【事件の表示】
　特許第２８８９５４９号「充実性腫瘍治療法及び組成物」の請求項１ないし７に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第２８８９５４９号の請求項１ないし７に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第２８８９５４９号発明は、平成２年１０月１９日（パリ条約による優先権主張、１９８９年１０月２０日、アメリカ合衆国）を国際出願日とする特願平３−５０１０３４号の一部を平成９年３月１７日に新たな特許出願としたものであって、平成１１年２月１９日にその特許権の設定登録がなされ、その後、都野キヨコより特許異議申立がなされ、当審より取消理由通知がされ、その指定期間内である平成１２年１１月２０日に訂正請求（後日取下）がなされた後、取消理由通知がされ、その指定期間内である平成１４年４月１０日に訂正請求（後日取下）がなされた後、取消理由通知がされ、その指定期間内である平成１６年３月３日に訂正請求書が提出されたものである。
　
２．訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
特許請求の範囲の請求項１に、
「充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、
　小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モル％とから成るリポソームであって、該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有するリポソーム、および
　リポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含む、リポソーム組成物。」とあるのを、
「充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、
　小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質（この場合、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化されるものである）１〜２０モル％とから成るリポソームであって、該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有するリポソーム、および
　リポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含み、
　ここで該リポソームは、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤のリポソームへの積載に用いられる、膜を横切るアンモニウムイオン勾配を含む、リポソーム組成物。」と訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、及び特許請求の範囲の拡張・変更の存否
　上記訂正は「ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで 誘導体化された両親媒性小胞形成脂質」を、「両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化されるもの」に限定し、及び、リポソームへの腫瘍結像剤または抗腫瘍剤の積載手段について、任意であったものを、「リポソームは、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤のリポソームへの積載に用いられる、膜を横切るアンモニウムイオン勾配を含む 」と限定するものであるから、いずれも、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。また、「両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化される」は、明細書の段落【００２２】〜【００３３】、及び図１〜図６に実質的に記載されており、「リポソームは、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤のリポソームへの積載に用いられる、膜を横切るアンモニウムイオン勾配を含む 」は、明細書の段落【００５２】 、及び 段落【０１６９】〜【０１７１】 に記載されているから、この訂正は、願書に添付された明細書及び図面に記載された範囲内のものであり、特許請求の範囲を拡張し、または変更するものではない。
　
（３）独立特許要件に対する判断
　後述の「３．特許異議申立についての判断」に記載した理由から明らかなように、訂正後の特許請求の範囲の請求項１〜７に係る発明は、独立して特許を受けることができる発明である。
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項、及び同条第３項で準用する平成５年法改正前の第１２６条第２項、及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議申立についての判断
（１）本件発明　
　本件発明は、上記のとおり訂正が認められるから、その特許明細書及び図面の記載からみて、特許請求の範囲の請求項１〜７に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】 充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、
　小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質（この場合、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化されるものである）１〜２０モル％とから成るリポソームであって、該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有するリポソーム、および
　リポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含み、
　ここで該リポソームは、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤のリポソームへの積載に用いられる、膜を横切るアンモニウムイオン勾配を含む、リポソーム組成物。（以下「本件発明１」という。）
【請求項２】前記親水性ポリマーが約１,０００〜５,０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載のリポソーム組成物。（以下「本件発明２」という。）
【請求項３】前記抗腫瘍剤の少なくとも約８０％がリポソームに取り込まれた形態である、請求項１または２に記載のリポソーム組成物。（以下「本件発明３」という。）
【請求項４】前記抗腫瘍剤がアントラサイクリン抗生物質である、請求項３に記載の組成物。（以下「本件発明４」という。）
【請求項５】前記アントラサイクリンがドキソルビシン、エピルビシン、およびダウノルビシンならびに薬理学的に許容可能なその塩および酸からなる群から選択される、請求項４に記載のリポソーム組成物。（以下「本件発明５」という。）
【請求項６】前記リポソームに取り込まれた前記抗腫瘍剤の濃度が５０μｇ（薬剤）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）を超える、請求項４または５に記載のリポソーム組成物。（以下「本件発明６」という。）
【請求項７】 充実性腫瘍中に、血流を介して局在化するためのリポソーム組成物の調製方法であって、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤をリポソーム中に取り込んで請求項１から６のいずれかに１項に記載のリポソーム組成物を形成する工程を包含する方法。（以下「本件発明７」という。）」である。
　
（２）異議申立の概要
　異議申立人都野キヨコは、甲第１〜４号証、及び参考資料１〜１０を提出して、本件発明は特許法第２９条第１項第３号、又は同法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものであり、また同法第３６条第３項及び第４項に規定する要件を満たしていない出願に対して特許されたものであるから、取り消されるべきであることを主張している。
　異議申立人が提出した証拠は次のとおりである。
甲第１号証：特表平５−５０１２６４号公報（以下「刊行物１」という。）　
甲第２号証：特開平１−２４９７１７号公報　（以下「刊行物２」という。）
甲第３号証：特開昭６１−１５８９３２号公報（以下「刊行物３」という。）
甲第４号証：特表平１−５０２５９０号公報（以下「刊行物４」という。）　
参考資料１：特許第２６６７０５１号公報
参考資料２：「一般審査基準、出願の分割」（特許庁編、社団法人発明協会発行）　の抜粋
参考資料３：「一般審査基準、発明の同一性に関する審査基準」（特許庁編、社団法人発明協会発行）の抜粋
参考資料４：Life  Sciences ,Vol.40, No.16, 1987, pp.1553-1560
参考資料５：International  Journal  of  Pharmaceutics, 29(1986)53-65
参考資料６：Journal  of  Pharmaceutical  Science, Vol.72,No.9,1983,1086-1088
参考資料７：FEBS  1212, Vol.167, No.1., 1984, 79-82
参考資料８：Life  Sciences, Vol. 40, No. 4, 1987, pp. 367-374
参考資料９：J. Pharm. Pharmacol. 39, Suppl., 52P, 1987
参考資料10：Advanced  Drug  Delivery  Reviews  16(1995) 157-182
　
（３）証拠に記載の事項
（ａ）刊行物２には、
「本発明の目的は、内包する薬物のもれが少ない安定なリポソームの製造法を提供することである。・・・・本発明は、リポソーム膜を脂質および式１で示される２，４−ビス（ポリエチレングリコール）−６−置換アミノ−ｓ−トリアジン誘導体より構成することを特徴とするリポソーム膜の製造方法に関する。・・・・・ポリエチレングリコール部の平均分子量は３５０〜５０００が望ましい」（第２頁左上欄第４行〜最下行）、
「リポソームに取りこませる親水性薬物としては例えば・・・・・抗がん剤・・・・・抗ウイルス剤・・・・・抗生物質・・・・・ペプチドホルモン剤・・・・・酵素剤・・・・・免疫賦活剤・・・・・蛋白質が挙げられる。」（第５頁左上欄第９行〜同右上欄第１行）、
「実施例１．
　卵黄レシチン３０ｍｇ、例示化合物２（１０ｍｇ）、コレステロール（１．４ｍｇ）をクロロホルム（３ｍｌ）に溶解し減圧留去して薄膜を作った。充分に乾燥後カルボキシフルオレセインのBuffer 溶液・・・・・３ｍｌを加えて１５分間ボルテクシングを行いその後プローブ型の超音波発生装置で１０分間ソニケーションを行った。・・・・・次に・・・カルボキシフルオレセインの漏出をけい光測定で追跡した。・・・・・・・本発明の化合物を用いることにより、リポソーム内容物の漏出が少なくなることがわかる。」（第６頁左上欄第４行〜右上欄第８行）（例示化合物２は、１分子あたり２分子のポリエチレングリコールを有する脂質に相当する。）
と記載されている。
　また、第２頁左下欄〜第３頁右上欄 には、式１で表される化合物の具体例として、１分子あたり２分子のポリエチレングリコールを有する脂質に相当する化合物が記載されている。
（ｂ）刊行物３には、
「本発明は、体内の腫瘍細胞に対する封入されたイメージング及び化学療法剤の溢出を増大させる簡便な方法を提供するものである。」（第５頁左上欄第７〜第９行）、
「ａ）化学的に純粋なリン脂質分子を含む２０００Åより小さい中性小ミセル粒子を調製し；ｂ）腫瘍内の該粒子の部位を検出する目的のイメージング薬剤、又は該腫瘍を治療する目的の化学療法薬剤を該ミセル粒子内に含有し；ｃ）前記ｂ）段階で得られたミセル粒子を体の血流内に導入し腫瘍内に該粒子を完全なまま位置させる；というステップを含む、該腫瘍の診断又は治療を目的として該薬剤を用いて体内の腫瘍を目標攻撃する方法」（第１ペ−ジ左下欄第６行〜第１６行）、
「”ミセル粒子”及び”ミセル”とは両親媒性分子の自発的な凝集によって引き起こされる水溶性粒子を意味する。・・・・・ミセルは・・・・・両親媒性分子の２つの平行な層から成る二重層でもあり得る。・・・・・リポソームとしても知られているものである。」（第６頁左上欄第２行〜第１２行）、
「前述の全ての小胞は電子顕微鏡によって０．１ミクロン（１０００Å）より小さい平均直径を有することが示された」（第７頁左上欄第５行〜第７行）
と記載されている。
（ｃ）刊行物４には、
「薬物がその内部に捕捉され、そのサイズが主として約０．０５〜０．５μであるリポソームの懸濁液を静脈注射により投与する、薬物による治療法であって；次のようなリポソームの調製を包含し、血流中におけるリポソームの寿命が長い、方法：(ａ)実質的に均一相の二重層を有し、該二重層は、主として飽和アシル鎖を有するスフィンゴミエリンおよび中性リン脂質でなる群から選択される膜強化性脂質を少なくとも約５０モル％の割合で含有し、そして、(ｂ)該二重層は、約５〜２０モル％の糖脂質を含有し、該糖脂質は、ガングリオシドＧＭ１、飽和ホスファチジルイノシトールおよびガラクトセレブロシド硫酸エステルでなる群から選択される 」（第１頁右下欄第１５行〜第２頁左上欄第３行）、
「薬物による腫瘍の治療に用いられる請求の範囲第８項に記載の方法であって、腫瘍に供給された薬物量が、薬物の投与２４時間後に薬物／腫瘍重量により算出すると、遊離型の薬物を投与したときよりも数倍高い、方法」（第２頁右上欄第１行〜第４行）、
「腫瘍治療における改良された薬剤供給および／または薬剤標的化のために、血流中で薬剤を運搬するリポソームの寿命を著しく延長する方法を提供することは、本発明のさらに別の目的である。」（第４頁左下欄第１５行〜第１８行）、
「血流中のリポソームの寿命が延長したので、注射されたリポソームの有意な量が、ＲＥＳによって血液から除去される前に標的部位に到達できるようになる。特に、腫瘍患者に静脈投与することにより、腫瘍組織を標的として薬剤治療を行なうことが望ましい。動物の腫瘍を標的とする本発明のリポソーム組成物の使用は、実施例１１〜１３に詳細に記載される。結果を要約すると、血液／ＲＥＳ比が増大したときのリポソームは、遊離の薬物に比べて腫瘍への取込みが１０〜３０倍増大する。腫瘍中に高濃度の薬物が認められるのは、投与後４〜４８時間であるが、腫瘍への取込みは投与後２４時間がピークであった。」（第８頁左下欄第２０行〜右下欄第１行〜第７行）と記載されている。
　
（４）判断
（Ｉ）特許法第２９条第１項第３号について
　異議申立人は、本件発明は、原出願に係る発明と同一であるから、本件特許は、適法に分割出願されたものでなく、出願日の遡及は認められないと主張しているので、まず、この点について検討する。
　
　原出願は特許第２６６７０５１号（参考資料１）として特許され、該特許発明は、その特許明細書及び図面の記載からみて、特許請求の範囲の請求項１〜７に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】 充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、
　小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択され、１,０００〜５,０００ダルトンの分子量を有する親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モル％とから成り、平均リポソームサイズが約０．７〜０．１２μｍのリポソーム、および
　リポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含む、リポソーム組成物。
【請求項２】前記親水性ポリマーが約１,０００〜５,０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載のリポソーム組成物。
【請求項３】前記抗腫瘍剤の少なくとも約８０％がリポソームに取り込まれた形態である、請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
【請求項４】前記抗腫瘍剤がアントラサイクリン抗生物質である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】前記アントラサイクリンがドキソルビシン、エピルビシン、およびダウノルビシンならびに薬理学的に許容可能なその塩および酸である請求項４に記載のリポソーム組成物。
【請求項６】前記リポソームに取り込まれた前記抗腫瘍剤の濃度が５０μｇ（薬剤）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）を超える、請求項４または５に記載のリポソーム組成物。
【請求項７】 充実性腫瘍中に血流を介して局在化するためのリポソーム組成物の調製方法であって、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤をリポソーム中に取り込んだ請求項１から６のいずれかに１項に記載のリポソーム組成物を形成する工程を包含する方法。」
