(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子における少なくとも１つの修飾塩基を検出するための方法であって、
ａ）ある核酸配列を含んでなる該二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記修飾塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程；および
ｅ）前記二本鎖核酸分子上の前記遮断の位置を決定する工程
を含んでなり、
ここで、前記工程ｅ）における前記決定は、
・前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚ）を測定する工程；
・前記二本鎖核酸分子が変性された際に、前記二本鎖核酸分子の、支持体に結合されている二末端間の距離（ｚｈｉｇｈ）を測定する工程；および
・ｚとｚｈｉｇｈを比較する工程
を含んでなり、
ここで、前記二本鎖核酸分子がヘアピンであり、かつ、前記二本鎖核酸の一方の末端が直接的または間接的に支持体に結合され、前記二本鎖核酸の他方の末端が可動支持体に結合している、方法。
【請求項２】
工程ｂ）において前記配列に対応する一本鎖核酸分子がさらに準備される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二本鎖核酸が、工程ａ）において、支持体同士を引き離すことによって変性される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
支持体を引き離すことによって前記二本鎖分子に１５ｐＮ以上の物理的力がかけられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記変性二本鎖核酸が、工程ｃ）において前記支持体同士を近づけることによって復元される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記二本鎖分子にかけられる力が、前記支持体同士を近づけることによって１２ｐＮ以下に低減される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程ａ）〜ｄ）が数回繰り返される（測定値を蓄積し、シグナル／ノイズ比を高めるために）、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
遮断の持続時間を測定するさらなる工程を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記遮断の持続時間を参照値と比較するさらなる工程を含んでなる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が結合した核酸配列を決定する工程をさらに含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの修飾塩基が、エピジェネティック修飾、ミスマッチ若しくはＳＮＰから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
修飾塩基が４−メチルシトシン（４ｍＣ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、５−ヒドロキシメチルウラシル（５ｈｍＵ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記修飾塩基が５ｍＣである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が、前記修飾塩基と結合し得る抗体若しくは酵素である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質がＭｕｔＳダイマー、Ｍｓｈ２／Ｍｓｈ６（ＭｕｔＳα）、およびＭｓｈ２／Ｍｓｈ３（ＭｕｔＳβ）からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
核酸分子に含まれる配列中の修飾塩基の検出が、
ａ）前記核酸を、その集団の大多数に見られる配列を含んでなる一本鎖核酸とハイブリダイズさせる工程；および
ｂ）生じたミスマッチを、請求項１〜１１または１４のいずれか一項に記載の方法によって検出する工程、を含んでなる、
請求項１〜１１または１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、あるタンパク質が特定のＤＮＡ配列に結合するかどうかを判定するための方法に関する。この方法は、特に、ＤＮＡ配列に対する修飾（例えば、メチル化）を、その修飾を特異的に認識するタンパク質（例えば、抗体）の結合によって同定するために、また、種々のタンパク質の、ＤＮＡ上の結合配列を特定するためにも有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡに対するタンパク質の結合は、生物学において主要な現象であり、それは細胞機能およびウイルス機能の調節に基本的役割を持つ。これらには、ＤＮＡ複製、転写、ＤＮＡ修復、およびＤＮＡ組換えなどの基本的細胞プロセス、また、ＤＮＡ修飾または染色体構造の維持も含まれる。
【０００３】
ゲノムの特定の部位に結合してゲノムの発現および維持を調節するタンパク質がいくつか存在する。ＤＮＡ結合タンパク質は、多様かつ重要な生体機能を有する大きなタンパク質ファミリーを成している。このＤＮＡ結合タンパク質ファミリーは、細菌、古細菌(archea)および真核生物の種々のゲノムの中で最も分布が多く、最も研究されているものである。真核生物および原核生物転写因子など、これらのタンパク質の大部分は、ＤＮＡの輪郭でそれらの認識を達成するために、独立に折り畳まれる単位（ドメイン）を含んでいる。それらには、転写因子として知られる重要な遺伝子調節タンパク質、およびＤＮＡプロセシングタンパク質、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮＡエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼ、およびＤＮＡ修復・組換えタンパク質が含まれる。
【０００４】
これらのタンパク質が結合する部位を特定することは至難の業であることが分かっている。例えば、ヒトゲノムでは、７００を超える推定Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー転写因子が存在する(Tadepally et al., BMC Evol. Biol., 8: 176, 2008)が、既知の結合モチーフを有するものはこれらのうち約１０％に過ぎない(Matys et al., Nucleic Acids Res., 34: D108-D110, 2006)。さらに、ＤＮＡに対するタンパク質結合の熱力学的平衡特性は周知であるが、それらの結合および非結合の動態を測定することはさらに困難な課題である。
【０００５】
ＤＮＡ−タンパク質相互作用は、ゲルシフトアッセイ、フットプリント法、および転写活性化などの様々な方法を用いて研究される(Carey et al., Cold Spring Harb Protoc, 2012(7): 733-57, 2012)。これらの方法はそれぞれ、結合の位置または効果に関して異なる情報を与え得るが、特定の結合を定量的に測定する簡便な方法を提供するものではない。蛍光偏光／異方性は、フィルター結合工程、電気泳動工程、または沈澱工程を用いずに直接溶液中でＤＮＡ−タンパク質結合を正確に測定するための、迅速で非放射性の方法を提供する(Guest et al., 1991; Heyduk and Lee, 1990; LeTilly and Royer, 1993; Lundblad et al., 1996; Royer et al., 1992)。
【０００６】
ゲノム情報が種々の生体分子の合成を指示する分子機構は、ここ３０年間、分子生物学研究の多くの焦点となっている。これまでの研究は一般に個々の遺伝子に集中しており、このようにして得られた一般原則は転写、クロマチンリモデリング、メッセンジャーＲＮＡスプライシング、ＤＮＡ複製および多くの他のゲノムプロセスに洞察を与えた。このような多くの原則が、さらなる遺伝子が検討されるにつれ妥当となると思われるが、それらは一般に、生体機能に関するゲノムワイドな洞察を与えるものではなかった。他方、転写産物および調節情報に系統的解析は遺伝子および調節領域の同定に不可欠であり、ヒトの生物学および疾患の研究の重要な情報源となる。また、このような解析は、遺伝子の編成および変動、ならびに細胞関連、種および個体間の調節情報の概観ももたらし得る。
【０００７】
例えばヒトゲノムの総ての転写因子結合部位を同定するためのエンコードプロジェクト(Encode project)（ＤＮＡ成分の百科事典）などのゲノムワイドな試みは、煩雑で極めて労働集約的であることが分かっている(The ENCODE Project Consortium, Nature, 489: 57-74, 2012)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、タンパク質／核酸の相互作用を検出するための簡単かつ信頼性のある方法の必要がなおある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、物理的操作によって核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法に関する。
【００１０】
物理的技術と電気的処理に基づく本発明による方法は、化学的または生化学的な現行アプローチとは異なる。本発明による方法は、従来技術に優る利点を与える。
１）単一の核酸分子に対する、単一のタンパク質またはタンパク質複合体分子の検出に基づくことから高感度であること。単一分子を使用することで、タンパク質がその核酸標的を見つけるのに必要な時間およびそれがその標的上に留まる時間だけでなく、その結合事象の正確な位置も測定することができる。
２）高価な標識ヌクレオチド（蛍光団または何らかの他の基を有する）を使用しないこと。
３）二本鎖核酸分子の二末端間の距離を測定することにより、二本鎖核酸上のタンパク質結合部位の正確な位置（ｂｐ単位）を測定可能なこと。
４）秒単位で周期的に測定を繰り返すことができるので、偽陽性が排除され、統計値が改善され、装置のドリフトが有意に軽減されること。
５）同じ分子で実験を何回も繰り返すことができるので、統計値および測定の信頼性が改善されること。
６）いずれの核酸結合タンパク質の検出も可能であること。従って、核酸の構造的修飾を特異的に認識するタンパク質が同定でき、その構造的修飾の部位が検出できる。
【００１１】
本発明は、配列決定された核酸分子上の、タンパク質が結合している部位の物理的位置に基づき、核酸配列に対するタンパク質の結合を検出するための方法に関する。
【００１２】
本発明に関して、「結合」とは、高分子間（例えば、タンパク質と核酸間）の非共有結合的相互作用を意味する。このような相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１以下の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」とは、結合の強度を意味し、高い結合親和性ほど低いＫｄと相関している。
【００１３】
「核酸分子に対するタンパク質の結合の検出」とは、本明細書では、前記タンパク質と前記核酸分子の間の相互作用の有無に関する何らかの情報の取得に直接的または間接的につながるあらゆる取り組みを意味する。前記結合の検出は、例えば、結合反応の動態パラメーターまたはタンパク質が結合した部位の配列などの付加的情報の決定を含んでも含まなくてもよい。当業者には自明であるように、本発明の方法は、このような決定を容易に実行可能とする。
【００１４】
本発明は、変性した二本鎖核酸の二鎖が適当な条件下で再ハイブリダイズするという所見に基づく。もし、復元工程の際に、ある分子が前記変性二本鎖核酸分子の鎖のいずれかに結合すれば、再ハイブリダイゼーションは部分的でしかなくなる。本発明者らは、今般、ある特定の条件下で、この再ハイブリダイゼーションの停止が、恒久的であれ一時的であれ、タンパク質と前記変性二本鎖核酸分子の間の相互作用を検出するために使用可能であることを見出した。本発明によれば、二本鎖核酸分子の再ハイブリダイゼーションの遮断を検出することができ、その後、この遮断に関連する物理的パラメーター（例えば、遮断の持続時間、二本鎖核酸分子上の遮断の位置）が、タンパク質と核酸の配列との間の相互作用の検出を可能とする。
【００１５】
よって、本発明は、ある核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法であって、変性した二本鎖核酸分子の復元の遮断を検出する工程を含んでなる方法に関する。
