(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト多能性幹細胞からヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を製造する方法であって、次の(1)〜(4)の工程を含む、前記方法；
(1) ヒト多能性幹細胞を、アクチビンA及びGSK3β阻害剤を含む培養液中で6日間、培養する工程、
(2) (1)の工程で得られた細胞を、BMP阻害剤及びTGFβ阻害剤を含む培養液中で4日間、培養する工程、
(3) (2)の工程で得られた細胞を、BMP4、レチノイン酸及びGSK3β阻害剤を含む培養液中で4日間、培養する工程、及び、
(4) 工程(3)の後に、カルボキシペプチダーゼM(CPM)が陽性であることを指標としてヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を抽出する工程。
【請求項２】
前記GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記BMP阻害剤がNogginであり、且つ前記TGFβ阻害剤がSB431542である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記工程(1)において、さらにROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤を培養液に添加してヒト多能性幹細胞を培養する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ROCK阻害剤がY-27632であり、及び/又は前記HDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記工程(4)の後に、ヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を、さらに3次元培養する工程を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記3次元培養期間が10〜12日間である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記3次元培養がヒト肺繊維芽細胞及び/又はヒト胎児肺繊維芽細胞との共培養である、請求項５又は６記載の方法。
【請求項８】
前記3次元培養がヒト胎児肺繊維芽細胞との共培養である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記3次元培養が、ステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びKGFを含む培養液中で行われる、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロイド剤がデキサメタゾンであり、前記cAMP誘導体が8Br-cAMPであり、且つ前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ヒト多能性幹細胞からヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を製造する方法であって、次の(1)〜(6)の工程を含む、前記方法；
(1) ヒト多能性幹細胞を、アクチビンA及びGSK3β阻害剤を含む培養液中で6日間、培養する工程、
(2) (1)の工程で得られた細胞を、BMP阻害剤及びTGFβ阻害剤を含む培養液中で4日間、培養する工程、
(3) (2)の工程で得られた細胞を、BMP4、レチノイン酸及びGSK3β阻害剤を含む培養液中で4日間、培養する工程、
(4) (3)の工程で得られた細胞を、FGF10を含む培養液中で7日間、培養する工程、
(5) (4)の工程で得られた細胞を、ステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びKGFを含む培養液中で4日間、培養する工程、及び、
(6) 工程(5)の後に、カルボキシペプチダーゼM(CPM)が陽性であることを指標としてヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を抽出する工程。
【請求項１２】
前記GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記BMP阻害剤がNogginであり、前記TGFβ阻害剤がSB431542であり、前記ステロイド剤がデキサメタゾンであり、前記cAMP誘導体が8Br-cAMPであり、且つ前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記工程(1)において、さらにROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤を培養液に添加してヒト多能性幹細胞を培養する、請求項１１又は１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ROCK阻害剤がY-27632であり、及び/又は前記HDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
アクチビンA、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、BMP4、レチノイン酸、及びカルボキシペプチダーゼM(CPM)に特異的親和性を有する試薬を含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法によりヒト多能性幹細胞からヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を製造するためのキット。
【請求項１６】
前記GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記BMP阻害剤がNogginであり、且つ前記TGFβ阻害剤がSB431542である、請求項１５記載のキット。
【請求項１７】
さらにROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤を含有する、請求項１５又は１６記載のキット。
【請求項１８】
前記ROCK阻害剤がY-27632であり、及び/又は前記HDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
アクチビンA、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、BMP4、レチノイン酸、及びカルボキシペプチダーゼM(CPM)に特異的親和性を有する試薬を含有する、請求項５〜１０のいずれか１項記載の方法によりヒト多能性幹細胞からヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を製造するためのキット。
【請求項２０】
前記GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記BMP阻害剤がNogginであり、且つ前記TGFβ阻害剤がSB431542である、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
さらにROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤を含有する、請求項１９又は２０記載のキット。
【請求項２２】
前記ROCK阻害剤がY-27632であり、及び/又は前記HDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
さらにステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤及びKGFを含有する、請求項１９〜２２のいずれか１項記載のキット。
【請求項２４】
前記ステロイド剤がデキサメタゾンであり、前記cAMP誘導体が8Br-cAMPであり、且つ前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)である、請求項２３記載のキット。
【請求項２５】
アクチビンA、GSK3β阻害剤、BMP阻害剤、TGFβ阻害剤、BMP4、レチノイン酸、ステロイド剤、cAMP誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、FGF10、KGF、及びカルボキシペプチダーゼM(CPM)に特異的親和性を有する試薬を含有する、請求項１１〜１４のいずれか１項記載の方法によりヒト多能性幹細胞からヒト肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団を製造するためのキット。
【請求項２６】
前記GSK3β阻害剤がCHIR99021であり、前記BMP阻害剤がNogginであり、前記TGFβ阻害剤がSB431542であり、前記ステロイド剤がデキサメタゾンであり、前記cAMP誘導体が8Br-cAMPであり、且つ前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMX(3-Isobutyl-1-methylxanthine)である、請求項２５記載のキット。
【請求項２７】
さらにROCK阻害剤及び/又はHDAC阻害剤を含有する、請求項２５又は２６記載のキット。
【請求項２８】
前記ROCK阻害剤がY-27632であり、及び/又は前記HDAC阻害剤が酪酸ナトリウムである、請求項２７記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造する方法に関する。本発明はまた、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
肺は最も複雑な組織の一つであり、約４０の異なる細胞種からなると考えられている。このうち肺胞は、ガスを溜める肺胞腔と、これを囲む肺胞上皮からなる。さらに、肺胞上皮はＩ型肺胞上皮細胞とＩＩ型肺胞上皮細胞からなる。前者は、肺胞を取り囲む毛細血管内皮細胞と基底膜を介して血液空気関門を形成し、肺胞内ガスと血液ガスの交換を行う。後者は層板小体を多く含み、肺サーファクタントを開口分泌し、肺胞被覆層を形成していると言われている。
近年、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や、体細胞へ未分化細胞特異的遺伝子を導入することで得られる人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）など多能性を有する細胞がこれまでに報告されており（ＵＳＰ  ５，８４３，７８０およびＷＯ２００７／０６９６６６）、これらの細胞から肺胞上皮細胞の誘導方法（非特許文献１〜３）が報告され、誘導に必要な増殖因子等の報告もされている。しかし、ヒトの肺胞の細胞を効率よく誘導できている例はない。
また、肺胞の破壊される疾患として、肺気腫、間質性肺炎、リンパ脈管筋腫症などが挙げられる。特に肺気腫は、現在のところ、対症療法や保存療法が行われており、根治療法はない。他の肺胞性疾患においても根治療法はなく、細胞移植療法の実現が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｒｉｐｐｏｎ  ＨＪ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．６：４９−５６，２００４
【非特許文献２】Ｃｏｒａｕｘ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．３２：８７−９２，２００５
【非特許文献３】Ｍｏｒｒｉｓｅｙ  ＥＥ  ａｎｄ  Ｈｏｇａｎ  ＢＬ．Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ．１８：８−２３，２０１０
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造する方法を提供することを目的とする。本発明はまた、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造するためのキットを提供することを目的とする。
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、各種増殖因子および化合物を用いることによって、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を分化誘導できることを初めて見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下を包含する。
［１］  多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造する方法であって、次の（１）〜（３）の工程を含む、前記方法；
（１）多能性幹細胞をアクチビンＡおよびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、
