【事件の表示】
　特許第３３６０５５７号「融合ＤＮＡ配列、融合蛋白質及び該蛋白質を発現させる方法」の請求項１ないし１１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３６０５５７号の請求項１ないし４に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３３６０５５７号は、平成８年１２月２７日（国内優先権主張平成７年１２月２８日）に特願平８−３５６７３９号として特許出願されたものであって、平成１４年１０月１８日にその特許の設定登録がなされ、その後、馬島希美子より特許異議の申立てがなされた。当審において取消理由の通知がなされ、その指定期間内に意見書が提出されると共に訂正請求がなされたが、当審において新たな取消理由の通知がなされ、その指定期間内である平成１６年２月２６日に意見書が提出されると共に、新たな明細書の訂正請求がなされたものである。
　
II．訂正の請求について
１．訂正事項
　平成１６年２月２６日付け訂正請求の訂正事項は、以下のとおりである。
（１）訂正事項ａ
　【特許請求の範囲】の請求項１〜１１項を
【請求項２】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が、フィロコッカス菌由来フェレドキシンのＤＮＡ配列である請求項１に記載の融合ＤＮＡ配列。
【請求項３】請求項１または２のいずれか１項に記載の融合ＤＮＡ配列から発現された融合蛋白質。
【請求項４】請求項１または２のいずれか１項に記載の融合ＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質を発現させる方法。」と訂正する。
　
（２）訂正事項ｂ
　明細書の段落番号【００１０】を
「本発明の耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、摂氏５５℃以上、好ましくは摂氏７５℃以上でも熱変性しない蛋白質をコードするＤＮＡ配列を意味する。熱変性の具体的な現象としては、蛋白質の失活、不溶化等を挙げることができる。摂氏５５℃以上で熱変性しない蛋白質をコードするＤＮＡ配列としては、例えば、摂氏５５℃以上で生息できる好熱菌の有するＤＮＡ配列を挙げることができる。発現される蛋白質の性状あるいは後処理のしやすさから、摂氏７５℃以上で生息できるいわゆる高度好熱菌の有するＤＮＡ配列の使用が好ましい。高度好熱菌としては、例えば、サーモフィラス、サルフォロボス、フィロコッカス、サーモトガ、フィロバクラム、フィロディクチウム、サーモコッカス、サーモディスカス、メタノサーマス、メタノコッカス（FEMS. MICRO. BIOL. REV., Vol.75, p117-124, (1990)、ANU. REV. MICROBIOL., Vol.47, p627-658, (1993) ）等を挙げることが出来る。また、耐熱性蛋白質としては、例えば、フィロコッカスフリオシス菌由来フェレドキシン（Pyrococcus furiosus 由来Ferredoxin :Biochemistry, Vol.31, p1192-1196,(1992) ）（以下本明細書中ではＦＤＸと記載する）等を挙げることができるが、本発明のＤＮＡ配列がコードしている耐熱性蛋白質はこれらに限定されるものではない。本発明の耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡは、これら高度好熱菌から精製することもできるが、既知のＤＮＡ配列を基に合成することもできる。耐熱性蛋白質のＤＮＡ合成には、β−シアノエチルフォスフォアミダイト法（Sinha et.al,Nucleic Acids Bos., 12, 4539, (1984)）、Letsinger. R. L et. al, J. Am. Chem. Soc., 88 5319 (1966) に記載の方法等の公知の技術を適宜用いることができる。本発明の一実施態様である実施例及び参考例では、配列表１及び３に示すアミノ酸配列を有するフィロコッカス菌由来ＦＤＸ及びサルファロボス菌由来アデニレートキナーゼ（Sulfolobus acidocaldalius 由来Adenylate Kinase: Arch. Biochem. Biophys., Vol.307, p405-410, (1993) ）（以下本明細書中ではＡＫと記載する）のＤＮＡをβ−シアノエチルフォスフォアミダイト法で合成した。合成したＤＮＡ配列を配列表２及び４に示す。」と訂正する。
　
（３）訂正事項ｃ
　明細書の段落番号【００４４】、【００４５】及び【００４７】における「実施例１２」を「参考例５」に訂正する。
　
（４）訂正事項ｄ
　明細書の段落番号【００４５】における「実施例１３」を「参考例６」に訂正する。
　
（５）訂正事項ｅ
　明細書の段落番号【００４７】及び【００４８】における「実施例１４」を「参考例７」に訂正する。
　
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
（１）訂正事項a
（１−１）請求項１についての訂正は、訂正前の請求項１において具体的に特定されていなかった「摂氏５５℃以上で熱変性しない耐熱性蛋白質のDNA配列」を、訂正前の請求項７に当該耐熱性蛋白質のDNA配列として具体的に例示されているものの一つである「耐熱性フェレドキシンのDNA配列」と限定するものであり、特許請求の範囲を減縮するものである。
（１−２）訂正前の請求項２〜８は削除されており、当該訂正は、特許請求の範囲の減縮に該当する。
（１−３）請求項２〜４についての訂正は、訂正前の請求項２〜８の削除により、訂正前の請求項９〜１１を請求項２〜４に繰り上げ、併せて、それぞれが引用する請求項の番号も繰り上げて整理するものであるから、明瞭でない記載の釈明に該当する。
　
（２）訂正事項b〜e
　訂正事項bは、具体的には
(i)訂正前の「耐熱性蛋白質としては、例えば、サルファロボス菌由来アデニレートキナーゼ（Sulfolobus acidocaldalius 由来Adenylate Kinase: Arch. Biochem. Biophys., Vol.307, p405-410, (1993) ）（以下本明細書中ではＡＫと記載する）、サーモフィラス菌由来ＤＮＡポリメラーゼ、フィロコッカスフリオシス菌由来フェレドキシン（Pyrococcus furiosus 由来Ferredoxin :Biochemistry, Vol.31, p1192-1196,(1992) ）（以下本明細書中ではＦＤＸと記載する）…（中略）…サーモコッカスセレール菌由来エロンゲーションファクター（Thermococcus celer由来 Elongation Factor 1-alpha: Nucleic acid res., Vol.18, p3989, (1990) ）等を挙げることができるが、」を、「耐熱性蛋白質としては、例えば、フィロコッカスフリオシス菌由来フェレドキシン（Pyrococcus furiosus 由来Ferredoxin :Biochemistry, Vol.31, p1192-1196,(1992) ）（以下本明細書中ではＦＤＸと記載する）等を挙げることができるが、」と訂正し、また、
