(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
多型性の標的核酸配列におけるバリアント核酸配列の存在を検出するための方法であって、前記標的核酸配列は所与の集団内で複数のアリルにおいて存在し、前記方法は、
ａ）前記標的核酸配列の第１アリルにハイブリダイズする場合に第１の融解温度（Ｔｍ）を有し、前記標的核酸配列の第２アリルにハイブリダイズする場合に、第２の、より低いＴｍを有し、バリアントが検出されることが望まれない部位において少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む、オリゴヌクレオチドプローブと、標的核酸配列とを含む反応混合物を提供すること、
ｂ）前記オリゴヌクレオチドプローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせること、および
ｃ）前記標的核酸配列にハイブリダイズした際の前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍを決定すること
を含み、それによってバリアント核酸配列が存在するか否かを決定する方法であって、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、第１の標的核酸配列に対して相補的な第１の核酸配列；第２の標的核酸配列に対して相補的な第２の核酸配列；ならびに、前記第１および第２の核酸配列を繋げるリンカー核酸配列を含み、このリンカー核酸配列は、前記第１の標的核酸配列にアニールした前記第１の核酸配列の融解温度と前記第２の標的核酸配列にアニールした前記第２の核酸配列の融解温度とが別個となるように、これら第１および第２の二核酸配列を分離している、
方法。
【請求項２】
前記ユニバーサル塩基が、２’−デオキシイノシン（ヒポキサンチンデオキシヌクレオチド）誘導体、ニトロアゾール類縁体、および疎水性芳香族非水素結合性塩基から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ユニバーサル塩基が、ｄ−イノシンおよび５−ニトロインドールから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記バリアントが検出されることが望まれない部位は、変異が表現型的にサイレントな変異である残基である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記バリアントが検出されることが望まれない部位は、変異が発現ペプチドの特性を変えない保存的置換を生じさせる残基である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、バリアントが検出されることが望まれない部位において１つより多いユニバーサル塩基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、バリアントが検出されることが望まれない部位を１箇所より多く含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍを決定することは、アリルがバリアントアリルであるか否かを決定するために、前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍを予測Ｔｍと比較することをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍを決定することは、前記第２のＴｍ以下である第１の温度において標的核酸配列に対するオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出し、前記第１のＴｍ以下であるが前記第２のＴｍよりは高い第２の温度においてハイブリダイゼーションを検出する段階を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチドプローブが標識されている、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記標識は、蛍光標識もしくは放射性標識であるか、または、二次的プローブが結合することができるリガンドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識は、前記オリゴヌクレオチドプローブが標的鎖にハイブリダイズしたか否かに応じて示差的なシグナルを生成する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
標的核酸配列の前記第２アリルを優先的に増幅する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程ｃ）の前に、
ｂ２）前記反応混合物に、核酸増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、それらプライマーは、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位の両側の第１および第２の部位にて標的核酸配列にハイブリダイズし、標的核酸配列にハイブリダイズしたプライマーのＴｍは前記第２アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍよりも高い、工程；
ｂ３）前記オリゴヌクレオチドプローブが前記第１アリルに優先的にハイブリダイズするように、前記反応混合物を、前記第１アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍと前記第２アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍとの間の温度にて維持する工程；
ｂ４）前記反応混合物に対して熱サイクリング増幅を実行する工程であって、前記増幅は、融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、前記伸長段階およびアニーリング段階の温度は、前記オリゴヌクレオチドプローブがこれらの段階の際に前記第１アリルにハイブリダイズするように、前記第１アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍと前記第２アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍとの間にあり、これによって前記第２アリルを増幅する工程
を含み、ここで、工程ｃ）は、前記第２アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍ以下の温度において標的核酸配列に対する前記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出すること；前記第１アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍ以下である、より高い温度において、標的核酸配列に対する前記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出すること；および、それら２つを比較することを含み、それによって、増幅された前記第２アリルを検出することを含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを検出することは、増幅混合物中の前記第１アリルおよび第２アリルの相対量を定量化することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１アリル対第２アリルの比が、前記第２アