(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）ヒト多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、Ｒａｘ遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程
を含む網膜色素上皮細胞の製造方法。
【請求項２】
（１）ヒト多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、Ｒａｘ遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程、及び
（４）工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する第四工程
を含む網膜色素上皮細胞シートの製造方法。
【請求項３】
前記工程（４）において、血清代替物存在下で接着培養が行われる請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記工程（４）において、ＲＯＣＫ阻害物質存在下で接着培養が行われる請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地を用いて接着培養が行われる請求項２から４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記工程（４）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養が行われる請求項２から５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記培養基質が、合成培養基質である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
前記培養基質が、ラミニンである請求項６に記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程（１）及び工程（２）が、血清代替物存在下で行われる請求項１から８のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる請求項１から９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる１以上のタンパク質である請求項１から１０のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
工程（２）におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地が、ＦＧＦシグナル経路阻害物質を更に含む、請求項１から１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを製造し、得られた該細胞または細胞シートに被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該細胞シートに及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法により網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを製造し、得られた該細胞または細胞シートの有効量を含有するように細胞治療用移植材料を調製することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜色素上皮細胞の製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
多能性幹細胞を用いて網膜色素上皮細胞を製造する報告が知られている（非特許文献１）。均一な多能性幹細胞の凝集体をＷｎｔシグナル経路阻害物質を含む無血清培地中で形成させ、これを基底膜標品の存在下において浮遊培養し、次いで血清培地中で浮遊培養した後、Ｗｎｔシグナル経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養することにより、網膜色素上皮細胞を得る方法（非特許文献２及び特許文献１）が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７７４２５号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ５，  ３９６−４０８  （２００９）
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  １０（６），  ７７１−７８５  （２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
多能性幹細胞から網膜色素上皮細胞を製造する方法の更なる開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、網膜色素上皮細胞又は網膜色素上皮細胞シートを多能性幹細胞から製造する方法等を提供する。
即ち、本発明は：
［１］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程
を含む網膜色素上皮細胞の製造方法（以下、本発明製造方法１と記すこともある。）；
［２］（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程、及び
（４）工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する第四工程
を含む網膜色素上皮細胞シートの製造方法（以下、本発明製造方法２と記すこともある。）；
［３］前記工程（４）において、血清代替物存在下で接着培養が行われる前記［２］に記載の製造方法；
［４］前記工程（４）において、ＲＯＣＫ阻害物質存在下で接着培養が行われる前記［２］または［３］に記載の製造方法；
［５］前記工程（４）において、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地を用いて接着培養が行われる前記［２］から［４］のいずれかに記載の製造方法；
［６］前記工程（４）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養が行われる前記［２］から［５］のいずれかに記載の製造方法；
［７］前記培養基質が、合成培養基質である前記［６］に記載の製造方法；
［８］前記培養基質が、ラミニンである前記［６］に記載の製造方法；
［９］前記多能性幹細胞が霊長類多能性幹細胞である前記［１］から［８］のいずれかに記載の製造方法；
［１０］前記多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である前記［１］から［９］のいずれかに記載の製造方法；
［１１］前記工程（１）及び工程（２）が、血清代替物存在下で行われる前記［１］から［１０］のいずれかに記載の製造方法；
［１２］浮遊培養が、基底膜標品非存在下で行われる前記［１］から［１１］のいずれかに記載の製造方法；
［１３］前記ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７及びＧＤＦ７からなる群から選ばれる１以上のタンパク質である前記［１］から［１２］のいずれかに記載の製造方法；
［１４］工程（２）におけるソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地が、ＦＧＦシグナル経路阻害物質を更に含む、前記［１］から［１３］のいずれかに記載の製造方法；
［１５］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを含有してなる、毒性・薬効評価用試薬；
［１６］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートに被検物質を接触させ、該物質が該細胞又は該細胞シートに及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法；
［１７］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを含有してなる、網膜組織の障害に基づく疾患の治療剤；
［１８］前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される、有効量の網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法；及び
［１９］網膜組織の障害に基づく疾患の治療における使用のための前記［１］から［１４］のいずれかに記載の方法により製造される網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シート；
