(57)【要約】  植物由来のタンパク質または超構造体タンパク質を回収する方法を提供する。本方法は、アポプラスト局在性のタンパク質または超構造体タンパク質を含む植物または植物質を取得し、細胞壁を弛緩させて弛緩した細胞壁を有する植物または植物質を生産し、よって細胞壁を通したアポプラスト内容物の放出を可能にすることで、植物または植物質からアポプラスト内容物画分を生産し、アポプラスト内容物画分を回収することを含む。アポプラスト内容物画分は植物由来タンパク質または超構造体タンパク質を含む。
2014510087.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物由来タンパク質または植物由来超構造体タンパク質を回収する方法であって、
ａ．アポプラスト局在性植物由来タンパク質またはアポプラスト局在性植物由来超構造体タンパク質を含む植物または植物質を取得すること、
ｂ．細胞壁が弛緩するように植物または植物質を処理して、弛緩した細胞壁を有する植物または植物質を生産し、それによって、植物由来タンパク質または植物由来超構造体タンパク質を含むアポプラスト画分の放出を可能にすること、および
ｃ．植物由来タンパク質または植物由来超構造体タンパク質を含むアポプラスト画分を回収すること
を含む方法。
【請求項２】
処理ステップ（ステップｂ）が、化学的処理、酵素的処理、生化学的処理、物理的処理またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
物理的処理がソニケーションを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
化学的処理が、１つまたは２つ以上のキレーター、プロトン供与体、ヒドロキシラジカル、水酸化カリウム、インドール−３−酢酸、イミダゾール、またはそれらの組み合わせによる処理を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
酵素的処理が酵素浸潤を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
酵素浸潤が、１つもしくは２つ以上のペクチナーゼ、１つもしくは２つ以上のセルラーゼ、または１つもしくは２つ以上のペクチナーゼおよび１つもしくは２つ以上のセルラーゼの浸潤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
キレーターが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
生物学的処理が、１つ以上のエクスパンシン、オーキシン、またはそれらの組み合わせによる処理を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
酵素的処理が、１つもしくは２つ以上のペクチナーゼ、１つもしくは２つ以上のセルラーゼ、または１つもしくは２つ以上のペクチナーゼおよび１つもしくは２つ以上のセルラーゼによる処理を含む、請求項２に記載の方法。  
【請求項１０】
酵素組成物が、リパーゼ、プロテアーゼまたはペクチナーゼの１つ以上を含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
取得ステップ（ステップａ）において、植物が、ペプチド、タンパク質、タンパク質ロゼット、タンパク質複合体、プロテアソーム、メタボロン、転写複合体、組換え複合体、光合成複合体、膜輸送複合体、核膜孔複合体、タンパク質ナノ粒子、糖タンパク質、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、ウイルス様粒子、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質、キメラタンパク質、キメラタンパク質複合体、キメラタンパク質ナノ粒子、キメラ糖タンパク質、キメラ抗体、キメラモノクローナル抗体、キメラ一本鎖モノクローナル抗体、キメラヘマグルチニン、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択されるタンパク質または超構造体タンパク質をコードする核酸配列で形質転換され、植物または植物質が収穫される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核酸が一過性に植物に導入される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
取得ステップ（ステップａ）において、植物を生長させ、植物または植物質が収穫される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
核酸がモノクローナル抗体またはインフルエンザヘマグルチニンをコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
植物由来タンパク質または超構造体タンパク質がノイラミニダーゼもＭタンパク質も含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物質が葉および培養植物細胞の群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ｄ）アポプラスト内容物画分から植物由来タンパク質または超構造体タンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ｄ）精製ステップが、深層濾過を使ってアポプラスト内容物画分を濾過することで、清澄化抽出物を生産し、次にサイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換樹脂もしくはアフィニティークロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを使って清澄化抽出物のクロマトグラフィーを行うことを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ｄ）アポプラスト内容物画分中のタンパク質または超構造体タンパク質を細胞破片および不溶物から分離するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ｄ）分離ステップが、遠心分離、深層濾過、またはそれらの組み合わせによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、植物由来タンパク質を回収する方法に関する。より具体的には、本発明は、植物および植物組織から、タンパク質超構造体を含むタンパク質を得る方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
［発明の背景］
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、昆虫細胞培養、および哺乳動物細胞培養などの宿主細胞における現在の組換え発現戦略は、培養培地中で、タンパク質を極めて高レベルに発現させ、分泌させる。これらの系を使って、高レベルな発現、適正なタンパク質フォールディングおよびタンパク質の翻訳後修飾が達成される。さらにまた、細胞内タンパク質は他の構成要素（ＤＮＡ、小胞、膜、色素など）から容易に隔離することができるので、発現したタンパク質の精製が簡単になる。植物発現系または酵母発現系の場合は、細胞壁が、発現したタンパク質の培養培地への分泌を妨げる。
【０００３】
科学界では細胞抽出物を生成するために、さまざまなアプローチが広く使用されている。細胞壁を破砕してその内容物を遊離させるための機械的アプローチは、通常、一定の種類のタンパク質または細胞構成要素に対して選択的ではない。目的タンパク質の発現を細胞培養培地に向かわせて、遠心分離または濾過によって細胞内夾雑物を除去できるようにすれば、目的タンパク質の簡単かつ迅速な濃縮が可能になる。また、目的のタンパク質またはタンパク質超構造体をワクチン製剤に使用する前に、タンパク質ロゼット、ナノ粒子、大きなタンパク質複合体、抗体またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）などを含む目的のタンパク質またはタンパク質超構造体を、植物または植物質中に存在するタンパク質、ＤＮＡ、膜フラグメント、小胞、色素、糖質などの一部または全てから分離することも望ましいだろう。
【０００４】
免疫グロブリン（ＩｇＧ）は、さまざまな性質の対応する特異的抗原に対して特徴的なアフィニティを有する複雑なヘテロ多量体タンパク質である。今日、ＩｇＧ産生細胞株の日常的な単離と、ＩｇＧの指向的進化および分子工学のための技術の出現は、バイオ治療薬としての、そしてまた一般ライフサイエンス市場における、それらの進化に、著しい影響を与えている。治療用モノクローナルＩｇＧ（モノクローナル抗体、ｍＡｂ）は、新しい抗炎症薬および抗がん薬の現在の市場を支配しており、何百という新しい候補が、改良された応用または新規な応用を求めて、現在、研究および臨床開発中である。ｍＡｂの年間市場需要は、数グラム（診断薬）、数キログラム（抗毒素）から、百〜数百キログラム（生物テロ防御、抗がん、抗感染、抗炎症）までにわたる。植物から修飾糖タンパク質を生産するための方法はＷＯ２００８／１５１４４０に記載されている（この文献は出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【０００５】
植物の細胞間隙からタンパク質を抽出するための方法であって、目的のタンパク質を含む間質液抽出物を得るための減圧および遠心分離プロセスを含む方法が、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０９７２５（Ｔｕｒｐｅｎら）に記載されている。このアプローチは、減圧および遠心分離下でマイクロファイバーのネットワークを通過する小さなタンパク質（５０ｋＤａ以下のもの）には適しているが、より大きなタンパク質、超構造タンパク質、タンパク質ロゼット、ナノ粒子、大きなタンパク質複合体、例えば抗体またはＶＬＰには適していない。
【０００６】
ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら，１９９９（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：７０３−７０８）は、発現したタンパク質を細胞外コンパートメントにターゲティングし、次に、葉および茎組織の減圧浸潤によってｓｃＦｖポリペプチドを回収するための、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）エピトープに融合されたイネアミラーゼシグナルペプチドの使用を開示している。Ｍｏｅｈｎｋｅら，２００８（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ３０：１２５９−１２６４）は、アポプラスト抽出を使ってタバコから組換え植物アレルゲンを得るための、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋの減圧浸潤法の使用を記述している。ＰＣＴ公開ＷＯ２００３／０２５１２４（Ｚｈａｎｇら）は、マウスシグナル配列を使ってアポプラスト間隙にターゲティングする、植物におけるｓｃＦｖ免疫グロブリンの発現を開示している。
【０００７】
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、例えばインフルエンザワクチンなどのワクチンを調製するために使用しうる。ＶＬＰなどの超構造体はウイルスキャプシドの構造を模倣しているが、ゲノムを欠くので、複製することも、二次感染のための手段を提供することもできない。ＶＬＰは、強い免疫応答を刺激するための、単離された（可溶性）組換え抗原に代わる改良された代替物を提供する。ＶＬＰは、特異的ウイルスタンパク質の発現時にアセンブルされ、そのコグネイトウイルスのものに似た外表面を提示するが、真のウイルス粒子とは異なり、遺伝物質は組み込まれていない。ネイティブウイルスのものに似た粒子状多価構造物における抗原の提示により、体液性構成要素と細胞性構成要素とのバランスがとれた、免疫応答の刺激の強化が達成される。単離された抗原による刺激と比べた上述の改良点は、エンベロープウイルスの場合には特に当てはまると考えられる。というのも、エンベロープＶＬＰは、表面抗原を、それ本来の膜結合状態で提示するからである（ＧｒｇａｃｉｃおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，２００６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４０，６０−６５）。さらにまた、インフルエンザＶＬＰは、そのナノ粒子構成により、組換えヘマグルチニンＨＡ（すなわちモノマーＨＡ、またはロゼットへと組織化したＨＡ；３〜８個のＨＡ三量体のアセンブリ）と比較して、より良いワクチン候補であることが示されており、それらは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を活性化することができる（Ｂｒｉｇｈｔ，Ｒ．Ａ．ら，２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５，３８７１−３８７８）。
【０００８】
脂質エンベロープを含むインフルエンザＨＡ  ＶＬＰの生産は、ＷＯ２００９／００９８７６およびＷＯ２００９／０７６７７８（Ｄ’Ａｏｕｓｔら）の発明者らによって、以前に記述されている（これらの文献はどちらも出典明示により本明細書に組み込まれる）。エンベロープウイルスの場合、脂質層または脂質膜は、ウイルスによって保持されていることが有利であるだろう。脂質の組成は系によって異なり（例えば植物が生産するエンベロープウイルスは、植物脂質またはフィトステロールをエンベロープ中に含むであろう）、改良された免疫応答の一因になりうる。
【０００９】
ＨＢＶ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を発現するトランスジェニックタバコにおけるエンベロープＶＬＰのアセンブリは、Ｍａｓｏｎら（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１１７４５−１１７４９）によって記載されている。植物が生産するＨＢＶ  ＶＬＰは、非経口的に投与した場合は、マウスにおいて、強力なＢ細胞およびＴ細胞免疫応答を誘導することが示されたが（Ｈｕａｎｇら，２００５，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２３，１８５１−１８５８）、給餌試験による経口免疫処置は、あまり大きな免疫応答を誘導しなかった（Ｓｍｉｔｈら，２００３，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１，４０１１−４０２１）。Ｇｒｅｃｏ（２００７，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２５，８２２８−８２４０）は、ＨＢｓＡｇと融合したヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）エピトープが、トランスジェニックタバコおよびアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）で発現させると、ＶＬＰとして蓄積することを示して、二価ＶＬＰワクチンを創製した。
【００１０】
トランスジェニックタバコ植物およびトランスジェニックジャガイモ植物におけるウイルスキャプシドタンパク質（ＮＶＣＰ）の発現は、非エンベロープＶＬＰのアセンブリをもたらした（Ｍａｓｏｎら，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，５３３５−５３４０）。ＮＶＣＰ  ＶＬＰは、アグロインフィルトレートしたベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）葉（Ｈｕａｎｇら，２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．  １０３，７０６−７１４）において生産され、経口投与時のそれらの免疫原性が、マウスにおいて実証された（Ｓａｎｔｉら，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６，１８４６−１８５４）。２１５〜７５１μｇのＮＶＣＰをＶＬＰの形態で含有する生ジャガイモを、健常成人ボランティアに２回または３回投与したところ、免疫処置されたボランティアの９５％において、免疫応答が発生した（Ｔａｃｋｅｔら，２０００，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．  １８２，３０２−３０５）。非エンベロープＶＬＰは、ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ；Ｈｕａｎｇら，２００９，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．  １０３，７０６−７１４）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）主要キャプシドタンパク質Ｌ１（Ｖａｒｓａｎｉら，２００３，Ａｒｃｈ．  Ｖｉｒｏｌ．  １４８，１７７１−１７８６）の発現からも得られている。
【００１１】
より単純なタンパク質またはタンパク質超構造体生産系、例えば１つまたは数個のタンパク質のみの発現に依拠するものが望ましい。植物系におけるタンパク質またはタンパク質超構造体、例えば限定するわけではないが、タンパク質ロゼット、ナノ粒子、大きなタンパク質複合体、例えば抗体またはＶＬＰなどの生産は、植物を温室または圃場において栽培することができ、無菌的な組織培養法や取り扱いを必要としないという点で、有利である。
【００１２】
植物タンパク質を実質的に含まないか、植物タンパク質から容易に分離され、それでもなお、タンパク質またはタンパク質超構造体の構造および特徴を保っている、タンパク質またはタンパク質超構造体を回収する方法が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、植物由来タンパク質を回収する方法に関する。より具体的には、本発明は、タンパク質超構造体を含むタンパク質を、植物および植物組織から回収するための方法を提供する。
【００１４】
植物由来タンパク質を回収する改良された方法を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を調製する方法（Ａ）であって、アポプラスト内に局在する植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を含む植物または植物質を取得すること；細胞壁が弛緩するように植物または植物質を処理して、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を含むアポプラスト内容物画分と、植物細胞画分とを生産すること；およびアポプラスト内容物画分を回収することを含む方法を提供する。本方法は、アポプラスト内容物画分から植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を精製するステップを、さらに含みうる。植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質は、キメラ植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質でありうる。植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質、その植物にとって異種でありうる。植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質は、タンパク質ロゼット、タンパク質複合体、プロテアソーム、メタボロン、転写複合体、組換え複合体、光合成複合体、膜輸送複合体、核膜孔複合体、タンパク質ナノ粒子、糖タンパク質、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質、キメラタンパク質、キメラタンパク質複合体、キメラタンパク質ナノ粒子、キメラ糖タンパク質、キメラ抗体、キメラモノクローナル抗体、キメラ一本鎖モノクローナル抗体、キメラヘマグルチニン、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質を含みうる。植物由来モノクローナル抗体は、キメラマウスヒトモノクローナル抗体、例えば、限定するわけではないがＣ２Ｂ８を含みうる。植物由来ＶＬＰはインフルエンザヘマグルチニンを含みうる。
【００１６】
アポプラスト内容物画分と細胞画分は、植物または植物質を化学的、酵素的、もしくは物理的に処理することによって、またはそれらの組み合わせによって、生産しうる。例えば植物または植物質を細胞壁弛緩組成物（ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）で処理しうる。細胞壁弛緩組成物は、キレーター、ヒドロキシラジカル、インドール−３−酢酸、エクスパンシン、ペクチナーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、およびそれらの組み合わせから選択される１つまたは２つ以上の化合物を含みうる。当業者には理解されるであろうとおり、セルラーゼは酵素の混合物であり、１つ以上のエンド−１，４−ベータ−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ（エキソセルラーゼ）、ベータ−グルコシダーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ（酸化的セルラーゼ）、セルロースホスホリラーゼ、およびヘミセルラーゼを含みうる。
【００１７】
さらにまた、アポプラスト内容物画分と細胞画分は、加圧または減圧浸潤法で細胞壁弛緩組成物を植物または植物質に浸潤させることによって生産することもできる。より具体的には、細胞壁弛緩組成物は、１つ以上の酵素、例えば１つもしくは２つ以上のペクチナーゼ、１つもしくは２つ以上のセルラーゼ、または１つもしくは２つ以上のペクチナーゼおよび１つまたは２つ以上のセルロースを含みうる。それゆえに、アポプラスト内容物画分と細胞画分は、例えば酵素浸潤などによって生産しうる。
【００１８】
アポプラスト内容物画分と細胞画分は、植物または植物質をソニケーションで処理することによって、またはソニケーションと組み合わせた細胞壁弛緩組成物で処理することによって生産することもできる。
【００１９】
植物または植物質（ｐｌａｎｔ  ｍａｔｔｅｒ）は、植物を栽培するか、収穫するか、または栽培しかつ収穫することによって得ることができる。植物質は、植物の一部または全部、１つまたは２つ以上の植物細胞、葉、茎、根または培養植物細胞を含みうる。
【００２０】
本発明は、上述のような植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を調製する方法であって、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質をコードする核酸が植物中に一過性に導入される方法を提供する。あるいは、核酸が植物のゲノム内に安定に組み込まれる。
【００２１】
本発明は、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質をアポプラスト内容物画分から精製するステップをさらに含む、上述のような植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を調製する方法も提供する。精製ステップは、深層濾過を使ってアポプラスト内容物画分を濾過することで、清澄化抽出物を生産し、次に陽イオン交換樹脂、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、またはそれらの組み合わせを使った清澄化抽出物のクロマトグラフィーを行うことを含みうる。
【００２２】
理論に束縛されることは望まないが、アポプラスト内容物画分から得られるタンパク質は、さまざまな細胞内コンパートメント、例えばミトコンドリア、クロロプラスト、および他の細胞小器官中に見いだされる中間体型の翻訳後修飾タンパク質または他のタイプのプロセシングを含むタンパク質が共抽出されないので、より均一である。典型的には、組換えタンパク質の均一度が高いほど、そのタンパク質を含む調製物の品質は高くなり、より高い力価、より長い半減期、またはより良い免疫原能を含む有益な性質を有する産物をもたらしうる。例えば、高マンノース型グリコシル化を含有する血液タンパク質は、複合型グリコシル化を含むタンパク質よりも迅速に血液循環から排除される。アポプラスト内容物画分中のグリコシル化タンパク質産物は、より複合型のグリコシル化を示す。それゆえに、細胞壁弛緩を伴う本明細書に記載の方法を使って調製されたタンパク質は、例えば、より良い循環半減期を示す。
【００２３】
植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質は、タンパク質ロゼット、タンパク質複合体、タンパク質ナノ粒子、抗体、モノクローナル抗体、ＶＬＰを含みうる。ＶＬＰは１つ以上のインフルエンザＨＡポリペプチドを含みうる。超構造体タンパク質はキメラ超構造体タンパク質であることができ、例えば、モノクローナル抗体はキメラモノクローナル抗体でありうるし、インフルエンザＨＡポリペプチドはキメラＨＡポリペプチドでありうる。超構造体タンパク質がＶＬＰである場合、植物由来ＶＬＰは血球凝集活性をさらに含みうる。植物または植物質は、植物を栽培するか、収穫するか、または栽培しかつ収穫することによって得ることができる。植物質は、植物の一部もしくは全部、または１つもしくは２つ以上の植物細胞、葉、茎、根もしくは培養細胞を含みうる。
【００２４】
本発明は、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を調製する方法（Ｂ）であって、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を含む植物または植物質を取得すること、細胞壁弛緩組成物、ソニケーション、またはそれらの組み合わせを使って植物質を処理することで、植物細胞画分およびアポプラスト内容物画分を生産すること、およびアポプラスト内容物画分を濾過して、濾過画分を生産し、その濾過画分から植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を回収することを含む方法も提供する。
【００２５】
理論に束縛されることは望まないが、植物由来脂質を含む植物製ＶＬＰは、他の製造系で作られたＶＬＰより強い免疫反応を誘導することができ、これらの植物製ＶＬＰによって誘導される免疫応答は、生または弱毒化全ウイルスワクチンによって誘導される免疫反応と比較しても、さらに強い。
【００２６】
