(57)【要約】本発明は、一般式（Ｉ）：A-B-C(F,G')-D-E-F-G-A'又は一般式（ＩＩ）：A-B-C(F',G')-D-B-E-F-G-A'(II),の化合物であり、ここで、Ａは、パーフルオロカーボン、パーフルオロシリコン化合物、及び／又は他のパーフルオロ化化合物の群から選択される分子の少なくとも１つ、Ｂは、物理的に、化学的に、又は酵素的に、切断できる結合の形態をした所定の切断点の少なくとも１つ、Ｃは、存在しない、又は少なくとも１つのリンカー分子、Ｄは、存在しない、又は少なくとも１つのスペーサー分子、Ｅは、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、修飾された核酸塩基、修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、修飾された核酸、ペプチド核酸モノマー、ペプチド核酸オリゴマー、及びペプチド核酸又は他の核酸アナログを含む群から選択される分子の少なくとも１つ、ＦとＦ′は、存在しない、又は配位子もしくは認識配列の少なくとも１つ、ＧとＧ′は、存在しない、又はマーカー分子の少なくとも１つ、Ａ′は、存在しない、又はＡ意味し、ここで、化合物ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、ｖｉ）が除外される。さらに、本発明は、細胞の中への、分子Ｅの非ウイルスの導入のための前述の化合物の使用、前述の化合物を含んでいる医薬品組成物、及び前述の医薬品組成物の使用に関する。【化４８】2014510743.tif 000055【選択図】なし
2014510743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
2014510743.tif 000052
又は一般式（ＩＩ）
2014510743.tif 000053
の化合物であり、
ここで、
Ａは、パーフルオロカーボン、パーフルオロシリコン化合物、及び／又は他のパーフルオロ化化合物の群から選択される分子の少なくとも１つ、
Ｂは、物理的に、化学的に、又は酵素的に、切断できる結合の形態をした所定の切断点の少なくとも１つ、
Ｃは、存在しない、又は少なくとも１つのリンカー分子、
Ｄは、存在しない、又は少なくとも１つのスペーサー分子、
Ｅは、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、修飾された核酸塩基、修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、修飾された核酸、ペプチド核酸モノマー、ペプチド核酸オリゴマー、及びペプチド核酸又は他の核酸アナログを含む群から選択される分子の少なくとも１つ、
ＦとＦ′は、存在しない、又は配位子もしくは認識配列の少なくとも１つ、
ＧとＧ′は、存在しない、又はマーカー分子の少なくとも１つ、
Ａ′は、存在しない、又はＡを意味し、ここで、次の化合物
【化１】
2014510743.tif 000054
を除く。
【請求項２】
Ａは、直鎖状の又は分枝状の、非環式の又は環式の、多環式の又はヘテロ環式の、脂肪族アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、又はこれらの化合物の組み合わせ、を含むパーフルオロカーボンの群から選択される分子の少なくとも１つであり、
ここで、前記これらの化合物中、すべてＨ原子がＦ原子によって置換され、
任意に、前記これらの化合物は、フッ素化されていない、又は部分的にフッ素化された、置換基の少なくとも１つを含んでおり、前記置換基は、官能基、又はヘテロ原子、特にＢｒ、Ｉ、Ｃｌ、Ｈ、Ｓｉ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、の1つ以上の形態をしている、又は前記官能基、又はヘテロ原子が、１つ以上の追加の官能基と結合した１つ以上の形態をしている、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａは、Ｃ１−Ｃ２００、好ましくはＣ１−Ｃ１００、特に好ましくはＣ１−Ｃ５０、非常に好ましくはＣ１−Ｃ３０、最も好ましくはＣ１−Ｃ２０の、アルカン、アルケン又はアルキンを含むパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）の群から選択され、
ここで、前記アルカン、アルケン又はアルキンは、直鎖状の、分枝状の、環式の、多環式の、ヘテロ環式の、Ｃ６−Ｃ５０、好ましくはＣ６−Ｃ３０、特に好ましくはＣ１−Ｃ２０の、芳香族又はヘテロ芳香族の系であり得る、
請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ａが、直鎖状又は分枝状の、非環式又は環式の、多環式又はヘテロ環式の、脂肪族シラン含むパーフルオロカーボンの群から選択される少なくとも１つの分子であり、
ここで、前記脂肪族シラン中、すべてのＨ原子がＦ原子によって置換され、
任意に、前記脂肪族シランが、フッ素化されていない、又は部分的にフッ素化された、置換基を含み、前記置換基は、官能基、又はヘテロ原子、特にＢｒ、Ｉ、Ｃｌ、Ｈ、Ａｌ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、の１つ以上を持つ、又は前記官能基、又はヘテロ原子が、１つ以上の追加の官能基と結合した１つ以上を持つ、
請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ａが、パーフルオロカーボン、パーフルオロシリコン化合物、及び他のパーフルオロ化化合物の群から選択される分子の２以上を含む、
請求項１から４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項６】
前記所定の切断点の少なくとも１つＢが、酸不安定基の形態で具体化され、特に、グリコシド結合、ジスルフィド架橋、エステル基、エーテル基、ペプチド結合、イミン結合、ヒドラゾン結合、アシルヒドラゾン結合、ケタール結合、アセタール結合、シス‐アコニトリル結合、トリチル結合、ベータ‐Ｄ‐グルコシルセラミド、及び／又はジチオトレイトールの形態、又はプラスマロゲン  パーフルオライド、ビニルエーテル基、又はオルトエステルの形態で具体化される、
請求項１から６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項７】
前記少なくとも１つのリンカー分子Ｃは、直鎖状の又は分枝状の、非環式の又は環式の、多環式の又はヘテロ環式の、脂肪族アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物又は官能基を持つこれらの化合物の組み合わせを含む群から選択される、
請求項１から６のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのスペーサー分子Ｄは、１つ以上の官能基を持った、直鎖状又は分枝状、アリフェートを含む群から選択され、又はリンカー分子Ｃとしてスペーサー分子Ｄを使用することができる、
請求項１から７のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項９】
前記分子Ｅは、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、シトシン、ウラシル、チミン、５−ブロムウラシル、５−フルオロウラシル、ジドブジン、アジドチミジン、スタブジン、ザルシタビン、ジアデノシン、イドクスウリジン、フルリジン及びリバビリン、アジドチミジン、ジドブジン、５−メチルウラシル、５−メチルシトシン、５−フルオロサイトシン、５−ブロモシトシン、２−アミノプリンのような、修飾された核酸塩基、及びそれらの「スピーゲルマー」を含む核酸塩基の群から選択される、
請求項１から９のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１０】
前記分子Ｅが、アデノシン、グアノシン、シチジン、５−メチルウリジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジンを含むヌクレオシド、又は２−チオシチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、２′−Ｏ−メチルシチジン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、２‐チオウリジン、４‐チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン、５−メチルアミノメチル−ウリジン、５−メトキシ−カルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシウリジン、２′−Ｏ−メトキシウリジン、リボチミジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンチルアデノシン、２′―Ｏ−メチルアデノシン、イノシン、１−メチルイノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−２−メチルグアノシン、Ｎ２−２，２−ジメチルグアノシン、７＋−メチルグアノシン、２′−Ｏ−メチルグアノシン、キューオシン、β―Ｄ−ガラクトシルキューオシン、β−Ｄ−マンノシル−キューオシン、アルカエオシン、２′‐Ｏ−リボシルアデノシンホスフェート、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、リシジン、ニコチン酸、リボフラビン及びパントテン酸、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、補酵素Ａ、及びサクシニル補酵素Ａ、ピューロマイシン、アシクロビル、ガンシクロビルのような、修飾されたヌクレオシド、及びそれらの「スピーゲルマー」、を含む群から選択される、
請求項１から９のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１１】
分子Ｅが、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ｍ５ＵＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ、ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃＡＤＰＲ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ｍ５ＵＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ｍ５ＵＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、を含むヌクレオチド、上記の構築ブロックに由来する修飾されたヌクレオチド、糖−リン酸構造上の修飾を持ったヌクレオチド、両性イオンのオリゴヌクレオチド、及びメチル・ホスホネート又はジメチル・スルホン基によりリン酸塩が置換されたヌクレオチドの群から選択される、
請求項１から１０のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１２】
分子Ｅは、一本鎖の又は二本鎖のオリゴヌクレオチド及び核酸の群から選択され、
ここで、前記オリゴヌクレオチド及び核酸は、１，０００，０００ｂｐより超えるまでの２塩基対の長さを有するものであって、１０〜５０ｂｐ、１５〜２５ｂｐ、２５〜２００ｂｐ、２５〜１００ｂｐ、２００〜３００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、５００〜１５００ｂｐ、８００〜１３００ｂｐ、１５００〜２０，０００ｂｐ、１５００〜５０００ｂｐ、３０００〜８０００ｂｐ、２０，０００〜１，０００，０００ｂｐ又は２０，０００〜５０，０００、の各長さ範囲が好ましい、
請求項１から１１のいずれか１つに記載された化合物。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの配位子Ｆ、Ｆ′は、トランスフェリン、葉酸、ガラクトース、ラクトース、マンノース、上皮成長因子、ＲＧＤペプチド、ビオチン、及び細胞又は核局在性配列の中への本発明の化合物の特異的な侵入を可能にする他の化合物、を含む群から選択される、
請求項１から１２のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのマーカー分子Ｇ、Ｇ′は、Ｄｉｌ、ＤｉｌＣ、ＤｉＯ、フルオレセイン、ローダミン、オキサシン、フクシン、ピロニン、アクリジン、オーラミン、パラローザニリン、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＤＡＰＩのような、蛍光染料、ＡＢＴＳのような、ペルオキシダーゼ染料、及び代謝中に分子を追跡することができる他の物質、を含む群から選択される、
請求項１から１３のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項１５】
