(57)【要約】  抗体が提供される。この抗体は、Ｆｃ領域およびＦａｂ領域を含み、（ｉ）前記Ｆｃ領域が２つの非同一の重鎖を含み、ただし、前記２つの非同一重鎖の少なくとも１つが、前記２つの非同一重鎖の間における相補を形成し、それにより、前記非同一重鎖のヘテロダイマーを形成する確率を増大させるように、かつ、同一重鎖のホモダイマーを形成する確率を低下させるようにアミノ酸修飾を含む；および（ｉｉ）前記Ｆａｂ領域が、前記Ｆａｂ領域の第１の重鎖と第１の軽鎖との間における第１の共有結合性連結、および、前記Ｆａｂ領域の第２の重鎖と第２の軽鎖との間における第２の共有結合性連結を含み、ただし、前記第１の重鎖に対する前記第１の共有結合性連結の位置が前記第２の重鎖に対する前記第２共有結合性連結の位置と異なる。かかる抗体を作製する方法、およびかかる抗体を使用する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ領域およびＦａｂ領域を含む抗体であって、
（ｉ）前記Ｆｃ領域が２つの非同一の重鎖を含み、ただし、前記２つの非同一重鎖の少なくとも１つが、前記２つの非同一重鎖の間における相補を形成し、それにより、前記非同一重鎖のヘテロダイマーを形成する確率を増大させるように、かつ、同一重鎖のホモダイマーを形成する確率を低下させるようにアミノ酸修飾を含む；および
（ｉｉ）前記Ｆａｂ領域が、前記Ｆａｂ領域の第１の重鎖と第１の軽鎖との間における第１の共有結合性連結、および、前記Ｆａｂ領域の第２の重鎖と第２の軽鎖との間における第２の共有結合性連結を含み、ただし、前記第１の重鎖に対する前記第１の共有結合性連結の位置が前記第２の重鎖に対する前記第２共有結合性連結の位置と異なる、
抗体。
【請求項２】
二重特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
非対称な単一特異性抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記相補は立体的相補を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記相補は電荷相補を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記Ｆｃ領域は、前記Ｆｃ領域の一方の重鎖の突出部、および、前記Ｆｃ領域の第２の重鎖における立体的代償空洞を含み、前記突出部は前記代償空洞の中に突き出る、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
前記突出部が、前記一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける１つの位置でのアミノ酸を、側鎖体積が元のアミノ酸よりも大きい別のアミノ酸により置換することによって生じる、請求項４に記載の抗体。
【請求項８】
前記代償空洞が、前記第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおける１つの位置でのアミノ酸を、側鎖体積が元のアミノ酸よりも小さい別のアミノ酸により置換することによって生じる、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記第１の共有結合性連結は、前記一方の重鎖のＣＨ１ドメインと、前記一方の軽鎖のＣＬドメインとの間に存在し、かつ、前記第２の共有結合性連結は、前記第２の重鎖のＶＨドメインと、前記第２の軽鎖のＶＬドメインとの間に存在する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記第１および第２の共有結合性連結はジスルフィド結合である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
側鎖体積が元のアミノ酸よりも大きい前記アミノ酸は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびトリプトファンからなる群から選択される、請求項７に記載の抗体。
【請求項１２】
側鎖体積が元のアミノ酸よりも小さい前記アミノ酸は、アラニン、グリシン、バリンおよびトレオニンからなる群から選択される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１３】
キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
前記第１の重鎖の前記ＣＨ３ドメインは前記第２の重鎖の前記ＣＨ３ドメインに共有結合により連結される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
前記抗体の第１の抗原結合部位が抗原の第１のエピトープと結合し、かつ、前記抗体の第２の抗原結合部位が前記抗原の第２のエピトープと結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１６】
前記抗体の第１の抗原結合部位が第１の抗原のエピトープと結合し、かつ、前記抗体の第２の抗原結合部位が第２の抗原のエピトープと結合する、請求項２に記載の抗体。
【請求項１７】
それぞれの軽鎖が、ただ１つだけのジスルフィド結合を介してその同族重鎖に連結される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
無傷の抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項１９】
前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項２０】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２１】
前記第１の重鎖はＴ３６６Ｗ変異を含み、かつ、前記第２の重鎖は、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
前記第１の重鎖はＳ３５４Ｃ変異を含み、かつ、前記第２の重鎖はＹ３４９Ｃ変異を含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
前記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、前記第２の抗原結合部位はｅｒｂＢ２と結合する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２４】
前記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、前記第２の抗原結合部位はシュードモナス菌体外毒素（ＰＥ）と結合する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２５】
前記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、前記第２の抗原結合部位はストレプトアビジンと結合する、請求項１６に記載の抗体。
【請求項２６】
前記重鎖の少なくとも１つが治療用成分と結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２７】
前記重鎖の少なくとも１つが、特定可能な成分と結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
霊長類抗体、ブタ抗体、ネズミ科抗体、ウシ抗体、ヤギ抗体およびウマ抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
（ａ）前記第１の重鎖をコードする第１の核酸分子を提供すること；
（ｂ）前記第２の重鎖をコードする第２の核酸分子を提供すること；
（ｃ）前記第１の軽鎖をコードする第３の核酸分子を提供すること；
（ｄ）前記第２の軽鎖をコードする第４の核酸分子を提供すること；
（ｅ）前記第１、第２、第３および第４の核酸分子を含む宿主細胞を、核酸分子の発現を可能にする条件のもとで培養すること、および
（ｆ）請求項１に記載の抗体を回収すること
を含む、請求項１に記載の抗体を調製する方法。
【請求項３０】
前記宿主細胞は細菌細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記宿主細胞は哺乳動物細胞を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記発現が前記細菌細胞の封入体で生じる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記核酸分子のそれぞれが、異なる宿主細胞にトランスフェクションされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸分子のそれぞれが、同じ宿主細胞にトランスフェクションされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記細菌細胞はグラム陰性細菌細胞を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
工程（ｆ）の後、前記抗体をプロテインＡ／Ｇ／Ｌで精製することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
活性な薬剤として、請求項１に記載の抗体を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項３８】
感染症あるいは炎症性の疾患または障害を処置するための請求項１に記載の抗体。
【請求項３９】
前記炎症性障害はガンである、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
感染症あるいは炎症性の疾患または障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、請求項１に記載の抗体の治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、前記感染症あるいは炎症性の疾患または障害を処置することを含む方法。
【請求項４１】
前記炎症性の疾患または障害はガンである、請求項４０に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、二重特異性抗体、単一特異性の非対称な抗体、および、それらの作製方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、それぞれの結合部位が異なる標的抗原に向けられ、これに対して同時に結合することができる２つの結合部位を有する抗体である（ＢａｅｕｅｒｌｅおよびＲｅｉｎｈａｒｄｔ、２００９）。この性質は、従来のモノクローナル抗体を用いた場合には不可能である治療戦略の開発を可能にする。二重特異性抗体の主な適用には、ａ）２つの標的（例えば、可溶性リガンドの受容体、受容体およびリガンド、または、２つの異なるリガンド）の同時阻害、ｂ）一方の結合特異性が標的細胞（通常の場合には腫瘍細胞）に向けられ、これに対して、他方の結合部位が、その標的細胞に対する毒性活性または毒性成分（Ｔ細胞またはＮＫ細胞；プロドラッグ活性化のための酵素；サイトカイン、放射性核種、ウイルス、毒素）を動員するために使用される再標的化、ｃ）両方の抗体アームの同時関与により媒介される強い結合が、両方の抗原を発現する細胞において生じ得るだけであるときの増大した特異性（ＦｉｓｃｈｅｒおよびＬｅｇｅｒ、２００７；Ａｍａｎｎ他、２００９；Ｌｕｔｔｅｒｂｕｅｓｅ他、２０１０）が含まれる。二重特異性抗体は有望な治療剤と見なされるので、いくつかの二重特異性様式がこれまでに開発されており、しかし、それらの有用性は、安定性および製造時の複雑性に関連する問題のために限定される。二重特異性抗体を作出するためのいくつかの戦略がこの２０年間にわたって提案されており、しかし、数多くの試みおよび様々な提案された抗体形式にもかかわらず、これらのＢｓＡｂは、製造物の均一性がないこと、および、困難な製造問題といった課題を抱えている（ＦｉｓｃｈｅｒおよびＬｅｇｅｒ、２００７；ＣｈａｍｅｓおよびＢａｔｙ、２００９）。
【０００３】
最初、二重特異性抗体を、異なる抗体をそれぞれが産生する２つのハイブリドーマを融合することによって製造するための様々な試みが行われたが、これらは、「クアドローマ」またはハイブリッドハイブリドーマと呼ばれるものをもたらした。しかしながら、クアドローマは遺伝的不安定性の問題があり、重鎖および軽鎖の不均一な混合物をもたらした。概して、Ｌ鎖のＨ鎖とのランダムな会合が２つの抗体に関して見出されたこと、また、ほんのわずかな割合が所望の二重特異性抗体であったことが見出された（Ｄｅ  Ｌａｕ他、１９９１；Ｍａｓｓｉｎｏ他、１９９７）。二重特異性抗体を２つの単一特異性抗体（ＡおよびＢ）から作出することを考えるならば、二重特異性抗体のＩｇＧ形式での効率的組立てでは、２つの基本的な必要条件が存在する。１つが、それぞれの重鎖が第２の抗体の重鎖と会合し（重鎖Ａが重鎖Ｂと会合し）、かつ、ホモ会合（Ａ＋Ａ、または、Ｂ＋Ｂ）が生じないことである。第２の必要条件が、それぞれの軽鎖がその同族重鎖と会合し（軽鎖Ａが重鎖Ａと会合し、かつ、軽鎖Ｂが重鎖Ａと会合せず、または、軽鎖Ａが重鎖Ｂと会合しない）ことである。クアドローマにおける抗体鎖のランダムな会合はそのような必要条件を満たすことができなった。
【０００４】
二重特異性抗体の効率的な作製が抗体工学における進歩によって可能となった。進歩した抗体工学は、新しい組換え抗体形式の作出、例えば、タンデム型単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のような抗体形式（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他、２００８）、ジアボディーのような抗体形式（ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ、１９９９）、タンデム型ジアボディーのような抗体形式（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ、２００９）、ツー・イン・ワン（ｔｗｏ−ｉｎ−ｏｎｅ）抗体のような抗体形式（Ｂｏｓｔｒｏｍ他、２００９）、および、二重可変ドメイン抗体のような抗体形式（Ｗｕ他、２００７）を可能にした。これらの新しい抗体形式は製造問題のいくつかを解決し、均一な調製物をもたらした。しかしながら、これらの足場体のほとんどは、それらの小さいサイズのために、不良な薬物動態学に悩まされ、したがって、半減期を改善するために、頻繁な服用、または、より大きいキャリア分子へのコンジュゲート化を必要とする（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｏｕ他、２００９）。
【０００５】
Ｒｉｄｇｗａｙ他（１９９６）は、ＩｇＧに基づく二重特異性抗体を再検討することを技術的に実行可能にする、二重特異性抗体を作製するための２つの基準の一方に対する解決法を提供した。Ｒｉｄｇｗａｙ他（１９９６）には、「抗体Ａおよび抗体Ｂ」の重鎖の間におけるヘテロダイマー化のみが形成することを可能とし、ホモダイマー化を許さない“ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ”と称される工学的方法が記載されている。重鎖会合のための規則を調べている間に、著者らは、重鎖会合が主として、２つの重鎖のＣＨ３ドメインの間における界面相互作用に依存していることを仮定した。タンパク質のドメインまたはサブドメインが相互作用するとき、ｋｎｏｂ（こぶ）は、向かい合ったドメインの中に突き出る嵩高い側鎖であり、このドメインにおいて、ｋｎｏｂは、そのような侵入を可能にする小さい側鎖と連係する。著者らの方法では、ｋｎｏｂ変化体およびｈｏｌｅ（穴）変化体は、ｋｎｏｂが相手方のＣＨ３ドメインにおける適切に設計されたｈｏｌｅの中に入り込むことによってヘテロダイマー化することが予想された。ｋｎｏｂは、小さい側鎖を最大の側鎖（チロシンまたはトリプトファン）で置換することによって構築された。サイズがｋｎｏｂと同一であるか、または、ｋｎｏｂとほぼ同等のサイズのｈｏｌｅが、大きい側鎖をそれよりも小さい側鎖（この場合にはアラニンまたはトレオニン）で置換することによって作出された。このように、ｋｎｏｂ変化体である２つの重鎖は、側鎖が衝突するためにホモ会合することができず、また、２つのｈｏｌｅ変化体のホモ会合は、安定化させる側鎖相互作用がないためにそれほど有利でない。続いて、このグループは、組み立てられた二重特異性抗体をさらに安定化するために、ＣＨ３ドメインのｃ末端近くのジスルフィド結合を操作した（Ｍｅｒｃｈａｎｔ他、１９９８）。
【０００６】
米国特許第７１８３０７６号は、このようなｋｎｏｂ−ａｎｄ−ｈｏｌｅ法を使用して二機能性抗体を作製する方法を教示する。
【０００７】
しかしながら、上記ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ法は、重鎖のヘテロ会合のためだけの解決法を提供しただけで、それぞれの重鎖がその同族軽鎖と正しく対形成するための解決法を提供しなかった。したがって、その研究では、ヒト受容体のＨＥＲ３およびｃＭｐＩに同時に結合することができる二重特異性ＩｇＧが、共通の軽鎖およびその対応する様々なリモデリングされた重鎖を共発現させ、その後、プロテインＡクロマトグラフィーを行うことによって調製された。これらの操作された重鎖は、抗ＨＥＲ２抗体を用いて明らかにされるように抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を支援するその能力を保持する（Ｍｅｒｃｈａｎｔ他、１９９８）。
【０００８】
国際特許出願２０１０／１１５５８９は、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ型の変異を有する単一特異性ＩｇＧに対して、第２の特異性のＶＨおよびＶＬが２つのＣＨ３ドメインのＣ末端において融合される三価の二重特異性抗体を教示する。
【０００９】
類似する分子が米国特許出願公開ＵＳ２０１０／０２５６３４０に記載される。
【００１０】
ジスルフィド安定化Ｆｖが、最初、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎのグループによって記載され（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ他、１９９０）、その後、Ｉｒａ  Ｐａｓｔａｎのグループによって記載された（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ他、１９９３；Ｒｅｉｔｅｒ他、１９９４ａ；Ｒｅｉｔｅｒ他、１９９４ｂ；Ｒｅｉｔｅｒ他、１９９５）。ＰａｓｔａｎのグループはｄｓＦｖに関する広範囲の研究を行い、分子モデリングを使用して、ＣＤＲから離れた距離にあり、かつ、ＶＨおよびＶＬの不安定なヘテロダイマーが構造的に保存されたフレームワーク位置の間に挿入される操作された鎖間ジスルフィド結合によって安定化される、組換えＦｖフラグメントを作製するために使用できる可能性がある、抗体Ｆｖフラグメント（Ｆｖ）の保存されたフレームワーク領域における位置を特定した。ジスルフィド結合がこれらの位置の１つにおいて導入され、ＶＨ４４−ＶＬ１０５またはＶＨ１１１−ＶＬ４８が、完全な結合および特異性を保持する様々なＦｖを安定化することが示された。
【００１１】
米国特許第５７４７６５４号、同第６１４７２０３号および同第６５５８６７２号は、Ｆｖを操作してさらなるジスルフィド結合を軽鎖と重鎖との間に導入する、ジスルフィド安定化Ｆｖを教示する。
【００１２】
追加の背景技術としては、以下のものが挙げられる：
Ｊａｃｋｍａｎ他，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ  ２８５，Ｎｏ．２７，ｐｐ．２０８５０−２０８５９，Ｊｕｌｙ  ２，  ２０１０  ａｎｄ  Ｓｃｈａｅｆｅｒ他，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１１  Ｊｕｌｙ  ５；１０８（２７）：１１１８７−１１１９２．
【発明の概要】
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、
（ｉ）Ｆｃ領域が２つの非同一の重鎖を含み、ただし、これら２つの非同一重鎖の少なくとも１つが、これら２つの非同一重鎖の間における相補を形成し、それにより、これら非同一重鎖のヘテロダイマーを形成する確率を増大させるように、かつ、同一重鎖のホモダイマーを形成する確率を低下させるようにアミノ酸修飾を含む；および
（ｉｉ）Ｆａｂ領域が、Ｆａｂ領域の第１の重鎖と第１の軽鎖との間における第１の共有結合性連結、および、Ｆａｂ領域の第２の重鎖と第２の軽鎖との間における第２の共有結合性連結を含み、ただし、第１の重鎖に対する第１の共有結合性連結の位置が第２の重鎖に対する第２共有結合性連結の位置と異なる、
Ｆｃ領域およびＦａｂ領域を含む抗体が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、
（ａ）第１の重鎖をコードする第１の核酸分子を提供すること；
（ｂ）第２の重鎖をコードする第２の核酸分子を提供すること；
（ｃ）第１の軽鎖をコードする第３の核酸分子を提供すること；
（ｄ）第２の軽鎖をコードする第４の核酸分子を提供すること；
（ｅ）第１、第２、第３および第４の核酸分子を含む宿主細胞を、核酸分子の発現を可能にする条件のもとで培養すること、および
（ｆ）抗体を回収すること