（２）（１）の工程で得られた細胞をＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む培養液中で培養する工程、および、
（３）（２）の工程で得られた細胞をＢＭＰ４、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程。
［２］  前記工程（３）の後に、さらにＣＰＭが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を抽出する工程を含む、［１］に記載の方法。
［３］  前記工程（１）において、さらにＲＯＣＫ阻害剤および／またはＨＤＡＣ阻害剤を培養液に添加して多能性幹細胞を培養する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］  前記工程（１）が、６日以上の期間培養する工程である、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］  前記工程（２）が、４日以上の期間培養する工程である、［１］〜［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］  前記工程（３）が、４日以上の期間培養する工程である、［１］〜［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］  前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＮｏｇｇｉｎであり、且つ前記ＴＧＦβ阻害剤がＳＢ４３１５４２である、［１］〜［６］のいずれか１項に記載の方法。
［８］  前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２であり、および／または前記ＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、［３］〜［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］  前記工程（３）の後に、さらに、次の（４）および（５）の工程を含む、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の方法；
（４）（３）の工程で得られた細胞をＦＧＦ１０を含む培養液中で培養する工程、および、
（５）（４）の工程で得られた細胞をステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびＫＧＦを含む培養液中で培養する工程。
［１０］  前記工程（５）の後に、さらにＣＰＭが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を抽出する工程を含む、［９］に記載の方法。
［１１］  前記工程（４）が、７日以上の期間培養する工程である、［９］または［１０］に記載の方法。
［１２］  前記工程（５）が、４日以上の期間培養する工程である、［９］〜［１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３］  前記ステロイド剤がデキサメタゾンであり、前記ｃＡＭＰ誘導体が８Ｂｒ−ｃＡＭＰであり、且つ前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がＩＢＭＸ（３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）である、［９］〜［１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４］  前記肺胞上皮前駆細胞が、ヒト肺胞上皮前駆細胞である、［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５］  ［１］または［２］に記載の方法で製造された肺胞上皮前駆細胞を、さらに３次元培養する工程を含む、肺胞上皮前駆細胞の製造方法。
［１６］  ［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の方法で製造された肺胞上皮前駆細胞。
［１７］  アクチビンＡ、ＧＳＫ３β阻害剤、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、ＢＭＰ４、レチノイン酸、ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＦＧＦ１０およびＫＧＦを含有する、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造するためのキット。
［１８］  さらにＲＯＣＫ阻害剤および／またはＨＤＡＣ阻害剤を含有する、［１７］に記載のキット。
［１９］  前記ＧＳＫ３β阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１であり、前記ＢＭＰ阻害剤がＮｏｇｇｉｎであり、前記ＴＧＦβ阻害剤がＳＢ４３１５４２であり、前記ステロイド剤がデキサメタゾンであり、前記ｃＡＭＰ誘導体が８Ｂｒ−ｃＡＭＰであり、且つ前記ホスホジエステラーゼ阻害剤がＩＢＭＸである、［１７］または［１８］に記載のキット。
［２０］  前記ＲＯＣＫ阻害剤がＹ−２７６３２であり、および／または前記ＨＤＡＣ阻害剤が酪酸ナトリウムである、［１８］または［１９］に記載のキット。
［２１］  肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団から、ＣＰＭが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を抽出する工程を含む、肺胞上皮前駆細胞を抽出する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２０１３−０８４０３４号の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
図１ＡおよびＢは、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造するスキームを示す。図中、ＳｔａｇｅＩは、Ｓｔｅｐ１と同意であり、同様に、ＳｔａｇｅＩＩは、Ｓｔｅｐ２と、ＳｔａｇｅＩＩＩは、Ｓｔｅｐ３と、ＳｔａｇｅＩＶは、Ｓｔｅｐ４と、およびＳｔａｇｅＶは、Ｓｔｅｐ５と同意であり、以下、全てＳｔｅｐと称す。
図２Ａは、Ｓｔｅｐ３終了後の細胞におけるＣＰＭおよびＮＫＸ２−１の免疫染色像を示す。図２Ｂは、Ｓｔｅｐ２（上図）およびＳｔｅｐ３（下図）終了後の細胞におけるＣＰＭおよびＮＫＸ２−１の免疫染色像を示す。
図３Ａは、Ｓｔｅｐ３終了後、ＣＰＭを指標としてＭＡＣＳによりソーティングした後の細胞のＣＰＭ陽性細胞率を示す。図中、Ｉｓｏｔｙｐｅ  ｃｏｎｔｒｏｌでは、陰性対照の結果を示し、Ｐｒｅ−ｓｏｒｔｉｎｇでは、ＭＡＣＳによるソーティング前の細胞群の結果を示し、ＣＰＭ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞群の結果を示し、および、ＣＰＭ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陰性細胞群の結果を示す。図３Ｂは、Ｓｔｅｐ３終了後、ＣＰＭを指標としてＭＡＣＳによりソーティングした後の細胞のＣＰＭ陽性細胞率を示す。Ｐｒｅ−ｓｏｒｔｉｎｇでは、ＭＡＣＳによるソーティング前の細胞群の結果を示し、ＣＰＭ（＋）ｓｏｒｔｉｎｇでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞群の結果を示し、および、ＣＰＭ（−）ｓｏｒｔｉｎｇでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陰性細胞群の結果を示す。
図４Ａは、Ｓｔｅｐ３終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞（ＣＰＭ（＋）ｓｏｒｔｉｎｇ）およびＣＰＭ陰性細胞（ＣＰＭ（−）ｓｏｒｔｉｎｇ）におけるＣＰＭおよびＮＫＸ２−１の免疫染色像を示す。図４Ｂは、Ｓｔｅｐ３終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞（ＣＰＭ（＋）ｓｏｒｔｉｎｇ）およびＣＰＭ陰性細胞（ＣＰＭ（−）ｓｏｒｔｉｎｇ）におけるＮＫＸ２−１の免疫染色像を示す。
図５Ａは、Ｓｔｅｐ３終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされた細胞におけるＮＫＸ２−１陽性細胞の含有率を示す。図中、Ｐｒｅ−ｓｏｒｔｉｎｇでは、ＭＡＣＳによるソーティング前の細胞群の結果を示し、ＣＰＭ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞群の結果を示し、および、ＣＰＭ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陰性細胞群の結果を示す。図５Ｂは、Ｓｔｅｐ３終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされた細胞におけるＮＫＸ２−１陽性細胞の含有率を示す。図中、ＣＰＭ＋ｓｏｒｔｅｄ  ｃｅｌｌｓでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞群におけるＮＫＸ２−１陽性率（９２．３±０．７％）を示し、および、ＣＰＭ−ｓｏｒｔｅｄ  ｃｅｌｌｓでは、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陰性細胞群におけるＮＫＸ２−１陽性率（２２．２±２．３％）を示す。
図６は、Ｓｔｅｐ３終了後、ＭＡＣＳによりＣＰＭを指標としてソーティングされた細胞におけるＣＰＭ（左図）またはＮＫＸ２−１（右図）のｍＲＮＡを定量ＰＣＲにて測定した結果を示す。Ｓｔｅｐ３は、ソーティング前の細胞群での結果を示し、Ｓｔｅｐ３（＋）は、ＣＰＭ陽性細胞での結果を示し、Ｓｔｅｐ３（−）は、ＣＰＭ陰性細胞での結果を示し、Ｆｅｔｕｓ  Ｌｕｎｇは、胎児肺細胞での結果を示し、Ａｄｕｌｔ  Ｌｕｎｇは、成人肺細胞での結果を示す。
図７は、Ｓｔｅｐ４終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされた細胞におけるＣＰＭ（左図）およびＮＫＸ２−１（右図）のｍＲＮＡを定量ＰＣＲにて測定した結果を示す。Ｓｔｅｐ４は、ソーティング前の細胞群での結果を示し、Ｓｔｅｐ４（＋）は、ＣＰＭ陽性細胞での結果を示し、Ｓｔｅｐ４（−）は、ＣＰＭ陰性細胞での結果を示し、Ｆｅｔｕｓ  Ｌｕｎｇは、胎児肺細胞での結果を示し、Ａｄｕｌｔ  Ｌｕｎｇは、成人肺細胞での結果を示す。
図８Ａは、ｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）のＳｔｅｐ５終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞における免疫染色像を示す。図８Ｂは、ｉＰＳ細胞（ＳＦＴＰＣレポーター細胞株；ＳＦＴＰＣ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２０１Ｂ７）のＳｔｅｐ５終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞における免疫染色像を示す。図８Ｃは、ｉＰＳ細胞（ＳＦＴＰＣレポーター細胞株；ＳＦＴＰＣ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２０１Ｂ７）のＳｔｅｐ５終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされたＣＰＭ陽性細胞におけるＥＧＦＰ陽性細胞の含有率を示す。
図９ＡおよびＢは、Ｓｔｅｐ５終了後の細胞における免疫染色像を示す。
図１０は、Ｓｔｅｐ５終了後、ＭＡＣＳによりソーティングされた細胞におけるＣＰＭ、ＮＫＸ２−１、ＳＦＴＰＡ２、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣ、ＤＣＬＡＭＰ、ＣＣＳＰ（ＳＣＧＢ１Ａ１）、ＳＣＧＢ３Ａ２およびＮＧＦＲのｍＲＮＡを定量ＰＣＲにて測定した結果を示す。Ｓｔｅｐ５は、ソーティング前の細胞群での結果を示し、Ｓｔｅｐ５（＋）は、ＣＰＭ陽性細胞での結果を示し、Ｓｔｅｐ５（−）は、ＣＰＭ陰性細胞での結果を示し、Ｆｅｔｕｓ  Ｌｕｎｇは、胎児肺細胞での結果を示し、Ａｄｕｌｔ  Ｌｕｎｇは、成人肺細胞での結果を示す。
図１１は、ヒト胎児肺組織におけるＣＰＭおよび胎生期、腺様期または肺管状期のマーカーであるＮＫＸ２−１、ＳＦＴＰＣまたはＴ１αとの共染色像を示す。
図１２は、マウスの各胎生期（Ｅ１２．５、Ｅ１５．５およびＥ１７．５）の肺組織におけるＣＰＭと胎生期、腺様期および肺管状期マーカーであるＮＫＸ２−１との共染色像を示す。
図１３は、Ｓｔｅｐ３終了後の細胞のうちＣＰＭ陽性細胞をソーティングし、ヒト胎児肺線維芽細胞と共培養する方法の概要を示す。
