(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含むことを特徴とする、平均直径が１０〜５００ｎｍであるマルチコンパートメント脂質ナノ粒子：
−  リン脂質二重層によって区切られた第２の親水性コンパートメントによって部分的に囲まれた、脂質を含有する第１の親油性コンパートメントであり、前記第２のコンパートメントに部分的に固定された前記第１のコンパートメント；
−  （ａ）リン脂質、及び、（ｂ）グリフィンＨＬＢ値が１１を超える「疎水性−親水性−疎水性」型の３連配列界面活性剤を含む非イオン性界面活性剤混合物。
【請求項２】
多分散指数が５〜１５％である請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
前記平均直径が１００〜２５０ｎｍである請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
前記親油性コンパートメントが、２５℃で液体状態又は半固体状態である脂質から成る請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
前記親油性コンパートメントが、グリセリドが混合されていてもよい脂肪酸エステルを含む請求項１〜４のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項６】
前記脂肪酸エステルが、親水部のモル質量が１００〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲であるポリエチレングリコールモノエステル及びポリエチレングリコールジエステルの混合物である請求項５に記載のナノ粒子。
【請求項７】
前記グリセリドが、２５℃で液体又は固体であるグリセロールモノエステル、グリセロールジエステル、及びグリセロールトリエステルの混合物からなる群から選択される請求項５又は６に記載のナノ粒子。
【請求項８】
前記リン脂質二重層が、少なくとも１つのリン脂質及び１つの親水性非イオン性界面活性剤を含む請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
前記リン脂質が、双性イオン性のリン脂質の混合物からなる群から選択される請求項８に記載のナノ粒子。
【請求項１０】
前記親水性非イオン性界面活性剤が、ポリオキシルグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される請求項８又は９に記載のナノ粒子。
【請求項１１】
少なくとも１つの対象となる分子をさらに含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項１２】
前記対象となる分子が、核酸、タンパク質、多糖類、及び４０〜２０００Ｄａの分子から選択される請求項１１に記載のナノ粒子。
【請求項１３】
薬剤的に許容可能な賦形剤中に請求項１〜１２のいずれか一項に記載のナノ粒子の懸濁液を含む医薬組成物。
【請求項１４】
以下の工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子を調製する方法：
−  少なくとも１つの脂質、リン脂質、及び、１つの親水性非イオン性界面活性剤を含み、少なくとも１つの対象となる分子を含んでいてもよく、前記親水性非イオン性界面活性剤は、グリフィンＨＬＢ値が１１を超える「疎水性−親水性−疎水性」型の３連配列界面活性剤を含む非イオン性界面活性剤混合物を含む、油／水エマルションを調製する工程；
−  ２００〜６００ｂａｒの圧力下で前記エマルションをホモジナイゼーションする工程。
【請求項１５】
前記エマルションをホモジナイゼーションする前に３０〜８０℃の温度に加熱する工程をさらに含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記脂質が、親水部のモル質量が１００〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲であるポリエチレングリコールモノエステル及びポリエチレングリコールジエステルの混合物である請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リン脂質が双性イオン性のリン脂質の混合物からなる群から選択される請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記親水性非イオン性界面活性剤が、ポリオキシルグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、及びポリオキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択される界面活性剤を含む請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記油／水エマルションが
−  ５〜３０質量％の脂質；
−  ０．５〜５質量％のリン脂質；
−  ０．５〜５質量％のポリオキシルグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル又はポリオキシエチレンアルキルエーテルを含む請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記脂質が、ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ又はＭ１９４４ＣＳである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記リン脂質が、ホスフォリポン９０Ｇ（登録商標）である請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリオキシルグリセリド又は前記ポリオキシエチレン脂肪酸エステルが、ゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートである請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子を含む、対象となる分子を投与するための担体。
【請求項２４】
請求項１１又は１２に記載のナノ粒子を含む医薬品。
【請求項２５】
