【事件の表示】
　特許第３２７７０４５号「ＨＩＶ−グループのレトロウイルスおよびその使用」の請求項１ないし１５に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３２７７０４５号の請求項１ないし１１に係る特許を維持する。
【理　由】
Ｉ．手続の経緯
　本件特許第３２７７０４５号の請求項１乃至１５に係る発明についての出願は、平成５年１０月５日（パリ条約による優先権主張１９９２年１０月６日、ドイツ国、１９９２年１０月２２日、ドイツ国１９９２年１２月３０日、ドイツ国）の出願であって、平成１４年２月８日にその特許の設定登録がなされ、その後、その特許について異議申立人田嶋順治より特許異議の申立がなされ、取消しの理由が通知され、その指定期間内である平成１６年２月１２日に訂正請求がなされたものである。
II．訂正請求
１．訂正の内容
（１）特許請求の範囲の請求項１に係る記載、
「【請求項１】European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）にNo．Ｖ ９２０ ９２ ３１８の番号で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有するＨＩＶおよびその変異体であるＨＩＶグループの免疫不全ウィルスであって、前記変異体が第１表または第３表に示すヌクレオチド配列と一致するまたは当該配列と相同性のある配列を有するものであり、前記相同性がヌクレオチド配列に基づき６６％以上である免疫不全ウイルス。」を、
「【請求項１】European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）にNo．Ｖ ９２０ ９２ ３１８の番号で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有す免疫不全ウイルス。」と訂正する。
（２）特許請求の範囲の請求項２乃至５を削除し、特許請求の範囲の請求項６に係る記載、
「【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の免疫不全ウイルスから調製された抗原。」を、
「【請求項２】表３に記載されたｇｐ４１のアミノ酸配列を有するＭＶＰ−５１８０／９１のタンパク質ｇｐ４１よりなる抗原。」と訂正する。
（３）特許請求の範囲の請求項２乃至５を削除したことに伴い、もとの請求項７〜１３を請求項３〜９とし、必要な訂正をする。
（４）特許請求の範囲の請求項１４に係る記載、
「【請求項１４】請求項１〜５のいずれかに記載のレトロウイルス、および／または請求項６〜９のいずれかに記載の抗原の、接種素の調製のための使用方法。」を、
「【請求項１０】請求項１に記載の免疫不全ウイルス、および／または請求項２〜５のいずれかに記載の抗原の、接種素の調製のための使用方法。」と訂正する。
（５）特許請求の範囲の請求項１５に係る記載、
「【請求項１５】請求項１〜５のいずれかに記載の免疫不全ウイルスをコードすることを特徴とするリボ核酸。」を、
「【請求項１１】請求項１に記載の免疫不全ウイルスをコードすることを特徴とするリボ核酸。」と訂正する。
（６）発明の名称に係る記載「ＨＩＶ−グループレトロウィルス及びその使用」を「ＨＩＶ−グループ免疫不全ウィルス」に訂正する。                                                                     
２．訂正の目的の適否、新規事項の有無及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　訂正事項(1)は、訂正前の請求項１に記載の免疫不全ウイルスを、特定の寄託された免疫不全ウイルスのみに限定するものであって、特許請求の範囲の減縮を目的とした訂正に該当する。
　訂正事項(２)は、訂正前の請求項６の抗原をｇｐ４１のみに限定するものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とした訂正に該当する。
  訂正事項(３)（５）は、訂正前の請求項２〜５を削除したことに伴い必要な訂正をしたものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とした訂正に該当する。
　訂正事項(４)（６）は、レトロウイルスという記載を訂正前の請求項１の記載に沿って免疫不全ウイルスと表現を統一するものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とした訂正に該当する。
　また、この訂正は新規事項に該当せず、実質上特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
３．むすび
　以上のとおりであるから、本件訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、請求のとおり当該訂正を認める。
　
III．特許異議申立
１．特許異議申立書の理由の概要
　特許異議申立人田嶋順治は、下記の甲第１乃至８号証を提出し、（１）訂正前の本件請求項１乃至３に係る特許発明は、甲第１、第２もしくは第４号証に基づく国際会議又は寄託機関により公知になった発明であるか、甲第１、第２又は第４号証に記載された発明と同一であるか、あるいは甲第１号証乃至甲第５号証に記載された発明に基づいて容易に発明ができたものであるから、特許法第２９条第１項第１号もしくは３号の規定に該当し、又は特許法第２９条第２項の規定に違反する、また本件請求項４乃至１５に係る特許発明は、甲第４号証に記載された発明であるか、又は甲第1号証乃至甲第８号証に記載された発明に基づいて容易に発明ができたものであるから、特許法第２９条第１項第３号の規定に該当し、又は特許法第２９条第２項の規定に違反する、（２）本件請求項１乃至５に係る発明については、請求項の記載が発明の構成に欠くことのできない事項のみを記載したものではなく、また、発明の詳細な説明は、当業者が容易にその実施をすることができる程度に記載されているとはいえず、特許法第３６条第４項及び第５項に規定する要件を満たしていないから取り消すべき旨、主張している。
甲第１号証：エイズ国際会議（1992年7月19〜24日）会議要旨Ｎｏ．ＰｕＡ6138
甲第２号証：エイズ国際会議（1991年6月16〜21日）会議要旨Ｎｏ．Ｍ．Ａ．1157
甲第３号証：ＭＶＰ−5180/91とＡＮＴ70との配列比較図
甲第４号証：公表特許公報平２−５０４５８３号公報
甲第５号証：Revue　francaise　laboratories、juin1994　No.266（1994年6月）93〜96頁
甲第６号証：NCBIにおけるANT70のアミノ酸配列出力結果
甲第７号証：Ｓｃｉｅｎｃｅ  Vol．237、1987年9月11日、1346〜1349頁
甲第８号証：Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、1986年4月12日
２．本件発明
　上記II．に示したように上記訂正は認められるから、訂正後の本件請求項１乃至１１に係る発明（以下、「本件発明１乃至１１」という。）は、上記訂正請求により訂正された特許請求の範囲の請求項１乃至１１に記載された事項により特定される、以下のとおりのものである。
「【請求項１】European Collection of Animal Cell Cultures（ECACC）にNo．Ｖ ９２０ ９２ ３１８の番号で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有す免疫不全ウイルス。
【請求項２】表３に記載されたｇｐ４１のアミノ酸配列を有するＭＶＰ−５１８０／９１のタンパク質ｇｐ４１よりなる抗原。
【請求項３】アミノ酸配列ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳまたは少なくとも６個の連続するアミノ酸を有するその部分配列を示すことを特徴とする抗原。
【請求項４】組換えにより調製されたことを特徴とする請求項２または３に記載の抗原。
【請求項５】合成により調製されたことを特徴とする請求項３に記載の抗原。
【請求項６】請求項２〜５のいずれかに記載の抗原が適用されることを特徴とする免疫不全病因ウイルスに対する抗体を検出するためのテストキット。
【請求項７】ウェスターンブロットであることを特徴とする請求項６記載のテストキット。
【請求項８】ＥＬＩＳＡテストであるかまたは蛍光抗体検出テストであることを特徴とする請求項６記載のテストキット。
【請求項９】請求項１に記載の免疫不全ウイルスおよび／または請求項２〜５のいずれかに記載の抗原の、免疫不全の原因となるレトロウイルスの検出のための使用方法。
【請求項１０】請求項１に記載の免疫不全ウイルス、および／または請求項２〜５のいずれかに記載の抗原の、接種素の調製のための使用方法。
【請求項１１】請求項１に記載の免疫不全ウイルスをコードすることを特徴とするリボ核酸。」
３．甲各号証の記載内容
　甲第１乃至８号証には以下の事項が記載されている
甲第１号証
１−１）末梢血(ＰＢＬ)から、このＨＩＶ株（ＭＶＰ−５１８０）を、受容ＰＢＬを添加することによって単離し、Ｈ９細胞内で増殖させた。（１２行〜１３行）
１−２）ＭＶＰ−５１８０は、細胞病原性であり、中程度の巨細胞形成を示す。他のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２株と対照的に、逆転写酵素がｐ５３とｐ６６の代わりにｐ５０とｐ６０のタンパク質からなる。ドイツの抗−ＨＩＶ−１血清では、糖タンパク質ｇｐ４１及びｇｐ１２０との反応は弱く、一方アフリカ血清(カメルーン、ウガンダ及びコートジボアール)との反応は強かった。（１７行〜２２行）
甲第２号証
２−１）分岐ＨＩＶ単離体（Ａｎｔ７０）のプロウイルスＤＮＡの分子解析。得られた配列データから、既知のＨＩＶ株との差異の、詳細な研究及びＨＩＶファミリーにおけるこの新規変異体の位置づけが可能となった。（１６行〜１９行）
２−２）配列解析は、Ａｎｔ７０のゲノムは、そのゲノムにおける局在性が関係する限り、他のＨＩＶ−１において発見されたすべてのオープンリーディングフレームを含んでいることを示している。Ａｎｔ７０とＨＩＶ株ＨＸＢ２との全体の配列相同性が７０%であり、同様の相同性は、さらに分岐した株であるＨＩＶｍａｌと、およびＨＩＶｃｐｚとでも発見された。（２８行〜３３行）
２−３）Ａｎｔ７０単離体のこの解析は、ＨＩＶ−１ファミリーにおける変異可能性が、それまでに考えられていたよりも大きく、より分岐したＨＩＶ−２サブグループと同様であろうということを示している。（３８行〜４０行）
甲第３号証
３−１）ＭＶＰ５１８０/９１とＡＮＴ７０のヌクレオチド配列の相同性が、全体で約８５%、四角で囲んだ部分で９３%であること。
甲第４号証
４−１）・・・ＨＩＶ−３(ＡＮＴ７０)が、カメルーン人女性および彼女の夫からのヒト免疫不全の単離及び特徴づけを報告する。・・・この単離物がＨＩＶ−１でもＨＩＶ−２でもないことを証明する。したがっって、本発明は・・・ＨＩＶ−３レトロウイルスまたはこのウイルスの変異体に関する。（４頁左上欄１０〜２４行公報）
４−２）ＨＩＶ−３（ＡＮＴ７０）は、ECACC　V8806301のもとに寄託されている。（公報４頁右下欄７〜８行）