　
　本件発明１と、原出願の請求項１に係る発明とを対比すると、前者は、リポソームへの腫瘍結像剤または抗腫瘍剤の積載手段として、「リポソームは、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤のリポソームへの積載に用いられる、膜を横切るアンモニウムイオン勾配を含む 」のに対し、後者には、リポソームへの腫瘍結像剤または抗腫瘍剤の積載手段について、このような構成が付されていないので、両者を同一発明であるとすることはできない。
　また、本件発明２〜７は、本件発明１をさらに限定したものであるか、または本件発明１のリポソーム組成物の調整方法の発明であるので、原出願の請求項２〜７に係る発明と同一発明であるとすることはできない。
　したがって、本件発明は、原出願に係る発明と同一であるから、本件特許は、適法に分割出願されたものでなく、出願日の遡及は認められないとの異議申立人の主張は採用できない。また、他に不適法に分割出願されたとする理由もなく、本件特許は、適法に分割出願されたものと認める。
　
 　本件特許は、前記したとおり適法な分割出願であり、平成２年１０月１９日（パリ条約による優先権主張、１９８９年１０月２０日、アメリカ合衆国）を出願日とみなされるものであるところ、 刊行物１は、本件の原出願に係る公表公報であって、その公表日は、平成５年３月１１日であるから、本件特許の優先権主張日後に頒布されたものであるので、特許法第２９条第１項第３号に規定する刊行物に該当しない。
　よって、異議申立人の主張は採用しない。
　
（ＩＩ）特許法第２９条２項について
　１）刊行物２の第２頁左下欄〜第３頁右上欄には、式１で示される２，４−ビス（ポリエチレングリコール）−６−置換アミノ−ｓ−トリアジン誘導体の具体例が記載されており、そのうち、２、４、６〜８の化合物は、１分子あたり２分子のポリエチレングリコール（親水性ポリマー）で誘導体化された脂質に相当するものと認められる。
　そこで、本件発明１と刊行物２に記載されたものとを対比すると、本件発明１のリポソームを構成する「親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質」が、「両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子の親水性ポリマー（ポリエチレングリコール等）で誘導体化」されたものであるのに対して、刊行物２に記載のものは、上記のとおり、脂質１分子あたり２分子のポリエチレングリコール（親水性ポリマー）で誘導体化されたものであるから、両者は、リポソームを構成する、親水性ポリマーで誘導体化された脂質の構成において相違する。
　
２）また、本件発明１のリポソームは、明細書の例１３に示されるとおり、腫瘍細胞への吸収の局在化の割合が、通常のリポソームの約２倍値となり、腫瘍成長抑制の実験においても、通常のリポソーム（参考例）中のドキソルビシン（抗腫瘍剤）が、遊離のドキソルビシンと比べ、同一、又は良好でないという結果を示すのに対して、例１５の本件発明１のリポソーム中のエピルビシン（抗腫瘍剤）は、遊離のエピルビシンに比べ、著しく腫瘍成長を抑制していることからして、本件発明１のリポソームは、全身性の血管外腫瘍中に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的に局在化させるという顕著な効果が認められる。
　これに対し、刊行物２には、該発明のリポソームが、リポソーム中に内包する薬物のもれを少なくするという製剤上の作用効果を奏することが示されているだけであって、抗ガン剤に関する記載について、単に内包される薬物の例として、抗ウイルス剤、抗生物質、ペプチドホルモン剤、酵素剤、免疫賦活剤、蛋白質と並列的にされているに過ぎず、該発明のリポソームが抗ガン剤を腫瘍細胞に選択的に局在化するのに特に適していることを示唆する記載は何らされていない。
　
３）異議申立人は、腫瘍中への溢出に充分なサイズ（２０００Å（０．２μｍ）以下、及び０．０５〜０．５μｍ）を有するリポソームを腫瘍の治療のために使用すること、そして、リポソームの血中滞留性を高めて腫瘍細胞への溢出を増大させることによりリポソームの腫瘍への局在化を達成することは、刊行物３及び刊行物４に記載されているので、刊行物２に記載された抗ガン剤を含有するポリエチレングリコール修飾リポソームを、刊行物３、又は刊行物４を参酌することによって、腫瘍への溢出を達成するのに適当なサイズに調製することは当業者が容易に想到しうることである、と主張している。
　しかしながら、刊行物２に記載されたリポソームと本件発明１のリポソームとが、リポソームを構成する親水性ポリマーで誘導体化された脂質の構成において相違することは、前記したところである。また、本件発明１のリポソームの、結像剤又は抗腫瘍剤を腫瘍へ選択的に局在化させるという効果は、リポソームのサイズにのみ依存するものとは直ちには認められず、むしろリポソームを構成する脂質を「ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質（この場合、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化されるものである。）」としたことによるものであることは、本件発明１のリポソーム及び通常のリポソームを、同じサイズ（１００ｎｍ）のものを使用して行っている明細書の例１３の実験において、本件発明１のリポソームの場合、腫瘍細胞への吸収の局在化の割合が通常のリポソームに比べて、約２倍となっていることからしても明らかである。
　このため、上記異議申立人の主張は採用できない。
　
４）なお、異議申立人は、参考資料４〜９（参考資料１０は本件優先権主張日１９８９年１０月２０日の後、１９９５年に発行されたものである。）を提出して、リポソーム又は高分子粒子の修飾成分としてポリエチレングリコールを使用すると、ＲＥＳによる取り込みを回避でき、血液滞留性が向上することは本件特許発明の優先日以前からの周知技術であると主張しているが、該周知技術は、本件発明１のリポソームの「全身性の血管外腫瘍中に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的に局在化させる」という効果を示唆するものではない。
　
５）以上のとおり、刊行物２〜４、及び参考資料４〜９には、本件発明１のリポソームを構成する、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子の親水性ポリマー（ポリエチレングリコール等）で誘導体化された両親媒性小胞形成脂質について記載も示唆もされておらず、また、本件発明１のリポソームは、「全身性の血管外腫瘍中に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的に局在化させる」という、刊行物２〜４、及び参考資料４〜９の記載からは予測することができない効果を奏するものと認められるから、本件発明１は、刊行物２〜４、及び参考資料４〜９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
６）また、本件発明２〜７は、本件発明１をさらに限定するか、本件発明１のリポソーム組成物の調整方法であるから、刊行物２〜４、及び参考資料４〜９に記載された発明に基づいて当業者が容易に発明をすることができたものとすることはできない。
　
（ III ）特許法第３６条第３項及び第４項について
異議申立人は、
（ｉ）請求項１に記載の「親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質」について、親水性ポリマーの分子量ならびに両親媒性小胞形成脂質に対する誘導体化の程度（即ち、１分子の脂質に対して結合している親水性ポリマーの分子数）が記載されていないので、親水性ポリマーの存在量が規定されず、記載が不十分である，
（ ii ）請求項１に記載の「親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成物質１〜２０モル％とから成るリポソーム」における「１〜２０モル％」は、発明の作用効果を発揮できない場合も含まれており、範囲が広すぎる，
（ iii ）請求項１に記載の「該腫瘍中への溢出に充分なサイズ」は単に発明が達成しようとする課題を記載したにすぎず、発明の構成に欠くことができない事項を記載したものではない，
（ iv ）ポリエチレングリコールで誘導体化された脂質を有するリポソームと、該脂質を有さない以外は同一の組成の脂質を有し、かつ同一粒径のリポソームを用いた比較実験が示されてないので、発明の効果が確認できない，として、明細書の記載が不備である旨主張している。
そこで、これらの点について検討する。
　
（ｉ）について
　親水性ポリマーの両親媒性小胞形成脂質に対する誘導体化の程度については、訂正請求により、「両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化される 」と訂正がされた。
　また、本件発明１は、明細書全体の記載からして、リポソーム組成物中に、親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質（この場合、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子の親水性ポリマーで誘導体化されるものである）を含有させる点に特徴を有するものと認められるところ、該親水性ポリマーの分子量については、本件明細書の記載に基づいて実施に際し当業者が適宜設定し得る事項であるから、構成に欠くことができない事項として特許請求の範囲に記載しなければならないほどのものとは認められない。
　したがって、親水性ポリマーの分子量、及び両親媒性小胞形成脂質に対する誘導体化の程度が特許請求の範囲に記載されていないことを理由に、親水性ポリマーの存在量が規定されず、記載不備とした異議申立人の主張は採用できない。
（ ii ）について
　異議申立人は、本件明細書には、親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成物質を１モル％、及び２０モル％含む場合についての実施例が示されておらず、１モル％の様に低い場合には、高い血中滞留性を維持するのは困難であり、２０モル％を含む場合には安定的にリポソームを作成することが困難となると主張している。
　しかしながら、本件明細書には、例６等に５モル％の場合、また、例１５等に９モル％の場合の実施例が示されているところ、１モル％、又は２０モル％においては所期の目的が達成し得ないとは必ずしもいうことができないので、異議申立人の主張は採用できない。
（ iii ）について
　本件発明１は、明細書全体の記載からして、リポソーム組成物中に、親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質（この場合、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子の親水性ポリマーで誘導体化されるものである）を含有する点に特徴を有するものと認められるところ、リポソームのサイズの具体的数値については、本件明細書の記載に基づいて実施に際し当業者が適宜設定し得る事項であるから、構成に欠くことができない事項として特許請求の範囲に記載しなければならないほどのものとは認められない。
　したがって、「該腫瘍中への溢出に充分なサイズ」は単に発明が達成しようとする課題を記載したにすぎず、発明の構成に欠くことができない事項を記載したものではないとする異議申立人の主張は採用できない。
（iv ）について
　本件明細書には、例１３（段落【０１８２】〜【０１８３】）において、本件発明１のリポソームと通常のリポソームを、ポリエチレングリコールで誘導体化された脂質（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）を有するリポソームと、該脂質を有さない以外は同一の組成の脂質（ＤＳＰＣ及びＣｈｏｌ）を有するもので、同じサイズ、１００ｎｍ（０．１μｍ）としたものを使用して、本件発明１のリポソームが通常のリポソームの腫瘍細胞への吸収の局在化の割合の約２倍値となることを示しており、また、腫瘍成長抑制の実験においても、参考例（段落【０２０１】〜【０２０２】）において、通常のリポソーム中のドキソルビシン（抗腫瘍剤）が、遊離のドキソルビシンと比べ、同一、又は良好でないという結果を示すのに対して、例１５（段落【０１９１】〜【０１９５】）の本件発明１のリポソーム中のエピルビシン（抗腫瘍剤）は、遊離のエピルビシンに比べ、著しく腫瘍成長を抑制している という結果を示しているので、特許異議申立人の「ポリエチレングリコールで誘導体化された脂質を有するリポソームと、該脂質を有さない以外は同一の組成の脂質を有し、かつ同一粒径のリポソームを用いた比較実験が示されてないので、発明の効果が確認できない。」という主張は採用できない。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、異議申立の理由及び証拠によっては本件発明についての特許を取り消すことはできない。
　また、他に本件発明についての特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年３月２９日（２００４．３．２９）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
充実性腫瘍治療法及び組成物
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、
　小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質
（この場合、両親媒性小胞形成脂質１分子あたり１分子のポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化されるものである）
リポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を
含み、
　
ここで該リポソームは、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤のリポソームへの積載に用いられる、膜を横切るアンモニウムイオン勾配を
　【請求項２】　前記親水性ポリマーが約１，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである、請求項１に記載のリポソーム組成物。
　【請求項３】　前記抗腫瘍剤の少なくとも約８０％がリポソームに取り込まれた形態である、請求項１または２に記載のリポソーム組成物。
　【請求項４】　前記抗腫瘍剤がアントラサイクリン抗生物質である、請求項３に記載の組成物。
　【請求項５】　前記アントラサイクリンがドキソルビシン、エピルビシン、およびダウノルビシンならびに薬理学的に許容可能なその塩および酸からなる群から選択される、請求項４に記載のリポソーム組成物。
　【請求項６】　前記リポソームに取り込まれた前記抗腫瘍剤の濃度が５０μｇ（薬剤）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）を超える、請求項４または５に記載のリポソーム組成物。
　【請求項７】　充実性腫瘍中に血流を介して局在化するためのリポソーム組成物の調製方法であって、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤をリポソーム中に取り込んで請求項１から６のいずれかに１項に記載のリポソーム組成物を形成する工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明はリポソーム組成物及び方法、特に腫瘍診断および／または治療に使用するためのものに関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　血管外腫瘍診断および治療のためには、結像化合物または治療化合物が血流を介して選択的に腫瘍を標的化することが望ましい。診断学において、このような標的化は、腫瘍部位に高濃度の結像剤を提供し、同時に、体の他の部分における結像剤のバックグラウンドのレベルを低減させるために使用されてきた。部位特異的標的化は腫瘍の治療に有用であり、毒性の副作用を低減し、かつ腫瘍部位へ安全に送達され得る薬剤の用量を増加させる。
　【０００３】
　リポソームは、結像化合物および治療化合物の両者を包含する静脈内（ＩＶ）投与化合物のための薬剤キャリヤーとして提案されている。しかし、血流を介する部位特異的標的化にリポソームを使用することは、網内細胞系（ＲＥＳ）の細胞によるリポソームの迅速なクリアランスによって厳しく制限される。一般に、ＲＥＳは１時間以内にＩＶ注射されたリポソームの用量の８０〜９５％を除去し、リポソームの吸収について、選択された標的部位と有効に競合する。
　【０００４】
