属酸化物粒子、さらにはコロイド状非金属粒子が標識粒子として広く用いられており、特開昭５５−１５１００および特開昭６４−３５３７２に記載されているごとくすでに公知である。また、近年、合成高分子化学分野の発展と共に染色された合成高分子ラテックス粒子の技術開発にはめざましいものがあり、この微粒子を用いるイムノクロマトグラフ法も開発され、特開平６−１８０３２および特開平６−１６０３８８に記載されているごとくすでに公知の方法である。本法を利用した製品には妊娠診断薬（クリアブルーワンステップ〈登録商標〉ユニパス社製）によって代表される。
　【０００３】
　従来のイムノクロマトグラフ法を利用する検出方法においては、上述の妊娠診断薬にみられるように１種類の着色コロイド粒子や１種類の着色ラテックス粒子を用いて、抗原となるヒトゴナドトロピン（ｈＣＧ）を検出して所期目的を達成するものであった。しかしながら、本発明の最も重要な特許構成要件の１つである『色調の異なる着色ラテックスを用い、同一支持体上において同時に簡便、迅速、明確に測定する』と云う方法は未だ開示された例がない。
　【０００４】
　また、本発明の簡易測定装置は検体溶解部、検体採取部および検出部の３機能を有しそれぞれの機能が分割可能な部品より構成されているのが特徴である。（図３）
　測定時はそれぞれの部品を一体化または連結して使用し、測定後は検出部のみを取り外すことができるので、極めて簡単な操作で目的が達成され、衛生的、かつ、検査結果の保存などすぐれた特徴を有する簡易測定装置は未だ開示された例がない。
　【０００５】
　【発明が解決しようとする課題】
　従来、イムノクロマトグラフ法を用いた体外診断薬分野への応用として、現在市販されている妊娠診断薬（クリアブルーワンステップ〈登録商標〉ユニパス社製）にみられるように、妊娠の重要なマーカーとして、尿中のヒトゴナドトロピン　ペプチドホルモンの検出でもって妊娠の有無を判定もしくは診断の一助とする方法は体外診断薬の分野では操作が簡単、迅速、かつ、正確な情報が得られる点で画期的な製品である。しかしながら、クリアブルーワンステップなど市販のイムノクロマトグラフ法を用いた妊娠診断薬では尿中のヒトゴナドトロピンを検出するラインと反応終了を示す２本のラインで示され、これらのラインを示す色調が例えば、ブルーなどの同一色であるため、使用者は薬局、薬店あるいは医師による充分な説明あるいは能書などを充分理解していなければ、しばしば誤認あるいは判定結果を違えることにもなりうるもので大きな社会問題にもなりかねない。
　【０００６】
　特に、我が国においては、妊娠診断薬は一般用の体外診断薬として薬局、薬店で購入が可能であるため、本製品は、いつでも、どこでも、誰にでも操作ができ、結果が間違うことなく明確に判定できることが最も重要なところである。本発明はこの点を特に重視し、２種類以上の色調の異なる着色ラテックス粒子を用い、いつでも、どこでも、誰にでも操作が可能な簡易測定装置を考案し、結果の判定については陰性側および陽性側が明確に区別できる方法を開示するものである。例えば、実施例２の１態様に従って説明すると、検査結果が陰性の場合は青色のインジケーターライン１本で示され、陽性の場合は青色のインジケーターラインと、例えば、ヘモグロビンが検出されたときに現われる赤色のラインの２本で示される。
　【０００７】
　【課題を解決するための手段】
　以下、本発明の完成に至った経緯および課題を解決するための手段について詳細に述べる。近年、抗原−抗体反応を利用して、目的とする免疫学的能力を有する物質の検出は医療分野を中心としてすばらしい進歩を遂げている。そもそも、抗原−抗体反応そのものは生体内あるいは自然界で必然性に応じて反応が生じているものであり、その原理・仕組みを人類が解明しつつあることによって多大な恩恵を受けている。特に医療分野では診断の予測あるいは診断の一助として大きな意義をもっており、血液、尿、糞便、体液などを被検液として用いるため、患者への苦痛を与えることなく検査できる点が利点である。
　【０００８】
　本来、抗原−抗体反応とは「錠前と鍵穴」の関係にたとえられるごとく、免疫学的な反応に授かる物質と対応する物質との結合によって特異的な結合体を形成するものであって、その大部分は共有結合のような強い結合ではなく、極く弱い結合を保持し成立している。このことから人為的に抗原−抗体反応複合体より抗原あるいは抗体をそれぞれ単独に回収することができる。したがって、抗原−抗体反応系には、丁度、酵素に対する基質の関係と同様にアフィニティー（親和性）の概念が成立する訳である。すなわち、目的とする酵素を単離・精製したいときは、目的とする酵素の基質をあらかじめ樹脂（担体）に固定しておき、目的とする酵素のみが基質と結合するので、水洗後、溶離液で溶出することによって一挙に高純度の酵素が回収できる。このような単離・精製手段をアフィニティークロマトグラフィーと命名されている。本法の検出手段として用いるイムノクロマトグラフィーは、クロマトグラフィーの体系からみると、まさしくアフィニティークロマトグラフィーに包括されるべきものであって、一般にクロマトグラフィーの名称で述べられている溶質と溶媒との分配係数の差でもって物質を分離・精製するという手段とは異なるものである。