真核生物、特に動物又は人間の、少なくとも１個の細胞の中への少なくとも１つの分子Ｅの非ウイルス性導入のための請求項１から１４のいずれか１つに記載の化合物の使用。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一つに記載の化合物の少なくとも一つ及び界面活性物質の少なくとも１つを含む医薬品組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、２ｎｍ及び２００μｍの間の、好ましくは２０ｎｍ及び４００ｎｍの間の、特に好ましくは、５０ｎｍの平均粒度で、分散、サスペンジョン、エマルジョン、又は溶液の形態で存在する、
請求項１６に記載の医薬品組成物。
【請求項１８】
真核生物の、特に動物又は人間の、細胞の少なくとも１個の中への少なくとも１つの分子Ｅの非ウイルス性導入のための請求項１６又は１７に記載の医薬品組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の内容は、請求項1に記載の化合物、請求項15に記載の化合物の使用、請求項16に記載の医薬品組成物、及び請求項18に記載の医薬品組成物の使用である。
【背景技術】
【０００２】
非ウィルス遺伝子導入は、基礎研究、及び医療における重要な重点的領域である。可能な適用が、特に古典的な遺伝病及び後天性の遺伝病(例えばHIV、慢性感染症、腫瘍、心臓及び循環系障害)に関して、生じる。過去に、医療において遺伝子治療を確立する試みは、ウイルス・ベクターにとりわけ注目された。しかしながら、それらは本質的な欠点を伴う。その適用は、十分に安全ではないし、そしてそのうえ、身体において一度だけの適用の後に免疫反応を引き起こし、その結果、二度目の適用を不可能にする。それを越えて、治療の結果として患者が重篤になる、又は死亡する、というインシデントが、繰り返し報告された。
【０００３】
ウィルス遺伝子導入の1つの代替手段は非ウィルス遺伝子導入でありえる。しかしながら、ここまで知られた方法はすべて非常に非能率的なので、それらは医療において使用されない。非ウイルスの導入法は、ウィルスが関係しない方法をすべて含んでいる。
【０００４】
裸のＤＮＡ又はＲＮＡの移入は既に研究されたが、輸血が開いた組織へ行なわれる又は注射が血流へ行なわれ、また、ＲＮＡとＤＮＡはヌクレアーゼに関して非常に脆弱であるので、従来の形態においては、実施できる適用をほとんど提供しない。その上に、トランスフェクション割合は非常に低い。
【０００５】
上述の問題を乗り越えるために、カチオンのポリマー(例えばＰＥＩ、ＰＥＧ、ＰＬＬ、ＰＬＡ)、又はカチオンの脂質(例えばＣＴＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ)を備えた、ＤＮＡ又はＲＮＡの複合体による非ウイルスの核酸導入の重要性が、ますます増加している。そのような分子の正電荷は、核酸の糖リン酸構造の負電荷を中和するために、又は細胞膜を介して、細胞の細胞質の中への吸収を促進するために、使用される。これらの方法には多数の特許がある。しかしながら、この文脈中の研究の結果は、単にトレンドの始まりを示す。結局、まだ不十分なトランスフェクション割合に加えて、これらのポリマーと脂質の毒性は、細胞にとって重大な障害を意味する。それとは別に、ポリマーの生分解性が低すぎるので、これらの複合体は細胞質内に凝集する傾向がある。ＤＮＡ又はＲＮＡを備えた荷重割合は、ポリマー又は脂質のプラス（正）電荷のレベルにつれて増加する。しかし、細胞へ特に有毒であると分かったのは、まさにこれらの非常にプラス(正)に帯電している分子である。これらのカチオンのポリマー及び脂質の毒性を低減するために、それらはますます親水性ポリマーと結合しているが、顕著な改良はこの方法で達成されない。
【０００６】
それらの低い効率とは別に、非ウィルス遺伝子導入用の従来知られている輸送分子には第二の欠点が共通にある:それらは、細胞の中への輸送の後に細胞質に残り、そこに蓄積する又は細胞分子と反応する、あるいは、それらは細胞膜の上に負の効果を有する。
【０００７】
更に、研究は、それらを核酸の非ウイルスの導入に適するように核酸構築ブロックを修飾することを行ってきた。例えば、ＷＯ２００８/０３９２５４及び米国特許２０１０/００１６４０９は、一部分又は全体の中で二重らせん構造であるＲＮＡ粒子状物質か、他の特定のコンフォメーションで存在し、他の分子に任意に連結されることを開示する。これらのＲＮＡ粒子状物質(それらはそれらのコンフォメーションにより一本鎖のｍＲＮＡより大きな安定性を持っている)は、非ウィルス遺伝子導入のために提案された。これらの分子の利点は、それらが非常に小さく、さらに、非常に細い毛細血管を通り抜けることができるということである。その上に、結果として、比較的大きなポリマーコンプレックスとしばしば生じるクランピングの危険性がほとんどない。この分子の1つの欠点は、治療の配列に加えて、ｍＲＮＡの分子に、あるエリアの自己会合にいたるように意図される、追加の配列を組み込まなければならないということであり、それは毛針、ナノ−リング、二次の構造等のような、ＲＮＡコンフォメーションをもたらす。ＲＮＡ分子は、純粋な一本鎖ｍＲＮＡより有機体内の寿命が長いが、リボソームへのトランスレーションのためのこれらの二重らせん構造のコンフォメーションの有効性は、まだ実証されていない。
【０００８】
ＥＰ  １  ８００  ６９７  Ｂ１は、Ｇ／Ｃ含有量が野生型と比較して高い、修飾ｍＲＮＡを開示し、細胞において比較的まれなｔＲＮＡのためにコード化する、野生型配列の少なくとも１つのコドンは、細胞において比較的一般的なｔＲＮＡのためにコード化するコドンと交換されることを開示する。このような方法で修飾されたｍＲＮＡは、他のいくつかのＲＮＡ方法（ｓｉＲＮＡ）で既に使用された、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｔｈｉｏａｔｅｓ）、ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）、ペプチド・ヌクレオチド、メチル・ホスホネート（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ）、７−デアザグアノシン（７−ｄｅａｚａｇｕａｎｏｓｉｎｅ）及び５―メチル・シトシン（5-ｍｅｔｈｙｌ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）及びイノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）から成る群からのヌクレオチド類似体の少なくとも１つが組み込まれるように、付加的に改変される。方法はオリジナルの野生型ペプチドからの配列−変更ｍＲＮＡについて開示される。
【０００９】
また、ＷＯ  ９９／１４３４６は、配列修飾、特に塩基削除又は塩基置換によるＣ−及び／又はＵ−含有量の低下、を通じて安定したｍＲＮＡについて記述する。
【００１０】
特許ＵＳ  ５，５８０，８５９及びＵＳ  ６，２１４，８０４は、発現ベクターを必要とし、ＤＮＡ構築物から出現する一時的な遺伝子療法構築物について記述する。
【００１１】
ＷＯ  ０２／０９８４４３は、治療患者において、形成されない、又は不十分で不完全な程度までしかで形成されない、従って、免疫反応を引き起こさない、生理活性ペプチドをコードするｍＲＮＡについて記述する。
【００１２】
非ウィルス遺伝子治療の分野の別の開発は、「マイクロバブル（microbubble）」技術であり、その技術においては、核酸で満たされた、安定したタンパク質ミクロスフェア（Ｋａｕｓｉｋ  Ｓａｒｋａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｃｏｕｓｔ．  Ｓｏｃ．  Ａｍ．  １１８，  Ｊｕｌｙ  １，  ２００５，  ｐａｇｅｓ：  ５３９−５５０）、又は糖ミクロスフェア（Ｓｃｈｌｉｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２２，  Ｉｓｓｕｅ  ４，  １９９６，  ｐａｇｅｓ  ４５３−４６２）が、超音波ガスでさらに充填される。超音波造影剤が、キャビテーションの増強をもたらし、結果として、細胞膜は一時的に透過性になることが観察された（Ｔａｃｈｉｂａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ．  ２００１  Ｍａｙ；１８（４）：３２３−８．参照）。これは、細胞の中への非ウィルス遺伝子導入構築物の増加した吸収をもたらした。それにもかかわらず、ウィルス遺伝子導入の効率は達成されなかった。
【００１３】
造影剤を用いる超音波方法もウィルス遺伝子導入の効率を増加させるためにますます使用されている（Ｂｌｏｍｌｅｙ，  ０９／２００３，  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，  ２２９，  ２９７−２９８）。
【００１４】
一連の他のガスに加えて、パーフルオロカーボン・ガスは、「マイクロバブル」技術に特に適していると分かった。それらの高い親液性の特性及び非常に低い表面張力の結果、それらは、細胞膜の完全性が乱されることを可能にし、従って、物質が通り過ぎることを可能にするのに大変適している。これらはある方法で、他の成分と結合されない純粋なパーフルオロカーボンである。しかしながら、純粋なパーフルオロカーボンによる非ウィルス遺伝子導入に関する実験は、細胞に入る前に、純粋なパーフルオロカーボンから、核酸が遠方に拡散することを示した。このように、核酸は、無作為のイベントの結果として取り込まれるだけである。
【発明の概要】
【００１５】
従来の解決策はすべて、ウィルス遺伝子導入の効率に比べてほど遠いものである。細胞の中への核酸用非ウイルス導入システムの開発に多大な関心があり、ひとつは、核酸用非ウイルス導入システムの有効性が、ウィルス遺伝子導入の有効性と同等以上であり、もうひとつは、核酸用非ウイルス導入システムの成分が、細胞に蓄積せず、細胞分子と反応せず、細胞膜に悪影響を及ぼさないことである。
【００１６】
従って、本発明は、ウィルス遺伝子導入の欠点を克服し、非ウィルス遺伝子導入に適した、安定した化合物を提供することを目的とする。
【００１７】
この目的は、請求項１の特徴を持つ、ヌクレオチド構築ブロックの非ウイルスの導入のための化合物の手段を通じて、適宜、達成された。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の化合物でトランスフェクションされた細胞の顕微鏡でのイメージを示す。
【図２】本発明の化合物でトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【図３】本発明の化合物でトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の化合物は、一般式（Ｉ）の構造、
2014510743.tif 000003
又は一般式（ＩＩ）の構造、
2014510743.tif 000004
を含み、
ここで、
−Ａは、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）、パーフルオロシリコン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｓｉｌｉｃｏｎ）化合物及び／又は他のパーフルオロ化化合物からなる群から選択される分子の少なくとも１つである、
−Ｂは、物理的に、化学的に又は酵素的に、切断できる結合の形態をした所定の切断点の少なくともひとつ、
−Ｃは存在しない、又は少なくとも１つのリンカー分子、
−Ｄは存在しない、又は少なくとも１つのスペーサー分子、
−Ｅは、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、修飾された核酸塩基、修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、修飾された核酸、ペプチド核酸モノマー、ペプチド核酸オリゴマー、及びペプチド核酸又は他の核酸アナログを含む群から選択される分子の少なくとも１つ、
−Ｆ、Ｆ′は存在しない、又は配位子若しくは認識配列の少なくとも１つ、
−Ｇ、Ｇ′は存在しない、又は少なくとも１つのマーカー分子、
−Ａ′は存在しない、又はＡを意味し、
ここで、前記化合物は、    
【化１】
2014510743.tif 000005
を除外する。
【００２０】
好ましくは、分子Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｆ′、Ｇ、Ｇ′及びＡ′は、各々、共有結合によってともに連結される。しかしながら、本発明の化合物の個々の分子又は分子群は、全体において、又は一部分において、イオン結合によってともに連結されることが考えられる。
【００２１】
従って、非ウィルス遺伝子導入のための新しい、有望な、物質群は、特に、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）及び、たとえば、いわゆるパーフルオロ化核酸構築ブロックである、所定の切断点を介してともに連結される核酸構築ブロックから構成される分子化合物である。
【００２２】
パーフルオロ化核酸構築ブロックの利点は以下のとおりである：
【００２３】