【００１６】
「変性」とは、本明細書では、二本鎖間の水素結合の大部分が切れた際に起こる二本鎖核酸分子の二鎖の分離のプロセスを意味する。変性プロセスにより変性した核酸分子が得られ、この変性した核酸分子とは本明細書では、二本鎖核酸分子の変性から生じる２本の分離した相補鎖を意味する。「復元」とは、本明細書では、２本の分離した相補鎖がハイブリダイゼーションを介して二重らせんに再形成するプロセスを意味する。本明細書で用いる場合、「ハイブリダイゼーション」は、核酸の２以上の相補鎖間の非共有結合的、配列特異的相互作用を確立して単一のハイブリッドとするプロセスである。
【００１７】
核酸を変性させるために当業者に公知の可能性がいくつかある。最も好ましい様式では、２本の鎖を、それらに物理的力をかけることによって分離する。本発明による「物理的力」は、ある物体にその移動、方向または幾何学的構成のいずれかに関して特定の変化を受けさせる任意の作用である。本発明による力が、例えば、温度などの他の物理的パラメーター（すなわち、それに対して及ぼされる作用というよりむしろ物体の特性そのものである）とは異なるということが当業者には明らかであろう。本発明による物理的力は、摩擦、張力、垂直力、空気抵抗力、付加力、および弾力などの力を含んでなる。最も好ましくは、本発明による物理的力は張力である。この実施形態によれば、前記二本鎖核酸の遊離末端を引き離して、対合塩基間の総ての結合を破断し、二本鎖核酸を開くことができる。
【００１８】
本発明は、いずれのタイプの二本鎖核酸にも当てはまる。ほとんどの場合、二本鎖核酸はＤＮＡであるが、本発明はまた、完全に対合したまたは完全には対合していない一本鎖ＤＮＡ−一本鎖ＤＮＡの二重鎖、あるいはまた完全に対合したまたは完全には対合していない一本鎖ＤＮＡ−一本鎖ＲＮＡの二重鎖、あるいはまた完全に対合したまたは完全には対合していない一本鎖ＲＮＡ−一本鎖ＲＮＡの二重鎖にも当てはまると理解される。さらに、二重鎖は、異なる起源のサンプルから得られた２本の一本鎖が少なくとも部分的に再対合したものからなってもよい。最後に、本発明はまた、単一の一本鎖ＤＮＡまたは単一の一本鎖ＲＮＡの二次構造にも当てはまる。
【００１９】
よって、本発明の方法は、ある核酸分子に対するタンパク質の結合を検出するための方法であって、
・二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；および
・前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
【００２０】
有利には、前記方法は、前記遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなる。
【００２１】
ＤＮＡ分子に対するタンパク質の結合をアッセイするためのこのタイプの方法では、再対合を促進するために、引き離す前に、二本鎖ＤＮＡの遊離末端（すなわち、支持体に結合されていない末端）が互いに共有結合的にまたは擬共有結合的に連結されるようにしておくことが有利であり得る。好ましい実施形態では、二本鎖核酸分子はヘアピンである。本発明に関して二本鎖核酸を図示することが望まれる場合には、開いた（または閉じた）「ジップファスナー」に模することができ、二本鎖核酸の変性はジップが開いた状態であり、復元は再び閉じた状態である。
【００２２】
本発明者らは、ある特定の条件下で、ある分子が変性した二本鎖核酸分子に結合すると、前記二本鎖核酸分子の復元が遮断されることを見出した。この結合分子は、前記変性二本鎖核酸分子、例えば、核酸、タンパク質または小分子上の特定の配列に親和性を有するいずれのタイプの分子であってもよい。
【００２３】
本発明の第１の態様では、タンパク質を用いて、前記二本鎖核酸の復元を遮断する。
【００２４】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書使用する場合、同義であり、ペプチド結合を介して共有結合的に連結されて鎖となったアミノ酸のポリマーを意味する。ペプチド結合は、あるアミノ酸のカルボキシル基と次のアミノ酸のアミノ基との間で形成される。これらの用語はまた、１以上のアミノ酸が、対応する天然アミノ酸の化学類似体または修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも当てはまる。用語「アミノ酸」は、Ｄ型およびＬ型両方の立体異性形の、天然に存在する総てのαアミノ酸、ならびにそれらの類似体および誘導体を意味する。類似体は、アミノ酸の原子の、通常類似の特性を有する異なる原子での置換と定義される。誘導体は、別の分子または原子がそれに結合されているアミノ酸と定義される。誘導体には、例えば、アミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化、または２つのシステイン分子の硫黄残基の酸化によるシスチンの形成が含まれる。
【００２５】
タンパク質は複数の機能を持ち得る。「結合タンパク質」は、別の分子と非共有結合的に結合し得るタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、ＤＮＡ分子と結合することができ（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子と結合することができ（ＲＮＡ結合タンパク質）、および／またはタンパク質分子と結合することができる（タンパク質結合タンパク質）。タンパク質結合タンパク質の場合、それはそれ同士で結合することができ（多量体の形成）、かつ／または異なる１または複数のタンパク質の１以上の分子と結合することができる。結合タンパク質は、２種類以上の結合活性を持ち得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合活性とＲＮＡ結合活性とタンパク質結合活性を持つ。よって、本発明による「核酸結合タンパク質」は、核酸と相互作用し得るタンパク質である。よって、本発明による「一本鎖核酸結合タンパク質」は、一本鎖核酸と相互作用し得るタンパク質であり、よって、本発明による「二本鎖核酸結合タンパク質」は、二本鎖核酸と相互作用し得るタンパク質である。
【００２６】
よって、この実施形態によれば、本発明の方法は、ある核酸配列を含んでなる核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法であって、
ａ）前記配列を含んでなる前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記タンパク質を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；および
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる方法に関する。
【００２７】
有利には、前記方法は、遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなる。
【００２８】
当技術分野で周知のように、核酸結合タンパク質は、それらが一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡおよびｓｓＲＮＡ）と結合し得るか、または二本鎖核酸（ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドなど）と結合し得るかによって区別され得る。
【００２９】
本発明の方法の第１の実施形態では、変性した二本鎖核酸の復元を遮断するために使用されるタンパク質は、一本鎖核酸と結合し得るタンパク質である。
【００３０】
一本鎖核酸に対して親和性を有する核酸結合タンパク質は、変性した二本鎖分子それ自体と相互作用でき、従って、二本鎖核酸の復元の遮断をもたらす。当業者であれば、本発明が、タンパク質が特定の配列と結合しなくとも、結合反応動態のパラメーターの容易かつ正確な決定を可能とすることを理解するであろう。実際に、一本鎖核酸結合タンパク質は、ほとんどの場合、特定の配列に親和性を持たず、むしろ核酸全般に親和性を持つ。例えば、ヘリカーゼは、ｄｓＤＮＡをほどくためにｓｓＤＮＡギャップに結合することが知られている。細菌の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、すなわちＳＳＢは、未熟なアニーリングを防ぐため、一本鎖ＤＮＡがヌクレアーゼによって消化されないようにするため、およびＤＮＡから二次構造を除くために、ＤＮＡの一本鎖領域と結合する。ＤＮＡ二本鎖切断修復および相同組換えに重要なタンパク質であるＲａｄ５２タンパク質は、一本鎖ＤＮＡ末端に結合し、相補的ＤＮＡ鎖のアニーリングに必要なＤＮＡ−ＤＮＡ相互作用を媒介する。
【００３１】
これらの一本鎖核酸結合タンパク質は核酸に全般的親和性を有し、このことは、本発明に関して、これらのタンパク質が、前記核酸の配列とは無関係に、一本鎖核酸と結合し得ることを意味する。このような非配列特異的核酸結合タンパク質は、異なる配列と１００倍未満、通常は１０倍未満の解離定数の違いで、複数の無関連のＤＮＡ配列と結合する。
【００３２】
他方、特定の配列を含む核酸分子に親和性を有する核酸結合タンパク質もあり、すなわち、それらは前記配列を含んでなる核酸のみを認識して結合する。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の総ての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格のリン酸残基との接触）。実際に、大多数の一本鎖核酸結合タンパク質は、核酸に全般的親和性しか持たず、これらのタンパク質の一部が一本鎖核酸の特異的配列と結合することができる。従って、配列特異的核酸結合タンパク質は、特定の配列、または互いに高い程度の配列同一性（例えば、少なくとも約８０％の配列同一性）を示す特定の配列のファミリーと、無関連の配列の少なくとも１００倍の親和性で結合する。配列特異的核酸結合タンパク質の、その特定の配列に対する解離定数は、通常、約１００ｎＭ未満であり、１０ｎＭ、１ｎＭ、１ｐＭ、または１ｆＭといった低いものである場合もある。
【００３３】
核酸結合タンパク質の多くは、一本鎖核酸と結合することができない。これらのタンパク質は、むしろ二本鎖核酸に対して親和性を有し、変性した二本鎖分子それ自体とは相互作用できない。これらのタンパク質は、これらの条件下で二本鎖核酸の復元の遮断を誘発しない可能性が高い。
【００３４】
これらのタンパク質のほとんどは、二本鎖核酸配列を認識して結合する。例えば、二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質は、新たなタンパク質の発現の調節に重要な役割を果たす。これらのタンパク質は、種々の構造モチーフの手段でＤＮＡと相互作用し、それらが結合するＤＮＡ配列の特性および位置に応じて、メッセンジャーＲＮＡの転写を刺激したり抑制したりすることができる。
【００３５】
この場合、前記二本鎖分子を変性させた後に、一本鎖核酸分子を前記二本鎖核酸結合タンパク質とともに提供することが有利であり得る。実際に、前記一本鎖核酸は、変性した二本鎖核酸の鎖の一方上にある相補配列とハイブリダイズして、そのタンパク質が結合できる二本鎖核酸ハイブリッドを形成することができることが当技術分野で周知である。この一本鎖核酸は、復元プロセスを遮断するのに十分な長さである限りいずれの長さであってもよい。優先的には、一本鎖核酸の長さは、３〜５０ヌクレオチドの間、より優先的には、３〜４５ヌクレオチドの間、３〜４０ヌクレオチドの間、３〜３５ヌクレオチドの間、３〜３０ヌクレオチドの間、３〜２５ヌクレオチドの間、３〜２０ヌクレオチドの間、３〜１５の間、いっそうより優先的には３〜１２の間で構成される。本発明の一本鎖核酸は、特に、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であってよく、天然型または修飾型のいずれでもよい。前記一本鎖核酸はまた、例えば、リボース部分が２’酸素および４’炭素をつなぐ付加的架橋で修飾されているヌクレオチドであるロックド核酸（ＬＮＡ）、または主鎖がペプチド結合で連結されたＮ−（２−アミノエチル）−グリシン単位の繰り返しで構成されるペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修飾ヌクレオチドから作製されてよい。
【００３６】
従って、一本鎖核酸分子を復元前に変性した二本鎖核酸に加えた場合、再ハイブリダイゼーションの遮断は、その一本鎖核酸分子の配列が二本鎖核酸分子の配列の少なくとも一部に相補的であることを示す。
【００３７】
