(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１０ｍｇ／ｃｍ３以上〜７０ｍｇ／ｃｍ３未満の範囲の密度のペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンと、を含む、多孔性スポンジ構造の乾燥ペクチンパッドであって、前記ペクチンが、エステル化度が２０〜４０％であり、アミド化度が１５〜３０％である低メトキシル（ＬＭ）ペクチンである、パッド。
【請求項２】
前記ペクチン密度が１０ｍｇ／ｃｍ３超〜７０ｍｇ／ｃｍ３未満である、請求項１に記載のパッド。
【請求項３】
前記ペクチン密度が１０ｍｇ／ｃｍ３〜５０ｍｇ／ｃｍ３である、請求項１に記載のパッド。
【請求項４】
前記ペクチン密度が１０ｍｇ／ｃｍ３〜５０ｍｇ／ｃｍ３未満である、請求項１に記載のパッド。
【請求項５】
前記ペクチン密度が３０ｍｇ／ｃｍ３〜５０ｍｇ／ｃｍ３未満である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のパッド。
【請求項６】
前記ペクチン密度が２９．４ｍｇ／ｃｍ３〜３０．６ｍｇ／ｃｍ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のパッド。
【請求項７】
前記２価の陽イオンがカルシウムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のパッド。
【請求項８】
低メトキシル（ＬＭ）ペクチンと、トロンビンと、を含む、多孔性スポンジ構造の乾燥ペクチンパッドを作製する方法であって、
ａ．前記ＬＭペクチンと、２価の陽イオンと、前記トロンビンとを用意する工程と、
ｂ．前記ＬＭペクチンと、前記２価の陽イオンと、前記トロンビンとを混合して、均質なゲル形成を可能にする条件下で、前記ＬＭペクチンを１０ｍｇ／ｃｍ３以上〜７０ｍｇ／ｃｍ３未満の濃度にする工程と、
ｃ．前記ゲルを凍結乾燥させる工程と、を含み、
前記ＬＭペクチンのエステル化度が２０〜４０％であり、前記ＬＭペクチンのアミド化度が１５〜３０％である、方法。
【請求項９】
最初に前記トロンビンを前記２価の陽イオンと混合してから、前記ＬＭペクチンを加えることによって工程ｂを行う、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記２価の陽イオンがカルシウムである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
患者の創傷部出血を低減する方法における使用のための請求項１〜７のいずれか一項に記載のパッドであって、前記方法は、前記パッドを前記創傷部に当てることによって、前記創傷部出血を低減することを含む、パッド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トロンビン−ペクチンパッド及びその作製に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペクチンは、植物性物質から抽出される天然の多糖類である。ペクチンは主に、α−（１〜４）グリコシド結合によって鎖状に結合したＤ−ガラクツロン酸（ＧａｌＡ）という、結合したモノマーの直鎖からなる。これらのＧａｌＡモノマーは、エステル化されたカルボキシル基（ＣＯＯＣＨ３）という側鎖を有し、この側鎖は、カルボキシル基（ＣＯＯＨ）、ヒドロキシル基（ＯＨ）、及びアミノ基（ＮＨ３）という３つの異なる側鎖で置換でき、様々な特徴を有するペクチンをもたらす［Ｐｒａｄｅ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｃｔｉｎｓ，ｐｅｃｔｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ−ｍｉｃｒｏｂｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｎｇ  Ｒｅｖ．１９９９］。側鎖の種類は、特定の酵素（側鎖に基づく）によって促進される化学反応と、溶剤条件（例えば、ｐＨレベル、異なる糖の存在、イオン組成など）によって決まる。
【０００３】
ペクチンには、高メトキシル（ＨＭ）ペクチンと低メトキシル（ＬＭ）ペクチンという２つの主な種類がある。これらの２つの群の識別は、エステル化されたＧａｌＡモノマーとＧａｌＡモノマー全体との比率（「エステル化度」−ＤＥという）に基づく。典型的には、市販のＨＭペクチンのＤＥ値は６０〜７５％の範囲であり、ＬＭペクチンのＤＥ値は２０〜４０％である。
【０００４】
ペクチンは、食品業界では例えば増粘剤として、医療業界では例えば丸剤コーティング材として用いられている。
【０００５】
２つの種類のペクチンのゲル形成特性：
ｐＨ約３、加熱（７５〜８０℃の温度）、及び６５％以上の濃度での可溶性固形物、例えば多糖類の存在という条件下で、ＨＭペクチン粉末に水を加えると、ゲルが形成される。多糖類を加えると、ペクチンと水の相互作用が低減され、その代わりに、ペクチンと糖の相互作用が生じ、それにより、ゲル化活性に寄与する。ＨＭペクチンと対照的に、ＬＭペクチンは、もっと広いｐＨ範囲（２．５〜６．５）でゲルを形成し、そのゲル形成は、多糖類含有量と温度レベルとは無関係である。ＬＭペクチンは、適切なゲル形成には、２価の陽イオンの存在（例えば、ペクチン０．０６ｇ（１ｇｒ）当たり約３０〜４０ｍｇのカルシウム）を必要とする。ＬＭペクチンのゲル化機構は、ヒドロキシル側鎖基とカルボキシル側鎖基との分子内結合の形成を伴う。この構造は「エッグボックス」モデルといい、このモデルでは、カルシウムが構造内に捕捉され、より強固なゲルが形成される。
【０００６】
ＨＭペクチンのタイプは、カルボキシル側鎖基含有率が低く、ゲル形成に必要とされる酸性ｐＨにより、負に帯電したカルボキシル側鎖基が欠如しているので（酸性ｐＨでは水素は放出されない）、正に帯電したカルシウムイオンを加えても、ゲルも形成されず、「エッグボックス」構造が立体的に形成されることもない。
【０００７】
いくつかの文献は、トロンビンを含むか又は含まないペクチンを含む組成物に関する。
米国特許出願公開第２０１２／０２８２３２０号は、出血を止めるための創傷被覆材として使用できる止血用パウダーの組成物に関する。この止血用パウダーは、ペクチン酸銀部分を含む。この明細書によれば、用いるペクチンは、カルシウム塩と反応して、不溶性のペクチン酸カルシウムを生成するように修正もしなければならない。２．３％のペクチン酸銀を含む止血用パウダーの組成物が例示されている。この文献には、凍結乾燥した被覆材とは対照的に、止血用パウダーを用いる方が優れていることが明示的に示されている。
【０００８】
米国特許第７０１９１９１号は、布基材と、その基材の上又は基材を貫通して配置された多孔性の水溶性又は水膨潤性ポリマーマトリックスとを含む、凍結乾燥した止血用創傷被覆材と、そのような止血用創傷被覆材を作製する方法とを開示している。多糖類は、水溶性又は水膨潤性ポリマーの（１７個の可能性のうちの）考えうる１つの選択肢として列挙されており、ペクチンは、３５個の考えうる多糖類のうちの考えうる１つの多糖類として列挙されている。被覆材が、例えばトロンビン、フィブリノゲン、及びフィブリンを保持できることが記載されている。
【０００９】
英国特許第７０８１４８号は、止血用調製剤と、その製造プロセスに関する。塩基性のアクリジン誘導体をトロンビン調製剤に加えると、トロンビンの活性が向上することをこの発明者は発見した。この特許は、トロンビン調製剤に含める考えうる選択肢として、ペクチンとペクチン誘導体を開示している。凍結乾燥したペクチン−トロンビン溶液の止血用調製剤が例示されている。この止血用調製剤は、１０％のペクチンを含む。
【００１０】
米国特許第４２６５２３３号は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子が固定された創傷治癒材を開示している。この治癒材は、創傷部位での安定化フィブリンの形成を促す。この明細書によれば、トロンビンをその治癒材に、血液凝固第ＸＩＩＩ因子とともに固定するのが好ましい。この治癒材は、モノフィラメント、繊維集合体、フィルム、又はスポンジの形態である。ペクチンは、この構造を構成できる（膨大なリストのうちの）１つの選択肢として示されている。この特許は、血液凝固第ＸＩＩＩ因子及びトロンビンを各種構造、例えばペクチン構造に結合させることに関する。
【００１１】
米国特許第４２９２９７２号は、ハイドロコロイド、ゼラチン、ペクチン、及びカルボキシメチルセルロースナトリウムから形成された医療上有用な止血特性及び付着特性を有する凍結乾燥発泡体スポンジ製品であって、密度が約０．０１〜約０．１０グラム／ｃｃである発泡体スポンジ製品に関する。そのゼラチンは、最終製品の約２０重量％〜約８０重量％で存在し、ペクチンとカルボキシメチルセルロースナトリウムはそれぞれ、最終製品の約１０重量％〜約５０重量％で存在する。この製品は、ハイドロコロイドの水性コロイド分散液を形成し、通気するか又は発泡させ、凍結し、凍結乾燥することによって作製する。
