(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管反応性の改善を必要とする被験体において血管反応性を改善するための医薬の製造における、ペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を含む組成物の使用であって、
前記被験体が、アテローム硬化性腎臓血管性疾患（ＡＲＶＤ）と診断されている、使用。
【請求項２】
ＡＲＶＤが、正常対照被験体と比較して低減した腎臓血流量（ＲＢＦ）を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ＡＲＶＤが、正常対照被験体と比較して低減した糸球体濾過率（ＧＦＲ）を含む、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
被験体に血管再生術が実施される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
血管再生術が、経皮経血管性腎臓血管形成術を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生術の前、最中および後に連続的に、医薬が被験体へ投与される、請求項４に記載の使用。
【請求項７】
血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間、医薬が被験体へ投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、医薬が被験体へ投与される、請求項６に記載の使用。
【請求項９】
血管再生術が、腎動脈閉塞の除去を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１０】
血管再生術が、１つ以上の血栓溶解薬の投与を含む、請求項４に記載の使用。
【請求項１１】
１つ以上の血栓溶解薬が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願６１/５４０，９１０（２０１１年９月２９日出願）、米国特出願６１/５９６，４５５（２０１２年２月８日出願）、米国特許仮出願６１/５５８，１７７（２０１１年１１月１０日出願）、米国特許仮出願６１/６４２，２８２（２０１２年５月３日出願）および米国特許仮出願６１/６８１，４４４（２０１２年８月９日出願）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）に対する利益および優先権を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明の技法は、一般的に、腎虚血／再灌流組織損傷を防止するかまたは治療する組成物および方法に関する。特に、本発明の技法の実施形態は、腎動脈狭窄の治療における腎動脈開存性の回復に関連した虚血／再還流損傷を防止するかまたは治療するために、ならびにアテローム硬化性腎血管性疾患（ＡＲＶＤ）の長期治療のために、芳香族陽イオン性ペプチドを有効量で投与することに関する。
【背景技術】
【０００３】
以下の説明は、読者の理解を手助けするために提供される。提供される情報または引用される参考文献はいずれも従来技術であるとは認められない。
【０００４】
アテローム硬化症によりもっとも一般的に引き起こされる腎動脈狭窄（ＲＡＳ）は、６５歳より上の成人ではほぼ７％の発生率を有する。アテローム硬化性ＲＡＳまたは（ＡＲＶＤ）を有する患者は、しばしば高血圧症または腎血管性高血圧症を発症し、これが、冠動脈疾患、卒中、末梢血管性疾患および末期腎臓疾患への進行に関する危険を増大する。さらに、腎機能における疾患は、それ自体、心臓血管性罹患率および死亡率増大に関連する。
【０００５】
アテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）を治療するに際して、直接的治療目標は腎動脈に対する開存性を回復することである。しばしば、経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）は、推奨治療過程である。しかしながら、腎動脈開存性の上首尾の回復は、必ずしも組織還流の回復に言い換えられない。腎臓微小血管系の粗鬆化（rarefaction）および再灌流損傷は、腎臓還流低減および長期腎機能不全を引き起こし得る。これらの作用を低減する方法は、ＰＴＲＡ療法を受けている患者およびＡＲＶＤを有する患者に関する長期予後を改善する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の技法は、それを必要とする被験体への、治療的有効量の芳香族陽イオン性ペプチド、例えばＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩の投与による、哺乳動物における腎虚血-再還流損傷およびＡＲＶＤの治療または防止に関する。いくつかの実施形態では、本発明の技法は、腎臓微小血管系粗鬆化の治療または防止において有用な方法に関する。いくつかの態様では、本発明の技法は、それを必要とする被験体への、治療的有効量の芳香族陽イオン性ペプチド、例えばＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩の投与による、ＡＲＶＤを有する被験体の長期治療に関する。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、腎虚血／再還流損傷、腎臓微小血管系粗鬆化および／またはアテローム硬化性腎血管性疾患（ＡＲＶＤ）の長期治療を治療するかまたは防止する方法であって、それを必要とする被験体に、治療的有効量の芳香族陽イオン性ペプチドまたはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を投与する方法を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、被験体に関して血管再生を実施することを包含する。いくつかの実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、以下の：
少なくとも１つの正味正電荷；
最低４個のアミノ酸；
最大約２０個のアミノ酸；
正味正電荷の最小数（ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係（この場合、３ｐmはｒ＋１以下である最大数である）；ならびに芳香族基（ａ）の最小数と正味正電荷の総数（ｐt）との間の関係（この場合、２ａは、ｐt＋１以下である最大数である。但し、ｐtは１でもあり得る）
を有するペプチドである。特定の実施形態では、被験体はヒトである。
【０００８】
いくつかの実施形態では、２ｐmは、ｒ＋１以下である最大数であり、ｐtと等しいこともある。芳香族陽イオン性ペプチドは、最低で２または最低で３の正電荷を有する水溶性ペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、１つ以上の非天然アミノ酸、例えば１つ以上のＤ-アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端でのアミノ酸のＣ末端カルボキシル基はアミド化される。ある実施形態では、ペプチドは、最低４個のアミノ酸を有する。ペプチドは、最大で約６、最大で約９または最大で約１２個のアミノ酸を有し得る。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端にチロシンまたは２’，６’-ジメチルチロシン（Ｄｍｔ）残基を含む。例えば、ペプチドは、式Ｔｙｒ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ＮＨ2または２’，６’-Ｄｍｔ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ＮＨ2を有し得る。別の実施形態では、ペプチドは、Ｎ末端にフェニルアラニンまたは２’，６’-ジメチルフェニルアラニン残基を含む。例えば、ペプチドは、式Ｐｈｅ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ＮＨ2または２’，６’-Ｄｍｐ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-ＮＨ2を有し得る。特定の実施形態では、芳香族性陽イオン性ペプチドは、式Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を有する。
【００１０】
一実施形態では、ペプチドは、式Ｉ：
【化１】
0006465927.tif 000002
（式中、Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、以下の：
（ｉ）水素；
（ｉｉ）線状または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）
【化２】
0006465927.tif 000003
【化３】
0006465927.tif 000004
【化４】
0006465927.tif 000005
から選択され；
Ｒ3およびＲ4、各々独立して、以下の：
（ｉ）水素；
（ｉｉ）線状または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；
（ｉｖ）アミノ
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ；
（ｖｉｉ）ニトロ；
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル；
（ｉｘ）ハロゲン（ここで、「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する）
から選択され；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9は、各々独立して、以下の：
（ｉ）水素；
（ｉｉ）線状または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；
（ｉｖ）アミノ
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ；
（ｖｉｉ）ニトロ；
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル；
（ｉｘ）ハロゲン（ここで、「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する）
から選択され；
ｎは、１〜５の整数である）
により定義される。
【００１１】
特定の実施形態では、Ｒ1およびＲ2は水素であり；Ｒ3およびＲ4はメチルであり；
Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8およびＲ9はすべて水素であり；そしてｎは４である。
【００１２】
一実施形態では、ペプチドは、式ＩＩ：
【化５】
0006465927.tif 000006
（式中、Ｒ1およびＲ2は、各々独立して、以下の：
（ｉ）水素；
（ｉｉ）線状または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル；
（ｉｉｉ）
【化６】
0006465927.tif 000007
【化７】
0006465927.tif 000008
【化８】
0006465927.tif 000009
から選択され；
Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12は、
各々独立して、以下の：
（ｉ）水素；
（ｉｉ）線状または分枝鎖Ｃ1〜Ｃ6アルキル
（ｉｉｉ）Ｃ1〜Ｃ6アルコキシ；
（ｉｖ）アミノ
（ｖ）Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；
（ｖｉ）Ｃ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ；
（ｖｉｉ）ニトロ；
（ｖｉｉｉ）ヒドロキシル；
（ｉｘ）ハロゲン（ここで、「ハロゲン」は、クロロ、フルオロ、ブロモおよびヨードを包含する）
から選択され；
ｎは、１〜５の整数である）
により定義される。
【００１３】
特定の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、Ｒ10、Ｒ11およびＲ12はすべて水素であり、そしてｎは４である。別の実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9およびＲ11はすべて水素であり、Ｒ8およびＲ12はメチルであり、Ｒ10はヒドロキシルであり、そしてｎは４である。
【００１４】
芳香族陽イオン性ペプチドは、種々の方法で投与され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、経口的に、局所的に、鼻内に、腹腔内に、静脈内に、皮下に、または経皮的に（イオン導入法により）投与され得る。いくつかの実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、動脈内経路により投与される。
【００１５】
一態様において、本発明の開示は、それを必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、当該方法は、前記被験体に関して血管再生術（revascularization procedure）を実施する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、血管再生術は、経皮経血管性腎臓血管形成術からなる。いくつかの実施形態では、アテローム硬化性腎動脈狭窄は、前記被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるがまたはそれに罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術前、血管再生術後、血管手法の最中および後、あるいは血管再生の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、血管再生術は腎動脈閉塞の除去からなる。いくつかの実施形態では、血管再生術は１つ以上の血栓溶解薬の投与からなる。いくつかの実施形態では、１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００２１】
別の態様では、本発明の開示は、それを必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄の治療方法であって、前記被験体に関して経皮経血管性腎臓血管形成術を実施すること、そして治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、前記被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるがまたはそれに罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、それを必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄の治療方法であって、前記被験体に関して経皮経血管性腎臓血管形成術を実施すること、そして治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法は、１つ以上の血栓溶解薬を被験体に投与することを包含する。いくつかの実施形態では、前記１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００２７】
いくつかの態様において、本発明の開示は、それを必要とする被験体における片側性または両側性アテローム硬化性腎動脈狭窄に関連した対側性腎臓損傷の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明の開示は、それを必要とする被験体における高血圧症または腎臓血管性高血圧症に関連した標的器官損傷（例えば腎臓または心臓）の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、当該方法は、前記被験体に関して腎臓血管再生術を実施する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、前記血管再生術は経皮経血管性腎臓血管形成術からなる。いくつかの実施形態では、アテローム硬化性腎動脈狭窄は、被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるがまたはそれに罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、前記血管再生術は腎動脈閉塞の除去からなる。いくつかの実施形態では、血管再生術は、１つ以上の血栓溶解薬の投与からなる。いくつかの実施形態では、前記１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００３４】
いくつかの態様において、本発明の開示は、それを必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄に関連したうっ血性心不全の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、当該方法は、前記被験体に関して腎臓血管再生術を実施する工程をさらに包含する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、前記血管再生術は経皮経血管性腎臓血管形成術からなる。いくつかの実施形態では、前記アテローム硬化性腎動脈狭窄は、前記被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるがまたはそれに罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも３３時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前記血管再生術は腎動脈閉塞の除去からなる。いくつかの実施形態では、血管再生術は、１つ以上の血栓溶解薬の投与からなる。いくつかの実施形態では、前記１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００４１】
いくつかの態様において、本発明の開示は、それを必要とする被験体におけるＡＲＶＤの治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＡＲＶＤはアテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）を含む。いくつかの実施形態では、ＡＲＶＤは、正常対照と比較した腎臓血行動態障害（impaired renal hemodynamics）を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は平均腎動脈血圧増大を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は腎臓容積低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は皮質還流低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は腎臓血流量（ＲＢＦ）低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は糸球体濾過率（ＧＦＲ）低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は皮質血液酸素化低減を含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＲＶＤは尿細管間質性線維症を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、治療することは、ペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の長期投与を包含する。いくつかの実施形態では、長期投与は、１週間より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を包含する。いくつかの実施形態では、長期投与は、１年より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を包含する。
【００４５】
別の態様において、本発明の開示は、アテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）により引き起こされる減損腎臓血行動態の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前記ＡＲＡＳは正常対照と比較した腎臓血行動態障害を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は平均腎動脈血圧増大を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は腎臓容積低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は皮質還流低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は腎臓血流量（ＲＢＦ）低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は糸球体濾過率（ＧＦＲ）低減を含む。いくつかの実施形態では、前記減損腎臓血行動態は皮質血液酸素化低減を含む。いくつかの実施形態では、前記ＡＲＶＤは尿細管間質性線維症を含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、治療することは、ペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の長期投与を包含する。いくつかの実施形態では、長期投与は、１週間より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を包含する。いくつかの実施形態では、長期投与は、１年より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を包含する。
【００４８】
別の態様において、本発明の開示は、アテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）により引き起こされる減損腎臓血行動態の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を１つ以上の抗高血圧薬とともに投与することを包含する方法を提供する。
【００４９】
いくつかの実施形態では、前記１つ以上の抗高血圧薬は、利尿薬、アドレナリン作動性受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、血管拡張薬またはアルファ-２作動薬を包含する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、前記利尿薬は、ループ利尿薬、チアジド利尿薬、チアジド様利尿薬またはカリウム保持性利尿薬を包含する。いくつかの実施形態では、前記利尿薬は、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、トルセミド、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド、インダパミド、クロルサリドン、メトラゾン、アミロリド、トリアムテレンまたはスピロノラクトンを包含する。
【００５１】
いくつかの実施形態では、前記アドレナリン作動性受容体拮抗薬は、ベータ遮断薬、アルファ遮断薬または混合アルファおよびベータ遮断薬を包含する。いくつかの実施形態では、前記アドレナリン作動性受容体拮抗薬は、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンズアミン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、ブシンドロール、カルベジロールまたはラベタロールを包含する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、前記カルシウムチャネル遮断薬はジヒドロピリジンまたは非ジヒドロピリジンを包含する。いくつかの実施形態では、前記カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピン、ジルチアゼムまたはベラパミルを包含する。
【００５３】
いくつかの実施形態では、前記レニン阻害薬はアリスキレン（登録商標）を包含する。いくつかの実施形態では、前記アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬は、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルまたはベナゼプリルを包含する。いくつかの実施形態では、前記アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬はイルベサルタン（登録商標）を包含する。いくつかの実施形態では、前記アルドステロン拮抗薬は、エプレレノンまたはスピロノラクトンを包含する。いくつかの実施形態では、前記血管拡張薬拮抗薬は、ニトロプルシドナトリウムまたはヒドララジンを包含する。いくつかの実施形態では、前記アルファ-２作動薬拮抗薬は、クロニジン、グアナベンズ、メチルドパ、グアネチジンまたはレセルピンを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１Ａは、時点および具体的介入を示す実験プロトコールの模式的線図である。図１Ｂ〜Ｇは、ベースライン（ペプチド注入前）、ＰＴＲＡの３０分後およびＰＴＲＡの１８０分後の、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2ペプチドブタにおける、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ-１）（Ｂ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）-α（Ｃ）、インターロイキン（ＩＬ）-１β（Ｄ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）（Ｅ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）-β（Ｆ）および血清クレアチニン（Ｓｃｒ）（Ｇ）を示すグラフである。*ｐ＜０．０５対ベースライン；＃ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクル。
【図２】図２Ａ〜Ｂは、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2ペプチド被験体における、ベースラインおよびＰＴＲＡの２１０分後の８-イソプロスタン（Ａ）および尿タンパク質（Ｂ）の尿中レベルを示すグラフである。＃ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクル。図２Ｃおよび２Ｄは、血管収縮薬（Ｃ）作用も血管拡張薬（Ｄ）作用もペプチドに対する応答において単離腎動脈環で観察されなかった、ということを示すグラフである。＃ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクル。
