(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと産卵低下症候群（EDS）ウイルス（EDSV）のファイバータンパク質中のノブ領域（Knob）を結合させた融合タンパク質であって、Knobが配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである融合タンパク質（但し、配列番号１１のN末端側に天然のシャフト領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸が１又は数個付加したものを除く）。
【請求項２】
前記ポリペプチドとKnobとの間にリンカー配列及び／又はタグ配列を有する請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記コイルドコイル形成ユニットが天然の多量体形成タンパク質に由来するものである請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記天然の多量体形成タンパク質がGCN4又はcartilage  matrix  protein（CMP）である請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
GCN4又はCMPがKnobのC末端側に結合したものである請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
GCN4がKnobのC末端側に結合したものである請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号１３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
CMPがKnobのC末端側に結合したものである請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
配列番号２３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
GCN4又はCMPがKnobのN末端側に結合したものである請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
GCN4がKnobのN末端側に結合したものである請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
CMPがKnobのN末端側に結合したものである請求項１０記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号２５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれかの項に記載の融合タンパク質を多量体化した融合タンパク質多量体。
【請求項１６】
請求項１ないし１４のいずれかの項に記載の融合タンパク質をコードするDNA配列からなる核酸断片。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸断片を含む組換え発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸断片が導入された形質転換体。
【請求項１９】
請求項１７に記載の組換え発現ベクターが導入された形質転換体。
【請求項２０】
請求項１ないし１４のいずれかの項に記載の融合タンパク質を有効成分として含有するEDS用ワクチン。
【請求項２１】
請求項１５に記載の融合タンパク質多量体を有効成分として含有するEDS用ワクチン。
【請求項２２】
請求項１７に記載の組換え発現ベクターを有効成分として含有するEDS用DNAワクチン。
【請求項２３】
請求項１ないし１４のいずれかの項に記載の融合タンパク質を含む、被検試料中のEDSVのKnobに対する抗体量を測定するためのキット。
【請求項２４】
請求項１５に記載の融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のEDSVのKnobに対する抗体量を測定するためのキット。
【請求項２５】
請求項１ないし１４のいずれかの項に記載の融合タンパク質を鶏に投与するEDSの予防方法。
【請求項２６】
請求項１５に記載の融合タンパク質多量体を鶏に投与するEDSの予防方法。
【請求項２７】
請求項１７に記載の組換え発現ベクターを鶏に投与するEDSの予防方法。
【請求項２８】
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと産卵低下症候群（EDS）ウイルス（EDSV）のファイバータンパク質中のノブ領域（Knob）を結合させた融合タンパク質であって、Knobが配列番号１１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド又はこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである融合タンパク質（但し、配列番号１１のN末端側に天然のシャフト領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸が１又は数個付加したもの、及び、配列番号１１のアミノ酸配列において１番目から９番目のアミノ酸のうち１もしくは数個のアミノ酸が欠失または置換されたものを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は鶏のEDSを予防するワクチンに関する。より具体的には、EDSの病因であるEDSウイルス（EDSV）のファイバータンパク質中の「ノブ(knob)領域」と「コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチド」を融合させた組換えタンパク質及び／又はその多量体を有効成分とするワクチンである。この融合タンパク質及び／又はその多量体を鶏に接種することで高い赤血球凝集抑制（HI）抗体が誘導され、EDSの発症を予防することが可能となる。
【背景技術】
【０００２】
EDSは、EDSVの感染鶏より産卵低下及び異常卵の産出を主徴とする鶏の疾病である（非特許文献１及び非特許文献２）。EDSVは、グループIIIトリアデノウイルスに分類され、赤血球凝集活性を有し、鶏の卵管で増殖することを特徴とする。EDSの臨床症状は皆無あるいは軽い下痢がみられる程度であるが、産卵最盛期の30〜40週齢に多く発生し、感染した鶏群では3〜8週間にわたる卵殻異常卵の産出や産卵低下を引き起こすことから、経済的被害は非常に大きい。予防にはワクチンが有効である（非特許文献３）ため、不活化ワクチンが採卵用鶏のワクチネーションプログラムに広く組み込まれている。【０００３】
EDS不活化ワクチンについては、発育アヒル卵で増殖させたウイルスを不活化後、アジュバントと混合したものが主流である。発育アヒル卵におけるEDSVの増殖は良好である（非特許文献４及び非特許文献５）反面、鳥インフルエンザなどの感染症の発生により、発育アヒル卵の供給が困難になる可能性もあることから、アヒル卵に依存しないワクチン抗原の供給手段が求められている。【０００４】
EDSVは約33 kbの二本鎖のゲノムDNAを持ち（非特許文献６）、血清型は単一で株間における抗原性の違いはほとんどない（非特許文献７）。ウイルス粒子は、コアタンパク、カプシドを構成するヘキソン、カプシドから繊維状の突起として突き出している3量体のファイバー及びその基部であるペントンベース等の構造タンパク質から構成される（非特許文献１及び非特許文献６）。そのうち、中和エピトープが存在するのはヘキソン（非特許文献８）、ファイバー及びペントンベース（非特許文献９）であり、なかでもファイバーは宿主細胞への侵入に関わる（非特許文献10）ことから多くの研究がなされている（非特許文献11）。ファイバータンパク質は、機能によって3つの領域に区分されている（非特許文献12）。ペントンベースとの接続に関与する（非特許文献13）N末端側はテイル（Tail）、中間の領域はシャフト（Shaft）と称される。C末端に存在するKnobは赤血球凝集活性をもち、細胞レセプターとの結合に関与することが報告されている（非特許文献11）。ヒトアデノウイルス５型について、ファイバータンパク質の3領域のうち、中和エピトープが存在するのはknobであるが、機能を発揮するには立体構造が重要であり、隣接するシャフト領域の一部と共に発現させることでレセプターとの結合活性を示したとの報告がある（非特許文献14）。【０００５】
ファイバータンパク質の軸を構成するシャフト領域は、プロリンあるいはグリシンを挟んだ疎水性領域からなるβらせん構造（1リピート）が複数連なったリピート構造（非特許文献12及び非特許文献15）を有し、かつ3分子が会合して3重βらせん構造を形成している（非特許文献15及び非特許文献16）。シャフトに続くknobも同様に3量体構造を取っている（非特許文献17）。通常、シャフトの1リピートは15アミノ酸からなる（非特許文献12）が、EDSVの場合はほとんどのリピートでそれより多くのアミノ酸から構成されている（非特許文献６）。ヒトアデノウイルスでは、シャフト長を短くすると、レセプターとの結合性及び培養細胞への感染性が低下する（非特許文献18）ことが報告されている。【０００６】