【００１２】
米国特許出願公開第２００８／０２６０８１０号は、吸収性発泡体と、吸収性織布又は吸収性編み布と、トロンビンと、フィブリノゲンとを含む止血材に関する。この明細書によれば、吸収性発泡体は、生体適合性の水溶性又は水膨潤性ポリマーであってよい。その発泡体を作製するのに用いる好ましい生体適合性の水溶性又は水膨潤性ポリマーとしては、多糖類が挙げられる。ペクチンは、可能性の膨大なリストのうちの考えうる多糖類として示されている。その出願は、酸化再生セルロース布に付着させた（水溶性又は水膨潤性ポリマーとしての）カルボキシメチルセルロース及び（発泡剤／界面活性剤としての）アルブミンと、その発泡体に組み込まれたか又はその発泡体の上に噴霧したトロンビン及びフィブリノゲンとを含む発泡体を例示している。
【００１３】
米国特許第５６８８９２３号は、局所塗布用の創傷被覆材を作製するのに有用なカルシウム感受性低メトキシル（ＬＭ）ペクチンから構成される多価陽イオン架橋ペクチン繊維組成物に関する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
トロンビンは、可溶性フィブリノゲンの不溶性フィブリンへの変換を触媒するセリンプロテアーゼである。手術では、トロンビン液が、活動性出血部位で内在のフィブリノゲンをフィブリンに変換することによって出血を止める単独の製品としての役割を果たすことが多い。しかしながら、トロンビン液は、滲出した血液によって出血部位から洗い流されることがあるので、トロンビンを単独で用い、効果が弱い場合がある。この課題を克服し、トロンビンを活動性出血部位上に物理的に保つために、トロンビンを含むパッド、スポンジ、又はパッチを用いるのが有益なことがある。
【００１５】
いくつかの文献には、止血用のトロンビンと併せて、動物由来タンパク質（例えばコラーゲン又はゼラチン）から形成された乾燥発泡体スポンジを用いることが示されている。しかしながら、動物源からスポンジを作るのは、費用のかかる手順であり、それに対して、植物性物質からスポンジを作ると、費用が抑えられる。
【００１６】
更に、動物由来物質には、ウイルスなどの感染性物質を伝染させるリスクが存在し得る。
【００１７】
本発明は、当該技術分野のパッドにおけるこれらの欠陥及びその他の欠陥を克服するパッドに対するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、ペクチンと、２価の陽イオン、例えばカルシウムと、トロンビンとを含む乾燥パッドと、その作製に関する。本発明の乾燥パッドにおけるペクチンの密度は、約１％（ｗ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖ）未満の範囲であるのが好ましい。本発明によるパッドは、メトキシル含量が少ないペクチン（本明細書では「ＬＭペクチン」という）を含む。
【００１９】
有益なことに、本発明に従って作製したパッドは、均質であり、液体／血液吸収力が高く、順応性があるので、破断することなく生体器官の形状に適合させるように容易に操作でき、標的組織への付着性が向上し、操作及び取扱い中に損なわれないで済む。パッドの順応性又は適合性により、様々な構造と形状を有する広範な器官の中に当てることができる。
【００２０】
注目すべきことに、本発明に従って作製したパッドは、付着特性が向上している。本発明のパッドは、（例えば、パッド内に存在するトロンビンが、患者の血液に由来するフィブリノゲンに対して及ぼす作用によって、）出血部位におけるフィブリンの形成を促すことによって、止血を増進させるのに用いることができる。
【００２１】
本発明の一実施形態では、乾燥パッド内のペクチン密度は、１％（ｗ／ｖ）超〜７％（ｗ／ｖ）未満である。
【００２２】
本発明の別の実施形態では、乾燥パッド内のペクチン密度は、約１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）である。
【００２３】
更なる実施形態では、乾燥パッド内のペクチン密度は、約１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満である。
【００２４】
更に本発明の別の実施形態では、乾燥パッド内のペクチン密度は、約３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満である。
【００２５】
更に本発明の更に別の実施形態では、乾燥パッド内のペクチン密度は、約３％（ｗ／ｖ）である。
【００２６】
本発明の一実施形態では、パッドは、下記の工程によって作製する。
ａ．ＬＭペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンを用意する工程
ｂ．上記のペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンを混合して、均質なゲル形成を可能にする条件で、ペクチンを約１％（ｗ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖ）未満の濃度にする工程
ｃ．ゲルを乾燥させる工程
【００２７】
本発明の一実施形態では、工程ｂは、まずトロンビンを２価の陽イオンと混合してから、ペクチンを加えることによって行う。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、２価の陽イオンはカルシウムである。
【００２９】
本発明は、患者の創傷部出血を低減する方法であって、本発明によるパッドを創傷に当てることによって、創傷部出血を低減することを含む方法にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
一態様では、本発明は、ペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンとを含む改良型の乾燥パッドを提供する。
【００３１】
本発明によると、特定の種類のペクチンを特定の密度で、トロンビンと併せて含む乾燥パッドにより、血液及びその他の流体を吸収して、そのパッドの隙間内に保持し、損傷部位においてフィブリンを形成させることによって出血を止められるようにする改良型の乾燥パッドの形成が可能になることが分かった。
【００３２】
本発明によるパッドは、低メトキシル（ＬＭ）ペクチンを約１〜７％（ｗ／ｖ）未満、１％（ｗ／ｖ）超〜７％（ｗ／ｖ）未満、約１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満、１％（ｗ／ｖ）超〜５％（ｗ／ｖ）未満、約３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満、又は約３％（ｗ／ｖ）の範囲の密度で含む。
【００３３】
本願全体で用いられている、ペクチンの割合の表現（％）は、ペクチンの体積当たりの重量（ｗ／ｖ）を意味する。
【００３４】
例えば、ペクチンを約１〜７％（ｗ／ｖ）未満の範囲の密度で含む乾燥パッドは、約１０ｍｇ／ｃｍ３〜７０ｍｇ／ｃｍ３未満の範囲である密度のペクチンを意味する。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「約」という用語は、±２％を指す。
【００３６】
「改良型の乾燥パッド」という用語は、例えば、出血、例えば軽度出血、中度出血、重度又は激しい出血を効果的に止められるようにし、破断することなく体表の形状に容易に適合する力を有し、標的組織への付着性が向上しており、液体／血液吸収力が高いパッドに関する。「出血を止める」と「止血」という用語は、置き換え可能である。
【００３７】
「液体／血液吸収力が高い」という用語は、例えば、パッドが、その重量の何倍もの血液及びその他の流体を吸収して、その隙間内に保持できるか、及び／又は血液及びその他の流体を迅速に吸収できる、例えば、パッド自体の重量の３０倍を３０秒以内に吸収できることを意味する。
【００３８】
「止血」という用語は、損傷下血管からの出血を止める、及び／又は血管内に血液を封じ込め続けることに寄与する薬剤の能力を指す。
【００３９】
本発明によるパッドは、その構造を保持したままで、破断せずに、体表の形状に容易に適合する力があり、粘着性があって、標的組織への付着性が向上しており、空隙率が向上しており、それにより、液体／血液のパッド内への効率的な吸収を可能にし、操作及び取扱い中に損なわれないままであることが分かった。
【００４０】
有益なことに、本発明による乾燥パッドは、均質であり、液体／血液吸収力が高く、容易に操作できるとともに、破断することなく、生体器官の形状に適合させることができ、標的組織への付着性が向上しており、操作及び取扱い中に損なわれないで済む。パッドの適合性により、様々な構造と形状を有する広範な器官の中に当てることができる。
【００４１】
