(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリウム塩を含んでなるバッファーの存在下でのコアビーズフロースルークロマトグラフィーの第１の工程を含んでなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルからＲＮＡを精製するための方法であって、
タンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでなるバッファー交換の１以上の工程をさらに含んでなる、方法。
【請求項２】
前記カリウム塩が、リン酸カリウムまたは塩化カリウムである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カリウム塩が１００〜５００ｍＭの濃度の塩化カリウムである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡが分取規模で精製される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
塩化リチウム、有機溶媒、７０℃を超える温度、および／またはＤＮＡの酵素消化の使用を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡまたは所望のＲＮＡ種を含有しない材料を廃棄し、ＲＮＡまたは所望のＲＮＡを含有する材料を維持することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルが、ＲＮＡと、プラスミドＤＮＡ、デオキシオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド一リン酸、リボヌクレオシド三リン酸およびタンパク質の１種以上とを含有し、場合により、前記サンプルが、ゲノムＤＮＡおよび／または細胞膜もしくはその断片を含有しない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが、ＲＮＡと、プラスミドＤＮＡ、デオキシオリゴヌクレオチド、デオキシヌクレオシド一リン酸、リボヌクレオシド三リン酸およびタンパク質の４種以下とを含有し、場合により、前記サンプルが、ゲノムＤＮＡおよび／または細胞膜もしくはその断片を含有しない、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡが、一本鎖ＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、少なくとも１，０００ヌクレオチドの線状配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
親水性固定相および／または親水性膜を使用する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を用いたＲＮＡ製造の工程をさらに含んでなる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＲＮＡが１２時間以内に少なくとも９９％の純度に精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ、ピロホスフェート、および遊離ヌクレオチドを含まない最終材料を１２時間以内に提供する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
精製されたＲＮＡを含む医薬組成物を処方する方法であって、
（ａ）請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法によってＲＮＡを精製する工程、および
（ｂ）精製されたＲＮＡを前記医薬組成物として処方する工程
を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１３年３月１５日に出願された米国仮出願第６１／７９９，７０５号の利益を主張するものであり、この全内容は、あらゆる目的で引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
技術分野
本発明は、ＲＮＡ精製の分野であり、特に、医薬用途のための、例えば、動物への免疫付与に使用するための、ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後に得られたサンプルなどの複雑なサンプルから大きなＲＮＡを大規模精製および処方するための方法である。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
ＲＮＡは、様々な医薬用途のための革新的な候補として浮上しているが、効率的な精製は課題であり続けている。これは、一つには、サンプル中の種々のタイプおよび組合せの所望でない夾雑物によるものであり、純粋なＲＮＡサンプルを得るためにはこれらを所望のＲＮＡ種から分離する必要がある。このような夾雑物は、一般に、任意の上流プロセス、例えば、ＲＮＡ製造の成分および副産物である。大きなＲＮＡを製造するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が使用される場合、転写が成功した後、サンプルは、一般に、所望のＲＮＡ種を、所望でないＲＮＡ種、タンパク質、ＤＮＡまたはその断片、ピロホスフェートおよび遊離ヌクレオチドなどの様々な夾雑物と一緒に含んでいる。
【０００４】
商業的下流用途（例えば、医薬組成物および／またはワクチンとしての処方および使用）は、大きなＲＮＡの任意の精製方法にさらなる制約を課し、（ｉ）ＲＮＡの安定性および機能性を保持しながらの高純度；（ｉｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏ送達のためのＲＮＡの任意の処方要件との適合性；および（ｉｉｉ）適正製造規範の遵守を必要とする。さらに、産業上の利用を促進するために、任意のＲＮＡ精製方法は、一貫した、コストおよび時間的効率の高い操作（例えば、大規模での、迅速で、容易な、再現性のある、高収量精製）を可能にする必要がある。
【０００５】
大きなＲＮＡの精製方法は当技術分野で公知である。Ｐａｓｃｏｌｏら（２００６）には、分析規模でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルからのｍＲＮＡの精製方法が記載されている（２０μｌサンプル容量中のＲＮＡ２５μｇの精製）。その方法は、ＤＮアーゼ処理し、その後、塩化リチウムを用いて長鎖のｍＲＮＡの沈殿を行うことを必要とする。しかしながら、著者らは、この方法は、ＤＮＡおよびタンパク質などの夾雑物を完全には除去しないため、高純度のＲＮＡを提供しないことを報告している。さらに、この方法は、有機溶媒の使用を必要とし、また、少なくとも１回の一晩のインキュベーション工程を含む、異なる条件での広範囲の手動サンプル処理を必要とする３６工程ほどの多くの工程を必要とし、労力と時間がかかる。従って、この手順は、研究および実験室規模のＲＮＡ精製のための要件を満たし得るが、ＲＮＡ純度の低さ、再現性の問題を抱えており、工業プロセスでの実施のための商業規模での医薬用ＲＮＡの精製には適していない。
【０００６】
ＷＯ２００８／０７７５９２には、多孔性逆固定相を用いたイオン対逆相ＨＰＬＣによる分取規模での大きなＲＮＡの精製方法が開示されている。指定の多孔性固定相を用いることの特別な利点は、過度に高い圧力を回避することができることであり、ＲＮＡの分取精製が容易になることが報告されている。しかしながら、この方法は、過酷な有機溶媒（例えば、アセトニトリル）ならびに分離カラムでの高温（７８℃）、およびサンプラーでの低温（１２℃）の使用を必要とする。この方法を用いて所望のＲＮＡからうまく分離することができる夾雑物の性質は、ＤＮアーゼ処理などの前工程の任意の要件を含め、例示されていない。加えて、イオン対逆相ＨＰＬＣまたはイオン交換樹脂に基づいたＲＮＡのクロマトグラフィー分離は、分子の総電荷に基づいており、約４，０００〜５，０００塩基までのＲＮＡ分子の精製に対して有効であり得る。しかしながら、より大きなＲＮＡ分子の精製は、サイズ排除の影響および回収率不良の問題を抱えている。さらに、それは、有機溶媒を用いたＲＮＡの溶出に依存しているが、これらの有機溶媒は、理想的には、残渣についての潜在的な安全上の懸念、高購入コスト、それらの環境影響、ならびにＲＮＡの安定性および効力への潜在的な有害な影響から避けるべきである。
【発明の概要】
【０００７】
従って、さらなる改良されたＲＮＡ精製方法、特に、ＲＮＡの安定性、生物学的な効力および機能性を保持しながら高い収量および医薬用純度で、工業規模での大きなＲＮＡのコストおよび時間的効率の高い精製を可能にする方法の必要性が残っている。出発サンプルが、複雑な生物学的サンプル、例えば、大きなＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写後に得られたものである場合のこのような方法が特に必要である。
【０００８】
発明の開示
これらの必要性に対応するために、本発明は、サンプルからＲＮＡを精製するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルトレーション、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、コアビーズフロースルークロマトグラフィー、またはそれらの任意の組合せの１以上の工程を含んでなる方法を提供する。これらの技術は個々に有用であるが、組み合わせて使用する場合、または特定の順序で行う場合に、極めて高い性能を示す。それらの方法は、ＲＮＡから夾雑物が実質的に取り除かれている組成物を提供するために、効力または安定性を過度に損なうことなく極めて効率的にＲＮＡを精製することができる。さらに、それらは、有機溶媒を必要とせずに行うことができ、本発明の方法は水性条件で行われることが好ましい。本発明のさらなる利点は、基本的に使い捨て可能な部品を使用することであり、それらが徹底的に清浄化された形態（特に、ＲＮアーゼ不含形態）で調製され、一度だけ使用され、その後、廃棄され得るため、実施間キャリースルーコンタミネーション(carry-through run-to-run contamination)を回避することができ、そしてそのことはＲＮアーゼ夾雑を回避する場合に特に有用であることを意味する。また、それらの方法は極めて迅速である。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、タンジェンシャルフローフィルトレーションの１以上の工程を含んでなる、サンプルからＲＮＡを精製するための方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１以上の工程を含んでなる、サンプルからＲＮＡを精製するための方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの１以上の工程を含んでなる、サンプルからＲＮＡを精製するための方法を提供する。
【００１２】
有用な実施形態では、前記方法は、タンジェンシャルフローフィルトレーションの工程、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程を含んでなる。タンジェンシャルフローフィルトレーションの工程は、好ましくは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程の前に行う。
【００１３】
別の有用な実施形態では、前記方法は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの工程、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程を含んでなる。コアビーズフロースルークロマトグラフィーの工程は、理想的には、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの工程の前に行う。
【００１４】
上述の実施形態のいずれにおいても、ＲＮＡ精製のための列挙した工程に続いて、例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでなる、バッファー交換の１以上の工程を行ってよい。
【００１５】
従って、本発明は、サンプルからＲＮＡを精製および処方するための方法であって、ＲＮＡ精製の１以上の工程と、バッファー交換の１以上の工程を含んでなる方法を提供する。好ましくは、バッファー交換の少なくとも１つの工程は、タンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでなる。
【００１６】
一実施形態では、本発明は、ＲＮＡを精製および処方するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルトレーションの２つの別個の工程を含んでなる方法を提供する。好ましくは、第１のバッファーは、タンジェンシャルフローフィルトレーションの第１の工程で使用され、第２の異なるバッファーは、タンジェンシャルフローフィルトレーションの第２の工程で使用される。第１のバッファーおよび第２のバッファーは、通常、２つの異なる緩衝塩に基づいている。例えば、第１のバッファーはＴｒｉｓ系バッファーであってよく、一方、第２のバッファーはクエン酸バッファーであってよい。好ましくは、第１のバッファーは精製バッファーであり、第２のバッファーは処方バッファーである。より好ましくは、精製バッファーは、塩を、５０〜５００ｍＭの間、例えば、２５０ｍＭの濃度で含んでなる。
【００１７】
例えば、精製バッファーは、塩を、０〜５００ｍＭの間、例えば、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約２０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約３０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約４０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４０ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭなどの濃度で含んでなり得る。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮＡを精製および処方するための方法であって、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの工程、続いて、タンジェンシャルフローフィルトレーションの工程を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、第１のバッファーがコアビーズフロースルークロマトグラフィーの工程で使用され、第２の異なるバッファーがタンジェンシャルフローフィルトレーションの工程で使用される。好ましくは、第１のバッファーは精製バッファーであり、第２のバッファーは異なる処方バッファーである。より好ましくは、精製バッファーは、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムなどの塩を含んでなる。最も好ましくは、精製バッファーは、塩化カリウムを、１００〜５００ｍＭの間、例えば、２５０ｍＭの濃度で含んでなる。
【００１９】
例えば、精製バッファーは、塩化カリウムを、０〜５００ｍＭの間、例えば、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭなどの濃度で含んでなり得る。
【００２０】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮＡを精製および処方するための方法であって、タンジェンシャルフローフィルトレーションの第１の工程、次いで、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの第２の工程、次いで、タンジェンシャルフローフィルトレーションの第３の工程を含んでなる方法を提供する。好ましい実施形態では、第１のバッファーがタンジェンシャルフローフィルトレーションの第１の工程で使用され、第２の異なるバッファーがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの第２の工程で使用され、第３の異なるバッファーがタンジェンシャルフローフィルトレーションの第３の工程で使用される。好ましくは、第１のバッファーおよび第２のバッファーは精製バッファーであり、第３のバッファーは異なる処方バッファーである。好ましくは、第１のバッファーは塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムを含まない。最も好ましくは、追加工程において、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムは、ＲＮＡ含有サンプルに、１００〜５００ｍＭの間、例えば、２５０ｍＭまたは５００ｍＭの終濃度で、タンジェンシャルフローフィルトレーションの第１の工程後、かつ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの第２の工程前に加えられる。
【００２１】