宿主細胞から得られるタンパク質抽出物の組成は複雑であり、典型的には、単離すべき目的のタンパク質または超構造体と共に、細胞間および細胞内の構成要素を含む。アポプラスト内容物画分の調製と、それに続いて、細胞壁構成要素を細胞内のタンパク質および構成要素と一緒に隔離するためのステップは、目的のタンパク質または超構造体が製造プロセス内で濃縮され、効率を向上させることができるので、有利であるだろう。工程数の少ない、効率のよいステップを含む、より簡単なプロセスにすることは、有意な収率増加とコスト削減をもたらしうる。細胞壁を弛緩するプロセスでは、消化された細胞壁が関与する方法（例えばＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８９またはＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８８）と比較して、類似するまたは増加した超構造体タンパク質収率が得られることもわかった。理論に束縛されることは望まないが、細胞壁弛緩のステップは、細胞壁のポリマー構成要素を弛緩させ、タンパク質または超構造体タンパク質、その他、細胞壁内で結合しているものの放出を補助しうる。このプロトコールは、細胞内構成要素によるタンパク質、または超構造体タンパク質の汚染も最小限に抑えうる。
【００２７】
ホモジナイゼーション、ブレンディングまたは粉砕を伴う植物由来超構造体タンパク質の調製方法と比較すると、本明細書に記載の方法では、植物由来超構造体タンパク質抽出物の破壊および汚染が少なくなる。本明細書に記載の方法は、プロトプラストおよびそれらの構成要素の完全性を維持したまま、植物組織のアポプラスト内容物画分を提供する。本明細書に記載の方法は、プロトプラストまたはプロトプラストの一部分がその完全性を失ってもはや無傷（ｉｎｔａｃｔ）ではなくなった場合でも、タンパク質または超構造体タンパク質の精製に有効である。
【００２８】
これらの方法は、標準的な組織破壊技法、例えばホモジナイゼーション、ブレンディングまたは粉砕を伴う超構造体タンパク質抽出の方法と比較して、タンパク質または超構造体タンパク質の収率の増加をもたらす。収率の増加は、一つには、タンパク質または超構造体タンパク質、そしてＶＬＰの場合は脂質エンベロープの、構造的完全性を破壊する剪断力の低減によるものでありうる。アポプラスト内容物画分は細胞質タンパク質が著しく減少しているかまたは細胞質タンパク質を含まないので、アポプラスト内容物画分からのタンパク質または超構造体タンパク質の調製は有利であるだろう。それゆえに、アポプラスト内容物画分では、超構造体タンパク質の単量体、二量体、三量体またはフラグメントを含む超構造体タンパク質が、他のタンパク質および物質から、容易に分離される。しかし、たとえプロトプラスト調製物またはプロトプラスト調製物の一部分が無傷ではない場合でも、本明細書に記載の方法を使って、タンパク質または超構造体タンパク質を、増加した収率で得ることができる。
【００２９】
アポプラストへと分泌される、超構造体糖タンパク質を含む糖タンパク質、例えばモノクローナル抗体は、細胞壁を弛緩させない抽出方法、例えばブレンダー抽出した植物と比較して、成熟が完了していて末端Ｎ−アセチルグルコサミンまたはガラクトース残基を含むＮ−グリカン（複合型Ｎ−グリカン）のパーセンテージが高い。複合型Ｎ−グリカンを含む超構造体糖タンパク質、例えばモノクローナル抗体は、末端マンノース残基（未熟（ｉｍｍａｔｕｒｅ）Ｎグリカン）を含むモノクローナル抗体と比較すると、血流中での増加した半減期という有益な性質を示すことがわかっている。
【００３０】
細胞壁の弛緩により、成熟が完了しているＮ−グリカンを含むアポプラスト抗体のプールを遊離させることが可能だろう。この抽出方法は、プロトプラスト画分中の未熟型グリコシル化抗体を分離して、複合型Ｎ−グリカンを保持するグリコシル化抗体の濃縮された集団または均一な集団を回収することを可能にしうる。未熟Ｎ−グリカンを保持する抗体のプールが望まれる場合は、プロトプラスト画分をとっておいて、そのプロトプラスト画分から抗体を精製することができる。
【００３１】
本発明のＶＬＰは、標準的な組織破壊技法を使って得られるものより強い血球凝集活性を示すとも特徴づけられる。この改良された血球凝集活性は、無傷のＶＬＰの収率が高い（溶解した状態の遊離のＨＡ単量体または三量体が少ない）こと、無傷の脂質エンベロープを有する無傷のＶＬＰの収率が高いこと、またはそれらの組み合わせに起因するのだろう。
【００３２】
ＶＬＰを使って作られたワクチンには、全ウイルスでできたワクチンと比較して、それらが非感染性であるという利点がある。それゆえに、生物学的封じ込めは問題ではなく、それは生産にとって必要でない。植物製ＶＬＰは、発現系を温室または圃場で栽培することが可能であり、それゆえに、著しく経済的であり、スケールアップにも適していることによって、さらなる利点を提供する。
【００３３】
加えて、植物は、シアル酸残基の合成とタンパク質への付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰをノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で生産することができ、植物におけるＶＬＰ生産を保証するために、ＮＡを共発現させる必要や、生産細胞または抽出物をシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）で処理する必要はない。
【００３４】
この発明の概要は、必ずしも、本発明の特徴の全てを述べたものではない。
【００３５】
本発明のこれらの特徴および他の特徴は、添付の図面を参照しながらなされる以下の説明から、より明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】Ｈ５  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ヘマグルチニンを発現させるためのＣＰＭＶＨＴ系発現カセット（コンストラクト６８５）の概略図である。
【００３７】
【図２】Ａ）Ｈ５／Ｉｎｄｏを発現させるためのコンストラクト（コンストラクト番号６８５）の一部分、ＰａｃＩ（３５Ｓプロモーターの上流）からＡｓｃＩ（ＮＯＳターミネーターのすぐ下流）までの核酸配列（配列番号１）を示す図である。Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５のコード配列に下線を引く。図２Ｂは、コンストラクト番号６８５がコードするＨ５  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／０５ヘマグルチニンのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【００３８】
【図３】サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によるヘマグルチニン（ＨＡ）含有構造物のキャラクタリゼーションを示す図である。消化された植物抽出物の遠心分離後に、ペレットを再懸濁し、ＳＥＣで分画した。図３Ａは、１画分あたりの全可溶性タンパク質含有量を示す（黒い三角形；最大に対する％、左側のＹ軸；ブラッドフォード法を使って決定）。集めた画分の血球凝集活性（黒いバー；右側のＹ軸）も示されている。図３ＢはＳＥＣ溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。分析に先だって、画分をアセトンで沈殿させ、１／４０体積の還元性試料ローディング緩衝液に再懸濁した。ゲルは０．１％クマシーＲ−２５０溶液で染色した。精製ＶＬＰを対照として流した。ＨＡ０単量体に対応するバンドを矢印で示す。ＭＷ−分子量標準（ｋＤａ）；Ｃ−精製ＶＬＰ（対照）；レーン７〜１０および１４〜１６は、図３Ａに示すＳＥＣ分析から溶出した画分番号に対応する。
【００３９】
【図４】酵素消化後に得られたタンパク質プロファイルと、Ｃｏｍｉｔｒｏｌ（商標）ホモジナイザーを使った機械的ホモジナイゼーションによって得られたタンパク質プロファイルとの比較を示す図である。試料を変性試料ローディング緩衝液で処理し、溶出画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、タンパク質を分離した。ゲルを０．１％クマシーＲ−２５０溶液で染色した。ＭＷ−分子量標準（ｋＤａ）；レーン１−酵素混合物２５μｌ；レーン２−植物組織の酵素消化物２５μｌ、およびレーン３−Ｃｏｍｉｔｒｏｌホモジナイザーで得られた抽出物５μｌ。
【００４０】
【図５】アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５のヘマグルチニンコード配列（コンストラクト番号６６０）、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含むＨＡ発現カセットの核酸配列（配列番号９）を示す図である。
【００４１】
【図６】アポプラスト画分中のＨＡ−ＶＬＰを分離するための、陽イオン交換樹脂でのＨＡ−ＶＬＰの直接的な捕捉を示す図である。試料を非還元性変性試料ローディング緩衝液で処理し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。ゲルを０．１％クマシーＲ−２５０溶液で染色した。レーン１：遠心分離後のアポプラスト画分、レーン２〜３：連続的精密濾過後のアポプラスト画分；レーン４：陽イオン交換の負荷試料；レーン５：陽イオン交換のフロースルー画分。レーン６；陽イオン交換からの溶出物、１０倍濃縮；レーン７：分子量標準（ｋＤａ）。
【００４２】
【図７】消化緩衝液にＮａＣｌを添加せずに清澄化した後のＨ５／Ｉｎｄｏ  ＶＬＰ（図７Ａ）およびＨ１／Ｃａｌ  ＶＬＰ（図７Ｂ）ならびにこれを添加した場合のＨ１／Ｃａｌ  ＶＬＰ（図７Ｃ）のナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）プロファイルを示す図である。ＮＴＡ実験はＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＬＭ２０（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ、英国エームズベリー）で行った。この装置は、青レーザー（４０５ｎｍ）、試料チャンバーおよびＶｉｔｏｎフルオロエラストマーＯリングを装備している。ビデオを室温で記録し、ＮＴＡ２．０ソフトウェアを使って解析した。試料を６０秒間記録した。シャッターとゲインは、最適な粒子解像度が得られるように、手動で選択した。
【００４３】
【図８】異なる緩衝液を使った酵素消化によって生成したＨ３／Ｂｒｉｓｂａｎｅ  ＶＬＰの抽出物のウェスタンブロットを示す図である。レーン１）純粋な組換えＨＡ標準（５μｇ、Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．から入手、ＩＴ−００３−００４２ｐ）。レーン２〜５は、以下の緩衝液で行われた、遠心分離済みの酵素抽出物７μｌを含んでいる：レーン２）６００ｍＭマンニトール＋１２５ｍＭクエン酸塩＋７５ｍＭ  ＮａＰＯ４＋２５ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０４％重亜硫酸塩（ｐＨ６．２）、レーン３）６００ｍＭマンニトール＋１２５ｍＭクエン酸塩＋７５ｍＭ  ＮａＰＯ４＋５０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０４％重亜硫酸塩（ｐＨ６．２）、レーン４）２００ｍＭマンニトール＋１２５ｍＭクエン酸塩＋７５ｍＭ  ＮａＰＯ４＋２５ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０３％重亜硫酸塩（ｐＨ６．２）、レーン５）２００ｍＭマンニトール＋１２５ｍＭクエン酸塩＋７５ｍＭ  ＮａＰＯ４＋５０ｍＭ  ＥＤＴＡ＋０．０３％重亜硫酸塩（ｐＨ６．２）。矢印は、ＨＡ０の免疫検出シグナルを表す。
【００４４】
【図９】コンストラクト番号５９０のアセンブリのために合成されたＤＮＡフラグメント（ＬＣフラグメント）（配列番号１５）の配列を示す図である。
【００４５】
【図１０】コンストラクト番号５９２のアセンブリのために合成されたＤＮＡフラグメント（ＨＣフラグメント）（配列番号１６）の配列を示す図である。
【００４６】
【図１１】図１１Ａおよび図１１Ｂは、それぞれ、コンストラクト番号５９５（図１１Ａ）およびコンストラクト番号Ｒ４７２（図１１Ｂ）の概略図である。
【００４７】
【図１２】細胞壁の機械的破壊（ブレンダー抽出）および酵素消化によって生産された抽出物から精製した抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ比較。各抽出法につき２つのロットを、独立して加工し、精製した。
【００４８】
【図１３】図１３Ａは、細胞壁の機械的破壊（ブレンダー抽出）および酵素消化によって精製されたＣ２Ｂ８上のオリゴマンノシドＮ−グリカンの比率を示す図である。図１３Ｂは、細胞壁の機械的破壊（ブレンダー抽出）および酵素消化によって精製されたＣ２Ｂ８上の複合型Ｎ−グリカンの比率を示す図である。
【００４９】
【図１４】図１４Ａは植物細胞壁のモデル（共有結合的架橋モデル）を示している。このモデルでは、細胞壁マトリックスポリマー（キシログルカン、ペクチン、および糖タンパク質）が共有結合で互いに連結されている。セルロースミクロフィブリルへのキシログルカンの結合は、壁に引張強さを与える非共有結合的架橋セルロース−ヘミセルロースネットワークをもたらす。図１４Ｂは、植物細胞壁の代替モデル（テザーモデル）を示している。このモデルでは、キシログルカン分子がセルロースミクロフィブリルに水素結合し、セルロースミクロフィブリルを架橋している。セルロース−キシログルカンネットワークは、非共有結合的架橋ペクチンネットワーク中に網目を作っている。図１４Ｃは、植物細胞壁のもう一つの代替モデル（拡散層モデル）を示している。このモデルでは、キシログルカン分子はセルロースミクロフィブリルの表面に水素結合しているものの、それらを直接的には架橋していない。強固に結合したキシログルカンは、それほど強固には結合していない多糖の層によって囲まれている。セルロースとキシログルカンはペクチンマトリックスに埋め込まれている。図１４Ｄは、植物細胞壁の代替モデル（成層モデル）を示している。このモデルでは、キシログルカン分子がセルロースミクロフィブリルに水素結合し、セルロースミクロフィブリルを架橋している。セルロース−キシログルカンのラメラが、ペクチン多糖の層によって分離されている。
【００５０】
【図１５】細胞壁解重合酵素の使用を伴うまたは伴わないＥＤＴＡ含有緩衝液による植物処理時に放出されるタンパク質を示す図である。図１５Ａ：ブラッドフォードアッセイを使ってタンパク質濃度を測定した。図１５Ｂ：赤血球を凝集させる最低量の抽出可能なタンパク質の逆数としてＨＡ活性を表す。
【００５１】
【図１６】図１６Ａは、酵素溶液／消化溶液を浸潤させた葉から４時間後（時間０．２５ｔ）に放出されるタンパク質（実施例１７参照）を、同じ酵素溶液／消化溶液に１６時間（時間ｔ）浸漬し振とうした葉と比較して示す図である。図１６Ｂは、酵素溶液／消化溶液を浸潤させた全植物体／葉から放出されるタンパク質を、同じ酵素溶液／消化溶液を浸潤させた切断葉と比較して示す図である。図１６Ｃは、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸＣＧおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を使用して、または使用せずに、１つまたは２つ以上のペクチナーゼ（例えばＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  １６２Ｌおよび／またはＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ４４４Ｌ）で全葉を処理した時に放出されるタンパク質を示す図である。さらにまた、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ＰＤＮ３３で全葉を処理した時のタンパク質放出も示されている。図１６Ｄは、ｐＨ５．８、ｐＨ６．０またはｐＨ６．２の緩衝液でアグロフィルトレーションの５日後に全葉を処理した時に放出されるタンパク質またはｐＨ６．２もしくはｐＨ６．５のさまざまな緩衝液でアグロインフィルトレーションの７日後に全葉を処理した後に放出されるタンパク質を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
詳細な説明
本発明は、植物由来タンパク質を回収する方法に関する。より具体的には、本発明は、植物および植物組織から、タンパク質またはタンパク質超構造体を回収する方法を提供する。
【００５３】
以下の説明は好ましい実施形態の説明である。
【００５４】
本発明は、目的の植物由来タンパク質またはタンパク質超構造体を回収するための方法を提供する。目的のタンパク質は、プロトプラスト／スフェロプラストコンパートメントを除く植物細胞部分に相当するアポプラストまたは細胞外コンパートメント中に存在しうる。本方法では、例えば細胞壁内で細胞壁ポリマー構成要素およびそれらに関連する連結を分解し、部分的に分解し、切断し、部分的に切断し、または他の形で構造的に変化させ、細胞壁ポリマー内または細胞壁ポリマー間の分子間非共有結合または共有結合を破断することなどによって、細胞壁を弛緩させる。本方法は、植物細胞からのプロトプラストまたはスフェロプラストの放出を伴っても、伴わなくてもよい。
【００５５】
「プロトプラスト」という用語は、その細胞壁が完全にまたは著しく除去されている植物細胞を意味し、例えば細胞壁の約５０％〜約１００％またはその間の任意の量が除去されうる。例えば、細胞壁の約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００％またはその間の任意の量が除去されうる。スフェロプラストでは細胞壁が部分的に除去されうる。例えば細胞壁の１０％〜約４９％またはその間の任意の量が除去されうる。例えば細胞壁の約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４９％またはその間の任意の量が除去されうる。
【００５６】
「アポプラスト」は、形質膜と細胞壁の間に含まれる植物細胞の一部分であり、植物の細胞壁および細胞間隙を含む。消化およびさらなる加工中にプロトプラスト（および／またはスフェロプラスト）の完全性は維持されることが好ましいが、本明細書に記載するタンパク質または超構造体タンパク質を濃縮するために、プロトプラストが無傷のままであることは要求されない。プロトプラストまたはスフェロプラストの形質膜は、分解、部分的に分解、切断、部分的に切断されていないこと、もしくは他の形で構造的に変化していないこと、弛緩していないこと、またはその完全性が変化していないことが好ましいが、形質膜の例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはその間の任意の量は、分解され、切断され、構造的に変化し、弛緩し、または除去されていてもよい。
【００５７】
「細胞壁」という用語は、植物細胞の外側細胞コンパートメントを形成する構造であって、形質膜の外側に位置してアポプラストの境界を成している構造を意味する。理論に束縛されるわけではないが、細胞壁は、ポリマーのマトリックス、例えばセルロースミクロフィブリルがヘミセルローステザーによって連結されて、ペクチンマトリックスに埋め込まれたセルロース−ヘミセルロースネットワークを形成しているものでできていると考えられる（植物細胞壁のいくつかの非限定的なモデルについては図１４Ａ〜１４Ｄを参照されたい）。細胞壁構成要素には、非限定的な例として、多糖、セルロース、ヘミセルロース（例えばキシラン、キシログルカン、グルクロノキシラン、アラビノキシラン、グルクロノアラビノキシラン、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ガラクトグルコマンナン）、ペクチン（例えばホモガラクツロナン、ラムノガラクツロナンＩ、ラムノガラクツロナンＩＩ、オリゴガラクツロニド、置換ガラクツロナン、キシロガラクツロナン、アピオガラクツロナン）、ポリマー、リグニン、クチン、スベリン、糖タンパク質、ヒドロキシプロリンリッチ糖タンパク質、アラビノガラクタンタンパク質、グリシンリッチタンパク質、プロリンリッチタンパク質、エクステンシン、エクスパンシン、ミネラル、カルシウム、ペクチン酸カルシウム、マグネシウム、ペクチン酸マグネシウム、ホウ酸塩、フェノールエステル、フェルラ酸、クマル酸を含めることができる。
【００５８】
構造上、細胞壁構成要素、特にペクチンマトリックスに埋め込まれたセルロース−ヘミセルロースネットワークは、細胞壁の半透性に貢献する。生理的環境において、細胞壁は通常、細胞壁構成要素によって形成されるメッシュを通して、小分子の通過を許す。細胞壁の弛緩は、細胞壁構成要素同士の相互作用の弛緩を伴い、直接的または間接的にメッシュの拡大または伸張をもたらすことで、細胞壁を通過することを通常許されるものより大きな分子の通過を可能にする。大きな分子による、弛緩した細胞壁の通過は、小さな分子による、弛緩していない細胞壁の通常の通過に作用する力、例えば膨圧、浸透圧および静水圧などによって促進することができる。本方法は、それらの力の１つ以上に作用して大きな分子の通過をさらに容易にするであろう試薬、化学薬品または生物製剤の使用を含みうる。
【００５９】
「細胞壁弛緩」とは、壁張力の緩和、壁応力緩和、不可逆的壁伸張（壁クリープ）、または細胞壁の１つ以上の構成要素の部分的なまたは完全な分解をもたらしうる細胞壁の構造的変化をもたらす、細胞壁の修飾を意味する。例えば、理論に束縛されることは望まないが、細胞壁弛緩は、細胞壁内のさまざまな構成要素間の結合、例えば細胞壁内の荷重負荷結合が破断される結果として生じうる。構造的変化は、例えば細胞壁構成要素の切断、部分的切断、分解または部分的分解、細胞壁構成要素内または細胞壁構成要素間の分子間非共有結合または共有結合の破断、または細胞壁を弱める他の修飾、細胞壁マトリックスの破壊、またはそれらの組み合わせによって起こりうる。弛緩は、壁の限局的領域において、細胞壁内のターゲット構成要素で起こりうるか、または弛緩は細胞壁全体に広く散在しうる。細胞壁弛緩は、例えばソニケーショなどの植物細胞の物理的処理、細胞壁弛緩組成物による化学的処理、酵素的処理、化学的処理と酵素的処理の両方、またはソニケーションと細胞壁弛緩組成物による処理との組み合わせ、または浸潤（減圧または加圧を用いるもの）と細胞壁弛緩組成物による処理との組み合わせで起こりうる。細胞壁の弛緩は細胞壁の部分的消化をもたらしうる。細胞壁を弛緩させるための処理を受けた植物細胞は、依然として、植物細胞壁または植物細胞壁の一部を、修飾された形態で含みうる。さらにまた、細胞壁の弛緩には、細胞壁の部分的分解または除去、例えば細胞壁の０％〜約６０％またはその間の任意の量が分解または除去されるもの、細胞壁の０％〜約３０％またはその間の任意の量が分解または除去されるもの、あるいは細胞壁の０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０％またはその間の任意の量が分解または除去されるものも含めることができる。しかし、プロトプラスト、スフェロプラスト、またはプロトプラストとスフェロプラストの両方が生産されてもよい。細胞壁を弛緩させるために本明細書に記載の処理を１つ以上行った後の細胞の集団内にある一部の植物細胞は、プロトプラストを含みうる、例えば、細胞集団の約０％〜約５０％またはその間の任意の量がプロトプラストを含みうるか、細胞集団の例えば０％〜約３０％またはその間の任意の量、０％〜約１０％またはその間の任意の量がプロトプラストを含みうるか、細胞集団の０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％またはその間の任意の量がプロトプラストを含みうる。同様に、一部の植物細胞はスフェロプラストを含みうる、例えば、細胞集団の約０％〜約９０％またはその間の任意の量がスフェロプラストを含みうるか、細胞集団の例えば０％〜約６０％またはその間の任意の量、０％〜約３０％またはその間の任意の量がスフェロプラストを含みうるか、細胞集団の０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０％またはその間の任意の量がスフェロプラストを含みうる。
【００６０】
「細胞壁弛緩組成物（ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ｌｏｏｓｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」という用語は、細胞壁弛緩をもたらす任意の組成物、例えば細胞壁内の構成要素が切断され、部分的に切断され、分解され、または部分的に分解されるように細胞壁を修飾する任意の組成物、または細胞壁構成要素内もしくは細胞壁構成要素間の分子間非共有結合または共有結合を破断する任意の組成物、または細胞壁を弱くし、細胞壁マトリックスを破壊する他の修飾をもたらす任意の組成物、またはそれらの組み合わせを意味する。細胞壁弛緩組成物の例には、細胞壁構成要素を破壊または加水分解する化学薬品、細胞壁構成要素を破壊または加水分解する酵素、細胞壁構成要素を破壊または加水分解する生物製剤、または細胞壁構成要素を破壊または加水分解する化学薬品、生物製剤および酵素のうちの少なくとも２つの任意の組み合わせなどがある。化学薬品の非限定的な例には、キレーター、例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどの二価カチオンキレーター、プロトン供与体、ヒドロキシラジカル、水酸化カリウム、インドール−３−酢酸、イミダゾール、およびそれらの組み合わせなどがある。生物製剤の非限定的な例には、オーキシン、エクスパンシン、例えば１つ以上のアルファ−エクスパンシンまたはベータ−エクスパンシン、およびそれらの組み合わせなどがある。酵素の非限定的な例には、グリカナーゼ、ガラクツロナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、ペクトリアーゼ、ペクトザイム（ｐｅｃｔｏｚｙｍｅ）、ペクチンエステラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、エンド−１，４−ベータ−グルカナーゼ、キシログルカントランスグリコシルヒドロラーゼ、キシログルカンエンドグルカナーゼ、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ、セロビオヒドロラーゼ（セキソセルラーゼ）、グリコシドヒドロラーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ（酸化的セルラーゼ）、セルロースホスホリラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、およびそれらの組み合わせなどがある。下記実施例（例えば実施例１）で述べるように、使用しうる酵素混合物の非限定的な例には、ペクチナーゼであるマセロチーム（ＭＡＣＥＲＯＺＹＭＥ）（ヤクルト薬品工業）およびセルラーゼ組成物であるオノズカ（ＯＮＯＺＵＫＡ）Ｒ−１０（ヤクルト薬品工業）がある。もう一つの非限定的な例（実施例１７；図１６）では、使用しうる酵素混合物が、例えばＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  １６２Ｌ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ４４４Ｌ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ＰＤＮ３３などといった、単独でまたは組み合わせて使用されるペクチナーゼを含む。ペクチナーゼまたはペクチナーゼ組成物を、例えばＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＣＧ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）またはその組合せなどといったセルラーゼと共に使用してもよい。細胞壁弛緩組成物がプロトプラストの調製に使用しうる酵素混合物を含む場合（例えば下記実施例の「細胞壁消化によるＶＬＰ抽出」、実施例１および実施例１７で述べるような場合；また、出典明示により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８９またはＰＣＴ／Ｃ���２０１０／００１４８８も参照されたい）、使用する酵素の量および／または消化時間または他の任意の消化パラメータは、プロトプラストを調製するために典型的に使用されるものより少ない。例えば、使用される酵素の量は、プロトプラストを調製するために通常使用されるであろう量の０．１〜約７５％またはその間の任意の量でありうる。例えば、細胞壁弛緩組成物として使用される酵素の量は、０〜約５０％またはその間の任意の量のプロトプラストを含む植物細胞組成物を生産するであろう。あるいは、細胞壁弛緩組成物として使用される酵素の量は、プロトプラストを調製するために使用されるもの（例えば実施例「細胞壁消化によるＶＬＰ抽出」および実施例１；ならびに出典明示により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８９またはＰＣＴ／ＣＡ２０１０／００１４８８に記述されているもの）に似ていてもよいが、インキュベーションの継続時間は、プロトプラストを調製するために通常使用されるであろう継続時間の約３０〜約８０％またはその間の任意の量だけ、短縮される。