「均質」という用語は、パッドのこの文脈においては、トロンビンとペクチンが、乾燥パッド全体に実質的に均一に分散されていることを意味する。有益なことに、パッドの様々な領域の生物学的活性は、大体同じである。
【００４２】
「乾燥」という用語は、乾燥組成物の総重量に対して、液体含有率が３重量％以下（ｗ／ｗ）であるパッドを指す。
【００４３】
有益なことに、ペクチンは、植物由来の多糖類であるので、ペクチンを用いて形成されたパッドは、ウイルス及び／又は未知の病原体の伝染のリスクを最小限にできる。
【００４４】
また、植物から抽出されるペクチンを医薬品で用いるのは有益である。ペクチンは、非免疫原性物質であり、費用効率がよく、安全期間が長い物質でもあるからである。
【００４５】
本発明の一実施形態では、乾燥パッド内の２価の陽イオンは、例えば、０．１〜１００ｍｇ／ｃｍ３の密度範囲、例えば４．５〜７．５ｍｇ／ｃｍ３の密度のカルシウムである。本発明の一実施形態では、パッド内のカルシウム密度は、４．５ｍｇ／ｃｍ３である。本発明の別の実施形態では、パッド内のカルシウム密度は、７．５ｍｇ／ｃｍ３である。
【００４６】
パッド内のトロンビンの密度は、１０〜１０００ＩＵ／ｃｍ３の範囲であることができ、例えば、密度は、約３４０ＩＵ／ｃｍ３又は６８０ＩＵ／ｃｍ３であることができる。
【００４７】
典型的には、本発明のパッドは、その生物学的活性を保ったまま、凍結しない温度保管条件（例えば、２〜８℃の温度及び最大で室温、又は３７℃未満の温度）で、比較的長い時間にわたって保管できる。「室温」は、約２０℃〜約２８℃、又は２２℃〜約２６℃の温度を含むように意図されている。
【００４８】
本発明の一実施形態では、パッドは、２年間、室温で保管できる。
【００４９】
別の態様では、本発明は、本発明による乾燥パッドを作製する方法に関する。
【００５０】
本発明の一実施形態では、この方法は、下記の工程を含む。
ａ．ＬＭペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンとを用意する工程
ｂ．上記のペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンを混合して、均質なゲル形成を可能にする条件で、ペクチンを約１％（ｗ／ｖ）以上〜７％（ｗ／ｖ）未満の濃度にする工程
ｃ．ゲルを乾燥させる工程
【００５１】
ペクチンの密度は、約１〜７％（ｗ／ｖ）未満、１％（ｗ／ｖ）超〜７％（ｗ／ｖ）未満、約１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満、１％（ｗ／ｖ）超〜５％（ｗ／ｖ）未満、約３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満、又は約３％（ｗ／ｖ）の範囲であることができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、パッドは、概ね後述のように作製した。第１の工程として、目視確認によって判断した場合に、その溶液が均質になるまで、１３００ＲＰＭで３〜６時間攪拌しながら、ＬＭペクチン粉末を４０〜７０℃の再蒸留水（ＤＤＷ）に溶解することによって、濃度が約１．５〜１５％（ｗ／ｖ）（１５〜１５０ｇ／Ｌ）の様々なペクチンストック溶液を調製した。ｐＨ３．５〜５．５の溶液を得た。次に、０．５ＭのＮａＯＨを加えて、ｐＨを約７．０にした。次の工程で、ペクチン溶液の安定化のために、ペクチンストック溶液を４℃で一晩（１４〜１８時間）保管した。次の工程で、トロンビン（ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ由来）１．７ｍＬと１０．８Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）２５μＬを混合してから、形成された混合物を各ペクチンストック溶液（１．５％、４．５％、７．５％、１０．５％、及び１５％）３．３ｍＬと混合して、最終ペクチン濃度がそれぞれ約１％、３％、５％、７％、及び１０％（ｗ／ｖ）（１０〜１００ｇ／Ｌ）のペクチンゲルを形成した。トロンビンをＣａＣｌ２と混合してから、ペクチンストック溶液と混合するのは、室温（２０〜２５℃）で行った。トロンビン−ＣａＣｌ２溶液をペクチン溶液と混合するのは、２個のシリンジを用いて行い（下の詳述を参照）、その溶液を２個のシリンジ間で１０〜１５回移動させた。５ｍＬの最終体積を得、最終混合物を、高さ２５ｍ、直径２５ｍｍという寸法の凍結乾燥用ガラスカップに入れた。この凍結乾燥用ガラスカップを凍結乾燥機に入れ、凍結乾燥して、水含有率が≦３％の乾燥パッドを形成した。各種の乾燥パッド（凍結乾燥工程後）は、密度約１％、３％、５％、７％、又は１０％（ｗ／ｖ）（１０〜１００ｍｇ／ｃｍ３）のペクチンと、３４０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンと、７．５ｍｇ／ｃｍ３のカルシウムを含んでいた。乾燥パッドの高さは１０〜１４ｍｍの範囲で、直径は２５ｍｍであった。
【００５３】
別の実施形態では、密度３％（ｗ／ｖ）のペクチン（３０ｍｇ／ｃｍ３）を含む乾燥パッドを以下のように作製した。
０．１４６ｇ（２．２５ｇｒ）のＬＭペクチン粉末を４８．５ｍＬのＤＤＷに溶解することによって、濃度４．５％（ｗ／ｖ）のペクチンストック溶液を得た。この溶解は、４０℃〜７０℃で、１３００ＲＰＭで攪拌しながら、（その溶液が、目視確認によって判断した場合に、均質になるまで）３〜６時間行った。ｐＨ３．５〜５．５の溶液を得た。溶解後、ペクチンストック溶液を０．５ＭのＮａＯＨ（約２ｍＬ）で滴定して、ｐＨを約７．０にした。
【００５４】
次の工程で、ペクチン溶液の安定化のために、ペクチンストック溶液を４℃で一晩（１４〜１８時間）保管した。
【００５５】
次の工程で、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含むトロンビン１．７ｍＬを１０．８ＭのＣａＣｌ２２５μＬと混合した（トロンビン溶液中の最終ＣａＣｌ２濃度は６７．５ｍＭとなった）。続いて、トロンビン−カルシウム混合溶液（約１．７ｍＬ）をペクチンストック溶液（濃度４．５％ｗ／ｖ）３．３ｍＬと混合して、ゲルを形成した。トロンビンをＣａＣｌ２と混合してから、ペクチンストック溶液と混合するのは、室温（２０〜２５℃）で行った。
【００５６】
混合は、三方活栓によって互いに連結させた２個の５ｍＬシリンジを用いることによって行い、一方のシリンジにはトロンビン−カルシウム溶液を入れ、もう一方のシリンジにはペクチンストック溶液を入れた。これらの溶液は、２個のシリンジ間で１０〜１５回移動させた。混合後、混合溶液（体積５ｍＬ）を凍結乾燥用カップ（上記と同じ寸法）に入れ、針を用いて、ゲルの上面に形成された泡のうち、針の届く泡を消してから、カップを凍結乾燥機に移し、凍結乾燥した。
【００５７】
形成されたパッド内のペクチンの最終密度は、３％（ｗ／ｖ）（３０ｍｇ／ｃｍ３）、トロンビンの最終密度は、３４０ＩＵ／ｃｍ３、カルシウムの最終密度は、７．５ｍｇ／ｃｍ３であった。
【００５８】
凍結乾燥手順後、パッドを閉ざされた区画に、乾燥剤とともに、室温（２０〜２５℃）で保管した。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ペクチン、トロンビン、及び／又はカルシウムの溶液体積を約１〜２０倍増大させて、もっと大きいパッド、及び／又はもっと多くのパッドを得る。
【００６０】
液体及びゲル物質においては、約１％（ｗ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖ）未満のペクチン濃度は、約１０ｇ／Ｌ〜７０ｇ／Ｌ未満の濃度範囲のペクチンを意味する。
【００６１】
「混合する」という用語は、構成成分（例えば、ペクチンと２価の陽イオンとトロンビン）を合わせてブレンドするか又は攪拌することを指す。
【００６２】
「均質なゲル形成を可能にする条件で混合する」という用語は、均一なゲルの形成を可能にする特定の条件（１つ又は複数）、例えば、ある方法（例えば、構成成分の特定の混合順序）、及び／又はある環境（例えば、特定のｐＨ、特定の温度、及び／又は泡の形成を回避する環境）で、構成成分をブレンド又は攪拌することを指す。一実施形態では、このような条件は、最初にトロンビンを２価の陽イオンと混合し、その後でペクチンを加えることを含む。
【００６３】
ゲルとの関連における「均質」と言う用語は、トロンビンとペクチンが、ゲル物質（パッドの乾燥前）全体に実質的に均一に分散されていることを意味する。例えば、ゲルの様々な領域のトロンビンとペクチンの濃度は、大体同じである。均質なゲルは、例えば、２価の陽イオンを含むトロンビン溶液と、ペクチン溶液を十分かつ静かに混合することによって得ることができる。一実施形態では、混合は、互いに連結させた２個のシリンジ（一方のシリンジは、ペクチン溶液を含み、もう一方のシリンジは、トロンビン溶液を含む）を用いることによって行う。
【００６４】
