(57)【要約】  本発明は、有機溶媒が関連するヒドロホビンの回収及び／又は精製プロセスに関し、分離技術を必要としない。特に、本発明は、ヒドロホビンＩＩの選択的アルコール沈殿法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロホビンＩＩを精製するための方法であって、Ｃ１〜Ｃ３アルコールをヒドロホビン溶液に添加して、第１の沈殿物を生成する工程と、前記Ｃ１〜Ｃ３アルコール／ヒドロホビン溶液から上澄み液をデカントする工程と、前記Ｃ１〜Ｃ３アルコールを前記上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成する工程と、を含み、前記第２の沈殿物が、精製されたヒドロホビンＩＩである、方法。
【請求項２】
前記Ｃ１〜Ｃ３アルコールがイソプロパノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
約２〜３容量のイソプロパノールを添加して、前記第１の沈殿物を生成する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
約２．５容量のイソプロパノールを添加して、前記第１の沈殿物を生成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
約１容量のイソプロパノールを前記上澄み液に添加して、前記第２の沈殿物を生成する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｃ１〜Ｃ３アルコールがメタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
約１〜２容量のメタノールを添加して、前記第１の沈殿物を生成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
約１．５容量のメタノールを添加して、前記第１の沈殿物を生成する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
約１容量のメタノールを前記上澄み液に添加して、前記第２の沈殿物を生成する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｃ１〜Ｃ３アルコールがエタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
約１〜２容量のエタノールを添加して、前記第１の沈殿物を生成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
約１．５容量のエタノールを添加して、前記第１の沈殿物を生成する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
約１容量のエタノールを前記上澄み液に添加して、前記第２の沈殿物を生成する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記方法が室温で行われる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アルコールが、ヒドロホビンＩＩを精製するために再生利用されるか、又は再使用される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製されたヒドロホビンＩＩが凍結乾燥される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製されたヒドロホビンＩＩの純度が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、質量分析、又はアミノ酸分析によってアッセイされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７に記載の方法のいずれか１つを含む、ヒドロホビンＩＩを精製するためのＣ１〜Ｃ３アルコールの使用。
【請求項１９】
前記第１の沈殿物が、茶色の沈殿物である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項２０】
前記第２の沈殿物が、白色の沈殿物である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１１年４月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／４７５，９３３号に対する優先権を主張する。２００９年１２月１７日にＰＣＴ公開第ＷＯ  ２００９／１５２１７６号として公開された、２００９年６月９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４６７８３号、２０１１年２月１７日にＰＣＴ公開第ＷＯ  ２０１１／０１９６８６号として公開された、２０１０年８月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４９６４号、２０１０年８月１０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４４９６４号、及び２０１２年３月２９日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１２／３１１０４号が参照される。
【０００２】
前述の出願、そこで又はそれらの審査中に引用されるすべての文書（「出願引用文書」）、該出願引用文書中で引用又は参照されるすべての文書、本明細書で引用又は参照されるすべての文書（「本明細書で引用される文書」）、及び該本明細書で引用される文書中で引用又は参照されるすべての文書が、本明細書又は参照することにより本明細書に組み込まれる文書において言及される任意の製品の任意の製造者の指示、説明、製品仕様書、及び製品シートとともに、参照することにより本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いられ得る。より具体的には、すべての参照される文書は、各個別の文書が参照により組み込まれるべきと明確かつ個別に示された場合と同じ程度まで、参照により組み込まれる。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、有機溶媒が関連するヒドロホビンの回収及び／又は精製プロセスに関し、分離技術を必要としない。
【背景技術】
【０００４】
ヒドロホビンは、糸状菌、例えばスエヒロタケコミューン（Schizophyllum commune）内に発生する、約１００〜１５０個のアミノ酸の低分子タンパク質である。これらは通常、８個のシステイン単位を有する。ヒドロホビンは、天然源から分離することができるが、遺伝子工学的な方法によっても得ることができる（例えば、第ＷＯ  ２００６／０８２２５１号及び同第ＷＯ  ２００６／１３１５６４号を参照）。
【０００５】
ヒドロホビンは、例えば、気中菌糸、胞子、子実体等の様々な真菌構造の表面上に、非水溶性の形態で広がる。ヒドロホビンの遺伝子は、子嚢菌類、不完全菌類、及び担子菌類から単離することができる。例えば、スエヒロタケコミューン、ネナガヒトヨタケコプリナス（Coprinus cinereus）、アスペルギルスニデュランス等の幾つかの菌類は、１つを超えるヒドロホビン遺伝子を有する。異なるヒドロホビンが、真菌の発達の異なる段階において明白に関与している。本明細書におけるヒドロホビンは、推定上異なる機能を担っている（ｖａｎ  Ｗｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６，２０１〜２１０、Ｋｅｒｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ，１９９８，２３，１８〜３３）。
【０００６】
今までに同定されたヒドロホビンは、概ね、クラスＩ又はクラスＩＩとして分類される。両タイプは、界面で両親媒性フィルムに自己集合する分泌タンパク質として菌類中に確認されている。クラスＩのヒドロホビンの集合は、通常、比較的不溶性である一方で、クラスＩＩのヒドロホビンの集合は、様々な溶媒中に容易に溶解する。
【０００７】
ヒドロホビンに関する生物学的機能として、気中菌糸の生成のための水の表面張力の低下に加えて、胞子の疎水化も記載されている（Ｗｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，１９，１９８５〜８８、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，６，２３８２〜２３９４）。更に、ヒドロホビンは、地衣類の子実体のガスチャネルを内張りし、菌類病原体により植物表面の認識システムにおける構成成分として機能する（Ｌｕｇｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９９，Ｍｙｃｏｌ．Ｒｅｓ．，１０３，６３５〜６４０、Ｈａｍｅｒ  ＆  Ｔａｌｂｏｔ  １９９８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌｕｍｅ  １，６９３〜６９７）。
【０００８】
これまで、ヒドロホビンは、慣例的な時間のかかるタンパク質の化学的精製（カラム精製及びＨＰＬＣ等）並びに単離法（結晶化等）を用いて、中程度の収量及び純度でのみ調製されていた。遺伝子法を用いたより大量のヒドロホビンを提供する試みも、成功していない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
大量のヒドロホビンを精製するための、より高速かつより経済的な方法のためのより効果的な方法が、当該技術分野において必要とされている。
【００１０】
本出願におけるいずれの文書の言及又は識別も、そのような文書が本発明の先行技術として利用できることを承認するものではない。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの使用、又はそれを精製するための方法に関し、本方法は、沈殿剤、好ましくは有機変性剤、より好ましくはアルコール、最も好ましくはＣ１〜Ｃ３アルコールを生物界面活性剤溶液に添加して、第１の沈殿物を生成する工程と、該沈殿剤／生物界面活性剤溶液から上澄み液をデカントする工程と、同一若しくは異なる沈殿剤を上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成する工程と、を含み得、第２の沈殿物は、精製された生物界面活性剤、有利には精製されたヒドロホビン、より有利には精製されたヒドロホビンＩＩであり得る。第１の沈殿物を生成するための沈殿剤は、第２の沈殿物を生成するための沈殿剤と同一であっても異なっていてもよい。
【００１２】
好ましくは、本発明は、ヒドロホビンＩＩの使用又はそれを精製するための方法に関し、本方法は、Ｃ１〜Ｃ３アルコールをヒドロホビン溶液に添加して、第１の沈殿物を生成する工程と、Ｃ１〜Ｃ３アルコール／ヒドロホビン溶液からの上澄み液をデカントする工程と、Ｃ１〜Ｃ３アルコールを上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成する工程と、を含み得、第２の沈殿物は、精製されたヒドロホビンＩＩであり得る。第１の沈殿物を生成するためのアルコールは、第２の沈殿物を生成するためのアルコールと同一であっても異なっていてもよい。
【００１３】
本発明は、一部、純粋なクラスＩＩのヒドロホビンが粗濃縮物からのイソプロパノール沈殿によって精製され得るという出願人の驚くべき所見に基づいている。
【００１４】
第１の実施形態では、アルコールは、イソプロパノールであってもよい。有利な実施形態では、約２〜３容量、好ましくは２〜３容量、より好ましくは２．５容量のイソプロパノールを添加して、第１の沈殿物を生成してもよい。別の有利な実施形態では、約１容量、好ましくは１容量のイソプロパノールを上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成してもよい。
