(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合し中和することができる単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、
Ｓ３０Ａ、Ｓ３０Ｈ、Ｓ３０Ｗ、Ｅ７４Ａ、Ｅ７４Ｃ、Ｅ７４Ｄ、Ｅ７４Ｆ、Ｅ７４Ｇ、Ｅ７４Ｈ、Ｅ７４Ｌ、Ｅ７４Ｐ、Ｅ７４Ｑ、Ｅ７４Ｒ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｅ７４ＷおよびＥ７４Ｙからなる群から選択される置換を有する、配列番号１の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；および
配列番号２の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン
を含む、上記単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
抗体はさらにヒトＩｇＧ定常領域を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
ＩｇＧ定常領域はヒトＩｇＧ４定常領域である、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
抗体はさらにヒトκ定常領域を含む、請求項３に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
ヒトＩｇＧ４定常領域は配列番号３の配列を含み、ヒトκ定常領域は配列番号４の配列を含む、請求項４に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ｓｃＦｖまたはジ−ｓ
ｃＦｖである、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
【請求項８】
ヒトＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合し中和することができる単離抗体
またはその抗原結合フラグメントの重鎖および軽鎖の両方をコードする単離核酸であって、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、
Ｓ３０Ａ、Ｓ３０Ｈ、Ｓ３０Ｗ、Ｅ７４Ａ、Ｅ７４Ｃ、Ｅ７４Ｄ、Ｅ７４Ｆ、Ｅ７４Ｇ、Ｅ７４Ｈ、Ｅ７４Ｌ、Ｅ７４Ｐ、Ｅ７４Ｑ、Ｅ７４Ｒ、Ｅ７４Ｓ、Ｅ７４Ｔ、Ｅ７４ＷおよびＥ７４Ｙからなる群から選択される置換を有する、配列番号１の配列を含む可変重鎖（ＶＨ）ドメイン；および
配列番号２の配列を含む可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン
を含む、上記単離核酸。
【請求項９】
請求項８に記載の単離核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントを製造するための方法であって、前記方法は、
抗体またはその抗原結合フラグメントのそれぞれの重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供すること；および
前記核酸配列の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養すること
を含む、上記方法。
【請求項１２】
ＴＧＦβ１、β２およびβ３の１つまたはそれ以上を阻害することが必要な患者の治療のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントの使用。
【請求項１３】
患者は、線維性疾患、癌、または免疫介在性疾患を有している、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
患者は、腎不全を有している、請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
患者は、巣状分節性糸球体硬化症を有している、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
患者は、特発性肺線維症を有している、請求項１２に記載の使用。
【請求項１７】
患者は、全身性硬化症を有している、請求項１２に記載の使用。
【請求項１８】
ＴＧＦβ１、β２およびβ３の１つまたはそれ以上を阻害することが必要な患者の治療のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
患者は、線維性疾患、癌、または免疫介在性疾患を有している、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
患者は、腎不全を有している、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
患者は、巣状分節性糸球体硬化症を有している、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
患者は、特発性肺線維症を有している、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
患者は、全身性硬化症を有している、請求項１８に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されており、その全体が参照によって組み入れられる配列表を含む。２０１４年３月７日に作成した前記ＡＳＣＩＩコピーを２０９２６２−０００１−００−ＷＯ−（５０９７３５）＿ＳＬ．ｔｘｔと命名し、そのサイズは１０，３３５バイトである。
【０００２】
抗体またはその抗原結合フラグメントが、形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）に結合するように改変される。抗体またはそのフラグメントを含む組成物、およびＴＧＦβ活性に関わる疾患を処置するために該組成物を使用する方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
多くの重症疾患は、ＴＧＦβにより誘発されるシグナル伝達経路の機能不全と関連している。ＴＧＦβの組織内レベルの増加は、例えば突発性の肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）および心筋線維症の進行の要因であると考えられている。更に、ＴＧＦβの高い局所的な組織内レベルにより、いくつかの種類の癌細胞が維持されるおよび増悪になる可能性がある。従って、ＴＧＦβシグナル伝達の下方制御により、そのような腫瘍細胞の生存率を低下させることができる。
【０００４】
ＴＧＦβアイソフォームは、２個の単量体がジスルフィド架橋により共有結合で連結されている類似の構造フレームワークを有する〜２５ｋＤａのホモ二量体分子である。哺乳類のアイソフォームは７０〜８２％の配列同一性を共有するが、血管の発達および免疫細胞の機能の制御での重複しない活性を有する。ヒトには、下記の３種のＴＧＦβアイソフォーム：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３（それぞれのＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１１３７、Ｐ０８１１２およびＰ１０６００）が存在する。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３は、Ｉ型ＴＧＦβ受容体およびＩＩ型ＴＧＦβ受容体として知られている２種の膜貫通受容体の細胞外ドメインへの結合時に細胞内シグナル伝達カスケードを引き起こす。ＴＧＦβ２の結合も、Ｉ型ＴＧＦβ受容体およびＩＩ型ＴＧＦβ受容体に、更にＩＩＩ型ＴＧＦβ受容体にも影響を及ぼすと考えられる。
【０００５】
ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３に結合することができる抗体分子が作製されている（例えばＧｅｎｚｙｍｅに対する特許文献１）。例えば非特許文献１には、悪性腫瘍および線維性疾患を処置するための臨床開発における、ヒトＩｇ４モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるＧＣ１００８が開示されている。ＧＣ１００８は３種全てのヒトＴＧＦβアイソフォームを中和することができることから、ＧＣ１００８は「汎特異的な（ｐａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）」ＴＧＦβ中和抗体である。ＧＣ１００８は、類似の親和性でヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３に結合する。ＧＣ１００８により認識されるＴＧＦβエピトープはＩ型ＴＧＦβ受容体およびＩＩ型ＴＧＦβ受容体用のＴＧＦβ結合部位と重複しており、このことがＧＣ１００８の中和能力の基礎となると考えられる。Ｇｒｕｔｔｅｒらは、３．１Åの解像度で、ＴＧＦβ３との複合体におけるＧＣ１００８のＦａｂフラグメントの３次元構造を開示する。複合体は、２個のＧＣ１００８のＦａｂフラグメントに挟まれているＴＧＦβ３ホモ二量体から成る。インターネット上でｐｒｏｔｅｏｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／３ｅｏ０（最終更新２０１２年１０月２０日）にある非特許文献２；およびインターネット上でｐｒｏｔｅｏｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ／３ｅｏ１（最終更新２０１２年１０月２０日）にある非特許文献３も参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第７，７２３，４８６号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｒｕｔｔｅｒら（２００８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０５（５１）：２０２５１〜５６頁
【非特許文献２】Ｐｒｏｔｅｏｐｅｄｉａ  ｅｎｔｒｙ  ３ｅｏ０、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＧＣ−１００８」
【非特許文献３】Ｐｒｏｔｅｏｐｅｄｉａ  ｅｎｔｒｙ  ３ｅｏ１、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆａｂ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＧＣ−１００８  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ−Ｂｅｔａ  ３」
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ＴＧＦβ結合抗体またはその抗原結合フラグメントが開示されている。ＴＧＦβ結合抗体またはその抗原結合フラグメントは、全てのＴＧＦβアイソフォーム（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）に汎特異的であってもよい。そのような抗体またはその抗原結合フラグメントは、全てのＴＧＦβアイソフォームを中和することができる。その代わりに、またはそれに加えて、ＴＧＦβ結合抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３と比較してヒトＴＧＦβ１に選択的に結合することができるか、またはヒトＴＧＦβ１およびヒトＴＧＦβ２と比較してヒトＴＧＦβ３に選択的に結合することができる。ＴＧＦβアイソフォーム特異的アンタゴニストが示す副作用はより低い可能性がある。本明細書ではＧＣ１００８（Ｆａｂ）である、ＴＧＦβ２に結合しているＧＣ１００８モノクローナル抗体の組み換えＦａｂフラグメントの共結晶構造により、加えて本明細書ではＧＣ１００９またはＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）として知られるＴＧＦβ１に結合しているＧＣ１００８のｓｃＦｖバージョンの別の共結晶構造により、抗体またはその抗原結合フラグメントの設計が容易になる。
【０００９】
単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＧＦβのパラトープ残基および非パラトープ（ｎｏｎ−ｐａｒａｔｏｐｅ  ｒｅｓｉｄｕｅ）残基を有するＰＥＴ１０７３Ｇ１２可変重鎖（ＶＨ）ドメイン（配列番号１）ならびにＴＧＦβ１のパラトープ残基および非パラトープ残基を有するＰＥＴ１０７３Ｇ１２可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン（配列番号２）のバリアントを含むことができ、
ＶＨドメインは、パラトープ残基の２０個以下の置換および非パラトープ残基の２０個以下の置換を含み、
ＶＬドメインは、パラトープ残基の２０個以下の置換および非パラトープ残基の２０個以下の置換を含み、
前記抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）に結合することができる。