を含む、抗体を調製する方法が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、活性な薬剤として、本明細書中に開示される抗体を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、感染症あるいは炎症性の疾患または障害を処置するための抗体が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の一局面によれば、感染症あるいは炎症性の疾患または障害をその必要性のある対象において処置する方法であって、本明細書中に開示される抗体の治療効果的な量を前記対象に投与し、それにより、前記感染症あるいは炎症性の疾患または障害を処置することを含む方法が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は二重特異性抗体である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は非対称な単一特異性抗体である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記相補は立体的相補を含む。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記相補は電荷相補を含む。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域の一方の重鎖の突出部、および、Ｆｃ領域の第２の重鎖における立体的代償空洞を含み、ただし、この場合、突出部は代償空洞の中に突き出る。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記突出部が、上記一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける１つの位置でのアミノ酸を、側鎖体積が元のアミノ酸よりも大きい別のアミノ酸により置換することによって生じる。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記代償空洞が、第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおける１つの位置でのアミノ酸を、側鎖体積が元のアミノ酸よりも小さい別のアミノ酸により置換することによって生じる。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の共有結合性連結は、上記一方の重鎖のＣＨ１ドメインと、上記一方の軽鎖のＣＬドメインとの間に存在し、かつ、上記第２の共有結合性連結は、上記第２の重鎖のＶＨドメインと、上記第２の軽鎖のＶＬドメインとの間に存在する。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１および第２の共有結合性連結はジスルフィド結合である。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、側鎖体積が元のアミノ酸よりも大きい上記アミノ酸は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびトリプトファンからなる群から選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、側鎖体積が元のアミノ酸よりも小さい上記アミノ酸は、アラニン、グリシン、バリンおよびトレオニンからなる群から選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の重鎖の上記ＣＨ３ドメインは上記第２の重鎖の上記ＣＨ３ドメインに共有結合により連結される。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体の第１の抗原結合部位が抗原の第１のエピトープと結合し、かつ、上記抗体の第２の抗原結合部位が前記抗原の第２のエピトープと結合する。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体の第１の抗原結合部位が第１の抗原のエピトープと結合し、かつ、上記抗体の第２の抗原結合部位が第２の抗原のエピトープと結合する。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、それぞれの軽鎖が、ただ１つだけのジスルフィド結合を介してその同族重鎖に連結される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は無傷の抗体である。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧからなる群から選択される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の重鎖はＴ３６６Ｗ変異を含み、かつ、上記第２の重鎖は、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の重鎖はＳ３５４Ｃ変異を含み、かつ、上記第２の重鎖はＹ３４９Ｃ変異を含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、上記第２の抗原結合部位はｅｒｂＢ２と結合する。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、上記第２の抗原結合部位はシュードモナス菌体外毒素（ＰＥ）と結合する。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、上記第２の抗原結合部位はストレプトアビジンと結合する。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記重鎖の少なくとも１つが治療用成分と結合する。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記重鎖の少なくとも１つが、特定可能な成分と結合する。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記抗体は、霊長類抗体、ブタ抗体、ネズミ科抗体、ウシ抗体、ヤギ抗体およびウマ抗体からなる群から選択される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記宿主細胞としては細菌細胞が含まれる。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記宿主細胞としては哺乳動物細胞が含まれる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記発現が上記細菌細胞の封入体で生じる。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記核酸分子のそれぞれが、異なる宿主細胞にトランスフェクションされる。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記核酸分子のそれぞれが、同じ宿主細胞にトランスフェクションされる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細菌細胞としてはグラム陰性細菌細胞が含まれる。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記方法はさらに、工程（ｆ）の後、上記抗体をプロテインＡ／Ｇ／Ｌで精製することを含む。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記炎症性障害はガンである。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記炎症性の疾患または障害はガンである。
【００５４】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５６】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ〜図１Ｂは、二重特異性抗体を製造するための新規な戦略の概略構造である。（Ａ）ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ法によって製造されるＩｇＧ抗体のスキーム。共通の軽鎖のほかに２つの異なる重鎖が存在する。（Ｂ）本発明の実施形態に従って調製される二重特異性抗体のスキーム。２つの異なる重鎖が存在し、それぞれがその同族軽鎖に対して対形成する。“ｋｎｏｂ”変異はＴ３６６Ｗに対応し、“ｈｏｌｅ”変異は、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｌ３６８Ａ置換、Ｙ４０７Ｖ置換に対応する。“ｋｎｏｂ”重鎖または“ｈｏｌｅ”重鎖のＣＨ３領域におけるシステイン置換変異のＳ３５４ＣおよびＹ３４９Ｃにより、９５％のヘテロダイマー化がそれぞれもたらされる（Ｍｅｒｃｈａｎｔ他、１９９８）。
【００５７】
【図２Ａ−２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｄは、単一特異性抗体および二重特異性抗体をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させるためのｐＨＡＫ−ＩｇＨ型プラスミドおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬ型プラスミドのマップの概略図である：ヒトのκ鎖または軽鎖を有する抗体を発現させるためのｐＨＡＫ−ＩｇＬ、ｄｓＦｖ様の鎖間ジスルフィド結合を含有する軽鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＬＣ−Ｃｙｓ、ヒトのγ１重鎖を有する抗体を発現させるためのｐＨＡＫ−ＩｇＨ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの“ｋｎｏｂ”変異を定常領域に含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−ｋｎｏｂ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの“ｈｏｌｅ”変異を定常領域に含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅ、シュードモナス菌体外毒素Ａの短縮型形態（ＰＥ３８）に融合される“ｈｏｌｅ”変異を含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８、ｄｓＦｖ様のジスルフィド鎖間結合を含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ、定常領域における“ｋｎｏｂ”変異と、ｄｓＦｖ様の鎖間ジスルフィド結合とを含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ−ｋｎｏｂ。
【図２Ｅ−２Ｈ】図２Ｅ〜図２Ｈは、単一特異性抗体および二重特異性抗体をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させるためのｐＨＡＫ−ＩｇＨ型プラスミドおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬ型プラスミドのマップの概略図である：ヒトのκ鎖または軽鎖を有する抗体を発現させるためのｐＨＡＫ−ＩｇＬ、ｄｓＦｖ様の鎖間ジスルフィド結合を含有する軽鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＬＣ−Ｃｙｓ、ヒトのγ１重鎖を有する抗体を発現させるためのｐＨＡＫ−ＩｇＨ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの“ｋｎｏｂ”変異を定常領域に含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−ｋｎｏｂ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの“ｈｏｌｅ”変異を定常領域に含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅ、シュードモナス菌体外毒素Ａの短縮型形態（ＰＥ３８）に融合される“ｈｏｌｅ”変異を含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８、ｄｓＦｖ様のジスルフィド鎖間結合を含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ、定常領域における“ｋｎｏｂ”変異と、ｄｓＦｖ様の鎖間ジスルフィド結合とを含有する重鎖を発現させるためのｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ−ｋｎｏｂ。
【００５８】
【図３】図３は、重鎖および軽鎖の精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真である。発現タンパク質を封入体として集め、逐次的な遠心分離工程によって精製し、６Ｍグアニジニウム塩酸塩緩衝液に溶解した。（１）Ｔ４２７  ＩｇＬ、（２）Ｔ４２７  ＩｇＨ、（３）Ｔ４２７−ＩｇＨ−ｋｎｏｂ、（４）Ｔ４２７−ＩｇＨ−ＰＥ３８、（５）Ｔ４２７−ＩｇＨ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８。“ｋｎｏｂ”変異はＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗに対応する。“ｈｏｌｅ”変異はＹ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖに対応する。
【００５９】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｂは、二重特異性のＩｇＧ様タンパク質の分析を提供する。（Ａ）ＩｇＧの重鎖および軽鎖、ならびに、形成され得る理論的に可能なＩｇＧ分子の概略構造。それぞれの変化体を分子量における有意な差に応じて容易に検出することができる。（Ｂ）プロテインＡ精製された生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）分析：ＰＥ３８を重鎖上に呈示するｗｔ型Ｔ４２７抗体（１）、Ｔ４２７抗体の“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”体（２）（Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ変異）、ｗｔ型ＦＲＰ５抗体（３）。
【００６０】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜図５Ｂは、プロテインＡ精製された生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）分析を提供する。（１）Ｔ４２７の“ｋｎｏｂ−ｋｎｏｂ”体（ＩｇＬ＋ＩｇＨ−ｋｎｏｂ  Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ変異）。（２）Ｔ４２７抗体の“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”体（Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ変異）。（３）Ｔ４２７の“ｈｏｌｅ−ｈｏｌｅ”体（ＩｇＬ＋ＩｇＨ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８  Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ変異）。（４）ＰＥ３８を重鎖上に呈示するｗｔ型Ｔ４２７抗体。（Ｍ）マーカー。
【００６１】
【図６】図６は、ＩｇＧタンパク質およびＩｇＧ様タンパク質のゲルろ過分析を示す。Ｔ４２７  ＩｇＧ抗体（１５０ｋＤａ）がＳｅｐｈａｄｅｘ２００ゲルろ過カラムにて１１．５分で溶出する。ＩｇＧ様のＴ４２７ヘテロダイマー（２ＩｇＬ＋ＩｇＨ−ｋｎｏｂ＋ＩｇＨ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８）（１９０ｋＤａ）が１０．３分で溶出する。小さい割合のｋｎｏｂ−ｋｎｏｂホモダイマー（１５０ｋＤａ）が１１．５分で溶出する。ｈｏｌｅ−ｈｏｌｅホモダイマー（２３０ｋＤａ）はおそらくはボイド容量（６．５分（示されず））において溶出する。
【００６２】
【図７Ａ−７Ｃ】図７Ａ〜図７Ｃは、プロテインＡ精製された生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（７．５％アクリルアミド）分析および密度分析を例示する。（Ａ）Ｔ４２７  ＩｇＧのｗｔ型タンパク質（１）、Ｔ４２７−ｋｎｏｂ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８タンパク質（２）、および、Ｔ４２７−ＰＥ３８タンパク質（３）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  １Ｄ走査型レーザーデンシトメトリーによるＳＤＳ−ＰＡＧＥのタンパク質バンド密度分析。（Ｃ）ヘテロダイマー化収量の円グラフがバンド位置における画素強度に従って見積もられた。Ｔ４２７−ｋｎｏｂ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８（２）は、２ＩｇＬ＋ＩｇＨ−ｋｎｏｂ＋ＩｇＨ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８からなる。Ｔ４２７−ＰＥ３８（３）は、２ＩｇＬ＋２ＩｇＨ−ＰＥ３８からなる。“ｋｎｏｂ”変異はＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗに対応する。“ｈｏｌｅ”変異はＹ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖに対応する。
【００６３】
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｂは、ＩｇＧタンパク質およびＩｇＧ様タンパク質のＥＬＩＳＡ分析を例示する。ＦＲＰ５  ＩｇＧおよび二重特異性ＦＲＰ５−Ｔ４２７−ＰＥ３８（Ｔ４２７の重鎖に融合されるＰＥ３８）の結合能。（Ａ）ＥＬＩＳＡプレートをｅｒｂＢ２（ＦＲＰ５抗体の抗原）により被覆し、抗体を抗ヒト二次抗体により検出した。（Ｂ）ＥＬＩＳＡプレートをｅｒｂＢ２（ＦＲＰ５抗体の抗原）により被覆し、抗体を抗ＰＥ二次抗体により検出した（二重特異性抗体の検出）。
【００６４】
ＦＲＰ５−Ｔ４２７−ＰＥ３８抗体は、ＩｇＬ−ＦＲＰ５タンパク質＋ＩｇＬ−Ｔ４２７タンパク質＋ＩｇＨ−ＦＲＰ５−ｋｎｏｂタンパク質＋ＩｇＨ−Ｔ４２７−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８タンパク質からなる。“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”変異：Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ／Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ。
【００６５】
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｂは、プロテインＡ精製されたＩｇＧタンパク質およびＩｇＧ様タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％および６％のアクリルアミド）分析を例示する。（１）ＦＲＰ５  ＩｇＧのｗｔ型。（２）Ｔ４２７  ＩｇＧのｗｔ型。（３）Ｔ４２７  ＩｇＧ−Ｃｙｓ（ＩｇＨ−Ｃｙｓ４４：Ｃｙｓ２２２Ａｌａ＋ＩｇＬ−Ｃｙｓ１０４：Ｃｙｓ２１８ｄｅｌ）。（４）二重特異性Ｔ４２７−ＦＲＰ５  ＩｇＧ（ＩｇＨ−ＦＲＰ５−ｈｏｌｅ＋ＩｇＬ−ＦＲＰ５＋ＩｇＨ−Ｔ４２７−ｋｎｏｂ−Ｃｙｓ４４：Ｃｙｓ２２２Ａｌａ＋ＩｇＬ−Ｔ４２７−Ｃｙｓ１０４：Ｃｙｓ２１８ｄｅｌ  ＩｇＧ）。“ｋｎｏｂ”変異はＳ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗに対応する。“ｈｏｌｅ”変異はＹ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖに対応する。
【００６６】
【図１０】図１０は、プロテインＡ精製されたＩｇＧタンパク質およびＩｇＧ様タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％アクリルアミド）分析である。（１）Ｔ４２７  ＩｇＧのｗｔ型。（２）抗Ｔａｃ  ＩｇＧのｗｔ型。（３）Ｔ４２７  ＩｇＧ−ＣｙｓのコントロールＡ（ＩｇＨ  ｗｔ＋ＩｇＬ−Ｃｙｓ１０４：Ｃｙｓ２１８ｄｅｌ）。（４）Ｔ４２７  ＩｇＧ−ＣｙｓのコントロールＢ（ＩｇＨ−Ｃｙｓ４４：Ｃｙｓ２２２Ａｌａ＋ＩｇＬ  ｗｔ）。
【００６７】
【図１１】図１１は、封入体として精製され、６Ｍグアニジニウム塩酸塩に再懸濁されたαＰＥ（Ｂ１１）抗体、Ｔ４２７抗体およびαＳＡ抗体の重鎖および軽鎖のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。サンプルを１２％アクリルアミドゲルで還元条件で分離した。
【００６８】
【図１２Ａ−１２Ｂ】図１２Ａ〜図１２Ｂは、αＳＡ（抗ストレプトアビジン）抗体のＥＬＩＳＡ分析である。Ｔ４２７、αＳＡ（モノクローナル）およびＴ４２７−αＳＡ（二重特異性）のプロテインＡ精製された各抗体をそれらのＣＤ３０結合能について分析した（Ａ）。結合を、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化抗体を使用して検出した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による被覆がコントロールとして役立った（Ｂ）。
【００６９】
【図１３Ａ−１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、αＰＥ（抗シュードモナス菌体外毒素３８ｋＤａフラグメント）抗体のＥＬＩＳＡ分析である。Ｔ４２７、αＰＥ  Ｂ１１クローン（モノクローナル）およびＴ４２７−αＰＥ（二重特異性）のプロテインＡ精製された各抗体をそれらのａｖｉｔａｇ−ＰＥ３８抗原結合能（Ａ）およびｄｓＦｖ−ＰＥ３８抗原結合能（Ｂ）について分析した。結合を、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化抗体を使用して検出した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）による被覆がコントロールとして役立った（Ｃ）。
【００７０】
【図１４】図１４は、ｐＤｕａｌベクターシステムの概略図である。ｐＤｕａｌベクターは、各種ＩｇＧを哺乳動物細胞において発現させるための二シストロン性のＣＭＶプロモーター型プラスミドである。ｐＤｕａｌベクターを、ｐＭＡＺベクターに由来する重鎖発現カセットおよび軽鎖発現カセットを組み合わせることによって構築した（Ｍａｚｏｒ  Ｙ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７  Ａｐｒ  １０）、３２１（１−２）：４１−５９）。
【００７１】
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ〜図１５Ｂは、ＣａＣｌ２トランスフェクションされた２９３Ｔｒｅｘ細胞の培地における分泌ＩｇＧの分析を例示する。（Ａ）ｐＤｕａｌ（ｗｔ）、ｐＤｕａｌ  Ｌ（Ｃｙｓ）＋Ｈ（ｗｔ）、または、ｐＭＡＺ−ＩｇＬ＋ｐＭＡＺ−ＩｇＨのベクターシステムによりトランスフェクションされた細胞培地のウエスタンブロット分析。抗体をヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体により検出した。培地中の抗体濃度をＥｒｂｉｔｕｘ抗体の二次希釈との比較で求めた（Ｂ）。
【００７２】
【図１６】図１６は、ｐＤｕａｌの単一特異性ベクターおよび二重特異性ベクターまたはベクターの組合せによりトランスフェクションされた２９３Ｔｒｅｘ細胞のウエスタンブロット分析を例示する。抗体をヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化抗体により検出した。
【００７３】
【図１７】図１７は、抗体分泌クローンのドットブロット分析から得られる例示的結果を示す。細胞培地をニトロセルロースメンブランに吸収させ、抗体をヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化抗体により検出した。分泌レベルを他のクローンに対して相対的に求めた。非処理細胞の細胞培地がコントロールとして役立った。
【００７４】
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ〜図１８Ｂは、二重特異性クローンの結合活性の検証を例示する。細胞培地をｅｒｂＢ２抗原（１８Ａ）またはＣＤ３０抗原（１８Ｂ）のどちらかとインキュベーションした。結合をヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化抗体により検出した。印が付けられたクローンは、両方の抗原に対する結合能が証明された。
【００７５】
【図１９Ａ−１９Ｂ】図１９Ａ〜図１９Ｂは、ＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）哺乳動物細胞で産生され、その後、プロテインＡ精製された各種ＩｇＧのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を例示する。タンパク質を、１５０ｋＤａの各種ＩｇＧを評価するために１０％アクリルアミドゲルで非還元状態で分離し（Ａ）、また、Ｔ４２７およびＦＲＰ５の重鎖および軽鎖の間における最小限の違いを評価し、かつ、二重特異性のＴ４２７−ＦＲＰ５分子における二重のバンドを求めるために１２％アクリルアミドゲルで還元状態で分離した（Ｂ）。
【００７６】
【図２０Ａ−２０Ｂ】図２０Ａ〜図２０Ｂは、哺乳動物細胞で産生されるプロテインＡ精製された各種ＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析を例示する。Ａ５は、４つのプラスミド（２つが単一特異性のＴ４２７抗体をコードし、２つが単一特異性のＦＲＰ５抗体をコードする）によりトランスフェクションされたコントロール細胞株である。二重特異性のＴ４２７−ＦＲＰ５は、それぞれの抗原（ｅｒｂＢ２およびＣＤ３０）に対する一価の結合能を有する二重特異性抗体分泌の安定なクローンＤ３を表す。結合を、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を使用して検出した。
【００７７】
