(57)【要約】  ヒトＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のディスアドヘリン（dysadherin）サブユニットを標的とする抗体であり、この複合体のαサブユニットに結合するステロイド剤に、安定なリンカーを介して共有結合するこの抗体は、癌の治療に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外標的化薬物複合体（ＥＤＣ）であって、ジギトキシゲニン又はシラレニンのいずれかである薬剤に共有結合で結合するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アミノ−グリコシドリンカーに共有結合されたＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のディスアドヘリンサブユニットに結合する抗体を含むＥＤＣであり、前記リンカーの前記ＰＥＧ部分が、２〜３６個のグリコール単位を含有し、前記アミノ−グリコシドが４−アミノ−リボシド又は４−アミノ−キシロシドであり、前記薬剤が、前記アミノ−グリコシドのＣ１ヒドロキシル基を介して前記リンカーに結合し、並びに前記複合体が２〜８個の薬剤を含有する、ＥＤＣ。
【請求項２】
３個の薬剤を含有する、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項３】
７個の薬剤を含有する、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項４】
前記リンカーの前記ＰＥＧ部分が、２４個のグリコール単位を含有する、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項５】
前記抗体が、Ｍ５３モノクローナル抗体である、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項６】
前記抗体が、Ｍ５３の重鎖又は軽鎖可変領域とヒト不変領域とを含むキメラ又はヒト化抗体である、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項７】
前記抗体が、配列番号３３〜３５からなる群から選択される1つまたは複数の重鎖ＣＤＲｓ、及び／又は配列番号３６〜３８からなる群から選択される1つまたは複数の軽鎖ＣＤＲｓを含む、請求項１に記載のＥＤＣ。
【請求項８】
薬学的に許容可能なビヒクル、ベクター、希釈剤、及び／又は賦形剤を含む、静脈内投与に好適な、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＥＤＣの医薬製剤。
【請求項９】
約５ｍｇ〜約５ｇの前記ＥＤＣを含有する、請求項７に記載の医薬製剤の単位投与形態。
【請求項１０】
請求項１に記載のＥＤＣの治療的有効用量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、癌を有する患者を治療する方法。
【請求項１１】
前記患者に第２の薬剤を投与することを更に含み、前記第２の薬剤が、ゲムシタビン、ＴＲＡＩＬ（腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド）、線維芽細胞成長因子受容体キナーゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、肺癌患者である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、膵臓癌患者である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が、リンパ腫患者である、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者に、ＴＲＡＩＬ又は線維芽細胞成長因子受容体キナーゼ阻害剤のいずれかである第２の薬剤が投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者に、前記ＥＤＣと併用してゲムシタビンが投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者に、患者の体重のｋｇ当たり（「ｍｇ／ｋｇ」）０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの前記範囲の用量で、前記ＥＤＣが投与される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記用量が、週に１回又は３週間毎に１回投与される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体薬物複合体でガンを治療するための医薬製剤および方法を提供し、ここで、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のディスアドヘリン（ｄｙｓａｄｈｅｒｉｎ）サブユニットの抗体は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のアルファサブユニットと結合する薬物に対して安定なリンカーによって連結される。本発明は、生物学、化学、医薬品化学、医学、分子生物学、および薬理学の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
発生、免疫、および腫瘍形成をはじめとする全ての基本的な生物学的プロセスは、異なる組織および細胞型における遺伝子の選択的および差次的発現に関連する。例えば、多くの悪性腫瘍の形成は、ある特定の細胞表面シグナル伝達分子の産生および／または発現と関連することが示されている。現代の分子医学の目標の１つは、薬物を選択的に標的として、薬物の不適切な毒性効果を軽減または除去する方法を見出すことである。抗体、ペプチドまたはアプタマーなどのターゲティング部分を用いて、病的細胞型に独特であるかまたは病的細胞型で高レベルにて発現される特定の標的に薬物を送達することが試みられてきた。これらのターゲティング部分を、リンカーを介して薬物に直接結合させるか、またはナノ粒子に結合させることも試みられてきた。
【０００３】
そのような薬物ターゲティングシステムは、「抗体薬物複合体」または略してＡＤＣと称され、１９８５年から熱心に研究されている（例えば、参照することによって本明細書中に組み込まれる、米国特許公開第２００９／０２２０５２９号を参照のこと）。このクラスの標的治療学の構成要素は、抗原に対して特異的な抗体、細胞内で作用する薬物（複数可）、および抗体を薬物（複数可）に連結するリンカーから構成される。ＡＤＣを作製するために、ある細胞型を特異的に標的とし、結合および内面化に際してのみ活性薬物を放出する抗体を同定するための継続的に努力して、多様な抗体、リンカー、および薬物が組み合わされ、試験されてきた。残念なことに、リンカーは循環構造で安定であるが、ＡＤＣがその標的と結合したら、または標的細胞中に内部移行したら「不安定」になる、抗体および薬物を連結するための手段を見出すのが困難であることをはじめとする多くの技術的問題点がＡＤＣアプローチで起こる
【０００４】
最近では、細胞外標的と特異的に結合する抗体などのターゲティング部分は、循環システムで安定なリンカーを介して近くの標的に作用する薬物に連結される、「細胞外標的化薬物複合体」または「ＥＤＣ」の出現とともに当該技術分野では刺激的な新しい進展があった。ＥＤＣは、薬物放出が有効性に必要でない点でＡＤＣとは異なるが；その代わり、無傷なＥＤＣがターゲティング部分の標的および薬物の標的の両方と結合する場合に最大の有効性が達成される。１つの実例的ＥＤＣは、ターゲティング部分がディスアドヘリンを標的とし、薬物が強心配糖体であるＥＤＣであり；このＥＤＣでは、ターゲティング部分および薬物はＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体の異なるサブユニットを標的とする。参照することによって本明細書中に組み込まれる、ＰＴＣ公開第２０１１／０３１８７０号を参照のこと。
【０００５】
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼを標的とする新しいＥＤＣ、それらを含む新規処方、それらの作製方法、およびそれらを単独またはガンを治療するための他の薬物と組み合わせて使用する方法が依然として必要とされている。本発明はこれらの必要性を満たす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
様々な態様において、本発明は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のアルファサブユニットと結合する薬物とそれ自体が共有結合する循環システムで安定なリンカーと共有結合するＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のディスアドヘリンサブユニットと結合する抗体から構成されるＥＤＣに関する。便宜上、このクラスのＥＤＣは本明細書中では「クラス１ＥＤＣ」と称する。
【０００７】
第１の態様において、本発明は、ガンの患者を治療する方法であって、治療上有効用量のクラス１ＥＤＣを、治療を必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、クラス１ＥＤＣに加えて１以上の薬物を患者に投与してガンを治療する。様々な実施形態において、他の薬物は、ゲムシタビン、ＴＲＡＩＬ（組織壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンドおよびＡｐｏ２Ｌとしても知られる）、線維芽細胞成長因子受容体キナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤および解糖阻害剤からなる群から選択される。
【０００８】
第１の実施形態において、患者は肺ガン患者である。１つの実施形態において、肺ガンは非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）である。１つの実施形態において、肺ガンは扁平細胞ガンである。別の実施形態において、肺ガンは大細胞ガンである。１つの実施形態において、患者に、クラス１ＥＤＣと組み合わせて肺ガンの治療に関して認可された別の薬物を投与する。様々な実施形態において、他の薬物は、ペメトレキセド、ドセタキセル、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、ビノレルビン、ポルフィマーナトリウム、エルロチニブ、エトポシド、トポテカン、メトトレキサート、ベバシズマブ、カルボプラチン、シスプラチン、およびクリゾチニブからなる群から選択される。
【０００９】
第２の実施形態において、患者は膵臓ガン（ＰａＣａ）患者である。１つの実施形態において、患者に、クラス１ＥＤＣと組み合わせて肺がんの治療に認可された別の薬物を投与する。様々な実施形態において、他の薬物はゲムシタビンである。他の実施形態において、他の薬物は、フルオロウラシル、エルロチニブ、ゲムシタビン、スニチニブ、エベロリムスおよびマイトマイシンＣからなる群から選択される。
【００１０】
第３の実施形態において、患者はリンパ腫ガン患者である。１つの実施形態において、リンパ腫はＢ細胞リンパ腫である。１つの実施形態において、患者にクラス１ＥＤＣと組み合わせてリンパ腫の治療に認可された別の薬物を投与する。様々な実施形態において、他の薬物は、メトトレキサート、ドキソルビシン、クロランブシル、ネララビン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、イブリツモマブ・チウキセタン、プロカルバジン、プレリキサフォル、プララトレキサート、デニロイキン・ジフチトクス、オファツムマブ、リツキシマブ、ロミデプシン、トシツモマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、ビンブラスチン、ボリノスタット、インターフェロン、ロミデプシン、ブレンツキシマブ・ベドチンおよびブリツモマブ（ｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）・チウキセタンからなる群から選択される。
【００１１】
本発明の治療法のこれらや他の実施形態において、治療有効用量は、約０．１ｍｇ／患者の体重ｋｇ（「ｍｇ／ｋｇ」）〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。様々な実施形態において、治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。様々な実施形態において、治療有効用量は、０．２５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。様々な実施形態において、治療有効用量を１週間に１回または３週間ごとに１回投与し、患者が治癒するまで、またはガンが進行するまで、その頻度で投薬を続ける。
【００１２】
第２の態様において、本発明は新規クラス１ＥＤＣを提供する。ＰＴＣ公開第２０１１／０３１８７０号で記載されているクラス１ＥＤＣは、本発明の方法および処方における使用に好適であるが、新規発明は、様々な新規クラス１ＥＤＣを提供する。一般的に、クラス１ＥＤＣは、（ｉ）共有結合したディスアドヘリンと結合する抗体；（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−アミノグリコシドリンカー；および（ｉｉｉ）リンカー中のグリコシドと結合するステロイド薬物から構成される。
【００１３】
様々な態様において、本発明のクラス１ＥＤＣの各抗体に結合した薬物の数（「薬物負荷」と称する）は、約２から約８までおよぶ。１つの実施形態において、薬物負荷は３である。別の実施形態において、薬物負荷は７である。
【００１４】
様々な態様において、抗体に結合した薬物は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のアルファサブユニットに結合するステロイドである。様々な実施形態において、ステロイドはジギトキシゲンまたはシラレニンである。
【００１５】
様々な態様において、薬物はグリコシドのＣ１ヒドロキシル基によりリンカーと結合し、グリコシドは、４−アミノ−リボシドおよび４−アミノ−キシロシドからなる群から選択され、リンカーのＰＥＧ部分はグリコシドのアミノ基と結合する。本発明のクラス１ＥＤＣの様々な実施形態において、ステロイドはジギトキシゲンまたはシラレニンであり、グリコシドは４−アミノ−リボシドまたは４−アミノ−キシロシドのいずれかである。
【００１６】
様々な態様において、リンカーのＰＥＧ部分は、２〜３６のグリコール単位を含む。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は、２４のグリコール単位を含む。
【００１７】
様々な態様において、抗体はＭ５３モノクローナル抗体である。様々な実施形態において、抗体は、Ｍ５３抗体と同じエピトープと結合するモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、抗体はＭ５３抗体のヒト化形態である。
【００１８】
第３の態様において、本発明は、静脈内投与を含むがこれに限定されない非経口投与に適したクラス１ＥＤＣの医薬製剤を提供する。１つの実施形態において、本発明は、薬剤的に許容されるビヒクル、ベクター、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせたクラス１ＥＤＣを含む、非経口投与に適した医薬製剤を提供する。本発明はさらに、これらの医薬製剤の単位投与形態も提供する。１つの実施形態において、本発明は、約５ｍｇ〜約５ｇのクラス１ＥＤＣを含む静脈内投与に適した本発明の医薬製剤を含む単位投与形態を提供する。様々な実施形態において、これらの単位投与形態は、０．５ｇ、１ｇ、２．５ｇ、または５ｇのクラス１ＥＤＣを含む。
【００１９】
本発明の医薬製剤は、疾患または障害細胞の過剰増殖の予防、改善、および／または治療目的のためにインビボで使用することができる。本発明による医薬製剤を使用することができる疾患または障害の非限定的例としては、ガン、転移、細胞アポトーシス障害、変性疾患、組織虚血、炎症障害、糖尿病および病的血管新生（ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｎｅｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が挙げられる。様々な実施形態において、前述の様に、これらに限定されないが、肺ガン、リンパ腫ガン、および膵臓ガンをはじめとするガンを治療するために本発明の医薬製剤を使用する。したがって、本発明の方法にしたがって、対象を薬学的に有効な量の本発明による化合物または組成物で治療することができる。本発明の１つの実施形態では、対象はヒト対象である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例５で記載するような様々な薬物負荷での抗体Ｍ５３およびクラス１ＥＤＣの薬物動態を示す。「ＥＤＣ−ＯＮＥ」は、様々な薬物負荷（２（「２ｘ」）、５（「５Ｘ」）、または９（「９Ｘ」のいずれか）でのＥＤＣを指す。
【図２】実施例６で記載される様に、様々な量のクラス１ＥＤＣの単回ボーラス注射で投薬し、２４日間の注射後期間で２回薬物負荷をしたマウスの体重測定値を示す。
【図３】実施例７で記載されるＡ５４９無胸腺ヌードマウス異種移植片モデルにおいてＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６で得られた結果を示す。
【図４】実施例７で記載されるＡ５４９無胸腺ヌードマウス異種移植片モデルにおいてＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６で得られた結果を示す。
【図５】実施例７で記載されるＨ４６０無胸腺ヌードマウス異種移植片モデルにおいてＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６で治療されたマウスの平均腫瘍容積および平均体重を示す。
【図６】実施例８で記載されるＰＡＮＣ−１異種移植片モデルにおいてＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６で得られた結果を示す。
【図７】実施例８で記載されるＰＡＮＣ−１異種移植片モデルにおいてＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６で得られた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、クラス１ＥＤＣの医薬製剤および単位投与形態ならびにガン、特に肺ガンおよび膵臓ガンの治療でそれらを単独または他の薬剤と組み合わせて使用するための方法に関する。読者の便宜のために、この本発明の詳細な説明をセクションに分ける。セクションＩは本明細書中で用いられる用語の定義を提供する。セクションＩＩは、本発明の方法により提供され、本発明の方法で有用なクラス１ＥＤＣを説明する。セクションＩＩＩは、ガンを治療するために、クラス１ＥＤＣを単独または他の薬物と組み合わせて使用するための本発明の方法を記載する。セクションＩＶは、本発明の医薬製剤および単位投与形態を記載する。本発明の詳細な説明に続いて本発明の様々な態様および実施形態を説明する一連の実施例を記載する。本明細書中で引用される全ての特許、特許出願、および科学参考文献はそれらの全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる。
【００２２】
Ｉ．定義
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するおよび非天然アミノ酸、ならびにアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣薬を指す。
【００２３】
「抗体」という用語は、抗原のエピトープと特異的に結合し認識する、免疫グロブリン遺伝子またはそれらのフラグメントによってコード化される１以上のペプチド鎖を含むタンパク質またはタンパク質の混合物を指す。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、およびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンに分類され、これらは次に免疫グロブリンクラス、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥをそれぞれ規定する。典型的には、抗体の抗原結合領域は、結合の特異性および親和性において最も重要である。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹを含む。本明細書中で用いられる場合、「抗体」という用語は、単鎖抗体を含む全抗体、およびそれらの抗原結合フラグメントを含むことを意味する。抗体は、抗原結合抗体フラグメントでもあり得、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合したＦｖ（ｓｄＦｖ）、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、小型抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、およびフＶＬまたはＶＨドメインのいずれかを含むフラグメント、ならびにナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ）ＰＣＴ公開番号第ＷＯ９４／０４６７８号およびＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｖ９  （１）  ｐｐ  １２９−１３４，  ２００３を参照のこと）を含むが、これらに限定されるものではない。抗体は、鳥類およびほ乳類をはじめとする任意の動物起源であり得る。典型的には、商業的または研究用途における抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ科（例えば、ラクダ、ラマ）、ウマ、またはニワトリ抗体である。「抗体」は、本明細書中で用いられる場合、モノクローナル、キメラ、およびヒト化抗体、ならびにインタクト抗体および単離された抗体を包含する。抗体は、単一特異的、二重特異的、三重特異的またはさらに高次の多重特異的であり得る。
【００２４】
「細胞外標的化薬物複合体」または「ＥＤＣ」という用語は、細胞外標的を標的とする抗体または他のターゲティング部分が安定または非切断性リンカーを介して細胞外標的と結合する薬物と結合する薬物複合体を指す。
【００２５】
「抗原」という用語は、抗体またはターゲティング部分が結合する物質または標的を指す。抗原は、抗体またはターゲティング部分によって「結合」される能力によって特徴づけられる。抗原はさらに、ターゲティング部分の産生、例えば、抗原で免疫化することによる抗原特異的抗体の産生を誘導するために用いられる物質を意味する可能性もある。
【００２６】
「抗原結合部位」または「エピトープ」という用語は、抗体が結合する抗原の部分を指す。
【００２７】
「結合親和性」という用語は、その結合定数および解離定数の関数としての、抗体（あるいは他のターゲティング部分もしくは薬物または他の薬剤）とその抗原（または標的）との間の相互作用の強度を指す。高い親和性は、典型的には、ターゲティング部分が速いオン速度（結合）および遅いオフ速度（解離）を有することを意味する。結合親和性は、様々な生理学的条件下で変化する可能性があり、これらの条件下でおよび抗原または抗体／ターゲティング部分に起こる変化のもとで変化する。ターゲティング部分の結合親和性は、治療薬および／またはリンカーが結合している場合にも変化する可能性がある。結合親和性は、抗原に若干の変化、例えば、抗原のアミノ酸またはグリコシル化における変化が起こる場合にも、変化する可能性がある。
【００２８】
「ガン」という用語は、細胞の制御できない異常な増殖、冒された細胞が局所的に、または血流およびリンパ系を通して身体の他の部分へ広がる（即ち、転移する）能力、ならびに多くの特有の構造的および／または分子的特徴のいずれかによって特徴づけられる多くの疾患のいずれかを指す。「ガン性細胞」または「ガン細胞」は、分化が欠損し、浸潤および転移することができる、特定の構造的特性を有する細胞と理解される。ガンの例は、胸部、肺、脳、骨、肝臓、腎臓、結腸、および前立腺ガンである（あらゆる目的についてその全体が参照することによって本明細書中に組み込まれる、ＤｅＶｉｔａ，  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  ２００５，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，  ６ｔｈ．  Ｅｄ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡを参照のこと）。
【００２９】
「キメラ抗体」という用語は、１つの種（典型的にはマウス）由来のモノクローナル抗体のＦｃ定常領域が、組換えＤＮＡ技術を用いて、別の種（典型的にはヒト）の抗体由来のＦｃ領域と置換されている抗体を指す。例えば、ネズミモノクローナル抗体をコード化するｃＤＮＡは、Ｆｃ定常領域をコード化する配列を除去するために特異的に選択された制限酵素で消化され、ヒトＦｃ定常領域をコード化するｃＤＮＡの等価な部分は置換されている。ＣＤＲグラフト抗体は、いわゆる「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、望ましい抗原特異性を有するいわゆる「ドナー」抗体からのＣＤＲ「グラフト」によって置換されている抗体である。一般的に、ドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種由来のモノクローナル抗体であり；典型的には、アクセプター抗体は、ヒト抗体（ヒトにおいてその抗原性を最小限に抑えるため）であり、この場合、結果として得られるＣＤＲグラフト抗体は「ヒト化」抗体と称される。グラフトは、アクセプター抗体の単一のＶＨまたはＶＬ内の単一のＣＤＲ（またはさらには単一のＣＤＲの一部）を有するものである可能性があるか、またはＶＨおよびＶＬの一方または両方の複数のＣＤＲ（もしくははそれらの部分）を有するものでる可能性がある。ＣＤＲグラフトおよびヒト化抗体を生成させるための方法は、参照することによって本明細書中に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号；ならびにＷｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号によって教唆されている。
【００３０】
「循環構造」という用語は、循環系の組織を含む、ほ乳類の体液、間質液、リンパ液および血液を指す。
【００３１】
「ディスアドヘリン」、「ＡＴＰアーゼ7サブユニットガンマ５」、「ＦＸＹＤ５」、または「ガンマ５」という用語は、本明細書中では交換可能に使用され、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のガンマサブユニット５を指す。
【００３２】
「エピトープ」という用語は、通常、特定の３次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有し、モノクローナル抗体によって特異的に結合することができる抗原の表面のアミノ酸残基または糖側鎖などの分子の集団を指す。
【００３３】
「細胞外」という用語は、細胞膜の外表面を指す。
【００３４】
「インタクト抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中ではＬＣＶＲＸまたはＶＬと略記される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬから構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される更に保存された領域が散在した、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端まで次の順序で並んだ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィドブリッジによって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１  ：  ５４４−５４６，  １９８９）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００３５】
「ヘテロ二機能性リンカー」という用語は、両側に異なる反応性基を有し、タンパク質および他の分子中の２つの異なる官能基間で連続結合を可能にするリンカーを指す。
【００３６】
「細胞外標的」という用語は、細胞膜の外表面上に位置する、タンパク質、抗原、および／またはエピトープなどの標的を指す。
【００３７】
「リンカー」という用語は、ターゲティング部分および薬物などの２以上の分子と共有結合する化学部分または結合を指す。
【００３８】
「リンカースペーサー基」という用語は、リンカーによって結合した２つの分子間に空間を提供するリンカー中の原子を指す。
【００３９】
「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して１つの結合特異性および親和性を示す。「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変および定常領域（存在する場合）を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合したヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生することができるが、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、任意の真核、原核、またはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を指し、それが産生される方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレー技術の使用を含む当該技術分野で公知の多様な技術を用いて調製することができる。
