(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎖状ポリマーが少なくとも表面に結合してなる固相担体であって、
前記鎖状ポリマーが、親水性構造単位の繰り返しから構成される第１のブロックと、反応性官能基を有する構造単位の繰り返しから構成される第２のブロックとを含むブロックポリマーであり、
前記鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基のモル数ａと、前記鎖状ポリマーに含まれる全構造単位のモル数ｂとの含有比率（ａ／ｂ）が、０．０３〜０．２３であり、
前記固相担体の表面に対して前記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１〜２本／ｎｍ2である、固相担体。
【請求項２】
前記第１のブロックが、前記固相担体の表面に直接結合したブロックである、請求項１に記載の固相担体。
【請求項３】
前記親水性構造単位が、水酸基、アルコキシ基、ポリオキシアルキレン基、双性イオン構造を有する基、スルホニル基、スルフィニル基及びリン酸基から選ばれる親水性基を有する構造単位である、請求項１又は２に記載の固相担体。
【請求項４】
前記反応性官能基が、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基及びアジド基から選ばれる反応性官能基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項５】
前記親水性構造単位が、下記式（３）で表される構造単位であり、前記反応性官能基を有する構造単位が、下記式（５）で表される構造単位である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の固相担体。
【化１】
0006453590.tif 000016
〔式（３）中、
Ｒ11は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ12は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ14−＊（Ｒ14は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ13と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ13は、双性イオン構造を有する基、水酸基を有する有機基、又はポリオキシアルキレン基を有する有機基を示す。〕
【化２】
0006453590.tif 000017
〔式（５）中、
Ｒ16は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ17は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊（Ｒ19は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（５）中のＲ18と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ17が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊である場合、Ｒ18は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ17が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊又はフェニレン基である場合、Ｒ18は、反応性官能基を有する有機基を示す。〕
【請求項６】
前記鎖状ポリマーの分子量分布が、１．０〜２．５である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項７】
前記鎖状ポリマーの数平均分子量が、１，０００〜１００，０００である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項８】
粒子である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項９】
磁性粒子である、請求項８に記載の固相担体。
【請求項１０】
前記反応性官能基の含有量が、固相担体の固形分１ｇあたり１〜３００μｍｏｌである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の固相担体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体。
【請求項１２】
前記リガンドが、抗体、抗原、核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、多糖、糖、脂質、ビタミン、薬物、基質、ホルモン又は神経伝達物質である、請求項１１に記載のリガンド結合固相担体。
【請求項１３】
イムノアッセイ用又は核酸検出用である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の固相担体又はリガンド結合固相担体。
【請求項１４】
請求項１１又は１２に記載のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の固相担体を製造する方法であって、
（工程１）重合開始基を少なくとも表面に有する担体を準備する工程と、
（工程２）前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項１６】
前記重合開始基が、原子移動ラジカル重合開始基である、請求項１５に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相担体、リガンド結合固相担体、標的物質の検出又は分離方法、及び前記固相担体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、核酸、細胞等の標的物質を血液等の試料から検出・分離することを目的として固相担体が利用されている。固相担体を用いた検出・分離法としては、固相担体にリガンドを固定し、これに試料を接触させることによって標的物質をリガンドと反応させる方法が一般的であるが、上記接触の際に、試料中の標的物質や不純物が、リガンドではなく固相担体の表面に非特異的に吸着し、これがノイズとなる場合がある。
【０００３】
そのため、上記非特異吸着を抑制することを目的として、磁気バイオセンサーの金膜チップ表面上に原子移動ラジカル重合開始基（ＡＴＲＰ開始基）を一定量導入し、斯かるＡＴＲＰ開始基を起点として特定のカルボキシベタインモノマーを重合させることで、ポリマーブラシを形成させる技術が提案されている（特許文献１）。
しかしながら、上記ポリマーブラシを備えた金膜チップはリガンドが結合しにくく、標的物質を充分に捕捉できない場合がある。
【０００４】
一方、臨床検査の酵素免疫測定法の診断薬に用いる固相担体として磁性粒子が近年注目されている。疾病の早期発見等が要求されるため、診断薬に用いる磁性粒子には標的物質を充分に捕捉できることが求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−６９１４１号公報
【特許文献２】特表２００９−５４２８６２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
これに対し、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリルアミド）・ポリ（メタクリル酸）ブロックコポリマー等をＡＴＲＰにより表面に結合させることでポリマーブラシを形成させた磁性粒子が提案されている（特許文献２）。
しかしながら、特許文献２に記載の磁性粒子は、試料中の標的物質や不純物が粒子表面に非特異的に吸着しやすく、この点で改善の余地があった。
したがって、本発明が解決しようとする課題は、リガンドが結合しやすく、且つ非特異吸着が抑制された固相担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記のような背景の下、本発明者が、特許文献２に記載の磁性粒子の各種物性について分析や検討をしたところ、ブロックコポリマーに含まれる反応性官能基量が大きいということが判明した（含有割合＝約０．２７）。
そして、本発明者は、さらに検討を進めた結果、親水性構造単位の繰り返しから構成される第１のブロックと、反応性官能基を有する構造単位の繰り返しから構成される第２のブロックとを含むブロックポリマーが少なくとも表面に結合してなる固相担体において、反応性官能基のモル数ａと、全構造単位のモル数ｂとの含有比率（ａ／ｂ）を、０．０３〜０．２５の範囲とし、且つ鎖状ポリマーの占有密度を、０．１本／ｎｍ2以上とすることによって、リガンドが結合しやすく、且つ非特異吸着が抑制されたものとなることを見出し、本発明を完成した。
【０００８】
すなわち、本発明は、＜１＞鎖状ポリマーが少なくとも表面に結合してなる固相担体であって、上記鎖状ポリマーが、親水性構造単位の繰り返しから構成される第１のブロックと、反応性官能基を有する構造単位の繰り返しから構成される第２のブロックとを含むブロックポリマーであり、上記鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基のモル数ａと、上記鎖状ポリマーに含まれる全構造単位のモル数ｂとの含有比率（ａ／ｂ）が、０．０３〜０．２５であり、上記固相担体の表面に対して上記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１本／ｎｍ2以上である、固相担体を提供するものである。
【０００９】
また、本発明は、＜２＞上記＜１＞の固相担体にリガンドを結合させてなる、リガンド結合固相担体を提供するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、＜３＞上記＜２＞のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とする、試料中の標的物質を検出又は分離する方法を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、＜４＞上記＜１＞の固相担体を製造する方法であって、（工程１）重合開始基を少なくとも表面に有する担体を準備する工程と、（工程２）上記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の固相担体は、リガンドが結合しやすく、且つ試料中の標的物質や不純物が表面に吸着しにくく非特異吸着が抑制されたものである。
