(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
３〜５個の配列セクションを含む腎臓の標的化のためのペプチドであって、
前記配列セクションが、−（ＫＫＥＥＥ）−、−（ＲＲＥＥＥ）−、−（ＫＫＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥＥ）−および−（ＫＫＫＥＥ）−からなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記配列セクションの前記ペプチド全体に対する割合が５０％（アミノ酸単位の数に基づく）を超え、かつ
前記ペプチド全体の少なくとも８０％（アミノ酸単位の数に基づく）が、Ｋ及びＥ、あるいはＲ及びＥからなる、
（但し、Ｅはグルタミン酸を、Ｋはリジンを、Ｒはアルギニンをそれぞれ示す）、
ことを特徴とする、腎臓の標的化のためのペプチド。
【請求項２】
前記ペプチド全体として、４０アミノ酸単位までの鎖長を有する、
ことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記配列セクションの３〜５個が連続している、
ことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
（ＲＲＥＥＥ）３Ｒ、（ＫＫＥＥ）５Ｋ、（ＫＫＫＥＥ）３Ｋ、（ＫＫＫＥＥＥ）３Ｋおよび（ＫＫＥＥＥ）３Ｋからなる群から選択されるいずれか１つである、
ことを特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
（ＲＲＥＥＥ）３Ｒ、（ＫＫＥＥ）５Ｋ、（ＫＫＫＥＥ）３Ｋ、（ＫＫＫＥＥＥ）３Ｋおよび（ＫＫＥＥＥ）３Ｋからなる群から選択されるいずれか１つである、
ことを特徴とする、ペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の少なくとも１つのペプチドと、
前記少なくとも１つのペプチドと共有結合された少なくとも１つの活性化合物とを含む
ことを特徴とする、腎臓の標的化のための接合体。
【請求項７】
前記少なくとも１つの活性化合物は、前記少なくとも１つのペプチドと、スペーサを介して共有結合されている
ことを特徴とする、請求項６に記載の接合体。
【請求項８】
活性化合物が、
免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤、免疫療法剤、消炎剤、抗生物質、静ウイルス剤、降圧剤、尿酸排泄剤、利尿剤ならびに抗線維化剤からなる群から選択される
ことを特徴とする、請求項６または７に記載の接合体。
【請求項９】
免疫抑制剤は、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、フィンゴリモドもしくはトリプトライドの群から選択される、
細胞分裂阻害剤は、アトラセンタン、ニンテダニブ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ドキシフルリジン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、シクロホスファミド、トロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、エストラムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、クロルメチン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、イホスファミド、テモゾロミド、チオテパ、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、ヒドロキシカルバミド、ミトタン、アザシチジン、シタラビン、ネララビン、ボルテゾミブ、アナグレリド、もしくは、タンパク質キナーゼインヒビターの群から選択される；
免疫療法剤は、セツキシマブ、アレムツズマブおよびベバシズマブの群から選択される；
消炎剤は、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾンもしくはブデソニドの群から選択される；
抗生物質は、ペニシリン系、セファロスポリン系、β−ラクタマーゼインヒビター、カルバペネム系、モノバクタム系、テトラサイクリン系、マクロライド系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ならびに、エンジイン類の群から選択される；
静ウイルス剤は、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、ブリブジン、シドホビル、ホスカルネット、イドクスウリジンもしくはトロマンタジンの群から選択される；
降圧剤は、ＡＣＥインヒビター、サルタン類、レニンインヒビター、ならびに、ベータブロッカーの群から選択される；
尿酸排泄剤は、プロベネシドもしくはベンズブロマロンから選択される；
利尿剤は、アセタゾラミド、フロセミド、トラセミド、ブメタニド、ピレタニド、アゾセミド、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドロクロロチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、クロパミド、キシパミド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、アミロライド、トリアムテレン、スピロノラクトン、カンレノン、エプレレノンもしくはスピロノラクトンの群から選択される；
抗線維化剤は、ピルフェニドンもしくはセリシクリブの群から選択される
ことを特徴とする、請求項８に記載の接合体。
【請求項１０】
タンパク質キナーゼインヒビターは、イマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブもしくはニロチニブの群から選択される；
ペニシリン系は、ベンジルペニシリン、メチシリンもしくはアモキシシリンの群から選択される；
セファロスポリン系は、セフロキシム、セフォタキシム、セファドロキシルもしくはセフィキシムの群から選択される；
β−ラクタマーゼインヒビターは、クラブラン酸、スルバクタムもしくはタゾバクタムの群から選択される；
カルバペネム系は、イミペネムもしくはメロペネムの群から選択される；
モノバクタム系は、アズトレオナムである；
テトラサイクリン系は、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンもしくはチゲサイクリンの群から選択される；
マクロライド系抗生物質は、エリスロマイシンＡである；
グリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシンである
エンジイン類は、カリチアマイシンである；
ＡＣＥインヒビターは、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルもしくはゾフェノプリルの群から選択される；
サルタン類は、ロサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、オルメサルタンもしくはテルミサルタンの群から選択される；
レニンインヒビターは、アリスキレンである；
ベータブロッカーは、プロプラノロール、ピンドロール、ソタロール、ボピンドロール、アテノロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、オクスプレノロール、カルベジロールもしくはラベタロールの群から選択される
ことを特徴とする、請求項９に記載の接合体。
【請求項１１】
ペプチドの少なくとも１つと、該少なくとも一つのペプチドと共有結合された活性化合物の１つ以上と、を含む接合体であって、
前記ペプチドが、３〜５個の連続した配列セクションを含み、
前記配列セクションが、−（ＫＫＥＥＥ）−、−（ＲＲＥＥＥ）−、−（ＫＫＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥＥ）−および−（ＫＫＫＥＥ）−からなる群から選択される少なくとも１つであり、
前記配列セクションの前記ペプチド全体に対する割合が５０％（アミノ酸単位の数に基づく）を超え、かつ
前記ペプチド全体の少なくとも８０％（アミノ酸単位の数に基づく）が、Ｋ及びＥ、あるいはＲ及びＥからなり、
（但し、Ｅはグルタミン酸を、Ｋはリジンを、Ｒはアルギニンをそれぞれ示す）、
前記活性化合物が、免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤、免疫療法剤、消炎剤、抗生物質、静ウイルス剤、降圧剤、尿酸排泄剤、利尿剤ならびに抗線維化剤からなる群から選択される、
ことを特徴とする、接合体。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの活性化合物は、前記少なくとも１つのペプチドと、スペーサを介して共有結合されている
ことを特徴とする、請求項１１に記載の接合体。
【請求項１３】
前記ペプチドは、腎臓の標的化のためのペプチドである、
ことを特徴とする、請求項１１または１２に記載の接合体。
【請求項１４】
前記ペプチド全体として、４０アミノ酸単位までの鎖長を有する、
ことを特徴とする、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項１５】
免疫抑制剤は、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、フィンゴリモドもしくはトリプトライドの群から選択される、
細胞分裂阻害剤は、アトラセンタン、ニンテダニブ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ドキシフルリジン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、シクロホスファミド、トロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、エストラムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、クロルメチン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、イホスファミド、テモゾロミド、チオテパ、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、ヒドロキシカルバミド、ミトタン、アザシチジン、シタラビン、ネララビン、ボルテゾミブ、アナグレリド、もしくは、タンパク質キナーゼインヒビターの群から選択される；
免疫療法剤は、セツキシマブ、アレムツズマブおよびベバシズマブの群から選択される；
消炎剤は、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾンもしくはブデソニドの群から選択される；
抗生物質は、ペニシリン系、セファロスポリン系、β−ラクタマーゼインヒビター、カルバペネム系、モノバクタム系、テトラサイクリン系、マクロライド系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、ならびに、エンジイン類の群から選択される；
静ウイルス剤は、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、ブリブジン、シドホビル、ホスカルネット、イドクスウリジンもしくはトロマンタジンの群から選択される；
降圧剤は、ＡＣＥインヒビター、サルタン類、レニンインヒビター、ならびに、ベータブロッカーの群から選択される；
尿酸排泄剤は、プロベネシドもしくはベンズブロマロンから選択される；
利尿剤は、アセタゾラミド、フロセミド、トラセミド、ブメタニド、ピレタニド、アゾセミド、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドロクロロチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、クロパミド、キシパミド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、アミロライド、トリアムテレン、スピロノラクトン、カンレノン、エプレレノンもしくはスピロノラクトンの群から選択される；
抗線維化剤は、ピルフェニドンもしくはセリシクリブの群から選択される
ことを特徴とする、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の接合体。
【請求項１６】
タンパク質キナーゼインヒビターは、イマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブもしくはニロチニブの群から選択される；
ペニシリン系は、ベンジルペニシリン、メチシリンもしくはアモキシシリンの群から選択される；
セファロスポリン系は、セフロキシム、セフォタキシム、セファドロキシルもしくはセフィキシムの群から選択される；
β−ラクタマーゼインヒビターは、クラブラン酸、スルバクタムもしくはタゾバクタムの群から選択される；
カルバペネム系は、イミペネムもしくはメロペネムの群から選択される；
モノバクタム系は、アズトレオナムである；
テトラサイクリン系は、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンもしくはチゲサイクリンの群から選択される；
マクロライド系抗生物質は、エリスロマイシンＡである；
グリコペプチド系抗生物質は、バンコマイシンである
エンジイン類は、カリチアマイシンである；
ＡＣＥインヒビターは、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルもしくはゾフェノプリルの群から選択される；
サルタン類は、ロサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、オルメサルタンもしくはテルミサルタンの群から選択される；
レニンインヒビターは、アリスキレンである；
ベータブロッカーは、プロプラノロール、ピンドロール、ソタロール、ボピンドロール、アテノロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、オクスプレノロール、カルベジロールもしくはラベタロールの群から選択される
ことを特徴とする、請求項１５に記載の接合体。
【請求項１７】
少なくとも１つの活性化合物が、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合されることを特徴とする、請求項６〜１６のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項１８】