均質なゲルは、例えば、ゲル内における大量の泡及び／若しくは大きな泡の存在を、例えば針を用いて消すことによって、並びに／又は、形成されたゲル上の液体の存在（この存在により、不適切に混合される）を回避することによって得ることができる。混合は、上記の溶液を十分に混合する攪拌装置を用いることによって行うこともできる。
【００６５】
「ゲル」という用語は、半硬質のゼリー状物質であって、液体の分子が固体に分散されているとともに、その固体が連続相であり、その液体が不連続相である物質を指す。典型的には、ゲルは、流動しない実質的に希薄な架橋系である。ゲルは、大部分は液体であるが、その液体内に３次元架橋網目構造が存在することにより、固体の特徴を有する。
【００６６】
ＬＭペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンは、溶液として用意できる。トロンビン溶液中の全固形分は、１ｍＬ当たり約１〜４５ｍｇであることができる。
【００６７】
本発明の一実施形態では、２価の陽イオンは、トロンビン溶液内に供給する。本発明の別の実施形態では、２価の陽イオンは、別の溶液として用意する。
【００６８】
乾燥工程は、当該技術分野において既知のいずれかの手順であって、熱による手順に敏感な活性成分、例えばトロンビンを分解させたり、又は変性させたりしない手順によって行うことができ、この手順としては、真空乾燥、凍結乾燥、及び室温乾燥のような空気乾燥が挙げられるが、これらに限らない。
【００６９】
一実施形態では、乾燥は、凍結乾燥によって行うことができる。「凍結乾燥」という用語は典型的には、混合物を凍結してから、水の濃度を、例えば昇華によって、生物反応又は化学反応を支えないレベルまで低下させるプロセスを指す。
【００７０】
典型的には、凍結乾燥後に、「固体ケーク」が得られる。「ケーク」、「固体ケーク」、「乾燥組成物」という用語は、凍結乾燥プロセスから生じる多孔性でスポンジ構造のような組成物を指す。
【００７１】
凍結乾燥プロセスの後、形成されたケークが、それ自体の構造を支えていたこと、すなわち、ゲル物質と固体組成物の構造及び体積が実質的に同じであったことが示された。このパラメーターは、パッドを静かに圧迫して、グローブに残ったパッドの割合を評価することによって評価できる。パッドは、有益には、操作及び取扱い中に、その構造を保持して、損なわれないままであるべきである。体の形状に容易に適合できるが、その構造を保持して破断しないことができるというパッドのバランスを保つことが重要である。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「乾燥組成物」と「乾燥パッド」という用語は置き換え可能であり、水含有率が約３％以下（ｗ／ｗ）である組成物を指す。
【００７３】
本発明に従って用いるペクチンは、いずれかの植物又はその一部（例えば、種子、葉、柄、花、根、及び／又は茎）から得る（例えば、抽出又は単離する）ことができる。このペクチンは、純度が様々なレベルであることができ、ペクチンに加えて、植物又はその一部から抽出又は単離される他の構成成分も含むことができる。
【００７４】
このペクチンは、エステル化度が約２０％〜７５％の範囲、アミド化度が約１５％〜３０％の範囲であることができる。
【００７５】
本発明の一実施形態では、エステル化度は、約２６〜２７％の範囲である。本発明の別の実施形態では、アミド化度は、約２０〜２２％の範囲である。
【００７６】
「エステル化度」という用語は、エステル化されたＧａｌＡモノマーとＧａｌＡモノマー全体との比率を指す。
【００７７】
「アミド化度」という用語は、アミド化されたＧａｌＡモノマーとＧａｌＡモノマー全体との比率を指す。
【００７８】
本発明の一実施形態では、パッドは、追加の止血剤を含む。「止血剤」という用語は、本明細書で使用する場合、その止血剤が、軽度出血、中度出血、重度又は激しい出血を含め、毛細血管、静脈、又は細動脈の出血を、当業者によって認識されている有効時間内で制御、低減、又は停止する力を指す。止血剤の例としては、プロトロンビン、フィブリン、フィブロネクチン、第Ｘ／Ｘａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、ビトロネクチン、組織因子、フォンビルブランド因子、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター、血小板活性化剤、止血活性を有する合成ペプチド、上記の誘導体、及びこれらのいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限らない。
【００７９】
「軽度」という用語は、少量かつ低速度の出血が生じる出血症状を指す。軽度出血では、出血は自力で、又は圧迫によって止まることができ、出血は、圧迫から約１０〜２０分後に止まるか、又は滲出するか若しくは滴り落ちるほどに治まることができ、及び／あるいは最大で４０分間滲出するか若しくは滴り落ちることがある。
【００８０】
軽度出血の例としては、抗凝固剤が処方されず、大静脈又は動脈に損傷が及ばない皮膚のような生体器官上の狭い区域内の損傷による出血が挙げられるが、これらに限らない。典型的には、軽度出血では、止血は、生来の血液凝固機序によって自然に行われる。
【００８１】
「中度」という用語は、遅い出血速度で長時間かけて大量の血液が喪失されるか、又は中度の出血速度で血液が短期間で失われる出血症状を指す。典型的には、中度出血では、出血は、約１５分の圧迫で遅くなるか、又は停止するが、圧迫をやめると、再び出血が始まり、及び／又は血液によって数枚の包帯が濡れる場合があるが、出血は速いことも、又は制御不能であることもない。
【００８２】
中度出血の例としては、皮膚のような生体器官上の広い区域内の損傷による出血、又は血液が豊富に供給される器官内で狭い区域が損傷されるケースが挙げられるが、これらに限らない。典型的には、中度出血では、止血を行わないと、数分から数時間で死に至ることがある。「重度又は激しい出血」という用語は、大量かつ高速の出血が生じる出血症状を指す。重度出血では、血液が創傷から噴出し、出血は、圧迫しても止まったり、若しくは遅くなったりせず、及び／又は血液により、包帯が次から次へとすぐに濡れてしまうことが多い。
【００８３】
重度及び激しい出血の例としては、動脈穿刺、肝臓切除、腎臓切除による出血、血友病患者、抗凝固剤を投与されている患者などが挙げられるが、これらに限らない。典型的には、重度又は激しい出血では、止血を行わないと、数秒から数分で死に至ることがある。
【００８４】
パッドが出血を止める有効性は、インビボ動物モデル実験を用いることによって評価できる。例えば、下記の実施例に記載されているような腎出血ラットモデル（重度出血のモデル）と、脾出血ブタモデル（軽度から中度の出血のモデル）。
【００８５】
本発明によると、トロンビンと、１％（ｗ／ｖ）以上〜５％（ｗ／ｖ）未満のＬＭペクチンとを含む乾燥パッドが、重度出血を効果的に止めることと、トロンビンと、１％（ｗ／ｖ）以上〜７％（ｗ／ｖ）未満のＬＭペクチンとを含む乾燥パッドが、軽度から中度の出血を効果的に止めることが分かった。
【００８６】
本発明の一実施形態では、乾燥パッドは、トロンビンと、約１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満の密度のＬＭペクチンとを含み、軽度から重度の出血に用いることができる。
【００８７】
本発明の一実施形態では、乾燥パッドは、軽度から中度の出血用であり、トロンビンと、約１％（ｗ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖ）未満の密度のＬＭペクチンとを含む。
【００８８】
本発明の一実施形態では、乾燥パッドは重度出血用であり、トロンビンと、約１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満の密度のＬＭペクチンとを含む。
【００８９】
本発明によれば、ペクチンパッドが出血を止める性能は、トロンビン密度を向上させることによって増進でき、例えば、３％（ｗ／ｖ）のペクチンと、３４０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンとを含むパッドの性能は、パッド内のペクチン密度を６８０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンまで向上させたら増進したことも分かった。
【００９０】
本発明の一実施形態では、ペクチンパッドの性能を向上させるには、トロンビンの密度を少なくとも２倍向上させることができる。
【００９１】
本発明のパッドは、様々なサイズ及び形状（意図する用途に応じて、正方形、多角形、球形、円錐形、立方体、楕円形、矩形、又は円柱形など）で作製及び提供できる。例えば、本発明のパッドは、５×１０ｃｍ、１０×１０ｃｍ（幅×長さ）というサイズの矩形形状（いずれも高さは１ｃｍ）で作製できる。別の例では、本発明のパッドは、直径が２ｃｍ、４ｃｍ、又は６ｃｍの円形状（いずれも高さは１ｃｍ）で作製できる。