(ii)訂正前の「本発明の一実施態様である実施例では、配列表１及び３に示すアミノ酸配列を有するフィロコッカス菌由来ＦＤＸ及びサルファロボス菌由来ＡＫのＤＮＡをβ−シアノエチルフォスフォアミダイト法で合成した。合成したＤＮＡ配列を配列表２及び４に示す。」を、「本発明の一実施態様である実施例及び参考例では、配列表１及び３に示すアミノ酸配列を有するフィロコッカス菌由来ＦＤＸ及びサルファロボス菌由来アデニレートキナーゼ（Sulfolobus acidocaldalius 由来Adenylate Kinase: Arch. Biochem. Biophys., Vol.307, p405-410, (1993) ）（以下本明細書中ではＡＫと記載する）のＤＮＡをβ−シアノエチルフォスフォアミダイト法で合成した。合成したＤＮＡ配列を配列表２及び４に示す。」と訂正するものである。
　訂正事項b(i)は、「耐熱性蛋白質」の例示から本件発明に係る「フェレドキシン」以外を削除するものであり、また、訂正事項b(ii)及び訂正事項c〜eは、当初当該耐熱性蛋白質として例示されており、かつ、実施例として記載されていた「サルフォロボス菌由来のアデニレートキナーゼ」の例を参考例とし、本件発明の実施例に該当しないことを明記する訂正である。これらは、発明の詳細な説明の記載を、減縮した特許請求の範囲と整合性を保つために整理したものであるから、明瞭でない記載の釈明に該当する。
　
　上記いずれの訂正も、願書に最初に添付した明細書に記載した事項の範囲内の訂正であり、実質上特許請求の範囲を拡張しまたは変更するものでもない。
　
　以上のとおりであるから、これらの訂正は、特許法第１２０条の４第２項、及び、同条第３項で準用する特許法第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、訂正を認める。
　
III.特許異議申立について
１．本件発明
　本件発明は、上述の訂正が認められることから、訂正明細書の請求項１〜４に記載された事項により特定される下記のとおりのものである（以下、それぞれ、「本件発明１」〜「本件発明４」ともいう。）。
　
【請求項２】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が、フィロコッカス菌由来フェレドキシンのＤＮＡ配列である請求項１に記載の融合ＤＮＡ配列。
【請求項３】請求項１または２のいずれか１項に記載の融合ＤＮＡ配列から発現された融合蛋白質。
【請求項４】請求項１または２のいずれか１項に記載の融合ＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質を発現させる方法。」
　
２．特許異議申立の概要
　特許異議申立人　馬島希美子は、下記甲第１号証を提出し、（１）訂正前の請求項１、２、１０及び１１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明と同一のものであるから特許法第２９条第１項第３号の規定により特許を受けることができないものであること、及び、（２）訂正前の請求項１〜１１に係る発明は、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明することができたものであるから特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものであることを主張している。
　
　甲第１号証：特表平５−５０７２０９号公報
　
３．当審の判断
（１）甲第１号証の記載　
　甲第１号証には、「発現目的蛋白をコードするDNAに融合したチオレドキシンなどのチオレドキシン様蛋白をコードするDNAを含む、融合蛋白をコードするDNA」に係る発明が記載されている（特許請求の範囲）。そして、当該チオレドキシンが８０℃以下の加熱に対して安定な耐熱性蛋白であることから（第３頁左下欄第４〜６行）、目的発現蛋白と融合した場合、当該融合蛋白に熱安定性が付与され、単純な熱処理によって初期有効精製が可能となる旨が記載されている（第６頁左下欄第３〜６行）。
　また、チオレドキシン（様蛋白）との融合蛋白について、細菌宿主細胞において低レベルでしか製造されないある種の望ましい治療用蛋白、例えばIL-11の高レベルの発現を可能にする旨が記載されている（第６頁左下欄第１〜２行）。
　
（２）特許法第２９条第１項第３号について
　IIで述べた訂正がなされたことで、本件発明１〜４には、耐熱性蛋白のDNA配列として「チオレドキシン」や「チオレドキシン様蛋白」のDNA配列を用いる場合は含まれないものとなったので、異議申立人の指摘する特許法第２９条第１項第３号違反についての主張はもはや成り立たない。
　
（３）特許法第２９条第２項について
（３−１）特許異議申立人の主張
　異議申立人の主張は概ね次のとおりである。
　甲第１号証は、目的とする蛋白質を融合蛋白質として発現させる技術であって、本件発明と共通の技術的課題に基づくものである。
　操作性、生産性、耐熱性などは当業者が考慮すべき一般的な課題であるから、発現目的蛋白質の融合相手として、例えば本件明細書の【００１０】に記載の、種々の公知の好熱菌、高度好熱菌由来の蛋白質を選択することについても、当業者の通常の創作能力の発揮に過ぎない。
　しかも、本件発明を甲第１号証と比較しても、本件発明において当業者が予測し得ないような顕著に優れた効果、もしくは異質な効果を奏するとも認められない。
　
（３−２）判断
　甲第１号証には、耐熱性蛋白チオレドキシン（様蛋白）との融合蛋白が熱処理による精製効率向上効果を有することが記載されているから、当業者は、同様の効果を期待して、他の耐熱性蛋白をチオレドキシン様蛋白に代えて用いようとするかもしれない。
　しかしながら、本件明細書の【００２６】段落に示されるとおり、耐熱性蛋白としてフェレドキシンを用いた場合には、それを融合しない場合と比較して、目的蛋白を約数１００倍もの量発現しているところ、同号証には、耐熱性蛋白と融合することによって、そのような大幅な発現量の増大効果がみられることについて記載されていないから、当該効果は当業者の予測し得た範囲を超えるものと認められる。
　なお、同号証の第６頁左下欄第１〜２行に記載されたIL-1の高レベル発現に関する効果は、高熱処理によって奏されるものではないから、このことがチオレドキシン（様蛋白）の耐熱性という性質に起因するものと理解することは困難と認められる。ゆえに、上述の「熱処理による精製効率向上」とは異なり、同号証に記載の当該効果に基づき、「耐熱性蛋白」一般について同様の効果を期待することは困難である。その上、同号証には、チオレドキシン（様蛋白）との融合蛋白について、どの程度の発現レベルの変化が得られるのか、具体的な試験結果は示されていない。してみると、当該甲第１号証の記載から、耐熱性蛋白一般を用いた場合に発現量の増大効果が奏されると当業者が予測し得たとはいえず、まして耐熱性フェレドキシンを用いた場合の大幅な増大効果を予測し得たとはいえないから、同記載を考慮しても上記認定は変わらない。
　したがって、本件発明１は甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明できたものであるとすることはできない。
　また、訂正後の本件発明２〜４は、本件発明１に記載のDNA配列の由来菌を特定した発明や、当該DNA配列から発現された融合蛋白質、及び、当該DNA配列を用いた融合蛋白質の発現方法に係る発明であるから、本件発明１と同様の理由により、甲第１号証に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたとはいえない。
　よって、特許法第２９条第２項違反に関する異議申立人の上記主張は採用できない。
　
IV.むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては本件請求項１〜４に係る発明の特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件請求項１〜４に係る特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