EDSVに関しては、knobと隣接するシャフト領域のC末端部位の34アミノ酸を大腸菌で発現させ、オイルワクチンとして投与した鶏において中和抗体が誘導されたとの報告がある（非特許文献19〜20、特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2004/078977号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Adair, B.M. & Fitzgerald, S.D. : Egg Drop Syndrome. In Diseases of Poultry, 12th ed. (Saif, YM et al. ed.), p266-276, Blackwell Publishing, Ames. 2008
【非特許文献２】山口成夫：産卵低下症候群．「鳥の病気  第7版」（鶏病研究会編），p50-53，鶏病研究会，東京，2010
【非特許文献３】Baxendale, W., Lutticken, D., Hein, R. & McPherson, I. : The results of field trials conducted with an inactivated vaccine against the egg drop syndrome 76 (EDS 76). Avian Pathol., 9: 77-91, 1980
【非特許文献４】野中富士男，松尾和夫，山田進二：産卵低下症候群-1976（EDS-76）ウイルスの培養細胞および発育鶏卵での増殖性ならびに病原性．日本獣医師会雜誌，37：510-515，1984
【非特許文献５】東原 稔，高井伸二，日高温子，宝達 勉，蛭間正巳，渡辺義計，松本 稔：産卵低下症候群 1976(EDS-76) ウイルスの分離．日本獸醫學雜誌，45：603-612，1983
【非特許文献６】Hess, M., Blocker, H. & Brandt, P.: The complete nucleotide sequence of egg drop syndrome virus: an intermediate between mastadenoviruses and aviadenoviruses. Virology, 238: 145-156, 1997
【非特許文献７】Tsukamoto, K., Kuwabara, M., Kaneko, M., Mase, M. & Imai, K.: No evidence for adaptation of current egg drop syndrome 1976 viruses to chickens. Avian Dis., 48: 220-223, 2004
【非特許文献８】Toogood, C.I., Crompton, J. & Hay, R.T.: Antipeptide antisera define neutralizing epitopes on the adenovirus hexon. J. Gen. Virol., 73: 1429-1435, 1992
【非特許文献９】Gahery-Segard, H., Farace, F., Godfrin, D., Gaston, J., Lengagne, R., Tursz, T., Boulanger, P. & Guillet, J.G.: Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. J. Virol., 72: 2388-2397, 1998
【非特許文献１０】Louis, N., Fender, P., Barge, A., Kitts, P. & Chroboczek, J.: Cell-binding domain of adenovirus serotype 2 fiber. J. Virol., 68: 4104-4106. 1994
【非特許文献１１】Horwitz, M.S.: Adenovirus. In Fields Virology, 4th ed., (Knipe DM et al. ed) p2301-2326, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia. 2001
【非特許文献１２】Green, N.M., Wrigley, N.G., Russell, W.C., Martin, S.R. & McLachlan, A.D.: Evidence for a repeating cross-beta sheet structure in the adenovirus fibre. EMBO J., 2: 1357-1365, 1983
【非特許文献１３】Hong, S.S. & Boulanger, P.: Protein ligands of the human adenovirus type 2 outer capsid identified by biopanning of a phage-displayed peptide library on separate domains of wild-type and mutant penton capsomers. EMBO J., 14: 4714-4727, 1995
【非特許文献１４】Henry, L.J., Xia, D., Wilke, M.E., Deisenhofer, J. & Gerard, R.D.: Characterization of the knob domain of the adenovirus type 5 fiber protein expressed in Escherichia coli. J. Virol., 68: 5239-5246, 1994
【非特許文献１５】van Raaij, M.J., Mitraki, A., Lavigne, G. & Cusack, S.: A triple beta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals a new structural motif for a fibrous protein. Nature, 401: 935-938, 1999
【非特許文献１６】Stouten, P.F., Sander, C., Ruigrok, R.W. & Cusack, S.: New triple-helical model for the shaft of the adenovirus fibre. J. Mol. Biol., 226: 1073-1084, 1992
【非特許文献１７】Xia, D., Henry, L., Gerard, R.D. & Deisenhofer, J. : Structure of the receptor binding domain of adenovirus type 5 fiber protein. Curr. Top Microbiol. Immunol., 199: 39-46, 1995
【非特許文献１８】Shayakhmetov, D.M. & Lieber, A.: Dependence of adenovirus infectivity on length of the fiber shaft domain. J. Virol., 74: 10274-10286, 2000
【非特許文献１９】Gutter, B., Fingerut, E., Gallili, G., Eliahu, D., Perelman, B., Finger, A. & Pitcovski, J.: Recombinant egg drop syndrome subunit vaccine offers an alternative to virus propagation in duck eggs. Avian Pathol., 37: 33-37, 2008
【非特許文献２０】Fingerut, E., Gutter, B., Gallili, G., Michael, A. & Pitcovski, J.: A subunit vaccine against the adenovirus egg-drop syndrome using part of its fiber protein.  Vaccine, 21: 2761-2766, 2003
【非特許文献２１】Adv.  Protein  Chem.  2005,70,37-78
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする課題は、EDSの発生が予想される農場に対して、EDSを有効に予防し得る組換えEDSワクチンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは前記課題を解決するべく、まず構造予測モデルを使ってEDSVのファイバータンパク質の構造を検討した結果、knob領域とシャフト領域の境目は、従来考えられていた位置よりもN末端側に存在することを知見した。そしてシャフト領域を含まないように画定したknob領域を、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと融合させた組換えタンパク質及び／又はその多量体は、ワクチンとして鶏に接種することで高いHI抗体を誘導することを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１１】