また、本発明の製造方法によれば、リガンドが結合しやすく、且つ試料中の標的物質や不純物が表面に吸着しにくく非特異吸着が抑制された固相担体を簡便に製造できる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
＜固相担体＞
本発明の固相担体は、鎖状ポリマーが少なくとも表面に結合してなる固相担体であって、上記鎖状ポリマーが、親水性構造単位の繰り返しから構成される第１のブロックと、反応性官能基を有する構造単位の繰り返しから構成される第２のブロックとを含むブロックポリマーであり、上記鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基のモル数ａと、上記鎖状ポリマーに含まれる全構造単位のモル数ｂとの含有比率（ａ／ｂ）が、０．０３〜０．２５であり、上記固相担体の表面に対して上記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１本／ｎｍ2以上のものである。まず、本発明の固相担体について詳細に説明する。
【００１４】
（第１のブロック）
第１のブロックは、親水性構造単位の繰り返しから構成されるものである。
親水性構造単位としては、親水性基を有する構造単位が好ましく、親水性基を側鎖に有する構造単位がより好ましい。親水性基の個数は、上記構造単位１個中に好ましくは１〜３個であり、より好ましくは１個である。
親水性基を側鎖に有する構造単位としては、例えば、親水性基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、親水性基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位、親水性基を有するスチレン系モノマーに由来する構造単位が挙げられる。中でも、非特異吸着抑制の観点から、親水性基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、親水性基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位が好ましい。
なお、本明細書において、親水性とは、水との親和力が強い性質を持つことを意味する。具体的には１種の構造単位のみからなるホモポリマー（実施例の測定法による数平均分子量が１，０００〜１００，０００程度のもの）が、常温（２５℃）において純水１００ｇに対して１ｇ以上溶解する場合にはその構造単位は親水性である。
【００１５】
また、親水性基としては、水酸基、アルコキシ基、ポリオキシアルキレン基、双性イオン構造を有する基、スルホニル基、スルフィニル基、リン酸基が挙げられ、これらのうち１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。アルコキシ基としては、炭素数１又は２のアルコキシ基が好ましい。例えば、メトキシ基、エトキシ基等が挙げられる。
これらの中でも、親水性基としては、非特異吸着抑制の観点から、水酸基、双性イオン構造を有する基、ポリオキシアルキレン基、リン酸基が好ましく、水酸基、双性イオン構造を有する基、ポリオキシアルキレン基がより好ましい。
【００１６】
上記ポリオキシアルキレン基としては、−（ＲaＯ）q−で表される基が好ましい（Ｒaは、アルカンジイル基を示し、ｑは、２〜１００の整数を示す。なお、ｑ個のＲaは同一でも異なっていてもよい）。
Ｒaで示されるアルカンジイル基の炭素数は、好ましくは２〜４であり、より好ましくは２又は３であり、特に好ましくは２である。
また、Ｒaで示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基等が挙げられる。これらの中でも、エタン−１，２−ジイル基が好ましい。
ｑは、２〜１００の整数を示すが、好ましくは３〜８０の整数であり、より好ましくは４〜６０の整数であり、さらに好ましくは５〜４０の整数であり、さらに好ましくは６〜３０の整数であり、特に好ましくは７〜２０の整数である。
【００１７】
上記双性イオン構造を有する基としては、非特異吸着抑制の観点から、第４級アンモニウム塩型カチオン性官能基と、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-、−ＳＯ3-及び−Ｏ−（Ｏ＝Ｐ−Ｏ-）−Ｏ−から選ばれる１価又は２価のアニオン性官能基とを有する有機基が好ましく、下記式（１）又は（２）で表される有機基がより好ましく、下記式（１）で表される有機基が特に好ましい。
【００１８】
【化１】
0006453590.tif 000002
【００１９】
〔式（１）中、
Ｒ1及びＲ2は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｒ3は、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-又は−ＳＯ3-を示し、
Ｒ4及びＲ5は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
【００２０】
【化２】
0006453590.tif 000003
【００２１】
〔式（２）中、
Ｒ6及びＲ7は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示し、
Ｒ8、Ｒ9及びＲ10は、それぞれ独立して、メチル基又はエチル基を示す。〕
【００２２】
式（１）中のＲ1及びＲ2、式（２）中のＲ6及びＲ7は、それぞれ独立して、単結合又は炭素数１〜１０の２価の有機基を示すが、非特異吸着抑制の観点から、炭素数１〜１０の２価の有機基が好ましく、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基、炭素数２〜１０の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基がより好ましく、炭素数１〜１０の２価の炭化水素基が特に好ましい。
２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３が特に好ましい。一方、２価の有機基が２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜８が好ましく、２〜６がより好ましく、２〜４がさらに好ましく、２又は３が特に好ましい。
【００２３】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ6及びＲ7における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【００２４】
式（１）中のＲ3としては、−（Ｃ＝Ｏ）Ｏ-が好ましい。
式（１）中のＲ4及びＲ5、式（２）中のＲ8、Ｒ9及びＲ10としては、メチル基が好ましい。
【００２５】
また、親水性構造単位の好適な具体例としては、下記式（３）で表される構造単位が挙げられる。
【００２６】
【化３】
0006453590.tif 000004
【００２７】
〔式（３）中、
Ｒ11は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ12は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ14−＊（Ｒ14は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（３）中のＲ13と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ13は、双性イオン構造を有する基、水酸基を有する有機基、又はポリオキシアルキレン基を有する有機基を示す。〕
【００２８】
式（３）中、Ｒ12としては、非特異吸着抑制の観点から、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＨ−＊が好ましい。
【００２９】
Ｒ13で示される双性イオン構造を有する基は、上記双性イオン構造を有する基と同様である。
【００３０】
Ｒ13で示される水酸基を有する有機基としては、下記式（４）で表されるものが挙げられる。
【００３１】
【化４】
0006453590.tif 000005
【００３２】
〔式（４）中、Ｒ15は、２価の有機基を示す。〕
【００３３】
Ｒ15で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられるが、好ましくは２価の炭化水素基である。
２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜４がさらに好ましく、１〜３が特に好ましい。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜８が好ましく、２〜６がより好ましく、２〜４がさらに好ましく、２又は３が特に好ましい。
【００３４】
Ｒ15における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【００３５】
Ｒ13で示されるポリオキシアルキレン基を有する有機基としては、−（ＲaＯ）q−Ｒbで表される基が好ましい（Ｒbは、炭素数１〜４のアルキル基を示す。なお、Ｒa及びｑは前記と同義であり、Ｒaはアルカンジイル基を、ｑは２〜１００の整数を、それぞれ示す）。
Ｒbで示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３であり、より好ましくは１又は２である。また、Ｒbで示されるアルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基が挙げられるが、メチル基が特に好ましい。
【００３６】
（第２のブロック）
第２のブロックは、反応性官能基を有する構造単位の繰り返しから構成されるものである。反応性官能基を有する構造単位としては、反応性官能基を側鎖に有する構造単位が好ましい。反応性官能基の個数は、上記構造単位１個中に好ましくは１〜３個であり、より好ましくは１個である。
反応性官能基を側鎖に有する構造単位としては、例えば、（メタ）アクリル酸又はその塩に由来する構造単位、反応性官能基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、反応性官能基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位、反応性官能基を有するスチレン系モノマーに由来する構造単位が挙げられる。中でも、非特異吸着抑制の観点から、（メタ）アクリル酸又はその塩に由来する構造単位、反応性官能基を有する（メタ）アクリレート系モノマーに由来する構造単位、反応性官能基を有する（メタ）アクリルアミド系モノマーに由来する構造単位が好ましい。