【００１５】
第２の実施形態では、アルコールは、メタノールであってもよい。有利な実施形態では、約１〜２容量、好ましくは１〜２容量、より好ましくは１．５容量のメタノールを添加して、第１の沈殿物を生成してもよい。別の有利な実施形態では、約１容量、好ましくは１容量のメタノールを上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成してもよい。
【００１６】
第３の実施形態では、アルコールは、エタノールであってもよい。有利な実施形態では、約１〜２容量、好ましくは１〜２容量、より好ましくは１．５容量のエタノールを添加して、第１の沈殿物を生成してもよい。別の有利な実施形態では、約１容量、好ましくは１容量のエタノールを上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成してもよい。
【００１７】
上記の実施形態では、第１の沈殿物は、茶色の沈殿物であってよく、及び／又は第２の沈殿物は、白色の沈殿物であってよい。
【００１８】
特に有利な実施形態では、この使用又は方法は、室温で行われてよい。更に、沈殿剤、好ましくは有機変性剤、より好ましくはアルコール、最も好ましくはＣ１〜Ｃ３アルコールは、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを精製するために再生利用されても、再使用されてもよい。
【００１９】
上記の使用又は方法によって精製される、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩは、凍結乾燥されてもよい。特に、精製された生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、質量分析、又はアミノ酸分析によってアッセイされ得る。
【００２０】
したがって、任意の以前に既知の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法を本発明に包含せず、その結果、出願人が本権利を所有し、それによって任意の以前に既知の産物、プロセス、又は方法の権利放棄を開示することが、本発明の目的である。本発明は、ＵＳＰＴＯ（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１２、第１項）又はＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の文書記述及び実施可能要件を満たさない、任意の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法を本発明の範囲内に包含することを意図せず、その結果、出願人が本権利を所有し、それによって任意の前述の産物、その産物を作製するプロセス、又はその産物を使用する方法の権利放棄を開示することに更に注意する。
【００２１】
本開示において、特に請求項及び／又はパラグラフにおいて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、及び同様の語）」等の用語は、米国特許法においてそれに属する意味を有し得、例えば、それらは「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｅｄ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ、及び同様の語）」等の用語を意味し得ること、並びに「本質的にそれからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ及びｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」等の用語は、米国特許法においてそれらに帰する意味を有し、例えば、それらは明示的に列挙されない要素を許可するが、先行技術において見出されるか、又は発明の基本的特徴若しくは新規特徴に影響する要素を除外することに注意する。
【００２２】
これら及び他の実施形態は、開示されるか、又は以下の発明を実施するための形態から明らかであり、それらによって包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
例として示されるが、説明される特定の実施形態のみに本発明を限定することを意図しない以下の発明を実施するための形態は、添付の図面と併せて最もよく理解され得る。
【図１】示されるように緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０）中のサンプルを希釈し、１×還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＬＤＳサンプル緩衝液と２：１で混合することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析された精製ＨＦＢＩＩを示す。サンプルを、９０℃で５分間インキュベートし、１５μＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％、１ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１０レーン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各ウェルに装填した。ゲルを、１ｘ  ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２００Ｖで３５分間泳動させ、クマシーブリリアントブルーを用いて染色し、脱染した（１０％のエタノール、１０％の酢酸）。得られたゲル画像は、精製ＨＦＢＩＩ中のＨＦＢＩＩについて透明な帯を示し、未精製濃縮物（１／１００）で見える非ヒドロホビン帯の形跡がないことを示す。
【図２】ＨＦＢＩＩの１ｍｇ／ｇ溶液のＲＰ−ＨＰＬＣが、１０％のアセトニトリル中でサンプルを希釈することによって調製されたことを示す。ＨＦＢＩＩは、リン酸ナトリウム緩衝液（「Ａ」、２５ｍＭ、ｐＨ  ２．５）及びアセトニトリル（「Ｂ」、０．０５％のＴＦＡ）の勾配を用いて、Ｃ５カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ５、３００Å、５μｍ、２．１×１００ｍｍ）における逆相ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分離された。ＨＦＢＩＩ溶液を、カラム（６０℃）に注入し（２０μＬ）、０．８ｍＬ／分で６分間にわたり、１０％の溶媒Ｂから７０％のＢに増加することによって溶出させた。このシステムを１０％のＢに戻し、次の注入前に２分間平衡化した。ＨＦＢＩＩは、２２２ｎｍでの吸光度によってモニタリングした。ＨＦＢＩＩは、Ｎ末端フェニルアラニン切断に対応する１つの大きなピーク及び小さなショルダーとして４．３８分でカラムから溶出する。クロマトグラムにおいてその他のピークは観察されていない。
【図３】ステンレス製ＭＡＬＤＩプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上に付け、０．５μＬの飽和シナピン酸溶液（５０％のアセトニトリル）と混合し、乾燥させた、精製ＨＦＢＩＩ（０．５μＬ）の質量分析を示す。サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析して、陽性モードで４，０００〜２０，０００ｍ／ｚを得た。得られたスペクトルは、７１８９．８ｍ／ｚで優位ピークを示し、これは、ＨＦＢＩＩの質量に相当する（ｍ＋１＝７１８９．４ｍ／ｚで計算）。他のピークは、既知のＮ末端フェニルアラニン切断（ｍ＋１＝７０４０．４９ｍ／ｚ）及びガス相ＨＦＢＩＩ二量体（１４３８０ｍ／ｚ）に起因し得る。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「生物界面活性剤」又は「生物学的に生成された界面活性剤」は、タンパク質、糖脂質、リポペプチド、リポタンパク質、リン脂質、中性脂肪、又は脂肪酸であり得、水と疎水性液体、又は水と空気との間の界面張力等の表面張力を減少させ得、生物系から生成又は得られることができる。生物界面活性剤は、ヒドロホビンを含む。生物界面活性剤は、サーファクチン、ペプチド脂質、セラウェチン、ビスコシン、サブチリシン、グラミシジン、ポリミキシン等のリポペプチド及びリポタンパク質を含む。生物界面活性剤は、ラムノリピッド、ソホロリピッド、トレハローリピッド、及びセロビオリピッド等の糖脂質を含む。生物界面活性剤は、エマルサン、バイオディスパーサン、マンナン−脂質−タンパク質、リポサン、炭水化物−タンパク質−脂質、タンパク質ＰＡ等のポリマーを含む。生物界面活性剤は、小胞、線毛、及び全細胞等の微粒子を含む。生物界面活性剤は、サポニン等の配糖体を含む。生物界面活性剤は、フィブロイン等の繊維性タンパク質を含む。生物界面活性剤は、自然に発生し得るか、又は自然界では見出されない突然変異若しくは遺伝子組み換えされた変異型であり得る。これは、本発明に従って生物界面活性剤の溶解度を低減させることによって発泡の制御を助長するように低溶解度に対して遺伝子操作を受けている生物界面活性剤の変異型を含む。生物界面活性剤としては、本明細書で使用される、関連生物界面活性剤、誘導生物界面活性剤、変異型生物界面活性剤、及び相同生物界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書で使用される、「生物系」は、病原菌、植物、真菌、昆虫、脊椎動物、又は合成生物学によって創出される生命体等の生物有機体を含む、又はそれらに由来する。生物有機体は、標準的な交配、クローン選択、突然変異誘発、及び遺伝的多様性を作り出すための同様の方法によって得られる自然界では見出されない変異体であり得るか、又は組み換えＤＮＡ技術によって得られた遺伝子組み換えされた有機体であり得る。生物有機体は、その全体で用いられ得るか、又は臓器培養、植物栽培品種、懸濁細胞培養、付着細胞培養、又は無細胞調製物等の成分の源であり得る。
【００２６】
