(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞を含む選択された腎細胞の単離集団の調製方法であって、以下のステップ：
哺乳類の分化した腎細胞の単離集団をインビトロで培養するステップと、ここで、前記集団が傍尿細管間質細胞および他の複数の種類の腎細胞を含み、
前記分化した腎細胞を２〜９回インビトロで継代するステップと、ここで、前記継代後に前記細胞がＥＰＯを産生し、
ＥＰＯを産生する細胞を選択するステップと、ここで、前記選択が、密度およびサイズに基づく選択を含み、
を含み、これにより、ＥＰＯ産生細胞を含む選択された腎細胞の単離集団が調製される、方法。
【請求項２】
前記哺乳類の分化した腎細胞の単離集団が、腎臓の内皮細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記選択が遠心勾配の使用を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖させるステップが、インスリン・トランスフェリン・セレン（ＩＴＳ）を含む培地中における分化した腎細胞の増殖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記インビトロで継代するステップが２〜５回行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記インビトロで継代するステップが少なくとも３回行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
請求項１の方法により調製された腎細胞の単離集団を、製薬上許容可能な担体中に提供するステップを含む、腎疾患の治療のための医薬組成物の調製方法。
【請求項９】
前記腎疾患の治療のための医薬組成物が、患者に注射または移植するのに適したものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記腎疾患の治療のための医薬組成物が、患者の腎臓または肝臓の中に注射するのに適したものである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記腎疾患の治療のための医薬組成物が、血管内に注射または注入するのに適したものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腎疾患の治療のための医薬組成物が、前記患者の門脈に注入するのに適したものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記製薬上許容可能な担体が、患者の腎臓の中に移植するのに適した生分解性スキャフォールドを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞が、前記患者に対して同系である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記製薬上許容可能な担体がゲルである、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記ゲルが、寒天ゲル、コラーゲンゲル、フィブリンゲルおよびヒドロゲルからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、２００７年６月８日出願の米国特許
仮出願第６０／９４２，７１６号の利益を主張する。その開示内容は参照によりその全文
が本明細書の記載の一部をなすものとする。
【０００２】
［発明の分野］
本発明は、臓器機能の回復のための選択的細胞治療の分野のものである。
【背景技術】
【０００３】
慢性腎不全は、腎機能の緩やかな低下が特徴であり、最終的には末期腎不全へと進行す
る可能性があり、そうなると腎臓はもはや体を維持するレベルで機能できない。末期腎不
全は、罹患者の複数の器官を巻き込む大変厳しい疾病である。米国における末期腎疾患の
最も一般的な原因は、糖尿病である。
【０００４】
腎臓によって働く機能の一つは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）の産生である。腎臓が正
しく機能する場合、腎間質の組織への酸素供給の低下が間質細胞を刺激してＥＰＯを産生
する。分泌されたＥＰＯは次に骨髄において赤血球の産生を刺激し、それにより組織酸素
分圧を正常レベルに回復させる。無効な造血に起因する貧血は、ＥＰＯを産生する腎臓の
能力の低下に起因する、慢性腎不全の避けられない結果の一つである。ＥＰＯはまた、酸
化ストレスおよびアポトーシスから身体を保護することも報告されている。
【０００５】
腎臓は身体内でＥＰＯの主な産生器官であり、それ故に腎不全に誘導される貧血の治療
の一次標的である。透析は多くの末期腎疾患患者の生存を延長させることができるが、現
在は腎移植だけが正常な機能を回復させることができる。しかし、腎移植は、決定的なド
ナー不足により非常に限られている。
【０００６】
長年にわたって腎不全に関連する貧血を軽減するために用いられる治療には、赤血球の
反復輸血ならびにテストステロンおよびその他のタンパク質同化ステロイドの投与が含ま
れる。しかし、これらの療法のどれもがこれまで完全に満足のいくものであったことはな
い。反復輸血を受ける患者は鉄過剰に陥りやすく、主要組織適合性抗原に対する抗体を発
生させることがある。テストステロンは、骨髄における赤血球生成（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏ
ｅｉｓｉｓ）に最小限の効果を有し、かつ、望ましくない男性化副作用に関係する。
【０００７】
腎不全に関連する貧血を緩和しようとするこれまでの努力には、精製された組換え型Ｅ
ＰＯの投与が含まれている（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６
，７４７，００２号、Ｗｅｓｔｅｎｆｅｌｄｅｒに対する同第６，７８４，１５４号を参
照されたい）。しかし、組換え型ＥＰＯの投与は血液中のＥＰＯレベルを一時的に上昇さ
せるだけであって、鉄欠乏症を導き得る。遺伝子治療アプローチも追求され、トランスフ
ェクトされた宿主細胞を用いてＥＰＯが産生された（例えば、Ｓｅｌｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ
．に対する米国特許第５，９９４，１２７号、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対す
る同第５，９５２，２２６号、Ｃａｒｃａｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．に対する同第６，７７７
，２０５号；Ｒｉｎｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ  ６２：１３９５−１４０１を参照されたい）。しかし、これらのアプロー
チは、非腎細胞のトランスフェクションを伴い、抗原認識および移植時の免疫拒絶を防ぐ
ための細胞のカプセル封入（ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ）などの技法を必要
とする。また、外因性ＤＮＡを用いるトランスフェクションは不安定である可能性があり
、細胞は時間とともにＥＰＯを発現する能力を失い得る。
【０００８】
腎細胞を用いた腎組織の置換アプローチは、十分な量の腎細胞を同定および拡張する必
要があるために限られている。その上、腎組織の操作を目的として腎細胞を培養すること
は、腎臓の独特の構造および細胞の不均一性により特に困難である。腎臓は、複数の機能
を有する複雑な器官であり、その機能には老廃物の排泄、身体のホメオスタシス、電解質
バランス、溶質輸送、ならびにホルモン産生が含まれる。
【０００９】
腎細胞の不全により十分量のエリスロポエチンを産生できないことに起因する貧血を軽
減するための代替治療選択肢に対する必要性は多く残っている。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書中の本発明の実施形態において、インビトロで継代し、かつ／または増殖させ
た腎臓の分化細胞から収集した、単離された腎細胞集団が提供される。一部の実施形態で
は、腎細胞には、傍尿細管（ｐｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ）間質細胞および／または内皮細胞
が含まれる。一部の実施形態では、腎細胞は、腎組織から収集し、インビトロで継代した
傍尿細管間質細胞および／または内皮細胞からなるか、または本質的になる。一部の実施
形態では、細胞は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する。さらなる実施形態では、腎
細胞は、ＥＰＯ産生について選択される。
【００１１】
また、単離されたＥＰＯ産生細胞集団を産生する方法も提供され、それには以下のステ
