(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
親細菌と比較して、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２活性が減少したまたは除去された遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸生成細菌であって、前記親細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである、遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸生成細菌。
【請求項２】
前記細菌が、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子内に少なくとも１つの破壊変異を含む、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記破壊変異が、親細菌と比較して、前記ＣＯＤＨ１遺伝子及び／または前記ＣＯＤＨ２遺伝子の発現を減少させるか、または除去する、請求項２に記載の細菌。
【請求項４】
前記破壊変異がノックアウト変異である、請求項２に記載の細菌。
【請求項５】
前記細菌が、前記親細菌と比較して、増大したＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性をさらに有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記細菌が、前記親細菌と比較して、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を過剰発現させる、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記細菌が、エタノール及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上を生成する、請求項１に記載の細菌。
【請求項８】
前記細菌が、前記親細菌と比較して、より多くの量のエタノールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項９】
前記細菌が、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する、請求項１に記載の細菌。
【請求項１０】
生成物を生成する方法であって、請求項１に記載の細菌を、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で培養し、それにより前記細菌が生成物を生成すること、を含む、方法。
【請求項１１】
前記細菌が、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子内に少なくとも１つの破壊変異を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記破壊変異が、親細菌と比較して、前記ＣＯＤＨ１遺伝子及び／または前記ＣＯＤＨ２遺伝子の発現を減少させたか、または除去する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記破壊変異がノックアウト変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌が、前記親細菌と比較して、増大したＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性をさらに有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌が、前記親細菌と比較して、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を過剰発現させる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生成物が、エタノール及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が、前記親細菌と比較して、より多くの量のエタノールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，１０１号、２０１４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，１０４号、及び２０１４年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０３６，１０７号の利益を主張し、それらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
特定の微生物は、一酸化炭素（ＣＯ）、二酸化炭素（ＣＯ２）、及び水素（Ｈ２）のうちの１つ以上を含むガス状基質の発酵によって、エタノールなどの燃料、及び２，３−ブタンジオールなどの他の化学物質を生成することができる。しかしながら、そのような燃料及び化学物質の効率的生成は、炭素基質の望まない副産物への転換、または緩徐な微生物増殖によって、制限され得る。したがって、改善された生成物及び／または増殖プロファイルを有する遺伝子操作された微生物（genetically engineered microorganisms）が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）活性が改変された遺伝子操作された微生物、及びそれに関する方法を提供する。具体的には、本発明は、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２活性が減少したまたは除去された、遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸生成細菌を提供する。本発明は、細菌をＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で培養することによって生成物を生成するための方法をさらに提供する。
【０００４】
本細菌は、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子内に少なくとも１つの破壊変異を含むように変性され得、それが減少したまたは除去されたＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２活性をもたらす。具体的には、破壊変異（複数可）は、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子の発現を減少させるか、または除去し得る。一実施形態において、破壊変異はノックアウト変異である。
【０００５】
さらには、本細菌は、増加したＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性を有するように変性され得る。一実施形態において、本細菌は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を過剰発現させ得、それが増加したＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性をもたらす。
【０００６】
本細菌は、エタノール、２，３−ブタンジオール、アセテート、及び／またはラクテートを含む、いくつかの生成物または副産物を生成し得る。好ましい実施形態において、本細菌は、エタノール及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上を生成する。本細菌はまた、減少した誘導期または増加した増殖速度など、親細菌と比較して改変された増殖特徴を有し得る。好ましくは、本細菌は、親細菌と比較して、より多くの量のエタノールを生成し、より多くの量の２，３−ブタンジオールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する。
【０００７】
本細菌は、概して、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質など、ガス状基質を消費する。ガス状基質は、例えば、合成ガスまたは工業プロセスに由来し得る。
【０００８】
好ましい実施形態において、本細菌は、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、またはクロストリジウム・ラグスダレイの親細菌に由来する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】３０ｐｓｉのＣＯでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図１Ａは増殖を示し、図１Ｂはエタノール生成を示し、図１Ｃは、アセテート生成を示し、図１Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図１Ｂ】３０ｐｓｉのＣＯでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図１Ａは増殖を示し、図１Ｂはエタノール生成を示し、図１Ｃは、アセテート生成を示し、図１Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図１Ｃ】３０ｐｓｉのＣＯでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図１Ａは増殖を示し、図１Ｂはエタノール生成を示し、図１Ｃは、アセテート生成を示し、図１Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図１Ｄ】３０ｐｓｉのＣＯでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図１Ａは増殖を示し、図１Ｂはエタノール生成を示し、図１Ｃは、アセテート生成を示し、図１Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図２Ａ】製鋼ガスでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図２Ａは増殖を示し、図２Ｂはエタノール生成を示し、図２Ｃはアセテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図２Ｂ】製鋼ガスでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図２Ａは増殖を示し、図２Ｂはエタノール生成を示し、図２Ｃはアセテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図２Ｃ】製鋼ガスでのＣＯＤＨ１変異体（三角形）及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図２Ａは増殖を示し、図２Ｂはエタノール生成を示し、図２Ｃはアセテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図３Ａ】Ｈ２＋ＣＯ２条件下でのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図３Ａは増殖を示し、図３Ｂはエタノール生成を示し、図３Ｃはアセテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図３Ｂ】Ｈ２＋ＣＯ２条件下でのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図３Ａは増殖を示し、図３Ｂはエタノール生成を示し、図３Ｃはアセテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図３Ｃ】Ｈ２＋ＣＯ２条件下でのＣＯＤＨ１変異体（三角形）、ＣＯＤＨ２変異体（バツ印）、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１（丸）の増殖及び代謝物プロファイルを示すグラフである。具体的には、図３Ａは増殖を示し、図３Ｂはエタノール生成を示し、図３Ｃはアセテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図４】ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳのプラスミドマップを示す図である。
【図５Ａ】１００％ＣＯでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現（ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）（四角形）及びプラスミド制御ｐＭＴＬ８３１５７（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現の効果を示すグラフである。具体的には、図５Ａは増殖を示し、図５Ｂはアセテート生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示し、図５Ｅはラクテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図５Ｂ】１００％ＣＯでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現（ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）（四角形）及びプラスミド制御ｐＭＴＬ８３１５７（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現の効果を示すグラフである。具体的には、図５Ａは増殖を示し、図５Ｂはアセテート生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示し、図５Ｅはラクテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図５Ｃ】１００％ＣＯでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現（ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）（四角形）及びプラスミド制御ｐＭＴＬ８３１５７（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現の効果を示すグラフである。具体的には、図５Ａは増殖を示し、図５Ｂはアセテート生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示し、図５Ｅはラクテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図５Ｄ】１００％ＣＯでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現（ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）（四角形）及びプラスミド制御ｐＭＴＬ８３１５７（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現の効果を示すグラフである。具体的には、図５Ａは増殖を示し、図５Ｂはアセテート生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示し、図５Ｅはラクテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図５Ｅ】１００％ＣＯでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現（ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）（四角形）及びプラスミド制御ｐＭＴＬ８３１５７（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現の効果を示すグラフである。具体的には、図５Ａは増殖を示し、図５Ｂはアセテート生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｃはエタノール生成を示し、図５Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示し、図５Ｅはラクテート生成を示す。Ｎ＝３。エラーバー＝平均の標準誤差。