少なくとも１つの活性化合物が、鎖内のアミノ酸に結合される
ことを特徴とする、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項１９】
活性化合物が、エステル結合を介して結合される
ことを特徴とする、請求項６〜１８のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項２０】
請求項６〜１９のいずれか一項に記載の接合体の調製のためのプロセスであって、前記少なくとも１つの活性化合物が前記少なくとも１つのペプチドにコンジュゲート化される
ことを特徴とする、プロセス。
【請求項２１】
腎臓の標的化のための医薬用としての、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項２２】
腎臓の標的化及び前記活性化合物による治療のための医薬用としての、請求項６〜１９のいずれか一項に記載の接合体。
【請求項２３】
腎臓の標的化のための医薬の調製における、請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１つの、腎臓の標的化のための有効成分としての使用。
【請求項２４】
腎臓の標的化及び活性化合物による治療のための医薬の調製における、請求項６〜１９のいずれか一項に記載の接合体の少なくとも１つの、腎臓の標的化及び該接合体が有する活性化合物による治療のための有効成分としての使用。
【請求項２５】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のペプチドの少なくとも１つを、腎臓の標的化のための有効成分として含む、腎臓の標的化のための医薬。
【請求項２６】
画像増強組成物である
ことを特徴とする、請求項２５に記載の医薬。
【請求項２７】
請求項６〜１９のいずれか一項に記載の接合体を、腎臓の標的化及び該接合体が有する活性化合物による治療のための有効成分として含む、腎臓の標的化及び該接合体が有する活性化合物による治療のための医薬。
【請求項２８】
治療用組成物または画像増強用組成物である、
ことを特徴とする、請求項２７に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５０％を超える式−（Ａｎ−Ｂｍ−Ｃｏ）−の配列セクションからなるペプチド、およびこのペプチドと少なくとも１つの共有結合した活性化合物とを含む接合体、およびこの接合体の調製のためのプロセスに関する。本発明はさらに、腎臓の標的化のためのこのペプチドおよび接合体の使用、ならびにこのペプチドまたは接合体を含む医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
腎臓は、特に、種々の物質の輸送および排泄のために、ならびにホルモンの生成において、重要なものである。腎臓の１つの機能は、尿路を介して身体から最終的に排泄される尿の形成を介した、代謝の最終生成物、いわゆる尿中出現性(urophanic)物質および毒素の、身体からの排泄である。腎臓は、水分バランスを調節し、従って、血圧の長期調節に役立つ。腎臓は、尿の組成の制御によって、電解質バランスおよび酸−塩基バランスを調節する。さらに、腎臓は、身体における中間代謝のための重要な臓器である（これは、糖新生をもたらす）。腎臓は、例えば、血液形成のためのエリスロポエチンなどのホルモンを生成し、ペプチドホルモンの分解の部位である。しかし、腎臓自体の多くの機能もまた、ホルモンによって制御される。
【０００３】
今日、約２億８千万の人々が慢性腎臓疾患に罹患している。多くの診断方法および治療方法が既に開発されている。例えば、免疫抑制剤、細胞分裂阻害剤、免疫療法剤、消炎剤、抗生物質、静ウイルス剤(virostatic)、降圧剤、尿酸排泄剤または利尿剤が、腎臓の処置のためまたは腎臓機能に影響を与えるために使用される。しかし、腎臓疾患の処置のための医薬の使用または投薬量は、医薬の副作用によってしばしば制限される。従って、可能な限り標的化された様式で腎臓に医薬が到達することが特に重要である。
【０００４】
同様に、画像化方法における腎臓の表示もまた、主として重要である。
【０００５】
確立された核医学的方法および放射線医学的方法、例えば、コンピューター断層撮影法(ＣＴ)、ＳＰＥＣＴ(単一光子放射型コンピューター断層撮影法)、ＰＥＴ(ポジトロン放出断層撮影法)、超音波およびＭＲＴ(磁気共鳴断層撮影法)は、いわゆる分子画像化によって描写される形態学的構造に加えて、酵素的プロセス、代謝的プロセス、特定の遺伝子の発現および分子反応を可能にする。上述の画像化モダリティは、必要に応じて、コンピューター断層撮影的方法および光学画像化方法(近赤外画像化、蛍光断層撮影法(ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ))によってさらに補足され得る。「分子画像化」の焦点は、目下、癌疾患、神経学的問題の診断、および遺伝子治療のモニタリングになお合わせられているが、将来的には、細胞性変化が可能な限り早期に発見される必要がある全ての領域に拡張される。
【０００６】
画像化方法のためのシグナル供給源として、「シグナル分子」が一般に、「担体分子」にカップリングされる。この「担体分子」は、例えば、標的細胞に特異的結合すること、または標的細胞内に捕捉されることによって、高度に特異的な標的化を確実にする。例えば、この担体分子は、受容体のリガンドまたは酵素の基質であり得る。この「シグナル分子」は、１または複数の画像化技術によって可視化され得る。シグナル分子の例は、例えば、その金属イオンが画像化技術を介して検出され得る錯化剤またはキレート剤である。シグナル分子および担体分子を含む化合物または接合体は、「診断剤」と呼ばれる。
【０００７】
腎臓の調査は、特に、腎シンチグラフィーを使用して実施される。これは、静態的観点および動態的観点からの腎機能の評価を可能にする核医学的調査方法である。各個々の腎臓の血液供給、機能および排泄が、ここで評価される。これは、特に小児における実質の瘢痕形成の認識のための確立された方法であり、さらに、領域的およびサイドに分離された腎機能の評価の役に立つ。
【０００８】
静態腎シンチグラフィーでは、機能的腎臓組織は、放射性核種９９ｍＴｃを使用して表示される。このとき、テクネチウムは、錯体形態で、例えば、２，３−ジメルカプトコハク酸(ＤＭＳＡ)と結合される。従って、静態腎シンチグラフィーは、主に、異常(ジストロフィー、馬蹄腎など)を有する腎臓、または炎症後の状態の表示のために適切である。
【０００９】
対照的に、動態腎シンチグラフィーは、腎機能を調査する。従って、糸球体濾過速度、腎血流量（ＲＢＦ）および尿細管分泌が、腎機能およびそのクリアランスの問題と共に調査され得る。
【００１０】
現在使用されている放射性医薬品は、以下の物質である：
・９９ｍＴｃ−ＭＡＧ３    メルカプトアセチルトリグリシン
・９９ｍＴｃ−ＤＭＳＡ    ２，３−ジメルカプトコハク酸
・９９ｍＴｃ−ＤＴＰＡ    ジエチレントリアミン五酢酸
・１２３Ｉ−ＯＩＨ    ヒプラン（ｈｉｐｐｕｒａｎ）（オルト−ヨード馬尿酸）。
【００１１】
従って、例えば、腎臓の標的化が改善され得る場合、画像化方法における腎臓の描写のため、およびまた治療目的のために、その両方で望ましい。
【００１２】
先行技術は、腎臓の標的化、即ち、腎臓中への標的化された輸送に適切な物質を、既に開示している。
【００１３】
例えば、比較的小さい内因性タンパク質、例えばリゾチーム(１４．３ｋＤａ)は、腎臓の糸球体を通過することができ、活性化合物による腎臓のアドレス指定のための輸送体として適切であることが公知である(Ｆｒａｎｓｓｅｎら：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５、７、１９９２、１２４６〜１２５９(非特許文献１)；Ｚｈａｎｇら：Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ３０、２００９、１３７２〜１３８１頁)。しかし、リゾチームが比較的に大きい分子であることは不利であり、これは、輸送体対活性化合物の比率が好ましくないことを意味する。さらに、存在する多くの反応性側基のうちの１つに対する活性化合物の結合が、非特異的に起こる。これは、化学的に規定されていない活性化合物／輸送体混合物を生じる。さらに、リゾチームなどのタンパク質は、免疫原性の可能性を有し得る。高分子量タンパク質の不利益は、低分子量ペプチドの使用には適用されない。
【００１４】
本文献は、腎臓によって選択的に取り込まれる約５〜２０アミノ酸を有する種々のペプチドをさらに記載する。これらは、例えば、ＡＰＡＳＬＹＮおよびＨＩＴＳＬＬＳ（Ｄｅｎｂｙら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５、９、２００７、１６４７〜１６５４）またはＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ（ＫｕｍａｒおよびＤｅｕｔｓｃｈｅｒ：Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４９、５、２００８、７９６〜８０３；Ｇｅｎｇら：Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３、２０１２、１２００〜１２１０）である。
【００１５】
ＷＯ２０１１／００９５３９Ａ１（特許文献１）は、活性化合物／ε−ポリリジン接合体、および腎臓におけるその高度に選択的な富化を開示している。ポリマー中のリジン単位の連結は、そのε−アミノ基を介して起きる。これらの化合物は、腎臓において非常に長い滞留時間を有し、従って比較的緩徐に分解される。
【００１６】
従って、腎臓に対する最も高い可能な親和性および選択性を有する新規物質または担体分子（「担体」）に対する需要が存在し続けている。それら自体で、またはまたそれらのコンジュゲート化した活性化合物を有する担体分子として、許容可能な期間内に腎臓の標的細胞中で生化学的に分解され得る物質を見出すことが、本明細書で望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】国際公開第２０１１／００９５３９号パンフレット
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｓｓｅｎら：Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５、７、１９９２、１２４６〜１２５９
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】構造ＭＡＧ３−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫおよびＭＡＧ３−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ（活性化合物のＮ末端連結−図１、上）ならびにＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ−ｙおよびＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ−ｙ（活性化合物のＣ末端連結−図１、下）について、活性化合物の放出に対する鎖長の影響を示す図である。
【図２】構造ｙ−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（活性化合物のＮ末端連結−図２、下）ならびに構造ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ−ｙおよびＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ−ｙ（活性化合物のＣ末端連結−図２、上）について、活性化合物の放出に対する鎖長の影響を示す図である。
【図３】投与の１時間後の、２つの構造ＫＫＥＥＥＫＫ（ｙ）−ＥＥＥＫＫＥＥＥ（鎖中で分岐した１３１−ヨードチロシン）およびＫＫＥＥＥＫｙＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（鎖中で直鎖の１３１−ヨードチロシン）の臓器分布を比較する図である。
【図４】構造ｙ−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（アミド結合を介した活性化合物の連結、図４、上）およびｙ○ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（エステル結合を介した活性化合物の連結、図４、下）に関して、連結の型の影響を比較する図である。
【図５】種々の時間後の、動物モデルマウスにおける、リポ酸（ＬＡ）接合体としてのペプチド（ＡＰＡＳＬＹＮ）２、ｙ（ＭＡＲＩＡ）３、ｙ（ＭＡＲＩＡ）３およびリポ酸接合体としてのｙ（ＫＫＥＥＥ）３のシンチグラフィー分布を比較する図である。
【図６】投与後のペプチドｙ（ＫＫＱＱＱ）３Ｋ−ＮＨ２のシンチグラフィー分布を示す図である。
【図７】投与後のリポ酸接合体としてのペプチドｙ（ＫＫＱＱＱ）３Ｋ−ＮＨ２のシンチグラフィー分布を示す図である。
【図８】ＮＭＲＩマウスへの静脈内投与後のペプチド（ｙＤ８）のシンチグラフィー分布を示す図である。
【図９】投与経路に応じた、１２５−ヨウ素標識接合体ｙ（ＫＫＥＥＥ）３Ｋの臓器分布を比較する図である。
【図１０】各場合において、ＮＭＲＩマウスへの静脈内投与の１時間後の、ヨウ素−１２５で放射活性により標識したペプチドｙ（ＫＫＥＥ）５Ｋ（図１０ａ）、ｙ（ＫＫＫＥＥ）３Ｋ（図１０ｂ）およびｙ（ＲＲＥＥＥ）３Ｒ（図１０ｃ）のシンチグラフィー分布を比較する図である。
【図１１】ＮＭＲＩマウスにおける静脈内投与後の、Ｎ末端において結合したジアセチルコーヒー酸（ＫＫＥＥＥ）３Ｋ活性化合物接合体のシンチグラフィー分布を示す図である。
【図１２】ＮＭＲＩマウスにおける静脈内投与後の、ジ接合体化分子ｙＫＫＫ（ＤＣＡ）ＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＫ（ＤＣＡ）ＥＥＥＫ（ＣＤＡ＝ジアセチルコーヒー酸）のシンチグラフィー分布を示す図である。
【図１３】ＮＭＲＩマウスにおける静脈内投与後の１２５Ｉ−ｙ（ＫＫＫε(リポ酸)ＥＥＥ）３Ｋのシンチグラフィー分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
従って、本発明の目的は、腎臓の標的化に適切な、特にまた、治療剤または診断剤のための担体分子として適切な物質の提供であった。
【００２１】
驚くべきことに、特定のアミノ酸配列のペプチドおよびその活性化合物接合体が、腎臓に対する非常に高い選択性を有すること、また同様に迅速に分解され得ることが見出されている。これらのペプチドは、シグナル分子、例えば、放射性同位体など、ならびに／または腎臓の診断的処置および／もしくは治療的処置のための活性化合物との接合体として使用され得る。