図１４Ａは、Ｓｔｅｐ３終了後のＣＰＭ陽性細胞を３次元培養した後のスフェロイドの透過電子顕微鏡像を示す。中央図および右図は、左図の拡大図を示す。図１４Ｂは、マウス肺のＩＩ型肺胞上皮細胞の透過電子顕微鏡像を示す。右図は、左図の拡大図を示す。図１４Ｃは、Ｅ１７．５のマウス胎児肺の透過電子顕微鏡像を示す。右図は、左図の拡大図を示す。各図中に記載されたＬｕは管腔を示す。
図１５Ａは、Ｓｔｅｐ３終了後のＣＰＭ陽性細胞（左図）およびＣＰＭ陰性細胞（右図）を３次元培養した後のヘマトキシリン−エオシン染色像を示す。下図は、上図の拡大図を示す。図１５Ｂは、Ｓｔｅｐ３終了後のＣＰＭ陽性細胞を３次元培養した後のスフェロイドを、ＣＰＭ、ＮＫＸ２−１、ＧＦＰ（ＳＦＴＰＣ）、ＳＦＴＰＣ（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ）、およびＡＱＰ５抗体を用いて免疫染色した像を示す。
図１６は、Ｓｔｅｐ３終了後のＣＰＭ陽性細胞を３次元培養した後のスフェロイドを、ＣＰＭ、ＮＫＸ２−１、ＳＦＴＰＣ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＤ、ＩＤ２、およびＳＯＸ９抗体を用いて免疫染色した像を示す。各肺胞上皮細胞関連蛋白質を、ＣＰＭまたはＮＫＸ２−１のいずれかと２重染色した像を右図に示す。
図１７は、Ｓｔｅｐ３終了後のＣＰＭ陽性細胞を３次元培養した後のスフェロイドを、Ｔ１α、ＳＦＴＰＣ、ＡＱＰ５、およびＣＡＶ１抗体を用いて免疫染色した像を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明を以下に詳細に説明する。
本発明は、多能性幹細胞を、（１）アクチビンＡおよびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程、（２）ＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む培養液中で培養する工程、および（３）ＢＭＰ４、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程を含む、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞（例えば、ヒト肺胞上皮前駆細胞）を製造する方法を提供する。
本発明において、肺胞上皮前駆細胞を製造するにあたり、工程（３）の後に、ＣＰＭが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を抽出する工程を含んでも良い。
本発明において、肺胞上皮前駆細胞に製造するにあたり、工程（３）の後に、さらに、（４）ＦＧＦ１０を含む培養液中で培養する工程、および、（５）ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびＫＧＦを含む培養液中で培養する工程を含んでも良い。また、工程（５）の後に、ＣＰＭが陽性であることを指標として肺胞上皮前駆細胞を抽出する工程を含んでも良い。
本発明において、肺胞上皮前駆細胞とは、Ｉ型肺胞上皮細胞またはＩＩ型肺胞上皮細胞の前駆細胞を意味し、ＣＰＭまたはＮＫＸ２−１を発現している細胞である。本明細書において肺胞上皮細胞は、肺胞上皮前駆細胞と同等の細胞を意味し、特別の断りがなければ、この２つの細胞を区別しない。本発明において、ＣＰＭは、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１００５５０２、ＮＭ−００１８７４またはＮＭ＿１９８３２０で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質である。本発明において、ＮＫＸ２−１は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１０７９６６８またはＮＭ＿００３３１７で示されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質である。
本発明において、肺胞上皮前駆細胞のマーカーとして、ＳＦＴＰＢ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０００５４２またはＮＭ＿１９８８４３）、ＳＦＴＰＣ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００１１７２３５７、ＮＭ＿００１１７２４１０またはＮＭ＿００３０１８）およびＣＣＳＰ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００３３５７）から成る群より選択されるポリヌクレオチドおよびこれらがコードするタンパク質が例示される。
＜アクチビンＡおよびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程＞
本発明の多能性幹細胞を培養する工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。より好ましくは、Ｂ２７および抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地である。
本工程では、上記の基礎培地へアクチビンＡおよびＧＳＫ３β阻害剤を添加して多能性幹細胞を培養することによって行われる。本工程では、さらにＨＤＡＣ阻害剤を添加してもよい。
ここで、アクチビンＡは、２つのベータＡ鎖のホモダイマーであり、アクチビンＡのアミノ酸配列は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ネコのタンパク質で１００％の相同性があるため、特に種の限定はされない。本発明において好ましくは、Ｎ末端ペプチドが切断された活性型であり、ｉｎｈｉｂｉｎ  ｂｅｔａ  Ａ鎖（例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００２１８３）のＮ末端ペプチドが切断されたＧｌｙ３１１−Ｓｅｒ４２６断片がジスルフィド結合したホモダイマーである。このようなアクチビンＡは、例えば、Ｗａｋｏ社Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入可能である。
培養液中におけるアクチビンＡの濃度は、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１５０ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍおよび１ｍｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
ここで、ＧＳＫ３β阻害剤とは、ＧＳＫ−３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、インジルビン誘導体であるＢＩＯ（別名、ＧＳＫ−３β阻害剤ＩＸ；６−ブロモインジルビン３’−オキシム）、マレイミド誘導体であるＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるＧＳＫ−３β阻害剤ＶＩＩ（４−ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるＬ８０３−ｍｔｓ（別名、ＧＳＫ−３βペプチド阻害剤；Ｍｙｒ−Ｎ−ＧＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ−ＮＨ２）および高い選択性を有するＣＨＩＲ９９０２１（６−［２−［４−（２，４−Ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌ）−５−（４−ｍｅｔｈｙｌ−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−２−ｙｌａｍｉｎｏ］ｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ］ｐｙｒｉｄｉｎｅ−３−ｃａｒｂｏｎｉｔｒｉｌｅ）が挙げられる。これらの化合物は、例えばＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社やＢｉｏｍｏｌ社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、他の入手先から入手してもよく、あるいはまた自ら作製してもよい。
本発明で使用されるＧＳＫ−３β阻害剤は、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。本工程における、培養液中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。本工程では、好ましくは、１μＭである。
ここで、ＨＤＡＣ阻害剤とは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の酵素活性を阻害または失活させる物質として定義され、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例えば、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば５’−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６（７）：７９５−７９７（２００８））が挙げられる。
本発明で使用されるＨＤＡＣ阻害剤は、好ましくは、酪酸ナトリウム（ＮａＢ）であり得る。培養液中における酪酸ナトリウム（ＮａＢ）の濃度は、例えば、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、７５０μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、２５０μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来または人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程において、多能性幹細胞を解離させる工程を含んでも良い。細胞を解離させる方法としては、例えば、力学的に解離する方法、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ）およびＡｃｃｕｍａｘ（ＴＭ）など）またはコラゲナーゼ活性のみを有する解離溶液を用いた解離方法が挙げられる。好ましくは、プロテアーゼ活性とコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（特に好ましくは、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＴＭ））を用いてヒト多能性幹細胞を解離する方法が用いられる。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
ここで、ＲＯＣＫ阻害剤とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）の機能を抑制できるものである限り特に限定されず、例えば、Ｙ−２７６３２（（＋）−（Ｒ）−ｔｒａｎｓ−４−（１−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−Ｎ−（４−ｐｙｒｉｄｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（例えば、Ｉｓｈｉｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５７，９７６−９８３（２０００）；Ｎａｒｕｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２５，２７３−２８４（２０００）参照）、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７（例えば、Ｕｅｎａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９９０−９９４（１９９７）参照）、Ｈ−１１５２（例えば、Ｓａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．９３：２２５−２３２（２００２）参照）、Ｗｆ−５３６（例えば、Ｎａｋａｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５２（４）：３１９−３２４（２００３）参照）およびそれらの誘導体、ならびにＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクターが挙げられる。また、ＲＯＣＫ阻害剤としては他の低分子化合物も知られているので、本発明においてはこのような化合物またはそれらの誘導体も使用できる（例えば、米国特許出願公開第２００５０２０９２６１号、同第２００５０１９２３０４号、同第２００４００１４７５５号、同第２００４０００２５０８号、同第２００４０００２５０７号、同第２００３０１２５３４４号、同第２００３００８７９１９号、及び国際公開第２００３／０６２２２７号、同第２００３／０５９９１３号、同第２００３／０６２２２５号、同第２００２／０７６９７６号、同第２００４／０３９７９６号参照）。本発明では、１種または２種以上のＲＯＣＫ阻害剤が使用され得る。