【００１０】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３を含む、ヒトＴＧＦβの３種全てのアイソフォームに結合することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８（Ｆａｂ）またはＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）と比較して２倍の、２．４倍の、３倍の、５倍の、１０倍の親和性またはそれより高い親和性でヒトＴＧＦβの３種全てのアイソフォームに結合することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｙ２７残基、Ｓ３０残基、Ｓ３１残基、Ｎ３２残基、Ｉ５２残基、Ｉ５４残基、Ｖ５５残基、Ｄ５６残基、Ｎ５９残基、Ｅ７４残基および／またはＧ１０１残基の置換を含むことができる。Ｙ２７は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＴｒｐに置換されていてもよい。Ｓ３０は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｙｒまたはＴｒｐに置換されていてもよい。Ｓ３１は、Ａｌａ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＴｒｐに置換されていてもよい。Ｎ３２は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐまたはＴｙｒに置換されていてもよい。Ｉ５２は、Ｖａｌに置換されていてもよい。Ｉ５４は、Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、ＶａｌまたはＴｒｐに置換されていてもよい。Ｖ５５は、ＰｈｅまたはＧｌｙに置換されていてもよい。Ｄ５６は、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｙｒまたはＶａｌに置換されていてもよい。Ｎ５９は、ＡｒｇまたはＴｙｒに置換されていてもよい。Ｅ７４は、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＴｒｐまたはＴｙｒに置換されていてもよい。Ｇ１０１は、Ｔｙｒに置換されていてもよい。ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、パラトープ残基の１９個以下の置換を含むことができる。好ましくは、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、パラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。パラトープ置換は、表５に記載の置換から選択されてもよい。ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、非パラトープ残基の１８個以下の置換を含むことができる。好ましくは、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、非パラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。
【００１１】
あるいは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３と比較してヒトＴＧＦβ１に選択的に結合することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８（Ｆａｂ）またはＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）と比べて２倍の、２．４倍の、３倍の、５倍の、１０倍の親和性またはそれより高い親和性でＴＧＦβ１に選択的に結合することができる。ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、パラトープ残基の２０個以下の置換を、好ましくはパラトープ残基の１９個以下の置換を、より好ましくはパラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。パラトープ置換は、表５に記載の置換から選択されてもよい。ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、非パラトープ残基の２０個以下の置換を、好ましくは非パラトープ残基の１８個以下の置換を、より好ましくは非パラトープ残基の１２個以下の残基を含むことができる。
【００１２】
あるいは、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ１およびヒトＴＧＦβ２と比較してヒトＴＧＦβ３に選択的に結合することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８（Ｆａｂ）またはＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）と比べて２倍の、２．４倍の、３倍の、５倍の、１０倍の親和性またはそれより高い親和性でＴＧＦβ３に選択的に結合することができる。ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、パラトープ残基の２０個以下の置換を、好ましくはパラトープ残基の１９個以下の置換を、より好ましくはパラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。パラトープ置換は、表５に記載の置換から選択されてもよい。ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、非パラトープ残基の２０個以下の置換を、好ましくは非パラトープ残基の１８個以下の置換を、より好ましくは非パラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。
【００１３】
上記いずれの場合においても、抗体は、例えばＧＣ１００８モノクローナル抗体のバリアントであるＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ４抗体であってもよい。この抗体の抗原結合フラグメントは、例えばＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）のバリアントであるｓｃＦｖまたはジ−ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）であってもよい。あるいは、ＶＨドメインは、ヒト重鎖定常ドメイン、例えばＩｇＧ１定常ドメイン、ＩｇＧ２定常ドメインまたはＩｇＧ４定常ドメインを更に含むことができ、ＶＬドメインは、ヒト軽鎖定常ドメイン、例えばκ軽鎖定常ドメインを更に含むことができる。重鎖定常ドメインは配列番号３に記載の配列を有するができ、軽鎖定常ドメインは配列番号４に記載の配列を有することができる。この実施形態では、抗原結合フラグメントは、例えばＧＣ１００８（Ｆａｂ）のバリアントであるＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２であってもよい。
【００１４】
単離核酸は、抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。この単離核酸はｃＤＮＡであってもよい。宿主細胞は単離核酸を含むことができる。抗体またはその抗原結合フラグメントを製造する方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するのに好適な条件下で宿主細胞を培養することを含むことができる。この方法により産生した抗体またはその抗原結合フラグメントを精製することができる。
【００１５】
組成物は、上述した抗体またはその抗原結合フラグメントの内の１種を含むことができる。この組成物は医薬組成物であってもよい。この医薬組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を含むことができる。この組成物は、１種またはそれ以上の生物学的な活性な成分を更に含むことができる。
【００１６】
ヒトにおいてＴＧＦβ活性に直接的または間接的に起因する疾患または状態を処置する方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量を含む医薬組成物を投与することを含むことができる。この疾患または状態を、線維性疾患、癌または免疫介在性疾患から成る群から選択することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントを、線維性疾患、癌または免疫介在性疾患から成る群から選択される疾患または障害を処置するための薬剤の製造で使用することができる。この疾患または障害の処置は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３を中和することを含むことができる。この疾患または障害の処置は、ＴＧＦβ１シグナル伝達、ＴＧＦβ２シグナル伝達および／またはＴＧＦβ３シグナル伝達を阻害することを含むことができる。この疾患または障害の処置は、ＴＧＦβ１介在性の、ＴＧＦβ２介在性のおよび／またはＴＧＦβ３介在性の、フィブロネクチン産生、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）産生、上皮細胞増殖、内皮細胞増殖、平滑筋細胞増殖または免疫抑制を阻害することを含むことができる。この疾患または障害の処置は、ナチュラルキラー細胞の活性を高めることを含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＧＣ１００８（Ｆａｂ）とヒトＴＧＦβ２（配列番号６）との共結晶構造を示す図である。
【図２】ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）とヒトＴＧＦβ１（配列番号５）との共結晶構造を示す図である。
【図３】ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）ＶＨドメイン（配列番号１）とヒトＴＧＦβ１（配列番号５）との共結晶構造の一部を示す図である。
【図４】ＧＣ１００８（Ｆａｂ）ＶＨドメイン（配列番号１）とヒトＴＧＦβ３（配列番号７）との共結晶構造の一部を示す図である。
【図５】ＧＣ１００８（Ｆａｂ）とヒトＴＧＦβとの共結晶構造の一部を示す図である。表７のヒートマップ分析を、重鎖（配列番号１）の残基Ｙ２７、Ｓ３０、Ｓ３１、Ｎ３２、Ｉ５２、Ｐ５３、Ｉ５４、Ｖ５５、Ｄ５６、Ｎ５９、Ｅ７４、Ｇ１０１、Ｖ１０３およびＬ１０４ならびに軽鎖（配列番号２）の残基Ａ９３に関して視覚化している。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本ＴＧＦβ結合抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８抗体の改変ＶＨドメインを含むバリアントであり、このバリアントは、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン（それぞれ配列番号１および配列番号２）のアミノ酸置換を含む。例えば、ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８抗体で観測したヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）への結合と同等のまたは該結合よりも向上したヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）への結合を付与するアミノ酸置換を有するＶＨドメインを含むことができる。ＴＧＦβアイソフォーム選択的抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３と比較してヒトＴＧＦβ１に選択的に結合することができる、またはヒトＴＧＦβ１およびヒトＴＧＦβ２と比較してヒトＴＧＦβ３に選択的に結合することができる。ＶＨドメイン（配列番号１）を含む抗体またはその抗原結合フラグメントの１個またはそれ以上のアミノ酸を置換することにより、選択的結合を実現することができる。
【００１９】
「選択的に結合する」とは、抗体またはその抗原結合フラグメントが、（ｉ）ＧＣ１００８抗体の未改変ＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントと比べて高い親和性でヒトＴＧＦβの特定のアイソフォームに結合することができること、および／または（ｉｉ）ＧＣ１００８抗体の未改変ＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントと比べて低い親和性でその他のＴＧＦβアイソフォームに結合することができることを意味する。例えば、ＴＧＦβ１アイソフォームに選択的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８（Ｆａｂ）またはＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）と比べて高い親和性で、例えば２倍高い、３倍高い、５倍高い、１０倍高い親和性またはそれ以上高い親和性でＴＧＦβ１に結合することができる。その代わりに、またはそれに加えて、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８（Ｆａｂ）またはＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）と比べて低い親和性で、例えば２倍低い、３倍低い、５倍低い、１０倍低いまたはそれ以上低い親和性でＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に結合することができる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、第１の要素「および／または」第２の要素とは、第１の要素単独のまたは第２の要素単独の具体的な開示を意味する、または第１の要素と第２の要素との組み合わせの具体的な開示を意味する。単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示している場合を除き複数の指示対象を含む。
【００２１】
抗体またはその抗原結合フラグメント