【図３】図３Ａは、遠隔測定法により測定した場合の、７１日の期間に亘る実験被験体における平均動脈圧を示すグラフである。図３Ｂ〜Ｅは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2ペプチド被験体における、腎臓皮質（黒色）および髄質（灰色）容積（Ｂ）、還流（Ｃ）、腎臓血流量（ＲＢＦ）（Ｄ）および糸球体濾過率（ＧＦＲ）（Ｅ）を示す。ペプチドの投与は、狭窄性血管再生化腎臓における腎機能を改善した。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド。
【図４】図４Ａは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体における、代表的末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）（上部パネル）およびカスパーゼ−３染色（下部パネル）を示す。図４Ｂは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体における、ＴＵＮＥＬ（黒色）およびカスパーゼ−３染色（灰色）の定量を示す。図４Ｃは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織における、Ｂ−細胞リンパ腫（Ｂｃｌ）−２、Ｂｃｌ−２−関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ共活性化因子（ＰＧＣ）−１α、核呼吸因子（ＮＲＦ）−１、ＧＡ−結合タンパク質（ＧＡＢＰ）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）α、ＰＰＡＲ−δ、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）−１およびサーチュイン（ＳＩＲＴ）−１の発現を示すウエスタン・ブロットである。図４Ｄは、ＧＡＰＤＨに関するこれらのタンパク質の定量を示す。
【図５】図５Ａは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体における代表的三次元マイクロＣＴ画像（上部パネル）ならびに皮質微小血管の経壁空間密度の定量（下部パネル）を示す。図５Ｂは、皮質微小血管の平均血管直径および血管蛇行率の定量を示す。図５Ｃは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体における、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体（ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ２）の腎臓発現のレベルを示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド。
【図６】図６Ａは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織における蛍光性ジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）およびＤＡＰＩ染色（上部パネル）ならびにシグナルの定量（下部パネル）を示す。図６Ｂは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織におけるｐ４７およびニトロチロシン（ＮＴ）のレベルを示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド。
【図７】図７Ａは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織における代表的ＭＣＰ−１（上部パネル）およびＣＤ１６３（下部パネル）染色を示す。図７Ｂは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織におけるＭＣＰ−１およびＣＤ１６３の定量を示す。図７Ｃは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織からのＴＮＦ−αのウエスタン・ブロット、ならびにＧＡＰＤＨに関するＴＮＦ-αレベルの定量を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド。
【図８】図８Ａは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織の代表的過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色、ならびに尿細管損傷の定量を示す。図８Ｂは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織における代表的フィブロネクチン（上部パネル）およびコラーゲンＩＶ（下部パネル）を示す。図８Ｃは、総面積のパーセントとしての、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの腎臓組織におけるフィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶ染色の定量を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド。
【図９】図９Ａは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体からの糸球体周辺（上部パネル）および尿細管-間質性（下部パネル）腎臓組織における代表的三重染色を示す。図９Ｂは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体における尿細管-間質性繊維症および糸球体スコアの定量を示す。パネル９Ｃは、正常、ＡＲＡＳ、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド被験体の腎臓組織からのＰＡＩ−１およびＴＧＦβ−１タンパク質のウエスタン・ブロット、ならびにＧＡＰＤＨに関するＰＡＩ−１およびＴＧＦβ−１レベルの定量を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチド。
【図１０】正常＋ビヒクル、正常＋ペプチド、ＡＲＡＳ＋ビヒクル、およびＡＲＡＳ＋ペプチド被験体からの腎臓組織切片の代表的三重染色（青色；倍率４０ｘ）を示す。
【図１１】図１０に示した正常＋ビヒクル、正常＋ペプチド、ＡＲＡＳ＋ビヒクル、およびＡＲＡＳ＋ペプチド被験体における三重染色の定量を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＶＤ＋ペプチド。
【図１２】正常＋ビヒクル、正常＋ペプチド、ＡＲＡＳ＋ビヒクル、およびＡＲＡＳ＋ペプチド被験体に関する代表的ＢＯＬＤ  ＭＲＩ画像を示す。
【図１３】正常＋ビヒクル、正常＋ペプチド、ＡＲＡＳ＋ビヒクル、およびＡＲＡＳ＋ペプチド被験体における皮質血液酸素化指数（Ｒ２*）の定量を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＶＤ＋ペプチド。
【図１４】Ａｃｈ注入に応答する正常＋ペプチド、ＡＲＡＳ＋ビヒクル、およびＡＲＡＳ＋ペプチド被験体における腎臓血流量における変化の大きさ（ΔＲＢＦ）を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＶＤ＋ペプチド。
【図１５】Ａｃｈ注入に応答する正常＋ペプチド、ＡＲＡＳ＋ビヒクル、およびＡＲＡＳ＋ペプチド被験体における糸球体濾過率における変化の大きさ（ΔＧＦＲ）を示す。*ｐ＜０．０５対正常；‡ｐ＜０．０５対ＡＲＶＤ＋ペプチド。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
（詳細な説明）
本発明の技法の実質的理解を提供するために、本発明の開示のある態様、方式、実施形態、変形および特徴は、種々のレベルで詳細に以下で記載される。
【００５６】
本発明の方法を実行するに際して、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多数の慣用的技法が用いられる。これらの技法は周知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III, Ausubel, Ed. (1997); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II, Glover, Ed. (1985); Oligonucleotide Synthesis, Gait, Ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, Ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning; the series, Meth. Enzymol., (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1987);およびMeth. Enzymol., Vols. 154 and 155, Wu & Grossman, and Wu, Eds.でそれぞれ説明されている。
【００５７】
この明細書で用いられるようなある用語の定義を、以下で提示する。別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、一般的に、この技術が属する当該技術分野における当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００５８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、当該内容が明らかにそうでないことを示すのでない限り、複数の指示対象を包含する。例えば、「１つの細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせを包含する、といった具合である。
【００５９】
本明細書中で用いる場合、被験体への作用物質、薬剤またはペプチドの「投与」は、化合物を被験体に導入するかまたは送達して、その意図された機能を実施する任意の経路を包含する。投与は、任意の適切な経路により、例えば経口的に、鼻内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹腔内に、または皮下に）、くも膜下腔内に、または局所的に実行され得る。いくつかの実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、動脈内経路により投与される。投与は、自己投与および／または別の人による投与を包含する。
【００６０】
本明細書中で用いる場合、「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸といわば同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を包含する。天然アミノ酸は、遺伝暗号によりコードされるもの、ならびに後に修飾されるアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメートおよびＯ-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本的化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合されるα-炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えばノルロイシン）または修飾ペプチド主鎖を有するが、しかし天然アミノ酸と同一の基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣物は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なるが、しかし天然アミノ酸といわば同様に機能する構造を有する化学化合物を指す。アミノ酸は、それらの一般に既知の三文字記号により、またはＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨される一文字記号により、本明細書中で言及され得る。
【００６１】
本明細書中で用いる場合、「有効量」という用語は、所望の治療的および／または予防的作用を達成するために十分である量、例えば、腎虚血-再還流損傷、あるいは腎虚血、虚血-再還流損傷またはアテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）に関連した１つ以上の症候の防止または低減を生じる量を指す。治療的または予防的適用の状況では、被験体に投与される組成物の量は、疾患の種類および重症度によって、ならびに個体の特質、例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬剤に対する耐容性によって決まる。それは、疾患の程度、重症度および種類によっても決まる。当業者は、これらのおよびその他の因子によって、適切な投与量を決定することができた。組成物は、１つ以上の付加的治療用化合物と組み合わせても投与され得る。本明細書中に記載される方法において、芳香族陽イオン性ペプチドは、腎虚血損傷、腎虚血-再灌流損傷、高血圧症、ＡＲＡＳまたは腎血管性高血圧症のうちの１つ以上の徴候または症候を有する被験体に投与され得る。他の実施形態では、当該哺乳動物は、腎機能不全の１つ以上の徴候または症候、例えば疲労または倦怠、組織腫脹、背部痛、食欲の変化、消化不良、血清クレアチニン上昇、腎性高血圧症、あるいは排尿の量、色または頻度の変化を有する。例えば、「治療的有効量」の芳香族陽イオン性ペプチドとは、腎虚血-再灌流損傷またはＡＲＡＳの生理学的作用が最低でも改善されるレベルを意味する。
【００６２】
本明細書中で用いる場合、「虚血再灌流損傷」という用語は、最初に組織への血液供給の制限、そしてその後の血液の突然の再供給およびフリーラジカルの付随的生成により引き起こされる傷害を指す。虚血は、組織への血液供給の減少であり、次いで、再灌流、欠乏組織中への酸素の突然の還流を生じる。虚血性損傷は、組織への血液供給の制限により引き起こされる傷害である。虚血性損傷は、急性虚血または慢性虚血のためであり得る。
【００６３】
「単離」または「精製」ポリペプチドまたはペプチドは、細胞性物質、あるいは当該作用物質が由来する細胞または組織供給源からのその他の夾雑ポリペプチドを実質的に含有しないし、あるいは化学的に合成される場合、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含有しない。例えば、単離芳香族陽イオン性ペプチドは、作用物質の診断的または治療的使用を妨げる物質を含有しない。このような妨害物質としては、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質性および非タンパク質性溶質が挙げられる。
【００６４】
本明細書中で用いる場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ペプチド結合または修飾ペプチド結合により互いに結合される２つ以上のアミノ酸を含むポリマー、すなわちペプチドイソスターを意味するために、本明細書中で互換的に用いられる。ポリペプチドは、短鎖（一般にペプチド、糖ペプチドまたはオリゴマーとして言及される）および長鎖（一般的にタンパク質として言及される）の両方を指す。ポリペプチドは、２０個の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、天然過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野で周知である化学的修飾技法により修飾されるアミノ酸配列を包含する。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「治療すること」または「治療」または「緩和」は、治療的治療および予防的または防止的手段の両方を指し、この場合、目的は、標的化された病理学的状態または障害を防止するかまたは遅らせる（少なくする）ことである。例えば、本明細書中に記載される方法に従って治療的有効量の芳香族陽イオン性ペプチドを接種後、被験体がＡＲＡＳに関連した腎虚血-再灌流損傷における観察可能なおよび／または測定可能な低減を示すならば、被験体は、ＡＲＡＳに関連した腎虚血／再灌流損傷に関して首尾よく「治療」される。記載されるような医学的症状の治療または防止の種々の方式が「実質的」（全体的な治療または防止を包含するが、全体的未満も包含する）を意味するよう意図され、この場合、いくつかの生物学的または医学的関連結果が達成される、とさらにまた理解されるべきである。
【００６６】
本明細書中で用いる場合、「長期治療」という用語は、単一回投与を上回る治療の一形態を施すことを指す。いくつかの実施形態では、治療は、１回より多く被験体に施される。いくつかの実施形態では、治療は、５回より多く被験体に施される。いくつかの実施形態では、治療は、１０より多く、２０回より多く、３０回より多く、４０回より多く、５０回より多く、６０回より多く、７０回より多く、８０回より多く、９０回より多く、または１００回より多く、被験体に施される。いくつかの実施形態では、治療は、約１週間より長い期間、約２週間より長い、約３週間より長い、約４週間より長い、約５週間より長い、約６週間より長い、約７週間より長い、約８週間より長い、約９週間より長い、約１０週間より長い、約１１週間より長い、約１２週間より長い、約１３週間より長い、約１４週間より長い、または約１５週間より長い期間、被験体に施される。いくつかの実施形態では、治療は、１年より長い、５年より長い、１０年より長い、または２０年より長い期間、被験体に施される。
【００６７】
本明細書中で用いる場合、障害または症状の「防止」または「防止すること」は、統計学的試料において、非治療対照試料に比して、治療試料における障害または症状の発生を低減する、あるいは非治療対照試料に比して、障害または症状の１つ以上の症候の開始を遅延するかまたはその重症度を低減する化合物を指す。本明細書中で用いる場合、虚血-再還流損傷を防止することは、酸化的傷害を防止すること、あるいはミトコンドリア透過性遷移を防止し、それにより腎臓への血流量の損失とその後の回復の有害作用を防止するかまたは改善することを包含する。
【００６８】
Ｉ．  高血圧および／または腎動脈狭窄に関連した腎臓および心臓損傷の防止または治療の方法
腎臓への血流量の回復は、腎臓狭窄に関する治療の重要部分である。血流量の急速な回復は、腎臓微小血管を傷害して、腎機能低減および長期予後不良を引き起こし得る。この作用は、虚血／再灌流損傷として既知である。
【００６９】
再灌流損傷は、腎臓以外の器官、例えば心臓、肝臓、腎臓、脳、皮膚等で起こり得る。再灌流時の組織傷害は、最初に、脳虚血で示唆された。短い２ 1/2分の虚血を蒙ったウサギの脳は、虚血が軽減されると、正常血流量を有した。ウサギがより長い虚血期間に曝露された場合、脳組織への正常流は、血管閉塞の軽減後でも、回復されなかった。長期虚血は、脳細胞への正常流を妨げる微小血管系における有意の変化を生じた。この現象の存在は、脳虚血の種々の動物モデルにおいて確証された。それは、種々のその他の器官、例えば皮膚、骨格筋および腎臓においても示された。さらに、微小循環改変は、臓器移植中の虚血-再灌流損傷により誘導される器官傷害を調整し得る。
【００７０】
本発明の技法は、それを必要とする被験体に、治療的有効量の芳香族陽イオン性ペプチド、例えばＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を投与することによる哺乳動物での虚血損傷および／または虚血-再還流損傷の治療または防止に関する。一態様において、本発明の技法は、腎動脈狭窄を有する被験体における腎血管再生に関する腎臓損傷の治療または防止に有用な方法に関する。
【００７１】
一態様において、本発明の技法は、それを必要とする被験体に、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を投与することを包含するＡＲＶＤの治療に関する。いくつかの実施形態では、治療は、１週間より長い期間投与される長期治療である。
【００７２】
別の態様では、本発明の技法は、組織再灌流の非存在下での虚血性損傷の治療または防止に関する。例えば、ペプチドは、血管再生術のための適切な候補でない、または血管再生術が容易に利用可能でない、１つ以上の組織または器官における急性虚血を経験している患者に投与され得る。付加的には、または代替的には、血管再生術に対する必要性に前もって措置を講じるために、ペプチドは１つ以上の組織における慢性虚血を有する患者に投与され得る。組織再灌流の非存在下での虚血性損傷の治療または防止のために芳香族陽イオン性ペプチドを投与される患者は、付加的には、本明細書中に記載される方法による血管再生術の前、最中および後に、ペプチドを投与され得る。
【００７３】
一実施形態では、腎臓再還流損傷は、芳香族陽イオン性ペプチドを投与されない同様の被験体と比較して、一被験体における組織再灌流の量または区域を増大することを包含する。一実施形態では、腎再灌流損傷の防止は、芳香族陽イオン性ペプチドを投与されない同様の被験体と比較して、一被験体における再灌流により引き起こされる微小血管傷害の量または区域を低減することを包含する。いくつかの実施形態では、腎再還流損傷の治療または防止は、芳香族陽イオン性ペプチドを投与されない同様の被験体と比較して、一被験体において、再灌流時に罹患血管に対する損傷を低減すること、血球による施栓の作用を低減すること、および／または内皮細胞腫脹を低減することを包含する。防止または治療の程度は、当該技術分野で既知の任意の技法、例えば腎臓容積、腎動脈圧、腎臓血流量（ＲＢＦ）および糸球体濾過率（ＧＦＲ）の測定（これらに限定されない）により、ならびに当該技術分野で既知の画僧処理技法、例えばＣＴおよびマイクロＣＴ（これらに限定されない）により測定され得る。上首尾の防止または治療は、芳香族陽イオン性ペプチドを投与されない対照被験体または対照被験体の一集団と比較した場合の、これらの画像処理技法のいずれかにより観察される被験体における腎臓再灌流損傷の程度を比較することにより決定される。
【００７４】
一態様において、本発明の技法は、それを必要とする被験体への、ある芳香族陽イオン性ペプチド、例えばＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩の投与による、腎臓血管再生に関連した腎臓再灌流損傷の治療または防止に関する。器官の再灌流時の腎臓に対する損傷を防止するために、被験体における腎狭窄を治療する方法も提供される。
【００７５】
一実施形態では、被験体への芳香族陽イオン性ペプチド（単数または複数）の投与は、腎臓再灌流損傷の発生の前である。例えば、いくつかの実施形態では、ペプチドは、それを必要とする被験体における虚血性損傷を抑制し、防止し、または治療するために、および／または再灌流治療に前もって措置を講じるために、および／または再灌流損傷を軽減するかまたは改善するために投与される。付加的には、または代替的には、いくつかの実施形態では、被験体への芳香族陽イオン性ペプチド（単数または複数）の投与は、腎臓再灌流損傷の発生の後である。一実施形態では、当該方法は、血管再生術とともに実施される。一実施形態では、血管再生術は、経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）である。一態様において、本発明の技法は、腎臓血管再生の方法であって、治療的有効量の芳香族陽イオン性ペプチドを哺乳動物被験体に投与すること、および当該被験体に関してＰＴＲＡを実施することを包含する方法に関する。
【００７６】
一実施形態では、被験体は、血管再を生手法の前に、ペプチド、例えばＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を投与される。別の実施形態では、被験体は、血管再生術後に、ペプチドを投与される。別の実施形態では、被験体は、血管再生術の最中および後に、ペプチドを投与される。さらに別の実施形態では、被験体は、血管再生術の前、最中および後に、ペプチドを投与される。別の実施形態では、被験体は、腎動脈狭窄および／または腎臓血管再生術後に、定期的に（すなわち長期的に）ペプチドを投与される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後にペプチドを投与される。一実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、または２４時間、ペプチドを投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に、４時間前に、少なくとも２時間前に、少なくとも１時間前に、または１０分前に開始して、ペプチドを投与される。一実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも１週間、少なくとも１か月または少なくとも１か月間、投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の前および後にペプチドを投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、特定期間に亘って、注入液としてペプチドを投与される。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ボーラスとして被験体に投与される。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、芳香族陽イオン性ペプチドを１つ以上の血栓溶解薬とともに投与することを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００７９】
高血圧症、腎血管性高血圧症または片側性腎動脈狭窄を有する患者における狭窄性腎臓および／または対側性腎臓損傷の防止または治療のための方法も本明細書中で提供される。このような患者において、対側性腎臓への損傷は、腎動脈狭窄に対する代償性生物学的応答の結果である。増大量のレニンが、腎臓細動脈における脈圧減少に応答して狭窄性腎臓から放出される。例えば、腎臓還流圧の５０パーセント減は、虚血性腎臓からのレニン分泌の即時的および持続的増大、ならびに対側性腎臓からの分泌の共存的抑圧をもたらす。これは、ナトリウム排出、交感神経活動、腎臓内プロスタグランジン濃度および一酸化窒素生成に及ぼす直接的作用を有する；したがって、腎臓血管性高血圧症を引き起こす。腎臓血管性高血圧症が持続される場合、血漿レニン活性は減少する（「逆タキフィラキシー」として言及される）。多年持続期間を有する腎臓血管性高血圧症患者は、対側性腎臓における広範な腎硬化症を蒙る。
【００８０】
高血圧症、片側性腎動脈狭窄または腎臓血管性高血圧症を有する患者における心臓損傷を防止するかまたは治療するための方法も、本明細書中で提供される。このような患者において、心臓損傷は、腎動脈狭窄および高血圧症に対する代償性生物学的応答の結果である。上記のように、増大量のレニンは腎臓細動脈における脈圧減少に応答して狭窄性腎臓から放出されるが、一方、レニンレベルは、対側性腎臓から減少される。これは、血漿レニンレベルおよび／または活性における全体的低減を生じる。これは、体液容積拡張および心拍出量増大により成し遂げられる。心拍出量における持続性増大は、うっ血性心不全の発症をもたらす。さらに、動脈圧の増大は後負荷を増大し、心臓肥大をもたらす。いくつかの実施形態では、ペプチドは、第二の活性作用物質、例えば抗高血圧薬とともに投与される。例示的作用物質としては、利尿薬、アドレナリン作動性受容体作動薬、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害薬、ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体作動薬、アルドステロン拮抗薬、血管拡張薬および／または中枢作用性アドレナリン作動薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