【００６１】
細胞壁弛緩組成物、例えば酵素溶液または消化溶液は、例えば減圧浸潤（実施例１７参照；例えば出典明示により本明細書に組み込まれるＤ’Ａｏｕｓｔら，２００８  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊ．  ６：９３０−９４０；ＷＯ００／０６３４００；ＷＯ００／０３７６６３に記載の条件と類似する条件を使用）または加圧浸潤（例えば約１〜約１５０ｋＰａまたはその間の任意の量の圧力を、約１分〜１０時間使用）を使って、全植物体（ｗｈｏｌｅ  ｐｌａｎｔ）、植物器官、または全葉に浸潤させうる。全植物体とは、根、茎および葉を含む植物を意味する。植物器官とは、根系、植物の地上部分（葉を伴う茎）、葉が除かれた茎、花、または１つ以上の葉（葉柄を伴うものまたは葉柄を伴わないもの）を意味する。全葉（単数または複数）とは、植物から取り出されているが、それ以外の点では小片に切り刻まれていないという点で無傷な、葉または１枚以上の葉（葉柄を伴うものまたは葉柄を伴わないもの）を意味する。本明細書において述べるように、例えば全植物体または１つ以上の全葉における細胞壁弛緩組成物の浸潤は、全植物体または葉からのタンパク質、超構造体タンパク質またはＶＬＰの放出を可能にする。理論に束縛されることは望まないが、細胞壁弛緩組成物を全葉内に浸潤させない場合は、酵素組成物が組織を徐々に消化することができるように、組成物のための葉内の侵入点を増加させる必要がある。例えば細胞壁弛緩組成物が溶液として用意され、そこに葉が浸漬される場合、酵素消化は、露出した周縁部から葉組織の内部に向かって起こる。この過程を機械的撹拌を使って強化すると、ペクトセルロースマトリックスからプロトプラストまたはスフェロプラストの放出が起こる。細胞壁弛緩組成物の浸潤により、必要とされる機械的撹拌が強さと継続時間の両面で低減され、プロトプラストの完全性の維持が助長され、プロトプラスト収量が増加しうる。酵素を葉（または器官もしくは全植物体）に浸潤させる場合は、葉（器官または植物）の連続的な撹拌を行ってもよいが、撹拌は必要ないだろう。
【００６２】
細胞壁を細胞壁弛緩組成物で処理することにより、目的の植物由来タンパク質またはタンパク質超構造体は、より容易に放出されうる。細胞壁弛緩のステップを含む方法を使用することにより、宿主細胞タンパク質の大部分を含有する細胞壁およびプロトプラストコンパートメントが、放出された目的の植物由来タンパク質またはタンパク質超構造体から隔離されるので、目的の植物由来タンパク質またはタンパク質超構造体を濃縮することができる。
【００６３】
「植物由来タンパク質」、「タンパク質」または「目的のタンパク質」（これらの用語は区別なく使用される）とは、植物内または植物の一部分内で発現させるべき、ヌクレオチド配列またはコード領域によってコードされるタンパク質またはタンパク質サブユニットであり、その植物または植物の一部分にとって外因性であるタンパク質およびタンパク質サブユニットを含む。タンパク質は、約１〜約１００ｋＤａまたはその間の任意の量、例えば１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量を有しうる。タンパク質は単量体、二量体、三量体または多量体でありうる。
【００６４】
タンパク質超構造体（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｐｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、超構造体タンパク質（ｓｕｐｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、タンパク質超構造（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｕｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）、または超構造タンパク質（ｓｕｐｅｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）とも呼ばれ、２つ以上のポリペプチドで構成されるタンパク質構造体である。それらのポリペプチドは同じであっても異なってもよく、異なる場合は約１：１〜約１０：１またはそれより大きな比で存在しうる。超構造体タンパク質には、タンパク質ロゼット、タンパク質複合体、タンパク質ナノ粒子、糖タンパク質、抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、またはウイルス様粒子、プロテアソーム、メタボロン、転写複合体、組換え複合体、光合成複合体、膜輸送複合体、核膜孔複合体、キメラタンパク質、キメラタンパク質複合体、キメラタンパク質ナノ粒子、キメラ糖タンパク質、キメラ抗体、キメラモノクローナル抗体、キメラ一本鎖モノクローナル抗体、またはキメラヘマグルチニン（ＨＡ）を含めることができるが、これらに限るわけではない。タンパク質超構造体がＶＬＰである場合、ＶＬＰは、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、およびウイルスコートタンパク質の群から選択しうる。植物由来ＶＬＰはインフルエンザ（ＨＡ）を含みうる。
【００６５】
典型的には、タンパク質超構造体（タンパク質超構造）は、アセンブルされた時には大きく、例えば７５ｋＤａより大きい分子量、例えば約７５〜約１５００ｋＤａまたはその間の任意の分子量を有する。例えば、タンパク質超構造体は、約７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量を有しうる。一体となってタンパク質超構造体を構成するサブユニットは、より小さい分子量のものであることができ、例えば各サブユニットは約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量を有しうる。タンパク質超構造体は、１つ以上のアミノ酸が、例えばタンパク質ヘリックス中の残基と水素結合している二次構造、三次元コンフィギュレーションを有する三次構造、またはマルチサブユニット複合体を形成する多重に折りたたまれたタンパク質分子またはコイル状タンパク質分子の配置を有する四次構造を示すタンパク質を含みうる。
【００６６】
マルチタンパク質複合体（またはタンパク質複合体）は、２つ以上の会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ポリペプチド鎖の群を含みうる。異なるポリペプチド鎖が異なるタンパク質ドメインを含有している場合、結果として生じるマルチタンパク質複合体は、多数の触媒機能を有することができる。タンパク質複合体は、単一ポリペプチド鎖内に多数の触媒ドメインを含むマルチ酵素ポリペプチドであってもよい。タンパク質複合体は典型的には四次構造の形態にある。標準的なタンパク質単離プロトコールを使用すると典型的には無傷のままで乗り切ることはできないが、本明細書に記載する方法を使用すれば取得することができるタンパク質複合体の例には、プロテアソーム（ペプチドまたはタンパク質の分解のため）、メタボロン（酸化的エネルギー生産のため）、リボソーム（タンパク質合成のため；例えばＰｅｒｅｉｒａ−Ｌｅａｌ，Ｊ．Ｂ．ら，２００６，Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．，３６１（１４６７）：５０７−５１７に記載されている）、転写複合体、組換え複合体、光合成複合体、膜輸送複合体、核膜孔複合体などがある。本方法は、安定なまたは弱いタンパク質ドメイン−タンパク質ドメイン相互作用を有すると特徴づけられるタンパク質複合体を取得するために使用することができる。
【００６７】
タンパク質またはタンパク質超構造体の例には、例えば工業用酵素、例えばセルラーゼ、キシラナーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、サブチリシン、飼料用もしくは食品用の、または飼料食品両用の、タンパク質サプリメント、栄養補助食品、付加価値製品、またはそれらのフラグメント、医薬活性タンパク質、例えば限定するわけではないが、成長因子、成長調節物質、抗体、抗原、およびそれらのフラグメント、または免疫処置もしくはワクチン接種などに有用なそれらの誘導体などがあるが、これらに限るわけではない。他の目的タンパク質には、インターロイキン、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−２４、ＩＬ−２６およびＩＬ−２７の１つまたは２つ以上、サイトカイン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インスリン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ｈＰＧ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦまたはそれらの組み合わせ、インターフェロン、例えばインターフェロン−アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−γ、血液凝固因子、例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、またはｔＰＡ  ｈＧＨ、受容体、受容体アゴニスト、抗体、神経ポリペプチド、インスリン、ワクチン、成長因子、例えば限定するわけではないが、上皮成長因子、ケラチノサイト成長因子、トランスフォーミング成長因子、成長調節物質、抗原、自己抗原、それらのフラグメント、またはそれらの組み合わせを含めることができるが、これらに限るわけではない。
【００６８】
タンパク質超構造体の非限定的な例は抗体である。抗体は、約１００〜約１０００ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量を有する糖タンパク質である。抗体は、ジスルフィド結合によってつながれた４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの軽鎖と２つの重鎖を含む。例えば、限定であるとみなしてはならないが、各軽鎖は、約２５ｋＤａの分子量、例えば約２０〜約３０ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量、さらには例えば約２０〜約３００ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量を有することができ、２つのドメイン、すなわち１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメイン（ＣＬ）で構成されている。各重鎖は、約５０ｋＤａの分子量、例えば約３０〜約７５ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量、さらには例えば約３０〜約５００ｋＤａまたはその間の任意の量の分子量を持つことができ、定常領域と可変領域とからなる。重鎖および軽鎖は、類似しているが同一ではないアミノ酸配列の群からなるいくつかの相同区域を含有する。これらの相同ユニットは約１１０アミノ酸からなり、免疫グロブリンドメインと呼ばれている。重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と、３つまたは４つの定常ドメイン（抗体クラスまたは抗体アイソタイプに応じてＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）とを含有する。ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間の領域はヒンジ領域と呼ばれ、Ｙ字状の抗体分子の２つのＦａｂアームの間に柔軟性を与えることで、それらが開閉して固定された距離だけ離れた２つの抗原性決定基への結合に適応することを可能にする。
【００６９】
タンパク質超構造体のもう一つの非限定的な例はＶＬＰである。ＶＬＰは、ＨＡ０前駆体型、またはジスルフィド架橋によって互いに保持されたＨＡ１もしくはＨＡ２ドメインを含みうる。ＶＬＰは、約２０ｎｍ〜１μｍまたはその間の任意の量、例えば６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０  １６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００ｎｍまたはその間の任意の量、例えば１００ｎｍの平均サイズを有することができ、脂質膜を含みうる。
【００７０】
タンパク質または超構造体タンパク質は、さらに１つ以上の脂質、リン脂質、核酸、膜なども含みうる。２つ以上のポリペプチドは、共有結合、ジスルフィド架橋、電荷相互作用、疎水性引力、ファンデルワールス力、水素結合などでつながりうる。タンパク質超構造体の一例は、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、一本鎖モノクローナル抗体、またはエンベロープ型でも非エンベロープ型でもよいウイルス様粒子（ＶＬＰ）、例えばウイルスエンベロープタンパク質、ウイルス構造タンパク質、ウイルスキャプシドタンパク質、またはウイルスコートタンパク質である。
【００７１】
タンパク質または超構造体タンパク質は、植物宿主細胞を含む適切な宿主細胞において生産することができ、所望であれば、さらに精製することができる。本明細書では、キメラモノクローナル抗体、インフルエンザＶＬＰ、およびキメラインフルエンザＶＬＰを例示するが、本明細書に記載の方法は、任意のサイトゾル植物由来タンパク質もしくは超構造体タンパク質、またはアポプラスト中に局在するかアポプラストに分泌される任意の植物由来タンパク質もしくは超構造体タンパク質に使用することができる。
【００７２】
本発明は、植物または植物質から植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を回収する方法であって、アポプラスト内容物内に局在した植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を含む植物または植物質を取得すること；その植物または植物質を細胞壁弛緩組成物、ソニケーション、または細胞壁弛緩組成物とソニケーションの両方で処理して、弛緩した細胞壁を有する植物または植物質を生産し、よって細胞壁を通したアポプラスト内容物の放出を可能にし、刺激し、増加させ、または強化し、それによってアポプラスト内容物画分を生産すること；アポプラスト内容物画分を濾過して濾過画分を生産し、その濾過画分から植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を回収することを伴う方法も提供する。所望であれば、植物由来タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質を、濾過画分から精製することができる。アポプラスト内容物画分からタンパク質または超構造体タンパク質を回収するには、例えば遠心分離およびデカンテーションを含む、当技術分野において知られる代替的方法を使用することができる。
【００７３】
本発明は、タンパク質または超構造体タンパク質を回収する方法であって、タンパク質または超構造体タンパク質が植物由来脂質エンベロープを含むもの、例えば植物由来脂質エンベロープを含むＶＬＰである方法も提供する。本方法は、目的の超構造体タンパク質、例えばＶＬＰを含む植物または植物質を得ること、その植物または植物質を細胞壁弛緩組成物、ソニケーション、または細胞壁弛緩組成物とソニケーションの両方で処理して、弛緩した細胞壁を有する植物または植物質を生産し、よって細胞壁を通したアポプラスト内容物の放出を可能にし、刺激し、増加させ、または強化し、それによってアポプラスト内容物画分を生産すること、およびそのアポプラスト内容物画分から植物由来脂質エンベロープを含む目的の超構造体タンパク質を分離することを含む。
【００７４】
植物組織培養、培養植物細胞、およびプロトプラスト、スフェロプラストの生産などの一般原理について説明している標準的参考資料には、次に挙げるものがある：ＭＫ  Ｒａｚｄａｎ「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」第２版（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００３；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）、あるいは例えば以下のＵＲＬも参照されたい：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ−ｐｌａｎｔ−ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｉｎｆｏ／ｐｌａｎｔ−ｔｉｓｓｕｅ−ｃｕｌｔｕｒｅ／ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．ｈｔｍ。プロトプラスト（またはスフェロプラスト）の生産および操作に関する方法および技法については、例えばＤａｖｅｙ  ＭＲら，２００５（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２３：１３１−１７１；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）に総説がある。タンパク質生化学、分子生物学などの一般的方法および原理を説明している標準的参考資料には、例えばＡｕｓｕｂｅｌら「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９８および２００１年までの追補；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク州プレーンビュー，１９８９（これは出典明示により本明細書に組み込まれる）；Ｋａｕｆｍａｎら編「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ボカラトン，１９９５（これは出典明示により本明細書に組み込まれる）；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ編「Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード，１９９１（これは出典明示により本明細書に組み込まれる）などがある。
【００７５】
細胞壁を修飾し、それによって細胞壁を弛緩させるのに有用な酵素は、当業者には知られており、例えばセルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、ペクチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、キチナーゼ（ＥＣ３．２．１．１４）、ヘミセルラーゼ、キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼグルカナーゼ、キシログルカンエンドトランスグリコシラーゼ、エンドグリカナーゼ、例えばβ−１，３−グルカナーゼおよびβ−１，４−マンナナーゼ、キシログルカンエンドトランスグルコシラーゼ／ヒドロラーゼ、またはそれらの組み合わせなどを挙げることができる。セルラーゼは酵素の混合物であり、１つ以上のエンド−１，４−ベータ−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ（エキソセルラーゼ）、ベータ−グルコシダーゼ、セロビオースデヒドロゲナーゼ（酸化的セルラーゼ）、セルロースホスホリラーゼ、およびヘミセルラーゼを含みうる。細胞壁弛緩組成物として使用しうる適切な酵素の非限定的な例には、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、およびペクチナーゼを含む多成分酵素混合物、例えばマセロチーム（商標）（おおよそ次の成分を含有する：セルラーゼ：０．１Ｕ／ｍｇ、ヘミセルラーゼ：０．２５Ｕ／ｍｇ、およびペクチナーゼ：０．５Ｕ／ｍｇ）などがある。市販酵素、酵素混合物および供給者の他の例を表１に列挙する（ＭＫ  Ｒａｚｄａｎ「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」第２版，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２００３参照）。
【００７６】
セルラーゼの別名およびタイプには、エンド−１，４−β−Ｄ−グルカナーゼ；β−１，４−グルカナーゼ；β−１，４−エンドグルカンヒドロラーゼ；セルラーゼＡ；セルロシンＡＰ；エンドグルカナーゼＤ；アルカリセルラーゼ；セルラーゼＡ３；セルデキストリナーゼ；９．５セルラーゼ；アビセラーゼ；パンセラーゼＳＳおよび１，４−（１，３；１，４）−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼなどがある。ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）の別名およびタイプには、ペクチンデポリメラーゼ；ペクチナーゼ；エンドポリガラクツロナーゼ；ペクトラーゼ（ｐｅｃｔｏｌａｓｅ）；ペクチンヒドロラーゼ；ペクチンポリガラクツロナーゼ；エンド−ポリガラクツロナーゼ；ポリ−α−１，４−ガラクツロニドグリカノヒドロラーゼ；エンドガラクツロナーゼ；エンド−Ｄ−ガラクツロナーゼおよびポリ（１，４−α−Ｄ−ガラクツロニド）グリカノヒドロラーゼなどがある。キシラナーゼの別名およびタイプには、ヘミセルラーゼ、エンド−（１→４）−β−キシラン４−キシラノヒドロラーゼ；エンド−１，４−キシラナーゼ；キシラナーゼ；β−１，４−キシラナーゼ；エンド−１，４−キシラナーゼ；エンド−β−１，４−キシラナーゼ；エンド−１，４−β−Ｄ−キシラナーゼ；１，４−β−キシランキシラノヒドロラーゼ；β−キシラナーゼ；β−１，４−キシランキシラノヒドロラーゼ；エンド−１，４−β−キシラナーゼ；β−Ｄ−キシラナーゼなどがある。キチナーゼの別名およびタイプには、キトデキストリナーゼ；１，４−β−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；ポリ−β−グルコサミニダーゼ；β−１，４−ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミジナーゼ；ポリ［１，４−（Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド）］グリカノヒドロラーゼなどがある。
［表１］細胞壁弛緩用の市販酵素の非限定的な例
【表１−１】
2014510087.tif 000003
【表１−２】
2014510087.tif 000004
【００７７】
特定の酵素または酵素の組合せならびに濃度および反応条件の選択は、ＶＬＰを含む細胞および弛緩画分を得るために使用する植物組織のタイプに依存しうる。セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびペクチナーゼの混合物、例えば、ペクチナーゼ・マセロチーム（商標）またはＭｕｌｔｉｆｅｃｔを、０．０１％〜２．５％（ｖ／ｖ）の範囲、例えば０．０１、０．０２、０．０４、０．０６、０．０８、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、もしくは２．５％（ｖ／ｖ）またはその間の任意の量の濃度で使用しうる。マセロチーム（商標）またはＭｕｌｔｉｆｅｃｔは、単独で使用するか、他の酵素、例えばセルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、またはそれらの組合せと組み合わせて使用することができる。セルラーゼは、０．１％〜５％の範囲の濃度、例えば０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０％（ｗ／ｖ）またはその間の任意の量で使用しうる。さらにまた、ペクチナーゼ、例えば限定するわけではないが、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  １６２Ｌおよび１４４Ｌ（ポリガラクツロニダーゼおよびペクチンリアーゼ活性を含む）を、単独で使用するか、他の酵素、例えばセルラーゼ、ペクチナーゼ、ヘミセルラーゼ、またはそれらの組み合わせと組み合わせて使用することができる。ペクチナーゼ（ポリガラクツロニダーゼおよびペクチンリアーゼ活性を含む）は、０．１％〜５％の範囲の濃度、例えば０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０％（ｗ／ｖ）またはその間の任意の量で使用しうる。
【００７８】
