(57)【要約】  本願は、抗生物質の使用を回避する、微生物感染の治療または微生物汚染の制御に使用するのための抗菌システムに関する。このような感染としては、乳腺炎、結核、嚢胞性線維症および医療デバイスでのバイオフィルム形成から生じ得る汚染が挙げられる。
2014510777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応性酸素種または反応性種を生成可能な成分を含有する殺菌性組成物であって、該組成物は、２４時間の間、反応性酸素種を１リットルあたり少なくとも０．４ミリモルのレベルに送達可能である、殺菌性組成物。
【請求項２】
２４時間の間、反応性酸素種を１リットルあたり少なくとも０．５ミリモルのレベルに送達可能である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記反応性酸素種が、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの基質および過酸化水素の反応によって生成される、請求項１または２のに記載の組成物。
【請求項４】
前記反応性酸素種が、ヒポチオシアン酸（ヒポチオシアナイト、ＳＣＮＯ−）、次亜ヨウ素酸（ＩＯ−）および次亜塩素酸塩（ＣＬＯ−）からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ペルオキシダーゼ酵素が、ラクトペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼおよびヨードオキシダーゼを含む群より選択される、請求項３または４に記載の組成物。
【請求項６】
ラクトペルオキシダーゼ酵素を含有し、ヨウ化物イオンまたはチオシアン酸イオンをさらに含有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
クロロペルオキシダーゼ酵素を含有し、塩化物イオンをさらに含有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
過酸化水素の供給源が、過酸化水素の溶液である、請求項３〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記過酸化水素が、過炭酸塩、クエン酸および過酸化水素化物類を含む群から選択される過酸化水素放出化合物によって、または酵素を使用する方法によって放出される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記過酸化水素が、糖と、前記糖の適切な酸化還元酵素との間の酵素反応によって生成される、請求項３〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酸化還元酵素が、ガラクトースオキシダーゼおよび／またはグルコースオキシダーゼである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
遊離単糖をさらに含有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
過酸化水素の供給源を生成するために、二糖と、前記二糖類の対応するグリコシド加水分解酵素とをさらに含有し、、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記グリコシド加水分解酵素がβ−ガラクトシダーゼであり、前記二糖がラクトースである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
グリコシド加水分解酵素および／または酸化還元酵素が感染部位に存在する糖との反応に使用される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
過酸化水素の追加の供給源が、ポリオール（糖アルコール）とその反応性オキシダーゼ酵素との反応に由来する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリオールがグリセロールであり、その関連のオキシダーゼ酵素がグリセロールオキシダーゼであるか、あるいは、前記このポリオールがマンニトールであり、その関連のオキシダーゼ酵素がマンニトールオキシダーゼである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記過酸化水素が、Ｌ−アミノ酸とＬ−アミノ酸オキシダーゼ、またはキサンチン（またはヒポキサンチン）とキサンチンオキシダーゼとの酵素的な反応から生成される、請求項２〜１７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１９】
ヒポキサンチンもしくはキサンチンまたはその両方をさらに含有する、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
遊離アミノ酸をさらに含有する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
ラクトフェリンまたはグルココルチコイドを付加的に含有する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記グルココルチコイドが、プレドニゾロンまたはプレドニゾンである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
乳房内注入または噴霧のために、抗菌性溶液、エマルジョンまたは乾燥生成物としての使用のため、皮膚への火傷の病変のための湿布に添加される抗菌性溶液としての使用のため、鼻洗浄剤として使用される抗菌性溶液としての使用のため、表面クリーナーとして使用される抗菌溶液としての使用のために適合されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組成物を填薬された乳房内注入送達デバイス。
【請求項２５】
前記溶液が、エマルジョン、または乾燥生成物として調製される、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記化合物が、医療デバイスの表面に付着される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記成分が、感染部位へ連続的にまたは累積的に送達するために適合されている、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記成分が、感染部位への添加の前に反応させられる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記成分が、感染部位への添加の前に反応させられ、過剰の過酸化水素を除去するためにカタラーゼで処理される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本願は、微生物感染の治療における使用のための抗菌性組成物に関する。具体的には、本組成物は、細菌感染を治療するため、または細菌汚染の制御のために用いられてもよく、これによって抗生物質の使用を回避する。このような感染としては、乳腺炎、結核、嚢胞性線維症および他の肺感染、ならびに医学デバイスの上などの表面上にバイオフィルム形成を生じ得る汚染が挙げられる。しかし、本組成物は、ウイルス、酵母もしくは真菌の感染の治療のために、またはこのような生物体による汚染の制御のためにも適している。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
乳腺炎は、雌ウシおよび他の乳産生動物の乳房の持続的な炎症状態である。乳腺炎は、米国において雌ウシでは最も一般的な疾患の１つであると共に、酪農業界では最も費用がかかるものでもある。乳腺炎は、通常は乳頭管中の細菌の侵襲に応答して、白血球が乳腺中に放出される時に生じる。乳腺炎を有する雌ウシからの乳汁は、体細胞数が高く、体細胞数が高くなるに従って、乳の質が低下する。
【０００３】
乳腺炎の通常の治療では、抗生物質が使用されるが、抗生物質で治療した雌ウシの乳は、この薬剤がその雌ウシの体から抜けるまでは、市場性がない。用いられる抗生物質は、全身性であり、身体に注射されてもよいし、または、乳房内注入によって乳頭管を通じて乳頭に注入されてもよい。乳腺炎は、臨床的であり、感染の目に見える兆候が確認されることもあれば、無症状性のこともあり、この場合、感染の存在は、得られた乳中の体細胞数の増大によってのみ確認される。いくつかの臨床的な状況では、ウシは、治療されないままである場合が多いが、乳中の体細胞数の上昇が起きる場合、乳に支払われる金銭の額が減ることによって酪農家には収入が減る。
【０００４】
本発明の抗菌組成物には他の多数の用途がある。これらとしては、哺乳動物の肺の感染が挙げられる。嚢胞性線維症と結核とは、現在、治療することが極めて困難である２つの疾患である。結核症は、肺の感染によって生じ、長期の抗生物質による治療を必要とする。嚢胞性線維症（ＣＦ）とは、罹患者の特に肺における膜を通過する塩化物イオンの移動を調節できない状態である。この状態は常に、多数の慢性の肺感染を生じる。いずれかの状態の抗生物質の治療は、重篤な薬物耐性をもたらし得、その有効性は最小化される。現在、抗生物質は、静脈内の血流を通じて、または経口懸濁物／錠剤によって、または吸入によって送達される。薬物送達は、ＣＦの罹患者には大きな問題である。なぜなら、抗生物質は、それを必要とする肺の膜を効率的に通過することができないからである。これによって、阻害濃度未満の誘導による薬物耐性が重篤な問題となり得るという問題が生じる。このため、薬物によるさらなる治療は時代遅れとなっている。
【０００５】
火傷の患者、または開放創傷がある患者は、細菌感染、特に、Ｓｔａｐｈｌｙｃｏｃｃａｌ種またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ種の細菌に起因する細菌感染を極めて受けやすい。このような感染の治療は常に、経口または静脈内のいずれかの抗生物質の投与による。これらは、予防的に、または感染が明らかな場合に与えられてもよい。抗生物質のこのような使用は、薬物に対する耐性を引き起こしたり、治療の転帰が効果的ではない場合が多い。研究者らは、現在の技術によって火傷患者を治療するという新規な方法を構想する。
【０００６】
さらに、毎年の多数の抗生物質による治療は、患者による使用の間に医療デバイスが感染されたために行われている。グラム陽性およびグラム陰性の両方の細菌を含めて、多数の生物体がこのような感染を担う。感染は、泌尿器または静脈内のカテーテルなどの品では、これらの滅菌されていないデバイスの挿入の結果である場合が多い。何日もの間、デバイスの表面上に存在する細菌細胞は、増殖して、バイオフィルムの生成につながる。このようなバイオフィルムは、そのバイオフィルムの塊の内部細胞を通過する薬物の移動が劣っているせいで、抗生物質で治療することが極めて困難であり、抗生物質に対してより大きいレベルのバイオフィルムの耐性さえもたらされる。医療デバイスの感染によって、それを患者の不快に対して取り除いて置き換える必要がある場合が多くなる。感染は、医療デバイスの挿入後何日も経過してから見つかる場合が多いが、これは、典型的には、挿入の極めて早期に細菌が存在していたためである。
【０００７】
静菌効果は、ラクトペルオキシダーゼによって触媒される、過酸化水素とチオシアン酸との反応（ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）系と呼ばれるプロセス）によって生じることが一般に知られている。特定の場合には、ペルオキシダーゼの供給源は、グルコースとグルコースオキシダーゼとの反応であり、これによって、グルコン酸および過酸化物の生成が生じる。このプロセスは、乳汁の輸送の間に用いられる。
【０００８】
感染の制御のための抗菌治療は、ＬＰ系に基づいて提唱された。例えば、国際公開第２００８／０４１２８号は、抗菌および免疫刺激効果での調製を開示しており、これは、酸化還元酵素、過酸化水素を生成するためにその酵素に適切な基質、および内因性の過酸化水素調製を包含する。この調製は、２段階の過酸化水素放出を生じる。すなわち、過酸化物の内因性の形成によって、直ちに利用可能な過酸化水素が存在し、さらに過酸化水素が、酸化還元酵素によって生成されることが保証される。
【０００９】
米国特許第６３１２６８７号は、抗菌性組成物としての使用のための、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ金属ハロゲン化物塩、および緩衝剤を含有する、安定化された水性酵素濃縮物を記載する。米国特許第５６０７６８１号は、抗菌性組成物を記載しており、これは、ヨウ化物アニオンおよびチオシアン酸アニオンを、Ｄ−グルコースとともに、およびグルコースオキシダーゼまたはグルコースオキシダーゼと一緒に少なくとも１つの抗酸化物質のいずれかを含有する。本組成物は、さらに、ラクトペルオキシダーゼを含有してもよい。
【００１０】
乳汁中のＬＰ系の静菌効果について提唱される基礎は、チオシアン酸および過酸化水素の供給源に基づく。チオシアン酸イオンは、過酸化水素の存在下で、ラクトペルオキシダーゼによって酸化されて、次亜チオシアン酸を生じる。特定の実施形態では、過酸化物イオンは、過酸化水素の溶液または適切な過酸化水素化物（例えば、過炭酸ナトリウム）からの過酸化水素の放出を用いることによるのではなく、グルコースオキシダーゼの作用によってグルコースから生成される。本願は、補充された酵素触媒によって過酸化水素を生成する反応をもたらすことを補助するためのさらなる基質の使用を示唆する。過酸化水素は、細菌および哺乳動物細胞の両方に毒性であるが、次亜チオシアン酸は、細菌のタンパク質中の遊離のスルフヒドリル基と反応して、いくつかの代謝酵素を不活性化する。
【００１１】