等を提供する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によれば、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを高効率に製造することが可能となる。本発明の製造方法においては、基底膜標品を培地中に添加することなく、すなわち基底膜標品非存在下に凝集体を浮遊培養して、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを得ることが可能であるので、得られた細胞または細胞シートへの異種由来成分の混入のリスクが低減される。本発明の製造方法によれば、化学物質等の毒性または薬効評価や移植治療などを目的として、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを効率よく提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、浮遊培養３日目にＢＭＰ４を培地に添加して浮遊培養したヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養１８日目の明視野像（Ａ）、および浮遊培養３日目にＢＭＰ４を培地に添加して浮遊培養し、浮遊培養１８日目からＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養したヒト胚性幹細胞由来凝集体の浮遊培養２０日目の明視野像（Ｂ）を示す図である。
【図２】図２は、浮遊培養開始３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養したヒト胚性幹細胞由来凝集体を、（Ａ）浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、その後ＢＭＰ４及びＣＨＩＲ９９０２１をいずれも含まない培地で浮遊培養した際の浮遊培養２７日目の明視野像、（Ｂ）浮遊培養１８日目から２７日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養した際の浮遊培養２７日目の明視野像、及び（Ｃ）浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養２１日目から２７日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１及びＳＵ−５４０２を含む培地で浮遊培養をした際の浮遊培養２７日目の明視野像、を示す図である。
【図３】図３は、ヒト胚性幹細胞由来凝集体を浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、培養２１日目に凝集体を破砕して得られた細胞をＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で接着培養した際の浮遊培養開始から２７日目の（Ａ）明視野像、（Ｂ）網膜色素上皮マーカーＭｉｔｆの蛍光免疫染色像、及び（Ｃ）密着結合マーカーＺＯ−１の蛍光免疫染色像である。
【図４】図４は、ヒト胚性幹細胞由来凝集体を浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養２１日目に分散して、得られた細胞をシンセマックスＴＭで表面処理したボイデンチャンバーに播種してＹ２７６３２を含む培地で接着培養した際の（Ａ）浮遊培養開始から４０日目の網膜色素上皮細胞シートの像、および（Ｂ）明視野拡大像である。
【図５】図５は、浮遊培養開始から４０日目の網膜色素上皮細胞シートの明視野拡大像である。ヒト胚性幹細胞由来凝集体を、浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、培養２１日目に分散して、得られた細胞をシンセマックスＴＭで表面処理したボイデンチャンバーに播種して接着培養した。浮遊培養開始から２４日目、すなわち接着培養開始から３日目に、（Ａ）成分添加せずに、または（Ｂ）３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１，（Ｃ）１０μＭ  ＳＵ−５４０２，（Ｄ）３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１と１０μＭ  ＳＵ−５４０２，（Ｅ）１ｎＭ  ヒトＢＭＰ４タンパク質、もしくは（Ｆ）５０ｎｇ／ｍｌ  ヒトアクチビンを添加して浮遊培養開始から４０日目まで接着培養を継続した。
【図６】図６は、ヒト胚性幹細胞由来凝集体を浮遊培養３日目から１８日目までＢＭＰ４を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養１８日目から２１日目までＢＭＰ４を含まずＣＨＩＲ９９０２１を含む培地で浮遊培養し、浮遊培養２１日目に分散して、得られた細胞を（Ａ）ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ、又は、（Ｂ）シンセマックスＴＭのいずれかで表面処理したボイデンチャンバーに播種して接着培養した際の、浮遊培養開始から２６日目の網膜色素上皮シートの像である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。
【００１０】
本発明における「浮遊培養」とは、細胞または細胞塊を培養器材等に接着させない条件で培養することをいう。
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されていないものなどを使用できる。
【００１１】
本発明において細胞の培養に用いられる培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｇｌａｓｇｏｗ  ＭＥＭ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ＭＥＭ  Ｚｉｎｃ  Ｏｐｔｉｏｎ培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ  ＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、Ｆ−１２培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。
【００１２】
本発明における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本発明では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
【００１３】
無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール又は３’チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、ＷＯ９８／３０６７９に記載の方法により調製することができる。血清代替物としては市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製：以下、ＫＳＲと記すこともある。）、Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（Ｇｉｂｃｏ社製）、ＧｌｕｔａｍａｘＴＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）が挙げられる。
【００１４】
浮遊培養で用いる無血清培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００１５】
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のＫＳＲを適量（例えば、約１％から約２０％）添加した無血清培地（例えば、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ及び４５０μＭ  １−モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。
【００１６】
本発明における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、２−メルカプトエタノール、１−モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
【００１７】
本発明における「基底膜標品」とは、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播腫して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有する基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて支持体から除去することで作製することができる。基底膜標品としては、基底膜調製物として市販されている商品（例えば、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ベクトン・ディッキンソン社製：以下、マトリゲルと記すこともある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫から抽出された基底膜調製物である。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの主成分はＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン及びエンタクチンであり、これらに加えてＴＧＦ−β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、組織プラスミノゲン活性化因子及びＥＨＳ腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭの「ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｄｕｃｅｄ製品」は、通常のＭａｔｒｉｇｅｌＴＭよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はＥＧＦが＜０．５ｎｇ／ｍｌ、ＮＧＦが＜０．２ｎｇ／ｍｌ、ＰＤＧＦが＜５ｐｇ／ｍｌ、ＩＧＦ−１が５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−βが１．７ｎｇ／ｍｌである。
