(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
豆乳中で単独発酵した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能なストレプトコッカス・サーモフィラスと、
豆乳中で前記ストレプトコッカス・サーモフィラスと共に継代培養を実施して得られた、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積可能なラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（豆乳中で単独で継代培養することができるものを除く）と、
からなる乳酸菌混合スターターを使用し、糖源を加えることなく発酵させて得られた、Ｄ／Ｌ乳酸比が０．０５以上である、豆乳発酵物。
【請求項２】
請求項１に記載した豆乳発酵物であって、前記豆乳発酵物の粒度分布において粒子径１００マイクロメートル以上の粒子の全体に占める比率が１０％以下である、豆乳発酵物。
【請求項３】
豆乳中で単独発酵した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能なストレプトコッカス・サーモフィラスと、
豆乳中で前記ストレプトコッカス・サーモフィラスと共に継代培養を実施して得られた、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積可能なラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス（豆乳中で単独で継代培養することができるものを除く）と、
からなる乳酸菌混合スターター。
【請求項４】
以下の工程を有する豆乳発酵物の製造方法。
（ａ）豆乳を主成分とする培地中に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスを選抜する工程
（ｂ）豆乳を主成分とする培地中に、（ａ）で選抜した菌株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスとを同時に接種して培養し、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスを選抜する工程
（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の菌株の組み合わせを、糖源を添加することなく豆乳に接種する工程
（ｄ）Ｄ−乳酸が０．４ｇ／Ｌ以上である豆乳発酵物を得るために発酵を行う工程
【請求項５】
前記（ａ）の工程が、３７〜４５℃、１２〜２４時間で実施される、請求項４に記載の豆乳発酵物の製造方法。
【請求項６】
前記（ｂ）の工程が、３０〜４５℃、４〜２４時間で実施される、請求項４に記載の豆乳発酵物の製造方法。
【請求項７】
前記（ａ）及び／又は（ｂ）の培養が、継代培養で行われる、請求項４に記載の豆乳発酵物の製造方法。
【請求項８】
以下の工程を有する乳酸菌混合スターターの製造方法。
（ａ）豆乳を主成分とする培地中に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスを選抜する工程
（ｂ）豆乳を主成分とする培地中に、（ａ）で選抜した菌株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスとを同時に接種し、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスを選抜する工程
【請求項９】
前記（ａ）の工程が、３７〜４５℃、１２〜２４時間で実施される、請求項８に記載の乳酸菌混合スターターの製造方法。
【請求項１０】
前記（ｂ）の工程が、３０〜４５℃、４〜２４時間で実施される、請求項８に記載の乳酸菌混合スターターの製造方法。
【請求項１１】
前記（ａ）及び／又は（ｂ）の培養が、継代培養で行われる、請求項８に記載の乳酸菌混合スターターの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、豆乳を乳酸菌で発酵することにより得られる豆乳発酵物に関する。
【背景技術】
【０００２】
大豆は畑の肉とも呼ばれ、豊富な植物性タンパク質を含む食品素材で、豆乳はその大豆から熱水等によりタンパク質その他の成分を溶出させ、繊維質を除去して得られる乳状の飲料であり、低コレステロール、高蛋白な健康素材として以前から注目されている。また、同様に健康素材として注目されている乳酸菌で豆乳を発酵させることによって、大豆と乳酸菌の相乗効果による健康機能も期待されている。しかしながら、大豆独特の不快臭または大豆臭や乳酸菌による発酵臭や漬物臭が課題となり、なかなか市場に浸透していないのが現状である。【０００３】
一方、牛乳においては、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会（コーデックス委員会）が定めたＣＯＤＥＸ（以下、「ＣＯＤＥＸ」という）によりヨーグルト用乳酸菌として定義されているストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）が、共生関係を構築することは以前から知られている。また、この共生関係を構築することによって両菌種の生育が単独発酵と比べ飛躍的に向上し、結果として風味の良いヨーグルトとなることも知られている。【０００４】
しかしながら、豆乳ではストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスをそのまま接種して発酵しても牛乳のように十分に発酵が進まず、豆乳に乳糖を添加するなどの操作を加えなければ乳酸生成によって物性の良好なカードを形成させたり良好な風味を生成したりすることが難しいことが知られている。これはラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスが豆乳に含まれるシュークロースを資化することができず、正常に乳酸発酵を行ったり菌数を増やしたりすることができない事が主因である。【０００５】
これまでに、乳酸発酵によって風味良好な豆乳発酵物を製造する方法は、多数報告されている。例えば、ラクトバチルス・アシドフィラス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィラスの５種の乳酸菌を混合させ、かつ、無調整の豆乳に糖分や脂質、ゼラチンを添加することで風味を改善する方法がある（特許文献１参照）。【０００６】
また、ラクトバチルス・プランタラム及びラクトコッカス・ラクティスの２種の乳酸菌で発酵することで風味を改善する方法（特許文献２参照）や、ラクトバチルス・アシドフィラス、又は、ラクトバチルス・カゼイのいずれかとビフィドバクテリウム属乳酸菌及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの少なくとも３菌種で発酵させ、風味の改善した豆乳発酵物を得る方法（特許文献３参照）、そしてラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスとラクトバチルス・アシドフィルスから選択される菌株１種とラクトバチルス・カゼイ及びストレプトコッカス・サーモフィラスの３種の乳酸菌で豆乳を発酵させる方法（特許文献４参照）など、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスに更に異なる菌種を加えたり、あるいはこれらの菌種を別の菌種に置き換えたりすることで豆乳中の乳酸発酵を促進し、風味を改善する種々の報告がある。また、口当たりを改善するために豆乳に糖および乳酸菌とプロテアーゼを同時に加えて発酵する方法（特許文献５参照）も報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開昭６３−７７４３号公報