本発明で使用されるＲＯＣＫ阻害剤は、好ましくは、Ｙ−２７６３２であり得る。Ｙ−２７６３２の濃度は、例えば、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭである。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、６日以上であり、特に好ましくは、６日である。また、ＲＯＣＫ阻害剤を添加する場合、その添加する期間は１日または２日であり、好ましくは１日である。さらに、ＨＤＡＣ阻害剤を添加する場合、本工程開始の翌日から添加して、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、またはそれ以上の日数、好ましくは、５日以上であり、特に好ましくは、５日間、ＨＤＡＣ阻害剤の存在下で培養する方法が例示される。
＜ＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む培養液中で培養する工程＞
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、３’−チオールグリセロールおよびアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の混合培地である。
本工程では、上記の基礎培地へＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を添加して前記工程（多能性幹細胞をアクチビンＡおよびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程）により得られた細胞を培養することによって行われる。
ここで、ＢＭＰ阻害剤とは、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ、などのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（すなわち、６−［４−（２−ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ−１−ｙｌ−ｅｔｈｏｘｙ）ｐｈｅｎｙｌ］−３−ｐｙｒｉｄｉｎ−４−ｙｌ−ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）、その誘導体（Ｐ．Ｂ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１６：ＩＩ＿６０；Ｐ．Ｂ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：３３−４１；Ｊ．Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，３（８）：ｅ２９０４）およびＬＤＮ−１９３１８９（すなわち、４−（６−（４−（ｐｉｐｅｒａｚｉｎ−１−ｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ）ｐｙｒａｚｏｌｏ［１，５−ａ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ−３−ｙｌ）ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）が例示される。ＤｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎおよびＬＤＮ−１９３１８９は市販されており、それぞれＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社およびＳｔｅｍｇｅｎｔ社から入手可能である。
本発明で使用されるＢＭＰ阻害剤は、好ましくは、Ｎｏｇｇｉｎであり得る。培養液中におけるＮｏｇｇｉｎの濃度は、ＢＭＰを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌである。
ここで、ＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβの受容体への結合からＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されず、例えば、Ｌｅｆｔｙ−１（ＮＣＢＩ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２（４−（４−（ｂｅｎｚｏ［ｄ］［１，３］ｄｉｏｘｏｌ−５−ｙｌ）−５−（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｙｌ）−１Ｈ−ｉｍｉｄａｚｏｌ−２−ｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，２：２０）、ＳＢ５０５１２４（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ−８３−０１（ＷＯ  ２００９１４６４０８）およびこれらの誘導体などが例示される。
本発明で使用されるＴＧＦβ阻害剤は、好ましくは、ＳＢ４３１５４２であり得る。培養液中におけるＳＢ４３１５４２の濃度は、ＴＧＦβを阻害する濃度であれば特に限定されないが、例えば、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、３５μＭ、４０μＭ、４５μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭおよび５００μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１０μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培養液を上記培養液へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＳＯＸ１７および／またはＦＯＸＡ２の陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培養液を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、４日である。
＜ＢＭＰ４、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程＞
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ  １９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、３’−チオールグリセロールおよびアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の混合培地である。
本工程では、上記の基礎培地へＢＭＰ４、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤を添加して前記工程（ＢＭＰ阻害剤およびＴＧＦβ阻害剤を含む培養液中で培養する工程）により得られた細胞を培養することによって行われる。
ここで、ＢＭＰ４とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００１２０２、ＮＭ＿１３０８５０またはＮＭ＿１３０８５１で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。
培養液中におけるＢＭＰ４の濃度は特に限定されないが、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
ここで、レチノイン酸とは、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）が例示されるが、天然のレチノイン酸が有する機能を保持しながら人工的に修飾されたレチノイン酸であってもよく、例えば、４−［［（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）ｃａｒｂｏｎｙｌ］ａｍｉｎｏ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＭ５８０）（Ｔａｍｕｒａ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ  Ｄｅｖ．３２：１７−２６（１９９０））、４−［（１Ｅ）−２−（５，６，７，８−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏ−５，５，８，８−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｙｌ）−１−ｐｒｏｐｅｎ−１−ｙｌ］−Ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＴＴＮＰＢ）（Ｓｔｒｉｃｋｌａｎｄ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４３：５２６８−５２７２（１９８３））、パルミチン酸レチノール、レチノール、レチナール、３−デヒドロレチノイン酸、３−デヒドロレチノール、３−デヒドロレチナールもしくは、Ａｂｅ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７８：４９９０−４９９４（１９８１）；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２４：１８（１９８３）；Ｔａｎｅｎａｇａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４０：９１４−９１９（１９８０）に記載されている化合物が挙げられる。
培養液中におけるレチノイン酸の濃度は、特に限定されないが、例えば、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、１５ｎＭ、２０ｎＭ、２５ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、５０ｎＭである。
本工程におけるＧＳＫ３β阻害剤は、上述したＧＳＫ３β阻害剤を用いることができ、好ましくは、ＣＨＩＲ９９０２１であり得る。本工程における、培養液中におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度は、例えば、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、１．５μＭ、２μＭ、２．５μＭ、３μＭ、３．５μＭ、４μＭ、４．５μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、１５μＭ、２０μＭ、２５μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭであるがこれらに限定されない。本工程では、好ましくは、２．５μＭである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来または人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培養液を上記培養液へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＳＯＸ２および／またはＳＯＸ１７および／またはＦＯＸＡ２の陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培養液を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、４日以上であり、より好ましくは４日である。
＜ＦＧＦ１０を含む培養液中で培養する工程＞
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｂ２７、Ｎ２、３’−チオールグリセロールおよびアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ培地およびＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の混合培地である。
本工程では、上記の基礎培地へＦＧＦ１０を添加して前記工程（ＢＭＰ４、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程）により得られた細胞を培養することによって行われる。
ここで、ＦＧＦ１０とは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００４４６５で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。このようなＦＧＦ１０は、例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社またはＷａｋｏ社から入手可能である。