例えば、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムは、ＲＮＡ含有サンプルに、０〜５００ｍＭの間、例えば、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭなどの終濃度で加えてよい。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、ＲＮＡを精製および処方するための方法であって、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの第１の工程、次いで、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの第２の工程、次いで、タンジェンシャルフローフィルトレーションの第３の工程を含んでなる方法を提供する。好ましい実施形態では、第１のバッファーがコアビーズフロースルークロマトグラフィーの第１の工程で使用され、第２の異なるバッファーがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの第２の工程で使用され、第３の異なるバッファーがタンジェンシャルフローフィルトレーション第３の工程で使用される。好ましくは、第１のバッファーおよび第２のバッファーは精製バッファーであり、第３のバッファーは異なる処方バッファーである。好ましくは、第１のバッファーは、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムを含まない。最も好ましくは、追加工程において、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムは、ＲＮＡ含有サンプルに、１００〜５００ｍＭの間、例えば、２５０ｍＭまたは５００ｍＭの終濃度で、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの第１の工程後、かつ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの第２の工程前に加えられる。
【００２３】
例えば、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムは、ＲＮＡ含有サンプルに、０〜５００ｍＭの間、例えば、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭなどの終濃度で加えてよい。
【００２４】
また、本発明は、サンプル（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応産物など）からＲＮＡを精製するための方法であって、ＲＮＡが１２時間以内（例えば、＜８時間、＜６時間、＜４時間、または＜２時間）に少なくとも９９％（例えば、≧９９．５％、≧９９．９％、あるいは≧９９．９５％）純度に精製される方法を提供する。
【００２５】
本発明の方法では、工程は、一般に、ＲＮＡ（または所望のＲＮＡ種）を含有する材料を維持する一方で、ＲＮＡを含有しない（または所望のＲＮＡ種を含有しない）材料を廃棄することを含む。従って、ある技術によって出発材料を分画する場合、所望の画分は保持され、一方、所望でない画分は廃棄することができる。同様に、ある技術によって所望でない材料が保持されるならば、所望のＲＮＡは通過され、通過画分が保持される。
【００２６】
ＲＮＡ
本発明によれば、所望のＲＮＡは、ＲＮＡ含有サンプルから精製される。本発明の所望のＲＮＡは、二本鎖であり得るが、好ましくは、一本鎖である。ＲＮＡが一本鎖、例えば、ｍＲＮＡまたは自己複製するＲＮＡレプリコンである場合、それは、一般に、１以上のタンパク質をコードし、これらの少なくとも１つは、後述のように、免疫原であることが有用であるが、目的の任意の非免疫原性治療または予防用タンパク質（例えば、遺伝子治療用医薬の成分として）でもあり得る。本発明の所望のＲＮＡは、環状であり得るが、好ましくは、線状である。
【００２７】
そのＲＮＡは（−）鎖であり得るが、好ましくは、逆転写などのいずれの介在複製工程も必要とせずに細胞によって翻訳され得るように（＋）鎖である。好ましい＋鎖ＲＮＡは、下記のように、自己複製する。好ましくは、そのＲＮＡは天然のウイルスＲＮＡではない。
【００２８】
そのＲＮＡは、小さなＲＮＡ、中間のＲＮＡ、または大きなＲＮＡであり得る。小さなＲＮＡの１鎖当たりのヌクレオチド数は、１０〜３０である（例えば、ｓｉＲＮＡ）。中間のＲＮＡは、１鎖当たり３０〜２０００ヌクレオチドの間を含む（例えば、自己複製しないｍＲＮＡ）。大きなＲＮＡは、１鎖当たり少なくとも２，０００ヌクレオチド、例えば、１鎖当たり、少なくとも２，５００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも６，０００ヌクレオチド、少なくとも７，０００ヌクレオチド、少なくとも８，０００ヌクレオチド、少なくとも９，０００ヌクレオチド、または少なくとも１０，０００ヌクレオチドを含む（例えば、下記の自己複製ＲＮＡ）。一本鎖ＲＮＡ分子の分子量（ｇ／ｍｏｌ（またはダルトン））は、以下の式を用いて概算することができる：分子量＝（ＲＮＡヌクレオチド数）×３４０ｇ／ｍｏｌ。
【００２９】
ＷＯ２０１１／００５７９９において述べられているように、ＲＮＡ（特に、自己複製ＲＮＡ）は、任意の５’キャップ構造に加えて、修飾核酸塩基を有する１以上のヌクレオチドを含むことができる。例えば、ＲＮＡは、１以上の修飾ピリミジン核酸塩基、例えば、シュードウリジンおよび／または５−メチルシトシン残基を含むことができる。しかしながら、いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、修飾核酸塩基を含まず、修飾ヌクレオチドを含まなくてよく、すなわち、ＲＮＡ中のヌクレオチドの総ては通常のＡ、Ｃ、ＧおよびＵリボヌクレオチドである（７’−メチルグアノシンを含む可能性がある任意の５’キャップ構造を除く）。他の実施形態では、ＲＮＡは、７’−メチルグアノシンを含んでなる５’キャップを含んでよく、最初の１つ、２つまたは３つの５’リボヌクレオチドは、そのリボースの２’位置でメチル化されていてもよい。
【００３０】
本明細書で使用されるＲＮＡは、理想的には、ヌクレオシド間のホスホジエステル結合のみを含むが、いくつかの実施形態では、ホスホルアミデート結合、ホスホロチオエート結合、および／またはメチルホスホネート結合を含むことができる。
【００３１】
本発明は、自己複製ＲＮＡの精製に特に好適である。自己複製ＲＮＡ分子（レプリコン）は、脊椎動物細胞に送達された場合、任意のタンパク質がなくても、それ自体からの転写により（それ自体から発生するアンチセンスコピーを介して）複数の娘ＲＮＡの生産を導くことができる。従って、自己複製ＲＮＡ分子は、一般に、細胞への送達後に直接翻訳され得る＋鎖分子であり、この翻訳によりＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが提供され、その後、送達されたＲＮＡからアンチセンスおよびセンス両方の転写産物が提供される。このようにして、送達されたＲＮＡによって複数の娘ＲＮＡの生産が導かれる。これらの娘ＲＮＡ、ならびにコリニア(collinear)サブゲノム転写産物は、それら自体が翻訳されて、目的のコードされたタンパク質（例えば、免疫原）のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらし得るし、または転写されて、送達されたＲＮＡと同じ向きのさらなる転写産物を提供し、これらの転写産物が翻訳されて、タンパク質（例えば、免疫原）のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらし得る。この一連の転写の全体的な結果は、導入されたレプリコンＲＮＡの数の非常に大きな増幅であり、そのため、コードされた免疫原は細胞の主要なポリペプチド産物になる。好適な自己複製ＲＮＡは、ＷＯ２０１２／００６３６９およびＷＯ２０１３／００６８３８に開示されている。
【００３２】
自己複製を達成するための１つの好適なシステムは、アルファウイルスに基づくＲＮＡレプリコンの使用である。これらの＋鎖レプリコンは細胞に送達された後に翻訳されて、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−転写酵素）を与える。レプリカーゼは、ポリタンパク質として翻訳され、これが自己切断して複製複合体を提供し、この複製複合体が＋鎖により送達されたＲＮＡのゲノム−鎖コピーを作り出す。これらの−鎖転写産物はそれら自体が転写されて、＋鎖親ＲＮＡのさらなるコピーを与え、また、免疫原をコードするサブゲノム転写産物を与える。従って、サブゲノム転写産物の翻訳は、感染細胞による免疫原のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらす。好適なアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。変異型または野生型ウイルス配列を使用することができ、例えば、レプリコンにはＶＥＥＶの弱毒化ＴＣ８３変異株が使用されている（ＷＯ２００５／１１３７８２）。
【００３３】
従って、好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および（ｉｉ）免疫原をコードする。前記ポリメラーゼは、例えば、アルファウイルスタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の１種以上を含んでなるアルファウイルスレプリカーゼであり得る。
【００３４】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼポリタンパク質に加えて、構造ビリオンタンパク質をコードするのに対し、本発明の自己複製ＲＮＡ分子はアルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。従って、好ましい自己複製ＲＮＡは、細胞内でのそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの生産を導くことができるが、ＲＮＡ含有ビリオンの生産を導くことはできない。これらのビリオンを生産ができないことは、野生型アルファウイルスとは異なり、自己複製ＲＮＡ分子はそれ自体を感染型で永続させることができないということを意味する。野生型ウイルスとしての永続に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡには存在せず、それらの場所は目的の免疫原をコードする遺伝子によって占められており、その結果、サブゲノム転写産物は構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく免疫原をコードする。
【００３５】
従って、本発明で有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有し得る。第１の（５’）オープンリーディングフレームはレプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは免疫原をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、例えば、さらなる免疫原をコードするため（下記参照）またはアクセサリーポリペプチドをコードするための追加の（例えば、下流）オープンリーディングフレームを有し得る。
【００３６】
自己複製ＲＮＡ分子は、コードされたレプリカーゼと適合する５’配列を有することができる。
【００３７】
自己複製ＲＮＡ分子は、様々な長さを有することができるが、それらは、典型的には、５０００〜２５０００ヌクレオチド長、例えば、８０００〜１５０００ヌクレオチド、または９０００〜１２０００ヌクレオチドである。
【００３８】
本発明で有用なＲＮＡ分子は、５’キャップを有し得る。このキャップは、ＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ翻訳を増強することができる。キャップは、天然キャップまたは非天然キャップであり得、一般には、５’−５’トリホスフェート結合によってＲＮＡの５’末端ヌクレオチドと結合している。例えば、７−メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇまたは「ＡＲＣＡ」（アンチリバースキャップアナログ）、ｍ２，２，７Ｇ、非メチル化キャップアナログなど、様々なキャップ構造が知られている。
【００３９】
本発明で有用なＲＮＡ分子の５’ヌクレオチドは、５’三リン酸基を有し得る。キャップ付きＲＮＡでは、これは、５’−５’架橋を介して７−メチルグアノシンと結合され得る。５’三リン酸は、ＲＩＧ−Ｉ結合を増強することができるため、アジュバント効果を促進することができる。
【００４０】
ＲＮＡ分子は、３’ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３’末端付近にポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。
【００４１】
一実施形態では、本発明の方法は、修飾されたｍＲＮＡを精製するために使用され、別の実施形態では、本発明の方法は、未修飾ｍＲＮＡを精製するために使用される。
【００４２】
ＲＮＡ含有サンプル
本発明によれば、所望のＲＮＡがＲＮＡ含有サンプルから精製される。サンプルの組成はＲＮＡの供給源および先行する精製工程によるところが大きい。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）源からの所望のＲＮＡの精製に特に有用である。これらの実施形態では、サンプルは、所望のＲＮＡ種と、一般に所望でないＲＮＡ、ＤＮＡ（例えば、ＩＶＴ由来の鋳型ＤＮＡ）、タンパク質（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、キャッピング酵素、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤）、ピロホスフェートおよび／または遊離ヌクレオチドを含む夾雑物を含有する。遊離ヌクレオチドは、ＩＶＴ混合物中に、未反応ＲＮＡ前駆体（例えば、リボヌクレオシド三リン酸）として、またはＤＮＡ消化由来の分解産物（例えば、デオキシヌクレオシド一リン酸）として見られる。ＩＶＴ反応の典型的バッファーはＴｒｉｓ系バッファー、例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０である。ＩＶＴを使用することの特定の利点は、制御された反応において大過剰量の所望のＲＮＡ種が産生されること、および修飾塩基がＲＮＡに容易に導入できることである。
【００４３】
従って、本発明の方法は、ＩＶＴによるＲＮＡ製造の予備精製工程を含み得る。従って、本発明は、精製されたＲＮＡを調製するための方法であって、（ｉ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行って、ＲＮＡを含んでなるサンプルを提供する工程、および（ｉｉ）タンジェンシャルフローフィルトレーション、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、コアビーズフロースルークロマトグラフィー、またはそれらの任意の組合せの１以上の工程を含んでなる、前記サンプルからＲＮＡを精製する工程を含む方法を提供する。
【００４４】
ＩＶＴは、一般に、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、および通常はキャッピング酵素）、ＲＮＡ前駆体（例えば、リボヌクレオシド三リン酸）、ＤＮＡ鋳型、還元剤（例えば、ＤＴＴ）、および好適なバッファーを含む無細胞の制御された生化学的反応において、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを産生する。ＩＶＴの後、ＤＮＡ鋳型は、最終産物に存在しないように除去されなければならず、従って、ＤＮＡ鋳型は消化（例えば、ＤＮアーゼを用いる）、または除去され得る。本ＲＮＡ精製法がタンジェンシャルフローフィルトレーションまたはコアビーズクロマトグラフィーを含む場合には、精製前に、例えば、ＤＮアーゼを用いてＤＮＡを除去することが好ましい。これに対して、本方法がヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを使用する場合には、ＤＮＡはＤＮアーゼ処理を必要とせずに除去することができるが、必要であれば、ＤＮアーゼ処理の工程をはやり使用することができる。
【００４５】
しかしながら、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応からのＲＮＡに限定されず、いくつかの実施形態では、ＲＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏ（細胞系）転写、化学合成、または合成ゲノミクスアプローチを用いて製造される。
【００４６】
本発明の方法はまた、サンプルがＲＮＡウイルス抽出物、ＲＮＡ含有細胞抽出物（例えば、動物、植物または細菌細胞由来）、またはＲＮＡ含有環境サンプルまたはそれらの抽出物である場合の、ＲＮＡ含有サンプルからのＲＮＡの精製にも有用である。
【００４７】
ＲＮＡ含有サンプルからのＲＮＡの精製
ＲＮＡ精製は、目的の特定のＲＮＡを含んでなる組成物から不純物を除去するために使用される。その組成物の非ＲＮＡ成分（例えば、ＤＮＡおよびタンパク質）から、ならびに他の夾雑ＲＮＡから、目的のＲＮＡを単離するためには、種々の精製工程が使用可能である。
【００４８】
