(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子の計数、及び／または、選別方法であって、
ａ．ナノポアアレイを提供し、ここに、当該アレイの個別のナノポアは、隣接した検知電極により個別にアドレス指定が可能であり、
ｂ．各々ヌクレオチドを含む複数のマーカーを提供し、ここに、ヌクレオチドの少なくとも２つが核酸サンプルにハイブリダイズし、そして前記マーカーは、個々の前記ナノポアにより捕捉され、前記検出電極を使用して、識別されることが可能であり、
前記マーカーが、
ｉ）第一のプローブを核酸サンプルにハイブリダイズし、
ｉｉ）第二のプローブを、核酸サンプル上で第一のプローブがハイブリダイズした領域に隣接する領域にハイブリダイズし、
ｉｉｉ）第一のプローブを第二のプローブに連結して、組合せプローブを生成し、及び、
ｉｖ）組合せプローブをオリゴヌクレオチドに結合したビーズで捕捉し、ここに、オリゴヌクレオチドは、組合せプローブにハイブリダイズする、
ことにより生成されるものであり、
ｃ．ナノポア当たり毎秒少なくとも１マーカーの速度で、前記ナノポアアレイで前記マーカーを捕捉し、識別し、並びに、
ｄ．分子を計数、及び／または、選別する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記検知電極がファラデーモードで動作する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項３】
前記検知電極が非ファラデーモードで動作する、請求項１に記載の前記方法。
【請求項４】
前記核酸サンプルが患者に由来する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５】
前記マーカーが、ナノポア当たり毎秒少なくとも４マーカーの速度で捕捉され、識別される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６】
複数の前記マーカーが、少なくとも４個の異なるマーカーを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項７】
前記マーカーが、少なくとも４つの異なる長さの尾部を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項８】
前記マーカーが前記ナノポアを放出する電圧に基づいて、前記マーカーを識別する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項９】
前記ナノポアから前記捕捉されたマーカーを放出することを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１０】
前記複数のマーカーは、選別すべきマーカーを含み、ここに、選別すべき前記マーカーがナノポア内に捕捉され、識別され、そして維持され、及び、
選別すべき前記マーカー以外のマーカーは、捕捉され、識別され、前記ナノポアから放出される、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１１】
選別すべき前記マーカーがグループとして放出され、収集される、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１２】
検出すべき前記マーカーの数を、ナノポアにより捕捉され、識別された前記マーカーの残りの数で割った比が、閾値を超えて上昇するとき、選別すべき前記マーカーが、グループとして放出される、請求項１０に記載の前記方法。
【請求項１３】
前記マーカーの総数の０．０５％未満を含むマーカーを定量することを、更に、含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１４】
選別すべきマーカーの捕捉、及び識別が、少なくとも、時間当たり１００万マーカーを捕捉し、識別することを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１５】
前記速度が、時間当たり少なくとも１億マーカーである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１６】
前記速度が、時間当たり少なくとも１０億マーカーである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１７】
選別すべきマーカーの捕捉、及び／または、識別は、マーカーの少なくとも８個の異なるタイプを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１８】
選別すべきマーカーの捕捉、及び／または、識別は、マーカーの少なくとも３２個の異なるタイプを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項１９】
選別すべきマーカーの捕捉、及び／または、識別は、マーカーの少なくとも１００個の異なるタイプを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２０】
選別すべきマーカーの捕捉、及び／または、識別は、マーカーの少なくとも５００個の異なるタイプを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２１】
選別すべきマーカーの捕捉、及び／または、識別は、マーカーの少なくとも５００個の異なるタイプを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２２】
前記ナノポアアレイが、異なるサンプル方法を実施できる複数の領域を有するように構成されている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２３】
前記マーカーが、個々のナノポアを通して流れる電流、及び／または、前記マーカーがナノポアを放出する電圧、に基づいて識別される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２４】
前記マーカーがそれぞれ、ビーズに結合した一本鎖の核酸分子を含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２５】
更に、核酸サンプル中の核酸配列のコピー数多型を決定することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２６】
更に、０．０５％以下であるコピー数の差異を検出することを含む、請求項２５に記載の前記方法。
【請求項２７】
更に、核酸サンプル中の相対的なＲＮＡ発現レベルを定量することを含む、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２８】
更に、核酸サンプルのＥＬＩＳＡアッセイを実施することを含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項２９】
前記第一プローブが、２０〜５０の間のヌクレオチドで構成される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３０】
前記第二プローブが、２０〜５０の間のヌクレオチドで構成される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３１】
前記第一プローブがビオチンを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３２】
前記ビーズが磁性である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３３】
更に、磁場を持つ前記ナノポアレイに隣接または近接して前記マーカーを濃縮させることを含む、請求項３２に記載の前記方法。
【請求項３４】
分子の計数、及び／または、選別方法であって、
ａ．ナノポアアレイを提供し、ここに、当該アレイの個々のナノポアは、非ファラデーモードで動作する隣接した検知電極によりアドレス指定可能であり、
ｂ．個別のナノポアにより捕捉できる複数のマーカーを提供し、及び検知電極を用いて識別し、前記マーカーが、
ｉ）第一のプローブを核酸サンプルにハイブリダイズし、
ｉｉ）第二のプローブを、核酸サンプル上で第一のプローブがハイブリダイズした領域に隣接する領域にハイブリダイズし、
ｉｉｉ）第一のプローブを第二のプローブに連結して、組合せプローブを生成し、及び
ｉｖ）組合せプローブをオリゴヌクレオチドに結合したビーズで捕捉し、ここに、オリゴヌクレオチドは、組合せプローブにハイブリダイズする、
ことにより生成されるものであり、及び、
ｃ．ナノポア当たり毎秒少なくとも１マーカーの速度で、前記ナノポアアレイで前記マーカーを捕捉し、識別し、並びに、
ｄ．分子を計数、及び／または、選別する、
ことを含む、前記方法。
【請求項３５】
前記マーカーが、ナノポア当たり毎秒少なくとも４マーカーの速度で捕捉され、識別される、請求項３４に記載の前記方法。
【請求項３６】
複数の前記マーカーが、少なくとも４つの異なるマーカーを含む、請求項３４または３５に記載の前記方法。
【請求項３７】
前記マーカーが、少なくとも４つの異なる長さの尾部を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３８】
前記マーカーがナノポアを放出する電圧に基づいて識別される、請求項３４〜３７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項３９】
更に、ナノポアから捕捉したマーカーを解放することを含む、請求項３４〜３８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４０】
複数のマーカーは、選別すべきマーカーを含み、ここで、選別すべきマーカーは、ナノポア内で、捕捉し、識別し、及び保持し、
そして、選別すべきマーカー以外のマーカーは、ナノポアから捕捉し、識別し、及び解放する、
請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４１】
選別すべきマーカーはグループとして解放され、収集される、請求項４０に記載の前記方法。
【請求項４２】
選別すべきマーカーの数をナノポアにより捕捉され、識別されたマーカーの残存数で割った比率が閾値を超えるとき、選別すべきマーカーはグループとして解放される、請求項４０に記載の前記方法
【請求項４３】
更に、前記マーカー総数の０．０５％未満を含むマーカーを定量することを含む、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の前記方法
【請求項４４】
選別すべきマーカーの捕捉、及び識別が、時間当たり少なくとも１００万マーカーを捕捉し、識別することを含む、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４５】
前記速度が、時間当たり少なくとも、１億マーカーである、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４６】
前記速度が、時間当たり少なくとも、１０億マーカーである、請求項３４〜４３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４７】
選別すべきマーカーの捕捉、及び識別が、少なくとも８個の異なるタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４８】
選別すべきマーカーの捕捉し、及び識別が、少なくとも３２個の異なるタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項４９】
選別すべきマーカーの捕捉し、及び識別が、少なくとも１００個の異なるタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５０】
選別すべきマーカーの捕捉し、及び識別が、少なくとも５００個の異なるタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む、請求項３４〜４６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５１】
前記ナノポアアレイは、異なるサンプルの前記方法を実行することができる複数の領域を有するように構成されている、請求項３４〜５０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５２】
前記マーカーが、個々のナノポアを通して流れる電流、及び／または、前記マーカーがナノポアを放出する電圧に基づいて識別される、請求項３４〜５１のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５３】