また、反応性官能基としては、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基、アシル基、アジド基が挙げられ、これらのうち１種を有していてもよく、２種以上を有していてもよい。これらの中でも、結合したリガンドが外れにくくする観点や、リガンドとしてタンパク質や核酸等の生体分子を使用する場合に、リガンドが元来有している官能基を使用して固相担体と結合できる点から、カルボキシ基、トシル基、アミノ基、エポキシ基が好ましく、固相担体に対しリガンドを簡便且つ迅速に結合させやすい点等から、カルボキシ基がより好ましい。
【００３７】
また、固相担体の固形分１ｇあたりの反応性官能基の含有量は、リガンド結合量の観点や検出の高感度化と低ノイズ化を両立する観点から、好ましくは１μｍｏｌ以上、より好ましくは５μｍｏｌ以上、さらに好ましくは１０μｍｏｌ以上、さらに好ましくは１５μｍｏｌ以上、さらに好ましくは２０μｍｏｌ以上、特に好ましくは３０μｍｏｌ以上であり、また、非特異吸着を抑制する観点から、好ましくは３００μｍｏｌ以下、より好ましくは２００μｍｏｌ以下、さらに好ましくは１７５μｍｏｌ以下、特に好ましくは１５０μｍｏｌ以下である。
反応性官能基の含有量は、例えば、反応性官能基がカルボキシ基の場合、電気伝導度測定法等により測定可能であり、具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。また、反応性官能基がトシル基の場合は、固相担体に導入されたトシル基の紫外可視光吸収を測定するなどして求めることができ、反応性官能基がアミノ基の場合は、アミノ基にＮ−スクシイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナートを反応させた後、還元し、遊離のチオピリジル基の吸光度を測定するなどして求めることができる。
【００３８】
反応性官能基を側鎖に有する構造単位の好適な具体例としては、下記式（５）で表される構造単位が挙げられる。
【００３９】
【化５】
0006453590.tif 000006
【００４０】
〔式（５）中、
Ｒ16は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ17は、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊（Ｒ19は、水素原子又はメチル基を示し、＊は、式（５）中のＲ18と結合する位置を示す）又はフェニレン基を示し、
Ｒ17が−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊である場合、Ｒ18は、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基を示し、Ｒ17が−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊又はフェニレン基である場合、Ｒ18は、反応性官能基を有する有機基を示す。〕
【００４１】
式（５）中、Ｒ17としては、水との親和性が高め、非特異吸着を抑制する観点から、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊が好ましい。Ｒ19は、水素原子又はメチル基を示すが、水素原子が好ましい。
【００４２】
また、Ｒ18で示される反応性官能基を有する有機基としては、下記式（６）で表される有機基が好ましい。なお、Ｒ18における反応性官能基は上記と同様である。
【００４３】
【化６】
0006453590.tif 000007
【００４４】
〔式（６）中、
Ｒ20は、２価の有機基を示し、
Ｙは、反応性官能基を示す。〕
【００４５】
Ｒ20で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。
２価の有機基が２価の炭化水素基である場合、その炭素数としては、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６が特に好ましい。一方、２価の有機基が炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数としては、２〜１０が好ましく、２〜８がより好ましく、２〜６が特に好ましい。
【００４６】
Ｒ20における「２価の炭化水素基」としては、２価の脂肪族炭化水素基が好ましい。当該２価の脂肪族炭化水素基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基が好ましく、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基等が挙げられる。
【００４７】
また、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、イミノ基、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基としては、簡便に鎖状ポリマーが得られる観点等から、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエステル結合を有する基が好ましく、−Ｒc−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）−Ｒd−＊で表される２価の基がより好ましい（Ｒc及びＲdは、それぞれ独立して、炭素数２〜４のアルカンジイル基を示し、＊は、式（６）中のＹとの結合位置を示す）。アルカンジイル基の炭素数としては、２又は３が好ましく、２がより好ましい。アルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基が挙げられる。
【００４８】
上記Ｒ17とＲ18との組み合わせとしては、Ｒ17が、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊であり、Ｒ18が、水素原子、又は反応性官能基を有する有機基である組み合わせ、Ｒ17が、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊であり、Ｒ18が、反応性官能基を有する有機基である組み合わせが好ましく、Ｒ17が、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｏ−＊であり、Ｒ18が、水素原子である組み合わせ、Ｒ17が、−（Ｃ＝Ｏ）−ＮＲ19−＊であり、Ｒ18が、反応性官能基を有する有機基である組み合わせが特に好ましい。
【００４９】
また、本発明の固相担体は、上記鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基のモル数ａと、上記鎖状ポリマーに含まれる全構造単位のモル数ｂとの含有比率（ａ／ｂ）が、０．０３〜０．２５である。斯かる構成によって、リガンドが結合しやすくなり、且つ非特異吸着が抑制される。
含有比率（ａ／ｂ）は、リガンドを結合しやすくする観点から、好ましくは０．０５以上、より好ましくは０．０８以上、さらに好ましくは０．１以上、特に好ましくは０．１３以上であり、また、非特異吸着抑制の観点から、好ましくは０．２３以下、より好ましくは０．２２以下である。
また、親水性構造単位が親水性基を有する構造単位である場合、上記鎖状ポリマーに含まれる親水性基のモル数ｃと、上記鎖状ポリマーに含まれる全構造単位のモル数ｂとの含有比率（ｃ／ｂ）は、リガンドを結合しやすくする観点から、好ましくは０．１以上、より好ましくは０．３以上、特に好ましくは０．５以上であり、また、ポリマー合成が容易である観点から、好ましくは１．５以下、より好ましくは１．２５以下、さらに好ましくは１以下、特に好ましくは０．９以下である。
また、上記モル数ａとしては、好ましくは１以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上であり、また、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下、さらに好ましくは２００以下、特に好ましくは１００以下である。
モル数ｂとしては、好ましくは２以上、より好ましくは６以上、さらに好ましくは１０以上、特に好ましくは２０以上であり、また、好ましくは１０００以下、より好ましくは６００以下、さらに好ましくは４００以下、特に好ましくは２５０以下である。
モル数ｃとしては、好ましくは１以上、より好ましくは３以上、さらに好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上であり、また、好ましくは５００以下、より好ましくは３００以下、さらに好ましくは２００以下、特に好ましくは１５０以下である。
モル数ａ、ｂ及びｃは、Ｘ線光電子分光分析や、固相担体１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの重量、鎖状ポリマーの分子量及び反応性官能基量等から算出可能である。具体的には、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
【００５０】
また、鎖状ポリマーは、上記第１のブロックを構成する構造単位と第２のブロックを構成する構造単位以外の構造単位を有していてもよいが、鎖状のビニルポリマーであるのが好ましく、ジブロックポリマーであるのがより好ましい。また、第１のブロックが、固相担体の表面に直接結合したブロックであるのが好ましい。鎖状ポリマーは、＊＊−（第１のブロック）−（第２のブロック）−で表されるジブロックポリマーであるのが好ましい（＊＊は、固相担体表面側の結合位置を示す）。
【００５１】
また、鎖状ポリマーの片方の末端は、固相担体の表面に結合していれば特に限定されないが、重合開始基の残基を含む２価の連結基を介して固相担体の表面に結合しているのが好ましい。重合開始基としては、リビング重合可能な重合開始基が好ましく、リビングラジカル重合開始基がより好ましく、原子移動ラジカル重合開始基、可逆的付加開裂連鎖移動重合開始基がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合開始基が特に好ましい。原子移動ラジカル重合開始基の残基を含む２価の連結基としては、下記式（７−１）又は（７−２）で表される２価の基が挙げられる。
【００５２】
【化７】
0006453590.tif 000008
【００５３】
〔上記式中、
Ｒ25及びＲ29は、−Ｏ−又は−ＮＨ−を示し、
Ｒ26及びＲ30は、それぞれ独立して、単結合又はフェニレン基を示し、
Ｒ27及びＲ28は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、
＊＊は、鎖状ポリマーの末端と結合する位置を示す。〕
【００５４】