前記医薬品は、注射、経口、経皮又は経鼻で投与される医薬品である請求項２４に記載の医薬品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は有効成分を投与するためのナノテクノロジー開発の文脈で理解されるべきである。
【０００２】
本発明は、マルチコンパートメント脂質ナノ粒子、（以下、「セリソーム（cellisomes）」と呼ぶ）、その調製方法、及び対象となる分子を、特に注射、経口、経鼻、又は経皮で投与するための担体としての該ナノ粒子の使用に関する。
【０００３】
下記説明では、角括弧（［］）内の参考文献は本文の最後に示される参考文献のリストを参照する。
【背景技術】
【０００４】
ここ３０年間、ナノメートルスケールの系の２つの主要なカテゴリー、すなわちポリマー系及び脂質系が、対象となる分子のための担体として使用するために開発されてきた。
【０００５】
これらのうち前者は、恐らく毒性に起因して、その工業的なアプリケーションに関して他と比べて期待に沿うものではないことが分かった。さらに、市場で入手可能な製剤は主として脂質に基づき、大きな２つの担体のファミリー、すなわちリポソーム及び脂質粒子（ナノエマルション（ＮＥ）、ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）、固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ））を生み出している。市場ではリポソーム及びより少ない程度にナノエマルションは、数多くの化粧品への適用及び幾つかの医薬品をもたらす一方で、最近になって開発されたナノ構造又は固体脂質粒子は、多くの化粧品製品に存在し、製薬部門の治験中にある。
【０００６】
リポソームは１つ以上の同心円状の脂質二重層から成り、水又は水性バッファーのコンパートメントをその中に包み込んでいる人工構造体として定義される。リポソームは、１種類以上の天然又は合成リン脂質から調製され、極性の頭部が一緒になるように組織されて二重層を作り出す。最も伝統的なリポソームの調製方法はいわゆる脂質膜の水和である。リポソームを水溶性、脂溶性、及び両親媒性有効成分のための担体として開発することがますます増えている。有効成分の水相又は脂質二重層への封入は、前記有効成分を酵素分解や免疫系による排除から保護することができ、また非経口投与に際し、その毒性副作用（例えば、溶血、血栓性静脈炎、血液凝固）の可能性を減少させることができる（Meure et al., Aaps Pharmscitech, 9:798-809, 2008; Storm and Crommelin, Pharmaceutical Science & Technology Today, 1:19-31, 1998）［１，２］。多くの市販組成物（例えば、Ｍｙｏｃｅｔ（登録商標）、Ｄｏｘｉｌ（登録商標）／Ｃａｅｌｙｘ（登録商標）、ＡｍＢｉｓｏｍｅ（登録商標）、Ｖｉｓｕｄｙｎｅ（登録商標）等）の根本では、リポソームには大きく不利な点が幾つかある。それら組成物は標的細胞について特異性がなく、リン脂質は酸化して物理的に不安定であるので凍結乾燥することが必要であり、工業的に製造するのに細心の注意を要し、対象となる分子の封入可能量に一定の限界がある。実際に、両親媒性又は親油性の分子は、その膜に挿入することによってリポソームと混合できるが、後者を不安定化するリスクがある。
【０００７】
エマルションは、一方の液体（分散相）が他方の液体（分散剤又は連続相）中で液滴となっている微細分散体であり、２つの液体は相互に非混和性である。エマルションはほとんどの場合、水／油タイプである。「ナノエマルション」（ＮＥ）という用語は、得られた粒径が非常に小さい、すなわち平均サイズが約１００ナノメートルである場合に使用される。それらは水相中での油相の機械的な断片化によって通常作られ、界面活性剤の存在によって安定化されうる。従来のエマルションと比較して、小球体のサイズが小さいこと
から、有利な薬学的性質、特に、保存中の物理的な安定性及び考えられる投与経路、特に小さい液滴の使用を要する静脈内投与の点で有利な薬学的性質をもたらす。しかし、これらの系はそのエマルションを構成する油（大豆油、オリーブ油）に可溶である非常に親油性の高い有効成分しか組み入れることができず、それらの潜在用途を制限する。
【０００８】
固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）及びナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、一般にその粘着性、閉塞性、及び皮膚保湿性に基づいた化粧品への最終的な使用、並びに対象となる有効成分を投与及び保護する医薬への最終的な使用のために、封入された有効成分の物理化学的な安定性及び全体として脂質担体の投与後安定性を高めるのに開発された（Bunjes, Current Opinion in Colloid & Interface Science, 16(5):405-411, 2011; Harde et al., Expert Opinion on Drug Delivery, 8(11):1407-1424, 2011; Harms et al., Journal of Drug Delivery Science and Technology, 21(1):89-99, 2011; Joshi and Muller, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 71:161-172, 2009; Muller et al., Current Drug Discovery technologies, 8(3):207-227, 2011; Pardeike et al., International Journal of Pharmaceutics, 366:170-184, 2009; Souto and Doktorovova, Methods in Enzymology, 464:105-129, 2009）［３〜９］。上記ナノエマルションと同様に、使用される原料の親油性が非常に高いことは、潜在的に投与可能な有効成分の選択を制限する。さらに、固体状態での脂質の多様性（polymorphism）は、特にＳＬＮの場合、その系の物理的安定性に大きな影響を及ぼす（活性分子の排出、ゲル化）ことが示された。
