(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーファクタントタンパク質ＡのＳＰ-Ｒ２１０受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)又はそのフラグメントであって、
(Ｉ)以下を含む可変重鎖配列：
ａ）配列ＧＹＩＦＳＤＹＹＭＲ(配列番号３)を含む重鎖相補性決定領域１(Ｐ２Ｈ１０-ＨＣＤＲ１)；及び
ｂ）配列ＤＩＮＰＫＮＧＤＴＦＹＮＱＫＦＫＧＫ(配列番号４)を含む重鎖相補性決定領域２(Ｐ２Ｈ１０-ＨＣＤＲ２)；及び
ｃ）配列ＲＥＧＤ(配列番号５)を含む重鎖相補性決定領域３(Ｐ２Ｈ１０-ＨＣＤＲ３)；及び、
以下を含む可変軽鎖配列：
ｄ）配列ＲＳＳＱＴＩＬＨＳＮＧＮＴＹＬＥ(配列番号６)を含む軽鎖相補性決定領域１(Ｐ２Ｈ１０-ＬＣＤＲ１)；及び
ｅ）配列ＫＶＳＫＲＦＳ(配列番号７)を含む軽鎖相補性決定領域２(Ｐ２Ｈ１０-ＬＣＤＲ２)；及び
ｆ）配列ＬＱＧＳＨＶＰＬＴ(配列番号８)を含む軽鎖相補性決定領域３(Ｐ２Ｈ１０-ＬＣＤＲ３)；
を含むか、
あるいは、
(II)以下を含む可変重鎖配列：
ｉ）配列ＧＹＴＦＴＤＹＡＭＨ(配列番号９)を含む重鎖相補性決定領域１(Ｐ４Ｇ４-ＨＣＤＲ１)；及び
ii）配列ＶＩＳＴＹＮＧＮＴＫＹＮＱＫＦＫＤ(配列番号１０)を含む重鎖相補性決定領域２(Ｐ４Ｇ４-ＨＣＤＲ２)；及び
iii）配列ＡＲＴＤＹＤＮＧＤＹＶＭＤＹ(配列番号１１)を含む重鎖相補性決定領域３(Ｐ４Ｇ４-ＨＣＤＲ３)；及び
以下を含む可変軽鎖配列：
iv）配列ＫＡＳＱＤＩＮＮＹＬＳ(配列番号１２)を含む軽鎖相補性決定領域１(Ｐ４Ｇ４-ＬＣＤＲ１)；及び
ｖ）配列ＲＡＮＲＬＶＤ(配列番号１３)を含む軽鎖相補性決定領域２(Ｐ４Ｇ４-ＬＣＤＲ２)；及び
vi）配列ＬＱＹＤＥＦＰＬＴ(配列番号１４)を含む軽鎖相補性決定領域３(Ｐ４Ｇ４-ＬＣＤＲ３)；
を含む、モノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項２】
前記(Ｉ)のモノクローナル抗体又はフラグメントが、ＳＰ-Ｒ２１０受容体のＳＰ-Ｒ２１０Sアイソフォームのみに特異的に結合し、前記(II)のモノクローナル抗体又はそのフラグメントが、ＳＰ-Ｒ２１０受容体のＳＰ-Ｒ２１０S及びＳＰ-Ｒ２１０Lアイソフォームに特異的に結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体又はそのフラグメントが、部分的に又は完全にヒト化されている、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメント。
【請求項４】
ヒトＩｇＧ定常領域を含んでいる、請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む、医薬組成物。
【請求項６】
個体におけるウイルス感染症又は細菌感染症を治療するために用いられる、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記個体が、ウイルス性インフルエンザ感染のための治療を必要としている、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記個体が、ウイルス性インフルエンザ感染に関連する肺炎を有している、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントをコードしている発現ベクター。
【請求項１０】
生体外細胞培養物であって、当該細胞培養物中の細胞が、請求項１に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを発現する、細胞培養物。
【請求項１１】
請求項１に記載のモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2014年7月14日に出願された米国特許出願62/024,314及び、2015年2月27日に出願された米国特許出願62/121,830に基づく優先権を主張し、それらのそれぞれの開示は本明細書中に包含される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、一般的に、マクロファージ媒介性免疫応答を含む状態を、予防、治療及び診断するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
サーファクタントタンパク質Ａ(SP-A)は、肺胞腔における肺の自然免疫系の重要成分である。SP-Aは、肺サーファクタントの主要なタンパク成分である；それは、肺胞表面を覆うサーファクタント・リン脂質の大きな凝集塊の組織化に関与し、病原体に対しオプソニンとして働く。SP-Aは、抹消気道上皮の肺胞内面液を覆う肺サーファクタントの管状ミエリン画分に取り込まれる。病原体由来分子の存在は、サーファクタント脂質の再編成を引き起こし、SP-Aをサーファクタント界面上の侵入ポイントで病原体と結合させる可能性がある。水性の下相中の肺胞マクロファージはその後、SP-A-オプソニン化細菌と結合しているサーファクタント層の異常エリアをパトロールし、SP-Aは、補体受容体-仲介性食作用を調節する際に重要な役割を果たすことが明らかになった。これに関連して、SP-Aは、生体内でまず感染の根絶に役立ち、その後炎症の回復に役立つ、マクロファージ食作用及び炎症促進反応と抗炎症反応のホストを調節する。複数のマクロファージ受容体が、病原体とアポトーシス細胞の排除及び肺の炎症の時間的コントロールを調和させるSP-Aの能力に関与している。SP-A受容体であるSP-R210は、非在来型Myo18Aの細胞表面アイソフォームとして特定された(Yang C. H., et al.(2005) J. Biol. Chem. 280, 34447-34457)。Myo18A遺伝子は、２つの選択的にスプライシングされたSP-R210アイソフォームである、SP-R210L及びSP-R210Sをコードする。より長い230〜240 kDaのSP-R210Lアイソフォームは、より短い210 kDaのSP-R210Sにはないアミノ末端PDZタンパク質相互作用モジュールを含む。SP-R210Sは、成熟マクロファージと未成熟単球性細胞の両方で高度に発現している。しかしながら、SP-R210Lは成熟マクロファージにのみ発現している。このように、様々な理由により、別個のSP-R210アイソフォームを選択的に標的にする／結合する新規な組成物及び方法を開発する必要性がある。本開示は、これらのニーズ及び他のニーズを満たす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、サーファクタントタンパク質受容体(SPR)(サーファクタントタンパク質Ａ(SPA)のためのSPRを含む)を伴うコンディションの予防、治療及び診断に使用するための組成物及び方法を提供する。特に、SP-R210として知らているSP-A受容体は、マクロファージによって少なくとも２つのアイソフォームで発現されており（すなわち、SP-R210LとSP-R210Sアイソフォーム）、SP-R210Lアイソフォームは、例えば、肺胞マクロファージ上で優勢である。本開示は、SP-R210L及びSP-R210Sアイソフォームのための新規な特異的結合パートナー、及びそのような結合パートナーを使用する方法を含む。
【０００５】
一面では、本開示はモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを含み、前記モノクローナル抗体は、図１４に記載されているハイブリドーマによって産生される。複数の実施形態において、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントは、図１４に記載のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体と同じ特異性を有するが、前記モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントは組換え技術によって産生される。ある実施形態では、モノクローナル抗体又はそれらの抗原結合性フラグメントは、医薬品として提供される。
【０００６】
ある実施形態では、モノクローナル抗体及び／又はそのフラグメントは、図１４に示されるP2H10と称されるハイブリドーマ、又はP4G4と称されるハイブリドーマによって産生され、あるいは組換え技術によって産生され、図１４に示されるP2H10と称されるハイブリドーマ、又はP4G4と称されるハイブリドーマによって産生されたmAbと同じアミノ酸配列、又は同じCDR配列を有する。複数の実施形態において、前記mAb又はそのフラグメントは、図３０Ａ、図３０Ｃ，図３０Ｅ、図３０Ｇに示されるアミノ酸配列又はそのフラグメント、及びそれらの組み合わせを含むか、それらからなる。そのようなmAb及びフラグメントをコードするDNA配列の非限定的な例は、図３０Ｂ、図３０Ｄ，図３０Ｆ、図３０Ｈそれぞれに図示されている。
【０００７】
ある側面では、この開示において説明されるモノクローナル抗体の抗原結合性フラグメントは、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、scFvフラグメント、及びそれらの組み合わせを含むが、必ずしもそれらに限定されない。ある実施形態では、前記モノクローナル抗体又はそれらの抗原結合性フラグメントは、融合タンパク質の構成成分として提供されてもよい。
【０００８】
別の側面では、本開示は、その必要がある個体を予防及び／又は治療する方法を含み、当該方法は、本明細書にさらに記載されるように、前記個体に、有効量のモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを投与することを含む。ある実施形態では、そのような抗体又は抗原結合性フラグメントを含む組成物が投与される個体は、細菌感染症、ウイルス感染症、又は望ましくない炎症を伴う他の何らかのコンディションから選択されるコンディションを必要とする。複数の実施形態において、前記個体は、ウイルス性肺炎に罹患している。複数の実施形態において、前記個体は、ウイルス性インフルエンザの治療を必要としている。
【０００９】
ある側面では、本開示は、個体において、病原微生物とマクロファージとの結合を阻害する方法を含み、当該方法は、本明細書に記載の医薬組成物を、個体に導入することを含む。複数の実施形態において、前記投与は、少なくとも部分的に病原微生物とマクロファージとの前記結合で惹起されるシグナル伝達カスケードを予防又は阻害する。
【００１０】
別の側面では、本開示は、モノクローナル抗体を作製する方法を含み、当該方法は、本明細書にさらに記載するハイブリドーマを含む培地から、前記モノクローナル抗体を単離することを含む。
【００１１】
別の側面では、本開示は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを作製する方法を含み、前記方法は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを、細胞培養物中に導入し、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを発現させ、細胞培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを単離することを含む。
【００１２】
モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクター、及びそのような発現ベクターを含む細胞培養物も、この開示の範囲内に含まれる。
【００１３】
mAb及びそれらの抗原結合フラグメントをコードする全てのポリヌクレオチドは、そのような抗体を作製する方法と同様、本開示に含まれる。
【００１４】
別の側面では、本開示は、個体において、病原微生物とマクロファージの集団との結合を阻害する方法を含み、当該方法は、前記個体に、本開示の医薬組成物を導入することを含む。
【００１５】
別の側面では、本開示は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを作製する方法を含み、当該方法は、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを、細胞培養物中に導入し、モノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを発現させ、細胞培養物からモノクローナル抗体又はその抗原結合性フラグメントを単離することを含む。
【００１６】
別の側面では、本開示は、少なくとも１種の細胞中(例えば、免疫細胞中)に、一以上の先天性受容体の増加した発現を誘発するような、SP-R210の調節を含む。非限定的な実施形態では、SP-R210Lの発現/機能を妨害することによって、タンパク質(TLR-2、CD11c、CD36、及びCD14)と転写(SR-A、 CD11b)レベルの両方で、複数の先天性受容体の２〜２０倍増加した発現が、達成できる。
【００１７】
様々な側面において、本開示は、SP-R210Lを調節することによって、ある抗原(LPSを含むが必ずしもこれに限定されない)へのマクロファージの応答性を調節することも含む。
【００１８】
様々な側面において、本開示は、SP-R210Lを調節することによる、マクロファージでのTLR4シグナル伝達の活性化を含み、さらに、CD14とTLR-4の内部移行を調節することも含み得る。
【００１９】
複数の実施形態において、本開示は、インフルエンザ肺炎の回復を促進するために、SP-R210Sを標的化することを一般に含む。本開示は、エフェクターＴリンパ球の調節によって、Ｔ細胞媒介性免疫(例えば、インフルエンザへの細胞性免疫反応)を増強することを含む。複数の実施形態において、本開示には、複数のインフルエンザＡウイルス株に対する交差防御免疫を与えることが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