【図２１Ａ−２１Ｂ】図２１Ａ〜図２１Ｂは、哺乳動物細胞で産生されるプロテインＡ精製された各種ＩｇＧのＥＬＩＳＡ分析を例示するグラフである。Ｔ４２７およびＦＲＰ５は、二価の結合活性を有する単一特異性抗体を表す。二重特異性Ｔ４２７−ＦＲＰ５は、それぞれの抗原（ｅｒｂＢ２およびＣＤ３０）に対する一価の結合能を有する二重特異性抗体分泌の安定なクローンＤ３を表す。Ｅｒｂｉｔｕｘが陰性コントロールとして役立った。結合を、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を使用して検出した。
【００７８】
【図２２】図２２は、（安定クローンの馴化培地からプロテインＡ精製される）Ｔ４２７−ＦＲＰ５二重特異性抗体を分泌するＢ３クローンの、Ａ４３１／ＣＤ３０細胞およびＳＫＢＲ３（ｅｒｂＢ２＋）細胞に対する結合能の細胞ＥＬＩＳＡ分析を例示するグラフである。結合を、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体を使用して検出した。
【００７９】
【図２３】図２３は、本発明の実施形態の単一特異性抗体の概略図である。
【００８０】
【図２４】図２４は、Ｔ４２７  ＫＩＨのＥＬＩＳＡ分析である。Ｔ４２７抗体のｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ（ＫＩＨ）体（２×ＩｇＬ＋ＩｇＨ−ｋｎｏｂ＋ＩｇＨ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８）との比較における、Ｔ４２７  ＩｇＧおよびＴ４２７−ＰＥ３８（重鎖に融合されるＰＥ３８）の結合能。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
本発明は、そのいくつかの実施形態において、二重特異性抗体、単一特異性抗体、非対称な抗体、および、それらの作製方法に関連する。
【００８２】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示される細部、または、実施例によって例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、あるいは、様々な方法で実施、または、実行される。また、本明細書中において用いられる表現法および用語法は説明のためであって、限定として見なされるべきでないことを理解しなければならない。
【００８３】
この数年、実験室研究および初期臨床研究の両方で、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）が、腫瘍細胞を、エフェクター細胞、放射性核種、薬物および毒素を含む様々な細胞毒性剤により標的化することによるか、または、２つの関連した腫瘍標的、すなわち、増殖因子受容体もしくはそれらのリガンドを同時に阻止し、したがって、多数の受容体活性化経路および下流側シグナル伝達経路を中和することによるかのどちらであれ、著しい応用可能性をガン治療において有するかもしれないことが明らかにされている。ＢｓＡｂの開発における大きな障害が、その材料を従来の技術（例えば、ハイブリッドハイブリドーマおよび化学的コンジュゲート化の方法など）によって十分な品質および量で製造することが困難であることである。したがって、治療剤としてのＩｇＧ様ＢｓＡｂの開発は、組換えＢｓＡｂ構築物の設計および製造効率においてなされる進歩に大きく依存するであろうと考えられている。
【００８４】
抗体“Ａ”および抗体“Ｂ”の重鎖の間におけるヘテロダイマー化が形成することを保証するために、または、抗体“Ａ”が抗体“Ａ”に対してホモダイマー化すること、および、抗体“Ｂ”が抗体“Ｂ”に対してホモダイマー化することを防止するために、ｋｎｏｂ−ａｎｄ−ｈｏｌｅ法が、米国特許第７１８３０７６号に開示されるように提案されている。しかしながら、このｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ法は、重鎖のヘテロ会合のためだけの解決法を提供するだけで、それぞれの重鎖がその同族軽鎖と正しく対形成するための解決法を提供していない。
【００８５】
本発明は、二重特異性抗体をＩｇＧ形式で効率的に組み立てる方法に関連する。この方法では、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ法を、それぞれの重鎖がその同族軽鎖のみと対形成することを容易にすることとの組合せで適用することによる２つの重鎖のヘテロダイマー化が伴う。
【００８６】
本発明者らは、同じ抗体の重鎖および軽鎖を、（図１Ｂに例示されるように）１つの生来型のＣＨ１−ＣＬ結合形成ジスルフィド結合と、１つの非生来型のＶＨ−ＶＬ結合形成ｄｓＦｖ様ジスルフィド結合とを使用して対形成させることを提案する。このように、一方の抗体枝は分子的に影響されないままであると考えられ、一方で、他方の抗体枝は新しいジスルフィド共有結合をｗｔ型Ｓ−Ｓ結合の代わりに可変領域において獲得すると考えられる。これらの誤対合した軽鎖および重鎖は、Ｓ−Ｓにより安定化された境界面を形成しないと考えられ、安定なＩｇＧ分子をもたらさないと考えられる。したがって、この戦略では、１つの抗体枝を、親和性または安定性の喪失を何ら伴うことなく、ｄｓＦｖ様分子に変換することが想定される。
【００８７】
本発明を実施に移している間に、本発明者らは、二重特異性抗体を、抗ＣＤ３０抗体（Ｔ４２７）および抗ｅｒｂＢ２抗体（ＦＲＰ５）を組み合わせることによって作製した。ｅｒｂＢ２抗体において、重鎖−軽鎖の会合が、重鎖のＣＨ１ドメインを軽鎖のＣＬドメインと共有結合により連結する天然型ジスルフィド結合によって促進された。抗ＣＤ３０抗体において、ＣＨ１内のシステインがアラニンに変異し、ＣＬのＣ末端システインが欠失され、これにより、生来型のＨ−Ｌジスルフィド結合の形成が防止された。除かれたジスルフィド結合の代わりに、２つのシステイン（重鎖の可変ドメインにおける１個、および、軽鎖の可変ドメインにおける１個）が、ジスルフィドにより安定化されたＦｖフラグメント（ｄｓＦｖ）の規則に従って導入された。結果として、抗ＣＤ３０抗体の重鎖および軽鎖が、これら２つのシステイン残基を介してＶＨとＶＬとの間に生じるジスルフィド結合による共有結合により会合した。したがって、本発明では、二機能性抗体の一方のアームにおける、重鎖と、その同族軽鎖との間での新規なジスルフィド架橋の生成、および、正しい組立てをさらに強化するように、同じ重鎖と、その同族軽鎖との間での天然に存在するジスルフィド架橋の欠失がともに意図される。
【００８８】
図９Ａ〜図９Ｂに例示されるように、この方法を使用して、全長型二機能性抗体が細菌細胞で作製された。抗ＣＤ３０抗体の重鎖および軽鎖が上記のように変異しなかったときには、全長型二機能性抗体が生じなかった（図１０）。
【００８９】
さらに、二重特異性ベクターを使用して、本発明者らは、哺乳動物細胞における全長型二機能性抗体の生成が、（図１７〜図２２に例示されるように）、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ法を、それぞれの重鎖がその同族軽鎖のみと対形成することを容易にすることとの組合せで適用することによって促進されたことを示した。
【００９０】
したがって、本発明の一局面によれば、
（ｉ）Ｆｃ領域が２つの非同一の重鎖を含み、ただし、これら２つの非同一重鎖の少なくとも１つが、これら２つの非同一重鎖の間における相補を形成し、それにより、これら非同一重鎖のヘテロダイマーを形成する確率を増大させるように、かつ、同一重鎖のホモダイマーを形成する確率を低下させるようにアミノ酸修飾を含む；および
（ｉｉ）Ｆａｂ領域が、Ｆａｂ領域の第１の重鎖と第１の軽鎖との間における第１の共有結合性連結、および、Ｆａｂ領域の第２の重鎖と第２の軽鎖との間における第２の共有結合性連結を含み、ただし、第１の重鎖に対する第１の共有結合性連結の位置が第２の重鎖に対する第２共有結合性連結の位置と異なる、
Ｆｃ領域およびＦａｂ領域を含む抗体が提供される。
【００９１】
抗体は、一連の逆平行ベータ鎖を免疫グロブリン様折り畳みに安定化する中心に置かれたジスルフィド架橋によって特徴づけられる。抗体の重鎖または軽鎖は、Ｎ末端（ＮＨ２）側の可変領域（Ｖ）と、Ｃ末端（−ＣＯＯＨ）側の定常領域（Ｃ）とを有する。重鎖可変領域はＶＨとして示され、軽鎖可変領域はＶＬとして示される。ＶＨフラグメントおよびＶＬフラグメントは一緒になって、「Ｆｖ」として示される。可変領域は、抗体の同族抗原に結合する分子の一部分であり、一方で、定常領域は抗体のエフェクター機能（例えば、補体結合、オプソニン化）を決定する。全長の免疫グロブリンまたは抗体の「軽鎖」（一般には約２５キロダルトン（Ｋｄ）、約２１４個のアミノ酸）が、Ｎ末端での可変領域遺伝子（一般には約１１０個のアミノ酸）と、ＣＯＯＨ末端での定常領域遺伝子とによってコードされる。全長の免疫グロブリンまたは抗体の「重鎖」（一般には約５０Ｋｄ、約４４６個のアミノ酸）が同様に、（一般には約１１６個のアミノ酸をコードする）可変領域遺伝子と、（約３３０個のアミノ酸をコードする）定常領域遺伝子の１つとによってコードされる。抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域は、４つの比較的保存されたフレームワーク領域またはＦＲが隣接する３つの超可変領域（これらはまた、相補性決定領域またはＣＤＲと呼ばれる）を含む。
【００９２】
本発明のこの局面の１つの実施形態によれば、抗体は二重特異性抗体である。
【００９３】
本明細書中で使用される場合、用語「二重特異性抗体」は、抗原の異なるエピトープにそれぞれが結合する２つの抗原結合部位を含む抗体を示す。本発明のこの局面の二重特異性抗体は共通の軽鎖を有しないし、また、共通の重鎖を有しない。
【００９４】
本発明の１つの実施形態によれば、これら２つの抗原結合部位はそれぞれが、同一抗原の異なるエピトープに結合する。別の実施形態によれば、これら２つの抗原結合部位はそれぞれが、異なる抗原における異なるエピトープに結合する。
【００９５】
本発明のこの局面の別の実施形態によれば、抗体は単一特異性の非対称な抗体である。
【００９６】
本発明のこの局面の単一特異性抗体は、同じパラトープを、同一の抗原と結合する両方のアームに有する。しかしながら、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖からなる対称的な組立てである従来のモノクローナル抗体とは異なり、本明細書中に記載される単一特異性抗体は、２つの非同一の重鎖および２つの非同一の軽鎖からなる非対称な組立てである。これら２つの重鎖の間における相違部、および、これら２つの軽鎖の間における相違部が、定常ドメインに、そして、これらの鎖のヘテロダイマー化を可能にする可変ドメインのフレームワーク領域に存在する。したがって、可変ドメインのＣＤＲループ、および、パラトープを含み得る支持する可変ドメイン残基が、鎖の対において同一である（図２３を参照のこと）。
【００９７】
特定の実施形態によれば、単一特異性抗体はＩｇＧ４である。
【００９８】
好ましくは、抗体の抗原結合部位のそれぞれの、その標的に対する親和性は、同一標的についてのその対応するモノクローナル抗体の１つのアームと比較した場合、実質的に低下していない。具体的な実施形態によれば、親和性は１００分の１を超えては低下せず、より好ましくは５０分の１を超えては低下せず、より好ましくは２０分の１を超えては低下せず、より好ましくは１０分の１を超えては低下せず、より一層好ましくは５分の１を超えては低下しない。
【００９９】
二重特異性抗体の例には、一方の抗原結合部位が第１の増殖因子リガンドに対して向けられ、第２の抗原結合部位が第２の増殖因子リガンドに対して向けられる二重特異性抗体；一方の抗原結合部位が第１の増殖因子受容体に対して向けられ、第２の抗原結合部位が第２の増殖因子受容体に対して向けられる二重特異性抗体；一方の抗原結合部位が第１のサイトカインに対して向けられ、第２の抗原結合部位が第２のサイトカインに対して向けられる二重特異性抗体；一方の抗原結合部位が第１のサイトカイン受容体に対して向けられ、第２の抗原結合部位が第２のサイトカイン受容体に対して向けられる二重特異性抗体；一方の抗原結合部位が増殖因子受容体に対して向けられ、第２の抗原結合部位が増殖因子リガンドに対して向けられる二重特異性抗体；一方の抗原結合部位がサイトカイン受容体に対して向けられ、第２の抗原結合部位がサイトカインリガンドに対して向けられる二重特異性抗体が含まれる。増殖因子、増殖因子受容体、サイトカインおよびサイトカイン受容体のさらなる組合せもまた意図される。
【０１００】
別の実施形態によれば、二重特異性抗体は血管形成の２つの経路を阻止し、ただし、この場合、一方の抗原結合部位が、第１の経路に関連する受容体またはリガンドに向けられ、他方の抗原結合部位が、第２の経路に関連する受容体またはリガンドに向けられる。
【０１０１】
具体的な実施形態によれば、二重特異性抗体は、腫瘍細胞抗原に対して向けられる一方の抗原結合部位と、サイトカイン誘因分子に対して向けられる他方の抗原結合部位とを含む（例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞ガン、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸ガン）、抗ＣＤ３／抗メラノサイト刺激ホルモンアナログ、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎カルシノーマ関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３など）。
【０１０２】
１つの抗原結合部位が腫瘍抗原に特異的に結合し、かつ、１つの抗原結合部位が毒素に結合する二重特異性抗体には、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドが含まれる。
【０１０３】
他の意図される二重特異性抗体には、変換酵素により活性化されたプロドラッグについての二重特異性抗体が含まれる（例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（これは、マイトマイシンホスファートプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する）など）。
【０１０４】
他の意図される二重特異性抗体には、線維素溶解剤として使用することができる二重特異性抗体が含まれる（例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型組織プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）など）。
【０１０５】
さらなる意図される二重特異性抗体には、免疫複合体を細胞表面受容体に標的化するための二重特異性抗体が含まれる（例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩまたはＦｃγＲＩＩＩ）など）。
【０１０６】
さらなる意図される二重特異性抗体には、感染性疾患の治療における使用のための二重特異性抗体が含まれる（例えば、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞受容体：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶなど）。インビトロまたはインビボでの腫瘍検出のためのさらなる二重特異性抗体には、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテンが含まれる。
【０１０７】
二重特異性抗体はワクチンアジュバントとして使用される場合がある（Ｆａｎｇｅｒ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１２（３，４）：１０１〜１２４（１９９２）を参照のこと）。
【０１０８】
二重特異性抗体は診断ツールとして使用される場合がある（例えば、抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼなど）。
【０１０９】
さらなる意図される二重特異性抗体には、第１の抗原結合部位がＣＤ３０と結合し、第２の抗原結合部位がｅｒｂＢ２と結合する二重特異性抗体；第１の抗原結合部位がＣＤ３０と結合し、第２の抗原結合部位がシュードモナス菌体外毒素（ＰＥ）と結合する二重特異性抗体；第１の抗原結合部位がＣＤ３０と結合し、第２の抗原結合部位がストレプトアビジンと結合する二重特異性抗体が含まれる。
【０１１０】
三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７、および、抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。
【０１１１】
本発明の抗体のＦｃ領域はどのような抗体からでも得ることができ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、あるいは、ＩｇＭなどから得ることができる。
【０１１２】
１つの実施形態によれば、Ｆｃ領域はＩｇＧのＦｃ領域である。
【０１１３】
述べられたように、本明細書中に記載される抗体のＦｃ領域は２つの非同一の重鎖（例えば、可変ドメインの配列が異なるもの）を含み、ただし、この場合、これら２つの非同一重鎖の少なくとも１つが、これら非同一重鎖の安定なヘテロダイマーを形成する確率を増大させるように、かつ、同一重鎖の安定なホモダイマーを形成する確率を低下させるようにアミノ酸修飾を含む。
【０１１４】
１つの実施形態によれば、少なくとも１つの重鎖が、境界面をはさんでの変化した電荷極性がもたらされるように遺伝子改変される。結果として、静電的に整合したＦｃ鎖の間における安定なヘテロダイマーが促進され、望まれないＦｃホモダイマー形成が、不利な反発的電荷相互作用のために抑制される。
【０１１５】
どのアミノ酸を改変するか、および、どのアミノ酸をどのアミノ酸に改変するかの決定がさらに、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ  Ｋ、Ｐｅｎｔｏｎｙ  Ｍ、Ｓｈｅｎ  Ｍ、Ｇａｒｒｅｔｔ  Ｌ、Ｆｏｒｔｅ  Ｃ、Ｗｏｏｄｗａｒｄ  Ａ、Ｎｇ  ＳＢ、Ｂｏｒｎ  Ｔ、Ｒｅｔｔｅｒ  Ｍ、Ｍａｎｃｈｕｌｅｎｋｏ  Ｋ、Ｓｗｅｅｔ  Ｈ、Ｆｏｌｔｚ  ＩＮ、Ｗｉｔｔｅｋｉｎｄ  Ｍ、Ｙａｎ  Ｗ、Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｖａｌｅｎｔ  ＩｇＧ．、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０１０  Ｊｕｎ  １８、２８５（２５）：１９６３７〜４６．Ｅｐｕｂ、２０１０  Ａｐｒ  １６において説明される（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１１６】
１つの実施形態によれば、アミノ酸修飾（電荷相補性に影響を与えるもの）が２つの重鎖の間の境界面の縁において行われ、境界面の疎水性コアにおける構造的に保存されている埋もれた残基では行われない。
【０１１７】
別の実施形態によれば、少なくとも１つの重鎖が、同一重鎖の場合（すなわち、ホモダイマー）とは対照的に、非同一重鎖により効率的に結合する３Ｄ構造を有する重鎖（すなわち、ヘテロダイマー）を生じさせるために遺伝子改変される。ヘテロダイマーの生成は立体的相補のために促され、ホモダイマーの生成は立体障害のために妨げられる。
【０１１８】
この実施形態によれば、一方の重鎖が、突出部を生じさせるために遺伝子改変され、第２の重鎖が、立体的な代償空洞を生じさせるために遺伝子改変され、ただし、この場合、突出部は代償空洞の中に突き出る。
【０１１９】
「突出部」は、第１の重鎖の境界面に由来する小さいアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（例えば、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシンまたはトリプトファン）により置換することによって構築される。サイズが突出部と同一であるか、または、突出部とほぼ同等のサイズの代償「空洞」が必要に応じて、大きいアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（例えば、アラニン、グリシン、セリン、バリンまたはトレオニン）により置換することによって第２の重鎖の境界面に作られる。
【０１２０】
このような突出部または空洞は、第１または第２の重鎖の境界面に、人工的手段によって、例えば、組換え技術、インビトロペプチド合成、前述の天然に存在しないアミノ酸残基を導入するためのそのような技術によって、ペプチドの酵素的カップリングまたは化学的カップリングによって、あるいは、これらの技術の何らかの組合せによって「導入」することができる。したがって、「導入」される突出部または空洞は「天然に存在しない」または「非生来的」であり、このことは、導入される突出部または空洞が自然界に存在せず、また、元のポリペプチド（例えば、ヒト化モノクローナル抗体）にも存在しないことを意味する。
【０１２１】
好ましくは、突出部を形成するための輸入アミノ酸残基は、比較的少数の「回転異性体」（例えば、約３〜６）を有する。「回転異性体」はアミノ酸側鎖のエネルギー的に有利な立体配座である。様々なアミノ酸残基の回転異性体の数が、ＰｏｎｄｅｒｓおよびＲｉｃｈａｒｄｓ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９３：７７５〜７９１（１９８７）において総説されている。
【０１２２】
突出部および／または空洞を形成するための元の残基を選択することに対する第１の工程として、抗体の三次元構造が、この技術分野で広く知られている技術を使用して、例えば、Ｘ線結晶学またはＮＭＲなどを使用して得られる。三次元構造に基づいて、当業者は境界面残基を特定することができるであろう。
【０１２３】
好ましい境界面は免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ３ドメインである。「埋もれた」残基を選択して置換するのが好ましい。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭのＣＨ３ドメインの境界面残基が、様々なＩｇＧサブタイプの境界面残基と、「埋もれた」残基とが特定されたように、輸入残基により置換するために最適である境界面残基を含めて特定されている（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０１５９８を参照のこと。これはその全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）。好ましいＣＨ３ドメインはＩｇＧ抗体（例えば、ヒトＩｇＧ１など）に由来する。
【０１２４】
ヒトＩｇＧ１のＣＨ３／ＣＨ３境界面は、それぞれの表面から１０９０ＡＮＧ２を埋める、４つの逆平行β鎖に位置するそれぞれのドメインにおける１６個の残基を伴う。変異は好ましくは、２つの中央の逆平行β鎖に位置する残基に対して向けられる。その目的は、作出される突出部が、相手方のＣＨ３ドメインにおける代償空洞によってではなく、周囲の溶媒の中に突き出ることによって抱き込まれ得る危険性を最小限にすることである。重鎖上の特定の部位を選択する様々な方法が米国特許第７１８３０７６号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に開示されている。
【０１２５】
具体的な実施形態によれば、第１の重鎖がＴ３６６Ｗ変異（すなわち、トレオニンからトリプトファンへ）を含み、第２の重鎖が、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの変異（すなわち、トレオニンからセリンへ；ロイシンからアラニンへ；チロシンからバリンへ）を含む。
【０１２６】
１つの実施形態によれば、アミノ酸修飾（構造的相補性に影響を与えるもの）が、境界面の疎水性コアにおける構造的に保存されている埋もれた残基において行われ、２つの重鎖の間の境界面の縁においては行われない。
【０１２７】
重鎖上の残基を置換することの影響を、分子グラフィックスモデリングプログラムを使用して、例えば、Ｉｎｓｉｇｈｔ（商標）プログラム（Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などを使用して調べることができる。
【０１２８】
好ましい元の残基／輸入残基が分子モデリングによって特定されると、アミノ酸置換を、この技術分野で広く知られている技術を使用して重鎖の中に導入することができる。
【０１２９】