【００９２】
本発明によるパッドは、そのまま出血部位に当てることができ、活動性出血部位において、内在のフィブリノゲンをフィブリンに変換することによって、出血を止めることができる。
【００９３】
本発明のパッドは、所望の部位に当てることができ、パッドと適用部位との界面で凝固が生じて出血が実質的に止まるのに十分な期間、例えば３０秒〜４分の範囲の期間、加圧下で保つことができる。
【００９４】
本発明の説明における範囲の開示は、当業者であれば容易に分かる。この開示は、制限的な数字及び値を含め、制限範囲間の連続的な値及び数字の開示を意味する。例えば、約１％（ｗ／ｖ）〜７％（ｗ／ｖ）未満の範囲が示されている場合、少なくとも１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、及び／又は７％（ｗ／ｖ）未満を意味し、１〜６．７５％（ｗ／ｖ）など、あらゆる組み合わせの中間の副範囲も含む。例えば、１％（ｗ／ｖ）超〜７％（ｗ／ｖ）未満の範囲が示されている場合、少なくとも１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、及び／又は７％（ｗ／ｖ）未満を意味し、１〜６．７５％（ｗ／ｖ）など、あらゆる組み合わせの中間の副範囲も含む。
【００９５】
別の態様では、本発明は、患者の創傷部出血を低減する方法であって、本発明によるパッドを創傷に当てることによって、創傷部出血を低減することを含む方法に関する。
【００９６】
「創傷部出血を低減する」とは、例えば、損傷組織及び／又は器官からの失血を低減、減少、又は解消することを意味する。
【００９７】
「創傷」という用語としては、動脈穿刺、肝臓切除、腎臓切除、皮膚欠損、静脈及び／又は動脈の損傷、手術中に行われる切開などが挙げられるが、これらに限らない。上又は下で引用されている特許出願、特許、及び文献の開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９８】
下記の実施例は例示であり、限定するものではない。
【実施例】
【００９９】
材料及び方法
トロンビン：下記の実験では、ＥＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ（イスラエルのＯｍｒｉｘ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．製）におけるようなトロンビン構成成分を用いた。
活性成分：ヒトトロンビン（８００〜１２００ＩＵ／ｍＬ）
他の成分：４０ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、６ｍｇ／ｍＬのヒトアルブミン、１ｇ／Ｌ（２０ｇｒ／Ｌ）のＤ−マンニトール、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、１３０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、注射用水（ＷＦＩ）。
【０１００】
ペクチン：下記の実験では、以下のような低メトキシルペクチン（ＬＭ、２つの異なる種類）と高メトキシル（ＨＭ）ペクチンを用いて、トロンビンを含むパッドを作製した。
１．ＬＭペクチン（カタログ＃１０４ＡＳ、ジョージア州アトランタのＣＰｋｅｌｃｏ）、エステル化度２７％、アミド化度２０％（本明細書では、「種類１」という）。柑橘類果皮から抽出される。
２．ＬＭペクチン（カタログ＃１０４ＡＳ  ＦＳ、ジョージア州アトランタのＣＰｋｅｌｃｏ）、エステル化度２６％、アミド化度２２％（本明細書では、「種類２」という）。柑橘類果皮から抽出される。
３．ＨＭペクチン（カタログ＃７６２８２、イスラエル、レホヴォトのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、エステル化度７０〜７５％。リンゴから抽出される。
【０１０１】
いずれのタイプのペクチンも、供給業者から粉末として得た。
【０１０２】
表１には、ＨＭペクチンとＬＭペクチンの特性が列挙されている。
【０１０３】
【表１】
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【０１０４】
凍結乾燥ゲル物質の凍結乾燥は、下記の表２に示されているサイクルに従って、凍結乾燥機Ｃｈｒｉｓｔ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  ２−８Ｄを用いて行った。凍結乾燥後に、「固体ケーク」が得られた。「ケーク」、「固体ケーク」、及び「乾燥組成物」という用語は、凍結乾燥プロセスから生じる多孔性でスポンジ構造のような組成物を指す。
【０１０５】
典型的には、凍結乾燥プロセスの後、ケークは、それ自体の構造を支持する。すなわち、ゲル物質及び凍結乾燥後に得られる固体物質の構造及び体積は実質的に同じである。
【０１０６】
【表２】
0006461957.tif 000003
【０１０７】
乾燥パッド内の水含有率の定量化：水含有率の測定は、カールフィッシャー容量滴定法（ＫＦＴ）を用いて行い、この方法は、米国薬局方のアッセイ（ＵＳＰ２７，＜９２１＞，Ｐ．２３９８〜２３９９）に基づいている。滴定の前に、凍結乾燥した組成物の入ったバイアルに４ｍＬの乾燥メタノールを加え、そのバイアルを３０分間、室温で回転させることによって、凍結乾燥した組成物から水を抽出した。続いて、滴定用に上清３ｍＬを取った。
【０１０８】
インビボモデルを用いた、パッドの止血効果の評価
腎出血ラットモデル−重度又は激しい出血のモデル：
インビボ急性腎出血ラットモデルを用いて効果を割り出した。
【０１０９】
月齢約３カ月、体重約２３ｇ（３５０ｇｒ）のスプラーグドーリーラットをこのモデルで用いた。ＩＰ（腹腔内）注射によって投与したペンタール５０ｍｇ／ｋｇで麻酔導入した。手順を行う間、麻酔の効果をモニタリングし、必要な場合には、ペンタールの追加の注射を行った。
【０１１０】
ラットを３８℃〜４０℃（最適には３８．４℃）の一定の体温に保つために、ラットを厚いプラスチックの処置台の上に乗せ、その台の下に、加熱ランプと、サーモプローブに連結した電熱パッドとの両方を置いた（サーモレギュレーター）。
【０１１１】
腰傍部開腹のために、ラットの左側腹部を剃毛した。剃毛部位を７０％のアルコールで拭いた。サーモプローブをラットの直腸に挿入して、体温をモニタリングした。ラットの方向を変えて、右側背側位になるようにした。ラットの血液中に存在する内因性トロンビンの活性を抑制するために、ヘパリン（ドイツのＲｏｔｅｘＭｅｄｉｃａ、＃ＥＴ３Ｌ１８４−１０、２００ＩＵ／ｋｇ）を静脈内にボーラス注射した（投与したヘパリンの濃度は、パッド内に存在するトロンビンに影響を及ぼさなかった）。このモデルを用いることによって、再現性が保たれる。動物は、内因性トロンビンによって体内の凝固機序を活性化できないからである。
【０１１２】
左殿部から第１２肋骨まで、約１〜２ｃｍの寸法で左側腰傍部の切開を行って、左腎を露出させた。腎臓を腎周囲脂肪から分離した。ラットを再び背臥位にした。柔らかい血管用クランプで腎血管を閉塞した。片腎摘をサジタル方向に行い、腎血管に垂直に腎臓の遠位側半分全体を除去した。残りの腎臓の切断面の水分を拭き取って乾燥した。試験パッドを腎臓の切断面に当てた。重合のために３分間置いてから、腎臓のクランプを解除した。腎臓のクランプを解除後、腎臓の出血の有無を観察した。出血が生じた場合、血液は、１時間でパッド内に吸収された。
【０１１３】
ラットが試験期間全体にわたって生存していた場合、パッドを除去して、切断面に当てた後のパッドの重量を、当てる前のパッドの重量から減じることによって、腎臓からの出血を評価した。パッドを除去した直後に、ＣＯ２を用いて、生存しているラット（麻酔下のままである）を安楽死させた。
【０１１４】
脾出血ブタモデル−軽度から中度の出血のモデル
下記の点を除き、本質的に、Ｃｏｌｅ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．「Ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａ  ｆｕｌｌｙ  ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  ｐｏｌｙ−Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ」Ｓｕｒｇｅｒｙ．１９９９  Ｓｅｐ；１２６（３）：５１０〜７に記載されているように手順を行った。
１−（Ｃｏｌｅ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．におけるように脾臓内に切開を作るのではなく）４ｍｍの生検パンチ針を用いて、脾臓内に円形の欠損を作ることによって、創傷を作製した。