融合ＤＮＡ配列、融合蛋白質及び該蛋白質を発現させる方法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】選択された蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端に、直接または間接に融合された摂氏５５℃以上で熱変性しない耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列を含む融合ＤＮＡ配列
であって、該耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列が、耐熱性フェレドキシンのＤＮＡ配列である融合ＤＮＡ配列
　【請求項２】耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列がフィロコッカス菌由来フェレドキシ
ンの
１に
融合
　【請求項３】請求項１
または２
融合
　【請求項４】請求項１
または２
融合
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】本発明は、融合蛋白質の発現に関するものである。更に詳しくは、耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む融合ＤＮＡ配列、該融合ＤＮＡ配列により発現される融合蛋白質及び該融合蛋白質を発現させる方法に関するものである。
　【０００２】
　【従来の技術】遺伝子工学の進歩は、これまで天然物から精製していた蛋白質を遺伝子レベルで解析し、目的蛋白質を人工的に増幅させることを可能にした（Ｉｔａｋｕｒａ　ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８　１０５６（１９７７））。その後発明されたチオレドキシン（以下本明細書中ではＴＲＸと記載する）（特表平５−５０７２０９）や、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下本明細書中ではＧＳＴと記載する）（特表平１−５０３４４１）等を融合させたＤＮＡ配列の応用によって、本来発現しにくいような蛋白質をも発現させることができるようになり、融合蛋白質を発現させる技術は広く用いられるようになった。
　【０００３】しかしながら、ＴＲＸやＧＳＴは様々な発現しにくい蛋白質の融合発現に応用できるものの、本来、可溶性の融合蛋白質を発現させる目的であったＧＳＴにおいても融合する蛋白質によっては融合蛋白質が不溶性になり生産性が落ちてしまったり、ＴＲＸを融合させた融合蛋白質は非特異反応が生じやすい等の問題が出ることがあり、更に操作性や生産性に優れた融合蛋白質の提供が望まれていた。
　【０００４】
　【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的は、目的とする蛋白質またはペプチドを発現させるために操作性や生産性に優れた新たな融合ＤＮＡ配列、該融合ＤＮＡ配列から発現される融合蛋白質及び該融合ＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質の発現方法を提供することである。
　【０００５】
　【課題を解決するための手段】本発明者等は、従来の課題を解決すべく鋭意研究した結果、選択された蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列と耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ配列とを直接または間接に融合し、該融合ＤＮＡ配列から融合蛋白質を発現させると、目的蛋白質またはペプチドの生産性が上がり、該融合蛋白質は熱耐性を得て精製操作が簡便になることを見い出して、本発明を完成した。
　【０００６】すなわち、本発明は、耐熱性蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む融合ＤＮＡ配列、該融合ＤＮＡ配列が発現する融合蛋白質及び該ＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質の発現方法に関するものである。
　【０００７】本発明の融合蛋白質は、可溶性が高く、耐熱性蛋白質遺伝子由来の耐熱性をも維持し得る。融合蛋白質のこのような特性により、融合蛋白質を精製する場合に、熱処理により簡便に不要物質を除去することができ、融合蛋白質を収量よく得ることができるのである。
　【０００８】また、融合蛋白質として広く用いられている大腸菌由来のＴＲＸや日本住血吸虫由来のＧＳＴでは、大腸菌や日本住血吸虫が哺乳類やその他の生物体内で生息し得るため、ＴＲＸやＧＳＴを用いた融合蛋白質を免疫反応の抗原として用いるような場合には、大腸菌や日本住血吸虫に起因する非特異反応を生じることがあった。これに対し、本発明の融合蛋白質は哺乳類やその他の生物の生体内では生息し得ない好熱菌由来の耐熱性蛋白質を用いているため、本発明の融合蛋白質を免疫反応の抗原として用いる場合等にも、融合蛋白質由来の非特異反応が生じにくいのが大きな特徴である。
　【０００９】以下、本発明を詳細に説明する。
　【００１０】本発明の耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、摂氏５５℃以上、好ましくは摂氏７５℃以上でも熱変性しない蛋白質をコードするＤＮＡ配列を意味する。熱変性の具体的な現象としては、蛋白質の失活、不溶化等を挙げることができる。摂氏５５℃以上で熱変性しない蛋白質をコードするＤＮＡ配列としては、例えば、摂氏５５℃以上で生息できる好熱菌の有するＤＮＡ配列を挙げることができる。発現される蛋白質の性状あるいは後処理のしやすさから、摂氏７５℃以上で生息できるいわゆる高度好熱菌の有するＤＮＡ配列の使用が好ましい。高度好熱菌としては、例えば、サーモフィラス、サルフォロボス、フィロコッカス、サーモトガ、フィロバクラム、フィロディクチウム、サーモコッカス、サーモディスカス、メタノサーマス、メタノコッカス（ＦＥＭＳ．ＭＩＣＲＯ．ＢＩＯＬ．ＲＥＶ．，Ｖｏｌ．７５，ｐ１１７−１２４，（１９９０）、ＡＮＵ．ＲＥＶ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．，Ｖｏｌ．４７，ｐ６２７−６５８，（１９９３））等を挙げることが出来る。また、耐熱性蛋白質としては、例えば
、フ
等を
及び参考例
アデニレートキナーゼ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｌｉｕｓ由来Ａｄｅｎｙｌａｔｅ　Ｋｉｎａｓｅ：Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．３０７，ｐ４０５−４１０，（１９９３））（以下本明細書中ではＡＫと記載する）
　【００１１】本発明の選択された目的蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列は、特定のＤＮＡ配列に限定されるものではない。融合蛋白質として発現させようと所望する蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列であれば、いずれのＤＮＡ配列をも用いることができる。選択された目的蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡそれ自体では必要な発現量が得にくいような蛋白質またはペプチドを発現させる場合には、本発明が特に有用である。
