(57)【要約】  本発明は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）により処置された患者における薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現をモニタリングする方法、ＰＤマーカーを測定することによる、細胞のＣＤＫＩに対する感受性の測定方法、および、候補ＣＫＤＩのスクリーニング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）による処置に対する患者の応答をモニタリングする方法であって：
ａ）少なくとも１種のＣＤＫＩを投与すること；
ｂ）ＣＤＫＩを投与された患者から得られた生物学的サンプルにおける、表２から選択される少なくとも１種の薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現を測定すること；および、
ｃ）該少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現を、対照サンプルにおける該少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現と比較すること、
を含む方法。
【請求項２】
ＰＤマーカーが、ＭＥＰＣＥ（配列番号１）、ＭＣＬ１（配列番号３）、ＭＹＣ（配列番号５）、ＨＥＸＩＭ１（配列番号７）、ＬＡＲＰ７（配列番号９）またはＷＨＳＣ２（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＤマーカーがＭＥＰＣＥ（配列番号１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１種のＰＤマーカーの核酸またはタンパク質を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも２種のＰＤマーカーの遺伝子発現を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＣＤＫＩの投与に先立ち、患者から生物学的サンプルを得ることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
生物学的サンプルを、肺癌、黒色腫、骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌またはＰＭＢＣから得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤＫＩがＣＤＫ９を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤＫＩが表１から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤＫＩを治療的有効量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
治療的有効量が、患者への後続のＣＤＫＩの投与のために調節される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＤマーカーの差次的発現を少なくとも２つの異なる時点で測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｂ）およびｃ）を、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間で繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
段階ａ）で２種の異なるＣＤＫＩを投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
２種の異なるＣＤＫＩを同時に投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
２種の異なるＣＤＫＩを異なる時点で投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
細胞のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）への感受性を測定する方法であって、
ａ）細胞を少なくとも１種のＣＤＫＩと接触させること；
ｂ）ＣＤＫＩと接触した細胞における、表２から選択される少なくとも１種の薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現を測定すること；および、
ｃ）該差次的遺伝子発現を、非処置またはプラセボ処置の対照細胞の遺伝子発現と比較すること、
を含む方法。
【請求項１９】
ＰＤマーカーが、ＭＥＰＣＥ（配列番号１）、ＭＣＬ１（配列番号３）、ＭＹＣ（配列番号５）、ＨＥＸＩＭ１（配列番号７）、ＬＡＲＰ７（配列番号９）またはＷＨＳＣ２（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＤマーカーがＭＥＰＣＥ（配列番号１）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１種のＰＤマーカーの核酸またはタンパク質を測定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現が減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも２種のＰＤマーカーの遺伝子発現を測定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
細胞を、肺癌、黒色腫、骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌またはＰＭＢＣから得る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＤＫＩが表１から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＤマーカーの差次的発現を少なくとも２つの異なる時点で測定する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２７】
段階ｂ）およびｃ）を、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間で繰り返す、請求項１８に記載の方法。
【請求項２８】
段階ａ）で細胞を２種の異なるＣＤＫＩと接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
細胞を２種の異なるＣＤＫＩと同時に接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞を２種の異なるＣＤＫＩと異なる時点で接触させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項３１】
ＣＤＫＩ候補をスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞をＣＤＫＩ候補と接触させること；
ｂ）ＣＤＫＩ候補と接触した細胞における、表２から選択される少なくとも１種の薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現を測定すること；および
ｃ）ＣＤＫＩ候補と接触した細胞における少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現を、表１から採用したＣＤＫＩと接触した細胞における少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現、および、非処置またはプラセボ処置の細胞における少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現と比較すること、
を含む方法。
【請求項３２】
ＰＤマーカーが、ＭＥＰＣＥ（配列番号１）、ＭＣＬ１（配列番号３）、ＭＹＣ（配列番号５）、ＨＥＸＩＭ１（配列番号７）、ＬＡＲＰ７（配列番号９）またはＷＨＳＣ２（配列番号１１）からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＰＤマーカーがＭＥＰＣＥ（配列番号１）である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１種のＰＤマーカーの核酸またはタンパク質を測定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現が減少し、該ＣＤＫＩ候補がＣＤＫ阻害剤であることを示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ＣＤＫ９阻害剤についてスクリーニングする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
ＣＤＫＩ候補の差次的遺伝子発現を、表１から選択されるＣＤＫＩの差次的遺伝子発現と比較する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
細胞を、肺癌、黒色腫、骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌またはＰＭＢＣから得る、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ＰＤマーカーの差次的発現を少なくとも２つの異なる時点で測定する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
段階ｂ）およびｃ）を、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間で繰り返す、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、薬理ゲノム学の分野に関し、処置に対する患者の応答、がんの感受性の追跡、および、化合物のスクリーニングに有用な薬力学的マーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
タンパク質キナーゼは、細胞内の様々なシグナル伝達過程の制御を担う、構造的に関連する酵素の大きいファミリーを構成する。（Hardie, G. and Hanks, S. The Protein Kinase Facts Book, I and II, Academic Press, San Diego, CA: 1995）。これらのキナーゼは、それらがリン酸化する基質によって、ファミリーに分類され得る（例えば、タンパク質−チロシン、タンパク質−セリン／スレオニン、脂質など）。
【０００３】
多くの疾患は、タンパク質キナーゼに媒介される上記の事象が引き金となる、異常な細胞の応答を伴う。これらの疾患には、自己免疫性疾患、炎症性疾患、骨疾患、代謝疾患、神経および神経変性疾患、がん、心血管疾患、アレルギーおよび喘息、アルツハイマー病、ウイルス性疾患およびホルモン関連疾患が含まれるが、これらに限定されない。例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のグリベックは、慢性骨髄性白血病および消化管間葉性腫瘍の処置に成功裏に使用されてきた。