前記マーカーが、それぞれ、ビーズに結合した一本鎖の核酸分子を含む、請求項３４〜５２のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５４】
更に、核酸サンプル中の核酸配列のコピー数多型を含む、請求項３４〜５３のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５５】
更に、０．０５％以下であるコピー数の差異を検出することを含む、請求項５４に記載の前記方法。
【請求項５６】
更に、核酸サンプル中の相対的なＲＮＡ発現レベルを定量することを含む、請求項３４〜５５のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５７】
更に、核酸サンプルのＥＬＩＳＡアッセイを実施することを含む、請求項３４〜５６のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５８】
前記第一プローブが、２０〜５０の間のヌクレオチドで構成される、請求項３４〜５７のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項５９】
前記第二プローブが、２０〜５０の間のヌクレオチドで構成される、請求項３４〜５８のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６０】
前記第一プローブがビオチンを含む、請求項３４〜５９のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６１】
前記ビーズが磁性である、請求項３４〜６０のいずれか１項に記載の前記方法。
【請求項６２】
更に、磁場を有する前記ナノポアアレイに隣接し、または近接して、前記マーカーを濃縮することを含む、請求項６１に記載の前記方法。
【請求項６３】
捕捉された組合せプローブが、ナノポアの近傍で磁気的に提示され、または濃縮されるものである、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願書は、２０１３年１０月２３日に出願された米国特許仮出願第６１／８９４５７７号に利益を主張し、その全体を参照することにより本明細書に導入したものとする。
【０００３】
ゲノム解析の一部の分野では、コピー数多型の検出を必要とする。例えば、染色体１３、１９、及び２１の特定部分が、胎児浮遊デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において、重複し、または削除されたどうかの出生前スクリーニングを決定することができる。これを達成する１つの方法は、選択された染色体上の特定領域のための全ゲノムサンプルを（例えば、ＰＣＲにより）富化することである。ＰＣＲは、しかし、酵素の反応速度間の不均衡、または特定サイトへのプライマーの結合親和性間の差異を含む、幾つかの異なる方法で生成物にバイアスや誤りを導入することになる。
【発明の概要】
【０００４】
ナノポアを使用して、分子の同一性を捕捉し、決定するための方法、装置及びシステムが本明細書に記載されている。分子は、ナノポアを多数使用して、並列的手法で、高速で、計数し、選別し、及び／または、ビニングすることができる（例えば、１３２，０００個のナノポアは、１時間で、１．８億の分子を読み取る）。分子のこの高速捕捉と読み取りは、プローブ分子、または、新規で、検出が困難な分子、または新規な分子の割合を表現するために生成した他の分子を捕捉するために使用できる。これは、例えば、コピー数多型など核酸（例えば、ＤＮＡ）多型の検出に使用することができる。サンプル分子、またはサンプル分子の代用物の正確な計数ができる。本明細書に記載された方法及びデバイスは、とりわけ、フローサイトメーターやその他の計数器を代替することができる（例えば、フローサイトメーターに対して、上昇した精度と処理能力を提供する）。幾つかの場合において、デバイス及び方法は、ナノポア中の特定分子または分子の代用物を捕捉し、保持し、そしてその後、それらを、フローサイトメーターと同様の機能で、捕捉物の選別、及びビニング機能を実行するために澄んだ溶液内に放出する。
【０００５】
態様において、本開示は、（ａ）ナノポアアレイを提供し、ここで、当該アレイの個々のナノポアは、個別に隣接する検知電極によりアドレス指定が可能となる；（ｂ）各々ヌクレオチドを含む複数のマーカーを提供し、ここで、ヌクレオチドの少なくとも２つが核酸サンプルとハイブリダイズし、そして、マーカーは、個々のナノポアにより、捕捉し、そして検出電極を使用して識別することが可能である；及び（ｃ）ナノポア当たり毎秒少なくとも約１マーカーの速度で、ナノポアアレイによりマーカーを捕捉し、識別する；ことを含む分子計数、及び／または、選別のための方法を提供する。
【０００６】
幾つかの実施形態では、検知電極は、ファラデーモードで動作する。
【０００７】
幾つかの実施形態では、検知電極は、非ファラデーモードで動作する。
【０００８】
幾つかの実施形態において、核酸サンプルは患者に由来する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、（ａ）ナノポアアレイを提供し、ここで、当該アレイの個々のナノポアは、個別に隣接する検知電極により、非ファラデーモードでアドレス指定が可能となり；（ｂ）個々のナノポアで捕捉可能な複数のマーカーを提供し、そして、検知電極を使用して識別し；及び（ｃ）ナノポア当たり毎秒少なくとも約１マーカーの速度で、ナノポアアレイによりマーカーを捕捉し、識別する；ことを含む分子を計数し、及び／または、選別するための方法を提供する。
【００１０】
幾つかの実施形態では、マーカーは、捕捉され、そして、毎秒ナノポア当たり、少なくとも約４マーカーの割合で識別される。
【００１１】
幾つかの実施形態では、複数のマーカーは、少なくとも４つの異なったマーカーを含む。
【００１２】
幾つかの実施形態では、マーカーは、少なくとも４つの異なる長さを有する尾部を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、マーカーは、マーカーがナノポアを放出する電圧に基づいて識別される。
【００１４】
幾つかの実施形態において、方法は、更に、ナノポアから捕捉されたマーカーを放出することを含む。
【００１５】
幾つかの実施形態では、複数のマーカーは、選別すべきマーカーを含み、ここに、選別すべきマーカーは、ナノポア内で捕捉され、識別され、保持され、選別すべきマーカー以外のマーカーは、捕捉され、識別され、ナノポアから放出される。
【００１６】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーは、グループとして放出され、収集される。
【００１７】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの数をナノポアで捕捉し、識別したマーカーの残留数で割った比率が閾値を超えて増加した場合、選別すべきマーカーは、グループとして放出される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、この方法は、更に、マーカーの総数の約０．０５％未満のマーカーを定量することを含む。
【００１９】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの捕捉、及び識別は、少なくとも、時間当たり約１００万のマーカーを捕捉し、識別することを含む。
【００２０】
幾つかの実施形態では、速度は、少なくとも時間当たり、少なくとも約１億マーカーである。
【００２１】
幾つかの実施形態では、速度は時間当たり、少なくとも約１０億マーカーである。
【００２２】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの捕捉、及び識別は、少なくとも約８個の異なったタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む。
【００２３】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの捕捉、及び識別は、少なくとも約３２個の異なったタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの捕捉、及び識別は、少なくとも約１００個の異なったタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む。
【００２５】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの捕捉、及び識別は、少なくとも約５００個の異なったタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む。
【００２６】
幾つかの実施形態では、選別すべきマーカーの捕捉、及び識別は、少なくとも約５００個の異なったタイプのマーカーを計数し、及び／または、選別することを含む。
【００２７】
幾つかの実施形態では、ナノポアアレイは、異なったサンプルの方法を実行することができる複数の領域を有するように構成されている。
【００２８】
幾つかの実施形態では、マーカーは、個々のナノポアを通して流れる電流に基づき、及び／または、マーカーがナノポアを放出する電圧に基づき識別される。
【００２９】
幾つかの実施形態では、マーカーは、それぞれ、ビーズに結合した一本鎖の核酸分子を含む。
【００３０】
幾つかの実施形態では、マーカーは、（ａ）核酸サンプルに第一のプローブをハイブリダイズし；（ｂ）第一のプローブに隣接する核酸サンプルに第二プローブをハイブリダイズし；（ｃ）第二のプローブに第一のプローブを連結して、組合せプローブを生成し；及び（ｄ）オリゴヌクレオチドに結合したビーズで組合せプローブを捕捉することにより生成され、ここに、オリゴヌクレオチドは、組合せプローブとハイブリダイズする。
【００３１】
幾つかの実施形態では、方法は、更に、核酸サンプル中の核酸配列のコピー数多型を決定することを含む。
【００３２】
幾つかの実施形態では、この方法は、更に、約０．０５％未満若しくはそれと同等であるコピー数を差異の検出することを含む。
【００３３】
幾つかの実施形態では、この方法は、更に、核酸サンプル中の相対的なＲＮＡ発現レベルを定量することを含む。
【００３４】
幾つかの実施形態では、方法は、更に、核酸サンプルのＥＬＩＳＡアッセイを実施することを含む。
【００３５】
幾つかの実施形態では、第一プローブは、約２０〜約５０の間のヌクレオチドで構成される。
【００３６】
幾つかの実施形態では、第二プローブは、約２０〜約５０の間のヌクレオチドで構成される。
【００３７】
幾つかの実施形態では、第一プローブは、ビオチンを含む。
【００３８】
幾つかの実施形態では、ビーズは磁性である。
【００３９】
幾つかの実施形態では、この方法は、更に、磁場を持つナノポアアレイに隣接し、または近接して、マーカーを濃縮させることを含む。
【００４０】
別の態様では、本開示は、（ａ）ナノポアアレイを提供し、ここで、当該アレイの個々のナノポアは、非ファラデーモード、またはファラデーモードで動作する隣接した検知電極により個別にアドレス指定が可能である；（ｂ）ナノポアアレイを用いて、配列すべき、計数すべき、及び／または、選別すべき複数の分子間で、分子に係合した磁気的に引き合う複数のビーズを提供する；
磁石付きのナノポアアレイの近傍で磁気吸引ビーズを濃縮し；及び（ｃ）ナノポアアレイで配列し、計数し、及び／または、選別する；ことを含む、分子を配列し、計数し、及び／または、選別するための方法を提供する。
【００４１】
幾つかの実施形態では、磁気吸引ビーズは、金属を含む。
【００４２】
幾つかの実施形態では、磁気吸引ビーズは、永久磁性材料を含む。
【００４３】
幾つかの実施形態では、磁気吸引ビーズを濃縮する前の磁気吸引ビーズの濃度は、最大で１００フェムトモルである。
【００４４】
幾つかの実施形態では、磁気吸引ビーズを濃縮する前の磁気吸引ビーズの濃度は、最大で１０フェムトモルである。
【００４５】
幾つかの実施形態では、ナノポアアレイ近辺での磁気吸引ビーズの濃度は、当該濃度の少なくとも、１００倍上昇する。
【００４６】
本開示の追加の態様及び利点は、以下の詳細な記述から当業者には容易に明白になるであろう。ここで、本開示の例示的な実施形態のみが示され、説明される。理解する通り、本開示は、その他の、及び異なる実施形態も可能であり、そして、その幾つかの詳細は、すべて、本開示から逸脱することなく、種々の明白な点において変更が可能である。したがって、図面及び説明は、本質的に例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