ＧＣ１００８抗体の改変ＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントとして、全抗体、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４等のＩｇＧまたはその抗原結合フラグメント、例えばＦ（ａｂ’）2ポリペプチド、ｓｃＦｖポリペプチド、ＦａｂポリペプチドもしくはｄＡｂポリペプチドが挙げられるがこれらに限定されない。一価の抗原結合フラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびジ−ｓｃＦｖを挙げることができ、ジ−ｓｃＦｖは、ペプチドリンカーで連結されている２個のｓｃＦｖ分子である。抗原結合フラグメントは、例えばＴＧＦβと別の抗原とを対象とする多価であってもよい。多価フラグメントとしてＦ（ａｂ’）2およびジ−ｓｃＦｖが挙げられ、ジ−ｓｃＦｖでは、２個のｓｃＦｖ成分が、別々の抗原を対象とする異なる可変ドメインから構成されている。本抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば改変ＧＣ１００８（全ヒトＩｇＧ４抗体）であってもよく、改変ＧＣ１００８（Ｆａｂ）（ＧＣ１００８のＦａｂフラグメント）であってもよく、または改変ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）（ＧＣ１００８のｓｃＦｖバージョン）であってもよい。ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）は、ペプチドリンカーで連結されているヒト重鎖ＰＥＴ１０７３Ｇ１２  ＶＨドメイン（配列番号１）およびヒト軽鎖ＰＥＴ１０７３Ｇ１２  ＶＬドメイン（配列番号２）を含む、組み換えにより産生された抗原結合フラグメントであり、このペプチドリンカーにより、２個のドメインが会合して抗原結合部位になることができる。ＧＣ１００８およびＧＣ１００９は、米国特許第７，７２３，４８６号明細書およびＧｒｕｔｔｅｒ（２００８）に更に詳細に開示されている。ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列を下記に記載し、この配列において、（Ｇｌｙ4／Ｓｅｒ）nモチーフのペプチドリンカー（配列番号１０）を太字で表すとともにイタリック体で表し、シグナルペプチドを灰色で強調表示する。
【化１】
0006495884.tif 000002
【００２２】
「改変」可変ドメインまたは「バリアント」可変ドメインは、参照配列と比較してアミノ酸置換を含む。例えば、「ＧＣ１００８抗体のバリアントＶＨドメイン」は、アミノ酸配列が配列番号１に記載されているＰＥＴ１０７３Ｇ１２のＶＨドメインと比較してアミノ酸置換を含むことができる。
【００２３】
ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、パラトープ残基の２０個以下の置換を、好ましくはパラトープ残基の１９個以下の置換を、より好ましくはパラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。例えば、２種のドメインの内の一方はパラトープ残基の置換を含むことができるが他方のドメインは改変されていない、または、両方のドメインがパラトープ残基の置換を含むことができる。パラトープ置換は、表５に記載の置換から選択されてもよい。パラトープの置換は、改変された抗体または抗原結合フラグメントのＴＧＦβアイソフォームへの選択的結合をもたらすことができ、またはパラトープの置換は、抗体または抗原結合フラグメントのＴＧＦβアイソフォームへの汎特異的な結合を保存することができる。両方のタイプのパラトープ置換を行うこともできる。例えば、パラトープ置換により、抗体または抗原結合フラグメントがＴＧＦβアイソフォームに選択的に結合することができ、同時に、汎特異的な結合を保持する別のパラトープ置換が行われて抗体また抗原結合フラグメントが脱免疫化（ｄｅ−ｉｍｍｕｎｉｚｅ）される。脱免疫化を、例えばＨａｒｄｉｎｇら（２０１０）ｍＡｂｓ  ２：２５６〜２６５頁の方法に従って実施することができる。
【００２４】
その代わりに、またはそれに加えて、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインは、非パラトープ残基の２０個以下の置換を、好ましくは非パラトープ残基の１８個以下の置換を、より好ましくは非パラトープ残基の１２個以下の置換を含むことができる。様々な理由で、例えば抗原結合フラグメントの耐熱性を高めるために、酸化もしくは脱アミドの影響を受けやすいアミノ酸残基を除去するために、例えば薬剤もしくはＰＥＧ分子に容易に共役され得るアミノ酸を追加するために、または潜在的なカルボキシル化部位を除去するために、非パラトープ残基を置換することができる。
【００２５】
改変はアミノ酸欠失を含むこともできる。例えば、１個または２個の非パラトープアミノ酸を、バリアントＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインから欠失させることができる。アミノ酸を、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインのカルボキシル末端またはアミノ末端から欠失させることができる。
【００２６】
本抗体またはその抗原結合フラグメントの可変ドメインは３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、各相補性決定領域はフレームワーク領域（ＦＷ）に挟まれている。例えば、ＶＨドメインは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３である３個の重鎖ＣＤＲのセットを含むことができる。ＶＬドメインは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３である３個の軽鎖ＣＤＲのセットを含むことができる。本明細書に開示するＨＣＤＲのセットを、ＶＬドメインと組み合わせて使用するＶＨドメイン中に設けることができる。ＶＨドメインに、本明細書に開示するＨＣＤＲのセットを設けることができ、そのようなＶＨドメインがＶＬドメインと対をなす場合には、ＶＬドメインに、本明細書に開示するＬＣＤＲのセットを設けることができる。本明細書では、免疫グロブリンの可変ドメインのＣＤＲ領域およびＦＷ領域の構造および位置を、Ｋａｂａｔら（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓを参照して決定する。
【００２７】
本抗体またはその抗原結合フラグメントは、「パラトープ」アミノ酸残基と「非パラトープ」アミノ酸残基とを含有する。本抗体またはその抗原結合フラグメントの「パラトープ」アミノ酸は、ヒトＴＧＦβアイソフォームの４Åの原子核（ａｔｏｍｉｃ  ｎｕｃｌｅｕｓ）内に原子核を有する。各ヒトＴＧＦβアイソフォームが本抗体またはその抗原結合フラグメントと構造的に異なる複合体を形成することから、パラトープ残基は各アイソフォームで異なることができる。例えば、「ヒトＴＧＦβ１パラトープ残基」は、ヒトＴＧＦβ１の４Åの原子核内に原子核を有する。表３は、ヒトＴＧＦβ１アイソフォーム、ヒトＴＧＦβ２アイソフォームおよびヒトＴＧＦβ３アイソフォームそれぞれに関する本抗体またはその抗原結合フラグメントのパラトープ残基を示す。「ＴＧＦβパラトープ」残基は、３種全てのヒトＴＧＦβアイソフォームの４Åの原子核内に原子核を有する。
【００２８】
Ｋａｂａｔ命名法により定義されるように、残基は、ＣＤＲ領域内のまたはＦＷ内の位置に関わらずパラトープ残基と称される。例えば表４に示すように、多くのパラトープ残基はＣＤＲ領域内に位置する。しかしながら、いくつかのパラトープ残基はＦＷ領域内に位置する。「非パラトープ」アミノ酸は、残基がＣＤＲ領域中に位置するかまたはＦＷ領域中に位置するかに関わらず、「パラトープ」アミノ酸ではない、抗体またはその抗原結合フラグメントの任意のアミノ酸である。
【００２９】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、様々なヒト生殖細胞系列から選択される重鎖アミノ酸置換および軽鎖アミノ酸置換を含むことができる。例えば、組み換えＤＮＡ技法を使用して、ＣＤＲを欠く可変ドメインのレパートリー中にＨＣＤＲのセットを導入することができる。生殖細胞系列フレームワークは、ＶＨ−１ファミリ由来のヒトＤＰ−１０（ＶＨ１−６９）生殖細胞系列またはヒトＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）に由来する重鎖配列を含む。軽鎖配列は、ヒトＶκ３ファミリ、例えばヒトＤＰＫ−２２（Ａ２７）に由来することができる。ヒト生殖細胞系列の可変ドメインのアミノ酸配列は、例えばＶＢＡＳＥ２によりｖｂａｓｅ２．ｏｒｇ／ｖｂｓｔａｔ．ｐｈｐでインターネット上に開示されている。例えば、ＰＥＴ１０７３Ｇ１２抗体、ＰＥＴ１０７４Ｂ９抗体またはＰＥＴ１２８７Ａ１０抗体の場合には、ＨＣＤＲのセットおよびＬＣＤＲのセットが一緒に対をなすことができる。そのため、抗体は、例えば改変されたＰＥＴ１０７３Ｇ１２  ＶＨドメインおよび／またはＰＥＴ１０７３Ｇ１２  ＶＬドメインを含むＩｇＧ４抗体分子であってもよい。ＨＣＤＲセットおよびＬＣＤＲセットを含む、ＰＥＴ１０７３Ｇ１２ドメイン、ＰＥＴ１０７４Ｂ９ドメインまたはＰＥＴ１２８７Ａ１０ドメインのアミノ酸配列は、米国特許第７，７２３，４８６号に開示されている。
【００３０】
抗原結合フラグメントは、抗体の定常領域またはその一部を更に含むことができる。例えば、ＶＬドメインをそのＣ末端で、ヒトＣκ鎖またはヒトＣλ鎖を含む抗体の軽鎖定常領域に結合させることができる。同様に、ＶＨドメインを含む抗体またはその抗原結合フラグメントはそのＣ末端で、あらゆる抗体のアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭに由来する免疫グロブリンの重鎖（例えばＣＨ１ドメイン）の全てもしくは一部またはアイソタイプのサブクラス、特にＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の内のいずれかを更に含むことができる。ＩｇＧ４があらゆる用途に好ましい。なぜならばＩｇＧ４は補体に結合せず、エフェクター機能を生じさせないからである。エフェクター機能が望ましい場合にはＩｇＧ１が好ましい。全ての場合において、抗体の定常領域およびその一部はヒト配列であってもよい。
【００３１】
抗体の定常領域に対する改変を行って、抗体またはその抗原結合フラグメントの様々な特性を改善することができる。例えば、組み換えアミノ酸改変を使用して、発現させたポリペプチドの構造上の均一性を低下させることができる。代表例はＰｅｔｅｒｓら（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７（２９）：２４５２５〜３３頁であり、これには、ジスルフィド結合の不均一性を低下させるおよびＦａｂドメインの熱安定性を高める、ＩｇＧ４ヒンジ領域におけるＣｙｓからＳｅｒへの置換が開示されている。同様に、Ｚｈａｎｇら（２０１０）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８２：１０９０〜９９頁には、ジスルフィド結合のランダムな形成（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）を制限するためのＩｇＧ２ヒンジ領域の改変および治療用途の構造異性体の形成が開示されている。ＣＨ３ドメインのアミノ酸改変を使用して、カルボキシ末端のＬｙｓ残基を欠失させて電荷を有するバリアントの数を低減させることもできる。アミノ酸改変を使用して、組み換え抗体またはその抗原結合フラグメントの薬理機能を改善することもできる。例えば、抗体または抗原結合フラグメントがＦｃ領域を含む場合には、アミノ酸改変を使用して補体活性化を高めることもできる、ＦｃγＲＩＩＩＡ結合を高めることによりもしくはＦｃγＲＩＩＩＢ結合を弱めることにより抗体依存性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）を増強するもできる、および／またはＦｃＲｎ結合を高めることにより血清半減期を増加させることもできる。そのようなアミノ酸改変は、例えばＢｅｃｋら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  １０：３４５〜５２頁に概説されている。
【００３２】
下記の表１は、未改変のＰＥＴ１０７３Ｇ１２  ＶＨドメインのアミノ酸配列（配列番号１）；ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列（配列番号３）；ＰＥＴ１０７３Ｇ１２  ＶＬドメインのアミノ酸配列（配列番号２）；およびＣκドメインのアミノ酸配列（配列番号４）を示し、これらはＧＣ１００８（Ｆａｂ）中に存在する。様々なＣＤＲ領域およびフレームワーク（ＦＷ）領域を標識し；ＣＤＲ残基も強調表示する。
【００３３】
【表１】
0006495884.tif 000003
【００３４】
抗体またはその抗原結合フラグメントはヒトＴＧＦβに単一特異的であってもよく、または二重特異性であってもよい。例えばＨｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４、４４６〜４４９頁に開示されているように、二重特異性抗体またはその抗原結合フラグメントを様々な方法で製造することができる。二重特異性抗体の例として、特異性が異なる２種の抗体の結合ドメインを使用することができるおよび短くて柔軟なペプチドを介して直接連結させることができる、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤｖＤ−ＩｇＧ）技法またはＢｉＴＥ（商標）技法のものが挙げられる。
【００３５】
組み換えにより改変されたＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン
本抗体またはその抗原結合の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインを組み換えにより改変して、生殖細胞系列配列由来のアミノ酸配列を変更することができる。例えば、重鎖ＣＤＲセットにおけるＣＤＲの内の１個もしくはそれ以上を改変してもよいし、軽鎖ＣＤＲセットの内の１個もしくはそれ以上のＣＤＲを改変してもよいし、ならびに／またはＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインにおけるフレームワーク領域の内の１個を改変してもよい。パラトープアミノ酸に対して、例えばＴＧＦβアイソフォームに対する結合親和性を強化もしくは弱化する置換を行うことができる、または置換されても結合親和性は比較的未変化のままであってもよい。非パラトープアミノ酸残基に対してその他の置換を行い、抗体またはその抗原結合フラグメントに様々な特性、例えば安定性の向上または共有結合により改変することができるドメイン表面の反応基の導入を付与することができる。従って、本明細書において、本抗体またはその抗原結合フラグメントのＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインに対するアミノ酸置換の下記の４つのカテゴリー：（１）ヒトＴＧＦβアイソフォームへの選択的結合を付与する置換；（２）３種全てのヒトＴＧＦβアイソフォームへの汎特異的な結合を維持する置換；（３）非パラトープアミノ酸に対する置換；および（４）多重アミノ酸置換が意図される。これらのカテゴリーのアミノ酸置換は互いに排他的ではない。