したがって、いくつかの態様において、本発明の開示は、それを必要とする被験体における片側性腎動脈狭窄に関連した対側性腎臓損傷の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、当該方法は、被験体に関する腎臓血管再生術を実施する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態では、血管再生術は、経皮経血管性腎臓血管形成術を包含する。いくつかの実施形態では、アテローム硬化性腎動脈狭窄は、被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を包含する。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があり、またはそれに罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前にペプチドを投与される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、血管再生術は、腎動脈閉塞の除去からなる。いくつかの実施形態では、血管再生術は、１つ以上の血栓溶解薬の投与からなる。いくつかの実施形態では、１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の開示は、それを必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄に関連したうっ血性心不全または心臓肥大の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法を提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、当該方法は、被験体に関する腎臓血管再生術を実施する工程をさらに包含する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、血管再生術は、経皮経血管性腎臓血管形成術からなる。いくつかの実施形態では、前記アテローム硬化性腎動脈狭窄は、被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるがまたはそれに罹患している。いくつかの実施形態では、被験体は、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前にペプチドを投与される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、被験体は、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、血管再生術は、腎動脈閉塞の除去からなる。いくつかの実施形態では、血管再生術は、１つ以上の血栓溶解薬の投与からなる。いくつかの実施形態では、１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載される方法は、組織再灌流の非存在下での虚血性損傷の治療または防止のために、それを必要とする被験体に１つ以上の芳香族陽イオン性ペプチドを投与することを包含する。いくつかの実施形態では、当該方法は、血管再生術のための適切な候補でない、または血管再生術が容易に利用可能でない、１つ以上の組織における急性虚血を経験している患者に、１つ以上のペプチド、例えばＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を投与することを包含する。いくつかの実施形態では、当該方法は、血管再生術に対する必要性に前もって措置を講じるために、１つ以上の組織における慢性虚血を有する患者に１つ以上のペプチドを投与することを包含する。いくつかの実施形態では、組織再灌流の非存在下での虚血性損傷の治療または防止のために芳香族陽イオン性ペプチドを投与される患者は、付加的には、血管再生術の前、最中および後に、ペプチドを投与される。
【００９５】
ＩＩ．  本発明の技法の芳香族陽イオン性ペプチドの調製
本発明の技法の芳香族陽イオン性ペプチドは、水溶性で高極性である。これらの特性にもかかわらず、ペプチドは細胞膜を容易に透過し得る。芳香族陽イオン性ペプチドは、典型的には、ペプチド結合により共有結合される最低でも３個、または最低でも４個のアミノ酸を含む。芳香族陽イオン性ペプチド中に存在するアミノ酸の最大数は、ペプチド結合により共有結合されるアミノ酸約２０個である。適切には、アミノ酸の最大数は、約１２、さらに好ましくは約９、もっとも好ましくは約６個である。
【００９６】
芳香族陽イオン性ペプチドのアミノ酸は、任意のアミノ酸であり得る。本明細書中で用いる場合、「アミノ酸」という用語は、少なくとも１つのアミノ基および少なくとも１つのカルボキシル基を含有する任意の有機分子を指すために用いられる。典型的には、少なくとも１つのアミノ基は、カルボキシル基に対してα位置にある。アミノ酸は、天然に生じるものであり得る。天然アミノ酸としては、例えば、哺乳動物タンパク質中に普通に見出される２０個の最も一般的な左旋性（Ｌ）アミノ酸、すなわち、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、チロシン（Ｔｙｒ）およびバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。その他の天然アミノ酸としては、例えば、タンパク質合成に関連しない代謝過程で合成されるアミノ酸が挙げられる。例えば、アミノ酸であるオルニチンおよびシトルリンは、尿の生成中に哺乳動物代謝において合成される。天然アミノ酸の別の例としては、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が挙げられる。
【００９７】
ペプチドは、任意に、１つ以上の非天然アミノ酸を含有する。いくつかの実施形態では、ペプチドは、天然に生じているアミノ酸を有さない。非天然アミノ酸は、左旋性（Ｌ-）、右旋性（Ｄ-）またはその混合物であり得る。非天然アミノ酸は、典型的には、生きている生物体において通常の代謝過程では合成されないアミノ酸であり、タンパク質中に天然に生じない。さらに、非天然アミノ酸は、適切には、さらにまた一般的プロテアーゼによって認識されない。非天然アミノ酸は、ペプチド中の任意の位置に存在し得る。例えば、非天然アミノ酸は、Ｎ末端、Ｃ末端に、またはＮ末端とＣ末端との間の任意の位置に存在し得る。
【００９８】
非天然アミノ酸は、例えば天然アミノ酸中に見いだされないアルキル、アリールまたはアルキルアリール基を含む。非天然アルキルアミノ酸のいくつかの例としては、β-アミノ酪酸、β-アミノ酪酸、γ-アミノ酪酸、δ-アミノ吉草酸およびε-アミノカプロン酸が挙げられる。非天然アリールアミノ酸のいくつかの例としては、オルト-、メタおよびパラ-アミノ安息香酸が挙げられる。非天然アルキルアリールアミノ酸のいくつかの例としては、オルト-、メタ-およびパラ-アミノフェニル酢酸、ならびにγ-フェニル-β-アミノ酪酸が挙げられる。非天然アミノ酸は、天然アミノ酸の誘導体を包含する。天然アミノ酸の誘導体は、例えば天然アミノ酸への１つ以上の化学基の付加を包含し得る。
【００９９】
例えば、１つ以上の化学基は、フェニルアラニンまたはチロシン残基の芳香族環の２’、３’、４’、５’または６’位置、あるいはトリプトファン残基のベンゾ環の４’、５’、６’または７’位置に付加され得る。当該基は、芳香族環に付加され得る任意の化学基であり得る。このような基のいくつかの例としては、分枝鎖または非分枝鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチルまたはｔ−ブチル、Ｃ1〜Ｃ4アルキルオキシ（すなわち、アルコキシ）、アミノ、Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノおよびＣ1〜Ｃ4ジアルキルアミノ（例えばメチルアミノ、ジメチルアミノ）、ニトロ、ヒドロキシル、ハロ（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード）が挙げられる。天然アミノ酸の非天然誘導体のいくつかの特定例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）およびノルロイシン（Ｎｌｅ）が挙げられる。
【０１００】
ペプチド内のアミノ酸の修飾の別の例は、ペプチドのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシル基の誘導体化である。誘導体化の一例は、アンモニアによる、あるいは第一級または第二級アミン、例えばメチルアミン、エチルアミン、ジメチルアミンまたはジエチルアミンによるアミド化である。誘導体化の別の例としては、例えばメチルまたはエチルアルコールによるエステル化が挙げられる。別のこのような修飾としては、リシン、アルギニンまたはヒスチジン残基のアミノ基の誘導体化が挙げられる。例えば、このようなアミノ基は、アシル化され得る。いくつかの適切なアシル基としては、例えば上記のＣ1〜Ｃ4アルキル基のいずれかを含むベンゾイル基またはアルカノイル基、例えばアセチルまたはプロピオニル基が挙げられる。
【０１０１】
非天然アミノ酸は、一般プロテアーゼに対して、好ましくは抵抗性であり、さらに好ましくは非感受性である。プロテアーゼに対して抵抗性または非感受性である非天然アミノ酸の例としては、上記天然Ｌ-アミノ酸の右旋（Ｄ-）型、ならびにＬ-および／またはＤ-非天然アミノ酸が挙げられる。Ｄ-アミノ酸はタンパク質中に天然では生じないが、しかしそれらは細胞の通常のリボソームタンパク質合成機構以外の手段により合成されるある種のペプチド抗生物質中に見いだされる。本明細書中で用いる場合、Ｄ-アミノ酸は非天然アミノ酸であるとみなされる。
【０１０２】
プロテアーゼ感受性を最小限にするために、アミノ酸が天然であるか、非天然であるかにかかわらず、ペプチドは、一般的プロテアーゼにより認識される連続Ｌ-アミノ酸を、５未満、好ましくは４未満、さらに好ましくは３未満、最も好ましくは２未満有するべきである。いくつかの実施形態では、ペプチドは、Ｄ-アミノ酸のみを有し、Ｌ-アミノ酸を有さない。ペプチドがアミノ酸のプロテアーゼ感受性配列を含有する場合、アミノ酸のうちの少なくとも１つは、好ましくは非天然Ｄ-アミノ酸であり、それにより、プロテアーゼ抵抗性を付与する。プロテアーゼ感受性配列の一例は、一般的プロテアーゼ、例えばエンドペプチダーゼおよびトリプシンにより容易に切断される２つ以上の連続塩基性アミノ酸を包含する。塩基性アミノ酸の例としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。
【０１０３】
芳香族陽イオン性ペプチドは、ペプチド中のアミノ酸の総数との比較において、生理学的ｐＨで最小数の正味負電荷を有するべきである。生理学的ｐＨでの正味負電荷の最小数は、（ｐm）として以下で言及される。ペプチド中のアミノ酸残基の総数は、（ｒ）として以下で言及される。以下で考察される正味正電荷の最小数は、すべて生理学的ｐＨでのものである。「生理学的ｐＨ」という用語は、本明細書中で用いる場合、哺乳動物身体の組織および器官の細胞における正常ｐＨを指す。例えば、ヒトの生理学的ｐＨは、通常はおよそ７．４であるが、しかし哺乳動物における正常生理学的ｐＨは約７．０から約７．８までの任意のｐＨであり得る。
【０１０４】
「正味電荷」は、本明細書中で用いる場合、ペプチド中に存在するアミノ酸により保有される正電荷の数と負電荷の数の均衡を指す。本明細書中では、正味電荷は生理学的ｐＨで測定される、と理解される。生理学的ｐＨで正に荷電される天然アミノ酸としては、Ｌ-リシン、Ｌ-アルギニンおよびＬ-ヒスチジンが挙げられる。生理学的ｐＨで負に荷電される天然アミノ酸としては、Ｌ-アスパラギン酸およびＬ-グルタミン酸が挙げられる。
【０１０５】
典型的には、ペプチドは、正荷電Ｎ末端アミノ基および負荷電Ｃ末端カルボキシル基を有する。電荷は、生理学的ｐＨで互いに相殺する。正味電荷の算定の一例として、ペプチドＴｙｒ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｌｙｓ-Ｇｌｕ-Ｈｉｓ-Ｔｒｐ-Ｄ-Ａｒｇは、１個の負荷電アミノ酸（すなわち、Ｇｌｕ）および４個の正荷電アミノ酸（すなわち、２個のＡｒｇ残基、１個のＬｙｓおよび１個のＨｉｓ）を有する。したがって、上記ペプチドは、３つの正味電荷を有する。
【０１０６】
一実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、生理学的ｐＨでの正味正電荷の最小数（Ｐm）と、アミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係を有する（ここで、３ｐmは、ｒ＋１以下である最大数である）。この実施形態では、正味正電荷の最小数（Ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係は、以下のとおりである：
【表１】
0006465927.tif 000010
【０１０７】
別の実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、正味正電荷の最小数（Ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係を有する（ここで、３ｐmは、ｒ＋１以下である最大数である）。この実施形態では、正味正電荷の最小数（Ｐm）と、アミノ酸残基の総数（ｒ）との間の関係は、以下のとおりである：
【表２】
0006465927.tif 000011
【０１０８】
一実施形態では、正味正電荷の最小数（Ｐm）とアミノ酸残基の総数（ｒ）は等しい。別の実施形態では、ペプチドは３または４個のアミノ酸残基および最低でも１の正味正電荷を有し、適切には、２の正味正電荷、さらに好ましくは最低でも３の正味正電荷を有する。
【０１０９】
芳香族陽イオン性ペプチドは、正味正電荷の総数（ｐt）との比較において、芳香族基の最小数を有する、ということも重要である。芳香族基の最小数は、（ａ）として以下で言及される。芳香族基を有する天然アミノ酸としては、アミノ酸であるヒスチジン、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンが挙げられる。例えば、ヘキサペプチドＬｙｓ-Ｇｌｎ-Ｔｙｒ-Ｄ-Ａｒｇ-Ｐｈｅ-Ｔｒｐは、正味正電荷が２で（リシンおよびアルギニン残基により与えられる）、そして３つの芳香族基（チロシン、フェニルアラニンおよびトリプトファン残基により与えられる）を有する。
【０１１０】
芳香族陽イオン性ペプチドは、さらにまた、芳香族基の最小数（ａ）と生理学的ｐＨでの正味正電荷の総数（ｐt）との間に関係を有すべきであって、ここで、３ａはｐt＋１以下である最大数であるが、但し、ｐtが１である場合、ａも１であり得る。この実施形態では、芳香族基の最小数（ａ）と、正味正電荷の総数（ｐｔ）との間の関係は、以下のとおりである：
【表３】
0006465927.tif 000012
【０１１１】
別の実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、芳香族基の最小数（ａ）と正味正電荷の総数（ｐt）との間に関係を有し、この場合、２ａはｐt＋１以下である最大数である。この実施形態では、芳香族アミノ酸残基の最小数（ａ）と、正味正電荷の総数（ｐｔ）との間の関係は、以下のとおりである：
【表４】
0006465927.tif 000013
【０１１２】
別の実施形態では、芳香族基の数（ａ）と正味正電荷の総数（ｐt）は等しい。
【０１１３】
カルボキシル基、特にＣ末端アミノ酸の末端カルボキシル基は、例えばアンモニアで適切にアミド化されて、Ｃ末端アミドを生成する。代替的には、Ｃ末端アミノ酸の末端カルボキシル基は、任意の第一級または第二級アミンでアミド化され得る。第一級または第二級アミンは、例えばアルキル、特に分枝鎖または非分枝鎖Ｃ1〜Ｃ4アルキル、あるいはアリールアミンであり得る。したがって、ペプチドのＣ末端のアミノ酸は、アミド、Ｎ−メチルアミド、Ｎ−エチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミド、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミド、Ｎ−フェニルアミドまたはＮ−フェニル−Ｎ−エチルアミド基に変換され得る。芳香族陽イオン性ペプチドのＣ末端に生じないアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基の遊離カルボキシレート基も、それらがペプチド内で生じるところではどこでも、アミド化される。これらの内部位置でのアミド化は、上記のアンモニアあるいは第一級または第二級アミンのいずれかを用いるものであり得る。
【０１１４】
一実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、２個の正味正電荷および少なくとも１個の芳香族アミノ酸を有するトリペプチドである。特定の実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドは、２個の正味正電荷および２個の芳香族アミノ酸を有するトリペプチドである。
【０１１５】
芳香族陽イオン性ペプチドとしては、以下のペプチド例が挙げられるが、これらに限定されない：
0006465927.tif 000014
【０１１６】
一実施形態では、ペプチドは、μ-オピオイド受容体作動薬活性を有する（すなわち、それらはμ-オピオイド受容体を活性化する）。μ-オピオイド活性は、クローン化μ-オピオイド受容体と結合する放射性リガンドにより、またはモルモット回腸を用いるバイオアッセイにより査定され得る（Schiller et al., Eur. J. Med. Chem., 35:895-901, 2000; Zhao et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 307:947-954, 2003）。μ-オピオイド受容体の活性化は、典型的には、鎮痛作用を引き出す。ある場合には、μ-オピオイド受容体作動薬活性を有する芳香族陽イオン性ペプチドが選択される。例えば、短期間治療の間、例えば急性疾患または症状においては、μ-オピオイド受容体を活性化する芳香族陽イオン性ペプチドを用いることが有益であり得る。このような急性疾患および症状は、しばしば、中等度または重度の疼痛と関連する。これらの場合、芳香族陽イオン性ペプチドの鎮痛作用は、ヒト患者またはその他の哺乳動物の治療レジメンにおいて有益であり得る。しかしながら、μ-オピオイド受容体を活性化しない芳香族陽イオン性ペプチドも、臨床的要件によって、鎮痛薬とともに、または伴わずに用いられ得る。
【０１１７】
代替的には、他の場合、μ-オピオイド受容体作動薬活性を有さない芳香族陽イオン性ペプチドが選択される。例えば、長期治療の間、例えば慢性疾患状態または症状では、μ-オピオイド受容体を活性化する芳香族陽イオン性ペプチドは、禁忌であり得る。これらの場合、芳香族陽イオン性ペプチドの潜在的に有害なまたは中毒性の作用は、ヒト患者またはその他の哺乳動物の治療レジメンにおいてμ-オピオイド受容体を活性化する芳香族陽イオン性ペプチドの使用を排除し得る。潜在的有害作用としては、鎮静、便秘および呼吸抑制が挙げられ得る。このような場合、μ-オピオイド受容体を活性化しない芳香族陽イオン性ペプチドが適切な治療であり得る。
【０１１８】
μ-オピオイド受容体作動薬活性を有するペプチドは、典型的には、Ｎ末端（すなわち、第一アミノ酸位置）にチロシン残基またはチロシン誘導体を有するペプチドである。チロシンの適切な誘導体としては、２’−メチルチロシン（Ｍｍｔ）；２’，６’−ジメチルチロシン（２’，６’−Ｄｍｔ）；３’，５’−ジメチルチロシン（３’５’Ｄｍｔ）；Ｎ，２’，６’−トリメチルチロシン（Ｔｍｔ）；および２’−ヒドロキシ−６’−メチルチロシン（Ｈｍｔ）が挙げられる。
【０１１９】
一実施形態では、μ-オピオイド受容体作動薬活性を有するペプチドは、式Ｔｙｒ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する。このペプチドは、アミノ酸チロシン、アルギニンおよびリシンにより与えられる３の正味正電荷を有し、アミノ酸フェニルアラニンおよびチロシンにより与えられる２個の芳香族基を有する。チロシンは、チロシンの修飾誘導体、例えば２’，６’−ジメチルチロシンであって、式２’，６’−Ｄｍｔ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する化合物を生成し得る。このペプチドは、６４０の分子量を有し、生理学的ｐＨで正味３の正電荷を保有する。ペプチドは、エネルギ依存的に、いくつかの哺乳動物細胞型の形質膜を容易に透過する。(Zhao et al., J. Pharmacol Exp Ther., 304:425-432, 2003)。
【０１２０】
μ-オピオイド受容体作動薬活性を有さないペプチドは、一般的に、Ｎ末端（すなわち、アミノ酸位置１）にチロシン残基またはチロシンの誘導体を有さない。Ｎ末端でのアミノ酸は、チロシン以外の任意の天然または非天然アミノ酸であり得る。一実施形態では、Ｎ末端のアミノ酸は、フェニルアラニンまたはその誘導体である。フェニルアラニンの例示的誘導体としては、２’−メチルフェニルアラニン（Ｍｍｐ）、２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（２’，６’−Ｄｍｐ）、Ｎ，２’，６’−トリメチルフェニルアラニン（Ｔｍｐ）および２’−ヒドロキシ−６’−メチルフェニルアラニン（Ｈｍｐ）が挙げられる。
【０１２１】
μ-オピオイド受容体作動薬活性を有さない芳香族陽イオン性ペプチドの一例は、式Ｐｈｅ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する。代替的には、Ｎ末端フェニルアラニンは、フェニルアラニンの誘導体、例えば２’，６’−ジメチルフェニルアラニン（２’，６’−Ｄｍｐ）であり得る。一実施形態では、アミノ酸位置１に２’，６’−ジメチルフェニルアラニンを有するペプチドは、式２’，６’−Ｄｍｐ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ2を有する。一実施形態では、アミノ酸配列は、ＤｍｔがＮ末端に存在しないよう再整列される。μ-オピオイド受容体作動薬活性を有さないこのような芳香族陽イオン性ペプチドの一例は、式Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ-Ｐｈｅ−ＮＨ2を有する。
【０１２２】
本明細書中で言及されるペプチドおよびその誘導体は、機能的類似体をさらに包含し得る。ペプチドは、当該類似体が既述のペプチドと同じ機能を有する場合、機能的類似体とみなされる。類似体は、例えば、１つ以上のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されるペプチドの置換変異体であり得る。ペプチドの適切な置換変異体は、保存的アミノ酸置換を包含する。アミノ酸は、以下のように、それらの物理化学的特質によって類別され得る：    （ａ）非極性アミノ酸：Ａｌａ（Ａ）Ｓｅｒ（Ｓ）Ｔｈｒ（Ｔ）Ｐｒｏ（Ｐ）Ｇｌｙ（Ｇ）Ｃｙｓ（Ｃ）；
（ｂ）酸性アミノ酸：Ａｓｎ（Ｎ）Ａｓｐ（Ｄ）Ｇｌｕ（Ｅ）Ｇｌｎ（Ｑ）；
（ｃ）塩基性アミノ酸：Ｈｉｓ（Ｈ）Ａｒｇ（Ｒ）Ｌｙｓ（Ｋ）；
（ｄ）疎水性アミノ酸：Ｍｅｔ（Ｍ）Ｌｅｕ（Ｌ）Ｉｌｅ（Ｉ）Ｖａｌ（Ｖ）；および
（ｅ）芳香族アミノ酸：Ｐｈｅ（Ｆ）Ｔｙｒ（Ｙ）Ｔｒｐ（Ｗ）Ｈｉｓ（Ｈ）。
【０１２３】
同一群における別のアミノ酸によるペプチド中のアミノ酸の置換は保存的置換として言及され、元のペプチドの物理化学的特質を保存し得る。これに対比して、異なる群における別のアミノ酸によるペプチド中のアミノ酸の置換は、一般的に、元のペプチドの特質を変更すると思われる。
【０１２４】
μ-オピオイド受容体を活性化するペプチドの例としては、表５に示される芳香族陽イオン性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない：
【表５】
0006465927.tif 000015
0006465927.tif 000016
0006465927.tif 000017
0006465927.tif 000018
【０１２５】
μ-オピオイド受容体を活性化しない類似体の例としては、表６に示される芳香族陽イオン性ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない：
【表６】
0006465927.tif 000019
【０１２６】
表５および６に示されるペプチドのアミノ酸は、Ｌ-またはＤ-型であり得る。
【０１２７】
ペプチドは、当該技術分野で周知の方法のいずれかにより合成され得る。タンパク質を化学的に合成するための適切な方法としては、例えばStuartとYoungによりSolid Phase Peptide Synthesis, Second Edition, Pierce Chemical Company (1984)に、およびMethods Enzymol., 289, Academic Press, Inc, New York (1997)に記載された方法が挙げられる。
【０１２８】
ＩＩＩ．  本発明の技法の芳香族陽イオン性ペプチドの予防的および治療的使用
概説：    本明細書中に記載される芳香族陽イオン性ペプチド、例えばＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩は、疾患または症状を防止するかまたは治療するために有用である。具体的には、本発明の開示は、腎動脈狭窄に関連した、または腎動脈狭窄の治療に関連した腎臓損傷の危険がある（またはそれが疑われる）被験体を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。いくつかの実施形態では、当該方法は、それを必要とする被験体において血管再生術を実施することを包含する。いくつかの実施形態では、血管再生術は、経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）を包含する。したがって、本発明の方法は、有効量の芳香族陽イオン性ペプチドを投与することにより、それを必要とする被験体における腎臓再還流損傷の防止および／または治療を提供する。
【０１２９】
芳香族陽イオン性ペプチドを基礎とした療法の生物学的作用の確定：    種々の実施形態において、特定の芳香族陽イオン性ペプチドを基礎とした療法の作用ならびにその投与が治療のために適応されるか否かを確定するために、適切なin vitroまたはin vivo検定が実施される。種々の実施形態において、in vitro検定は、所定の芳香族陽イオン性ペプチドを基礎とした療法が腎臓再灌流損傷を防止するかまたは治療するのに所望の作用を発揮するか否かを確定するために、代表的動物モデルを用いて実施される。治療に用いるための化合物は、ヒト被験体を試験する前に、適切な動物モデル系、例えばラット、マウス、ニワトリ、ブタ、ウシ、サル、ウサギ、ヒツジ、モルモット等で試験され得る。同様に、in vivo試験のために、当該技術分野で既知の動物モデル系のいずれかが、ヒト被験体に投与する前に用いられ得る。
【０１３０】