本発明の方法は、３つの技術：タンジェンシャルフローフィルトレーション；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；および／またはコアビーズフロースルークロマトグラフィーの１以上を使用する。これらの方法は総て水性条件下で行うことができ、従って、本発明の方法は有機溶媒の使用を必要とせず、有機溶媒を使用せずに、特に、医薬組成物の一部としてヒトに投与される場合に毒性となり得る、かつ／または大きなＲＮＡの安定性に悪影響を及ぼし得る有機溶媒を使用せずに、理想的に実施される。従って、本発明の方法は、アセトニトリル、クロロホルム、フェノールおよび／またはメタノールを使用せずに理想的に実施される。理想的には、それらはいずれの有機溶媒も使用せずに行うことができる。
【００４９】
本発明の方法は、好都合には、室温で実施できる。
【００５０】
タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）
本発明によれば、低分子量種を除去することにより目的のＲＮＡを精製するためにタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）が使用される。従って、本発明の方法は、ＴＦＦの１以上の工程を含んでなり得る。ＴＦＦは、大きなＲＮＡ種の精製に特に有用である。本発明者らは、ＲＮＡ精製にＴＦＦを用いて、精製されたＲＮＡの安定性および効力を保持しつつ、高収率（少なくとも９０〜９５％）および高純度（少なくとも９０〜９９．９％）が達成できたことを示した。有用には、ＴＦＦはまた、精製と同時にバッファー交換（透析）を可能とする（またはＴＦＦは、例えば、最終処方バッファーに交換するための別のバッファー交換工程として、精製されたＲＮＡとともに使用することができる）。ＴＦＦは、時間効率の高い操作（ＲＮＡ精製とバッファー交換の療法にわずか約７０分）が容易であり、閉鎖系として操作可能であるために、夾雑（例えば、ＲＮアーゼの夾雑）が避けられる。ＴＦＦは、ＩＶＴ混合物からの遊離ヌクレオチドの除去に特に有用である。
【００５１】
ＴＦＦは、サンプルを含有する液体を濾過膜に接線方向に通すことを含む。従って、ＴＦＦは、サンプルが膜に対して接線方向ではなく膜に通されるデッドエンド濾過とは対照的である。ＴＦＦでは、サンプル側は一般に、濾液側に対して陽圧で保持される。液体がフィルターに流れると、その中の成分は膜を通過して濾液へ行くことができる。ＩＶＴ反応サンプルが使用される場合、リボヌクレオシド三リン酸、消化された鋳型ＤＮＡなどの小核酸断片、および／または他の所望でない成分は一般に、濾液中に除去され、一方、長いＲＮＡは保持液から回収される。多くのＴＦＦシステムが市販されている（例えば、ＧＥヘルスケアおよびＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから入手可能なものなどの中空線維を使用）。ＴＦＦ膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、どの溶質が膜を通過できるか（すなわち、濾液へ）、どの溶質が保持されるか（すなわち、保持液中）を決定する。本明細書で使用されるＴＦＦフィルターのＭＷＣＯは、目的の溶質（すなわち、所望のＲＮＡ種）の実質的に総てが保持液中に保持され、所望でない成分が通過して濾液へ行くように選択される。保持液は、付加的サイクルで再濾過するためにフィードリザーバーへ再循環させてもよい。デッドエンド濾過に比べ、保持液は濾過プロセス中に洗浄されるので、当技術分野で「膜汚損」として周知の膜の目詰まりが最小となり、膜に対して高位安定の濾過速度が維持され、かつ、プロセスが継続的に稼働できる時間が長くなる。
【００５２】
本発明によるＴＦＦを作動するためのパラメーターは、ＲＮＡの完全性および／または効力に有意な影響を及ぼさずに、不純物が濾過膜を透過でき、目的のＲＮＡが保持されるように選択される。
【００５３】
濾過膜の平均孔径は、当技術分野では「膜孔径」と呼ばれる。膜孔径は通常ｋＤａで示され、膜が保持すると思われる最小の粒子または高分子の平均分子量を意味する。あるいは、膜孔径はμｍで示すこともでき、膜が保持すると思われる最小の粒子の直径を意味する。この直径は、類似の形状の分子（例えば、球形分子）の分子量に比例する。例えば、球形分子では、５００ｋＤａの膜孔径は、およそ０．０２μｍの膜孔径に相当する。
【００５４】
本発明者らは、大きなＲＮＡを精製する場合には、２５０〜１０００ｋＤａの間、例えば、２５０〜７５０ｋＤａの間、または好ましくは４００〜６００ｋＤａの間の膜孔径が有用であることを見出した。孔径約５００ｋＤａの膜が特に好ましい。好ましくは、膜孔径は、目的のＲＮＡ分子のサイズと膜孔径の比が少なくとも１．５：１（例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１または少なくとも６：１）となり、かつ／または最大非ＲＮＡ不純物のサイズと膜孔径の比が少なくとも１：１．５（例えば、少なくとも１：２、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５または少なくとも１：６）となるように選択される。
【００５５】
サンプルが所望のＲＮＡと、異なるサイズの所望でないＲＮＡ種とを含んでなる場合、本方法は、２以上の工程のタンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでよく、各工程は、一工程で目的のＲＮＡよりも小さい分子が除去され、ＲＮＡ含有保持液画分が保持され、１以上の追加工程で目的のＲＮＡより大きい分子が除去され、目的のＲＮＡが濾液から回収されるように、異なる膜孔径を使用する。このような方法は、下記のようにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびコアビーズフロースルークロマトグラフィーと組み合わせることができる。よって、一実施形態では、本発明は、サンプルからＲＮＡを精製するための方法であって、第１の膜を用いたタンジェンシャルフローフィルトレーションの第１の工程、場合により次いで、（ａ）コアビーズフロースルークロマトグラフィーおよび／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１または複数のさらなる工程、次いで、第２の膜を用いたタンジェンシャルフローフィルトレーションの第２の工程を含んでなり、第１の膜が保持液中に目的のＲＮＡを保持し、第２の膜が、目的のＲＮＡが膜の孔を通過して濾液へ行き、保持液中に不純物を保持することを可能とするように、第１の膜と第２の膜が異なる孔径を有する方法を提供する。
【００５６】
ＴＦＦは、好適ないずれの濾過膜を用いて行ってもよい。本発明者らは、中空線維フィルターが特に有利であることを見出した。中空線維フィルターは一般に、多数（束）の中空開口管（線維）を含んでなり、これに、サンプルを含有する液体がフィード側から保持液側へと通される。これらの管の壁面は一般に相互接続したキャビティー（孔）の三次元内部構造を有する膜（濾過膜）から構成される。本発明において使用可能な一般的濾過膜ポリマーは、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）である。ＰＥＳは、親水性が増強されるように、また、非修飾ＰＥＳよりも高い透過流束量を有するように修飾されてよい（ｍＰＥＳ）。疎水性ＰＥＳ膜を親水性ＰＥＳ膜に変換するためには、いくつかの異なる方法が知られている。本発明者らは、親水性膜および特に修飾ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）膜がＲＮＡ精製に特に有利であることを見出した。
【００５７】
ＴＦＦ膜は、それらの有効表面積によって異なり得る。有効膜表面積は一般にｃｍ２で示され、サンプルに露出している濾過膜の全表面を意味する。中空線維膜の有効表面積は、平均直径および線維の有効長および線維の総数によって決まる。本発明者らは、有効膜面積が本ＴＦＦ法の操作時間ならびにＲＮＡ精製およびバッファー交換の効率に影響を及ぼし得ることを見出した。小規模容量に関して決定されたプロセスパラメーターは、フィルターの有効長を維持し、かつ、有効膜面積を増大する（例えば、平均線維直径および／または線維総数を増すことによる）ことによって、大容量に対して使用することができる。
【００５８】
ＴＦＦ法は、プロセス中に適用される膜間差圧によって異なり得る。膜間差圧は、濾過膜のフィード側と濾液側の間の平均圧力差である。理想的には、膜間差圧は、任意の不純物からの目的のＲＮＡの効率的分離を維持しつつ、かつ、濾過膜の表面でのゲル層の形成を回避しつつ、膜を通過する流体の高いフラックスが達成されるように選択される。本発明者らは、１ｐｓｉ（６８９５Ｐａ）〜５ｐｓｉ（３４４７５Ｐａ）の間の膜間差圧が好ましいことを見出した。理想的には、膜間差圧は約２ｐｓｉ（１３７９０Ｐａ）に設定される。
【００５９】
ＴＦＦ法は、剪断速度（または当技術分野では保持液速度としても知られる）よって異なり得る。剪断速度は一般に秒の逆数（ｓ−１）で示され、当技術分野で公知の式に従って計算することができる。理想的には、剪断速度は、ＲＮＡの完全性を維持しつつ、かつ、濾過膜の表面でのゲル層の形成を回避しつつ、フィルターを通過する流体の高いフラックスが達成されるように選択される。本発明者らは、約５００〜５０００ｓ−１の間の剪断速度が好ましいことを見出した。より好ましくは、約８００ｓ−１の剪断速度が用いられる。
【００６０】
例えば、約５００ｓ−１、約６００ｓ−１、約７００ｓ−１、約８００ｓ−１、約９００ｓ−１、約１０００ｓ−１、約１１００ｓ−１、約１２００ｓ−１、約１３００ｓ−１、約１４００ｓ−１、約１５００ｓ−１、約１６００ｓ−１、約１７００ｓ−１、約１８００ｓ−１、約１９００ｓ−１、約２０００ｓ−１、約２５００ｓ−１、約８００ｓ−１、約３０００ｓ−１、約３５００ｓ−１、約４０００ｓ−１、約４５００ｓ−１、約５０００ｓ−１、約５００ｓ−１〜約５０００ｓ−１、約５００ｓ−１〜約４０００ｓ−１、約５００ｓ−１〜約３０００ｓ−１、約５００ｓ−１〜約２０００ｓ−１、約５００ｓ−１〜約１０００ｓ−１、約６００ｓ−１〜約５０００ｓ−１、約６００ｓ−１〜約４０００ｓ−１、約６００ｓ−１〜約３０００ｓ−１、約６００ｓ−１〜約２０００ｓ−１、約６００ｓ−１〜約１０００ｓ−１、約７００ｓ−１〜約５０００ｓ−１、約７００ｓ−１〜約４０００ｓ−１、約７００ｓ−１〜約３０００ｓ−１、約７００ｓ−１〜約２０００ｓ−１、約７００ｓ−１〜約１０００ｓ−１、約８００ｓ−１〜約５０００ｓ−１、約８００ｓ−１〜約４０００ｓ−１、約８００ｓ−１〜約３０００ｓ−１、約８００ｓ−１〜約２０００ｓ−１、または約８００ｓ−１〜約１０００ｓ−１などの剪断速度が使用可能である。流体は、ＲＮＡ含有サンプルに加えてＴＦＦシステムに供給可能である。流体は一般にバッファーである。バッファーの選択および組成は、ＲＮＡ精製および／またはバッファー交換の効率、タンパク質凝集のレベル、ＲＮＡ−タンパク質の分離およびＲＮＡの安定性に影響を及ぼし得る。典型的なバッファーとしては、クエン酸およびＴｒｉｓに基づくものが含まれる。本発明者らは、Ｔｒｉｓ系バッファー、例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓを含有するものが特によい性能であることを見出した。好ましくは、バッファーのｐＨは６．５〜９．０の間、７．０〜８．５の間、７．５〜８．５の間、７．８〜８．２の間である。より好ましくは、サンプルバッファーのｐＨは８．０である。
【００６１】
例えば、バッファーのｐＨは、約６．５、約７．０、約７．５、約７．８、約８．０、約８．２、約８．５、約９．０、約６．５〜約９．０の間、約６．５〜約８．５の間、約６．５〜約８．２の間、約６．５〜約８．０の間、約７．０〜約９．０の間、約７．０〜約８．５の間、約７．０〜約８．２の間、約７．０〜約８．０の間、約７．５〜約９．０の間、約７．５〜約８．５の間、約７．５〜約８．２の間、約７．５〜約８．２の間、約７．８〜約９．０の間、約７．８〜約８．５の間、または約７．８〜約８．２の間などであり得る。バッファーは、任意の緩衝塩に加えて１以上の塩をさらに含み得る。理想的には、溶液中で所望のＲＮＡを維持しつつ、ＲＮＡ−タンパク質の相互作用が弱くなるような塩のタイプおよび濃度が使用される。例えば、１５０ｍＭ〜５００ｍＭの間、または２００〜３００ｍＭの間の総塩濃度が使用可能である。好ましくは、塩濃度は２５０ｍＭである。塩は塩化ナトリウムであり得る。
【００６２】
例えば、バッファーは、１種類以上の塩を、０〜５００ｍＭの間、例えば、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭなどの総塩濃度で含み得る。
【００６３】
しかしながら、本発明者らは、バッファー中の過剰な塩濃度は、ＴＦＦ中のＲＮＡの沈澱のリスクまたは任意の下流の方法における不利な作用のために理想的には避けるべきであることを見出した。従って、緩衝塩以外の塩がＴＦＦ精製用のバッファーに添加されないことが好ましい。バッファーへのＥＤＴＡの添加は、有利にもいずれのＲＮアーゼ活性も阻害することが知られている。しかしながら、本発明の方法は、ＥＤＴＡを添加せずにＲＮＡを精製することができ、従って、バッファーはＥＤＴＡを含まなくてよい。
【００６４】
追加流体（すなわち、サンプルの流体の他に添加される流体）の容量比は、ＲＮＡ精製および／またはバッファー交換中の小分子の除去の効率に影響を及ぼし得る。しかしながら、容量が大きいほど、操作時間は長くなる。一般に、追加流体とサンプルの流体の容量比は５：１〜１０：１の間である。本発明者らは、操作時間を過度に延長せずに、効率的な精製および／またはバッファー交換を確保するためには約８：１の比が特に有利であることを見出した。
【００６５】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー
本発明者らは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いてＩＶＴ混合物から大きなＲＮＡを精製するために特に有用であるが、短鎖ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）および中等度のＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の精製にも使用可能な、工業的にスケーラブルなプロセスを考案した。よって、本発明の方法は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの１以上の工程を含んでなり得る。
【００６６】
この技術の特定の利点は、鋳型ＤＮＡの酵素消化を含んでなる工程を省くことができることである。これは、鋳型ＤＮＡの消化に頼る従来技術の方法を超える改良点をなす。この方法は、所望のＲＮＡ種から鋳型由来ＤＮＡまたはその断片、ならびにタンパク質を効率的に除去するために特に有利である。
【００６７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、固定相としてヒドロキシアパタイトを含む。ヒドロキシアパタイトは、化学式［Ｃａ５（ＰＯ４）３（ＯＨ）］２を有するリン酸カルシウの形態である。核酸のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイト媒体の表面での、それらの負電荷を有するリン酸骨格と正電荷を有するカルシウムイオンの間の電荷相互作用を活用すると考えられる。示差的溶出（例えば、所望のＲＮＡ種からタンパク質、ＤＮＡおよび所望でないＲＮＡ種を分離するため）は、漸増リン酸勾配の適用によって達成される。バッファー中に存在するリン酸イオンは、ヒドロキシアパタイト媒体上のカルシウムをめぐって保持されている核酸種のリン酸基と競合するので分子の選択的溶出による分離が可能である。この混合様式のクロマトグラフィーでは、結合は、ヒドロキシアパタイト媒体のカルシウムイオンに対するＲＮＡリン酸骨格の引力と、ヒドロキシアパタイト媒体のリン酸基からのＲＮＡリン酸骨格の反発とのバランスである。イオン交換クロマトグラフィーに比べて、ヒドロキシアパタイト媒体上の結合の強度は、総電荷よりもむしろ電荷密度に依存する。この重要な違いは、それらの電荷密度での分子の分離（例えば、ＲＮＡ対ＤＮＡ対タンパク質）、ならびにその総電荷に関わらず、従ってその長さに関わらずに、ＲＮＡの結合および溶出を可能とする。よって、この方法は、いずれの長さのＲＮＡ分子の精製にも使用可能である。
【００６８】
ヒドロキシアパタイトを用いる核酸の分画は１９６０年代に記載されている(Bernardi et al. 1965)。このアプローチは、環境サンプルからのウイルスＲＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびｓｓＤＮＡの単離および分離(Andrews-Pfannkoch et al. 2010)、組織抽出核酸からのＤＮＡおよびＲＮＡの分離(Beland et al. 1979)およびハイブリダイゼーション研究用のＤＮＡの分離(Kamalay et al. 1984)を含む適用に活用されている。本発明者らの知る限りでは、ＩＶＴから得られたＲＮＡの精製のための生体プロセスにおいてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの使用について、サンプルの特徴のために当業者に具体的な取り組みを主張する証拠は公表されていない。
【００６９】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーパラメーターは、所望のＲＮＡが保持され、その後、ＲＮＡの完全性および／または効力に有意に影響を及ぼすことなく選択的に溶出可能なように選択される。