［図１］図１は、SP-A SP-R210受容体及びその２つのアイソフォームであるSP-R210LとSP-R210Sのドメイン構成の図画描写を提示する。図１の挿入図は、フローサイトメトリーによって判定されるように、SP-R210がマクロファージの表面に発現することを実証する。非特異的なコントロールIgGと、SP-R210のカルボキシ末端領域に結合する抗体(抗SP-R210 IgGと称される)ともに、細胞をインキュベートした。続いて細胞を、一次IgGの結合レベルを決定するために、二次蛍光性抗-IgG抗体を用いて調べた。赤色のトレースは、Ｘ軸上でSP-R210の蛍光強度としてのレベルを表し、これは、バックグラウンド・コントロールIgGのための青色のトレースと明確に離れている。それゆえ、SP-R210は、細胞の外部環境へアクセス可能な細胞膜上に存在している。
【００２１】
［図２］SP-R210S及びSP-R210Lの、マウス(Ms)とヒト(Hu)SP-R210カルボキシ末端(cooh)領域のタンパク質配列アラインメントのエピトープ位置。P4G4と称されるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、太字のイタリック体で示されるKYQKKKNK(配列番号１５)とVKSWLSKNK(配列番号１６)を含み、共通モチーフであるKxxxxKNK(配列番号１７)をもたらす。後ほど説明するP2H10と称されるハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、太字で示されるDLINSLQD(配列番号１８)を含む。注目すべきことに、KYQKKKNK(配列番号１５)とDLINSLQD(配列番号１８)のエピトープは、さらに後ほど説明するSP-R210Sに特有の１５のアミノ酸挿入を包含する。
【００２２】
［図３］図３は、遺伝子導入マウスにおいて、マクロファージ中のSP-R210の条件的破壊を生じさせるクローニング法の図画描写を提示する。Ms SP-R210Scooh(配列番号１９)；Ms SP-R210Lcooh(配列番号２０)；Hu SP-R210Scooh(配列番号２１)；Hu SP-R210Lcooh(配列番号２２)
【００２３】
［図４］図４は、SP-R210Lの欠損が、マクロファージにおけるインフルエンザＡウイルス(IAV)の感染をブロックすることを実証するデータの写真及びグラフ表示を提示する。
【００２４】
［図５］図５は、SP-R210Lの欠損が、IAVの結合と内部移行には影響を与えないが、核へのNPのエンドサイトーシス輸送は、SP-R210Lが存在しない場合、ブロックされることを実証するデータを提示する。
【００２５】
［図６］図６は、マクロファージのSP-R210L-介在性IAV感染が、TNFαの産生と関連していることを実証するデータの図画描写を提示する。
【００２６】
［図７］図７は、SP-R210L-欠損マクロファージとAMが、TLR7リガンドに過反応性であることを実証するデータの図画描写を提示する。
【００２７】
［図８］図８は、IAV感染が、時間依存的様式でSP-R210L発現の阻害をもたらすことを示すデータのグラフ及び写真表示を提示する。
【００２８】
［図９］図９は、SP-R210L-欠損マウスがIAV感染に有意に罹患しやすいことを実証するグラフ及び免疫組織化学的データを提示する。
【００２９】
［図１０］図１０は、マクロファージにおけるSR-R210アイソフォーム-介在性結合及び内部移行を実証する顕微鏡画像を提示する。
【００３０】
［図１１］図１１は、肺胞マクロファージ(AM)におけるSP-R210の破壊が、生体内でIAVの複製を遅らせることを示すグラフデータを提示する。
【００３１】
［図１２］図１２は、SP-R210に対する抗体が、IAV感染を阻害することを示すフローサイトメトリーとグラフデータを提示する。
【００３２】
［図１３］図１３は、脱シアル化(DS)SP-Aが、IAVによるマクロファージの感染をブロックすることを実証するフローサイトメトリーのデータを提示する。このようにSP-Aは、受容体へのインフルエンザウイルスの結合を競合的に阻害する。
【００３３】
［図１４］図１４は、マウスをr350タンパク質で免疫し、r350及びr300タンパク質に対してスクリーニングすることによって産生されたハイブリドーマを要約する表を提示する(ｒ＝組換え型；350と300タンパク質は図１に示されている)。表は以下のものを示す：1ELISAデータ；融合物(ハイブリドーマ)の推定上陽性のスクリーンのためのデータ。2R350＝U18AC2；R300＝U18AC2。3立体構造-対-線状エピトープ抗体をスクリーニングするために、抗体を、無処置(インタクト)抗原及び変性抗原に対して試験した；4インフルエンザＡウイルスとマクロファージとの結合を阻害する抗体；5免疫沈降によって天然タンパク質を認識する抗体は、ipと表示される；6マウスモノクローナル抗体は、標準手順を使用して調製された。BALB/cマウスは、RIBIアジュバント中の精製組換えマウスSP-R210CL(R350)タンパク質を使用して免疫化された。免疫処置ごとにマウスの１部位あたり0.05 mLの体積で、皮下及び腹腔内の両方で、免疫処置を行った。免疫処置は、隔週で３回行い、最終の追加免疫は、生理食塩水中のタンパク質として投与した。最終の追加免疫の３日後、マウスをケタミン/キシラジンを使用して麻酔し、脾臓とリンパ節を全採血後に取り除いた。免疫細胞の単細胞浮遊液を調製し、ハイブリドーマの産生のために、P3X63-Ag8.653骨髄腫細胞と融合した。ハイブリドーマの培養液上清を、ELISAによって、SP-R210CLとSP-R210CS(R300)に対する反応性についてスクリーニングし、陽性の培養液を増殖とクローニングのために単離した。モノクローナル抗体の大量生産のために、Sigma EX-CELL 610HSF無血清培地を使用して、ELISAで反応性抗体を産生する陽性クローンを、無血清コンディションに適合させた。
【００３４】
［図１５］SP-R210Lのドミナント・ネガティブ破壊。Raw264.7細胞を、空のpTriexNeo2 コントロール、又は、SP-R210カルボキシ末端アイソフォームの300(SP-R210L(DN1))及び 350(SP-R210L(DN2))bp cDNAを含むベクターを用いて安定にトランスフェクトした(6)。Ａ)界面活性剤抽出物を、SP-R210L及びSP-R210Sの両方を認識するアフィニティー精製ポリクローナル抗体を使用して、ウエスタンブロット法で分析した。レーンには、５μgのタンパク質を負荷した。Ｂ)表示の細胞株からの全RNAを逆転写し、TaqManアッセイ及び、SP-R210L-特異的エクソン１及び２を含むプライマー(赤色のバー)、及び両方のSP-R210アイソフォームに共通のエクソン１７及び１８を含むインターナル・プライマー(黒色バー)と18S rRNA(内部標準としての)を使用するqPCRで、定量した(n＝4 ***p＜0.001)。
【００３５】
［図１６］SP-R210Lの欠乏は、マクロファージ内で先天性受容体の発現を差別的に増強する。コントロールとSP-R210L(DN)細胞を、表示のAPC(Ａ)又はPE-結合抗体(Ｂ、Ｃ)を使用して、フローサイトメトリーで分析した(n＝4-8)。(Ｄ)コントロール細胞に対する、SP-R210L(DN)細胞中の表記受容体のmRNAレベルを、qRT-PCRで測定した(n＝4、独立した実験を二度繰り返して行った、**p＜0.02、***p＜0.005)。
【００３６】
［図１７］LPSに対するSP-R210L(DN)細胞の増加した応答性。コントロールとSPR210L(DN)細胞を、150,000細胞/ウェルの密度で、12-ウェル組織培養皿に蒔き、RPMI/10％FBS中で２４時間培養した。細胞をその後、100 ng/mL LPSで、２，４，８，１６及び２４時間処理した。Ａ)TNFαの細胞内染色を、LPSによる処理後、ブレフェルジンＡでブロックした細胞中で２時間行った。ドットによるヒストグラムは、未処理細胞を示す。黒、赤、及び青色のヒストグラムは、コントロール、SP-R210L(DN)1、及びSP-R210L(DN)2細胞の細胞内TNFα染色を示す。Ｂ)分泌されたTNFαのレベルは、LPSでの処理後、表示時点において、培地中で、ELISAによって測定した(n＝6；***p＜0.005)。
【００３７】
［図１８］SP-Aは、SP-R210の発現を誘発する。方法１によって精製したSP-Aで(濃度を増加しながら)処理したコントロール(Ａ)及びSP-R210L(DN)(Ｂ)細胞における、SP-R210の発現を、ウエスタンブロット解析で測定した。細胞は、100 ng/mL LPSでも処理した。ブロットは、ローディング・コントロールとしてのアクチンで再調査した。コントロール(Ａ)及びSP-R210L(DN)(Ｂ)細胞を、２４時間、12ウェル皿で培養し、その後、濃度の異なるSP-A、又は100 ng/mL LPSで処理した。SP-R210L、SP-R210S、及びアクチンのバンド強度は、濃度測定によって決定した。濃度測定データは、アクチンで正規化し、未処理(NT)コントロール細胞(Ａ)中のSP-R210L、及びSP-R210L(DN)(Ｂ)細胞中のSP-R210Sに対して相対的に表した。
【００３８】
［図１９］SP-Aは、生体内で、肺胞マクロファージ中のSP-R210Lの発現を増強する。肺胞マクロファージは、肺洗浄によって単離され、ウエスタンブロット(Ａ)、及びポリクローナル抗-SP-R210抗体を使用する濃度測定解析(Ｂ)のために処理された。***p＜0.001、n＝8 WTマウス、及びn＝6 SR-A-/-マウス、２つの独立した実験より。
【００３９】
［図２０］SP-A及びSP-R210Lは、LPSに対するマクロファージの応答性を調節する。コントロールとSP-R210L(DN)細胞を、本明細書に記載する方法１(SP-Am1)又は方法２(SP-Am2)のどちらかで精製したAPF-1(図２７)由来のSP-Aで前処理した。細胞を、２４時間、表示量のSP-Am1(Ａ)又はSP-Am2(Ｂ)で前処理し、その後100 ng/mL LPSとともにインキュベートした。分泌されたTNFαのレベルを、LPSの添加後４時間目に、ELISAによって、培地中で測定した。示されているデータは、平均値±標準偏差であり、３〜６回の独立した実験の代表的なn＝3である。線は、*p＜0.0001；#p＜0.04；$p＜0.005での表示グループ間の有意差を示す。
【００４０】
［図２１］SP-R210と先天性受容体との相互作用。コントロール及びSP-R210L(DN)マクロファージからの10 mg/mL(Ａ及びＢ)又は2.5 mg/mL(Ｃ)の細胞抽出液を使用して、ポリクローナル抗-SP-R210(Ａ)、モノクローナルCD11b(Ｂ)を用いて、免疫沈降実験を行った。LPS処理の効果を評価するために、免疫沈降反応を、100 ng/mL LPSでの処理後、１０、３０、６０、及び１２０分に実施した(Ｃ)。共沈殿タンパク質をSDS-PAGEゲル上で分離し、表示の抗体を用いてブロットした。モノクローナル抗-SP-R210を用いて免疫沈降させた抽出液を、ポリクローナルSP-R210抗体を用いて再調査した。無関係のウイルス抗原に対するモノクローナルIgG1をコントロールとして使用した(Ｃ)。示されている結果は、２〜４回の独立した実験の代表例である。
【００４１】
［図２２］LPSへの炎症反応に対する中和抗体の効果。コントロール及びSP-R210L(DN)マクロファージを、表示した個々の抗体あるいは抗体の組み合わせ又はそれぞれのアイソタイプ・コントロール20μg/mLを用いて３０分間前処理し、その後100 ng/mLのLPSで４時間刺激した。細胞をその後収集し、TNFα抗体で、細胞内サイトカイン染色した。染色された細胞を、フローサイトメトリーで解析した。陽染性細胞の平均蛍光を、アイソタイプ・コントロール処理細胞のパーセントとして表した。示されているデータは、平均値±SDを表し、三つ組で行われた２〜４回の独立した実験からプールされた。*p＜0.04
【００４２】
［図２３］コントロール及びSP-R210L(DN)細胞におけるTLR4シグナル伝達の活性化。マクロファージを、表示の時点で、100 ng/mL LPSで刺激した。無刺激の(NS)及び刺激した細胞を収集し、ウエスタンブロット解析のために処理した。ブロットを、IRAK-1抗体(Ａ)又はNFκB p65(Ｂ)を用いて調査し、取り除き、IkB又はリン酸化p65をそれぞれ用いて再調査した。ブロットは、ローディング・コントロールとしてチューブリンを用いて再調査した。濃度測定解析により、リン酸化p65のレベルを、チューブリンと比較した(Ｃ)。示されているデータは平均値±標準偏差、n＝4の独立した実験、*p＜0.05
【００４３】
［図２４］コントロール及びSP-R210L(DN)細胞におけるNFκBの核移行。マクロファージを、２４時間、ガラス製のカバースリップで増殖し、その後、100 ng/mLのLPSで刺激した。刺激した細胞を、その後、LPS処理の後、表示の時点で、抗-p65 NFκBを用いて免疫蛍光染色のために処理した。NFκBの核局在性を、共焦点顕微鏡によって可視化した(Ａ)。核p65を含む細胞の比率を、100×拡大率にて、１０個の無作為の顕微鏡視野で、定量化した(Ｂ)。示されているデータは平均値±標準偏差、n＝4の独立した実験、*p＜0.01
【００４４】
［図２５］CD14及びTLR-4の内部移行とシグナル伝達に対するSP-R210L破壊の影響。12ウェル皿上で２４時間培養したマクロファージを、表示の時点で、100 ng/mL LPSで刺激した。細胞をその後、表示の時点で、非酵素的細胞置換培地を使用して収集し、CD14(Ａ及びＢ)又はTLR-4(Ｃ)に対する抗体で染色した。CD14の内部移行に対するダイナソア(dynasore)の影響(Ｂ)、及びTNFα合成に対するダイナソア、EIPA、及びNSC23766の影響(Ｄ)を、LPS添加の３０分前の阻害剤添加によって評価した。収集した細胞を、フローサイトメトリーで解析し、平均蛍光を、無刺激のコントロール又はSP-R210L(DN)細胞(t＝0)と比較したコントロールの％として(Ａ〜Ｃ)、又は、コントロール細胞と比較したSP-R210L(DN)細胞中のコントロールTNFαの％として表した(Ｄ)。示されているデータは、平均値±SD、n＝２〜４回の独立した実験(三つ組で行われた)、***p＜0.01、*p＜0.04
【００４５】
［図２６］マクロファージ活性化における、SP-R210アイソフォームと、CD14及びSR-Aとの提唱される相互作用。SP-R210Lは、rac1との相互作用を通じてLPS-CD14のマクロピノサイトーシスを媒介し、TLR-4へのエンドソームLPS送達及びNFκBの下流活性化をもたらす。その後のLPSの分解は、NFκBシグナル伝達をもたらす。SP-R210L-媒介性マクロピノサイトーシスとシグナル伝達は、EIPA及びNSC23766の両方に感受性である。細胞表面からのTLR-4シグナル伝達は、ダイナソアに感受性である。SP-R210L発現の阻害は、SP-R210S-CD14-SR-A複合体の形成をもたらす。LPSの結合は、SP-R210S-CD14-SR-A複合体のマクロピノサイトーシス様内部移行、及びSR-Aによるrac1の活性化に依存するフィードフォワードの炎症経路の活性化をもたらす。SP-R210S-CD14-SR-A経路はNSC23766に感受性であるが、EIPAには感受性ではない。