予防的方法：    一態様において、本発明の開示は、症状の開始または進行を防止する芳香族陽イオン性ペプチドを被験体に投与することにより、被験体における腎虚血または再灌流損傷を防止するための方法を提供する。腎臓再灌流損傷の危険がある被験体は、例えば、本明細書中に記載されるような、または当該技術分野で既知であるような診断または予後検定のいずれかまたはその組合せにより同定され得る。予防的適用では、芳香族陽イオン性ペプチドの薬学的組成物または医薬品は、疾患または症状が疑われるか、そうでなければその危険がある被験体に、疾患または症状、例えば疾患または症状の生化学的、組織学的および／または行動的症候、疾患または症状の発症中に存在するその合併症および中間の病理学的表現型の危険を排除するかまたは低減し、その重症度を低下させ、あるいはその着手を遅らせるのに十分な量で投与される。疾患または障害が防止され、代替的には、その進行を遅延されるよう、予防的芳香族陽イオン性ペプチドの投与は異所性の特徴を示す症候の症状発現前に起こり得る。適切な化合物は、上記のスクリーニング検定に基づいて決定され得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、予防方法は、１つ以上の血栓溶解薬とともに芳香族陽イオン性ペプチドを投与することを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【０１３２】
治療方法：    当該技法の別の態様は、治療目的のために芳香族陽イオン性ペプチドを被験体に投与することにより、被験体における腎臓再灌流損傷を治療する方法を包含する。治療的適用において、組成物または医薬品は、このような疾患または症状が疑われるか、または既に罹患している被験体に、疾患または症状の発症におけるその合併症および中間病理学的表現型を含めて疾患または症状の症候を治癒し、または少なくとも部分的に阻止するために十分な量で投与される。このようなものとして、当該技法は、腎臓再灌流損傷に苦しむ個体を治療する方法を提供する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、治療方法は、１つ以上の活性作用物質とともに芳香族陽イオン性ペプチドを投与することを包含する。いくつかの実施形態では、ペプチド投与は長期的である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、ペプチドは１つ以上の血栓溶解薬とともに投与される。いくつかの実施形態では、１つ以上の血栓溶解薬は、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、治療方法は、１つ以上の抗高血圧薬とともに芳香族陽イオン性ペプチドを投与することを包含する。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗高血圧薬は、利尿薬、アドレナリン作動性受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、血管拡張薬またはアルファ-２作動薬を包含する。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、前記利尿薬は、ループ利尿薬、チアジド利尿薬、チアジド様利尿薬またはカリウム保持性利尿薬を包含する。いくつかの実施形態では、前記利尿薬は、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、トルセミド、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド、インダパミド、クロルサリドン、メトラゾン、アミロリド、トリアムテレンまたはスピロノラクトンを包含する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、前記アドレナリン作動性受容体拮抗薬は、ベータ遮断薬、アルファ遮断薬または混合アルファおよびベータ遮断薬を包含する。いくつかの実施形態では、前記アドレナリン作動性受容体拮抗薬は、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンズアミン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、ブシンドロール、カルベジロールまたはラベタロールを包含する。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、前記カルシウムチャネル遮断薬はジヒドロピリジンまたは非ジヒドロピリジンを包含する。いくつかの実施形態では、前記カルシウムチャネル遮断薬は、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピン、ジルチアゼムまたはベラパミルを包含する。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、前記レニン阻害薬はアリスキレン（登録商標）を包含する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、前記アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬は、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルまたはベナゼプリルを包含する。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、前記アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬は、イルベサルタン（登録商標）を包含する。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、前記アルドステロン拮抗薬は、エプレレノンまたはスピロノラクトンを包含する。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、前記血管拡張薬拮抗薬は、ニトロプルシドナトリウムまたはヒドララジンを包含する。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、前記アルファ-２作動薬拮抗薬は、クロニジン、グアナベンズ、メチルドパ、グアネチジンまたはレセルピンを包含する。
【０１４５】
Ｖ．  投与方式および有効投与量
細胞、器官または組織をペプチドと接触させるための、当業者に既知の任意の方法が用いられ得る。適切な方法としては、in vitro、ex vivoまたはin vivo方法が挙げられる。in vivo方法は、典型的には、芳香族陽イオン性ペプチド、例えば上記のペプチドを、哺乳動物に、適切にはヒトに投与することを包含する。治療のためにin vivoで用いられる場合、芳香族陽イオン性ペプチドは、有効量（すなわち、所望の治療効果を有する量）で被験体に投与される。用量および投薬レジメンは、被験体における損傷の程度、用いられる特定の芳香族陽イオン性ペプチドの特質、例えばその治療指数、被験体および被験体の病歴によって決まる。
【０１４６】
有効量は、開業医および臨床医には周知の方法により、前臨床試験および臨床試験中に決定され得る。当該方法に有用なペプチドの有効量が、薬学的化合物を投与するために多数の周知の方法のいずれかにより、それを必要とする哺乳動物に投与され得る。ペプチドは、全身的に、または局所的に投与され得る。
【０１４７】
ペプチドは、製薬上許容可能な塩として処方され得る。「製薬上許容可能な塩」という用語は、患者、例えば哺乳動物への投与のために許容可能である塩基または酸から調製される塩（例えば、所定の投薬レジメンに関して許容可能な哺乳動物安全性を有する塩）を意味する。しかしながら、塩、例えば患者への投与のために意図されない中間化合物の塩は、製薬上許容可能な塩である必要はない、と理解される。製薬上許容可能な塩は、製薬上許容可能な無機または有機塩基に、および製薬上許容可能な無機または有機酸に由来し得る。さらに、ペプチドが、塩基性部分、例えばアミン、ピリジンまたはイミダゾール、および酸性部分、例えばカルボン酸またはテトラゾールをともに含有する場合、両性イオンが形成され得るし、本明細書中で用いられる場合、「塩」という用語内に包含される。製薬上許容可能な無機塩基に由来する塩としては、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛塩等が挙げられる。製薬上許容可能な有機塩基に由来する塩としては、第一級、第二級および第三級アミン、例えば置換アミン、環状アミン、天然アミン等塩、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、piperadine、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等が挙げられる。製薬上許容可能な無機酸に由来する塩としては、ホウ酸、カルボン酸、ハロゲン化水素酸（臭化水素酸、塩酸、フッ化水素酸またはヨウ化水素酸）、硝酸、リン酸、スルファミン酸および硫酸の塩が挙げられる。製薬上許容可能な有機酸由来の塩としては、脂肪族ヒドロキシル酸（例えば、クエン酸、グルコン酸、グリコール酸、乳酸、ラクトビオン酸、リンゴ酸および酒石酸）、脂肪族モノカルボン酸（例えば、酢酸、酪酸、蟻酸、プロピオン酸およびトリフルオロ酢酸）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）、芳香族カルボン酸（例えば、安息香酸、ｐ−クロロ安息香酸、ジフェニル酢酸、ゲンチシン酸、馬尿酸およびトリフェニル酢酸）、芳香族ヒドロキシル酸（例えば、ｏ−ヒドロキシ安息香酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸および３−ヒドロキシナフタレン−２−カルボン酸）、アスコルビン酸、ジカルボン酸（例えば、フマル酸、マレイン酸、シュウ酸およびコハク酸）、グルクロン酸、マンデル酸、ムチン酸、ニコチン酸、オロト酸、パモ酸、パントテン酸、スルホン酸（例えば、ベンゼンスルホン酸、樟脳スルホン酸、エジシル酸、エタンスルホン酸、イセチオン酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレン−１，５−ジスルホン酸、ナフタレン−２，６−ジスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸）、キシナホ酸等の��が挙げられる。いくつかの実施形態では、塩は酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩である。
【０１４８】
本明細書中に記載される  芳香族陽イオン性ペプチド、例えばＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩、例えば酢酸塩またはトリフルオロ酢酸塩は、単独で、または組み合わせて、本明細書中に記載される障害の治療または防止のために被験体に投与するために、薬学的組成物中に組み入れられ得る。このような組成物は、典型的には、活性作用物質および製薬上許容可能な担体を含む。本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」という用語は、生理食塩水、溶媒、分散媒、コーチング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等（薬学的投与と適合性）を包含する。補足的活性化合物も組成物中に組み入れられ得る。
【０１４９】
薬学的組成物は、典型的には、その意図される投与経路と適合性であるよう処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、皮内、腹腔内または皮下）、経口、吸入、経皮（局所）、眼内、イオン泳動および経粘膜投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下適用のために用いられる溶液または懸濁液は、以下の構成成分を含み得る：滅菌希釈液、例えば注射用の水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；抗細菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩、ならびに張性の調整のための作用物質、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは、酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調整され得る。非経口調製物は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回用量バイアル中に封入され得る。患者または治療医の便宜のために、治療（例えば７日治療）経過中、必要な装備（例えば、薬剤のバイアル、希釈液のバイアル、注射器および針）をすべて含有するキット中で、用量投与処方物は提供され得る。
【０１５０】
注射用に適した薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性である場合）または分散液、ならびに滅菌注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を包含し得る。静脈内投与に関して、適切な担体としては、生理学的食塩水、静菌水、クレモフォー（Cremophor）ＥＬ（登録商標）（BASF, Parsippany, N.J.）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合に、非経口投与のための組成物は滅菌性でなければならず、容易に注射可能的に存在する程度に流動性であるべきである。それは製造および貯蔵条件下で安定であるべきで、細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。
【０１５１】
芳香族陽イオン性ペプチド組成物は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る担体を含み得る。適正な流動性は、例えばレシチンのようなコーチングの使用により、分散液の場合は必要な粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により保持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チオメルサール等により達成され得る。グルタチオンおよびその他の酸化防止剤は、酸化を防止するために含まれ得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の吸収延長は、吸収を遅延する作用物質、例えばアルミニウムモノステアレートまたはゼラチンを組成物中に含むことによりもたらされ得る。
【０１５２】
滅菌注射溶液は、上記列挙した成分のうちの１つまたは組合せとともに、適切な溶媒中に必要量で活性化合物を混入し、必要に応じて、その後、濾過して滅菌することにより調製され得る。一般的に、分散液は、滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み入れることにより調製され、これは、塩基性分散媒および上記列挙のものからの必要なその他の成分を含有する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、典型的調製方法としては真空乾燥および凍結乾燥が挙げられ、これらは、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液から活性成分＋任意の付加的所望成分の粉末を生じ得る。
【０１５３】
経口組成物は、一般的には、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療的投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに組み入れられて、錠剤、トローチ剤またはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形態で用いられ得る。経口組成物は、口内洗浄剤としての使用のために流体担体を用いても調製され得る。薬学的に相溶性の結合剤および／またはアジュバント物質は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分または同様の性質の化合物のいずれかを含有し得る：結合剤、例えば微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはステロテス（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイドに酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；あるいは風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香料。
【０１５４】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴射剤、例えば気体、例えば二酸化炭素を含有する加圧容器またはディスペンサー、あるいはネブライザーからエーロゾル噴霧の形態で送達され得る。このような方法は、米国特許第６，４６８，７９８号に記載されたものを含む。
【０１５５】
本明細書中に記載されるような治療用化合物の全身投与は、経粘膜または経皮的手段によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与のために、透過されるべきバリアに適した浸透剤が処方物中に用いられる。このような浸透剤は一般的に当該技術分野で既知であり、例えば経粘膜投与のためには、洗剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻噴霧の使用により成し遂げられ得る。経皮投与のためには、活性化合物は、当該技術分野で一般的に既知であるように、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリーム中に処方される。一実施形態では、経皮投与は、イオン泳動により実施され得る。
【０１５６】
治療用タンパク質またはペプチドは、担体系中に処方され得る。担体は、コロイド系であり得る。コロイド系は、リポソーム、リン脂質二重層ビヒクルであり得る。一実施形態では、治療用ペプチドは、ペプチド完全性を保持しながら、リポソーム中に封入される。当業者が理解するように、リポソームを調製するためには種々の方法がある（Lichtenberg et al., Methods Biochem. Anal., 33:337-462 (1988); Anselem et al., Liposome Technology, CRC Press (、1993)参照）。リポソーム処方物は、クリアランスを遅延し、細胞取り込みを増大し得る（Reddy, Ann. Pharmacother., 34(7-8):915-923 (2000)参照）。活性作用物質も、製薬上許容可能な成分から調製される粒子中に、例えば可溶性、不溶性、透過性、不透性、生分解性または胃保持性ポリマーまたはリポソーム（これらに限定されない）中に詰め込まれ得る。このような粒子としては、ナノ粒子、生分解性ナノ粒子、微小粒子、生分解性微小粒子、カプセル、乳濁液、リポソーム、ミセルおよびウィルスベクター系が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５７】
担体は、ポリマー、例えば生分解性、生体適合性ポリマーマトリクスでもあり得る。一実施形態では、治療用ペプチドは、タンパク質完全性を保持しながら、ポリマーマトリクス中に包埋され得る。ポリマーは、天然、例えばポリペプチド、タンパク質または多糖、あるいは合成、例えばポリα-ヒドロキシ酸であり得る。例としては、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、多糖、フィブリン、ゼラチンおよびその組合せから作られた担体が挙げられる。一実施形態では、ポリマーは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）またはコポリ乳酸／グリコール酸（ＰＧＬＡ）である。ポリマーマトリクスは、種々の形態およびサイズで調製され、単離され、マイクロスフェアおよびナノスフェアを包含し得る。ポリマー処方物は、治療効果の持続期間延長をもたらし得る（Reddy, Ann. Pharmacother., 34(7-8):915-923 (2000)参照）。ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）に関するポリマー処方物が、臨床試験で用いられてきた（Kozarich and Rich, Chemical Biology, 2:548-552 (1998)参照）。
【０１５８】
ポリマーマイクロスフェア徐放性処方物の例は、ＰＣＴ公告ＷＯ  ９９／１５１５４(Tracy等)、米国特許第５，６７４，５３４号および第５，７１６，６４４号(ともにZale等)、ＰＣＴ公告ＷＯ  ９６／４００７３(Zale等)およびＰＣＴ公告ＷＯ  ００／３８６５１(Shah等)に記載されている。米国特許第５，６７４，５３４号および第５，７１６，６４４号、ならびにＰＣＴ公告ＷＯ  ９６／４００７３は、塩による凝集に対して安定化されるエリスロポエチンを含有するポリマーマトリクスを記載する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、治療用化合物は、身体からの迅速な排除に対して治療用化合物、例えば移植片および微小封入送達系を含めた制御放出処方物を防御する担体を用いて調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸が用いられ得る。このような処方物は、既知の技法を用いて調製され得る。当該物質は、さらにまた、例えばAlza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に得られる。リポソーム懸濁液（例えば細胞特異的抗原に対するモノクローナル抗体を有する特定細胞に標的化されるリポソーム）も、製薬上許容可能な担体として用いられ得る。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載されているように、当業者に既知の方法に従って調製され得る。
【０１６０】
治療用化合物は、細胞内送達を増強するためにも処方され得る。例えば、リポソーム送達系は、当該技術分野で既知である（例えば、Chonn and Cullis, “Recent Advances in Liposome Drug Delivery Systems,” Current Opinion in Biotechnology 6:698-708 (1995); Weiner, “Liposomes for Protein Delivery: Selecting Manufacture and Development Processes,” Immunomethods, 4(3):201-9 (1994);およびGregoriadis, “Engineering Liposomes for Drug Delivery: Progress and Problems,” Trends Biotechnol., 13(12):527-37 (1995)参照）。Mizguchi et al., Cancer Lett., 100:63-69 (1996)は、in vivo およびin vitroの両方で細胞にタンパク質を送達するための融合性リポソームの使用を記載する。
【０１６１】
治療薬の投与量、毒性および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準薬学的手法により確定され得る。毒性作用と治療効果との間の用量比が治療指数であり、それは、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表され得る。高治療指数を示す化合物が選択される。毒性副作用を示す化合物は用いられ得るが、非感染細胞に対する潜在的傷害を最小限にして、それにより副作用を低減するために、罹患組織の部位にこのような化合物を向ける送達系を設計するよう注意が払われるべきである。
【０１６２】
細胞培養検定および動物試験から得られるデータは、ヒトでの使用のための一連の投与量を処方するのに用いられ得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、毒性をほとんどまたはまったく有さないＥＤ５０を包含する一連の循環濃度内にある。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路によって、この範囲内で変わり得る。当該方法で用いられる任意の化合物に関して、治療的有効用量は、最初に細胞培養検定から概算され得る。用量は、細胞培養で確定した場合にＩＣ５０（すなわち、症候の半最大抑制を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルで処方され得る。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために用いられ得る。血漿中レベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１６３】
典型的には、治療的または予防的効果を達成するために十分な芳香族陽イオン性ペプチドの有効量は、約０．０００００１ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜約１０，０００ｍｇ／体重１ｋｇ／日の範囲である。好ましくは、投与量範囲は、約０．０００１ｍｇ／体重１ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／体重１ｋｇ／日である。例えば投与量は、１ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇを、毎日、２日毎または３日毎、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇを、毎週、２週間毎または３週間毎であり得る。一実施形態では、ペプチドの単一回投与量は、０．１〜１０，０００μｇ／体重１ｋｇの範囲である。一実施形態では、担体中の芳香族陽イオン性ペプチド濃度は、０．２〜２０００μｇ／送達１ｍｌの範囲である。例示的治療レジメンは、１回／日または１回／週の投与を課する。治療的適用において、相対的に短い間隔での相対的に高い投与量は、疾患の進行が低減されるかまたは終結されるまで、好ましくは被験体が疾患の症候の部分的または完全な改善を示すまで、時として必要とされる。その後、患者は予防的レジメンを施され得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドの治療的有効量は、１０-12〜１０-6モル、例えば約１０-7モルという標的組織での濃度と限定される。この濃度は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇの全身用量投与または体表面積による等価用量投与により送達され得る。用量投与スケジュールは、最も好ましくは１日１回または週１回投与により、標的組織での治療濃度を保持するよう最適化されるが、しかし連続投与（例えば、非経口的注入または経皮適用）も包含される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、芳香族陽イオン性ペプチドの投与量は、「低」、「中」または「高」用量レベルで提供される。一実施形態では、低用量は、約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈ、適切には約０．０００１〜約０．１ｍｇ／ｋｇ／ｈで提供される。一実施形態では、中用量は、約０．００１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、適切には約０．０１〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／ｈで提供される。一実施形態では、高用量は、約０．００５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／ｈ、適切には約０．０１〜約２ｍｇ／ｋｇ／ｈで提供される。