この文献の結果によって、ＬＰ系がカタラーゼ陽性のグラム陽性細菌に対して主に静菌効果を有すること、およびまた、いくつかのグラム陰性の細菌にはｐＨ依存性の静菌効果があることが教示される（ＷｏｆｓｏｎおよびＳｕｍｎｅｒ，１９９３，「Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ」Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  １９９３，５６（１０）：８８７−８９２；Ｋｕｓｓｅｎｄｒａｇｅｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｈｏｏｉｊｄｏｎｋ，２０００「Ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，８４，補遺１，Ｓ１９−Ｓ２５；Ｓｅｉｆｕら、２００５「Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄａｉｒｙ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ」，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，１３７−１５４）。ＬＰ系の抗菌特性を支える正確な機構はまだ未解明である。この文献中で報告される実験プロトコールは、広範に変化し、多くの著者らが細菌阻害、ただし特定の期間後の再増殖、従って、殺菌効果ではなく静菌効果を報告している（例えば、Ｉｓｈｉｄｏら、「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  ＯＳＣＮ−  ｉｏｎｓ  ｂｙ  ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｃｔｏｓｅ  ａｓ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｎｔｉ−ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」，Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，６６  １，２０１１）。文献ではまた、ＬＰ系を用いる殺菌活性も請求されたが、ＬＰ濃度の上昇でさえ、試験後にかなりの数の培養可能な細胞が残っていることが報告された（例えば、Ｇａｒｃｉａ−Ｇａｒｉｂａｙら、１９９５，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｍｉｌｋ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ」Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（３），１５７−１６６）。本願のいずれかに考察されるように、培地中で得られるか、またはＬＰ反応の間に生成されるかのいずれかの過酸化水素は、細菌細胞にとって毒性であり、特異的な制御がない限り、所定の位置で、報告された抗菌活性に寄与し得る。先行技術はまた、ある範囲の報告された相乗作用的な化合物を開示しており、これは、ＬＰ系の有効性を増強するか、または実際には可能にすると請求されている。さらに、米国特許出願公開第２０１１／０００８３６１号（Ａ１）は、ＬＰを含めて、記載された抽出された陽イオン性画分の抗菌効果は、感染を除去し、直接の抗菌効果を補助する、免疫刺激の組み合わせであることを示唆している。
【００１２】
ＬＰ系の抗菌性効果に影響する正確な要因に対する全身的な情報が無いことは、商業的適用に対する障壁である。なぜなら、哺乳動物の肺などのデリケートな設定においては、過酸化水素の毒性があり得るからである。
【００１３】
ＬＰ系は、広範に記載されているが、当業者にとっては、細菌感染の治療に利用するにはこれは、有効ではない系であると考えられている。（Ｒａｉｎａｒｄ  ＆  Ｒｉｏｌｌｅｔ  ２００６，「Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ」，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７，３６９−４００；Ｓａｋａｉら、２００８，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｂｙ  ａ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎ  ｗｈｅｙ  ｏｆ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５，２５７−２６１；Ｓａｋａｉら、２００８，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎ  ｍｉｌｋ  ｆｒｏｍ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ｃｏｗｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｍｉｌｋ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５，３３５〜３３９）。ＬＰおよび同様の系に堅調でかつ有効な静菌能力がないことは、このような適用にとって重大な障壁である。ＬＰ系に基づく現在の商業的な適用としては、口腔洗浄液、歯磨き粉、食品防腐および消毒薬が挙げられ、これは主に、細胞の殺傷および種々の設状況からの細菌集団の全体的な排除ではなく、微生物の増殖の阻害に基づく。例えば、ラクトペルオキシダーゼ系に関して提出された特許（米国特許第４７２６９４５号および同第５６０７６８１号）を局所治療に用い、これは、存在する細菌の増殖を低減する方法として（溶液中で、例えば、イオンエマルジョンとして、または座瘡もしくは水虫の治療、あるいは実際には、動物の食糧中の予防薬として）主として設計される。
【００１４】
本発明の抗菌種の広範なスペクトルおよび多数の潜在的な標的は、耐性遺伝子の増殖を誘導する可能性は低い。治療用組成物の成分は、哺乳動物の体内で天然に産生され得るので（例えば、チオシアン酸塩、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースなどの中間体を介して）、薬物反応は、問題ではないかもしれない。薬物に対する反応は、現状の問題であって、ここでは患者のうち２０％が、Ｂ−ラクタム薬物と反応している（「Ｒａｐｉｄ  ｄｅ−  ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ」，Ｗｈｉｔａｋｅｒら、２０１１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ，１０（４）：２８２−５）。
【００１５】
Ｉｓｈｉｄｏら、（Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔ，第６６巻、第１号，２０１１）は、抗菌性であると言われる、ラクトペルオキシダーゼ系であって、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ、ラクトースおよびチオシアン酸カリウムを剤として含有する系を記載する。全ての場合に、ラクトースが、組成物中に存在した。しかし、この文献は、細菌増殖抑制しか記載しておらず、４８時間を超えては分析を行っていなかった。本明細書はまた、グラム陰性細菌であるＥ．ｃｏｌｉおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、ならびにグラム陽性種である、Ｓ．ｘｙｌｏｓｕｓ、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍおよびＥ．ｒａｆｆｉｎｏｓｕｓに対して阻害性の効果はなかったと述べている。本文献中の結果は、「増殖抑制」時間として表示しており、試験した時間は１２時間を超えている。従って、本文献は、全体として静菌効果を記載しており、殺菌効果ではない。
【００１６】
Ｇａｒｃｉａ−Ｇａｒｉｂａｙら、（Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９（３），１５７−１６６（１９９５）は、乳汁中で望ましくない微生物を減少するために、生乳中で過酸化水素を生成するためのβ−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼの使用を記載している。２４時間だけ再試験を行い、従って、微生物数の減少を示している提示されたデータは、静菌効果を示しているに過ぎない。
【００１７】
Ｓａｎｄｈｏｌｍら、（Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｂ  ３５，３４６−３５２（１９８８）は、乳頭（乳首）または乳房内の消毒剤における抗菌剤としての使用のためのグルコースオキシダーゼを記載している。
【００１８】
米国特許第５６０７６８１号は、ヨウ化物およびチオシアン酸イオン、酸化還元酵素、およびその対応する酸化可能な基質をラクトペルオキシダーゼと一緒に含有する抗菌組成物を記載する。この文献は、最大７２時間までの細菌に対する活性を記載しており、その系の治療適用は記載していない。
【００１９】
本発明は、先行技術からのパラダイムシフトを示す。これは、感染の治療のための広範なスペクトルの、真に殺菌性の治療を記載している。
−本発明者らは、ＬＰ系によって、または他の手段によって生じる反応性酸素種（ＲＯＳ）が、実際には、広範な病原性のグラム陽性およびグラム陰性細菌に対して、種々の培地中で、ならびに広範なｐＨおよび温度範囲にまたがって、濃度依存性の応答に基づいて殺菌性であることを示した（本発明の詳細な説明を参照のこと）。著者らは、ＲＯＳが、種々の表面上で、バイオフィルム中で増殖している細菌および真菌を完全に殺傷できることもまた示した。
−制御されたトライアルの一連の詳細では、この殺菌活性は、ＲＯＳの作用に起因して排他的であり得ること、およびＲＯＳは、これに関して、残留する過酸化水素が存在せず、なんら他の相乗効果的な剤、例えば、ラクトフェリン、四級アンモニウム化合物、脂肪酸などが存在しない場合に有効であることが示された（本発明の詳細な説明を参照のこと）。
−特定の状況で細菌の特定の集団を完全に殺傷するために必要なＲＯＳの濃度を、抗生物質および他の抗菌治療剤に用いられるのと同様の方式で、算出して用いて、正確な用量応答／最小阻害濃度の情報を得てもよい（本発明の詳細な説明を参照のこと）。
−ＲＯＳ種のこれらの用量レベルでの投与を用いて、ウシの乳房および哺乳動物の肺から単離された細菌性病原体、種々の表面に付着されたバイオフィルムとして増殖している細菌性病原体；患者から単離された細菌性病原体；ならびに広範な抗生物質に耐性の細菌性病原体を含めて、広範なグラム陰性およびグラム陽性の細菌性病原体を完全に殺傷できる（本発明の詳細な説明を参照のこと）。
−ＲＯＳ種の必要な殺菌性および治療性の濃度が、例えば、ウシの乳房中でＬＰ系を用いて、治療の部位で生成され得ること、またはＲＯＳ種は、感染の部位に対して外部で調製されて、なんら他の活性な成分なしに送達されて、細菌感染の首尾よい治療および排除を可能にし得ることもまた示された。従って、本発明の技術は、例えば、医療デバイスの表面上での細菌感染およびバイオフィルム増殖を制限する固有の方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明の目的
本発明の第一の目的は、微生物感染の治療のための改善された組成物を提供することにある。さらなる目的は、細菌、ウイルス、真菌および酵母の増殖を遅くすることとは対照的に、殺傷できる組成物を提供することにある。なおさらなる目的は、抗生物質耐性の生物体を殺傷できる組成物を提供することにある。
【００２１】
乳腺炎
さらなる目的は、抗生物質を使用することなく、臨床的および無症候性の乳腺炎の治療のための組成物を提供することにある。本発明のさらなる目的は、治療の間に乳汁を廃棄することを必要としない乳腺炎の治療を提供することにある。
【００２２】
本発明のさらなる態様は、施行することが容易である、乳腺炎の臨床的な解決法を提供することにある。上記で考察される先行技術の反応では、全ての成分が一緒に混合されたかのようであり、その反応は即時的に生じて、そのため短い半減期となる。先行技術では、生成物を投与する前、従って反応を開始する前に混合される２つのアリコートが必要である。別の欠点は、グルコース濃度が常に制限因子であるということである。臨床状況で十分なグルコースを有するために、濃縮された供給源を添加することが必要であった。これによって、溶解度の問題がもたらされる。外因性のグルコースの添加はまた、乳汁の下流の処理に問題を生じ得、また消費用の乳の味覚および甘味に関して消費者の問題を生じ得る。
【００２３】
グルコース投与の必要性を回避する試みでは、乳汁自体の特徴を、本発明者らによって試験した。乳汁は、ラクトースの供給源である。β−ガラクトシダーゼは、二糖類をその成分である、グルコースとガラクトースとに切断して変換する酵素である。従って、酵素の使用は、乳自体の重要な成分に依存して、ＬＰ系が感染の部位で反応性酸素種を生成する能力を引き出す。この酵素を用いることによって、グルコースが存在するまでこの系は反応しない（そしてグルコースは、β−ガラクトシダーゼが乳汁と接触するまで生成されない）ので、カクテルを投与することが容易になる。これは、グルコースまたは実際には適切な単糖類もしくは二糖類を利用の前に投与しなければならないことよりもかなり有用であり、濃縮された、問題のある糖溶液の使用がなくなる。
【００２４】
肺感染
本発明の別の目的は、多数の他の細菌の感染の治療である。抗生物質の薬物送達および耐性は、嚢胞性線維症（ＣＦ）および結核（ＴＢ）の両方の治療において大きな問題である。抗生物質耐性は、標的部位、すなわち、肺に達する薬物の阻害性に満たない濃度の結果として生じる場合が多い。慢性感染は、この状況から生じる場合が多く、患者の健康に重篤な影響を与える。肺の成分の理想的な送達は、直接の肺への、噴霧スプレーとしてである。これは、この成分が正確な部位で、および正確な濃度で生物体と直接相互作用するという利点を有する。これが経口的にまたは血流を通じて投与される場合、同じ効果を得るには、より大きい濃度が必要である。抗生物質を用いる場合、これは、用いられる薬物をより大きい濃度にし、薬物の耐性または反応の機会を増大する。本発明の系の成分は、哺乳動物の系では天然には存在しない（または通常は飼料中で用いられる）ので、それに対する反応は、薬物反応が一般的である抗生物質での治療に有利である可能性は極めて低い。ＣＦを有する患者では、膜中で水の調節ができないせいで、天然のレベルのチオシアン酸塩は肺中で低下し、臓器中の天然に見出されるラクトペルオキシダーゼ系の有効性は低下する。ＣＦと診断された人で予防的に作用し得るか、または肺感染を既に発症した患者を治療するために用いられ得る反応性酸素種の外因性の添加。このような噴霧されたスプレーは、体腔が環境に対して開口されていてリスクがある手技の間の感染、特に抗生物質耐性の細菌株による感染を最小限にするために病院で用いられる可能性がある。