　ＲＥＳのリポソーム吸収率を左右する種々のファクターが報告されている（たとえば、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７４（文献番号１１）；Ｊｏｎａｈ（文献番号１８）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７２（文献番号１０）；Ｊｕｌｉａｎｏ（文献番号１９）；Ａｌｌｅｎ，１９８３（文献番号１ｂ）；Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，１９７６（文献番号２１）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（文献番号２９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ（文献番号２４）；Ａｌｌｅｎ，１９８１（文献番号１ａ）；Ｓｃｈｅｒｐｈｏｆ（文献番号３２）；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９８０（文献番号１２）；Ｈｗａｎｇ（文献番号１６）；Ｐａｔｅｌ，１９８３（文献番号３９）；Ｓｅｎｉｏｒ，１９８５（文献番号３４）；Ｅｌｌｅｎｓ（文献番号７）；Ｓｅｎｉｏｒ，１９８２（文献番号３３）；Ａｓｈｗｅｌｌ（文献番号４）；Ｈａｋｏｍｏｒｉ（文献番号１４）；Ｋａｒｌｓｓｏｎ（文献番号２０）；Ｓｃｈａｕｅｒ（文献番号３１）；Ｄｕｒｏｃｈｅｒ（文献番号６）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（文献番号１３）；Ｗｏｏｄｒｕｆｆ（文献番号３８）；Ｃｚｏｐ（文献番号５）；およびＯｋａｄａ（文献番号２６））。簡単に述べると、リポソームサイズ、電荷、脂質の飽和度、および表面部分が、すべて、ＲＥＳによるリポソームのクリアランスに関与する。しかし、長い血中半減期、およびより詳細には、注射の２４時間後の血流中のリポソームの比較的高い百分率を提供するために有効なファクターは現在までひとつも確認されていない。
　【０００５】
　長い血中半減期に加えて、腫瘍部位への有効な薬剤送達のためには、リポソームが、腫瘍に血液を供給する血管の周囲の連続内皮細胞層およびその下の基底膜に浸透することができることも要求される。腫瘍は、損傷を受けた、漏れやすい内皮を与え得るが、特に、腫瘍への血流が少ないこと、そのため循環するリポソームに対する曝露が制限されることを考慮すると、リポソームの有効量が腫瘍細胞に到達するためには、リポソームが内皮細胞バリヤーおよび隣接する基底膜を通過することを促進するメカニズムを有しなければならないことが一般に認識されている（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ（文献番号３７））。ほとんどの腫瘍内で見いだされる、通常より高い間隙圧によって、腫瘍からの液体の血管外への移動が生じ、リポソームの溢出の機会が減少する傾向もある（Ｊａｉｎ（文献番号１７））。指摘されているように、腫瘍中での溢出に対するこれらのバリヤーを克服し、同時にＲＥＳによる認識および吸収を回避するリポソームを設計することは成功しそうもなかった（Ｐｏｚｎａｎｓｋｉ（文献番号２８））。
　【０００６】
　実際、いままで報告されている研究は、血管への透過性が増大した場合でさえも、従来のリポソームの管を通る溢出は著しく増加しないことを示している（Ｐｏｓｔｅ）。これらの知見に基づき、疾病によって損なわれた毛管から、制限された検出レベル未満のリポソームの溢出が生じ得るとはいえ、その治療的有用性は最小であると結論された（Ｐｏｓｔｅ（文献番号２７））。
　【０００７】
　【発明が解決しようとする課題】
　本発明の目的は、腫瘍の標的化に有効であるリポソーム組成物および方法を提供することであり、これによって全身性の血管外腫瘍中に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的に局在化させることである。
　【０００８】
　【課題を解決するための手段】
　本発明のリポソーム組成物は、充実性腫瘍中に、血流を介して腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を局在化するために使用されるリポソーム組成物であって、小胞形成脂質と、ポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、およびポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーから選択される親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モル％とから成るリポソームであって、該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有するリポソーム、ならびにリポソームに取り込まれた形態の腫瘍結像剤または抗腫瘍剤を含む。
　【０００９】
　好適な実施態様によれば、上記親水性ポリマーは、約１，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールである。
　【００１０】
　好適な実施態様によれば、上記抗腫瘍剤の少なくとも約８０％は、リポソームに取り込まれた形態である。
　【００１１】
　好適な実施態様によれば、上記抗腫瘍剤はアントラサイクリン抗生物質である。
　【００１２】
　好適な実施態様によれば、上記アントラサイクリンは、ドキソルビシン、エピルビシン、およびダウノルビシンならびに薬理学的に許容可能なその塩および酸からなる群から選択される。
　【００１３】
　好適な実施態様によれば、上記リポソームに取り込まれた上記抗腫瘍剤の濃度は、５０μｇ（薬剤）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）を超える。
　【００１４】
　本発明の方法は、充実性腫瘍中に血流を介して局在化するためのリポソーム組成物の調製方法であって、腫瘍結像剤または抗腫瘍剤をリポソーム中に取り込んで上記のリポソーム組成物を形成する工程を包含する。
　【００１５】
　【発明の実施の形態】
　本発明は、１つの局面によれば、血流を介して下記の第ＩＶ章（腫瘍局在化法）に示すように充実性腫瘍中に化合物を局在化させるために使用されるリポソーム組成物であり、以下を包含する：この組成物を形成するリポソームは、（ｉ）小胞形成脂質、および親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モルパーセントから成り、かつ（ｉｉ）該腫瘍中への溢出に充分なサイズを有する。好ましい実施態様においては、上記リポソームは、約０．０７〜０．１２ミクロンの間の範囲の選択された平均サイズを有する。化合物は取り込まれた形でリポソーム中に含有される（すなわち、リポソーム膜と結び付いているか、あるいはリポソーム内部の水性部分内に内包される）。この文章中で、小胞形成脂質とは、それ自体で、あるいは他の脂質と組み合わされて二重層構造を形成するすべての脂質として定義される。
　【００１６】
　好ましい実施態様において、親水性ポリマーはポリエチレングリコール、ポリ乳酸、ポリグリコール酸であり、約１，０００〜５，０００ダルトンの分子量を有し、リン脂質へと誘導体化される。
　【００１７】
　腫瘍の処置に使用するための、ある実施態様における化合物は、アントラサイクリン抗生物質または植物アルカロイドであり、化合物の少なくとも約８０％は、リポソームに取り込まれた形であり、この薬剤は、アントラサイクリン抗生物質の場合リポソーム中に少なくとも約２０μｇ（化合物）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）の濃度で存在し、そして植物アルカロイドの場合１μｇ／μｍｏｌ（脂質）の濃度で存在する。
　【００１８】
　関連する局面において、本発明は以下によって特徴付けられるリポソームの組成物を包含する：
　（ａ）小胞形成脂質、および親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モルパーセントから成るリポソーム、
　（ｂ）ＩＶ投与の２４時間後に血液中に存在するリポソームマーカーのパーセントとして測定され、誘導体化された脂質の不存在下でのリポソームのパーセントより数倍長い血中半減期、
　（ｃ）約０．０７〜０．１２ミクロンの間の選択されたサイズ範囲である平均リポソームサイズ、および
　（ｄ）リポソームに取り込まれた形の化合物。
　【００１９】
　製剤がＩＶ注射によって投与される場合、充実性腫瘍中に局在化するための製剤を製造する方法も開示される。この場合、ＩＶ投与の後、製剤は、注射後最初の４８時間の間、薬剤がほとんど漏れないリポソームに取り込まれた形で血流中を運ばれる。この期間ＲＥＳによる吸収の割合が低いため、リポソームは腫瘍へと運ばれ、そして腫瘍中に侵入する機会がある。一旦、腫瘍の間隙空間に入ってしまえば、腫瘍細胞が実際にリポソームを吸収（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）することは必要ではない。取り込まれた薬剤は、腫瘍の近傍で数日間から数週間にわたってリポソームから放出される。この薬剤はさらに、腫瘍塊中に（拡散プロセスによって）自由に浸透し、そして腫瘍細胞中に直接侵入し、その抗増殖活性が作用する。この方法は、上記で特徴付けたタイプのリポソームに薬剤を取り込むことを包含する。アントラサイクリン抗生物質または植物アルカロイド抗腫瘍剤を全身性充実性腫瘍へと輸送させるために好適なリポソーム組成物の１つは、高相転移（ｈｉｇｈ　ｐｈａｓｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）リン脂質およびコレステロールを含む。このタイプのリポソームは、投与後最初の２４〜４８時間、薬剤を放出する傾向がなく、その間、血流中を循環するからである。
　【００２０】
　他の局面において、本発明は被験体の充実性腫瘍中に化合物を局在化する方法を包含する。この方法は、（ｉ）小胞形成脂質、および親水性ポリマーで誘導体化された両親媒性小胞形成脂質１〜２０モルパーセントから成り、（ｉｉ）約０．０７〜０．１２ミクロンの間の選択されたサイズ範囲であり、かつ（ｉｉｉ）リポソームに取り込まれた形で化合物を含む、リポソームの組成物を調製することを包含する。組成物を、充実性腫瘍中に治療上有効な用量の薬剤が局在化するに十分な量で患者にＩＶ注射する。
　【００２１】
　本発明のこれらの目的および他の目的ならびに特徴は、以下の記載および実施例を添付図面と共に読んだ場合に一層十分に明らかになる。
　【００２２】
（Ｉ．誘導体化された脂質の製造）
　図１は、生体適合性親水性ポリマーで誘導体化される小胞形成脂質を製造するための一般反応式を示す。生体適合性親水性ポリマーの例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸、およびポリグリコール酸が挙げられ、これらは全て容易に水に溶解し、小胞形成脂質と結合することができ、インビボで毒性作用なしに許容される。使用される親水性ポリマー、例えばＰＥＧは、一方の末端がメトキシ、エトキシ、または他の非反応性基によってキャップされるか、あるいはその代わりに一方の末端に他の末端よりもはるかに反応性が高い化学基を有することが好ましい。ポリマーを下記のようにその末端の一方で、適切な活性化剤、たとえばシアヌル酸、ジイミダゾール、無水物試薬などで活性化する。次いで活性化された化合物を小胞形成脂質、たとえばジアシルグリセロールと反応させて、誘導体化された脂質を製造する。このジアシルグリセロールは、ジアシルホスホグリセロールを包含する。ここで２個の炭化水素鎖は、典型的には、炭素原子数１４〜２２の長さであり、種々の飽和度を有する。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）がこの目的に好適なリン脂質の例である。なぜなら活性化されたポリマーに結合するのに有利な反応性アミノ基を有するからである。あるいは、脂質基はポリマーとの反応のために活性化され得、あるいはこの２つの基は公知のカップリング法に従って協奏カップリング反応によって結合し得る。一方の末端がメトキシ基またはエトキシ基でキャップされたＰＥＧは、種々のポリマーサイズ（たとえば、分子量５００〜２０，０００ダルトン）で市販されている。
　【００２３】
　小胞形成脂質は、２個の炭化水素鎖、主としてアシル鎖、および極性ヘッド基を有するものが好ましい。このクラスには、リン脂質、たとえばホスファチジルコリン（ＰＣ）、ＰＥ、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、およびスフィンゴミエリン（ＳＭ）が包含され、ここで２個の炭化水素鎖は典型的には長さが炭素原子数約１４〜２２であり、そして種々の度合の不飽和度を有する。またこのクラスには、グリコ脂質、たとえばセレブロサイドおよびモノシアロガングリオシドが包含される。
　【００２４】
　使用され得る他の小胞形成脂質は、コレステロールおよび関連するステロールである。一般に、コレステロールは、特にポリアルキルエーテルのような高分子量ポリマーで誘導体化される場合、脂質二重層にあまりしっかりとは固定され得ない。従って、血流中でＲＥＳからのリポソームの回避を促進するためにはあまり有効ではない。
　【００２５】
　さらに一般的には、本明細書中では「小胞形成脂質」は、疎水性基と極性ヘッド基とを有するすべての両親媒性脂質を包含することを意図する。そしてこれは（ａ）たとえばリン脂質のように水中でそれ自体で自発的に二重層を形成し得るか、あるいは（ｂ）リン脂質と組み合わされて安定に脂質二重層中に組み込まれる（その疎水性部分が二重層膜内部の疎水性領域と接し、そしてその極性ヘッド基部分が膜の外部の極性表面に配向する）。後者のタイプの小胞形成脂質の例は、コレステロール、ならびにコレステロールサルフェートおよびコレステロールヘミサクシナートのようなコレステロール誘導体である。
　【００２６】
　本発明の１つの重要な特徴によれば、小胞形成脂質は比較的流動的な脂質であり、典型的にはこれは、その脂質相が、比較的低い、液体から液晶への融点（たとえば室温またはそれ以下）を有することを意味する。あるいは小胞形成脂質は比較的堅い脂質であり、これは脂質が比較的高い融点（たとえば６０℃まで）を有することを意味する。原則として、より堅い脂質（すなわち飽和脂質）は脂質二重層構造においてより高い膜硬度に寄与し、そしてまた血清中でのより高い二重層の安定性に寄与する。他の脂質成分、たとえばコレステロールもまた、脂質二重層構造において膜の硬度および安定性に寄与することが知られている。長鎖（たとえばＣ−１８）飽和脂質とコレステロールの組合せは、充実性腫瘍にアントラサイクリン抗生物質および植物アルカロイド抗腫瘍剤を送達するために好適な組成物の１つである。これらのリポソームは、注射後最初の４８時間の間に血流を通って循環して腫瘍に入り、その間、血漿中に薬剤を放出する傾向がないからである。アシル鎖が種々の飽和度であるリン脂質は市販されており、あるいは公開された方法に従って製造することができる。
　【００２７】
　図２は、ＰＥ−ＰＥＧ脂質を製造する反応式を示し、ここでＰＥＧはシアヌルクロライド基によってＰＥに誘導体化される。反応の詳細は例１に示す。簡潔に述べると、メトキシでキャップされたＰＥＧを、炭酸ナトリウムの存在下、図中に示す活性化されたＰＥＧ化合物を生じる条件下で、シアヌルクロライドによって活性化する。この材料を精製して、未反応のシアヌル酸を除去する。活性化ＰＥＧ化合物を、トリエチルアミンの存在下、ＰＥと反応させて、図中に示す所望のＰＥ−ＰＥＧ化合物を製造する。収率はＰＥＧの最初の量に対して約８〜１０％である。
　【００２８】
　いま記載した方法は、ＰＥ、コレステリルアミン、および糖−アミン基を有するグリコ脂質を包含する種々の脂質アミンに適用することができる。
　【００２９】
　キャップされたＰＥＧのようなポリアルキルエーテルを脂質アミンにカップリングさせる第二方法を、図３に示す。ここではキャップされたＰＥＧをカルボニルジイミダゾールカップリング試薬で活性化し、図３中に示される活性化されたイミダゾール化合物を形成する。ＰＥのような脂質アミンとの反応によって、図に示されるポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）化合物で例示されるように、アミド結合によって脂質と結合したＰＥＧが導かれる。反応の詳細は例２に示す。
　【００３０】
　キャップされたポリアルキルエーテルを脂質アミンにカップリングさせる第三の反応方法を図４に示す。この場合、まずＰＥＧをその一方の末端でトリメチルシラン基で保護する。この末端保護反応を図中に示す。この反応は、トリエチルアミンの存在下、トリメチルシリルクロライドとＰＥＧとを反応させることを包含する。次いで、保護されたＰＥＧをトリフルオロメチルスルホナートの無水物と反応させて、トリフルオロメチルスルホナートで活性化されたＰＥＧ化合物を形成する。この活性化された化合物とＰＥのような脂質アミンとをトリエチルアミンの存在下で反応させて、所望の誘導体化された脂質生成物、たとえばＰＥＧ−ＰＥ化合物を得る。この生成物中で、脂質アミン基はポリエーテルポリマーの末端メチレン炭素を介してポリエーテルと結合する。トリメチルシリル保護基は、図に示したような酸処理によって、あるいは第４級アミンフルオライド塩、たとえばテトラブチルアミンのフルオライド塩との反応によって脱離され得る。
　【００３１】