　【０００９】
　すなわち、あらかじめ支持体上に固相化した抗原もしくは抗体が存在し、支持体の下端に着色した標識微粒子が水などの溶媒を媒体として支持体のもつ毛細管現象の作用で順次拡散・移動し、その際、免疫的に形成せしめた複合体−着色標識粒子によって、先の抗原もしくは抗体を固相化しておいた位置にその複合体−微粒子が到達し、その場所で特異的に抗原−抗体反応を生じ、着色シグナルとして目視的に観察することができるものである。
　【００１０】
　以上のようなアフィニティークロマトグラフィーの原理に基づいて、本法をさらに発展せしめ鋭意研究を重ねた結果、以下、本発明の完成に至った。本特許記載のイムノクロマトグラフィーに用いる微粒子には色調の異なる別々のコロイド状金属粒子、あるいは色調の異なる別々のコロイド状金属酸化物粒子、さらには色調の異なる別々のコロイド状非金属粒子を用いることができるが、色調の多様性やイムノクロマトグラフィー展開後の鮮明さを考慮すると合成高分子ラテックス粒子が好ましい。イムノクロマトグラフィーに用いる市販の合成高分子ラテックス粒子は当業者が本クロマトグラフィーを最適な条件で実施できるように設計されており、また、現在の高分子化学の合成技術水準からみても、高い水準の技術を駆使した高品質の製品である。ちなみに、本発明者らの本特許記載の実施例における使用実績からみても、抗原もしくは抗体による標識粒子の調製、標識後の乾燥工程による安定性さらには支持体上での拡散・移動性および固相化位置における着色の鮮明性などに何ら問題を生じるものではない。このような高品質のラッテクス粒子は当業者が容易に入手することができる。
　【００１１】
　例えば、ブルーラテックス粒子分散液、グリーンラテックス粒子分散液およびレッドラテックス粒子分散液の色調の異なったラテックス粒子はポリマーラボラトリー社より容易に入手することができる。その他、ローヌプーラン社、セラダイン社、インターナショナルダイナミクスコーポレーション社および積水化学工業株式会社などからも入手が可能である。また、イムノクロマトグラフ用のラテックス粒子の大きさは０．０５〜５μｍの範囲で市販されており、この範囲内の任意の大きさで使用も可能であるが、好ましくは標識する抗原もしくは抗体によって、適宜、粒子の大きさを選択することも感度・精度の上からも重要であり、通常０．４５μｍの大きさが適している。
　【００１２】
　次に本発明に用いるイムノクロマトグラフィーに使用する支持体について説明する。本発明に有用なイムノクロマトグラフィーに使用する支持体は毛細管現象を起こす作用を有し、かつ、合成高分子標識ラテックス粒子と検出しようとする物質との複合体がイムノクロマトグラフ用展開剤、例えば、水や緩衝液などですみやかに拡散・移動できるような支持体であれば良い。一般にイムノクロマトグラフィーに使用する担体としてガラス繊維状のシート、濾紙あるいはナイロンシート、ニトロセルロースシートなどが使用できるが、本発明に好適なシートはニトロセルロースシートである。ニトロセルロースシートはＢＡＳ−８５（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）、ＨＡＨＹ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）として市販されており、当業者は容易に入手することができる。
　【００１３】
　次に支持体上へ複数の抗原もしくは抗体の固相化方法について説明する。本発明の完成に有用な支持体としてニトロセルロースシートを選ぶことができ、本支持体へ複数の抗原もしくは抗体を固相化するに当たっては、実施例に記載した態様を例にあげて具体的に説明すれば良く理解することができる。
　【００１４】
　本発明のインジケーター物質とは被検液中に存在する測定しようとする物質およびその物質と免疫学的に反応する能力のある物質と交差反応を示さない物質であれば本発明に用いることができるので、特に限定されないが、通常、他動物のイムノグロブリンが好適である。また、赤色のラインは交通標識の信号機の色と同様な解釈であり、警告あるいは異常を示し、青色のラインのみの場合は異常が認められなかったことを示す意味である。したがって、このように色調の異なった色で陰性あるいは陽性を区別することは、誰にでも理解されやすいので誤った判定が避けられ安心して使用することができる。
