(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記ＰＥＧに結合する第１の抗原結合部位と、
ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＴＡＧ−７２またはＣＤ１９のいずれかである前記標的リガンドに結合する第２の抗原結合部位と、を含み、
前記第１の抗原結合部位が、（１）配列番号２１６のＣＤＲ１配列と配列番号２１７のＣＤＲ２配列と配列番号２１８のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＬドメイン、配列番号２１９のＣＤＲ１配列と配列番号２２０のＣＤＲ２配列と配列番号２２１のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＨドメイン、または（２）配列番号２２２のＣＤＲ１配列と配列番号２２３のＣＤＲ２配列と配列番号２２４のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＬドメイン、及び配列番号２２５のＣＤＲ１配列と配列番号２２６のＣＤＲ２配列と配列番号２２７のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＨドメインを含み、
前記第２の抗原結合部位が、配列番号５、７、８、１１、１５または１６の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、ヒト化二重特異性抗体。
【請求項２】
前記第１のＶＨドメイン及び前記ｓｃＦｖ間に配置された、配列番号３の第１のＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインをさらに含む、請求項１に記載のヒト化二重特異性抗体。
【請求項３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）骨格及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記ＰＥＧに結合する第１の抗原結合部位と、
ＣＤ１９またはＨＥＲ２である前記標的タンパク質に結合する第２の抗原結合部位と、を含み、
前記第１の抗原結合部位が、配列番号２２２のＣＤＲ１配列と配列番号２２３のＣＤＲ２配列と配列番号２２４のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＬドメイン、及び配列番号２２５のＣＤＲ１配列と配列番号２２６のＣＤＲ２配列と配列番号２２７のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＨドメインを含み、
前記第２の抗原結合部位が、（１）配列番号２３の第２のＶＬ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２４の第２のＶＨ−Ｃκドメイン、あるいは（２）配列番号２６の第２のＶＬ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２７の第２のＶＨ−Ｃκドメインを含む、ヒト化二重特異性抗体。
【請求項４】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の末端メトキシまたはヒドロキシル基及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記ＰＥＧに結合する第１の抗原結合部位と、
ＨＥＲ２またはＣＤ１９である前記標的リガンドに結合する第２の抗原結合部位と、を含み、
前記第１の抗原結合部位が、配列番号２２８のＣＤＲ１配列と配列番号２２９のＣＤＲ２配列と配列番号２３０のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＬドメイン、及び配列番号２３１のＣＤＲ１配列と配列番号２３２のＣＤＲ２配列と配列番号２３３のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＨドメインを含み、
前記第２の抗原結合部位が、（１）配列番号２３の第２のＶＬ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２４の第２のＶＨ−Ｃκドメイン、あるいは（２）配列番号２６の第２のＶＬ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２７の第２のＶＨ−Ｃκドメインを含む、ヒト化二重特異性抗体。
【請求項５】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の末端メトキシまたはヒドロキシル基及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記ＰＥＧに結合する第１の抗原結合部位と、
ＨＥＲ２またはＥＧＦＲである前記標的リガンドに結合する第２の抗原結合部位と、を含み、
前記第１の抗原結合部位が、配列番号２２８のＣＤＲ１配列と配列番号２２９のＣＤＲ２配列と配列番号２３０のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＬドメイン、及び配列番号２３１のＣＤＲ１配列と配列番号２３２のＣＤＲ２配列と配列番号２３３のＣＤＲ３配列とを含む第１のＶＨドメインを含み、
前記第２の抗原結合部位が、配列番号１５または１６のヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、ヒト化二重特異性抗体。
【請求項６】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の末端メトキシまたはヒドロキシル基及び標的リガンドに対するヒト化二重特異性抗体であって、
前記ＰＥＧに結合する第１の抗原結合部位と、
ＣＤ１９またはＣＤ２０である前記標的タンパク質に結合する第２の抗原結合部位と、を含み、
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１７のヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、
前記第２の抗原結合部位が、配列番号２１の第１のＶＬ−Ｃκドメイン、及び配列番号２０の第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む、ヒト化二重特異性抗体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化二重特異性抗体、及びペグ化物質を含む医薬キットであって、前記物質がタンパク質、ペプチド、または化学療法薬もしくはイメージング剤を含有するナノ粒子のいずれかである、医薬キット。
【請求項８】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、アミフォスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、シトシンアラビノシド、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、エトポシド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、インターフェロンベータ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギン酸、ロムスチン、メクロレタミン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ミトタン、パクリタキセル（タキソール）、プリカマイシン、ペントスタチン、ストレプトゾシン、トポテカン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＳＮ３８またはその組合せのいずれかである、請求項７に記載の医薬キット。
【請求項９】
前記イメージング剤が、量子ドット（ＱＤ）、マイクロバブル造影剤、蛍光色素、キレート化された放射性同位体、常磁性鉄または金ナノ粒子である、請求項７に記載の医薬キット。
【請求項１０】
前記タンパク質がケモカインまたはサイトカインであり、前記ペプチドがロイプロリド、ゴセレリン、オクトレオチド、ヒストレリン、アバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、シレンジタイド、ＡＴＮ−１６１、またはＩＭ８６２のいずれかである、請求項７に記載の医薬キット。
【請求項１１】
癌を治療するための薬剤を調製するための医薬の組み合わせの使用であって、
前記医薬の組み合わせは、第１の量の請求項１〜６のいずれかに記載のヒト化二重特異性抗体と第２の量のペグ化物質との混合物を含み、
前記混合物が集合体を形成し、癌の治療とは癌の増殖または転移を阻害することであり、前記ペグ化物質が治療効果があり、タンパク質、ペプチド、化学療法薬を含有するナノ粒子のいずれかである、使用。
【請求項１２】
前記化学療法薬が、アドリアマイシン、アミフォスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、シトシンアラビノシド、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、エトポシド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、インターフェロンベータ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギン酸、ロムスチン、メクロレタミン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ミトタン、パクリタキセル（タキソール）、プリカマイシン、ペントスタチン、ストレプトゾシン、トポテカン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ＳＮ３８またはその組合せのいずれかである、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記タンパク質がケモカインまたはサイトカインであり、前記ペプチドがロイプロリド、ゴセレリン、オクトレオチド、ヒストレリン、アバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、シレンジタイド、ＡＴＮ−１６１、またはＩＭ８６２のいずれかである、請求項１１の使用。
【請求項１４】
前記癌が、乳癌、大腸癌、結腸癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、膵癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、卵巣癌、子宮頸癌、造血器悪性腫瘍、食道癌、腎細胞癌、扁平上皮癌、神経膠腫、及び白血病のいずれかである、請求項１１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、癌治療に関する。具体的に、本開示は新規の二重特異性抗体、及び癌の増殖または転移を抑制し、癌の発生を追跡するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質、ペプチド、及びナノ粒子（ＮＰ）（例、リポソーム、ミセルなど）などの物質にポリ（エチレングリコール）を共有結合（ペグ化）することは、薬剤の生物学的利用能を向上し、血液循環の半減期を増し、細網内皮系（ＲＥＳ）による捕捉を妨げることができる。これらの有利な特質により、卵巣及び胸部悪性腫瘍、カポジ肉腫を治療するリポソーム化ドキソルビシン（キャエリクス）、ならびに韓国で転移性乳癌、非小細胞肺癌及び卵巣癌用に承認されたＧｅｎｅｘｏｌ−ＰＭ（登録商標）（パクリタキセル搭載ＰＥＧ−ＰＬＡミセル）など、臨床用途に利用できるものを含むＮＰの開発において、ペグ化は広く使用されている。ペグ化ナノ粒子（ＰＥＧ−ＮＰ）は、ドラッグデリバリーシステムの第二世代として、治療剤またはイメージング剤の主流として高く評価されている。
【０００３】
腫瘍における内皮細胞の異常構造により引き起こされる血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果のため、ペグ化物質、特にＰＥＧ−ＮＰは腫瘍に蓄積することができる。しかし、ＰＥＧ−ＮＰは腫瘍の近くに蓄積することが多く、腫瘍塊に浸透せず、ＰＥＧ−ＮＰから癌細胞へ薬剤が拡散しにくいものがある。したがって、ＰＥＧ−ＮＰへの抗体の化学的結合は、治療効果及びイメージング感度を改善する特異的標的化、ならびに細胞内取り込みを向上することが、複数の研究により報告された。しかし、ＰＥＧ−ＮＰに抗体を化学的に連結することは困難である。多くの官能基（例えば、アミノ、カルボキシル、チオール基）がリガンドに豊富に存在し、これが抗体機能の損失を引き起こしたり、または抗体の配向性が不均一になる場合がある。これにより化学的結合後に再現可能な産物を得ることが困難になる。さらに、化学的結合はナノ担体及びカプセル型薬剤の構造を変えることもある。こうした問題は、標的ＮＰの臨床適用性を限定する。
【０００４】
上記を鑑み、従来の技術には、再現可能であり使用が容易なペグ化物質（例えば、ＰＥＧ−ＮＰ）を標的とする方法を改良する必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７，９６８，６８７号明細書Ｂ２
【特許文献２】欧州特許出願公開第２３３２９９０号明細書Ａ１
【特許文献３】欧州特許出願公開第２２５８７２６号明細書Ａ１
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｕａｎｇ  Ｋ−Ｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１０（５１）：９３３〜９４１
【非特許文献２】Ｍａｋａｂｅら、（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２８３、１１５６〜１１６６
【非特許文献３】Ｓｈａｈｉｅｄら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、５３９０７〜５３９１４
【非特許文献４】Ｃｈｕａｎｇら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｂａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７、７０７〜７１４
【非特許文献５】Ｓｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１０）２１（７）、１２６４〜１２７０
【非特許文献６】Ｋ  Ｃ  Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：９３８〜９４８，２０１１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本開示は、ヒト化二重特異性抗体、及び癌を治療するか、または癌発生を追跡するためのその使用を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本開示の第１の目的は、ＰＥＧ分子（例えば、ＰＥＧの末端メトキシもしくはヒドロキシル基、またはＰＥＧ骨格）及び標的リガンド（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＴＡＧ７２、ＣＤ１９、またはＣＤ２０）である、異なる２つのエピトープに結合する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を提供することである。本開示のＢｓＡｂは、ＰＥＧに結合する第１の抗原結合部位を含み、第１の軽鎖可変ドメイン及び第１の重鎖可変ドメインと、標的リガンド（例えば、腫瘍抗原）に結合する第２の抗原結合部位を含む。本開示のＢｓＡｂはさらに、第１の抗原結合部位及び第２の抗原結合部位間にペプチドリンカーを含むことが好ましい。任意で、第１の抗原結合部位はさらに、第１のヒンジドメインを含んでもよい。
【０００９】
標的リガンドは上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ２）、ＨＥＲ３、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）、ＣＤ１９及びＣＤ２０からなる群から選択されるタンパク質でよい。
【００１０】
いくつかの実施形態において、ＢｓＡｂの第１の抗原結合部位は、ＰＥＧ骨格に結合し、配列番号１と少なくとも９０％同一である第１のＶＬ−Ｃｋドメイン、配列番号２と少なくとも９０％同一である第１のＶＨ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号３と少なくとも９０％同一である第１のヒンジドメインを含む。一方、ＢｓＡｂの第２の抗原結合部位は、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のいずれかに結合し、配列番号５、７または８と少なくとも９０％同一である単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ペプチドリンカーは配列番号４と少なくとも９０％同一である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＰＥＧ骨格に結合し、配列番号９と少なくとも９０％同一である第１のＶＬ−Ｃｋドメイン、及び配列番号１０と少なくとも９０％同一である第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインを有する。一方、第２の抗原結合部位は、ＥＧＦＲまたはＣＤ１９に結合し、配列番号７または１１と少なくとも９０％同一であるｓｃＦｖを含む。ペプチドリンカーは配列番号４と少なくとも９０％同一である。
【００１２】
他の実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＰＥＧ骨格に結合し、配列番号９と少なくとも９０％同一である第１のＶＬ−Ｃｋドメイン、配列番号１０と少なくとも９０％同一である第１のＶＨ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２２と少なくとも９０％同一である第１のＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。一方、第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９またはＨＥＲ２に結合し、配列番号２３または２６と少なくとも９０％同一である第２のＶＬ−ＣＨ１ドメイン、配列番号２４または２７と少なくとも９０％同一である第２のＶＨ−Ｃｋドメイン、及び配列番号２５と少なくとも９０％同一である第２のＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。
【００１３】
別の実施形態において、第１の抗原結合部位は、ＰＥＧの末端メトキシまたはヒドロキシル基に結合し、配列番号１２と少なくとも９０％同一である第１のＶＬ−Ｃｋドメイン、配列番号１３と少なくとも９０％同一である第１のＶＨ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２２と少なくとも９０％同一である第１のＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。一方、第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９またはＨＥＲ２に結合し、配列番号２３または２６と少なくとも９０％同一である第２のＶＬ−ＣＨ１ドメイン、配列番号２４または２７と少なくとも９０％同一である第２のＶＨ−Ｃｋドメイン、及び配列番号２５と少なくとも９０％同一である第２のＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。
【００１４】
さらに別の実施形態において、第１の抗原結合部位は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の末端メトキシまたはヒドロキシル基に結合し、配列番号１２と少なくとも９０％同一である第１のＶＬ−Ｃｋドメイン、配列番号１３と少なくとも９０％同一である第１のＶＨ−ＣＨ１ドメイン、及び配列番号２２と少なくとも９０％同一である第１のＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを含む。一方、第２の抗原結合部位は、ＨＥＲ２またはＥＧＦＲに結合し、配列番号１５または１６と少なくとも９０％同一であるヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、第１の抗原結合部位は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の末端メトキシまたはヒドロキシル基に結合し、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一方、第２の抗原結合部位は、ＣＤ１９またはＣＤ２０に結合し、配列番号２１と少なくとも９０％同一である第１のＶＬ−Ｃｋドメイン、及び配列番号２０と少なくとも９０％同一である第１のＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む。
【００１６】
本開示の第２の目的は、転移性及び／または薬剤耐性癌を含む癌を治療するか、または癌の発生を追跡する医薬キットを提供することである。この医薬キットは、少なくとも２つ構成要素を含み、それぞれ上記二重特異性抗体、及び治療剤またはイメージング剤のどちらかであるペグ化物質である。治療剤はタンパク質、ペプチド、または化学療法薬を含有するナノ粒子のいずれかでよい。イメージング剤は、量子ドット（ＱＤ）、マイクロバブル造影剤、蛍光色素、鉄ナノ粒子、キレート化された放射性同位体または金ナノ粒子でよい。
【００１７】
実際には、医薬キットの二重特異性抗体及びペグ化物質をまず混合して集合体を形成し、その後この集合体を、癌を治療するか、または癌を追跡するために被験者に投与する。
【００１８】
したがって、本開示の第３の目的は、癌の増殖に苦しむ被験者を治療する方法を提供することである。本方法は、上記二重特異性抗体及び治療剤を含有するペグ化物質を同時または順次に、被験者の癌の増殖または転移を阻害するのに十分な量で被験者に投与する工程を含む。本方法は、上記二重特異性抗体、及び治療剤を含有するペグ化物質を混合して集合体を形成する工程と、被験者の癌の増殖または転移を阻害するのに十分な量で、この集合体を被験者に投与する工程とを含むことが好ましい。被験者への投与量は、被験者の体重１Ｋｇあたり約０．１〜５０ｍｇである。ある実施形態において、被験者への投与量は、被験者の体重１Ｋｇあたり約１〜４０ｍｇであり、好ましくは被験者の体重１Ｋｇあたり約５〜１０ｍｇである。投与量は単回投与、または２回以上少量で投与してもよい。
【００１９】