【００４０】
「修飾抗体」という用語は、抗体の部分を、例えば欠失、付加、または置換することによって修飾された、モノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体を指す。例えば、抗体は、定常領域を欠失させ、抗体の半減期、例えば血清半減期、安定性または親和性を増大させることを目的とする定常領域とそれを置換することによって修飾することができる。治療薬の複数の分子または複数の異なる薬剤を１つの抗体分子とカップリングさせることができる。例えば、異なる部分を同じリンカーによって抗体分子にカップリングさせることができるか、または複数の結合部位を提供する複数のリンカー（例えば、デンドリマー）を使用することができる。
【００４１】
「非切断」および「未切断」という用語は、存在するＥＤＣ成分の大部分（例えば、＞５０％、＞６０％、＞７０％または＞８０％）が無傷である、すなわち薬剤をターゲティング部分に結合させるために使用するリンカーは切断されていない、任意の時点のＥＤＣ組成物を指す。
【００４２】
「非切断性リンカー」という用語は、同じ生理学的条件下で治療またはターゲティング部分のいずれかよりもインビボで安定である特性を有する安定なリンカーを指す。非切断性リンカーの例としては、酸または塩基感受性でなく（例えば、ヒドラゾン含有リンカー）、還元剤または酸化剤に対して感受性でなく（例えば、ジスルフィド結合を含むもの）、そして細胞または循環システムで見出すことができる酵素に対して感受性でないポリエチレングリコール鎖またはポリエチレン鎖を含むリンカーが挙げられる。
【００４３】
送達される薬物の量に関連した「薬剤的に有効な量」および「有効量」という用語は組織、系、動物、またはヒトにおいて所望の生物学的または医学的応答を誘発することができる薬物の量を指す。
【００４４】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、ペプチド模倣薬および「タンパク質」という用語は、多少交換可能に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣薬であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用する。これらの用語は、「抗体」という用語も包含する。「ペプチド」は多くの場合、「ポリペプチド」または「タンパク質」よりも少ないアミノ酸残基のポリマーを指すために用いられる。タンパク質は、同一または互いに異なる可能性がある２以上のポリペプチドを含む可能性がある。
【００４５】
「受容体」という用語は、細胞の原形質膜または細胞質のいずれかに埋め込まれ、１以上の特定の種類のシグナル伝達分子が結合することができる、細胞外標的タンパク質分子を指す。各細胞は、典型的には、多くの異なる種類の多くの受容体を有する。
【００４６】
「実質的に同時に」という用語は、同時または比較的狭い時間枠内で起こる２以上の事象を指す。様々な実施形態において、実質的に同時にとは、互いに約６０、約４０、約３０、約２０、約１０、約５、約２または約１秒以内に起こる２以上の事象を指す。例えば、本発明のＥＤＣは、ターゲティング部分結合および薬剤（薬物）作用が実質的に同時に起こるような特性を有する。
【００４７】
「循環構造で安定な」という用語は、分解に抵抗するＥＤＣなどの化合物の特性を指し、例えば、化合物の約５０％未満、または約２０％未満、または典型的には約２％未満が、約３７℃の循環血液において少なくとも約２時間分解または切断されることを意味する。
【００４８】
「安定なリンカー」という用語は、インビボまたはインビトロで生理学的条件（３７℃およびｐＨ７）においてＥＤＣが標的（複数可）に到達し、標的（複数可）と結合するのを可能にするために十分な時間、複合体が標的部位に送達または輸送されるまで安定かつ無傷のままであるリンカー（それが結合する２つの分子に共有結合したままである安定なリンカー）を指す。したがって、安定なリンカーは、一般的に、循環構造内で安定である（一般的に、少なくとも２時間後、そしていくつかの実施形態では、少なくとも４、８、１６、または２４時間後で５％未満の分解を意味する）。
【００４９】
「相乗的に」という用語は、２以上の薬剤を単独で使用する場合の効果の合計よりも高い、組み合わせて使用される場合の２以上の薬剤の効果を指す。例えば、本発明のＥＤＣでは、リンカーを介して連結された場合の抗体と薬剤（薬物）との相互作用の複合的治療効果は、単独で使用される場合のターゲティング部分および薬剤の個々の効果を合わせたものよりも高い。「効果」は、結合、治療効果、および／または特異性のいずれかを指す可能性がある。
【００５０】
「標的」という用語は、ターゲティング部分が結合するタンパク質、糖タンパク質、抗原、炭水化物または核酸を指し、また治療薬（本明細書中では「薬物」とも称する場合がある）が結合するタンパク質、糖タンパク質、抗原、炭水化物または核酸も指す。薬剤およびターゲティング部分は、「標的複合体」において異なる標的と結合する可能性があり、この場合、「標的複合体」は、２以上の分子、例えば、多サブユニットタンパク質の異なるサブユニットまたは多タンパク質複合体中の２つの異なるタンパク質などであって、インビボで互いに物理的に近接したものを指す。
【００５１】
「標的細胞」という用語は、病理に関与し、したがって治療活性の好ましい標的である細胞を指す。標的細胞は、例えば限定されないが、以下の群の１以上の細胞であり得る：一次または二次腫瘍細胞（転移）、一次または二次腫瘍の間質細胞、腫瘍または腫瘍転移の血管新生内皮細胞、マクロファージ、単球、多形核白血球およびリンパ球、ならびに腫瘍および腫瘍転移に浸潤する多核薬剤。
【００５２】
「ターゲティング部分」および「ターゲティング薬剤」という交換可能な用語は、標的と特異的に結合する抗体を指す。
【００５３】
「標的組織」という用語は、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）および標的細胞の環境中の細胞を指す。
【００５４】
「治療薬」および「薬物」および「薬剤」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられ、治療有効量で存在する場合、作用部位に結合すると、治療効果をもたらし、その作用部位が標的細胞の表面上もしくは内部に位置するか、またはその効果が標的細胞の表面上もしくは内部で発揮される化合物を指す。
【００５５】
「治療効果」という用語は、対象における疾患、疾患の症状または疾患の副作用の減少、除去、および／または予防を指す。
【００５６】
「半減期を増大させる」という用語は、血液中の化合物、典型的には治療薬の平均滞留時間を増大させること、または参照化合物と比較して血液もしくは血漿クリアランスを減少させることを意味する。
【００５７】
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇおよびｔｒｅａｔ）」という用語は交換可能に用いられ、治療薬または組成物を、疾患もしくは障害（例えば、ガンもしくは転移ガン）、疾患もしくは障害の症状または疾患もしくは障害に対する素質を有する患者に、疾患もしくは障害、疾患もしくは障害の症状、または疾患に対する素質を治療、治癒、軽減、緩和、変更、矯正、改善、向上または影響を及ぼす目的で投与することを指す。ガンまたは転移ガンの「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇまたはｔｒｅａｔ）」とは、任意の客観的もしくは主観的パラメータ、例えば症状の寛解；緩和；減退または疾患状態を患者にとってより許容されるようにすること；悪化もしくは減退の速度を遅らせること；または悪化の最終点をあまり減弱しないようにすることをはじめとする、ガンの治療または改善または予防を指す。症状の治療または改善は、医師による診察の結果をはじめとする、客観的または主観的パラメータに基づく可能性がある。したがって、「治療する」という用語は、新生物疾患を含むがこれに限定されない疾患に関連する症状または状態の発生を予防もしくは遅延するため、軽減するため、または停止もしくは阻害するために、治療薬を投与することを含む。
【００５８】
「腫瘍特異的抗原」という用語は、腫瘍に特有であるか、または正常な細胞と比べて、腫瘍細胞上で少なくともより豊富にあるタンパク質または他の分子を指す。
【００５９】
ＩＩ．クラス１ＥＤＣ
クラス１ＥＤＣは、安定または非切断性リンカー（このリンカーは、ＥＤＣがその最大治療効果を発揮する場合に無傷で切断されない）によって、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のアルファサブユニットと結合するステロイド薬物に連結されたヒトディスアドヘリン（human dysadherin）を標的とするかまたは結合する抗体を含む。したがって、全ての実施形態において、クラス１ＥＤＣは、細胞外標的と結合するターゲティング部分を含み、安定または非切断性リンカーを介してステロイドと結合しつつ、ヒトＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体に対して作用することによって治療効果を発揮する。これらの成分のそれぞれを、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体の簡単な説明後に後述する。
【００６０】
Ａ．Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体
ヒトＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体は、その存在を決定し、存在する場合は細胞中または細胞上の位置を決定する複数のサブユニット、イソ型および／またはグリコシル化パターンを有する。提示は、細胞型、細胞上の位置、細胞の位置、ならびに／または生理学的および病的状態に依存する可能性がある。例えば、Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体およびそのグリコシル化パターン中で見出されるベータサブユニットの種類（１対２）は、細胞型ごとに異なる（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ２００８；８（１６）：３２３６−５６、およびＡｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １９９７；２７２（１  Ｐｔ  ｌ）：Ｌ８５−９４を参照のこと）。異常なグリコシル化はガンの顕著な特徴であり、糖タンパク質、糖脂質、およびグリコサミノグリカンの炭水化物含有量の変化を含む（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ２００８；８（１）：２−２１およびＢｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９９；１４７３（ｌ）：２１−３４を参照のこと）。Ｎａ／Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のガンマサブユニットイソ型５またはＦＸＹＤ５遺伝子によってコード化されるので「ＦＸＹＤ５」とも称される「ディスアドヘリン」は、実験的ガン転移を促進することが示され、多くの異なる種類のヒトガンについて転移および生存の独立した予後指標である、グリコシル化膜タンパク質である［Ｎａｍ  ｅｔ．  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２５５（２）  １６１−９  （２００７）を参照のこと］。
【００６１】
本発明のクラス１ＥＤＣは、ステロイド薬物、安定なまたは非切断性リンカー、およびＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のディスアドヘリンサブユニットの細胞表面露出エピトープを認識する抗体を含む。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼは、そのアルファ−、ベータ−およびガンマ−サブユニットの複数のイソ型の発現および差次的会合（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）から生じる複合分子多様性によって特徴付けられる（Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７５  （Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ４４）：  Ｆ６３３−Ｆ６５０，  １９９８中の総説を参照のこと）。Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼは、細胞膜を通過する様々なカチオンの能動輸送の原因となるＰ型ＡＴＰアーゼの広く分布するクラスに属する。現在のところ、４つもの異なるアルファ−イソ型３つの異なるベータ−イソ型、および９つの異なるガンマ−イソ型がほ乳類細胞で特定されている。発生中の複合体のイソ型の構造並びにそれらの組織特異的および発現の発生パターンに対する厳しい制約は、異なるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体が細胞要件に応じるために異なる特性を生じさせたことを示唆する。アルファ−サブユニットの異なるイソ型は、異なる細胞型に関して異なるレベルで発現され、異なって挙動する。アルファ−サブユニットは、カチオン、ＡＴＰ、Ｓｒｃキナーゼ、および分子の強心配糖体クラス中に含まれるステロイド薬物を含む様々な治療薬の結合部位を含有する。したがって、本発明の１つの実施形態において、アルファ−サブユニットは、本発明のＥＤＣの薬剤の標的として作用する可能性があり、薬剤は強心配糖体のステロイド薬物である。特に、分子の強心配糖体クラスは、それらの抗不整脈効果のために、主に、心不全の治療において治療的に用いられてきた。最近、このクラスの薬物は抗ガン活性も有することが見出されたが、抗ガン薬としての使用は、必要なレベルでの心臓毒性のためにまだ認可されていない。このクラスの分子を心臓からガン細胞へ向けることは、したがって有益である。
【００６２】
Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼ複合体のベータ−サブユニットは、アルファ−サブユニットのシャペロンとしての機能を果たし、細胞膜上にその位置に向けると考えられ、ある異常細胞上で異常にグリコシル化される可能性がある。
【００６３】
ガンマ−サブユニットの特異的役割はイオン輸送の活性を調節すると考えられ、複合体の電圧依存性を修飾することが示された。ガンマ−サブユニットはＡＴＰアーゼ活性に必要ではないと考えられる（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９８１  １０２：２５０−２５１）。特に、ガンマサブユニットイソ型５は、あるガン細胞型に関して過剰発現され、転移の唯一の予言物質であるようである（Ｎａｍ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｅｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．  ２５５（２）：  １６１−１６９）。ガンマ−サブユニットは、広範なＦＸＹＤペプチド範囲から構築される。複数のＦＸＹＤまたはガンマ−サブユニットイソ型があり、発現は細胞型や細胞環境によって異なる。このサブユニットはさらに、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼイオンポンプ以外に他のタンパク質と複合体形成することが示された。Ｎａ−Ｋ−ＡＴＰアーゼの調節性ＦＸＹＤサブユニットの組織／細胞特異的発現は静的ではなく、所定の生理学的または病的状態に適応するように変化する可能性がある。ＦＸＹＤサブユニットを含む複合体は、様々なイソ型の発現レベル、および関連する複合体との競合に基づいてそうすると考えられる。したがって、ＦＸＹＤおよび特にＦＸＹＤ５の発現は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼイオンチャンネルと関連するであろうことを必ずしも示す訳ではない。本発明のクラス１ＥＤＣでは、ガンマ−サブユニット５（ディスアドヘリンおよびＦＸＹＤ５としても知られる）は、ＥＤＣの抗体の標的である。特に、本発明のＥＤＣは、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のアルファサブユニットに対して作用するステロイド薬物、非切断性リンカー、およびガンマ５サブユニットＦＸＹＤ５に結合する抗体を含む。様々な実施形態において、抗体は、Ｍ５３あるいはＭ５３またはＭ５３と同じエピトープに結合する別の抗体の重鎖もしくは軽鎖可変配列と同じ可変配列を有する別の抗体である（下記実施例２を参照）。本発明の様々な実施形態において、ＥＤＣは、シラレニン、シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド、およびＰＥＧ２４−ＣＥＮ−０９−１０６を含む。
【００６４】
Ｂ．クラス１ＥＤＣの抗体成分
抗体は、モノクローナル抗体ＮＣＣ−Ｍ５３（Ｍ５３）を含むディスアドヘリンに対して生成し［Ｓｈｉｍａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１（４）  ６５９−６６７  （２００３）］、これらの抗体は本発明のクラス１ＥＤＣにおいて使用することができる。さらに、下記実施例２で記載されるように、Ｍ５３抗体によって認識されるディスアドヘリン上のエピトープはマッピングされ、このエピトープと特異的に結合し、腫瘍細胞の表面上のディスアドヘリンと結合する任意の抗体を本発明のクラス１ＥＤＣで抗体として使用することができる。
【００６５】
したがって、クラス１ＥＤＣ中の抗体は、ヒトディスアドヘリンの細胞外ドメインと特異的に結合する。クラス１ＥＤＣの抗体は、Ｍ５３の重鎖および／または軽鎖（ＣＥＮ−ＡＢ−０１０；それぞれ配列番号３１および３２）を含む可能性がある。１つの実施形態において、クラス１ＥＤＣの抗体は、Ｍ５３の重鎖からの１以上のＣＤＲ（例えば、配列番号３３〜３５）を含む可能性がある。１つの実施形態において、クラス１ＥＤＣの抗体は、Ｍ５３の軽鎖からの１以上のＣＤＲ（例えば、配列番号３６〜３８）を含む可能性がある。１つの実施形態において、クラス１ＥＤＣの抗体は、Ｍ５３の重鎖からの１以上のＣＤＲ（例えば、配列番号３３〜３５）およびＭ５３の軽鎖からの１以上のＣＤＲ（例えば、配列番号３６−３８）を含む可能性がある。
【００６６】
クラス１ＥＤＣの抗体は、モノクローナル抗体、例えばネズミモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト抗体またはヒト化抗体である可能性がある。１つの実施形態において、抗体はヒト化抗体、例えば、Ｍ５３のヒト化形態である。１つの実施形態において、抗体は、下記実施例４で記載されるＭ５３のキメラ形態である。１つの実施形態において、抗体は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントである。１つの実施形態において、クラス１ＥＤＣの抗体は、配列番号１で表されるポリペプチド内のエピトープと結合するか、または選択的に結合する。１つの実施形態において、クラス１ＥＤＣの抗体は、Ｍ５３抗体によって認識されるＦＸＹＤ５上のエピトープと結合する。
【００６７】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を産生するために以前に用いられていた様々な方法は、クラス１ＥＤＣで使用される抗体を産生するために使用することができる。単一種の抗体を産生するクローンされた細胞系に適用するハイブリドーマ技術は、マウス（ネズミ）、ハムスター、ラット、およびヒトをはじめとする様々な種の細胞を使用する。キメラおよびヒト化抗体を含むＭＡｂを調製するための他の方法は、遺伝子工学、すなわち組換えＤＮＡ技術を用いる。モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体の集団から得られる。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系もヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，  （１９８４）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １３３  ：３００１、およびＢｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ．  ５１−６３  （Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７））。
【００６８】
モノクローナル抗体をコード化するＤＮＡは容易に単離され、配列決定される；ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの供給源として機能する。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、これを次いで大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の方法では抗体タンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、モノクローナル抗体の合成を得る（ＵＳ２００５／００４８５７２；ＵＳ２００４／０２２９３１０；Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５  ：２５６−２６２；およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  （１９９２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｓ．  １３０：  １５１−１８８．を参照のこと。ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖および系鎖定常ドメインのコーディング配列をホモローガスなネズミ配列の代わりに置換することによって（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１  ：６８５１）、または免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全部または一部を共有結合させることによっても、修飾することができる。
【００６９】
ヒト化の代替法として、ヒト抗体を生成させることができる。トランスジェニック動物（例えば、マウス）は、免疫化によって、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で全種類のヒト抗体を産生することができる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：２５５１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８；  Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９９３）  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．  ７：３３；米国特許第５，５９１，６６９号；米国特許第５，５８９，３６９号；および米国特許第５，５４５，８０７号）。
【００７０】
抗体フラグメントは、インタクト抗体のタンパク分解性消化によって得ることができる（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈ．  ２４：  １０７−１１７；およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ  （１９８５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：８１を参照のこと）または組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  （１９９２）  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：  １６３−１６７）。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）は、ＰＴＣ公開第ＷＯ９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号；および米国特許第５，５８７，４５８号で記載されるようにして調製することができる。抗体フラグメントは、例えば、米国特許第５，６４１，８７０号で記載されているように、「線状抗体」でもあり得る。
【００７１】
３以上の価数を有する抗体を本発明のＥＤＣの様々な実施形態で用いることができる。３以上の抗原結合部位と２以上の可変ドメインとを有する多価「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）」抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコード化する核酸の組換え発現によって容易に産生することができる（ＵＳ２００２／０００４５８６；ＷＯ０１／７７３４２）。例えば、三重特異的抗体を調製することができる（Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９９１）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７：６０）。
【００７２】
本発明のＥＤＣにおける抗体は、前述の説明の範囲内の様々な抗体を含み得る。したがって、クラス１ＥＤＣ中の抗体は、完全ヒト化抗体、ヒトキメラまたは、抗原結合Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および小型抗体を含む抗体フラグメントである可能性があり、抗体を増強して、抗体の親和性、安定性、および発現レベルを増加させることができる（Ｎａｔ  Ｍｅｄ．  ２００３  Ｊａｎ；  ９（１）：  １２９−３４を参照のこと）。
【００７３】
典型的には、抗体は、クラス１ＥＤＣの形成で使用する前に、（例えば、Ｌｏｗｒｙ法によって測定して）９５重量％超まで、多くの場合は９９重量％超まで精製される。通常、抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。抗体が十分な純度で利用可能ならば、本明細書中で検討したように、それを様々なリンカーおよび結合化学のいずれかによって治療薬と連結することができる。
【００７４】
Ｃ．クラス１ＥＤＣのリンカー成分
クラス１ＥＤＣを形成するために、ステロイド薬物をディスアドヘリン抗体に安定なリンカーによってカップリングさせる。リンカーは、クラス１ＥＤＣの一部としてではなく、別個のものとして概念化される場合、１以上の薬物を抗体と連結させてＥＤＣを形成するために使用することができる二官能性または多官能性部分である。ＥＤＣは、薬物と、および抗体との結合のための反応性官能基を有するリンカーを使用して都合よく調製することができる。例えば、システインチオール、またはアミン、例えば抗体のＮ末端またはアミノ酸側鎖、例えばリジンは、リンカー試薬または薬物−リンカー試薬の官能基と結合を形成することができる。
【００７５】
本発明の方法に好ましいクラス１ＥＤＣで使用するためのリンカーは、一般的に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびアミノグリコシドから構成される。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は、２〜３６個のグリコール単位を含む。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は２４個のグリコール単位を含む。典型的には、本発明の製造方法にしたがったＥＤＣの製造では、薬物−リンカー試薬が形成され、薬物−リンカー試薬を抗体と共役結合させて、クラス１ＥＤＣを形成する。典型的には、ステロイド薬物をアミノグリコシドのＣ１ヒドロキシル基によりリンカーと結合させ、グリコシドは、３−アミノ−リボシド、４−アミノ−リボシド、３−アミノ−キシロシド、および４−アミノ−キシロシドからなる群から選択され、そしてリンカーのＰＥＧ部分をグリコシドのアミノ基と結合させる。ステロイドがジゴキシゲニン、プロゲステロン、またはシラレニンである場合、グリコシドは４−アミノ−リボシドまたは４−アミノ−キシロシドのいずれかである。ステロイドがウアバインである場合、グリコシドは３−アミノ−リボシドまたは３−アミノ−キシロシドである。
【００７６】
本発明のＥＤＣで用いられるリンカーは安定である。投与後、ＥＤＣは安定であり、無傷なままである。即ち、ターゲティング部分はリンカーを介して薬剤と連結したままである。リンカーは標的細胞の外側で安定であり、有効性のために切断されていないままである。有効なリンカーは：（ｉ）抗体の特異的結合特性を維持する；（ｉｉ）複合体または薬剤の送達を可能にする；（ｉｉｉ）安定かつ無傷なままである、即ち、抗体および／または薬剤が安定かつ無傷なままである限り切断されない；そして（ｉｖ）ＥＤＣが無傷なままで薬剤の細胞毒性、殺細胞効果または細胞増殖抑制効果を維持する。例として、安定なリンカーは、本発明のＥＤＣ中にある場合、最小（即ち、１０％未満）の切断を示し、一方、循環構造中、標的組織の表面、標的細胞の表面、または細胞外マトリックス中に、少なくとも４〜８時間以上、例えば８〜２４時間、または１〜１０日以上の期間存在する場合；非切断性リンカーは、さらに長い期間、例えば２０日以上もの長い期間、これらの条件で安定である（Ｄｕｒｃｙ，  Ｌ．  ｅｔ．  ａｌ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０，  ２１，  ５−１３）。
【００７７】