Ｒ25及びＲ29としては、−Ｏ−が好ましく、Ｒ26及びＲ30としては、単結合が好ましく、Ｒ27及びＲ28としては、アルキル基が好ましい。
Ｒ27及びＲ28で示されるアルキル基の炭素数としては、１〜８が好ましく、１〜４がより好ましく、１又は２が特に好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、具体的には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基等が挙げられる。
【００５５】
一方、鎖状ポリマーの他方の末端は特に限定されないが、ハロゲン原子が好ましい。ハロゲン原子としては、臭素原子、塩素原子、フッ素原子等が挙げられる。
【００５６】
また、本発明の固相担体は、固相担体の表面に対して上記鎖状ポリマーが占有する密度が、０．１本／ｎｍ2以上である。すなわち、固相担体表面上で、鎖状ポリマーから構成されるポリマーブラシが形成されており、そして、上記構成により、リガンドが結合しやすくなり、且つ非特異吸着が抑制される。
上記鎖状ポリマーが占有する密度は、非特異吸着を抑制する観点やリガンド結合量の観点、検出の高感度化と低ノイズ化を両立させる観点から、好ましくは０．３本／ｎｍ2以上、より好ましくは０．４本／ｎｍ2以上、さらに好ましくは０．６本／ｎｍ2以上であり、また、ポリマーブラシの形成が簡便な点で、好ましくは２本／ｎｍ2以下、より好ましくは１．６本／ｎｍ2以下、さらに好ましくは１．２本／ｎｍ2以下である。
上記鎖状ポリマーの密度は、例えば、下記式で算出可能である。具体的には、加水分解等により固相担体から鎖状ポリマーを遊離させ、後述する実施例に記載の方法に従い測定できる。
鎖状ポリマーの密度（本／ｎｍ2）＝担体１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数（本）／担体１ｇの総表面積（ｎｍ2）
【００５７】
また、鎖状ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）としては、１，０００〜１００，０００が好ましく、３，０００〜５０，０００がより好ましく、５，０００〜３０，０００がさらに好ましい。
また、鎖状ポリマーの重量平均分子量（Ｍｗ）としては、１，０００〜１００，０００が好ましく、３，０００〜５０，０００がより好ましく、５，０００〜３０，０００が特に好ましい。
また、分子量分布（Ｍｗ／Ｍｎ）としては、非特異吸着の抑制及び固相担体に結合されたリガンドの活性を高める観点から、１．０〜２．５が好ましく、１．０〜２．０がより好ましく、１．０〜１．５がさらに好ましい。
なお、数平均分子量、重量平均分子量は、加水分解等により固相担体から鎖状ポリマーを遊離させ、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定したポリエチレングリコール換算の平均分子量を意味する。なお、後述する実施例に記載のような方法で反応性官能基導入前の鎖状ポリマーの分子量を測定し、斯かる分子量と、反応性官能基が導入される構造単位のモル数と、反応性官能基の導入に用いる化合物の構造から計算することもできる。
【００５８】
本発明の固相担体を構成する鎖状ポリマー以外の部分は、有機物でも金属や金属酸化物等の無機物でもよく特に限定されないが、本発明の固相担体は、鎖状ポリマーの他に樹脂を含むものが好ましい。樹脂としては、アガロース、デキストラン、セルロース等の多糖類で構成される天然高分子でもよく、合成高分子でもよい。
また、本発明の固相担体の形態は特に限定されるものではなく、粒子、モノリス、膜、繊維、チップ等のいずれでもよいが、標的物質の検出又は分離の容易性の観点から、粒子が好ましく、磁性粒子がより好ましい。
本明細書において「磁性粒子」とは、磁性体を有する粒子を意味する。本発明の固相担体は、磁性粒子の形態でも高い水分散性を有する。また、磁性粒子とした場合には、遠心分離器等を用いずに磁石等を用いて分離することができるため、試料からの固相担体の分離を簡素化又は自動化することができる。
また、磁性体は、強磁性、常磁性、超常磁性のいずれであってもよいが、磁場による分離と磁場を取り除いた後の再分散を容易にする観点から、超常磁性であることが好ましい。磁性体としては、フェライト、酸化鉄、鉄、酸化マンガン、マンガン、酸化ニッケル、ニッケル、酸化コバルト、コバルト等の金属、又は合金が挙げられる。
また、磁性粒子としては、具体的には、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかの粒子の少なくとも表面に、上記鎖状ポリマーを結合してなるものが挙げられる。好ましくは多孔質又は非多孔質の磁性ポリマー粒子である。
【００５９】
（ｉ）樹脂等の非磁性体を含む連続相中に磁性体微粒子が分散している粒子
（ｉｉ）磁性体微粒子の２次凝集体をコアとし、樹脂等の非磁性体をシェルとする粒子
（ｉｉｉ）樹脂等の非磁性体で構成される核粒子と、該核粒子の表面に設けられた磁性体微粒子を含む磁性体層（２次凝集体層）とを有する母粒子をコアとし、該母粒子の最外層に、樹脂等の非磁性体層がシェル（以下、最外層シェルとも称する）として設けられた粒子
（ｉｖ）粒子の最外層に樹脂等の非磁性体層がシェルとして設けられていてもよい、樹脂やシリカ等からなる多孔質粒子の孔内に磁性体微粒子が分散している粒子
なお、（ｉ）〜（ｉｖ）の粒子はいずれも公知であり、常法に従い製造可能である。
【００６０】
上記（ｉｉｉ）の核粒子及び（ｉｖ）の多孔質粒子における樹脂としては、単官能性モノマー及び架橋性モノマーから選ばれる１種又は２種以上に由来する樹脂が挙げられる。
上記単官能性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン等の単官能性芳香族ビニル系モノマー；メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、イソボルニル（メタ）アクリレート等の単官能性（メタ）アクリレート系モノマーが挙げられる。
上記多官能性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン等の多官能性芳香族ビニル系モノマー；エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）メタクリレート、アリル（メタ）アクリレート等の多官能性（メタ）アクリレート系モノマー；ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等が挙げられる。
【００６１】
また、上記（ｉ）及び（ｉｉ）における樹脂並びに上記（ｉｉｉ）及び（ｉｖ）の最外層シェルにおける樹脂としては、グリシジル基、アミノ基及び水酸基から選ばれる１種又は２種以上の官能基を少なくとも表面に有している樹脂が好ましい。上記官能基は、樹脂表面の化学修飾により導入してもよいし、上記官能基を有するモノマー１種又は２種以上を少なくとも含むモノマー組成の重合により導入してもよい。上記化学修飾としては、例えばグリシジル基の加水分解による水酸基の生成や、ニトロ基の還元によるアミノ基の生成が挙げられる。上記官能基を有するモノマー組成としては、グリシジル基含有モノマーを少なくとも含むモノマー組成がより好ましい（以下、上記最外層シェルにおける樹脂が、グリシジル基含有モノマーを少なくとも含むモノマー組成により形成された樹脂である粒子を、グリシジル基含有磁性粒子とも称する）。なお、上記単官能性モノマー及び架橋性モノマーから選ばれる１種又は２種以上をさらに含んでいてもよい。
【００６２】
グリシジル基含有モノマーとしては、グリシジル（メタ）アクリレート、アリルグリシジルエーテル等が挙げられる。アミノ基含有モノマーとしては、２−アミノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。水酸基含有モノマーとしては、１，４−シクロヘキサンジメタノールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００６３】
また、本発明の固相担体が粒子の場合の平均粒径（体積平均粒径）は、好ましくは０．１〜５００μｍであり、より好ましくは０．２〜５０μｍであり、さらに好ましくは０．３〜１０μｍである。斯様な範囲とすることにより、固相担体が磁性粒子である場合に集磁速度が速くなりハンドリング性が改善され、また、リガンド結合量が大きくなり、検出感度等が良好になる。また、平均粒径の変動係数は、２０％以下程度であればよい。
また、比表面積は、１．０〜２．０ｍ2／ｇ程度であればよい。
なお、上記平均粒径及び比表面積は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
【００６４】
＜固相担体の製造方法＞
本発明の固相担体は常法を適宜組み合わせて製造することができるが、本発明の固相担体の製造方法としては、固相担体の表面に対する鎖状ポリマーが占有する密度を高密度化しさらに非特異吸着が抑制されたものとする観点や、分子量分布の狭い鎖状ポリマーを固相担体に結合しさらに非特異吸着が抑制されたものとする観点、固相担体に結合するリガンドの働きを高める観点等から、（工程１）重合開始基を少なくとも表面に有する担体（以下、重合開始基含有担体とも称する）を準備する工程と、（工程２）前記重合開始基を起点としてモノマーを重合させる工程を含む方法が好ましい。
上記製造方法としては、具体的には、以下の方法＜ＰＲ−１＞及び＜ＰＲ−２＞が挙げられる。これら方法について、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を反応性官能基として有するジブロックポリマー（１５）が結合した固相担体の製造方法を例に挙げて説明する。
＜ＰＲ−１＞（工程１）重合開始基含有担体を準備し、（工程２−１−１）親水性モノマー（１１）と、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入可能な官能基（例えば、水酸基、エポキシ基、エステル基、アミノ基、カルボン酸保護基等である。以下、同じ。）を有するモノマー（１２）とを、前記重合開始基を起点として片方ずつ重合させ、（工程２−１−２）固相担体に導入された鎖状ポリマー（１４）に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入する方法。