ップ：１）分化した腎細胞を収集するステップと；２）分化した腎細胞を継代するステッ
プと、この際、細胞は前記継代の後にＥＰＯを産生する；が含まれ、それにより単離され
たＥＰＯ産生細胞集団が産生される。一部の実施形態では、この方法には、分化した腎細
胞をＥＰＯ産生について選択するステップがさらに含まれる。一部の実施形態では、継代
ステップには、インスリン・トランスフェリン・セレン（ＩＴＳ）を含む培地中での分化
した腎細胞の増殖が含まれる。
【００１２】
ＥＰＯ産生の低下をもたらす腎疾患またはその他の病気を、治療を必要とする被験体（
例えば、患者）において治療する方法も提供され、それには次のステップ：１）単離され
たＥＰＯ産生細胞集団を準備するステップと、２）前記集団を被験体に（例えば、腎疾患
および／またはＥＰＯ産生の低下を治療するために効果的な量で）投与するステップとが
含まれ、それにより前記ＥＰＯ産生細胞はインビボでＥＰＯを産生する。一部の実施形態
では、準備するステップは、腎臓の分化した腎細胞を収集するステップと、細胞をインビ
トロで継代するステップとにより行われる。一部の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞集団は
、腎臓の分化細胞から収集され、インビトロで継代された、分化した傍尿細管内皮細胞お
よび／または間質細胞を含むか、それらからなるか、あるいはそれらから本質的になる。
一部の実施形態では、前記集団は、投与に適した担体（例えば、コラーゲンゲル）中に提
供される。一部の実施形態では、この投与ステップは、細胞集団を患者の腎臓の中に移植
することにより実行される。一部の実施形態では、この投与ステップは、前記組成物を皮
下に注射または移植することにより実行される。一部の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞は
ヒトである。
【００１３】
ヒト腎組織より収集され、インビトロで継代された、分化したヒト腎細胞を含む、単離
された細胞集団がさらに提供される。一部の実施形態では、腎細胞は、腎組織から収集し
、インビトロで継代した傍尿細管間質細胞および／または内皮細胞からなるか、または本
質的になる。一部の実施形態では、分化したヒト腎細胞は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）
を産生する。一部の実施形態では、ヒト腎細胞は、１〜２０回継代されている。一部の実
施形態では、ヒト腎細胞は、少なくとも３回継代されている。一部の実施形態では、この
集団は、ＥＰＯ産生のために選択されている。一部の実施形態では、細胞は、ポリペプチ
ドをコードする外因性ＤＮＡをトランスフェクトされていない。
【００１４】
本明細書に記載されるヒト腎細胞集団および製薬上許容可能な担体を含む組成物も提供
される。一部の実施形態では、前記担体はコラーゲンを含む。
【００１５】
本発明のもう一つの態様は、本明細書に記載される治療において使用するための、また
は治療方法を実行するための（例えば、腎疾患、またはＥＰＯ産生の低下をもたらすその
他の病気を治療するための）組成物または薬物の調製のための、あるいは本明細書に記載
される物品の製造を行うための、本明細書に記載される方法の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生の機構を示す図である。腎臓の腎間質性傍尿細管細胞が血中酸素レベルの低下を検知し、ＥＰＯが血液中に分泌される。ＥＰＯは、赤血球前駆細胞の網状赤血球への増殖および分化を刺激し、アポトーシスを阻止することにより、より多くの網状赤血球を循環血液に入らせる。網状赤血球は赤血球へと分化し、赤血球系のサイズを増大させる。組織への酸素送達はこのようにして増大する。
【図２】細胞内エリスロポエチンの免疫反応性を示す図である。細胞内エリスロポエチンの免疫活性を、継代１（Ｐ１）、継代２（Ｐ２）および継代３（Ｐ３）での腎細胞の初代培養中で、陰性対照と比較して確認した（４００倍）。
【図３】腎組織（左パネル）および培養腎細胞（右パネル）におけるエリスロポエチン発現細胞の顕微鏡画像を示す図である。
【図４】エリスロポエチン（ＥＰＯ）産生細胞の数量化を示す図である。ＥＰＯを発現している細胞の数は、その後の継代につれて減少した（＊ｐ＜０．０５）。
【図５】早期の継代初代培養腎細胞（Ｐ０−Ｐ３）ＥＰＯタンパク質（３４ｋＤａ）を検出した、界面活性剤で可溶化した細胞抽出物のウエスタンブロット解析を示す図である。
【図６】ＦＡＣＳを用いるＥＰＯ発現分析を示す図である。上列：マウス細胞、継代０−３。下列：ラット細胞、継代０−３。
【図７】マウス腎細胞の特徴付けを示す図である。ＥＰＯ発現が免疫蛍光により確認される（図７Ａ）（ＫＮＲＫ細胞を陽性対照として使用した）。ＧＬＥＰＰ１およびＴａｍｍ  Ｈｏｒｓｆａｌｌ腎臓マーカーも検出した（図７Ｂ）。
【図８】ラット腎細胞の特徴付けを示す図である。培養したラット腎細胞は、位相差顕微鏡により示される様々な細胞形態を有し（左パネル）、かつ、ＧＬＥＰＰ１およびＴａｍｍ  Ｈｏｒｓｆａｌｌ腎臓マーカーを発現する（右パネル）。
【図９】ＨｅｐＧ２細胞におけるＥＰＯ発現をウエスタンブロットにより示し、腎組織におけるＥＰＯ発現と比較した図である。
【図１０】低酸素条件下での培養細胞のＥＰＯタンパク質発現を示す図である。ルイスラット腎細胞およびＨｅｐＧ２細胞を、標準条件および低酸素条件下で培養し、ＥＰＯ産生を、細胞のウエスタンブロットにより評価した。３４ｋＤａ＝ＥＰＯ；４３ｋＤａ＝β−アクチン。
【図１１】低酸素条件下、培地中でのＥＰＯタンパク質発現を示す図である。ルイスラット腎細胞およびＨｅｐＧ２細胞の培地中のＥＰＯを、ウエスタンブロットにより評価した。３４ｋＤａ＝ＥＰＯ；４３ｋＤａ＝β−アクチン。
【図１２】全タンパク質可溶化液を、継代１および２でのラット腎初代細胞から調製した。正常酸素圧の試料（ＮＣ）、３％Ｏ２および７％Ｏ２中の試料から得たプレートを処理し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。ＫＮＲＫ細胞系を陽性対照として使用した。
【図１３】ウエスタンブロットによる培地濃縮物中のＥＰＯの判定を示す図である。ルイスラット由来の初代培養細胞を、１０ｃｍプレートでそれぞれの継代ごとにほぼコンフルエンシー寸前まで増殖させた。細胞は、ＫＳＦＭを２４時間欠乏させ、次に低酸素チャンバ（１％Ｏ２）の中に２４、４８または７２時間入れた。低酸素インキュベーションに続いて、培地を回収し、１０Ｋ  ｍｗｃｏアミコンウルトラ遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。４０ｕｇの全タンパク質を、次に１０％ポリアクリルアミドゲルの上に乗せた。ＫＮＲＫ細胞を陽性対照として使用した。
【図１４】回収した移植片の組織学的解析により、腎細胞がインビボで生存し、組織を形成したことが示された。ＥＰＯ産生細胞が存在することは、ＥＰＯ特異的抗体を用いて免疫組織化学的に確認された（４００倍）。左パネル：１×１０６細胞／注入の初期細胞密度。右パネル：１×１０６細胞／注入の初期細胞密度。上列の各々のパネル：２週。下列の各々のパネル：４週。
【図１５】リアルタイムＰＣＲにより測定した、培地および低酸素の腎初代細胞への効果を示す図である。腎初代細胞（ｐ０）を、１０ｃｍプレート中８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。３枚の細胞プレートを、無血清ＫＳＦＭまたはＤＭＥＭのいずれかで増殖させ、３％Ｏ２の低酸素チャンバの中に入れた。２４時間後、全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成のために試料を処理した。リアルタイムＰＣＲを三重反復で行って、試料を正常酸素圧の試料と比較して定量した。
【図１６】リアルタイムＰＣＲにより測定した、低酸素の腎初代細胞への効果を示す図である。腎初代細胞（継代０および２）を、１０ｃｍプレート中８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。次に、細胞を無血清ＫＳＦＭ中で増殖させ、１％Ｏ２の低酸素チャンバの中に入れた。２４、４８または７２時間後、全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成のために試料を処理した。リアルタイムＰＣＲを三重反復で行って、試料を正常酸素圧の試料と比較して定量した。
【図１７】リアルタイムＰＣＲにより測定した、低酸素の腎初代細胞への効果を示す図である。腎初代細胞（継代０）を、１０ｃｍプレート中８０％のコンフルエンシーまで増殖させた。次に、細胞を１％Ｏ２の低酸素チャンバの中に２４時間になるまで入れた。次に、試料を全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成のために処理した。リアルタイムＰＣＲを三重反復で行って、試料を正常酸素圧の試料と比較して定量した。
