(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルと、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液とを用い、金コロイド標識抗体と測定サンプルと展開液との混合液を展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンであり、前記抽出液が陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
【請求項２】
ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも３０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とする請求項１記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
【請求項３】
陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを用いることを特徴とする請求項１又は２記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
【請求項４】
非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を用いることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
【請求項５】
大豆７Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
【請求項６】
ごま１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２を用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法。
【請求項７】
変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料からアレルゲンを抽出するための陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含有する抽出液と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備え、前記アレルゲンが大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンであることを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
【請求項８】
陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする請求項７記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
【請求項９】
非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含有することを特徴とする請求項７又は８記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
【請求項１０】
大豆７Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
【請求項１１】
ごま１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２であることを特徴とする請求項７〜９のいずれか記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キット。
【請求項１２】
ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２を含むことを特徴とする大豆７Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体の組合せ。
【請求項１３】
ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２を含むことを特徴とするごま１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体の組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、大豆やごまの主要アレルゲンを含む食品等の被検試料から、陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を用いて大豆やごまの主要アレルゲンを抽出し、これらアレルゲンが変性／未変性のいかなる状態にあっても陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤で効率よく抽出し、さらに抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速に検出することのできるイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法やそれに使用することができるイムノクロマト用アレルゲンの検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
自然環境の減少、車や工場などからの排気ガス、住宅事情等、或いは食べ物の変化など様々な因子により、現在では、３人に１人が何らかのアレルギー疾患をもつといわれている。特に、食物アレルギーは、食品中に含まれるアレルギー誘発物質（以下、食物アレルゲンという）の摂取が引き起こす有害な免疫反応であり、皮膚炎、喘息、消化管障害、アナフィラキシーショック等を引き起こし、このような食物アレルギーの患者が増加していることから、医学上及び食品産業上、深刻な問題を生じている。これらの危害は死に至らせることがあり、未然に処置を施す必要がある。そのためには、表示を通じて消費者へ情報提供の必要性も高まっており、ＦＡＯ／ＷＨＯ合同食品規格委員会は、アレルギー物質として知られている８種の原材料を含む食品にあっては、それを含む旨の表示について合意し、加盟国で各国の制度に適した表示方法を検討することとした（１９９９年６月）。日本では過去の健康危害などの程度、頻度を考慮して重篤なアレルギー症状を起した実績のある２４品目の食品について、その表示方法が定められた（２００２年４月より施行）。その後、食物アレルギー患者の実態調査などに基づき見直しが行われ、表示推奨品目として２００４年に「バナナ」が、２０１３年に「ごま」「カシューナッツ」が追加された。また、表示推奨品目であった「えび」「かに」が２００８年に表示義務品目となり、２０１５年５月現在では、合計２７品目の食品について表示方法が定められている。アレルギーを引き起こす食品としては、卵類、牛乳類、肉類、魚類、甲殻類、軟体動物類、穀類、豆類、ナッツ類、果実類、野菜類、ビール酵母及びゼラチンなどが知られている。