【００３６】
１．選択的結合を付与する置換
ＴＧＦβアイソフォーム選択的抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨドメイン（配列番号１）内にアミノ酸置換を含むことができる。例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトＴＧＦβ２およびヒトＴＧＦβ３と比較してヒトＴＧＦβ１に選択的に結合することができる、またはヒトＴＧＦβ１およびヒトＴＧＦβ２と比較してヒトＴＧＦβ３に選択的に結合することができる。１個またはそれ以上のパラトープアミノ酸を置換することにより、選択的結合を実現することができる。
【００３７】
アミノ酸置換が抗体またはその抗原結合フラグメントのＴＧＦβアイソフォームと相互作用する能力にどの程度影響を及ぼすことができるかの予測は、各ＴＧＦβアイソフォームとの共結晶構造によって容易になる。ＧＣ１００８（Ｆａｂ）とＴＧＦβ３との共結晶構造はＧｒｕｔｔｅｒ（２００８）に開示されている。ＧＣ１００８（Ｆａｂ）とＴＧＦβ２との共結晶構造を図１に示す。ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）とＴＧＦβ１との共結晶構造を図２に示す。
【００３８】
表２は、ヒトＴＧＦβ１アイソフォーム、ヒトＴＧＦβ２アイソフォームおよびヒトＴＧＦβ３アイソフォームのアミノ酸配列を示す。共結晶構造の比較により、３種のアイソフォーム間でのパラトープの差異が明らかになる。表２において、ＧＣ１００８と相互作用する各アイソフォーム中のＴＧＦβ残基を太字で表す。
【００３９】
【表２】
0006495884.tif 000004
【００４０】
下記の表３には、各ヒトＴＧＦβアイソフォームとの共結晶構造により決定した、ＶＨドメインのパラトープ残基（配列番号１）およびＶＬドメインのパラトープ残基（配列番号２）が列挙されている。太字のＧＣ１００８パラトープ残基は、３種全てのＴＧＦβアイソフォーム間で共有される。ＴＧＦβエピトープの３個の領域を、「先端」、「疎水性パッチ」および「ヘリックス３」と命名する。配列Ｌ２８ＧＷＫＷ３２（配列番号８）を有する、ＴＧＦβの「疎水性パッチ」内の４Åの原子核内に原子核を有するＶＨドメイン残基およびＶＬドメイン残基が３種全てのアイソフォームで保存されている。しかしながら、「先端」領域および「ヘリックス３」領域と相互作用するＧＣ１００８残基は、より高い多様性を示す。３種全ての共結晶構造を比較することにより、ＧＣ１００８が向きを変え、３種全てのＴＧＦβアイソフォームに類似の親和性を適応させるようにＣＤＲループの位置および側鎖の立体構造を調節することは明らかである。図１および図２を参照されたい。例えば、Ｇｒｕｔｔｅｒ（２００８）は、ミンク肺上皮細胞（ＭＬＥＣ）増殖アッセイにおいて、ＧＣ１００８が下記の３種のアイソフォームに対して下記の類似の親和性、即ち：ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３それぞれに対して１±２ｎＭ、１４±５ｎＭおよび７±２ｎＭのＩＣ５０値を示すことを開示している。３種のＴＧＦβアイソフォームの更なる残基６７および６８は、それらのＶＨパラトープ残基Ｙ２７との相互作用が異なる。ＶＨ残基Ｙ２７は、水素結合によりＴＧＦβ１残基Ｑ６７およびＨ６８と相互作用する。対照的に、ＶＨ残基Ｙ２７は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３のＴ６７およびＹ５０と疎水的な相互作用を形成する。これにより、ＴＧＦβ２複合体およびＴＧＦβ３複合体とは対照的に、ＴＧＦβ１複合体ではＨＣＤＲ１ループの再配列が生じる。
【００４１】
【表３】
0006495884.tif 000005
【００４２】
共結晶においてＴＧＦβ３の４Åの原子核内であるＶＨドメインおよびＶＬドメインの残基を示すために、表３の情報を表４で再構成する。パラトープ残基を太字で示す。パラトープ残基の全てではないがほとんどがＨＣＤＲ内に位置する。
【００４３】
【表４】
0006495884.tif 000006
【００４４】
共結晶構造の比較により、ＶＨドメイン残基および／またはＶＬドメイン残基への置換を導いてＴＧＦβアイソフォームに対するＧＣ１００８の親和性を変更することができる。特に、アミノ酸置換は、残基が抗原と相互作用するかどうかまたはＣＤＲループを安定化させるその他のＣＤＲまたは構造要素との相互作用に関わるかどうかを考慮して、３種の結晶構造における各ＶＨ残基および／またはＶＬ残基の位置に基づくことができる。例えば、ＬＣＤＲ３上のＩ９７は、３種の構造のいずれにおいてもＴＧＦβと直接相互作用しないが、Ｉ９７は、抗体の内部に向いており、ＨＣＤＲ３のＶ１０３およびＬ１０４からも構成される疎水性ポケット中にある。Ｖ１０３およびＬ１０４はＴＧＦβ結合に重要なパラトープであることから、ＴＧＦβに対する親和性を例えば１０倍を超えて著しく変化させないのであれば、Ｉ９７の中程度のもしくは低い疎水性のまたは弱い極性の残基への置換が許容される場合がある。
【００４５】
ヘリックス３領域は、エピトープ配列において最大の多様性を示す。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２の６０位でのリジンおよびアルギニンにより、ＴＧＦβ３と比較してＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に結合しているＧＣ１００８の回転が生じる。残基６７および残基６８で、ＴＧＦβ１は、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３と同様にトレオニンおよびイソロイシン／ロイシンの代わりにグルタミンおよびヒスチジンをそれぞれ有する（図３）。Ｓ３０が疎水性残基、例えばＡ、Ｗに変異している場合には、保存されたＴＧＦβのＬ６４との更なる疎水性相互作用が好ましく、これにより３種全てのＴＧＦβに対する親和性が高められる。残基６７および残基６８でＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３と同様に上述したトレオニンおよびイソロイシン／ロイシンに起因して、この親和性の増大はＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３の場合により顕著であり、この親和性の増大は、ＴＧＦβ１のＱおよびＨよりも疎水性残基を選択する。ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２では、６０位での正電荷側鎖は、重鎖においてＥ７４とイオン相互作用する。Ｅ７４の正電荷残基への置き換えは、ＴＧＦβ１に結合するＧＣ１００８にとってあまり好ましくないが、ＴＧＦβ３は６０位でトレオニンを有するＴＧＦβ３にとっては比較的好ましい（図４）。ＴＧＦβ３のＴ６０側鎖のサイズが小さいため、重鎖上のＥ７４においてほとんどの変異が許容され得る。Ｔ６０の部分的な疎水性のために、Ｅ７４での疎水性置換はＴＧＦβ３への結合親和性を劇的に高めることもでき、ｋｄバリアント：ｋｄ野生型比の２倍を超える改善をもたらすことが多い。
【００４６】
特定のＴＧＦβアイソフォームに対する親和性がより大きいまたは１種のアイソフォームに対する選択性がその他のアイソフォームよりも高いＴＧＦβ抗体またはその抗原結合フラグメントを速やかに選択するために、表３に列挙した位置をその他の１９種のアミノ酸に無作為化することができる。このことは、当業界公知の技法を使用する、ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）ライブラリ、ＧＣ１００８ＦａｂフラグメントライブラリまたはＧＣ１００８ライブラリのインビトロ表示により実現され得る（Ｂｒａｄｂｕｒｙら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（３）：２４５〜２５４頁）。ＴＧＦβ１の結晶構造およびＴＧＦβ２の結晶構造それぞれをＧＣ１００９およびＧＣ１００８Ｆａｂに複合化させることなく、Ｇｒｕｔｔｅｒ（２００８）に開示されているＴＧＦβ３複合体構造に由来するＴＧＦβ３接触アミノ酸をベースとするこのインビトロ表示技法を使用して、ＴＧＦβ３に対してのみ親和性がより高い抗体またはその抗原結合フラグメントを同定することができる。新規のＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を、発明者らが決定したＧＣ１００９構造およびＧＣ１００８Ｆａｂ構造に複合化させることにより、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２に対する親和性がより高い抗体またたこの抗原結合フラグメントをこの表示技法により速やかに同定することもできる。更に、３種全ての構造に関する情報を有することにより、アイソフォーム選択的バリアントを同定するためにライブラリにより焦点を当てることが可能になる。例えばＴＧＦβ１に関して焦点を当てたライブラリでは、ＶＨドメイン（配列番号１）の２７位および３０位の無作為化だけを必要とすると予想される。３２２（１０２４）種の可能な変異体は、ライブラリサイズがわずか〜１０５種であるファージライブラリでカバーされると予想される。（最初の２つの位置では４種の核酸の内のいずれかであり、３番目の位置ではＧまたはＣであるＮＮＧ／Ｃの配列を有する３２種のコドンにより、２０種のアミノ酸を表すことができる）。ＴＧＦβ１の結晶構造およびＴＧＦβ２の結晶構造をＧＣ１００９／ＧＣ１００８に複合化させることなく、Ｇｒｕｔｔｅｒ（２００８）に開示されているＴＧＦβ３複合体構造に由来する１４種全てのＴＧＦβ３接触アミノ酸を無作為化する必要があると予想される。あらゆる公知のライブラリの中で最良のもの（約〜１０１１種以下を示す）であっても、３２１４（１０２１）種の多様性を有するファージライブラリは完全には表されないと予想される。そのため、本明細書に記載の構造データにより、ＴＧＦβ選択的アンタゴニストの速やかなスクリーニングおよび同定が可能となると予想される。
【００４７】
２．汎特異的な結合を維持する置換
ＴＧＦβアイソフォームに対する結合親和性を大きく変更しない置換を行うことができる。ＴＧＦβアイソフォームに対する結合親和性を「大きく変更」しない置換により、野生型の解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｄ野生型）に対するバリアントの解離速度（ｋｄバリアント）の比は２．４を超えて増加しない（即ち、ｋｄバリアント／ｋｄ野生型は２．４以下である）。この目的のために「汎特異的な結合」を示す抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）に対して少なくとも１０ｎＭ、３０ｎＭまたは１００ｎＭの見かけ上の結合定数を有することができる。当業界におけるあらゆる適切な技法、例えばＧｒｕｔｔｅｒ（２００８）に開示されているＭＬＥＣ増殖アッセイまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）結合アッセイを使用して、ＴＧＦβアイソフォームに対する親和性を測定することができる。この目的のために「汎特異的な結合」を示す抗体またはその抗原結合
フラグメントは、ＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３）に対して、野生型と比較して２．４倍以下の、３倍以下の、５倍以下のまたは１０倍以下の見かけ上の結合親和性（ｋｄバリアント：ｋｄ野生型）を有することができ、好ましくは野生型と比較して２．４倍以下の見かけ上の結合親和性（ｋｄバリアント：ｋｄ野生型）を有することができる。この置換を、ＧＣ１００８／ＧＣ１００９と３種のＴＧＦβアイソフォームとの間の３種の共結晶構造から導くことができる。Ｏｂｅｒｌｉｎら（２０１２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｍｏｄｅｌ．５２：２２０４〜２２１４頁を参照されたい。
【００４８】
ＴＧＦβへの汎特異的な結合を維持する置換は、ＴＧＦβアミノ酸残基との立体障害を生じないと予想される、または抗体もしくはこの抗原結合フラグメントの安定性への深刻な悪影響を有すると予想される。安定性への深刻な悪影響を有する置換により、局所的なアンフォールディングまたはミスフォールディングを生じさせて抗体またはその抗原結合フラグメントの凝集および不活化を促進することができる。不安定な凝集抗体またはその抗原結合フラグメントは免疫原性を誘導することができるが、これはなぜなら、患者の免疫系はそのような凝集体を外来性分子として認識できるからである。
【００４９】
汎特異的な結合を維持する置換の例は、ＬＣＤＲ１上のＲ２４である。Ｒ２４はＴＧＦβ結合部位から離れており、ＶＬドメイン表面上に露出している。この位置は、ＰｒｏおよびＣｙｓを除くほとんどの極性残基への置換を受け入れることができ、ＰｒｏおよびＣｙｓは一般的に回避される。一方、ＨＣＤＲ２上のＩ５２はＴＧＦβ上の「疎水性パッチ」（Ｌ２８ＧＷＫＷ３２（配列番号８））とほぼ疎水的に相互作用し、そのためＩ５２置換は中程度のサイズの疎水性残基に限定されており、Ｖａｌ置換の可能性があるが、より大きい疎水性残基への置換により結合複合体中に立体障害が生じる可能性がある。
【００５０】
表５には、配列番号２のＶＬドメインのアミノ酸置換の非限定的な例（表５Ａ）および配列番号１のＶＨドメインのアミノ酸置換の非限定的な例（表５Ｂ）が記載されている。場合によっては、パラトープ内のフレームワーク残基、例えばＦＷ２領域中のＶＬ残基Ｙ５０に対してアミノ酸置換を行うことができる。下記置換の内の１つまたはそれ以上を有する抗体または抗原結合フラグメントは、ＧＣ１００８／ＧＣ１００９と同様の汎特異性およびＴＧＦβに対する改善された親和性を有すると予想され、即ち、野生型と比較して２．４倍以下の、３倍以下の、５倍以下のまたは１０倍以下の結合親和性（ｋｄバリアント：ｋｄ野生型）で全てのＴＧＦβアイソフォームに結合すると予想される。
