(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列を含む、グルコネートリプレッサー活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号２の塩基配列を含むものである、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項２に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５】
請求項１に記載のポリペプチドを発現する、Ｌ-リシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項６】
前記コリネバクテリウム属微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項５に記載のＬ-リシンを生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項７】
（ａ）請求項５または６に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；
及び
（ｂ）前記（ａ）段階で培養された微生物または培養培地からＬ-リシンを回収する段階を含む、Ｌ-リシンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規グルコネートリプレッサー変異体、それを含む微生物、及びそれを利用したＬ-リシン生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノ酸など有用産物の大量生産のためにコリネバクテリウム菌株で糖の流入とペントースリン酸化経路の調節は非常に重要である（非特許文献１）。
【０００３】
グルコネートリプレッサー（Gluconate repressor、GntR）は、糖流入及びペントースリン酸化経路を介して炭素の流れを調節する重要な調節タンパク質であって、コリネバクテリウム・グルタミカム菌株には、２つのグルコネートリプレッサー（ＧｎｔＲ１及びＧｎｔＲ２）が知られている。 ＧｎｔＲ１及びＧｎｔＲ２はグルコネート（gluconate）代謝に関連するグルコネートパーミアーゼ（gluconate permease、gntP）、グルコネートキナーゼ（gluconate kinase、gntK）、６-ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（6-phosphogluconate dehydrogenase、gnd ）を暗号化する遺伝子の発現を強く抑制し、ペントースリン酸化経路の主要な遺伝子であるｔｋｔ-ｔａｌ-ｚｗｆ-ｏｐｃＡ-ｄｅｖＢオペロンの発現を弱く抑制する役割をする。一方、コリネバクテリウム菌株の主要な糖流入代謝経路であるホスホトランスフェラーゼシステム（Phospho-Transferase System、PTS）のブドウ糖特異的トランスポーター酵素II（glucose-specific transpoter enzyme II、ptsG）及び原糖特異的トランスポーター酵素II（sucrose-specific transpoter enzyme II、ptsS）を暗号化する遺伝子の発現を促進し、糖流入に関しても重要に関与する（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国特許登録特許第１０-０９２４０６５号
【特許文献２】韓国特許登録特許第１０-０１５９８１２号
【特許文献３】韓国特許登録特許第１０-０３９７３２２号
【特許文献４】韓国特許登録特許第１０-００７３６１０号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Handbook of Corynebacterium glutamicum. 2005. 215-240
【非特許文献２】Julia Frunzke, Verena Engels, Sonja Hasenbein, Cornelia Gatgens and Michael Bott, Molecular Microbiology (2008) 67(2), 305-322
【非特許文献３】Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40
【非特許文献４】J. Biol. Chem. 1948. 176:367-388
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らはＬ-リシン生産性に有効な効果を与える遺伝子を発掘しようと鋭意努力した結果、新規変異型グルコネートリプレッサー１（Gluconate repressor、ＧｎｔＲ１）を開発し、それを含むＬ-リシンを生産する微生物の場合、野生型グルコネートリプレッサー１を含む微生物に比べて、糖の消費速度及びＬ-リシン生産性の向上が確認されることにより、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一つの目的は、グルコネートリプレッサータンパク質の新規な変異体を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記変異体をコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供することにある。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体を発現する、Ｌ-リシンを生産する微生物を提供することにある。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は、（ａ）前記Ｌ-リシンを生産する微生物を培地で培養する段階;及び（ｂ）前記（ａ）段階で培養された微生物または培養培地からＬ-リシンを回収する段階を含む、Ｌ-リシンを生産する方法を提供することにある。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るグルコネートリプレッサー変異体を含むＬ-リシンを生産する微生物は、前記変異体を含まない微生物に比べて、向上された糖の消費速度を示し、Ｌ-リシンの効果的な生産をもたらすことができる。特に、Ｌ-リシンは、動物飼料の必須アミノ酸で産業的に大量生産が要求されるところ、本発明に基づいて、高効率でＬ-リシンを生産すると、飼料製造のコストの削減効果も得ることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明を具現する一つの様態は、グルコネートリプレッサータンパク質の新規な変異体を提供する。