　【００１５】
　すなわち、通常、イムノクロマトグラフィーを行うのに適した任意の大きさに整えたニトロセルロース支持体をあらかじめ準備し、本支持体の任意に選んだ一定のゾーンに第１の抗原もしくは抗体（実施例２では抗ウサギＩｇＧポリクロナール抗体）を塗布またはスプレーで散布し、上記以外のゾーンに第２の抗原もしくは抗体（実施例２では抗ヒトヘモグロビン抗体）を塗布またはスプレーで散布するなどして固相化する。また第３、第４、第５などの抗原もしくは抗体の固相化も同様に為し得る。なお、ここで支持体に固相化した抗原もしくは抗体は後のイムノクロマトグラフィーの展開によって、それぞれ位置の異なった固相化したゾーンで抗原−抗体反応を生じ着色する訳であるから、あらかじめ着色の形状を設定しておくことが望ましい。
　【００１６】
　しかしながら、本発明においてはそれぞれのゾーンで色調の異なる着色を示すので着色の形状が●、−、＋、◎、×、△、…などのいかなる表示方法であっても許容できる。好ましくは、スポット状（●）またはライン状（−）の表示が簡単、明瞭である。
　【００１７】
　次に、乾燥工程について説明する。通常の乾燥は室温放置で良いが、必要であれば３０〜５０℃の熱風による乾燥あるいは真空乾燥などの方法を適宜行っても差支えはない。乾燥後、ニトロセルロース支持体上の第１および第２あるいは第３、第４、第５などの抗原もしくは抗体の固相化したゾーン以外の領域を不活化するために、別なタンパク質でもってマスキングすることが通常行われている。一般にマスキング剤としては生理食塩水に０．２％を溶解したカゼイン溶液あるいは１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）、４％ブロックエース（明治乳業社製）などを用いるが、使用する抗原または抗体あるいは支持体の性質によって、その都度、適切なマスキング剤を選択する必要がある。
　【００１８】
　次に、合成高分子標識着色ラテックス粒子の調製法ならびに装着方法について説明する。各々の色調を有する別々のラテックス粒子にそれぞれ複数の抗原もしくは抗体を標識するにあたっては、例えば、赤色のラテックス粒子には第１の抗原もしくは抗体、青色のラテックス粒子には第２の抗原もしくは抗体、さらに黄色、あるいは緑色のラテックス粒子には第３、第４の抗原もしくは抗体をそれぞれ個別に標識しておく。標識方法は通常行われている方法であれば特に限定はしないが、一般にはラテックス粒子と標識する物質を室温約１時間位混和することによって達成できる。その後、各々標識した着色ラテックス粒子を個別に遠心分離などの方法またはミリポアフィルターによる吸引濾過法によって集め、通常使用されている緩衝液、例えば、リン酸緩衝液などでよく洗浄後、マスキング剤で各々の標識ラテックス粒子を個別にマスキングしておく。マスキング剤は先の支持体で抗原もしくは抗体の固相化後に用いたマスキング剤と同様なもので良い。
　【００１９】
　しかしながら、マスキング剤の選択は標識に使用した抗原または抗体および支持体の性質によって、その都度、適格か否かを判断する必要がある。このようにして各々、個別に標識し得た着色ラテックス粒子を保存液に貯えておく。各々の標識着色ラテックス粒子を保存した液より一定量ずつ取り出しよく混和後、よく洗浄して不織布などの多孔性ポリマーに含浸させて凍結乾燥を行う。これを支持体の一定の場所に装着することによって本発明の検出可能な試験片が完成する。なお、標識ラテックス粒子の支持体への装着については特に限定されるものではなく、標識ラテックス粒子を直接支持体へ塗布する方法等も利用することができる。装着位置についてはイムノクロマトグラフィーの展開方法によって定まるもので、例えば展開が上昇法の場合には下端部に、下降法の場合には上端に、水平方式の場合には両端部のどちらか一方に、円形方式の場合には同心円の中心部分に装着することになる。
　【００２０】
　本発明においては展開方法を特に限定するものではないが、通常、一般に行われている上昇法が望ましい。この場合、試験者は装着した支持体部分を被検液に浸すのみで展開できるので有利である。
　【００２１】
　次に、試験片について説明する。（図１参照）