２−パッドを当てる手順は、以下のようにして行った。：創傷からの出血を５秒間放置してから、サージカルスポンジで軽く圧をかけることによって、蓄積された血液を除去した。試験する止血材（ペクチン−トロンビンパッド、又はコントロール処置材、すなわち、トロンビン溶液に浸漬したＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｓｐｏｎｇｅ。正確な調合については、下記の実施例４を参照）を３０秒間、直接指で圧迫して当ててから、圧迫せずに６０秒間観察した。創傷部が出血し続けたり、又は再度出血した場合には、更なる止血材を加えることなく、すでに当てた止血材を所定の位置に残し、上記のサイクルの圧迫（３０秒後に、６０秒間観察）を２回目として繰り返した。創傷の作製から、このサイクルを、合わせて５分間、繰り返した。５分以内に止血ができなかった場合には、試験は不成功とした。この実験では、各試験について、パッド／スポンジを出血部位に当ててから止血までの時間（最長５分）を測定し、記録した。
【０１１５】
本願全体にわたって用いられているペクチン濃度（％）は、体積当たりの重量（ｗ／ｖ）である。
【０１１６】
液体及びゲル物質においては、１％  ｗ／ｖのペクチンは、１０ｇ／Ｌの濃度のペクチンを意味する。
【０１１７】
乾燥パッドにおいては、１％  ｗ／ｖのペクチンは、１０ｍｇ／ｃｍ３の密度のペクチンを意味する。
【０１１８】
実施例１：各種のＬＭペクチン濃度を用いた、乾燥トロンビン−ペクチンパッドの作製
約１〜１０％（ｗ／ｖ）（１０〜１００ｍｇ／ｃｍ３）のＬＭペクチンとトロンビンとを含むパッドは概ね、以下のようにして作製した。３％（ｗ／ｖ）（３０ｍｇ／ｃｍ３）のＬＭペクチンを含むパッドの調製については、下で更に詳細に説明する。
【０１１９】
第１の工程として、目視確認によって判断した場合に、その溶液が均質になるまで、１３００ＲＰＭで３〜６時間攪拌しながら、ＬＭペクチン粉末（上記の種類１。下記の表３に列挙されている量）を４８．５ｍＬのＤＤＷに４０〜７０℃で溶解することによって、濃度が約１．５〜１５％（ｗ／ｖ）（１５〜１５０ｇ／Ｌ）の各種のペクチンストック溶液を調製した。ｐＨ３．５〜５．５の溶液を得た。次に、０．５ＭのＮａＯＨを加えて、ｐＨを約７．０にした（具体的な滴定量は、下記の表３に列挙されている）。
【０１２０】
各種のペクチンストック溶液を調製するのに用いた具体的なペクチン粉末重量と、ＮａＯＨの滴定量は、下記の表３に定められている。
【０１２１】
【表３】
0006461957.tif 000004
【０１２２】
次の工程で、ペクチン溶液の安定化のために、ペクチンストック溶液を４℃で一晩（１４〜１８時間）保管した。
【０１２３】
次の工程で、トロンビン（上記のＥＶＩＣＥＬ（登録商標）Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ）１．７ｍＬと、１０．８Ｍの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）２５μＬを混合してから、形成された混合物を各ペクチンストック溶液（１．５％、４．５％、７．５％、１０．５％、及び１５％）３．３ｍＬと混合して、最終ペクチン濃度がそれぞれ約１％、３％、５％、７％、及び１０％（ｗ／ｖ）（１０〜１００ｇ／Ｌ）のペクチンゲルを形成した。トロンビンをＣａＣｌ２と混合してから、ペクチンストック溶液と混合するのは、室温（２０〜２５℃）で行った。トロンビン−ＣａＣｌ２溶液をペクチン溶液と混合するのは、２個のシリンジ（下記の詳述を参照）を用いて行い、その溶液を２個のシリンジ間で１０〜１５回移動させた。５ｍＬの最終体積を得、最終混合物を、高さ２５ｍｍ、直径２５ｍｍという寸法の凍結乾燥用ガラスカップに入れた。この凍結乾燥用ガラスカップを凍結乾燥機に入れ、上記の表２に従って凍結乾燥して、カールフィッシャー滴定法によって測定した場合の水含有率が≦３％の乾燥パッドを形成した。
【０１２４】
これらの各種の乾燥パッド（凍結乾燥工程後）は、密度約１％、３％、５％、７％、又は１０％（ｗ／ｖ）（１０〜１００ｍｇ／ｃｍ３）のペクチンと、３４０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンと、７．５ｍｇ／ｃｍ３のカルシウムとを含んでいた。乾燥パッドの高さは１０〜１４ｍｍの範囲、直径は２５ｍｍであった。
【０１２５】
密度３％（ｗ／ｖ）のペクチン（３０ｍｇ／ｃｍ３）を含む乾燥パッドの調製方法の詳細
【０１２６】
０．１４６ｇ（２．２５ｇｒ）のＬＭペクチン粉末（上記の種類１）を４８．５ｍＬのＤＤＷに溶解することによって、濃度４．５％（ｗ／ｖ）のペクチンストック溶液を得た。この溶解は、４０℃〜７０℃で、（目視確認によって判断した場合に、その溶液が均質になるまで）１３００ＲＰＭで３〜６時間攪拌しながら行った。ｐＨ３．５〜５．５の溶液を得た。溶解後、ペクチンストック溶液を０．５ＭのＮａＯＨ（約２ｍＬ）で滴定して、ｐＨを約７．０にした。
【０１２７】
次の工程で、ペクチン溶液の安定化のために、ペクチンストック溶液を４℃で一晩（１４〜１８時間）保管した。
【０１２８】
次の工程で、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含むトロンビン１．７ｍＬを１０．８ＭのＣａＣｌ２２５μＬと混合した（トロンビン溶液中の最終ＣａＣｌ２濃度６７．５ｍＭを得た）。続いて、トロンビン−カルシウム混合溶液（約１．７ｍＬ）をペクチンストック溶液（濃度４．５％  ｗ／ｖ）３．３ｍＬと混合して、ゲルを形成した。トロンビンをＣａＣｌ２と混合してから、ペクチンストック溶液と混合するのは、室温（２０〜２５℃）で行った。
【０１２９】
混合は、三方活栓（カタログ１０９７、インド、ハリヤナ州のＩｌｉｆ）によって互いに連結させた２個の５ｍＬシリンジを用いることによって行い、一方のシリンジにはトロンビン溶液を入れ、もう一方のシリンジにはペクチンストック溶液を入れた。溶液は、２個のシリンジ間で１０〜１５回移動させた。混合後、混合溶液（体積５ｍＬ）を凍結乾燥用カップ（上記の寸法を参照）に入れ、針を用いて、ゲルの上面に形成された泡のうち、針の届く泡を消してから、カップを凍結乾燥機に移し、上記の表２に従って凍結乾燥した。
【０１３０】
形成されたパッド内のペクチンの最終密度は、３％（ｗ／ｖ）（３０ｍｇ／ｃｍ３）、トロンビンの最終密度は、３４０ＩＵ／ｃｍ３、カルシウムの最終密度は、７．５ｍｇ／ｃｍ３であった。
【０１３１】
３％（ｗ／ｖ）（３０ｍｇ／ｃｍ３）のＬＭペクチン（種類１）と、７．５ｍｇ／ｃｍ３のカルシウムとを含むパッド（トロンビンは含まない）を作製し、下記の実験／測定におけるコントロールとした。このコントロールパッドは、１．７ｍＬのトロンビン溶液の代わりに、トロンビンバッファー構成成分（６ｍｇ／ｍＬのヒトアルブミンと、２０ｍＭの酢酸ナトリウムと、１ｇ／Ｌ（２０ｇｒ／Ｌ）のＤ−マンニトールと、１３０ｍＭのＮａＣｌと、４０ｍＭのＣａＣｌ２とを含む注射用水１．７ｍＬ）を用いた以外は、３％（ｗ／ｖ）のＬＭペクチンと、３４０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンと、７．５ｍｇ／ｃｍ３とを含むパッドと同じ方法で作製した。
【０１３２】
凍結乾燥手順の後、止血効果を評価するとともに、特定のパラメーターについて目視検査するまでは、パッドを閉ざされた区画に、乾燥剤とともに、室温（２０〜２５℃）で保管した（Ｓｏｒｂ−Ｉｔ、＃４２４３、ドイツ、ミュンヘンのＳｕｄ−Ｃｈｅｍｉｅ）。
【０１３３】
下記のパラメーターについての目視検査は、上記の調製済みゲルに対して行った（２個のシリンジの中身を混合して、その中身を凍結乾燥用カップに注入した後、かつ、その凍結乾燥を行う前）。
【０１３４】
いずれのパラメーターのランク付けも、１〜５の段階で行い（１が低く、５が高い）、いずれの評価も定性的であり、ランク付けは、他のゲル調製物との比較で判断し、各パラメーターの最適値は、括弧内に示されている。
−発泡スジ（１）−このパラメーターを評価するときには、形成されたゲル内の泡の量とサイズの両方を検討した。ゲル調製物内に大量の泡又は大きい泡が存在するのは望ましくない。泡のせいで、ゲル内に不均質に分布された大きい空洞を有する乾燥パッドとなり、止血と乾燥パッドの堅固さに悪影響が及ぶことがあるからである。
−ゲル上の液体（１）−このパラメーターは、ゲルの入ったカップを傾け、ゲル上の液体量を視覚評価することによって評価した。形成されたゲル上に液体が存在することは望ましくない。ゲルの均質性が低いこと、ひいては、凍結乾燥後のパッドの均質性が低いことを指すからである。
−粘着性（４〜５）−このパラメーターは、ニトリルグローブでゲルに触れて、ゲルのグローブへの密着性を定性的に評価することによって評価した。高い値の粘着性が望ましい。乾燥後に得られる乾燥パッドの表面への密着性が高いことを示すからである。