１）生理学的条件(脂肪酸より親液性)の下で、パーフルオロ化核酸構築ブロックの高い親液性、かつさらに、それらの非常に低い表面張力の結果、これらの分子は、細胞膜の表面に迅速に付く。そこで、それらは、ピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、エンドサイトーシス又はエンドシトーシス‐非依存性経路のような規則的に生じるプロセスを通じて細胞へ吸収される。ここで、ＰＦＣは、他の方法では容易に吸収できない核酸構築ブロックのための、細胞の中への導入システムある。
【００２４】
2)それらの強いＣ−Ｆ結合により、ＰＦＣは非常に不活性であり、細胞分子で反応しない。
【００２５】
3)核酸構築ブロックから取り除かれた後に、ＰＦＣは、小さい、荷電していない親液性分子であり、分子濃度勾配に依存して、受動的に細胞から出ていく。
【００２６】
4)人間における酸素担体/代替血液として、ＰＦＣの医療の適用を通じて、ＰＦＣが、肺、腎臓及び皮膚を介して、身体から排泄されることが示された。
【００２７】
5)それらが代替血液と造影剤として既に承認されたので、非ウィルス遺伝子導入用のＰＦＣの医学の承認はより容易のようだ。
【００２８】
6)パーフルオロ化核酸構築ブロックは、非ウィルス遺伝子導入の他の物質より細胞の中への著しく高い吸収を示し、ウィルス遺伝子導入の真の代替物である。
【００２９】
7)ウィルス遺伝子導入と異なり、パーフルオロ化核酸構築ブロックは、身体の免疫反応を起こさせず、すきなだけ何度も使用することができる。
【００３０】
8)ｍＲＮＡの導入に関して、投薬は、ｍＲＮＡの制限のある寿命及び導入の無制限の反復性により、達成することができる。
【００３１】
純粋なパーフルオロカーボンは、もとは高機能滑沢剤産業から知られている。製薬分野では、それらは、とりわけ高い割合の酸素溶解度により、代替血液として、又は造影剤として、以前に使用された。また、ガス状の純粋なパーフルオロカーボンで充填された、非ウィルス遺伝子導入マイクロバブルを用いた超音波適用では、遺伝子導入の効率が他のガスと比較して増加されたことが、示された。
【００３２】
しかしながら、核酸が純粋なパーフルオロカーボンに付着せず、したがって、任意のイベントによってのみ取り込まれることができるので、純粋なパーフルオロカーボンは、細胞の中への核酸の非ウィルス遺伝子導入にほとんど適していない。所定の切断点によって分割することができる、正確な結合が、パーフルオロカーボン及び核酸構築ブロックとの間で必要である。
【００３３】
従って、本発明の化合物は、細胞の中へのパーフルオロ化核酸構築ブロックの吸収、核酸構築ブロック及びパーフルオロカーボン分子間の所定の切断点の切断、細胞質中への分解産物(一つは、核酸構築ブロック、他方は、パーフルオロカーボン分子)の放出、及び細胞からパーフルオロカーボン分子の続いて起こる拡散又は活発な放出、を特徴とし、パーフルオロ化核酸構築ブロックのエンドサイトーシス‐非依存性吸収を可能とする。
【００３４】
上記に説明するように、パーフルオロ化核酸は帯電性かつ非常に親液性の分子である。これらの分子の二次及び三次構造は、細胞膜を不安定にさせ、細胞へ吸収されるのに非常によく適している。生理学的条件の下では、パーフルオロカーボンは脂肪酸よりさらに親液性で、非常に低い表面張力を有し、分子が細胞膜の大きな表面を覆って伸びることができる。
【００３５】
細胞に入った後、核酸構築ブロックと分子のパーフルオロ化部分の間の所定の切断点によって、核酸のパーフルオロ化部分は分割される。これは、通常、酸−不安定な所定の切断点によって生じる。細胞質中の増加した還元電位、そして、それ以上に、エンドソーム中の低ｐＨ値(ｐＨ＝４．５まで)が、それらの加水分解のための条件を作成する。
【００３６】
分解産物が、まったくか又はわずかであるか、分子の改変にあわないように、このシステム用の所定の切断点が捜し出される。不変の核酸及び非常に親液性かつ無極性の性質を得たパーフルオロカーボン基を残す「痕跡がない」所定の切断点は、これに非常に適している。そのような所定の切断点の1つの例は次の図解1に示される:
【化２】
2014510743.tif 000006
【００３７】
細胞質へ放たれた核酸は、細胞に自由にアクセス可能である。それらは、例えばｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アプタマー、アンチセンスＲＮＡ等のように、細胞質において作用部位を持つことができる。あるいは、それらは、核局在配列を持った又は持たないＤＮＡ、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、又は個々のヌクレオチド及びヌクレオシドのように、核へ輸送することができる。
【００３８】
細胞質へ放たれた、対応する所定の切断点を持ったパーフルオロカーボン分子は荷電していず、親液性で、非常に小さい。これらの特性は、細胞膜を介して濃度勾配に沿った自由拡散のための条件である。また、エキソサイトーシス又は細胞からの別の放出経路も可能である。パーフルオロカーボン分子は非常に不活性で、細胞分子と反応しない。それらの分子構造が比較的変わらない限り、それらは脂質にも付かない。肺及び腎臓機能並びに皮膚を介して、身体からそれらが排泄されることは、代替血液としてパーフルオロカーボンの医療用用途から分かる。
【００３９】
また、パーフルオロ化核酸構築ブロックは、細胞のおけるそれらの経路を追求するために蛍光染料と連結することができる。特定の配位子又は他の認識配列で連結することによって、システムは、特定の細胞型の治療のために組み立てることができる。原則として、パーフルオロ化核酸構築ブロックを含む導入システムは、核酸又は修飾された核酸アナログが細胞へ輸送されることになっているあらゆる適用に使用することができる。
【００４０】
本発明の化合物の１つの実施形態では、分子Ａの少なくとも１つは、直鎖状の又は分枝状の、非環式又は環式の、多環式の又はヘテロ環式の、脂肪族アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物又はそれらの化合物の組み合わせを含むパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）の群から選択され、
ここで、前記それらの化合物中、すべてのＨ−原子がＦ−原子によって置換され、任意に、前記それらの化合物は、非フッ素化又は部分的にフッ素化している置換基の一以上を含むことができ、前記置換基は、官能基、脂肪鎖、又は、ヘテロ原子、特にＢｒ、Ｉ、Ｃｌ、Ｈ、Ｓｉ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐなど、の１つ以上の形態をしている、又は前記官能基、脂肪鎖、又はヘテロ原子が、一以上の追加的な官能基と結合した一以上の形態をしている。
【００４１】
また、Ａは、Ｃ１−Ｃ２００、好ましくはＣ１−Ｃ１００、特に好ましくはＣ１−Ｃ５０、さらに好ましくは、Ｃ１−Ｃ３０、最も好ましくは、Ｃ１−Ｃ２０の、アルカン、アルケン、又はアルキンを含む、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）の群から選択され、前記アルカン、アルケン、又はアルキンは、直線状、分枝状、環式、多環式又はヘテロ環式、Ｃ６−Ｃ５０、好ましくはＣ６−Ｃ３０、特に好ましくはＣ１−Ｃ２０の、芳香族又はヘテロ芳香族系、であり得えることを特徴とする。
【００４２】
典型的に、本発明に関して、Ａ−分子及びＡ−分子基は、
-（ＣｎｎＦ（２ｎ＋２）−１）であり、ｎ≧１、好ましくはｎ＝１−２０、例えば‐ＣＦ３、‐Ｃ２Ｆ５、‐Ｃ３Ｆ７、‐Ｃ４Ｆ９、‐Ｃ４Ｆ１１など、
-（ＣｎｎＦ２ｎ−１）であり、ｎ≧２、好ましくはｎ＝２−２０、例えば-Ｃ２Ｆ３、-Ｃ３Ｆ５、-Ｃ４Ｆ７など、
−（ＣｎｎＦ（２ｎ−２）−１）であり、ｎ≧２、好ましくはｎ＝２−２０、例えば-Ｃ２Ｆ、-Ｃ３Ｆ３、-Ｃ４Ｆ５、-Ｃ５Ｆ７など、
を含むＰＦＣ基から選択することができる。
【００４３】
本発明の化合物を製造するために、ＢとＥのような他の分子と共有結合へ入るために適切な官能基があるパーフルオロ化化合物を使用することは賢明である。出発物質として使用されるパーフルオロ化化合物のこの官能基は、特に、追加、置換、エステル化、エーテル化、縮合などを可能にする。そのような結合反応は当業者に知られている。好ましい官能基は、
ハロゲン・アルカン、ヒドロキシル、エーテル、アミノ、スルヒドリル(ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ)、アルデヒド、ケト、カルボキシル、エステル、及び酸アミドの基、
カルボン酸、ペルオキシカルボキシル酸、チオカルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルフェネ酸（ｓｕｌｆｅｎｅ  ａｃｉｄｓ）、スルホキシド、カルボン酸塩、スルホン酸塩、スルフィン酸塩、スルフェネ酸塩（ｓｕｌｆｅｎｅ  ａｃｉｄ  ｓａｌｔｓ）、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物、スルホン酸ハロゲン化物、カルボン酸アミド、スルホン酸アミド、カルボン酸ヒドラジド、ニトリル、アルデヒド、チオアルデヒド、ケトン、チオケトン、オキシム、アルコール、フェノール、チオール、アミン、イミン、ヒドラジン、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、ハロゲン化水素、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、アゾ化合物、ジアゾ化合物、ジアゾニウム塩、イソシアナート、シアナート、エーテル、酸アミド、及びチオエーテル、又はそれらの多重結合により反応的になりうる化合物の物質群由来の分子、及びラジカル又はイオンを持つ基、
を含む群から選択される。特に、Ｂｒ，Ｉ，Ｃｌ，Ｈ，Ｓｉ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ、などヘテロ原子、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシルの基、ハロゲン・アルカン、カルボン酸アミン、アルコール、ヒドラジン、イソシアナート、チオシアナート及び酸アミドが好まれる。
【００４４】
好ましくは、本発明の化合物中の分子Ａの調製物用の出発化合物として、求核置換に適している物質が使用される。分子Ａの調製物用の出発物質には当業者にとって容易に認識可能な求核的な脱離基がある。従って、追加的な好ましいＡ分子は、次の出発物質のうちのいずれか１つに基づくことができる：
−Ｆ）ＣＦ２）ｎＸ、ここで、ｎ＝１−５０、好ましくは、ｎ＝１−１０、及びＸ＝Ｂｒ、Ｉ、Ｃｌ、Ｈ又はＸ＝官能基に結合する、Ｓｉ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、特にＣ８Ｆ１７Ｉ、Ｃ８Ｆ１７Ｂｒ；
−Ｆ（ＣＦ２）ｎ）−ＣＨ２）ｎＸ、ここで、ｎ＝１−５０、好ましくはｎ＝１−１０、ｍ＝１−２６、好ましくは、ｍ＝１−６、及びＸ＝Ｓｉ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ；
−Ｆ（ＣＦ２）ｎ−Ｏｂ−ＣＨ＝ＣＨ２、ここで、ｎ＝１−５０、好ましくはｎ＝１−１０、及びｂ＝０又は１、好ましくはｂ＝０；
−Ｃ６Ｆ１３ＣＨ２ＣＨ２ＭｇＩ,（Ｃ６Ｆ１３ＣＨ２ＣＨ２）３ＳｎＰｈ,（Ｃ６Ｆ１３ＣＨ２ＣＨ２）３ＳｎＢｒ,（Ｃ６Ｆ１３ＣＨ２ＣＨ２）３ＳｎＨ；
−Ｃ２Ｆ５Ｉ,Ｃ３Ｆ７Ｂｒ,Ｃ４Ｆ９Ｉ,Ｃ５Ｆ１１Ｂｒ,Ｃ６Ｆ１３Ｂｒ,Ｃ８Ｆ１５Ｂｒ,Ｃ１０Ｆ１７Ｉ,
−Ｃ４Ｆ９ＣＨ＝ＣＨＣ４Ｆ９,Ｃ８Ｆ１６Ｃ１２,Ｃ１０Ｆ１９Ｎ,Ｃ６Ｆ１９Ｂｒ,Ｃ９Ｆ２１Ｎ,Ｃ１０Ｆ２１Ｂｒ,Ｃ１１Ｆ２２Ｎ２Ｏ２,Ｃ６Ｆ１３ＣＨ＝ＣＨＣ６Ｆ１３,Ｃ１２Ｆ２７Ｎ,Ｃ１２Ｆ２７Ｎ,Ｃ１６Ｆ２５Ｂｒ；
−Ｃ８Ｆ１７Ｉ,Ｃ８Ｆ１７Ｂｒ。
【００４５】
本発明に関して使用されるパーフルオロハイドロカーボンの群からのＡ分子の追加の好ましい出発物質は次のとおりである：
−パーフルオロ化コレステリル（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｙｌ）及びアダマンチル（ａｄａｍａｎｔｙｌ）化合物、パーフルオロ化シス‐エイコセノイック（ｃｉｓ−ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ），パーフルオロ化芳香族化合物、パーフルオロ化ピレン、パーフルオロ化グリセリド；及び
【化３】
2014510743.tif 000007
【００４６】
−イオン結合の形態で結合することについては、次のＰＦＣを使用することができる、例えば
【化４】
2014510743.tif 000008
【化５】
2014510743.tif 000009
【化６】
2014510743.tif 000010
【００４７】
本発明の別の実施形態は、分子Ａの少なくとも１つが、直鎖状の又は分枝状の、非環式の又は環式の、多環化の又はヘテロ環式の、脂肪族シランを含む、パーフルオロシリコン化合物の群から選択され、