　イムノクロマトグラフィーに関する試験片については、すでに数多くの発明が開示されているので、特に本発明で詳細に言及する必要はない。しかしながら、本発明の方法が確実に、また正確に当事者によって容易に実施できる「証」としてその１例を記す。実施例に示した試験片はニトロセルロースなど、使用しやすさなどを考慮して任意の長方形の大きさに裁断し支持体を作製する。支持体の下端部分を被検液に浸して毛細管現象により水などの溶媒を媒体として微量に溶けている抗原もしくは抗体を吸い上げ、ニトロセルロース支持体上部へ移動せしめる不活性材質から選ばれる部分を装着する。本不活性な材質には一般に濾紙、ガラス繊維シート、メンブランフィルターシートなどが用いられる。ニトロセルロース支持体の下端部分には先に説明した不織布上に載せた標識混合着色ラテックス粒子の凍乾物（着色ラテックス粒子標識物質凍乾担体）を一定の大きさに裁断したものを、例えば、両面テープなどで軽く固定しておくか、最終的に試験片として組み終えた段階でセロテープなどで圧着固定しても差支えがない。また、図１に示したごとく、ニトロセルロース上のそれぞれ異なった位置にあらかじめ複数の抗原もしくは抗体を固相化しておく。
　【００２２】
　一方、ニトロセルロース支持体の上端部分には、図１に示すごとく吸水性の担体を装着することによって、イムノクロマトグラフィーの展開が正確に、また迅速に為し得るため、さらには展開し終えた後の液漏れなどを防ぐ目的で本担体を装着しておくことが望ましい。このような吸水性担体はアドバンテック東洋社製の濾紙Ｎｏ．５２６やワットマン社製の１７Ｃｒ，３ＭＭなどが市販されており容易に入手することができる。以上、このような簡単な試験片で本発明の方法を検証または実施することができる。
　【００２３】
　本明細書において記載の都合上、検出すべき物質が抗原である場合には、例えば、ニトロセルロース支持体上に検出すべき物質の一定部位を認識できる抗体を固相化し、一方、合成高分子ラテックス粒子への標識には先の抗体とは別な個所の抗原分子を認識できる抗体であれば本発明の方法は達成できる。また、本発明は上述とは逆に抗体の検出の場合には、固相化抗原−検出すべき物質−検出すべき物質の抗体からなる系でもって実施できることは当業者には容易に理解されよう。したがって、本発明は検出すべき物質が抗原である場合だけに限定されず、抗体をも包含するものであり、表現としては「抗原もしくは抗体」として記してあるが、どちらか一方が定まればおのずから対応する他方が定まることになり、「抗原」および「抗体」なる文字を適宜使い分けることにより、本発明の方法を実施することができる。
　【００２４】
　次に簡易測定装置について説明する。本装置の１例を図３に示したが、被検体が糞便など半固形の場合あるいは尿、血液、など流体の場合はそれらの物性に応じて、適宜、採取部分の形状を変える必要があることは自明である。被検体が半固形状の場合は、例えば、スパイラル状の溝や、○リング状の窪み、スポット状の窪みなどを設けることによって本目的が達成できる。一方、尿や血液などの流体の場合には、例えば、採取部分をスプーン状にしたり、一定量の液体が吸収できる濾紙やガラス繊維シートなどの不活性なシートをはさみ込むことによって目的が達成できる。図３に示した本装置は被検体が糞便であって、糞便中のヒトヘモグロビンを測定する１形状を説明するが、本発明の装置はこれによって必ずしも限定されるものではない。糞便の採取にあたっては、検体採取部品と検出部品を連結して先端部分を便に数ヶ所突き刺し、検体採取穴に便を容易に入れることができる。そのとき、他の部分についた便はトイレットペーパーなどで拭き取り便の一定量を採取することが可能である。便を採取した採取部先端で軽く押して検体溶解部のシールを破り、そのまま、さらに押し込んで連結密着させ、次いで一体化した簡易測定装置を上下に激しく振り混ぜて便を溶解する。
　【００２５】
　その後、一体化した簡易測定装置を水平に保つことによって一定量の溶解液が検体取り込み口に入り、この溶解液量でもって展開・移動せしめ、３〜５分後に青色のラインと赤色のラインの２本が認められれば陽性、青色のラインのみの場合には陰性であると容易に判定することができる。また、検査結果の取り扱いについては、検出部を取り外すことができるので以下に示すメリットがある。すなわち、簡易型の本装置は極めて簡単な操作で目的が達成され、検査結果の保存または郵送あるいは持ち運びが簡単であるため、従来、被検者が直接外来に便を提出することを考えれば、極めて衛生的であり、被検者に対する精神面の苦痛が取り除かれ、さらには、医療従事者へのバイオハザードの面からも極めてメリットの大きい装置である。
　【００２６】
　【実施例】
　以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に、具体的に説明するが、本発明の方法および装置についてはこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