オリゴヌクレオチド媒介変異誘発が、第１または第２の重鎖をコードするＤＮＡの置換変化体を調製するための好ましい方法である。この技術は、Ａｄｅｌｍａｎ他、ＤＮＡ、２：１８３（１９８３）に記載されるようにこの技術分野では広く知られている。簡単に記載すると、第１または第２のポリペプチドをコードするＤＮＡを、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドをＤＮＡテンプレートにハイブリダイゼーションさせることによって変化させる。ただし、この場合、テンプレートは、ヘテロマルチマーの未変化または生来的なＤＮＡ配列を含有するプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖形態である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを使用してテンプレートの第２の相補鎖全体を合成し、したがって、オリゴヌクレオチドプライマーが取り込まれることになり、かつ、ヘテロマルチマーＤＮＡにおける選択された変化がコードされることになる。
【０１３０】
Ｗｅｌｌｓ他、Ｇｅｎｅ、３４：３１５（１９８５）に記載されるように、カセット変異誘発は、目的とするＤＮＡの領域を、相補的オリゴヌクレオチドのアニーリングによって生じる合成された変異フラグメントにより置き換えることによって行うことができる。ＰＣＲ変異誘発もまた、第１または第２のポリペプチドのＤＮＡの変化体を作製するために好適である。下記の議論はＤＮＡに言及するが、この技術はまた、ＲＮＡを用いた応用も見出されることが理解される。ＰＣＲ技術では一般に、下記の手順が参照される（Ｅｒｌｉｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２：１６４３〜１６５０（１９９１）、Ｒ．Ｈｉｇｕｃｈｉによる章（６１頁〜７０頁）を参照のこと）。
【０１３１】
さらなる修飾もまた、２つの重鎖の間における相互作用の特異性をさらに高めるために意図される。したがって、本発明では、共有結合性連結が２つの重鎖の間に（例えば、ＣＨ３ドメイン上に）組み込まれる。
【０１３２】
本発明によって意図される共有結合性連結の例には、アミド連結およびジスルフィド連結が含まれる。
【０１３３】
したがって、例えば、本発明では、分子間ジスルフィド結合を抗体の２つの重鎖の間に形成する遊離チオールの導入が意図される。この遊離チオールは、重鎖の天然に存在する残基を、例えば、重鎖間のジスルフィド結合の形成に備える位置においてシステインにより置換することによって、一方の重鎖の境界面に導入することができる。
【０１３４】
表現「遊離チオール含有化合物」は、本明細書中で使用される場合、化合物の遊離チオール成分が、本発明のさらなるポリペプチドの境界面において遊離チオール成分と相互作用してジスルフィド結合を形成するために位置するように、本発明のポリペプチド境界面に取り込まれ得るか、または、本発明のポリペプチド境界面のアミノ酸と反応し得る化合物を示す。好ましくは、遊離チオール含有化合物はシステインである。
【０１３５】
具体的な実施形態によれば、第１の重鎖がＳ３５４Ｃ変異（すなわち、セリンからシステインへ）を含み、第２の重鎖がＹ３４９Ｃ変異（チロシンからシステインへ）を含む。
【０１３６】
修飾をそれらの重鎖に有することと同様に、本明細書中に記載される抗体の少なくとも１つの軽鎖もまた、第１の重鎖と第１の軽鎖との間における第１の共有結合性連結、および、第２の重鎖と第２の軽鎖との間における第２の共有結合性連結が存在するように改変され、ただし、この場合、第１の重鎖に対する第１の共有結合性連結の位置が第２の重鎖に対する第２共有結合性連結の位置と異なる。
【０１３７】
第１および第２の共有結合性連結の位置は、重鎖とその同族軽鎖との間での対形成が容易になり、一方で、抗体の特異性および安定性が、当該抗体が作製される個々の抗体と比較した場合、２０％を超えて低下しないように、または、好ましくは１０％を超えて低下しないように、または、より一層好ましくは５％を超えて低下しないように選択される。
【０１３８】
別の実施形態によれば、第１の重鎖とその同族軽鎖との間における共有結合性連結がＣＨ１領域とＣＬ領域との間に位置し、第２の重鎖とその同族軽鎖との間における共有結合性連結がＶＨ領域とＶＬ領域との間に位置する。
【０１３９】
本発明によって意図される共有結合性連結の例には、例えば、アミド連結、ジスルフィド連結、および、非天然型アミノ酸を含めて、部位特異的に挿入されたアミノ酸残基との間に存在する共有結合のさらなる形態が含まれる（Ｗｕ，Ｘ．、Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１３１（３５）：１２４９７〜５１５、２００９；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ＢＭ、Ｋａｚａｎｅ  ＳＡ、Ｓｔａｆｌｉｎ  Ｋ、Ｆｏｒｓｙｔｈ  ＪＳ、Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ  Ｂ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ、Ｓｍｉｄｅｒ  ＶＶ、Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｃａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｒｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０１１  Ｍａｒ  ４）、４０６（４）：５９５〜６０３、Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊａｎ  １３）；Ｌｉｕ  ＣＣ、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ＰＧ、Ａｄｄｉｎｇ  ｎｅｗ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０１０、７９：４１３〜４４、総説、を参照のこと。これらのすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１４０】
したがって、本発明では、重鎖の少なくとも１つおよびその同族軽鎖を、これら２つの分子をつなぐ少なくとも１つの天然に存在する（すなわち、生来型）ジスルフィド結合がもはや生じることができないように変異させることが意図される。典型的には、これは、本明細書中上記で記載される位置におけるシステインを欠失（または置換）することによって達成される。
【０１４１】
本明細書中で使用される場合、表現「生来型（の）ジスルフィド結合」は、重鎖を、天然に存在する生殖細胞系列の抗体遺伝子にコードされるその同族軽鎖につなぐ（典型的には軽鎖の定常領域と重鎖のＣＨ１領域との間をつなぐ）鎖間のジスルフィド結合を示す。
【０１４２】
上記システインの置換は典型的には、このアミノ酸を、サイズおよび電荷が類似するアミノ酸（すなわち、保存的アミノ酸）により置き換えること（例えば、システインをアラニンに置換することなど）によって達成される。
【０１４３】
本発明では、第１の共有結合性連結が、天然に存在するジスルフィド結合であり、第２の共有結合性連結が、天然に存在しない共有結合（例えば、操作されたジスルフィド結合）であることが意図され、ただし、この場合、少なくとも１つのシステインアミノ酸残基が鎖の中に挿入されている（すなわち、操作されたシステイン）。
【０１４４】
用語「操作されたシステイン」は、本明細書中で使用される場合、天然の生殖細胞系列の抗体配列中システインが存在しない位置において抗体フラグメント配列に導入されているシステインを示す。
【０１４５】
あるいは、第１の共有結合性連結および第２の共有結合性連結の両方が、天然に存在しないものである場合があり、また、（非修飾抗体では、ジスルフィド結合を生じさせるためのアミノ酸残基としてはたらく）システインが、共有結合を生じさせるためのアミノ酸残基としてはたらくことができない他のアミノ酸によって置換される場合がある。
【０１４６】
目的とする抗体に関する情報が、ジスルフィド結合の適正な設置をもたらすために必要である。どの配列を変異させることができるかを決定し、その結果、システインが、所望される抗体のフレームワーク領域においてジスルフィド結合を提供するためのそれぞれの重鎖可変領域および軽鎖可変領域の適正な位置にコードされるようにするために、目的とする可変領域のアミノ酸配列が、ＫａｂａｔおよびＷｕによる広く知られている刊行物［“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、Ｅ．Ｋａｂａｔ他、米国政府印刷局、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２（１９９１）］（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）におけるそれらの類似配列とのアラインメントによって比較される。
【０１４７】
配列がアラインメントされた後、ＫａｂａｔおよびＷｕによって使用される番号表記システムにおける下記の位置と一致する目的とする配列におけるアミノ酸位置が特定される：重鎖可変領域の４３位、４４位、４５位、４６位および４７位（グループ１）、ならびに、１０３位、１０４位、１０５位および１０６位（グループ２）；そして、軽鎖可変領域の４２位、４３位、４４位、４５位および４６位（グループ３）、ならびに、９８位、９９位、１００位および１０１位（グループ４）。場合により、これらの位置のいくつかが欠けている場合があり、これらはアラインメントにおけるギャップを表す。
【０１４８】
その後、これらの特定された位置の２つにおけるアミノ酸をコードする核酸配列を、これら２つのアミノ酸がシステイン残基に変異するように変化させる。選択されるべきアミノ酸の意図される対が、ＶＨ４４−ＶＬ１００、ＶＨ１０５−ＶＬ４３、ＶＨ１０５−ＶＬ４２、ＶＨ４４−ＶＬ１０１、ＶＨ１０６−ＶＬ４３、ＶＨ１０４−ＶＬ４３、ＶＨ４４−ＶＬ９９、ＶＨ４５−ＶＬ９８、ＶＨ４６−ＶＬ９８、ＶＨ１０３−ＶＬ４３、ＶＨ１０３−ＶＬ４４、ＶＨ１０３−ＶＬ４５である。
【０１４９】
最も好ましくは、システインの置換が下記の位置で行われる：ＶＨ４４−ＶＬ１００またはＶＨ１０５−ＶＬ４３。（例えば、ＶＨ４４−ＶＬ１００の表記は、システインを４４位に有するＶＨと、１００位におけるＶＬ内のシステインとを有するポリペプチドを示す；この場合、これらの位置は、ＫａｂａｔおよびＷｕによって与えられる番号表記に従っている）。
【０１５０】
ＫａｂａｔおよびＷｕに従う位置の割り当てに関して、位置の番号表記は、所与の抗体において、規定の保存残基を示し、実際の連続して番号づけされたアミノ酸位置を示していないことに留意されたい。例えば、下記の実施例において記載されるようなｄｓ（Ｆｖ）Ｂ３を作製するために使用される（ＫａｂａｔおよびＷｕの）ＣｙｓＬ１００は実際には、Ｂ３（ＶＬ）の１０５位に対応する。
【０１５１】
１つの実施形態によれば、どのアミノ酸を変異させるかの選択を、米国特許第５７４７６５４号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に示される規則に従って行うことができる。システイン残基に対する変異部位を、下記において例示されるように、実際の抗体または目的とする抗体のモデルのどちらかの検討によって特定することができる。タンパク質（例えば、抗体など）のモデルを作製するための様々なコンピュータープログラムが一般に利用可能であり、当業者には広く知られている（ＫａｂａｔおよびＷｕ；Ｌｏｅｗ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｑｕａｎｔ．Ｃｈｅｍ．，Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．Ｓｙｍｐ．、１５：５５〜６６（１９８８）；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３５：５６４〜５６８（１９８８）；Ｃｈｏｔｈｉａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３３：７５５〜７５８（１９８６）を参照のこと。これらのすべてが参照によって本明細書中に組み込まれる）。市販のコンピュータープログラムを使用して、これらのモデルをコンピュータースクリーンに表示すること、原子間の距離を計算すること、および、種々のアミノ酸が相互作用する可能性を推定することができる（Ｆｅｒｒｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈｉｃｓ、６：１３〜２７（１９８８）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。例えば、コンピューターモデルでは、結合において操作可能であり、かつ、関連がある荷電アミノ酸残基を予測することができ、その後、立体配座的に制限された有機分子を合成することができる。例えば、Ｓａｒａｇｏｖｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：７９２（１９９１）を参照のこと（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。他の場合には、抗体の実験的に決定された実際の構造が利用可能である場合がある。
【０１５２】
１つの実施形態によれば、１対の好適なアミノ酸残基は、（１）これら２つの残基の間のＣα−Ｃα距離が８ＡＮＧ以下（好ましくは６．５ＡＮＧ以下）でなければならず（これは、利用可能な抗体（例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋから得られる抗体など）の結晶構造から求められる）、かつ、（２）ＣＤＲ領域からできる限り離れていなければならない。それらが特定されると、それらはシステインにより置換することができる。
【０１５３】
システインを標的点においてコードするための遺伝子の改変は、広く知られている技術、例えば、（本明細書中上記で記載されるような）オリゴヌクレオチド誘導変異誘発、部位特異的変異誘発（ＧｉｌｌｍａｎおよびＳｍｉｔｈ、Ｇｅｎｅ、８：８１〜９７（１９７９）；ならびに、Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｓ．他、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：７３１〜７３４（１９８７）を参照のこと。これらの両方が参照によって本明細書中に組み込まれる）などによって、または、Ｋｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８〜４９２（１９８５）（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される方法によって、または、遺伝子全合成（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｒ．Ａ．他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第４９８巻、２７７頁〜３０９頁（２０１１））によって、または、この技術分野で知られているいずれかの他の手段によって容易に達成することができる。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態の抗体は、ヒト、ブタ、ネズミ科、ウシ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコおよびヒツジなどを含めて、どのような哺乳動物起源に由来するものであってもよい。抗体は異種抗体であってもよい。
【０１５５】
本明細書中で使用される場合、「異種抗体」は、トランスジェニック宿主（例えば、抗体を発現する植物など）に関連して定義される。
【０１５６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、抗体は、単離された無傷の抗体（すなわち、細胞物質、異なる抗原特異性を有する他の抗体、および／または、他の化学物質を実質的に有しないもの）である。
【０１５７】
本明細書中で使用される「組換え抗体」は、組換え手段によって調製、発現、作出または単離される無傷の抗体を示し、例えば、（ａ）免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）について遺伝子導入されている動物（例えば、マウス）から単離される抗体、または、そのような動物から調製されるハイブリドーマから単離される抗体；（ｂ）抗体を発現させるために形質転換される宿主細胞から単離される抗体；（ｃ）組換え抗体ライブラリーから単離される抗体；および（ｄ）他のＤＮＡ配列への免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う何らかの他の手段によって調製、発現、作出または単離される抗体などを示す。特定の実施形態において、本発明の免疫グロブリンは、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有し得る。他の実施形態において、そのような組換えヒト抗体はインビトロ変異誘発に供することができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列のＶＨ配列およびＶＬ配列に由来し、かつ、関連づけられる一方で、自然の状態ではインビボにおけるヒト抗体の生殖系列レパートリーにおいて存在しないかもしれない配列を含む。
【０１５８】
抗体の下記の例示的な実施形態が本発明の範囲によって包含される。
【０１５９】
本明細書中で使用される「ヒト抗体」は、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域の両方が、例えば、Ｋａｂａｔ他によって記載されるようなヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する無傷の抗体を示す（Ｋａｂａｔ、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（第５版、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２）を参照のこと）。ヒト抗体の定常領域もまた、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する。ヒト抗体は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発または部位特異的変異誘発によって導入される変異、あるいは、インビボでの体細胞変異）を含むことができる。しかしながら、用語「ヒト抗体」は、本明細書中で使用される場合、別の哺乳動物種（例えば、マウスなど）の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列にグラフト化されている抗体を含むようには意図されない。
【０１６０】
本明細書中で使用される「キメラ抗体」は、可変領域が第１の生物種に由来し、定常領域が第２の生物種に由来する無傷の抗体を示す。キメラな免疫グロブリンは、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、ヒト起源の定常ドメインを有するマウス抗体からのＶＨおよびＶＬドメイン）から遺伝子操作によって構築することができる。
【０１６１】
本明細書中で使用される「ヒト化免疫グロブリン」は、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）からの最小限のマウス部分がヒト抗体に移し替えられる無傷の抗体を示す；一般に、ヒト化抗体は５％〜１０％がマウス部分であり、９０％〜９５％がヒト部分である。
【０１６２】
一般に、ヒト化抗体は、実質的にはすべての可変ドメインまたは１つ以上の（典型的には２つ）可変ドメインを含み、この場合、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の一部を、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３〜５９６（１９９２）］。
【０１６３】
非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法がこの技術においては広く知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、輸入残基と呼ばれており、この輸入残基は、典型的には、輸入可変ドメインに由来する。ヒト化は、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法に従って本質的には行うことができる［Ｊｏｎｅｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２〜５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３〜３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４〜１５３６（１９８８）］。従って、そのようなヒト化抗体は、実質的に完全でないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第４８１６５６７号）。実際、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であり、この場合、一部のＣＤＲ残基およびおそらくは一部のＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似部位に由来する残基によって置換される。
【０１６４】
ヒト抗体はまた、ファージディスプレーライブラリー［ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１（１９９１）］を含む、この分野で知られている様々な技術を使用して製造することができる。Ｃｏｌｅ他およびＢｏｅｒｎｅｒ他の技術もまた、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用することができる［Ｃｏｌｅ他、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６〜９５（１９９１）］。同様に、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を、内因性免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活性化されている遺伝子組換え動物（例えば、マウス）に導入することによって作製することができる。抗原投与したとき、ヒト抗体の産生が認められ、この場合、その産生は、遺伝子再配置、組み立ておよび抗体レパートリーを含むすべての点に関してヒトにおいて見られる産生と非常に似ている。この方法は、例えば、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、同第５６６１０１６号、および下記の科学的刊行物：Ｍａｒｋｓ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８５６〜８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８：８１２〜１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４５〜５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８２６（１９９６）；ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３：６５〜９３（１９９５）に記載されている。
【０１６５】
本発明の抗体は機能的成分（例えば、検出可能成分または治療用成分など）にコンジュゲートすることができる。
【０１６６】
様々なタイプの検出可能成分またはレポーター成分を本発明の抗体にコンジュゲートすることができる。これらには、放射性同位体（例えば、［１２５］Ｉなど）、リン光性化学物質、化学発光性化学物質、蛍光性化学物質（蛍光団）、酵素、蛍光性ポリペプチド、親和性タグ、および、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって検出可能である分子（造影剤）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６７】