【００７０】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、バッチ形式またはカラム形式を用いて行ってよい。カラム形式が好ましい。カラムは、固定相を含んでなる。カラム形式を用いる精製は、ＲＮＡ含有サンプルをカラムに適用すること、通過画分を廃棄すること、溶出バッファーをカラムに通すこと、および所望の溶出液またはそれらの画分を回収することを含み得る。本方法は、これらの工程の前または間に洗浄工程などの追加工程を含んでなり得る。好適なクロマトグラフィー設定は当技術分野で公知であり、例えば、ＧＥヘルスケアからのＡＫＴＡ液体クロマトグラフィーシステムなどの液体クロマトグラフィーシステムがある。
【００７１】
好ましいヒドロキシアパタイト固定相は、セラミックヒドロキシアパタイトである。セラミックヒドロキシアパタイトは、球形、多孔質形態の結晶性ヒドロキシアパタイトであり、一般に、結晶性ヒドロキシアパタイトを高温で焼結することにより得られる。固定相としてセラミックヒドロキシアパタイトを用いるヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、高い流速および繰り返し使用に耐え得る特に安定な材料であるので、大規模ＲＮＡ精製に特に有利である。
【００７２】
ヒドロキシアパタイト粒子の公称孔径は一般に０．０５〜０．１３μｍ、例えば、０．０８〜０．１μｍの間である。
【００７３】
公称平均粒径は一般に２０〜８０μｍ、例えば、４０μｍである。
【００７４】
例示的なヒドロキシアパタイト媒体は、Ｂｉｏ−ＲａｄからのＣＨＴ（商標）セラミックヒドロキシアパタイト（タイプＩＩ、粒径４０μｍ）である。
【００７５】
クロマトグラフィーは一般に、２５０〜３５０ｃｍ／時、例えば、３００ｃｍ／時の線形流速で実施される。ＲＮＡを含有する溶出液画分は、２６０ｎｍでＵＶ吸収を測定することにより同定することができる。溶出液中に回収された目的のＲＮＡを含んでなる組成物は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程前の調製物に比べて高度に精製される。目的のＲＮＡを含有する複数の溶出画分はさらなる処理の前に合わせてよい。
【００７６】
溶出には任意の好適なリン酸バッファーを使用することができる。特に好ましいリン酸バッファーは、同じ濃度およびｐＨで使用した場合に、好ましいとは言えないリン酸バッファーに比べてＲＮＡ沈澱のレベルを最小限とするものである。本発明者らは、リン酸カリウムバッファーが特に好適であり、同じ濃度およびｐＨで使用した場合に、リン酸ナトリウムバッファーに比べてＲＮＡ沈澱のレベルを有利にも最小限とするので、リン酸ナトリウムバッファーよりも好ましいことを見出した。一般に、本発明者らは、コスモトロピックの増大を伴う陽イオンの使用が好ましいことを見出した。
【００７７】
本発明者らはまた、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーパラメーターが、ＲＮＡおよびＤＮＡの分離の改良を可能とするように変更可能であることも見出した。これは、１種以上の溶出バッファー中、１または複数種のリン酸塩に加え、最終溶出バッファー中の塩の濃度が溶出の間、一定に留まるような量の塩を使用することによって達成することができる。例えば、塩化ナトリウムなど、任意の好適な塩が使用可能である。加えて、または代わりに、サンプルがヒドロキシアパタイトカラムに適用される前に、サンプルに一定量の塩を加えてもよい。例えば、塩化カリウムまたは塩化ナトリウムは、サンプルに１００〜５００ｍＭの間、例えば、２５０ｍＭまたは５００ｍＭの終濃度で加えてよく、１または複数のリン酸溶出バッファーに塩を添加しないことが、高純度を維持しつつ高収率でのＲＮＡの精製のために特に有利な方法を提供する。
【００７８】
例えば、塩化ナトリウムおよび／または塩化カリウムは、サンプルに、０〜５００ｍＭの間、例えば、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約７５ｍＭ〜約５００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約４００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約３００ｍＭ、約７５ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約３００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭなどの終濃度で加えてよい。
【００７９】
本発明者らはまた、驚くことに、ＤＮＡまたは他の不純物ではなくＲＮＡの選択的溶出は、溶出バッファー中のリン酸濃度が、ＲＮＡが選択的に溶出されるようなものである溶出工程を用いることにより達成され得ることを見出した。好適なリン酸濃度の正確な範囲は実験的に決定することができ、溶出バッファー中の、塩化ナトリウムなどの付加的な任意の非リン酸塩の存在に依存する。例えば、付加的な塩が存在しない場合、本発明者らは、リン酸溶出バッファーが約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）〜３．８Ｓ／ｍ（３８ｍＳ／ｃｍ）の間、または２．１Ｓ／ｍ（２１ｍＳ／ｃｍ）〜３Ｓ／ｍ（３０ｍＳ／ｃｍ）の間、例えば、約２．１Ｓ／ｍ（２１ｍＳ／ｃｍ）の導電率を有する溶出工程を使用すると、ＲＮＡの選択的溶出が得られることを見出した。
【００８０】
例えば、リン酸溶出バッファーは、約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）、約１．９Ｓ／ｍ（１９ｍＳ／ｃｍ）、約２．０Ｓ／ｍ（２０ｍＳ／ｃｍ）、約２．１Ｓ／ｍ（２１ｍＳ／ｃｍ）、約２．２Ｓ／ｍ（２２ｍＳ／ｃｍ）、約２．３Ｓ／ｍ（２３ｍＳ／ｃｍ）、約２．４Ｓ／ｍ（２４ｍＳ／ｃｍ）、約２．５Ｓ／ｍ（２５ｍＳ／ｃｍ）、約２．６Ｓ／ｍ（２６ｍＳ／ｃｍ）、約２．７Ｓ／ｍ（２７ｍＳ／ｃｍ）、約２．８Ｓ／ｍ（２８ｍＳ／ｃｍ）、約２．９Ｓ／ｍ（２９ｍＳ／ｃｍ）、約３．０Ｓ／ｍ（３０ｍＳ／ｃｍ）、約３．１Ｓ／ｍ（３１ｍＳ／ｃｍ）、約３．２Ｓ／ｍ（３２ｍＳ／ｃｍ）、約３．３Ｓ／ｍ（３３ｍＳ／ｃｍ）、約３．４Ｓ／ｍ（３４ｍＳ／ｃｍ）、約３．５Ｓ／ｍ（３５ｍＳ／ｃｍ）、約３．６Ｓ／ｍ（３６ｍＳ／ｃｍ）、約３．７Ｓ／ｍ（３７ｍＳ／ｃｍ）、約３．８Ｓ／ｍ（３８ｍＳ／ｃｍ）、約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）〜約３．８Ｓ／ｍ（３８ｍＳ／ｃｍ）、約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）〜約３．５Ｓ／ｍ（３５ｍＳ／ｃｍ）、約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）〜約３．０Ｓ／ｍ（３０ｍＳ／ｃｍ）、約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）〜約２．５Ｓ／ｍ（２５ｍＳ／ｃｍ）、約１．８Ｓ／ｍ（１８ｍＳ／ｃｍ）〜約２．１Ｓ／ｍ（２１ｍＳ／ｃｍ）、約２．０Ｓ／ｍ（２０ｍＳ／ｃｍ）〜約３．８Ｓ／ｍ（３８ｍＳ／ｃｍ）、約２．０Ｓ／ｍ（２０ｍＳ／ｃｍ）〜約３．５Ｓ／ｍ（３５ｍＳ／ｃｍ）、約２．０Ｓ／ｍ（２０ｍＳ／ｃｍ）〜約３．０Ｓ／ｍ（３０ｍＳ／ｃｍ）、または約２．０Ｓ／ｍ（２０ｍＳ／ｃｍ）〜約２．１Ｓ／ｍ（２１ｍＳ／ｃｍ）などの導電率を有し得る。
【００８１】
これは、例えば、約１８０ｍＭのリン酸カリウム濃度を有する溶出バッファーを用いる溶出工程を使用することによって達成することができる。また、他のリン酸バッファー（例えば、リン酸ナトリウム）の好適な濃度も使用可能である。記載のような選択的ＲＮＡ溶出の工程を含んでなる段階的（不連続）溶出勾配を使用することが、ＲＮＡの精製に特に有利である。
【００８２】
前述のように、サンプルおよび／または１または複数の溶出バッファーへの塩の添加および段階的溶出勾配の使用は、有利には、不純物からのＲＮＡの特に効率的な分離を得るために組み合わせることができる。例えば、本方法は、１種以上の溶出バッファー中、１または複数種のリン酸塩に加え、最終溶出バッファー中の塩の濃度が溶出の間、一定に留まるような量の塩を使用すること、またはサンプルをヒドロキシアパタイトカラムに適用する前にサンプルに一定量の塩を加えること（場合により、１または複数種のリン酸溶出バッファーに塩が添加されない場合）、および溶出が、溶出バッファー中のリン酸濃度が、ＲＮＡが選択的に溶出されるようなものである溶出工程を含んでなる場合を含み得る。
【００８３】
好ましくは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、本発明によれば、他のＲＮＡ精製法と併用され、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの前に、遊離ヌクレオチドを効率的に除去する方法が行うことができる。なぜならば、本発明者らは驚くことに、これらがカラムを遮断し、または飽和させることを見出したためである。。本発明者らは、このような方法の組合せが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写サンプルからの大きなＲＮＡの特に効率的な精製をもたらすことを見出した。例えば、コアビーズフロースルークロマトグラフィーまたはタンジェンシャルフロークロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに先行する精製工程として使用することができる。
【００８４】
コアビーズフロースルークロマトグラフィー
本発明によれば、ＲＮＡは、コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いて精製することができる。よって、本発明の方法は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの１以上の工程を含んでなり得る。本発明者らは、この技術が高収率で純粋なＲＮＡを得るための迅速な工業規模の精製プロセスを可能とし、例えば、ＩＶＴ反応サンプルにおいて所望のＲＮＡ種からタンパク質夾雑物を除去するために特に有利であることを見出した。本発明者らは、３メガダルトンを超えるものを含んでなる極めて大きなＲＮＡ種がこの方法を用いて精製可能であることを示した。本発明者らの知る限り、特にＩＶＴ後に、コアビーズクロマトグラフィーまたは他の任意の方法を用いてこのように大きなＲＮＡ種の精製を可能とする従来技術の方法はない。しかしながら、この方法は大きなＲＮＡ分子の精製に限定されず、下記のように好適なビーズ孔径が選択される限り、いずれのサイズのＲＮＡ分子（例えば、中等度のＲＮＡ）もこの方法で精製可能である。
【００８５】
コアビーズフロースルークロマトグラフィーは、バッチ形式またはカラム形式を用いて行うことができる。カラム形式が好ましい。カラムは固定相を含んでなる。カラム形式は、ＲＮＡ含有サンプルをカラムに適用すること、通過画分を回収すること、および場合により、溶出バッファーをカラムに通すこと、および所望の溶出液またはその画分を回収することを含み得る。本方法は、例えば、サンプルをカラムに適用した後の洗浄工程などの追加工程を含んでなってもよく、通常「チェイス」バッファーがカラムに添加される。好適なクロマトグラフィー設定は当技術分野で公知であり、例えば、ＧＥヘルスケアからのＡＫＴＡ液体クロマトグラフィーシステムなどの液体クロマトグラフィーシステムがある。
【００８６】
ＲＮＡ含有サンプルをカラムに適用した後、その内容物は重力のみによってカラムを移動することもできるし、またはそれらの通過速度を高めるために外圧をかけてもよい。ＲＮＡ含有サンプルをカラムに適用した後、当技術分野で一般に「チェイスバッファー」と呼ばれるバッファーもまたカラムに適用し、重力のみを用いて、またはサンプル成分がカラムを通過する速度を高めるために外圧をかけることによってカラムを通過させてよい。流速は体積流量（単位時間当たりにカラムを通過する移動相、例えば、サンプルバッファーおよび／またはチェイスバッファーの体積）または線形流速（単位時間当たりに移動する移動相前線の距離）として示すことができる。流速を計算して線形流速から体積流量に変換する方法は当技術分野で公知である。
【００８７】
本発明によれば、クロマトグラフィー媒体は、通常はポリマーから形成される多孔質材料（マトリックス）から構成されるビーズから構成される。このマトリックスは、例えば、外層（シェル）に取り囲まれた内層（コア）などの少なくとも２層を含んでなるが、このマトリックスはまた、内層と外層の間に１以上の付加的（中間）層を含んでなってもよい。
【００８８】
各マトリックス層は少なくとも１つの配位子で官能化されてもよいし、官能化されなくともよい。一般に、これらの層は、少なくとも１つの配位子の存在または不在によって互いに識別可能である。
【００８９】
例えば、コアはＮ個の異なる配位子で官能化されてよく、シェルはＮ−１個以下のこれらの配位子で官能化される。Ｎは任意の正の整数であってよく、例えば、１である。例えば、コアは１個の配位子で官能化されてよく、シェルは１以上の異なる配位子で官能化されるか、またはいずれの配位子でも官能化されなくてよい。好ましい実施形態では、コアは１個の配位子で官能化され、シェルはいずれの配位子でも官能化されない。
【００９０】
好ましくは、少なくとも１つの配位子は複数の官能基を有する配位子であり、例えば、配位子は疎水性と正電荷の両方を有する。例えば、配位子はモノ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−アミンであってよく、例えば、配位子はオクチルアミン（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＮＨ２）であってよい。
【００９１】
よって、本発明の好ましい実施形態では、コアは１個の配位子で官能化され、この配位子は複数の官能基を有し、例えば、この配位子は疎水性と正電荷の両方を有し、例えば、この配位子はモノ−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル−アミンであってよく、例えば、この配位子はオクチルアミンであってよく、また、シェルはいずれの配位子でも官能化されない。
【００９２】
マトリックスは規定の孔径を有し、これにより、分子のサイズに基づいてある割合の分子がコアに入らないようにし、それらはカラム通過画分中に回収される（フロースルー様式）。マトリックスを通過できる分子はコアに入り、そこでそれらは一般に配位子との結合によって保持され得る。保持された分子は、好適な溶出剤を用いてビーズから溶出させることができる（結合−溶出様式）。一般に、溶出剤は、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）と溶媒を含んでなる溶液である。
【００９３】
コアビーズフロースルークロマトグラフィーのパラメーターは、ＲＮＡの完全性および／または効力に有意な影響を及ぼさずに、所望のＲＮＡが１以上の通過画分から選択的に回収可能なように選択される。
【００９４】
好ましくは、マトリックスは、多孔質マトリックス、例えば、アガロース、好ましくは、高架橋アガロースである。
【００９５】
マトリックス孔径は通常ｋＤａで示され、マトリックスが拒絶されると思われる最小粒子の平均分子量（ＭＷＣＯとも呼ばれる）を意味する。あるいは、マトリックス孔径は、μｍで示すこともでき、ＴＦＦに関して上記されたように、マトリックスが拒絶されると思われる最小粒子の直径を意味する。孔径は、カットオフがＲＮＡサイズより小さく、タンパク質サイズよりも大きくなるように選択される。この方法を用いれば、ビーズの分子カットオフよりも大きいＲＮＡ種が精製できる。より好ましくは、所望のＲＮＡ種は、精製されるサンプル中で最も大きい分子である。従って、本発明により、ＲＮＡが１以上の通過画分から回収される。
【００９６】
本発明者らは、大きなＲＮＡの精製に関して、少なくとも２５０ｋＤａのＭＷＣＯ／孔径、例えば、少なくとも３００ｋＤａ、４００ｋＤａ、５００ｋＤａ、６００ｋＤａ、または少なくとも７００ｋＤａなどが有用であることを見出した。少なくとも約７００ｋＤａの分子量カットオフが特に好ましい。一般に、ＭＷＣＯは、目的のＲＮＡ分子の分子量とＭＷＣＯの比が少なくとも１．５：１（例えば、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１または少なくとも６：１）となり、かつ／または最大の非ＲＮＡ不純物の分子量とＭＷＣＯの比が少なくとも１：１．５（例えば、少なくとも１：２、少なくとも１：３、少なくとも１：４、少なくとも１：５または少なくとも１：６）となるように選択される。
【００９７】
ビーズの平均直径（粒径）は、性能に必要な過度の圧力のためにＲＮＡの完全性および／または効力に有意な影響を及ぼすことなく、最短の操作時間で効率的なＲＮＡ精製が可能となるように選択される。大きな粒子および大きな孔径ほど一般に定圧力の使用が可能であるが、分離効率は低下し得る。本発明者らは、約５０〜１００μｍの粒径が好ましく、約６０〜９０μｍの粒径がより好ましく、約７０〜８０μｍの粒径がさらにより好ましいことを見出した。約８５μｍの粒径が最も好ましい。
【００９８】
例示的コアビーズフロースルークロマトグラフィー媒体は、ＧＥヘルスケアからのＣａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ  ７００ビーズである。