すなわち本発明は以下のものである。
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとEDSVのファイバータンパク質中のknob領域を結合させた融合タンパク質。【００１２】
前記コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドが、GCN4又はcartilage  matrix  protein（CMP）である融合タンパク質。【００１３】
前記融合タンパク質を多量体化した融合タンパク質多量体。【００１４】
前記融合タンパク質をコードするDNA配列からなる核酸断片。【００１５】
前記核酸断片を含む組換え発現ベクター。【００１６】
前記核酸断片が導入された形質転換体。【００１７】
前記組換え発現ベクターが導入された形質転換体。【００１８】
前記融合タンパク質またはその多量体と結合することができる抗体。【００１９】
前記融合タンパク質を有効成分として含有するEDS用ワクチン。【００２０】
前記抗体を有効成分として含有するEDS用治療剤。【００２１】
前記核酸断片又は組換え発現ベクターを有効成分として含有するEDS用DNAワクチン。【００２２】
前記融合タンパク質又はその多量体を含む被検試料中のEDSVのknob領域に対する抗体量を測定するためのキット。【００２３】
前記抗体を含む被検試料中のEDSVのknob領域の含有量を測定するためのキット。【００２４】
前記融合タンパク質、その多量体、核酸断片又は組換え発現ベクターを鶏に投与するEDSの予防方法。【００２５】
前記抗体を鶏に投与するEDS治療方法。
【発明の効果】
【００２６】
EDSVのknob領域とコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドを融合させた組換えタンパク質及び／又はその多量体を有効成分とする本発明のワクチンは、鶏に接種することで高いHI抗体が誘導され、鶏のEDSの発症を予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例１〜４及び比較例１で調製した融合タンパク質の模式図である。
【図２】実施例１〜４及び比較例１で調製した融合タンパク質の多量体形成を確認したSDS-PAGE解析図である。
【図３】実施例１〜４及び比較例１で調製した融合タンパク質について、ゲル濾過による分子量分布を解析した図である。
【図４】試験例３における実施例１〜４及び比較例１で調製した融合タンパク質を免疫した鶏血清のHI試験の結果を示す図である。
【図５】試験例４におけるKnob-GCN4の有効抗原量確認試験結果を示す図である。
【図６】試験例４におけるCMP-Knobの有効抗原量確認試験結果を示す図である。
【図７】試験例５における免疫後の抗EDSV HI抗体価の推移（平均値）を示す図である。
【図８】試験例５における強毒EDSV感染後の正常産卵数の推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明には、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと鶏のEDSVのファイバータンパク質中のknob領域が結合した融合タンパク質が含まれる。
【００２９】
EDSVのファイバータンパク質は、その機能によって、N末端側からテイル（Tail）、シャフト（Shaft）、ノブ（Knob）の3つの領域に区分される。本発明の融合タンパク質を構成するEDSVのknob領域には、溶解性が低下するおそれがあるためシャフト領域は含まれないことが好ましい。一方、knob領域の天然高次構造が損なわれるおそれがあるため、knob領域を完全に包含することが好ましい。このようなEDSVのknob領域として、配列番号11で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが例示される。このアミノ酸配列は、従来シャフト領域に含まれるとされていたN末端側の9アミノ酸分を含むものであるが（非特許文献20）、本発明者らが構造予測モデルから検討した結果、この位置までがknob領域であることが予測された。本発明の融合タンパク質を構成するEDSVのknob領域には配列番号11で表されるアミノ酸配列及びこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。本明細書において、数個のアミノ酸とは、通常２〜９個、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個のアミノ酸をいう。さらにこれらのアミノ酸配列との相同性が、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００３０】
またEDSVのknob領域をコードする遺伝子としては、配列番号12のDNA配列、大腸菌や酵母で発現させるためにコドンを最適化したDNA配列、これらのDNA配列に適当な制限酵素切断部位が付加されたDNA配列及びこれらのDNA配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列も包含される。本明細書において、数個の塩基とは、通常２〜９個、好ましくは２〜５個、さらに好ましくは２〜３個の塩基をいう。さらに、これらのDNA配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるDNA配列も包含される。
【００３１】
一方、Knobと結合して本発明の融合タンパク質を構成するコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドは、コイルドコイル構造を形成する能力を有するものであれば特に制限されないが、天然の多量体を形成するタンパク質（多量体形成タンパク質）に由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものが好適である。例えば、非特許文献21（Adv.  Protein  Chem.  2005,70,37-78）に記載の多量体形成タンパク質が例示されるが、中でも、Knobとの融合タンパク質とした場合に、可溶性タンパク質として高収率で得られ、HI抗体誘導効果に優れるため、GCN4、鶏由来のCMP、バクテリオファージT4由来のfibritinなどに由来するコイルドコイル形成ユニットを有するものが好ましく、GCN4、CMPがより好ましく、特にCMPが好ましい。
【００３２】
GCN4のコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドには、2量体型である配列番号27のアミノ酸配列、3量体型である配列番号28〜30のアミノ酸配列及びこれらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。さらにこれらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。中でも3量体型が好適であり、特に配列番号30のアミノ酸配列からなるポリペプチドが好適である。
【００３３】
CMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドには、配列番号31で表されるアミノ酸配列及びこのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。さらにこれらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００３４】
CMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドをコードするDNA配列としては、配列番号32のDNA配列、大腸菌で発現させるためにコドンを最適化した配列番号33等のDNA配列、これらのDNA配列に適当な制限酵素切断部位が付加されたDNA配列及びこれらのDNA配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加されたDNA配列が包含される。さらに、これらのDNA配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるDNA配列も包含される。
【００３５】
本発明の融合タンパク質において、上記GCN4、CMPなどのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドは、KnobのN末端側及びC末端側のいずれに結合してもよい。例えば、コイルドコイル形成ユニットとしてCMPを用いる場合、KnobのN末端側及びC末端側のいずれに結合させても高いHI抗体誘導効果を示す。一方、GCN4を用いた場合には、KnobのN末端側に結合させた方がHI抗体誘導効果が高い。またコイルドコイル形成ユニットを有するペプチドとKnobが隣接して結合していてもよいが、両者の分子間相互作用を低減させる等の目的で間にリンカー配列などのスペーサーが挿入されていてもよい。リンカー配列としては、特に限定されないが、例えばGPGP(GP)2もしくはGGGGS(G4S)の組み合わせによる配列を用いることができる。また、(G4S)が1〜4回繰り返された配列((G4S)1〜(G4S)4)を用いてリンカー配列として使用することもでき、さらに、これに(GP)2を組み合わせてもよい。また、Hisx6（H6）タグ配列であってもよい。好適なリンカー配列またはタグ配列とリンカー配列の組み合わせとして、(G4S)1、(G4S)2、(G4S)2H6(G4S)2、(G4S)2H6(G4S)1(G3S)1等が例示できる。タグ配列は、融合タンパク質のN末端またはC末端に付加してもよい。