【０００３】
上記のアレルゲンを迅速で簡易に検出するため、抗原−抗体による特異的反応を利用して特定の抗原または抗体よりなる被検出物質を検出する免疫測定法としては、試料中の被検出物質を、微粒子に感作させた抗体または抗原と免疫反応により結合させ、結合によって生じる微粒子の凝集状態を測定する凝集法が簡便な免疫測定法であり、特に目視判定が可能である点で一般的に用いられている方法である。
【０００４】
また、試料中の被検出物質に、放射性同位元素、酵素または蛍光物質からなる標識物質により標識した抗体または抗原を免疫反応により結合させ、この結合した標識物質を測定する放射免疫測定法、酵素免疫測定法あるいは蛍光免疫測定法も採用されている。これらの免疫測定法では、競合型反応、サンドイッチ型反応が広く使われている。これらのうち、いわゆるサンドイッチ型反応の測定法として、イムノクロマトグラフィー法が知られており（例えば、特許文献１参照）、抗原抗体反応に起因する高い特異性に加え、簡易、迅速を特徴とする種々のアレルゲン検出キットが販売されている。
【０００５】
かかるイムノクロマトグラフィー法に適用される試料としては、生体試料や食品からの抽出物などあるが、試料の種類によっては、検体が存在しないにもかかわらず捕捉部位で淡い呈色を示す所謂非特異反応を生じることがあり、検査における確度の低下をもたらすことがあった。そこで、緩衝液中に、ホスホリルコリン基を有する重合体を、０.００５〜０.３ｗ／ｖ％の濃度で含有し、該重合体の数平均分子量は４０，０００以上であることを特徴とする、測定時の非特異的凝集および非特異反応を防止し、以って、高い確度で測定を可能とする展開溶媒（例えば、特許文献２参照）が提案されている。
【０００６】
また、上記免疫測定法においては、タンパク質に加熱や加圧などによって変性等が生じた場合、測定結果が低くなったり、測定できないケースが認められていた。特定原材料の検査方法として厚生労働省より通知されている食安発第０１２２００１号に収載されているサンドイッチＥＬＩＳＡ法では、加熱した被検試料から各アレルゲンを十分に抽出するために、変性剤及び還元剤（２−メルカプトエタノール）を用いた抽出溶液を用いて抽出する方法が採用されている。これは、従来より利用されてきた、タンパク質の分析に用いられるＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法のサンプル調製方法が応用されており、被検試料から各アレルゲンの抽出効率を高めるには変性剤と還元剤が必要不可欠であると考えられていた。また、これらをイムノクロマトグラフィー法に適応した場合、多くの非特異反応が見られるために正確な検査ができず、変性タンパク質を測定する際に問題となっていた。
【０００７】
本出願人は、変性剤及び還元剤を用いた抽出溶液を用いて抽出し、イムノクロマトグラフィー法に適応した場合でも、金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え迅速かつ精度よくアレルゲンを検出することのできるイムノクロマト法を提案している（例えば、特許文献３参照）。当該方法では、加熱した被検試料から各アレルゲンを十分に抽出し、さらに簡便なイムノクロマトグラフィー法により検査が可能となったため、精度と簡便さについて飛躍的に向上することができた。しかし、用いる還元剤（２−メルカプトエタノール）においては特異な臭いがあることと、２−メルカプトエタノールが２００８年７月１日より毒物として指定されたことから、食品製造工場などでの簡便な使用が困難となっていた。そこで、より安全で効率のよい抽出方法と、これらをイムノクロマトグラフィー法に適応した場合、非特異反応が見られず、正確な検査が可能なイムノクロマトグラフィー法が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開平５−０１０９５０号公報
【特許文献２】特開２００３−３４４４０６号公報
【特許文献３】特開２００７−２７８７７３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、大豆やごまの主要アレルゲンを含む食品等の被検試料から、２−メルカプトエタノールを使用することなく、大豆アレルゲンやごまアレルゲンを抽出し、さらに、抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速かつ精度よくアレルゲンを検出することのできるイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、かかる方法に用いることができるイムノクロマト用アレルゲンの検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンに対するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、アレルゲンを含む食品等の被検試料から、陰イオン性界面活性剤とチオ硫酸塩、又は、陰イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤を用いて抽出した変性及び未変性のアレルゲンの測定サンプルを含む展開液を用い、展開支持体に展開させた後、金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法（国際公開ＷＯ２０１０／０９５４６９号パンフレット）を既に開発しており、乳アレルゲンの主要成分としてのαｓ１カゼイン、ホエーアレルゲンの主要成分であるβラクトグロブリン、卵白アレルゲンとしてのオボアルブミンとオボムコイド、小麦アレルゲンの主要成分としてのグリアジン、そばの主要タンパク質である分子量２４ｋＤａと７６ｋＤａのタンパク質、落花生の主要タンパク質であるＡｒａｈ１から選ばれる変性及び未変性のアレルゲンについて優れた検出能が確認されている。本発明者らは、さらに検討を続け、１年を超える試行錯誤の末、大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンに対する優れたモノクローナル抗体を開発した。また、被検試料から、陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含む抽出液を用いて抽出することにより、大豆やごまの主要アレルゲンを、前記抗体を用いて迅速かつ精度よく検出することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１１】
