(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経の損傷の治療又は予防のための医薬組成物であって、長さ１２〜３２アミノ酸残基のポリアルギニンポリペプチドである単離ペプチドを有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項２】
前記単離ペプチドは１２〜２２個のアルギニン残基を含むポリアルギニンポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記単離ペプチドは１５〜１８個のアルギニン残基を含むポリアルギニンペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記単離ペプチドは、配列番号９、１０、１１、１２、１３からなる群から選択されるペプチドのうちのいずれか１つ以上を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記単離ペプチドは、神経細胞の生存を促進するか；神経細胞死を阻害するか；細胞のエンドサイトーシスのプロセスを促進するか；細胞表面の受容体と相互作用して細胞内カルシウム流入の低減をもたらすか；ミトコンドリア外膜との相互作用及びミトコンドリア外膜の安定化のうち少なくともいずれか一方を行ってミトコンドリアの機能を維持するか；又は、カルシウム依存性プロタンパク質転換酵素を阻害する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記単離ペプチドは合成ペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記単離ペプチドはＤ−アルギニン残基で構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記単離ペプチドはＬ−アルギニン残基で構成されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記単離ペプチドはＤ−アルギニン残基及びＬ−アルギニン残基を混合状態で含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記単離ペプチドは１０μＭ未満のＩＣ５０レベルの神経保護活性を示す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
請求項８に記載のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む、神経の損傷の治療又は予防のための医薬組成物であって、前記単離ポリヌクレオチドの配列に相補的な配列、前記単離ポリヌクレオチドの配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、及び前記単離ポリヌクレオチドの配列との少なくとも６０％の相同性を有する配列を含み、前記単離ポリヌクレオチドは、請求項８に記載のペプチドをコードする単離核酸を含む、天然に存在しないポリヌクレオチド、人造の人工構築物、ｃＤＮＡ、又はベクターである、医薬組成物。
【請求項１２】
神経の損傷の治療又は予防のための医薬組成物の製造における、長さ１２〜３２アミノ酸残基のポリアルギニンポリペプチドである単離ペプチドの使用。
【請求項１３】
配列番号９、１０、１１、１２、１３、及び１６のうちのいずれか１つ以上を含む単離ペプチドの、神経の損傷を治療又は予防するための医薬組成物の製造における使用。
【請求項１４】
神経の損傷が、虚血、周産期の低酸素性虚血、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、脊髄損傷、てんかん、緑内障、及び神経障害性の疼痛のうちの１つ以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
神経の損傷が、虚血、周産期の低酸素性虚血、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、末梢神経障害、脊髄損傷、てんかん、緑内障、及び神経障害性の疼痛のうちの１つ以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
神経の損傷が、虚血、周産期の低酸素性虚血、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、脊髄損傷、てんかん、緑内障、及び神経障害性の疼痛のうちの１つ以上である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
神経の損傷の治療のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、神経の損傷が、虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、脊髄損傷、及びてんかんのうちの１つ以上である、医薬組成物。
【請求項１８】
神経の損傷が、脳卒中、脊髄損傷、脳又は脊髄への虚血性又は外傷性の損傷のうちの１つ以上であり、一般に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞へのダメージであり、前記医薬組成物は、神経損傷後１時間以内（まで）（０〜１時間）、２時間まで、３〜５時間まで、又は２４時間若しくはそれ以上までに投与されるものである、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
脳血管又は心血管の外科的処置に関連する脳虚血又は脳卒中における神経の損傷の予防のための請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、前記医薬組成物は、外科的処置の０．２５時間〜４時間前、又は０．５〜３時間前、又は１〜２時間前に投与されるものである、医薬組成物。
【請求項２０】
薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクルを含む、請求項１〜１１及び１４〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
１つ以上の容器に入った請求項１〜１１及び１４〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物と、該医薬組成物の適用に関わる指示及び情報のうち少なくともいずれか一方に関する取扱説明書又は情報小冊子とを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経保護活性を有するペプチドであって、卒中及びその他の神経の損傷又は障害を治療するのに有用なペプチドに関する。本発明はさらに、本発明のペプチドを使用して神経の損傷又は障害を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞透過性ペプチド（cell penetrating peptide、ＣＰＰ）は、他のペプチド、タンパク質、核酸又は薬物のような通常は非透過性の積荷物の細胞内への送達を容易にするために使用される、小さなペプチドである。
【０００３】
治療薬送達の促進剤としての、ペプチド細胞内導入ドメイン（peptide transduction domain 、ＰＴＤ）とも呼ばれる細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）の開発は、一般にＴＡＴと呼ばれるヒト免疫不全ウイルスタイプ１のトランス活性化能を有する転写活性化因子（trans-activating transcriptional activator）の内部におけるＰＴＤの最初の発見以来、著しく進歩してきた（Frankel and Pabo, 1988; Green and Loewenstein, 1988）。その時以来、この配列の活性輸送部分が単離され（ＴＡＴ４８〜５８：ＴＡＴペプチドと呼ばれる）、同様に１００以上の新規なＣＰＰの発見及び合成もなされてきた（Milletti, 2012）。
【０００４】
ＣＰＰに融合せしめられた潜在的治療薬は、神経細胞培養系において、並びに脳虚血、てんかん、パーキンソン病及びアルツハイマー病を含む様々な障害における神経損傷のメカニズムを模倣する動物モデルにおいて、評価されてきた（Lai et al. 2005; Liu et al. 2006; Arthur et al. 2007; Colombo et al. 2007; Nagel et al. 2008; Meade et al. 2009）。神経障害のためのＣＰＰの使用は、ＣＰＰが血液脳関門を横切って積荷物を輸送し、次いで脳実質内の神経細胞の中に入る能力により、特に魅力的である（Aarts et al. 2002; Zhang et al. 2013）。臨床試験に入ったＣＰＰ融合型の神経保護ペプチドの２つの実例は、ＪＮＫ阻害ペプチド（ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ又はＸＧ‐１０２；ARAMIS, 2012）及びＮＭＤＡ受容体／シナプス後肥厚（postsynaptic density）‐９５阻害ペプチド（ＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃ又はＮＡ‐１；Dolgin, 2012）である。いずれのペプチドもＴＡＴに融合されている。
【０００５】
あらゆるＣＰＰの重要な特徴は、臨床的に意義のある用量において毒性が限定的であることであり、毒性が限定的なＣＰＰの必要性は大きい。同様に、神経の損傷を治療する場合には神経保護性のペプチドの必要性は大きい。ＣＰＰの構造及びアミノ酸含量は極めて多様であり、神経を保護する実験で使用される最も広く用いられているＣＰＰであるＴＡＴペプチドが、内因性の神経保護特性をも有するようであることが、最近示されてきている。最近の研究（Xu et al. 2008; Vaslin et al. 2009; Meade et al. 2010a,b; Craig et al. 2011）から、ＴＡＴペプチドは、興奮毒性及び酸素グルコース欠乏の後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、また脳室内注射後にＰ１２ラットにおける脳虚血の後にｉｎ  ｖｉｖｏで、神経保護作用を示すことが報告されている。ＴＡＴの神経保護作用の正確なメカニズムは完全には理解されていない一方、ＴＡＴがＮＭＤＡ受容体の活性化を妨げるという推論はあるが（Xu et al. 2008; Vaslin et al. 2009）、ある研究では結合相互作用を検出できなかった（Li et al. 2008）。加えて、構築物を送達するためにＣＰＰを使用するＲＮＡｉ研究では、ＴＡＴペプチド及びペネトラチンペプチドはいずれも単独で気管内投与後に肺のＭＡＰキナーゼｍＲＮＡをダウンレギュレートすることが示された（Moschos et al. 2007）。
【０００６】
神経細胞又は神経の損傷又は障害、例えば偏頭痛、卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、てんかん並びに神経変性障害、例えばハンチントン舞踏病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）などは、長期的な脳又は脊髄の損傷から生じる病的状態及び能力障害の主な原因である。脳損傷は一般に、アポトーシス、自食作用、ネクロプトーシス及びネクローシスを含む一連の細胞死プロセスを伴い、神経細胞である星状細胞、オリゴデントロサイト、ミクログリア及び血管内皮細胞（まとめて神経血管単位；ＮＶＵと呼ばれる）に影響を及ぼす。神経の損傷に関与する有害な誘因は、グルタミン酸興奮毒性のカルシウム過負荷、酸化ストレス、タンパク質分解酵素及びミトコンドリアの異常を伴う種々の経路に関わっている。
【０００７】
本明細書中で使用されるように、用語「卒中」には、脳又は脊髄に影響する任意の虚血性障害、例えば脳又は脊髄の動脈における血栓塞栓性の閉塞、重症の低血圧、周産期の低酸素虚血、心筋梗塞、低酸素、脳内出血、血管痙攣、末梢血管障害、静脈血栓症、肺塞栓、一過性脳虚血発作、肺虚血、不安定狭心症、可逆性虚血性神経症候、補助的な血栓溶解活性（adjunct thrombolytic activity）、過度の凝血状態、大脳の再潅流障害、鎌状赤血球貧血、卒中障害によるか若しくは医原的に誘発された虚血期間、例えば血管形成術、又は脳虚血、が含まれる。
【０００８】
神経伝達物質であるグルタミン酸の細胞外レベルの増加は、興奮毒性によって引き起こされる急性及び遅発性の有害なプロセスを介した神経細胞死の原因となる可能性がある。細胞外のグルタミン酸の蓄積は、ＮＭＤＡ受容体及びＡＭＰＡ受容体を過剰刺激する結果として細胞外のカルシウムイオン及びナトリウムイオンの流入並びに細胞内貯蔵部位からの結合カルシウムの放出をもたらす。ＮＭＤＡ受容体の過剰活性化はさらに、有害な分子（例えば、一酸化窒素、ＣＬＣＡ１；カルシウム活性化塩素チャネル調節因子１、カルパイン、ＳＲＥＢＰ１：ステロール調節エレメント結合タンパク質‐１）の産生及びシグナル伝達経路（例えばＤＡＰＫ；細胞死関連タンパク質キナーゼ、ＣａｍＫＩＩ：カルシウム‐カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）を誘発する可能性もある。加えて、グルタミン酸誘導性の神経細胞の脱分極及び興奮毒性は、電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ、例えばＣａＶ２．２、ＣａＶ３．３）、ナトリウム・カルシウム交換輸送体（ＮＣＸ）、酸感受性イオンチャネル（ＡＳＩＣ）、一過性受容器電位カチオンチャネル２及び７（ＴＲＰＭ２／７）並びに代謝型グルタミン酸受容体（ｍＧｌｕＲ）を介したさらなる細胞内カルシウム流入を引き起こす可能性がある。
【０００９】
細胞内カルシウムの増加は、ホスホリパーゼ、タンパク質分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ及び一酸化窒素合成酵素を伴う一連の細胞に有害な事象、並びに細胞死（すなわちアポトーシス、自食作用、ネクロプトーシス及びネクローシス）を誘発する経路の活性化を引き起こす。
【００１０】
脳虚血の神経変性性の影響を治療するために使用される化合物の実例には、電位依存性カルシウムチャネルに結合して該チャネルをブロックするω‐コノトキシンペプチド及び関連ペプチドを使用して虚血関連の神経細胞のダメージを治療する方法について述べている特許文献１、並びに、ある種のオピオイドペプチドを使用する治療について述べている特許文献２が挙げられる。さらなる実例には、ＮＭＤＡ受容体とＮＭＤＡＲ相互作用タンパク質との相互作用を阻害することにより哺乳動物細胞に対する損傷という有害な影響を低減するための、他のペプチドに連結された融合ペプチドの使用について開示する特許文献３が挙げられる。同様に、特許文献４は、神経を保護する機能性を提供するための、連結された標的指向性ペプチド及び他のペプチドの使用について開示している。特許文献５は、化学式１：
【００１１】
【化１】
0006495270.tif 000002
【００１２】
の化合物と結合した短いアルギニンに富んだオリゴペプチドから選択される、興奮毒性による神経細胞のダメージからの保護を提供する化合物を開示している。
数多くの潜在的な神経保護作用薬は低〜中程度の用量では毒性も示す。多くのＣＰＰも、低〜中程度の用量で毒性を示す。よって、低用量で有効であり、低い細胞毒性を示し、かつ２種類以上の神経損傷からの保護を提供する、神経保護ペプチドが必要とされている。
【００１３】
背景技術についてのこの議論は、単に本発明についての理解を促進するように意図されている。言及された材料のうちのいずれも、本願の優先日における共通の一般的知識の一部である、又は一部であった、と認識又は承認することは意図されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第５，５５９，０９５号明細書
【特許文献２】米国特許第４，６８４，６２４号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０２８１０３６号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／００２７７８１号明細書
【特許文献５】米国特許第６，２５１，８５４号明細書
【発明の概要】
【００１５】
本発明の１つの態様によれば、塩基性（すなわちカチオン性）アミノ酸に富んだ単離ペプチドの神経保護作用薬としての使用が提供される。単離ペプチドはＣＰＰであってよい。
【００１６】
そのため、本発明は、神経保護活性を有するカチオン性アミノ酸に富んだ単離ペプチドにも及ぶ。本発明は、神経保護活性を示すペプチドの機能性フラグメントにも及ぶ。
ペプチドは、ｐＨ７で８以上、好ましくはｐＨ７で１０以上、最も好ましくはｐＨ７で１１以上の正味電荷を有しうる。
【００１７】
ペプチドは天然に存在しないペプチドであってもよい。そのため、本発明のペプチドは人造ペプチドであってもよい。
ペプチドのカチオン性（すなわち塩基性）アミノ酸残基形成部はアルギニン又はリジンであってよい。よって、ペプチドはアルギニンに富んでいてよい。別例として、又は追加として、ペプチドはリジンに富むか、トリプトファンに富むかのうち少なくともいずれかであってもよい。
【００１８】
ペプチドは１０アミノ酸〜１００アミノ酸の長さ、好ましくは１０アミノ酸〜３２アミノ酸であってよい。
ペプチドは、配列：
Ｘ（Ｋ）‐Ｚ（Ｎ）‐Ｘ（Ｋ）‐Ｚ（Ｎ）‐Ｘ（Ｋ）
であって、
上記配列中、Ｘは、カチオン性（すなわち塩基性）のアミノ酸残基を含む、任意の天然型又は合成のアミノ酸であってよく；
Ｋは１〜５の整数であり；
Ｚは塩基性（すなわちカチオン性）のアミノ酸残基であり；
かつＮは１〜３０の整数である、配列を有することができる。
【００１９】
「Ｘ」の位置における、神経保護ペプチドの神経保護効果を減少させないアミノ酸を用いた置換が好ましい。１つの実施形態では、Ｚはアルギニンであってよい。別の実施形態では、Ｚはリジンであってよい。ペプチドは、連続したアルギニンに富む少なくとも１個のセグメントを含みうる。他の実施形態では、ペプチドは非連続的なアルギニンに富むセグメントを含みうる。
【００２０】
塩基性（すなわちカチオン性）のアミノ酸残基は、該ペプチド又はセグメントの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、場合によっては該ペプチド又はセグメントの１００％もの比率で含まれうる。ペプチドは、該ペプチドのアミノ酸含量の２０％を超える、好ましくは３０％を超える、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える  ８０％を超える、９０を超える、９５％を超える、９９％を超える、又は最も好ましくは１００％の、アルギニン含量を有しうる。本発明のある実施形態では、ペプチドは、４０％を超える、５０％を超える、６０％を超える、７０％を超える  ８０％を超える、９０を超える、９５％を超える、９９％を超える、又は最も好ましくは１００％の、アルギニン及びリジン合計含量を有しうる。
【００２１】
ペプチドは、複数の単一のカチオン性アミノ酸残基（アルギニン残基など）を備えてその間に他のアミノ酸残基が点在していてもよく、特に、該ペプチドにはリジン、及びトリプトファンのうち少なくともいずれかのような塩基性（すなわちカチオン性）のアミノ酸残基が点在しうる。ペプチドは、ＲＲ、又はＲＲＲ、又はＲＲＲＲ、又はより高次の繰り返しのような、隣接して配置されたアルギニン残基の繰り返しを含んでもよく、かつ他のアミノ酸の間に、又はアミノ酸の連続部の間に点在せしめられてもよい。
【００２２】
そのため、ペプチドは完全にカチオン性アミノ酸からなっていてもよい。１つの実施形態では、ペプチドは完全にアルギニン残基からなる。
本発明の態様によれば、神経損傷の治療のための長さ１０〜３２アミノ酸残基の単離ペプチドであって、少なくとも１０〜２２個の残基を含む単離ペプチドの使用が提供される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、ペプチドは、神経損傷の治療のための長さ１０〜３２アミノ酸残基の単離ペプチドであって、少なくとも１０〜２２個のアルギニン残基を含む単離ペプチドであってよい。
【００２４】
単離ペプチドは、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％のアルギニン残基含量を有しうる。
【００２５】
単離ペプチドは１０〜１８個のアルギニン残基を含むポリアルギニンペプチドであってよい。好ましい実施形態では、単離ペプチドはＲ１２、Ｒ１５、又はＲ１８であり、最も好ましくはＲ１５である。
【００２６】
具体的には、単離ペプチドは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、並びに神経保護活性を有するこれらの機能性フラグメント及びアナログからなる群から選択されたペプチドのうちのいずれか１つ以上を含むことができる。
【００２７】
単離ペプチドは、少なくとも４個の連続したアルギニン残基を含む少なくとも１個のポリアルギニンセグメント、好ましくは少なくとも２個のポリアルギニンセグメント、より好ましくは３個のポリアルギニンセグメントを含みうる。
【００２８】
単離ペプチドはペネトラチン（配列番号２２）であってもよい。
単離ペプチドは、プロタミン誘導体の混合物を含むことができる。プロタミン誘導体の混合物は硫酸プロタミンを含むことができる。
【００２９】
単離ペプチドは、細胞のエンドサイトーシスのプロセスに影響する場合があり；細胞表面受容体の機能に影響して細胞のカルシウム流入の低減をもたらす場合もあり；ミトコンドリア外膜との相互作用及びミトコンドリア外膜の安定化のうち少なくともいずれか一方を為してミトコンドリアの機能を維持する場合もあり；又は、カルシウム依存性プロタンパク質転換酵素フューリンを阻害するか、ダウンレギュレートするか、若しくは影響を及ぼす場合もある。
【００３０】
単離ペプチドは合成ペプチドであっても人造ペプチドであってもよい。単離ペプチドは、他のポリペプチド内に含まれてもよいし、他のポリペプチドに融合していてもよい。単離ペプチドどうしが、少なくとも１つのリンカー配列で互いに融合していてもよい。
【００３１】
単離ペプチドは、５０μＭ未満、好ましくは２０μＭ未満、最も好ましくは１０μＭ未満のＩＣ５０レベルで神経保護活性を示しうる。
本発明は、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、及び神経保護活性を有するこれらの機能性フラグメント又はアナログのうちのいずれか１つ以上を含む単離ペプチドの、神経の損傷を治療又は予防するための医薬組成物又は薬剤の製造における使用にも及ぶ。
【００３２】
本発明の単離ペプチド又は本発明のポリヌクレオチド配列を含んでいる医薬組成物又は薬剤は、神経の損傷の治療又は予防のために使用可能である。
医薬組成物又は薬剤は、虚血、周産期の低酸素性虚血、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、脊髄損傷、又はてんかんの治療又は予防において使用されうる。
【００３３】
医薬組成物又は薬剤は、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクルを含むことができる。
本発明の別の態様によれば、神経の損傷を治療するか又は神経細胞の生存を促進する方法であって、投与を必要とする患者に、薬学的に許容可能な及び／又は薬学的に有効な量の、本発明のペプチド又は本発明の医薬組成物若しくは薬剤を、投与するステップを含む方法が提供される。
【００３４】
本発明のさらに別の態様によれば、対象者における神経細胞死を阻害する方法であって、そのような治療を必要とする対象者に、薬学的に許容可能な及び／又は薬学的に有効な量の、本発明のペプチド又は本発明の医薬組成物若しくは薬剤を、投与することを含む方法が提供される。
【００３５】
投与は０．００１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇであってよい。
本発明は、１つ以上の容器に入った本発明の医薬組成物又は薬剤と、医薬組成物の適用に関わる指示及び情報のうち少なくともいずれかに関する取扱説明書又は情報小冊子とを含むキットにも及ぶ。
【００３６】
より具体的には、ペプチドは、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７として示された配列を有するペプチドのうちのいずれか１つ以上であってもよいし、前記ペプチドに対する、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９９％、又はそれより高い配列同一性を有する配列を含んでもよく、そのようなペプチドは神経保護活性を有する。