【００４６】
［図２７］SP-BのSP-Aとの同時単離。(Ａ)「材料と方法」で記載する方法１及び２を使用して、様々な肺胞タンパク症患者から治療による肺洗浄で得た肺胞タンパク症液(APF)から、SP-Aを精製した。SP-Aの純度は、銀染色で評価した。同時単離低分子量バンドを、トリプシンで消化し、質量分析によってSP-Bを特定した(図示しない)。(Ｂ)SP-Bの存在を、ウエスタンブロット解析によって検証した。タンパク質は、還元(図２７Ａ)又は非還元(図２７Ｂ)の4-17％SDS-PAGEゲル上で分離した。両方の方法で精製されたSP-Aは、SP-Dを含まなかった(図示しない)。本研究の全ての実験は、APF-1から精製したSP-Aを用いて行った。矢印は、SP-BとSP-Aの位置を示す。
【００４７】
［図２８Ａ］モノクローナルSP-R210抗体は、インフルエンザ肺炎からの回復を促進する。インフルエンザウイルスH1N1 PR8を3LD50で用いる感染の２４時間前に、マウスの腹腔内に、100μgの抗体又は100μLのPBSビヒクルを注射した。マウスの病的状態と体重を毎日モニターした。IgG1：アイソタイプ・コントロール抗体；P2H10：抗-SP-R210S抗体；P4G4：抗-SP-R210L+S抗体  １グループあたりn＝5マウス
［図２８Ｂ］モノクローナルSP-R210抗体は、インフルエンザ感染による致死からの生存を増進する。1000 ffcのインフルエンザウイルスH1N1 PR8を用いる感染の２４時間前に、マウスの腹腔内に、100μgの抗体又は100μLのPBSビヒクルを注射した。マウスの病的状態と体重を毎日モニターした。IgG1：アイソタイプ・コントロール抗体；P2H10：抗-SP-R210S抗体；P4G4：抗-SP-R210L+S抗体. １グループあたりn＝5マウス  *p＜0.04
【００４８】
［図２９］CD103+樹状細胞におけるSP-R210の欠失は、IAV感染からの回復及びエフェクターＴリンパ球の動員を促進する。loxP導入SP-R210ノックイン対立遺伝子を保有するマウスを、Clec9A-Creマウスと交配し、CD103+DC中のSP-R210を破壊した。WT同腹仔コントロールとDC SP-R210-欠損マウスを、亜致死量である0.75LD50のIAV PR8を用いて鼻腔内感染させた。(Ａ)体重を１４日間に渡ってモニターした。各時点ごとに、１グループあたりn＝4〜12マウス。感染後、３，７及び１４日目に、各グループの４匹のマウスを肺洗浄液を得るために使用した。エフェクターＴリンパ球の数(Ｂ)及びリンパ球の総数(Ｃ)を、フローサイトメトリーで測定した。Ａ〜Ｃに示すデータは、平均値±SEMである。
【００４９】
［図３０Ａ］ハイブリドーマP2H10によって産生された抗-SP-R210S可変重鎖のCDRマッピング。
［図３０Ｂ］ハイブリドーマP2H10によって産生された抗-SP-R210S可変重鎖のコード配列。CDRコード配列の位置を、太字で示す。
［図３０Ｃ］ハイブリドーマP2H10によって産生された抗-SP-R210S可変軽鎖のCDRマッピング。
［図３０Ｄ］ハイブリドーマP2H10によって産生された抗-SP-R210S可変軽鎖のコード配列。CDRコード配列の位置を、太字で示す。
［図３０Ｅ］ハイブリドーマP4G4によって産生された抗-SP-R210S+L可変重鎖のCDRマッピング。
［図３０Ｆ］ハイブリドーマP4G4によって産生された抗-SP-R210S+L可変重鎖のコード配列。CDRコード配列の位置を、太字で示す。
［図３０Ｇ］ハイブリドーマP4G4によって産生された抗-SP-R210S+L可変軽鎖のCDRマッピング。
［図３０Ｈ］ハイブリドーマP4G4によって産生された抗-SP-R210S+L可変軽鎖のコード配列。CDRコード配列の位置を、太字で示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本開示は、微生物病原体及び、それらに向けられた自然免疫応答に関与する免疫細胞を伴うコンディションの予防、治療及び診断のために使用する組成物及び方法を提供する。本開示は、自然免疫応答、特に、マクロファージによって少なくとも部分的に促進されることが知られている炎症経路を調節する方法を含む。複数の実施形態において、本開示は、細胞性応答を調節する方法を含む。複数の実施形態において、免疫応答の調節には、免疫応答の刺激、又は免疫応答の阻害が含まれる。一実施形態では、免疫応答の阻害は、炎症及び／又は炎症経路の阻害を含む。
【００５１】
マクロファージは、本開示中で時々「Mφ」とも称される。マクロファージは、サーファクタントタンパク質Ａ(SPA)及びＤ(SPD)の受容体などの、サーファクタントタンパク質受容体を発現する。これらの受容体は、例えば、細菌感染症やウイルス感染症(黄色ブドウ球菌やインフルエンザウイルスのような病原体による感染を含むが、いかなる方法でもこれらに限定されない)に対する防御の主要ラインである。特に、SP-R210として知られているSP-A受容体は、SP-A-オプソニン化病原体のクリアランスを仲介する。簡単に上述したように、Mφは、少なくとも２つのSP-R210変異体、すなわちSP-R210L及びSP-R210Sを発現する。SP-R210Lは、例えば、肺胞マクロファージ(AM)で優勢である。本開示は、数ある発見の中で特に、インフルエンザＡウイルス(IAV)感染におけるSP-R210Lの役割、及びSP-R210に対する抗体が、マクロファージのIAV内部移行を阻害することを実証する。さらに、及び以下に証明するように、本開示は、SP-R210Sアイソフォームに特異性を有するSP-R210認識抗体が、インフルエンザ肺炎からの回復を促進し、致死的なインフルエンザ負荷から保護さえできることを実証する。例えば、図２８に提示したデータを得るために、マウスは、0.75LD50のインフルエンザウイルス H1N1 PR8で感染させる２４時間前に、100μgの抗体又は100μLのPBSビヒクルを腹腔内に注射された。図２８Ａに示すように、モノクローナル抗-SP-R210抗体は、インフルエンザ肺炎の回復を促進した。さらに、図２８Ｂに示すように、モノクローナル抗-SP-R210抗体は、インフルエンザ感染による暴露後の生存を増進する(そうでなければ死に至る)。これは、CD103+樹状細胞におけるSP-R210の欠失が、IAV感染からの回復及びエフェクターＴリンパ球の動員を促進することを実証する、図２９に示すデータと一致する。このように、本開示は、SP-R210Sアイソフォームを標的とすることによって達成される多数の有利な効果（インフルエンザ肺炎の回復を含むが必ずしもこれに限定されない）、及び、樹状細胞におけるSP-R210Sアイソフォームを標的にすることが、エフェクターＴリンパ球の誘導と急速な収縮によって示されるように、Ｔ細胞媒介性免疫を増進することを実証する。さらに、これらのデータは、SP-R210Sの標的化を通じて増強されたＴ細胞媒介性免疫が、全てのインフルエンザＡウイルス株に対する幅広い交差防御免疫をもたらすことを示唆する。
【００５２】
前記２つのSP-R210アイソフォームに関し、そのドメイン構成の図画描写を図１に示す。図１は、U18AC1(SP-R210L)及びU18AC2(SP-R210S)のアノテーションを含み、その中で、U18AC2領域は、マクロファージにおけるＳ形を規定すると考えられる独特な１５個のアミノ酸挿入を有する。
【００５３】
前記１５個のアミノ酸挿入を含まないマウスのU18AC1アミノ酸構成は、以下の通りである：EDEMESDENEDLINSEGDSDVDSELEDRVDGVKSWLSKNKGPSKAPSDDGSLKSSSPTSHWKPLAPDPSDDEHDPVDSIFRPRFSHSYLSDSDTEAKLTETSA(配列番号１)。
このアミノ酸配列は、本明細書中で「R300」とも称される。この配列は、SP-R210αサブユニット・スプライスバリアントCSのために、 GenBank受入番号AAV80767.1で利用可能である。「CL」及び「CS」は、SP-R210カルボキシ末端領域の２つの変異体、すなわち「カルボキシ末端ラージ(Carboxy-terminal Large)」及び「カルボキシ末端スモール(Carboxy-terminal Small)」をそれぞれ意味する。N-末端Eは、SP-R210Sでは残基1580、SP-R210Lでは残基1938である。
【００５４】
マウスのU18AC2特有の挿入物は、以下のアミノ酸配列構成中で示される、下線を付されたイタリック体の１５個のアミノ酸配列である。
EDEMESDENEDLINSLQDMVTKYQKKKNKLEGDSDVDSELEDRVDRVKSWLSKNKGPSKAPSDDGSLKSSSPTSHWKPLAPDPSDDEHDPVDSISRPRFSHSYLSDSDTEAKLTETSA(配列番号２)。
このアミノ酸配列は、本明細書中で「R350」とも称される。この配列は、SP-R210αサブユニット・スプライスバリアントCLのために、 GenBank受入番号AAV80766.1で利用可能である。
【００５５】
図２は、マウス(MSP)及びヒト(HSP)のSP-R210カルボキシ末端CS及びCLアミノ酸配列のアミノ酸配列アラインメントを提示する。色つきのアミノ酸は、説明文に示すように、マウスとヒトの配列間の違いを示す。本明細書に示す実施例と表で証明するように、この開示のある実施形態のために、我々は、マウスを免疫するため、マウスのR350(SP-R210CL)配列を使用した。このタンパク質は、タンパク質精製で使用するために、カルボキシ末端に、６つのヒスチジンタグを含む。CLの識別ペプチドは、CSに存在せず、マウスとヒトCL間のKからRへの単一保存的置換で一致しており、我々は、マウス抗体がヒト相同体と交差反応性であることを実証した。
【００５６】
本開示の一側面は、ヒトのサーファクタントタンパク質Ａ(SP-A)受容体に特異的に結合する新規な結合パートナーを含む。複数の実施形態において、前記結合パートナーは、SP-Aアイソフォームに特異的に結合する抗体及び／又はその抗原結合性フラグメントを含む。複数の実施形態では、前記特異的な結合パートナーが結合するアイソフォームは、SP-R210Lアイソフォーム、又はSP-R210Sアイソフォームである。
【００５７】
我々は図１４に提示する表に特性を示す一連のハイブリドーマを産生した。これらの各ハイブリドーマ、及びそれらを含む細胞培養物、及びそれらの子孫は、本発明に含まれる。さらに、前記ハイブリドーマによって産生される抗体をコードする各ポリヌクレオチドは、天然及び単離型で本発明に含まれる（例えば、それらが天然及び単離型で産生するmRNA、それらのmRNAから産生されたcDNA）。モノクローナル抗体及びその抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターも、そのような発現ベクターを含む細胞培養物と同様に、含まれる。複数の実施形態において、本開示は、ハイブリドーマ培地からmAbを単離することによって、図１４の表に示すハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体(mAb)を作製すること、及び、そのようなmAb又はその抗原結合性フラグメントをコードする発現ベクターを細胞培養物中に導入し、mAb又はその抗原結合性フラグメントを発現させ、組換え技術によって産生されたmAb又はその抗原結合性フラグメントを細胞培養物から単離することによって、mAb及びそれらの抗原結合性フラグメントを作製する組換え方法を含む。複数の実施形態において、本発明によって提供されるポリヌクレオチドは、mAbの一以上の相補性決定領域(CDR)をコードする。複数の実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、CDR1、CDR2、CDR3、又はそれらの組み合わせをコードする。
【００５８】
このように、一側面では、本開示は、SP-R210Lアイソフォーム、又はSP-R210Sアイソフォームを特異的に認識する、一以上の単離された及び／又は組換え技術によってあるいは他の方法で合成された結合パートナーを含む。そのような結合パートナーは、SP-Aアイソフォームに特異的に結合できる、及びSP-Aアイソフォームを互いに区別できる抗体及びそれらの抗原結合性フラグメントを含んでもよい。複数の実施形態において、前記抗原結合性フラグメントは、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fdフラグメント、Fvフラグメント、scFvフラグメント、アプタマー及び二重特異性抗体を含むことができる。SP-R210Sアイソフォームに対する抗体は、マクロファージにおいてＳ形を規定すると考えられるU18AC2(SP-R210S)アミノ酸配列の構成要素として先に述べた独特の１５アミノ酸配列中の一以上のエピトープに特異的に結合してもよい。別の実施形態では、前記独特の１５アミノ酸配列は、mAb又はその抗原結合性フラグメントによって特異的に認識される立体構造エピトープの形成によって含まれるか、あるいはそのような形成に関与する。同様に、ある実施形態では、mAb又はそれらの抗原結合性フラグメントは、SP-R210Sアイソフォーム中の前記独特の１５アミノ酸配列(そのような結合パートナーのための結合サイトを提供する線状又は立体構造エピトープをもたらしうる)の不存在に起因して、R210Lアイソフォームに特異的に結合できる。R210Lに存在しR210Sには存在しないＮ末端の458アミノ酸に対するmAbも、本開示に包含される。
【００５９】
複数の実施形態において、抗体及びそれらの抗原結合性フラグメントは、SP-R210L又はSP-R210Sタンパク質の少なくとも７つの連続アミノ酸中に存在する少なくとも１つのエピトープを特異的に認識し、複数の実施形態において、本開示によって提供される結合パートナーは、前述の７つのアミノ酸セグメントの少なくとも１つを認識する少なくとも１つのパラトープ、又は前述のセグメントの少なくとも１つを認識する少なくとも２つのパラトープを含むことができる。
【００６０】