　上記のような反応に加えて、公知の種々のカップリング反応が、ＰＥＧのような親水性ポリマーによって誘導体化された小胞形成脂質の製造に適することが理解される。たとえば、図４に示した無水スルホナートカップリング試薬を、両親媒性脂質のヒドロキシル基、たとえばコレステロールの５’−ＯＨに、活性化されたポリアルキルエーテルを結合させるために使用することができる。他の反応性脂質、たとえば酸またはエステル脂質基もまた、公知のカップリング法に従ってカップリングに使用することができる。たとえばホスファチジン酸の酸基を、適切な無水物、たとえば無水酢酸と反応させて活性化し、活性な脂質無水物を形成し、次いでこの反応性脂質をイソチオシアナート試薬の存在下反応させて、保護されたポリアルキルアミンに結合させることができる。
　【００３２】
　他の実施態様においては、誘導体化された脂質成分を、不安定な脂質−ポリマー結合、たとえばペプチド、エステル、またはジスルフィド結合を含むように製造する。この結合は選択された生理的条件下、たとえばペプチダーゼ酵素またはエステラーゼ酵素、あるいはグルタチオンのような血流中に存在する還元剤の存在下において切断され得る。図５は、（Ａ）ペプチド含有結合、（Ｂ）エステル含有結合、および（Ｃ）ジスルフィド含有結合を介して結合した脂質の例を示す。ペプチド結合化合物は、たとえば、まずポリアルキルエーテルをたとえば図３で示した反応によって、図示したトリペプチドのＮ−末端アミンにカップリングさせることによって製造され得る。次いでペプチドカルボキシル基を、常法に従ってカルボジイミドカップリング試薬によって脂質アミン基に結合させ得る。エステル結合化合物は、たとえば、ホスファチジン酸のような脂質酸を、無水物カップリング剤によりアルコールを用いて、ポリアルキルエーテルの末端アルコール基に結合させることによって製造され得る。あるいは、内部エステル結合および適切な末端基、たとえば第一アミン基を有する短い結合断片を用いて、ポリアルキルエーテルを両親媒性脂質にアミドまたはカルバメート結合によって結合させることができる。同様に、図５のＣに示される化合物の形成に使用するために、この結合断片は内部ジスルフィド結合を有し得る。このような可逆的結合によってリン脂質に結合されるポリマーは、注射後最初の数時間、これを含有するリポソームの高い血中レベルを提供するために有用である。この期間の後、血漿成分がこの可逆的結合を切断してポリマーが離脱し、そして「非保護」リポソームはＲＥＳによって迅速に取り込まれる。
　【００３３】
　図６は、ポリ乳酸をＰＥで誘導体化する方法を示す。例４に詳述するように、ポリ乳酸をＰＥの存在下にジシクロヘキシルカルボイミド（ＤＣＣＩ）と反応させる。同様に、ポリグリコール酸で誘導体化した小胞形成脂質もまた、例４に詳述するように、適切なカップリング剤、たとえばＤＣＣＩの存在下に、ポリグリコール酸またはグリコール酸とＰＥとの反応によって形成し得る。ポリ乳酸またはポリグリコール酸で誘導体化された小胞形成脂質は、本発明の一部である。また本発明の一部を構成するものは、これらの誘導体化された脂質を１〜２０モルパーセント含有するリポソームである。
　【００３４】
（ＩＩ．リポソーム組成物の製造）
（Ａ．脂質成分）
　本発明のリポソームを形成する際に用いられる脂質成分は、代表的にはリン脂質、スフィンゴ脂質、およびステロールを包含する種々の小胞形成脂質から選択され得る。以下に示すように、本発明のリポソームの１つの必要条件は、長い血中循環寿命である。従って、脂質成分の血中半減期に対する影響を評価するために使用され得る血中寿命の標準化された測定を確立することは有用である。
　【００３５】
　インビボのリポソーム循環時間を評価するために用いられる１つの方法は、ＩＶ注射したリポソームの血流中およびＲＥＳの主要器官における分布を、注射後選択された時間に測定することである。本明細書で用いる標準化された方法において、ＲＥＳ吸収は、血流中の全リポソームの、ＲＥＳの主要な器官である肝臓および脾臓中の全リポソームに対する割合として測定される。実際には、例５で詳述するように、年齢および性別を合わせたマウスに放射性標識したリポソーム組成物を尾静脈にＩＶ注射し、そして各時間ポイントで、全血ならびに一緒にした肝臓および脾臓で放射性標識カウントを測定して決定する。
　【００３６】
　肝臓および脾臓はＲＥＳによるリポソームの初期吸収のほぼ１００％を占めるので、上記の血液／ＲＥＳ割合はインビボにおける血液からＲＥＳへの吸収程度を示す良好な近似値を提供する。たとえば、約１またはそれ以上の割合は注射されたリポソームのうち血流中に残存するものが優勢であることを示し、約１未満の割合はＲＥＳ中のリポソームが優勢であることを示す。目的とする脂質組成物のほとんどに関して、血液／ＲＥＳ割合は注射後１、２、３、４、および２４時間後に算出した。
　【００３７】
　本発明のリポソームは、第Ｉ章（誘導体化された脂質の製造）に記載した親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質の１〜２０モルパーセントを含む。本発明の１つの局面によれば、このリポソームの血中循環半減期はこのリポソームを構成するリン脂質成分の飽和度にほとんど依存しないことが見いだされた。すなわち、リン脂質成分は、主に流動性の比較的不飽和のアシル鎖、またはより飽和した堅いアシル鎖成分から成り得る。本発明のこの特徴は例６中に示される。ここではＰＥＧ−ＰＥ、コレステロール、およびＰＣで形成され、異なる飽和度を有するリポソームの血液／ＲＥＳ割合を調べた（表４）。この例の表５のデータから明らかなように、バルクＰＣリン脂質における脂質不飽和の程度に関係なく、実質的にすべてのリポソーム処方において高い血液／ＲＥＳ割合が達成され、脂質飽和の程度の関数としての系統的な傾向は全く観察されなかった。
　【００３８】
　したがって、選択された度合の流動性または硬度を達成し、血清中のリポソームの安定性ならびにリポソームからの取り込まれた薬剤の血流および／または腫瘍中への放出速度をコントロールするように、小胞形成脂質を選択し得る。小胞形成脂質はまた、所望のリポソーム製造特性を達成するように、脂質飽和特性において選択され得る。一般に、たとえばより流動性の脂質は、より堅い脂質組成物よりも押出しおよび均質化方法によって形成および小型化するのが容易である。
　【００３９】
　同様に、リポソーム中のコレステロールの百分率が、観察される血液／ＲＥＳ割合に対して著しい影響を与えずに変化し得ることが見いだされた。例７Ａに示した研究を表６と比較すると、０〜３０モルパーセントのコレステロールの範囲で血液／ＲＥＳ割合における実質的な変化を示さない。
　【００４０】
　さらに、本発明に従って行われた研究において、血液／ＲＥＳ割合が、荷電した脂質成分、たとえばホスファチジルグリセロール（ＰＧ）の存在によっても比較的影響されないことが見いだされた。これは図７から明らかである。これは、４．７モルパーセントのＰＧ（三角形）または１４モルパーセントのＰＧ（丸）のいずれかを含むＰＥＧ−ＰＧリポソームについて内包マーカーの損失率をプロットしたものである。２４時間にわたって血流中のリポソーム保持の差は実質的に観察されなかった。ＲＥＳ吸収に悪影響を与えることなくリポソーム中に負電荷を包含させるという選択は、多くの可能性のある利点を提供する。負電荷を有するリポソーム懸濁液は、高いイオン強度の緩衝液中における凝集にあまり敏感ではない傾向を示し、それゆえ物理的安定性が増強される。また、リポソーム膜中に存在する負電荷は、多量のカチオン性薬剤を効果的に結合する処方手段として使用され得る。
　【００４１】
　親水性ポリマーで誘導体化された小胞形成脂質は、誘導体化された脂質のモルに基づき小胞形成脂質の全モルの百分率として、好ましくは約１〜２０モルパーセントの量で存在する。より低いモル割合、たとえば１．０モルパーセント未満は、より分子量の大きいポリマー、たとえば１００キロダルトンの分子量を有するポリマーによる脂質誘導体に適切であり得ることが理解される。第Ｉ章（誘導体化された脂質の製造）に示したように、誘導体化された脂質中の親水性ポリマーは、好ましくは約２００〜２０，０００ダルトン、より好ましくは約５００〜５，０００ダルトンの分子量を有する。血液／ＲＥＳ割合に対する極めて短いエトキシエーテル部分の影響を調べる例７Ｂによれば、血液／ＲＥＳ割合を著しく増加させるためには炭素が約５個より大きいポリエーテル部分が必要とされることが示される。
　【００４２】
（Ｂ．リポソーム組成物の製造）
　リポソームを、Ｓｚｏｋａ等、１９８０（文献番号３６）に詳述されているような種々の技術によって製造し得る。薬剤含有リポソームを製造する１つの方法は、Ｓｚｏｋａ等によって記載され、そして米国特許第４，２３５，８７１号中に記載された逆相蒸発法（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）である。逆相蒸発小胞（ＲＥＶ）は、約２〜４ミクロンの典型的な平均サイズを有し、主にオリゴラメラであり、すなわち１つまたは数個の脂質二重層殻を有する。この方法を例４Ａ中に詳述する。
　【００４３】
　多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）を、簡単な脂質−フィルム水和技術によって形成することができる。この操作では、適切な有機溶媒中に溶解した上記タイプのリポソーム形成脂質の混合物を容器中で蒸発させ、薄いフィルムを形成する。次いで、このフィルムは例４Ｂ中で詳述するように水性媒体によって覆われる。脂質フィルムは水和されて、典型的には約０．１〜１０ミクロンのサイズのＭＬＶを形成する。
　【００４４】
　本発明の１つの重要な局面に従って、リポソームを、約０．０７ミクロンと０．１２ミクロンとの間の選択されたサイズ範囲内で実質的に均一なサイズを有するように製造する。特に、このサイズ範囲内のリポソームは、以下の第ＩＩＩ章（充実性腫瘍中のリポソームの局在化）に記載するように、充実性腫瘍中に容易に溢出することができ、そして同時に、実質的な量の積載薬剤を腫瘍に運ぶことができる（薬剤積載能力が厳しく制限された小さな単ラメラ小胞とは異なる）。
　【００４５】
　ＲＥＶおよびＭＬＶのための有効な分粒法（ｓｉｚｉｎｇ）の１つは、０．０３から０．２ミクロンの範囲、主として０．０５、０．０８、０．１、または０．２ミクロンの、選択された均一な細孔サイズを有する一連のポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことを伴う。膜の細孔サイズは、特に同一の膜を通して２回またはそれ以上押し出すことによって製造される場合、その膜を通して押し出されて製造されるリポソームの最も大きいサイズにほぼ相当する。このリポソーム分粒の方法を、下記例中に記載される均一サイズのＲＥＶおよびＭＬＶ組成物の製造に用いる。より最近の方法は、非対称セラミックフィルターを通す押出しを伴う。この方法は、１９８８年４月１２日に発行されたリポソーム押出しに関する米国特許第４，７３７，３２３号に詳述されている。均質化方法もまた、１００ｎｍまたはそれ以下のサイズにリポソームを小型化するために有用である（マーチン（文献番号２５））。
　【００４６】
（Ｃ．化合物積載）
　１つの実施態様において、本発明の組成物を、結像剤、たとえば６７Ｇａまたは１１１Ｉｎを含む放射性同位元素あるいは常磁性化合物を腫瘍部位に局在化するために使用する。この適用においては、放射性標識は比較的低濃度で検出され得るので、結像剤を受動積載（ｐａｓｓｉｖｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）によって、すなわちリポソーム形成の間に内包することで一般に十分である。これは、たとえば内包される剤の水溶液で脂質を水和することによって行われ得る。典型的な放射性標識剤は、キレート形態の放射性同位元素、たとえば６７Ｇａ−デスフェラルであり、実質的に取り込まれた形でリポソーム中に保持される。リポソーム形成および分粒の後、内包されなかった材料を種々の方法のうちの１つで、たとえばイオン交換またはゲル濾過クロマトグラフィーによって除去し得る。受動積載によって達成することができるキレート金属の濃度は水和媒体中の剤の濃度によって限定される。
　【００４７】
　放射性結像剤の能動積載（ａｃｔｉｖｅ　ｌｏａｄｉｎｇ）もまた可能であり、これは高い親和性の水溶性キレート剤（たとえばＥＤＴＡまたはデスフェロオキサミン）をリポソームの水性コンパートメント内に取り込み、取り込まれなかったキレート剤をすべて透析またはゲル排除カラムクロマトグラフィーによって除去し、より低い親和性の脂溶性キレート剤（たとえば８−ヒドロキシキノリン）に対してキレート形成した金属放射性同位元素の存在下でこのリポソームをインキュベートすることによって行われる。金属放射性同位元素は、脂溶性キレート剤によってリポソーム中に運び込まれる。一旦リポソーム内に入ると、放射性同位元素は、取り込まれた水溶性キレート剤によってキレート形成され、リポソーム内部に放射性同位体が効率的に捕捉される（ガビゾン，１９８８−１９８９（文献番号９））。
　【００４８】
　受動積載はまた、比較的低い薬物用量（たとえば約１〜１５ｍｇ／ｍ２）で治療上活性な、両親媒性の抗腫瘍化合物、たとえばアルカロイドであるビンブラスチンおよびビンクリスチンのために使用され得る。ここで薬剤は、化合物の溶解度に応じて、脂質を水和するために使用される水性相中に溶解されるか、あるいはリポソーム形成工程において脂質中に入れられるかのいずれかである。リポソーム形成および分粒の後、遊離の（非結合）薬剤は、上述のように、たとえばイオン交換またはゲル排除クロマトグラフィー法によって除去され得る。
　【００４９】
　抗腫瘍化合物がペプチドまたはタンパク質薬剤、たとえばインターロイキン−２（ＩＬ−２）または組織壊死因子（ＴＮＦ）を含む場合、あるいはリポソームがペプチド免疫調節物質、たとえばムラミルジ−またはトリ−ペプチド誘導体またはタンパク質免疫調節物質、たとえばマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）を含むように処方される場合、リポソームは、上記逆相法によって、あるいはタンパク質と単ラメラ小胞の水による懸濁液との凍結乾燥混合物を再水和することによって、製造されることが好ましい（キルビー（文献番号２２））。どちらの方法も、受動積載を比較的高い内包効率、たとえば５０％までの効率と結び付ける。内包されなかった材料は、たとえば透析、透析濾過、または排除クロマトグラフィーによってリポソーム懸濁液から容易に除去することができる。
　【００５０】
　リポソームに収容され得る疎水性薬剤の濃度は、膜中の薬剤／脂質相互作用に依存するが、一般に、約２０μｇ（薬剤）／ｍｇ（脂質）未満の薬剤濃度に限定される。より詳細には、ドキソルビシンおよびエピルビシンのような種々のアントラサイクリン抗生物質に関して、受動積載によってリポソームの水性コンパートメントに取り込むことができる、取り込まれる材料の最高濃度は、（これらの化合物の固有水溶性が低いために）約１０〜２０μｇ／μｍｏｌ（脂質）である。ＰＧのようなアニオン性リン脂質が２０〜３０モルパーセント膜中に含まれると、積載ファクターは約４０μｇ／μｍｏｌ（脂質）まで増加し得る。アントラサイクリンは正に荷電しているので、負に荷電したＰＧと、膜界面で「イオン対」複合体を形成するからである。しかし、このように荷電した複合体化したアントラサイクリンの処方物は、本発明の状況（ＩＶ投与の後、最初の２４〜４８時間、薬剤がリポソームに取り込まれた形で血流中を運ばれることが必要とされる）においては限定された有用性を有しているに過ぎない。なぜならこの薬剤は、血漿中に導入されたときリポソーム膜から迅速に放出される傾向にあるからである。
　【００５１】
　本発明の他の局面によれば、種々の両親媒性抗腫瘍薬剤の治療上有効な薬用量を腫瘍に送達するためには、能動薬剤積載法によって高い薬剤濃度で薬剤をリポソームに積載することが必須であることが見いだされた。たとえばアントラサイクリン抗生物質薬剤、たとえばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、カルシノマイシン、Ｎ−アセチルアドリアマイシン、ルビダゾン、５−イミドダウノマイシン、およびＮ−アセチルダウノマイシンについては、リポソームに取り込まれる薬剤の最終濃度は、約２５μｇ／μｍｏｌ（脂質）よりも高く、好ましくは５０μｇ／μｍｏｌ（脂質）が望ましい。１００〜２００μｇ／μｍｏｌ（脂質）という高い内部薬剤濃度が企図される。
　【００５２】
　両親媒性薬剤のリポソームへの能動積載のための１つの方法は、共有に係る米国特許第５１９２５４９号に記載されている。この方法においては、リポソームを比較的高濃度のアンモニウムイオン（たとえば０．１２５Ｍの硫酸アンモニウム）の存在下で製造する。所望のサイズにリポソームを分粒した後、リポソーム膜を横切って内側から外側へのアンモニウムイオン勾配が生じるようにリポソーム懸濁液を処理する。勾配は、アンモニウムを含まない媒体、たとえば等張のグルコース媒体に対して透析するか、あるいはゲル濾過、たとえば０．１５ＭのＮａＣｌまたはＫＣｌで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０カラム上でのゲル濾過によって、外側の相のアンモニウムイオンをナトリウムまたはカリウムイオンで効率的に置換することによって、生じさせることができる。あるいは、リポソーム懸濁液をアンモニウムを含まない溶液で希釈して、これによって、外相のアンモニウムイオン濃度を低下させることができる。リポソームの内側のアンモニウム濃度は、外部リポソーム相の、好ましくは少なくとも１０倍、そしてより好ましくは少なくとも１００〜１０００倍である。