【０００４】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）複合体は、興味深い標的であるキナーゼのクラスである。ＣＤＫは、細胞周期の進行および細胞の転写に関与し、増殖制御の喪失は、疾患における異常な細胞増殖に関連する（Malumbres and Barbacid, Nat. Rev. Cancer 2001, 1:222）。サイクリン依存性キナーゼの活性の上昇または時期的に異常な活性化は、ヒトの腫瘍の発生をもたらすと示された（Sherr C. J., Science 1996, 274: 1672-1677）。実際に、ヒトの腫瘍の発生は、一般的に、ＣＤＫタンパク質自体またはそれらの調節因子のいずれかの変化を伴う（Cordon-Cardo C., Am. J. Pathol. 1995; 147(3): 545-560; Karp J. E. and Broder S., Nat. Med. 1995; 1: 309-320; Hall M., Adv. Cancer Res. 1996; 68: 67-108）。
【０００５】
ＣＤＫ７およびＣＤＫ９は、各々、転写の開始および伸長に重要な役割を果たす（例えば、Peterlin and Price 2006, Cell 23: 297-305, Shapiro. J., Clin. Oncol. 2006; 24: 1770-83 参照）。ＣＤＫ９の阻害は、ＭＣＬ１などの抗アポトーシスタンパク質の転写の下方調節を通して、造血系統の腫瘍細胞におけるアポトーシスの直接的誘導と関連づけられた（Chao S.-H., J. Biol. Chem. 2000;275: 28345-28348; Chao, S.-H., J. Biol. Chem. 2001;276:31793-31799; Lam, Genome Biology 2001 2: 1-11; Chen, Blood 2005; 106:2513; MacCallum, Cancer Res. 2005; 65:5399; and Alvi, Blood 2005; 105:4484）。固形腫瘍細胞において、ＣＤＫ９活性の下方調節による転写阻害は、細胞周期ＣＤＫ、例えば、ＣＤＫ１および２の阻害と協力して、アポトーシスを誘導する（Cai, D.-P., Cancer Res. 2006, 66:9270）。ＣＤＫ９またはＣＤＫ７を介する転写阻害は、半減期の短いｍＲＮＡ（例えば、マントル細胞リンパ腫のサイクリンＤ１）の転写に依存する腫瘍細胞タイプに対して、選択的非増殖作用を有する。ＭｙｃおよびＮＦ−κＢなどのいくつかの転写因子は、ＣＤＫ９を選択的にそれらのプロモーターに補充し、これらのシグナル伝達経路の活性化に依存する腫瘍は、ＣＤＫ９阻害に感受性であり得る。
【０００６】
ある種のＣＤＫ阻害剤は、正常な形質転換されていない細胞の細胞周期の進行を阻害する能力により、化学的保護剤として有用である（Chen, J., Natl. Cancer Instit., 2000; 92: 1999-2008）。細胞毒性剤の使用に先立ち、がん患者をＣＤＫ阻害剤で予め処置することは、化学療法に一般的に伴う副作用を低減できる。正常な増殖している組織は、選択的ＣＤＫ阻害剤の作用により、細胞毒性作用から保護される。
【０００７】
治療が有効であることを示す薬力学的（ＰＤ）マーカーを見いだすことは、価値あることであり得る。そのようなマーカーは、治療を受ける患者の応答をモニタリングするのに使用できる。患者が処置に適切に応答していないとＰＤマーカーが示す場合、投与量を増加、減少または完全に中止できる。従って、ＣＤＫ阻害剤に関連するＰＤマーカーを開発する必要がある。このアプローチは、患者が最も適切な処置を受けることを確実にする。
【０００８】
ＣＫＤ阻害剤の開発において、ＰＤマーカーは、投与時の作用メカニズムの理解を助けるであろう。作用メカニズムは、細胞周期の調節メカニズムの複雑なカスケードを含み得、この分析は、候補ＣＤＫ阻害剤の特定の活性を測定するために、薬物開発の前臨床段階で行われる。薬力学的調査における特別な関心は、本明細書で開示されるものなどの、活性の特異的マーカーの同定である。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明は、ＣＤＫ阻害剤（以後、「ＣＤＫＩ」）の活性の特異的薬力学（ＰＤ）マーカーとして作用する、表２で同定される数々の遺伝子の分析に関する。特に、本発明は、ＣＤＫＩ処置後の、同定された遺伝子の発現の上方または下方調節に関する。ＰＤマーカーは、患者が正しい処置の経過を受けていることを判定するのに有用である。本発明は、患者が彼らに特異的な機能的なゲノムの特徴に基づいて処置される「個人化医療」の例である。
【００１０】
本発明は、患者の処置への応答のモニタリング方法を含む。この方法は、任意のＣＤＫＩを患者に投与し、患者から得られた生物学的サンプルの遺伝子発現を測定する段階を含む。患者の応答は、少なくとも１種の表２のバイオマーカーの遺伝子発現の検出に基づいて評価される。ベースラインと比較した少なくとも１種のＰＤマーカーの発現の検出および／またはレベルの変化は、患者の処置への応答を示すものであり得る。発現レベルの変化のパターンは、好ましい応答または好ましくない応答を示すものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
図面の説明
【図１】図１は、ＣＤＫＩ（７）またはＣＤＫＩ（８）で処置された細胞のＩＣ５０値を示す。
【図２】図２は、ＣＤＫＩ（７）による処置後の２つの異なる細胞株における差次的遺伝子発現を示す。
【図３】図３は、細胞をＣＤＫＩ（８）、ＣＤＫＩ（１１）またはアクチノマイシンＤで処置したときのＭＥＰＣＥ発現の減少を示す。
【図４】図４は、ＣＤＫＩ（７）による処置後のＭＥＰＣＥおよびＬＡＲＰ７タンパク質レベルの差次的発現を示す。
【図５】図５は、ＣＤＫＩ（７）で処置された肺癌細胞株におけるアポトーシスの調節に関与する遺伝子の差次的遺伝子発現を示す。
【図６】図６は、ＣＤＫＩ（７）で処置されたときのイヌの白血球細胞におけるＭＥＰＣＥ発現の減少を示す。
【図７】図７は、ＣＤＫＩ（７）で処置されたときのイヌの白血球細胞におけるＭＹＣ発現の減少を示す。
【図８】図８は、ＣＤＫＩ（７）で処置されたときのイヌの白血球細胞におけるＭＣＬ１発現の減少を示す。
【図９】図９は、ＣＤＫＩ（１２）で処置されたときのイヌの白血球細胞におけるＭＥＰＣＥ発現の減少を示す。
【図１０】図１０は、ＣＤＫＩ（１２）で処置されたときのイヌの白血球細胞におけるＭＹＣ発現に減少がないことを示す。
【図１１】図１１は、ＣＤＫＩ（１２）で処置されたときのイヌの白血球細胞において、ＭＣＬ１発現の減少がないことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の説明
ある態様では、本開示は、薬力学（ＰＤ）マーカーとして作用できる表２で同定される数々の遺伝子の分析に関する。ＣＤＫＩ処置後のＰＤマーカーの発現の増加または減少は、阻害剤が活性であることを示す。患者の応答は、少なくとも１種の表２のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現の検出に基づいて評価される。ベースラインと比較した少なくとも１種のＰＤマーカーの発現の検出および／またはレベルの変化は、ＣＤＫＩ活性を示すものであり、これは、処置に対する患者の応答に相関し得る。発現レベルの変化のパターンは、患者の好ましい応答または好ましくない応答を示すものであり得る。
【００１３】
従って、本開示は、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）による処置に対する患者の応答をモニタリングする方法を提供し、その方法は以下を含む：
ａ）少なくとも１種のＣＤＫＩを投与すること；
ｂ）ＣＤＫＩを投与された患者から得られた生物学的サンプルにおける、表２から選択される少なくとも１種の薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現を測定すること；および、
ｃ）該少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現を、対照サンプルにおける該少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現と比較すること。
【００１４】
ＰＤマーカーが、ＭＥＰＣＥ（配列番号１）、ＭＣＬ１（配列番号３）、ＭＹＣ（配列番号５）、ＨＥＸＩＭ１（配列番号７）、ＬＡＲＰ７（配列番号９）またはＷＨＳＣ２（配列番号１１）からなる群から選択される、該方法。
ＰＤマーカーがＭＥＰＣＥ（配列番号１）である、該方法。
少なくとも１種のＰＤマーカーの核酸またはタンパク質を測定する、該方法。
少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現が減少する、該方法。
少なくとも２種のＰＤマーカーの遺伝子発現を測定する、該方法。
ＣＤＫＩの投与に先立ち、患者から生物学的サンプルを得ることをさらに含む、該方法。
生物学的サンプルを、肺癌、黒色腫、骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌またはＰＭＢＣから得る、該方法。
ＣＤＫＩがＣＤＫ９を阻害する、該方法。
ＣＤＫＩが表１から選択される、該方法。
ＣＤＫＩを治療的有効量で投与する、該方法。
治療的有効量が、患者への後続のＣＤＫＩの投与において調節される、該方法。
ＰＤマーカーの差次的発現を少なくとも２つの異なる時点で測定する、該方法。
段階ｂ）およびｃ）を、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間で繰り返す、該方法。
段階ａ）で２種の異なるＣＤＫＩを投与する、該方法。
２種の異なるＣＤＫＩを同時に投与する、該方法。
２種の異なるＣＤＫＩを異なる時点で投与する、該方法。
【００１５】
細胞のサイクリン依存性キナーゼ阻害剤（ＣＤＫＩ）への感受性を測定する方法であって、
ａ）細胞を少なくとも１種のＣＤＫＩと接触させること；
ｂ）ＣＤＫＩと接触した細胞における、表２から選択される少なくとも１種の薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現を測定すること；および、
ｃ）該差次的遺伝子発現を、非処置またはプラセボ処置の対照細胞の遺伝子発現と比較すること、
を含む方法。
【００１６】
ＰＤマーカーが、ＭＥＰＣＥ（配列番号１）、ＭＣＬ１（配列番号３）、ＭＹＣ（配列番号５）、ＨＥＸＩＭ１（配列番号７）、ＬＡＲＰ７（配列番号９）またはＷＨＳＣ２（配列番号１１）からなる群から選択される、該方法。
ＰＤマーカーがＭＥＰＣＥ（配列番号１）である、該方法。
少なくとも１種のＰＤマーカーの核酸またはタンパク質を測定する、該方法。
少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現が減少する、該方法。
少なくとも２種のＰＤマーカーの遺伝子発現を測定する、該方法。
細胞を、肺癌、黒色腫、骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌またはＰＭＢＣから得る、該方法。
ＣＤＫＩがＣＤＫ９を阻害する、該方法。
ＣＤＫＩが表１から選択される、該方法。