【００１８】
本発明において、「物質Ｘを含む培地」とは、外因性（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ）の物質Ｘが添加された培地または外因性の物質Ｘを含む培地を意味し、「物質Ｘを含まない培地」とは、外因性の物質Ｘが添加されていない培地または外因性の物質Ｘを含まない培地を意味する。ここで、「外因性の物質Ｘ」とは、その培地で培養される細胞または組織にとって外来の物質Ｘを意味し、その細胞または組織が産生する内在性（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）の物質Ｘはこれに含まれない。
例えば、「ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地」とは、外因性のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された培地または外因性のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む培地である。「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地」とは、外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地または外因性のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない培地である。
【００１９】
本発明における「霊長類」とは、霊長目に属するほ乳類動物をいい、霊長類としては、キツネザルやロリス、ツバイなどの原猿亜目と、サル、類人猿、ヒトなどの真猿亜目が挙げられる。
【００２０】
本発明における「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する細胞のことであり、組織が傷害を受けたときにその組織の再生に寄与することができる。幹細胞としては、胚性幹細胞（以下、ＥＳ細胞と記すこともある。）もしくは組織幹細胞（組織性幹細胞、組織特異的幹細胞又は体性幹細胞とも呼ばれる）、又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）が挙げられる。上記の幹細胞由来の組織細胞は、組織再生が可能なことから分かるように、生体に近い正常な細胞に分化できることが知られている。
幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２及びＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、ＥＢ５細胞は独立行政法人理化学研究所より、Ｄ３株はＡＴＣＣより、入手可能である。
幹細胞は、自体公知の方法により維持培養できる。例えば、ヒト幹細胞は、ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を添加した培地で培養することにより維持できる。マウス幹細胞は、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）及びＬｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ）を添加し無フィーダー下に培養することにより維持できる。
【００２１】
本発明における「多能性幹細胞」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、胎盤を除く生体を構成するすべての細胞（三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）由来の組織）に分化しうる能力（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ））を有する幹細胞をいう。胚性幹細胞（ＥＳ細胞）も「多能性幹細胞」に含まれる。「多能性幹細胞」は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞又は組織内幹細胞から得られる。体細胞に数種類の遺伝子を導入することにより、胚性幹細胞に似た多能性を人工的に持たせた細胞（人工多能性幹細胞とも呼ばれる）も「多能性幹細胞」に含まれる。多能性幹細胞は、自体公知の方法で作製することが可能である。作製方法としては、例えばＣｅｌｌ，２００７，１３１（５） ｐｐ．８６１−８７２や、Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４） ｐｐ．６６３−６７６に記載される方法が挙げられる。
【００２２】
本発明における「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」とは、自己複製能を有し、多分化能（特に、多能性「ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ」）を有する幹細胞であり、初期胚に由来する多能性幹細胞をいう。胚性幹細胞は、１９８１年に初めて樹立され、１９８９年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。１９９８年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。
【００２３】
本発明における「人工多能性幹細胞」とは、繊維芽細胞等分化した細胞をＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ等の数種類の遺伝子の発現により直接初期化するなどして多分化能を誘導した細胞である。２００６年、山中らによりマウス細胞で人工多能性幹細胞が樹立された（Ｃｅｌｌ，２００６，１２６（４） ｐｐ．６６３−６７６）。人工多能性幹細胞は、２００７年にヒト繊維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多分化能を有する（Ｃｅｌｌ，２００７，１３１（５） ｐｐ．８６１−８７２；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，３１８（５８５８） ｐｐ．１９１７−１９２０；Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００８，２６（１） ｐｐ．１０１−１０６）。
【００２４】
遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
【００２５】
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離されたゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
【００２６】
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）やＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）やＵｎｉｖｅｒｓａｌ  ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ  Ｋｉｔｓ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ製）などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することもできる。
【００２７】
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）；バイオマニュアルシリーズ８，ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（１９９５）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリＡ選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
【００２８】
本発明における「凝集体」とは、培地中に分散していた細胞が集合して形成した塊をいう。本発明における「凝集体」には、浮遊培養開始時に分散していた細胞が形成した凝集体と浮遊培養開始時に既に形成されていた凝集体とが含まれる。
「凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで質的に均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。