　【００１２】本発明の融合ＤＮＡ配列は、ライゲーション法、リンカーライゲーション法等の既知の方法を用いて融合することができる。融合に当たっては、選択された目的蛋白質またはペプチドのＤＮＡ配列の５’末端と耐熱性蛋白質のＤＮＡ配列の３’末端とを直接融合させても、必要に応じて間接融合させてもよい。間接融合させる場合には、目的蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端と耐熱性蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’末端との間にリンカー配列を挿入する。該リンカー配列としては、目的蛋白質またはペプチドと耐熱性蛋白質とを相互に結合させるためのポリペプチドをコードする配列の他、公知の化学的方法、酵素的方法等により、選択的に開裂または消化できるポリペプチドをコードする配列を用いることができる。目的蛋白質またはペプチドをコードするＤＮＡ配列と耐熱性蛋白質をコードするＤＮＡ配列との間にリンカー配列を挿入した場合は、融合蛋白質を発現させた後、ブロムシアン等の化学的方法や、トロンビン、ファクターＸａ等の酵素的方法等でリンカー配列を開裂または消化し、選択された目的蛋白質またはペプチド部分だけを精製することもできる。
　【００１３】本発明の融合蛋白質を発現させるには、通常の遺伝子工学技術を用いることができる。例えば、本発明の融合ＤＮＡ配列を発現に適したベクターに挿入し、該ベクターを培養宿主に導入し、融合蛋白質の発現を誘導する。宿主を培養等により増やした後、宿主破砕、カラム操作等の精製手段を経て、目的の融合蛋白質またはペプチドを入手する。用いる宿主細胞は、異種蛋白質またはペプチドを発現させることができる細胞であれば、細菌細胞、真核生物細胞、哺乳類細胞等いずれの細胞であってもよく、例えば、大腸菌、酵母、枯草菌、バキュロウイルス、ＣＯＳ細胞等を挙げることができる。
　【００１４】本発明の融合蛋白質は、融合蛋白質としてそのまま用いることも、目的蛋白質またはペプチド部分を分離精製して用いることもできる。
　【００１５】
　【実施例】本発明を以下参考例及び実施例により更に詳細に説明する。
　【００１６】実施例１　ＦＤＸ発現ベクターｐＷＦ６Ａの作製
フィロコッカスフリオシス菌由来ＦＤＸの既知のＤＮＡ配列をもとにＤＮＡ合成装置（モデル３９２、パーキンエルマー社製）を用いて作製した５３ｍｅｒのプライマーを８個使用し、アセンブルＰＣＲ法により、フィロコッカスフリオシス菌由来ＦＤＸの遺伝子を合成した。アセンブルＰＣＲ法にはＴａｑポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用し、９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−１分、３０サイクルの条件で、総塩基数２４８ｂｐを増幅した。５’末に制限酵素ＮｄｅＩ部位を、３’末に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を、Ｃ末にはトロンビン切断部位を付加した。この断片をｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）とｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシアバイオテック社製）より作製した４．６ＫｂのｐＷ６ＡベクターのＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＦＤＸを発現するベクターとしてｐＷＦ６Ａを作製した。ｐＷ６Ａの詳細図を図１に、ｐＷＦ６Ａの詳細図を図２に示す。ｐＷＦ６ＡはＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位に、ＦＤＸ由来の６７アミノ酸、トロンビン開裂部位由来の１０アミノ酸及びｐＷ６Ａマルチクローニングサイト由来の１９アミノ酸を含む９６アミノ酸からなる融合蛋白質の遺伝子を含んでいる。挿入断片はＤＮＡシーケンスキット（シーケナーゼキットＶｅｒ．２．０、アマーシャムユナイテッド　ステイツ　バイオケミカル社製）によりＤＮＡ配列を確認した。ｐＷ６Ａに挿入したＦＤＸのＤＮＡ配列及び該配列がコードするアミノ酸配列を、配列表１及び２に、ｐＷ６ＡのＤＮＡ配列を配列表５に示す。配列表には、制限酵素部位ＮｄｅＩのＡＴＧを１番として、マルチクローニングサイトのストップコドンの前までの配列を示した。ｐＷＦ６Ａを宿主大腸菌に導入後、１％バクトトリプトン、０．５％イーストエキストラクト、１％塩化ナトリウム、５０μｇ／ｍｌアンピシリン、ｐＨ７．５培地（以下本明細書中ではＬＢ培地と記す）で２時間培養後、１ｍＭイソプロピルチオガラクトピラノシド（以下本明細書中ではＩＰＴＧと記す）を添加し２時間培養して、発現を誘導した。大腸菌の沈渣に１０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ７．５、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（以下本明細書中ではＥＤＴＡと記載する）（以下この緩衝液を本明細書中ではＴＥ緩衝液と記載する）を加え超音波破砕し、レムリー法による１５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下本明細書中ではＳＤＳ−ＰＡＧＥと記載する）を行った。クマシーブリリアントブルー染色（以下本明細書中ではＣＢＢ染色と記す）で約２２Ｋｄａ付近にバンドを確認し、二量体を形成したフィロコッカスフリオシスのＦＤＸと認めた。
　【００１７】実施例２　ＦＤＸの精製
実施例１で作製したｐＷＦ６Ａを宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養にて波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。３時間培養後、遠心を行い大腸菌を回収した。回収した大腸菌に５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ８．０（以下本明細書中ではトリス緩衝液と記載する）を２００ｍｌ加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。発現した融合蛋白質は、遠心後可溶性成分として上清に回収された。この上清について８５℃１５分間熱処理を行ったところ、約８０％の大腸菌蛋白は熱変性沈殿し、熱処理後の遠心上清に９０％以上のＦＤＸを回収した。
　【００１８】この上清を、トリス緩衝液で平衡化したＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシアバイオテック社製）でイオン交換精製した。塩化ナトリウムを含むカラム平衡緩衝液で溶出したところ、約０．３Ｍ塩化ナトリウム濃度溶出画分にＦＤＸを回収した。次いでこのＦＤＸ画分を、２０ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社製）で精製した。アセトニトリルで溶出したところ、約１０％アセトニトリル溶出画分に精製ＦＤＸを回収した。
　【００１９】参考例１　ＴＲＸの精製