【０１６６】
被験体を有効に治療するために必要とされるある種の因子、例えば疾患または障害の重症度、以前の治療、被験体の全身健康状態および／または年齢、ならびに存在する他の疾患（これらに限定されない）が、投与量および時機に影響を及ぼし得る、と当業者は理解する。さらに、治療的有効量の本明細書中に記載される治療用組成物により被験体の治療は、単一治療または一連の治療を包含し得る。
【０１６７】
本発明の方法に従って治療される哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば農場動物、例えばヒツジ、ブタ、ウシおよびウマ；ペット動物、例えばイヌおよびネコ；実験室動物、例えばラット、マウスおよびウサギであり得る。適切な実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１６８】
Ｖ．  腎損傷関連腎動脈狭窄の測定
画像処理技法は、腎臓は、再還流損傷に及ぼす本発明の技法のペプチドの作用を査定するのに有用である。例えば、腎臓微小血管構築は、ＣＴ、マイクロＣＴまたはＭＲＩにより可視化され得る。代替的には、腎臓微小血管構築は、本明細書中に記載される方法と適合性である当該技術分野で既知の方法を用いて査定され得る。画像処理方法は、腎臓微小血管密度の密度および蛇行率、ならびに平均血管直径を評価するために有用である。
【０１６９】
付加的にまたは代替的には、腎臓再灌流損傷は、腎臓機能の種々のパラメーター、例えば動脈圧、腎臓容積、腎臓血流量、腎臓酸素化および糸球体濾過率（これらに限定されない）を測定することにより評価され得る。これらのパラメーターを測定するための方法は、当該技術分野で既知であり、例としては、血中酸素レベル依存性磁気共鳴画像処理（ＢＯＬＤ-ＭＲＩ）および多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）（これらに限定されない）が挙げられる。
【０１７０】
付加的にまたは代替的には、腎臓再灌流損傷は、in vitro方法、例えばアポトーシス、腎臓形態、例えば炎症および繊維症、ならびに酸化ストレスの測定（これらに限定されない）により査定され得る。アポトーシスは、当該技術分野で既知の方法、例えば末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）によるＤＮＡ断片化の検出、カスパーゼ活性化の検出および前アポトーシスタンパク質、例えばＢｃｌ-ｘＬおよびＢａｘの検出を用いて査定され得る。腎臓形態学、例えば炎症および繊維症は、当業界で既知の方法、例えばヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、三重染色、ならびにＣＤ１６３、ＭＭＰ−９、ＰＡＩ−１、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＶＥＧＲ１レベルの検出（これらに限定されない）を用いて検出され得る。酸化ストレスは、当該技術分野で既知の方法、例えばイソプロスタン、スーパーオキシ度、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ、ＤＨＥ、ＭｎＣｕＺｎ-ＳＯＤ、ＮＯシンターゼ、ヘムオキシゲナーゼおよび血漿硝酸塩／硝酸塩レベル（これらに限定されない）により測定され得る。
【実施例】
【０１７１】
以下の実施例により本発明の技法をさらに例証するが、これらはいかなる点でも本発明を限定するものではない。
【０１７２】
上記のように、虚血は、多数の組織／器官への正常血流量を妨害する微小血管系における有意の変化を生じ得る。このようなものとして、虚血／再灌流現象は、種々の組織／器官、例えば心臓、肝臓、脳、皮膚、骨格筋、腎臓等で起こり得る。本発明の技法の芳香族陽イオン性ペプチドは、種々の組織／器官における虚血／再灌流損傷を防止するかまたは治療する方法に有用である、と予測される。さらに、本発明の技法の芳香族陽イオン性ペプチドはＡＲＶＤの長期治療のための方法に有用である、と予測される。
【０１７３】
実施例１  Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与によるブタ腎臓アテローム硬化性動脈狭窄（ＡＲＡＳ）における経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）後の腎臓損傷の低減
Ａ．  要約
この実施例は、腎臓アテローム硬化性動脈狭窄（ＡＲＡＳ）に関連した腎臓損傷の防止および治療における芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の使用を実証する。本発明の方法に従って、動物被験体に、ＡＲＡＳの期間とその後の経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）による腎臓血管再生を施した。血管再生術の前および後の限定期間を含めてＰＴＲＡとともに、芳香族陽イオン性ペプチドを被験体に投与した。対照動物には、対照ビヒクル単独の注入なしまたはその注入を施した。対照被験体と比較して、ペプチドを摂取している被験体では、腎臓機能の多数の態様、例えば腎臓容積、腎臓血流量、糸球体濾過率、腎臓微小血管系密度、平均血管直径、血管蛇行率および腎臓酸素化が改善された。ペプチドの投与は、腎臓炎症、アポトーシス、繊維症および酸化ストレスも低減した。結果は、ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＡＲＡＳの治療におけるＰＴＲＡによる血管再生に関連した腎臓損傷を治療するかまたは防止する方法に有用である、ということを実証している。
【０１７４】
Ｂ．  実験計画の大要
実験予定表の要約を、表７および図１に示す。実験はすべて、ガイドラインに従って実施され、所内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された。被験体は、１６週間の観察の間、若い雌被験体（Manthei Hog Farm, LLC, MN）で構成された（図１）。ベースラインでは、動物を正常（ｎ＝７）またはＡＲＡＳ（ｎ＝２１）群で無作為化した。正常動物には正常ブタ用噛み餌を与え、ＡＲＡＳ被験体には高コレステロール餌（ＴＤ-９３２９６、Harlan-Teklad, Indianapolis, IN, USA）（これは、以前に示されているように、ＲＡＳ腎臓におけるコレステロールレベルおよび腎機能低下の増大、炎症および繊維症により特性化されるび漫性早期アテローム硬化症を誘導する）を与えた（表８参照）。
【表７】
0006465927.tif 000020
【０１７５】
６週間の期間後、ＡＲＡＳ被験体には、主腎動脈中に局所刺激用コイルを入れることにより誘導される片側性ＲＡＳを施し、一方、正常動物には擬似操作を施した。麻酔のために、動物にケタミンおよびキシラジン（０．５ｇ）の筋肉内注射で誘導して、静脈内ケタミン（０．２ｍｇ／ｋｇ／分）およびキシラジン（０．０３ｍｇ／ｋｇ／分）で麻酔を保持した。遠隔測定システム（Data Sciences International, St Paul, Minnesota, USA）を左大腿動脈中に埋め込んで、その後１０週間、平均動脈圧（ＭＡＰ）を継続的に測定した。
【０１７６】
ＲＡＳ誘導の６週間後に、動物を同様に麻酔して、狭窄の程度を血管造影法により測定し、被験体をＰＴＲＡまたはＳｈａｍで治療した。手術中、加熱パッドで動物の体温を３７℃まで保持して、ＰＴＲＡおよびステント挿入を蛍光顕微鏡下で（以前の記述通りに）実施した。さらに、ＰＴＲＡまたはＳｈａｍの３０分前から３．５時間後まで、０．０５０ｍｇ／ｋｇのペプチドまたは等容量の生理食塩水ビヒクルの連続静脈内注入で、ＡＲＡＳ被験体を治療した。基線（ペプチド注入直前）、再灌流の３０分後、および再灌流の１８０分後に、薬物動態分析のために、ならびに炎症および損傷バイおよびバイオマーカー用に、下大静脈（ＩＶＣ）試料を採取した。ペプチド注入前およびＰＴＲＡの２１０分後に、尿試料を採取した。
【０１７７】
４週間後、被験体を再び同様に麻酔して、狭窄の程度を血管造影により確定した。ＰＲＡ、クレアチニンおよびコレステロール測定のために、ＩＶＣ試料を採取した。尿試料を採取して、アルブミン濃度を定量した（ＥＬＩＳＡ、Bethyl Laboratories, Texas）。各腎臓における腎臓血行力学および機能を、多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）を用いて査定した。
【表８】
0006465927.tif 000021
【０１７８】
in vivo試験完了の３日後、動物をペントバルビタール・ナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、 Sleepaway（登録商標）、Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa, USA)で安楽死させた。腎臓を取り出し、切開して、ex vivo試験用に調製した。正常動物からの腎動脈を採取して、単離リングを、クレブス溶液を充てんした器官小室中に吊り下げて、ペプチドにおうとうする血管反応性を評価した。ミトコンドリア・バイオジェネシス、微小血管構築、アポトーシス、血管形成、炎症、酸化ストレス、尿細管損傷および繊維症を、ex vivoで評価した。
【０１７９】
片腎腎臓血行力学および機能の査定のために、ＭＤＣＴ試験を実施した。イオパニドール（０．５ｍＬ／ｋｇ／２秒）の中心静脈注入後、１４０連続スキャンを実施した。横断画像を再構築して、Analyze（商標）ソフトウェアパッケージ(Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, Rochester, MN)で分析した。皮質および髄質容積ならびに還流、ＲＢＦおよびＧＦＲを、以前に詳細に記載されたように、算定した。
【０１８０】
Ｃ．  方法
薬物動態分析
ベースライン（ペプチド注入直前）、ＰＴＲＡ直前、ならびに再還流後３０分および１８０分に、４ｍＬの静脈全血試料をペプチド処理動物から採取した。注射器を用いて、Ｋ２ＥＤＴＡ、１０ｍＬ／管を含有するBD Vacutainer（登録商標）PST（商標）血漿分離管(ラベンダートップ)中に静脈血を入れた。管を静かに８回反転させて、遠心分離まで氷水浴中に保持した。１時間以内に、１０００〜１３００ＲＣＦ（または約１５００×Ｇ）で、４℃で１５分間、スイングバケット式遠心分離機で試料を遠心分離した。血漿を個々の血液管から採取して、単一ポリプロピレン・バイアル（またはネジ蓋式管）中に入れて、検定まで約−８０℃Ｃで保存した。
【０１８１】
Ｋ２-ＥＤＴＡブタ血漿中で、定性ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ検定を用いて、Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2の血漿濃度を確定した。検定は、重水素標識ｄ5-Ｄ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2を分析内部標準（ＩＳ）として用いた。要するに、試料に内部標準を加え、タンパク質沈殿抽出により処理し（回収率約９０％）、Ｔｕｒｂｏ  Ｉｏｎ  Ｓｐｒａｙ（登録商標）ＭＳ／ＭＳ検出とともに逆相ＨＰＬＣを用いて分析した。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2およびＩＳ（ｄ5−Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2）に関する陽性（Ｍ＋２Ｈ）2＋イオンを、ＭＲＭ方式でモニタリングした。標準に関する薬剤対ＩＳピーク面積比を用いて、２．５〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲の線形較正曲線を作成した。検定精度に関する変動の日間係数は１０％未満で、精度は３．６〜１１．８％の範囲であった。
【０１８２】
炎症および損傷マーカー
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）（Invitrogen、カタログ番号ＫＳＣ３０１１）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）（R&D systems  ＤＹ６８１）、単球走化性タンパク質（ＭＣＰ−１）（Kingfisher Biotech、カタログ番号ＶＳ００８１Ｓ−００２）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（NovaTein Bio.カタログ番号ＢＧ−ＰＯＲ１１１５７）および形質転換増殖因子−β（ＴＧＦ−β）のＩＶＣレベルを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、ベースライン（ペプチド注入前）ならびにＰＴＲＡ後３０分および１８０分で測定した。同様に、血清クレアチニンレベル（ベースライン、ＰＴＲＡ後３０分および１８０分）ならびに８−エピ−イソプロスタンおよびタンパク質の尿中レベルを、ベースラインおよびＰＴＲＡ後２１０分に標準手法により測定した。
【０１８３】
血管反応性
ペプチド（またはビヒクル）に対する血管収縮および血管拡張応答を、前記と同様に、正常動物から腎動脈切片を切開し、クレブス溶液を充填した器官小室中に吊り下げて評価した。切開腎動脈切片（長さ２〜３ｍｍ、２個／動物）を、３７℃でクレブス溶液（ｐＨ＝７．４、９５％Ｏ2および５％ＣＯ2）を充填した２５ｍｌ器官小室中に吊り下げた。固定支柱に取り付けたその管腔を通したステンレスクリップおよびひずみ計を用いて、吊り下げた腎動脈切片により等尺性力を測定した。塩化カリウム（ＫＣｌ、２０ｍＭ）を用いることにより、血管リングを段階的に引っ張って、それらの長さ-張力関係に関する最適点を得た。
【０１８４】
一旦、最適張力を確定したら、対照溶液で洗浄後、血管リングを３０分間平衡させた。４つの血管リングにおいて、漸増用量のペプチド（１０-9Ｍ〜１０-4Ｍ）を投与して、血管収縮応答の存在に関して試験した。他の４つのリングでは、エンドセリン-１（１０-7Ｍ）(Phoenix Pharmaceuticals, Mountain View, CA, USA)で前収縮処理後に漸増用量のペプチドを投与して、内皮細胞弛緩を評価した。ＷｉｎＤａｑ獲得ソフトウェア(DATAQ Instruments, Inc. Akron, OH, USA)を用いて、データを定量した。
【０１８５】
アポトーシスおよびミトコンドリア・バイオジェネシス
ＴＵＮＥＬ(Promega, Madison, WI, USA)およびカスパーゼ-３(１：２００、Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)で染色した腎組織切片で、アポトーシスを査定した。さらに、アポトーシス染色調節因子タンパク質Ｂｃｌ−２(Lifespan BioSciences, Seattle, WA, USA; 1:1000)およびＢａｘ(Santa Cruz Biotechnology、１：２００)の腎臓タンパク質発現を、ウエスタン・ブロットにより評価した。
【０１８６】
ＰＧＣ−１α(Abcam、 １：１０００)、ＮＲＦ−１(Abcam, Cambridge, MA, USA;１：３００)、ＧＡＢＰ(Abcam、 １：１０００)、ＰＰＡＲ−α(Abcam、１：１０００)、ＰＰＡＲ−δ(Abcam、１：３００)、ＨＯ−１(Abcam、１：２５０)およびＳＩＲＴ−１(Abcam、１：１０００)の腎臓発現により、ミトコンドリア・バイオジェネシスを評価した。
【０１８７】
微小血管構築および血管形成
微小血管構築を評価するために、放射線不透過性シリコーンポリマー(Ｍｉｃｒｏｆｉｌ  ＭＶ１２２；Flow Tech, Carver, MA, USA)を用いて生理学的還流圧下で、腎臓を還流した。マイクロＣＴスキャナーを用いて還流腎臓切片を走査し、Ａｎａｌｙｚｅ（商標）を用いて再構築画像（１８μｍボクセル）を表示した。腎臓皮質微小血管(直径４０〜５００μｍ)の空間密度、平均直径および蛇行性を、前記と同様に算定した。さらに、ＶＥＧＦおよびその受容体（ＶＥＧＦＲ−１および２）の腎臓タンパク質発現(Santa Cruz Biotechnology;１：２００)を、ウエスタン・ブロットにより測定した。
【０１８８】
腎臓形態学および繊維症
コンピューター援用画像分析プログラムＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（登録商標）４．８．２．０(Carl ZEISS SMT, Oberkochen, Germany)を用いて、マッソン三重染色で染色した各腎臓の５μｍ中腎門横断切片で、腎繊維症を査定した。尿細管間質性繊維症および糸球体スコア（１００個の糸球体からの硬化性の％）を、１５〜２０視野で定量した。さらに、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）で染色した切片において、盲検方式で尿細管損傷をスコア付けした。要するに、尿細管損傷（拡張、肥大、円柱形成、細胞剥離または尿細管基底膜の肥厚）を、以下のように１から５までスコア付けした：０は正常である；１：損傷尿細管＜１０％；２：損傷尿細管１０〜２５％；３：損傷尿細管２６〜５０％；４：損傷尿細管５１〜７５％；５：損傷尿細管＞７５％。
【０１８９】
炎症および酸化ストレス
ＭＣＰ−１またはＣＤ１６３（腎臓マクロファージの定量)で染色した組織切片において、そしてウエスタン・ブロットにより測定されるＴＮＦ−α(Santa Cruz Biotechnology; １：２００)のタンパク質発現により、腎臓炎症を査定した。
【０１９０】
腎臓組織のジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）染色、８-エピ-イソプロスタン(ＥＩＡキット)の全身レベル、ＮＡＤＰＨ−オキシダーゼサブユニットｐ４７(Santa Cruz、１：２００)およびニトロチロシン(Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA;１：２００)の腎臓タンパク質発現により、酸化ストレスを査定した。
【０１９１】
統計学的方法
ＪＭＰソフトウェアパッケージ・バージョン８．０(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて、全データを解析した。 シャピロ・ウィルク検定を用いて、正規性からの偏差に関して試験した。正規分布データに関する平均±標準偏差（ＳＤ）、および非正規分布データに関する中位（範囲）として結果を表した。パラメトリック(ＡＮＯＶＡおよび非対応スチューデントｔ検定)および非パラメトリック(Wilcoxon and Kruskal Wallis)検定を、適宜用いた。p≦0.05の値は、統計学的に有意であるとみなされた。
【０１９２】
Ｄ．  結果
ＲＡＳの誘導および軽減
ＲＡＳの誘導の６週間後および血管再生前に、全ＡＲＡＳ動物において有意程度の狭窄が得られ（７７．５％（６５〜９５％））、平均動脈圧（ＭＡＰ）は同様に増大された（ｐ＜０．０５対正常）（図３Ａ）。
【０１９３】
ＰＴＲＡ中のペプチドおよび損傷シグナルの循環レベル
全身血漿ペプチド濃度は、注入後３０分までに治療レベル（〜１００ｎｇ／ｍＬ）に増大し、その後、注入の６０〜９０分後に、注入の末期の間中、見かけの定常状態濃度に達した（表９）。
【０１９４】
単球走化性タンパク質（ＭＣＰ-１）の全身血漿レベルは、同様に、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド動物（図１Ｂ、ともにｐ＜０．０５対ベースライン）において血管再生後に増大した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−１β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βおよびクレアチニンの全身レベルは、尿タンパク質および８-エピ-イソプロスタンレベル（図２Ａ〜Ｂ）と同様に、血管再生後も依然として変化しなかった（図１Ｃ〜Ｇ）。
【０１９５】
薬物動態分析
ペプチドＩＶ注入をＰＴＲＡ手順の３０分前に開始して、０．０５ｍｇ／ｋｇ／ｈで２１０分間継続した。注入まで３０分（ＰＴＲＡ手順の時間）での平均血漿レベルは、１００．６ｎｇ／ｍＬであった（表７）。血漿濃度は増大し続けて、約６０〜９０分で見かけの定常状態濃度（〜１２５ｎｇ／ｍＬ）に達し、注入末期を通して定常状態レベルを保持した。
【表９】
0006465927.tif 000022
【０１９６】
血管反応性
漸増量のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2に曝露された単離腎動脈リングは、直径の変化を示さなかった（図２Ｃ〜Ｄ）。この結果は、ペプチドが、血管収縮も血管拡張も誘導しない、ということを示唆している。
【０１９７】
ＰＴＲＡの４週間後の腎臓機能および構造
表８は、ＰＴＲＡまたはｓｈａｍの４週間後の全群における全身パラメーターを示す。残留狭窄はＰＴＲＡ治療動物においては観察されず、ＭＡＰは正常レベルに減少した（図３Ｂ）。血清クレアチニンレベルは、正常と比較して全ＡＲＡＳで上昇した（すべてｐ＜０．０５対正常）が、しかし血漿レニン活性（ＰＲＡ）および尿アルブミンレベルは正常被験体と同様であった。総コレステロールレベル、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）は、正常と比較して、全ＡＲＡＳで高かった。
【０１９８】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は腎臓血行力学および機能を改善した
血管再生の４週間後、皮質および髄質容積は、正常動物と比較して、全ＡＲＡＳで同様に低かった（図３Ｂ）。これに対比して、皮質および髄質還流、ＲＢＦおよびＧＦＲ（ＡＲＡＳでは有意に低減され、ＰＴＲＡ単独によって変化は認められなかった）は、ペプチド治療被験体では正常レベルに回復した（図３Ｃ〜Ｅ、すべてｐ＜０．０５対正常）。
【０１９９】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2はアポトーシスを減少し、ミトコンドリア・バイオジェネシスを促した
末端デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）およびカスパーゼ−３に関して陽性であるアポトーシス細胞の数は、正常と比較した場合、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルにおいて増大したが、しかしＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド被験体では減少した（図４Ａ〜Ｂ）。Ｂ細胞リンパ腫（Ｂｃｌ）−２の腎臓発現は群間で異なったが、しかしＰＴＲＡ中のペプチドによる治療は、前アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２−関連Ｘタンパク質（Ｂａｘ、図４Ｃ〜Ｄ）のその後の発現を有意に低減した。
【０２００】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、さらにまた、ＰＧＣ−１α、核呼吸因子（ＮＲＦ）−１、ＧＡ−結合タンパク質（ＧＡＢＰ）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）−αの発現を上方調節した（図４Ｃ〜Ｄ）。ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）−１およびＰＰＡＲ−δの腎臓発現は、全ＡＲＡＳ群において依然として同様に鈍いままであった。血管再生（補助的ペプチドを伴うかまたは伴わない）は、ＡＲＡＳで観察されたサーチュイン（ＳＩＲＴ）−１の下方調節化発現を正常レベルに回復した（図４Ｃ〜Ｄ、ｐ＞０．０５対正常）。
【０２０１】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は微小血管網を改善した
腎臓皮質微小血管の空間密度は、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクル動物において同様に低かったが、しかしＰＴＲＡ中にペプチドで治療された被験体においては正常レベルと異ならなかった（図５Ａ）。さらに、平均血管直径および蛇行性は、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルにおいて同様に増大されたが、しかしペプチド治療被験体において改善された（図５Ｂ）。ＶＥＧＦおよびその受容体（ＶＥＧＦＲ−１および２）の腎臓発現は、正常と比較して、ＡＲＡＳにおいては低く、ＰＴＲＡ＋ビヒクルで治療された動物においては依然として低減されたままであった。しかしながら、ＰＴＲＡ＋ペプチドによる治療は、それらを正常と同様のレベル（ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２）または正常を上回るレベル（ＶＥＧＦ）に回復させた（図５Ｃ）。
【０２０２】
酸化ストレスはＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2で治療された動物において減少した
８−エピ−イソプロスタンの全身レベルは、正常と比較して、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルにおいて増大されたが、しかしＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド被験体においては正常レベルに減少された（表８、ｐ＞０．０５対正常）。同様に、狭窄後腎臓におけるスーパーオキシド陰イオンのin-situ産生は、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルにおいて有意に増大されたが、しかし、ｐ４７およびニトロチロシンの腎臓発現（図６Ｂ、ともにｐ＞０．０５対正常）と同様に、ペプチドで治療された動物においては正常と異ならないレベルに減少された（図６Ａ）。
【０２０３】
炎症はペプチド治療被験体において根絶された
ＭＣＰ−１免疫反応性は、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルにおいては等しく上方調節されたが、しかし腎臓に浸潤するＣＤ１６３＋マクロファージの数と同様に、ペプチドで治療された被験体において改善された（図７Ａ〜Ｂ）。同様に、ＴＮＦ−αの腎臓発現増大は、ペプチド治療被験体においてのみ正規化された（図７Ｃ）。
【０２０４】
ＰＴＲＡ中の炎症および損傷マーカー
単球走化性タンパク質（ＭＣＰ-１）の血漿レベルは、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド動物において、血管再生後に同様に増大した（図１Ｂ、ともにｐ＜０．０５対ベースライン）。しかしながら、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターロイキン（ＩＬ）−１β、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−βの血漿レベル、または血清クレアチニンレベルは、血管再生直後に変化しなかった（図１Ｃ〜Ｇ）。