癌、好ましくはＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＴＡＧ７２、ＣＤ１９またはＣＤ２０の発現レベルが増したものは、本開示の方法により治療可能である。好ましい実施形態において、本開示の方法は、乳癌、頭頸部癌、大腸癌または卵巣癌の被験者を治療するのに有効である。
【００２０】
本開示の第４の目的は、生きている被験者の組織を撮像する方法を提供することである。本方法は、上記二重特異性抗体、及び治療剤を含有するペグ化物質を同時または順次に、被験者の組織を撮像するのに十分な量で被験者に投与する工程を含む。本方法は、（ａ）第１の十分量の本開示におけるいずれかのヒト化二重特異性抗体、及び第２の十分量のペグ化物質（例えば、量子ドット（ＰＥＧ−ＱＤ）または蛍光色素などのイメージング剤を含有するナノ粒子）を混合して集合体を形成する工程と；（ｂ）工程（ａ）の集合体を被験者に注射する工程と；（ｃ）蛍光イメージング、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）イメージング、ガンマカメライメージング、Ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、または核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により、被験者の組織を撮像する工程と、を含むことが好ましい。いくつかの実施形態によれば、ＰＥＧ−ＱＤはＣｄＨｇＴｅ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＴｅ／ＣｄＳ、ＰｂＳｅ及びＰｂＳからなる群から選択される量子ドットナノ結晶を含む。
【００２１】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細は、下記説明に記述する。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本発明または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図を含有する。カラー図面を含む本発明または公開特許公報の複製は、依頼及び必要手数料の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【００２３】
本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、以下の記述、添付の特許請求の範囲、添付図面を参照して、より理解されるであろう。
【００２４】
【図１】図１は、指示されたドメインを有するＩｇＧ抗体の模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本開示の一実施形態による、ダイマーＢｓＡｂ構造の模式図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本開示の一実施形態による、モノマーＢｓＡｂ構造の模式図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本開示の別の実施形態による、モノマーＢｓＡｂ構造の模式図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本開示の一実施形態による、「ノブインホール」ＢｓＡｂ構造の模式図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本開示の一実施形態による、交差型重鎖及び軽鎖を有する修飾された「ノブインホール」ＢｓＡｂ構造を示す模式図である。
【図３】図３は、本開示の一実施形態による、ヒト化抗ｍＰＥＧ  ＢｓＡｂを使用した癌の標的化及び治療一段階工程を示す模式図である。
【図４】図４は、本開示の一実施例による、ハイブリドーマ１５−２ｂにより分泌された抗ｍＰＥＧ抗体の固定化ＰＥＧ分子への結合を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本開示の一実施形態による、実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの構造の概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、本開示の一実施形態による、還元または非還元条件における、実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、本開示の一実施形態による、実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのウェスタンブロット分析を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、本開示の一実施形態による、ムチンに対する実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの抗原結合活性を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本開示の一実施形態による、ＢＳＡ−ＰＥＧ５，０００に対する実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの抗原結合活性を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、本開示の一実施形態による、ＢＳＡに対する実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの抗原結合活性を示す。
【図７】図７は、本開示の一実施形態による、実施例１．２のヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの癌細胞選択性を示す。
【図８Ａ】図８Ａは、本開示の一実施形態による、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ−７２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）またはＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例１．４のダイマーヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの癌細胞選択性を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、本開示の一実施形態による、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ−７２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）またはＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例１．４のダイマーヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのペグ化リポソーム化テキサスレッドとの結合活性を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、本開示の一実施形態による、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ−７２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）またはＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例１．４のダイマーヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのペグ化量子ドット（Ｑｄｏｔ６５５）との結合活性を示す。
【図９】図９は、本開示の一実施形態による、実施例２．１の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクト及び一価ＢｓＡｂの構造の概略図である。
【図１０】図１０は、本開示の一実施形態による、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ−７２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）またはＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例２．１の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂの癌細胞選択性を示す。
【図１１】図１１は、本開示の一実施形態による、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ−７２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）またはＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例２．１の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのペグ化リポソーム化テキサスレッドとの結合活性を示す。
【図１２】図１２は、本開示の一実施形態による、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ−７２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＥＧＦＲ＋）またはＢＴ−４７４（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例２．１の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂのペグ化量子ドット（Ｑｄｏｔ６５５）との結合活性を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、本開示の一実施形態による、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクト及びＢｓＡｂの構造の概略図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、本開示の一実施形態による、還元または非還元条件における、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、本開示の一実施形態による、ＮＨ２−ＰＥＧ１０，０００−ＮＨ２に対する実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂの抗原結合活性を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、本開示の一実施形態による、ＢＳＡに対する実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂの抗原結合活性を示す。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、本開示の一実施形態による、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）またはＡ４３１（ＥＧＦＲ＋）細胞における、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂのペグ化量子ドット（Ｑｄｏｔ６５５）またはペグ化リポソーム化テキサスレッドとの結合活性を示す。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、本開示の一実施形態による、ＣＨ３−ＰＥＧ５，０００−Ａｌｅｘａ６４７に対する実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂの結合動態を示す。
【図１４Ｅ】図１４Ｅは、本開示の一実施形態による、ＣＨ３−ＰＥＧ５，０００−Ａｌｅｘａ６４７に対する実施例２．２の一価ヒト化抗ＣＤ１９ＢｓＡｂの結合動態を示す。
【図１５】図１５は、本開示の一実施形態による、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋）細胞における、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂのペグ化量子ドット（Ｑｄｏｔ６５５）との細胞内活性を示す実時間画像である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、本開示の一実施形態による、Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋）における、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂによる、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す折れ線グラフである。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、本開示の一実施形態による、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＥＧＦＲ＋）における、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂによる、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す折れ線グラフである。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、本開示の一実施形態による、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋）における、実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂによる、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す折れ線グラフである。
【図１７】図１７は、本開示の一実施形態による、ＣＤ１９＋及びＥＧＦＲ＋腫瘍に対してＰＥＧ−ＮＩＲ７９７を標的とした実施例２．２の一価ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂの腫瘍画像強調を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、本開示の一実施形態による、ヒト化抗ｍＰＥＧ  ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、本開示の一実施形態による、還元または非還元条件における、実施例２．３のヒト化ＢｓＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、本開示の一実施形態による、ＳＷ４８０細胞（ＥＧＦＲ＋）（図２Ｃ）における、実施例２．３のヒト化ＢｓＡｂの指示されたＰＥＧ−ＮＰとの結合活性を示す。
【図１８Ｄ】図１８Ｄは、本開示の一実施形態による、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＨＥＲ２＋）（図２Ｄ）における、実施例２．３のヒト化ＢｓＡｂの指示されたＰＥＧ−ＮＰとの結合活性を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、本開示の一実施形態による、ＳＷ４８０細胞（ＥＧＦＲ＋）及びＳＷ６２０細胞（ＥＧＦＲ−）（図２Ｃ）における、実施例２．３のヒト化ＢｓＡｂで処理されたＰＥＧ−ＮＰの癌細胞選択性を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、本開示の一実施形態による、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＨＥＲ２−）における、実施例２．３のＰＥＧｘＥＧＦＲまたはＰＥＧｘＨＥＲ２で処理されたＰＥＧ−ＮＰの癌細胞選択性を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａは、本開示の一実施形態による、ＳＷ４８０細胞（ＥＧＦＲ＋）における、実施例２．３のＰＥＧｘＥＧＦＲによるＬｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、本開示の一実施形態による、ＳＷ６２０細胞（ＥＧＦＲ−）における、実施例２．３のＰＥＧｘＥＧＦＲによるＬｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、本開示の一実施形態による、ＳＫ−ＢＲ−３細胞（ＨＥＲ２＋）における、実施例２．３のＰＥＧｘＥＧＦＲによるＬｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、本開示の一実施形態による、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＨＥＲ２−）における、実施例２．３のＰＥＧｘＥＧＦＲによるＬｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す。
【図２１】図２１は、本開示の一実施形態による、Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０を標的化する実施例２．３のＰＥＧｘＥＧＦＲのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングである。
【図２２Ａ】図２２Ａは、本開示の一実施形態による、ＰＥＧｘＥＧＦＲ標的Ｌｉｐｏ／ＤＯＸで処置したＥＧＦＲ＋腫瘍の大きさを示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、本開示の一実施形態による、ＰＥＧｘＥＧＦＲ標的Ｌｉｐｏ／ＤＯＸで処置したＥＧＦＲ−腫瘍の大きさを示す。
【図２２Ｃ】図２２Ｃは、図２２Ａ及び２２Ｂにおける、試験動物の体重の変化を示す折れ線グラフである。
【図２３Ａ】図２３Ａは、本開示の一実施形態による、ヒト化抗ｍＰＥＧ（ｈ１５−２ｂ）抗ＣＤ１９  ＢｓＡｂ及び抗ｍＰＥＧ（ｈ１５−２ｂ）抗ＣＤ２０  ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、本開示の一実施形態による、Ｒａｊｉ細胞における、実施例２．４のＢｓＡｂの癌細胞選択性を示す。
【図２３Ｃ】図２３Ｃは、本開示の一実施形態による、実施例２．４のＢｓＡｂのｍＰＥＧ結合活性を示す。
【図２３Ｄ】図２３Ｄは、本開示の一実施形態による、実施例２．４のＢｓＡｂの二重結合活性を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａは、本開示の一実施形態による、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ１５−２ｂ）ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクト及びＢｓＡｂの構造の概略図である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、本開示の一実施形態による、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクト及びＢｓＡｂの構造の概略図である。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、本開示の一実施形態による、非還元条件における、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ１５−２ｂまたはｈ６．３）ＢｓＡｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図２５】図２５は、本開示の一実施形態による、Ｒａｍｏｓ（ＣＤ１９＋）、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）及びＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ１５−２ｂ）ＢｓＡｂの癌細胞選択性を示す。
【図２６】図２６は、本開示の一実施形態による、Ｒａｍｏｓ（ＣＤ１９＋）、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）及びＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（１５−２ｂ）ＢｓＡｂのペグ化量子ドット（Ｑｄｏｔ６５５）との二重結合活性を示す。
【図２７】図２７は、本開示の一実施形態による、Ｒａｍｏｓ（ＣＤ１９＋）、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）及びＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂの癌細胞選択性を示す。
【図２８】図２８は、本開示の一実施形態による、Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）及びＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）細胞における、実施例３．１のヒト化ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ１５−２ｂまたはｈ６．３）ＢｓＡｂのペグ化量子ドット（Ｑｄｏｔ６５５）との二重結合活性を示す。
【図２９】図２９は、本開示の一実施形態による、実施例４．１のＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図である。
【図３０Ａ】図３０Ａは、本開示の一実施形態による、ＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋）における、実施例４．１のＢｓＡｂによるＬｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、本開示の一実施形態による、Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋）における、実施例４．１のＢｓＡｂによるＬｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ−ｖｉｔｒｏ細胞毒性の増加を示す。
【図３１Ａ】図３１Ａは、本開示の一実施形態による、ＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋）における、実施例４．１のＢｓＡｂによるＬｉｐｏ／ＤＯＸの相乗的な抗癌作用を示す。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、本開示の一実施形態による、Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋）における、実施例４．１のＢｓＡｂによるＬｉｐｏ／ＤＯＸの相乗的な抗癌作用を示す。