【００３７】
ペプチドは、Ｒ８〜Ｒ２２の任意の長さのポリアルギニンペプチド、又はその繰り返しを含むことができる。１つの実施形態では、ペプチドは、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、及びＲ１８を含む群から選択される。１つの好ましい実施形態では、ペプチドはＲ１０である。別の好ましい実施形態では、ペプチドはＲ１２である。さらに別の好ましい実施形態では、ペプチドはＲ１５である。別の好ましい実施形態では、ペプチドはＲ１８である。
【００３８】
ペプチドの使用は、本発明のペプチド、特に配列番号３２〜３６のうちの任意の２つ以上の混合剤の、神経の損傷の治療又は予防における使用を含みうる。
別の実施形態では、使用には、配列番号３７のペプチドを神経の損傷の治療若しくは予防において使用すること、又は配列番号３７を配列番号３２〜３６のペプチドのうちのいずれかとともに使用することが含まれうる。
【００３９】
本発明の別の態様では、配列番号３２〜３７の単離ペプチドが、前記ペプチドに対する少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、実に９９％又はそれより高い配列同一性を有する配列を含めて提供され、そのようなペプチドは神経保護活性を有する。
【００４０】
ペプチドは、サケ精子から単離された市販のプロタミンペプチド混合剤であってもよい。
そのため、ペプチドは、２０１２年１１月１５日に公表された、欧州医薬品庁（European Medicines Agency ）「プロタミン含有医薬製造品に関する評価報告（Assessment Report for Protamine containing medicinal products ）」、手続き番号ＥＭＥＡ／Ｈ／Ａ−５（３）／１３４１に記載されているように、硫酸プロタミンを含む混合剤の形態であってもよく、前記文献の内容は単に参照することにより本願に組み込まれる。
【００４１】
表１は、様々な形態のサケ精子プロタミンの概要を示す。該プロタミンペプチド配列（サケ）は、臨床用途の硫酸プロタミン中に存在するものであるか、又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース由来のものである。本明細書中で使用されるように、用語「プロタミン」は、配列番号３２〜３５のペプチドの混合剤を含む市販の注射可能な形態又は硫酸プロタミンを指す。
【００４２】
ペプチドはペプチドの混合剤中において次の比率（％）で存在しうる：
【００４３】
【表１】
0006495270.tif 000003
【００４４】
好ましい実施形態では、ペプチドはペプチドの混合剤中において次の比率（％）で存在する：
【００４５】
【表２】
0006495270.tif 000004
【００４６】
最も好ましい実施形態では、ペプチドはペプチドの混合剤中において次の比率（％）で存在する：
【００４７】
【表３】
0006495270.tif 000005
【００４８】
より詳しくは、ペプチドの混合剤は、例えばサノフィ・アベンティス（Sanofi Aventis）製の硫酸プロタミン（サケ）として市販されている、配列番号３２、３３、３４、及び３５のペプチドの混合剤であってもよい。
【００４９】
そのため、ペプチドの混合剤には、塩化ナトリウム、塩酸、水酸化ナトリウム及び水が混ざっていてもよい。
ペプチドの混合剤は、静脈内に注射可能又は投与可能な送達調合物に含まれていてもよい。
【００５０】
ペプチドは、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの範囲内、最も好ましくは１０ｍｇ／ｍｌの濃度で送達調合物中に存在していてもよい。
【００５１】
使用時には、送達調合物は、注射可能又は静脈注射用の調合物の形態である場合、１〜３０分間にわたる、好ましくは５〜２０分間にわたる、最も好ましくは１０分間にわたる緩徐な静脈内注射によって投与されうる。
【００５２】
ペプチドは細胞透過活性を有していてもよい。そのため、ペプチドはＣＰＰであってもよい。
ペプチドは、ＲＲ、又はＲＲＲ、又はＲＲＲＲ、又はより高次の繰り返しのような、隣接した配置状態のアルギニン残基の繰り返しを含んでもよく、かつ他のアミノ酸の間に、又はアミノ酸の連続部の間に、点在せしめられてもよい。
【００５３】
本発明のさらなる態様によれば、神経の損傷を治療するための医薬組成物又は薬剤の製造における、本発明のペプチドの使用が提供される。本発明は、神経の損傷を治療するための薬剤の製造における、本発明のペプチドの混合剤の使用にも及ぶ。
【００５４】
本発明のさらに別の態様によれば、カルシウム流入に関連した細胞表面受容体の機能に影響を及ぼすための、より具体的にはＮＭＤＡ、ＡＭＰＡ、ＶＧＣＣ、ＮＣＸ、ＴＲＭＰ２／７、ＡＳＩＣ及びｍＧｌｕ受容体と相互作用するための、より具体的にはさらに細胞内カルシウム流入の低減をもたらすための、本発明のペプチド又は医薬組成物の使用が提供される。本発明の別の実施形態では、ミトコンドリア外膜との相互作用及びミトコンドリア外膜の安定化のうち少なくともいずれか一方を行うことによりミトコンドリアの機能の維持を支援するための、本発明のペプチド又は医薬組成物の使用が提供される。本発明のさらに別の態様によれば、カルシウム依存性プロタンパク質転換酵素フューリンを阻害するか、ダウンレギュレートするか、若しくは影響を及ぼすための、本発明のペプチド又は医薬組成物の使用が提供される。
【００５５】
本発明の別の態様によれば、神経の損傷の治療のための医薬組成物又は薬剤であって、本発明の単離ペプチド、又は本発明の単離ペプチドのうち任意の１つ以上を含む、医薬組成物又は薬剤が提供される。
【００５６】
医薬組成物又は薬剤は、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクルを含むことができる。
本発明のまたさらに別の態様によれば、神経の損傷を治療する方法であって、投与を必要とする患者に、薬学的に許容可能な及び／又は薬学的に有効な量の、本発明のペプチドを投与するステップを含む方法が提供される。患者は、生理学的に許容可能な量の本発明のペプチドを投与されてもよい。
【００５７】
本発明のまたさらなる態様によれば、対象者における神経細胞死を阻害するための方法であって、そのような治療を必要とする対象者に、対象者における神経細胞死を阻害するのに有効な量の神経保護ペプチドを投与することを含み、神経保護ペプチドは本発明のペプチドのうち任意の１つ以上である、方法が提供される。
【００５８】
患者は、生理学的に許容可能な量の、本発明のペプチドのうち任意の２つ以上の混合剤を投与されてもよい。
より詳しくは、患者は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６、又は３７を含む群から選択された任意の２つ以上のペプチドの混合剤を投与されうる。本発明の１つの特定の態様では、患者は、配列番号３２、３３、３４及び３５を含む混合剤を投与されうる。他の組み合わせでは、患者は、配列番号３２、３３、３４及び３５からなる群から選択されたペプチドと、配列番号３６のペプチドとの任意の組み合わせを投与されうる。特定の実施形態では、患者は配列番号３５を投与されてもよい。
【００５９】
本発明のペプチドは、神経伝達物質受容体のアンタゴニストに対抗する神経保護活性を提供しうる。神経伝達物質受容体は、ＮＭＤＡ、グルタミン酸、カイニン酸、又は虚血プロセスによって結合がなされ、これらと相互作用し、又はこれらにより影響を受ける受容体であってよい。本発明のペプチドは他のポリペプチド内に含まれていてもよいし、他のポリペプチドに融合せしめられてもよい。本発明のペプチドは、そのような他のポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに連結又は融合されうる。本発明のペプチドは、そのような他のポリペプチドに、神経の損傷を治療するために適した立体配座をとって本発明のペプチドを提示するように連結又は融合されうる。
【００６０】
別例として、又は追加として、本発明のペプチドのうち１つ以上がリンカー配列で互いに融合されてもよい。リンカー配列は、任意の配列のアミノ酸、例えば、限定するものではないが塩基性／カチオン性のアミノ酸に富んだリンカー配列を含むことができる。別例として、又は追加として、リンカー配列は開裂可能なリンカーであってよい。１つの実施形態では、リンカーは、１つ以上のＭＭＰ型リンカー、カルパインリンカー、カスパーゼリンカー又はｔＰＡリンカーであってよい。ＭＭＰ型リンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって認識及び開裂されるペプチド配列として定義される。同様に、カルパインリンカー、カスパーゼリンカー又はｔＰＡリンカーは、これらのタンパク質分解酵素（すなわちそれぞれカルパイン、カスパーゼ又はｔＰＡ）によって認識及び開裂されるペプチド配列である。本発明のペプチドはさらに、神経の損傷の部位へと輸送されるか、又は神経細胞の中へ若しくは神経細胞内部で細胞内輸送されることになっている他のペプチドに融合されてもよい。
【００６１】
本発明のペプチドは、神経の機能に害を及ぼす酵素に結合するか又は該酵素と相互作用することが可能である付随的ペプチドに連結されて、その結果、該付随的ペプチドが、細胞膜を横切る輸送の後で該酵素の競合的阻害剤として機能することが可能であるようになっていてもよい。付随的ペプチドは、ｔＰＡ、カルパイン、及びＭＭＰから選択可能であり、カスパーゼ配列のような開裂可能なリンカーを使用して本発明のペプチドに連結されて、その結果、ｔＰＡ、カルパイン又はＭＭＰが本発明のペプチドから解放され、次いで神経の機能に害を及ぼす酵素にとっての競合的阻害剤として細胞内で機能しうるようになっていてもよい。
【００６２】
そのため、本発明は、本発明のペプチドがカスパーゼ切断部位に連結され、それ自体がひいてはカルパイン、ｔＰＡ又はＭＭＰに連結されているものにも及ぶ。
本発明のペプチドは、１０μＭ未満、好ましくは５μＭ未満、好ましくは１μＭ未満、場合によっては０．２μＭ程度又は０．２μＭ未満、さらには０．１μＭ程度のＩＣ５０レベルの神経保護活性を示しうる。
【００６３】
以前に言及されたように、ペプチドは本発明のペプチド配列の繰り返し、又はその機能性フラグメント、すなわち神経保護活性を示すフラグメントを含みうる。
従って、本発明の１つの態様は、単離ポリペプチドであって、該ポリペプチド内に含まれた神経保護効果を示す長さ８〜１００アミノ酸残基のペプチドセグメントを有し、該神経保護ペプチドはペプチドセグメントの長さの２０％超、好ましくは３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超  ８０％超、９０超、９５％超、９９％超、又は最も好ましくは１００％の塩基性／カチオン性アミノ酸含量を有するペプチドセグメントから選択される、単離ポリペプチドを提供する。
【００６４】
本発明の別の態様によれば、本発明のペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド配列、該単離ポリヌクレオチド配列に相補的な配列、及び該単離ポリヌクレオチド配列との少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％の相同性を有する配列が提供される。該ポリヌクレオチド配列は１つ以上の単離された配列であってよく、本発明のポリヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であってもよい。該ポリヌクレオチド配列は天然に存在しないポリヌクレオチド配列又はＤＮＡであってもよい。そのため、それらは人造の、ｃＤＮＡのような人工構築物を含みうる。さらに本発明に含まれるのは、単離された先述の単離核酸を含む、発現ベクターのようなベクター、同様にそのようなベクター又はＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞である。該ポリヌクレオチド配列はプロタミンをコードしていてもよい。該ポリヌクレオチド配列は配列番号３８の配列であってもよい。
【００６５】
本発明の別の態様では、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１６、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、及び３７からなる群から選択された単離ペプチドが、前記ペプチドに対する、少なくとも６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、なおより好ましくは９０％、さらにより好ましくは９９％又はそれ以上の配列同一性を有する配列を含めて提供され、そのようなペプチドは神経保護活性を有する。
【００６６】
医薬調合物又は薬剤の調製における単離核酸、ベクター、又は細胞の使用も提供される。
本発明は更に、上記調合のうち少なくとも１つの上述の医薬組成物（１つ以上の容器に入っている）と、該医薬組成物の適用に関わる指示及び情報のうち少なくともいずれか一方に関する取扱説明書又は情報小冊子とを含むキットを提供する。
【００６７】
１つの実施形態では、上記に定義されるような本発明のペプチドを含む医薬組成物は、虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、脊髄損傷又はてんかんの治療に使用するためのものである。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、神経細胞の生存を促進する方法であって、神経細胞を本発明のペプチド又はその組み合わせと接触させるステップを含む方法を提供する。好ましくは、該方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。本発明は、その別の態様において、ＯＧＤ又は虚血から血液脳関門内皮細胞を保護するための方法及び組成物を提供する。
【００６９】
これらの所見は、本発明のペプチドが、興奮毒性及び虚血による損傷に関連した神経に有害な事象／経路を阻害又は改善する能力を有すること、並びに、前記の阻害又は改善を行うための方法に使用可能であることを実証している。さらに、本明細書中に包含された傷害前曝露試験（pre-insult exposure trial ）におけるプロタミン及びプロタミン誘導体の効果によって示されるように、新たな重要な所見は、グルタミン酸又はＯＧＤ曝露の１〜４時間前の神経細胞のプロタミン治療が、細胞死の低減による神経保護性の応答を誘導することができるということであった。このことは意義深いことである、というのも、患者が脳虚血又は脳卒中を患う結果として脳損傷を生じる可能性のあるリスクがある、脳血管の外科的処置（例えば頚動脈血管内膜切除術）及び心血管の外科的処置（例えば冠動脈バイパスグラフト）が多数存在するからである。
【００７０】
したがって、本発明の方法は、本発明の少なくとも１つのペプチド、薬剤、又は医薬組成物を、何らかのそのような大脳虚血事象から脳を保護するためにそのような処置の０．２５時間〜４時間前、好ましくは０．５〜３時間前、最も好ましくは１〜２時間前の時間帯に投与することにも及ぶ。
【００７１】
このように本発明は、神経損傷、脳血管の傷害若しくは損傷、心血管の傷害若しくは損傷の治療若しくは予防における、又は患者が脳虚血又は卒中に罹患するリスクのありうる外科的処置における、本発明の少なくとも１つのペプチドの使用にも及ぶ。
【００７２】
本明細書中に開示された本発明の配列の一次アミノ酸配列の軽微な改変は、ほぼ等価の又は増強された活性を有するタンパク質を生じる場合がある。この改変は、部位特異的突然変異誘発によるものなど、計画的であってもよいし、例えばプロタミン又はＬＭＷＰを産生する生物体である宿主の突然変異によるものなど、偶発的であってもよい。これらの改変はすべて、神経保護活性が保持される限りは本発明の範囲内に含まれる。
【００７３】
本発明のさらなる特徴は、単に本発明を例証する目的で含められたいくつかの非限定的な実施形態についての以下の説明において、より十分に記載されている。以下の説明は、上記に提示されたような本発明の広範な概要、開示又は説明に対する制限ではなく、添付の図面に関してなされるものであり、図中、用語「プロタミン」又は「Ｐｔｍ」は市販の硫酸プロタミン（サノフィ・アベンティスを含むいくつかの製造業者により、典型的にはホフマン（Hoffman ）、１９９０年に指定されているようにして市販用に製造されている）を指し、「Ｐｔｍ１」〜「Ｐｔｍ」５はそれぞれ配列番号３２、３３、３４、３５、及び３６を指している。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１ａ】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。Ａ：グルタミン酸への曝露並びにＣＰＰ、陽性対照ペプチド（ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ／ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ）及びグルタミン酸受容体遮断薬（Ｂｌｋｒｓ；５μＭ：ＭＫ８０１／５μＭ：ＣＮＱＸ）を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害（no insult ）対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｂ】グルタミン酸興奮毒性モデルのさらなる結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。グルタミン酸への曝露並びにＴＡＴ‐Ｌ及びＴＡＴ‐Ｄペプチドを用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｃ】グルタミン酸興奮毒性モデルのさらなる結果を示す図。具体的には、グルタミン酸傷害に先立って洗浄除去された場合のペプチドの効能である（ペプチドの濃度はμＭ単位）。ＣＰＰが傷害に先立って洗浄除去された場合のグルタミン酸への曝露の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｄ】グルタミン酸興奮毒性モデルからのさらなる結果を示す図。グルタミン酸傷害の後に添加された場合のペプチドの効能である。Ａｒｇ‐９及びＡｒｇ‐１２ペプチド並びに対照ペプチドＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ及びＮＲ２９ｃが傷害後０分又は１５分で添加された場合のグルタミン酸曝露の後２４時間の神経細胞の生存率であり、この実験では、グルタミン酸への曝露は対照群において他の実験よりも生じた細胞死が少なかった（６０％対９５％）。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｅ】グルタミン酸興奮毒性モデルからのさらなる結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。Ａ：グルタミン酸への曝露並びにＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８及びＲ９／ｔＰＡ／Ｒ９を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｆ】グルタミン酸興奮毒性モデルからのさらなる結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。グルタミン酸への曝露並びにＲ９、Ｅ９／Ｒ９、ＤＡＨＫ及びＰＴＤ４を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｇ】グルタミン酸興奮毒性モデルからのさらなる結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。グルタミン酸への曝露、並びにＲ９及びＮＲ２９ｃ並びに対照ペプチドＰＣＹ３６（ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ）を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｈ】グルタミン酸興奮毒性モデル（穏やかな傷害）からのさらなる結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。グルタミン酸への曝露、並びにＲ９、Ｒ１２及びＮＲ２９ｃ並びに対照ペプチドＪＮＫ（ＪＮＫＩ‐１‐ＴＡＴ）を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｉ】グルタミン酸興奮毒性モデル（穏やかな傷害）からのさらなる結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。グルタミン酸への曝露、並びにＲ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１２及びＮＲ２９ｃ対照ペプチドを用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１ｊ】グルタミン酸興奮毒性モデルからのさらなる結果を示す図；ペプチドの濃度＝５μＭ。グルタミン酸への曝露及びＲ１、Ｒ３、Ｒ９旧（ミモトープス（Mimotopes ））、Ｒ９新（チャイナ・ペプチド（China peptides））、Ｒ１２を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２】カイニン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。ペプチドの濃度はμＭ単位。カイニン酸への曝露並びにＣＰＰ、陽性対照ペプチド（ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ／ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ）及びグルタミン酸受容体遮断薬（Ｂｌｋｒｓ；５μＭ：ＭＫ８０１／５μＭ：ＣＮＱＸ）を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３ａ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血モデルの結果を示す図。ペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血の間存在し、虚血後には５０％の用量で存在：ペプチドの濃度はμＭ単位。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血並びにＣＰＰ、陽性対照ペプチド（ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ）及びグルタミン酸受容体遮断薬（Ｂｌｋｒｓ；５μＭ：ＭＫ８０１／５μＭ：ＣＮＱＸ）を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３ｂ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血モデルのさらなる結果を示す図。ペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血の後に存在し：ペプチドの濃度はμＭ単位。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血並びにＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８を用いた処置の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３ｃ】ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血モデルのさらなる結果を示す図。Ｒ９ペプチドはｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血の間存在し、虚血後には５０％の用量で存在：ｂＥＮＤ３細胞のためのペプチド用量はｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血の間は１０μＭ／虚血後は５μＭであった。ＳＨ‐５ＹＳＹ細胞のためのペプチド用量はｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血の間は５μＭ／虚血後は２．５μＭであった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血の後２４時間の細胞生存率（ＭＴＳデータは平均±ＳＥＭ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図４】培養物を様々なペプチド濃度に曝露した後の神経細胞の生存率を示す図。ペプチド濃度はμＭで示されている。Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８、ＪＮＫ（ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ）及びＮＲ２９ｃペプチドを用いた曝露の後２４時間の神経細胞の生存率。４９０ｎｍにおけるＭＴＳ吸光度として表わされた細胞生存率データ（平均±ＳＥＭ；ｎ＝４）。