培養液中におけるＦＧＦ１０の濃度は特に限定されないが、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来または人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培養液を上記培養液へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＮＫＸ２−１および／またはＦＯＸＡ２の陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培養液を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、７日以上あり、より好ましくは７日である。
＜ステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびＫＧＦを含む培養液中で培養する工程＞
本工程において用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）（ＥＳ細胞培養時のＦＢＳの血清代替物）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、ＩＴＳプレミックス、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオールグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、Ｌ−グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの１つ以上の物質も含有し得る。好ましくは、アルブミン、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、塩化カルシウム、ＩＴＳプレミックスおよび抗生物質を含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地である。
本工程では、上記の基礎培地へステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびＫＧＦを添加して前記工程（ＦＧＦ１０を含む培養液中で培養する工程）により得られた細胞を培養することによって行われる。
ここで、ステロイド剤とは、ステロイド系抗炎症薬であり、グルココルチコイドあるいはその合成誘導体であり、例えば、ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、コハク酸メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、デキサメタゾン、ベタメタゾンが例示される。
本発明で使用されるステロイド剤は、好ましくは、デキサメタゾンであり得る。培養液中におけるデキサメタゾンの濃度は特に限定されないが、例えば、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、５０ｎＭである。
ここで、ｃＡＭＰ誘導体とは、ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰへ置換基が修飾された化合物であり、例えば、ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｃＡＭＰ）、８−ｂｒｏｍｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ又は８Ｂｒ−ｃＡＭＰ）、８−ｃｈｌｏｒｏ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−Ｃｌ−ｃＡＭＰ）、８−（４−Ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｙｌｔｈｉｏ）ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（８−ＣＰＴ−ｃＡＭＰ）およびＤｉｂｕｔｙｒｙｌ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＤＢ−ｃＡＭＰ）が例示される。
本発明で使用されるｃＡＭＰ誘導体は、好ましくは、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰであり得る。培養液中における８−Ｂｒ−ｃＡＭＰの濃度は特に限定されないが、例えば、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００μＭである。
ここで、ホスホジエステラーゼ阻害剤とは、ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）を阻害することにより、ｃＡＭＰあるいはｃＧＭＰの細胞内濃度を上昇させる化合物であり、例えば、１，３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ、６，７−Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−１−（３，４−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｙｌ）ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ、４−｛［３’，４’−（Ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｏｘｙ）ｂｅｎｚｙｌ］ａｍｉｎｏ｝−６−ｍｅｔｈｏｘｙｑｕｉｎａｚｏｌｉｎｅ、８−Ｍｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅおよび３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）が例示される。
本発明で使用されるホスホジエステラーゼ阻害剤は、好ましくは、ＩＢＭＸであり得る。培養液中におけるＩＢＭＸの濃度は特に限定されないが、例えば、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、４００μＭ、５００μＭ、６００μＭ、７００μＭ、８００μＭ、９００μＭ、１ｍＭであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００μＭである。
ここで、ＫＧＦとは、ＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＭ＿００２００９で示されるポリヌクレオチドによってコードするタンパク質であり、プロテアーゼによる切断を受けて活性化された形態であってもよい。このようなＫＧＦは、例えば、Ｗａｋｏ社から入手することができる。
培養液中におけるＫＧＦの濃度は特に限定されないが、例えば、１０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、２００ｎｇ／ｍｌ、３００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、６００ｎｇ／ｍｌ、７００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、９００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌであるがこれらに限定されない。好ましくは、１００ｎｇ／ｍｌである。
本工程において、コーティング処理された培養容器を用いて培養してもよい。コーティング剤としては、天然由来または人工的に合成された細胞外マトリックスでよく、例えば、マトリゲル（ＢＤ）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、マトリゲルである。
本工程は、前記工程により得られた細胞の培養液を上記培養液へと交換することによって行われても良い。また、細胞を解離させ、再度、培養容器に播種することによって行われてもよい。このように細胞を解離させる場合、特定の細胞を選択してもよく、例えば、ＮＫＸ２−１の陽性細胞を選択して、本工程に用いても良い。好ましくは、培養液を交換することによって行われる方法である。
本工程において、解離させる工程を含む場合、解離により多能性幹細胞の細胞死を抑制するため、ＲＯＣＫ阻害剤を培養液に添加することで行うことができる。
培養条件について、培養温度は、以下に限定されないが、約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃であり、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で培養が行われ、ＣＯ２濃度は、好ましくは約２〜５％である。
培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、１日以上、２日以上、３日以上、４日以上、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、４日以上であり、特に好ましくは、４日である。
＜３次元培養＞
本発明において、肺胞上皮前駆細胞をさらに成熟化させるために、肺胞上皮前駆細胞を３次元培養する方法を提供する。本発明において、３次元培養とは、細胞を塊（スフェロイド）として浮遊状態で培養することを意味する。本発明の３次元培養では、例えば、ＢＤ社が提供するセルカルチャーインサートを使用して行うことができる。
本発明の３次元培養では、他の細胞種と共培養しても良く、この時用いる他の細胞種としては、ヒト肺線維芽細胞、およびヒト胎児肺線維芽細胞が例示され、このような細胞は、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）およびＤＶｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社などから入手可能である。
本発明の３次元培養において、用いる培養液は、上述のステロイド剤、ｃＡＭＰ誘導体、ホスホジエステラーゼ阻害剤およびＫＧＦを含む培養液中で培養する工程で用いる培養液を用いることができ、好ましくは、培養液に細胞外基質を添加して用いてもよい。細胞外基質と培養液の比率は特に限定されないが、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４および１：５の比率で混合することが例示される。本発明において、細胞外基質とは、細胞の外に存在する超分子構造体であり、天然由来であっても、人工物（組換え体）であってもよい。例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、フィブリリン、ラミニンといった物質またはこれらの断片が挙げられる。これらの細胞外基質は、組み合わせて用いられてもよく、例えば、ＢＤ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＴＭ）などの細胞からの調製物であってもよい。人工物としては、ラミニンの断片が例示される。
３次元培養での培養期間は、長期の培養により特段の問題が起きないため、特に限定されないが、５日以上、６日以上、７日以上、８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、またはそれ以上の日数が挙げられる。好ましくは、１０日以上であり、特に好ましくは、１０日、１１日または１２日である。
＜多能性幹細胞＞
本発明で使用可能な多能性幹細胞は、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。本発明では、胚の破壊を行わずに得られると意味では、ｉＰＳ細胞またはＭｕｓｅ細胞を用いることが好ましい。
（Ａ）胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
ＥＳ細胞は、受精卵の８細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ＥＳ細胞は、マウスで１９８１年に発見され（Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ（１９８１），Ｎａｔｕｒｅ２９２：１５４−１５６）、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもＥＳ細胞株が樹立された（Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５−１１４７；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，５５：２５４−２５９；Ｊ．Ａ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｓ．Ｍａｒｓｈａｌｌ（１９９８），Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５）。