【００９９】
ＲＮＡは、カラムから通過画分中に選択的に回収される。タンパク質および短い核酸はビーズに保持される。ＲＮＡを含有する通過画分は、２６０ｎｍでのＵＶ吸収を測定することによって同定することができる。通過画分中に回収された目的のＲＮＡを含んでなる組成物は、コアビーズクロマトグラフィー工程前の調製物に比べて高度に精製される。目的のＲＮＡを含有する複数の溶出画分はさらなる処理の前に合わせてよい。
【０１００】
サンプルがカラムに通される前にＲＮＡ含有サンプルに一定量の塩を添加してもよい。本発明者らは、これがタンパク質不純物の除去に特に有利であることを見出した。任意の好適な塩を好適な濃度、例えば、約１５０ｍＭ〜５００ｍＭの間で使用してよい。
【０１０１】
例えば、塩は、ＲＮＡ含有サンプルに、０〜５００ｍＭの間、例えば、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約６００ｍＭ、約７００ｍＭ、約７５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約６００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約４００ｍＭなどの終濃度で加えてよい。
【０１０２】
本発明者らは、約１２５ｍＭ〜２５０ｍＭの間の塩濃度が特に有利であり、高いＲＮＡ収率および効率的なタンパク質除去を伴うＲＮＡ精製が得られることを見出した。あるいは、タンパク質不純物の除去よりも高いＲＮＡ収率が必要とされる場合、例えば、タンパク質を実質的に含まないサンプルが使用される場合には、２５０ｍＭ以下、または好ましくは１２５ｍＭ以下の塩濃度が使用可能である。タンパク質不純物の除去よりも高いＲＮＡ収率および／または高いヌクレオチド除去効率が必要とされる場合、例えば、タンパク質を実質的に含まないが、多量の遊離ヌクレオチドを含有するサンプルが使用される場合には、２５０ｍＭ以下、好ましくは１２５ｍＭ以下の塩濃度が使用され、最も好ましくは、塩は添加されない。
【０１０３】
好適な塩は一般に、同じ濃度およびｐＨで使用した場合に、好ましいとは言えない塩に比べてＲＮＡ沈澱のレベルを最小限とする塩である。本発明者らは、一般にリン酸カリウムおよび／または塩化カリウムが特に好適であり、カリウム塩は有利にも、濃度およびｐＨで使用した場合にナトリウム塩に比べてＲＮＡ沈澱のレベルを最小限とすることから、リン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムよりも好ましいことを見出した。一般に、本発明者らは、コスモトロピックの増大を伴う陽イオンの使用が好ましいことを見出した。
【０１０４】
ＲＮＡ含有サンプルは、サンプルがカラムに通される前に希釈してもよい。例えば、サンプルは、サンプル容量の約５倍、約４倍、約３倍、約２倍、または約１倍に相当する希釈液容量で希釈してよい。１倍希釈溶液は、サンプルの容量に等しい容量の希釈液がサンプルに添加されることを意味する。任意の好適な希釈液を使用することができ、一般にはバッファーである。好適な希釈液は、続いての任意の精製またはバッファー交換工程に干渉しないものである。例えば、希釈液は、ＲＮＡ含有サンプルのバッファーと同じバッファーであり得る（例えば、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）。
【０１０５】
流速は、ＲＮＡ回収率および／またはタンパク質除去率の改善を達成するために変更可能である。高いＲＮＡ回収率が望まれる場合には、２００〜５００ｃｍ／時の間の線形流速が有利である。高レベルのタンパク質除去率が望まれる場合には、５０〜３００ｃｍ／時の間の流速が有利である。一般に、最適な回収率およびタンパク質除去率のためには、２５０〜３００ｃｍ／時の間、好ましくは約２７５ｃｍ／時の流速が使用される。
【０１０６】
上記のような塩の添加、サンプルの希釈、および流速の変更は、有用には組み合わせることができる。例えば、ＲＮＡ含有サンプルを希釈してよく、サンプルがカラムに通される前にサンプルに一定量の塩を添加してよい。高純度、高収率および短い操作時間で大きなＲＮＡを精製するための特に有利な方法は、サンプルをカラムに適用する前にサンプルを４倍希釈し、線形流速２７５ｃｍ／時でクロマトグラフィーを行い、サンプルバッファーおよび／またはチェイスバッファーに２５０ｍＭで塩（例えば、ＫＣｌまたはＮａＣｌ）を添加するというものである。
【０１０７】
コアビーズクロマトグラフィーが本発明に従って使用される場合、それは目的のＲＮＡからタンパク質夾雑物を除去するために特に有用である。１回の精製実施でクロマトグラフィーカラムに適用されるＲＮＡ含有サンプルが、固定相（すなわち、コアビーズ）１ｍｌ当たり５〜１５ｍｇ以下、例えば、１０ｍｇ／ｍｌ以下、または１３ｍｇ／ｍｌ以下の総タンパク質を含有する場合に、特に良好な結果が得られる。これらの値は、総タンパク質が、一般にＴ７ポリメラーゼ、キャッピング酵素、ＲＮアーゼ阻害剤およびピロホスファターゼといったｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物の成分であるタンパク質から構成される場合に特に関するものである。
【０１０８】
大規模精製を行う場合には、能力を増大させるために、クロマトグラフィーカラムを互いに直列に接続してもよい。
【０１０９】
本発明者らはまた、コアビーズフロースルークロマトグラフィー工程の後にＴＦＦ工程を行う場合に、いっそう高レベルの純度（例えば、ＩＶＴから残留する遊離ヌクレオチドをより効率的に除去することによる）が達成可能であることも見出した。ＴＦＦ工程は、精製／バッファー交換プロセス中に処方バッファーを使用することにより、ＲＮＡ精製、特に、ヌクレオチド除去、およびバッファー交換を同時に行うために使用可能である。処方バッファーは、任意の先行工程で使用される精製バッファーとは異なる。
【０１１０】
方法の組合せ
開示される方法はいずれも、ＲＮＡ精製の少なくとも１つの工程、および場合により、さらなるバッファー交換の工程を含んでなるプロセスで単独でまたは組み合わせて使用することができる。例えば、ＴＦＦ、コアビーズフロースルークロマトグラフィー、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ＲＮＡ精製に使用され、場合により、その後、バッファー交換および／またはＲＮＡ精製のためのさらなるＴＦＦ工程が行われる。
【０１１１】
別の例では、ＴＦＦがＲＮＡ精製のためにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーと併用され、場合により、その後、バッファー交換および／またはＲＮＡ精製のためのさらなるＴＦＦ工程が行われる。
【０１１２】
別の例では、コアビーズフロースルークロマトグラフィーがＲＮＡ精製のためにヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーと併用され、場合により、その後、バッファー交換および／またはＲＮＡ精製のためのＴＦＦ工程が行われる。
【０１１３】
別の例では、ＴＦＦがＲＮＡ精製のためにコアビーズフロースルークロマトグラフィーと併用され、場合により、その後、バッファー交換および／またはＲＮＡ精製のためのさらなるＴＦＦ工程が行われる。
【０１１４】
別の例では、コアビーズフロースルークロマトグラフィーが使用される場合、その後に、タンジェンシャルフローフィルトレーションが行われる。このような方法はまた、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの後に続き、タンジェンシャルフローフィルトレーションに先行するヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーも含み得る。
【０１１５】
別の例では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが使用される場合、その前にタンジェンシャルフローフィルトレーションまたはコアビーズフロースルークロマトグラフィーが行われる。このような方法はまた、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの後に続くタンジェンシャルフローフィルトレーションも含み得る。
【０１１６】
方法の組合せが同じ方法を２工程、例えば、１工程のタンジェンシャルフローフィルトレーションとさらに１工程のタンジェンシャルフローフィルトレーションを含んでなる場合、一般に、第１の工程および第２の工程で２つの異なるバッファーが使用される。一般に、第１のバッファーは、第２のバッファーとは少なくとも１つの成分および／または特徴が異なる。例えば、塩濃度、塩の種類、張度、ｐＨまたは夾雑物の量が異なり得る。通常、これらのバッファーは異なる緩衝系に基づき、例えば、第１のバッファーはＴｒｉまたはリン酸系バッファーであり得、第２のバッファーはクエン酸系バッファーである。
【０１１７】
本発明者らは、上記に挙げた方法の組合せは、最終的なＲＮＡ産物の純度（例えば、リボヌクレオシド三リン酸、タンパク質、ＤＮＡおよびその断片の除去）および収率、操作の容易性、時間効率、およびプロセス全体のスケーラビリティーの点でいっそう大きな利点をもたらすことを示した。
【０１１８】
装置の特徴
本発明の１つの利点は、使い捨て可能な部品を使用することである。よって、本発明の方法は、その方法が実施される装置の一部または全部を、その方法が実施された後に廃棄する工程を含むことができる。例えば、任意のＴＦＦカラム、ヒドロキシアパタイト支持体、および／またはコアビーズフロースルーカラムが廃棄でき、それらを接続するために使用されていた配管およびコネクターも同様に廃棄できる。これらの部品は、生物有害廃棄物として廃棄することができる。
【０１１９】
よって、本発明の方法は、使い捨て可能な装置部品を使用することができる。さらに、本発明の方法は、一般に、ＲＮアーゼからの容易に浄化できる装置部品を使用する。この要件はこれらの部品の材料、形状、構造および寸法に反映させることができる。
【０１２０】
迅速法
前述のように、本発明は、サンプルからＲＮＡを精製するための方法であって、ＲＮＡが１２時間以内に少なくとも９９％純度まで精製される方法を提供する。
【０１２１】
同様に、本発明は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ピロホスフェート、および遊離ヌクレオチド（未反応ＲＮＡ前駆体としておよび／またはＲＮＡまたはＤＮＡからの分解産物として）を含有するサンプルからＲＮＡを精製するための方法を提供し、この方法は、１２時間以内に、ＤＮＡ、ピロホスフェート、および遊離ヌクレオチドを含まない最終材料を提供する。
【０１２２】
ＲＮＡ含有サンプルはＩＶＴ反応の生成物であり得、従って、上述のように典型的なＩＶＴ夾雑物を含有する。
【０１２３】
ＲＮＡは、高純度、例えば、≧９９．５％、≧９９．９％、またはさらには≧９９．９５％に調製可能である。よって、精製材料中の少なくとも９９％以上の成分（水および緩衝塩以外）が目的のＲＮＡである。
【０１２４】
本方法は、１２時間以内、例えば、＜８時間、＜６時間、＜４時間、または＜２時間で完了して精製ＲＮＡを提供することができる。
【０１２５】
本方法は、本明細書の他所に開示されている工程（およびそれらの組合せ）のいずれを使用することもできる。本方法は理想的には終始水性条件を用いて行われる。
【０１２６】
医薬組成物
本発明により精製されたＲＮＡは、例えば、対象を様々な疾患に対して免疫する際にワクチンとして使用するための医薬組成物中の成分として有用である。これらの組成物は一般に、ＲＮＡと薬学的に許容可能な担体とを含む。薬学的に許容可能な担体の詳細な考察は、Gennaro et al.において得られる。本発明の医薬組成物はまた、小分子免疫増強剤（例えば、ＴＬＲアゴニスト）などの１以上の付加的成分も含み得る。本発明の医薬組成物はまた、ＲＮＡの送達系、例えば、リポソーム、水中油型エマルション、または微粒子も含み得る。
【０１２７】
本発明の医薬組成物は好ましくは、ＲＮＡの製造および精製から生じる夾雑物を実質的に含まない。ＩＶＴが使用される場合、このような夾雑物としては、タンパク質、例えば、酵素、例えば、ポリメラーゼ、特に、Ｔ７ポリメラーゼ、およびキャッピング酵素、遊離ヌクレオチド、および鋳型ＤＮＡおよび／またはその断片を含み得る。
【０１２８】
本発明の医薬組成物は、淡水（例えば、ｗ．ｆ．ｉ．）中、または最終的な処方バッファー、例えば、リン酸バッファー、Ｔｒｉｓバッファー、ホウ酸バッファー、コハク酸バッファー、ヒスチジンバッファー、もしくはクエン酸バッファー中にＲＮＡを含み得る。緩衝塩は一般に５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。
【０１２９】
本発明の組成物は、金属イオンキレート剤を含み得る。これらは、ホスホジエステル加水分解を加速する可能性のあるイオンを除去することによってＲＮＡの安定性を延長することができる。よって、組成物は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＢＡＰＴＡ、ペンテト酸などのうち１以上を含み得る。このようなキレート剤は一般に、１０〜５００μＭの間、例えば、０．１ｍＭで存在する。クエン酸ナトリウムなどのクエン酸塩はキレート剤としても働くことができると同時に有利には緩衝活性も提供する。
【０１３０】
本発明の組成物は、張度を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含み得る。１０±２ｍｇ／ｍｌ濃度のＮａＣｌが典型的であり、例えば、約９ｍｇ／ｍｌである。
【０１３１】
本発明の医薬組成物は、５．０〜９．５の間、例えば、６．０〜８．０の間のｐＨを持ち得る。
【０１３２】
本発明の医薬組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、例えば、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、または２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間のモル浸透圧濃度を持ち得る。
【０１３３】
本発明の医薬組成物は、１以上の保存剤、例えば、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールを含み得る。水銀不含の組成物が好ましく、保存剤不含のワクチンが調製可能である。本発明の医薬組成物は好ましくは無菌である。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は好ましくは非発熱性であり、例えば、１用量当たり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準尺度）、好ましくは、１用量当たり＜０．１ＥＵを含有する。
【０１３５】
本発明の医薬組成物は好ましくはグルテン不含である。
【０１３６】
本発明の医薬組成物は、単位投与形で調製することができる。いくつかの実施形態では、単位用量は０．１〜１．０ｍｌの間、例えば、約０．５ｍｌの容量であり得る。
【０１３７】
これらの組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射液として調製することができる。本組成物は、例えば、微細噴霧剤を用いた吸入による肺投与用に調製することができる。本組成物は、例えば、噴霧剤または滴剤としての鼻腔、耳内または眼内投与用に調製することができる。筋肉内投与用の注射液が典型的である。
【０１３８】
組成物が送達系を含む場合、これは通常にはリポソーム（例えば、ＷＯ２０１２／００６３７６、ＷＯ２０１２／０３０９０１、ＷＯ２０１２／０３１０４３、ＷＯ２０１２／０３１０４６、およびＷＯ２０１３／００６８２５参照）、水中油型エマルション（例えば、ＷＯ２０１２／００６３８０、ＷＯ２０１３／００６８３４、およびＷＯ２０１３／００６８３７参照）、または微粒子（例えば、ＷＯ２０１２／００６３５９参照）である。本発明のプロセスは、精製ＲＮＡ分子を送達系と合わせるさらなる工程を含み得る。同様に、本発明は、本発明の方法を用いてＲＮＡを精製する工程と、精製されたＲＮＡを送達系、例えば、リポソームまたは水中油型エマルションと合わせる工程とを含んでなる、医薬組成物を調製するための方法を提供する。
【０１３９】
組成物は、免疫学的に有効な量のＲＮＡ、ならびに必要に応じて他の任意の成分を含んでなる。「免疫学的に有効な量」とは、その量の、単回用量でまたはシリーズの一部としての個体への投与が治療または予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康状態および生理状態、齢、治療される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系の抗体合成能、望まれる防御の程度、ワクチンの処方、治療を行う医師の医学的状態の評価、および他の関連因子によって異なる。この量は通常の治験を通じて決定され得る比較的広い範囲に入ると思われる。本発明の組成物のＲＮＡ含量は一般に、１用量当たりのＲＮＡの量として表される。好ましい用量は、≦１００μｇＲＮＡ（例えば、１０〜１００μｇ、例えば、約１０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇまたは１００μｇ）を含むが、発現はもっと低レベル、例えば、≦１μｇ／用量、≦１００ｎｇ／用量、≦１０ｎｇ／用量、≦１ｎｇ／用量などで見られ得る。