実施例１で作製したｐＷＦ６Ａ同様にＴＲＸを発現するベクターとして作製したｐＷＴ８Ａを宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。実施例１と同様の発現誘導を行った後、遠心で大腸菌を回収した。回収した大腸菌にオスモテックショックを与え、ペリプラズム画分にあるＴＲＸを抽出した。抽出ＴＲＸは２０ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社製）で一回目の精製を行った。アセトニトリルで溶出したところ、約１０％〜２０％アセトニトリル溶出画分にＴＲＸを回収した。回収したＴＲＸを４Ｍグアニジン塩酸に透析後、同条件下での逆相カラムで二回目の精製を行った。一回目同様、約１０％〜２０％アセトニトリル溶出画分に精製ＴＲＸを回収した。
　【００２０】実施例３　ウエスタンブロット法によるＦＤＸとＴＲＸの特異性試験非特異反応物質として抗大腸菌抗体を想定し、実施例２で精製したＦＤＸと参考例１で精製したＴＲＸの反応性を調べた。
　【００２１】大腸菌ＤＨ５αのＳＤＳ可溶化物、超音波破砕物上清及びｐＷ５０ベクター（自家製）導入大腸菌のＳＤＳ可溶化物を免疫源として、それぞれウサギ３羽づつ計９種の抗大腸菌ウサギ血清を作製した。実施例２で精製したＦＤＸと参考例１で精製したＴＲＸをレムリー法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後ニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜上の残っている蛋白吸着部分を１％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした後、これに１次抗体としてそれぞれ５００倍希釈した上記の抗大腸菌ウサギ血清９種を、２次抗体としてペルオキシダーゼ（以下本明細書中ではＰＯＤと記載する）標識抗ウサギ抗体を用いて、ウエスタンブロット法を行った。発色には４−クロロ−１−ナフトール及び過酸化水素を用いた。ＦＤＸ分子量相当部分に抗大腸菌ウサギ抗体と反応するバンドは確認されなかったが、ＴＲＸ分子量相当部分では、抗大腸菌ウサギ血清９種中、大腸菌ＤＨ５αの超音波破砕物上清及びｐＷ５０ベクター導入大腸菌のＳＤＳ可溶化物を免疫源とした６種が反応した。
　【００２２】上記と同様に、１次抗体としてヒト検体ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩミックスパネル２０４血清（ボストン　バイオメデイカ社製）２５例をそれぞれ５０倍希釈し、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを用い、ウエスタンブロット法を行った。ＦＤＸが転写された部位での反応性は確認されなかったが、ＴＲＸが転写された部位では２５例中２例の反応が確認された。結果を表１に示す。
　【００２３】
　【表１】
　【００２４】実施例４　ヒト検体を用いたＥＬＩＳＡ法によるＦＤＸとＴＲＸの特異性試験
ＥＬＩＳＡプレ−ト（ベクトン　デッキンソン社製）に実施例２で精製したＦＤＸと参考例１で精製したＴＲＸを各々２５μｇ／ｍｌで５０μｌずつ感作した。
　【００２５】ＥＬＩＳＡプレートのウエル上の残っている蛋白吸着部分を１％スキムミルクを含むＰＢＳでブロッキングした後、１次抗体として実施例３で使用したボストン　バイオメデイカ社製ヒト検体５００倍希釈物を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを用いて、ＥＬＩＳＡ法による特異性試験を行った。発色にはＡＢＴＳ及び過酸化水素を用いた。測定結果は波長４０５ｎｍと波長４９２ｎｍの吸光度の差で表示した（吸光度の差は、Ａ４０５／４９２ｎｍと記載した）。検体との反応において、ＦＤＸではブランクの２倍を越える検体はなかったのに対し、ＴＲＸでは２５例中６例でブランクの２倍を越える検体が確認された。フィロコッカスフリオシス由来のＦＤＸは大腸菌由来ＴＲＸと異なり、大腸菌由来の非特異反応、交叉反応は認められなかった。結果を図３に示す。
　【００２６】実施例５　ＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９融合蛋白質及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９融合蛋白質の発現
ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩを発現している感染細胞株から、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の方法でゲノミックＤＮＡを抽出した。次にＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位を付加したプライマーを用い実施例１と同様の方法でＰＣＲ法を行って、それぞれのｇａｇ領域のｐ１９ＤＮＡ断片約４００ｂｐを得、これらをｐＷＦ６Ａに組み込み、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９を発現するベクターとしてｐＷＦＩＰ１９を、ＨＴＬＶ−ＩＩのｐ１９を発現するベクターとしてｐＷＦＩＩＰ１９を作製した。ベクターに挿入したＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９のＤＮＡ配列を配列表６及び８に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表７及び９に示す。これらのベクターを実施例１と同様に大腸菌に導入し各融合蛋白質の発現を誘導した。実施例１と同一条件で泳動用サンプルを調製し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染色、他の１枚は実施例３に示した方法でニトロセルロース膜に転写した。一次抗体として、抗ネイティブＨＴＬＶ−Ｉｐ１９モノクローナル抗体（ＧＩＮ−７抗体、Ｔａｎａｋａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ　Ｇａｎｎ．，７４，３２７−３３０，（１９８３））又は抗ネイティブＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９モノクローナル抗体を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用い、実施例３と同様の方法で融合蛋白と反応させ４ークロロー１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、各融合蛋白質に対応したモノクローナル抗体が反応する融合蛋白質の発現が認められた。これらの融合蛋白質はＣＢＢ染色ゲルと同位置約３４Ｋｄａ付近にバンドを生じた。ＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ１９及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ１９は、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ１９及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ１９を直接発現させた場合と比較すると、約数１００倍発現量が増加した。
　【００２７】実施例６　ＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）融合蛋白質及びＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）融合蛋白質の発現