【００４７】
参考文献の導入
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願の場合と同様に、同程度の参照により本明細書に導入され、具体的に、個別に、参照により導入したことを示す。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、例示的な実施形態を示す以下の詳細な記載を参照することにより得られるであろう。ここで、本発明の原理、添付の図面（本明細書において、「図（ＦＩＧ．）」及び「図（Ｆｉｇｕｒｅ）」）が活用される：
【図１】方法の工程を模式的に示す；
【図２Ａ】ナノポア検出器の例を示し、ここに、図２Ａは、電極上に配置されたナノポアを有する；
【図２Ｂ】ナノポア検出器の例を示し、ここに、図２Ｂはウェル上の膜に挿入されたナノポアを有する；
【図２Ｃ】ナノポア検出器の例を示し、ここに、図２Ｃは、突起電極の上にナノポアを有する；
【図３】ナノポア検出器のアレイを示す；
【図４】２つのレーンに分けたナノポアのアレイを示す；
【図５】ナノポア内に通過するマーカーエンティティ（または複数のマーカー）により生成される信号の例を示す；
【図６】小型のセンサ回路の一例を示す；
【図７】マーカーエンティティを計数し、選別し、またはビニングするためにナノポアを使用する例を示す；
【図８】マーカーエンティティの例、及びマーカーエンティティの生成のための方法を示す；
【図９】一方向ゲートを有するマーカーエンティティの一例を示す；
【図１０】その降下電圧に基づき、マーカーエンティティの識別情報の一例を示す；
【図１１】印加電圧を較正するために降下電圧を用いた例を示す；
【図１２】分子エンティティを選別し、ビニングするためのデバイス、及び／または、方法の一例を示す；及び
【図１３】プログラム化された、またはそうでなければ、本開示の方法を実施するように構成されたコンピュータシステムの一例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本発明の様々な実施形態を本明細書に図示し、説明するが、そのような実施形態は例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多くの変形、変化、及び置換は、本発明から逸脱することなく当業者に想起することができる。なお、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替を用いることができることを理解すべきであろう。
【００５０】
本明細書で使用される用語「ナノポア」は、一般的に、チャネルまたは通路に形成され、さもなければ、膜に設けられたポアを指す。膜は、脂質二重層などの有機膜、またはポリマー材料から形成された合成膜などであってもよい。膜は、ポリマー材料であってもよい。ナノポアは、例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）、または電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）回路などの検知回路、または検知回路に係合した電極に隣接し、または近接して配置することができる。幾つかの例では、ナノポアは、０．１ナノメートル（ｎｍ）〜約１０００ｎｍ次元の特徴的な幅または直径を有する。幾つかのナノポアは、タンパク質であり、α溶血素は、タンパク質ナノポアの一例である。
【００５１】
本明細書で使用する用語「核酸」は、一般的に、１つ若しくはそれ以上の核酸サブユニットを含む分子を指す。核酸は、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）またはその変異体から選択される１つまたはそれ以上のサブユニットを含でもよい。ヌクレオチドは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ、若しくはその変異体を含むことができる。ヌクレオチドは、成長する核酸鎖に組み込むことができる任意のサブユニットを含むことができる。そのようなサブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵ、または、１つ若しくはそれ以上のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ若しくはＵの相補体、または、プリンの相補体（即ち、ＡまたはＧ、若しくはその変異体）、または、ピリミジンの相補体（即ち、Ｃ、ＴまたはＵ、若しくはその変異体）に対して特異的なその他いずれかのサブユニットであってもよい。サブユニットは、個々の核酸塩基、または塩基のグループ（例えば、ＡＡ、ＴＡ、ＡＴ、ＧＣ、ＣＧ、ＣＴ、ＴＣ、ＧＴ、ＴＧ、ＡＣ、ＣＡ、またはウラシルの対応部分）を分割することが可能である。幾つかの例において、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、若しくはその誘導体である。核酸は一本鎖、または二本鎖であってもよい。
【００５２】
本明細書で用いられる用語「ポリメラーゼ」は、一般的に、重合反応を触媒することができる任意の酵素を指す。ポリメラーゼの例としては、核酸ポリメラーゼまたはリガーゼが挙げられるが、それに限定されない。ポリメラーゼは、重合酵素であり得る。
方法及びデバイス
【００５３】
態様では、本開示は、分子の計数、及び／または、選別のための方法及びデバイスを提供し、ナノポアアレイを提供することを含み、ここに、各々のナノポアは個別にアドレス指定することが可能であり、そして検知電極に隣接して配置される。個別にアドレス指定が可能なナノポアは、それぞれが独自の電子信号を提供することができる（例えば、検知電極を用いて）。幾つかの場合には、それぞれ個別にアドレス指定可能なナノポアに適用した電圧を個別に制御することができる。幾つかの場合において、ナノポアはグループに分けられ、ここで、ナノポアの種々のグループは、互いに、個別にアドレス指定可能である（例えば、信号を提供し、及び／または、個別に印加する電圧を有することができる）。
【００５４】
方法は、ナノポアにより捕捉され、識別可能なマーカーエンティティ（また、本明細書中では、「マーカー」）を複数提供すること含むことができる。マーカーエンティティは、ナノポアにより捕捉され、識別可能な、任意の分子または分子複合体であり得る。本開示は、マーカーエンティティ及び分子エンティティの幾つかの例を提供する。
【００５５】
幾つかの場合では、方法はナノポアアレイによりマーカーエンティティを捕捉し、識別することを含む。検知電極は、非ファラデー（または容量性）検知モードで動作することができる（例えば、電極と電解質が、酸化還元反応を実行しない場合に）。幾つかの実施形態では、マーカーエンティティは捕捉され、高速で（例えば、毎秒ナノポア当たり、少なくとも約１マーカーエンティティの速度で）識別される。
【００５６】
図１は、本方法の工程の一例を示す図である。幾つかの場合では、マーカーは、核酸サンプルから生成される。核酸サンプルは、生物体、組織、または細胞から抽出することができる。マーカーエンティティは、本明細書に記載の方法に従って製造することができる（例えば、図８及びその対応するテキストを参照）。マーカーエンティティは、ナノポアアレイを用いて検出することができる。
【００５７】
本開示のデバイス及び方法は、幾つかの異なるマーカーエンティティを検出し、及び／または、計数することが可能である（例えば、同一ナノポアに関して、及び／または、ナノポアアレイの異なる部分と並行して）。方法は、マーカーエンティティの任意の適切な数を、計数し、及び／または、選別することが可能であり得る。幾つかの場合では、方法は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約１０、約１２、約１５、約２０、約２５、約３０、または、約５０の異なるタイプのマーカーエンティティを計数し、及び／または、選別することが可能である。幾つかの場合では、方法は、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、または、少なくとも約５０の異なるタイプのマーカーエンティティを計数し、及び／または、選別することが可能である。
ナノポアアレイ
【００５８】
ナノポアの助けを借りて、計数し、ビニングし、及び選別するためのシステム及び方法が本明細書に提供される。ナノポアは、集積回路などの検知回路として形成されるか、またはそうでなければ、検知回路の検知電極に隣接して配置された膜に埋め込まれてもよい。集積回路は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）であってもよい。幾つかの例では、集積回路は、電界効果トランジスタまたは相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）である。検知回路は、チップ内に、またはナノポアを有する他のデバイスに位置してもよく、または、オフチップ構成などのチップまたはデバイスのオフに位置してもよい。半導体は、ＩＶ族（例えば、シリコン）、及びＩＩＩ〜Ｖ族半導体（例えば、ガリウム砒素）を含む、任意の半導体であり得るが、それに限定されない。
【００５９】
幾つかの場合では、マーカーエンティティがナノポアを通して、またはナノポアに隣接して流れるとき、検知回路は、マーカーエンティティに関連する電気信号を検出する。マーカーエンティティは、より大きい分子のサブユニットであってもよい。マーカーエンティティは、ヌクレオチド組み込みイベントの副産物、またはタグ付き核酸とナノポアの間、またはナノポアに隣接した核酸由来のマーカーエンティティを切断する酵素などの種との間の、その他の相互作用の副産物であってもよい。マーカーエンティティは、核酸に結合したままであってもよい。検出信号は収集され、記憶場所に格納され、後でマーカーエンティティを計数するために使用することができる。収集された信号は、エラーなど検出されたいずれかの信号の異常性を説明するために処理してもよい。
【００６０】
図２は、米国特許出願公開第２０１１／０１９３５７０号に記載された方法に基づき生成できる、温度制御を備えたナノポア検出器（またはセンサ）の例を示し、それは、参照することにより本明細書に導入したものとする。図２Ａを参照すると、ナノポア検出器は、導電性溶液（例えば、食塩水）２０７と接触する上部電極２０１を含む。底部の導電性電極２０２は、膜２０５に挿入されたナノポア２０６に近く、隣接し、または近接している。幾つかの例では、底部の導電性電極２０２は、半導体基板２０４内の電気回路に組み込まれた半導体２０３に、はめ込まれている。半導体２０３の表面は、疎水性に処理してもよい。マーカーエンティティを有し、検出されるサンプルは、ナノポア２０６のポアを通過する。半導体チップセンサは、パッケージ２０８内に配置され、そして、次に、これは温度制御素子２０９の近傍にある。温度制御素子２０９は、熱電性の加熱、及び／または、冷却デバイス（例えば、ペルチェ素子）であってもよい。複数のナノポア検出器は、ナノポアのアレイを形成することができる。
【００６１】
図２Ｂを参照すると、同じ数字は、同じ素子を表すので、膜２０５は、ウェル２１０上に配置でき、センサ２０２はウェル表面の一部を形成する。図２Ｃは、電極２０２が処理された半導体表面２０３から突出した例を示している。
【００６２】
幾つかの例では、膜２０５は、半導体２０３上ではなく、底部導電性電極２０２上に形成する。そのような場合には、膜２０５は、底部導電性電極２０２と係合相互作用を形成し得る。しかし、幾つかの場合では、膜２０５は、底部の導電性電極２０２、及び半導体２０３上に形成する。別の方法として、膜２０５は、底部の導電性電極２０２上ではなく、半導体２０３上に形成することができるが、しかし、底部の導電性電極２０２上に伸びてもよい。
【００６３】
ナノポアは、電気的検出である場合には、マーカーエンティティを、間接的に、計数し、選別し、またはビニングするために使用してもよい。間接的な検出は、マーカーエンティティがナノポアを通過しない任意の方法であってもよい。マーカーエンティティがナノポアで検出されるような距離内にある幾つかの場合において、マーカーエンティティは、ナノポアに対して任意の適切な距離内で、及び／または、近接して通過することができる。
【００６４】
ヌクレオチド導入イベントの副産物は、ナノポアにより検出することができる。「ヌクレオチド導入イベント」は、成長しているポリヌクレオチド鎖へのヌクレオチドの導入である。副生成物は、所定のタイプのヌクレオチドの導入と相関させることができる。ヌクレオチド導入イベントは、一般的に、ＤＮＡポリメラーゼのような酵素により触媒される。そして、それぞれの位置での導入のために利用できるヌクレオチド間で選択するために、テンプレート分子との塩基対相互作用を使用する。幾つかの場合において、マーカーエンティティは、核酸分子を配列するために使用される。