【図５】ラットの恒久的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）卒中モデルにおけるＲ９Ｄペプチドの効能を示す、初期の動物モデルパイロット試験の結果を示す図。Ｒ９ＤペプチドはＭＣＡＯ後３０分で静脈内投与された。梗塞体積（脳損傷）はＭＣＡＯ後２４時間で測定された（平均±ＳＤ）。
【図６】グルタミン酸モデルにおけるＲ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４を使用した用量応答研究を示す図。平均±ＳＥＭ：Ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５。（ペプチド濃度はμＭ単位）。
【図７】グルタミン酸モデルにおけるＲ９Ｄ、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５を使用した用量応答研究を示す図。平均±ＳＥＭ：Ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５。（ペプチド濃度はμＭ単位）。
【図８】グルタミン酸モデルにおけるＲ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９を使用した用量応答研究を示す図。平均±ＳＥＭ：Ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５。（ペプチド濃度はμＭ単位）。
【図９】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、３７℃で５分間のグルタミン酸への曝露（１００μＭ）の前に１５分間であった。グルタミン酸への曝露及び様々なプロタミン濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ対照）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１０】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、３７℃で５分間のグルタミン酸への曝露（１００μＭ）の前１５分間及び曝露中であった。グルタミン酸への曝露及び様々なプロタミン濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ対照）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１１】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、グルタミン酸への曝露（１００μＭ）（３７℃で５分間）の前５分間又は１０分間のみであった。グルタミン酸への曝露及び様々なプロタミン濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１２】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミン及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）の濃度はμＭ単位。プロタミン又はＬＭＷＰを用いた神経細胞培養物の処置は、３７℃で５分間のグルタミン酸への曝露（１００μＭ）の前１５分間及び曝露中であった。グルタミン酸への曝露及び様々なプロタミン若しくはＬＭＷＰの濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ対照）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１３】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミン及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）の濃度はμＭ単位。プロタミン又はＬＭＷＰを用いた神経細胞培養物の処置は、３７℃で５分間のグルタミン酸への曝露（１００μＭ）の前１５分間及び曝露中であった。グルタミン酸への曝露及び様々なプロタミン若しくはＬＭＷＰの濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ対照）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１４】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミン及びＬＭＷＰの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、グルタミン酸への曝露（１００μＭ；３７℃で５分）の直前又は１若しくは２時間前の１０分間のみであった。グルタミン酸への曝露及び様々なプロタミン若しくはＬＭＷＰの濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ対照）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１５】グルタミン酸興奮毒性モデルの結果を示す図。プロタミン及びプロタミンペプチド１〜５（「Ｐｔｍ１〜５」）の濃度はμＭ単位。プロタミン及びプロタミンペプチドを用いた神経細胞培養物の処置は、３７℃で５分間のグルタミン酸への曝露（１００μＭ）の前１５分間であった。グルタミン酸への曝露並びに様々なプロタミン及びプロタミンペプチドの濃度を用いた処置又は未処置（Ｇｌｕｔ対照）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１６】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、５０分間のＯＧＤの直後及び実験終了までであった（２４時間）。ＯＧＤ及び様々なプロタミン濃度を用いた処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１７】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、５０分間のＯＧＤの直後及び実験終了までであった（２４時間）。ＯＧＤ及び様々なプロタミン濃度を用いた処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１８】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミン及びＬＭＷＰの濃度はμＭ単位。プロタミン又はＬＭＷＰを用いた神経細胞培養物の処置は、５０分間のＯＧＤの１時間前に１０分間であった。ＯＧＤ及び様々なプロタミン濃度を用いた前処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図１９】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、５０分間のＯＧＤの後に１５分間又は３０分間であった。ＯＧＤ及び様々なプロタミン濃度を用いた後処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２０】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミン及びＬＭＷＰの濃度はμＭ単位。プロタミン又はＬＭＷＰを用いた神経細胞培養物の処置は、５０分間のＯＧＤの後に１５分間であった。ＯＧＤ及び様々なプロタミン濃度若しくはＬＭＷＰ濃度を用いた後処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２１】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミン及びプロタミンペプチドの濃度はμＭ単位（５μＭ）。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、４５分間のＯＧＤの後に１５分間であった。ＯＧＤ並びに様々なプロタミン濃度及びプロタミンペプチド濃度を用いた後処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝５；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２２】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミン、プロタミンペプチド及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）ペプチドの濃度はμＭ単位（５μＭ）。プロタミンを用いた神経細胞培養物の処置は、４５分間のＯＧＤの後に１５分間であった。ＯＧＤ並びに様々なプロタミン濃度及びプロタミンペプチド濃度を用いた後処置又は未処置（ＯＧＤ）の後２４時間の神経細胞の生存率。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２３】脳血管内皮細胞（ｂＥＮＤ３細胞）を使用した酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルの結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いたｂＥＮＤ３培養物の処置は、３通りの異なるＯＧＤ持続期間（２時間１５分、２時間３０分及び２時間４５分）の直前１５分から実験終了までであった（２４時間）。細胞の生存率はＯＧＤの２４時間後に測定された。ＭＴＳデータは、非ＯＧＤ対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２４】脳血管内皮細胞（ｂＥＮＤ３細胞）へのプロタミンペプチドの曝露の結果を示す図。プロタミンの濃度は１μＭ。プロタミンペプチド１〜５（Ｐｔｍ１〜Ｐｔｍ５）、硫酸プロタミン（Ｐｔｍ）、及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）はＯＧＤ（２時間３０分の持続期間）の直前に１５分間、ｂＥＮＤ３細胞培養物に添加された。ＭＴＳアッセイを使用してＯＧＤの２４時間後に評価された細胞の生存率。ＭＴＳデータは４９０ｍｍでの吸光度として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２５】脳血管内皮細胞（ｂＥＮＤ３細胞）へのプロタミンの曝露の結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いたｂＥＮＤ３培養物の処置は０．５時間、１時間又は２時間であった。プロタミンへの曝露又は未処置（対照）の後２時間の細胞の生存率。ＭＴＳデータは４９０ｍｍでの吸光度として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２６】脳血管内皮細胞（ｂＥＮＤ３細胞）へのプロタミンの曝露の結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いたｂＥＮＤ３培養物の処置は２時間であった。プロタミンへの曝露又は未処置（対照）の後２時間の細胞の生存率。ＭＴＳデータは４９０ｍｍでの吸光度として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２７】恒久的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）卒中モデルにおける閉塞３０分後に静脈内投与された場合のＲ１２、Ｒ１５、Ｒ１８及びプロタミン（Ｐｔｍ）ペプチドの神経保護効果を示す図。ペプチド用量は１μｍｏｌ／ｋｇ（６００μｌ：ＩＶ）であり、梗塞の評価はＭＣＡＯの２４時間後であった（平均±ＳＥ；ｎ＝８〜１０；＊Ｐ＜０．０５）。動物の処置は無作為化され、全ての工程は処置に対して盲検化されて実施された。
【図２８】ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の間にのみ神経細胞培養物中に存在する場合のグルタミン酸興奮毒性モデルにおけるＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図２９】ペプチドがグルタミン酸への曝露の前に１０分間だけ神経細胞培養物中に存在する場合のグルタミン酸モデルにおけるＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３０】ペプチドがグルタミン酸への曝露の１〜５時間前に１０分間だけ神経細胞培養物中に存在する場合のグルタミン酸モデルにおけるＲ１２及びＲ１５の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３１】酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）モデルにおける、ペプチドがＯＧＤ直後に神経細胞培養物に添加されて１５分後に除去された場合のＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８の神経保護性の効能を示す図。ＯＧＤの後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３２】酸素グルコース欠乏における、ペプチドがＯＧＤの１〜３時間前に１０分間だけ神経細胞培養物中に存在する場合のＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８の神経保護性の効能を示す図。ＯＧＤの後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３３】グルタミン酸興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、ＰＴＤ４、Ｅ９／Ｒ９及びＲ９の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３４】グルタミン酸興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、ＸＩＰ及びＰＹＣ３６‐ＴＡＴの神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３５】グルタミン酸興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、ＮＣＸＢＰ３の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３６】グルタミン酸興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、Ｋ１０、Ｒ１０及びＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃの神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３７】ＮＭＤＡ興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のＮＭＤＡへの曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、Ｒ１５及びＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃの神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３８】グルタミン酸興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、Ｒ８及びＣａｌ／Ｒ９の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図３９】グルタミン酸への曝露前に１０分間だけ神経細胞培養物に添加される前に、±ヘパリン（２０ＩＵ／ｍｌ）として室温で５分間インキュベートされたＲ９Ｄ、Ｒ１２、Ｒ１５及びＰＹＣ３６‐ＴＡＴペプチドの神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図４０】神経細胞培養物が±ヘパリン（４０ＩＵ／ｍｌ）として３７℃で５分間インキュベートされた後にペプチドが３７℃で１０分間だけ添加され、その後グルタミン酸への曝露の前に除去された場合の、Ｒ９Ｄ、Ｒ１２、及びＲ１５並びにグルタミン酸受容体遮断薬（Ｂｌｋｓ：５μＭのＭＫ８０１／５μＭのＣＮＱＸ）の神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図４１】グルタミン酸興奮毒性モデルにおける、ペプチドが５分間のグルタミン酸への曝露の前１５分間及び曝露中に神経細胞培養物中に存在する場合の、ｋＦＧＦ、ｋＦＧＦ‐ＪＮＫＩ‐１、ＴＡＴ‐ＪＮＫＩ‐１及びＪＮＫＩ‐１ＴＡＴＤの神経保護性の効能を示す図。グルタミン酸の後２０〜２４時間で測定された神経細胞の生存率。ペプチドの濃度はμＭ単位。ＭＴＳデータは、非傷害対照を１００％の生存率として得られた神経細胞の生存率（％）として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５）。
【図４２】酸素グルコース欠乏の前に１５分間の初代ラット星状細胞に対する硫酸プロタミン（Ｐｔｍ）及びＲ１８ペプチドの事前曝露の結果を示す図。ペプチドの濃度は２μＭ。ＭＴＳアッセイを使用してＯＧＤの２４時間後に評価された細胞の生存率。ＭＴＳデータは４９０ｍｍでの吸光度として表わされた（平均±ＳＤ；ｎ＝４〜６；＊Ｐ＜０．０５）。
【図４３】初代ラット星状細胞に対するプロタミンペプチド１〜５（Ｐｔｍ１〜Ｐｔｍ５）、硫酸プロタミン（Ｐｔｍ）、及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）の曝露の結果を示す図。プロタミンの濃度はμＭ単位。プロタミンを用いた星状細胞培養物の処置は２４時間であった。プロタミンへの曝露又は未処置（対照）の後２４時間の細胞の生存率。ＭＴＳデータは４９０ｍｍでの吸光度として表わされた（ｎ＝４）。
【図４４】神経細胞培養物における、グルタミン酸への曝露後のグルタミン酸受容体遮断薬（５μＭ／５μＭのＭＫ８０１／ＣＮＱＸ）、Ｒ９Ｄ、Ｒ１５、ＰＹＣ３６‐ＴＡＴ、ＴＡＴ、ＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃ  ＪＮＫＩ‐１‐ＴＡＴＤ、ＴＡＴ‐ＪＮＫＩ‐１、ｋＦＧＦ‐ＪＮＫＩ‐１及びｋＦＧＦについての細胞内カルシウム流入の動態を示す図。Ｆｕｒａ‐２ＡＭが細胞内カルシウムの評価に使用された。代表的な蛍光Ｆｕｒａ−２ＡＭトレーサー；グルタミン酸（終濃度１００μＭ）の添加（矢印）の３０秒前及び添加後の神経細胞培養物の蛍光強度（ＦＩ）。ペプチド又はグルタミン酸受容体遮断薬は、神経細胞培養物に１０分間添加されてグルタミン酸の前に除去された（時間＝０）。値は平均±ＳＥ；ｎ＝３。ペプチド濃度は５μＭであった。
【図４５】神経細胞表面構造物のエンドサイトーシスによる細胞内移行を誘導するアルギニンに富んだＣＰＰについての提唱モデルを示す図。注記：モデルは、神経細胞のシナプス及びシナプス外の原形質膜、並びに潜在的には星状細胞、周細胞、脳血管内皮細胞、オリゴデントロサイト及びミクログリアの原形質膜に当てはまる。ＮＭＤＡＲ：Ｎ‐メチル‐Ｄ‐アスパルテート受容体；ＡＭＰＡＲ：α‐アミノ‐３‐ヒドロキシ‐５‐メチル‐４‐イソキサゾールプロピオン酸受容体；ＮＣＸ：ナトリウム・カルシウム交換輸送体；ＶＧＣＣ：電位依存性カルシウムチャネル（例えばＣａＶ２．２、ＣａＶ３．３）；ＡＳＩＣ：酸感受性イオンチャネル；ＴＲＰＭ２／７：一過性受容器電位カチオンチャネル２及び７：ｍＧｌｕＲ：代謝型グルタミン酸受容体；ＶＲ１：バニロイド受容体１又は一過性受容器電位カチオンチャネル・サブファミリーＶのメンバー１；ＴＮＦＲ：腫瘍壊死因子受容体；ＥＡＡＴ：興奮性アミノ酸輸送体；ＡＱＰ４：アクアポリン４；Ｔｒｋ：トロポミオシン受容体キナーゼ受容体。
【図４６】本明細書中において記載及び使用される配列の参照表。
【図４７】本明細書中において記載及び使用される配列の参照表。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
実施形態の説明
本明細書全体を通じて、文脈からそうでないことが必要とならないかぎり、単語「〜を含む（comprise）」若しくは「〜を含む（comprises ）」や「〜を含む（comprising）」のような変化形、又は「〜を含む、具備する（includes）」若しくは「〜を含んでいる、具備している（including ）」は、明示された整数又は整数群を含むが任意の他の整数又は整数群を排除するものではないことを意味すると理解されることになる。
【００７６】
本発明は、単離ペプチド及び該単離ペプチドを含む組成物、並びにこれらの使用に関する。単離ペプチドは、神経の損傷又は脳血管の虚血事象（例えば、特に卒中）の神経変性作用を、その神経の損傷又は虚血事象の前後に投与された場合に、低減することが可能であるという点で特徴づけられる。よって、本発明の組成物の投与は、神経の損傷又は脳血管の虚血事象の後の神経細胞の喪失を低減する。本出願人はここで、驚くべきことに、ＣＰＰの形態であるある種のポリペプチド、及び連続的に連なった塩基性／カチオン性アミノ酸（特にアルギニン残基であるがリジン残基及びトリプトファン残基も含む）を有するポリペプチドは、神経刺激活性又は神経保護活性を示し、かつ単独で、すなわち他の神経保護性の作用薬又はペプチドに融合される必要を伴わずに、神経保護作用薬としての（すなわち神経の損傷の治療のための）役割を果たすことが可能である、ということを見出した。そのため、本発明は、長さ１０〜３２アミノ酸のポリペプチドであって、該アミノ酸のうち１０〜２２個はカチオン性アミノ酸残基（典型的にはアルギニン残基）であり、そのようなペプチドは典型的には３０％以上のアルギニン含量を有し、そのようなペプチドは確立された神経損傷モデルにおいて神経保護活性を示す、ポリペプチドに関する。これは、ポリアルギニンペプチドに加えて、硫酸プロタミン（サケ精子から得られたプロタミンペプチドの混合剤として）、及びこれらのペプチドの様々な変型、アナログ、バリアント又はフラグメント、例えばプロタミン及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）、並びにこれらの混合剤を含んでいる。
【００７７】
本明細書中で使用されるような用語「アミノ酸」又は「残基」には、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちのいずれか１つ、天然に存在するアミノ酸のうちいずれか１つのＤ型、天然に存在しないアミノ酸、並びにこれらの誘導体、アナログ及びミメティックが含まれる。天然に存在するアミノ酸を含むいかなるアミノ酸も、商業的に購入可能であるか又は当分野で既知の方法によって合成可能である。天然に存在しないアミノ酸の例には、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、β‐アラニン、Ｌ‐若しくはＤ‐ナフタラニン（naphthalanine ）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ホモアルギニン（ｈｏｍｏＡｒｇ）、及びその他のペプチド分野において良く知られたもの、例えばＭ．ボダンツキー（Bodanzsky ）、「ペプチド合成の原理（Principles of Peptide Synthesis ）」第１版及び第２改訂版、１９８４年及び１９９３年、米国ニューヨーク州ニューヨークのシュプリンガー・フェアラーク（Springer-Verlag ）、並びにスチュアート（Stewart ）及びヤング（Young ）、「固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis ）」第２版、１９８４年、米国イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル社（Pierce Chemical Co. ）に記載されたものがあり、前記文献はいずれも参照により本願に組込まれる。