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍ以下の第１温度において前記反応混合物を維持すること；ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ分子を検出すること；前記反応混合物を、前記第２アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍより高いが前記第１アリルにハイブリダイズした前記オリゴヌクレオチドプローブのＴｍ以下である第２温度へと上昇させること；および、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドプローブ分子を検出することによって定量化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１のプライマーはオリゴヌクレオチドプローブ標的部の３’側に結合し、第２のプライマーはオリゴヌクレオチドプローブ標的部の５’側に結合する、請求項１４〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記プライマーのうちの１つが律速的な量において供給され、増幅反応は非対称的ＰＣＲである、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多いユニバーサル塩基を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の標的核酸配列と第２の標的核酸配列とは隣接している、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記リンカー核酸配列はヌクレオシドリンカー核酸配列であり、より好ましくは前記リンカー核酸配列はポリデオキシリボヌクレオチドを含み、最も好ましくは前記リンカー核酸配列はポリデオキシイノシンを含むかもしくはポリデオキシイノシンからなる、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカー核酸配列は、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチドまでの長さである、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の両方がレポーター領域であり、それぞれ標識を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記オリゴヌクレオチドプローブはブロッキング領域を含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
複数、好ましくは２つのオリゴヌクレオチドプローブが供給される、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記複数のオリゴヌクレオチドプローブの各々が少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記標的核酸配列の隣接した部分にハイブリダイズするように選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記複数のオリゴヌクレオチドプローブの各々が、請求項１〜２３のいずれかに記載されたリンカー核酸配列を含むプローブである、請求項２５〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸配列は、微生物薬剤耐性遺伝子の一部分であり、好ましくはマイコバクテリウム・ツベルクローシスの遺伝子、より好ましくはｒｐｏＢの一部分である、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸配列は、薬剤またはその他の治療に対する感受性に影響を有する遺伝子である、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸配列は、遺伝的状態の要因となる遺伝子である、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
標的核酸配列の第１アリルにハイブリダイズする場合に第１の融解温度（Ｔｍ）を有し、標的核酸配列の第２アリルにハイブリダイズする場合に、第２の、より低いＴｍを有し、バリアントが検出されることが望まれない部位において少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む、オリゴヌクレオチドプローブであって、
前記オリゴヌクレオチドプローブは、第１の標的核酸配列に対して相補的な第１の核酸配列；第２の標的核酸配列に対して相補的な第２の核酸配列；ならびに、前記第１および第２の核酸配列を繋げるリンカー核酸配列を含み、このリンカー核酸配列は、前記第１の標的核酸配列にアニールした前記第１の核酸配列の融解温度と前記第２の標的核酸配列にアニールした前記第２の核酸配列の融解温度とが別個となるように、これら第１および第２の二核酸配列を分離している、
オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３３】
前記ユニバーサル塩基は、２’−デオキシイノシン（ヒポキサンチンデオキシヌクレオチド）誘導体、ニトロアゾール類縁体、または疎水性芳香族非水素結合性塩基である、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３４】
前記ユニバーサル塩基は、ｄ−イノシンまたは５−ニトロインドールである、請求項３２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３５】
バリアントが検出されることが望まれない部位において１つより多いユニバーサル塩基を含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３６】
バリアントが検出されることが望まれない部位を１箇所より多く含む、請求項３２〜３５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３７】
前記オリゴヌクレオチドプローブはＤＮＡである、請求項３２〜３６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３８】
前記オリゴヌクレオチドプローブは標識されている、請求項３２〜３７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項３９】
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多いユニバーサル塩基を含む、請求項３２〜３８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４０】
前記リンカー核酸配列はヌクレオシドリンカー核酸配列であり、より好ましくは前記リンカー核酸配列はポリデオキシリボヌクレオチドを含み、最も好ましくは前記リンカー核酸配列はポリデオキシイノシンを含むかもしくはポリデオキシイノシンからなる、請求項３２〜３９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４１】
前記リンカー核酸配列は、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチドまでの長さである、請求項３２〜４０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４２】
前記第１の核酸配列および前記第２の核酸配列の両方が、標識を含むレポーター領域である、請求項３２〜４１のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４３】