生物系は、生物界面活性剤を隔離する場合に、生体細胞を含んでいても含んでいなくてもよい。生物系は、自然源から見出しても、回収してもよく、養殖、栽培してもよく、又は産業条件下で増殖させてもよい。生物系は、前駆体又は供給される栄養素から生物界面活性剤を合成してもよく、又はその環境から生物界面活性剤を増やしてもよい。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「生産」は、化学的及び生物学的産物の生産のための製造方法に関し、これには、収穫、収集、圧縮、放出、冷浸、均質化、すりつぶし、醸造、発酵、回収、固液分離、細胞分離、遠心分離、濾過（真空濾過等）、製剤化、貯蔵、又は輸送が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「発酵ブロス組成物」は、ヒドロホビン等の所望のタンパク質を含有する細胞増殖培地を指す。細胞増殖培地は、細胞及び／又は細胞残屑を含んでよく、また濃縮されていてもよい。代表的な発酵ブロス組成物は、ヒドロホビンを含有する、限外濾過濃縮された発酵ブロスである。精密濾過は、従来、例えば細胞分離のために、細胞残屑を保有し、タンパク質を通過させるために使用されるが、一方、限外濾過は、従来、例えば、濃縮のためにタンパク質を保有し、溶質を通過させるために使用される。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指すために互換的に使用される。アミノ酸残基について、本明細書では従来の１文字コード又は３文字コードが使用される。ポリマーは直鎖又は分枝鎖であってよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断され得る。この用語は、自然に、又は介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾、例えば、標識成分との共役によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、非天然アミノ酸等を含む）を含有するポリペプチド、並びに当該技術分野において既知の他の修飾物も、定義内に含まれる。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「培養液」は、生物界面活性剤並びに所望の生物界面活性剤が回収されるように意図される他の可溶性及び不溶性成分を含む液体である。そのような成分には、他のタンパク質、細胞又は細胞残屑等の非タンパク性不純物、核酸、多糖類、脂質、消泡剤等の化学物質、凝集剤、塩、糖類、ビタミン、成長因子、沈殿物等が含まれる。「培養液」はまた、「タンパク質溶液」、「液体培地」、「ディアフィルターブロス」、「浄化ブロス」、「濃縮物」、「ならし培地」、「発酵ブロス」、「溶解ブロス」、「溶解物」、「細胞ブロス」、又は単に「ブロス」とも称され得る。存在する場合、細胞は、細菌、真菌、植物、動物、ヒト、昆虫、合成物質等であり得る。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、用語「回収」とは、生物界面活性剤及び１つ以上の望ましくない成分を含む液体培養が、細胞及び細胞残屑、他のタンパク質、アミノ酸、多糖類、糖類、ポリオール、無機又は有機塩、酸及び塩基、並びに微粒子材料等の望ましくない成分の少なくとも幾つかから生物界面活性剤を分離するためのプロセスに供される、プロセスを指す。
【００３２】
本明細書で使用されるとき、「生物界面活性剤の産物」とは、顧客等のエンドユーザに提供するのに適している生物界面活性剤の調製物を指す。生物界面活性剤の産物は、生物界面活性剤の機能的な保存期間を延長する、又は最終用途適用を促進するために、添加又は保有される、細胞、細胞残屑、培地成分、緩衝液、塩、防腐剤、還元剤、糖類、ポリオール、界面活性剤等の製剤賦形剤を含み得る。生物界面活性剤の産物はまた、精製されてもよい。
【００３３】
本明細書で使用されるとき、機能的及び／又は構造的に類似した生物界面活性剤は、「関連生物界面活性剤」であると考えられる。そのような生物界面活性剤は、異なる属及び／若しくは種の有機体、又は更には異なる部類の有機体（例えば、細菌及び真菌）に由来し得る。関連生物界面活性剤はまた、一次配列分析によって決定されるか、三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定される、相同体も包含する。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、用語「誘導生物界面活性剤」は、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか若しくは両方に１つ以上のアミノ酸を付加することにより、アミノ酸配列中の１つ若しくは多数の異なる部位で１つ以上のアミノ酸を置換することにより、並びに／あるいはタンパク質のいずれか若しくは両方の末端で又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を欠失させることにより、並びに／あるいは、アミノ酸配列中の１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を挿入することにより、生物界面活性剤から誘導されるタンパク質系の生物界面活性剤を指す。生物界面活性剤誘導体の調製は、天然タンパク質をコード化するＤＮＡ配列を改変し、このＤＮＡ配列をより好適な宿主に形質転換させ、改変されたＤＮＡ配列を発現させてタンパク質誘導体を形成することにより、達成され得る。「誘導生物界面活性剤」はまた、脂質又は炭水化物部分のいずれかが、合成中又は合成後のいずれかにタンパク質骨格に付着している生物界面活性剤誘導体も包含し得る。
【００３５】
関連（及び誘導）生物界面活性剤には、「変異型生物界面活性剤」が含まれる。変異型タンパク質系生物界面活性剤は、１つ以上のアミノ酸残基での置換、欠失、及び／又は挿入によって、比較／親生物界面活性剤、例えば、野生型生物界面活性剤とは異なる。異なるアミノ酸残基の数は、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異型生物界面活性剤は、野生型生物界面活性剤と少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は更には少なくとも約９９％、あるいはそれ以上のアミノ酸配列同一性を共有する。変異型生物界面活性剤はまた、選択したモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等においても比較生物界面活性剤とは異なり得る。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「キメラ」又は「キメラの」とは、単一組成物、有利には異なる有機体からのものであり得る複合成分を有するポリペプチドを指す。本明細書で使用されるとき、「キメラの」とは、個々のタンパク質部分の機能又は活性に対応する領域を有する融合タンパク質をもたらすように遺伝子操作を受けている、生物界面活性剤又はその変異型生物界面活性剤を含む、直列に配列された部分を指すのに使用される。一実施形態。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、用語「類似配列」は、生物界面活性剤と類似する機能、三次構造、及び／又は保存残基を提供するタンパク質系生物界面活性剤内の配列を指す。例えば、α−立体らせん又はβ−シート構造を含むエピトープ領域において、類似配列における置き換えアミノ酸は、好ましくは同一の特定構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列も指す。幾つかの実施形態では、類似配列は、置き換えアミノ酸が、類似する機能又は改善された機能を示す変異酵素をもたらすように開発される。幾つかの実施形態では、生物界面活性剤におけるアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、所望のセグメント若しくは断片に位置するか、又はその付近に位置する。したがって、所望のセグメント又は断片が、α−立体らせん又はβ−シート構造を含む場合、置き換えアミノ酸は、好ましくはその特定の構造を維持する。
【００３８】
本明細書で使用されるとき、用語「相同生物界面活性剤」は、比較生物界面活性剤に類似する活性及び／又は構造を有する生物界面活性剤を指す。相同体が必ずしも進化的に関連することは意図しない。それ故に、この用語は、異なる有機体から得られる同じ、類似の又は相当する生物界面活性剤（すなわち、構造及び機能の点で）を包含することが意図される。幾つかの実施形態では、比較生物界面活性剤に類似する四次、三次、及び／又は一次構造を有する相同体を同定することが望ましい。
【００３９】
配列間の相同性の程度は、当該技術分野において既知の任意の好適な方法を使用して決定され得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５を参照）。
【００４０】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定する有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法の簡略化を使用する（Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されるものと類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重量０．１０のデフォルトギャップ長重量及び重みつき末端ギャップが挙げられる。有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌらにより記載される、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７）。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、及び両ストランドの比較を使用する。有利には、ＢＬＡＳＴプログラム又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを実行するプログラムを用いて、配列相同性又は同定レベルを決定する。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、少なくとも２つの核酸又はポリペプチドの文脈における語句「実質的に同様である」及び「実質的に同一である」は、典型的には、ポリヌクレオチド又はポリペプチドが、参照（すなわち、野生型）配列と比較して、少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は更には少なくとも約９９％の同一性又はそれ以上の同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準パラメーターを用いた、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、及びＣＬＵＳＴＡＬ等の既知のプログラムを使用して決定され得る（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５、Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３、及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７〜２４４を参照）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。また、データベースは、ＦＡＳＴＡを使用して検索され得る（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４〜２４４８）。有利には、ＢＬＡＳＴプログラム又はＢＬＡＳＴアルゴリズムを実行するプログラムを用いて、配列相同性又は同定レベルを決定する。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの印は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応する。したがって、例えば、２つのペプチドが同類置換のみ異なる場合は、実質的に第２のポリペプチドと同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である他の印は、２つの分子がお互いに厳格な条件（例えば、中程度から高度に厳格な条件の範囲内）においてお互いに混成することである。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「野生型」及び「天然の」生物界面活性剤は、自然界に見出されるものである。用語「野生型配列」及び「野生型遺伝子」は、本明細書において互換的に使用され、宿主細胞において天然又は自然発生する配列を指す。幾つかの実施形態では、野生型配列は、タンパク質工学計画の出発点である所望の配列を指す。自然発生するタンパク質をコードする遺伝子は、当業者に公知の一般的な方法に従って得ることができる。これらの方法は一般に、生物界面活性剤の推定上の配列をコードする領域を有する標識プローブを合成する工程と、タンパク質を発現する生物からゲノムライブラリーを調製する工程と、プローブへのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子に関してライブラリーをスクリーニングする工程と、を含む。次いで、確実に混成するクローンがマップ化され、配列決定される。