すなわち本発明は、（１）変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルと、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液とを用い、金コロイド標識抗体と測定サンプルと展開液との混合液を展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法において、前記アレルゲンが大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンであり、前記抽出液が陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とするイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（２）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも３０重量％含まれている展開液を用いることを特徴とする前記（１）記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（３）陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを用いることを特徴とする前記（１）又は（２）記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（４）非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を用いることを特徴とする前記（１）〜（３）のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（５）大豆７Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２を用いることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、（６）ごま１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２を用いることを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか記載のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法に関する。
【００１２】
また本発明は、（７）変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料からアレルゲンを抽出するための陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含有する抽出液と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備え、前記アレルゲンが大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンであることを特徴とするイムノクロマト用アレルゲンの検出キットや、（８）陰イオン性界面活性剤としてドデシル硫酸ナトリウムを含有することを特徴とする前記（７）記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットや、（９）非イオン性界面活性剤としてＴｗｅｅｎ２０を含有することを特徴とする前記（７）又は（８）記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットや、（１０）大豆７Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２であることを特徴とする前記（７）〜（９）のいずれか記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットや、（１１）ごま１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体が、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２であることを特徴とする前記（７）〜（９）のいずれか記載のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットや、（１２）ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２を含むことを特徴とする大豆７Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体の組合せや、（１３）ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２を含むことを特徴とするごま１１Ｓグロブリンに対するモノクローナル抗体の組合せに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法によると、陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含む抽出液を用いた場合、抗体に結合した金コロイドの崩壊に伴う非特異反応を抑え、迅速かつ精度よく大豆やごまを検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】大豆７Ｓグロブリンに対して陽性を示す５種類の抗体の、固相の抗原に対する特異性を示すグラフである。
【図２】ごま１１Ｓグロブリンに対して陽性を示す６種類の抗体の、固相の抗原に対する特異性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法としては、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルと、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）が少なくとも１０重量％含まれている展開液とを用い、金コロイド標識抗体と測定サンプルと展開液との混合液を展開支持体に展開させた後、前記所定の位置における金コロイドの集積の有無により、アレルゲンを検出するイムノクロマト法であって、前記アレルゲンが大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンであり、前記抽出液が陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含むことを特徴とする検出方法であれば特に制限されず、本発明の方法における被検試料としては、アレルゲンが存在する可能性のある食品等の被検試料を挙げることができ、かかる食品等の被検試料には、種々の食品のほか、該食品を製造するために用いられる原料、該食品を製造するために使用された装置に残るカス、沈殿物等の残留物、該装置を洗浄した洗浄液、該洗浄液を取り除くために使用されたすすぎ液、該食品を包装した包装紙や包装容器など、食品中に存在するアレルゲンが二次的に存在する可能性がある試料を含めることができる。
【００１６】