＜ＰＲ−２＞（工程１）重合開始基含有担体を準備し、（工程２−２−１）カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入可能な官能基を有するモノマー（１２）に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入して、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を反応性官能基として有するモノマー（１３）を得て、（工程２−２−２）このモノマー（１３）と親水性モノマー（１１）とを、前記重合開始基を起点として片方ずつ重合させる方法。なお、カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を有するモノマーを使用する際は、（工程２−２−１）を行わずに製造できる。カルボキシ基、アミノ基又はトシル基を有するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸、（メタ）アクリル酸塩、アミノエチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。
【００６５】
（工程１）
重合開始基含有担体は、例えば、水酸基、アミノ基、エポキシ基及びカルボキシ基から選ばれる１種又は２種以上（以下、これを総称して水酸基等とも称する）を少なくとも表面に有する原料担体（以下、原料担体とも称する）に、重合開始基を有する化合物を接触させ、上記水酸基等に含まれる水素原子を重合開始基に変換することで得ることができる（以下、この反応を重合開始基導入反応とも称する）。なお、上記原料担体のうち、水酸基を少なくとも表面に有する原料担体は、例えば、上記グリシジル基含有磁性粒子と無機酸、有機酸等の酸とを接触させ、グリシジル基を開環するなどして得ることができる。
また、重合開始基含有担体は、重合開始基を有するモノマーを含むモノマー組成を重合しても得ることもできる。重合開始基を有するモノマーとしては、２−（２−ブロモイソブチリルオキシ）エチルメタクリレート等が挙げられる。
【００６６】
上記重合開始基を有する化合物としては、リビング重合可能な重合開始基を有する化合物が好ましく、リビングラジカル重合開始基を有する化合物がより好ましく、原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物、可逆的付加開裂連鎖移動重合開始基を有する化合物がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物が特に好ましい。原子移動ラジカル重合開始基を有する化合物としては、例えば、２−ブロモイソブチリルブロミド、４−（ブロモメチル）安息香酸、２−ブロモイソ酪酸エチル、２−ブロモプロピオニルブロミド、トシルクロリド等が挙げられる。
重合開始基導入反応において、重合開始基を有する化合物の合計使用量は、原料担体に対し、通常０．００１〜１００質量倍程度であり、好ましくは０．０１〜５０質量倍程度である。
【００６７】
重合開始基導入反応は、トリエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン等の塩基性触媒存在下で行うのが好ましい。なお、これら塩基性触媒のうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
塩基性触媒の合計使用量は、重合開始基を有する化合物に対し、通常１〜１０モル当量程度であり、好ましくは１〜５モル当量程度である。
また、重合開始基導入反応は、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、テトラヒドロフラン、１，４−ジオキサン、１，３−ジオキサン等のエーテル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等のプロトン性溶媒が挙げられ、これら溶媒は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、重合開始基導入反応の反応時間は、通常３０分〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。
【００６８】
（工程２−１−１）
工程２−１−１における重合反応の重合法は、重合開始基の種類に応じて選択すればよいが、目的物を簡便且つ容易に得る観点から、リビング重合が好ましく、リビングラジカル重合がより好ましく、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ重合）、可逆的付加開裂連鎖移動重合（ＲＡＦＴ重合）がさらに好ましく、原子移動ラジカル重合が特に好ましい。原子移動ラジカル重合で重合させることにより、幅広い種類の担体に鎖状ポリマーを簡便に結合させることができ、しかも、生体適合性や高圧縮弾性、低摩擦特性、サイズ排除特性が、得られる固相担体に付与され、且つ固相担体の表面に対する鎖状ポリマーが占有する密度を高密度化されるため非特異吸着しにくくなる。
【００６９】
モノマー（１１）としては、水酸基を有するモノマー、ポリオキシエチレン基を有するモノマー、双性イオンを有する基を有するモノマー、リン酸基を有するモノマー等の他、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド、イソプロピル（メタ）アクリルアミド、ジエチル（メタ）アクリルアミド等の親水性を示すものが例示される。
水酸基を有するモノマーとしては、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリルアミド、グリセロール１−（メタ）アクリレート、グリセロール１−（メタ）アクリルアミド等が例示される。ポリオキシエチレン基を有するモノマーとしては、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリルアミド等が例示される。双性イオンを有する基を有するモノマーとしては、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトエチル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトプロピル）ジメチルアミニウム、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホメチル）アンモニウムヒドロキシド、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホエチル）アンモニウムヒドロキシド、［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル］ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド、Ｏ−［２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エトキシ（オキシラト）ホスフィニル］コリン等が例示される。リン酸基を有するモノマーとしては、２−ホスフォリックエチル（メタ）アクリレート、２−ホスフォリックエチル（メタ）アクリルアミド等が例示される。
なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
【００７０】
モノマー（１２）としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（メタ）アクリレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。
モノマー（１１）、（１２）の各合計使用量は、それぞれ、担体表面に結合している重合開始基に対し、通常５〜１００００モル当量程度であり、好ましくは１０〜５０００モル当量程度である。
【００７１】
また、工程２−１−１における重合反応を、原子移動ラジカル重合により行う場合は、反応効率の観点から、遷移金属化合物及び配位子の存在下で反応を行うのが好ましい。
遷移金属化合物としては、銅化合物が好ましい。銅化合物としては、臭化銅（Ｉ）、臭化銅（ＩＩ）、塩化銅（Ｉ）、塩化銅（ＩＩ）等のハロゲン化銅の他、銅（Ｉ）トリフレート、銅（ＩＩ）トリフレート等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。遷移金属化合物の合計使用量は、反応系中、通常１〜１０，０００ｐｐｍ程度である。
配位子としては、同一分子内に２つ以上の窒素原子を含む配位子が好ましい。同一分子内に２つ以上の窒素原子を含む配位子としては、トリス（２−ピリジルメチル）アミン、ビピリジン、ビピリジン誘導体、トリス［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミン等が挙げられる。なお、これらのうち１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用してよい。配位子の合計使用量は、遷移金属化合物に対し、通常０．５〜１０モル当量程度である。
【００７２】
また、工程２−１−１における重合反応は、反応効率の観点から、還元剤、溶媒存在下で行うのが好ましい。
還元剤としては、アスコルビン酸、グルコース、ヒドラジン、銅等が挙げられ、これら還元剤は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
溶媒としては、水；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒；メタノール、エタノール等のアルコール系溶媒；アニソール等のエーテル系溶媒等が挙げられ、これら溶媒は１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、重合反応の反応系のｐＨとしては、３〜１０が好ましい。重合反応の反応時間は、通常３０分〜１２時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。重合反応は、２５〜６０℃程度の温和な条件でも進行する。
【００７３】
（工程２−１−２）
工程２−１−２は、固相担体に導入された鎖状ポリマー（１４）に、付加反応、置換反応、縮合反応又は脱保護反応によってカルボキシ基、アミノ基又はトシル基を導入する工程である。
カルボキシ基を導入する方法としては、モノマー（１２）として水酸基又はアミノ基を有するモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）にカルボン酸無水物を付加反応させる方法や、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）を加水分解し水酸基を生成した後に、カルボン酸無水物を付加反応させる方法、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）にメルカプト基やアミノ基等の求核基及びカルボキシ基を有する化合物を付加反応させる方法、モノマー（１２）としてカルボキシ基が保護されたモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）を脱保護する方法等が挙げられる。