【特許文献２】特開平５−１８４３２０号公報
【特許文献３】特開平１０−２０１４１５号公報
【特許文献４】特開２０１１−１６７１９０号公報
【特許文献５】特開平７−１４７８９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、これらの従来技術においては、ＣＯＤＥＸで定義されたヨーグルト用乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類の乳酸菌だけでなく、該乳酸菌とは異なる種類の乳酸菌を使用して豆乳を発酵するため、その乳酸菌由来の雑味や漬物臭等が生じてしまったり、牛乳を発酵したヨーグルトとは大きく異なる風味や物性になってしまう問題があった。また、３種類以上の乳酸菌を用いることで、各菌株の製造・管理が非常に煩雑となり、製造ロットの品質の維持が容易でなくなる問題や、大豆由来以外の食品原料を調合したり、乳酸菌接種と同時に酵素を添加するなど、加工上の煩雑さが加わるといった問題もある。【０００９】
従って本発明が解決しようとする課題は、豆乳を原料とする発酵物を製造する際に、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）のみを乳酸菌混合スターターとする場合であっても、原料である豆乳に酵素処理や抽出処理などの加工処理を施さず、また糖源などの原料を加えることなく、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトと同等の風味や滑らかな物性を有する豆乳発酵物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ＣＯＤＥＸで定義されたヨーグルト用乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類の乳酸菌を組み合わせた乳酸菌混合スターターにおいて、豆乳中でフラクトースを０．４ｇ／Ｌ以上蓄積することができるストレプトコッカス・サーモフィラスと、同ストレプトコッカス・サーモフィラスと組み合わせた際に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を生成することができるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスを組み合わせることにより、豆乳環境においても乳環境とほぼ同程度に２種類両方の菌が生育し、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトに近い風味や物性を有する豆乳発酵物が得られることを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、（１）豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスと、を含む乳酸菌混合スターターを使用して得られた豆乳発酵物を提供するものである。【００１２】
また、本発明は、（２）豆乳に接種し培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラスと、豆乳に接種して培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積可能であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスと、を含む乳酸菌混合スターターを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、豆乳を原料とし、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスのみを乳酸菌混合スターターとする場合であっても、原料である豆乳に酵素処理や抽出処理などの加工処理を施さず、また糖源などの原料を加えることなく、牛乳を乳酸発酵したヨーグルトと同程度に風味・物性が優れた豆乳発酵物を提供することができる。本発明のヨーグルト様豆乳発酵物は、大豆発酵物特有の不快臭を感じさせないため、大豆と乳酸菌の相乗効果による優れた機能を有する健康素材として普及することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｋ１５８１株）と、市販混合スターターより単離して選抜したストレプトコッカス・サーモフィラス株または、育種したストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｋ１５８０株）とを混合して豆乳に接種し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を示した図である。
【図２】育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス株（Ｋ１５８５株）と市販混合スターターより単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株とを混合して、豆乳に接種し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を示した図である。
【図３】育種したストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｋ１５８０株）と、市販混合スターターより単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株とを混合して豆乳に接種し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を示した図である。
【図４】育種や単離操作、選抜操作などを行っていない市販混合スターター（ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスの混合スターター）のみで発酵（４２℃、２４時間）して得た豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を示した図である。
【図５】無調整豆乳をＭＦ限外ろ過膜によって透過した液に１．０％（ｗ／ｖ）のフラクトースを添加した豆乳膜透過液をラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス単独で、４２℃、２４時間発酵して得た発酵液中のＤ―乳酸生成量を測定した図である。
【図６】無調整豆乳をＭＦ限外ろ過膜によって透過した液に１．０％（ｗ／ｖ）のフラクトースを添加し、ｐＨを５．０に合わせた酸性豆乳膜透過液をラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス単独で、４２℃、２４時間発酵して得た発酵液中のＤ−乳酸生成量を測定した図である。