【００２２】
従って、本発明は、５０％（アミノ酸単位の数に基づく）を超える式（１）の配列セクション
−（Ｂｍ−Ａｎ−Ｃｏ）−    （１）
からなるペプチドに関し、
式中、
Ａは、酸性側基を有するアミノ酸を示し、
Ｂは、塩基性側基を有するアミノ酸を示し、
Ｃは、任意の所望のアミノ酸を示し、
ｎ、ｍは、互いに独立して、１〜１０の整数を示し、ここで、ｎ：ｍ＝１：３〜３：１であり、
ｏは、０と１０との間の整数を示し、
−このペプチド全体は、５〜１００アミノ酸単位の鎖長を有し、
−このペプチドは、少なくとも５０％（アミノ酸単位の数に基づく）のアミノ酸ＡおよびＢからなる。
【００２３】
本発明によれば、ペプチドは、アミド結合を介した２つ以上のアミノ酸を連結することで形成される化合物を意味すると解釈される。本明細書の個々のアミノ酸は、鎖を形成するために、規定された配列で接続される。
【００２４】
本発明によれば、アミノ酸は、少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つのカルボキシル基を有する化合物である。例は、天然のタンパク新生アミノ酸、または生物中に存在するもしくは合成により調製される非タンパク新生アミノ酸である。
【００２５】
アミノ酸単位は、本発明に従うペプチド中にＤまたはＬ形態で存在し得る。
【００２６】
本発明によれば、このペプチドは５〜１００アミノ酸を含む。好ましい一実施形態では、このペプチドは、５〜４０アミノ酸単位の鎖長、特に好ましくは１０〜３０アミノ酸単位の鎖長を有する。
【００２７】
本発明によれば、このペプチドは、５０％（アミノ酸単位の数に基づく）を超える式（１）の配列セクション
−（Ｂｍ−Ａｎ−Ｃｏ）−    （１）
からなる。
【００２８】
このペプチドは、好ましくは７０％を超える式（１）の配列セクション、特に好ましくは９０％を超える式（１）の配列セクションからなる。
【００２９】
式（１）中、Ａは、酸性側基を有するアミノ酸を示す。これは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニノスクシネート(argininosuccinate)および／またはシステイン酸であり得る。カルボキシル官能基を有するアミノ酸、即ち、グルタミン酸および／またはアスパラギン酸、特に好ましくはグルタミン酸が好ましい。
【００３０】
ペプチド内で、Ａは、酸性側基を有する異なるアミノ酸を示し得、即ち、例えば、グルタミン酸ならびにまたアスパラギン酸、アルギニノスクシネートおよび／またはシステイン酸残基の両方が、このペプチド中に同時に存在し得る。
【００３１】
代替的な一実施形態では、このペプチドの配列セクション内の酸性側基を有するアミノ酸Ａは、同一である；この場合、例えば、このペプチドの１つの配列セクション中の式（１）の全てのアミノ酸Ａは、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニノスクシネートまたはシステイン酸を示し、このペプチドのさらなる配列セクション中の式（１）の全てのアミノ酸Ａは、上記配列セクションとは独立して、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステイン酸を示す。
【００３２】
さらなる代替的な一実施形態では、このペプチド内の酸性側基を有するアミノ酸Ａは、同一である；この場合、このペプチドの全てのアミノ酸Ａは、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニノスクシネートまたはシステイン酸を示す。
【００３３】
好ましい一実施形態では、このペプチド内の全てのアミノ酸Ａはグルタミン酸を示す。
【００３４】
式（１）中のｎは、アミノ酸単位Ａの数を規定する。ｎは、本明細書で、１〜１０の整数を示す。ｎは、好ましくは１〜５の整数、特に好ましくは２または３を示す。
【００３５】
式（１）中、Ｂは、塩基性側基を有するアミノ酸を示す。これは、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよび／またはオルニチンであり得る。リジンが好ましい。
【００３６】
ペプチド内で、Ｂは、塩基性側基を有する異なるアミノ酸を示し得る、即ち、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンおよび／またはオルニチン残基の両方が、このペプチド中に同時に存在し得る。
【００３７】
代替的な一実施形態では、このペプチドの配列セクション内の塩基性側基を有するアミノ酸Ｂは、同一である；この場合、例えば、このペプチドの１つの配列セクション中の式（１）の全てのアミノ酸Ｂは、リジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチンを示し、このペプチドのさらなる配列セクション中の式（１）の全てのアミノ酸Ｂは、上記配列セクションとは独立して、リジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチンを示す。
【００３８】
さらなる代替的な一実施形態では、このペプチド内の塩基性側基を有するアミノ酸Ｂは、同一である；この場合、このペプチドの全てのアミノ酸Ｂは、例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンまたはオルニチンを示す。
【００３９】
好ましい一実施形態では、このペプチド内の全てのアミノ酸Ｂは、リジンを示す。
【００４０】
式（１）中のｍは、アミノ酸単位Ｂの数を規定する。ｍは、本明細書で、１〜１０の整数を示す。ｍは、好ましくは１〜５の整数、特に好ましくは２または３を示す。
【００４１】
式（１）中、Ｃは、任意の所望のアミノ酸を示す。これは、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンおよび／またはシトルリンであり得る。
【００４２】
天然の様式で連結されたタンパク新生アミノ酸が好ましい。これは、毒物学的に完全に良性の代謝物を生じる、腎臓の近位尿細管細胞におけるこのペプチドの分解を確実にする。
【００４３】
ペプチド内で、Ｃは、異なるアミノ酸を示し得る。
【００４４】
式（１）中のｏは、アミノ酸単位Ｃの数を規定する。ｏは、本明細書で、０〜１０の整数を示す。ｏは、好ましくは０、１または２、特に好ましくは０または１を示す。非常に特に好ましい一実施形態では、ｏは０を示す、即ち、この場合アミノ酸単位Ｃはこのペプチド中に存在しない。
【００４５】
好ましい一実施形態では、ｎおよびｍは、互いに独立して２または３を示す。
【００４６】
本発明によれば、式（１）中のｎ：ｍの比は、１：３〜３：１である。式（１）の配列セクションの例示的実施形態は、以下である：
−（Ｂ３−Ａ１−Ｃｏ）−、−（Ｂ２−Ａ１−Ｃｏ）−、−（Ｂ１−Ａ１−Ｃｏ）−、
−（Ｂ６−Ａ２−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ２−Ｃｏ）−、−（Ｂ４−Ａ２−Ｃｏ）−、
−（Ｂ３−Ａ２−Ｃｏ）−、−（Ｂ２−Ａ２−Ｃｏ）−、−（Ｂ１−Ａ２−Ｃｏ）−、
−（Ｂ９−Ａ３−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ３−Ｃｏ）−、−（Ｂ７−Ａ３−Ｃｏ）−、
−（Ｂ６−Ａ３−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ３−Ｃｏ）−、−（Ｂ４−Ａ３−Ｃｏ）−、
−（Ｂ３−Ａ３−Ｃｏ）−、−（Ｂ２−Ａ３−Ｃｏ）−、−（Ｂ１−Ａ３−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ４−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ４−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ４−Ｃｏ）−、
−（Ｂ７−Ａ４−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ４−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ４−Ｃｏ）−、
−（Ｂ４−Ａ４−Ｃｏ）−、−（Ｂ３−Ａ４−Ｃｏ）−、−（Ｂ２−Ａ４−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ５−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ５−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ５−Ｃｏ）−、
−（Ｂ７−Ａ５−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ５−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ５−Ｃｏ）−、
−（Ｂ４−Ａ５−Ｃｏ）−、−（Ｂ３−Ａ５−Ｃｏ）−、−（Ｂ２−Ａ５−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ６−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ６−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ６−Ｃｏ）−、
−（Ｂ７−Ａ６−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ６−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ６−Ｃｏ）−、
−（Ｂ５−Ａ６−Ｃｏ）−、−（Ｂ３−Ａ６−Ｃｏ）−、−（Ｂ２−Ａ６−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ７−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ７−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ７−Ｃｏ）−、
−（Ｂ７−Ａ７−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ７−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ７−Ｃｏ）−、
−（Ｂ４−Ａ７−Ｃｏ）−、−（Ｂ３−Ａ７−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ８−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ８−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ８−Ｃｏ）−、
−（Ｂ７−Ａ８−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ８−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ８−Ｃｏ）−、
−（Ｂ４−Ａ８−Ｃｏ）−、−（Ｂ３−Ａ８−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ９−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ９−Ｃｏ）−、−（Ｂ８−Ａ９−Ｃｏ）−、
−（Ｂ７−Ａ９−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ９−Ｃｏ）−、−（Ｂ５−Ａ９−Ｃｏ）−、
−（Ｂ４−Ａ９−Ｃｏ）−、−（Ｂ３−Ａ９−Ｃｏ）−、
−（Ｂ１０−Ａ１０−Ｃｏ）−、−（Ｂ９−Ａ１０−Ｃｏ）−、
−（Ｂ８−Ａ１０−Ｃｏ）−、−（Ｂ７−Ａ１０−Ｃｏ）−、−（Ｂ６−Ａ１０−Ｃｏ）−、
−（Ｂ５−Ａ１０−Ｃｏ）−または−（Ｂ４−Ａ１０−Ｃｏ）−、
式中、Ａ、Ｂ、Ｃおよびｏは、上記のように規定される。
【００４７】
本発明によれば、式（１）の配列は、例えば、
−（ＫＫＫＥ）−、−（ＫＫＥ）−、−（ＫＥ）−、
−（ＫＫＫＫＫＥＥ）−、−（ＫＫＫＫＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥ）−、−（ＫＫＥＥ）−、−（ＫＥＥ）−、
−（ＫＫＫＫＫＥＥＥ）−、−（ＫＫＫＫＥＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥＥ）−、−（ＫＫＥＥＥ）−、−（ＫＥＥＥ）−、
−（ＫＫＫＫＫＥＥＥＥ）−、−（ＫＫＫＫＥＥＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥＥＥ）−、−（ＫＫＥＥＥＥ）−、
−（ＫＫＫＫＫＥＥＥＥＥ）−、−（ＫＫＫＫＥＥＥＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥＥＥＥ）−、
−（ＫＫＥＥＥＥＥＥ）−、
−（ＫＫＫＤ）−、−（ＫＫＤ）−、−（ＫＤ）−、
−（ＫＫＫＫＫＤＤ）−、−（ＫＫＫＫＤＤ）−、−（ＫＫＫＤＤ）−、−（ＫＫＤＤ）−、−（ＫＤＤ）−、
−（ＫＫＫＫＫＤＤＤ）−、−（ＫＫＫＫＤＤＤ）−、−（ＫＫＫＤＤＤ）−、−（ＫＫＤＤＤ）−、−（ＫＤＤＤ）−、
−（ＫＫＫＫＫＤＤＤＤ）−、−（ＫＫＫＫＤＤＤＤ）−、−（ＫＫＫＤＤＤＤ）−、−（ＫＫＤＤＤＤ）−、
−（ＫＫＫＫＫＤＤＤＤＤ）−、−（ＫＫＫＫＤＤＤＤＤ）−、−（ＫＫＫＤＤＤＤＤ）−、
−（ＫＫＤＤＤＤＤＤ）−、
−（ＲＲＲＥ）−、−（ＲＲＥ）−、−（ＲＥ）−、
−（ＲＲＲＲＲＥＥ）−、−（ＲＲＲＲＥＥ）−、−（ＲＲＲＥＥ）−、−（ＲＲＥＥ）−、−（ＲＥＥ）−、
−（ＲＲＲＲＲＥＥＥ）−、−（ＲＲＲＲＥＥＥ）−、−（ＲＲＲＥＥＥ）−、−（ＲＲＥＥＥ）−、−（ＲＥＥＥ）−、
−（ＲＲＲＲＲＥＥＥＥ）−、−（ＲＲＲＲＥＥＥＥ）−、−（ＲＲＲＥＥＥＥ）−、−（ＲＲＥＥＥＥ）−、
−（ＲＲＲＲＲＥＥＥＥＥ）−、−（ＲＲＲＲＥＥＥＥＥ）−、−（ＲＲＲＥＥＥＥＥ）−、−（ＲＲＥＥＥＥＥＥ）−、
−（ＫＲＫＥ）−、−（ＲＫＥ）−、
−（ＫＫＲＲＫＥＤ）−、−（ＫＫＫＫＥＤ）−、−（ＫＫＨＥＣ）−、−（ＫＫＥＤ）−、
−（ＫＫＫＨＫＤＥＥ）−、−（ＫＫＫＫＥＤＤ）−、−（ＲＲＲＥＤＥ）−、−（ＫＨＤＣＥ）−、−（ＫＤＥＥ）−、
−（ＲＫＲＫＲＤＥＤＥ）−、−（ＫＫＫＨＤＥＥＤ）−、−（ＫＲＨＥＤＣＥ）−、−（ＫＫＥＤＤＥ）−、
−（ＫＫＲＲＫＥＥＥＥＥ）−、−（ＫＫＲＫＥＥＥＥＤ）−、−（ＫＫＲＥＤＤＥＥ）−、
−（ＫＫＤＤＥＥＥＥ）−から選択される配列を示すことが可能であり、これらの各々において、アミノ酸の１文字コードが使用される：Ｅ（グルタミン酸）、Ｄ（アスパラギン酸）、Ｃ（システイン酸）、Ｋ（リジン）、Ｒ（アルギニン）、Ｈ（ヒスチジン）。
【００４８】