４−３）・・・抗−ＨＩＶ−２抗血清をＨＩＶ−３タンパク質と共にインキュベートした時にも、抗−ＨＩＶ−３抗血清をＨＩＶ−２タンパク質とインキュベートした時にも、ｅｎｖ遺伝子産物の交差反応性は全く観察されなかった。・・・抗−ＨＩＶ−３血清はＨＩＶ−１のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産物と交差反応するだけでなく、たとえ低親和性でもｇｐ４１及びｇｐ１２０ｅｎｖ遺伝子産物とも幾らか交差反応する・・・。（公報７頁右上欄下から２行〜同頁左下欄１１行）
４−４）・・・ＨＩＶ−１タンパク質をもとにしたエンザイムイムノアッセイ・・・において、ＡＮＴ７０ＮＡの陽性反応を検出・・・それぞれＡＮＴ７０およびＡＮＴ７０ＮＡで感染された２個体の場合、ＨＩＶ−１のｐ２４とエンベロープタンパク質の両方に対して交差反応が観察された・・・このウイルスに特異的な診断テストを開発することが不可欠である。（公報１８頁左下欄下から９行〜右下欄最終行）
甲第５号証
５−１）１９９１年、ミュンヘンのＭ.Ｖ.ペッテンコファー研究所において、同様のレトロウイルスが、ウエスタンブロットでは検出されないＡＩＤＳを有するカメルーンの３４歳の患者の白血球から単離された。このＭＶＰ５１８０と呼ばれる微生物の配列は、保存された遺伝子について、微生物ＡＮＴ−７０と９０%を超える相同性を有する。（９３頁左欄１５行〜２０行）
甲第６号証
６−１）ＬＷＧＣＫＧＫＬ及びＣＹＴＳＶＫＷＮＲのアミノ酸配列（２頁１１行）
甲第７号証
７−１）・・・実験したＨＩＶ様ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２及びＳＴＬＶ−III）のすべてについて、膜貫通糖タンパク質上に、高度に免疫反応性のエピトープを同定した・・・そのエピトープは、それぞれのウイルスの類似する領域に位置し、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｘ−Ｃｙｓという共通するアミノ酸配列を共有している。（１３４８頁左欄１８行〜２６行）
甲第８号証
８−１）それらは、カメルーンからのヒトの中には、ＬＡＶ/ＨＴＬＶ−IIIに関連するが、それとは同一ではないウイルスに暴露されたヒトがいることを示唆している。（左欄１８〜２０行）
４．特許法第２９条第１項第１号もしくは３号及び特許法第２９条第２項違反について
  本件発明１乃至１１は、新種の免疫不全ウイルスＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１を単離し、その全アミノ酸配列を解明し、他のＨＩＶと差別化できる、タンパク質ｇｐ４１よりなる抗原、アミノ酸配列ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳまたは少なくとも６個の連続するアミノ酸を有するその部分配列を含む抗原を提供したものであり、エイズ研究、診断、治療等に有用なものである。
　そこで、本件発明１乃至１１と本件優先日前に頒布された甲第１、２、４、７、８号証刊行物に記載された発明とを、甲第３、５、６、号証を斟酌して比較・検討すると、甲第１、２、４、７、８号証刊行物には、本件発明１乃至１１に係る、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１の全アミノ酸配列、タンパク質ｇｐ４１よりなる抗原、アミノ酸配列ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳまたは少なくとも６個の連続するアミノ酸を有するその部分配列を含む抗原は記載されていないし、又それを示唆する記載もない。
　特許異議申立人は、甲第１号証にＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０の存在が報告され、甲第２号証にＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０の変異体であるＨＩＶ株ＡＮＴ７０の存在が報告され、甲第４号証にＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０の変異体であるＨＩＶ株ＡＮＴ７０が記載されているから、訂正前の本件請求項１に記載されたＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１自体は、甲第１号証のエイズ国際会議で公知となった発明であり、甲第１号証に記載された発明である旨、また、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１ウイルス変異体は、甲第２号証のエイズ国際会議及び甲第4号証に記載されたＥＣＡＣＣで既に公知となった発明であり、さらに、甲第２号証及び甲第4号証に記載された発明である旨主張している。
  しかしながら、上記訂正により、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１ウイルス変異体は本件請求項１からは削除されたから、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１ウイルス変異体に関する異議申立人の主張は理由のないものとなった。　
   そこで、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１自体について検討すると、出願人が提出した乙１号証に係る、本件発明の発明者であり、甲第１号証のエイズ国際会議における発表者であるルーツ・ゲー・ギュルトラー博士の陳述書によると、甲第１号証のエイズ国際会議における発表は、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０の第３者への分譲を前提としたものではなく、実際に、本件出願の優先日前に第３者に分譲した事実もないから、発表者以外は、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０を入手することは不可能であったものと認められる。
  そうすると、甲第１号証には、１−１）乃至１−２）のとおりのＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０に関する限定された情報しか示されておらず、発表者以外は、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０を入手することは不可能であったのであるから、その全配列が解明されたＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１自体は、甲第１号証のエイズ国際会議で公知となった発明であるとも、また、甲第１号証に記載された発明であるものとすることはできない。
　次に、特許異議申立人は、甲第１号証には、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０、及びその単離方法並びにこの株と既知のＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２との相違点が記載され、甲第２号証には、ＨＩＶ変異体であるＡＮＴ７０、及びその単離方法が記載され、甲第４号証には、ＡＮＴ７０が記載され、Ｖ８８０６３０１のもとにＥＣＡＣＣに寄託されている旨が記載され、この細胞系統は、１９８９年１２月１３日から入手可能であり、甲第５号証には、ＭＶＰ５１８０の配列は、ＡＮＴ−７０と９０%を超える相同性を有することが記載され、甲第８号証には、カメルーン人の血液中にＬＡＶ/ＨＴＬＶ−IIIに関連するウイルスがいることが示唆されているから、訂正前の本件請求項１に係る発明は、甲第１号証、甲第２号証または甲第４号証及び甲８号証の記載に基づき、または、これらと甲第３号証に記載された配列の相同性、及甲第５号証の記載より、当業者であれば、カメルーン人の血液サンプル中からウイルスを検出しようと試みるのは当然のことである旨主張している。
　しかしながら、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１を持っているのは、エイズに感染しているカメルーン人の約２．５％のみであるとされており、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１を単離すべき血清を得ることが容易であるとはいえないから、異議申立人の主張は採用できない。
　したがって、本件発明１乃至１１は、本件優先日前に公然知られた発明であるとも、本件優先日前に頒布された甲第１、２、４、７、８号証刊行物に記載された発明と同一であるとも、また、甲第１、２、４、７、８号証刊行物に記載された発明に基づき、当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
５．特許法第３６条第４項及び第５項違反について
   特許異議申立人は、
１）訂正前の本件請求項１乃至５に記載された発明は、６６%以上、７５%以上、及び８５%以上の相同性のある配列を有する変異体に関するものであるが、これらの変異体が有する特定の相同性のある配列のヌクレオチド長については何ら規定されていないから、請求項の記載が発明の構成に欠くことのできない事項のみを記載したものではない、
２）訂正前の本件請求項１〜５に記載された発明は、６６%以上、７５%以上、及び８５%以上の相同性のある配列を有する変異体に関し、種々の公知のＨＩＶ単離物間で変異があることから、当業者であっても、何が当該請求項に記載された発明に該当するのか、及び、第１表または第３表に示すヌクレオチド配列と、６６%以上、７５%以上または８５%以上の相同性のある配列を有するＭＶＰ−５１８０の変異体をどのようにして得ることができるのかを知ることは容易ではないから、本件特許明細書の発明の詳細な説明は、当業者が容易にその実施をすることができる程度に記載されているとはいえない、旨主張している。
　しかしながら、上記訂正により、ＨＩＶ株ＭＶＰ−５１８０／９１ウイルス変異体は 本件請求項１から削除され、また、訂正前の請求項２乃至５は削除されたから、上記不備は解消した。
６．まとめ
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、本件発明１乃至１１についての特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ＨＩＶ−グループの免疫不全ウイルス
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にＮｏ．Ｖ　９２０　９２　３１８の番号で寄託されたＭＶＰ−５１８０／９１なる呼称を有す免疫不全ウイルス。
　【請求項２】　表３に記載されたｇｐ４１のアミノ酸配列を有するＭＶＰ−５１８０／９１のタンパク質ｇｐ４１よりなる抗原。
　【請求項３】　アミノ酸配列ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳまたは少なくとも６個の連続するアミノ酸を有するその部分配列を示すことを特徴とする抗原。
　【請求項４】　組換えにより調製されたことを特徴とする請求項２または３に記載の抗原。
　【請求項５】　合成により調製されたことを特徴とする請求項３に記載の抗原。
　【請求項６】　請求項２〜５のいずれかに記載の抗原が適用されることを特徴とする免疫不全病因ウイルスに対する抗体を検出するためのテストキット。