実施例５と同様の方法で、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ感染細胞のＤＮＡを用いＰＣＲ法により各々ｅｎｖ領域のｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）ＤＮＡ断片約５００ｂｐを得た。これらのＤＮＡ断片を実施例１で作製したｐＷＦ６ＡのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位に組込み、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ２０Ｅを発現するベクターとしてｐＷＦＩＥ１、ＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２０Ｅを発現するベクターとしてｐＷＦＩＩＥ１０を作製した。ベクターに挿入したＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０ＥのＤＮＡ配列を配列表１０及び１２に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表１１及び１３に示す。これらのベクターを大腸菌に導入し、実施例１と同様の条件でＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ融合蛋白質（以下本明細書中ではＦＤＸ−２０（Ｉ）と記載する）及びＦＤＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ融合蛋白質（以下本明細書中ではＦＤＸ−２０（ＩＩ）と記載する）の発現を誘導した。実施例１と同様に大腸菌を超音波破砕し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染色を行い、他の１枚のゲルは１２０ｍＡ、３時間でニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜上の残っている蛋白吸着部分を１％ＢＳＡを含むリン酸緩衝液でブロッキング後、ネイティブのＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）に反応する抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノクローナル抗体（Ｆ−１０Ｓｕｇａｍｕｒａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３２，３１８０−３１８４（１９８４））１μｇ／ｍｌと融合蛋白とを室温で１時間反応させ、次いで、ＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを室温で１時間反応させた。続いて、４ークロロー１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、各融合蛋白質に対応して抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノクロナール抗体と反応する融合蛋白質の発現が認められた。これらの融合蛋白質は、ＣＢＢ染色ゲルと同位置の約３２Ｋｄａ付近にバンドを生じた。
　【００２８】ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）共に、ＨＴＬＶ−Ｉのｐ２０Ｅ及びＨＴＬＶ−ＩＩのｐ２０Ｅを直接発現させた場合と比較すると、発現量が約数１００倍増加した。
　【００２９】実施例７　ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）融合蛋白質の精製
実施例６で作製したｐＷＦＩＥ１とｐＷＦＩＩＥ１０を各々宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養として波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。ＩＰＴＧ添加３時間後、遠心を行い菌の回収を行った。回収した大腸菌に１％トライトンＸ１００、２Ｍ尿素を含む５０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０緩衝液２００ｍｌを加え、氷冷下で超音波破砕処理を行った。遠心を行って不溶体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ）の回収を行った。４Ｍグアニジン塩酸１０ｍＭジチオスレイトール（以下本明細書中ではＤＴＴと記す）溶液で不溶体を可溶化した。２０％アセトニトリル、２０ｍＭ水酸化ナトリウムで平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社製）にて可溶化物を精製した。アセトニトリル溶出を行ったところ、約３０−４０％アセトニトリル溶出画分にそれぞれ精製ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）融合蛋白質を回収した。
　【００３０】参考例２　ＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ融合蛋白質及びＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ融合蛋白質の精製
参考例１で作製したＴＲＸ発現ベクターｐＷＴ８Ａに、実施例６と同様にＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩのｅｎｖ領域のｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）を導入しｐＷＴＩＥ１とｐＷＴＩＩＥ１０を作製し発現を行った。実施例７と同様にリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社製）を用いた精製法によりＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−Ｉｐ２０Ｅ融合蛋白質（以下本明細書中ではＴＲＸ−２０（Ｉ）と記載する）及びＴＲＸ融合ＨＴＬＶ−ＩＩｐ２０Ｅ融合蛋白質（以下本明細書中ではＴＲＸ−２０（ＩＩ）と記載する）を精製した。
　【００３１】実施例８　融合蛋白質の反応性試験
（１）ウエスタンブロット法による試験実施例７で精製したＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）と、参考例２で精製したＴＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とを用い、ウエスタンブロット法におけるヒトＨＴＬＶ検体との反応性を比較した。
　【００３２】１次抗体としてボストン　バイオメデイカ社製ヒト検体ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩミックスパネルの５０倍稀釈物を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを用いて、実施例３と同様にウエスタンブロット法を行った。ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）とＴＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とは同様の検体と反応した。結果を表２に示す。
　【００３３】
　【表２】
　【００３４】（２）ＥＬＩＳＡ法による比較