【図６Ａ】ＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化（四角形）及びＷＴ（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖を示すグラフである。図６Ａは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＫＯ変異体がＣＯで増殖しないことを示す。図６Ｂは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＫＯ変異体がＣＯ２＋Ｈ２で増殖しないことを示す。
【図６Ｂ】ＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化（四角形）及びＷＴ（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖を示すグラフである。図６Ａは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＫＯ変異体がＣＯで増殖しないことを示す。図６Ｂは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＫＯ変異体がＣＯ２＋Ｈ２で増殖しないことを示す。
【図７Ａ】フルクトースでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（四角形）、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳで補完されたＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（三角形）、及びＷＴ（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化の効果を示すグラフである。具体的には、図７Ａは増殖を示し、図７Ｂはアセテート生成を示し、図７Ｃはエタノール生成を示し、図７Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。
【図７Ｂ】フルクトースでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（四角形）、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳで補完されたＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（三角形）、及びＷＴ（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化の効果を示すグラフである。具体的には、図７Ａは増殖を示し、図７Ｂはアセテート生成を示し、図７Ｃはエタノール生成を示し、図７Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。
【図７Ｃ】フルクトースでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（四角形）、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳで補完されたＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（三角形）、及びＷＴ（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化の効果を示すグラフである。具体的には、図７Ａは増殖を示し、図７Ｂはアセテート生成を示し、図７Ｃはエタノール生成を示し、図７Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。
【図７Ｄ】フルクトースでのＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（四角形）、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳで補完されたＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体（三角形）、及びＷＴ（丸）Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の増殖及び代謝物プロファイルに対するＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化の効果を示すグラフである。具体的には、図７Ａは増殖を示し、図７Ｂはアセテート生成を示し、図７Ｃはエタノール生成を示し、図７Ｄは２，３−ブタンジオール生成を示す。
【図８】ＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化が、ウッド・ユングダール経路が解糖中に生成される還元当量のためのシンクとして機能することを防ぎ得るために、過度の還元当量がエタノール及び２，３−ブタンジオール生成のための駆動力を発生させることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、特に、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）活性が改変された新規の遺伝子操作された微生物、及びそれに関する方法を提供する。
【００１１】
ＣＯＤＨ酵素（ＥＣ１．２．９９．２）は、等式：
【数１】
0006454000.tif 000002
に従って、ＣＯのＣＯ２への可逆的酸化を触媒し、還元当量を生成する酸化還元酵素である。ＣＯＤＨは、性質が周知であり、カルボキシド栄養性アセトゲンを含む様々な生物体において説明されている。
【００１２】
ＣＯＤＨは、（ｉ）高度に保存されたモリブデン活性部位を含み、かつ最終電子受容体として酸素（時には硝酸塩）を使用する、カルボキシド細菌に由来する好気性Ｃｏｘ型のＭｏ−Ｃｕ−Ｓｅ  ＣＯＤＨ、ならびに（ｉｉ）ＣＯ酸化から放出される電子を、フェレドキシン、シトクロム、フラボドキシン、ルブレドキシン、及びＮＡＤ（Ｐ）＋を含む一連の生理学的電子受容体へ輸送する、嫌気性型のＮｉ−ＣＯＤＨの２種類に大きく分類され得る。次いで、還元当量は、酢酸生成、メタン生成、硫酸還元、水素生成、及び金属還元を含むいくつかの経路において利用され得る。
【００１３】
Ｏ２感受性のＮｉ−ＣＯＤＨは、（ｉ）ＣＯ酸化において生理学的に機能する単官能性ＣＯＤＨ、及び（ｉｉ）ＣＯ２のＣＯ部分への還元をアセチル−ＣｏＡ生合成へと結びつける、二官能性ＣＯＤＨ／ＡＣＳ複合体の一部としてのＣＯＤＨという２つの群にさらに分けることができる。
【００１４】
例えば、Ｃ．オートエタノゲナムは、炭素及びエネルギーの唯一の供給源としてＣＯを用いて独立栄養的に増殖することが可能である。ゲノム配列決定は、このアセトゲン内に３つの推定上のＮｉ−ＣＯＤＨ、つまりＣＡＥＴＨＧ＿３００５（ＣＯＤＨ１）、ＣＡＥＴＨＧ＿３８９９（ＣＯＤＨ２）、及びＣＡＥＴＨＧ＿１６２０−１６２１（二官能性ＣＯＤＨ／ＡＣＳ複合体のＣＯＤＨ構成成分をコードするＡｃｓＡ）を発見した。ＣＯＤＨ１が、タンパク質及びフェレドキシン−ＮＡＤ（＋）還元酵素を結合する推定上の４Ｆｅ−４ＳフェレドキシンＦｅ−Ｓの上流で遺伝子共存下にある一方、ＣＯＤＨ２は、オーファンであるように見える。同様に、カルボキシド栄養性アセトゲンＣ．リュングダリ及びＣ．カルボキシジボランスも、３つのＣＯＤＨ、１つの二官能性ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、及び２つの追加の単官能性ＣＯＤＨを有すると記載される。加えて、少なくともＣＯＤＨ１は、Ｃ．リュングダリ、Ｃ．ラグスダレイ、Ｃ．ディフィシル、及びＡ．ウッディなど、全ての配列決定されたカルボキシド栄養性アセトゲン中に見られる。
【００１５】
先行技術は、概して、ＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２などのＣＯＤＨがＣＯ利用に関与していることを認めている。例えば、米国第２０１０／０１５１５４３号は、どのようにして酢酸生成クロストリジウム内でのＣＯＤＨの過剰発現が合成ガス構成成分から酸化ヌクレオチド共因子ＮＡＤ＋及びＮＡＤＰ＋への電子流を増加させ得、それにより次いでヌクレオチド共因子（ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨ）がウッド・ユングダール経路内の中間化合物の生成を刺激するかを記載する。
【００１６】
しかしながら、本発明者らは、驚くべきことに、カルボキシド栄養性酢酸生成微生物内のＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２を破壊することがガス利用に悪影響を与えないことを特定した。実際、本発明者らは、カルボキシド栄養性酢酸生成微生物内のＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２を破壊することが、未変性の親微生物と比較して、より多い量のエタノールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する微生物をもたらすことを発見した。
【００１７】
本発明は、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２活性が減少したまたは除去された、遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸生成細菌を提供する。本発明は、細菌をＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で培養することによって生成物を生成するための方法をさらに提供する。
【００１８】
微生物
本発明の微生物は、遺伝子操作されている、即ち、非天然型である。「遺伝子修飾」または「遺伝子工学」という用語は、幅広く微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子操作された」という用語は、操作されたゲノムまたは核酸（a manipulated genome or nucleic acids）を含む微生物を指す。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモーター挿入または欠失、核酸変異、改変遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識型設計、ランダム突然変異導入法、遺伝子シャフリング、及びコドン最適化を含む。
【００１９】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
【００２０】
「親微生物」は、本発明の微生物を発生させるために使用される微生物である。親微生物は、天然に存在する微生物（即ち、野生型微生物）または以前に変性されたことのある微生物（即ち、変異体または組換え微生物）であり得る。本発明の微生物は、親微生物において発現または過剰発現されていなかった１つ以上の酵素を発現または過剰発現させるように変性され得る。同様に、本発明の微生物は、親微生物によって含有されなかった１つ以上の遺伝子を含有するように変性され得る。一実施形態において、親微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリ、またはＣ．ラグスダレイである。好ましい実施形態において、親微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１である。
【００２１】
用語「〜由来の」は、核酸、タンパク質、または微生物が異なる（例えば、親または野生型）核酸、タンパク質、または微生物から変性または適合されて、新しい核酸、タンパク質、または微生物を生成することを示す。そのような変性または適合は、典型的には、核酸または遺伝子の挿入、欠失、突然変異、または置換を含む。一般に、本発明の微生物は、親微生物に由来する。一実施形態において、本発明の微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリ、またはＣ．ラグスダレイに由来する。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ＤＳＭＺ受託番号ＤＳＭ２３６９３の下で寄託される、Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１に由来する。
【００２２】
本発明の微生物は、機能特性に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロジェン、カルボキシド栄養生物、及び／またはそれらの組み合わせであり得るか、またはそれらに由来し得る。表１は、微生物の代表的な一覧を提供し、それらの機能特性を特定する。
【表１】
0006454000.tif 000003
0006454000.tif 000004