【００２５】
火傷／皮膚／口腔
この技術の適切な標的である他の感染とは、火傷または開放傷の結果として被る感染である。現在の抗生物質治療の投与計画を上回る、記載された系を用いることの利点は、薬物の反応、安全性、有効性および耐性に関してＣＦまたはＴＢを治療するのに上記される利点と同様であろう。本発明者らは、反応性酸素種が、バイオフィルムのベースの細胞（固体層に付着された細胞）の治療に有効であることを示した。これは、ＴＢ／ＣＦ患者の肺で、および開口の創傷または火傷において、最も注目される細菌の表現型である。この表現型は、広範な抗生物質に対して細菌に対する一般化された耐性を付与する（「Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ｂｉｏｆｉｌｍｓ」，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＆  Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ，２００１，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ，３５８，１３５−１３８）。
【００２６】
この系の形態はまた、多数の目的を有する、一般的な抗菌溶液としても機能し得る。例えば、抗菌系を含有する口腔洗浄液は、口腔内のバイオフィルムの形成を妨げることを補助し得る。同様に、抗菌の鼻腔リンスは、副鼻腔炎またはアレルギー性鼻炎などの副鼻腔の問題を軽減することを補助するために用いられ得る。現在、ステロイドおよび生理食塩水の鼻腔洗浄液が用いられる。しかし、抗菌の生理食塩水洗浄液はまた、鼻腔内の細菌のコロニー形成と戦うことも補助するであろう。
【００２７】
医療用デバイス
反応性酸素種、例えば、ハロペルオキシダーゼベースの系によって生成されるものの使用はまた、移植された医療用デバイス上での細菌感染の治療および予防に多数の利点を保持するであろう。感染（強固なバイオフィルムの形態）は、カテーテルなどの種々のデバイスで極めて一般的である。種々の酵素で含浸されるかまたはコーティングされたデバイスは、血中に天然に存在する基質と反応し得る。
【００２８】
一般的な抗菌洗浄液
本発明の別の目的は、多重の目的の生成物のための一般化され、安全な、抗菌の洗浄液としての使用のための組成物を提供することにある。提唱された系は、表面、パイプ、ビールのライン、調理設備などから細菌を洗浄／除去するのに有効であろう。
【００２９】
抗真菌剤
感染は、酵母、真菌増殖および細菌の結果として生じ得る。従って、抗微生物活性（抗生物質の場合など、抗菌活性とは対照的）を発揮できる治療的な投与計画が大きな利点である。この目的を達成するために、反応性酸素種（次亜ヨウ素酸）の抗菌活性を、注の２つの真菌株に対して試験した（下の実施例１８）。真菌のＣａｎｄｉｄａ株は典型的には、日和見の病原体と記載される。それらは、種々の皮膚の病態、例えば、外陰膣炎および尿路感染を生じ得る。それらは、ＨＩＶ患者および他の免疫無防備状態の患者で蔓延している。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ（一般に、酵母、パン酵母として知られる）は、食品中で重要な生物体である。これはまた、飲料業でも大きな問題となり、ビールのラインでみられる典型的な生物体であり、飲料を損なう原因である。従って、本発明の抗菌性反応性酸素種は、真菌感染を治療もしくは制御するため、または表面を清浄にして真菌汚染を根絶させるための、良好な治療候補である。
【００３０】
また、本発明は、抗ウイルス剤としての用途を見出す。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明によれば、反応性種または反応性種を生成可能な成分を含有する殺菌性組成物が提供され、本組成物は、２４時間の間反応性酸素種を１リットルあたり少なくとも０．４ミリモルのレベルに送達可能である。本組成物は、この反応性酸素種を、２４時間の間、１リットルあたり少なくとも０．５ミリモル、または１リットルあたり少なくとも０．６ミリモル、または１リットルあたり少なくとも０．７ミリモル、または１リットルあたり少なくとも０．８ミリモル、または１リットルあたり少なくとも０．９ミリモル、または１リットルあたり少なくとも１．０ミリモルのレベル、または１リットルあたり少なくとも２．０ミリモルのレベルに送達できる場合がある。
【００３２】
反応性酸素種は、ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの基質および過酸化水素の反応によって生成され得る。
【００３３】
殺菌性の（ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄａｌ）とは、細菌、ウイルス、真菌および酵母などの微生物を、単にそれらの増殖を遅らせるのとは対照的に、殺傷できる組成物を、本発明者らは意味する。この殺菌性の組成物は、それが加えられる、環境中に存在する微生物の少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％を殺傷できる。
【００３４】
また、本組成物は、抗生物質耐性の生物体を殺傷できる。
【００３５】
本組成物の反応性酸素種は、ヒポチオシアン酸（ヒポチオシアナイト、ＳＣＮＯ−としても公知）を含有してもよい。
【００３６】
本組成物の反応性酸素種はまた、次亜ヨウ素酸（次亜ヨウ素酸塩としても公知のＩＯ−）を含有してもよい。
【００３７】
本組成物の反応性酸素種はまた、次亜塩素酸塩（ＣＩＯ−）を含有してもよい。
【００３８】
さらなる態様においては、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素および酸化還元酵素をさらに含有する殺菌性組成物を提供する。本組成物は特に、嚢胞性線維症または結核患者、火傷の被害者、または医療デバイスを挿入されている患者における感染の治療に特に適切である。
【００３９】
さらなる態様においては、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素、酸化還元酵素、およびグリコシド加水分解酵素をさらに含有する殺菌性組成物を提供する。本組成物は特に、乳腺炎感染の治療に適切である。
【００４０】
また、本組成物は、ペルオキシダーゼの基質を含有してもよい。
【００４１】
ペルオキシダーゼは、ハロペロオキシダーゼであってもよい。ハロペルオキシダーゼ酵素は、ラクトペルオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ、ブロモペルオキシダーゼ、またはヨードペルオキシダーゼであってもよい。適切なクロロペルオキシダーゼ類としては、ミエロペルオキシダーゼおよび好酸球ペルオキシダーゼが挙げられる。適切なブロモペルオキシダーゼ類としては、オボペルオキシダーゼ、バナジウムブロモペルオキシダーゼおよびＭｕｒｅｘ  ｓｎａｉｌブロモペルオキシダーゼが挙げられる。適切なヨードペルオキシダーゼ類としては、西洋わさびペルオキシダーゼおよび甲状腺ペルオキシダーゼが挙げられる。
【００４２】
ラクトペルオキシダーゼ酵素を用いる場合、本組成物はさらに、ヨウ化カリウムもしくはヨウ化ナトリウム、またはチオシアン酸カリウムもしくはチオシアン酸ナトリウムを基質として含有してもよい。クロロペルオキシダーゼは、塩化物イオンと反応し、乳汁、血液などの中で容易に利用可能であり、そのため、塩化物イオンの添加は、常に必要なわけではない。ブロモオキシダーゼまたはヨードオキシダーゼが用いられる場合、その基質はそれぞれ、臭化物イオンまたはヨウ化物イオンの供給源であり得る。
【００４３】
ハロペルオキシダーゼは、利用可能な過酸化水素、および適切な基質（ヨウ化物／臭化物／塩化物またはチオシアン酸塩）と反応して、抗菌性の反応性種を生成する。グリコシド加水分解酵素は、β−ガラクトシダーゼであってもよく、これは、乳汁中の自由に利用可能なラクトースをグルコースおよびガラクトースに変換する。
【００４４】
酸化還元酵素は、グルコースオキシダーゼであってもよく、これは、得られたグルコースと反応して、過酸化水素を生成する。同様に、ガラクトースと反応して、過酸化水素を生成するガラクトースオキシダーゼもまた用いてもよい。
【００４５】
好ましくは、本組成物はさらに、二糖を含有してもよい。この二糖類は、その対応するグリコシドヒドロラーゼ、例えば、スクロースおよびスクラーゼによって引き続いて加水分解され得、これによって単糖類の糖の放出が可能になり、これが次に、対応する酸化還元酵素の使用によって追加の過酸化水素の供給源として機能し得る。
【００４６】
さらに、３つ以上の糖分子を含有し、かつ過酸化水素の供給源を生成するために切断されるオリゴ糖類または多糖類が添加されてもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、本組成物は、過酸化水素の供給源となる、二糖を成分の単糖類へ壊すグリコシド加水分解酵素と、単糖類の糖と反応して過酸化水素を放出する酸化還元酵素との２つの酵素を含有する二糖成分。
【００４８】
本組成物は、過酸化水素の追加の供給源を含有してもよい。過酸化水素の１つの追加の供給源は、過酸化水素の溶液の外因性の添加、または過炭酸ナトリウムなどの適切な過酸化水素化物によるその放出である。
【００４９】
上記に代えて、あるいは上記に加えて、多数の酵素を用いて、過酸化水素を生成してもよい。キサンチン酸化還元酵素／オキシダーゼは、ヒポキサンチンまたはキサンチン（乳汁中に両方とも存在する）のいずれかと反応して、過酸化水素を生成する。従って、キサンチン酸化還元酵素／オキシダーゼおよび／またはキサンチンを、過酸化水素を生成する組成物に添加してもよい。同様に、糖アルコールは、それらの適切なオキシダーゼ酵素と反応して、過酸化水素の供給源を生成し得る。例えば、グリセロールオキシダーゼは、グリセロールと反応して、過酸化水素の供給源を生成し、従って、グリセロールオキシダーゼ／グリセロールが組成物に添加されてもよい。別の例は、マンニトールオキシダーゼと反応するマンニトールである。これに加えて、クエン酸が、過酸化水素を放出することが公知であり、従ってまた組成物に添加されてもよい。同様に、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼは、遊離アミノ酸（これも乳汁中に存在する）と反応して、過酸化水素を生成する酵素である。同様に、その添加（Ｌ−アミノ酸補充の有無）によって、過酸化水素の供給源が提供され得る。
【００５０】
本発明の態様であって、ペルオキシダーゼ酵素、酸化還元酵素、およびグリコシド加水分解酵素（特にβ−ガラクトシダーゼ）をさらに含有する殺菌性の組成物を提供する態様は、乳汁中で極めて有効な抗菌性の質を有することが証明された。具体的には、この系は、グラム陽性およびグラム陰性の細菌の両方を高レベルのバイオバーデン（すなわち、１０８〜１０細胞／ｍｌと推定）で完全に殺傷するのに有効である。先行技術によれば、ＷＨＯは、ラクトペルオキシダーゼ系は「生乳中で主に静菌効果を発揮する」ものであって、冷蔵がない条件で、生乳の輸送の間にこのような手段によって短期間、細菌増殖を制限するのにしか適さないと述べているので、これは驚くべき知見である（２００５年１１月２８日〜１２月２日、イタリア、ローマ、ＦＡＯ／ＷＨＯ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ＦＡＯ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓの報告）。他の研究者らは、この系での任意の殺菌活性が、過酸化水素成分に起因すること、およびラクトペルオキシダーゼ系が静菌性であることを結論付けた（Ｔｈｏｍａｓら、１９９４，「Ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｒａｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ」，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，第６２巻、第２号，５２９〜５３５頁）。
【００５１】
β−ガラクトシダーゼは、乳汁中に存在するラクトースと反応して、グルコースおよびガラクトースを生成する。この得られたグルコースは、グルコースオキシダーゼと反応して、過酸化水素を生成する。この過酸化水素は、ヨウ化カリウム／チオシアン酸カリウムと反応して抗菌効果を生じる。この抗菌性効果は、ヨウ化物の過酸化および他の適切な基質を触媒するラクトペルオキシダーゼによって補助される。
【００５２】
乳汁中に内在するラクトースに依存して、インビトロの状況では限定要因である、高度に濃縮されたグルコース溶液の使用は回避され、野外で生成物を用いることが可能になる。
【００５３】
本発明の別の態様においては、キサンチン酸化還元酵素／オキシダーゼを含有する、感染または汚染の治療のための組成物が提供される。本組成物はさらに、ヒポキサンチンもしくはキサンチンのいずれか、またはその両方を含有してもよい。また、本組成物は、酸化還元酵素またはグリコシド加水分解酵素または二糖類を含有してもよい。
【００５４】
本発明のさらに別の態様においては、Ｌアミノ酸オキシダーゼを含有する感染または汚染の治療のための組成物が提供される。本組成物はさらに、遊離アミノ酸を含有してもよい。また、本組成物は、酸化還元酵素またはグリコシド加水分解酵素または二糖も含有してもよい。