ＰＤマーカーの差次的発現を少なくとも２つの異なる時点で測定する、該方法。
段階ｂ）およびｃ）を、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間で繰り返す、該方法。
段階ａ）で細胞を２種の異なるＣＤＫＩと接触させる、該方法。
細胞を２種の異なるＣＤＫＩと同時に接触させる、該方法。
細胞を２種の異なるＣＤＫＩと異なる時点で接触させる、該方法。
【００１７】
ＣＤＫＩ候補をスクリーニングする方法であって、
ａ）細胞をＣＤＫＩ候補と接触させること；
ｂ）ＣＤＫＩ候補と接触した細胞における、表２から選択される少なくとも１種の薬力学（ＰＤ）マーカーの差次的遺伝子発現を測定すること；および
ｃ）ＣＤＫＩ候補と接触した細胞における少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現を、表１から採用したＣＤＫＩと接触した細胞における少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現、および、非処置またはプラセボ処置の細胞における少なくとも１種のＰＤマーカーの差次的遺伝子発現と比較すること、
を含む方法。
【００１８】
ＰＤマーカーが、ＭＥＰＣＥ（配列番号１）、ＭＣＬ１（配列番号３）、ＭＹＣ（配列番号５）、ＨＥＸＩＭ１（配列番号７）、ＬＡＲＰ７（配列番号９）またはＷＨＳＣ２（配列番号１１）からなる群から選択される、該方法。
ＰＤマーカーがＭＥＰＣＥ（配列番号１）である、該方法。
少なくとも１種のＰＤマーカーの核酸またはタンパク質を測定する、該方法。
少なくとも１種のＰＤマーカーの遺伝子発現が減少し、該ＣＤＫＩ候補がＣＤＫ阻害剤であることを示す、該方法。
ＣＤＫ９阻害剤についてスクリーニングする、該方法。
ＣＤＫＩ候補の差次的遺伝子発現を、表１から選択されるＣＤＫＩの差次的遺伝子発現と比較する、該方法。
細胞を、肺癌、黒色腫、骨髄腫、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌またはＰＭＢＣから得る、該方法。
ＰＤマーカーの差次的発現を少なくとも２つの異なる時点で測定する、該方法。
段階ｂ）およびｃ）を、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間で繰り返す、該方法。
【００１９】
本明細書に記載のＰＤマーカーは、処置に対する患者の応答をモニタリングするのに利用し得る。例えば、表２に開示されるＰＤマーカーの差次的発現により測定される患者のＣＤＫＩへの応答に応じて、投与量を調節し得るか、さらなる治療を導入し得るか、毒性の応答または他の有害事象を予示し、未然に防ぎ得るか、または、処置を中止し得る。
【００２０】
定義
明細書および特許請求の範囲で使用するとき、単数形の「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明らかにそうではないと示さない限り、複数形への言及を含む。例えば、用語「細胞」は、複数の細胞を含み、その混合物を含む。
【００２１】
範囲を含む、すべての数字で表した表記、例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度および分子量は、０.１の増分で（＋）または（−）に変動する概算値である。常に明示的に述べられるわけではないが、すべての数字で表した表記には、用語「約」が先行すると理解されるべきである。常に明示的に述べられるわけではないが、本明細書に記載の試薬は単なる例示にすぎず、そのようなものと同等のものが当分野で知られていることも理解されるべきである。
【００２２】
用語「薬力学マーカー」または「ＰＤマーカー」は、本明細書で互換的に使用される。薬力学マーカーは遺伝子であり、核酸またはポリペプチドレベルの存在、非存在または差次的発現は、投与されたＣＤＫＩが活性であるか否かの判定に使用される。例えば、細胞を任意のＣＤＫＩに接触させた後、ＭＥＰＣＥ遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ＣＤＫＩ阻害剤と接触させる前のＭＥＰＣＥ発現またはプラセボ処置／非処置対照と比較して、減少する。
【００２３】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログのいずれでも）の重合形を表す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構築の前または後で行われ得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分で中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との結合により、重合後にさらに修飾され得る。この用語は、また、二本鎖および一本鎖分子の両方を表す。特記されない限り、または、必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施態様は、二本鎖形態、および、二本鎖形態を形成すると知られているか、または予想される２本の相補的一本鎖形態の各々を包含する。
【００２４】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後で特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードする能力のある、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むポリヌクレオチドを表す。ポリヌクレオチド配列は、それらが付随する遺伝子のより大きい断片または全長コード配列を同定するために使用され得る。より大きい断片の配列を単離する方法は、当業者に知られている。
【００２５】
「遺伝子産物」または代替的に「遺伝子発現産物」は、遺伝子が転写および翻訳されるときに生成されるアミノ酸（例えば、ペプチドまたはポリペプチド）を表す。
【００２６】
用語「ポリペプチド」は、用語「タンパク質」と互換的に使用され、その最も広い意味で、２個またはそれ以上のサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物の化合物を表す。これらのサブユニットは、ペプチド結合により連結されていてよい。他の実施態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどで連結されていてもよい。
【００２７】
本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」は、天然および／または非天然または合成アミノ酸、および、ＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣物を表す。３個またはそれ以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短いならば、一般的にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長いならば、ペプチドは一般的にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００２８】
用語「単離された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片が、自然界で通常付随している細胞その他の構成要素から分離していることを意味する。本発明のある態様では、単離されたポリヌクレオチドは、天然または自然の環境で、例えば、染色体上で、それが通常付随している３'および５'の隣接するヌクレオチドから分離されている。当業者に明らかな通り、非天然産生のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その天然産生の相対物からそれを区別するために、「単離」を必要としない。加えて、「濃縮された」、「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、濃度または体積当たりの分子数が、「濃縮された」の場合は高く、「分離された」場合は低いという点で、その天然産生の相対物と区別することができる。その一次配列により、または、例えば糖鎖付加のパターンにより、天然産生の相対物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その一次配列、あるいは、糖鎖付加パターンなどの他の特徴によりその天然産生の相対物と区別できるので、その単離された形態で存在する必要はない。従って、非天然産生のポリヌクレオチドは、単離された天然産生のポリヌクレオチドとは別の実施態様として提供される。細菌の細胞で産生されるタンパク質は、それが自然に産生される真核細胞から単離された天然産生のタンパク質とは別の実施態様として提供される。
【００２９】
「プローブ」は、ポリヌクレオチドの操作の文脈で使用されるとき、標的とハイブリダイズすることにより、関心のあるサンプル中に存在する可能性のある標的を検出する試薬として提供されるオリゴヌクレオチドを表す。通常、プローブは、標識またはハイブリダイゼーション反応の前または後に標識が結合できる手段を含む。適する標識には、放射性同位元素、蛍光色素、化学発光化合物、染料、および、酵素を含むタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
「プライマー」は、関心のあるサンプル中に存在する可能性のある標的または「鋳型」に、標的とハイブリダイズすることにより結合し、その後標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、一般的に遊離の３'−ＯＨ基を有する短いポリヌクレオチドである。「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」のプライマーからなる「プライマーの対」または「プライマーの組」、および、ＤＮＡポリメラーゼなどの重合の触媒、典型的には熱安定性のポリメラーゼ酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドの複製コピーが作成される反応である。ＰＣＲの方法は当分野で周知であり、例えば、PCR: A Practical Approach, M. MacPherson et al., IRL Press at Oxford University Press (1991) で教示される。ＰＣＲまたは遺伝子のクローニングなどの、ポリヌクレオチドの複製コピーを産生するための全方法は、本明細書で集合的に「複製」と呼ばれる。プライマーは、サザンまたはノザンブロット分析などのハイブリダイゼーション反応のプローブとしても使用できる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition (1989)）。
【００３１】
本明細書で使用するとき、「発現」は、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される過程、および／または、転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質に翻訳される過程を表す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来するならば、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００３２】