【００３６】
本発明の融合タンパク質としては、例えば、GCN4のコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドをKnobのC末端側に付加し、それらの間にリンカー配列（(G4S)2）が挿入され、C末端にタグ配列（H6）を結合した融合タンパク質Knob-GCN4（例えば配列番号13（アミノ酸配列）、配列番号14（DNA配列））が例示される。またGCN4のコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドをKnobのN末端側に配置し、それらの間にリンカー配列（(G4S)1）が挿入され、C末端にタグ配列（H6）を結合した融合タンパク質GCN4−Knob（例えば配列番号21（アミノ酸配列）、配列番号22（DNA配列））が例示される。本発明の融合タンパク質には、配列番号13または21のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、これらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００３７】
さらに本発明の融合タンパク質として、CMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドを、KnobのC末端側に結合し、それらの間にタグ配列（H6）とリンカー配列（(G4S)2）が挿入された融合タンパク質（例えば配列番号23（アミノ酸配列）、配列番号24（DNA配列））、CMPのコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドを、KnobのN末端に結合し、それらの間にタグ配列とリンカー配列の組み合わせ（(G4S)2H6(G4S)1(G3S)1）が挿入された融合タンパク質（例えば配列番号25（アミノ酸配列）、配列番号26（DNA配列））も例示される。本発明の融合タンパク質には、配列番号23または25のアミノ酸配列で示されるタンパク質だけでなく、これらのアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドが包含される。また、これらのアミノ酸配列との相同性が80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドも包含される。
【００３８】
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとKnobを結合させる際には、遺伝子工学的に両者を結合させて発現させることができる。例えば、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とKnobのDNA配列が隣接するように発現ベクターを作製した後に適当な宿主に導入し、融合タンパク質を発現させる方法が例示される。コイルドコイル形成ユニットのDNA配列は、KnobのDNA配列の5’側に配置してもよく、3’側に配置しても構わない。前記の発現ベクターを作製する際に、リンカー配列及び／又はタグ配列のDNA配列が、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とKnobのDNA配列の間に挿入されていてもよく、上記のDNA配列の5’側や3’側に付加されていてもよい。例えば、5’側からKnobのDNA配列、タグ配列及び／又はリンカー配列のDNA配列、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列と配置して発現ベクターを作製する方法が例示される。
【００３９】
上記のDNA配列は化学合成によって入手し、それを鋳型として公知の遺伝子増幅方法によって増幅し、各種制限酵素を用いて発現ベクターに組み込み、組換え発現ベクターを作製することが可能である。遺伝子増幅で使用するオリゴヌクレオチドは、鋳型のDNA配列の5’側もしくは3’側にハイブリダイズするように設計され、制限酵素による切断部位が付加されていることが好ましい。上記のオリゴヌクレオチド、鋳型DNA、DNAポリメラーゼ等を用いて、公知の遺伝子増幅方法により、鋳型DNAを増幅することが可能である。増幅したDNA配列と発現ベクターを制限酵素で処理した後、それらを適当なDNAリガーゼにより結合させることで、目的のDNA配列が挿入された組換え発現ベクターを構築することが可能である。本発明にはそうした組換え発現ベクターも含まれる。
【００４０】
発現ベクターとしては、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクター等が挙げられるが、簡便な取り扱いとコストの観点からプラスミドベクターが好ましい。例えば、宿主が大腸菌の場合には、pFN6A  (HQ)  Flexi  Vector（Promega）、pFN7A  (HQ)  Flexi  Vector（Promega）、pFN2A  (GST)  Flexi  Vector（Promega）、pET-15b（MERCK）、pET-21d（MERCK）、pUC57(GenScript)、pET-22b（MERCK）、pET-21d（MERCK）、pColdベクター（タカラバイオ）等、哺乳動物の場合には、pF4A  CMV  Flexi  Vector（Promega）、pF5A  CMV-neo  Flexi  Vector（Promega）、pF9A  CMV  hRluc-neo  Flexi  Vector（Promega）、pCI-neo  Mammalian  Expression  Vector（Promega）が挙げられる。発現ベクターには、複製起点、遺伝子発現に調節的役割を持つプロモーター配列、エンハンサー配列等の調節配列、選択マーカーの配列が含まれていてもよい。
【００４１】
プロモーター配列の一例としては、細菌プロモーターは、大腸菌lacI及びlacZプロモーター、T3及びT7プロモーター、gptプロモーター、ラムダPR、PLプロモーター、tacプロモーター、及びtrp、trcプロモーターである。そのうち、この点に関して適当な公知の真核細胞プロモーターは、サイトメガロウイルス（「CMV」）即時型プロモーター、単純ヘルペスウイルス（「HSV」）チミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期Simian virus（SV）40プロモーター、レトロウイルスLong Terminal Repeat（LTR）のプロモーター、例えばラウス肉腫ウイルス（「RoSV」）のプロモーター、及びメタロチオネイン−Iプロモーターなどのメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【００４２】
高等な真核細胞を宿主として融合タンパク質を発現させる際には、エンハンサー配列を発現ベクター中に挿入することにより転写活性を増加させてもよい。エンハンサー配列は、所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する。エンハンサーの例は、SV40エンハンサー、CMV初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオーマエンハンサー、βアクチンエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーなどを包含する。
【００４３】
選択マーカーの一例としては、大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  serevisiae）のｔｒｐ１遺伝子、哺乳動物細胞のネオマイシン耐性遺伝子が例示される。
【００４４】
本発明には、上記本発明の融合タンパク質をコードする、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とKnobのDNA配列を含む核酸断片が含まれる。本発明の核酸断片は、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とKnobのDNA配列が連続して配置した核酸断片、あるいは、コイルドコイル形成ユニットのDNA配列とKnobのDNA配列の間にタグ配列及び／又はリンカー配列のDNA配列が挿入された核酸断片が含まれる。例えば、配列番号14、24、26、28の核酸断片が含まれる。
【００４５】