【００５５】
本発明の組成物の１つの能力は、ウシ（または他の哺乳動物）の乳腺炎の治療にある。本組成物は、臨床的および無症候性の乳腺炎の両方を治療するために用いることが可能で、バルクプールから得られた治療済みの乳を除去する必要がないという利点をもたらす。提唱された溶液中に存在する酵素は、安全であり、かつヨウ化カリウムまたはチオシアン酸カリウムを含めて潜在的な基質は、用いられる濃度で安全である。本組成物は、抗生物質に対する抵抗性を誘導する可能性が低く、これが追加的な利点である。さらに、２００５年１１月２２日〜１２月２日のイタリア、ローマのＦＡＯ／ＷＨＯテクニカルミーティングの報告では、ラクトペルオキシダーゼ系は、正常な代謝物ではない物質を乳汁中へ誘導しないことが示された。
【００５６】
本発明の殺生物性の反応性酸素種を生成する酵素の使用は、長期間にわたって組成物を連続的に生成する手段を提供し、これは、抗菌性活性を補充するために新しい分子を外部から追加しなければならない抗生物質での治療と比較した場合、有利である。
【００５７】
乳腺炎の治療に適切な１つの製品は、乳房内注入送達デバイス（必要に応じて、二重外筒注射器として示される）であって、乳腺炎を治療するための殺菌性の反応性酸素種を生成するために用いられる、２ｍｇのグルコースオキシダーゼ（約２００単位／ｍｇ）、０．５ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ（≧２，６００単位／ｍｌ）、４ｍｇのラクトペルオキシダーゼ（≧８０単位／ｍｇ）、および１００〜１５０ｍｇのヨウ化カリウムを含有する７〜１０ｍｌ溶液（ゼラチン補充で粘度が漸増する）を充填されたデバイスである。
【００５８】
他の調製物は、使用前に基質の溶液と混合される凍結乾燥粉末として酵素を保持可能であり、これによって冷蔵ができない反応の保存寿命を補助する。他の同様の生成物が、動物（ヒツジなど）の体重、乳生産および感染乳房のバイオバーデンレベルに基づいて生成され得る。これに加えて、種々の組み合わせの成分を、特に、ヨウ化物の代わりに臭化物／チオシアン酸塩を用いて、種々の酸化還元酵素、または過酸化水素の供給源の種々の可能性のある供給源の補充を用いて、またはキサンチン酸化還元酵素（キサンチンオキシダーゼを含む複合酵素）またはＬ−アミノ酸オキシダーゼ（酸化還元酵素ファミリーのメンバー）のアプローチを用いて調製してもよい。
【００５９】
別の生成物は、ラクトペルオキシダーゼを、過酸化水素および適切な基質と反応して、抗菌性種を生成する任意の他の酵素で置き換えることを包含する。これらのうちでも、クロロペルオキシダーゼは、２ｍｇのグルコースオキシダーゼ（約２００単位／ｍｇ）、０．５ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ（≧２，６００単位／ｍｌ）、および５０μｌのクロロペルオキシダーゼ（＞１１，１００単位／ｍｌ）を含有している７〜１０ｍｌの溶液（ゼラチン補充によってその粘度が増大する）の填薬と適切である。
【００６０】
ラクトペルオキシダーゼ系は、以前に多数の処方物で記載されている（米国特許第４７２６９４８号および米国特許第５６０７６８１号）。Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ（２００５年１１月２８日〜１２月２日のイタリア、ローマのＦＡＯ／ＷＨＯテクニカルミーティング（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ）ＦＡＯ  Ｈｅａｄｑｕａｒｔｅｒｓの報告）は、第三世界の国での冷蔵庫のなしの状況における乳の寿命の延長の方法としてのその使用を推奨した。ＷＨＯは、過酸化水素の供給源として過炭酸ナトリウムを用いるシステムを推奨した。本明細書に推奨される本発明の態様は、乳内に存在するラクトースの連続的切断によって提供される別の過酸化水素の供給源を用いるという点で、公知のＬＰ系とは異なる。これに加えて、ラクトペルオキシダーゼの代わりにクロロペルオキシダーゼ酵素を用いることが別法であり、ここでは、これが、乳内に既に存在する塩と反応して、乳房に対するハライドの補充の必要性をなくする。本発明のこの態様のいずれの形態でも（ラクトペルオキシダーゼ／クロロペルオキシダーゼ）、乳房に投与されるまでそれらが反応を開始しないという点で、既存の調製物を超える利点がある。各々が４℃で長い貯蔵期間を有する。ＷＨＯは、本明細書に記載される本発明の態様で生じないＬＰ系の彼らの記載した生まれ変わりにおける多くの問題を考察した。ＷＨＯによって提唱される系は、チオシアン酸塩および過炭酸塩の粉末を小袋（ｓａｃｈｅｔ）の形態で乳に送達した。粉末化されたチオシアン酸塩は、吸湿性であって、かつ経時的に分解され得、過炭酸ナトリウムは、過酸化水素の供給源として、酸素を生成させることができ、これが小袋（ｓａｃｈｅｔ）の破れおよび破壊を生じ得る。
【００６１】
本明細書に記載される本発明は、Ｋｕｓｓｅｎｄｒａｇｅｒ  ａｎｄ  ｖａｎ  Ｈｏｏｉｊｄｏｎｋ，２０００（Ｌａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｓｄａｓｅ：ｐｈｙｓｉｃｏ−ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，８１，５１９−５２５）に記載されるラクトペルオキシダーゼ系を改善する。乳腺炎を治療する場合、これは、乳自体の重要な成分であるラクトースを用いて、細菌の反応性酸素種の特定の必要な濃度を生じる反応を駆動して、感染を排除する。過炭酸ナトリウムとは対照的に、２つの酵素（β−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ）の補充によって、制御されたレベルで殺菌性剤の連続的な生成を可能にするために必要な過酸化水素の緩徐で、長期的な放出が可能になる。提唱される環境でのラクトースの利用性のおかげで、過酸化水素は、反応における限定要因ではない。比較的少量のβ−ガラクトシダーゼは、大容積のグルコース補充とちょうど同じく有効であることが証明された。
【００６２】
本発明は、哺乳動物に天然に見出されるラクトペルオキシダーゼ系を、それが、存在する過酸化水素（および実際は任意の他の成分）のレベルを調節するので、改善する。典型的な感染の間、過酸化水素のレベルは、細菌のカタラーゼ活性によってクエンチされ、それによってその系の有効性が低下される。過酸化水素の利用性が低いことで、多数の研究者らは、ラクトペルオキシダーゼ系の抗菌性の性質が「疑わしい」と考えるようになった（Ｒａｉｎａｒｄ  ＆  Ｒｉｏｌｌｅｔ  ２００６，「Ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｏｖｉｎｅ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ」，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７，３６９〜４００；Ｓａｋａｉら、２００８，「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｂｙ  ａ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎ  ｗｈｅｙ  ｏｆ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５，２５７−２６１；Ｓａｋａｉら、２００８，「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｓｓ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ  ｉｎ  ｍｉｌｋ  ｆｒｏｍ  Ｈｏｌｓｔｅｉｎ  ｃｏｗｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｎｄ  ｌｏｗ  ｍｉｌｋ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔ」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７５，３３５−３３９）。
【００６３】
キサンチン酸化還元酵素／オキシダーゼまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼを、過酸化水素の供給源として用いる本発明の実施形態によって、この技術は改善され、糖補充を必要とせず、乳自体の構成物質を用い、その甘味に関して乳の味を変えない。
【００６４】
ラクトペルオキシダーゼ系に関して出願された特許（米国特許第４７２６９４５号および同第５６０７６８１号）は局所の治療のために用いられ、主に存在する細菌の増殖を減らす手段として（溶液中で、例えば、イオン性エマルジョンとして、または座瘡もしくは水虫の治療、あるいは実際には、動物の飼料における予防薬として）設計される。本発明は、抗生物質投与計画の代用として、「本格的な（ｆｕｌｌ−ｂｌｏｗｎ）」細菌感染を治療する新規な手段を提供する。高レベルの殺菌性の活性が、本発明を用いて、その種々の態様において、インビトロおよびインビボのレベルの両方で示された。
【００６５】
この技術の変形例、すなわち、殺菌性の反応性酸素種を生成するために利用される酵素および基質の種類は、他の種類の細菌感染を治療するために用いられる。
【００６６】
本発明による抗菌性の鼻腔リンス製品は、この系の必要な成分を含有する。これらとしては、適切なペルオキシダーゼ酵素、例えば、ラクトペルオキシダーゼまたはクロロペルオキシダーゼ、適切な基質（例えば、ヨウ化物、チオシアン酸、または塩化物イオン）が挙げられる。同様に、過酸化水素の供給源は、単糖類の糖およびその切断酵素、例えば、グルコースおよびグルコースオキシダーゼ、または過酸化水素遊離分子、例えば、過炭酸塩またはクエン酸によって必要に応じて供給される。これらの成分および基質（単数または複数）は、使用前に再水和される小袋中の乾燥の塩の粉末／凍結乾燥された酵素として補充されてもよい。生理食塩水溶液の使用（または小袋に対する余分な塩化ナトリウムの追加）は、必要な塩分濃度を調節する。同様に、炭酸水素ナトリウムの使用は、酸性度を調節する。この系の乾燥粉末型によって、生成物は貯蔵期間を維持し、その生成物の容積を減らすことが可能になり、その結果、この系を「活性化する」には水しか必要としない。
【００６７】
ＣＦ／ＴＢの治療のための組成物は、噴霧スプレーによって肺に送達される溶液であってもよく、この溶液が本発明の必要な成分（ラクトペルオキシダーゼまたはクロロペルオキシダーゼのいずれか）、必要な基質（チオシアン酸／塩化物）および過酸化水素の供給源（グルコースおよびグルコースオキシダーゼ、または他の可能な酵素方法、例えば、キサンチン酸化還元酵素／オキシダーゼおよびヒポキサンチン／キサンチンまたはＬ−アミノ酸オキシダーゼおよびＬ−アミノ酸、または過炭酸ナトリウムなどの過酸化水素化物の添加、または過酸化水素溶液の直接添加にさえよる）を肺に送達する。この溶液の貯蔵は、肺への送達のみを生じる反応を確実にするために特定の成分を節約することによって達成され得る。従って、１つの溶液は、ハロペルオキシダーゼ酵素およびグルコースを含んでもよく、基質およびグルコースオキシダーゼを含有する別の溶液と混合される。これらの混合が反応を開始し、極めて抗菌性の反応性種を生成し、これが、所定の容積でネブライザーによって肺に送達され得る。
【００６８】
各々の成分の濃度は、ヒトの肺に対して調整されれてもよいが、上記の乳腺炎治療について記載されたのと同じ潜在的な桁数である。同様に、同じ全体的な送達機構を、噴霧の必要性を要しない、一般的な抗菌性の咽喉スプレーに用いてもよい。
【００６９】
本発明によってバイオフィルムの細胞を効率的に根絶する能力（本発明の実施例３の詳細な説明を参照のこと）によって、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄ株が、抗生物質に対してより大きい耐性を示すように、肺の嚢胞性線維症感染の治療において効率的ではないことが公知の現在用いられている抗菌性の治療を上回る有意な改善が得られる。（「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｉｒｗａｙｓ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ  ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ」，Ｆｒｉｃｋｓ−Ｌｉｍａら、２０１１，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ，３７（４），３０９−３１５）。
【００７０】
本発明の１つの実施形態はまた、火傷患者を治療する新規な方法を提供する。抗菌性種を生成可能な酵素（特に、ハロペルオキシダーゼ；例えば、ラクトペルオキシダーゼ／クロロペルオキシダーゼ；および酸化還元酵素、例えばグルコースオキシダーゼ）に含浸した湿布は、抗菌性の化合物の生成に必要な成分（潜在的な基質、特にヨウ化物／チオシアン酸塩／塩化物；および、酸化還元酵素、特にグルコースと反応する単糖類の糖）を含有しているゲルベースの溶液に浸漬され得る。この湿布は、必要に応じて創傷の上に置かれて、組織の修復に必要な安全な好気性の環境を維持している極めて抗菌性の化合物の安全な放出を可能にし得る。
【００７１】
この成分の濃度は、やはり、乳腺炎の治療について上記されたものと同様である。過酸化水素を生成する別の方法は、酸化還元酵素および糖の変化によって、他の酵素的反応（Ｌ−アミノ酸オキシダーゼおよびＬ−アミノ酸、キサンチン酸化還元酵素／オキシダーゼおよびキサンチン／ヒポキサンチン）によって、過炭酸ナトリウムなどの過酸化水素化物の添加によって、または過酸化水素の溶液の直接添加によってであってもよい。
【００７２】