【００５１】
【表５】
0006495884.tif 000007
【００５２】
【表６】
0006495884.tif 000008
【００５３】
【表７】
0006495884.tif 000009
【００５４】
３．非パラトープのアミノ酸残基の置換。
非パラトープのアミノ酸を組み換えにより置換して、生殖細胞系の可変ドメインと比較して同様のまたは変更された特性を有する可変軽ドメインまたは可変重ドメインを作ることができる。「改変された」可変ドメインはアミノ酸欠失も含み、更に置換も含む。例えば、改変された可変ドメインにおいて、Ｎ末端のまたはＣ末端のアミノ酸置換を欠失させることができる。
【００５５】
非パラトープのアミノ酸置換を行って、例えば安定性を高めたり、および／または凝集する傾向を低下させたりすることができる。乏しい安定性により、抗原結合フラグメントの例えば組み換えにより発現させた場合に適切に折り重なる能力が影響を受けて、発現されたフラグメントの一部が機能しなくなる可能性がある。安定性が低い抗体またはその抗原結合フラグメントは、潜在的に免疫原性の凝集体を形成しやすい可能性もある、または親和性もしくは保存可能期間が低下している可能性もある。ｓｃＦｖポリペプチドは特に、細菌の発現系および哺乳類の発現系の両方において、安定性、溶解性、発現、凝集、分解産物および全体的な製造可能性に関する問題を示す可能性がある。例えばＷＯ２００７／１０９２５４号には、例えばｓｃＦｖポリペプチドにおけるＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインの安定性を高めるならびに／または該ドメインの凝集の傾向を低下させると予想されるフレームワークのアミノ酸置換が開示されている。本ＶＨドメインおよびＶＬドメインにおける対応する残基の置換も同様に、安定性を高めるおよび／または凝集する傾向を低下させると予想される。
【００５６】
許容され得る置換は、配列番号１または配列番号２の非パラトープのアミノ酸を、別のヒトＶＨドメインのまたはヒトＶＬドメインの生殖細胞系配列中に生じる、対応するアミノ酸に置き換えると予想される置換を含むと予想される。現在、約４０種の可変カッパ生殖細胞系配列および約３０種の可変ラムダ生殖細胞系配列と同様に、当業界では約４０種の可変重生殖細胞系配列が知られている。非パラトープのアミノ酸の、これらの生殖細胞系配列の内のいずれかで生じるアミノ酸への置換は許容されると予想される。例えば、配列番号１のＶＨドメインの残基が、任意のＶＨ生殖細胞系配列、例えばＤＰ−１０由来の生殖細胞系配列（ＶＨ１−６９）またはＤＰ−８８由来の生殖細胞系配列（ＶＨ１−ｅ）での対応する位置に現われるアミノ酸に置換される可能性がある。この場合における対応する位置は、当業界公知のアラインメント技法、例えばＣｌｕｓｔａｌＷを使用する、様々な生殖細胞系配列間の配列アラインメントにより決定される。
【００５７】
許容されると予想される更なる置換は、３種の共結晶構造の分析により決定した、側鎖のほとんどが溶媒に露出しているアミノ酸に対して行われる置換である。当業界公知の技法を使用して、残基の溶媒接触可能表面領域（ｓｏｌｖｅｎｔ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｒｅａ）を推定することができる。更に、アミノ酸の側鎖が隣接する残基と立体障害を生じない場合には、可変ドメイン内に埋もれているアミノ酸に対する置換がより許容され得ることが予想される。このため、埋もれているアミノ酸は一般的に、類似のまたはより小さいサイズの側鎖を有するアミノ酸に置換される。例えば、埋もれたＩｌｅ残基のＬｅｕ、Ｖａｌ、ＡｌａまたはＧｌｙへの置換が許容されると予想される。置換により生じ得る立体障害を、３種の共結晶構造の分析により予測することができる。許容されると予想される更なる置換は、可変ドメイン内の既存の静電的相互作用、例えば双極子間相互作用、誘起双極子相互作用、水素結合またはイオン結合を維持する置換である。
【００５８】
可変ドメインの更なるアミノ酸置換として、抗体またはその抗原結合フラグメントに新規で有用な特性を付与すると予想される置換が挙げられる。例えば、ＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインにおける推定上のＮ−グリコシル化部位を除去して、Ｎ−糖形態の形成を防止するまたは減少させることができる。アミノ末端残基をＧｌｎ残基に置換してピログルタミル化を引き起こすことができ、これにより電荷を有するバリアントの数を減少させることができる。アミノ酸置換を使用して等電点を下げることができ、これにより、例えばＩｇＧポリペプチド抗体の排出速度を低下させることができる。
【００５９】
可変ドメインの表面残基を例えばＣｙｓ残基またはＬｙｓ残基に置換し、次いで共有結合により改変し、抗体またはその抗原結合フラグメントに有用な特性を付与する分子、例えば検出可能な標識、毒素、標的部分またはタンパク質に連結させることができる。例えば、Ｃｙｓ残基を細胞毒性薬に連結させて薬物複合体を形成することができる。Ｃｙｓ残基を、血清半減期を増加させる分子、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または血清アルブミンに連結させることもできる。そのようなアミノ酸改変が、例えばＢｅｃｋら（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  １０：３４５〜５２頁で概説されている。
【００６０】
検出可能な標識として１３１Ｉまたは９９Ｔｃ等の放射性標識が挙げられ、この放射性標識を、当業界公知の方法を使用して抗体またはその抗原結合フラグメントに取り付けることができる。標識として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等の酵素標識も挙げられる。標識として、特定の同種の検出可能な部分、例えば標識アビジンへの結合により検出することができる、ビオチン等の化学部分が更に挙げられる。精製を容易にするその他の部分を取り付けることができる。例えば、組み換え改変および発現の公知の方法を使用して、抗体またはその抗原結合フラグメントにＨｉｓタグを付けることができる。
【００６１】
４．可変ドメインに対する多重アミノ酸置換
抗体またはその抗原結合フラグメントに対して多重アミノ酸置換を行うことができる。一般に、少なくともいくつかの無作為に選択されたアミノ酸置換後に、抗体またはその抗原結合フラグメントは安定性および機能性を維持すると予想される。例えばＷｅｌｌｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２９：８５０９〜１７頁（１９９０）を参照されたい。しかしながら、更なる置換が可変ドメイン中に無作為に導入されることから、例えば、ドメイン全体の安定性が低下する可能性があり、該可変ドメインの凝集する傾向が高まる可能性があり、該可変ドメインのＴＧＦβに対する親和性が増加する可能性があり、および該可変ドメインの考えられる免疫原性が高まる可能性がある。そのため、多重アミノ酸置換を行う場合の好ましい置換は上述した置換から選択され、この置換により、安定性および機能性が維持されると予想される。当業界公知の慣例的な方法を使用して、改変した可変ドメインの機能性を試験することができ、この方法として、Ｇｒｕｔｔｅｒ（２００８）に開示されているＭＬＥＣ増殖アッセイが挙げられるがこれに限定されない。
【００６２】
抗体および抗原結合フラグメントの製造に関する核酸および方法
本発明の更なる態様は、本明細書に開示している抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を提供する。単離核酸は、例えば合成ＤＮＡ、天然には存在しないｍＲＮＡまたはｃＤＮＡであってもよい。核酸を、プラスミド、ベクターまたは転写カセットもしくは発現カセットに挿入することができる。組み換え宿主細胞は、上記の１種またはそれ以上の構築物を含むことができる。「単離」核酸（または抗体もしくはこの抗原結合フラグメント）をその天然の環境から取り出し、更に実質的に純粋、例えば９０％以上の純度にしてもよいし、または均一の形態にしてもよい。
【００６３】
抗体またはその抗原結合フラグメントを調製する方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントを産生するための条件下で、コードする核酸を宿主細胞中で発現させること、および抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む。抗体またはその抗原結合フラグメントを回収するプロセスは、抗体またはその抗原結合フラグメントの単離および／または精製を含むことができる。産生方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントを、少なくとも１種の追加の成分、例えば薬学的に許容される賦形剤を含む組成物に調合することを含むことができる。
【００６４】
抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸を含む好適なベクターを選択するまたは構築することができ、このベクターは、プロモーター配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および必要に応じてその他の配列等の適切な調節配列を含有する。ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、ファージミド、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルスであってもよい。例えば核酸構築物の調製、変異誘発、シークエンシング、ＤＮＡの細胞への導入および遺伝子発現において核酸を操作するための技法およびプロトコルは当業界公知である。
【００６５】
そのような核酸の宿主細胞への導入は、当業界公知の技法を使用して達成することができる。真核細胞の場合、好適な技法として、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介性トランスフェクション、およびレトロウイルスまたはその他のウイルスを使用する形質導入を挙げることができる。細菌性細胞の場合、好適な技法として、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔、およびバクテリオファージを使用するトランスフェクションを挙げることができる。例えば遺伝子の発現用の条件下で宿主細胞を培養することにより、導入後に核酸からの発現を引き起こすまたは可能とすることができる。一実施形態では、本発明の核酸は、宿主細胞の遺伝子、例えば染色体に組み込まれている。標準的技法に従って、遺伝子の組み換えを促進する配列の挿入により組み込みを促進することができる。
【００６６】
様々な異なる宿主細胞中でのポリペプチドのクローニングおよび発現のためのシステムは公知である。好適な宿主細胞として、細菌、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、真菌、酵母、ならびに遺伝子導入植物および遺伝子導入動物が挙げられる。異種ポリペプチドの発現用に当業界において利用可能な哺乳類細胞株として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、マウスメラノーマ細胞、ラットミエローマ細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞、ヒト胎児由来網膜細胞およびその他多数が挙げられる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の原核細胞中での抗体および抗体フラグメントの発現は当業界で十分に確立されている。概説として、例えばＰｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５〜５５１頁（１９９１）を参照されたい。例えばＡｎｄｅｒｓｅｎら（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１７〜２３頁で概説されているように、当業者は、培養されている真核細胞中での発現も利用可能である。
【００６７】
天然に、もしくは発現宿主、例えばＣＨＯ細胞またはＮＳＯ（ＥＣＡＣＣ  ８５１１０５０３）細胞の選択のどちらかで抗体もしくはこの抗原結合フラグメントをグリコシル化することができる、または例えば原核細胞中での発現により産生する場合には、抗体もしくはこの抗原結合フラグメントを非グリコシル化することができる。例えばフコシル化を阻害することにより、グリコシル化を意図的に変更して、結果として生じる抗体のＡＤＣＣ活性を高めることもできる。
【００６８】
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法
患者に有効量を投与することを含む、ヒト患者の疾患または障害の処置（予防的処置を含むことができる）の方法等のヒトまたは動物の身体の処置または診断の方法で、本抗体またはその抗原結合フラグメントを使用することができる。処置可能な状態として、ＴＧＦβが役割を果たすあらゆるもの、例えば線維性疾患、癌、免疫介在性疾患および創傷治癒が挙げられる。
【００６９】
本抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＴＧＦβ活性に直接的または間接的に起因する疾患および状態の処置に有用である。本抗体またはその抗原結合フラグメントは、インビトロでまたはインビボでヒトＴＧＦβアイソフォームの活性を選択的に阻害することができる。ＴＧＦβアイソフォームの活性として、ＴＧＦβ媒介性シグナル伝達、細胞外基質（ＥＣＭ）沈着、上皮細胞増殖および内皮細胞増殖の阻害、平滑筋増殖の促進、ＩＩＩ型コラーゲン発現の誘導、ＴＧＦ−β、フィブロネクチン、ＶＥＧＦおよびＩＬ−１１の発現の誘導、潜伏期間関連ペプチドの結合、腫瘍により誘発される免疫抑制、血管新生の促進、筋線維芽細胞の活性化、転移の促進、およびＮＫ細胞活性の阻害が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、肝線維症（ＨＦ）、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、強皮症（ＳＳｃ）およびマルファン症候群の処置に有用である。