【００７８】
一般のアミノ酸はその正式名、標準的な１文字記法（ＩＵＰＡＣ）、又は標準的な３文字記法、例えば：Ａ、Ａｌａ、アラニン；Ｃ、Ｃｙｓ、システイン；Ｄ、Ａｓｐ、アスパラギン酸；Ｅ、Ｇｌｕ、グルタミン酸；Ｆ、Ｐｈｅ、フェニルアラニン；Ｇ、Ｇｌｙ、グリシン；Ｈ、Ｈｉｓ、ヒスチジン；Ｉ、Ｉｌｅ、イソロイシン；Ｋ、Ｌｙｓ、リジン；Ｌ、Ｌｅｕ、ロイシン；Ｍ、Ｍｅｔ、メチオニン；Ｎ、Ａｓｎ、アスパラギン；Ｐ、Ｐｒｏ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｎ、グルタミン；Ｒ、Ａｒｇ、アルギニン；Ｓ、Ｓｅｒ、セリン；Ｔ、Ｔｈｒ、トレオニン；Ｖ、Ｖａｌ、バリン；Ｗ、Ｔｒｐ、トリプトファン；Ｘ、Ｈｙｐ、ヒドロキシプロリン；Ｙ、Ｔｙｒ、チロシン、によって引用されうる。本明細書の組成物中のあらゆるアミノ酸が、天然に存在するか、合成物であるか、これらの誘導体又はミメティックである。
【００７９】
本明細書中で使用されるように、「単離（された）」は、本明細書中に記載されたペプチドであって天然の状態ではない（例えば、該ペプチドが天然においてその中に存在するか、又は通常はそれと関連付けられている、より大きなタンパク質分子又は細胞残屑から、該ペプチドが切り離されている）もの、又は天然に存在するタンパク質の天然に存在しないフラグメントであるもの（例えば、該ペプチドは天然に存在するタンパク質の２５％未満、好ましくは１０％未満、及び最も好ましくは５％未満を含む）を意味する。単離（された）はさらに、ペプチドのアミノ酸配列が、例えば、該配列が天然に存在する配列から（例えばアルギニン、トリプトファン若しくはリジンのような塩基性（すなわちカチオン性）のアミノ酸を含むある種のアミノ酸の変更により）改変されているという理由で、又は該配列が天然では存在する隣接アミノ酸を含有していないという理由で、天然には存在しないということを意味する場合もある。用語「単離（された）」は、ペプチド又はアミノ酸配列が人造の配列又はポリペプチドであって天然には存在しないであろうことを意味する場合もある。
【００８０】
同様に、ペプチドをコードする核酸に関して使用されるような「単離（された）」は、前述の全てを包含し、例えば、単離核酸は、該核酸が天然において関連している隣接ヌクレオチドから切り離されており、かつ、組換え法、合成法、生物学的抽出物からの精製などにより生産が可能である。単離核酸は、前述のペプチドのうちの１つをコードする部分と、別のペプチド又はタンパク質をコードする別の部分とを含有することが可能である。単離核酸は標識付けすることも可能である。核酸は、動物、細菌、植物、又は真菌が使用するのに好適なコドンを含んでいる。ある実施形態では、単離核酸は、前述の単離ペプチドのうちの１つをコードする核酸を含んでいる、発現ベクターのようなベクターである。任意の所望のＤＮＡ配列の構築のための一般的な方法は、例えば、ブラウン（Brown ）Ｊ．ら、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）、１９７９年、第６８巻、ｐ．１０９；上述のサムブルック（Sambrook）Ｊ、マニアティス（Maniatis）Ｔ、１９８９年に提供されている。
【００８１】
ペプチドの非ペプチド性アナログ、例えば安定した構造又は生分解の減少を提供するものも企図される。ペプチド模倣アナログは、選択されたペプチドを基にして１つ以上の残基を非ペプチド部分により置換することによって、調製可能である。好ましくは、非ペプチド部分は、ペプチドがその自然な立体配座を保持すること、又は好ましい（例えば生物活性を有する）立体配座を安定化することを可能にする。ペプチドから非ペプチド性の模倣アナログを調製するための方法の１例は、ナフマン（Nachman ）ら、レギュラトリー・ペプタイズ（Regul. Pept.）、１９９５年、第５７巻、ｐ．３５９−３７０に記載されている。本明細書中で使用されるような用語「ペプチド」は前述のものをすべて包含する。
【００８２】
上述のように、本発明のペプチドは、天然に存在するアミノ酸すなわちＬ‐アミノ酸、又はＤ‐アミノ酸すなわち天然の配列と比較してレトロインベルソ型の順序でＤ‐アミノ酸を含むアミノ酸配列のＤ‐アミノ酸、のうちいずれかで構成されうる。用語「レトロインベルソ型（retro-inverso ）」とは、配列の方向が逆転しており、かつ各アミノ酸残基のキラリティーが反転している線状ペプチドの異性体を指す。よって、Ｌ型で存在している本明細書中の任意の配列は、本質的にＤ型対掌体の（レトロインベルソ型）ペプチド配列としても本明細書中に開示されている。本発明によるＤ型対掌体の（レトロインベルソ型）ペプチド配列は、例えば、対応する天然型のＬ‐アミノ酸配列について逆のアミノ酸配列を合成することによって、構築可能である。Ｄ‐レトロインベルソ型対掌体のペプチド、例えば単離ペプチドの構成要素において、個々の単一のアミド結合の中のカルボニル基及びアミノ基の位置は交換されている一方、各α炭素の側鎖基の位置は保存されている。
【００８３】
Ｄ型対掌体のアミノ酸を有する上記に定義されるような本発明の単離ペプチドの構成要素の調製は、対応する天然のＬ型アミノ酸配列の逆のアミノ酸配列を化学合成することにより、又は当業者に知られた任意の他の適切な方法により、達成することが可能である。別例として、Ｄ‐レトロインベルソ型対掌体の形態のペプチド又はその構成要素は、Ｌ型のペプチド又はその構成要素を、Ｄ‐レトロインベルソ型対掌体の形態を化学合成するためのマトリックスとして利用する上記に開示されるような化学合成を使用して調製されてもよい。
【００８４】
カチオン性アミノ酸に富んだポリペプチド（カチオン性アミノ酸ポリマー又はコポリマーと呼ぶことも可能）は、長さ１０〜３２アミノ酸のポリペプチド又はオリゴマーを含むことができる。したがって、「カチオンに富んだ」によって意味されるのは、任意のペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドであって、典型的には、３０％超のカチオン性残基、５０％超、さらには６０％超をも含むかまたは具備しているものである。ある実施形態では、これは、９０％、又は実に１００％のカチオン性残基、例えば好ましくはアルギニン残基などを含むペプチドを伴う場合がある。従って、アルギニンに富んだポリペプチド（アルギニンアミノ酸ポリマー又はコポリマーと称することも可能）によって、長さ１０〜３２アミノ酸のポリペプチド又はオリゴマーを含むことができる。したがって、「アルギニンに富んだ」によって意味されるのは、任意のペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチドであって、１０個以上のアルギニン残基、又は３０％超のアルギニン残基、５０％超、さらには６０％超をも含むかまたは具備しているものである。そのため、ある種の実施形態は、アミノ酸の１００％がアルギニン残基であるペプチドであってＲ１０〜Ｒ１８の範囲内かつ薬学的に有効な用量で使用されたときに適切な効能及び低い毒性を備えたペプチドを含む一方、他の場合にはそれは断続的に連なったアルギニン残基を有する他のペプチド（例えばＣＰＰでありプロタミン及びＬＭＷＰを含むもの）を指す。通常、このアルギニン残基の連なりは、連続／隣接した４〜５個のアルギニン残基を含み、その間に他のアミノ酸残基が点在している。好ましい実施形態では、間に点在しているアミノ酸はリジン（Ｋ）残基である、というのはこれらも概してカチオン性の電荷を有するからである。
【００８５】
ある実施形態では、アルギニンポリマー又はコポリマーは少なくとも１１個の連続したアルギニン残基、より好ましくは少なくとも１２個の連続したアルギニン残基、より好ましくは少なくとも１３個の連続したアルギニン残基、より好ましくは少なくとも１４個の連続したアルギニン残基、より好ましくは少なくとも１５個の連続したアルギニン残基、より好ましくは少なくとも１６個の連続したアルギニン残基、より好ましくは少なくとも１７個の連続したアルギニン残基及びより好ましくは少なくとも１８個の連続したアルギニン残基を含んでいる。しかしながら、ある実施形態では、他の、アルギニン以外の残基が間に点在した４〜５個のアルギニン残基の連続した配列、例えば、本明細書中に示されるような、プロタミン、ＬＭＷＰ、及びこれらの機能性バリアントであって神経保護活性を有するか又は神経損傷の治療において使用するためのバリアントによって例証されるものなどがありうる。好ましい実施形態では、Ｒ１５が利用される。
【００８６】
連続したアルギニン残基は、ポリペプチドのＣ末端、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドの中心（例えば、アルギニン以外のアミノ酸残基によって囲まれている）、又はポリペプチド内の任意の位置に、存在することができる。アルギニン以外の残基は、好ましくはアミノ酸、アミノ酸誘導体、又はアミノ酸ミメティックであって細胞内へのポリマーの膜輸送の速度をあまり低減しないもの、例えば、グリシン、アラニン、システイン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、セリン、トレオニン、α‐アミノ‐β‐グアニジノプロピオン酸、α‐アミノ‐γ‐グアニジノ酪酸、及びα‐アミノ‐ε‐グアニジノカプロン酸である。
【００８７】
様々な変更、例えばペプチドの機能のしかたに影響を及ぼさないか又はペプチドの機能のしかたに有利な影響を及ぼす、様々な側鎖基の追加などがなされうる。そのような変更は、荷電基の付加又は除去、アミノ酸の置換、脂肪親和性部分の付加であって結合をもたらすことはないが分子の全体的な電荷特性に影響して血液脳関門を越えての送達を促進するもの、などを伴いうる。個々のそのような変更について、その分子が本発明に従って機能するかどうかを試験するのに必要なのは日常的な実験作業だけである。単に所望の変更を加えるか又は所望のペプチドを選択し、実施例に詳細に述べられているような方式でそれを適用するだけである。例えば、ペプチド（改変型であれ非改変型であれ）がカイニン酸からの保護の試験において活性がある場合、又はそのようなペプチドが神経伝達物質機能の試験において元の神経伝達物質と競合する場合、そのペプチドは機能的な神経伝達物質ペプチドである。
【００８８】
本発明はさらに、単離ペプチドの機能性バリアントも包含する。本明細書中で使用されるように、単離ペプチドの「機能性バリアント」又は「バリアント」とは、単離ペプチドの一次アミノ酸配列に対する１つ以上の改変を含み、かつ本明細書中に開示された特性を保持しているペプチドである。単離ペプチドの機能性バリアントを作出する改変は、例えば、１）発現系におけるペプチド安定性のような、単離ペプチドの特性を増強するために；２）単離ペプチドに、抗原エピトープの付加若しくは検出可能部分の付加のような、新規な活性又は特性を提供するために；又は３）同一若しくは類似のペプチド特性を生じる異なるアミノ酸配列を提供するために、なされる可能性がある。単離ペプチドに対する改変は、該ペプチドをコードする核酸に対してなされることが可能であり、かつ該改変には、欠失、点突然変異、短縮化、アミノ酸置換及びアミノ酸の付加が含まれうる。別例として、改変は、例えば開裂、リンカー分子、好ましくはＭＭＰ、カルパイン、ｔＰＡのような開裂可能なリンカーの付加、ビオチンのような検出可能部分の付加、脂肪酸の付加、あるアミノ酸を別のアミノ酸の代替とすることなどにより、ペプチドに直接なされることも可能である。改変はさらに、単離ペプチドのアミノ酸配列のすべて又は一部を含む融合タンパク質も包含する。１つの実施形態では、リンカーは、１つ以上のＭＭＰタイプのリンカー、カルパインリンカー、カスパーゼリンカー、又はｔＰＡリンカーから選択される。ＭＭＰタイプのリンカーは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって認識及び開裂されるペプチド配列として定義される。同様に、カルパイン、カスパーゼ又はｔＰＡリンカーは、これらのプロテアーゼ酵素によって認識及び開裂されるペプチド配列である。ある実施形態では、本発明のペプチドは、神経の損傷部位へと輸送されることになっているか、又は神経細胞の中に細胞内輸送されることになっている、他のペプチドにも融合せしめられる。したがって、本発明のペプチドは、神経の機能に害を及ぼす酵素への結合又は該酵素との相互作用が可能である付随的ペプチドに連結されて、該付随的ペプチドが、本発明のペプチドによる細胞膜を横切る輸送の後に該酵素の競合的阻害剤として機能することが可能であるようになっていてもよい。付随的ペプチドは、ｔＰＡ、カルパイン、及びＭＭＰであり、かつカスパーゼ配列のような開裂可能なリンカーを使用して本発明のペプチドに連結され、その結果、ｔＰＡ、カルパイン又はＭＭＰが本発明のペプチドから解放されて、その後神経の機能に害を及ぼす酵素についての競合的阻害剤として細胞内で機能するようになっている。
【００８９】
したがって本発明は、カスパーゼ切断部位であってそれ自体が今度はカルパイン、ｔＰＡ又はＭＭＰに連結されたカスパーゼ切断部位に連結された、Ｒ１０〜Ｒ１８又はＰｔｍ１〜５若しくはＬＭＷＰのような本発明のペプチド、又はこれらのバリアントに及ぶ。
【００９０】
本明細書中に定義されるような用語「配列同一性」は、配列を以下のようにして比較することを意味する。２つのアミノ酸配列の同一性（％）を決定するためには、該配列を、最適な比較を目的としてアラインせしめることができる（例えば、第１のアミノ酸配列の配列にギャップを導入することが可能である）。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸を比較することが可能である。第１の配列内の位置が第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸によって占められている場合、それらの分子はその位置について同一である。２つの配列の間の同一性（％）は、該配列によって共有される同一な位置の数の関数である。例えば、特定のペプチドが規定の長さの参照ポリペプチドに対して具体的な同一性（％）を有すると言われる場合、その同一性（％）は参照ペプチドに関するものである。よって、長さ１００アミノ酸の参照ポリペプチドに対して５０％同一であるペプチドとは、その参照ポリペプチドの長さ５０アミノ酸の部分と完全に同一な５０アミノ酸のポリペプチドであってもよい。さらに、参照ポリペプチドの長さ全体にわたって５０％同一な、長さ１００アミノ酸のポリペプチドであることも考えられる。２つの配列の同一性（％）についてのそのような決定は、数学的アルゴリズムを使用して遂行可能である。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好適な非限定的実例は、カーリン（Karlin）ら、米国科学アカデミー紀要（PNAS USA）、１９９３年、第９０巻、ｐ．５８７３−５８７７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれており、前記プログラムは本発明のアミノ酸配列に対して所望の同一性を有する配列を同定するために使用可能である。比較の目的でギャップ付き（gapped）アラインメントを得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをアルツシュル（Altschul）ら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res ）、１９９７年、第２５巻、ｐ．３３８９−３４０２に記載されているようにして利用することが可能である。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することが可能である。配列はさらに、ジェネティック・コンピューティング・グループ（Genetic Computing Group ）のＧＡＰ（グローバルアラインメントプログラム）のバージョン９を使用し、デフォルト（ＢＬＯＳＵＭ６２）マトリックス（−４〜＋１１の値）を−１２のギャップオープンペナルティ（ギャップの最初のヌル（null）について）及び−４のギャップ伸長ペナルティ（ギャップ中の個々の追加の連続ヌルごとに）とともに使用して、アラインされてもよい。アラインメント後、同一性（％）は、一致した数を許請求の範囲に記載された配列中のアミノ酸の数の百分率として表現することにより算出される。２つのアミノ酸配列の同一性（％）を決定する上記方法は、核酸配列に相応に適用することが可能である。
【００９１】
本発明のペプチドは、直接、又はリンカーを介して連結されうる。この文脈での「リンカー」は通常はペプチド、オリゴペプチド又はポリペプチドであり、複数のペプチドを互いに連結するために使用されうる。互いに連結されるように選択される本発明のペプチドは、同一の配列である可能性もあるし、又は本発明のペプチドのうち任意のものから選択される。リンカーは、１〜１０アミノ酸の長さ、より好ましくは１〜５アミノ酸の長さ、最も好ましくは１〜３アミノ酸の長さを有することが可能である。ある実施形態では、リンカーは何らかの二次構造を形成する特性を有することは必要とされない、すなわち、例えばリンカーが少なくとも３５％のグリシン残基からなる場合にα‐らせん又はβ‐シート構造を形成する傾向を必要としない。本明細書中に前述されるように、リンカーは、正常な細胞のプロセスによって細胞内で開裂せしめられてそれまで連結していたペプチドの細胞内用量を有効に上昇させる一方、細胞外用量は有毒とはみなされないように十分低く保つことが可能な、ＭＭＰペプチドのような開裂可能なペプチドであってよい。細胞内で／内発的に開裂可能なペプチド、オリゴペプチド、又はポリペプチド配列のリンカーとしての使用は、該ペプチドが標的細胞への送達後に互いに分離することを可能にする。この意味での開裂可能なオリゴペプチド又はポリペプチドの配列にはさらに、プロテアーゼで開裂可能なオリゴペプチド又はポリペプチドの配列であって、プロテアーゼ切断部位は典型的には処置される細胞により内生的に発現されるプロテアーゼに応じて選択される、配列も含まれる。上記に定義されるようなリンカーは、オリゴペプチド又はポリペプチドの配列として存在する場合、Ｄ‐アミノ酸又は天然に存在するアミノ酸（すなわちＬ‐アミノ酸）のいずれかからなることが可能である。上記の別例として、ペプチドのカップリング又は融合が、カップリング剤又はコンジュゲート剤、例えば架橋試薬を介して遂行されることも可能である。利用可能ないくつかの分子間架橋試薬があるが、例えば、ミーンズ（Means ）及びフィーニー（Feeney）、「タンパク質の化学修飾（Chemical Modification of Proteins ）」、１９７４年、ホールデン‐デイ（Holden-Day）、ｐ．３９−４３を参照されたい。これらの試薬の中には、例えば、Ｎ‐スクシンイミジル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）又はＮ，Ｎ’‐（１，３‐フェニレン）ビスマレイミド；Ｎ，Ｎ’‐エチレン‐ビス‐（ヨードアセトアミド）又はその他の６〜１１個の炭素メチレンブリッジを有するそのような試薬；及び１，５‐ジフルオロ‐２，４‐ジニトロベンゼンがある。この目的に有用なその他の架橋試薬には：ｐ，ｐ’‐ジフルオロ‐ｍ，ｍ’‐ジニトロジフェニルスルホン；アジプイミド酸ジメチル；フェノール‐１，４‐ジスルホニルクロリド；ヘキサメチレンジイソシアナート若しくはジイソチオシアナート、又はアゾフェニル‐ｐ‐ジイソシアナート；グルタルアルデヒド及びジスジアゾベンジジン（disdiazobenzidine）が挙げられる。架橋試薬は、ホモ二官能性、すなわち同一の反応を生じる２つの官能基を有していてよい。好ましいホモ二官能性の架橋試薬はビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）である。ＢＭ���は、穏やかな条件下（ｐＨ６．５〜７．７）でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する２個のマレイミド官能基を含有する。２個のマレイミド基は炭化水素鎖によって接続されている。したがって、ＢＭＨは、システイン残基を含有するタンパク質（又はポリペプチド）の不可逆的な架橋結合に有用である。架橋試薬はヘテロ二官能性であってもよい。ヘテロ二官能性の架橋試薬は、２個の異なる官能基、例えば、それぞれ遊離のアミン及びチオールを有する２つのタンパク質を架橋結合するであろうアミン反応性基及びチオール反応性基、を有する。ヘテロ二官能性の架橋試薬の例は、スクシンイミジル４‐（Ｎ‐マレイミドメチル）シクロヘキサン‐１‐カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、ｍ‐マレイミドベンゾイル‐Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、及びＭＢＳの鎖延長型のアナログであるスクシンイミド４‐（ｐ‐マレイミドフェニル）ブチラート（ＳＭＰＢ）、である。第一級アミンを備えたこれらの架橋試薬のスクシンイミジル基、及びチオール反応性のマレイミドは、システイン残基のチオールとともに共有結合を形成する。架橋試薬は水中での溶解度が低いことが多いので、スルホナート基のような親水性部分が、水中溶解度を改善するために架橋試薬に付加されてもよい。スルホＭＢＳ及びスルホＳＭＣＣは、水への溶解度のために修飾された架橋試薬の例である。数多くの架橋試薬が、細胞条件の下では本質的に開裂不可能なコンジュゲートを生じる。したがって、いくつかの架橋試薬は、細胞条件の下で開裂可能な、ジスルフィドのような共有結合を含有する。例えば、トラウト試薬すなわちジチオビス（スクシンイミジルプロピオナート）（ＤＳＰ）、及びＮ‐スクシンイミジル３‐（２‐ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）は、良く知られた開裂可能な架橋剤である。開裂可能な架橋試薬の使用により、細胞が架橋試薬の特定の配列を開裂することが可能であるという条件で、望ましい場合には、ペプチドが標的細胞内への送達後に分離されることが可能となる。この目的には、直接的なジスルフィド結合も有用であるかもしれない。化学的架橋にはさらに、スペーサーアームの使用も挙げられる。スペーサーアームは、分子内の可撓性を提供するか、又はコンジュゲートされた部分どうしの間の分子内距離を調節し、これにより生物活性の維持を支援しうる。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸（例えばプロリン）を含むタンパク質（又はポリペプチド）部分の形態であってもよい。別例として、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（米国イリノイ州ロックフォードのピアス・ケミカル社（Pierce Chem. Co.）カタログ番号２１６５１Ｈ）におけるような架橋試薬の一部であってもよい。上記に議論されたものを含む多数の架橋試薬が市販されている。それらを使用するための詳細な説明書は、商品の供給業者から容易に入手可能である。タンパク質の架橋及びコンジュゲートの調製についての一般的参照文献は：ウォン（Wong）、「タンパク質のコンジュゲーション及び架橋の化学（Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking）」、１９９１年、シーアールシープレス（CRC Press ）、である。
【００９２】
本発明のペプチドはさらに、「誘導体」、「バリアント」、又は「機能性フラグメント」、すなわち、上記に定義されるような本発明のペプチドの天然に存在する（Ｌ‐アミノ酸の）配列から、該アミノ酸配列の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の置換を経るか、天然に存在する配列の任意の部位における１つ以上のアミノ酸の欠失を経るか、天然に存在するペプチド配列の１つ以上の部位における１つ以上のアミノ酸の挿入を経るか、のうち少なくともいずれかにより得られたペプチドの配列も包含しうる。「誘導体」は、本発明のペプチドとして使用される場合、その生物学的活性を保持しているものとし、例えば、本発明のペプチドのうち任意のものの誘導体はその神経保護活性を保持しているものとする。本発明の文脈における誘導体はさらに、上記に定義されるような該誘導体のＬ‐アミノ酸若しくはＤ‐アミノ酸の配列の形態で、又は両方の形態でも生じうる。
【００９３】