本発明のＥＤＣで用いられるリンカーは２段階で都合よく産生することができる。第１段階で、遊離第１アミンなどの活性な求核試薬を含むグリコシドが結合される。第２段階で、二官能性ＰＥＧリンカーをグリコシドのアミンに結合させる。この方法は、グリコシドの様々な組み合わせおよび異なるリンカーの長さが連続して付け加えられることを可能にする点で有利である。加えて、グリコシドは、本発明のリンカー部分で用いられる場合にある利点を有することが示されている。
【００７８】
安定なリンカーは、治療薬とターゲティング部分との間に共有結合を形成するので、結合する場合、薬剤およびターゲティング部分は、それらの各標的に対して結合し、作用することができる。安定なリンカーは単に、ターゲティング部分および薬剤上の反応性部位間で形成される共有結合である可能性があるが、本発明の安定なリンカーは、典型的には、リンカースペーサー基、すなわち繰り返す一連のエチレングリコール単位およびアミノグリコシドを含む。リンカーを介してターゲティング部分を薬剤に結合させるために、相補的反応性基を利用する。例えば、ターゲティング部分上のアクセス可能なスルフヒドリル基は、活性なマレイミド基と反応して、安定なチオエーテル結合を形成することができる。さらなる例は、薬剤上のアクセス可能なアミンであり、これはスクシンイミドエステルと反応して、安定なアミド結合を形成することができる。一端上にマレイミドを有し、他端上にスクシンイミドエステルを有する二官能性リンカーを、薬物を抗体と連結するために使用することができる。下記実施例で例示するように、クラス１ＥＤＣは、アミノグリコシドをステロイド薬物のヒドロキシル基と連結させ、Ｏ−グリコシド結合を形成することによって都合よく調製することができる。次いで、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド試薬をアミノグリコシドのアミノ基と連結させて、「リンカー試薬」を形成する。最後に、リンカー試薬中のマレイミドを抗体中のシステイン部分と共有結合させる。
【００７９】
したがって、異なる化学リンカー（単一の共有結合とは対照的に）は、典型的にはＥＤＣで使用される。このタイプのリンカーは、典型的には、ターゲティング部分および／または治療薬をリンカーと共有結合させる連結試薬として機能することができる官能基を含有する２つの「末端」を有する１以上の「リンカースペーサー基」からなる原子の直鎖またはポリマーである。好適なリンカーとしては、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、アルデヒド、酸、エステルおよび無水物、スルフィドリル（ｓｕｌｆｙｄｒｙｌ）またはカルボキシル基、例えば、マレイミド安息香酸誘導体、マレイミドカプロン酸誘導体、ならびにスクシンイミド誘導体など含むが、これらに限定されない多種多様の官能基および部分を挙げることができる、またはシアン化臭素もしくはシアン化塩素、スクシンイミジルエステルまたはスルホン酸ハロゲン化物などから誘導することができる。
【００８０】
リンカーは、ターゲティング部分および薬物を物理的に連結することに加えて、有益な特性を本発明のＥＤＣに付与することができる。リンカーは、薬剤に起因するＥＤＣの薬剤自己会合または凝集を最小限に抑えるために使用することができる。リンカーはまた、ＥＤＣの治療効果を改善する可能性もある。リンカーはまた、ＥＤＣの薬物動態も改善する可能性がある。ターゲティング部分が治療薬と連結される場合、リンカー基は、本発明の化合物を、さらに生物学的耐性にする、さらに生物学的適合性にする、免疫原性を低くする、毒性を低くする、および／あるいは循環構造中でさらに安定にする、もしくは他の種類の破壊もしくは除去に対してさらに安定にする、または非切断性にするなどのいくつかの他の機能を有する可能性がある。したがって、ある実施形態では、安定または非切断性リンカーは、生理学的条件下でのターゲティング部分の治療薬に対する結合を維持するが、有益な治療効果も同様に有する可能性がある。
【００８１】
安定な、非切断性リンカーの一例は、ポリアルキレングリコールリンカーである。安定な非切断性リンカーの別の例は、ポリアルキレングリコールリンカーに結合したグリコシドである。ポリアルキレングリコールリンカーは、エーテル結合の形態で酸素によって一緒に結合した、少なくとも２、典型的には３以上のアルキレン部分を有する直鎖である。グリコシド結合ポリアルキレングリコールリンカーは、アミノグリコシドなどの糖が結合したポリアルキレングリコールの直鎖である。アルキレン基は置換されている可能性があるが、典型的には置換されていない可能性があり、任意の所望の数のアルキレン単位を含む可能性があるが、典型的には少なくとも２または１００以下のそのような単位、例えばエチレン、プロピレン、ヘキシレンなどを含む可能性がある。１つの実施形態において、リンカーは２４のエチレングリコール反復単位から構成され、ＰＥＧ２４型リンカーを作製する。このリンカーは、両端に結合した反応性基に応じて約９０〜１００オングストロームの長さである。一般的に、リンカー長さは、約５０〜約５００オングストロームまたは約５０〜約２００オングストロームの範囲である。１つの実施形態において、リンカーは糖から構成される。様々な実施形態において、前述のように、リンカーはアミノ糖を含む。ポリアルキレングリコール残基は、全て同じであるか、または長さおよび／もしくは置換が異なるアルキレン反復単位を含む可能性がある。様々な実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、（ＰＥＧ）３６二官能性リンカーを用いて構築される。特定の実施形態において、本発明のＥＤＣのリンカーは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得られるＳＭ（ＰＥＧ）２４を用いて構築される。
【００８２】
薬物に対してターゲティング部分を連結させるためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する場合、ＥＤＣは免疫系による攻撃に抵抗することができる可能性がある。ＰＥＧをタンパク質または小分子に添加することは、あるタンパク質または小分子治療法の治療効果を改善することが示されている（参照することによって本明細書中に組み込まれる、ＰＥＧｙｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇｓ：  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ；  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｓｅｒｉｅｓ：  Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏ  Ｍ．  （Ｅｄ．）２００９およびＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ５５，  Ｉｓｓｕｅ  １０，  ２６  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００３，  Ｐａｇｅｓ  １２６１−１２７７を参照のこと）。ＰＥＧは、したがって血清半減期を増大させ、抗原性を減少させる可能性がある。
【００８３】
ポリアルキレングリコールを介して抗体を薬物に連結させるためにアミノグリコシドなどの糖を使用する場合、ＥＤＣは、そのような糖が欠損したＥＤＣと比べて免疫系による攻撃に抵抗する能力が向上する可能性がある。糖をタンパク質または小分子に添加することは、抗体または小分子治療法の治療効果を改善することが示された（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ８，  ２２６−２３４  （Ｍａｒｃｈ  ２００９）を参照のこと、そしてＥｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  ２００９を参照のこと）。糖はしたがって溶解度を増大させることができ、かくして凝集を減少させ、抗原性を減少させる。
【００８４】
抗体、リンカー部分、および薬物の結合の順序はＥＤＣの製造で変わる可能性があるが、典型的には、製造プロセスは、まず薬物を合成し、次いでリンカーの糖部分を結合し、次にリンカーのＰＥＧ部分を結合し、そして最後に抗体を結合することによって進行する。当業者が理解するように、抗体は、薬物−リンカー試薬（またはリンカー）の共有結合のために複数の部位を提示する可能性がある。カップリング条件の適切な修飾により、抗体あたりの薬物の平均数が用いられる条件にしたがって変化するＥＤＣの製剤を作製することができる。本発明の様々な方法において、後述するように、この平均数は、ＥＤＣの最大の有益な治療効果を達成するのに重要である。
【００８５】
Ｄ．クラス１ＥＤＣのステロイド薬物
様々なステロイド薬物は、本発明によるクラス１ＥＤＣにおける使用に好適である。例えば限定されることなく、ステロイド薬物は、抗腫瘍、抗血管新生、または抗炎症治療活性を有する薬剤である可能性がある。様々な実施形態において、ステロイド薬物はシラレニンである。様々な実施形態において、ステロイド薬物はジギトキシゲンである。
【００８６】
一般的に、任意の強心配糖体のステロイド成分は、本発明のクラス１ＥＤＣのステロイド薬物として用いることができる。ジギトキシンおよびプロスシラリジンは、強力な抗腫瘍活性を有するが、高い心臓毒性も有する強心配糖体である（Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  ２００７；  ３０：  １０，  １２１６−１２２４を参照のこと）。強心配糖体は、ジギタリス属、ストロファンシス属などの植物由来の薬物の一種であり、これらは何世紀もの間、鬱血性心不全や不整脈を治療するために処方されてきた。これらの状態では、強心配糖体は、アルファサブユニットＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体と結合し、そのポンピング活性を阻害する。最近の１０年間にわたっておこなわれた研究によって強心配糖体が抗ガン薬剤として活性を有することが示された［Ｍｉｊａｔｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７７６：３２−５７およびＰＴＣ公開第２０１０／０１７４８０号］。
【００８７】
本発明の医薬製剤で用いられるクラス１ＥＤＣの様々な実施形態において、ステロイドはシラレニンである。様々な実施形態において、ステロイドはジギトキシゲンである。様々な実施形態において、ステロイドは、ＰＴＣ公開第ＷＯ２０１０／０１７４８０号（ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５３１５９）で特定される化合物である。
【００８８】
好適なステロイド薬物の非限定的例には、下記式Ｉのもの、ならびにそれらの薬剤的に許容されるエステル、誘導体、複合体、水和物、溶媒和物、プロドラッグおよび塩、または前記のいずれかの混合物が含まれる：
【００８９】
【化１】
2014510080.tif 000002
ここで、ステロイド環は、飽和、不飽和またはそれらの組み合わせのいずれかであり、
【００９０】
【化２】
2014510080.tif 000003
【００９１】
ＲａはＣＨ３である；Ｒｂは、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、またはＣＨＯである；Ｒｃは、Ｈ、ＯＨまたはＣＨ３ＣＯＯである；Ｒｄは、Ｈ、ＯＨまたはＣＨ３ＣＯＯである；Ｒｅは、Ｈまたは基が存在しない；Ｒｆは、Ｈ、ＯＨまたは、ＲｅがＨであるかもしくはＲｅ、ＲｆおよびＲｇと結合した原子間にＣ＝Ｃが存在する場合、Ｒｆは基が存在しない；ＲｇはＨであるかまたは、ＲｅがＨであるかもしくはＲｅ、ＲｆおよびＲｇに結合した原子間にＣ＝Ｃが存在する場合、Ｒｇは基が存在しない；ＲｈはＨまたはＯＨである；ＸはＯまたはＮ（ＯＲ’）である；そしてＲ’はアルキルまたはアリール基である。
【００９２】
したがって、多種多様のステロイド薬物をクラス１ＥＤＣで用いることができる。
【００９３】
Ｅ．結合化学
ＥＤＣは、（１）抗体の求核基または求電子基を二価リンカー試薬と反応させて、共有結合により抗体−リンカー中間体を形成し、続いて活性化薬物と反応させること；および（２）薬物の求核基および求電子基とリンカー試薬（完全リンカーまたはその一部であってよく、一部だけの場合、残りの部分をその後共有結合させることができる）とを反応させて共有結合により薬物−リンカー中間体（「薬物−リンカー試薬」）を形成し、続いて抗体の求核基または求電子基と反応させることを含む、当業者に公知の有機化学反応、条件、および試薬を用いるいくつかの経路のいずれかによって調製することができる。結合方法（１）および（２）を様々な抗体、薬物、およびリンカーとともに用いて本発明のＥＤＣを調製することができる。
【００９４】
抗体上の求核基としては、例えば：（ｉ）Ｎ末端アミン基、（ｉｉ）側鎖アミン基、例えばリジン、（ｉｉｉ）側鎖チオール基、例えばシステイン、および（ｉｖ）糖ヒドロキシルまたはアミノ基が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、ここで、抗体はグリコシル化されている。アミン、チオール、およびヒドロキシル基は求核性であり：（ｉ）ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物などの活性エステル；（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して、共有結合を形成することができる。ある抗体は、還元性鎖間ジスルフィド、すなわちシステインブリッジを有する。抗体は、ＤＴＴ（クレランド試薬、ジチオトレイトール）またはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩などの還元剤での処理によってリンカー試薬との結合について反応性にすることができる；Ｇｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ  （１９９９）  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０；  Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，  Ｂｅｖｅｒｌｙ，  Ｍａｓｓ．）。各システインジスルフィドブリッジはしたがって、理論的に２つの反応性チオール求核試薬を形成するであろう。さらなる求核基は、リジンと２−イミノチオラン（トラウト試薬）との反応により抗体に導入することができ、結果としてアミンがチオールに変換される。
【００９５】
抗体−薬物複合体は、リンカー試薬または薬物上の求核性置換基と反応することができる抗体を修飾して求電子部分を導入することによっても産生することができる。グリコシル化抗体の糖を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤と反応させてアルデヒドまたはケトン基を形成することができ、これはリンカー試薬または薬物部分のアミン基と反応する可能性がある。結果として得られるイミンシッフ塩基基は、安定な連結を形成することができるか、または、例えばボロヒドリド試薬によって還元して、安定なアミン結合を形成することができる。１つの実施形態において、グリコシル化抗体の炭水化物部分とガラクトースオキシダーゼまたはメタ過ヨウ素酸ナトリウムのいずれかとの反応によってカルボニル（アルデヒドおよびケトン）基がタンパク質中で得られる可能性があり、これは薬物上の適切な基と反応することができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，  Ｇ．  Ｔ．  （１９９６）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ；  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ：  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ２３４−２４２）。別の実施形態において、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基を含むタンパク質はメタ過ヨウ素酸ナトリウムと反応することができ、第１アミノ酸の代わりにアルデヒドが生じる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ＆  Ｓｔｒｏｈ，  （１９９２）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３：１３８−１４６；米国特許第５，３６２，８５２合）。そのようなアルデヒドを薬物部分またはリンカー求核試薬と反応させることができる。
【００９６】
同様に、薬物部分上の求核基としては：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含む、リンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
同様に、薬物部分上の求核基としては：（ｉ）活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハロゲン化物；（ｉｉ）ハロゲン化アルキルおよびハロゲン化ベンジル、例えばハロアセトアミド；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基を含むリンカー部分およびリンカー試薬上の求電子基と反応して共有結合を形成することができる、アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
下記実施例で例示するように、クラス１ＥＤＣは、アミノグリコシドをステロイド薬物のヒドロキシル基と連結させて、Ｏ−グリコシド結合を形成することによって都合よく調製することができる。次いで、ＮＨＳ−ＰＥＧ−マレイミド試薬をアミノグリコシドのアミノ基と連結して、「リンカー−試薬」を形成する。最後に、リンカー試薬中のマレイミドを抗体中のシステイン部分と共有結合させる。
【００９９】
Ｆ．薬物負荷
薬物負荷とは、ＥＤＣ製剤中の抗体あたりの薬物の平均数を指す。各リンカーが１つの薬剤に連結される場合、薬剤の平均数は、抗体上のリンカーの平均数と等しくなる。薬剤負荷は、典型的には抗体あたり１から８までの薬物に及ぶ、すなわち、１、２、３、４、５、６、７、または８の薬剤が抗体と共有結合する。リンカー（または薬物−リンカー試薬）が共有結合できる抗体上の複数の部位が存在するので、また潜在的な結合部位の１つのサブセットだけに結合の化学を向けることは困難であるので、ほとんどのＥＤＣ製剤は、異なる薬物負荷を有する抗体の混合物である。したがって、ＥＤＣの組成物は、典型的には、１〜８の薬物範囲と結合した抗体の集まりを含む。
【０１００】
典型的には、理論的最大よりも少ない薬物部分が結合反応中に抗体と結合する。抗体は、例えば、薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）またはリンカー試薬と反応しないシステイン残基を多く含む可能性がある。さらに、最も反応性の高いシステインチオール基のみがチオール−反応性リンカー試薬と反応することができる。一般的に、抗体は、薬物部分と連結することができる遊離および反応性システインを、たとえあったとしても多くは含まない。化合物の抗体中のほとんどのシステインチオール残基はジスルフィドブリッジとして存在し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）またはＴＣＥＰなどの還元剤で、部分または完全還元条件下で還元されるはずである。ＥＤＣの負荷（薬物／抗体比）は：（ｉ）薬物−リンカー（Ｄ−Ｌ；下記実施例では「リンカー対応（ｌｉｎｋｅｒ−ｒｅａｄｙ）治療薬と称する）またはリンカー試薬の抗体に対するモル過剰を制限すること、（ｉｉ）結合反応時間または温度を制限すること、および（ｉｉｉ）システインチオール修飾のための部分的または限定的還元条件をはじめとする、いくつかの異なる方法で制御することができる。
【０１０１】
薬物負荷は、ＥＤＣの薬力学、活性、毒性、および抗体安定性に影響を及ぼす可能性がある。したがって、当業者は、抗体あたりの薬物の数を最適化することが重要であることを理解する。ＥＤＣ薬物負荷を最適化するために、あるＥＤＣ特性、例えば血清半減期および安定性、ならびにインビボ有効性対毒性を測定することができる。反応混合物から、準最適負荷を有する抗体から最適数の薬物をロードされた抗体薬物複合体を精製する方法を記載する文献では、複数の方法が記載されている（米国特許第７，８１１，５７２号を参照のこと）。
【０１０２】
本発明は、最適治療効果を得るための薬物負荷はガンの間で異なる可能性があるという発見に一部起因する。しかしながら一般的に、最適薬物負荷は３〜６の範囲内である。１つの実施形態において、本発明の医薬製剤中のクラス１ＥＤＣは、ＥＤＣがモノクローナル抗体である場合、平均でＥＤＣあたり３つの薬物を有する。別の実施形態では、本発明の医薬製剤中のクラス１ＥＤＣは、ＥＤＣがモノクローナル抗体である場合、平均でＥＤＣあたり７つの薬物を有する。下記実施例で説明するように、薬物負荷が低いほど、ＥＤＣの半減期が長くなり、そしてＥＤＣの細胞毒性が低くなる。したがって、例えば薬物負荷が３の本発明のＥＤＣは、長い間隔（例えば、週１回、２もしくは３週間ごとに１回、または月１回）で投薬することができ、そしてさらに有利な副作用プロフィールを有する可能性がある。
【０１０３】
結合反応から得られるＥＤＣの製剤中の抗体あたりの薬物の平均数は、分光光度分析、質量分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、電気泳動、およびＨＰＬＣなどの常法によって特徴づけることができる。場合によっては、薬剤の数が、他の薬物負荷を有するＥＤＣに対してある値である、均一なＥＤＣの分離、精製、および特性化は、逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動などの手段によって達成することができる。ポリマー逆相（ＰＬＲＰ）および疎水性相互作用（ＨＩＣ）などの液体クロマトグラフィー法は、混合物中のＥＤＣを薬物負荷値によって分ける。１つの薬剤負荷値を有するＥＤＣの製剤を単離することができる。しかしながら、１つの薬剤ロードを有するこれらのＥＤＣは依然として不均一な混合物である。なぜなら、薬物部分を、抗体上の異なる部位でリンカーにより結合させることができるからである。
【０１０４】
ＩＩＩ．治療方法
本発明のＥＤＣは、一般的に、ガン患者の治療法で有用である。そのような方法は、治療上有効用量のクラス１ＥＤＣを、治療を必要とする患者に投与することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、クラス１ＥＤＣに加えて１以上の薬物を患者に投与して、例えば、ディスアドヘリン陽性ガンを含むガンを治療する。様々な実施形態において、他の薬物は、ゲムシタビン、パクリタキセル、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２リガンドおよびＡｐｏ２Ｌとしても知られる組織壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド）（例えば、ｉｚＴｒａｉｌ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体キナーゼ阻害剤（例えば、ＰＤ１７３０７４）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、エベロリムス）および解糖阻害剤（例えば、ＣＥＮ１０−１２８−ｃｙｓ）からなる群から選択される。驚くべきことに、本明細書中で開示されるクラス１ＥＤＣは、細胞死の促進において、ＴＲＡＩＬ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）受容体キナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、または解糖阻害剤のいずれかと相乗作用することが示されている。
【０１０５】
第１の態様において、患者は肺ガン患者である。１つの実施形態において、肺ガンは非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）である。１つの実施形態において、肺ガンは扁平細胞ガンである。別の実施形態において、肺ガンは大細胞ガンである。１つの実施形態において、患者に、クラス１ＥＤＣと組み合わせて肺ガンの治療について認可された第２の薬物を投与する。１つの実施形態において、第２の薬物はパクリタキセルまたはドセタキセルまたは別のタキサン薬物である。１つの実施形態において、第２の薬物は、これに限定されないがｉｚＴＲＡＩＬを含むＴＲＡＩＬである。１つの実施形態において、第２の薬物はＴＲＡＩＬの受容体に対する抗体であり、ここで、抗体はＴＲＡＩＬのようにアポトーシスのシグナルを送る働きをする。１つの実施形態において、第２の薬物は、これに限定されないがＰＤ１７３０７４を含むＦＧＦ受容体キナーゼ阻害剤である。１つの実施形態において、第２の薬物は、これに限定されないがエベロリムスを含むｍＴＯＲ阻害剤である。１つの実施形態において、第２の薬物は、これに限定されないがＣＥＮ１０−１２８−ｃｙｓを含む解糖阻害剤である。様々な実施形態において、他の薬物は、ペメトレキセド、ドセタキセル、ゲフィニチブ、ゲムシタビン、ビノレルビン、ポルフィマーナトリウム、エルロチニブ、エトポシド、トポテカン、メトトレキサート、ベバシズマブ、カルボプラチン、シスプラチン、およびクリゾチニブからなる群から選択される。
【０１０６】
第２の実施形態において、患者は膵臓ガン（ＰａＣａ）患者である。１つの実施形態において、患者に、クラス１ＥＤＣと組み合わせて膵臓癌の治療について認可された別の薬物を投与する。様々な実施形態において、他の薬物はゲムシタビンである。他の実施形態において、他の薬物は、フルオロウラシル、エルロチニブ、ゲムシタビン、スニチニブ、エベロリムスおよびマイトマイシンＣからなる群から選択される。
【０１０７】
第３の実施形態において、患者はリンパ腫ガン患者である。１つの実施形態において、リンパ腫はＢ細胞リンパ腫である。１つの実施形態において、患者に、クラス１ＥＤＣと組み合わせてリンパ腫の治療について認可された別の薬物を投与する。様々な実施形態において、他の薬物は、メトトレキサート、ドキソルビシン、クロランブシル、ネララビン、ベンダムスチン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、シクロホスファミド、イブリツモマブ・チウキセタン、プロカルバジン、プレリキサフォル、プララトレキサート、デニロイキン・ジフチトクス、オファツムマブ、リツキシマブ、ロミデプシン、トシツモマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、ビンブラスチン、ボリノスタット、インターフェロン、ロミデプシン、ブレンツキシマブ・ベドチンおよびブリツモマブ（ｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）・チウキセタンからなる群から選択される。
【０１０８】
本発明の治療方法のこれらや他の実施形態において、治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重（「ｍｇ／ｋｇ」）から約１００ｍｇ／ｋｇの範囲内である。様々な実施形態において、治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。様々な実施形態において、治療有効用量は０．２５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇである。様々な実施形態において、治療有効用量は１週間に１回または３週間に１回投与され、患者が治癒するか、またはガンが進行するまで、投薬はその頻度で継続される。
【０１０９】
下記実施例で示すよう薬物負荷は、正常細胞およびガン細胞の両方に対して、そしてクラス１ＥＤＣの半減期に対して、毒性に関して重大な影響を及ぼす可能性がある。特に、低い薬物負荷、即ち、抗体あたり２または３の薬物の薬物負荷は、高い薬物負荷、すなわち、抗体あたり８または９の薬物の薬物負荷と比べて、クラス１ＥＤＣの血清半減期を増大させることができ、そして正常細胞毒性を減少させることができる。しかしながら、一部のガンについては、より高い薬物負荷がより良好な有効性を提供する。したがって、様々な実施形態において、本発明のクラス１ＥＤＣの各抗体に結合する薬物の数（「薬物負荷」と称する）は２〜９である。１つの実施形態において、薬物負荷は２である。別の実施形態において、薬物負荷は３である。他の実施形態において、薬物負荷は５、７、または９である。
【０１１０】
様々な態様において、抗体に結合した薬物は、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼシグナル伝達複合体のアルファサブユニットに結合するステロイド薬物である。様々な実施形態において、ステロイドはジギトキシゲンまたはシラレニンである。様々な実施形態において、薬物は、グリコシドに対するアミド結合によってリンカーに結合し、そのグリコシド結合は、付加されたグリコシドのＣ１とステロイドアグリコンのＣ３との間で形成される。グリコシドは、例えば、４−アミノ−リボシドおよび４−アミノ−キシロシドからなる群から選択することができ、リンカーのＰＥＧ部分をグリコシドのアミノ基と結合させる。本発明のクラス１ＥＤＣの様々な実施形態において、ステロイドはジギトキシゲンまたはシラレニンであり、グリコシドは４−アミノ−リボシドまたは４−アミノ−キシロシドのいずれかである。
【０１１１】
様々な態様において、薬物をグリコシドのＣ１ヒドロキシル基によりリンカーと結合させ、グリコシドは４−アミノ−リボシドまたは４−アミノ−キシロシドであり、リンカーのＰＥＧ部分をリンカーのグリコシド部分のアミノ基と結合させる。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は２〜３６個のグリコール単位を含む。様々な実施形態において、リンカーのＰＥＧ部分は２４個のグリコール単位を含む。
【０１１２】