本発明者らは、二本鎖核酸結合タンパク質が存在する場合、それは変性した二本鎖核酸と一本鎖核酸分子の間で形成されたハイブリッドと結合できることを示した。このタンパク質と核酸ハイブリッドの間の相互作用は、遮断の持続時間の変化をもたらす。ほとんどの場合、この相互作用は、復元の遮断の延長をもたらす。例えば、プライマーゼは、そうでなければヘアピンの復元を検出に十分な時間遮断するには十分安定でなかったであろうＤＮＡオリゴを安定化する。同様に、プライマーとして使用される小オリゴヌクレオチドの３’末端へのＤＮＡポリメラーゼの結合はその安定性を増す。あるいは、遮断の持続時間は短縮することもできる。実際に、本発明者らは、いくつかのヘリカーゼの結合が前記ハイブリッドの不安定化を誘発し、より短い遮断時間で翻訳されることを示した。
【００３８】
よって、この好ましい実施形態によれば、本発明の方法は、
ａ）特定の配列を含んでなる二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記タンパク質と前記核酸配列に対応する一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質と前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；および
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる。
【００３９】
この実施形態は、二本鎖核酸内に含まれる配列に対する前記タンパク質の結合の判定を可能とすることから特に有利である。
【００４０】
典型的な構成では、二本鎖核酸分子は、２つの固体基質（例えば、顕微鏡スライド、マイクロピペット、微粒子）に特異的に固定することができる。一方の末端を表面に直接的または間接的に固定し、他方の末端を可動表面に直接的または間接的に固定することができる。この実施形態では、これらの支持体を遠ざけると、二本鎖核酸の両末端に張力がかけられる。張力が閾値よりも大きいと、２本の鎖は分離され、核酸分子は変性される。かけられる張力は優先的には１５ｐＮ以上であり、より優先的には１６ｐＮ以上であり、いっそうより優先的には１７ｐＮ以上であり、極めて好ましい態様では、１８ｐＮ以上である。この力は、温度、ヌクレオチドタイプおよびバッファーによって変わり得るが、当業者ならば、２本の鎖の分離を得るためにこれらのパラメーターに対して前記の力を容易に適合させることができる。他方、張力が最小値よりも小さくなれば、変性した二本鎖核酸の２本の鎖は再ハイブリダイズすることができる。前記２本の鎖の再ハイブリダイゼーションを得るためには、１２ｐＮ以下の張力が優先的にかけられ、より優先的には、１１ｐＮ以下であり、いっそうより優先的には１０ｐＮ以下である。
【００４１】
最も好ましくは、二本鎖核酸はヘアピンである。本明細書で用いる場合、「ヘアピン」とは、一方の鎖の５’末端が他方の鎖の３’末端に不対合ループによって物理的に連結されている二重らせんを意味する。前記の物理的連結は、共有結合または非共有結合のいずれであってもよい。優先的には、前記物理的連結は共有結合であっても非共有結合であってもよい。優先的には、前記物理的連結は共有結合である。よって、ヘアピンは、二本鎖ステムと、不対合の一本鎖ループからなる。ヘアピンにおいて、ループに関与していない２本の鎖の末端は遊離状態であり、従って引き離すことができる。その結果、二本鎖核酸の対合解除が起こり、変性した二本鎖核酸分子が生じる。閾値より大きな力で前記核酸分子の各末端を引っ張ることによって、ヘアピン二本鎖核酸分子を完全に開くことができる。この分子にかけられる張力が最小値よりも小さくなると、核酸分子は再ハイブリダイズしてヘアピンを再形成する。前記の変性した核酸分子（例えば、ｓｓＤＮＡ）に結合したタンパク質が存在すると、再ハイブリダイゼーションの停止が起こる。同様に、開いたヘアピンの核酸鎖の一方にハイブリダイズした一本鎖核酸分子が存在しても再ハイブリダイゼーションの停止が起こり、この停止の持続時間は、二本鎖核酸結合タンパク質がその複合体に結合している場合には変更される（すなわち、延長または短縮される）。従って、このような停止の持続時間における変化の検出は、タンパク質が二本鎖ステムの少なくとも一部に結合していることを示す。
【００４２】
この点で、ヘアピンが短い期間、例えば１秒の後にリフォールディングするようなループの配列および長さを設計することが有利である。この効果に対する方法は従来技術、例えば、Woodside et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103(16): 6190-6195, 2006に記載されている。この力を開状態から試験値まで小さくすると、開いたヘアピンの伸長は一本鎖ＤＮＡの弾性のために変動する。このヘアピンのリフォールドまでの小さな遅延により、ユーザーは、遮断状態を検出するために使用したものと同じ力でヘアピン伸長を測定することが可能となる。
【００４３】
ヘアピンを使用すれば、特に、対合と対合解除のサイクルを行うこと、従って、シグナル／ノイズ比を改善することが可能となる。
【００４４】
二本鎖核酸の遊離末端を互いに連結させる技術は公知であり、いくつかを以下にさらに詳しく記載する。
【００４５】
遮断の判定とは、本明細書では、遮断に関連する物理的パラメーターの決定を意味する。１つの有用なパラメーターは二本鎖核酸分子上の遮断の位置であり、この位置は開いた二本鎖核酸分子に対するタンパク質の結合の位置、または開いた二本鎖核酸分子上への一本鎖核酸分子のハイブリダイゼーションに相当する。実際に、本発明者らは、復元の停止が起こる二本鎖核酸上の位置が正確に決定可能であることを見出し、ヘアピンの使用は、当業者に変性／復元プロセス中の任意の時点でヘアピンの２つの遊離末端間の物理的距離を測定する手段を与える。
【００４６】
よって、本発明によれば、前記方法は遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなることが特に有利である。
【００４７】
この好ましい実施形態によれば、本発明は、ある核酸配列を含んでなる核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法であって、
ａ）ある核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記タンパク質を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程；および
ｅ）前記二本鎖核酸分子上の前記遮断の位置を決定する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００４８】
「遊離末端」とは、本明細書では、もう一方の鎖の末端に共有結合的に連結されていない一方の鎖の末端を意味し、上述したように、これらの遊離末端はそれぞれ異なる表面に結合させることができる。例えば、これらの表面の一方は可動であり得、他方は不動であり得る。従って当業者は、ヘアピン二本鎖核酸の遊離末端間の距離を測定するために、単にその２つの表面間の距離を測定すればよいということを容易に理解するであろう。
【００４９】
この距離は、ヘアピン核酸はその後完全に伸長されるため、ヘアピン分子が完全に変性された際に最大（ｚｈｉｇｈ（Ｆｏｐｅｎ））となり、ヘアピン分子が完全に復元された際に最小（ｚｌｏｗ（Ｆｔｅｓｔ））となる。長さの比較は総て、一本鎖核酸が同じ弾性特性を有するように同じ力Ｆｔｅｓｔで行うことが有利である。当業者は、ループが閉じる時間の遅れを用いてＺｈｉｇｈ（Ｆｔｅｓｔ）を測定することができる。同様に、復元プロセスが一時的に停止された場合の２つの遊離末端間の距離を測定することができ、予想されるように、この距離ｚはｚｈｉｇｈとｚｌｏｗの間を含む（ｚは総てＦ＝Ｆｔｅｓｔで測定される）。距離ｚは、ヘアピン分子内の、一本鎖核酸結合タンパク質の結合の位置、またはそれに対して一本鎖核酸が相補的である配列の結合の位置によって異なることは自明である。前記タンパク質がヘアピンの遊離末端付近に位置する配列に結合すれば、自己再ハイブリダイゼーションプロセスは、完全なヘアピンが再形成される直前で遮断され、この場合にｚｐａｕｓｅは最小となる。他方、前記タンパク質がヘアピンの、不対合ループ付近の部分に結合すれば、復元プロセスは、ヘアピンが完全にまたはほぼ完全に変性された状態で停止され、この場合にｚｐａｕｓｅは最大となる。同様に、前記一本鎖核酸が、ヘアピンの遊離末端付近に位置する配列とハイブリダイズすれば、自己再ハイブリダイゼーションプロセスは、完全なヘアピンが再形成される直前で遮断され、この場合にｚｐａｕｓｅは最小となる。他方、前記一本鎖核酸がヘアピンの、不対合ループ付近の部分に結合すれば、復元プロセスは、ヘアピンが完全にまたはほぼ完全に変性された状態で停止され、この場合にｚｐａｕｓｅは最大となる（図１）。
【００５０】
二本鎖核酸分子における物理的距離と塩基数は正確に相関させることができる。例えば、距離０．８ｎｍは、１０ｐＮの力の下で、一本鎖核酸において２つの連続するヌクレオチドにわたる距離（１ｂｐ）に相当する。力に対する伸長の正確な較正は、一本鎖核酸の弾性により与えられる。従って、部分的に再閉鎖した二本鎖核酸分子の２つの遊離末端（または分子上の任意の２つ参照位置）の間の距離を単に測定することにより、復元が遮断された場所を正確に決定することができる。
【００５１】
よって、一実施形態では、本発明は、核酸分子に対するタンパク質の結合を判定するための方法からなり、この場合、前記二本鎖核酸分子をまず、物理的力をかけることによって変性させ、次に、前記タンパク質および場合により一本鎖核酸の存在下で再ハイブリダイズさせ、再ハイブリダイゼーションの遮断の存在を検出する。一態様において、復元プロセスが遮断された際に、部分的に復元した二本鎖分子の２つの末端間の距離が決定される。優先的には、分子が完全に変性された際に、前記分子の２つの末端間の距離が決定される。より優先的には、これら２つの距離が比較され、遮断の位置が決定される。より優先的には、完全に伸長されたループと参照ハイブリダイゼーション位置の間の距離が測定され、遮断の位置を決定するために使用される。いっそうより優先的には、２つの参照ハイブリダイゼーション位置の間の距離が測定され、遮断の位置を決定するために使用される。
【００５２】
分子上のその位置の他、復元の遮断に関連する最も有用なパラメーターは、復元が遮断されている時間（本明細書では復元停止の持続時間と呼ばれる）である。実際に、再ハイブリダイゼーションが遮断されている時間を測定することが可能である。例えば、当業者ならば、二本鎖核酸の２つの末端間の距離が上記で定義されたようなｚ、すなわち、ｚｈｉｇｈとｚｌｏｗの間の中間値である時間を決定することができる。
【００５３】
変性した二本鎖核酸と相補的な一本鎖核酸の間のハイブリダイゼーションにより遮断が生じる場合、遮断の持続時間は、２配列間の相補性の程度に依存する。相補性が高いほど、２分子間で確立される結合の数が増え、従って、持続時間が長くなる。また、遮断時間は２配列間の相補性の領域の長さに依存することも明らかである。領域が長いほど、２分子間で確立される結合の数が増え、従って、持続時間が長くなる。従って、ある特定の条件下では復元停止の持続時間がほぼ恒久的となることが容易に想像できる。特に、一本鎖核酸が変性した二本鎖核酸とハイブリダイズ可能な２０を超える、好ましくは２５を超える、いっそうより好ましくは３０を超えるヌクレオチドを含んでなる場合には、その一本鎖核酸は、前記二本鎖核酸にかけられる力がＦｔｅｓｔまで小さくなって二本鎖ヘアピンとハイブリダイズしたままとなり(何分も）、従って、前記二本鎖ヘアピンの自己再ハイブリダイゼーションを妨げる。このような場合、一本鎖核酸分子の放出のために酵素を使用すること、または力を数秒間０．５もしくは１ｐＮに引き下げて、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを効率的に放出する第三相を加えることが有利であり得る。従って、前記一本鎖核酸分子の放出は、対合と対合解除のサイクルを行うこと、従って、シグナル／ノイズ比を改善することを可能とする。
【００５４】
停止の持続時間はまた、反応条件によって異なり得る。前記持続時間は、温度が高くなるほど短くなる。同様に、バッファー条件も停止の持続時間を変調することができ、例えば、マグネシウム、ベタインおよび塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣはモル濃度で使用される）は遮断時間を延長する。これらの化合物はＧＣ対よりもＡＴ対を強めるので、これらの対の間の強度の違いを小さくする。しかしながら、温度およびバッファーが固定された場合、停止の持続時間は、変性した二本鎖核酸上の引っ張り力および一本鎖核酸とのその相補性にのみ依存する。実際に、本発明者らは、力が小さくなると遮断時間が指数関数的に短くなることを示した。