【００４３】
本発明の方法は、培養液から生物界面活性剤を単離するために適用することができる。有利には、生物界面活性剤は、微生物によって分泌される可溶性細胞外生物界面活性剤である。
【００４４】
一連の代表的な生物界面活性剤は、糸状菌によって発現されるシステインリッチなポリペプチドの類であるヒドロホビンである。ヒドロホビンは、細胞及び人工物質を含む対象物の表面上に疎水性コーティングを形成するその能力で知られている低分子（約１００個のアミノ酸）のポリペプチドである。１９９１年にスエヒロタケコミューンにおいて最初に発見されたヒドロホビンは、現在多数の糸状菌において認識されている。ハイドロパシー及び他の生物物理学的特性における差異に基づいて、ヒドロホビンは、クラスＩ又はクラスＩＩとして分類される。
【００４５】
ヒドロホビンの発現は、通常、発酵中に大量の１つ以上の泡止め剤（すなわち、消泡剤）の添加を必要とする。そうでなければ、ヒドロホビンポリペプチドによって生成される発泡体が、ブリーザフィルターを飽和させ、通気口を汚し、圧力の蓄積をもたらし、タンパク質収量を減少させる。結果として、ヒドロホビンの粗濃縮物は、従来、特にヒドロホビンが食品添加物として意図されるとき、ヒドロホビン調製物において望ましくない、残留量の消泡剤並びに宿主細胞混入物を含有する。
【００４６】
ヒドロホビンは、その実際の分子量よりも大きい見かけの分子量を有する形態で可逆的に存在することができ、そのためヒドロホビンは、本方法を用いて回収するために好適となる。ヒドロホビンを含有する液体又は発泡体は、記載されるタンパク質回収のための発酵槽から継続的又は周期的に採取され得るか、あるいは発酵操作の終了時にバッチで採取され得る。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「ヒドロホビン」という用語は、親水性／疎水性界面で自己集合することができるポリペプチドを指すことができ、一般式（Ｉ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−（Ｘ２）ｂ−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−（Ｘ６）ｆ−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ        （Ｉ）を有し、
式中、ｍ及びｎは独立して、０〜２０００であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、及びＢ８はそれぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも６つがＣｙｓであり、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ７、Ｙ１、及びＹ２は独立して、任意のアミノ酸を示し、ａは１〜５０であり、ｂは０〜５であり、ｃは１〜１００であり、ｄは１〜１００であり、ｅは１〜５０であり、ｆは０〜５であり、ｇは１〜１００である。
【００４８】
幾つかの実施形態では、ヒドロホビンは、ヒドロホビンコア中に４０〜１２０個のアミノ酸の配列を有する。幾つかの実施形態では、ヒドロホビンは、ヒドロホビンコア中に４５〜１００個のアミノ酸の配列を有する。幾つかの実施形態では、ヒドロホビンは、ヒドロホビンコア中に５０〜９０個、好ましくは、５０〜７５個、又は５５〜６５個のアミノ酸の配列を有する。用語「ヒドロホビンコア」は、残基Ｂ１で始まり、残基Ｂ８で終わる配列を意味する。
【００４９】
式（Ｉ）では、Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、又は８つすべての残基が、Ｃｙｓである。
【００５０】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｍは、適切には、０〜５００、又は０〜２００、又は０〜１００、又は０〜２０、又は０〜１０、又は０〜５、又は０である。
【００５１】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｎは、適切には、０〜５００、又は０〜２００、又は０〜１００、又は０〜２０、又は０〜１０、又は０〜３である。
【００５２】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ａは、３〜２５、又は５〜１５である。一実施形態では、ａは、５〜９である。
【００５３】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｂは、０〜２、又は好ましくは０である。
【００５４】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｃは、５〜５０、又は５〜４０である。幾つかの実施形態では、ｃは、１１〜３９である。
【００５５】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｄは、２〜３５、又は４〜２３である。幾つかの実施形態では、ｄは、８〜２３である。
【００５６】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｅは、２〜１５、又は５〜１２である。幾つかの実施形態では、ｅは、５〜９である。
【００５７】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｆは、０〜２、又は０である。
【００５８】
式（Ｉ）では、幾つかの実施形態では、ｇは、３〜３５、又は６〜２１である。一実施形態では、ｇは、６〜１８である。
【００５９】
幾つかの実施形態では、本発明で使用されるヒドロホビンは、一般式（ＩＩ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−（Ｘ２）ｂ−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−（Ｘ６）ｆ−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ        （ＩＩ）を有し得、
式中、ｍ及びｎは独立して、０〜２０であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、及びＢ８はそれぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つがＣｙｓであり、ａは３〜２５であり、ｂは０〜２であり、ｃは５〜５０であり、ｄは２〜３５であり、ｅは２〜１５であり、ｆは０〜２であり、ｇは３〜３５である。
【００６０】
式（ＩＩ）では、Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つ、又は８つすべての残基がＣｙｓである。
【００６１】
幾つかの実施形態では、本発明で使用されるヒドロホビンは、一般式（ＩＩＩ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ          （ＩＩＩ）を有し得、
式中、ｍ及びｎは独立して、０〜２０であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、及びＢ８はそれぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つがＣｙｓであり、ａは５〜１５であり、ｃは５〜４０であり、ｄは４〜２３であり、ｅは５〜１２であり、ｇは６〜２１である。
【００６２】
式（ＩＩＩ）では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つ、又は８つがＣｙｓである。
【００６３】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの６つ又は７つがＣｙｓであるとき、残基Ｂ３〜Ｂ７がＣｙｓであることが好ましい。
【００６４】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、幾つかの実施形態では、（ａ）Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８がＣｙｓであり、Ｂ２はＣｙｓ以外であり、（ｂ）Ｂ１〜Ｂ７がＣｙｓであり、Ｂ８はＣｙｓ以外であり、（ｃ）Ｂ１はＣｙｓ以外であり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓである。残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、他の残基は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、又はＬｅｕであることが好ましい。幾つかの実施形態では、Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＳｅｒである。幾つかの実施形態では、Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＬｅｕである。更なる実施形態では、Ｂ１はＰｒｏであり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓである。
【００６５】
本発明で使用されるヒドロホビンのシステイン残基は、還元型で存在し得るか、又は任意の可能な組み合わせで、互いにジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）架橋を形成し得る。幾つかの実施形態では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの８つすべてがＣｙｓであるとき、ジスルフィド架橋は、システイン残基対：Ｂ１及びＢ６、Ｂ２及びＢ５、Ｂ３及びＢ４、Ｂ７及びＢ８のうちの１つ以上（好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ、最も好ましくは４つすべて）で形成され得る。幾つかの実施形態では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの８つすべてがＣｙｓであるとき、ジスルフィド架橋は、システイン残基対：Ｂ１及びＢ２、Ｂ３及びＢ４、Ｂ５及びＢ６、Ｂ７及びＢ８のうちの１つ以上（少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は４つすべて）で形成され得る。
【００６６】