ＥＳ細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子（ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ（ＬＩＦ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ））などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのＥＳ細胞の樹立と維持の方法については、例えばＵＳＰ５，８４３，７８０；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．９２：７８４４−７８４８；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｓｃｉｅｎｃｅ．２８２：１１４５−１１４７；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２；Ｍ．Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：９５５４−９５５９；Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２２２：２７３−２７９；Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９：１５８０−１５８５；Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ  Ｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｎａｔｕｒｅ．４４４：４８１−４８５などに記載されている。
ＥＳ細胞作製のための培養液として、例えば０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、２０％ＫＳＲおよび４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液を使用し、３７℃、５％ＣＯ２、湿潤雰囲気下でヒトＥＳ細胞を維持することができる（Ｈ．Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３４５：９２６−９３２）。また、ＥＳ細胞は、３〜４日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば１ｍＭ  ＣａＣｌ２および２０％ＫＳＲを含有するＰＢＳ中の０．２５％トリプシンおよび０．１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＶを用いて行うことができる。
ＥＳ細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Ｏｃｔ−３／４、Ｎａｎｏｇなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてＲｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ法で行うことができる。特に、ヒトＥＳ細胞の選択では、ＯＣＴ−３／４、ＮＡＮＯＧ、ＥＣＡＤなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる（Ｅ．Ｋｒｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：４４３−４５２）。
ヒトＥＳ細胞株（例えばＷＡ０１（Ｈ１）およびＷＡ０９（Ｈ９））は、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから、ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２およびＫｈＥＳ−３は、京都大学再生医科学研究所（京都、日本）から入手可能である。
（Ｂ）精子幹細胞
精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ＥＳ細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ（Ｍ．Ｋａｎａｔｓｕ−Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，６９：６１２−６１６；Ｋ．Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００４），Ｃｅｌｌ，１１９：１００１−１０１２）。神経膠細胞系由来神経栄養因子（ｇｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））を含む培養液で自己複製可能であるし、またＥＳ細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる（竹林正則ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４１〜４６頁，羊土社（東京、日本））。
（Ｃ）胚性生殖細胞
胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ＥＳ細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、ＬＩＦ、ｂＦＧＦ、幹細胞因子（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる（Ｙ．Ｍａｔｓｕｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ，７０：８４１−８４７；Ｊ．Ｌ．Ｒｅｓｎｉｃｋｅｔ  ａｌ．（１９９２），Ｎａｔｕｒｅ，３５９：５５０−５５１）。
（Ｄ）人工多能性幹細胞
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞は、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｙａｍａｎａｋａ（２００６）Ｃｅｌｌ，１２６：６６３−６７６；Ｋ．Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２；Ｊ．Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７−１９２０；Ｎａｋａｇａｗａ，Ｍ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１０１−１０６（２００８）；国際公開ＷＯ２００７／０６９６６６）。初期化因子は、ＥＳ細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｒｄｉｎｇ  ＲＮＡまたはＥＳ細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ  Ｙ，ｅｔａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ  Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤［例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤、ＨＤＡＣに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ（例、ＨＤＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  Ｓｍａｒｔｐｏｏｌ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ＨｕＳＨ  ２９ｍｅｒ  ｓｈＲＮＡ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ＨＤＡＣ１（ＯｒｉＧｅｎｅ）等）等の核酸性発現阻害剤など］、ＭＥＫ阻害剤（例えば、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６、ＳＬ３２７およびＰＤ０３２５９０１）、Ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３阻害剤（例えば、ＢｉｏおよびＣＨＩＲ９９０２１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、ＢＩＸ−０１２９４等の低分子阻害剤、Ｓｕｖ３９ｈ１、Ｓｕｖ３９ｈ２、ＳｅｔＤＢ１およびＧ９ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等の核酸性発現阻害剤など）、Ｌ−ｃｈａｎｎｅｌ  ｃａｌｃｉｕｍ  ａｇｏｎｉｓｔ（例えばＢａｙｋ８６４４）、酪酸、ＴＧＦβ阻害剤またはＡＬＫ５阻害剤（例えば、ＬＹ３６４９４７、ＳＢ４３１５４２、６１６４５３およびＡ−８３−０１）、ｐ５３阻害剤（例えばｐ５３に対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ＡＲＩＤ３Ａ阻害剤（例えば、ＡＲＩＤ３Ａに対するｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ）、ｍｉＲ−２９１−３ｐ、ｍｉＲ−２９４、ｍｉＲ−２９５およびｍｉｒ−３０２などのｍｉＲＮＡ、Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（例えばｓｏｌｕｂｌｅ  Ｗｎｔ３ａ）、神経ペプチドＹ、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンＥ２およびプロスタグランジンＪ２）、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、ＵＴＦ１、ＩＲＸ６、ＧＬＩＳｌ、ＰＩＴＸ２、ＤＭＲＴＢｌ等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、ＨＩＶ由来のＴＡＴおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
一方、ＤＮＡの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター（以上、Ｃｅｌｌ，１２６，ｐｐ．６６３−６７６，２００６；Ｃｅｌｌ，１３１，ｐｐ．８６１−８７２，２００７；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８，ｐｐ．１９１７−１９２０，２００７）、アデノウイルスベクター（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２，９４５−９４９，２００８）、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクター（ＷＯ  ２０１０／００８０５４）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ、ＰＡＣ）などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる（Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２２：９４９−９５３，２００８）。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ＦＬＡＧなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にＬｏｘＰ配列を有してもよい。
また、ＲＮＡの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、５−メチルシチジンおよびｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を取り込ませたＲＮＡを用いても良い（Ｗａｒｒｅｎ  Ｌ，（２０１０）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．７：６１８−６３０）。
ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、例えば、１０〜１５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２又はＤＭＥ培養液（これらの培養液にはさらに、ＬＩＦ、ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液［例えば、マウスＥＳ細胞培養用培養液（ＴＸ−ＷＥＳ培養液、トロンボＸ社）、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液（霊長類ＥＳ／ｉＰＳ細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（ｍＴｅＳＲ、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）］などが含まれる。