【００５５】
最後に、停止の持続時間は、タンパク質と変性した二本鎖核酸と相補的一本鎖核酸の間で形成される複合体の特性にも依存する。二本鎖核酸結合タンパク質(double-stranded acid nucleic-binding protein)はこの複合体を安定化させ得る。その二本鎖核酸に対する親和性が高いほど、停止は長くなる。また、タンパク質が二本鎖核酸を不安定化して（例えば、ＲＮＡポリメラーゼの開放型複合体の場合）停止を短くすることもできる。
【００５６】
同様に、変性した二本鎖核酸と結合し得るタンパク質の存在は、前記核酸分子の復元を一時的に遮断する。この遮断の持続時間もまた、核酸に対するタンパク質の親和性に依存する。前記分子に対して高い親和性を有するタンパク質が、より低い親和性を有するタンパク質よりも長い停止をもたらすのは明らかである。
【００５７】
当業者ならば、停止の測定が、実験の節に説明されるように、平均遮断時間、従って、結合反応の動態パラメーターの決定を可能とすることを容易に理解するであろう。
【００５８】
よって、１つの特定の態様では、本発明の方法は、
ａ）前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）タンパク質と、場合により一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質と、場合により前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程；および
ｅ）停止の持続時間を決定する工程
を含んでなる。
【００５９】
好ましくは、前記方法は、遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなる。
【００６０】
この実施形態では、この停止の持続時間を対照と比較してもよい。特に、前記タンパク質が二本鎖核酸結合タンパク質である場合、前記の停止を、その方法をそのタンパク質の不在下で行った場合に測定された停止と比較することが有利であり得る。上記で説明したように、変性した二本鎖核酸と相補的一本鎖核酸の間で形成された複合体に対する前記タンパク質の結合は、復元遮断の持続時間を変化させる。前記の遮断は、停止の持続時間の延長または短縮（具体的なタンパク質による）として解釈される。
【００６１】
よって、好ましい一実施形態では、本発明の方法は、
ａ）前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）タンパク質と、場合により一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質と、場合により前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程；
ｅ）停止の持続時間を決定する工程；および
ｆ）タンパク質の不在下での持続時間と比較する工程
を含んでなる。
【００６２】
有利には、前記方法は、遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなる。
【００６３】
結合部位の配列に関する情報を求めずに核酸に対するタンパク質の結合を検出および測定することができるが、適用によっては、そのような配列を決定することが有用な場合もある。例えば、前記タンパク質の結合を排除する前記結合部位の突然変異を同定することに着目される場合がある。
【００６４】
よって、好ましい一実施形態では、本発明の方法は、ある核酸配列を含んでなる二本鎖核酸分子の対するタンパク質の結合を判定するための方法であって、
ａ）前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）前記タンパク質と、場合により前記二本鎖核酸分子の少なくとも一部に相補的な一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）前記タンパク質と、場合により前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程；および
ｅ）前記タンパク質が結合した核酸配列の配列を決定する工程
を含んでなる。
【００６５】
有利には、復元の遮断の検出の後に、遮断の位置を決定する工程を行う。
【００６６】
好ましくは、前記タンパク質および前記一本鎖核酸分子は、結合部位の配列決定を行う前に、二本鎖核酸分子を洗い流す。
【００６７】
本発明の方法は単一分子の検出に基づくので、事前の増幅なく単一分子を配列決定できる方法を使用することが好都合である。このような単一分子の同定および配列決定法は、従前に記載されている（ＷＯ２０１１／１４７９３１；ＷＯ２０１１／１４７９２９；Ding et al., Nature Met, 9(4): 367-372, 2012）。これらの配列決定法は、変性した二本鎖核酸分子の復元の遮断の検出に基づく。よって、本発明による配列決定法は、好ましくは、
ａ）前記核酸配列に対応する二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｂ）一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｃ）前記一本鎖核酸分子の存在下で前記二本鎖核酸分子を復元する工程；および
ｄ）前記二本鎖核酸の復元の遮断を検出する工程
を含んでなる。
【００６８】
有利には、前記方法は、遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなる。
【００６９】
これらの配列決定法は、本方法と同じ装置を使用するので、本発明の方法と容易に組み合わせることができる。ヘアピンにより表面につなぎ止められた磁性ビーズを引っ張ることにより、分子のジップを開くことができる。この開状態で、それは相補的一本鎖核酸とハイブリダイズすることができ、これにより、引張力が小さくなった際にヘアピンの再閉を一時的に遮断する。表面から遮断されたヘアピンのビーズまでの距離を測定することにより、分子上のハイブリッドの位置をほぼ一塩基の精度で決定することができ、従って、そのローカル配列（溶液中の既知の一本鎖核酸の配列の相補物）がどこにあるかを確認することができる。従って、実験の構成を変更することなく、タンパク質および場合により相補的一本鎖核酸を含有するバッファーを、前記方法に従って配列決定を行うのに好適なバッファーに置き換えるだけで、前記タンパク質が結合した分子を直接、配列決定することができる。
【００７０】
ＤＮＡシス調節エレメントの効率的な同定は、ポストゲノム生物学の中心的課題である。ゲノム内の特定の核酸結合タンパク質の結合部位を総て同定することは、その発現が前記タンパク質により調節される可能性のある総ての遺伝子を同定することになるので、特に有用である。ＤＮＡシス調節エレメントの包括的同定は、転写ネットワーク動態の予測的理解に重要である。
【００７１】
全ゲノムＤＮＡ配列データ、ハイスループット技術、および新規なアルゴリズムの合流は、我々の転写調節エレメントの同定および特性決定能を急速に高めている(Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95: 14863-14868, 1998; Tavazoie et al., Nat. Genet., 22: 281-285, 1999; Bussemaker et al., Nat. Genet., 27: 167-171, 2001; Lee et al., Science, 298: 799-804, 2002)。しかしながら、これらのアプローチは内在限界を持つ。例えば、遺伝子発現クラスタリングおよびシス調節モチーフの発見を用いるハイブリッド法の成功は、実験室で使用される生理学的摂動の範囲により制限される。チップに基づくクロマチン免疫沈降法（ＣｈＩＰ）などのｉｎ  ｖｉｖｏアプローチについても、ＤＮＡ−タンパク質の相互作用が、まさにそれらの調節的役割のために特定の環境条件下でしか起こらず、同じことが言える(Lee et al., Science, 298: 799-804, 2002)。これらの制限は、実験データを得るのがより難しい後生動物真核生物ではいっそうより厳しい。
【００７２】
本方法は、ＣｈＩＰ（染色体免疫沈降法）およびＤＮアーゼＩフットプリント法などの従来技術の方法に代わる、ゲノムにおける転写因子の結合位置をマッピングするための別法を与える(The ENCODE Project Consortium, Nature, 489: 57-74, 2012)。
【００７３】
よって、別の態様によれば、本発明はまた、特定の核酸結合タンパク質と結合し得る配列を含んでなる核酸分子を同定するための方法であって、
ａ）二本鎖核酸分子の集団を準備する工程；
ｂ）前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、上記の方法によって試験する工程；および
ｃ）前記タンパク質と結合し得る核酸分子を選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００７４】
好ましくは、本方法は、前記核酸分子の結合部位に相補的な一本鎖核酸の提供を含む。
【００７５】
よって、この実施形態によれば、本方法は、
ａ）二本鎖核酸分子の集団を準備する工程；
ｂ）前記二本鎖核酸分子を、前記分子に物理的力をかけることによって変性させる工程；
ｃ）前記タンパク質と前記結合部位に相補的な一本鎖核酸分子を準備する工程；
ｄ）前記タンパク質と前記一本鎖核酸分子の存在下で、前記二本鎖核酸分子を復元する工程；
ｅ）前記二本鎖核酸の復元の遮断の有無を検出する工程；および
ｆ）復元が一時的または恒久的に遮断される核酸分子を選択する工程
を含んでなる。
【００７６】
有利には、前記方法は、遮断の位置を決定するさらなる工程を含んでなる。
【００７７】
このようにして単離される核酸分子は、前記の特定の結合配列を含んでなる核酸分子の集団に相当する。従って、それらは、この特異的配列を含むという点で他の核酸分子とは異なる。これらの分子は総てこの配列を有しているが、それ以外の点は同じであってもなくてもよい。特定の実施形態では、当業者には、前記の特定の結合配列外で異なる各核酸分子の配列を同定することが好ましい場合がある。実際に、特定の核酸結合タンパク質に対する１以上の結合部位を含む核酸分子を同定する場合には、同定された分子を、例えば、上記の配列決定法で配列決定することが有利であり得る。この工程によって得られた情報によって、全ゲノムにおける前記分子の位置決定が可能となり、従って、この結合部位によって調節され得るまたは調節されないと思われる発現単位が同定できる。これは、配列決定工程により得られた情報を用いてデータベースを注意深く検索することによって容易に達成でき、当業者は、配列決定により得られた配列を含むクローンを、公開配列データベース（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ）を助けにどのようにして探せばよいかを知っており、これはここでさらに詳しく述べる必要はない。
【００７８】
好ましい実施形態では、二本鎖核酸分子の集団は、全ゲノムを表す。
【００７９】
二本鎖核酸分子の集団は有利には、まず、染色体をレアカッター制限酵素により消化することによって得られる。当業者に知られているように、レアカッター制限酵素は、ゲノムに稀にしか存在しない認識配列、例えば、７または８塩基を含んでなる認識配列を有する制限酵素である。このようなレアカッター酵素の例としては、ＳｆｉＩ、Ｘｍａ  Ｉ、Ａｓｃ  Ｉ、ＡｓｉＳ  Ｉ（イソ制限酵素Ｓｇｆ  Ｉ）、Ｎｏｔ  Ｉ（イソ制限酵素ＣｃｉＮ  Ｉ）、Ｓｂｆ  Ｉ（イソ制限酵素Ｓｓｅ８３８７  Ｉ、Ｓｄａ  Ｉ）、Ｆｓｅ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉなどが挙げられる。これらの酵素は総て市販されている。第２段階において、このようにして得られた制限断片をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩなどの通常の６塩基制限酵素で消化する。次に、得られた直鎖二本鎖断片をヘアピンへ変換することができる。二本鎖の遊離末端を互いに連結させる技術は公知であり、いくつかを以下にさらに詳しく記載する。
【００８０】
本発明の方法のもう１つの特定の適用は、エピジェネティック修飾の検出におけるものである。このような試験は現在のところ実施が極めて難しく、多くのＤＮＡ修飾を見過ごす。しかしそれでも、エピジェネティック修飾は、微生物感染および腫瘍学を含む様々な病理に極めて重要である。上記発明は、ゲノムＤＮＡに対する修飾を全領域または選択領域においてスクリーニングするために使用できることが有利である。