【００２３】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯ及びＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるＣ１固定微生物に由来する。
【００２４】
「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、もしくは死滅し得る。典型的には、本発明の微生物は嫌気性細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される嫌気性細菌に由来する。
【００２５】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物としてアセテート（または酢酸）を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、ならびにアセチル−ＣｏＡ及びアセテートなどのアセチル−ＣｏＡ由来生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、及び非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物はアセトゲンである。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるアセトゲンに由来する。
【００２６】
「エタノロジェン」は、エタノールを生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、本発明の微生物はエタノロジェンである。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロジェンに由来する。
【００２７】
「独立栄養生物」は、有機炭素がなくても増殖することが可能な微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯ及び／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は独立栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される独立栄養生物に由来する。
【００２８】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素の唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な微生物である。典型的には、本発明の微生物はカルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物に由来する。
【００２９】
より広範には、本発明の微生物は、表１で特定される任意の属または種に由来し得る。
【００３０】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃ．オートエタノゲナム種、Ｃ．リュングダリ種、及びＣ．ラグスダレイ種を含むクロストリジウムのクラスターに由来する。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（Ｃ．オートエタノゲナム）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（Ｃ．リュングダリ）、及びＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃ．ラグスダレイ）によって最初に報告され、かつ特徴付けられた。
【００３１】
これら３つの種は、多くの類似点を有する。具体的には、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、酢酸生成、エタノロジェン、及びカルボキシド栄養性のクロストリジウム属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型及び表現型ならびにエネルギー節約及び発酵代謝のモードを有する。さらには、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、約２２〜３０モル％の含有量でＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態及びサイズを有し（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖する）、４〜７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことには、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性増殖を示し、主な発酵生成物としてエタノール及びアセテート（または酢酸）を生成し、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオール及び乳酸を生成する。
【００３２】
しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃ．オートエタノゲナムはウサギの腸から、Ｃ．リュングダリは養鶏場の廃棄物から、及びＣ．ラグスダレイは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これらの種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、及び他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらには、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、ウッド・ユングダール経路遺伝子及びタンパク質の核酸及びアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子及びタンパク質の一般的構成及び数は、全ての種において同じであることが分かっている（Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。
【００３３】
したがって、要するに、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリ、またはＣ．ラグスダレイの特徴の多くは、その種に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、酢酸生成、エタノロジェン、及びカルボキシド栄養性のクロストリジウム属メンバーのこのクラスターの一般的な特徴である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【００３４】
本発明の微生物はまた、Ｃ．オートエタノゲナム、Ｃ．リュングダリ、またはＣ．ラグスダレイの分離株または変異体に由来し得る。Ｃ．オートエタノゲナムの分離株及び変異体としては、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、及びＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙げられる。Ｃ．リュングダリの分離株及び変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、及びＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃ．ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙げられる。Ｃ．ラグスダレイの分離株及び変異体としては、ＰＩ１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が挙げられる。
【００３５】
酵素
「ＣＯＤＨ１」は、等式：
【数２】
0006454000.tif 000005
に従って、ＣＯのＣＯ２への可逆的酸化を触媒し、還元当量を生成するＣＯＤＨを指す。本明細書における「ＣＯＤＨ１」への言及は、機能的に同等のそれらの変異体への言及を含むものと解釈されるべきである。ＣＯＤＨ１は、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（配列番号１）、Ｃ．ラグスダレイ（配列番号５）、Ｃ．リュングダリ（ＡＤＫ１３９７９．１）、Ｃ．ディフィシル（ＹＰ＿００１０８６６４４．１）、またはＡ．ウッディ（ＹＰ＿００５２６９５７３）のＣＯＤＨ１であり得る。
【００３６】
「ＣＯＤＨ２」は、等式：
【数３】
0006454000.tif 000006
に従って、ＣＯのＣＯ２への可逆的酸化を触媒し、還元当量を生成するＣＯＤＨを指す。本明細書における「ＣＯＤＨ２」への言及は、機能的に同等のそれらの変異体への言及を含むものと解釈されるべきである。ＣＯＤＨ２は、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（配列番号３）、Ｃ．ラグスダレイ（配列番号７）、Ｃ．リュングダリ（ＡＤＫ１４８５４．１）、Ｃ．スカトロゲネス（配列番号９）、Ｃ．アセトブチリカム（ＡＡＫ７８１０１．１及びＡＡＫ８０４５２．１）、Ｃ．カルボキシジボランス「Ｐ７」（ＺＰ＿０５３９０１６４．１）、Ｃ．ハイドロゲノフォルマンス（ＡＢＢ１４２２０．１、ＡＢＢ１４４３２．１、及びＡＢＢ１５０６６．１）、またはＣ．ベイジェリンキイ（ＹＰ＿００１３１０１１５．１）のＣＯＤＨ２であり得る。さらには、ＣＯＤＨ２相同体は、Ｃ．ボツリヌス（ＣＢＯ＿２２１８；Ａ５Ｉ３Ｙ９）中に見られ得るが、Ｃ．パーフリンジェンス、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．パストゥリアヌム、またはＣ．クルイベリ中では見られない。
【００３７】
二官能性「ＣＯＤＨ／ＡＣＳ」は、酢酸生成細菌に特有であり、ＣＯの可逆的酸化に加えて、ＣＯ、メチル基、及びＣｏＡからのアセチル−ＣｏＡ合成も触媒する。ＣＯＤＨ／ＡＣＳ酵素複合体は、ＣＯＤＨサブユニット（ＡｃｓＡ）、ＡＣＳサブユニット（ＡｃｓＢ）、コリノイド鉄‐硫黄タンパク質大サブユニット（ＡｃｓＣ）、コリノイド鉄−硫黄タンパク質小サブユニット（ＡｃｓＤ）、メチルトランスフェラーゼサブユニット（ＡｃｓＥ）、及びＣＯＤＨアクセサリータンパク質（ＣｏｏＣ）という、複数のサブユニットからなる。本発明者らは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳの活性レベルを増大させることが、増殖及び／または生成物形成を改善することを発見した。驚くべきことに、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ複合体の単一のＣＯＤＨサブユニットの過剰発現は、複合体の活性を増大させるのに十分である。
【００３８】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳのＡｃｓＢサブユニットは、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（ＣＡＥＴＨＧ＿１６０８遺伝子、ＷＰ＿０２３１６２３３９．１タンパク質）、Ｃ．リュングダリ（ＣＬＪＵ＿ｃ３７５５０遺伝子、ＷＰ＿０１３２４０３５９．１タンパク質）、Ｃ．ラグスダレイ（ＨＱ８７６０３２．１遺伝子、ＡＥＩ９０７６１．１タンパク質）、Ｃ．カルボキシジボランス（Ｃｃａｒ３２４５遺伝子、ＷＰ＿００７０６１８４１．１）、Ｃ．スカトロゲネス（ＷＰ＿０２９１６２９５３．１タンパク質）、Ｃ．ディフィシル（ＣＤ０７２８遺伝子、ＷＰ＿０２１３６９３０７．１タンパク質）、及びＡ．ウッディ（Ａｗｏ＿ｃ１０７６０遺伝子、ＷＰ＿０１４３５７６９１．１タンパク質）のＡｃｓＢであり得る。
【００３９】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳのＡｃｓＣサブユニットは、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（ＣＡＥＴＨＧ＿１６１０遺伝子、ＷＰ＿０２３１６２３４１．１タンパク質）、Ｃ．リュングダリ（ＣＬＪＵ＿ｃ３７５７０遺伝子、ＷＰ＿０１３２４０３６１．１タンパク質）、Ｃ．ラグスダレイ（ＨＱ８７６０３２．１遺伝子、ＡＥＩ９０７６３．１タンパク質）、Ｃ．カルボキシジボランス（Ｃｃａｒ３２４７遺伝子、ＷＰ＿００７０６１８４３．１タンパク質）、Ｃ．スカトロゲネス（ＷＰ＿０２９１６２９５５．１タンパク質）、Ｃ．ディフィシル（ＣＤ０７３０遺伝子、ＷＰ＿０２１３６９３０９．１タンパク質）、またはＡ．ウッディ（Ａｗｏ＿ｃ１０７２０遺伝子、ＷＰ＿０１４３５７６８７．１タンパク質）のＡｃｓＣであり得る。
【００４０】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳのＡｃｓＤサブユニットは、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（ＣＡＥＴＨＧ＿１６１１遺伝子、ＷＰ＿０２３１６２３４２．１タンパク質）、Ｃ．リュングダリ（ＣＬＪＵ＿ｃ３７５８０遺伝子、ＷＰ＿０１３２４０３６２．１タンパク質）、Ｃ．ラグスダレイ（ＨＱ８７６０３２．１遺伝子、ＡＥＩ９０７６４．１タンパク質）、Ｃ．カルボキシジボランス（Ｃｃａｒ３２４８遺伝子、ＷＰ＿００７０６１８４４．１タンパク質）、Ｃ．スカトロゲネス（ＷＰ＿０２９１６２９５６．１タンパク質）、Ｃ．ディフィシル（ＣＤ０７３１遺伝子、ＷＰ＿０２１３６９３１０．１タンパク質）、またはＡ．ウッディ（Ａｗｏ＿ｃ１０７１０遺伝子、ＷＰ＿０１４３５７６８６．１タンパク質）のＡｃｓＤであり得る。
【００４１】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳのＡｃｓＥサブユニットは、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（ＣＡＥＴＨＧ＿１６０９遺伝子、ＷＰ＿０２３１６２３４０．１タンパク質）、Ｃ．リュングダリ（ＣＬＪＵ＿ｃ３７５６０遺伝子、ＷＰ＿０１３２４０３６０．１タンパク質）、Ｃ．ラグスダレイ（ＨＱ８７６０３２．１遺伝子、ＡＥＩ９０７６２．１タンパク質）、Ｃ．カルボキシジボランス（Ｃｃａｒ３２４６遺伝子、ＷＰ＿００７０６１８４２．１タンパク質）、Ｃ．スカトロゲネス（ＷＰ＿０２９１６２９５４．１タンパク質）、Ｃ．ディフィシル（ＣＤ０７２９遺伝子、ＷＰ＿０２１３６９３０８．１タンパク質）、またはＡ．ウッディ（Ａｗｏ＿ｃ１０７３０遺伝子、ＷＰ＿０１４３５７６８８．１タンパク質）のＡｃｓＥであり得る。