−剛性（３〜４）−このパラメーターは、ゲルを静かに手で圧迫することによって評価した。３〜４の値が望ましい。乾燥後に得られる乾燥パッドの剛性が、その構造を保つのに十分であるが、剛性が高過ぎないので、生体器官の形状に適合するように操作及び適応させることができることを示すからである。
【０１３５】
各種ゲルの目視確認の結果は、下記の表４に示されている。
【０１３６】
【表４】
0006461957.tif 000005
【０１３７】
目視検査は、乾燥パッド（凍結乾燥後）についても行った。凍結乾燥後、「固体ケーク」／「ケーク」が得られた。「固体ケーク」は、凍結乾燥プロセスから生じる多孔性のスポンジ構造のような組成物を指す。以下のパラメーターを評価した。いずれのパラメーターのランク付けも、１（低い）〜５（高い）の段階で行い、いずれの評価も定性的であり、ランク付けは、他のゲル調製物との比較で判断し、各パラメーターの最適値は、括弧内に示されている。
−脆さ（１）−このパラメーターは、各パッドを静かに圧迫し、グローブに残った、パッドの一部を評価することによって評価した。パッドは、有益には、操作及び取扱い中に、その構造を保持して、損なわれないままであるべきである。
−発泡性（３）−このパラメーターは、パッドの発泡体のような構造に関し、パッドに静かに圧を加え、（パッドを圧迫する力／パッドを圧迫することに対する耐性に基づき）パッド内の空洞を評価することによって評価した。３という値は、血液をケーク（上記の「ケーク」の説明を参照）から逃がすことなく、液体／血液を吸収できる空隙率を有するパッドを示す。
−粘着性（４〜５）−ゲル調製物に関して上記したように評価した。粘着性のあるパッドの方が、標的組織にしっかり付着する。
−剛性／こわさ（３）−このパラメーターは、パッドを静かに手で圧迫し、圧に対する耐性を評価することによって評価した。３という値は、容易に体の形状に適合できるが、その構造を保持して破断しないことができるというパッドのバランスを示している。
【０１３８】
また、乾燥パッド組成物中の全固形分を、パッドの体積（乾燥パッドを作製するのに用いたゲル物質体積。パッドの体積と実質的に同じである。約５ｍＬ）で除することによって、各乾燥パッドの密度を数学的に計算した。
【０１３９】
トロンビン構成成分溶液中の全固形分は、１ｍＬ当たり約４０ｍｇである。
【０１４０】
各種の乾燥パッドの目視確認の結果と、密度の計算結果は、下記の表５に示されている。
【０１４１】
【表５】
0006461957.tif 000006
【０１４２】
結果から、ゲルの物理的特徴（表４）によれば、ＬＭペクチン濃度７％（ｗ／ｖ）のゲルの方が、他のゲルと比べて優れていることが示されている。
【０１４３】
驚くべきことに、乾燥パッドの物理的特徴（表５）から、ＬＭペクチン密度が７％及び１０％（ｗ／ｖ）のペクチンパッドは、ペクチン密度の低いパッドよりも劣っていることが示された。ペクチン密度が３％及び５％（ｗ／ｖ）のＬＭペクチンを有するゲル／パッドは、最適な特徴を有していた。
【０１４４】
上記の調製方法では、トロンビン−ペクチンゲルは、まず、トロンビンをＣａＣｌ２と混合してから、ペクチン溶液と組み合わせて混合するという手順順序に従って形成した。
【０１４５】
混合の順序を変えて、まずＣａＣｌ２をペクチン溶液と混合するときには（そして、その後にトロンビン溶液と混合するときには）、すぐにゲル化が行われる。このようなゲル化の早期開始により、ゲルドロップが生成されたので、ペクチンゲル内の均質性が失われ、次の工程で、トロンビン溶液との混合が不十分となった。
【０１４６】
これらの結果から、均質なパッドを形成するには、まず、カルシウムをトロンビン溶液と混合し、次の工程で、ペクチン溶液を加えるのが有益であることが示されている。
【０１４７】
また、種類１のＬＭペクチンの場合と同様の方法で、種類２のＬＭペクチン（上で定義されているようなもの）からパッドを作製した。ゲルとパッドの目視検査を、上で定めたパラメーターについて行った。得られた結果と結論は、種類１のＬＭペクチンの場合と同様であった。
【０１４８】
実施例２：各種のＨＭペクチン濃度を用いた、乾燥トロンビン−ペクチンパッドの作製
０．６６〜５．３３％（ｗ／ｖ）（６．６〜５３．３ｍｇ／ｃｍ３）のＨＭペクチンとトロンビンとを含むパッドを以下のようにして作製した。
【０１４９】
第１の工程として、濃度８％（ｗ／ｖ）（８０ｇ／Ｌ）のＨＭペクチンを有するペクチンストック溶液を以下のようにして調製した。５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムバッファー（カタログ＃３１４３７、イスラエル、レホヴォトのＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）１００ｍＬをミキサーボウルに入れ、ペクチンが完全に溶解し（目視観察する）、塊のない均質なペースト状溶液が形成されるまで、ミキサー（カタログ：Ｋ５ＳＳＷＨ  ３２５ワット、ミシガン州セントジョーゼフのＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄ）を２８０ＲＰＭの速度で、約３０分間、室温（２０〜２５℃）で用いることによって混合中に、ＨＭペクチン（上記の材料及び方法の項に記載されているようなもの）０．５ｇ（８ｇｒ）を少しずつ加えた。このペースト状溶液のｐＨは約３．０であった。
【０１５０】
次の工程で、下記の表６に示されている体積（総体積は３０ｍＬ）で、８％のＨＭペクチンストック溶液を５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムで溶解することによって、このペースト状溶液を用いて、様々なペクチン濃度（１％、２％、４％、６％、及び７％（ｗ／ｖ）（１０〜７０ｇ／Ｌ））を形成した。
【０１５１】
【表６】
0006461957.tif 000007
【０１５２】
次の工程で、トロンビン溶液（材料及び方法の項に記載されているようなもの）を、この各種ペクチン溶液（８％ペクチンストック溶液を含む）に１：２の比率［トロンビン溶液１５ｍＬと、ペクチン溶液３０ｍＬ］で加えた。ＨＭペクチンは、ゲル化に糖を必要とするので、（トロンビン構成成分中のマンニトール濃度は、ゲル物質を形成させるには不十分であった）、形成された溶液は液体状で、ゲル状ではなかった。形成された溶液は、粘性があり、一部のみが均質であったことが観察された。
【０１５３】
得られた混合物５ｍＬを凍結乾燥用ガラスカップ（高さ２５ｍｍ、直径２５ｍｍ）に入れ、表２に記載されている凍結乾燥サイクルに従って凍結乾燥した。この各種の乾燥パッドにおける最終ペクチン密度は、０．６６％、１．３３％、２．６６％、４％、４．６６％、５．３３％（ｗ／ｖ）（６．６〜５３．３ｍｇ／ｃｍ３）であり、トロンビン密度は３３３ＩＵ／ｃｍ３であり、カルシウム密度は１．４８ｍｇ／ｃｍ３であった。乾燥パッドの高さは９〜１０ｍｍの範囲、直径は２５ｍｍであった。
【０１５４】
凍結乾燥手順の後、止血効果と、脆さ、発泡性、粘着性、及び剛性（実施例１におけるような上記のランク付けを使用）という特徴とを評価するまでは、パッドを閉ざされた区画に、乾燥剤とともに、室温（２０〜２５℃）で保管した（Ｓｏｒｂ−Ｉｔ、＃４２４３、ドイツ、ミュンヘンのＳｕｄ−Ｃｈｅｍｉｅ）。これらのパッドでは、目視検査は、乾燥パッドにおいてのみ行った。
【０１５５】
また、ＬＭペクチンパッドについて記載したように、各乾燥パッドの密度を数学的に計算した（ゲル物質体積は５ｍＬであった）。
【０１５６】
密度と各検査パラメーターの値は、下記の表７に示されている。
【０１５７】
【表７】
0006461957.tif 000008
【０１５８】
結果から、パッド内のＨＭペクチン密度が、上記の試験特徴に対して影響を及ぼさなかった（全てのパッドにおいて、同じランク付けがなされた）ことが示されている。
【０１５９】
これらのパッドが不均質で、固体結晶を含んでいた（目視観察）ことも示された。
【０１６０】
これらの結果から、ＨＭペクチンを含むとともに、上記の条件下で作製したパッドは、吸収品質が悪くなり、操作が容易でなく、生体器官の形状に適合せず、標的組織に効率的には付着しないので、出血を止めるには効率的でないことが暗示されている。
【０１６１】
実施例３：ＨＭ及びＬＭペクチン−トロンビンパッドの急性腎出血ラットモデルにおけるインビボでの止血効果
下記の実施例は、重度出血モデルにおいて、実施例１及び２に従って作製したトロンビン−ペクチンパッドの止血効果を測定するのを目的としていた。評価は、上記のインビボ急性腎出血ラットモデルを用いて行った。
【０１６２】
ＬＭペクチン密度が１％、３％、５％、７％、及び１０％（ｗ／ｖ）の乾燥パッドを試験し、ＨＭペクチン密度が０．６６％、１．３３％、２．６６％、及び４．６６％（ｗ／ｖ）のパッドを試験した。
【０１６３】
ＬＭペクチンパッドにおけるカルシウム密度は７．５ｍｇ／ｃｍ３、トロンビン密度は３４０ＩＵ／ｃｍ３であった。
【０１６４】
ＨＭペクチンパッドにおけるカルシウム密度は１．４８ｍｇ／ｃｍ３、トロンビン密度は３３３ＩＵ／ｃｍ３であった。