本発明で有用な特定のヒドロホビンの例には、刊行物：Ｌｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖ．２００５，２９，８７７〜８９６、Ｋｕｂｉｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，８，４、Ｓｕｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｎ，２００８，３９，７７３〜７８４、Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，３８，１〜４５、Ｗｏｓｔｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００１，５５，６２５〜６４６、Ｈｅｋｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００５，１６，４３４〜４３９、Ｓｚｉｌｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００７，４６，２３４５〜２３５４、Ｋｉｓｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１６１２〜１６１９、Ｂｌｉｊｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｓｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ，２０１０，６，１７９９〜１８０８、Ｗｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４，１３，５８４８〜５８５４、Ｈａｋａｎｐａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９，５３４〜５３９、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，２００４，１３，８１０〜８２１、Ｄｅ  Ｖｏｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８，７４，２０５９〜２０６８、Ａｓｋｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００６，７，１２９５〜１３０１、Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００７，２３，７９９５〜８００２、Ｌｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２００１，２，５１１〜５１７、Ｋａｌｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００７，２８２，２８７３３〜２８７３９、Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉｊｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００１，５６，１〜８、Ｌｕｍｓｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ＆  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，２００５，４４，１７２〜１７８、Ｐａｌｏｍｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ２００３，４，２０４〜２１０、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｋｅｙｈａｎｉ，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｊｕｌｙ  １７  ２０１０（ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｓｔｕｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０  Ｊｕｎｅ  ２０１０（ｅ−ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）、Ｌａａｋｓｏｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，５１８５〜５１９２、Ｋｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００８，３８２，７０８〜７２０、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，１５４，１６７７〜１６８５、Ｌａｈｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，２００８，５９，１８〜２４、Ｓｚｉｌｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２００７，５８１１，２７２１〜２７２６、Ｈａｋａｎｐａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．２００６，６２，３５６〜３６７、Ｓｃｈｏｌｔｍｅｉ��ｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００２，６８，１３６７〜１３７３、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２００６，７  Ｓｕｐｐ．４，Ｓ１６、国際特許公開第ＷＯ  ０１／５７０６６号、同第ＷＯ  ０１／５７５２８号、同第ＷＯ  ２００６／０８２２５３号、同第ＷＯ  ２００６／１０３２２５号、同第ＷＯ  ２００６／１０３２３０号、同第ＷＯ  ２００７／０１４８９７号、同第ＷＯ  ２００７／０８７９６７号、同第ＷＯ  ２００７／０８７９６８号、同第ＷＯ  ２００７／０３０９６６号、同第ＷＯ  ２００８／０１９９６５号、同第ＷＯ  ２００８／１０７４３９号、同第ＷＯ  ２００８／１１０４５６号、同第ＷＯ  ２００８／１１６７１５号、同第ＷＯ  ２００８／１２０３１０号、同第ＷＯ  ２００９／０５００００号、米国特許公開第ＵＳ  ２００６／０２２８４８４号、及び欧州特許第ＥＰ  ２０４２１５６Ａ号において開示され例示されるものが挙げられ、これらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。  ヒドロホビンは、当該技術分野において既知のいかなるクラスＩ又はクラスＩＩのヒドロホビンであってもよく、例えば、アガリクス属（例えば、アガリクスビスポラス（Agaricus bisporus））、アグロサイブ（Agrocybe）属（例えば、ポプラキノコ（Agrocybe aegerita））、アジェロミセス（Ajellomyces）属（例えば、アジェロミセスカプスラタス（Ajellomyces capsulatus）、アジェロミセスデルマティティディス（Ajellomyces dermatitidis））、アスペルギルス（Aspergillus）属（例えば、アスペルギルスアルビ（Aspergillus arvii）、アスペルギルスブレビプス（Aspergillus brevipes）、アスペルギルスクラバタス（Aspergillus clavatus）、アスペルギルスデリカウリス（Aspergillus duricaulis）、アスペルギルスエリプティカス（Aspergillus ellipticus）、アスペルギルスフラバス（Aspergillus flavus）、アスペルギルスフミガーツス（Aspergillus fumigatus）、アスペルギルスフミシネマタス（Aspergillus fumisynnematus）、アスペルギルスレンタス（Aspergillus lentulus）、アスペルギルスニゲル（Aspergillus niger）、アスペルギルスユニラテラリス（Aspergillus unilateralis）、アスペルギルスビリジニュータンス（Aspergillus viridinutans））、ボーベリア（Beauveria）属（例えば、ボーベリアバッシアナ（Beauveria bassiana））、クラビセプス（Claviceps）属（例えば、クラビセプスフシホルミス（Claviceps fusiformis））、コクシジオイド（Coccidioides）属（例えば、コクシジオイドポサダシ（Coccidioides posadasii））、コクリオボラス（Cochliobolus）属（例えば、コクリボルスヘテロストロフス（Cochliobolus heterostrophus））、クリニペリス（Crinipellis）属（例えば、クリニペリスペルニキオサ（Crinipellis perniciosa））、クリフォネクトリア（Cryphonectria）属（例えば、クロフォネクトリアパラシティカ（Cryphonectria parasitica））、ダビディエラ（Davidiella）属（例えば、ダビディエラタシアナ（Davidiella tassiana））、ディクチオネマ属（例えば、ディクチオネマグラブラタム（Dictyonema glabratum））、エメリセラ（Emericella）属（例えば、エメリセラニデュランス（Emericella nidulans））、フランムリナ（Flammulina）属（例えば、フランムリナベルティペス（Flammulina velutipes））、フサリウム（Fusarium）属（例えば、フサリウムクルモラム（Fusarium culmorum））、ギベレラ（Gibberella）属（例えば、ギベレラモニリホルミス（Gibberella moniliformis））、グロメレラ（Glomerella）属（例えば、グロメレラグラミニコラ（Glomerella graminicola））、グリフォラ（Grifola）属（例えば、グリフォラフロンドサ（Grifola frondosa））、ヘテロバシジオン（Heterobasidion）属（例えば、ヘテロバシイオンアンノサム（Heterobasidion annosum））、ヒポクレア（Hypocrea）属（例えば、ヒポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）、ヒポクレアリキシ（Hypocrea lixii）、ヒポクレアビレンス（Hypocrea virens））、ラッカリア（Laccaria）属（例えば、ラッカリアビカラ（Laccaria bicolor））、レンチヌラ属（Lentinula）（例えば、レンチヌラエドーデス（Lentinula edodes））、マグナポルテ（Magnaporthe）属（例えば、マグナポルテオリザエ（Magnaporthe oryzae））、マラスミウス（Marasmius）属（例えば、マラスミウスクラドフィラス（Marasmius cladophyllus））、モニリオフトラ（Moniliophthora）属（例えば、モニリオフトラペルニシオサ（Moniliophthora perniciosa））、ネオサルトリア（Neosartorya）属（例えば、ネオサルトリアアウレオラ（Neosartorya aureola）、ネオサルトリアフェンネリア（Neosartorya fennelliae）、ネオサルトリアフィッシェリ（Neosartorya fischeri）、ネオサルトリアグラブラ（Neosartorya glabra）、ネオサルトリアヒラツカ（Neosartorya hiratsukae）、ネオサルトリアニシムラ（Neosartorya nishimurae）、ネオサルトリアオータニ（Neosartorya otanii）、ネオサルトリアスードフィッシェリ（Neosartorya pseudofischeri）、ネオサルトリアクアドリシンクタ（Neosartorya quadricincta）、ネオサルトリアスパスラタ（Neosartorya spathulata）、ネオサルトリアスピノサ（Neosartorya spinosa）、ネオサルトリアストラメニア（Neosartorya stramenia）、ネオサルトリアウダガワ（Neosartorya udagawae））、ニューロスポラ（Neurospora）属（例えば、ニューロスポラクラッサ（Neurospora crassa）、ニューロスポラジスクレタ（Neurospora discreta）、ニューロスポラインターメディア（Neurospora intermedia）、ニューロスポラシトフィラ（Neurospora sitophila）、ニューロスポラテトラスペルマ（Neurospora