【図３２】図３２は、本開示の一実施形態による、ＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋）における、実施例４．１のＢｓＡｂによるＬｉｐｏ／ＤＯＸの相乗的な抗癌作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
添付図面に関する以下の詳細な説明は、本実施例の説明としてのものであり、本実施例が構成または利用される形式のみを表すものではない。この記述は、実施例の機能、ならびに実施例を構成及び実施する工程の順番を明記するが、同じまたは同等の機能及び順番が、異なる実施例により行われてもよい。
【００２６】
Ｉ．定義
「抗体」という語は、広義で用いられ、具体的には所望の生物活性を示しさえすれば、すなわち、タンパク質及び／または他の分子の複合混合物における標的抗原を選択的に認識して、抗原に特異的に結合しさえすれば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、及び抗体断片を包含するものである。
【００２７】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という語は、実質的に同質の抗体の個体群から得られる抗体を指し、任意の特定の方法による抗体作製が必要であるとして構成されるものではない。通常、異なるエピトープに方向づけられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原のたった１つの決定基（例、エピトープ）に方向づけられる。本開示のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法または組換えＤＮＡ法により作製してもよい。ここで、具体的にはモノクローナル抗体は、所望の生物活性を示す限り、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定種由来、あるいはある抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応配列と同一であるか同種であり、一方、鎖の残りの部分は別種由来、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに該抗体の断片の対応配列と同一であるか同種である、「キメラ」または「組換え」抗体を含む。
【００２８】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。ヒト化抗体は、超可変領域残基をマウス、ラット、 ウサギなどの非ヒト種、または所望の特異性もしくは親和性を有する非ヒト霊長類の超可変領域残基で置き換えたヒト免疫グロブリンである。いくつかの例においては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基で置き換える。一般的に、ヒト化抗体は、すべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを実質的にすべて含む。ヒト化抗体は任意で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常ヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。
【００２９】
「単離された」抗体は、自然環境の構成要素から特定、分離及び／または回収された抗体である。自然環境の格納要素は、本発明の抗体の治療用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク性または非タンパク性溶質を挙げることができる。単離された抗体は、組換え細胞内の原位置に抗体を含む。通常、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００３０】
「二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）」という語は、少なくとも２つの異なる抗原に対する特異性を有する抗体を指す。例えば、ＢｓＡｂは、腫瘍関連抗原など、１つの抗原部位に特異性を有する１つのアームを有し、一方、他のアームは、致死剤（例えば、ＩＮＦ−αもしくはビンカアルカロイドなどの抗癌剤を含有するリポソーム）に結合したハプテン、またはイメージング剤（例えば、造影剤もしくは量子ドットもしくは蛍光色素を含有する微小気泡）など、異なる標的を認識する。好ましい実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、抗原結合部位を２つ有し、１つは腫瘍抗原（例えば、ＴＡＧ７２、ＣＤ１９、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２）に方向づけられ、もう１つは癌治療剤を含有するナノ粒子（例えば、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ）に結合する親水性ポリマー（例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＧ））に方向づけられる。
【００３１】
本明細書で用いる「価」という語は、抗体分子における特定の結合部位数の存在を指す。正確には、「一価」、「二価」、「三価」及び「四価」という語は、それぞれ抗体分子における、１、２、３、及び４個の結合部位の存在を指す。本開示のＢｓＡｂは、少なくとも「二価」であり、四価などの多価でもよい。
【００３２】
「リンカー」及び「ぺプチドリンカー」という語は、本開示では区別せずに用いられ、ポリペプチド２個を連結するための天然または合成アミノ酸残基を有するペプチドを指す。例えば、ペプチドリンカーを、ＶＨ及びＶＬを連結するのに用いて単鎖可変断片（例、ｓｃＦｖ）を形成し、またはｓｃＦｖを全長抗体に連結するのに用いて本開示のＢｓＡｂを形成することができる。好ましくは、リンカーは、少なくとも５アミノ酸残基長、例えば５〜１００アミノ酸残基長、より好ましくは１０〜３０アミノ酸残基長を有するペプチドである。ｓｃＦｖ内のリンカーは、少なくとも５アミノ酸残基長、好ましくは１５〜２０アミノ酸残基長のペプチドである。一実施例において、リンカーは、（ＧｎＳ）ｍ（Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、ｎ＝１〜４の数、ｍ＝１、２または３）の配列を含む。リンカーは、（Ｇ４Ｓ）３の配列、または（Ｇ３Ｓ）及び（Ｇ３Ｓ２）の配列を含むことが好ましい。
【００３３】
本明細書で用いる「ペグ化物質」という語は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で覆われた物質を指し、タンパク質（例、ケモカイン）、ペプチド（例、ロイプロリド）及び治療剤またはイメージング剤を含有するナノ粒子（ＮＰ）が挙げられるが、これに限定されない。ナノ粒子を作ることができる現状公知の物質は、メソポーラスシリカ、並びに構造内に治療剤（例、抗癌剤）またはイメージング剤（例、蛍光色素、量子ドット、キレート化された放射性同位体、常磁性鉄、金ナノ粒子もしくは造影剤）を含むことができるミセル構造を形成する親水性部分及び疎水性部分を有する物質が挙げられる。本開示におけるナノ粒子を形成する適当な物質としては、メソポーラスシリカ；ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、スフィンゴミエリン（ＳＰＭ）などの単独または併用して用いるリン脂質；ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリジオキサノン（ＰＤＯ）、ポリ酸無水物、ポリオルトエステル、キトサンなどの単独または併用して用いる生分解性ポリマーが挙げられるが、これに限定されない。ペグ化ＮＰなどのペグ化物質は、ミセル構造内に癌治療剤またはイメージング剤をさらに含有することが好ましい。
【００３４】
「癌」及び「腫瘍」という語は、本開示で代わりに用いられ、好ましくは、通常未制御の細胞増殖を特徴とする、哺乳動物、特にヒトにおける生理的状態を指す。この点における癌は、転移癌及び／または薬剤耐性癌が挙げられる。癌は、ＴＡＧ７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９及びＣＤ２０の発現レベルが増加したものであることが好ましい。したがって、本開示により治療可能な癌または腫瘍は、乳房、肺、結腸、大腸、脾臓、腎臓、肝臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、血液、胸腺、子宮、睾丸、頸部、及びニューロンである。より詳細には、癌は乳癌、大腸癌、頭頸部癌、結腸癌、肝癌、非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、膵癌、肺癌、胃癌、前立腺癌、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、卵巣癌、子宮頸癌、造血器悪性腫瘍、食道癌、腎細胞癌、扁平上皮癌、神経膠腫、及び白血病からなる群から選択される。
【００３５】
本明細書で用いる「治療剤」という語は、癌など被験者の病気または状態を治療、対抗、緩和、予防、または改善するために利用される薬剤を指す。したがって、癌を治療するための治療剤は、癌治療の治療効果を向上することが知られている細胞毒性剤を指すことが好ましい。したがって、本開示で用いられる細胞毒性剤としては、放射線、化学療法薬、抗体などが挙げられるが、これに限定されない。
【００３６】
本明細書で用いる「薬剤耐性癌」という語は、化学療法薬、抗体、ペプチドまたはその組合せである周知の細胞毒性剤の適用により、増殖が抑制または遅延されない癌を指す。いくつかの実施形態において、薬剤は化学療法薬である。化学療法薬の例としては、ニトロソウレア、シスプラチンまたはダカルバジンなどのアルキル化剤；葉酸、プリンまたはピリミジン拮抗薬などの代謝拮抗剤；ビンカアルカロイドなどの分裂抑制因子；細胞毒性抗生物質、及びカンプトテシン誘導体が挙げられる。好ましい化学療法薬としては、アドリアマイシン、アミフォスチン、ブレオマイシン、ブスルファン、シスプラチン、並びに／または好ましくはカルボプラチン及び／もしくはオキサリプラチンを含む他の白金化合物、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、シトシンアラビノシド、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドセタキセル、ダカルバジン、ダクチノマイシン、エトポシド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、インターフェロンベータ、イリノテカン、Ｌ−アスパラギナーゼ、Ｌ−アスパラギン酸、ロムスチン、メクロレタミン、マイトマイシン、メトトレキサート、ミトキサントロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、ミトタン、パクリタキセル（タキソール）、プリカマイシン、ペントスタチン、ストレプトゾシン、トポテカン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、並びにその組合せが挙げられる。他の実施形態において、薬剤は、ケモカイン（例、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカイン、Ｃケモカイン及びＣＸ３Ｃケモカイン）またはサイトカイン（例、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン及び腫瘍壊死因子）である。さらなる実施形態において、薬剤はペプチド、好ましくは癌細胞に対する細胞毒性効果を有するペプチドである。抗癌ペプチドは、ロイプロリド、ゴセレリン、オクトレオチド、ヒストレリン、アバレリクス、セトロレリクス、デガレリクス、シレンジタイド、ＡＴＮ−１６１及びＩＭ８６２からなる群から選択されることが好ましい。
【００３７】
本明細書で用いる「治療有効量」という語は、転移性及び／または薬剤耐性癌を含む癌の治療に関して、治療上所望の結果を得るために必要な投与量、期間での有効な量を指す。
【００３８】
「医薬的に許容される」という表現は、例えば、生理的に耐えられる、ヒトに投与したとき、急性胃蠕動、目まいなどアレルギーまたは類似の有害反応を通常引き起こさない、「一般的に安全とみなされる」分子的実体及び組成物を指す。好ましくは、本明細書で用いる「医薬的に許容される」という語は、中央政府または州政府の規制機関により承認された、あるいは動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、米国薬局方または他の一般的に承認された薬局方に記載されたことを意味する。
【００３９】
「投与された」、「投与する」または「投与」という語は、本明細書では区別せず用いられ、本開示の二重特異性抗体または組成物を直接投与する手段を指す。
【００４０】
「被験者」または「患者」という語は、本開示の組成物及び／または方法で治療可能なヒトを含む動物を指す。特に１つの性別を指示しない限りは、「被験者」または「患者」という語は、男性及び女性両方を指す。したがって、「被験者」または「患者」という語は、癌治療が有効である任意の哺乳動物を含む。「被験者」または「患者」の例としては、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及び家禽が挙げられるが、これに限定されない。典型的な実施形態において、患者はヒトである。
【００４１】
本明細書で用いる「同一である」または「同一性パーセント」という語は、最大一致のために比較し、直線に並べた時に、同じであるか、またはある特定割合の同じアミノ酸残基を有する、２つまたは複数の配列または部分列を指す。同一性パーセントを判断するため、最適比較目的で配列を並べる（例えば、第２のアミノ酸配列との最適アライメントのため、第１のアミノ酸配列の配列にギャップを入れる）。その後、対応するアミノ酸位置のアミノ酸残基を比較する。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、配列により共有される同一位置の数の関数である（例えば、同一性パーセント＝同一位置の数／位置（例えば、重複位置）の総数×１００）。ある実施形態において、２つの配列は同じ長さである。
【００４２】
他に明確に指示がない限り、本明細書では単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、複数の指示物を含むように用いられる。
【００４３】
ＩＩ．発明の説明
したがって、本開示の第１の態様は、非標的ペグ化物質を腫瘍標的ペグ化物質に変換する二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）を提供することであり、これにより癌の増殖を抑制するか、または薬剤耐性癌を含む癌の浸潤または転移を妨げる。
【００４４】
１．本開示のＢｓＡｂの構造
抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤを含むタンパク質の免疫グロブリンクラスに分けられる。血清に存在する最も豊富な免疫グロブリンはＩｇＧであり、その概略構造を図１に示す。ＩｇＧ構造は軽鎖２本及び重鎖２本の４本鎖を有し、各軽鎖は２つのドメイン、各重鎖は４つのドメインを有する。抗原結合部位は、軽鎖可変（ＶＬ）及び重鎖可変（ＶＨ）ドメイン、並びに軽鎖定常（ＣＬ）及び重鎖定常（ＣＨ１）ドメインを含有する抗原結合性断片（Ｆａｂ）領域に位置する。重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン領域は、結晶化フラグメント（Ｆｃ）領域と呼ばれる。したがって、全長抗体の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ領域（ＨＲ）、ＣＨ２及びＣＨ３からなるポリペプチドであり、ＶＨ−ＣＨ１−ＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３と略す。全長抗体の軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向のＶＬ及びＣＬに存在するポリペプチドであり、ＶＬ−ＣＬと略す。ＣＬにはκ（カッパ）またはλ（ラムダ）がある。ＩｇＧは、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメイン間と、２本の重鎖のヒンジ領域間のジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）で、共に保持された２本の重鎖を有するヘテロテトラマーとみなされる。
【００４５】
「定義」項で上記したように、ＢｓＡｂは、異なる少なくとも２つの抗原に特異性を有するＡｂを指す。したがって、本開示のＢｓＡｂは、異なる抗原に結合することができる配列を含有するように改変された組換えＡｂである。したがって、様々な組換え二重特異性抗体型が、本開示で開発されており、これらのＢｓＡｂの概略構造を図２Ａ〜２Ｅに示す。
【００４６】
いくつかの実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、４価ダイマー二重特異性抗体であり、第１の抗原に方向づけられた全長ＩｇＧの重鎖２本が、それぞれペプチドリンカーを介して第２の抗原に方向づけられた単鎖可変断片（例、ｓｃＦｖ）と融合される（図２Ａ）。ｓｃＦｖ、好ましくはジスルフィド安定化ｓｃＦｖは、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、並びにリンカーからなり、ＶＨ−リンカー−ＶＬと略す。
【００４７】
あるいは、本開示のＢｓＡｂは、二価モノマー二重特異性抗体でもよく、第１の抗原に方向づけられたＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖ＶＬ−ＣＬドメインは、第２の抗原に方向づけられたジスルフィド安定化単鎖ドメインにペプチドリンカーを介して融合さる（図２Ｂ）。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、二価モノマー二重特異性抗体であり、第１の抗原に方向づけられたジスルフィド安定化単鎖ドメインは、第２の抗原に方向づけられたモノマー抗体にペプチドリンカーを介して連結される（図２Ｃ）。
【００４９】
他の実施形態において、本開示のＢｓＡｂは、「ノブイントゥホール」構造を有し、第１の重鎖のＣＨ３ドメインにおけるノブは、数個のアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることにより作り、第２の重鎖のＣＨ３ドメインでの並列位置におけるホールは、適切なアミノ酸を別のもので置き換えることにより作る。また、システイン残基を導入して、重鎖間にジスルフィド結合を形成する。「ノブイントゥホール」ＢｓＡｂ構造の概略的な説明は図２Ｄに示す通りである。
【００５０】
さらなる実施形態において、図２Ｄに示すような「ノブインホール」ＢｓＡｂをさらに修飾し、転写中にモノマー抗体の重鎖をその軽鎖と交差する。これにより、Ｎ末端からＣ末端方向のＶＨ、ＣＬ、ヒンジ領域（ＨＲ）、ＣＨ２及びノブ−ＣＨ３に存在する修飾された抗体重鎖のヘテロポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ−ＨＲ−ＣＨ２−ノブ−ＣＨ３と略す）と、Ｎ末端からＣ末端方向のＶＬ及びＣＨ１に存在する修飾された抗体軽鎖のヘテロポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１と略す）を作る。図２Ｅはこの修飾された「ノブイントゥホール」ＢｓＡｂ構造の模式図であり、１つのモノマー抗体重鎖がその軽鎖と交差し、他のモノマー抗体構造は変わらない。
【００５１】
２．抗体調製
本開示のＢｓＡｂを調製する方法を実施例に記載する。ヒト化ＢｓＡｂを調製するため、非ヒト（例えば、マウス）抗体を調製し、初期物質として用いる。関連技術を以下の項で簡単に記載する。
【００５２】
２．１  マウス抗ｍＰＥＧ抗体の作製
所望のモノクローナル抗体を作製するため、まずマウス、ラットまたはウサギなどの動物に、適当な量のｍＰＥＧ誘導体化タンパク質（つまり、ＰＥＧ分子が末端メトキシ基を有する）分子またはＰＥＧ誘導体化タンパク質（つまり、ＰＥＧ分子が末端ヒドロキシル基を有する）で免疫を与える。一般に、ｍＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体化タンパク質で動物に免疫を与える場合、アジュバント及びｍＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体化タンパク質溶液を共に混合する。本発明に有用なアジュバントの例としては、完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）、不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）及び水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。一般に、免疫は主に抗原の静脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射により行われる。免疫間隔は特に限定されない。免疫は、数日から数週間隔、好ましくは２〜３週間隔で、１〜１０回、好ましくは２〜５回行ってよい。免疫の結果、１０００倍に希釈した血清サンプル中の抗体力価が、吸光度レベルで２以上に達すれば、動物を約１か月間放置する。
【００５３】
その後、再免疫を少なくとも１回行う。最後の免疫後数日、好ましくは３〜５日で、脾細胞及び所属リンパ節を除去する。血液サンプルを免疫後一定間隔で取り、遠心分離にかけて血清を分離する。その後、得られた血清を任意の適当な方法により、抗体力価を測定する。適当な方法としては、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、または放射免疫測定法（ＲＩＡ）が挙げられるが、これに限定されない。好ましい一実施例において、抗体力価はＥＬＩＳＡにより測定する。その後、ｍＰＥＧまたはＰＥＧ由来タンパク質アイソフォームに対して高い抗体力価を示す動物に最後の免疫を行う。
【００５４】
抗体産生細胞を免疫動物の脾細胞及び所属リンパ節などから調製する。抗体産生細胞の調製では、組織残屑及び赤血球をできる限り除去することが好ましい。この目的のために、市販の赤血球除去剤を用いてもよい。あるいは、塩化アンモニウムトリス緩衝液を調製し、用いてもよい。
【００５５】