前記レポーター領域はブロッキング領域をさらに含む、請求項４２に記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４４】
配列番号５〜配列番号１０から選択されるヌクレオチド配列を含むか、または、配列番号１〜配列番号１０から選択される配列の改変型を含む、請求項３２〜４３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項４５】
請求項３２〜４４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブを複数含むキット。
【請求項４６】
前記複数のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸配列の隣接した部分にハイブリダイズするように選択される、請求項４５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ゲノム解析のための方法および組成物に関し、特に、ゲノム遺伝子座における変異アリルの存在あるいは不在を決定するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡまたは増幅ＤＮＡにおける特定の標的配列の存在を同定するために核酸プローブがしばしば使用される。標的に対するプローブのアニーリング温度あるいは融解温度は、そのプローブと標的とによって共有される相補的領域の長さ、および、相補的塩基対のなかにあるミスマッチの存在によって影響される。このことは、例えばＳＮＰや多重反復配列のようなバリアントの存在を検出するために使用することができる。プローブは、野生型配列に対する第１の融解温度（Ｔｍ）を有するように設計することができ、標的に対するプローブのアニーリングは、例えばアニーリングの際の蛍光の発生を通じて監視することができる。Ｔｍが、予測される値と異なっていれば、その標的配列はバリアントを含んでいることになる。
【０００３】
国際特許出願ＷＯ２０１２／０９３２６２は、野生型アリルにハイブリダイズする場合よりも低いＴｍにおいてバリアント型アリルにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用した、一塩基多型（ＳＮＰ）の検出および解析のための方法を記載している。この方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、標的配列を含むゲノムの断片を第１のＴｍと第２のＴｍとの間の温度にて増幅する。標的配列が野生型である場合には、プローブは標的に結合したままとなって増幅を阻止する。標的配列がバリアント型である場合には、プローブは標的に結合せず、増幅が起こる。このようにしてバリアント型の存在が確立され、試料においてバリアント型アリルが選択的に濃縮される。
【０００４】
国際特許出願ＷＯ２０１３／０４１８５３は、ＳＮＰおよび短タンデム反復（ＳＴＲ）を含む多型を検出するためのプローブを記載している。そのプローブは、リンカー核酸配列で接続された第１および第２の領域を含み、第１および第２の領域が独立したＴｍを有するようになっている。プローブ配列は、第１標的領域および第２標的領域にバリアント型アリルが存在するか野生型アリルが存在するかによって異なるＴｍを有するように設計され得る。このリンカープローブの使用は、従来型プローブを用いる場合と比べ、より長い配列において単一のオリゴヌクレオチドプローブを使用してバリアントを検出することを可能にする。
【０００５】
しかしながら、すべてのバリアントが臨床的に重要であるわけではない。特に、ある変異は表現型多様性（例えば特定の薬剤に対する感受性）に関連し得るとしても、他の変異は表現型的には中性あるいはサイレント（無変化）ですらあり得る。サイレント変異は、特に、ヌクレオチド配列における変異が、コードされるポリペプチド配列において対応する変異を生じないものである。特定のコドンの３つめの塩基における変異に関してこれが典型的である。
【０００６】
http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Genetic_code&oldid=567109686から引用した下記表には遺伝暗号が示されており、遺伝暗号の縮重（degeneracy）が図示され、どの変異が表現型的にサイレントであり得るかが示されている。例えば、ＵＵＵからＵＵＣに変異してもやはりフェニルアラニンがコードされ、発現されるタンパク質には影響が生じない。
【表１】
0006461114.tif 000002
【０００７】
他の変異は発現されるタンパク質の配列に何らかの影響を有し得るが、それでも、例えば１つのアミノ酸を機能的に類似したアミノ酸に置換することにより、臨床的な影響は有さないことがあり得る。
【０００８】
現在の検出方法は、１つの特定の変異について特異的であるが故に、複数の変異が存在し得る場合により一般的に使用できないか、または、あらゆる変異に感応するが故に、臨床的に重要な変異だけでなく重要でない変異までも同定してしまうかのいずれかである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際特許出願ＷＯ２０１２／０９３２６２
【特許文献２】国際特許出願ＷＯ２０１３／０４１８５３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
重要でない変異は検出されないが、いくらかの範囲の他の変異を同定するための十分な感受性は維持しているような方法を得ることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の側面によれば、多型性の標的核酸配列におけるバリアント核酸配列の存在を検出するための方法が提供され、その標的配列は所与の集団内で複数のアリルにおいて存在し、その方法は、
ａ）前記標的配列の第１アリルにハイブリダイズする場合に第１の融解温度（Ｔｍ）を有し、前記標的配列の第２アリルにハイブリダイズする場合に、第２の、より低いＴｍを有し、バリアントが検出されることが望まれない部位において少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む、オリゴヌクレオチドプローブと、標的核酸配列とを含む反応混合物を提供すること、
ｂ）前記プローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせること、および
ｃ）前記標的核酸配列にハイブリダイズした際の前記プローブのＴｍを決定すること
を含み、それによってバリアント核酸配列が存在するか否かを決定する。
【００１２】
ユニバーサル塩基は、４つの古典的核酸塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）のいずれともワトソン・クリック塩基対を形成することができるものである。ユニバーサル塩基の例としては、２’−デオキシイノシン（ヒポキサンチンデオキシヌクレオチド）誘導体、ニトロアゾール類縁体、および疎水性芳香族非水素結合性塩基が挙げられる。本発明における使用のために好ましいユニバーサル塩基としては、ｄ−イノシンおよび５−ニトロインドールが挙げられる。
【００１３】
バリアントが検出されることが望まれない部位は、好ましくは、変異が表現型的にサイレントな変異である残基（例えば、典型的には、変異が発現アミノ酸を変化させない、コドンの３つ目の塩基）であり、あるいは、変異がペプチド配列を変化させるが発現ペプチドの特性は変えない保存的置換を生じさせる残基であり得る。いうまでもなく、本発明の方法を使用してあらゆる所望の変異の検出を抑制することが可能であり、それがサイレント変異である必要はない。