【０１４０】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を含有する送達デバイス（例えば、シリンジ、ネブライザー、噴霧器、吸入器、皮膚パッチなど）を提供する。このデバイスは、脊椎動物対象に本組成物を投与するために使用できる。
【０１４１】
治療方法および医学的使用
本発明の医薬組成物は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて目的の免疫原に対する免疫応答を惹起するために使用することができる。
【０１４２】
よって、本発明は、有効量の本発明の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法を提供する。免疫応答は好ましくは防御的であり、好ましくは、抗体および／または細胞性免疫を含む。本方法は追加免疫応答を惹起し得る。
【０１４３】
本発明はまた、脊椎動物において免疫応答を惹起するための方法において使用するための本発明の医薬組成物を提供する。
【０１４４】
本発明はまた、脊椎動物において免疫応答を惹起するための薬剤の製造における本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０１４５】
これらの使用および方法によって脊椎動物において免疫応答を惹起することにより、脊椎動物は様々な疾患および／または感染症、例えば、上述のような細菌および／またはウイルス疾患から防御され得る。これらの組成物は免疫原性組成物であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的であっても（すなわち、感染を予防するため）または治療的であっても（すなわち、感染を治療するため）よいが、一般に予防的である。
【０１４６】
脊椎動物は好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒトまたは大型の獣医学的哺乳動物（例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヤギ、ブタ）である。ワクチンが予防的使用のためである場合、ヒトは好ましくは、小児（例えば、幼児)または１０代であり；ワクチンが治療的使用のためである場合、ヒトは好ましくは１０代または成人である。小児に意図されるワクチンはまた、例えば、安全性、用量、免疫原性などを評価するために成人に投与されてもよい。
【０１４７】
本発明により調製されるワクチンは、小児および成人の両方を治療するために用いてよい。よって、ヒト患者は、１歳未満、５歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを受容するのに好ましい患者は、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、および好ましくは６５歳）、若年者（例えば、≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍隊および軍人、妊娠女性、慢性疾患患者、または免疫不全患者である。本ワクチンは単にこれらの群に好適なだけでなく、より一般的には、集団に使用され得る。
【０１４８】
本発明の組成物は一般に患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば、皮下、腹膜内、静脈内、筋肉内、皮内、または組織の間質空間）によって達成することができる。別の送達経路としては、直腸、経口（例えば、錠剤、スプレー）、頬側、舌下、膣、局所、経皮または皮膚経由、鼻腔内、眼内、耳内、肺または他の粘膜投与が含まれる。皮内および筋肉内投与が２つの好ましい経路である。注射は針（例えば、皮下針）を介したものでもよいが、代わりに無針注射を用いてもよい。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。
【０１４９】
本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために、好ましくは、強い全身免疫および／または粘膜免疫を惹起するために使用可能である。
【０１５０】
用量は単回用量計画または複数回用量計画によるものであってよい。複数回用量は初回免疫計画および／または追加免疫計画で使用可能である。複数回用量計画では、例えば、非経口プライムと粘膜ブースト、粘膜プライムと非経口ブーストなど、種々の用量を同じまたは異なる経路によって与えることができる。複数回用量は一般に少なくとも１週間（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）あけて投与される。一実施形態では、複数回用量は、世界保健機関拡大予防接種計画(World Health Organisation’s Expanded Program on Immunisation)（「ＥＰＩ」）で使用される場合が多い、誕生のおよそ６週間後、１０週間後および１４週間後、例えば、６週齢、１０週齢および１４週齢時に投与することができる。別の実施形態では、２回の初期用量が約２か月あけて、例えば、約７週間、８週間または９週間あけて投与された後、１回以上の追加免疫用量が、２回目の初期用量の約６か月〜１年後に、例えば、２回目の初期用量の約６か月、８か月、１０か月または１２か月後に投与される。さらなる実施形態では、３回の初期用量が約２か月あけて、例えば、約７週間、８週間または９週間あけて投与された後、１回以上の追加免疫用量は、３回目の初期用量の約６か月〜１年後に、例えば、３回目の初期用量の約６か月、８か月、１０か月、または１２か月後に投与される。
【０１５１】
全般的内容
本発明の実施には、特に断りのない限り、当技術分野の技能の範囲内で化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。このような技術は文献で十分に説明されている。
【０１５２】
「含んでなる」という用語は、「含む」ならびに「からなる」を包含し、例えば、Ｘを「含んでなる」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、または例えばＸ＋Ｙなどの何らかの付加を含んでもよい。
【０１５３】
数値ｘに関する「約」という用語は任意選択であり、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１５４】
「実質的に」という語は「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要であれば、「実質的に」という語は、本発明の定義から省かれてもよい。
【０１５５】
電荷、陽イオン、陰イオン、両性イオンなどに対する言及はｐＨ７で考える。
【０１５６】
本発明に関して「収率」という用語は、精製前に比べた場合の、精製後のサンプル中に含まれるＲＮＡの比率を表す。一般に、収率は収率％として表され、式：［（精製後のＲＮＡ量／精製前のＲＮＡ量）×１００］に従って計算される。サンプル中のＲＮＡ量は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）などのＲＮＡ特異的蛍光色素を用いて測定することができる。
【０１５７】
「精製」または「精製する」という用語は、サンプル中の所望のＲＮＡが所望でない成分から分離されることを意味する。よって、「ＲＮＡ精製」は、目的のＲＮＡと不純物を含んでなる組成物から目的のＲＮＡを精製するための方法を意味する。よって、精製後、ＲＮＡは精製前よりも純粋な形態で存在する。これは、所望でない成分は、精製前よりも、所望のＲＮＡの量に対してより低い量で存在することを意味する。所望のＲＮＡから分離する必要があり得る、ＲＮＡ含有サンプルの所望でない成分としては、ＤＮＡ、デオキシヌクレオシド一リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、所望でないＲＮＡ種（例えば、所望のＲＮＡサイズよりも長い／短い、もしくは所望のＲＮＡサイズ範囲外のＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡ対一本鎖ＲＮＡ）、デオキシオリゴヌクレオチド、タンパク質（特に、酵素、例えば、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、ｍＲＮＡキャッピング酵素、ピロホスファターゼ、ＤＮアーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤）などを含み得る。
【０１５８】
「効力」または「機能性」という語は、ＲＮＡ分子の意図される生物学的機能およびＲＮＡの精製前に比べて精製後にその機能が保持されるレベルを表す。例えば、ＲＮＡ効力が精製後も不変のままであれば、例えば、ある量の投入ＲＮＡに対して任意のコードタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ発現レベルによって測定した場合、そのＲＮＡの特定の生物学的機能の程度は変化していない。
【０１５９】
「安定性」という語は、ＲＮＡ分子がその構造的完全性を保持し、かつ、物理的または化学的操作中、分解に耐える程度を意味する。例えば、ＲＮＡの安定性が精製後も不変のままであれば、例えば、平均ＲＮＡサイズまたはＲＮＡサイズ分布を分析することにより測定される構造的完全性のレベルは変化していない。
【０１６０】
ＲＮＡ精製法に関して「分取」、「大規模」、「商業規模」および「工業規模」という用語は、多量のＲＮＡが少なくとも９０％の純度まで精製可能であることを意味する。このような多量は、本発明の方法を用いる場合、例えば、少なくとも０．５ｍｇ、１ｍｇ、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、５００ｍｇ、あるいは少なくとも１０００ｍｇである。
【０１６１】
「固定相」という用語は、クロマトグラフィーベッドに含まれる非移動相を意味する。
【０１６２】
「粒径」という用語は、固定相粒子の平均直径を意味する。
【０１６３】
「孔径」という用語は、固定相が拒絶する、またはサンプル側で膜が保持する最小の粒子の平均サイズを意味する。このサイズは一般に、粒子直径または分子量で表される。
【０１６４】
「溶出勾配」という用語は、溶出プロセス中に溶出剤の組成が連続的または段階的に変更されることを意味する。これに対して「無勾配溶出」は、溶出プロセス中、固定の溶出剤組成を用いて行われる。
【０１６５】
「工程」は、それらの工程が異なる方法（例えば、タンジェンシャルフローフィルトレーションとヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）を用いる場合、またはそれらの工程が同じ方法を用いるが、異なる条件下で行われる（例えば、異なるバッファー、異なる膜、または異なる固定相を用いる）場合には、ＲＮＡ精製またはバッファー交換の別の工程とが異なる。
【０１６６】
第２の工程が別の第１の工程の「後」または第１の工程に「続いて」行われる場合、第２の工程は、その方法において先行する第１の工程の直後に行われてよく、すなわち、これら２つの工程の間に行われ得る希釈または保存などの工程以外には、第１の工程と第２の工程の間にいずれの工程も行われない。あるいは、第１の工程と第２の工程の間に１または複数の他の工程を行ってもよい。
【０１６７】
第１の工程が別の第２の工程の「前」または第２の工程に「先行して」行われる場合、第１の工程は、その方法において続く工程の直前に行われてよく、すなわち、これら２つの工程の間に行われ得る希釈または保存などの工程以外には、第１の工程と第２の工程の間にいずれの工程も行われない。あるいは、第１の工程と第２の工程の間に１または複数の他の工程を行ってもよい。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１】図１は、タンジェンシャルフローフィルトレーションおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−タンパク質除去−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル  精製前（レーン１）、タンジェンシャルフローフィルトレーション後（レーン２）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後（レーン３）、タンジェンシャルフローフィルトレーション後（レーン４）。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す。図２Ａは、ホフマイスター系列のイオンをそれらのタンパク質塩析能の順に示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す。図２Ｂは、種々の溶出バッファー中でのＲＮＡ凝集塊粒径の動的光散乱分析を示す−ｘ軸：塩濃度（ｍＭ）；ｙ軸：粒子半径（ｎｍ）。
【図３】図３Ａは、タンジェンシャルフローフィルトレーションおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−タンパク質除去−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル  精製前（レーン１）、タンジェンシャルフロー精製後（レーン２）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後（レーン３）。図３Ｂは、タンジェンシャルフローフィルトレーションおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＤＮＡ除去−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル中に存在するＲＮＡ  １ｍｇ当たりのＤＮＡ  精製前（左から最初のデータ点）、タンジェンシャルフローフィルトレーション後（２番目のデータ点）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後（３番目のデータ点）。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−タンパク質除去−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写サンプル  精製前（レーン１）、コアビーズフロースルークロマトグラフィー後の通過画分（レーン２）、カラム定置洗浄後の溶出液（レーン３）。
【図５】図５は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−タンパク質除去の際のサンプルおよびチェイスバッファー中の塩の効果。
【図６】図６Ａは、ＲＮＡまたはＲＮＡおよびヌクレオチドの定量の結果を示す。図６Ｂおよび図６Ｄは、タンジェンシャルフローフィルトレーション対コアビーズフロースルークロマトグラフィーの結果を示す−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ヌクレオチド除去。図６Ｃは、タンジェンシャルフローフィルトレーション対コアビーズフロースルークロマトグラフィー対コアビーズフロースルークロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー対タンジェンシャルフローフィルトレーションおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの結果を示す−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−タンパク質除去。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ａは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイ（サンプル希釈１００００倍）による直接定量によって測定されたＲＮＡ回収率を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ｂは、定量的ＥＬＩＳＡによるＲＮＡサンプルの純度を示す（Ｔ７ポリメラーゼ、斜体のサンプルはＬＯＱを下回る）。このグラフは検出可能なＴ７を示し、ＥＬＩＳＡによればほとんどのサンプルでＬＯＱを下回る。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ｃは、定量的ＥＬＩＳＡによるＲＮＡサンプルの純度を示す（キャッピング酵素、斜体のサンプルはＬＯＱを下回り、「０」はＬＯＤ未満に相当する）。このグラフは、ＣＣ２５０後のサンプルＰ３、ならびにＨＴＰ後のＰ２およびＰ４でキャッピング酵素がＬＯＤを下回ることを示す。
【図７Ｄ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ｄは、ＳＤＳ  ｐａｇｅ−銀染色によるＲＮＡサンプルの純度を示す（各レーンに４μｇのＲＮＡをロードした）。
【図７Ｅ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ｅは、ＯＤによる定量値／ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）による定量値の比として表されるヌクレオチド除去率を示す（Ｙ軸がＯＤ／ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）を示す）。