前記ハイブリドーマは、我々の所有であり、容易に特性を明らかにできるため、それらが分泌する免疫グロブリン(Ig)をコードするDNAを配列決定でき、それゆえ、当該Igのアミノ酸配列が決定でき、前記Igの重鎖及び軽鎖の相補性決定領域(CDR)を決定でき、及び、前記ハイブリドーマによって作られる抗体の合成版を作るために、あるいは本明細書にさらに記載する抗原結合部分を作るために使用することができる。あるいは、モノクローナル抗体の継続的ソースを提供する同じ娘クローンを産生するために、前記抗体を産生する細胞をクローン化することができる。これに関連して、ある非限定的な実施形態では、前記モノクローナル抗体及び／又はそれらのフラグメントは、図１４に示すP2H10と称されるハイブリドーマ、又はP4G4と称されるハイブリドーマによって産生されるか、あるいは、組換え技術によって、しかし図１４に示すP2H10と称されるハイブリドーマ、又はP4G4と称されるハイブリドーマによって産生されるmAbと、同じアミノ酸配列、又は同じCDR配列を有するように産生される。複数の実施形態において、mAb及び／又はそれらのフラグメントは、図３０Ａ(P2H10重鎖タンパク質及びCDR)、図３０Ｃ(P2H10軽鎖タンパク質及びCDR)、図３０Ｅ(P4G4重鎖VHタンパク質及びCDR)、図３０Ｇ(P4G4軽鎖タンパク質)に提示されるアミノ酸配列の配列又はセグメント、及びそれらの組み合わせを含む。そのようなmAb及びフラグメントをコードするDNA配列の非限定的な例が、図３０Ｂ、３０Ｄ、３０Ｆ及び３０Ｈにそれぞれ示される。便宜上、本明細書において時々、慣習的であり当業者に自明であるように、前記ハイブリドーマによって産生されたmAbは、ハイブリドーマそれ自身と同じ名前で呼ばれることもある。
【００６１】
我々は、P2H10及びP4G4ハイブリドーマによって産生される２つの代表的なmAbによって認識されるエピトープを決定した。mAb P4G4には、２つのエピトープ：KYQKKKNK(配列番号１５)及びVKSWLSKNK(配列番号１６)が存在する。これらはKxxxxKNK(配列番号１７)の共通モチーフを提示し、ここで「x」は任意のアミノ酸である。mAb P2H10では、エピトープはDLINSLQD(配列番号１８)である。これらのエピトープは、図２の２つのアイソフォームの構成中に見ることができ、P2H10 mAbがＳアイソフォームのみに検出可能に結合し、他方、P4G4はＳ及びＬアイソフォームの両方に検出可能に結合することが明らかである。しかしながら、実施形態において、P4G4は、他のタンパク質との交差反応が観察されなかったので、Ｓ形に特異的に結合すると考えられる。複数の実施形態において、本開示は、これらのエピトープのいずれか１つ又は任意の組み合わせに特異的に結合する、任意の他の抗体及びそれらのフラグメントを包含し、且つ、本明細書に記載された抗体やフラグメントを作製する及び使用するための組成物及び方法を含む。
【００６２】
図３０に提示されたアミノ酸配列から分かるように、複数の実施形態において、本開示は、サーファクタントタンパク質ＡのSP-R210受容体に特異的に結合するmAb又はそのフラグメントを含み、当該mAb又はそのフラグメントは、(I)以下を含む可変重鎖配列：ａ）配列GYIFSDYYMR(配列番号３)を含む重鎖相補性決定領域１(P2H10-HCDR1)；及びｂ）配列DINPKNGDTFYNQKFKGK(配列番号４)を含む重鎖相補性決定領域２(P2H10-HCDR2)；及びｃ）配列REGD(配列番号５)を含む重鎖相補性決定領域３(P2H10-HCDR3)；及び／又は以下を含む可変軽鎖配列：ｄ）配列RSSQTILHSNGNTYLE(配列番号６)を含む軽鎖相補性決定領域１(P2H10-LCDR1)；及びｅ）配列KVSKRFS(配列番号７)を含む軽鎖相補性決定領域２(P2H10-LCDR2)；及びｆ）配列LQGSHVPLT(配列番号８)を含む軽鎖相補性決定領域３(P2H10-LCDR3)を含む。このように、本開示は、P2H10ハイブリドーマによって作られたmAbであって、エピトープ認識に寄与する一つのCDR又はCDRの組み合わせを含んでいる任意のmAb又はその抗原結合性フラグメントを含む。
【００６３】
本開示は、(II)以下を含む可変重鎖配列：i）配列GYTFTDYAMH(配列番号９)を含む重鎖相補性決定領域１(P4G4-HCDR1)：及びii）配列VISTYNGNTKYNQKFKD(配列番号１０)を含む重鎖相補性決定領域２(P4G4-HCDR2)：及びiii）配列ARTDYDNGDYVMDY(配列番号１１)を含む重鎖相補性決定領域３(P4G4-HCDR3)：及び以下を含む可変軽鎖配列：iv）配列KASQDINNYLS(配列番号１２)を含む軽鎖相補性決定領域１(P4G4-LCDR1)：及びv）配列RANRLVD(配列番号１３)を含む軽鎖相補性決定領域２(P4G4-LCDR2)：及びvi）配列LQYDEFPLT(配列番号１４)を含む軽鎖相補性決定領域３(P4G4-LCDR3)を含むmAb又はそのフラグメントも含む。このように、本開示は、P4G4ハイブリドーマによって作られたmAbであって、エピトープ認識に寄与する一つのCDR又はCDRの組み合わせを含んでいる任意のmAb又はその抗原結合性フラグメントを含む。
【００６４】
複数の実施形態において、本開示は、SP-R210受容体のSP-R210Sアイソフォームにのみ特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメント、又はSP-R210受容体のSP-R210SとSP-R210Lアイソフォームに特異的に結合するモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む。
【００６５】
本開示は、混合された重及び軽可変領域も含み、それゆえ、P2H10重鎖とP4G4軽鎖、及びその逆の、全ての組み合わせを含む。従って、本開示は、一価及び多価のSP-R210受容体結合パートナーを含む。
【００６６】
複数の実施形態において、本開示は、その必要がある個体を治療する方法を含み、当該方法は、前記個体に、本明細書に記載されるモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含む有効量の組成物を投与することを含む。ある側面では、前記個体は、ウイルス感染症又は細菌感染症のための治療を必要とする。ある実施形態では、前記個体は、ウイルス性インフルエンザ感染(肺炎に関連しても、しなくてもよい)のための治療を必要とする。
【００６７】
ある実施形態では、本開示は、本明細書に記載のモノクローナル抗体又はそのフラグメントを含有する医薬組成物を含む。
【００６８】
ある実施形態では、前記mAb又はそれらの抗原結合性フラグメントは、融合タンパク質の構成成分であるか、又は、他の成分に共有結合的に付着するように、あるいは基質に固定されるように、あるいはSP-R210タンパク質との複合体中に存在するように、化学的に修飾されている。
【００６９】
本明細書に記載される種類の非ヒト哺乳類由来のハイブリドーマによって産生された抗体は、キメラの又は部分的もしくは完全にヒト化した型を提供するために、改変されてもよく、本開示にはそのような改変が含まれる。一般に、非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体由来の最小配列を含むキメラ抗体である。ヒト化抗体は、本質的にヒトの免疫グロブリン(「レシピエント」抗体とも呼ばれる)であって、その中で、レシピエントの超可変領域由来の残基が、非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ラビット、又は所望の抗体特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類)の超可変領域(「ドナー」抗体とも呼ばれる)由来の残基で置き換えらている。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体で又はドナー抗体で見受けられない残基を含んでもよい。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させるために行われる。一般に、前記ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのそれらに対応し、FRの全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のそれらである。ヒト化抗体は任意で、免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むこともできる。さらなる詳細については以下を参照；Jone等, Nature 321:522-525(1986); Riechmann等, Nature 332:323-329(1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)
【００７０】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該分野で周知である。本開示によって製造される抗体のヒト化は、基本的に、ヒト抗体の対応配列を、マウスのCDR配列で置換することによる、Winterと共同研究者の方法に従って実施できる(Jones等., Nature, 321:522-525(1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327(1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))。
【００７１】
複数の実施形態において、本発明の抗体及び／又は抗原結合性フラグメントは、医薬製剤中で提供され、それは、薬学的に許容されるキャリア、賦形剤又は安定剤などの成分を含むことができる。
【００７２】
複数の実施形態において、前記抗体又はそれらの抗原結合性フラグメント、非経口的、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む適切な手段によって投与されてもよい。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、リンパ内又は皮下投与が含まれる。さらに、前記モノクローナル抗体及び／又はそれらの抗原結合性フラグメントは、パルス注入によって(例えば用量を減少させながら)、投与されてもよい。
【００７３】
様々な実施形態において、前記mAb及びそれらの抗原結合性フラグメントを使用する方法が提供される。一側面では、本開示は、その必要がある個体に、有効量のmAb及び／又はその抗原結合性フラグメントを含む組成物を投与することを含む。複数の実施形態において、その必要がある個体は、微生物(ウイルスを含む)に感染した、又は感染するリスクのある患者であり、ここで、前記微生物は、SP-R210Lアイソフォーム 、又はSP-R210Sアイソフォーム、又はその両方に対するリガンドを発現するか、あるいは含んでいる。一実施形態では、前記個体は、細菌感染症の予防及び／又は治療の必要がある。一実施形態では、前記個体は、ウイルス感染症の予防及び／又は治療の必要がある。一実施形態では、前記個体は、ブドウ球菌、RSウイルス(respiratory syncytial virus)の病原株による、又はインフルエンザウイルスによる感染の予防及び／又は治療の必要がある。複数の実施形態において、抗体又はその抗原結合性フラグメントの量は、個体における症候性感染が確立しないように、又は、個体における症候性感染が、前記抗体又はその抗原結合性フラグメンを投与されていない個体よりも早く軽減されるように、例えば、SP-Aの結合をブロック又は阻害するのに、又はSP-Aを含む複合体のエンドサイトーシス輸送を阻害するのに適切な量であり、ここで、前記SP-Aは、病原性微生物によって発現されている。複数の実施形態において、前記個体は、炎症を軽減する必要があり、そのような炎症は、個体への感染、又は外傷、又は他の侵襲、又は増加した炎症と相関する疾患(例えば、循環器疾患、慢性閉塞性肺疾患、及び癌)によって引き起こされるか、又はそれらに関連している。
【００７４】
別の側面では、本開示は、mAb又はその抗原結合性フラグメントとSP-A受容体アイソフォームとの複合体を形成することを含む。複数の実施形態において、前記複合体は、特定のアイソフォームを発現する細胞の免疫学的検出における使用のために検出されてもよく、又は、細胞を選別するための(例えば、フローサイトメトリー及び蛍光標識細胞分取(FACS)による)様々な技術において使用されることができる。複数の実施形態において、生体サンプルは個体から得られ、SP-R210Lアイソフォーム、又はSP-R210Sアイソフォーム、又はその両方を発現するマクロファージなどの細胞の存在、不存在又は量を決定するために試験される。複数の実施形態において、生体サンプルは、個体から得られ、操作されてもよい(例えば、SP-R210Lアイソフォーム、又はSP-R210Sアイソフォームを発現する細胞を枯渇させるため、又はインビボで分析及び／又は培養するために前記サンプルからそのような細胞を精製するため、又はそのような細胞の濃縮集団を提供するため)。このような方法は、SP-R210Lアイソフォーム、又はSP-R210Sアイソフォームの特異的認識に基づく適切な免疫分離技術を使用して、場合によっては、前記mAb又はそれらの抗原結合性フラグメントを使用することによって、行うことができる。複数の実施形態において、前記mAb又はそれらの抗原結合性フラグメントは、基質に付着されてもよく、及び、例えば捕捉剤として使用されることができる。
【００７５】
別の実施形態では、mAb又はそれらの抗原結合性フラグメントは、他の成分に結合されてもよく(例えば、mAb又はその抗原結合性フラグメントと他のポリペプチド配列との融合タンパク質であって、受容体へのアクセスを増加させるためにペプチド又は分子を細胞内部に侵入させる場合)、又はそれらは、治療薬、あるいは検出可能な標識として機能できる剤(蛍光標識を含むが、必ずしもこれに限定されない)と結合されてもよい。
【００７６】
複数の実施形態において、本開示は、生体外用途において前記抗体又はそれらの抗原結合性フラグメントを使用する方法を含み、これらには、養子免疫療法アプローチが含まれるが、必ずしもこれに限定されない。一実施形態では、マクロファージが個体から単離され、抗体又はそれらの抗原結合性フラグメントと接触され、所定の期間後、前記マクロファージを、それらを得た個体、あるいは他の個体に導入する。