本発明のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットとしては、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体と、変性及び未変性のアレルゲンを共に認識し、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するモノクローナル抗体が所定の位置に固定された展開支持体と、被検試料からアレルゲンを抽出するための陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含有する抽出液と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備え、前記アレルゲンが大豆７Ｓグロブリン又はごま１１Ｓグロブリンであることを特徴とする検出キットであれば特に制限されないが、製造年月日から１年以上常温保存した場合においても、実用性に耐えうる精度・安定性を有するものが望ましい。
【００１７】
上記展開液におけるウシ胎児血清（ＦＢＳ）濃度としては、１０〜５０重量％を挙げることができ、２０〜４０重量％が好ましく、２５〜３５重量％がより好ましく、１０重量％未満の場合、非特異反応を生じやすく好ましくない。また、展開液には、緩衝液中にウシ胎児血清（ＦＢＳ）の他、必要に応じて他の界面活性剤、防腐剤、無機塩などの各種添加剤を懸濁もしくは乳濁または溶解せしめて調製することができる。緩衝液は、そのｐＨが４〜１０、特にｐＨ６〜８が好ましく、例えば、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）やトリス緩衝液（ＴＢＳ）などを好適に例示することができる。
【００１８】
上記モノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体の作製方法は従来公知の方法を含め特に制限されないが、例えば、０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液に、２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）にモノクローナル抗体を溶解した溶液を加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を加え、さらに１５分間反応させ、遠心分離する方法を挙げることができる。また、金コロイド標識抗体担持体は、上記作製した金コロイド標識抗体を、例えばガラスウール製コンジュゲートパッドに塗布し、乾燥させることにより作製することができる。
【００１９】
上記展開支持体は、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体を含む緩衝液を、例えば、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた後、ブロッキング処理することにより作製することができる。
【００２０】
被検試料から抽出液を用いて抽出したアレルゲンの測定サンプルを調製する際に用いられる抽出液における、陰イオン性界面活性剤としては、高級アルコール硫酸エステル塩、アルキルナフタレンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキルリン酸エステル塩などを挙げることができ、具体的にはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を好適に例示することができる。チオ硫酸塩としては、チオ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、チオ硫酸アンモニウムなどを挙げることができ、具体的にはチオ硫酸ナトリウムを好適に例示することができる。非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ソルビタン脂肪酸エステルなどを挙げることができ、具体的にはポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）を好適に例示することができる。上記陰イオン性界面活性剤の濃度は０．１〜２．０％、好ましくは０．２５％〜１％であり、チオ硫酸塩の濃度は０．０１〜５．０％、好ましくは０．０５％〜０．５％であり、非イオン性界面活性剤の濃度は０．０１〜１．０％、好ましくは０．
１〜０．５％であり、これらの濃度範囲の陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含む抽出液を用いると、抽出効率が高く且つ非特異反応を抑制しうる点で好ましい。
【００２１】
上記測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体としては、ガラスウール製のサンプルパッドを例示することができる。そして、このサンプル用担体、前記金コロイド標識抗体担持体、前記展開支持体、好ましくはこの展開支持体の他端に展開液の吸収する吸収パッド等の吸収体を順次連結することによりイムノクロマト測定用試験片とすることができる。そして、サンプル用担体に測定サンプルをスポットし、ウシ胎児血清を含む展開液に浸漬すると、測定サンプル中のアレルゲンは毛管現象等により移動し、金コロイド標識抗体と結合し、この抗原抗体複合体は展開支持体上をなおも毛管現象等により移動して、金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体が固定された所定位置で抗原抗体複合体が捕捉されて、金コロイドの集積により所定位置に現れる着色ラインの有無により、アレルゲンを検出することができる。
【００２２】
上記変性及び未変性のアレルゲンを共に認識するモノクローナル抗体としては、大豆の主要アレルゲンとしての７Ｓグロブリン、ごまの主要アレルゲンとしての１１Ｓグロブリンから選ばれる変性及び未変性のアレルゲンを、特異的に認識する２種類のモノクローナル抗体を好適に例示することができる。
【００２３】
より好ましくは、本発明者らにより作製された、抗大豆７Ｓグロブリンモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生する抗大豆７Ｓグロブリンモノクローナル抗体ＰＤＳＹ１や、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生する抗大豆７Ｓグロブリンモノクローナル抗体ＰＤＳＹ２を挙げることができ、抗ごま１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体として、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生する抗ごま１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体ＰＤＳＥ１や、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生する抗ごま１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体ＰＤＳＥ２を挙げることができる。