【００８１】
ＤＮＡに対するエピジェネティック修飾は、ほとんど総ての生物のゲノムに存在する。それらの種類および位置は、生物、組織、および細胞種によって、経時的に、また、環境との相互作用によって異なる。これらの修飾には慎重に制御されたプロセスによって生じるものがある。他のものはＤＮＡ損傷の結果である。
【００８２】
このような修飾は、ＤＮＡ内に保存可能な情報の量を著しく拡大する。例えば、大腸菌(Escherichia coli)のｄａｍ遺伝子は、二本鎖ＤＮＡの−ＧＡＴＣ−配列のアデニンをメチル化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼをコードし、これにより遺伝子発現を調節する（例えば、Calmann and Marinus, J. Bacteriol., 185(16): 5012-5014, 2003)参照）。他方、真核生物において最も一般的なエピジェネティックマーカーは５−メチルシトシン（５ｍＣ）である。この特異的修飾は、多様な重要細胞プロセスおよびより広い生理学的プロセスを制御および調節するために必要とされ、ヒトにおけるＤＮＡメチル化の問題は、様々な疾患、最も顕著には特定のタイプの癌に関連付けられている。５ｍＣの他、真核生物には多様な他のＤＮＡ修飾が存在する(Korlach and Turner, Curr.Opin.Struct.Biol., 22: 251-261, 2012)。
【００８３】
本時点で、５ｍＣの判定の標準は「バイサルファイト変換」であり、メチル化されているもの（不変で残る）以外の全てのシトシン残基がウラシルに変換される。次に、このＤＮＡ産物を増幅させると、ウラシルがチミンへ変換される。その後、これらの変換の変化をＤＮＡの配列決定により検出することができる(Song et al., Nature Biotechnol, 30(11): 1107-1116, 2012)。しかしながら、これは煩雑で、時間がかかり、コストもかかる方法であり、誤り率は５〜３４％である(Beck, Nature Biotechnol, 10: 1026- 1028, 2010)。
【００８４】
本発明は、核酸のエピジェネティック修飾を検出するための容易な方法を提供する。「エピジェネティック修飾」は、本明細書において、前記核酸分子の合成後に起こる核酸分子を構成する塩基の修飾を意味する。このようなエピジェネティック修飾には、とりわけ、４−メチルシトシン（ｍ４Ｃ）、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）および５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、ならびにＤＮＡにおける６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、およびＲＮＡにおける５−ヒドロキシメチルウラシル（５ｈｍＵ）およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）が含まれる。
【００８５】
よって、１つの特定の態様では、本発明は、二本鎖核酸分子内に含まれる少なくとも１つの修飾塩基を検出するための方法であって、
ａ）前記二本鎖核酸を準備する工程；
ｂ）前記修飾塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程；および
ｃ）前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を上記の方法によって試験する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００８６】
場合により、本発明の方法は、結果をより良くバリデートするために可能性のある修飾の部位を認識する単純なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを試験するさらなる工程を含んでなり得る。例えば、５ｍＣメチル化をその抗体で検出した後に、配列ＡＴＧＣをオリゴＮＮＴＡＣＧＮＮで検出することができる。
【００８７】
この方法は、非修飾結合分子を可逆的プロセスで使用するので特に有利である。例えば、５ｍＣを検出するために使用される場合には、ＤＮＡに対する化学的（重硫酸ナトリウム）反応は必要とされない。さらに、本発明の方法は、単一分子の単位で修飾塩基の検出を可能とするので、従来技術のいずれの方法よりもはるかに感度が高い。
【００８８】
好ましい実施形態では、修飾塩基は、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）、５−ヒドロキシメチルウラシル（５ｈｍＵ）、およびＮ６−メチルアデノシン（ｍ６Ａ）からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、前記塩基は５ｍＣと５ｈｍＣの間で選択される。いっそうより好ましい実施形態では、前記塩基は５ｍＣである。これらの修飾塩基を特異的に認識し結合するタンパク質が記載されている。例えば、５ｍＣに対する抗体が記載されており、細胞に基づく可視化のためにこの修飾を染色することにより使用される(Ito et al., Nature, 466: 1129-1133, 2010; Ko et al., Nature, 468: 839-843, 2010; Szulwach etal., Nature Neurosci, 14: 1607-1611, 2011; Haffner et al., Oncotarget, 2: 627-637, 2011; Inoue et al., Science, 334: 194, 2011; Inoue et al., Cell Res, 21: 1670-1676, 2011)。このような抗体は市販されている（例えば、クローン３３Ｄ３；ｒｅｆ：Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆの３９６４９）。抗体の他、対象とするヌクレオチドを特異的に認識してそれと反応する酵素が同定されている(Song et al., Nature Biotechnol, 30(11): 1107-1116, 2012)。例えば、Ｔ４バクテリオファージ酵素β−グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）は、グルコース部分を５ｈｍＣに転移する。Ｔｅｔ１−３タンパク質は、５ｍＣの５ｈｍＣへの変換を担う。メチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）は、５−ｍＣを含むＤＮＡに対するその親和性により最初に同定された。好ましくは、前記タンパク質は、前記修飾塩基に対する抗体または前記塩基を特異的に認識する酵素である。より好ましくは、前記タンパク質は抗体である。
【００８９】
同じ方法が核酸の他の修飾の検出にも適用できることが明らかである。例えば、二本鎖核酸分子に存在するミスマッチを検出することができる。細菌ＭｕｔＳなどのタンパク質は、娘鎖上のミスマッチ塩基を認識し、突然変異したＤＮＡと結合することが長年知られている。このような特性は、二本鎖核酸分子中のミスマッチを検出および同定するために利用することができる。
【００９０】
従って、二本鎖核酸分子中の少なくとも１つのミスマッチを検出するための方法であって、
ａ）前記二本鎖核酸分子を準備する工程；
ｂ）ミスマッチ塩基と結合し得るタンパク質を準備する工程；および
ｃ）前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、上記の方法によって試験する工程
を含んでなる方法を提供することも本発明の一態様である。
【００９１】
ＭｕｔＳはミスマッチにダイマーとして結合することが知られているので、本発明の方法においてＭｕｔＳダイマーを使用することが有利である。真核生物では、ＭｕｔＳホモログは、２つの主要なヘテロ二量体：Ｍｓｈ２／Ｍｓｈ６（ＭｕｔＳα）およびＭｓｈ２／Ｍｓｈ３（ＭｕｔＳβ）を形成する。好ましくは、前記タンパク質は、ＭｕｔＳダイマー、Ｍｓｈ２／Ｍｓｈ６（ＭｕｔＳα）、およびＭｓｈ２／Ｍｓｈ３（ＭｕｔＳβ）の間で選択される。
【００９２】
一塩基多型（ＳＮＰ、pronounced snip； plural snips）は、生物種のメンバー間またはヒトの対をなす染色体間で、ゲノム（または他の共有配列）中の一塩基、すなわちＡ、Ｔ、ＣまたはＧが異なる場合に生じるＤＮＡ配列バリエーションである。平均して、ＳＮＰはヒト集団中に１％を超える割合で見られる。ヒトのＤＮＡ配列のうち約３〜５パーセントのみがタンパク質の産生をコードしているので、ほとんどのＳＮＰはコード配列外に見られる。コード配列内に見られるＳＮＰは、タンパク質の生体機能を変化される可能性が高いことから、特に注目される。
【００９３】
ＳＮＰを含んでなる分子は、その集団の大多数に見られる配列を含んでなる分子とハイブリダイズした際にミスマッチを生じる。よって、本発明は、ＳＮＰの容易な検出を可能とする。
【００９４】
よって、この実施形態は、核酸分子に含まれる配列中のＳＮＰを検出するための方法であって、
ａ）前記核酸を、その集団の大多数に見られる配列を含んでなる一本鎖核酸とハイブリダイズさせる工程；および
ｂ）生じたミスマッチを、上記の方法によって検出する工程
を含んでなる方法に関する。
【００９５】
供試核酸が二本鎖核酸である場合、工程ａ）の前に前記核酸を変性させることが有利であり得る。
【００９６】
これらの方法は、上記の方法の簡単な適合によって全ゲノムスケールで実施可能であることが明らかである。これは、例えば、ゲノムにおいて特定の修飾塩基を含む総ての部位の同定につながるであろう。その発現が前記の修飾塩基によって影響を受けやすい遺伝子は、このような修飾塩基を含む核酸分子の配列決定を行うことによって同定することができる。さらに、次に、前記修飾塩基の後代への伝達を評価することもできる。これらの情報は、サイレントで留まる遺伝子もあれば世代を経て発現を維持する遺伝子もあることを確認することが重要である動物または植物の選抜などの分野で注目され得る。
【００９７】
さらに別の態様では、タンパク質のその特定の結合配列に対する結合を妨げる化合物を同定するための方法が提供される。これらの化合物は、前記タンパク質のその結合部位への結合を減少させるか、または無くす。このような化合物は、治療薬として有用であり得る。例えば、発癌型のｃＭｙｃのその結合部位との相互作用を妨げる化合物は、癌を治療するために有用となろう。
【００９８】
この実施形態によれば、本発明は、タンパク質とその結合部位の間の相互作用を妨げ得る少なくとも１つの化合物を同定するための方法であって、
ａ）前記タンパク質と、前記結合部位に対応する配列を含んでなる核酸分子とを準備する工程；
ｂ）化合物を準備する工程；および
ｃ）前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合を、上記の方法によって試験する工程
を含んでなる方法に関する。
【００９９】
好ましい実施形態では、化合物は、前記核酸分子に対する前記タンパク質の結合が減少するか、または無くなる場合に選択される。
【０１００】
癌に関与するほとんどの核酸結合タンパク質は、二本鎖核酸と結合する転写因子であることが明らかである。従って、別の好ましい実施形態では、前記核酸分子は二本鎖核酸分子である。さらなる好ましい実施形態では、本方法は、前記二本鎖核酸分子の配列に相補的な一本鎖核酸を準備する工程をさらに含んでなる。当然のことながら、これらの分子は、結合の試験を行う前に準備される。
【０１０１】
本発明の方法の実施は、特に、単一分子のレベルでリアルタイム核酸互作用をプロービングするように設計されたデバイスの存在によって可能となった。このようなデバイスは、例えば、米国特許第７，０５２，６５０号および同第７，２４４，３９１号に記載されている。そこに記載されている装置では、ミクロンサイズの超常磁性ビーズにピコニュートン規模の力をかけるために磁気トラップを使用する。簡単に述べれば、前記装置は、光学顕微鏡、磁石およびＰＣを含んでなる。二本鎖核酸分子の一方の末端が静止部材、例えば、表面に複数の点で固定され、他方の末端は可動表面、この場合には磁性ビーズに固定される。このビーズに作用する磁石を設ける。特に、これらの磁石は前記表面からビーズを引き離すために使用することができる。しかしながら、本発明の方法の実施は、上記の装置に限定されない。本発明の方法を実施するためには、一分子の二本鎖核酸を完全に伸長させ、次いでリフォールディングし、同時に前記分子の伸長をモニタリングすることを可能とするいずれのデバイスも使用可能である。例えば、光ピンセットが使用可能であるが、それらは事前の力の較正を必要とし、ハイスループット測定のための並列化が容易ではない。さらなる欠点は、核酸のねじれの制御の調節が複雑なこと、および集束レーザーにより溶液が局所的に加熱される可能性があり、ハイブリダイゼーション条件を変化させるおそれがあることである。