　【００５３】
　次いで、このアンモニウムイオン勾配によって、アンモニウムがリポソーム膜を横切って放出されプロトンがリポソームの内部水性相中に捕捉されるにつれ、ｐＨ勾配が生じる。リポソームに選択された薬剤を積載するためには、リポソーム懸濁液（たとえば約２０〜２００ｍｇ／ｍｌ（脂質））を薬剤の水溶液と混合し、そしてこの混合物をある期間（たとえば数時間）にわたって、室温から６０℃までの温度（リポソームを形成するために使用する脂質の相転移温度に応じる）で平衡化させる。１つの典型的な方法において、脂質濃度が５０μｍｏｌ／ｍｌのリポソーム懸濁液を、濃度約５〜８ｍｇ／ｍｌのアントラサイクリン薬剤の等容量と混合する。インキュベート期間の終わりに、懸濁液を処理して遊離の（非結合）薬剤を除去する。アントラサイクリン薬剤についての薬剤除去の好ましい１つの方法は、Ｄｏｗｅｘ　５０　ＷＸ−４のような、この薬剤と結合し得るイオン交換樹脂を通すことである。
　【００５４】
　上記のように、ビンクリスチンのような植物アルカロイドは抗腫瘍活性が本質的に高いので高い積載ファクターでリポソームに積載される必要はなく、従って受動取り込み法によって積載され得るが、能動法によってこれらの薬剤を積載することもまた可能である。ビンクリスチンは両親媒性であり、かつ弱い塩基なので、ビンクリスチンおよび同様な分子は、アントラサイクリン抗生物質について上で述べたように、硫酸アンモニウムを取り込むことによって形成されるｐＨ勾配を用いてリポソーム中に積載することができる。
　【００５５】
　ここで記載した間接（ｒｅｍｏｔｅ）積載法は、例１０中に示される。そこでは、最終濃度約８０〜１００μｇ／μｍｏｌ（脂質）までドキソルビシンを積載した０．１ミクロンのＭＬＶの製造が記載される。このリポソームを４℃で貯蔵した場合、薬剤の漏れ速度は極めて低い。
　【００５６】
（ＩＩＩ．充実性腫瘍中のリポソームの局在化）
（Ａ．延長された血流半減期）
　本発明によれば、標的とする腫瘍中のリポソームの局在化のための必要条件の１つは、ＩＶリポソーム投与の後の血流中における延長されたリポソーム寿命である。血流中でのリポソーム寿命の測定の１つは、上記のようにリポソーム投与から選択された時間の後に決定される血液／ＲＥＳ割合である。種々のリポソーム組成物についての血液／ＲＥＳ割合を例５の表３に示す。ＰＥＧ誘導体化脂質の非存在下では血液／ＲＥＳ割合は０．０３またはそれ以下である。ＰＥＧ誘導体化脂質の存在下では血液／ＲＥＳ割合は、低分子量ＰＥＧについては０．２から、いくつかの処方物については１．７〜４の間の範囲であった。これらの処方物のうち１つはコレステロールを欠き、そして３つは荷電したリン脂質（たとえばＰＧ）が添加されていない。
　【００５７】
　例６の表５に示したデータは、約１．２６と３．２７との間の血液／ＲＥＳ割合（回収率が低い２点を除く）を示し、表３に示すデータと一致する。上記第ＩＩ章（リポソーム組成物の製造）に示したように、血中寿命の値は、リポソーム脂質の飽和度、コレステロールの存在、および荷電した脂質の存在に実質的に無関係である。
　【００５８】
　上述の血液／ＲＥＳ値を、共有に係る米国特許第４，９２０，０１６号で報告された血液／ＲＥＳ値と比較することができる。この特許では、表３および５で示されるデータを得るために使用されたのと同様の血液／ＲＥＳ測定法を用いた。上記特許で報告された最高の２４時間での血液／ＲＥＳ割合は、モノシアロガングリオシド（ＧＭ１）、飽和ＰＣ、およびコレステロールからなる処方物についての、０．９であった。次に高い２４時間での血液／ＲＥＳ割合を与える処方物の値は約０．５であった。従って、本発明による処方物のうちの多くで得られる典型的な２４時間での血液／ＲＥＳ割合は、いままで報告されてきた最も優れた処方より２倍も高い。さらに、ＧＭ１またはＨＰＩ脂質による高い血液／ＲＥＳを達成する能力は、主としてリポソーム中の飽和脂質およびコレステロールの存在に依存した。
　【００５９】
　血流中におけるリポソームマーカーの血漿薬物動態は、本発明のリポソーム処方によって達成される延長されたリポソーム寿命の、別の尺度を提供し得る。図７および図８は、典型的なＰＥＧ−リポソーム処方物において、マーカーが脂質であるかあるいは内包された水溶性化合物であるかに実質的に関係なく、リポソームマーカーが血流から２４時間にわたってゆっくりと失われることを示す（図８）。どちらのプロットでも、リポソーム注射の２４時間後に存在するリポソームマーカーの量は、元々注射される材料の１０％より多い。
　【００６０】
　図９は、典型的なＰＥＧ−リポソーム処方物およびＰＥＧ誘導体化脂質を含まない同様のリポソームについて、血流からのリポソームの損失のキネティックスを示す。２４時間後、ＰＥＧ−リポソーム中に残存するマーカーの百分率は約２０％より高いが、通常のリポソームでは、血液中で３時間後には保持率が５％未満であり、そして２４時間の時点ではマーカーは実質的に検出されなかった。
　【００６１】
　図７〜９に示した結果は、種々のリポソーム処方物について測定され、以下の例５〜８の表３および表５〜７に記載された２４時間での血中リポソーム値と整合する。例５の表３に示されるように、従来のリポソームでは２４時間における血中残存薬用量の百分率は１％未満であるのに対し、ＰＥＧ−リポソームでは少なくとも５％であった。最良の処方では、約２０〜４０％の間の値が得られた。例６の表５においても同様に、２４時間後の血中リポソームレベルは投与された総薬用量の１２％と約２５％との間であった（回収値の少ない２つは再び無視する）。同様の結果が、例７の表６および７に報告される。
　【００６２】
　リポソームが全身性腫瘍に到達し、かつ侵入する機会を提供するために必要とされる、リポソームが２４〜４８時間にわたって血流中で両親媒性抗腫瘍薬剤を保持する能力もまた研究された。例１１で報告される研究において、ＰＥＧ−リポソームに積載されたドキソルビシン、遊離形態で与えられるドキソルビシン、および水素化ホスファチジルイノシトール（ＨＰＩ）を含むリポソーム中に積載されたドキソルビシンの血漿薬物動態を、ビーグル犬で調べた。ＨＰＩリポソームは、ほぼ飽和したＰＣ脂質とコレステロールとから処方され、共有に係る上記米国特許で記載された最適処方の１つを代表する。薬剤投与から７２時間までの血液中でのドキソルビシンのキネティックスを図１０に示す。どちらのリポソーム処方物も薬剤の一次指数関数的減少を示すが、対照的に遊離薬剤は二次指数関数的パターンを示す。しかし、７２時間における血流中の薬剤保持量は、ＰＥＧ−リポソームが約８〜１０倍多かった。
　【００６３】
　血液／ＲＥＳ割合および血流中のリポソーム保持時間の両方に関して、モデル動物系から得られるデータから、ヒトおよび目的とする家畜用動物に対して合理的な推定をすることができる。これは、肝臓および脾臓によるリポソームの吸収が、マウス、ラット、サル、およびヒトを含むいくつかの哺乳類において同様の速度で生じることが見いだされているからである（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，１９７４（文献番号１１）；Ｊｏｎａｈ（文献番号１８）；Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ，１９７６（文献番号２１）；Ｊｕｌｉａｎｏ（文献番号１９）；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ（文献番号２９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ（文献番号２４））。この結果は、ＲＥＳによるリポソームの吸収において最も重要であると考えられる生化学的因子−血清リポタンパク質によるオプシン化、サイズに依存する吸収効果、および表面部分による細胞保護を包含する−が、試験された全ての哺乳類において共通する特徴であるという事実を反映していると思われる。
　【００６４】
（Ｂ．腫瘍への溢出）
　本発明によれば、充実性腫瘍を標的化する高活性リポソームのために要求される他の特徴は、毛細血管によって供給を受ける腫瘍細胞から毛細血管を分離する内皮細胞バリヤーおよびその下の基底膜を通って、リポソームが腫瘍中に溢出することである。この特徴は、０．０７ミクロンと０．１２ミクロンとの間のサイズのリポソームにおいて最適化される。
　【００６５】
　選択された薬剤の標的化のためにはリポソームの腫瘍への送達が必要とされ、このことは例１２で報告される研究によって示され得る。マウスにＪ−６４５６リンパ腫を皮下接種し、このリンパ腫は１〜２週間後に約１ｃｍ３の充実性腫瘍塊を形成した。次に、この動物に、遊離のドキソルビシンかあるいはＰＥＧ−リポソームに積載されたドキソルビシンのいずれかを体重１ｋｇ当り１０ｍｇの薬用量で注射した。薬剤投与の４時間後、２４時間後、および４８時間後に、薬剤の組織分布（心臓、筋肉、および腫瘍）を検定した。図１１のＡは、遊離薬剤について得られた結果を示す。腫瘍中への選択的な薬剤蓄積は起こらず、実際、初期薬剤レベルが最も高いのは、最も高い毒性が生じる心臓であった。
　【００６６】
　比較すると、ＰＥＧ−リポソームは４〜２４時間の間、腫瘍中への薬剤の蓄積の増加を示し、そして２４時間と４８時間との間、高い選択的腫瘍レベルを示した。心臓および筋肉組織による薬剤の吸収は両方とも、対照的に、遊離薬剤よりも低い。図１１のＢにおいてプロットされたデータからわかるように、注射２４時間後には、腫瘍は健康な筋肉に比べて８倍、そして心臓に比べて６倍の量の薬剤を含んでいた。
　【００６７】
　ＰＥＧ−リポソームがより多くの抗腫瘍薬剤を腹腔内腫瘍に送達することを確認するために、マウスのグループに１０６のＪ−６４５６リンパ腫細胞を腹腔内（ＩＰ）注射した。５日後、ＩＰ腫瘍が確立され、そして遊離薬剤形態またはＰＥＧ−含有リポソームに取り込まれた形態のいずれかで、１０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンでこの動物をＩＶ処置した。薬剤の組織分布を例１２の表９に示す。示されたように、リポソーム送達では遊離薬剤よりも腫瘍／心臓割合は２４時間で約２７２倍高く、そして４８時間では約４７倍高かった。
　【００６８】
　表９に示された結果がリポソームがそのままで腫瘍の管外領域に入るためであることを例証するために、腫瘍組織を細胞画分および上清画分（細胞間液体）に分離し、両画分中のリポソームに結び付いた薬剤および遊離薬剤の存在を検定した。図１２は、薬剤の全量（黒菱形）、ならびに腫瘍細胞中に存在する薬剤量（黒まる）およびリポソームに結び付いた形で上清中に存在する薬剤量（黒三角）を、注射後４８時間にわたって示す。リポソームに結び付いた薬剤を検定するために、上清をイオン交換樹脂に通して遊離薬剤を除去し、上清中に残存する薬剤を検定した（黒三角）。示されるように、腫瘍中の薬剤のほとんどはリポソームに結び付いている。
　【００６９】
　腫瘍細胞中へのリポソームの溢出のさらなる例証は、例１４に詳述するように、正常な肝組織および充実性腫瘍におけるリポソームの分布を顕微鏡で直接観察することによって得られた。図１３は、ＰＥＧ−リポソームのＩＶ注射２４時間後の正常な肝組織中でのリポソームの分布（小さい、濃く染色された部分）を示す。リポソームはもっぱらクッパー細胞中に限定され、正常肝組織の肝細胞中または細胞間液体中のいずれにも存在しない。
　【００７０】
　図１４は、マウスの肝臓中に移植されたＣ−２６結腸癌の領域の、ＰＥＧ−リポソーム注射から２４時間後を示す。図中、毛細血管領域中、内皮細胞バリヤーおよび基底膜上の腫瘍組織側でリポソームの濃縮が明らかである。リポソームはまた腫瘍細胞の細胞間液体中にも豊富に存在し、これは毛細内腔から腫瘍への通過のさらなる証拠である。図１５の顕微鏡写真は腫瘍の別の領域を示し、ここでもまた細胞間液体中にリポソームが豊富であることが明らかである。同様な知見が、図１６に示されるように皮下注射されたＣ−２６結腸癌細胞領域へのリポソームの溢出について得られた。
　【００７１】
（ＩＶ．腫瘍局在化法）
　上で詳述したように、血流中でのリポソームの延長された寿命、ならびに腫瘍中に溢出することを可能にし、比較的高い薬剤運搬能力を可能にし、かつリポソームが腫瘍に分配され侵入するのに必要とされる時間（注射後、最初の２４〜４８時間）の間、取り込まれた薬剤の漏れを最小にとどめることを可能にするリポソームサイズのために、本発明のリポソームは特に充実性腫瘍領域に局在化するに有効である。従って、このリポソームは、このようなリポソームに化合物を取り込み、そしてこのリポソームを被験体にＩＶ注射することによって化合物を選択的に充実性腫瘍に局在化させる有効な方法を提供する。本明細書において、充実性腫瘍とは（たとえば、白血病のような血液性腫瘍とは対照的に）血流の外側の解剖学的部位で増殖し、そしてこの増殖する腫瘍塊に栄養等を供給する小血管および毛細管の形成が必要とされる腫瘍として定義される。この場合、ＩＶ注射されたリポソーム（および取り込まれた抗腫瘍薬剤）が腫瘍部位に到達するためには、リポソームは血流から離れ、腫瘍中へと侵入しなければならない。１つの実施態様において、この方法は抗腫瘍薬剤を選択的に腫瘍中に局在化させることによる腫瘍の処置のために使用される。使用され得る抗腫瘍薬剤は任意の化合物であり、以下に挙げる化合物を包含し、これらの化合物は、適切な積載ファクターでリポソーム中に安定に取り込まれることができ、かつ治療上有効な薬用量（各化合物の後のかっこの中に示す）で投与することができる。これらの化合物は両親媒性抗腫瘍化合物、たとえば植物アルカロイドであるビンクリスチン（１．４ｍｇ／ｍ２）、ビンブラスチン（４〜１８ｍｇ／ｍ２）、およびエトポサイド（３５〜１００ｍｇ／ｍ２）、ならびにドキソルビシン（６５〜７５ｍｇ／ｍ２）、エピルビシン（６０〜１２０ｍｇ／ｍ２）、およびダウノルビシン（２５〜４５ｍｇ／ｍ２）を含むアントラサイクリン抗生物質を包含する。メトトレキセート（３ｍｇ／ｍ２）、シトシンアラビノサイド（１００ｍｇ／ｍ２）、およびフルオロウラシル（１０〜１５ｍｇ／ｍ２）のような水溶性抗代謝産物、ブレオマイシン（１０〜２０単位／ｍ２）、マイトマイシン（２０ｍｇ／ｍ２）、プリカマイシン（２５〜３０μｇ／ｍ２）、およびダクチノマイシン（１５μｇ／ｍ２）のような抗生物質、ならびにシクロホスファミド（３〜２５ｍｇ／ｋｇ）、チオテパ（０．３〜０．４ｍｇ／ｋｇ）、およびＢＣＮＵ（１５０〜２００ｍｇ／ｍ２）を含むアルキル化剤もまた、この目的において有用である。上述のように、ビンクリスチンによって例示される植物アルカロイドならびにドキソルビシン、ダウノルビシン、およびエピルビシンを含むアントラサイクリン抗生物質は、好ましくは能動的にリポソームに積載され、受動積載によって達成され得るよりも数倍高い薬剤／脂質割合を達成する。また上述のように、リポソームは内包された、ＩＬ−２のような腫瘍治療用のペプチド薬剤およびタンパク質薬剤、および／またはＴＮＦ、および／またはＭ−ＣＳＦのような免疫調節剤を含み得、これらは単独で存在するか、あるいはアントラサイクリン抗生物質薬剤のような抗腫瘍薬剤と組み合わされて存在する。
　【００７２】
　本発明によって充実性腫瘍を有効に処置する能力は、種々のインビボ系で示された。例１５で報告される方法では、Ｃ−２６結腸癌を皮下移植された動物において腫瘍の増殖速度を比較する。遊離形態または本発明によるＰＥＧ−リポソームに取り込まれた形態のいずれかでのエピルビシンによる処置を行い、結果を図１７のＡ〜Ｃに示した。示されるように、そしてさらに例１５で詳細に述べられるように、エピルビシンを積載したＰＥＧ−リポソームによる処置によって腫瘍増殖が著しく抑制され、そして通常の致死量の腫瘍細胞を接種された動物のグループの中で長期間生存するに至った。さらに、エピルビシン積載ＰＥＧ−リポソームによる動物の遅延処置によって、確立された皮下腫瘍の退化が生じた。遊離薬剤による処置では見られない結果である。
　【００７３】
　例１６で詳述するように、同様の結果がマウスの腹腔内に移植されたリンパ腫の処置について得られた。ここでは、遊離形態またはＰＥＧ−リポソームに取り込まれた形態のドキソルビシンで動物を処置した。腫瘍移植および薬剤処置から１００日間にわたる生存率を図１８に示す。その結果は上述の結果と同様であり、ＰＥＧ−リポソームによって、遊離薬剤処置に比べて生存時間中間値および生存率の著しい上昇が見られた。
　【００７４】
　従来のリポソームに取り込まれたドキソルビシンによる腫瘍の処置ではモデル動物系および臨床試験において毒性の低下が観察されているので（たとえば米国特許第４，８９８，７３５号で報告されているように）、本発明の腫瘍処置法で提供される毒性保護の度合を決定することは興味深い。例１７で報告される研究において、遊離形態あるいは従来のリポソームまたはＰＥＧ−リポソームに取り込まれた形態のドキソルビシンまたはエピルビシンの薬用量を増加させて、動物にＩＶ注射した。種々の薬剤処方についての最大許容薬用量（ＭＴＤ）をこの例の表１１に示す。どちらの薬剤でも、ＰＥＧ−リポソームへ取り込むことによって、薬剤のＭＴＤはおよそ２倍になる。同様の保護は従来のリポソームによって達成された。
　【００７５】