また、大豆７Ｓグロブリンに対する２種類のモノクローナル抗体の組合せとしては、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）が産生するＰＤＳＹ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）が産生するＰＤＳＹ２を好適に挙げることができ、ごま１１Ｓグロブリンに対する２種類のモノクローナル抗体の組合せとしては、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）が産生するＰＤＳＥ１及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）が産生するＰＤＳＥ２を好適に挙げることができる。ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）、ハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）、及びハイブリドーマ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）はｓ、２０１５年５月７日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） 特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に受領されている。
【００２４】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２５】
１．抗大豆７Ｓグロブリンモノクローナル抗体の確立
（１）大豆７Ｓグロブリンの調製
大豆をミルサーにより粉砕し、アセトンを用いて脱脂したのち一晩室温により風乾し、アセトンを除去したものを脱脂大豆粉末とした。この脱脂大豆粉末をプレップセル９６０（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて精製を行った。７Ｓグロブリン画分を透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥粉末を用い、生理食塩水で０．１％の７Ｓグロブリン溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−４０℃にて凍結保管した。
【００２６】
（２）免疫
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）を０．１％の７Ｓグロブリン溶液が５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）を０．１％の７Ｓグロブリン溶液が５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００２７】
（３）血中抗体価の測定
初回又は追加免疫で７Ｓグロブリンを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温にて２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗７Ｓグロブリン抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００２８】
（４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％７Ｓグロブリン溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ、７０ｍｍ、Becton Dickinson社製）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６細胞／ウェルとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。
【００２９】
（５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗７Ｓグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡにより７Ｓグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６細胞／ウェルとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００３０】
（６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、大豆７Ｓグロブリンを含む未変性大豆粗タンパク質（以下「Ｎ−ＳＯＹ」という）と、大豆７Ｓグロブリンを含む尿素処理大豆粗タンパク質（以下「Ｄ−ＳＯＹ」という）の２種類のタンパク質に対する反応性の違いを調べることで特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−ＳＯＹは、脱脂大豆粉末を１ｍｇ量り、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、尿素６．０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。精製抗体のＮ−ＳＯＹとＤ−ＳＯＹとに対する反応性をそれぞれダイレクトＥＬＩＳＡにて調べ、Ｎ−ＳＯＹ及びＤ−ＳＯＹに対して陽性を示す抗体を５種類選抜した。
【００３１】
（７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Ｊｏｎｅｓら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６細胞のクローニングされた、上記選抜された抗体を産生する各ハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）により精製し、変性及び未変性の大豆７Ｓグロブリンに対して特異性を有する５種類の精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を取得し、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＰＤＳＹ１、及びＰＤＳＹ２と呼ぶこととした。
【００３２】
（８）抗大豆７ＳグロブリンＭＡｂの特性
大豆７Ｓグロブリンに対して陽性を示す５種類の精製した抗体の特異性を確認した。固相の大豆７Ｓグロブリンを含む未変性大豆粗タンパク質（Ｎ−ＳＯＹ）又は、大豆７Ｓグロブリンを含む尿素処理大豆粗タンパク質（Ｄ−ＳＯＹ）に対する反応性をそれぞれ図１に示す。
【００３３】
（結果）