【００１３】
本発明における用語、「グルコネートリプレッサータンパク質」は、グルコネート代謝または糖流入などに関与する調節タンパク質を意味する。前記グルコネートリプレッサータンパク質は、特にこれに限定されないが、コリネバクテリウム属微生物、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のグルコネートリプレッサータンパク質であってもよく、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のＧｎｔＲ１タンパク質であってもよいが、これらに限定されない。前記グルコネートリプレッサータンパク質は、その例として、配列番号４のアミノ酸配列を有するＧｎｔＲ１であってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記グルコネートリプレッサータンパク質は配列番号４のアミノ酸配列及びこれと８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列であってもよい。また、前記配列番号４のアミノ酸配列を有するグルコネートリプレッサータンパク質は、配列番号３の塩基配列を有するｇｎｔＲ１遺伝子によりコードされるものであってもよいが、これらに限定されない。例えば、前記配列番号３の塩基配列及びこれと８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有する塩基配列であってよい。
【００１４】
本願における用語、「相同性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分（moiety）間の同一性のパーセントをいう。一つの部分から他の一つの部分までの配列間の相同性は周知の当該技術により決定されうる。例えば、相同性は、配列情報を整列して容易に入手可能なコンピュータプログラムを利用して二つのポリヌクレオチド分子または二つのポリペプチド分子間の配列情報を直接に整列して決定されてもよい。前記コンピュータプログラムはＢＬＡＳＴ(NCBI), ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ (CLC bio), ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ(DNASTAR Inc)などであってもよい。また、ポリヌクレオチド間の相同性は、相同領域間の安定された二本鎖を形成する条件下で、ポリヌクレオチドを混成化した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより分解させて、分解された断片のサイズを決定することにより、決定してもよい。
【００１５】
前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体は、配列番号４のアミノ酸配列から１０２番目のアミノ酸であるアルギニン（arginine、R）がアルギニン以外のアミノ酸に置換されたポリペプチドであってもよい。具体的には、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体は、１０２番目の位置のアルギニンがシステイン（cysteine、C）に置換されて、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。
【００１６】
これらのグルコネートリプレッサータンパク質の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドだけでなく、これと８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有する変異体であって、実質的に配列番号１で記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質と同一であるか、相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する場合も、本発明の範囲に含まれるのは自明である。
【００１７】
本発明のもう一つの様態は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチド及び前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。
【００１８】
前記グルコネートリプレッサータンパク質及びその変異体については、前記で説明した通りである。
【００１９】
具体的に、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドだけでなく、８０％以上、具体的には、９０％以上、より具体的には、９５％以上、さらに具体的には、９９％以上の相同性を有するポリヌクレオチドであってもよい。前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドは、その例として、配列番号２の塩基配列を有してもよいが、これに限定されるものではない。
【００２０】
本発明における用語、「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体が共有結合により長く鎖状に繋がったヌクレオチドの重合体であって、一般的に一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖を意味する。前記ポリヌクレオチドは、遺伝暗号の 縮退性（genetic code degeneracy）に起因して、同一のアミノ酸配列をコードする、多様なヌクレオチド配列を有することができる。また、宿主細胞の種類に応じて発現を最適化するために、コドン最適化された配列を有することができる。
【００２１】