ここで、前記脂肪族シラン中、Ｆ−原子によりすべてのＨ−原子が置換され、任意に、前記脂肪族シランは、任意に、フッ素で処理されていない又は部分的にフッ素で処理された置換基をさらに含み、前記置換基は、官能基又はヘテロ原子、特にＢｒ、Ｉ、Ｃｌ、Ｈ、Ａｌ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、Ｐ、の一以上を持ち、又は前記官能基又はヘテロ原子が、１つ以上の追加の官能基と結合した一以上を持つことを特徴とする。
【００４８】
好ましくは、Ｓｉ１−Ｓｉ２００、好ましくは、Ｓｉ１−Ｓｉ１００、特に好ましくは、Ｓｉ１−Ｓｉ５０、非常に好ましくは、Ｓｉ１−Ｓｉ３０、最も好ましくは、Ｓｉ１−Ｓｉ２０の、パーフルオロ化シリコン化合物含んでいる群から選択されるパーフルオロシリコン化合物を使用する。また、パーフルオロシリコン化合物を、ＰＦＣの場合のように、適切な置換基で官能基化する。
【００４９】
追加の好ましい官能基化されたパーフルオロシリコン化合物は、次の基から選ぶことができる：
‐一般式−［−ＳｉＲ２−Ｏ−］ｎ、ここで、ｎ≧１及びＲ＝パーフルオロ化カーボン又はＦ、
‐一般式ＨＯ−Ａ−［−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ−］−ＳｉＲ３Ｒ４Ｒ５のシロキサノール（ｓｉｌｏｘａｎｏｌｅ）、ここで、Ｒ３、４、５＝Ｆ又は−Ｆ（ＣＦ２）ｎ、ここでｎ＝１−１０及びＡ＝アルキル鎖、
‐パーフルオロ化ケイ酸塩、ケイ酸、ケイ酸ナトリウム、ポリシラザン、ケイ化物、シリコン・テトラハロゲニド（ｔｅｔｒａｈａｌｏｇｅｎｉｄｅ）、シリコン、シリコン油、ゼオライト、ケイ酸ジルコニウム、
‐一般式C-CH2-Si(OR)3のシラン、Ｘは、求核置換に適している脱離基である、ここで、Ｘ＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、ＯＨ、又は、アミノ、ビニル、カルバマート（ｃａｒｂａｍａｔｏ）、グリシドキシ（ｇｌｙｃｉｄｏｘｙ）、メチルアルコキシ、フェニル、又はアセトキシの基を含む官能基、及び-F(CF2)n、ここで、ｎ＝１−１０、
‐一般式Ｘ−Ｓｉ（ＣＦ３）３又はＸ−Ｓｉ（Ｒ）３のシラン、Ｘは、求核置換に適している脱離基であり、ここで、Ｘ＝Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｈ、ＯＨ、アミノ、ビニル、カルバマート（ｃａｒｂａｍａｔｏ）、グリシドキシ（ｇｌｙｃｉｄｏｘｙ）、メチルアルコキシ、フェニル基、又はアセトキシの基のような官能基、及びＲ＝Ｆ、又は−Ｆ（ＣＦ２）ｎ、ここで、ｎ＝１−１０。
【００５０】
さらに、別の実施形態では、少なくとも１つの分子Ａは、他のパーフルオロ化化合物の群から選択され、分子ＡはＮＦ３、Ｎ２Ｆ４、ＳＮＦ３、ＣＦ３ＳＮ、ＳＦ４、ＳＦ６、パーフルオロ化窒素−イオウ化合物の中から選択されている化合物に基づいている。
【００５１】
本発明の化合物が、パーフルオロカーボン（ＰＦＣ）、パーフルオロシリコン化合物及び他のパーフルオロ化化合物に群から選択される分子Ａの２つ以上を含むことが好ましい。
【００５２】
典型的には、上記の官能基化されたパーフルオロ化化合物は、いくつかの単位へ統合することができる。次の分子が例として言及される：
【化７】
2014510743.tif 000011
【００５３】
本発明の化合物に含まれる他の分子へのこれらの分子の結合は、ＮＨ２基又はＯＨ基又は他の適切な基によって行うことができる。
【００５４】
本発明の化合物の変異型では、所定の切断点Ｂの少なくとも１つは、酸不安定基の形態で、特に、グリコシド結合、少なくとも１つのジスルフィド架橋、少なくとも１つの、エステル基、エーテル基、ペプチド結合、イミン結合、ヒドラゾン結合、アシルヒドラゾン結合、ケタール結合、アセタール結合、シス‐アコニトリル（ａｃｏｎｉｔｒｉｌｅ）結合、トリチル結合、ベータ‐Ｄ‐グルコシルセラミド、及び／又はジチオトレイトールの形態で具体化される。
【００５５】
所定の切断点にはＰＦＣ及び核酸構築ブロックの構成物内の２つの重要な機能がある。一つには、所定の切断点は、いわゆる「漏出」の目的に役立つ。ここで、ＰＦＣ核酸化合物の粒子状物質は細胞のエンドソーム細胞膜に付いており、次に、これらのエンドソームから放出されるに違いない。これは、膜の完全性の破壊を通じて生じ、それは構成物の分離によって引き起こされる。もう一つには、核酸構築ブロックを細胞に利用可能にするために、ＰＦＣ分子の基を分割しなければならない。ここで、上記にリストされた、グルコシド結合、ジスルフィド架橋、エステル、又はエーテルのような、酸−不安定な所定の切断点は、例えば、ヌクレオチドの２′位置、又は他の位置で、化学的な酸性の条件の下で、又は加水分解酵素／エステラーゼによって加水分解（分割）される。
【００５６】
より複雑な所定の切断点は、酵素用の特定の基質、ｐＨ‐及び感光性の脂質機能、超音波作用又は温度-調整脂質修飾による放出を持った分子、及び、生理学的条件の下で分離できる他の結合を有する分子の形で存在することができる。
【００５７】
具体例のために、次の所定の切断点が言及される：
-光によって切断される、プラスマロゲン  パーフルオライド（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｄｅ）
【化８】
2014510743.tif 000012
【００５８】
−ｐＨ感受性のパーフルオロ化ビニルエーテル官能基
【化９】
2014510743.tif 000013
【００５９】
−再配列によって割れるオルトエステル
【化１０】
2014510743.tif 000014
【００６０】
本発明の１つの実施形態では、少なくとも１つのリンカー分子Ｃは、直鎖状又は分枝状、非環式の又は環式の、多環化式の又はヘテロ環式の、脂肪族アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物あるいは官能基を持ったこれらの化合物の組み合わせを含む群から選択される。
【００６１】
好ましくは、使用されるリンカー分子Ｃは、例えばマーカー分子Ｇ′及び／又は、配位子Ｆ′又は他の認識配列のような、他の追加の分子のために、１つ以上の結合サイトを本発明の化合物において利用可能にするために、使用される。
【００６２】
好ましくは、リンカー分子Ｃは、特に、
ハロゲン・アルカン、ヒドロキシル、エーテル、アミノ、スルヒドリル（ｓｕｌｈｙｄｒｙｌ）、アルデヒド、ケト、カルボキシル、エステル及び酸アミドの基、
カルボン酸、ペルオキシカルボキシル酸、チオカルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルフェン酸、スルホキシド、カルボン酸塩、スルホン酸塩、スルフィン酸塩、スルフェン酸塩、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物、スルホン酸ハロゲン化物、カルボン酸アミド、スルホン酸アミド、カルボン酸ヒドラジド、ニトリル、アルデヒド、チオアルデヒド、ケトン、チオケトン、オキシム、アルコール、フェノール、チオール、アミン、イミン、ヒドラジン、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、水素ハロゲン化物、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、アゾ化合物、ジアゾ化合物、ジアゾニウム塩、イソシアナート、シアナート、イソシアナート、チオシアナート、イソチオシアネート、ヒドロペルオキシド、過酸化物、又はそれらの多重結合により反応的になりえる化合物の物質群由来の分子、及びラジカル又はイオンを持った基、
又は、ヨウ素、臭素、又は硫黄の原子、カルバメート、チオエーテル、又はジスルフィドの基、グリセロール、スクシニル・グリセロール、燐酸の基、を持った官能化パーフルオロハイドロカーボン、
及び、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、修飾されたヌクレオシド、修飾されたヌクレオチド、修飾されたオリゴヌクレオチド、修飾された核酸、ペプチド・ヌクレオシド、ペプチド・ヌクレオチド、ペプチド・オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、又は製薬の物質、に結合が確立することができる、他の基又は原子を持った官能化パーフルオロハイドロカーボン、
を含む群から選ばれる。
【００６３】
好ましいリンカー分子Ｃは、ヒドロキシル基又はアミノ基、カルボキシル基、エステル、エーテル、チオエーテル、チオエステル、カルボン酸アミド、多重結合、カルバメート、ジスルフィド架橋及びヒドラジドを持った化合物、ハロゲン・アルカン、スルヒドリル、アルデヒド、ケト、カルボキシル、エステル及び酸アミドの基、チオール、アミン、イミン、ヒドラジン、又はジスルフィドの基、グリセロール、スクシニル・グリセロール、オルトエステル、リン酸ジエステル及びビニルエーテルに基づく。特に、エステル及びエーテルの基、ジスルフィド架橋が、非常に好ましい。
【００６４】
上述のように、リンカー分子Ｃは、他のマーカーＧ′及び／又は、配位子、Ｆ′又は、下記に定義された配位子Ｆ及びマーカーＧと同じ基を実質的に含むが、本発明の化合物内の配置によってこれらとそれにもかかわらず異なる、他の認識配列を、結合するために使用することができる。
【００６５】
マーカーＧ′のここでの好適な例は、Ｄｉｌ、ＤｉｌＣ、ＤｉＯ、フルオレセイン、ローダミン、オキサシン（ｏｘａｃｉｎｅ）、フクシン、ピロニン、アクリジン、オーラミン、パラローザニリン、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＤＡＰＩ又は、ＡＢＴＳなど、ペルオキシダーゼ染料のような、蛍光染料である。
【００６６】
配位子と認識配列は、ある細胞タイプ中の特定の導入に必要とされる。なぜなら、それらが細胞表面上のレセプターに結合することで、細胞へ特定の受け入りを可能にするからである。一般的に、配位子は、アクセス可能な側又は末端のアミノ基によって構成物に結合される。しかしながら、他の基による結合は可能である。
【００６７】
トランスフェリン、葉酸、ガラクトース、マンノース、上皮成長因子、ＲＧＤペプチド、ビオチン及び他の物質は、適切な配位子Ｆ′としてここで使用することができる。認識配列の例は、核局在性配列又はエンドサイトーシス‐非依存性吸収用配列である。
【００６８】
本発明の別の変異型では、少なくとも１つのスペーサー分子Ｄは、１つ以上の官能基を持った、直鎖状又は分枝状、アリフェート（ａｌｉｐｈａｔｅ）を含む群から選択され、リンカー分子Ｃとしてスペーサー分子Ｄを使用することもできる。
【００６９】
本発明の化合物では、スペーサー分子は、立体障害を防ぐために分子中の様々な基により多くのスペースを与えるために、又は他の分子領域へのフッ素構築ブロックの負電荷を弱めるために、使用される。特に好ましくは、スペーサー分子Ｄは、脂肪酸アルコール、脂肪酸ジオール、及び脂肪酸多価アルコールの群から選択される。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態では、分子Ｅとして使用される核酸塩基は、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、シトシン、ウラシル、チミン、５−ブロムウラシル、５−フルオロウラシル、ジドブジン、アジドチミジン、スタブジン（ｓｔａｖｕｄｉｎｅ）、ザルシタビン、ジアデノシン（ｄｉａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、イドクスウリジン、フルリジン（ｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）及びリバビリン、アジドチミジン、ジドブジン、５−メチルウラシル、５−メチルシトシン、５−フルオロサイトシン、５−ブロモシトシン（ｂｒｏｍｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、２−アミノプリンのような、修飾された核酸塩基、及びそれらの「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」を含む群から選択される。特に、核酸塩基アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンが、好ましい。
【００７１】