【図７Ｆ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ｆは、プラスミドでのｑＰＣＲアッセイを用いたプラスミドＤＮＡのキャリーオーバーを示す。精製前のＤＮＡ：１．０ｎｇ／用量。精製後：０．６／０．７ｎｇ／用量。ＨＴＰクロマトグラフィー後に最低濃度が見られた。４種類のプロセス／工程の総てで同じＴＦＦカートリッジを使用した：キャリーオーバーの可能性。この実験ではバックグラウンド（バッファー）対照を用いなかった。
【図７Ｇ】図７Ａ〜７Ｇは、本明細書に記載の方法の組合せを用いたＲＮＡ精製の結果を示す：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−ＲＮＡ回収率、タンパク質除去率、ヌクレオチド除去率およびＤＮＡ除去率に対する効果。図７Ｇは、大腸菌(E.coli)に対する宿主（大腸菌）タンパク質ｏａｔポリクローナル抗体（ＨＲＰ標識）を用いた大腸菌タンパク質夾雑のレベルを示す。このアッセイでは、Ｌ．Ｏ．Ｄ．（検出限界）は１ｎｇ／バンドであり、各レーンに４μｇのＲＮＡをロードした。この図は、宿主夾雑物が１ｎｇ／タンパク質を下回ることを示す。
【図８】図８は、コアビーズフロースルークロマトグラフィー−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル−パラメーターの最適化−塩濃度に関する統計学的に有意な実験アプローチの設計を示す：０ｍＭ（−１）〜５００ｍＭ（１）；サンプル希釈：無希釈（１）〜４倍希釈（−１）；流速（線形速度）：５０ｃｍ／時（−１）〜５００ｃｍ／時（１）。
【実施例】
【０１６９】
発明を実施するための形態
実施例１：ＲＮＡ収率およびヌクレオチド除去率を定量するための方法
ＲＮＡは、サンプル中で、ＲＮＡ特異的蛍光色素（ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標））を用いて定量した。精製前と後のＲＮＡレベルを比較し、ＲＮＡ収率％を計算した。ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）は遊離ヌクレオチドを検出しない。
【０１７０】
遊離ヌクレオチドは、未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）反応において見られ、ＲＮＡの未反応前駆体（リボヌクレオシド三リン酸）およびＤＮアーゼ消化からの分解産物（デオキシヌクレオシド一リン酸）を含む。ＲＮＡの存在下でヌクレオチドを測定するための方法を開発した。純粋なＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）を用いて（図６Ａ、１番目の棒）、また、ＲＮＡの標準的近似消衰係数として４０を用いて２６０ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）により（２番目の棒）測定した。ヌクレオチドの混合物を純粋なＲＮＡサンプルに、ＲＮＡに対して１０倍質量過剰で加えた。得られたサンプルを、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）を用いて（３番目の棒）およびＯＤにより（４番目の棒）再び測定した。
【０１７１】
これらの結果は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）による測定がサンプル中のヌクレオチドの存在により影響を受けないが、検出されるＯＤ値はサンプル中のＲＮＡおよびヌクレオチドの総濃度を反映することを示す。ＲＮＡ精製工程後のヌクレオチド除去の指標としてのヌクレオチドの存在は、ＯＤ測定値とＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイ測定値の比として計算した。およそ１の比は、純粋なＲＮＡ、すなわち、完全なヌクレオチドを示す。１を超える比は、サンプル中のヌクレオチドの存在を示す。
【０１７２】
実施例２：タンジェンシャルフローフィルトレーションを用いたＲＮＡ精製およびバッファー交換
１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ならびに完全に化学的に定義された酵素、鋳型、物質およびバッファーによるキャッピングによって産生された。単一の閉鎖系でＲＮＡ精製とバッファー交換の両方のためにＫｒｏｓＦｌｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩＩｉタンジェンシャルフローフィルトレーションシステムを用いた（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。下記に示すように最適な結果を得るために様々なパラメーターを試験した：膜化学、膜孔径、膜面積、膜間差圧、剪断速度（保持液速度）、バッファー体積、緩衝能、バッファーｐＨ、サンプルの塩濃度、およびバッファー中のＥＤＴＡの存在。
【０１７３】
【表１】
0006461830.tif 000002
【０１７４】
４種類の稠度の実施は最適化された条件を用いて行い、タンジェンシャルフローフィルトレーション法はＲＮＡを、高回収率（＞９５％）、タンパク質除去率により測定される純度（ＥＬＩＳＡにより定量したところ、＞９０％のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが除去；精製後、ＲＮＡ７５μｇ当たりＴ７ポリメラーゼ５ｎｇ；ＥＬＩＳＡにより定量したところ、＞９５％のワクシニアキャッピング酵素が除去）およびヌクレオチド除去率により測定したところ（実施例１のアッセイを用いて定量したところ、＞９９．９％の遊離ヌクレオチドが除去）、効力（精製後の効力に変化無し）および安定性（精製後もＲＮＡは安定である）を伴って精製することを実証した。単一の閉鎖系としての操作は、ＲＮアーゼなどの外因性因子の夾雑を防ぐ。本方法は迅速（合計およそ７０分）かつ操作が容易である。
【０１７５】
図６Ｂおよび６Ｄおよび図７Ｅに示されるように、本方法は、サンプルから遊離ヌクレオチドを除去するのに特に有用である。図５（レーン１１）、図６Ｃならびに図７Ｂ、７Ｃおよび７Ｄに示されるように、タンパク質不純物もまたサンプルから効率的に除去される。
【０１７６】
実施例３：ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが大きなＲＮＡの精製に有用であり得るかどうか調べるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物から塩化リチウムにより精製した８０μｇの１０ｋｂ  ＲＮＡ（レプリコン）をヒドロキシアパタイトカラムにロードし、様々な割合のバッファーＡ（１０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．８）およびバッファーＢ（５００ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ６．８）から構成されるリン酸直線勾配で溶出させた。ｍＲＮＡはヒドロキシアパタイトカラムに効率的に結合させ、それから回収できることが判明した。ＲＮＡ収率／回収率は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物から塩化リチウムにより精製した同一量のｍＲＮＡをヒドロキシアパタイトカラムにロードするか、またはカラムを迂回するクロマトグラフィーシステムに送ることによって測定した。溶出ピーク下の面積を計算し、カラム通過精製無しに対するカラム通過後の比をＲＮＡ収率の指標として用いた（１４０１．２５ｍＡｕ／ｍｌ対１９３４．７６ｍＡｕ／ｍｌ）。ＲＮＡ収率は７２％と計算された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物から塩化リチウムにより精製された１０ｋｂ  ＲＮＡ（レプリコン）をヒドロキシアパタイトカラムにロードし、リン酸バッファーを用いて溶出させた。回収した画分４、５および６を変性ＲＮＡゲルにロードしたところ、光学密度の読み取り値がＲＮＡに関連付けられることが確認された。
【０１７７】
ＲＮＡがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いてタンパク質または非消化ＤＮＡなどの夾雑物からより効率的に分離できるかどうかを調べるため、精製されたＲＮＡの溶出動態を、溶出バッファー中、種々の量の塩（０〜１０００ｍＭ塩化ナトリウム）の存在下で分析した。塩化ナトリウムを、リン酸勾配において一定濃度となるように溶出バッファーＡおよびＢの両方に加えた。ＲＮＡ溶出ピークの右方向へのシフトは、漸増塩濃度を用いたＲＮＡ溶出に漸増濃度のリン酸が必要とされることを示す。これにより、ＲＮＡをタンパク質または他の不純物からさらに分離するために、異なる条件の設定が可能となる。従って、リン酸溶出バッファーへの塩の添加は、不純物からのＲＮＡの分画を最適化するために活用することができる。ｍＲＮＡ収率は溶出バッファー中の塩化ナトリウムの濃度と逆の相関があることが判明した。
【０１７８】
ＲＮＡが（未消化鋳型）ＤＮＡからより効率的に分離できるかどうかを調べるため、１００μｇの純粋なＤＮＡまたは純粋なＲＮＡを、同じパラメーターを用いてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付した。リン酸カリウム溶出バッファーの連続的勾配を使用した。ＲＮＡからのＤＮＡの分離に及ぼす溶出条件の影響を決定した。ＤＮＡはＲＮＡよりも高いリン酸濃度で溶出される（溶出ピークの右方向へのシフト）ことが判明した。従って、本発明者らは、溶出バッファー中のリン酸濃度が連続的にではなく段階的に高まる段階的溶出法を考案した。従って、ＲＮＡは溶出されるが、ＤＮＡまたは他の夾雑物は溶出されない溶出バッファーリン酸濃度を選択することにより、ＲＮＡを選択的に溶出させることができる。次に、等量の精製ＲＮＡおよびＤＮＡを溶液中、総量が２００μｇとなるように混合した試験実施を行い、バッファーＡおよびＢの段階的溶出勾配を用いてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに付した。
【０１７９】
勾配溶出において、ＲＮＡ溶出は、２１．０４ｍＳ／ｃｍ前後のバッファー導電率で起こった。ＤＮＡ溶出は、３０．５２ｍＳ／ｃｍ前後で起こった。このことは、ＲＮＡ／ＤＮＡ混合物の存在下で、約１８０ｍＭ濃度のリン酸カリウム（または２１．０４ｍＳ／ｃｍを超え、３０．５２ｍＳ／ｃｍ未満の導電率値となる任意のリン酸カリウム濃度）は選択的にＲＮＡを溶出し、ＤＮＡを溶出しないことを示す。次に、精製されたＤＮＡが上記と同じ条件下で分析される試験実施を行った。約１８０ｍＭ（約１８％Ｂ）を下回るリン酸カリウムでは、溶出は見られなかった。これらの結果は、ＲＮＡおよびＤＮＡが段階的溶出で効率的に分離できることを示す。ＤＮＡの溶出は、３８％バッファーＢ、約３８０ｍＭリン酸カリウム（または３０．５２ｍＳ／ｃｍを超える導電率値となる任意のリン酸カリウム濃度）で達成できる。タンジェンシャルフローフィルトレーションおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル）を用い、ＲＮＡからＤＮＡを分離するための溶出条件を最適化した。
【０１８０】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際のＲＮＡの溶出に有用な種々のリン酸バッファーの比較において、リン酸カリウムバッファーは、溶液中にＲＮＡを保持する上でリン酸ナトリウムよりも良好な性能を示し、ヒドロキシアパタイトカラム溶出のより良い候補であることが判明した。動的光散乱実験（図２）は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの際の溶出バッファーにおける漸増濃度のリン酸ナトリウムは、おそらく塩により誘発されるＲＮＡ沈澱（「塩析」）のために、溶出したＲＮＡの見かけの粒径にますますの増大をもたらすことを示した。この効果は、リン酸ナトリウムの代わりに同じ濃度（最大５００ｍＭの濃度）でリン酸カリウムを使用した場合に軽減される。リン酸カリウムバッファーはヒドロキシアパタイトカラムからのＲＮＡ溶出に関して試験され、このプロセスのＲＮＡ純度および回収率に関してリン酸ナトリウムバッファーに匹敵する性能を示した。従って、リン酸カリウムは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーによるＲＮＡ精製に最適な塩と特定される。
【０１８１】
次に、１００μｇの１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコンを含有する非精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いて分析した。回収した画分１、２および３を変性ＲＮＡゲルにロードした。ゲル上にＲＮＡは見られなかった。画分Ｂ９（画分２のすぐ前の画分に相当）およびＣ１（画分３に相当）を逆相ＨＰＬＣにより分析した。溶出時間をヌクレオチド標品と比較したところ、非精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルを用いた場合にＯＤ２６０で観察された溶出ピークは、主としてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物由来の遊離ヌクレオチドから構成されたことが確認された。
【０１８２】
実施例４：タンジェンシャルフローフィルトレーションおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いるＲＮＡ精製
タンジェンシャルフローフィルトレーションと、その後のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組合せを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルからのＲＮＡ精製の効率の改善に関して、特に、サンプルがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーに使用される前のヌクレオチドの除去に関して調べた。１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコン産物を含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を出発サンプルとして使用した。図３Ａおよび３Ｂは、このような方法の組合せが、タンジェンシャルフローフィルトレーション工程ではヌクレオチドの、また、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程ではＤＮＡ（精製ＲＮＡ１ｍｇ当たりＤＮＡ５．９３ｎｇに低減）およびタンパク質（検出レベルを下回るまでに低減）の効率的除去を可能とし、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程（実施例３に記載のように段階的溶出勾配を溶出に使用した）の後には純粋なＲＮＡ（＞８０％）の回収が可能とすることを示す。これは、全ＲＮＡ精製手順から鋳型ＤＮＡの消化を省くことができ、より速い操作時間をもたらすので、特に有用である。
【０１８３】
図１から、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を用いたタンパク質除去の効率がさらに確認され、タンパク質不純物のレベルが銀染色を用いた検出レベルを下回るまでに低減されることを示す（各レーンに４μｇの精製ＲＮＡをロードした）。リン酸バッファーの交換のために任意選択のさらなるタンジェンシャルフローフィルトレーション工程を用いた（この場合、精製ＲＮＡがヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー後に下流適用に好適なクエン酸バッファー中に溶出される）。
【０１８４】
また、図６Ｃ（レーン「ＴＦＦ０ＨＴＰ０」対レーン「投入時」）からも、ＲＮＡ含有サンプルからタンパク質不純物を除去するための、タンジェンシャルフローフィルトレーションとその後のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを組み合わせたＲＮＡ精製方法の有用性が確認される。
【０１８５】
実施例５：コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製
コアビーズフロースルークロマトグラフィーをＲＮＡの精製に関して試験した。１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコン産物を含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物（Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０中）を出発サンプルとして使用した。ＧＥ  ＡＫＴＡａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００  ＦＰＬＣシステムで、まず、ＨｉＳｃｒｅｅｎ  Ｃａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ  ７００カラム（製品コード：１７−５４８１−１５）を使用した。サンプルを、Ｔｒｉｓ  ５０ｍＭ、ｐＨ８．０のバッファーで、ＲＮＡ終濃度が６００ｎｇ／μｌ（最終容量：５．１ｍｇのＲＮＡを含有する８．５ｍｌ）となるように希釈した。このサンプルをカラムに注入し、サンプルの溶出が完了するまでＴｒｉｓバッファー（５０ｍＭ）でチェイスした。流速は１ｍｌ／分（１２５ｃｍ／時に相当）に設定した。カラム定置洗浄（ＣＩＰ）および再生は、製造者の説明書に従った。ＲＮＡはカラムの通過画分中に回収できることが判明した（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプル、５．１ｍｇＲＮＡ、ＲＮＡは通過画分に溶出した）。図４Ａおよび４Ｂは、ＲＮＡはカラムの通過画分から高レベルの収率で回収され（図４Ｂレーン２対レーン１）、コアビーズフロースルークロマトグラフィー前に比べて低いレベルのタンパク質不純物を含有する（図４Ａレーン２対レーン１）ことを示す。