【０００９】
アンジェ大学によって開発された脂質ナノカプセルは相転換法によって得られ、リン脂質単層によって取り囲まれている。ＳＬＮ及びＮＬＣ型ナノ分散体に非常に類似しているが、それらの粒子はリン脂質の結晶層及び非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤によって安定化されたナノカプセルとして記載されている（国際出願国際公開第０１／６４３２８号；Huynh et al., Journal of Pharmaceutics, 379:201-209, 2009）［１０、１１］。興味深いことに、該粒子は比較的「柔らかい（mild）」ので、相転換技術は比較的特定の原料の使用及び調製過程中の非常に繊細な温度制御を要する。これらの面はこの方法の大規模な開発を制限しうる。
【００１０】
数年前に、「ハンドバッグ（handbags）」と呼ばれる２つのコンパートメント油／水構造から成るサブミクロンの大きさの陽イオン性エマルションが開発された（図１）。有効成分のための担体として使用するために、それらのエマルションの形成には、水性コンパートメントを区切る脂質二重層へのトリグリセリドの大量挿入を助けるステアリルアミンの存在を必要とする（Texeira et al., Pharmaceutical Research, 17:1329-1332, 2000）［１２］。残念なことには、これらの２つのコンパートメント体は、調製過程中に形成される多数の他の物体（ミセル、リポソーム、ナノエマルション）のなかで少ない割合（２０％未満）にとどまる。そのうえ、ステアリルアミンなどの陽イオン性界面活性剤の使用は、負に帯電した生物学的製剤膜に対するその種の産物の毒性を考慮して、慎重に考えられるべきである。
【００１１】
リポソーム中のように、少なくとも１つのリン脂質二重層によって囲まれ、安定化された、液体形態又は固体形態の脂質から成る脂質コアを含む直径が１０〜２５０ｎｍである粒子の微々たるナノエマルション（エマルソーム（emulsome）又はウルトラソーム（ultrasome）と呼ばれる）が、脂溶性分子又は水溶性分子の非経口投与、経口投与、直腸投与、鼻腔内投与、又は局所投与のために開発及び設計された（米国特許第５，５７６，０１６号；Gupta et al., Journal of Drug Targeting, 15:437-444, 2007; Gupta and Vyas,
Journal of Drug Targeting, 15:206-217, 2007; Kretschmar et al., Mycoses, 44:281-286, 2001; Paliwal et al., International Journal of Pharmaceutics, 380:181-188,
2009; Wu et al., Journal of Immunology, 185(6):3401-3407, 2010）［１３−１８］。これらのエマルソームを調製する方法は、一般に有機溶媒の使用並びにリン脂質膜の沈
殿及び再水和を要するので工業規模で適用するには困難が伴う。実際に、これらの粒子は主に、水相が予め形成される脂質ナノ粒子を含有することを除いてはリポソームに用いられるものと非常に類似したリン脂質膜水和技法によって得られる。最終的な粒子は、リン脂質二重層中の油滴の「統計的な閉じ込め（statistical confinement）」に由来する。結果として、該方法は先験的に（a priori）、脂質とリン脂質部分を結びつけること無く物体（エマルソーム、リポソーム、ナノエマルション、又は固体ナノ粒子）のさまざまな集団を生成する。これは先験的に（a priori）、ある特定の精製操作（例えば、遠心分離）又は保存中に系の安定性の問題を引き起こしうる。
【００１２】
よって、特に、広い範囲の極性をもつ、大量の対象となる分子を投与するための脂質担体の長期安定性を制御し、随意に、同じナノ物体への親水性有効成分及び親油性有効成分の共封入（co-encapsulation）を想定することを可能にする簡単な生産方法のために、先行技術の欠点、デメリット、及び障害を克服する脂質担体に対する真の必要性がある。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
脂質ナノ系の安定性及び毒性に関する発明者ら自身の経験に基づいて、発明者らは新規のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（又はセリソーム）を開発した。該粒子は上記のもの、つまりリポソームと脂質粒子（図２Ａ〜Ｂ）との間の混成系を意味し、脂質マトリックスと水性コンパートメントが同じナノメートルスケールの物体内で混合される。本発明のセリソームの主たる新規性は、工業的規模で適用できる簡単な調製法（高圧ホモジナイゼーション）にもかかわらずマルチコンパートメント形態であること（図３）に由来する。さらに、使用される原料は比較的安価で、既にさまざまな薬局方で認められ、製薬産業で用いられている。
【００１４】
形態学的に、これらの本発明のマルチコンパートメントナノ粒子はエマルソームと完全に異なる。後者では、脂質コンパートメントが１つ以上のリン脂質二重層内に組み込まれ、同心円状の水性コンパートメントを区切るので、物体は等方性（中心から、全方向で同じ特性）である。本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）の場合では、脂質コンパートメントは水性コンパートメントによって部分的にしか覆われないので、組織は異方性である（中心から、特性が方向に依存して異なる）。
【００１５】
本発明のセリソームでは、脂質コアは室温（２５℃）で液体又は半固体であり、グリセリド及びポリエチレングリコールエステルを組み入れる脂質混合物から構成できる。後者の面は、広範囲の極性を有する有効成分（ＡＰ）（グリセリド中で親油性のＡＰ、ポリエチレングリコール中でより親水性のＡＰ）の前記ナノ粒子内への封入を可能にする点で非常に重要である。
【００１６】