【０２０５】
タンパク尿ならびに８-イソプロスタンおよびＴＧＦ-βの尿中レベルは、ＰＴＲＡ後も依然として変化しなかった（図２Ａ〜Ｂ）。
【０２０６】
ペプチドによる治療は尿細管傷害および腎臓瘢痕を減少させた
尿細管損傷スコアは、全ＡＲＡＳ群においては正常より高かった（すべてｐ＜０．０５）が、しかしＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド被験体においては、根絶はされなかったが、有意に減少された（図８Ａ）。
【０２０７】
前繊維症マーカー  フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶの免疫染色は、ＡＲＡＳおよびＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ビヒクルにおいて増大されたが、しかしペプチド治療被験体においては低減された（図８Ｂ〜Ｃ）。尿細管間質性繊維症および糸球体スコアも、正常と比較して、全ＡＲＡＳにおいて高かったが、しかしＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド被験体においては有意に低減された（図９Ａ〜Ｂ）。プラスミノーゲン活性因子阻害剤（ＰＡＩ）−１の腎臓発現は、両ＰＴＲＡ群で有意に弱められた（ともにｐ＞０．０５対正常）が、しかし、ＴＧＦ−β１発現は、ペプチド治療被験体においてのみ、正常レベルに回復された（図９Ｃ）。
【０２０８】
Ｅ．  考察
本試験は、アテローム硬化性腎血管性疾患における血管再生に対する腎臓応答減衰におけるｍＰＴＰ開口の関与を実証する。さらに、それは、ブタＡＲＡＳにおける閉塞性腎動脈病変の血管再生後の腎臓構造的および機能的結果を保持するためのミトコンドリア標的化ペプチドに関する新規の役割を確立する。血管再生の４週間後、ミトコンドリア・バイオジェネシスは、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋ペプチド被験体で上方調節されたが、一方、酸化ストレス、細胞アポトーシス、微小血管粗鬆化および組織損傷は、それらの狭窄後腎臓において改善された。さらに、狭窄性腎臓還流、ＲＢＦおよびＧＦＲはペプチド治療被験体で正規化されたが、これは、アテローム硬化性腎臓血管性疾患における腎臓機能結果を改善するためにＰＴＲＡと協力するペプチドの腎臓保護作用を明示している。このようなものとして、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ミトコンドリア・バイオジェネシスを上方調節するための方法において有用であり、狭窄後腎臓を有する被験体における酸化ストレス、細胞アポトーシス、微小血管粗鬆化および組織損傷を減少させる。さらに、芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、アテローム硬化性腎臓血管性疾患における腎臓機能的結果を改善するためにＰＴＲＡと協力する腎臓保護作用を提供するための方法において有用である。
【０２０９】
ＡＲＡＳは、酸化的傷害、アポトーシス、炎症および間質性繊維症を増大するいくつかの機序を活性化して、腎機能悪化をもたらし、そして閉塞腎動脈の血管再生は、潜在的に限定的な治療選択肢として出現した。さらにまた、ステント挿入法＋投薬療法と投薬療法単独を比較する大規模無作為化対照試験は、腎動脈開存性の改善と血管再生後の腎臓結果との間の乖離を示した。ＰＴＲＡは狭窄性ブタ腎臓における構造的および機能的悪化を逆転できなかった、ということが以前に示されており、これは、継続的アポトーシスおよび酸化ストレスを伴い、ＡＲＡＳにおける腎機能を改善するためにＰＴＲＡと組み合わせたより有効な戦略の必要性を強調している。
【０２１０】
ＰＴＲＡ中の腎組織傷害を永続させる機序の１つは急性ＩＲＩであり、これは、ＲＯＳの産生および炎症機序の活性化を包含する。さらに、実験および臨床データは、ＩＲＩ後の細胞死を加速するに際してのｍＰＴＰ開口の役割を支持する。ＲＯＳの過剰産生は、ｍＰＴＰ開口および細胞基質中へのチトクロームの放出をもたらし、これは、アポトーシス（カスパーゼ３および９を活性化することによる）だけでなく、細胞基質中へのミトコンドリアＲＯＳの放出に派生する尿細管傷害も誘発する。それゆえ、ｍＰＴＰを選択的に標的にする治療的介入は、細胞保護を付与し、腎不全への進行を緩和する。
【０２１１】
いくつかの動物モデルにおける従来の研究は、アポトーシスを抑制し、酸化ストレスを弱めることにより、ミトコンドリア標的化ペプチドの保護作用を実証している。抗アポトーシス作用（ｍＰＴＰの開口の抑制により達成される）のほかに、ＲＯＳを補足し、ミトコンドリア内膜（ＲＯＳ産生のための主要部位）で濃縮するそれらの能力は、他の抗酸化剤療法と比較して、酸化ストレスを抑制するための並外れた効能を有するこれらの小ペプチドを提供する。実際、血管再生直前のシクロスポリン（ｍＰＴＰの強力な阻害剤）による治療は、急性心筋梗塞を有する患者におけるより小さな梗塞と関連しており、これらの治療的介入の臨床的重要性を強調する。しかしながら、その治療能力は、少なからぬ副作用により制限される。
【０２１２】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、ミトコンドリア内膜において極端に高い濃度に達して、抗アポトーシスおよび酸化防止特性を発揮する細胞透過性テトラペプチドである。他のｍＰＴＰ阻害剤と違って、本発明の技法のペプチドは、既知の免疫抑制作用を有さない。実験的げっ歯類モデルにおける近年の研究は、梗塞サイズを低減し、高血圧性心筋症を弱めるに際しての本発明の技法のペプチドの有益な作用を示した。さらに、それは、急性虚血再灌流損傷および片側性尿管閉塞のラットモデルにおいて、間質性繊維症を防止し、尿細管細胞再生を加速し、このことは、損傷腎臓の機能および構造を保持するためのこの薬剤に関する効能を示唆している。この試験は、ＰＴＲＡ中のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による治療が、ミトコンドリア・バイオジェネシスを回復し、アポトーシスおよび酸化ストレスを弱めて、結局、慢性ブタＡＲＡＳにおける腎機能改善をもたらす。
【０２１３】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の強力な抗アポトーシス作用は、この試験では、ＴＵＮＥＬ＋カスパーゼ-３＋細胞の数の低減により反映された。さらに、前アポトーシスタンパク質Ｂａｘの腎臓発現は、ペプチド治療被験体において実質的に減少され、これは、アポトーシスの開始を防止するよう配向される療法の有効性を生じる。付加的には、ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による治療は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ-オキシダーゼ（ｐ４７ｐｈｏｘ）およびニトロチロシンのＲＯＳ産生および発現低減により立証されるように、酸化ストレスマーカー８-イソプロスタンの全身レベルおよび腎臓酸化ストレスを低減した。
【０２１４】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2治療後の全身性および腎臓性酸化ストレスにおけるこの低減は、狭窄腎臓における微小血管網の保存に寄与したと思われる。ＲＯＳの産生の増大または延長は、腎臓微小血管の完全性を危うくして、腎臓損傷の進行および血管再生に対する応答の重要な決定因子であるリモデリングまたは粗鬆化をもたらす。近年の研究において、微小血管損失は、皮質微小血管の空間密度増大および平均直径減少において反映されるように、ＡＲＡＳ＋ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2被験体において弱められたが、一方、微小血管未成熟を反映する蛇行性は減少した。理論に縛られずに考えると、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、さらにまた、血管細胞アポトーシスを鈍らせ、血管形成を促進することにより微小血管損失を防止し得たが、これは、血管形成因子ＶＥＧＦおよびその受容体の腎臓発現増大により示唆される。
【０２１５】
腎臓炎症は、ＡＲＡＳにおける疾患進行の重要決定因子である。酸化ストレス増大は、狭窄性ブタ腎臓におけるマクロファージおよびリンパ球の浸潤と関連しており、これは、血管再生に対する不十分な腎臓応答と関連づけられ、長期酸化防止剤補足により弱められる、ということが従来示されている。注目すべきは、ＭＣＰ-１の正規化尿細管-間質性発現により立証されるように、ＰＴＲＡ中のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による短期治療が、４週間後に腎臓炎症を根絶したことであったが、これは、狭窄性腎臓におけるＣＤ１６３マクロファージの浸潤低減を説明し得た。その強力な抗炎症作用は、前炎症性サイトカインＴＮＦ-αの正規化腎臓発現によっても支持された。重要なことは、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での治療後に減少された炎症、酸化ストレスおよびアポトーシスが、すべて、尿細管傷害を弱め得たことで、これは尿細管損傷スコア低減により反映される。したがって、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2は、尿細管刷子縁を保存し、尿細管細胞剥離を最小限にすることにより、ラットにおける急性虚血誘導性尿細管傷害を弱めた。
【０２１６】
ミトコンドリア・バイオジェネシスは、ペプチドで治療された動物において促進され、ＰＧＣ-１α、ＮＦＲ-１、ＧＡＢＰおよびＰＰＡＲ-αのレベル回復により明らかにされたが、これは酸化ストレスおよび炎症の改善におけるこの経路の活性化に関与する。ＮＲＦ-１およびＧＡＢＰ（ＮＲＦ-２としても知られている）のＰＧＣ-１α媒介性活性化は、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ（ＮＱＯ１）のような解毒酵素の発現を調節するヒト酸化防止剤応答因子（ｈＡＲＥ）を結合することにより、酸化ストレスに関与する多数の遺伝子の発現を調節する。さらに、ペプチド誘導性ミトコンドリア・バイオジェネシスは、ＨＯ-１酵素活性を増大することによりマクロファージおよび内皮細胞炎症応答を調節する腎臓において高度に発現される転写因子であるＰＰＡＲ-αの発現を上方調節したが、しかし、ＨＯ-１発現は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2治療群では抑圧されたままであった。同様に、ＰＰＡＲ-δおよびＳＩＲＴ-１の腎臓発現は、ペプチド治療被験体においては依然として下方調節されたままで、これは、ＰＴＲＡ後のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2誘導性炎症減衰にそれらが保護的に寄与することと反対の結論を示している。総合すると、これらの観察は、ＰＴＲＡ中のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の補助的注入が、ミトコンドリア・バイオジェネシスの急性低下を防止し得た、ということを示し、これは、４週間後に持続される腎臓機能および構造改善を説明し得た。
【０２１７】
ＰＴＲＡ＋Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による治療は、尿細管-間質性および糸球体繊維症を４週間後に減少させるが、これは、フィブロネクチンおよびコラーゲンＩＶ含量減少と関連した。さらに、繊維形成因子ＴＧＦ-βおよびＰＡＩ-１の腎臓発現は、ペプチド治療動物で正規化され、おそらくは、腎臓酸化ストレスレベル減少により助長される。次いで、これらは、ペプチド治療被験体における腎臓血行力学および機能改善に寄与し得たが、これは正規化単腎還流、ＲＢＦおよびＧＦＲにより立証され、ＡＲＡＳにおける腎機能不全を減じるためのペプチドの実現可能性を強調する。しかしながら、これらの作用は、in vitroでのペプチドに応答する腎臓血管反応性の欠如を考えると、血管の調子の直接的調節のためとは思われない。狭窄性腎臓ＧＦＲの改善にもかかわらず、血清クレアチニンレベルは依然としてわずかに高いままで、おそらくは、高コレステロール血症に関連した非狭窄性腎臓における何らかの残留性または高血圧性傷害あるいは腎機能不全のためであり、残存する異脂肪血症に対するより標的化された治療を保証し得る。
【０２１８】
ＰＴＲＡ後３時間枠内に炎症または酸化媒介物質の検出可能な急性変化は認められなかったが、但し、ＭＣＰ-１は増大しており、これはＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2により影響されなかった。ＰＴＲＡ中のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2への曝露は、４週間後に持続された強力な保護作用を付与するのに十分であった。
【０２１９】
ＡＲＡＳのこのブタモデルは、早期アテローム硬化症の作用を再現し、臨床的に適用可能なツールを用いて単腎機能および構造を試験するのを可能にして、腎臓機能を改善し、ＡＲＡＳ腎臓におけるアポトーシスおよび繊維症への進行を低減するためのペプチドの潜在的作用を査定する機会を提供する。
【０２２０】
総合的には、これらの結果は、アテローム硬化性腎臓血管性疾患の血管再生におけるｍＰＴＰ開口の重要性を強調し、ブタＡＲＡＳにおけるアポトーシス、炎症および酸化ストレスを減少させるためにＰＴＲＡと協力するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の腎臓保護作用を明示する。さらに、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による治療は、ミトコンドリア・バイオジェネシスを上方調節し、血管形成を改善して、結局は、ＡＲＡＳにおける血管再生後の腎臓血行力学および機能を改善した。これらの結果は、慢性腎臓血管性疾患におけるＰＴＲＡ御の応答の改善に際してのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2に関する独特の役割を明らかにした。
【表１０】
0006465927.tif 000023
【０２２１】
これらの結果は、本発明の技法のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＲＡＳを有する被験体におけるＰＴＲＡによる血管再生に関連した腎臓損傷の治療および防止のための方法において有用である、ということを実証している。特に、これらの結果は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与が再灌流関連損傷に対して微小血管を保護し、非治療対照と比較して改善された腎機能をもたらし、そしてＲＡＳに関して治療された被験体の予後改善をもたらす、ということを実証する。
【０２２２】
実施例２：  Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与によるヒトアテローム硬化性動脈狭窄（ＡＲＡＳ）における経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）後の腎臓損傷の低減
Ａ．  要約
この実施例は、ヒトにおける腎臓アテローム硬化性動脈狭窄（ＡＲＡＳ）に関連した腎臓損傷の防止および治療における芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の使用を実証する。本発明の方法に従って、ＡＲＡＳを有するヒト被験体は、経皮経血管性腎臓血管形成術（ＰＴＲＡ）による腎臓血管再生を受けた。血管再生術の前および後の限定期間を含めてＰＴＲＡとともに、芳香族陽イオン性ペプチドを被験体に投与した。対照被験体には、対照ビヒクル単独の注入なしまたはその注入を施した。対照被験体と比較して、ペプチドを摂取している被験体では、腎臓機能の多数の態様、例えば腎臓容積、腎臓血流量、糸球体濾過率、腎臓微小血管系密度、平均血管直径、血管蛇行率および腎臓酸素化が改善されると予測される。結果は、ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ヒトでのＡＲＡＳの治療においてＰＴＲＡによる血管再生に関連した腎臓損傷を治療するかまたは防止する方法に有用である、ということを実証している。
【０２２３】
Ｂ．  実験計画の大要
ＡＲＡＳを有するヒト被験体を、実験群と対照群に無作為化する。被験体をステント挿入を伴うＰＴＲＡにより治療し、ＰＴＲＡの３０分前の時点からＰＴＲＡ後３時間まで、芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（０．０５ｍｇ／ｋｇ  ＩＶ）を補助的連続注入する。要するに、タンタルステントにより包まれるバルーンカテーテルを蛍光顕微鏡ガイダンス下で腎動脈の近位中央断面に噛み合わせ、膨らませると、完全直径に拡大して、管腔開口を回復する。バルーンを萎ませて、取り出し、ステントを血管壁に埋め込まれたままにしておく。実験被験体を、ＰＴＲＡの３０分前から３時間半後まで、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の単一連続静脈内注入で治療する。対照被験体には、注入を施さないか（「無注入対照」）または生理食塩水ビヒクルのみを注入する（「ビヒクル対照」）。ＰＴＲＡの４週間後、血管造影により狭窄の程度を確定し、全身および腎静脈血液試料の両方を、血漿レニン活性およびクレアチニン測定のために採取する（GammaCoat ＰＲＡキット; DiaSorin, Inc., Stillwater, Minnesota, USA）。各腎臓における腎臓血行力学および機能を、ＭＤＣＴを用いて査定し、腎臓酸素化をＢＯＬＤ  ＭＲＩにより査定する。
【０２２４】
Ｃ．  方法
血中酸素レベル依存性磁気共鳴画像処理（ＢＯＬＤ-ＭＲＩ）  -  ＰＴＲＡの４週間後に、ＢＯＬＤ-ＭＲＩを３  Ｔｅｓｌａ  (Signa Echo Speed; GE Medical Systems, Milwaukee, WI)で実施して、カスタマイズ化腹部器官プロトコールを用いて、腎臓の髄質および皮質領域におけるＲ２*レベルを測定する。ＢＯＬＤ法の原理は、以前の出版物で詳細に記載されている。要するに、常磁性分子は、磁場摂動を誘導する。血中で、オキシヘモグロビンは反磁性であり、その濃度はＴ２*に影響を及ぼさないが、しかしデオキシヘモグロビンは常磁性であり、組織Ｔ２*を減少させる。したがって、勾配ＭＲＩ獲得のエコー時間が増大すると、ＭＲＩシグナル減衰は、デオキシヘモグロビンの濃度増大に伴って増大する。Ｌｎ（強度）対エコー時間の傾斜は緩和時間率Ｒ２*（＝１／Ｔ２）と等しく、デオキシヘモグロビンの濃度と直接的に比例する。ベースラインＢＯＬＤ獲得後、フロセミド（２０ｍｇ）を静脈内投与して、２ｍｌの生理食塩水で洗い流す。ＢＯＬＤ測定を、１５分後に反復する。データ分析のために、各実験期間における最良の解剖学的詳細を提供する７-ｍｓエコー時間画像で、皮質および髄質において当該領域を手動でトレースする。各エコー時間に関して、ソフトウェアは、各々の当該領域内のＭＲシグナルの平均を自動的に計算する。ＢＯＬＤシグナルが、緩和性Ｒ２*により特性化されるように、次いで測定される。ベースラインからフロセミドまでのＲ２*の変化は、「デルタ-Ｒ２*」として確定される。
【０２２５】
多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）  -  ＢＯＬＤ  ＭＲＩの１〜２日後に、ＭＤＣＴを用いて各腎臓における腎臓血行力学および機能を査定する。ＭＤＣＴは、単腎容積、局部的還流、血流量、糸球体濾過率（ＧＦＲ）および尿細管機能の精確且つ非侵襲的定量を提供する超速スキャナーである。要するに、イオパミドール（０．５ｍＬ／ｋｇ／２秒）の中心静脈注入後の４５連続スキャン後に、画像が得られる。ＭＤＣＴ画像は、Analyzeソフトウェアパッケージ（Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, MN, USA）を用いて再構成され、表示される。大動脈、腎臓皮質および髄質からの横断面画像から、当該領域を選択する。各領域における平均組織減衰を経時的にプロットし、曲線適合アルゴリズムにより適合させて、腎機能の測定値を得る。皮質および髄質容積を、皮質および髄質還流の生成物ならびに対応する容積の和として、Ａｎａｌｙｚｅ（Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, MN, USA）およびＲＢＦを用いて算定する。近位尿細管曲線の傾斜を用いて、皮質曲線からＧＦＲを算定する。アセチルコリン（Ａｃｈ）（５μｇ／ｋｇ／分）の１０分副腎注入の終わりに向けて、１５分後に同一手順を反復して、内皮依存性微小血管反応性を試験する。頸動脈から導入されるトラッカーカテーテル（Prowler Microcatheter, Cordis, Miami, FL, USA）を、Ａｃｈの注入のために腎動脈上に配置する。したがって、血行力学および機能は、ベースラインでの安定３分観察期間およびＡｃｈ注入中に測定される。
【０２２６】
血漿硝酸塩／亜硝酸塩レベル  -  メーカーの使用説明書に従って、市販のキット（酸化窒素定量キット、Active Motif, Carlsbad, CA）を用いて２段階検定により、血漿硝酸塩／亜硝酸塩レベルを定量する。
【０２２７】
薬物動態分析：
血液試料採取および取扱い
１．生物分析的検定開発のための対照血液試料採取：  ２０ｍＬの静脈全血試料を採取する。Ｋ２ＥＤＴＡ（１０ｍＬ／管）を含有するＢＤ  Vacutainer（登録商標）ＰＳＴ（商標）血漿分離管(lavender top)中に、注射器を用いて静脈血を引き抜く。管を静かに８回反転させて、遠心分離まで氷水浴中に保持した。血液試料採取後１時間以内に、１０００〜１３００ＲＣＦ（または約１５００×Ｇ）で、４℃で１５分間、スイングバケット式遠心分離機で試料を遠心分離する。血漿を個々の血液管から採取して、単一ポリプロピレン・バイアル（またはネジ蓋式管）中に入れて、−７０℃で保存する。
【０２２８】
２．ＰＫおよびバイオマーカー分析のための血液試料採取：  静脈全血試料を、ＰＫ分析のために、ならびにバイオマーカー分析、および以下で特定される時点でのその他の炎症バイオマーカーのために、採取する。
【０２２９】
（ｉ）ＰＫ分析：  Ｋ2ＥＤＴＡを含有するＢＤ  Vacutainer（登録商標）ＰＳＴ（商標）血漿分離管(lavender top)中に、注射器を用いて、以下の時点で４ｍＬ静脈全血を採取する：Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2注入直前、ＰＴＲＡ直前、ならびに再灌流後３０、６０および１８０分。ＰＫ血液管を静かに混合し、直ちに氷中に入れる(氷浴または砕氷)。採取の３０分以内に、１５００×Ｇで４℃で１５分、試料を遠心分離した後、２つの血漿アリコート(各々約０．５ｍＬ)を取り出し、直ちにネジ蓋付ポリプロピレン管中に入れる。個々の血漿試料をドライアイス上で急速冷凍して、分析まで−７０°Ｃ±１５°Ｃで保存する。
【０２３０】
（ｉｉ）バイオマーカー分析：  ＢＤ  Vacutainer（登録商標）ＰＳＴ（商標）血漿分離管(lavender top)中に、以下の時点で４ｍＬ静脈全血を採取する：Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2注入直前、ＰＴＲＡ直前、ならびに再灌流後３０、６０および１８０分。充填後、管を少なくとも５回反転させる。管を約１時間室温に保持して、血液を凝固させ、血清試料を収集するために遠心分離する。血清が生じない場合は、以下のベースライン参照を用いる：凝固後、スイングバケット中での遠心分離を、室温で固定角ローター中で、１０００〜１３００ＲＣＦで１０分間または１５分間実施する。血清を５本のポリプロピレン管中に収集し（各々約０．５ｍＬの血清を含有する）、−７０℃で保存する。
【０２３１】
尿試料採取および取扱い
１．生物分析的検定開発のための対照尿試料採取：  １０ｍＬの対照尿試料を、各被験体から採取する。試料を、約１５００×Ｇで１０分間、遠心分離して、あらゆる破砕屑を除去する。試料をポリプロピレン・バイアル中に入れて、−７０℃で保存する。
【０２３２】
２．Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2測定のための尿試料採取：  Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2注入の最後（２１０分）に、あらかじめ計量した容器中に出して膀胱を空にする。試料と容器の併合重量を測定して、記録する。十分に混合した後、２つの１０ｍＬアリコートをラベルを貼ったネジ蓋式ポリプロピレン管中に分配する。個々の尿試料をドライアイス上で急速冷凍して、試験まで−７０℃±１５℃で保存する。
【０２３３】
統計学的方法
結果を、平均±ＳＥＭとして表す。対応スチューデントｔ検定を用いて群内の比較を、ＡＮＯＶＡを用いて群間の比較を実施し、その後、テューキー検定を実施する。全検定に関する統計学的有意は、ｐ≦０．０５に関して許容される。
【０２３４】
Ｄ．  結果
ＰＴＲＡ後、全被験体が、正常対照の値に匹敵するレベルへの平均動脈圧の低下を示す（ｐ＞０．０５）、と予測される。さらに、ＰＴＲＡと一緒にＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2注入を受けている被験体は、対照被験体と比較して、改善された腎臓容積、腎臓血流量、糸球体濾過率、腎臓微小血管密度、平均血管直径、血管蛇行率および腎臓酸素化を示す。
【０２３５】
Ｅ．  結論
これらの結果は、本発明の技法のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＲＡＳを有するヒト被験体において、ＰＴＲＡによる血管再生に関連した腎臓損傷の治療および防止のための方法に有用である、ということを実証する。特に、これらの結果は、ペプチドの投与が再灌流関連損傷に対して腎臓微小血管を保護して、対照被験体と比較して改善された腎機能を、そしてＲＡＳに関して治療された被験体に関する改善された予後をもたらす、ということを実証する。
【０２３６】
実施例３：  Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与によるブタアテローム硬化性腎臓動脈狭窄（ＡＲＡＳ）における腎臓悪化の低減
Ａ．  要約
この実施例は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与が、血管介入で治療されないＡＲＡＳ被験体における腎細胞アポトーシスおよび炎症、酸化ストレス、繊維症、ならびに腎臓機能的-構造的悪化を弱める、ということを実証する。この実施例の結果は、ＰＴＲＡに関する候補でないＡＲＡＳ被験体に特に関係がある。
【０２３７】
Ｂ．  実験計画の大要