　毒性の低下は上記で報告された腫瘍処置の効力の増加に寄与し得るが、リポソーム溢出による薬剤の選択的な局在化もまた薬剤の効力の増加のために重要である。このことは例１８に記載される薬剤処置法において例証される。ここではドキソルビシンを含む従来のリポソーム（ＩＶ投与した場合、溢出による腫瘍での吸収をほとんど示さないかあるいは全く示さない）を、皮下移植腫瘍の増殖速度を低減させる同一の薬用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で、遊離薬剤と比較した。図１９では、生理食塩水コントロール（実線）、遊離薬剤（黒丸）、および従来のリポソーム（黒三角）について腫瘍移植の後の日数での腫瘍サイズをプロットする。明らかなように、従来のリポソームは同一の薬用量の遊離薬剤よりも大きい度合での腫瘍の増殖の抑制はしない。この知見は、図１７のＡ〜Ｃおよび図１８に示された結果ときわだって対照的である。これらの図においては、ＰＥＧリポソームに取り込まれたアントラサイクリン抗腫瘍薬剤によって腫瘍を有する動物を処置すると、遊離の薬剤に比べて生存率および腫瘍増殖の抑制が向上することが示されている。
　【００７６】
　このように、この腫瘍処置法はリポソーム中の薬剤毒性の低下によって投与すべき薬剤のレベルを高めることを可能とし、かつ腫瘍の細胞間液体中のリポソームの選択的局在化によって薬剤の効力を高めることを可能とする。
　【００７７】
　リポソーム溢出によって腫瘍中に選択的に化合物を局在化させる能力はまた、腫瘍の診断のために結像剤の腫瘍への標的化を改良するためにも利用できることが理解される。この場合、結像剤、典型的にはキレート形態の放射性同位体または常磁性分子がリポソーム中に取り込まれ、次いで検査される被験体にＩＶ投与される。選択された期間（典型的には２４〜４８時間）の後に、たとえば放射性同位体の場合にはガンマシンチレーションラジオグラフィーによって、あるいは常磁性剤の場合にはＮＭＲによって被験体をモニターし、結像剤の局所的な吸収領域を検出する。
　【００７８】
　【実施例】
　以下の実施例は、循環時間が増大したリポソームの製造法、およびインビボおよびインビトロにおける循環時間の評価の例示である。これらの例は本発明の特定のリポソーム組成物および方法の具体例を例示することを意図し、本発明の範囲を限定することをいかなる意味でも意図しない。
　【００７９】
（材料）
　コレステロール（Ｃｈｏｌ）は、シグマ（セントルイス、ＭＯ）から入手した。スフィンゴミエリン（ＳＭ）、卵ホスファチジルコリン（レシチン又はＰＣ）、組成ＩＶ４０、ＩＶ３０、ＩＶ２０、ＩＶ１０、及びＩＶ１（表４を参照のこと）を有する部分的に水素化されたＰＣ、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジパルミトイルＰＣ（ＤＰＰＣ）、ジオレイルＰＣ（ＤＯＰＣ）及びジステアロイルＰＣ（ＤＳＰＣ）は、アバンチ極性脂質（バーミンガム、ＡＬ）又はオースチンケミカル社（シカゴ、ＩＬ）から入手した。
　【００８０】
　〔１２５Ｉ〕−チラミニル−イヌリンを、公知処理に従って製造した。６７ガリウム−８−ヒドロキシキノリンは、ＮＥＮネオスカン（ボストン、ＭＡ）によって供給された。ドキソルビシンＨＣｌ及びエピルビシンＨＣｌを、アドリア研究所（コロンバス、ＯＨ）又はファルミタリアカルロエルバ（ミラノ、イタリー）から入手した。
　【００８１】
（例１：シアヌル酸クロライドによって結合されたＰＥＧ−ＰＥの製造）
（Ａ．活性化されたＰＥＧの製造）
　活性化されたＰＥＧとこれまで呼ばれている２−０−メトキシポリエチレングリコール１９００−４，６−ジクロロ−１，３，５トリアジンを、次の変法を伴って
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
　【００８２】
　シアヌル酸クロライド（５．５ｇ：０．０３モル）を、無水炭酸ナトリウム１０ｇを含有する無水ベンゼン４００ｍｌ中に溶解し、ＰＥＧ−１９００（１９ｇ；０．０１モル）を加え、混合物を一晩室温で撹拌した。溶液を濾過し、石油エーテル６００ｍｌ（沸騰範囲、３５〜６０°）を、撹拌しながらゆっくり加えた。微細な沈殿をフィルター上に集め、ベンゼン４００ｍｌ中に再溶解した。沈殿及び濾過工程を、石油エーテルが残存シアヌル酸クロライドを含有しなくなるまで数回くり返した。これは５−ｍ“リクロソルブ（ＬｉＣｈｒｏｓｏｒｂ）”（イー・メルク社）のカラム（２５０×３．２ｍｍ）上でヘキサンで展開され、紫外線検出器で検出される高圧液体クロマトグラフィーによって測定された。水性緩衝液中でｐＨ１０．０、室温で一晩の加水分解の後、活性化されたＰＥＧ−１９００を硝酸銀で滴定して、ＰＥＧモルあたり離脱したクロライド１．７モルの値が得られた。
　【００８３】
　生成物のＴＬＣ分析を、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社（フィリップスバーグ、ＮＪ）から入手したＴＬＣ逆相プレートで、展開剤としてメタノール−水、４：１；ｖ／ｖを用いて視覚化のためにヨウ素蒸気にさらして行った。この条件下で、出発メトキシポリグリコール１９００はＲｆ＝０．５４〜０．６０で現われた。活性化されたＰＥＧはＲｆ＝０．４１で現われた。未反応シアヌル酸クロライドは、Ｒｆ：０．８８で現われ、除かれた。
　【００８４】
　活性化されたＰＥＧを、窒素について分析し、適当な修正を、次の合成工程に使用する反応成分の量の選択の際に用いた。従って、生成物が理論量の２０％しか窒素を含有しなかった場合、次の合成工程で使用される材料の量を、１００／２０まで、すなわち５倍まで増加した。生成物が理論量の５０％の窒素を含有した場合、１００／５０すなわち２倍の増加が必要とされた。
　【００８５】
（Ｂ．Ｎ−（４−クロロ−ポリグリコール１９００）−１，３，５−トリアジニル卵ホスファチジルエタノールアミンの製造）
　ねじブタ付き試験管中で、クロロホルム中に卵ホスファチジルエタノールアミンの１００ｍｇ／ｍｌ（０．１００ｍｍｏｌ）貯蔵溶液の０．７４ｍｌを、窒素を流しながら蒸発乾固し、Ａ欄に記載した活性化されたＰＥＧの残部に２０５ｍｇ（０．１００ｍｍｏｌ）の供給量で加えた。この混合物に、５ｍｌの無水ジメチルホルムアミドを加えた。トリエチルアミン２７マイクロリットル（０．２００ｍｍｏｌ）を混合物に加え、空気を窒素ガスで置換した。混合物を、１１０℃で保った砂浴中で一晩加熱した。
　【００８６】
　次いで混合物を減圧下で蒸発乾固し、結晶性固体ののり状塊を得た。この固体を、アセトン４容量及び酢酸１容量の混合物５ｍｌ中に溶解した。生じた混合物を、シリカゲル（メルクシリカゲル６０，７０−２３０メッシュ）で充填された２１ｍｍ×２４０ｍｍクロマトグラフィー吸着カラムの頭部に置いた。このシリカゲルは先にアセトン及び酢酸、８０／２０；ｖ／ｖから成る溶剤で湿らせた。
　【００８７】
　カラムクロマトグラフィーを、同一の溶剤混合物で展開し、別々の溶出液の一部２０〜５０ｍｌを集めた。展開剤として２−ブタノン／酢酸／水；４０／２５／５；ｖ／ｖ／ｖを用いて及び視覚化のためにヨウ素蒸気さらして、シリカゲル被覆されたプレート上でＴＬＣにより溶出液の各々の部分を検定した。Ｒｆ＝約０．７９の材料しか含有しない画分を一緒にし、減圧下で蒸発乾固した。高減圧下で恒量まで乾燥して、リンを含有するほとんど無色の固体Ｎ−（４−クロロ−ポリグリコール１９００）−１，３，５−トリアジニル卵ホスファチジルエタノールアミン８６ｍｇ（３１．２マイクロモル）を得た。
　【００８８】
　固体化合物を、２４ｍｌのエタノール／クロロホルム；５０／５０クロロホルム中に取り、遠心分離して、不溶性物質を除去した。澄明化された溶液の減圧下での蒸発乾固により、無色固体２１ｍｇ（７．６２マイクロモル）を得た。
　【００８９】
（例２：カルバマート及びアミドで連結された親水性ポリマーとＰＥの製造）
（Ａ．ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のイミダゾールカルバマートの製造）
　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏ．から入手したポリエチレングリコールメチルエーテル１９００　９．５グラム（５ｍｍｏｌ）をモレキュラーシーブで乾燥したベンゼン４５ｍｌ中に溶解した。純粋なカルボニルジイミダゾール０．８９グラム（５．５ｍｍｏｌ）を加えた。純度を赤外スペクトルで調べた。反応容器中の空気を窒素で置換した。容器を密封し、砂浴中で７５℃で１６時間加熱した。
　【００９０】
　反応混合物を冷却し、室温で澄明な溶液が形成した。溶液を乾燥ベンゼンで５０．０ｍｌに希釈し、ＰＥＧエーテル１９００のイミダゾールカルバマートの１００マイクロモル／ｍｌ貯蔵溶液として冷蔵庫中に保存した。
　【００９１】
（Ｂ．ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のホスファチジルエタノールアミンカルバマートの製造）
　ポリエチレングリコールメチルエーテル１９００のイミダゾールカルバマートの１００ｍｍｏｌ／ｍｌ貯蔵溶液の１０．０ｍｌ（１ｍｍｏｌ）を１０ｍｌナス型フラスコ中にピペットで入れた。溶剤を減圧下に除去した。クロロホルム（０．５ｍｍｏｌ）中の卵ホスファチジルエタノールアミンの１００ｍｇ／ｍｌ溶液の３．７ｍｌを加えた。溶剤を減圧下で蒸発した。１，１，２，２−テトラクロロエチレン２ｍｌ及び１３９マイクロリットル（１．０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを加えた。容器を閉じ、９５℃に保たれた砂浴中で６時間加熱した。この時、薄層クロマトグラフィー分析を上記混合物の画分を用いて行い、ブタノン／酢酸／水；４０／５／５；ｖ／ｖ／ｖ；を展開剤として使用して、ＳｉＯ２被覆されたＴＬＣプレート上に結合する程度を測定した。Ｉ２蒸気視覚化により、Ｒｆ＝０．６８の遊離ホスファチジルエタノールアミンのほとんどが反応し、Ｒｆ＝０．７８〜０．８０のリン含有脂質によって置換されたことが明らかとなった。
　【００９２】
　残存する反応混合物中の溶剤を、減圧下で蒸発した。残留物をメチレンクロライド１０ｍｌ中に入れ、予めメチレンクロライドで洗浄したメルクシリカゲル６０（７０−２３０メッシュシリカゲル）で充填されたクロマトグラフィー吸着カラム２１ｍｍ×２７０ｍｍの頭部に置いた。混合物を下記の溶剤を順番に用いてカラムに通過させた。
　【００９３】
　【表１】
　【００９４】
　溶出液の一部を５０ｍｌ集め、各々の部分を、ＳｉＯ２被覆されたプレート上でＴＬＣによって検定した。その際クロロホルム／メタノール／水／濃水酸化アンモニウム；１３０／７０／８／０．５％；ｖ／ｖ／ｖ／ｖで展開後、視覚化のためにＩ２蒸気吸着を用いた。ホスファートのほとんどが、画分１１，１２，１３及び１４中に見い出された。
　【００９５】
　これらの画分を一緒にし、減圧下で蒸発乾固し、高減圧で恒量まで乾燥した。これにより、ポリエチレングリコールメチルエーテルのホスファチジルエタノールアミンの無色のワックス状物６６９ｍｇを得た。これは２６３マイクロモルであり、ホスファチジルエタノールアミンを基準に５２．６％の収率を示した。
　【００９６】
　重クロロホルム中に溶解された生成物のＮＭＲスペクトルは、δ＝３．４ｐｐｍでエチレンオキサイド鎖のメチレン基に帰因する強いシングレットと共に、卵ＰＥのスペクトルに相当するピークを示した。エチレンオキサイドからのメチレンプロトンとＰＥアシル基の末端メチルプロトンとの割合は、所望の生成物ポリエチレングリコール結合ホスファチジルエタノールアミンカルバマート（分子量２，６５４）の分子のポリエチレンオキサイド部分の約２０００の分子量を確認するのに十分な大きさであった。
　【００９７】
（Ｃ．ホスファチジルエタノールアミンのポリ乳酸アミドの製造）
　ポリ（乳酸）、分子量＝２，０００（ＩＣＮ，クリーブランド、オハイオ州）２００ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）を、ジメチルスルホキシド２．０ｍｌ中に、材料が完全に溶解する様に撹拌しながら加熱して溶解した。次いで溶液を直ちに６５℃まで冷却し、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（Ｃａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）７５ｍｇ（０．１ｍｍｏｌ）とジシクロヘキシルカルボジイミド４１ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）の混合物上に注いだ。次いでトリエチルアミン２８ｍｌ（０．２ｍｍｏｌ）を加え、空気を窒素ガスでチューブから追い出し、チューブに栓をし、６５℃で４８時間加熱した。
　【００９８】
　この時間の後に、チューブを室温まで冷却し、クロロホルム６ｍｌを加えた。クロロホルム溶液を、３回続けて６ｍｌ容量の水で洗浄し、各々の洗浄の後に、遠心分離し、相をパスツールピペットで分離した。残存するクロロホルム相を、吸引濾過して、懸濁したジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを除去した。濾液を、減圧下で乾燥し、半結晶性固体２１２ｍｇを得た。
　【００９９】
　この固体を、エタノール４容量と水１容量の混合物１５ｍｌ中に溶解し、深さ５０ｍｍ及び直径２１ｍｍのＨ＋Ｄｏｗｅｘ　５０カチオン交換樹脂の吸着床を通過させ、同一溶剤１００ｍｌで洗浄した。
　【０１００】
　濾液を、蒸発乾固し、無色ワックス状物１３１ｍｇを得た。
　【０１０１】
　この様なワックス状物２９１ｍｇを、クロロホルム２．５ｍｌ中に溶解し、クロロホルムで湿らせたシリカゲルの２１ｍｍ×２８０ｍｍカラムの頭部に移した。下記クロロホルム各々１００ｍｌを順番にカラムに通して、クロマトグラムを展開した：
　１００％クロロホルム、０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　９０％クロロホルム、１０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　８５％クロロホルム、１５％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　８０％クロロホルム、２０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　７０％クロロホルム、３０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）。
　【０１０２】
　個々に２５ｍｌ部の溶出液をとっておき、ＳｉＯ２被覆されたプレート上でＴＬＣによって検定し、その際展開剤としてＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＯＨ、Ｈ２Ｏ、濃ＮＨ４ＯＨ、１３０、７０、８、０．５ｖ／ｖ及び視覚化のためにＩ２蒸気吸収を使用した。
　【０１０３】
　カラム溶出液の２７５〜３２５ｍｌ部分は、Ｒｆ＝０．８９の単一材料（ＰＯ４＋）を含有していた。
　【０１０４】
　一緒にし、蒸発乾固すると、これらは無色ワックス状物３１９ｍｇを生じた。
　【０１０５】
　ホスファート分析は、約１１５，０００の分子量と一致した。
　【０１０６】
　明らかに、ポリ（乳酸）の重合が、ホスファチジルエタノールアミンとの反応速度と匹敵する速度で起こった。
　【０１０７】
　この副反応は、より希釈された反応成分溶液を用いて行うことによって恐らく最小にすることができる。
　【０１０８】
（Ｄ．ＤＳＰＥのポリ（グリコール酸）アミドの製造）
　グリコール酸２６６ｍｇ（３．５０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド７４５ｍｇ（３．６０ｍｍｏｌ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン７５ｍｇ（０．１０ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン３２マイクロリットル（０．２３ｍｍｏｌ）、及び乾燥ジメチルスルホキシド５．０ｍｌの混合物を窒素雰囲気下で７５℃で加熱し、室温まで冷却し、次いで同容量のクロロホルムで希釈し、次いで３回続けて同量の水で洗浄し、ジメチルスルホキシドを除去した。遠心分離し、相をパスツールピペットでその都度分離する。
　【０１０９】
　クロロホルム相を吸引濾過し、少量の懸濁する物質を除き、濾液を減圧で蒸発乾固し、薄いコハク色のワックス状物５７２ｍｇを得る。
　【０１１０】
　クロロホルム２．５ｍｌ中にこの材料を再溶解し、クロロホルムで湿らせたシリカゲル（メルクシリカゲル６０）の２１ｍｍ×２７０ｍｍカラムの頭部に移す。
　【０１１１】
　下記クロロホルム各々１００ｍｌを順番にカラムに通して、クロマトグラムを展開する：
　１００％クロロホルム、０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　９０％クロロホルム、１０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　８５％クロロホルム、１５％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　８０％クロロホルム、２０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）；
　７０％クロロホルム、３０％（メタノール中１％　ＮＨ４ＯＨ）。
　【０１１２】