好ましいように、ヌクレオシドが分子Ｅとして使用される場合、ヌクレオシドは、アデノシン、グアノシン、シチジン、５−メチルウリジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、又は、２−チオシチジヂン（２−ｔｈｉｏｃｙｔｉｄｉｎｅ）、Ｎ４−アセチルシチジン（Ｎ４−ａｃｅｔｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、２′−Ｏ−メチルシチジン（２′−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、３−メチルシチジン（３−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−メチルシチジン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｉｄｉｎｅ）、２−チオウリジン、４−チオウリジン、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）−ウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン（５−ｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）、５−メトキシ−カルボニルメチル−ウリジン、５−メトキシウリジン（５−ｍｅｔｈｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、２′−Ｏ−メチルウリジン（２′−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｕｒｉｄｉｎｅ）、リボチミジン、１−メチルアデノシン（１−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、２−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン（Ｎ６−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、Ｎ６−イソペンテニルアデノシ（Ｎ６−ｉｓｏｐｅｎｔｅｎｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、２′―Ｏ−メチルアデノシン（２′―Ｏ−ｍｅｔｈｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、イノシン、１−メチルイノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−２−メチルグアノシン、Ｎ２−２，２−ジメチルグアノシン、７＋−メチルグアノシン（７＋−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２′―Ｏ−メチルグアノシン（２′―Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、キューオシン、β―Ｄ−ガラクトシルキューオシン（β―Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）、β―Ｄ−マンノシル‐キューオシン（β―Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌ−ｑｕｅｕｏｓｉｎｅ）、アルカエオシン（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ）、２′―Ｏ−リボシルアデノシンフォスフェート（２′―Ｏ−ｒｉｂｏｓｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン（Ｎ６−ｔｈｒｅｏｎｙｌｃａｒｂａｍｏｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ）、リシジン、ニコチン酸、リボフラビン及びパントテン酸、ＮＡＤＰＨ、ＮＡＤＨ、ＦＡＤ、補酵素Ａ及びサクシニル補酵素Ａ、ピューロマイシン、アシクロビル、ガンシクロビルのような、修飾されたヌクレオシド、及びそれらの「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」を含む群から選択され、特に、ヌクレオシドは、アデノシン、グアノシン、ウリジン、シチジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、デオキシチミジンが、好ましい。
【００７２】
本発明の化合物の別の好ましい実施形態では、分子Ｅとして使用されるヌクレオチドは、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ｍ５ＵＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ｄＣＭＰ、ｃＡＭＰ、ｃＧＭＰ，  ｃ−ｄｉ−ＧＭＰ、ｃＡＤＰＲ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ｍ５ＵＤＰ、ＵＤＰ、ＣＤＰ、ｄＡＤＰ、ｄＧＤＰ、ｄＴＤＰ、ｄＵＤＰ、ｄＣＴＰ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ｍ５ＵＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ，ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＣＴＰ、又は上記の構築ブロックに由来する修飾されたヌクレオチド、糖−リン酸構造上の修飾を持ったヌクレオチド、両性イオンのオリゴヌクレオチド、並びにメチル・ホスホネート又はジメチル・スルホン基によりリン酸塩が置換されたヌクレオチド、を含む群から選択され、特に、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ｍ５ＵＭＰ、ＵＭＰ、ＣＭＰ、ｄＡＭＰ、ｄＧＭＰ、ｄＴＭＰ、ｄＵＭＰ、ｄＣＭＰが好ましい。
【００７３】
分子Ｅとして、デオキシリボ核酸、リボ核酸、及び修飾された核酸を使用することが、さらに好まれ、例えば、ヌクレオシド・ホスホロチオエート、両性イオンの核酸、ホスフェートが、メチル・ホスホネート又はジメチル・スルホン基と置換された核酸、架橋された核酸（ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ））、「スピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）」、リボース燐酸ジエステル骨格が、ヘキシトール系骨格鎖又はグリセリン単位に基づいた核酸アナログのような、様々な重合体構築物と交換された核酸、モルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）オリゴヌクレオチド、ホスホロチオエート・デオキシリボ核酸、シクロヘキセン核酸、Ｎ３′―Ｐ５′―ホスホラミデート（Ｎ３′―Ｐ５′―ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅｓ）、トリシクロ―デオキシリボ核酸、モルフォリノ・ホスホラミデート核酸、トレオース核酸であり、特に好ましいのは、ヌクレオシド・ホスホロチオエート、ホスホロチオエート・デオキシリボ核酸である。
【００７４】
また、分子Ｅとして、使用するのに好ましい例は、（Ｆｍｏｃ）−アデニン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）−シトシン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）−グアニン―（Ｂｈｏｃ）ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）−チミン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨなどのペプチド核酸のモノマー、又は塩基がカルボキシメチレン単位によってバックボーンに連結されるＮ−（２−アミノ−エチル）グリシン・サブユニットに基づく、ペプチドのアキラル性のバックボーンにより完全なリボース燐酸ジエステルバックボーンが置換されたペプチド核酸のモノマーであり、特に好ましいのは、（Ｆｍｏｃ）、―アデニン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）−シトシン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨ、（Ｆｍｏｃ）−グアニン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨ、及び（Ｆｍｏｃ）―チミン−（Ｂｈｏｃ）ＯＨである。
【００７５】
好ましいように、一本鎖又は二本鎖の、オリゴヌクレオチド及び核酸が、分子Ｅとして使用される場合、それらは１，０００，０００ｂｐより超えるまでの２塩基対の長さを持つことができるのが、好ましく、各々次の長さ範囲：
１０〜５０ｂｐ、１５〜２５ｂｐ、２５〜２００ｂｐ、２５〜１００ｂｐ、２００〜３００ｂｐ、２００〜５００ｂｐ、５００〜１５００ｂｐ、８００〜１３００ｂｐ、１５００〜２０，０００ｂｐ、１５００〜５０００ｂｐ、３０００〜８０００ｂｐ、２０，０００〜１，０００，０００ｂｐ、又は２０，０００〜５０，０００が好ましく、特に、１０〜５０のｂｐ及び２００〜５００ｂｐ及び５００〜１５００ｂｐの間の長さのオリゴヌクレオチドが非常に好ましい。
【００７６】
化合物の変異型では、分子Ｅは、
ヒドラジド、ハロゲン・アルカン、ヒドロキシル、エーテル、アミノ、スルヒドリル―、アルデヒド、ケト、カルボキシル、エステル及び酸アミドの基、
カルボン酸、ペルオキシカルボキシル酸、チオカルボン酸、スルホン酸、スルフィン酸、スルフェン酸、スルホキシド、カルボン酸塩、スルホン酸塩、スルフィン酸塩、スルフェン酸塩、カルボン酸無水物、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、カルボン酸ハロゲン化物、スルホン酸ハロゲン化物、カルボン酸アミド、スルホン酸アミド、カルボン酸ヒドラジド、ニトリル、アルデヒド、チオアルデヒド、ケトン、チオケトン、オキシム、アルコール、フェノール、チオール、アミン、イミン、ヒドラジン、エーテル、エステル、チオエーテル、チオエステル、ハロゲン化水素、ニトロ化合物、ニトロソ化合物、アゾ化合物、ジアゾ化合物、ジアゾニウム塩、イソシアナート、シアナート、イソシアニド、チオシアナート、イソチオシアネート、ヒドロペルオキシド、過酸化物、又はそれらの多重結合により反応的になりうる化合物の物質群からの分子、及びラジカル又はイオンを持った基、
又はヨウ素、臭素、又は硫黄の原子、カルバメート、チオエーテル、又はジスルフィドの基、グリセロール、スクシニル・グリセロール、燐酸の基又は官能化パーフルオロカーボンに結合できる他の官能基、をもつ官能化パーフルオロカーボン、
を含む群から選択される官能基を有する。
【００７７】
官能基はヌクレオチド上の追加の置換基として理解できる。例えば、ＮＨ２基は、パーフルオロ化（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ）にはもとは使用可能ではなかった、ヌクレオシド又はヌクレオチドのデオキシリボースの２′Ｈ位置をパーフルオロ化（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎａｔｉｏｎ）のために準備するために、この位置で導入することができる。ＳＨ基も、後でジスルフィド架橋を作るために、例えば、リボースの２′ＯＨ位置で、導入することができる。
【００７８】
分子Ｅの好ましい置換基又は官能基は、―ＯＨ、―ＮＨ２及び―ＳＨ基、ヒドラジド、ハロゲン・アルカン、スルヒドリル、アルデヒド、ケト、カルボキシル、エステル、及び酸アミドの基、エーテル、チオエステル及びチオエーテルである。
【００７９】
好ましくは、本発明の化合物の中に存在する配位子Ｆは、トランスフェリン、葉酸、ガラクトース、ラクトース、マンノース、上皮成長因子、ＲＧＤペプチド、ビオチン、及び細胞の中への本発明の化合物の特異的な侵入を可能にする他の物質を含んでいる基から選ばれる。
【００８０】
好ましくは、本発明の化合物の中に存在するマーカー分子Ｇは、Ｄｉｌ、ＤｉｌＣ、ＤｉＯ、フルオレセイン、ローダミン、オキサシン（ｏｘａｃｉｎｅｓ）、フクシン、ピロニン、アクリジン、オーラミン、パラローザニリン、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＤＡＰＩのような、蛍光染料、ＡＢＴＳのような、ペルオキシダーゼ染料、及び分子が代謝中に追跡されることを可能にする他の物質を含む群から選ばれる。
【００８１】
本発明の化合物は、真核生物、特に動物又は人間、の細胞の少なくとも１個の中へ少なくとも１つの分子Ｅの非ウイルス性の導入に特に適切であり、使用することができる。
【００８２】
特に好ましくは、本発明の化合物は、少なくとも１つの界面活性物質を持った医薬品組成物の形態で使用され、ここで、適切な界面活性物質は、例えばポロキサマー、レシチン又は他の細胞に許容された界面活性剤である。
【００８３】
医薬品組成物は、２ｎｍと２００μｍの間、好ましくは、２０ｎｍと４００ｎｍの間、特に好ましくは、５０ｎｍ、の平均粒度を特に有する、エマルジョン、分散、サスペンジョン又は溶液の形で、存在することができる。粒子径は適用に応じて変化できる。適切な方法、例えば、ソニケーター、噴霧法、又は溶媒法、を通して、細胞中への吸収に好都合な希望の粒子径を調節することができる。また、本発明の医薬品組成物は、真核生物、特に動物又は人間、の細胞の少なくとも１個の中への少なくとも１つの分子Ｅの非ウイルス性導入に適切であり、使用することができる。
【００８４】
本発明の化合物は様々な方法で製造し修正することができる。特に、パーフルオロシリコン化合物及び／又はパーフルオロカーボン（ＰＦＣ）のような、パーフルオロ化化合物への分子Ｅの結合が、これにアクセス可能な分子Ｅの異なる位置で生じる場合がある。
【００８５】