【００７７】
一実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、獣医の目的のため、すなわち、非ヒト動物における使用のために好適である。
【００７８】
以下の実施例は本発明を説明するものであり、限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
図３に示すように、本開示は、遺伝子導入マウスのMφ内でSP-R210の条件的破壊を生じさせるためのクローニング法の図解を提供する。この図に示すように、これは、SP-R210 エクソン１のCRE-介在性逆位によって行われた。SP-R210 flox/+マウスを、CD11cCREマウスと交雑させ、逆位ノックアウト対立遺伝子を有するヘテロ接合性SP-R210-/+、及びSP-R210 flox/+子孫を産生した。SP-R210L欠損(DN)細胞株(300＆350)は、Raw264.7 Mφ中のSP-R210のドミナント・ネガティブ破壊によっても構築された。
【実施例２】
【００８０】
図４で証明するように、この開示は、SP-R210Lの欠如が、Ｍφ中でインフルエンザＡウイルス(IAV)の感染をブロックすることを実証する。パネルＡ)は、RAW 264.7 WT及びSP-R210L(DN)細胞におけるSP-R210アイソフォームのウエスタンブロット解析である。パネルＢ)は、コントロールWT及びSP-R210L(DN)細胞を、IAV PR8(H1N1株、パネルＢ上段)及びPhil82(H3N2株、パネルＢ下段)で感染させ、その後感染を進行させ、６，１２又は２４時間目に収集し、フローサイトメトリーによって感染を評価するために処理した。この目的のために、細胞を、インフルエンザ核タンパク質NPに対する抗体で染色した。染色細胞のフローサイトメトリーは、コントロール細胞中の２つのピークを識別する。左側のピークは、入ってきたウイルス及び感染の進行に伴う経時的な減少を示し、右側のピークはウイルスが増殖するにつれて核内に経時的に蓄積する新しいNPの合成を示す；NP合成のピークは、SP-R210L(DN)細胞中では減弱するか、存在せず、これはインフルエンザが、標的細胞に感染するためにSP-R210Lを利用することを示す。
【実施例３】
【００８１】
図５にて証明するように、この開示は、SP-R210Lの欠損が、IAVの結合及び内部移行に影響を与えないが、核へのNPのエンドサイトーシス輸送は、SP-R210Lが存在しない場合遮断されることを実証する。コントロール及びSP-R210L(DN)Mφを、1：1 MOIのIAV PR8で感染させた。Ａ)結合ウイルスを、NP抗体を使用するフローサイトメトリーで可視化した。Ｂ)細胞を３７℃で４時間スイッチし、NPを蛍光顕微鏡法で可視化した。核をDAPIで染色した。
【実施例４】
【００８２】
図６にて証明するように、この開示は、MφのSP-R210L-介在性IAV感染が、TNFα産生と連結していることを実証する。コントロール(上段)とSP-R210L(DN)(下段)細胞をPR8で感染させた。細胞内NP及びTNFαを、フローサイトメトリーで解析した。
【実施例５】
【００８３】
図７にて証明するように、この開示は、SP-R210L-欠損Mφ及びAMが、TLR7リガンドに過反応性であることを実証する(７Ａ)。未処理(薄いヒストグラム)又は、2μg/mLのイミキモドあるいはssRNA40で８時間インキュベートした細胞(濃いヒストグラム)。細胞内TNFαをフローサイトメトリーで解析した。肺洗浄によって収集したAMを、2μg/mLのイミキモド(７Ｂ)あるいはssRNA40(７Ｃ)で処理した。TNFαは、処理後２４時間目に、ELISAによって培地中で測定された。
【実施例６】
【００８４】
図８にて証明するように、この開示は、IAV感染が、時間依存的様式でSP-R210L発現の阻害をもたらすことを示す。(８Ａ)コントロールWT細胞をPR8で感染させ、収集し、抗-SP-R210、又はb-アクチンを用いたウエスタンブロットのために処理した。(８Ｂ)濃度測定データを、Bio-Rad Quantity Oneソフトウェアを使用して得て、グラフ化した。
【実施例７】
【００８５】
図９にて証明するように、この開示は、SP-R210L-欠損マウスがIAV感染に有意に罹患しやすいことを実証する。マウスを、マウス当たり0.75LD50のPR8で感染させた。体重(Ａ)及び生存(Ｂ)を毎日モニターした。(Ｃ)肺組織を単離し、病理組織学のためHE染色で処理した(接種後１８日)。EM：上皮細胞化成；N：好中球；BOOP：閉塞性細気管支炎性器質化肺炎
【実施例８】
【００８６】
図１０にて証明するように、この開示は、マクロファージにおけるSR-R210アイソフォーム-介在性結合及び内部移行を実証する。Ａ)SP-R210及びIAVを、感染後６時間で、(Ａ)共焦点顕微鏡、及び(Ｂ)電子顕微鏡で位置特定した。
【実施例９】
【００８７】
図１１にて証明するように、この開示は、AMにおけるSP-R210の破壊が、生体内でIAVの複製を遅らせることを実証する。マウスを、0.75LD50のPR8を用いて鼻腔内感染させた。全肺組織の総RNAを接種後３及び７日目に抽出した。ウイルスMI遺伝子のmRNAを、精製ウイルスRNAの検量線に対して、リアルタイムPCRで定量化した。
【実施例１０】
【００８８】
図１２にて証明するように、この開示は、SP-R210に対する抗体が、IAV感染を阻害することを示すフローサイトメトリーとグラフデータを提供する。この図に示すデータは、ハイブリドーマP3D7、P2H10、及びP2F8によって産生されたmAbを使用して得られた。我々は、P2F5、P6B9、及びP8F6も試験した。検出可能な活性を有するものは、図１４において、＋又は＋/−で記す。これらのデータを得るために、マクロファージを、IAV血球凝集素(HA)、ヒトパピローマウイルス(HPV)表面タンパク質に対する抗体(α)、又は、SP-R210Lに対する抗体(Ａ及びＢ)、又は、αSP-R210LとαSP-R210S抗体の組み合わせを含むハイブリドーマ培地の不存在下又は存在下で、１時間プレインキュベートした。細胞をその後、PR8で感染させ、２４時間後に感染をフローサイトメトリーで測定した。
【実施例１１】
【００８９】
図１３にて証明するように、この開示は、脱シアル化(DS)SP-Aが、IAVによるマクロファージの感染をブロックすることを実証する。このように、SP-Aは、受容体へのインフルエンザウイルスの結合を競合的に阻害する。インフルエンザはむしろSP-A上のシアル酸に結合するため、この図は、天然及び脱シアル化SP-Aは両方とも、同じ受容体、すなわちSP-R210へのインフルエンザの結合に競合することを実証する。いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、この生物学的意義は、SP-Aの多型又は変異が、インフルエンザによる破たん的な感染を可能にする受容体に対するその親和性を変化させうることである。このように、本開示に係る抗体の使用は、治療のための相当に改善された選択肢になると予期される。
【００９０】
前述したことから、SP-R210LがMΦで核へのIAVのエンドサイトーシス輸送に必要であること、SP-R210L-欠損細胞が炎症に過反応性であること、及びマウスモデルは、AM中のSP-R210Lを障害すると、IAV感染におけるSP-R210Lの有益な機能を減じ、AM以外の細胞におけるより多くのウイルス増殖を促進し、過度の肺炎症をもたらすことが明らかである。このように、いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、SP-R210Lを利用することによって、IAVは、SP-R210Lの有益な機能を減じる、機能的な「ノックダウン」を引き起こし、肺において炎症の増強をもたらすと考えられる。したがって、本開示の組成物や方法を使用して、IAVのSP-R210Lとの相互作用をブロックすることで、IAV感染及び／又はその結果生じる炎症を減じることができると予想することが妥当である。さらに、本明細書に提示する、データ、結果及び図が、多くの異なる病原体による感染の予防及び／又は治療において使用するためのmAb又はそれらの抗原結合性フラグメントの多種多様の用途を強くサポートし、さらに、炎症の調節、及び細胞集団の生体外操作、並びに診断方法のさらに広い意味においてこれらの試薬を使用する実現可能性を実証するので、本開示をIAVに限定する特別の理由はない。
【実施例１２】
【００９１】
この及び以下の実施例において、SP-R210及びMyo18Aという用語は、それぞれ、免疫細胞及び非免疫細胞のために使用される。この名前の理由は、Myo18A遺伝子が、細胞種依存性選択的スプライシングを受けることを示す実験的及び計算的な証拠に基づいている。例えば、SP-R210L及びSP-R210Sアイソフォームを産生するスプライシングに加えて、小エクソンのスプライシングは、マクロファージにおけるMyo18A特有のカルボキシ末端領域の代替形を産生する。当該技術分野で知られており、且つ、簡単に上述したように、SP-Aは、マクロファージの自然免疫機能を調節するために多様な制御及び反制御メカニズムを利用する。この開示のある実施例で、我々は、SP-R210Lアイソフォームの発現を欠くマクロファージを解析した。その知見は、SP-R210L及びSP-R210Sが、マクロファージにおける自然免疫受容体の機能と発現を調和させることを示す。このように、様々な実施形態において、本開示は、免疫応答に影響を与えるマクロファージの機能、特にマクロファージの機能と活性を調節することに関与する。この実施例は、以下の実施例で提示するデータを得るために使用された材料と方法の説明を提供し、及び、当業者に明らかであるいくつかのケースでは、前述の実施例にも関連する。
【００９２】
試薬と抗体
【００９３】
化学薬品は、Sigma-Aldrich(セントルイス、ミズーリ州)から購入した。染色された分子量マーカーは、Bio-Rad(ハーキュリーズ、カリフォルニア州)から、ウシ胎児血清(FBS)はAtlanta Biologicals(アトランタ、ジョージア州)から入手した。TNFαELISAキットは、eBioscience(サンディエゴ、カリフォルニア州)から入手した。大腸菌血清型O111:B6又はO26:B6由来のスムースリポ多糖(LPS)は、Sigma-Aldrichから入手した。RNAeasy midiキットは、Qiagen(バレンシア、カリフォルニア州)から入手した。高容量cDNA逆転写キット及びTaqMan qRT-PCR遺伝子発現アッセイは、Life Technologies/Invitrogen(カールズバッド、カリフォルニア州)から入手した。CD11c(N418)；CD11b(M1/70)；CD14(Sa2-8)；CD282(TLR-2；mT2.7)；CD284(TLR-4；UT41)；SIRPα(P84)；F4/80(BM8)；Ly-6C(HK1.4)；TNFα(MPX-XT22)、及びCD16/32 Fcブロック(93)に対する蛍光色素結合モノクローナル抗体は、eBiosciences(サンディエゴ、カリフォルニア州)から入手した。CD36(72-1)及びCD284(TLR-4；Sa15-21)抗体は、Biolegend(サンディエゴ、カリフォルニア州)から入手した。SR-AI/MSR1(クローン：268318)及びCD87(uPAR；クローン109801)抗体は、R＆D(ミネアポリス、ミネソタ州)から入手した。アイソタイプを適合させたコントロールは、eBiosciences又はR＆Dから入手した。マウスCD14、TLR-2、CD36、SR-AI/MSR1に対する非抱合型ヤギポリクローナル、及びラットモノクローナル抗-マウスCD11b(M1/70)は、R＆Dから購入した。ヒトSP-Aに対するラビットポリクローナル抗体は、標準アプローチとして使用した。SP-Bに対する抗体は、Seven Hills Bioreagents(シンシナティ、オハイオ州)から入手した。ブレフェルジンＡ、及び、細胞内サイトカイン染色のための固定/透過処理液は、eBiosciencから入手した。NF-kBサブユニットRelA(p65)、RelA(p65)S536、IRAK-1、及びIκBに対する抗体は、Cell Signalingから購入した。二次HRP-結合ロバ 抗-ヤギ抗体は、R＆Dから入手した。True blot HRP-結合抗-ラビット及びプロテインＧ-セファロースIPビーズは、eBioscience又は GE Lifesciencesから入手した。ECL化学発光キットは、Perkin Elmer(ウォルサム、マサチューセッツ州)から入手した。モノクローナル抗-SP-R210抗体の産生と精製は、他の部分で報告する。ダイナソアは、SIGMAから入手し、5-(N-エチル-N-イソプロピル)アミロライド(EIPA)とNSC23766は、Fisher Scientificを通じてSelleckChemから入手した。
【００９４】
マウス
【００９５】
WT C57BL/6マウスは、JAX Labs(バーハーバー、ミネソタ州)から購入した。SP-A-/-マウスを繁殖し、シンシナティ医科大学又はペンシルベニア州立医科大学のどちらかの地域で維持した。マウスを、マイクロアイソレーター換気ケージ中で維持し、オートクレーブ処理水と食料を自由に与えた。２つの施設におけるSP-A-/-遺伝子導入マウスは、既知のアプローチ及びC57BL/6遺伝的背景への戻し交配を使用して独立的に得られた。全ての手順は、施設の動物実験委員会に従った。
【００９６】
肺胞マクロファージの単離
【００９７】
肺胞マクロファージは、肺胞内容物を、1 mM EDTAを補充した0.5 mLのPBSを用いて、連続的に５回洗浄することによって、肺胞から単離した。肺胞マクロファージを、遠心分離によって収集し、標準技術を使用するウエスタンブロット解析のために処理した。
【００９８】
ヒトSP-Aの精製及び性質決定
【００９９】