本発明のペプチドの誘導体の調製のためにアミノ酸の置換が実行される場合、保存的な（アミノ酸）置換が好ましい。保存的な（アミノ酸）置換には、典型的には次のグループ：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン及びグルタミン；セリン及びトレオニン；リジン及びアルギニン；並びに、フェニルアラニン及びチロシン、のグループ内での置換が挙げられる。よって、好ましい保存的置換グループは、アスパルラギン酸‐グルタミン酸；アスパラギン‐グルタミン；バリン‐ロイシン‐イソロイシン；アラニン‐バリン；及びフェニルアラニン‐チロシン、である。そのような突然変異によって、例えば、ペプチドの安定性及び有効性のうち少なくともいずれか一方が増強される場合がある。突然変異がペプチドに導入される場合、該ペプチドは、例えば、配列において、機能において、及び抗原としての形質又は他の機能において、（機能的に）相同なままである。ペプチドのそのような突然変異した構成要素は、ある種の適用について本発明のペプチドの変化していない配列よりも有利な場合のある変化した特性を有する可能性がある（例えば、ｐＨ最適条件の拡大、温度安定性の上昇など）。
【００９４】
本発明のペプチドの誘導体は、本発明のペプチドの改変されていない配列とほぼ同一であるとして定義される。特に好ましいのは、天然に存在するアナログに対する少なくとも３０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、なお好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、なお好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、さらになお好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは９０％の配列同一性及び最も好ましくは少なくとも９５％又は９９％もの配列同一性を有するアミノ酸配列である。本発明のペプチドの機能的誘導体の合成又は単離のための、並びに２つのアミノ酸配列の同一性（％）の決定のための、適切な方法については上述されている。加えて、上記に開示されるようなペプチドの誘導体の生産のための方法は良く知られており、当業者に周知の以下の標準的な方法に従って実行可能である（例えば、サムブルック（Sambrook）Ｊ、マニアティス（Maniatis）Ｔ、１９８９年を参照されたい）。
【００９５】
さらなる実施形態として、本発明は、本明細書中に定義されるようなペプチドを含む医薬組成物又は薬剤を提供する。ある実施形態では、そのような医薬組成物又は薬剤は、本明細書中に定義されるように、ペプチドのほかに任意選択のリンカーも含む。加えて、そのような医薬組成物又は薬剤は、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクルを含むことが可能である。本発明による「薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクル」は、共に調合されるペプチドの薬理学的活性又は生理学的な標的指向を破壊しない無毒な担体、アジュバント、又はビヒクルを指す。本発明の医薬組成物に使用可能な薬学的に許容可能な担体、アジュバント、又はビヒクルには、限定するものではないが、頭蓋若しくは頭蓋内に適用可能であるか、又は血液脳関門（ＢＢＢ）を横断可能であるものが挙げられる。上記にかかわらず、本発明の医薬組成物は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合剤、水、塩類又は電解質、例えばリン酸水素２ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダル‐シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ろう、ポリエチレン‐ポリオキシプロピレン‐ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及び羊毛脂を含みうる。
【００９６】
本発明の医薬組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔内に、経膣的に、脳内に、又は移植されたリザーバを介して、投与されうる。
【００９７】
本明細書中で使用されるような非経口的という用語には、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、脊髄腔内、肝臓内、病巣内及び頭蓋内への注射又は注入の技法が含まれる。医薬組成物は、経口的に、腹腔内に、又は静脈内に投与される。本発明の医薬組成物の無菌の注射剤型は、水性又は油性の懸濁液であってよい。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を使用して、当分野で既知の技法に従って調合可能である。無菌の注射用調製物はさらに、無毒な非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の、例えば１，３‐ブタンジオールの中の溶液としての、無菌の注射用の溶液又は懸濁液であってよい。使用されうる許容可能なビヒクル及び溶媒の中には、水、リンゲル液及び等張食塩水がある。さらに、無菌の固定油は溶媒又は懸濁媒として従来通りに使用される。
【００９８】
そのため、合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油が使用されうる。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、天然の薬学的に許容可能な油、例えばオリーブ油又はヒマシ油などが特にそのポリオキシエチル化物であるときのように、注射剤の調製に有用である。これらの油中溶液又は懸濁液はさらに、長鎖アルコールの希釈剤又は分散剤、例えばカルボキシメチルセルロース又は類似の分散剤であって、乳剤及び懸濁液を含む薬学的に許容可能な剤形の調合において一般に使用されるものも含有しうる。その他の一般に用いられている表面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）、Ｓｐａｎ（登録商標）及び他の乳化剤又は生物学的利用能増強剤であって薬学的に許容可能な固体、液体、又はその他の剤形の製造に一般に使用されるものも、調合を目的として使用されうる。
【００９９】
本明細書中の薬学的に許容可能な組成物は、任意の経口的に許容可能な剤形、例えば、限定するものではないがカプセル剤、錠剤、水性の懸濁液又は溶液に含めて経口投与されうる。経口的な使用のための錠剤の場合、一般に使用される担体にはラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような平滑剤も典型的には加えられる。カプセルの形態での経口投与については、有用な希釈剤にはラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化剤及び懸濁化剤と組み合わされる。望ましい場合には、ある種の甘味料、調味料又は着色剤も添加されうる。
【０１００】
別例として、本明細書中に定義されるような医薬組成物は、直腸内投与用の坐薬の形態で投与される場合もある。そのような坐薬は、作用薬を、室温では固体であるが直腸温では液体であることから直腸中では溶けて薬物を放出することになる適切な非刺激性の賦形剤とともに混合することにより、調製可能である。そのような材料には、ココアバター、みつろう及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【０１０１】
本明細書中に定義されるような医薬組成物は、特に治療の標的が局所適用により容易にアクセス可能な区域又は器官を含んでいる、例えば脳、その他の頭蓋内組織、眼、若しくは皮膚の疾患などの場合、局所投与されてもよい。適切な調合物は、これらの区域又は器官のそれぞれについて容易に調製される。
【０１０２】
局所適用については、本明細書中に定義されるような医薬組成物は、１つ以上の担体中に懸濁又は溶解された、本明細書中で同定されるようなペプチドを含有する適切な軟膏に調合されうる。ペプチドの局所投与のための担体には、限定するものではないが、鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう及び水が挙げられる。別例として、本明細書中に定義されるような医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な担体中に懸濁又は溶解されたペプチドを含有する適切なローション剤又はクリーム剤に調合可能である。適切な担体には、限定するものではないが、鉱油、ソルビタンモノステアラート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２‐オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水が挙げられる。
【０１０３】
本明細書中に定義されるような医薬組成物は、鼻エアロゾル又は吸入によって投与されてもよい。そのような組成物は、医薬製剤の分野において良く知られた技法によって調製可能であり、ベンジルアルコール又はその他の適切な保存剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及びその他の従来の可溶化剤又は分散剤のうち少なくともいずれかを使用して、食塩水中の溶液として調製されうる。本明細書中の薬学的に許容可能な組成物又は薬剤は、経口投与用、又は例えば注射による非経口投与用に、調合される。
【０１０４】
治療のためには、無毒であり、ダメージを低減する、有効な量のペプチドが、上記に定義されるような医薬組成物の調製に使用されうる。したがって、ある量のペプチドが、上記に定義されるような組成物を生じるために担体材料と組み合わされうる。医薬組成物は典型的には単回（又は複数回）投薬形態で調製されるが、これは治療される被治療者及び特定の投与様式に応じて変化することになろう。通常、医薬組成物は、ペプチドを１日に体重１ｋｇあたり０．０００１〜１００ｍｇという１用量当たりの投薬量範囲が、該医薬組成物を投薬される患者に投与されることが可能であるように、調合される。１用量当たりの好ましい投薬量範囲は、１日に体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１日に体重１ｋｇあたり５０ｍｇの範囲であり、１用量当たりのさらなる好ましい投薬量範囲は、１日に体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１日に体重１ｋｇあたり１０ｍｇの範囲である。しかしながら、上記に言及されるような投薬量範囲及び治療レジメンは、任意の特定の患者について、様々な要因、例えば使用される特異的なペプチドの活性、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与の時間、排出の速度、薬物の併用、治療している医師の判断及び治療されている特定の疾患の重症度、に応じて適切に合わせることができる。これに関連して、投与は初期の投薬量範囲でなされうるが、該投薬量範囲は治療の時間とともに、例えば、上記に述べたような範囲内で初期の投薬量範囲を増加又は減少させることによって、変化せしめられてもよい。別例として、投与は、具体的な投薬量範囲が投与されることにより連続方式で実行され、それにより治療の時間全体にわたって初期の投薬量範囲が維持されてもよい。例えば、投薬量範囲が治療の様々なセッションの間で適合せしめられる（増加又は減少せしめられる）が単一のセッション内では一定に保たれて、様々なセッションの投薬量範囲が互いに異なるようになっている場合、両方の投与形態を更に組み合わせることができる。
【０１０５】
本発明の医薬組成物及びペプチドのうち少なくともいずれか一方は、本明細書中に開示されるように、細胞、特に哺乳動物細胞への損傷の有害な影響に関係する疾患の治療、改善又は予防のために、特に神経の損傷、例えば脳卒中又は脊髄損傷、てんかん、周産期の低酸素性虚血、脳又は脊髄への虚血性若しくは外傷性の損傷、及び中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞へのダメージ、例えば、限定するものではないが、急性のＣＮＳ損傷、虚血性の脳卒中若しくは脊髄損傷、並びに無酸素症、虚血、機械的損傷、神経障害性の疼痛、興奮毒性、及び関連する損傷の治療のために、使用可能である。更に、本発明の医薬組成物及びペプチドは、興奮毒性及び虚血による損傷、興奮毒性、神経栄養性の支援の欠乏、離断、神経細胞へのダメージ、例えばてんかん、慢性的神経変性状態などに対する、神経活性効果又は神経保護効果を、又は治療を、提供するために使用可能である。これに関連して、興奮毒性は、卒中、外傷性脳損傷及び中枢神経系（ＣＮＳ）の神経変性疾患、例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、神経障害性の疼痛、結合組織炎、パーキンソン病（ＰＤ）、周産期の低酸素性虚血、及びハンチントン舞踏病に特に関与している可能性があり、前記疾患は本明細書中において治療可能である。神経細胞周囲の過剰なグルタミン酸濃度を引き起こし、かつ本明細書中で治療されうるその他の一般的状態は、低血糖症、血管痙攣、ベンゾジアゼピン離脱症状及びてんかん重積持続状態、緑内障／網膜神経節細胞の劣化などである。
【０１０６】
上記に定義されるような哺乳動物細胞に対する損傷の有害な影響に関係するほかに、本明細書中で言及されるようなさらなる疾患又は障害に関係する疾患の治療、改善又は予防は、典型的には、本発明の医薬組成物又はペプチド若しくはペプチド混合剤を、本明細書中に記載されるような投薬量範囲で投与することにより実行される。医薬組成物又はペプチドの投与は、興奮毒性及び（虚血性）脳損傷のうち少なくともいずれか一方、すなわち哺乳動物細胞への損傷の有害な影響の、発症に先立って実行されてもよいし、同時的又はその後に実行されてもよく；例えば、医薬組成物又はペプチドの投与は、脳卒中又は脊髄損傷、脳又は脊髄への虚血性又は外傷性の損傷、及び一般に、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞へのダメージの後、１時間以内（まで）（０〜１時間）、２時間まで、３〜５時間まで、又は２４時間若しくはそれ以上までに実行されうる。慢性的神経変性障害（ＡＤ、ＰＤ、ＡＬＳ、ＭＳなど）では、治療は生涯にわたる毎日の治療を必要とするかもしれない。
【０１０７】
治療的に使用される場合、本発明の化合物は治療上有効な量で投与される。一般に、治療上有効な量とは、治療される特定の状態の発生を遅らせるか、該状態の進行を抑制するか、該状態を完全に止めるのに必要な量を意味する。治療上有効な量は、具体的には、卒中又はその他の大脳の虚血発作の後の神経細胞の生存に望ましい影響を及ぼす量になるであろう。一般に、治療上有効な量は、いずれも当業者によって判断可能な、対象者の年齢及び状態、並びに対象者における疾患の性質及び程度に応じて変わることになろう。投薬量は、特に何らかの合併症が認められている場合には、個々の医師によって調整されうる。
【０１０８】
上記に言及されるように、本発明の１つの態様は、単離ペプチド又はそのバリアントをコードする核酸配列及びその誘導体、並びにストリンジェントな条件下で上記のヌクレオチド配列で構成されている核酸分子にハイブリダイズするその他の核酸配列に関する。本明細書中で使用されるような用語「ストリンジェントな条件」とは、当分野には馴染みのパラメータを指す。核酸ハイブリダイゼーションのパラメータは、そのような方法を編集した参照文献、例えばＪ．サムブルック（Sambrook）ら編「分子クローニング：実験の手引き（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第二版、１９８９年、米国ニューヨーク・コールドスプリングハーバーのコールド・スプリング・ハーバー研究所出版社（Cold Spring Harbor Laboratory Press ）、又はＦ．Ｍ．オースベル（Ausubel ）編「分子生物学の最新プロトコール（Current Protocols in Molecular Biology）」、米国ニューヨークのジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（John Wiley and Sons, Inc. ）において見出されうる。より具体的には、ストリンジェントな条件は、本明細書中で使用されるように、ハイブリダイゼーションバッファー（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり；ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写されたメンブレンは２×ＳＳＣで室温にて洗浄され、その後０．１×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳで６５℃にて洗浄される。
【０１０９】
本発明は、上記の調合物のうち少なくとも１つに含められた上述の医薬組成物（１つ以上の容器に入ったもの）と、該医薬組成物の適用に関わる指示及び情報のうち少なくともいずれか一方に関する取扱説明書又は情報小冊子とを含むキットを更に提供する。
【０１１０】
本明細書の全体にわたって、特に別記しない限り、又は文脈からそうでないことが必要とされない限り、単一のステップ、物の組成物、ステップ群又は物の組成物群への言及は、１つ及び複数（すなわち１つ以上）のそれらのステップ、物の組成物、ステップ群又は物の組成物群を包含するように解釈されるものとする。
【０１１１】
本発明の分野の当業者は、本明細書中に記載された発明が具体的に記載されたもの以外の変形形態及び改変形態を許容しうることを認識するであろう。当然ながら、本発明はそのような機能上の変形形態及び改変形態をすべて含む。本発明はさらに、本明細書中で言及又は表示されたステップ、特徴、組成物及び化合物すべてを、個々に又は総体として、並びに前記のステップ又は特徴のあらゆる組み合わせ又は任意の２つ以上を、含んでいる。本発明は、単に例証目的が意図されているにすぎない本明細書中に記載された具体的な実施形態によって、範囲を限定されるべきではない。機能的に等価な生成物、組成物及び方法は、本明細書中に記載されるように、明らかに本発明の範囲内にある。更に、本発明は、別段の指示がないかぎり、分子生物学、微生物学、神経生物学、ウイルス学、組換えＤＮＡ技術、溶液中ペプチド合成、固相ペプチド合成、及び免疫学の従来の技法、又は本明細書中で引用された技法を使用して、不適当な実験作業を伴うことなく実施される。
【０１１２】
本出願人は、驚くべきことに、ある種のＣＰＰ、特にアルギニンに富んだペプチドが、過去に同定された神経保護ペプチドに融合されるという従来の必要性を伴うことなく神経保護性の効能を示すことを見出した。これらのＣＰＰのうちあるものはさらに低い毒性も示し、かつ低い用量又は濃度で機能的である。これらのＣＰＰにはペネトラチン及びＰｅｐ‐１が含まれる。しかしながら、さらに驚くべきことに、本出願人は、長さ１０〜２０残基（両端値を含む）、好ましくは長さ１０〜１８残基（両端値を含む）のポリアルギニンペプチドのような長く連なった塩基性（すなわちカチオン性）アミノ酸、及びプロタミン又はＬＭＷＰのような１０残基を超えるアルギニンを含有するある種のペプチドは、上記のＣＰＰと比較された場合、特にＲ１〜Ｒ８のようなより短いアルギニンに富む配列と同様の濃度で比較された時、非常に高い神経保護活性を示すことも見出した。特に、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８は、グルタミン酸損傷モデル及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血性損傷モデルのうち少なくともいずれか一方においてアッセイされた時、上述のＣＰＰと比較して高い神経保護を提供した。この２つの異なる神経細胞損傷モデルは異なる有害な細胞経路を活性化する可能性が高く、したがって本発明のペプチドの神経保護の範囲及び可能な作用様式に対する一層の洞察を提供することになろう。
【０１１３】
本明細書中、略語「Ａｒｇ」に整数が後続するものは、その数のアルギニンがペプチド中で繰り返されていることを示す。よって、Ａｒｇ‐１５（アルギニンに関するＩＵＰＡＣの一文字略号に従ってＲ１５と略記される）は、ペプチド形成における連続アルギニン残基を指す。しかしながら、実行可能な限り、本明細書は一文字アミノ酸コードを、すなわち例えばＡｒｇ‐１５の代わりにＲ１５を用いることになろう。
【０１１４】
［神経細胞死を伴う神経細胞障害］
神経障害、例えば片頭痛、卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷  てんかん、周産期の低酸素性虚血、並びにハンチントン舞踏病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）及び筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む神経変性障害は、長期の脳損傷から生じる病的状態及び能力障害の主な原因である。脳損傷は一般に、アポトーシス、自食作用、ネクロプトーシス及びネクローシスを含む一連の細胞死プロセスを伴い、神経細胞である星状細胞、オリゴデントロサイト、ミクログリア及び血管内皮細胞（まとめて神経血管単位；ＮＶＵと呼ばれる）に影響を及ぼす。神経の損傷に関与する有害な誘因は、グルタミン酸興奮毒性のカルシウム過負荷、酸化ストレス、タンパク質分解酵素及びミトコンドリアの異常を伴う種々の経路に関わっている。本明細書中で使用されるように、用語「卒中」には、脳又は脊髄に影響する任意の虚血性障害、例えば脳又は脊髄の動脈における血栓塞栓性の閉塞、重症の低血圧、周産期の低酸素虚血、心筋梗塞、低酸素、脳内出血、血管痙攣、末梢血管障害、静脈血栓症、肺塞栓、一過性脳虚血発作、肺虚血、不安定狭心症、可逆性虚血性神経症候、補助的な血栓溶解活性、過度の凝血状態、大脳の再潅流障害、鎌状赤血球貧血、卒中障害によるか若しくは医原的に誘発された虚血期間、例えば血管形成術、又は脳虚血、が含まれる。
【０１１５】
神経伝達物質であるグルタミン酸の細胞外レベルの上昇は、興奮毒性によって引き起こされた急性及び遅発性の有害なプロセスを介した神経細胞死の原因となる場合がある。細胞外のグルタミン酸の蓄積は、ＮＭＤＡ受容体及びＡＭＰＡ受容体、並びに続いてＶＧＣＣ、ＮＣＸ、ＴＲＭＰ２／７、ＡＳＩＣ及びｍＧｌｕ受容体を過剰刺激する結果として、細胞外のカルシウム及びナトリウムイオンの流入並びに細胞内貯蔵部位からの結合カルシウムの放出をもたらす。ＮＭＤＡ受容体の過剰活性化はさらに、有害な分子（例えば、一酸化窒素、ＣＬＣＡ１；カルシウム活性化塩素チャネル調節因子１、カルパイン、ＳＲＥＢＰ１：ステロール調節エレメント結合タンパク質‐１）の産生及びシグナル伝達経路（例えばＤＡＰＫ；細胞死関連タンパク質キナーゼ、ＣａｍＫＩＩ：カルシウム‐カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ）を誘発することも可能である。細胞内カルシウムの増加は、ホスホリパーゼ、タンパク質分解酵素、ホスファターゼ、キナーゼ及び一酸化窒素合成酵素を伴う一連の細胞に有害な事象、並びに細胞死（すなわちアポトーシス、自食作用、ネクロプトーシス及びネクローシス）を誘発する経路の活性化を引き起こす。
【０１１６】
本発明のペプチドは神経細胞の死を防ぐことが本明細書中において示されているので、国際公開第２００９１３３２４７号及び欧州特許第１９６９００３号明細書に包含された開示は、本発明のペプチドがさらに、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、又はてんかんの治療及び予防のうち少なくともいずれか一方に、並びにそれに応じて本明細書中に記載されたその他の関連する病的状態にも適用されることを示している。従って、本発明は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、てんかん、脊髄損傷、糖尿病又は薬物嗜癖の治療のための方法であって、薬学的に有効な量の本発明のペプチドのうちいずれか１つ以上が患者に投与される方法に関する。換言すれば、本発明によるペプチドは、虚血に関連した損傷のほかに、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン舞踏病（ＨＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、急性散在性脳脊髄膜炎（ＡＤＥＭ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、卒中、末梢神経障害、てんかん、脊髄損傷及び本明細書中に記載されたその他の関連する病的状態の、治療に使用するためのものである。
【０１１７】