本出願に関して、パーフルオロ化の側又は位置は、分子Ｅにおける場所として特に理解され、その場合、パーフルオロ化分子Ａ又はＡ′への分子Ｅの結合は、スペーサー分子Ｄ及び／又はリンカー分子Ｃを任意的に使用してもつ所定の切断点Ｂによって、好んで生じる。
【００８６】
次のものでは、好ましいパーフルオロ化位置は、様々な分子（Ｅ）のためにリストされる：
ａ）核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、のパーフルオロ化、ｂ）ペプチド核酸モノマー及びオリゴマー、ペプチド核酸、のパーフルオロ化、ｃ）オリゴヌクレオチドのパーフルオロ化。
【００８７】
第一の変異型において、分子Ｅとしての核酸塩基のパーフルオロ化が、好ましいパーフルオロ化サイトである、ＮＨ２及びＮＨ基で、分子中のすべてのアクセス可能な場所に生じうる。ただ一つの制限がそれぞれのＮＨ基（矢印）にてヌクレオシドへの転化の間に生じる。図解２を参照してください。
【化１１】
2014510743.tif 000015
【００８８】
第二の変異型において、また、パーフルオロ化は、リボースの２′、３′、及び／又は５′位置である、好ましいパーフルオロ化サイトで、ヌクレオシドの糖分子中のパーフルオロ化サイトにて可能である。また、リボースの対応する位置は、―ＳＨ及び／又は―ＮＨ２、２′−ＮＨ２、２′−ＳＨなどに対応する好ましいパーフルオロ化サイトの形で修飾されうる。図解３を参照してください。
【化１２】
2014510743.tif 000016
【００８９】
ヌクレオチドのパーフルオロ化のために、２′及び３′位置において、リボースのパーフルオロ化サイトに加えて、第３の変異型によって、遊離ＯＨ基で、あるいは少なくとも１つの酸素原子上など、燐酸基にて追加的なパーフルオロ化サイトがある。図解４を参照してください。
【化１３】
2014510743.tif 000017
【００９０】
あるいは、しかしながら、図解５に示されるように、パーフルオロ化サイトは、例えば、Ｓ又はＮ又は他のもの等、ヘテロ原子を持った修飾された糖リン酸構造上で発生する場合もある。
【化１４】
2014510743.tif 000018
【００９１】
第４の変異型おいて、ペプチド核酸モノマー、ペプチド核酸オリゴマー及びペプチド核酸のパーフルオロ化が生じうる。これらは核酸のアナログである。糖‐燐酸主鎖は、疑似ペプチド、例えば、中性のアミド結合により一緒に結合したアミノエチレングリシン単位によって置換される。それらは非常に安定している。なぜなら、ヌクレアーゼ、又はプロテアーゼにもそれらを分解することができないためである。それらは、オリジナルのオリゴマーとして相補的ＤＮＡ及びＲＮＡ配列でより厳重にハイブリダイズし、追加のパーフルオロ化サイトは、ＮＨ２とカルボキシ基、Ｏ原子、及び、修飾されたペプチド構造の官能基に存在する；図解６を参照してください。
【化１５】
2014510743.tif 000019
【００９２】
第５の変異型において、核酸オリゴマー又はオリゴヌクレオチド、及び核酸高分子のパーフルオロ化が、可能な異なるアプローチを用いて生じうる。
【００９３】
第一のアプローチでは、パーフルオロ化ヌクレオチドは、例えば、固相合成により、又はＰＣＲによって、適切なＲＮＡ又はＤＮＡ塩基配列に直接組み込まれ、２′位置（つまりリボースの２′位置において）にてパーフルオロ化された、パーフルオロ化ヌクレオチドを使用することが好ましい。この理由は、一つには、このサイトでのパーフルオロ化が、重合又は合成中に鎖切断をもたらさないことである。また、もう一つには塩基対間の相互作用は妨害されないことである。図解７の２つの上部の例を参照してください。
【００９４】
２ＸＯＨ位置がＲＮＡ分子において簡単にパーフルオロ化される一方、ＤＮＡ分子では、２′Ｈ位置は、例えば、Ｈ又は２′アミノ―２′−デオキシウリジンの代わりにＮＨ２のようなパーフルオロ化できる基によって最初に官能化されるに違いない。
【００９５】
第二のアプローチにおいて、ＤＮＡ配列におけるＲＮＡヌクレオチドのとり込み、又はオリゴヌクレオチドの又はＤＮＡ高分子の、５′又は３′端末にてパーフルオロ化ＤＮＡヌクレオチドのとり込み；図解７で３番目の具体例を参照してください。このアプローチでは、従って、パーフルオロ化ヌクレオチドのようなパーフルオロ化化合物は、好ましくは化学合成による完成したオリゴヌクレオチドの端末に加えられる。使用したヌクレオチドは、好ましい２′―及び５′−パーフルオロ化ヌクレオチドを用いて、上記に記述されるような任意の可能な位置で、パーフルオロ化されうる。ここで、ただ一つの例外は、Ｃ８Ｆ１７を持った５′位置にてパーフルオロ化されたヌクレオチドである。
【化１６】
2014510743.tif 000020
【００９６】
本発明の化合物は、異なる構造をもつ異なる構成物で存在することができ、化合物が分子Ｃ、Ｄ、Ｆ及びＧの存在に依存して次の追加の基本構造を持つことができるといえる。
2014510743.tif 000021
【００９７】
具体例のために、次の化合物が言及される：
【００９８】
【化１７】
2014510743.tif 000022
【００９９】
【化１８】
2014510743.tif 000023
【０１００】
【化１９】
2014510743.tif 000024
【０１０１】
【化２０】
2014510743.tif 000025
【０１０２】
【化２１】
2014510743.tif 000026
【０１０３】
【化２２】
2014510743.tif 000027
【０１０４】
本発明の方法の化合物は、例えば、添加、置換、縮合、エーテル化又はエステル化によって、個々の分子構築ブロックの連続的な結合を可能にする、合成の既知の方法によって、調製される。そのような合成経路は当業者として合成化学者に知られている。
【０１０５】
本発明についてのよりよい理解については、図に関してのサンプル実施形態に基づいて次のものの中で説明されるが、これらの具体例に制限されない。
【０１０６】
図１は、本発明の化合物でトランスフェクションされた細胞の顕微鏡でのイメージを示す。
【０１０７】
図２は、本発明の化合物でトランスフェクションされた細胞のＦＡＣＳ分析を示す。
【実施例】
【０１０８】
サンプル実施形態１：パーフルオロ化核酸塩基の合成
【０１０９】
核酸塩基のパーフルオロ化は、ウィリアムソン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）のエーテル合成によっておこなわれる。ここで、ＮＨ２基は、比較的、容易にアクセス可能である。チミンはＮＨ２基を持っていないが、４つの構造が、パーフルオロ化可能なＯＨ基を持っている、６つの互変異性の構造中で生じることができる。
【化２３】
2014510743.tif 000028
【０１１０】
サンプル実施形態２：２′−パーフルオロ化ウリジン′に基づく２′−パーフルオロ化ヌクレオシドの合成
【０１１１】
ウリジンはＲＮＡの重要な構成要素である。ＲＮＡ鎖へのとり込みが、糖の中の３′及び５′位置のＯＨ基によって生じる。したがって、核酸塩基の結合部位に悪影響を及ぼさずに、置換基の導入にウリジンの２′位置は、特に適している。様々な２′−置換ウリジンは、２′エーテル又はエステル、２′チオエーテル又はエステル、２′酸アミド、又は２′カルバメート、又は２−Ｃさえによって、結合が生じることが、知られている。図解８を参照してください。
【化２４】
2014510743.tif 000029
【０１１２】
２′位置における、パーフルオロアルキレン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏａｌｋｙｌｅｎｅ）を有するウリジンの合成のために、新しい合成が行われた。例えば２′−ＯＨ基への直接の結合はエーテル官能基及びエステル官能基によって行った。図解９を参照してください。
【化２５】
2014510743.tif 000030
【０１１３】
また、２′−ＯＨ基への結合は、短いスペーサーを使用するエーテル官能基又はエステル官能基によって可能である。図解１０を参照してください。
【化２６】
2014510743.tif 000031
【０１１４】
別の可能性はスペーサー及び所定の切断点によってパーフルオロ化アルキル基の結合である。図解１１を参照してください。
【化２７】
2014510743.tif 000032
【０１１５】
図解９〜１１中に表された、すべての反応のために、３′及び５′―ＯＨ基を保護しなければならない。シリル保護基はこの目的に適している。しかしながら、ここで、２′‐及び３′‐置換ウリジン間の平衡が、ある場合（アシル移動）において、作成することができることは、注目されるに違いない。この理由で、ウリジンの２′位置への疎水基の結合は、エーテル官能基によって、又はアミノ官能基（２′−アミノ―２′−デオキシウリジン）によって行った。
【０１１６】
２′エーテル官能基によるパーフルオロ化：
パーフルオロ化疎水基の続いて起こる導入は、エーテル官能基による２′−ＯＨ基によって行われる。これのために、ＯＨ基は、テトライソプロピル−ジコール（ｄｉｃｈｏｒ）−ジシランを使用して、３′と５′において、最初の工程で保護された。また、次のステップで、ＯＨ基は、１−ヨウ素−パーフルオロオクタン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃｔａｎｅ）又は１−ヨウ素−パーフルオリン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｉｎｅ）−ウンデカンを用いて、２′位置において続いてエーテル化され、脱保護された。反応のコースによって、反応の中間体及び最終生成物は、調製用クロマトグラフィーによって精製された。その反応は防湿の下で、及び不活性ガス（アルゴン）の下で行なわれた。また、使用される前に、使用される溶剤を乾かさなければならなかった。
【０１１７】
具体的には、一つは、ウリジン上の３′−ＯＨと５′−ＯＨ基が、最初に、保護基（３′、５′−ジエーテルブチルシロキサン（ｄｉｅｔｈｅｒｂｕｔｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ））を与えられ、ウリジン及び官能化パーフルオロヒドロカーボン（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）（Ｃ８Ｆ１７Ｂｒ又はＣ８Ｆ１７Ｊ）から始まる。官能化パーフルオロヒドロカーボンとの反応は、ウリジンの２′−ＯＨ基で起こる。この目的のために、Ｃ８Ｆ１７Ｂｒ（あるいはＣ８Ｆ１７Ｊ）は、ウィリアムソンのエーテル合成の手段により、ウリジンの２′−ＯＨ基に結合され、その結果、ウリジン−２′０−Ｃ８Ｆ１７（３′、５′−ジエーテルブチルシロキサン（ｄｉｅｔｈｅｒｂｕｔｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を持った）を産出する。官能化パーフルオロヒドロカーボンとの反応は、ウリジンの２′−ＯＨ基にて起こる。この目的のために、１９９１年、Ｍｏｎｏｋａｎｅｎ等、及び１９９３年、Ｍｏｎｏｋａｎｅｎ等、による反応が行われ、その結果、ウリジン−２′０−Ｃ８Ｆ１７（３′、５′−ジエーテルブチルシロキサン（ｄｉｅｔｈｅｒｂｕｔｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）を持った）を産出する。最後に、保護基を分割する。図解１２を参照してください。
【化２８】
2014510743.tif 000033
【０１１８】
サンプル実施形態３：２′アミノ―２′−デオキシウリジンの２′−アミノ官能基によるパーフルオロ化  
【０１１９】
第２の合成経路は、市販で入手可能である、２′アミノ―２′−デオキシウリジンから始まる。これは、パーフルオロカルボキリック酸（ｐｅｒｆｌｕｏｒｏｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄｓ）で酸アミドに変換された。ここで、また、不活性ガスは防湿の下で使用された。最終生成物は，調製用カラムクロマトグラフイーを使用して精製された。ウリジンの５′位置における第一級ＯＨ基は、ＤＭＴ‐で保護された。核酸成分の他の位置でのアナログの反応については、適切な保護基を加えるか省略することができる。図解１３を参照してください。
【化２９】
2014510743.tif 000034
【０１２０】
サンプル実施形態４：ビオチンの形をしている認識配列を持つパーフルオロ化ヌクレオシドの合成
【０１２１】
合成の出発点は、アミノアルコールを持つ２′−修飾ウリジン・ヌクレオシドだった。アミノアルコールは、Ｃ８Ｈ１７ＯＨとそのアミノ官能基にてパーフルオロ化された。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）（ＨＯＢｔ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の使用を通じて、化学選択的なアミド形成が、アルコール性水酸基に対する攻撃をすることなく達成された。その後、残る第一級水酸基は、ビオチンでエステル化された。
【化３０】
2014510743.tif 000035
【０１２２】
サンプル実施形態５：蛍光染料を持つパーフルオロ化ヌクレオシドの合成
【０１２３】