式（１）の配列は、好ましくは、−（ＫＫＥＥＥ）−、−（ＲＲＥＥＥ）−、−（ＫＫＥＥ）−、−（ＫＫＫＥＥＥ）および−（ＫＫＫＥＥ）−を含む群から選択される配列を示す。
【００４９】
式（１）の配列は、特に好ましくは配列−（ＫＫＥＥＥ）−：
【００５０】
【化１】
0006510494.tif 000002
【００５１】
を示す。
【００５２】
本発明によれば、このペプチドは、少なくとも５０％（アミノ酸単位の数に基づく）のアミノ酸ＡおよびＢからなる。このペプチドは、好ましくは少なくとも７０％（アミノ酸単位の数に基づく）のアミノ酸ＡおよびＢ、特に好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸ＡおよびＢからなる。
【００５３】
本発明によれば、式（１）の配列セクションは、合計で１〜５０回、好ましくは１〜３０回、特に好ましくは１〜１０回、特に好ましくは２〜５回、このペプチド中に存在し得る。
【００５４】
可能な一実施形態では、このペプチドは、複数の直接連続する式（１）の配列セクションを含む。このペプチドは、好ましくは３〜５個連続する式（１）の配列セクションを含む。
【００５５】
例えば、このペプチドは、３〜５個連続する式（１）の配列セクションと、Ｃ末端および／またはＮ末端における１または複数のさらなるアミノ酸とからなり得る。これは、式（２）中に示される：
Ｘｐ（ＢｍＡｎＣｏ）ｘＹｑ    （２）
式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ｎ、ｍおよびｏは、上で規定したとおりであり、
ｘは、３、４または５を示し、
ＸおよびＹは、互いに独立して、任意の所望のアミノ酸、好ましくはＢを示し、
ｐおよびｑは、互いに独立して、０と３との間の整数、好ましくは０または１を示す。
【００５６】
可能なペプチドの例は、（ＲＲＥＥＥ）３Ｒ、（ＫＫＥＥ）５Ｋ、（ＫＫＫＥＥ）３Ｋ、（ＫＫＫＥＥＥ）３Ｋおよび（ＫＫＥＥＥ）３Ｋを含む群から選択されるペプチドである。
【００５７】
本発明はさらに、上で規定したような少なくとも１つのペプチドと、任意選択でスペーサーを介して共有結合された少なくとも１つの活性化合物とを含む接合体にも関する。
【００５８】
本発明によれば、本発明に従う接合体１つ当たり、１または複数の同一または異なる活性化合物分子が結合され得る。
【００５９】
同様に、本発明に従う接合体は、特に、比較的大きい活性化合物分子、例えばタンパク質などの高分子の場合、活性化合物の腎臓特異的濃縮を促進するために、活性化合物分子に結合された２つ以上のペプチドもまた含み得る。これらのペプチドは、典型的には、再度、本明細書では高分子に共有結合される。本発明によれば、高分子は、タンパク質などの大きい分子だけでなく、その代わり、活性化合物がそれによって輸送または活性化合物に結合され得る、任意の形態の粒子（例えば、ナノ粒子）、リポソームまたは他の系もまた意味すると解釈される。
【００６０】
本発明によれば、活性化合物は、診断的処置および／または治療的処置のためにその活性化合物を使用するために、オリゴマーにカップリングされ得る任意の物質を意味すると解釈される。従って、本発明によれば、これは、シグナル分子または「古典的」活性化合物のいずれかであり得る。
【００６１】
本発明によれば、Ｇｅｒｍａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｃｔに従う活性化合物または活性化合物分子は、医薬の調製において医薬的に活性な構成要素として使用されること、または医薬の調製における使用の際に医薬的に活性な構成要素になることが意図される物質である（Ｇｅｒｍａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｃｔ  §４（１９））。活性化合物は一般に、生物において特定の影響を引き起こす。本発明に従う活性化合物は、典型的には、医薬的に活性な分子または医薬、例えば、免疫抑制剤、例えば、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、フィンゴリモドもしくはトリプトライド、細胞分裂阻害剤、例えば、アトラセンタン、ニンテダニブ、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ドキシフルリジン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、カンプトテシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、シクロホスファミド、トロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、エストラムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、クロルメチン、トレオスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ニムスチン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、イホスファミド、テモゾロミド、チオテパ、ビノレルビン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、パクリタキセル、ドセタキセル、メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、フルオロウラシル、カペシタビン、シトシンアラビノシド、ゲムシタビン、チオグアニン、ペントスタチン、メルカプトプリン、フルダラビン、クラドリビン、ヒドロキシカルバミド、ミトタン、アザシチジン、シタラビン、ネララビン、ボルテゾミブ、アナグレリド、特に、タンパク質キナーゼインヒビター、例えば、イマチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブもしくはニロチニブなど、免疫療法剤、例えば、セツキシマブ、アレムツズマブおよびベバシズマブ、消炎剤、例えば、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ヒドロコルチゾンもしくはブデソニド、抗生物質、特に、ペニシリン系、例えば、ベンジルペニシリン、メチシリンもしくはアモキシシリンなど、セファロスポリン系、例えば、セフロキシム、セフォタキシム、セファドロキシルもしくはセフィキシムなど、□−ラクタマーゼインヒビター、例えば、クラブラン酸、スルバクタムもしくはタゾバクタムなど、カルバペネム系、例えば、イミペネムもしくはメロペネムなど、モノバクタム系、例えば、アズトレオナムなど、テトラサイクリン系、例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンもしくはチゲサイクリンなど、マクロライド系抗生物質、例えば、エリスロマイシンＡなど、グリコペプチド系抗生物質、例えば、バンコマイシンなど、エンジイン類、例えば、カリチアマイシンなど、静ウイルス剤、例えば、アシクロビル、バラシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ペンシクロビル、ファムシクロビル、ブリブジン、シドホビル、ホスカルネット、イドクスウリジンもしくはトロマンタジン、降圧剤、特に、ＡＣＥインヒビター、例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、ホシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルもしくはゾフェノプリルなど、サルタン類、例えば、ロサルタン、バルサルタン、イルベサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、オルメサルタンもしくはテルミサルタンなど、レニンインヒビター、例えば、アリスキレンなど、ならびにベータブロッカー、例えば、プロプラノロール、ピンドロール、ソタロール、ボピンドロール、アテノロール、ビソプロロール、セリプロロール、エスモロール、メトプロロール、ネビボロール、オクスプレノロール、カルベジロールもしくはラベタロールなど、尿酸排泄剤、例えば、プロベネシドもしくはベンズブロマロン、または利尿剤、例えば、アセタゾラミド、フロセミド、トラセミド、ブメタニド、ピレタニド、アゾセミド、エタクリン酸、エトゾリン、ヒドロクロロチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、クロルタリドン、インダパミド、メフルシド、メトラゾン、クロパミド、キシパミド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、アミロライド、トリアムテレン、スピロノラクトン、カンレノン、エプレレノンもしくはスピロノラクトン、抗線維化剤、例えばピルフェニドンまたはセリシクリブなどである。
【００６２】
さらに、抗腫瘍剤、例えば、増殖している細胞に対して有効な薬剤も、本発明によれば、同様に活性化合物である。例示的な抗腫瘍剤には、サイトカイン、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、腫瘍壊死因子など、レクチン炎症反応促進物質（セレクチン）、例えば、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンなど、および類似の分子が含まれる。
【００６３】
活性化合物分子に加えて、または活性化合物分子の代わりに、他の官能基、例えば、診断方法または画像化方法のための官能基などもまた、本発明に従う接合体に結合され得る。
【００６４】
同様に、フッ素含有側鎖が、任意選択のスペーサーを介して、官能基として取り込まれ得る。従って、腎臓中の対応する分子の蓄積は、１９Ｆ核共鳴断層撮影法（１９Ｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）の助けによって表示され得る。均一な共鳴周波数を有する高度に対称的に整列されたフッ素原子が、ここでは特に有利である。１９Ｆシグナルを改善するために、核スピン断層撮影法(nuclear spin tomography)において有用な造影剤、例えば、ガドブトロール（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標））などが使用され得る。
【００６５】
錯化剤も同様に、「活性化合物」としてこの接合体中に存在し得る。本発明によれば、錯化剤は、金属イオンを錯体化することが可能な、即ち、金属イオンと金属−キレート錯体を形成することが可能な、任意の分子構造である。錯化剤は、しばしば、キレート剤としても公知である。本発明に従って適切な錯化剤の例は、ＥＤＴＡ、ＮＯＴＡ、ＴＥＴＡ、イミノ二酢酸、ＤＯＴＡまたはＤＴＰＡである。ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、ＣＴまたはＭＲＴ測定において検出され得る金属イオンを結合する錯化剤が、本発明に従って特に好ましい。好ましい錯化剤は、ＤＯＴＡもしくはＤＴＰＡ、またはそれらの誘導体である。本発明によれば、錯化剤は、金属イオンが既に結合している分子、およびまた金属イオンが結合され得るが、現段階では結合していない分子の両方である。
【００６６】
錯化剤への結合について本発明に従って適切な金属イオンは、例えば、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋、Ｃｕ２＋、Ｃｒ３＋、Ｇｄ３＋、Ｅｕ３＋、Ｄｙ３＋、Ｌａ３＋、Ｙｂ３＋および／もしくはＭｎ２＋、またはまた、放射性核種、例えば、ガンマ放射体、陽電子放射体、オージェ電子放射体、アルファ放射体および蛍光放射体、例えば、５１Ｃｒ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、１１１Ｉｎ、９９ｍＴｃ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、８８Ｙ、９０Ｙ、１４９Ｐｍ、１７７Ｌｕ、４７Ｓｃ、１４２Ｐｒ、１５９Ｇｄ、２１２Ｂｉ、７２Ａｓ、７２Ｓｅ、９７Ｒｕ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１０１ｍＲｈ、１１９Ｓｂ、１２８Ｂａ、１９７Ｈｇ、２１１Ａｔ、１６９Ｅｕ、２０３Ｐｂ、２１２Ｐｂ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、１８８Ｒｅ、１８６Ｒｅ、１９８Ａｕおよび／もしくは１９９Ａｇのイオンである。
【００６７】
適切な金属イオンおよびそれらのそれぞれの使用の例は、以下である：
・ＳＰＥＣＴのための１１１Ｉｎ
・ＰＥＴのための６８Ｇａ
・治療のための９０Ｙ
・ＭＲＴのためのＧｄ、Ｅｕ、Ｍｎ
・コンピューター断層撮影法のための、タンタル、タングステン、または高い原子番号を有する他の元素。
【００６８】
本発明に従う接合体が錯化剤を含む場合、本発明に従う接合体上に位置する錯化剤の助けにより、ガドリニウムもしくはマンガン、または当業者に公知の別の強く常磁性の金属イオンを一体化することが特に有利である。本明細書で適切な錯化剤は、例えば、ＤＯＴＡおよびＤＴＰＡである。
【００６９】
さらに、錯化剤、例えば、ヒドロキシキノリン、チオ尿素、グアニジン、ジチオカルバメート、ヒドロキサム酸、アミドキシム、アミノリン酸、（環状）ポリアミノ、メルカプト、１，３−ジカルボニルおよび一部の場合には異なる金属のイオンに関して非常に特異的な活性を有するクラウンエーテルラジカルが、−任意選択でスペーサーを介しても−、接合体化され得る。
【００７０】
細胞特異的標的化のための官能基、例えば、抗体、抗体断片またはアプタマーなども、本発明に従う接合体に結合され得る。蛍光色素またはインターロイキン、例えばＩＬ−２もまた、結合され得る。
【００７１】
活性化合物、ペプチド、錯化剤または他の官能基は、直接、またはスペーサーによって、ペプチドに共有結合され得る。
【００７２】
しばしばリンカーとも呼ばれるスペーサーは、１つの分子の２つの部分の間、本発明の場合には、例えばペプチドと活性化合物との間での共有結合をもたらす。例えば、２つの部分間の接続が直接的化学結合を介して起こらないだけでなく、その代わりに２つの部分間で特定の分離が生成される場合に、スペーサーが導入される。同様に、スペーサーは、他の方法では互いに反応しない１つの分子の２つの部分を接続するために必要な化学官能基を提供し得る。ペプチドまたは活性化合物上へのスペーサーのコンジュゲート化は、好ましくは、アミド結合またはエステル結合を介して起こる。スペーサーは、例えば、脂肪族炭化水素、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール）、ペプチド、または鎖構造を有する類似の要素であり得る。このスペーサーは、安定であり得る、即ち、このスペーサーは、生理学的条件下で僅かな程度までしか切断され得ないもしくは全く切断され得ない、またはこのスペーサーは不安定であり得る、即ち、このスペーサーは少なくとも特定の生理学的条件下で切断され得る。