【図１８】初代ヒト腎細胞を拡張した。継代２、４、７および９の細胞を示す図である。
【図１９】ヒト初代腎細胞は、２０倍増まで維持された。
【図２０】ヒト腎細胞の特徴付け。ＧＬＥＰＰ１およびＥＰＯ陽性細胞が集団中に存在する。
【図２１】２０ｍｇ／ｍｌコラーゲン担体を用いたインビボでのヒト腎細胞送達を示す図である。注射後３週の回収時、注入量は維持されたまま、新血管新生が存在した。
【図２２】コラーゲンとともに培養ヒト腎細胞を注入した結果、インビボでＥＰＯ発現組織が形成された。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
細胞に基づく腎不全の治療法は２つの方向、全体的および選択的方向からのアプローチ
が可能である。本明細書に記載されているのは、特定の機能器官の構成要素の修復を達成
するための選択的細胞治療アプローチである。
【００１８】
本明細書に引用される全ての米国特許参照文献の開示内容は、それらが本明細書中で説
明される開示内容と一致する程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の説
明および添付される特許請求の範囲において、本明細書において用いられる、単数形「ａ
」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに示されている場合を除き、複数形も同様
に含むことが意図される。さらに、用語「約」および「およそ」は、本明細書において、
化合物、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値に言及する場合は、指定された量
の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またさらには０．１％の変動を包含すること
を意味する。また、本明細書において、「および／または」または「／」とは、１以上の
関連記載事項のありとあらゆる可能性のある組合せ、ならびに別の選択（「または」）に
解釈される場合には組合せの欠如を指し、かつ包含する。
【００１９】
「腎組織」は、腎臓から単離された、または収集された組織である。この組織は腎細胞
を含む。一部の実施形態では、腎細胞は１以上の既知の腎臓マーカー、例えば、ＧＬＥＰ
Ｐ１、Ｔａｍｍ  Ｈｏｒｓｆａｌｌ、その他に陽性である。単数または複数の「細胞」は
、いずれの適した種の細胞であってもよく、一部の実施形態では、本明細書中のプロセス
により作製される組織を移植する被験体と同じ種であってよい。哺乳類細胞（マウス、ラ
ット、イヌ、ネコ、サルおよびヒト細胞を含む）は、一部の実施形態において特に好まし
い。「単離された」は、本明細書において、細胞がその自然環境以外の条件に置かれてい
ることを示す。組織または細胞は、被験体、例えば、一次外稙体から最初に単離された時
に「収集（ｈａｒｖｅｓｔｅｄ）」される。
【００２０】
「被験体」は、一般にヒト被験体であり、限定されるものではないが、「患者」を含む
。被験体は雄であっても雌であってもよく、どのような人種または民族性であってもよい
。それには、限定されるものではないが、白色人種、アフリカ系アメリカ人、アフリカ人
、アジア人、スペイン系アメリカ人、インド人などが含まれる。被験体はどのような年齢
であってもよい。それには、新生児（ｎｅｗｂｏｒｎ）、新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）、乳
児、小児、青年、成人、および老年が含まれる。
【００２１】
被験体には、動物被験体、特に哺乳類被験体、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、
ヒツジ、ブタ、げっ歯類（例えば、ラットおよびマウス）、ウサギ目、非ヒト霊長類など
も、例えば、獣医学および／または医薬品開発目的のために含まれてよい。
【００２２】
細胞は、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）（すなわち、組織移植拒絶を最小化するために、
遺伝子的に同一であるかまたは近縁種である）、同種異系（すなわち、同じ種の遺伝子的
に同一でないメンバーに由来する）または異種（すなわち、異なる種のメンバーに由来す
る）であってよい。同系細胞には、自己（すなわち、治療される患者に由来する）および
同系（ｉｓｏｇｅｎｅｉｃ）（すなわち、遺伝子的に同一であるが被験体が異なる、例え
ば、一卵性双生児に由来する）の細胞が含まれる。細胞は、例えば、ドナー（生体または
死体）から採取されてもよいし、樹立細胞株または細胞系に由来してもよい。細胞は、ド
ナーから、例えば当分野で公知の標準的な生検技法を用いて、収集されてよい。
【００２３】
「初代培養」は、脱凝集した細胞または一次外植片を培養容器の中に播種した後に確立
される最初の培養である。「増殖」とは、本明細書において、生存細胞の数の増加を指す
。増殖は、例えば、細胞を１以上の細胞周期によって「増殖させること」により達成する
ことができ、この際、少なくとも一部の細胞が分裂してさらなる細胞を生じる。
【００２４】
「インビトロで継代した」または「継代した」とは、細胞培養の第２の培養容器への移
動または継代培養を指し、通常、増殖の速度に応じて、機械によるかまたは酵素による脱
凝集、再播種、および多くの場合２以上の娘培養（ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ
）への分割、の意味を含む。この集団が特定の遺伝子型または表現型について選択される
ならば、この培養物は継代培養の際に「細胞株」となり、すなわち培養は均質であり、望
ましい特性（例えば、ＥＰＯを発現する能力）を保有する。
【００２５】
ＥＰＯを「発現する」またＥＰＯの「発現」とは、ＥＰＯをコードする遺伝子が転写さ
れる、そして好ましくは、翻訳されることを意味する。一般に、本発明によれば、ＥＰＯ
コーディング領域が発現すると、コードされるポリペプチドが産生され、その細胞は「Ｅ
ＰＯ産生細胞」となる。一部の実施形態では、細胞は外来性遺伝子の導入などのさらなる
操作を行わずにＥＰＯを産生する。一部の実施形態では、本発明は、ＥＰＯ産生細胞が、
外来性遺伝子の導入および／またはＥＰＯの産生を刺激する外来化学物質により操作され
ないという条件に従う。
【００２６】
一部の実施形態では、収集した細胞は継代されない。その他の実施形態では、細胞は、
１回、２回、または３回継代される。さらにその他の実施形態では、細胞は、３回より多
く継代される。一部の実施形態では、細胞は、０〜１、０〜２または０〜３回継代される
。一部の実施形態では、細胞は、１〜２、１〜３、または１〜４回あるいはそれより多く
継代される。一部の実施形態では、細胞は、２〜３または２〜４回あるいはそれより多く
継代される。さらなる実施形態では、細胞は、５、８、１０、１２または１５回あるいは
それより多く継代される。一部の実施形態では、細胞は、０、１、２、３または４〜８、
１０、１５または２０回あるいはそれより多く継代される。使用される継代の回数は、例
えば、それぞれの継代の後に細胞集団において測定される相対的なＥＰＯ産生により選択
されてよい。
【００２７】
腎細胞の増殖および増殖は、これらの細胞が成長停止および早期分化に陥りやすいため
に、特に手腕が問われる。この課題は、本発明の一部の実施形態において、腎細胞の増殖
を促進する添加剤を含む腎細胞特異的培地を使用することにより克服される。したがって
、一部の実施形態では、腎細胞は、増殖因子および腎細胞の増殖を促進するその他の補助
物質（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）などの添加剤を含有する培地中で増殖される。さらに、
一部の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞は、その他の腎細胞種とともに共培養で増殖される
。
【００２８】
一部の実施形態では、腎細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウシ胎児血清（
ＦＣＳ）および、所望により、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を添加したダ
ルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖される。その他の実施形態では、腎細胞
は、ケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）中で増殖される。さらなる実施形態では、腎
細胞は、次の添加剤、ウシ下垂体抽出物（ＢＰＥ）（例えば、５０ｇ／ｍＬ）、上皮成長
因子（ＥＧＦ）（例えば、５ｎｇ／ｍＬ）、抗生物質−抗真菌溶液（ＧＩＢＣＯ）（例え
ば、５ｍＬ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔ）（例