本発明における用語、「ベクター」は、宿主細胞へのポリヌクレオチドのクローニング及び/または転移のための任意の媒介物をいう。ベクターは他のＤＮＡ断片が結合して、結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（replicon）であってもよい。「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自家ユニットとして機能する、即ち、自らの調節により複製可能である任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウィルス）をいう。本発明において、ベクターは宿主の中で複製可能であるものであれば、特に限定されず、当業界に公知の任意のベクターを用いてもよい。前記組換えベクターの製作に使用されるベクターは、天然状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウィルス、及びバクテリアファージであってもよい。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、λＥＭＢＬ３、λＥＭＢＬ４、λＦＩＸＩＩ、λＤＡＳＨＩＩ、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを使用してもよく、プラスミドベクターとしてｐＤＺベクター、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを使用してもよい。 使用可能なベクターは、特に制限されるものではなく、公知された発現ベクターを使用してもよい。具体的には、ｐＤＺ（特許文献１;本願発明の全体として引用されて含まれる。）が使用されてもよいが、これに限定されない。
【００２２】
本発明では、「形質転換」は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で発現させることができるようにすることであり、形質転換された前記ポリヌクレオチドが宿主細胞内で発現することができれば、宿主細胞の染色体内挿入または染色体外に位置しているものであれ、制限なく含まれてもよい。
【００２３】
前記ポリヌクレオチドは、 自体的に発現されるに必要なすべての要素を含むポリ構造体である、発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されうる。前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター、転写終結信号、リボソーム結合部位及び翻訳終結信号を含む。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体または発現カセットの形態として宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよいが、これに制限されない。
【００２４】
本発明のもう一つの様態は、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体を発現する、Ｌ-リシンを生産する微生物である。
【００２５】
前記グルコネートリプレッサータンパク質及びその変異体については、前記で説明した通りである。
【００２６】
本発明における用語、「Ｌ-リシン」は、塩基性α-アミノ酸の一つであって、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式は[ＮＨ２(ＣＨ２)４ＣＨ(ＮＨ２)ＣＯＯＨ]であるＬ-アミノ酸の一種を意味する。Ｌ-リシンは、オキサロ酢酸からリシン生合成経路を介して生合成され、ＮＡＤＰＨ依存性還元酵素がリシン生合成のための中間過程を触媒する。１分子のＬ-リシン生合成過程で３分子のＮＡＤＰＨが糖酵素によって直接的に消費され、１分子のＮＡＤＰＨが間接的に利用される。
【００２７】
前記微生物は、突然変異によって前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体を含むか、前記グルコネートリプレッサータンパク質の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターによって形質転換されたものであってもよい。
【００２８】
前記微生物は、当該グルコネートリプレッサータンパク質の変異体の活性を有するタンパク質を含むか、当該タンパク質が発現できるように形質転換されるものであれば、原核微生物及び真核微生物いずれのものであっても含まれてもよい。例えば、 エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serratia）属、プロビデンシア（Providencia）属、エンテロバクテリア（Enterobacteria）属、サルモネラ（Salmonella）属、ストレプトマイセス（Streptomyces）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、 ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属などの微生物菌株が含まれてもよい。具体的には、コリネバクテリウム属に属する微生物であり、より具体的にはコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよいが、これに限定されない。
【００２９】
本発明のグルコネートリプレッサータンパク質の変異体タンパク質が、Ｌ-リシンを生産する微生物に含まれる場合、野生型グルコネートリプレッサータンパク質を含む微生物に比べて糖を効果的に消費してＬ-リシンの生産能を高めることができる。
【００３０】
前記Ｌ-リシンを生産する微生物は、Ｌ-リシン生産能を有するものであれば、微生物の種類に制限なく含まれ、天然型菌株及び組換え菌株の形態をすべて含む。
【００３１】
Ｌ-リシン生産能を有し得るコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ-リシン類似体に耐性を持つ変異株になることもある。Ｌ-リシン類似体は、コリネ微生物の生育を阻害するが、これらの阻害は、Ｌ-リシンが培地に共存するときには、完全にまたは部分的に解除される。Ｌ-リシン類似体の例としては、オキサＬ-リシン、Ｌ-リシンヒドロキサメート、Ｓ-（２-アミノエチル）-Ｌ-システイン（ＡＥＣ）、γ-メチルＬ-リシン、α-クロロカプロラクタムなどが挙げられるが、これらに限定されない。これらのＬ-リシン類似体に対して耐性を有する変異株は、コリネバクテリウム属微生物に通常の人工変異処理で処理することにより得ることができるが、これに限定されない。これに対する非限定的な例として、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（特許文献２、特許文献３）、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＦＣＣ１１００１、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（特許文献４）が含まれるが、これに限定されない。