【図７】市販混合スターター（ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスの混合スターター）から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株を４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のフラクトース濃度を測定した図である。
【図８】市販混合スターターＹＯ−ＭＩＸ３０５、４９９から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株と同じく市販混合スターターＹＯ−ＭＩＸ５０５、５１１、８６３から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスを１：１で混合し、４２℃、２４時間発酵して得た豆乳発酵物中のＤ−乳酸生成量を測定した図である。
【図９】育種した乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で豆乳を４２℃で発酵した際の経時的なスクロース濃度の推移を示した図である。
【図１０】育種した乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で豆乳を４２℃で発酵した際の経時的なフラクトース濃度の推移を示した図である。
【図１１】育種した乳酸菌であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株と育種した乳酸菌であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８１株で豆乳を４２℃で共発酵した際の経時的なフラクトース濃度の推移を示した図である。
【図１２】市販混合スターター又は育種株の混合スターター、あるいは選抜株の混合スターターで発酵して得た豆乳発酵物の粒度分布の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の豆乳発酵物は、豆乳に酵素処理など特別な加工処理を加えずに、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類の乳酸菌のみで発酵することにより得られる。
【００１６】
本発明で使用する豆乳としては、従来の方法により得られるものであれば何れのものでも良く、市販の豆乳を使用しても良い。例えば、脱皮した大豆または脱脂大豆を水に浸漬して膨潤させた豆類を蒸煮・摩砕して得られる液体を使用することができ、該液体からおからを除去した液体を使用することが味や食感の観点からより好ましい。さらに、全粒大豆粉、脱脂大豆粉等を溶解した液を用いても良い。ＪＡＳ規格では、大豆固形分８．０％以上のものは豆乳と定義され、調製豆乳は６．０％以上、豆乳飲料は４．０％以上と定義されているが、大豆固形分量に関しては、特に限定されるものではない。
【００１７】
本発明で使用するストレプトコッカス・サーモフィラスは豆乳で増殖可能であり、単独で豆乳中に増殖させた場合に豆乳中のシュークロースを分解してグルコースとフラクトースを生成し、そのうちフラクトースを０．４ｇ／Ｌ以上の濃度で蓄積する性質を有することが求められる。
【００１８】
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスは豆乳に含まれるシュークロースを糖源として資化することができないが、ストレプトコッカス・サーモフィラスがシュークロースをグルコースとフラクトースに分解することにより、それらを資化してラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスも増殖することができる。
【００１９】
ストレプトコッカス・サーモフィラスはシュークロースを分解しながら、自ら分解産物を糖源として取り込むが、特に分解力が高い菌株を選抜すれば発酵物中に分解した糖が蓄積する。そしてそのようにして蓄積したフラクトースの量が０．４ｇ／Ｌを越える豆乳発酵物中では、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスは良く増殖し、そして増殖過程において種々の代謝産物を生成してヨーグルトの風味を形成するうえで大きな役割を担うことができる。
【００２０】
このようにラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの代謝は豆乳をヨーグルト様に発酵する上で重要だが、その代謝によって生成するＤ−乳酸は、Ｌ−乳酸のみを生成するストレプトコッカス・サーモフィラスでは生成しないことからラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの代謝活動を示す測定容易な指標として活用することができる。本発明においてそのＤ−乳酸量が発酵物中で０．４ｇ／Ｌ以上蓄積する発酵物はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスが活発に代謝産物を生成した結果、特に風味が良くなることを見い出したのである。
【００２１】
上記性質を有する乳酸菌は、牛乳のヨーグルト製造に用いられる乳酸菌や環境中の同種の乳酸菌から選抜することができる。乳酸菌を育種する場合には、一般的に広く用いられる手段は全て利用することができる。例えば、紫外線を用いた変異の誘発や薬剤を用いた変異の誘発、豆乳を主成分とする培地での継代培養などを行うことによって、豆乳中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積するストレプトコッカス・サーモフィラスやそれらと同時に培養した際に豆乳中での０．４ｇ／Ｌ以上の高いＤ−乳酸生成量を示すラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを得ることが可能である。
【００２２】
乳酸菌の育種を行うに当たっては、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを同時に接種して、発酵温度を３０〜４５℃、より好ましくは３２〜４２℃で、発酵時間を４〜２４時間を行うことによって酸生成力の高い株を育種することができる。
【００２３】
Ｄ−乳酸を生成する乳酸菌はラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスであるが、豆乳中の糖の主成分であるスクロースを資化することができないため、単独では増殖することができず、死滅してしまうこともある。一方、ストレプトコッカス・サーモフィラスはスクロースを資化して豆乳中である程度生育できるものが多く、その際に同乳酸菌がスクロースを分解することによってグルコースとフラクトースが生成され、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを共存させると、それらを資化して徐々に生育することができるようになることを発明者らは見出した。
【００２４】
ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを増殖させるために、豆乳に糖を添加して補完させることも考えられるが、糖の補完だけでは十分な量のＤ−乳酸生成を示さない場合もあり、糖の補完関係以外に２つの株の相性が存在することから、フラクトースを蓄積するストレプトコッカス・サーモフィラスと共に培養した際にＤ−乳酸量として０．４ｇ／Ｌ以上生成できる代謝が活発なラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを選択することが重要である。
【００２５】
多数存在するストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの中から適切な株の組合せを選抜あるいは育種することによって、豆乳中で両菌種が共に活性化しヨーグルト様の良好な風味や物性を形成することができるが、ストレプトコッカス・サーモフィラスがシュークロースを盛んに資化する結果、同菌が生成するＬ−乳酸も発酵物中に生成される。
ヨーグルト様の良好な豆乳発酵物を得るためには、Ｄ−乳酸だけでなく、ストレプトコッカス・サーモフィラスによって生成されるＬ−乳酸も含まれている必要がある。
【００２６】
本発明で用いる乳酸菌は、上述したように選抜あるいは育種によって得ることができ、本願明細書の実施例においては、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスＫ１５８１株の組合せ、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８４株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスＫ１５８５株の組合せ、ストレプトコッカス・サーモフィラス  ダニスコ社株（混合スターターＹＯ−ＭＩＸ４９９より単離した株）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス  ダニスコ社株（混合スターターＹＯ−ＭＩＸ５０５、５１１、８６３より単離した株）の組合せ、などが該当する。本発明の豆乳発酵物は、上記性質を有する乳酸菌を使用することにより得ることができるため、実施例記載の菌株に限定されるものではない。
【００２７】
豆乳を乳酸菌で発酵する方法に関しては、一般的に知られているヨーグルトや乳酸菌飲料の製法に基づいて行うことができ、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィラスを１×１０４〜１×１０８ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは、１×１０５〜１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスを１×１０２〜１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは、１×１０３〜１×１０５ｃｆｕ／ｍＬとなるように豆乳に接種し、発酵温度３０〜４５℃、より好ましくは３７〜４２℃で、４〜２４時間の範囲内で発酵すれば良く、発酵形態は特に制限されるものではない。
【００２８】
このようにして得られる本発明のヨーグルト様豆乳発酵物は、Ｄ−乳酸を０．４ｇ／Ｌ以上含有することを特徴としており、ストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの代謝が共に盛んになることで、これまで市販の乳酸菌混合スターターをそのまま用いた場合では得られなかった乳酸生成量を示し、それぞれの菌種に由来する芳香成分を有するヨーグルト様の風味や物性の良い豆乳発酵物となる。また、大豆由来以外の原料を添加せずに発酵することが可能であることから、副原料由来の味に影響されることも無い。さらに、本発明の豆乳発酵物は汎用性が高く、ヨーグルト様食品だけでなく、調味料やチーズ、飲料形態など、大豆関連飲食品のいずれの製品にも応用することが可能である。
【００２９】
なお、本実施形態ではストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２種類のみを用いて乳酸発酵物を製造する例を説明したが、これに限定されず、ストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの乳酸発酵や得られる豆乳発酵物の風味に影響を与えない限り、本発明に示す２種の乳酸菌に加えてストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス以外の乳酸菌を併用してもよい。
【００３０】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００３１】
１．市販の乳酸菌混合スターターを用いた豆乳発酵物のＤ−乳酸量の測定
（１）乳酸菌混合スターター
乳酸菌混合スターターとして、市販のヨーグルト製造用の乳酸菌混合スターター（ダニスコ社製、ストレプトコッカス・サーモフィラス株及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の両方を含む凍結乾燥品。以下、「市販混合スターター」ということがある）を使用した。この市販混合スターターは、ストレプトコッカス・サーモフィラス株及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の性質に応じて、種々のものが存在する。具体的には、ＹＯ−ＭＩＸ３００、ＹＯ−ＭＩＸ３０５、ＹＯ−ＭＩＸ４９６、ＹＯ−ＭＩＸ４９９、ＹＯ−ＭＩＸ５０５、ＹＯ−ＭＩＸ５１１、ＹＯ−ＭＩＸ８６３、ＹＯ−ＭＩＸ８８３、ＹＯ−ＭＩＸ８８５、ＹＯ−ＭＩＸ４０１、ＹＯ−ＭＩＸ４２１、ＹＯ−ＭＩＸ４９５、ＹＯ−ＭＩＸ６０１である（いずれも製品番号）。【００３２】
（２）発酵条件及び測定方法
豆乳発酵原液には、市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を用いた。一方、各乳酸菌混合スターターの凍結乾燥物を１０ｍＬのＬＭ１７培地（Ｔｅｒｚａｇｈｉ及びＳａｎｄｉｎｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９，８０７〜８１３，１９７５）で培養し、培養液を０．９％ＮａＣｌ溶液で遠心・洗浄し、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。この調製した懸濁液を上記豆乳発酵原液に１．０％（ｖ／ｖ）接種し、４２℃、２４時間発酵した。そして、２４時間経過後に発酵を終了し、豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を、酵素電極法（王子計測社製、バイオセンサーＢＦ−５）により測定した。【００３３】
（３）結果
結果を図４に示す。２４間発酵させて得られた豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を測定したところ、Ｄ−乳酸はほとんど生成されず、所望のヨーグルト様の風味を持つ豆乳発酵物が得られないことを確認した（図４）。【００３４】
２．供試菌株の単離、選抜及び育種
（１）ストレプトコッカス・サーモフィラス