本発明の核酸断片は配列全体を化学合成によって入手することが可能である。また、一部の核酸断片と残りの部分の核酸断片を化学合成によって入手後、公知の遺伝子組換え技術によって、それらを連結させても構わない。例えば、Knob又はコイルドコイル形成ユニットのDNA配列を化学合成した後に、それらを公知の遺伝子増幅方法を用いて増幅させた後、別々のクローニングベクターに挿入する。それぞれのクローニングベクターからKnobのDNA配列又はコイルドコイル形成ユニットのDNA配列を制限酵素によって切り出したのち、同じく制限酵素処理した発現ベクターに挿入し、組換え発現ベクターを作製する。挿入する際には、それぞれの断片が連続的に配置されるように設計する。そして、組換え発現ベクターから制限酵素などを用いて核酸断片を切り出すことで、コイルドコイル形成ユニットとKnobのDNA配列が連結された核酸断片を入手することが可能である。上記の方法で核酸断片を作製する際に、タグ配列やリンカー配列のDNA配列をコイルドコイル形成ユニットとKnobのDNA配列の間に挿入させて発現ベクターを作成し、核酸断片を作製してもよい。
【００４６】
上記のようにして作製された発現ベクターで宿主を形質転換することにより、発現ベクターを含有する形質転換体を得ることができる。本発明にはそうした形質転換体も含まれる。宿主としては、大腸菌、酵母、哺乳動物細胞株、昆虫細胞、植物等の公知のものが挙げられる。大腸菌としては、BL21株、DH5α等が例示できる。酵母としては、ピキア・パストリス(Pichia  pastoris)、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces  cerevisiae）、哺乳動物細胞としては、CHO細胞、HEK293細胞、COS-1/-7細胞等が挙げられる。
【００４７】
宿主への発現ベクターの導入は、宿主に応じて公知の方法によって行うことができ、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法等が例示できる。導入後、選択マーカーを含む培地で培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換体を選択することができる。
【００４８】
上記のようにして作製された形質転換体を好適な条件下で増殖させた後、選択されたプロモーターを特定の条件下（pH、温度、化合物の添加）で誘導させ、融合タンパク質を産生することができる。発現した融合タンパク質は、細胞内で蓄積あるいは細胞外へ分泌される。
大腸菌を宿主にして発現させる場合には、封入体画分に融合タンパク質を発現させてもよい。大腸菌から封入体を回収する方法としては、例えば、超音波破砕法、高圧ホモジナイザー法、BugBuster（メルク株式会社）を用いた方法が例示される。
【００４９】
このようにして得られる本発明の融合タンパク質は、単量体として利用することもできるが、高いHI抗体を誘導できることから多量体として用いることが好適である。このような融合タンパク質多量体は、例えば、2量体、3量体、3量体以上であり、それらの多量体の混合物も含まれる。例えば、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとしてGCN4、CMP等を用いて融合タンパク質を発現させた場合には多量体として得られるが、必要に応じ公知のリフォールディング処理を行ってもよい。
【００５０】
なお本発明の融合タンパク質は、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドとKnobが結合したものであるが、それらは化学的に結合させてもよい。その際には、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドと、Knobを個別に発現させて、クロスリンカーを用いて結合する方法が例示される。
【００５１】
コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドやKnobを個別に発現させる際には、それぞれのDNA配列を化学合成により入手し、それを鋳型として公知の遺伝子増幅方法で増幅させ、上記の方法でそれぞれの発現プラスミドを構築することが可能である。発現プラスミドは上記のように宿主に導入して、目的タンパク質をそれぞれ入手することが可能である。
【００５２】
クロスリンカーを用いて結合させる際には、タンパク質に存在するアミノ基やチオール基（SH基）、タンパク質に存在する糖鎖のアルデヒド基などを利用して結合させる事ができるが、用いる官能基に制限はない。例えば、コイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドのSH基とKnobのアミノ基とを反応させる方法が例示でき、より具体的には、ジチオトレイトール（DTT）等の還元剤により還元処理したポリペプチドと、N−スクシニル−3−（2−ピリジルジチオ）プロプリオネート（SPDP)によりピリジルジスルフィド基を導入したKnobとをインキュベートすることによって結合させることができる。さらにビオチン、アビジンなどの生体分子同士の相互作用を利用した結合を利用することで化学的に結合することもできる。
【００５３】
上記の方法で得られた融合タンパク質及びその多量体は、一般的な精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等各種精製法が挙げられる。
【００５４】
本発明には、前記した本発明の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を有効成分とするEDS用ワクチンが含まれる。本発明のワクチンには、融合タンパク質多量体が含まれることが好ましい。好ましくは2量体、3量体、3量体以上、又はそれらの多量体の混合物である。
【００５５】
EDS用ワクチンには、1用量あたり0.3〜10μgの前記融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を含むことが好ましい。
【００５６】
本発明のワクチンには、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる、また、これにアジュバント、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などの添加剤を適宜配合してもよい。
【００５７】
アジュバントとしては、油性アジュバント、酢酸トコフェロール、アラム、サポニン（QS21、ISCOM）、CpGオリゴ等が含まれる。
【００５８】
本発明のワクチンには、前記の融合タンパク質以外に鶏の感染症を予防する抗原を混合してもよい。そのような感染症として、ニューカッスル病、鶏伝染性気管支炎、伝染性コリーザ、鶏伝染性ファブリキウス嚢病、レオウイルス感染症、マイコプラズマ感染症、サルモネラ感染症等が例示される。
【００５９】
本発明のワクチンは、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等の任意の投与経路で投与することができる。
【００６０】
従来のEDS用ワクチンにおける抗体価と防御の関係について、赤血球凝集抑制抗体価（HI抗体価）として16倍以上あれば防御可能であるとされているが、本発明のワクチンは、鶏に投与することによりHI抗体価はこれよりも顕著に向上し、EDSの発生を効果的に予防し得るものであることが確認された。
【００６１】
本発明には、前記の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を含む、被検試料中のEDSVのknob領域に対する抗体量を測定するためのキットが含まれる。本発明の融合タンパク質を含むキットは、融合タンパク質が固相化されたプレートであっても良い。被検試料を前記のプレートに適用して、プレート上の融合タンパク質と被検試料中に含まれる抗体を反応させる。酵素や蛍光物質で標識した二次抗体を適用して、一次抗体と反応させる。必要に応じて酵素の基質を加えて、酵素反応の生成物や蛍光量を検出することで、被検試料中に含まれる抗体量を測定しても良い。本発明のキットは、融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を有効成分とするワクチンを鶏へ免疫後に、ワクチンに由来する抗体産生の有無を検出することによって、ワクチンの有効性評価に使用することもできる。
【００６２】
本発明には、上述の核酸断片や組換え発現ベクターを有効成分とするEDS用DNAワクチンが含まれる。本発明のDNAワクチンにおいて、核酸断片や組換え発現ベクターは鶏に免疫後に融合タンパク質を発現させるプロモーター配列を含むことが好ましい。
【００６３】
本発明のDNAワクチンを鶏へ接種する前後にEDSVで鶏へ攻撃試験を行い、その結果、EDSに伴う症状を有意に軽減させた核酸断片や組換え発現ベクターをEDS治療剤の有効成分として選抜し、その際の投与量から有効成分量を規定することができる。
【００６４】
本発明のDNAワクチンには、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。また、これにアジュバント、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などの添加剤を適宜配合することができる。