カルボン酸無水物としては、例えば、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水グルタル酸、無水フタル酸、ヘキサヒドロ無水フタル酸等が挙げられる。中でも、水酸基やアミノ基との反応が容易に進行する観点から、無水コハク酸が好ましい。カルボン酸無水物等の合計使用量は、モノマー（１２）由来の構造単位に対し、通常０．１〜２０００モル当量程度であり、好ましくは１〜１０００モル当量である。
メルカプト基やアミノ基等の求核基及びカルボキシ基を有する化合物としては、メルカプトプロピオン酸やアミノ酸が挙げられる。カルボキシ基が保護されたモノマーとしては、ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（メタ）アクリレートが挙げられる。なお、脱保護方法は、保護基に応じて周知の方法で実施でき、加水分解等が挙げられる。
アミノ基を導入する方法としては、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）にアンモニア又は２つ以上のアミノ基を有する化合物を付加反応させる方法が挙げられる。２つ以上のアミノ基を有する化合物としては、エチレンジアミンが挙げられる。
トシル基を導入する方法としては、モノマー（１２）として水酸基又はアミノ基を有するモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）にトシルクロライドを付加させる方法や、モノマー（１２）としてエポキシ基を有するモノマーを使用し、得られた鎖状ポリマー（１４）を加水分解し水酸基を生成した後にトシルクロライドを付加させる方法等が挙げられる。
【００７４】
また、工程２−１−２は、工程１と同様の塩基性触媒、溶媒存在下で行うのが好ましい。工程２−１−２の反応時間は、通常３０分〜２４時間程度であり、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよい。
【００７５】
なお、工程２−２−１は、工程２−１−２に準じて行えばよく、工程２−２−２は、工程２−１−１に準じて行えばよい。
【００７６】
そして、上記のようにして得られる本発明の固相担体は、リガンドが反応性官能基に結合しやすく、非特異吸着が抑制されたものである。また、鎖状ポリマーがブロックポリマーであるため、抗体等のリガンドが結合しやすく、抗原抗体反応を利用した検出における高感度化と低ノイズ化を両立しやすい。斯様な効果が得られる理由は必ずしも明らかではないが、ブロックポリマーの場合は、反応性官能基が局所的に存在するため抗体が結合しやすく、サンドイッチ構造（一次抗体−抗原―二次抗体）等の高次構造をとりやすくなるためであると、本発明者は推察する。
したがって、本発明の固相担体をアフィニティー担体とすることで、酵素免疫測定、放射免疫測定、化学発光免疫測定等の抗原抗体反応を利用したイムノアッセイ；タンパク質、核酸等の検出；細胞、タンパク質、核酸等の生体関連物質のバイオセパレーション；薬物探索；バイオセンサー等をはじめとする、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明の固相担体は、イムノアッセイのため、或いは核酸検出のための使用に特に適する。
【００７７】
＜リガンド結合固相担体＞
本発明のリガンド結合固相担体は、本発明の固相担体にリガンドを結合させてなるものである。
上記リガンドは、標的物質と結合する分子であればよいが、例えば、抗体；抗原；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；ヌクレオチド；ヌクレオシド；プロテインＡ、プロテインＧ、（ストレプト）アビジン、酵素、レクチン等のタンパク質；インシュリン等のペプチド；アミノ酸；ヘパリン等の糖又は多糖；脂質；ビオチン等のビタミン；薬物；基質；ホルモン；神経伝達物質等が挙げられる。
これらの中でも、診断薬用等に適したリガンド結合固相担体とする観点からは、抗体、抗原が好ましい。抗体、抗原は標的物質と結合するものであればよいが、例えば、抗アンチプラスミン抗体、抗Ｄダイマー抗体、抗ＦＤＰ抗体、抗ｔＰＡ抗体、抗トロンビン・アンチトロンビン複合体抗体、抗ＦＰＡ抗体等の凝固線溶関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＢＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＴＳＨ抗体、抗フェリチン抗体、抗ＣＡ１９−９抗体等の腫瘍関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗アポリポタンパク抗体、抗β２−ミクロブロブリン抗体、抗α１―ミクログロブリン抗体、抗免疫グロブリン抗体、抗ＣＲＰ抗体等の血清蛋白関連検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ＨＣＧ抗体等の内分泌機能検査用抗体又はこれに対する抗原；抗ジゴキシン抗体、抗リドカイン抗体等の薬物分析用抗体又はこれに対する抗原；ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗原、ＨＩＶ−１抗原、ＨＩＶ−２抗原、ＨＴＬＶ−１抗原、マイコプラズマ抗原、トキソプラズマ抗原、ストレプトリジンＯ抗原等の感染症関連検査用抗原又はこれに対する抗体；ＤＮＡ抗原、熱変成ヒトＩｇＧ等の自己免疫関連検査用抗原又はこれに対する抗体等が挙げられる。なお、抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい。
【００７８】
リガンドの結合は常法に従い行えばよいが、共有結合法で行うのが好ましい。例えば、反応性官能基がカルボキシ基であり、リガンドがアミノ基を有するものである場合は、脱水縮合剤を用いて結合させればよい。
【００７９】
本発明のリガンド結合固相担体は、体外診断や生化学分野における研究等に広く利用できる。本発明のリガンド結合固相担体は、イムノアッセイのため、或いは核酸検出のための使用に特に適する。
【００８０】
＜標的物質の検出又は分離方法＞
本発明の試料中の標的物質を検出又は分離する方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いることを特徴とするものである。
【００８１】
標的物質はリガンドと結合するものであればよいが、具体的には、抗原；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；細胞（正常細胞、及び大腸がん細胞、血中循環がん細胞等のがん細胞）；ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸；タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン等の生体関連物質が挙げられ、創薬ターゲットとなる薬物、ビオチン等の小分子化合物でもよい。なお、標的物質は、蛍光物質などにより標識化されたものでもよい。
なお、試料は、上記標的物質を含むもの又は標的物質を含む可能性があるものであればよく、具体的には、血液、血漿、血清、標的物質を含有するバッファー溶液等である。
【００８２】
本発明の検出又は分離方法は、本発明のリガンド結合固相担体を用いる以外は常法にしたがって行えばよい。例えば、本発明のリガンド結合固相担体と標的物質を含む試料を、混合するなどして接触させる工程（接触工程）、及び標的物質を捕捉したリガンド結合固相担体を、磁石などを用いて試料から分離する工程（分離工程）を含む方法が挙げられる。なお、当該分離工程の後に、標的物質を検出する工程、又はリガンドと標的物質を解離させる工程を含んでいてもよい。
【実施例】
【００８３】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。実施例における各分析条件は以下に示すとおりである。
【００８４】
＜鎖状ポリマーの分子量測定＞
鎖状ポリマーの分子量は、水酸化ナトリウム水溶液を用いて加水分解することで、鎖状ポリマーを粒子から遊離させてから測定した。
すなわち、水酸化ナトリウム水溶液（１Ｎ、ｐＨ１４）４ｇに粒子１ｇを分散し、２５℃で３時間撹拌して、鎖状ポリマーを粒子から遊離した。磁気を用いて粒子を分離し、鎖状ポリマーが溶解した上清を回収した。次に、この鎖状ポリマー溶液に、溶液のｐＨが７になるまで１Ｍの塩酸を加え中和した。鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、加えた１Ｍ塩酸の重量から、生成する塩化ナトリウムの重量を計算しておき、中和後の溶液を凍結乾燥することで、粉末として、塩化ナトリウムを含む鎖状ポリマーを得た。また、鎖状ポリマーの重量の算出に用いるために、粉末の重量を測定しておいた。
上記粉体を検体とし、東ソー社製  ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬカラム及び日本分光社製  Ｃｈｒｏｍ  ＮＡＶ  クロマトグラフィデータステーションプログラムを使用して、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  ＰｅｒｍｅａｔｉｏｎＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：  ＧＰＣ）により以下の条件で測定することで、粒子表面に形成された鎖状ポリマーのＭｎ及びＭｗを測定した。
（測定条件）
流量：０．８ｍＬ／分
溶出溶媒：０．２Ｍ  りん酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
カラム温度：２５℃
標準物質：東ソー社製  ＴＳＫｇｅｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）  ＳＥ−ｋｉｔ  及び和光純薬工業社製  ＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅＧｌｙｃｏｌ  ４，０００
【００８５】
＜粒子表面を占める鎖状ポリマーのポリマー密度＞
粒子から遊離させた鎖状ポリマーの重量、鎖状ポリマーの数平均分子量、及び粒子の表面積から、下記式よりポリマー密度を算出した。
〔粒子表面を占める鎖状ポリマーの密度（本／ｎｍ2）〕＝〔粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数（本）〕／〔粒子１ｇあたりの総表面積（ｎｍ2）〕