tetrasperma））、オフィオストマ（Ophiostoma）属（例えば、オフィオストマノボ−ウルミ（Ophiostoma novo-ulmi）、オフィオストマクエルカス（Ophiostoma quercus））、パラコクシジオイド（Paracoccidioides）属（例えば、パラコクシジオイドブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis））、パッサローラ（Passalora）属（例えば、パッサローラフルバ（Passalora fulva））、パキシルスフィラメントサス（Paxillus filamentosus）、パキシラスインボルタス（Paxillus involutus）、ペニシリウム（Penicillium）属（例えば、ペニシリウムカメンベルチ（Penicillium camemberti）、ペニシリウムクリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウムマルネッフェイ（Penicillium marneffei））、フレビオプシス（Phlebiopsis）属（例えば、フレビオプシスギガンテア（Phlebiopsis gigantea））、ピソリタス（Pisolithus）（例えば、ピソリサスティンクトリウス（Pisolithus tinctorius））、プレウロタス（Pleurotus）属（例えば、プレウロタスオストレアタス））、ポドスポラ（Podospora）属（例えば、ポドスポラアンセリナ））、ポスティア（Podospora）属（例えば、ポスティアプラセンタ（Postia placenta））、ピレノホラ（Pyrenophora）属（例えば、ピレノホラトリティキ−レペンティス（Pyrenophora tritici-repentis��）、シゾフィリウム（Schizophyllum）属（例えば、スエヒロタケコミューン））、タラロマイセス（Talaromyces）属（例えば、タラロマイセススティピタタス（Talaromyces stipitatus））、トリコデルマ（Trichoderma）属（例えば、トリコデルマアスペレラム（Trichoderma asperellum）、トリコデルマアトロビリデ（Trichoderma atroviride）、トリコデルマビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマレーシ（Trichoderma reesii）［以前のヒポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）］）、トリコロマ（Tricholoma）属（例えば、トリコロマテレウム（Tricholoma terreum））、ウンキノカルプス（Uncinocarpus）属（例えば、ウンキノカルプスレーシ（Uncinocarpus reesii））、ベルティシリウム（Verticillium）属（例えば、ベルティシリウムダリア（Verticillium dahliae））、キサントダクチロン（Xanthodactylon）属（例えば、キサントダクチロンフランメウム（Xanthodactylon flammeum））、キサントリア（Xanthoria）属（例えば、キサントリアカルシコラ（Xanthoria calcicola）、キサントリアカペンシス（Xanthoria capensis）、キサントリアエクタネオイド（Xanthoria ectaneoides）、キサントリアフランメア（Xanthoria flammea）、キサントリアカロオエンシス（Xanthoria karrooensis）、キサントリアリグラタ（Xanthoria ligulata）、キサントリアパリエティナ（Xanthoria parietina）、キサントリアツルビナタ（Xanthoria turbinata））等からのヒドロホビンである。ヒドロホビンは、例えば、Ｓｕｎｄｅ，Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｍｉｃｒｏｎ  ３９：７７３〜８４、Ｌｉｎｄｅｒ
，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．２９：８７７〜９６、及びＷｏｓｔｅｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５５：６２５〜４６において検討されている。
【００６７】
特に有利な実施形態では、ヒドロホビンは、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマアスペレラム（Trichoderma asperellum）、トリコデルマアトロビリデ（Trichoderma atroviride）、トリコデルマビリデ（Trichoderma viride）、トリコデルマレーシ（Trichoderma reesii）［以前のヒポクレアジェコリナ（Hypocrea jecorina）］）、有利にはトリコデルマリーゼイからのものである。
【００６８】
当該技術分野において、本明細書で説明されるとき、ヒドロホビンは、クラスＩ及びＩＩに分類される。クラスＩ及びＩＩのヒドロホビンが、溶解度特性を含む多くの理由において区別され得ることは、当該技術分野において周知である。本明細書で説明されるとき、ヒドロホビンは、界面（例えば、水／空気界面）で両親媒性界面薄膜に自己集合する。クラスＩのヒドロホビンの集合した両親媒性薄膜は、通常、強酸（典型的には、ギ酸又はトリフルオロ酢酸等の４よりも低いｐＫａを有するもの）中でのみ再可溶化され、一方、クラスＩＩのヒドロホビンは、より広範囲の溶媒中で可溶性である。
【００６９】
幾つかの実施形態では、ヒドロホビンは、クラスＩＩのヒドロホビンである。幾つかの実施形態では、ヒドロホビンは、クラスＩのヒドロホビンである。
【００７０】
幾つかの実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、水／空気界面で上記の自己集合特性を有するヒドロホビンを含み、集合した両親媒性薄膜は、室温で、水性エタノール溶液（６０％  ｖ／ｖ）中で少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の濃縮物に再溶解することができる。幾つかの実施形態では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有するが、この特定の再分解特性を有さないヒドロホビンを含む。
【００７１】
幾つかの実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、水／空気界面で上記の自己集合特性を有するヒドロホビンを含み、集合した両親媒性薄膜は、室温で、ドデシル硫酸ナトリウム溶液（２％  ｗ／ｗ）中で少なくとも０．１％（ｗ／ｗ）の濃縮物に再溶解することができる。幾つかの実施形態では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有するが、この特定の再分解特性を有さないヒドロホビンを含む。
【００７２】
クラスＩ及びＩＩのヒドロホビンはまた、ヒドロホビンタンパク質の多くの領域の疎水性／親水性によっても区別することができる。
【００７３】
幾つかの実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有し、残基Ｂ３とＢ４との間の領域、すなわち、この部分（Ｘ３）ｃが主に疎水性である、ヒドロホビンを含む。幾つかの実施形態では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有するが、残基Ｂ３とＢ４との間の領域、すなわち、この基（Ｘ３）ｃが主に親水性である、ヒドロホビンを含む。
【００７４】
幾つかの実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有し、残基Ｂ７とＢ８との間の領域、すなわち、この部分（Ｘ７）ｇが主に疎水性である、ヒドロホビンを含む。幾つかの実施形態では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有するが、残基Ｂ７とＢ８との間の領域、すなわち、この部分（Ｘ７）ｇが主に親水性である、ヒドロホビンを含む。
【００７５】
幾つかの実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有し、残基Ｂ３とＢ４との間の領域、すなわち、この部分（Ｘ３）ｃが主に疎水性である、ヒドロホビンを含む。幾つかの実施形態では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有するが、残基Ｂ３とＢ４との間の領域、すなわち、この基（Ｘ３）ｃが主に親水性である、ヒドロホビンを含む。
【００７６】
幾つかの実施形態では、用語「クラスＩＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有し、残基Ｂ７とＢ８との間の領域、すなわち、この部分（Ｘ７）ｇが主に疎水性である、ヒドロホビンを含む。幾つかの実施形態では、用語「クラスＩのヒドロホビン」は、上記の自己集合特性を有するが、残基Ｂ７とＢ８との間の領域、すなわち、この部分（Ｘ７）ｇが主に親水性である、ヒドロホビンを含む。
【００７７】
ヒドロホビンタンパク質の様々な領域の相対的な疎水性／親水性は、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８２，１５７，１０５〜１３２に記載されている方法を用いてヒドロホビンのハイドロパシーパターンを比較することによって規定され得る。コンピュータプログラムを用いて、そのアミノ酸配列に沿ってタンパク質の親水性及び疎水性を徐々に評価することができる。この目的のため、該方法は、２０個のアミノ酸側鎖のそれぞれの親水性特性及び疎水性特性を比較するハイドロパシー尺度（文献に由来する多くの実験観察に基づく）を用いる。このプログラムは、配列を通って前進する際の所定の長さのセグメント内の平均ハイドロパシーを継続的に決定する移動セグメントアプローチを用いる。連続スコアが、アミノ末端からカルボキシ末端までプロットされる。同時に、配列決定されたタンパク質のほとんどに見られるアミノ酸組成物のハイドロパシーの総加算平均に対応する中点線が印刷される。本方法は、Ｗｅｓｓｅｌｓ，Ａｄｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９７，３８，１〜４５においてヒドロホビンについて更に記載されている。
【００７８】
クラスＩＩのヒドロホビンはまた、それらの保存配列によっても特徴づけられ得る。
【００７９】
一実施形態では、本発明で用られるクラスＩＩのヒドロホビンは、一般式（ＩＶ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ              （ＩＶ）を有し得、
式中、ｍ及びｎは独立して、０〜２００であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、及びＢ８はそれぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、又はＧｌｙから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも６つがＣｙｓであり、ａは６〜１２であり、ｃは８〜１６であり、ｄは２〜２０であり、ｅは４〜１２であり、ｇは５〜１５である。
【００８０】
式（ＩＶ）では、幾つかの実施形態では、ａは、７〜１１である。
【００８１】
式（ＩＶ）では、幾つかの実施形態では、ｃは、１０〜１２である。幾つかの実施形態では、ｃは１１である。
【００８２】
式（ＩＶ）では、幾つかの実施形態では、ｄは、４〜１８である。幾つかの実施形態では、ｄは、４〜１６である。