ハロペルオキシダーゼベースの系を利用する本発明の実施形態はまた、医療デバイスの物理的な特性を改善するため、患者への移植の間に感染を生じる機会を制限するために使用され得る。この方法は安全であり、抗生物質を用いる場合によくあるように、薬物の反応または耐性を制限している。必要な酵素、ラクトペルオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｅｒｐｏｘｉｄａｓｅ）またはクロロペルオキシダーゼ、および酸化還元酵素、グルコースオキシダーゼおよび／または追加的な基質のデバイスの表面上への含浸は、実行可能な送達方法である。典型的には、反応を駆動するのに必要な基質、特にグルコースおよびチオシアン酸塩／塩化物が、血液、唾液、乳汁および尿中に存在し、それによって反応は、酵素および／または追加の基質の緩徐な放出を生じる。この酵素の緩徐な放出は、含浸された生分解性ポリマーの形態で、荷電によって表面上にそれらを固定／コーティングすることによって行われ得る。ポリマーが分解するにつれて、新鮮な酵素分子は、デバイス上に通過する基質と自由に反応する。含浸後、最初の数日の経過にまたがるこれらの酵素の一定の放出は、感染／バイオフィルムが正常には支配する重要な絶好の機会においてデバイスの無菌性を維持する。
【００７３】
一般化された抗菌性の溶液は、２つの溶液（または可能性としてはそれらの乾燥粉末型が含まれる水）の混合によって生成され得る。例えば、抗菌性の溶液は、ペルオキシダーゼ酵素（例えば、クロロペルオキシダーゼまたはラクトペルオキシダーゼ）の粗供給源、適切な基質（必要に応じて、塩の形態で、例えば、ヨウ化ナトリウム／チオシアン酸／または塩化物）および過酸化水素の供給源（安価な供給源は、クエン酸、過炭酸塩、過酸化水素自体、またはそれと反応するための適切な酵素との糖−例えば、グルコースおよびグルコースオキシダーゼ）の混合によって調製され得る。本発明に対するこの態様は、溶液中の成分の混合によって活性化される。この溶液は、浄化される必要がある表面に送達され得る。このような例としては、ビールのライン、セラミックの表面、金属表面などが挙げられ、病院、工場、台所などで用いられてもよい。この溶液は、比較的非毒性であり、漂白剤などの多くの浄化生成物と関連する臭いを生じない。これに加えて、ラクトフェリンなどのタンパク質が、力価を増大する系に補充され得る。ラクトフェリンは、細菌のバイオフィルムを破壊することを補助し、従って、その製品の抗菌性の性質を強調するように機能し得ることが公知である。
【００７４】
同様に、提唱された組成物は、感染部位への投与の前に予め調製されるか、または活性化され得る。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
実施例１
抗菌性組成物は、１５０ｍｇのヨウ化カリウム、４ｍｇのラクトペルオキシダーゼ（≧８０単位／ｍｇ）、および２ｍｇのグルコースオキシダーゼ（約２００単位／ｍｇ）の７ｍｌの滅菌水への添加によって、生成した。この実施形態は、「ＫＩ用量１５０（ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０）」と呼ばれる。同様に、組成物を、１５０ｍｇのチオシアン酸カリウムを用いて調製し、「チオ用量１５０（Ｔｈｉｏ−Ｄｏｓｅ−１５０）」と呼ぶ。これらの相互作用の抗菌性の特性を、二重の希釈の９６ウェルプレート増殖アッセイベースの方法を用いて試験した。本組成物のアリコートを、１０７−８個の細菌細胞を含有する１５０μｌの増殖培地（１〜２％グルコースが存在する）に添加して、３００μｌの最終容積にした。本組成物の濃度を、１５０μｌの混合物を取り出し、１５０μｌの同一の増殖培地を含有している次のウェルに移すことによって二倍に希釈して、ＲＯＳ生成成分をなくす。この培地の光学密度を、５９５ｎｍで２４時間測定した。細菌を完全に阻害するのに必要な濃度は、２４時間後に培地中の増殖の可視徴候を生じない、使用される組成物の最低濃度であった。対照は、組成物の補充のないか、または成分の１つを本組成物から除去したウェルを含む。この方法を用いて、本組成物の抗菌性の能力を、種々の微生物、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、非溶血性大腸菌に対して決定した。これらの生物体は、多数の感染、特にウシ乳腺炎、嚢胞性線維症肺感染、皮膚感染、火傷感染などの原因因子として記載されることが多く、従って、本組成物が治療に用いられる種々の生物体に相当する。本組成物に対する生物体の相対的な感染しやすさは、表１に記載しており（比は、増殖がまだ記録されない本組成物の最低の希釈を示し、例えば、１：８００ならば、増殖培地８００μｌごとに１μｌの組成物と等価まで希釈された組成物を有した）、増殖を阻害した組成物の最低濃度である。２４時間の経過にわたって生成された、抗菌性の反応性酸素種（ＲＯＳ）の推定レベルもまた示す（下記の実施例１９も参照のこと）。
【００７６】
【表１】
2014510777.tif 000003
【００７７】
実施例２
ラクトペルオキシダーゼ系が、その静菌性または阻害性の質に関して考察された。実施例１に記載のプロトコールは、大規模の容積で行った（ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０またはＴｈｉｏ−Ｄｏｓｅ−１５０の最初の５００μｌのアリコートを、試験生物体を含む１０ｍｌの増殖培地に添加して、二倍希釈した）。インキュベーションの４８時間後、この系の殺菌性の質を、寒天プレートに対する接種ブロスの継代培養によって検討した。本組成物は、新鮮な寒天プレートへの継代培養の２４時間後に（すなわち、抗菌組成物に対する暴露７２時間後）、細胞のわずか０．０００１％以下しか、回復可能でなかった場合に、ある特定の濃度である細菌株に対して殺菌性であるとみなされた。本組成物は、感染治療について達成可能な濃度で試験した各々の株に対して殺菌性であった（阻害が示された最低希釈は、上の表１に示す）。
【００７８】
実施例３
過酸化水素供給源の選択は、ＬＰ系に、そしてまた、ＲＯＳに基づいて殺菌性の濃度で抗菌性組成物を生成する能力にも影響することが示され得る。栄養ブロスのアリコート（２０ｍｌ）に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２の１０８個の細胞を摂取し、１５０μｌの接種されたブロスを、９６ウェルの増殖プレート中のウェルに添加した。これを繰り返して、接種されたブロスにはさらに、ＬＰ（３７．５μｌの４ｍｇ／ｍｌ溶液）およびＫＩ（７５μｌの４０ｍｇ／ｍｌ溶液）をこの培地に補充した。
【００７９】
過酸化水素の供給源を、ウェル１に添加し（１５０μｌ）、ウェル１１には二倍希釈して添加したが、ウェル１２には添加せず、これを対照として使用した。過酸化水素の供給源は以下のとおりであった。
−４０μｌのＨ２Ｏ２を含有する５ｍｌの水（３０％（ｗ／ｖ））
−５０ｍｇの過炭酸ナトリウムを含有する５ｍｌの水
−５ｍｌのグルコース（２０％）＋４７μｌのグルコースオキシダーゼ（２．５ｍｇ／ｍｌ、２００単位／ｍｇ）
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】Ｈ２Ｏ２溶液の１：８希釈および１：１６希釈が、Ｅ．ｃｏｌｉに対して阻害性であるが、１：３２希釈は阻害性ではなかったことを示すグラフである。
【図２】図２．光学密度５９５ｎｍで測定した、ＫＩ／ＬＰの存在下における、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖のＨ２Ｏ２に対する感受性は、１／８および１／１６希釈では阻害されたが１／３２希釈では阻害されなかったことを示すグラフである。
【図３】図３．光学密度５９５ｎｍで測定した、過炭酸塩の添加によって放出された過酸化物に対する、Ｅ．ｃｏｌｉの増殖の感受性は、１／８および１／１６希釈では阻害されたが１／３２希釈では阻害されなかったことを示すグラフである。
【図４】図４．光学密度５９５ｎｍで測定した、ＫＩ／ＬＰの存在下における、過炭酸塩の添加によって放出された過酸化物に対するＥ．ｃｏｌｉの増殖の感受性は、１／８および１／１６希釈では阻害されたが１／３２希釈では阻害されなかったことを示すグラフである。
【図５】図５．グルコースオキシダーゼを介した酵素活性によるグルコースから生成された過酸化物に対する、Ｅ．ｃｏｌｉの感受性を示すグラフである。
【図６】図６．補充されたＫＩおよびＬＰの存在下において、酵素的なグルコースおよびグルコースオキシダーゼを放出する過酸化物に対する、Ｅ．ｃｏｌｉの感受性を示すグラフである。
【図７】経時的な過酸化水素レベルの提唱された模式的なモデルである。
【図８】光学密度に対するチオシアン酸塩レベルの標準曲線である。
【００８１】
図１によって、Ｈ２Ｏ２溶液の１：８希釈および１：１６希釈が、Ｅ．ｃｏｌｉに対して阻害性であるが、１：３２希釈は阻害性ではなかったことが示される。ＫＩおよびＬＰの補充の存在下でのこのアッセイの繰り返しは、直接Ｈ２Ｏ２を用いて観察された効果を強調せず、１：３２希釈はやはり細菌に阻害性ではなかったが（図２）、Ｈ２Ｏ２のレベルは、この場合、インキュベーションの間に有意に低下した。このために、補充されたＬＰは、利用可能な過酸化物を用いて、基質として補充されたＫＩを用い、反応性酸素種の生成を触媒する。
【００８２】
摂取されたブロスへの過炭酸ナトリウム溶液の添加によって生じる阻害のパターン（図３）は、直接のＨ２Ｏ２添加後に観察されたパターンと同一であった。過酸化水素の供給源として過炭酸ナトリウムを用いる場合、ＫＩおよびＬＰの補充後、阻害に関して相違はなかったが（図３および図４）、過酸化物を、インキュベーションの間、毒性の少ない反応性酸素種、次亜ヨウ素酸を生じるのに用いたことが明らかである。
【００８３】
添加された１：２および１：４希釈のグルコース／グルコースオキシダーゼ溶液のみが、阻害性であるのに十分なＨ２Ｏ２を生成したが（図５）、１：８（部分的）、１：１６または１：３２の希釈では生成しなかったことが明らかになった。しかし、ＫＩおよびＬＰの存在下におけるグルコース／グルコースオキシダーゼアッセイの１回の反復の際（図６）、Ｅ．ｃｏｌｉの阻害は、添加されたＫＩおよびＬＰの非存在下で達成できるよりもかなり大きい希釈（最大で１：３２希釈までを含む）で生じた（図５）ことが明らかであった。
【００８４】
この結果、細菌に対して阻害性であるレベルよりもかなり低いレベルで、過酸化水素の酵素的生成が、阻害性濃度の抗菌性反応性酸素種の生成を十分に駆動するということが明らかに示される。これによって、潜在的に毒性のＨ２Ｏ２の蓄積なしに、治療用量の抗菌性の反応性酸素種を送達する方法が得られる。
【００８５】
実施例４
乳（１０ｍｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉに接種して、ラクトペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ヨウ化カリウムおよびβ−ガラクトシダーゼを、本発明の抗菌性組成物を生成するための機構として補充した。３．７５ｍｇ／Ｌのグルコースオキシダーゼ（約２００単位／ｍｇ）、１２ｍｇ／Ｌのラクトペルオキシダーゼ（≧８０単位／ｍｇ）、１２０ｍｇ／Ｌのヨウ化カリウム／チオシアン酸塩、および４００ｍｌの／Ｌβ−ガラクトシダーゼ（≧２，６００単位／ｍｌ）≧の濃度が、抗菌活性を観察するのに十分であった。最適化濃度では、これらの混合物は、最大１０８細胞／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉまで致死性と証明された（新鮮な寒天プレートへの溶液の継代培養で得られた細胞が、回復可能ではなかった）。
【００８６】
同時並行の陰性対照（各々の成分を除外している）によって、乳汁中で継続する２４時間にわたる細菌数の増大が生じた。この方式で生成される組成物は、最初の２時間で効率的に作用して、細菌を根絶する。調製物は、乳房内注入法によるウシ乳腺炎の治療における使用のために設計した。野外試験（６頭の雌ウシ、６クオーター）を行い、ここでは雌ウシを、酵素系によって生成される提唱された殺菌性組成物によって、搾乳後、４回治療した（この場合、β−ガラクトシダーゼ乳活性化を、本発明の目的として用いる）。この調製物は、１用量あたりラクトペルオキシダーゼ（４ｍｇ≧８０単位／ｍｇ）、グルコースオキシダーゼ（２ｍｇ、約２００単位／ｍｇ）、β−ガラクトシダーゼ（０．４ｍｌ、≧２，６００単位／ｍｌ）、およびヨウ化カリウム（１５０ｍｇ）を含んていた。治療の結果、治療後５〜３０日の間に記録された、動物の体細胞数の有意な減少が確認された。トライアルの結果の、農場Ｃおよび農場Ｄを下記の表に示す（表２）。
【００８７】
【表２】
2014510777.tif 000004
【００８８】
酵素的成分に対する乳の低温殺菌処理の影響を決定する試みを行い、これを用いて、本発明の組成物の反応性酸素種を生成してもよい。作用濃度の酵素を５０μｌの容積中で７２℃に加熱し、１５、３０、６０、３００または６００秒間保持した。
【００８９】
次いで、適切な濃度のこれらのアリコートを、この系の必須の成分および約１０８細胞／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉを含有する乳に移した。総生存可能カウントを、３７℃でのインキュベーションの２４時間後に行った。これによって、この酵素が加熱後でも活性であるか否かの決定を可能にした。グルコースオキシダーゼは、ラクトペルオキシダーゼと同様に、３００秒の加熱後活性を示した。しかし、β−ガラクトシダーゼの活性は、加熱過程によって損なわれ、典型的な低温殺菌サイクル（７２℃で１５秒間）では、酵素は完全に不活性化された。これによって、乳の加工後に用いられる細菌の開始培地（ヨーグルトおよびチーズ）は、記載の調製物の使用によって阻害されず、本発明の反応性酸素種を生成することが示唆される。
【００９０】
１０ｍｌの乳で、クロロペルオキシダーゼ酵素が、ラクトペルオキシダーゼの代わりに抗菌性反応性酸素種を生成するために用いられ得るという仮説を試験するためのモデルを用いた。乳を再度、Ｅ．ｃｏｌｉ（約１０７細胞／ｍｌ）でスパイクした。適切な濃度の、β−ガラクトシダーゼ（２〜３μｌ、＞２，６００単位／ｍｌ）およびグルコースオキシダーゼ（１５μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ溶液、約２００単位／ｍｇ）の両方をこの乳に補充した。次いで、クロロペルオキシダーゼ（０．５μｌ、＞１１，１００単位／ｍｌ）の調製物を添加し、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の完全な根絶が３７℃で２４時間内に得られた。対照の実験によって、各々の、または２つの酵素なしで、同じインキュベーション条件内で細菌数の増殖を生じた（１０８−９細胞／ｍｌ）。