【００７０】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、線維性疾患（例えば糸球体腎炎、神経の瘢痕、皮膚の瘢痕、肺線維症、肺線維症（ｌｕｎｇ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、放射線により誘発された線維症、肝線維症、骨髄線維症）、熱傷、免疫媒介性疾患、炎症性疾患（関節リウマチを含む）、移植片拒絶反応、癌、デュピュイトラン拘縮および胃潰瘍が挙げられるがこれらに限定されない疾患および状態の処置に有用である。本抗体またはその抗原結合フラグメントは、下記のものが挙げられるがこれらに限定されない腎不全：糖尿病性腎障害（Ｉ型およびＩＩ型）、放射線により誘発された腎障害、閉塞性腎症、びまん性全身性硬化症、肺線維症、同種移植片拒絶反応、遺伝性腎臓疾患（例えば腎嚢胞、海綿腎、馬蹄腎）、糸球体腎炎、腎硬化症、腎石灰化症、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、ベルガー病、全身性高血圧または糸球体性高血圧、尿細管間質性腎障害、尿細管性アシドーシス、腎結核および腎梗塞の処置、予防および発病のリスクの低減にも有用である。特に、本抗体またはその抗原結合フラグメントは、下記のもの：レニン阻害薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、ＡｎｇＩＩ受容体アンタゴニスト（「ＡｎｇＩＩ受容体遮断薬」としても知られている）およびアルドステロンアンタゴニストが挙げられるがこれらに限定されないレニン−アンジオテンシン−アルドステロン系のアンタゴニストと併用する場合に有用である。そのようなアンタゴニストとの併用で抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法は、例えばＷＯ２００４／０９８６３７に記載されている。
【００７１】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、全身性硬化症、術後の癒着、ケロイドおよび肥厚性瘢痕化、増殖性硝子体網膜症、緑内障ドレナージ手術、角膜損傷、白内障、ペーロニー病、成人呼吸窮迫症候群、肝硬変、心筋梗塞後の瘢痕化、血管形成後の再狭窄、くも膜下出血後の瘢痕化、多発性硬化症、椎弓切除後の線維形成、腱およびその他の修復後の線維形成、入れ墨除去に起因する瘢痕化、胆汁性肝硬変（硬化性胆管炎を含む）、心膜炎、胸膜炎、気管切開、貫通性中枢神経系損傷、好酸性筋肉痛症候群、血管再狭窄、静脈閉塞性疾患、膵炎および乾癬性関節炎等のＥＣＭの沈着に関連する疾患および状態の治療にも有用である。
【００７２】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、静脈性潰瘍、虚血性潰瘍（褥瘡）、糖尿病性潰瘍、移植片部位、移植片ドナー部位、擦過傷および熱傷、気管支上皮の疾患、例えば喘息、ＡＲＤＳ、腸上皮の疾患、例えば細胞毒性処置に関連する粘膜炎、食道潰瘍（逆流症）、胃潰瘍、小腸のおよび大腸の障害（炎症性腸疾患）等の疾患および状態での再上皮化の促進に更に有用である。
【００７３】
抗体またはその抗原結合フラグメントを、例えばアテローム性プラークの安定化、血管吻合部の治癒の促進での内皮細胞増殖の促進に、または例えば動脈疾患、再狭窄および喘息での平滑筋細胞増殖の抑制に使用することもできる。
【００７４】
抗体またはその抗原結合フラグメントは、マクロファージ媒介感染症への免疫応答を高めるのに有用である。抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば腫瘍、ＡＩＤＳまたは肉芽腫性疾患により引き起こされた免疫抑制を弱めるのにも有用である。抗体またはその抗原結合フラグメントは、これらに限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、胃癌、腎臓癌、膵臓癌、大腸癌、皮膚癌、肺癌、子宮頸癌および膀胱癌、神経膠腫、中皮腫等の癌、加えて様々な白血病およびカポジ肉腫等の肉腫等の過剰増殖性疾患の処置に有用であり、更にこの抗体またはその抗原結合フラグメントは、そのような腫瘍の再発または転移の処置または予防に有用である。抗体またはその抗原結合フラグメントは、シクロスポリン媒介転移の抑制にも有用である。
【００７５】
癌治療との関連において、「処置」は、腫瘍増殖の遅延または腫瘍転移の低減をもたらし、患者の平均余命を延すために癌の部分寛解ももたらすあらゆる医学的介入を含む。
【００７６】
処置の方法は、抗体もしくはこの抗原結合フラグメントまたは抗体もしくはこの抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む。投与する薬剤の製造で、抗体またはその抗原結合フラグメントを使用することができる。例えば、薬剤または医薬組成物を製造する方法は、抗体またはその抗原結合フラグメントと薬学的に許容される賦形剤とを調合することを含む。組成物を、単独で、または処置しようとする状態に応じて同時にもしくは逐次的にその他の処置と組み合わせて投与することができる。
【００７７】
好ましくは、患者に対して利益を示すのに十分である「治療有効量」が投与される。そのような利益は少なくとも、具体的な疾患または状態の少なくとも１種の症状の改善であってもよい。投与される実際の量、ならびに投与の速度および経時変化は、処置する疾患または状態の性質および重症度に依存すると予想される。処置の処方、例えば投薬量の決定等を、前臨床研究および臨床研究に基づいて決定することができ、この前臨床研究および臨床研究の設計は十分に当業界の技術レベル内である。
【００７８】
正確な用量は、抗体またはその抗原結合フラグメントが診断用または処置用であるかどうか、処置しようとする領域のサイズおよび位置、抗体またはその抗原結合フラグメントの正確な性質、例えば全抗体、ＦａｂまたはｓｃＦｖフラグメント、ならびに抗体またはその抗原結合フラグメントに取り付けられた任意の検出可能な標識またはその他の分子の性質等の多くの因子に依存すると予想される。例えば全抗体の典型的な用量は、全身投与の場合には１００μｇ〜１ｇの範囲であってもよく、局所投与の場合には１μｇ〜１ｍｇの範囲であってもよい。成人患者の１回の処置用の用量を、小児用におよび乳児用に比例的に調整することができ、分子量および活性に比例してその他の抗体形態用にも調整することができる。医師の裁量で、処置を毎日、１週間に２回、毎週、毎月またはその他の間隔で繰り返すことができる。処置は周期的であってもよく、投与間の期間は約２週間もしくはそれ以上であり、好ましくは約３週間もしくはそれ以上であり、より好ましくは約４週間もしくはそれ以上であり、または１カ月に約１回である。
【００７９】
患者の体重ｋｇ当たり約０．１ｍｇ、約０．３ｍｇ、約１ｍｇ、約３ｍｇ、約１０ｍｇまたは約１５ｍｇの用量レベルが有益で安全であると思われる。例えば、ラットおよびマウスでの０．５〜５ｍｇ／ｋｇは、深刻な設定での有効用量である。従って、長期の投薬の場合、２１日という予測される半減期に基づいて０．３〜１０ｍｇ／ｋｇをヒトに投与することができる。用量は、効力に関しては十分であるが、同時に最適な投与を容易にする程度に十分低くてもよい。例えば、５０ｍｇ未満の用量により皮下投与が容易になる。高用量および長期の投薬間隔を必要とする場合がある重症疾患用の送達の経路として、静脈内投与を使用することができる。皮下注射により、製品に対する潜在的な免疫反応を高めることができる。局所性疾患用の局所投与により、投与する製品の量を低減することおよび作用部位での濃度を高めることができ、これにより安全性を改善することができる。
【００８０】
注射により、例えば、皮下注射により、静脈内注射により、（例えば腫瘍切除後の）体腔内注射により、病巣内注射により、腹腔内注射によりまたは筋肉内注射により、抗体またはその抗原結合フラグメントを投与することができる。吸入により、または局所的に（例えば眼球内に、鼻腔内に、直腸に、創傷中に、皮膚上に）または経口で、抗体またはその抗原結合フラグメントを送達することもできる。
【００８１】
抗体またはその抗原結合フラグメントを通常は医薬組成物の形で投与することができ、この医薬組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントに加えて少なくとも１種の成分を含むことができる。そのため、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤、基剤、緩衝剤、安定剤または当業者に公知のその他の物質を含むことができる。そのような物質は非毒性でなくてはならず、活性成分の効力を妨げてはならない。そのような物質として、例えばありとあらゆる溶媒、分散媒体、被覆剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤を挙げることができる。薬学的に許容される基剤のいくつかの例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノール等およびそれらの組み合わせである。多くの場合では、組成物に等張剤、例えば糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムが含まれることが好ましいと予想される。薬学的に許容される物質の追加の例は、湿潤剤または補助物質、例えば乳化剤、防腐剤もしくは緩衝剤であり、これらにより貯蔵寿命または効力が高められる。
【００８２】
基剤またはその他の物質の厳密な性質は投与の経路に依存すると予想される。静脈注射または罹患部位での注射の場合、活性成分は、発熱物質を含まず適切なｐＫ、等張性および安定性を有する非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。当業者は、例えば等張ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液および乳酸加リンガー注射液を使用して好適な溶液を十分に調製することができる。防腐剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤および／またはその他の添加剤を含ませることができる。
【００８３】
抗体またはその抗原結合フラグメントを、溶液（例えば注射可能な溶液および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、粉末、リポソームおよび坐薬等の、液状に、半固体状にまたは固体状に製剤化することができる。好ましい形態は、意図されている投与様式、治療用途、分子の物理化学的特性および送達の経路に依存する。製剤は、賦形剤または賦形剤の組み合わせ、例えば糖類、アミノ酸および界面活性剤を含むことができる。液剤は、広範囲の抗体濃度およびｐＨを含むことができる。固形剤を、例えば凍結乾燥、噴霧乾燥または超臨界流体技法による乾燥によって製造することができる。
【００８４】
治療用組成物を、溶液、マイクロエマルション、分散液、リポソームまたは高薬剤濃度に適したその他の秩序構造として製剤化することができる。抗体またはその抗原結合フラグメントを、上記に列挙した成分の内の１種または組み合わせと共に適切な溶媒中に取り込み、続いてろ過滅菌することにより、無菌の注射可能な溶液を調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本の分散媒と上記に列挙したものからのその他の成分とを含有する無菌ビヒクルに取り込むことにより調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は、活性成分および任意の所望の追加成分の粉末を、それらの予め滅菌ろ過された溶液から得る真空乾燥および凍結乾燥である。例えばレシチン等の被覆剤を使用することにより、分散液の粒径を維持することによりまたは界面活性剤を使用することにより、溶液の適切な流動性を維持することができる。組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアレートおよびゼラチンを含ませることにより、注射可能な組成物の持続的吸収をもたらすことができる。
【００８５】
ある実施形態では、活性化合物を、急速な放出から抗体またはその抗原結合フラグメントを保護することができる基剤、例えばインプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達システム等の放出制御製剤と共に調製することができる。生物分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸を使用することができる。そのような製剤を調製する多くの方法が特許化されている、または当業者に一般に知られている。
【００８６】
抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法は、ＴＧＦβへの結合を引き起こすまたは可能にすることを含むことができる。そのような結合はインビボで起こることができ、例えば抗体もしくはこの抗原結合フラグメントの患者への投与後に起こることができる、またはそのような結合はインビトロで起こることができ、例えばＥＬＩＳＡで、ウェスタンブロッティングで、免疫細胞化学で、免疫沈降で、親和性クロマトグラフィーでもしくは細胞に基づくアッセイで起こることができる、またはエキソビボをベースとする治療法で起こることができ、例えば細胞もしくは体液をエキソビボで抗体もしくはこの抗原結合フラグメントと接触させ、次いで患者に投与する方法で起こることができる。
【００８７】
抗体またはその抗原結合フラグメントを含むキットが提供される。抗体またはその抗原結合フラグメントを標識化して、該抗体またはその抗原結合フラグメントのサンプル中での反応性の測定を可能とすることができる。キットを例えば診断解析で用いることができる。キットは、組成物の使用に関する説明書を含有することができる。そのような方法の実施を補助するためのまたは該方法の実施を可能とするための補助材をキットに含めることができる。
【００８８】