酵素溶液（細胞壁弛緩組成物ともいう）は、一般に、緩衝液または緩衝液系、浸透圧調節物質、および１つまたは２つ以上の塩、二価カチオンまたは他の添加剤を含むであろう。緩衝液または緩衝液系は、酵素活性または精製すべきタンパク質もしくはＶＬＰの安定性にとってｐＨが適切な範囲に、例えば約ｐＨ５．０〜約８．０の範囲内またはそれらの間の任意の値に維持されるように選択される。選択される使用ｐＨは、回収すべきＶＬＰに依存して変動し、例えばｐＨは、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０またはその間の任意のｐＨでありうる。緩衝液または緩衝液系の例には、ＭＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩などがあるが、これらに限るわけではない。酵素溶液（細胞壁弛緩溶液）では１つ以上の緩衝液または緩衝液系を組み合わせることができ、それら１つ以上の緩衝液は、０ｍＭ〜約２００ｍＭまたはその間の任意の量、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０もしくは１９０ｍＭまたはその間の任意の量の濃度で存在しうる。適宜、所望であれば、浸透圧調節物質構成要素を加えることができる。浸透圧調節物質とその濃度は、酵素溶液の浸透力が上がるように選択される。浸透圧調節物質の例には、マンニトール、ソルビトールまたは他の糖アルコール、さまざまなポリマー長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などがある。浸透圧調節物質の濃度範囲は、植物の種、使用する浸透圧調節物質のタイプ、選択した植物組織のタイプ（種、元の器官、例えば葉または茎）に依存して変動しうる−一般的には範囲は、０Ｍ〜約０．８Ｍ、例えば０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．５、０．６、０．７、もしくは０．７５Ｍまたはその間の任意の量、例えば０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００ｎＭマンニトール、またはその間の任意の量である。浸透圧調節物質の濃度は、パーセンテージ（ｗ／ｖ）として表すこともできる。一部の植物または組織タイプについては、細胞壁からの植物細胞形質膜の分離を容易にしうるわずかに高張性の調製物を使用することが有益であるだろう。細胞壁弛緩のステップ中は浸透圧調節物質を省くこともできる。
【００７９】
細胞壁を修飾しそれによって細胞壁を弛緩させるのに有用な化学薬品組成物および化学化合物は、例えば限定するわけではないが、キレーター、二価キレーター、ヒドロキシラジカル、インドール−３−酢酸およびエクスパンシンを含む。キレーターの例には、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などがあるが、これらに限るわけではない。キレーターは、０ｍＭ〜約５００ｍＭまたはその間の任意の量、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００ｍＭまたはその間の任意の量の濃度で存在しうる。１つまたは２つ以上のキレーターを、追加の化学化合物、酵素溶液、または追加の化学化合物と酵素溶液との組み合わせと組み合わせて細胞壁弛緩組成物としてもよい。エクスパンシンの例には、例えばエクスパンシンＡ、エクスパンシンＢ、エクスパンシン様Ａ、エクスパンシン様Ｂおよびエクスパンシン様Ｘなどがあるが、これらに限るわけではない。エクスパンシンは、０．１％〜５％の範囲、例えば０．１、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５．０％（ｗ／ｖ）の濃度で使用しうる。１つまたは２つ以上のエクスパンシンを酵素溶液と組み合わせて細胞壁弛緩組成物としてもよい。
【００８０】
細胞壁は、壁ポリマーの非酵素的切断によって弛緩されるかもしれない。そのような非酵素的切断の例には、ヒドロキシラジカルによる切断が含まれる。ヒドロキシラジカルは、例えば触媒量のＣｕまたはＦｅイオンの存在下でアスコルビン酸によるＨ２Ｏ２の還元（フェントン試薬）によって生産されうる。ヒドロキシラジカル誘発性細胞壁弛緩に関する方法および技法については、例えばＳｃｈｏｐｆ，Ｐｅｔｅｒ  （出典明示により本明細書に組み込まれるＴｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２００１，２８（６），６７９−６８８）に総説がある。
【００８１】
あるいは、細胞壁は、約０〜約２００μＭまたはその間の任意の量、例えば５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００μＭまたはその間の任意の量のインドール−３−酢酸（オーキシン）添加によって弛緩されるかもしれない。インドール−３−酢酸を酵素溶液と組み合わせて細胞壁弛緩組成物としてもよい。
【００８２】
細胞壁はさらに、植物細胞の物理的処理、例えばソニケーションなどによって弛緩されるかもしれない。さまざまな超音波浴が市販されており、本発明にはそれらを使用しうる。超音波という用語は、ヒトの可聴域のすぐ上の周波数、したがって約２０ｋＨｚを指す。あるいは、超音波エネルギーを、例えば振動子によって、細胞の溶液または懸濁液に直接送達することもできる。細胞の溶液または懸濁液を、例えば、超音波エネルギーを伝達することができる媒質が入っている容器もしくはウェルまたは一連の容器もしくはウェルに入れることができる。媒質の非限定的な例は細胞壁弛緩組成物である。入力エネルギーを超音波エネルギーに変換することができる適切な振動子または他のデバイスにウェルを取り付けるか、近づける。細胞は、試料ホルダーとして機能するウェルまたは一連のウェルに直接入れるか、あるいは細胞を容器に入れて、ウェル内に含まれている液体に沈めることができる。漏出またはエアロゾル化を防ぐために、適切な覆いでウェルに蓋をすることができる。ある範囲のソニケーション周波数が植物試料のソニケーションには適しており、約５ＫＨＺ〜約６０ＫＨＺの範囲またはその間の任意の量、例えば１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５ＫＨＺの超音波エネルギーを使用しうる。ソニケーションは、約５秒〜約１０分間またはその間の任意の時間、続けうる。
【００８３】
細胞壁の弛緩を助けるために調節しうるもう一つのパラメータは温度である。温度は細胞壁弛緩ステップ中に制御しうる。有用な温度範囲は４℃〜４０℃またはその間の任意の温度、例えば約４℃〜約１５℃またはその間の任意の量、または約４℃〜約２２℃もしくはその間の任意の温度である。選択した温度に応じて、最適な抽出条件を維持するために、他の細胞壁弛緩実験パラメータを調節することができる。
【００８４】
形質膜の安定性を改善するために、カチオン、塩またはその両方、例えば０．５〜５０ｍＭまたはその間の任意の量の二価カチオン、例えばＣａ２＋またはＭｇ２＋、約０〜約７５０ｍＭまたはその間の任意の量、例えば１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００または７５０ｍＭの塩、例えばＣａＣｌ２、ＮａＣｌ、ＣｕＳＯ４、ＫＮＯ３など加えることができる。他の添加剤、例えば、約０〜約２００ｍＭまたはその間の任意の量、例えば５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍＭまたはその間の任意の量のキレーター、例えば限定するわけではないがＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、０．００５〜０．４％またはその間の任意の量、例えば０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１５、０．２、０，２５、０．３、０．３５、０．４％またはその間の任意の量の、酸化を防止するための還元剤、例えば限定するわけではないが、重亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸、特異的酵素阻害剤（下記参照）、および所望であれば、葉の老化の阻害剤、例えばシクロヘキシミド、カイネチン、または１つ以上のポリアミンも加えうる。
【００８５】
細胞壁弛緩組成物は、１つ以上の浸透圧調節物質、例えば約０〜約６００ｍＭのマンニトール、約０〜約５００ｍＭのＮａＣｌ、約０〜約５０ｍＭのＥＤＴＡ、約１％〜約２％ｖ／ｖのセルロース、約０〜約１％ｖ／ｖのペクチナーゼ、約０．０３〜約０．０４％のメタ重亜硫酸ナトリウム、約０〜約１２５ｍＭのクエン酸塩、または約０〜７５ｍＭのＮａＰＯ４も含みうる。ただし、本明細書に記載する方法は、細胞壁を完全に消化するのではなく、細胞壁を弛緩させるものであるから、細胞壁弛緩組成物における浸透圧調節物質の使用は、任意である。
【００８６】
植物細胞壁への酵素または酵素組成物のアクセスが強化されるように植物質を処理しうる。例えば、酵素組成物による処理の前に、葉の表皮を除去または「剥離」することができる。植物質は（手作業で、またはＵｒｓｃｈｅｌスライサーなどの裁断具もしくは切断具で）小片に切り分けることができ；切り刻んだ植物質に、さらに、化学薬品組成物、酵素組成物、または化学薬品と酵素の混合物を、部分減圧下で浸潤させうる（ＮｉｓｈｉｍｕｒａおよびＢｅｅｖｅｒｓ，１９７８，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ６２：４０−４３；Ｎｅｗｅｌｌら，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｂｏｔａｎｙ  ４９：８１７−８２７）。植物組織には、酵素組成物による処理の前または処理中に、植物質の機械的撹乱も適用することができる（Ｇｉｒｉｄｈａｒら，１９８９．  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ  １５１：１５１−１５７）。さらにまた、液体培養または固形培養の培養植物細胞を使って、弛緩した細胞壁を含む植物調製物を調製してもよい。
【００８７】
リパーゼまたはプロテアーゼを欠くか、リパーゼまたはプロテアーゼが不活化されている酵素組成物を使用することが望ましいだろう。例えば、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤またはリパーゼ阻害剤を、酵素組成物に含めることができる。リパーゼ阻害剤の例にはＲＨＣ８０２６７（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）があり；プロテアーゼ阻害剤の例には、Ｅ−６４、Ｎａ２ＥＤＴＡ、ペプスタチン、アプロチニン、ＰＭＳＦ、ペファブロック、ロイペプチン、ベスタチンなどがある。
【００８８】
酵素組成物中の植物質を混合または撹拌する任意の適切な方法を使用しうる。例えば植物質は、トレイもしくはパンに入れて、またはロータリーシェーカーを使って、穏やかに旋回または振とうするか、回転式または振動式ドラム中でタンブリングすることができる。
【００８９】
非限定的な例として、５００ｍＭマンニトール、１０ｍ  ＣａＣｌ２および５ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ５．６）中に１．５％セルラーゼ（オノズカＲ−１０）および０．３７５％マセロチーム（商標）を含む酵素組成物を、植物組織、例えばタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）組織に使用するための細胞壁弛緩組成物として、使用することができる。本明細書で述べるように、マンニトールの濃度は約０〜約５００ｍＭまたはその間の任意の量でさまざまであることができる。本明細書に開示する情報を考慮すれば、当業者は、そのタバコ属の齢および株に適した、またはＶＬＰの生産に使用される他の植物種に適した酵素組成物を、決定することができるであろう。もう一つの非限定的な例として、６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液中に、１〜４％（ｖ／ｖ）またはその間の任意の量、例えば１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０％（ｖ／ｖ）またはその間の任意の量の１つ以上のペクチナーゼ、例えば１〜４％またはその間の任意の量のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  １６２Ｌ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ４４４Ｌのそれぞれ、またはそれらの組み合わせを含む酵素組成物を、植物組織、例えばタバコ属組織に使用するための細胞壁弛緩組成物として、使用することができる。さらにまた、６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液中に、１つ以上のペクチナーゼ（例えばそれぞれ１％〜４％ｖ／ｖまたはその間の任意の量のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  １６２Ｌ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ４４４Ｌ、またはそれらの組み合わせ）を、それぞれ１％〜４％（ｖ／ｖ）またはその間の任意の量の１つ以上のセルラーゼ、例えばＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＣＧ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、またはそれら組み合わせと共に含む組成物を、植物組織、例えばタバコ属組織に使用するための細胞壁弛緩組成物として、使用することができる。
【００９０】
「アポプラスト内容物画分」とは、細胞壁弛緩組成物を使って、または他の方法、例えばソニケーションで細胞壁が弛緩するように細胞壁を修飾することによって、または細胞壁弛緩組成物とソニケーションとの組み合わせを使って、細胞壁を弛緩または部分的に弛緩させた後に、得られる画分を意味する。アポプラスト内容物画分は、植物または植物材料を細胞壁弛緩組成物と共にインキュベーションするか、ソニケーションするか、またはそれらを組み合わせることで植物インキュベーション混合物を得て、その植物インキュベーション混合物を濾過するか、遠心分離するか、またはそれらを組み合わせることでアポプラスト内容物画分を生産した後に、得ることができる。アポプラスト内容物画分は、典型的には、アポプラスト中に存在する可溶性構成要素を含む。アポプラスト内容物画分は、細胞壁の破壊から生じるいくつかの構成要素も含みうる。
【００９１】
理論に束縛されることは望まないが、細胞壁弛緩のステップは、細胞壁のポリマー構成要素を弛緩させ、植物タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質、その他、細胞壁内に捕捉されているものの放出を助長しうる。このプロトコールは、細胞内構成要素による植物タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質の汚染も最小限に抑える。細胞壁の弛緩後に、低速遠心分離と、それに続く濾過、深層濾過、沈降、沈殿、例えば限定するわけではないが硫酸アンモニウム沈殿、またはそれらの組み合わせを使って、目的の植物タンパク質、タンパク質または超構造体タンパク質を、細胞破片から分離することで、目的の植物タンパク質、タンパク質または超構造体タンパク質を含むアポプラスト内容物画分を得ることができる。
【００９２】
本明細書に記載する方法は、細胞壁を完全に消化するのではなく、細胞壁を弛緩させるものであるから、浸透圧調節物質は必要ないだろう。浸透圧調節物質を使用する場合は、任意の適切な技法、例えば限定するわけではないが、遠心分離、濾過、深層濾過、沈降、沈殿、またはそれらの組み合わせを使って、細胞小器官、プロトプラストおよび細胞壁を含む細胞画分をアポプラスト内容物画分から分離することで、目的の植物タンパク質または超構造体タンパク質を含み、かつ／または目的のタンパク質または超構造体タンパク質を含むプロトプラスト／スフェロプラストを含む、弛緩したプロトプラスト画分を得ることができる。
【００９３】
分離された画分は、例えば上清（遠心分離、沈降、または沈殿を行った場合）、または濾液（濾過した場合）であることができ、タンパク質、または超構造体タンパク質が濃縮されている。タンパク質、または超構造体タンパク質の単離、精製、濃縮、またはそれらの組み合わせのために、例えばさらなる遠心分離ステップ、沈殿、クロマトグラフィーステップ（例えばサイズ排除、イオン交換、アフィニティークロマトグラフィー）、タンジェンシャルフロー濾過、またはそれらの組み合わせによって、分離された画分をさらに加工することができる。精製されたタンパク質または超構造体タンパク質の存在は、例えば未変性ＰＡＧＥまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、適当な検出抗体を使ったウェスタン分析、キャピラリー電気泳動、または当業者には明白であるだろう他の任意の方法によって確認することができる。
【００９４】
目的の植物タンパク質、タンパク質、または超構造体タンパク質は、合成時に、形質膜の外へ分泌されうる。超構造体タンパク質がＶＬＰである場合、その平均サイズは、約２０ｎｍ〜１μｍまたはその間の任意の量である。超構造体タンパク質が抗体である場合、その分子量は、約１００ｋＤａ〜約１０００ｋＤａまたはその間の任意の量である。タンパク質、または超構造体タンパク質がひとたび合成されると、それらはそのサイズゆえに、形質膜と細胞膜の間に捕捉されたままになって、植物タンパク質を得るために使用される標準的な機械的方法を使った単離またはさらなる精製を受け付けない場合がある。収量を最大にし、細胞性タンパク質による超構造体タンパク質画分の汚染を最小限に抑え、タンパク質または超構造体タンパク質の完全性と、必要であれば、会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）脂質エンベロープまたは膜の完全性とを維持するために、タンパク質または超構造体タンパク質を放出させるために細胞壁を弛緩させる方法であって、プロトプラストおよび／またはスフェロプラストへの機械的ダメージが最小限に抑えられるもの、例えば本明細書に記載する化学的方法、酵素的方法、またはそれらの組み合わせは、有用でありうる。ただし、この手法の間に、全てのプロトプラストの完全性が保たれる必要はない。
【００９５】
植物で生産される超構造体タンパク質、例えばＶＬＰは、植物由来脂質との複合体を形成しうる。植物由来脂質は脂質二重層の形態をとることができ、さらに、ＶＬＰを取り囲むエンベロープを含みうる。植物由来脂質は、限定するわけではないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、グリコスフィンゴリピド、フィトステロール、またはそれらの組み合わせなど、ＶＬＰが生産される植物の形質膜の脂質構成要素を含みうる。植物由来脂質は「植物脂質」と呼ばれる場合もある。フィトステロールの例は当技術分野において知られており、例えばスチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールなどがある（Ｍｏｎｇｒａｎｄら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７９：３６２７７−８６）。
【００９６】
ポリペプチド発現は、植物の任意の細胞内もしくは細胞外間隙、細胞小器官または組織に、望みどおりにターゲティングすることができる。発現されたポリペプチドを特定の場所に局在化させるには、そのポリペプチドをコードする核酸を、シグナルペプチドまたはリーダー配列をコードする核酸配列に連結することができる。シグナルペプチドは、輸送ペプチド、シグナル配列、またはリーダー配列と呼ばれる場合もある。発現されたポリペプチドのアポプラストへの局在化を指示するためのシグナルペプチドまたはペプチド配列には、（そのタンパク質に関して）ネイティブなシグナルもしくはリーダー配列、または異種シグナル配列、例えば限定するわけではないが、イネアミラーゼシグナルペプチド（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  １９９９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：７０３−７０８）、アミノ酸配列：
ＭＡＫＮＶＡＩＦＧＬＬＦＳＬＬＬＬＶＰＳＱＩＦＡＥＥ；配列番号１０
を有するタンパク質ジスルフィドイソメラーゼシグナルペプチド（ＰＤＩ）、植物感染特異的（ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｒｅｌａｔｅｄ）タンパク質（ＰＲＰ；Ｓｚｙｐｅｒｓｋｉら，ＰＮＡＳ  ９５：２２６２−２２６２）、例えばタバコ植物感染特異的タンパク質２（ＰＲＰ）、ヒトモノクローナル抗体シグナルペプチド（ＳＰ、またはリーダー配列）、またはそのタンパク質に関してネイティブな任意のシグナルペプチドなどがあるが、これらに限るわけではない。
【００９７】
いくつかの例では、例えばシグナルペプチドまたは輸送ペプチドの非存在下でポリペプチドを発現させ分泌させた場合に、発現されたポリペプチドが、特異的細胞間もしくは細胞外間隙（アポプラストなど）、細胞小器官または組織に蓄積しうる。
【００９８】
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）または「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」という用語は、自己集合（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅ）し、ウイルス表面タンパク質、例えばインフルエンザＨＡタンパク質、またはキメラインフルエンザＨＡタンパク質を含む、構造を指す。ＶＬＰおよびキメラＶＬＰは、一般に、感染時に生産されるウイルス粒子に形態的および抗原的に似ているが、複製するのに十分な遺伝情報を欠くので、非感染性である。
【００９９】
「キメラタンパク質」または「キメラポリペプチド」とは、単一ポリペプチドとして融合された２つまたは３つ以上の供給源、例えば限定するわけではないが、２つ以上のインフルエンザ型または亜型に由来するアミノ酸配列を含む、タンパク質またはポリペプチドを意味する。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、そのポリペプチドもしくはタンパク質の残りの部分と同じ（すなわちネイティブの）またはそのポリペプチドもしくはタンパク質の残りの部分とは異種のシグナルペプチドを含みうる。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、キメラヌクレオチド配列からの転写産物として生産されて、無傷のままであることができ、あるいは必要であれば、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドは、合成後に切断されうる。無傷のキメラタンパク質、またはキメラタンパク質の切断された一部分は、会合して、多量体型タンパク質を形成しうる。キメラタンパク質またはキメラポリペプチドには、ジスルフィド架橋によって会合したサブユニットを含むタンパク質またはポリペプチド（すなわち多量体型タンパク質）も含まれうる。例えば、２つまたは３つ以上の供給源に由来するアミノ酸配列を含むキメラポリペプチドはサブユニットに加工され、それらのサブユニットがジスルフィド架橋を介して会合することで、キメラタンパク質またはキメラポリペプチドを生産しうる。キメラタンパク質の非限定的な例は、キメラモノクローナル抗体、例えばＣ２Ｂ８、またはキメラＶＬＰ、例えば限定するわけではないが、米国仮特許出願ＵＳ６１／２２０，１６１およびＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３（これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されている６９０、６９１、６９６、７３４、７３７、７４５または７４７と番号付けされたコンストラクト（表２）によって生産されるタンパク質およびＶＬＰである。
【０１００】
タンパク質または超構造体タンパク質は糖タンパク質であってもよく、細胞壁弛緩による抽出を伴う本明細書に記載の方法は、ＷＯ２０００８／１５１４４０（「Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ」；この文献は出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されているような糖タンパク質とＮグリコシル化プロファイルを修飾するための１つ以上の酵素とを共発現する植物にも、修飾された成熟Ｎ−グリカンを保持する糖タンパク質の回収に有利に働くように応用することができる。例えば、成熟Ｎ−グリカンはキシロース残基およびフコース残基が除外されているか、またはフコシル化度、キシロシル化度、もしくはフコシル化度とキシロシル化度の両方が低いＮ−グリカンであることができる。あるいは、フコシル化、キシロシル化、またはその両方を欠き、ガラクトシル化が増加している、修飾されたグリコシル化パターンを含む目的のタンパク質を得ることもできる。
【０１０１】
修飾されたＮグリコシル化プロファイルは、ＷＯ２０００８／１５１４４０に記載されているように、植物、植物の一部分、または植物細胞内で、ベータ−１，４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）の触媒ドメインに融合されたＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１）のＣＴＳドメイン（すなわち細胞質テール、膜貫通ドメイン、ステム領域）を含むハイブリッドタンパク質（ＧＮＴ１−ＧａｌＴ）をコードする第１ヌクレオチド配列（第１ヌクレオチド配列は当該植物中で活性な第１調節領域と作動的に連結されている）と、目的の超構造体タンパク質をコードするための第２ヌクレオチド配列（第２ヌクレオチド配列は当該植物中で活性な第２調節領域と作動的に連結されている）とを含むヌクレオチドチド配列を共発現させ、第１および第２ヌクレオチド配列を共発現させることで、修飾されたＮ−グリコシル化プロファイルを有するグリカンを含む目的の超構造体タンパク質を合成することによって、得ることができる。
【０１０２】
超構造体タンパク質はインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）であってもよく、キメラＨＡまたはキメラインフルエンザＨＡを生産するために、ポリペプチドを構成している２つまたは３つ以上のアミノ酸配列を異なるＨＡから得てもよい。キメラＨＡは、合成後に切断される異種シグナルペプチドを含むアミノ酸配列も含みうる（キメラＨＡプレタンパク質）。本明細書に記載する発明において使用しうるＨＡタンパク質の例は、ＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ２００９／０７６７７８；ＷＯ２０１０／００３２２５（これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。キメラポリペプチドをコードする核酸は、「キメラ核酸」または「キメラヌクレオチド配列」と記載しうる。キメラＨＡで構成されるウイルス様粒子は「キメラＶＬＰ」と記載しうる。キメラＶＬＰは、２０１０年６月２５日出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３および米国仮特許出願第６１／２２０，１６１号（２００９年６月２４日；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）に、さらに記載されている。ＶＬＰはネイティブＨＡまたはキメラＨＡの発現から得ることができる。