培養法の例としては、たとえば、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ又はＤＭＥＭ／Ｆ１２培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約４〜７日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約１０日後からｂＦＧＦ含有霊長類ＥＳ細胞培養用培養液で培養し、該接触から約３０〜約４５日又はそれ以上ののちにｉＰＳ様コロニーを生じさせることができる。
あるいは、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて、フィーダー細胞（たとえば、マイトマイシンＣ処理ＳＴＯ細胞、ＳＮＬ細胞等）上で１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培養液（これにはさらに、ＬＩＦ、ペニシリン／ストレプトマイシン、ピューロマイシン、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸類、β−メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約２５〜約３０日又はそれ以上ののちにＥＳ様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．４：ｅ８０６７またはＷＯ２０１０／１３７７４６）、もしくは細胞外基質（例えば、Ｌａｍｉｎｉｎ−５（ＷＯ２００９／１２３３４９）およびマトリゲル（ＢＤ社））を用いる方法が例示される。
この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Ｓｕｎ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０６：１５７２０−１５７２５）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（０．１％以上、１５％以下の酸素濃度）によりｉＰＳ細胞を樹立しても良い（Ｙｏｓｈｉｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：２３７−２４１またはＷＯ２０１０／０１３８４５）。
上記培養の間には、培養開始２日目以降から毎日１回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ１００ｃｍ２あたり約５×１０３〜約５×１０６細胞の範囲である。
ｉＰＳ細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。一方、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ）と連動して発現する薬剤耐性遺伝子をマーカー遺伝子として導入した場合は、対応する薬剤を含む培養液（選択培養液）で培養を行うことにより樹立したｉＰＳ細胞を選択することができる。また、マーカー遺伝子が蛍光タンパク質遺伝子の場合は蛍光顕微鏡で観察することによって、発光酵素遺伝子の場合は発光基質を加えることによって、また発色酵素遺伝子の場合は発色基質を加えることによって、ｉＰＳ細胞を選択することができる。
本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ＥＳ細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
（Ｅ）核移植により得られたクローン胚由来のＥＳ細胞
ｎｔ  ＥＳ細胞は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のＥＳ細胞であり、受精卵由来のＥＳ細胞とほぼ同じ特性を有している（Ｔ．Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２：７４０−７４３；Ｓ．Ｗａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，７２：９３２−９３６；Ｊ．Ｂｙｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｎａｔｕｒｅ，４５０：４９７−５０２）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたＥＳ細胞がｎｔ  ＥＳ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＥＳ）細胞である。ｎｔ  ＥＳ細胞の作製のためには、核移植技術（Ｊ．Ｂ．Ｃｉｂｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８），Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：６４２−６４６）とＥＳ細胞作製技術との組み合わせが利用される（若山清香ら（２００８），実験医学，２６巻，５号（増刊），４７〜５２頁）。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
（Ｆ）Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  Ｓｔｒｅｓｓ  Ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ（Ｍｕｓｅ細胞）
Ｍｕｓｅ細胞は、ＷＯ２０１１／００７９００に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは８時間または１６時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、ＳＳＥＡ−３およびＣＤ１０５が陽性である。
＜多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞への分化誘導用キット＞
本発明は、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を分化誘導（又は製造）するためのキットを提供する。本キットには、上述した分化誘導に用いる増殖因子、化合物、培養液、解離溶液および培養容器のコーティング剤を含んでもよい。本キットには、さらに分化誘導の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
＜肺胞上皮前駆細胞を選択する方法＞
本発明において、肺胞上皮前駆細胞とは、肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団であればよく、好ましくは、本発明において、肺胞上皮前駆細胞を含有する細胞集団とは、肺胞上皮前駆細胞を５０％、６０％、７０％、８０％または９０％以上含有する細胞集団である。
従って、本発明は、肺胞上皮前駆細胞を抽出する方法を提供する。抽出される細胞集団は、上述の方法で得られた肺胞上皮前駆細胞であってもよく、その製造工程（（３）ＢＭＰ４、レチノイン酸およびＧＳＫ３β阻害剤を含む培養液中で培養する工程の終了後または（４）ＦＧＦ１０を含む培養液中で培養する工程の終了後）において得られる細胞集団であってもよい。肺胞上皮前駆細胞の抽出は、ＣＰＭに特異的親和性を有する試薬を用いて行うことができる。ＣＰＭはこれまで成人のＩ型の肺胞上皮細胞のマーカーとして知られていたが、発生過程の前駆細胞で発現していることは知られておらず、肺胞上皮前駆細胞のマーカーであるＮＫＸ２−１と同等に表面マーカーとして用いることが本発明により初めて見出されたものである。
ここで、特異的親和性を有する試薬とは、抗体、アプタマー、ペプチドまたは特異的に認識する化合物などを用いることができ、好ましくは、抗体もしくはその断片である。
本発明において、抗体はポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。これらの抗体は、当業者に周知の技術を用いて作成することが可能である（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ１１．１２−１１．１３）。具体的には、本発明の抗体がポリクローナル抗体の場合には、常法に従って大腸菌または哺乳類細胞株等で発現し精製したＣＰＭがコードするタンパク質、部分アミノ酸配列を有するオリゴペプチドあるいは糖脂質を精製して、家兎等の非ヒト動物に免疫し、該免疫動物の血清から常法に従って得ることが可能である。一方、モノクローナル抗体の場合には、上述の免疫された非ヒト動物から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させて調製したハイブリドーマ細胞の中から得ることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｅｄｉｔ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ．Ｓｅｃｔｉｏｎ１１．４−１１．１１）。抗体の断片としては、抗体の一部（たとえばＦａｂ断片）または合成抗体断片（たとえば、一本鎖Ｆｖ断片「ＳｃＦｖ」）が例示される。ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２断片などの抗体の断片もまた、遺伝子工学的に周知の方法によって作製することができる。例えば、ＣＰＭに対する抗体をＬｅｉｃａ  ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社より入手することができる。
ＣＰＭを発現する細胞を認識または分離することを目的として、当該親和性を有する試薬は、例えば、蛍光標識、放射性標識、化学発光標識、酵素、ビオチンまたはストレプトアビジン等の検出可能な物質またはプロテインＡ、プロテインＧ、ビーズまたは磁気ビーズ等の単離抽出を可能とさせる物質と結合または接合されていてもよい。
当該親和性を有する試薬はまた、間接的に標識してもよい。当業者に公知の様々な方法を使用して行い得るが、例えば、当該抗体に特異的に結合する予め標識された抗体（二次抗体）を用いる方法が挙げられる。
肺胞上皮前駆細胞を抽出する方法には、当該親和性を有する試薬へ粒子を接合させ沈降させる方法、磁気ビーズを用いて磁性により細胞を選別する方法（例えば、ＭＡＣＳ）、蛍光標識を用いてセルソーターを用いる方法、または抗体等が固定化された担体（例えば、細胞濃縮カラム）を用いる方法等が例示される。
＜肺胞疾患治療剤＞
本発明で得られた肺胞上皮前駆細胞は、製剤として肺胞の破壊される疾患患者に投与することができる。得られた肺胞上皮前駆細胞をシート化して、患者の肺胞上皮に貼付してもよく、生理食塩水等に懸濁させ、患者の肺胞に直接移植することによって行われ得る。従って、本発明では、上記の方法で多能性幹細胞より得られた肺胞上皮前駆細胞を含む肺胞疾患治療剤を提供する。
本発明において、肺胞疾患治療剤に含まれる肺胞上皮前駆細胞の細胞数は、移植片が投与後に生着できれば特に限定されなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
【実施例】
【０００７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
＜ｉＰＳ細胞培養＞
ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）は、京都大学の山中教授より受領し、従来の方法で培養した（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１３１：８６１−８７２，２００７）。また、Ｍａｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．４：１３６７，２０１３に記載された方法と同様の方法を用いてヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７）のＳＦＴＰＣの開始コドンの下流にＥＧＦＰ配列をＫｎｏｃｋ−ｉｎさせたＳＦＴＰＣ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２０１Ｂ７を作製した。
＜肺胞上皮前駆細胞誘導＞
ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造するスキームを図１に示す。
肺胞上皮前駆細胞は、ヒトｉＰＳ細胞をＡｃｃｕｔａｓｅにより解離させ、マトリゲルコーティングした２４ウェルプレートに１ウェルあたり２．０ｘ１０５個、またはマトリゲルコーティングした６ウェルプレートに１ウェルあたり９．６ｘ１０５個を播種し、次の条件で培養することによって誘導した（図１ＡおよびＢ）。
（Ｓｔｅｐ１）