　【請求項７】　ウェスターンブロットであることを特徴とする請求項６記載のテストキット。
　【請求項８】　ＥＬＩＳＡテストであるかまたは蛍光抗体検出テストであることを特徴とする請求項６記載のテストキット。
　【請求項９】　請求項１に記載の免疫不全ウイルスおよび／または請求項２〜５のいずれかに記載の抗原の、免疫不全の原因となるレトロウイルスの検出のための使用方法。
　【請求項１０】　請求項１に記載の免疫不全ウイルス、および／または請求項２〜５のいずれかに記載の抗原の、接種素の調製のための使用方法。
　【請求項１１】　請求項１に記載の免疫不全ウイルスをコードすることを特徴とするリボ核酸。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　本発明は、ＨＩＶ群由来の新規レトロウイルスおよびそのウイルスの本質的性質を有する変異株またはそれらの部分に関する。そのレトロウイルスの培養方法も説明される。さらに本発明は、このレトロウイルスの取得のほか、そのウイルス、その部分または抽出物の、医学目的、診断のための、また接種素調製の際における使用にも関する。
　いわゆるＨＩＶ群に属すレトロウイルスはそれに感染した人間に免疫不全またはエイズ（先天性免疫不全症候群）という集合概念で総括される症状を招く。
　【０００２】
　疫学的研究により、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）がエイズ（先天性免疫不全症候群）症例の圧倒的多数の病因であることが実証されている。１９８３年にある患者から単離され特性評価されたレトロウイルスにＨＩＶ−１という名称が与えられた（Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２０，８６８−８７１〔１９８３〕）。ＨＩＶ−１の一変異株がＷＯ　８６／０２３８３に記載されている。
　第２のヒト免疫不全ウイルス群は１９８５年に西アフリカで同定され（Ｃｌａｖｅｌ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３３，３４３−３４６〔１９８６〕）、そしてヒト免疫不全ウイルス・タイプ２（ＨＩＶ−２）と名付けられている（ＥＰ−Ａ−０　２３９４２５）。ＨＩＶ−２レトロウイルスは、明らかにＨＩＶ−１とは区別されるが、なおもサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ−２）と近縁関係をも示す。ＨＩＶ−１と同様、ＨＩＶ−２もエイズ症状を生じる。
　免疫不全レトロウイルスのもう一つの変異株がＥＰ−Ａ−０　３４５　３７５に記載されており、そこではＨＩＶ−３レトロウイルスと名付けられている（ＡＮＴ　７０）。
　【０００３】
　Ｌａｎｃｅｔ　Ｖｏｌ．３４０，Ｓｅｐｔ．１９９２，ｐｐ．６８１−６８２には免疫不全ウイルスのもう一つの変異株の単離が記載されている。
　高い変異性を示すことがヒト免疫不全ウイルスの一特徴であり、これが様々な単離物の比較の可能性を明らかにめんどうにしている。様々なＨＩＶ−１−単離物を比較すると、他のゲノム領域は比較的保存されたままであるのに、いくつかのゲノム領域では高い変異性が認められる（Ｂｅｎｎ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０，９４９−９５１〔１９８５〕）。本質的により大きい多形態性はＨＩＶ−２についても観察することができた（Ｃｌａｖｅｌ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３２４，６９１−６９５〔１９８６〕）。構造的および酵素的に不可欠なタンパク質をコードしているｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子は大きな遺伝安定性を有し；ｅｎｖ遺伝子および調節タンパク質をコードする遺伝子（ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ）は高い変異度を示す。さらにＨＩＶ−１に対する抗血清がほんのわずかな配列相同性しかなくても、ＨＩＶ−２のｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子産生物とも交叉反応することも示すことができた。同様に、あまり厳しくない条件を用いなければ両ウイルス間のハイブリダイゼーションはほとんど有意でなかった（Ｃｌａｖｅｌ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３２４，６９１−６９５〔１９８６〕）。
　【０００４】
　ＨＩＶ群由来レトロウイルスが広く伝播していることから、そして感染時点と、病理学的変化の明らかな徴候が認められるまでの時点との間に数年乃至多年（２〜２０年）の間隔があることから、ＨＩＶ群レトロウイルスをできるだけ早くそしてとりわけ確実に測定することは疫学的に極めて重要なことである。これは免疫不全の徴候を示す患者の診断の際だけでなく供血者の検査においても役割を果す。ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２タイプのレトロウイルスまたはそれらの構成部分をヒト血清の検出系に用いた場合、それら血清が由来する患者に免疫不全の徴候が現われているのに、抗体を全く検出できないかあるいは弱い検出しかなされないことがわかっている。本発明によるＨＩＶ群由来レトロウイルスを用いれば一定の場合にそのような検出が可能である。
　【０００５】
　１９９１年に免疫不全の徴候を示した３４才のカメルーンの女性患者の末梢リンパ球から単離された、以下ＭＶＰ−５１８０／９１と称する新規ヒト免疫不全ウイルスの単離および特性評価を記述する。地理的には、このレトロウイルスは、ＨＩＶ−２およびＨＩＶ−１ウイルス感染の伝播を特色とする西アフリカと、ほぼもっぱらにＨＩＶ−１が伝播している東中央アフリカとの間に位置するアフリカの地域に由来している。さらに本発明の対象は、ＭＶＰ−５１８０／９１と称されるＨＩＶ群の新規レトロウイルスおよびその変異株のほか、それより導かれるＤＮＳ配列およびアミノ酸配列または部分配列、およびこれらを含むテストキットである。レトロウイルスＭＶＰ−５１８０／９１はブダペスト条約の条件に従ってＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にＶ９２０　９２　３１８の番号の下に寄託された。
　【０００６】
　ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２と同様に、本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１は次の細胞系統、ＨＵＴ７８、Ｊｕｒｋａｔ−細胞、Ｃ８１６６−細胞およびＭＴ−２−細胞で増殖する。ウイルスの単離および増殖は“Ｖｉｒａｌ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｉｎ　ＨＩＶ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ（ＨＩＶ感染におけるウイルス定量）、Ｊｅａｎ−Ｍａｒｉｅ　Ａｎｄｒｉｅｎ編、Ｊｏｈｎ　Ｌｉｂｂｅｙ　Ｅｕｒｏｔｅｘｔ発行、１９９１年”、という本に詳述されている。そこに記述されている操作方法を引用により本出願の開示の一部とする。
　さらに、本発明ウイルスはマグネシウム依存性ではあるがマンガン依存性ではない逆転写酵素を有する。このことは、ウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２とのもう一つの一致点である。
　【０００７】
　本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１ウイルスとレトロウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の相違をよく理解してもらうために、免疫不全の原因となるレトロウイルスの構築をまず簡単に説明する。ウイルスの内部には、ｐ２４（ｐはｐｒｏｔｅｉｎ（タンパク質）のｐである）の呼称を有するサブユニットより組成された円錐状コアにＲＮＡが存在する。この内部コアは、タンパク質ｐ１７で構築されたタンパク質外被（外部コア）で囲まれ、そして宿主細胞に由来する脂質のほかにトランスメンブレン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ）タンパク質ｇｐ４１および外被タンパク質１２０（ｇｐ１２０）を含む糖タンパク質外被により囲まれている。このｇｐ１２０は次いで宿主細胞のＣＤ−４−レセプターと結合することができる。
　【０００８】
　知られている限り、ＨＩＶ−ウイルスのＲＮＡは（簡略化して記述した場合）次の遺伝子領域を示す：両末端にいわゆるロングターミナルリピート、および次の遺伝子領域、すなわちｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖおよびｎｅｆ。ｇａｇ遺伝子はとりわけ中核（コア）−タンパク質であるｐ２４およびｐ１７をコードし、ｐｏｌ遺伝子はとりわけ逆転写酵素、ＲＮエース（リボヌクレアーゼ）Ｈおよびインテグラーゼをコードし、そしてｅｎｖはウイルス外被の糖タンパク質であるｇｐ４１およびｇｐ１２０をコードする。ｎｅｆ遺伝子は調整機能を有するタンパク質をコードする。ＨＩＶ型のレトロウイルスのゲノム配置の概略図を図１に示す。
　【０００９】
　レトロウイルスＨＩＶ−１とＨＩＶ−２との間の区別は、ウイルス抗原がＡｂｂｏｔｔ社のテストキット（ＨＩＶＡＧ−１　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）として商業的に入手されるモノクローナル抗体を用いてテストしそして（ＨＩＶ−１）ｐ２４に指向させることにより可能になる。ウイルス型ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２における逆転写酵素含量が略等しいことは知られている。そこで可溶化されたウイルスの希釈液について抗原抗体反応によって得られる吸光度（Ｅ４９０ｎｍ）を逆転写酵素の活性に対してプロットすると大体図２に相当するグラフが得られる。ここでわかることは、ＨＩＶ−１における逆転写酵素含量に比例して使用モノクローナル抗体にはｐ２４に対する極めて高い結合親和性が存在することである。それに対し、ＨＩＶ−２については、モノクローナル抗体をこの場合も逆転写酵素含量に関係させて用いた場合極めてわずかな対ｐ２４結合親和性しか認められない。この測定をＭＶＰ−５１８０／９１について行うとかなり正確にＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の曲線の中間にくる、すなわちモノクローナル抗体の結合親和性はＨＩＶ−１よりも低下している。図２はこれらの事実を図示したものであり、ここでＲＴは逆転写酵素を意味し、そして抗原（Ａｇ）としては、Ａｂｂｏｔｔ社より購入されるテストキットに存在するモノクローナル抗体がそれに対して指向するタンパク質ｐ２４が用いられる。
　【００１０】