そのうえ、多くの薬物担体で観察されることと違って、本発明のセリソームの懸濁液の安定性は、例えばリポソームの場合のような凍結乾燥工程を必要とすることなく、数十箇月に延びる。本発明のセリソームは、リン脂質を含有する界面活性剤の混合物（例えば、ホスフォリポン（Phospholipon）（登録商標）９０Ｇ）及びグリフィンＨＬＢ値が１１を超える「疎水性−親水性−疎水性」型をいくらか含む非イオン性界面活性剤の混合物を用いて安定化される。例えば、これらの３連配列（three-sequence）界面活性剤は、マクロゴールグリセリド（例えば、ゲルシア（Gelucire）（登録商標）５０／１３）又はポリオキシエチレン脂肪酸（例えば、ポリオキシエチレン（４０）ステアレート）のファミリーに属することができる。この界面活性剤の混合物はカカオバターナノ粒子の長期安定化（４年を超える）に有利であることがこれまで示されている。また、後者の非常に低い毒性がテトラゾリウム塩（ＭＴＴ）を用いる比色分析アッセイによって示された。好ましくは、リノレオイルポリオキシルグリセリド及び／又はオレイルポリオキシルグリセリド（ラブラフィル（Labrafil）（登録商標））からなる脂質相の場合、下記プロトコールに従っ
てこれらの賦形剤を混合及び処理することにより、典型的なナノエマルション（ＮＥ）のイメージと明らかに異なる本発明のセリソームが作られる。
【００１７】
さらに、暗くて電子で密な外層の厚さの測定は、リン脂質二重層（二重層）によって区切られた第２の親水性コンパートメントによって部分的に囲まれた第１の親油性コンパートメント（脂質マトリックス又はコア）を強く示唆する。そのうえ、本発明のセリソームの構造の研究によって、上記のものなどの好適な非イオン性界面活性剤の使用に起因して、前記第１のコンパートメントが前記第２のコンパートメントに部分的に固定されていることがわかった。この説明によって制限されないが、本発明のセリソームの構築上の要石は、「疎水性−親水性−疎水性」型の３つのセグメント（three-segment）誘導体を少な
くとも１つ含有する親水性非イオン性界面活性剤混合物の使用に基づいているようである。疎水性セグメントは、脂肪族アルコール、脂肪酸、グリセリド、コレステロール、又はリン脂質膜に親和性をもつ他の基から成ることができる。親水部は、ポリオキシエチレン、ポリプロピレン、多糖類型のポリマー、又は疎水性セグメントと併せて、ＨＬＢ値が１１を超える界面活性剤を生成できる任意の型のポリマーから成ることになる。ＨＬＢ値はグリフィンによって記載された尺度に従って本明細書で定義される。例えば、これらの界面活性剤は、ポリオキシルグリセリド若しくはマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルエーテルのファミリーに属することがあり、好ましくはゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートであることになる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルは、親水性ポリ（オキシエチレングリコール）鎖でエステル化された脂肪酸の混合物であり、脂肪酸−ＰＥＧ型（モノエステル）の２つのブロックが並んだ誘導体及び脂肪酸−ＰＥＧ−脂肪酸型（ジエステル）の３つのブロックが並んだ誘導体のさまざまな割合での混合物を含有する。また、マクロゴールグリセリドはグリセリドを含有する。特に、ゲルシア（登録商標）５０／１３は、グリセリドと１５００ｇ／ｍｏｌの親水性ポリ（オキシエチレングリコール）鎖でエステル化された脂肪酸の混合物であり、脂肪酸−ＰＥＧ−脂肪酸型（図４Ａ）の３つのブロックが並んだ誘導体を約４０％含む。提案された系では、ジエステル部分は、間違いなく二重層と脂質部の間の固定位置（anchor point）である（図４Ｂ）。実際に、リン脂質の脂質粒子型製剤への組み込みが、一般に２つのタイプの物体、ナノ粒子及びリポソームを含有する不均一な製剤を生じることは当該技術分野において公知である。グリフィンＨＬＢ値が１１を超える「疎水性−親水性−疎水性」型の非イオン性界面活性剤が非存在の場合に本発明の実験プロトコールを適用することによって同じ結果が得られた（データ示さず）。提案された系では、これらの界面活性剤部分は、間違いなく二重層と脂質部の間の固定位置である（図４Ｂ）。
【００１８】
よって、本発明は平均直径が約１０〜５００ｎｍであるマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）であって、リン脂質二重層によって区切られた第２の親水性コンパートメントによって部分的に囲まれた第１の親油性コンパートメントを含み、前記第１のコンパートメントが前記第２のコンパートメントに部分的に固定されていることを特徴とするマルチコンパートメント脂質ナノ粒子、を目的として有する。
【００１９】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明のセリソームは、多分散指数（すなわち粒子集団のサイズ分布）が約５〜１５％、好ましくは１０％である。
【００２０】
好ましくは、本発明のセリソームは平均直径が約１００〜２５０ｎｍである。
【００２１】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のセリソームの親油性コンパートメントは室温で液体状態又は半固体状態の脂質から成る。好ましくは、前記親油性コンパートメントは、本質的にグリセリドと混合されていてもよい脂肪酸エステルから成る。
【００２２】
好ましくは、前記脂肪酸エステルは、親水部のモル質量が１００〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲であるポリエチレングリコールモノエステル及びポリエチレングリコールジエステルの混合物からなる群から選択される。
【００２３】
好ましくは、グリセリドは、室温で液体又は固体であるグリセロールモノエステル、グリセロールジエステル、及びグリセロールトリエステルの混合物からなる群から選択される。
【００２４】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明のセリソームのリン脂質二重層は、本質的にリン脂質及び親水性非イオン性界面活性剤から成る。
【００２５】
好ましくは、前記リン脂質は、本質的に双性イオン性のリン脂質の混合物からなる群から選択される。
【００２６】