このようにして調製した抗体産生細胞を、骨髄腫細胞などの不死細胞と直ちに融合して、抗体を産生しながら半永久的に増殖し続けるハイブリドーマ細胞を作製する。マウスなどの動物由来の一般に入手可能な細胞株を使用できる。本発明で使用するのに好ましい細胞株は、効果的に融合し、安定した高いレベルの抗体産生を支持し、ヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含有するＨＡＴ選択培地に感受性があり、抗体産生細胞と融合する場合のみ、生存するものである。骨髄腫細胞の例としては、マウス骨髄腫細胞系（骨髄腫ＦＯ細胞など）及びヒト骨髄腫細胞系（Ｋａｒｐａｓ７０７Ｈなど）が挙げられるが、これに限定されない。
【００５６】
通常、約２００〜２０，０００ダルトンの平均分子量を有するＰＥＧなどの細胞融合プロモーターの存在下、脾細胞またはリンパ節細胞を市販の骨髄腫細胞と混合することにより、細胞融合を行う。あるいは、電気融合などの電気刺激を利用する市販の細胞融合装置で細胞融合を行ってもよい。融合後、得られた細胞を希釈し、ＨＡＴ培地で培養する。
【００５７】
その後、関心の対象となるハイブリドーマを融合細胞から選択する。ＨＡＴ培地で培養された生存する融合細胞はコロニーを形成する。その後、各培養ウェルの上清を採取し、ｍＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体化タンパク質に対する抗体力価の有無を調べる。確認方法としては、ＥＬＩＳＡ、ＥＩＡまたはＲＩＡを用いてもよく、ＣＨ３−ＰＥＧ７５０−ＮＨ２またはＮＨ２−ＰＥＧ３０００−ＮＨ２をプレートにコートし、スクリーニング基準として用いる。抗体陽性ウェルを確認すると、細胞をアミノプテリンを含有しないＨＴ培地で培養する。しばらく培養後、培地上清の抗体力価を再度確認する。その後、最後に選択する細胞をクローニングして、単一の細胞を得る。ｍＰＥＧまたはＰＥＧ由来タンパク質に高い特異性を示すクローンを選択し、ある程度増殖して、ハイブリドーマを確立する。
【００５８】
本開示の好ましい実施形態によれば、Ｅ１１、１５−２ｂ及び６−３の３つのハイブリドーマを選択した。１５−２ｂハイブリドーマは、ＰＥＧの骨格ではなく、末端メトキシまたはヒドロキシル基に特異的に結合する抗ｍＰＥＧモノクローナル抗体を産生した。一方、Ｅ１１及び６−３ハイブリドーマは、ＰＥＧの末端メトキシまたはヒドロキシル基ではなく、骨格に結合する抗ＰＥＧ骨格モノクローナル抗体を産生した。
【００５９】
いくつかの実施形態において、抗ｍＰＥＧモノクローナル抗体がペグ化ナノ粒子と結合すると、抗ｍＰＥＧ Ａｂによる空間均一性のため、抗ＰＥＧ骨格モノクローナル抗体ではなく抗ｍＰＥＧモノクローナル抗体が選択される。他の実施形態において、抗ｍＰＥＧモノクローナル抗体ではなく、抗ＰＥＧ骨格モノクローナル抗体が選択される。
【００６０】
このようにして作製した抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧモノクローナル抗体を、任意の公知の方法により単離または調製してもよい。例えば、低血清濃度の培地でハイブリドーマを培養することにより得られた培養上清から、抗体を調製することができる。あるいは、ハイブリドーマを動物の腹腔に注射し、得られた腹水を採取して抗体を調製してもよい。アフィニティカラム、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどを利用する方法により、抗体を精製または単離してもよい。これらの公知の方法のいずれかを適切に選択するか、または併用すればよい。
【００６１】
あるいは、抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧモノクローナル抗体をＤＮＡクローニングにより作製してもよい。抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ ｍＡｂをコードするＤＮＡを、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いるなど、従来の手順を使用して簡単に単離及び配列決定できる。ハイブリドーマ細胞（例えば、Ｅ１１、６−３または１５−２ｂハイブリドーマ）は、該ＤＮＡの好ましい供給源として働く。単離すると、ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、その後これを免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞で所望のモノクローナル抗体を合成する。
【００６２】
その後、このように作製したモノクローナル抗体及び該抗体をコードするＤＮＡ用いて、キメラ抗体（例えば、二重特異性抗体）、ヒト化抗体及び／またはこれから誘導した抗体断片を作製することができる。
【００６３】
２．２  ヒト化抗ｍＰＥＧ（１５−２）または抗ＰＥＧ（Ｅ１１または６．３）抗体の作製
非ヒト由来モノクローナル抗体の主要な懸案事項は、レシピエントに対する免疫原性であり、危険なアレルギー反応を引き起こすことがある。多くのモノクローナル抗体はマウス由来のものであり、ヒトに注射されたとき、免疫原性を有することがわかっている。本発明の抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ ｍＡｂの免疫原性を低減するため、ヒト抗体の定常領域にマウス抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ Ａｂの重鎖及び軽鎖の可変ドメインを接続することにより、ヒト化抗体を作製する。
【００６４】
ヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ抗体を作るため、該抗体をコードするＤＮＡを、２．１項で上述した方法に従って単離及び配列決定した後、これを用いてヒト化コンストラクトを作る。詳細な作製方法は、実施例に記載する。
【００６５】
本開示の好ましい実施形態によれば、ＣＤＲ（相補性決定領域）移植を利用し、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子におけるＣＤＲ領域を、適切なＣＤＲコーディング断片（ＰＥＧ結合に関与するアミノ酸断片をコードする抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ ＡｂのＤＮＡ断片など）で置き換える。したがって、結果として生じる抗体は、ＣＤＲのみが最初のマウス抗体由来であり、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のフレームワーク領域、並びに定常領域遺伝子（つまり、ＣＫまたはＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、ヒトＩｇＧのものである可変領域を有する。
【００６６】
好ましい実施形態において、ヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ Ａｂは、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む。ヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ Ａｂが作製されると、クロスフローろ過、アフィニティカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過などを含む、当技術分野の標準的な手順に従って精製してもよい。ヒト化抗体は、マウス抗ｍＰＥＧ Ａｂと同一または実質的に類似の方法で機能することを理解すべきである。好ましくは、ヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ Ａｂ（Ｆａｂまたは全長ＩｇＧのいずれかの形状）は、マウス型と比べて、ヒトの被験者に使用するのにより有益である。いくつかの実施形態において、ヒト化抗ｍＰＥＧ Ａｂを本開示の二重特異性抗体の作製に用いる。他の実施形態において、ヒト化抗ＰＥＧ Ａｂを本開示の二重特異性抗体の作製に用いる。
【００６７】
２．３  二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＡｂ）の作製
ＢｓＡｂを作製するため、第２．２項で上述したヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ Ａｂ（Ｆａｂまたは全長ＩｇＧのいずれかの形状）を、癌標的効果を与えるために、腫瘍抗原に結合する抗体またはｓｃＦｖとさらに連結する。詳細な作製方法は実施例に記載する。
【００６８】
一般に、ヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ配列の重鎖及び軽鎖を含む、上記ヒト化抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ ＡｂのＤＮＡ配列を、リンカーを用いて腫瘍抗原と結合する所望の抗体またはｓｃＦｖのＤＮＡ配列とライゲートした後、キメラ配列を宿主細胞をトランスフェクションするための発現ベクターにクローニングし、続いて第２．２項で上述した類似工程に従って精製する。その後、このように作製したＢｓＡｂを、イメージングシステムの補助のもと、癌の治療または癌の発生追跡のために用いてもよい。
【００６９】
結果的に、ペグ化分子及び腫瘍抗原の両方に対して二重特異性を有するヒト化モノマー及びダイマー抗体を作製する。腫瘍抗原としては、ＴＡＧ７２、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ１９及びＣＤ２０が挙げられるが、これに限定されない。
【００７０】
いくつかの実施形態において、ＰＥＧｘＥＧＦＲ（抗ＰＥＧ抗ＥＧＦＲ）、ＰＥＧｘＴＡＧ７２（抗ＰＥＧ抗ＴＡＧ７２）及びＰＥＧｘＨＥＲ２（抗ＰＥＧ抗ＨＥＲ２）を含むモノマーＢｓＡｂを、ｈＥ１１ Ｆａｂ断片由来の抗ＰＥＧ部分を用いて作製する。別の実施形態において、モノマーｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ（抗ＰＥＧ抗ＥＧＦＲ）及びｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９（抗ＰＥＧ抗ＣＤ１９）を、ｈＥ１１ Ｆａｂの代わりにｈ６．３Ｆａｂを、ＥＧＦＲまたはＣＤ１９に対するｓｃＦｖと融合して作製する。さらなる実施形態において、モノマーｈ１５−２ｂ  ＦａｂｘＥＧＦＲ ｓｃＦｖ（抗ＰＥＧ抗ＥＧＦＲ）、ｈ１５−２ｂ ＦａｂｘＨＥＲ２ ｓｃＦｖ（抗ＰＥＧ抗ＨＥＲ２）を、ｈ１５−２ｂ Ｆａｂを、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２に対するｓｃＦｖと融合して作製する。またさらなる実施形態において、モノマーｈ１５−２ｂ  ｓｃＦｖｘＣＤ１９ Ｆａｂ（抗ＰＥＧ抗ＣＤ１９）及びｈ１５−２ｂ ｓｃＦｖｘＣＤ２０ Ｆａｂ（抗ＰＥＧ抗ＣＤ２０）を、ｈ１５−２ｂ ｓｃＦｖを、ＣＤ１９またはＣＤ２０に対するＦａｂと融合して作製する。
【００７１】
他の実施形態において、ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ（抗ＰＥＧ抗ＥＧＦＲ）、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２（抗ＰＥＧ抗ＴＡＧ７２）及びＰＥＧ２ｘＨＥＲ２（抗ＰＥＧ抗ＨＥＲ２）を含むダイマーＢｓＡｂを作製する。モノマーＢｓＡｂと違い、各ダイマーＢｓＡｂは、腫瘍抗原（例、ＴＡＧ７２、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２）と結合するｓｃＦｖに連結した各重鎖を有する全長ＩｇＧを含む。さらに、本開示のＰＥＧｘＥＧＦＲ、ＰＥＧｘＨＥＲ２及びＰＥＧｘＴＡＧ７２のモノマーＢｓＡｂは、それぞれの構造にＨＲ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインを保持しない点で、ダイマー型における同等のもの（すなわち、ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ、ＰＥＧ２ｘＨＥＲ２及びＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２）とは異なる。
【００７２】
さらにいくつかの他の実施形態において、「ノブインホール」ＢｓＡｂを作る。これは、抗体の重鎖、特に２つの重鎖のＣＨ３ドメインをコードするＤＮＡ配列が、２つの重鎖のそれぞれのＣＨ３ドメインの接続部分に、特定及び相補的な相互作用を導入するように設計される。例えば、第１の重鎖のＣＨ３ドメインにおいて、数個のアミノ酸を別のアミノ酸で置換して「ノブ」構造を作り、第２の重鎖のＣＨ３ドメインにおける数個のアミノ酸を変更して「ホール」を作り、これらのＤＮＡ配列から発現した抗体の重鎖が、第１の組のみまたは第２の組のみの組み合わせを形成せず、「ノブインホール」重鎖の組を形成するようする。このノブインホール技術は、当業者に周知であり、本開示のＢｓＡｂを形成するのに容易に適用できる。また、「ノブインホール」ＢｓＡｂをさらに、 抗体重鎖及び抗体軽鎖を交差することにより修飾してもよく、これによりＮ末端からＣ末端方向のＶＨ、ＣＬ、ヒンジ領域（ＨＲ）、ＣＨ２及びノブ−ＣＨ３に存在する抗体重鎖のヘテロポリペプチド（ＶＨ−ＣＬ−ＨＲ−ＣＨ２−ノブ−ＣＨ３と略す）を作り、Ｎ末端からＣ末端方向のＶＬ及びＣＨ１に存在する抗体軽鎖のヘテロポリペプチド（ＶＬ−ＣＨ１と略す）を作る。
【００７３】
したがって、一特定の実施形態において、「ノブインホール」抗ｍＰＥＧ抗ＣＤ１９ＢｓＡｂを作製する。具体的には、Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗの２つの点突然変異を、１つのｈ１５−２ｂ（抗ｍＰＥＧ）重鎖のＣＨ３領域に導入してノブ構造を作る。一方、Ｓ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖのさらに４つの点突然変異を、１つのＢＵ１２（抗ＣＤ１９）重鎖のＣＨ３領域に導入して、ホール構造を作製する。それぞれの重鎖にノブ及びホール構造を作ることに加えて、Ｂｕ１２−ホール重鎖をさらに、その軽鎖と交差させることにより修飾して、上記ヘテロ重鎖ポリペプチド及びヘテロ軽鎖ポリペプチドを作製する。したがって、Ｙ字型ｈ１５−２ｂノブ／Ｂｕ１２−ホールＢｓＡｂの各アームはそれぞれ、異なる抗原、すなわち、ペグ化分子及びＣＤ１９を認識する。一特定の実施形態においては、Ｙ字型ｈ１５−２ｂノブ／ＨＥＲ２−ホールＢｓＡｂの２本のアームがそれぞれ、ペグ化分子及びＨＥＲ２を認識するｈ１５−２ｂノブ／ＨＥＲ２−ホールＢｓＡｂを提供する。
【００７４】
本開示のＢｓＡｂの成分及びそれぞれのアミノ酸配列を表１〜１３にまとめる。
【００７５】
表１  ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２のアミノ酸配列
【００７６】
【表１】
0006447887.tif 000002
0006447887.tif 000003
【００７７】
表２  ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲのアミノ酸配列
【００７８】
【表２】
0006447887.tif 000004
0006447887.tif 000005
【００７９】
表３  ＰＥＧ２ｘＨＥＲ２のアミノ酸配列
【００８０】
【表３】
0006447887.tif 000006
0006447887.tif 000007
【００８１】
表４  ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲのアミノ酸配列
【００８２】
【表４】
0006447887.tif 000008
0006447887.tif 000009
【００８３】
表５  ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のアミノ酸配列
【００８４】
【表５】
0006447887.tif 000010
0006447887.tif 000011
【００８５】
表６  ｈ１５−２ｂ  ＦａｂｘＨＥＲ２  ｓｃＦｖのアミノ酸配列
【００８６】
【表６】
0006447887.tif 000012
0006447887.tif 000013
【００８７】
表７  ｈ１５−２ｂ  ＦａｂｘＥＧＦＲ  ｓｃＦｖのアミノ酸配列
【００８８】
【表７】
0006447887.tif 000014
0006447887.tif 000015
【００８９】
表８  ｈ１５−２ｂ  ｓｃＦｖｘＣＤ１９  Ｆａｂのアミノ酸配列
【００９０】
【表８】
0006447887.tif 000016
0006447887.tif 000017
【００９１】
表９  ｈ１５−２ｂ  ｓｃＦｖｘＣＤ２０  Ｆａｂのアミノ酸配列
【００９２】
【表９】
0006447887.tif 000018
0006447887.tif 000019
【００９３】
表１０  １５−２ｂノブ／Ｂｕ１２ホールのアミノ酸配列
【００９４】
【表１０】
0006447887.tif 000020
0006447887.tif 000021
【００９５】
表１１  １５−２ｂノブ／抗ＨＥＲ２ホールのアミノ酸配列
【００９６】
【表１１】
0006447887.tif 000022
0006447887.tif 000023
【００９７】
表１２  ｈ６．３ノブ／ＢＵ１２ホールのアミノ酸配列
【００９８】
【表１２】
0006447887.tif 000024
0006447887.tif 000025
【００９９】
表１３  ｈ６．３ノブ／抗ＨＥＲ２ホールのアミノ酸配列
【０１００】
【表１３】
0006447887.tif 000026
0006447887.tif 000027
【０１０１】
３．医薬キット
本開示の第２の態様は、転移性及び／または薬剤耐性癌を含む癌を治療または撮像するための医薬キットを提供することである。この医薬キットは、少なくとも２つの構成要素を含む。第１の構成要素は本開示のＢｓＡｂであり、第２の構成要素はペグ化物質であり、ペグ化物質内に癌治療剤（例えば、ビンカアルカロイド）またはイメージング剤（例えば、造影剤を含有する微小気泡または量子ドット）を含む。通常、各構成要素はそれぞれ別の容器に含有される。好ましくは、第１及び第２の構成要素はそれぞれ、乾燥固体状で、または生理学的に許容される水性担体の懸濁液として容器中に存在する。このキットは、注射前に乾燥構成要素を再構成するための生理食塩水など、生理学的に許容される水性担体を任意で含んでもよい。２つ構成要素を、それぞれの担体で別々に再構成した後、混合し、集合体を形成する。これを被験者に（例えば、注射により）投与する。
【０１０２】
４．癌の標的化、治療一段階法
したがって、本開示の第３の態様は、転移性及び／または薬剤耐性癌を含む癌の標的化及び治療一段階法を提供することである。本方法は第３項に記載した医薬キットを利用しており、第２項に記載した単離したヒト化抗ＰＥＧ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）をペグ化物質と混合して、集合体を形成し、被験者に投与する。あるいは、第２項に記載したヒト化ＢｓＡｂをまず、被験者（例えば、ヒト）に注射し、その後ペグ化物質を注射する（データ図示せず）。
【０１０３】
図３は、本開示の医薬キット３００の使用により、癌の標的化及び治療一段階工程を示す概略図である。本医薬キット３００は、ヒト化抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂ３１０及びペグ化物質３２０を含む。ヒト化抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂ３１０は、その構造内に癌治療剤を含有するペグ化物質３２０に選択的に結合する第１の抗原結合部位３１１と、腫瘍抗原３４０などの標的タンパク質に選択的に結合する第２の抗原結合部位３１２から構成される。本実施形態において、ペグ化物質３２０はリポソームまたはミセルとして示し、リポソームまたはミセル構造内に癌治療剤３２１、及びリポソームまたはミセルの表面から伸びる複数のＰＥＧ分子３２２を有することを特徴とする。ペグ化物質３２０に結合すると、ＢｓＡｂ３１０の第１の抗原結合部位３１１は、ＢｓＡｂ３１０にペグ化物質３２０の表面から外側に第２の抗原結合部位３１２を配置させる。これにより、非標的ペグ化物質３２０を腫瘍細胞標的ペグ化物質に変換する。
【０１０４】
実際には、一段階の標的化及び治療目的を達成するため、ヒト化抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂ３１０をペグ化物質３２０と混合して、集合体３３０を形成した後、集合体３３０を直ちに被験者（例えば、図３に描写したようなヒト３６０）に（例えば、注射により）投与する。
【０１０５】
したがって、本開示の第３の態様は、癌の治療方法を提供することである。本方法は、本開示のＢｓＡｂ及び癌治療剤を含有するペグ化物質を、被験者の癌の増殖または転移を阻害するのに十分な量で被験者に投与する工程を含む。被験者への投与量は、約０．１〜５０ｍｇ／被験者の体重Ｋｇである。ある実施形態において、被験者への投与量は、約１〜４０ｍｇ／被験者の体重Ｋｇであり、例えば１０〜３０ｍｇ／被験者の体重Ｋｇである。投与量は、単回投与、あるいは少量を２回以上投与できる。
【０１０６】
本開示のＢｓＡｂ及びペグ化物質を、受動もしくは電気泳動的輸送などの経口、経鼻、経肺、経皮、または例えば、直腸、デポ剤、皮下、静脈内、筋肉内、鼻腔内、小脳内、点眼剤もしくは軟膏である非経口など、適切または所望の作用部位にペグ化物質を含有する癌治療剤を効果的に輸送できる任意の手段により、哺乳類、特にヒトに投与することができる。当然のことながら、被験者に所望の反応を引き出すため、選択される癌治療剤、投与経路、及びペグ化物質と併用されるＢｓＡｂの能力だけでなく、緩和される病状または状態の重症度、患者の年齢、性別、体重、患者の様子、治療する病態の重症度、併用投薬または患者が従う特別食などの要因、及び当業者が認識する他の因子のため、また適切な投与量は結局のところ担当医の裁量であり、本開示の投与量は被験者によって変わる。治療反応を改善するため、投薬計画を調節してもよい。また、治療有効量は、治療に有益な効果が癌治療剤の任意の有毒または有害作用を上回るものである。好ましくは、症状の数及び／または重症度が低下するように、ある投与量、ある期間で本開示のＢｓＡｂ及びペグ化物質を投与する。
【０１０７】
５．標的組織の撮像方法
本開示の第４の態様は、生きている被験者の組織、特に癌の組織を撮像する方法を提供することである。また、本方法は、第２項に記載の単離したヒト化抗ＰＥＧ二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）をペグ化物質と混合して集合体を形成し被験者に投与する、第３項に記載した医薬キットを利用している。
【０１０８】