好適な蛍光団の例には、フィコエリトリン（ＰＥ）、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、Ｃｙ−クロム、ローダミン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、テキサスレッドおよびＰＥ−Ｃｙ５などが含まれるが、これらに限定されない。蛍光団選択、蛍光団を様々なタイプの分子に連結する方法に関するさらなる指針については、下記を参照のこと：Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １９９２〜１９９４”、第５版、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）；米国特許第６０３７１３７号（Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｉｎ  Ｉｎｃ．）：Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、“Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９９５）；Ｋａｙ  Ｍ．他、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３４：２９３；Ｓｔｕｂｂｓ他、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：９３７；Ｇａｋａｍｓｋｙ  Ｄ．他、「蛍光共鳴エネルギー移動による受容体化学量論の評価」、“Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｒｃｈ”（第２版）、Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｃ．およびＨｏｒｔｏｎ  Ｒ．（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＵＫ（２００１）：米国特許第６３５０４６６号（Ｔａｒｇｅｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．）。蛍光性の検出可能成分にコンジュゲートされたときの抗体を検出するために使用することができる蛍光検出方法には、例えば、蛍光活性化フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、共焦点免疫蛍光顕微鏡法、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が含まれる。
【０１６８】
数多くのタイプの酵素を本発明の抗体に結合させることができ［例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）］、酵素コンジュゲート化抗体の検出を、ＥＬＩＳＡ（例えば、溶液中で）、酵素結合免疫組織化学アッセイ（例えば、固定処理された組織で）、酵素結合化学発光アッセイ（例えば、電気泳動によって分離されたタンパク質混合物中で）、または当該技術分野で公知の他の方法（例えば、Ｋｈａｔｋｈａｔａｙ  ＭＩ．およびＤｅｓａｉ  Ｍ．、１９９９、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、２０：１５１〜８３；Ｗｉｓｄｏｍ  ＧＢ．、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３２：４３３〜４０；Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ．他、１９８３、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、４：２０９〜３２７；Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ  Ｍ．、１９８０、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８：１９７〜２０８；Ｓｃｈｕｕｒｓ  ＡＨ．およびｖａｎ  Ｗｅｅｍｅｎ  ＢＫ．、１９８０、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１：２２９〜４９を参照のこと）を使用して行うことができる。
【０１６９】
親和性タグ（または結合対の成分）は、対応する抗体によって特定可能である抗原［例えば、抗ＤＩＧ抗体によって特定されるジゴキシゲニン（ＤＩＧ）］、または、タグに対する高い親和性を有する分子［例えば、ストレプトアビジンおよびビオチン］が可能である。親和性タグと結合する抗体または分子は蛍光標識することができ、あるいは、上記のような酵素にコンジュゲートすることができる。
【０１７０】
様々な方法がこの技術分野では広く実施されており、これらを、ストレプトアビジン分子またはビオチン分子を本発明の抗体に結合させるために用いることができる。例えば、ビオチン分子を、下記の実施例の節において、また、Ｄｅｎｋｂｅｒｇ，Ｇ．他、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３０：３５２２〜３５３２に記載されるように、ビオチンプロテインリガーゼ（例えば、ＢｉｒＡ）の認識配列を介して本発明の抗体に結合させることができる。あるいは、ストレプトアビジン分子を、基本的には下記に記載されるように、抗体フラグメント（例えば、単鎖Ｆｖなど）に結合させることができる：（例えば、Ｃｌｏｕｔｉｅｒ  ＳＭ．他、２０００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３７：１０６７〜１０７７；Ｄｕｂｅｌ  Ｓ．他、１９９５、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７８：２０１；Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳ．他、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２０３：４６；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ．他、１９９５、Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ、６：９３；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ．他、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、９：２０３；Ｐｅａｒｃｅ  ＬＡ．他、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌｅｃ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｌ、４２：１１７９〜１１８８を参照のこと）。
【０１７１】
ストレプトアビジンにコンジュゲート化された機能的成分（例えば、蛍光団など）が免疫蛍光フローサイトメトリー試薬の本質的にはすべての主要な供給者から市販されている（例えば、ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎまたはＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【０１７２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ビオチンコンジュゲート化抗体が、ストレプトアビジン分子に結合して多価組成物（例えば、抗体のダイマー形態またはテトラマー形態）を形成する。
【０１７３】
表１は、本発明の抗体にコンジュゲートすることができる特定可能な成分の限定されない例を提供する。
【表１】
2014510084.tif 000002
【０１７４】
述べられたように、抗体を治療用成分にコンジュゲートすることができる。治療用成分としては、例えば、細胞毒性成分、毒性成分、サイトカイン成分、および、本発明の抗体とは異なる特異性を備える二次抗体成分が可能である。
【０１７５】
本発明の抗体にコンジュゲートすることができる治療用成分の限定されない例が本明細書中下記の表２に提供される。
【表２】
2014510084.tif 000003
【０１７６】
機能的成分は、Ｎ末端またはＣ末端のどちらであれ、ＶＨ配列またはＶＬ配列にコンジュゲートすることができ、あるいは、好適な位置において他のタンパク質配列の中に挿入することができる。例えば、シュードモナス菌体外毒素（ＰＥ）由来の融合タンパク質については、ＶＨまたはＶＬのどちらかが毒素のＮ末端に連結されるか、あるいは、ＰＥのドメインＩＩＩの中に挿入されるにちがいない。ジフテリア毒素由来の抗体については、ＶＨまたはＶＬが好ましくは、毒素のＣ末端に連結される。
【０１７７】
そのような融合はまた、化学的コンジュゲート化を使用して行われ得ること（すなわち、組換えＤＮＡ技術によってでないこと）が理解されるであろう。
【０１７８】
本発明において適用されるＶＨ配列およびＶＬ配列は、この技術分野では知られている様々な技術のいずれか１つによって産生される抗体から得ることができる。
【０１７９】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を作製する方法がこの技術分野では広く知られている（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと。これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０１８０】
典型的には、抗体が、非ヒト動物（好ましくは、マウス）を、所望される抗原または免疫原を含む免疫原により免疫化することによってもたらされる。代替では、抗体が、例えば、Ｗａｒｄ他（Ｎａｔｕｒｅ、３４１（１９８９）、５４４）において開示されるように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって提供され得る。したがって、免疫グロブリン抗体が最終的には細菌宿主において発現される限り、どのような抗体作製方法も、本発明の教示に従って想定される。
【０１８１】
非ヒト哺乳動物を抗原により免疫化する工程を、マウスにおける抗体の産生を刺激することについてこの技術分野では広く知られているいずれかの様式で行うことができる（例えば、Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８））を参照のこと）。好ましい実施形態において、非ヒト動物は哺乳動物であり、例えば、齧歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどである。述べられたように、非ヒト哺乳動物は、「ヒト」抗体を産生させるために遺伝子改変または遺伝子操作することができる（例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ）またはＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ）など）。典型的には、免疫原が、必要な場合にはアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバントなど）とともに緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための様々な方法が当業者には広く知られており、これらの方法は本発明に関して決して限定的ではない。これらのパラメーターは免疫原毎に異なり得るが、容易に明らかにされる。
【０１８２】
同様に、抗体の産生を刺激するために十分な免疫化の場所および頻度もまた、この技術分野では広く知られている。典型的な免疫化プロトコルにおいて、非ヒト動物には、抗原が１日目に腹腔内注射され、約１週間後に再び腹腔内注射される。この後、２０日目前後での抗原のリコール（ｒｅｃａｌｌ）注射が、必要な場合にはアジュバント（不完全フロイントアジュバントなど）とともに行われる。リコール注射は静脈内または腹腔内に行われ、数日間連続して繰り返すことができる。この後、４０日目でのブースター注射が、典型的にはアジュバントを伴うことなく、静脈内または腹腔内のどちらかで行われる。このプロトコルにより、抗原特異的な抗体を産生するＢ細胞の産生が約４０日後にもたらされる。免疫化において使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生がもたらされる限り、他のプロトコルもまた利用することができる。
【０１８３】
代替となる実施形態において、免疫化されていない非ヒト哺乳動物からのリンパ球が単離され、インビトロで成長させられ、その後、細胞培養において免疫原にさらされる。その後、リンパ球が集められ、下記で記載される融合工程が行われる。
【０１８４】
モノクローナル抗体については、その次の工程が、免疫化された非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離、および、抗体産生ハイブリドーマを形成するための、そのような脾臓細胞と、不死化細胞とのそれに続く融合である。非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離はこの技術分野では広く知られており、典型的には、脾臓を麻酔された非ヒト哺乳動物から取り出すこと、脾臓を小片に切り刻むこと、および、単細胞懸濁物を作製するように、脾臓細胞を脾臓被膜から、細胞ろ過器のナイロンメッシュに通して、適切な緩衝液の中に絞り出すことを伴う。細胞は洗浄され、遠心分離され、（赤血球が存在すれば）赤血球を溶解する緩衝液に再懸濁される。溶液が再び遠心分離され、ペレットにおける残留するリンパ球が最後に、新鮮な緩衝液に再懸濁される。
【０１８５】
いったん単離され、単細胞懸濁物で存在すると、リンパ球は不死性細胞株に対して融合される。これは典型的にはマウスのミエローマ細胞株であるが、ハイブリドーマを作出するために有用な多くの他の不死性細胞株がこの技術分野では知られている。好ましいマウスミエローマ系統には、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、米国）から入手可能な、ＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するミエローマ系統、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ、米国）から入手可能なＸ６３  Ａｇ８６５３細胞およびＳＰ−２細胞が含まれるが、これらに限定されない。融合が、ポリエチレングリコールなどを使用して達成される。得られたハイブリドーマは、その後、融合されていない親ミエローマ細胞の成長または生存を阻害する１つまたは複数の物質を含有する選択培地において成長させられる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を有しないならば、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、この場合、そのような物質により、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長が妨げられる。
【０１８６】
ハイブリドーマは典型的には、マクロファージのフィーダー層の上で成長させられる。マクロファージは、好ましくは、脾臓細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹子に由来し、典型的には、ハイブリドーマを置床する数日前に、不完全フロイントアジュバントなどにより抗原刺激処理される。様々な融合方法が、Ｇｏｄｉｎｇ、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９頁〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６）に記載される。
【０１８７】
細胞は、コロニー形成および抗体産生のための十分な期間、選択培地において成長させられる。これは通常、７日〜１４日の間である。その後、ハイブリドーマのコロニーが、免疫原／抗原と結合する抗体の産生についてアッセイされる。アッセイは典型的には、比色法によるＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが成長させられるウエルに適合化され得るアッセイはどれも用いることができる。他のアッセイには、免疫沈降および放射免疫アッセイが含まれる。所望される抗体産生について陽性であるウエルが、１つまたは複数の異なるコロニーが存在するかどうかを明らかにするために調べられる。２つ以上のコロニーが存在するならば、細胞は、ただ１つの細胞が、所望される抗体を産生するコロニーを生じさせていることを確実にするために再クローン化し、成長させることができる。ただ１つの明らかなコロニーを有する陽性のウエルが典型的には、１つのモノクローナル抗体のみが検出および産生され続けることを保証するために再クローン化および再アッセイされる。
【０１８８】
モノクローナル抗体を産生し続けていることが確認されるハイブリドーマが、その後、適切な培地において、例えば、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０などにおいて、より大きな量で成長させられる。代替では、ハイブリドーマ細胞を動物における腹水腫瘍としてインビボで成長させることができる。
【０１８９】
所望されるモノクローナル抗体を産生させるために十分に成長させた後、モノクローナル抗体を含有する成長培地（または腹水）が細胞から分離され、それに存在するモノクローナル抗体が精製される。精製は典型的には、ゲル電気泳動、透析、プロテインＡ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅまたはプロテインＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用するクロマトグラフィー、あるいは、固体担体（例えば、アガロースビーズまたはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズなど）に連結された抗マウスＩｇによって達成される（これらはすべてが、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、刊行物番号１８−１０３７−４６、Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＣ）に記載される。その開示は本明細書により参照によって組み込まれる）。結合した抗体が典型的には、低いｐＨの緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシン緩衝液または酢酸塩緩衝液）を使用することによって、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムまたはプロテインＬカラムから溶出され、抗体含有分画物が直ちに中和される。これらの分画物はプールされ、透析され、必要に応じて濃縮される。
【０１９０】
抗体の重鎖および軽鎖をコードするＤＮＡが、（例えば、抗体（例えば、マウスまたはヒト）の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）従来の手順を使用して容易に単離され、配列決定されることができる。単離されると、ＤＮＡは発現ベクターに連結することができ、その後、発現ベクターが宿主細胞にトランスフェクションされる。
【０１９１】
本発明による抗体は、典型的には、組換え手段によって生成される。
【０１９２】
免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドおよび重鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、組換えＤＮＡ手法に都合よく供され得る、任意のベクターであり得る別々の組換えベクターまたは単一のベクターに独立して挿入されることができる。ベクターの選択は多くの場合、ベクターが導入されることになる宿主細胞に依存する。
【０１９３】
組換え産生のための様々な方法が最新技術で広く知られており、それらは、原核生物細胞および真核生物細胞におけるタンパク質発現を、その後の抗体単離、および、通常は医薬的に許容される純度への精製とともに含む。
【０１９４】
宿主細胞における上述されるような抗体の発現のために、それぞれの改変された軽鎖および重鎖をコードする核酸が標準的方法によって発現ベクターに挿入される。
【０１９５】
ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、プロモーター（例えば、構成的または誘導可能）、および、必要な場合にはターミネーター配列をそれぞれ連結し、かつ、それらを、複製のために必要な情報を含有する好適なベクターに挿入するために使用される手順が、当業者には広く知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８９）を参照のこと）。
【０１９６】
発現が、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、酵母細胞または細菌細胞のような適切な原核生物または真核生物の宿主細胞において行われ、抗体が細胞（溶解後の上清または細胞）から回収される。
【０１９７】
本発明では、抗体のそれぞれの構成成分をそれ自身の個々の宿主細胞において発現させるか、または、抗体構成成分の様々な組合せをそれら自身の宿主細胞において発現させることが意図される。したがって、例えば、軽鎖を１つの宿主細胞において発現させることができ、重鎖を別の宿主細胞において発現させることができる。あるいは、１つの軽鎖および１つの重鎖が１つの宿主細胞において発現させられ、第２の軽鎖および第２の重鎖が別の宿主細胞において発現させられる。またあるいは、両方の重鎖および両方の軽鎖を同じ宿主細胞において発現させることができる。
【０１９８】
両方の重鎖および両方の軽鎖が同じ宿主細胞において発現させられるとき、これらの鎖のインビトロ組立ては必要でなく、馴化培地からの抗体の精製のみが、すなわち、プロテインＡクロマトグラフィーによる精製のみが要求されることが理解されるであろう（例えば、Ｊａｃｋｍａｎ  Ｊ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２０１０  Ｊｕｌ  ２）、２８５（２７）：２０８５０〜９、Ｅｐｕｂ  ２０１０  Ｍａｙ  ５）を参照のこと）。
【０１９９】
鎖の少なくとも１つが、それ以外の３つの鎖とは異なる宿主細胞において発現させられるときには、これらの鎖のインビトロ組立てが要求される。
【０２００】
具体的な実施形態によれば、宿主細胞としては細菌細胞が含まれる。
【０２０１】
別の実施形態によれば、抗体が、国際公開ＷＯ２００９／１０７１２９（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載されるようにｉｎｃｌｏｎａｌ（インクローナル）体として作製される。
【０２０２】
組換えタンパク質（すなわち、重鎖および軽鎖）を封入体（すなわち、染色性物質の核凝集物または細胞質凝集物）として生じさせることができる細菌宿主が選択されることができる。
【０２０３】
使用される宿主細胞（例えば、第１の宿主細胞および第２の宿主細胞）は、同一の生物種または異なる生物種に属し得る。
【０２０４】
本発明の具体的な実施形態によれば、宿主細胞はグラム陰性細菌から選択される。
【０２０５】
本明細書中で使用される「グラム陰性細菌」は、特徴的な染色特性を顕微鏡下で有する細菌を示し、この場合、グラム陰性細菌はグラム染色法の期間中に染色されないか、または、アルコールによって脱色されるかのどちらかである。グラム陰性細菌は一般に、下記の特徴を有する：（ｉ）それらの細胞壁は、（グラム陽性細菌においてはるかにより大きいレベルで存在する）ペプチドグリカンのほんの数層を含む；（ｉｉ）細胞が、ペプチドグリカン層の外側にある、（リピドＡ（コア多糖）およびＯ−多糖からなる）リポ多糖を含有する外膜によって取り囲まれる；（ｉｉｉ）ポーリンが外膜に存在し、特定の分子に対する細孔のように作用する；（ｉｖ）細胞周辺腔と呼ばれる、ペプチドグリカンの層と、二次的細胞膜との間の空間が存在する；（ｖ）Ｓ層が、ペプチドグリカンではなく、外膜に直接に結合する；（ｖｉ）リポタンパク質が多糖骨格に結合し、これに対して、グラム陽性細菌では、リポ多糖が存在しない。