　多面的に利用可能な遺伝子工学系はいわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）であり、その場合、この方法の実施に必要な成分は購入することができる。この方法を用いれば、増幅すべき配列のＤＮＡ領域が知られていればＤＮＡ配列を増幅することができる。その際、増幅すべき核酸配列の短い領域に付着する短い相補ＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド＝プライマー）を合成する必要がある。テストの実施には、そのほかにポリメラーゼとヌクレオチドトリホスフェートを含有する反応混合物中でＨＩＶ−核酸をそのプライマーと混合する。重合（ＤＮＡ合成）を一定の時間行った後、核酸鎖を加温により分離させる。冷却後、重合を改めて開示させる。従って本発明によるレトロウイルスにおいてＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスが問題とされる場合には、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ウイルスの既知配列内で保存されたプライマーを用いて核酸を増幅し得たはずであろう。そのようなプライマーは一部報告されている（ｐｏｌ３およびｐｏｌ４についてはＬａｕｒｅ，Ｆ．ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ，（１９８８）５３８−５４１、またはｓｋ３８／３９、ｓｋ６８／６９についてはＯｕ　Ｃ．Ｙ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　
２３９
　【００１１】
　今般次の配列を示す一定のプライマー対、すなわち
　【化１】
　【００１２】
またはｐｏｌ３およびｐｏｌ４と
　　ＵＮＩ−１：ＧＴＧＣＴ　ＴＣＣＡＣ　ＡＧＧＧＡ　ＴＧＧＡＡ
　　ＵＮＩ−２：ＡＴＣＡＴ　ＣＣＡＴＧ　ＴＡＴＴＧ　ＡＴＡ
　　（Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ　Ｌ．Ａ．ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　
２８
との組合せを用い、そしてネステッド・プライマー（ｎｅｓｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒ）を用いたＰＣＲを行うとＭＶＰ−５１８０／９１−ＤＮＡの弱い増幅物が得られることがわかった。
　【００１３】
　次のプライマー配列
　【化２】
を用いると、増幅物は全く得られなかったが、ＨＩＶ−１に比べ弱い増幅物しか得られなかったが、これは場合によっては汚染によるかもしれない。
　【００１４】
を用いるとＨＩＶ−１に比べ弱いが使用ＨＩＶ−２単離物（ＭＶＰ−１１９７１／８７）と同じ強さを示す増幅物が得られた。
　【００１５】
　広く普及しているＨＩＶ−抗体の検出方法は、いわゆるウエスターンブロット（免疫ブロット）である。その場合、ウイルスタンパク質はゲル電気泳動的に分離された後、膜に移される。その移されたタンパク質を有する膜は次に検査すべき患者の血清を結合させる。ウイルスタンパク質に対する抗体が存在すれば、これはそのタンパク質に結合する。洗浄後はウイルスタンパク質に対する特異的抗体のみが残る。その抗体は次に、呈色反応を触媒する酵素と規則的にカップリングされた抗抗体により視認可能にできる。この方法により、ウイルスタンパク質のバンドを可視化することとができる。
　【００１６】
　本発明によるウイルスＭＶＰ−５１８０／９１はウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２に対し、ウェスターンブロットにおいて二つの著しい本質的相違点を示す。ＨＩＶ−１は、タンパク質ｐ２４に対応する強いバンドと、ｐ２３に対応する極めて弱い、しばしばほとんど視認できないバンドを規則的に示す。ＨＩＶ−２はタンパク質ｐ２５に対応する強力なバンドを、そして多くの場合にｐ２３に対応する弱いバンドを示す。これとは対照的に、本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１ウイルスはタンパク質ｐ２４およびｐ２５に相当するほぼ同じ強さの二本のバンドを示す。
　【００１７】
　もう一つの著しい相違点は逆転写酵素に対応するバンドに存在する。ＨＩＶ−１は逆転写酵素に相当する一本のバンド（ｐ５３）とＲＮエースＨと結合した逆転写酵素に相当する一本のバンド（ｐ６６）を示す。ＨＩＶ−２ではその逆転写酵素はタンパク質ｐ５５に相当し、またそれがＲＮエースＨと結合している場合はタンパク質ｐ６８に相当する。それに対し本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１は、タンパク質ｐ４８のところに逆転写酵素に相当する一本のバンド、およびタンパク質ｐ６０のところにＲＮエースＨと結合した逆転写酵素に相当する一本のバンドを示す。
　これらの結果から、ＭＶＰ−５１８０／９１の逆転写酵素はＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の逆転写酵素よりも約３〜約７キロダルトン小さい分子量を有すると結論することができる。ＭＶＰ−５１８０の逆転写酵素は従ってＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２の逆転写酵素よりも約４，５００〜約５，５００ダルトン小さい分子量を示す。
　【００１８】
　本発明によるウイルスＭＶＰ−５１８０／９１を用いた場合、抗−ｅｎｖ−抗体は免疫不全の徴候を示すドイツの患者の血清中にはほんの弱くに検出され得るにすぎないが、本発明によるウイルスに代えてＨＩＶ−１ウイルスを用いるとそれらの血清が強く反応することが見出された。この強力な検出反応はとりわけｇｐ４１タンパク質に局在した。それらの試験では、一方はドイツの患者に由来し、そして他方は免疫不全の徴候を示すアフリカの患者に由来する血清パネルを対比した。
　前述の諸特徴が本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１に相当するようウイルス変異株を特徴付ける。従って、免疫不全徴候を示しそして好ましくはアフリカに由来する人々に由来するヘパリン加供血者血液から免疫不全ウイルスが単離されれば、この方法により本発明によるウイルスまたはその変異株を得ることができる。
　【００１９】
　前述の性質を示すウイルスが単離されたのでｃＤＮＡのクローニングを次の方法により行うことができる：そのウイルスを相応の量（約１リットル）の培養液から沈殿させ、そしてホスフェート緩衝食塩水にとる。次に（２０％）サッカロース−パッドを通してペレット化を行う。そのウイルスペレットは、２０ｍＭジチオトレイトールおよび０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ　ｐ４０中の６Ｍグアニジニウムクロライド中に懸濁することができる。ＣｓＣｌを２Ｍ濃度になるまで添加しそしてその破砕されたウイルスを含有する溶液を塩化セシウムパッドに適用する。次いでウイルスＲＮＡを遠心分離によりペレット化し、溶解し、フェノール抽出し、そしてエタノールおよび塩化リチウムを用いて沈殿させる。オリゴ（Ｔ）−プライマーを用いて第一ｃＤＮＡ鎖の合成をウイルスＲＮＡまたはその一部で行う。逆転写酵素を添加しての合成は購入により入手されるキットを用いて行うことができる。第二鎖の合成にはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ鎖をＲＮエースＨで希釈しそして大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて合成される。次いでＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ平滑末端を作ることができ、そしてこれを制限切断部位に適したリンカーと結合させる。適切な制限エンドヌクレアーゼによる制限消化の後、ｃＤＮＡ断片をアガロースゲルから単離し、そして予め適切な方法で切断されたベクターに結合する。ｃＤＮＡ−インサートを有するそのベクターを次いでコンピテント大腸菌細胞の形質転換に用いることができる。得られたコロニーを次いで膜に移動し、溶菌させそして変性させ、そして最後にハイブリダイゼーションにより、ジゴキシゲニンまたはビオチンで標識された核酸と結合させる。相当するｃＤＮＡの遺伝子工学的調製後、レトロウイルスに由来する目的とするＤＮＡ断片の単離が可能である。適切な発現ベクター中でこの断片を構築することにより、次いで目的とするタンパク質またはタンパク質断片を発現させ、そして診断テストに適用することができる。
　【００２０】
　前述の方法とは別の選択肢として、免疫不全ウイルスをＰＣＲ法を用いてクローン化でき、その際前述のプライマーを用いることができる。
　様々なウイルス単離物の間の類似性を核酸またはタンパク質配列の相同度により絞り出すことができる。例えば５０％相同性は配列中の１００のヌクレオチド−またはアミノ酸−位のうち５０が一致することを意味している。タンパク質の相同性は配列分析により決定される。相同ＤＮＡ配列はハイブリダイゼーション法によっても調べることができる。
　【００２１】
　本発明によれば、まず外被タンパク質の一部について配列決定がされたところ、この配列がＨＩＶ型のウイルスの相当する配列に対して比較的わずかな相同性しか示さないことが確認された。特にｇｐ４１領域に関しては、データバンクを利用して行われたＨＩＶ−配列との比較によって高々６６％（核酸配列）の相同性が見出されたにすぎない。
　更に、ｇｐ４１をコードする領域も配列決定された。この配列を第１表または第３表に示す。
　【００２２】
　従って本発明の主題は、第１表および／または第３表のヌクレオチド配列に関し、本発明によるＨＩＶウイルス、ＭＶＰ　５１８０／９１に対して６６％以上、好ましくは７５％以上、そして特に好ましくは８５％以上の相同性を示すようなウイルスである。
　更に本発明の主題は、少くとも５０、好ましくは１００、ヌクレオチド長の第３表に記載の核酸配列の部分配列に対して６６％以上、好ましくは７５％以上、そして特に好ましくは８５％以上の相同性を示すようなウイルスである。これは、少くとも１６、そして好ましくは３３、のアミノ酸のアミノ酸長に相当する。
　【００２３】
　本発明によるウイルスはその配列によって従来より知られるウイルスとは区別される。従って本発明の主題は、相同度により相違度を確認した場合に本発明によるウイルスの配列に広範に対応するようなウイルスおよび相当する核酸またはアミノ酸配列である。従って例えば８５％以上の相同性は、１００のヌクレオチドまたはアミノ酸のうち少くとも８５において同じヌクレオチドまたはアミノ酸を示し残りは異なっていてもよいような配列が包含されることを意味する。相同性を確認するにあたって、両配列はできるだけ多くの相互に対応するヌクレオチドまたはアミノ酸が相互に一致するように対応される。
　【００２４】
　本発明によるウイルスのＤＮＡ配列として記載された（ほぼ）完全な配列を第７表に示す。ここで本発明の主題は第７表による配列を示すウイルス、および第７表の配列に対し高い相同性を示すそれらの変異株、およびそれらより導かれる、診断的に使用できるかまたは接種素として通用できるタンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドである。
　【００２５】