えば、２．５％の１２．５ｍＬ）、およびインスリン・トランスフェリン・セレン（ＩＴ
Ｓ）（Ｒｏｃｈｅ）（例えば、５Ｌ培地に対して５０ｍｇ）の１以上を含むＫＳＦＭ中で
増殖される。当業者に理解されるように、上記培地の一部の実施形態では、ペニシリン−
ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）および抗生物質−抗真菌溶液は相互に交換可能である。
【００２９】
一部の実施形態に従う腎細胞の継代は、当分野で公知の標準的な手順を用いて達成され
てよい。例えば、細胞はトリプシン／ＥＤＴＡを用いて剥離し、他のプレートに移してよ
い。これは多くの細胞種について標準的な手順である。手短に言うと、一部の実施形態で
は、これは次のステップを用いて達成されてよい。１）培地を除去する。２）１０ｍｌの
ＰＢＳ／ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）を４分間添加する。位相差顕微鏡で細胞間結合の分離を確
認する。３）ＰＢＳ／ＥＤＴＡを除去し、７ｍｌのトリプシン／ＥＤＴＡを添加する。４
）顕微鏡で見て細胞の８０〜９０％がはがれた（ｌｉｆｔ）時に、５ｍｌの培地を添加す
る。５）細胞懸濁液を１５ｍｌの試験管の中に吸引回収する。６）１０００ｒｐｍにて４
分間細胞を遠心分離する。７）上清を除去する。８）５ｍｌの培地に細胞を再懸濁する。
９）１００μｌの細胞懸濁液をピペットで取り出し、生死判別試験のためにトリパンブル
ー染色を行う。１０）血球算定器で細胞の数を計数する。１１）所望の数の細胞をプレー
トに等分し、培地の容積を合計１０ｍｌとする。１２）細胞をインキュベーターの中に入
れる。
【００３０】
「選択」は、１つの細胞種を別の細胞種と区別する任意の特有の特性、例えば、密度、
サイズ、特有のマーカー、特有の代謝経路、栄養要求量、タンパク質発現、タンパク質排
泄などに基づいてよい。例えば、細胞は、遠心勾配を用いて密度およびサイズに基づいて
選択されてよい。特有のマーカーは、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＳＣ）、免疫磁性ビー
ズ選別法、磁気細胞分離法（ＭＡＳＣ）、パニングなどで選択されてよい。特有の代謝経
路および栄養要求量は、特に無血清環境で、細胞を増殖している培地の構成および／また
は栄養成分の量を変えることにより活用されてよい。タンパク質発現および／または排泄
は、様々なアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて検出することができる。
【００３１】
「ＥＰＯ産生細胞」とは、その少なくとも一部がＥＰＯを産生する（例えば、細胞の少
なくとも２０、３０、４０、または５０％またはそれ以上、あるいは、より好ましくは６
０、７０、８０、または９０％またはそれ以上がＥＰＯを産生する）、分化した細胞を指
す。一部の実施形態では、細胞は外来性遺伝子の導入などのさらなる操作を行わずにＥＰ
Ｏを産生する。一部の実施形態では、本発明は、ＥＰＯ産生細胞が外来性遺伝子の導入お
よび／またはＥＰＯの産生を刺激する外来化学物質により操作されていないという条件に
従う。細胞は、例えば、傍尿細管間質細胞から収集されてよい。一部の実施形態では、細
胞は、ＥＰＯを産生するそれらの能力について選択される。その他の実施形態では、細胞
は、細胞培養技法、例えば、継代により数が拡張される。腎臓由来の、かつその他の起源
由来の、ＥＰＯ産生という特定の機能を有する細胞を使用することができる。例えば、Ｅ
ＰＯは通常、肝臓でも産生される。
【００３２】
腎臓において、ＥＰＯは、一般に間質性傍尿細管細胞（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｐ
ｅｒｉｔｕｂｕｌａｒ  ｃｅｌｌ）により産生されることが知られている（図１）。一部
の実施形態では、分化した腎細胞の単離された集団は、８０、９０、９５、または９９パ
ーセントまたはそれ以上からなるかまたは本質的になる腎臓の間質性管周囲細胞、あるい
は多くて２０、１０、５または１パーセントまたはそれ未満の多くのその他の細胞種を含
むか、それらからなるか、あるいはそれらから本質的になる。その他の実施形態では、単
離された分化した腎細胞の集団にはその他の細胞種、例えば、内皮傍尿細管細胞が含まれ
る。
【００３３】
一部の実施形態では、単離された分化した腎細胞集団は、８０、９０、９５、または９
９パーセントまたはそれ以上からなるかまたは本質的になるＥＰＯ産生のために選択され
る腎細胞、あるいは多くて２０、１０、５または１パーセントまたはそれ未満のＥＰＯを
発現していない多数の細胞を含むか、それらからなるか、あるいはそれらから本質的にな
る。選択は、特異的マーカーを用いてＥＰＯを発現する細胞を選択することにより達成さ
れてよい。一部の実施形態では、細胞には、その細胞がＥＰＯを発現するのであれば、様
々な種類の腎細胞が含まれてよい。さらなる実施形態では、全腎細胞コロニーを拡張およ
び治療のために用いることができる。
【００３４】
一部の実施形態では、単離された分化した腎細胞集団は、インビトロで増殖した場合に
それらが少なくとも５、１０、１５、２０、２５または３０倍またはそれ以上の集団倍増
によって増殖できるような「寿命延長」を有する。一部の実施形態では、細胞は、インビ
トロで増殖した場合に４０、５０または６０倍の集団倍増またはそれ以上によって増殖で
きる。
【００３５】
「分化した」とは、特殊化した機能、例えば、ＥＰＯ産生および／または分化した細胞
の既知マーカーの発現（例えば、ＧＬＥＰＰ１および／またはＴａｍｍ  Ｈｏｒｓｆａｌ
ｌ腎臓細胞マーカー）を有する細胞または細胞を含む集団を指す。この意味において、そ
れらは前駆体または幹細胞ではない。本発明の一部の実施形態は、収集した分化した細胞
は、特殊化の程度の低い細胞集団を作り出す条件下で継代されないという条件に従う。
【００３６】
あるいは、その他の実施形態では、細胞は、後に分化されてさらに特殊化した細胞を生
成し得る細胞系を作製するために培養される。「細胞系」の確立は、細胞株とは対照的に
、概して、未分化であるが、特定の分化系列に関係づけられ得る。増殖は本来増殖性の表
現型を好み、一部の実施形態では、細胞は、例えば、培養条件の変更による分化の再誘導
を必要とし得る。細胞系で分化を誘導し得る多数の分化因子が当分野で公知である（例え
ば、エピモルフィンおよびＨＧＦなどのサイトカイン、ビタミンなど）。
【００３７】
＜治療方法＞
一部の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞は、それを必要とする被験体に（例えば、注射に
より）腎臓に（例えば、皮質および／または髄質の中に）投与される。その他の実施形態
では、ＥＰＯ産生細胞は、身体のその他の領域、例えば、肝臓、腹膜などに投与される。
一部の実施形態では、ＥＰＯ産生細胞は、皮下、被膜下などに投与される。さらなる実施
形態では、ＥＰＯ産生細胞は、本明細書に記載される前記ＥＰＯ産生細胞を含む基質（例
えば、コラーゲンゲルスキャフォールド）の移植により投与される。さらにその他の実施
形態では、ＥＰＯ産生細胞は、血管アクセスによって（例えば、全身的にまたは局所的に
）投与される。
【００３８】
本明細書に開示される方法を用いて処理することのできる疾患としては、限定されるも
のではないが、貧血が挙げられる。貧血としては、限定されるものではないが、腎不全ま
たは末期腎疾患に関連する貧血、化学療法または放射線療法に起因する貧血、慢性疾患、
例えば、慢性感染症、自己免疫疾患、関節リウマチ、ＡＩＤＳ、悪性腫瘍による貧血、未
熟児貧血、甲状腺機能低下症による貧血、栄養障害（例えば、鉄欠乏症）による貧血、お
よび血液障害に関連する貧血が挙げられる。
【００３９】
「治療する」とは、患者、例えば、疾患（例えば、腎疾患、貧血など）に罹患している
か、または疾患を発症する危険性のある患者に利益を与えるあらゆる種類の治療を指す。
治療には、患者の状態を改善する（例えば、１以上の症状の軽減）、疾患の発症または進
行の遅延などの目的で、とられる処置と、とることを控える処置が含まれる。
【００４０】
その他の内分泌系は、本明細書に開示される治療法、例えば、ビタミンＤ産生細胞治療
またはアンジオテンシン系から利益を受けることができる。例えば、参照により本明細書
に組み込まれる、Ａｔａｌａ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許出願公開第２００５／００
０２９１５号を参照されたい。特定の機能を有する細胞は、腎臓およびその他の供給源、
すなわち目的の機能を生じる細胞から使用することができる。例えば、ＥＰＯは通常肝臓
でも産生される。
【００４１】
好ましくは、細胞は投与の前に製薬上許容可能な担体と混合されるか、またはその上に
播種される。「製薬上許容可能な」とは、疾患の重篤度および治療の必要性を踏まえて過
度に有害な副作用なく本明細書に記載の治療を達成するために、化合物または組成物が被