本発明においては、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させることが好ましい。このように多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。
凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（９６穴プレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することで細胞を凝集させる方法が挙げられる。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことや、凝集体を形成する各細胞において上皮様構造が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
【００２９】
本発明における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
【００３０】
本発明における「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、これらの前駆細胞、または網膜前駆細胞などの細胞が、少なくとも複数種類、層状で立体的に配列した網膜組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現有無若しくはその程度等により確認できる。
【００３１】
本発明における「網膜層」とは、網膜を構成する各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層、視細胞層、外境界膜、外顆粒層、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜を挙げることができる。
【００３２】
本発明における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞、色素上皮細胞、杆体細胞及び錐体細胞を挙げることができる。
【００３３】
本発明における「網膜色素上皮細胞」とは生体網膜において神経網膜組織の外側に存在する上皮細胞を意味する。網膜色素上皮細胞であるかは、当業者であれば、例えば細胞マーカー（RPE65（色素上皮細胞）、Mitf（色素上皮細胞）など）の発現や、メラニン顆粒の存在、多角形の特徴的な細胞形態などにより確認できる。
【００３４】
本発明における「網膜前駆細胞」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞のいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、網膜節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、網膜節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。
【００３５】
網膜細胞マーカーとしては、網膜前駆細胞で発現するＲａｘ及びＰＡＸ６，視床下部ニューロンの前駆細胞では発現するが網膜前駆細胞では発現しないＮｋｘ２．１、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないＳｏｘ１、視細胞の前駆細胞で発現するＣｒｘなどが挙げられる。網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するＣｈｘ１０及びＬ７、節細胞で発現するＴｕｊ１及びＢｒｎ３、アマクリン細胞で発現するＣａｌｒｅｔｉｎｉｎ、水平細胞で発現するＣａｌｂｉｎｄｉｎ、視細胞で発現するＲｈｏｄｏｐｓｉｎ及びＲｅｃｏｖｅｒｉｎ、色素上皮細胞で発現するＲＰＥ６５及びＭｉｔｆ、杆体細胞で発現するＮｒｌ、錐体細胞で発現するＲｘｒ−ｇａｍｍａなどが挙げられる。
【００３６】
本発明製造方法１は、下記工程（１）、（２）及び（３）を含む網膜色素上皮細胞の製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、及び
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程。
【００３７】
多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる工程（１）について説明する。
【００３８】
工程（１）において用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質及びＷｎｔシグナル経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１−モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
工程（１）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
【００３９】
工程（１）における多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば９６穴マイクロウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約１×１０３から約1×１０５細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０４細胞、より好ましくは約５×１０３から約３×１０４細胞、最も好ましくは約１．２×１０４細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
【００４０】
凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。例えば、ヒトＥＳ細胞の場合には、好ましくは約２４時間以内、より好ましくは約１２時間以内に凝集体を形成させる。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
【００４１】
工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程（２）について説明する。
【００４２】
工程（２）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されておらずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地であり、基底膜標品を添加する必要は無い。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＩＭＤＭとＦ−１２の１：１の混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ１−モノチオグリセロール及び１ｘＣｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのＫＳＲの添加量としては、例えばヒトＥＳ細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
工程（２）で用いられる無血清培地は、工程（１）で用いた無血清培地がソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない限り、当該培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。工程（１）で用いた無血清培地をそのまま工程（２）に用いる場合、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
【００４３】
ソニック・ヘッジホッグ（以下、Ｓｈｈと記すことがある。）シグナル伝達経路作用物質とは、Ｓｈｈにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｓｈｈシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｓｈｈ）、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト、Ｐｕｒｍｏｒｐｈａｍｉｎｅ、又はＳＡＧなどが挙げられる。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
【００４４】
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質とは、ＢＭＰにより媒介されるシグナル伝達経路を増強し得る物質である。ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。ＢＭＰ２タンパク質、ＢＭＰ４タンパク質及びＢＭＰ７タンパク質は例えばＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから、ＧＤＦ７タンパク質は例えば和光純薬から入手可能である。
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＢＭＰ４の場合は、約０．０１nMから約１μM、好ましくは約０．１nMから約１００nM、より好ましくは約１．５nMの濃度となるように培地に添加する。