【００８３】
式（ＩＶ）では、幾つかの実施形態では、ｅは、６〜１０である。幾つかの実施形態では、ｅは、９又は１０である。
【００８４】
式（ＩＶ）では、幾つかの実施形態では、ｇは、６〜１２である。幾つかの実施形態では、ｇは、７〜１０である。
【００８５】
幾つかの実施形態では、本発明で用いられるクラスＩＩのヒドロホビンは、一般式（Ｖ）：
（Ｙ１）ｎ−Ｂ１−（Ｘ１）ａ−Ｂ２−Ｂ３−（Ｘ３）ｃ−Ｂ４−（Ｘ４）ｄ−Ｂ５−（Ｘ５）ｅ−Ｂ６−Ｂ７−（Ｘ７）ｇ−Ｂ８−（Ｙ２）ｍ              （Ｖ）を有し得、
式中、ｍ及びｎは独立して、０〜１０であり、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ７、及びＢ８はそれぞれ独立して、Ｃｙｓ、Ｌｅｕ、又はＳｅｒから選択されるアミノ酸であり、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つがＣｙｓであり、ａは７〜１１であり、ｃは１１であり、ｄは、４〜１８であり、ｅは、６〜１０であり、ｇは、７〜１０である。
【００８６】
式（ＩＶ）及び（Ｖ）では、幾つかの実施形態では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの少なくとも７つがＣｙｓであるか、又は残基Ｂ１〜Ｂ８のすべてがＣｙｓである。
【００８７】
式（ＩＶ）及び（Ｖ）では、幾つかの実施形態では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、残基Ｂ３〜Ｂ７がＣｙｓであることが好ましい。
【００８８】
式（ＩＶ）及び（Ｖ）では、幾つかの実施形態では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、（ａ）Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＣｙｓ以外であるか、（ｂ）Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＣｙｓ以外であるか、又は（ｃ）Ｂ１はＣｙｓ以外であり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓであることが好ましい。幾つかの実施形態では、残基Ｂ１〜Ｂ８のうちの７つがＣｙｓであるとき、他の残基は、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、又はＬｅｕであることが好ましい。幾つかの実施形態では、Ｂ１及びＢ３〜Ｂ８はＣｙｓであり、Ｂ２はＳｅｒである。幾つかの実施形態では、Ｂ１〜Ｂ７はＣｙｓであり、Ｂ８はＬｅｕである。幾つかの実施形態では、Ｂ１はＰｒｏであり、Ｂ２〜Ｂ８はＣｙｓである。
【００８９】
式（ＩＶ）及び（Ｖ）では、幾つかの実施形態では、基（Ｘ３）ｃは、配列モチーフＺＺＸＺを含み、式中、Ｚは脂肪族アミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸である。用語「脂肪族アミノ酸」は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、及びプロリン（Ｐ）からなる群から選択されるアミノ酸を意味する。
【００９０】
幾つかの実施形態では、基（Ｘ３）ｃは、ＬＬＸＶ、ＩＬＸＶ、ＩＬＸＬ、ＶＬＸＬ、及びＶＬＸＶからなる群から選択される配列モチーフを含む。幾つかの実施形態では、基（Ｘ３）ｃは、配列モチーフＶＬＸＶを含む。
【００９１】
式（ＩＶ）及び（Ｖ）では、幾つかの実施形態では、基（Ｘ３）ｃは、配列モチーフＺＺＸＺＺＸＺを含み、式中、Ｚは脂肪族アミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸である。幾つかの実施形態では、基（Ｘ３）ｃは、配列モチーフＶＬＺＶＺＸＬを含み、式中、Ｚは脂肪族アミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【００９２】
出願人は、他の方法により生成されたヒドロホビンＩＩが、Ｃ末端で切断された１つ以上のアミノ酸をもたらし得ることを観察している。本発明の方法は、完全長ヒドロホビンＩＩ及びＣ末端で切断されたヒドロホビンＩＩの両方を沈殿させるであろう。
【００９３】
ヒドロホビン様タンパク質（例えば、「チャプリン」）はまた、放線菌及びストレプトマイセス種等の糸状菌において同定されている（第ＷＯ０１／７４８６４号、Ｔａｌｂｏｔ，２００３，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ，１３：Ｒ６９６〜Ｒ６９８）。真菌ヒドロホビンとは対照的に、これらの細菌性タンパク質は、２つのシステイン残基のみを有し得るため、多くとも１つのジスルフィド架橋のみを形成し得る。そのようなタンパク質は、ヒドロホビンに対して機能的に等価物の一例であり、本明細書の方法の生物界面活性剤の範囲内の別の種類の分子である。
【００９４】
生物界面活性剤を生成するための発酵は、バイオリアクター又は発酵槽内の液体発酵培地中の宿主細胞又は微生物を培養することによって行われる。培地の組成物（例えば、栄養素、炭素源等）、温度、及びｐＨは、生物界面活性剤の培養及び／又は生成の成長の適切な条件を提供するように選択される。空気又は酸素富化空気は、通常、培養の呼吸のための酸素を提供するように培地に散布される。
【００９５】
本明細書で使用されるとき、「発酵ブロス組成物」は、ヒドロホビン等の所望のタンパク質を含有する細胞増殖培地を指す。細胞増殖培地は、細胞及び／又は細胞残屑を含んでよく、濃縮されていてもよい。代表的な発酵ブロス組成物は、ヒドロホビンを含有する、限外濾過濃縮された発酵ブロスである。精密濾過は、従来、例えば、細胞分離のために細胞残屑を保有し、タンパク質を通過させるために使用されるが、一方、限外濾過は、従来、例えば、濃縮のためにタンパク質を保有し、溶質を通過させるために使用される。
【００９６】
有利には、クロスフロー膜濾過回収法は、ＰＣＴ特許公開第ＷＯ  ２０１１／０１９６８６号（参照により組み込まれる）に記載されるヒドロホビン濃縮物の調製を可能にし得る。他の実施形態では、サイズ排除濾過及び結晶化も、ヒドロホビン濃縮物の調製を可能にし得る。
【００９７】
本発明は、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを精製するための方法を包含し、本方法は、沈殿剤を生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの溶液に添加して、第１の沈殿物を生成する工程と、該沈殿剤／生物界面活性剤溶液から上澄み液をデカントする工程と、同一若しくは異なる沈殿剤を上澄み液に添加して、第２の沈殿物を生成する工程と、を含み得、第２の沈殿物は、精製された生物界面活性剤、有利には精製されたヒドロホビン、より有利には精製されたヒドロホビンＩＩであり得る。好適な沈殿剤の例としては、無機塩、有機変性剤、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。第１の沈殿物を生成するための沈殿剤は、第２の沈殿物を生成するための沈殿剤と同一であっても異なっていてもよい。好適な沈殿剤のいかなる組み合わせも、本発明によって企図され得る。
【００９８】
本明細書で使用されるとき、有機変性剤は、水中で混和性である有機溶媒である。当業者は、化学分野における当業者に既知の知識及び／又は方法を用いて、特定の有機変性剤が水中で混和性であるかどうかを確認することができる。例えば、特定の有機変性剤が水に添加された場合の二相混合物の不在は、水中で混和性であることを示す。特定の有機変性剤が水に添加された場合の二相混合物の存在は、水中で不混和性であることを示す。好適な有機変性剤の例としては、アセトニトリル、アセトン、アルコール、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサン、及びテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
有利には、沈殿剤は、アルコール、より有利にはＣ１〜Ｃ４アルコール、最も有利にはＣ１〜Ｃ３アルコールである。アルコールは、一価であっても、多価であってもよい。Ｃ１〜Ｃ４アルコールの例としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール又はイソプロピルアルコール）、ｔ−ブタノール等が挙げられるが、これらに限定されない。Ｃ１〜Ｃ３アルコールの例としては、メタノール、エタノール、１−プロパノール、及び２−プロパノール（イソプロパノール又はイソプロピルアルコール）が挙げられるが、これらに限定されない。有利には、アルコールは、メタノール、エタノール、又はイソプロピルアルコールである。
【０１００】
理論に束縛されるものではないが、添加されるある量の沈殿剤、好ましくは、アルコール、より好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルコール、最も好ましくは、Ｃ１〜Ｃ３アルコールは、主に、第１の沈殿物中でタンパク質を沈殿させ得る。沈殿剤／生物界面活性剤溶液から上澄み液をデカントした後、同一の又は異なる沈殿剤、好ましくは、アルコール、より好ましくは、Ｃ１〜Ｃ４アルコール、最も好ましくは、Ｃ１〜Ｃ３アルコールを上澄み液に添加することにより、第２の沈殿物中に、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを生成し得る。
【０１０１】
生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩは、イソプロピルアルコール又はイソプロパノールで沈殿させ得る。約２〜３容量のイソプロパノール、有利には約２．５容量のイソプロパノールを、１容量の生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの水溶液に添加して、有利には茶色の沈殿物であり得る第１の沈殿物を生成し得る。上澄み液をデカントし得、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを、約１容量のイソプロパノールを添加することによって、有利には白色の沈殿物であり得る第２の沈殿物として沈殿させ得る。
【０１０２】
有利には、イソプロパノールが添加される。２〜３容量のイソプロパノール、有利には２．５容量のイソプロパノールを、１容量の生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの水溶液に添加し得る。当業者は、初期沈殿物（茶色の沈殿物であり得る）の形成を確認することができるが、初期の沈殿物は、撹拌溶液中に約１５分後に形成され得る。当業者は、有利には白色の沈殿物であり得る第２の沈殿物の形成を確認し得るが、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの第２の沈殿物が、撹拌溶液中に約１０分後に形成される。
【０１０３】
生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩは、メタノールで沈殿され得る。約１〜２容量のメタノール、有利には約１．５容量のメタノールを、１容量の生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの水溶液に添加して、有利には茶色の沈殿物であり得る第１の沈殿物を生成し得る。上澄み液をデカントし得、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを、約３容量のメタノールを添加することによって、有利には白色の沈殿物であり得る第２の沈殿物として沈殿させ得る。