【００１４】
このようにして、プローブは、ユニバーサル塩基に対応する残基においてのみ異なるアリル（複数）には同じＴｍでハイブリダイズする。アリル（複数）が、ユニバーサル塩基が無い残基において異なる場合においてのみ、変化したＴｍが見出される。このようにして、一定範囲の異なる変異を検出するプローブの能力を変えることなく、ある種の変異の存在の検出は抑えることができる。
【００１５】
いくつかの実施態様では、プローブは、バリアントが検出されることが望まれない部位において１つより多いユニバーサル塩基を含み得る。それに加えて、あるいはそれに代えて、プローブには、バリアントが検出されることが望まれない部位が１箇所より多く存在していてもよい。
【００１６】
第１アリルは野生型と指定され得、そして第２アリルが複数のバリアント（例えば複数の異なるＳＮＰ、および、単一のバリアントアリル内における複数のＳＮＰ）を包含し得るが、ただし第１アリルおよび第２アリルにハイブリダイズした際のプローブの相対的Ｔｍは上述した通りである。
【００１７】
好ましくは、プローブはＤＮＡである。
【００１８】
第１アリルと第２アリルとの間の配列の違いは、好ましくは、プローブが結合する領域の内側にある。すなわち、プローブと第１アリルとの間のミスマッチは、プローブの末端にあるのではない。
【００１９】
プローブは、１０、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチドまでの長さであり得る。より長い、あるいはより短いプローブも可能であるが、異なるアリルのＴｍ間の適切な差別化や、より短いプローブではプライマーのＴｍとの適切な差別化を達成することが難しくなり得る。
【００２０】
プローブのＴｍを決定する工程は、アリルがバリアントアリルであるか否かを決定するために、プローブのＴｍを予測Ｔｍと比較することさらに含み得る。
【００２１】
標的核酸配列にハイブリダイズした際のプローブのＴｍを決定する工程ｃ）は、第２のＴｍ以下である第１の温度において標的に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出し、第１のＴｍ以下であるが第２のＴｍよりは高い第２の温度においてハイブリダイゼーションを検出する工程を含み得る。
【００２２】
プローブは標識されていてもよい。例えば、プローブは、蛍光標識もしくは放射性標識を含み得、または、二次的プローブが結合することができるリガンドで標識され得る。好ましくは、プローブは蛍光標識で標識され、また好ましくは、プローブが標的鎖にハイブリダイズしたか（すなわち、プローブが二本鎖核酸の一部となっているか）否か（プローブが一本鎖の状態であるか）に応じて示差的なシグナルを標識が生成する。１つの好ましいプローブはＨｙＢｅａｃｏｎ（登録商標）プローブである（例えば、Mol Cell Probes. 2002 Oct; 16(5):319-26, “Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon probes and direct PCR amplification from saliva”, French DJ, Archard CL, Andersen T, McDowell DG参照）。示差的シグナルの生成は、プローブが標的に結合したか否かについての簡便で迅速な分析を可能にする。
【００２３】
本方法は、標的配列の第２アリルを優先的に増幅する工程をさらに含み得る。これは、工程ｃ）の前に、
ｂ２）反応混合物に、核酸増幅のための一対のオリゴヌクレオチドプライマーを提供する工程であって、それらプライマーは、オリゴヌクレオチドプローブ結合部位の両側の第１および第２の部位にて核酸にハイブリダイズし、プライマー：試料のＴｍはプローブ：第２アリルのＴｍよりも高い、工程；
ｂ３）プローブが第１アリルに優先的にハイブリダイズするように、反応混合物を、プローブ：第１アリルのＴｍとプローブ：第２アリルのＴｍとの間の温度にて維持する工程；
ｂ４）反応混合物に対して熱サイクリング増幅を実行する工程であって、前記増幅は、融解段階、アニーリング段階、および伸長段階を含み、伸長段階およびアニーリング段階の温度は、プローブがこれらの段階の際に第１アリルにハイブリダイズするように、プローブ：第１アリルのＴｍとプローブ：第２アリルのＴｍとの間にあり、これによって第２アリルを増幅する工程
を含み得、ここで、工程ｃ）は、プローブ：第２アリルのＴｍ以下の温度において試料に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出すること；プローブ：第１アリルのＴｍ以下である、より高い温度において、試料に対するプローブのハイブリダイゼーションを検出すること；および、それら２つを比較することを含み、それによって、増幅された第２アリルを検出する。
【００２４】
これにより、Ｔｍを検出し決定するに先立ってアリルを選択的に増幅することにユニバーサル塩基プローブを使用することが可能になる。これを用いて、第２アリルを少ないコピー数でしか有していないかもしれない試料を富化することができる。プローブは、最初は、伸長段階のあいだ第１アリルに結合したままでいることにより第１アリルの増幅を阻止することに使用され、それから、増幅後にアリルを検出することに使用される。伸長段階のあいだ、オリゴヌクレオチドプローブは第１アリルにハイブリダイズしたままでいる。これが、その同じ核酸にハイブリダイズしたプライマーの鎖伸長を妨げ、その一方で、第２アリルにハイブリダイズしたプライマーは、そのアリルにはプローブがハイブリダイズしていないので、自由に鎖伸長を行うことができる。このようにして、第２アリルが優先的に増幅される。いくつかの実施態様では、１つまたは両方のプライマーがプローブ結合部位とオーバーラップして、結合に関してプローブがプライマーと競合するようにし得る。これはプライマーの結合、ひいては鎖伸長を妨げ得る。他の実施態様では、プライマーとプローブはオーバーラップしないが、プライマーはさらなる鎖伸長を阻止する。
【００２５】
ハイブリダイズしたプローブ分子を検出する工程は、増幅混合物中の第１アリルおよび第２アリルの相対量を定量化することをさらに含み得る。本発明のいくつかの実施態様では、増幅工程の後だけでなく増幅工程の前にも検出工程を実行し得る。好ましい一実施態様において、第１アリル対第２アリルの比は、プローブ：第２アリルのＴｍ以下の第１温度において反応混合物を維持すること；ハイブリダイズしたプローブ分子を検出すること；反応混合物を、プローブ：第２アリルのＴｍより高いがプローブ：第１アリルのＴｍ以下である第２温度へと上昇させること；および、ハイブリダイズしたプローブ分子を検出することによって測定され得る。第１の、より低い温度においては、プローブは第１アリルと第２アリルとの両方にハイブリダイズし、第２の、より高い温度においては、プローブは第１アリルにのみハイブリダイズする。
【００２６】
プライマーは、好ましくは、プローブが結合する領域の外側の領域において結合する。すなわち、第１のプライマーはプローブ標的部の３’側に結合し、第２のプライマーはプローブ標的部の５’側に結合する（両プライマーは二本鎖ＤＮＡの異なる鎖に結合することを考慮に入れる）。プライマーが鎖伸長を行うと、結合したプローブによってこれが妨害され、鎖が増幅できないようになる。いくつかの実施態様では、プライマーは、プローブが結合する領域に隣接して結合し得、あるいは１つ、２つ、３つ、もしくはそれより多いヌクレオチドに渡ってプローブとオーバーラップさえし得るが、ただしこれは好ましくない。いうまでもなく、２つのプライマーが異なる程度においてプローブ標的部とオーバーラップしていてもよく、１つがオーバーラップしてもう１つがオーバーラップしなくてもよい。プローブとプライマーがオーバーラップする場合には、プローブは結合に関してプライマーと（好ましくはプライマーの３’末端において）競合し、このようにして伸長を妨害し得る。