【００４５】
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（１）の浮遊培養開始から約２４時間後以降に添加されていればよく、浮遊培養開始後数日以内（例えば、１５日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後１日目から１５日目までの間、より好ましくは１日目から９日目までの間、最も好ましくは３日目に培地に添加する。
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。これにより、培地に掛かる経費を抑えることができる。網膜細胞への分化誘導が開始された細胞は、例えば、当該細胞におけるＲaｘ遺伝子の発現を検出することにより確認することができる。ＧＦＰ等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がＲaｘ遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を工程（１）で用いて形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。工程（２）の実施態様の一つとして、工程（１）で形成された凝集体を、Ｒaｘ遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含みソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
【００４６】
工程（２）における培養温度、ＣＯ２濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約３０℃から約４０℃、好ましくは約３７℃である。またＣＯ２濃度は、例えば約１％から約１０％、好ましくは約５％である。
【００４７】
網膜前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるＲaｘ又はＰＡＸ６を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。
【００４８】
工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る工程（３）について説明する。
【００４９】
工程（３）において用いられる培地は、例えば、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質がいずれも添加されておらずWntシグナル経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地である。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質がいずれも添加されていない」培地には、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地としては、上述したような培地を挙げることができる。好ましくは、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地等の基礎培地に、Ｎ２ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）またはＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等の神経栄養因子混合物が添加され、ＫＳＲが添加されていない無血清培地を挙げることができる。
【００５０】
Ｗｎｔシグナル経路作用物質とは、Ｗｎｔにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Ｗｎｔシグナル経路作用物質としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ）、Ｗｎｔ受容体アゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）などが挙げられる。
Ｗｎｔシグナル経路作用物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約３μＭの濃度で添加する。
Ｗｎｔシグナル経路作用物質は、例えばヒトＥＳ細胞を用いる場合、工程（１）の浮遊培養開始から１２日目以降、好ましくは１８日目に添加する。
【００５１】
工程（３）において、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質とＦＧＦシグナル経路阻害物質とを含む無血清培地又は血清培地中で凝集体を培養することがより好ましい。
【００５２】
ＦＧＦシグナル経路阻害物質とは、ＦＧＦにより媒介されるシグナルを阻害し得る物質である。ＦＧＦシグナル経路阻害物質としては、例えば、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＳＵ−５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８）、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害物質（例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤などが挙げられる。
工程（３）で用いられるＦＧＦシグナル経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばＳＵ−５４０２場合、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１０μＭの濃度で添加する。
【００５３】
このようにして製造された網膜色素上皮細胞は凝集体の表面に存在するため、顕微鏡観察等で確認が可能である。網膜色素上皮細胞が存在する凝集体を、例えば分散処理（例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ処理）し、得られた細胞をＦＡＣＳを用いて選別することにより、高純度な網膜色素上皮細胞を得ることも可能である。ピンセット等を用いて、凝集体から物理的に網膜色素上皮細胞を切り出し、培養することも可能である。分散または切り出した網膜色素上皮細胞は接着条件下で培養することができる。網膜色素上皮細胞を含む凝集体を微量分注器によるピペッティング操作等によって破砕し、得られた細胞を接着条件下で培養することもできる。接着培養する場合、細胞接着性の培養器、例えば細胞外マトリクス等（例えば、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン）によりコーティング処理された培養器を使用することが好ましい。接着培養における培養温度、ＣＯ２濃度、Ｏ２濃度等の培養条件は、適宜決定できる。この際、血清、既知の増殖因子や増殖を促進する添加剤や化学物質の存在下で培養してもよい。既知の増殖因子としては、例えばＥＧＦ、ＦＧＦなどをあげることができる。増殖を促進する添加剤としてＮ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）やＢ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）などをあげることができる。
【００５４】
本発明製造方法２は、下記工程（１）、（２）、（３）及び（４）を含む網膜色素上皮細胞シートの製造方法である：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）工程（１）で形成された凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質を含まずＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程、
（３）工程（２）で得られた凝集体を、ソニック・ヘッジホッグシグナル伝達経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を含まずＷｎｔシグナル経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜色素上皮細胞を含む凝集体を得る第三工程、及び
（４）工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する第四工程。
【００５５】
本発明製造方法２の工程（１）、工程（２）及び工程（３）は、本発明製造方法１の工程（１）、工程（２）及び工程（３）と同様に実施することができる。
【００５６】
工程（３）で得られた凝集体を分散し、得られた細胞を接着培養する工程（４）について説明する。
【００５７】
工程（４）は、工程（３）の実施開始から６０日以内、好ましくは３０日以内、より好ましくは３日後に実施する。
【００５８】
工程（４）において分散した凝集体由来細胞は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度となるよう接着培養容器に播種する。例えば６５ｍｍボイデンチャンバーを用いて凝集体由来細胞を接着培養する場合、１ウェルあたり約１×１０３から約１×１０７細胞、好ましくは約３×１０３から約５×１０６細胞、より好ましくは約５×１０３から約１×１０６細胞、さらに好ましくは約２×１０５細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体由来細胞を接着させ培養する。