【０１０３】
本発明が提供する方法に従って調製されるＶＬＰのＨＡには、既知の配列と、今後開発または同定されうる変異体ＨＡ配列とが含まれる。さらにまた、本明細書において記載するように生産されるＶＬＰは、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）または他の構成要素、例えばＭ１（Ｍタンパク質）、Ｍ２、ＮＳなどを含まない。ただし、ＨＡとＮＡとを含むＶＬＰが望まれる場合には、ＮＡやＭ１をＨＡと共発現させうる。
【０１０４】
一般に「脂質」という用語は脂溶性（親油性）の天然分子を指す。本発明のいくつかの態様に従って植物中で生産されるキメラＶＬＰは、植物由来脂質との複合体を形成しうる。植物由来脂質は、脂質二重層の形態をとることができ、さらに、ＶＬＰを取り囲むエンベロープを含みうる。植物由来脂質は、例えばリン脂質、トリ−、ジ−およびモノグリセリド、ならびに脂溶性ステロールまたはステロールを含む代謝産物など、ＶＬＰが生産される植物の形質膜の脂質構成要素を含みうる。その例には、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、グリコスフィンゴリピド、フィトステロールまたはそれらの組み合わせなどがある。植物由来脂質を「植物脂質」と呼ぶこともできる。フィトステロールの例には、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラシカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはベータ−シトステロールなどがある（Ｍｏｎｇｒａｎｄら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３６２７７−８６）。当業者には容易に理解されるであろうとおり、細胞の形質膜の脂質組成は、細胞の培養条件もしくは成長条件、またはその細胞の由来である生物または種と共に変動しうる。
【０１０５】
形質膜は、一般に、脂質二重層と、さまざまな機能のためのタンパク質とを含む。脂質二重層には「脂質ラフト」と呼ばれる特定脂質の局所的濃縮が見られる場合がある。これらの脂質ラフト微小領域はスフィンゴリピドおよびステロールに富むだろう。理論に束縛されることは望まないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染性因子の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、その細胞または生物の他の構造構成要素、例えば細胞内および細胞外マトリックスとの相互作用に重要な役割を有しうる。
【０１０６】
脂質エンベロープを含むＶＬＰは、以前に、ＷＯ２００９／００９８７６；ＷＯ２００９／０７６７７８、およびＷＯ２０１０／００３２２５（これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されている。インフルエンザウイルスについていえば、本明細書において使用する「ヘマグルチニン」または「ＨＡ」という用語は、インフルエンザウイルス粒子の構造糖タンパク質を指す。本発明のＨＡは任意の亜型から得ることができる。例えばＨＡは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６のものであるか、インフルエンザＢ型またはＣ型のものであることができる。本発明の組換えＨＡは任意のヘマグルチニンの配列に基づくアミノ酸配列も含みうる。インフルエンザヘマグルチニンの構造は詳しく研究されており、二次、三次および四次構造に高度の保存を示す。アミノ酸配列にはばらつきがありうるにもかかわらず、この構造的保存は観察される（例えばＳｋｅｈｅｌおよびＷｉｌｅｙ，２０００  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６９：５３１−６９；Ｖａｃｃａｒｏら，２００５参照；これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列はよく知られており、例えばＵＲＬ：ｂｉｏｈｅａｌｔｈｂａｓｅ．ｏｒｇ／ＧＳｅａｒｃｈ／ｈｏｍｅ．ｄｏ？ｄｅｃｏｒａｔｏｒ＝Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のＢｉｏＤｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ（現在はＩｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ；Ｓｑｕｉｒｅｓら，２００８  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３６：Ｄ４９７−Ｄ５０３）から、または国立バイオテクノロジー情報センターによって維持されているデータベース（ＮＣＢＩ；例えばＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｓｉｔｅｓ／ｅｎｔｒｅｚ？ｄｂ＝ｎｕｃｃｏｒｅ＆ｃｍｄ＝ｓｅａｒｃｈ＆ｔｅｒｍ＝ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）から入手することができる（これらはどちらも出典明示により本明細書に組み込まれる）。
【０１０７】
本発明は、ヒト、または宿主動物、例えば霊長類、ウマ、ブタ、鳥（ｂｉｒｄ）、ヒツジ、水鳥（ａｖｉａｎ  ｗａｔｅｒ  ｆｏｗｌ）、渡り鳥、ウズラ、カモ、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ科動物（ｃａｎｉｎｅ）、イヌ、ネコ科動物（ｆｅｌｉｎｅ）、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ムナジロテン、フェレット、家庭用ペット、家畜、マウス、ラット、鰭脚類、クジラなどに感染するウイルスのインフルエンザＶＬＰなどといった、ＶＬＰを調製、回収もしくは単離する方法、またはＶＬＰを調製し、回収しかつ単離する方法にも関係する。一部のインフルエンザウイルスは２種類以上の宿主動物に感染しうる。インフルエンザウイルスのヘマグルチニンではアミノ酸変異が許容される。この変異が、同定され続けている新しい株をもたらす。感染性は新しい株の間でさまざまでありうる。しかし、引き続いてＶＬＰを形成するヘマグルチニン三量体の情報は維持される。本発明には、ＨＡの亜型もしくは配列、またはそのＶＬＰを構成するキメラＨＡ、または起源の種とは無関係に、任意の植物由来ＶＬＰを回収する方法も含まれる。
【０１０８】
超構造体タンパク質の正しいフォールディングは、タンパク質の安定性、多量体の形成、タンパク質の形成および機能にとって重要でありうる。タンパク質のフォールディングは、例えば限定するわけではないが、タンパク質の配列、タンパク質の相対的存在量、細胞内密集度、フォールディングされたタンパク質、部分的にフォールディングされたタンパク質またはフォールディングされていないタンパク質に結合するか、それらと一過性に会合しうる補因子の利用可能性、１つ以上のシャペロンタンパク質の存在などといった、１つ以上の因子によって左右されうる。
【０１０９】
熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）またはストレスタンパク質は、タンパク質合成、細胞内輸送、ミスフォールディングの防止、タンパク質凝集の防止、タンパク質複合体の集合および解体、タンパク質フォールディング、およびタンパク質脱凝集を含むさまざまな細胞プロセスに参加しうるシャペロンタンパク質の例である。そのようなシャペロンタンパク質の例には、Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ６５、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ２０−３０、Ｈｓｐ１０、Ｈｓｐ１００−２００、Ｈｓｐ１００、Ｈｓｐ９０、Ｌｏｎ、ＴＦ５５、ＦＫＢＰ、シクロフィリン、ＣｌｐＰ、ＧｒｐＥ、ユビキチン、カルネキシン、およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼなどがあるが、これらに限るわけではない（例えばＭａｃａｒｉｏ，Ａ．Ｊ．Ｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｒｅｓ．  ２５：５９−７０，１９９５；Ｐａｒｓｅｌｌ，Ｄ．Ａ．およびＬｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｓ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．  ２７：４３７−４９６（１９９３）；米国特許第５，２３２，８３３号を参照されたい）。キメラＨＡのフォールディングを保証するために、シャペロンタンパク質、例えば限定するわけではないが、Ｈｓｐ４０およびＨｓｐ７０を使用することができる（２０１０年６月２５日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３、および２００９年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６１／２２０，１６１号；ＷＯ２００９／００９８７６およびＷＯ２００９／０７６７７８；これらは全て出典明示により本明細書に組み込まれる）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ；アクセッション番号Ｚ１１４９９）も使用することができる。
【０１１０】
回収されたら、タンパク質または超構造体タンパク質を、構造、サイズ、力価または活性について、例えば限定するわけではないが、電子顕微鏡法、光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロット分析、電気泳動、ＥＬＩＳＡ、活性に基づくアッセイ、例えば血球凝集アッセイ、または他の任意の適切なアッセイによって評価することができる。ＶＬＰのサイズ、濃度、活性および組成を評価するためのこれらの方法および他の方法は、当技術分野では知られている。
【０１１１】
分取用サイズ排除クロマトグラフィーのために、タンパク質または超構造体タンパク質を含む調製物を、本明細書に記載の方法によって得て、不溶物を遠心分離によって除去することができる。ＰＥＧまたは硫酸アンモニウムによる沈殿も有益でありうる。回収されたタンパク質は従来の方法（例えばブラッドフォードアッセイ、ＢＣＡ）を使って定量し、抽出物を例えばＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）または類似の媒質を使ったサイズ排除カラム、イオン交換カラムを使ったクロマトグラフィー、またはアフィニティカラムを使ったクロマトグラフィーに通し、活性画分を集める。アフィニティに基づく磁気分離を使って、例えばＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、タンパク質複合体を得て、そのＤｙｎａｂｅａｄｓ（商標）からタンパク質複合体を溶離させることもできる。クロマトグラフィープロトコールと分離プロトコールの組み合わせも使用しうる。クロマトグラフィーまたは分離に続いて、所望により、タンパク質電気泳動、イムノブロット、ＥＬＩＳＡ、活性に基づくアッセイによって、画分をさらに分析することで、超構造体タンパク質の存在を確認しうる。
【０１１２】
超構造体タンパク質がＶＬＰである場合は、血球凝集アッセイを使用することで、当技術分野において周知の方法を使ってＶＬＰ含有画分の血球凝集活性を評価することができる。理論に束縛されることは望まないが、異なる動物に由来するＲＢＣに結合するＨＡの能力は、シアル酸α２，３またはα２，３に対するＨＡのアフィニティとＲＢＣの表面にこれらのシアル酸が存在することとによる。インフルエンザウイルス由来のウマおよびトリＨＡが、シチメンチョウ、ニワトリ、カモ、モルモット、ヒト、ヒツジ、ウマおよびウシを含むいくつかの種の全てに由来する赤血球を凝集させるのに対し、ヒトＨＡは、シチメンチョウ、ニワトリ、カモ、モルモット、ヒトおよびヒツジの赤血球に結合するであろう（Ｉｔｏ  Ｔ．ら，１９９７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２７：４９３−４９９；Ｍｅｄｅｉｒｏｓ  Ｒら，２００１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２８９：７４−８５）。
【０１１３】
キメラＨＡまたはキメラＶＬＰを含むワクチンまたはワクチン組成物によって誘導される抗体の効力が、組換えＨＡによる赤血球（ＲＢＣ）の凝集を阻害できることを実証するために、血球凝集阻害（ＨＩまたはＨＡＩ）アッセイも使用しうる。血清試料の血球凝集阻害抗体価は、マイクロタイターＨＡＩ（Ａｙｍａｒｄら，１９７３）によって評価しうる。いくつかの種−例えばウマ、シチメンチョウ、ニワトリなど−のどれに由来する赤血球でも使用しうる。このアッセイは、ＶＬＰ表面でのＨＡ三量体のアセンブリに関する間接的情報を与えて、ＨＡ上の抗原部位の適正な提示を裏付ける。
【０１１４】
交差反応性ＨＡＩ価を使って、そのワクチン亜型に関連する他のウイルス株に対する免疫応答の効力を実証することもできる。例えば、第１インフルエンザ型または亜型のＨＤＣを含むキメラヘマグルチニンを含むワクチン組成物で免疫処置された対象からの血清を、ＨＡＩアッセイにおいて第２の株の全ウイルスまたはウイルス粒子と共に使用して、ＨＡＩ価を決定することができる。
【０１１５】
本発明の方法によって調製されるインフルエンザＶＬＰを、既存のインフルエンザワクチンと一緒に使用することで、そのワクチンを補完（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）し、それをより有効にするか、必要な投与量を減らすことができる。当業者には知られているであろうとおり、ワクチンは１つまたは２つ以上のインフルエンザウイルスに指向させることができる。適切なワクチンの例には、Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ、ＩＤ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、Ｍｅｒｉａｌ、Ｓｉｎｏｖａｃ、Ｃｈｉｒｏｎ、Ｒｏｃｈｅ、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｓｅｒｏｎｏ、Ｓｈｉｒｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓなどから市販されているものがあるが、これらに限るわけではない。所望であれば、本発明のＶＬＰは、当業者には知られているであろうとおり、適切なアジュバントと混合することができる。さらにまた、本発明に従って生産されたＶＬＰは、他のタンパク質構成要素と共発現させるか、他のＶＬＰまたはインフルエンザタンパク質構成要素、例えばノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍ１、およびＭ２と共に再構成させうる。例えばマラリア抗原、ＨＩＶ抗原、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）抗原などのワクチンタンパク質でできた他のＶＬＰと共発現または再構成させることもできる。
【０１１６】
タンパク質または超構造体タンパク質を含むトランスジェニック植物、植物細胞、植物質または種子の形質転換および再生のための方法は、当技術分野では確立されており、当業者に知られている。形質転換植物および再生植物を取得する方法は、本発明にとって決定的な問題ではない。
【０１１７】
「形質転換」とは、遺伝子型もしくは表現型またはその両方によって発露される遺伝情報（ヌクレオチド配列）の種間移動を意味する。キメラコンストラクトから宿主への遺伝情報の種間移動は、遺伝性（すなわち宿主のゲノム内への組込み）であって遺伝情報の移動が安定であると見なされる場合も、移動が一過性であって遺伝情報の移動が遺伝性でない場合もある。
【０１１８】
「植物質（ｐｌａｎｔ  ｍａｔｔｅｒ）」という用語は、植物に由来する任意の物質を意味する。植物質は、植物全体、組織、細胞、またはその任意の画分を含みうる。さらに、植物質は、細胞内植物構成要素、細胞外植物構成要素、植物の液状もしくは固形抽出物、またはそれらの組合せを含みうる。さらに、植物質は、植物の葉、茎、果実、根またはそれらの組合せから得られる植物、植物細胞、組織、液状抽出物、またはそれらの組合せを含みうる。植物質は、何の加工ステップにも付されていない植物またはその一部を含みうる。植物の一部分は植物質を含みうる。植物または植物質は、任意の方法で収穫または取得することができ、例えば全植物体を使用するか、葉または他の組織を、ここに記載する方法で使用するために、特に取り出すことができる。ＶＬＰを発現し分泌するトランスジェニック植物も、本明細書に記載する加工のための出発材料として使用しうる。
【０１１９】
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、浸潤などを使って、植物細胞中に導入することができる。そのような技法の総説としては、例えばＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，ＶＩＩＩ，ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；ＧｅｉｅｒｓｏｎおよびＣｏｒｅｙ「Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」第２版（１９８８）；ならびにＤＴ．  Ｄｅｎｎｉｓ，ＤＨ  Ｔｕｒｐｉｎ，ＤＤ  Ｌｅｆｅｂｒｖｅ，ＤＢ  Ｌａｙｚｅｌｌ編「Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」第２版（Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ  Ｌｔｄ．，ロンドン）のｐｐ．５６１−５７９、ＭｉｋｉおよびＩｙｅｒ「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ」（１９９７）を参照されたい。他の方法には、例えばプロトプラストを使った、直接ＤＮＡ取り込み、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカーの使用、および減圧浸潤などがある。例えば、Ｂｉｌａｎｇら（Ｇｅｎｅ  １００：２４７−２５０（１９９１）、Ｓｃｈｅｉｄら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２８：１０４−１１２，１９９１）、Ｇｕｅｒｃｈｅら（Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５２：１１１−１１６，１９８７）、Ｎｅｕｈａｕｓｅら（Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ７５：３０−３６，１９８７）、Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７）；Ｈｏｗｅｌｌら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８：１２６５，１９８０）、Ｈｏｒｓｃｈら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１２２９−１２３１，１９８５）、ＤｅＢｌｏｃｋら，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ９１：６９４−７０１，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９８８）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＳｃｈｕｌｅｒおよびＺｉｅｌｉｎｓｋｉ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，１９８９）、ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈ，１０５：３４３−３４８，２００２）、米国特許第４，９４５，０５０号；同第５，０３６，００６号；同第５，１００，７９２号；同第６，４０３，８６５号；同第５，６２５，１３６号（これらは全て出典明示により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２０】
本発明のコンストラクトを発現させるには一過性の発現方法を使用しうる（ＬｉｕおよびＬｏｍｏｎｏｓｓｏｆｆ，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０５：３４３−３４８；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）。あるいは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／０６３４００、ＷＯ００／０３７６６３（出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されているような減圧に基づく一過性の発現方法も使用しうる。これらの方法には、例えばアグロイノキュレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ）またはアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の方法を挙げることができるが、これらに限るわけではなく、他の一過性の方法を上述のように使用することもできる。アグロイノキュレーションまたはアグロインフィルトレーションのいずれかにより、所望の核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば葉、植物の地上部分（茎、葉および花を含む）、植物の他の部分（茎、根、花）、または全植物体の細胞間隙に進入する。表皮を横切った後、アグロバクテリウムは感染し、細胞内にｔ−ＤＮＡコピーを導入する。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡが翻訳されて、感染細胞における目的のタンパク質の生産をもたらすが、核内へのｔ−ＤＮＡの通過は一過性である。
【０１２１】
本明細書に記載する配列を以下に要約する。
【表１−３】
2014510087.tif 000005
【０１２２】
本発明を以下の実施例でさらに例示する。ただし、これらの実施例は例示を目的とするに過ぎず、決して本発明の範囲を限定するために使用されてはならないと理解すべきである。
【実施例】
【０１２３】
発現カセットのアセンブリ
ＶＬＰの生産に使用しうるコンストラクトは、米国仮特許出願第６１／２２０，１６１号およびＰＣＴ／ＣＡ２０１０／０００９８３（これらは出典明示により本明細書に組み込まれる）、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３２２５（これらは全て出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されている。コンストラクトには、表２に列挙するものも含めることができる。これらのコンストラクトのアセンブリは、ＷＯ２００９／００９８７６、ＷＯ２００９／０７６７７８、ＷＯ２０１０／００３２２５およびＵＳ６１／２２０，１６１に記載されている。既知のＨＡ（表２に記載するものを含むが、これらに限るわけではない）を含み、類似するまたは異なる調節要素およびプロモーターと組み合わされた、他のコンストラクトも、本明細書に記載するように、ＶＬＰの生産に使用しうる。
［表２］ヘマグルチニン生産に使用することができるコンストラクトの非限定的な例
【表２−１】
2014510087.tif 000006
【表２−２】
2014510087.tif 000007
【０１２４】
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットは、目的のコード配列（位置１１５および１６１に突然変異したＡＴＧを有するササゲモザイクウイルス（ＣＰＭＶ）ＲＮＡ２由来のヌクレオチド１〜５１２が５’側に隣接し、ＣＰＭＶ  ＲＮＡ２由来のヌクレオチド３３３０〜３４８１（３’ＵＴＲに相当）とそれに続くＮＯＳターミネーターが３’側に隣接しているもの）を含むｍＲＮＡの発現を制御するために、３５Ｓプロモーターを含んでいた。ＣＰＭＶ−ＨＴベースのヘマグルチニン発現カセットのアセンブリにはプラスミドｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣ（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙら，２００８；Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：８２−９２およびＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３５４８０）を使用した。ＣＰＭＶ  ＲＮＡ２の位置１１５および１６１にあるＡＴＧの突然変異は、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：７７−８５  （１９９５））に記載されているＰＣＲベースのライゲーション法を使って行った。テンプレートとしてｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣを使用して、２つの別々のＰＣＲを行った。第１増幅用のプライマーはｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号３）およびＭｕｔ−ＡＴＧ１１５．ｒ（配列番号４）とした。第２増幅用のプライマーはＭｕｔ−ＡＴＧ１６１．ｃ（配列番号５）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号６）とした。次に２つのフラグメントを混合し、ｐＢｉｎＰｌｕｓ．２６１３ｃ（配列番号３）およびＬＣ−Ｃ５−１．１１０ｒ（配列番号６）をプライマーとして用いる第３増幅のためのテンプレートとして使用した。その結果生じたフラグメントをＰａｃＩとＡｐａＩで消化し、同じ酵素で消化したｐＢＤ−Ｃ５−１ＬＣにクローニングした。生成した発現カセットを８２８と名付けた。
【０１２５】
ＣＰＭＶ−ＨＴ発現カセットにおけるＨ５  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５のアセンブリ（コンストラクト番号６８５）
このカセットのアセンブリは出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／００９８７６，    ＷＯ２００９／０７６７７８およびＷＯ２０１０／００３３２５に記載されている。