【００６５】
本発明のDNAワクチンは、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等の任意の投与経路で投与することができる。
【００６６】
本発明には前記の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体と結合する抗体が含まれる。本発明の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を抗原に、通常の免疫方法（Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Antibody  Engineering:  A  PRACTICAL  APPROACH  Edited  by  J.  McCAFFERTY  et  al.あるいはANTIBODY  ENGINEERING  second  edition  Edited  by  Carl  A.K.  BORREBAECK）によってモノクローナル及びポリクローナル抗体等の作製あるいはこれらのヒト型抗体の作製が可能となる。あるいは、ファージディスプレイ技術を利用した抗体作製技術（Phage  Display  of  Peptides  and  Proteins:  A  Laboratory  Manual  Edited  by  Brian  K.  Kay  et  al.、Antibody  Engineering:  APRACTICAL  APPROACH  Edited  by  J.  McCAFFERTY  et  al.あるいはANTIBODY  ENGINEERING  second  edition  Edited  by  Carl  A.  K.  BORREBAECK）により当該融合タンパク質及び／又はその多量体と結合する抗体の作出が可能である。本発明の抗体は後述するEDS用治療剤、キット、アフィニティークロマトグラフィー用担体としての用途が想定される。
【００６７】
本発明には上記の抗体を有効成分とするEDS用治療剤が含まれる。本発明のEDS用治療剤は、前記の抗体を有効成分とし、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。例えば、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる、また、これにアジュバント、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤などの添加剤を適宜配合してもよい。
【００６８】
本発明のEDS用治療剤は、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与等の任意の投与経路で投与してもよい。
【００６９】
本発明には、融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体に結合する抗体を含み、被検試料中のEDSVのknob領域の含有量を測定するためのキットが含まれる。このようなキットとしては、融合タンパク質に結合する抗体をプレート等に固相化したキットが含まれる。本発明の抗体を含むキットは、Knobの含有量を指標にして、EDSV感染の有無を評価する際に使用することも可能である。例えば、前記の抗体を固相化したプレートに被検試料を適用したのち、酵素や蛍光色素で標識した抗体を適用する。プレートをインキュベーション、洗浄した後、必要に応じて発色基質を加え、蛍光量を測定することで被検試料中のKnobの含有量を評価することが出来る。
【００７０】
プレートとしては、Nunc  イムノプレート  マキシソープ（Thermo  scientific）、ELISA用プレート（住友ベークライト株式会社）、ELISPOT（MERCK）、イムノプレート（コスモバイオ株式会社）、エライサプレート（IWAKI）、ELISAプレート（ExtraGene）が例示され、当業者において通常実施される方法で抗体をプレートに結合させることができる。
抗体を酵素や蛍光色素で標識する方法としては、EasyLink  antibody  conjugation  kits（abcam）、Lightning-Link  Rapid  Conjugation  System（Innova  Biosciences  Ltd）、Oyster  Antibody  Labeling  Kit（Luminartis  GmbH）、酵素標識キットEZ-Link（PIERCE  Biotechnology）、PlatinumLink  Protein  Labeling  Kit（Kreatech  Biotechnology  BV）、DyLight  Antibody  Labeling  Kit（PIERCE  Biotechnology）が例示される。
【００７１】
本発明には、融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体に対する抗体を担体に結合させたアフィニティークロマトグラフィー用担体が含まれる。本発明の融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体は宿主の内外で発現され、宿主内に発現された場合には宿主を破壊して融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体が回収され、宿主外に発現された場合には培養環境から融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体が回収される。本発明の担体はそうした夾雑画分から融合タンパク質及び／又は融合タンパク質多量体を回収する等の用途が想定される。
【００７２】
担体としては、HiTrap  NHS-activated  HP（GEヘルスケア）、NHS-activated  Sepharose  4  Fast  Flow（GEヘルスケア）、CNBr-activated  Sepharose  4B（GEヘルスケア）、CNBr-activated  Sepharose  4  Fast  Flow（GEヘルスケア）、EAH  Sepharose  4B（GEヘルスケア）、ECH  Sepharose  4B（GEヘルスケア）、Profinity  エポキシ樹脂（BIORAD）、アフィゲル  Hz  Hydrazide  ゲル（BIORAD）が例示され、当業者において通常使用される方法で抗体を結合させてもよい。
【実施例】
【００７３】
以下、本発明についてさらに実施例等を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制限されるものではない。【００７４】
実施例１
Knob-GCN4タンパク質及びその多量体の調製
（１）Knob-GCN4発現ベクターの構築
EDSV KE-80株から下記の方法によりゲノムDNAを抽出した。9日齢の発育家鴨卵尿膜腔内にウイルスを接種後、6日目に採取した尿膜腔液をプロテイナーゼK（1 mg/ml）を添加したプロナーゼ溶液中に加え、50℃で1時間、更に37℃で1晩振盪した。その後、フェノール/クロロホルムによる除タンパク質、エタノール沈殿、RNase A（Qiagen）処理を行い、ウイルスゲノムDNAを抽出した。
抽出したウイルスゲノムDNAを鋳型として、NcoI認識配列を有するセンス鎖プライマー（配列番号3）及びXhoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー（配列番号4）を用いて、ファイバータンパク質のknob領域及び8リピート分のシャフト領域の一部（配列番号5）をコードするDNA断片（配列番号6）をPolymerase Chain Reaction（PCR）によって増幅した。この増幅DNA断片及びプラスミドpET-15b(メルク株式会社)を制限酵素NcoI及び制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター1とした。
改変型GCN4タンパク質（NCBI#: 1CZQ_A）の3価コイルドコイル形成ユニット（以下、GCN4）に(G4S)2リンカー配列を付加したポリペプチド（以下、(G4S)2-GCN4）（配列番号7）を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNcoI認識配列並びに3'末端へのXhoI認識配列を付加したDNA配列（配列番号8）を設計し、これを人工合成した。この合成DNA及びプラスミドpET-21d(メルク株式会社)を制限酵素NcoI及び制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター2とした。