遺伝子に適用される「差次的に発現される」は、その遺伝子から転写および／または翻訳されたｍＲＮＡまたはその遺伝子によりコードされるタンパク質産物の差次的産生を表す。差次的に発現される遺伝子は、正常または対照細胞の発現レベルと比較して、過剰発現または過小発現され得る。しかしながら、本明細書で使用するとき、過剰発現は、遺伝子発現の増加であり、一般的に、正常または対照の相対物である細胞または組織で検出されるものよりも、少なくとも１.２５倍、または、代替的に、少なくとも１.５倍、または、代替的に、少なくとも２倍、または、代替的に、少なくとも４倍の発現である。本明細書で使用するとき、過小発現は、遺伝子発現の減少であり、一般的に、正常または対照の相対物である細胞または組織で検出されるものよりも、少なくとも１.２５倍、または、代替的に、少なくとも１.５倍、または、代替的に、少なくとも２倍、または、代替的に、少なくとも４倍少ない発現である。用語「差次的に発現される」は、また、細胞または組織における発現が検出されるが、対照の細胞または組織における発現は検出できない場合も表す。
【００３３】
遺伝子の高い発現レベルは、遺伝子の過剰発現または遺伝子のコピー数の増加のために起こり得る。また、遺伝子は、負の調節因子の調節解除または不在により、より多くのタンパク質に翻訳され得る。
【００３４】
「遺伝子発現プロファイル」は、複数のサンプルで生じる少なくとも１種のＰＤマーカーの発現のパターンを表し、組織タイプ、特定の処置への応答、または、細胞における特定の生物学的過程または経路の活性化などの、これらのサンプルに共通する特性を反映する。さらに、遺伝子発現プロファイルは、その共通の特性を共有するサンプルと、そうでないものとを、サンプルを無作為に２つの群に割り当てることにより達成されると見込まれるものよりも良好な正確さで識別する。遺伝子発現プロファイルは、未詳の状態のサンプルが、その共通の特性を共有するか否かを予測するために使用し得る。少なくとも１種のＰＤマーカーのレベルと典型的なプロファイルの間にいくらかの変動が予測されるであろうが、典型的なプロファイルに対する発現レベルの全体的な類似性は、発現プロファイルが反映する共通の特性を共有しないサンプルにおいてその類似性が偶然観察されることは統計的に起こらないと見込まれる程度である。
【００３５】
用語「ｃＤＮＡ」は、相補的ＤＮＡ、即ち、逆転写酵素などの酵素によりｃＤＮＡにされた細胞または生物に存在するｍＲＮＡ分子を表す。「ｃＤＮＡライブラリー」は、すべて酵素の逆転写酵素でｃＤＮＡ分子にされ、「ベクター」（外来ＤＮＡの添加後に複製を継続できる他のＤＮＡ分子）に挿入された、細胞または生物に存在する全ｍＲＮＡ分子の集合である。例示的なライブラリー用のベクターには、バクテリオファージ（「ファージ」としても知られる）、即ち、細菌に感染するウイルス、例えば、ラムダファージが含まれる。ライブラリーは、次いで、関心のある特異的ｃＤＮＡ（従ってｍＲＮＡ）について探索できる。
【００３６】
本明細書で使用するとき、互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、特定の支持体のタイプに限定されない。むしろ、多数の支持体が利用でき、当業者に知られている。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチックフィルム、ガラスビーズ、コットン、プラスチックビーズ、アルミナゲル、マイクロアレイおよびチップが含まれる。本明細書で使用するとき、「固体支持体」は、また、合成抗原提示マトリックス、細胞およびリポソームを含む。適する固相支持体は、所望の最終的使用および様々なプロトコールへの適合性に基づいて選択され得る。例えば、ペプチド合成のために、固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Bachem Inc., Peninsula Laboratories から得られるPAM-レジン）、polyHIPE(R)（商標）レジン（Aminotech, Canada から得られる）、ポリアミドレジン（Peninsula Laboratories から得られる）、ポリエチレングリコールで接ぎ合わされたポリスチレンレジン（TentaGelR（商標）, Rapp Polymere, Tubingen, Germany）、または、ポリジメチルアクリルアミドレジン（Milligen/Biosearch, California から得られる）などのレジンを表し得る。
【００３７】
ポリヌクレオチドは、また、高処理量スクリーニングアッセイで使用するために、固体支持体に結合させることができる。ＰＣＴ ＷＯ９７／１０３６５は、例えば、高密度オリゴヌクレオチドチップの構築を開示している。米国特許第５,４０５,７８３号；第５,４１２,０８７号；および第５,４４５,９３４号も参照。この方法を使用して、誘導体化されたガラス表面でプローブを合成し、チップのアレイを形成する。光防護されたヌクレオシドホスホラミダイトをガラス表面に結合させ、光リソグラフィーマスクを通して光分解により選択的に脱防護し、第二の防護されたヌクレオシドホスホラミダイトと反応させる。所望のプローブが完成するまで、結合／脱保護の過程を繰り返す。
【００３８】
例として、Affymetrix HG-U133-Plus-2 GeneChips（商標）などの遺伝子チップを使用してメッセンジャーＲＮＡのレベルを測定することにより、転写活性を評価し得る。かくして、関心のある多数の遺伝子のＲＮＡの高処理量リアルタイム定量が、再現可能なシステムで可能になる。
【００３９】
用語「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、核酸プローブがその標的下位配列に特異的にハイブリダイズし、他の配列にはしない条件を表す。ハイブリダイゼーションの厳密さを決定する条件には、温度、イオン強度およびホルムアミドなどの変性剤の濃度が含まれる。これらの要素の１つを変えることは、他の要素に影響し得、当業者は、所望の厳密さのレベルを維持する条件の変化を理解するであろう。厳密さの高いハイブリダイゼーションの例は、０.０１５Ｍ塩化ナトリウム、０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５−６８℃、または、０.０１５Ｍ塩化ナトリウム、０.００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミド、４２℃である（Sambrook（既出）参照）。「中程度の厳密さ」のハイブリダイゼーションの例は、０.０１５Ｍ塩化ナトリウム、０.００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０−６５℃、または、０.０１５Ｍ塩化ナトリウム、０.００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミド、３７−５０℃の条件である。中程度の厳密さの条件は、中程度の量の核酸のミスマッチが望ましいときに使用される。当業者は、洗浄がハイブリダイゼーション条件の一部であることを理解するであろう。例えば、洗浄条件は、０２.Ｘ−０.１ＸＳＳＣ／０.１％ＳＤＳおよび４２−６８℃の温度を含み得、温度の上昇は洗浄条件の厳密さを高める。
【００４０】
ハイブリダイゼーションが２本の一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平行配置で起こるとき、反応は、「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補的」であると説明される。ハイブリダイゼーションが第一のポリヌクレオチドの鎖の１本と第二のポリヌクレオチドの鎖の１本との間で起こり得るならば、二本鎖ポリヌクレオチドは、もう１つのポリヌクレオチドに対して「相補的」または「相同」であり得る。「相補性」または「相同性」（あるポリヌクレオチドが他のものと相補的である程度）は、一般的に受け入れられている塩基対の規則に従って、互いに水素結合を形成すると予測される、反対の鎖の中の塩基の割合という観点で数量化できる。
【００４１】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの領域（または、ポリペプチドまたはポリペプチドの領域）が、他の配列に対して一定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有することは、整列させたときに、その割合の塩基（またはアミノ酸）が、２つの配列を比較して同じであることを意味する。このアライメントおよび相同性の割合または配列同一性は、当分野で知られているソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., (1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1 に記載のものを使用して決定できる。好ましくは、初期設定のパラメーターをアライメントに使用する。好ましいアライメントプログラムはＢＬＡＳＴであり、初期設定のパラメーターを使用する。特に、好ましいプログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰであり、以下の初期設定のパラメーターを使用する：Genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant。
【００４２】
用語「細胞増殖性障害」は、異常な細胞増殖および／または分裂または機能喪失を特徴とする、正常な生理学的機能の調節不全を含む。「細胞増殖性障害」の例には、過形成、新生物、異形成および様々な自己免疫性障害、例えばＴ細胞アポトーシスの機能不全を特徴とするもの、が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書で使用するとき、用語「新生物細胞」、「新生物疾患」、「新生物」、「腫瘍」、「腫瘍細胞」、「がん」および「がん細胞」（互換的に使用される）は、細胞増殖の制御の有意な喪失（即ち、調節されない細胞分裂）を特徴とする異常な増殖の形質を示すように、比較的自律的な増殖を示す細胞を表す。新生物細胞は、悪性または良性であり得る。転移細胞または組織は、細胞が付近の身体構造に侵入し、破壊できることを意味する。
【００４４】
用語「がん」は、例えば、癌腫（例えば、肺癌、黒色腫、骨髄障害（例えば、骨髄性白血病、多発性骨髄腫および赤白血病）、リンパ性白血病、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌および肉腫（例えば、骨肉腫）を含むがん疾患を表す。
用語「ＰＢＭＣ」は、末梢血単核細胞を表し、「ＰＢＬ」即ち末梢血リンパ球を含む。
【００４５】
腫瘍の増殖を「抑制する」は、ＣＤＫＩ化合物と接触しない場合の腫瘍の増殖と比較して、腫瘍細胞の増殖が低下することを示す。腫瘍細胞の増殖は、腫瘍サイズの測定、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイを使用する、腫瘍細胞が増殖しているか否かの判定、ＦＤＧ−ＰＥＴ（フルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影）イメージングによるグルコース取り込みの測定、または、腫瘍細胞の計数を含むがこれらに限定されない、当分野で知られている任意の手段で評価できる。腫瘍細胞の増殖を「抑制する」ことは、以下の状態のいずれかまたはすべてを含む：腫瘍の増殖を減速、遅延および停止させること、並びに、腫瘍を縮小させること。