【００６５】
ナノポアは、アレイを形成することができる。本開示は、マーカーエンティティを検出するためのナノポア検出器（またはセンサ）のアレイを提供する。図３を参照すると、複数のマーカーエンティティは、ナノポア検出器のアレイ上で検出することができる。ここで、各ナノポアの位置（例えば、３０１）は、ポリメラーゼ酵素、及び／または、ホスファターゼ酵素に結合した幾つかの場合では、ナノポアを含む。本明細書の他の箇所に記載される通り、各アレイ位置でのセンサは、一般的に存在する。それぞれのナノポアは、個別にアドレス指定することができてよい。
【００６６】
ナノポアのアレイは、任意の適切な数のナノポアを有してもよい。幾つかの例においては、アレイは、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約１００００、約１５０００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、約２０００００、約４０００００、約６０００００、約８０００００、約１００００００などのナノポアを含む。アレイは、少なくとも２００、少なくとも４００、少なくとも６００、少なくとも８００、少なくとも１０００、少なくとも１５００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、少なくとも１５０００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、少なくとも２０００００、少なくとも４０００００、少なくとも６０００００、少なくとも８０００００、少なくとも１００００００のナノポアを含むことができる。
【００６７】
幾つかの場合において、マーカーエンティティは、ナノポア近辺で提示され、または濃縮される（例えば、磁気的に）。ナノポアに隣接するナノポアセンサは、個々のマーカーエンティティ、または複数のマーカーエンティティを検出することができる。マーカーエンティティに関連付けられた１つ若しくはそれ以上の信号が検出され、平均化された信号を得るために処理され得る。
【００６８】
マーカーエンティティは、時間の関数としてのセンサにより検出できる。経時的に検出されたマーカーエンティティは、センサデータを記録し、及び、データから計数、選別、またはビニング機能を発生させるためにプログラム化したコンピュータシステム（例えば、図１３を参照）の助けを借りて、マーカーエンティティの同一性を決定するために使用され得る。
【００６９】
ナノポア検出器のアレイは、高密度の別個のサイトを有してもよい。例えば、単位面積当たり（即ち、密度）のサイトの比較的多くは、ポータブルで、低コストで、または他の有利な特徴を有する、より小さなデバイスの構築を可能にする。アレイ内の個々のサイトは、個別にアドレス指定可能なサイトであり得る。ナノポア及び検知回路を含む多数のサイトは、比較的多数のマーカーエンティティを一度に検出することを可能にする。そのようなシステムは、スループットを増加させ、及び／または、計数、選別、またはビニングのコストを低下させることができる。
【００７０】
マーカーエンティティは、離散サイトを含む表面を備えた基板を有する、センサ（または検出器）を用いて検出することができ、各個々のサイトは、ナノポアを有し、そして幾つかの場合では、ナノポアに結合したポリメラーゼ、及びナノポアに隣接する検知回路を有する。システムは、更に、基板と流体連通するフローセルを含み、フローセルは、基板への１つ若しくはそれ以上の試薬を送達するように適合される。
【００７１】
表面は、個別サイトの任意の適切な濃度を含む（例えば、一定時間内または所定のコストのためにマーカーエンティティを決定するのに適した濃度）。各個別のサイトに、センサを含むことができる。表面は、１ｍｍ２当たり、約５００サイトより大きく、若しくは同等の個別サイトの密度を有してもよい。幾つかの実施形態では、表面は、１ｍｍ２当たり、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、約２０００、約３０００、約４０００、約５０００、約６０００、約７０００、約８０００、約９０００、約１００００、約２００００、約４００００、約６００００、約８００００、約１０００００、または約５０００００サイトの、個別サイトの密度を有する。幾つかの例では、表面は、１ｍｍ２当たり、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも６０００、少なくとも７０００、少なくとも８０００、少なくとも９０００、少なくとも１００００、少なくとも２００００、少なくとも４００００、少なくとも６００００、少なくとも８００００、少なくとも１０００００、または少なくとも５０００００サイトの、個別サイトの密度を有する。
【００７２】
幾つかの場合において、ナノポアアレイは、異なるサンプルでの方法を実行することが可能な領域（例えば、レーン）を複数有するように構成されている。サンプルは、異なってもよく、またはサンプルは、各ボリュームに対して実行できるアッセイと異なる別のボリュームに分割することもできる。
【００７３】
幾つかの場合では、複数のウェル（全数ウェルの任意のサブセットを含む）が、共通の電解質プールを含む。各ウェルは、その上部に配置されたナノポアを有する膜、及びウェルの下部、若しくはその中に検知電極を有することができる。図４に示すように、ウェル４０１は、ウェルの列がウェルの上部の共通電解質プールを共有するように、ウェル４０２により、列方向に分離することができる。本明細書で説明する通り、バイオチップを分離することは、複数のサンプルを単一のバイオチップ上で分析することを可能し得る（例えば、チップの異なる部分に異なるサンプルを置くことにより）。
【００７４】
検知電極とその動作法
マーカーエンティティは、ナノポアを通して流れる電流、及び／または、マーカーエンティティがナノポアを放出する（またはそれから除去される）電圧（例えば、降下電圧）に基づいて識別することができる。図５は、マーカーエンティティが時間をかけて、ナノポアを流れる電流を遮断する予言プロットを示す。電流は、ナノポア中のマーカーエンティティの非存在下でのベースラインレベル５０５である。電流は、異なるタグがナノポアに位置しているとき、異なる程度まで低下することができる（例えば、５０１、５０２、５０３、５０４）。降下電圧に基づくマーカーエンティティの検出について下記に説明する。
【００７５】
電流が検知電極で検出することができる（例えば、検知回路を含み、または、それと電気的に接続することができる）。検知電極は、ファラデー、及び非ファラデー検知モードのいずれかで可能であってよい。
【００７６】
ファラデー導電モードでは、金属電極と導電性塩は反応して（例えば、酸化／還元（レドックス）反応を行って）、新しい金属種、及び、後にチップのセンサ回路により検知される電子を形成する。ファラデーモードでは、イオン流が、電子を溶液中のイオンと反応させることができる電極間に印加される電位により生成することができる。塩化銀（ＡｇＣｌ）電極の例では、印加電位下で１つの電極での過剰電子によりクロライドアニオン（Ｃｌ−）が放出され、一方、他方の電極での電子の欠乏により、存在する銀（Ａｇ）がＣｌ−と反応してＡｇＣｌを形成し得る。このシステム（例えば、還元：電子＋ＡｇＣｌ＝Ａｇ＋Ｃｌ−；酸化：Ｃｌ−＋Ａｇ＝ＡｇＣｌ＋電子）は、ファラデーモードとして説明され、そして、イオン流を生成するために、任意の金属の酸化及び還元を用いて、任意のモデルで表すことができる。システムが動作するとき、電極でのＡｇ及びＡｇＣｌのバランスを維持するために、及び二重層または膜とナノポアのいずれかの側に存在するイオンのバランスを支援するために、時々（または頻繁に）、反応を逆転させるために、電極上の電位を反転させる必要があり得る。
【００７７】
イオン流は、非ファラデー手段により生成することもできる。非ファラデーモード（また、本明細書中では、「容量性モード」及び「高速モード」と呼ばれる）において、金属電極及び塩は、一般的には、反応しない（例えば、酸化還元反応を行わない）。その結果、金属電極は、一般的に、新たな種を形成しないことになり得る。非ファラデーモードでは、塩イオン流は、電圧（または電位）降下を、金属及び塩の間、または液体との間に存在する容量性二重層を横断して適用することにより確立することができる。電位下では、二重層の静電容量は、二重層（コンデンサ）が電荷を蓄積するために、その最大能力に達するまで、二重層は電荷を伝導し保持することができるように、十分に大きくなる可能性がある。電位を除去し、ナノポアを介してコンデンサ放電を行うことで、センサ回路により検出できる塩イオン流を生成することができる。十分に速く電圧を切り替えることにより（例えば、極性と電圧の大きさを切り替えることにより）、一連の放電サイクルは、ナノポアと相互作用する分子の効果を検出し、表現するために、時間的に十分接近していることとつなぎ合わせすることができる。この技術は、非常に小さな金属、または非金属の導電性電極に、電極を分解させないで、または実験の過程にわたって変化させないで、イオン及び電流を生成させることが可能な利点を有する。
【００７８】
容量性の方法は、電極からイオン引付け、及び電極からイオンを反発させるために使用することができるが、イオンは、電極の表面で化学反応を起こさないかもしれない。電子の流れは、なお、電極に誘導することができるが、しかし、それは、電荷の影響の結果であり、物理化学反応及び電子放出または捕捉の結果ではない。電荷及び非ファラデー法におけるイオン流の動作は、例えば、ゼロまたは実質的にゼロ、または検出不可能な限界に容量値をリセットするために、電極に印加する電位を時々（あるいは頻繁に）反転させることから利益を得ることができる。
【００７９】
本開示の方法は、ファラデー金属電極ナノポアのアレイを用いて実現することができるが、しかし非ファラデー動作は、大幅に高速に計数され、かなり長い時間間隔で実行することになり得る。また、非ファラデー的なアプローチは、マーカーエンティティの非常に高速な引き合い、及び捕捉のための基礎とすることができる。また、その後、ナノポアバレルの近くで、またはその近傍でマーカーエンティティを反発させるか、及び、または、排除するために使用することができる。
【００８０】
ファラデー及び非ファラデーの両方のモードでは、電位を反転させる行為は、ナノポア中のマーカーエンティティが方向を逆転させることを引き起こす可能性がある。ナノポアシステムでは、正及び負の電流の両方向の測定値を取ることが困難であり得る。正の電流のみを読み取る場合には、すべての負の印加電位の測定値はゼロとして読み取ることができる。その結果、マーカーエンティティの位置が失われることになる。幾つかの例では、マーカーエンティティでも、ナノポアから放出することができ、そして、次の正の印加電位の間に、マーカーエンティティを再捕捉することが必要であるといえる。
【００８１】
小さな、または顕微鏡サイズの電極を用いた、マーカーエンティティのファラデーまたは非ファラデー電気的検出の使用は、マーカーエンティティが方向を逆転させることを引き起こす可能性がある（例えば、大規模並列ナノポアアレイ内の場合のように）。このようなシステムでは、保持され、ナノポアを通して通過する分子を超えるイオン流を測定することにより、分子は検出するこることができ、ポリマーは配列することができる（マーカーエンティティはポリマーを含むことができる）。多数のポアを作成し、多くの類似な、または異なる分子の並列読み取りを行うために、多数の電極とそれに関連するナノポアを使用することができる。小領域内の多数の電極／ナノポアを作成するために、電極は、小さくてもよい。小さな電極、及び／または、電極の側面に膜または二層の材料でシールした少量の試薬は、イオンの流れを電流に変換するときに、電子にその有効性を失わせる可能性がある。
【００８２】
図６は、小型の検知回路の一例を示している。印加電圧Ｖａは、ＭＯＳＦＥＴ電流伝達ゲート６０１の先のオペアンプ６００にも適用することができる。また、電極６０２とデバイス６０３により検出されたマーカーエンティティの抵抗がここに示されている。
【００８３】