【０１８６】
コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いた場合の、タンパク質不純物の除去に及ぼす塩の存在の影響を調べるために、精製時のサンプルおよびチェイスバッファー中に添加した漸増濃度の塩化ナトリウムまたはリン酸ナトリウムを試験した。これらの精製のためのクロマトグラフィー条件は、上記に明示したものと同一であった。等量の精製ＲＮＡ（５μｇを含有する）通過画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色によって分析した。図５は、漸増する塩濃度はタンパク質性夾雑物の除去レベルと正の相関があることを示す。塩をサンプルおよびチェイスバッファーに加えた。矢印は、２種類のタンパク質夾雑物（Ｔ７ポリメラーゼおよびキャッピング酵素の大サブユニット）を示す。右端の対照サンプルは、タンジェンシャルフローフィルトレーションのみを用いた場合のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物の精製後である。結論としては、漸増する塩濃度は、タンパク質のキャリーオーバーの除去を助長し、最終タンパク質質量が銀染色ポリアクリルアミドゲルおよび５μｇのＲＮＡを用いた場合の検出レベルを下回るに至る。
【０１８７】
コアビーズフロースルークロマトグラフィーの条件をさらに最適化し、特に、塩濃度（０〜５００ｍＭ）、流速（５０〜５００ｃｍ／時）、およびサンプル希釈率（４倍希釈〜無希釈；カラムに適用する前）を変更し、コアビーズフロースルークロマトグラフィー後のＲＮＡ収率（回収率）、タンパク質除去率（Ｔ７ポリメラーゼおよび／またはキャッピング酵素）およびヌクレオチド除去率のレベル、ならびにカラム入口圧およびクロマトグラフィー法の操作時間に及ぼすそれらの影響に関して評価した。図８は、統計学的に有意な実験アプローチの計画を示す。試験した変数の値の範囲および評価した出力パラメーターを示す。モデル詳細：応答局面法(Response Surface Designs)、中心複合計画(Central Composite Designs)、外接法。出発サンプルは、目的のＲＮＡを含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルであった。タンパク質のキャリーオーバーは、通過画分材料の、銀染色したＳＤＳ  ｐａｇｅにより評価し、タンパク質バンドの濃度測定により定量した。ヌクレオチド除去率およびＲＮＡ収率は、実施例１に記載の通りに定量した。
【０１８８】
表１は、種々の条件下で実施したコアビーズフロースルークロマトグラフィー後の出力値としての、ＲＮＡ収率（回収率）、タンパク質除去率（Ｔ７ポリメラーゼおよびキャッピング酵素）、ＯＤ２６０ｎｍ値、操作時間およびカラム入口圧を示す（サンプルＡ〜Ｔ）。
【０１８９】
【表２】
0006461830.tif 000003
【０１９０】
サンプルＡ〜Ｔにおける出力パラメーターとしてのＴ７ポリメラーゼ除去率およびキャッピング酵素除去率を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色を用いたコアビーズクロマトグラフィー通過画分画分の分解能と、その後のタンパク質バンドの濃度測定を用いた定量によって定量した。未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写サンプルを対照として用いた。結果をクロマトグラフィー条件によってさらに分析した：ＲＮＡ回収率、Ｔ７ポリメラーゼ除去率（相対単位での定量）およびキャッピング酵素除去率（相対単位での定量）に及ぼす塩濃度およびサンプル希釈の影響；ＲＮＡ回収率、Ｔ７ポリメラーゼ除去率およびキャッピング酵素除去率に及ぼす流速およびサンプル希釈の影響；ＲＮＡ回収率、Ｔ７ポリメラーゼ除去率およびキャッピング酵素除去率に及ぼす流速および塩濃度の影響。
【０１９１】
出発サンプルとして未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を用い、コアビーズフロースルークロマトグラフィーを用いてタンパク質が十分に除去される、カラム容量（ＣＶ）当たりの最大サンプル容量を決定した。タンパク質除去率に及ぼすサンプルとカラムの容量比の影響を決定した。サンプルは、１０：１（ＣＶ：１ｍｌ；ＩＤ：０．７ｃｍ；高さ：２．５ｃｍ、Ｌ．  ｖｅｌ：２５０ｃｍ／時；流速：１．６ｍｌ／分；接触時間：３６秒）または６４：１（ＣＶ：０．１３７ｍｌ；ＩＤ：０．５ｃｍ；高さ：０．７ｃｍ、Ｌ．  ｖｅｌ：２５０ｃｍ／時；流速：０．８２ｍｌ／分；接触時間：１０秒）の最大サンプル／ＣＶ比まで希釈し、塩化カリウムを終濃度２５０ｍＭまで加えた。各実施からの通過画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色により分析した。用いた条件下では、サンプル−ＣＶ比が約１０：１を超えた場合にタンパク質の破過が起こったことが判明した。結論として、用いた試験条件では、１０までのサンプル／ＣＶ比がタンパク質不純物からＲＮＡを効率的に精製した（例えば、１０ｍｌ  ＩＶＴ反応物は４０ｍｌまで希釈することができ、１ｍｌカラムを用いて効率的に精製できる）。
【０１９２】
さらに、コアビーズフロースルークロマトグラフィーで使用するための種々のサンプルバッファーおよび／またはチェイスバッファー組成を、これらのバッファー中で見られたＲＮＡ沈澱の程度に関して比較し、動的光散乱およびＲＮＡ沈澱の指標としての見かけ粒径の増大を用いて測定した。表２に、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの結果：種々の塩の存在下でのＲＮＡ凝集塊粒径の動的光散乱分析をまとめる。２つ目の欄は塩濃度（ｍＭ）を意味する。３つ目〜７つ目の欄の数字は、粒子半径（ｎｍ）である。この表は、リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）および塩化カリウムバッファー（ｐＨ８．０）が最適な通過画分精製の良好な候補であることを示す。
【０１９３】
【表３】
0006461830.tif 000004
【０１９４】
実施例６：コアビーズフロースルークロマトグラフィーおよびタンジェンシャルフローフィルトレーションを用いたＲＮＡ精製
出発サンプルとして１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコン産物を含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を用い、ヌクレオチドおよびタンパク質除去率を、タンジェンシャルフローフィルトレーションまたはコアビーズフロースルークロマトグラフィーのいずれかを用いて比較した（サンプル中、０、２５０または５００ｍＭの塩化カリウム濃度を使用）。図６Ｂおよび６Ｄは、タンジェンシャルフローフィルトレーションがヌクレオチド不純物を効率的に除去することを示す。図６Ｃは、コアビーズフロースルークロマトグラフィーが塩化カリウムの存在下でタンパク質不純物を効率的に除去することを示す。従って、ヌクレオチドおよびタンパク質不純物を除去することが望まれる場合には、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの後にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行うことが望ましい。
【０１９５】
実施例７：コアビーズフロースルークロマトグラフィーおよびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを用いたＲＮＡ精製
サンプルバッファーおよび／またはチェイスバッファー中の、塩化カリウムなどの付加的塩の存在は、場合により所望されないこともある。出発サンプルとして１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコンを含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を用い、コアビーズフロースルークロマトグラフィー（付加的塩を用いない、すなわち、０ｍＭ塩化カリウム）単独またはその後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（この場合も付加的塩を用いない、すなわち、０ｍＭ塩化ナトリウム）を用いてタンパク質除去率を比較した。図６Ｃ（レーン「ＣＣ０ＨＴＰ０」対レーン「ＣＣ０」）は、コアビーズフロースルークロマトグラフィーの後にヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを行った場合、付加的塩の不在下であっても効率的なタンパク質除去が達成できることを示す。
【０１９６】
実施例８：ＲＮＡ精製およびバッファー交換のための方法の組合せ
４種類の異なるプロセス流（Ｐ１〜Ｐ４）をＲＮＡ精製のために考案し（表３）、およびＲＮＡ回収率／収率および純度に関して比較を行った（図６Ａ〜６Ｇ）。
【０１９７】
【表４】
0006461830.tif 000005
【０１９８】
目的の１０ｋｂ  ＲＮＡレプリコンを含有するｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応物を出発サンプルとして用いた。
【０１９９】
ＲＮＡ純度は、各工程後のタンパク質（Ｔ７ポリメラーゼ、キャッピング酵素、ＲＮアーゼ阻害剤、ピロホスファターゼ、ＤＮＡ鋳型増幅から持ち越された大腸菌タンパク質）、プラスミドＤＮＡおよびヌクレオチドのレベルに関するものであった。ＲＮＡ回収率およびヌクレオチドレベルは、実施例１の方法を用いて測定した。タンパク質レベルは、ＥＬＩＳＡまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動とその後の銀染色または抗体に基づく検出（ウエスタンブロット）を用いて測定した。ＤＮＡレベルは、定量的ＰＣＲにより測定した。
【０２００】
タンジェンシャルフローフィルトレーションの工程は、バッファー交換のために使用され得るが、これが純度上昇をもたらす場合には、それは精製工程でもある。
【０２０１】
比較のため、ＩＶＴ後で、クロマトグラフィー／濾過システムにサンプルを適用する前の、総てのプロセスに関して、ＤＮアーゼを用いたＤＮＡ消化の工程を行った。しかしながら、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが使用される場合など、この工程は必須ではないことを注記しておくべきである。
【０２０２】
図７Ａ〜７Ｇは、タンパク質キャリーオーバー（Ｔ７およびキャッピング酵素）がプロセス１でのみ見られることを示す。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーおよびコアビーズクロマトグラフィーは、タンパク質のキャリーオーバーを効率的に除去することができる。精製後には、ＥＬＩＳＡアッセイの検出レベルを下回る微量が検出される。コアビーズフロースルー精製とその後のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーよりも操作が容易である。ＲＮＡ収率は：Ｐ１：７４．８％、Ｐ２：３７．３％、Ｐ３：７６．２％、Ｐ４：６０．７％であった（ＲＮＡ回収率は表４にまとめる）。ヌクレオチド除去は、総てのプロセスで最終産物において完全であった。処理時間は、総てのプロセスに関して、４５分〜８４分の範囲である。最終産物中のＤＮＡ濃度はＲＮＡ７５μｇ当たりＤＮＡ０．６ｎｇであった。大腸菌タンパク質夾雑のレベルは、用いたウエスタンブロット法の検出レベルを下回った。最終産物において動的光散乱により測定された見かけのＲＮＡ粒径は、総てのプロセスに関して、半径４０〜４５ｎｍであった。
【０２０３】
【表５】
0006461830.tif 000006
【０２０４】
実施例９：ＲＮＡの大規模精製
タンジェンシャルフローフィルトレーションとその後のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組合せを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルからの分取ＲＮＡ精製に用いた。６ｍｇの１０ｋｂ  ＲＮＡキャップレプリコン産物を含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を出発サンプルとして用いた。タンジェンシャルフローフィルトレーションは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０を用いて行った。ＲＮＡ含有画分が保持された。このサンプルに終濃度５００ｍＭで塩化カリウムを加え、そのサンプルをヒドロキシアパタイトカラム（ＧＥ  Ｈｉ  Ｓｃａｌｅ  ２６カラム、高さ２０ｃｍ、１００ｍｌ中、ＣＨＴ（商標）ＣｅｒａｍｉｃヒドロキシアパタイトタイプＩＩ、４０μｍ粒径、Ｂｉｏｒａｄ；ＧＥ  ＡＫＴＡ  ｅｘｐｌｏｒｅｒ  １００で実施；流速１０ｍｌ／分；線形速度３００ｃｍ／時）に適用した。溶出バッファーは、バッファーＡ（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．５）およびバッファーＢ（１Ｍリン酸カリウム、ｐＨ６．５）であった。ＲＮＡを、１８％バッファーＢ（１８０ｍＭリン酸カリウム）で選択的に溶出させた。結果は、この方法が大規模分取ＲＮＡ精製を高収率かつ高純度で達成することを示す。
【０２０５】
コアビーズフロースルークロマトグラフィーとその後のＴＦＦの組合せを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物サンプルからの分取ＲＮＡ精製に用いた。１２０ｍｇの１０ｋｂキャップＲＮＡレプリコン産物を含有する未精製ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を出発サンプルとして用いた。このサンプルを４倍希釈した後、場合により、塩化カリウムを２５０ｍＭまたは５００ｍＭまで加え、このサンプルを、Ｃａｐｔｏ（商標）Ｃｏｒｅ  ７００ビーズを用いたコアビーズ通過画分カラムに適用した。クロマトグラフィーを、線形流速２７５ｃｍ／時（体積測定により２５ｍｌ／分）にて、接触時間２．２１分で行った。次に、ＲＮＡ含有通過画分を、ＴＦＦ（中空線維モジュール、５００ｋＤａカットオフ、ｍＰＥＳ）を用いてさらに精製し、２倍濃縮し、最終処方バッファーへのバッファー交換バッファーを行った（総て１手順）。
【０２０６】
このプロセスを、５０ｍｌ  Ｃａｐｔｏｃｏｒｅカラム（Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ  ７００、内径２．６ｃｍ、高さ１０ｃｍ、上記の条件で実施、流速２５ｍｌ／分）および７９０ｃｍ２  ＴＦＦカートリッジ（同条件、流速２００ｍｌ／分）を用い、１００ｍｌのキャップＩＶＴ  ＲＮＡ（約１２０ｍｇ）で試験した。最終材料は、活性、純度および収率に関して小規模プロセスに匹敵する特徴を持っていた。予備実験でさえも、このプロセスは、１工程当たり約８０％の収率を持ち、全体としては６５％の回収率が得られ、７０分（Ｃａｐｔｏｃｏｒｅ工程に１２分、ＴＦＦに５８分）で完了した。
【０２０７】
以下の表は、１０〜１０００ｍｌのサンプル容量に対応できる４つの入手可能なカラムに関する好適なプロセスパラメーターを示す。
【０２０８】
【表６】
0006461830.tif 000007
【０２０９】
この表は流速を線形速度として示し、このことは、カラムの内径が本方法の規定に無関係であることを意味する。線形速度は、スケールアップの過程で一定に維持することができる。線形速度を一定に維持するため、従って、同じ接触時間（すなわち、サンプルがカラム内に留まる時間）を維持するために、異なるカラム直径を用いて流速をｍｌ／分で計算する。
【０２１０】
参照文献
0006461830.tif 000008
【図１】
0006461830.tif 000009
【図２Ａ】
0006461830.tif 000010
【図２Ｂ】
0006461830.tif 000011
【図３】
0006461830.tif 000012
【図４】
0006461830.tif 000013
【図５】
0006461830.tif 000014
【図６】
0006461830.tif 000015
【図７Ａ】
0006461830.tif 000016
【図７Ｂ】
0006461830.tif 000017
【図７Ｃ】
0006461830.tif 000018
【図７Ｄ】
0006461830.tif 000019
【図７Ｅ】
0006461830.tif 000020
【図７Ｆ】
0006461830.tif 000021
【図７Ｇ】
0006461830.tif 000022
【図８】
0006461830.tif 000023