フルオレセイン構築ブロックは、反応的なアミノ官能基で合成された。それによってアミド結合による結合を可能にする。５−ニトロフルオロセイン（ｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）は、４−ニトロフタル酸及びレゾルシノールから調製された。縮合反応は、６−ニトロフルオロセイン（ｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）及び５−ニトロフルオロセイン（ｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）の混合物を産出し、６−ニトロフルオロセイン（ｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）は分別結晶によって分離された。続いて起こる合成の間に、ニトロ官能基はアミノ官能基に還元された。化合物中のカルボキシル基はメチルエステルに変換された。得られる化合物は、コハク酸無水物でアシル化され、対応するアミドを産出した。
【化３１】
2014510743.tif 000036
【０１２４】
遊離カルボキシル基はパーフルオロ化ヌクレオチドの水酸基でエステル化された。
【化３２】
2014510743.tif 000037
【０１２５】
サンプル実施形態６：認識配列と蛍光染料を持つパーフルオロ化ヌクレオシドの合成
【化３３】
2014510743.tif 000038
【０１２６】
サンプル実施形態７：パーフルオロ化オリゴヌクレオチド及び核酸の合成
【０１２７】
ベークアウトした５０ｍｌのシュレンク管において、０．９０ｍｍｏｌの２′パーフルオロ化ウリジンは、アルゴン大気の下で２０ｍｌの乾性ジクロロメタンに溶かされる。１．００ｍｍｏｌのＣｙＴＩＰＰ及び０．４５Ｍテトラゾール溶液（アセトニトリル中の）の２．３０ｍｌを溶液に加えた後に、反応混合液は室温で２時間撹拌され、反応の進行はＤＣの手段によりモニターされる。ロータリー・エバポレータに混合物を濃縮した後、カラムクロマトグラフィーの精製後に、３′−ホスホラミダイト−２′−パーフルオロ−ウリジン（３′−ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ−２′−Ｐｅｒｆｌｕｏｒｏ―ｕｒｉｄｉｎｅ）を得る。これらのヌクレオチドは、モノマーのヌクレオチドがともに結合されるホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）方法の出発点である。この方法では、モノマーのヌクレオチド構築ブロックは、３′−ホスホラミダイト（３′―ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ）として固相にともに結合される。配列の構築物が、３′スクシナートによって、標準合成において、適切な固相に結合された「リーダー・ヌクレオシド」と共に３′から５′端末へ生じる。３′−ホスホラミダイトとして持ち込まれたヌクレオシドは、５′水酸基にて酸―不安定な保護基及び塩基の環外のアミノ官能基にて塩基‐不安定な保護基を持つ。合成サイクル（それは何度も繰り返される）は、次の反応を含む：
ホスホラミダイトは、４，５−ジシアミノイミダゾール又は１−Ｈ−テトラゾールのような、弱酸の追加を通じて、活性化され、固定化されたヌクレオシドの５′―水酸基と結合される。転化されないＯＨ基は無水酢酸でアセチル化され、さらなる転化からブロックされる。酸化がルゴール液で生じて、リン酸トリエステルをもたらす。酸不安定なトリチル保護基はジクロロ酢酸溶液で取り除かれる。配列の完成に際して、オリゴヌクレオチド及び核酸塩基の保護基は、５５°Ｃで、アンモニア水を用いた処理を通じて切断される。
【０１２８】
ホスホラミダイト方法又はオリゴマー及び核酸の調製物のための他の化学的手法は、世界的に様々な会社によって現在の技術の中で既に提示され、ヌクレオチド配列の達成可能な長さは、人工遺伝子のサイズに達した。
【０１２９】
サンプル実施形態８：パーフルオロ化オリゴヌクレオチド及び核酸の代替的な合成
【０１３０】
また、全オリゴマー及び核酸のパーフルオロ化は、例えば、弗素酸を用いた酸−触媒方法を通して、可能である。あるいは、パーフルオロ化ヌクレオチドの重合は、ポリメラーゼ（ポリメラーゼチェーン反応）を使用して、可能である。
【０１３１】
サンプル実施形態９：修飾された核酸構築ブロックのパーフルオロ化
【０１３２】
例えば、ホスホロチオエート、電気的に中性のメチル・ホスホネート誘導体、電気的に中性のジメチル・スルホン誘導体、又はリボースの２′炭素原子での誘導体化によって、核酸は電荷を安定させるか除去するために誘導することができる。通常の核酸構築ブロックを用いるのと同様に、パーフルオロ化の可能性は、修飾された糖‐燐酸主鎖上に、及び塩基にある。パーフルオロ化経路については、パーフルオロ化ヌクレオシド、ヌクレオチド及びパーフルオロ化オリゴヌクレオチドの合成を参照してください。
【化３４】
2014510743.tif 000039
【０１３３】
サンプル実施形態１０：アラニル  ヌクレオアミノ（ｎｕｃｌｅｏａｍｉｎｏ）酸の形をしているパーフルオロ化ペプチド核酸モノマーの合成
【０１３４】
ペプチド核酸モノマーは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン・サブユニット又は他のペプチド単位に基づく、ペプチドのアキラル性のバックボーンによりリボース‐燐酸ジエステル・バックボーンが置換された、ヌクレオチド類似体である。ここで、パーフルオロ化塩基は、カルボキシメチレン単位によってバックボーンに結合される。核酸塩基のＮＨ２基にてパーフルオロ化がオリゴマーへのとり込みに影響を示さない一方、ペプチド単位のアミノ末端及びカルボキシ末端部でのパーフルオロ化は、合成を停止させる効果がある。アラニル  ヌクレオアミノ酸の合成は、Ａ／−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン・ラクトンに変換された、Ａ／−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン及びＡ／−Ｂｏｃ−Ｄセリンから始まる。Ｂｏｃセリン・ラクトンは、ベンジルオキシカルボニル−保護シトシン、及びグアニン前駆物質２−アミノ６−クロロプリンを通して、ＢｏｃＬ−ＡｌａＧ−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｄ−ＡｌａＧ−ＯＨ及びＢｏｃ−ＡｌａＣＺ−ＯＨへの又はその鏡像異性体へ求核のリング開口によって反応する。シトシンの環外のアミノ官能基での保護基ベンジルオキシカルボニルは、続いて起こるペプチド固相合成に必要である。環外のアミノ基が求核性をほとんど示さないので、グアニンは保護を必要としない。
【化３５】
2014510743.tif 000040
【０１３５】
Ａ／−Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸ベンジルエステル又はＢｏｃＤ−アスパラギン酸ベンジルエステルは、ホモアラニル（ｈｏｍｏａｌａｎｙｌ）−ヌクレオアミノ（ｎｕｃｌｅｏａｍｉｎｏ）酸の合成のための出発化合物として、使用された。側鎖は、ＢＨ３−ＴＨＦでアルコールに還元され、アペルの反応によって、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−γ−臭素−ホモアラニルベンジルエステル又はＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−γ−臭素−ホモアラニルベンジルエステルへ臭素化された。
【化３６】
2014510743.tif 000041
【０１３６】
Ｋ２ＣＯ３の下で、ベンジルオキシカルボニル−保護シトシン及び２−アミノ６−クロロプリンを用いて、ブロミドの求核置換は行なわれた。次のステップで、Ｂｏｃ保護基が同時に取り除かれて、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏは加水分解された。続いて起こるステップは、ＰｄＯ−Ｈ２Ｏで水素化分解的に（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）行なわれた。Ｂｏｃ-Ｌ−ＨａｌＧ−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｄ−ＨａｌＧ−ＯＨへのＢｏｃ無水物を持った防護がこれに続いた。
【化３７】
2014510743.tif 000042
【０１３７】
モノマーのパーフルオロ化は、４８時間の間Ｋ２ＣＯ３／アセトン及び官能化パーフルオロカーボン分子を使用して、ウィリアムソンのエーテル合成によって行われる。核酸塩基にて、及びペプチド構築ブロックにてアクセス可能なＮＨ２及びＯＨ基はすべてパーフルオロ化されている。このパーフルオロ化の１つの例が、Ｃ８Ｆ１７Ｊの例を使用して、ここに示される。
【化３８】
2014510743.tif 000043
【０１３８】
別の可能性は、パーフルオロ化が起こる前の、ペプチド部分のＯＨ基のマスクキングである。それらの環境の下では、核酸塩基のＮＨ２基だけがパーフルオロ化される。これを達成するために、ジテルトブチルシリルジトリフレート（ｄｉｔｅｒｔｂｕｔｙｌｓｉｌｙｌｄｉｔｒｉｆｌａｔｅ）で水酸基を保護しなければならない。パーフルオロ化の後、これらのＯＨ基は、ペプチド合成に利用可能なために、再び脱保護されなければならない。これらのモノマーを使用して、オリゴマー合成は、パーフルオロ化モノマーが既に組込まれている可能性がある。しかしながら、必要とされる追加の反応工程により、それは最初に合成し、そしてその後、オリゴマーをパーフルオロ化する方がより簡単なようだ。
【０１３９】
具体例のためにリストされた追加のパーフルオロ化：
【化３９】
2014510743.tif 000044
【０１４０】
サンプル実施形態１１：パーフルオロ化ペプチド核酸オリゴマー及びペプチド核酸の合成
【０１４１】
ペプチド核酸の場合には、リボース‐燐酸ジエステル・バックボーン全体がＮ−（２−アミノエチル）−グリシン・サブユニット又は他のペプチド単位に基づく、ペプチド性の、アキラル性のバックボーンにより置換された。パーフルオロ化塩基は、カルボキシメチレン単位によって、ここでバックボーンに結合された。次に、核酸塩基はペプチド単位に結合された。その後、モノマーは固相合成中のオリゴマーに結合された。オリゴマーの合成の後にだけパーフルオロ化ステップを行なうことは、より簡単であると分かった。パーフルオロ化工程は、モノマーのパーフルオロ化の中で使用される反応工程に従う。
【０１４２】
アラニルヌクレオアミノ酸の合成は、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン・ラクトン又はＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−セリン・ラクトンに変換された、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−セリン及びＡ／−Ｂｏｃ−Ｄ―セリンからスタートする。Ｂｏｃ−セリン・ラクトンは、ベンジルオキシカルボニル−保護シトシン及びグアニン前駆物質２−アミノ−６−クロロプリンを介して、Ｂｏｃ−Ｌ−ＡｌａＧ−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｄ−ＡｌａＧ−ＯＨ及びＢｏｃ−ＡｌａＣＺ−ＯＨ又はその鏡像異性体へ求核性開環によって、反応する。シトシンの環外のアミノ官能基上の保護基ベンジルオキシカルボニルは、続いて起こるペプチド固相合成に必要である。環外のアミノ基が求核性をほとんど示さないので、グアニンは保護を必要としない。
【化４０】
2014510743.tif 000045
【０１４３】
Ａ／−Ｂｏｃ−Ｌ−アスパラギン酸ベンジルエステル又はＢｏｃ‐Ｄ−アスパラギン酸ベンジルエステルは、出発化合物としてホモアラニル‐ヌクレオアミノ酸の合成に使用された。側鎖はＢＨ３−ＴＨＦで、アルコールに還元され、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｌ−γ−臭素−ホモアラニルベンジルエステル又はＮ−Ｂｏｃ−Ｄ−γ−臭素−ホモアラニルベンジルエステルへ、アペルの反応によって、臭素化された。
【化４１】
2014510743.tif 000046
【０１４４】
Ｋ２ＣＯ３の下で、ベンジルオキシカルボニル−保護シトシン及び２−アミノ６−クロロプリンで、ブロミドの求核置換は行なわれた。次のステップで、Ｂｏｃ保護基が同時に取り除かれて、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏは加水分解された。続いて起こるステップは、ＰｄＯ−Ｈ２Ｏで水素化分解的に（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）行なわれた。Ｂｏｃ無水物を用いて、保護が、ＢｏｃＬ−ＨａｌＧ−ＯＨ又はＢｏｃ−Ｄ−ＨａｌＧ−ＯＨの中へ行われた。
【化４２】
2014510743.tif 000047
【０１４５】
シトシン塩基のベンジルオキシカルボニル保護基を得ることが適切な結果だったので、ベンジル基の水素化分解的な（ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｌｙｔｉｃ）切断はここで生じることができなかった。したがって、塩基性鹸化はＮａＯＨ／ジオキサン／Ｈ２Ｏで行なわれた。