サンプル中での抗体またはその抗原結合フラグメントの反応性を、任意の適切な手段、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定することができる。放射性活性物質で標識した抗原を未標識の抗原（検査サンプル）と混合し、抗体またはその抗原結合フラグメントとの結合を可能にすることができる。結合した抗原を未結合の抗原から物理的に分離し、抗体またはその抗原結合フラグメントに結合した放射性抗原の量を測定する。レポーター分子に連結された抗原または類似体を使用して、非放射性抗原の競合結合アッセイを使用することもできる。レポーター分子は、蛍光色素、リン光体または色素であってもよい。好適な蛍光色素として、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリンおよびテキサスレッドが挙げられる。好適な発色性色素としてジアミノベンジジンが挙げられる。
【００８９】
その他のレポーターとして、高分子のコロイド粒子または粒子状物質、例えば有色性である、磁性であるまたは常磁性であるラテックスビーズ、および視覚的に観察される、電子的に検出されるまたは別の方法で記録される検出可能なシグナルを直接的または間接的に生じさせることができる生物学的にまたは化学的に活性な作用剤を挙げることができる。これらの分子は、例えば発色させるもしくは変色させるまたは電気的特性の変化を生じさせる反応を触媒する酵素であってもよい。これらの分子は分子的に励起可能であってもよく、その結果、エネルギー状態間の電子遷移により特徴的なスペクトル吸収または発光が生じる。これらの分子は、バイオセンサーと共に使用される化学実体を含むことができる。ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンおよびアルカリホスファターゼ検出システムを用いることができる。抗体−レポーター複合体により生成されたシグナルを使用して、サンプル中の関連する抗体結合の定量可能な絶対的データまたは相対的データを導くことができる。
【００９０】
本発明は、競合アッセイでの抗原レベルを測定するための抗体またはその抗原結合フラグメントの使用も提供する。結合時に物理的なまたは光学的な変化が生じるようなレポーター分子の抗体またはその抗原結合フラグメントへの連結は１つの可能性である。レポーター分子は、検出可能なシグナル、好ましくは測定可能なシグナルを直接的または間接的に生成することができる。レポーター分子の連結は、例えばペプチド結合により直接的なもしくは間接的な共有結合的であってもよく、または非共有結合的であってもよい。抗体またはその抗原結合フラグメントとタンパク質レポーターとをペプチド結合により連結させ、融合タンパク質として組み換えにより発現させることができる。
【００９１】
下記の実験的例証を含む本発明の開示を考慮して、本発明の更なる態様および実施形態が当業者に明らかになると予想される。
【００９２】
〔実施例１〕
米国特許第７，７２３，４８６号の実施例１に開示されている下記の非限定的な実施例に従って、抗ＴＧＦβ単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を調製することができた。変異誘発技法および／またはコンビナトリアル技法を使用して、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３に対する中和力価を高めることができた。米国特許第７，７２３，４８６号の実施例１に記載されているファージ抗体ライブラリの選択およびスクリーニングにより、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２および／またはＴＧＦβ３に対する力価が改善されたｓｃＦｖを生成することができた。この実施例で生成されたｓｃＦｖをＭＬＥＣ増殖アッセイにおいて１Ｄ１１．１６と比較しており、この１Ｄ１１．１６は米国特許第７，７２３，４８６号に開示されている。
【００９３】
米国特許第７，７２３，４８６号の実施例１では、高力価のＴＧＦβ中和ｓｃＦｖの集団の中で、特定の生殖細胞系が高度に出現することが分かった。重鎖の場合にはＤＰ−１０／１−６９およびＤＰ−８８／１−ｅ（両方ともＶＨ１生殖細胞系ファミリのメンバー）であり、軽鎖の場合にはＤＰＫ２２／Ａ２７（Ｖκ３ファミリ）であった。これらの生殖細胞系は、高力価のＴＧＦβ汎中和抗体に特に適した構造的フレームワークを形成すると思われる。ＰＥＴ１０７３Ｇ１２、ＰＥＴ１０７４Ｂ９およびＰＥＴ１２８７Ａ１０のｓｃＦｖは、ＭＬＥＣ増殖アッセイにおいて、３種全てのＴＧＦβアイソフォームに対して１Ｄ１１．１６の力価に近いまたはこの力価を超える力価を示した。
【００９４】
ＰＥＴ１０７３Ｇ１２、ＰＥＴ１０７４Ｂ９およびＰＥＴ１２８７Ａ１０のＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントの誘導されたアミノ酸配列を、ＶＢＡＳＥデータベース（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ、Ｖ−ＢＡＳＥ配列ディレクトリ、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ（１９９７））中の公知のヒト生殖細胞系配列に対して並べ、最も近いヒト生殖細胞系を配列類似性によって同定した。ＰＥＴ１０７３Ｇ１２およびＰＥＴ１０７４Ｂ９のＶＨ遺伝子セグメントに最も近いヒト生殖細胞系遺伝子をＤＰ−１０／１−６９（ＶＨ１生殖細胞系ファミリ）として同定し、ＰＥＴ１２８７Ａ１０のＶＨ遺伝子セグメントに最も近いヒト生殖細胞系遺伝子をＤＰ−８８／１−ｅ（ＶＨ１生殖細胞系ファミリ）として同定した。ＰＥＴ１０７３Ｇ１２、ＰＥＴ１０７４Ｂ９およびＰＥＴ１２８７Ａ１０のＶＬ遺伝子セグメントに最も近いヒト生殖細胞系遺伝子をＤＰＫ２２／Ａ２７（Ｖκ３生殖細胞系ファミリ）として同定した。部位特異的な変異誘発を使用して、生殖細胞系とは異なるフレームワーク残基を生殖細胞系残基に置換したが、そのような変化により、ＭＬＥＣ増殖アッセイにおいて、結果として生じる抗体の任意のＴＧＦβアイソフォームに対する力価の低下が３倍を超えないことを条件とした。そのような力価の低下を観測した場合には、非生殖細胞系のフレームワークのアミノ酸を最終抗体中で維持した。
【００９５】
生殖細胞系化したＰＥＴ１０７３Ｇ１２および生殖細胞系化したＰＥＴ１０７４Ｂ９では、全てのフレームワーク残基がＶＨ中の２個の残基およびＶＬ中の１個の残基を除いて生殖細胞系であった。生殖細胞系化したＰＥＴ１０７３Ｇ１２のアミノ酸配列は、ＶＨに関しては米国特許第７，７２３，４８６号の配列番号２に記載されており、ＶＬに関しては米国特許第７，７２３，４８６号の配列番号７に記載されている。生殖細胞系化したＰＥＴ１０７４Ｂ９のアミノ酸配列は、ＶＨに関しては米国特許第７，７２３，４８６号の配列番号１２に記載されており、ＶＬに関しては米国特許第７，７２３，４８６号の配列番号１７に記載されている。生殖細胞系化したＰＥＴ１２８７Ａ１０では、全てのＶＨフレーム残基およびＶＬフレーム残基が生殖細胞系であった。生殖細胞系化したＰＥＴ１２８７Ａ１０のアミノ酸配列は、ＶＨに関しては米国特許第７，７２３，４８６号明の配列番号２２に記載されており、ＶＬに関しては米国特許第７，７２３，４８６号の配列番号２７に記載されている。
【００９６】
〔実施例２Ａ〕
米国特許第７，７２３，４８６号の実施例４に開示されているＴＧＦβ依存性ＭＬＥＣ増殖アッセイを使用して、抗ＴＧＦβ抗体またはその抗原結合フラグメントの中和力価をアッセイすることができた。ＭＬＥＣ増殖アッセイは、Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１３８：７９〜８６頁（１９８９）により説明されているアッセイに基づいていた。このアッセイは、ミンク肺上皮細胞に添加したＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３が血清誘導性細胞増殖を阻害するという原理で機能する。細胞増殖の修復を引き起こすＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３の中和に関して抗体を試験した。［３Ｈ］−チミジンの取り込みにより増殖を測定した。抗体の力価を、単一の濃度のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３を５０％のレベルで中和する抗体の濃度（ＩＣ５０、ｎＭ）と定義した。
【００９７】
ＭＬＥＣ増殖アッセイのプロトコル：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎからＭＬＥＣ系統（カタログ番号ＣＣＬ−６４）を得た。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（Ｇｉｂｃｏ）を含有する最小必須培地（ＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）中で細胞を増殖させた。Ｔ−１７５フラスコからのコンフルエント細胞をこのフラスコから分離し、遠心沈殿させ、洗浄し、１％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１％ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を含有するＭＥＭから作製したＭＬＥＣアッセイ用培地中に再懸濁させた。次いで、細胞のアリコートをトリパンブルーで標識して血球計数器で計数し、細胞ストックを、アッセイ用培地を使用してｍｌ当たり１．７５×１０５個の細胞に希釈した。この懸濁液１００μＬを組織培養用の平底９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、３〜５時間にわたりインキュベートした。
【００９８】
ＴＧＦβ／抗体溶液の調製：６ｎｇ／ｍｌ（最終アッセイ濃度の６倍）のＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３の希釈標準溶液、および最終の最大アッセイ濃度の３倍の抗体（１Ｄ１１．１６等の対照を含む）の希釈標準溶液をＭＬＥＣアッセイ用培地中で調製した。このアッセイにおけるＴＧＦβの最終濃度（１ｎｇ／ｍｌまたは４０ｐＭ）は、ＴＧＦβを含まない対照と比較して細胞増殖の約８０％の阻害を誘導する濃度（即ちＥＣ８０値）に相当した。
【００９９】
希釈プレートの準備：試験抗体および対照抗体の試料を、ＭＬＥＣアッセイ用培地中で３倍の希釈工程で滴定し、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２またはＴＧＦβ３の存在下でまたは不存在下でインキュベートした。１Ｄ１１．１６および／または必要に応じて参照抗体を試験し、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２もしくはＴＧＦβ３の滴定を実施する全ての実験に、関連する全ての対照を含めた。完了したプレートを、１時間±１５分にわたり、加湿した組織培養用インキュベーター中に置いた。
【０１００】
平板培養細胞へのＴＧＦβ／抗体溶液の添加：適切なインキュベーション時間の後、希釈プレートの各ウェルから１００μＬを平板培養ＭＬＥＣに移し、プレートを４４±２時間にわたりインキュベーターに戻した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の希釈した１０μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−チミジン２５μＬを各ウェルに添加した（０．２５μＣｉ／ウェル）。次いで、プレートを４時間±３０分にわたりインキュベーターに戻した。
【０１０１】
細胞の回収：各ウェルにトリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％、Ｇｉｂｃｏ）１００μＬを添加し、プレートをインキュベーター中で１０分にわたりインキュベートし、ＴｏｍｔｅｃまたはＰａｃｋａｒｄ９６ウェル細胞回収装置を使用して細胞を回収した。
【０１０２】
データの蓄積および解析：ベータ−プレートリーダー（ＴｏｐＣｏｕｎｔ、Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、回収した細胞からのデータを読み取った。データを解析してＩＣ５０値および標準偏差値を得た。ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍ２．０（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用することにより得た。
【０１０３】
結果：精製した、ＰＥＴ１０７３Ｇ１２の、ＰＥＴ１０７４Ｂ９およびＰＥＴ１２８７Ａ１０の生殖細胞系化したＩｇＧ４を、ＭＬＥＣ増殖アッセイにおいて１Ｄ１１．１６と一緒に試験した。ＩｇＧ４を、米国特許第７，７２３，４８６号の実施例３に記載されているように作製した。ＰＥＴ１０７３Ｇ１２およびＰＥＴ１２８７Ａ１０のＩｇＧ４に関する平均ＩＣ５０データは、これらの抗体がＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３に対して１Ｄ１１．１６の力価に類似するまたは近い力価を有することを示した。
【０１０４】
平均ＩＣ５０データは、ＭＬＥＣアッセイにおいて完全な用量反応曲線が得られなかったが、ＰＥＴ１０７４Ｂ９のＩｇＧ４がＴＧＦβ１に対してより強力であることを示した。比較として、１Ｄ１１．１６は、９１ｐＭの濃度でＴＧＦβ１に対して１２％の中和を示し、ＰＥＴ１０７４Ｂ９は、９２ｐＭという類似の濃度で７８％の中和を示した。
【０１０５】
〔実施例２Ｂ〕
加えて、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）機器を使用して、ＧＣ１００８抗体のＴＧＦβアイソフォーム結合親和性を測定した。内製したＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２を１０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５）で〜１μｇ／ｍＬに希釈し、ＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．０）で〜２μｇ／ｍＬに希釈した。ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの標準アミンカップリングキットを使用して、ＣＭ５センサーチップのフローセル２、３および４に５０〜１００ＲＵのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２およびＴＧＦβ３それぞれを共有結合で固定した。フローセル１を対照表面として使用した。動力学的結合（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）を分析するために、ＧＣ１００８をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液で３３．３ｎＭ〜１．２ｎＭの１：３に順次希釈し、４個全てのフローセルに５分にわたり３連で注入し、続いて３０μＬ／分の流量の緩衝液で５分解離させた。７５μＬ／分での４０ｍＭのＨＣｌの２回にわたる３０秒の注入により、表面を再生した。ＢＩＡ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による緩衝液および対照のフローセル屈折率変化の減算後の１：１結合モデルを使用して、各センサーグラムを合わせた。表６に示すＫＤは、２５を超える独立したアッセイの平均である。