製薬上の適用においては、ペプチドは、例えばコアセルベーション技法若しくは界面重合法（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンのマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリラート）のマイクロカプセル）によって調製されたマイクロカプセル中に、コロイド系薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョン中に、封入されることも可能である。そのような技法は「レミングトンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences ）」に開示されている。これは徐放性調製物を使用して遂行されることもできる。徐放性調製物の適切な例には、ペプチドを包含している固体の疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、例えばフィルムのような成形物、又はマイクロカプセルの形態である、マトリックスが挙げられる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ランガー（Langer）ら、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ（J. Biomed. Mater. Res.）、１９８１年、第１５巻、ｐ．１６７−２７７及びランガー、ケムテック（Chem.Tech.）、１９８２年、第１２巻、ｐ．９８−１０５に記載されているようなヒドロゲル、若しくはポリビニルアルコール、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書、欧州特許第５８，４８１号明細書）、又は非分解性のエチレン酢酸ビニルが挙げられる。
【０１１８】
１つの実施形態では、上記に定義されるような本発明のペプチドを含む医薬組成物は、虚血による損傷、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、卒中、末梢神経障害、又はてんかんの治療に使用するためのものである。別の実施形態では、本発明は、神経細胞を本発明のペプチド又はその組み合わせと接触させるステップを含む、神経細胞の生存を促進するための方法を提供する。該方法は本明細書中に示されるようにｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施可能である。
【０１１９】
本発明の背景を明らかにするために、かつ特に本発明の実行に関するさらなる詳細を提供するために、本明細書中で使用される出版物及びその他の資料は、参照により本願に組み込まれる。本発明は以下の実施例においてさらに説明されており、該実施例は本発明の範囲を限定するようには意図されていない。
【０１２０】
実施例（下記の表１、２及び５のポリアルギニンペプチド並びにアルギニンに富んだペプチド及びアルギニンに富んだプロタミンペプチド）。
［硫酸プロタミン、プロタミンペプチド及びその他のペプチド］
ペプチドは表５に列挙されている。硫酸プロタミン（プロタミン；Ｐｔｍ）はサノフィ・アベンティス（Sanofi Aventis）から入手された。低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）はミモトープス株式会社（Mimotopes Pty Ltd ）（オーストラリア連邦）によって合成された。プロタミンペプチド１〜５（Ｐｔｍ１、Ｐｔｍ２、Ｐｔｍ３、Ｐｔｍ４、Ｐｔｍ５）はペプミック株式会社（Pepmic Co Ltd ）（中華人民共和国）よって合成された。ペプチドは９０〜９８％を超えるようにＨＰＬＣ精製された。ペプチドはすべて通常生理食塩溶液中で１００×ストック（５００μＭ）として調製され、損傷モデルに応じて０．１〜１０μＭの濃度範囲で評価された。
【０１２１】
注目すべきは、硫酸プロタミン（プロタミン；Ｐｔｍ）がＰｔｍ１〜Ｐｔｍ４１の混合剤であることである。プロタミンペプチド（Ｐｔｍ、Ｐｔｍ１〜５、ＬＭＷＰ）はアルギニンに富んでいる。
【０１２２】
方法（ポリアルギニンペプチド及びアルギニンに富んだペプチド）
［初代皮質神経細胞培養物］
皮質培養物の確立は以前に記載されたとおりとした（メロニ（Meloni）ら、２００１年）。簡潔に述べると、Ｅ１８〜Ｅ１９のスプレーグ・ドーリー（Sprague-Dawley）ラット由来の皮質組織は、１．３ｍＭのＬ‐システイン、０．９ｍＭのＮａＨＣＯ３、１０ユニット／ｍｌのパパイン（米国のシグマ（Sigma ））及び５０ユニット／ｍｌのＤＮアーゼ（シグマ）を補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；オーストラリア連邦のインビトロジェン（Invitrogen））の中で解離せしめられ、冷ＤＭＥＭ／１０％ウマ血清の中で洗浄された。神経細胞は、２％のＢ２７（登録商標）サプリメント（Ｂ２７；インビトロジェン）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）（インビトロジェン）の中で再懸濁された。播種の前に、９６ウェルサイズのガラスウェル（直径６ｍｍ、オーストラリア連邦のプロテック（ProTech ））又は９６ウェルのプラスチックプレート（オーストラリア連邦のプロサイテック（ProSciTech））は、ポリＤリジンで一晩コーティングされた（５０ｍｌ／ウェル：５０ｍｇ／ｍＬ；７０〜１５０Ｋ、シグマ）。その後、過剰なポリＤリジン溶液は除去され、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（２％のＢ２７；４％のウシ胎児血清；１％のウマ血清；６２．５ｍＭのグルタミン酸；２５ｍＭの２‐メルカプトエタノール；並びに３０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン及び３０ｍｇ／ｍＬのペニシリンを含有）に置き換えられた。神経細胞はプレート培養されて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの１１〜１２日目に各ウェルにつき〜１０，０００個の生存能力のある神経細胞が得られた。神経細胞培養物は、ＣＯ２インキュベータ（５％ＣＯ２、９５％空気のバランス、湿度９８％）中で３７℃に維持された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの４日目に培地に３分の１が除去され、有糸分裂阻害剤であるシトシンアラビノフラノシド（終濃度１ｍＭ；シグマ）を含有する新鮮なＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に置き換えられた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの８日目に、培地の半分がＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に置き換えられた。培養物はｉｎ  ｖｉｔｒｏの１１日目又は１２日目に使用されたが、その後は常に＞９７％の神経細胞及び１〜３％の星状細胞で構成されている（メロニ（Meloni）ら、２００１年）。
【０１２３】
［使用された他の細胞株］
脳内皮細胞株（ｂＥＮＤ３）及び神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ）も、いくつかの実験に使用された。ｂＥＮＤ３及びＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞は、５％又は１５％のウシ胎仔血清を加えたＤＭＥＭ中で標準的技法を使用して培養された。ラットの初代星状細胞は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７の代わりにＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清が使用され、有糸分裂阻害剤であるシトシンアラビノフラノシドは使用されなかった以外は、皮質神経細胞について記載されたようにして入手及び培養された。
【０１２４】
［細胞透過性ペプチド及び対照ペプチド］
表１に列挙されたペプチドは、ペプスキャン・プレスト（Pepscan Presto）（オランダ国）により合成されたＴＡＴ‐Ｌ、並びにチャイナペプチド株式会社（China Peptide Co., Ltd）により合成されたＲ９／ｔＰＡ／Ｒ９、ＮＣＸＢＰ３及びＲ９／Ｘ７／Ｒ９を除き、ミモトープス株式会社（Mimotopes Pty Ltd ）（オーストラリア連邦）によって合成された。表２に列挙されたペプチドは、チャイナペプチド（China Peptides）（中華人民共和国）によって合成された。ペプチドは８８〜９６％を超えるようにＨＰＬＣ精製された。ＴＡＴ‐Ｌ、ペネトラチン、Ｒ９及びＰｅｐ‐１はＬ型アイソフォームで、ＴＡＴ‐Ｄ及びＡｒｇ９‐ＤはＤ型アミノ酸から逆配列で合成されるプロテアーゼ耐性のＤ‐レトロインベルソ型（以降Ｄ型アイソフォームと称する）で、合成された（ブルギドウ（Brugidou）ら、１９９５）（表１）。Ｄ型アイソフォームのＴＡＴ融合型ＪＮＫ阻害ペプチド（ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ）及びＬ型アイソフォームのＴＡＴ融合型ＡＰ‐１阻害ペプチド（ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ）が、陽性対照として使用された（表１；ボルセロ（Borsello）ら、２００３年；ミード（Meade ）ら、２０１０年ｂ）。ペプチドはすべて通常生理食塩溶液中で１００×ストック（５００μＭ）として調製され、損傷モデルに応じて０．１〜１５μＭの濃度範囲で評価された。ＴＡＴ‐Ｌペプチドはグルタミン酸興奮毒性モデルにおいてのみ使用された。
【０１２５】
【表４−１】
0006495270.tif 000006
【表４−２】
0006495270.tif 000007
【０１２６】
［グルタミン酸及びカイニン酸及びＮＭＤＡ興奮毒性モデル並びにペプチドインキュベーション］
ペプチドは、グルタミン酸又はカイニン酸への曝露の１５分前に、培地を除去してＣＰＰ、対照ペプチド又はＭＫ８０１／ＣＮＱＸを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７を５０μｌ加えることにより、培養ウェル（９６ウェルプレート型式）に添加された。興奮毒性を誘発するために、５０μｌの、グルタミン酸（２００μＭ）又はカイニン酸（４００μＭ）又はＮＭＤＡ（２００μＭ）を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７が培養ウェルに添加された（終濃度は１００μＭグルタミン酸、２００μＭカイニン酸及びＮＭＤＡは１００μＭ）。培養物は、グルタミン酸については５分間、カイニン酸については４５分間及びＮＭＤＡへの曝露については１０分間、ＣＯ２インキュベータにて３７℃でインキュベートされ、その後培地は、１００μｌの、５０％のＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｎ２サプリメント（インビトロジェン）及び５０％の平衡塩類溶液（ＢＳＳ；以下参照）に置き換えられた。培養物はＣＯ２インキュベータにて３７℃でさらに２４時間インキュベートされた。グルタミン酸又はカイニン酸による処置の有無に関わらず、未処置の対照には同じ洗浄及び培地添加が行われた。
【０１２７】
１つの実験では、１５分間のＣＰＰインキュベーション（５又は１０μＭ）に続いて、ウェル中の培地が除去され、ウェルは３００μｌのＢＳＳで１回洗浄されてからグルタミン酸を含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７（１００μＭ／１００μｌ）を添加された。このステップに続いて、培養物は上述のように処置された。グルタミン酸への曝露の有無に関わらず、未処置の対照には同じ洗浄ステップ及び培地添加が行われた。加えて、グルタミン酸曝露後のＣＰＰ処置（５μＭ）実験は、Ｒ９ペプチド及びＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ対照ペプチドについて実施された。この実験では、神経細胞は、上述のようにして１００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に含めたグルタミン酸（１００μＭ）に５分間曝露され、その後、培地は除去されて５０μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｎ２サプリメントに置き換えられ、続いてグルタミン酸曝露の０分後及び１５分後にペプチド（ＢＳＳ中に含めて１０μＭ／５０μｌ）が添加された。
【０１２８】
グルタミン酸曝露前の実験については、神経細胞は、グルタミン酸への曝露の直前又は１、２、３、４若しくは５時間前に、ペプチドに１０分間曝露された。これは、培地を除去してペプチドを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７を５０μｌ加えることにより実施された。ＣＯ２インキュベータにて３７℃で１０分後、培地は除去されて１００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に置き換えられた（即時のグルタミン酸曝露については培地がグルタミン酸を含有；１００μＭ）。適切なペプチド事前処置時間において、培地が除去されてグルタミン酸（１００μＭ）を含有する１００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に置き換えられた。５分間のグルタミン酸曝露に続いて、神経細胞培養ウェルは上述のように処置された。すべての実験について、グルタミン酸による処置の有無に関わらず、未処置の対照には同じインキュベーションステップ及び培地添加が行われた。
【０１２９】
［ヘパリン実験］
ヘパリン（注射用）はファイザー（Pfizer）から入手した（１０００ＩＵ／ｍｌ）。２つの異なるヘパリン実験が実施された。すなわち１．ペプチドは、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７に含めたヘパリン（２０ＩＵ／ｍｌ）とともに室温で５分間インキュベートされた後、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で１５分間、培養ウェルに添加された（５０μｌ）。インキュベーション期間に続いて、ウェル中の培地は除去され、グルタミン酸（１００μＭ）を含有する１００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に置き換えられ、続いて上述のように処置された；２．ウェル中の培地は、ヘパリンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７（５０μｌ；４０ＩＵ／ｍｌ）に置き換えられ、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で５分間インキュベートされた。インキュベーション期間に続いて、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７（５０μｌ）に含めたペプチド又はグルタミン酸受容体遮断薬（ＭＫ８０１／ＣＮＱＸ）が培養ウェルに添加され、培養物はＣＯ２インキュベータ中３７℃でさらに１０分間インキュベートされた。インキュベーション期間に続いて、ウェル中の培地は除去され、グルタミン酸（１００μＭ）を含有する１００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７に置き換えられ、続いて上述のように処置された。すべての実験について、グルタミン酸処置を伴うがヘパリン処置されないペプチド対照には同じインキュベーションステップ及び培地添加が行われた。
【０１３０】
［Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血／ＯＧＤモデル及びペプチドインキュベーション］
初代皮質神経細胞培養物について使用されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血モデルは、以前に記述されたとおりに実施された（メロニ（Meloni）ら、２０１１年）。簡潔に述べると、培地がウェル（ガラス製９６ウェルプレート型式）から除去され、３１５μｌのグルコース非含有平衡塩類溶液（ＢＳＳ；ｍＭ単位で１１６ＮａＣｌ、５．４ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、０．８ＭｇＳＯ４、１ＮａＨ２ＰＯ４；ｐＨ６．９）で洗浄された後に細胞透過性ペプチド又は対照ペプチド（表１を参照）を含有する６０μｌのＢＳＳが添加された。グルタミン酸受容体遮断薬（５μＭのＭＫ８０１／５μＭの６‐シアノ‐７‐ニトロキノキサリン：ＭＫ８０１／ＣＮＱＸ）で構成されている非ペプチドの陽性対照も含まれた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血は、ウェルを３７℃の無酸素インキュベータ（英国のドン・ホワイティ・サイエンティフィック（Don Whitely Scientific）；５％ＣＯ２、１０％Ｈ２及び８５％アルゴンの雰囲気、湿度９８％）中に５５分間置くことにより開始された。無酸素インキュベータから取り出してすぐに、６０μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｎ２サプリメントがウェルに添加され、培養物はＣＯ２インキュベータ中３７℃でさらに２４時間インキュベートされた。対照培養物には、虚血処置された培養物と同じＢＳＳ洗浄手順及び培地添加が行われてからＣＯ２インキュベータ中３７℃でのインキュベーションがなされた。
【０１３１】
ＯＧＤ曝露前の実験については、手順は、１０分間のペプチド事前処置が１００μｌのＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｂ２７を使用して実施されたことを除いてグルタミン酸モデルに記載されているのと同じであった。対照培養物には、ＯＧＤ処理培養物と同じＢＳＳ洗浄手順及び培地添加が行われた。
【０１３２】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血モデルはｂＥＮＤ３細胞、ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞、及び星状細胞についても用いられた。ｂＥＮＤ３細胞については、無酸素インキュベーションは２〜３時間に延長され、無酸素インキュベータから取り出してすぐに、６０μｌのＤＭＥＭ／２％ＦＣＳがウェルに添加された。ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ細胞については、最初のＢＳＳ洗浄ステップ（３１５μｌ）は省略され、無酸素インキュベーションは２〜５時間に延長された。無酸素インキュベータから取り出してすぐに、６０μｌのＤＭＥＭ／２％ＦＣＳがウェルに添加された。星状細胞については、無酸素インキュベーションは１：１５〜２：００時間に延長され、無酸素インキュベータから取り出してすぐに、６０μｌのＤＭＥＭ／２％ＦＣＳがウェルに添加された。
【０１３３】
［Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける神経細胞、ｂＥＮＤ３及び星状細胞の毒性モデル並びにペプチドインキュベーション］
神経細胞培養物については、ペプチドは、培地を除去して、ＣＰＰ、ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ又はＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃを含有する１００μｌの５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｎ２サプリメント及び５０％ＢＳＳを加えることにより、培養ウェル（９６ウェルプレート型式）に添加された。対照の培養物には５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ／２％Ｎ２サプリメント及び５０％ＢＳＳの培地のみが加えられた。培養物は、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で２０時間インキュベートされ、その後ＭＴＳアッセイを使用して細胞生存率が評価された。ｂＥＮＤ３培養物については、ペプチドは、培地を除去し、ペプチドを含有するＤＭＥＭ／２％ＦＣＳを１００μｌ加えることにより、培養ウェル（９６ウェルプレート型式）に添加された。対照の培養物には、ＤＭＥＭ／２％ＦＣＳのみが１００μｌ添加された。培養物は、ＣＯ２インキュベータ中３７℃にて０．５、１又は２時間インキュベートされ、その後ＭＴＳアッセイを使用して細胞生存率が評価された。星状細胞培養物については、ペプチドは、培地を除去し、ペプチドを含有するＤＭＥＭ／２％ＦＣＳを１００μｌ加えることにより、培養ウェル（９６ウェルプレート型式）に添加された。対照の培養物には、ＤＭＥＭ／２％ＦＣＳのみが１００μｌ添加された。培養物は、ＣＯ２インキュベータ中３７℃で２４時間インキュベートされ、その後ＭＴＳアッセイを使用して細胞生存率が評価された。
【０１３４】
［細胞生存率の評価及び統計解析］
傷害の２４時間後、神経細胞培養物は、神経細胞生存率の定性的評価のために光顕微鏡検査法により検査された。神経細胞生存率は、３‐（４，５，ジメチルイアゾール‐２‐イル）‐５‐（３‐カルボキシメトキシ‐フェニル）‐２‐（４‐スルホフェニル）‐２Ｈ‐テトラゾリウム塩（ＭＴＳ）アッセイ（オーストラリア連邦のプロメガ（Promega ））によって定量的に測定された。ＭＴＳアッセイは、テトラゾリウム塩から、４９０ｎｍにて分光測光法で検出される水溶性の茶色のフォルマザン塩への細胞内変換を測定する。ＭＴＳの吸光度データは、未処置の対照を１００％の生存率として、未処置対照及び処置対照に関する相対的な細胞生存率を反映するように変換され、平均±ＳＥＭとして示された。星状細胞、ｂＥＮＤ３及びＳＨ‐Ｙ５Ｙ細胞を使用する研究については、ＭＴＳの生データを使用してグラフが生成された。生存率データは、分散分析とその後の事後のフィッシャーのＰＬＳＤ検定によって解析され、Ｐ＜０．０５の値が統計的に有意とみなされた。４〜６個のウェルがすべてのアッセイに使用された。
【０１３５】
［ラット永久局所脳虚血モデル  −  実験群及び処置］
すべての処置は盲検下にて無作為化及び施用された。ペプチド（ＤＲ９：ｒｒｒｒｒｒｒｒｒ‐ＮＨ２；Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８、硫酸プロタミン；プロタミン）又はビヒクル（生理食塩水：０．９％ＮａＣｌ）の処置溶液の投与は、ＭＣＡＯ後３０分で実施された。ペプチド処置は、右頚静脈を介して５〜６分かけて施用される１μｍｏｌ／ｋｇ又は１０００ｎｍｏｌ／ｋｇの静脈内負荷量を提供するように、生理食塩水（６００μｌ）に含めたＤＲ９から成っていた。
【０１３６】
［ラット永久局所脳虚血モデル］
本研究は、西オーストラリア大学（University of Western Australia ）の動物倫理委員会（Animal Ethics Committee ）によって承認された。体重２７０ｇ〜３５０ｇの雄のスピローグ・ドーリー（Sprague Dawley）ラットは、１２時間の明暗サイクルで食物及び水を自由摂取とした、制御された飼育条件下で管理された。実験動物は一晩断食せしめられ、以下のようにして恒久的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）に供された。
【０１３７】
麻酔は、マスクを介して４％のイソフルラン及びＮ２ＯとＯ２との２：１混合物を用いて導入された。麻酔は１．７〜２％イソフルランに維持された。脳血流（ＣＢＦ）は、レーザドップラー流速計（Ｂｌｏｏｄ  ＦｌｏｗＭｅｔｅｒ、オーストラリア連邦シドニーのエーディー・インスツルメンツ（AD Instruments））を使用して連続的にモニタリングされた。プローブは、ブレグマから尾側に１ｍｍ及び側方（右）に４ｍｍに位置付けられた。血圧を連続的にモニタリングし、かつ血糖値及び血液ガス読取値のための試料を提供するために、カニューレが右大腿動脈に挿入された。血糖はグルコース計（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのアボット・ラボラトリーズ（Abbott Laboratories ）、メディセンス・プロダクツ（MediSense Products））を使用して測定され、血液ガスは血液ガス分析計（ＡＢＬ５、デンマーク国コペンハーゲンのラジオメータ（Radiometer））を使用して測定された。血圧は８０〜１００ｍｍＨｇに維持された。手術中、直腸温は３７±０．５℃に維持され、必要な場合はファンヒータを用いて加温された。静脈内注入については、ヘパリン処理された生理食塩水の入った長いＰＶＣラインが右頚静脈の適所につながれ、次いで背側中央〜肩甲骨の切開部を通じて外在化されて自由運動が可能なように設計されたテザー／スイベルシステム（米国フィラデルフィアのインステック・ラボラトリーズ（Instech Laboratories））に達せられた。