好ましくは、前記非イオン性界面活性剤は、「疎水性−親水性−疎水性」型の３つのセグメント誘導体を少なくとも１つ含有する親水性非イオン性界面活性剤混合物からなる群から選択される。疎水性セグメントは、脂肪族アルコール、脂肪酸、グリセリド、コレステロール、又はリン脂質膜に親和性をもつ他の任意の基から成ることができる。親水部は、ポリオキシエチレン、ポリプロピレン、多糖類型のポリマー、又は疎水性セグメントと併せて、ＨＬＢ値が１１を超える界面活性剤を生成できる任意の型のポリマーから成ることになる。ＨＬＢ値はグリフィンによって記載された尺度に従って本明細書で定義される。例えば、これらの界面活性剤は、ポリオキシルグリセリド若しくはマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルエーテルのファミリーに属することがあり、好ましくはゲルシア５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートであることになる。
【００２７】
本発明はまた、少なくとも１つの対象となる分子をさらに含む本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）を目的として有する。
【００２８】
好ましくは、対象となる分子は、核酸、タンパク質、多糖類、小分子、又は医薬品、化粧品、及び／若しくは食品加工関連の他の分子から選択される。
【００２９】
本発明の文脈では、「小分子」は、例えば、分子量が６０〜５０００Ｄａ、好ましくは４０〜３０００Ｄａ、最も好ましくは２０００Ｄａ未満である分子を意味する。
【００３０】
本発明はまた、薬剤的に許容可能な賦形剤中に本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）の懸濁液を含む医薬組成物を目的として有する。
本発明はまた、以下の工程を含む本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）を調製する方法を目的として有する：
−  少なくとも１つの脂質、１つのリン脂質、１つの親水性非イオン性界面活性剤を含み、少なくとも１つの対象となる分子を含んでいてもよい、油／水エマルションを調製する工程；
−  高圧下で前記エマルションをホモジナイゼーションする工程。
【００３１】
本発明の特定の実施形態によれば、前記本発明の方法は、エマルションをホモジナイゼーションする前に３０〜８０℃、好ましくは〜７０℃の温度に加熱する工程をさらに含む。
【００３２】
好ましくは、前記脂質は、親水部のモル質量が１００〜７００ｇ／ｍｏｌの範囲であるポリエチレングリコールモノエステル及びポリエチレングリコールジエステルの混合物か
らなる群から選択される。
【００３３】
好ましくは、前記リン脂質は、本質的に双性イオン性のリン脂質の混合物からなる群から選択される。
【００３４】
好ましくは、前記親水性非イオン性界面活性剤は、ポリオキシルグリセリド若しくはマクロゴールグリセリド、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、又はポリオキシエチレンアルキルエーテルのファミリー、好ましくはゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートからなる群から選択される。
好ましくは、本発明の方法の油／水エマルションは以下を含む：
−  ５〜３０％の脂質、好ましくは、ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ又はＭ１９４４ＣＳ；
−  ０．５〜５％のリン脂質、好ましくはホスフォリポン９０Ｇ（登録商標）；
−  ０．５〜５％のマクロゴールグリセリド又はポリオキシエチレン脂肪酸エステル、好ましくはゲルシア（登録商標）５０／１３又はポリオキシエチレン（４０）ステアレート；
−  水、適量  １００ｇ。
【００３５】
「％」符号はエマルションの総質量に対する％を指す。
【００３６】
本発明はまた、対象となる分子を投与するための担体として使用するための本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）を目的として有する。
【００３７】
本発明はまた、医薬品、好ましくは注射、経口、経鼻、又は経皮で投与される医薬品として使用するための本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）を目的として有する。
【００３８】
他の利点は、例示目的で提供された添付の図面によって説明される下記の実施例を読めば当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、さまざまな操作条件下で得られた「ハンドバッグ」と呼ばれる構造の電子顕微鏡画像を示す。いずれの条件でも、「ハンドバッグ」は少ない割合にとどまる。
【図２】図２は、リポソーム（Ａ）及び脂質粒子（Ｂ）の模式的な説明並びにクライオ透過電子顕微鏡（クライオ−ＴＥＭ）画像を示す。
【図３】図３は、本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子のクライオ−ＴＥＭ画像を示す。
【図４Ａ】図４は、ゲルシア（登録商標）５０／１３の成分（Ａ）及び本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の膜超構造の模式図（Ｂ）を示す。
【図４Ｂ】図４は、ゲルシア（登録商標）５０／１３の成分（Ａ）及び本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の膜超構造の模式図（Ｂ）を示す。
【図５】図５は、本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の調製の模式図を示す。
【図６】図６は、ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳについて、マルチコンパートメント脂質ナノ粒子のサイズ及びその多分散性の２０箇月にわたるモニターリングを示す。