　個々に２５ｍｌ部の溶出液を集め、ＳｉＯ２被覆されたプレート上でＴＬＣによって各々検定し、その際展開剤としてＣＨＣｌ３、ＣＨ３ＯＨ、Ｈ２Ｏ、濃ＮＨ４ＯＨ；１３０、７０、８、０．５ｖ／ｖを使用する。
　【０１１３】
　ほとんどすべてのＰＯ４＋物質は、溶出液の２７５−３００ｍｌ部分中に存在する。これを減圧下で蒸発乾固し、高減圧乾燥し、無色ワックス状物２８１ｍｇを得る。
　【０１１４】
　ホスファート分析は、分子量９２４，０００を示した。反応の間の溶剤容量及びグルコール酸とジシクロヘキシルカルボジイミドとのモル割合を操作することにより、恐らく他の大きさの分子を得る。
　【０１１５】
（例３：エチレン結合したＰＥＧ−ＰＥの製造）
（Ａ．１−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールの製造）
　１−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールの製造は、図４に示した反応式中に示される。
　【０１１６】
　ポリエチレングリコール、分子量１５００（Ａｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ）１５．０グラム（１０ｍｍｏｌ）をベンゼン８０ｍｌ中に溶解した。クロロトリメチルシラン（Ａｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ社）１．４０ｍｌ（１１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン１．５３ｍｌ（１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を、室温で不活性雰囲気下で５時間撹拌した。
　【０１１７】
　混合物を、吸引濾過して、トリエチルアンモニウムクロライドの結晶を分離し、結晶をベンゼン５ｍｌで洗浄した。濾液及びベンゼン洗浄液を一緒にした。この溶液を、減圧下で蒸発乾固し、無色油状物１５．８３グラムを得、これは放置すると固まった。
　【０１１８】
　展開剤としてエタノール４容量と水１容量の混合物を用いるＳｉ−Ｃ１８逆相プレート上での生成物のＴＬＣ、及びヨウ素蒸気視覚化は、すべてのポリグリコール１５００（Ｒｆ＝０．９３）が使い果され、Ｒｆ＝０．８２の物質に代っていることを示した。赤外スペクトルは、ポリグリコールのみに特徴のある吸収ピークを示した。
　【０１１９】
　１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール（分子量１５００）の収量は、ほぼ定量的であった。
　【０１２０】
（Ｂ．１−トリメチルシリルオキシ−ポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルの製造）
　上記で得られた、結晶性１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５．７４グラム（１０ｍｍｏｌ）を、無水ベンゼン４０ｍｌ中に溶解し、粉砕した氷の浴中で冷却した。トリエチルアミン１．５３ｍｌ（１１ｍｍｏｌ）及びＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．から得られる無水トリフルオロメタンスルホン酸１．８５ｍｌ（１１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物が褐色に変わるまで、混合物を不活性雰囲気下で一晩撹拌した。
　【０１２１】
　次いで溶剤を減圧下で蒸発し、残存するシロップ状ペーストをメチレンクロライドで希釈して１００．０ｍｌにした。トリフルオロメタンスルホン酸エステルの反応性は高いので、１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルの更なる精製は行わなかった。
　【０１２２】
（Ｃ．Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＥの製造）
　１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールのトリフルオロメタンスルホニルエステルのメチレンクロライド貯蔵溶液１０ｍｌを減圧下で蒸発乾固し、残留物約１．２グラム（約０．７ｍｍｏｌ）を得た。この残留物に、卵ＰＥ３７２ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を含有するクロロホルム溶液３．７２ｍｌを加えた。生じた溶液に、トリエチルアミン１３９マイクロリットル（１．０ｍｍｏｌ）を加え、溶剤を減圧下で蒸発した。得られた残留物に、乾燥ジメチルホルムアミド５ｍｌ及びトリエチルアミン（ＩＶ）７０マイクロリットル（０．５０ｍｍｏｌ）を加えた。反応容器の空気を窒素で置換した。容器を閉じ、砂浴中で１１０℃で２２時間加熱した。溶剤を減圧下で蒸発し、褐色がかった油状物１．５８グラムを得た。
　【０１２３】
　シリカゲル６０シリカ７０−２３０メッシュで充填された２１×２６０ｍｍクロマトグラフィー吸着カラムを調製し、ブタノン４０容量、酢酸２５容量及び水５容量から成る溶剤で洗浄した。粗生成物を、同一の溶剤３ｍｌ中に溶解し、クロマトグラフィーカラムの頭部に移した。クロマトグラムを同一溶剤で展開し、連続して溶出液３０ｍｌ部を各々ＴＬＣによって検出した。
　【０１２４】
　ＴＬＣ検出システムは、ブタノン／酢酸／水の溶剤混合物、４０／２５／５；ｖ／ｖ／ｖを用いて、シリカゲル被覆されたガラスプレートを使用した。ヨウ素蒸気吸収は、視覚化に役立った。この溶剤系で、Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＥは、Ｒｆ＝０．７８で現われた。未変化ＰＥはＲｆ＝０．６８で現われた。
　【０１２５】
　所望のＮ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコール１５００ＰＥは、カラム溶出液の１７０〜３００ｍｌ部分の主たる成分であった。減圧で蒸発乾固すると、この部分は薄い黄色油状の化合物１１１ｍｇを生じた。
　【０１２６】
（Ｄ．Ｎ−ポリエチレングリコール１５００の製造：ホスファチジル−エタノールアミン酢酸脱保護）
　一度クロマトグラフィー分離されたＰＥ化合物を、テトラヒドロフラン２ｍｌ中に溶解した。これに酢酸６ｍｌ及び水２ｍｌを加えた。得られる溶液を３日間、２３℃で放置した。反応混合物からの溶剤を、減圧で蒸発し、恒量まで乾燥し、薄い黄色ワックス状物７５ｍｇを得た。エタノール４容量部と水１容量部の混合物で展開されたＳｉ−Ｃ１８逆相プレート上でのＴＬＣは、いくつかの遊離ＰＥ及びいくつかのポリグリコール様物質が加水分解中に形成されたことを示した。
　【０１２７】
　残留物をテトラヒドロフラン０．５ｍｌ中に溶解し、エタノール水（８０；２０；ｖ：ｖ）の溶液３ｍｌで希釈した。混合物を、オクタデシルが結合した相のシリカゲルで充填された１０ｍｍ×２５０ｍｍクロマトグラフィー吸着カラムの頭部に供給し、カラムをエタノール水８０：２０容量％で展開し、連続して溶出液２０ｍｌ部を集めた。溶出液を、逆相ＴＬＣによって検定した。Ｒｆ＝０．０８〜０．１５の生成物しか含有しない画分を一緒にした。これは、主として溶出液の２０〜１００ｍｌ部分であった。減圧で蒸発乾固した場合、これらの部分は無色ワックス状物ＰＥＧ−ＰＥ３３ｇを生じ、これは出発ホスファチジルエタノールアミンを基準にしてわずか３％の収率に相当した。
　【０１２８】
　ＮＭＲ分析は、生成物はＰＥ残基もポリエチレングリコール残基も含んでいるが、一見好ましい元素分析にかかわらず、ポリグリコール鎖の鎖長がエチレンオキシド残基約３個〜４個に減少したことを示した。製造された生成物を、ＰＥＧ−ＰＥリポソームの製造に使用した。
　【０１２９】
（Ｅ．フルオライド脱保護によるＮ−ポリエチレングリコール１５００Ｐ．Ｅ．の製造）
　粗Ｎ−１−トリメチルシリルオキシポリエチレングリコールＰＥ５００ｍｇを、テトラヒドロフラン５ｍｌ中に溶解し、テトラブチルアンモニウムフルオライド１８９ｍｇ（０．６００ミリモル）を加え、溶解するまで撹拌した。反応成分を、室温（２０℃）で一晩放置した。
　【０１３０】
　溶剤を減圧下で蒸発し、残留物をクロロホルム１０ｍｌ中に溶解し、２回続けて１０ｍｌずつの水で洗浄し、遠心分離してクロロホルム相と水相を分けた。クロロホルム相を減圧下で蒸発し、橙褐色ワックス状物３９０ｍｇが得られ、これは不純なＮ−ポリエチレングリコール１５００ＰＥ化合物であることを示した。
　【０１３１】
　ワックス状物を、クロロホルム５ｍｌ中に再溶解し、クロロホルムで湿らせたシリカゲルを有する２１×２７０ｍｍカラムの頭部に移した。
　【０１３２】
　溶剤１００ｍｌをカラムに通してカラムを展開した。表２の溶剤を、順番に用いた：
　【０１３３】
　【表２】
　【０１３４】
　分離したカラム溶出液の画分５０ｍｌをとっておいた。カラムの画分を、ＴＬＣによってＳｉ−Ｃ１８逆相プレート上で分離した。ＴＬＣプレートを、水１容量と混合されたエタノール４容量で展開した。視覚化を、ヨウ素蒸気にさらすことによって行った。
　【０１３５】
　Ｒｆ約０．２０のヨウ素吸収脂質を含有する画分のみを一緒にし、減圧下で蒸発乾固し、恒量まで高減圧で乾燥した。この方法でワックス状の結晶性固体９４ｍｇが、分子量２２２６で得られた。重クロロホルム中に溶解されたこの物質のプロトンＮＭＲスペクトルは、ポリエチレングリコールに帰因すると考えられるいくつかのメチレンプロトンと共に分子のホスファチジルエタノールアミン部分に原因があると予測されるピークを示した（δ＝３．７）。
　【０１３６】
（例４：ＲＥＶ及びＭＬＶの製造）
（Ａ．分粒されたＲＥＶ）
　下記の例中に示されるモル割合で、全部で１５μｍｏｌの選択された脂質成分をクロロホルム中に溶解し、ロータリーエバポレーターによって薄いフイルムとして乾燥した。この脂質フイルムを、蒸留水で洗浄されたジエチルエーテル１ｍｌ中に溶解した。この脂質溶液に５ｍＭトリス、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有する水性緩衝溶液、ｐＨ７．４、０．３４ｍｌを加え、混合物を、１分間音波処理によって乳化し、溶液の温度を室温又はそれ以下に保った。内包された〔１２５Ｉ〕チラミニル−イヌリンを含有するようにリポソームを製造した場合、チラミニル−イヌリンは約４μＣｉ／ｍｌ緩衝液の濃度でホスファート緩衝液中で含まれた。
　【０１３７】
　エーテル溶剤を減圧下で室温で除去し、生じるゲルを、上記緩衝液０．１ｍｌ中に、取り、激しく振った。生じるＲＥＶ懸濁液は、顕微鏡検査によって測定される約０．１ないし２０ミクロンの粒子サイズを有し、１個又はほんの僅かの二重層ラメラを有する比較的大きい（１ミクロンより大きい）小胞から主に成っていた。
　【０１３８】
　リポソームを、選択された細孔サイズ０．４ミクロン又は０．２ミクロンを有するポリカーボネートフイルター（Ｓｚｏｋａ，１９７８）を２回通して押し出した。０．４ミクロンフィルターを通して押し出されたリポソームは、０．１７±（０．０５）ミクロン直径、０．２ミクロンフィルターを通したものは、０．１６（０．０５）ミクロン直径を平均とした。内包されていない〔１２５Ｉ〕チラミニル−イヌリンを、押し出されたリポソームをセファデックスＧ−５０（ファルマシア）通過させることによって除去した。
　【０１３９】
（Ｂ．分粒されたＭＬＶ）
　多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）リポソームを、標準操作に従って、脂質混合物を主にＣＨＣｌ３を含有する有機溶剤中に溶解し、減圧下で回転によって薄いフイルムとして脂質を乾燥して、製造した。ある場合には、脂質相のための放射性標識を、乾燥前に脂質溶液に加えた。脂質フイルムを、所望の水性相及び３ｍｍガラスビーズの添加によって水和し、次いでボルテックスで撹拌し、少なくとも１時間リン脂質成分の相転移温度以上で振とうした。ある場合には、水性相のための放射性標識を、緩衝液中に含有させた。ある場合には、次の押出し工程を容易にするために、水和された脂質を、繰り返し３回凍結し解凍した。
　【０１４０】
　リポソームサンプルのサイズを、加圧された窒素ガスを用いて、定められた細孔ポリカーボネートフィルターを通して押し出してコントロールした。ある操作では、リポソームを０．４μｍの細孔を有するフィルターを１回通し、次いで０．１μｍの細孔を有するフィルターを１０回通し押し出した。別の操作では、リポソームを０．２μｍの細孔を有するフィルターを３回通し、その後粒子の平均直径がＤＬＳにより測定された場合に１００ｎｍ以下になるまで、０．０５μｍの細孔での押出しをくり返した。空隙容量のリポソームを包含容量の小分子から分離するゲルパーミエーションカラムに、押し出されたサンプルを通すことによって非内包水性成分を除去した。
　【０１４１】
（Ｃ．６７ＧａのＤＦ含有リポソームへの積載）
　Ｇａ６７−ＤＦ標識されたリポソームを製造するプロトコルは、公知手順（ガビゾン，１９８９（文献番号８））に適合するようにした。簡単に述べると、リポソームを内部水性相中にイオンキレーターデスフェラルメシラートが内包されるように製造し、ヒドロキシキノリン（オキシン）によって二重層を通って運搬されたＧａを不可逆的に結合した。
　【０１４２】
（Ｄ．動的光散乱）
　リポソーム粒子サイズ分布測定が、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　ＢＩ−２０３０ＡＴオートコリレーターを備えたＮＩＣＯＭＰモデル２００を用いてＤＬＳによって得られた。機器を、製造業者による指示書に従って操作した。ＮＩＣＯＭＰ結果は、平均直径及び相対容量による小胞のガウス分布の標準偏差として表わした。
　【０１４３】
（例５：リポソーム血中寿命測定）
（Ａ．血中循環時間及び血液／ＲＥＳ割合の測定）
　リポソームのインビボ試験を、２つの異なる動物モデルで行った：各２５ｇのスイス−ウェブスターマウス及び各２００〜３００ｇの実験用ラット。マウス試験は、１μＭリン脂質／マウスにリポソームサンプルの尾静脈注射を行い、次いで動物を一定の時間後屠殺し、ガンマカウンティングによって標識を定量するために組織除去することを包含した。各組織中で注射された薬用量の重量及びパーセントを測定した。ラットの試験は、大腿静脈中に長時間持続するカテーテルの確立を包含した。この長時間持続するカテーテルは、３〜４μＭリン脂質／ラットで他の大腿動脈中のカテーテル中にリポソームサンプルを注射した後の一定の時間に血液サンプルを除去するためのカテーテルである。血液中に残存する注射された薬用量のパーセントを２４時間までのいくつかの時点で測定した。
　【０１４４】
（Ｂ．血流中のリポソーム保持の時間経過）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）及び１−パルミトイル−２−オレイル−ＰＥ（ＰＯＰＥ）から成るＰＥＧ−ＰＥを例２と同様に製造した。ＰＥＧ−ＰＯＰＥ脂質を約０．１：２の脂質：脂質モル割合で部分的に水素化された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）と一緒にし、脂質混合物を水和し、例４中に記載した様に０．１ミクロンポリカーボナート膜を通して押し出し、平均サイズ約０．１ミクロンのＭＬＶを生じた。ＭＬＶ脂質は少量の放射性標識された脂質マーカー１４Ｃ−コレステリルオレアート、及び内包されたマーカー３Ｈ−イヌリンを含んでいた。
　【０１４５】
　リポソーム組成物を注射し、マウス中の初期の注射薬用量に対するパーセントを、注射後１、２、３、４及び２４時間で例４中に記載した様に測定した。脂質マーカー及び内包されたマーカーは両方とも２４時間後最初に注射された薬用量の１０％より大きいことを示した。
　【０１４６】
（Ｃ．２４時間血中リポソームレベル）
　血液中に注射される薬用量に対するパーセント、及びリポソームマーカーの血液／ＲＥＳ割合を静脈内リポソーム注射後２４時間で測定するための試験を、上述の様に実施した。下記表３中の左欄に示した組成を有するリポソーム処方物を上述の様に製造した。特に明記しない限り、脂質誘導体化されたＰＥＧはＰＥＧ−１９００であり、リポソームサイズは０．１ミクロンであった。静脈内投与後２４時間で血液中に残存する薬用量パーセント、及び測定された２４時間血液／ＲＥＳ割合を、表の中央及び右欄にそれぞれ示す。
　【０１４７】
　【表３】
　【０１４８】
＊すべての処方物は、３３％のコレステロール及び７．５％の充填成分を含有し、記載される場合以外は１００ｎｍ平均直径であった。ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、記載される場合以外はＰＥＧ１９００から成った。
　【０１４９】
　明らかな様に、注射後２４時間の血液中に残存する薬用量パーセントは、ＰＥＧ誘導体化された脂質を含有するリポソームに関して５〜４０％の間であった。対照的に、ＰＥＧ誘導体化された脂質のない両方のリポソーム処方物においては、２４時間後に残存するリポソームマーカーは、１％より小さかった。また表３から明らかな様に、血液／ＲＥＳ割合は、コントロールリポソーム中の０．０１〜０．０３から、ＰＥＧ誘導体化されたリポソームを含有するリポソーム中で少なくとも０．２に増加し、４．０の高さまで増加した。
　【０１５０】
（Ｄ．ポリ乳酸誘導体化されたＰＥを用いる血中寿命測定）