【０１２６】
簡単に述べると、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５のコード配列を、次のようにしてＣＰＭＶ−ＨＴにクローニングした：テンプレートとしてコンストラクト番号６６０（Ｄ’Ａｏｕｓｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：９３０−９４０（２００８））を使用し、プライマーＡｐａＩ−Ｈ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）．１ｃ（配列番号７）およびＨ５（Ａ−Ｉｎｄｏ）−ＳｔｕＩ．１７０７ｒ（配列番号８）によるＰＣＲ増幅を行うことにより、制限部位ＡｐａＩ（開始ＡＴＧのすぐ上流）およびＳｔｕＩ（停止コドンのすぐ下流）を、ヘマグルチニンコード配列に付加した。コンストラクト６６０は、アルファルファプラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ、Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／５／２００５由来のＨ５のヘマグルチニンコード配列（コンストラクト番号６６０）、アルファルファプラストシアニン３’ＵＴＲおよびターミネーター配列を含む（配列番号９；図５）。その結果生じたフラグメントをＡｐａＩおよびＳｔｕＩ制限酵素で消化し、前もって同じ酵素で消化しておいたコンストラクト番号８２８にクローニングした。その結果生じたカセットをコンストラクト番号６８５と名付けた（図１、２）。
【０１２７】
サイレンシングのサプレッサー
植物における導入遺伝子の発現の制限には転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）が関与する場合があり、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解に対抗するために、ジャガイモウイルスＹ由来のサイレンシングのサプレッサー（ＨｃＰｒｏ）の共発現を使用することができる（Ｂｒｉｇｎｅｔｉら，１９９８）。これに代わるサイレンシングのサプレッサーは、例えば限定するわけではないが、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ  ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのキャプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ；ＣＭＶ−２ｂ）、ジャガイモＸウイルスのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、カンキツトリステザウイルのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウリーフロール病関連ウイルス−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ハナウド（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ）潜伏ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）、またはニンニク潜伏ウイルス（Ｇａｒｌｉｃ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌａｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）のｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）など、当技術分野ではよく知られており、本明細書において述べるように使用することができる（Ｃｈｉｂａら，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４６：７−１４；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）。それゆえに、植物内での高レベルなタンパク質生産をさらに確実にするために、サイレンシングのサプレッサー、例えば限定するわけではないが、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ  −ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ  ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ−２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２  ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０を、目的のタンパク質をコードする核酸配列と一緒に共発現させることができる。
【０１２８】
ｐ１９の構築は、ＷＯ２０１０／０００３２２５（これは出典明示により本明細書に組み込まれる）に記述されている。簡単に述べると、トマトブッシースタントウイルス（ＴＢＳＶ）のｐ１９タンパク質のコード配列を、Ｄａｒｖｅａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２６：７７−８５（１９９５））に掲載されているＰＣＲベースのライゲーション法によってアルファルファプラストシアニン発現カセットに連結した。１ラウンド目のＰＣＲでは、テンプレートとしてコンストラクト６６０（出典明示により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０００３２２５に記載されている）を使用し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃ：
ＧＴＡＴＴＡＧＴＡＡＴＴＡＧＡＡＴＴＴＧＧＴＧＴＣ（配列番号１１）
とｓｕｐＰ１９−ｐｌａｓｔｏ．ｒ
ＣＣＴＴＧＴＡＴＡＧＣＴＣＧＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号１２）
とを使って、プラストシアニンプロモーターのセグメントを増幅した。これと並行して、Ｖｏｉｎｎｅｔら（Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ３３：９４９−９５６（２００３））に記載のコンストラクト３５Ｓ：ｐ１９をテンプレートとして使用し、プライマーｓｕｐＰ１９−１ｃ  
ＡＴＧＧＡＡＣＧＡＧＣＴＡＴＡＣＡＡＧＧ（配列番号１３）
とＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒ  
ＡＧＴＣＧＡＧＣＴＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＧＡＡＧ（配列番号１４）
とを使って、ｐ１９のコード配列を含有するもう一つのフラグメントを増幅した。次に、増幅産物を混合し、プライマーＰｌａｓｔｏ−４４３ｃとＳｕｐＰ１９−ＳａｃＩ．ｒとによる２ラウンド目の増幅（アセンブリング反応）のテンプレートとして使用した。その結果生じたフラグメントをＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中）とＳａｃＩ（ｐ１９コード配列の末端）とで消化し、前もって同じ制限酵素で消化しておいたコンストラクト番号６６０にクローニングすることで、コンストラクト番号Ｒ４７２を得た。これらのプラスミドを使用して、エレクトロポレーション（Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈら，１９８９）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＧＬ１；ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス２０１０８）を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を制限酵素マッピングによって確認した。Ｒ４７２（図１１Ｂ）を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を「ＡＧＬ１／Ｒ４７２」と名付けた。
【０１２９】
ＨｃＰｒｏコンストラクト（３５ＨｃＰｒｏ）はＨａｍｉｌｔｏｎら（２００２）に記載されているように調製した。全てのクローンを配列決定して、コンストラクトの完全性を確認した。これらのプラスミドを使って、エレクトロポレーション（Ｍａｔｔａｎｏｖｉｃｈら，１９８９）により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（ＡＧＬ１；ＡＴＣＣ、米国バージニア州マナッサス２０１０８）を形質転換した。全てのアグロバクテリウム・ツメファシエンス株の完全性を制限酵素マッピングによって確認した。
【０１３０】
植物バイオマスの調製、接種材料、アグロインフィルトレーション、および収穫
市販のピートモス基質で満たした平箱においてベンセミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を種子から生長させた。植物は、温室において、１６／８光周期および日中２５℃／夜間２０℃の温度レジーム下で生長させた。播種の３週間後に、個々の小植物を選定し、鉢に移植して、温室中、同じ環境条件下でさらに３週間生長させた。６週間後に、植物の平均重量は８０ｇ、高さは３０ｃｍである。
【０１３１】
Ｄ’Ａｏｕｓｔら，２００８（Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６：９３０−９４０）に記載された方法を使って、アグロバクテリウム株ＡＧＬ１に、以下に示すコンストラクトをトランスフェクト（エレクトロポレーション）した。トランスフェクトされたアグロバクテリウムを、１０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足したＹＥＢ培地（ｐＨ５．６）中で、ＯＤ６００が０．６〜１．６になるまで成長させた。アグロバクテリウム懸濁液を使用前に遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁した。
【０１３２】
植物を、Ｄ’Ａｏｕｓｔら（前掲）に記載されているように、アグロインフィルトレートした。簡単に述べると、減圧浸潤のために、アグロバクテリウム・ツメファシエンス懸濁液を遠心分離し、浸潤培地に再懸濁し、４℃で終夜保存した。浸潤当日、培養バッチを２．５培養体積に希釈し、使用前に温めておいた。気密ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液に２０〜４０Ｔｏｒｒの減圧下で２分間、ベンサミアナタバコの全植物体を上下逆さまにして入れた。別段の指定がない限り、浸潤は全て、Ｒ４７２で形質転換された細菌（ＡＧＬ１／Ｒ４７２株）との比率１：１での共浸潤として行った。減圧浸潤後に、植物を室温に戻し、４〜６日間のインキュベーション期間を経てから、収穫した。
【０１３３】
葉のサンプリングおよび全タンパク質抽出（機械的ホモジナイゼーション）
４、５、６、７および８日間のインキュベーション後に、植物の地上部分を収穫し、直ちに使用した。１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および０．００４％メタ重亜硫酸ナトリウムを含有する３体積の冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で植物組織をホモジナイズすることによって全可溶性タンパク質を抽出した。植物組織は、１体積の冷５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で、ＰＯＬＹＴＲＯＮ（商標）を使用するか、乳鉢と乳棒で粉砕するか、またはＣＯＭＩＴＲＯＬ（商標）を使って、機械的にホモジナイズした。ＣＯＭＩＴＲＯＬ（商標）と共に使用した緩衝液は、０．０４％メタ重亜硫酸ナトリウムも含有していた。ホモジナイゼーション後に、粉砕した植物材料のスラリーを、４℃、５，０００ｇで、５分間遠心分離し、粗抽出物（上清）を分析のためにとっておいた。清澄化した粗抽出物の総タンパク質含量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によって決定した。
【０１３４】
細胞壁消化によるＶＬＰ抽出
ベンサミアナタバコ植物から葉組織を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断した。葉小片を５００ｍＭマンニトールに室温（ＲＴ）で３０分間浸漬した。次に、マンニトール溶液を除去し、プロトプラスト化溶液（５００ｍＭマンニトール、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２および５ｍＭ  ＭＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ５．６））中の酵素混合物（トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）由来のセルラーゼ（オノズカＲ−１０；３％ｖ／ｖ）およびクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来のペクチナーゼの混合物（マセロチーム（商標）；０．７５％ｖ／ｖ）（どちらもヤクルト薬品工業））と交換した。使用した比は、溶液１００ｍＬあたり葉小片２０ｇである。この調製物を浅い容器（〜１１×１８ｃｍ）に均等に拡げ、４０ｒｐｍおよび２６℃のロータリーシェーカー上で１６時間インキュベートした。
【０１３５】
あるいはＶＬＰ抽出を次のように行ってもよい。実施例１で述べるように、ＡＧＬ１／＃６８５を植物にアグロインフィルトレートした。浸潤後６日目にベンサミアナタバコ植物から葉組織を集め、〜１ｃｍ２の小片に切断した。比が１：２．５（ｗ／ｖ）の新鮮バイオマス；消化緩衝液を使って、ＭｕｌｔｉｆｅｃｔペクチナーゼＦＥ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＣＧおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を、６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液に、それぞれ１．０％（ｖ／ｖ）になるように加えた。バイオマスをオービタルシェーカーにおいて室温で１５時間消化した。
【０１３６】
インキュベーション後に、葉破片を濾過（２５０または４００μｍメッシュのナイロンフィルター）によって除去した。懸濁状態のプロトプラストを２００×ｇでの遠心分離（１５分）によって収集した後、上清をさらに清澄化するために、上清を５０００×ｇで遠心分離（１５分間）した。あるいは、５０００×ｇで１５分間の１回の遠心分離ステップを使用してもよい。次に、７０ｍＬの上清を７０，０００×ｇで３０分間遠心分離した。その結果生じたペレットを１．７ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、直ちに分析するか、または凍結した。
【０１３７】
タンパク質分析
Ｈ５に関する血球凝集アッセイは、ＮａｙａｋおよびＲｅｉｃｈｌ（２００４）に記載の方法に基づいた。簡単に述べると、試験試料の連続二倍希釈液（１００μＬ）を、１００μＬのＰＢＳが入っているＶ底９６ウェルマイクロタイタープレートに作成し、各ウェルに１００μＬの希釈試料が残るようにした。１００μｌの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁液（Ｂｉｏ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州シラキュース）を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全な血球凝集を示す最高希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えＨＡ５標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、コネティカット州メリデン）をＰＢＳに希釈し、各プレート上で対照として処理した。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡ
１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００による処理とそれに続くＴｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｅｒ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）での１分間の機械的撹拌によって破壊した精製ウイルス様粒子で、ＨＡ５標準を調製した。Ｕ底９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃、１６〜１８時間において、５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）中の１０μｇ／ｍＬの捕捉抗体（Ｉｍｍｕｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、＃ＩＴ−００３−００５Ｉ）でコーティングした。洗浄は全て０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．０１Ｍ  ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）（ｐＨ７．４）で行った。インキュベーション後に、プレートを３回洗浄し、３７℃において１時間、ＰＢＳ中の１％カゼインでブロッキングした。インキュベーション後に、プレートを３回洗浄し、３７℃において１時間、ＰＢＳ中の１％カゼインでブロッキングした。ブロッキングステップ後に、プレートを３回洗浄した。５００〜５０ｎｇ／ｍＬの標準曲線を作成するために、ＨＡ５標準をモック抽出物（ＡＧＬ１／Ｒ４７２のみを浸潤させた葉組織から調製したもの）に希釈した。定量するための試薬を１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で処理してから、マイクロプレートにローディングした。プレートを３７℃で１時間、さらにインキュベートした。洗浄後に、ＨＡ５に対するヒツジポリクローナル抗体（ＣＢＥＲ／ＦＤＡ）の１：１０００希釈液を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後に、１：１０００希釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートウサギ抗ヒツジ抗体を加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。最後の洗浄後に、プレートをＳｕｒｅＢｌｕｅ  ＴＭＢペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）と共に室温で２０分間インキュベートした。１Ｎ  ＨＣｌの添加によって反応を停止させ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使って、Ａ４５０値を測定した。
【０１３９】
実施例１：植物組織の酵素抽出は、相対的活性が上昇している大量のＨＡを放出する
本酵素抽出法から得られるＨＡの量および相対的活性を、一般的な機械的抽出法から得られるＨＡのものと比較した。ベンサミアナタバコ植物にＡＧＬ１／６８５を浸潤させ、５〜６日のインキュベーション期間後に、葉を収穫した。葉ホモジネートを次のように調製した：２ｇの葉をポリトロンホモジナイザーでホモジナイズし；４ｇの葉を乳鉢と乳棒で粉砕し；２５ｋｇの葉を、抽出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、比１：１ｗ／ｖ）中、ＣＯＭＩＴＲＯＬ（商標）プロセッサー（Ｕｒｓｃｈｅｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でホモジナイズした。酵素抽出は次のように行った：収穫した葉２０グラムを、上述のマセロチームペクチナーゼおよびオノズカＲ−１０セルラーゼによる消化に付した。消化後に、葉破片を濾過（ナイロンフィルター、２５０μｍメッシュ）によって除去した。懸濁状態のプロトプラストを２００×ｇでの遠心分離（１５分）によって除去し、５０００×ｇでの遠心分離（１５分）によって上清をさらに清澄化した。
【０１４０】
これらの植物抽出物のそれぞれにおけるＨＡの相対的活性および量を表３に示す。細胞壁の酵素消化によって放出されるＨＡの量は、使用した他の技法と比較すると、有意に上回っている。
［表３］異なる機械的方法または酵素的方法によって生成した植物抽出物から回収されるＨＡ−ＶＬＰ。活性に基づく比較およびＥＬＩＳＡ比較のために、新鮮バイオマスの液体抽出の相対的体積に応じてデータを標準化した。Ｃｏｍｉｔｒｏｌ抽出を使って得られたタンパク質を１００％とし、他の方法をこの値と比較した。
【表３】
2014510087.tif 000008
＊量はＥＬＩＳＡ分析によって評価した。
【０１４１】
実施例２：植物組織の酵素消化は、ＶＬＰに組織化されたＨＡを放出する
分画遠心分離とサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）とを併用して、本明細書に記載する酵素抽出法によって得られるＨＡが、ＶＬＰとして組織化されていることを実証した。ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、ＡＧＬ１／６８５をアグロインフィルトレートした。実施例１で述べたように、浸潤の６日後に植物から葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断した後、消化し、粗濾過し、遠心分離した。
【０１４２】
次に、ＶＬＰの隔離を可能にするために、清澄化した試料を７０，０００×ｇで遠心分離した。ＶＬＰを含有する遠心分離ペレットを１／５０体積のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に静かに再懸濁してから、ＳＥＣカラムにローディングした。
【０１４３】
ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（商標）Ｓ−５００高分離能ビーズ（Ｓ−５００ＨＲ：ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン国ウプサラ、カタログ番号１７−０６１３−１０）３２ｍｌのＳＥＣカラムを、平衡化／溶出緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８）で調製した。平衡化したカラムに１．５ｍＬのＶＬＰ試料をローディングし、４５ｍＬの平衡化／溶出緩衝液でそれを溶出させることによって、ＳＥＣクロマトグラフィーを行った。溶出物を１．７ｍＬの画分ずつに収集し、１０μＬの溶出物画分を２００μＬの希釈Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質色素試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）と混合することによって、各画分のタンパク質含有量を評価した。各分離に先だって、Ｂｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐ．、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）によるキャリブレーションを行った。分離の一様性を保証するために、各分離ごとにＢｌｕｅ  Ｄｅｘｔｒａｎ  ２０００と宿主タンパク質の両方の溶出プロファイルを比較した。
【０１４４】
ＳＥＣ溶出画分のタンパク質分析
清澄化粗抽出物の総タンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によって決定した。ＳＥＣ溶出物画分中に存在するタンパク質をアセトンで沈殿させ（Ｂｏｌｌａｇら，１９９６）、それぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用またはイムノブロット用に０．２５体積または０．０５体積の変性試料ローディング緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８、０．０５％ブロモフェノールブルー、１２．５％グリセロール、４％ＳＤＳおよび５％ベータ−メルカプトエタノール）に再懸濁した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離は還元条件下で行い、タンパク質染色にはクマシーブリリアントブルーＲ−２５０を使用した。
【０１４５】
Ｈ５に関する血球凝集アッセイは、ＮａｙａｋおよびＲｅｉｃｈｌ（２００４）に記載の方法に基づいて行った。簡単に述べると、試験試料の連続二倍希釈液（１００μＬ）を、１００μＬのＰＢＳが入っているＶ底９６ウェルマイクロタイタープレートに作成し、各ウェルに１００μＬの希釈試料が残るようにした。１００μｌの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁液（Ｂｉｏ  Ｌｉｎｋ  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州シラキュース）を各ウェルに加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。完全な血球凝集を示す最高希釈度の逆数を血球凝集活性として記録した。並行して、組換えＨ５標準（Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１）（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、コネティカット州メリデン）をＰＢＳに希釈し、各プレート上で対照として処理した。
【０１４６】
図３Ａは、血球凝集活性がカラムの空隙容量に相当する画分に濃縮されることを示しており、血球凝集活性が高分子量の構造的組織化によって発生していることが確認される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３Ｂ）により、同じ空隙容量画分（画分７〜１０）が最も高いＨＡ含有量も示し、ＨＡ０モノマーに対応するバンドを約７５ｋＤａに検出できることが明らかになった。
【０１４７】
実施例３：植物組織の酵素消化は夾雑物の少ないＨＡ−ＶＬＰを放出する
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、ＡＧＬ１／６８５をアグロインフィルトレートした。実施例１で述べたように、浸潤後６日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、消化し、粗濾過し、遠心分離した。
【０１４８】