【００７３】
直接的結合が起こり得る官能基の例は、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨ、−Ｈａｌ（例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）、−アルキン、−ＮＣＳ、−ＮＣＯ、ＳＯ２Ｃｌ、−アジド、−カーボネート、−アルデヒド、−エポキシド、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ、式中、Ｒは、この場合、好ましくはハロゲンであり、または好ましくは、アクチベーター、即ち、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ペンタフルオロフェニルまたはパラ−ニトロフェニルなどの良好な脱離基である。可能な共有結合型のカップリングの概説は、例えば、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、１３７〜１６５頁に見出され得る。
【００７４】
例えば、活性化合物は、本発明に従う接合体において、切断可能なリンカーを介して結合され得る。次いで、このリンカーは、特定の条件下でｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば酵素的または化学的に切断され、活性化合物を放出する。この目的のために、適切なリンカーは、カルボキシレートおよびジスルフィド結合を含むリンカーであり、ここで、前者の基は、酵素的または化学的に加水分解され、後者は、例えば、グルタチオンの存在下でのジスルフィド交換によって分離される。
【００７５】
切断可能なスペーサーの一例は、特異的内因性酵素の助けによって特異的に切断され得るペプチド、またはあるいは身体に添加されるペプチドでもある。従って、例えば、ペプチド配列ＤＥＶＤ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ）は、カスパーゼ−３によるアポトーシス誘導後に切断される。従って、例えば、このタイプのスペーサーを介して結合される活性化合物は、腎臓の中での特定の滞留時間後に腎臓から除去され得るか、またはあるいは、腎臓の対応する機能性（特定の酵素の存在または非存在）がチェックされ得る。さらなる例は、マトリクスメタロプロテアーゼ−１３によって切断され得る、ペプチド配列ＣＰＥＮ↓ＦＦＷＧＧＧＧ（Ｓａｌｉｎａｓら  ２００８、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２９、２３７０〜２３７７）またはＰＥＮＦＦである。
【００７６】
切断可能なスペーサーの単純な一実施形態は、エステラーゼによって容易に切断され得るカルボキシレートの形成である。
【００７７】
従って、本発明の好ましい一実施形態では、この活性化合物は、エステル結合を介して結合される。これは、腎臓における活性化合物分子の正確な切断を可能にする。しかし、同時に、この結合は、未熟な切断を防止するために、腎臓中への輸送のために予め十分に安定である。
【００７８】
さらに、活性化合物の活性化合物輸送体への容易に切断可能なエステル結合は、標的部位におけるこの活性化合物の比較的迅速な放出を可能にする。エステル結合の切断は、プロテアーゼによる活性化合物輸送体の分解よりも、時間的により迅速に起こる。
【００７９】
あるいは、このスペーサーは、酸不安定性構造、例えば、ヒドラゾン、イミン、カルボキシルヒドラゾン、アセタールまたはケタールを含み得る（例えば、Ｈａａｇ−Ｒ、Ｋｒａｔｚ−Ｆ、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  １２１８頁（２００６）を参照）。
【００８０】
カーボネートは、脂肪族または芳香族のヒドロキシル基を有する活性化合物のコンジュゲート化に有利である。これらは、クロロホルメートとの反応によって、対応するアルコールまたはフェノールから、簡単に、かつ高収量で合成され得る。例えば、クロロギ酸プロパルギル（ＣＡＳ番号３５７１８−０８−２）などの、三重結合を含むクロロホルメートとの反応は、本明細書で特に有利である。この方法で導入される三重結合が、酵素的に容易に切断され得るカーボネートが、１，３−双極子付加環化、いわゆるＨｕｉｓｇｅｎ反応によって、簡単に、かつ非常に穏やかな条件下で、ペプチドオリゴマー中に取り込まれたアジドに連結されることを可能にする。
【００８１】
同じことが、クロロホルメートの助けによる、脂肪族または芳香族のアミノ基のコンジュゲート化に適用される。カーボネートの代わりに、エステラーゼによって同様に容易に切断され得る対応するカルバメートが、ここで形成する。ここでまた、三重結合を含むクロロホルメートへの連結が、特に有利である。
【００８２】
本発明によれば、この少なくとも１つの活性化合物は、ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に結合され得る。
【００８３】
代替的な一実施形態では、この活性化合物は、鎖中のアミノ酸に結合され得る。
【００８４】
さらなる代替的な一実施形態では、この活性化合物は、アミノ酸間の鎖中に結合され得る。
【００８５】
本発明に従うペプチドおよびその活性化合物接合体は、腎臓によって高度に選択的に取り込まれ、比較的迅速に分解される。
【００８６】
ペプチドの鎖長および分子構造の適切な選択、ならびにペプチド上の活性化合物の連結部位の適切な選択は、所望の薬物速度論、即ち、標的部位、即ち腎臓における所望の活性化合物放出が本明細書で確立されるのを可能にする。
【００８７】
典型的には、より長いペプチドは、より短いペプチドと比較して、遅延された放出を生じる。より長いペプチドは、例えば、２０〜４０アミノ酸、好ましくは３０アミノ酸の鎖長を有するが、より短いペプチドは、典型的には、３〜１０アミノ酸、好ましくは５アミノ酸の鎖長を意味すると解釈される。
【００８８】
Ｃ末端において連結された活性化合物の放出は、Ｎ末端において連結された活性化合物の放出よりも顕著に迅速に起こる。この理論に束縛されないが、ペプチド分解における律速段階は、特に、Ｃ末端から出発してペプチドを分解するカルボキシペプチダーゼによって影響されると推測される。
【００８９】
本発明によれば、分岐鎖様式で鎖中に取り込まれた活性化合物もまた、直鎖様式で連結されたものよりも顕著に緩徐に放出される。分岐鎖ペプチド構造の酵素的分解は、基本的には、直鎖ペプチドの分解よりも顕著に困難である。
【００９０】
さらに、活性化合物の放出速度は、本発明によれば、オリゴマーへのその連結の型によっても制御され得る。容易に切断可能なエステル結合は、標的部位における活性化合物の比較的迅速な放出を可能にする（上を参照のこと）。
【００９１】
本発明は、上記のような接合体の調製のためのプロセスであって、任意選択で活性化された活性化合物が、ペプチド上にコンジュゲート化されることを特徴とするプロセスにも関する。
【００９２】
本発明に従う接合体の調製は、典型的には、少なくとも以下のプロセスステップを有する：
ａ）少なくとも１つの反応性基を含む、本発明に従うペプチドの提供、
ｂ）ステップａ）からのペプチド上への、少なくとも１つの任意選択で活性化された活性化合物のコンジュゲート化。
【００９３】
本発明に従うプロセスの一実施形態では、接合体が活性化合物として錯化剤を含む場合、ステップｂ）で得られた化合物を、さらなるステップｃ）において金属塩と接触させ、その結果、金属イオンは、錯化剤によって錯体化される。
【００９４】
本発明に従う接合体のペプチドは、特に、ペプチド合成の分野の当業者に公知の種々のプロセスによって、調製され得る。
【００９５】
この調製は、典型的には、固相合成を介して実施される。
【００９６】
本発明によれば、固相は、固相合成において樹脂または支持体として使用され得る、有機、無機または有機／無機複合材料である。さらに、成形品、例えば、マイクロタイタープレートまたは粒状材料、例えば、有機もしくは無機ナノ粒子、金属粒子などの表面もまた、本発明に従って固相とみなされる。
【００９７】
固相合成は、従来のペプチド合成（例えば、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕペプチド合成またはＢｏｃ／ベンジルペプチド合成）と対応する様式で実施される。この型の固相合成は、当業者に公知である。ペプチド合成のための適切な教科書は、「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」：２８９（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、Ｓｉｄｎｅｙ  Ｐ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ(著者)、Ｇｒｅｇｇ  Ｂ．Ｆｉｅｌｄｓ(発行元)、Ｍｅｌｖｉｎ  Ｉ．Ｓｉｍｏｎ(発行元)Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ（１９９７年１１月）または「Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｗ．Ｃｈａｎ(著者)、Ｗ．Ｃ．Ｃｈａｎ(発行元)、Ｐｅｔｅｒ  Ｄ．Ｗｈｉｔｅ(発行元)「Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒ（２０００年３月２日）である。各場合において使用されるモノマーは、本明細書で、本発明に対応するペプチドが形成されるような方法で選択される。アミノ酸単位の型に応じて、合成は、誘導体化されたアミノ酸単位を直接使用して、または誘導体化のために意図した部位において最初に保護されたアミノ酸単位を使用して、実施され得る。ペプチドの合成が完了したところで、活性化合物による最終的な誘導体化が、固相において、または固相からの切断後に溶液において、実施され得る。
【００９８】
この場合における活性化合物の結合は、好ましくは、完了したペプチド、即ち、ペプチドの固相合成が完了したときになお固相上に存在するペプチド、または後者が切断された後に溶液中に存在するペプチドのいずれかに対して起こる。
【００９９】
活性化合物が、例えばペプチドのＮ末端に結合される場合、これらのペプチドは、典型的には、例えばＦｍｏｃなどのアミノ末端保護基を用いて生成される。この活性化合物が、一方では合成樹脂からペプチドを切断するために使用され、他方では側鎖を脱保護するために使用される条件に抵抗できる場合、このＦｍｏｃ基は、完全な樹脂結合ペプチドのＮ末端から切断され得、活性化合物を遊離Ｎ末端アミンに結合させることを可能にする。かかる場合、この活性化合物は、典型的には、オリゴマーアミノ基へのアミド結合またはカルバメート結合を形成するのに有効な活性エステルまたは活性カーボネート基を生成するための、当該分野で一般に公知のプロセスによって活性化される。当然、異なる連結化学を使用することも可能である。
【０１００】
本明細書で副反応を最小化するために、グアニジノ基およびアミジノ基は、従来の保護基、例えば、カルボベンジルオキシ基（ＣＢＺ）、ジ−ｔ−ＢＯＣ、ＰＭＣ、Ｐｂｆ、Ｎ−ＮＯ２などを使用して、遮断され得る。
【０１０１】
カップリング反応は、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリドン、ジクロロメタンおよび／または水などの溶媒中で、公知のカップリングプロセスによって実施される。例示的なカップリング試薬には、Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−ｔｒｉｓ(ピロリジノ)ホスホニウムブロミド(ＰｙＢｒｏＰ)などが含まれる。他の試薬、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン(ＤＭＡＰ)、４−ピロリジノピリジン、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどが存在し得る。
【０１０２】
分子が錯化剤を含む場合、金属イオンは、公知の方法によって錯体化され得る。
【０１０３】
本発明は、本発明に従うペプチドおよび接合体が、例えば、血流中への注射後に、または皮下注射後に、腎臓において事実上排他的に富化されるという驚くべき効果に基づく。従って、本発明に従うペプチドおよび／または接合体は、腎臓の描写のためおよび腎標的化のための画像化方法において、腎臓の処置のための治療方法における使用に適切である。
【０１０４】
従って、本発明は、医薬、例えば、特に、治療組成物または画像増強組成物としての、上記のような本発明に従うペプチドまたは接合体にも関する。
【０１０５】
本発明は、腎臓の標的化のための、上記のような本発明に従うペプチドまたは接合体の使用にも関する。本明細書で、腎臓の標的化は、好ましくは、腎臓における医薬品適用または診断適用のため、即ち、身体の残部と比較して腎臓において増加した取り込みを生じるために、医薬を富化するのに役立つ。
【０１０６】
あるいは、結合した活性化合物を有さないペプチド単独もまた、腎臓中で富化され得る。従って、腎臓に対するその高度な選択性のために、ペプチドの投与は、例えば、治療の間に投与される腎臓損傷性物質の富化が、予防または少なくとも低減されることを可能にする。
【０１０７】
従って、本発明は、腎臓の保護のための、上記のようなペプチドの使用にも関する。
【０１０８】
神経内分泌腫瘍の放射性ペプチド(radiopeptide)治療では、例えば、物質ＤＯＴＡＴＯＣが使用される。ＤＯＴＡとコンジュゲート化したこのオクタペプチドは、腎臓（即ち、近位尿細管細胞、ＰＴＣ）によって、約２０％の程度まで取り込まれるという望ましくない副作用を有する。腎臓における損傷は、本明細書では、用量／治療サイクル制限性である。ＤＯＴＡＴＯＣの取り込みは、本発明に従うペプチドが同時に投与される場合、低減され得る。理論に束縛されないが、ＤＯＴＡＴＯＣの取り込みを担う受容体（メガリン／キュビリン）は、ＰＴＣの頂端側において遮断され、従って、より多くのＤＯＴＡＴＯＣが尿中に入ると考えられる。
【０１０９】
腎臓を標的化するための本発明に従う接合体の使用は、他の公知の低分子量構造と比較して有利であるが、それは、これらが、活性化合物とのコンジュゲート化において、腎臓中で非常に良好な濃縮もまた示すからである。腎臓によって選択的に取り込まれる文献中に記載されたペプチド（ＡＰＡＳＬＹＮおよびＨＩＴＳＬＬＳ、アミノ酸は一文字コードで示される（Ｄｅｎｂｙら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５、９、２００７、１６４７〜１６５４））との比較は、ほとんどのペプチドが、静脈内投与の後に、より高度に顕著なまたはあまり高度には顕著でない腎臓選択性を有するが、これが、活性化合物とのコンジュゲート化においては当てはまらないことを示している。しかし、腎臓疾患の処置のための輸送系としてのペプチド構造の薬理学的有用性は、これらのペプチドが、コンジュゲート化された活性化合物と一緒に、腎臓、即ち近位尿細管細胞によって事実上排他的に取り込まれる場合にのみ、生じる。この場合にのみ、活性化合物の全身性投与を上回る顕著な利点が生じる。