【０１０２】
二本鎖核酸を、その一方の標識（例えば、ビオチン）末端で結合する適当なビーズ（例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたもの）の溶液中で数分間インキュベートする。これらのビーズは、後に光ピンセットが操作に使用される場合には透明であり得、または磁気トラップもしくは磁気ピンセットを操作に使用する場合には磁性であり得る。
【０１０３】
ビーズ−核酸アセンブリは流体チャンバー中に注入され、その流体チャンバーの表面は、分子の他方の標識末端と結合するような処理が施されている（例えば、核酸のＤｉｇ標識末端と結合するように抗Ｄｉｇでコーティングされた表面）。従って、これらのビーズは、核酸ヘアピンを介して表面に固定される（図１ａ参照）。次に、前記ビーズと前記表面の距離が当業者に公知の様々な手段でモニタリングされるが、例えば、カメラでのそれらの画像の回折リングを用いてそれらの距離を導き出すこともできるし、またはエバネッセントモードで照射を行う場合には、それらが散乱する（もしくは蛍光により発する）光強度を用いてそれらの距離を測定することができる。あるいは、それらが生じる磁場を測定して（ＧＭＲまたはＨａｌｌセンサなどの磁気センサを使用）、固定表面上のセンサまでのそれらの距離を導き出すことができる。
【０１０４】
ビーズを固定する核酸分子を表面に引き寄せるため、種々の技術が記載されている。集束レーザービームの光を用いれば、焦点付近の透明ビーズを捕捉することができる。固定表面に対する光線の相対的並進により、つなぎ止めている分子に力をかけることができる（典型的な光ピンセットアッセイ）。かけられている力はその平衡位置からのビーズの移動に比例し、つなぎ止めている分子に一定の力をかけるには、トラッピングビームにフィードバックループを必要とする。
【０１０５】
ビーズに一定の力をかけるためには、ビーズ周囲の流れによって生じる流体力学的抵抗の使用が記載されているが、通常、それから得られる空間精度は低い（＞１００ｎｍ）。好ましい実施形態は、上記のように、核酸ヘアピンによって表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成では、サンプル上に配置した小さな磁石を用いて、固定されたビーズに一定の力をかけるが、その位置は＜１ｎｍの精度で決定することができる（引張力および流体力学的抵抗による散逸による）。
【０１０６】
どの場合においても、つなぎ止めているヘアピンは、約１６ｐＮより大きな力でビーズを引き寄せることによって機械的に完全に開くことができることを注記しておく。分子にかける張力を約１１ｐＮより小さくすると、ヘアピンに自発的に再閉させることができる（開状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である）。もし、開状態の際に、伸長した一本鎖核酸に、溶液中の一部の分子（例えば、タンパク質、またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡもしくはＰＮＡの相補的オリゴヌクレオチド）が結合していれば、力が１１ｐＮよりも小さくなった場合に、これらの分子はヘアピンの再閉を遮断する。従って、このアッセイの原理は２つの力の間の切り替えであり、大きい方のＦｏｐｅｎはヘアピンを開き、小さい方のＦｔｅｓｔは、再閉させ、一時的遮断の際の分子の伸長を測定するために用いられる。遮断位置は、完全伸長と遮断状態の間の直線関係により、配列に関連づける。精度を最も良くするためには、完全伸長は、好ましくは、テスト張力Ｆｔｅｓｔで測定する。これは、力がＦｏｐｅｎからＦｔｅｓｔへと小さくなったところで、一瞬でリフォールディングされるようにヘアピンループを設計することによって達成される。
【０１０７】
核酸を表面または支持体に結合させるためには、当技術分野で公知のいずれの技術を用いてもよい。本質的に、核酸は、例えばマイクロビーズなどの支持体に直接的に固定され、支持体は、例えば核酸の官能基化末端と反応することができるストレプトアビジン、ＣＯＯＨ基などでコーティングすることによるなど、この表面の官能基化を含む。
【０１０８】
このような方法では一般に、核酸の、特に３’および５’末端の官能基化、すなわち、適当な化学基をそれらにグラフトすることが必要となる。さらに、操作の終了時に鎖が解離するのを防ぎ、適切な場合、後者を繰り返すことができるように、分子の他の２つの遊離末端をループにより連結することが好ましい。この目的で、様々な手順を採用することができる。
【０１０９】
最も単純なのは、合成オリゴヌクレオチドを用いて二本鎖核酸の一方の末端を２種類の異なる官能基（例えば、ビオチンとアミン）で官能基化することであり、これにより２つの異なる前処理面への固定が可能となる。この２本の鎖の他方の末端は、部分的に対合したループの形態の合成ヌクレオチドを用いて連結することができる。このようにして、対合した一本鎖核酸、すなわちヘアピンが二本鎖核酸から生成される。この方法の利点は、大きな核酸断片の異種集団（遺伝子または染色体の分画で得られるような）を官能基化し、次に同時に分析できる能力にある。この場合、核酸サンプルは２種類の（またはそれを越える）制限酵素を用いて分画され、その酵素は、断片全体は類似している、その末端に２種類の異なる制限部位を有する部分集団を得ることを可能にする。これにより、二末端に異なる処理を施すことができる（例えば、一方の末端を、その末端に適当な制限部位を有するループの形態のオリゴヌクレオチドに連結することによる）。この方法の欠点は２つの隣接する官能基間の立体的障害にあり、これにより表面への結合が困難となる場合がある。この問題を解決するために、ヘアピン分子の各遊離末端に塩基の「スペーサー」配列を付加し、次にその末端に官能基を付加し、２つのスペーサー配列は非相補的であり、各官能基に、その専用の表面に結合する十分なスペースを提供することが有利であり得る。さらに有利には、各スペーサー配列の配列が、既知配列の一本鎖シークエンシングプライマーを本発明の配列決定法において使用するために設計される。二本鎖核酸分子へのループおよび／またはスペーサーの付加は、分子生物学で慣用されている任意の方法を用いて行うことができる。これらの方法は当業者に周知であり、従ってここでは詳細に記載する必要はない。
【０１１０】
実際の固定技術については、多数あり、それらは高分子（タンパク質、ＤＮＡなど）を市販の前処理表面に固定するための技術から派生したものである。これらの技術の大部分は免疫学的検査のために開発されたものであり、タンパク質（免疫グロブリン）を、タンパク質のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）末端またはアミン（−ＮＨ２）末端と反応できる基（−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＯＨなど）を有する表面に連結させる。
【０１１１】
核酸の共有結合による固定は、直接的に、分子の５’末端の遊離のリン酸基を介して行うことができ、それは第二級アミン（ストラスブールのＰｏｌｙｌａｂｏにより市販されているＣｏｖａｌｉｎｋ−ＮＨ表面）と反応して共有結合を形成する。また、ＤＮＡをアミン基で官能基化し、次にタンパク質と同様に処理することも可能である。
【０１１２】
ストレプトアビジンでコーティングした表面（Ｄｙｎａｌビーズなど）もあり、ストレプトアビジンとビオチン化ＤＮＡ分子との間の擬共有結合的固定を可能にする。最後に、ジゴキシゲニンに対する抗体を表面にグラフトすることにより（上述の方法による）、ジゴキシゲニンで官能基化された核酸がそこに固定され得る。これは多くの潜在的な固定技術の一例にすぎない。
【０１１３】
結合および固定技術としては、例えば、欧州特許第１５２８８６号に記載の、セルロースなどの固相支持体へのＤＮＡの結合のために酵素的カップリングを用いる技術も挙げておくべきである。
【０１１４】
また、欧州特許第１４６８１５号は、支持体へのＤＮＡの結合の種々の方法を記載している。
【０１１５】
同様に、特許出願ＷＯ９２／１６６５９は、ＤＮＡを結合させるためにポリマーを使用する方法を提案している。
【０１１６】
当然ながら、核酸は支持体に直接結合させてもよいが、必要であれば、特に表面の作用を限定することを目的に、例えば、欧州特許３２９１９８号に記載されているように、核酸をペプチドまたは他の種の不活性アームの末端に結合させてもよい。
【０１１７】
以下の実施例は、本発明のその他の特徴および利点を明らかにすることを明らかにすることを可能にするであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】オリゴヌクレオチドの、ヘアピンＤＮＡ上のその相補配列へのハイブリダイゼーションの検出原理。表面にビーズを固定するヘアピンＤＮＡ（ａ）は、ビーズを引き寄せる力を約１６ｐＮの値まで大きくすることによって瞬時に開く。この状態で、溶液中の相補的断片が開いたＤＮＡヘアピン上のその標的とハイブリダイズし、これにより、力が再び最初の値まで小さくなった際に、ヘアピンの再閉が一時的に妨げられる（ｂ）。遮断点とヘアピンの最初の長さとの間の分子の伸長の差（ｚｈｉｇｈ−ｚ）から、ヘアピン上のどこに相補配列が対合したかを導き出す。遮断の平均タイムスパンから、そのハイブリッド上にミスマッチが存在する可能性およびそれらの位置を読み取ることができる。（ｃ）力を１１．４ｐＮから１７．８ｐＮに増し、再び最初の値まで戻した時のヘアピンのタイムトレース。約１０秒の再ハイブリダイゼーション中に停止が見られる。この停止は７ヌクレオチドより長い（ここでは、シグナルは１０マーによるもの）相補的（またはほぼ相補的）オリゴマーの溶液中でのみ存在が見られる。
【図２】ａ）Ｆｔｅｓｔ＝９ｐＮで得られた１０ｎｔのオリゴヌクレオチドの遮断時間の指数分布。ｂ）９ｎｔのオリゴヌクレオチドで得られたＦｔｅｓｔに対するＴｏｆｆの指数関数的依存。
【図３】その相補性を見出すための、１２ｎｔオリゴヌクレオチドによる、開状態の持続時間Ｔｏｐｅｎの時の遮断確率Ｐｂｌｏｃｋ＝Ｎｂ．遮断されたサイクル／Ｎｂ．サイクルの推移。フィットは、オリゴヌクレオチド濃度が２０ｎＭである場合、分子がその標的を見つけるのに必要な時間Ｔｏｎは一般に１５秒であることを示す。この時間は試験中に使用される力に依存しない。総ての事象が検出されたならばパラメーターａ（Ｆ）は１に相当するが、短い事象は見逃されるので、特にＦｔｅｓｔが小さい場合には、ａ（Ｆ）は１より小さい。
【図４】遮断確率は、オリゴヌクレオチド濃度とともに上昇し、飽和する。ここでは、濃度２７．５ｎＭの１２ｎｔのオリゴヌクレオチドは、１０秒持続する開状態およびＦｔｅｓｔ＝８ｐＮの場合に、２サイクルに１回見られる遮断をもたらす。図３に示すように、Ｐｂｌｏｃｋの飽和は事実上１には達しないが、これは極めて見時間遮断が見逃されるからである。
【図５】１２ｎｔのオリゴヌクレオチドのその相補的基質に対する結合特性をバッファーのイオン強度の関数として定義する動態パラメーター。ｋｏｆｆはイオン強度によってほとんど変動はないが、ｋｏｎは強い依存性を示す。ｋｏｎは、Ｍｇ２＋を添加することにより３倍上昇する。平衡定数ｋｄは、両動態パラメーターから計算することができる。
【図６】プライミングＤＮＡ配列に相補的な５ｎｔ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドを安定化するプライマーゼによるヘアピンの遮断。ｂ）配列上の遮断事象の位置。ｃ）Ｆｔｅｓｔ＝９ｐＮの場合に見られた、プライミングプロセスにおいてペンタマーＲＮＡオリゴヌクレオチドを安定化するＴ４プライマーゼにより生じた遮断時間の分布。５ｎｔ−ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、目に見える様式ではヘアピンのリフォールディングを遮断しない。Ｔ４プライマーゼＷＴを用いた場合、配列上の予想された位置で遮断が起こり、遮断時間は５秒である。Ｅ２４８Ｑ突然変異体を用いた場合、本発明者らは、同じ現象を観察したが、遮断時間は有意に短い。
【図７】Ｆｏｐｅｎ＝２０ｐＮでの開放段階、Ｆｔｅｓｔ＝１０ｐＮでの試験段階およびＦｃｌｅａｎ＝０．５ｐＮでの洗浄段階の３相でＤＮＡに対するヘリカーゼＲｅｃＱの結合を試験するサイクルシリーズ。１０のトレースが示され、少数が１サイクルに遮断事象を示す。力の小さい洗浄段階は、鋳型から結合したいずれの酵素も除去されるように保証する。ＡＴＰの不在下で、ＲｅｃＱがまさに結合してリフォールディングを遮断し、リフォールディングフォークの圧力がヘリカーゼのスライディングを生じ、その遮断の位置は連続工程によって低下する。