【図７Ａ】図７は、水性媒体に溶かしたクェルセチンの安定性試験［室温Ｈ２Ｏ；室温、ｐＨ７．４の水性媒体；室温模擬胃液（ＳＧＦ）；３７℃模擬胃液（ＳＧＦ）；室温模擬腸液（ＳＩＦ）］（Ａ）並びに本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子封入クェルセチンのさまざまな濃度（１、２、３、４、及び５％）の化学的安定性試験（Ｂ、右）を示す。粒子の物理的安定性は図７Ｂの左に示される。
【図７Ｂ】図７は、水性媒体に溶かしたクェルセチンの安定性試験［室温Ｈ２Ｏ；室温、ｐＨ７．４の水性媒体；室温模擬胃液（ＳＧＦ）；３７℃模擬胃液（ＳＧＦ）；室温模擬腸液（ＳＩＦ）］（Ａ）並びに本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子封入クェルセチンのさまざまな濃度（１、２、３、４、及び５％）の化学的安定性試験（Ｂ、右）を示す。粒子の物理的安定性は図７Ｂの左に示される。
【実施例】
【００４０】
実施例１：マルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）の調製
調製
マルチコンパートメント脂質ナノ粒子の調製を図５に模式的に示す。
【００４１】
加熱系を備え付け、一次エマルションの調製のためのＴ２５ウルトラタラックス（ultra-turrax）（ヤンケ＆クンケルＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）を付随した２段式ホモジナイザー（ＡＰＶ２０００、インベンシス、アルバーツランド、デンマーク）を用いてナノ分散体を調製した。
各バッチについて、以下の３つの工程を含むプロトコールに従って５０ｇのナノ分散体を調製した。
【００４２】
分散：まず最初に、脂質及び界面活性剤（ゲルシア（登録商標）５０／１３及びホスフォリポン（登録商標）９０Ｇ）を秤量し、それぞれ２０ｍｌフラスコ及び１００ｍｌフラスコに入れた。必要量の水を界面活性剤の入ったフラスコに加え、次に７０℃にて９５００ｒｐｍの速度で５分間機械的に撹拌して（Ｔ２５ウルトラタラックス、ヤンケ＆クンケルＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）、界面活性剤懸濁液を調製した。最後に、脂質混合物もまた７０℃に加熱し、それを水相に加え、ウルトラタラックスを用いて１３５００ｒｐｍの速度で５分間撹拌して油／水予備分散体を作った。
【００４３】
ＨＰＨを用いた粒子サイズ削減及びホモジナイゼーション：得られた予備分散体を素早く、予め７０℃に加熱した２段式ホモジナイザー（ＡＰＶ２０００、インベンシス、アルバーツランド、デンマーク）に入れた。その中で、連続ホモジナイゼーションサイクルを、５分間、二段式の圧力（第１段の圧力は６００ｂａｒ及び第２段の圧力は２００ｂａｒ）の下で数回行ない、高温の油／水ナノエマルションを形成した。
【００４４】
粒子の冷却：次にナノ分散体を室温及び４℃で維持した。
【００４５】
組成物
上記調製方法によって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は例えば以下を含む。
脂質（ラブラフィル（登録商標））                          ５〜２０％
リン脂質（ホスフォリポン９０Ｇ）                            １％
マクロゴールグリセリド（ゲルシア（登録商標）５０／１３）    ２％
水（適量）                                        １００ｇ
【００４６】
マルチコンパートメント脂質ナノ粒子の安定性
粒子のサイズ及び多分散性について、水に懸濁したマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の室温での保存を数箇月にわたってモニターした。ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳについて、このモリタリングの例を示した。平均直径（ｎ＝３）の標準偏差は概し
て記号で隠され、方法の良好な再現性を裏付けた。２００ｎｍ未満のナノ粒子直径は静脈内投与に適する。０．２未満の多分散性は平均値前後の狭いサイズ分布を表わす。
【００４７】
水に懸濁した際、最も古いマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は同一の直径（１７０〜１８０ｎｍ）及び多分散性（〜０．１）を２０箇月を超えて保持した（図６）。
【００４８】
実施例２：クェルセチン用担体としてのマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）
有効成分用担体としてのマルチコンパートメント脂質ナノ粒子の調製
上記プロトコールによって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子を、医薬的有効成分を封入するその能力について試験した。
【００４９】
この目的を達成するために、例えば、クェルセチンの封入について研究を実施した。この有効成分には、比較的水に不溶であること（〜０．４μｇ／ｍｌ）及び一定のｐＨ条件下で急速に加水分解されることという対になった（twin）デメリットがある。よって、封入の利点をこれらの２つの点について調べた。
【００５０】
上記プロトコールに従って界面活性剤を含有する水相への乳化前に有効成分を脂質相に飽和するまで溶かすことによって粒子を調製した。封入されなかった有効成分を超遠心分離（Ｏｐｔｉｍａ  ＬＥ−８０Ｋ超遠心分離機、３００００ｒｐｍ、１時間、４℃）で分離し、次に該研究所で開発された方法に従って高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、封入された画分をナノ粒子を含有する上澄み中で分析した。すなわち、ＵＶ検出器（ウォーターズ（商標）２４８７デュアルλ吸光度検出器）、ポンプ（ウォーターズ（商標）１５２５バイナリＨＰＬＣポンプ）、自動試料移送システム（ウォーターズ（商標）７１７プラスオートサンプラー）と組み合わせたインジェクター、及びライン内脱ガス装置（ウォーターズ（商標）インラインデガッサーＡＦ）を備え付けたウォーターズ（商標）ＨＰＬＣ装置を用いてクェルセチンを分析した。分離はカラム（Ｍｏｄｕｌｏ−ｃａｒｔ  ＱＫ３  Ｃ１８−２カラム、１５０ｍｍ×３ｍｍ、Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）上で、２５℃でアセトニトリル−水−トリフルオロ酢酸（３０：７０：０．