葉の制御された酵素消化は細胞壁を少なくとも部分的に除去することで、細胞壁と形質膜の間の空隙に存在するタンパク質および構成要素の抽出媒質への放出を可能にした。大半の細胞内タンパク質および細胞内構成要素は依然として損傷を受けず、ほとんど無傷のプロトプラスト内に含まれていたので、最初の遠心分離ステップでそれらを除去することが可能になり、したがって、図４に示すように、細胞外植物タンパク質および細胞外植物構成要素（アポプラスト内容物画分）に加えて細胞壁分解酵素を含む溶液が、結果として得られた。
【０１４９】
図４は、先に述べた葉組織の制御された酵素消化後に結果として得られる溶液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示しており、レーン１は、使用した酵素混合物を示し、レーン２は酵素消化後に得られた溶液を示す。Ｃｏｍｉｔｒｏｌ（商標）からの粗抽出物のタンパク質内容物が、比較のためにレーン３に提示されている。レーン２に提示した抽出物に関するバイオマス：緩衝液比は１：５（ｗ／ｖ）であったが、レーン３の場合はそれが１：１（ｗ／ｖ）だった。それゆえにレーン２とレーン３のそれぞれは、等量の出発材料から得られたタンパク質を含有している。ほぼ同じ緩衝液：植物比では、機械的植物抽出物が、約３．５〜４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を含有していたのに対し、本発明に従って得られた酵素植物抽出物は、約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を示した。
【０１５０】
レーン３中に存在する主要夾雑物は、２タイプのタンパク質サブユニット、すなわちラージ鎖（Ｌ、約５５ｋＤａ）とスモール鎖（Ｓ、約１３ｋＤａ）でできているＲｕｂｉｓｏＣｏ（リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナーゼ）であることがわかった。合計８つのラージ鎖二量体と８つのスモール鎖とが通常は互いに集合して、５４０ｋＤａのより大きな複合体ＲｕｂｉｓＣｏになっている。この植物タンパク質夾雑物は機械的抽出法によって生じる植物抽出物中に大量に見いだされるが（図４の矢印参照）、本明細書に記載する酵素消化法によって得られる植物抽出物には事実上存在しない。それゆえに、本方法では、なかんずく、この主要植物タンパク質夾雑物を、プロセスの初期段階で、排除することが可能になる。
【０１５１】
実施例４：植物組織の酵素消化は、ＨＡ−ＶＬＰを陽イオン交換樹脂で直接捕捉することができるような条件下で、ＨＡ−ＶＬＰを放出する
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、ＡＧＬ１／６８５をアグロインフィルトレートした。浸潤後６日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、オービタルシェーカーにおいて室温で１５時間消化した。消化緩衝液は、１．０％（ｖ／ｖ）ＭｕｌｔｉｆｅｃｔペクチナーゼＦＥ、１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＣＧおよび／または１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（いずれもＧｅｎｅｎｃｏｒ製）を、それぞれ６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液中に含有し、１：２．５（ｗ／ｖ）のバイオマス：消化緩衝液比で使用した。
【０１５２】
消化後に、アポプラスト内容物画分を４００μｍナイロンフィルターで濾過することで、粗未消化植物組織を除去した（＜出発バイオマスの５％）。次に、プロトプラストおよび細胞内夾雑物（タンパク質、ＤＮＡ、膜、小胞、色素など）を除去するために、濾過した抽出物を室温において５０００×ｇで１５分間、遠心分離した。次に、０．６５μｍガラス繊維フィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ＧＦ  ｐｌｕｓ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）および０．４５／０．２μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ  ２／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ）を使って、上清を（清澄化のため）深層濾過してから、クロマトグラフィーに付した。
【０１５３】
清澄化したアポプラスト内容物画分を、平衡化／溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、ｐＨ６．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にローディングした。ＵＶがゼロに戻ったら、含有するＮａＣｌ濃度（５００ｍＭ）が増加する平衡化／溶出緩衝液で、抽出物を段階的に溶出させた。必要な場合は、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯを備えたＡｍｉｃｏｎ（商標）デバイスを使って、クロマトグラフィー画分を１０倍濃縮した。タンパク質分析は先の実施例で述べたように行った。
【０１５４】
上記の条件下では、大半の酵素および植物タンパク質が陽イオン交換樹脂に結合しなかったのに対し、ＨＡ−ＶＬＰは結合したので、溶出画分ではＨＡ−ＶＬＰがかなり濃縮された（図６）。加えて、図６に示すように、レーン４およびレーン５では、セルラーゼおよびペクチナーゼが、７未満のｐＨにおいて陽イオン交換カラムに結合しなかった。ＨＡ血球凝集活性に基づくＨＡ−ＶＬＰの回収率は陽イオン交換カラム後に９２％だった。陽イオン交換樹脂からの溶出画分では１９４という精製倍率が測定された。
【０１５５】
実施例５：消化緩衝液へのＮａＣｌの添加
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、目的のヘマグルチニン（Ｈ１／Ｃａｌ  ＷＴ、Ｂ／Ｆｌｏ、Ｈ５／ＩｎｄｏまたはＨ１／Ｃａｌ  Ｘ１７９Ａ）を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株をアグロインフィルトレートした。浸潤後６日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、以下に注記する点以外は実施例４に従って消化した。濾過、遠心分離および清澄化は、実施例４で述べたように行った。
【０１５６】
消化緩衝液にＮａＣｌを加えることで、それがＨＡ−ＶＬＰ回収率に及ぼす潜在的効果を評価した。推測された利点は、ＨＡと、植物細胞または清澄化時に除去される懸濁状態にある粒子との、非特異的会合の潜在的防止、ならびにＨＡ−ＶＬＰのコロイド安定性の達成および／または維持および／または改善に対する潜在的効果であった。
【０１５７】
消化緩衝液への５００ｍＭ  ＮａＣｌの添加は、遠心分離によってプロトプラストと細胞破片を除去した後の、バイオマス１グラムあたりのＨＡ−ＶＬＰ回収収量の増加をもたらした。しかしこの増加は、Ｈ１／Ｃａｌ  ＷＴ株およびＢ／Ｆｌｏ株についてのみ認められ、Ｈ５の回収収量はこのアプローチでは有意に増加しなかった（表４）
［表４］消化ステップへのＮａＣｌの添加が、ＨＡ−ＶＬＰの回収収量に及ぼす効果（血球凝集活性単位で測定；ｄｉｌ：希釈度の逆数）
【表４】
2014510087.tif 000009
１ＮａＣｌありの収量（ｄｉｌ／ｇ）をＮａＣｌなしの収量（ｄｉｌ／ｇ）で割ったもの
【０１５８】
消化時に５００ｍＭ  ＮａＣｌを添加すると、さらに、消化中のＨＡ−ＶＬＰの放出の増加が起こり、それが結果として、Ｈ１／Ｃａｌ  ＷＴ株とＨ１／Ｃａｌ  Ｘ−１７９Ａ株の両者について清澄化後の回収率の増加をもたらしたが（表５）、Ｈ５／Ｉｎｄｏ株ではそうならなかった。
［表５］消化ステップへのＮａＣｌの添加が清澄化ステップ後のＨＡ−ＶＬＰ回収収量に及ぼす効果（血球凝集活性単位によって測定）
【表５】
2014510087.tif 000010
１回収率は、遠心分離した消化抽出物中に見いだされる活性と比較した、深層濾過後に得られた血球凝集活性のパーセンテージとして表す。
【０１５９】
酵素消化時にＮａＣｌの添加を行った場合と行わない場合のＨＡ−ＶＬＰの会合状態を、Ｈ５／ＩｎｄｏおよびＨ１／Ｃａｌ  ＷＴについて、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）を使って調べた（それぞれ図７Ａおよび７Ｂ）。Ｈ５については、ＮａＣｌの非存在下で消化を行った場合に、粒子の単分散調製物が観察されたが、Ｈ１／Ｃａｌ調製物は、はるかに大きな一連の粒子種を示した。消化緩衝液へのＮａＣｌの添加は、図７Ｃに見いだされるかなり単分散性の粒子分布によって示されるとおり、Ｈ１／Ｃａｌに関して、ＨＡ−ＶＬＰ自己会合を減少させた。Ｈ１／Ｃａｌ  ＷＴ−ＶＬＰの場合、１５０ｎｍにおける粒子数は、消化緩衝液への５００ｍＭ  ＮａＣｌの添加によって、増加（約５倍）した。
【０１６０】
実施例６：色素放出の制御
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、目的のヘマグルチニン（Ｈ５／Ｉｎｄｏ）を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株をアグロインフィルトレートした。浸潤後６日目に葉を収集し、約１ｃｍ２の小片に切断し、消化緩衝液に５００ｍＭ  ＮａＣｌを加えるか、５００ｍＭ  ＮａＣｌと２５ｍＭ  ＥＤＴＡとを加えて、実施例４で述べたように消化した。濾過、遠心分離および清澄化は実施例４で述べたように行った。
【０１６１】
酵素消化ステップ中に起こる緑色を有する構成要素の放出は、緑色に着色したＶＬＰの精製調製物をもたらす。そこで、細胞壁消化溶液の組成を調べて、緑色の着色が少なく、したがって純度が向上しているＶＬＰ精製調製物が得られるように、細胞壁消化溶液の組成を調節した。理論に束縛されることは望まないが、Ｃａ２＋は、細胞壁の中層の構成成分を一まとめにしておくことに極めて重要な役割を果たすので、植物細胞壁中には通常は高濃度のＣａ２＋が存在するという事実を考慮すると、Ｃａ２＋キレーターであるＥＤＴＡは、細胞壁の酵素的解重合を容易にし、それによって、無傷の細胞内細胞小器官、例えばクロロプラストを保護し、緑色色素構成要素の放出を防止することができるかもしれない。
【０１６２】
表６に示すように、調製物の吸収（ＯＤ６７２ｎｍ〜ＯＤ６５０ｎｍ）の相違を測定することによって評価した場合、消化緩衝液への２５ｍＭ  ＥＤＴＡの添加により、精製Ｈ５−ＶＬＰ調製物の緑色の着色を低減することが可能になった。緑色構成成分が大量に放出されるか、適切に除去されなかった場合は、ＶＬＰ調製物がΔＯＤ＞０．０４０を示した。
［表６］消化緩衝液への２５ｍＭ  ＥＤＴＡの添加がＨ５−ＶＬＰ調製物の緑色着色に及ぼす効果
【表６】
2014510087.tif 000011
【０１６３】
実施例７：代替的消化緩衝液組成物
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、目的のヘマグルチニン（Ｈ５／Ｉｎｄｏ）を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株をアグロインフィルトレートした。浸潤後６日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、実施例４に従って消化した、ただし、消化緩衝液は、表７〜９に記すとおり、０％、０．２５％、０．５％、０．７５％または１％ｖ／ｖのＭｕｌｔｉｆｅｃｔペクチナーゼＦＥ、Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ−ＣＧセルラーゼおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂセルロースを含むように改変した。濾過、遠心分離および清澄化は、実施例４で述べたように行った。
【０１６４】
下記の表７および表８に示すように、ペクチナーゼは、消化緩衝液中には必須でないことが実証された。ペクチナーゼの存在下でも、非存在下でも、類似するレベルのＨ５／ＩｎｄｏまたはＨ１／Ｃａｌ  ＷＴ  ＶＬＰを、本方法で抽出することができる。さらにまた、先の実施例と比較してセルラーゼの濃度を減らしても、抽出の量に有意な影響はないこともわかった（表９）。
［表７］ベンサミアナタバコ葉の消化によるＨ５／Ｉｎｄｏ  ＶＬＰの放出。どの条件も多重に試験した。（血球凝集活性によって測定したＨＡ−ＶＬＰの濃度、ｄｉｌ：希釈度の逆数）
【表７】
2014510087.tif 000012
＊Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＧＣ            
［表８］ベンサミアナタバコ葉の消化によるＨ１／Ｃａｌ  ＷＴ  ＶＬＰの放出。どの条件も多重に試験した。（血球凝集活性によって測定したＨＡ−ＶＬＰの濃度、ｄｉｌ：希釈度の逆数）
【表８】
2014510087.tif 000013
＊各１％のＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＧＣおよびＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ
［表９］ベンサミアナタバコ葉の消化によるＨ１／Ｃａｌ  ＷＴ  ＶＬＰの放出。どの条件も多重に試験した。（血球凝集活性によって測定したＨＡ−ＶＬＰの濃度、ｄｉｌ：希釈度の逆数）
【表９】
2014510087.tif 000014
＊Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＧＣ
【０１６５】
実施例８：中性ｐＨに近い条件での酵素消化
消化中のｐＨの制御は、一部のＶＬＰの抽出にとって極めて重要でありうる。消化ステップ中に起こる細胞壁の解重合が、適当な緩衝液の存在下で溶液を酸性化（すなわちｐＨ６〜５）させうる酸性糖を放出しうること、および一部のＶＬＰ（例えばＨ３／ＢｒｉｓおよびＢ／Ｆｌｏ  ＨＡを含むもの）が温和な酸性条件に対して強い感受性を示していることを考慮して、そのような潜在的酸性化が生産されるＶＬＰの収量に及ぼす影響を調べた。
【０１６６】
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、目的のヘマグルチニン（Ｂ／Ｆｌｏ、Ｈ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ３／Ｂｒｉｓ）を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株をアグロインフィルトレートした。浸潤後６日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、実施例４に従って消化した、ただし、消化条件は、５００ｍＭ  ＮａＣｌ；２５または５０ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．０３または０．０４％重亜硫酸ナトリウム；０、１００、２００または６００ｍＭマンニトール、７５、１２５または１５０ｍＭクエン酸塩；および／または７５ｍＭ  ＮａＰＯ４を含むように改変し、消化緩衝液のｐＨは表１０〜１４に説明するように調節した。濾過、遠心分離および清澄化は、実施例４で述べたように行った。
【０１６７】
クエン酸塩濃度の増加（ｐＨ３．０とｐＨ５．４の間の緩衝効果）およびリン酸ナトリウムの添加（６．０を上回るｐＨでの緩衝効果）を含めて、酵素消化の最後までに約５．５のｐＨが達成されるように、さまざまな消化緩衝液組成を調べた。表１０は、消化後ｐＨがｐＨ６．０に近い場合に、Ｂ株からのＶＬＰが、より効率よく抽出されることを示している。
［表１０］Ｂ／Ｆｌｏ  ＶＬＰの抽出収量に対する消化緩衝液組成の効果
【表１０】
2014510087.tif 000015
１緩衝液はいずれも６００ｍＭマンニトール、メタ重亜硫酸ナトリウム０．０４％を含有した。
【０１６８】
次に、ｐＨ６．０に近い最終ｐＨ値に到達するように、より高いｐＨで消化を開始した場合の効果を調べた。表１１に示すように、そのようなほぼ中性条件での植物細胞壁の消化は可能であり、Ｈ５／Ｉｎｄｏ  ＶＬＰに関して、抽出収量を損なわなかった。
［表１１］Ｈ５／Ｉｎｄｏ  ＶＬＰの抽出収量に対する消化緩衝液の初期ｐＨの効果
【表１１】
2014510087.tif 000016
１緩衝液はいずれも６００ｍＭマンニトール、メタ重亜硫酸ナトリウム０．０４％、１２５ｍＭクエン酸塩＋７５ｍＭ  ＮａＰＯ４＋５００ｍＭ  ＮａＣｌ＋２５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有した。
【０１６９】
ＶＬＰの抽出収量に負の影響を及ぼさずに消化溶液の他の構成要素を改変しうることも示された。表１２に、５．４〜５．７の消化後ｐＨを得つつ、Ｂ／Ｆｌｏ  ＶＬＰの抽出収量を向上させるために消化溶液に適用することができる改変を例示する。そのような改変には、クエン酸塩の濃度を増加させること、およびＰＯ４緩衝液を加えることが含まれる。ＥＤＴＡ濃度の増加は、一般に、より酸性化された抽出物と、より低いＶＬＰ抽出収量につながることがわかった。
［表１２］Ｂ／Ｆｌｏ  ＶＬＰの抽出収量に対するさまざまな消化緩衝液構成要素の効果
【表１２】
2014510087.tif 000017
１緩衝液はいずれも５００ｍＭ  ＮａＣｌおよびメタ重亜硫酸ナトリウム０．０４％を含有した。
【０１７０】
Ｈ３／Ｂｒｉｓｂａｎｅ  ＶＬＰの抽出収量を改善するために、緩衝液組成をさらに改変した（表１３）。
［表１３］Ｈ３／Ｂｒｉｓ  ＶＬＰの抽出収量に対する消化溶液中のマンニトールおよび重亜硫酸ナトリウムの濃度の効果
【表１３】
2014510087.tif 000018
１緩衝液はいずれも１２５ｍＭクエン酸塩、７５ｍＭ  ＮａＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌを含有した。
【０１７１】
表１２および１３に示すように、マンニトール濃度は、ＶＬＰ抽出収量に有意な影響を及ぼすことなく、２００ｍＭまで下げることができた。マンニトール濃度を１００ｍＭまでさらに下げても、さらにはマンニトールを消化溶液から完全に省いても、得られるＨＡ−ＶＬＰのレベルに有意な影響はなかった（表１４）。
［表１４］マンニトールの濃度が異なる緩衝液中で行われたバイオマスの消化によるＨ５／Ｉｎｄｏ  ＶＬＰの放出
【表１４】
2014510087.tif 000019
１緩衝液はいずれも７５ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．０＋メタ重亜硫酸ナトリウム０．０４％を含有している。
２マンニトールなし（試行１）およびマンニトール１００ｍＭ（試行２）とマンニトール６００ｍＭとを対比してＶＬＰの抽出収量を比較するために、２つの試行を行った。
【０１７２】
実施例９：多種多様なＨＡ−ＶＬＰへの酵素消化の適合性
本明細書に記載する植物バイオマスの酵素消化法は、多種多様なＨＡ−ＶＬＰの抽出に応用できる可能性を有している。先の実施例で示したＨ５／Ｉｎｄｏ、Ｈ１／Ｃａｌ  ＷＴ  ＶＬＰ、Ｈ３／ＢｒｉｓおよびＢ／Ｆｌｏを含むＨＡ−ＶＬＰの抽出に加えて、本明細書に記載の方法は、表１５に示すように、季節性Ｈ１／ＢｒｉｓおよびＨ１／ＮＣからのＨＡ−ＶＬＰの抽出に適していることも示された。
［表１５］アグロインフィルトレートされたベンサミアナタバコ葉の消化による季節性Ｈ１／ＢｒｉｓおよびＨ１／ＮＣ  ＶＬＰの放出（血球凝集活性によって測定されたＨＡの濃度、ｄｉｌ：希釈度の逆数）。
【表１５】
2014510087.tif 000020
【０１７３】
実施例１０：抗体の調製、発現および分析
Ｃ２Ｂ８発現カセット（コンストラクト番号５９５）のアセンブリ
Ｃ２Ｂ８は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）上に発現するＢ細胞特異的抗原ＣＤ２０に対するキメラ（マウス／ヒト）モノクローナル抗体である。Ｃ２Ｂ８は、補体および抗体依存性細胞性細胞傷害を媒介し、インビトロで悪性Ｂ細胞株に対して直接的な抗増殖効果を有する（Ｎ  Ｓｅｌｅｎｋｏら，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００１，１５（１０）；１６１９−１６２６）。
【０１７４】
８４ｂｐのアルファルファプラストシアニンプロモーター、完全なＣ２Ｂ８軽鎖コード配列および完全なアルファルファプラストシアニンターミネーターを含むＤＮＡフラグメントを合成した（ＬＣフラグメント）。このＬＣフラグメントは、ＤｒａＩＩＩ制限部位（プラストシアニンプロモーター中に見いだされるもの）とプラストシアニンターミネーターの下流にあるＥｃｏＲＩ部位に挟まれていた。ＬＣフラグメントの配列を図９（配列番号１５）に示す。ＬＣフラグメントを含有するプラスミドをＤｒａＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、前もって同じ酵素で消化しておいたコンストラクト番号６６０（Ｄ’Ａｏｕｓｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．  ２００８，６：９３０−９４０）にクローニングした。その結果生じたプラスミドをコンストラクト番号５９０と名付けた。８４ｂｐのアルファルファプラストシアニンプロモーター、完全なＣ２Ｂ８重鎖コード配列および完全なアルファルファプラストシアニンターミネーターを含む第２のＤＮＡフラグメントを合成した（ＨＣフラグメント）。このＨＣフラグメントは、ＤｒａＩＩＩ制限部位（プラストシアニンプロモーター中に見いだされるもの）とプラストシアニンターミネーターの下流にあるＥｃｏＲＩ部位とに挟まれていた。ＨＣフラグメントの配列を図１６（配列番号１６）に示す。ＨＣフラグメントを含有するプラスミドをＤｒａＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、前もって同じ酵素で消化しておいたコンストラクト番号６６０  （Ｄ’Ａｏｕｓｔら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．  ２００８，６：９３０−９４０）にクローニングした。その結果生じたプラスミドをコンストラクト番号５９２と名付けた。５９２を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスを「ＡＧＬ１／５９２」と呼ぶ。
【０１７５】
Ｃ２Ｂ８発現用に二つの発現カセットを含むプラスミド（コンストラクト番号５９５）を次のように組み立てた。コンストラクト番号５９２をＥｃｏＲＩで消化し、平滑末端を生成させるためにＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理し、ＳｂｆＩで消化した。その結果生じたフラグメント（これは、ＳｂｆＩ部位と平滑末端とに挟まれた、Ｃ２Ｂ８重鎖を発現させるための完全なカセットを含む）を、前もってＳｂｆＩとＳｍａＩで消化しておいたコンストラクト番号５９０に挿入した。図１１Ａは、植物中でＣ２Ｂ８を発現させるために使用したコンストラクト番号５９５の概略図を表す。
【０１７６】
Ｐ１９発現カセット（コンストラクト番号Ｒ４７２）のアセンブリ
ｐ１９タンパク質をコードするコンストラクトＲ４７２については上で説明した（「サイレンシングのサプレッサー」；図１１Ｂ参照）。
【０１７７】
植物バイオマスの調製、細菌接種材料、アグロインフィルトレーション、および収穫
ベンサミアナタバコ植物は、上述のように（「植物バイオマスの調製、接種材料、アグロインフィルトレーション、および収穫」）、温室において、１６／８光周期および日中２５℃／夜間２０℃の温度レジーム下で生長させた。播種の３週間後に、個々の小植物を選定し、鉢に移植して、温室中、同じ環境条件下でさらに３週間生長させた。
【０１７８】
コンストラクト番号５９５またはコンストラクト番号Ｒ４７２を保持するアグロバクテリウムを、１０ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補足したＢＢＬ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＰＳ  ＬＢブロス培地（ｐＨ５．６）中で、ＯＤ６００＞２．０に達するまで成長させた。使用前にアグロバクテリウム懸濁液を遠心分離し、浸潤培地（１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．６）に再懸濁し、４℃で終夜保存した。浸潤当日、培養バッチを６．７培養体積に希釈し、使用前に温めておいた。気密ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液に２０〜４０Ｔｏｒｒの減圧下で１分間、ベンサミアナタバコの全植物体を上下逆さまにして入れた。浸潤後、植物を温室に戻し、５日間のインキュベーション期間を経てから、収穫した。浸潤は、ＡＧＬ１／５９５株とＡＧＬ１／Ｒ４７２株による、比率１：１での共浸潤として行った
【０１７９】
葉のサンプリングおよび全タンパク質抽出（機械的抽出）
インキュベーション後に、植物の地上部分を収穫し、直ちに使用した。家庭用ブレンダーにおいて、１．５体積の冷２０ｍＭ  ＮａＰＯ４（ｐＨ６．０）、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび２ｍＭメタ重亜硫酸ナトリウムで３分間、植物組織をホモジナイズすることによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、大きな不溶性破片を除去するために、粉砕された植物材料のスラリーをＭｉｒａｃｌｏｔｈで濾過した。１Ｍ  ＨＣｌの添加によって抽出物のｐＨを４．８に調節し、非可溶性材料を、１８０００ｇで１５分間（４℃）の遠心分離によって除去した。上清を集め、２ＭのＴｒｉｓ塩基でｐＨを８．０に調節した。４℃、１８０００ｇで１５分間の遠心分離によって不溶物を除去し、粗抽出物（上清）を集めた。清澄化粗抽出物のタンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミンを使用するブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によって決定した。
【０１８０】
細胞壁消化によるタンパク質抽出
ベンサミアナタバコ植物から葉組織を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断した。葉小片を２．４２５体積の消化溶液（７５ｍＭクエン酸塩ｐＨ６．９、６００ｍＭマンニトール、１％ＭｕｌｔｉｆｅｃｔペクチナーゼＦＥ、１％Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸＧ、１％Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  Ｂ）に入れた。この調製物を浅い容器に均等に拡げ、１２０ｒｐｍおよび１８℃のオービタルシェーカー上で１６時間インキュベートした。インキュベーション後に、葉破片をナイロンフィルター（２５０μｍメッシュ）での濾過によって除去した。抽出物を５０００ｇで１５分間（２２℃）遠心分離し、上清を集め、０．６５μｍガラス繊維で濾過した。抽出物を０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ塩基でｐＨ６．０に調節し、ＰＥＳメンブレン０．４５／０．２２μｍで濾過した。