印加電圧Ｖａは、電流コンベアゲート６０１を駆動することができる。電極上に生じた電圧は、ＶｔがＭＯＳＦＥＴの閾値電圧であるＶａ−Ｖｔである。幾つかの例では、これは、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧として電極に印加される実際の電圧の制限された制御をもたらし、プロセス、電圧、温度をかなり変化させ、更にはチップ内のデバイス間でも変化させる。閾値以下の漏えいの影響が、活動を始めるＶｔの変動を低電流レベルで大きくすることができる。したがって、印加電圧のより良好な制御を提供するために、オペアンプは、電流コンベアデバイスと従動フィードバック構成で使用することができる。これは、電極に印加される電圧が、ＭＯＳＦＥＴの閾値電圧の変動とは無関係であるＶａであることを確実にする。幾つかの場合には、電極に印加される電圧は、以下に記載される通り、降下電圧を使用して較正される。
【００８４】
本明細書に記載されるセンサ、及び／または、方法は、非ファラデーモードまたはファラデーモードで動作させることができる。幾つかの例では、単数若しくは複数の溶液中にトレハロースを含めることは、ファラデーモード電極を約１時間動作することを可能にし、それは、本明細書に記載する通り、分子の計数、及び／または、選別を実行するのに十分長くなり得る。幾つかの場合では、ファラデー読み取りは、非ファラデー動作よりも優れた分解能を与えることができる。
【００８５】
マーカーエンティティ及びその決定：
本開示の方法は、ナノポアアレイを有するマーカーエンティティを捕捉し、識別することを含むことができる。マーカーエンティティは、任意の分子または分子複合体であってもよいが、幾つかの場合では、それらは、ビーズに結合したポリマー（例えば、核酸またはペプチド）である。図７は、ビーズ７１５に結合した異なるポリマー（この場合、２つの異なるマーカー７０５及び７１０である）を有するマーカーエンティティの一例を示す。マーカーエンティティのポリマー部分は、ナノポア内に引き込むことができ、それらはナノポアを通って流れる電流を遮断する。各々異なるタイプのマーカーエンティティは、固有の電子署名を提供することができ、ここで、マーカーエンティティ７２０を含まないナノポアが、第一のマーカーエンティティ７２５を含むナノポアから区別され、それはマーカーエンティティ７３０を有する第二のナノポアからを区別される。
【００８６】
複数のマーカーエンティティは、任意の数の異なったマーカーエンティティを含むことができ、及び／または、本明細書に記載された方法及びデバイスは、任意の数の異なるマーカーエンティティを区別することが可能である。幾つかの場合では、マーカーエンティティは、ビーズ（例えば、７０５対７１０）に結合された異なるポリマーを含む。異なるポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、異なる配列を有する核酸、または異なる配列を有するペプチドが挙げられる。幾つかの場合において、マーカーエンティティは、ビーズに結合した同一のポリマー（例えば、両方のＰＥＧ）を有するが、ポリマーの長さが変化する（例えば、７０５対７３５）。幾つかの場合において、ポリマーのタイプは、電流のレベルに基づいて識別することができ（例えば、図５）、そして、ポリマーの長さは、その降下電圧に基づいて識別することができる（例えば、図１０）。
【００８７】
サンプルは、任意の数の異なるマーカーエンティティを有することができる。幾つかの場合において、サンプルは、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約１０、約１２、約１５、約２０、約２５、約３０、または約５０の異なるタイプのマーカーエンティティを有する。幾つかの場合において、サンプルは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約１０、少なくとも約１２、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、または少なくとも約５０の異なるタイプのマーカーエンティティを有する。
【００８８】
複数のマーカーエンティティは、任意の数の異なる長さを有する（ポリマー）尾部を含むことができる。幾つかの場合において、分子エンティティは、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０の異なる長さを有する尾部を含む。幾つかの場合において、分子エンティティは、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、または少なくとも約１０の異なる長さを有する尾部を含む。
【００８９】
幾つかの場合において、マーカーエンティティは、ビーズに結合した一本鎖の核酸分子を含む。マーカーエンティティは、任意の適切な方法で生成することができる。
【００９０】
図８を参照して、幾つかの場合では、マーカーエンティティは、ゲノムＤＮＡサンプル８１０に第一のプローブ８０５をハイブリダイズすることにより、第一のプローブに隣接するゲノムＤＮＡサンプルに第二のプローブ８１５をハイブリダイズすることにより、そして、組合せプローブを生成するために第二のプローブに第一のプローブを連結すること（８２０）により生成する。幾つかの場合において、第一のプローブは結合したビオチン分子８２５を有している。第二のプローブは、所定のマーカーのためのナノポア中に独自の電流レベルを提供する塩基８３０（例えば、２塩基）の配列を有することができる。幾つかの場合において、第二のプローブは、第一のプローブの長さを変化させることにより、電流レベルを決定することができる。マーカーエンティティの尾部の長さは、マーカーエンティティの同一性を決定する第二の手段を提供するために変えることができる（例えば、降下電圧を介した電流レベルと尾部の長さ）。第二のプローブは、ビーズ８４０に結合されたオリゴヌクレオチド８３５にハイブリダイズすることができる（例えば、組合せプローブの捕捉及び分離のため）。方法は、オリゴヌクレオチドに結合したビーズと組合せたプローブを捕捉することを含むことができ、ここで、オリゴヌクレオチドは、組合せプローブとハイブリダイズする。
【００９１】
マーカーエンティティ、第一プローブ、第二プローブ、及び／または、組合せプローブは、任意の適切な長さを有することができる。幾つかの場合において、マーカーエンティティ、第一プローブ、第二プローブ、及び／または、組合せプローブは、ヌクレオチドを含む。幾つかの例において、第一プローブは、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約８０、または、約１００のヌクレオチドを含む。幾つかの例において、第一プローブは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、または、少なくとも約１００のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、第一プローブは、高々約１０、高々約１５、高々約２０、高々約２５、高々約３０、高々約３５、高々約４０、高々約４５、高々約５０、高々約６０、高々約８０、または、高々約１００のヌクレオチドを含む。幾つかの場合において、第一プローブは、約２０と約５０の間のヌクレオチドを含む。
【００９２】
幾つかの例では、第二のプローブは、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約８０、または１００のヌクレオチドを含む。幾つかの例では、第二のプローブは、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、または、少なくとも１００のヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態において、第二のプローブは、高々約１０、高々約１５、高々約２０、高々約２５、高々約３０、高々約３５、高々約４０、高々約４５、高々約５０、高々約６０、高々約８０、または、高々１００のヌクレオチドを含む。幾つかの場合において、第二プローブは、約２０と約５０の間のヌクレオチドを含む。
【００９３】
第一及び第二のプローブは、サンプルＤＮＡ上の特定サイトで互いに隣にハイブリダイズするので、マーカーエンティティは、サンプルＤＮＡに由来する情報を送達する。わずかな温度上昇は、サンプルからの組合せプローブを分離することができる。幾つかの場合では、ＤＮＡサンプルの関心領域が複数の組合せのプローブを有するまで、このサイクルは繰り返される（例えば、サンプルは、複数のマーカーエンティティを生成し、及び／または、マーカーエンティティは、２つより多くのプローブから生成することができる）。
【００９４】
ナノポア内の直線配列のため、または検出のための、これらの個々の組合せプローブは、長く読み込んだ鎖への組合せプローブのそれぞれの分離及びその後の結合を可能とする選択分子を導入することができる（例えば、２から、１０，０００までの組合せプローブを含む）。これらの読み取り鎖におけるこれらの組合せプローブは、繰り返す同一の組合せプローブの読み取り鎖をもたらす、１つのサンプルからの１つの特定配列からであり得る。幾つかの場合において、これらの読み取り鎖は、１つのサンプルからの複数の特異的配列領域からであり得るが、それは、異なった組合せプローブ（２から１，０００若しくはそれ以上）の混合物を含む読み出し鎖を生じる。これらの組合せプローブを結合するための１つの方法は、一方の５’末端及び他方の３’の末端に標識化することである。標識は、Ｆ４Ｂ及びＨｉＮｙｃ（即ち、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）、ストレプトアビジン及びビオチン、または、アルキン及びアジドの任意の組合せであり得る（即ち、クリックケミストリー）。
【００９５】
幾つかの場合において、鎖媒介の連結は、ナノポアベースシステムにおいて、個々のハイブリダイズし連結したプローブを単一負荷及び配列のため単一長鎖に一緒に連結するために使用することができる。そのようなシステムは、望ましい連結プローブから、未連結プローブとサンプルＤＮＡの連結及び分離を含むことができる。
【００９６】
また、これらの読み取り鎖は、サンプル識別子、またはサンプルバーコードが組み込まれた各々のプローブと組合せた異なるプローブ（２〜１，０００、若しくはそれ以上）の混合物を含む、読取り鎖が発生する多数の異なるサンプルからの複数の特定の配列領域からであり得る。
【００９７】
各々組合せたプローブは、濃縮するために選択された特定サイトで互いに隣接して結合するプローブ分子の新規なハイブリダイゼーション部分；全長プローブのサンプル数を識別する非連結部分；ビオチン、または未連結プローブから望ましい連結プローブの分離を可能にする、単数若しくは複数の他の結合分子；などの任意の組合せ、または多くの特徴を有することができる。
【００９８】
方法の幾つかの実施形態では、ポリマーの修飾は、分子がナノポアを縫うことを可能にし、未だ、ナノポアを介して方向を逆にすることができない。このプローブ法は、単方向のゲート部の導入を使用することができる（例えば、超並列電気的検出でこの反応の生成物の非酵素的鎖配列を可能にするための、ナノポアベースのシステム）。
【００９９】
幾つかの場合において、マーカーエンティティは、一方向にナノポアを通過させることができるだけである（例えば、方向を変えることなく）。ゲートが一方向に、別の方向ではなく、マーカーエンティティの尾部に位置合わせするとき、マーカーエンティティは、ナノポアを通過するのに十分薄いマーカーエンティティに結合するヒンジゲートを持つことができる。図９を参照すると、本開示は、第一のセグメント９１０及び第二のセグメント９１５を含む、第一のポリマー鎖９０５を含む、マーカーエンティティ分子を提供し、ここで、第二セグメントは、第一のセグメントよりも狭い。第二セグメントは、ナノポアの最も狭い開口部よりも小さい幅を有することができる。マーカーエンティティ分子は、２つの端部を含む第二のポリマー鎖９２０を含むことができ、ここで、第一の端部は、第二のセグメントに隣接する第一のポリマー鎖に固定され、第二の端部は、第一のポリマー鎖に固定されていない。マーカーエンティティ分子は、第一の方向にナノポアを通すことが可能であり、ここで、第二のポリマー鎖は、第二のセグメント９２５に隣接して整列する。幾つかの場合において、マーカーエンティティ分子は、第二の方向にナノポアを通すことを可能にし、ここで、第二のポリマー鎖は、第二のセグメント９３０に隣接して整列しない。第二の方向は、第一の方向と反対方向にできる。
【０１００】
第一、及び／または、第二のポリマー鎖はヌクレオチドを含むことができる。幾つかの場合において、第二のポリマー鎖は、第二のセグメントに隣接して整列しないとき、第一のポリマー鎖と対をなす。幾つかの例では、第一のポリマー鎖は、ビーズ９３５に固定される。
【０１０１】
第二セグメントは、ゲート（第二ポリマー）に整列したときに、ナノポアを通過するのに十分に薄い任意のポリマー、または他の分子を含むことができる。例えば、第二のセグメントは、脱塩基ヌクレオチド（即ち、核酸塩基を含まない核酸鎖）、または、炭素鎖を含むことができる。