【００２７】
本発明の好ましい実施態様では、増幅反応はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。いくつかの実施態様では、プライマーは異なる濃度で供給され得る。好ましくは、プライマーのうちの１つが律速的な量において供給され、増幅反応は非対称的ＰＣＲである。非対称的ＰＣＲにおいては、律速的プライマーが使い尽くされ他方のプライマーのみが鎖伸長の開始のために利用可能となるので、２つの標的ＤＮＡ鎖のうちの１つが優先的に増幅される。優先的増幅の対象となる方はセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかであり得る。好ましくは、優先的に増幅される鎖はプローブに対する相補的鎖である。
【００２８】
プローブは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多いユニバーサル塩基を含み得る。
【００２９】
いくつかの実施態様では、プローブは、第１の標的核酸配列に対して相補的な第１の核酸配列；第２の標的核酸配列に対して相補的な第２の核酸配列；ならびに、前記第１および第２の核酸配列を繋げるリンカー核酸配列を含み得、このリンカーは、第１の標的核酸配列にアニールした第１配列の融解温度と第２の標的核酸配列にアニールした第２配列の融解温度とが別個となるように、これら第１および第２の二配列を分離する。
【００３０】
リンカー領域の存在は、異なるハイブリダイゼーション特性を有する機能的要素にプローブを分割することを可能にする。これらのリンカーを含むことは「バブル」構造を創出し、熱力学的な観点からプローブの各要素を隔離し、異なる結合特性を有する領域を提供する。さらに、リンカー核酸配列の存在は、プローブ全体が単一のポリヌクレオチド分子の性質を有しながら、より短い別々の核酸プローブから構成されているかのように振る舞うことを可能にする。リンカー領域は、第１および第２の配列がそれぞれの標的配列にハイブリダイズする際に折れ曲がってループアウト（突出輪）を形成し得る。
【００３１】
このプローブ構造は、より長いプローブ（例えば、第１および第２の標的領域の両方に渡る単一プローブ）ではＴｍ分析によってバリアントを区別するための十分な情報を提供できないであろう連続的領域をプローブすることを可能にする。従って、好ましくは、第１および第２の標的核酸配列は連続的である。
【００３２】
好ましくは、リンカーはヌクレオシドリンカーである。より好ましくは、リンカーはポリデオキシリボヌクレオチドを含む。最も好ましくは、リンカーは、ポリデオキシイノシンを含むかまたはポリデオキシイノシンからなる。デオキシイノシンは、より弱い水素結合のために、天然塩基と比較して低い融解温度を有する。他のヌクレオシドを使用してもよい。
【００３３】
好ましくは、リンカーは、５、１０、１５、２０、３０、４０、または５０ヌクレオチドまでの長さである。
【００３４】
第１および第２の核酸配列のうちの少なくとも１つはレポーター領域である。レポーター領域は標識成分、好ましくは蛍光標識を含む。このことにより、標的配列への結合が起こった際にプローブの検出を行うこと、および、バリアント標的配列の存在を決定するために温度範囲に渡ってアニーリングを監視することが可能になる。プローブは好ましくはクエンチャー成分を含まず、また、標識がクエンチャーと共に使用されることが意図されもしない。適切な標識としては、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、およびＣｙ５が挙げられる。その他の適切な標識は当業者に知られるところであろう。好ましくは標識はＴヌクレオチド上に組み入れられるが、ただしあらゆる適切なヌクレオチドが使用され得る。
【００３５】
レポーター領域は好ましくは１５〜２００ｎｔ（ヌクレオチド）の長さであり、より好ましくは１５〜１５０、さらにより好ましくは１５〜１００、または２０〜１００、３０〜８０、４０〜６０、もしくは約５０ｎｔの長さである。
【００３６】
レポーター領域は、ブロッキング領域、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を阻止して、例えばＰＣＲの際の鎖伸長を妨害する役目を果たす部分をさらに含み得る。ポリメラーゼ酵素ブロッキング基は、ポリマーのさらなる伸長を阻止する機能特性を有するべきものである。ブロッキング基は、ヌクレオチドに備え付けることができ、その修飾ヌクレオチドの５’末端がＤＮＡ鎖中で別のヌクレオチドの３’末端に結合することは許容するが、その修飾ヌクレオチドの３’末端水酸基へのヌクレオチドの結合は許容しない、あらゆる化学基であり得る。適切なことに、３’位におけるＯＨ基の不在はポリメラーゼ活性によるさらなる伸長を妨げる。特に好ましい一実施態様において、ブロッキング基は、アセチル、ＣＨ３、グリシル、ロイシル、およびアラニル基から選択される。別の実施態様では、ブロッキング基は、ジペプチドまたはトリペプチドの形態であり得る。
【００３７】
本発明の好ましい一実施態様において、第１および第２の核酸配列のうちの両方がレポーター領域である。それらは異なる標識を含み得る。そのようなプローブは、マルチプレックスレポーターとして使用され、単一プローブによって広域に渡る標的配列を検出することを可能にし得る。
【００３８】
本発明のいくつかの実施態様では、複数、好ましくは２つのオリゴヌクレオチドプローブが供給され得る。これらのプローブは、いずれかまたは両方が、少なくとも１つのユニバーサル塩基を含み得、好ましくは両方が少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む。これらのプローブは、好ましくは、標的配列の連続（隣接）した部分にハイブリダイズするように選択される。このことにより、単一の長いプローブを供給しなければならないということの制約を受けずに、標的のより大きな実効的「リードスルー（読み通し）」が可能となる。さらに、標的配列の連続的部分を効果的に検出するこの能力は予測外のものである。なぜならば、当業者は、２つの隣接するプローブは互いに干渉し得ると予測することができ、特に化学的修飾（例えば伸長ブロッカー、または標識）がプローブの３’および／または５’末端に存在する場合にはそのように予測し得るからである。
【００３９】
複数のオリゴヌクレオチドプローブが供給される本発明の好ましい実施態様において、全ての（好ましくは両方の）プローブが上述した「リンカープローブ」であり、すなわち、リンカー核酸配列によって繋げられた、第１および第２の標的配列に対して相補的な第１および第２の核酸配列を含むものである。そのような配置は、標的の比較的長いセクションに渡るバリアント配列の検出を提供し、標的のサイズに対してプローブのサイズを釣り合わせる。
【００４０】
標的配列は、微生物薬剤耐性遺伝子の一部分であってもよい。好ましい一実施態様では、標的配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌）の遺伝子であり、好ましくはｒｐｏＢである。この遺伝子はリファンピン耐性の要因となる。他の実施態様では、標的配列は、患者自身の遺伝子であってもよく、例えば、ある種の薬剤もしくはその他の治療に対する感受性が決定され、または、遺伝的状態の診断がなされる。
【００４１】