【００４６】
「組成物」は、活性物質および他の担体、例えば、アジュバント、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝化剤、塩、親油性溶媒、防腐剤、アジュバントなどの、不活性（例えば、検出可能な物質または標識）または活性の化合物または組成物の組合せである。また、担体は、医薬的補助剤および添加物、例えば；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質および炭水化物（例えば、単糖類およびオリゴ糖類を含む糖；誘導体化された糖、例えば、アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖など；および、多糖類または糖ポリマー）を含み、それは、単独で存在しても組み合わせて存在してもよく、単独で、または組合せで、重量または体積で１−９９.９９％を含む。炭水化物の補助剤には、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ−マンノース、ソルボースなどの単糖類；ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖類；ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン類、デキストラン類、デンプン類などの多糖類；および、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）およびミオイノシトールなどのアルジトール類が含まれる。
【００４７】
例示的なタンパク質の補助剤には、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの血清アルブミン、組み換えヒトアルブミン（ｒＨＡ）、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝化能力においても機能できる代表的なアミノ酸／抗体の成分には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルテームなどが含まれる。
【００４８】
用語「担体」は、さらに、緩衝化剤またはｐＨ調節剤を含む；典型的には、緩衝化剤は、有機酸または塩基から調製される塩である。代表的な緩衝化剤には、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸の塩などの有機酸塩；Ｔｒｉｓ、トロメタミン塩酸塩またはリン酸緩衝化剤が含まれる。さらなる担体には、ポリビニルピロリドン類などのポリマー性補助剤／添加物、フィコール類（ポリマー糖）、デキストラン類（例えば、２−ヒドロキシプロピル−クアドラチュア（quadrature）−シクロデキストリンなどのシクロデキストリン類）、ポリエチレングリコール類、風味剤、抗菌剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０（商標）およびＴＷＥＥＮ８０（商標）などのポリソルベート類）、脂質（例えば、リン脂質、脂肪酸）、ステロイド類（例えば、コレステロール）、および、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）が含まれる。
【００４９】
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容され得る担体」は、リン酸緩衝塩水、水および乳液、例えば油／水または水／油乳液、および、様々なタイプの湿潤剤などの任意の標準的な医薬担体を包含する。また、組成物は、安定化剤および防腐剤並びに任意の上記の担体を、それらがインビボでの使用に許容され得るならば、含むことができる。担体、安定化剤およびアジュバントの例には、Remington’s Pharmaceutical Science., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975) and in the Physician’s Desk Reference, 52nd ed., Medical Economics, Montvale, N.J. (1998) 参照。
【００５０】
「有効量」は、有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回またはそれ以上の投与、適用または投薬で投与できる。
【００５１】
「対象」、「個人」または「患者」は、本明細書で互換的に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを表す。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、農場の動物、競技用動物および愛玩動物が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用されるサイクリンＤキナーゼの「阻害剤」は、サイクリンＤキナーゼの作用を低下させる。この阻害は、例えば、キナーゼ活性の低下または転写伸長の低下を含み得る。
【００５３】
ＣＤＫＩのＰＤマーカーとして、数々の遺伝子が同定されている。本明細書で同定されるＰＤマーカーの１種またはそれ以上の遺伝子発現の減少または増加は、ＣＤＫＩが所望の効果、例えば、ＣＤＫＩ投与後の遺伝子発現の減少または過小発現を有するか否かを判定するのに使用できる。例として、ＣＤＫＩによる処置の２時間後に、ＭＥＰＣＥの遺伝子発現の減少は、ＣＤＫＩが活性であるか否かの情報を提供する。ＣＤＫＩのＰＤマーカーのリストは、表２に見いだされる。
【００５４】
ＣＤＫ阻害剤（ＣＤＫＩ）は、ＣＤＫ９の阻害剤である化合物であり、本発明の方法と併せて有用である。ＣＤＫ９は、転写伸長の下流のエフェクターであるので、ＣＤＫＩは、ＣＤＫ９の阻害が指示されるヒトまたは獣医学用途の医薬組成物において、例えば、腫瘍および／または癌細胞の増殖の処置において、有用である。特に、がんの進行は少なくとも部分的に転写伸長に依存し、従って、ＣＤＫ９活性の妨害による処置に影響を受けやすいので、そのような化合物はヒトのがんの処置において有用である。ＣＤＫＩ化合物は、例えば、癌腫（例えば、肺癌、黒色腫、骨髄障害（例えば、骨髄性白血病、多発性骨髄腫および赤白血病）、リンパ性白血病、乳癌、神経膠芽腫、膵臓癌、甲状腺癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、大腸癌および肉腫（例えば、骨肉腫）の処置において有用である。ＣＤＫＩ化合物のリストは、表１に見いだされる。
【００５５】
表１−ＣＤＫＩ化合物
【化１】
2014510533.tif 000002
ＣＤＫＩ（１）
【００５６】
【化２】
2014510533.tif 000003
ＣＫＤＩ（２）
【００５７】
【化３】
2014510533.tif 000004
ＣＫＤＩ（３）
【００５８】
【化４】
2014510533.tif 000005
ＣＫＤＩ（４）
【００５９】
【化５】
2014510533.tif 000006
ＣＫＤＩ（５）
【００６０】
【化６】
2014510533.tif 000007
ＣＫＤＩ（６）
【００６１】
【化７】
2014510533.tif 000008
ＣＤＫＩ（７）
【００６２】
【化８】
2014510533.tif 000009
ＣＤＫＩ（８）
【００６３】
【化９】
2014510533.tif 000010
ＣＫＤＩ（９）
【００６４】
【化１０】
2014510533.tif 000011
ＣＫＤＩ（１０）
【００６５】
【化１１】
2014510533.tif 000012
ＣＤＫＩ（１１）
【００６６】
【化１２】
2014510533.tif 000013
ＣＤＫＩ（１２）
【００６７】
遺伝子発現の測定
遺伝子発現の検出は、例えば、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量、または、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの逆転写から産生されたｃＤＮＡの量、または、その遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはタンパク質の量を検出することを含む、任意の適切な方法によることができる。これらの方法は、サンプル毎に実施できるか、または、高処理量分析のために改変できる。例えば、Affymetrix（商標）U133 マイクロアレイチップを使用する。
【００６８】
ある態様では、ＰＤマーカーに適切なプローブに特異的にハイブリダイズするプローブへのハイブリダイゼーションにより、遺伝子発現を検出および定量する。また、プローブは、当分野で知られている方法を使用する高処理量スクリーニングアッセイに使用するために、固体支持体に結合させることもできる。ＷＯ９７／１０３６５および米国特許第５,４０５,７８３号、第５,４１２,０８７号および第５,４４５,９３４号は、例えば、本明細書に開示する配列の１つまたはそれ以上を含み得る高密度オリゴヌクレオチドチップの構築を開示している。米国特許第５,４０５,７８３号、第５,４１２,０８７号および第５,４４５,９３４号に開示される方法を使用して、誘導体化されたガラス表面で本発明のプローブを合成する。光防護されたヌクレオシドホスホラミドをガラス表面に結合させ、光リソグラフィーマスクを通して光分解により選択的に脱防護し、第２の防護されたヌクレオシドホスホラミドと反応させる。結合／脱防護の過程を、所望のプローブが完成するまで繰り返す。
【００６９】
ある態様では、核酸サンプルをプローブで修飾されたチップに暴露することを通して、遺伝子の発現レベルを測定する。抽出された核酸を、例えば、蛍光タグで、好ましくは増幅段階中に標識する。標識されたサンプルのハイブリダイゼーションを、適切な厳密さのレベルで実施する。プローブ−核酸ハイブリダイゼーションの程度を、検出装置を使用して定量的に測定する。米国特許第５,５７８,８３２号および第５,６３１,７３４号参照。
【００７０】
あるいは、遺伝子のコピー数、転写または翻訳のいずれかを、既知の技法を使用して測定できる。例えば、ＰＣＲなどの増幅方法は、有用であり得る。ＰＣＲの一般的手法は、MacPherson et al., PCR: A Practical Approach, (IRL Press at Oxford University Press (1991)）に教示されている。しかしながら、各応用反応に使用するＰＣＲ条件は、経験的に決定される。数々のパラメーターが反応の成功に影響を与える。これらには、アニーリングの温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋および／またはＡＴＰの濃度、ｐＨ、および、プライマー、鋳型およびデオキシリボヌクレオチドの相対的濃度が含まれる。増幅後、アガロースゲル電気泳動と、続くエチジウムブロマイド染色および紫外線照射による可視化によって、得られたＤＮＡ断片を検出できる。