験体への投与に適していることを意味する。かかる製剤は、当分野で周知の技法を用いて
調製することができる。例えば、米国特許出願第２００３／０１８０２８９号；Ｒｅｍｉ
ｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ
ｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄｉｔｏｒ，２０ｔｈ  ｅｄ．Ｌｉｐｐ
ｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐ
Ａ，２０００を参照されたい。担体は固体であっても液体であっても、または両方（例え
ば、ヒドロゲル）であってもよく、かつ、細胞とともに単位容量製剤として処方すること
ができる。一部の実施形態では、細胞は、細胞の凝集を減らすために担体中の懸濁液とし
て提供される。その他の実施形態では、細胞は生分解性スキャフォールドまたはマトリッ
クスの上に播種される。
【００４２】
一部の実施形態では、細胞は投与に適したゲルと混合される。本発明で用いることので
きる、適したゲルとしては、限定されるものではないが、寒天、コラーゲン、フィブリン
、ヒドロゲルなどが挙げられる。ゲルのほかに、その他の支持化合物も本発明で利用する
ことができる。例えば、細胞外マトリックス類似体を、支持ゲルと組み合わせてゲルを最
適化または機能性にする。１またはそれ以上の増殖因子を細胞懸濁液に導入してもよい。
【００４３】
本発明の製剤には、注射または移植による非経口投与（例えば、皮下、筋肉内、皮内、
静脈内、動脈内、腹膜内注射）のための製剤が含まれる。一実施形態では、投与は、単一
の注射によるか、または適した血管、例えば腎動脈の中に位置づけられたカテーテルを通
じての注射により血管内に実行される。一部の実施形態では、投与は、「注入」により実
行され、それによって組成物が静脈（例えば、門脈）を通じて身体に導入される。もう一
つの実施形態では、投与は、上に考察されるように、増加させるべき器官または組織、例
えば、腎臓および／または肝臓に対する移植片として実行される。
【００４４】
「生分解性スキャフォールドまたはマトリックス」は、有毒でないかまたは生物学的機
能に有害な作用を及ぼすあらゆる物質であり、かつ、宿主によりその基本的な構成要素に
分解されることが可能である。好ましくは、該スキャフォールドまたはマトリックスは、
細胞がマトリックスの上に、かつマトリックスの孔の中に沈殿できるように、多孔性であ
る。かかる製剤は、少なくとも１つの細胞集団を生分解性スキャフォールドに供給して、
細胞集団をスキャフォールドの上および／またはスキャフォールドの中に播種することに
より調製することができる。播種されたスキャフォールドは、次にレシピエント被験体の
身体内に移植され得る。
【００４５】
一部の実施形態では、細胞は、（例えば、適した担体中での）細胞の注射により被験体
の組織の中へ直接投与される。例えば、細胞は腎臓の中（例えば、腎臓の被膜下腔）に注
射されてよい。ＥＰＯ産生の機能的効果は全身性となるので、細胞をその他の組織への注
射により投与してもよい（例えば、肝臓、皮下など）。
【００４６】
細胞は、全身的に送達することもできる。さらなる実施形態では、ＥＰＯ産生の機能的
効果の結果が全身的となるので、細胞は、腎臓の外部の組織（例えば、肝臓）に送達され
る。例えば、確立された送達法である「エドモントン・プロトコール（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ）」を参照すると、細胞は患者の門脈に注入される（Ｓｈａｐｉｒｏ
ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：２３０−２３８）。
【００４７】
一部の実施形態によれば、被験体に投与される細胞は、上記の通り、治療される被験体
に関して、細胞の免疫抑制療法の封入または投与の存在または不在などのその他のステッ
プに応じて、同系（ｓｙｎｇｅｎｅｉｃ）（すなわち、組織移植拒絶を最小化するために
、遺伝子的に同一であるかまたは近縁種である）、同種異系（すなわち、同じ種の遺伝子
的に同一でないメンバーに由来する）または異種（すなわち、異なる種のメンバーに由来
する）であってよい。同系細胞には、自己（すなわち、治療される被験者に由来する）お
よび同系（ｉｓｏｇｅｎｅｉｃ）（すなわち、遺伝子的に同一であるが被験体が異なる、
例えば、一卵性双生児に由来する）の細胞が含まれる。細胞は、例えば、ドナー（生体ま
たは死体）から採取されてもよいし、樹立細胞株または細胞系に由来してもよい。ドナー
（例えば、バイオスキャフォールド移植片の可能性のあるレシピエント）由来の細胞を入
手するために用いることのできる方法の一例として、当分野で公知の標準的な生検技法を
用いてよい。あるいは、細胞は、被験体から収集され、インビトロで拡張／選択され、そ
して同じ被験体に再導入されてよい（すなわち自己）。
【００４８】
一部の実施形態では、細胞は治療上有効な量で投与される。細胞の治療上有効な投与量
は被験体によって多少変動し、被験体の年齢、体重、および状態ならびに送達経路などの
因子によって決まる。かかる投与量は、当業者に公知の手順に従って決定してよい。一般
に、一部の実施形態では、被験体あたり１×１０５、１×１０６または５×１０６から最
大１×１０７、１×１０８または１×１０９細胞またはそれ以上の投与量が与えられ、単
一回で一緒に投与されるかまたは数回のさらに分割された投与として与えられる。その他
の実施形態では、被験体の体重１キログラムあたり１〜１００×１０８細胞の間の投与量
が与えられてよく、単一回で一緒に投与されるかまたは数回のさらに分割された投与とし
て与えられる。当然、必要であれば追加投与を行ってもよい。
【００４９】
細胞は、一部の実施形態に従って標的ヘマトクリット範囲を実現するために投与されて
よい。理想的なまたは目標とするヘマトクリット範囲は、例えば、特定の併存症にもよる
が、被験体によって変動し得る。一部の実施形態では、目標ヘマトクリットは３０〜４０
％、一部の実施形態では、目標ヘマトクリットは３３〜３８％、一部の実施形態では、目
標ヘマトクリットは３３〜３６％である。本発明に従う細胞の投与の際には、ヘマトクリ
ットを測定してもよく、かつ、所望または必要であれば、例えば、細胞のさらなる移植お
よび／またはその他の当分野で公知の方法（例えば、組換え型ＥＰＯの補充）により補正
してよい。貧血および／または腎疾患のためのその他の治療方法を、本明細書に提供され
る治療方法、例えば、適応したタンパク質カロリー摂取食とともに用いてよい。
【００５０】
さらなる実施形態では、所望または必要であれば、被験体に、投与した細胞の移植拒絶
を阻害するための薬剤、例えばラパマイシン、アザチオプリン、コルチコステロイド、シ
クロスポリンおよび／またはＦＫ５０６などを、公知の技法に従って投与してもよい。例
えば、Ｒ．Ｃａｌｎｅ、米国特許第５，４６１，０５８号、同第５，４０３，８３３号お
よび同第５，１００，８９９号を参照されたい；また、米国特許第６，４５５，５１８号
、同第６，３４６，２４３号および同第５，３２１，０４３号も参照されたい。一部の実
施形態は、移植および移植片拒絶を最小化する免疫抑制を組み合わせて使用する。移植は
、適切な質量の移植組織を作り出すために必要なだけ繰り返されてよい。
【００５１】
本発明を、以下の限定されない実施例においてさらに詳細に説明する。
【００５２】
［実施例］
貧血は、傍尿細管間質細胞によりエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生する能力の低下を
原因とする、慢性腎不全の避けられない結果である。本発明者らは、エリスロポエチン産
生細胞の補充が腎不全に誘導される貧血の可能な治療選択肢となるのかどうかを、細胞に
基づく治療のためのエリスロポエチン産生細胞の選択および拡張の実現可能性を検討する
ことにより調査した。
【００５３】
以下の実施例は、マウスおよびラット腎臓から収集した腎細胞にＥＰＯ産生細胞が存在
することを実証する。加えて、下に記載される方法を用いて単離および拡張された細胞に
は、調べたあらゆる培養ステップでＥＰＯを発現している細胞が含まれる。さらに、培養
中でＥＰＯマーカーを発現している細胞の実際の百分率は、正常な腎組織に存在する細胞
集団と一致した（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ−Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｅｔ  Ｍｅ
ｄ  Ｓｃｉ，６７：８９１，２００５；Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ  Ｂ
ｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４：１７７５，２０００；Ｋｒａｎｔｚ，Ｂｌ
ｏｏｄ，７７：４１９，１９９１を参照されたい）。