本発明のさらなる一側面によれば、標的配列の第１アリルにハイブリダイズした際に第１の融解温度（Ｔｍ）を有し、標的配列の第２アリルにハイブリダイズした際に第２の、より低いＴｍを有する、オリゴヌクレオチドプローブが提供され、このプローブは、バリアントが検出されることが望まれない部位において少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む。
【００４２】
ユニバーサル塩基の例としては、２’−デオキシイノシン（ヒポキサンチンデオキシヌクレオチド）誘導体、ニトロアゾール類縁体、および疎水性芳香族非水素結合性塩基が挙げられる。本発明における使用のために好ましいユニバーサル塩基としては、ｄ−イノシンおよび５−ニトロインドールが挙げられる。
【００４３】
バリアントが検出されることが望まれない部位は、好ましくは、変異が表現型的にサイレントな変異である残基（例えば、典型的には、変異が発現アミノ酸を変化させない、コドンの３つ目の塩基）であり、あるいは、変異がペプチド配列を変化させるが発現ペプチドの特性は変えない保存的置換を生じさせる残基であり得る。
【００４４】
いくつかの実施態様では、プローブは、バリアントが検出されることが望まれない部位において１つより多いユニバーサル塩基を含み得る。それに加えて、あるいはそれに代えて、プローブには、バリアントが検出されることが望まれない部位が１箇所より多く存在していてもよい。
【００４５】
好ましくは、プローブはＤＮＡである。
【００４６】
プローブは標識されていてもよい。例えば、プローブは、蛍光標識もしくは放射性標識を含み得、または、二次的プローブが結合することができるリガンドで標識され得る。好ましくは、プローブは蛍光標識で標識され、また好ましくは、プローブが標的鎖にハイブリダイズしたか（すなわち、プローブが二本鎖核酸の一部となっているか）否か（プローブが一本鎖の状態であるか）に応じて示差的なシグナルを標識が生成する。１つの好ましいプローブはＨｙＢｅａｃｏｎ（登録商標）プローブである（例えば、Mol Cell Probes. 2002 Oct; 16(5):319-26, “Ultra-rapid DNA analysis using HyBeacon probes and direct PCR amplification from saliva”, French DJ, Archard CL, Andersen T, McDowell DG参照）。
【００４７】
プローブは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれより多いユニバーサル塩基を含み得る。
【００４８】
いくつかの実施態様では、プローブは、第１の標的核酸配列に対して相補的な第１の核酸配列；第２の標的核酸配列に対して相補的な第２の核酸配列；ならびに、前記第１および第２の核酸配列を繋げるリンカー核酸配列を含み得、このリンカーは、第１の標的核酸配列にアニールした第１配列の融解温度と第２の標的核酸配列にアニールした第２配列の融解温度とが別個となるように、これら第１および第２の二配列を分離する。
【００４９】
好ましくは、リンカーはヌクレオシドリンカーである。より好ましくは、リンカーはポリデオキシリボヌクレオチドを含む。最も好ましくは、リンカーは、ポリデオキシイノシンを含むかまたはポリデオキシイノシンからなる。デオキシイノシンは、より弱い水素結合のために、天然塩基と比較して低い融解温度を有する。他のヌクレオシドを使用してもよい。
【００５０】
好ましくは、リンカーは、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０ヌクレオチドまでの長さである。
【００５１】
第１および第２の核酸配列のうちの少なくとも１つはレポーター領域である。レポーター領域は標識成分、好ましくは蛍光標識を含む。このことにより、標的配列への結合が起こった際にプローブの検出を行うこと、および、バリアント標的配列の存在を決定するために温度範囲に渡ってアニーリングを監視することが可能になる。プローブは好ましくはクエンチャー成分を含まず、また、標識がクエンチャーと共に使用されることが意図されもしない。適切な標識としては、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、Ｃｙ３、およびＣｙ５が挙げられる。その他の適切な標識は当業者に知られるところであろう。好ましくは標識はＴヌクレオチド上に組み入れられるが、ただしあらゆる適切なヌクレオチドが使用され得る。
【００５２】
レポーター領域は好ましくは１５〜２００ｎｔの長さであり、より好ましくは１５〜１５０、さらにより好ましくは１５〜１００、または２０〜１００、３０〜８０、４０〜６０、もしくは約５０ｎｔの長さである。
【００５３】
レポーター領域は、例えばＰＣＲの際に鎖伸長を妨害するように、ブロッキング領域、すなわち、ＤＮＡポリメラーゼによる核酸鎖の伸長を阻止する役目を果たす部分さらに含み得る。ポリメラーゼ酵素ブロッキング基は、ポリマーのさらなる伸長を阻止する機能特性を有するべきものである。ブロッキング基は、ヌクレオチドに備え付けることができ、その修飾ヌクレオチドの５’末端がＤＮＡ鎖中で別のヌクレオチドの３’末端に結合することは許容するが、その修飾ヌクレオチドの３’末端水酸基へのヌクレオチドの結合は許容しない、あらゆる化学基であり得る。適切なことに、３’位におけるＯＨ基の不在はポリメラーゼ活性によるさらなる伸長を妨げる。特に好ましい一実施態様において、ブロッキング基は、アセチル、ＣＨ３、グリシル、ロイシル、およびアラニル基から選択される。別の実施態様では、ブロッキング基は、ジペプチドまたはトリペプチドの形態であり得る。
【００５４】
本発明の好ましい一実施態様において、第１および第２の核酸配列のうちの両方がレポーター領域である。それらは異なる標識を含み得る。そのようなプローブは、マルチプレックスレポーターとして使用されて、単一プローブを用いて広域に渡り標的配列を検出することを可能にし得る。
【００５５】
本発明のいくつかの実施態様では、複数、好ましくは２つのオリゴヌクレオチドプローブが供給され得る。これらのプローブは、いずれかまたは両方が、少なくとも１つのユニバーサル塩基を含み得、好ましくは両方が少なくとも１つのユニバーサル塩基を含む。これらのプローブは、好ましくは、標的配列の連続（隣接）した部分にハイブリダイズするように選択される。複数のオリゴヌクレオチドプローブが供給される本発明の好ましい実施態様において、全ての（好ましくは両方の）プローブが上述した「リンカープローブ」であり、すなわち、リンカー核酸配列によって繋げられた、第１および第２の標的配列に対して相補的な第１および第２の核酸配列を含むものである。
【００５６】
標的配列は、微生物薬剤耐性遺伝子の一部分であってもよい。好ましい一実施態様では、標的配列は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（結核菌）の遺伝子であり、好ましくはｒｐｏＢである。この遺伝子はリファンピン耐性の要因となる。他の実施態様では、標的配列は、患者自身の遺伝子であってもよく、例えば、ある種の薬剤もしくはその他の治療に対する感受性が決定され、または、遺伝的状態の診断がなされる。
【００５７】
本発明のいくつかの実施態様では、プローブは、配列番号５〜配列番号１０から選択される配列を含み得、または、そのような配列の改変型（modified version）もしくは配列番号１〜配列番号４から選択される配列の改変型を含み得る。「改変型」とは、１つ、２つ、もしくは３つのヌクレオチドの欠失もしくは追加によって、または、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、もしくは８つのヌクレオチドの置換（標準的ヌクレオチドから非標準的ヌクレオチド（例えばユニバーサル塩基または代替的塩基）への置換を含む）によって、またはその両方によって異なっている配列を意味する。改変型は、これらに加えてあるいはこれらに代えて、長さおよび／もしくは組成が異なるリンカー配列、別の蛍光標識、または別のユニバーサル塩基を含み得る。