【図８】ＲｅｃＱの遮断確率の、その濃度に対する推移。Ｐｂｌｏｃｋは濃度の上昇とともに上昇して飽和し、これはここでは特性濃度が２２６ｐＭと定義される。
【図９】ＡＴＰを含まない場合の鋳型上のＲｅｃＱヘリカーゼの遮断位置の分布。
【図１０】１．２ｋｂ  ＤＮＡヘアピン上の、メチル化シトシンに対する抗体によりもたらされた遮断のシグナルの生値。３つのトレースは、５サイクルにわたってヘアピンの伸長を示した。各サイクルは２０ｐＮの力で５．５秒間ヘアピンを開くことで始め、その後、Ｆ＝６．５ｐＮで３７秒持続する試験段階が続く。  ほとんどの回で、サイクルは遮断を呈することはなく（１）、１つのヘアピンが同じサイクルで連続的遮断を呈する可能性があり（２）、その遮断は数サイクルで拡大する可能性がる。［Ａｃ］抗体濃度は３５ｎＭであり、バッファーは、非特異的結合を妨げるために０．２％のＢＳＡを含有するＴｒｉｓ  １００ｍＭである。  トレースは見やすいようにｙ軸でシフトさせた。
【図１１】ヒトＤＮＡメチルトランスフェラーゼによりメチル化された後の１．２ｋｂヘアピンの配列上のメチル化位置のヒストグラム。異なるビーズの４つのヒストグラムを示す。結合位置には共通点があり、真核生物のメチル化に関して４つの予想結合位置、ならびにそのＤＮＡが元々産生された大腸菌(E. coli)により行われたメチル化に相当する８８２に１つが見られる。
【図１２】２秒で強め２秒で弱める力の平滑勾配でヘアピンを開閉する３０サイクルの記録。サイクルの代表的な点を、Ｆ＝１．５ｐＮおよびＺ＝０で始まる反時計回りに（矢印参照）示す：力が増すと、力が１５ｐＮになるまでは伸長は極めて小さく留まり、そこで分子が開き、Ｚが１．３μｍに達する。力が一定勾配で小さくなると、ＺはＦ＝１１ｐＮまでゆっくり小さくなり、この時点で、ヘアピンは１２ｎｔのオリゴヌクレオチドにぶつかるまでリフォールディングする。力が小さくなり続けると遮断のＺも小さくなり続けるが、力が小さくなると、間もなく、菱形の記号によるＺマークの急速な低下に見られるように、オリゴヌクレオチドが放出される時点に達する。オリゴヌクレオチドの解離に対応する力の分布は右に示し、７ｐＮ前後のその最大値は、Ｔｏｆｆが一瞬に値する力に相当する。
【図１３】ヒト細胞から得られたヒトＤＮＡ上のメチル化部位の検出。ヘアピンＤＮＡは、２．５ｋｂヒトゲノムＤＮＡ分子から調製した。Ａ）測定サイクル中にかけられる力の変動：ヘアピンは１９ｐＮの力で５秒間開かれ、この力は１０秒間８．５ｐＮに引き下げられる。Ｂ）分子の開状態を示す、５ｍＣに対する抗体の存在下でのおよそ２０サイクルで得られたシグナルの重畳と、その後の一時的遮断によって中断されるその再閉。これらの遮断は、５ｍＣに対する抗体の結合によって引き起こされる。Ｃ）遮断位置ヒストグラムは、５ｍＣの存在に相当する十分に定義された位置を示す。約２０か所が存在し、およそ１００塩基につき１つのメチル化であることが示唆される。
【実施例】
【０１１９】
試験例
発明の背景
ＤＮＡに対するタンパク質の結合は、生物学において主要な現象であり、それは多くの反応を制御する極めて一般的なプロセスである。この機構の熱力学的平衡特性は周知であり、その動態の測定は、より困難な課題である。単一分子を使用することで、タンパク質がそのＤＮＡ標的を見つけるのに必要な時間だけでなく、その結合事象の正確な位置も測定することができる。本発明者らは、ここで、これらの目標を達成する新規な単一分子アッセイを記載する。
【０１２０】
このアッセイは幅広いが、本発明者らはまず、特異的オリゴヌクレオチドの結合、およびｓｓＤＮＡに対するヘリカーゼの非特異的結合に対するその適用を説明する。最後に、本発明者らは、ＤＮＡ中のメチル化部位を認識する抗体の特異的結合について述べる。
【０１２１】
概要
本発明は、ＤＮＡヘアピンの再ハイブリダイゼーションの中断の機械的検出に基づく、多様なＤＮＡ修飾およびＤＮＡ−タンパク質結合事象の検出のための新規な方法に関する。このアッセイは、単一分子の結合の統計情報を提供する一連のサイクルに頼るものである。一サイクルとしては、単一のＤＮＡヘアピンが、約１６ｐＮより大きな力Ｆｏｐｅｎでその末端を引っ張ることによって時間Ｔｏｐｅｎ中にフォールディングを解除される、開放段階で始まる。第２の試験段階では、Ｔｔｅｓｔを持続して、張力Ｆｔｅｓｔを約１１ｐＮより小さくすると、ヘアピンを再閉することができる。溶液中に存在する分子が特定の配列に結合できるか、または開いたヘアピン上に非特異的に結合（例えば、修飾できればされたまたは修飾されていない特定の一本鎖または二本鎖配列を認識することができるタンパク質）、それは確率ＰｂｌｏｃｋでそのＤＮＡと結合し、そうなれば、力が約１１ｐＮより小さくなった際にその再閉を一時的に遮断する。この中断は、ヘアピンの再ハイブリダイゼーション中に特定の位置で生じる停止として容易に検出でき、３つのパラメーターをもたらす：
・伸長したＤＮＡ上のこの停止の位置Ｚｂｌｏｃｋは、認識される配列に特徴的である
・遮断の持続時間Ｔｏｆｆは、分子がＤＮＡとの結合を維持していた時間を特徴付ける；および
・分子がその結合部位を見つけるのに必要な時間Ｔｏｎに関する遮断確率Ｐｂｌｏｃｋ。
【０１２２】
ＴｏｎおよびＴｏｆｆは両方とも、ＤＮＡと遮断分子の間の相互作用の強度に特徴的である。よって、ＤＮＡ配列（ヘアピンとして一方の末端をビーズに、他方の末端を表面に結合されたもの）をメチル化認識タンパク質または抗体でプロービングすることにより、ヘアピンの開閉のサイクルを繰り返すことによって、プロービングされたメチル化部位の存在を同定することができる（再ハイブリダイゼーションの際のヘアピンの一部の遮断の存在による）。同様に、タンパク質が存在する場合と存在しない場合で相補的オリゴヌクレオチド間のハイブリッドの安定性の増大を測定することにより、推定ｄｓＤＮＡ部位に対するタンパク質の結合を測定することもできる。
【０１２３】
本発明は、バイサルファイト反応およびＰＣＲ増幅工程を経ることなく、ゲノムＤＮＡにおけるＤＮＡ修飾を検出することを可能とする。本発明は、ビーズを表面に結合するために使用可能なヘアピン断片へとそれを処理するために必要なＤＮＡのいくらかの前処理を必要とする（断片化および適切な断片との連結）。本発明は、タンパク質またはＤＮＡの蛍光標識を必要としない。その現行の具現化では、技術は、再ハイブリダイゼーションの際のヘアピンの遮断を検出するための光学系（顕微鏡）を必要とする。
【０１２４】
詳細な技術の説明
数百〜数千塩基対の間の大きさの二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ断片（例えば、ゲノムＤＮＡの機械的剪断または制限酵素切断から得られる）を、その一方の末端でＤＮＡループと連結する。その他方の末端はｄｓＤＮＡ断片と連結することで、その２本の鎖を異なるコーティング表面に結合させることが可能となる。例えば、一方の鎖の遊離３’末端をビオチンで標識してストレプトアビジンコーティングビーズへの結合を可能とし、反対の鎖の５’末端をジゴキシゲニンで標識して抗Ｄｉｇ抗体でコーティングした表面へのその結合を可能とする。この末端標識は、ビオチン（またはｄｉｇ）修飾ヌクレオチドを付加するための末端トランスフェラーゼの使用または適宜標識したオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションなどの、当業者に知られている様々な方法によって行うことができる。
【０１２５】
このＤＮＡ構築物を、それがその標識（例えば、ビオチン）末端の一方により結合する適当なビーズ（例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたもの）の溶液中で数分間インキュベートする。よって、これらのビーズは、後に光ピンセットが操作に使用される場合には透明であり得、または磁気トラップもしくは磁気ピンセットを操作に使用する場合には磁性であり得る。
【０１２６】
ビーズ−核酸アセンブリは流体チャンバー中に注入され、その流体チャンバーの表面は、分子の他方の標識末端と結合するような処理が施されている（例えば、ＤＮＡのＤｉｇ標識末端と結合するように抗Ｄｉｇでコーティングされた表面）。従って、これらのビーズは、ＤＮＡ−ヘアピンを介して表面に固定される（以下の図１ａ参照）。次に、前記ビーズと前記表面の距離が種々の手段でモニタリングされる。例えば、カメラでのビーズ画像の回折リングを用いてそれらの距離を導き出すことができる。
【０１２７】
また、エバネッセントモードで照射を行う場合には、ビーズにより散乱される（または蛍光として放出される）光強度を用いてそれらの距離を測定することもできる。あるいは、磁性ビーズを用いる場合には、生じる磁場を測定して（ＧＭＲまたはＨａｌｌセンサを使用）、固定表面上のセンサまでのビーズ表面距離を導き出すことができる。
【０１２８】
ビーズを固定する核酸分子を表面に引き寄せるため、種々の技術が記載されている。集束レーザービームの光を用いれば、焦点付近の透明ビーズを捕捉することができる。固定表面に対する光線の相対的並進により、つなぎ止めている分子に力をかけることができる（典型的な光ピンセットアッセイ）。かけられている力はその平衡位置からのビーズの移動に比例し、つなぎ止めている分子に一定の力をかけるには、トラッピングビームにフィードバックループを必要とする。
【０１２９】
ビーズに一定の力をかけるためには、ビーズ周囲の流れによって生じる流体力学的抵抗の使用が記載されているが、通常、それから得られる空間精度は低い（＞１００ｎｍ）。好ましい実施形態は、上記のように、核酸ヘアピンによって表面に固定された超常磁性ビーズを引き寄せるために磁気トラップを使用する。この構成では、サンプル上に配置した小さな磁石を用いて、固定されたビーズに一定の力をかけるが、その位置は約１ｎｍの精度で決定することができる（引張力および流体力学的抵抗による散逸による）。
【０１３０】
どの場合においても、つなぎ止めているヘアピンは、約１６ｐＮより大きな力でビーズを引き寄せることによって機械的に完全に開くことができることを注記しておく。分子にかける張力を約１１ｐＮより小さくすると、ヘアピンに自発的に再閉させることができる（開状態の移行はヒステリシス的ではあるが可逆的である）。
【０１３１】
もし、開状態の際に、伸長した一本鎖（ｓｓ）ＤＮＡに、溶液中の一部の分子（例えば、タンパク質、および／またはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡもしくはＰＮＡの相補的オリゴヌクレオチド）が結合していれば、力が約１１ｐＮよりも小さくなった場合に、これらの分子はヘアピンの再閉を一時的に遮断する。
【０１３２】
一連のサイクルでこれらの再閉停止の１つの際にＤＮＡ分子の伸長Ｚ（ｔ）（ビーズと表面の距離）を測定することにより、およそ１ｎｍの精度（１０ｐＮの力の下、ｓｓＤＮＡのヌクレオチド２個（１ｂｐ）にわたる距離に相当する）でその遮断の位置を決定することができる。さらに、遮断の平均時間を測定することにより、Ｔｏｆｆ＝１／ｋｏｆｆを決定することができる。Ｐｂｌｏｃｋを測定し、分子濃度［Ｍ］を知ることで、Ｔｏｎおよび、従ってｋｏｎを得ることが可能となる。これらのパラメーターの一方または両方は、結合特性を決定するために役立つ。それが相補的オリゴヌクレオチドとの完全なハイブリダイゼーションによるものかどうか、またはタンパク質がそのハイブリダイゼーションを安定化するかどうか、また、ミスマッチが存在するか、そしてそれがどこにあるか（例えば、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドの中央かまたはその一方の末端付近か）を決定することが可能となる。
【０１３３】
これらの所見は、ＤＮＡ修飾の検出、より一般には、タンパク質とｓｓまたはｄｓＤＮＡとの相互作用検出における適用に様々な具現化を示唆する。
【０１３４】
再ハイブリダイゼーション中の遮断の機械的検出によるＤＮＡ修飾の検出
ＤＮＡヘアピンが機械的に開かれる場合にオリゴヌクレオチド（ヌクレオチド数個よりも長いもの）が溶液中に存在すれば、これらのオリゴヌクレオチドは、力が１１ｐＮより小さくなった際に、ＤＮＡ上のそれらの相補配列と対合して、ヘアピンの完全な再閉を一時的に妨げることができる（図１ｂ参照）。同じ分子で一連の複数回の開／再閉サイクルを行い、オリゴヌクレオチドと開状態のＤＮＡとの対合による、再閉時の遮断（停止）を検出することが容易にできる。
【０１３５】