　単離された配列に基づき免疫支配エピトープ（ペプチド）を調製し（ｋｏｎｆｅｋｔｉｏｎｉｅｒｔ）合成することができる。ウイルスの核酸配列がわかっているので当業者はそれよりアミノ酸配列を導くことができる。アミノ酸配列の部分領域を第３表に記述する。従って本発明の主題は、第７表または第４表に開示された情報を用いて調製することができる抗原、すなわちタンパク質、オリゴペプチドまたはポリペプチドでもある。これらの抗原、タンパク質、ポリペプチドおよびオリゴペプチドは、第７表から導き得る、または第３表に記載されているアミノ酸配列を示す。それら抗原またはペプチドは第３表に記載されているかまたは第７表より導き得るアミノ酸配列の比較的短い部分配列を示すことができる。このアミノ酸配列は、少くとも６アミノ酸長、好ましくは少くとも１０アミノ酸長、そして特に好ましくは１５アミノ酸長である。これらのペプチドは組換え法によるだけでなく合成法によって調製することもできる。適当な調製方法の一つはＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型の固相合成である。この方法の更なる記述および他の従来技術として知られる方法は文献、例えばＭ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ　Ｗｅｅｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，第二版，１９７６にみることができる。
　【００２６】
　診断テストにおいては、検査すべき人の血清検体をＭＶＰ−５１８０／９１に由来する一以上のタンパク質または糖タンパク質（それらは真核細胞系統において発現させることができる）のタンパク鎖またはその一部と混合する。好ましいテスト方法には免疫蛍光または免疫酵素テスト法（例えばＥＬＩＳＡ、イムノブロット）が包含される。
　免疫酵素テスト（ＥＬＩＳＡ）においては、例えばＭＶＰ−５１８０／９１またはその変異株に由来する抗原をミクロタイタープレートの壁面に結合することができる。その際に用いられる用量はテストシステムおよびミクロタイタープレートの操法に本質的に依存する。次いで検査すべき人に由来する血清または血清希釈液をそのミクロタイタープレートの穴に添加する。一定のインキュベーション時間の後、そのプレートを洗浄する。特異免疫複合体は、ヒト免疫グロブリンに特異的に結合しそして予め酵素例えば西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼなどに結合しておいた抗体により、あるいは酵素標識抗原を用いて検出される。この酵素は無色基質を強く発色した生成物に変えることができ、次いでその色の強さで特異抗−ＨＩＶ−抗体の存在を読み取ることができる。テストシステムにおける本発明ウイルス利用のもう一つの可能性はウェスターンブロットへの利用である。
　【００２７】
　たとえ、免疫不全疾患に対する接種素の調製が極端に困難であるとわかっても、このウイルスまたはその一部、すなわち免疫支配エピトープおよび細胞性免疫のインデューサー、あるいは遺伝子工学的に調製された抗原は接種素の開発および調製に用いることができる。
　【００２８】
　実施例１
　本発明による免疫不全ウイルスＭＶＰ−５１８０／９１を免疫不全徴候を伴う女性患者の血液から単離した。そのために、ＨＩＶに感染していない供血者の血液からの末梢リンパ球（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　ｂｌｏｏｄ　ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＰＢＬ）および末梢単核細胞（末梢血リンパ球、ＰＢＬ）を植物性血球凝集素（フィトヘマグルチニン）で刺激しそして培養液に保った。そのために、１０％牛胎仔血清含有の普通培地ＲＰＭＩ　１６４０を用いた。培養条件はＬａｎｄａｙ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，
１６１
　【００２９】
　ＨＩＶウイルス増殖が確認できた後、ＨＩＶで感染されていない健常供血者の血液からの新鮮末梢リンパ球（ＰＢＬ）を初代培養液上清で感染させた。この段階を反復した後その上清でＨ９またはＨＵＴ７８細胞を感染させた。この方法により免疫不全ウイルスの永続的生産が可能であった。そのウイルスはＥＣＡＣＣにＮｏ．Ｖ　９２０　９２　３１８の番号で寄託された。
　【００３０】
　実施例２
　ＨＩＶ感染の検出には、現在のところいわゆるウェスターンブロットまたはイムノブロットが標準的方法である。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．
１５
ウイルス型：ドイツの患者から単離されたＨＩＶ−１ウイルス
　ドイツの血清　　強い反応
　アフリカの血清　ｇｐ４１と強い反応
ウイルス型：ＭＶＰ−５１８０／９１
　ドイツの血清　　ｇｐ４１と無反応乃至弱い反応
　アフリカの血清　強い反応
　【００３１】
　前述の結果は、ドイツの患者から単離されたＨＩＶ−１型ウイルスをＨＩＶ−感染の検出に用いる場合、患者が本発明によるＭＶＰ−５１８０／９１に相当するウイルスに感染しているときは、一義的結果は多分全く得られないことを示している。さらにそれによって、本発明によるウイルスを用いればゲノム全体に関し少くとも約８５％相同性を本発明ウイルスに対して示すようなウイルスを検出できると結論される。
　【００３２】
　実施例３
　実施例２に記載の手順に従ってさらなるウェスターンブロットを行った。その結果を添付した図３に示す。このテストでは、本発明による免疫不全ウイルスＭＶＰ−５１８０／９１のウイルスタンパク質、およびＨＩＶ−１型ウイルス（ＭＶＰ−８９９）のウイルスタンパク質をそれぞれ、ゲル電気泳動分離した後セルロースフィルターに移した。これらフィルター片を様々な患者の血清と共にインキュベートした後特異抗体を呈色反応により視認できるようにした。ＭＶＰ−５１８０の標題のある図の左半分は本発明による免疫不全ウイルスを示す。図の右半分は、ＨＩＶ−１ウイルスに関係する、ドイツの供血者から単離されたウイルス（ＭＶＰ−８９９）を示す。
　それら個々のフィルター片を今度は様々な患者の血清と共にインキュベートした。図３からわかるように、それぞれ同じ（ドイツの患者の）血清を各々２つのフィルター片と反応させた。８と２６；９と２７；１０と２８；１１と２９；１３と３０；１３と３１；１４と３２；１５と３３および１６と３４の番号は同じ血清を表示している。１７および１８番のウェスターンブロットでは、アフリカの患者の血清を適用した。右側余白の数値は概ねの分子量を１０００（ＫＤ）単位で記述したものである。
　【００３３】
　図３は、本発明による免疫不全ウイルスを有するドイツの患者の血清がウェスターンブロットにおいてｇｐ４１とは極めて弱くしか反応しないことを明らかに示している。これに対し、アフリカの患者の血清は本発明による免疫不全ウイルスと極めて強く反応する。従って図３は、本発明による免疫不全ウイルスを用いればＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２ウイルスを用いた場合には不確かな、すなわち一義的でない陽性結果しか得られないような免疫不全感染を検出できることを明らかにしている。この検出可能性は遠大な診断上の意義を有し得る。何故ならば、ウェスターンブロットで不確かな結果しか得られない場合は、免疫不全ウイルスによる感染が関係しているかどうかを明確な確実さをもって確認することができないからである。しかしながら本発明による免疫不全ウイルスを用いてかかる不確かな結果が本発明によるタイプのウイルスによる感染と相関させることができるところ、これは診断上大変な進歩である。
　【００３４】
　実施例４
ＨＩＶ−単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム断片のＤＮＡ単離、増幅および構造的特徴評価
　ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞よりのゲノムＤＮＡを標準的方法により単離した。
　単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム領域の特徴評価をするためにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を外被タンパク質領域ｇｐ４１からのプライマー対を用いて行った。そのＰＣＲ実験の実施は次の改変を加えたＳａｉｋｉら（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７−４９１，１９８８）の方法により行った：ＨＩＶ−特異的ＤＮＡ領域を増幅するために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの５μｌのゲノムＤＮＡを１００μｌの反応混合物（０．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー１およびプライマー２、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ８．３、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社））にピペットで取り、そして次の温度プログラムに従って増幅した：１．初期変性：３分９５℃、２．増幅：９０秒９４℃、６０秒５６℃、９０秒７２℃（３０サイクル）。
　【００３５】
　前記ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に用いたプライマーはＢｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ社のオリゴヌクレオチド合成装置８７５０で合成された。
　　プライマー１：ＡＧＣ　ＡＧＣ　ＡＧＧ　ＡＡＧ　ＣＡＣ　ＴＡＴ　ＧＧ
　　（ＨＩＶ単離物Ｈ×Ｂ２からの座標（コーディネート）：塩基７７９５−７８１４、プライマーｓｋ６８に相当）
　　ライマー２：ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＴＣＣ　ＡＧＡ　ＧＣＡ　ＡＣＣ　ＣＣ
　　（ＨＩＶ１単離物Ｈ×Ｂ２からの座標：塩基８００３−８０２２、プライマーｅｎｖ　ｂに相当）。
　【００３６】
　増幅したＤＮＡを３％“Ｎｕｓｉｅｖｅ”アガロースゲル（Ｂｉｏｚｙｍｅ社）で分離し、増幅した断片を切り取りそして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ（０．０９Ｍ　Ｔｒｉｓ　ボレート、０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と混合した。そのＤＮＡ−アガロースゲル混合物を７０℃で１０分間インキュベートし、次いでフェノール抽出した後、そのＤＮＡを水性相から１／１０容の３Ｍ　ＮａＡｃ（ｐＨ５．５）および２容のエタノールを添加することにより−２０℃で１５分間沈殿させ、次いで遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）でペレット化した（１３０００ｒｐｍ、１０分、４℃）。ペレット化したＤＮＡを乾燥し、水にとり、そして分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ社）において２６０ｎｍでのＤＮＡ濃度を光度計測定した後、Ｓａｎｇｅｒ（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５４６３，１９７７）の方法により配列決定した。Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた配列決定に代えてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のキット（“Ｔａｑ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”、注文番号（Ｂｅｓｔ．−Ｎｒ．）：４０１１５０）を用いて配列決定反応を行った。プライマーとしては別々の配列決定反応にプライマー１またはプライマー２（各１μＭ）を適用した。配列決定反応系の分析はＤＮＡ配列決定装置３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で、装置製造元の指示に従って行われた。