実施例１　ヘモグロビン、トランスフェリンの検出方法
　【００２７】
（１）
抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体の作製
　２回結晶ヒトヘモグロビン（Ｓｉｇｍａ社製）を滅菌蒸留水に溶解し、１０ｍｇ／ｍｌのヒトヘモグロビン溶液を調製した。次にヒトヘモグロビン溶液とＦｒｅｕｎｄのコンプリートアジュバントを等量混合しオイルエマルジョンとした。これをＢＡＬＢ／ｃＡマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ　ｊｃｌ，７週齢、雌）の背部皮下に０．２ｍｌずつ投与した。初回免疫後、７日目と１６日目に追加免疫を行い、さらに細胞融合３日前にヒトヘモグロビン溶液を０．２５ｍｇ／０．２ｍｌずつ腹腔内に投与した。最終免疫から３日目のマウス脾細胞とミエローマ細胞（Ｐ３ｘ６３−Ａｇ−６，５，３）を１０：１の割合で５０％ポリエチレングリコール４０００を用いて融合し、ＨＡＴ培地により選択した。細胞融合後、１４日目に培養上清のヒトヘモグロビンに対する抗体活性をＥＩＡ法により測定した。測定方法はヒトヘモグロビン１００μｇ／ｍｌで固相化した９６穴ＥＩＡプレート（コースター社製）を用い融合細胞の培養液２００μｌを添加した。その後、３７℃、１時間反応後、洗浄を行いペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ社製、１：５００）２００μｌを添加した。洗浄後、基質液（０．１Ｍ　Ｏ−フェニレンジアミンと０．０１２％過酸化水素水）を各ウエルに２００μｌずつ添加し、室温で５分間反応させた。反応後、各ウエルに４Ｎ硫酸５０μｌずつ添加し酵素反応を停止した。次に４９２ｎｍにおける吸光値を測定し、ヒトヘモグロビンに反応するクローンを限界希釈法により２回クローニングを行った。その結果、クローニング後に腹水として得られたモノクロナール抗体は１０クローンであった。これらの得られた各々の腹水１ｍｌをＰＢＳ１ｍｌで２倍に希釈し、飽和硫酸アンモニウム２ｍｌを滴加して４℃、４時間放置した。その後、３，０００ｒｐｍ，２０分間遠心分離し沈査をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液）２ｍｌに浮遊し透析を行った。この中で反応性の良い２クローン（Ｋ−６，Ｋ−８）を選択し以下の試験に用いた。なお、２クローンのイムノグロブリン　サブクラスはＩｇＧ１，Ｌ鎖はカッパー型であった。
　【００２８】
（２）
抗体固相化支持体の作製
　ニトロセルロースシート（ＢＡＳ−８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）を５ｍｍ×５０ｍｍに裁断し、その下端より１０ｍｍの位置に抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｋ−６），１５ｍｍの位置に抗ヒトトランスフェリンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（ケミコン社製）、２０ｍｍの位置に抗ウサギＩｇＧポリクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｃａｐｐｅｌ社製）を各々エアーブラシ（オリンポス社製）を用いて塗布し、抗ヒトヘモグロビン抗体と抗ヒトトランスフェリン抗体および抗ウサギＩｇＧ抗体のラインを作製した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）−０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳに３７℃、２時間浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥し抗体固相化支持体を作製した。
　【００２９】
（３）
着色ラテックス粒子標識物の調製
ａ．
レッドラテックス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体
　レッドラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ，１０％，４５０ｎｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）３００μｌにＰＢＳ１．２ｍｌを加え、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠心分離を行った。沈査に抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体溶液（０．５ｍｇ／ｍｌ）（Ｋ−８）１ｍｌを加え、充分混和して、室温１時間反応を行った。未反応の抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体を除去するため、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠心分離を行い、沈査をＰＢＳ１．５ｍｌに懸濁し、再度遠心分離を行った。４％ブロックエース（明治乳業社製）１ｍｌを加え、室温６０分間反応させてマスキングを行った。その後、１３，０００ｒｐｍ，５分間遠心分離を行い、沈査を１％スキムミルク−０．０１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ１．５ｍｌに懸濁し冷蔵保存した。
ｂ．
グリーンラテックス粒子標識抗ヒトトランスフェリン抗体
　グリーンラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ，１０％，４５０ｎｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）および抗ヒトトランスフェリンモノクロナール抗体（０．５ｍｇ／ｍｌ，アドバンス　イムノケミカル社製）を用いて上記と同様な操作で調製した。
ｃ．
ブルーラテックス粒子標識ウサギＩｇＧ
　ブルーラテックス粒子分散液（ＰＬ−Ｌａｔｅｘ，１０％，４５０ｎｍ，Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）およびウサギＩｇＧ（０．５ｍｇ／ｍｌ，Ｃａｐｐｅｌ社製）を用いて上記と同様な操作で調製した。
ｄ．
着色ラッテクス粒子標識物凍乾担体
　それら３種類の着色ラテックス粒子標識物を等量混和し、ベンリーゼ（登録商標）不織布（旭化成社製）５ｍｍ×５ｍｍに１０μｌ含浸させ凍結乾燥をして調製した。
　【００３０】
（４）
試験片の作製
抗体固相化支持体の下端から２．５ｍｍの位置まで着色ラテックス標識物凍乾担体を重ねた。さらに、着色ラテックス標識物凍乾担体上に被検液浸漬用担体を下端から２．５ｍｍの位置まで重ねた。また、抗体固相化支持体の上端から５ｍｍの位置まで吸水性担体５ｍｍ×２０ｍｍ（Ｎｏ．５２６，アドバンテック東洋社製）を重ね、最後に透明なテープを上部に貼り固定して試験片とした。（図１）
　【００３１】
（５）
標準液を用いた反応性試験
　ヒトヘモグロビン（２回結晶、Ｓｉｇｍａ社製）、ヒトトランスフェリン（ケミコン社製）を各々１００μｇ／ｍｌになるように０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで溶解し２種類の標準液を調製した。標準液２００μｌを試験片の被検液浸漬用担体に滴加してのち展開した。５分後、あらかじめ固相化したライン部分の着色の有無により判定を行った。なお、対照として０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳのみを用いて同様に操作した。２種類の標準液を展開した場合には赤色のライン（ヒトヘモグロビン）、緑色のライン（ヒトトランスフェリン）青色のライン（インジケーター物質）が検出された。また、ヒトヘモグロビン標準液では赤色と青色のライン、ヒトトランスフェリン標準液では緑色と青色のライン、対照では青色のラインのみが検出された。（図２）
　【００３２】
実施例２　便中ヒトヘモグロビンの検出方法（試験片）
（１）
抗体固相化支持体の作製
　ニトロセルロースシート（ＢＡＳ−８５，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　Ｓｃｈｕｅｌｌ社製）を５ｍｍ×５０ｍｍに裁断し、その下端より１０ｍｍの位置に抗ヒトヘモグロビンモノクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｋ−６），２０ｍｍの位置に抗ウサギＩｇＧポリクロナール抗体溶液０．５ｍｇ／ｍｌ（Ｃａｐｐｅｌ社製）を各々エアーブラシ（オリンポス社製）を用いて塗布し、抗ヒトヘモグロビン抗体および抗ウサギＩｇＧ抗体のラインを作製した。室温で２時間乾燥後、１％スキムミルク（ＤＩＦＣＯ社製）−０．１％ツィーン２０を含むＰＢＳに３７℃、２時間浸漬しマスキングを行った。その後、充分に乾燥し抗体固相化支持体を作製した。
　【００３３】
（２）
着色ラテックス粒子標識物の調製