【００４２】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳのＣｏｏＣアクセサリータンパク質は、例えば、Ｃ．オートエタノゲナム（ＣＡＥＴＨＧ＿１６１２遺伝子、ＷＰ＿０２３１６２３４３．１タンパク質）、Ｃ．リュングダリ（ＣＬＪＵ＿ｃ３７５９０遺伝子、ＷＰ＿０１３２４０３６３．１タンパク質）、Ｃ．ラグスダレイ（ＨＱ８７６０３２．１遺伝子、ＡＥＩ９０７６５．１タンパク質）、Ｃ．カルボキシジボランス（Ｃｃａｒ３２４９遺伝子、ＷＰ＿００７０６１８４５．１タンパク質）、Ｃ．スカトロゲネス（ＷＰ＿０２９１６２９５７．１タンパク質）、Ｃ．ディフィシル（ＣＤ０７３２遺伝子、ＷＰ＿０２１３６９３１１．１タンパク質）、またはＡ．ウッディ（Ａｗｏ＿ｃ１０７０９遺伝子、ＷＰ＿０１４３５７６８５．１タンパク質）のＣｏｏＣであり得る。
【００４３】
本発明に適用可能な例示的配列を特定するため、また当業者が不要な実験をすることなく本発明の特定の実施形態を実践できるように、ＣＯＤＨ１、ＣＯＤＨ２、及びＣＯＤＨ／ＡＣＳについての配列情報が提供される。ＣＯＤＨ１、ＣＯＤＨ２、及びＣＯＤＨ／ＡＣＳのための核酸及びアミノ酸配列は、微生物ごとに異なり得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、これら特定の配列及び実施形態に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、他の菌株及び種内の相同体を含む、本明細書内で言及される任意の特定のＣＯＤＨ１、ＣＯＤＨ２、またはＣＯＤＨ／ＡＣＳの機能的に同等の変異体にまで及ぶと解釈されるべきである。
【００４４】
用語「変異体」は、核酸及びタンパク質の配列が、従来技術において開示されるかまたは本明細書に例示される参照核酸及びタンパク質の配列などの、参照核酸及びタンパク質の配列から変化する、核酸及びタンパク質を含む。本発明は、参照核酸またはタンパク質と実質的に同じ機能を果たす変異体核酸またはタンパク質を使用して実施されてもよい。例えば、変異体タンパク質は、参照タンパク質と実質的に同じ機能を果たすか、または実質的に同じ反応を触媒してもよい。変異体遺伝子は、参照遺伝子と同じ、または実質的に同じタンパク質をコードしてもよい。変異体プロモーターは、参照プロモーターと実質的に同じ、１つ以上の遺伝子の発現を促進するための能力を有してもよい。
【００４５】
そのような核酸またはタンパク質は、本明細書において「機能的に同等の変異体」と称され得る。一例として、機能的に同等の核酸変異体は、対立遺伝子変異型、遺伝子のフラグメント、突然変異遺伝子、多型などを含み得る。他の微生物からの相同遺伝子もまた、機能的に同等の変異体の例である。これらは、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．ベイジェリンキイ、またはＣ．リュングダリなどの種内の相同遺伝子を含み、それらの詳細は、ＧｅｎｂａｎｋまたはＮＣＢＩなどのウェブサイト上で公開されている。機能的に同等の変異体はまた、配列が特定の微生物に対するコドン最適化の結果として変化する核酸を含む。核酸の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照核酸と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超える核酸配列同一性（相同性パーセント）を有する。タンパク質の機能的に同等の変異体は、好ましくは、参照タンパク質と少なくとも約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％、またはそれを超えるアミノ酸同一性（相同性パーセント）を有する。変異体核酸またはタンパク質の機能同等性は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して評価され得る。例えば、ＣＯＤＨ１、ＣＯＤＨ２、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、及びそれらの変異体の活性を分析するのに使用する酵素アッセイは、ＣＯＤＨの嫌気性浄化、続いて電子受容体としてメチルビオローゲンを使用して６０４ｎｍで吸収度の変化を分光光度計測することを含む（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２５８：２３６４−２３６９，１９８３）。
【００４６】
本発明の微生物は、ＣＯＤＨ１、ＣＯＤＨ２、及び／またはＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性が改変されている。「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応を触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。したがって、酵素活性を「増大させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増大させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を増大させることを含む。同様に、酵素活性を「減少させること」または「低減すること」は、酵素の活性を減少させること、酵素の量を減少させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を減少させることを含む。一実施形態において、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２の機能または活性は減少される。別の実施形態において、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２の機能または活性は、除去されるか、または実質的に除去される。別の実施形態において、ＣＯＤＨ／ＡＣＳの機能または活性は増大される。関連実施形態において、ＣＯＤＨ／ＡＣＳの１つ以上のサブユニットまたはアクセサリータンパク質の機能または活性、特にＣＯＤＨサブユニットの機能または活性が増大される。
【００４７】
１つのアプローチとして、酵素活性における変化は、タンパク質をコードする遺伝子を変異させることによって達成され得る。「変異した」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物において変性されている核酸またはタンパク質を指す。一実施形態において、変異は、酵素をコードする遺伝子中の欠失、挿入、または置換であってもよい。別の実施形態では、突然変異は、酵素中の１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、または置換であってもよい。
【００４８】
具体的には、「破壊変異」は、遺伝子または酵素の発現または活性を低減または除去する（即ち、「破壊する」）変異である。破壊変異は、遺伝子または酵素を、部分的に不活性にし得るか、完全に不活性にし得るか、または削除し得る。破壊変異は、ノックアウト（ＫＯ）変異であり得、それにより遺伝子またはタンパク質が無効力にされる。破壊変異は、酵素によって生成される生成物の生合成を低減する、防ぐ、または妨害する任意の変異であり得る。破壊変異は、例えば、酵素をコードする遺伝子における変異、酵素をコードする遺伝子の発現に関与する遺伝子調節エレメントにおける変異、酵素の活性を低減または阻害するタンパク質を生成する核酸の導入、または酵素の発現を阻害する核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ）もしくはタンパク質の導入を含み得る。本発明の微生物は、典型的には、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子内に少なくとも１つの破壊変異を含む。そのような変異は、親微生物と比較して、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子の発現を減少させ得るか、または除去し得る。
【００４９】
破壊変異は、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して導入され得る。具体的には、破壊変異は、外来ＤＮＡのコード配列内への標的挿入により遺伝子を永久に不活性化することによって導入され得る。ＣｌｏｓＴｒｏｎとして知られる遺伝ツールが、イントロン（１．８ｋｂ）を特定の遺伝子座にしっかりと挿入するために使用され得る。具体的には、ＣｌｏｓＴｒｏｎは、Ｌ．ラクチスからの可動グループＩＩイントロンＬｌ．ｌｔｒＢの特異性を利用して、ＲＮＡ媒介性のレトロホーミング機構を介して特定の部位内へ移入する（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，８０：４９−５５，２０１０）。別のアプローチは、相同組換えを用いることにより遺伝子の一部または全体を永久に削除するためのホモロジーアームを用いたプラスミドの伝達に関与する。例えば、「ＡＣＥ」または対立遺伝子結合交換と呼ばれる遺伝子法（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２）が、カウンタ選択マーカーの使用に頼ることなくこの削除を実施するために使用され得る。
【００５０】
いくつかの実施形態において、本発明の微生物は、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２の減少したまたは除去された活性と組み合わせて、ＣＯＤＨ／ＡＣＳの増大した活性を有する。具体的には、本微生物は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を過剰発現させ得る。本明細書において、「ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子」は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ酵素複合体の任意のサブユニットまたはアクセサリータンパク質をコードする任意の遺伝子を指す。好ましい実施形態において、本微生物は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ酵素複合体のＣＯＤＨサブユニットをコードする遺伝子を発現する。「過剰発現した」とは、本発明の微生物が由来する野生型または親微生物と比較して、本発明の微生物における核酸またはタンパク質の発現の増加を指す。過剰発現は、遺伝子コピー数、遺伝子転写速度、遺伝子翻訳速度、または酵素分解速度を修正すること含む、当該技術分野において既知の任意の方法によって達成され得る。
【００５１】
核酸は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用して、本発明の微生物に送達され得る。例えば、核酸は、ネイキッド核酸として送達され得るか、またはリポソームなどの１つ以上の薬剤を配合され得る。核酸は、適切であるように、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはそれらの組み合わせであり得る。制限阻害剤が特定の実施形態において使用され得る。追加ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、コスミド、及び人工染色体を含み得る。好ましい実施形態において、核酸は、プラスミドを使用して本発明の微生物に送達され得る。一例として、形質転換（形質導入またはトランスフェクションを含む）は、エレクトロポレーション、超音波処理、ポリエチレングリコール媒介性の形質転換、化学的または自然的能力、プロトプラスト形質転換、プロファージ誘発、または接合によって達成され得る。活性制限酵素系を有する特定の実施形態においては、核酸の微生物内への導入前に核酸をメチル化する必要があり得る。
【００５２】
さらには、核酸は、特定の核酸の発現を増大させるか、または別途制御するためにプロモーターなどの調節エレメントを含むように設計され得る。プロモーターは、構成型プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。理想的には、プロモーターは、ウッド・ユングダール経路プロモーター、フェレドキシンプロモーター、ピルビン酸：フェレドキシン酸化還元酵素プロモーター、Ｒｎｆ複合体オペロンプロモーター、ＡＴＰ合成酵素オペロンプロモーター、またはホスホトランスアセチラーゼ／酢酸キナーゼオペロンプロモーターである。
【００５３】
本発明の核酸は、特定の菌株または種、特に、Ｃ．オートエタノゲナム（Ｃ．オートエタノゲナムＬＺ１５６１を含む）、Ｃ．リュングダリ、またはＣ．ラグスダレイにおける発現のために最適化されるコドンであり得る。「コドン最適化」は、特定の菌株または種における核酸の最適化されたまたは改善された翻訳のための遺伝子などの核酸の変異を指す。コドン最適化は、より速い翻訳速度またはより高い翻訳正確性をもたらし得る。
【００５４】
増殖及び生成物
本発明の微生物は、それが由来される親微生物と比較して、改変された増殖及び／または代謝プロファイルを有する。例えば、本微生物は、親細菌と比較して、より多くの量のエタノールを生成し、より多くの量の２，３−ブタンジオールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する。
【００５５】
本発明の微生物は、改変された誘導期を有し得る。「誘導期」または「増殖誘導期」は、微生物の培養物または集団が、植え付け後に早期対数増殖期または対数／指数増殖期に達するまでにかかる時間を指す。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較してより短い誘導期を有する。例えば、本微生物は、親微生物の誘導期よりも約２０％、２５％、または３０％短い誘導期を有し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物の誘導期よりも約２５％〜３０％短い誘導期を有する。他の実施形態において、本微生物は、親微生物の誘導期よりも約３、５、または８倍短い誘導期を有し得る。一実施形態において、誘導期は、親微生物の誘導期よりも約７．８〜８日短い場合がある。別の実施形態において、誘導期は、約１〜４日以下、または約２．９日以下であり得る。いくつかの場合において、本微生物は、親微生物よりも劇的に短い誘導期を有し得る。例えば、本微生物は、親微生物の誘導期よりも約１０、５０、１００、または２００倍短い誘導期を有し得る。一実施形態において、誘導期は約０．１日以下であり得る。
【００５６】