中間ベクター1を鋳型として、NcoI認識配列を有するセンス鎖プライマー（配列番号9）及びNcoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー（配列番号10）を用いて、Knob（配列番号11）をコードするDNA断片（配列番号12）をPCRによって増幅した。この増幅DNA断片及び中間ベクター2を制限酵素NcoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB2とした。pKNOB2はKnob、(G4S)2リンカー配列、GCN4及びHisx6（H6）タグ配列で構成されるポリペプチド（以下、Knob-GCN4）（配列番号13）（図1）をコードするDNA配列（配列番号14）を含む。pKNOB2を大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Knob-GCN4発現大腸菌KNOB2株を得た。【００７５】
（２）組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製
200 mLサイズの三角フラスコに10 mlのLB培地とアンピシリン溶液（終濃度100 μg/ml）を分注し、Knob-GCN4発現大腸菌KNOB2株を接種して、37℃で14時間程度振盪培養した（前培養）。2 Lサイズの三角フラスコに250 mLのLB培地とアンピシリン溶液（終濃度100 μg/ml）を分注し、これに5 mlの前培養菌液を植菌して、OD590が0.6を超えるまで37℃で振盪培養した。本培養のOD590が0.6を超えたところで、終濃度が1 mMとなるようイソプロピル‐β‐D‐ガラクトピラノシド（IPTG）を添加し、37℃で4時間、振盪培養した。本培養液を遠心管に移し、8,000 rpm・4℃・30分間の遠心分離によって菌体ペレットを回収した。
50 mL のBugBuster Master Mix（Novagen社）にComplete プロテアーゼインヒビターカクテル錠（Roche）を2錠加え、これを菌体破砕液とした。菌体ペレットを菌体破砕液に懸濁して室温で60分間インキュベーションし、その後、超音波破砕（氷上、Output 4、Duty 70%、10分間を3回）した。破砕液を遠心分離（15,000 rpm, 4℃・30分間)し、上清（可溶性画分）を回収した。
可溶性画分に含まれる組換え抗原タンパク質を、HisTrap HP, 5mlカラム（GEヘルスケア社）を用い、カラムに付属する説明書に従って精製した。20 mM（終濃度）のイミダゾールを添加した可溶性画分をカラムにアプライし、20 mM（終濃度）のイミダゾールを含むバッファーでカラム洗浄した後、500 mM（終濃度）のイミダゾールを含むバッファーでカラム溶出を行った。得られた溶出画分をAmicon Ultra-15 10K（Millipore社）によって濃縮し、透析によってバッファー成分をPBSへ置換しKnob-GCN4抗原を得た。【００７６】
実施例２
GCN4-Knobタンパク質及びその多量体の調製
（１）GCN4-Knob発現ベクターの構築
中間ベクター2を鋳型として、NcoI認識配列を有するセンス鎖プライマー（配列番号15）及びXhoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー（配列番号16）を用いて、GCN4に(G4S)1リンカー配列を付加したポリペプチド（以下、GCN4-(G4S)1）（配列番号17）をコードするDNA断片（配列番号18）をPCRによって増幅した。この増幅DNA断片及びプラスミドpET-21d(メルク株式会社)を制限酵素NcoI及び制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター3とした。
中間ベクター1を鋳型として、XhoI認識配列を有するセンス鎖プライマー（配列番号19）及びXhoI認識配列を有するアンチセンス鎖プライマー（配列番号20）を用いて、Knob（配列番号11）をコードするDNA断片（配列番号12）をPCRによって増幅した。この増幅DNA断片及び中間ベクター3を制限酵素XhoIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB3とした。pKNOB3はGCN4、(G4S)1リンカー配列、Knob及びヒスチジンヘキサマータグ配列で構成されるポリペプチド（以下、GCN4-Knob）（配列番号21）（図1）をコードするDNA配列（配列番号22）を含む。pKNOB3を大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、GCN4-Knob発現大腸菌KNOB3株を得た。
（２）実施例１と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、GCN4-Knob抗原を得た。【００７７】
実施例３
Knob-CMPタンパク質及びその多量体の調製
（１）Knob-CMP発現ベクターの構築
Knob、(G4S)2H6(G4S)2リンカー配列、及びCMPタンパク質（NCBI#: NP_001025546）の3価コイルドコイル形成ユニットで構成されるポリペプチド（以下、Knob-CMP）（配列番号23）（図1）を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNdeI認識配列並びに3'末端へのBamHI認識配列を付加し、更に5'末端並びに3'末端への保護塩基を付加したDNA配列（配列番号24）を設計し、人工合成した。この合成DNAと制限酵素EcoRVによって切断処理したプラスミドpUC57（ジェンスクリプト株式会社）をDNAリガーゼによって結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター4とした。
中間ベクター4を制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理し、Knob-CMPをコードするDNA断片を得た。このDNA断片と制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理したプラスミドpET-11a（メルク株式会社）をDNAリガーゼで結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB4とした。さらに、pKNOB4を大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Knob-CMP発現大腸菌KNOB4株を得た。
（２）実施例１と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、Knob-CMP抗原を得た。【００７８】
実施例４
CMP-Knobタンパク質及びその多量体の調製
（１）CMP-Knob9発現ベクターの構築
CMP、(G4S)2H6(G4S)1(G3S)1リンカー配列、及びKnobで構成されるポリペプチド（以下、CMP-Knob）（配列番号25）（図1）を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNdeI認識配列並びに3'末端へのBamHI認識配列を付加し、更に5'末端並びに3'末端への保護塩基を付加したDNA配列（配列番号26）を設計し、人工合成した。この合成DNAと制限酵素EcoRVによって切断処理したプラスミドpUC57（ジェンスクリプト株式会社）をDNAリガーゼによって結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドを中間ベクター5とした。
中間ベクター5を制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理し、CMP-KnobをコードするDNA断片を得た。このDNA断片と制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理したプラスミドpET-11a（メルク株式会社）をDNAリガーゼで結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB5とした。さらに、pKNOB5を大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、CMP-Knob発現大腸菌KNOB5株を得た。
（２）実施例１と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、CMP-Knob抗原を得た。【００７９】
比較例１
Knobタンパク及びその多量体の調製
（１）Knob発現ベクターの構築
EDSVファイバータンパク質のknob領域にヒスチジンヘキサマータグ配列を付加したポリペプチド（配列番号1）（図1）を大腸菌で発現させるため、それをコードするDNA配列のコドンを最適化し、発現ベクターにクローニングするための5'末端へのNdeI認識配列並びに3'末端へのBamHI認識配列を付加したDNA配列（配列番号2）を設計し、これを人工合成した。この合成DNA及びプラスミドpET-11a(メルク株式会社)を制限酵素NdeI及び制限酵素BamHIで切断処理し、その後、DNAリガーゼで両者を結合した。結合産物を大腸菌DH5αへ導入し、得られたプラスミドをpKNOB1とした。さらに、pKNOB1を大腸菌BL21(DE3)（メルク株式会社）に導入し、Knob発現大腸菌KNOB1株を得た。
（２）実施例１と同様にして組換え大腸菌の培養及び発現タンパク質の精製を行い、Knob抗原を得た。【００８０】
試験例１