【００５９】
工程（４）における接着培養に用いられる無血清培地又は血清培地としては、上述したような培地を挙げることができる。調製の煩雑さ回避するには、市販のＫＳＲ等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２とＮｅｕｒｏｂａｓａｌの１：１混合液に１／２ｘ Ｎ２サプリメント、１／２ｘ Ｂ２７サプリメント及び１００μＭ  ２−メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へ添加されるＫＳＲの濃度としては、例えばヒトＥＳ細胞由来細胞の場合は、通常約１％から約２０％であり、好ましくは約２％から約２０％である。
【００６０】
工程（４）において、ＲＯＣＫ阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養することが好ましい。
【００６１】
ＲＯＣＫ阻害物質とは、Ｒｈｏキナーゼにより媒介されるシグナルを阻害し得る物質である。ＲＯＣＫ阻害物質としては、例えば、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌが挙げられる。
工程（４）で用いられるＲＯＣＫ阻害物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＹ−２７６３２の場合、約０．０１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約２０μＭの濃度となるように添加する。
【００６２】
工程（４）において、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１以上の物質を更に含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養することがより好ましい。
【００６３】
Ｗｎｔシグナル経路作用物質としては、例えば、Ｗｎｔファミリーに属するタンパク質（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ）、Ｗｎｔ受容体アゴニスト、ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、６−Ｂｒｏｍｏｉｎｄｉｒｕｂｉｎ−３’−ｏｘｉｍｅ（ＢＩＯ）、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）が挙げられる。
工程（４）で用いられるＷｎｔシグナル経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＣＨＩＲ９９０２１の場合には、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約３μＭの濃度となるように添加する。
Ｗｎｔシグナル経路作用物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
【００６４】
ＦＧＦシグナル経路阻害物質としては、例えば、ＦＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体阻害剤（例えば、ＳＵ−５４０２、ＡＺＤ４５４７、ＢＧＪ３９８）、ＭＡＰキナーゼカスケード阻害物質（例えば、ＭＥＫ阻害剤、ＭＡＰＫ阻害剤、ＥＲＫ阻害剤）、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ａｋｔ阻害剤が挙げられる。
工程（４）で用いられるＦＧＦシグナル経路阻害物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＳＵ−５４０２の場合、約０．１μＭから約１００μＭ、好ましくは約１μＭから約３０μＭ、より好ましくは約１０μＭの濃度となるように添加する。
ＦＧＦシグナル経路阻害物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
【００６５】
Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質とは、Ａｃｔｉｖｉｎにより媒介されるシグナルを増強し得る物質である。Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質としては、例えば、Ａｃｔｉｖｉｎファミリーに属するタンパク質（例えば、Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ，Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｂ，Ａｃｔｉｖｉｎ  Ｃ，Ａｃｔｉｖｉｎ  ＡＢなど）、Ａｃｔｉｖｉｎ受容体、Ａｃｔｉｖｉｎ受容体アゴニストが挙げられる。
工程（４）で用いられるＡｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社  ＃３３８−ＡＣ）の場合、約１ｎｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌから約１μｇ／ｍｌ、より好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度となるように添加する。
Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
【００６６】
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質としては、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４もしくはＢＭＰ７等のＢＭＰタンパク質、ＧＤＦ７等のＧＤＦタンパク質、抗ＢＭＰ受容体抗体、又は、ＢＭＰ部分ペプチドなどが挙げられる。
工程（４）で用いられるＢＭＰシグナル伝達経路作用物質の濃度は、網膜色素上皮細胞の均一なシートを効率的に形成させることができる濃度であればよい。例えばＢＭＰ４の場合は、約０．０１ｎＭから約１μＭ、好ましくは約０．１ｎＭから約１００ｎＭ、より好ましくは約１．５ｎＭの濃度となるように培地に添加する。
ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質は、工程（４）の開始から例えば１８日以内、好ましくは６日目に添加する。
【００６７】
工程（４）において、例えば、Ｗｎｔシグナル経路作用物質、ＦＧＦシグナル経路阻害物質、Ａｃｔｉｖｉｎシグナル経路作用物質及びＢＭＰシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる１種類の物質を更に含む無血清培地又は血清培地、又は、Ｗｎｔシグナル経路作用物質とＦＧＦシグナル経路阻害物質とを更に含む無血清培地又は血清培地中で細胞を培養する。
【００６８】
工程（４）において、培養基質で表面処理された培養器材上で接着培養を行うことが好ましい。
工程（４）における培養器材の処理に用いられる培養基質としては、凝集体由来細胞の接着培養と網膜色素上皮シートの形成を可能とする細胞培養基質が挙げられる。調製の煩雑さを回避し異種由来成分の混入を防止するためには、合成培養基質、ヒト由来基底膜成分、または組換えヒト型基底膜タンパク質等を用いることが好ましい。かかる培養基質として、具体的には、シンセマックスＴＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）等の合成培養基質、ＣｅｌｌｓｔａｒｔＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）若しくはヒト細胞外基質（ＢＤ社）等のヒト由来基底膜成分、または、ヒト組換えラミニン１１１（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン５１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン５２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン４１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン４２１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）、ヒト組換えラミニン３３２（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）若しくはヒト組換えラミニン２１１（ＢｉｏＬａｍｉｎａ社）等の組換えヒトラミニンがあげられる。ここで、ラミニン１１１とは、α１鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン５１１とは、α５鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン５２１とは、α５鎖、β２鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン４１１とは、α４鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン４２１とは、α４鎖、β２鎖及びγ１鎖から成るラミニンであり、ラミニン３３２とは、α３鎖、β３鎖及びγ２鎖から成るラミニンであり、ラミニン２１１とは、α２鎖、β１鎖及びγ１鎖から成るラミニンである。さらに、ラミニンのα鎖、β鎖及びγ鎖それぞれのＣ末端領域から構成されるＥ８フラグメントと称する部分も細胞が発現するインテグリンに対して結合活性を示すことが知られている（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８４，７８２０−７８３１（２００９））ので上記のラミニンと同様に使用できることが期待される。