本発明の微生物は、改変された増殖速度を有し得る。「増殖速度」または「増殖の速度」は、微生物の培養物または集団が時間と共に増加する速度を指す。増殖速度は、典型的には、単位ｈ−１を使用して本明細書内では表現される。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、増大したまたはより高い増殖速度を有する。例えば、本微生物は、親微生物の増殖速度よりも約２０％、４０％、６０％、８０％、または１００％高い増殖速度を有し得る。特定の実施形態において、本微生物は、親微生物の増殖速度よりも約２、３、４、または５倍高い増殖速度を有する。
【００５７】
本発明の微生物は、改変された量のバイオマスを生成し得る。「バイオマス」は、増殖または発酵プロセスから発生する微生物の合計集団を指す。一実施形態において、本微生物の発酵は、親微生物の発酵と比較して、増大したまたはより多い量のバイオマスを生成する。例えば、本微生物の発酵は、親微生物の発酵と比較して、約２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、または２２０％多くのバイオマスを生成し得る。一実施形態において、本微生物の発酵は、親微生物の発酵と比較して、約２００％〜２２０％多くのバイオマスを生成する。
【００５８】
本発明の微生物は、改変された量のエタノールを生成し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、増大したまたはより多い量のエタノールを生成する。例えば、本微生物は、親微生物と比較して、約１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、または１２０％多くのエタノールを生成し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、約２０％〜１１３％多くのエタノールを生成する。
【００５９】
本発明の微生物は、改変された量の２，３−ブタンジオールを生成し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、増大したまたはより多い量の２，３−ブタンジオールを生成する。例えば、本微生物は、親微生物と比較して、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２２０％、２４０％、２６０％、２７０％、２８０％、３００％、３２０％、または３４０％多くの２，３−ブタンジオールを生成し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、約２２０％〜２３０％多くの２，３−ブタンジオールを生成する。別の実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、少なくとも約３３０％多くの２，３−ブタンジオールを生成する。さらなる実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、約３００％〜３３０％多くの２，３−ブタンジオールを生成する。追加の実施形態において、本微生物は、約０．５〜２０ｇ／Ｌの２，３−ブタンジオールを生成する。
【００６０】
本発明の微生物は、改変された量のアセテートを生成し得る。「アセテート」という用語は、酢酸塩のみ、ならびに分子または遊離酢酸及び酢酸塩の混合物の両方を含む。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、減少したまたはより少ない量のアセテートを生成する。例えば、本微生物は、親微生物と比較して、約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％少ないアセテートを生成し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、約１８％〜３７％少ないアセテートを生成する。別の実施形態において、本微生物は、約０〜５ｇ／Ｌのアセテートを生成する。
【００６１】
本発明の微生物は、改変された量のラクテートを生成し得る。一実施形態において、本微生物は、親微生物と比較して、減少したまたはより少ない量のラクテートを生成する。
【００６２】
特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は、親微生物と比較して、増大した量のエタノール及び／または２，３−ブタンジオール、ならびに減少した量のアセテートを生成する。
【００６３】
本明細書に記載される微生物及び方法は、発酵プロセスの効率を増大させるために使用され得る。「効率を増大させること」、「増大した効率」などは、微生物増殖速度、生成物生成速度もしくは体積、消費される基質の体積当たりの生成物体積、または生成物選択性を増大させることを含むが、これらに限定されない。効率は、本発明の微生物が由来する親微生物の性能に対して測定され得る。
【００６４】
本発明の微生物はまた、１つ以上の追加の生成物を生成し得る。例えば、クロストリジウム・オートエタノゲナムは、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０及びＷＯ２０１２／０５３９０５）、ブチレート（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、ラクテート（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２及びＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）、ならびに１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）を生成するか、または生成するように操作され得る。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が生成物と見なされ得る。
【００６５】
本発明は、本発明の微生物を培養することによって、エタノール及び／または２，３−ブタンジオールなどの１つ以上の生成物を生成するための方法をさらに提供する。本発明はまた、本発明の微生物を使用して産業廃棄ガス中のＣＯ、ＣＯ２、及び／またはＨ２を有用な生成物に変換することにより、産業プロセスからの大気中の炭素排出を減少させるための方法を提供する。
【００６６】
基質
「基質」は、本発明の微生物のための炭素及び／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、及び／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質はまた、Ｈ２、Ｎ２、または電子など、他の非炭素構成成分をさらに含み得る。
【００６７】
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯなど、少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０〜７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼または溶鉱炉ガス）、約２０〜３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素溶鉱炉ガス）、または約１５〜４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１〜１０または１〜２０モル％のＣＯなど、比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部分を生成物に変換する。いくつかの実施形態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない。
【００６８】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない。Ｈ２リッチガス流は、例えば、炭化水素の水蒸気改質、特に天然ガスの水蒸気改質、石炭または炭化水素の部分酸化、水の電気分解、ならびに塩素を生成するために使用される電解セルから及び精錬または化学的な流れからの捕捉副産物を介して生成され得る。
【００６９】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない。ＣＯ２リッチガス流は、例えば、天然ガスまたは油燃焼などの炭化水素燃焼からの排出ガス、アンモニア、石灰、またはリン酸塩の生成からの副産物、及び天然二酸化炭素井戸を含む。
【００７０】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替の形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００７１】
基質及び／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副産物として得られる、または何らかの他の源からの排ガスであってもよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製プロセス、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、及びコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質及び／またはＣ１炭素源は、任意の従来の方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【００７２】
基質及び／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど、合成ガスであってもよい。別の実施形態において、合成ガスは、一般廃棄物または産業廃棄物のガス化から得てもよい。
【００７３】
基質の組成は、反応の効率及び／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などの任意の望ましくない不純物を除去すること、及び／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【００７４】
基質及び遺伝子修飾の効果
基質の組成は、本発明の微生物の増殖及び／または代謝プロファイルに影響を与え得る。例えば、ＣＯで増殖される微生物は、ＣＯ２＋Ｈ２で増殖される微生物とは異なる増殖及び／または代謝プロファイルを有し得る。加えて、遺伝子修飾の特定の組み合わせが、本発明の微生物の増殖及び／または代謝プロファイルに影響を与え得る。例えば、ＣＯＤＨ１遺伝子内に破壊変異を含む微生物は、ＣＯＤＨ２遺伝子内に破壊変異を含む微生物とは異なる増殖及び／または代謝プロファイルを有し得、それはＣＯＤＨ１遺伝子及びＣＯＤＨ２遺伝子の両方に破壊変異を含む微生物とは異なる増殖及び／または代謝プロファイルを有し得る。これらの微生物のうちのいずれかにおけるＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現は、微生物の増殖及び／または代謝プロファイルをさらに改変し得る。遺伝子修飾を戦略的に組み合わせ、かつ特定の基質上で微生物を増殖させることが、特定の用途または生成目標に合わせた増殖及び／または代謝プロファイルをもたらし得る。
【００７５】
ＣＯＤＨ１ノックアウト菌株をＣＯで増殖させることは、概して、減少したバイオマス生成、減少したアセテート生成、増大したエタノール生成、及び同様の２，３−ブタンジオール生成をもたらす。ＣＯＤＨ１ノックアウト菌株をＣＯ２＋Ｈ２で増殖させることは、概して、減少した誘導期及びより速い増殖をもたらす。例えば、ＣＯ２＋Ｈ２で増殖されるＣＯＤＨ１ノックアウト菌株は、誘導期を有しない場合があり、かつ約０．４ｇ／Ｌのバイオマスを生成し得る。
【００７６】
ＣＯＤＨ２ノックアウト菌株をＣＯで増殖させることは、概して、減少した誘導期、減少したエタノール生成、減少したアセテート生成、及び増大したか、または同様の２，３−ブタンジオール生成をもたらす。例えば、ＣＯで増殖されるＣＯＤＨ２ノックアウト菌株は、２〜４日の誘導期を有し得、かつ約０．１〜４ｇ／Ｌのアセテートを生成し得る。ＣＯＤＨ２ノックアウト菌株をＣＯ２＋Ｈ２で増殖させることは、概して、減少した誘導期及びより速い増殖をもたらす。例えば、ＣＯ２＋Ｈ２で増殖されるＣＯＤＨ２ノックアウト菌株は、４日の誘導期を有し得る。
【００７７】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現菌株をＣＯで増殖させることは、概して、減少した誘導期、増大したエタノール生成、同様のアセテート生成、及び増大したラクテート生成をもたらす。
【００７８】
発酵
典型的には、培養はバイオリアクタ中で実施される。用語「バイオリアクタ」は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器及び第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、用語「培養」及び「発酵」は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期及び生成物生合成期の両方を包含する。
【００７９】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、及び／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知である。
【００８０】
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成のために適切な条件下で実施されるべきである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、及び生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【００８１】
上昇した圧力でバイオリアクタを動作させることは、気相から液相へのガス物質移動の増加した速度を可能にする。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、及びその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ所望の保持時間を達成することがバイオリアクタの必要な体積をさらに示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、及びその結果として発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。
【００８２】