【化４３】
2014510743.tif 000048
【０１４６】
ペプチド核酸の合成は、ペプチド合成と同様に行なわれる。その合成は固体状態システム上で行なわれる。その合成はＢｏｃ合成方法又はＦｍｏｃ合成方法を使用して行なうことができる。この場合、Ｂｏｃ合成方法が選ばれた：
【０１４７】
ＨＢＴＵ（Ｎ−（１−Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスファート（N-(1-H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-hexafluorophosphate)）及びＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ）はアミノ酸のカップリング試薬として使用された。ホモアラニルヌクレオアミノ酸はＨＡＴＵとＨＯＡｔで活性化された。ＢｏｃＬ−Ｌｙｓ（２−Ｃｌ−Ｚ）―ＯＨで覆われた、ＭＢＨＡ-ＰＳ樹脂は固体状態として使用された。アミノ酸によって、カップリングは３５分及び２時間の間で行なわれた。樹脂を酸性切断と同時に側鎖の保護基を取り除くことができたように、側鎖の保護基が選択された。リジンについては、側鎖は（２−Ｃｌ−Ｚ）で保護され、グルタミニン酸のためには、（ＯＢｎ）で保護され、チロシンのためには（２−Ｂｒ-Ｚ）基で保護された。
【０１４８】
−１．脱保護：ＴＦＡ中の５％  ｍ−クレゾール（１×５分、１×１０分）；２．洗浄：ＤＣＭ／ＮＭＰ（５ｘ）＋ピリジン；
【０１４９】
−１．カップリング：５．０当量Ｂｏｃ−Ｈａｌ−ＯＨ又は５．０当量Ｂｏｃ−ＡＳ−ＯＨ、４．５当量のＨＡＴＵ又はＨＢＴＵ、５．０当量のＨＯＡｔ又はＨＯＢｔ  １２当量のＤＩＰＥＡ、ＮＭＰ；２．洗浄：ＤＣＭ／ＮＭＰ（５ｘ）、ＮＭＰ（３ｘ）中の１０％のピペリジン、ＤＣＭ／ＮＭＰ（５ｘ）；
【０１５０】
−１．キャッピング：Ａｃ２０／ＤＩＰＥＡ／ＮＭＰ（１：１：８）（２×５分）；２．洗浄：ＤＣＭ／ＮＭＰ（５ｘ）、ＮＭＰ（３ｘ）中の１０％のピペリジン、ＤＣＭ／ＮＭＰ（５ｘ）；切断：ＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／ｍ−クレゾール（８：１：１）
【化４４】
2014510743.tif 000049
【０１５１】
取り込まれたヌクレオアミノ酸を持った１５マー（ｍｅｒ）ペプチドはこの方法を使用して調製された。
【０１５２】
この後に、Ｋ２ＣＯ３／アセトン及び官能化パーフルオロカーボン分子によるウィリアムソンのエーテル合成は４８時間行った。パーフルオロ化は、個々の核酸塩基及びペプチド核酸モノマーのパーフルオロ化に同様に生じる反応で、アクセス可能なＮＨ２及びＯＨ基すべてに達した（上記に記述されたように）。反応時間（２ｈ〜７２ｈ）を変えることによって、パーフルオロ化の程度は減少させられる又は増加させられることができた。
【０１５３】
サンプル実施形態１２：所定の切断点の選択
【０１５４】
次の所定の切断点がここで使用された：ｆＰＦＣ／ｍＲＮＡ複合体はエンドシトーシスにより吸収され、リソソームの中で充填される。この処理中に、７．４から７．２までのｐＨの中の実質的なジャンプが、ＡＴＰ依存性プロトンポンプによって引き起こされるリソソームにおいて、４．０までに細胞外液腔で生じる（Ｓｅｒｒｅｓｉら、２００９）。４．０のこの低ｐＨ値は所定の切断点の選択には重大である。ｆＰＦＣシステムの検討に値する、一連の酸−不安定な所定の切断点がある（ワルネッケ（２００８年）及びワルネッケ２０１０）。しかしながら、２′位置でのグリコシド結合は低ｐＨ値にて加水分解する。図解１４を参照してください。
【化４５】
2014510743.tif 000050
【０１５５】
パーフルオロカーボンがヒドロラーゼから分子を覆うので、化学的加水分解が生じ、その結果、パーフルオロカーボン鎖への有害なＯＨ基の結合が防がれる。つまり、切断されたパーフルオロカーボン鎖は不活性のままで、細胞分子と結合しない。しかしながら、細胞質中で切断する所定の切断点も有用である（約ｐＨ値＝７）。
【０１５６】
サンプル実施形態１３：パーフルオロ化オリゴヌクレオチド及び核酸の代替的な合成
【０１５７】
また、例えば、弗素酸を用いた酸−触媒反応方法、又はポリメラーゼ（ポリメラーゼチェーン反応）を使用してパーフルオロ化ヌクレオチドの重合、を使用して、オリゴマー及び核酸全体のパーフルオロ化も可能である。
【０１５８】
サンプル実施形態１４：エマルジョンの調製物
【０１５９】
Ａ）ある粒子径を調節するために、界面活性剤を使用することが必要かもしれない。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８をここで使用した。５ｍｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８を１０ｍｌの蒸留水に溶かす。０．５ｍｌの官能化パーフルオロカーボン／ｍＲＮＡ溶液（１．０ｇ／１．０マイクロリットル）をこれに加えた。その後、超音波処理を３サイクル、強度６０で行なう。その後、得られたエマルジョンは、過度に大きな粒子状物質を沈殿させるために、遠心分離機にかけられる（１２００  ＲＰＭ／５ｍｉｎ）。５０−１００ナノメートルの粒子径を持った粒子状物質が、過度に大きな粒子状物質の上澄み中に見つかる。これらを使用する。
【０１６０】
Ｂ）溶解力のあるエマルジョン：０．５ｍｌの官能化パーフルオロカーボン／ｍＲＮＡ溶液（１．０ｇ／１．０マイクロリットル）を、２ｍｌのテトラヒドロフランに加え、溶かす。その後、これを、蒸留水を使用して、１０ｍｌにする。その後、得られたエマルジョンは、過度に大きな粒子状物質を沈殿させるために、遠心分離機にかけられる（１２００  ＲＰＭ／５ｍｉｎ）。５０−１００ナノメートルの粒子径を持った粒子状物質は過度に大きな粒子状物質の上澄みで見つかる。これらを使用する。
【０１６１】
Ｃ）０．５ｍｌの官能化パーフルオロカーボン／ｍＲＮＡ溶液（１．０ｇ／１．０マイクロリットル）を１０ｍｌの蒸留水に加える。その後、超音波処理を３サイクル、強度６０で行う。その後、得られたエマルジョンは、過度に大きな粒子状物質を沈殿させるために、遠心分離機にかけられる（１２００  ＲＰＭ／５分）。５０−１００ナノメートルの粒子径を持った粒子状物質は過度に大きな粒子状物質の上澄みで見つかる。これらを使用する。
【０１６２】
サンプル実施形態１５：後天性の遺伝病を治療するための治療効果のある配列を持った人工ｍＲＮＡの調製物
【０１６３】
上述のように、人工のパーフルオロ化ｍＲＮＡを調製する。このシステムの所定の切断点はグリコシド結合である。さらに、同じコード情報を維持しながら、人工ｍＲＮＡのＧＣ含量を増加し、寿命（ＲＮＡｓｅｓに対する抵抗）を増加させる。
【０１６４】
人工ｍＲＮＡ及び官能化パーフルオロカーボンの複合体は親水性・疎水性特性を両方持っており、追加的な界面活性剤を必要としない。サンプル実施形態８のＣ）で記述されるように、エマルジョンの調製物を作る。バッファーの中に混合されたエマルジョンを、吸入スプレーとして適用されるエアロゾルの中へ装置によって処理し、肺によって身体の血流に入る。複合体は血液の中で循環し、エンドシトーシス／ピノサイトーシスによって非特異的に吸収される。所定の切断点の切断が、化学的加水分解によって細胞のエンドソーム及びリソソームにおいて、生じる。放出されたｍＲＮＡ及び放出されたパーフルオロカーボン分子は、エンドソームによって、又はリソソームによって、細胞質の中へ放出される。ｍＲＮＡのトランスレーション及び治療効果のあるタンパク質の形成が、細胞質に生じる。輸送系（パーフルオロカーボン分子）は不活性で、細胞分子で反応することができない。その蒸気圧及び他の物理的性質により、輸送系は肺及び腎臓機能によって排泄される。
【０１６５】
サンプル実施形態１６：癌治療での治療効果のあるｓｉＲＮＡの放出：
【０１６６】
エマルジョンの調製のように、上記に記述されるように、ｓｉＲＮＡの調製、及びシステムへのトランスフェリンの結合を行った。このエマルジョンは静脈内に投与される。配位子トランスフェリンによって、粒子状物質は、腫瘍細胞に特に強く吸収され、それは特定の標的細胞においてｓｉＲＮＡを用いた処理を可能にする。所定の切断点は、化学的な加水分解によってエンドソーム又はリソソームの中で切断される。ｓｉＲＮＡとパーフルオロカーボンの分子は細胞質へ放出される。パーフルオロカーボン分子は肺及び腎臓機能によって排泄される。
【０１６７】
サンプル実施形態１７：ＨＰＶタイプ１６に対して治療効果のある予防接種
【０１６８】
上記に記述されるように、ＨＶＰタイプ１６の特定遺伝子発現を停止するためのｓｉＲＮＡ及びそのエマルジョンを調製する。バッファーの中で、このエマルジョンは、粘膜に塗布されるチンキ剤へ処理される。複合体は組織に入り込み、エンドシトーシス／ピノサイトーシスにより細胞に吸収される。ｓｉＲＮＡの作用経路、及びパーフルオロカーボン分子の排出経路は、上記に記述された通りである。
【０１６９】
サンプル実施形態１８：細胞の中へのパーフルオロ化核酸の吸収の検出
【０１７０】
細胞の中へのパーフルオロ化核酸の経路を追求するために、ローダミン結合を持った次の構成物が使用された：
【化４６】
2014510743.tif 000051
【０１７１】
最初に、化合物をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶かした。続いて、この溶液をイソプロパノールの中で滴定した。得られた粒子状物質は５０ｎｍの平均サイズがあった。
【０１７２】
ラインＨＥＫ  ２９３の細胞を細胞培養として使用した。トランスフェクションを細胞拡大の１日後に行った。コントロールとして、トランスフェクションを、パーフルオロ化核酸をテストするための同等なローダミン濃度の純粋なローダミン粒子状物質を用いて、行った。トランスフェクション直後、パーフルオロ化核酸を持った細胞の細胞培養培地は、透明にかつ変化してないように見える。ローダミンを持った培養液は、わずかに曇りかつ赤みがかっているように見えた。ローダミンがパーフルオロ化核酸中のＰＦＣ粒子に結合し、小さな粒子として底まで沈み、一方、染料が、純粋なローダミンを持った培地に完全に溶かされるという、この１つの説明は可能である。
【０１７３】
トランスフェクションの２０分後に、パーフルオロ化核酸を持った細胞の細胞表面上に均質の着色を観察することができた。純粋なローダミンを持った細胞において、この時点で説明した着色を見ることができなかった。
【０１７４】
トランスフェクションの２４時間後に、パーフルオロ化核酸を持った細胞の着色は２０分後の特徴と比較して変わった：もはや細胞表面上の一様に均質の着色を観察することができなかった。代わりに、粒状の着色が観察され、その小水疱が色彩強度を上げ、そして、中間のスペースがどんな着色もほとんど示さなかった。
【０１７５】
このプロセスの調査中に、パーフルオロ化核酸が、エンドソームとリソソーム中に、輸送されたことが、共焦点顕微鏡（図１を参照）上で画像を使用して、明らかになった。パーフルオロ化核酸で満たされたエンドソームとリソソームは、細胞質の全体にわたって検知された。粒子状物質は核で見つけられなかった（核局在性配列又は細胞分裂が必要とされる）。さらに、エンドソーム／リソソームから放出された粒子状物質の量が細胞質（それは小胞に外部での拡散した着色において明白だった）に既にあったことが観察された。
【０１７６】
対照的に、純粋なローダミン用いたトランスフェクションで、着色は２４時間の後に観察されたが、細胞質の代わりに細胞表面上と比較してそれは実質的により弱く、拡散していて  粒状だった。  
【０１７７】
トランスフェクトされた細胞もＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類（Fluorescence  Activated  Cell  Sorting））を使用して、研究された（図２を参照）。ＦＡＣＳ研究は、純粋なローダミン（コントロール）、及びパーフルオロ化核酸でトランスフェクトされた細胞上で行なわれた。また、共焦点顕微鏡検査法の結果が確認された。パーフルオロ化核酸は、細胞により確かに吸収され、エンドソームとリソソームの中で充填され、これらによって細胞質の中へ放出される。
【０１７８】
細胞の中へのパーフルオロ化核酸の吸収の有効性の高いレベルの結果、この方法は、ウイルスで媒介した遺伝子導入、及び細胞へ核酸、及びそのアナログ（修飾された核酸、ペプチド核酸）を転送する他の方法の正確な代案を構成する。
【図１】
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【図２】
2014510743.tif 000057
【図３】
2014510743.tif 000058
2014510743.tif 000059
2014510743.tif 000060
【国際調査報告】
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2014510743.tif 000062
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