市販スターター（いずれもストレプトコッカス・サーモフィラス及びラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカスの２菌種を含む）から、ストレプトコッカス・サーモフィラス株のみを単離した。単離した株は、市販スターターの製品番号に基づき、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ：Ｓｔ．）４５株、Ｓｔ．４０株、Ｓｔ．５０５株、Ｓｔ．５１１株、Ｓｔ．８６３株、Ｓｔ．８８３株、Ｓｔ．８８５株、Ｓｔ．３００株、Ｓｔ．３０５株、Ｓｔ．４９５株、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．１８７株、Ｓｔ．２０５株、Ｓｔ．２０７株、Ｓｔ．２０８株、Ｓｔ．２１１株、Ｓｔ．４０１株、Ｓｔ．４２１株、Ｓｔ．４９２株、Ｓｔ．６０１株とした。【００３５】
上記の単離株のうち、単離菌株の種菌を１％の比率で豆乳に接種し、３７〜４５℃で１２〜２４時間培養した際に発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のフラクトースを蓄積可能であるストレプトコッカス・サーモフィラス株を選抜し、選抜株とした。具体的には、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔ．）４０株、Ｓｔ．５１１株、Ｓｔ８６３株、Ｓｔ．８８５株、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．１８７株、Ｓｔ．２０５株、Ｓｔ．４０１株、Ｓｔ．４２１株、Ｓｔ．４９２株、Ｓｔ．６０１株を選抜株とした。【００３６】
また、オランダに拠点を置くＮＩＺＯ  ｆｏｏｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社が保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．２３３３株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１８５株を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７〜４５℃で１２〜２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株をＫ１５８０株とした。【００３７】
さらに同じくＮＩＺＯ  ｆｏｏｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ社が保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．１３１株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１９４株を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７〜４５℃で１２〜２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したストレプトコッカス・サーモフィラス株をＫ１５８４株とした。【００３８】
（２）ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス
上記市販スターターから、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株のみを単離した。単離した株は、市販スターターの製品番号に基づき、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ：Ｌｂ．）３００株、Ｌｂ．３０５株、Ｌｂ．４０１株、Ｌｂ．Ｌｂ．４２１株、Ｌｂ．４９２株、Ｌｂ．４９５株、Ｌｂ．４９６株、Ｌｂ．４９９株、Ｌｂ．５０５株、Ｌｂ．５１１株、Ｌｂ．６０１株、Ｌｂ．８６３株、Ｌｂ．８８３株、Ｌｂ．８８５株とした。【００３９】
上記の単離株のうち、上述したストレプトコッカス・サーモフィラスの選抜株１．０％と共に、上記単離株の種菌１．０％を豆乳に接種して３７〜４５℃で１２〜２４時間培養した際に、発酵物中に０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を蓄積するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株を選抜し、選抜株とした。具体的には、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス（Ｌｂ．）４９２株、Ｌｂ．５０５株、Ｌｂ．５１１株、Ｌｂ．６０１株を選抜株とした。【００４０】
また、ＮＩＺＯ  ｆｏｏｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈが保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．２３３３株とラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１８５を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７〜４５℃で１２〜２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株をＫ１５８１株とした。【００４１】
さらに同じくＮＩＺＯ  ｆｏｏｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈが保有するストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｓｔ．１３１とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）Ｌｂ．１９４を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、継代培養を行った。豆乳発酵物を１％（ｖ／ｖ）の比率で繰り返し豆乳に接種し、３７〜４５℃で１２〜２４時間培養した。およそ７００世代、継代培養を実施し、得られた豆乳発酵物から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株をＫ１５８５株とした。同様にＳｔ．１３１とＬｂ．１８５の継代培養から得たラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株をＫ１５８３株とした。【００４２】
３．豆乳発酵物中のＤ−乳酸量の比較
（１）供試菌株
市販混合スターターから単離した乳酸菌及び選抜・育種した乳酸菌（上記２参照）を用いて豆乳を発酵させ、得られた豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を測定・比較した。【００４３】
（２）発酵条件及び測定方法
発酵原料は、成分無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を用いた。この発酵原料に、ストレプトコッカス・サーモフィラス株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株からなる乳酸菌混合スターターを構成したものを添加し、４２℃、２４時間発酵した。発酵終了後、得られた豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を酵素電極法（王子計測社製、バイオセンサーＢＦ−５）で測定した。【００４４】