【０１３８】
右総頚動脈（ＣＣＡ）は腹側の頚部切開部を通じて露出された。外頚動脈（ＥＣＡ）は上甲状腺動脈及び後頭動脈の焼灼の後に単離された。ＥＣＡの単離切開面は断端を作出するために結紮及び焼灼された。頚動脈小体は除去され、翼突口蓋動脈が結紮された。直径０．３９ｍｍのシリコーンチップを備えた４‐０ナイロンモノフィラメント（ドッコル（Doccol）、米国カリフォルニア州レッドランズ）は、ＥＣＡの断端を通してＣＣＡに挿入され、レーザドップラー流速計が脳血流量のベースラインから＞３０％の減少を記録するまで、内頚動脈（ＩＣＡ）の中へ吻側へと前進せしめられた。モノフィラメントは、残りの実験のために２箇所に（ＥＣＡ断端の基部及びＩＣＡ上に）固定された。動物には、頭及び下肢の切開部位におけるペチジン（３ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）及びブピバカイン（１．５ｍｇ／ｋｇ、皮下）で構成される術後麻酔が施された。
【０１３９】
手術後の動物は、温度湿度が制御されたチャンバ内で回復せしめられ、該動物の中核体温は、３〜４時間の間、モニタリングされて必要な場合は冷却／加熱ファンによって３７±０．５℃に維持された。
【０１４０】
［組織の処理過程及び梗塞体積の測定］
動物はＭＣＡＯ後２４時間でペントバルビタールナトリウム（９００ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を用いて屠殺された。安楽死の後、脳が摘出されて０．９％ＮａＣｌの滅菌容器内に入れられ、次いで−８０℃の冷凍庫内に７分間置かれた。その後、脳は、小脳と大脳との接合部からこの地点より１２ｍｍ吻側まで冠状に薄切されて、２ｍｍ厚の切片となされた。切片は直ちに１％の２，３，５トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ、米国ミズーリ州セントルイスのシグマ（Sigma ））を用いて３７℃で２０分間染色され、続いて４％ホルマリン中で室温にて少なくとも１８〜２４時間固定されてから梗塞体積が測定された。切片は走査され、画像は、処置状況を把握していないオペレータによってイメージジェイ（ImageJ）第３版（米国ＮＩＨ）を使用して解析された。総梗塞体積は、２ｍｍの切片標本の両側における梗塞組織の面積を合計することにより決定された。この測定面積に、切片の厚さの半分（１ｍｍ）が乗じられ、かつ病変半球と正常半球との面積の比を乗じることにより、大脳の浮腫について補正された。
【０１４１】
［統計解析］
梗塞体積の測定について、ペプチド処置群は、スチューデントのｔ検定（Ｒ９Ｄの試行）又は分散分析とその後の事後のフィッシャーのＰＬＳＤ検定（Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８及びＰｔｍの試行）によって、ビヒクル対照群と比較された。
【０１４２】
実験実施例１
［グルタミン酸への曝露後の神経保護］
ＣＰＰであるＴＡＴ‐Ｄ、Ｒ９、及びペネトラチンは用量応答的に顕著な神経保護を提供した（図１ａ、表３）。損傷後の培養物の視覚的評価からも、未処置のグルタミン酸曝露された培養物についての約５％から、Ｒ９で処置された培養物についての１００％生存に及ぶ、神経保護効果が確認された。Ｒ９はＩＣ５０値が０．７８μＭの最も強力なペプチドであり、続いてペネトラチン（ＩＣ５０：３．４μＭ）及びＴＡＴ‐Ｄ（ＩＣ５０：１３．９μＭ）であった。Ｐｅｐ‐１ペプチドは無効であった。グルタミン酸受容体遮断薬及び対照ペプチド（ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ、ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ）もこのモデルにおいて非常に有効であった（図１ａ）。
【０１４３】
加えて、ＴＡＴ‐ＤペプチドはＴＡＴ‐Ｌペプチドと同様のレベルの神経保護を示した（図１ｂ）。ＣＰＰがグルタミン酸への曝露の前に洗浄除去された場合、（本実験では）Ｒ９のみが高レベルの神経保護を示した（図１ｃ）。
【０１４４】
Ｒ９及びＲ１２ペプチドはグルタミン酸への曝露の直後に添加された場合にも非常に有効であり、Ｒ９は傷害後１５分で添加された場合は軽度に有効であった。対照的に、ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ及びＮＲ２９ｃ（ＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃとも呼ばれる）ペプチドは、グルタミン酸への曝露の直後に、又は１５分後に添加された場合、神経細胞の生存をあまり高めなかった（図１ｄ）。
【０１４５】
図１ｅ〜ｊは、ペプチドＲ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８、Ｒ９／Ｅ９（Ｅ９／Ｒ９とも呼ばれる）、Ｒ９／ｔＰＡ／Ｒ９（Ｒ９／Ｘ７／Ｒ９とも呼ばれる）、並びに対照ペプチドのＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ及びＮＲ２９ｃについての、グルタミン酸モデルにおけるさらなる効能データを提示している。
【０１４６】
用量応答研究において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８をグルタミン酸モデルにおいて使用することにより、ｉ）Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６及びＲ７は神経保護を全く〜ごくわずかしか示さないこと；ｉｉ）Ｒ８は５μＭで神経保護を示すこと、（ｉｉｉ）その他のペプチドについての効力の順序はＲ１５＞Ｒ１８＞Ｒ１２＞Ｒ９であること；ｉｖ）Ｒ１５及びＲ１８についての神経保護性の効能はより高い濃度（５μＭ）では低減されること；が明らかとなった；表４、図１ｅ、１Ｉ、１ｊ、６、７、及び８を参照されたい。
【０１４７】
用量応答研究において、Ｒ９、ＤＡＨＫ（タンパク質アルブミンの最後４つのＮ末端アミノ酸）ＰＴＤ４（細胞透過能が３３×に高められた修飾型ＴＡＴペプチド；（ホー（Ho）ら、２００１年）、Ｒ９／Ｅ９（Ａｒｇ‐９／Ｇｌｕ‐９；中性のペプチド）及びＲ９／ｔＰＡ／Ｒ９（組織プラスミノーゲン活性化因子酵素ペプチド切断部位にＲ９が隣接しているもの）をグルタミン酸モデルにおいて使用することにより、ｉ）ＰＴＤ４及びＲ９／Ｅ９は神経保護を全く〜ごくわずかしか示さず；ＤＡＨＫは低レベルの神経保護を有すること；並びにｉｉ）Ｒ９／ｔＰＡ／Ｒ９はＲ１２とＲ１８との間の効力を有すること；が明らかとなった。さらに、ＴＡＴ‐ＮＲ２９Ｃペプチド（Ｃ末端ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＲＡ受容体サブユニットペプチド；ＰＳＤ‐９５タンパク質を伴うＮＭＤＡＲシグナル伝達を阻止してＮＯ（亜酸化窒素）産生を阻止する；アーツ（Aarts ）ら、２００２年）は効果がなかった。表４及び図１ｄ、ｇ、ｈを参照のこと。
【０１４８】
ペプチドＲ１２は（濃度０．６２５μＭでの神経保護に基づけば）Ｒ９よりも有効であり、かつ両者とも、グルタミン酸モデルでは、ＰＣＹ‐３６‐ＴＡＴと比較してより有効であった一方、ＮＲ２９ｃは無効であった（図１ｇ）。ペプチドＲ１２は、（濃度０．５μＭ及び１μＭでの神経保護に基づけばＲ９よりも有効であったが、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６及びＮＲ２９ｃは無効であった（図１ｉ）。２つの異なる会社によって合成されたペプチドＲ９も、グルタミン酸モデルにおける同様の効能を有していた（図１ｊ）。
【０１４９】
ペプチドＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８は、５分間のグルタミン酸傷害の間にのみ神経細胞培養物に添加された場合（図２８）、又は１０分間の事前曝露の後に傷害に先立って培養物から取り除かれた場合（図２９）、有効であった。
【０１５０】
ペプチドＲ１２及びＲ１５は、グルタミン酸傷害の１〜４時間前に１０分間、神経細胞培養物に添加された場合、有効であった（図３０）。
ペプチドＰＴＤ４は低レベルの神経保護を示し、ペプチドＥ９／Ｒ９はグルタミン酸モデルでは保護を示さない（図３３）一方、アルギニンに富んだペプチドＸＩＰ及びＮＣＸＢＰ３は高レベルの保護を示す（図３４、３５）。ポリリジン１０ペプチド（Ｋ１０）及びＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃペプチドは、それぞれグルタミン酸モデル（図３６）及びＮＭＤＡモデル（図３７）において低レベルの神経保護を示す。Ｒ８及びカルパイン切断部位に融合したＲ９（Ｃａｌ／Ｒ９）は、グルタミン酸において中〜高レベルの神経保護を示す（図３８）。図３９及び４０は、グルタミン酸モデルにおいて、陰性に荷電した分子ヘパリンは、Ｒ９Ｄ、Ｒ１２、Ｒ１５及びＰＹＣ３６‐ＴＡＴの神経保護作用を阻止するが、グルタミン酸受容体遮断薬（５μＭ  Ｋ８０１／５μＭ  ＣＮＱＸ）については阻止しないことを示している。図４１は、ＪＮＫＩ‐１ペプチドが、取り込みについてエンドサイトーシスに依存しない（非アルギニンの）ｋＦＧＦ  ＣＰＰに融合された時、グルタミン酸モデルにおいて神経保護性でなかったこと；ｋＦＧＦペプチドも無効であったこと、を示す。対照的に、ＴＡＴ‐ＪＮＫＩ‐１及びＪＮＫＩ‐１‐ＴＡＴＤは神経保護性であった。図４４は、ペプチドＲ９Ｄ、Ｒ１２、Ｒ１５、及びＰＹＣ３６‐ＴＡＴ、ＴＡＴ、ＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９ｃ、ＴＡＴ‐ＪＮＫＩ‐１及びＪＮＫＩ‐１‐ＴＡＴＤ並びにグルタミン酸受容体遮断薬（５μＭ  Ｋ８０１／５μＭ  ＣＮＱＸ）が、グルタミン酸を用いた処置の後に神経細胞培養物中のカルシウム流入を様々な程度に低減したことを示している。
【０１５１】
実験実施例２
［カイニン酸への曝露後の神経保護］
カイニン酸への曝露の後、ＴＡＴ‐Ｄ、Ｒ９及びペネトラチンは神経保護性であったが、グルタミン酸モデルの場合ほど有効ではなく、また必ずしも典型的な用量応答パターンを示さなかった（図２、表２）。Ｐｅｐ‐１は無効であった。Ｒ９は最も強力なペプチドであり、神経細胞の生存を〜２０％から最大〜８０％まで増大させていた。Ｒ９、ペネトラチン、及びＴＡＴ‐Ｄに関するそれぞれのＩＣ５０値は、０．８１、２．０及び６．２μＭであった。グルタミン酸受容体遮断薬、ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ及びＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴもこのモデルにおいて有効であった（図２）。
【０１５２】
実験実施例３
［ｉｎ  ｖｉｔｒｏ虚血／酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）の後の神経保護］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血の後、４つのＣＰＰ全てが神経保護効果を示した（図３、表２）。Ａｒｇ‐９（ＩＣ５０：６．０μＭ）及びＴＡＴ‐Ｄ（ＩＣ５０：７．１μＭ）による神経保護は類似しており；効能は用量応答パターンに従い、神経細胞の生存を〜１０％から４０〜５０％に増大させた。神経保護性の効能はペネトラチンの濃度が高まるとともに（≧５μＭ）失われ、Ｐｅｐ‐１はより低い濃度（１〜５μＭ）でのみ神経保護性であった。グルタミン酸受容体遮断薬及びＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴも、このモデルにおいて有効であった（図３ａ）。
【０１５３】
加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血後に添加された場合のＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８は神経保護効果を示したが、より高濃度のＲ１５及びＲ１８は効能が低下した（図３ｂ）。
【０１５４】
Ｒ９はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血に供された場合のｂＥＮＤ３およびＳＨ‐５ＹＳＹの細胞死も低減した（図３ｃ）。Ｒ１８も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血に供された場合の星状細胞の細胞死を低減した（図４２）。
【０１５５】
図６は、グルタミン酸モデルにおけるＲ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３及びＲ１４を使用した用量応答研究を示し、該研究から、２μＭ及び５μＭで有意な神経保護を示したＲ１１を除き、全てのペプチドが１〜５μＭで有意な神経保護を示すことが明らかとなった。平均±ＳＥＭ：Ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５。（ペプチド濃度はμＭ単位）。
【０１５６】
図７は、グルタミン酸モデルにおけるＲ９Ｄ、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５を使用した用量応答研究を示し、該研究から、全てのペプチドが１〜５μＭで神経保護を示すことが明らかとなった。平均±ＳＥＭ：Ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５。（ペプチド濃度はμＭ単位）。
【０１５７】
図８に示されるように、グルタミン酸モデルにおけるＲ６、Ｒ７、Ｒ８、及びＲ９を使用した用量応答研究において、ペプチドＲ８及びＲ９はそれぞれ５μＭ並びに１μＭ及び５μＭの濃度で有意な神経保護を示す一方、Ｒ６及びＲ７は有意な神経保護を示さないことが明らかとなった。平均±ＳＥＭ：Ｎ＝４；＊Ｐ＜０．０５。（ペプチド濃度はμＭ単位）。図３１は、ペプチドがＯＧＤの後に１５分間添加された場合の、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８を使用した用量応答研究を示す。神経保護はＲ１２、Ｒ１５及びＲ１８について示されたが、１μＭ及び５μＭのＲ９では示されなかった。
【０１５８】
ペプチドＲ１２及びＲ１８は、ＯＧＤの１〜３時間前に神経細胞培養物に１０分間添加された場合に有効であった（図３２）。
【０１５９】
【表５】
0006495270.tif 000008
【０１６０】
【表６】
0006495270.tif 000009
【０１６１】
実験実施例４
［動物での試行］
行われた最初の動物での試行において、Ａｒｇ‐９（Ｒ９）、Ｒ１８及びプロタミン（Ｐｔｍ）がｉｎ  ｖｉｖｏで神経保護活性を有することが示された。この試行から、ラットの恒久的な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）卒中モデルにおけるＲ９Ｄペプチドの効能が示された。Ｒ９ＤペプチドはＭＣＡＯ後３０分で静脈内投与された。梗塞体積（脳損傷）はＭＣＡＯ後２４ｈで測定された（平均±ＳＥＭ）。これは図５及び２７に示されており、同図には、（各群につきＮ＝８〜１２匹の動物での）Ｒ９Ｄ、Ｒ１８及びプロタミン（Ｐｔｍ）を用いた処置が、ＭＣＡＯ卒中後に梗塞体積（脳のダメージ）をおよそ２０％低減することにより統計的に有意な神経保護効果を示したことを見ることができる。
【０１６２】
［概説及び議論］
本出願人は、グルタミン酸、カイニン酸、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの虚血（酸素グルコース欠乏）への曝露後の皮質神経細胞培養物において、既知の神経保護性の実例としてＴＡＴと、その他の３つのＣＰＰ（ペネトラチン、Ｒ９、及びＰｅｐ‐１）とを、その神経保護特性について評価した。
【０１６３】
加えて、ポリアルギニンペプチド（Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５、Ｒ１８）及びアルギニンに富んだプロタミンペプチドのうち少なくともいずれかについても、星状細胞、脳内皮細胞株（ｂＥＮＤ３）、及び神経芽細胞腫細胞株（ＳＨ‐ＳＹ５Ｙ）の培養物のうち少なくともいずれかにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血モデルを使用して評価がなされた。
【０１６４】
Ｒ９、ペネトラチン及びＴＡＴ‐Ｄは、グルタミン酸損傷モデル（ＩＣ５０：０．７８、３．４、１３．９μＭ）及びカイニン酸損傷モデル（ＩＣ５０：０．８１、２．０、６．２μＭ）のいずれにおいても一致した高レベルの神経保護活性を示したが、Ｐｅｐ‐１は無効であった。
【０１６５】
ＴＡＴ‐Ｄアイソフォームは、グルタミン酸モデルにおいてＴＡＴ‐Ｌアイソフォームと同様の効能を示した。Ｒ９は、グルタミン酸への曝露に先立って洗浄除去された時も効能を示した。しかしながら、Ｒ９は、かつて神経保護性であることが示されたペプチド、すなわちＴＡＴ‐Ｄ、ＴＡＴ‐Ｌ、ＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ、ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴよりも有意に高く有効であった。
【０１６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血後の神経保護は一層変動的であり、全てのペプチドがあるレベルの神経保護を提供していた（ＩＣ５０はＲ９：６．０μＭ、ＴＡＴ‐Ｄ：７．１μＭ、ペネトラチン／Ｐｅｐ‐１：＞１０μＭ）。陽性対照ペプチドであるＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ（ＪＮＫ阻害ペプチド）及びＰＹＣ３６Ｌ‐ＴＡＴ（ＡＰ‐１阻害ペプチド）のうち少なくともいずれか一方は、すべてのモデルにおいて神経保護性であった。
【０１６７】
グルタミン酸処置後の実験では、Ｒ９は直後に添加された場合に極めて有効であり、傷害後１５分で添加された場合は軽度に有効であった一方、ＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴ対照ペプチドは傷害後に添加された場合は無効であった。
【０１６８】
行われた最初の動物での試行では、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１８、及びプロタミンがｉｎ  ｖｉｖｏで神経保護活性を有することが示された。
用量応答研究において、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８をグルタミン酸モデルにおいて使用することにより、ｉ）Ｒ１、Ｒ３、Ｒ６、及びＲ７は神経保護を全く〜ごくわずかしか示さないこと；ｉｉ）他のペプチドについての効力の順序はＲ１５＞Ｒ１８＞Ｒ１２＞Ｒ９であること；並びに、ｉｉｉ）Ｒ１５及びＲ１８についての神経保護性の効能は試験されたうちのより高い濃度（５μＭ）では低減されること；が明らかとなった。
【０１６９】
用量応答研究において、Ｒ９、ＤＡＨＫ（タンパク質アルブミンの最後４つのＮ末端アミノ酸）、ＰＴＤ４（細胞透過能が×３３に高められた修飾型ＴＡＴペプチド；ホー（Ho）ら、２００１年）、Ｒ９Ｅ９（Ｒ９／Ｇｌｕ‐９；中性のペプチド）及びＲ９／ｔＰＡ／Ｒ９（組織プラスミノーゲン活性化因子酵素ペプチド切断部位にＲ９が隣接しているもの）をグルタミン酸モデルにおいて使用することにより、ｉ）ＰＴＤ４及びＲ９／Ｅ９は神経保護を全く〜ごくわずかしか示さず；ＤＡＨＫは低レベルの神経保護を有すること；並びにｉｉ）Ｒ９／ｔＰＡ／Ｒ９はＲ１２とＲ１８との間の効力を有すること；が明らかとなった。さらに、ＴＡＴ‐ＮＲ２Ｂ９Ｃペプチド（Ｃ末端ＮＲ２Ｂ  ＮＭＤＲＡ受容体サブユニットペプチドはＰＳＤ‐９５タンパク質を伴うＮＭＤＡＲシグナル伝達を阻止してＮＯ産生を阻止する；アーツ（Aarts ）ら、２００２年）。ポリアルギニン及びアルギニンに富んだ（プロタミン）ペプチドも、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血後の星状細胞、ｂＥＮＤ３、及びＳＨ‐ＳＹ５Ｙの細胞死を低減することが可能であった。
【０１７０】
これらの所見は、本発明のペプチドが、興奮毒性及び虚血による損傷に関連した神経に有害な事象／経路を阻害する能力を有することを実証している。≧９個のアルギニンアミノ酸残基を備えたポリアルギニンペプチドは特に神経保護性である。
【０１７１】
本発明のペプチドの細胞保護的な特性は、該ペプチドが、損傷後のＣＮＳに神経保護薬を送達するため、及び、それ自体が潜在的な神経保護物質としての役割を果たすためのうち少なくともいずれか一方の、理想的な担体分子であることを示唆している。
【０１７２】
本発明のペプチドはこのように、ｉｎ  ｖｉｖｏのモデルに結びつけることが可能であることを示されている様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏの損傷モデルにおいて神経保護特性を示す。これは、行われた初期の動物での試行において示された神経保護効果によってさらに支持される。Ｒ９の優れた神経保護作用は驚くべきものであり；ＩＣ５０値に基づけば、Ｒ９はグルタミン酸モデル及びカイニン酸モデルにおいてＴＡＴ‐Ｄよりもそれぞれ１７倍及び７倍強力であり、かつグルタミン酸への曝露に先立って洗浄除去された場合でも有効な唯一のペプチドであった。この所見は、Ｒ９の、アルギニン残基の増加及びわずかに高い正味電荷（ｐＨ７において１０対９）のうち少なくともいずれか一方が、興奮毒性の後の神経保護のための重要な要因であることを示唆している。更に、グルタミン酸への曝露に先立って洗浄除去された後にＴＡＴ及びペネトラチンは効能を喪失するがＲ９は喪失しない正確な理由は不明であるが、これは細胞外のメカニズムではなくＲ９の細胞内への取り込みの速度に関係するのかもしれない。このことは、Ｒ９はグルタミン酸への曝露の後に添加された場合に有効であったがＪＮＫＩ‐１Ｄ‐ＴＡＴペプチドは無効であったという所見によって支持される。
【０１７３】
更に、アルギニン並びにポリアルギニンペプチドＲ１、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８がグルタミン酸損傷モデルにおいて評価された場合、ペプチドＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８のみが試験された用量において有意な神経保護を示し；Ｒ１５は最も強力なペプチドであるように見えた。さらに、ｔＰＡ切断リンカー部位を含有するハイブリッド型のＲ９ペプチド（Ｒ９／ｔＰＡ／Ｒ９）も、グルタミン酸モデルにおいて非常に有効であった。Ｒ９も、グルタミン酸への曝露後に添加された時にＲ１２よりも有効であった。興味深いことに、ＰＴＡ４（通常のＴＡＴと比較して３３×の改善された導入効率を備えた修飾型ＴＡＴペプチド；ホー（Ho）ら、２００１年）、Ｒ９／Ｅ９ハイブリッド及びＮＲ２９ｃ（ＮＭＤＡ／グルタミン酸受容体により誘導されるＮＯ産生を阻止するＴＡＴ融合ペプチド）並びにＤＡＨＫ（タンパク質アルブミンの最後４つのＮ末端アミノ酸）は、グルタミン酸への曝露後は概して無効であった。
【０１７４】
ペプチドＲ９、Ｒ１２、Ｒ１５及びＲ１８はさらに、無酸素インキュベーションの後に（すなわち損傷の再灌流期の間に）添加された場合にｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血モデルにおいても有効であった。Ｒ９はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血後に脳内皮細胞（ｂＥＮＤ３細胞）及び神経芽細胞腫細胞（ＳＨ‐５ＹＳＹ細胞）を保護することもできた。
【０１７５】