実施例１〜４及び比較例１において精製した5種類の組換え抗原タンパク質（Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP）についてBCA Protein Assay Kit (Pierce社) を用いて定量を行った。結果を表１に示す。【００８１】
【表１】
0006620386.tif 000002
【００８２】
試験例２
組換えタンパク質の性状解析：
実施例１〜４及び比較例１において精製した5種類の組換え抗原タンパク質（Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP）についてSDS-PAGE解析を行った。組換え抗原タンパク質を還元剤を含まないサンプルバッファーと混合し、100℃・5分間の熱変性処理を行ったタンパク質サンプルおよび熱変性処理を行わなかったタンパク質サンプルを2μg/レーンで12.5%均一濃度トリス−グリシン系ゲル（Atto, E-R12.5L）にアプライして10 mAで130分間通電した。CBB染色はEz Stain Aqua（Atto, AE-1340）を用いて行った。ウェスタンブロット解析は、一般的な方法でPVDF膜転写を行った後、100倍希釈した抗Knobタンパク質ニワトリ血清で一次抗体反応を行い、4,000倍希釈した抗ニワトリIgG-HRPコンジュゲート抗体（Chicken IgG(IgY)-heavy and light chain Antibody、BETHYL LABORATORIES社）で二次抗体反応を行った。二次抗体反応後、Western Lightning Plus-ECL（Perkin Elmer Life and Analytical Science社）を用いて化学発光反応を行い、Image Quant LAS4000 mini（GEヘルスケア社）で発光像を記録した。その結果、5種類の組換え抗原タンパク質がいずれも3量体と推定される分子を形成していることを確認した（図2）。
ゲル濾過解析はAKTA Prime Plus (GEヘルスケア社)に接続したHiLoad 16/60 Superdex 200 prepgradeカラム (GEヘルスケア)を用いて行った。流速は0.8 ml/minに設定し、バッファーはPBSを用いた。分子量マーカーはGel Filtration Calibration Kits LMWおよびHMW (GEヘルスケア社) を用いた。解析の結果、5種類の組換え抗原タンパク質がいずれも3量体と推定される分子を形成していることを確認した（図3）。【００８３】
試験例３
組換え抗原の免疫原性評価（赤血球凝集抑制試験（HI試験））：
実施例１〜４及び比較例１において精製した5種類の組換え抗原タンパク質（Knob、GCN4-Knob、Knob-GCN4、CMP-Knob、Knob-CMP）について、鶏へ免疫を行い誘導されるHI抗体価を測定した。組換え抗原タンパク質がKnob換算で10μg/0.5mLとなるよう油性アジュバント（軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの）と混合・調製した。対照ワクチンとして、化血研から市販されているEDSワクチンの抗原であるEDSV（EB66）を使用した。EB66細胞で培養したEDSVを106.7 TCID50/0.5mL以上となるよう油性アジュバント（軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの）と混合・調製した。調製したワクチンを29日齢のSPF鶏の下腿脚部筋肉内に0.5mL筋肉注射により接種した。免疫7週後に鶏から採血を行い、採取された血清についてHI試験を実施した。HI試験は試験血清を3倍量の25%カオリンと混合（=4倍希釈）して室温で5分毎に振とうしながら20分間処理し、2,000rpmで5分間遠心した検体を測定用試料とした。測定試料をPBS(-)で2倍段階希釈したのち、希釈した試料0.025mLに4単位/0.025mLに調製したHA抗原0.025mLを添加して室温で10〜20分間感作させ、さらにPBSに浮遊させた0.5%鶏赤血球0.05mLを添加、混合して室温で1時間反応させた後の赤血球凝集像よりHI抗体価を判定した。試験の結果、組換え抗原タンパク質の中でも多量体形成ユニットを付加したもの、特にGCN4-Knob、CMP-Knob、Knob-CMPの3種類の組換えタンパク質抗原で誘導されるHI抗体価が向上することを確認した（図4）。【００８４】
試験例４
有効抗原量確認試験：
実施例１及び４において精製した組換え抗原タンパク質（Knob-GCN4及びCMP-Knob）について、鶏への有効抗原量確認試験を実施した。組換え抗原タンパク質（Knob-GCN4及びCMP-Knob）がKnob換算で10μg/0.5mL、3μg/0.5mL、1μg/0.5mL、0.3μg/0.5mLとなるよう油性アジュバント（軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの）と混合・調製し、29日齢のSPF鶏の下腿脚部筋肉内に0.5mL筋肉注射により接種した。免疫7週後に鶏から採血を行い、採取された血清についてHI試験を実施した。HI試験は試験血清を3倍量の25%カオリンと混合（=4倍希釈）して室温で5分毎に振とうしながら20分間処理し、2,000rpmで5分間遠心した検体を測定用試料とした。測定試料をPBS(-)で2倍段階希釈したのち、希釈した試料0.025mLに4単位/0.025mLに調製したHA抗原0.025mLを添加して室温で10〜20分間感作させ、さらにPBSに浮遊させた0.5%鶏赤血球0.05mLを添加、混合して室温で1時間反応させた後の赤血球凝集像よりHI抗体価を判定した。試験の結果、組換え抗原タンパク質（Knob-GCN4）は１μg/0.5mL以上で、組換え抗原タンパク質（CMP-Knob）は0.3μg/0.5mL以上で良好なHI抗体誘導効果を示すことが確認された（図５及び図６）。【００８５】
試験例５
強毒EDSVの感染に対する防御効果確認試験：
実施例4において精製した組換え抗原タンパク質（CMP-Knob）について、当該タンパク質を免疫した鶏における強毒EDSV感染に対する発症防御効果確認試験を実施した。組換え抗原タンパク質（CMP-Knob）がKnob換算で10 μg/0.5mLとなるよう油性アジュバント（軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの）と混合・調製した。対照ワクチンとして、化血研から市販されているEDSワクチンの抗原であるEDSV（EB66）を使用した。EB66細胞で培養したEDSVを106.7 TCID50/0.5mL以上となるよう油性アジュバント（軽質流動パラフィン, モノオレイン酸ソルビタン, ポリソルベート80を混合したもの）と混合・調製した。調製したワクチンを約210日齢の市販鶏（レイヤー）の下腿脚部筋肉内に0.5mL筋肉注射により接種した。免疫4、6、9、12及び16週目に採血を行い、採取された血清についてHI試験を実施した。HI試験は試験血清を3倍量の25%カオリンと混合（=4倍希釈）して室温で5分毎に振とうしながら20分間処理し、2,000rpmで5分間遠心した検体を測定用試料とした。測定試料をPBS(-)で2倍段階希釈したのち、希釈した試料0.025mLに4単位/0.025mLに調製したHA抗原0.025mLを添加して室温で10〜20分間感作させ、さらにPBSに浮遊させた0.5%鶏赤血球0.05mLを添加、混合して室温で1時間反応させた後の赤血球凝集像よりHI抗体価を判定した。免疫16週後に強毒EDSV KE-80株を106.5 TCID50/羽となるように経口投与により感染させ、攻撃後4週間産卵状況を観察した。試験の結果、組換え抗原タンパク質（CMP-Knob）は10 μg/0.5mL免疫することで免疫後16週間にわたり高いHI抗体価を維持することが確認された（図７）。また、組換え抗原タンパク質（CMP-Knob）を免疫した鶏は免疫16週後の時点で強毒EDSVを感染させても、産卵停止・異常卵産出などの臨床症状を大幅に軽減可能であることが確認された（図８）。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
本発明のEDSVのknob領域とコイルドコイル形成ユニットを有するポリペプチドを融合させた組換えタンパク質及び／又はその多量体を有効成分とするワクチンは、鶏に接種することで高いHI抗体が誘導され、鶏のEDSの発症を予防することが可能である。したがって、EDSの発生が予想される農場においてEDSの発症予防を行うことが可能である。また本発明のワクチンは、アヒル卵に依存することなく生産することができ、安定的に供給可能なものである。
【図１】
0006620386.tif 000003
【図２】
0006620386.tif 000004
【図３】
0006620386.tif 000005
【図４】
0006620386.tif 000006
【図５】
0006620386.tif 000007
【図６】
0006620386.tif 000008
【図７】
0006620386.tif 000009
【図８】
0006620386.tif 000010
【配列表】
0006620386000001.app