【００７１】
ある実施態様では、サンプル核酸に結合した１種またはそれ以上の標識を検出することにより、ハイブリダイズした核酸を検出する。標識は、当業者に周知の数々の手段のいずれによって組み込んでもよい。しかしながら、ある態様では、標識は、サンプル核酸の調製における増幅段階中に同時に組み込まれる。従って、例えば、標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識された増幅産物を提供する。別の実施態様では、上記の通り、標識されたヌクレオチド（例えば、フルオレセインで標識したＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を使用する転写増幅は、転写される核酸に標識を組み込む。
【００７２】
あるいは、元の核酸サンプル（例えば、ｍＲＮＡ、ｐｏｌｙＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）に、または、増幅が完了した後で増幅産物に、標識を直接付加してもよい。核酸に標識を結合させる手段は当業者に周知であり、例えば、ニックトランスレーション、または、核酸をキナーゼ処理し、続いてサンプル核酸を標識（例えば、フルオロフォア）に連結する核酸リンカーを付加（ライゲーション）することによる、末端標識化（例えば、標識されたＲＮＡを用いる）が含まれる。
【００７３】
本発明で使用するのに適する検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気学的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の化合物が含まれる。本発明において有用な標識には、標識化ストレプトアビジン結合体で染色するためのビオチン、磁気ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光染料（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび他の一般的にＥＬＩＳＡで使用されるもの）、および、コロイド金または色ガラスなどの熱量測定用標識、または、プラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが含まれる。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３,８１７,８３７号；第３,８５０,７５２号；第３,９３９,３５０号；第３,９９６,３４５号；第４,２７７,４３７号；第４,２７５,１４９号；および第４,３６６,２４１号が含まれる。
【００７４】
標識の検出は、当業者に周知である。従って、例えば、写真のフィルムまたはシンチレーションカウンターを使用して放射性標識を検出し得、放出された光を検出する光検出器を使用して蛍光マーカーを検出し得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、酵素の基質に対する作用により産生される反応生成物を検出することにより検出し、熱量測定用標識は、色のついた標識を単純に可視化することにより検出する。
【００７５】
検出可能な標識は、ＷＯ９７／１０３６５に記載されているように、ハイブリダイゼーションの前または後に、標的（サンプル）核酸に付加し得る。これらの検出可能な標識は、ハイブリダイゼーションに先立ち、標的（サンプル）核酸に直接結合させるか、組み込まれる。対照的に、「間接的標識」は、ハイブリダイゼーション後に、ハイブリッド二本鎖に加えられる。一般的に、間接的標識は、ハイブリダイゼーションに先立ち標的核酸に付加された結合部分に付加する。例えば、標的核酸は、ハイブリダイゼーション前にビオチニル化され得る。ハイブリダイゼーション後に、アビジンを結合したフルオロフォアが、ビオチンを担持するハイブリッド二本鎖に結合し、容易に検出される標識を提供する。核酸の標識および標識化されたハイブリダイズした核酸の検出の方法の詳細な検討には、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993) を参照されたい。
【００７６】
ポリペプチドの検出
ＰＤマーカーの発現レベルは、タンパク質産物を調べることにより測定することもできる。タンパク質レベルの測定には、（ａ）少なくとも１種のＣＤＫＩの投与；および（ｂ）ＣＤＫＩを投与された患者から得られたサンプル中のＰＤマーカーのポリペプチドを選択的に認識し、結合する抗体との間に生じる免疫特異的結合の量の測定；および、（ｃ）対照サンプルと少なくとも１種のＰＤマーカーの免疫特異的結合量の比較が含まれる。
【００７７】
タンパク質分析の分野の様々な技法を利用できる。それらには、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫放射定量測定法、インサイチュの免疫アッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、共焦点顕微鏡法、酵素的アッセイ、表面プラズモン共鳴法およびＰＡＧＥ−ＳＤＳが含まれるが、これらに限定されない。
【００７８】
ＰＤマーカーおよびＣＤＫＩ処置のアッセイ
ＣＤＫＩの患者への投与は、処置の過程を通して、連続的または断続的に、１つの用量で行うことができる。最も有効な投与の手段と用量の決定方法は当業者に周知であり、治療に使用する組成物、治療の目的、処置される標的細胞および処置される対象に伴って変動する。処置する医師により選択される用量レベルとパターンで、単回または複数回の投与を実施できる。薬剤の投与に適する投与製剤および方法は、経験的に調節され得る。
【００７９】
ＣＤＫＩが活性であるか否かを判定するために、ＣＤＫＩ投与後にＰＤマーカーをアッセイする。加えて、単回のＣＤＫＩ投与後に、複数の時点でＰＤマーカーをアッセイできる。例えば、最初のＣＤＫＩのボーラスを投与し、その最初の処置の１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間後にＰＤマーカーをアッセイする。
【００８０】
各ＣＤＫＩ投与後にＰＤマーカーをアッセイできるので、複数回のＣＤＫＩ投与がある場合、各投与後にＰＤマーカーをアッセイできる。患者は複数回のＣＤＫＩ投与を受け、次いで、ＰＤマーカーを異なる時点でアッセイすることができる。例えば、処置の過程は、最初のＣＤＫＩ投与、特定の期間後の２回目の投与、および、２回目の投与の後にさらに第３の投与時間を必要とし得る。各ＣＤＫＩ投与の１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間後にＰＤマーカーをアッセイし得る。
【００８１】
異なるＰＤマーカーを異なる時点でアッセイすることも、本開示の範囲内である。いかなる理論にも束縛されないが、ＣＤＫＩまたはＰＤマーカーの作用メカニズムのために、ＣＤＫＩへの応答は遅れ、ＰＤマーカーは投与後のいかなる時点でもアッセイされる。例えば、最初のＰＤマーカーはＣＤＫＩへの早期応答性のマーカーであり、投与の０−４時間以内のいずれかの時点でアッセイされる。次いで、第２のＰＤマーカーは、ＣＤＫＩ投与の４−８時間以内のいずれかの時点でアッセイできる。各ＣＤＫＩ投与後の少なくとも１種のＰＤマーカーのアッセイは、処置の手段、用量および過程のガイダンスを提供する。
【００８２】
最終的に、異なるＣＤＫＩを投与し、続いて、少なくとも１種のＰＤマーカーをアッセイする。この実施態様では、表１から１種を超えるＣＤＫＩを選択し、患者に投与する。次いで、各々の異なるＣＤＫＩの投与後に、少なくとも１種のＰＤマーカーをアッセイできる。異なるＣＤＫＩの投与後に、このアッセイを複数の時点で行うこともできる。例えば、第１のＣＤＫＩを患者に投与し、ＰＤマーカーを、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間後にアッセイできる。次いで、第２のＣＤＫＩを投与し、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１６時間、２４時間および４８時間でＰＤマーカーを再度アッセイできる。
【００８３】
本開示の他の態様は、ＣＤＫＩの投与後に表２で同定される遺伝子の少なくとも１種の差次的発現をモニタリングすることを含む、適するＣＤＫＩの用量レベルを評価する方法を提供する。例えば、ＣＤＫＩの最初のボーラス投与後に、ＰＤマーカーを分析し、この結果に基づいて、ＣＤＫＩ投与量の増加を推奨する。より高い投与量のＣＤＫＩの投与後に、ＰＤマーカーの分析は、より高い用量が、期待される利益、例えば、腫瘍増殖の抑制を提供するか否かを判定する。
【００８４】
ＣＤＫＩの活性を評価するためのキットを作成できる。例えば、表２に挙げる遺伝子のＰＣＲ用またはマイクロアレイハイブリダイゼーション用の核酸プライマーを含むキットを、ＣＤＫＩ活性の評価に使用できる。あるいは、表２に挙げる遺伝子の少なくとも１種の抗体と共に供給されるキットは、ＣＤＫＩ活性またはその耐性をアッセイするのに有用であろう。
【００８５】
特に処置が長くなるときに癌が化学療法的処置に耐性になり得ることは、当分野で周知である。癌がＣＤＫＩに感受性であるか否かを判定するために、ＰＤマーカーの差次的発現のアッセイを、任意の化学療法剤による長い処置の後に行うことができる。例えば、グリベックなどのキナーゼ阻害剤は、特定のキナーゼを強く阻害するが、他のキナーゼも弱く阻害し得る。本明細書に記載されたＣＤＫＩとは異なる、他のＣＤＫ阻害剤もある。患者が以前に他のキナーゼ阻害剤または他のタイプのＣＤＫ阻害剤で処置されていたならば、腫瘍がＣＤＫＩに感受性であるか否かを判定するために表２のＰＤマーカーについてアッセイすることは、患者にとって有用な情報である。このアッセイは、癌が寛解に向かい、その後再増殖したか、または異なる部位に転移した場合に、患者にとって特に有益であり得る。
【００８６】
ＣＤＫ阻害剤のスクリーニング
他のＣＤＫ阻害剤をスクリーニングするために、本発明のＣＤＫＩおよびＰＤマーカーを使用することができる。この方法は、細胞をＣＤＫ阻害剤候補と接触させること、表２に挙げるＰＤマーカーの少なくとも１種の差次的遺伝子発現を測定すること、および、結果を、表１のＣＤＫＩと接触した細胞の差次的遺伝子発現、および、対照細胞の少なくとも１種のＰＤマーカーの発現と比較することを含む。例えば、候補ＣＤＫ阻害剤は、ＰＤマーカーの発現を、少なくとも表１に挙げるＣＤＫＩと同じくらい強く減少させる。ＰＤマーカー発現の測定は、以前に記載された方法、例えば、ＰＣＲまたはマイクロアレイ分析により行うことができる。
【００８７】
表２
【表１】
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【実施例】
【００８８】
実施例
実施例１
５種の細胞株を分析した：ＮＣＩ−Ｈ９２９、多発性骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ.＃ＣＲＬ−９０６８）；ＮＣＩ−Ｈ４４１、肺乳頭腺癌細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ.＃ＨＴＢ−１７４）；Ａ３７５、黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ.＃ＣＲＬ−１６１９）；Ａ２０５８、黒色腫細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ.＃ＣＲＬ−１１４７）およびＵ−８７−ＭＧ、神経膠芽腫細胞株（ＡＴＣＣ Ｃａｔ.＃ＨＴＢ−１４）。細胞株をＡＴＣＣにより推奨される培地で増殖させ、以下の通りに処置した：