　増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれたアミノ酸配列を第１表に示す。
　【００３７】
　【表１】
　【００３８】
　実施例５
　確認された第１表記載のヌクレオチド配列の相同配列をＧＥＮＥＢＡＮＫデータバンク（リリース７２、１９９２年６月）でＧＣＧ−コンピュータープログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．社、米国ウイスコンシン州、バージョン７．１、１９９２年３月）を用いて調べた。このデータバンクには１９９２年７月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。
　【００３９】
　第１表のヌクレオチド配列は最良の場合にはチンパンジーからの単離物に対し６６％の相同性を示す。ＨＩＶ１単離物に対して、ＭＶＰ５１８０／９１は調べたＤＮＡ配列において最良の場合に６４％相同である。ＨＩＶ２単離物に対し第１表のＤＮＡは５６％相同である。チンパンジーからの単離物の外には第１表のヌクレオチド配列と霊長類からの単離物（ＳＩＶ：サル免疫不全ウイルス）からのＤＮＡ断片の間の最良の相同性は、単離物ＳＩＶ（アフリカ産オナガザル）ＴＹＯ−１の外被タンパク質の部分領域をコードするＤＮＡ配列に存在する。その相同性は６１．５％である。
　【００４０】
　実施例６
　確認された第１表に記載のアミノ酸配列の相同配列をＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データバンク（リリース２２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバンクには１９９２年６月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほとんどが含まれている。
　【００４１】
　第１表記載のアミノ酸配列は前述のチンパンジーからの単離物の外被タンパク質断片に対し最良の場合６２．５％相同である。ＨＩＶ１−外被タンパク質の下では、第１表のアミノ酸配列との最良の相同性は単離物ＨＩＶ１　Ｍａｌに認められる。その相同性は５９％である。ＨＩＶ２−外被タンパク質に対しては第１表のアミノ酸配列との相同性は最良の場合５２％（単離物ＨＩＶ２　Ｒｏｄ）である。ＨＩＶ１およびＨＩＶ２−単離物も最良の場合対応するタンパク質断片においてわずか６４％が一致するに過ぎないことから、単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の場合はＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは明らかに構造的に区別され従ってそれらから独立したＨＩＶウイルス群の代表であるＨＩＶ変異株が関係していると思われる。
　【００４２】
　ＨＩＶ単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の増幅されたＤＮＡ領域のアミノ酸配列（第１表）は、ＨＩＶ１の外被タンパク質の免疫診断的に重要な領域（アミノ酸５８４−６１８＊）とオーバーラップする（第２表）（Ｇｎａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５６：２６１−２６７，１９８７；Ｎｏｒｒｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：２４８−２５０，１９８７）。
　ＨＩＶ２およびＳＩＶの外被タンパク質の対応するアミノ酸領域も同様に免疫診断的に保存されている（Ｇｎａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．１３４６−１３４９，１９８７）。従ってＨＩＶ１およびＨＩＶ２のこの外被タンパク質領域からのペプチドは多くの商業的に入手し得るＨＩＶ　１／２抗体スクリーニングテストに固相抗原として適用される。それによって約９９％の抗ＨＩＶ１および抗ＨＩＶ２陽性血清を捕捉することができる。
　【００４３】
　ＭＶＰ−５１８０／９１−外被タンパク質のアミノ酸領域（第１表）は、ｇｐ４１の免疫診断的に重要な領域とオーバーラップしていることから、血清診断的に重要であり得る。特に、ＨＩＶ感染した患者の抗血清が商業的に入手される抗体スクリーニングテストのいずれとも陽性に反応しない場合にはそうである。これらの場合には、ＭＶＰ−５１８０／９１と密接な関係にあるウイルスによる感染が存在し得る。
　【００４４】
　【表２】
　【００４５】
　実施例７
（ｇｐ４１をコードする）ＨＩＶ単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム診断のＤＮＡ単離、増幅および構造的特徴評価
　ＭＶＰ−５１８０／９１に感染したＨＵＴ７８細胞からのゲノムＤＮＡを前述の如く単離した。
　単離物ＭＶＰ−５１８０／９１のゲノム領域の特徴評価を行うために、外被タンパク質領域ｇｐ４１からのプライマー対を用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）実験を行った。ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７−４９１，１９８８）および逆ＰＣＲ（Ｔｒｉｇｌｉａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｓｉｄｓ，Ｒｅｓ．
１６
　【００４６】
　１．ＰＣＲ
　ＨＩＶ−特異的ＤＮＡ領域を増幅するために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの５μｌ（２１８μｇ／ｍｌ）のゲノムＤＮＡを１００μｌの反応混合物（０．２５ｍＭ　ｄＮＴＰ、各１μＭのプライマー１６３ｅｎｖおよびプライマーｅｎｖｅｎｄ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００１％ゼラチン、２．５単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ社））にピペットでとりそして次の温度プログラムに従って増殖した：１．初期変性：３分間９５℃、２．増幅：９０秒間９４℃、６０秒間５６℃、９０秒間７２℃（３０サイクル）。
　【００４７】
　２．ｇｐ４１の５′領域（Ｎ−末端）およびｇｐ１２０の３′配列を“逆ＰＣＲ”により増幅した。そのために、ＭＶＰ−５１８０／９１に感染させたＨＵＴ７８細胞からの１００μｌのゲノムＤＮＡ調製物（２１８μｇ／ｍｌ）を１０単位の制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３ａを含む２００μｌの最終容量中３７℃で１時間消化した。そのＤＮＡを次にフェノール処理し、そして酢酸ナトリウム（最終濃度３００ｍＭ）および２．５容エタノールを用いて−７０℃で１０分間沈殿させ、エッペンドルフ遠心分離機で遠心分離し、そしてそのペレットを乾燥しそして８９０μｌの蒸留水に再懸濁した。１００μｌのリガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、ｐＨ７．８、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌ牛血清アルブミン）および１０μｌのＴ４　ＤＮＡ−リガーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社、マンハイム）を添加した後、それらＤＮＡ断片を室温で３時間結合し、改めてフェノール処理し、そして前述の如く酢酸ナトリウムおよびエタノールを用いて沈殿させた。遠心分離および乾燥後、そのＤＮＡを４０μｌの蒸留水に再懸濁し、そして１０単位の制限エンドヌクレアーゼ　Ｓａｃ　Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社、マンハイム）を用いて１時間消化した。次に５μｌのこの混合物を“１．ＰＣＲ”に記載の如くＰＣＲ実験に適用した。プライマー１６３ｅｎｖおよびｅｎｖｅｎｄに代えてプライマー１６８；および１６９；を逆ＰＣＲに用いた。
　【００４８】
　それらプライマー１６３ｅｎｖ、１６８；および１６９；は、ＨＩＶ−単離物ＭＶＰ−５１８０のすでに確認されている部分配列から選択した（実施例４）。
　ＰＣＲ／逆ＰＣＲおよびヌクレオチド配列決定に用いられたプライマーはＢｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ社のオリゴヌクレオチド合成装置８７５０で合成したところ、該プライマーは次の配列を示す：
　【００４９】
　増幅されたＤＮＡを３％“Ｎｕｓｉｅｖｅ”−アガロースゲル（Ｂｉｏｚｙｍｅ社）で分離し、増幅された断片を切り取りそして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ（０．０９Ｍ　Ｔｒｉｓボレート、０．００２Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）と混合した。そのＤＮＡ−アガロースゲル混合物を７０℃で１０分間インキュベーションし次いでフェノール抽出した後、ＤＮＡを水性相から１／１０容の３Ｍ　ＮａＡｃ、ｐＨ５．５および２容のエタノールを用いて−２０℃で１５分間沈殿させ、次いでエッペンドルフ遠心分離機でペレット化した（１３０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）。そのペレット化されたＤＮＡを乾燥し、水にとり、そして分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ社）により２６０ｎｍでのＤＮＡ濃度を光度計測定した後、Ｓａｎｇｅｒ（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，７４：５４６３，１９７７）の方法に従って配列決定した。Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼを用いた配列決定に代えてＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のキット（“Ｔａｑ　Ｄｙｅ　Ｄｅｏｘｙ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　Ｃｙｃｌｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”、注文番号：４０１１５０）を用いて配列決定反応を行った。プライマーとしては別々の配列決定反応にプライマー１６３ｅｎｖまたはプライマーｅｎｖｅｎｄ（各１μＭ）を適用した。この逆ＰＣＲ実験で増幅されたＤＮＡをプライマー１６８；および１６９；を用いて配列決定した。配列決定反応の分析はＤＮＡ配列決定装置３７３Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）で装置製造元の指示に従って行われた。