　レッドラテックス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体およびブルーラテックス粒子標識ウサギＩｇＧは実施例１で調製した各々の標識ラテックス粒子を使用した。
着色ラテックス粒子標識物凍乾担体
　それら２種類の着色ラテックス粒子標識物を等量混合し、ベンリーゼ（登録商標）不織布（旭化成社製）５ｍｍ×５ｍｍに１０μｌ含浸させ凍結乾燥をして調製した。
（３）
試験片の作製
　実施例１と同様に作製した。
　【００３４】
（４）
標準液を用いた反応性試験
　ヒトヘモグロビン（２回結晶、Ｓｉｇｍａ社製）を各々１ｍｇ／ｍｌ，１μｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ，１０ｎｇ／ｍｌになるように０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで溶解し標準液を調製した。標準液２００μｌを試験片の被検液浸漬用担体に滴加してのち展開した。なお、対照として０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳを用いて同様に操作した。ヒトヘモグロビン濃度が１００ｎｇ／ｍｌまで赤色のラインを検出した。また、インジケーター物質であるウサギＩｇＧのラインは全例検出された。なお、試験結果を表１に示した。
　【００３５】
　【表１】
　【００３６】
（５）
糞便中のヒトヘモグロビン検出試験
　便潜血陰性便にヒトヘモグロビンを便１ｇあたり１，０．１，０．０５，０．０１ｍｇを添加し、よく混和した。次に各ヒトヘモグロビン添加便を１０ｍｇずつ採取して、各々０．００５％ツィーン２０−０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ２ｍｌに懸濁し、よく混和後、スポンジですばやく濾過した液を便懸濁液とした。便懸液２００μｌを被検液浸漬用担体に滴加してのち展開した。ヒトヘモグロビン無添加便も対照として同様の測定を行った。ヒトヘモグロビン添加便は０．０５ｍｇ／ｇ濃度まで赤色のラインが検出された。また、インジケーター物質であるウサギＩｇＧの青色のラインは全例検出された。なお、試験結果を表２に示した。
　【００３７】
　【表２】
　【００３８】
実施例３　便中ヒトヘモグロビンの検出法（一体型簡易測定装置を用いた測定）
（１）
一体型簡易測定装置の作製
　本装置は検体溶解部（３１）、検体採取部（３２）、検出部（３３）から構成されている。検体溶解部（３１）には溶解液（３４）（０．１％ＢＳＡ−０．００５％ツィーン２０を含むＰＢＳ）２ｍｌを加え、開口部は液漏れを生じないようにアルミ製基材のシールで完全に接着した。検出部（３３）は上下に２分割できる構造であり、この中に実施例１で作製した試験片を装着した。次に検体採取部（３２）の検出部（３３）側の開口部のところに、検体溶解液吸収性担体（３７）として５ｍｍ×３０ｍｍに裁断した濾紙（Ｎｏ．５２６、アドバンテック東洋社製）を挿入した。連結部（３８）を介して、検出部（３３）と検体採取部（３２）を連結して検体採取可能な装置とした。
　【００３９】
（２）
検査法
　検体採取仕様の検体採取部（３２）側で便を数回突き刺し、検体採取穴（３５）に便を入れた。検体採取部（３２）の先端についた余分な便をトイレットペーパーでふきとり、検体溶解部（３１）のシールを検体採取部の先端で破り、検体溶解部（３１）と検体採取仕様にしたものを連結後、一体型簡易測定装置にして、その装置を上下に激しく振り便を溶解した。判定部を上にした後、ただちに一体型簡易測定装置を水平に静置した。この操作により一定量（２００μｌ）の検体溶解液が取り込み口より入り、展開・移動して、５分後反応が終了した。その後、検体採取部（３２）と検出部（３３）の連結部分から検出部（３３）を取り外し結果を判定した。
　【００４０】
（３）
糞便中のヒトヘモグロビン検出試験
　便潜血陰性便にヒトヘモグロビンを便１ｇあたり、各々１，０．１，０．０５，０．０１ｍｇを添加し、よく混和してヒトヘモグロビン添加便を調製した。この添加便を実施例３（２）の検査法で測定した。なお、表３に示すように一体型簡易測定装置を用いても、試験片のみの場合と同じ結果を示した。
　【００４１】
　【表３】
　【００４２】
（４）
大腸がん患者便の測定
　大腸がんと診断された患者の便１０例について、一体型簡易測定装置を用いて測定を行った。なお、対照として健常者便１０例も同様に行った。その結果、大腸がんの患者便では全例赤色のライン（ヒトヘモグロビン）と青色のライン（ウサギＩｇＧ）が検出され、便潜血陽性と判定された。また、健常者便では全例青色のライン（ウサギＩｇＧ）が検出されたのみで便潜血陰性と判定された。
　【００４３】