【０１０２】
ゲートの作成は、多くの方法で行うことができる。分子は、直接合成してもよいか、または分子は、付加し、または共に連結することができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、ゲートが接続される場所であればどこにでも組み込まれたアルキン標識化ヌクレオチドを使用して作成することができる。第二のアジド末端標識化ヌクレオチドは、（例えば、それは、ヌクレオチド取付け面積に対してアンチセンスであってもよい）クリックケミストリーを使用して取り付けることができる。他の結合化学及び技術は、商業的な方法（例えば、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）またはアミン−ＣＯＯＨの組合せなどを利用することができる。
降下電圧
【０１０３】
マーカーエンティティがナノポアから除去され、または離れる（または、取り除くとき）ときの電圧に基づいて、マーカーエンティティは、識別することができる（降下電圧）。非ファラデーモードでは、様々な長さの尾部（例えば、ポリマー）を有するマーカーエンティティは、電圧が減少するとき異なる電圧でナノポアから降下し得る。図１０は、時間に対するナノポア（実線）を流れる電流及び印加電圧（破線）のプロットを示す。分子は、ナノポア１００５に捕獲されたとき、電流が減少し得る。印加電圧が時間１０１０にわたって減少するとき、分子がナノポアの外に降下するまで電流が減少し、このとき、電流は印加電圧の期待レベルに増加する。ここに、分子が低下する印加電圧は、分子の長さに依存し得る。例えば、３０塩基尾部を持つマーカーエンティティは、４０ミリボルト（ｍＶ）（１０１５）近辺に降下するが、一方、５０塩基の尾部を持つマーカーエンティティは、１０ｍＶ（１０２０）近辺に降下し得る。この例に示すように、３０塩基より短い尾部を有するマーカーエンティティは、４０ｍＶ（１０２５）よりも高い印加電圧でナノポアから降下することができた。
【０１０４】
様々な電流レベル及び降下電圧は、マーカーエンティティを識別するために使用することができる。例えば、４つの異なる電流レベル及び２つの異なる降下電圧を検出する能力は、８つの異なるマーカーエンティティの使用を可能にすることができる。
【０１０５】
幾つかの場合では、印加電圧は、降下電圧を用いて較正または再較正することができる。較正は、マーカーエンティティの識別を可能にすることができる。幾つかの例では、較正は、識別可能な信号を有する既知のマーカーエンティティを備えたバイオチップ（またはナノポアセンサ装置）の、またはそれと関連する、コンピュータプロセッサをプログラムすること、及び、その後の測定のためのバイオチップの、またはそれと関連する、記憶場所に信号を記憶することを含む。
【０１０６】
図１１を参照して、平均降下電圧１１０５を有する所定のマーカーエンティティについて、時間をかけて異なったナノポアのため、または同じナノポア上の異なる測定のための降下電圧の変化１１１０が存在し得る。期待値に対するこの降下電圧を調整することにより、データをより簡単に、及び／または、より正確に解釈することができる。
【０１０７】
単一分子ナノポアのセンサデバイスからの分子固有の出力信号は、電解液に囲まれたイオン不透過性の膜を横切る電気化学的電位差の存在に由来し得る。この膜貫通電位差は、電極表面で発生する、犠牲的（即ち、ファラデー的）と非犠牲的（即ち、非ファラデー的）反応のいずれかを介してデバイス内の電子デバイスにより、検出することができるナノポア固有の電気化学的電流強度を決定することができる。
【０１０８】
ナノポアの任意の既定状態（即ち、開放チャネル、捕捉状態など）のために、時間依存性の膜貫通電位は、ナノポア錯体を通して流れる結果として得られる電流を時間の関数として決定できる入力信号として作用し得る。このナノポア電流は、ナノポアセンサデバイスにより出力される特定分子の信号を提供することができる。開放チャネルのナノポア電流は、ナノポアとチャネルを通して流れるイオン流を部分的に遮断する捕捉分子の間の相互作用により様々な程度に調節できる。
【０１０９】
これらの変調は、幾つかの分子をそのナノポアの電流変調から直接識別することを可能にする捕捉された分子の種類に対する特異性を示すことができる。所定分子の種類やデバイス条件の固定された設定に対しては、このタイプの捕捉された分子による開放チャネルのナノポア電流の変調度は、塗布膜貫通電位に依存して、特定の電流対電圧（Ｉ−Ｖ）曲線を各タイプの分子にマッピングして変更できる。
【０１１０】
印加電圧の設定と膜貫通電位との間の体系的な可変オフセットは、横方向の電圧軸に沿ってこのＩ−Ｖ曲線の横方向のシフトを導入でき、それは、出力信号としてナノポアセンサデバイスにより報告された測定された電流信号に基づき分子の識別精度を潜在的に低下させる。したがって、印加された膜貫通電位間の未制御のオフセットは、確実に同一条件下で同一分子の測定値を比較するためには問題となり得る。
【０１１１】
外部から印加される電位と実際の膜貫通電位との間のこのいわゆる「オフセット電位」は、実験内、及び実験間の両方で変動し得る。オフセット電位の変動が、初期条件における両変動により、及び、ナノポアセンサデバイス内の電気化学的条件の時間的変動（ドリフト）により、引き起こされる可能性がある。
【０１１２】
本明細書で説明するように、これらの測定誤差を除去することが、各実験のための印加電圧と膜貫通電位との間で時間依存性のオフセットを較正することにより実施できる。物理的に、ナノポア捕捉分子の逸脱イベントを観察する確率は、印加された膜貫通電位に依存し得る。そして、この確率分布は、同一条件下での分子の同一サンプルについて同じであり得る（例えば、割合がサンプル間で変化しない条件下では、サンプルは分子の異なるタイプの混合物であってもよい）。幾つかの場合では、逸脱イベントが固定サンプルタイプで発生する電圧の分布は、印加電位と膜貫通電位間のオフセット尺度を提供する。この情報は、ナノポアを横断して印加される電圧を較正するために、使用することができ、実験内及び実験間のオフセット電位に起因する誤差の系統的な原因を排除し、そして、分子識別及び他の測定値の精度を向上させることができる。
【０１１３】
同じ分子サンプル及び試薬を用いて動作する所定のナノポアセンサ装置に対して、逸脱電圧分布の期待値は、単一分子の逸脱イベントの統計的サンプルから推定することができる（個々のイベントはランダムな変動に対して確率過程の対象になり得るが）。この推定値は、実験内のオフセット電位の時間変動の評価にすることができる。これは、Ｉ−Ｖ空間にプロットした場合、効果的に「ラインアップ」したすべての横方向のポアの測定において、印加電圧の設定と実際電圧との間の変動可能な差異を較正することができる。
【０１１４】
幾つかの場合では、オフセット電位（即ち、電圧）の較正は、電流利得、及びオフセット電流の変動を考慮しない。それは、また、改善された精度及びナノポア電流測定値の再現性のために較正することができる。しかし、オフセット電位の較正は、一般的に、電流利得とオフセット電流の変動を推測する際にエラーが発生することを防止するために、電流利得とオフセット較正の前に実施する。何故ならば、これらは、順番に、電流対電圧（Ｉ−Ｖ）の近似曲線を含むからであり、そして、これらの近似結果は、オフセット電圧の変動に影響を受ける（即ち、Ｉ−Ｖスペースにおいて、左から右（水平方向）へのデータシフトでは、電流利得とオフセット電流の較正において、エラーを導入することになる）。
【０１１５】
幾つかの場合には、印加電圧が較正される。較正は、検出電極の予想された逸脱電圧分布対時間の推定を含むことができる。較正は、次に、予想された逸脱電圧分布と基準点との間の差異を計算することができる（例えば、ゼロなどの任意の基準点）。較正が計算値の差異により印加電圧をシフトさせることができる。幾つかの場合には、印加電圧は、経時的に減少する。
【０１１６】
幾つかの場合では、時間に対する予想される逸脱電圧の分布を推定する。幾つかの例では、基準点はゼロボルトである。方法は、予想される逸脱電圧分布の変化において、検出された変動を除去できる。幾つかの場合では、方法は、検出電極に隣接する独立してアドレス指定可能な複数のナノポア上で実施される。
【０１１７】
幾つかの実施形態では、ナノポア中のマーカーエンティティの存在は、印加電圧において検出電極で測定された電流を低減する。
【０１１８】
幾つかの例では、較正無しで方法を実施するために比較した場合、較正はこの方法の正確さを上昇させる。幾つかの場合では、較正は、経時的な、電気化学的条件の変化を補正する。幾つかの例では、較正は、複数のナノポアを有するデバイスにおいて、異なる電気化学条件を有する異なるナノポアを補正する。幾つかの実施形態では、較正は、この方法の各々の実績のために異なる電気化学的条件を補正する。幾つかの場合において、方法は、更に、オフセット電流の電流利得、及び／または、変動のばらつきの較正することを含む。
【０１１９】
高速で、正確で、及び精密な計数：
ナノポアを使用したマーカーエンティティを識別し、及び／または、計数するための方法及びデバイスが本明細書に提供される。幾つかの場合において、識別、及び／または、計数は、高速で、正確、及び／または、精密である。
【０１２０】
マーカーエンティティは、識別され、及び／または、任意の適切な速度で計数することができる。幾つかの場合において、ナノポア当たり、毎秒の割合で、約０．２、約０．５、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、または約３０のマーカーエンティティを識別し、及び／または、計数する。幾つかの場合において、ナノポア当たり、毎秒の割合で、少なくとも約０．２、少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、または少なくとも約３０のマーカーエンティティを識別し、及び／または、計数する。
【０１２１】
幾つかの例において、方法、及び／または、ナノポアアレイは、時間当たり、約５０万、約１００万、約５００万、約１０００万、約５０００万、約１億、約５億、または約１０億のマーカーエンティティを識別することができる。幾つかの例において、方法、及び／または、ナノポアアレイは、時間当たり、少なくとも約５０万、少なくとも約１００万、少なくとも約５００万、少なくとも約１０００万、少なくとも約５０００万、少なくとも約１億、少なくとも約５億、または少なくとも約１０億のマーカーエンティティを識別することができる。
【０１２２】
本明細書に記載の方法及びデバイスは、コピー数多型または相対ＲＮＡ発現レベルを決定するために用いることができる。幾つかの場合では、方法は非常に正確である（例えば、コピー数多型、または相対ＲＮＡ発現レベルにおいて非常に小さな差異を検出することができる）。幾つかの例において、本方法は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、または約５％のコピー数の差異を検出することができる。幾つかの例において、本方法は、約０．０１％未満、約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、または約５％未満のコピー数の差異を検出することができる。
【０１２３】
本明細書に記載の方法及びデバイスは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の代替を実施するために使用することができる（例えば、希薄な、または、まれなエンティティを定量化する）。幾つかの場合では、デバイスまたは方法は、マーカーエンティティの合計数の、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％、約２％、約３％、または約５％を含むマーカーエンティティを定量化することが可能である。幾つかの例では、デバイスまたは方法は、マーカーエンティティの合計数の、約０．０１％未満、約０．０５％未満、約０．１％未満、約０．５％未満、約１％未満、約２％未満、約３％未満、または約５％未満を含むマーカーエンティティを定量化することが可能である。
【０１２４】
選別及びビニング：
本開示は、マーカーエンティティを選別するために使用することができるデバイス及び方法を提供する。幾つかの場合では、選別されたマーカーエンティティが収集される。マーカーエンティティは、それらの同一性に応じて別々のリザーバ内に収集することができる（例えば、ビニングする）。
【０１２５】