実施例７で精製したＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）と、参考例２で精製したＴＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とをそれぞれ３μｇ／ｍｌの濃度で、ＥＬＩＳＡプレート（ベクトン　デッキンソン社製）に５０μｌずつ感作した。
　【００３５】このＥＬＩＳＡプレートを用い、実施例４と同様に１次抗体として５００倍希釈したボストン　バイオメデイカ社製ヒト検体を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧを用いてＥＬＩＳＡ法を行った。ＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）と、ＴＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とは同様の検体と反応した。結果を図４、５に示す。
　【００３６】（３）ＥＬＩＳＡ法による濃度依存性試験
抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノクローナル抗体及び陰性血清に対する反応性試験を調べるために、実施例７で精製したＦＤＸ−２０（Ｉ）及びＦＤＸ−２０（ＩＩ）と、参考例２で精製したＴＲＸ−２０（Ｉ）及びＴＲＸ−２０（ＩＩ）とを、をそれぞれ１０μｇ／ｍｌから１／２稀釈系列を作製して、ＥＬＩＳＡプレート（ベクトン　デッキンソン社製）に５０μｌずつ感作した。
　【００３７】このＥＬＩＳＡプレートを用い、１次抗体として５００倍希釈した抗ｐ２０Ｅ（ｇｐ２１）モノクローナル抗体を、２次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用いてＥＬＩＳＡ法を行った。陰性血清は、実施例４と同様の方法でＥＬＩＳＡ法を行った。モノクローナル抗体との反応性に差はなく、陰性血清との反応性は、ＨＴＬＶ−Ｉ及びＨＴＬＶ−ＩＩ共にＦＤＸとの融合蛋白質の方が低かった。結果を図６、７に示す。
　【００３８】参考例３　ＧＳＴと梅毒トレポネマ１５Ｋｄａ抗原との融合蛋白質の作製
梅毒菌継代ウサギ睾丸から精製した梅毒菌（トレポネーマパリダムニコルス株）から、ゲノミックＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、既知のＤＮＡ配列をもとに、ＤＮＡ合成機（モデル３９２、パーキンエルマー社製）を用いてプライマーを作製した。このプライマーを用いて、サーマルサイクラー（モデルＰＪ１０００、パーキンエルマー社製）で、梅毒トレポネマ（以下本明細書中ではＴｐと記載する）の１５Ｋｄａの表面抗原（以下本明細書中ではＴｐ１５と記載する）をコードするＤＮＡ断片約３７０ｂｐを増幅した。このＤＮＡ断片を、ｐＷ６ＡにＧＳＴのＤＮＡ配列を挿入したＧＳＴ発現型ベクターｐＷＧ６ＡのＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＧＳＴとＴｐ１５との融合蛋白質（以下本明細書中ではＧＳＴ−１５と記載する）を発現するベクターｐＷＧＴｐ１５を得た。ベクターに挿入したＧＳＴ−１５のＤＮＡ配列を配列表１４に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表１５に示す。これを実施例１と同様に大腸菌に導入しＧＳＴ−１５の発現を誘導した。実施例１と同条件で電気泳動用サンプルを調製し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染色、他の１枚は実施例３に示した方法でニトロセルロース膜に転写した。一次抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナール抗体を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用いて実施例３と同様の方法で反応させ４ークロロー１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、ＣＢＢ染色ゲルと同位置約４２Ｋｄａ付近にバンドを生じた。
　【００３９】参考例４　ＴＲＸとＴｐ１５との融合蛋白質の作製
参考例３で増幅したＴｐ１５のＤＮＡ断片を、ｐＷ６ＡにＴＲＸのＤＮＡ配列を挿入したＴＲＸ発現型ベクターｐＷＴ８ＡのＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＴＲＸとＴｐ１５との融合蛋白質（以下本明細書中ではＴＲＸ−１５と記載する）を発現するベクターｐＷＴＴｐ１５を得た。ベクターに挿入したＴＲＸ−１５のＤＮＡ配列を配列表１６に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表１７に示す。これを実施例１と同様に大腸菌に導入しＴＲＸ−１５の発現を誘導した。実施例１と同条件で電気泳動用サンプルを調製し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染色、他の１枚は実施例３に示した方法でニトロセルロース膜に転写した。一次抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナール抗体を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用い実施例３と同様の方法で反応させ４ークロロー１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、ＣＢＢ染色ゲルと同位置約２７Ｋｄａ付近にバンドを生じた。
　【００４０】実施例９　ＦＤＸとＴｐ１５との融合蛋白質の作製
参考例３で増幅したＴｐ１５のＤＮＡ断片を、実施例１で作製したＦＤＸ発現型ベクターｐＷＦ６ＡのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ部位に組込み、ＦＤＸとＴｐ１５との融合蛋白質（以下本明細書中ではＦＤＸ−１５と記載する）を発現するベクターｐＷＦＴｐ１５を得た。ベクターに挿入したＦＤＸ−１５のＤＮＡ配列を配列表１８に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表１９に示す。これを実施例１と同様に大腸菌に導入しＦＤＸ−１５の発現を誘導した。実施例１と同条件で電気泳動用サンプルを調製し、レムリー法による１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、１枚のゲルはＣＢＢ染色、他の１枚は実施例３に示した方法でニトロセルロース膜に転写した。一次抗体として抗Ｔｐ１５モノクロナール抗体を、二次抗体としてＰＯＤ標識抗マウスＩｇＧを用い実施例３と同様の方法で反応させ４ークロロー１ーナフトール及び過酸化水素で発色を行ったところ、ＣＢＢ染色ゲルと同位置約３０Ｋｄａ付近にバンドを生じた。
　【００４１】実施例１０　ＦＤＸ−１５、ＧＳＴ−１５及びＴＲＸ−１５の耐熱試験