１、ｖ／ｖ）の移動相を用いて実施した。検出器の波長は３７１ｎｍに設定した。流量は０．５ｍｌ／分であり、注入体積は２０μｌであった。白色脂質粒子を含有する３つの独立したストック液から確立された標準範囲は相関係数（ｒ２）が０．９９９８であり、５０〜５０００ｎｇ／ｍｌの広い領域の線形性を有した。これらのデータから、所与のクロマトグラフィー条件下において、該方法の特異性、感度、及び正確さが高いことが確認された。ＨＰＬＣで分析する前に、試料はすべて線形範囲内の濃度にメタノールに溶かし、次に平均空隙率が０．２μｍの膜（ミニザルト（登録商標）高流量親水性１６５３２Ｋ、ザルトリウス・ステディム・バイオテック有限会社、ゲッティンゲン、ドイツ）を通してろ過した。開発されたＨＰＬＣ法はＡＰと賦形剤を分離し、脂質粒子に封入されたＡＰ含量並びにさまざまな溶解媒質での安定性及び放出速度論（kinetics）を直接決定することを可能にする。
【００５１】
懸濁液中の有効成分の最大搭載量は約１％（又はその水への溶解度の５×１０３倍）であり、最適条件下での封入収率は約９６％である。
【００５２】
くわえて、明らかになったのは、ナノ粒子が表面上にＰＥＧが存在することにより、「ペグ化された」リポソームと広く記載される、生体内投与に必須である捕捉不能性の（細網内皮系による捕捉から逃れる）利点を先験的に（a priori）享受できることである。
【００５３】
遊離クェルセチン又は封入されたクェルセチンの安定性
水性媒体中で加水分解され、本発明のマルチコンパートメント脂質ナノ粒子に封入されたクェルセチンの安定性を調べた。
【００５４】
その目的で、さまざまな流動体中のクェルセチンの安定性をＨＰＬＣ分析を用いて定量した。試験に供されたさまざまな流動体は、室温の模擬胃液（ＳＧＦ、米国薬局方）、並びに３７℃の模擬腸液（ＳＩＦ、米国薬局方）、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）、及び室温の水であった。２４時間にわたって採取された試料により、室温の水では、約５０％のクェルセチンが１７時間以内に分解されるが（図７Ａ）、より酸性の液では該分子はより安定であることが特に示された。
【００５５】
他方では、封入し、懸濁液として水に保存し、超遠心分離した後に、ナノ粒子の分析は９０日間保存した後、約１００％のクェルセチンが依然として見られたことを示した（図７Ｂ、右）。さらに、有効成分を封入する粒子は、４℃同様に、室温で少なくとも９０日間物理的に安定した状態を保った（図７Ｂ、左）。
【００５６】
実施例３：マルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）の調製
さまざまな賦形剤から上記プロトコールに従って、他のセリソームを得た。
【００５７】
例えば、脂質部分はリノレオイルマクロゴール−６  グリセリド（ヨーロッパ薬局方）、オレオイルマクロゴール−６  グリセリド（ＥＰ）、又はプロピレングリコールモノラウレート（ＥＰ）で作られ、リン脂質はジパルミトイルホスファチジルコリンから作られ、非イオン性界面活性剤はステアロイルマクロゴール−３２  グリセリド（ＥＰ）、ステアリン酸のモノエステルとジエステルの合成混合物、及びマクロゴール−３２（４０／６０ｍ／ｍ）、又はポリオキシエチレン（４０）ステアレートで作られた。
【００５８】
これらの賦形剤の全てについて、クライオ−ＴＥＭ観察により、ナノ粒子がコンパートメント化され、図３に示されるものと同様の形態であることを確認した。
【００５９】
実施例４：１０ｇバッチのマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）の調製
調製
マルチコンパートメント脂質ナノ粒子の調製を図５に模式的に示す。
【００６０】
加熱系を備え付け、一次分散体の調製のためのＩＫＡ  Ｔ１０ウルトラタラックス（ヤンケ＆クンケルＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）を付随した単段式ホモジナイザー（ＨＰＨラボラトリー、スタンステッドフルードパワー社（Stansted Fluid Power Ltd）、英国）を用いてナノ分散体を調製した。
以下の３つの工程を含むプロトコールに従って１０グラムのナノ分散体を調製した。
【００６１】
分散：まず最初に、脂質及び界面活性剤（ゲルシア（登録商標）５０／１３及びホスフォリポン（登録商標）９０Ｇ）を計量し、それぞれ７ｍｌフラスコ及び２０ｍｌフラスコに入れた。必要量の水を界面活性剤の入ったフラスコに加え、次に７０℃にて８５００ｒｐｍの速度で５分間機械的に撹拌して（ＩＫＡ  Ｔ１０ウルトラタラックス、ヤンケ＆クンケルＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）、界面活性剤懸濁液を調製した。最後に、脂質混合物もまた７０℃に加熱し、それを水相に加え、ウルトラタラックスを用いて２００００ｒｐｍの速度で５分間撹拌して油／水予備分散体を得た。
【００６２】
ＨＰＨを用いた粒子サイズ削減及びホモジナイゼーション：得られた分散体を素早く、予め７０℃に加熱した単段式ホモジナイザー（ＨＰＨラボラトリー、スタンステッドフルードパワー社、英国）に入れた。その中で、ホモジナイゼーションサイクルを１０００ｂａｒの圧力下で４回行なった。
【００６３】
粒子の冷却：次にナノ分散体を室温で維持した。
【００６４】
組成物
上記調製方法によって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は以下を含む（質量％）：
ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ      ２０％
ホスフォリポン９０Ｇ                          １％
ゲルシア（登録商標）５０／１３                ２％
水（適量）                            １０ｇ
【００６５】
サイズ及び形態の分析
この調製法の後、ナノ粒子は流体力学的直径が２２８±２ｎｍである。さらに、クライオ−ＴＥＭ観察により、ナノ粒子がコンパートメント化され、図３に示されるものと同様の形態であることを確認した。