【００５８】
本発明のさらなる一側面は、上記で説明したように、複数のオリゴヌクレオチドプローブを供給する。
【００５９】
本発明のさらに別の一側面は、上記で説明したような１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブ、および、そのプローブがハイブリダイズする標的核酸部位の両側のプライマー対を含む、キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、プローブ構成の概略図を示す（ＷＯ２０１３／０４１８５３から取った）。
【図２】図２は、５０５番コドンから５３３番コドンまでのｒｐｏＢ遺伝子のコア（中核部）のコンセンサス配列を、個々の変異と共に示している。
【図３】図３は、現実施例において使用した２つのリンカープローブの、ｒｐｏＢ遺伝子のコア上の位置（５０７〜５２０番コドンおよび５２１〜５３３番コドンに渡る）を示す。
【図４】図４は、ユニバーサル塩基５−ニトロインドール−ＣＥホスホラミダイトの構造を示す。
【図５】図５は、現実施例において使用したリンカープローブの配列を示す。
【図６】図６は、変異を伴う鋳型ｒｐｏＢ配列に対して使用した場合のリンカープローブの融解温度における変化の検出を示す。
【図７】図７は、図６の反応からの代表的な融解曲線を示す。
【図８】図８は、２つのリンカープローブを組み合わせて使用して５０７〜５３３番コドンにおける変異について観察した、融解温度の変化を示す。
【図９】図９は、低コピー数試料からの結果の検出を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
まず最初に図１を参照すると、この図は、本発明で使用されるプローブの一般的構造を示している。このプローブは３つの領域からなる：第１の標的配列に対して相同性を有する第１のレポーター配列；リンカー配列（この例では５つのイノシンヌクレオ塩基を含む）；および、第２の標的配列に対して相同性を有する第２のレポーター配列である。第２のレポーターはまた、３’末端において、重合反応の際に鎖伸長を妨げるブロッキング配列を含む。それぞれのレポーター領域は異なるアニーリング温度を有し、１つ以上の蛍光ヌクレオチド（好ましくはＦＡＭ−Ｔ）または異なる／複数の色を有する。レポーターは、特定の配列または配列バリアント（例えばＳＮＰ、挿入、欠損等）の存在を表示するために使用される。これにより、単一プローブで、広域に渡って複数の配列を検出することが可能になる。それぞれの領域は、野生型配列の場合には類似の（あるいは同一の）Ｔｍを有するが変異の場合には変化したＴｍを有するように調整され、従ってユーザーは、バリアントが存在することを知るためには、変化したＴｍを検出しさえすればよい。「類似の」とは、Ｔｍの違いが最大でも２℃、１．５℃、１℃、０．５℃であることを意味する。
【００６２】
ここで、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis：結核菌）ｒｐｏＢ遺伝子におけるバリアントを検出する、マルチプレックス化レポータープローブの使用の一例を示す。結核菌における多剤耐性は複雑である。リファンピンは第一に使用される結核菌薬物療法であり、現場で治療に先立って同定される主要な標的である。リファンピン耐性結核菌は、ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードするｒｐｏＢ遺伝子の８１塩基対（ｂｐ）コア領域において変異を有する。結核菌のリファンピン耐性臨床分離株の９６％がこの遺伝子に変異を有する。５１６番、５２６番、または５３１番コドンにおける変異は高レベルのリファンピン耐性をもたらす。しかしながら、８１ｂｐ遺伝子領域に渡って変異を検出することは、複数の従来型プローブを要することが普通であり、それらのいくつかはオーバーラップする必要があり、従って複数の検出工程が必要となる。
【００６３】
上述のリンカープローブを使用することで、この問題にいくらか対処することになるが、それでもなお、表現型的にサイレントであり薬剤耐性に何ら影響を有さない変異があるという問題は残されたままとなる。従って、本発明は、高感度で所望の変異を検出する能力を維持しながら、そのようなサイレント変異の検出は防ぐために、ユニバーサル塩基を組み入れたリンカープローブを利用する。
【００６４】
図２は、ｒｐｏＢ遺伝子の５０５〜５３３番コドンからの野生型コンセンサス配列を、この領域における既知の変異（サイレントおよび非サイレント）と共に示している。多数の既知変異が存在していることが明らかであり、サイレント変異を感度良く検出することは、重要な変異に関する診断検査の選択性（および有用性）を損なうおそれがある。
【００６５】
本発明の原理を実証するために、ＭＴＢのｒｐｏＢ遺伝子の５０７〜５２０番コドンおよび５２０〜５３３番コドンに渡る９０ｂｐ領域を覆う２つのリンカープローブを合成した。オリゴヌクレオチドは、シアノエチルホスホロアミダイト法を使用して作製した。ゲノム配列に対するプローブの位置を図３に示す。プローブの２つのレポータードメインはＺ１およびＺ２と表示している。各プローブにおいてこれらはリンカー（図３では図示していない）によって繋がれている。各プローブの３’末端はブロッカー基を含む。これら２つのリンカープローブはゲノム配列の隣接した領域を覆っていることに注意されたい。
【００６６】
図３に記載した配列を有する無修飾プローブを使用し、プローブ配列と標的配列との間のミスマッチから生じる融解温度の変化によって、標的配列中の変異の存在を検出することが可能である。一塩基のミスマッチを高感度で検出することができる。例えば、同様のプローブ（ただし、隣接したプローブの対ではなくて個別のプローブのみ）を使用してｒｐｏＢ遺伝子におけるＳＮＰ変異を検出することを記述した国際特許出願ＷＯ２０１３／０４１８５３を参照。
【００６７】
ここに記述される実験の目的は、選択された位置における変異の検出を抑制するという可能性を調査することであった。この目的のために、表現型的にサイレントな変異が取り上げられることを防ぐという観点から、ユニバーサル塩基５−ニトロインドール−ＣＥホスホラミダイト（グレンリサーチ；図４）を使用して、融解曲線不安定化に及ぶ変異の影響を解消させた。５０７＞５２０番コドンにおいて、不可知的な（agnostic）３番目塩基を有するコドンとして合計４つが見出された。これらの塩基を５−ニトロインドールまたはｄ−イノシンのいずれかで置換し、不安定化作用を中和することに関するこの塩基の効果を調べた。
【００６８】
プローブの配列を図５に示す。この図において、標準的ＤＮＡ塩基は通常の記号（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）を有し、非標準的塩基あるいは修飾は数字によって表示している：１＝フルオレセインｄＴ；２＝リン酸ブロック；３＝トリメトキシスチルベン；４＝５−ニトロインドール；＊＝イノシン残基（プローブ当たり５個）。各種プローブは下記の通りである。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）連結型プローブ（配列番号１）―リンカー、蛍光残基、およびブロッカーを含み５０７〜５２０番コドンをカバーする標識プローブ。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）（配列番号２）―リンカーもブロッカーも有さず５０７〜５２０番コドンに渡る標識ヌクレオチドプローブ。