SP-Aを、Hawgoodと共同研究者による伝統的なブタノール/オクチルグルコシド抽出法(方法１)の変法によって、又は、当該分野で既知の詳細な方法(方法２)に従って、肺胞タンパク症患者からの廃棄された治療上の肺洗浄液から単離した。SP-A標本を、pH 7.5の5 mMのヘぺス中で透析し、使用するまで−８０℃で冷凍保存した。全ての手順は、Millipore水質浄化システム(Millipore RiOs 16及びMilli-Q Biocel、抵抗＞18.2 MΩ)によるLPSフリーの水を使用した。精製SP-A中のLPSの濃度は、Limulus Amebocyte Lysate QCL-1000アッセイ(Lonza、ウォーカーズビル、マサチューセッツ州)を使用して測定した。LPSは、方法１で精製されたSP-A中では検出できなかった。方法２を使用して調製したSP-A中のLPSの濃度は、20 pg/μgタンパク質であった。タンパク質純度は、銀染色によって測定した。質量分析のために、SDS-PAGEゲルを、Invitrogen SilverQuest染色キットを用いて染色した。SP-Aとタンパク質の同時単離は、トリプシンで消化されたゲル中で行われ、タンパク質は、ペンシルベニア州立医科大学の質量分析施設で、MALDI質量分析によって特定した(図２７)。
【０１００】
細胞培養
【０１０１】
コントロール及びSP-R210L(DN)Raw264.7細胞の産生は、近年、我々によって記述されている[8]。手短に説明すると、細胞を、SP-R210(SP-R210L(DN)細胞)のカルボキシ末端領域を発現するpTriex-2ベクターを用いて安定にトランスフェクトした[6]。コントロール細胞は、空のベクターでトランスフェクトした。細胞を、10％ウシ胎児血清(FBS)を補充したRPMI中で２０〜４８時間培養した。細胞を、96ウェル皿で50,000細胞/ウェルの密度で、又は12ウェル皿で150,000〜250,000細胞/ウェルの密度で培養した。
【０１０２】
フローサイトメトリー
【０１０３】
コントロール及びSP-R210L(DN)Raw264.7細胞を、非酵素的細胞解離培地(SIGMA)を使用して剥離し、PBS中で洗浄した。細胞を、氷上で、1％ヤギ血清、0.5％BSA、及び5μg/mLのFcブロックを補充したpH 7.4のPBS中で、1×107細胞/mLの濃度で、１時間ブロックした。細胞を、氷上で３０分間、推奨濃度のモノクローナル抗体で染色した。細胞を、タンパク質又はアジドを含まないPBSで２度洗浄した。細胞を、４℃で２０分間、eBioscience e506 Fixable Viability色素で染色した。細胞を、FACSバッファー(Ca+とMg+、2％FBS、0.02％アジ化ナトリウムを含むHanks緩衝塩溶液(HBSS))で１度洗浄し、その後細胞を、室温で３０分間、100μLのeBioscience細胞内(IC)固定バッファーで固定し、その後eBioscienc透過バッファーを用いて透過処理した。細胞内サイトカイン染色のために、細胞を、設定した時点で、ブレフェルジンＡの存在下で、添加剤とともにインキュベートし、その後、フィコエリトリン(PE)結合 抗-マウスTNFαで染色した。事象は、BD FACS Calibur又はLSR IIフローサイトメーター(BD Pharmingen)のどちらかを使用して取得し、FlowJoフローサイトメトリー解析ソフトウェア(Treestar、マウンテンビュー、カリフォルニア州)を使用して解析した。
【０１０４】
エンドサイトーシス・アッセイ
【０１０５】
コントロール及びSP-R210L(DN)細胞を、12ウェルプレートに、250,000細胞/ウェルの密度で置き、２０時間RPMI/10％FBS中で培養した。細胞をその後、CD14及びTLR-4エンドサイトーシス・アッセイのために100 ng/mL又は2μg/mLのLPSでそれぞれ刺激し、刺激後０，１，２，３及び４時間目に、細胞解離バッファーを使用して収集した。細胞を、1％ヤギ血清と5μg/mLのFcブロックを含むPBS中で、室温で３０分間ブロックし、その後、PE-TLR4抗体(Biolegend)を用いたフロー染色のために、室温で３０分間処理した。阻害剤の効果をテストするために、LPSの添加の３０分前にノーマル培地中で、細胞を、ダイナミンを阻害するために80μMのダイナソア、マクロピノサイトーシスを阻害するために40μMのEIPA、又はRAC1を阻害するために100μMのNSC23766で処理した。細胞表面のCD14とTLR-4を、Cy7-結合CD14(クローンSa2-8)又はPE-結合TLR-4(クローンSa15-21)抗体を用いたフローサイトメトリーで評価した。
【０１０６】
細胞抽出液の生成及びウエスタンブロット解析
【０１０７】
培養した細胞をPBS中で洗浄し、非酵素的細胞解離培地を使用して剥離した。細胞懸濁液を、４℃で210×gで遠心分離し、凍結と解凍サイクルによって氷冷溶解バッファー中で溶解した。抽出物は直ちに使用するか、−８０℃で冷凍保存した。タンパク質は、4〜17％のSDS-PAGE勾配ゲルで分離し、セミドライ・ブロッティングによってニトロセルロースに移した。ブロットをその後、0.1％Tween20と5％脱脂粉乳を補充した、pH 7.5の、トリス緩衝生理食塩水中でブロックした。ブロットを、抗-Myo18A、CD14、SR-A、TLR-2、又はCD36抗体を用いて探査し、その後、HRP-結合抗-ラビット又は抗-ヤギ二次抗体とともにインキュベートした。結合抗体は、高感度化学発光によって可視化した。相対的なバンド強度は、GS-800 Calibrated Densitometer(Bio-Rad)及びQuantity Oneソフトウェア(Bio-Rad)を使用する濃度測定によって決定した。
【０１０８】
共焦点顕微鏡法
【０１０９】
ガラス・カバースリップ上で増殖させたマクロファージを、設定した時点で100 ng/mLのLPSで刺激し、PBSで洗浄し、4％パラホルムアルデヒドを用いて１５分後に固定し、0.3％Triton X-100/PBS中で１０分間透過処理し、その後、室温で６０分間、10％ヤギ血清/PBS中でブロックした。続いて、細胞を、ラビットp65(RelA)抗体(1:400希釈)で、次にCy3-結合抗-ラビット二次抗体(1:500希釈)で染色した。カバースリップを、DAPIを含むProlong封入剤(Life Technologies)を使用して、スライドにマウントした。蛍光標識した細胞の共焦点像は、医薬イメージングコアのペンシルベニア州立大学で、高解像度Leica 40X/1.3 Plan-Apochromat油浸レンズを使用する、 Leica AOBS SP8レーザー走査型共焦点顕微鏡(Leica、ハイデルベルク、ドイツ)を用いて、取得した。励起のために使用したレーザー線は、連続波405(DAPI用)、及び80 MHzパルス591(Cy3用)であった。これらのレーザー線は、UVダイオード、80 MHz白色光レーザー(Leica AOBS SP8 モジュール)によってそれぞれ生成し、それぞれの発光シグナルは、AOBS同調フィルターを連続的に使用して収集した。全てのイメージ及びスペクトルデータ、測定データは、高感度HyD検出器(時間ゲートオプション付)を用いて作製した。前記サンプルからの後方散乱発光シグナルは、AOBS同調フィルター(照射レーザーを除くため)、１Airy単位にセットした検出ピンホール(最適なラテラル及びアキシャル解像度を得るため)、スペクトル分散プリズム、及び最終的にはHyD検出器を通して送達された。各HyDの前のスリット幅は、各HyDが10-nmバンド幅から最大でそのシステムの全体のスペクトル・キャパシティ(400〜800 nm)に及ぶスペクトル領域を検出できるように、ソフトウェアで調節できる。この特有のオプションを使用して、スペクトル走査は、シグナル特異性を確認するために、全ての色素について行われた。共焦点像は、Imaris Softwareを使用して解析された。
【０１１０】
免疫沈降
【０１１１】
コントロール及びSP-R210L(DN)細胞を、100 mm皿中で２４時間、DMEM/10％FBS中で培養し、その後、100 ng/mLのLPSで、１０，３０，６０及び１２０分間刺激した。設定した期間後に、培地を吸引し、プレートを冷PBSで２度洗浄した。細胞をその後、氷上で３０分間、完全溶解バッファー液(1 mM MnCl2、10％グリセリン、1X 細胞シグナル伝達ホスファターゼ/プロテアーゼ阻害剤混合物を補充した、50mM Tris-HCl、pH 8.0、150mM NaCl、1％NP-40)を使用してプレート上で直接溶解し、その後、可溶化液を、1.5mLのエッペンドルフ管に集めた。可溶化液を、１５分間10,000×gで遠心分離し、上清を、沈渣を乱すことなく収集した。上清のタンパク質濃度は、BCAアッセイを使用して測定し、サンプル当たり1.5〜2.0 mgのタンパク質を、４℃で３時間、回転子上でプレ平衡化プロテインＧアガロースビーズ(Roche)とともにプレインキュベートした。ビーズを、12,000×g・１分間の遠心分離によって除去し、上清を新しい管に移した。プレ吸着した可溶化液をその後、表示の抗体又はアイソタイプ・コントロールとともに、４℃で１時間、回転子上でインキュベートし、その後、40〜50μLのプレ平衡化プロテインＧアガロースビーズ(1：1 ビーズ：ベッドボリューム)を可溶化液に添加した。サンプルを、４℃で１晩、回転子上でインキュベートした。免疫沈降産物を、１分間12,000×gで遠心分離し、上清は廃棄した。ビーズを溶解バッファー(50mM Tris-HCl、pH 8.0、150 mM NaCl、1％NP-40)中で３回洗浄し、溶解バッファーは各遠心分離後に廃棄した。最後の洗浄後、2x 尿素サンプルバッファー(50mM Tris-HCl、pH 6.8、1.6％SDS、7％グリセリン、8M 尿素、200mM DTT、0.01％ブロモフェノール・ブルー)を、ビーズに直接添加した。調製したサンプルを、室温で２０分間インキュベートし、２分間９５℃で加熱した。サンプルを１分間12,000×gで遠心分離し、タンパク質を、4〜17％のSDS-PAGEゲル上で分離し、ウエスタンブロット法で分析した。免疫沈降反応は、1.5 mg/mLのタンパク質抽出物を使用して実施した。
【０１１２】
定量的リアルタイムRT-PCR
【０１１３】
DNAase-処理mRNAを、Qiagen RNAeasyキットを使用して、コントロール及びSP-R210L(DN)マクロファージから単離した。cDNAを、製造者の手順書に従って、高容量cDNA逆転写キットを用いて合成した。手短に説明すると、1μgの精製RNAを、2μLの10X バッファー、0.8μLの25X dNTPs、2μLの10X ランダムプライマー、1μLのRNA分解酵素阻害剤、及び50Uの逆転写酵素(最終体積20μL)とともにインキュベートした。反応は、２５℃で１０分間、３７℃で２時間のインキュベートによって行い、８５℃で５分間失活した。TaqMan遺伝子発現アッセイを用いるPCR増幅前に、cDNAを５倍希釈し、SR-A、CD11b、CD36、及びCD14及び18S ribosomal[登録商標]RNAを、TaqManアッセイを用いるリアルタイムRT-PCR(qRT-PCR)によって定量した。SP-R210L mRNAは、Myo18A遺伝子のエクソン１及びエクソン２ mRNAジャンクションを含むPDZドメインを包含するプライマーを使用して測定した。エクソン１８と１９間で共通のインターナル・プライマーは、SP-R210Lと SP-R210S mRNAの両方を定量するために使用した。それぞれ20μLのqPCR反応は、10μLの2X TaqMan Gene Expression Master Mix、1μLの20X TaqMan Gene Expression Assay、及び全部で10〜40 ngのcDNAを含んだ。反応は、384-ウェル光学プレート中で、５０℃にて２分間、９５℃にて１０分間、９５℃にて１５秒間(４０サイクル)及び６０℃にて１分間でインキュベートすることによって行った。各サンプルを、テンプレート無しのコントロールとともに、三つ組で解析した。結果は、ペンシルベニア州立医科大学の機能ゲノム学コア施設で、ABI PRISM 7900HT配列検出システム(Applied Biosystems)によって、モニターし、保存した。各遺伝子のmRNAの発現は、18S rRNAで正規化した。データは、コントロール細胞と比較したSP-R210(DN)中の相対的mRNA発現として表し、これは、標準物質としてコントロール細胞中の平均△Ctを使用する２-△△Ct法を用いて計算した[57]。
【０１１４】
統計
【０１１５】
データの統計比較は、GraphPad Prism 5.0ソフトウェア(サンディエゴ、カリフォルニア州)を使用して行った。ウィルコクソン・マッチドペアｔ検定を使用するペアワイズ比較を、統計的差異を評価するために使用した。P＜0.05を有意とみなした。
【実施例１３】
【０１１６】
この実施例は、SP-R210L(DN)細胞中のSP-R210L mRNAのドミナント・ネガティブ阻害を実証する。Raw264.7マクロファージにおける、SP-R210の独特なカルボキシ末端(ct)領域、SP-R210ct[5,6]の安定な発現は、SP-R210Lの選択的なドミナント・ネガティブ(DN)阻害をもたらした。SP-R210ctアイソフォームは、１５個のアミノ酸挿入によって異なり、図１５Ａ上でSP-R210L(DN1)及びSP-R210L(DN2)と名付けられた。ウエスタンブロット法(図１５Ａ)及びqPCR解析(図１５Ｂ)は、どちらかのSP-R210ct欠失変異体の安定な発現が、SP-R210LのmRNAとタンパク質発現の両方を85％以上ブロックすることを実証する。対照的に、SP-R210S変異体の発現は、有意に減少しなかった。
【実施例１４】
【０１１７】