【００３２】
また、Ｌ-リシン生産能を有し得るコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ-リシン生合成関連タンパク質の活性が非変異菌株に比べて強化されるように変形されたものであってもよい。即ち、Ｌ-リシン生合成関連遺伝子１種以上の発現を向上させる場合を挙げることができる。これらの発現向上は、遺伝子増幅、プロモーターまたは開始コドンのような配列の交替あるいは変形、発現が向上されるように変異導入などでなされることがあるが、これに限定されない。これに対する非限定的な例として、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献３）が含まれるが、これに限定されない。
【００３３】
また、Ｌ−リシン生合成関連遺伝子の例としては、Ｌ−リシン生合成経路上に位置する遺伝子を挙げることができ、具体的に ジヒドロジピコリン酸シンターゼ遺伝子（ｄａｐＡ）、アスパルトキナーゼ遺伝子（ｌｙｓＣ）、ジヒドロジピコリン酸リダクターゼ遺伝子（ｄａｐＢ）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｌｙｓＡ）、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子（ｄｄｈ）、 ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（ｐｐｃ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子（ａｓｄ）、アスパルターゼ遺伝子（ａｓｐＡ）、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子（Ｐｙｃ）を挙げることができるが、これらに限定されない。また、ペントースリン酸経路上に存在するトランスケトラーゼ（ｔｋｔ）などを挙げることができるが、これに限定されない。
【００３４】
一方、前記Ｌ−リシン生産能を有することができるコリネバクテリウム属微生物はＬ−リシン生産と関連された当業界に公知された変異を含むようにして、Ｌ−リシン生産能を現すことができるが、これに制限されない。
【００３５】
本発明のもう一つの様態は、（ａ）前記Ｌ-リシンを生産する微生物を培地で培養する段階；及び（ｂ）前記（ａ）段階で培養された微生物または培養培地からＬ-リシンを回収する段階を含む、Ｌ-リシンを生産する方法である。
【００３６】
前記Ｌ-リシン、及びそれを製造する微生物については、前記で説明した通りである。
【００３７】
本願における用語、「培養」は、前記微生物を適当に人工的に調節した環境条件で生育させることを意味する。本願の培養過程は、当業界で知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。具体的な培養温度、培養時間及び培地のｐＨなどの条件は、当業者の一般的な知識または従来の公知の方法によって行うことができ、これにより適切に調節されてもよい。具体的には、これらの公知の培養方法は、文献[Chmiel; Bioprozesstechnik 1 Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)、及びStorhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)]に詳細に記述されている。また、培養方法には回分式培養（batch culture）、連続式培養（cintinuous culture）及び流加式培養（fed-batch culture）が含まれてもよく、具体的には、バッチ工程または注入バッチまたは反復注入バッチ工程（fed batch or repeated fed batch process）において連続式で培養してもよいが、これに限定されるものではない。
【００３８】
培養に使用される培地は、適切な方法で特定菌株の要件を満たす必要がある。前記培地で用いられる炭素源としては、ブドウ糖、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、でん粉、セルロースのような糖及び炭水化物、大豆油、ひまわり油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油及び脂肪、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸のような脂肪酸、グリセロール、エタノールのようなアルコール、酢酸のような有機酸などが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。これら物質は、個別または混合物として用いられてもよく、これに限定されない。用いられてもよい窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、肉汁、麦芽エキス、トウモロコシ浸漬液、大豆、小麦、及び尿素または無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムなどが含まれてもよく、窒素源も個別または混合物として用いられてもよく、これに限定されない。用いられてもよいリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムまたは相応するナトリウム含有塩などが含まれてもよく、これに限定されない。また、培養培地は成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含有してもよい。最後に、前記物質に加えてアミノ酸及びビタミンのような必須成長物質が用いられてもよい。また、培養培地に適切な前駆体が用いられてもよい。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法によって回分式または連続式で添加してもよいが、これに限定されない。
【００３９】