【０１１０】
さらに、本発明に従う接合体は、腎臓中への活性化合物輸送について文献中に記載されたペプチド／タンパク質の静脈内投与に加えて、腎臓に首尾よく対処するための、本発明に従うペプチド／活性化合物接合体の皮下投与および腹腔内投与を可能にする。
【０１１１】
腹腔内投与経路、および具体的には皮下投与経路が、医師および患者にとって、静脈内経路と比較して、潜在的な活性化合物の投与に有利である。
【０１１２】
本発明は、上記のような少なくとも１つの本発明に従うペプチドまたは接合体を含む医薬または医薬組成物、特に治療組成物または画像増強組成物にも関する。
【０１１３】
本発明によれば、このペプチドまたは接合体は、全ての比率でのそれらの混合物を含む、その医薬的に使用可能な塩および立体異性体の形態でもあり得る。
【０１１４】
医薬組成物または医薬、特に、治療組成物、ならびに／または核医学的画像化のための画像増強組成物（例えば、造影媒(contrast medium)）および／もしくは放射能標識されたトレーサーの調製のための本発明に従うペプチドおよび／または接合体の使用もまた、本発明に従う。
【０１１５】
本発明によれば、本発明は、少なくとも１つの本発明に従うペプチドおよび／または接合体を含む医薬または医薬組成物、特に治療組成物または画像増強組成物の調製のためのキットにも関し得る。次いで、このペプチドおよび／または接合体は、治療組成物または画像増強組成物の調製のために、適用に応じて、例えば、適切な活性化合物と反応させ得る。
【０１１６】
本発明によれば、画像増強組成物もしくは造影媒または画像増強作用を有する物質は、一般に、環境に対するコントラストを増加させることによって、または環境に対して標的臓器のシグナルを増加させることによって、特定の診断方法において標的臓器の描写を改善する物質または組成物を意味すると解釈される。
【０１１７】
本発明はさらに、
−医薬としての、
−医薬としての使用のための、
−医薬における活性化合物または活性構成成分としての、
−診断剤、
−診断剤としての使用のための、
−腎臓の標的化における使用のための、および
−特に、腎臓の疾患の処置のための医薬としての、
本発明に従うペプチドおよび／または接合体、ならびに／または全ての比率でのそれらの混合物を含む、その医薬的に使用可能な塩および立体異性体、ならびに任意選択で賦形剤および／またはアジュバントに関する。
【０１１８】
治療組成物、医薬組成物または医薬は一般に、少なくとも、活性化合物−この場合、活性化合物が結合した本発明に従うペプチドまたは接合体−と、治療組成物の適用を可能にする１または複数の適切な溶媒および／または賦形剤とからなる。
【０１１９】
診断組成物または診断剤は、診断方法において画像増強組成物または画像化組成物として機能する。診断剤は、一般に、少なくとも、シグナル供給源、即ち、画像化構成成分および／または画像増強構成成分−この場合、本発明に従う接合体、ここで、この場合、少なくとも１つの活性化合物が、好ましくは錯化剤である−と、診断組成物の適用を可能にする１つまたは複数の適切な溶媒および／または賦形剤とからなる。
【０１２０】
診断適用のために、本発明に従う接合体は、好ましくは、画像増強造影媒においてシグナル供給源として機能し、後者が、核医学的方法および／もしくは放射線医学的方法、例えば、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、超音波によって、ならびにまたは磁気共鳴断層撮影法、コンピューター断層撮影的方法および光学画像化方法（近赤外画像化）によっても、検出されることを可能にする。検出方法および画像増強造影媒の適用は、当業者に公知である。適切な適用の例は、癌疾患、神経学的問題の診断、治療に対する応答のチェック、例えば自己免疫疾患の場合の腎臓における損傷の程度のチェック、および遺伝子治療のモニタリングであるが、細胞性変化の認識もそうである。
【０１２１】
医薬組成物または医薬は、任意の所望の適切な方法を介する投与、例えば、経口（頬側または舌下を含む）、直腸、経鼻、外用（頬側、舌下または経皮を含む）、膣内または非経口（皮下、筋内、静脈内または皮内を含む）の方法による投与のために適合され得る。かかる製剤は、例えば、活性成分を賦形剤（複数可）またはアジュバント（複数可）と組み合わせることによって、医薬品分野において公知の全てのプロセスを使用して調製され得る。
【０１２２】
経口投与のために適合された医薬製剤は、例えば、カプセル剤もしくは錠剤；粉末もしくは顆粒；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁物；食用発泡体もしくは発泡体食品；または水中油液体乳濁物もしくは油中水液体乳濁物などの別々の単位として投与され得る。
【０１２３】
従って、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態での経口投与の場合、この活性成分構成成分は、経口の非毒性で医薬的に許容される不活性賦形剤、例えば、エタノール、グリセロール、水などと組み合わされ得る。粉末は、適切な微細サイズまで化合物を粉末状にし、これを、類似の様式で粉末状にされた医薬品賦形剤、例えば、食用炭水化物、例えば、デンプンまたはマンニトールなどと混合することによって、調製される。香料、防腐剤、分散剤および色素も同様に存在し得る。
【０１２４】
カプセル剤は、上記のように粉末混合物を調製し、成形ゼラチンシェルに粉末混合物を充填することによって生成される。固体形態の、流動促進剤(glidant)および滑沢剤、例えば、高度分散ケイ酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムまたはポリエチレングリコールなどが、充填操作の前に、粉末混合物に添加され得る。崩壊剤または可溶化剤、例えば、寒天（アガー）、炭酸カルシウムまたは炭酸ナトリウムなども同様に、カプセル剤が摂取された後の医薬のアベイラビリティを改善するために、添加され得る。
【０１２５】
さらに、所望または必要な場合、適切な結合剤、滑沢剤および崩壊剤ならびに色素も同様に、混合物中に取り込まれ得る。適切な結合剤には、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えば、グルコースまたはβ−ラクトースなど、トウモロコシから製造された甘味料、天然ゴムおよび合成ゴム、例えば、アカシア、トラガントまたはアルギン酸ナトリウムなど、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックスなどが含まれる。これらの投薬形態において使用される滑沢剤には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。崩壊剤には、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンゴムなどが含まれるが、これらに限定されない。錠剤は、例えば、粉末混合物を調製し、この混合物を顆粒化もしくは乾式プレスし、滑沢剤および崩壊剤を添加し、混合物全体をプレスして錠剤を得ることによって、製剤化される。粉末混合物は、上記のように、適切な様式で粉末状にされた化合物を、希釈剤または塩基と混合し、任意選択で、結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチンもしくはポリビニルピロリドンなど、溶解遅延剤、例えばパラフィンなど、吸収促進剤、例えば第四級塩など、および／または吸収剤、例えばベントナイト、カオリンもしくはリン酸二カルシウムなどと混合することによって、調製される。粉末混合物は、この粉末混合物を、結合剤、例えば、シロップ、デンプンペースト、アカディア(acadia)粘液、またはセルロースもしくはポリマー材料の溶液などで湿らせ、篩を通してプレスすることによって、顆粒化され得る。顆粒化の代替法として、粉末混合物は、錠剤化機械を通されて、顆粒を形成するために破壊される非均一形状の塊を生じ得る。顆粒は、錠剤鋳型への粘着を防止するために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルクまたは鉱油の添加によって滑沢化され得る。次いで、滑沢化された混合物は、プレスされて錠剤を生じる。本発明に従う化合物はまた、自由流動性不活性賦形剤と組み合わせることができ、次いで、顆粒化ステップも乾式プレスステップも実施することなく、直接プレスされて錠剤を生じることが可能である。セラック密封層、糖またはポリマー材料の層、およびワックスの光沢層からなる透明または不透明な保護層もまた、存在し得る。色素が、異なる投薬単位間の識別を可能にするために、これらのコーティングに添加され得る。
【０１２６】
経口液体、例えば、溶液、シロップおよびエリキシル剤などは、投薬単位の形態で調製され得、その結果、所与の量は、予め特定された量の化合物を含む。シロップは、化合物を適切な香料を含む水性溶液中に溶解させることによって調製され得るが、エリキシル剤は、非毒性アルコール性ビヒクルを使用して調製される。懸濁物は、非毒性ビヒクル中での化合物の分散によって製剤化され得る。可溶化剤および乳化剤、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコールおよびポリオキシエチレンソルビトールエーテルなど、防腐剤、香料添加剤、例えば、ペパーミント油など、あるいは天然甘味料またはサッカリンもしくは他の人工甘味料なども、同様に添加され得る。
【０１２７】
経口投与のための投薬単位製剤は、所望の場合、マイクロカプセル剤中にカプセル化され得る。製剤は、放出が延長または遅延されるような方法で、例えば、ポリマー、ワックスなどにおける粒状材料のコーティングまたは包埋などによっても、調製され得る。
【０１２８】
本発明に従うペプチドまたは接合体は、リポソーム送達系、例えば、小単層膜小胞、大単層膜小胞および多重層膜小胞などの形態でも投与され得る。リポソームは、種々のリン脂質、例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンなどから形成され得る。
【０１２９】
本発明に従うペプチドまたは接合体は、ペプチドまたは接合体がカップリングされる個々の担体としてモノクローナル抗体を使用しても送達され得る。これらのペプチドまたは接合体はまた、標的化された医薬担体としての可溶性ポリマーにカップリングされ得る。かかるポリマーは、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルタミドフェノールまたはパルミトイルラジカルで置換されたポリエチレンオキシドポリリジンを包含し得る。さらに、これらの化合物は、医薬の制御された放出を達成するのに適切な生分解性ポリマーのクラス、例えば、ポリ乳酸、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル類、ポリアセタール類、ポリジヒドロキシピラン類、ポリシアノアクリレート類およびヒドロゲルの架橋されたまたは両親媒性のブロックコポリマーに、カップリングされ得る。
【０１３０】
経皮投与のために適合された医薬製剤は、レシピエントの表皮との、延長された密接な接触のための独立したプラスターとして投与され得る。従って、例えば、この活性成分は、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、３（６）、３１８（１９８６）において一般的な用語で記載されるように、イオントフォレシスによってプラスターから送達され得る。
【０１３１】
外用投与のために適合された医薬化合物は、軟膏、クリーム、懸濁物、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油として製剤化され得る。
【０１３２】
直腸投与のために適合された医薬製剤は、坐剤または浣腸の形態で投与され得る。
【０１３３】
担体物質が固体である、経鼻投与のために適合された医薬製剤は、例えば、２０〜５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗い粉末を含み、この粉末は、吸い込みが起こる様式で、即ち、鼻に近づけられた粉末を含むコンテナからの鼻孔を介した迅速な吸入によって、投与される。担体物質として液体を用いる、経鼻スプレーまたは点鼻剤としての投与に適切な製剤は、水または油中の活性成分溶液を包含する。
【０１３４】
吸入による投与のために適合された医薬製剤は、エアロゾル、ネブライザーまたは吸入器を備えた種々の型の加圧ディスペンサーによって生成され得る、微細な粒状の粉塵または霧を包含する。
【０１３５】
非経口投与のために適合された医薬製剤には、製剤を処置されるレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含む、水性および非水性の無菌注射溶液；ならびに懸濁媒および増粘剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁物が含まれる。これらの製剤は、単一用量または多用量のコンテナ、例えば密封アンプルおよびバイアル中で投与され得、フリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵され得、その結果、使用直前の、注射目的のための水などの無菌担体液体の添加のみが必要である。レシピに従って調製された注射溶液および注射懸濁物は、無菌の粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【０１３６】
本発明に従うペプチドまたは接合体は、好ましくは、非経口投与される。
【０１３７】
言うまでもないが、上で特に言及された構成要素に加えて、これらの製剤は、特定の型の製剤に関して当該分野で一般的な他の薬剤もまた含み得る；従って、例えば、経口投与のために適切な製剤は、香料を含み得る。
【０１３８】
治療有効量の本発明に従うペプチドまたは接合体は、カップリングされた活性化合物の型、患者の年齢および体重、処置を必要とする正確な状態およびその重症度、製剤の性質、ならびに投与の方法を含むいくつかの因子に依存する。
【０１３９】
本発明は、本発明に従うペプチドまたは接合体を少なくとも含む医薬組成物、特に、画像増強組成物または治療組成物の調製のためのキットにも関する。接合体が錯化剤を含む場合、これは、好ましくは、画像増強作用または治療作用を有する任意の金属イオンを錯体化していない。本発明に従うペプチドまたは接合体は、溶媒（例えば、水性緩衝液）中に溶解された形態で、または好ましくは、凍結乾燥物の形態で、キット中に存在し得る。