様々な態様において、抗体はＭ５３モノクローナル抗体である。様々な実施形態において、抗体は、Ｍ５３抗体と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。様々な実施形態において、抗体はＭ５３抗体のキメラ形態である。様々な実施形態において、抗体はＭ５３抗体のヒト化形態である。
【０１１３】
本発明による化合物の投与は、治療薬について承認され、当該技術分野で一般的に知られている任意の投与方法によっておこなうことができる。プロセスとしては、例えば、非経口、経口、鼻による全身投与、または局所投与が挙げられるが、これに限定されるものではない。非経口投与は、皮下、筋肉内もしくは静脈内注射によるか、または潅流によっておこなわれる。一般に、本発明のＥＤＣなどの抗体ベースの治療法は、典型的には静脈内投与される。注射可能な組成物は、懸濁液もしくは液体溶液、または液体中に即座に溶解させるのに適した固体形態のいずれかの標準的な形態で調製することができる。１つの実施形態において、非経口投与は、一定の服用レベルの維持を保証する徐放または持続放出系の装置を使用する。
【０１１４】
疾患の治療に関して、ＥＤＣの適切な投薬量は、治療される疾患の種類、疾患の重篤度および経過、薬歴、患者の病歴および抗体に対する応答、ならびに担当医の判断によって変わるであろう。したがって、本発明による化合物の投与のための投薬量は、対象の種類、血統、年齢、体重、性別および医学的状態；治療される状態の重篤度；投与方法；対象の腎機能および肝機能の状態ならびに投与される特定のＥＤＣの特質をはじめとする様々な因子にしたがって選択される。通常の経験豊富な医師は、治療される医学的状態を治療するための所望のＥＤＣの有効量を容易に決定し、処方するであろう。例をあげれば、非経口投与する場合、本発明のクラス１ＥＤＣの有効レベルは、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．２５ｍｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。クラス１ＥＤＣは、静脈内投与する場合、一般的に、毎週または隔週または３週間ごとに投与される。
【０１１５】
本発明のＥＤＣを用いて、ヒトまたは動物対象におけるガンおよび自己免疫状態などの様々な疾患または障害を治療することができる。１つの実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は非ヒト動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、鳥など）である。例示的な状態また障害としては、良性または悪性腫瘍；白血病およびリンパ性悪性疾患；ニューロン、グリア、星状細胞（ａｓｔｒｏｃｙｔａｌ）、視床下部、腺、マクロファージ、上皮、間質、胞胚腔、炎症、血管新生および免疫障害などの他の障害が挙げられる。
【０１１６】
本明細書中で治療されるガンの例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病またはリンパ性悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。そのようなガンの更に特定の例としては、扁平細胞ガン（例えば、上皮扁平細胞ガン）、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫をはじめとする肺ガン、腹膜ガン、肝細胞ガン、胃腸ガンを含む胃腸または胃ガン、胃腸間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、膵臓ガン、グリア芽細胞腫、子宮頸がん、卵巣ガン、肝臓ガン、膀胱ガン、肝細胞ガン、乳ガン、結腸ガン、直腸ガン、結腸直腸ガン、子宮内膜ガンまたは子宮ガン、唾液腺癌、腎臓ガンまたは腎ガン、前立腺ガン、外陰ガン、甲状腺ガン、肝ガン、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頸部ガンが挙げられる。
【０１１７】
ガンに加えて、本発明のＥＤＣを、抗炎症剤として、または他の疾患を治療するために用いることができる。研究により、嚢胞性線維症患者の肺におけるＮａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼサブユニットイソ型／モジュレータ分布およびレベルは、正常な肺のものとは異なり、したがって嚢胞性線維症過剰炎症に対する治療薬の標的であることが示唆される。研究から、Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼと結合する強心配糖体は、ＮＦ−カッパＢ阻害剤の特異的阻害リン酸化（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）により、培養されたＣＦ上皮細胞からのＩＬ−８の過剰分泌を抑制することができることが明らかにされている（参照することによって本明細書中に組み込まれるＳｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｍ．，  ｅｔ．ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ２００４，  １０１，  ７６９３−７６９８を参照のこと）。強心配糖体の潜在的な治療的使用の総説は、肥満、腎疾患、偏頭痛、てんかん、ジストニア、パーキンソン症候群を検討している（２００７  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２６１；  ４４−５２）。
【０１１８】
本明細書中のクラス１ＥＤＣを第２の薬物と同時に、連続して、もしくは交互に投与することができるか、または他の療法との非反応性によって投与することができる。したがって、第２の薬物の併用投与には、別々の処方または単一の医薬製剤を使用する同時投与、およびいずれかの順序での連続投与が含まれ、この場合、好ましくは両方の（または全ての）療法がそれらの生物学的活性を同時に発揮する時間がある。複数の第２の薬物を本発明のＥＤＣと組み合わせて用いることができる。したがって、本発明のＥＤＣを、複合医薬製剤、または併用療法としての投薬レジメンにおいて、抗ガン特性を有する第２の化合物と組み合わせることができる。複合医薬製剤または投薬レジメンの第２の化合物は、好ましくは組み合わせのＥＤＣに対する相補的活性を有するので、互いに悪影響を及ぼさない。
【０１１９】
第２の化合物は、化学治療薬、細胞毒性剤、サイトカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、抗アンドロゲン、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝子治療ワクチン、抗血管新生剤および／または心臓保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）であってもよい。そのような分子は、好適には意図される目的に有効な量の組み合わせで存在する。ＥＤＣを含有する医薬組成物はさらに、治療有効量の、チューブリン形成阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡバインダーなどの化学治療薬を有していてもよい。
【０１２０】
１つの実施形態において、併用治療薬は、ＴＲＡＩＬまたは類似の活性を有するアゴニストｍＡＢ；ベバシズマブ；カルボプラチン；シスプラチン；シクロホスファミド；ドセタキセル注射；ドキソルビシン；エトポシド；リン酸エトポシド；ジェムザール（ゲムシタビンＨＣＬ）；ハイカムチン（塩酸トポテカン）；イホスファミド；イレッサ（ゲフィニチブ）；イリノテカン注射；メトトレキサート注射；マイトマイシン；パクリタキセル；フォトフリン、ＱＬＴ；プレメトレキセド（Ｐｒｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）；プロカルバジン；ストレプトゾシン；タルセバ（エルロチニブ）；ビンブラシン（Ｖｉｎｂｌａｓｉｎｅ）；ビンクリスチン；および酒石酸ビノレルビンから選択される。
【０１２１】
したがって、他の治療レジメンを本発明にしたがってクラス１ＥＤＣの投与と組み合わせることができる。併用療法を同時または連続レジメンとして投与することができる。連続して投与する場合、組み合わせは２回以上の投与で投与することができる。併用投与は、別の処方または単一医薬製剤使用する同時投与、ならびにいずれかの順序での連続投与を含み、この場合、両方の（または全ての）活性剤が同時にそれらの生物学的活性を発揮する期間がある。
【０１２２】
１つの実施形態において、本発明のＥＤＣでの治療は、異なる化学治療薬のカクテルの同時投与を含む、本明細書中で特定される抗ガン剤、および１以上の化学治療薬または成長阻害剤の併用投与を含む。化学治療薬は、タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ））および／またはアントラサイクリン抗生物質を含む。そのような化学治療薬の調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示にしたがって、または当業者によって経験的に決定できるように、使用することができる。そのような化学療法剤の調製および投薬スケジュールは、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｅｄ．，  Ｍ．  Ｃ．  Ｐｅｒｒｙ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍｄ．  （１９９２）でも記載されている。
【０１２３】
抗ガン剤は、抗ホルモン化合物；例えば、タモキシフェンなどの抗エストロゲン化合物；オナプリストンなどの抗プロゲステロン（ＥＰ６１６８１２）；またはフルタミドなどの抗アンドロゲンと、そのような分子について公知の投薬量で組み合わせてもよい。治療されるガンがホルモン非依存性ガンである場合、患者をあらかじめ抗ホルモン療法に付し、ガンがホルモン非依存性になった後、抗ＥｒｂＢ２抗体（および場合によって本明細書中で記載するような他の薬剤）を患者に投与することができる。心臓保護剤（療法に関連する心筋機能障害を予防もしくは軽減するため）または１以上のサイトカインを患者に同時投与することも有益である可能性がある。前記治療法に加えて、患者はガン細胞の外科的切除および／または放射線療法を受けてもよい。
【０１２４】
前記の同時投与される薬剤のいずれかの好適な投薬量は、現在使用されているものであり、新たに同定された薬剤および他の化学治療薬または治療の複合作用（相乗効果）のために少なくすることができる。
【０１２５】
併用療法は、一緒に使用される活性成分が、化合物を別々に使用することから得られる効果の合計よりも大きい場合に達成される効果を提供する可能性がある。効果は、活性成分が：（１）同時処方され、投与されるか、または複合単位投薬処方で同時に送達される場合；（２）別の処方として交互に、もしくは平行して送達される場合；または（３）ある他のレジメンによって、達成される可能性がある。交互療法で送達される場合、効果は、化合物が連続して、例えば別のシリンジ中で異なる注射により投与または送達される場合に達成される可能性がある。一般に、交互療法中、有効投薬量の各活性成分を連続して、すなわち順次投与し、一方、併用療法では、有効投薬量の２以上の活性成分を一緒に投与する。
【０１２６】
本発明の治療用ＥＤＣは、治療される状態に適切な任意の経路によって投与することができる。ＥＤＣは、典型的には、非経口的に、すなわち、注入、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、髄腔内、ボーラス、腫瘍内注射または硬膜外投与される（Ｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ  （２００４）  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９３（６）：  １３９０−１４０２）。
【０１２７】
ＩＶ．医薬製剤および単位投与形態
本発明は、静脈内投与を含むがこれに限定されない非経口投与に適したクラス１ＥＤＣの医薬製剤を提供する。１つの実施形態において、本発明は、クラス１ＥＤＣを薬剤的に許容されるビヒクル、ベクター、希釈剤、および／または賦形剤と組み合わせて含む、非経口投与に適した医薬製剤を提供する。本発明はまた、これらの医薬製剤の単位投与形態も提供する。１つの実施形態において、本発明は、約２．５ｍｇ〜約１．５ｇのクラス１ＥＤＣを含む静脈内投与に適した本発明の医薬製剤を含有する単に投与形態を提供する。様々な実施形態において、これらの単位投与形態は、５ｍｇ、１０ｇ、２５ｍｇ、０．５ｇ、または１ｇのクラス１ＥＤＣを含有する。
【０１２８】
ＥＤＣの医薬製剤は、典型的には、薬剤的に許容される非経口ビヒクルを用いて単位投薬注射可能な形態で非経口投与用に調製される。所望の程度の純度を有するＥＤＣを、場合によって薬剤的に許容される希釈剤、担体、賦形剤または安定剤と、凍結乾燥処方または水溶液の形態で混合する（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （１９８０）  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．）。
【０１２９】
許容される非経口ビヒクル、希釈剤、担体、賦形剤、および安定剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンをはじめとする他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖類、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。例えば、凍結乾燥抗ＥｒｂＢ２抗体処方は、ＷＯ９７／０４８０１（参照することによって本明細書中に明らかに組み込まれる）で記載されている。ＥＤＣの例示的処方は、約１００ｍｇ／ｍｌのトレハロース（２−（ヒドロキシメチル）−６−［３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）テトラヒドロピラン−２−ｙｌ］オキシ−テトラヒドロピラン−３，４，５−トリオール；Ｃ１２Ｈ２２Ｏ１１；ＣＡＳ番号９９−２０−７）および約０．１％ＴＷＥＥＮ（商標）２０（ポリソルベート２０；ドデカン酸２−［２−［３，４−ビス（２−ヒドロキシエトキシ）テトラヒドロフラン−２−イル］−２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エチルエステル；Ｃ２６Ｈ５０Ｏ１０；ＣＡＳ番号９００５−６４−５）を約ｐＨ６で含有する。
【０１３０】
治療用ＥＤＣの医薬製剤は、ある量の未反応薬物部分（Ｄ）、抗体（または他のターゲティング部分）−リンカー中間体（Ａｂ−Ｌ）、および／または薬物−リンカー中間体（Ｄ−Ｌ）、ＥＤＣを作製するプロセス；あるいは時間／温度加水分解またはバルクＥＤＣもしくは処方されたＥＤＣ組成物の貯蔵による分解における過剰の試薬の不完全な精製および分離の結果としての、不純物、および副生成物を含む可能性がある。例えば、検出可能な量の薬物−リンカーまたは様々な中間体を含む可能性がある。代替的にまたは付加的に、それは検出可能な量の連結していない遊離ターゲティング部分を含む可能性がある。例示的場合によっては薬物−リンカー複合体は遊離型薬物よりも殺細胞において有効でないことがインビトロ細胞増殖アッセイによって確認されたので、処方は１０％モル当量までの薬剤リンカーの薬剤を含む可能性がある。
【０１３１】
活性な医薬成分は、例えば、コアセルベーション技術によるか、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えばそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中にトラップすることもできる。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｏｓｏｌ，  Ａ．  Ｅｄ．  （１９８０）で開示されている。
【０１３２】
持続放出性製剤を調製することができる。持続放出製剤の好適な例としては、ＥＤＣを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、例えばフィルム、またはマイクロカプセルなどの成形品の形態であるマトリックスが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１３３】
インビボ投与のために使用される処方は無菌でなければならず、これは、無菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成される。
【０１３４】
処方は、前記投与経路に適したものを含む。処方は、単位投与形態で都合よく提供することができ、調剤分野で周知の方法のいずれかによって調製することができる。技術および処方は、概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）で見出される。そのような方法は、活性成分を１以上の副成分を構成する担体と結合させるステップを含む。一般に、処方は、活性成分を液体担体または微粉末固体担体または両者と均一かつ密接に結合させ、次いで、必要ならば、生成物を成形することによって調製される。
【０１３５】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物で活性物質（ＥＤＣ）を含む。そのような賦形剤は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポビドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなどの懸濁剤、ならびに分散または湿潤剤、例えば天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）を含む。水性懸濁液はさらに、ｐ−ヒドロキシ−安息香酸エチルまたはｎ−プロピルなどの１以上の防腐剤、１以上の着色剤、１以上の矯味矯臭剤およびスクロースまたはサッカリンなどの１以上の甘味料を含んでもよい。
【０１３６】
ＥＤＣの医薬組成物は、無菌注射用水性または油性懸濁液などの無菌注射用製剤の形態であってよい。この懸濁液は、公知技術にしたがって、前述の好適な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して処方することができる。無菌注射用製剤は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中無菌注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタン−ジオール中溶液であってもよいし、または凍結乾燥粉末として調製してもよい。用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌固定油は、溶媒または懸濁媒として通常用いることができる。このために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドをはじめとする、任意の無刺激性固定油を用いることができる。加えて、オレイン酸などの脂肪酸も同様に注射製剤で用いることができる。
【０１３７】
単一投与形態を製造するために担体物質と組み合わせることができる活性成分の量は、治療される宿主および特定の投与様式に応じて変わるであろう。約３０ｍＬ／ｈｒの速度で好適な体積の注入が起こり得るために、例えば、静注を意図される水溶液は、溶液１ミリリットルあたり約３〜５００μｇの活性成分を含んでもよい。皮下（ボーラス）投与は、約１．５ｍｌ以下の総容積および１ｍｌあたり約１００ｍｇのＥＤＣの濃度で実施することができる。頻回および慢性投与を必要とするＥＤＣについて、例えばあらかじめ充填されたシリンジまたは自動注射装置技術によるなど、皮下経路を用いることができる。
【０１３８】
一般的問題として、１回につき投与されるＥＤＣの薬剤的に有効な初回量は約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲、即ち、約０．２５〜５ｍｇ／ｋｇ患者体重／日の範囲であり、使用される化合物の典型的な初期範囲は０．２５〜５ｍｇ／ｋｇ／日である（多くの場合、週１回投薬またはそれほど頻繁でない投薬でさえも用いられる）。例えば、ヒト患者に、最初に患者の体重１ｋｇあたり約０．２５ｍｇのＥＤＣを投与することができる。用量は最大耐性量（ＭＴＤ）まで増大させてもよい。投薬スケジュールは、ほぼ毎週１回または３週ごとに１回であってよいが、診断された状態または応答によって、スケジュールはさらに頻繁であっても、頻繁でなくてもよい。用量は、約４以上などの複数周期で安全に投与することができるＭＴＤ以下となるように治療の過程でさらに調節することができる。
【０１３９】
非経口投与に好適な処方には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および処方を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含んでもよい水性および非水性無菌注射溶液；ならびに懸濁剤および増粘剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁液が含まれる。
【０１４０】
処方は、単位用量または複数回投与容器、例えば密封アンプルおよびバイアル中に包装することができ、また使用直前に注射用の無菌液体担体、例えば水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存することができる。即席注射溶液および懸濁液は、すでに記載した種類の無菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。例示的単位投薬量処方は、活性成分の１日用量または単位１日分割用量、またはその適切なフラクションを含む。
【０１４１】
本発明は、少なくとも１つの前記定義の活性成分を獣医学的担体と一緒に含む獣医学的組成物をさらに提供する。獣医学担体は、組成物を投与する目的に有用な物質であり、それ以外では獣医学分野で不活性または許容される固体、液体または気体状物質であり得、活性成分と適合性である。これらの獣医学的組成物を、非経口的、経口的または任意の他の所望の経路によって投与することができる。
【０１４２】
本発明による組成物は滅菌することができる、および／または：非毒性アジュバントおよび補助物質、例えば保存、安定化、湿潤または乳化のための薬剤；溶解を促進する薬剤；ならびに浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液の１以上を含む可能性がある。加えて、それらは治療上の利点を提供する他の物質も含有する可能性がある。組成物は、それぞれ、当業者に周知の混合、増粒またはコーティングの標準的プロセスによって調製される。
【０１４３】
本発明の別の実施形態において、前述の障害の治療に有用な物質を含む製品が提供される。１つの態様において、製品は、（ａ）本明細書中の化合物を含む容器（好ましくは、容器は、ＥＤＣおよび薬剤的に許容される担体または希釈剤を容器内に含む）；ならびに（ｂ）患者において障害を治療するための指示を記載した添付文書を含む。
【０１４４】
したがって、別の実施形態において、製品、またはＥＤＣおよび前述の障害の治療のために有用な物質を含む「キット」が提供される。製品は、容器およびラベルまたは容器上に添付された添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、またはブリスターパックが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。容器は、状態を治療するために有効なＥＤＣ組成物を保持し、無菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穴を明けることができるストッパーを有するバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤はＥＤＣである。ラベルまたは添付文書は、ガンなどの選択される状態を治療するために組成物が使用されることを示す。例えば、ガンは、本発明のＥＤＣの標的の１つを過剰発現するものである可能性がある。ラベルまたは添付文書はさらに、本発明のＥＤＣの標的の１つの過剰発現によって特徴付けられないガンを治療するために組成物を使用することができることも示す可能性がある。他の実施形態において、添付文書は、ホルモン非依存性ガン、前立腺ガン、結腸ガンまたは結腸直腸ガンを治療するためにもＥＤＣ組成物を使用することができることを示す可能性がある。
【０１４５】
製品は、化合物がその中に含まれた容器を含んでもよく、その化合物は本発明のＥＤＣを含む。この実施形態における製品は、ガンを治療するためにＥＤＣを使用することができることを示す添付文書を更に含んでもよい。代替的に、または付加的に、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー液およびデキストロース溶液などの薬剤的に許容される緩衝液を含む第２（または第３）容器を更に含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジを含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の物質を更に含んでもよい。
【実施例】
【０１４６】
本発明の更なる利点及び特性は、例示として提示された以下の実施例から明らかになるであろうし、この実施例は限定するものとみなされるべきではなく、この実施例では参照が添付の図面でなされるであろう。本発明は、前述の実施例で具体的に記載されたものとは別の方法で実施されてもよいことは、明白であろう。本発明の多くの修正及び変形が、上記の教示に照らして可能であり、したがって、多くの修正及び変形は、これら実施例に続く添付の特許請求の範囲の範囲内である。この実施例は、薬剤合成セクション、抗体セクション及びＥＤＣセクションに分けられている。
【０１４７】
実施例１：リンカー動作可能治療薬の合成
本実施例は、ステロイド剤をリンカーに結合させて、本明細書に記載されるような抗体に容易に結合し得る「リンカー動作可能」薬剤を生成するための合成プロトコルを記載する。このリンカー動作可能薬剤はまた、インビボにおけるプロテアーゼによるＥＤＣ分解によって生成され得るような、可能性のあるＥＤＣ分解生成物の活性を究明する試験において対照薬としても使用され得る。本実施例で記載されるこのリンカー動作可能試薬としては、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０及びＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９が挙げられる。
【０１４８】
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、ステロイド、リンカー及び活性マレイミド基を含むシラレニン系リンカー動作可能薬剤である。ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の調製のための一般的合成工程は以下のとおりである。
【化３】
2014510080.tif 000004
２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド−１−トリクロロアセチミデート。１−アリル−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（１１．９ｇ、２８．１ミリモル）を、アルゴン下でジクロロメタン／メタノール（８０ｍＬ、９０：１０）中に溶解し、ＰｄＣｌ２（０．５ｇ、２．８ミリモル）をこの溶液に加えた。混合物を室温で一晩攪拌し、セライトのパッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのパッド（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７０：３０）を通して濾過した。得られた化合物（８．３８ｇ、２１．８３ミリモル）を、アルゴン下で乾燥ジクロロメタン（１７０ｍＬ）中に溶解し、ＣＣｌ３ＣＮ（２１．９ｍＬ、２１８．３ミリモル）を加え、続いて０℃でＤＢＵ（１．６３ｍＬ、１０．９１ミリモル）を滴加した。反応物を０℃で１時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をシリカゲルのパッド（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６０：４０〜４０：６０）を通して濾過して、２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド−１−トリクロロアセチミデートを黄色油状物として得た（９．７ｇ、６５％）。この化合物を更なる精製することなく、次に進めた。Ｒｆ０．３７（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０）。
【化４】
2014510080.tif 000005
シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド。２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド−１−トリクロロアセチミデート（０．４８３ｇ、０．９１５ミリモル）を、０℃にてアルゴン下で、乾燥ジクロロメタン（１５ｍＬ）中の活性化４Å分子篩（９０ｍｇ）の懸濁液に加えた。次いで、シラレニン（０．１８２ｇ、０．４７４ミリモル）をこの混合物に加えた。５分後に、Ｚｎ（ＯＴｆ）２（１７ｍｇ、０．０４７ミリモル）を加え、反応混合物を０℃で更に３０分間攪拌した。シラレニンの追加量（０．１８２ｇ、０．４７４ミリモル）を加えた。反応混合物を０℃で３０分間攪拌した。Ｅｔ３Ｎの数滴で反応を停止させた。混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、７５：２５〜５０：５０）によって精製し、シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを白色粉末として得た（０．５２１ｇ、７６％）。Ｒｆ０．３５（シリカゲル、ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５０：５０）。