【０２０６】
本発明の教示に従って使用することができるグラム陰性細菌の例には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、ｅｒｗｉｎｉａ、および、Ｓｅｒｒａｔｉａが含まれるが、これらに限定されない。大腸菌以外のそのようなグラム陰性細菌、例えば、シュードモナス属細菌などを宿主細胞として使用することは、シュードモナス属細菌の代謝特性および生理学的特性の両方のために大きい経済的価値をもたらすことに留意しなければならない。特定の条件のもとで、例えば、シュードモナス属細菌は、大腸菌よりも大きい細胞培養密度に成長させることができ、したがって、潜在的により大きい生成物収量をもたらすことができる。
【０２０７】
本発明の教示に従った使用のために好適な細菌発現ベクターの例には、この分野では広く知られているｐＥＴ（商標）システム、Ｔ７システムおよびｐＢＡＤ（商標）システムが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
発現ベクターを細菌宿主細胞に導入する様々な方法がこの分野では広く知られており、これらの方法は主に、使用される宿主システムに依存する。
【０２０９】
宿主細胞は、同じ培地において共培養することができ、または、別々に培養することができる。
【０２１０】
宿主細胞は、多量の組換え重鎖および組換え軽鎖の発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、組換えタンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素の条件が含まれるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細菌が、本発明の組換えタンパク質を産生させるために培養される任意の培地を示す。そのような培地には典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細菌宿主は、所望される量に依存して、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿において培養することができる。培養を、組換え宿主のために適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量で行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０２１１】
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の適切な発現レベルが得られると、ポリペプチドが封入体から回収される。組換えタンパク質を細菌の封入体から回収する様々な方法がこの技術分野では広く知られており、そのような方法は典型的には、細胞溶解、それに続く、変性剤での可溶化を伴う［例えば、Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｅｚ−ＣｌａｒｋおよびＧｅｏｒｇｉｏｕ、「封入体および凝集状態からのタンパク質の回収」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １：１〜２０（１９９１）。同様にまた、「大腸菌におけるＩｎｃｌｏｎａｌの発現」と題される下記の実施例の節を参照のこと］。
【０２１２】
簡単に記載すると、封入体を、効果的な精製戦略を与える簡単な遠心分離によって細胞質タンパク質の大部分から分離することができる。その後、封入体は、尿素（例えば、８Ｍ）またはグアニジニウム塩酸塩のような強い変性剤によって、また、時には極端なｐＨまたは温度を伴って可溶化することができる。変性剤濃度、暴露時間および暴露温度はそれぞれのタンパク質について標準化されなければならない。完全に可溶化される前に、封入体は、混入タンパク質のいくらかを除くために、変性剤および界面活性剤の薄い溶液により洗浄することができる。
【０２１３】
最後に、可溶化された封入体を変性条件下でのクロマトグラフィー技術によるさらなる精製に直接に供することができ、または、重鎖および軽鎖が精製前において生来の立体配座にリフォールディングされる場合がある。
【０２１４】
したがって、再構成／リフォールディングされた重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチド（すなわち、可溶化されている還元されたポリペプチド）のさらなる精製を、リフォールディングの前において、および、代替として、または、加えて、リフォールディングの後において行うことができる。
【０２１５】
抗体精製の様々な方法がこの技術分野では広く知られており、本明細書中上記および下記の実施例の節において記載される。ＩｇＧを精製するための他の方法が、「親イオウ様（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ−ｌｉｋｅ）相互作用を発現させるシアル酸によりグラフト化される担体でのＩｇＧおよびインスリンの精製」、Ｈａｍｉｄ  ＬａｋｈｉａｒｉａおよびＤａｎｉｅｌ  Ｍｕｌｌｅｒｂ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｂ、第８１８巻、第１号、２００５年４月１５日、５３頁〜５９頁に記載される。
【０２１６】
代替として、または、加えて、精製は、確認用成分または治療用成分を介して、（例えば、ＰＥ３８に融合される抗体を精製するためにＰＥ３８と結合する抗体カラムを使用して）親和性に基づくことができる。
【０２１７】
抗体のさらなる精製を、細胞成分または他の混入物（例えば、他の細胞核酸または細胞タンパク質）を、この技術分野で広く知られているアルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌでのバンド形成、カラムクロマトグラフィーおよびアガロースゲル電気泳動などを含めて、標準的な技術によって除くために行うことができる。Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７））を参照のこと。種々の方法がタンパク質精製のために十分に確立され、広範囲に使用される（例えば、微生物タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、カチオン交換（カルボキシメチル樹脂）、アニオン交換（アミノエチル樹脂）および混合モード交換）、親イオウ性吸着（例えば、ベータ−メルカプトエタノールおよび他のＳＨリガンドとの吸着）、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−アガロース、アザ−アレノフィリック（ａｚａ−ａｒｅｎｏｐｈｉｌｉｃ）樹脂またはｍ−アミノフェニルボロン酸を用いたクロマトグラフィー）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ｎｉ（ＩＩ）親和性物質およびＣｕ（ＩＩ）親和性物質を用いたクロマトグラフィー）、サイズ排除クロマトグラフィー、および、電気泳動的方法（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ，Ｍ．Ａ．、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７５（１９９８）、９３〜１０２））。
【０２１８】
リフォールディング収率を改善するために、再構成された重鎖および再構成された軽鎖は、無傷の抗体の形成を最大限にするために選択される比率で提供される。この目的を達成するために、約１：１から１：３まで、１：１．５から１：３まで、１：２から１：３までの重鎖対軽鎖のモル比が提供される。例示的な実施形態において、重鎖対軽鎖のモル比は約１：２である。
【０２１９】
所望されるとき、免疫グロブリンは、管理されたインビトロでのグリコシル化に供することができ、この場合、グリコシル化は、Ｉｓａｂｅｌｌｅ  Ｍｅｙｎｉａｌ−ｓａｌｌｅｓおよびＤｉｄｉｅｒ  Ｃｏｍｂｅｓ（タンパク質のインビトログリコシル化：酵素的アプローチ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４６巻、第１号、１９９６年４月１８日、１頁〜１４頁）によって記載される方法に従って行うことができる。
【０２２０】
本発明の１つの局面が、本発明による抗体を含む医薬組成物である。本発明の別の局面が、医薬組成物を製造するための本発明による抗体の使用である。本発明のさらなる局面が、本発明による抗体を含む医薬組成物を製造するための方法である。別の局面において、本発明は、医薬用キャリアと一緒に配合される、本発明による抗体を含有する組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【０２２１】
抗体、および、抗体を含む組成物（例えば、医薬組成物）は、診断用途および治療用途で使用することができ、また、そのようなものとして、治療キットまたは診断キットに含むことができる。
【０２２２】
従って、本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分（即ち、抗体）を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、ＦＤＡ承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された症状を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０２２３】
本発明による抗体の一つの用途は、炎症および感染に関連する疾患を処置するための用途である。
【０２２４】
本明細書中で使用される用語「炎症」は、（例えば、リンパ節への）細胞の遊走が炎症の開始または進行に寄与する炎症性応答を含むいかなる病状をも示す。
【０２２５】
慢性炎症性疾患および急性炎症疾患の両方を含めて、炎症性応答を含む多くの疾患および状態が、本明細書中上記に記載される方法論を使用して処置されることができる。
【０２２６】
かかる疾患の例は、過敏症に関連する炎症性疾患を含む。
【０２２７】
過敏症の例としては、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Ｔリンパ球媒介過敏症およびＤＴＨが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
本明細書中に開示される二機能性抗体により処置することができる他のタイプの炎症性疾患が、自己免疫疾患、感染性疾患、移植片拒絶疾患、アレルギー性疾患およびガン性疾患である。
【０２２９】
本明細書中で使用される用語「ガン」は、ガン腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病を含むがこれらに限定されない増殖性疾患を示す。ガン性疾患の具体的な例には、下記のものが含まれるが、それらに限定されない：骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、成熟化を伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ性白血病、急性単球性白血病、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病など；悪性リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など；リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病など；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺混合腫瘍、結腸腺腫；腺ガン、例えば、小細胞肺ガン、腎臓、子宮、前立腺、膀胱、卵巣、結腸、肉腫、脂肪肉腫、粘液様、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（胞巣型）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング腫瘍など；その他、これには、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中皮腫、乳房、皮膚、前立腺および卵巣が含まれる。
【０２３０】
疾患の処置を、抗体を単独で、または、医薬組成物としてキャリアと一緒に投与することによって行うことができる。
【０２３１】
本明細書中で使用される場合、「医薬用キャリア」には、生理学的に適合可能であるありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、キャリアは、（例えば、注射または注入による）静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、脊髄投与または表皮投与のために好適である。
【０２３２】
本発明の組成物は、この技術分野で知られている様々な方法によって投与することができる。当業者によって理解されるであろうように、投与経路および／または投与様式は、所望される結果に依存して変わるであろう。本発明の化合物をある特定の投与経路によって投与するために、化合物を、その不活性化を防止するための物質により被覆すること、または、化合物を、その不活性化を防止するための物質とともに同時投与することが必要である場合がある。例えば、化合物を適切なキャリア（例えば、リポソームまたは希釈剤）において対象に投与することができる。
【０２３３】
医薬的に許容される希釈剤には、生理食塩水および緩衝剤水溶液が含まれる。医薬用キャリアには、無菌の水溶液または水性分散液、および、無菌の注射可能な溶液または分散物を即時調製するための無菌粉末が含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用がこの技術分野では知られている。
【０２３４】
表現「非経口投与」および表現「非経口投与される」は、本明細書中で使用される場合、経腸投与および局所投与でない投与様式、通常的には注射による投与様式を意味し、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内の注射および注入を包含する。
【０２３５】
これらの組成物はまた、補助剤（例えば、保存剤、湿潤化剤、乳化剤および分散化剤など）を含有することができる。微生物の存在の防止を、無菌化手順（上記）によって、また、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールおよびソルビン酸など）を含むことによって、それらの両方で保証することができる。等張剤（例えば、糖および塩化ナトリウムなど）を組成物の中に含むこともまた望ましい場合がある。
【０２３６】
加えて、注射可能な医薬形態物の長期にわたる吸収を、吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）を含むことによってもたらすことができる。
【０２３７】
選択される投与経路にかかわらず、本発明の化合物（これは好適な水和形態で使用される場合がある）および／または本発明の医薬組成物は、当業者に知られている従来の方法によって、医薬的に許容される投薬形態物に配合される。
【０２３８】
本発明の医薬組成物における有効成分の実際の投薬レベルは、所望される治療応答を特定の患者、組成物および投与様式について達成するために効果的である当該有効成分の量を、患者にとって毒性であることを伴うことなく得るように変化させることができる。選択される投薬レベルは、用いられる本発明の特定の組成物の活性、投与経路、投与時間、用いられている特定の化合物の排出速度、処置の継続期間、用いられる特定の組成物との併用で使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置されている患者の年齢、性別、体重、病状、全体的な健康状態および以前の病歴、ならびに、医療技術分野で広く知られている同様な要因を含めて、様々な薬物動態学的要因に依存するであろう。
【０２３９】
組成物は無菌でなければならず、かつ、組成物がシリンジによって送達可能である程度に流動的でなければならない。水に加えて、キャリアは好ましくは、等張性の緩衝生理食塩溶液である。
【０２４０】
適正な流動性を、例えば、被覆（例えば、レシチンなど）の使用によって、また、分散の場合には要求される粒子サイズを維持することによって、また、界面活性剤の使用によって維持することができる。多くの場合、等張剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトールなど）および塩化ナトリウム）を組成物に含むことが好ましい。
【０２４１】
本発明の二重特異性抗体の他の意図される使用には、分析物の精製における使用；免疫組織化学および酵素免疫アッセイにおける使用；放射線画像法および放射免疫治療のための使用、ならびに、薬物送達のための使用が含まれる。
【０２４２】
他の意図される使用が、Ｃａｏ  Ｙ、Ｓｕｒｅｓｈ  ＭＲ、Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、１９９８（Ｎｏｖ−Ｄｅｃ）、９（６）：６３５〜４４に示される（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）。
【０２４３】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２４４】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２４５】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２４６】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２４７】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２４９】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２５０】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２５１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明のいくつかの実施形態を非限定様式で例示する。
【０２５２】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ���Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２５３】
実施例１〜実施例４のための材料および方法
重鎖および軽鎖のための発現ベクターの構築：抗体の重鎖および軽鎖をＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させるためのベクターをｐＨＡＫベクターの骨格で構築した（ＨａｋｉｍおよびＢｅｎｈａｒ、２００９）。重鎖ベクターを、Ｋｕｎｋｅｌ変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５）を使用してＣＨ２−ＣＨ３定常領域において改変して、“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”法（Ｍｅｒｃｈａｎｔ他、１９９８）による重鎖・重鎖ヘテロダイマー優先変異を含有させた。その目的のために、ｐＨＡＫ−ＩｇＨベクターのＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＣＪ２３６株において調製し、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させ、放出された一本鎖ウラシル含有プラスミドＤＮＡを、フェノール−クロロホルム精製を使用して翌日に集めた。ＤＮＡサンプルを、ＴＭ緩衝液（０．０１Ｍ  ＭｇＣｌ２、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５）において、プライマー１（“ｋｎｏｂ”変異導入用）、または、プライマー２、プライマー３およびプライマー４（“ｈｏｌｅ”変異導入用）の混合物のどちらかとインキュベーションした（表３、本明細書中下記）。その次の工程において、ＤＮＡサンプルをＴ７ポリメラーゼ酵素およびＴ４リガーゼ酵素（これらは、０．４ｍＭ  ＡＴＰ、０．４ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、６ｍＭ  ＤＴＴによって供給された）の存在下でインキュベーションし、形質転換によりＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細菌に導入した。得られた構築物を、ｐＨＡＫ−ＨＣ−ｋｎｏｂ（これは、Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃの変異を有する）およびｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅ（これは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ３４９Ｃの変異を有する）と名づけた。変異含有領域を、ＮｓｉＩ−ＮｄｅＩの制限酵素を使用してｐＨＡＫ−ＩｇＨ−ＰＥ３８ベクター（ＨａｋｉｍおよびＢｅｎｈａｒ、２００９）にサブクローン化し、これにより、ｐＨＡＫ−ＨＣ−ｋｎｏｂ−ＰＥ３８ベクターおよびｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８ベクターを得た。上記構築物は、ＰＥ３８毒素に融合される抗体重鎖の発現をもたらした。
【表３】
2014510084.tif 000004
2014510084.tif 000005
【０２５４】
重鎖−軽鎖の効率的な対形成に備えるために、生来型の鎖間ジスルフィド結合を１つのＩｇＨ／ＩｇＬ対において代替位置における操作された結合により置き換えた。ｐＨＡＫ−ＬＣ−Ｃｙｓに挿入された変異は、ＶＬにおけるＡ１０４Ｃ、および、Ｃ−カッパにおけるＣ２１８ｄｅｌであった。ｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓに挿入された変異は、ＶＨにおけるＡ４４Ｃ、および、ＣＨ１におけるＣ２２２Ａであった。ｐＨＡＫ−ＬＣ−Ｃｙｓベクターの構築は、２つの逐次クローニング工程を含むものであった。最初、選択された抗体の軽鎖可変ドメインをプライマー５およびプライマー６により増幅し、ＮｄｅＩ−ＢｓｉＷＩの制限酵素で消化し、同じ酵素で前もって消化されたｐＨＡＫ−ＩｇＬにクローン化した。得られたベクターは、プライマー５およびプライマー７によるＩｇＬの増幅のためのテンプレートとして役立った。これをＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩの酵素で消化し、（ＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ消化の）ｐＨＡＫ−ＩｇＬにクローン化した。ｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ（Ａ４４Ｃ）を構築するために、選択された抗体の重鎖可変領域を、ＳｔｕＩ−ＮｈｅＩ消化およびｐＨＡＫ−ＩｇＨベクターへのクローニングの後、プライマー８およびプライマー９により増幅した。Ｃ２２２Ａ変異のＣＨ１への挿入を、プライマー１０およびプライマー１２によるか、または、プライマー１１およびプライマー１３によるかのどちらかで作製された２つのＰＣＲフラグメントの２つを増幅し、その後、プライマー１２およびプライマー１３によるアセンブリーＰＣＲによって行った。組み立てられたＤＮＡフラグメントをＮｄｅＩおよびＢｓｒＧＩの制限酵素で消化し、前もって構築されたｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ（Ａ４４Ｃ）ベクターにクローン化した。
【０２５５】