【００６９】
本発明製造方法１または２により製造された網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートは、生体の網膜色素上皮細胞に極めて類似した特徴を有しているので、網膜細胞の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニング、その他の原因による細胞損傷状態における治療薬に対しての細胞治療用移植用材料や疾患研究材料、創薬材料として利用可能である。また化学物質等の毒性・薬効評価においても、光毒性等の毒性研究、毒性試験等に活用可能である。
網膜細胞の障害に基づく疾患としては、例えば、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、緑内障、糖尿病性網膜症、新生児網膜症、などが挙げられる。
【００７０】
本発明製造方法１または２により製造された網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートは、細胞損傷状態において、当該細胞や、障害を受けた組織自体を補充する（例えば、移植手術に用いる）ためなどに用いる移植用網膜色素上皮細胞として用いることができる。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７２】
実施例１：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養し、顕微鏡観察を実施した。
浮遊培養開始１８日目では、神経上皮の形成が確認された（図１Ａ）。浮遊培養開始２１日目には、上皮の厚さが薄い網膜色素上皮細胞へと分化した細胞が確認された（図１Ｂ）。【００７３】
実施例２：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで浮遊培養した。対照として、ＣＨＩＲ９９０２１非存在下でも同様に凝集体を培養した。ＣＨＩＲ９９０２１を含む前記培地で浮遊培養した凝集体の一部は浮遊培養開始２７日目まで同じ培地条件で浮遊培養し、他の一部については、浮遊培養開始２１日目から、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）と１０μＭ  ＳＵ−５４０２（ＦＧＦシグナル経路阻害物質）とを含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地にて３７℃、５％  ＣＯ２で浮遊培養開始２７日目まで浮遊培養した。
培養２１日目からＷｎｔシグナル経路作用物質非存在下で培養した凝集体では、上皮の厚さが薄い網膜色素上皮から厚みのある神経上皮へと戻っていたのに対し（図２Ａ）、Ｗｎｔシグナル経路作用物質存在下での培養を継続した凝集体では、ほぼ全ての凝集体の表面において黒色を呈する網膜色素上皮細胞が出現した（図２Ｂ）。Ｗｎｔシグナル経路作用物質とＦＧＦシグナル経路阻害物質の存在下で培養した凝集体では、分化誘導の効率が増大し、凝集体表面のほぼ全面が網膜色素上皮細胞である凝集体が形成された（図２Ｃ）。【００７４】
実施例３：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞の製造
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に倣って培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで浮遊培養した。浮遊培養開始２１日目に凝集体を微量分注器による溶液の出し入れによって破砕し、得られた細胞を、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地により３７℃、５％  ＣＯ２で接着培養した。
浮遊培養開始から２７日目には特徴的な多角形の細胞形態を有する網膜色素上皮細胞が観察された（図３Ａ）。細胞染色法によりタンパク質の発現を確認したところ、網膜色素上皮細胞マーカーである転写因子Ｍｉｔｆ陽性（図３Ｂ）および密着結合マーカーであるＺＯ−１陽性（図３Ｃ）であり、得られた細胞が網膜色素上皮細胞であることが確認された。【００７５】
実施例４：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、単一分散されたＥＳ細胞を非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養した。浮遊培養開始２１日目に、細胞分散液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ社）を用いて凝集体を分散し、４０μｍ  セルストレイナーでデブリを除去した。得られた細胞を１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、１／２  Ｎ２サプリメント、１／２  Ｂ２７サプリメント、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁して、シンセマックスＴＭでコーティング処理を行った６５ｍｍ  ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）に播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して、３７℃、５％  ＣＯ２で接着培養を実施した。培地交換を３日に一度実施し、浮遊培養開始から４０日目に上皮の形成の程度を顕微鏡により観察した。
浮遊培養開始から４０日目には、特徴的な多角形の細胞形態を有し（図４Ｂ）、色素が蓄積した一様な網膜色素上皮細胞のシートが形成された（図４Ａ）。【００７６】
実施例５：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造
ヒトＥＳ細胞（ＫｈＥＳ−１由来）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に準じて培養した。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いた。培養された前記ＥＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散し、培養された前記ＥＳ細胞を、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で培養した。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を３日おきに、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養した。浮遊培養開始２１日目に、細胞分散液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ社）を用いて凝集体を分散し、４０μｍ  セルストレイナーでデブリを除去した。得られた細胞を１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、１／２  Ｎ２サプリメント、１／２  Ｂ２７サプリメント、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁し、シンセマックスＴＭでコーティング処理を行った６５ｍｍ  ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）に播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して３７℃、５％  ＣＯ２で接着培養を実施した。浮遊培養開始から２４日目、すなわち接着培養開始から３日目に、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を添加、１０μＭ  ＳＵ−５４０２を添加、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１と１０μＭ  ＳＵ−５４０２とを同時添加、１ｎＭ  組換えヒトＢＭＰ４タンパク質を添加、または、５０ｎｇ／ｍｌ  組換えヒトアクチビンを添加し、接着培養を継続した。前記物質を添加しない条件でも同様に培養した。培地交換を３日に一度実施し、浮遊培養開始から４０日目に上皮の形成の程度を顕微鏡により観察した。