【００９１】
実施例５
野外試験を、補充されたグルコースベースの酵素系を用いて行って、反応性酸素種を生成し、このようなアプローチが抗菌剤を生じる有効性を評価した。多数の雌ウシ（８）を、供給された系によって２日間、１日に２回治療した。これらの雌ウシは、それらの体細胞数で顕著な減少があった（５日後に５０％の領域で、表３を参照、Ａ農場およびＢ農場、続いて、Ｂ農場ではさらに５日後同様の減少があり、これはその後のデータが利用可能であった）、細菌の負荷を測定するというプロキシ法。これによって、β−ガラクトシダーゼを使用することなく、抗菌性種を生成するのにおけるラクトペルオキシダーゼ系の有効性であって、殺菌性の種の生成のために実現可能な供給源であることを保証する有効性が示された。
【００９２】
【表３】
2014510777.tif 000005
【００９３】
実施例６
提唱された組成物がバイオフィルムベースの細菌性細胞を根絶する能力を決定するためのトライアルを行った。これは、２つの培養技術を用いて行った。Ｅ．ｃｏｌｉの連続培養を、ケモスタットを用いて樹立した。この系は、オペレーターが生物体の増殖速度を制御することを可能にするように設計される。ほとんどの感染は、細胞の増殖を遅らせる結果として生じる（栄養利用性の制限に起因する）。この表現型は、抗菌剤に対する細胞の耐性に対して影響を有し、宿主環境のなかでより現実的である。これに加えて、これらの培養物を用いて、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｄｅｖｉｃｅでバイオフィルムを増殖し、ここでは、細胞を、ポリウレタン切り取り試片の表面上に結合させて増殖させた。これらの細胞は、乳腺炎、ＣＦ／ＴＢ肺、創傷、火傷における、および医療デバイスにおける典型的な感染において注目されるバイオフィルム細胞の表現型を共有しており、かつ同様の形式で応答して、抗菌性試験の実現可能なモデルを提供する。
【００９４】
抗菌性種を、ラクトペルオキシダーゼ（２ｍｇ／Ｌ、＞８０単位／ｍｇ）、ヨウ化カリウム、（３００ｍｇ／Ｌ）、グルコース（１２．５ｇ／Ｌ）およびグルコースオキシダーゼ（０．５７ｍｇ／Ｌ、＞２００単位／ｍｇ）を含有するラクトペルオキシダーゼベースの系を用いて、試験の切り取り試片で、この切り取り試片をこの溶液に３７℃で２４〜４８時間浸漬することによって生成した。対照の切り取り試片はまた、生理食塩水溶液またはこの成分の１つを欠いているこの系の混合物で治療した。
【００９５】
次いで、細胞を超音波によって切り取り試片の表面から回収して、それらの生存度を決定した。生理食塩水のみで処理した細胞は生存しており（１０５細胞／切り取り試片）、抗菌性種を生成するのに必要な成分の１つを欠いている系で試験したものも同様であった。生きている細胞は、細胞が、ＬＰ系を完全に機能化させることによって生成される抗菌性種に曝された、切り取り試片から回収はされなかった。この結果は、種々の抗生物質を用いる同様の以前に報告された治療投与計画と比べて遜色がなく（「Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｅｐｅｒｅｚｏｌｉｄ，ｖａｎｏｃｍｙｃｉｎ，ａｎｄ  ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ  ｉｎ  ａｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｌｏｃｋ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｓｔａｐｈｙｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｖｅｎｏｕｓ  ｃａｔｈｅｔｅｒ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ」，Ｃｕｒｔｉｎら、２００３，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，第４７巻、第１０号、ｐ３１４５−３１４８）、ここでは、細胞は、１０ｇ／Ｌのゲンタマイシンの治療の１０日後、および１０ｇ／Ｌのバンコマイシンの治療での７日後、やはり回収可能であったが、リネゾリドおよびエペレゾリド（ｅｐｅｒｅｚｏｌｉｄ）については、より優れた結果が記録された。このような濃度は、浮遊性で増殖した同じ株に対して致死性である濃度よりもかなり大きい（最大１，０００倍まで）。それに対して、本実験で生成された抗菌性種の濃度は、浮遊性の細胞を殺傷するために用いられる濃度と同じ程度の大きさであった。
【００９６】
実施例７
ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０組成物に対する多数のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ株の感受性の強さを、実施例１に記載の方法を用いて試験した。これらの株は、嚢胞性線維症に関連する肺感染を治療するために典型的に用いられる種々の重要な抗生物質に対して耐性の増大を示すので、目的の株であり、肺感染を示している嚢胞性線維症患者の喀痰から回収された。相対的な感受性の大きさを表４に記載する。表４から証明されるとおり、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの抗生物質耐性株は、ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０に対してもはや耐性ではなく、これによって、この系は、肺に送達された時に、このような感染を治療するのに有効であることを示している。「Ｓ」は、感受性（ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）を示し、「Ｒ」は、抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）または耐性の増大を示す。
【００９７】
【表４】
2014510777.tif 000006
【００９８】
実施例８
抗生物質による呼吸器系の感染の治療は、典型的に、経口または静脈内の薬物を用いて送達される。噴霧型の抗生物質を用いてまた、血液から肺胞を通過する感染部位への薬物の移動が劣ることに対抗してもよい。提唱された抗菌性組成物の種々の実施形態を、ＡｅｒｏＮｅｂネブライザー（Ａｅｒｏｇｅｎ  Ｌｔｄ．から無料提供）を用いて噴霧した。過酸化水素／グルコース／グルコースオキシダーゼ／ラクトペルオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｐｅｒｐｏｘｉｄａｓｅ）／ヨウ化物／またはチオシアン酸塩の溶液を、ネブライザーを一回通過させるか、または一緒に混合して、ネブライザーを通過させ、そのエラロゾルを、無菌の２５ｍｌ容器中に収集した。噴霧型の抗菌力を、マルチウェルのプレートベースのアッセイで二倍希釈を用いて、非噴霧型（実施例１に記載）と比較した。提唱された組成物は、噴霧されなかった溶液と比較した場合、なんら活性の低下を示さなかった。さらに、抗菌性種を生成するために用いられ得る酵素系は噴霧による影響を受けなかったことが実証された。
【００９９】
具体的には、この溶液は、同じ成分のストック溶液と比較した場合、なんら酵素活性の低下を示さず、存在する化合物のレベルの低下も示さなかった。このモデルによって、提唱された抗菌性の系が、呼吸器感染を治療するための、肺への首尾よいエアロゾル送達のための良好な標的または候補であることが示唆される。
【０１００】
実施例９
ラクトフェリンは、特にバイオフィルムに対する抗菌性特性を働かせるために特徴付けられた哺乳動物タンパク質である。従って、ラクトフェリンは、感染モデルにおいてバイオフィルム産生を標的および破壊し得る良好な能力の化合物であって、本発明の抗菌性組成物などの系と相乗的に作用し得る化合物である。ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０およびＴｈｉｏ−Ｄｏｓｅ−１５０の関連の抗菌性能力を、種々の濃度のラクトフェリンの有無の両方において、実施例１に記載のように試験した。チオシアン酸モデルに対する補充されたラクトフェリンの存在は、既に存在する抗菌性の特性を増強しなかった（チオシアン酸に対するラクトフェリンの比は、１：１、１：２、１：４であった）。これによって、ラクトフェリンの存在は有意な濃度で、抗菌性種を生じるラクトフェリン−チオシアン酸塩モデルの作用を阻害しないことが示唆される。浮遊性の細胞が用いられ、強化された抗菌性効果が、実際の感染の治療に関して確認される可能性が生じた。
【０１０１】
しかし、ヨウ化物に対するラクトフェリンについての同じ比によって、抗菌性種の生成についてラクトペルオキシダーゼ−ヨウ化物モデルの抗菌性活性において顕著な２倍の増大がもたらされ、これによって、この比は、提唱された治療投与計画における適切な手引きであることが示唆された。ラクトフェリンの非存在下では、この系の２５６倍の希釈は、やはりＥ．ｃｏｌｉに対して阻害性であった。ラクトフェリンの（３つの記載された比での）添加によれば、５１２という希釈係数がまた、細菌培養に対して阻害性であった。感染部位は、バイオフィルムから構成される場合が多く、これによってラクトフェリンの活性の増大が注目されるようになる。
【０１０２】
実施例１０
ウシ乳腺炎の治療のために設計された抗生物質療法は、乳房の炎症を誘導する場合が多く、動物の体細胞数の増大をもたらす。これは、販売される乳の価格が体細胞数の低さに依存するという点で不利である。多数の薬物が典型的には、抗菌性療法の乳房内注入に起因して増大する炎症に反撃するために追加され得る。プレドニゾン（またはその活性型、プレドニゾロン）は、望ましくない免疫応答を最小化するために用いられるグルココルチコイドステロイドである。１０〜２０ｍｇの投薬量が、体細胞数の増大を停止するための抗生物質ベースの乳房内注入と組み合わせて投与される場合が多い。プレドニゾンまたはプレドニゾロンのいずれかの有無において、提唱されたラクトペルオキシダーゼ系（ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０）の用量を用いるインビトロの実験系は、組成物の抗菌性能力の減少をなんら生じなかった。これによって、いずれかの薬物の典型的な用量の使用は、本発明の組成物が乳房（または他の環境）で細菌を根絶する能力を妨害せず、体細胞数の増大を最小化することを補助することが示される。
【０１０３】
実施例１１
酵素系が、連続的に抗菌性種を生成する能力を、抗菌性組成物含有溶液への細菌培養物の反復接種によって決定した。ＬＢ増殖培地の１０ｍｌ容積に、グルコースオキシダーゼ（１５μｌの２．５ｍｇ／ｍｌ、２００単位／ｍｇ）、β−ガラクトシダーゼ（３０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、４８，０００単位／ｍｇ）、ラクトペルオキシダーゼ（２０μｌ、４ｍｇ／ｍｌ、８０単位／ｍｇ）ヨウ化カリウム（３０μｌ、４０ｍｇ／ｍｌ）を補充して、最終濃度は２％ラクトースとした。約１０８ｃｆｕのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２を添加して、その混合物を１晩、３７℃でインキュベートした。２４時間後、新鮮な栄養寒天プレートに回収可能な細胞はなかった。次いで、約１０８ｃｆｕのＥ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ  ２５９２２細胞のさらなる接種をこの容積に加えて、その混合物を再度、一晩インキュベートさせた。同様に、細菌を含むブロスの引き続く接種（１日間隔で１０回接種）は、細菌細胞の増殖も回復も生じなかった。この結果、抗菌性反応性種の濃度は、有意な期間にわたって殺菌性レベルを有意に上回って保持されることが示される。
【０１０４】
実施例１２
種々の系によって生成される組成物の力価に対する基質選択の効果は、様々な阻害増殖アッセイを用いて決定され、まず、ここでは、Ｈ２Ｏ２の濃度（グルコースおよびグルコースオキシダーゼの酵素的反応によって生成される）は、一定であって、選択された基質の濃度が変更された。第二に、基質の濃度が一定に維持され、Ｈ２Ｏ２レベルが変化されたアッセイを使用した。
【０１０５】
（ｉ）一定のＨ２Ｏ２
Ｅ．ｃｏｌｉ（５０μｌの一晩培養物）を、５μｌのグルコースオキシダーゼ（２．５ｍｇ／ｍｌ）および１０μｌのＬＰ（４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロスに添加した。これを、９６ウェルプレートの列にアリコートした（１５０μｌ）。等容積（１５０μｌ）のヨウ化カリウムまたはチオシアン酸カリウム（両方とも４０ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを、最初のウェルに添加した。このサンプルを、ウェル１１に関しては二倍希釈し、ウェル１２は対照として残した。このプレートを３７℃で一晩インキュベートして、光学密度を、全体を通して測定した。
【０１０６】
結果：希釈１〜９のチオシアン酸塩濃度は、細菌の完全な阻害のために十分なレベルであった。希釈１〜８のヨウ化物濃度は、細菌の完全な阻害に十分なレベルであった。この結果、いずれの基質によって生成される反応性種の力価にも有意な相違はなく、注目されたどんな相違でもその濃度のモル濃度の相違の結果であり得ることが最初に示される。
【０１０７】
（ＩＩ）一定の基質