標的生成物は、例えば、分留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、及び、例えば、液−液抽出などの抽出発酵など、当該技術分野で既知の任意の方法またはその組み合わせを使用して、発酵ブロスから分離または精製され得る。特定の実施形態において、標的生成物は、ブロスの一部分をバイオリアクタから連続除去し、微生物細胞をブロスから分離し（濾過により簡便に）、かつ１つ以上の標的生成物をブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコール及び／またはアセトンは、例えば、蒸留によって回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、バイオリアクタに戻される。標的生成物が除去された後に残っている無細胞浸透水も、好ましくは、バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）が、無細胞浸透水に添加されて、それがバイオリアクタに戻される前に培地を補充し得る。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【００８４】
この実施例は、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１内の炭素固定に関与するＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２遺伝子のグループＩＩイントロンベースの挿入不活性化を説明する。
【００８５】
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１は、ＤＳＭＺ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより得た。大腸菌接合菌株ＣＡ４３４は、Ｎｉｇｅｌ  Ｍｉｎｔｏｎ教授（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）よりご提供いただいた。
【００８６】
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のゲノムは、一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）ＣＯＤＨ１（配列番号１及び２）ならびにＣＯＤＨ２（配列番号３及び４）をコードする。これらのＣＯＤＨを、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン媒介性遺伝子破壊ツール（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，８０：４９−５５，２０１０）を用いて不活性化した。ＣｌｏｓＴｒｏｎウェブサイト上に設けられたＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを使用して、ＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２遺伝子それぞれのセンス鎖上の６００／６０１系統間及び５２８／５２９系統間のグループＩＩイントロン標的部位を特定した。同じアルゴリズムを使用して、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．（ＣＡ）により市販用に合成され、かつｐＴＭＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクター（ＨＱ２６３４１０．１）内で送達される、ＣＯＤＨ１（配列番号１５）及びＣＯＤＨ２（配列番号１６）のためのイントロン標的領域を設計した。最終ベクター、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＣＯＤＨ１−６００！６０１ｓ及びｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＣＯＤＨ２−５２８！５２９ｓは、標的部位への挿入時に抗生物質クラリスロマイシンに対する抵抗性を付与するレトロトランスポゾン活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有した。
【００８７】
ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＣＯＤＨ１−６００！６０１ｓ及びｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＣＯＤＨ２−５２８！５２９ｓプラスミドを、上記及びＷＯ２０１２／０５３９０５に記載されるようにＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１内へ導入した。形質転換混合物を、ＹＴＦ寒天培地上にスポットし、嫌気性ワークステーション内で３７℃でインキュベートした。２４時間後、細胞を、５００μＬのＰＢＳ中に削り落として再懸濁し、７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコール（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＹＴＦ寒天培地上に広げた。７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを使用して形質転換体を選択した。インキュベーションの３日後、コロニーが観察された。
【００８８】
単一コロニーのストリークを、まずは７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコール及び１０μｇ／ｍＬのトリメトプリムが補充されたＹＴＦ培地、続いて６μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含有するＹＴＦ培地上に連続して作製した。フランキングオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ（Ｍａｘｉｍｅ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  ｋｉｔ）によるグループＩＩ挿入について、８つ未満のコロニーを無作為にスクリーニングした。
【表２】
0006454000.tif 000007
【００８９】
フランキングオリゴヌクレオチド及びゲル電気泳動解析を用いたクラリスロマイシン抵抗性コロニーの増幅は、より小さい野生型バンド（＜５２０ｂｐ）の代わりにより大きいＣｌｏｓＴｒｏｎバンド（＞２ｋｂ）を示し、それは、グループＩＩイントロンが指定したＣＯＤＨ部位（ＣＯＤＨ１：：ＣＴｅｒｍＢ−６０１ｓ及びＣＯＤＨ２：：ＣＴｅｒｍＢ−５２９ｓ）内への挿入に成功したことを示した。これらのアンプリコンを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）、及びサンガー配列決定（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）により確認された配列を使用して精製した。
【００９０】
最終確認ステップとして、ＰＣＲ検証されたクローンをサザンブロット解析に供し、単一のＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入を確認した。ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体のゲノムＤＮＡを、Ｂｅｒｔｒａｍ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：５５１−５５７，１９８９に従って単離し、次いで制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化物を、無作為標識したＤＩＧプローブ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてサザンブロット解析に供し、製造者の指示に従って実施した。テンプレートとしてプラスミドｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２を使用して、オリゴヌクレオチドＥＢＳ２（配列番号２７）及びＩｎｔｒｏｎ−ＳａｌＩ−Ｒ１（配列番号２８）を使用してプローブを生成した。結果として生じるプローブをグループＩＩイントロンにハイブリダイズした。サザンブロット解析は、変異体クローン当たり単一のバンドを検出し、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のゲノム内へのグループＩＩイントロン挿入の単一事象を示した。これらの確認された変異体を、ＣＯＤＨ１：：ＣＴｅｒｍＢ−６０１ｓ（または「ＣＯＤＨ１変異体」）及びＣＯＤＨ２：：ＣＴｅｒｍＢ−５２９ｓ（または「ＣＯＤＨ２変異体」）と呼んだ。
【実施例２】
【００９１】
この実施例は、ＣＯ条件下で培養されるＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ１の不活性化の効果を実証する。
【００９２】
ＣＯＤＨ１変異体が１００％ＣＯで独立栄養的に増殖する能力を、３０ｐｓｉのＣＯで加圧される５０ｍＬのＰＥＴＣ培地を含有する３連の２５０ｍＬ血清瓶内で試験した。０．５  ＯＤ６００当量の活性培養物を各血清瓶内に植え付け、６００ｎｍの波長でのＯＤ測定及びＨＰＬＣによる代謝物分析のために液相試料を採取した。
【００９３】
代謝物の分析は、３５℃で動作されるＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）及び６０℃に維持されるＡｌｌｔｅｃｈ  ＩＯＡ−２０００有機酸カラム（１５０×６．５ｍｍ、粒径５μｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００  Ｓｅｒｉｅｓ  ＨＰＬＣシステムを用いてＨＰＬＣによって実施した。弱酸性水を移動相として０．７ｍｌ／分の流量で使用した（０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）。タンパク質及び他の細胞残渣を除去するため、４００μｌの試料を１００μｌの２％（ｗ／ｖ）５−スルホサリチル酸と混合し、１４，０００×ｇで３分間遠心分離して沈殿した残渣を分離した。次いで、１０μｌの上澄みを、分析のためにＨＰＬＣ内に注入した。
【００９４】
図１Ａ〜１Ｄに示されるように、ＣＯＤＨ１変異体は、バイオマス（４２％少ない）及びアセテート形成を代償にして、改良されたエタノールの形態にある好ましい代謝物プロファイルを呈した。ＣＯＤＨ１変異体は、６４％多くのエタノール（図１Ｂ）、２５％少ないアセテート（図１Ｃ）、及びＷＴと同様の２，３−ブタンジオール（図１Ｄ）を生成した。
【００９５】
ＣＯＤＨ１変異体及びＷＴが、５１．２４％ＣＯ、３１．２２％Ｎ２、１１．９８％ＣＯ２、及び３．０５％Ｈ２を含む、Ｇｌｅｎｂｒｏｏｋ，Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄにある製鋼所からの製鋼ガス内で増殖されたときにも同様のパターンが観察された。本実験は、１００ｍＬのＰＥＴＣ培地を含有し、かつ製鋼ガスで３０ｐｓｉまで加圧される３連の２５０ｍＬ血清瓶内で実施された。ＣＯ（製鋼ガス中）での増殖に関して、ＣＯＤＨ１変異体は、ここでもバイオマス（１７％少ない）（図２Ａ）及びアセテート（１８％少ない）（図２Ｃ）を代償にして、ＷＴよりも１１３％多くのエタノール（図２Ｂ）を生成した。
【実施例３】
【００９６】
この実施例は、ＣＯ条件下で培養されるＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ２の不活性化の効果を実証する。
【００９７】
ＣＯＤＨ２変異体が１００％ＣＯ中で独立栄養的に増殖する能力を、上記のＣＯＤＨ１変異体と同じ条件下で試験した。ＷＴと比較して、ＣＯＤＨ２変異体は、基質として１００％ＣＯを利用しながら、１日の誘導期減少を示した（図１Ａ）。ＣＯＤＨ２変異体の早期指数期は、ＷＴの４．８日目での指数期と比較して、３．８日目で発生した（図１Ａ）。ＣＯＤＨ２変異体は、ＷＴよりも２７％少ないアセテート（図１Ｃ）及び２７％少ないエタノールを生成した（図１Ｂ）。しかしながら、ＣＯＤＨ２変異体のピーク２，３−ブタンジオール生成は、ＷＴよりも高かった（図１Ｄ）。
【実施例４】
【００９８】
この実施例は、Ｈ２＋ＣＯ２条件下で培養されるＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ１またはＣＯＤＨ２の不活性化の効果を実証する。
【００９９】
ＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２変異体が水素及び二酸化炭素中で増殖する能力を試験するため、ＷＴ及びＣＯＤＨ変異体を、３連の２５０ｍＬ血清瓶内の５０ｍＬのＰＥＴＣ培地（フルクトースなし）へ別個に植え付け、ヘッドスペースを２０ｐｓｉのＨ２＋１０ｐｓｉのＣＯ２と交換した。培養物を撹拌しながら３７℃で増殖させ、ＯＤ６００測定及びＨＰＬＣ分析のために試料を採取した。
【０１００】
Ｈ２＋ＣＯ２条件下で、ＣＯＤＨ１変異体は、ＷＴより大きく改善された増殖プロファイルを示した。ＷＴは、２２．７日目に０．１８４の最大ＯＤ６００に達する前に６日の誘導期を経たが、一方でＣＯＤＨ１変異体は、明白な誘導期なしに増殖することができ、かつ１．６日目に０．４０の最大ＯＤ６００に達した（図３Ａ）。ＣＯＤＨ２変異体は、ＷＴよりも短い誘導期及び早い増殖を示し、かつ０．２０のピークＯＤ６００に達した（図３Ａ）。ＨＰＬＣ分析は、非常に類似したレベルのアセテート及びエタノールが、Ｈ２＋ＣＯ２条件下で、ＣＯＤＨ１変異体、ＣＯＤＨ２変異体、及びＷＴによって生成されたことを示した（図３Ｂ〜５Ｃ）。
【実施例５】
【０１０１】
この実施例は、ＣＯ条件下で培養されるＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２の組み合わせた不活性化の予測効果を説明する。
【０１０２】
ＣＯ条件下におけるＣＯＤＨ１変異体の望ましい代謝物プロファイル、及びＣＯ及びＨ２＋ＣＯ２両方の条件下におけるＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２変異体の減少した誘導期を考えると、ＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２の組み合わせた不活性化は、独立栄養性条件下で優れた増殖及び代謝物プロファイルを有する菌株をもたらし得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、これら２つのＣＯＤＨの不活性化は、ＣＯ及び／またはＣＯ２のＣＯＤＨ／ＡＣＳとの反応における可用性を増大させ、アセチル−ＣｏＡのより効率的な形成をもたらし得る。
【０１０３】