この実施例は、SP-R210L(DN)細胞の表面上の先天性受容体の増加したレベルを実証する。我々は、SP-R210Lの破壊が、先天性受容体の発現を変化させるかどうか分析した。以下に提示するデータは、両方のSP-R210L(DN)細胞株からの総合データを表す。図１６は、SP-R210L(DN)細胞において、SR-AとCD36の２０倍と４倍高い細胞表面レベル(図１６Ａ)、TLR-2とCD14の２〜３倍の増加(図１６Ｂ)、CD11bとCD11cの４倍及び２倍の増加(図１６Ｃ)を実証する。興味深いことに、SP-R210L(DN)細胞におけるTLR-4のレベルは、コントロールより40％低かった(図１６Ｂ)。単球マーカーLy-6CとuPARは、低レベルで発現し、コントロールとSP-R210L(DN)細胞間で差はなかった(図１６Ａ及び１６Ｂ)。マクロファージ分化マーカーF4/80は、コントロール細胞と比較して統計的に異ならなかった(図１６Ａ及び１６Ｃ)。さらに、SP-R210Lの欠損は、SIRPαの発現を変化させなかった(図１６Ｃ)。興味深いことに、SP-R210Lの欠乏は、CD11bとSR-AのmRNAレベルの４倍及び２０倍の増加をもたらした(図１６Ｄ)。CD14とCD36のmRNAレベルは、たとえ４つの受容体全ての表面発現が、SP-R210L(DN)細胞上で有意に増加したとしても、コントロール細胞と同等であった(図１６Ｄ)。CD14レベルがSP-R210L(DN)細胞中で増加したと考えて、我々は、LPSとのインキュベーション後、TNFαのレベルを測定した。コントロール及びSP-R210L(DN)細胞は、CD14を経てマクロファージ活性化を引き起こすために、100 ng/mLのスムースLPSで処理した。LPSによる負荷の４時間後の細胞内染色は、コントロールと比べて、SP-R210L(DN)1及びSP-R210L(DN)2細胞の両方においてTNFαの合成の強い増加を実証する(図１７Ａ)。同様の結果が、SP-R210L(DN)1及びSP-R210L(DN)2細胞で得られたことから、SP-R210L(DN)について記載される結果は、その後の研究における両方の細胞株からの統合データである。図１７Ｂは、SP-R210L(DN)細胞が、コントロール細胞と比べて有意に多くのTNFαを分泌したことを示し、これは、CD14のより高いレベルと一致している。スカベンジャー受容体の増加した機能活性は、SP-R210L(DN)細胞におけるSR-AとCD36のより高いレベルと一致している(図１６Ａ)。総合すれば、これらの発見は、SP-R210Lが、転写及び転写後の両方のメカニズムを通じて、先天性受容体発現と機能の内因性リプレッサーとして作用することを示す。
【実施例１５】
【０１１８】
この実施例は、SP-Aが、マクロファージにおけるSP-R210の発現を増加させることを実証する。
【０１１９】
我々は、SP-Aが、それ自身の受容体であるSP-R210の発現に影響を与えるかどうか解析した。図１８Ａは、SP-Aが、コントロール細胞において、SP-R210LとSP-R210Sの両方の発現を、25〜100μg/mLのSP-Aの範囲において濃度依存的な様式で誘発することを実証する(低濃度の5μg/mLのSP-Aによる処理は、阻害性に思えるが)。しかしながら、SP-R210Lの破壊は、SP-R210Sの発現を誘発するSP-Aの能力を減弱した（図１８Ｂ）。
【０１２０】
SP-Aが生体内でSP-R210発現を調節するかどうか決定するために、SP-R210を、WT及びSP-A-/-マウスから得た肺胞マクロファージで評価した。SP-R210Lは、肺胞マクロファージの主アイソフォームである(図１９Ａ)。注目すべきことに、SP-A-/-マウスの肺胞マクロファージは、SP-R210LとSP-R210S両方を同程度のレベルで発現するように見える。濃度測定解析は、WTマクロファージが、SP-A-/-マウスと比較して、５倍近く高いレベルのSP-R210Lを発現することを示した(図１９Ｂ)。これらの結果は、SP-AがマクロファージにおけるSP-R210発現の自己分泌制御因子であることを示唆する。
【実施例１６】
【０１２１】
この実施例は、SP-A製剤が、LPSに対するマクロファージの応答性に影響を与えることを実証する。
【０１２２】
我々は、SP-AがLPSへの炎症反応を改変するかどうか評価した。これらの研究のために、我々は、修正ブタノール/オクチルグルコシド法(SP-Am1)又は既知の技術を使用するイソプロピルエーテル/ブタノール抽出法(SP-Am2)のどちらかで精製した同じ個体の肺胞タンパク症液から得られたSP-Aを使用した；Raw264.7マクロファージを含む複数のマクロファージ系統において、SP-Am1が、マクロファージ活性化を増加することを示した一方、SP-Am2は、複数のToll様受容体の強力な拮抗剤であることを示した。コントロール及びSP-R210L(DN)マクロファージを、低濃度(5μg/mL)又は高濃度(50μg/mL)のSP-Am1に、２４時間暴露し、続いて、100 ng/mLのLPSとともにインキュベートした(図２０Ａ)。図２０Ａは、SP-Am1が、SP-R210アイソフォームの発現も増加する高濃度にて、コントロール及びSP-R210L(DN)細胞の両方においてLPSへの応答性を増加させたことを示す(図２０Ａ)。低濃度のSP-Am1単独は、効果が無かった。SP-Am1と対照的に、図２０Ｂは、SP-Am2が、両方の細胞株のLPS-誘発TNFαを阻害したことを示す。SP-Am2の効果は、50μg/mLで試験された(図２０Ｂ)。SP-Am2は測定できる濃度のLPSを含み、言い換えると、50μg/mLのSP-A量で、1 ng/mLのLPSである。この濃度にて、SP-Am2単独での処理は、同等量のLPS単独による処理と比較して、コントロール及びSP-R210L(DN)細胞の両方において、20〜30％少ないTNFαを産生し(図２０Ｂ)、これは、LPSの活性に対するSP-Am2の阻害効果と一致している。
【０１２３】
SP-Am1及びSP-Am2-処理マクロファージにおける、LPSへの異なる応答を調べるために、我々は、銀染色及び質量分析によって、同じ及び異なる個体から得たSP-A標本の純度を調べた(図２７)。既知のホルムアルデヒド/グルタルアルデヒドを使用する銀染色は、SP-Am2が、サーファクタントタンパク質Ｂ(SP-B)の分子範囲において、約8〜15 kDaの低分子量タンパク質を高濃度で同時単離することを明らかにした(図２７Ａ、Ｃ)。注目すべきことに、SP-Bはクマシーブルー染色によって検出できず、それゆえクマシーで染色されたSP-A標本は、純粋に見える。我々は、異なる３個体から得たSP-Aを使用して同様の結果を得た(図２７Ａ、Ｃ)。ウエスタンブロット解析は、両方のSP-A標本と同時単離されるSP-Bの存在を確認した(SP-Am2標本で明確に顕著であったが)(図２７Ｂ)。Invitrogenの質量分析適合性SilverQuestによる銀染色は、さらに300 kDaを超えるタンパク質種と、8〜25 kDa範囲のタンパク質を明らかにした(図２７Ｃ)。低分子量タンパク質は、SP-Am2標本で顕著であり、これは一つのSP-Am1と両方のSP-Am2標本に存在する一つのタンパク質を伴う(図２７Ｃ、バンド５及び６) 。APF-1タンパク症材料からのSP-Am1とSP-Am2におけるこれらのタンパク質バンドは、ゲル内消化され、MALDI質量分析で特定された。高分子量バンド１及び２のタンパク質は両方とも、SP-Aの既知の結合タンパク質であるgp340と特定された。バンド３は、SP-Aのフラグメントとフェリチン軽鎖(前述した、SP-A標本の混入物質)を含む。SP-Am1中のバンド４と、SP-Am2中のバンド６，７，８は全てSP-Bを含む。バンド５は、アスパルチル プロテアーゼ ナプシンＡを含む。SP-Bに加えて、バンド６及び７も、肺特異的ナプシンＡ及び核ヒストンＨ４をそれぞれ含む。ゲルのブランク部分は、タンパク質同定をもたらさなかった。分泌されたナプシンＡは、肺胞細胞上の細胞表面タンパク質を分解するかもしれないが、細胞内ナプシンＡは、肺胞タイプII表皮細胞の層状体中でpro-SPBを処理することを示した。30 kDaのバンド９は、予想通りSP-Aのみを含んでいた。全てのタンパク質は、信頼指数100で同定された。これらの研究は、SP-Aが、SP-R210Lを経てLPSへの応答性増加のためにマクロファージを刺激することを示す。しかしながら、インビトロにおいて増加又は減少した応答性をもたらすSP-A処理は、異なるSP-A標本中に同時単離される生理活性サーファクタント成分の濃度に依存しうる。
【実施例１７】
【０１２４】
本実施例は、SP-R210SがCD14共受容体であることを実証する。SP-R210が、CD14を経てLPS応答性を調節するかどうかを究明するために、我々は免疫沈降実験を行って、SP-R210がCD14と物理的に相互作用するかどうかを評価し、及び、中和抗体を使用して、LPSに対するコントロール及びSP-R210L(DN)マクロファージの応答性を評価した。我々は、SP-R210L(DN)細胞において増加しているSR-A、CD11b、CD36、及びTLR-2(図１６上部)と、SP-R210が相互作用するかどうかも究明した。これらのうち、CD11b、TLR-2、及びSR-Aは、SP-A及び／又はSP-R210と相互作用することが知られている。我々は、SP-R210L及びSP-R210Sの両方を認識するアフィニティー精製ポリクローナル抗-SP-R210抗体を使用した。図２１Ａは、コントロール及びSP-R210L(DN)細胞の両方において、CD14がSP-R210抗体とともに沈降したことを示す。共沈殿CD14は、SP-R210L(DN)細胞中で明確に多かった。興味深いことに、SR-AもSP-R210L(DN)細胞中で多く、このことは、SP-R210LがSP-R210SとSR-A間の物理的会合をコントロールすることも示唆する。対照的に、SP-R210は、コントロールでもSP-R210L(DN)細胞でも、CD36及びTLR-2と共沈せず(図２１Ａ)、これは、CD14及びSR-AとのSP-R210相互作用の特異性を示す内部標準として役立つ。モノクローナルCD11b抗体を使用する相互免疫沈降アッセイ。図２１Ｂは、CD11bが、コントロール細胞中でSP-R210Sと優先的に相互作用することを示す。興味深いことに、CD11bとSP-R210Sは、SP-R210L(DN)細胞中で共沈しなかった。ミオシン・ファミリーのメンバーとして、SP-R210は、カルボキシ末端コイルドコイル領域を経て二量体を形成すると予想される。しかしながら、部分的ではあるが、優先的な、短SP-R210S(長SP-R210Lではなく)アイソフォームとCD11bとの相互作用は、SP-R210LとSP-R210Sが、マクロファージ中でお互いとヘテロ二量体を形成しないことを示唆する。SP-R210(図２１Ａ)と同様に、CD11bは、TLR-2(図２１Ｂ)又はCD36(図示せず)と会合しなかった。SP-R210に対するモノクローナル抗体を使用する免疫沈降実験は、SP-R210sとCD14が、SP-R210L(DN)細胞中で２時間にわたるLPSを用いた細胞処理の前後に安定な複合体を形成することを示す(図２１Ｃ)。興味深いことに、LPS処理は、経時的に、免疫沈降SP-R210アイソフォームのレベルを増加させた。対照的に、コントロール細胞中の共沈殿CD14のレベルは、SP-R210L(DN)細胞中の沈殿CD14より低く、これは、SP-R210Lが、CD14とSP-R210Sとの会合をコントロールすることを示唆する(図２１Ｃ)。
【０１２５】
これらの相互作用の機能的意義を評価するために、我々は抗体を使用してLPSによるマクロファージの活性化を評価した(図２２)。細胞を、抗体で、その後100 ng/mLのLPSで４時間前処理し、細胞内TNFαを調べた。SP-R210及びCD11b抗体を用いたマクロファージの前処理は、LPS刺激コントロール細胞中でTNFα合成に影響を与えなかった。しかしながら、SR-A抗体は、SP-R210L(DN)中で、コントロール細胞と比較して約30％ほど、有意にTNFαを刺激した(図２２)。CD14抗体は、両細胞株中でTNFαを50％ブロックした。SP-R210又はSR-A抗体との併用処理は、SP-R210L(DN)細胞中でTNFα合成を阻害するCD14抗体の能力を妨げ、これは、上記免疫沈降の結果から予測される、SP-R210L(DN)細胞中のSP-R210S、CD14及びSR-A間の物理的近接と一致している。SP-R210とCD11bとの相互作用の欠如と一致して(図２１Ｂ) 、CD11b抗体は、CD14阻害効果を妨害しなかった(図２２)。総合すると、これらの結果は、SP-R210Lが、活性先天性受容体複合体(その中で、SP-R210SとSR-Aは、CD14の共受容体の役割を果たす)の形成を調節することを示唆する。
【実施例１８】
【０１２６】
この実施例は、SP-R210アイソフォームが、TLR-4の下流でNFkB活性化を調節することを実証する。
【０１２７】
LPSとCD14の結合、及びLPSのToll様受容体TLR-4への移行は、転写因子NFκBの核移行と活性化をもたらす。近位TLR-4シグナル伝達経路は、ミッドソーム(myddosome)形成と、それに続くIRAK-1の活性化と分解、及びIκBの下流リン酸化と分解に関与する。IkBの分解は、NFκB p65(RelA)サブユニットのリン酸化と核への転位を可能にする。IκB発現の回復は、NFκBシグナル伝達の終了に寄与する。それゆえ、我々は、SP-R210Lの欠如が、TLR-4シグナル伝達を変更するかどうかを判定した。図２３Ａのウエスタン分析は、IRAK1とIκB分解が、コントロール及びSP-R210L(DN)細胞間で同程度であるという動力学を実証する。IκB発現は、両方の細胞株中でLPS刺激の30分後に回復した。しかしながら、図２３Ｂ及び２３Ｃのウエスタン分析及び濃度測定分析は、セリン536でのNFκBのリン酸化が、コントロール細胞中では一過性であるが、SP-R210L(DN)細胞中では上昇したままであることを実証した。さらに、図２４Ａ及びＢの共焦点蛍光顕微鏡分析は、コントロールと比べて、SP-R210L(DN)細胞の核中でNFκBの保持が延長したことを示す。これらの結果は、SP-R210が、TLR-4活性化の初期のシグナル伝達事象に影響を与えることなく、NFκBシグナル伝達の持続時間を調節することを示す。
【実施例１９】
【０１２８】
この実施例は、SP-R210LとSP-R210Sが、CD14の異なる内部移行メカニズムを媒介することを実証する。
【０１２９】