実施例９、参考例３及び参考例４で作製したＦＤＸ−１５、ＧＳＴ−１５及びＴＲＸ−１５を発現するベクターを宿主大腸菌に導入後、それぞれＬＢ培地１リッター３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養として波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。遠心により菌体の回収を行った後、菌体にトリス緩衝液２００ｍｌを加え、氷冷下で超音波破砕処理後、遠心上清にそれぞれ融合蛋白質を回収した。これを各々８００μｌずつ取り、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃及び８０℃の恒温槽にて１３分間振盪した。それぞれのサンプルを遠心後、上清と沈殿に分離し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット法にて分析した。ウェスタンブロット法のブロッキング剤として１％スキムミルク、一次抗体には抗ＴＰウサギ抗体を用いた。二次抗体にＰＯＤ標識抗ウサギ抗体、発色剤に４ークロロー１ーナフトール及び過酸化水素を用いた。ウェスタンブロットの発色結果はデンシトメーターにより確認した。結果を図８、９に示す。ＴＲＸ−１５及びＧＳＴ−１５は４０℃で熱変性により一部沈殿を生じ、６０℃で約８０％、７０℃で約１００％が沈殿した。ＦＤＸ−１５は４０℃〜８０℃ではほとんど熱変性による沈殿を生じることがなく、８０℃でもほぼ１００％が上清に存在した。
　【００４２】実施例１１　ＦＤＸ−１５の熱処理による精製
実施例９で作製したｐＷＦＴｐ１５を宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地１リッター３７℃の条件下で培養した。培養液の大腸菌濃度を予備培養として波長６００ｎｍで吸光度約１．０の濁度とした後、１ｍＭ　ＩＰＴＧを添加し発現誘導を行った。遠心により菌体の回収を行った。菌体にトリス緩衝液２００ｍｌを加え、超音波破砕処理により菌体を破砕し、遠心上清にＦＤＸ−１５を回収した。次いで、ホットプレート及び恒温槽を用いて７０℃１０分間の熱処理を行い、遠心上清にＦＤＸ−１５を回収した。トリス緩衝液で平衡化したＱＦＦ陰イオン交換カラム（ファルマシアバイオテック社製）で熱処理上清を精製した。塩化ナトリウムを含むカラム平衡緩衝液による溶出を行ったところ、約０．３Ｍ〜０．４Ｍ塩化ナトリウム濃度溶出画分にＦＤＸ−１５を回収した。次いでＱＦＦ回収画分に１０ｍＭＤＴＴを加え、２０ｍＭ水酸化ナトリウム溶液で平衡化したリソースＲＰＣ逆相カラム（ファルマシアバイオテック社製）で精製した。アセトニトリルにより溶出を行ったところ、約２０％〜２５％アセトニトリル溶出画分にＦＤＸ−１５を回収した。この逆相回収画分をセントリプレップ（アミコン社製）にて濃縮し、スーパーデックス２００カラム（ファルマシアバイオテック社製）にてゲルろ過した。６Ｍ尿素、０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭトリス−塩酸ｐＨ８．０緩衝液により溶出したところ、分子量約５万付近に精製ＦＤＸ−１５を回収した。６０℃の熱処理で大腸菌蛋白の約８０％は熱変性により沈殿し、ＦＤＸ−１５は７０℃でもほぼ１００％が上清に回収され、熱処理のみにより約５倍精製度が上昇した。
　【００４３】また、参考例３で作製したｐＷＧＴｐ１５を宿主大腸菌に導入後、同様に誘導、発現操作を行い熱処理を行わず通常のカラム操作により精製したＧＳＴ−１５と熱処理により精製ＦＤＸ−１５とを抗Ｔｐウサギ抗体を用いて実施例１０と同様にウエスタンブロット法を行った。熱処理精製したにもかかわらずＦＤＸ−１５は反応性を保持していることが示された。結果を図１０に示す。
　【００４４】
参考例５
サルファロボス菌由来ＡＫの既知のＤＮＡ配列をもとにＤＮＡ合成装置（パーキンエルマー社製）を用いて作製した５３ｍｅｒのプライマーを１６個使用し、アセンブルＰＣＲ法により、サルファロボスアシドカルダリウスＡＫの遺伝子を合成した。アセンブルＰＣＲ法にはＴａｑポリメラーゼ（東洋紡社製）を使用し、９４℃−１分、５５℃−１分、７２℃−１分、３０サイクルの条件で、総塩基数６３０ｂｐを増幅した。５’末に制限酵素ＮｄｅＩ部位を、３’末に制限酵素ＥｃｏＲＩ部位を、Ｃ末にはトロンビン切断部位を付加した。この断片をｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）とｐＧＥＸ−２Ｔ（ファルマシアバイオテック社製）より作製した４．６ＫｂのｐＷ６ＡベクターのＮｄｅＩ、ＥｃｏＲＩ部位に組込み、ＡＫを発現するベクターとしてｐＷ６ＡＫを作製した。ｐＷ６ＡＫの詳細図を図１１に示す。ｐＷ６ＡＫはＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位に、ＡＫ由来の１９４アミノ酸、トロンビン開裂部位由来の１０アミノ酸及びｐＷ６Ａマルチクローニングサイト由来の１９アミノ酸を含む２２３アミノ酸からなる融合蛋白質の遺伝子を含んでいる。挿入断片はＤＮＡシーケンスキット（シーケナーゼキットＶｅｒ．２．０、アマーシャム　ユナイテッド　ステイツ　バイオケミカル社製）によりＤＮＡ配列を確認した。ｐＷ６Ａに挿入したＡＫのＤＮＡ配列を配列表３に、該ＤＮＡ配列がコードするアミノ酸配列を配列表４に示す。宿主大腸菌に導入後、ＬＢ培地で２時間培養後、１ｍＭＩＰＴＧを添加し２時間培養して、発現を誘導した。大腸菌の沈渣にＴＥ緩衝液を加え超音波破砕し、レムリー法による１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＣＢＢ染色で約４０Ｋｄａ付近にバンドを確認した。
　【００４５】
参考例６
参考例５
　【００４６】この上清を、トリス緩衝液で平衡化したハイドロキシアパタイトカラム（バイオラド社製）で精製した。リン酸ナトリウム緩衝液で溶出したところ、約０．２Ｍリン酸ナトリウム濃度溶出画分にＡＫを回収した。次いでこのＡＫ画分を、６Ｍ尿素０．５Ｍ塩化ナトリウム２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ９．４で平衡化したスーパーデックス２００　２６／６０カラムでゲルろ過精製した。分子量約２万の画分に精製ＡＫを回収した。
　【００４７】
参考例７
参考例３で増幅したＴｐ１５のＤＮＡ断片を、
参考例５
　【００４８】
参考例８
参考例７
　【００４９】実施例１１と同様に抗Ｔｐウサギ抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところ、熱処理したにもかかわらずＡＫ−１５は反応性を保持していることが示された。結果を図１２に示す。
　【００５０】
　【発明の効果】本発明により、従来の融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列よりも操作性や生産性に優れた融合ＤＮＡ配列、該融合ＤＮＡ配列から発現される融合蛋白質及び該ＤＮＡ配列を用いた融合蛋白質の発現方法を提供することができる。
　【００５１】
　【配列表】
　【００５２】
　【００５３】
　【００５４】
　【００５５】
　【００５６】
　【００５７】
　【００５８】
　【００５９】
　【００６０】
　【００６１】
　【００６２】
　【００６３】
　【００６４】
　【００６５】
　【００６６】
　【００６７】
　【００６８】
　【００６９】
　【００７０】
　【００７１】
【図面の簡単な説明】
　【図１】発現ベクターｐＷ６Ａの詳細図である。
　【図２】発現ベクターｐＷＦ６Ａの詳細図である。
　【図３】融合蛋白質と陰性検体との反応性を示すグラフである。
　【図４】ＨＴＬＶ−Ｉ融合蛋白質と陽性検体との反応性を示すグラフである。
　【図５】ＨＴＬＶ−ＩＩ融合蛋白質と陽性検体との反応性を示すグラフである。
　【図６】ＨＴＬＶ−Ｉ融合蛋白質の濃度依存反応性を示すグラフである。
　【図７】ＨＴＬＶ−ＩＩ融合蛋白質の濃度依存反応性を示すグラフである。
　【図８】熱処理上清の融合蛋白質活性を示すグラフである。
　【図９】熱処理沈殿の融合蛋白質活性を示すグラフである。
　【図１０】熱処理精製後の融合蛋白質活性を示す図である。
　【図１１】発現ベクターｐＷ６ＡＫの詳細図である。
　【図１２】熱処理精製後の融合蛋白質活性を示す図である。