なお、粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数と粒子１ｇの総表面積の算出法は以下のとおりである。
（粒子１ｇに結合した鎖状ポリマーの本数）
粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量を下記式（α）により算出し、得られた値から、粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数を下記式（β）及び（γ）により算出した。
（α）：  粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量（ｍｇ）  ＝  凍結乾燥後の粉末の重量（ｍｇ）  −  塩化ナトリウムの重量（ｍｇ）
（β）：  粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（ｍｏｌ）  ＝  ｛粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマー重量（ｍｇ）  ÷  鎖状ポリマーの数平均分子量（ｇ／ｍｏｌ）｝÷１０００
（γ）：  粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（本）  ＝  粒子１ｇあたりに結合した鎖状ポリマーの本数（ｍｏｌ）  ×  ６．０２×１０23（アボガドロ数）
（粒子１ｇあたりの総表面積）
下記式（δ）〜（θ）により算出した。なお、式（ε）中の粒子の比重は、ポリマーの比重、磁性体の比重及び粒子に占めるポリマーと磁性体の比率から計算した。
（δ）：  粒子１個あたりの体積（μｍ3）  ＝  ４／３  ×  π  ×  ｛粒子の体積平均半径（μｍ）｝3
（ε）：  粒子１個あたりの質量（ｇ）  ＝  粒子１個あたりの体積（μｍ3）×粒子の比重（ｇ／μｍ3）
（ζ）：  粒子１ｇあたりの粒子数（個）  ＝  １ｇ  ／  粒子１個あたりの質量（ｇ）
（η）：  粒子１個あたりの表面積（ｎｍ2）  ＝  ４  ×  π  ×  ｛粒子の半径（ｎｍ）｝2
（θ）：  粒子１ｇあたりの総表面積（ｎｍ2）  ＝  粒子１個あたりの表面積（ｎｍ2）  ×  粒子１ｇあたりの粒子数（個）
【００８６】
＜反応性官能基含有量＞
粒子から遊離させた鎖状ポリマーに含まれる反応性官能基（カルボキシ基）の含有量を、電気伝導度測定法（Ｍｅｔｒｏｈｍ社、７９４  Ｂａｓｉｃ  Ｔｉｔｒｉｎｏ）を用いて測定することで、粒子固形分１ｇあたりの反応性官能基の含有量を求めた。
【００８７】
＜モル数ａ、ｂ及びｃ＞
モル数ａとモル数ｃは以下の方法で算出した。モル数ａとモル数ｃを合計しモル数ｂを算出した。
（モル数ａ）
モル数ａ  ＝  粒子１ｇあたりの反応性官能基量（ｍｏｌ）  ／  粒子１ｇあたりのポリマー本数（本）
（モル数ｃ）
下記式（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）から算出した。
（Ａ）：  第２のブロックを構成する構造単位の粒子１ｇあたりの重量（ｇ）  ＝  粒子１ｇあたりの反応性官能基量（ｍｏｌ）  ×  第２のブロックを構成する構造単位の分子量（ｇ／ｍｏｌ）
（Ｂ）：  第１のブロックを構成する構造単位の粒子１ｇあたりの重量（ｇ）  ＝  粒子１ｇあたりの鎖状ポリマーの重量（ｇ）  ―  第２のブロックを構成する構造単位の粒子１ｇあたりの重量（ｇ）
（Ｃ）：  モル数ｃ  ＝  ｛第１のブロックを構成する構造単位の粒子１ｇあたりの重量（ｇ）  ／  第１のブロックを構成する構造単位の分子量（ｇ／ｍｏｌ）｝  ／  粒子１ｇあたりのポリマー本数（本）
【００８８】
＜体積平均粒径＞
各粒子の体積平均粒径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定装置（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＬＳ１３  ３２０）にて測定した。
【００８９】
〔合成例１  水酸基を表面に有する磁性粒子の合成〕
ジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、日油（株）製）２ｇをドデシル硫酸ナトリウム１質量％水溶液２０ｇと混合し、超音波分散機にて微細乳化した。これを、ポリスチレン粒子（数平均粒子径：０．７７μｍ）１３ｇ及び水４１ｇの入った反応器に入れ、２５℃で１２時間撹拌した。
次いで別の容器にて、スチレン９６ｇ及びジビニルベンゼン４ｇをドデシル硫酸ナトリウム０．１質量％水溶液４００ｇで乳化させ、これを上記反応器に入れ、４０℃で２時間撹拌した後、７５℃に昇温して８時間重合した。室温まで冷却した後、遠心分離により粒子のみ取り出したものを水洗し、乾燥した。この粒子を核粒子（数平均粒径：１．５μｍ）とする。
【００９０】
次に別の容器にて、油性磁性流体（「ＥＸＰシリーズ、ＥＭＧ」、（株）フェローテック製）にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、疎水化処理された表面を有するフェライト系の磁性体微粒子（平均一次粒子径：０．０１μｍ）を得た。
【００９１】
次いで、上記核粒子１５ｇ及び上記疎水化処理された磁性体微粒子１５ｇをミキサーでよく混合し、この混合物をハイブリダイゼーションシステムＮＨＳ−０型（（株）奈良機械製作所製）を使用して、羽根（撹拌翼）の周速度１００ｍ／秒（１６，２００ｒｐｍ）で５分間処理し、磁性体微粒子からなる磁性体層を表面に有する母粒子（数平均粒子径：２．０μｍ）を得た。
【００９２】
次に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液２５０ｇを５００ｍＬセパラブルフラスコに投入し、次いで、上記磁性体層を有する母粒子１０ｇを加え、ホモジナイザーで分散した後、６０℃に加熱し温度を保持した。
次いで別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液７５ｇ、メタクリル酸メチル（以下、「ＭＭＡ」という。）１３．５ｇ、トリメチロールプロパントリメタクリレート（以下、「ＴＭＰ」という。）１．５ｇ及びジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、日油（株）製）０．３ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに２時間かけて全量滴下した。滴下終了後、６０℃に保持し１時間撹拌した。
その後別の容器に、ドデシル硫酸ナトリウム０．５０質量％水溶液３７．５ｇ、グリシジルメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」という。）６．５６ｇ、ＴＭＰ０．９４ｇ及びジ（３，５，５−トリメチルヘキサノイル）パーオキサイド７５％溶液（「パーロイル３５５−７５（Ｓ）」、日油（株）製）０．１５ｇを入れて分散させプレエマルジョンを得た。このプレエマルジョンを、６０℃に保持した上記５００ｍＬセパラブルフラスコに１時間２０分かけて全量滴下した。その後７５℃に昇温した後さらに２時間重合を続けて、反応を完了させた。続けて、この５００ｍＬセパラブルフラスコに１ｍｏｌ／Ｌの硫酸水溶液１０ｍＬを入れ、６０℃で６時間撹拌した。次いで、上記５００ｍＬセパラブルフラスコ中の粒子を、磁気を用いて分離した後、蒸留水を用いて繰り返し洗浄した。
以上により、水酸基を表面に有する磁性粒子を得た。
【００９３】
〔合成例２  原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（１）〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン７．５ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２−ブロモイソブチリルブロミド６．３ｍＬを３０分かけて滴下した。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ａ）とする。
【００９４】
〔合成例３  原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（２）〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン０．４ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２−ブロモイソブチリルブロミド０．２ｍＬを加えた。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ｂ）とする。
【００９５】
〔合成例４  原子移動ラジカル重合開始基を表面に有する磁性粒子の合成（３）〕
合成例１で得た水酸基を表面に有する磁性粒子１０ｇをフラスコに投入し、窒素フロー下、脱水テトラヒドロフラン３２ｍＬとトリエチルアミン０．２ｍＬとを加え、撹拌した。このフラスコを氷浴に浸し、２−ブロモイソブチリルブロミド０．１ｍＬを３０分かけて滴下した。室温で６時間反応後、フラスコ内の粒子を、磁気を用いて分離した後、粒子をアセトンに再分散させた。磁気分離と再分散をさらに複数回行った後、ドデシル硫酸ナトリウム０．１０質量％水溶液に粒子を分散した。蛍光Ｘ線分析により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）に含まれるＢｒを検出した。
以上により、原子移動ラジカル重合開始基（２−ブロモイソブチリル基）を表面に有する磁性粒子を得た。この粒子を、粒子（Ｃ）とする。
【００９６】
〔実施例１〕
（１）以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行った。
【００９７】
【化８】
0006453590.tif 000009
【００９８】
すなわち、合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、２−ヒドロキシエチルアクリルアミド（以下、「ＨＥＡＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２−ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ−アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。
【００９９】
（２）次いで、以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行い、ポリ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレート）ブロックのエステル結合を加水分解した。