また、培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸及び硫酸のような化合物を培養物に適切な方法で添加して、培養物のｐＨを調整してもよい。培養中には脂肪酸ポリグリコールエステルのような消泡剤を使用して気泡生成を抑制してもよい。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入してもよい。培養物の温度は、通常２０℃〜４０℃、具体的には、３０℃〜３５℃、または、これらに限定されるものではない。 培養期間は、所望の有用物質の生成量を得るまで継続されてもよく、具体的には１０〜１００時間であってもよい。Ｌ−リシン酸は、培養培地中に排出されるか、微生物中に含まれてもよい。
【００４０】
また、本願のＬ−リシンを生産する方法には、培養された微生物または培養培地からＬ−リシンを回収する方法は、当業界に広く知られている。前記Ｌ−リシンの回収方法には、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが使用されてもよいが、これらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４１】
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４２】
実施例１：変異型コリネバクテリウム・グルタミカムゲノミック（genomic）ＤＮＡライブラリ製作
【００４３】
本実施例では、Ｌ-リシン生産能及び生産性に有効な効果を与える遺伝子及び変異を発掘するためにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２菌株にＮ-メチル-Ｎ-ニトロ-Ｎ-ニトログアニジン（ＮＴＧ）による人工突然変異を誘導した後、通常の公知の抽出法によってゲノミックＤＮＡを抽出した。用意されたＤＮＡに制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを処理して、１〜３ｋｂの部分切片を獲得した。前記切片を制限酵素ＢａｍＨＩ末端を有する大腸菌及びコリネバクテリウムの形質転換用のシャトルベクターｐＥＣＣＧ１２２に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ/Ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲ（配列番号５及び６のプライマーを使用）を介して前記切片が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、これらをすべて混合培養し、通常の公知であるプラスミド抽出法によってプラスミドを抽出した。
【００４４】
配列番号５ : ＴＣＡＧＧＧＴＧＴＡＧＣＧＧＴＴＣＧＧＴＴＴＡＴ
【００４５】
配列番号６ : ＣＣＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ
【００４６】
実施例２：人工変異ライブラリの導入及びＬ-リシン生産能の向上菌株選別
【００４７】
ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０８８１と公開されたが、ブダペスト条約下の国際寄託機関に再寄託されてＫＣＣＭ１１０１６Ｐと寄託番号を与えられた、特許文献２）菌株を親菌株にして、前記製作されたベクターを形質転換して、下記の複合平板培地に塗抹した。
【００４８】
<複合平板培地>
ブドウ糖２０ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４５０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４５ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１０ｇ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ 、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ、寒天２０ｇ、カナマイシン２５ｍｇ（蒸留水1Ｌ基準）
【００４９】
確保された約１０，０００個のコロニーをそれぞれ３００μｌの選別培地に接種して、９６ディープウェルプレート（deep well plate）で３２℃、１０００ｒｐｍで約１６時間培養した。培養中に生産されたＬ-リシンの生産量を分析するためにニンヒドリン方法を用いた（非特許文献４）。培養が完了した後、培養上清液１０μｌとニンヒドリン反応溶液１９０μｌ（６３％グリセロール、２７％ニンヒドリン溶液）を６５℃で３０分間反応させた後、波長５７０ｎｍで分光光度計で吸光度を測定し、対照区（ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｐＥＣＣＧ１２２）の吸光度と比較して、類似または増加された吸光度を示す変異菌株２４８種を選別した。前記条件の培養時、対照区菌株は、１〜２ｇ/Ｌの残留糖が残っているため、対照区に比べ糖の消費速度が速くなったり、リシン生産能が増加された菌株を選別することができた。
【００５０】
<選別培地（pH8.0）>
ブドウ糖１０ｇ、硫酸アンモニウム （ammonium sulfate）５．５ｇ、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４０．８ｇ、 Ｋ２ＨＰＯ４１６．４ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ （蒸留水１Ｌ基準）
【００５１】
また、選別された２４８種の菌株を対象に、前記の方法を繰り返して行い、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/ｐＥＣＣＧ１２２菌株に比べて、Ｌ-リシン生産能が１０％以上向上された上位２９種の変異菌株を選別した。
【００５２】
実施例３：人工変異選別株のＬ-リシン生産能及び糖消費速度の分析
【００５３】
前記実施例２で選別した２９種の菌株のＬ-リシン生産能と糖消費速度を下記の方法で培養して分析した。
【００５４】
種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバブルフラスコに各菌株を接種して、３０℃で２０時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌコーナーバブルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種して、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＨＰＬＣを利用して、Ｌ-リシンの濃度を分析し、菌株の糖の消費速度及び生産性を測定するために時間帯別、培養液中の残留糖濃度を測定した。