ｒｐｏＢ（５２０＞５３３）連結型プローブ（配列番号３）―リンカー、蛍光残基、およびブロッカーを含み５２１〜５３３番コドンをカバーする標識プローブ。
ｒｐｏＢ（５２０＞５３３）（配列番号４）―リンカーもブロッカーも有さず５２１〜５３３番コドンに渡る標識ヌクレオチドプローブ。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿サイレント＿１（配列番号５）―リンカー、蛍光残基、およびブロッカーを含み、プローブの各レポーター部分において単一のサイレント変異が５−ニトロインドールにより置き換えられ、５０７〜５２０番コドンをカバーする、標識プローブ。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿短（配列番号６）―ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿サイレント＿１の、より短いバージョン。
ｒｐｏＢ（５２０＞５３３）＿サイレンス＿全（配列番号７）―リンカー、蛍光残基、およびブロッカーを含み、プローブの各レポーター部分において４つのサイレント変異が５−ニトロインドールにより置き換えられ、５２１〜５３３番コドンをカバーする、標識プローブ。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿サイレンス＿全（配列番号８）―リンカー、蛍光残基、およびブロッカーを含み、プローブの各レポーター部分において全てのサイレント変異が５−ニトロインドールにより置き換えられ、５０７〜５２０番コドンをカバーする、標識プローブ。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿短Ａ（配列番号９）―ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿サイレント＿１の、より短いバージョン。
ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿短Ｂ（配列番号１０）―ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）＿サイレンス＿全の、より短いバージョン。
【００６９】
試料からの標的ｒｐｏＢ配列のＰＣＲ増幅のために使用されたプライマーを下記に示す。
ＦＷＤプライマーｖ１
（５’＞３’）
ＧＣＡＧＡＣＧＴＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＣＣ（配列番号１１）
ＦＷＤプライマーｖ２
（５’＞３’）
ＣＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＴＣＡＣＡＣＣＧＣＡＧＡＣＧＴＴ（配列番号１２）
【００７０】
［結果］
ｒｐｏＢを含む試料を、プライマーを使用して増幅し、ｒｐｏＢ（５０７＞５２０）連結型プローブおよびｒｐｏＢ（５２０＞５３３）連結型プローブ（どちらもサイレンス化変異部位を含まない）の両方を用いて融解曲線分析に付した。単一変異および複数変異が、プローブの融解温度における変化として検出可能であったことをデータは示している（図６、７）。図６（上部グラフ）は、文献において報告されている、各コドンにおける変異の頻度を示している。赤（中塗り）の点は、インドにおけるこれらの変異の頻度を示している。図６の下部グラフは、５０７＞５２０プローブ上の５０７＞５２０番コドン間の変異および５２０＞５３３プローブ上の５２０＞５３３番コドン間の変異の、示される融解温度に対する影響（ＷＴ（野生型）からの逸脱として）を示している。
【００７１】
ｒｐｏＢ（５２０＞５３３）連結型プローブについて示されるＴＭは、５０７〜５２０番コドンに変異が存在し従ってこのプローブによっては報告されない鋳型においては７７．５℃±０．２７℃におけるピークによって表され、５２０〜５３３番コドンに変異が存在し従って７４．８℃±１．１４℃の平均ＴＭとなるＴＭの変化によって表される鋳型と比較された。
【００７２】
代表的な融解曲線を図７に示す。これは、分離されたプローブを使用して、臨床的ＲＲＤＲ単離株Ｄ５１６Ｖ（上）およびＮ５３１Ｌ（下）由来のｒｐｏＢにおけるｒｐｏＢ変異の融解曲線分析を行ったものである。５０７＞５２０番コドンをカバーするプローブを使用した上側のグラフでは、６９．９℃におけるピークによりＤ５１６Ｖ鋳型（オレンジ、左側のピーク）が報告され、これは、変異がプローブ領域外に外れそのプローブの野生型（黒、右側ピーク）位置である７２．２℃にて報告されるＮ５３１Ｌ（紫、右側ピーク）と比較される。逆に、これら同じ鋳型を、５２０＞５３３をカバーするプローブと共に使用した場合には、Ｄ５１６Ｖ（オレンジ、右側ピーク）に関して報告される位置は野生型（黒、右側ピーク）の７５．９℃であり、これは、７３．５℃の位置にて報告されるＮ５３１Ｌ変異（紫、左側ピーク）と比較される。
【００７３】
野生型表現型をもたらす塩基（サイレント変異）を５−ニトロインドールにより置換すると、上記不安的化作用が打ち消されることが示された。サイレント変異であるが従来型ＳＮＰプローブで検出され得ることが以前示されていた、５０７における変異および５１４における変異は、どちらも完全に中和された（図７）。必要であれば、同じ手法を用いて５２０＞５３３において１０カ所の候補位置を中和し得る。
【００７４】
図８は、完全にサイレンス化されたプローブであるｒｐｏＢ（５０７＞５２０）サイレンス＿全と非サイレンス化プローブであるｒｐｏＢ（５２０＞５３３）連結型プローブとの両方の組合せを使用して、ｒｐｏＢ遺伝子に渡る多様な異なるＳＮＰまたは複数変異に関して見られたＴｍの変化を示す。サイレンス化された変異である５０７．３、５０８．２、５１２．１、および５１４．２は、野生型範囲内のＴｍを維持する一方、その他の、非サイレンス化変異は、野生型と比較して、より大きなＴｍ変動を示していることが明らかである。これは、本手法および本プローブが確固としたものであることの確証となっている。
【００７５】
図８は、５０７＞５２０間のコドンにおける変異の、５０７＞５２０プローブに対する影響、および、５２０＞５３３間のコドンにおける変異の、５２０＞５３３プローブに対する影響を示している。塩基が５−ニトロインドールで置換された、表現型的にサイレントな変異に対応する位置においては、変化が抑制されている。複数の変異を有する鋳型も、両プローブの報告位置において変化をもたらしており、あるいは、サイレント変異に対応する塩基において５−ニトロインドールが置換された場合には、やはりその変化がサイレント化されて正しい表現型報告が可能となっていることが示されている。
【００７６】
複数の変異は、ミスマッチの数が増加すると共にＴＭの変化の増加と連関していた。欠損も、ＴＭの大きな変化によって検出された。
【００７７】
このアッセイは、１００（上）または１０（下）まで少ない試料を使用しても高感度であった（図９）。それは、５１６、５２６、５３１、および５３３番コドンにおける重要な変異を含む、すべてのコドンにおける変異の検出を可能にし、そのことに加えて、他製品において問題となることが以前報告されていた５０７および５１４番コドンにおけるサイレント変異の影響を中和する。
【００７８】
この２つの連結型プローブのセットはＲＩＦ変異検出のための高感度かつ最先端の試験を体現し、この手法は他のゲノム遺伝子座にも同様に適用可能であると我々は考える。
【図１】
0006461114.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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