本方法は、（ａ）第１の十分量の本開示におけるヒト化ＢｓＡｂ及び第２の十分量のペグ化量子ドット（ＰＥＧ−ＱＤ）または蛍光色素を含有するペグ化リポソームを混合して集合体を形成する工程と；（ｂ）工程（ａ）の集合体を被験者の体部に注射する工程と；（ｃ）蛍光イメージング、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）イメージング、Ｘ線イメージング、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、または核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）により被験者の体部を撮像する工程とを含む。ＰＥＧ−ＱＤは、ＣｄＨｇＴｅ、ＣｄＳｅ、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＣｄＴｅ／ＣｄＳ、ＰｄＳｅ及びＰｂＳからなる群から選択される量子ドットナノ結晶を含む。
【０１０９】
次に、本発明を、限定するためではなく説明するための以下の実施形態を参照して、より詳細に説明する。
【実施例】
【０１１０】
材料及び方法
細胞及び動物
本開示では、乳癌細胞系ＭＣＦ−７、ヒトＴリンパ球細胞系Ｊｕｒｋａｔ、卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３、類表皮癌細胞系Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５５５）、Ｂリンパ球細胞系Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ８６）、悪性黒色腫細胞系Ａ−３７５、２９３ＦＴ細胞、Ｂリンパ芽球細胞系Ｒａｍｏｓ（ＣＤ１９＋）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５９６）、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）、ＳＷ６２０ヒト結腸癌細胞、ヒト乳腺癌細胞系ＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２＋）、ヒト乳腺癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＢＡＬＢ３Ｔ３細胞、及びＧＰ２−２９３レトロウイルスパッケージング細胞を用いた。一般に、細胞を１０％ウシ胎児血清（ハイクローン、ユタ州ローガン）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン添加ダルベッコ改変イーグル培地（シグマ、米国ミズーリ州セントルイス）で、空気中３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養した。同じ補助剤を含有するが１０％ウシ血清源を有するＲＰＭＩ−１６４０で、Ａ４３１、Ｒａｊｉ及びＲａｍｏｓ細胞を増殖した。
【０１１１】
メスＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（６〜８週齢）を国家実験動物センター（台湾台北市）から得た。動物実験はすべて、施設のガイドラインに則って行われ、中央研究院生物医学科学研究所の実験動物施設及び病理委員会により承認された。
【０１１２】
マウス抗ＰＥＧ抗体（Ａｂ）の作製
抗ＰＥＧ  Ａｂを分泌するハイブリドーマ細胞を、上記のようにメスＢＡＬＢ／ｃマウスをｍＰＥＧ由来タンパク質またはＰＥＧ由来タンパク質で免疫を与えることにより作製した（Ｓｕら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１０）２１（７）、１２６４〜１２７０）。その後、ハイブリドーマをＥＬＩＳＡにより選別した。具体的には、９６ウェルプレートを、５μＬ／ウェルの０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３／Ｎａ２ＣＯ３中、１μｇ／ウェルのＣＨ３−ＰＥＧ７５０−ＮＨ２、ＮＨ２−ＰＥＧ３０００−ＮＨ２（シグマアルドリッチ）、またはＣＨ３−ＰＥＧ５０００−ＮＨ２で３７℃で３時間コートした後、２００μＬ／ウェルの希釈緩衝液（ＰＢＳ中２％スキムミルク）で、４℃で一晩ブロッキングした。５０μＬの２％スキムミルク中、段階的濃度の抗体を室温で１時間プレートに加えた。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で３回、ＰＢＳで２回洗浄した。５０μＬ希釈緩衝液中のＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＭμ鎖（２μｇ／ｍＬ）またはＨＲＰ結合ロバ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ（２μｇ／ｍＬ）を１時間加えた。プレートを洗浄し、ペルオキシダーゼ活性を１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（バイオレジェンド、カリフォルニア州サンディエゴ）を室温で３０分間加えることにより測定した。停止緩衝液（２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４、５０μＬ／ウェル）添加後、吸光度（４０５ｎｍ）を読んだ。選択したハイブリドーマを、１５％ウシ胎児血清（ハイクローン）添加ＨＴ培地（シグマアルドリッチ）を用いて、胸腺細胞であるフィーダー細胞を含有する９６ウェルプレートにおいて、限界希釈により３回クローニングした後、Ｅ１１、６−３及び１５−２ｂの３つのハイブリドーマ細胞を作製した。Ｅ１１及び６−３は抗ＰＥＧ骨格Ａｂを分泌し、一方１５−２ｂは抗ｍＰＥＧ  Ａｂを分泌した。
【０１１３】
ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２、ＰＥＧ２ｘＨＥＲ２、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ及びｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＤＮＡプラスミドの構築
抗ＰＥＧＦａｂまたはＩｇＧを基にしたＢｓＡｂを作製するため、抗ＰＥＧ抗体のマウスＶＬ及びＶＨドメインをＥ１１、６−３及び１５−２ｂハイブリドーマ細胞からそれぞれ調製したｃＤＮＡからクローニングした。抗ＰＥＧ（ｈＥ１１、ｈ６−３）及び抗ｍＰＥＧ（ｈ１５−２ｂ）抗体のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインを、Ｅ１１、ｈ６−３及び１５−２５の軽重鎖可変領域遺伝子の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡ配列を、ヒトＩｇＧ  ＶＬ及びＶＨ遺伝子のフレームワーク領域に移植することにより作製し、残りのヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子をコードするＤＮＡ配列と融合した。
【０１１４】
ヒトＩｇＧ１のＣｋ、ＣＨ１及び部分ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）の定常ドメインを、表１４のプライマーを用いて抽出したヒトＰＢＭＣ  ｃＤＮＡからクローニングした。
【０１１５】
表１４  ヒトＣＨ１、Ｃｋ及びＦｃ断片をクローニングするためのプライマー
【０１１６】
【表１４】
0006447887.tif 000028
【０１１７】
ヒト化可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨ）及びヒト抗体定常ドメイン（Ｃｋ、ＣＨ１またはヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）をオーバーラップＰＣＲにより連結した。この目的のため、すべてのヒト化ＶＬ断片をＰＣＲにより増幅させて、表１５のプライマーを用いて、Ｃ末端に部分Ｃκ断片を導入した。
【０１１８】
表１５  ヒト化Ｅ１１、６−３、１５−２ｂ抗ＰＥＧ断片のＶＬドメインをクローニングするためのプライマー
【０１１９】
【表１５】
0006447887.tif 000029
【０１２０】
ＶＬ−部分Ｃｋ及びＣｋ断片を、再びオーバーラップＰＣＲにより連結して、表１４及び１５に上記したＶＬドメインの順方向プライマー及びＣκ逆方向プライマーを用い、ＶＬ−Ｃｋ断片を作製した。
【０１２１】
同様に、全ヒト化ＶＨ断片をＰＣＲにより増幅して、表１６に示すプライマーを用いて、Ｃ末端に部分ＣＨ１断片を導入した。
【０１２２】
表１６  ヒト化Ｅ１１、６−３、１５−２ｂ抗ＰＥＧ断片のＶＨドメインをクローニングするためのプライマー
【０１２３】
【表１６】
0006447887.tif 000030
【０１２４】
ＶＨ−部分ＣＨ１、ＣＨ１及びＦｃ断片を、オーバーラップＰＣＲにより連結して、表１４及び１６に上記したＶＨドメインの順方向プライマーと、ＣＨ１及びＦｃ逆方向プライマーを用いて、ＶＨ−ＣＨ１またはＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３断片を作製した。
【０１２５】
ｈＢＵ１２  ｄｓＦｖ  ＤＮＡ断片を、米国特許第７，９６８，６８７号明細書Ｂ２（全体を参照により本明細書に組み込む）に記載のｈＢＵ１２のＶＨ及びＶＬ配列を基に、アセンブリＰＣＲにより合成した。ＰＣＲは以下の通り、９５℃３分；９５℃３０秒、６３〜５３℃のタッチダウン、１分（毎サイクル１℃低下）、７２℃１分の１０サイクル；９５℃３０秒、５３℃１分、７２℃１分の２５サイクル；７２℃１０分で行った。ＶＨ及びＶＬ断片を、表１７に記載したＰ１及びＰ２２プライマーを用いて、連結及び増幅した。１１Ｆ８  ｄｓＦｖ  ＤＮＡ断片を、欧州特許出願公開第２３３２９９０号明細書Ａ１（全体を参照により本明細書に組み込む）に記載の１１Ｆ８のＶＨ及びＶＬ配列を基に、アセンブリＰＣＲにより合成した。ＰＣＲは上記のように実施した。ＶＨ及びＶＬ断片を、表１８に記載した、それぞれＰ２３〜Ｐ３４プライマー及びＰ３５〜Ｐ４４プライマーを用いて、アセンブリＰＣＲにより作製した。ｈＣＣ４９  ｓｃＦｖ及びＤＮＳ  ｓｃＦｖ  ＤＮＡ断片を、我々の以前の研究（Ｋ  Ｃ  Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２：９３８〜９４８，２０１１）に記載したプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅した。Ｃ６ＭＬ３−９  ｄｓＦｖプラスミドの作製を、欧州特許出願公開第２２５８７２６号明細書Ａ１に記載した。次に我々は、表１９に記載のプライマーを用いてＰＣＲにより、ＳａｌＩ−リンカー−ＭｆｅＩ−ｈＢＵ１２  ｓｃｄｓＦｖ−ＭｌｕＩ−６ｘＨｉｓ−ＣｌａＩを作製し、表２０に記載されたプライマーを用いてＰＣＲにより、ＭｆｅＩ−リンカー−１１Ｆ８  ｄｓＦｖ−ＭｌｕＩ、ＭｆｅＩ−リンカー−ＤＮＳ  ｄｓＦｖ−ＭｌｕＩ及びＭｆｅＩ−リンカー−ｈＣＣ４９  ｄｓＦｖ−ＭｌｕＩを作製した。
【０１２６】
表１７  ｈＢＵ１２  ｄｓＦｖをクローニングするためのプライマー
【０１２７】
【表１７】
0006447887.tif 000031
0006447887.tif 000032
0006447887.tif 000033
0006447887.tif 000034
【０１２８】
表１８  １１Ｆ８  ｄｓＦｖをクローニングするためのプライマー
【０１２９】
【表１８】
0006447887.tif 000035
0006447887.tif 000036
【０１３０】
表１９  ＳａｌＩ−リンカー−ＭｆｅＩ−ｈＢＵ１２  ｓｃＦｖ−ＭｌｕＩ−６ｘＨｉｓ−ＣｌａＩをクローニングするためのプライマー
【０１３１】
【表１９】
0006447887.tif 000037
【０１３２】
表２０  ＭｆｅＩ−リンカー−１１Ｆ８  ｄｓＦｖ−ＭｌｕＩ、ＭｆｅＩ−リンカー−ＤＮＳ  ｄｓＦｖ−ＭｌｕＩ及びＭｆｅＩ−リンカー−ｈＣＣ４９  ｄｓＦｖ−ＭｌｕＩをクローニングするためのプライマー
【０１３３】
【表２０】
0006447887.tif 000038
【０１３４】
さらなるサブクローニングのため、ｐＬＮＣＸ−ＳｆｉＩ−ｍＡＧＰ３  ＶＬ−Ｃｋ−ＸｈｏＩ−Ｆ２Ａ−ＢｇｌＩＩ−ｍＡＧＰ３  ＶＨ−ＣＨ１−ＳａｌＩ−ｅＢ７−ＣｌａＩプラスミドをテンプレートとして用いた。これらＳｆｉＩ−ＶＬ−Ｃｋ−ＸｈｏＩまたはＢｇｌＩＩ−ＶＨ−ＣＨ１−ＳａｌＩまたはＢｇｌＩＩ−ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＳａｌＩ断片を、適した制限酵素で消化することにより、上記テンプレートＤＮＡプラスミドにサブクローニングして、ｐＬＮＣＸ−ＳｆｉＩ−抗ＰＥＧ  ＶＬ−Ｃｋ−ＸｈｏＩ−Ｆ２Ａ−ＢｇｌＩＩ−抗ＰＥＧ  ＶＨ−ＣＨ１−ＳａｌＩ−ｅＢ７−ＣｌａＩまたはｐＬＮＣＸ−ＳｆｉＩ−抗ＰＥＧ  ＶＬ−Ｃｋ−ＸｈｏＩ−Ｆ２Ａ−ＢｇｌＩＩ−抗ＰＥＧ  ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３−ＳａｌＩ−ｅＢ７−ＣｌａＩプラスミドを作製した。さらに、単鎖可変断片（ｓｃＦｖまたはｓｃｄｓＦｖ）を、ＳａｌＩ及びＣｌａＩまたは続いてＭｆｅＩ及びＣｌａＩ酵素消化を用いて、これらのプラスミドにサブクローニングした。
【０１３５】
１５−２ｂノブ／Ｂｕ１２ホール、１５−２ｂノブ／抗ＨＥＲ２ホール、ｈ６．３ノブ／Ｂｕ１２ホール、及びｈ６．３ノブ／抗ＨＥＲ２ホール用ＤＮＡプラスミドの構築
ノブイントゥホールＢｓＡｂを構築するため、ｈ１５−２ｂまたはｈ６．３のＶＨ−ＣＨ１を修飾ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインと融合して、ｈ１５−２ｂ−ノブまたはｈ６．３−ノブの重鎖をアセンブリＰＣＲにより形成した。フーリン−２Ａ（Ｆ２Ａ）由来の配列、及びｈ１５−２ｂまたはｈ６．３の軽鎖配列が次に続く重鎖配列を、ＮｈｅＩ及びＰｍｅＩ制限部位の使用により、レンチウイルスベクターのｐＬＫＯＡＳ３Ｗ−ｈｙｇ（ＲＮＡｉ  ｃｏｒｅ、台湾台北中央研究院）にクローニングした。我々は、ＣＨ１の位置及びヒンジ領域の修飾と併せて、免疫グロブリンドメイン交差手法を採用して、ＢＵ１２−ホール及びα−ＨＥＲ２−ホールを作製した。簡単に述べると、重鎖のＮ末端で融合したヒトインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タグタンパク質を有するＶＨ−部分ＣＨ１−Ｃｋ−部分ヒンジを、ヒトＩｇＧ１のＣＨ２−ＣＨ３ドメインと融合して、新しい重鎖を形成する。α−ＨＥＲ２  ＡｂまたはＢＵ１２のＶＬ−ＣＨ１−部分ヒンジ配列を、Ｆ２Ａ配列により新しい重鎖配列に連結し、レンチウイルスベクターのｐＬＫＯＡＳ３Ｗ−ｐｕｒ（ＲＮＡｉ  ｃｏｒｅ、台湾台北中央研究院）に、ＳｆｉＩ及びＰｍｅＩ制限部位を用いて、クローニングした。クローニングに用いたプライマーを表２１に示した。
【０１３６】
表２１  ノブイントゥホールＢｓＡｂをクローニングするためのプライマー
【０１３７】
【表２１】
0006447887.tif 000039
0006447887.tif 000040
0006447887.tif 000041
0006447887.tif 000042
【０１３８】
１５−２ｂ  ＦａｂｘＨＥＲ２  ｓｃＦｖ、１５−２ｂ  ＦａｂｘＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、１５−２ｂ  ｓｃＦｖｘＣＤ１９  Ｆａｂ、及び１５−２ｂ  ｓｃＦｖｘＣＤ２０  Ｆａｂ用ＤＮＡプラスミドの構築
抗ｍＰＥＧ抗体のＶＬ−Ｃｋ及びＶＨ−ＣＨ１ドメインを１５−２ｂハイブリドーマのｃＤＮＡからクローニングし、以前述べたように（Ｃｈｕａｎｇ  Ｋ−Ｈら、Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．２０１０（５１）：９３３〜９４１）ヒト化した。ヒト化抗ｍＰＥＧのＶＬ及びＶＨ断片をアセンブリポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により合成し、それぞれ特異なＢｇｌＩＩ、ＳａｌＩ、ＳｆｉＩ、及びＸｈｏＩ制限酵素部位で、レトロウイルスベクターのｐＬＮＣＸ−抗ＰＥＧ−ｅＢ７にサブクローニングした。１５−２ｂ  Ｆａｂ配列をクローニングするプライマーを表２２に挙げる。ヒト抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖを、ｈ５２８Ｆｖ  ＤＮＡ配列を基にクローニングした（Ｍａｋａｂｅら、（２００８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２８３、１１５６〜１１６６）。したがって、ｈ５２８Ｆｖ  ＤＮＡ配列をアセンブリＰＣＲにより作製した。抗ＥＧＦＲのＶＨ及びＶＬのクローニングに用いるプライマーを表２３に挙げる。その後、Ｍｆｅ−ａｈＥＧＦＲ  ＶＬプライマー、ａｈＥＧＦＲ  ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）２プライマー、（Ｇ４Ｓ）２−ａｈＥＧＦＲ  ＶＨプライマー及びａｈＥＧＦＲ  ＶＨ−ストップ−Ｃａｌプライマーを用いて、配列の前にｍｙｃタグ及び１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）３可動性リンカーを含有するヒト抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦＶを作った。
【０１３９】
ヒト抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ及び抗ＤＮＳ  ｓｃＦｖを、それぞれｐＢｕｂ−ＹＣＭＣプラスミド（Ｓｈａｈｉｅｄら、（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９、５３９０７〜５３９１４）及びｐＬＮＣＸ−ＤＮＳ−Ｂ７（Ｃｈｕａｎｇら、（２００６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｂａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７、７０７〜７１４）からクローニングした。ヒト抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ及び抗ＤＮＳ  ｓｃＦｖをクローニングするためのプライマーを、それぞれ表２４及び表２５に挙げる。ｍｙｃタグ及び１５アミノ酸（ＧＧＧＧＳ）３可動性リンカーを、抗ｍＰＥＧ  Ｆａｂ及びｓｃＦｖ遺伝子間に配置して、ｐＬＮＣＸ−ＰＥＧｘＥＧＦＲ、ｐＬＮＣＸ−ＰＥＧｘＨＥＲ２及びｐＬＮＣＸ−ＰＥＧｘＤＮＳのプラスミドを、ＳａｌＩ及びＣａｌＩ制限酵素部位を用いて作製した。
【０１４０】
表２２  ｈ１５−２ｂ  Ｆａｂ配列をクローニングするためのプライマー
【０１４１】
【表２２】
0006447887.tif 000043
0006447887.tif 000044
0006447887.tif 000045
【０１４２】
表２３  ｈ５２８（抗ＥＧＦＲ）ｓｃＦｖのクローニング用プライマー
【０１４３】
【表２３】
0006447887.tif 000046
0006447887.tif 000047
0006447887.tif 000048
【０１４４】
表２４  Ｃ６ＭＬ３−９（抗ＨＥＲ２）ｓｃＦｖのクローニング用プライマー
【０１４５】
【表２４】
0006447887.tif 000049
【０１４６】
表２５  ｈ１５−２ｂ ｓｃＦｖのクローニング用プライマー
【０１４７】
【表２５】
0006447887.tif 000050
【０１４８】
ヒト抗ＣＤ１９のＶＨ及びＶＬをクローニングするプライマーを表２６に挙げる。その後、クローニングしたヒト抗ＣＤ１９のＶＨ及びＶＬ配列（表１３）を、ｈ１５−２ｂ  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列と融合させて、ＰＥＧｘＣＤ１９のＢｓＡｂを発現するＤＮＡコンストラクトを作製した。同様に、ヒト抗ＣＤ２０のＶＨ及びＶＬを表２７に挙げたプライマーによりクローニングし、その後クローニングしたヒト抗ＣＤ２０及び抗ＣＤ２２配列をｈ１５−２ｂ  ｓｃＦｖのＤＮＡ配列と融合して、それぞれＰＥＧｘＣＤ２０及びＰＥＧｘＣＤ２２のＢｓＡｂを発現するコンストラクトを作製した。
【０１４９】
表２６  ｈＨＢ１２ｂ（抗ＣＤ１９）のＶＬ及びＶＨのクローニング用プライマー
【０１５０】
【表２６】
0006447887.tif 000051
0006447887.tif 000052
0006447887.tif 000053
【０１５１】
表２７  Ｆ２Ｆ（抗ＣＤ２０）のＶＬ及びＶＨのクローニング用プライマー
【０１５２】
【表２７】
0006447887.tif 000054
0006447887.tif 000055
0006447887.tif 000056
【０１５３】
組換えＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２、ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ、ＰＥＧ２−ＨＥＲ２、ＰＥＧｘＴＡＧ７２、ＰＥＧｘＥＧＦＲ及びＰＥＧｘＨＥＲ  ＢｓＡｂの作製
ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２及びＰＥＧ２ｘＤＮＳ  ＢｓＡｂを安定して分泌するＣＨＯ−Ｋ１／ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２及びＣＨＯ−Ｋ１／ＰＥＧ２ｘＤＮＳ細胞を、ＣＨＯ−Ｋ１チャイニーズハムスター卵巣細胞のレトロウイルス形質導入により作製した。ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２、ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ、ＰＥＧ２−ＨＥＲ２、ＰＥＧｘＴＡＧ７２、ＰＥＧｘＥＧＦＲ及びＰＥＧｘＨＥＲ  ＢｓＡｂを、対応するプラスミドを用いた２９３ＦＴ細胞の一過性トランスフェクションにより作製した。ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９及びｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ  ＢｓＡｂを安定して分泌した２９３ＦＴ／ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９及び２９３ＦＴ／ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ細胞を、レンチウイルス形質導入により作製した。組換えレンチウイルス粒子を、１０ｃｍ培養皿（培養密度９０％）で増殖した２９３ＦＴ細胞において、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ、ウィスコンシン州マディソン）（４５μＬ）を用いて、ｐＡＳ３ｗ．Ｐｐｕｒｏ−ｐＡＳ３ｗ．Ｐｐｕｒｏ−ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９及びｐＡＳ３ｗ．Ｐｐｕｒｏ−ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ（７．５μｇ）を、ｐＣＭＶΔＲ８．９１（６．７５μｇ）及びｐＭＤ．Ｇ（０．７５μｇ）と、共トランスフェクションすることによりパッケージングした。４８時間後、レンチウイルス粒子を採取し、超遠心分離（ベックマンＳＷ４１Ｔｉ超遠心スイングバケットロータ、５０，０００ｇ、１．５時間、４℃）により濃縮した。レンチウイルス粒子を５μｇ／ｍＬポリブレン含有培養培地に懸濁し、０．４５μｍフィルタでろ過した。２９３ＦＴ細胞をウイルス感染の１日前に６ウェルプレートに播種（１ｘ１０５細胞／ウェル）した。レンチウイルス含有培地を細胞に添加した後、１．５時間遠心分離した（５００ｇ、３２℃）。細胞をピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）で選択して、安定細胞株を作製した。これらの抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂを、ＴＡＬＯＮカラムでアフィニティクロマトグラフィにより精製した。簡単に述べると、培地を７〜１０日ごとに、ＣＥＬＬｉｎｅ接着性細胞用１０００バイオリアクター（インテグラバイオサイエンス社、スイス）から採取した。ポリヒスチジンタグＢｓＡｂを、Ｃｏ２＋−ＴＡＬＯＮカラム（ＧＥヘルスケアライフサイエンス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で精製した。カラムを５倍ベッド体積の結合緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸塩／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）の後、１０倍ベッド体積の洗浄緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸塩／５ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で洗浄した。これらのポリヒスチジンタグＢｓＡｂを溶出緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ／２０ｍＭリン酸塩／１５０ｍＭイミダゾール／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で溶出した。溶出したタンパク質をセファデックスＧ−２５で脱塩し、ＰＢＳで平衡化し、限外ろ過により濃縮した。タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質定量法（ピアス、米国イリノイ州ロックフォード）により判断した。
【０１５４】
ＰＥＧｘＥＧＦＲ、ＰＥＧｘＨＥＲ２及びＰＥＧｘＤＮＳのＢｓＡｂの作製
所望のＢｓＡｂを作製するため、ＢＡＬＶ  ３Ｔ３プロデューサー細胞を、上記本発明のプラスミドでトランスフェクションし、続いてＭｏＦｌｏ（登録商標）ＸＤＰ（ベックマンコールター社、カリフォルニア州ブレア）で、ＦＡＣＳにより４℃で分類した後、１％ＣＣＳ  ＤＭＥＭを含むＣＥＬＬｉｎｅ（インテグラバイオサイエンス社、スイスツィツァース）で培養した。培養培地採取後、ＢｓＡｂをｍＰＥＧアフィニティクロマトグラフィにより精製した。ｍＰＥＧアフィニティクロマトグラフィは、３６ｍｇのｏ−（２−アミノエチル）−ｏ’−メチルポリエチレングリコール７５０（フルカ−シグマアルドリッチ、ミズーリ州セントルイス）を１ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）４Ｂ（ＧＥヘルスケア、英国リトルチャルフォント）に結合することにより生成した。この手順をＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）４Ｂ（ＧＥヘルスケア）の取扱説明書に従って行った。
【０１５５】
ノブインホールＢｓＡｂの精製
ＢｓＡｂを安定して発現する２９３ＦＴ細胞を、開始細胞数５ｘ１０７で、１０％低ウシＩｇＧ培地（血清をプロテインＡレジンで前吸収した）を含むＤＭＥＭで、ＣＥＬＬｉｎｅ接着性細胞用１０００（インテグラバイオサイエンス社、スイスツィツァース）を用いて培養した。培養上清を毎週採取した。集めた上清を８００ｇ、１０分４℃で遠心分離して細胞を除去し、続いて１５０００ｒｐｍ、２５分４℃で遠心分離して細胞残屑を除去した。その後、上清をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で、０．４５μＭフィルタ及びＧ２５カラムを通過させ、最後にプロテインＡセファロースを用いてＢｓＡｂをアフィニティ精製した。プロテインＡ精製後、ＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）４Ｂの１ｇあたり３５ｍｇのメチル−ＰＥＧ１０００−ＮＨ２を結合させたＣＮＢｒ活性化セファロース（登録商標）４Ｂ（シグマアルドリッチ化学社、米国ミズーリ州セントルイス）を用いたアフィニティクロマトグラフィにより、精製物をさらに精製した。続いて、精製したＢｓＡｂをピアス抗ＨＡアガロース（サーモサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州）を用いたアフィニティクロマトグラフィによりさらに精製した。精製したＢｓＡｂ画分を３回１０００倍体積のＰＢＳに対して透析し、アミコンウルトラ（３０ｋＤカットオフ）（ミリポア）を用いて濃縮した。
【０１５６】
精製ＢｓＡｂの分析
ＢｓＡｂ（ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２、ＰＥＧ２ｘＤＮＳ、ｍＰＥＧｘＥＧＦＲ、ｍＰＥＧｘＨＥＲ２、ｍＰＥＧｘＤＮＳ、１５−２ｂ／ＢＵ１２、ｈ６．３／ＢＵ１２、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ及びｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＢｓＡｂなど）５マイクログラムを、還元または非還元条件下、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した後、クマシーブルーで染色した。
【０１５７】
ＥＬＩＳＡ  
ＢｓＡｂの抗ＰＥＧ結合特異性を、５０μＬの２％スキムミルク中、段階的濃度のＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２、ＰＥＧ２ｘＤＮＳ、ｈＣＣ４９  ｓｃＦｖ、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲまたはｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９を、ムチン、ＢＳＡ−ＰＥＧ５０００、ＮＨ２−ＰＥＧ３ｋ−ＮＨ２またはＢＳＡでコートしたプレートに室温で１時間加えることにより測定した。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で３回洗浄した。５０μＬ希釈緩衝液中のＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ（２μｇ／ｍＬ）またはＨＲＰ結合ヤギＩｇ抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ（２μｇ／ｍＬ）（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルベニア州ウェストグローブ）を含むウサギ抗６ｘＨｉｓ（２μｇ／ｍＬ）を１時間室温で加えた。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ）で３回、ＰＢＳで２回洗浄した。結合ペルオキシダーゼ活性を、１５０μＬ／ウェルのＡＢＴＳ基質溶液（バイオレジェンド、カリフォルニア州サンディエゴ）を３０分間室温で加えることにより測定した。ウェルの吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、カリフォルニア州メンローパーク）で測定した。
【０１５８】
フローサイトメーター分析
ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２または対照のＰＥＧ２ｘＤＮＳのＢｓＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）を、Ａ−３７５（ＴＡＧ７２−）、ＭＣＦ−７（ＴＡＧ７２＋）、Ｊｕｒｋａｔ（ＴＡＧ７２＋）またはＯＶＣＡＲ−３（ＴＡＧ７２＋）細胞と４℃で３０分、続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンの第２抗体（２μｇ／ｍＬ）（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）またはＦＩＴＣ標識４アームＰＥＧ（２μｇ／ｍＬ）と培養した。また、ペグ化化合物の腫瘍特異的標的化を、０．０５％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（染色緩衝液）中、１０μｇ／ｍＬのｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲまたはｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＢｓＡｂでＡ４３１（ＥＧＦＲｈｉｇｈ）及びＲａｊｉ（ＣＤ１９ｈｉｇｈ）細胞系を４℃で３０分染色することにより調べた。細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。染色緩衝液中のＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５（８ｎＭ）（インビトロジェン、ニューヨーク州グランドアイランド）またはＰＥＧ−リポソーム化テキサスレッド（１００ｎｍサイズ、５０μＭ、液体濃縮）（フォーミュマックスサイエンティフィック、カリフォルニア州パロアルト）を、３０分間４℃で細胞に加えた。Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋）またはＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋）を、１０μｇ／ｍｌのｈ１５−２ｂ−ノブ／ＢＵ１２−ホール、ｈ１５−２ｂ−ノブ／抗ＨＥＲ２−ホール、ｈ６−３−ノブ／ＢＵ１２−ホールまたはｈ６−３−ノブ／抗ＨＥＲ２−ホールのＢｓＡｂと培養、洗浄し、０．２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧまたは１０ｎＭメトキシ−ＰＥＧ  Ｑｄｏｔ６５５と４℃で３０分間培養した。冷ＰＢＳで洗浄後、１０４生存細胞の表面蛍光をＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーター（ベクトンディッキソン、米国カリフォルニア州マウンテンビュー）で測定した後、Ｆｌｏｗｊｏ（ツリースター社、米国カリフォルニア州サンカルロス）で分析した。
【０１５９】
ＢｓＡｂ標的ナノ粒子の共焦点顕微鏡検査
ＰＯＣチャンバのカバースリップ（３０ｍｍ）を、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍＬのポリ−Ｌ−リシンで３０分間室温でコートした。カバースリップをＰＢＳで２回洗浄した後、Ａ４３１（ＥＧＦＲ＋）腫瘍細胞を５ｘ１０４細胞／チャンバでカバースリップ上に播種した。Ａ４３１細胞を１μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２及び１００ｎＭのＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）Ｒｅｄ  ＤＮＤ−９９（インビトロジェンライフテクノロジー社、米国ニューヨーク）を含有する１０μｇ／ｍＬのｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲまたはｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＢｓＡｂと３７℃で３０分間培養した。細胞を培養培地で２回洗浄した。１６ｎＭのＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５溶液（インビトロジェンライフテクノロジー社、米国ニューヨーク）を加えた後、細胞イメージングをＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ共焦点顕微鏡（カールツァイス、ニューヨーク州ソーンウッド）で記録した。
【０１６０】
細胞毒性分析
Ａ４３１（ＥＧＦＲｈｉｇｈ）及びＲａｊｉ（ＣＤ１９ｈｉｇｈ）細胞（５０００細胞／ウェル）を９６ウェルプレートに一晩播種した。１５μｇ／ｍＬのｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲまたはｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＢｓＡｂを、これらの細胞に３０分間３７℃で加え、続いて段階的濃度の遊離ドキソルビシンまたはペグ化リポソーム化ドキソルビシン（ドキシソーム（商標登録）、台湾リポソーム社、台湾台北）をこれらの細胞に３連で、３７℃で４時間加えた。続いて、細胞を１度洗浄し、新鮮な培養培地でさらに４８時間培養した後、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）で１６時間パルスした。結果を未処理細胞と比較した細胞ＤＮＡへの３Ｈチミジン取り込みの阻害割合として表す。
【０１６１】
ＰＥＧ−ＮＩＲ７９７プローブのｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージング
後肢領域にＲａｍｏｓ（ＣＤ１９＋）及びＡ４３１（ＥＧＦＲ＋）腫瘍（〜２５０ｍｍ３）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ（５０μｇ）及びＰＥＧ−ＮＩＲ７９１（５０μｇ）を用いて、静脈内注射した。ペントバルビタール麻酔したマウスを、ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（励起７４５ｎｍ、放射８４０ｎｍ、パーキンエルマー社、米国マサチューセッツ州）で、注射後４５分、２４時間及び４８時間に順次撮像した。
【０１６２】
結腸及び乳癌細胞における腫瘍マーカー発現レベルの検出
ＳＷ４８０またはＳＷ６２０細胞を１ｍｇ／ｍｌのエルビタックス、続いて１ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）を用いて４℃で染色することにより、ＥＧＦＲ発現を測定した。同じ手順を用いて、１ｍｇ／ｍｌのハーセプチン、続いて１ｍｇ／ｍｌＦＩＴＣ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃにより染色したＳＫ−ＢＲ−３またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞のＨＥＲ２発現を測定した。氷冷ＰＢＳを用いて充分に洗浄後、生存細胞の表面免疫蛍光をＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス、カリフォルニア州サンディエゴ）で測定し、蛍光強度をＣｅｌｌｑｕｅｓｔプロソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス）で分析した。
【０１６３】
ＰＥＧｘＥＧＦＲ及びＰＥＧｘＨＥＲ２の二機能分析
９６ウェルプレートをＰＢＳ中ポリ−Ｌ−リシン（４０μｇ／ｍｌ）を用いて、２μｇ／ウェルで５分間室温でコートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）またはＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）腫瘍細胞を用いて、２ｘ１０５細胞／ウェルでコートした。ＰＥＧｘＥＧＦＲ、ＰＥＧｘＨＥＲ２及びＰＥＧｘＤＮＳ（１０μｇ／ｍｌ）を、室温で１時間ウェルに添加した。その後、ウェルをＤＭＥＭで３回洗浄し、２００ｎｇ／ｍｌのＬｉｐｏ／ＤＯＸ、６６．７ｎｇ／ｍｌのＬｉｐｏ／ＩＲ７８０、１００ｎｇ／ｍｌのＳＮ３８／ＰＭ、６００ｎｇ／ｍｌのＦｅＯｄｏｔ、０．５ｎＭのＡｕＮＰ及び０．５ｎＭのＱｄｏｔ５６５ｎｍを２０分間、ウェルに加えた。ＤＭＥＭで十分に洗浄後、５μｇ／ｍｌの抗ＰＥＧ骨格Ａｂ（６−３ハイブリドーマ由来の６−３Ａｂ）を１時間加え、その後３回ＤＭＥＭ洗浄することにより、ＰＥＧ−ＮＰの濃度を判断した。信号を増幅するため、０．４μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社、米国ペンシルベニア州）をウェルに加えた。ＤＭＥＭ、続いてＡＢＴＳ基質でウェルを４回洗浄した後、４０５ｎｍの吸光度値をマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、米国カリフォルニア州メンローパーク）で測定した。
【０１６４】
ＰＥＧｘＥＧＦＲ及びＰＥＧｘＨＥＲ２を用いたＰＥＧ−ＮＰの非共有修飾
ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ緩衝液中０．０５％ＢＳＡ）中のＰＥＧ−ＮＰに、タンパク質／ＰＥＧ−ＮＰ比が３８０〜５７０μｇＢｓＡｂ／１μｍｏｌドキソルビシン（Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ）、５５０μｇＢｓＡｂ／１μｍｏｌＦｅＯｄｏｔ及び１４０ｎｇＢｓＡｂ／１ｐｍｏｌＱｄｏｔで、ＢｓＡｂを４℃で１時間添加した。ＰＥＧｘＥＧＦＲまたはＰＥＧｘＨＥＲ２修飾後、ＰＥＧ−ＮＰは、αＥＧＦＲ−ＮＰまたはαＨＥＲ２−ＮＰとなった。
【０１６５】
非標的ＮＰの標的ＮＰへの変換の確認
９６穴プレートをＰＢＳ中ポリ−Ｌ−リシン（４０μｇ／ｍｌ）を用いて、２μｇ／ウェルで５分間室温でコートし、ＰＢＳで２回洗浄した後、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）、ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）腫瘍細胞を用いて、２ｘ１０５細胞／ウェルでコートした。ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）及びＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）細胞を、４μｇ／ｍｌのαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、１μｇ／ｍｌのαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０及び４μｇ／ｍｌのＦｅＯｄｏｔと２０分間培養した。ＤＭＥＭを用いて充分に洗浄後、５μｇ／ｍｌの抗ＰＥＧ骨格Ａｂ（６−３Ａｂ）を１時間加え、ＤＭＥＭ洗浄を３回行うことにより、ペグ化ＮＰの濃度を判断した。信号を増幅するため、０．４μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃ−ＨＲＰ（ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ社、米国ペンシルベニア州）をウェルに添加した。ＤＭＥＭでウェルを洗浄後、ＡＢＴＳ基質を加え、４０５ｎｍの吸光度値をマイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス、米国カリフォルニア州メンローパーク）で測定した。同じ手順で、４μｇ／ｍｌのαＨＥＲ２−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、４μｇ／ｍｌのＦｅＯｄｏｔ及び２ｎＭのαＥＧＦＲ−Ｑｄｏｔ５６５ｎｍで２０分間染色したＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）細胞を調べた。
【０１６６】
ＢｓＡｂ標的ＮＰの共焦点顕微鏡検査
１２ウェルプレートの円形カバースリップ（１８ｍｍ）を、ＰＢＳ中ポリ−Ｌ−リシン（４０μｇ／ｍｌ）を用いて、２０μｇ／ウェルで５分間室温でコートした。カバースリップをＰＢＳで２回洗浄した後、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）、ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）、ＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）腫瘍細胞を４ｘ１０４細胞／ウェルで、カバースリップにコートした。ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）及びＳＷ６２０細胞（ＥＧＦＲ−）を、３００ｎｇ／ｍｌのαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／Ｒｈｏ及びαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／Ｒｈｏと、３７℃で１時間培養した。細胞をＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで、３０分４℃で固定し、ＤＡＰＩを用いて、４５分４℃で染色した。その後、カバースリップをＰＢＳで４回洗浄した後、顕微鏡ガラススライド上に蛍光封入剤（ダコ、デンマークグロストルプ）で封入した。αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／Ｒｈｏ及びαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／Ｒｈｏの蛍光信号をオリンパスＦｌｕｏＶｉｅｗ（登録商標）ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（オリンパスイメージングアメリカ社、ペンシルベニア州センターバレー）で記録した。同じ手順で、それぞれ４ｎＭのαＨＥＲ２−Ｑｄｏｔ５６５ｎｍ及びαＤＮＳ−Ｑｄｏｔ５６５ｎｍで染色したＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）細胞を撮像した。
【０１６７】
ＭＲイメージングによるＢｓＡｂ標的ＦｅＯｄｏｔの標的化
ＭＲイメージングを、臨床３．０Ｔ  ＭＲ画像装置（シグナ、ＧＥヘルスケア、英国リトルチャルフォント）を用いて実施した。１ｘ１０７ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）またはＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）細胞を異なる濃度のαＥＧＦＲ−ＦｅＯｄｏｔまたはαＤＮＳ−ＦｅＯｄｏｔ（７μＭ、１４μＭ及び２８μＭ）と共に、４℃で３０分間培養した。細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、ＢｓＡｂ−ＦｅＯｄｏｔの蓄積をＴ２強調高速スピンエコーシーケンス（ＴＲ／ＴＥ＝２５００ミリ秒／６０ミリ秒）によりスキャンした。同じプロトコールを用いて、ＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）及びＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）細胞でのαＨＥＲ２−ＦｅＯｄｏｔ及びαＤＮＳ−ＦｅＯｄｏｔの局在を調べた。