図１から明らかなとおり、５種類の抗体、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＰＤＳＹ１、及びＰＤＳＹ２のいずれも、未変性大豆７Ｓグロブリン及び変性大豆７Ｓグロブリンを認識することが確認されたが、未変性大豆７Ｓグロブリンと変性大豆７Ｓグロブリンとに対する特異性の強度はそれぞれの抗体において異なっていた。
【００３４】
（９）抗体の組合せの検討
上記精製された５種の抗体について、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれＨＲＰ標識を行った。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（株式会社同仁化学研究所製）の取扱説明書に従い、ＨＲＰ標識されたモノクローナル抗体を得た。固相の抗原に対し陽性反応を示した５種のＭＡｂをそれぞれ固相又はＨＲＰ標識抗体として、ＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。測定対象として脱脂大豆粉末に０．５％ＳＤＳ、０．１％チオ硫酸ナトリウム、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０が含まれるＰＢＳを加えて沸騰水中で１０分間加熱したもの（以下「Ｓ−ＳＯＹ」という）を作製し適宜希釈したものを用いた。反応性が異なるＭＡｂの組合せ５種の抗体の、サンドイッチＥＬＩＳＡによる反応性（Ｓ−ＳＯＹ １ｐｐｍでの吸光値）の結果を以下の表１に示す。
【００３５】
【表１】
0006510307.tif 000002
【００３６】
（結果）
表１から明らかなとおり、Ｓ−ＳＯＹを検出できる組合せの中で最も感度の高い組合せとして、プレート固定化抗体ＰＤＳＹ１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）とＨＲＰ標識抗体ＰＤＳＹ２（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）を選択した。
【００３７】
２．イムノクロマトグラフィーによる陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤で抽出した大豆アレルゲンの検出
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＳＹ２（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４０）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
【００３８】
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＳＹ１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０３９）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃にて１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００３９】
（３）イムノクロマトストリップの組立
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
【００４０】
（４）大豆タンパク質の調製  大豆をミルサーで粉砕し、アセトンで脱脂した粉末を大豆タンパク質とした。
【００４１】
（５）モデル食肉製品
試験のためのモデル食肉製品としてハムとハンバーグとを選択し、それぞれ表２と表３とに示す配合にて各濃度の大豆タンパク質を含むモデルハムとモデルハンバーグを作製した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００４２】
【表２】
0006510307.tif 000003
【００４３】
【表３】
0006510307.tif 000004
【００４４】
（６）加熱温度・時間
モデルハムは、７５℃にて３０分加熱し、モデルハンバーグは沸騰水で１０分加熱した。加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。
【００４５】
（７）サンプルの前処理
検出用サンプル１ｇを量り取り、それに抽出液として、０．５％ＳＤＳ、０．１％チオ硫酸ナトリウム、及び０．２％Ｔｗｅｅｎ２０が含まれるＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
【００４６】
（８）イムノクロマトグラフィーによる検出の確認
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として牛胎児血清（ＦＢＳ）を３０μｌ、測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、検出を確認した。
【００４７】
（結果）
次に検出結果を表４に示す。判定はラインの強い方から順に＋＋、＋と表記し、陰性を−表記とした。
【００４８】
【表４】
0006510307.tif 000005
【００４９】
表４に示すように全ての測定サンプルで２ｐｐｍまで陽性と判定され、０ｐｐｍでは非特異反応はなかった。精度のよいイムノクロマトキットを構築することが可能となった。
【００５０】
以上の結果より、大豆７Ｓアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を担持させた金コロイド標識抗体担持体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識する大豆７Ｓアレルゲンに対するモノクローナル抗体が固定された展開支持体と、被検試料から、アレルゲンを抽出するための陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液と、抽出した大豆７Ｓアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備える検出キットを作製することにより、大豆７Ｓアレルゲンを検出するための精度のよいイムノクロマトキットを構築することができた。また、かかるイムノクロマトキットは、製造年月日から１年以上常温にて保存した場合においても、実用性に耐えうる精度を維持することができることが確認されている。
【実施例２】
【００５１】
１．抗ごま１１Ｓグロブリンモノクローナル抗体の確立
（１）ごま１１Ｓグロブリンの調製
ごまをミルサーにより粉砕し、アセトンを用いて脱脂したのち一晩室温により風乾し、アセトンを除去したものを脱脂ごま粉末とした。この脱脂ごま粉末をプレップセル９６０（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて精製を行った。１１Ｓグロブリン画分を透析後、凍結乾燥を行った。これらの凍結乾燥粉末を用い、生理食塩水で０．１％の１１Ｓグロブリン溶液を作製し、１ｍｌ容エッペンドルフチューブに５００μｌずつ分注して抗原溶液とし、免疫に供するまで−４０℃にて凍結保管した。