【０１０４】
有利には、メタノールは、室温で添加される。１〜２容量のメタノール、有利には１．５容量のメタノールを、１容量の生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの水溶液に添加し得る。当業者は、有利には茶色の沈殿物であり得る、初期沈殿物の形成を確認することができるが、初期沈殿物は、撹拌溶液中に約１５分後に形成され得る。当業者は、有利には白色の沈殿物であり得る、第２の沈殿物の形成を確認し得るが、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの第２の沈殿物が、撹拌溶液中に約１０分後に形成される。
【０１０５】
生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩは、エタノールで沈殿され得る。約１〜２容量のエタノール、有利には約１．５容量のエタノールを、１容量の生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの水溶液に添加して、有利には茶色の沈殿物であり得る第１の沈殿物を生成し得る。上澄み液をデカントし得、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを、約３容量のエタノールを添加することによって、有利には白色の沈殿物であり得る第２の沈殿物として沈殿させ得る。
【０１０６】
有利には、エタノールは、室温で添加される。１〜２容量のエタノール、有利には１．５容量のエタノールを、１容量の生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの水溶液に添加し得る。当業者は、有利には茶色の沈殿物であり得る、初期沈殿物の形成を確認することができるが、初期沈殿物は、撹拌溶液中に約１５分後に形成され得る。当業者は、有利には白色の沈殿物であり得る第２の沈殿物の形成を確認し得るが、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの第２の沈殿物が、撹拌溶液中に約１０分後に形成される。
【０１０７】
当業者は、特定の沈殿剤、好ましくは有機変性剤、より好ましくはアルコールかどうかについて確認し、加えて初期沈殿物が存在するかどうかを決定することにより、更には、第２の沈殿物の存在によって決定されるように、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩが上澄み液から沈殿するかどうかを決定することによって、特定の沈殿剤の具体的な容量を決定することができる。有利には、初期又は第１の沈殿物は茶色であり、第２の沈殿物は白色である。そのような観察は、当事者の範囲内である。
【０１０８】
本発明の特に有利な実施形態は、沈殿剤、好ましくは有機変性剤、より好ましくはアルコールが再使用又は再生利用され、それによって廃棄物を減量することができることである。換言すれば、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩを沈殿させるために使用される沈殿剤、好ましくは有機変性剤、より好ましくはアルコールは、生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの更なる沈殿のために再使用又は再生利用することができる。
【０１０９】
沈殿物は、微粉を生じ得る遠心分離及び凍結乾燥によって採取され得る。有利な実施形態では、この粉末は白色である。粉末は、溶媒（水、水／アルコール混合、水／有機物混合（水／アセトニトリル等）、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ等の有機溶媒等）中に溶媒され得、冷凍され得る。
【０１１０】
生物界面活性剤、有利にはヒドロホビン、より有利にはヒドロホビンＩＩの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、質量分析、及びアミノ酸分析等であるがこれらに限定されない、当該技術分野において既知の任意の方法によって評価され得る。例えば、図１〜３、及び表１は、本明細書に開示された方法によって単離されたヒドロホビンＩＩの純度を示す。
【０１１１】
本発明及びその利点が詳細に記載されてきたが、様々な変更、置換、及び修正は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書で行われ得ることを理解されたい。
【０１１２】
本発明は、以下の実施例に更に説明されるが、これは例示目的のみで供され、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１１３】
ヒドロホビンＩＩのイソプロパノール沈殿。未精製ヒドロホビン濃縮物（２００ｍＬ、１５０ｍｇ／ｇ）を１Ｌのガラスビーカーに添加し、５００ｍＬ（２．５容量）のイソプロパノールとゆっくり混合した。溶液を室温で１５分間撹拌して、茶色沈殿物の形成物を得た。混合物を遠心分離し（５分間、１０，０００ｒｐｍ、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｕｎｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ、ＳＬＡ−１５００ローター）、ＨＦＢＩＩを含有する上澄み液を無菌の１Ｌガラスビーカーにデカントした。イソプロパノール（１容量）を上澄み液に添加し、室温で１０分間撹拌して、微細な白色の沈殿物を得た。この沈殿物を、遠心分離（１０分間、１０，０００ｒｐｍ）によって採取し、１２００ｍＬの凍結乾燥瓶に移し、６２時間凍結乾燥して、微細な白色の粉末を得た。この粉末を、１００ｍＬの脱イオン水中に溶解させ、冷凍した。
【０１１４】
乾燥固体分析。１ｇの固体含有量の精製ＨＦＢＩＩを、マイクロ波乾燥（Ｏｍｎｉｍａｒｋ  μＷａｖｅ  Ｍｏｉｓｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）によって分析して、７．３３％の乾燥固体を得た。
【０１１５】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。図１に示されるように、精製ＨＦＢＩＩを、示されるように緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−８０）中のサンプルを希釈し、１ｘ還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＬＤＳサンプル緩衝液と２：１で混合することによって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。サンプルを、９０℃で５分間インキュベートし、１５μＬを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１２％、１ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、１０レーン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の各ウェルに装填した。ゲルを、１ｘ  ＭＥＳ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で２００Ｖで３５分間泳動させ、クマシーブリリアントブルーを用いて染色し、脱染した（１０％のエタノール、１０％の酢酸）。得られたゲル画像は、精製されたサンプル中のＨＦＢＩＩについて透明な帯を示し、未精製濃縮物（１／１００）で見える非ヒドロホビン帯の形跡がないことを示す。
【０１１６】
ＲＰ−ＨＰＬＣ。図２に示されるように、ＨＦＢＩＩの１ｍｇ／ｇ溶液を、１０％のアセトニトリル中でサンプルを希釈することにより調製した。ＨＦＢＩＩは、リン酸ナトリウム緩衝液（「Ａ」、２５ｍＭ、ｐＨ  ２．５）及びアセトニトリル（「Ｂ」、０．０５％のＴＦＡ）の勾配を用いて、Ｃ５カラム（Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ５、３００Å、５μｍ、２．１×１００ｍｍ）における逆相ＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって分離された。ＨＦＢＩＩ溶液を、カラム（６０℃）に注入し（２０μＬ）、０．８ｍＬ／分で６分間にわたり、１０％の溶媒Ｂから７０％のＢに増加することによって溶出させた。このシステムを１０％のＢに戻し、次の注入前に２分間平衡化した。ＨＦＢＩＩは、２２２ｎｍでの吸光度によってモニタリングした。ＨＦＢＩＩは、Ｎ末端フェニルアラニン切断に対応する１つの大きなピーク及び小さなショルダーとして４．３８分でカラムから溶出する。クロマトグラムにおいてその他のピークは観察されていない。
【０１１７】
質量分析。図３に示されるように、精製ＨＦＢＩＩ（０．５μＬ）を、ステンレス製ＭＡＬＤＩプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に付け、０．５μＬの飽和シナピン酸溶液（５０％のアセトニトリル）と混合し、乾燥させた。サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって分析して、陽性モードで４，０００〜２０，０００ｍ／ｚを得た。得られたスペクトルは、７１８９．８ｍ／ｚで優位ピークを示し、これは、ＨＦＢＩＩの質量に相当する（ｍ＋１＝７１８９．４ｍ／ｚで計算）。他のピークは、既知のＮ末端フェニルアラニン切断（ｍ＋１＝７０４０．４９ｍ／ｚ）及びガス相ＨＦＢＩＩ二量体（１４３８０ｍ／ｚ）に起因し得る。
【０１１８】
アミノ酸分析。精製ＨＦＢＩＩ（１ｍＬ）を、外部実験室（ＡＡＡ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）によってアミノ酸分析について二重に分析した。表１に示されるように、結果は、ＨＦＢＩＩが６３．２ｍｇ／ｇで存在し、計算されたアミノ酸組成物と観察されたアミノ酸組成物との間の類似性によって示されるように、溶液中の主要タンパク質であることを示す。
【０１１９】
【表１】
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【０１２０】
アルコール沈殿スキャン。代替アルコールは、ＨＦＢＩＩを選択的に沈殿させるそれらの能力についてアッセイした。共溶媒を１容量のＨＦＢＩＩ濃縮物に添加し、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、沈殿について評価した。１及び２容量のメタノールの添加により、それぞれ濃茶色又は薄茶色の沈殿物を得た。この溶液の上澄み液を、更に３容量のメタノール（合計５）と混合して、イソプロパノールでまさに観察されたような多量の白色の沈殿物を得た。同様の結果が、共溶媒としてエタノールで観察された。グリセロールは、４：１の比率ではいかなるタンパク質も沈殿させることができなかった。また、１−ブタノール及び１−オクタノールは、いかなるタンパク質も沈殿させず、その代わりに、二相混合物を形成した。したがって、小型鎖（Ｃ３以下）のアルコールは、ＨＦＢＩＩを選択的に沈殿させるのに有効である。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態についてこのように詳細に説明したが、上記パラグラフにより定義される発明は、本発明の趣旨又は範囲から逸脱することなく、その多くの明らかな変型が可能であるため、上記の説明に記載される特定の詳細に限定されるものではないことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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