１Ｈ−ＮＭＲ（３００Ｈｚ，ＣＤＣｌ３），０．６８（ｓ，３Ｈ），０．９０−２．１７（ｍ，２１Ｈ），２．３９−２．４４（ｍ，１Ｈ），３．４７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．０，９．５Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．７９−３．８７（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．１７−４．２２（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ），４．７８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−１），５．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．６，６．８Ｈｚ，Ｈ−２），５．３３（ｓ，１Ｈ），５，４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，Ｈ−３），６，２２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．６Ｈｚ），７．１８−７．１９（ｍ，１Ｈ），７．３３−７．３９（ｍ，４Ｈ），７．４７−７．５３（ｍ，２Ｈ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．６Ｈｚ），７．９２−７．９７（ｍ，４Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６．７，１９．０，２１．４，２５．８，２８．７，２８．８，３２．４，３２．８，３５．２，３７．６，４０．８，４２．９，４８．４，５０．２，５１．２，５９．２，６３．１，７１．６，７２．９，７６．１，８５．２，１００．０，１１５．５，１２１．７，１２２．８，１２８．５，１２８．６，１２９．１，１２９．５，１２９．９，１３０．１，１３３．４，１３３．６，１４６．９，１４７．６，１４８．７，１６２．５，１６５．３，１６５．７．
【化５】
2014510080.tif 000006
シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド。シラレニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（０．３５１ｇ、０．４６８ミリモル）を、メタノール（２１ｍＬ）中に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（７ｍＬ）及びＨ２Ｏ（７ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で２日間攪拌した。混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９８：２〜９５：５）によって精製し、シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを黄色粉末として得た（４０ｍｇ、２４％）。Ｒｆ０．３１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ），０．７４（ｓ，３Ｈ），１．０３−２．２１（ｍ，２１Ｈ），２．５２−２．５７（ｍ，１Ｈ），３．１２−３．２０（ｍ、２Ｈ），３．４０−３．４４（ｍ，２Ｈ），３．８７−３．９２（ｍ，１Ｈ），４．１７−４．２３（ｍ，１Ｈ），４．３１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，Ｈ−１），５．３５（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．８Ｈｚ），７．４３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５Ｈｚ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．６Ｈｚ）．
【化６】
2014510080.tif 000007
シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド．シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１．６１ｇ、２．３４ミリモル）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（２．８ｍＬ、９０：１０）中に溶解した。ポリマー結合型ＰＰｈ３（７９ｍｇ、３ミリモル．ｇ−１）を加えた。反応混合物を４０℃で２時間攪拌した。次いで混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９０：１０〜８０：２０）によって精製し、シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドを黄色粉末として得た（２３ｍｇ、５８％）。Ｒｆ０．２（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ），０．７４（ｓ，３Ｈ），１．０６−２．１９（ｍ，２１Ｈ），２．５２−２．５７（ｍ，１Ｈ），２．７５−２．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．１４−３．２４（ｍ、２Ｈ，Ｈ−２，Ｈ−３），３．６４−３．７２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５ｂ），３．８７−３．９１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−５ａ），４．１９−４．２４（ｍ，１Ｈ），４．３６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ−１），５．３８（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．６Ｈｚ），７．４２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．５；Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）１７．４，１９．６，２２．５，２６．８，２９．９，３０．１，３３．３，３３．６，３６．６，３８．８，４１．８，４３．５，４９．４，５１．７，５２．２，７５．３，７６．５，７８．９，７９．３，７９．８，８５．８，１０３．７，１１５．６，１２３．４，１２５．１，１４８．４，１４９．４，１５０．５，１６４．９．
【化７】
2014510080.tif 000008
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６．室温でＤＭＦ（１ｍＬ）中のシラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１８．５ｍｇ、０．０３５９ミリモル）の溶液に、ＮＨＳ−ＰＥＧ２４−マレイミド（５０ｍｇ、０．０３５９ミリモル）を加えた。次いでＥｔ３Ｎ（０．０２５ｍＬ、０．１８ミリモル）を加えた。反応物を室温で２時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５〜８０：２０）によって精製し、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６を黄色油状物として得た（４８ｍｇ、７５％）。Ｒｆ０．６６（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）。ＨＰＬＣ分析［Ｌｕｎａ  Ｃ１８、２５０×４６０ｍｍ、５μｍ、５％〜９５％のＡＣＮで３２分間、１ｍｌ．分−１］は、＞９５％の純度である生成物を示した。ＨＲＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）：Ｃ８７Ｈ１４７Ｎ３Ｏ３５に関する［Ｍ＋Ｋ＋］＋計算値は１８３２．９４５２であり、実測値１８３２．９７７７であった。ＮＨＳ-(ＰＥＧ）ｎ−マレイミド（ここでｎは整数）は、同様な反応条件を使用して、いずれのアミンを有する分子（下記参照）にも結合し得る。
【０１４９】
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７は、ステロイド、リンカー及び活性マレイミド基を含むシラレニン系リンカー動作可能薬剤である。これは、リンカーが４−アミノ−キシロシド糖の代わりに４−アミノ−リボシドを含有することでＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６とは異なる。ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７の調製のための一般的合成工程は以下のとおりである。
【化８】
2014510080.tif 000009
１−アリル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．１−アリル−２，３−Ｏ−イソプロピリデン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（８．５３ｇ、３３．６ミリモル）をＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（８０：２０、４０ｍＬ）中に溶解した。反応混合物を０℃で３０分間攪拌した。減圧下で溶媒を除去し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５）によって精製し、１−アリル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを褐色油状物として得た（２６．３ｇ、７２％）。Ｒｆ０．５（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９５：５）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ），３．４９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１，３．５Ｈｚ，Ｈ−２），３．５８（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝６．７，３．９，３．２Ｈｚ，Ｈ−４），３．７５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．６，６．７，Ｈ−５ｂ），３．８３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．６，３．９Ｈｚ，Ｈ−５ａ），４．０５（ｄｄｔ，２Ｈ，Ｊ＝１．４，６．０，１３．０Ｈｚ，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），４．０９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，Ｈ−３），４．２３（ｄｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，５．２，１３．０Ｈｚ，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），４．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，Ｈ−１），５．１７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．４，２．９，１０．４Ｈｚ，ＣＨ２＝ＣＨ），５．３０（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．７，３．４，１７．３Ｈｚ，ＣＨ２＝ＣＨ），６．００−５．８７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ）．
【化９】
2014510080.tif 000010
１−アリル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．１−アリル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（４．０ｇ、１８．６ミリモル）を、アルゴン下で乾燥ジクロロメタン（１２０ｍＬ）中に溶解した。ピリジン（４．５ｍＬ、５５．７６ミリモル）を加え、混合物を３０℃で３０分間攪拌した。次いでＢｚＣｌ（２．２５ｍＬ、１９．５１ミリモル）を滴加した。次いでこれを室温にて一晩攪拌した。減圧下で溶媒を除去した。得られた残渣をＥｔＯＡｃ中に溶解し、水、０．１ＮのＨＣｌ及び食塩水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過し、濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ、９５：５〜９０：１０）によって精製し、１−アリル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを褐色油状物として得た（４．４６ｇ、７５％）。Ｒｆ０．４５（トルエン／ＥｔＯＡｃ、９０：１０）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ），３．７７−３．８６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−４，Ｈ−５ｂ），３．９６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８，１１．７Ｈｚ，Ｈ−５ａ），４．０２−４．１０（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），４．２０−４．２７（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），４．３６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，Ｈ−３），４．９５（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｈ−１），５．１５−５．３３（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ），５．８５−５．９８（ｍ，１Ｈ，ＣＨ２＝ＣＨ），７．４７−７．５３（ｍ，２Ｈ，Ｈ−Ａｒ），７．５９−７．６５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−Ａｒ），８．１０−８．１７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−Ａｒ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）６０．１（Ｃ−４），６２．３（Ｃ−５），６７．７（Ｃ−３），７０．１（ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），７３．１（Ｃ−２），９８．７（Ｃ−１），１１７．７（ＣＨ２＝ＣＨ），１２９．６５（Ｃ−Ａｒ），１３１．１（Ｃ−Ａｒ），１３４．６（ＣＨ２＝ＣＨ），１３５．６（Ｃ−Ａｒ），１６７．７（Ｃ＝Ｏ）．
【化１０】
2014510080.tif 000011
１−アリル−３−Ｏ−アセチル２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．１−アリル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（４．４５ｇ、１３．９３ミリモル）を、アルゴン下で０℃にて無水ピリジン（５．６ｍＬ、６９．６５ミリモル）中に溶解し、Ａｃ２Ｏを滴加した。混合物を室温で一晩撹拌した。次いでジクロロメタンを加え、有機層を水、０．１ＮのＨＣｌ及び食塩水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濾過し濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（トルエン／ＥｔＯＡｃ、９０：１０）によって精製し、１−アリル−３−Ｏ−アセチル２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを黄色油状物として得た（５．０３ｇ、１００％）。Ｒｆ０．５０（トルエン／ＥｔＯＡｃ、９０：１０）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３），２．０１（ｓ，３Ｈ），３．８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４，３．１Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．９２−３．９５（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），４．００−４．０６（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），４．２１（ｄｄｔ，１Ｈ，Ｊ＝１２．８，５．３，１．４Ｈｚ，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），４．９６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｈ−１），５．１８−５．３４（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２，ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），５．５１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７７Ｈｚ，Ｈ−３）、５．８２−５．９５（ｍ，１Ｈ，ＣＨ＝ＣＨ２），７．４２−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．５５−７．６０（ｍ，１Ｈ），８．１２−８．１５（ｍ，２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）２０．８（ＣＨ３），５６．８（Ｃ−４），６１．２（Ｃ−５），６８．６（Ｃ−３），６８．７（Ｃ−２），６９．０（ＣＨ２＝ＣＨ−），９７．５（Ｃ−１），１１８．３（ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２），１２８．７（Ｃ−Ａｒ），１２９．７．１（Ｃ−Ａｒ），１３０．２（Ｃ−Ａｒ），１３３．４（Ｃ−Ａｒ），１３３．６（ＣＨ２＝ＣＨ），１６６．０（Ｃ＝Ｏ），１６９．９（Ｃ＝Ｏ）．
【化１１】
2014510080.tif 000012
１−トリクロロアセチミド−３−Ｏ−アセチル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．１−アリル−３−Ｏ−アセチル２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（５．０３ｇ、１３．９３ミリモル）を、アルゴン下でジクロロメタン／メタノール（４０ｍＬ、９０：１０）中で溶解し、ＰｄＣｌ２（０．５ｇ、２．６ミリモル）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌した。この混合物をセライトのパッドを通して濾過し、減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲルのパッド（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、８０：２０〜５０：５０）を通して濾過した。得られた化合物（２ｇ、６．２２ミリモル）を、アルゴン下で乾燥ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解し、この溶液を０°に冷却した。ＣＣｌ３ＣＮ（６．２４ｍＬ、６２．２ミリモル）を加え、続いてＤＢＵ（０．４６ｍＬ、３．１１ミリモル）を滴加した。反応を０℃で１時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をヘキサン−ＥｔＯＡｃ（６０：４０）中に取り上げ、シリカゲルのパッド（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６０：４０〜４０：６０）を通して濾過して、１−トリクロロアセチミド−３−Ｏ−アセチル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを白色粘性物として得た（１．７ｇ、２６％）。この化合物を更なる精製することなく、次に進めた。Ｒｆ０．５５（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５０：５０）。
【化１２】
2014510080.tif 000013
シラレニン−３−Ｏ−アセチル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．アルゴン下、０℃の乾燥ジクロロメタン（６０ｍＬ）中の活性化４Å分子篩（１６０ｍｇ）の懸濁液に、最少量の乾燥ジクロロメタン中の１−トリクロロアセチミド−３−Ｏ−アセチル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（５．０３ｇ、１３．９３ミリモル）を加えた。シラレニン（０．７ｇ、１．８２５ミリモル）を加え、５分後、０℃で、Ｚｎ（ＯＴｆ）２（０．１３３ｇ、０．３６５ミリモル）を加えた。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した。シラレニンの別の０．５当量（０．７ｇ、１．８２５ミリモル）を加えた。反応混合物を０℃で更に３０分の時間にわたって撹拌した。反応をＥｔ３Ｎの数滴で停止させた。混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、６０：４０〜４０：６０）によって精製し、シラレニン−３−Ｏ−アセチル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを白色固体として得た（１．６４ｇ、６５％）。Ｒｆ０．３９（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５０：５０）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３），０．７２（ｓ，３Ｈ），１．０３−２．２０（ｍ，２４Ｈ），２．４２−２．４８（ｍ，１Ｈ），３．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４，３．１Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．９４−３．９７（ｍ，１Ｈ），４．１２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１２．４，２．４Ｈｚ，Ｈ−５ａ）４．１７−４．２２（ｍ，１Ｈ），５．１０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６Ｈｚ，Ｈ−１），５．２６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，Ｈ−２）、５．３１（ｓ，１Ｈ），５．５３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．７５Ｈｚ，Ｈ−３），６．２４−６．２７（ｍ，１Ｈ），７．２２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．６Ｈｚ），７．４４−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．５６−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．８２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，２．６Ｈｚ），８．１３−８．１６（ｍ、２Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６．４，１８．９，２０．６，２１．２，２５．２，２８．５，２８．６，３２．２，３２．６，３５．０，３７．５，４０．６，４２．７，４８．２，５０．１，５１．０，５６．７（Ｃ−４），６０．９（Ｃ−５），６７．７（Ｃ−３），６９．１（Ｃ−２），７３．６，８５．０，９６．２（Ｃ−１），１１５．３，１２１．２，１２１．６，１２８．５，１２９．５，１２９．９，１３３．３，１４６．７，１４７．５，１４８．５，１６２．３（Ｃ＝Ｏ），１６５．９（Ｃ＝Ｏ），１６９．７（Ｃ＝Ｏ）．
【化１３】
2014510080.tif 000014
シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．シラレニン−３−Ｏ−アセチル−２−Ｏ−ベンゾイル−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（１．６１ｇ、２．３４ミリモル）をメタノール（２０ｍＬ）中に溶解した。Ｅｔ３Ｎ（２．５ｍＬ）及びＨ２Ｏ（２．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９０：１０）によって精製して、シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを白色固体として得た（０．９３ｇ、７３％）。Ｒｆ０．２５（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９０：１０）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ），０．７４（ｓ，３Ｈ），１．０６−２．２２（ｍ，２１Ｈ），２．５２−２．５７（ｍ，１Ｈ），３．４２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４，３．２Ｈｚ，Ｈ−２），３．５４−３．５９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．７２−３．８９（ｍ，２Ｈ，Ｈ−５ａ，Ｈ−５ｂ），４．０９−４．１２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３）４．１６−４．２１（ｍ，１Ｈ），４．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，Ｈ−１），５．３４（ｓ，１Ｈ），６．２８（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．７Ｈｚ），７．４２−７．４３（ｍ，１Ｈ），７．９９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、２．６Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤ３ＯＤ）１７．３，１９．５，２２．４，２６．５，２９．８，３０．０，３３．２，３３．５，３６．５，３８．７，４１．７，４３．４，４９．６，５１．６，５２．１，６０．５（Ｃ−４），６２．１（Ｃ−５），６９．６（Ｃ−３），７２．０（Ｃ−２），７５．５，８５．７，１００．４（Ｃ−１），１１５．４，１２３．１，１２５．０，１４８．４，１４９．３，１５０．５，１６４．８（Ｃ＝Ｏ）．
【化１４】
2014510080.tif 000015
シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド．シラレニン−４−アジド−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（１．６１ｇ、２．３４ミリモル）をＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ、９０：１０）中に溶解した。ポリマー結合型ＰＰｈ３（２．３４ｇ、３ミリモル．ｇ−１）を加えた。混合物を４０℃で６時間撹拌した。この混合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、９０：１０〜８０：２０）によって精製し、シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシドを黄色粉末として得た（０．６７ｇ、７３％）。Ｒｆ０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、８０：２０）；１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ），０．６３（ｓ，３Ｈ），０．９６−２．１０（ｍ，２１Ｈ），２．４３−２．４６（ｍ，１Ｈ），２．９０−２．９２（ｍ，１Ｈ，Ｈ−４），３．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，Ｈ−２），３．４５（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．４，５．４Ｈｚ，Ｈ−５ｂ），３．６３−３．６８（ｍ，２Ｈ，Ｈ−３，Ｈ−５ａ）４．０２−４．０８（ｍ，１Ｈ），４．６９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．２Ｈｚ，Ｈ−１），５．２４（ｓ，１Ｈ），６．２９（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７，０．７Ｈｚ），７．４８−７．５８（ｍ，１Ｈ），７．９２（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ、２．５Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，（ＣＤ３）２ＳＯ）１６．６，１８．６，２０．９，２５．２，２８．４，２８．５，３１．８，３１．９，３４．８，３７．０，３９．７，４１．５，４７．８，４９．６，４９．９，５０．８（Ｃ−４），６３．７（Ｃ−５），６７．１，７１．２（Ｃ−３），７２．３（Ｃ−３），８３．１，９９．１（Ｃ−１），１１４．２，１２２．２，１２２．６，１４６．１，１４７．３，１４９．２，１６１．３（Ｃ＝Ｏ）．