（３）結果
図１は、各種ストレプトコッカス・サーモフィラス株と、育種株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８１株とで乳酸菌混合スターターを構成し、発酵して得られた豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を測定した結果を示す図である。【００４５】
図２は、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８１株に代えて、同じく育種株であるラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスＫ１５８５株を乳酸菌混合スターターとし、同様の条件で豆乳を発酵し、得られた豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を測定した結果を示す図である。【００４６】
図１及び図２に示すように、同じラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株でも、組み合わせるストレプトコッカス・サーモフィラス株によってＤ−乳酸生成量が異なることから、ストレプトコッカス・サーモフィラス株の特徴によってもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の代謝能が変化することを確認した。特に、フラクトースの生成量が０．４ｇ／Ｌ以上となることを指標に選抜した株では顕著にＤ−乳酸生成量が高くなる傾向にあった。【００４７】
図３は、育種株であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株と、市販スターターから単離した各ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株とで乳酸菌混合スターターを構成し、これを豆乳に接種し、同様の条件で発酵して得た豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を測定した結果を示す図である。【００４８】
図３に示すように、育種したストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を使用した場合でも、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株によってそのＤ−乳酸量の生成に大きな違いがあることを確認した。【００４９】
図１、図２、図３、図４で示すように、ストレプトコッカス・サーモフィラス株、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株共に、市販の乳酸菌混合スターターをそのまま用いた発酵によって得た豆乳発酵物中では、Ｄ−乳酸があまり生成されないのに対し、ストレプトコッカス・サーモフィラス株、およびラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の両方を選抜または育種した株に置き換えることによって、０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸を含んだ豆乳発酵物を得ることができる。特に、本発明にて育種した乳酸菌同士（ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株Ｋ１５８１株）から構成された乳酸菌混合スターターを用いた場合では、更にＤ−乳酸量の多い豆乳発酵物を得ることができる（図１参照）。【００５０】
以上の結果から、ストレプトコッカス・サーモフィラスの持つ特徴によって共に発酵するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスによるＤ−乳酸生成量に大きな変化が見られ、またラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスも株により豆乳中でのＤ−乳酸生成量が大きく異なることを確認した。【００５１】
４．無調整豆乳膜透過液中でのラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株による発酵後のＤ−乳酸量の比較
（１）上述のように、ストレプトコッカス・サーモフィラス株の特徴によってラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株によるＤ−乳酸生成量が大きく変化したことが分かった。そこで、選抜・育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株と市販スターターから単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株の豆乳膜透過中での代謝能の違いを確認するため、予めフラクトースを補糖した豆乳膜透過液中でのＤ−乳酸生成量を比較した。豆乳膜透過液は豆乳から高分子の不溶性タンパク質や脂質が取り除かれたものであり、豆乳中の遊離アミノ酸、可溶性のペプチド、糖分やミネラルなど大きな違いはないものと考えられる。【００５２】
（２）無調整豆乳膜透過液の作製
市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を中空糸状の限外ろ過モジュール（型式：ＵＳＰ−１４３（旭化成社製））を用い、真空ポンプで吸引し（−６０ｋＰａ）、膜を透過した液を成分無調整の豆乳膜透過液とした。この液に対し、終濃度１．０％（ｖ／ｖ）となるようにフラクトースを無菌的に添加した（無調整豆乳膜透過液）。更に、この豆乳膜透過液に塩酸を添加し、ｐＨ５．０に調整した酸性豆乳膜透過液を作製した。【００５３】
（３）豆乳膜透過液での培養後のＤ−乳酸生成量の測定
市販のヨーグルト製造用粉末混合スターター（ダニスコ社製：ストレプトコッカス・サーモフィラス株およびラクトバチルス・ブルガリカス株を含む凍結乾燥品）から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株、育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株３株（Ｋ１５８１株、Ｋ１５８３株、Ｋ１５８５株）、野生株（ＡＴＣＣ１１８４２株）をそれぞれＭＲＳ培地で培養した。得られた菌液を０．８５％滅菌食塩水で２度遠心・洗浄し、得られたペレットを無調整豆乳膜透過液に懸濁し、スターター菌液とした。【００５４】
無調整豆乳膜透過液、酸性（ｐＨ５．０）豆乳膜透過液それぞれに洗菌した菌液を１．０％接種し、４２℃で２４時間培養（ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株単独培養）し、培養後の菌液のＤ−乳酸量を測定した（図５及び図６）。【００５５】