【００５２】
（２）免疫  
供試動物として、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本クレア株式会社製）５尾を用いた。初回免疫には、完全フロイントアジュバント（Difco）を０．１％の１１Ｓグロブリン溶液が５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。また、追加免疫は、３週間の間隔で２回行った。免疫には、不完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ社製）を０．１％の１１Ｓグロブリン溶液が５００μｌ入ったエッペンドルフチューブに等量加え、ボルテックスミキサーにて攪拌して作製したエマルジョンを供試した。このエマルジョンを１尾当たり１５０μｌ腹腔内に注射した。
【００５３】
（３）血中抗体価の測定
初回又は追加免疫で１１Ｓグロブリンを注射した１週間後に、各ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾部静脈より採血を行った。採血した血液は室温にて２時間放置後、遠心分離を行い、血清を得た。これらの血清の１０倍希釈段を作製し、非競合法ＥＬＩＳＡによりマウス血中の抗１１Ｓグロブリン抗体価を調べた。なお、二次抗体にはアルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Jackson ImmunoReserch Laboratories Inc.製）を用いた。
【００５４】
（４）ハイブリドーマの作製
ハイブリドーマの作製は、ケラーとミルシュタインの方法（１９７５）に従った。すなわち、十分に抗体価が上がったマウスに、０．１％１１Ｓグロブリン溶液１００μｌを尾部静脈より注射した。静脈注射から４日後、マウスより脾臓を無菌的に摘出した。脾臓を細切後、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄して、滅菌ナイロンメッシュ（Ｃｅｌｌ Ｓｔｒａｉｎｅｒ、７０ｍｍ、Becton Dickinson社製）を通し、脾臓細胞懸濁液を得た。１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離により脾臓細胞を集め、再度ＲＰＭＩ１６４０で再懸濁し細胞数をカウントした。この脾臓細胞懸濁液とマウスミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３）懸濁液を細胞数が１０：１になるように混合し、再度１０００ｒｐｍ×１０分の遠心分離を行い、ペレットを得た。このペレットに平均分子量３３５０の４５％ポリエチレングリコールを滴下し細胞融合を行った。細胞溶液にＲＰＭＩ１６４０を加え希釈後、遠心分離でペレットにした。このペレットに、ハイブリドーマ用培地（１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地）に１００μＭのヒポキサンチン、０．４μＭのアミノプテリン、１６μＭのチミジンを含むＨＡＴ選択培地を加え、５×１０６細胞／ウェルとなるように２４ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に分注し、５％ＣＯ２下３７℃にて培養した。
【００５５】
（５）限界希釈法によるクローニング
細胞培養用プレートの各ウェルの培養上清について、ＥＬＩＳＡの一次抗体として供試し、抗ごま１１Ｓグロブリン抗体を産生しているハイブリドーマの存在を調べた。ＥＬＩＳＡによりごま１１Ｓグロブリンに対して陽性を示したウェルのハイブリドーマについて、０．９細胞／ウェルとなるように９６ウェルの細胞培養用プレート（Becton Dickinson社製）に移し、限界希釈法によるクローニングを行った。なお、フィーダー細胞として、４週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス胸腺細胞を５×１０６細胞／ウェルとなるように９６ウェル細胞培養用プレートの各ウェルに加えた。クローニングされたハイブリドーマの培養には、１０％牛胎児血清、４０ｍＭの２−メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。
【００５６】
（６）抗体のスクリーニング
モノクローナル抗体のスクリーニングは、ごま１１Ｓグロブリンを含む未変性ごま粗タンパク質（以下「Ｎ−ＳＳＭ」という）、ごま１１Ｓグロブリンを含む尿素処理ごま粗タンパク質（以下「Ｄ−ＳＳＭ」という）の２種類のタンパク質に対する反応性の違いを調べることにより特異性の異なるクローンを得ることとした。Ｄ−ＳＳＭは、脱脂ごま粉末を１ｍｇ量り、５％ＥＤＴＡ１００μｌ、尿素６．０ｇ、２−メルカプトエタノール０．２ｍｌ、５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．６）１ｍｌ、蒸留水１．５ｍｌを加え、アルミフォイルで蓋をした後、１００℃で１時間オイルバスで加熱、変性処理を行った。精製抗体のＮ−ＳＳＭとＤ−ＳＳＭとに対する反応性をそれぞれダイレクトＥＬＩＳＡにて調べ、Ｎ−ＳＳＭ及びＤ−ＳＳＭに対して陽性を示す抗体を６種類選抜した。
【００５７】
（７）腹水の採取及びＭＡｂの精製
Ｊｏｎｅｓら（１９９０）に従い、まず、ＢＡＬＢ／ｃマウスに不完全フロイントアジュバントを０．２ｍｌ腹腔内に注射した。１週間後、一尾当たり５×１０６細胞のクローニングされた、上記選抜された抗体を産生する各ハイブリドーマを接種した。腹水貯留後、シリンジにより腹水を採取した。採種した腹水をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）により精製し、変性及び未変性の１１Ｓグロブリンに対して特異性を有する６種類の精製モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を取得し、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＰＤＳＥ１、及びＰＤＳＥ２と呼ぶこととした。
【００５８】
（８）抗ごま１１ＳグロブリンＭＡｂの特性
ごま１１Ｓグロブリンに対して陽性を示す６種類の精製した抗体の特異性を確認した。固相のごま１１Ｓグロブリンを含む未変性ごま粗タンパク質（Ｎ−ＳＳＭ）又は、ごま１１Ｓグロブリンを含む尿素処理大豆粗タンパク質（Ｄ−ＳＳＭ）に対する反応性をそれぞれ図２に示す。
【００５９】
（結果）
図２から明らかなとおり、６種の抗体、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＰＤＳＥ１、及びＰＤＳＥ２のいずれも、未変性ごま１１Ｓグロブリン及び変性ごま１１Ｓグロブリンを認識することが確認されたが、未変性ごま１１Ｓグロブリンと変性ごま１１Ｓグロブリンとに対する特異性の強度はそれぞれの抗体において異なっていた。