例えば、対立遺伝子結合交換またはＡＣＥ（Ｈｅａｐ，Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，４０：ｅ５９，２０１２）が、ダブルＣＯＤＨ（即ち、ＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２）破壊を発生させるために使用され得る。この技術を使用して、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のｐｙｒＥ遺伝子（配列番号１９）は、遺伝子操作の後の段階でｐｙｒＥを陽性及び陰性選択マーカーとして使用することができるように削除され得る。ｐｙｒＥが削除された変異体は、ウラシル栄養要求性に栄養要求性であり、プロドラッグ５｀−フルオロオロチン酸に対して抵抗性である。次のステップとして、ＣＯＤＨのうちの１つを標的とするＣｌｏｓＴｒｏｎプラスミドが、ｐｙｒＥ削除変異体内へ導入され得、クラリスロマイシン抵抗性コロニーが、ＰＣＲ、配列決定、及びサザンブロットにより検証され得る。一方のＣＯＤＨのＣｌｏｓＴｒｏｎ不活性化がこのｐｙｒＥ削除変異体内で確認されると、陰性選択マーカーとしてｐｙｒＥを含有するＡＣＥ削除プラスミドが、他方のＣＯＤＨを削除するために導入され得る。最終ステップとして、ｐｙｒＥ遺伝子を有するＡＣＥプラスミドが、ｐｙｒＥの完全性を回復するために導入され得、機能するｐｙｒＥ遺伝子を有するＷＴバックグラウンド内に組み合わされたＣＯＤＨ１及びＣＯＤＨ２破壊変異体をもたらす。
【実施例６】
【０１０４】
この実施例は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現プラスミドの構築、及びＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１内への導入を実証する。
【０１０５】
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１は、ＤＳＭＺ、Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａsｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙより得た。大腸菌株ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ及びＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅよりそれぞれ購入した。
【０１０６】
共にＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１からの、ウッド・ユングダールプロモーター（ＰＷＬ）（配列番号１８）ならびに二官能性一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチル−ＣｏＡ合成（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）サブユニットＡｃｓＡ（配列番号１２）及びＡｃｓＢ（配列番号１４）のＤＮＡ配列は、ゲノム配列決定から得た。Ｃ．オートエタノゲナムのウッド・ユングダールクラスターは、独立栄養性条件下で高発現されることが分かっていたため（Ｋoｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）、ＰＷＬをＣＯＤＨ／ＡＣＳの発現のために使用した。
【０１０７】
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１からのゲノムＤＮＡを、Ｂｅｒｔｒａｍ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：５５１−５５７，１９８９による修正された方法を使用して単離した。１００ｍｌの一晩培養物を採取し（６，０００×ｇ、１５分、４℃）、リン酸カリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ７．５）で洗浄し、１．９ｍｌのＳＴＥ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２００ｍＭのスクロース、ｐＨ８．０）中に懸濁させた。３００μｌのリゾチーム（約１００，０００Ｕ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、続いて２８０μｌの１０％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ溶液の添加、及び１０分間のさらなるインキュベーションを行った。ＲＮＡは、２４０μｌのＥＤＴＡ溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８）、２０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（１Ｍ、ｐＨ７．５）、及び１０μｌのＲＮａｓｅ  Ａ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）の添加により室温で消化された。次いで、１００μｌのプロテイナーゼＫ（０．５Ｕ）を添加すると、タンパク質分解が３７℃で１〜３時間発生した。最後に、６００μｌの過塩素酸ナトリウム（５Ｍ）を添加し、続いてフェノール・クロロホルム抽出及びイソプロパノール沈殿を行った。ＤＮＡの量及び質を分光光度的に検査した。
【０１０８】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子及びＰＷＬを、ＰｈｕｓｉｏｎハイフィデリティーＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ＰＣＲにより増幅した。増幅された５７３ｂｐ  ＰＷＬを、ＮｏｔＩ及びＮｄｅＩ制限部位ならびに菌株ＤＨ５α−Ｔ１Ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、大腸菌−クロストリジウムシャトルベクターｐＭＴＬ８３１５１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＪ７９７６４７、Ｎｉｇｅｌ  Ｍｉｎｔｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，７８：７９−８５，２００９）内へクローン化し、プラスミドｐＭＴＬ８３１５７をもたらした。ＣＯＤＨ／ＡＣＳのコード配列は１つの内部ＮｄｅＩ部位を含有するため、スプライスオーバーラップ（ＳＯＥ）ＰＣＲ（Ｗａｒｒｅｎｓ，Ｇｅｎｅ，１８６：２９−３５，１９９７）を使用して、コドンの改変なしにこのＮｄｅＩ部位を除去した。ＣＯＤＨ／ＡＣＳの１９４６ｂｐ  ＰＣＲ生成物及びプラスミドｐＭＴＬ８３１５７の両方が、ＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化され、かつライゲートされてプラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ（図４）（配列番号２０）を生成した。
【０１０９】
発現プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳの挿入は、オリゴヌクレオチドＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＮｄｅＩ−Ｆ（配列番号３１）及びＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＳａｃＩ−Ｒ（配列番号３２）を使用して、完全に配列決定された。プライマープライマーＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＮｄｅＩ−Ｆ及びＣＯＤＨ／ＡＣＳ−ＳａｃＩ−Ｒを使用したサンガー配列決定は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳの内部ＮｄｅＩ部位が、無事に改変され、かつ変異を有しないことを確認した。
【表３】
0006454000.tif 000008
【０１１０】
プラスミドｐＭＴＬ８３１５７及びｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳを、ドナーであるドナー大腸菌株ＣＡ４３４と接合することにより、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１内へ導入した。ドナー株を、２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンが補充されたＬＢ培地内で増殖させた。遠心分離により１．５ｍＬの培養物から細胞を採取し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄した。嫌気性ワークステーション内で、ドナー細胞ペレットを、２００μＬの指数関数的増殖受容菌Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中に再懸濁させた。接合混合物を、ＹＴＦ寒天培地上にスポットし、嫌気性ワークステーション内で３７℃インキュベートした。２４時間後、細胞を、５００μＬのＰＢＳ中に削り落として再懸濁し、７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコール（Ｓｉｇｍａ）及び１０μｇ／ｍＬのトリメトプリム（Ｓｉｇｍａ）が補充されたＹＴＦ寒天培地上に広げた。Ｃ．オートエタノゲナム接合完了体を、７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを使用して選択し、大腸菌ＣＡ４３４株を、１０μｇ／ｍＬのトリメトプリムを使用して対抗選択した。インキュベーションの３日後にコロニーを観察し、それらを精製のために同じ選択的寒天培地上に再ストリークした。
【０１１１】
同様に、プラスミドが、同様のプロトコルを使用して、Ｃ．リュングダリまたはＣ．ラグスダレイなどの他のカルボキシド栄養性アセトゲン内へ導入され得る。
【０１１２】
接合完了体の同一性をチェックするため、１６ｓ  ｒＲＮＡは、オリゴヌクレオチドＵｎｉｖ−００２７−Ｆ（配列番号２５）及びＵｎｉｖ−１４９２−Ｒ（配列番号２６）を使用して、増幅され、かつサンガー配列決定された。プラスミド制限消化分析を実行する前に、プラスミドＤＮＡをＣ．オートエタノゲナム接合完了体から抽出し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へ形質転換した。これは、クロストリジウムから単離されるプラスミドが制限消化分析のために十分な質でないため、「プラスミドレスキュー」と一般に称される。ｐＭＴＬ８３１５７接合完了体からレスキューされるＰｍｅＩ及びＦｓｅＩ制限消化プラスミドのゲル電気泳動は、予測フラグメント（２６００ｂｐ及び２４２４ｂｐ）の存在を示した。ｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ接合完了体からレスキューされるＮｄｅＩ及びＳａｃＩ制限消化プラスミドのゲル電気泳動は、予測フラグメント（４９９５ｂｐ及び１９３２ｂｐ）の存在を示した。
【実施例７】
【０１１３】
この実施例は、ＣＯ条件下で培養されるＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ／ＡＣＳの過剰発現の効果を実証する。
【０１１４】
プラスミド制御（ｐＭＴＬ８３１５７）に対するＣＯＤＨ／ＡＣＳの過剰発現の効果を、単一炭素及びエネルギー源としてＣＯを用いたバッチ増殖実験において比較した。１００％ＣＯ下で、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現菌株は、プラスミド制御と同様の量のアセテートを生成しつつ、増殖の誘導期において４．２日の減少を示し、２１％多くのエタノールを生成し、２．７倍高いラクテート力価を生成した（図５Ａ〜５Ｅ）。
【０１１５】
両方の菌株を、１００％ＣＯ中で独立栄養的に増殖させ、５０ｍＬのＰＥＴＣ培地を含有し、かつ３０ｐｓｉのＣＯで加圧される３連の２５０ｍＬ血清瓶内で試験した。チアンフェニコールを最終濃度７．５μｇ／ｍＬまで補充した。０．５のＯＤ６００に値する活性培養物を各血清瓶内に植え付け、６００ｎｍの波長でのＯＤ測定及びＨＰＬＣによる代謝物分析のために液相試料を採取した。
【０１１６】
代謝物の分析は、３５℃で動作されるＲＩＤ（Ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）及び３５℃に維持されるＢｉｏｒａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（１３００×７．８ｍｍ、粒径９μｍ）を備えたＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒ  ＨＰＬＣシステムを用いて実施した。弱酸性水を移動相として０．５ｍｌ／分の流量で使用した（０．００５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）。タンパク質及び他の細胞残渣を除去するため、試料を１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みをＳｐａｒｔａｎ１３／０．２ＲＣフィルタで濾過した。次いで、２０μｌの上澄みを、分析のためにＨＰＬＣ内に注入した。
【実施例８】
【０１１７】
この実施例は、ＣＯ条件下で培養されるＣ．リュングダリ中のＣＯＤＨ／ＡＣＳの過剰発現の予測効果を説明する。
【０１１８】
上記のＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現プラスミドもＣ．リュングダリ内に導入され得る。Ｃ．リュングダリは、１００％ＣＯで増殖され得る。これらの条件下で、Ｃ．リュングダリを過剰発現させるＣＯＤＨ／ＡＣＳは、エタノール及びラクテート生成を少なくとも２０％増大させながら、減少した増殖誘導期を示すはずである。
【実施例９】
【０１１９】
この実施例は、ＣＯ２＋Ｈ２条件下で培養されるＣ．オートエタノゲナム中のＣＯＤＨ／ＡＣＳの過剰発現の予測効果を説明する。
【０１２０】
Ｃ．オートエタノゲナムのＣＯＤＨ／ＡＣＳ過剰発現菌株及びプラスミド制御菌株は、炭素及びエネルギーの単一供給源として８０％ＣＯ２及び２０％Ｈ２を有するＰＥＴＣ−ＭＥＳ培地上で増殖され得る。これらの条件下で、Ｃ．オートエタノゲナムを過剰発現させるＣＯＤＨ／ＡＣＳは、減少した増殖誘導期、及び少なくとも２０％増大させたエタノール及びラクテート生成を示すはずである。
【実施例１０】
【０１２１】
この実施例は、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ／ＡＣＳの不活性化を実証する。