【０１４０】
本発明に従う接合体の錯化剤によって錯体化される金属イオンは、多くの適用について放射活性であるので、この接合体を含む医薬組成物は、所望に応じて前もって調製することができない。さらに、この放射活性のために、職業上の安全性に関する特定の手順が、その後調製の間に行われなければならない。この理由のために、錯化剤が最終的な適用に必要な金属イオンをまだ錯体化していない、本発明に従う接合体を含むキットを提供することが、本発明に従って好ましい。
【０１４１】
本発明に従うペプチドまたは接合体は、適用後短時間で、腎臓中に特異的に、即ち、排他的にまたは事実上排他的に既に濃縮されていることが見出されている。本発明に従う接合体の好ましい静脈内投与の場合、腎臓における濃縮は、僅か５分後に観察される。１時間後、注射された用量のうち、３０％を超える、好ましくは５０％を超える、特に好ましくは７０％を超える、非常に特に好ましくは８０％を超えるものが、腎臓中に位置する（放射活性の測定値に基づく％データ）。
【０１４２】
放射能標識された本発明に従う接合体を用いた臓器分布において（例えば、ＰＥＴ測定または他の非侵襲性画像化）、本発明に従う接合体は、典型的には、適用の１時間後に、身体の残部（血液、心臓、肺、脾臓、肝臓、筋肉、脳）と比較して、腎臓において少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍の濃度を示す。これは、腎臓中の放射能標識された化合物の量と直接相関するシグナルが、血液、心臓、肺、脾臓、肝臓、筋肉および脳から一緒に得られたシグナルの合計の少なくとも２倍の強さであることを意味している。
【０１４３】
従って、本発明に従うペプチドまたは接合体は、一般に、腎癌および所望の場合には腎癌の転移の治療および診断、腎臓のＣＴおよび／または腎臓の超音波、ならびに腎臓の特異的標的化のための、診断適用、例えば、腎シンチグラフィー、腎ＰＥＴおよび腎ＭＲＴ、腎臓の機能的試験のために、非常に良好に使用され得る。
【０１４４】
治療適用は、特に、臓器腎臓の薬物標的化においてである。特に、本発明に従うペプチドまたは接合体は、腎臓の疾患の処置のための、またはその処置においてその作用部位が腎臓である医薬が使用される疾患のための、医薬として機能し得る。１つまたは複数の活性化合物、例えば、抗生物質、炎症インヒビター、ＡＣＥインヒビター、利尿剤、免疫抑制剤または化学療法剤が、好ましくは、例えば切断可能なスペーサー配列を介して、本発明に従うペプチドに結合される。
【０１４５】
腎臓毒性物質の再吸収を遮断するための本発明に従う接合体の使用もまた可能である。
【０１４６】
さらに、本発明に従うペプチドは、腎臓中への腎臓損傷性物質の取り込みを予防または低減させるためにも使用され得る。
【０１４７】
本発明によれば、腎臓の標的化とは、身体の残部と比較して、腎臓における適用された物質の増加した取り込みの達成を意味する。本発明に従うペプチドまたは接合体を用いた腎臓の標的化の場合、身体の残部（血液、心臓、肺、脾臓、肝臓、筋肉、脳）と比較して、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、特に好ましくは少なくとも１０倍の濃縮が、本発明に従う接合体の投与によって、腎臓において好ましくは達成される。これらの値は、放射能標識された本発明に従う接合体を用いた臓器分布研究（例えば、ＰＥＴ測定または他の非侵襲性画像化）によって決定される。腎臓中での濃縮は、典型的には、適用の型に応じて、３０分後〜８時間後に起こる。
【０１４８】
さらなるコメントがなくても、当業者は、最も広い範囲で上記記載を利用できるとみなされる。従って、好ましい実施形態および例は、絶対的に決して限定ではない記述的開示としてのみ、みなすべきである。
【実施例】
【０１４９】
１．材料合成
１．１．  固相ペプチド合成
これらのペプチドを、ポリマー性支持体としてＴｅｎｔａｇｅｌ  Ｓ  ＲＡＭ樹脂（ローディングの度合い：０．２４ｍｍｏｌ／ｇ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＦｍｏｃ／ｔＢｕ戦略に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）のＡＢＩ  ４３３Ａ完全自動ペプチド合成機上で調製する。酸不安定性側鎖保護基を含むＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ；Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）（例えば、Ａｒｇ(Ｐｂｆ)、Ａｓｎ(Ｔｒｔ)、Ａｓｐ(ＯｔＢｕ)、Ｃｙｓ(Ｔｒｔ)、Ｇｌｎ(Ｔｒｔ)、Ｇｌｕ(ＯｔＢｕ)、Ｈｉｓ(Ｔｒｔ)、Ｌｙｓ(Ｂｏｃ)、Ｓｅｒ(ｔＢｕ)、Ｔｈｒ(ｔＢｕ)、Ｔｙｒ(ｔＢｕ)）を、出発材料として使用する。合成サイクルは、ａ）Ｎ−メチル−２−ピロリドン(ＮＭＰ)中２０％のピペリジンを使用するＦｍｏｃ保護基の切断、ｂ）ＮＭＰによる洗浄ステップ、ｃ）カップリング：Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／ジイソプロピルエチルアミン(ＤＩＰＥＡ)／ペプチド樹脂  １０／１０／２０／１、８分、ｄ）ＮＭＰによる洗浄ステップ、からなる。Ｆｍｏｃの切断の有効性を、自動伝導率測定によってモニタリングする。これらのペプチドを、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン(ＴＩＰＳ)（９５／２．５／２．５）（室温で２時間）を使用して樹脂から切断し、冷メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）中で沈殿させ、遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分）によって分離し、減圧中で乾燥させ、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１）から凍結乾燥させる。ＭＡＧ３は、上記のようにペプチド合成機で調製した、３つのグリシン単位および１つのチオグリコール酸誘導体を含むペプチド断片である（即ち、所望のペプチド配列が、１つのＭＡＧ３単位によって延長されている）。
【０１５０】
１．２  ペプチドの精製および特徴付け
樹脂から切断されたペプチドの精製を、ＬａＰｒｅｐユニット（ＶＷＲ  ＧｍｂＨ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するセミ分取ＨＰＬＣによって実施する。使用するカラムは、Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ１３０  ＰＲＥＰ  Ｃ１８（５μｍ、１９×１５０ｍｍ）カラム（流速：８〜２０ｍｌ／分；溶媒：水中０．１％のＴＦＡからアセトニトリル中０．１％のＴＦＡ）である。分離を、対応するペプチドの物理化学的特性と一致する、水からアセトニトリルまでの勾配を使用して実施する。精製されたペプチドが、凍結乾燥後に得られる。
【０１５１】
特徴付けのために、調製したペプチドを、分析的ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００）およびＨＰＬＣ−ＭＳ（Ｅｘａｃｔｉｖｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって分析する。標準的な条件下でのＨＰＬＣ分析を、水中０．１％のＴＦＡからアセトニトリル中０．１％のＴＦＡまで５分間の直線勾配に基づいて実施する（条件：ＣｈｒｏｍｏｌｉｔｈＲ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＲＰ−１８ｅカラム、１００×３ｍｍ；流速：２ｍｌ／分、波長＝２１４ｎｍ）。質量分析のために、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００がＨＰＬＣシステムとして機能する（条件：Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  Ｇｏｌｄ  Ｃ１８カラム、０．２１×２００ｍｍ、勾配：水中０．０５％のＴＦＡからアセトニトリル中０．０５％のＴＦＡまで３０分間、流速：２００μｌ／分、カラムオーブン：６０℃、波長＝２１４ｎｍ）。
【０１５２】
１．３  ペプチドの放射活性ヨウ素化
標識化を、水中の、標識されるペプチドの１ｍＭストック溶液を使用して実施する（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が、より良い溶解度のために添加されていてもよい）。チロシン含有ペプチドを、クロラミン−Ｔ法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によって、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５またはヨウ素−１３１で標識する。この目的を達成するために、２０μｌのリン酸塩緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ７．４）を、１０μｌのストック溶液に添加し、所望の量の放射活性ヨウ素を添加する。標識化のために、５μｌのクロラミン−Ｔ（Ｈ２Ｏ  １ｍｌ当たり２ｍｇ）を添加する。この反応を３０秒間実施し、引き続いて、１０μｌの飽和メチオニン溶液を使用して終了させる。遊離ヨウ素と副生成物とを分離するために、この反応混合物を、セミ分取ＨＰＬＣ（Ｃｈｒｏｍｏｌｉｔｈ  ＲＰ−１８ｅ、１００×４．６ｍｍ）によって精製する。分離を、水中０．１％のＴＦＡからアセトニトリル中０．１％のＴＦＡまで１０分間の直線勾配を使用して実施する（流速：２ｍｌ／分、２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収、γ検出）。引き続いて、溶媒を、ロータリーエバポレーターにおいて除去し、標識されたペプチドを、所望の緩衝液中に取る。
【０１５３】
１．４  ９９ｍテクネチウムによるＭＡＧ３の放射活性標識化
標識化のために、１０μｌの１ｍＭペプチド溶液を、１０μｌのリン酸塩緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ９）に添加する。４μｌの酒石酸ナトリウム（Ｈ２Ｏ  １ｍｌ当たり１００ｍｇ）、２μｌのラクトース溶液（Ｈ２Ｏ  １ｍｌ当たり１００ｍｇ）および１μｌのＳｎＣｌ２溶液（１０ｍｇ／ｍｌのＳｎＣｌ２×２Ｈ２Ｏ）を、引き続いて添加する。このＳｎＣｌ２溶液の調製のために、８０ｍｇ／ｍｌを、短時間の加熱によって濃塩酸中に溶解させ、水で１０ｍｇ／ｍｌに希釈する。必要な活性の９９ｍＴｃ（テクネチウムジェネレーターから）を添加し、引き続いて、この溶液を、９５℃で３０分間加熱し、セミ分取ＨＰＬＣによって精製し（１．３を参照のこと）、溶媒から取り出し、３００μｌの無菌０．９％  ＮａＣｌ溶液中に取る。
【０１５４】
１．５  リポ酸−ｙ（ＫＫＥＥＥ）３Ｋの調製
ペプチドｙ（ＫＫＥＥＥ）３Ｋを、アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するＦｍｏｃ／ｔＢｕ戦略の固相合成によって、１．１の下に記載したように、ペプチド合成機において調製する。最初、このペプチドは、樹脂から切断されないが、その代わり、最終的なＦｍｏｃ脱保護の後にＮＭＰ中に懸濁される（１ｍｌのＮＭＰを、１００ｍｇのペプチド樹脂当たり使用する）。(ＲＳ)−リポ酸（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ；その間、樹脂ローディングに基づいて４当量）を、ＮＭＰ（１００ｍｇ当たり１ｍｌ）中に溶解させ、ＨＢＴＵ（４当量）を添加し、この混合物を、室温で約１０分間撹拌する。この反応混合物をペプチド樹脂に添加し、ＤＩＰＥＡ（１０当量）を添加し、この混合物を、室温で約４時間振盪する。樹脂を、ＮＭＰで５回洗浄し、ジクロロメタン（ＤＣＭ）で５回洗浄し、減圧中で約４時間乾燥させる。リポ酸／ペプチド接合体を、ＴＦＡ／チオアニソール／アニソール（９０／８／２）を使用して室温で約１時間樹脂から切断し、冷ＭＴＢＥ中で沈殿させ、遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分）によって分離し、減圧中で乾燥させ、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１）から凍結乾燥させ、１．２の下に記載したように精製する。
他の活性化合物との接合体もまた、同様に調製され得る。
【０１５５】
１．６  ｙＫＫＫ（ジアセチルコーヒー酸）（ＥＥＥＫＫ）２Ｋ（ジアセチルコーヒー酸）ＥＥＥＫの調製
リジン側鎖上へのジアセチルコーヒー酸の消化性接合体化のために、アミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｍｔ）−ＯＨを、ペプチド骨格の配列中に取り込む。切断前に、ジクロロメタン（ＤＣＭ）／トリイソプロピルシラン／ＴＦＡ（９４：５：１）を、１．１の下で調製したペプチド樹脂に３分間添加し、この混合物を、ＤＣＭで５回洗浄する。この操作を３回繰り返す。リジンの直交性に脱保護された側鎖へのカップリングのために、４当量のジアセチルコーヒー酸を、ＮＭＰ中に溶解させ、４当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、４当量のエチルシアノ（ヒドロキシイミノ）アセテート（Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ）および１０当量のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を添加し、この混合物を、室温で約１０分間撹拌し、引き続いて、ペプチド樹脂に添加する。この反応混合物を、室温で約１時間振盪し、ＮＭＰで５回洗浄し、ＤＣＭで５回洗浄し、減圧中で乾燥させる。官能化ペプチドを、１．１の下に記載したように樹脂から切断し、１．２の下に記載したように精製する。
他の活性化合物との接合体もまた、同様に調製され得る。
【０１５６】
１．７  ｙ（ＫＫＫε（リポ酸）ＥＥＥ）３Ｋの調製
【０１５７】
【化２】
0006510494.tif 000003
【０１５８】
１．７．１  Ｆｍｏｃ−リジン（ε−リポ酸）−ＯＨ基本単位の合成