ＮＣＩ−Ｈ９２９：２時間：ＤＭＳＯ、２００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）。
ＮＣＩ−Ｈ４４１およびＡ３７５：０時間：非処置、他のプレートに化合物が添加されるときに回収。
２時間：ＤＭＳＯ、２００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（７）（プレート３枚ずつ、全１２枚）。（商標）
８時間：ＤＭＳＯ、２００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（７）（プレート３枚ずつ、全１２枚）。
１６時間：ＤＭＳＯ、２００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）または５００ｎＭ ＣＫＤＩ（７）（プレート３枚ずつ、全１２枚）。
Ａ２０５８、Ｕ−８７−ＭＧ
０時間：非処置、他のプレートに化合物が添加されるときに回収（プレート３枚）。
２時間：ＤＭＳＯ、５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）（プレート３枚ずつ、全６枚）。
８時間：ＤＭＳＯ、５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）（プレート３枚ずつ、全６枚）。
１６時間：ＤＭＳＯ、５００ｎＭ ＣＫＤＩ（８）（プレート３枚ずつ、全６枚）。
【００８９】
この分析のＩＣ５０結果を、図１に示す。製造業者の推奨するプロトコールを実行する Affymetrix GeneChip ArrayStation（商標） (Affymetrix, Santa Clara, CA USA) を使用するマイクロアレイプロファイリングのために、ＲＮＡを調製した。標的生成物を Affymetrix（商標） U133-Plus-2 全ゲノムマイクロアレイにハイブリダイズさせ、Affymetrix GeneChip Scanner 3000（商標）でスキャンした。未加工のデータに生物情報学的分析を実施し、結果を得た。実験室での処理およびデータ分析の間に製造業者の推奨する品質管理基準を検査し、高品質の結果を確実にした。
【００９０】
同型腫瘍の幾何平均（geomean）発現レベルをコンピューター処理することにより、各プローブセットにつき、各時点および処置条件で平均発現レベルを測定した。この実験のために、ＣＤＫＩ処置／媒体のみの対照の比が、少なくとも１つの時点で、０.００１未満のｐ値で２倍より高いか低いならば、プローブセットを有意に差次的であると同定した。ｐ値は、不等分散を仮定する両側ｔ検定により決定した（Satterwaithe の近似法）。Affymetrix により供給される標的プローブ配列を GenBank（商標）に対してブラスト処理することにより、プローブセットを遺伝子にマッピングした。
【００９１】
マイクロアレイで探索された遺伝子の中で、ＰＤマーカーＭＥＰＣＥ、ＭＣＬ、ＭＹＣ、ＨＥＸＩＭ、ＬＡＲＰ７およびＷＨＳＣ２の発現が減少し、これは、ＣＤＫＩが活性であることを示す。これを図２に示し、ここでは、ＣＤＫＩに感受性であるＡ３７５細胞をＣＤＫＩ（７）で処置し、遺伝子発現の減少を処置の２、８および１６時間後に測定した。図２に示す通り、ある種の遺伝子、例えばＭＥＰＣＥの発現は、８時間の時点で最大の減少量である。
【００９２】
図３は、特異的ＣＤＫ９阻害剤であるＣＤＫＩ（８）での処置の際にＭＥＰＣＥ発現が減少すること、および、この発現の減少はすべてのＣＤＫを強く阻害する汎ＣＤＫ阻害剤であるＣＤＫＩ（１１）に匹敵することを示す。ＣＤＫＩ（１１）は、ＳＣＨ７２７９６５またはジナシクリブ（Dinaciclib）（登録商標） (Mol. Cancer Ther. 2010, 9(8):2344-2353) としても知られている。図３に示す通り、ＣＤＫＩ（８）およびＣＤＫＩ（１１）は、両方とも、ＭＥＰＣＥの発現を減少させ、これは、ＭＥＰＣＥが任意のＣＤＫ９阻害剤のＰＤマーカーであることを示す。転写伸長も低下させるアクチノマイシンＤも使用し、図３は、この化合物による処置がＭＥＰＣＥの発現も低下させることを示す。
【００９３】
実施例２
ＣＤＫＩによる処置の後、５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７.４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％Ｂｒｉｊ−３５、０.１％デオキシコレート、プロテアーゼ阻害剤（Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany）を含有する改変されたＲＩＰＡバッファー中で細胞を溶解させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％ゲル）を使用して、溶解物中のタンパク質を分離させた。電気泳動後、タンパク質をポリビニリデンフルオライド微多孔膜に電気転写し（electrotransferred）、標準的な手順を使用して免疫検出した。図４は、ＣＤＫＩ（７）またはＤＭＳＯで処置された多発性骨髄腫株ＮＣＩ−Ｈ９２９のウエスタンブロットおよび処置中のある時点で分析された遺伝子発現である。ブロット中に示される通り、ＭＥＰＣＥの遺伝子発現は経時的に減少し、１６時間の時点では殆どないレベルから検出できないレベルのタンパク質発現である。従って、マイクロアレイによりｍＲＮＡレベルで見られる、ＣＤＫＩに応答する遺伝子発現の減少は、ウエスタンブロットによりタンパク質レベルで確認される。
【００９４】
図５は、ＣＤＫＩ（８）処置後の抗アポトーシス性およびアポトーシス促進性のファミリーのメンバーの発現の減少を比較するウエスタンブロットである。例えば、ＭＣＬ１タンパク質の発現は、処置の２時間後に減少し、１６時間のＣＤＫＩ（８）暴露後に、さらに減少する。
【００９５】
実施例３
イヌの毒性学研究の一部として、ＣＤＫＩ（７）をイヌに投与した。白血球細胞を回収し、ＭＥＰＣＥ、ＭＹＣおよびＭＣＬ１の遺伝子発現をＰＤマーカーとして評価した。これらのＰＤマーカーの各々のｍＲＮＡレベルを TaqMan（登録商標）により、ＣＤＫＩ（７）処置後の様々な時点で測定した。
【００９６】
この研究では、各々３匹のイヌの３つの群を用いた。群１のイヌ（＃１０１、＃１０２および＃１０３）を０.５ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（７）で、群２のイヌ（＃１０４、＃１０５および＃１０６）を１ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（７）で、そして、群３のイヌ（＃１０７、＃１０８および＃１０９）を、２ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（７）で処置した。処置前（０時間）、処置後３時間、７時間および２４時間で、各群につき全部で１２個のサンプルを回収した。血液サンプルを QIAGEN RNAprotect（登録商標） Animal Blood tubes (Cat. # 76554 QIAGEN- Valencia, CA, USA) に凍結して受け入れた。QIAGEN RNeasy（登録商標） Protect Animal Blood kit (Cat. # 73224) を使用してＲＮＡサンプルを抽出した。Invitrogen の RNA Quant-iT RNA（登録商標）(Cat. # Q32852 Invitrogen - Grand Island, NY, USA) アッセイを使用してＲＮＡサンプルを定量し、Invitrogen Qubit fluorometer（登録商標）(Cat. # Q32857) で読み取った。Applied Biosystems の High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（登録商標）(Cat. # 4368814 Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA) を使用して、２０μｌの反応体積中、ＲＮＡ５００ｎｇで第１の鎖のｃＤＮＡ合成を実施した。次いで、ｃＤＮＡサンプルを希釈し、TaqMan（登録商標） 反応のために１０ｎｇのｃＤＮＡ材料を得た。Applied Biosystems の TaqMan（登録商標） Gene Expression Master Mix (Cat. # 4369016) を ABI 7500（登録商標）装置で使用して、TaqMan（登録商標）反応をトリプリケートで実施した。ＭＥＰＣＥ、ＭＹＣおよびＭＣＬ１の発現をアッセイするのに使用したプローブセットを表３に示す。ｃＤＮＡ材料における差異のための内在性対照として、１８Ｓ ｒＲＮＡレベルを使用した。相対的定量方法を使用して、データを分析した；この方法は、１つのサンプルを較正サンプルとして使用し、ｍＲＮＡレベルをそのサンプルと比較して表す。結果をＲＱ値（相対的定量値）として表し、ＲＱ ＭｉｎおよびＲＱ Ｍａｘ値は、実際のＲＱ値に９５％信頼区間を定める。用量によってサンプルを分類し、投与前のサンプルの１つを較正サンプルとして使用して、各群を別個の実験として処理した。初期値からの増加または減少がより容易に表されるように、ＲＱ値の対数をプロットした；対数目盛では：ＲＱ値の１０倍の増加または１０倍の減少は、各々＋１および−１と表される。ＲＮＡの収量が非常に低かったため、イヌ＃１０８の最後のデータポイントは除いたことに留意されたい。
【００９７】
表３  使用した TaqMan（登録商標）遺伝子発現アッセイ
【表２】
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【００９８】
先の実施例は、ＭＥＰＣＥのｍＲＮＡが、任意のＣＤＫＩによるＣＤＫ９阻害に特に感受性であることを示す（図２参照）。加えて、ＭＥＰＣＥは、ＣＤＫ９に結合する正の転写伸長因子であるＰ−ＴＥＦｂを捕捉し、それを不活性形態に維持する７ＳＫ ｓｎＲＮＡ複合体の一部である。相対的定量方法を使用して、TaqMan（登録商標）によりｍＲＮＡレベルを測定した。較正サンプルは、０.５ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤＫＩ（７）には０時間の時点のイヌ＃１０１、１ｍｇ／ｋｇの用量には０時間の時点のイヌ＃１０４、そして、２ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤＫＩ（７）には０時間の時点のイヌ＃１０７である。ＲＱ値の対数（基準１０）を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共にプロットする。ＭＥＰＣＥ ｍＲＮＡの結果を図６に示す。３種すべてのＣＤＫＩの用量で、明確なＭＥＰＣＥの下方調節がある。下方調節の振幅と期間は、用量依存的である；０.５ｍｇ／ｋｇ ＣＤＫＩ（７）で、最大の下方調節は３時間で３.２倍、１ｍｇ／ｋｇ ＣＤＫＩ（７）では、７時間で５.２倍、２ｍｇ／ｋｇでは、７時間で１４倍である。２４時間では、イヌのうち１匹（＃１０９）が依然としてある程度の下方調節を示す２ｍｇ／ｋｇの用量を除き、ＭＥＰＣＥ ｍＲＮＡレベルは処置前のレベルに戻る。