浮遊培養開始から２４日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を添加（図５Ｂ）した場合、無添加のコントロール（図５Ａ）と比較して黒色のより濃い網膜色素上皮細胞へと分化した。３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１と１０μＭ  ＳＵ−５４０２との同時添加（図５Ｄ）では、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１単独の添加（図５Ｂ）よりもさらに濃く着色した色素上皮が得られた。１ｎＭ  組換えヒトＢＭＰ４タンパク質を添加（図５Ｅ）、または５０ｎｇ／ｍｌ  組換えヒトアクチビンを添加（図５Ｆ）した場合はそれぞれ、無添加のコントロール（図５Ａ）と比較してより均一な上皮が得られた。【００７７】
実施例６：ヒトＥＳ細胞を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造
６５ｍｍ  ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）のウェルに、３０倍に希釈したグロースファクターリデュースドマトリゲルＴＭ、又は、４０倍に希釈したシンセマックスＴＭ（コーニング）の何れかを各１００μｌ添加し、上記マトリゲルを添加したチャンバーについては４℃で２４時間、上記シンセマックスＴＭを添加したチャンバーについては室温で２時間、それぞれ保温することにより、培養器材のコーティング処理を実施した。実施例４に記載の方法で浮遊培養開始２１日目の凝集体から単細胞の懸濁液を調製し、上記各条件でコーティングしたウェルに１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、１／２  Ｎ２サプリメント、１／２  Ｂ２７サプリメント、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁した細胞を播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して３７℃、５％  ＣＯ２で接着培養を実施した。ボイデンチャンバーへの播種から５日目に細胞の接着と上皮形成を観察した。
シンセマックスＴＭ（図６Ｂ）でコーティングした培養器材では、基底膜標品であるマトリゲルをコーティングした培養器材（図６Ａ）においてと同様に、培養した凝集体由来細胞が接着し、細胞同士が密接した網膜色素上皮様の形態が観察された。【００７８】
実施例７：人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた網膜色素上皮細胞の製造例
ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター又はｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から入手可能）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に準じて培養する。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いる。培養された前記ｉＰＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で浮遊培養する。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いる。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続する。ウェル内の培養液の半量を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に３日おきに交換する。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養する。浮遊培養開始２１日目に凝集体を微量分注器による溶液の出し入れによって破砕し 、得られた細胞を、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｗｎｔシグナル経路作用物質）を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘＮ２サプリメントを添加した無血清培地により３７℃、５％ＣＯ２で接着培養する。浮遊培養開始から２７日目に、顕微鏡による細胞形態の観察および細胞染色法による網膜色素上皮マーカー遺伝子（Ｍｉｔｆ、ＺＯ−１）の発現の確認を行う。
このようにして、ヒトｉＰＳ細胞から網膜色素上皮細胞を製造する。【００７９】
実施例８：人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を用いた網膜色素上皮細胞シートの製造例
ヒトｉＰＳ細胞株２０１Ｂ７（独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンター又はｉＰＳアカデミアジャパン株式会社から入手可能）を「Ｕｅｎｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ  ２００６，１０３（２５），９５５４−９５５９」、「Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２００７，２５，６８１−６８６」に記載の方法に準じて培養する。培地にはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ）に２０％  ＫＳＲ（ＫｎｏｃｋｏｕｔＴＭ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｘ  非必須アミノ酸、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを添加した培地を用いる。培養された前記ｉＰＳ細胞を、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単一分散した後、非細胞接着性の９６穴培養プレート（スミロン  スフェロイド  プレート，住友ベークライト社）の１ウェルあたり１．２×１０４細胞になるように１００μｌの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、３７℃、５％  ＣＯ２で浮遊培養する。その際の無血清培地には、Ｆ−１２培地とＩＭＤＭ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、４５０μＭ  １−モノチオグリセロール、１ｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地を用いる。浮遊培養開始３日目に終濃度１．５ｎＭのＢＭＰ４を添加して浮遊培養を継続する。ウェル内の培養液の半量を、ＢＭＰシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に３日おきに交換する。浮遊培養開始１８日目に３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地に１ｘ  Ｎ２サプリメントを添加した無血清培地へ凝集体を移し、浮遊培養開始２１日目まで培養する。浮遊培養開始２１日目に、細胞分散液Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＩＣＴ社）を用いて凝集体を分散し、４０μｍ  セルストレイナーでデブリを除去する。得られた細胞を１ウェルあたり２ｘ１０５細胞になるように、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地の１：１混合液に１０％  ＫＳＲ、１／２  Ｎ２サプリメント、１／２  Ｂ２７サプリメント、２０μＭ  Ｙ２７６３２を添加した無血清培地２００μｌに懸濁し、シンセマックスＴＭでコーティング処理を行った６５ｍｍ  ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ，コーニング）に播種し、同じ組成の培地１ｍｌを下部のウェルにも添加して３７℃、５％  ＣＯ２で接着培養を実施する。浮遊培養開始から２４日目、すなわち接着培養開始から３日目に、３μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ  ＳＵ−５４０２、１ｎＭ  組換えヒトＢＭＰ４タンパク質、５０ｎｇ／ｍｌ  組換えヒトアクチビンのいずれか、あるいはこれらを組み合わせて添加してもよい。培地交換を３日に一度実施し、浮遊培養開始から４０日目に上皮の形成の程度を顕微鏡により観察する。
このようにして、ヒトｉＰＳ細胞から網膜色素上皮細胞シートを製造する。【００８０】
本出願は、2013年11月11日付で日本国に出願された特願2013-232795を基礎としており、ここで言及することによりその内容は全て本明細書に包含される。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明の製造方法によれば、網膜色素上皮細胞または網膜色素上皮細胞シートを高効率に製造することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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