【０１８１】
硫酸アンモニウム沈殿および抗体精製
タンパク質抽出物に硫酸アンモニウムをゆっくり加えて４５％飽和にした。抽出物を６０分間氷上に保ち、１８０００ｇで２０分間（４℃）遠心分離した。上清を捨て、使用時までペレットを凍結保存（−８０℃）した。
【０１８２】
凍結したタンパク質ペレットを融解し、１／１０体積（沈殿前の体積との比較）のタンパク質再懸濁溶液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に懸濁した。タンパク質溶液を１２０００ｇで２０分間（４℃）遠心分離することで、可溶化されなかった物質を除去した。タンパク質溶液をＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カナダ国ベーダーフェ）にローディングした。カラムを１０ＣＶの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで洗浄し、抗体を６ＣＶの１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出させた。１／１０ＣＶの２Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、ＮａＣｌ  １５０ｍＭが入っているチューブに、溶出液を１ＣＶずつ集めた。溶出画分をそのタンパク質含有量（ブラッドフォード法によって測定）に基づいて選択し、選択した画分を合わせて、分析まで凍結保存（−８０℃）した。
【０１８３】
タンパク質定量およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
総タンパク質含有量は、参照標準としてウシ血清アルブミン（粗タンパク質抽出物用）または市販のリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、カナダ国ミシソーガ）（精製抗体用）を使用するブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によって決定した。クマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥはＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ  １９７０，２２７：６８０−６８５）に記述されているとおりに行った。
【０１８４】
ＥＬＩＳＡによるＣ２Ｂ８定量
マルチウェルプレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢ、ＴｈｅｒｍｏＬａｂ  Ｓｙｓｔｅｍ、マサチューセッツ州フランクリン）を、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中、４℃で、１６〜１８時間、２．０μｇ／ｍｌのモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、Ａｂ９２４３）でコーティングした。次に、マルチウェルプレートを、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の１％カゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、イリノイ州ロックフォード）において、３７℃で１時間インキュベートすることにより、ブロッキングした。リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ、カナダ国ミシソーガ）の希釈液を使って標準曲線を作成した。イムノアッセイを行う際は、マトリックス効果を排除するために、全ての希釈（対照および試料）を、モック接種材料（ＡＧＬ１／Ｒ４７２のみ）を使って浸潤およびインキュベーションを行った植物組織から得られる植物抽出物で行った。プレートをタンパク質試料および標準曲線希釈液と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄した後、プレートをペルオキシダーゼコンジュゲートロバ抗ヒトＩｇＧ抗体（ブロッキング溶液中に１／４０００希釈）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７０９−０３５−１４９）と共に３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔによる洗浄を繰り返し、プレートを、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）Ｓｕｒｅ  Ｂｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ、メリーランド州ゲイサーズバーグ）と共にインキュベートした。１Ｎ  ＨＣｌを加えることによって反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。各試料を三重にアッセイし、濃度を標準曲線の直線部分に内挿した。
【０１８５】
Ｎ−グリカン分析
Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標）；５０μｇ）を含む試料を１５％ＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離した。重鎖および軽鎖をクマシーブルーで明らかにし、重鎖に対応するタンパク質バンドを切り出し、小さな断片に切断した。断片を０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３／ＣＨ３ＣＮ（１／１）の溶液６００μＬで３回、各１５分間洗浄し、乾燥した。
【０１８６】
ジスルフィド架橋の還元は、ゲル断片を、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の０．１Ｍ  ＤＴＴ溶液６００μＬにおいて、５６℃で４５分間インキュベートすることによって行った。アルキル化は、０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の５５ｍＭヨードアセトアミド溶液６００μＬを室温で３０分間加えることによって行った。上清を捨て、ポリアクリルアミドの断片をＮＨ４ＨＣＯ３  ０．１Ｍ／ＣＨ３ＣＮ（１／１）中でもう一度洗浄した。
【０１８７】
次にタンパク質を、６００μＬの０．０５Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３中、７．５μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、３７℃で１６時間、消化した。２００μＬのＣＨ３ＣＮを加え、上清を集めた。次に、ゲルの断片を２００μＬの０．１Ｍ  ＮＨ４ＨＣＯ３で洗浄し、次に２００μＬ  ＣＨ３ＣＮで再び洗浄し、最後に２００μＬのギ酸５％で洗浄した。全ての上清を合わせて凍結乾燥した。
【０１８８】
Ｓｅｐ−Ｐａｃｋ  Ｃ１８カートリッジでのクロマトグラフィーによって糖ペプチドをペプチドから分離した。糖ペプチドを水中の１０％ＣＨ３ＣＮで特異的に溶出させた後、３３７ｎｍ窒素レーザーを備えたＶｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−Ｐｒｏ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ計器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、米国）でのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって分析した。質量分析は、マトリックスとしてジヒドロ安息香酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いるリフレクター遅延引き出しモードで行った。
【０１８９】
実施例１１：Ｃ２Ｂ８抗体抽出収量の比較
Ｃ２Ｂ８抗体の抽出について酵素消化を機械的抽出と比較した。ベンサミアナタバコ植物にＡＧＬ１／５９５とＡＧＬ１／Ｒ４７２をアグロインフィルトレートした。６日間のインキュベーション後に、葉を収穫し、タンパク質を酵素消化または機械的抽出によって抽出した。抽出は２回行い、その結果生じた抽出物を、体積、タンパク質濃度および抗体（Ｃ２Ｂ８）含有量について比較した。結果を表１６に示す。
［表１６］細胞壁の機械的破壊（ブレンダー抽出）と酵素消化についての抽出収量の比較
【表１６】
2014510087.tif 000021
【０１９０】
７００ｇのバイオマスから、機械的抽出は平均１４４０ｍｌのタンパク質抽出物を生成したのに対して、消化は２２８５ｍｌのタンパク質抽出物を生成した。Ｃ２Ｂ８抗体のパーセンテージは、ブレンダーで生産された抽出物（平均値は抽出されたタンパク質の３．４９％）よりも、消化からの抽出物の方が高かった（平均値は抽出されたタンパク質の４７９％）。総合すると、抽出物の体積が多く、かつ抽出物中に見いだされる抗体の濃度が高いことから、消化（２４０．７５ｍｇ  Ｃ２Ｂ８／ｋｇ新鮮重量）の方が機械的抽出（１７５．９５ｍｇ  Ｃ２Ｂ８／ｋｇ新鮮重量）より、抽出収量は３７％高くなる。
【０１９１】
実施例１３：精製Ｃ２Ｂ８抗体の比較（タンパク質内容物）
Ｃ２Ｂ８抗体を、実施例１０で述べたように、アフィニティークロマトグラフィーによって抽出物から精製した。機械的抽出または消化によって得られた抽出物から精製された産物を、そのタンパク質内容物に基づいて比較した。各抽出ロットから精製された抗体の電気泳動プロファイルを図１２に示す。これらの結果は、ブレンダー抽出または細胞壁消化から精製された産物のプロファイルが類似していることを示している。
【０１９２】
実施例１４：精製Ｃ２Ｂ８抗体の比較（Ｎ−グリコシル化）
タンパク質のＮ−グリコシル化の本質は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列（ここで、Ｎはアスパラギンであり、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であり、Ｓ／Ｔはセリンまたはスレオニンである）を有する分泌タンパク質のアスパラギン上の複合型グリカン構造の付加にある。前駆体グリカンは、タンパク質の翻訳に際し、早期に、小胞体において付加され、それらが分泌経路を移行する間に、Ｎ−グリカンは成熟を起こす。小胞体（ＥＲ）中の高マンノース型Ｎ−グリカンから始まる植物におけるＮ−グリカン成熟には、グルコース残基の付加および除去、遠位にあるマンノースの除去、ならびにＮ−アセチルグルコサミン、キシロース、フコースおよびガラクトース残基の付加が含まれる。植物におけるＮ−グリカン成熟については、Ｇｏｍｏｒｄらが、「Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ」（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌ．  ２００４，７：１７１−１８１）に記載している。Ｎ−グリコシル化経路の酵素は、分泌経路の各コンパートメント中の正確な場所、すなわち小胞体、シスゴルジ、中間ゴルジおよびトランスゴルジに配置されている。それゆえにタンパク質のＮ−グリコシル化パターンは、抽出の瞬間におけるその位置に依存して異なるであろう。本発明者らは、ベンサミアナタバコのアグロインフィルトレーションを使って生産された抗体が、アポプラストへのターゲティングにもかかわらず、一定の比率で高マンノース型の未熟Ｎ−グリカンを保持することを、以前に観察していた（Ｖｅｚｉｎａら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．  ２００９  ７：４４２−４５５）。同様の観察が、他でも報告されている（Ｓｒｉｒａｍａｎら，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．  ２００４，２，２７９−２８７）。どちらの場合も、一定比率の抗体上に未熟Ｎ−グリカンが存在することは、抽出の瞬間に分泌経路の初期コンパートメント中に抗体が存在した結果と解釈された。
【０１９３】
下記の研究では、細胞壁消化による分泌糖タンパク質の抽出が、複合型Ｎ−グリカンを保持する組換えタンパク質を優先的に抽出しているかどうかを調べた。アポプラストに分泌される抗体および他の糖タンパク質は、その成熟が完了したＮ−グリカンを保持していると予想される。成熟Ｎ−グリカンは、ほとんどの場合、末端Ｎ−アセチルグルコサミンまたはガラクトース残基を保持し、複合型Ｎ−グリカンとも呼ばれる。これに対して、主に分泌経路の途中にあるタンパク質上に見いだされる未熟Ｎ−グリカンは、末端マンノース残基を含んでいる。Ｃ２Ｂ８（Ｒｉｔｕｘａｎ（商標））上のＮ−グリカンの高いマンノース含有量は、血流における低下した半減期と関連付けられている（Ｋａｎｄａら，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００６，１７：１０４−１１８）。この点で、複合型Ｎ−グリカンを保持するアポプラスト糖タンパク質の植物からの抽出に有利に働きうる抽出方法は望ましいであろう。
【０１９４】
精製Ｃ２Ｂ８抗体のＮ−グリコシル化の比較分析を実施例１０で述べたように行った。これらの結果は、消化されたバイオマスから精製された抗体では、オリゴマンノシドＮ−グリカンの比率が有意に低いこと（図１３Ａ）と、それに伴う当然の結果として、複合型Ｎ−グリカンの比率が有意に高いこと（図１３Ｂ）とを実証している。
【０１９５】
細胞壁消化による抽出は、修飾成熟Ｎ−グリカンを保持する糖タンパク質の回収を有利にするために、ＷＯ２０００８／１５１４４０（「Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ」；これは出典明示により本明細書に組み込まれる）に記載されているような、糖タンパク質とＮ−グリコシル化プロファイルを修飾するための１つ以上の酵素とを共発現する植物にも、適用することができるだろう。例えば成熟Ｎ−グリカンは、キシロース残基およびフコース残基が少ないか、キシロース残基およびフコース残基が除去されていてもよい。
【０１９６】
Ｎ−グリコシル化を修飾するための方法は、目的のタンパク質を、ベータ−１．４ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ；ＷＯ２０００８／１５１４４０の配列番号１４として記載）、例えば限定するわけではないが哺乳動物ＧａｌＴまたはヒトＧａｌＴ（ただし他の供給源に由来するＧａｌＴも使用しうる）をコードするヌクレオチド配列と共に共発現させることを伴いうる。ＧａｌＴの触媒ドメイン（例えばＷＯ２０００８／１５１４４０に記載の配列番号１４のヌクレオチド３７０〜１１９４）を、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧＮＴ１；例えばＷＯ２０００８／１５１４４０に記載の配列番号１７のヌクレオチド３４〜８７を含むもの）のＣＴＳドメインに融合して、ＧＮＴ１−ＧａｌＴハイブリッド酵素を生産してもよい。このハイブリッド酵素を、目的の超構造体タンパク質をコードする配列と共発現させることができる。さらには、目的の超構造体をコードする配列を、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴ−ＩＩＩ；ＷＯ２０００８／１５１４４０に記載の配列番号１６）をコードするヌクレオチドと共発現させることもできる。哺乳動物ＧｎＴ−ＩＩＩまたはヒトＧｎＴ−ＩＩＩ、他の供給源に由来するＧｎＴ−ＩＩＩも使用することができる。さらに、ＧｎＴ−ＩＩＩに融合されたＧＮＴ１のＣＴＳを含む、ＧＮＴ１−ＧｎＴ−ＩＩＩハイブリッド酵素（ＷＯ２０００８／１５１４４０に記載の配列番号２６）も使用しうる。
【０１９７】
実施例１５：植物細胞壁を弛緩させるための植物バイオマスの処理
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、目的のヘマグルチニン（Ｈ１／ＣＡ０７）を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株をアグロインフィルトレートした。浸潤後５日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、実施例４に従って、７５ｍＭクエン酸塩、５００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．１）緩衝液を使用し、０、２５、１００または２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを含むように改変を加えて、消化した。細胞破片の粗濾過および遠心分離は実施例４で述べたように行った。この遠心分離からの上清を、タンパク質濃度および血球凝集活性について試験した。植物を、タンパク質の放出に対するＥＤＴＡの効果を例証するために、実施例４で述べたように、消化酵素ありまたは消化酵素なしで処理した。消化緩衝液に添加した酵素が約０．８ｍｇ／ｍｌを占めることに注目すべきである。図１５は、植物にＥＤＴＡを添加すると、酵素なしで、アポプラストからタンパク質を抽出することができ、それがＨ１  ＶＬＰを含有することを示している。
【０１９８】
図１５は、ＥＤＴＡが、Ｈ１  ＶＬＰの放出を強化する効果を有することも示しており、最大効果は２０〜１００ｍＭにある。ＥＤＴＡは、植物細胞壁の重要な構成成分であるＣａ＋＋のスカベンジャーとして作用することで、植物細胞壁の解重合を助けると考えられる。
【０１９９】
実施例１６：植物細胞壁を弛緩させるための植物バイオマスの処理
ベンサミアナタバコ植物に、実施例１で述べたように、目的のヘマグルチニン（Ｈ１／ＣＡ０７）を発現するコンストラクトを保有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株をアグロインフィルトレートした。浸潤後５日目に葉を収集し、〜１ｃｍ２の小片に切断し、実施例４に従って消化した。対照消化緩衝液は、１．０％（ｖ／ｖ）ＭｕｌｔｉｆｅｃｔペクチナーゼＦＥ、１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＣＧおよび／または１．０％（ｖ／ｖ）Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（いずれもＧｅｎｅｎｃｏｒ製）を、それぞれ６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液の溶液中に含有し、１：２．５（ｗ／ｖ）のバイオマス：消化緩衝液比で使用した。同じ消化緩衝液中に３％ＭｕｌｔｉｆｅｃｔペクチナーゼＦＥ（ｖ／ｖ）を含有する比較消化を行った。細胞破片の粗濾過および遠心分離は実施例４で述べたとおりとした。この遠心分離からの上清をタンパク質濃度および血球凝集活性について調べた。表１７は、ペクチナーゼ構成要素がタンパク質およびＨＡ  ＶＬＰの放出を可能にすることを示している。
【０２００】
表１７は、セルロース特異的およびヘミセルロース特異的酵素を使用して、または使用せずに、３％ペクチナーゼで植物を処理した時のタンパク質およびＶＬＰの放出を示している。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイを使って測定した。ＨＡ活性は、赤血球を凝集させる最低量の抽出可能なタンパク質の逆数として表す。
［表１７］
【表１７】
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【０２０１】
実施例１７：酵素浸潤による葉および植物の処理
酵素浸潤は全葉からのＶＬＰ放出を増加させうる。このアプローチを検討するために、減圧下または加圧下で細胞壁弛緩組成物を浸潤させた葉からＶＬＰを抽出した。
【０２０２】
ＶＬＰ抽出
植物に、実施例１で述べたように、ＡＧＬ１／＃６８５をアグロインフィルトレートした。葉組織は、ベンサミアナタバコ植物から、浸潤後５日目または７日目に収集した。全植物体および／または全葉を、６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液中に１つ以上のペクチナーゼ（１％〜４％（ｖ／ｖ）のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  １６２Ｌ、１％〜４％（ｖ／ｖ）のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ４４４Ｌ、またはそれぞれ１％〜４％（ｖ／ｖ）のそれらの組み合わせ、１％〜４％（ｖ／ｖ）のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ＰＤＮ３３を含む酵素溶液に、比が１：２．５（ｗ／ｖ）の新鮮バイオマス：消化緩衝液を使って、浸漬するか、または浸潤（アグロインフィルトレーションについて上述したものと同様の条件を使用；「植物バイオマスの調製、接種材料、アグロインフィルトレーション、および収穫」参照）に付した。全植物体または全葉を、６００ｍＭマンニトール、７５ｍＭクエン酸塩、０．０４％重亜硫酸ナトリウム（ｐＨ６．０）緩衝液中にペクチナーゼ（１％〜４％（ｖ／ｖ）のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  １６２Ｌおよび１％〜４％（ｖ／ｖ）のＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔｓ  ４４４Ｌ）およびセルラーゼ（Ｍｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  ＣＧおよび／またはＭｕｌｔｉｆｅｃｔ  ＣＸ  Ｂ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、それぞれ１％〜４％（ｖ／ｖ））を含む酵素溶液でも、比が１：２．５（ｗ／ｖ）の新鮮バイオマス：消化緩衝液を使って、浸漬または浸潤させた。ある例では、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  １６２Ｌを１％になるように加え、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  ４４Ｌを４％４４４Ｌになるように加えたが、消化期間に応じてこれらのパーセンテージを変更しうることは、当業者には理解されるであろう。ペクチナーゼ活性が高いほど、消化期間は短い。また当業者には、この手法のペクチン分解要件が満たされる限り、当技術分野で知られる広範囲にわたる酵素を使用しうることも理解される。緩衝液は５．０〜６．５のｐＨまたはその間の任意の量に調節して、消化の継続期間中はそのままにしておくか、または緩衝溶液の添加によって初期値（すなわち５．０〜６．５の範囲またはその間の任意の量）が保たれるようにｐＨを調節することができる。さらにまた、場合によっては、緩衝液に、さまざまな酸化防止剤、例えばメタ重亜硫酸塩などを補足してもよい。酵素溶液からの酵素は、減圧浸潤または加圧浸潤によって全植物体または全葉に浸潤させる。
【０２０３】
酵素浸潤後は全葉および／または全植物体を消化緩衝液中に放置して手順の最後に振とうするか、全消化期間にわたってゆっくり振とう（容器のタイプに応じて４０〜８０ｒｐｍ）することができる。異なる撹拌は、特に脈管組織（葉脈）については、異なるレベルの消化につながるだろう。酵素を浸潤させていない葉は長時間（実施例４で概説したように１５時間法）を要し、より強い撹拌が要求される。
【０２０４】
図１６Ａは、酵素溶液を浸潤させた葉からは、同じ酵素溶液中に葉を浸漬して振とうしただけの場合の１６時間（時間ｔ）後と同じぐらいのＶＬＰ（溶液へのＨＡ放出）が、４時間（時間０．２５ｔ）で放出されることを示している。反復浸潤が長時間の単回浸潤ステップより有益であることも観察された（未掲載の結果）。酵素浸潤は、同じ酵素溶液に浸漬して振とうするが浸潤はさせない葉と比較して、同じ量のＨＡ／ＶＬＰを４分の１の消化時間で放出させることを可能にする。
【０２０５】
ＨＡ放出を決定した場合、酵素浸潤は、切断葉より全葉の方が効果的であることも観察された（図１６Ｂ参照）。酵素浸潤は、全葉または全植物体を使用することができ、それゆえに植物または植物材料を切断するステップを省略することができるので、より簡単な抽出プロセスを可能にする。
【０２０６】
葉組織の液化は、ペクチナーゼのみを使用して得ることができ、効率のよいＨＡ／ＶＬＰの放出が起こる。ペクチナーゼの酵素浸潤も、ペクチナーゼのみで行う方が上手く機能し、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  ４４４Ｌのみの場合と比較して、高い相対的ポリガラクツロナーゼ含有量を有する酵素（例えばＢｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  １６２Ｌ／１４４Ｌ）では特にそうである（図１６Ｃ）。どのペクチナーゼでも、それらがポリガラクツロニダーゼ活性もしくはペクチンリアーゼ活性またはその両方を有する限り、単独で、または互いに組み合わせて使用することができる。適切なペクチナーゼは、例えば「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  １６２Ｌ」および／または「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ  １４４Ｌ」である。酵素浸潤は、より簡単な消化溶液、例えばペクチナーゼのみを含む溶液の使用を可能にする。理論に束縛されることは望まないが、この溶液はプロトプラストにはそれほど有害でないだろう。
【０２０７】
図１６Ｄからわかるように、適正な緩衝液および酵素混合物を使えば、ＨＡ／ＶＬＰの酵素支援抽出は、ほぼ中性のｐＨで起こりうる。それゆえに、酵素浸潤の使用は、ｐＨ感受性タンパク質の精製を可能にする。
【０２０８】
全ての引例は、個々の刊行物が出典明示により本明細書に組み込まれることを個別に明記したかのように、そして本明細書に完全に記載されているかのように、出典明示により本明細書に組み込まれる。本明細書における参考文献の引用を、それらの参考文献が本発明に対する先行技術であるとの自認であると見なしてはならない。
【０２０９】
現時点において好ましい本発明の実施形態を、例示のために、いくつか説明した。本発明は、実施例および図面を参照して上に実質的に記載されている、全ての実施形態、改変および変形を包含する。特許請求の範囲に記載する本発明の範囲から逸脱することなくいくつかの変形および改変を加えうることは、当業者には明白であるだろう。そのような改変の例には、実質的に同じ方法で同じ結果が達成されるように、本発明の任意の態様を既知の等価物で置き換えることが含まれる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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