【化１５】
2014510080.tif 000016
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７．Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１．５ｍＬ）中のシラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−リボピラノシド（２０ｍｇ、０．０３７ミリモル）とマレイミド―ＰＥＧ２４−ＮＨＳエステル（５２ｍｇ、０．０３７ミリモル）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．０２６ｍＬ、０．１８６ミリモル）を加えた。反応混合物をＲＴで１時間にわたって撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、９５：５〜８０：２０）によって精製し、ＣＥＮ１０−１２９を無色油状物として得た（３０ｍｇ、７３％）。Ｒｔ１５．６５分（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１８分間にわたって１０％〜９０％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ、１ｍＬ．分−１）。
【０１５０】
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０は、ステロイド、リンカー及び活性マレイミド基を含むシラレニン系リンカー動作可能薬剤である。これは、リンカーが約１５Å長いこと及び生理学的ｐＨ下でプラスに帯電していると予想される遊離アミンを含有することで、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６とは異なる。ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０の調製のための一般的合成工程は以下のとおりである。
【化１６】
2014510080.tif 000017
ｐＮＺ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ．Ｈ２Ｏ（６ｍＬ）中のＮａ２ＣＯ３（１８０ｍｇ、１．７０ミリモル）の激しく撹拌した溶液に、ジオキサン（３ｍＬ）中のＨ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（２５０ｍｇ、０．６８ミリモル）の溶液を加えた。ジオキサン（３ｍＬ）中の塩化ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル（１６１ｍｇ、０．７４ミリモル）の溶液を、０℃でゆっくりと加えた。反応混合物を０℃で２．５時間にわたって撹拌し、次いでＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で希釈し、１ＮのＨＣｌ（２０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。粗物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、９８：２〜９０：１０）によって精製し、ｐＮＺ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを白色固体として得た（３００ｍｇ、８２％）。Ｒｆ０．２１（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、９０：１０）。
【化１７】
2014510080.tif 000018
シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−イル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシド．シラレニン−４−アミノ−４−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（１５０ｍｇ、０．２９１ミリモル）、ｐＮＺ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（１６０ｍｇ、０．２９１ミリモル）及びＰｙＢＯＰ（１８２ｍｇ、０．３４９ミリモル）を、ＤＭＡ（３ｍＬ）中に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ、１．１６４ミリモル）を加え、混合物を室温で１時間にわたって撹拌した。ＤＭＡを真空中で除去した。残渣をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）中に溶解し、次いでＨ２Ｏ（２×１０ｍＬ）、食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、９８：２〜９０：１０）によって精製し、シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−イル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシドを灰白色固体として得た（２８８ｍｇ、９５％）。Ｒｆ０．２１（ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ、９５：５）、ｒｔ２１．８２分（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０％〜９５％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ）。
【化１８】
2014510080.tif 000019
シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓイル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシド．シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−イル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシド（１００ｍｇ、０．０９６ミリモル）を、ＤＭＡ（１ｍＬ）中に溶解した。ピペリジン（９４μＬ、０．９５７ミリモル）を加え、混合物を室温で１０分間撹拌した。反応混合物を冷Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）に滴加した。沈殿物を遠心分離により回収し、少量の冷Ｅｔ２Ｏで２回洗浄し、シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓイル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシドを灰白色固体として得た（６１ｍｇ、７７％）。ｒｔ１４．７５分（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０％〜９５％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ）。
【化１９】
2014510080.tif 000020
シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓ―（マレイミド−ＰＥＧ２４）−イル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシド．シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓイル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシド（６１ｍｇ、０．０７４ミリモル）及びマレイミド−ＰＥＧ２４−ＮＨＳ（１０３ｍｇ、０．０７４ミリモル）を、ＤＭＡ（１．５ｍＬ）中に溶解した。ＴＥＡ（５１μＬ、０．３７ミリモル）を加え、反応混合物を室温で２０分間撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ、８５：１５：１）によって精製し、シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓ―（マレイミド−ＰＥＧ２４）−イル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシドを無色油状物として得た（８６ｍｇ、５５％）。Ｒｆ０．５３（ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ、８５：１５：１）、ｒｔ１６．３３分（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０％〜９５％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ）。Ｍａｌｄｉ（ｍ／ｚ）；Ｃ１０１Ｈ１６４Ｎ６Ｏ４０に関する［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値は２１２４．１であり実測値は２１２４．１であり、［Ｍ＋Ｋ］＋計算値は２１４０．１であり実測値２１４０．１であった。
【化２０】
2014510080.tif 000021
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０．シラレニン−４−Ｎ−［ｐＮＺ−Ｌｙｓ―（マレイミド−ＰＥＧ２４）−イル］−４−デオキシ−４−アミノ−Ｌ−キシロピラノシド（５５ｍｇ、０．０２６ミリモル）を、乾燥ＭｅＯＨ（２ｍＬ）中に溶解した。ＳｎＣｌ２（４９ｍｇ、０．２６ミリモル）及び１．６ｍＭのＨＣｌの３滴を加えた。反応混合物を４５℃で４時間にわたって撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗物質を、ＨＰＬＣ（ｒｔ１３．５３分、Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１０％〜９５％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ）によって精製して、ＣＥＮ−３０１を得た（７．６ｍｇ、１３％）。Ｍａｌｄｉ（ｍ／ｚ）；Ｃ９３Ｈ１５９Ｎ５Ｏ３６に関する［Ｍ＋Ｈ］＋計算値は１９２３．１であり、実測値１９２３．１であり、［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値は１９４５．１であり、実測値１９４５．０であった。
【０１５１】
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９は、ステロイド、リンカー及び活性マレイミド基を含むジギトキシゲニン系リンカー動作可能薬剤である。ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９の調製のための一般的合成工程は以下のとおりである。
【化２１】
2014510080.tif 000022
ジギトキシゲニン（２）．ＲＴで、ＭｅＯＨ（２７０ｍｌ）中のジギトキシン（１、１０．２ｇ、１３．３３ミリモル）の懸濁液に、ＰＴＳＡ（０．２５ｇ、１．３３ミリモル）を加えた。反応混合物をＲＴで２日間にわたって撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、４：６〜３．７）によって精製し、２を白色固体として得た（３．４４ｇ、６８％）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）５．９０（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２２），４．９７（ｄｄ，Ｊ＝１．５，１８．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．８７（ｄｄ，Ｊ＝１８．２，１．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．１７（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，ＯＨ），４．０５（ｓ，ＯＨ），３．８９（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），２．７５−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１７），２．０９−１．９７（ｍ，２Ｈ），１．８４−１．７０（ｍ，５Ｈ），１．６４−１．５６（ｍ，２Ｈ），１．４９−１．３０（ｍ，８Ｈ），１．２０−１．０５（ｍ，４Ｈ），０．８７（ｓ，３Ｈ），０．７６（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６）１７６．３，１７３．８，１１６．２，８３．８，７３．１，６４．６，５０．２，４９．４，４０．９，３９．０，３５．７，３５．０，３４．７，３３．１，３２．２，２９．５，２７．５，２６．５，２６．４，２３．７，２１．１，２０．８，１５．７
【化２２】
2014510080.tif 000023
ジギトキシゲニン−２，３−ジ−Ｏ−ベンゾイル−４−デオキシ−４−アジド−β−Ｌ−キシロピラノシド（４）．新しく蒸留した乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の３（１．４０ｇ、２．６７ミリモル）の溶液とジギトキシゲニン（２、１．００ｇ、２．６７ミリモル）を、アルゴン下０℃で、新しく蒸留したＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の活性化４Å分子篩（０．３ｇ）の懸濁液に加えた。１０分間の撹拌後に、ＴＭＳＯＴｆ（２４μＬ、０．１３４ミリモル）を加えた。反応混合物を０℃で２時間撹拌し、次いでＥｔ３Ｎ（４０μＬ、０．２６８ミリモル）で反応を止めた。溶媒を真空中で除去した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、７：３〜１：１）によって精製し、４を白色粉末として得た（１．６２ｇ、８２％）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）８．００−７．９４（ｍ，４Ｈ），７．５６−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．４２−７．３４（ｍ，４Ｈ），５．８４（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，Ｈ−２２），５．５２（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），５．３２（ｄｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，６．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２’），４．９７（ｄｄ，Ｊ＝１８．２，１．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．７８（ｄｄ，Ｊ＝１．７，１８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．７０（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，４．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），４．０３（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．８６（ｄｄｄ，Ｊ＝９．２，９．１，４．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．４７（ｄｄ，Ｊ＝１２．０，９．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），２．７６−２．７１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１７），２．１８−２．０２（ｍ，２Ｈ），１．８９−１．６３（ｍ，６Ｈ），１．５５−１．２５（ｍ，１０Ｈ），１．２０−１．０１（ｍ，４Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ），０．５７（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）１７４．７，１７４．６，１６５．７，１６５．２，１３３．６，１３３．４，１３０．０，１２９．９，１２９．４，１２９．０，１２８．６，１２８．５，１１７．７，９８．９，８５．６，７３．７，７３．５，７２．９，７１．４，６３．１，５９．２，５１．０，４９．７，４１．９，４０．０，３６．３，３５．７，３５．０，３３．２，３３．１，２９．５，２７．０，２６．５，２３．９，２３．３，２１．４，２１．２，１５．８．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）；Ｃ４２Ｈ４９Ｎ３Ｏ９に関する［Ｍ＋Ｈ］＋計算値は７４０．３であり、実測値７４０．３であり、［Ｍ＋ＮＨ４］＋計算値は７６２．３であり、実測値は７６２．４であった。
【化２３】
2014510080.tif 000024
ジギトキシゲニン−４−デオキシ−４−アジド−β−Ｌ−キシロピラノシド（５）．ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の４（５００ｍｇ、０．６７６ミリモル）の溶液に、Ｎａ２ＣＯ３（０．５ｍＬ）の飽和水溶液をＲＴで加えた。反応混合物をＲＴで３日間にわたって撹拌した。ｐＨを１ＮのＨＣｌで５に調整した。ＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）を加えた。有機層を水（２×５ｍＬ）及び食塩水（５ｍＬ）で洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）真空中で濃縮した。粗物質を、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン−ＥｔＯＡｃ、６：４〜４：６）によって精製し、５を白色泡状物として得た（２６２ｍｇ、７３％）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ）５．８９（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，Ｈ−２２），４．９６（ｄｄ，Ｊ＝１８．２，１．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．８６（ｄｄ，Ｊ＝１８．５，１．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．１４（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），３．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．７４（ｄｄ，Ｊ＝１１．３，５．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝１０．２，４．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−４’），３．２７（ｄｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−３’），３．０８−２．９７（ｍ，２Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−５’），２．７４−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１７），２．０８−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．５６（ｍ，８Ｈ），１．４９−１．２７（ｍ，８Ｈ），１．１５−１．０７（ｍ，３Ｈ），０．８６（ｓ，３Ｈ），０．７５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ）１７６．３，１７３．８，１１６．２，１０１．６，８３．８，７５．５，７３．６，７３．１，７２．９，６２．９，６１．４，５０．２，４９．４，４０．９，３９．０，３５．９，３４．８，３４．８，３２．２，３１．６，２９．５，２６．４，２３．７，２３．５，２１．０，２０．８，１５．７．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）；Ｃ４２Ｈ４９Ｎ３Ｏ９に関する［Ｍ＋Ｈ］＋計算値は５３２．３であり実測値は５３２．２であり、［Ｍ＋ＮＨ４］＋計算値は５４９．３であり実測値は５４９．３であり、、［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値は５５４．３であり実測値は５５４．２であった。
【化２４】
2014510080.tif 000025
ジギトキシゲニン−４−デオキシ−４−アミノ−β−Ｌ−キシロピラノシド（６）．ＴＨＦ−Ｈ２Ｏ（８ｍＬ、９０：１０）中の５（２３０ｍｇ、０．４３３ミリモル）の溶液に、ＰＰｈ３（５６７ｍｇ、２．１６ミリモル）を加えた。反応混合物を４０℃で一晩撹拌した。溶媒を真空中で除去した。粗物質をフラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ、８５：１５：１〜７５：２５：２．５）によって精製し、６を白色粉末として得た（１６０ｍｇ、７３％）。Ｒｔ１２．６７分（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１８分間にわたって１０％〜９０％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ、１ｍＬ．分−１）。１Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ）５．８９（ｂｒ，ｓ，１Ｈ，Ｈ−２２），４．９５（ｄｄ，Ｊ＝１８．５，１．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．８６（ｄｄ，Ｊ＝１８．４，１．４Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−２１），４．０９（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−１’），３．８６（ｍ，１Ｈ，Ｈ−３），３．６２（ｄｄ，Ｊ＝１１．４，５．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５’），２．９８−２．８９（ｍ，３Ｈ，Ｈ−２’，Ｈ−３’，Ｈ−５’），２．７４−２．７０（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１７），２．５４−２．４６（ｍ、１Ｈ，Ｈ−４’），２．０８−１．９６（ｍ，２Ｈ），１．８７−１．５６（ｍ，８Ｈ），１．４９−１．２７（ｍ，８Ｈ），１．１５−１．０２（ｍ，３Ｈ），０．８５（ｓ，３Ｈ），０．７５（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−ｄ６／Ｄ２Ｏ）１７６．４，１７３．８，１１６．２，１０９．３，１０１．９，８３．８，７７．４，７３．６，７３．１，７２．５，６６．６，５３．１，５０．２，４９．４，４１．０，３９．０，３６．０，３４．９，３４．８，３２．２，３１．７，２９．６，２６．４，２３．７，２３．５，２１．０，２０．８，１５．７．ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）；Ｃ２９Ｈ４１ＮＯ７に関する、［Ｍ＋Ｈ］＋計算値は５０６．３であり、実測値は５０６．４であった。
【化２５】
2014510080.tif 000026
ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９．Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（０．４ｍＬ）中のジギトキシゲニン−４−デオキシ−４−アミノ−β−Ｌ−キシロピラノシド（２２ｍｇ、０．０４３ミリモル）及びマレイミド−ＰＥＧ２４−ＮＨＳエステル（６０ｍｇ、０．０４３ミリモル）の溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．０３ｍＬ、０．２１５ミリモル）を加えた。反応混合物をＲＴで２時間にわたって撹拌し、次いでＨＰＬＣによって精製し、７を無色油状物として得た（５６ｍｇ、７３％）。Ｒｔ１９．３２分（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｃ１８、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、１８分間にわたって２０％〜５０％、次いで２分間にわたって９０％のＡＣＮ、０．１％のＴＦＡ、１ｍＬ．分−１）。ＥＳＩ−ＭＳ（ｍ／ｚ）；Ｃ８６Ｈ１４９Ｎ３Ｏ３５に関する、［Ｍ＋Ｎａ］＋計算値は１８０６．９８７であり、実測値は１８０６．９４９であり、［Ｍ＋Ｋ］＋計算値は１８２２．９６１であり、実測値は１８２２．９２２であった。
【０１５２】
実施例２：Ｍ５３抗体；エピトープマッピング；及びリンカー動作可能薬剤への複合体形成
Ｍ５３抗体（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら著、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２１（４）６５９−６６７（２００３）に記載される）及び対照の４Ｆ１２抗体を、これら実施例では使用した。抗体Ｍ５３は、ヒトディスアドヘリンを認識しかつこれに結合し（配列番号１にアミノ酸配列を示す）、対照の抗体４Ｆ１２は配列番号１内で見出されるペプチドを認識しこれに結合するが、ヒト細胞の表面上で発現されるようなディスアドヘリンには結合しない。記載される両抗体は、マウス由来の及びＩｇＧ１のκイソタイプ型のモノクローナルである。
【０１５３】
長さが１５〜１７個のアミノ酸の重複ペプチド配列（配列番号２〜配列番号１６；それぞれＣＥＮＰ００１、及びＣＥＮＰ００４〜ＣＥＮＰ０１７と呼ばれる）を合成し、これはディスアドヘリンの細胞外ドメインの２４〜１４５位（配列番号１の残基２２〜１４５）に相当する。各ペプチドは、マレイミド活性化ＢＳＡ（カタログ番号：７７１１６、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）への結合を容易にするＣ末端システインを含有した。ペプチド及びＬ−システイン（ＢＳＡ−対照複合体として使用された）を製造業者のプロトコルによってＢＳＡに結合させた。透明な９６ウェルの培地結合ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号：９０１７、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）の各ウェルを、２００ｍＭの炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）の１００μＬ中の２５０ｎｇのＢＳＡ−ペプチド又はＢＳＡ−対照複合体で、４℃で一晩、個々にコーティングした。コーティングしたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄し、１％のＮＦＤＭを含有するＰＢＳ（ｐＨ７）（ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ）で３０分間ブロックし、次いでＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ中で１ｕｇ／ｍＬ（１００ｕＬ）まで希釈したＭ５３を、全てのＢＳＡ−ペプチド及びＢＳＡ−対照複合体でコーティングされたウェルに加え、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。ヤギ抗−マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ（カタログ番号：Ａ１４１８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ中で１：１５，０００に希釈し、各ウェルに加え（１００ｕｌ）、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。５０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する１ＭのＤＥＡ（ｐＨ９．８）中で１ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＰを加え（ウェル当たり１００ｕＬ）、ＲＴで３０分間インキュベートし、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｍｏｄｅｌ  １４２０−０４１アッセイプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して４０５ｎｍにおける吸光度を決定した。
【０１５４】
Ｍ５３が２つの重複するペプチド配列（配列番号４及び配列番号５に）結合したことを決定し、このことは、エピトープがヒトディスアドヘリン（配列番号１）の３８位と５９位の間に存在することを示している。このことによって、その配列が重複ペプチド（配列番号４及び配列番号５）のハイブリッド体であるペプチドＣＥＮＰ０１８（配列番号１７）が生成された。本実施例の方法を使用して、Ｍ５３がペプチド配列（配列番号１７）に結合することが決定された。本発明のクラス１  ＥＤＣｓの様々な実施形態では、抗体はこのエピトープに結合する。