【実施例１】
【００５４】
腎細胞初代培養の拡張。７〜１０日齢のマウスＣ５７ＢＬ／６由来の腎細胞を培養拡張
した。刻んだ腎臓（１匹のマウスの１つの腎臓）を、１５ｍｌのコラゲナーゼ／ディスパ
ーゼ（０．２ｍｇ／ｍｌ）を含む５０ｃｃ管に入れた。この腎組織断片を、３７℃のシェ
ーカー中で３０分間コラゲナーゼ／ディスパーゼ・ミックス（０．２ｍｇ／ｍｌ；１５ｍ
ｌ）とともにインキュベートした。ゼラチンを含む無菌ＰＢＳ（２０ｍｌ）（ゼラチン（
ＤＩＦＣＯ）２ｍｇ／ｍｌ）を、消化溶液に添加した。この混合物を７０ミクロンのフィ
ルターに通して濾過して、未消化の組織断片を除去した。回収した溶液を十分混合し（気
泡を作らないように注意深く）、２本の５０ｃｃ管に分けた。この管を１０００（〜１５
００）ＲＰＭにて５分間遠心した。上清を処分し、各管のペレットを３ｍｌのＫＳＦＭ培
地に再懸濁した。ＤＭＥＭ培地（１０％  ＦＢＳ、５ｍｌ  Ｐ／Ｓ）を間質細胞に使用し
、ＢＰＥ、ＥＧＦ、５ｍｌ抗生物質−抗真菌薬、１２．５ｍｌ  ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ  
Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔ、２．５％）、インスリン・トランスフェリン・セレン（Ｒｏｃ
ｈｅ）（５Ｌ培地に対して５０ｍｇ）とＢＰＥおよびＥＧＦを含むＫＳＦＭを上皮構成要
素に使用する。Ｐ／Ｓまたは抗生物質−抗真菌薬（ＧＩＢＣＯ）を添加してもよい。各組
織を２５ｍｍプレートに播種し、培地を添加した（合計３ｍｌ）。
【００５５】
翌日に、その後細胞密度によって１日おきに培地を交換することにより細胞を維持した
。細胞が８０〜９０％コンフルエントになったらトリプシン／ＥＤＴＡを使用して剥離す
ることにより細胞を継代し、次のステップを用いて他のプレートに移した。１）培地を除
去する。２）１０ｍｌのＰＢＳ／ＥＤＴＡ（０．５Ｍ）を４分間添加する。位相差顕微鏡
で細胞間結合の分離を確認する。３）ＰＢＳ／ＥＤＴＡを除去し、７ｍｌのトリプシン／
ＥＤＴＡを添加する。４）顕微鏡で見て細胞の８０〜９０％がはがれた（ｌｉｆｔ）時に
、５ｍｌの培地を添加する。５）細胞懸濁液を１５ｍｌの試験管の中に吸引回収する。６
）１０００ｒｐｍにて４分間細胞を遠心分離する。７）上清を除去する。８）５ｍｌの培
地に細胞を再懸濁する。９）１００μｌの細胞懸濁液をピペットで取り出し、生死判別試
験のためにトリパンブルー染色を行う。１０）血球算定器で細胞の数を計数する。１１）
所望の数の細胞をプレートに等分し、培地の容積を合計１０ｍｌとする。１２）細胞をイ
ンキュベーターの中に入れる。
【００５６】
あるいは、以下のプロトコールを使用した。１０日齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の
腎臓を、汚染の危険性を回避するため１０％抗生物質／抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ  Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ  ＵＳＡ）を含有するＫｒｅｂｓ緩衝液（Ｓｉｇ
ｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ＵＳＡ）中に回収した。この腎臓を、
カプセルが取り除かれた培養フードに直ちに運んだ。腎臓の髄質領域を除去し、皮質組織
だけを用いて、ＥＰＯ産生細胞として既に同定されている細胞を単離した（Ｍａｘｗｅｌ
ｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，４４：１１４９，１９
９３）。腎組織を刻み、リベラーゼブレンザイム（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｂｌｅｎｄｚｙｍ
ｅ）（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５分間３７℃にて振
盪水浴中で酵素により消化させた。上清を除去し、細胞ペレットを１００μｍ細胞ストレ
ーナに通して培養用の単細胞懸濁液を得た。
【００５７】
その後、細胞を５×１０５細胞／ｍｌの密度で培地を充填した１０ｃｍの組織培養処理
プレートに蒔いた。この培地は、ケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）と、前もって混
合したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の１：１の比の混合物からなった。前も
って混合したＤＭＥＭ培地は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレ
プトマイシン、１％グルタミン１００×（Ｇｉｂｃｏ）、１ｍｌの０．４μｇ／ｍｌヒド
ロコルチゾン、０．５ｍｌの１０−１０Ｍコレラ毒素溶液、０．５ｍｌの５ｍｇ／ｍｌイ
ンスリン溶液、１２．５ｍｌ／５００ｍｌの１．２ｍｇ／ｍｌアデニン溶液、０．５ｍｌ
の２．５ｍｇ／ｍｌトランスフェリン＋０．１３６ｍｇ／ｍｌトリヨードチロニン混合物
、および０．５ｍｌの１０μｇ／ｍｌ上皮成長因子（ＥＧＦ）溶液を補充した、３／４Ｄ
ＭＥＭおよび１／４ＨＡＭのＦ１２栄養混合物を含有した。全ての組織培養試薬は、別に
指定されない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ  ＵＳＡ）から
購入した。３日に１回培地を交換して５％ＣＯ２下、３７℃にて細胞をインキュベートし
、コンフルエントの時に１：３の比で拡張のために細胞を継代培養した。
【実施例２】
【００５８】
ＥＰＯ産生の特徴付け。早期継代（１、２および３）からの細胞を、免疫細胞化学およ
びウエスタンブロット解析を用い、特異的抗体（ウサギポリクローナル抗ＥＰＯ抗体、ｓ
ｃ−７９５６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕ
ｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＥＰＯ発現について特徴付けた。
【００５９】
８ウェルのチャンバスライドにウェルあたり３０００細胞の密度で腎細胞を蒔いた。細
胞を、５％ＣＯ２下、３７℃にて２４時間インキュベートして付着させた。それに続いて
、室温にて１０分間４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏ
ｎ−Ｘ  １００を３分間室温にて添加することにより細胞膜の透過処理を行った。次に、
細胞をヤギ血清中で３０分間室温にてインキュベートした。洗浄後、細胞を一次抗体とと
もに１時間（１：５０）室温にてインキュベートした。細胞を２度目に洗浄し、ビオチン
化ヤギポリクローナル抗ウサギ抗体（ポリクローナル抗ウサギＩｇＧ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）（
１：２００）を添加し、それに続いて室温にて４５分間インキュベートした。ＥＰＯの発
色検出の後に最後の洗浄ステップが続き、Ｖｅｃｔｏｒ  ＡＢＣキットを製造業者の取扱
説明書に従って用いて行った（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂ
ｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。一次抗体を含まないスライドは、内部陰
性対照としての役割を果たし、正常マウス腎組織は陽性対照としての役割を果たす。
【００６０】
培養中の腎細胞は、顕微鏡で複数の表現型を示した。細胞はプレーティングから７〜１
０日以内にコンフルエンシーに達した。腎臓から単離後の最初の３回の継代で観察された
多くの細胞は、バックグラウンド染色または非特異的染色のない（図２）陰性対照と比較
して、ＥＰＯに対して陽染された、このことは、観察した染色が培養物中のＥＰＯの存在
に起因する可能性のあることを示した。ＥＰＯについて陽染した細胞の数は調査した３継
代にわたって、同じ期間中の培養物で表現型の変化が観察された時でさえ、一定のままで
あった。腎組織の免疫組織化学的染色は、培養細胞中に見出されるものと同様量のＥＰＯ
発現を示した（図３）。
【００６１】
ＥＰＯを発現している細胞の数は、その後の継代とともにわずかに減少した（図４）。
これは、時間および操作を通じての継代数の増加および細胞／機能の喪失による可能性が
最も高い。しかし、相対百分率は最初の継代の後も安定していると思われる。
【００６２】
ＥＰＯ発現を、図５に示されるウエスタンブロットによっても確認した。
【実施例３】
【００６３】
マウスおよびラット腎細胞の特徴付け。ＦＡＣＳ解析を用いて、各々の継代（１〜３継
代）の確立された腎細胞培養中のＥＰＯ産生細胞の数を数量化した。細胞をトリプシン処
理および遠心分離により回収し、培地に再懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナに通過させて