【０１２２】
Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１の上流ＣＯＤＨ／ＡＣＳ（ＣＡＥＴＨＧ＿１６２１）を、ＣｌｏｓＴｒｏｎグループＩＩイントロン媒介性遺伝子破壊ツール（Ｈｅａｐ，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈ，８０：４９−５５，２０１０）を用いて不活性化した。ＣｌｏｓＴｒｏｎウェブサイトに設けられたＰｅｒｕｔｋａアルゴリズムを使用して、ＣＡＥＴＨＧ＿１６２１のセンス鎖上の１４２／１４３系統間のグループＩＩイントロン標的部位を特定した。同じアルゴリズムを使用して、ＤＮＡ２．０  Ｉｎｃ．（ＣＡ）により市販用に合成され、かつｐＴＭＬ００７Ｃ−Ｅ２ベクター（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＨＱ２６３４１０．１）内で送達される、イントロン標的領域（配列番号１７）を設計した。最終ベクター、ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ−１４２！１４３ｓは、標的部位への挿入時に抗生物質クラリスロマイシンに対する抵抗性を付与するレトロトランスポゾン活性化ｅｒｍＢマーカー（ＲＡＭ）を含有した。
【０１２３】
ｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２−ＣＯＤＨ／ＡＣＳ−１４２！１４３ｓプラスミドを、上記のようにＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１内へ接合した。Ｃ．オートエタノゲナム接合完了体を、７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコールを使用して選択し、大腸菌ＣＡ４３４株を、１０μｇ／ｍＬのトリメトプリムを使用して対抗選択した。インキュベーションの３日後、コロニーが観察された。単一コロニーのストリークを、まずは７．５μｇ／ｍＬのチアンフェニコール及び１０μｇ／ｍＬのトリメトプリムが補充されたＹＴＦ培地、続いて６μｇ／ｍＬのクラリスロマイシンを含有するＹＴＦ培地上に連続して作製した。フランキングオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＣＲ（Ｍａｘｉｍｅ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ  ｋｉｔ）によるグループＩＩ挿入について、８つ未満のコロニーを無作為にスクリーニングした。
【表４】
0006454000.tif 000009
【０１２４】
フランキングオリゴヌクレオチド及びゲル電気泳動解析を用いたクラリスロマイシン抵抗性コロニーの増幅は、より小さい野生型バンド（＜５２０ｂｐ）の代わりにより大きいＣｌｏｓＴｒｏｎバンド（＞２ｋｂ）を示し、それは、グループＩＩイントロンが指定したＣＯＤＨ／ＡＣＳ部位内への挿入に成功したことを示した。これらのアンプリコンを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）、及びサンガー配列決定（Ｓｏｕｒｃｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）により確認された配列を使用して精製した。
【０１２５】
最終確認ステップとして、ＰＣＲ検証されたクローンをサザンブロット解析に供し、単一のＣｌｏｓＴｒｏｎ挿入を確認した。ＣｌｏｓＴｒｏｎ変異体のゲノムＤＮＡを、Ｂｅｒｔｒａｍ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１５１：５５１−５５７，１９８９に従って単離し、次いで制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。消化物を、無作為標識したＤＩＧプローブ（Ｒｏｃｈｅ）を用いてサザンブロット解析に供した。テンプレートとしてプラスミドｐＭＴＬ００７Ｃ−Ｅ２を使用して、オリゴヌクレオチドＥＢＳ２（配列番号２７）及びＩｎｔｒｏｎ−ＳａｌＩ−Ｒ１（配列番号２８）を使用してプローブを生成した。結果として生じるプローブをグループＩＩイントロンにハイブリダイズした。サザンブロット解析は、変異体クローン当たり単一のバンドを検出し、Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１のゲノム内へのグループＩＩイントロン挿入の単一事象を示した。確認された変異体を、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ：：ＣＴｅｒｍＢ−１４３ｓ（または「ＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体」）と呼んだ。相補性アッセイのため、過剰発現プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳをＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体内へ接合した。
【０１２６】
したがって、ＣＯＤＨ／ＡＣＳが、Ｃ．オートエタノゲナムの独立栄養性増殖（ＣＯまたはＨ２＋ＣＯ２）のために必要とされる。
【実施例１１】
【０１２７】
この実施例は、フルクトースで増殖されるＣ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１中のＣＯＤＨ／ＡＣＳの不活性化の効果を実証する。
【０１２８】
Ｃ．オートエタノゲナムは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ酵素の不活性化後、ＣＯ（図６Ａ）またはＣＯ２及びＨ２（図６Ｂ）で増殖することができないが、この菌株は、依然として、フルクトースなどの糖で増殖することができる。驚くべきことに、これらの条件下で、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化菌株は、アセテートの生成を止めることが分かった。これは、アセテート形成が典型的には、アセトゲンの特徴的な機能であることから、特に驚きである。従属栄養性増殖中、アセトゲンは典型的には、Ｈ２の存在下で、ＣＯ２（糖代謝中に生成される）を、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ、及び還元的アセチル−ＣｏＡ経路としても知られるウッド・ユングダール経路からの他の遺伝子の働きにより、バイオマス及び生成物内へ固定する。
【０１２９】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化変異体、相補株、及びＷＴ  Ｃ．オートエタノゲナムＤＳＭ１００６１を、Ｎ２大気下で、１０ｇ／Ｌのフルクトース（最終濃度）が補充された５０ｍＬのＰＥＴＣ培地を含有する三連の２５０ｍＬ血清瓶内で増殖させた。０．５  ＯＤ６００当量の活性培養物を各血清瓶内に植え付け、６００ｎｍの波長でのＯＤ測定及びＨＰＬＣによる代謝物分析のために液相試料を採取した。
【０１３０】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳの不活性化は、ピークＯＤ６００を、４．５３のＷＴレベルから１．７７まで、６１％、著しく減少させた（図７Ａ）。これは、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体における増殖誘導期の増大も伴った（図７Ａ）。ＫＯ変異体中のｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳのプラスミド発現によるＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性の相補性は、ピークＯＤ６００を３．１１まで増大させ、さらに増殖誘導期をＷＴレベル近くまで短くした（図７Ａ）。
【０１３１】
ＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体の１つの顕著な特色は、２．８日目にわずか２．６１ｍＭのアセテートが瞬間的に観測されたように（図７Ｂ）、アセテート生成がないことである。反対に、ＷＴは、３．０日目に最大８５．９６ｍＭのアセテートを生成した（図７Ｂ）。
【０１３２】
著しいアセテート生成を伴わずに、フルクトースからの炭素の大部分は、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体中の還元生成物エタノール及び２，３−ブタンジオールへと転換された。ＣＯＤＨ／ＡＣＳの不活性化は、ピークエタノールレベルを、４８．３ｍＭのＷＴレベルから１０２．７ｍＭまで、１１３％増大させた（図７Ｃ）。さらには、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体のピーク２，３−ブタンジオールレベルはまた、ＷＴよりも１３８％高かった（１０．９５ｍＭ対４．６１ｍＭ）（図７Ｄ）。ＣＯＤＨ／ＡＣＳ  ＫＯ変異体中の相補性プラスミドｐＭＴＬ８３１５７−ＣＯＤＨ／ＡＣＳの発現は、アセテート、エタノール、及び２，３−ブタンジオールレベルをＷＴレベル近くまで回復させることに成功し（図７Ｂ〜７Ｄ）、従属栄養性増殖中のＣ．オートエタノゲナム中のＣＯＤＨ／ＡＣＳの役割を確証した。
【０１３３】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ不活性化が、ウッド・ユングダール経路が解糖中に生成される還元当量のためのシンクとして機能することを防ぐために、過度の還元当量がエタノール及び２，３−ブタンジオール生成のための駆動力を発生させるようである（図８）。
【０１３４】
配列の説明
本明細書内で参照される核酸及びアミノ酸配列を、以下に簡単にまとめる。
【表５】
0006454000.tif 000010
0006454000.tif 000011
【０１３５】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の従来技術への言及は、その従来技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０１３６】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと」、「有すること」、「含むこと」、及び「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（即ち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる用語も、本発明の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すものと解釈するべきではない。
【０１３７】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物及び均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
親細菌と比較して、ＣＯＤＨ１及び／またはＣＯＤＨ２活性が減少したまたは除去された遺伝子操作されたカルボキシド栄養性酢酸生成細菌。
［２］
前記細菌が、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子内に少なくとも１つの破壊変異を含む、上記［１］に記載の細菌。
［３］
前記破壊変異が、親細菌と比較して、前記ＣＯＤＨ１遺伝子及び／または前記ＣＯＤＨ２遺伝子の発現を減少させるか、または除去する、上記［２］に記載の細菌。
［４］
前記破壊変異がノックアウト変異である、上記［２］に記載の細菌。
［５］
前記細菌が、前記親細菌と比較して、増大したＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性をさらに有する、上記［１］に記載の細菌。
［６］
前記細菌が、前記親細菌と比較して、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を過剰発現させる、上記［５］に記載の細菌。
［７］
前記細菌が、エタノール及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上を生成する、上記［１］に記載の細菌。
［８］
前記細菌が、前記親細菌と比較して、より多くの量のエタノールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する、上記［１］に記載の細菌。
［９］
前記細菌が、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質を消費する、上記［１］に記載の細菌。
［１０］
前記親細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである、上記［１］に記載の細菌。
［１１］
生成物を生成する方法であって、上記［１］に記載の細菌を、ＣＯ、ＣＯ２、及びＨ２のうちの１つ以上を含むガス状基質の存在下で培養し、それにより前記細菌が生成物を生成すること、を含む、方法。
［１２］
前記細菌が、ＣＯＤＨ１遺伝子及び／またはＣＯＤＨ２遺伝子内に少なくとも１つの破壊変異を含む、上記［１１］に記載の方法。
［１３］
前記破壊変異が、親細菌と比較して、前記ＣＯＤＨ１遺伝子及び／または前記ＣＯＤＨ２遺伝子の発現を減少させたか、または除去する、上記［１２］に記載の方法。
［１４］
前記破壊変異がノックアウト変異である、上記［１２］に記載の方法。
［１５］
前記細菌が、前記親細菌と比較して、増大したＣＯＤＨ／ＡＣＳ活性をさらに有する、上記［１１］に記載の方法。
［１６］
前記細菌が、前記親細菌と比較して、ＣＯＤＨ／ＡＣＳ遺伝子を過剰発現させる、上記［１５］に記載の方法。
［１７］
前記生成物が、エタノール及び２，３−ブタンジオールのうちの１つ以上を含む、上記［１１］に記載の方法。
［１８］
前記細菌が、前記親細菌と比較して、より多くの量のエタノールを生成し、より少ない量のアセテートを生成し、より短い誘導期を有し、及び／またはより高い増殖速度を有する、上記［１１］に記載の方法。
［１９］
前記親細菌が、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・リュングダリ、またはクロストリジウム・ラグスダレイである、上記［１１］に記載の方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【配列表】
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