【０１５５】
複合体形成のための抗体の調製。スルフヒドリル残基を通しての抗体の選択的複合体形成は、先ず第１にジスルフィド還元を必要とする。これは、２つの方法のうちの１つを使用して実行される。ＢＭＥ法と呼ばれる１つの方法では、２−メルカプトエタノールが使用され、ＴＣＥＰ法と呼ばれる第２の方法については、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンが使用された。各方法は以下に記載され、これら方法は、カップリングのために抗体を調製するよう様々な例で使用されたが、ＴＣＥＰ法がより一般的に使用されてきた。
【０１５６】
ＢＭＥ法を使用する抗体還元については、１ｍｇのβ−ＭＥを、１ｍｇの抗体に添加し、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、０．１５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡの５００ｕｌ中で混合し、３７℃で１．５時間インキュベートする。過剰なβ−ＭＥを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５又は同類物を使用するゲル濾過によって除去する。最終溶液をＰＢＳ中１ｍｌに持っていく。
【０１５７】
ＴＣＥＰ法を使用する抗体還元については、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＬＬＣ）中の８モル当量のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）（カタログ番号：ＨＲ２−６５１、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で、３７℃で２時間処理した。反応を氷浴中に定置し、一旦冷却されたら、リンカー薬剤を加えた。
【０１５８】
抗体へのリンカー薬剤のカップリング。冷還元された抗体に、抗体の当量当たり９．６モル当量のリンカー動作可能薬剤を加えた。反応を氷上で３０分間進めさせた。次いでＬ−システインを２倍過剰量で加え、いずれの未反応のマレイミド基を反応停止させた。薬剤結合体を濃縮しかつ抗体に結合しなかった過剰のリンカー動作可能薬剤を除去するために、複合体形成反応を濃縮し、次いでＭｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の３０Ｋカットオフスピン濃縮装置を使用して、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）及び１５０ｍＭのＮａＣｌに３回にわたり緩衝液交換を行った。キャッピングされたリンカー動作可能薬剤対照（抗体なし）については、抗体添加及び濃縮工程を省略した上記手順に従って実行された。
【０１５９】
薬物負荷の決定。ステロイドシラレニンを封じ込めた抗体薬剤複合体については、吸光度を使用して薬物負荷が算定された。まず初めに、遊離抗体の吸光度が２８０ｎｍ（Ａ２８０Ａｂ）及び２９９ｎｍ（Ａ２９９Ａｂ）の双方で測定され、抗体定数［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｂ］を決定した。次に、遊離薬剤の吸光度が２８０ｎｍ（Ａ２８０ｄｒｕｇ）及び２９９ｎｍ（Ａ２９９ｄｒｕｇ）の双方で測定され、薬剤定数［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｄｒｕｇ］を決定した。最後に、抗体薬剤複合体の吸光度が測定された［Ａ２８０及びＡ２９９］。濃度換算は、２８０ｎｍにおける抗体のモル吸光係数（２０４，０００Ｍ−１ｃｍ−１）及び２９９ｎｍにおける薬剤のモル吸光係数（５６２３Ｍ−１ｃｍ−１）を基準とした。以下の計算は、薬物負荷を算定するために使用された：［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｂ］＝Ａ２９９Ａｂ／Ａ２８０Ａｂ；［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｄｒｕｇ］＝Ａ２９９ｄｒｕｇ／Ａ２８０ｄｒｕｇ；Ａ２８０Ａｂ＝Ａ２８０−（Ａ２９９−［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｂ］×Ａ２８０）／（［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｒｕｇ］―［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｂ］）；Ａ２９９ｄｒｕｇ＝Ａ２９９−［Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ａｂ］×Ａ２８０Ａｂ；抗体濃度＝Ａ２８０Ａｂ／２０４，０００Ｍ−１ｃｍ−１；薬剤濃度＝Ａ２９９ｄｒｕｇ／５６２３Ｍ−１ｃｍ−１；薬物負荷＝薬剤濃度／抗体濃度。ステロイドジギトキシゲニンを封じ込めた抗体薬剤複合体については、これが可視領域で光を吸収する発色団を含有しないために、薬物負荷は吸光度によって算定され得ず、そこで（シラレニン含有複合体の装填効率及び相対的活性）に基づいて算定された。典型的には、癌細胞に基づくインビトロアッセイでは、より高い薬物負荷は、より多くの細胞毒性複合体をもたらした。
【０１６０】
実施例３：インビトロ細胞毒性アッセイ
本実施例は、本発明の例示的化合物がインビトロにおいて腫瘍細胞を標的化しかつ死滅させることで有用であることを立証する。抗体Ｍ５３（ヒト細胞系Ｈ４６０、Ａ５４９、Ａ３７５、ＰＡＮＣ１、及びＨ９２９上で発現されるがＨ５２０上では発現されないディスアドヘリンに特異的）と抗体４Ｆ１２（ディスアドヘリン細胞外部分内のペプチド配列に特異的であるが、ヒト細胞系上で発現されるディスアドヘリンを認識しない）を使用して、実施例２に記載されるような薬剤複合体を生成した。ＥＤＣｓは、リンカー動作可能薬剤であるＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０及びＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９を使用して構築された。実施例１に記載されるように、リンカー動作可能薬剤ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９は、ジギトキシゲニンを含有し、一方他の薬剤はシラレニンを含有する。リンカー動作可能薬剤ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０は全て異なるリンカーを使用する。特に、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及びＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７はリンカー内に異なる糖を有するが、一方ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０は第一級アミンを有するより長いリンカーを含有する。Ｍ５３及び４Ｆ１２を伴うこれらリンカー動作可能薬剤は、活性ＥＤＣｓ  Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０７、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９並びに非活性対照複合体４Ｆ１２−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及び４Ｆ１２−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ１０−１１０を生成するよう使用された（リンカー動作可能薬剤は対照としても使用された）。
【０１６１】
インビトロにおける癌細胞の細胞毒性分析。全ての細胞系を完全培地［１０％（重量／容量）のウシ胎児血清及びゲンタマイシン（５０μｇ／ｍｌ）で補充されたＲＰＭＩ培地１６４０］中で維持した。細胞を各３８４−ウェルの白色組織培養処理マイクロタイタープレートのウェル当たり１２５０個の細胞の密度で、２０ｕｌの完全培地中でプレート化し、次いで、試験化合物の添加前に、加湿されたインキュベーター内で７％のＣＯ２で３７℃にて２４時間培養した。別個の９６−ウェルプレートにおいて、Ｍ５３、キャップされたリンカー動作可能薬剤及び抗体複合体（ＰＢＳ中）原液を、最終使用濃度の５倍で完全培地中で系列希釈し、アッセイで使用される細胞に５ｕｌを添加した。細胞生存率試験の前に、細胞を薬剤／複合体と共に３日間インキュベートした。細胞生存率試験は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用した。各細胞系に対する薬剤のＤＥ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して決定した。
【０１６２】
結果を以下の表１に示し、これは、Ｍ５３を含有する本発明の異なる複合体は、抗体及び薬剤の標的を近接して提示するこれら細胞系において、ピコモルから低いナノモル濃度で細胞毒性であることを立証している。Ｈ５２０を除いて、以下の細胞系の全ては、ディスアドヘリンサブユニットを有するＮａ、Ｋ−ＡＴＰアーゼを発現し、同様も抗体及び薬剤の標的も近接して提供する。Ｈ５２０細胞系は薬剤の標的を発現するが、異なるγサブユニットイソタイプを含有するために、抗体の標的を提示しない。この結果はまた、キャップされたリンカー動作可能薬剤及び４Ｆ１２複合体は、Ｍ５３系クラス１  ＥＤＣｓと比較する場合、少なくとも１００倍活性が少ないことも示している。この結果は更に、抗体５３の単独は、試験された最高濃度で不活性であることも示し、したがって、抗体は細胞毒性を呈するステロイド剤を必要とすることを立証している。この結果は更に、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６がＨ５２０細胞上では活性ではないことも示し、このことは、Ｍ５３抗体の標的であるディスアドヘリン（ＦＸＹＤ５）を発現しないことが免疫組織化学法によって示されている。
【表１】
2014510080.tif 000027
上記表は、薬剤抗体リンカー複合体、Ｍ５３抗体単独及びリンカー動作可能薬剤のナノモルにおけるＥＣ５０値を示す。
【０１６３】
Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６薬剤併用を使用するインビトロの癌細胞の細胞毒性分析。ＦＧＦＲキナーゼインヒビターＰＤ  １７３０７４（ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）又は可溶性組換え体ヒトＴＲＡＩＬ（ｉｚＴｒａｉｌ，Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ，ＮＹ）若しくはＥｖｅｒｏｌｉｍｕｓ又はＣＥＮ１０−１２８−ｃｙｓ（Ｃｅｎｔｙｒｏｓｅ特許出願第ＵＳ  ２０１１／００６４７５２  Ａ１号）と組み合されたＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６のＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９に対する細胞毒性効果を測定した。この試験は、濃度勾配全体の薬剤の固定比率（それぞれ単独のＥＣ５０値を基準とした）を使用した。単一薬剤のＥＤ５０値を最初に決定し、これらの数値から、全ての化合物について８工程における３倍系列希釈法によって併用薬剤分析を調製した。併用薬剤は、固定濃度比率を使用して試験を行った。ＰＤ  １７３０７４及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６については、比率勾配は、それぞれ０．１２マイクロモル及び２ピコモルから２５１マイクロモル及び３６００ピコモルまで及んだ。ＴＲＡＩＬ及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６については、比率勾配はそれぞれ０．２５ｎｇ／ｍＬ〜２ピコモルから５４０ｎｇ／ｍＬ〜３６００ピコモルまで及んだ。Ｅｖｅｒｏｌｉｍｕｓ及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６については、比率勾配は、それぞれ０．０１ナノモル及び０．４ピコモルから２６．１ナノモル及び９００ピコモルまで及んだ。ＣＥＮ１０−１２８−ｃｙｓ及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６については、比率勾配は、それぞれ１６０ナノモル及び１ピコモルから３３０マイクロモル及び１．７ナノモルに及んだ。全ての化合物濃度及び薬剤併用は、二通りで試験された。細胞培養及び細胞生存率アッセイは記載の通りに実施された。
【表２】
2014510080.tif 000028
上記表は、培地中で増殖されたＡ５４９細胞上で試験される場合の薬剤（単独及び併用）のＥＣ５０値を示す。
【０１６４】
上記表中のデータは、併用での薬剤についてのＥＣ５０値が、それ自体による薬剤のＥＣ５０値未満であることを示し、したがってこれら併用は相乗的であることを示している。この結果は、ＴＲＡＩＬ及び線維芽細胞成長因子受容体キナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤及び解糖阻害剤が、クラス１  ＥＤＣｓと相乗的に働き、用量依存的方法で癌細胞死を促進することを立証している。これに加えて、併用される場合、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６単独と比較する場合、生存する細胞の総数は減少することを試験は示すことが望ましい。更に、併用される場合、この試験は、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６単独と比較する場合、生存する細胞の総数が減少することを示した。このことは、これら併用がインビボにおいて、腫瘍抑制及び／又は腫瘍退縮の増加にも導くべきことを示唆している。
【０１６５】
インビトロの正常細胞の細胞毒性。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３１９、プロシラリジン及びジギトキシンのディスアドヘリン陽性一次正常ヒト細胞及びディスアドヘリン陽性ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞系に対するインビトロ細胞毒性活性を試験し比較した。使用された細胞は、一次ヒト腎上皮細胞（ＨＲＥｐＣ）、一次ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、一次ヒト臍動脈内皮細胞（ＨＵＡＥＣ）、及びＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞であった。一次細胞は、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手され、ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９は、ＡＴＣＣから入手された。一次腎上皮細胞は、腎上皮細胞成長培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖された。一次内皮細胞は、内皮細胞成長培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖された。ＮＳＣＬＣ細胞系は、１０％のウシ胎児血清で補充されたＲＰＭＩ−１６４０（ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で増殖された。ＨＲＥｐＣ、ＨＵＶＥＣ、ＨＵＡＥＣ、及びＡ５４９細胞を、１２５０、１８７５、２５００、及び１２５０細胞／ウェル（それぞれ）で３８４ウェルプレートにプレート化し、５％のＣＯ２、及び１００％の湿度で３７℃にて２４時間インキュベートさせた。様々な濃度の複合体Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−１０６及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３２０及びＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６並びにＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３２０を、５ｕＬの総容量の培地で、ウェルに添加し、プレートを更に７２時間インキュベートした。７２時間の薬剤への曝露の後に、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、製造業者の使用説明書に従って、細胞生存率を評価した。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｍｏｄｅｌ  １４２０−０４１アッセイプレートレーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して、発光測定を実施した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用して、各試験薬剤に関するＥＣ５０値を決定した。化合物がそれぞれの細胞系の細胞生存率に及ぼす最大効果の半分を及ぼす場合の濃度を以下の表に示し、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及びＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３２０について示されたＥＣ５０濃度は、小薬剤分子それ自体の濃度であり、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ−３２０について示されたＥＣ５０濃度は、これら複合体の抗体部分の濃度である。これらデータは、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６が、ＦＸＹＤ５陽性ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９に比べてＦＸＹＤ５陽性一次正常細胞に対して、１７０〜＞１１８０倍の著しく少ない細胞毒性であることを示している。
【表３】
2014510080.tif 000029
【０１６６】
実施例４．Ｍ５３配列決定及びヒトキメラ抗体の生成
Ｍ５３を生成するハイブリドーマ細胞系から単離されたｍＲＮＡをクローンし、このマウスＩｇＧ１、κ免疫グロブリンの可変ドメインをコード化する核酸配列を決定するために配列決定した。５’−ＲＡＣＥ（Ｓｍａｒｔ  ＲＡＣＥキット；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、Ｍ５３のＩｇＧ重鎖及びκ軽鎖をコード化するｍＲＮＡの５’を増幅した。簡単に言うと、約１μｇのｍＲＮＡを逆転写に使用して、ｃＤＮＡプールを生成する。次に、ｃＤＮＡを、ＲＡＣＥキットを備えるユニバーサルプライマーと遺伝子特異的プライマーでのＰＣＲを介して増幅した。このユニバーサルプライマーは配列番号１８であって、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２Ａ及びＩｇＧ２ｂに関する遺伝子特異的プライマーは、それぞれ配列番号１９及び配列番号２０であった。ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ｐＳＵＰＥＲ−ブルントベクター（Ａｄｅｘｏｎ）中にクローンし、複数のコロニーを配列決定した。内因性異常軽鎖をスクリーニングによって除去し、非異常のクローンを配列決定した。配列決定結果をＮＴＩベクター上で分析した。全てのクローンの配列決定分析の結果は、ハイブリドーマが真のモノクローナル抗体を生成することを明らかにした。Ｍ５３重鎖可変領域のコード化配列は、配列番号２１の核酸（２４０〜５９９）で示され、Ｍ５３軽鎖可変領域のコード化配列は、配列番号２２の核酸（２２１〜５５９）で示される。
【０１６７】
キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体（すなわち、キメラ抗体）は、当該技術分野で既知である組換えＤＮＡ技術によって生成される（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，ｎｏ．２、２００１年４月１日：１８８−１９４）。例えば、ヒトＩｇＧの不変領域に融合されたマウスＩｇＧ由来の可変領域を含む、組み立てられたＩｇＧ分子の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）タンパク質をコード化する哺乳類発現ベクターの使用は、当該技術分野で周知である。配列番号２１の不変領域コード化配列（ヌクレオチド２４３〜２４５）がキメラ重鎖タンパク質（配列番号２３）の２位でバリンの代わりにシステインをコード化するよう変更されたことを除けば、Ｍ５３生成ハイブリドーマ系から単離されたＨＣ及びＬＣ可変領域をコード化するＤＮＡを使用して、キメラＭ５３（ｃＭ５３）の生成のための哺乳類発現ベクターを構築した。標準組換えＤＮＡ技術（ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００６年１２月  ２２；６：４９）を使用して、ＩｇＧ１κ抗体Ｍ５３に由来するその可変領域がヒトＩｇＧ１  ＨＣ及びＬＣ不変領域に融合された、ＨＣ（配列番号２３）及びＬＣ（配列番号２４）タンパク質配列の発現のために、キメラＭ５３（ｃＭ５３）哺乳類発現ベクターを生成した。キメラＨＣの発現のためのベクター挿入物のＤＮＡ配列（配列番号２５）は、シグナルペプチド（ヌクレオチド１〜９０）、Ｍ５３可変ＨＣドメイン（ヌクレオチド９１〜４５０、ここではヌクレオチド９４〜９６はバリンの代わりにシステインをコード化するよう変更されている）、及びヒトＩｇＧ１不変ＨＣドメイン（ヌクレオチド４５１〜１４４３）をコード化する。キメラＬＣの発現のためのベクター挿入物のＤＮＡ配列（配列番号２６）は、シグナルペプチド（ヌクレオチド１〜６０）、Ｍ５３可変ＬＣドメイン（ヌクレオチド６１〜３９９）、及びヒトＩｇＧ１不変ＬＣドメイン（４００〜７２３）をコード化する。ＨＥＫ２９３細胞におけるｃＭ５３の一過性発現に使用されるシグナルペプチド配列（配列番号２７及び２８）は開裂され、培養培地中のｃＭ５３の分泌を可能にし、同様に機能する他のシグナルペプチドは、当該技術分野で既知である（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００７）２，１−１７）。ＨＣ及びＬＣ哺乳類発現ベクターは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において一過性で発現された。簡単に言うと、プラスミドＤＮＡ（ＨＣ及びＬＣ哺乳類発現ベクターの１：１混合物）を、ポリエチレンイミンと１：４で組み合わせた（すなわち、１リットルのＨＥＫ２９３Ｆ細胞培養について、１ｍｇのプラスミドＤＮＡ及び４ｍＬのポリエチレンイミン（１ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で混合し、次いで細胞に添加する前に、１０分間インキュベートした）。細胞を、３７℃、８％のＣＯ２で、振蕩しながら（１２５ｒｐｍ）５〜７日間培養し、細胞生存度が５０％に近づいた時点で、細胞培養培地を回収した。得られた細胞培養培地を遠心分離し、上澄み液を０．２２ｕｍのフィルターで濾過した。キメラマウス／ヒトＩｇＧを、タンパク質Ｇ親和性クロマトグラフィーによ���て、濾過した細胞培養培地から単離した。
【０１６８】
精製したｃＭ５３及びＭ５３抗体を、リンカー動作可能試薬ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６に結合した。簡単に言うと、抗体を１０当量のジチオスレイトール（ＤＴＴ）で、室温（ＲＴ）で１時間処理した。Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）３０Ｋカットオフスピン濃縮装置を使用して、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）及び１５０ｍＭのＮａＣｌへの緩衝液交換によって、過剰なＤＴＴを除去した。抗体を２当量のデヒドロアスコルビン酸で、ＲＴにて３時間処理し、次いで５当量のＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６をそれぞれの反応に加え、ＲＴで１時間インキュベートした。次いでＬ−システインを２倍の過剰量でＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６に加え、未反応のマレイミド基を反応停止させた。試料濃度及び抗体に結合しなかった過剰なリンカー剤の除去を達成するために、複合体形成反応を濃縮し、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＹＭ−３０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）３０Ｋカットオフスピン濃縮装置を使用して、２０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７）及び１５０ｍＭのＮａＣｌへの緩衝液交換を３回行った。
【０１６９】
得られた複合体を、上記のように、ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９に対するインビトロ活性について試験した。得られた複合体、ｃＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及びＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、Ａ５４９細胞に対して同様な活性を示した（それぞれ、２．０及び１．９のＥＣ５０値）。
【０１７０】
単鎖可変断片構築。Ｍ５３の重可変鎖及び軽可変鎖を含有するｓｃＦｖをコード化するよう合成遺伝子構築体を設計し、ここではシステインが、重可変鎖（配列番号２９）のＮ末端において末位から二番目のアミノ酸位でバリンに置換された。このｓｃＦｖ遺伝子構築体を含有する発現構築体（ｐＪｅｘｐｒｅｓｓ４１１：５８８６６−ＣＥＮｓｃＦｖ００３［重鎖状のシステイン］＿ｏｐｔＥｃ＿Ｖ２）を、ＤＮＡ  ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）によって合成した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現される場合、この構築体は、ＰｈｏＡ（アルカリホスファターゼ）シグナル配列を含むタンパク質（配列番号３０）を生成し、このシグナル配列は、発現されたタンパク質を周辺細胞質に向けるもので、この周辺細胞質では、発現されたタンパク質が、タンパク質の残部（１〜２１位）、Ｍ５３可変ＨＣドメイン（２２〜１４１位、ここでは２３位がバリンに代わってシステインである）、グリシンリッチの可撓性リンカー（１４２〜１５６位）、及びＭ５３可変ＬＣドメイン（１５７〜２６９）から放出される。
【０１７１】
ｓｃＦｖ００３発現構築体を、大腸菌ＥＸＰＲＥＳＳ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ケミカルコンピテント細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，ＷＩ）に導入した。３０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地の６リットルを、上記形質転換体と共にインキュベートし、ＩＰＴＧを２００ｕＭで添加させる場合、１７℃で０．８Ｏ．Ｄ．６００まで増殖した。１８時間のインキュベーション後に、２０．６グラムの細胞ペーストを成長培地の４０００ｒｐｍの遠心分離によって回収した。細胞を、超音波処理によって、９０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１ｍＭ−ＤＴＰＡ中、氷上で細胞溶解した。細胞溶解物を、１４，０００ｒｐｍにての２０分間の遠心分離によって透明にして、次いで０．８ｕｍのフィルター、その後０．４５ｕｍのフィルターを通して濾過した。抗―ＦＸＹＤ５  ｓｃＦｖ００３を、免疫親和性クロマトグラフィーによって細胞溶解物から精製した。この免疫親和性樹脂は、製造業者のプロトコルに従って、ＣＥＮＰ０１８（ＰＴＲＡＰＤＡＶＹＴＥＬＱＣ）（配列番号１１）をＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｒｅｓｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に、１ｍｇのペプチド／樹脂のｍＬの装填率で、複合体形成することによって調製された。２ｍＬのペプチド修飾樹脂を含有するカラムを調製し、細胞溶解物をこの樹脂全体に流した。次いでカラムを、１００カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１ｍＭのＤＴＰＡで洗浄し、結合したｓｃＦｖを０．１Ｍのクエン酸で溶出し、タンパク質を含有する溶出液をＴｒｉｓ塩基で直ちに中和した。タンパク質含有溶出物を濃縮し、５ｍＬの６Ｋ  ＭＷＣＯポリアクリルアミド脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１ｍＭのＤＴＰＡに緩衝液交換した。
【０１７２】