１０週間のＡＲＡＳ後、ならびにＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2または生理食塩水ビヒクルの長期皮下（ＳＣ）注入４週間後、ブタの２つの群を試験する（表１１、１２）。多検出器コンピューター断層撮影および血中酸素レベル依存性磁気共鳴を用いて、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またで治療されない、または治療された被験体において、単腎容積、還流、腎臓血流量、糸球体濾過率および酸素化を試験する。埋め込み可能な遠隔測定用送量装置を用いて、血圧を毎日追跡する。腎臓炎症、アポトーシス、繊維症、血管形成および酸化ストレスに及ぼすＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の作用を、標準in vitroプロトコールを用いて査定する。腎臓微小血管構築に及ぼすＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の作用を、マイクロコンピューター断層撮影を用いてex vivoで試験する。
【０２３８】
所内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）による承認後、１６週間の観察期間中、１４匹のブタ（５０〜６０ｋｇ）を試験する。ベースラインで、全被験体は、び漫性早期アテローム硬化症が狭窄に先行する臨床状況をシミュレートするために、２％コレステロールおよび１５％ラードを含有する高コレステロール餌を開始する（表１２）。６週間後、ＡＲＡＳ被験体を、０．５gの筋肉内ケタミンおよびキシラジンで麻酔して、静脈内ケタミン（０．２ｍｇ／ｋｇ／分）およびキシラジン（０．０３ｍｇ／ｋｇ／分）で麻酔を保持した。主腎動脈中に局所刺激用コイルを入れることによりＲＡＳを誘導し、これは、Chade et al., FASEB J 2006; 20: 1706-1708に記載されたように、片側性ＲＡＳの漸次発症をもたらす。
【表１１】
0006465927.tif 000024
【表１２】
0006465927.tif 000025
【０２３９】
ＲＡＳ（またはｓｈａｍ）の誘導後、遠隔測定システムを左大腿動脈中に埋め込んでＭＡＰを測定し、さらに１０週間動物を追跡調査する。各試験前の最後の２週間における平均ＭＡＰを算定する。ＲＡＳの誘導の６週間後に、動物を同様に麻酔して、狭窄の程度を血管造影法により測定する。ｓｈａｍ手順を全被験体で実施するが、これは、腎動脈の評価と、造影剤注入を伴う選択的腎臓血管造影を包含する。さらに、７匹のＡＲＡＳ被験体は、毎週５日、毎日１回、生理食塩水中の０．１ｍｇ／ｋｇのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の長期ＳＣ注入による治療を開始する。生理食塩水ビヒクルを、他の７匹のＡＲＡＳ被験体に投与する（表１２）。
【０２４０】
４週間後、被験体を再び同様に麻酔する。狭窄の程度を血管造影により確定し、全身および腎臓静脈の両方の血液試料を、血漿レニン活性（GammaCoat ＰＲＡキット; DiaSorin, Inc., Stillwater, Minnesota, USA）、およびクレアチニン測定のために採取する。各腎臓における腎臓血行力学および機能を、多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）を用いて査定し、腎臓酸素化を血中酸素レベル依存性磁気共鳴画像処理（ＢＯＬＤ  ＭＲＩ）により査定する（表１３）。
【０２４１】
全試験完了後、被験体を、１００ｍｇ／ｋｇという致死静脈内用量のペントバルビタール・ナトリウム（Ｓｌｅｅｐａｗａｙ、Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa, USA)で安楽死させる。腹膜後切開を用いて腎臓を取り出し、直ちに切開して、切片を液体窒素中で凍結させ（そして−８０℃で保持）、あるいはin vitro試験のためにホルマリン中で保存する（表１３）。
【０２４２】
Ｃ．  方法
血中酸素レベル依存性磁気共鳴画像処理（ＢＯＬＤ-ＭＲＩ）  -  注入の４週間後に、ＢＯＬＤ-ＭＲＩを３  Ｔｅｓｌａ(Signa Echo Speed; GE Medical Systems, Milwaukee, WI)で実施して、前記と同様に、カスタマイズ化腹部器官プロトコールを用いて、腎臓の髄質および皮質領域におけるＲ２*レベルを測定する。呼吸一時停止中に、ＭＲＩ実験を実施する。ＢＯＬＤ法の原理は、以前の出版物で詳細に記載されている。要するに、常磁性分子は、磁場摂動を誘導する。血中で、オキシヘモグロビンは反磁性であり、その濃度はＴ２*に影響を及ぼさないが、しかしデオキシヘモグロビンは常磁性であり、組織Ｔ２*を減少させる。したがって、勾配ＭＲＩ獲得のエコー時間が増大すると、ＭＲＩシグナル減衰は、デオキシヘモグロビンの濃度増大に伴って増大する。Ｌｎ（強度）対エコー時間の傾斜は緩和時間率Ｒ２*（＝１／Ｔ２）と等しく、デオキシヘモグロビンの濃度と直接的に比例する。ベースラインＢＯＬＤ獲得後、フロセミド（２０ｍｇ）を耳静脈カテーテル中に静脈内投与して、２ｍｌの生理食塩水で洗い流す。ＢＯＬＤ測定を、１５分後に反復する。データ分析のために、各実験期間における最良の解剖学的詳細を提供する７-ｍｓエコー時間画像で、皮質および髄質において当該領域を手動でトレースする。各エコー時間に関して、ソフトウェアは、各々の当該領域内のＭＲシグナルの平均を自動的に計算する。ＢＯＬＤシグナルが、緩和性Ｒ２*により特性化されるように、次いで測定される。最後に、ベースラインからフロセミドまでのＲ２*の変化は、「デルタ-Ｒ２*」として確定される。
【０２４３】
多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）  -  ＢＯＬＤ  ＭＲＩの１〜２日後に、ＭＤＣＴを用いて各腎臓における腎臓血行力学および機能を査定する。ＭＤＣＴは、単腎容積、局部的還流、ＲＢＦ、ＧＦＲおよび尿細管機能の精確且つ非侵襲的定量を提供する超速スキャナーである。要するに、イオパミドール（０．５ｍＬ／ｋｇ／２秒）の中心静脈注入後の１６０連続スキャン後に、画像が得られる。ＭＤＣＴ画像は、Analyzeソフトウェアパッケージ（Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, MN, USA）を用いて再構成され、表示される。大動脈、腎臓皮質および髄質からの横断面画像から、当該領域を選択する。各領域における平均組織減衰を経時的にプロットし、曲線適合アルゴリズムにより適合させて、腎機能の測定値を得る。皮質および髄質容積を、皮質および髄質還流の生成物ならびに対応する容積の和として、ＡｎａｌｙｚｅおよびＲＢＦにより算定する。近位尿細管曲線の傾斜を用いて、皮質曲線からＧＦＲを算定する。アセチルコリン（Ａｃｈ）（５μｇ／ｋｇ／分）の１０分副腎注入の終わりに向けて、１５分後に同一手順を反復して、内皮依存性微小血管反応性を試験する。頸動脈から導入されるトラッカーカテーテル（Prowler Microcatheter, Cordis, Miami, FL, USA）を、Ａｃｈの注入のために腎動脈上に配置する。したがって、血行力学および機能は、ベースラインでの安定３分観察期間およびアセチルコリン（Ａｃｈ）注入中に測定される。
【０２４４】
組織学  -  コンピューター援用画像分析プログラム（MetaMorph, Meta Imaging, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA）を用いて、各腎臓の５μｍ中腎門横断切片（１／動物）を検査する。各スライドにおいて、三重染色またはＤＨＥ蛍光を、コンピュータープログラムにより１５〜２０視野で半自動的に定量して、腎臓表面積の分数として表し、全視野からの結果を平均する。
【０２４５】
アポトーシス  -  末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）検定、活性化カスパーゼ−３染色、ならびに前アポトーシスＢａｘおよび抗アポトーシスＢｃｌ−ｘＬタンパク質により、アポトーシスを評価する。
【０２４６】
酸化ストレス  -  腎臓における酸化ストレスを査定するために、in vitro試験を実施する。酸化ストレスバイオマーカー・イソプロスタンの全身レベルを、前記のように、EIAキットを用いて査定する。腎臓レドックス状態を、前記のようにジヒドロエチジウム（ＤＨＥ）を用いて蛍光顕微鏡により、そしてラジカル生成酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート水素（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）-オキシダーゼおよび内皮酸化窒素シンターゼ（ｅＮＯＳ）の発現により検出されるスーパーオキシド陰イオンのin situ産生を査定することにより評価する。
【０２４７】
血漿硝酸塩／亜硝酸塩レベル  -  メーカーの使用説明書に従って、市販のキット（酸化窒素定量キット、Active Motif, Carlsbad, CA, USA）を用いて、両方の合計に関して、２段階検定により、血漿硝酸塩／亜硝酸塩レベルを定量する。
【０２４８】
ウェスタン・ブロッティング  -  以下の：ＭＭＰ−９、ＰＡＩ−１、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ１）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）および形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）に対する特異的ポリクローナル抗体を用いて、ウェスタン・ブロッティングプロトコールを進行する。タンパク質発現を各腎臓で確定して、タンパク質帯域（１／動物）の強度を定量する。
【０２４９】
マイクロコンピューター断層撮影分析（ＭＣＴ）  -  腎臓を洗い流したのち、microfil ＭＶ１２２（血管内造影剤）を、腎動脈の分枝中に結紮されるカニューレを通して生理学的圧下で、狭窄腎臓中で還流する。前記と同様に、試料を調製し、走査して、画像を分析する。腎臓皮質の内、中および外３分の１における微小血管（２０〜５００ｍｍの範囲の直径）の空間密度および平均直径も、ソフトウェアパッケージＡＮＡＬＹＺＥ（商標）を用いて算定する。
【表１３】
0006465927.tif 000026
【０２５０】
統計学的方法  -  予備データに基づいて、検出力計算は、８０％の検出力で差異を検出するためには６匹（動物損失を考慮して＋１）／群が必要である、ということを示す。結果は、平均±ＳＥＭで表わされる。対応スチューデントｔ検定を用いて群内の比較を、ＡＮＯＶＡを用いて群間の比較を実施し、その後、テューキー検定を実施する。全検定に関する統計学的有意は、ｐ≦０．０５に関して許容される。
【０２５１】
Ｄ．  結果
Ｂａｘのレベルの低減、Ｂｃｌ-ｘＬのレベルの増大、およびＴＵＮＥＬ＋細胞の数の減少により示されるように、非治療ＡＲＡＳ被験体へのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与は、アポトーシスを減少させる、と予測される。さらに、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与は、繊維症三重染色の程度の減少、ならびに繊維形成因子ＴＧＦ-βおよびＰＡＩ-１の発現により示されるように、腎臓血管、尿細管および糸球体繊維症の減少を引き起こす、と予測される。さらに、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与は、ＴＮＦ-α、ＣＤ１６３およびＭＣＰ-１レベルの減少により示されるように、腎臓炎症を減少させる、と予測される。さらに、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与は、ＮＯ利用可能性（ｅＮＯＳ発現、硝酸塩／亜硝酸塩レベル）増大を伴うスーパーオキシドのin situ産生およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼ発現の低減により示されるように、酸化ストレスを減少させる、と予測される。さらに、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の投与は、マイクロ-ＣＴにより検出されるように、腎臓微小血管の損失を防止して、微小血管密度、腎臓血行力学および酸素化の増大をもたらす、と予測される。
【０２５２】
Ｅ．  結論
この結果は、芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、血管介入により治療されない被験体、例えばＰＴＲＡの候補でない被験体におけるＡＲＡＳの治療のための方法および組成物に有用である。
【０２５３】
実施例４：  Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による長期治療はブタＡＲＡＳにおける狭窄腎を保存する
要約
この実施例は、ブタＡＲＶＤにおける狭窄腎臓の保存における芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の使用を実証する。本発明の方法によれば、動物被験体はＡＲＡＳの期間に付された。被験体に、１０週間期間のうちの最後の４週間、毎日芳香族陽イオン性ペプチドを投与した。対照動物には、注入を施さないか、または対照ビヒクル単独の注入を施した。腎機能の多数の態様、例えば単腎容積、還流、腎臓血流量（ＲＢＦ）、糸球体濾過率（ＧＦＲ）、皮質酸素化および腎臓繊維症（これらに限定されない）は、対照被験体と比較して、ペプチドを摂取している被験体において改善された。結果は、ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2が、ＡＲＶＤの長期治療のための方法に有用である、ということを実証している。
【０２５４】
実験計画
実験はすべて、ガイドラインに従って実施され、所内動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認された。被験体は、１０週間の観察の間、若い雌被験体（Manthei Hog Farm, LLC, MN）で構成された。ベースラインでは、動物を正常またはＡＲＡＳ群で無作為化した。正常動物には正常ブタ用噛み餌を与え、ＡＲＡＳ被験体には高コレステロール餌（ＴＤ-９３２９６、Harlan-Teklad, Indianapolis, IN, USA）（これは、ＲＡＳ腎臓におけるコレステロールレベルおよび腎機能低下の増大、炎症および繊維症により特性化されるび漫性早期アテローム硬化症を誘導する）を与えた（表１４参照）。
【０２５５】
６週間の期間後、ＡＲＡＳ被験体には、主腎動脈中に局所刺激用コイルを入れることにより誘導される片側性ＲＡＳを施し、一方、正常動物には擬似操作を施した。麻酔のために、動物にケタミンおよびキシラジン（０．５ｇ）の筋肉内注射で誘導して、静脈内ケタミン（０．２ｍｇ／ｋｇ／分）およびキシラジン（０．０３ｍｇ／ｋｇ／分）で麻酔を保持した。遠隔測定システム（Data Sciences International, St Paul, Minnesota, USA）を左大腿動脈中に埋め込んで、その後１０週間、平均動脈圧（ＭＡＰ）を継続的に測定した。
【０２５６】
ＲＡＳ誘導の１０週間後に、被験体に、０．１ｍｇ／ｋｇのＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはビヒクルを、４週間の期間の間、各週のうち５日、皮下注射を施した。
【０２５７】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはビヒクルでの治療の４週間後、被験体を同様に麻酔して、狭窄の程度を血管造影により確定した。単腎腎臓血行力学および機能の査定のために、多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）試験を実施した。イオパミドール（０．５ｍＬ／ｋｇ／２秒）の中心静脈注入後、１４０連続スキャンを実施した。横断面画像を再構築し、Analyze（商標）ソフトウェアパッケージ（Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, MN）を用いて分析した。腎臓皮質および髄質の横断面画像から、当該領域を選択した。各領域における平均組織減衰を経時的にプロットし、曲線適合アルゴリズムにより適合させて、腎機能の測定値を得た。皮質および髄質容積を、皮質および髄質還流の生成物ならびに対応する容積の和として、ＡｎａｌｙｚｅおよびＲＢＦにより算定した。近位尿細管曲線の傾斜を用いて、皮質曲線からＧＦＲを算定した。Ａｃｈ（５μｇ／ｋｇ／分）の１０分副腎注入の終わりに向けて、１５分後に同一手順を反復して、内皮依存性微小血管反応性を試験した。頸動脈から導入されるトラッカーカテーテル（Prowler Microcatheter, Cordis, Miami, FL, USA）を、Ａｃｈの注入のために腎動脈上に配置した。血行力学および機能を、ベースラインでの安定３分観察期間およびＡｃｈ注入中に測定した。腎臓酸素化を、血中酸素レベル依存性（ＢＯＬＤ）ＭＲＩを用いて査定した。
【表１４】
0006465927.tif 000027
【０２５８】
in vivo試験完了後、動物をペントバルビタール・ナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、 Sleepaway（登録商標）、Fort Dodge Laboratories, Fort Dodge, Iowa, USA)で安楽死させた。腎臓を取り出し、切開して、ex vivo試験用に調製した。
【０２５９】
コンピューター援用画像分析プログラムＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ（登録商標）４．８．２．０(Carl ZEISS SMT, Oberkochen, Germany)を用いて、マッソン三重染色で染色した各腎臓の５μｍ中腎門横断切片で、腎繊維症を査定した。尿細管間質性繊維症および糸球体スコア（１００個の糸球体からの硬化性の％）を、１５〜２０視野で定量した。
【０２６０】
ＪＭＰソフトウェアパッケージ・バージョン８．０(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)を用いて、全データを解析した。シャピロ・ウィルク検定を用いて、正規性からの偏差に関して試験した。正規分布データに関する平均±標準偏差（ＳＤ）、および非正規分布データに関する中位（範囲）として結果を表した。パラメトリック(ＡＮＯＶＡおよび非対応スチューデントｔ検定)および非パラメトリック(Wilcoxon and Kruskal Wallis)検定を、適宜用いた。p≦0.05の値は、統計学的に有意であるとみなされた。
【０２６１】
結果
ＲＡＳの誘導の６週間後、全ＡＲＡＳ動物において有意程度の狭窄が得られ（８１．０％〜８９．８％）、平均動脈圧（ＭＡＰ）は同様に増大された（ｐ＜０．０５対正常）（表１５）。
【０２６２】
表１５は、１０週間のＡＲＡＳ期間の最後の４週間の間のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2またはビヒクルでの治療後の正常およびＡＲＡＳ被験体における平均動脈圧（ｍｍＨｇ）、腎臓容積（ｃｃ）、皮質還流（ｍｌ／分／ｃｃ）、ＲＢＦ（ｍｌ／分）、ＧＦＲ（ｍｌ／分）および尿細管間質性繊維症（％）を示す。腎臓組織切片の三重染色を図１０に示し、図１１で定量する。血中酸素レベル依存性（ＢＯＬＤ）ＭＲＩ画像を図１２に、皮質血液酸素化指数（Ｒ２*）の定量を図１３に示す。
【０２６３】
ＡＲＡＳの誘導の４週間後、腎臓血行力学的パラメーターは、正常対照と比較して、ＲＡＡＳ被験体において低減された（表１５）。同様に、ＡＲＡＳ被験体は、正常対照と比較して、尿細管間質性繊維症増大および皮質血液酸素化低減を示した（表１５；図１０〜１３）。血管反応性は、Ａｃｈに応答したＲＢＦおよびＧＦＲの大きさの変化により測定されるように、ＡＲＡＳ被験体において低減された。
【０２６４】
Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による治療は、非治療対照と比較して、ＡＲＡＳ被験体において尿細管間質性繊維症を低減し、腎臓容積、皮質還流、ＲＢＦおよびＧＦＲを増大した（表１５；図１０〜１１）。Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による治療は、非治療対照と比較して、皮質血液酸素化およびＡｄｈに対する血管反応性も改善した（図１２〜１５）。
【表１５】
0006465927.tif 000028
【０２６５】
これらの結果は、本発明の技法のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチドが、ＡＲＡＳを有する被験体の治療に有用である、ということを実証する。特に、これらの結果は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチドによるＡＲＡＳ被験体の長期治療が、腎臓尿細管間質性繊維症を低減し、腎臓血行力学および血管反応性を改善する、ということを示す。結果はさらに、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチドが、一般的にＡＲＶＤを有する被験体において腎機能を改善し、被験体の予後を改善するために有用である、ということを示す。
【０２６６】
実施例５：  ＡＲＶＤを有するヒト被験体におけるＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2での長期治療後の腎機能改善
要約
この実施例は、ＡＲＶＤを有するヒト被験体の長期治療における芳香族陽イオン性ペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2の使用を実証する。
【０２６７】
本発明の方法に従って、ＡＲＶＤを有するヒト被験体に、数週間の期間中、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2を投与する。対照被験体には、対照ビヒクル単独の注入なしまたはその注入を施す。対照被験体と比較して、ペプチドを摂取している被験体では、腎臓機能の多数の態様、例えば腎臓容積、皮質還流、ＲＢＦ、ＧＦＲ、皮質血液酸素化および血管反応性が改善されると予測される。結果は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチドが、ＡＲＶＤを有するヒト被験体の長期治療のための方法に有用である、ということを実証している。
【０２６８】
実験計画
ＡＲＶＤを有するヒト被験体を、実験群と対照群に無作為化する。被験体を、４週間の期間中１日１回皮下投与するＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（０．１ｍｇ／ｋｇ）ペプチドで治療する。各腎臓における腎臓血行力学および機能を、ＭＤＣＴを用いて査定し、腎臓酸素化をＢＯＬＤ  ＭＲＩにより査定する。
【０２６９】
血中酸素レベル依存性磁気共鳴画像処理（ＢＯＬＤ-ＭＲＩ）  -  ＰＴＲＡの４週間後に、上記と同様に、ＢＯＬＤ-ＭＲＩを３  Ｔｅｓｌａ  (Signa Echo Speed; GE Medical Systems, Milwaukee, WI)で実施して、カスタマイズ化腹部器官プロトコールを用いて、腎臓の髄質および皮質領域におけるＲ２*レベルを測定する。要するに、常磁性分子は、磁場摂動を誘導する。血中で、オキシヘモグロビンは反磁性であり、その濃度はＴ２*に影響を及ぼさないが、しかしデオキシヘモグロビンは常磁性であり、組織Ｔ２*を減少させる。したがって、勾配エコーＭＲＩ獲得のエコー時間が増大すると、ＭＲＩシグナル減衰は、デオキシヘモグロビンの濃度増大に伴って増大する。Ｌｎ（強度）対エコー時間の傾斜は緩和時間率Ｒ２*（＝１／Ｔ２）と等しく、デオキシヘモグロビンの濃度と直接的に比例する。ベースラインＢＯＬＤ獲得後、フロセミド（２０ｍｇ）を静脈内投与して、２ｍｌの生理食塩水で洗い流す。ＢＯＬＤ測定を、１５分後に反復する。データ分析のために、各実験期間における最良の解剖学的詳細を提供する７-ｍｓエコー時間画像で、皮質および髄質において当該領域を手動でトレースする。各エコー時間に関して、ソフトウェアは、各々の当該領域内のＭＲシグナルの平均を自動的に計算する。ＢＯＬＤシグナルが、緩和性Ｒ２*により特性化されるように、次いで測定される。ベースラインからフロセミドまでのＲ２*の変化は、「デルタ-Ｒ２*」として確定される。
【０２７０】
多検出器コンピューター断層撮影（ＭＤＣＴ）  -  ＢＯＬＤ  ＭＲＩの１〜２日後に、ＭＤＣＴを用いて各腎臓における腎臓血行力学および機能を査定する。ＭＤＣＴは、単腎容積、局部的還流、血流量、糸球体濾過率（ＧＦＲ）および尿細管機能の精確且つ非侵襲的定量を提供する超速スキャナーである。要するに、イオパミドール（０．５ｍＬ／ｋｇ／２秒）の中心静脈注入後の４５連続スキャン後に、画像が得られる。ＭＤＣＴ画像は、Analyzeソフトウェアパッケージ（Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, MN, USA）を用いて再構成され、表示される。大動脈、腎臓皮質および髄質からの横断面画像から、当該領域を選択する。各領域における平均組織減衰を経時的にプロットし、曲線適合アルゴリズムにより適合させて、腎機能の測定値を得る。皮質および髄質容積を、皮質および髄質還流の生成物ならびに対応する容積の和として、Ａｎａｌｙｚｅ（Biomedical Imaging Resource, Mayo Clinic, MN, USA）およびＲＢＦを用いて算定する。近位尿細管曲線の傾斜を用いて、皮質曲線からＧＦＲを算定する。アセチルコリン（Ａｃｈ）（５μｇ／ｋｇ／分）の１０分副腎注入の終わりに向けて、１５分後に同一手順を反復して、内皮依存性微小血管反応性を試験する。頸動脈から導入されるトラッカーカテーテル（Prowler Microcatheter, Cordis, Miami, FL, USA）を、Ａｃｈの注入のために腎動脈上に配置する。したがって、血行力学および機能は、ベースラインでの安定３分観察期間およびＡｃｈ注入中に測定される。
【０２７１】
結果を、平均±ＳＥＭとして表す。対応スチューデントｔ検定を用いて群内の比較を、ＡＮＯＶＡを用いて群間の比較を実施し、その後、テューキー検定を実施する。全検定に関する統計学的有意は、ｐ≦０．０５に関して許容される。
【０２７２】
結果
本発明の技法のペプチドＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2による長期治療後、ＡＲＶＤ被験体は、非治療対照と比較して、改善された腎臓容積、皮質還流、ＲＢＦ、ＧＦＲ、皮質血液酸素化および血管反応性、ならびに平均動脈血圧低下を示す、と予測される。さらに、治療被験体は、非治療対照被験体と比較して、尿細管間質性繊維症低減を示す、と予測される。前記パラメーターに関する値は、正常対照に匹敵する、と予測される（ｐ＜０．０５）。
【０２７３】
これらの結果は、本発明の技法のＤ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチドが、ＡＲＡＳを有するヒト被験体の治療において有用である、ということを実証する。特に、これらの結果は、Ｄ−Ａｒｇ−２’，６’−Ｄｍｔ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＮＨ2ペプチドでのヒトＡＲＡＳ被験体の長期治療が、腎臓尿細管間質性繊維症を低減し、腎臓血行力学および血管反応性を改善する、ということを示す。結果は、さらに、一般的にＡＲＶＤを有する被験体における腎機能を改善し、そして被験体の予後を改善するために有用である、ということを示す。
【０２７４】
参考文献
Bakker EN, et al., Small artery remodeling depends on tissue-type transglutaminase. Circ Res. 2005;96:119-126.