一緒にされたｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ−ｋｎｏｂベクター（Ａ４４Ｃ、Ｃ２２２Ａ、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ）を、ｐＨＡＫ−ＨＣ−ＣｙｓのＮｄｅＩ−ＳａｃＩＩ消化領域をｐＨＡＫ−ＨＣ−ｋｎｏｂベクターに挿入することによって構築した。所望される抗体の軽鎖可変領域または重鎖可変領域をｐＨＡＫ−ＬＣ型ベクター（ＮｄｅＩ−ＢｓｉＷＩサブクローニングを使用）またはｐＨＡＫ−ＨＣ型ベクター（ＮｄｅＩ−ＮｈｅＩサブクローニングを使用）のどちらかにおいてクローン化した。
【０２５６】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩｇＧ産生：ｐＨＡＫ−ＩｇＨおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬにそれぞれ基づく重鎖構築物および軽鎖構築物を、封入体として、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  ｐＵＢＳ５００の別個の細菌培養において発現させた。封入体を、Ｉｎｃｌｏｎａｌｓ  ＩｇＧ製造法（ＨａｋｉｍおよびＢｅｎｈａｒ、２００９）に従って精製し、変性させ、混合し、再折り畳みさせた。二重特異性ＩｇＧを生成するために、相補的な重鎖を１：１のモル比で加えた。同じ規則が軽鎖について適用された。
【０２５７】
プロテインＡ精製：再折り畳みプロセスの後、ＩｇＧおよびＩｇＧ型融合タンパク質をプロテインＡアフィニティーカラムに負荷し、細菌由来混入物および効率的に再折り畳みされなかったタンパク質から分離した。タンパク質を０．１ｍＭクエン酸により溶出し、１ＭのＴｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ８．５）により中和し、その後、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に対して透析した。タンパク質の最終濃度を２８０ｎｍにおける吸光度によって求めた。
【０２５８】
ゲルろ過クロマトグラフィー：ゲルろ過分析を、精製抗体の分子量を求めるために、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＡＥＫＴＡ  ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。プロテインＡ精製されたタンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）により前もって平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに加え、同じ緩衝液を０．５ｍｌ／分の流速で使用して分離した。調べたＩｇＧ様タンパク質の分子量を、その溶出体積を標準物のＩｇＧ（１５０ｋＤａ）およびＩｇＧ型免疫毒素ＩｇＧ−ＰＥ３８（２２５ｋＤａ）の溶出体積と比較することによって求めた。
【０２５９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動をＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）に従って行った。１／５体積の５ｘサンプル緩衝液をタンパク質サンプルに加え、その後、ゲルへの負荷に先立って５分間煮沸した。７．５％、１０％および１２％のミニゲルを１２０Ｖで泳動した。全長型ＩｇＧの評価のために、非還元のサンプル（β−メルカプトエタノール非存在下）を負荷し、一方で、還元後のタンパク質サンプルを重鎖構成成分および軽鎖構成成分に分離した。ゲルをクーマシーブルー溶液（０．０５％クーマシーＲ−２５０、２０％エタノール、１０％氷酢酸）で２時間染色し、タンパク質バンドが明瞭に認められ得るまで脱色溶液（２０％エタノール、１０％氷酢酸）において洗浄した。タンパク質バンドの密度を、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  １Ｄ走査型レーザーデンシトメーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）によって分析した。染色されたゲルには、非精製の分画物についてはレーンあたり２０μｇのタンパク質が、または、精製タンパク質については３μｇ〜５μｇが負荷された。免疫ブロッティングによってさらに処理されたゲルには、その量の１／１０が負荷された。
【０２６０】
ウエスタンブロット分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を、（Ｔｏｗｂｉｎ他、１９９２）に従ってニトロセルロースメンブランに電気転写した。メンブランを、ゆっくりとした振とうとともに、５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳにより少なくとも１時間、室温でブロッキング処理した。メンブランをＰＢＳにより洗浄し、その後、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とインキュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）による３回の洗浄、および、ＰＢＳによる１回の洗浄を行った後、ニトロセルロースフィルターを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）により、供給者によって記載されるように発色させた。
【０２６１】
ＥＬＩＳＡ分析：単一特異性ＩｇＧおよび二重特異性ＩｇＧによる抗原結合を下記のように求めた：９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳにおける５μｇ／ｍｌの純粋な抗原（１００μｌ／ウエル）により４℃で一晩にわたって被覆し、（ＰＢＳにおける）３％スキムミルクにより３７℃で１時間にわたってブロッキング処理した。すべてのその後の工程を室温（２５℃）で行った。プロテインＡ精製されたタンパク質をＰＢＳＴにおける３倍希釈系列でプレートに加えて１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（ＰＢＳＴにおける１：５０００の希釈、１００μｌ／ウエル）との１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、発色性ＨＲＰ基質ＴＭＢを使用して発色させ、発色反応を１ＭのＨ２ＳＯ４により停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０２６２】
実施例１
Ｉｎｃｌｏｎａｌｓ法を使用するＥ．ｃｏｌｉにおける全長型ＩｇＧの産生
全長型ＩｇＧをＥ．ｃｏｌｉ細菌において産生させるためのＩｎｃｌｏｎａｌｓ法（ＨａｋｉｍおよびＢｅｎｈａｒ、２００９）には、ｐＨＡＫ−ＩｇＨベクターおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬベクターを、ＩｇＨおよびＩｇＬを別個の細菌培養においてそれぞれ産生させるために使用することが含まれる。重鎖および軽鎖の可変領域が抗体特異性を規定し、その一方で、定常領域がそれぞれのベクターについて共通している。タンパク質の発現、精製および再折り畳みをＩｎｃｌｏｎａｌｓプロトコルに従って行い、精製タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、サイズ排除クロマトグラフィーおよび抗原結合分析を使用して評価した。単一特異性抗体とは対照的に、二重特異性ＩｇＧは、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖からなり、したがって、発現工程および再折り畳み工程には、４つのタンパク質による同時作業が含まれる。
【０２６３】
実施例２
重鎖−重鎖ヘテロダイマーの構築および評価
“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”法（Ｒｉｄｇｗａｙ他、１９９６）を、Ｅ．ｃｏｌｉにおける二重特異性ＩｇＧ産生のための異なる重鎖の好ましいヘテロダイマー化に対する解決法として実行した。４つの変異（“ｋｎｏｂ”重鎖におけるＴ３６６Ｗ、および、“ｈｏｌｅ”重鎖におけるＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）および非対称なジスルフィド結合（相補的な重鎖におけるＳ３５４ＣおよびＹ３４９Ｃ）の導入は、哺乳動物細胞で産生されるＩｇＧにおける重鎖の高い（９５％超の）ヘテロダイマー化レベルをもたらしたことが以前に明らかにされた（Ｍｅｒｃｈａｎｔ他、１９９８）（図１Ａ）。上記変異を、重鎖の発現および試験に使用されるｐＨＡＫ−ＨＣ−ｋｎｏｂベクターおよびｐＨＡＫ−ＨＣ−ｈｏｌｅベクターの構築のために使用し、一方で、共通する非改変の軽鎖がすべてのＩｇＧ構築物のために役立った（図２Ａ〜図２Ｈ）。Ｔ４２７（抗ＣＤ３０）抗体およびＦＲＰ５（抗ｅｒｂＢ２）抗体を方法評価のためのモデルＩｇＧとして使用した（Ｈａｒｗｅｒｔｈ他、１９９２；Ｎａｇａｔａ他、２００４）。抗体の重鎖および軽鎖を封入体として発現させ、遠心分離によって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図３）。Ｉｎｃｌｏｎａｌｓプロトコルに従った一緒での４つの抗体鎖の再折り畳み、続いてのプロテインＡ精製は、全長型ＩｇＧの生成を可能にした。
【０２６４】
ヘテロダイマー化収量の詳細な特徴づけのために、“ｈｏｌｅ−重”鎖を、さらなる３８ｋＤａをタンパク質分子量に与えたＰＥ３８毒素（Ｋｒｅｉｔｍａｎ他、１９９２）との融合タンパク質として発現させた。図４Ａ〜図４Ｂに例示されるように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を使用した場合、“ｋｎｏｂ”重鎖のホモダイマー（１５０ｋＤａ）、毒素融合の“ｈｏｌｅ”重鎖のホモダイマー（２３０ｋＤａ）、および、２つの異なる重鎖のヘテロダイマー（１９０ｋＤａ）を識別することが可能であった。図４Ｂは、Ｉｎｃｌｏｎａｌｓ法の製造されたＴ４２７“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”抗体が非還元性ポリアクリアミドゲルでは１９０ｋＤａのバンドとして移動したこと、そして、還元性条件下では３つの構成成分（ＩｇＬ、ＩｇＨおよびＩｇＨ−ＰＥ３８）に分離され得たことを明示している。
【０２６５】
ＩｇＧの“ｋｎｏｂ−ｋｎｏｂ”体および“ｈｏｌｅ−ｈｏｌｅ”体を、再折り畳み溶液に一方の重鎖タイプのみ（“ｋｎｏｂ”または“ｈｏｌｅ”のどちらか）を供給することによって生成させようとする試みでは、ＩｇＧの組立て不良、および、部分的サイズの分子の成績がもたらされた（図５Ａ〜図５Ｂ）。
【０２６６】
サイズ排除クロマトグラフィーを使用する二重特異性のｉｎｃｌｏｎａｌｓ型“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”抗体の評価により、タンパク質の大部分が１９０ｋＤａの分子として移動し、一方で、ほんの小さいタンパク質割合がホモダイマーを表したことが明らかになった（図６）。Ｉｎｃｌｏｎａｌｓ型“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥでの密度分析では、Ｅ．ｃｏｌｉにより産生されたＩｇＧの９０％超が重鎖ヘテロダイマー化を受けたと結論された（図７Ａ〜図７Ｃ）。
【０２６７】
二重特異性分子の結合活性を評価するために、“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”二重特異性Ｔ４２７−ＦＲＰ５抗体を構築した。このＩｇＧは、４つの異なる鎖から、すなわち、ＦＲＰ５−ｋｎｏｂ重鎖およびＴ４２７−ｈｏｌｅ−ＰＥ３８重鎖、ならびに、ＦＲＰ５（ｗｔ）軽鎖およびＴ４２７（ｗｔ）軽鎖からなるものであった。この構築物におけるＰＥ３８毒素は、Ｔ４２７重鎖存在についての検出シグナルとして使用された。単一特異性のＴ４２７  ＩｇＧおよびＦＲＰ５  ＩｇＧをコントロールとした。間接的ＥＬＩＳＡを使用して、本発明者らは各抗原に対する抗体の結合能を明らかにした（ＦＲＰ５についてはｅｒｂＢ２（図８Ａ）、Ｔ４２７についてはＣＤ３０（示されず））。特別なＥＬＩＳＡ（図８Ｂ）分析により、ＦＲＰ５抗原に対する抗体結合が調べられるが、Ｔ４２７−ＰＥ３８鎖が検出された。このアッセイでは、２つの抗原と結合することができるＴ４２７−ＦＲＰ５ヘテロダイマーの存在が明らかにされた。
【０２６８】
実施例３
重鎖−軽鎖の特異的対形成の構築および評価
ジスルフィド結合を２つの可変ドメインの間に導入して、生来型の重鎖−軽鎖の鎖間Ｓ−Ｓ結合を置き換えるために、Ｔ４２７抗体を使用した。この抗体は広範囲に研究されており、ｄｓＦｖのためのそのシステイン位置が十分に明確にされている（Ｎａｇａｔａ他、２００４）。ｐＨＡＫ−ＨＣ−ＣｙｓベクターおよびｐＨＡＫ−ＬＣ−Ｃｙｓベクターを、定義されるｄｓＦｖによる従来のシステイン位置の置換によって構築した。ｄｓＦｖ様の改変された単一特異性ＩｇＧの生成により、ただ１つだけのｄｓＦｖ様の重鎖−軽鎖の鎖間Ｓ−Ｓ結合によって安定化される全長型ＩｇＧの効率的な形成が明らかにされた（図９、レーン３）。
【０２６９】
ｐＨＡＫ−ＨＣ−Ｃｙｓ−ｋｎｏｂの構築は、完全に二重特異性の全長型Ｔ４２７−ＦＲＰ５  ＩｇＧの生成を可能にした（図９、レーン４）。重鎖のヘテロダイマー化が“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”戦略によってもたらされ、重鎖−軽鎖の対整合が、非対称な鎖間ジスルフィド結合によって保証された。さらに、対をなさない重鎖および軽鎖が与えられたＩｇＧ再折り畳み溶液では、完全なＩｇＧ分子が生じなかった（図１０）。
【０２７０】
実施例４
２つのさらなる二重特異性抗体を、材料および方法において上記で記載されるように生成し、精製し、評価した。
【０２７１】
１．Ｔ４２７−αＳＡ  ＩｇＧ：これはＣＤ３０およびストレプトアビジン（ＳＡ）に結合する。この二重特異性抗体は、４つの鎖から、すなわち、ＩｇＬ−Ｔ４２７−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ１０４：Ｃｙｓ２１８ｄｅｌ）、ＩｇＨ−Ｔ４２７−ｋｎｏｂ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ４４：Ｃｙｓ２２２Ａｌａ＋Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ）、ＩｇＬ−αＳＡおよびＩｇＨ−αＳＡ−ｈｏｌｅ（Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ）からなるものであった。
【０２７２】
２．Ｔ４２７−αＰＥ（Ｂ１１クローン）ＩｇＧ：これはＣＤ３０およびＰＥ３８（シュードモナス菌体外毒素の３８ｋＤａフラグメント）に結合する。この二重特異性抗体は、４つの鎖から、すなわち、ＩｇＬ−Ｔ４２７−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ１０４：Ｃｙｓ２１８ｄｅｌ）、ＩｇＨ−Ｔ４２７−ｋｎｏｂ−Ｃｙｓ（Ｃｙｓ４４：Ｃｙｓ２２２Ａｌａ＋Ｓ３５４Ｃ：Ｔ３６６Ｗ）、ＩｇＬ−αＰＥおよびＩｇＨ−αＰＥ−ｈｏｌｅ（Ｙ３４９Ｃ：Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ）からなるものであった。
【０２７３】
抗ストレプトアビジン（αＳＡ）抗体および抗ＰＥ  Ｂ１１クローン（αＰＥ）抗体を、“Ｒｏｎｉｔｌ”抗体ファージディスプレーライブラリーを親和性選択することによってｓｃＦｖとして単離した（Ａｚｒｉｅｌ−Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ他、２００４、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、３３５、１７７〜９２）。重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインを（上記のように）ｐＨＡＫ−ＩｇＨ−ｈｏｌｅおよびｐＨＡＫ−ＩｇＬにそれぞれクローン化した。鎖を封入体としてＥ．ｃｏｌｉ細菌において産生させ、遠心分離によって精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分析した（図１１）。適切な重鎖および軽鎖を、Ｉｎｃｌｏｎａｌｓプロトコル（ＨａｋｉｍおよびＢｅｎｈａｒ、２００９）に従って、単一特異性のＴ４２７抗体、αＳＡ抗体、αＰＥ抗体、ならびに、二重特異性のＴ４２７−αＳＡ抗体およびＴ４２７−αＰＥ抗体の製造のために混合し、再折り畳みさせ、プロテインＡ親和性精製によって精製した。これらの抗体をそれぞれの抗原に対する結合活性についてＥＬＩＳＡによって分析した（図１２および図１３）。示されるように、これらの二重特異性抗体が首尾良く生成し、その２つのアームの特異性に従って２つの抗原と結合した。特異性が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に対する無視できる結合によって明らかにされた。
【０２７４】
実施例５〜実施例９の材料および方法
哺乳動物細胞におけるＩｇＧの発現のためのｐＤｕａｌベクターの構築：抗体の重鎖および軽鎖をＥ．ｃｏｌｉにおいて産生させるためのベクターをｐＭＡＺベクターの骨格で構築した（Ｍａｚｏｒ  Ｙ．他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７  Ａｐｒ  １０）、３２１（１−２）：４１〜５９）。２つの二シストロン型ｐＭＡＺベクターを構築した：重鎖およびネオマイシン選択マーカーを有したｐＭＡＺ−ＩｇＨ、および、軽鎖およびハイグロマイシン選択マーカーを有したｐＭＡＺ−ＩｇＬ。ＩｇＧ発現が、これら２つのベクターの共トランスフェクション、続いて、安定なトラスフェクタントを得るための二重の薬物選抜によって媒介された。
【０２７５】
ｐＤｕａｌベクターは、定常領域におけるＡｐａＩ制限部位を欠失させるためにＩｇＨ−Ａｐａｄｅｌ−ＮｈｅＩ−ＦｏｒプライマーおよびＩｇＨ−ＢｓｒＧＩ−Ｒｅｖプライマーを使用して前もって変異させたｐＭＡＺ−ＩｇＨベクターに基づくものであった。その次の工程は、ｐＣＭＶ−ＩｇＬ−ｔｅｒｍカセットを構築すること、および、それをｐＭＡＺ−ＩｇＨ−ＡｐａｄｅｌベクターのＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ制限部位の間にクローン化することであった。ｐＣＭＶ−ＩｇＬ−ｔｅｒｍカセットを、１）ＡｐａＩ制限部位によるＢｓｓＨＩの置換をもたらしたｐＣＭＶ−ＫｐｎＩ−ＦｏｒプライマーおよびｐＣＭＶ−Ｒｅｖプライマーを使用するｐＣＭＶプロモーターの増幅（このＡｐａＩ部位は、Ｆｃコード領域に存在したＡｐａＩ部位が変異させられたので、このプラスミドにおいて唯一となるであろう）；２）ＮｏｔＩ制限部位によるＸｂａＩの置換をもたらしたＴ４２７Ｌ−ＦｏｒプライマーおよびＴ４２７Ｌ−Ｒｅｖプライマーを使用するＴ４２７軽鎖抗体（ＶＬ＋ＬＣ）の増幅；３）ＢＧＨ−ｐｏｌｙＡ−ＦｏｒプライマーおよびＢＧＨ−ｐｏｌｙＡ−ＥｃｏＲＩ−Ｒｅｖプライマーを使用するＢＧＨポリアデニル化部位の増幅、を含む３つのＰＣＲ生成物の組立てによって組み立てた。上記ＰＣＲ生成物を、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（アセンブリーＰＣＲ）、続いて、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素による消化、そして、上記で記載されるようなｐＭＡＺ−ＩｇＨ−ＡｐａｄｅｌベクターへのクローニングによってｐＣＭＶ−ＩｇＬ−ｔｅｒｍカセットに組み立てた。得られたベクターをｐＤｕａｌと名づけ、これを、ＶＬ（カッパ軽鎖；ラムダ軽鎖については、Ｖ−ラムダ可変ドメインがＡｐａＩ−ＡｖｒＩＩ制限フラグメントとしてクローン化されなければならない、ラムダ軽鎖を有する別個のベクターが要求される）のためのＡｐａＩ−ＢｓｉＷＩの制限部位と、ＶＨのためのＢｓｓＨＩ−ＮｈｅＩの制限部位とを使用する異なる抗体の可変ドメインのクローニングのためにさらに使用した。
【０２７６】
ハイグロマイシン選択マーカーを有する類似したｐＤｕａｌベクターを構築した。
【０２７７】
上記ｐＤｕａｌベクターを作製するために使用されたプライマーのリストを本明細書中下記の表４にまとめる。
【表４】
2014510084.tif 000006
2014510084.tif 000007
【０２７８】
ＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）細胞のトランスフェクション：リン酸カルシウムトランスフェクション法を、１μｇのｐＤｕａｌプラスミドまたはｐＭＡＺプラスミドをＴ−ＲＥｘ  ２９３細胞（これはトランスフェクションの２４時間前に６ウエルプレートに３×１０５細胞／ウエルで播種された）に導入するために適用した。一過性トランスフェクションについては、培地サンプルをトランスフェクション後２４時間、４８時間および７２時間で集めた。安定なトランスフェクタントを得るために、細胞をトランスフェクション後２４時間で集め、適切な抗生物質（１．２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．２ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン）が補充されるＤＭＥＭに播種した。安定なクローンを集め、それらの培地を抗体の存在について評価した。
【０２７９】
ＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）細胞におけるＩｇＧ産生：前もって得られた安定なクローンを、０．９ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．１５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン（通常濃度の７５％）が補充されるＤＭＥＭにおいて組織培養フラスコ（２５０ｃｍ３）に移した。翌日（または、細胞が８０％のコンフルエンスに達したとき）、培地を５０％ＤＭＥＭ（＋Ｌ−Ｇｌｕ、ＰＮＳおよびウシ血清）および５０％ＤＣＣＭ１（＋Ｌ−Ｇｌｕ、ＰＮＳ、血清非含有）＋７５％の抗生物質濃度（０．９ｍｇ／ｍｌのＧ４１８および０．１５ｍｇ／ｍｌのハイグロマイシン）に２４時間にわたって変えた。翌日、培地を１００％の血清非含有ＤＣＣＭ１（＋Ｌ−Ｇｌｕ、ＰＮＳ）に変えた。細胞由来のＤＣＣＭ１培地を２日〜４日毎に集め、新しい血清非含有培地に静かに変えた。フラスコから４回までの収集物を集めることが可能であった。
【０２８０】
哺乳動物細胞において産生されたＩｇＧのプロテインＡ精製：抗体分泌細胞由来の集められたＤＣＣＭ１培地を、１５分間、５５００ｒｐｍで遠心分離し、その後、０．４５μｍのフィルトラップ（ｆｉｌｔｒａｐ）を使用してろ過した。培地を×２０濃度のリン酸塩緩衝液（４００ｍＭ）により１：２０で希釈して、２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４および２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４の最終濃度にし、混合物を１ｍｌ／分の流速でプロテインＡカラムに負荷した。タンパク質を０．１ｍＭクエン酸（ｐＨ３）により溶出し、１ＭのＴｒｉｓ（ＨＣｌ）（ｐＨ８．５）により中和し、その後、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に対して透析した。タンパク質の最終濃度を２８０ｎｍにおける吸光度によって求めた。
【０２８１】
ＥＬＩＳＡ分析：単一特異性ＩｇＧおよび二重特異性ＩｇＧによる抗原結合を下記のように求めた：９６ウエルＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳにおける５μｇ／ｍｌの純粋な抗原（１００μｌ／ウエル）により４℃で一晩にわたって被覆し、（ＰＢＳにおける）３％ミルクにより３７℃で１時間にわたってブロッキング処理した。すべてのその後の工程を室温（２５℃）で行った。プロテインＡ精製されたタンパク質（または馴化培地）をＰＢＳＴにおける３倍希釈系列でプレートに加えて１時間インキュベーションし、ＰＢＳＴにより３回洗浄した。ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（ＰＢＳＴにおける１：５０００の希釈、１００μｌ／ウエル）との１時間のインキュベーションの後、プレートをＰＢＳＴで洗浄し、発色性ＨＲＰ基質ＴＭＢを使用して発色させ、発色反応を１ＭのＨ２ＳＯ４により停止させた。プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【０２８２】