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．１５ｇ、１０ｍｍｏｌ）、α−リポ酸（２．０２ｇ、９．８ｍｍｏｌ）および（１．９２ｇ、１０ｍｍｏｌ）の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を、５０ｍｌのＤＭＦ中に溶解させ、室温で約４時間撹拌する。次いで、６０ｍｌの酢酸エチルを、バッチに添加する。有機相を、６０ｍｌの蒸留水で３回洗浄し、６０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で３回洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液で１回洗浄する。酢酸エチル相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、乾燥するまで蒸発させる
収量：２．２３ｇ（７３．５％）。
【０１５９】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（２．６５ｇ、７．２ｍｍｏｌ）を、１１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）中に懸濁し、（２．１４ｇ、７．０５ｍｍｏｌ）のリポ酸活性エステル（１３０ｍｌのアセトン中に溶解させた）を添加し、この混合物を、室温で撹拌する。約３時間の反応時間後、この溶液を、０．１Ｎ  ＮａＯＨ溶液によってｐＨ７に調整し、室温で約２０時間撹拌する。次いで、このバッチを、０．１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨ９にし、約３０ｍｌの酢酸エチルで２回洗浄し、引き続いて、１Ｎ  ＨＣｌを使用してｐＨ３に調整し、約４０ｍｌの酢酸エチルで３回抽出する。合わせた有機相を、飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、乾燥するまで蒸発させる
粗製生成物の重量：４．１４ｇ（１０３．２５％）。
【０１６０】
粗製生成物の精製を、フラッシュクロマトグラフィーによって実施する（固定相：シリカゲル６０、粒子サイズ：１５〜４０μｍ、Ｇｏｔｅｃ−Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨによって予めパックされたもの、移動相：クロロホルム、メタノール（０．１％のＨＯＡｃを含む）、流速：６０ｍｌ／分、ローディング：約２ｇ、勾配：１００％から７５％のクロロホルム、１８分）。生成物画分（Ｒｔ＝９．１分）を合わせ、乾燥するまで蒸発させる
生成物重量：３．１８ｇ（７７％）。
【０１６１】
１．７．２  固相ペプチド合成
ペプチドを、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）の合成機、モデル４３３Ａを使用して調製する。アミノ酸の反応性側鎖を、以下のように保護する：Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）およびＴｙｒ（ｔＢｕ）。Ｒａｐｐ−Ｐｏｌｙｍｅｒｅ  ＧｍｂＨのＲｉｎｋアミド樹脂（ローディングの度合い：０．２４ｍｍｏｌ／ｇ）が固相として機能する。対応するアミノ酸、Ｆｍｏｃ−リジン（ε−リポ酸）−ＯＨ基本単位およびＨＢＴＵを、４倍過剰で使用する。使用する溶媒はＮＭＰであり、ピペリジン（ＮＭＰ中２０％）を、それぞれのＦｍｏｃ切断に使用する。
【０１６２】
保護されたペプチドを、ＴＦＡ：チオアニソール：アニソール＝９０：８：２（１００ｍｇ当たり１ｍｌ）を使用して樹脂から切断し（１〜２時間）、ＭＴＢＥ中で沈殿させ、遠心分離し、乾燥させる。
【０１６３】
１．７．３  ペプチドの放射活性ヨウ素化
チロシン含有ペプチドを、クロラミン−Ｔ法によって、１２５ヨウ素で標識する。標識化のために、水中の１ｍＭストック溶液を使用する。必要に応じて、ＤＭＳＯを、より良い溶解度のために添加する。この目的を達成するために、２０μｌのリン酸塩緩衝液（０．２５Ｍ、ｐＨ７．４）を、１０μｌのストック溶液に添加し、所望の量の放射活性ヨウ素を添加する。標識化を、５μｌのクロラミン−Ｔ（Ｈ２Ｏ  １ｍｌ当たり２ｍｇ）を使用して実施する。この反応を３０秒間実施し、引き続いて１０μｌの飽和メチオニン溶液を使用して終了させる。
【０１６４】
標識化後、このペプチドを、過剰の遊離ヨウ素および他の副生成物を除去するために、セミ分取ＨＰＬＣによって精製する。１００μｌの０．１ｍＭストック溶液を、注射のために各場合において使用する。注射前に、放射活性を、Ｇｅｉｇｅｒカウンターによって記録する。
他の活性化合物との接合体もまた、同様に調製され得る。
【０１６５】
２．使用例
２．１．  臓器分布研究
薬物速度論を決定するために、放射活性により標識した調査すべき分子を、尾部静脈を介して雌性ＮＭＲＩマウス中に注射する（動物１匹当たり約１００μｌ）。これらの動物（１つの時点当たりｎ＝３）を、引き続いて、対応する時点において屠殺し、解剖し、単離した臓器（肝臓、腎臓、肺、脾臓、腸、脳、心臓、血液、…）における放射活性の分布を、γカウンター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  ＬＢ９５１Ｇ）によって定量する。注射用量（ＩＤ）に基づいて臓器／組織１グラム当たりの測定された放射活性を決定し、ＩＤ／ｇの％とした。
【０１６６】
２．２  活性化合物の鎖長および連結部位の影響
さらなる実験において、分子構造を改変する。
【０１６７】
構造ＭＡＧ３−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ、ＭＡＧ３−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥおよびｙ−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（活性化合物のＮ末端連結−図１、上および図２下）ならびに構造ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ−ｙおよびＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥ−ｙ（活性化合物のＣ末端連結−図１、下および図２、上）を調査し、ここで、ｙは、Ｄ−チロシンを示し；ＭＡＧ３は、９９ｍＴｃを錯体化するペプチド断片を示す。
【０１６８】
結果は、図１および２に示される（本明細書で、ＩＤ／ｇは、組織１グラム当たりの注射用量を示す）：放射能標識されたチロシン（「活性化合物」として）の放出は、一方では鎖長を介して、他方では「活性化合物」の連結部位（Ｃ末端またはＮ末端）を介して、強く影響される。基本的に、より長いペプチドは、遅延した放出を生じる。さらに、Ｃ末端において連結されたトレーサー（ヨードチロシンまたは９９ｍＴｃを有するＭＡＧ３もまた）の放出は、Ｎ末端連結の場合よりも顕著に迅速に進行する。ペプチド分解における律速段階は、特に、Ｃ末端から出発してペプチドを分解するカルボキシペプチダーゼによって、見かけ上影響される。
【０１６９】
活性化合物の放出速度論は、ペプチドの分子構造および活性化合物の連結部位（Ｃ末端またはＮ末端）を介して、故意に調整され得る。
【０１７０】
２．３．  分岐の程度の影響
分岐鎖ペプチド構造の酵素的分解は、基本的に、直鎖ペプチドの分解よりも顕著に困難である。この目的のために、モデル活性化合物放射性ヨードチロシン(radioiodotyrosine)が直鎖様式で鎖中に取り込まれた、または分岐鎖様式で鎖中に取り込まれた、比較実験を実施する。構造ＫＫＥＥＥＫＫ−（ｙ）ＥＥＥＫＫＥＥＥおよびＫＫＥＥＥＫｙＥＥＥＫＫＥＥＥＫを調査する。
結果を図３に示す：この図は、投与の１時間後の臓器分布を示す。分岐鎖様式で鎖中に取り込まれた放射性ヨードチロシン（図３、上）は、直鎖放射性ヨードチロシン（図３、下）よりも、本明細書で、顕著により緩徐に分解される。
【０１７１】
２．４．  連結の型の影響
構造ｙ−ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（アミド結合を介した活性化合物の連結）およびｙ○ＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＥＥＥＫ（エステル結合を介した活性化合物の連結）を調査する。
結果を図４に示す：迅速に放出される活性化合物の結合について、活性化合物の容易に切断可能なエステル結合の、活性化合物輸送体への取り込みが、有利であることが証明された（図４、下）。エステル結合の分解は、プロテアーゼによる活性化合物輸送体の分解よりも、時間的により迅速に起こる。
【０１７２】
２．５．  比較実験
文献中で言及されたペプチドの腎臓特異性を本発明に従う構造と比較できるようにするために、文献中で公知のペプチドＡＰＡＳＬＹＮおよびＨＩＴＳＬＬＳ（Ｄｅｎｂｙら：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５、９、２００７、１６４７〜１６５４）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅペプチド合成機、モデル４３３Ａの助けによって調製し、実際の活性化合物と接合体化する。ペプチド配列を、Ｆｍｏｃ戦略によって構築し、活性化合物を、固相反応によって担体にコンジュゲート化する。さらなる比較として、１６アミノ酸を有する任意の所望のペプチド配列ｙ（ＭＡＲＩＡ）３を選択する。ペプチド（ＨＩＴＳＬＬＳ）中に放射能標識化のためのチロシンが存在しない場合、Ｄ−チロシンをさらに挿入する。使用する活性化合物は、（ＲＳ）−リポ酸（略号：ＬＡ）である。
【０１７３】
図５は、種々の時間後の、動物モデルマウスにおけるペプチド（ＡＰＡＳＬＹＮ）２およびｙ（ＭＡＲＩＡ）３の分布のＳＰＥＣＴ記録を示す。（ＡＰＡＳＬＹＮ）２の例では、このペプチドの腎臓選択性は、活性化合物リポ酸なしで既に不適切である。自由に選択したペプチド配列ｙ（ＭＡＲＩＡ）３は、良好な腎臓選択性を有するが、これは、リポ酸とのコンジュゲート化後に実質的に失われる。比較すると、本発明に従う構造（ＫＫＥＥＥ）３における腎臓選択性は、コンジュゲート化したリポ酸を有していても保持される。
【０１７４】
さらなる実験において、ペプチドｙ（ＫＫＥＥＥ）３Ｋ−ＮＨ２中のグルタミン酸を、グルタミンで置き換える。得られたペプチドｙ（ＫＫＱＱＱ）３Ｋ−ＮＨ２は、酸基を含まない。ペプチド自体の取り込みおよびリポ酸とコンジュゲート化したペプチドの取り込みを調査する。
【０１７５】
結果（図６および７を参照のこと）：放射性ヨウ素によるペプチドの標識化後、腎臓中へのこのペプチドの高い取り込みが、画像化によって検出され得る（図６）。しかし、活性化合物リポ酸とのペプチドのコンジュゲート化後、この腎臓特異性は、事実上完全に失われる（図７）。
【０１７６】
さらなる実験において、酸基を有するアミノ酸のみから構築されたペプチド（ｙＤ８）を合成する。このペプチドも同様に、放射性ヨウ素で標識し、ＮＭＲＩマウスに静脈内投与する。
【０１７７】
図８は結果を示す：わずか１５分後に、投与された放射活性の大部分は、実験動物の膀胱中に位置する。完全に酸性アミノ酸から構築されたペプチドは、見かけ上、腎臓を介して非常に迅速に排泄され、腎臓の近位尿細管細胞によって再吸収されない。この型の純粋に酸性の分子構造は、見かけ上、近位尿細管細胞中への活性化合物の輸送に適切ではない。
【０１７８】
２．６．  ｙ（ＫＫＥＥ）５Ｋ、ｙ（ＫＫＫＥＥ）３Ｋおよびｙ（ＲＲＥＥＥ）３Ｒのシンチグラフィー分布
さらなる実験において、酸／塩基比を変動させ、リジンをアルギニンによって置き換える。以下のペプチドを本明細書で調査する：ｙ（ＫＫＥＥ）５Ｋ、ｙ（ＫＫＫＥＥ）３Ｋおよびｙ（ＲＲＥＥＥ）３Ｒ。
結果（図１０を参照のこと、ヨウ素−１２５によるペプチドのそれぞれの放射活性標識化後の１時間の値、および雌性ＮＭＲＩマウスへの静脈内投与後のシンチグラフィー調査）：１：１（ｙ（ＫＫＥＥ）５Ｋ）（図１０（ａ））から２：３（ｙ（ＫＫＫＥＥ）３Ｋ）（図１０（ｂ））への酸／塩基比における変化は、ペプチドの腎臓選択性を検出可能には変化させない。しかし、アルギニンによるリジンの置き換え（ｙ（ＲＲＥＥＥ）３Ｒ）に際し、投与された放射活性の大部分は、１時間後に実験動物の膀胱中に位置する。高い腎臓特異性が保持され、他の臓器は対処されないが、腎排出は、アミノ酸の置き換えによって加速されるようである（図１０（ｃ）を参照のこと）。
【０１７９】
２．７．  ジアセチルコーヒー酸接合体のシンチグラフィー分布
さらなる実験において、潜在的活性化合物ジアセチルコーヒー酸（ＤＣＡ）は、Ｎ末端においてペプチド骨格のリジン側鎖に両方結合され、また増加する。ｙ（ＫＫＥＥＥ）３ＫとのＮ末端接合体の調製を、１．５．の下に記載したのと同様に実施する；ジ接合体化分子（構造：ｙＫＫＫ（ＤＣＡ）ＥＥＥＫＫＥＥＥＫＫＫ（ＤＣＡ）ＥＥＥＫ）の調製を、１．６の下に記載したのと同様に実施する。この方法で得られたペプチド／活性化合物接合体を、ヨウ素−１２５による標識化および動物モデルマウスにおける静脈内投与の後にその腎臓選択性について調査する。
結果（図１１および１２を参照のこと）：調製されたペプチド／活性化合物接合体は、ジアセチルコーヒー酸のＮ末端結合後に両方ともその高い腎臓特異性を保持し（図１１）、ペプチド骨格のリジンの異なる側鎖へのジアセチルコーヒー酸の二重の結合の場合にも、高い腎臓特異性を保持する（図１２）。
【０１８０】
２．８．  投与経路
さらなる実験において、投与経路を調査する。この目的を達成するために、９匹のＮＭＲＩマウスを、３つの群に分ける。全ての動物は、体重１ｋｇ当たり、Ｎ末端において（ＫＫＥＥＥ）３Ｋに結合したＤ−チロシンの接合体１０ｍｇを受ける。接合体の一部を、クロラミン−Ｔ法によって、Ｄ−チロシン上で放射活性ヨウ素同位体で標識する。標識した接合体を、群１には静脈内で、群２には皮下で、群３には腹腔内で投与する。本明細書の接合体を、１００μｌのＰＢＳ緩衝液中に溶解させる。次いで、それぞれの群由来の動物のＳＰＥＣＴスキャンを、種々の時間において実施する（４０分、６０分、１２０分および２４０分）。この実験シリーズの結果を図９に示す。
【０１８１】
腎臓中への活性化合物の輸送について文献中に記載されたペプチド／タンパク質の静脈内投与に加えて、ペプチドまたは本発明に従うペプチド／活性化合物接合体の皮下投与および腹腔内投与もまた、腎臓に首尾よく対処できる。
【０１８２】
２．９  例１．７に従うリポ酸接合体のシンチグラフィー分布
さらなる実験において、潜在的な活性化合物リポ酸を、ペプチド骨格のリジン側鎖を介して結合させる。接合体ｙ（ＫＫＫε（リポ酸）ＥＥＥ）３Ｋの調製を、例１．７に記載したように実施する。この方法で得られたペプチド／活性化合物接合体を、ヨウ素−１２５による標識化および動物モデルマウスにおける静脈内投与の後にその腎臓選択性について調査する。
結果（図１３を参照のこと）：調製されたペプチド／活性化合物接合体は、高い腎臓特異性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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