Chade AR and Kelsen S, Renal Microvascular Disease Determines the Responses to Revascularization in Experimental Renovascular Disease, Circ Cardiovasc Interv 2010; 3(4): 376-383.
Chade AR, et al., Antioxidant intervention blunts renal injury in experimental renovascular disease, J Am Soc Nephrol 2004; 15: 958-966.
Chade AR, et al., Antioxidant intervention prevents renal neovascularization in hypercholesterolemic pigs, J Am Soc Nephrol 2004; 15: 1816-1825.
Chade AR, et al., Beneficial effects of antioxidant vitamins on the stenotic kidney. Hypertension. 2003;42:605-612.
Chade AR, et al., Comparison of acute and chronic antioxidant interventions in experimental renovascular disease, Am J Physiol Renal Physiol 2004; 286: F1079-1086.
Chade AR, et al., Distinct renal injury in early atherosclerosis and renovascular disease, Circulation 2002; 106: 1165-1171.
Chade AR, et al., Endothelin-1 receptor blockade prevents renal injury in experimental hypercholesterolemia, Kidney Int 2003; 64: 962-969.
Chade AR, et al., Mechanisms of renal structural alterations in combined hypercholesterolemia and renal artery stenosis, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23: 1295-1301.
Chade AR, et al., Simvastatin promotes angiogenesis and prevents microvascular remodeling in chronic renal ischemia, FASEB J 2006; 20: 1706-1708.
Cho S, et al., A novel cell-permeable antioxidant peptide, SS31, attenuates ischemic brain injury by down-regulating CD36, J Biol Chem 2007; 282: 4634-4642.
Daemen MA, et al., Inhibition of apoptosis induced by ischemia-reperfusion prevents inflammation, J Clin Invest 1999; 104: 541-549.
Dai DF, et al., Mitochondrial targeted antioxidant peptide ameliorates hypertensive cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2011.
Epstein FH and Prasad P, Effects of furosemide on medullary oxygenation in younger and older subjects, Kidney Int 2000; 57: 2080-2083.
Epstein FH, et al., Effect of diabetes on renal medullary oxygenation during water diuresis, Diabetes Care 2002; 25: 575-578.
Favreau F, et al., Revascularization of swine renal artery stenosis improves renal function but not the changes in vascular structure, Kidney Int. 2010; 78(11): 1110-1118. 
Gerwins P, et al., Function of fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factors and their receptors in angiogenesis. Crit Rev Oncol Hematol. 2000;34:185-194.
Gloviczki ML, et al., Comparison of 1.5 and 3 T BOLD MR to study oxygenation of kidney cortex and medulla in human renovascular disease, Invest Radiol 2009; 44: 566-571.
Gloviczki ML, et al., Preserved oxygenation despite reduced blood flow in poststenotic kidneys in human atherosclerotic renal artery stenosis, Hypertension 55: 961-966.
Gomez SI, et al., Increased hypoxia and reduced renal tubular response to furosemide detected by BOLD magnetic resonance imaging in swine renovascular hypertension, Am J Physiol Renal Physiol 2009; 297: F981-986.
Hansen KJ, et al., Prevalence of renovascular disease in the elderly: a population-based study, J Vasc Surg 2002; 36: 443-451.
Heil M and Schaper W. Influence of mechanical, cellular, and molecular factors on collateral artery growth (arteriogenesis). Circ Res. 2004;95:449-458.
Hricik DE, et al., Captopril-induced functional renal insufficiency in patients with bilateral renal-artery stenoses or renal-artery stenosis in a solitary kidney. N Engl J Med.
Juillard L, et al., Blood oxygen level-dependent measurement of acute intra-renal ischemia, Kidney Int 2004; 65: 944-950.
Kalra PA, et al., Atherosclerotic renovascular disease in United States patients aged 67 years or older: risk factors, revascularization, and prognosis, Kidney Int 2005; 68: 293-301.
Langille BL and Dajnowiec D. Cross-linking vasomotor tone and vascular remodeling: A novel function for tissue transglutaminase? Circ Res. 2005;96:9-11.
Lavi R, et al., Simvastatin decreases endothelial progenitor cell apoptosis in the kidney of hypertensive hypercholesterolemic pigs, Arterioscler Thromb Vasc Biol 30: 976-983.
Lerman LO, et al., Noninvasive evaluation of a novel swine model of renal artery stenosis, J Am Soc Nephrol 1999; 10: 1455-1465.
Mizuguchi Y, et al., A novel cell-permeable antioxidant peptide decreases renal tubular apoptosis and damage in unilateral ureteral obstruction, Am J Physiol Renal Physiol 2008; 295: F1545-1553.
Nogae S, et al., Induction of apoptosis in ischemia-reperfusion model of mouse kidney: possible involvement of Fas, J Am Soc Nephrol 1998; 9: 620-631.
Orrenius S, Reactive oxygen species in mitochondria-mediated cell death, Drug Metab Rev 2007; 39: 443-455.
Plouin PF, et al.,  Blood pressure outcome of angioplasty in atherosclerotic renal artery stenosis: a randomized trial, Essai Multicentrique Medicaments vs Angioplastie (EMMA) Study Group, Hypertension 1998; 31: 823-829.
Prasad PV and Epstein FH, Changes in renal medullary pO2 during water diuresis as evaluated by blood oxygenation level-dependent magnetic resonance imaging: effects of aging and cyclooxygenase inhibition, Kidney Int 1999; 55: 294-298.
Prasad PV, et al., Noninvasive evaluation of intrarenal oxygenation with BOLD MRI, Circulation 1996; 94: 3271-3275.
Rosenberger C, et al., Up-regulation of hif in experimental acute renal failure: Evidence for a protective transcriptional response to hypoxia. Kidney Int. 2005;67:531-542.
Sachse A and Wolf G. Angiotensin ii-induced reactive oxygen species and the kidney. J Am Soc Nephrol. 2007;18:2439-2446.
Shanley PF. The pathology of chronic renal ischemia. Semin Nephrol. 1996;16:21-32.
Stulak JM, et al., Renal vascular function in hypercholesterolemia is preserved by chronic antioxidant supplementation. J Am Soc Nephrol. 2001;12:1882-1891.
Szeto HH, et al., Mitochondria-targeted peptide accelerates atp recovery and reduces ischemic kidney injury. J Am Soc Nephrol. 2011;22:1041-1052.
Szeto HH, Mitochondria-targeted cytoprotective peptides for ischemia-reperfusion injury, Antioxid Redox Signal 2008; 10: 601-619.
Textor SC and Wilcox CS, Renal artery stenosis: a common, treatable cause of renal failure?, Annu Rev Med 2001; 52: 421-442.
van Jaarsveld BC, et al., The effect of balloon angioplasty on hypertension in atherosclerotic renal-artery stenosis. Dutch Renal Artery Stenosis Intervention Cooperative Study Group, N Engl J Med 2000; 342: 1007-1014.
Vedder NB, et al., Inhibition of leukocyte adherence by anti-CD18 monoclonal antibody attenuates reperfusion injury in the rabbit ear, Proc Natl Acad Sci U S A 1990; 87: 2643-2646.
Verhoeff BJ et al.,  Influence of percutaneous coronary intervention on coronary microvascular resistance index. Circulation. 2005;111:76-82.
Webster J, et al., Randomised comparison of percutaneous angioplasty vs continued medical therapy for hypertensive patients with atheromatous renal artery stenosis. Scottish and Newcastle Renal Artery Stenosis Collaborative Group, J Hum Hypertens 1998; 12: 329-335.
Wheatley K, et al., Revascularization versus medical therapy for renal-artery stenosis. N Engl J Med. 2009;361:1953-1962.
Yao EH, et al., Oxidative stress on progenitor and stem cells in cardiovascular diseases. Curr Pharm Biotechnol. 2006;7:101-108.
Zhu XY, et al., Antioxidant intervention attenuates myocardial neovascularization in hypercholesterolemia, Circulation 2004; 109: 2109-2115.
Zhu XY, et al., Cortical microvascular remodeling in the stenotic kidney: role of increased oxidative stress, Arterioscler Thromb Vasc Biol 2004; 24: 1854-1859.Zhu XY, et al., Redox-sensitive myocardial remodeling and dysfunction in swine diet-induced experimental hypercholesterolemia, Atherosclerosis 2007; 193: 62-69.Zhu XY, et al., Simvastatin prevents coronary microvascular remodeling in renovascular hypertensive pigs, J Am Soc Nephrol 2007; 18: 1209-1217.
Zhu, et al., The chemokine monocyte chemoattractant protein-1 contributes to renal dysfunction in swine renovascular hypertension, J Hypertens 2009; 27: 2063-2073.
〔１〕アテローム硬化性腎動脈狭窄の治療を必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
〔２〕前記被験体に関して血管再生術を実施する工程をさらに含む、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕前記血管再生術が、経皮経血管性腎臓血管形成術を含む、前記〔２〕記載の方法。
〔４〕前記アテローム硬化性腎動脈狭窄が、前記被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む、前記〔１〕記載の方法。
〔５〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるかまたはそれに罹患している、前記〔１〕記載の方法。
〔６〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される、前記〔１〕記載の方法。
〔７〕前記被験体が、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生術の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される、前記〔２〕記載の方法。
〔８〕前記被験体が、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される、前記〔７〕記載の方法。
〔９〕前記被験体が、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される、前記〔７〕記載の方法。
〔１０〕前記血管再生術が、腎動脈閉塞の除去を含む、前記〔２〕記載の方法。
〔１１〕前記血管再生術が、１つ以上の血栓溶解薬の投与を含む、前記〔２〕記載の方法。
〔１２〕前記１つ以上の血栓溶解薬が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される、前記〔１１〕記載の方法。
〔１３〕アテローム硬化性腎動脈狭窄の治療を必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄の治療方法であって、前記被験体に関して経皮経血管性腎臓血管形成術を実施する工程と、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与する工程とを含むことを特徴とする方法。
〔１４〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるかまたはそれに罹患している、前記〔１３〕記載の方法。
〔１５〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される、前記〔１４〕記載の方法。
〔１６〕前記被験体が、血管形成術前、血管形成術後、血管形成術の最中および後、あるいは血管形成術の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される、前記〔１３〕記載の方法。
〔１７〕前記被験体が、血管形成術後少なくとも３時間、血管形成術後少なくとも５時間、血管形成術後少なくとも８時間、血管形成術後少なくとも１２時間、または血管形成術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される、前記〔１６〕記載の方法。
〔１８〕前記被験体が、血管形成術の少なくとも８時間前に開始して、血管形成術の少なくとも４時間前に開始して、血管形成術の少なくとも２時間前に開始して、血管形成術の少なくとも１時間前に開始して、または血管形成術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される、前記〔１６〕記載の方法。
〔１９〕１つ以上の血栓溶解薬の投与を含む、前記〔１３〕記載の方法。
〔２０〕前記１つ以上の血栓溶解薬が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される、前記〔１９〕記載の方法。
〔２１〕片側性または両側性アテローム硬化性腎動脈狭窄に関連した対側性腎臓損傷の治療を必要とする被験体における片側性または両側性アテローム硬化性腎動脈狭窄に関連した対側性腎臓損傷の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与することを包含する方法。
〔２２〕前記被験体に関して腎臓血管再生術を実施する工程をさらに包含する、前記〔２１〕記載の方法。
〔２３〕前記血管再生術が、経皮経血管性腎臓血管形成術を含む、前記〔２２〕記載の方法。
〔２４〕前記アテローム硬化性腎動脈狭窄が、前記被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む、前記〔２１〕記載の方法。
〔２５〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるかまたはそれに罹患している、前記〔２１〕記載の方法。
〔２６〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される、前記〔２１〕記載の方法。
〔２７〕前記被験体が、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生術の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される前記〔２２〕記載の方法。
〔２８〕前記被験体が、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される、前記〔２７〕記載の方法。
〔２９〕前記被験体が、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも１時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される、前記〔２７〕記載の方法。
〔３０〕前記血管再生術が、腎動脈閉塞の除去を含む、前記〔２２〕記載の方法。
〔３１〕前記血管再生術が、１つ以上の血栓溶解薬の投与を含む、前記〔２２〕記載の方法。
〔３２〕前記１つ以上の血栓溶解薬が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される、前記〔３１〕記載の方法。
〔３３〕アテローム硬化性腎動脈狭窄に関連したうっ血性心不全の治療を必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄に関連したうっ血性心不全の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
〔３４〕前記被験体に関して腎臓血管再生術を実施する工程をさらに含む、前記〔３３〕記載の方法。
〔３５〕前記血管再生術が、経皮経血管性腎臓血管形成術を含む、前記〔３４〕記載の方法。
〔３６〕前記アテローム硬化性腎動脈狭窄が、前記被験体の腎臓微小血管系の崩壊または閉塞を含む、前記〔３３〕記載の方法。
〔３７〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の危険があるかまたはそれに罹患している、前記〔３３〕記載の方法。
〔３８〕前記被験体が、腎臓微小血管系粗鬆化の開始前に前記ペプチドを投与される、前記〔３３〕記載の方法。
〔３９〕前記被験体が、血管再生術前、血管再生術後、血管再生術の最中および後、あるいは血管再生術の前、最中および後に連続的に、ペプチドを投与される、前記〔３４〕記載の方法。
〔４０〕前記被験体が、血管再生術後少なくとも３時間、血管再生術後少なくとも５時間、血管再生術後少なくとも８時間、血管再生術後少なくとも１２時間、または血管再生術後少なくとも２４時間ペプチドを投与される、前記〔３９〕記載の方法。
〔４１〕前記被験体が、血管再生術の少なくとも８時間前に開始して、血管再生術の少なくとも４時間前に開始して、血管再生術の少なくとも２時間前に開始して、血管再生術の少なくとも３３時間前に開始して、または血管再生術の少なくとも１０分前に開始して、ペプチドを投与される、前記〔３９〕記載の方法。
〔４２〕前記血管再生術が、腎動脈閉塞の除去を含む、前記〔３４〕記載の方法。
〔４３〕前記血管再生術が、１つ以上の血栓溶解薬の投与を含む、前記〔３４〕記載の方法。
〔４４〕前記１つ以上の血栓溶解薬が、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アシル化型のプラスミノーゲン、アシル化型のプラスミンおよびアシル化ストレプトキナーゼ-プラスミノーゲン複合体からなる群から選択される前記〔４３〕記載の方法。
〔４５〕アテローム硬化性腎臓血管性疾患（ＡＲＶＤ）の治療を必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎臓血管性疾患（ＡＲＶＤ）の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
〔４６〕前記ＡＲＶＤが、アテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）を含む、前記〔４５〕記載の方法。
〔４７〕前記ＡＲＶＤが、正常対照と比較した腎臓血行動態障害を含む、前記〔４５〕記載の方法。
〔４８〕前記腎臓血行動態障害が、平均腎動脈血圧増大を含む、前記〔４７〕記載の方法。
〔４９〕前記腎臓血行動態障害が、腎臓容積低減を含む、前記〔４７〕記載の方法。
〔５０〕前記腎臓血行動態障害が、皮質還流低減を含む、前記〔４７〕記載の方法。
〔５１〕前記腎臓血行動態障害が、腎臓血流量（ＲＢＦ）低減を含む、前記〔４７〕記載の方法。
〔５２〕前記腎臓血行動態障害が、糸球体濾過率（ＧＦＲ）低減を含む、前記〔４７〕記載の方法。
〔５３〕前記腎臓血行動態障害が、皮質血液酸素化低減を含む、前記〔４７〕記載の方法。
〔５４〕前記ＡＲＶＤが、尿細管間質性線維症を含む、前記〔４５〕記載の方法。
〔５５〕治療が、ペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の長期投与を含む、前記〔４５〕記載の方法。
〔５６〕長期投与が、１週間より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を含む、前記〔５５〕記載の方法。
〔５７〕長期投与が、１年より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を含む、前記〔５５〕記載の方法。
〔５８〕アテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）により引き起こされる減損腎臓血行動態の治療を必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）により引き起こされる減損腎臓血行動態の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
〔５９〕前記ＡＲＡＳが、正常対照と比較した腎臓血行動態障害を含む、前記〔４５〕記載の方法。
〔６０〕前記腎臓血行動態障害が、平均腎動脈血圧増大を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６１〕前記腎臓血行動態障害が、腎臓容積低減を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６２〕前記腎臓血行動態障害が、皮質還流低減を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６３〕前記腎臓血行動態障害が、腎臓血流量（ＲＢＦ）低減を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６４〕前記腎臓血行動態障害が、糸球体濾過率（ＧＦＲ）低減を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６５〕前記腎臓血行動態障害が、皮質血液酸素化低減を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６６〕前記ＡＲＡＳが、尿細管間質性線維症を含む、前記〔５９〕記載の方法。
〔６７〕治療が、ペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の長期投与を含む、前記〔５８〕記載の方法。
〔６８〕長期投与が、１週間より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を含む、前記〔６７〕記載の方法。
〔６９〕長期投与が、１年より長い期間のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩の投与を含む、前記〔６７〕記載の方法。
〔７０〕アテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）により引き起こされる減損腎臓血行動態の治療を必要とする被験体におけるアテローム硬化性腎動脈狭窄（ＡＲＡＳ）により引き起こされる減損腎臓血行動態の治療方法であって、治療的有効量のペプチドＤ-Ａｒｇ-２’，６’-Ｄｍｔ-Ｌｙｓ-Ｐｈｅ-ＮＨ2またはその製薬上許容可能な塩を１つ以上の抗高血圧薬とともに前記被験体に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
〔７１〕前記１つ以上の抗高血圧薬が、利尿薬、アドレナリン作動性受容体拮抗薬、カルシウムチャネル遮断薬、レニン阻害薬、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アルドステロン拮抗薬、血管拡張薬またはアルファ-２作動薬を含む、前記〔７０〕記載の方法。
〔７２〕前記利尿薬が、ループ利尿薬、チアジド利尿薬、チアジド様利尿薬またはカリウム保持性利尿薬を含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔７３〕前記利尿薬が、ブメタニド、エタクリン酸、フロセミド、トルセミド、エピチジド、ヒドロクロロチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド、インダパミド、クロルサリドン、メトラゾン、アミロリド、トリアムテレンまたはスピロノラクトンを含む、前記〔７２〕記載の方法。
〔７４〕前記アドレナリン作動性受容体拮抗薬が、ベータ遮断薬、アルファ遮断薬または混合アルファおよびベータ遮断薬を含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔７５〕前記アドレナリン作動性受容体拮抗薬が、アテノロール、メトプロロール、ナドロール、オキシプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、チモロール、ドキサゾシン、フェントラミン、インドラミン、フェノキシベンズアミン、プラゾシン、テラゾシン、トラゾリン、ブシンドロール、カルベジロールまたはラベタロールを含む、前記〔７４〕記載の方法。
〔７６〕前記カルシウムチャネル遮断薬が、ジヒドロピリジンまたは非ジヒドロピリジンを含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔７７〕前記カルシウムチャネル遮断薬が、アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、レルカニジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニトレンジピン、ジルチアゼムまたはベラパミルを含む、前記〔７６〕記載の方法。
〔７８〕前記レニン阻害薬が、アリスキレン（登録商標）を含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔７９〕前記アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬が、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリルまたはベナゼプリルを含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔８０〕前記アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬が、イルベサルタン（登録商標）を含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔８１〕前記アルドステロン拮抗薬が、エプレレノンまたはスピロノラクトンを含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔８２〕前記血管拡張薬拮抗薬が、ニトロプルシドナトリウムまたはヒドララジンを含む、前記〔７１〕記載の方法。
〔８３〕前記アルファ-２作動薬拮抗薬が、クロニジン、グアナベンズ、メチルドパ、モキソニジン、グアネチジンまたはレセルピンを含む、前記〔７１〕記載の方法。
【図１】
0006465927.tif 000029
【図２】
0006465927.tif 000030
【図３】
0006465927.tif 000031
【図４】
0006465927.tif 000032
【図５】
0006465927.tif 000033
【図６】
0006465927.tif 000034
【図７】
0006465927.tif 000035
【図８】
0006465927.tif 000036
【図９】
0006465927.tif 000037
【図１０】
0006465927.tif 000038
【図１１】
0006465927.tif 000039
【図１２】
0006465927.tif 000040
【図１３】
0006465927.tif 000041
【図１４】
0006465927.tif 000042
【図１５】
0006465927.tif 000043