CD14は、細胞表面又はエンドサイトーシス小胞のどちらかからの、TLR-4活性化を決定しうるTLR-4の内部移行をコントロールする。CD14は、LPSのマクロピノサイトーシス-介在性クリアランスを媒介することも知られている。我々はそれゆえ、SP-R210変異体が、CD14の輸送に影響を与えるかどうか調べた。コントロール及びSP-R210L(DN)マクロファージを100 ng/mLのLPSで処理し、CD14の内部移行を経時的にモニターした。図２５Ａは、CD14の25％が、LPS添加後２時間で細胞表面から失われ、４時間後に新しい又は再生CD14が細胞表面に回復することを実証する。対照的に、CD14はSP-R210L(DN)細胞中でより早く補充された(図２５Ｂ)；CD14の15％のみが、３０分で細胞表面から失われ、表面CD14は、細胞表面に速やかに戻って非刺激SP-R210L(DN)細胞のレベルを超えた。CD14の輸送をさらに探索するために、我々は、クラスリン及びダイナミン依存性エンドサイトーシスの阻害剤であるダイナソアの添加後に、表面CD14をモニターした。ダイナソアは、マクロファージにおける、液相エンドサイトーシス、エンドソーム再循環、及び恒常的なタンパク質分泌も阻害できる。図２５Ｂは、ダイナソアが、コントロール細胞中でCD14の内部移行をブロックしなかったことを実証し、これは、CD14のダイナソア-非感受性マクロピノサイトーシスと一致する。しかしながら、ダイナソアは、コントロース細胞中で完全に、SP-R210L(DN)細胞中で部分的に、表面CD14の補充をブロックし、これはダイナソアが、新しく合成されたCD14の分泌を阻害することを示唆する。しかしながら、ダイナソアは、SP-R210L(DN)細胞中の別個の輸送プロセスを明らかにし、これは、LPSの添加後最初の１時間にわたる内部移行と、それに続く細胞表面へのCD14の回復を特徴とする(図２５Ｂ)(これが、CD14のダイナソア-非感受性再循環又は分泌を意味するかどうかを識別するために追加の研究が必要となるが)。CD14の輸送の差は、しかしながら、TLR-4のエンドサイトーシスを損なわない(図２５Ｃ)(SP-R210L(DN)細胞におけるTLR-4の内部移行は、コントロールと比較して、LPSの１時間後に明らかになったが)。ダイナソアは、細胞内区画からのシグナル伝達を阻害するTLR-4のエンドサイトーシスをブロックすることを示した。CD14は、しなしながら、マクロピノサイトーシスを経るLPSのエンドサイトーシスを媒介することを示した。それゆえ、我々は、LPS応答の読み出し情報として細胞内TNFαを使用して、LPSへの炎症反応に対する、ダイナソアと、マクロピノサイトーシス阻害剤であるEIPAの影響を比較した。図２５Ｄは、ダイナソアとEIPAが、TNFαをそれぞれ40％及び60％阻害ししたことを示し、これは、CD14の内部移行が、コントロール細胞における炎症反応を部分的に媒介するために要求されることを示唆する。対照的に、SP-R210L(DN)細胞は、ダイナソアとEIPA両方による阻害に非感受性であった(図２５Ｄ)。従前の研究は、小GTPアーゼrac1が、マクロファージ中でマクロピノサイトーシスを媒介することを示している。したがって、小GTPアーゼrac1及びrac2の阻害剤であるNSC23766は、コントロール及びSP-R210L(DN)細胞の両方で、TNFα産生をブロックした。興味深いことに、NSC23766は、コントロール細胞と比べて、SP-R210L(DN)中でTNFαを阻害するのに有意に効率的であった(図２５Ｄ)。総合すると、これらの結果は、SP-R210LとSP-R210Sアイソフォームが、別個のマクロピノサイトーシス-様メカニズムを通じてCD14の輸送を媒介することを示唆する。
【０１３０】
前述のことから、自然免疫系の正確な制御が、呼吸器の健康に最も重要であることが理解されるであろう。先天性受容体の発現と細胞内局在は、病原体のクリアランスに合わせて炎症を調整するシグナル伝達応答の結果を決定する。本発見は、SP-A受容体であるSP-R210Lアイソフォームが、マクロファージの先天性受容体の内因性調節因子であることを実証する。
【０１３１】
我々は、SP-R210L破壊が、２〜２０倍増加した複数の先天性受容体の発現を、タンパク質(TLR-2、CD11c、CD36、及びCD14)と転写(SR-A、CD11b)レベルの両方で、もたらすことを見い出した。シグナル伝達経路に関する研究は、SP-R210SとSP-R210Lが、転写因子NFκBの活性化と不活性化をそれぞれコントロールすることを示す。さらに、我々は、SP-Aが、SP-R210アイソフォームの発現をSP-R210L-依存性様式で誘発することを確定し、これは、炎症刺激への応答性を調節するためにSP-R210アイソフォーム間のクロストークをSP-Aが媒介するという観念をサポートする。重要なことに、SP-A-/-マウスから得た肺胞マクロファージの研究は、SP-Aが、SP-R210Lの最適な発現レベルを維持するために自己分泌様式で働き、それによって、生体内で肺胞マクロファージの機能的表現型を調節することを示す。
【０１３２】
本結果は、SP-R210L-欠損細胞の又はSP-Aによるマクロファージ処理後のLPSへの増加した応答性によって示されるように、SP-R210Lがマクロファージのプライミングを調節するという示唆をサポートする。我々は、SP-Aへのマクロファージの暴露が、コントロール及びSP-R210L(DN)細胞の両方で、続くLPSの添加に対する炎症応答を増大させるためにマクロファージを刺激したことを示す。これに関連して、最近の研究は、肺胞マクロファージが炎症促進性の特徴を維持していることを示し、これは、肺胞マクロファージが、生体内で、炎症物質への応答性増加のためにすでに刺激されていることを示唆する。逆に、肺胞マクロファージはLPS及び他の炎症刺激の免疫寛容原性作用に抵抗性である。ここで、我々は、マクロファージ活性化閾値を調節する先天性受容体と、炎症刺激へ適切に応答するためのマクロファージの準備のバランスを保つために役立つかもしれない両方のSP-R210アイソフォームの発現を、SP-Aが増加したことを示す(SP-R210Lは、生体内でSP-Aによって影響される肺胞マクロファージ上の主な変異体であるが)。
【０１３３】
本開示において、我々は、たとえ複数のクラスの先天性受容体が増加するとしても、SP-R210Lの破壊が、表面TLR-4のレベルを減少させることを示す。さらに、我々は、コントロールとSP-R210L(DN)細胞間での異なるCD14の輸送メカニズムを発見し、これは、SP-R210アイソフォームが、マクロファージの機能性表現型の内因性制御因子であるという観念をサポートする。
【０１３４】
さらなるサーファクタント成分が、マクロファージのミクロピノサイトーシス応答を改変するかもしれない。インビトロ研究で使用したSP-Aの質量分光測定特性評価に基づくと、SP-A標本の抗炎症活性は、同時単離されたサーファクタントタンパク質ＢとナプシンＡの異なる濃度に一部起因しているかもしれない。同じ個体から、一般に使用されているブタノール/オクチルグルコシド法(SP-Am1)又は修正イソプロピルエーテル/ブタノール/エタノール抽出法(SP-Am2)によって調製されたSP-Aの対照比較は、後者の方法において、これらのタンパク質の濃度が高いことを明らかにした。しかしながら、SP-Am2中の同時単離SP-Bが常により多いものの(図２７Ａ〜Ｃ)、異なる個体から調製されたSP-Am1は、SP-Am2と同様、下流アッセイに影響を与えうる同時単離タンパク質を異なる濃度で含有する。既知の細胞外SP-A結合タンパク質である、gp340の存在が、生物活性SP-Aの有効濃度を制限した可能性がある(それは全ての標本で同程度の濃度で発見されたが)。我々は、SP-Am1と異なり、SP-Am2が、LPS-誘導TNFαを刺激せず、一貫して阻害することを確認した。
【０１３５】
本開示は、SP-R210とCD14の相互作用にさらに取り組んだ。SP-R210Lの破壊は、CD14取込みの別個のメカニズム(それは、LPSに応答してのマクロファージ活性化の閾値と持続時間を調節する)を明らかにした。個々の又は組み合わせの中和抗体及び免疫沈降実験を使用する機能分析によって明らかにされたように、我々は、SP-R210S、CD14、及びSR-Aが、SP-R210L(DN)細胞中で炎症促進性複合体を形成することを発見した。さらに、我々はコントロール及びSP-R210L(DN)細胞中でのCD14の異なる輸送メカニズムを示し、ここで、LPSの添加後、細胞膜へのCD14の再配置又は分泌は、コントロール細胞中ではダイナソア感受性であるが、SP-R210L(DN)細胞ではダイナソア-非感受性である。LPSによって刺激されたCD14の初期の内部移行は、ダイナミン-非依存性内部移行と一致して、ダイナソアに非感受性である。ダイナソアはしかしながら、コントロール細胞でのみ、LPS-誘導TNFαを一部阻害し、これは、TLR4ダイナミン-依存性エンドサイトーシスの阻害、及び、エンドソームTLR4による炎症反応の完全な活性化と一致する。LPSによるTNFαの誘導は、顕著なマクロピノサイトーシス阻害剤EIPAによっても、コントロール細胞中で阻害され、これは、CD14及び／又はTLR-4のマクロピノサイトーシス内部移行が、炎症反応の下流活性化のために必要とされることを示す。EIPAとダイナソアは、しかしながら、SP-R210L(DN)細胞におけるLPS応答に対する効果はなく、これは、SP-R210L発現が減弱される場合の、新規な炎症メカニズムの展開を示唆する。興味深いことに、小GTPアーゼrac1の阻害は、両方の細胞中でLPS活性化を減少させ(SP-R210L(DN)細胞中でより効率的であるが)、これは、rac1が、LPS内部移行とシグナル伝達の共通の下流エフェクターであるという観念をサポートする。rac1は、マクロピノサイトーシスを媒介する複数のGTPアーゼの一つである。他方、rac1は、TLR-4又はSR-Aの下流で、SP-R210L(DN)細胞におけるNFκBの長期の活性化に寄与しているかもしれない。
【０１３６】
特定の理論によって拘束されることを意図しないが、総合すると、本発見は、図２６に描写したモデルをサポートする。このモデルでは、SP-R210Lは、rac1シグナル伝達経路と相互作用して、CD14を経るLPSのマクロピノサイトーシスとクリアランスを強化し、エンドソームTLR-4の中程度活性化を伴う。我々は、顕性の炎症を伴わずにLPSを除去する肺胞マクロファージの能力を強化する、SP-R210Lを高レベルで維持するSP-Aの能力が、生体内におけるSP-Aの抗炎症作用のメカニズム的説明を提供することを提案する。次に、SP-R210Lは、環境内の高レベルの炎症物質に適切に応答するために、マクロファージを刺激する先天性受容体の発現と局在化を調節する。しかしながら、SP-R210L-介在性調節がない場合、LPSへの応答は、SP-R210S、CD14、及びSR-A間の炎症促進性複合体を通じて媒介され、そこで、SR-Aは、LPSのマクロピノサイトーシス-様内部移行と、rac-1シグナル伝達経路の長期活性化の原因となる。本開示はそれゆえ、SP-R210変異体の発現差異が、マクロファージの炎症表現型を決定することを示唆する。
【実施例２０】
【０１３７】
この実施例は、モノクローナル抗-SP-R210抗体が、インフルエンザ肺炎の回復を促進することを実証する。データを図２８にまとめ、体重(図２８Ａ)及び生存(図２８Ｂ)に対する効果を示す。このデータを得るために、3LD50のインフルエンザウイルスH1N1 PR8で感染させる２４時間前に、マウスに、100μgの抗体又は100μLのPBSビヒクルを腹腔内注射した。マウスの病的状態と体重を毎日モニターした。IgG1：アイソタイプ・コントロール抗体；P2H10：抗-SP-R210S抗体；P4G4：抗-SP-R210L+S抗体、１グループあたりN＝5マウス。図２８Ｂに示すように、モノクローナルSP-R210抗体は、インフルエンザ感染の致死的暴露からの生存を増進した。マウスに、3LD50のインフルエンザウイルスH1N1 PR8による感染の２４時間前に、100μgの抗体又は100μLのPBSビヒクルを腹腔内注射した。マウスの病的状態と体重を毎日モニターした。IgG1：アイソタイプ・コントロール抗体；P2H10：抗-SP-R210S抗体；P4G4：抗-SP-R210L+S抗体、１グループあたりN＝5マウス、*p＜0.04
【０１３８】
図２９に示すように、CD103+樹状細胞中のSP-R210の欠失は、IAV感染からの回復とエフェクターＴリンパ球の動員を促進した。図２９に示すデータを得るために、loxP導入SP-R210ノックイン対立遺伝子を有するマウスを、Clec9A-Creマウスと交雑し、CD103+DC中のSP-R210を妨害した。WT同腹仔コントロールと、DC SP-R210-欠損マウスに、亜致死量である0.75LD50のIAV PR8を鼻腔内感染させた。(Ａ)体重を、１４日間にわたってモニターした。各時点ごとに、グループあたりN＝4〜12マウス。感染後、３，７及び１４日目に、各グループの４匹のマウスを、肺洗浄液を得るために使用した。エフェクターＴリンパ球の数(Ｂ)とリンパ球の総数(Ｃ)は、フローサイトメトリーによって測定した。Ａ〜Ｃに示すデータは平均値±SEMである。
0006495434.tif 000002
【図１】
0006495434.tif 000003
【図２】
0006495434.tif 000004
【図３】
0006495434.tif 000005
【図４】
0006495434.tif 000006
【図５】
0006495434.tif 000007
【図６】
0006495434.tif 000008
【図７】
0006495434.tif 000009
【図８】
0006495434.tif 000010
【図９】
0006495434.tif 000011
【図１０】
0006495434.tif 000012
【図１１】
0006495434.tif 000013
【図１２】
0006495434.tif 000014
【図１３】
0006495434.tif 000015
【図１４】
0006495434.tif 000016
【図１５】
0006495434.tif 000017
【図１６】
0006495434.tif 000018
【図１７】
0006495434.tif 000019
【図１８】
0006495434.tif 000020
【図１９】
0006495434.tif 000021
【図２０】
0006495434.tif 000022
【図２１】
0006495434.tif 000023
【図２２】
0006495434.tif 000024
【図２３】
0006495434.tif 000025
【図２４】
0006495434.tif 000026
【図２５】
0006495434.tif 000027
【図２６】
0006495434.tif 000028
【図２７】
0006495434.tif 000029
【図２８】
0006495434.tif 000030
【図２９】
0006495434.tif 000031
【図３０Ａ】
0006495434.tif 000032
【図３０Ｂ】
0006495434.tif 000033
【図３０Ｃ】
0006495434.tif 000034
【図３０Ｄ】
0006495434.tif 000035
【図３０Ｅ】
0006495434.tif 000036
【図３０Ｆ】
0006495434.tif 000037
【図３０Ｇ】
0006495434.tif 000038
【図３０Ｈ】
0006495434.tif 000039
【配列表】
0006495434000001.app