実施例５：医薬及び／又は化粧品目的の分子のための担体としての１０ｇバッチのマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）
【００６６】
実施例４に記載のプロトコールに従ってマルチコンパートメント脂質ナノ粒子を調製し、さまざまな有効成分を封入するその能力について調べた。
【００６７】
皮膚への適用には、皮膚化粧品目的の分子を計算オクタノール−水分配係数（ＬｏｇＰ）及びモル質量に従って選択し、次に製剤に組み込んだ。３つの分子はカフェイン（抗セルライト；ｌｏｇＰ＝−０．５５；１９４ｇ／ｍｏｌ）、クロロキシレノール（防腐剤；ｌｏｇＰ＝３．３０；１５６ｇ／ｍｏｌ）、及びイルガサン（殺菌剤；ｌｏｇＰ＝４．９８；２８９ｇ／ｍｏｌ）であった。
【００６８】
これらの対象となる分子を親水性のものは水相に溶かし、親油性のものは脂質相に溶かした後、実施例３に記載のプロトコールのウルトラタラックスで混合した。コンパートメント化されたナノ粒子のさまざまな液体構成成分への溶解度を考慮して、カフェインを水相に導入した一方で、クロロキシレノール及びイルガサンを脂質相に組み込んだ。
【００６９】
マルチコンパートメントナノ粒子分散体中の対象となる化合物の各々の最終濃度は１質量％である。
【００７０】
サイズ及び形態の分析
この調製法の後、カフェインを含有するナノ粒子は流体力学的直径が２２３±３ｎｍであり、２５℃で少なくとも１２日間安定した状態を保ち、イルガサンを含有するナノ粒子は流体力学的直径が２２４±４ｎｍであり、２５℃で少なくとも１２日間安定した状態を保ち、クロロキシレノールを含有するナノ粒子は流体力学的直径が２４５±２ｎｍであり、２５℃で少なくとも１箇月間安定した状態を保った。
【００７１】
組み込まれた分子の各々について、クライオ−ＴＥＭ観察により、ナノ粒子がコンパートメント化され、図３に示されるものと同様の形態であることを確認した。
【００７２】
実施例６：マルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）ゲルの調製
実施例４に記載のプロトコールに従って、マルチコンパートメント脂質ナノ粒子を調製した。
【００７３】
この調製の後、コンパートメント化されたナノ粒子を、トリエタノールアミンで中和した２％カーボポール（登録商標）９７４ＮＦ予成形ゲルと混ぜた。カーボポール（登録商
標）９７４ＮＦ中に０．２％及び０．４％に濃縮し、それぞれ脂質賦形剤（質量による）を２０．７％及び１８．４％含有し、最終的なゲルはナノ粒子を含まないカーボポール（登録商標）９７４ＮＦゲルのずり減粘性を保持する。
【００７４】
流体力学的直径の測定及びクライオ−ＴＥＭ観察から、カーボポール（登録商標）９７４ＮＦを含む混合物が、２５℃で５箇月間保存した後でも、ナノ粒子のサイズ又はコンパートメント化された形態を変えないことが示された。
【００７５】
実施例７：１ｋｇバッチのマルチコンパートメント脂質ナノ粒子（セリソーム）の調製
調製
マルチコンパートメント脂質ナノ粒子の調製を図５に模式的に示す。
【００７６】
加熱系を備え付け、一次分散体の調製のためのＴ１８ウルトラタラックスベーシック（Ultra-Turrax Basic）（ヤンケ＆クンケルＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）を付随した２段式ホモジナイザー（ＡＰＶ２０００、インベンシス、アルバーツランド、デンマーク）を用いてナノ分散体を調製した。
【００７７】
以下の３つの工程を含むプロトコールに従って１キログラムのナノ分散体を調製した。
【００７８】
分散：まず最初に、脂質及び界面活性剤（ゲルシア（登録商標）５０／１３及びホスフォリポン（登録商標）９０Ｇ）を計量し、それぞれ２００ｍｌビーカー及び１０００ｍｌビーカーに入れた。必要量の水を界面活性剤の入ったビーカーに加え、次に７０℃にて１１０００ｒｐｍの速度で１５分間機械的に撹拌して（Ｔ１８ウルトラタラックスベーシック、ヤンケ＆クンケルＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ，ＩＫＡ（登録商標）−Ｌａｂｏｔｅｃｈｎｉｋ、ドイツ）、界面活性剤懸濁液を調製した。最後に、脂質混合物もまた７０℃に加熱し、それを水相に加え、油／水予備分散体を得るためにウルトラタラックスを用いて２００００ｒｐｍの速度で１５分間撹拌した。
【００７９】
ＨＰＨを用いた粒子サイズ削減及びホモジナイゼーション：得られた分散体を、予め７０℃に加熱した２段式ホモジナイザー（ＡＰＶ２０００、インベンシス、アルバーツランド、デンマーク）に入れ、レイネリ１１４４ミキサーを用いて機械的に撹拌（８００ｒｐｍ）しながら維持した。その中で、連続ホモジナイゼーションサイクルを、１５分間、二段式の圧力（第１段の圧力は６００ｂａｒ及び第２段の圧力は２００ｂａｒ）の下で数回行ない、高温の油／水ナノエマルションを形成した。
【００８０】
粒子の冷却：次にナノ分散体を２０ｍｌフラスコに入れ、室温で維持した。
【００８１】
組成物
上記調製方法によって得られたマルチコンパートメント脂質ナノ粒子は以下を含む（質量％）：
ラブラフィル（登録商標）Ｍ２１２５ＣＳ      ２０％
ホスフォリポン９０Ｇ                          １％
ゲルシア（登録商標）５０／１３                ２％
水（適量）                              １ｋｇ
【００８２】
サイズ及び形態の分析
この調製法の後、クライオ−ＴＥＭ観察により、ナノ粒子がコンパートメント化され、図３に示されるものと同様の形態であることを確認した。
【００８３】
参考文献
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【図１】
0006489556.tif 000002
【図２】
0006489556.tif 000003
【図３】
0006489556.tif 000004
【図４Ａ】
0006489556.tif 000005
【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
0006489556.tif 000008
【図７Ａ】
0006489556.tif 000009
【図７Ｂ】
0006489556.tif 000010