【００５５】
<種培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖２０ｇ、ペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、尿素１．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４４ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド２０００μｇ （蒸留水１Ｌ基準）
【００５６】
<生産培地（ｐＨ ７．０）>
ブドウ糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１Ｌ基準）。
【００５７】
２９種の変異菌株の中で対照区に比べてＬ-リシン濃度は同等レベル以上であり、糖の消費速度及び生産性が向上された３種の菌株を選別して、前記培養及び分析を繰り返し行い、分析された結果は、表１のようである。
【００５８】
【表１】
0006465997.tif 000002
【００５９】
前記３つの菌株は対照区と同等レベル以上のＬ-リシンを生産したが、単位時間当たりの糖の消費速度が対照区より向上されて発酵生産性が改善されたことを確認できた。選抜された変異株の中、生産性が最も有意に向上された菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０を最終選別し、糖の消費速度及び生産性増加を誘発した根本的な遺伝子レベルでの塩基配列の突然変異を探索するためにプラスミドを抽出した。その後、配列番号５及び６のプライマーを用いて塩基配列を分析した。ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０由来のプラスミドは、ＮＣｇｌ２４４０遺伝子ＯＲＦ開始コドンの上流約４５０ｂｐ地点から終止コドンの下流約３５０ｂｐ付近までが含まれていた。また、米国国立衛生研究所の遺伝子銀行（NIH GenBank）を基にした遺伝子の塩基配列分析を通じて、遺伝子がグルコネートリプレッサーのいずれか一つであるｇｎｔＲ１であることを確認し、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０菌株に導入されたｇｎｔＲ１変異は３０４番目の塩基配列がＣからＴに置換されて１０２番目のアミノ酸がアルギニンからシステインに突然変異されたことを確認した。
【００６０】
即ち、配列番号4のアミノ酸配列を有するｇｎｔＲ１の１０２番目のアミノ酸であるアルギニンがシステインに置換されたことを確認した。
【００６１】
実施例４：ｇｎｔＲ１変異をＬ-リシン生産株の染色体に導入するためのベクター製作
【００６２】
前記実施例３で確認されたｇｎｔＲ１変異適用効果を確認するために、これを染色体上に導入することができるベクターを製作した。
【００６３】
報告された塩基配列に基づいて、５’末端にＥｃｏＲＩ制限酵素部位を挿入したプライマー（配列番号７）と３’末端にＳａｌＩ制限酵素部位を挿入したプライマー（配列番号８）を合成した。このプライマー対を用いて、ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ/１１６０のプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行い、ｇｎｔＲ１遺伝子断片を増幅した。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒の変性、５６℃で３０秒のアニーリング、７２℃で４０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。
【００６４】
配列番号 ７： ＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣ
【００６５】
配列番号 ８：ＡＡＧＴＣＧＡＣＧＧＧＡＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＧＣＧ
【００６６】
ＰＣＲで増幅された遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩで処理して、それぞれのＤＮＡ切片を獲得した後、これを制限酵素ＥｃｏＲＩとＳａｌＩ末端を有する染色体導入用ｐＤＺベクター（特許文献１）に連結した後、大腸菌ＤＨ５αに形質転換して、カナマイシン（２５ｍｇ/Ｌ）が含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。 ＰＣＲを使用して目的の遺伝子が挿入されたベクターで形質転換されたコロニーを選別した後、通常の公知のプラスミド抽出法を利用して、プラスミドを獲得し、このプラスミドのｇｎｔＲ１に挿入された変異に基づいてｐＤＺ-ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。
【００６７】
実施例５：Ｌ-リシン生産株であるＫＣＣＭ１１０１６ＰにｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の製作及び生産性の比較
【００６８】
前記実施例４で製造した新規変異導入ベクターを２段階相同染色体組換えによってＬ-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換させた。その後、染色体上のｇｎｔＲ１変異が導入された菌株を塩基配列分析により選別し、前記ｇｎｔＲ１変異が導入された菌株をＫＣＣＭ１１０１６Ｐ :: ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。
【００６９】
実施例３と同様の方法で培養して、そこからＬ-リシン濃度および残留糖濃度を測定した。また、原糖における培養効果も確認するために、ブドウ糖の生産培地の代わりに原糖生産培地を用いて同様の方法で分析した（表２）。
【００７０】
<原糖生産培地（ｐＨ７．０）>
原糖１００ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４４０ｇ 、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Corn Steep Solids）５ｇ、尿素３ｇ、ＫＨ２ＰＯ４１ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミン塩酸塩１０００μｇ、パントテン酸カルシウム２０００μｇ、ニコチン酸アミド３０００μｇ、ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１基準）。