比較例１　ラテックス法との比較
　糞便検体１４０例を用い、ラテックス凝集法を原理とした便中のヘモグロビン測定試薬『ＯＣ−ヘモディア』（登録商標）（栄研化学社製）と一体型簡易測定装置を用いた便潜血測定法を比較した。表４に示すように１４０例中１３１例が両方で一致し、一致率は９３．６％であり良好な結果を示した。
　【００４４】
　【表４】
　【００４５】
比較例２　従来法と本発明による判定結果の難易性の比較
　インジケーターラインと検出すべき物質のラインが異なる色調の場合（本発明法）と同一の色調である場合（従来法）に対する判定結果の難易性についてパネラーを無作為に１２名選び比較を行った。
（１）
従来法（同一色調）試験片の作製
　抗体固相化支持体は実施例２の抗ウサギＩｇＧポリクロナール抗体溶液の代わりに抗マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製）を用いて同様に作製した。一方、ブルーラッテクス粒子標識抗ヒトヘモグロビン抗体は実施例１と同様に作製した。この粒子をベンリーゼ（登録商標）不織布（５ｍｍ×５ｍｍ，旭化成社製）に１０μｌ含浸させ凍結乾燥をして調製した。先の支持体と担体を用いて実施例１の方法に従って試験片を作製し、実施例２の標準液を用いて反応性試験を行ったところ、ヒトヘモグロビン濃度が１００ｎｇ／ｍｌまで青色のラインを検出した。また、インジケーターラインは全例青色のラインとして検出され、本試験片は正常に作動することが判った。
　【００４６】
（２）
本発明による方法と従来法の着色試験片の作製
　実施例２で作製した本発明の試験片と従来法の試験片に各々ヒトヘモグロビン標準液（１μｇ／ｍｌ、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで溶解）を実施例２（４）の方法に従って反応せしめ、両法による着色試験片を各々作製した。
　【００４７】
（３）
本発明による方法と従来法による判定結果に対する難易性の比較
　両法の判定結果に対する難易性を比較するため、パネラー１２名（女性５名含む）を任意に選出し、２点嗜好試験法による官能検査（「官能検査ハンドブック」日科技連官能検査委員会（編）、１９８５）に準拠して判定を行った。表５に示したように本検査に準拠した方法から、１２名ともに本発明による方法の方が「判定しやすい」との回答が得られ、明らかに本発明の方法が優れていた。
　【００４８】
　【表５】
　【００４９】
　【発明の効果】
　本発明によれば、色調の異なる標識ラテックス粒子を用い、イムノクロマトグラフィーによって複数の物質を目視的に別々の色調で同時に検出することができる。本発明による簡易型の測定装置を提供することによって、例えば、一般用医薬品としての体外診断薬に応用すれば、いつでも、どこでも、誰にでも容易に実施することができる。さらに、検査結果の判定には色調の異なるラテックス粒子を用いていることから、間違うことなく明確に判定できることが特徴である。また、本簡易測定装置は連結可能な一体型の装置として考案しているので、検査終了後、すみやかに検出部品のみを切り離し、回収して検査機関や病院へ郵送したり、届けたりすることができる。このように本装置はきわめて衛生的である、また医療従事者に対するバイオハザードの面からも極めて優れた装置を提供するものである。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　本発明の試験片の１態様を示したものであり、該試験片上部図および断面図である。
　【図２】
　本発明の方法を用いた測定結果の１態様を示したものであり、ヒトヘモグロビン、ヒトトランスフェリンを同時に検出、測定した結果である。
　【図３】
　本発明の連結一体型簡易測定装置の１態様を示したものであり、一体型（全体図）、検体採取仕様（断面図、上部図）、測定仕様（上部図）である。
　【符号の説明】
　１　吸収性担体
　２　抗体固相化支持体
　３　着色ラテックス粒子標識物凍乾担体
　４　被検液浸漬用担体
　５　抗ウサギＩｇＧ抗体固相化ゾーン
　６　抗ヒトトランスフェリン抗体固相化ゾーン
　７　抗ヒトヘモグロビン抗体固相化ゾーン
　２１　ヒトヘモグロビン標準液とヒトトランスフェリン標準液の混合液を展開したクロマトグラム
　２２　ヒトヘモグロビン標準液を展開したクロマトグラム
　２３　ヒトトランスフェリン標準液を展開したクロマトグラム
　２４　対照を展開したクロマトグラム
　３１　検体溶解部
　３２　検体採取部
　３３　検出部
　３４　溶解液
　３５　検体採取穴
　３６　検体溶解液取り込み口
　３７　検体溶解液吸収性担体
　３８　連結部
　３９　試験片
　４０　判定窓