Ｅ．ｃｏｌｉ（２００μｌの一晩培養物）を、２０ｍｌのＭｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎブロス（既に、４０μｌのＬＰ（４ｍｇ／ｍｌ）および６０μｌのヨウ化カリウムまたはチオシアン酸カリウム（４０ｍｇ／ｍｌ）のいずれかを含有している）に添加した。これを、９６ウェルプレートにアリコートした（１５０μｌ）。Ｈ２Ｏ２生成系のサンプル（２ｍｌの２０％グルコースであって、１０μｌグルコースオキシダーゼ、２．５ｍｇ／ｍｌを含有）を、最初のウェルに添加し、二倍希釈して、ウェル１２は対照として残した。
【０１０８】
結果：一定のチオシアン酸塩濃度を有するブロスを用いて、サンプル（Ｈ２Ｏ２）の２つの最高希釈で阻害があった。しかし、ヨウ化物を用いれば、サンプルの６倍希釈を含めて、細菌増殖の最大までの阻害があった。
【０１０９】
この結果、基質レベルを一定レベルで維持した場合、より低いレベルの過酸化水素を放出する酵素系を用いて生成される抗菌性種の力価に有意な相違があることが示される。これによって、より低レベルのＨ２Ｏ２生成が典型的である場合、ヨウ化物を用いれば別個の利点があることが意味される。モル濃度の相違は、チオシアン酸塩に代わってヨウ化物を用いる場合、結果の明らかな相違を説明できない。
【０１１０】
増殖培地として乳を用いる（ｉ）および（ｉｉ）の繰り返しによって、極めて似通った結果およびパターンが示された。Ｈ２Ｏ２の別の供給源を用いること（この場合直接の添加）では、ヨウ化物とチオシアン酸との間に固有の結果の相違は示されなかった。
【０１１１】
実施例１３
ブロス中の細菌細胞を阻害／殺傷するのにおける使用のための本発明の抗菌種の適切な濃度をオペレーターが決定することを可能にするプロトコールを作成した。このプロトコールは、実施例１に記載の９６ウェルプレートで用いられるのと同様に、成分の２倍希釈に基づく。細菌培養物（１０７ｃｆｕ／ｍｌ）を樹立して、試験管にアリコートする（１５ｍｌの試験管に５ｍｌを添加し、必要な酸素について十分な隙間を確保し、ここで第一の試験管は２倍の容積１０ｍｌを含む。このブロスは、酵素を用いてＨ２Ｏ２を生成する場合、十分な適切な糖、例えば、グルコースを、グルコースオキシダーゼを用いる場合、含まなければならず、これは、典型的には、１〜２％が十分である）。
【０１１２】
過酸化水素生成成分のアリコート（好ましくは、その溶液の総容積、５００μｌの５％以下）を、最初の容積に添加し、二倍希釈した。２４時間後、過酸化水素に対する細菌株の生来の耐性のレベルを、試験管内の増殖／増殖無しのパターンによって決定してもよい。過酸化水素生成成分は、単糖類または二糖類、およびそれらの適切な切断酵素（特にラクトースおよびβ−ガラクトシダーゼおよびグルコースオキシダーゼ、またはグルコースおよびグルコースオキシダーゼ）から構成されてもよく、またはさらに単純には、過酸化水素が直接添加されてもよいし、または過酸化水素放出過炭酸塩もしくはクエン酸などとして添加されてもよい。
【０１１３】
試験株の生来の過酸化水素感受性を決定するための試験と共に、同じ試験を、反応性酸素種生成溶液（例えば、実施例１に記載されるような、Ｔｈｉｏ−Ｄｏｓｅ−１５０またはＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０）を用いて用いてもよく、ここでは、過酸化水素生成成分が存在し、同様に、ペルオキシダーゼ酵素（クロロペルオキシダーゼまたはラクトペルオキシダーゼ、およびそれらの適切な基質）も存在する。
【０１１４】
ＬＰ系の種々の比および種々の濃度を例えば、使用して、抗菌性および殺菌性の濃度の反応性種を、生成してもよいが、著者らは、可能な比の７５：２の基質対ラクトペルオキシダーゼを推奨する（例えば、１５０ｍｇのＫＩおよび４ｍｇのラクトペルオキシダーゼ（ｌａｃｔｏｅｒｐｏｘｉｄａｓｅ）（少なくとも８０単位／ｍｇ）。同様に、Ｈ２Ｏ２が、グルコースの酵素的な切断によって生成される場合、例えば、著者らは、７５：２：１の基質、ラクトペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼ（２００単位／ｍｇグルコースオキシダーゼ）を推奨する。このサンプルは、適切な温度でインキュベートされ、一晩振盪されなければならない。対照の培養物（例えば、ＬＰ成分もＨ２Ｏ２もなし）は、細菌増殖を生じるはずである。十分に高い濃度のＨ２Ｏ２（最初の２〜３の試験管）では、増殖は、観察されないはずであるが、Ｈ２Ｏ２レベルが低下するにつれて（より薄い培養物）、増殖が明らかになる。これによって、オペレーターは、Ｈ２Ｏ２の作用に対するこの株の生来の耐性を決定できるようになる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ株はＨ２Ｏ２の作用に対して極めて感受性である場合が多い。なぜなら、それらは、Ｈ２Ｏ２分子を切断するために必要なカタラーゼを欠くが、他の種は、約２ｍＭのレベルでＨ２Ｏ２耐性である（例えば、いくつかの酵母）。最初の試験管に対する基質およびラクトペルオキシダーゼの添加は、以前に阻害されなかったＨ２Ｏ２のレベルで増殖しないはずである。なぜならより強力な反応性種が生成されるからである。同様に、増殖が生じるような希釈のレベルがある。「Ｈ２Ｏ２のみ」および「Ｈ２Ｏ２および基質およびＬＰ」との間の結果の相違によって、オペレーターは、試験株を殺傷するのに、または必要に応じて２４時間もしくは４８時間にわたってその増殖を阻害するのに必要なＬＰ系の成分の濃度についての情報を得る。著者らは、Ｈ２Ｏ２がそれ自体阻害性ではない濃度の選択を推奨する。実施例３に記載のデータによって、糖の酵素的切断の使用が記述され、これによって、溶液中で生成されるＨ２Ｏ２レベルが阻害を生じるのに不十分であるが、ＬＰ反応による抗菌性反応性酸素種の生成を駆動するのに十分である「ウインドウ」を可能にする（この株がカタラーゼを生じず、従って、Ｈ２Ｏ２の作用に対して極めて感受性である場合、著者らは、典型的なカタラーゼ産生株を殺傷するのに十分なレベルを用いることを推奨する）。２４／４８／７２時間の時点で適切な寒天プレートへの継代培養によって、オペレーターは、この成分のどの濃度が、静菌性のレベルと対照的に、殺菌性の濃度で生成されるかを決定することが可能になる。本組成物は、出発した細胞数の０．００１％しかブロスから回収できない場合に、殺菌性と決定される。
【０１１５】
この試験によって、オペレーターは、用量の殺菌濃度、およびまた、阻害性レベルの過酸化水素を生成することなく、酵素系を用いて成分を生成するのに必要な過酸化水素の濃度も、決定することが可能になる。このような情報は、哺乳動物肺などの、デリケートな環境に酵素系を導入することを考慮した場合、有用であろう。
【０１１６】
既存の統計学的モデルによってオペレーターは、次に、適切に「大規模化（スケールアップ）」して、感染または大容積の液体など、例えば、乳房または肺を治療するために必要な必須のレベルを決定することが可能になる。
【０１１７】
実施例１４
抗菌剤の阻害性の殺生物性濃度を生じるのに必要な酵素系における各々の成分の下限を決定した（例えば、表１および表５）。各々の成分に関してこれらの下限を確立するため、各々についての最小阻害濃度を、実施例１に記載の方式と同様の方式で、９６ウェルプレートでの二倍希釈を用いて算出するが、ここでは、選り抜きの成分の濃度は、増殖に対する影響が示されなくなるまで低下される。１２０ｍｇ／ＬのＫＩ、３２０単位ＬＰを充填された１０ｍｌのＬＢブロス増殖培地（２％グルコース含有）では、１ｍｌあたり少なくとも０．５単位のグルコースオキシダーゼが、過酸化水素を生成するために必要である。これより下の濃度では、殺菌性濃度での反応性酸素種のさらなる生成を提供するために生成されている過酸化水素が不十分であった。同様に、グルコースレベルの低下によって、代償するためにグルコースオキシダーゼレベルの増大が必要となる；１％グルコースは、１単位／ｍｌを必要としたが、０．５％グルコースは、２単位／ｍｌの活性グルコースオキシダーゼを必要とした。グルコースレベルおよびグルコースオキシダーゼレベルが十分である溶液中では、必要なヨウ化物（またはチオシアン酸塩）基質のレベルは、約０．５ｍＭであった。これより下のレベルでは、有効な殺菌性の活性を生じるために生成される反応性酸素種は不十分であった。必要な濃度で、反応性酸素種を生成する反応に必要なＬＰのレベルは、０．１５単位活性／ｍｌで決定した（１ｍＭ  ＫＩが存在）。これより下のレベルでは、ほとんど抗菌性の活性は生じなかった。乳腺炎の治療的な治療のために適切な本発明のこの実施形態はまた、乳内に存在するラクトースをグルコースに変換するβ−ガラクトシダーゼを含んでいた。この酵素の必要なレベルのインビトロの実験は、乳中で（５％ラクトース）、１ｍＭのＫ、０．７５単位／ｍｌのグルコースオキシダーゼ活性／ｍｌ（これより下のレベルは、酵素経路の「ボトルネック」を生じ、これによって、生成されている反応性酸素種は不十分になる）、および１ｍｌあたりに存在する１単位のラクトペルオキシダーゼ活性で行った。β−ガラクトシダーゼの必要な活性は、約１．５単位活性／ｍｌで１ａｙ。β−ガラクトシダーゼ活性は、これより下のレベルで、細菌の増殖の阻害も、細菌細胞の殺傷も生じず、細菌増殖を生じた。
【０１１８】
実施例１５
本発明の組成物の抗菌性反応性酸素種を、それを感染の部位に添加する前に生成することが可能である。これは、必要な酵素成分の混合によって達成され得、これによって、得られた反応性酸素種（ＲＯＳ；ヒポチオシアン酸、次亜ヨウ素酸、または次亜塩素酸塩（ｈｙｐｏｃｈｌｏｒａｔｅ））が治療部位の外側で生成されることが、確実にされる。これに加えて、カタラーゼ（これは、過酸化水素と反応して、酸素ガスおよび水を生成する）の添加によって反応物が除去できた後、過剰な過酸化水素が残っていた。これによって、潜在的に不利な過酸化水素分子なしで、選り抜きのＲＯＳを送達する極めて安全な方法が証明され得る。
【０１１９】
同様に、感染の部位でカタラーゼを誘導し、また有害な過酸化水素の潜在的な構築を「クエンチする」ことを補助することも可能である。
【０１２０】
これを実証するため、ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０およびＴｈｉｏ−Ｄｏｓｅ−１５０組成物の力価を、実施例１に記載のプロトコールを用いて、カタラーゼを含有する（２０μｌの４ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｌのブロスに対して＞１，０００単位／ｍｇ）ブロス増殖培地中で試験した。この用量の力価は、逆転されなかった。この用量の１：１０２４希釈は、カタラーゼの非存在下では阻害性であって、この用量の１：５１２希釈は、カタラーゼの存在下で阻害性であった。
【０１２１】
比較として、試験を、過酸化水素（０．８５Ｍ）のみを用いて、カタラーゼの有無の両方で行った。カタラーゼレベルは、過酸化水素の阻害性の性質を完全に逆転するのに十分であって、このことは、実験に用いたカタラーゼのレベルが、活性を「クエンチ」するのに十分であって、従って、ヨウ化物またはチオシアン酸塩基質が使い古される場合に生成される過剰の過酸化水素を「ふき取る（ｍｏｐ  ｕｐ）」が、基質が依然として存在している場合は、反応自体は阻害しないために適切な成分であることを示している。
【０１２２】
これは、哺乳動物組織を保護するように機能し得る。
【０１２３】
実施例１６
事前活性化された系のさらなる例は、以下のとおり使用した：０．８５ＭのＨ２Ｏ２に加えて、なにもなしか、または２．５ＭのＮａＣｌ／５μｌクロロペルオキシダーゼ（約１０，０００単位／ｍｌ）を含有する溶液（４ｍｌの容積）をインキュベートさせた。次いで、その溶液を分けて、カタラーゼ処理する（５０μｌの４ｍｇ／ｍｌ、＞１，０００単位／ｍｇ）かまたは、カタラーゼ処理しなかった。次いで、溶液の相対的な抗菌性特性を、Ｅ．ｃｏｌｉ補充ブロスを用いて実施例１に記載などのプロトコールを用いて試験した。細菌の阻害は、過酸化水素のみ、過酸化水素＋クロロペルオキシダーゼ／ＮａＣｌ、およびカタラーゼ処理された過酸化水素＋クロロペルオキシダーゼ／ＮａＣｌサンプルについて＞１：６４０希釈で注目された。しかし、カタラーゼ処理された過酸化水素サンプルについては、阻害は気づかれなかった。この結果、反応性酸素種の力価を低下することなく、カタラーゼ治療によって過剰の過酸化水素を除去することができることが示唆される。この溶液は、より長期間インキュベートすることが可能であり、その後（７２時間）、その結果が繰り返された。これによって、この形態のＲＯＳは、比較的安定であり、かつ使用に先立って調製できることが示唆される。
【０１２４】
実施例１７
実施例１に記載のプロトコールを用いて、ヨウ化物およびラクトペルオキシダーゼを欠いているバージョンである「ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０」、同様に、グルコースオキシダーゼを欠いているバージョンを試験した。３つ全てを、Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅに対して試験した。プロトコールは、実施例１に記載の方法を用いて２％グルコースを各々が補充された、それぞれ、栄養ブロスおよびＬＢブロス中で、Ｃａｎｄｉｄａ株およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ株について行った。結果を表５に示す。表５から、全ての株が、「ＫＩ−Ｄｏｓｅ−１５０」の作用によって阻害されること、および反応性酸素種がこのように抗菌性であって、かつ抗菌性なだけではないことが明らかである。本組成物のこれらの希釈で生成される過酸化水素のレベルは、試験された株に対してそれ自体非阻害性であった。
【０１２５】
【表５】
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【０１２６】
実施例１８
実施例３に示される結果によって、Ｈ２Ｏ２の３つの重大なレベルがあることが示される。これらのレベルは、図７に図示されるような、模式的なモデルを用いて記述され得る。第一に、より高いＨ２Ｏ２の閾値レベルであって、それ以上では、細菌増殖の阻害が増殖培地中のＨ２Ｏ２の濃度の直接の結果として生じる、Ｈ２Ｏ２のレベルがある。これは、抗菌性組成物の作用の好ましい機構ではない。なぜなら、Ｈ２Ｏ２は宿主細胞に対して毒性であり、例えば、哺乳動物の組織損傷に関連していたからである。
【０１２７】