細胞ＥＬＩＳＡ分析：Ａ４３１／ＣＤ３０細胞株（これは、ＣＤ３０、すなわち、Ｔ４２７のための標的抗原を発現する）およびＳＫＢＲ３細胞株（これは、ＥｒｂＢ２、すなわち、ＦＲＰ５のための標的抗原を発現する）を、１０％ウシ胎児血清、１％Ｌ−グルタミンおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されるＤＭＥＭにおいて維持し、５％ＣＯ２とともに３７℃で成長させた。細胞（２×１０４個／ウエル）を１００μｌの培地において９６ウエル組織培養プレートに播種し、３７℃で一晩成長させた。一晩の成長の後、培地を静かに注ぎ出し、細胞を、室温で１５分間、３％グルタルアルデヒド水溶液により固定処理した。細胞をＰＢＳにより洗浄し、ＰＢＳにおける５％ＢＳＡにより２時間、３７℃でブロッキング処理した。すべてのその後の工程は、通常のＥＬＩＳＡプロトコルに従って室温（２５℃）で行った。
【０２８３】
ドットブロット分析：トランスフェクション後７２時間の細胞馴化培地の１００μｌのサンプルを等体積のＰＢＳで希釈し、ドットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ、米国）を使用して真空マニホールドを介してニトロセルロースメンブランフィルターに加えた。メンブランを３７℃で１時間、ＰＢＳにおける３％（ｖ／ｖ）脱脂乳によりブロッキング処理した後、メンブランをＰＢＳにより軽く洗浄し、その後、ヤギ抗ヒトＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳによる３回の洗浄の後、メンブランをＥＣＬ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、米国）により発色させた。
【０２８４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動をＬａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ、１９７０）に従って行った。１／５体積の５ｘサンプル緩衝液をタンパク質サンプルに加え、その後、ゲルへの負荷に先立って５分間煮沸した。７．５％、１０％および１２％のミニゲルを１２０Ｖで泳動した。全長型ＩｇＧの評価のために、非還元のサンプル（β−メルカプトエタノール非存在下）を負荷し、一方で、還元後のタンパク質サンプルを重鎖構成成分および軽鎖構成成分に分離した。ゲルをクーマシーブルー溶液（０．０５％クーマシーＲ−２５０、２０％エタノール、１０％氷酢酸）で２時間染色し、タンパク質バンドが明瞭に認められ得るまで脱色溶液（２０％エタノール、１０％氷酢酸）において洗浄した。タンパク質バンドの密度を、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ  １Ｄ走査型レーザーデンシトメーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデン）によって分析した。染色されたゲルには、非精製の分画物についてはレーンあたり２０μｇのタンパク質が、または、精製タンパク質については３μｇ〜５μｇが負荷された。免疫ブロッティングによってさらに処理されたゲルには、その量の１／１０が負荷された。
【０２８５】
ウエスタンブロット分析：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離されたタンパク質を、（Ｔｏｗｂｉｎ他、１９９２）に従ってニトロセルロースメンブランに電気転写した。メンブランを、ゆっくりとした振とうとともに、５％脱脂粉乳を含有するＰＢＳにより少なくとも１時間、室温でブロッキング処理した。メンブランをＰＢＳにより洗浄し、その後、ＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）とインキュベーションした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）による３回の洗浄、および、ＰＢＳによる１回の洗浄を行った後、ニトロセルロースフィルターを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）により、供給者によって記載されるように発色させた。
【０２８６】
実施例５
哺乳動物細胞におけるＩｇＧの産生
二重特異性抗体を産生させるための哺乳動物細胞におけるＩｇＧの産生のために使用されるベクターシステムは、モノクローナル抗体を哺乳動物細胞培養で産生させるためのｐＭＡＺベクターに基づくものであった（Ｍａｚｏｒ  Ｙ他、２００７）。ベクターｐＭＡＺ−ＩｇＨをヒトγ１重鎖発現のために設計し、ｐＭＡＺ−ＩｇＬをヒトκ軽鎖発現のために設計した。軽鎖および重鎖の可変ドメインを適切なベクターに導入し、ＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションし、安定な抗体分泌クローンを特定し、保存した。血清に対する細胞クローンの飢餓化により、所望される抗体の分泌が１リットルの培養液あたり最大で２０ｍｇの総収量でもたらされた。
【０２８７】
実施例６
ＩｇＧ分子を哺乳動物細胞において産生させるための二重ベクターの構築
ｐＤｕａｌベクターを、同じベクターを使用する抗体の軽鎖および重鎖の産生のためのキメラ構築物を組み立てるために、抗体の軽鎖および重鎖を独立して産生させるために以前に使用されたｐＭＡＺ−ＩｇＬベクターおよびｐＭＡＺ−ＩｇＨベクター（Ｍａｚｏｒ  Ｙ他、２００７）に由来するＤＮＡフラグメントの融合によって構築した（図１４）。ＩｇＬおよびＩｇＨを、別個のＣＭＶプロモーターの制御下にある別個のカセットとしてｐＤｕａｌベクターにおいて構築した。軽鎖カセットにおけるＡｐａＩ制限部位によるＢｓｓＨＩの置換は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの二重ベクターへのその後のクローニングを簡略化した：ＡｐａＩ−ＢｓｉＷＩがＶＬのクローニングのために使用され、ＢｓｓＨＩ−ＮｈｅＩがＶＨのクローニングのために使用された。
【０２８８】
実施例７
哺乳動物細胞へのトランスフェクションのための二重特異性ベクターの構築
二重特異性分子を産生させるためのｐＤｕａｌ型ベクターを構築するために、“ｋｎｏｂ”、“ｈｏｌｅ”および“Ｃｙｓ”に関連づけられる変異をｐＨＡＫベクターからｐＤｕａｌシステムにクローン化した。このクローニングプロセスにより、表５に列挙される一連の構築物が得られた。ｐＤｕａｌ−Ｔ４２７ベクターにおけるＨｙｇｒｏ耐性カセットによるＮｅｏＲの置換を、ＡｖｒＩＩおよびＫｐｎＩの制限酵素を使用するｐＭＡＺ−ＩｇＬベクターからの当該カセットのサブクローニングによって行った。得られたｐＤｕａｌ−ＮｅｏＲベクターおよびｐＤｕａｌ−ＨｙｇｒｏＲベクターの対を、哺乳動物細胞におけるトランスフェクションと、４つの異なる抗体鎖、すなわち、２つの重鎖および２つの軽鎖を１つの細胞株において産生する安定なクローンの選択とのために使用することができる。
【表５】
2014510084.tif 000008
【０２８９】
実施例８
一過性トランスフェクションされたＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）細胞における二重特異性ＩｇＧ分子の産生および評価
下記の実施例では、ＩｇＧ分泌システムにおける抗体の軽鎖と重鎖との間でのＳ−Ｓ架橋の重要性が明らかにされ、また、二重特異性抗体の適切な軽鎖および重鎖をカップリングするための“代替システイン”理論が、Ｅ．ｃｏｌｉにより産生された二重特異性“Ｉｎｃｌｏｎａｌｓ”において明らかにされているのと同様に、哺乳動物の産生システムにおいて当てはまることが証明される。ＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）細胞株をこの研究のために使用した。細胞を、ｐＤｕａｌ−Ｔ４２７（ｗｔ）（これはｗｔ型ＩｇＧをコードする）、ｐＤｕａｌ−Ｔ４２７−Ｌ（Ｃｙｓ）−Ｈ（ｗｔ）（これは、ｗｔ型重鎖と、Ｃ−κシステインを欠き、かつ、操作されたシステインをＶＬに含有する軽鎖とをコードし、これは、ＩｇＧを形成するはずがない１対の鎖であるにちがいない）、または、コントロールとしてのｐＭＡＺ−ＩｇＬ＋ｐＭＡＺ−ＩｇＨの対（これはｗｔ型ＩｇＧ産生のための以前のシステムである）による一過性トランスフェクションに供した。トランスフェクション後の培地のウエスタンブロット分析による評価では、完全なサイズの抗体がｐＤｕａｌ−Ｔ４２７−Ｌ（Ｃｙｓ）−Ｈ（ｗｔ）トランスフェクション細胞の培地において検出されず、一方で、ｐＤｕａｌ（ｗｔ）構築物のトランスフェクションが、（Ｅｒｂｉｔｕｘ希釈物との比較では１μｇ／ｍｌにまで達する）検出可能なレベルの分泌された抗体をもたらしたことが示された（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。
【０２９０】
二重特異性ＩｇＧ分子の分泌もまた明らかにされ、また、二重特異性ＩｇＧの形成が、“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”法および“代替システイン”法（これは“ジスルフィド安定化”法とも呼ばれる）を使用した場合には優先することもまた評価された。ｐＤｕａｌベクターを、ＨＥＫ２９３  ＴＲｅｘ細胞に一過性にトランスフェクションし、分泌された抗体を馴化培地のウエスタンブロット分析によって検出した。４つのｐＭＡＺベクター（ｐＭＡＺ−Ｔ４２７−ＩｇＬ、ｐＭＡＺ−Ｔ４２７−ＩｇＨ、ｐＭＡＺ−ＦＲＰ５−ＩｇＬおよびｐＭＡＺ−ＦＲＰ５−ＩｇＨ）によりトランスフェクションされた細胞をコントロールとした。実験の分析により、１）“ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ”法は、異なる重鎖の効率的なヘテロダイマー化のための解決法であること；２）“代替Ｃｙｓ”法は、同じ抗体アームの軽鎖および重鎖のカップリングのための解決法を提供すること；３）上記２つの方法の組合せは、哺乳動物細胞の産生システムにおける全長型の二重特異性ＩｇＧ抗体の分泌をもたらすことが明らかにされた。図１６に示されるように、鎖の「誤った」組合せが使用されるときには、完全なサイズのＩｇＧを馴化培地の免疫ブロット分析において全く認めることができない。無傷のＩｇＧを、単一特異性ＩｇＧを発現する細胞（レーン１およびレーン２）、２つの単一特異性ＩｇＧを発現する細胞（レーン５（２つのｐＤｕａｌベクター）およびレーン４（４つのｐＭＡＺベクター））、および、二重特異性ＩｇＧを発現する細胞（レーン７）において認めることができる。
【０２９１】
実施例９
安定なトランスフェクションＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）細胞における二重特異性ＩｇＧ分子の産生および評価ならびに抗原結合の評価
安定な抗体分泌クローンを得るために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３  Ｔ−ＲＥｘ（商標）細胞をｐＤｕａｌ−ＦＲＰ５−Ｌ（ｗｔ）−Ｈ（ｈｏｌｅ）ＮｅｏＲベクターおよびｐＤｕａｌ−Ｔ４２７−Ｌ（Ｃｙｓ）−Ｈ（Ｃｙｓ−ｋｎｏｂ）ＨｙｇｒｏＲベクターにより共トランスフェクションした。得られたＮｅｏ＋Ｈｙｇｒｏ耐性クローンを、それらの能力について、すなわち、１）抗体分泌能、２）両方の抗原と結合する能力、３）さらなる精製のための全長型ＩｇＧを分泌する能力について確認した。予備的な抗体分泌試験を、ドットブロット分析を使用して行い（図１７において明らかにされる試験例）、これにより、低分泌クローン、中程度分泌クローンおよび高分泌クローンが特定された。中程度分泌体および高分泌体として特徴づけられるクローンをそれらの抗原結合活性について調べた。ＥＬＩＳＡを行って、ｅｒｂＢ２組換え抗体（ＦＲＰ５）およびＣＤ３０組換え抗体（Ｔ４２７）に対するそれぞれのクローンの結合レベルを評価した（図１８）。これらの抗原のそれぞれと結合することができた数クローンが第３工程にまで続き、それらをプロテインＡアフィニティーカラムで精製した（図１９）。精製抗体を分析して、それらのサイズ、純度、および、組換え抗原または抗原提示細胞のどちらかに対する結合活性を求めた（図２０および図２１）。図１８に示されるように、ＥＬＩＳＡにおける結合シグナルはこれらのクローンの分泌レベルと相関した。図２０および図２１に示されるように、プロテインＡ精製された二重特異性ＩｇＧはＣＤ３０抗原およびＥｒｂＢ２抗原の両方に結合した。そのようなＥＬＩＳＡ（図２１）において、単一特異性ＩｇＧ（これらは二価である）は、それぞれがその同族抗原に対してであるが、アビディティー効果のために、より強い結合シグナルを示すであろうことが予想された。予備的な細胞ＥＬＩＳＡ（図２２）では、クローンＤ３によって分泌される二重特異性抗体により、抗原陽性細胞が染色されることが示される。
【０２９２】
実施例１０
単一特異性抗体の構築
最初に、ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ（ＫＩＨ）変異を含む単一特異性抗体（Ｔ４２７  ＩｇＧ）を作製した。ＫＩＨ型Ｔ４２７  ＩｇＧ分子の結合活性を評価するために、ＥＬＩＳＡを行った。ＥＬＩＳＡプレートをＭＢＰ−ＣＤ３０により被覆し、（ＰＥ３８に融合される）Ｔ４２７  ＫＩＨ型ＩｇＧとインキュベーションした。Ｔ４２７  ＫＩＨ型分子の結合能が、非改変型Ｔ４２７  ＩｇＧおよびＴ４２７−ＰＥ３８  ＩｇＧ−ＰＥ３８の結合と類似していたことが明らかにされた（図２４）。
【０２９３】
続いて、ＫＩＨ変異と、本明細書中上記で記載されるような軽鎖におけるシステイン変異との両方を含む単一特異性抗体（Ｔ４２７  ＩｇＧ）を作製した。
【０２９４】
この単一特異性Ｔ４２７抗体を生成するために、下記の４つの鎖を構築した：ＩｇＬ−ＰＥ３８、ＩｇＨ−ｋｎｏｂ、ＩｇＨ−Ｃｙｓ−ｈｏｌｅおよびＩｇＬ−Ｃｙｓ。ＶＬ非改変の軽鎖に融合される３８ｋＤａのＰＥ３８の存在は、（ＫＩＨヘテロダイマー化分析と同様な）適切な重鎖および軽鎖の対形成、ならびに、完全なサイズの単一特異性分子の形成の分析可能性をもたらした（図は示されず）。
【０２９５】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２９６】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【図２Ａ−２Ｄ】
2014510084.tif 000009
【図２Ｅ−２Ｈ】
2014510084.tif 000010
【図１Ａ−１Ｂ】
2014510084.tif 000011
【図３】
2014510084.tif 000012
【図４Ａ−４Ｂ】
2014510084.tif 000013
【図５Ａ−５Ｂ】
2014510084.tif 000014
【図６】
2014510084.tif 000015
【図７Ａ−７Ｃ】
2014510084.tif 000016
【図８Ａ−８Ｂ】
2014510084.tif 000017
【図９Ａ−９Ｂ】
2014510084.tif 000018
【図１０】
2014510084.tif 000019
【図１１】
2014510084.tif 000020
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2014510084.tif 000021
【図１３Ａ−１３Ｃ】
2014510084.tif 000022
【図１４】
2014510084.tif 000023
【図１５Ａ−１５Ｂ】
2014510084.tif 000024
【図１６】
2014510084.tif 000025
【図１７】
2014510084.tif 000026
【図１８Ａ−１８Ｂ】
2014510084.tif 000027
【図１９Ａ−１９Ｂ】
2014510084.tif 000028
【図２０Ａ−２０Ｂ】
2014510084.tif 000029
【図２１Ａ−２１Ｂ】
2014510084.tif 000030
【図２２】
2014510084.tif 000031
【図２３】
2014510084.tif 000032
【図２４】
2014510084.tif 000033
【配列表】
2014510084000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成25年7月21日(2013.7.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ領域およびＦａｂ領域を含む抗体であって、
（ｉ）前記Ｆｃ領域が２つの非同一の重鎖を含み、ただし、前記２つの非同一重鎖の少なくとも１つが、前記２つの非同一重鎖の間における立体的相補を形成するようにアミノ酸修飾を含み、前記Ｆｃ領域は、前記Ｆｃ領域の一方の重鎖の突出部、および、前記Ｆｃ領域の第２の重鎖における立体的代償空洞を含み、前記突出部は前記代償空洞の中に突き出ており、前記相補が、
（ａ）前記一方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける１つの位置でのアミノ酸を、側鎖体積が元のアミノ酸よりも大きい別のアミノ酸により置換して前記突出部を生成すること；および
（ｂ）前記第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおける１つの位置でのアミノ酸を、側鎖体積が元のアミノ酸よりも小さい別のアミノ酸により置換して前記代償空洞を生成すること
によって生じ、
側鎖体積が元のアミノ酸よりも大きい前記アミノ酸は、チロシン、アルギニン、フェニルアラニン、イソロイシンおよびトリプトファンからなる群から選択され、側鎖体積が元のアミノ酸よりも小さい前記アミノ酸は、アラニン、グリシン、バリンおよびトレオニンからなる群から選択される；および
（ｉｉ）前記Ｆａｂ領域が、前記Ｆａｂ領域の第１の重鎖と第１の軽鎖との間における第１の共有結合性連結、および、前記Ｆａｂ領域の第２の重鎖と第２の軽鎖との間における第２の共有結合性連結を含み、ただし、前記第１の共有結合性連結は、前記一方の重鎖のＣＨ１ドメインと、前記一方の軽鎖のＣＬドメインとの間の天然に存在するジスルフィド結合であり、前記第２の共有結合性連結は、前記第２の重鎖のＶＨドメインの４４位のシステインと、前記第２の軽鎖のＶＬドメインの１００位のシステインとの間のジスルフィド結合であり、前記位置の番号表記は、ＫａｂａｔおよびＷｕによるものであり、前記第２の重鎖は、前記第２の軽鎖とのその生来型のジスルフィド結合を欠いており、前記生来型のジスルフィド結合は、重鎖を、天然に存在する生殖細胞系列の抗体遺伝子にコードされるその同族軽鎖につなぐ鎖間のジスルフィド結合である、
抗体。
【請求項２】
キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記第１の重鎖の前記ＣＨ３ドメインは前記第２の重鎖の前記ＣＨ３ドメインに共有結合により連結される、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体の第１の抗原結合部位が抗原の第１のエピトープと結合し、かつ、前記抗体の第２の抗原結合部位が前記抗原の第２のエピトープと結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体の第１の抗原結合部位が第１の抗原のエピトープと結合し、かつ、前記抗体の第２の抗原結合部位が第２の抗原のエピトープと結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
それぞれの軽鎖が、ただ１つだけのジスルフィド結合を介してその同族重鎖に連結される、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
無傷の抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＧからなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記第１の重鎖はＴ３６６Ｗ変異を含み、かつ、前記第２の重鎖は、Ｔ３６６Ｓ変異、Ｌ３６８Ａ変異、Ｙ４０７Ｖ変異を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記第１の重鎖はＳ３５４Ｃ変異を含み、かつ、前記第２の重鎖はＹ３４９Ｃ変異を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、前記第２の抗原結合部位はｅｒｂＢ２と結合する、請求項５に記載の抗体。
【請求項１３】
前記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、前記第２の抗原結合部位はシュードモナス菌体外毒素（ＰＥ）と結合する、請求項５に記載の抗体。
【請求項１４】
前記第１の抗原結合部位はＣＤ３０と結合し、かつ、前記第２の抗原結合部位はストレプトアビジンと結合する、請求項５に記載の抗体。
【請求項１５】
前記重鎖の少なくとも１つが治療用成分と結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１６】
前記重鎖の少なくとも１つが、特定可能な成分と結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
霊長類抗体、ブタ抗体、ネズミ科抗体、ウシ抗体、ヤギ抗体およびウマ抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の抗体。
【請求項１８】
（ａ）前記第１の重鎖をコードする第１の核酸分子を提供すること；
（ｂ）前記第２の重鎖をコードする第２の核酸分子を提供すること；
（ｃ）前記第１の軽鎖をコードする第３の核酸分子を提供すること；
（ｄ）前記第２の軽鎖をコードする第４の核酸分子を提供すること；
（ｅ）前記第１、第２、第３および第４の核酸分子を含む宿主細胞を、核酸分子の発現を可能にする条件のもとで培養すること、および
（ｆ）請求項１に記載の抗体を回収すること
を含む、請求項１に記載の抗体を調製する方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞は細菌細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞は哺乳動物細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記発現が前記細菌細胞の封入体で生じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸分子のそれぞれが、異なる宿主細胞にトランスフェクションされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸分子のそれぞれが、同じ宿主細胞にトランスフェクションされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌細胞はグラム陰性細菌細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｆ）の後、前記抗体をプロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬからなる群から選択されるタンパク質で精製することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
活性な薬剤として、請求項１に記載の抗体を含み、かつ、医薬的に許容されるキャリアを含む医薬組成物。
【請求項２７】
感染症あるいは炎症性の疾患または炎症性の障害の処置において使用するための請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
前記炎症性障害はガンである、請求項２７に従って使用するための、請求項１に記載の抗体。
【国際調査報告】
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