無調整豆乳膜透過液では、市販スターターやＡＴＣＣ１１８４２株に比べ、本発明にて育種したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株によるＤ−乳酸産生量は顕著に高い値を示した。同様に、酸性豆乳膜透過液では無調整豆乳膜透過液に比べ、市販スターターと育種した株とで、Ｄ−乳酸生成量に顕著な違いが見られた。市販スターターより分離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株では特に低ｐＨ条件下（ｐＨ５．０）において、Ｄ−乳酸の生成量が低いのに対し、育種した株は同条件下で、およそ３倍以上のＤ−乳酸を産生することを確認した。豆乳中でのストレプトコッカス・サーモフィラス株との共発酵では、先にサーモフィラス株の生育によりｐＨが低下し、その後ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株が生育すると考えられる。市販のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカス株では、以上のような環境では、Ｄ−乳酸の生成が０．４（ｇ／Ｌ）を超える株が存在せず、やはり、豆乳環境中では生育・代謝が制限されていることが確認された。以上の結果と合わせ、育種した株に関しては、低ｐＨ、かつ豆乳条件下においても、市販株やＡＴＣＣ１１８４２株と比べ、非常に代謝が盛んに起こっていると推察され、結果として、ヨーグルト様の良好な酸味や風味のある豆乳発酵物を作製することができるものと考えられる。【００５６】
なお、市販スターター由来の単離株の中にはＬｂ．５０５株やＬｂ．５１１株など、図３において選抜株として０．４ｇ／Ｌ以上のＤ-乳酸を生成した株も含まれており、図５、図６においても他の市販スターター由来の株よりも高いＤ−乳酸生成を示しているが、０．４ｇ／Ｌの生成量には至っていない。これは図５、図６に示した試験においてはストレプトコッカス・サーモフィルスが存在しないためであると考えられる。無調整豆乳膜透過液にフラクトースを補糖しているが、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシース・ブルガリカスの代謝を活発化してＤ−乳酸の生成量を高めるには単純にフラクトースを供給するだけでなく、ストレプトコッカス・サーモフィルスは他の役割も担っていると考えられる。【００５７】
５．サーモフィラス単独で発酵して得た豆乳発酵液中のフラクトース残糖量の測定
市販の乳酸菌混合スターター（ダニスコ社製）ＹＯ−ＭＩＸ３００、３０５、４９６、４９９、５０１、８８５からストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．３００株、Ｓｔ．３０５株、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．５０１株、Ｓｔ．８８５株）のみを単離した。単離した各菌株を１０ｍＬのＬＭ１７培地で培養し、培養液を０．９％ＮａＣｌ溶液で遠心・洗浄し、１０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液に再懸濁した。豆乳発酵原液には、市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を用いた。この豆乳発酵原液に上述で調製した懸濁液を１．０％（ｖ／ｖ）接種し、４２℃、２４時間発酵した。発酵後、遠心上清を回収し、フラクトースの残糖量をＦキット  Ｄ−グルコース/果糖（ジェイ・ケイ・インターナショナル社製）により測定した。結果を図７に示す。【００５８】
図７に示すように、ストレプトコッカス・サーモフィラス株の中には、Ｓｔ．４９６株、Ｓｔ．４９９株、Ｓｔ．８８５株のように、豆乳発酵物中にフラクトースを０．４ｇ／Ｌ以上蓄積する株と、蓄積しない株が存在することが判明した。【００５９】
６．乳酸菌スターターの組み合わせによるＤ−乳酸量の生成に及ぼす影響
フラクトースを蓄積する特徴のあるストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．４９９株）と蓄積しない株（Ｓｔ．３０５株）を市販混合スターターＹＯ−ＭＩＸ５０５、５１１、８６３から単離したラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株（Ｌｂ．５０５株、Ｌｂ．５１１株、Ｌｂ．８６３株）と１：１で組合せた乳酸菌混合スターターを構成した。これを市販の無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に添加し４２℃で２４時間、発酵して豆乳発酵物を得た。そして、発酵終了後、得られた豆乳発酵物中のＤ−乳酸量を酵素電極法（王子計測社製、バイオセンサーＢＦ−５）で測定した。【００６０】
図８に、豆乳発酵物中のＤ−乳酸生成量の測定結果を示す。図８に示すように、フラクトースを蓄積するストレプトコッカス・サーモフィラス株と組合せることで、０．４ｇ／Ｌ以上のＤ−乳酸が生成され、副原料無添加でもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスとの共生関係が豆乳でも構築されることを確認した。【００６１】
７．豆乳発酵中の糖濃度の経時的推移
ストレプトコッカス・サーモフィラス株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株が豆乳中で共生関係を構築するためには、ストレプトコッカス・サーモフィラス株によって豆乳の主要糖分であるスクロースを分解し、フラクトースを蓄積することで、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株に糖源を供給することが不可欠であると考えられる。今回、育種したストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で発酵した時、また、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株を共発酵した時のスクロース、フラクトースの残糖量を経時的に測定した。発酵温度は４２℃に設定した。スクロースの経時変化を図９に、フラクトースの経時変化を図１０に示す。【００６２】
図１１は、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株で豆乳を４２℃で共発酵した際の経時的なフラクトース濃度の推移を示した図である。【００６３】
ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で発酵した条件では、スクロースの量が経時的に減少し、フラクトースの蓄積が確認された（図９、図１０）。一方、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株で共発酵した際には、一度、フラクトースが少量蓄積され、その後減少することが分かった（図１１）。【００６４】
２つの結果から、Ｋ１５８１株によってフラクトースが代謝され、結果としてＤ−乳酸やその他、芳香成分の生成に寄与しているものと考えられる。ストレプトコッカス・サーモフィラスにはフラクトースを積極的に資化する株とそうでない株とに分けられ、本実施例における選抜株及び育種株の様にフラクトースを資化せずに、発酵物中に蓄積させる特徴のあるストレプトコッカス・サーモフィラスを用いることで、豆乳中においてもラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスと共生関係を構築し、ラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス由来の風味を豆乳発酵物に付与することができ、結果として風味の良い豆乳発酵物を産み出すことが可能となる。【００６５】