　増幅されたＤＮＡ領域のヌクレオチド配列およびそれより導かれたアミノ酸配列を第３表に示す。
　【００５０】
　【表３】
　【００５１】
　【表４】
　【００５２】
　実施例８
　確認された第３表記載のヌクレオチド配列の相同配列をＧＥＮＥＢＡＮＫ−データーバンク（リリース７２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．社、米国ウイスコンシン州、バージョン７．１、１９９２年３月）を用いて調べた。このデータバンクには１９９２年７月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のヌクレオチド配列のほとんどが含まれている。
　第３表記載のヌクレオチド配列はＨＩＶ１−単離物に対して最良の場合６２％相同性を示す。ＨＩＶ２単離物に対して第５表記載のＤＮＡは５０％相同である。
　第３表のヌクレオチド配列から導かれるアミノ酸配列の相同配列をＳＷＩＳＳＰＲＯＴタンパク質データバンク（リリース２２、１９９２年６月）においてＧＣＧ−コンピュータープログラムを用いて調べた。このデータバンクには１９９２年６月までに知られた、ヒト起源の免疫不全ウイルスのおよび霊長類からの単離物のタンパク質配列のほとんどが含まれている。
　【００５３】
　第３表記載のアミノ酸配列はチンパンジーからの単離物ＣＩＶ（ＳＩＶｃｐｚ）の相当する外被タンパク質断片に対し最良の場合５４％相同であり、そしてＨＩＶ１単離物Ｍａｌに対して５４．５％相同である。ＨＩＶ２−外被タンパク質に対する第３表記載のアミノ酸配列の相同性は最良の場合３４％（単離物ＨＩＶ２Ｄ１９４）である。
　それに対し、ＨＩＶ１のｇｐ４１−アミノ酸配列をＳＷＩＳＳＲＰＯＴ−データバンクに存在するＨＩＶ１　ｇｐ−４１配列と比較すると期待されたとおり最良の場合ほぼ１００％の相同性、そして最悪の場合に７８％の相同性が得られる。
　第３表記載の配列領域とＨＩＶ１およびＨＩＶ２の対応する断片との間にこのような明らかな構造的相違があることから、単離物ＭＶＰ−５１８０／９１の場合は、ＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは明らかに構造的に区別されるＨＩＶ変異株が関係していると思われる。おそらくＭＶＰ−５１８０／９１はＨＩＶ１およびＨＩＶ２とは区別される特別なＨＩＶウイルス群に帰属すると思われる。
　【００５４】
　ＨＩＶ１−外被タンパク質領域のアミノ酸５８４−６１８のペプチドは血清診断的に特に重要である（番号付けは次による：Ｗａｉｎ　Ｈｏｂｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　４０：９−１７，１９８５，Ｇｎａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．１５６：２６１−２６７，１９８７；Ｎｏｒｒｂｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：２４８−２５０，１９８７）。ＨＩＶ２およびＳＩＶの外被タンパク質の相当するアミノ酸領域も同じく免疫診断的に保存されている（Ｇｎａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．１３４６−１３４９，１９８７）。従ってＨＩＶ１およびＨＩＶ２のこの外被タンパク質領域からのペプチドは多くの商業的に入手し得るＨＩＶ　１／２　抗体スクリーニングテストに固相抗原として適用される。それによって約９９％の抗−ＨＩＶ１および抗−ＨＩＶ２陽性血清を捕捉することができる。
　ＭＶＰ−５１８０／９１外被タンパク質の相当するアミノ酸領域（第４表）およびこの単離物のｇｐ４１全体は、ＨＩＶ感染患者の抗血清が商業的に入手される抗体スクリーニングテストにおいてほんの弱くしかあるいはそもそも全く反応しない場合に特に血清診断的に重要であり得る。これらの場合には、ＭＶＰ−５１８０／９１と密接な関係にあるウイルスによる感染が存在し得る。
　【００５５】
　【表５】
　【００５６】
　ＭＶＰ５１８０に由来する情報を用いて確認されたペプチドは従って次のアミノ酸配列を有する：ＲＬＱＡＬＥＴＬＩＱＮＱＱＲＬＮＬＷＧＣＫＧＫＬＩＣＹＴＳＶＫＷＮＴＳ。
　従って本発明の主題は、組換えまたは合成により調製することかでき、そして前述の配列または、少くとも６個の連続するアミノ酸、好ましくは９個そして特に好ましくは１２個の連続するアミノ酸を示す部分配列を示すペプチドである。
　【００５７】
　実施例９
ＨＩＶ単離物ＭＶＰ５１８０の全ゲノムのクローニング
ａ）　ゲノムライブラリーの調製
　ＭＶＰ５１８０感染ＨＵＴ７８細胞由来のゲノムＤＮＡを前述の如く単離した。
　３００μｇのこのＤＮＡを７７０μｌの容量として０．２４Ｕの制限酵素Ｓａｕ３Ａと共に４５分間インキュベートした。それによって部分的にのみ切断されたＤＮＡを次いで０．７％アガロース（低融点アガロース、Ｎｕｓｉｅｖｅ）でサイズ分画し、そして１０ｋｂと２１ｋｂの間の断片を切り取った。そのアガロースを７０℃で１０分間溶融し、そして等容の緩衝液（１×ＴＢＥ、０．２Ｍ　ＮａＣｌ）と混合した。次いでフェノールで２回、そしてクロロホルムで１回抽出した後、１／１０容の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．９）および２．５容のエタノールの添加により−７０℃で１０分間ＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを遠心分離し、乾燥しそして１μｇ／μｌ濃度で水に溶解した。
　【００５８】
　サイズ分画されたＤＮＡの収量は約６０μｇであった。５μｇのこのＤＮＡを１Ｕアルカリ性ホスファターゼと共に相当する緩衝液中、３７℃で２０分間インキュベートした。５′−末端ホスフェート残基を分離することによってサイズ分画されたＤＮＡの過度の多重な挿入を減少させた。そのホスファターゼ処理をフェノール処理により停止し、ＤＮＡを前述の如く沈殿させ、１μｇのベクター（２　ＤＡＳＨ、ＢａｍＨＩ切断Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｎｏ．：２４７６１１）と、全容量を６μｌとして２Ｗｅｉｓｓ単位のラムダＴ４リガーゼを用いて１５℃で１２時間結合した。結合が行われた後、そのＤＮＡをパッキングキット（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩ　Ｇｏｌｄ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｎｏ．：２４７６１１）を用いて製造元の指示に正しく従ってファージ外被にパッキングした。
　【００５９】
ｂ）　ＤＮＡプローブの放射性標識
　標識にはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ社の“ラムダ・プライムド・ＤＮＡ・ラベリング・キット（Ｒａｎｄｏｍ　Ｐｒｉｍｅｄ　ＤＮＡ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ）”（Ｎｏ．：７１３　０２３）を適用した。実施例３に記載の如くプライマーｓｋ６８およびｅｎｖｂを用いて得られたＰＣＲ生成物を標識した。１μｇのこのＤＮＡを２×５分間煮沸した後氷水中で冷却することにより変性した。標識のために５０ｍＣｉ〔α−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰ（ＮＥＮ，Ｎｏ．：ＮＥＸ−０５３Ｈ）を添加した。その他の添加物質を製造元の指示に従ってピペットで添加した。３７℃で３０分間インキュベーションした後、放射性標識済みのＤＮＡを沈殿させた。
　【００６０】
ｃ）　ファージ−ライブラリーのスクリーニング
　２００μｌの３０℃で一夜培養した培養液（１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４のほか０．２％マルトースを含有するＬＢ培地中のＳＲＢ（Ｐ２）株〔Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｎｏ．：２４７６１１〕）に、１００μｌのＳＭ緩衝液（５．８ｇのＮａＣｌ、２ｇのＭｇＳＯ４、５０ｍｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、および５ｍｌの２％ゼラチン溶液を１リットルのＨ２Ｏに溶解）中の２００００ｐｆｕ（プラーク形成単位）のライブラリーを添加し、ファージを２０分間３７℃で細菌に吸着させ、７．５ｍｌの５５℃に冷却したＴｏｐ−アガロースと混合しそして予め加温した直径１４ｃｍのＬｂ−寒天プレートで分別した。約８時間後にプラークが全面に及んだ。そこでプレートにニトロセルロースフィルターを数分間重ねそして非対称的マーキングを設けた。注意深く取り除いた後そのフィルターを２分間変性し（０．５Ｍ　ＮａＯＨ、１．５Ｍ　ＮａＣｌ）そして次に５分間中和した（０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１．５Ｍ　ＮａＣｌ）。そのフィルターを次に８０℃で６０分間ベーキング後プローブとハイブリダイズさせることができた。
　【００６１】
　プレハイブリダイゼーションを行うべき、そのフィルターをフィルター１枚あたり１５ｍｌのハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および０．１ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）中、４２℃で振盪しながら２〜３時間インキュベートした。〔３２Ｐ〕標識ＤＮＡプローブを２〜５分間１００℃で変性し、氷冷し、プレハイブリダイゼーション溶液を添加しそして１２時間４２℃でハイブリダイズした。次にそのフィルターを６０℃で、まず２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで、次に０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄した。そのフィルターを乾燥後、ハイブリダイゼーションシグナルをレントゲンフィルムＸ−ＯＭＡＴＴＨＡＲ（Ｋｏｄａｋ社）を用いて検出した。
　あるシグナルを帰属させることができたプラークをＳＭ緩衝液で溶出後さらなる希釈段階で分離した。
　２×１０６プラークのスクリーニング後、下記のクローンを確認することができた。
　【００６２】
ｄ）　ファージＤＮＡの単離およびサブクローニング