【０１００】
【化９】
0006453590.tif 000010
【０１０１】
すなわち、上記で得られた粒子を、アニソール６ｍＬに分散させ、これに、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレート０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２−ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合アニソール溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ−アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌアニソール溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で１時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。
次に、水１０ｍＬを加え、２５℃で１２時間撹拌した。
以上で、ＨＥＡＡとメタクリル酸（以下、「ＭＡＡ」という。）のブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子１（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体のＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びブロック共重合体のポリマー密度を測定した。また、反応性官能基（カルボキシ基）含有量と、モル数ａ、ｂ及びｃを測定した。測定結果は表１に示す。
【０１０２】
〔実施例２〕
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレートで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応の反応時間を、１時間から３０分間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子２（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。
【０１０３】
〔実施例３〕
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレートで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応の反応時間を、１時間から１５分間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子３（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。
【０１０４】
〔実施例４〕
（鎖状ポリマー伸長反応（１））
以下の合成経路に従い、鎖状ポリマー伸長反応を行った。
【０１０５】
【化１０】
0006453590.tif 000011
【０１０６】
すなわち、合成例２で得た粒子（Ａ）２ｇを、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］（カルボキシラトメチル）ジメチルアミニウム（以下、「ＣＢＭＡ」という。）０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２−ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ−アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で４時間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去した。
【０１０７】
（鎖状ポリマー伸長反応（２））
次いで、以下の合成経路に従い鎖状ポリマー伸長反応を行った。
【０１０８】
【化１１】
0006453590.tif 000012
【０１０９】
すなわち、上記で得られた粒子を、りん酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）６ｍＬに分散させ、これに、ＨＥＡＡ０．５ｇ、及び０．０５ｍｏｌ／Ｌのトリス（２−ピリジルメチル）アミンと０．０５ｍｏｌ／Ｌの臭化銅（ＩＩ）との混合水溶液０．４０ｍＬを加えた。続いて、Ｌ−アスコルビン酸０．２ｍｏｌ／Ｌ水溶液１．０ｍＬを加え、密栓し反応を開始した。４５℃で３０分間撹拌後、開封し空気にばく露することで反応を停止させた。磁気を用いて粒子を分離し、未反応のモノマーや触媒等を除去することで、ＣＢＭＡとＨＥＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子を得た。ＣＢＭＡとＨＥＡＡのブロック共重合体のＭｎ、Ｍｗ、Ｍｗ／Ｍｎ、及びブロック共重合体のポリマー密度を測定した。測定結果は表１に示す。
【０１１０】
（縮合反応）
次に、以下の合成経路に従い、縮合反応を行った。
【０１１１】
【化１２】
0006453590.tif 000013
【０１１２】
すなわち、上記で得られた粒子１．５ｇを、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）８ｍＬに分散させ、これに、無水コハク酸１．５ｇを溶解したＤＭＳＯ溶液７．２ｍＬ、及びトリエチルアミン０．３ｍＬを加え反応を開始した。２５℃で４時間撹拌後、磁気を用いて粒子を分離し、過剰の原料を除去した。
以上で、ＨＥＡＡ末端の水酸基が反応性官能基（カルボキシ基）に変換された磁性粒子４（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。反応性官能基（カルボキシ基）含有量と、モル数ａ、ｂ及びｃを測定した。測定結果は表１に示す。
【０１１３】
〔実施例５〕
粒子（Ａ）を合成例３で得た粒子（Ｂ）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子５（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。
【０１１４】
〔比較例１〕
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレートで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応の反応時間を、１時間から３時間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子６（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。
【０１１５】
〔比較例２〕
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレートの使用量を０．５ｇから０．１ｇに変更し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドメタクリレートで鎖状ポリマーを伸長させる鎖状ポリマー伸長反応の反応時間を、１時間から１５分間に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子７（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。
【０１１６】
〔比較例３〕
粒子（Ａ）を合成例４で得た粒子（Ｃ）に変更した以外は実施例１と同様の操作を行い、ＨＥＡＡとＭＡＡのブロック共重合体が表面に結合した磁性粒子８（体積平均粒径：３．０μｍ）を得た。
なお、実施例１と同様にして行った各測定の結果は表１に示す。
【０１１７】
〔試験例１〕
各実施例及び比較例で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子にＪｕｒｋａｔ細胞破砕液（タンパク質夾雑物１００μｇが含まれる）１００μＬを加え、３０分間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、粒子をＴＢＳ−Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄した。さらに磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した後、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム水溶液（０．５質量％）を加え、非特異吸着したタンパク質夾雑物を粒子から剥離した。この剥離溶液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動し、ゲルをＣＢＢ染色して粒子に非特異吸着したタンパク質の量を目視にて確認し、以下の基準により評価した。タンパク質の量が少ない粒子ほど非特異吸着の少ない良好な粒子といえる。評価結果は表２に示す。
（評価基準）
◎：タンパク質の吸着がみられず、非常に良好
○：タンパク質の吸着があまりみられず、良好
×：タンパク質の吸着がはっきりと確認され、不良
【０１１８】
〔試験例２〕
各実施例及び比較例で得られた磁性粒子１ｍｇを、水２ｍＬにそれぞれ分散させた。この水分散液をエッペンドルフチューブに投入し、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。次いで、粒子をＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）９９０μＬに分散させ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを加え、室温で３０分間インキュベートした。磁気を用いて粒子を分離して上清を除去し、ＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ５．０）１ｍＬに分散させ、抗ＴＳＨ抗体（フナコシ社製）１５μｇを加えた。室温で１２時間インキュベートした後、磁気を用いて粒子を分離して上清を除去した。ＴＢＳ−Ｔ（０．０５質量％Ｔｗｅｅｎ２０）緩衝液で５回洗浄し、抗体結合粒子を得た。抗体結合量をＢＣＡ  Ａｓｓａｙにより求めた。結果を表２に示す。
【０１１９】
【表１】
0006453590.tif 000014
【０１２０】
【表２】
0006453590.tif 000015
【０１２１】
表２に示すとおり、各実施例で得られた磁性粒子は、リガンドが結合しやすく、且つ非特異吸着が抑制されたものであった。