遮断時間の持続は、一般に指数分布を呈し、Ｆｔｅｓｔに従って指数関数的に小さくなる値Ｔｏｆｆを意味する。この確率分布は、このアッセイ単一分子特性を暗示する。いくつかの結論が得られ、最も確率の高い遮断時間は０であり、本発明者らの実験分解能よりも短いことから検出され得ない遮断の実質的画分が存在することを意味する。ヘアピンのリフォールディングを遮断する分子は、ＤＮＡフォークの圧力解除下にある。Ｆｔｅｓｔが１５ｐＮ（機械的ヘアピン開放力）に近づくとこの圧力は弱くなり、逆に、Ｆｔｅｓｔが小さくなると、フォーク圧力は分子の放出を劇的に増やす。本発明者らは、図２に示すように、ＴｏｆｆはＦｔｅｓｔに従って指数関数的に小さくなることを見出した。この依存性は極めて強いので、少数のｐＮの範囲のＴｏｆｆが測定できるに過ぎない。また、Ｔｏｆｆ（Ｆ）は、ここでは達成されないＦｔｅｓｔ＝Ｆｕｎｚｉｐ＝１５ｐＮの場合に自発的に結合を解除する分子の古典的Ｔｏｆｆとのみ一致することも注記しておく。
【０１３６】
遮断確率Ｐｂｌｏｃｋは、開段階のＴｏｐｅｎの持続時間とともに増大し、図３に示されるように、指数関数的挙動Ｐｂｌｏｃｋ＝ａ（Ｆ）．［１−ｅｘｐ（Ｔｏｐｅｎ／Ｔｏｎ）］を示す。
【０１３７】
分子の濃度に伴うＰｂｌｏｃｋの増大が予測できるので、図４において、本発明者らは、１２ｎｔのオリゴヌクレオチドについて、Ｐｂｌｏｃｋが［Ｍ］とともに増大し、飽和することを示す。
【０１３８】
Ｔｏｐｅｎと分子濃度［Ｍ］が分かれば、以下の関係を用いてＰｂｌｏｃｋからｋｏｎを導き出すことができる。
ｋｏｎ＝−Ｌｏｇ（１−Ｐｂｌｏｃｋ／ａ（Ｆ））／（［Ｍ］Ｔｏｐｅｎ）
【０１３９】
結合強度（図５参照）は、下式によって特徴付けることができる。
ｋｄ−１＝−（Ｔｏｆｆ  Ｌｏｇ（１−Ｐｂｌｏｃｋ／ａ（Ｆ））／（［Ｍ］Ｔｏｐｅｎ）
【０１４０】
平均遮断時間Ｔｏｆｆは、オリゴヌクレオチドの大きさ、再閉の際にかけられる力Ｆｔｅｓｔ、温度および有意ではないが、使用するバッファーのイオン強度に依存する。
【０１４１】
Ｔｏｎもまた、オリゴヌクレオチドの大きさ、温度、バッファーイオン強度、有意ではないが、Ｆｔｅｓｔに依存する。図５に示されるように、オリゴヌクレオチドと基質の間のミスマッチもまた、これらの動態定数を測定することによって特徴付けることができる。例えば、完全に相補的な１２ｎｔのオリゴヌクレオチドは１．５×１０−６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを示し、一方の末端から３塩基離れたところに１個のミスマッチが導入されてもｋｏｎをそれほど変化させない。
【０１４２】
そのミスマッチがオリゴヌクレオチドの中央に移動すると、ｋｏｎは１０分の１だけ小さくなる。
【０１４３】
また、Ｔｏｆｆは、ハイブリッドを安定化させ得るｄｓＤＮＡ結合タンパク質の存在にも依存する。例えば、本発明者らは、プライマーゼは、そうでなければ、ヘアピンの再ハイブリダイゼーションを検出に十分な時間遮断するには十分安定でなかったであろうＤＮＡオリゴを安定化することを示した（図６参照）。同様に、プライマーとして使用される小オリゴヌクレオチドの３’末端へのポリメラーゼの結合もその安定性を増し、このアッセイを用いて、そのプライマー部位に対するポリメラーゼの親和性を決定することができる。同様に、タンパク質は特定のｓｓＤＮＡ部位（例えば、メチル化塩基）に結合する場合には、それは特定の部位で、検出に十分な時間、再閉を遮断する。
【０１４４】
ｓｓまたはｄｓＤＮＡ上のＤＮＡ修飾を同定するための技術を使用することができる。よって、ビーズを表面に固定するＤＮＡヘアピンをその塩基の１つの特定の修飾に対する抗体（Ａｂ）でプロービングすることにより、そのヘアピンの再ハイブリダイゼーションの際のＡｂ結合から起こる一時的遮断によって、その鎖上のこの修飾塩基の存在および位置を検出することができる。結合部位を相補的オリゴヌクレオチドのセットでプロービングすると、その修飾を示すＤＮＡ断片の同定が可能となる。
【０１４５】
ｓｓＤＮＡ鋳型に対するＲｅｃＱの結合親和性の検出
ヘリカーゼは、ｄｓＤＮＡをほどくためにｓｓＤＮＡギャップに結合する。これらの酵素の活性は、ｓｓＤＮＡに対するその親和性に直接的に依存する。本発明者らは、ここで、このパラメーターを直接的に、またはアッセイを用いて測定することを提案する。これはＡＴＰもしくはＡＤＰもしくは他の類似体を用いて、または用いずに行うことができる。本発明者らは、ここに、ＡＴＰを用いない場合の、大腸菌由来ＲｅｃＱヘリカーゼに関するいくつかの結果を示す。典型的な結合シグナルは図７に見て取ることができ、これにより、あるヘリカーゼ濃度に対してＰｂｌｏｃｋを測定することが可能となる。［ＲｅｃＱ］に対するＰｂｌｏｃｋの推移を図８に示す。［ＲｅｃＱ］の特性濃度が２２６ｐＭに相当することが見て取れる。図９では、ヘリカーゼが非特異的に結合することが見て取れる。最後に、この酵素による遮断はズレ挙動(slippage behavior)を示し、Ｚの位置は、本当は一定ではなく、複数の工程によって小さくなる。この挙動を伴うと、Ｔｏｆｆの真の値を定義することは難しいことから、本発明者らは、Ｔｏｎとｋｏｎを測定することしかできない。
【０１４６】
Ｚ＝０におけるピークは、遮断には相当せず、ちょうどダイレクトリフォールディングに当たる。ＲｅｃＱ遮断は鋳型に沿って一様に見られ、０．９μｍにおける減衰は、わずかに伸長が異なる分子の平均によるものである。
【０１４７】
メチル化の検出
図１１：５ｍＣに対する抗体による遮断時間のヒストグラム。大部分の遮断は短く、１．３秒を特性時間とする指数分布に合理的によく適合し得る。しかしながら、１７．５％という遮断の実質的数字は３０秒を超える。この条件では、酵素のＴｏｆｆを決定することはあまり容易ではなく、本発明者らは、２つの異なる結合機構が競合し、一方が他方よりも強くなっていると考えている。
【０１４８】
あるいは、修飾を認識するタンパク質（例えば、メチル化シトシンを認識するメチル結合ドメインタンパク質１（ＭＢＤ１）、または特異的に修飾されたｄｓＤＮＡに対する適当なＡｂ）の存在下（または不在下）で、推定修飾部位に相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、既知のＤＮＡ修飾の存在をプロービングすることができる。タンパク質の存在下での遮断時間は有意に延長され、修飾塩基の容易な同定および位置決定につながる。
【０１４９】
ミスマッチ認識タンパク質を使用することにより、上記の方法を同様に、ＤＮＡ上のミスマッチ（すなわち、ＳＮＰ）を同定するために使用することもできる。また、所与のタンパク質／ＤＮＡ複合体の安定性に影響を及ぼすタンパク質（または薬物）を検出するためのアッセイを使用することもできる。
【０１５０】
アッセイに影響を及ぼすパラメーター
Ｆｏｐｅｎ：２０ｐＮの値は、これが多数のビーズが同時に開くことを保証するので良好な選択肢である（それらの磁化、従ってそれらの力は１０〜２０％変動する）。
【０１５１】
Ｔｏｐｅｎは、分子濃度と組み合わせて、重要なパラメーターと思われ、遮断を観察するためには、両パラメーターの組合せを使用しなければならず、式：
Ｐｂｌｏｃｋ＝ａ（Ｆ）．［１−ｅｘｐ（Ｔｏｐｅｎ．ｋｏｎ．［Ｍ］）］
に従い、Ｐｂｌｏｃｋの実質的値が得られる。
【０１５２】
ｋｏｎを測定したければ、Ｐｂｌｏｃｋを飽和させるのは避けることが賢明であり、Ｐｂｌｏｃｋが０．２〜０．５の範囲となるように［Ｍ］とＴｏｐｅｎを調整することで、妥当な統計値を達成するための最小数のサイクルが保証される。Ｔｏｐｅｎは、単に取得プログラムにおいてパラメーターを調整することで変更することができ、酵素濃度を変更するには、フローチャンバー中のバッファーを変更する必要があることを注記しておく。他方、ｋｏｎが測定されない場合には、Ｐｂｌｏｃｋを飽和させる価値があり、これにより、遮断の最良の統計値が得られる。分子濃度はその供給量または望まない結合により限定される場合があり、例えば、５ｍＣに対する抗体を高濃度で用いる試験では、この酵素は、閉状態のヘアピンの二本鎖ＤＮＡに結合し、そのフォールディング解除を妨げる。本発明者らは、酵素濃度を３５ｎＭ未満に限定することでこの問題が解決されることを見出した。これらの実験では、Ｔｏｐｅｎを増大させることが、Ｐｂｌｏｃｋを増大させるための唯一の方法である。
【０１５３】
パラメーターａ（Ｆ）は、基本的に１に近く、その値を評価する最良の方法は、図３および４においてＰｂｌｏｃｋが漸近的にａ（Ｆ）に達するまで、Ｔｏｐｅｎまたは［Ｍ］のいずれかを変化させる飽和アッセイを行うことである。あるいは、下式：
ａ（Ｆ）＝ｅｘｐ（−Ｔｄｅａｄ／Ｔｏｆｆ）
（式中、Ｔｄｅａｄは、この検出系のデッドタイムであり、Ｔｏｆｆは、平均遮断時間である）
を用いてａ（Ｆ）を評価することもできる。一般に、Ｔｄｅａｄは０．１秒程度である。
【０１５４】
Ｆｔｅｓｔは、調整に極めて重要なパラメーターであり、その範囲は使用するヘアピンに依存するが、一般に［１２ｐＮ、２ｐＮ］にわたる。１２ｐＮより大きな力の場合、ヘアピンのリフォールディングは、着目するシグナルをマスクするｓｓＤＮＡを形成する二次構造のためにすでにいくらかの遮断を示す。力が小さいと、ＤＮＡの伸長が極めて小さくなり、ノイズが劇的に増える。ヘアピンフォーク圧は、極めて効率的に分子をハイブリダイズ解除に向かわせ、本発明者らは、Ｔｏｆｆ＝Ｔ０  ｅｘｐ  Ｆ／Ｆ０を見出し、従って、Ｆｔｅｓｔが小さくなるとＴｏｆｆは極めて速やかに小さくなる。例えば、９ｎｔのオリゴヌクレオチドは、Ｆｔｅｓｔ＝１１ｐＮ前後で１秒の遮断をもたらし、９ｐＮより小さい力では、遮断は視認しにくい（ａ（Ｆ）が小さくなる）。１２ｎｔのオリゴヌクレオチドでは、観察範囲は［１０ｐＮ、６ｐＮ］となる。３７ｎｔのオリゴヌクレオチドでは、遮断は、６ｐＮでは恒久的に続き、Ｆｔｅｓｔ＝３ｐＮでは数秒に落ちる。同じことが結合タンパク質の場合にも見られ、結合が強いほど、遮断が見られる力が小さくなる。
【０１５５】
本発明者らは、遮断時間が測定可能となるように（ａ（Ｆ）約１）、しかしながら、Ｔｔｅｓｔが相対的に短くなって多数回のサイクルが行えるように、長過ぎないようにＦｔｅｓｔを調整する。
【０１５６】
このアッセイにおいて、Ｔｏｆｆは０．２秒〜２０秒の範囲で測定できる。時間が短いほど、高速ビデオカメラなどのより速い測定装置で観察が可能となり、分布の平均をとるために数サイクルを行う必要があることから、時間が長いほど、極めて長い取得が得られる。オリゴヌクレオチドでは、ＴｏｆｆはＦｔｅｓｔに従って指数関数的に変化するので、本発明者らはＴｏｆｆを使用可能な範囲とするようにＦｔｅｓｔを調整することができる。タンパク質では、Ｆｔｅｓｔに従うＴｏｆｆの変動は知られていないが、本発明者らは、Ｆｔｅｓｔが小さくなると、通常、Ｔｏｆｆも劇的に小さくなることを見出している。しかしながら、先験的にＴｏｆｆは未知であり、広い範囲で変動する可能性がある。Ｆｔｅｓｔの典型的な値に関する知見を得るために、本発明者らは、まず、図１２で実施されたような、数秒の勾配に従う力の上昇および低下を伴う、一連の複数回のサイクルを行うのが好都合であることを見出した。遮断段階の終了は力Ｆｃに相当する。Ｆｃの分布は、Ｔｏｆｆが勾配の持続時間程度である値に関して極大となる。
【０１５７】
次に、測定可能な範囲でＴｏｆｆを得るために＜Ｆｃ＞よりもやや大きいＦｔｅｓｔを用い、力（ＦｏｐｅｎおよびＦｔｅｓｔ）にプラトーを有するサイクルで処理を行うことができる。
【０１５８】
ＴｔｅｓｔおよびＮｃｙｃｌｅｓ：  Ｔｔｅｓｔは、Ｔｏｆｆの２倍または３倍であるべきである。最後に、サイクル数は測定の全体的な精度を規定する。Ｘ％の精度を達成するためには、Ｎｃｙｃｌｅ＝１００００／（Ｘ２Ｐｂｌｏｃｋ）であるとき、Ｐｂｌｏｃｋ＝Ｎｂｌｏｃｋ／Ｎｃｙｃｌｅの場合にＸ／１００＝１／Ｎｂｌｏｃｋ１／２を必要とする。
【０１５９】
アッセイの改善：  様々な問題が頻繁に起こり、酵素の結合が短い、また極めて長い事象を呈する場合があり（図９）、この最後の状況は、遮断が、試験段階の終了時および新たなサイクルの開始時にもなお活性であることの結果である（図７）。開状態では遮断は潜伏し、連続サイクルで拡張する遮断は起こり得るが、けして証明された事象ではない。この扱いにくい状況を避けるため、遮断は通常、小さな力では極めて短いという事実を利用することができる。従って、試験段階の後に小さな力を用いる第三の段階を加えることにより、Ｆｃｌｅａｎ＝０．５ｐＮおよびＴｃｌｅａｎ＝２秒で、ヘアピンから結合分子を除去することができ、いずれの結合分子も除去して、次のサイクルのためにクリーンなヘアピンが得られる。分子にはまたいくつかの結合部位が存在する場合があり、従って、遮断シグナルは、最初の遮断の後に、第２の結合部位に分子遮断があるなど、階段状の様相を持つと考えられる（図１０）。第２の遮断では、有効開状態はＴｏｐｅｎ＋Ｔｂｌｏｃｋ１であり（図１０）；Ｔｂｌｏｃｋ１がＴｏｐｅｎより大きければ、第１の遮断の後に第２の遮断が見られ、動態パラメーターの測定を誤る可能性が高い。この影響を最小にするために、ＴｔｅｓｔＴ比べて大きなＴｏｐｅｎを使用するほうが良い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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