　ＳＭ緩衝液中のファージ溶出液１０μｌを用いて宿主株ＳＲＢ（Ｐ２）の一夜培養物を、培養物の最初の濃密な増殖の後、約６〜８時間後に溶解（Ｌｙｓｅ）が行われるように感染させた。その溶解培養物から、９０００ｇで２回１０分間遠心分離することにより細胞残渣を分離した。次にファージを遠心分離（３５０００ｇ、１時間）によりペレット化し、７００μｌの１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４にとり、そしてタンパク質中間相（インターフェーズ）がもはやみられなくなるまでフェノール処理した。そこでファージＤＮＡを沈殿させ、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、そしてそれによって得られたＥｃｏＲＩ断片をベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ−（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｎｏ．：２１２２０８）にサブクローン化した。全部で４つのクローンが得られた：
　【００６３】
　【表６】
　【００６４】
　不足している塩基７４１６と７６５９の間の断片はプライマー１５７（ＣＣＡ　ＴＡＡ　ＴＡＴ　ＴＣＡ　ＧＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＡ　Ｇ）および２２６（ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＴＡ　ＴＡＡ　ＧＧＧ）を用いたＰＣＲにより得た。ＤＮＡ鋳型としてはクローンのファージＤＮＡを用いた。ＰＣＲの条件は次のとおりとした：１）初期変性：９４℃、３分間、２）増幅：１．５分間９４℃、１分間５６℃および１分間７２℃（３０サイクル）。
　ＤＮＡの配列決定は実施例４に記載の如く行った。全ゲノムからその鎖のほかに対向鎖も配列決定した。すべてのＥｃｏＲＩ切断部位の場合に、クローンのファージＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲによって、サブクローン移行時点で各々単一のＥｃｏＲＩ切断部位が関係していることが確認された。
　【００６５】
　【表７】
　ＭｖＰ５１８０／９１の全配列は次の第７表に示されている。
　【００６６】
　【表８】
　【００６７】
　【表９】
　【００６８】
　【表１０】
　【００６９】
　【表１１】
　【００７０】
　【表１２】
　【００７１】
　【表１３】
　【００７２】
　【表１４】
　【００７３】
　実施例１０
ＭｖＰ５１８０／９１の全配列の他のＨＩＶ１単離物からの区別
　以下の配列比較の基礎は、遺伝子バンク・リリース７５（１９９３年２月）、ＥＭＢＬ３３（１９９２年１２月）およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔ　２４（１９９３年１月）といったデータバンクであった。相同性比較はＧＣＧソフトウエア（バージョン７．２、１９９２年１０月、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ−Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ．ウイスコンシン）を用いて行われた。
　【００７４】
　まずアミノ酸レベルでＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶの配列をプログラム“Ｗｏｒｄｓｅａｒｃｈ”を用いてデータバンクと比較した。５０の最良の相同性をプログラム“Ｐｉｌｅｕｐ”を用いて各々相互比較した。その結果、ＭｖＰ５１８０／９１がＨＩＶ１系統に属するが極めて早い時期に、それどころか更にチンパンジーウイルスＳＩＶｃｐｚより前に分岐し、ＨＩＶ１の新しい亜科（サブファミリー）を代表していることが明らかにわかる。相同性の数値を得るためにプログラム“Ｇａｐ”を用いてＭｖＰ５１８０を各々最も適切なＨＩＶ１、ＨＩＶ２およびＳＩＶ配列そして更にＳＩＶｃｐｚ配列と比較した。
　【００７５】
　【表１５】
　【００７６】
　上側の数値は両配列の同一性を、下側は類似性を示す。更に、そのデータバンクを“Ｗｏｒｄｓｅａｒｃｈ”および“Ｇａｐ”を用いてヌクレオチドレベルで徹底的に調べた。各々最良の“符合（ｍａｔｃｈｅｓ）”についての相同性値を第９表にまとめる。
　【００７７】
　【表１６】
　【００７８】
　実施例１１
ＨＩＶ５１８０単離物のｇａｇ遺伝子のＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定の概要説明
　ウイルス増幅の過程で生じる自然突然変異を明示するためにウイルスゲノムの一部をＰＣＲ法によりクローン化しそしてそのように得られたＤＮＡ配列を第７表による配列と比較した。
　ｇａｇ配列をＭｖＰ５１８０ゲノムの左端のＬＴＲ（“ロング・ターミナル・リピート”、ＬＴＲ１プライマー）からｐｏｌ（ポリメラーゼ遺伝子、ｐｏｌ　１３．５；プライマー）まで内部をオーバーラップさせながらクローン化した。クローニング手法は図４に概略図で示されている。
　それらＰＣＲ反応は、ＨＩＶ−１コンセンサス配列から導かれた配列を有する下記のＤＮＡプライマーを用いて行われた。配列決定はジデオキシ連鎖中断法を用いて行われた。
　ＭｖＰ５１８０ｇａｇ遺伝子をコードする配列は、ヌクレオチド８１７（ＡＴＧ開始コドンのＡ）からヌクレオチド２３００（最後のコドンのＡ）まで延びる。
　【００７９】
　【００８０】
　ＰＣＲ法により得られたＤＮＡ配列を第７表に示されたＤＮＡ配列と対比した。両ＤＮＡ配列の比較を図５〜７に示す。その際、同じウイルスを問題としているのにヌクレオチドが約２％相互に違っていることが確認された。図５〜７において各々上列は第７表に示されているＤＮＡ配列を表わし、そして下列はＰＣＲ法で得られたＤＮＡ配列を表わしている。
　更に、ＰＣＲ法により調査されたタンパク質ｇａｇのアミノ酸配列を第７表から導かれる相当するタンパク質のアミノ酸配列と対比した。その際約２．２％のアミノ酸相違が認められた。その比較を図８に示すが、図において下列は各々ＰＣＲ法により得られた配列から導かれたアミノ酸配列を表わす。
　【００８１】
　実施例１２
　本発明によるウイルスＭｖＰ５１８０の配列をＨＩＶ１およびＨＩＶ２と、そして知られている限りＡＮＴ−７０（ＷＯ８９／１２０９４）の配列と比較した。
　その際に次の結果が得られた：
　【表１７】
　【００８２】
　前記の表において、“ＨＩＶ−１”はＨＩＶ−１ウイルスのコンセンサス配列を意味し；“ＨＩＶ−２”はＨＩＶ−２ウイルスのコンセンサス配列を意味し；ＡＮＴ−７０はＷＯ８９／１２０９４より知られたＨＩＶ−３と表示されるウイルスの部分配列を意味する。
　【００８３】
　従って本発明の主題は、遺伝子座（Ｇｅｎｏｒｔ）に関し第７表に示された配列に対し、％値で表わした場合、高々第１１表に記載の割合が異なるような相同性を示すウイルス、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびそれらの部分配列である。
　【００８４】
　【表１８】
　【００８５】
　第１１表に記載の％単位の相同性値は、第７表による配列を別のウイルスの配列と比較した場合に高々前述の％値に相当する配列割合だけ異なっていてもよいことを意味している。
　【００８６】
　実施例１３
Ｖ３−ループ／Ｖ３−シュラウフェ（Ｓｃｈｌａｕｆｅ）
　このシュラウフェはＨＩＶにおける主に中和性の領域であり、そしてその領域の免疫特異性を示したものが図９に要約してある。これはＰｅｔｅｒ　Ｎａｒａ（１９９０）の研究によるエイズからのコピーである。次にＶ３−シュラウフェをアミノ酸レベルで記述し、そしてＩＩＩＢウイルス（現在のＬＡＩ）および最初のＨＩＶ−２単離物（ＲＯＤ）と比較した。シスチン架橋の個々のアミノ酸は保存されている。ＨＩＶ−１のクローンはＧＰＧＲまたはＧＰＧＱであり、そしてＨＩＶ−２のクローンはＧＨＶＦであるのに対し、ＭｖＰ５１８０／９１のクローンはアミノ酸ＧＰＭＲから形成されている。メチオニンを用いたモチーフはこれまで報告されてなく、ＭｖＰ５１８０／９１の個性を強めている。
　【００８７】
　ウイルスの核酸配列を調べた後、そのＶ３−ループ領域を適切なプライマーを用いたＰＣＲ法により増幅した。その際に、突然変異、特にメチオニンコドン（ＡＴＧ）からロイシンコドン（ＣＴＧ）への変化をみることができた。
　【００８８】
　次いでクローン化された核酸から導かれたアミノ酸配列とＰＣＲ法を用いた増幅により得られた配列とを比較した：
　　ＭｖＰ５１８０（クローン化）：ＣＩＲＥＧＩＡＥＶＱＤＩＹＴＧＰＭＲＷＲＳＭＴＬＫＲＳＮＮＴＳＰＲＳＲＶＡＹＣ
　【００８９】
　　ＭｖＰ５１８０（ＰＣＲ法）：ＣＩＲＥＧＩＡＥＶＱＤＬＨＴＧＰＬＲＷＲＳＭＴＬＫＫＳＳＮＳＨＴＱＰＲＳＫＶＡＹＣ
　【００９０】
　実施例１４
　本発明によるウイルスＭｖＰ５１８０またはそれにより導かれる抗原を用いれば、通常のＨＩＶ−１＋２スクリーニングテストを用いたのでは把握できないような血清もＨＩＶ−１として陽性に検出できることを示すために、カメルーンからの患者の様々な血清を検査した。
　【００９１】
　カメルーンでの研究において１５６の抗−ＨＩＶ−１−陽性血清が検査された。二つのこれらの血清において、相当な、診断上重要な相違が認められた。次の第１２表に吸光度測定値を記す。ＣＡＭ−ＡまたはＣＡＭ−Ｂは異なる患者の血清を表わしている。
　【００９２】
　【表１９】
　【００９３】
　両テストのカットオフ値は０．３００であった。
　カメルーンからの４７の抗−ＨＩＶ−１陽性血清を用いたもう一つの研究において二つの血清が特に目立った。そのうちの一つ（９３−１０００）はわずかに症候を示す患者、もう一つ（９３−１００１）はエイズ病患者に由来する。次の第１３表において、両ＥＩＡテストの吸光度値を相互に比較する：
　【００９４】
　【表２０】
　【００９５】
　この場合にもカットオフ値は０．３であった。患者９３−１００１の吸光度値は、通常のＨＩＶ−１＋ＨＩＶ−２　ＥＩＡでは失敗し得るのに対し本発明による抗原を適用することにより明瞭な検出が可能であることを示している。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　ＨＩＶ型レトロウイルスのゲノム配置概略図。
　【図２】
　ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＭＶＰ−５１８０ウイルスの希釈液について市販テストキットを用いた抗原抗体反応により得られる吸光度と逆転写酵素活性の関係図。
　【図３】
　ＭＶＰ−５１８０およびＭＶＰ−８９９ウイルスのウェスターンブロット図。
　【図４】
　ＨＩＶ５１８０の遺伝子のＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定の手法図。
　【図５】
　ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の比較図。
　【図６】
　ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の図５に続く比較図。
　【図７】
　ＰＣＲ法により得られたＭＶＰ−５１８０のＤＮＡ配列と第７表に示されたＤＮＡ配列の図６に続く比較図。
　【図８】
　ｇａｇタンパク質の比較図（一つは第７表に従って（各々上列）、一つはＰＣＲ法で（各々下列）確認）。
　【図９】
　ＨＩＶ−１（ＬＡＩ）、ＨＩＶ５１８０およびＨＩＶ−２（ＲＯＤ）のＶ３−シュラウフェを示す図。