Ｈ２Ｏ２の第二の閾値レベルは、抗菌性反応性酸素種の有効な生成に必要なものである。本明細書に示される実験（実施例３）は、Ｈ２Ｏ２生成の酵素を使用する方法の使用によって得られる別個の利点を記載しており、ここではＨ２Ｏ２のレベルは、長期間にわたってこの必要な「ウインドウ」（図７）内で維持され得る（すなわち、これらは、反応性酸素種の必要な濃度の生成を可能にするのに有効であるが、それ自体では毒性ではないＨ２Ｏ２の濃度である）。
【０１２８】
最後に、Ｈ２Ｏ２の第三の閾値レベルとは、酵素系を用いて反応性酸素種の生成について阻害または提供するのにＨ２Ｏ２が不十分であるレベルである。
【０１２９】
過酸化物のより直接的な供給源（例えば、過炭酸ナトリウムまたは過酸化水素自体）を用いることで、所望の反応性酸素種の生成に有効ではないレベルまでＨ２Ｏ２の高い初期濃度が急速に低下される（図７）。
【０１３０】
実施例１９
基質の抗菌性反応性酸素種（ＲＯＳ）への変換は、変換の間、および例えば、２４時間後に関連の基質濃度の直接測定によって評価した。種々の抗菌性反応性酸素種は比較的短い寿命であるが、用いられる基質次第で可変性の半減期を有し、そのため直接の滴定は有用ではなかった。例えば、チオシアン酸塩濃縮物は、１×（１．３６ｍＭ）および５×（６．８ｍＭ）レベルで、グルコース、ラクトペルオキシダーゼ、およびグルコースオキシダーゼを含有する溶液中でのインキュベーションの前後に比較した。これらを、以下のように比色定量アッセイを用いて、チオシアン酸レベルの標準的な濃度曲線と比較した（０、０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１、２、および５×の濃度）：五グラムの塩化第二鉄を、５０ｍｌの水中に懸濁した。溶解されていない塩化第二鉄を、遠心分離によって取り除き、約３０ｍｌの塩化第二鉄溶液を残した。キュベットに、１５０μｌの鉄の溶液を添加し、続いて７００μｌの水を添加した。１０×のチオシアン酸を、各々のキュベットに添加した（２００μｌ、１６０μｌ、１００μｌ、４０μｌ、２０μｌ、１０μｌ、５μｌ、２５μｌ（１：１０）、１２．５μｌ（１：１０）、０μｌ）。キュベット中の最終容積は、水の添加によって１，０５０μｌにされた。このサンプルについて、５０μｌの以前にインキュベートされた１×または５×の希釈物を添加し、これに１５０μｌの水を加えた。光学密度は、４６０ｎｍで記録し、その濃度を次に、標準曲線を用いて算出した。得られた標準曲線は、＞０．９９というｒ２値を有し（図８を参照のこと）、これによって、これが、未知の濃度のチオシアン酸を決定するという正確な方法であったことが示される。
【０１３１】
１×用量（この酵素系で一晩インキュベートさせておいた）は、２４時間後に０．１７×用量と解釈される。同様に、５×用量（この酵素系で一晩インキュベートさせておいた）は、２４時間後に１．１用量と解釈される。これらの結果の両方によって、これらの条件下で、チオシアン酸レベルの８０〜８５％低下があったということが示される。ＲＯＳ生成に対するチオシアン酸塩損失の比を１：１と仮定すると（この場合、ＯＳＣＮ−）、これによって、それぞれ、１×および５×用量に関して２４時間の間、１ｍＭおよび５ｍＭの領域で生成されるＲＯＳレベルを決定することが可能になる。この値は、ここで試験された少なくとも範囲内に、変換の効率を維持しながら、より高い基質濃度を用いて適合され得る。
【０１３２】
殺菌性の活性および殺真菌性の活性を提供するとして本明細書に開示されるＲＯＳの特定のレベルは、他のいずれかでＬＰ系を用いて生成されるレベルよりも大きい。この濃度は、本願に記載される殺微生物性の効果に依存する；標的株に対する、ならびに種々の培地および設定における、ＲＯＳの最小阻害性濃度を決定する能力によって、本発明の組成物を、単に一般的な非特異的な静菌性効果を有する適用ではなく、標的化の殺菌性および殺微生物性の治療および抗菌性の組成物として使用することが可能になる。
【０１３３】
実施例２０
インビボで反応性酸素種の潜在的な治療用量を達成する能力を、ここでも乳モデルを用いて検討した。乳房内注入方法を用いて、実施例４の記載された原型［１５０ｍｇのＫＩ、４ｍｇのラクトペルオキシダーゼ（３２０単位）、２ｍｇのグルコースオキシダーゼ（４００単位）、およびβ−ガラクトシダーゼ、（１，３５０単位）］を雌ウシの乳房に導入した。これを、動物の搾乳後に行った。次の搾乳の際に、乳のサンプルを得た。乳のアリコート（１０ｍｌ）を、約１０７ｃｆｕ／ｍｌの細菌株（Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、またはＳ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）でスパイクして、振盪しながら３７℃で一晩インキュベートさせた。全体の生菌数カウントを、寒天プレートを用いて行った。乳は、この株に対して完全に阻害性だった。これによって、これらの乳腺炎原因生物体を殺傷するのに十分な濃度で、乳中の反応性酸素種の存在が示される。これは治療剤としての技術を示すのに重要であり、これに加えて、反応性酸素種が比較的寿命が短いせいで、濃度は乳房自体でより高くなる可能性が高く、さらに治療の有効性が増大する。
【０１３４】
投与に適切な組成物
１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼ、および０．１〜１０，０００ｍｇのチオシアン酸／ヨウ化物、および０．０１〜１００，０００単位の活性のβ−ガラクトシダーゼを含有する溶液は、動物の乳房への乳房内注入として投与されるのに適切である。
【０１３５】
１〜１００，０００単位の活性のガラクトースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼ、および０．１〜１０，０００ｍｇのチオシアン酸／ヨウ化物、および０．０１〜１００，０００単位の活性のβ−ガラクトシダーゼを含有する溶液は、動物の乳房への乳房内注入として投与されるのに適切である。
【０１３６】
１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼ、および０．１〜１０，０００ｍｇのチオシアン酸／ヨウ化物、および０．０１〜１００，０００ｍｇのグルコースを含有している溶液は、動物の乳房への乳房内注入として投与されるのに適切である。
【０１３７】
１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼ、および０．１〜１０，０００ｍｇのチオシアン酸／ヨウ化物、および０．０１〜１００，０００ｍｇグルコースを含有する溶液は、細菌感染の治療のために肺へ噴霧スプレーとして投与するのに適切である。
【０１３８】
ラクトフェリン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、プレドニゾン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、またはプレドニゾロン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、カタラーゼ（１〜１，０００，０００単位）またはこれらの２つ以上の組み合わせを補充されている上記と同じ溶液。
【０１３９】
１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のクロロペルオキシダーゼ、および０．１〜１０，０００ｍｇの塩化物イオン、および０．０１〜１００，０００ｍｇのグルコースを含有する溶液であって、細菌感染の治療のために肺へ噴霧スプレーとして投与されるされる溶液。
【０１４０】
補充されたラクトフェリン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、プレドニゾン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、またはプレドニゾロン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、またはこれらのうちの２つ以上の組み合わせを含有する上記と同じ溶液。１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼ、および０．１〜１０，０００ｍｇのチオシアン酸／ヨウ化物、および０．０１〜１００ｍｌの過酸化水素を含有する溶液は、細菌感染の治療のために肺へ噴霧スプレーとして投与するのに適切である。
【０１４１】
１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼに含浸された湿布、および患者の火傷または開放傷を治療するのにおけるその使用の前にその湿布に適用される付随するゲル（０．１〜１０，０００ｍｇのチオシアン酸／ヨウ化物、および０．０１〜１００，０００ｍｇのグルコースを含有）。
【０１４２】
１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のクロロペルオキシダーゼに含浸された湿布、および患者の火傷または開放傷を治療するのにおけるその使用の前にその湿布に適用される付随するゲル（０．１〜１０，０００ｍｇ塩化物イオン、および０．０１〜１００，０００ｍｇグルコースを含有）。
【０１４３】
補充されたラクトフェリン（０．０１〜１００，０００ｍｇ），プレドニゾン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、またはプレドニゾロン（０．０１〜１００，０００ｍｇ）、カタラーゼ（１〜１，０００，０００単位）またはそれらのうち２つ以上の組み合わせを含有する容器と同じ湿布。種々の医療デバイスを、１〜１００，０００単位の活性のグルコースオキシダーゼ、１〜１００，０００単位の活性のラクトペルオキシダーゼを用いて、患者の身体への挿入の前に、コーティング／含浸してもよい。
【０１４４】
ヨウ化物／チオシアン酸イオン（０．１〜１０，０００ｍｇ）を含有する事前調製された組成物によって、ラクトペルオキシダーゼ（０．０１〜１，０００，０００単位）の存在下で過酸化水素（０．０１〜１００ｍｌ）と完全に反応することが可能になった。本組成物をカタラーゼ処理して（０．０１〜１，０００，０００単位）、その組成物を用いて感染部位を治療する前に、過剰の過酸化水素を除去する。
【０１４５】
塩化物イオン（０．１〜１０，０００ｍｇ）を含有している事前調製された組成物によって、クロロペルオキシダーゼ（０．０１〜１，０００，０００単位）の存在下で過酸化水素（０．０１〜１００ｍｌ）と完全に反応することが可能になった。本組成物をカタラーゼ処理して（０．０１〜１，０００，０００単位）、その組成物を用いて感染部位を治療する前に、過剰の過酸化水素を除去する。
【０１４６】
塩化物イオン（０．１〜１０，０００ｍｇ）を含有している事前調製された組成物によって、クロロペルオキシダーゼ（０．０１〜１，０００，０００単位）の存在下で過炭酸ナトリウム（０．０１〜１００，０００ｍｇ）と完全に反応することが可能になった。本組成物をカタラーゼ処理して（０．０１〜１，０００，０００単位）、その組成物を用いて感染部位を治療する前に、過剰の過酸化水素を除去する。
【０１４７】
チオシアン酸塩／ヨウ化物（０．１〜１０，０００ｍｇ）を含有している事前調製された組成物によって、ラクトペルオキシダーゼ（０．０１〜１，０００，０００単位）の存在下で過炭酸ナトリウム（０．０１〜１００，０００ｍｇ）と完全に反応することが可能になった。本組成物をカタラーゼ処理して（０．０１〜１，０００，０００単位）、その組成物を用いて感染部位を治療する前に、過剰の過酸化水素を除去する。
【０１４８】
塩化物イオン（０．１〜１０，０００ｍｇ）を含有している事前調製された組成物によって、クロロペルオキシダーゼ（０．０１〜１，０００，０００単位）の存在下で、グルコース（０．０１〜１００，０００ｍｇ）およびグルコースオキシダーゼ（０．１〜１，０００，０００単位）と完全に反応することが可能になった。本組成物をカタラーゼ処理して（０．０１〜１，０００，０００単位）、その組成物を用いて感染部位を治療する前に、過剰の過酸化水素を除去する。
【０１４９】
チオシアン酸／ヨウ化物イオン（０．１〜１０，０００ｍｇ）を含有している事前調製された組成物によって、ラクトペルオキシダーゼ（０．０１〜１，０００，０００単位）の存在下で、グルコース（０．０１〜１００，０００ｍｇ）およびグルコースオキシダーゼ（０．１〜１，０００，０００単位）と完全に反応することが可能になった。本組成物をカタラーゼ処理して（０．０１〜１，０００，０００単位）、その組成物を用いて感染部位を治療する前に、過剰の過酸化水素を除去する。
【０１５０】
ラクトフェリン（０．００１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ）、プレドニゾン（０．００１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ）、またはプレドニゾロン（０．００１ｍｇ〜１０，０００ｍｇ）を個々に、または２つ以上の組み合わせで補充された上記の事前調製された溶液。
【０１５１】
「〜を含有する（含む）／〜を含有する（含んでいる）」という言葉、および「〜を有する／〜を備える」という言葉は、本明細書において本発明に関して用いられる場合、陳述された特徴、整数、工程、または構成要素が存在することを特定するために用いられるが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、構成要素、またはそれらの群の存在または追加を排除するものではない。
【０１５２】
明確にするために、別々の実施形態の文脈で説明されている、本発明の特定の特徴は、１つの実施形態中に組み合わされて提供されてもよいことが理解される。逆に、１つの実施形態の文脈で簡略化して説明されている本発明の様々な特徴が、別々に示されて、または任意の適切なサブコンビネーションで示されてもよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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