【０１６８】
ＢｓＡｂ標的Ｌｉｐｏ／ＤＯＸのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞毒性
ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）及びＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）細胞（３ｘ１０３／ウェル）を９６ウェルプレートに播種した。２μｇ／ｍｌまたは４μｇ／ｍｌのαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、及びＬｉｐｏ／ＤＯＸを各ウェルに加え、３７℃で１時間培養した。培地を補給し、７２時間細胞を培養した後、細胞の生存をＡＴＰｌｉｔｅ（登録商標）発光測定システム（パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）で測定した。αＨＥＲ２−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたはＬｉｐｏ／ＤＯＸと３７℃で３時間培養したＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）細胞の生存を、同じ手順に従って測定した。結果を未処理細胞と比較した発光阻害割合として、以下の式、阻害％＝１００ｘ（処理発光／未処理発光）により表した。各データ点の標準偏差は、３サンプル（ｎ＝３）の平均を取った。
【０１６９】
ＢｓＡｂ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０及びＬｉｐｏ／ＩＲ７８０のｉｎ  ｖｉｖｏ光学イメージング
後肢領域にＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）及びＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍（約１００ｍｍ３）を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、それぞれαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０及びＬｉｐｏ／ＩＲ７８０（１００μｇ／マウス）で静脈内注射した。ペントバルビタール麻酔したマウスを、ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステム（励起７４５ｎｍ、放射８４０ｎｍ、パーキンエルマー社、マサチューセッツ州ウォルサム）で、注射後２４、４８及び７２時間に順次撮像した。
【０１７０】
ＢｓＡｂ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ及びＬｉｐｏ／ＤＯＸを用いたＥＧＦＲ＋及びＥＧＦＲ−腫瘍の処理
ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝６）を、後肢領域に４ｘ１０６ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）細胞及び１ｘ１０６ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）細胞で皮下接種した。腫瘍サイズが約２０ｍｍ３に達した後、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ及びαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸを５ｍｇＤＯＸ／ｋｇで３週間、１週間に１回、総量１５ｍｇＤＯＸ／ｋｇで、静脈内投与した。他の処置群は生理食塩水を包含した。腫瘍測定をキャリパーを用いて１週間に３回実施し、腫瘍サイズを（長さｘ幅ｘ高さ）／２の式を用いて計算した。マウスの体重を１週間に１回測定して、毒性を調べた。
【０１７１】
統計分析
平均値差の統計的有意性をノンパラメトリックマンホイットニー検定を用いて、ＪＭＰ９．０ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社、ノースカロライナ州ケーリー）で推定した。細胞毒性分析及びｉｎ  ｖｉｖｏ毒性におけるＰ値＜０．０５と、ｉｎ  ｖｉｖｏ処理におけるＰ値＜０．０１を、統計的に有意であるとみなした。
【０１７２】
実施例１  ダイマーヒト化二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）の作製及び特性評価
１．１  マウス抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ  Ａｂの作製
ヒト化ＢｓＡｂを作製するため、Ｅ１１、１５−２ｂ及び６−３の３つのハイブリドーマ細胞を確認し、それぞれのモノクローナルＡｂをアフィニティクロマトグラフィーにより採取した。その後、固定化ＰＥＧに対する採取された抗体の結合特異性を判断した。ハイブリドーマ１５−２ｂにより産生したモノクローナル抗体及びＰＥＧ間の典型的な結合特異性を図４に示す。
【０１７３】
図４から明らかなように、ハイブリドーマ１５−２ｂにより産生したモノクローナル抗体は、ＮＨ２−ＰＥＧ３０００−ＮＨ２ではなく、ＣＨ３−ＰＥＧ７５０−ＮＨ２に結合し、これはかかるモノクローナル抗体がＣＨ３−ＰＥＧ分子の末端メトキシ基、またはＰＥＧ分子の末端ヒドロキシル基を特異的に認識したことを示す（図４）。したがって、抗ｍＰＥＧ  Ａｂと命名した。一方、ハイブリドーマ６−３またはＥ１１により産生した抗体は、ＰＥＧ分子の末端メトキシまたはヒドロキシル基ではなく、骨格部分を特異的に認識したため、抗ＰＥＧ  Ａｂと命名した。
【０１７４】
その後、抗ｍＰＥＧまたは抗ＰＥＧ  ＡｂをコードするＤＮＡを単離し、従来の手順を用いて（つまり、モノクローナルＡｂの重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）配列決定した。
【０１７５】
１．２  ダイマーヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）抗ＴＡＧ７２ＢｓＡｂの作製
二重特異性を持つヒト化Ａｂを作製するため、材料及び方法項に記載した手順に従って、実施例１．１のマウス抗ｍＰＥＧ  ｍＡｂのＤＮＡ配列をヒト化し、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ−７２）抗原（ｈｃｃ４９  ｓｃＦｖ）またはダンシル（ＤＮＳ）ハプテンに対するヒト化単鎖抗体断片遺伝子と融合した。
【０１７６】
図５Ａは、本実施例で調製したヒト化二重特異性ＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図である。一般に、各コンストラクトは、ＨＡエピトープタグ（ＨＡ）、ｈＥ１１抗ＰＥＧ軽鎖、Ｆ２Ａ二シストロン性要素、ｈＥ１１抗ＰＥＧ重鎖、ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン、リンカーペプチド（Ｌ）、抗腫瘍ｓｃＦｖ配列（例えば、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２プラスミドではｈｃｃ４９  ｓｃＦｖ、及びコントロールのＰＥＧ２ｘＤＮＳプラスミドでは抗ダンシルｓｃＦｖ）、及びヒスチジンタグの配列をコードした。図５Ｂは、本実施例のダイマーヒト化抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂの概略図である。結果、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２及びＰＥＧ２ｘＤＮＳを含むＢｓＡｂを作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＢｓＡｂが還元条件下、ＶＨ−ＣＨ１−Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３−ｓｃＦｖ断片（７２ｋＤａ）及び軽鎖（３５ｋＤａ）により構成されることを示した（図５Ｃ、右図）。一方、２３０ｋＤａのジスルフィド結合したＢｓＡｂを非還元条件下で観察した（図５Ｃ、左図）。結果をさらに、ウェスタンブロット分析により確認した。ｈＥ１１抗ＰＥＧ軽鎖のＮ末端のＨＡエピトープタグ、及びｈＥ１１抗ＰＥＧ重鎖に結合したｓｃＦｖのＣ末端に存在するＨｉｓエピトープタグを検出し、二重特異性抗体が予期した構造で存在することを明示した（図５Ｄ）。
【０１７７】
１．３  実施例１．２のＢｓＡｂの機能の特性評価
実施例１．２のヒト化ｈＥ１１  ＢｓＡｂの二官能活性を本実施例で調べた。
【０１７８】
ＢｓＡｂの結合をＥＬＩＳＡにより検出した。まず、マイクロタイタープレートを抗原でコートした後、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２、ＰＥＧ２ｘＤＮＳのＢｓＡｂまたはｈＣＣ４９（抗ＴＡＧ７２）単鎖抗体を加えた。プレートを充分に洗浄して非結合抗体を除去した後、各ウェルの残留結合抗体をＨＲＰ結合二次抗体で検出した。ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２  ＢｓＡｂは、ムチン（ＴＡＧ−７２腫瘍抗原）（図６Ａ）並びにＢＳＡ−ＰＥＧ（図６Ｂ）の両方に結合することができるが、ＢＳＡ（図６Ｃ）には結合せず、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２がＰＥＧ及びムチンの両方に二重抗原特異性を示したことを明示した。一方、コントロールのＰＥＧ２ｘＤＮＳ  ＢｓＡｂはＢＳＡ−ＰＥＧに結合したが、ムチンには結合しなかった。同様に、ｈｃｃ４９  ｓｃＦｖは、ムチンには結合し、ＢＳＡ−ＰＥＧには結合しなかった。要するに、実施例１．２のＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂは、ＰＥＧ及び腫瘍抗原の両方に結合できる。
【０１７９】
標的細胞に実施例１．２のｈＥ１１  ＢｓＡｂが結合できるかどうかを判断するため、ｈＣＣ４９抗体により認識されるＴＡＧ−７２抗原を発現するＭＣＦ−７乳癌、ＪｕｒｋａｔＴ細胞及びＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞を、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２及びＰＥＧ２ｘＤＮＳのＢｓＡｂと培養した。ＴＡＧ−７２抗原を発現しないＡ−３７５悪性黒色腫細胞を、陰性対照の細胞系として用いた。これら細胞から非結合ＢｓＡｂを洗浄した後、細胞に結合したＢｓＡｂを、ＦＩＴＣ結合抗ヒト免疫グロブリン抗体で検出した。フローサイトメータを用いた表面免疫蛍光の検出により、ＴＡＧ−７２陽性細胞がＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２  ＢｓＡｂに結合したが、対照のＰＥＧ２ｘＤＮＳ  ＢｓＡｂには結合しないことを明示した（図７、左図）。ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２が癌細胞及びペグ化分子に同時に結合することができるかどうかを試験するため、まず細胞をＢｓＡｂと培養し、洗浄後、ＦＩＴＣ標識ＰＥＧ分子と培養した。対照のＰＥＧ２ｘＤＮＳ  ＢｓＡｂではなく、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２  ＢｓＡｂと培養したＴＡＧ−７２陽性細胞は、ＰＥＧ−ＦＩＴＣに結合することができ、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２が腫瘍抗原及びＰＥＧ分子に同時に結合することができる正真正銘のＢｓＡｂとして作用することを明示した（図７、右図）。
【０１８０】
１．４  ダイマーヒト化抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）抗ＥＧＦＲまたは抗ＨＥＲ  ＢｓＡｂの作製及び特性評価
他の細胞内標的を抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂにより標的とできるかどうかを評価するため、実施例１．２と類似の手順により、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）及びＨＥＲ２抗原に対する単鎖抗体断片遺伝子を、ヒト化Ｅ１１抗体の重鎖ＣＨ３領域遺伝子のＣ末端に融合して、それぞれＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ及びＰＥＧ２ｘＨＥＲ２を作製した。
【０１８１】
癌細胞に結合するこれらのＢｓＡｂの能力の評価は、ＰＥＧ２ｘＴＡＧ７２がＪｕｒｋａｔＴ細胞（ＴＡＧ−７２陽性）に結合し、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞またはＢＴ−４７４細胞に結合しないことを示した。一方、ＰＥＧ２ｘＥＧＦＲ  ＢｓＡｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＥＧＦＲ陽性）に結合するが、他の２つの細胞には結合せず、ＰＥＧ２ｘＨＥＲ２  ＢｓＡｂは、ＢＴ−４７４細胞（ＨＥＲ２陽性）に特異的に結合した（図８Ａ）。このように、これらのＢｓＡｂは、抗体依存的にそれぞれの標的細胞に結合した。
【０１８２】
癌細胞及びペグ化化合物に同時に結合する二重特異性抗体の能力を、まず細胞をＢｓＡｂと培養し、この細胞から非結合抗体を洗浄した後、ＰＥＧ−リポソーム化テキサスレッドまたはＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５（ペグ化量子ドット）を添加することにより、さらに検討した。各ＢｓＡｂは、表面に対応する標的抗原を発現した細胞に、ペグ化リポソーム（図８Ｂ）またはペグ化ナノ粒子（図８Ｃ）を選択的に蓄積した。
【０１８３】
要するに、本実施例の抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂは、標的抗原及びペグ化物質に同時に結合することができ、それぞれの標的細胞にペグ化化合物及びナノ粒子を選択的に蓄積する。
【０１８４】
実施例２  一価ヒト化ＢｓＡｂの作製及び特性評価
２．１  一価抗ＰＥＧ（Ｅ１１）ＢｓＡｂの作製及び特性評価
抗ＰＥＧ抗体Ｅ１１由来のヒト化抗体のＦａｂ断片を、腫瘍関連抗原に特異性を持つ単鎖抗体に融合することにより、一価抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂを作製した。具体的には、ｈＥ１１Ｆａｂ断片を、抗ＴＡＧ７２、抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）または抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕ抗体由来の単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）と融合した（図９）。一価ＢｓＡｂを安定して発現するＣＨＯ細胞を作製し、各発現細胞系の培養培地を採取した。
【０１８５】
一価ＢｓＡｂの標的タンパク質との結合特異性を、ＢｓＡｂ産生細胞の培養培地を採取し、標的タンパク質を発現した細胞に採取した培地を加えた後、ＥＬＩＳＡにより結合を判断することにより測定した。この細胞を洗浄後、結合ＢｓＡｂをＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒト免疫グロブリンの第２抗体により検出した。ＰＥＧｘＴＡＧ７２はＪｕｒｋａｔＴ細胞（ＴＡＧ−７２陽性）に結合するが、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞またはＢＴ−４７４細胞には結合しないことがわかった。一方、ＰＥＧｘＥＧＦＲ  ＢｓＡｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞（ＥＧＦＲ陽性）に結合するが、他の２つの細胞には結合せず、ＰＥＧｘＨＥＲ２  ＢｓＡｂは、ＢＴ−４７４細胞（ＨＥＲ２陽性）に特異的に結合することがわかった（図１０）。このように、一価抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂは、抗体依存的及び選択的に標的細胞に結合した。
【０１８６】
癌細胞及びペグ化化合物に同時に結合する一価ＢｓＡｂの能力を、標的細胞をＢｓＡｂ及びペグ化物質と培養することにより調べた。この細胞から非結合抗体を洗い流した後、ＰＥＧ−リポソーム化テキサスレッドまたはＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５（ペグ化量子ドット）を添加した。各ＢｓＡｂは、表面に対応する標的抗原を発現した細胞に、ペグ化リポソーム（図１１）またはペグ化ナノ粒子（図１２）を選択的に蓄積した。このように、一価抗ＰＥＧ（ｈＥ１１）ＢｓＡｂは、標的抗原及びペグ化物質に同時に結合することができ、標的細胞の表面にペグ化化合物及びナノ粒子を選択的に蓄積する。
【０１８７】
２．２  一価抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂの作製及び特性評価
ヒト化抗ＰＥＧ（ｈ６．３）Ｆａｂを、「材料及び方法」項に記載した手順に従って、ＶＬ−Ｃｋ及びＶＨ−ＣＨ１をＦ２Ａ（フーリン−２Ａ）ペプチドリンカーと融合し、別々に軽鎖及び重鎖を発現させることにより、単一のオープンリーディングフレームとして構築した。単鎖ジスルフィド安定化可変断片（ｄｓＦｖ）を、ペプチドリンカーを介して、６．３ＦａｂのＣＨ１ドメインのＣ末端に連結して、ｈ６．３−１１Ｆ８（ｈ６−３ＦａｂｘＥＧＦＲ）ＢｓＡｂ及びｈ６．３−ｈＢＵ１２（ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９）ＢｓＡｂを作製した（図１３Ａ）。その後、これら２個のＢｓＡｂをレンチウイルス発現ベクターに挿入して、安定２９３ＦＴプロデューサー細胞株を作製した。培養培地から精製した（ｈ６−３ＦａｂｘＥＧＦＲ及びｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９を含む）ＢｓＡｂは、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、予期した分子サイズを示した（図１３Ｂ）。
【０１８８】
さらに、ｈ６−３ＦａｂｘＥＧＦＲ及びｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＢｓＡｂはどちらも、ＮＨ２−ＰＥＧ１０，０００−ＮＨ２に結合したが、対照のＢＳＡタンパク質には結合せず、ＰＥＧ分子に対する結合特異性を示した（図１４Ａ及び１４Ｂ）。標的抗原に対する結合特異性については、フローサイトメータ分析により、ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９ではなく、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲは、ペグ化物質（ＰＥＧ−リポソーム化テキサスレッド及びＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５を含む）をＡ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋）に方向づけることができ、一方、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲではなく、ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９は、ペグ化物質をＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋）に方向づけることができることが明らかになった（図１４Ｃ）。ｈ６−３ＦａｂｘＥＧＦＲ及びｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９のＢｓＡｂのＰＥＧ結合動態を、マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）により確認した（図１４Ｄ及び１４Ｅ）。
【０１８９】
ＢｓＡｂ標的物質が抗原陽性癌細胞により吸収され得ることができるかどうかを確認するため、リソソームトラッカー及びＢｓＡｂで細胞を染色し、続いてＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５を添加、培養することにより、生細胞イメージングを実施した。ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ処理Ａ４３１細胞は、エンドサイトーシス小胞内で赤色蛍光を示し、ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９処理Ａ４３１細胞は、ＰＥＧ−Ｑｄｏｔ６５５信号を生成しないことが分かった（図１５）。この観察は、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ媒介ＥＧＦＲエンドサイトーシスによって、ＰＥＧ物質がＡ４３１細胞へ取り込まれることを示す。
【０１９０】
次に、ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９及びｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲのＢｓＡｂが、抗原陽性癌細胞に対する薬剤搭載ナノ粒子（ＮＰ）の細胞毒性を増加することができるかどうかの能力を検討した。Ｒａｊｉ（ＣＤ１９＋）及びＡ４３１（ＥＧＦＲ＋）細胞を、ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９及びｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲと培養し、続いて段階的濃度のドキシソーム（つまり、ペグ化リポソーム化ドキソルビシン）を添加した。ドキシソーム単独と比較したとき、ｈ６．３ＦａｂｘＣＤ１９及びｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲのどちらも、それぞれＲａｊｉ、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８及びＡ４３１細胞に対するドキシソームの細胞毒性を高めた（図１６）。この結果は、抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂが腫瘍選択性を与え、抗原陽性癌細胞に対するペグ化ＮＰ（例、ドキソシーム）の細胞毒性を高めることを示す。