【０１６５】
この実験では、３％（ｗ／ｖ）のＬＭペクチンと、７．５ｍｇ／ｃｍ３のカルシウムとを含むパッド（トロンビンは含まない）であって、実施例１で詳述したようにして作製したパッドの性能を試験した。
【０１６６】
止血面で効率的なパッドは、失血を約０．３ｇ（４ｇｒ）以下にするパッドとした。
【０１６７】
各種のペクチンパッドを用いたときの失血の結果及び平均値は、下記の表８（ＬＭペクチンを含むパッド）及び表９（ＨＭペクチンを含むパッド）に示されている。
【０１６８】
【表８】
0006461957.tif 000009
【０１６９】
【表９】
0006461957.tif 000010
【０１７０】
結果から、１％及び３％（ｗ／ｖ）のＬＭペクチン（種類１及び２の両方）を含むパッドの失血の平均は、０．３ｇ（４ｇｒ）未満と、許容可能であったことが示されている（表８を参照）。
【０１７１】
また、結果から、３％（ｗ／ｖ）のＬＭペクチンを含むとともに、トロンビンを含まないパッドの失血は多く、許容不能であったことも示されている（表８を参照）。
【０１７２】
許容可能な失血効果を示したＨＭペクチンパッドはなく、いずれも、失血が多く、許容不能であった（表９を参照）。
【０１７３】
これらの結果から、重度出血を効果的に止めることのできるパッドを得るには、ペクチンパッドは、有益には、トロンビンと、１％（ｗ／ｖ）以上〜５％（ｗ／ｖ）未満のＬＭペクチンとを含むべきであることが示されている。
【０１７４】
実施例４：ＬＭペクチン−トロンビンパッドの脾出血ブタモデルにおけるインビボでの止血効果
上記の実施例から、トロンビンと、１及び３％（ｗ／ｖ）の密度のＬＭペクチンとを含むパッドが、重度出血を効果的に止めたことが示された。以下の例は、各種のトロンビン−ＬＭペクチンパッドが、軽度から中度の出血を止める効果を評価するのを目的とした。
【０１７５】
この例では、脾出血ブタモデルを上記のように使用した。上で示したように、各試験において、止血までの時間（最長５分）を記録した。成功とされる許容可能な基準は、３００秒以内の止血時間である。
【０１７６】
試験パッドは、１〜５％（ｗ／ｖ）の範囲の密度のペクチンと、３４０及び６８０ＩＵ／ｃｍ３の密度のトロンビンと、４．５及び７．５ｍｇ／ｃｍ３の密度のカルシウムとを含んでいた。
【０１７７】
パッドは、以下のようにして作製した。
０．３ｇ（５ｇｒ）のＬＭペクチン粉末（上記の種類１）を４０ｍＬのＤＤＷに溶解することによって、１０％（ｗ／ｖ）ペクチン溶液を調製した。ペクチン粉末をＤＤＷに少しずつ加え、４０℃〜７０℃の温度で、１３００ＲＰＭで、３〜６時間攪拌しながら溶解工程を行った。溶解後、得られた溶液のｐＨは５．０であったので、０．５ＭのＮａＯＨ約２ｍＬで滴定を行って、ｐＨを約７．０にした。次の工程で、ＤＤＷを溶液に加え、最終体積を５０ｍＬにした。安定化のために、ペクチンストック溶液を４℃で一晩（１４〜１８時間）保管した。
【０１７８】
続いて、４０ｍＭのＣａＣｌ２を含むトロンビン溶液を２．７ＭのＣａＣｌ２２５μＬと混合した（トロンビン溶液内における最終カルシウム濃度は２７ｍＭであった）。続いて、トロンビン−カルシウム溶液をＤＤＷと混合した（各パッドにおけるトロンビン溶液とＤＤＷの体積は、下記の表１０を参照）。
【０１７９】
続いて、上記の溶液をペクチンストック溶液と混合して、ペクチン−トロンビンゲルを形成した（各パッドにおける１０％ｗ／ｖのペクチンストック溶液の体積は、下記の表１０を参照）。混合は、実施例１に記載されているように、室温で行った。
【０１８０】
【表１０】
0006461957.tif 000011
【０１８１】
２個のシリンジ内で混合した後、その溶液（約５ｍＬ）を凍結乾燥用カップ（上記の寸法を参照）に移し、凍結乾燥機に入れ、表２に記載されているサイクルに従って凍結乾燥した。
【０１８２】
最終のペクチン、トロンビン、及びカルシウムの密度は、表１１に列挙されている。乾燥パッドの寸法は、高さが８〜１２ｍｍの範囲、直径が２５ｍｍであった。
【０１８３】
【表１１】
0006461957.tif 000012
【０１８４】
ポジティブコントロールとして、ＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）Ａｂｓｏｒｂａｂｌｅ  Ｇｅｌａｔｉｎ  Ｓｐｏｎｇｅをトロンビンとともに用いた（下記のように作製）。ＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）スポンジは、出血面に当てることによって止血するための無菌の水不溶性かつ順応性のブタゼラチン吸収性スポンジである。このスポンジの外観は灰白色であり、多孔性である。この実験では、使用前に、ＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標）（高さ１０ｍｍ）を２０×３０ｍｍのサイズに切断し、２ｍＬのトロンビン溶液（フィブリンシーラントＥＶＩＣＥＬ（登録商標）におけるようなトロンビ構成成分を、トロンビン構成成分１ｍＬに対して生理食塩水４ｍＬとなるように希釈したもの）で飽和させた。この飽和スポンジを当てる前に、グローブをはめた指の間でスポンジを絞って気泡をなくし、上記のモデルにおいて詳述されている手順に従って当てた。
【０１８５】
各種のペクチンパッド及びコントロール処置材（トロンビンを含むＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標））を用いたときに止血が得られるまでの平均時間は、下記の表１２に示されている。上述のように、許容可能な止血時間は３００秒以内である。
【０１８６】
【表１２】
0006461957.tif 000013
【０１８７】
結果から、このモデルにおいて、全ての試験パッドが出血を効果的に止めたこと、すなわち、止血時間が３００秒以内であったことが示されている。
【０１８８】
また、結果から、臨床現場において現在、標準的な手術手順材であるコントロール処置材（トロンビンを含むＳＵＲＧＩＦＯＡＭ（登録商標））の結果と同様に、３％（ｗ／ｖ）のペクチンとともに、６８０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンを含むパッドでも最適な結果が得られ、止血時間が３０秒であったことも示されている。
【０１８９】
これらの結果から、トロンビン密度を向上させることによって、ペクチンパッドの性能を増進できることが示されており、例えば、３％（ｗ／ｖ）のペクチンと３４０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンとを含むパッドの性能と、３％（ｗ／ｖ）のペクチンと６８０ＩＵ／ｃｍ３のトロンビンとを含むパッドの性能との比較を参照されたい。
【０１９０】
〔実施の態様〕
（１）  １％（ｗ／ｖ）以上〜７％（ｗ／ｖ）未満の範囲の密度のペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンと、を含む乾燥パッドであって、前記ペクチンが低メトキシル（ＬＭ）ペクチンである、パッド。
（２）  前記ペクチン密度が１％（ｗ／ｖ）超〜７％（ｗ／ｖ）未満である、実施態様１に記載のパッド。
（３）  前記ペクチン密度が約１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）である、実施態様１に記載のパッド。
（４）  前記ペクチン密度が約１％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満である、実施態様１に記載のパッド。
（５）  前記ペクチン密度が約３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）未満である、実施態様１〜４のいずれかに記載のパッド。
【０１９１】
（６）  前記ペクチン密度が約３％（ｗ／ｖ）である、実施態様１〜５のいずれかに記載のパッド。
（７）  前記２価の陽イオンがカルシウムである、実施態様１〜６のいずれかに記載のパッド。
（８）  低メトキシル（ＬＭ）ペクチンと、トロンビンと、を含む乾燥パッドを作製する方法であって、
ａ．ＬＭペクチンと、２価の陽イオンと、トロンビンとを用意する工程と、
ｂ．前記ペクチンと、前記２価の陽イオンと、前記トロンビンとを混合して、均質なゲル形成を可能にする条件下で、ペクチンを１％（ｗ／ｖ）以上〜７％（ｗ／ｖ）未満の濃度にする工程と、
ｃ．前記ゲルを乾燥させる工程と、を含む方法。
（９）  最初にトロンビンを前記２価の陽イオンと混合してから、ペクチンを加えることによって工程ｂを行う、実施態様８に記載の方法。
（１０）  前記２価の陽イオンがカルシウムである、実施態様９に記載の方法。
【０１９２】
（１１）  患者の創傷部出血を低減する方法であって、実施態様１〜７のいずれかに記載のパッドを前記創傷部に当てることによって、前記創傷部出血を低減することを含む、方法。