【０１０６】
【表８】
0006495884.tif 000010
【０１０７】
〔実施例３〕
米国特許第７，７２３，４８６号の実施例７に記載のラット一側尿管閉塞（ＵＵＯ）モデルを使用して、慢性腎疾患およびその他の臨床的適応症を処置するための抗体またはその抗原結合フラグメントの生物学的効力を測定することができた。体重２５０〜２８０ｇ（約６週齢）の成体のスプラーグドーリーラット（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、Ｎ．Ｙ．）を、空気、温度および光を制御した環境中で飼育した。ＵＵＯを実施するラットの腹側正中線に小さい正中切開を施して、左側の腎臓および尿管上部を露出させた。絹の縫合糸を用いて腎臓の下極のレベルで尿管を結紮し、最初の結紮の約０．２ｃｍ下で２回目の結紮を行った。偽手術ラットに同じ外科的プロトコルを施したが、尿管を結紮しなかった。
【０１０８】
米国特許第７，７２３，４８６号に開示されているように、閉塞したラットを、ＰＢＳ、汎的に中和するマウスモノクローナル抗体（１Ｄ１１）、アイソタイプを一致させた対照抗体（１３Ｃ４）、またはヒトのＴＧＦ−βを汎的に中和するモノクローナル抗体で処置した。尿管結紮の日から開始して３週間にわたり、ラットに抗体を腹腔内投与した。１３Ｃ４および１Ｄ１１を５ｍｇ／ｋｇ（３回／週）で投与し、汎的に中和するヒト抗体を５ｍｇ／ｋｇ（５日毎）でラットに与えた。３週の最後に、ラットを屠殺し、３分にわたりＰＢＳを腎臓に灌流させ、ｍＲＮＡの解析、コラーゲン含有量の測定および組織学的検査のために、灌流させた腎臓を採取した。
【０１０９】
組織の線維化の程度を評価するために、Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏらに従って、加水分解抽出物中のヒドロキシプロリンの生化学解析により組織コラーゲン含有量の総量を測定した。コラーゲン含有量の総量に関してＳｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイも実施した。Ｓｉｒｃｏｌコラーゲンアッセイでは、組織コラーゲンの側鎖へのＳｉｒｉｕｓレッド色素の特異的結合に基づいて、酸／ペプシン可溶性コラーゲンの総量を測定した。
【０１１０】
ヒトの汎的に中和するモノクローナル抗体で処置したＵＵＯラットは、ＰＢＳ処置群（３．５±０．３μｇ／ｍｇ乾燥組織、ｐ＜０．０５）と比較した場合にヒドロキシプロリン含有量の４３．４％の減少（１．９８±０．２６μｇ／ｍｇ乾燥組織）を示した。腎臓の線維化の減少は、Ｓｉｒｉｕｓレッド色素に基づくアッセイにより測定した（偽：１８．５±２．６、ＰＢＳ：６９．３±３．８、および汎的に中和するヒトモノクロール抗体：３５．６±５．２μｇ／１００ｍｇ組織、ｐ＜０．０５対ＰＢＳ）ように、罹患した腎臓中における可溶化コラーゲンの総量の減少により更に裏付けられた。
【０１１１】
ヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体の、免疫組織化学的検査による組織線維化を低減する能力も評価した。対照動物では、３週にわたる尿管閉塞により、著しい膨張、細胞の萎縮および壊死／アポトーシス、組織の炎症、ならびに明らかな線維化を伴う尿細管間質拡張を伴う、尿細管構造の広範囲に及ぶ破壊が引き起こされた。糸球体損傷の証拠はほとんどなかった。これに対して、１Ｄ１１またはヒトの汎的に中和するモノクローナル抗体で処置したラットでは、尿細管の拡大および破壊の減衰、炎症性浸潤物（細胞性）の減少ならびに尿細管間質の拡張および線維化の減少によって判断すると、腎臓の構造の維持が示された。
【０１１２】
ヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦβモノクローナル抗体による処置の、ＴＧＦ−βによって調節される遺伝子発現への効果も測定した。ＴＧＦβ１のｍＲＮＡは、ＰＢＳで処置した動物または１３Ｃ４対照抗体で処置した動物と比較して、ヒトの汎的に中和するモノクローナル抗体で処置したＵＵＯ動物で減少した。ＰＢＳまたは１３Ｃ４で処置した閉塞腎臓と比較して、ヒトおよびマウスの抗ＴＧＦ−β抗体で処置した閉塞腎臓においてＩＩＩ型コラーゲンのｍＲＮＡレベルの著しい減少も見られ、このことは、コラーゲン合成の減少を示した。
【０１１３】
腎臓のＴＧＦ−β１タンパク質の総量を測定することにより、ヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体の、自己誘導によるＴＧＦ−βの合成を減少させる効力を更に確認した。偽手術動物と比較して、閉塞腎臓は組織ＴＧＦβ１の総量の著しい増加を示した。しかしながら、ヒトの汎的に中和するモノクローナル抗体を投薬した閉塞ラットでは、両方の対照群で記録されたレベルよりも低い、組織ＴＧＦ−β１レベルの７５％の低下が示された。比較すると、マウスの１Ｄ１１抗体は、対照群と比較して組織ＴＧＦ−β１レベルを４５％減少させた。上述の結果から、ヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体によるＴＧＦ−βの中和が、ＴＧＦ−β１の産生およびコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡ発現の阻止と同時にＴＧＦ−βの自己分泌調節ループを妨害することを実証した。
【０１１４】
ＴＧＦ−β抑制の間接的な指標として、ヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体の平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現への効果を更に判定した。平滑筋アクチンの発現は、組織線維化に関連しているおよび線維性の結合組織をもたらす、活性化された筋線維芽細胞の指標である。ＴＧＦ−βは、間質線維芽細胞および常在の上皮細胞の活性化および筋線維芽細胞への形質転換の誘導物質である。標準的なウェスタンブロット分析によりα−ＳＭＡタンパク質を検出した。
【０１１５】
偽手術動物と比較した場合、腎臓が閉塞されたラットでは、組織ホモジネートのウェスタンブロットにより測定した場合にα−ＳＭＡタンパク質の劇的な上方制御が示された。ヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体を投薬した閉塞ラットでは、測定可能なα−ＳＭＡ発現の著しい減少（ＰＢＳ対照と比較して７５％）が示された。
【０１１６】
これらの結果から、線維性腎臓でのコラーゲン沈着の減少におけるヒトの汎的に中和する抗ＴＧＦ−βモノクローナル抗体の効力が実証され、この抗体が、重度の腎損傷および尿細管間質性線維症のこのモデルにおける腎臓コラーゲンの産生および沈着の強力な阻害物質であることが明確に示された。肺、肝臓または腎臓等の臓器における組織線維化のプロセスには共通の機序および経路があることから、当業者は、この抗体が、慢性の腎疾患の処置で有用であり、更に病原性の線維化を特徴とするその他の臨床的適応症の処置においても有用であることを認識すると予想される。
【０１１７】
〔実施例４〕
ＧＣ１００８（Ｆａｂ）−ＴＧＦβ２複合体の構造を下記のようにして決定した。Ｃ末端がＨｉｓ６タグである（配列番号１１）組み換えＧＣ１００８（Ｆａｂ）をＨＥＫ２９３ＦＳ細胞中で過度的に発現させ、Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ親和性樹脂で精製し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。精製したＧＣ１００８（Ｆａｂ）をＴＧＦβ２ホモ二量体と混合し、この複合体を、サイズ排除クロマトグラフを使用して単離した。ＧＣ１００８（Ｆａｂ）−ＴＧＦβ２複合体を３５％  ＰＥＧ４００、１００ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ｐＨ６．０）中において２０℃で結晶化させ、播種およびｐＨ最適化により更に最適化した。空間群Ｐ２１２１２において２．８３Åに最終データセットを収集し、Ｇｒｕｔｔｅｒ（２００８）に開示されているＧＣ１００８（Ｆａｂ）−ＴＧＦβ３構造に置き換えた分子を使用して構造を解いた。ＧＣ１００８（Ｆａｂ）−ＴＧＦβ２複合体の構造を図１に示す。
【０１１８】
〔実施例５〕
ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）−ＴＧＦβ１複合体の構造を下記のようにして決定した。Ｃ末端がＨｉｓ６タグである（配列番号１１）組み換えＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で過剰発現させ、Ｎｉｃｋｅｌ−ＮＴＡ親和性樹脂で精製し、続いてサイズ排除クロマトグラフィーで精製した。精製したＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）をＴＧＦβ１ホモ二量体と混合し、この複合体を、サイズ排除クロマトグラフを使用して単離した。ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）−ＴＧＦβ１複合体を１６％  ＰＥＧ４Ｋ、０．１Ｍ  クエン酸塩（ｐＨ５．０）、４％  ２−プロパノール中において２１℃で結晶化させた。空間群Ｃ２において３．００Åに構造を決定し、この構造を、実施例４で決定したＧＣ１００８（Ｆａｂ）−ＴＧＦβ２構造に置き換えた分子を使用して解いた。ＧＣ１００９（ｓｃＦｖ）−ＴＧＦβ１複合体の構造を図２に示す。
【０１１９】
〔実施例６〕
ＧＣ１００８の重鎖または軽鎖のどちらかをコードするプラスミドを、ＰＣＲベース変異誘発反応でのテンプレートとして使用した。コードするＤＮＡの変異を行って、コードされた重鎖アミノ酸配列の１５５個の単一アミノ酸置換およびコードされた軽鎖アミノ酸配列の１個の単一アミノ酸置換を引き起こした。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ）を製造業者の説明書に従って使用して、縮重コドン（ＮＮＫ）により特定のアミノ酸または２０種全てのアミノ酸のどちらかに対して設計した１組のフォワードプリマ−およびリバースプライマーを使用してＤＮＡ変異を引き起こした。配列決定による確認後、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）宿主細胞懸濁液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中にトランスフェクトするために、同定した変異体ＤＮＡを野生型の軽鎖ＤＡＮまたは重鎖ＤＮＡと対にした。トランスフェクション後４日目に馴化培地（１ｍＬ）を回収し、１ｍＬのプロテインＡ  ＰｈｙＴｉｐ（登録商標）カラム（ＰｈｙＮｅｘｕｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）およびＰｕｒｅＳｐｅｅｄ（商標）１２チャンネルピペット（Ｒａｉｎｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ＬＬＣ、Ｏａｋｌａｎｄ、ＣＡ）を使用して精製した。精製したバリアント抗体サンプルを、１００ＲＵレベルのＴＧＦβ１を固定した表面、ＴＧＦβ２を固定した表面およびＴＧＦβ３を固定した表面を使用して５０ｎＭの濃度でＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上において２連で分析した。バリアントの解離速度（ｋｄ）を野生型対照のｋｄで割ることにより、ｋｄの倍率変化を得た。（ｋｄバリアント／ｋｄ野生型）が１未満である場合には親和性の増加が示され、この値が１を超える場合には減少が示された。ヒートマップを作成して結果を視覚化した。ＴＧＦβに対する親和性を完全に失っているバリアントを、番号なしの黒色で示した。結果を表７Ａ、表７Ｂおよび表７Ｃに示す。
【０１２０】
【表９】
0006495884.tif 000011
【０１２１】
【表１０】
0006495884.tif 000012
【０１２２】
【表１１】
0006495884.tif 000013
【０１２３】
表７のヒートマップ分析を図５で可視化しており、図５はＴＧＦβに結合したＧＣ１００８の３Ｄ構造を示す。灰色の鎖はＧＣ１００８を表し、黒色の鎖はＴＧＦβ２を表す。表７Ａの下部で示した、ヒートマップ分析で使用したカラースキームに従って、残基Ｉ５２、Ｉ５４およびＶ５５を黒色の文字で標識し、残基Ｙ２７、Ｓ３１、Ｎ３２およびＤ５６を灰色で標識し、残基Ｓ３０およびＥ７４を白色で標識した。より小さいフォントで標識した更に６個の残基Ｐ５３、Ｎ５９、Ｇ１０１、Ｖ１０３、Ｌ１０４およびＡ９３（軽鎖）は、ヒートマップ分析に従って同じ色である。変異誘発分析に基づいて、敏感な位置のほとんど（黒色の文字のＩ５２、Ｉ５４、Ｖ５５）は、完全に保存されたＴＧＦβの疎水性パッチ領域のコアと相互作用するパラトープ残基であるが、耐性のある位置のほとんど（白色の文字のＳ３０、Ｅ７４）は更に離れており、ＴＧＦβのヘリックス３領域と相互作用する。
【図１】
0006495884.tif 000014
【図２】
0006495884.tif 000015
【図３】
0006495884.tif 000016
【図４】
0006495884.tif 000017
【図５】
0006495884.tif 000018
【配列表】
0006495884000001.app