【０１９１】
抗ＰＥＧ（ｈ６．３）ＢｓＡｂ−ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍標的化を判断するため、後肢領域にＲａｍｏｓ（ＣＤ１９、左側）及びＳＷ４８０（ＥＧＦＲ、右側）腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ及びＰＥＧ−ＮＩＲ７９７プローブを用いて静脈内注射した。その後、マウスをＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステムを用いて、注射後４５分、２４時間、４８時間に撮像した。ＰＥＧ−ＮＩＲ７９７の信号増強をＡ４３１腫瘍で観察したが、Ｒａｍｏｓ腫瘍では観察されず（図１７）、ｈ６．３ＦａｂｘＥＧＦＲ  ＢｓＡｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏの抗原陽性腫瘍で優先的にＰＥＧプローブをＥＧＦＲに送達することを明示した。
【０１９２】
２．３  一価抗ｍＰＥＧ（ｈ１５．２ｂ）ＢｓＡｂの作製及び特性評価
本実施例において、材料及び方法項に記載した手順に従って、実施例１．１のマウス抗ｍＰＥＧ  ｍＡｂのＤＮＡ配列をヒト化し、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をコードする別の核酸と組み合わせた。
【０１９３】
図１８Ａは、本実施例で調製したヒト化二重特異性ＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図であり、ＰＥＧｘＥＧＦＲ、ＰＥＧｘＨＥＲ２及びＰＥＧｘＤＮＳを含む３つのＢｓＡｂを作製した。一般に、各コンストラクトは、シグナルペプチド（ＳＰ）、ＨＡエピトープタグ（ＨＡ）、抗ｍＰＥＧ軽鎖、Ｆ２Ａ二シストロン性要素、抗ｍＰＥＧ重鎖Ｆｄ断片、ｍｙｃエピトープタグ、１５アミノ酸可動性リンカーペプチド（Ｌ）、並びにＰＥＧｘＥＧＦＲプラスミドでは抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、ＰＥＧｘＨＥＲ２プラスミドでは抗ＨＥＲ２  ｓｃＦｖ、及び対照のＰＥＧｘＤＮＳプラスミドでは抗ダンシル  ｓｃＦｖなど、抗腫瘍マーカー配列に対するｓｃＦｖの配列をコードした。結果、ＰＥＧｘＥＧＦＲ、ＰＥＧｘＨＥＲ２及びＰＥＧｘＤＮＳを含む３つのＢｓＡｂを作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ＢｓＡｂが還元条件下、Ｆｄ−ｓｃＦｖ断片（５６ｋＤａ）及び軽鎖（３５ｋＤａ）により構成されたことを示し、一方、９１ｋＤａのジスルフィド結合ＢｓＡｂを非還元条件下で観察した（図１８Ｂ）。
【０１９４】
その後、このように作製したヒト化ＢｓＡｂを抗原陽性または抗原欠損癌細胞において、二官能活性検査に付した。簡潔に述べると、まず、細胞および過発現したＥＧＦＲ（つまり、ＳＷ４８０、ＥＧＦＲ＋）またはＨＥＲ２（つまり、ＳＫ−ＢＲ−３、ＨＥＲ２＋）を、本実施例のヒト化ＢｓＡｂと培養し、非結合ＢｓＡｂを緩衝溶液で洗い流し、その後、様々なＰＥＧ−ＮＰ（つまり、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０、ＳＮ３８／ＰＭ、ＦｅＯｄｏｔ、ＡｕＮＰ及びＱｄｏｔ５６５ｎｍ）を加え、ＢｓＡｂのそれぞれの結合活性をＥＬＩＳＡにより、抗ｍＰＥＧ抗体を用いて検出した。
【０１９５】
陰性対照のＰＥＧｘＤＮＳではなく、ＰＥＧｘＥＧＦＲが、ＥＧＦＲ＋ＳＷ４８０癌細胞に対する、試験したＰＥＧ−ＮＰのすべての結合を媒介したことに留意する（図１８Ｃ）。同様に、ＰＥＧｘＤＮＳではなくＰＥＧｘＨＥＲ２が、ＨＥＲ２＋ＳＫ−ＢＲ−３癌細胞に対する、ＰＥＧ−ＮＰの結合を媒介した（図１８Ｄ）。要するに、ＰＥＧｘＥＧＦＲ及びＰＥＧｘＨＥＲ２のどちらも二官能結合活性を示し、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２腫瘍マーカー発現細胞に対するＰＥＧ−ＮＰの架橋結合を媒介することができる。
【０１９６】
本発明のＢｓＡｂがＰＥＧ−ＮＰに癌細胞特異性を付与することができるかどうかを評価するため、本発明のＢｓＡｂを様々なＰＥＧ−ＮＰ（例えば、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０及びＦｅＯｄｏｔ）に添加して、標的ＰＥＧ−ＮＰを作製した。その後、結合特異性をＥＬＩＳＡにより測定した。結果を図１９に示す。対照のαＤＮＳ−ＮＰは、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）またはＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍細胞のどちらにも結合しないため、ＰＥＧ−ＮＰ標的化は、ＢｓＡｂの抗ＥＧＦＲ部分に依存することがわかる（図１９Ａ）。同様に、ＰＥＧ−ＮＰをＰＥＧｘＨＥＲ２と培養すると、ＮＰをＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）腫瘍細胞ではなく、ＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）腫瘍細胞に結合させる（図１９Ｂ）。こうした結果は、ＰＥＧｘＥＧＦＲまたはＰＥＧｘＨＥＲ２をＰＥＧ−ＮＰと混合することにより、癌細胞のＥＧＦＲまたはＨＥＲ２に特異性を有するＮＰを与えることができることを明示する。
【０１９７】
抗原陽性癌細胞を死滅する際の標的ＰＥＧ−ＮＰの能力をさらに検討し、結果を図２０に示す。図２０に示すように、αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸは、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたはαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸと比べて、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）癌細胞に対してより高い細胞毒性を示した（図２０Ａ）。一方、αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸは、ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍細胞に対して、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたはαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸと同様の細胞毒性を示した（図２０Ｂ）。同様に、αＨＥＲ２−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸは、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたはαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸよりもＳＫ−ＢＲ−３（ＨＥＲ２＋）癌細胞に対して著しく強い細胞毒性を有した（図２０Ｃ）。しかし、αＨＥＲ２−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸは、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたはαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸと比べて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＨＥＲ２−）癌細胞に対して、同様の細胞毒性を示した（図２０Ｄ）。したがって、抗ｍＰＥＧ  ＢｓＡｂは、腫瘍選択性を付与し、抗原陽性癌細胞に対するＰＥＧ−ＮＰ（Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ）の細胞毒性を増加することができると結論付けるのは妥当である。
【０１９８】
ＢｓＡｂ−ＮＰのｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍標的化を検討するため、後肢領域にＥＧＦＲ−ＳＷ６２０（左側）及びＥＧＦＲ＋ＳＷ４８０（右側）腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０またはＬｉｐｏ／ＩＲ７８０で静脈内注射した。このマウスを、ＩＶＩＳスペクトル光学イメージングシステムで、注射後２４、４８及び７２時間後に撮像した。αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０の蛍光信号は、プローブ注射後２４〜７２時間で、ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍と比べて、ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）腫瘍において強くなった（図２１、下段）。ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）腫瘍におけるαＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０の蛍光強度は、ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍よりも、２４、４８及び７２時間後、それぞれ２．０３７倍、２．３１８倍及び２．３２８倍高かった（表２８）。一方、Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０及びαＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０は、おそらくＥＰＲ効果により、ＳＷ６２０腫瘍でより強く局在した。これらのデータは、αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＩＲ７８０がＥＧＦＲ＋癌細胞の選択性を有することを示し、これによりＥＧＦＲ＋腫瘍における高度蓄積を促進する。
【０１９９】
表２８  ＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）のＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍に対する対象領域（ＲＯＩ）比を指示時間で判断した
0006447887.tif 000057
【０２００】
本実施例のＰＥＧｘＥＧＦＲがｉｎ  ｖｉｖｏでＥＧＦＲ＋腫瘍に対するＬｉｐｏ／ＤＯＸの治療効果を強めることができるかどうかを調べるため、後肢領域にＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）及びＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ  αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたは生理食塩水で処置した。マウスの体重で判断した通り（図２２Ｃ）、αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸは、明らかな毒性を示さずに、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸで処置したものより著しくＳＷ４８０（ＥＧＦＲ＋）腫瘍の増殖を抑制したことがわかった（８〜４５日でＰ＜０．０１）（図２２Ａ）。ＳＷ６２０（ＥＧＦＲ−）腫瘍モデルでは、αＥＧＦＲ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ、αＤＮＳ−Ｌｉｐｏ／ＤＯＸまたはＬｉｐｏ／ＤＯＸで処置したマウスにおける腫瘍の大きさに有意差はなかった（図２２Ｂ）。したがって、本実施例のＰＥＧｘＥＧＦＲがｉｎ  ｖｉｖｏでのＥＧＦＲ＋腫瘍に対するＬｉｐｏ／ＤＯＸの抗腫瘍効果を実際に増強することができると結論付けるのは妥当である。
【０２０１】
２．４  一価抗ｍＰＥＧ（ｈ１５．２ｂ）抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０ＢｓＡｂの作製及び特性評価
本実施例において、材料及び方法項に記載した手順に従って、マウス抗ｍＰＥＧ  ｍＡｂのヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を、ＣＤ１９またはＣＤ２０のモノマーＩｇＧをコードする別の核酸と組み合わせた。
【０２０２】
図２３Ａは、本実施例で調製したヒト化二重特異性ＡｂのＤＮＡコンストラクトの概略図である。一般に、各コンストラクトは、シグナルペプチド（ＳＰ）、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０の重鎖配列（ＶＨ−ＣＨ１）、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０の軽鎖配列（ＶＬ−Ｃｋ）、アミノ酸可動性リンカーペプチド（Ｌ）、及び抗ｍＰＥＧ  ｓｃＦｖの配列をコードした。したがって、それぞれＣＤ１９及びＣＤ２０に方向づけられた２個の抗ｍＰＥＧ  ＢｓＡｂを作製した。結合結果により、本実施例の抗ｍＰＥＧ  ＢｓＡｂが、ＣＤ１９及びＣＤ２０（例、Ｒａｊｉ細胞）（図２３Ｂ）、並びにＰＥＧ分子の末端メトキシまたはヒドロキシル基（図２３Ｃ）を確実に発現する細胞に特異的に結合することを確認した。さらに、本実施例の抗ｍＰＥＧ  ＢｓＡｂを治療効果のあるナノ粒子（例、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ）と混合すると、ＣＤ１９またはＣＤ２０陽性癌細胞に治療効果のあるナノ粒子を標的化及び送達することができる（図２３Ｄ）。
【０２０３】
実施例３  ダイマーヒト化ノブインホールＢｓＡｂの構築及び特性評価
３．１  ノブインホール抗ＰＥＧ（ｈ６．３またはｈ１５．２ｂ）抗ＨＥＲ２または抗ＣＤ１９ＢｓＡｂの作製
組換えＤＮＡ技術を用いて、抗ＨＥＲ２抗体（Ｃ６）または抗ＣＤ１９抗体（ＢＵ１２）、及びヒト化抗メトキシ−ＰＥＧモノクローナルｈ１５−２ｂまたはヒト化抗ＰＥＧ抗体ｈ６．３のどちらかのＶＨ及びＶＬのｃＤＮＡコーディング領域由来ＢｓＡｂを、ヘテロダイマー形成及び適切な抗体の重鎖及び軽鎖集合体のため、「ノブイントゥホール」戦略及び免疫グロブリンドメイン交差手法を利用して作った。
【０２０４】
適切に組み立てた抗体を作製するため、ＢＵ１２またはＣ６抗体どちらかの抗原結合断片（Ｆａｂ）内の軽鎖Ｃｋドメイン及び重鎖ＣＨ１ドメインを交換し、抗ＰＥＧ抗体は修飾しなかった。特に、腫瘍抗原抗体ＢＵ１２及びＣ６のＣｋを、その抗体重鎖の部分ＣＨ１断片及び部分ヒンジで置き換え、抗体重鎖内の元のＣＨ１断片部位を抗体軽鎖のＣｋ配列で置き換えた。これは、この軽鎖を抗ＰＥＧ−ノブ抗体の重鎖と対にせずに、同種の重鎖と対にする。また、重鎖のヘテロダイマー形成のため、ノブ構造（Ｔ３６６Ｗ及びＳ３５４Ｃ）をｈ１５−２ｂ及びｈ６．３のＣＨ３領域に導入し、ホール構造（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ及びＹ３４９Ｃ）をそれぞれＣ６及びＢＵ１２のＣＨ３に導入した。抗ｍＰＥＧ（ｈ１５−２ｂ）−ノブ抗体及びＢＵ１２−ホール抗体または抗ＨＥＲ２−ホール抗体から構成したＢｓＡｂの構築マップを図２４Ａに示す。一方、抗ＰＥＧ抗体（ｈ６．３）−ノブ及びＢＵ１２−ホールまたは抗ＨＥＲ２−ホール抗体から構成したＢｓＡｂのＤＮＡマップを図２４Ｂに示す。
【０２０５】
その後、ＢｓＡｂのＤＮＡコンストラクトをレンチウイルス発現ベクターに挿入して、安定２９３ＦＴプロデューサー細胞株を作製した。培養培地から精製されたＢｓＡｂ（ｈ１５−２ｂノブ＋ＢＵ１２−ホール、ｈ６．３＋ＢＵ１２−ホールを含む）は、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで予期した分子サイズを示した（図２４Ｃ）。
【０２０６】
３．２  実施例３．１のノブインホールＢｓＡｂの特性評価
本実施例において、実施例３．１の精製したノブインホールＢｓＡｂの二重特異性を検討した。簡潔に述べると、Ｒａｍｏｓ細胞（ＣＤ１９＋）及びＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋）を用いて、精製したＢｓＡｂがＰＥＧ化合物、及びＣＤ１９またはＨＥＲ２／ｎｅｕ腫瘍抗原を発現する癌細胞の両方に結合することができるかどうかを確認した。簡潔に述べると、Ｒａｍｏｓ細胞（ＣＤ１９＋）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ１９＋）またはＳＫＢＲ３細胞（ＨＥＲ２＋）を、１０μｇ／ｍｌのｈ１５−２ｂ−ノブ／ＢＵ１２−ホールまたはｈ１５−２ｂ−ノブ／抗ＨＥＲ２−ホールＢｓＡｂと培養、洗浄し、０．２５μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧまたは１０ｎＭメトキシ−ＰＥＧ  Ｑｄｏｔ６５５と４℃で３０分間培養した。生存細胞の表面蛍光をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで測定した。結果を図２５〜２８に示す。
【０２０７】
ｈ１５−２ｂ−ノブ／ＢＵ１２−ホールＢｓＡｂは、ＳＫＢＲ３細胞ではなく、ＣＤ１９陽性Ｒａｍｏｓ細胞に結合し、一方、ｈ１５−２ｂ−ノブ／抗ＨＥＲ２−ホール  ＢｓＡｂはＳＫＢＲ３（ＨＥＲ２陽性）に結合することが分かった（図２５）。これは、ｈ１５−２ｂ  ＢｓＡｂが、抗体依存的な方法で癌細胞に特異的に結合する能力を保持したことを示す。より重要なことには、ｈ１５−２ｂ−ノブ／ＢＵ１２−ホールが、Ｒａｍｏｓ及びＲａｊｉ細胞でペグ化Ｑｄｏｔを安定して保持でき、ｈ１５−２ｂ−ノブ／抗ＨＥＲ２−ホールは、ＳＫＢＲ３細胞でＱｄｏｔを保持することができた（図２６）。このように、これらの試剤は正真正銘の二重特異性分子として作用した。同様の結果を、ＦＡＣで測定したようなＣＤ１９（Ｒａｍｏｓ及びＲａｊｉ）を発現する細胞に結合することができるｈ６．３−ノブ／ＢＵ１２−ホールＢｓＡｂで観察した（図２７）。また、ｈ６．３−ノブ／ＢＵ１２−ホールは、ＰＥＧ修飾ＱｄｏｔにＲａｊｉ細胞を効果的に結合し（図２８）、このＢｓＡｂが癌細胞のＣＤ１９及びペグ化ナノ粒子のＰＥＧ分子に同時に結合することができることを明示した。
【０２０８】
実施例４  組換え無傷抗癌ＢｓＡｂの構築及び特性評価
４．１  ハーセプチン／ｈ−α−ＰＥＧ及びエルビタックス／ｈ−αＰＥＧのＡｂの作製
相乗的に癌細胞を攻撃することができる試剤を作るため、機能的ヒト化抗ＰＥＧ単鎖Ａｂ（ｈ−αＰＥＧ  ｓｃＦｖ）を、市販の標的抗体（ハーセプチン及びエルビタックスを含む）のＣ末端に融合して、二官能のハーセプチン／ｈ−αＰＥＧ、及びエルビタックス／ｈ−αＰＥＧのＡｂを形成した（図２９）。したがって、ハーセプチン及び／またはエルビタックス抗体の元の抗癌作用が保持されているだけでなく、新規で作製したＢｓＡｂが腫瘍部位でペグ化薬剤に活発に結合することができ相乗的な抗癌作用（つまり、二重攻撃戦略）を生じる。
【０２０９】
４．２  実施例４．１のＢｓＡｂ機能の特性評価
本実施例において、実施例４．１のＢｓＡｂの二官能活性を検討した。簡単に述べると、ＨＥＲ２／ｃ−ｅｒｂ−２遺伝子産物を過剰発現するＳＫＢＲ３ヒト乳腺癌細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレートにコートし、その後ハーセプチン／ｈ−αＰＥＧ抗体及び対照のハーセプチン抗体をマイクロタイタープレートに添加した。非結合の二官能抗体を洗い流した後、ドキソルビシンを含有するペグ化リポソーム（ここでは、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ）をウェルに添加した。ペグ化化合物の結合をＥＬＩＳＡにより判断した。
【０２１０】
予想通り、対照のハーセプチン抗体ではなく、ハーセプチン／ｈ−αＰＥＧが、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸをＳＫＢＲ３細胞に選択的に結合した（図３０Ａ）。また、同様の結果は、ＥＧＦＲの過剰発現レベルを示すＡ４３１ヒト上皮癌細胞で観察された。対照のエルビタックス抗体ではなく、エルビタックス／ｈ−αＰＥＧが、ペグ化化合物を方向付けて、Ａ４３１細胞（ＥＧＦＲ＋）の表面に蓄積した（図３０Ｂ）。
【０２１１】
実施例４．１のＢｓＡｂを用いて、癌細胞に対するＬｉｐｏ／ＤＯＸを標的とする抗癌作用を、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べた。結果を図３１に示す。
【０２１２】
対照のＡｂではなく、ハーセプチン／ｈ−αＰＥＧ（図３１Ａ）及びエルビタックス／ｈ−αＰＥＧ（図３１Ｂ）は、それぞれＬｉｐｏ／ＤＯＸと組み合わされると、相乗的な抗癌作用を示すことが確認され、二重攻撃戦略がより高いレベルの腫瘍致死効果を実現することを示した。
【０２１３】
同様の実験において、ＨＥＲ２陽性ＳＫＢＲ３細胞を５μｇ／ｍＬのハーセプチン／ｈ−αＰＥＧまたはハーセプチンと、３７℃で１時間、前培養した。洗浄して非結合Ａｂを除去した後、細胞を段階的濃度（９、３及び０．３３μｇ／ｍＬ）のＬｉｐｏ／ＤＯＸで、３連で６時間処理した。その後、薬剤含有培地を新鮮培地で置き換え、細胞をさらに７２時間培養し続けた。その後、薬剤処理細胞における細胞のＡＴＰ合成を、未処理細胞のものと比較した。
【０２１４】
細胞毒性レベルは、ハーセプチン単独またはＬｉｐｏ／ＤＯＸ単独のどちらかで処理した細胞よりも、二重特異性ハーセプチン抗体及びＬｉｐｏ／ＤＯＸで前処理した細胞ではるかに高かったことが分かった（図３２）。この発見は、図３１の通りであり、Ｌｉｐｏ／ＤＯＸ及び抗ＰＥＧ  ＢｓＡｂにより引き起こされる相乗的な致死効果が観察された。
【０２１５】
当然のことながら、実施形態の上記説明は例示のためにのみ挙げられるものであり、様々な修正が当業者によりなされてもよい。上記明細書、実施例及びデータは、本発明の典型的な実施形態の構造及び使用を完全に記述する。本発明の様々な実施形態を、ある程度詳細に、または１つもしくは複数の個々の実施形態を参照して記述しているが、当業者は本発明の主旨または範囲を逸脱することなく、開示された実施形態に多くの変更を加えることができる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
0006447887.tif 000070
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【配列表】
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