図１２は、分子エンティティを選別し、及びビニングするためのデバイス、及び／または、方法の例を示す。ナノポアの分子エンティティを持たないことは、白丸として図示されている。選別し、ビニングする分子エンティティを持つナノポアは、黒丸として図示されている。選別し、ビニングすべきもの以外の分子エンティティを有するナノポアは、灰色丸で図示される。ナノポアアレイのナノポアは、選別すべきもの１２０５及び選別すべきもの１２１０以外のものを含むマーカーエンティティを捕捉し、識別することができる。幾つかの場合において、選別すべき分子エンティティは、ナノポア中に保持され（例えば、適度に高い印加電圧を維持することにより）。選別すべきもの以外の分子エンティティは、ナノポアから放出されるが（例えば、印加電圧の極性をスイッチオフ、または逆転させることにより）、幾つかの場合では、未だ選別される分子エンティティを保持することができる（例えば、ナノポアは、個別にアドレス指定が可能であるからである）。選別すべきマーカーエンティティを有しないナノポアは、継続して捕捉され、識別され、そしてその同一性を元にマーカーエンティティを保持するか、または放出するかのいずれかを行う。この継続的なプロセスの間に、選別すべき、更なるマーカーエンティティを捕捉することができる（１２２０）。任意の適切な時間、及び／または、選別すべき任意の適切な数のマーカーエンティティが捕捉され、識別された後に、選別すべきもの以外の大部分または全部のマーカーエンティティを放出し（１２２５）、すべて（または、ほとんどすべて）の選別すべきマーカーエンティティを有するナノポアアレイをもたらすことができる。この時点で、選別すべきマーカーエンティティのほとんど、またはすべてが、ナノポア配列から（例えば、グループとして）放出できる。幾つかの場合では、選別する放出されたマーカーエンティティは、ビニング（例えば、グループとして）することができる。幾つかの場合では、方法は、選別される具体的なマーカーエンティティの第二グループを捕捉することを繰り返すことができる（例えば、選別すべきマーカーエンティティの第一のグループ以外）。幾つかの場合において、ナノポアアレイのナノポアの第一のグループは、選別すべきマーカーエンティティの第一のグループを捕捉し、保持し、そして、ナノポアアレイのナノポアの第二のグループは、選別すべきマーカーエンティティの第二のグループを捕捉し、保持する。
【０１２６】
幾つかの場合において、選別すべきマーカーエンティティは、捕捉された選別すべきマーカーエンティティの割合が適度に高いとき、グループとして放出される。幾つかの例において、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９９％、約９９．５％、または約９９．９％の選別すべきマーカーエンティティが捕捉されるとき、選別すべきマーカーエンティティが解放される。幾つかの例において、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または少なくとも約９９．９％の選別すべきマーカーエンティティが捕捉されるとき、選別すべきマーカーエンティティが解放される。
【０１２７】
幾つかの場合において、ナノポアにより捕捉され、識別され、選別すべきマーカーエンティティ以外のマーカーエンティティで割られる選別すべきマーカーエンティティの割合が、閾値以下に低下するとき、選別すべきマーカーエンティティは、グループとして放出される。幾つかの場合において、閾値は、約１０％、約５％、約３％、約１％、約０．５％、約０．１％、約０．０５％、または約０．０１％である。幾つかの場合において、閾値は、約１０％未満、約５％未満、約３％未満、約１％未満、約０．５％未満、約０．１％未満、約０．０５％未満、または約０．０１％未満である。
【０１２８】
磁気濃度：
幾つかの場合において、マーカーエンティティは、ナノポアアレイと接触してバルク溶液中で低濃度となるが（例えば、ナノポアによる捕捉率が適度に高いされる濃度以下）、磁気を使用して、ナノポアの近くに濃縮する（例えば、マーカーエンティティの捕捉及び識別の速度が適度に高くなるように）。幾つかの場合では、マーカーエンティティのビード部分（例えば、図９の９３５）は、磁性または常磁性である。幾つかの場合では、この方法は、磁石により提供することができる磁場を有するナノポアアレイ近傍のマーカーエンティティを濃縮することを含む（例えば、永久磁石または電磁石で）。
【０１２９】
態様では、分子を配列し、計数し、及び／または、選別するための方法は、各ナノポアが個別にアドレスを指定可能で、検知電極に隣接して配置されたナノポアアレイを提供することを含む。この方法はまた、配列すべき、計数すべき、及び／または、ナノポアのアレイを使用して選別すべき分子に係合された磁気的に引き合う（または、活性な）複数のビーズを提供すること、及び磁石付きナノポアアレイの近傍に磁気吸引ビーズを濃縮することを含むことができる。この方法は、更に、ナノポアアレイを有する分子を配列し、計数し、及び／または、選別することを含むことができる。
【０１３０】
幾つかの場合では、磁気的に吸引するビーズは金属を含む。幾つかの例では、磁気的に吸引するビーズは、永久磁性材料を含む。
【０１３１】
マーカーエンティティ、及び／または、磁気吸引ビーズは、マーカーエンティティ、及び／または、磁気吸引ビーズを濃縮する前に（例えば、ナノポア配列と接触しているバルク溶液中で）、任意の適度に低い初期濃度であってもよい。幾つかの場合では、初期濃度は、約１フェムトモル（ｆＭ）、約５ｆＭ、約１０ｆＭ、約５０ｆＭ、約１００ｆＭ、約５００ｆＭ、または約１マイクロモル濃度（μＭ）である。幾つかの場合では、初期濃度は、高々約１フェムトモル（ｆＭ）、高々約５ｆＭ、高々約１０ｆＭ、高々約５０ｆＭ、高々約１００ｆＭ、高々約５００ｆＭ、または高々約１マイクロモル濃度（μＭ）である。
【０１３２】
マーカーエンティティ、及び／または、磁気的に吸引するビーズは、任意の適切な程度まで、ナノポアの近辺に濃縮することができる（例えば、バルク溶液中の初期濃度に濃縮した後のナノポア近辺の濃度の適切に高い比率）。幾つかの場合では、ナノポアアレイ近辺における磁気吸引ビーズの濃度は、約５倍、約１０倍、約５０倍、約１００倍、約５００倍、約１０００倍、約５０００倍、または約１００００倍増加する。幾つかの実施形態では、ナノポアアレイ近辺における磁気吸引ビーズの濃度は、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約５０００倍、または少なくとも約１００００倍増加する。
コンピュータシステム：
【０１３３】
本明細書に記載するデバイスは、コンピュータシステム（例えば、データを収集し、及び／または、個々にアドレス指定可能なナノポアを各々制御する）に係合することができる。幾つかの場合において、本明細書に記載される方法は、コンピュータシステムの助けを借りて実施される。コンピュータシステムは、１つ若しくはそれ以上のコンピュータプロセッサ、及びコンピュータプロセッサに係合された記憶場所を含むことができる。記憶場所は、コンピュータプロセッサによる実行時に、本明細書に記載する方法のいずれかを実装するマシン実行可能なコードを含む。
【０１３４】
図１３は、プログラム化された、または、さもなくば、本開示のシステムの１つ若しくはそれ以上のプロセスパラメータを制御する、または、調節するために構成されたシステム１３００を示す。システム１３００は、本明細書に開示される方法を実施するようにプログラム化されたコンピュータサーバ（「サーバ」）１３０１を含む。サーバ１３０１は、中央処理装置（本明細書では、ＣＰＵ、また、「プロセッサ」及び「コンピュータプロセッサ」と参照する）１３０５含み、それは、シングルコア若しくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のために複数のプロセッサとすることができる。サーバ１３０１は、また、メモリ１３１０（例えば、ランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子記憶装置１３１５（例えば、ハードディスク）、１つ若しくはそれ以上のシステムとの通信のため通信インターフェース１３２０（例えば、ネットワークアダプタ）、及び、キャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置、及び／または、電子ディスプレイアダプタなどの周辺デバイス１３２５を含む。メモリ１３１０、記憶ユニット１３１５、インターフェース１３２０、及び周辺デバイス１３２５は、通信バスを介してＣＰＵ１３０５、マザーボード等（実線）と通信する。記憶装置１３１５は、データを記憶するデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）とすることができる。サーバ１３０１は、通信インターフェース１３２０の助けを借りてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３３０に動作可能に係合することができる。ネットワーク１３３０は、インターネット、インターネット及び／またはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネット及び／またはエクストラネットであり得る。幾つかの場合におけるネットワーク１３３０は、通信、及び／または、データネットワークである。ネットワーク１３３０は、クラウド型コンピュータシステムとしての分散型コンピュータシステムを有効にすることができる、１つ若しくはそれ以上のコンピュータサーバを含むことができる。サーバ１３０１の助けを借りた幾つかの場合におけるネットワーク１３３０は、クライアントまたはサーバとして動作するように、サーバ１３０１に係合されたデバイスを可能にする、ピア・ツー・ピアネットワークを実装することができる。サーバ１３０１は、システム１３３５を、直接に、またはネットワーク１３３０を介して係合することができる。システム１３３５は、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、またはポリマー（例えば、タンパク質）の配列、または分子の計数を実行するように構成することができる。
【０１３５】
記憶装置１３１５は、システム１３３５のプロセスパラメータ（例えば、較正パラメータ）を記憶することができる。プロセスパラメータは、充放電パラメータを含むことができる。幾つかの場合では、サーバ１３０１は、サーバ１３０１の外部にある、イントラネットまたはインターネットを介してサーバ１３０１と通信するリモートサーバ上に位置する、１つ若しくはそれ以上の追加のデータ記憶ユニットを含むことができる。
【０１３６】
サーバ１３０１は、ネットワーク１３３０を介して１つ若しくはそれ以上のリモートコンピュータシステムと通信することができる。図示の例では、サーバ１３０１は、リモートコンピュータシステム１３４０と通信する。リモートコンピュータシステム１３４０は、例えば、パーソナルコンピュータ（例えば、ポータブルＰＣ）、スレート型、または、タブレット型ＰＣ（例えば、アップル（登録商標）社のｉＰａｄ（登録商標）、サムスン（登録商標）社のギャラクシータブ）、電話、スマートフォン（例えば、アップル（登録商標）社のｉＰｈｏｎｅ（登録商標）、アンドロイド起動のデバイス、ブラックベリー（登録商標））、またはパーソナルデジタル支援機器であり得る。
【０１３７】
幾つかの状況では、システム１３００は、単一のサーバ１３０１を含む。他の状況では、システム１３００は、イントラネット、及び／または、インターネットを介して互いに通信する複数のサーバを含む。
【０１３８】
本明細書に記載の方法は、マシン（またはコンピュータプロセッサ）、例えば、メモリ１３１０または電子記憶装置１３１５などの、サーバ１３０１の電子的記憶場所に格納された実行可能なコード（またはソフトウェア）により実行することができる。使用時に、コードは、プロセッサ１３０５により実行することができる。幾つかの場合では、コードは、記憶装置１３１５から取得することができ、プロセッサ１３０５による素早いアクセスのためにメモリ１３１０に格納されている。幾つかの状況では、電子記憶ユニット１３１５は、排除することができ、マシン実行可能命令は、メモリ１３１０に格納されている。代替的に、コードは、第２のコンピュータシステム１３４０上で実行することができる。
【０１３９】
コードは、プレコンパイルされ、そして、コードを実行するように適合されたプロセッサを有するマシンと一緒に使用するように構成することができる。または、ランタイム中にコンパイルできる。コードはプレコンパイルされ、またはコンパイル方式で実行するコードを可能にするように選択することができるプログラミング言語で供給できる。
【０１４０】