【００９９】
ＭＹＣ転写因子は、既知の癌遺伝子であり、先の実施例はそのｍＲＮＡが短命であり、ＣＤＫ９阻害に感受性であることを示した（図２参照）。相対的定量方法を使用する TaqMan（登録商標）により、ＭＹＣのｍＲＮＡレベルを測定した。較正サンプルは、０.５ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤＫＩ（７）には０時間の時点のイヌ＃１０１、１ｍｇ／ｋｇＣＤＫＩ（７）の用量には０時間の時点のイヌ＃１０４、そして、２ｍｇ／ｋｇＣＤＫＩ（７）の用量には０時間の時点のイヌ＃１０７である。ＲＱ値の対数（基準１０）を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共にプロットする。ＭＹＣ ｍＲＮＡ（図７参照）は、２ｍｇ／ｋｇの用量でのみ、一貫した下方調節を示す。３匹すべてのイヌのＭＹＣ発現は、３時間（最大３.８倍）で、３匹のうち２匹は７時間で下方調節を示す。低いほうの用量では、有意な下方調節がないか（０.５ｍｇ／ｋｇ）、または、１ｍｇ／ｋｇでは３または７時間の時点で小さい増加（２倍）がある。すべての場合で、ｍＲＮＡレベルは２４時間までに処置前のレベルに戻った。
【０１００】
ＭＣＬ１遺伝子は、癌においてしばしば増幅される生存促進因子をコードし、我々は、先にそのｍＲＮＡが短命であり、ＣＤＫ９阻害に感受性であることを示した（図２参照）。相対的定量方法を使用して、TaqMan（登録商標）により、ｍＲＮＡレベルを測定した。較正サンプルは、０.５ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤＫＩ（７）には０時間の時点のイヌ＃１０１、１ｍｇ／ｋｇの用量には０時間の時点のイヌ＃１０４、そして、２ｍｇ／ｋｇの用量には０時間の時点のイヌ＃１０７である。ＲＱ値の対数（基準１０）を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共にプロットする。ＭＣＬ１ ｍＲＮＡ（図８参照）は、２ｍｇ／ｋｇの用量でのみ、一貫した下方調節を示す。３匹すべてのイヌでＭＣＬ１発現は３時間（最大２.７倍）で下方調節を示すが、７時間では示さない。低いほうの用量では、有意な下方調節がないか（０.５ｍｇ／ｋｇ）、または、１ｍｇ／ｋｇでは７時間の時点で３匹中２匹のイヌで小さい増加（２倍）がある。
【０１０１】
３種のｍＲＮＡをＣＤＫＩ（７）の効果のＰＤマーカーとして測定した。ＭＥＰＣＥ ｍＲＮＡは３種のマーカーのうちで最も鋭敏であり、３種の用量のすべてで測定可能な明確な下方調節を示した。応答の振幅および期間は、両方とも用量に比例し、７時間で１４倍の最大の下方調節に達した。上記で論じた細胞株での実験に基づき、ＭＥＰＣＥは、ＣＤＫ９を阻害するいかなる分子または化合物についてもＰＤマーカーであることが明らかである。ＭＥＰＣＥの下方調節は、このＣＤＫＩ（７）を用いる研究において示され、上記の実験は、以下に示す通り、ＣＤＫＩ（８）、ＣＤＫＩ（１１）およびＣＤＫＩ（１２）によるＭＥＰＣＥの減少における減少を示す。ＭＹＣ ｍＲＮＡは、二番目に鋭敏なマーカーであった；それは、０.５または１ｍｇ／ｋｇでは有意に下方調節されなかったが、２ｍｇ／ｋｇの用量のＣＤＫＩ（７）は、ＭＹＣの発現を低減させた。下方調節は、７時間よりも３時間でより強く、より一貫していた。下方調節の振幅はＭＥＰＣＥよりも小さく、最大でＭＥＰＣＥの１４倍に対して、３.８倍であった。最後に、ＭＣＬ１ ｍＲＮＡは、３つのマーカーで最も鋭敏ではなかった。それは、２ｍｇ／ｋｇでのみ下方調節されたが、３時間の時点のみであり、振幅はＭＹＣ ｍＲＮＡよりも小さかった（最大３.８倍に対して、２.７倍）。
【０１０２】
この実験は、また、患者に治療剤として投与されている場合に、ＣＤＫＩが有効であるか否かを判定するために非癌性組織をアッセイできることを示す。例えば、黒色腫を減らす目的で黒色腫の患者にＣＤＫＩを投与する場合、このイヌの研究で行ったように、患者の末梢血の白血球細胞（ＰＢＭＣ）をＭＥＰＣＥについてアッセイできる。これは、癌組織および正常組織の組織生検は、ＣＤＫＩが活性であるか否かを判定するのに厳密には必要がないことを意味する。一連の血液採取および TaqMan（登録商標）アッセイが、この情報を提供できる。
【０１０３】
実施例４
イヌの毒性学研究の一部として、薬力学マーカーのＭＥＰＣＥ、ＭＹＣおよびＭＣＬ１を、ＣＤＫＩ（１２）処置後の様々な時点で、白血球細胞において、TaqMan（登録商標）により測定した。これらのｍＲＮＡは、以前に、マウスおよびラットで、異種移植片および白血球細胞の両方において、ＣＤＫ９阻害剤およびＣＤＫＩにより調節されると示された。
【０１０４】
この研究では、各々３匹のイヌの３つの群を用いた。群１のイヌ（＃１００１、＃１００２および＃１００３）を媒体で処置し、群３のイヌ（＃３００１、＃３００２および＃３００３）を０.１ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（１２）で処置し、群５のイヌ（＃５００１、＃５００２および＃５００３）を０.１５ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（１２）で処置した。サンプルを処置前の０時間の時点；処置後４時間、８時間および２４時間で、各群につき全部で１２個のサンプルで、回収した。血液サンプルを QIAGEN RNAprotect（登録商標） Animal Blood tubes (Cat. #76554) に凍結して受け入れた。QIAGEN RNeasy（登録商標） Protect Animal Blood kit (Cat. # 73224) を使用してＲＮＡサンプルを抽出した。Invitrogen の RNA Quant-iT RNA assay（登録商標）(Cat. # Q32852) を使用してＲＮＡサンプルを定量し、Invitrogen Qubit fluorometer（登録商標）(Cat. # Q32857) で読み取った。Applied Biosystems の High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit（登録商標）(Cat. # 4368814) を使用して、２０μｌの反応体積中、ＲＮＡ５００ｎｇで第１の鎖のｃＤＮＡ合成を実施した。次いで、ｃＤＮＡサンプルを２ｎｇ／μｌ（各反応で５μｌ中１０ｎｇ）に希釈した。各 TaqMan（登録商標）反応は、全体積２５μｌに、ｃＤＮＡ５μｌ、各プローブ（１８Ｓ ｒＲＮＡおよび関心のある遺伝子）１.２５μｌ、水５μｌおよび Applied Biosystems の TaqMan（登録商標）Gene Expression Master Mix from (Cat. #4369016) １２.５μｌを含有した。TaqMan（登録商標）反応を、ABI7500（登録商標）装置で、トリプリケートで行った。使用したプローブを表３に示す（上記実施例３参照）。ｃＤＮＡ材料における差異を補正するための内在性対照として、１８Ｓ ｒＲＮＡレベルを使用した。相対的定量方法を使用して、データを分析した；この方法は、１つのサンプルを較正サンプルとして使用し、ｍＲＮＡレベルをそのサンプルと比較して表す。結果をＲＱ値（相対的定量値）として表し、ＲＱ ＭｉｎおよびＲＱ Ｍａｘ値は、ＲＱ値に９５％信頼区間を定める。サンプルを処置および時点によって分類し、各々トリプリケートで測定した３匹のイヌからのデータを平均した。０時間の時点の媒体処置群を較正サンプルとして使用し、かくして、様々な時点で試験品に応答したｍＲＮＡレベルの変化を測定することを我々に可能にした。初期値からの増加または減少がより容易に表されるように、ＲＱ値の対数をプロットした；対数目盛ではＲＱ値の１０倍の増加または１０倍の減少は、各々＋１および−１と表される。
【０１０５】
我々は、先に、ＭＥＰＣＥ ｍＲＮＡはＣＤＫ９阻害および任意のＣＤＫＩに特に感受性であることを示した（上記実施例参照）。加えて、ＭＥＰＣＥは、ＣＤＫ９に結合する正の転写伸長因子であるＰ−ＴＥＦｂを捕捉し、それを不活性形態に維持する７ＳＫ ｓｎＲＮＡ複合体の一部である。相対的定量方法を使用して、TaqMan（登録商標）により、ｍＲＮＡレベルを測定した。較正サンプルは、０時間の時点での媒体である。ＲＱ値の対数（基準１０）を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共にプロットする。ＭＥＰＣＥ ｍＲＮＡの結果を図９に示す。最高用量のＣＤＫＩ（１２）（０.１５ｍｇ／ｋｇ）で、明確なＭＥＰＣＥの下方調節がある。ｍＲＮＡレベルは４および８時間で下がり、２４時間までに処置前のレベルに戻る。０.１ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（１２）では下方調節は少ないが、曲線は０.１５ｍｇ／ｋｇの群のものと平行する。
【０１０６】
ＭＹＣ転写因子は、既知の癌遺伝子であり、我々は先にそのｍＲＮＡが短命であり、ＣＤＫ９阻害に感受性であることを示した。相対的定量方法を使用して、TaqMan（登録商標）により、ＭＹＣのｍＲＮＡレベルを測定した。較正サンプルは、時点０の媒体である。ＲＱ値の対数（基準１０）を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共にプロットする。
【０１０７】
ＭＹＣ ｍＲＮＡ（図１０参照）は、試験した用量のいずれでも、有意な下方調節を示さない。
【０１０８】
ＭＣＬ１遺伝子は、癌においてしばしば増幅される生存促進因子をコードし、我々は、先にそのｍＲＮＡが短命であり、ＣＤＫ９阻害およびＣＤＫＩに感受性であることを示した。ＭＣＬ１ ｍＲＮＡ（上記表３参照）のために、２種のプローブ、即ち、プローブＣｆ０２７１３４６８＿ｍ１（ＭＣＬ１−１）およびプローブＣｆ０２６２２２８６＿ｍ１（ＭＣＬ１−２）を使用した。両方のプローブは、非常に似た結果を示す。相対的定量方法を使用する TaqMan（登録商標）により、ｍＲＮＡレベルを測定した。較正サンプルは、０時間の時点での媒体である。ＲＱ値の対数（基準１０）を、９５％信頼区間を表すエラーバーと共にプロットする。ＭＣＬ１ ｍＲＮＡ（図１１参照）は、試験した用量のいずれでも、有意な下方調節を示さない。
【０１０９】
まとめると、ＣＤＫＩ（１２）の投与後に３種の異なるＰＤマーカーをアッセイした。ＭＥＰＣＥは３種のマーカーのうちで最も鋭敏であり；０.１５ｍｇ／ｋｇおよび０.１ｍｇ／ｋｇのＣＤＫＩ（１２）で、各々明確な下方調節を示した。ｍＲＮＡのレベルは４および８時間で低下し、２４時間までに処置前のレベルに戻った。ＭＹＣおよびＭＣＬ１のｍＲＮＡは、試験した用量で有意に下方調節されなかった。実施例３にＣＤＫＩ（７）で示す通り、ＭＹＣおよびＭＣＬ１は、調節されるにはより高い用量を必要とし、これはＣＤＫＩ（１２）でも該当し得る。
【図１】
2014510533.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成25年11月8日(2013.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2014510533.tif 000028