【００６０】
（９）抗体の組合せの検討
上記精製された６種の抗体について、サンドイッチＥＬＩＳＡに供試するため、それぞれＨＲＰ標識を行った。Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ−ＳＨ（株式会社同仁化学研究所製）の取扱説明書に従い、ＨＲＰ標識されたモノクローナル抗体を得た。固相の抗原に対し陽性反応を示した各ＭＡｂをそれぞれ固相又はＨＲＰ標識抗体として、ＭＡｂの組合せを、サンドイッチＥＬＩＳＡにおける検出感度の点から選出した。測定対象として脱脂ごま粉末に０．５％ＳＤＳ、０．１％チオ硫酸ナトリウム、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０が含まれるＰＢＳを加えて沸騰水中で１０分間加熱したもの（以下「Ｓ−ＳＳＭ」という）を作製し適宜希釈したものを用いた。反応性が異なるＭＡｂの組合せ６種の抗体の、サンドイッチＥＬＩＳＡによる反応性（Ｓ−ＳＳＭ１ｐｐｍでの吸光値）の結果を以下の表５に示す。
【００６１】
【表５】
0006510307.tif 000006
【００６２】
（結果）
表５から明らかなとおり、いずれの抗体の組合せにおいても、Ｓ−ＳＳＭは検出されており、サンドイッチＥＬＩＳＡによる抗原捕捉能は確認されたが、Ｓ−ＳＳＭを検出できる組合せの中で最も感度の高い組合せとして、プレート固定化抗体ＰＤＳＥ１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）とＨＲＰ標識抗体ＰＤＳＥ２（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）を選択した。
【００６３】
２．イムノクロマトグラフィーによる陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤で抽出したごまアレルゲンの検出
（１）金コロイド標識抗体の作製
２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）で１ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＳＥ２（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４２）のＭＡｂ溶液を調製した。あらかじめ０．２Ｍ炭酸カリウム溶液でｐＨ９．０に調製した金コロイド溶液（シグマ社製）５ｍｌにＭＡｂ溶液を５００μｌ加え、室温で３０分間反応した後、１０％ＢＳＡ溶液を６３５μｌ加え、さらに１５分間反応させた。遠心分離を行い、１％ＢＳＡ溶液でＯＤ５２５＝１．０になるよう調製した。
【００６４】
（２）抗体固定化メンブレンの作製
ＰＢＳで４ｍｇ／ｍｌとなるようにＰＤＳＥ１（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２０４１）のＭＡｂ溶液を調製し、ニトロセルロースメンブレンに直線状に塗布し乾燥させた。その後、１％スキムミルクを含むＴＢＳで３７℃にて１時間ブロッキング後、ＴＢＳで洗浄し乾燥させた。
【００６５】
（３）イムノクロマトストリップの組立
抗体固定化メンブレンに加えて、被検液スポット用のガラスウール製サンプルパッド、被検液吸収用のガラスウール製吸収パッドを別途用意し、サンプルパッド、抗体固定化メンブレン、吸収パッドの順にそれぞれ貼り付け、イムノクロマトストリップとした。検出用サンプルには、以下のモデル食肉製品を供試した。
【００６６】
（４）ごまタンパク質の調製
ごまをミルサーで粉砕し、アセトンで脱脂した粉末をごまタンパク質とした。
【００６７】
（５）モデル食肉製品
試験のためのモデル食肉製品としてハムとハンバーグを選択し、それぞれ表６と表７とに示す配合にて各濃度のごまタンパク質を含むモデルハムとモデルハンバーグを作製した。各配合に従い添加物を計量し、フードプロセッサーにて混合後、塩ビチューブに充填を行った。
【００６８】
【表６】
0006510307.tif 000007
【００６９】
【表７】
0006510307.tif 000008
【００７０】
（６）加熱温度・時間
モデルハムは、７５℃にて３０分加熱し、モデルハンバーグは沸騰水で１０分加熱した。加熱後、フードプロセッサーにて均一としたものを検出用サンプルとした。
【００７１】
（７）サンプルの前処理
検出用サンプル１ｇを量り取り、それに抽出液として、０．５％ＳＤＳ、０．１％チオ硫酸ナトリウム、及び０．２％Ｔｗｅｅｎ２０が含まれるＰＢＳを１９ｍｌ加え撹拌し、沸騰水中で１０分間加熱し、冷却遠心後、上清を測定サンプルとした。
【００７２】
（８）イムノクロマトグラフィーによる検出の確認
調製した金コロイド標識抗体を２０μｌ、展開液として牛胎児血清（ＦＢＳ）を３０μｌ、測定サンプルを５０μｌ加え、イムノクロマトストリップに供試し、検出を確認した。
【００７３】
（結果）
次に検出結果を表８に示す。判定はラインの強い方から順に＋＋、＋と表記し、陰性を−表記とした。
【００７４】
【表８】
0006510307.tif 000009
【００７５】
表８に示すように全ての測定サンプルで２ｐｐｍまで陽性と判定され、０ｐｐｍでは非特異反応はなかった。
【００７６】
以上の結果より、ごま１１Ｓアレルゲンに対するモノクローナル抗体に金コロイドを結合した金コロイド標識抗体を担持させた金コロイド標識抗体担持体と、前記金コロイド標識抗体と異なるエピトープを認識するごま１１Ｓアレルゲンに対するモノクローナル抗体が固定された展開支持体と、被検試料から、アレルゲンを抽出するための陰イオン性界面活性剤、チオ硫酸塩、及び非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液と、抽出した１１Ｓアレルゲンの測定サンプルを担持させることができるサンプル用担体と、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）又はウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む展開液とを備える検出キットを作製することにより、ごま１１Ｓアレルゲンを検出するための精度のよいイムノクロマトキットを構築することができた。また、かかるイムノクロマトキットは、製造年月日から１年以上常温にて保存した場合においても、実用性に耐えうる精度を維持することができることが確認されている。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
大豆アレルゲン、ごまアレルゲン等の食物アレルゲンを、迅速かつ精度よく検出することのできる、本発明のイムノクロマト法によるアレルゲンの検出方法や、それに用いることができる本発明のイムノクロマト用アレルゲンの検出キットは、食品産業において有用である。
【図１】
0006510307.tif 000010
【図２】
0006510307.tif 000011