サーバ１３０１などの本明細書で提供されるシステム及び方法の態様は、プログラムで具現化できる。技術の様々な態様は、一般的には、マシン読取り可能媒体のタイプで実施し、または具現化されるマシン（あるいはプロセッサ）で実行可能なコード、及び／または、関連するデータの形態である「製品」または「製造品」と想定してもよい。マシン実行可能なコードは、メモリ（例えば、読み出し専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）またはハードディスクなどの電子記憶ユニットに記憶することができる。「記憶」タイプのメディアは、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリ、または様々な半導体メモリ、磁気テープドライブ、ディスクドライブなどの関連するモジュールのいずれかまたはすべてを含むことができる。これは、ソフトウェアプログラムのための任意の時点で非一時的記憶装置を提供することができる。ソフトウェアの全部または一部は、何時でもインターネットまたは他の様々な通信ネットワークを介して通信することができる。そのような通信は、例えば、１つのコンピュータまたはプロセッサから、別のコンピュータに、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームにソフトウェアの負荷を可能にできる。このように、ソフトウェアエレメントを有してもよい別のタイプのメディアは、有線及び光固定電話網を介して、及び様々なエアリンクを介して、ローカルデバイス間の物理インターフェース間で使用されるような、光学波、電波、及び電磁波を含む。有線または無線リンク、光リンクなどのウエーブを運ぶ物理的要素は、また、ソフトウェアを担持媒体と見なすことができる。本明細書で使用する通り、非一時的有形「記憶」メディアに限定されない限りは、コンピュータまたはマシンでの「読取可能媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
【０１４１】
したがって、このようなコンピュータ実行可能コードなどのマシン読取り可能メディアは、有形の記憶メディア、搬送波メディアまたは物理的な伝送メディアを含む、多くの形体を取ってもよいが、それに限定されない。不揮発性記憶メディアとしては、例えば、図示する通り、データベースを実行するために使用できる、光ディスクまたは磁気ディスクなどの任意の単数若しくは複数のコンピュータでのいずれかの記憶デバイスを含む。揮発性記憶メディアには、コンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形の伝送媒体は、同軸ケーブル；銅線、コンピュータシステム内のバスを有するワイヤを含む光ファイバ含む。搬送波伝送メディアは、電気若しくは電磁気信号、または無線周波数（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信中に生成される音波または光波の形態を取ることができる。コンピュータで読取り可能な媒体の一般的な形態は、従って、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤまたはＤＶＤ−ＲＯＭ、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する他の物理記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＰＲＯＭ、及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、任意の他のメモリチップ、またはカートリッジ、搬送波輸送データまたは命令、このような搬送波または他の任意の媒体、コンピュータがプログラミングコード、及び／または、データを読み取ることができる搬送ケーブルまたはリンクが挙げられる。コンピュータ読み取り可能メディアの多くのこれらの形態は、実行のためにプロセッサに１つ若しくはそれ以上の命令の１つ若しくはそれ以上のシーケンスを運ぶことに関与し得る。
【０１４２】
本明細書に記載のシステムの種々のパラメータは、ユーザの電子デバイスのユーザインターフェース（ＵＩ）上でユーザに提示することができる。ＵＩの例としては、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）、ウェブベースのユーザインターフェースが挙げられるが、それに限定されない。ＵＩ（例えば、ＧＵＩ）は、ユーザやサーバ１３０１の電子デバイスのディスプレイ上に提供できる。ディスプレイは、容量性または抵抗膜式タッチディスプレイであってもよい。このようなディスプレイは、他のシステム、及び本開示の方法で使用することができる。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明を例示するが、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１４４】
【実施例１】
【０１４５】
非ファラデーアレイの作成とマーカー検出の実証：
ナノポアセンサチップは、非ファラデーの高速モード（例えば、非ファラデーモード）動作用に最適化された電極金属で作成した。加工電極は、２０フェムトファラド（ｆＦ）〜６０ｆＦの容量を有する個別の電極をもたらした。非ファラデー導電性塩溶液を、試験し、再現可能で適切な開放チャネル電流レベルを提供するように選択した。塩溶液は、容易に自由浮動マーカーエンティティを捕捉するのに十分な電圧を可能にした。ナノポアセンサチップのハードウェア及びソフトウェアは、高速モード動作のために修正された。ナノポアセンサチップの連続運転は、３０分間、最小値５活性ポアで実証された。ポアは、少なくとも、毎秒２個の速度でマーカー（例えば、ＤＮＡ）を捕捉した。マーカーが試験され、４つの異なるマーカーが１,８００のマーカー捕捉を超える９５％、若しくはそれ以上の精度で４つの異なる電流レベルを与えるように選択された。試験は５回繰り返された。
【実施例２】
【０１４６】
チップの最適化と特徴化：
高速モードで動作することを可能にするナノポアの動作を作り出した。最少４０ポアは、１０回の連続試行から５回の試行で作成された。ポアは高速モードで動作可能であり、そして３０分以上継続して最少２０ポアを有する。チップは、高速モードで動作し、マーカーエンティティの計数を実証した。２つの異なるマーカーを含む溶液は、少なくとも２０ポアの動作を高速モードで動作して読み出された。マーカーは，合計７２,０００の読み取りに対して、３０分間、２０ポアを毎秒２マーカーの速度で読み取った。予想される読み取り速度を期待比でチェックした。４つの異なるマーカーの降下電圧は、マーカーの長さがマーカーの電位プールを上昇させるために使用することができるかどうかを決定するために特徴付けられた。
【実施例３】
【０１４７】
高速分子検知：
２６４個の個別にアドレス指定可能なナノポアを有するナノポアアレイが提供された。約７５個のナノポアは、配列目的のために動作した。４個の異なるマーカーエンティティの混合物が提供された。ナノポアの動作は、毎秒約４マーカーエンティティの割合で、マーカーエンティティを識別した。ナノポアアレイは、毎秒チップ当たり約３００マーカーエンティティ、毎分チップ当たり約１８,０００マーカーエンティティ、または毎時間チップ当たり約１,０８０,０００マーカーエンティティを読み込んだ。２時間では、ナノポアアレイは、チップ当たり約２,１６０,０００マーカーエンティティを読み込んだ。
【実施例４】
【０１４８】
高速分子検知：
２６４個の個別にアドレス指定可能なナノポアを有するナノポアアレイが提供された。約７５のナノポアが動作した。８個の異なったマーカーエンティティの混合物は、異なる尾部長さを有する幾つかのマーカーを備えていた。ナノポアアレイは、動作ナノポア当たり毎秒約１個の測度でマーカーエンティティを捕捉し、識別した。ナノポアアレイは、毎秒チップ当たり約７５マーカーエンティティを読み込んだ。ナノポアアレイは、毎分チップ当たり、約４,５００マーカーエンティティ、毎時間チップ当たり、約２７０,０００マーカーエンティティ、または２時間で、チップ当たり、約５４０,０００マーカーエンティティを読み込んだ。
【実施例５】
【０１４９】
高速分子検知：
１３２,０００個の個別にアドレス指定可能なナノポアを有するナノポアアレイが提供された。約５０,０００のナノポアが動作した。４つの異なるマーカーエンティティの混合物が提供された。ナノポアは、動作ナノポア当たり毎秒約４個の速度でマーカーエンティティを捕捉し、識別した。ナノポアアレイは、毎秒チップ当たり、約２００,０００マーカーエンティティ、毎分チップ当たり、約１２,０００,０００マーカーエンティティ、または１時間でチップ当たり、約７２０,０００,０００マーカーエンティティを読み込んだ。
【実施例６】
【０１５０】
高速分子検知：
１３２,０００個の個別にアドレス指定可能なナノポアを有するナノポアアレイが提供された。約５０,０００のナノポアが動作した。８個の異なるマーカーエンティティの混合物は、幾つかの異なる尾部長さを有するマーカーを備えていた。ナノポアは、動作ナノポア当たり毎秒約１個の速度でマーカーエンティティを捕捉し、識別した。ナノポアアレイは、毎秒チップ当たり、約５０,０００マーカーエンティティ、毎分チップ当たり、約３,０００,０００マーカーエンティティ、または１時間で、チップ当たり、約１８０,０００,０００マーカーエンティティを読み込んだ。
【実施例７】
【０１５１】
高速分子検知：
１３２,０００個の個別にアドレス指定可能なナノポアを有するナノポアアレイが提供された。アレイは、各々が約２０,０００ナノポアを有する４つのレーンに分割された。各レーンは、約７,５００個の動作するナノポアを有し、異なるアッセイを実施することができた。３２個の異なるマーカーエンティティの混合物が提供された。混合物を４つのレーン間で分割した。ナノポアは、動作ナノポア当たり、毎秒約４個の速度でマーカーエンティティを捕捉し、識別した。ナノポアアレイは、毎秒レーン当たり、約３０,０００マーカーエンティティ、毎分レーン当たり、約１８,０００,０００マーカーエンティティ、または、１時間で、レーン当たり、約１０８,０００,０００マーカーエンティティを読み込んだ。
【実施例８】
【０１５２】
高速分子検知：
９６個のウェルプレートは、各ウェルが１つのマーカーを捕捉するビーズを有するようにビーズを移入した。１個のサンプルから作成されたマーカーは、それらが特定のビーズに結合することを可能にする特別な結合サイトを有していた。各ビーズのために、８個の異なるマーカーが結合することができるように、マーカーの組合せを構成することができた。残りのマーカーは、他のビーズのための結合サイトを有していた。わずか８マーカーがそれぞれ異なるビーズのために許可されるように、マーカーエンティティのミックスが作成された。この例では、各ビードに対して８マーカー、及びウェル当たり８個のグループに分けられた７６８個の固有のマーカーに対して、９６個のビーズが存在した。
【０１５３】
サンプル溶液は、順次、各ウェル毎曝露し、それぞれ曝露した後、ウェルの底に磁気ビーズを引き込み、曝露のため次のウェルにサンプル液を移動した。マーカーの収集は、本明細書で説明するナノポア検出法を用いた検出用に分離することができる。分離収集マーカーを可能にする、空間的にビーズを分離する他の方法が実施できた（例えば、ナノポアアレイチップ上の既知の位置に空間的に位置するマーカーまたはビーズを含む、１つの溶液に連続曝露したビーズ）。
【０１５４】
９６個のウェルプレートの各ウェル中のマーカー収集が、ビーズを溶融させ、または、ビーズ上に残留させ、そしてナノポア検出器チップ上のチャネルを通って流動させた。マーカーは、フローセル内での検出後、フローセルから洗い流し、そして異なったビーズに結合したマーカーの次の異なる収集が行われ、検出し、または計数することができた。ビーズ及びマーカーの完全な洗い出しは、ビーズの磁気特性により支援することができる。磁気吸引力だけでなく、液体洗浄力を適用すると、フローセルからのほぼすべてのマーカーの完全なすすぎを確実に実施できた。
【０１５５】
本発明の好適な実施形態を、本明細書に図示し説明したが、そのような実施形態は、例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。多くの変更、変化、及び代替は、本発明から逸脱することなく、当業者には思い当たるであろう。なお、本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明を実施する際に使用してもよいことを理解すべきであろう。これは、次の特許請求範囲が、本発明の範囲を定義することを意図し、これらの特許請求範囲、及びそれらの等価物の範囲内の方法及び構造が、それによりカバーされることを意図する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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