８．育種株を用いた官能評価
育種株であるストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株からなる乳酸菌混合スターターを調製し、これを用いて、無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）を４２℃、２４時間発酵させて豆乳発酵物を得た。一方、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株を単独で無調整豆乳に添加し、４２℃、２４時間発酵させ、豆乳発酵物を得た。それぞれの成分分析値は以下のとおりである。【００６６】
【表１】
0006495163.tif 000002
【００６７】
次に、単独発酵した豆乳発酵物と共発酵物を適宜混合することで、発酵物中のＤ−乳酸量を調製した。すなわち、１００％共発酵物（サンプル１）、４０％共発酵物（サンプル２）、３０％共発酵物（サンプル３）、２０％共発酵物（サンプル４）、１５％共発酵物（サンプル５）、１０％共発酵物（サンプル６）、１００％単独発酵物（サンプル７）をそれぞれ作製した。各サンプルのＤ−乳酸推測値、推定Ｄ／Ｌ比は表２のとおりである。【００６８】
また、各サンプルを試食し、Ｄ−乳酸量と豆乳発酵物の風味との関係を下記の評価基準で評価した。【００６９】
（評価基準）
◎：非常に風味が良い
○：風味が良い
△：風味が少し悪い
×：風味が悪い【００７０】
結果を表２に示す。表２に示すように、サンプル１からサンプル３までは風味良好であることが判明した。従って、豆乳発酵物においては、Ｄ−乳酸を少なくとも０．４ｇ／Ｌ以上生成するラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株を使用することで風味が良好になることが判明した。また、単にラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株のみが旺盛に生育するだけでは良好な風味が得られるのではなく、ストレプトコッカス・サーモフィラスの生育とのバランスが重要であり、Ｄ／Ｌ乳酸比が０．０５以上であることが好ましいことが明らかとなった。【００７１】
【表２】
0006495163.tif 000003
【００７２】
９．その他市販混合スターターを用いて発酵して得た豆乳発酵物の官能評価
市販のヨーグルト製造用粉末混合スターター（ダニスコ社製：ストレプトコッカス・サーモフィラス株およびラクトバチルス・ブルガリカス株を含む凍結乾燥品）ＹＯ−ＭＩＸ３００、ＹＯ−ＭＩＸ３０５、ＹＯ−ＭＩＸ５１１、ＹＯ−ＭＩＸ８６３（いずれも製品番号）の粉末を滅菌水で溶解し、同量の懸濁液を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、４２℃、２４時間発酵させ、豆乳発酵物を得た。【００７３】
一方、市販混合スターターＹＯ−ＭＩＸ８８５、ＹＯ−ＭＩＸ４９６由来のストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．８８５株、Ｓｔ．４９６株）を単離した。また、市販混合スターターＹＯ−ＭＩＸ３０５、ＹＯ−ＭＩＸ４９２、ＹＯ−ＭＩＸ６０１由来のラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株（Ｌｂ．３０５株、Ｌｂ．４９２株、Ｌｂ．６０１株）を単離し、それぞれグリセロールストック菌液として保管し、試験に用いた。【００７４】
また、育種株として、ストレプトコッカス・サーモフィラスＫ１５８０株及びＫ１５８４株とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスＫ１５８１株及びＫ１５８５株を用いた。【００７５】
作製したストレプトコッカス・サーモフィラス株（Ｓｔ．株）とラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株（Ｌｂ．株）をそれぞれ１：１で混合し（例えば、Ｋ１５８０株＋Ｋ１５８１株やＳｔ．８８５株＋Ｌｂ．３０５株など）、１０ｍＬの無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）で発酵させ、前発酵物を得た。この前発酵物１．０％（ｖ／ｖ）を無調整豆乳（キッコーマンソイフーズ社製）に接種し、４２℃、２４時間発酵させ、豆乳発酵物を得た。各豆乳発酵物の乳酸分析値を以下に示す。【００７６】
【表３】
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【００７７】
上記のようにして得られた各豆乳発酵物に、終濃度６．０％（ｗ／ｖ）となるようにショ糖を添加し、風味や呈味について官能評価を実施した。その結果、Ｄ−乳酸を含まない豆乳発酵物では、甘さが先行し、好ましいものにはならなかったが、Ｄ−乳酸を０．４ｇ／Ｌ以上含む豆乳発酵物では、酸甘バランスが取れ、風味良好な豆乳発酵物となることが判明した。以上のことから、豆乳発酵物に砂糖を添加した場合においても、本発明に係る乳酸菌混合スターター（選抜または育種した株からなる乳酸菌混合スターター）を用いて製造した豆乳発酵物の方が優れた風味や呈味を有することを見出した。【００７８】
１０．豆乳発酵物の物性測定
豆乳発酵物の物性を測定し、評価を実施した。物性の評価に関しては、豆乳発酵物中にどのような粒子径の粒子が、どのような割合で含まれているかを示す指標である粒度分布を用いた。粒度分布を測定することで、発酵物を口に含んだときの舌触りや滑らかさを評価することができる。【００７９】
市販のヨーグルト製造用粉末混合スターター（ダニスコ社製：ストレプトコッカス・サーモフィラス株およびラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカス株を含む凍結乾燥品）ＹＯ−ＭＩＸ３００、ＹＯ−ＭＩＸ３０５（いずれも製品番号）によって発酵して得た豆乳発酵物、また、選抜または育種した株（Ｋ１５８０株＋Ｋ１５８１株、Ｓｔ．４９６＋Ｌｂ．６０１、Ｓｔ．８８５＋Ｌｂ．３０５）によって発酵して得た豆乳発酵物を均一に撹拌し、レーザー回折式粒度分布測定装置（ＳＡＬＤ−２２００（島津製作所））に供し、粒度分布を測定した。【００８０】
測定結果を図１２に示す。グラフ内には各サンプルごとに同一シンボルで粒子径の出現頻度と共に積算結果も示した。市販スターターによって発酵して得た豆乳発酵物に比べ、選抜または育種した株の発酵によって得た豆乳発酵物においては、粒子径１００マイクロメートル以上の粒子が全体に占める比率が１０％以下であり、より舌触りのなめらかな豆乳発酵物であることが確認された。これは育種あるいは選抜によって豆乳発酵時のストレプトコッカス・サーモフィラスとラクトバチルス・デルブルッキー・サブスピーシーズ・ブルガリカスの代謝がそれぞれ活性化されたことにより、それら乳酸菌が生成する多糖類の生成も盛んになり、結果としてザラツキの原因となる大豆タンパクの過剰な凝集を防止して物性が改善されたことを示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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