【００７１】
【表２】
0006465997.tif 000003
【００７２】
その結果、単位時間当たりの糖の消費速度はブドウ糖及び原糖培地で対照区であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐに比べＫＣＣＭ１１０１６Ｐ::ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）はＬ-リシン生産能には影響を与えずに、糖消費速度が増加したことを確認した。また、ブドウ糖及び原糖をすべて消費した時点を確認した結果、対照区は７２時間、６８時間に完全に消費してＬ-リシンをそれぞれ４３．５ｇ/Ｌ、４７．０ｇ/Ｌ生産しており、ｇｎｔＲ１変異導入株は６０時間、５８時間にＬ-リシンをそれぞれ４３．９ｇ/Ｌ、４７．４ｇ/Ｌ生産した。即ち、ｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の場合には、時間当たりのＬ-リシンの生産性がブドウ糖、原糖においてそれぞれ２１％、１８％増加していることを確認した（表３）。
【００７３】
【表３】
0006465997.tif 000004
【００７４】
前記の結果は、ｇｎｔＲ１変異の導入が同等レベルのＬ-リシン生産能を有しながらも、ブドウ糖及び原糖消費速度に効果的であることが分かった。すなわち、本発明のｇｎｔＲ１変異を導入した場合、Ｌ-リシン発酵生産性が改善される効果の優秀性を示唆するものである。そこで、本発明者らは、前記糖消費速度及び生産性が向上された菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ :: ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）をコリネバクテリウム・グルタミカム「ＣＡ０１-２２９３」と命名し、２０１４年１２月５日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１６２８Ｐを与えられた。
【００７５】
実施例６：Ｌ-リシン生産株であるＫＣＣＭ１１３４７ＰにｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の製作及び生産性の比較
【００７６】
コリネバクテリウム・グルタミカムに属する他の菌株においての効果も確認するために、前記実施例５と同様の方法でＬ-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（前記微生物はＫＦＣＣ１０７５０と公開されたがブダペスト条約の下、国際寄託機関に再寄託されて、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐを与えられた、特許文献４）にｇｎｔＲ１変異が導入された菌株を製作し、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ :: ｇｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。前記実施例５と同様の方法で製作された菌株を培養して、リシン生産能と残留糖を比較した（表４）。
【００７７】
【表４】
0006465997.tif 000005
【００７８】
その結果、前記実施例５と同様にｇｎｔＲ１変異導入株は対照区に比べてブドウ糖、原糖の両方で糖の消費速度が増加したことを確認した。また、ブドウ糖及び原糖をすべて消費した時点を確認した結果、対照区は７２時間、６９時間に糖を完全に消費し、Ｌ-リシンをそれぞれ３８．６ｇ/Ｌ、４１．３ｇ/Ｌ生産しており、ｇｎｔＲ１変異導入株は６１時間、５８時間にＬ-リシンを３８．７ｇ/Ｌ、４１．４ｇ/Ｌ生産した。即ち、ｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の場合、時間当たりのＬ-リシンの生産性がブドウ糖、原糖においてそれぞれ１８％、１９％増加することを確認した（表５）。
【００７９】
【表５】
0006465997.tif 000006
【００８０】
実施例７：Ｌ-リシン生産株であるＣＪ３ＰにｇｎｔＲ１変異を導入した菌株の製作及び生産性比較
【００８１】
コリネバクテリウム・グルタミカムに属する別の菌株での効果も確認するために、前記実施例５と同様の方法でＬ-リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献３）にｇｎｔＲ１変異が導入された菌株を製作し、ＣＪ３Ｐ:: ＧｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）と命名した。ＣＪ３Ｐ菌株は、公知の技術を基に、野生株に３種の変異（ｐｙｃ（Ｐｒｏ４５８Ｓｅｒ）、ｈｏｍ（Ｖａｌ５９Ａｌａ）、ｌｙｓＣ（Ｔｈｒ３１１Ｉｌｅ））を導入し、Ｌ-リシン生産能を有することになるコリネバクテリウム・グルタミカム菌株である。前記実施例５と同様の方法で製作された菌株を培養して、リシン生産能と時間帯別の培養液中の残留糖濃度を測定した（表６）。
【００８２】
【表６】
0006465997.tif 000007
【００８３】
その結果、前記実施例５、６と同様にｇｎｔＲ１変異導入する対照区に比べてブドウ糖及び原糖の両方で糖の消費速度が増加したことを確認した。また、ブドウ糖及び原糖をすべて消費した時点を確認した結果、対照区はブドウ糖と原糖をそれぞれ48時間、42時間に完全に消費してＬ-リシンをそれぞれ８．２、８．８ｇ/Ｌ生産しており、ＧｎｔＲ１（Ｒ１０２Ｃ）を導入菌株は４２時間、３８時間にＬ-リシンをそれぞれ８．４、９．０ｇ/Ｌ生産した、すなわち、ＧｎｔＲ１変異を導入した菌株の場合には、時間当たりのＬ-リシンの生産性が１７％、１３％増加していることを確認した（表７）。
【００８４】
【表７】
0006465997.tif 000008
【００８５】
したがって、前記の結果からコリネバクテリウム属由来のリシン生産菌株のｇｎｔＲ１変異の導入時、糖消費速度の増加によるリシン生産性向上に効果があることを確認した。
【００８６】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００８７】
0006465997.tif 000009
【配列表】
0006465997000001.app