本明細書中に先述されるように、本研究の結果は、ペネトラチン及びＰｅｐ‐１も神経保護特性を示すということの実証であった。ペネトラチン及びＰｅｐ‐１ペプチドは、互いに、又はＴＡＴ／Ｒ９ペプチドと、アミノ酸配列の同系性を有していない。興味深いことに、ペネトラチンは興奮毒性のモデルにおいては高度に神経保護性であったが（ＩＣ５０：３．４及び２μＭ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血モデルにおいては濃度が高まると効能が低減し、あまり有効ではなかった。Ｐｅｐ‐１ペプチドは、興奮毒性のモデルにおいては概して効果がなく、かついくつかの実験では神経細胞死を増加させるように見えたが（データは示さない）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血後にはより低濃度において神経保護性であった。興味深いことに、ペネトラチンがグルタミン酸への曝露に先立って神経細胞培養物から洗浄除去された場合、目視による観察から、該ペプチドがいくらかの早期の神経保護効果を示すことが明らかとなった（データは示さない）。従って、ペネトラチン及びＰｅｐ‐１はいずれも、損傷モデルにおいて、互いに、またＴＡＴ／Ｒ９ペプチドとは、異なるように作用した。
【０１７６】
興奮毒性及び虚血による損傷モデルにおける、４つのＣＰＰの神経保護性の応答の差異は、ペプチドの物理化学的特性に、及びより明確にはペプチドのエンドサイトーシス誘発特性に関係する可能性が高い。更に、ＣＰＰの神経保護作用は細胞膜（例えば受容体、イオンチャネル）において仲介される可能性が高い。スー（Xu）ら（２００８年）は、ＴＡＴが細胞膜を変化させ、それによりＮＭＤＡ受容体のような細胞表面の受容体の機能に影響を及ぼし、その結果カルシウム流入が低下する可能性があることを示唆している。
【０１７７】
しかしながら、本発明の１又は複数のペプチドは、ＮＭＤＡ受容体の機能の阻止、及びカルシウムの流入の阻止、ダウンレギュレーション、又は減速、のうち少なくともいずれかを為すように作用することが可能であると考えられる。別例のメカニズムは、ＣＰＰがミトコンドリア外膜と相互作用してこれを安定化することにより、ミトコンドリアの機能を維持する助けとなるということである。潜在的な恩恵は、ＡＴＰ合成の維持、活性酸素種の産生の低減、カルシウム輸送の改善である。この目的で、本出願人は、正常な神経細胞中及び損傷後にＡｒｇ‐９がＭＴＳ吸光度レベルをベースラインレベルより上に増加させることができることを観察済みである（例えば図１Ａ、１５μＭ）。ＭＴＳの、そのフォルマザン生成物への還元は、主としてミトコンドリアにおいて生じるので、Ａｒｇ‐９がフォルマザンのレベルを上昇させる能力は、該ペプチドがミトコンドリアの機能を改善しているということを支持している。特にＲ９及びＴＡＴに関しての別のメカニズムの可能性は、これらのアルギニンに富んだペプチドがカルシウム依存性プロタンパク質転換酵素フューリン（カスプルザック（Kacprzak）ら、２００４年）を阻害しており、それにより潜在的に有害なタンパク質の活性化を阻止しているということである。
【０１７８】
本発明は、カチオン性アミノ酸に富んだＣＰＰ、特にアルギニンに富んだＣＰＰ又は担体ペプチド（例えばＲ１２、Ｒ１５、プロタミン）が、一般のＣＰＰとは対照的に、高レベルの神経保護を示すことを実証している。このことは、ＣＰＰに融合した神経保護ペプチドの作用メカニズムが、それに限られないにしても大部分は、その担体‐ペプチドの神経保護効果の増強の結果である、という可能性を高めている。更に、アルギニンに富んだＣＰＰがその神経保護作用を発揮するメカニズムは、特異的な細胞質の標的との相互作用によるのではなく、主たる担体‐ペプチドの細胞内取込み経路であるエンドサイトーシスに、結びつけることができる。対照的に、エンドサイトーシスによって細胞内に入る担体‐ペプチドに融合した神経保護ペプチドは最初にエンドソームを回避しなければならないがこれは極めて非能率的なプロセスであることが知られており（アル＝タエイ（Al-Taei ）ら、２００６年；エル＝サイード（El-Sayed）ら、２００９年；アッペルバウム（Appelbaum ）ら、２０１２年；チエン（Qian）ら、２０１４年）、その後で細胞質の標的と相互作用することが可能になる、ということから、ペプチドがその意図された標的との相互作用を通じて作用することができるということは全くありそうもない。
【０１７９】
ＣＰＰの細胞内侵入に関して、有力なメカニズムはエンドサイトーシス（マクロピノサイトーシス）によるものと考えられている（パーム＝アペルギ（Palm-Apergi ）ら、２０１２年）。本発明にはあまり関連しないが、最近の報告から、積荷物の特性も、ある種のＣＰＰによる直接的細胞侵入メカニズムを促進しうることが実証されている（ヒロセ（Hirose）ら、２０１２年）。しかしながら、可能性として極めて関連が高いことは、具体的な積荷物、ペプチド又はその他のものが、ＣＰＰに対し、その神経保護作用の増強、移動効率の改善、及びカードーゾ（Cardozo ）ら（２００７年）により実証されるようなその毒性の増大、のうち少なくともいずれかにより、どのように影響を及ぼしうるか、ということである。これは積荷物がそれ自体神経保護性である場合は特に重要である、というのも、上述のように、これはＣＰＰと積荷物との間の神経保護効果を識別することを非常に難しくする。例えば、従来の研究（ミード（Meade ）ら、２０１０年ａ）において、ＰＹＣ３６ペプチド由来の３アミノ酸残基（Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ）の  ＴＡＴ‐Ｄペプチドへの付加（ＡＭ８Ｄ‐ＴＡＴ）により、グルタミン酸モデルではＴＡＴ‐Ｄについての＞１５μＭからＡＭ８Ｄ‐ＴＡＴについての１．１μＭへのＩＣ５０値の低下がもたらされた。
【０１８０】
ＴＡＴペプチド対照を用いての陽性の効果が必ずしも観察されるとは限らなかった。いくつかの考えられる説明があるが、この問題に取り組むために：最初に必要であるのは、対照として、ＴＡＴペプチドのみ（すなわちＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧ）を使用する研究と、レポーターのタンパク質（例えばＧＦＰ、β‐ｇａｌ）又はペプチド（例えばＨＡ及び６×ＨＩＳタグのうち少なくともいずれか一方、混在型ペプチド）に融合したＴＡＴを使用する研究とを区別することである。対照としてＴＡＴペプチドを単独で使用した研究に関しては、ＴＡＴが使用された用量では無効であったこと、及び、損傷モデルが重症すぎて神経保護効果を見出すことができなかったこと、のうち少なくともいずれか一方が考えられる。例えば、ボレセロ（Boresello）ら（２００３年）は、１００μＭ  ＮＭＤＡへの皮質神経細胞培養物の１２、２４又は４８時間の曝露後には、ＴＡＴペプチドを用いた神経保護効果を検出しなかった。対照的に、Ｌ‐ＪＮＫＩ‐１ペプチドは１２時間及び２４時間で有効であった一方、プロテアーゼ抵抗性のＤ‐ＪＮＫＩ‐１ペプチドは全ての時点で有効であった。ＪＮＫＩ‐１ペプチドの効能がＴＡＴペプチドと比較して上位にあることを考えると、試験された濃度ではＴＡＴは神経保護性ではなかった、又はＮＭＤＡ傷害が重症であることによりいかなる神経保護効果も無効にされた、という可能性がある。アシュポール（Ashpole ）及びハドモン（Hudmon）による研究（２０１１年）では、ＴＡＴペプチドを用いた軽度の保護効果が、グルタミン酸への曝露後の皮質神経細胞培養物において観察された。更に、この著者らは、ＴＡＴペプチドが保護をほとんど提示しないので、ＣＡＭＫＩＩ阻害ペプチドについて観察された神経保護は「インポート配列」（すなわちＴＡＴ）に起因するものではないという結論を下した。しかしながら、ＣＡＭＫＩＩ阻害ペプチドがＴＡＴペプチドの潜在能力を高めたということは除外することはできない。最後に、ＴＡＴペプチドが特定の損傷モデル及び細胞種においてのみ神経保護性であることもありうる。
【０１８１】
レポータータンパク質又は対照ペプチドに融合したＴＡＴを使用する研究では、上記に取り上げた点に加えて、対照のタンパク質／ペプチドがＴＡＴペプチドの神経保護特性を弱めるか又は無効にするように作用する場合があることもあり得る。対照としてＴＡＴ融合タンパク質／ペプチドを使用してきて神経保護効果を示さなかった数多くの研究に基づけば、これが当てはまるように見えるであろう（例えば、クルチ（Kilic ）ら、２００３年；デップナー（Doeppner）ら、２００９年）。しかしながら、心に留めておく必要があるのは、タンパク質がＣＰＰであるという単なる事実は、該タンパク質が神経保護性であろうということを必ずしも意味しない、ということであり、このことは、ＰＴＤ‐４ペプチド（ＴＡＴそれ自体より３３×優れた導入効率を備えた修飾型ＴＡＴペプチド；ホー（Ho）ら、２００１年）が神経保護特性をほとんど又は全く有していないという事実によって裏付けられる。
【０１８２】
【表７】
0006495270.tif 000010
【０１８３】
（臨床用途のための硫酸プロタミン中又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに存在するプロタミンペプチド配列（サケ）。［ａ＝硫酸プロタミン１のＨＰＬＣ後に同定されたピーク１〜４；ｂ＝ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ中の配列（Swissprot:P14402）。（１）ホフマン（Hoffmann）ＪＡ１、チャンス（Chance）ＲＥ、ジョンソン（Johnson ）ＭＧ、「高速液体クロマトグラフィーを使用するインスリン調合物中に含有されるシロザケプロタミンの主要構成成分の精製及び解析（Purification and analysis of the major components of chum salmon protamine contained in insulin formulations using high-performance liquid chromatography ）」、プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピューリフィケイション（Protein Expr Purif. ）、１９９０年、第１巻、第２号、ｐ．１２７−３３。（２）チャン（Chang ）ＬＣ、リー（Lee ）ＨＦ、ヤン（Yang）Ｚ、ヤン（Yang）ＶＣ、「無毒なヘパリン／低分子量ヘパリン解毒剤としての低分子量プロタミン（LMWP）（Ｉ）：調製及び特性解析（Low molecular weight protamine（LMWP）as nontoxic heparin/low molecular weight heparin antidote（I）：preparation and characterization ）」、ファームサイ（PharmSci）、２００１年、第３巻、第３号：Ｅ１７）。
【０１８４】
実験実施例１
［グルタミン酸曝露後の神経保護］
硫酸プロタミン（プロタミン；Ｐｔｍ）は、用量応答的に、有意な神経保護を提供した（図９、１０、１２、１３、１５）。損傷後の培養物の視覚的評価も、未処置のグルタミン酸曝露された培養物についての〜５％から、プロタミンで処置された培養物についての８５〜１００％％の生存に及ぶ、神経保護効果を確認した。加えて、５分間又は１０分間のプロタミン事前曝露も高度に神経保護性であり、１００％の神経細胞の生存をもたらした（図１１）。用量応答実験において、低分子量（ＬＭＷＰ）、プロタミン１（Ｐｔｍ１）、プロタミン２（Ｐｔｍ２）、プロタミン３（Ｐｔｍ３）、プロタミン４（Ｐｔｍ４）、プロタミン５（Ｐｔｍ５）、のペプチドも神経保護性であった（図１２、１３、１５）。
【０１８５】
プロタミン及びＬＭＷＰの事前曝露の実験では、プロタミンは神経細胞がグルタミン酸傷害の直前及び１時間又は２時間前にプロタミンに曝露された場合に神経保護性であった一方、ＬＭＷＰは曝露がグルタミン酸傷害の直前であった場合にのみ神経保護性であった（図１４）。
【０１８６】
実験実施例２
［酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）後の神経保護］
ＯＧＤモデルでは、プロタミンは、神経細胞が傷害の１時間前（図１８）又は傷害後（図１６、１７）にペプチドで処置された場合に神経保護性であった。加えて、１５分間又は３０分間添加された場合、ＯＧＤ後のプロタミンは同じく神経保護性であった（図１９、２０、２１、２２）。ＬＭＷＰは、神経細胞がＯＧＤの１時間前にペプチドに事前曝露された場合は神経保護性ではなかったが、ＯＧＤ後に１５分間添加された場合は神経保護性であった。さらに、プロタミンペプチド（Ｐｔｍ１〜Ｐｔｍ５）及びＬＭＷＰがＯＧＤ後に１５分間添加された場合、ペプチドＰｔｍ２、Ｐｔｍ４、Ｐｔｍ５及びＬＭＷＰが神経保護性であった（図２２）。
【０１８７】
実験実施例３
［酸素グルコース欠乏（ＯＧＤ）後のｂＥＮＤ３細胞の保護］
ＯＧＤモデルでは、プロタミン及びプロタミン４（ｐｔｍ４）が、ＯＧＤの１５分前にペプチドで処置された場合に血液脳関門（ｂＥＮＤ３）内皮細胞を保護した（図２３、２４）。加えて、ｂＥＮＤ３を１．２５〜１５μＭの範囲の濃度のプロタミンに０．５〜２時間曝露しても、ＭＴＳアッセイベースでいかなる有意な毒性も引き起こさなかった（図２５、２６）。図４３は、２．５〜１０μＭの濃度のＰｔｍ１〜Ｐｔｍ５及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ）が、２４時間の曝露後に有意な星状細胞の細胞死を引き起こさなかったことを示している。
【０１８８】
［概説及び議論］
本出願人は、アルギニンに富んだ硫酸プロタミン（プロタミン；Ｐｔｍ）、プロタミンペプチド１〜５（Ｐｔｍ１〜Ｐｔｍ５、それぞれ配列番号３２〜３６）、及び低分子量プロタミン（ＬＭＷＰ、配列番号３７）について、皮質神経細胞培養物におけるグルタミン酸又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの虚血（酸素グルコース欠乏：ＯＧＤ）への曝露後の神経保護特性に関して評価を行った。いずれの損傷モデルも虚血性脳卒中の影響を模倣するために一般的に使用されている。
【０１８９】
本出願人はさらに、ＯＧＤからの血液脳関門（ｂＥＮＤ３）内皮細胞の保護におけるプロタミンペプチドの使用についても評価した。
プロタミンは、グルタミン酸及びＯＧＤのいずれの損傷モデルにおいても一貫した高レベルの神経保護活性を示した一方、プロタミンはさらにｂＥＮＤ３細胞の保護も提供した。ＬＭＷＰは、神経細胞のグルタミン酸及びＯＧＤ損傷モデルにおいて（プロタミンと同等の神経保護を達成するための用量濃度に基づけば）わずかに劣る有効性であった。このことは、ＬＭＷＰペプチドが含有するアルギニン残基がより少数であることに起因する可能性が高い。プロタミンペプチド１〜５（Ｐｔｍ１〜Ｐｔｍ５）もグルタミン酸モデルにおいて高度に神経保護性であり、さらにＰｔｍ２、Ｐｔｍ４及びＰｔｍ５はＯＧＤモデルにおいて神経保護性であった。
【０１９０】
ｂＥＮＤ３細胞を使用するＯＧＤの研究では、プロタミンを用いた１５分の事前曝露は、様々なＯＧＤ持続期間（２時間１５分、２時間３０分又は２時間４５分）の後に、細胞の生存率及びしたがって保護を著しく高めた。加えて、Ｐｔｍ４を用いた１５分の事前曝露も、ＯＧＤモデルにおいて、細胞の生存率及びしたがって保護を著しく高めた。
【０１９１】
様々な濃度のプロタミンを使用するｂＥＮＤ３毒性試験では、プロタミンは１５μＭの高濃度でも毒性ではないことが明らかとなった。
これらの所見は、本発明のプロタミンペプチドが、興奮毒性及び虚血による損傷に関連した神経に有害な事象／経路を阻害する能力を有することを実証している。さらに、事前曝露の試行におけるプロタミンの効果により、１つの新しい重要な所見は、グルタミン酸又はＯＧＤへの曝露の１又は２時間前の神経細胞のプロタミン処置が、細胞死の低減により、神経保護性の応答を引き起こすことができるということであった。このことは重要である、というのも、患者が脳損傷という結果をもたらす脳虚血又は脳卒中を被るリスクのある、数多くの脳血管性（例えば頚動脈血管内膜切除術）及び心臓血管性（例えば冠動脈バイパス移植術）の外科手術手技が存在するからである。したがって、プロタミンペプチドは、何らかのそのような大脳の虚血事象から脳を保護するために、そのような手技の１〜２時間前に投与されうる可能性がある。
【０１９２】
本発明のペプチドの細胞保護特性は、該ペプチドがＣＮＳ損傷の治療のための理想的な神経保護薬であることを示唆している。加えて、該ペプチドは細胞透過性を有する可能性もあるので［プロタミンは遺伝子治療の送達用にＦＤＡの承認を受けており（ＤＮＡ、ウイルスベクター；ソルジ（Sorgi ）ら、１９９７年）、またＬＭＷＰは細胞透過性ペプチドとして使用されている；パーク（Park）ら、２００５年］、これらは損傷後のＣＮＳに神経保護薬を送達する理想的な担体分子である。
【０１９３】
本発明のペプチドの神経保護効果はペプチドの物理化学的特性と関係しているようである。更に、おそらくは、アルギニンに富んだプロタミンペプチドの神経保護作用は細胞膜（例えば受容体、イオンチャネル）を介しているであろう。研究により、アルギニンに富んだペプチド、例えばＴＡＴ（スー（Xu）ら、２００８年）、Ｒ６（ファーラー＝モンティエル（Ferrer-Montiel）ら、１９８８年）並びにＲ９‐ＣＢＤ３（フェルトマン（Feldman ）及びハンナ（Khanna）、２０１３年）及びＴＡＴ‐ＣＢＤ３（ブルストベトスキー（Brustovetsky）ら、２０１４年）は、細胞表面の受容体及びイオンチャネル、例えばＮＭＤＡ受容体などの機能に影響を及ぼして、カルシウム流入の低減をもたらしうることが示唆されている。しかしながら、本発明の１又は複数のペプチドは、ＮＭＤＡ受容体の機能の阻止、及びカルシウムの流入の阻止、ダウンレギュレーション、又は減速、のうち少なくともいずれかを為すように作用することが可能であると考えられる。別例のメカニズムは、プロタミンペプチドがミトコンドリア外膜と相互作用してこれを安定化することにより、ミトコンドリアの機能を維持する助けとなるということである。潜在的な恩恵は、ＡＴＰ合成の維持、活性酸素種の産生の低減、及びカルシウム輸送の改善である。この目的で、本出願人は、正常な神経細胞において、かつ損傷後に、プロタミンがＭＴＳ吸光度レベルをベースラインレベルより上に上昇させることができることを観察済みである（例えば図１１、１２；５μＭ）。ＭＴＳの、そのフォルマザン生成物への還元は、主としてミトコンドリアにおいて生じるので、プロタミンがフォルマザンのレベルを上昇させる能力は、該ペプチドがミトコンドリアの機能を改善しているということを支持している。別のメカニズムの可能性は、これらのアルギニンに富んだペプチドがカルシウム依存性プロタンパク質転換酵素フューリン（カスプルザック（Kacprzak）ら、２００４年）を阻害しており、それにより潜在的に有害なタンパク質の活性化を阻止しているということである。
【０１９４】
プロタミンペプチドの細胞内侵入に関して、アルギニンに富んだペプチドについての有力なメカニズムはエンドサイトーシス（マクロピノサイトーシス）によるものと考えられている（パーム＝アペルギ（Palm-Apergi ）ら、２０１２年）。したがって、原形質膜を横切るペプチドのエンドサイトーシスの際に、細胞表面構造物のエンドソームによる内在化が生じることがありそうである（図４６を参照）。神経細胞の興奮毒性及び虚血という状況においては、イオンチャネルのダウンレギュレーションは、通常は神経に有害なカルシウム及び他のイオンの流入を低減するので、有益であろう。
【０１９５】
本出願人は、ＣＰＰに加えて神経保護ペプチドとしての役割をも果たすことが可能な、新しい部類又は群のペプチドを同定したという見解である。本出願人は、ポリアルギニンペプチド又はアルギニンに富んだペプチド、特にプロタミン又は低分子量プロタミンから選択されたもの（並びにそれらの混合剤及び誘導体、特に市販の硫酸プロタミンの形態のもの）が、新規な神経保護特性又は神経活性特性を有することを見出した。本発明の一部として本明細書中に開示されたペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用された時に同じ範囲の神経保護特性又は神経活性特性を有し（ヴァスリン（Vaslin）ら、２００９年）、かつ神経の損傷の治療に用いられる、ということが証明されている。
【０１９６】
本出願人はこのように、アルギニンに富んだペプチド及びＴＡＴに無関係なＣＰＰ、特にポリアルギニン配列及び長さ１０〜３２アミノ酸の配列であって１０個を超えるアルギニン残基を有するもの（例えばプロタミン、ＬＭＷＰ、及びこれらの誘導体など）が、新規な神経保護特性を有することを見出した。本発明のＣＰＰは、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用された時に同じ範囲の神経保護特性を有し（ヴァスリン（Vaslin）ら、２００９年）、かつ神経の損傷の治療に用いられる、ということが証明されている。
【０１９７】
参照文献
【０１９８】
【表８−１】
0006495270.tif 000011
【表８−２】
0006495270.tif 000012
【表８−３】
0006495270.tif 000013
【図１ａ】
0006495270.tif 000014
【図１ｂ】
0006495270.tif 000015
【図１ｃ】
0006495270.tif 000016
【図１ｄ】
0006495270.tif 000017
【図１ｅ】
0006495270.tif 000018
【図１ｆ】
0006495270.tif 000019
【図１ｇ】
0006495270.tif 000020
【図１ｈ】
0006495270.tif 000021
【図１ｉ】
0006495270.tif 000022
【図１ｊ】
0006495270.tif 000023
【図２】
0006495270.tif 000024
【図３ａ】
0006495270.tif 000025
【図３ｂ】
0006495270.tif 000026
【図３ｃ】
0006495270.tif 000027
【図４】
0006495270.tif 000028
【図５】
0006495270.tif 000029
【図６】
0006495270.tif 000030
【図７】
0006495270.tif 000031
【図８】
0006495270.tif 000032
【図９】
0006495270.tif 000033
【図１０】
0006495270.tif 000034
【図１１】
0006495270.tif 000035
【図１２】
0006495270.tif 000036
【図１３】
0006495270.tif 000037
【図１４】
0006495270.tif 000038
【図１５】
0006495270.tif 000039
【図１６】
0006495270.tif 000040
【図１７】
0006495270.tif 000041
【図１８】
0006495270.tif 000042
【図１９】
0006495270.tif 000043
【図２０】
0006495270.tif 000044
【図２１】
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【図２２】
0006495270.tif 000046
【図２３】
0006495270.tif 000047
【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
0006495270.tif 000050
【図２７】
0006495270.tif 000051
【図２８】
0006495270.tif 000052
【図２９】
0006495270.tif 000053
【図３０】
0006495270.tif 000054
【図３１】
0006495270.tif 000055
【図３２】
0006495270.tif 000056
【図３３】
0006495270.tif 000057
【図３４】
0006495270.tif 000058
【図３５】
0006495270.tif 000059
【図３６】
0006495270.tif 000060
【図３７】
0006495270.tif 000061
【図３８】
0006495270.tif 000062
【図３９】
0006495270.tif 000063
【図４０】
0006495270.tif 000064
【図４１】
0006495270.tif 000065
【図４２】
0006495270.tif 000066
【図４３】
0006495270.tif 000067
【図４４】
0006495270.tif 000068
【図４５】
0006495270.tif 000069
【図４６】
0006495270.tif 000070
【図４７】
0006495270.tif 000071
【配列表】
0006495270000001.app