播種した細胞（Ｄａｙ０）を１００ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加した基礎培地１（２％Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および０．５％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｉｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ））中で培養した。翌日（Ｄａｙ１）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および０．２５ｍＭ  ＮａＢを含有する基礎培地１へ培地を交換し、翌日（Ｄａｙ２）および３日後（Ｄａｙ４）に同じ条件の培地へ培地を交換し、５日間培養した。
もしくは、播種した細胞（Ｄａｙ０）を１００ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１および１０μＭ  Ｙ−２７６３２を添加した基礎培地１中で培養した。翌日（Ｄａｙ１）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、１０μＭ  Ｙ−２７６３２および０．１２５ｍＭまたは０．２５ｍＭ  ＮａＢを含有する基礎培地１へ培地を交換し、翌日（Ｄａｙ２）、１００ｎｇ／ｍｌ  Ａｃｔｉｖｉｎ  Ａ、１μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１、および０．１２５ｍＭまたは０．２５ｍＭ  ＮａＢを含有する基礎培地１へ培地を交換し、３日後（Ｄａｙ４）に同じ条件の培地へ培地を交換した。
（Ｓｔｅｐ２）
Ｓｔｅｐ１で得られた細胞（Ｄａｙ６）を２００ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＮｏｇｇｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および１０μＭ  ＳＢ−４３１５４２を添加した基礎培地２（１％Ｇｌｕｔａｍａｘ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２％Ｂ２７  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、１％Ｎ２  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．８％  ＳｔｅｍＳｕｒｅＴＭ  ５０ｍｍｏｌ／ｌ  Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍｌ  Ｌ−ａｓｃｏｒｂｉｃ  ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．５％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｉｕｔｉｏｎを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で４日間培養した。この時、２日に一度同じ条件の培地へ培地を交換した。
（Ｓｔｅｐ３）
Ｓｔｅｐ２で得られた細胞（Ｄａｙ１０）を１００ｎｇ／ｍｌ  ｈＢＭＰ４（ＨｕｍａｎＺｙｍｅ，Ｉｎｃ．）、０．０５μＭ  ａｌｌ−ｔｒａｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）および２．５μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含有する基本培地２中で４日間培養した。この時、２日に一度同じ条件の培地へ培地を交換した。
（Ｓｔｅｐ４）
Ｓｔｅｐ３で得られた細胞（Ｄａｙ１４）を１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ１０（Ｗａｋｏ）を含有する基本培地２中で７日間培養した。この時、２日に一度同じ条件の培地へ培地を交換した。
（Ｓｔｅｐ５）
培地交換後、Ｓｔｅｐ４で得られた細胞（Ｄａｙ２１）を５０ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．１ｍＭ  ８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｂｉｏｌｏｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、０．１ｍＭ  ３−Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−１−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ（ＩＢＭＸ）（Ｗａｋｏ）および１００ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦ（Ｗａｋｏ）を含有する基礎培地３（３．３３％ＢＳＡ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（７．５％）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．８ｍＭ  ＣａＣｌ２（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）、１％ＩＴＳプレミックス（ＢＤ）および０．５％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｉｕｔｉｏｎを含有するＨａｍ’ｓ  Ｆ１２  ｍｅｄｉａ（Ｗａｋｏ））中で培養し、以後２日に一度同じ条件の培地へ培地を交換した。４日後（Ｄａｙ２５）、得られた肺胞上皮前駆細胞について解析を行った。
＜細胞解析＞
（１）Ｓｔｅｐ３終了後
Ｓｔｅｐ３終了後（Ｄａｙ１４）の細胞を免疫染色にてＣＰＭおよびＮＫＸ２−１の発現を確認したところ、これらのマーカーの共陽性細胞が確認された（図２ＡおよびＢ）。さらに、Ｄａｙ１４の細胞からＭＡＣＳ（ミルテニー社）を用いてＣＰＭ陽性細胞を採取し（図３ＡおよびＢ）、得られた細胞をサイトスピンにてスライドグラスに張り付けて、免疫染色を行ったところ、その多くがＮＫＸ２−１も陽性であることが確認された（図４ＡおよびＢ）。この時の細胞をフローサイトメーターを用いて解析したところ、ＭＡＣＳにより得られたＣＰＭ陽性細胞のうち９２％の細胞がＮＫＸ２−１陽性であることが確認された（図５ＡおよびＢ）。また、ＭＡＣＳにより得られたＣＰＭ陽性細胞を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＰＭおよびＮＫＸ２−１のｍＲＮＡ量を測定したところ、ＣＰＭ陽性細胞をソーティングすることで、顕著にＣＰＭおよびＮＫＸ２−１のｍＲＮＡ量が増加していることが確認された（図６）。
（２）Ｓｔｅｐ４終了後
Ｓｔｅｐ４終了後（Ｄａｙ２１）の細胞からＭＡＣＳを用いてＣＰＭ陽性細胞を採取し、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＰＭおよびＮＫＸ２−１のｍＲＮＡ量を測定したところ、ＣＰＭ陽性細胞をソーティングすることで、顕著にＣＰＭおよびＮＫＸ２−１のｍＲＮＡ量が増加していることが確認された（図７）。
（３）Ｓｔｅｐ５終了後
Ｓｔｅｐ５終了後（Ｄａｙ２５）の細胞からＭＡＣＳを用いてＣＰＭ陽性細胞を採取し、得られた細胞をサイトスピンにてスライドグラスに張り付けて、免疫染色を行ったところ、その多くがＮＫＸ２−１も陽性であった（図８Ａ）。さらに、ＳＦＴＰＣ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２０１Ｂ７を用いて同様に分化誘導した細胞についても免疫染色をおこなったところ、ＣＰＭ陽性細胞においてＳＦＴＰＣまたはｐｒｏＳＰＢ陽性の細胞が混在することが確認できた（図８Ｂ）。このＳＦＴＰＣ陽性細胞の含有率をフローサイトメーターにより解析したところ、０．９％程度であることが確認された（図８Ｃ）。
続いて、Ｓｔｅｐ５終了後のＤａｙ２５の細胞（２０１Ｂ７）について免疫染色を行ったところ、ＣＰＭ、ＮＫＸ２−１、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣおよびＣＣＳＰが陽性の細胞を確認した（図９ＡおよびＢ）。このとき、各マーカー遺伝子は、ＣＰＭと共陽性であることが確認できた。さらにＭＡＣＳにより得られたＣＰＭ陽性細胞を定量ＲＴ−ＰＣＲを用いてＣＰＭ、ＮＫＸ２−１、ＳＦＴＰＡ２、ＳＦＴＰＢ、ＤＣＬＡＭＰ、ＳＦＴＰＣ、ＣＣＳＰおよびＮＧＦＲのｍＲＮＡ量を測定したところ、ＣＰＭ陽性細胞をソーティングすることで、顕著にＣＰＭおよびＮＫＸ２−１のｍＲＮＡ量が増加していることが確認された（図１０）。
以上より、本方法を用いることで、ｉＰＳ細胞から肺上皮細胞またはその前駆細胞が誘導できることが確認された。
＜ＣＰＭのマーカーの効果＞
ヒト胎児由来の肺組織（図１１）およびマウス胎児由来（Ｅ１２．５、Ｅ１５．５およびＥ１７．５）の肺組織（図１２）において、ＣＰＭの発現を確認したところＮＫＸ２−１、ＳＦＴＰＣおよびＴ１αと共陽性であることが確認された。従って、ＣＰＭは、肺発生の管状期（ヒト：胎生１６〜２４週、マウス：胎生１６．５〜１７．５日）および腺様期（ヒト：胎生７〜１６週、マウス：胎生１４．０〜１６．５日）のみならず胎生期（ヒト：胎生３〜７週、マウス：胎生９〜１４日）といった初期の段階における肺胞上皮前駆細胞を認識できることが確認された。
以上より、ＣＰＭを指標とすることで肺胞上皮前駆細胞を認識し、抽出できることが確認された。
＜３次元培養＞
上述のＳＦＴＰＣ−ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ２０１Ｂ７におけるＳｔｅｐ３終了後に得られた細胞をＭＡＣＳにて抽出したＣＰＭ陽性細胞２×１０４個を、２×１０６個のヒト胎児由来の肺線維芽細胞（ＤＶ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ：ＰＰ００２−Ｆ−１３４９）と共に、マトリゲルと５０ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．１ｍＭ  ８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、０．１ｍＭ  ＩＢＭＸおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦを含有する基礎培地３を１：１で混合した培地を４００μｌを加えた１２ｗｅｌｌのＣｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｓｅｒｔｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に移し、下層には、１０μＭ  Ｙ−２７６３２、５０ｎＭ  Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、０．１ｍＭ  ８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ、０．１ｍＭ  ＩＢＭＸおよび１０ｎｇ／ｍｌ  ＫＧＦを含有する基礎培地３を加えてスフェロイド（細胞塊）を形成し、１０日から１２日間培養した（図１３）。得られたスフェロイドを透過電子顕微鏡で調べたところ、層状体様構造を有する細胞群となっていることが確認された（図１４Ａ）。
さらに、ヘマトキシリン−エオシン染色をおこなったところ、淡い色の細胞質を有するＣＰＭ（−）細胞由来のスフェロイドに比べ、ＣＰＭ（＋）細胞由来のスフェロイドではダークピンク色に染まる細胞質を有するシスト状（嚢胞状）の偽層状、円柱状、または立方状の細胞が観察された（図１５Ａ）。これらの細胞は、ＮＫＸ２−１とＣＰＭの両陽性細胞であり、さらにＳＦＴＰＣ陽性である細胞を含有していた（図１５Ｂ）。このとき、Ｉ型肺胞上皮細胞マーカーであるＡＱＰ５の陽性細胞は、ＳＦＴＰＣ陽性細胞と隣り合って存在することが確認された。
肺胞上皮細胞マーカーの発現を調べたところ、ＳＦＴＰＡ、ＳＦＴＰＢ、ＳＦＴＰＣおよびＳＦＴＰＤが、ＣＰＭとＮＫＸ２−１陽性細胞において陽性であることが確認された（図１６）。これらの遺伝子は、定量ＰＣＲにおいても３次元培養することでその発現が高くなることが確認された。さらに、いくつかのスフェロイド中のＣＰＭおよびＮＫＸ２−１の陽性細胞には、末梢気道誘導の指標であるＳＯＸ９およびＩＤ２を発現しているものも見受けられた（図１６）。
また、ＰＤＰＮおよびＣＡＶ１は、スフェロイド周辺に存在する線維芽様細胞で陽性であった（ａｒｒｏｗｓ）が、スフェロイドにも発現していた（ａｒｒｏｗｈｅａｄｓ）（図１７）。
以上より、肺胞上皮細胞は、ＣＰＭ陽性細胞から誘導できることが見出され、ＣＰＭは肺胞上皮細胞の前駆細胞のマーカーとして有用であることが示された。さらに、得られたＣＰＭ陽性細胞は、ヒト胎児由来の肺線維芽細胞との３次元共培養によって、成熟した肺胞上皮細胞へと誘導できることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００８】
本発明に示す方法により、多能性幹細胞から肺胞上皮前駆細胞を製造することが可能となる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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