上記で調製されたｓｃＦｖタンパク質の不対システインを、システインジスルフィド還元の必要なく、ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６と反応させた。簡単に言うと、５モル当量のＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）＋１ｍＭ−ＤＴＰＡ中ｓｃＦｖ００３の氷冷した３２ｕＭ溶液に加え、氷上で一晩反応させた。７．５モル当量のＬ−システインを加えることによって、未反応のマレイミドを反応停止させて、室温で３０分間反応させた。次いで、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔａ−０．５ｍＬ  １０Ｋ遠心分離濃縮機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、緩衝液交換を繰り返すことによって、得られた複合体を過剰のリンカー薬剤から精製した。ｓｃＦｖについての２８０ｎｍにおけるモル吸光係数値５１，５９０Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、実施例２に記載のように、この複合体に関するＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の装填率を決定した。
【０１７３】
得られた複合体を、上記記載の通りに、ＮＳＣＬＣ細胞系Ａ５４９に対するインビトロ活性について試験した。得られた複合体は、Ａ５４９細胞に対して活性を示した（ＥＣ５０＝１．６ｎＭ）。ｓｃＦｖ−ＰＥＧｎ−ＣＥＮ０９−０１６（ここでｎ＝２４）に関するこの結果に加えて、ｓｃＦｖ−ＰＥＧｎ−ＣＥＮ０９−０１６複合体（ここでｎ＝１２及び３６）もまた生成し、Ａ５４９に対して試験した。ｓｃＦｖ−ＰＥＧ１２−ＣＥＮ０９−０１６及びｓｃＦｖ−ＰＥＧ３６−ＣＥＮ０９−０１６は、ｓｃＦｖ当たり１つの薬剤を有し、並びにそれぞれ９．１及び１．１のＥＣ５０値を有することが決定された。追加的試験では、ｓｃＦｖ−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の細胞毒性活性は、Ｍ５３抗体で中和又は競合され得ることを示し、このことは、ｓｃＦｖとＭ５３が同一のエピトープと反応することを立証している。
【０１７４】
実施例５．Ｍ５３及び異なる薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の薬物動態
薬物負荷の薬物動態効果を評価するために、非複合体型抗体Ｍ５３及び抗体当たり２、５、及び９の薬剤の薬物負荷を有する抗体薬剤複合体Ｍ５３ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６処方物を、ＳＣＩＤベージュマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｎ＝２）に、尾静脈注射によって１ｍｇ／ｋｇの試験物質（抗体成分に基づいて）を投与した。注射後１時間後、並びに１、２、３、６及び１５日後に、後眼窩採血によって採取された血液試料から血清を単離した。血液をヘパリンでコーティングされた試験管に採取し、続いて遠心分離し（５，０００×ｇ、５分）、血漿を単離した。
【０１７５】
Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及び非複合体型Ｍ５３の血漿濃度を、以下の方法で抗原結合ＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルの透明底ＥＬＩＳＡプレートのウェルを、２００ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）１００ｕＬ中、ウェル当たり４００ｎｇのＢＳＡ−ペプチド複合体で、ＢＳＡに結合されたＣＥＮＰ０１８（配列番号１７）で４℃にて一晩コーティングすることによって、抗原補足用プレートを調製した。抗原コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄し、１％のＮＦＤＭを含有するＰＢＳ（ｐＨ７）（ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ）でブロックし、次いでＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。非複合体型Ｍ５３及び各ＥＤＣの希釈された血清及び標準曲線を、上記ブロッキング緩衝液中で調製し、コーティングされたウェルに加え、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧアルカリホスファターゼ（カタログ番号：Ａ１４１８；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ中で１：１５，０００に希釈し、各ウェルに加え（１００ｕＬ）、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。５０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する１ＭのＤＥＡ（ｐＨ９．８）中の１ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＰを加え（ウェル当たり１００ｕＬ）、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｍｏｄｅｌ  １４２０−０４１アッセイプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｕｇ，ＭＤ）を使用して、合計で６回の読み取りで５分毎に、４０５ｎｍにおける吸光度を決定した。既知の抗体濃度標準からの吸光度値を使用して、血清試料中の抗体の濃度を決定した。これら血清濃度は、次いでプロットされ、図１に示すグラフを作成した。
【０１７６】
図１は、ＥＤＣの曝露（血清中半減期）（「ＥＤＣ−ＯＮＥ」、「２ｘ」、「５ｘ」、及び「９ｘ」として示した）が、薬物負荷が減少するにつれて増加することを示す。図１はまた、２の薬物負荷が、遊離抗体と同様な又はそれよりも良好な血清中半減期をもたらすことも示す。非複合体型Ｍ５３に関する検出可能な（抗原結合によって）抗体の血清中半減期は、約６日であると決定されたが、一方２、５、及び９の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６に関する検出可能な抗体の血清中半減期は、それぞれ約７、４、及び２日であった。
【０１７７】
別の薬物動態試験では、非複合体型抗体Ｍ５３と３の薬物負荷を有するＥＤＣ  Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０６−１０６をマウスに投与し、抗体の薬物動態を、上記記載の方法及びＥＬＩＳＡを使用して測定した。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６のステロイド剤の薬物動態を、以下に記載される薬剤特異的ＥＬＩＳＡを使用して測定した。２つのＥＬＩＳＡ結果間の比較（抗体濃度−薬剤濃度）を使用して、薬剤分解の速度を決定し、これによって、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の安定性を検討した。
【０１７８】
Ｂａｌｂ／ｃマウス（３匹のマウス／群）に、Ｍ５３及び３の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の１ｍｇ／ｋｇを、尾静脈注射によって投与した。注射後１、２、４、８、１６、２６、及び４０日に、後眼窩採血によって取得された血液試料から血清を単離した。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及び非複合体型抗体Ｍ５３の血漿濃度を、上記のように抗原結合ＥＬＩＳＡによって測定した。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６中のステロイド剤の濃度を以下のように測定した。抗原コーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄し、１％のＮＦＤＭを含有するＰＢＳ（ｐＨ７）（ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ）でブロックし、次いでＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の希釈された血清試料及び標準曲線を、上記ブロッキング緩衝液中で調製し、コーティングされたウェルに加え、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。ビオチニル化２５Ｃ２Ｅ３（ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６のステロイド部分に特異的なモノクローナルＩｇＧ１抗体であり、ビオチンに結合されたもの［Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＰＮ２１９１１］）を、ＰＢＳ＋ＮＦＤＭ中で１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに加え（１００ｕＬ）、ＲＴで３０分間インキュベートし、ウェルをＰＢＳ（ｐＨ７）で３回洗浄した。５０ｍＭのＭｇＣｌ２を有する１ＭのＤＥＡ（ｐＨ９．８）中の１ｍｇ／ｍＬのＰＮＰＰを加え（ウェル当たり１００ｕＬ）、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｍｏｄｅｌ  １４２０−０４１アッセイプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｕｇ，ＭＤ）を使用して、５分毎で合計６回の読み取りで、４０５ｎｍにおける吸光度を決定した。
【０１７９】
両ＥＬＩＳＡｓについて、既知の標準からの吸光度値を、吸光度として経時的にプロットし、各濃度について線形勾配を生じた。次いでこの生じた勾配を標準の対応の濃度に対してプロットし、第２の線形プロットを作成した。未知の血清試料に関する吸光度を経時的にプロットし、未知試料に関する勾配を確立した。次いで、勾配対濃度プロットからの線形推定を使用して、それぞれの未知試料に関する濃度をそれらの勾配に基づいて推定した。
【０１８０】
これら実験から、非複合体型Ｍ５３の抗体部分の血清中半減期を、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇで投与されたそれぞれで１０．３日及び１１．９日であると決定した。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の抗体部分の血清中半減期を、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇで投与されたそれぞれで９．２日及び１１．９日であると決定した。Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６のステロイド部分の血清中半減期を、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇで投与されたそれぞれで８日及び１１日であると決定した。これら試料における無処置ＥＤＣの血清安定性（経時的に抗体から薬剤が放出する）を決定するために、抗体部分の血清減衰に対する薬剤部分の血清減衰の勾配の比を計算した。これら比から、１０ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇで投与される場合のＥＤＣ血清安定性半減期を計算し、それぞれ３９日及び４５日であった。
【０１８１】
これら試験からの結論は以下のようである：（１）ＥＤＣの最大曝露を得るために、２又は３の薬物負荷が最適であるが、５までの薬物負荷は、非複合体型抗体よりもわずか２日間短い血清中半減期に導くこと；（２）ＥＤＣの血清分解はＥＤＣの血清中半減期に比較される場合に無視できること；（３）ＰＥＧ２４−アミノ−グリコシドリンカーは、非切断可能なリンカーであること；並びに（４）ＥＤＣ血清中半減期は、投与レベルによって大きく影響されることはないこと。
【０１８２】
実施例６．Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の耐容用量
抗体当たり２、５又は９個の薬剤の薬物負荷を有するＥＤＣ  Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６調製物を、２５、５０、１００及び２００ｍｇ／ｋｇの単回投与量で、尾静脈を介してＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ｎ＝１）に投与し、単回投与量ＭＴＤｓを決定した。マウスを２４日間毎日監視し体重及び臨床所見の双方を記録した（体重を週に少なくとも２回測定し、毒性の明白な徴候に関する評価を一日２回行った）。ＭＴＤは、いずれの動物においても重篤で明白な毒性を引き起こさない又は＞２０％の体重減少を引き起こさない最高投与量として定義される。
【０１８３】
抗体当たり２個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６について、体重増加又は減少％を測定し、投与の日に対してプロットし、グラフに表し、これを図２に示した。ＭＴＤは＞１００ｍｇ／ｋｇであると決定し、これは、いずれの動物においても＞２０％の体重減少、苦痛の重篤な徴候、又は明白な毒性を誘導しなかった最高投与量であった。２００ｍｇ／ｋｇの用量では、マウスは一日目に手足の虚弱を経験したが、３日目までに回復し、体重において２５％の減少を経験した。
【０１８４】
抗体当たり５個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６単回投与耐容量を、同一の基準を使用して＞５０ｍｇ／ｋｇであると決定した。２５及び５０ｍｇ／ｋｇでは、毒性の徴候及び体重減少は観察されなかった。１００ｍｇ／ｋｇ用量では、マウスはその体重の２７％を減少させ、わずかな弛緩及び閉じた前肢を経験したが、３日目までに回復した。２００ｍｇ／ｋｇの用量では、マウスは１日目及び２日目に弛緩及び閉じた前肢並びに虚弱を経験した。
【０１８５】
抗体当たり９個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６単回投与耐容量を、同一の基準を使用して＞２５ｍｇ／ｋｇであると決定した。２５ｍｇ／ｋｇでは、毒性の徴候及び体重減少は観察されなかった。５０ｍｇ／ｋｇ用量では、マウスは５日目までにその体重の３０％を減少させ、これは１０日目までに正常に戻り、わずかな弛緩を２日目に経験したが３日目までに回復した。１００及び２００ｍｇ／ｋｇの用量では、マウスは１日目までに弛緩、閉じた前肢並びに虚弱を経験し、これらは２日目まで続いた。
【０１８６】
別の実験において、雄ＭＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＨｓｄ、Ｈａｓｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、腹腔内注射によって、抗体当たり２個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の５００ｍｇ／ｋｇの単回及び即時投与を施した。動物の体重を２２日間の期間にわたって記録し、目視観察を１４６日間にわたって実行し、ビヒクル対照を受容したマウスと比較した。体重測定値は、注射後最初の６日間にわたり３０％の体重の平均的減少を示したが、目視観察は毒性の明らかな徴候を示さなかった。マウスは、１５日目までに正常な対照体重に回復した。
【０１８７】
これらの結果は、腹腔内投与された、抗体当たり２個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の５００ｍｇ／ｋｇが、単回静脈内ボーラス注射を投与された、抗体当たり２個の薬剤を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の２００ｍｇ／ｋｇと同様に良好に耐容されたように、投与の経路は、最高耐容用量に影響を及ぼし得ることを示唆している。これはまた、腹腔内投与による血流へのより遅い放出にも起因し得る。
【０１８８】
実施例５及び６からの結論は、以下のようである：（１）薬物負荷はＥＤＣの耐容用量に影響を及ぼし、抗体当たり２個の薬剤は、マウスにおいて５００ｍｇ／ｋｇまでの耐容用量を示し、抗体当たり９個の薬剤は、２５と５０ｍｇ／ｋｇの間の耐容用量を示すこと；（２）２〜４個の薬剤の抗体負荷が、最小毒性及び最大薬物動態を維持するために最適であること；（３）ＥＤＣｓが血流内に入る投与の経路及び／又は速度が、ＭＴＤに影響を及ぼし得、より遅い血流投与がより耐容されること；並びに（４）体重減少及び明らかな毒性は、高レベルの投与量及び高レベルの薬物負荷によって影響されること。これらの結果はまた、耐容されたヒト投与量は、１０ｍｇ／ｋｇよりも高いことが可能であることを立証している。
【０１８９】
実施例７．Ａ５４９及びＨ４６０異種移植モデルにおけるＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の有効性
抗体当たり８個のステロイド剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の有効性を、Ａ５４９異種移植モデルにおいて立証した。簡単に言うと、非小細胞肺癌疾患モデルを確立するために、２００μＬのＲＰＭＩ１６４０＋５０％のＭａｒｅｉｇｅｌ  ＨＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中の６×１０６個のＡ５４９細胞を、Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎｌｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の左脇腹に移植した。次いで、５匹の動物の群における腫瘍体積が〜３００ｍｍ３の平均値になった場合に、抗体−薬剤複合体による処置を開始した。ビヒクル対照、０．１及び１ｍｇ／ｋｇのＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、及び１０ｍｇ／ｋｇの対照Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６（抗体当たり７個の薬剤の薬物負荷を有する対照複合体で、ここでは抗体の標的は細胞表面上にはないが、薬剤及びリンカー並びに抗体イソタイプはＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６と同様である）を使用する処置を、７日毎に１回の注射で合計３回の注射用量（ｑ７ｄ×３）の実施計画を使用して静脈内で全て施した。ｑ２ｄ×５で投与された１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルは、陽性対照処置群として働いた。この実施計画を使用して、腫瘍体積を、校正済みノギスを用いて各群について測定し、移植後５４日間及び最初の投与後４０日間にわたって腫瘍移植の最初の日に対してプロットし、図３に示すグラフを作成した。この結果は、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６が１ｍｇ／ｋｇで、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の６５％の増殖阻害を生じたことを示す。パクリタキセルはその最適投与量で、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の４５％の増殖阻害を生じた。同一の実施計画による０．１ｍｇ／ｋｇでは、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の３５％の増殖阻害を生じた。同一の実施計画による１０ｍｇ／ｋｇでは、対照Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の３５％の増殖阻害を生じた。
【０１９０】
第２番目のＡ５４９試験では、抗体当たり３個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の有効性が立証された。簡単に言うと、非小細胞肺癌疾患モデルを確立するために、皮下Ａ５４９異種移植を、８ｍｍ３のＡ５４９腫瘍断片を左脇腹に皮下注射により移植することによって、雌ＨＲＬＮＭ  ｎｕ／ｎｕマウスにおいて開始した。腫瘍増殖を監視し、６０〜１８０ｍｍ３の腫瘍を保持するマウスを試験のために選択した。約１１０ｍｍ３の群平均腫瘍体積を有する腫瘍保持マウス（ｎ＝７匹のマウス／群）を、５ｍｇｓ／ｋｇのＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６（ｑ３ｄｘ４で）、２０ｍｇ／ｋｇのシラレニン−４−アミノ−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシド（Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の構築体中の中間体で、細胞毒素として知られる）（ｑ２ｄｘ５で）、及び１５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセル（ｑ１ｄｘ５で）で腹腔内にて処置した。校正済みノギスを用いて、腫瘍体積を各群について測定し、１００日間にわたって最初の投与の日に対してプロットし、図４に示すグラフを作成した。
【０１９１】
この実施計画を使用して、最初の投与から１００日後に、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、５ｍｇ／ｋｇで、ビヒクルと比較した場合、７２％の腫瘍の増殖阻害を生じた。パクリタキセルは、その最適濃度で、ビヒクルと比較した場合、７２％の腫瘍の増殖を阻害した。２０ｍｇ／ｋｇで、シラレニン−４−アミノ−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドは、ビヒクルと比較した場合、６０％の腫瘍の増殖阻害を生じた（図４参照）。パクリタキセルを投与されたマウスは、１１％の体重減少を示し、シラレニン−４−アミノ−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドでは８％の体重減少を示したが、一方他のマウスの全てはわずかな体重増加を示した。この試験は、抗体当たり３個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の５ｍｇ／ｋｇが、その最適投与量でのパクリタキセルと同様な様式で腫瘍増殖を遅らせることで、有効性を示すことを表示している。この試験はまた、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の有効性が、４２７倍低い総モルレベルで投与される場合、シラレニン−４−アミノ−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドと同様であることも立証した。加えて、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は体重減少を生じず、このことは、これがパクリタキセル又はシラレニン−４−アミノ−デオキシ−Ｌ−キシロピラノシドよりも毒性が低いことを立証している。これら結果はまた、有効なヒト投与量は、５ｍｇ／ｋｇを包含する範囲にあり得ることも立証する。
【０１９２】
別の試験で、抗体当たり８個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の有効性が、Ｈ４６０異種移植モデルにおいて立証された。簡単に言うと、非小細胞肺癌疾患モデルを確立するために、１００μＬのＲＰＭＩ１６４０＋３０％のＭａｒｅｉｇｅｌ  ＨＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）中の１×１０６個のＨ−４６０細胞を、Ｈｓｄ：無胸腺ヌード−Ｆｏｘｎｌｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の左脇腹に移植した。５匹の動物の群における腫瘍サイズが〜２００ｍｍ３の平均値になった場合に、治療を開始した。ビヒクル対照、０．１及び１ｍｇ／ｋｇのＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、及び１０ｍｇ／ｋｇの対照Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６（上記記載の通り）を使用する処置は、７日毎に１回の注射を合計２回注射する実施計画（ｑ７ｄｘ２）を使用する複数回の静脈注射からなる。パクリタキセルは、陽性対照処置群として働き、２日毎に１回の注射で合計５回注射する実施計画（ｑ２ｄｘ５）を使用して、１５ｍｇ／ｋｇで静脈投与した。この実施計画を使用して、腫瘍体積を、校正済みノギスを用いて各群について測定し、移植後２４日間及び最初の投与後１２日間にわたって腫瘍移植の日に対してプロットし、図５に示すグラフを作成した。この結果は、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６が１ｍｇ／ｋｇで、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の７３％の増殖阻害を生じたことを示している。同一の実施計画による０．１ｍｇ／ｋｇでは、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の３８％の増殖阻害を生じ、体重減少は生じなかった。パクリタキセルはその最適投与量で、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の７８％の増殖阻害を生じ、１５％の平均体重減少を生じた。同一の実施計画による１０ｍｇ／ｋｇでは、対照Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、ビヒクルと比較した場合、腫瘍の３３％の増殖阻害を生じた。
【０１９３】
実施例８．ＰＡＮＣ−１異種移植モデルにおけるＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６併用療法の有効性
別の試験において、抗体当たり８個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の有効性を、ＰＡＮＣ−１異種移植モデルにおいてゲムシタビンと併用で立証した。１００μＬのＤＭＥＭ中の５×１０６個のＰＡＮＣ−１細胞を、７週齢の雌Ｃ．Ｂ−１７／ＩｃｒＨｓｄ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＬｙｓｔｂｇマウスの左脇腹に移植することによって、膵臓癌の疾患モデルを確立した。次いで、３匹の動物の群における腫瘍サイズが〜５００ｍｍ３の平均値になった場合に、マウスを、８個の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６及び／又はゲムシタビンで処置した。処置は、ビヒクル対照、６０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンの有無で、０．２、１及び５ｍｇ／ｋｇでのＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６、又は６０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビン単独からなり、並びに静脈内投与される７日毎に１回の注射で合計３回の注射（ｑ７ｄ×３）のＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６実施計画及び腹腔内投与される３日毎に１回の注射で合計３回の注射のゲムシタビン実施計画を使用する複数の注射からなった。腫瘍体積を、校正済みノギスを用いて各群について測定し、最初の投与後２８日間にわたって腫瘍移植の最初の日に対してプロットし、グラフを作成し、図６に示した。最初の投与から２８日目に、Ｍ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６は、０．２、１、５ｍｇ／ｋｇで、ビヒクルと比較する場合、それぞれ３８％、４８％及び７６％の腫瘍の増殖阻害を生じた。ゲムシタビン（３日毎に１回の注射で合計５回の注射）がＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の同一の実施計画及び投与量（０．２、１、５ｍｇ／ｋｇ）と併用された場合、この投与量は、０．２ｍｇ／ｋｇについては、８８％の増殖阻害を生じ、他の併用投与量については腫瘍退縮を生じた。ゲムシタビン単独は、ビヒクルと比較する場合、腫瘍の６８％の増殖阻害を生じた。
【０１９４】
別の試験では、Ｐａｎｃ−１皮下異種移植モデルを使用して、抗体当たり７個の薬剤の薬物負荷を有するＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６の抗腫瘍活性を評価した。１ｍｍ３のＰＡＮＣ−１腫瘍断片を左脇腹に皮下注射により移植することによって、皮下Ｐａｎｃ−１異種移植を雌ＨＲＬＮ  ｎｕ／ｎｕマウスにおいて開始し、腫瘍増殖を監視し、８０〜１２０ｍｍ３の腫瘍を保持するマウスを試験用に選択した。腫瘍体積を、校正済みノギスを用いて各群について週に２回測定し、最初の投与の日に対してプロットし、図７に示すグラフを作成した。処置群の中では、毒性作用は観察されなかった（毒性は、試験期間中の＞１０％の体重減少として判定された）。この試験からの結論は、ヒト膵臓細胞系ＰＡＮＣ１から発生した固形腫瘍を有するマウスへのＭ５３−ＰＥＧ２４−ＣＥＮ０９−１０６投与は、ビヒクル群１と比較する場合、用量依存的方法で腫瘍縮小に導くことであった。
【表４】
2014510080.tif 000030
【図１】
2014510080.tif 000031
【図２】
2014510080.tif 000032
【図３】
2014510080.tif 000033
【図４】
2014510080.tif 000034
【図５】
2014510080.tif 000035
【図６】
2014510080.tif 000036
【図７】
2014510080.tif 000037
【配列表】
2014510080000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年2月4日(2014.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2014510080000001.app
【国際調査報告】
2014510080.tif 000038
2014510080.tif 000039