単細胞懸濁液を確保した。細胞を計数した後、細胞を遠心沈殿し、ＰＢＳに５〜７．５×
１０５細胞／管で再懸濁してＦＢＳを細胞から除去した。細胞を２％ホルムアルデヒドに
４℃にて１０分間固定し、１００％メタノールを用いて室温にて１０分間透過処理した。
その後、細胞をＰＢＳ中３％ヤギ血清に再懸濁し、それに続いてウサギ抗ＥＰＯ一次抗体
ｓｃ−７９５６（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃ
ｒｕｚ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）とともに４５分間氷上でインキュベートした。フルオレ
セインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役ヤギ抗ウサギ二次抗体での１時間のインキュ
ベーションの前に細胞をＰＢＳ中３％ヤギ血清で２回洗浄した。次に、細胞をＰＢＳ中３
％血清で完全に洗浄し、ＦＡＣＳ機に移した（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ  Ｅ６２０４，
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓ
ｅｙ）。
【００６４】
蛍光活性化細胞選別実験により、継代１（Ｐ１）細胞の４４％がＥＰＯ陽性であること
が実証された。この割合は継代２（Ｐ２）で８２％に増加し、次いで継代３（Ｐ３）で４
２％に低下した。このことにより、培養の最初の２〜３日の間、正常な生組織と比較して
培地中の低い酸素濃度に応答してＥＰＯ産生細胞の増殖および／またはＥＰＯ遺伝子発現
のアップレギュレーションが起こることが示され得る。次に、これらの応答は、次の２〜
３日にわたって正常化されることができ、その結果、ＥＰＯ産生細胞の数は腎組織に見出
される数に近くなる（図６、上列）。
【００６５】
ＦＡＣＳデータにより、ＥＰＯ発現が数継代にわたって維持されていることが実証され
る。注目すべきは、継代２培養でＥＰＯ発現細胞の数に急激な増加（８２％）があったこ
とであり、これは数回の反復実験で確認された。特定の理論に縛られることを望むもので
はないが、この現象の一つの可能性のある説明として、ＥＰＯ発現が、必要に応じてオン
およびオフにすることのできる、全ての腎細胞の有する固有の形質であるということもあ
り得る。この場合、身体と培養プレートの間の生存条件の突然の変化に従って、細胞は培
養物の安定化が起こるまでＥＰＯの発現が一時的に誘発された可能性がある。これに一致
して、ＥＰＯの急激な増加は急速に反転し、継代３分析はより低い割合のＥＰＯ産生細胞
（４２％）を示した。
【００６６】
免疫蛍光によるマウス細胞の特徴付けにより、ＥＰＯ発現を確認した（図７Ａ）。細胞
集団は、腎細胞マーカーＧＬＥＰＰ１およびＴａｍｍ  Ｈｏｒｓｆａｌｌに対して陽性で
あった（図７Ｂ）。
【００６７】
ラット細胞継代０、１および２も、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いてＥＰＯ
産生について分析した（図６、下列）。培養したラット細胞は、様々な細胞形態を有し、
腎細胞マーカーＧＬＥＰＰ１およびＴａｍｍ  Ｈｏｒｓｆａｌｌに対して陽性であった（
図８）。
【実施例４】
【００６８】
ＥＰＯ産生培養物の低酸素条件への曝露。表現型の特徴の維持は、細胞の拡張ステップ
の間には必須であるが、細胞治療の成功を確実にする重要な構成要素は、ＥＰＯ産生細胞
が正常なＥＰＯレベルを調節かつ維持する能力である。ＥＰＯは、造血性サイトカインフ
ァミリーに属し、骨髄において赤血球新生を制御し、かつ、ＥＰＯ受容体（ＥＰＯＲ）媒
介性シグナル伝達によって赤血球前駆細胞の増殖、分化および生存を調節する。ＥＰＯは
、大部分は腎臓で産生され、この器官が機能しないと、ＥＰＯ産生は減少し、貧血を引き
起こす。身体内のＥＰＯ発現は、ＥＰＯを産生することのできる細胞を取り囲んでいる環
境における酸素圧に大部分は依存する。酸素レベルに影響を及ぼす因子としては、周囲空
気中の酸素の欠乏および腎血流量の低下が挙げられる。
【００６９】
培養中のＥＰＯ発現細胞が変化する酸素レベルに応答できるかどうかを判定するため、
細胞を２４時間血清飢餓状態にし、それに続いて細胞をインビトロで様々な濃度の酸素に
曝露する実験を行った。ルイスラット腎細胞およびＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞肝癌細胞系）
細胞を、標準条件および低酸素条件下で培養し、細胞のウエスタンブロットによりＥＰＯ
産生を評価し、確認した。培地中のＥＰＯの存在も、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）
ＩＶＤ（登録商標）エリスロポエチンＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録
商標），Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）を用いる二重抗体サンドイッチ
酵素結合免疫吸着（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｒｂｅｎｔ）アッセイを用いて、正常酸素圧
および低酸素条件下で培養腎細胞からの上清を分析することにより測定し、確認した。
【００７０】
細胞を、実験の前に２４時間無血清培地に入れた。次に、プレートを低酸素チャンバに
移し、異なる低酸素条件（酸素１％、３％、５％、および７％）に曝露させた。ＨｅｐＧ
２細胞は培養中に高レベルのＥＰＯを産生することが既に報告されているため、ＨｅｐＧ
２細胞を陽性対照として用いた（Ｈｏｒｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９６
：３７４３）。ＨｅｐＧ２によるＥＰＯ発現をウエスタンブロットにより確認した（図９
）。全ての細胞は、ＮＰ−４０を含有する溶解バッファー中で収集した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ
タンパク質アッセイを用いて各々の試料中のタンパク質濃度を測定した。４０μｇの全タ
ンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて１０％アクリルアミドゲルに流した。次に、タンパ
ク質をＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．）の上に移した。可溶化液中のβ−
アクチン発現の検出を、ローディングコントロールとして用いた。ＥＰＯ抗体（ウサギポ
リクローナルｓｃ−７９５６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を
１：２００で使用し、二次抗体（ヤギ抗ウサギ７０７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を１：２００
０で使用した。初代腎培養により培地に分泌されたＥＰＯの量を測定するため、培地を回
収し、アミコンウルトラ遠心濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，
Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて５００ｕｌに濃縮した。こ
の培地の試料を１０％ポリアクリルアミドゲルに流した。ＥＰＯ抗体（ウサギポリクロー
ナルｓｃ−７９５６、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１：１０
０で使用し、二次抗体（ヤギ抗ウサギ７０７４、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）を１：２０００で使用した。
【００７１】
ウエスタンブロット法により、低酸素の後の細胞可溶化液中のＥＰＯ発現のわずかな増
加が示された（図１０）。しかし、これらの結果は、培地濃縮物を用いてＥＰＯを測定し
た場合には見出されなかった（図１１）。この培地試験により、全ての培地濃縮物（低酸
素および正常酸素圧条件）が同じ少量のＥＰＯを含むことが示された。
【００７２】
あるいは、全タンパク質可溶化液を、継代１および２のラット腎初代細胞から調製した
。正常酸素圧の試料（ＮＣ）、３％Ｏ２および７％Ｏ２中の試料から得たプレートを処理
し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに流した。ＫＮＲＫ細胞系を陽性対照として使用した。結果
を図１２に示す。
【００７３】
特定の理論に縛られることを望むものではないが、これにより、分泌されたＥＰＯレベ
ルがウエスタンブロットで検知可能なレベルまで上昇するためには、２４時間は十分な時
間ではないことが示され得る。デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）タンパク質産生が明らかとなる
のには数時間かかるので、細胞がＥＰＯを分泌し始めるためにより長い曝露時間が必要で
あると思われる。そのために、細胞を低酸素条件に２４、４８および７２時間置く、以下
の実験を行った。
【００７４】
ルイスラット由来の初代培養細胞を、１０ｃｍプレートでそれぞれの継代ごとにほぼコ
ンフルエンシーまで増殖させた。細胞を、低酸素チャンバ（１％Ｏ２）の中に２４、４８
または７２時間入れた。低酸素インキュベーションに続いて、培地を回収し、１０Ｋ  分
子量カットオフのアミコンウルトラ遠心装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮した。４０μ
ｇの全タンパク質を、次に１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷した。ＫＮＲＫ細胞を陽
性対照として使用した。結果を図１３に示す。
【００７５】
要約すれば、全ての実験により、初代培養細胞中のＥＰＯレベルは、ＨｅｐＧ２陽性対
照中で測定したレベルよりも大きいかまたは等しく、ＥＰＯ産生細胞は変化する環境に応
答することができることが示された。
【実施例５】
【００７６】
インビボでのＥＰＯ産生細胞の投与。ＥＰＯ産生細胞がインビボで生存し、組織を形成
するかどうかを判定するため、コラーゲンゲルと混合した腎細胞を無胸腺マウスの皮下に
１×１０６および５×１０６の濃度で移植し、続いて分析のため移植後１４および２８日
目に回収した。１〜５の異なる継代の細胞を使用した。注入しやすくするために細胞をコ
ラーゲンゲルに懸濁した（濃度：０．１ｍｇ／ｍｌ）。
【００７７】
組織学的に、回収した移植片は、生存する腎細胞がＥＰＯタンパク質を発現し続けるこ
とを示し、ＥＰＯ特異的抗体を用いて免疫組織化学的に確認した（図１４）。
【００７８】
これらの結果は、培養中で増殖および拡張されたＥＰＯ産生腎細胞がインビボで安定し
てＥＰＯを発現することを実証する。従って、ＥＰＯ産生細胞を慢性腎不全に起因する貧
血の治療選択肢として用いることができる。
【実施例６】
【００７９】
リアルタイムＰＣＲによるＥＰＯ発現の分析。リアルタイムＰＣＲを行って低酸素条件
に応答するラット細胞のＥＰＯ発現を評価した。
【００８０】
培地の効果を試験するため、ＫＳＦＭおよびＤＭＥＭのいずれかで増殖した細胞を、低
酸素条件（３％Ｏ２）に曝露した。腎初代細胞（継代０）を、１０ｃｍプレート中８０％
のコンフルエンシーまで増殖させた。３枚の細胞プレートを、無血清ＫＳＦＭまたはＤＭ
ＥＭのいずれかで増殖させ、３％Ｏ２の低酸素チャンバの中に入れた。２４時間後、全Ｒ
ＮＡおよびｃＤＮＡ合成のために試料を処理した。リアルタイムＰＣＲを三重反復で行っ
て、試料を正常酸素圧の試料と比較して定量した。結果を図１５に示す。
【００８１】
ラット腎臓培養ＥＰＯ発現を、２４、４８および７２時間にわたるリアルタイムＰＣＲ
で比較した。腎初代細胞（継代０および２）を、１０ｃｍプレート中８０％のコンフルエ
ンシーまで増殖させた。次に、細胞を無血清ＫＳＦＭ中で増殖させ、１％Ｏ２の低酸素チ
ャンバの中に入れた。２４、４８または７２時間後、全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成のため
に試料を処理した。リアルタイムＰＣＲを三重反復で行って、試料を正常酸素圧の試料と
比較して定量した。結果を図１６に示す。
【００８２】
２４時間までの時点を試験するため、腎初代細胞（継代０）を、１０ｃｍプレート中８
０％のコンフルエンシーまで増殖させた。次に、細胞を１％Ｏ２の低酸素チャンバの中に
２４時間になるまで入れた。次に、試料を全ＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成のために処理した
。リアルタイムＰＣＲを三重反復で行って、試料を正常酸素圧の試料と比較して定量した
。結果を図１７に示す。
【実施例７】
【００８３】
ヒト腎細胞の拡張。初代ヒト腎細胞の増殖および拡張性も上記の培地および条件を用い
て実証された。継代２、４、７および９からの培養物を図１８に示す。ヒト初代腎細胞は
、２０倍増まで維持することができることが実証された（図１９）。ヒト腎細胞培養をＥ
ＰＯおよびＧＬＥＰＰ１発現について特徴付けた（図２０）。
【実施例８】
【００８４】
コラーゲン注入によるヒト腎細胞送達。コラーゲンゲルに混合したヒト腎細胞を上記の
実施例５のように無胸腺マウスの皮下に移植した。１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌおよび２
０ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度を比較した。１および２ｍｇ／ｍｌでは、インビボの容積
は投与後に消失した。２０ｍｇ／ｍｌでは、インビボの注入量は維持され、新血管新生が
図２１に見られた。組織学によりＥＰＯ発現組織がインビボで形成されたことが確認され
た（図２２）。
【実施例９】
【００８５】
磁気細胞選別によるＥＰＯ産生細胞の選択。細胞を、磁気細胞選別を用いてＥＰＯ産生
のために選択する。標準的な調製法を用いて単細胞懸濁液を単離する。単細胞懸濁液の調
製後、細胞の総数を計数し、細胞試料を遠心してペレットを得る。細胞を１０％の（二次
抗体が作製される動物の）ヤギ血清で１０分間ブロッキングする。１または２ｍＬのブロ
ッキング溶液を添加する。１０分の遠心分離の後、細胞をＥＰＯに対する一次抗体に再懸
濁する（１μｇの一次抗体／１００万の細胞を使用）。一般に、４〜８℃にて１５分間の
標識で十分である。１０７細胞あたり１〜２ｍＬのバッファーで細胞を２回洗浄して未結
合の一次抗体を除去し、３００×ｇにて１０分間遠心する。２回の連続洗浄の後、ペレッ
トを１０７細胞あたり８０μＬのＰＢＳ（０．５％のＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐ
Ｈ７．２）中に再懸濁する。１０７細胞あたり２０μＬのヤギ抗ウサギＭｉｃｒｏＢｅａ
ｄｓを添加する。十分混合し、４〜８℃にて１５分間インキュベートする。１０７細胞あ
たり１〜２ｍＬのバッファーを添加して細胞を２回洗浄し、３００×ｇにて１０分間遠心
する。上清をピペットで完全に取り去る。５００μＬのバッファー中１０８細胞までを再
懸濁する（注：より多くの細胞数には、バッファー容積を適宜スケールアップする；ＬＤ
Ｃｏｌｕｍｎｓが枯渇している場合、１．２５×１０８細胞までについて５００μＬの
バッファーに細胞ペレットを再懸濁する）。磁気細胞分離に進む。
【００８６】
注意：作業は迅速に、細胞は冷たく保ち、予め冷却した溶液を使用すること。これによ
り細胞表面での抗体のキャッピングおよび非特異的細胞標識が防止される。下記に示され
る磁気ラベリングのための容積は、１０７全細胞までのものである。１０７細胞よりも少
ない数で作業する場合には、示された容積と同じ容積を使用する。それよりも多い細胞数
で作業する場合には、全ての試薬容積および全容積を適宜スケールアップする（例えば、
２×１０７全細胞には、示される全ての試薬容積および全容積の２倍の容積を使用する）
。氷上での作業は、インキュベーション時間を増加する必要があり得る。高い温度および
／または長いインキュベーション時間は非特異的細胞標識をもたらす。
【００８７】
以上は、本発明を例証するものであり、本発明を制限するものと解釈されない。本発明
は以下の特許請求の範囲により規定され、該特許請求の範囲の同等物はその中に含まれる
。
【図１】
0006461216.tif 000002
【図２】
0006461216.tif 000003
【図３】
0006461216.tif 000004
【図４】
0006461216.tif 000005
【図５】
0006461216.tif 000006
【図６】
0006461216.tif 000007
【図７Ａ】
0006461216.tif 000008
【図７Ｂ】
0006461216.tif 000009
【図８】
0006461216.tif 000010
【図９】
0006461216.tif 000011
【図１０】
0006461216.tif 000012
【図１１】
0006461216.tif 000013
【図１２】
0006461216.tif 000014
【図１３】
0006461216.tif 000015
【図１４】
0006461216.tif 000016
【図１５】
0006461216.tif 000017
【図１６】
0006461216.tif 000018
【図１７】
0006461216.tif 000019
【図１８】
0006461216.tif 000020
【図１９】
0006461216.tif 000021
【図２０】
0006461216.tif 000022
【図２１】
0006461216.tif 000023
【図２２】
0006461216.tif 000024