　静脈内リポソーム注射後、数回血液中の注射された薬用量パーセントを測定するための試験を、上述の様に実施した。２：３．５：１又は１：３．５：１重量％のどちらかの組成のポリ乳酸‐ＰＥ：ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌを有するＭＬＶリポソーム処方物を製造した。
　【０１５１】
　このデータは、ポリ乳酸被覆リポソームのクリアランスがポリ乳酸誘導体化されたＰＥを含有しない類似の処方物よりも数倍遅いことを示す。
　【０１５２】
（Ｅ．ポリグリコール酸誘導体化されたＰＥを用いる血中寿命測定）
　静脈内リポソーム注射後、数回血液中の注射された薬用量パーセントを測定するための試験を、上述の様に実施した。２：３．５：１重量％で組成のポリグリコール酸‐ＰＥ：ＨＳＰＣ：Ｃｈｏｌを有する押し出されたＭＬＶリポソーム処方物を製造した。
　【０１５３】
　これらのデータは、ポリグリコール酸被覆リポソームのクリアランスがポリグリコール酸誘導体化されたＰＥを含有しない類似の処方物よりも数倍遅いことを示す。
　【０１５４】
（例６：ＰＥＧ‐ＰＥリポソーム中の血液／ＲＥＳ割合に対するリン脂質アシル鎖飽和の作用）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）及びジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）から成るＰＥＧ‐ＰＥを、例２と同様に製造した。ＰＥＧ‐ＰＥ脂質を、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、完全に水素化された大豆ＰＣ（ＰＣ）、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、部分的に水素化された大豆ＰＣ（ＰＨＳＰＣ）、及び表４中にＰＣ　ＩＶ１、ＩＶ１０、ＩＶ２０、ＩＶ３０、及びＩＶ４０として同定される一部水素化されたＰＣ脂質のうちから選択された脂質を用いて処方した。脂質成分を、表５中の左欄に示されるモル割合で混合し、例４中に示した様に０．１ミクロンに分粒されたＭＬＶを形成するのに使用した。
　【０１５５】
　【表４】
　【０１５６】
　【表５】
　【０１５７】
　注射後２４時間で、血液中、ならびに肝臓（Ｌ）及び脾臓（Ｓ）中に残存する（１４Ｃ−コレステリルオレアートのパーセントによって測定される様に）注射された物質のパーセントを測定した。血液及びＬ＋Ｓ（ＲＥＳ）値を、各組成物に関する血液／ＲＥＳ値を算出するのに使用した。表５の右欄（％残存率）は、２４時間後の動物の放射能の全量から決定した、投与後２４時間における動物に残存する投与されたリポソーム用量の百分率を示す。表中の２つの低い全回収値は、異常クリアランス挙動を示す。
　【０１５８】
　表からの結果は、血液／ＲＥＳ割合がリポソームを形成するリン脂質成分の流動性又は飽和度と全く無関係であることを示す。特に、飽和度の高いＰＣ成分（たとえばＩＶ１　ＰＣ及びＩＶ１０　ＰＣ）、ほとんど不飽和のＰＣ成分（たとえばＩＶ４０）、及び中間的な飽和成分（たとえばＩＶ２０）を含有するリポソームの間で観察される血液／ＲＥＳ割合で系統的な変化はない。
　【０１５９】
　更に、比較的飽和したＰＥＧ−ＤＳＰＥ化合物及び比較的不飽和のＰＥＧ−ＰＯＰＥ化合物（例５）を用いて得られた血液／ＲＥＳ割合の比較は、誘導体化された脂質の飽和度がそれ自体ではＲＥＳによって吸収を逃れるリポソームの能力に対して重要ではないことを示す。
　【０１６０】
（例７：ＰＥＧ‐ＰＥリポソーム中、血液／ＲＥＳ割合に対するコレステロールとエトキシ化コレステロールの作用）
（Ａ．添加されたコレステロールの作用）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）およびＤＳＰＥから成るＰＥＧ‐ＰＥを例２に記載した様に製造した。ＰＥＧ‐ＰＥ脂質を下表６中の左欄に示した様にスフィンゴミエリン（ＳＭ）、完全に水素化された大豆ＰＣ（ＰＣ）及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）の中から選ばれた脂質を用いて処方した。表中に示した３つの処方物は、約３０，１５及び０モルパーセントのコレステロールを含有する。ＲＥＶ（０．３ミクロンサイズ）及びＭＬＶ（０．１ミクロンサイズ）をともに、実質上例４に於ける様に、トリチウム標識されたイヌリンを内包して製造した。
　【０１６１】
　投与後２及び２４時間で血液中に残存する内包されたイヌリンパーセントは、下表６の右に示す様に０〜３０モルパーセントの範囲でコレステロールの測定できる影響を示さない。
　【０１６２】
　【表６】
　【０１６３】
（Ｂ．エトキシ化コレステロールの作用）
　メトキシ‐エトキシ‐コレステロールを、第Ｉ章（誘導体化された脂質の製造）で記載したトリフルオロスルホナートカップリング法を経てメトキシエタノールをコレステロールにカップリングすることによって製造した。メトキシＰＥＧ（分子量１９００）およびＤＳＰＥから成るＰＥＧ‐ＰＥを、例２に記載した様に製造した。ＰＥＧ‐ＰＥ脂質を表７の右に示す様なジステアリルＰＣ（ＤＳＰＣ）、部分的に水素化された大豆ＰＣ（ＰＨＳＰＣ）、コレステロール及びエトキシ化コレステロールの中から選択された脂質を用いて処方した。データは、（ａ）エトキシ化コレステロールは（ＰＥＧ‐ＰＥと組み合わせて）、ＰＥＧ‐ＰＥ単独とほぼ同一の血液中のリポソーム寿命の増加度を生じることを示す。単独では、エトキシ化コレステロールは、リポソーム寿命の中程度の増加度を生じるが、ＰＥＧ‐ＰＥによって得られるものよりも実質的に小さい。
　【０１６４】
　【表７】
　【０１６５】
（例８：ＰＥＧ‐ＰＥリポソームにおける血液／ＲＥＳ割合に対する荷電した脂質成分の作用）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）およびＤＳＰＥから成るＰＥＧ‐ＰＥを、例２に記載した様に製造した。ＰＥＧ‐ＰＥ脂質を、図７中に示した様に、卵ＰＧ（ＰＧ）、部分的に水素化された卵ＰＣ（ＰＨＥＰＣ）、及びコレステロール（Ｃｈｏｌ）の中から選択された脂質を用いて処方した。図中に示された２つの処方物は、約４．７モルパーセント（三角）又は１４モルパーセント（まる）ＰＧを含有していた。脂質を、例４に於けると同様に０．１ミクロンに分粒したＭＬＶとして製造した。
　【０１６６】
　注射後０．２５、１、２、４、及び２４時間で存在する注射されたリポソーム薬用量のパーセントを、図７に両処方物に関してプロットする。明らかな様に、組成物中のＰＧパーセントは、血流中リポソーム保持に関してほとんど又は全く作用を有しなかった。また示された内包されたマーカーの損失速度は、ＰＣを含有する、同様に製造されたリポソームに対して観察された損失速度と同様である。
　【０１６７】
（例９：ＰＥＧ‐被覆リポソーム及び非被覆リポソームの血漿のキネティックス）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）及びジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）から成るＰＥＧ‐ＰＥを、例２に於ける様に製造した。ＰＥＧ‐ＰＥ脂質をＰＨＥＰＣ、及びコレステロールを用いて０．１５：１．８５：１のモル割合で処方した。第二の脂質混合物は、同一脂質を含有していたが、ＰＥＧ‐ＰＥは含まなかった。リポソームを、例５に記載した様にデスフェラルメシラートの存在下に脂質水和によって２つの脂質混合物から製造し、０．１ミクロンに分粒し、ゲル濾過によって取り込まれなかったデスフェラルを除去し、次いでリポソームに６７Ｇａ−オキシンを積載した。非内包６７Ｇａを、セファデックスＧ−５０ゲル排除カラムの通過の間に除いた。両組成物は０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、０．５ｍＭデスフェラル中に１０μｍｏｌ／ｍｌを含有する。
　【０１６８】
　２つのリポソーム組成物（０．４ｍｌ）を例６に記載した様に動物にＩＶ注射した。注射後０．２５、１、３又は５及び２４時間で、血液サンプルを取り、血液中に残存するイヌリン量を検出し、注射直後に測定された量の百分率として表わす。結果を、図９中に示す。明らかな様に、ＰＥＧ彼覆リポソームは、約１１時間の血中半減期を有し、注射された材料のほぼ３０％は、２４時間後の血液中に存在する。対照的に、非被覆リポソームは、１時間より少ない血液中の半減期を示す。２４時間で、注射された物質の量は、検出不可能であった。
　【０１６９】
（例１０：ドキソルビシンリポソームの製造）
　０．３：０．３：１．４：１のモル割合で、ＰＥＧ‐ＰＥ、ＰＧ、ＰＨＥＰＣ、及びコレステロールを含有する小胞形成脂質をクロロホルム中に溶解し、２５μｍｏｌリン脂質／ｍｌの最終脂質濃度とした遊離塩基形でアルファ−トコフェロール（α−ＴＣ）を、クロロホルム：メタノール（２：１）溶液中に加え、０．５％の最終モル割合とした。脂質溶液を乾燥して薄い脂質フィルムとし、次いで１ｍＭデスフェラルを含有する１２５ｍＭ硫酸アンモニウムの熱い（６０℃）溶液で水和した。水和を、リン脂質５０μｍｏｌにつき水溶液１ｍｌを用いて実施した。脂質材料を１０回の凍結／解凍サイクルで、液体窒素及び熱い水浴を用いて水和した。
　【０１７０】
　リポソーム分粒を、２個の核細孔ポリカーボネート膜、３サイクル０．２ミクロンフィルター、次いで１０サイクル０．０５ミクロンフィルターを通して押出しすることによって実施した。最終リポソームサイズは１００ｎｍであった。次いで分粒されたリポソームを、２４時間の間３回５％グルコース５０〜１００容量に対して透析した。第４サイクルを１時間ｐＨ６．５〜７．０に滴定された５％グルコースに対して実施した。
　【０１７１】
　０．９％ＮａＣｌ及び１ｍＭデスフェラル中にドキソルビシン１０ｍｇ／ｍｌを含有する溶液を製造し、透析されたリポソーム製造物の等容量と混合した。混合物中の薬剤の濃度は、約５ｍｇ／ｍｌ薬剤５０μｍｏｌ／ｍｌリン脂質であった。混合物を１時間６０℃で水浴中で振とうしながらインキュベートした。取り込まれていない薬剤を、小さいカラム中に充填されたＤｏｗｅｘ　５０ＷＸを通して除去した。カラムをベンチトップ遠心分離器中で５分間遠心分離して、完全にリポソーム懸濁液を溶離した。混合物の滅菌を、０．４５ミクロン膜の通過によって行い、リポソームを５℃で保存した。
　【０１７２】
（例１１：遊離ドキソルビシン及びリポソームドキソルビシンの血漿のキネティックス）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）及びジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）から成るＰＥＧ‐ＰＥを、例２と同様に製造した。ＰＥＧ−ＰＥ脂質を水素化された大豆ＰＣ（ＨＳＰＣ）及びコレステロールで０．１５：１．８５：１（ＰＥＧ‐Ｄｏｘ）のモル割合で処方した。第二脂質混合物は、水素化されたホスファチジルイノシトール（ＨＰＩ）、ＨＳＰＣコレステロールを１：１０：５（ＨＰＩ‐Ｄｏｘ）のモル割合で含有していた。各脂質処方物を、例１０と同様に、アンモニウムイオン勾配を有する、分粒されたＭＬＶの製造に使用した。
　【０１７３】
　リポソームを、例１５と同様にドキソルビシン溶液の等容量（１０ｍｇ／ｍｌ）プラス１ｍＭデスフェラルと混合して、ドキソルビシンを積載した。２つの組成物を、図１０及び下記表８にＰＥＧ‐ＤＯＸ及びＨＰＩ‐ＤＯＸリポソームとしてそれぞれ示す。ドキソルビシンＨＣｌ溶液（市販の生成物、遊離Ｄｏｘ）を、病院薬局から入手した。遊離ＤＯＸ，ＰＥＧ‐Ｄｏｘ及びＨＰＩ‐Ｄｏｘを、注射日に非緩衝の５％グルコースを用いて同一濃度（１．８ｍｇ／ｍｌ）に希釈した。犬を３つのグループ（雌２匹、雄１匹）に無作為に選び体重をはかった。１８ケージヴェンフロン（Ｖｅｎｆｌｏｎ）ＩＶカテーテルを、各々の動物の表面の四肢静脈に挿入した。薬剤及びリポソーム懸濁液を、急速濃縮塊（ｑｕｉｃｋ　ｂｏｌｕｓ）によって注射した（１５秒）。４ｍｌ血液サンプルを、注射前、及び注射後５、１０、１５、３０、４５分、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、４８及び７２時間で採取した。また、リポソームグループでは、血液を９６、１２０、１４４、及び１６８時間後採取した。血漿を、遠心分離によって全血の形成成分から分離し、そしてドキソルビシン濃度を標準蛍光技術によって検出した。血液中に残存するドキソルビシンの量を、注射直後に測定された標識された薬剤のピーク濃度の百分率として表わした。その結果を、図１０中にプロットし、ＰＥＧ−ＤＯＸ及びＨＰＩ−ＤＯＸ組成物ともに線形対数プロット（シングル−モード指数関数）を生じ、遊離薬剤は下記表８中に示す様な２次モデル（ｂｉｍｏｄｅｌ）指数関数曲線を生じる。これらの曲線から測定される２つのリポソーム処方物の半減期を表８中に示す。
　【０１７４】
　また表８中に、７２時間のテスト期間にわたって血漿のキネティックス曲線を積分することによって決定される曲線下の領域（ＡＵＣ）も示す。ＡＵＣ結果は、注射後７２時間でＰＥＧ−ＤＯＸリポソームからの薬剤の全利用可能性がＨＰＩ−ＤＯＸリポソームの利用可能性のほぼ２倍であったことを示す。このことはＰＥＧ−ＤＯＸリポソームのほぼ２倍大きい半減期と一致する。表８中の「ＣＬ」記載は、体内からの薬剤の除去速度（ｍｇ／ｈｒ）を示す。
　【０１７５】
　【表８】
　【０１７６】
（例１２：ドキソルビシンの組織分布）
（Ａ．皮下腫瘍）
　ドキソルビシンが積載されたＰＥＧ‐リポソームを、例１１と同様に製造した（ＰＥＧ−ＤＯＸリポソーム）。使用される遊離薬剤は、病院薬局から得られる臨床材料であった。
　【０１７７】
　１２匹のマウスの２つのグループに、１０６のＪ−６４５６腫瘍細胞を皮下注射した。１４日後、腫瘍が皮下空間で約１ｃｍ３サイズに成長し、動物に遊離薬剤として（グループ１）又はＰＥＧリポソーム中に内包された形で（グループ２）ドキソルビシン１０ｍｇ／ｋｇをＩＶ注射（尾静脈）した。薬剤注射後４、２４、及び４８時間で、各グループ中の４匹の動物を屠殺し、腫瘍、心臓及び筋肉組織の箇所を切除した。各組織をはかりホモジネートし、標準蛍光検定処理（ガビゾン，１９８９（文献番号８））を用いるドキソルビシン濃度の測定のために抽出した。各ホモジネート物中で測定された全薬剤を、組織１ｇあたりのμｇ薬剤として表わした。
　【０１７８】
　心臓、筋肉及び肝臓中の薬剤分布に関するデータを、それぞれ図１１のＡ及び図１１のＢ中に遊離及びリポソームに結び付いたドキソルビシンに対してプロットする。図１１のＡ中、最初に薬剤は心臓中に優先的に吸収されるが、すべての３つの組織タイプは組織１ｇあたりほぼ同一量の薬剤を吸収することが分る。対照的に、ＰＥＧ‐リポソーム中に取り込まれている時、薬剤は心臓及び筋肉組織中で減少したレベルを有しながら、腫瘍中に強い選択的局在化を示す。
　【０１７９】
（Ｂ．腹水腫瘍）
　１５匹のマウスを有する２つのグループに、１０６Ｊ−６４５６リンパ腫細胞を腹腔内注射した。腫瘍を１−２週間成長させ、その時腹水液５ｍｌが蓄積していた。次いでマウスにドキソルビシン１０ｍｇ／ｋｇを遊離薬剤形で（グループ１）又は例１１に記載された様なＰＥＧリポソーム中に取り込まれた形のどちらかでＩＶ注射した。腹水液を、処理後１、４、１５、２４及び４８時間で各グループ中の３匹の動物から採取した。更に腹水腫瘍を細胞成分と液体成分に遠心分離（１５分、５０００ｒｐｍ）によって分画した。上清中の遊離及びリポソーム結合薬剤を、上述のＤｏｗｅｘ　ＷＸ樹脂に液体を通して遊離薬剤を除去して測定した。腹水液、腫瘍細胞、上清、及び樹脂処理された上清中のドキソルビシン濃度を次いで測定し、これらの値からμｇ（ドキソルビシン）／１グラム（組織）を算出した。腹水液中のドキソルビシンの総濃度（黒菱形）、上清中のリポソームが結び付いた形のドキソルビシンの総濃度（上清から遊離薬剤除去後）（黒三角）、及び単離された腫瘍細胞中のドキソルビシンの総濃度（黒まる）に関する値を図１２中にプロットする。明らかな様に、腹水液中の全ドキソルビシンは、約２４時間まで一定に増加し、次いで次の２４時間にわたって僅かに減少した。腫瘍中のほとんどのドキソルビシンは、リポソームに取り込まれた形であり、リポソームがそのままの形で充実性腫瘍中に溢出することができることを示す。
　【０１８０】
　同様な実験で、１２匹のマウスの２つのグループに、Ｊ−６４５６リンパ腫をＩＰ移植し、腫瘍を上述の様に生じさせた。いったん腹水腫瘍が約５ｍｌに達すると、動物の１グループに、遊離ドキソルビシン１０ｍｇ／ｋｇを、及び他のグループにＰＥＧリポソーム中に取り込まれたドキソルビシン１０ｍｇ／ｋｇを注射した。処理後４、２４及び４８時間で、腹水液及び血液サンプルを、各グループの動物４匹から採取し、動物を屠殺した。肝臓及び心臓の組織の部分を各動物から切除し、ホモジネート化し、上述の様に薬剤濃度を検出した。血漿を、遠心分離によって全血液から分離し、薬剤濃度を上述の様に検出した。腹水液中のドキソルビシン濃度も測定した。結果を表９中に表わす。血漿及び腹水液レベルを、ｍｌあたりのμｇドキソルビシンとして、肝臓及び心臓の組織値を１グラムの組織あたりのμｇドキソルビシンとして表わす。各測定に関する標準偏差をかっこ内に示す。示されている様に、すべての時間点でＰＥＧリポソームに取り込まれた形で薬剤を摂取するグループに関して、血漿中にかなり多くのドキソルビシンが存在する。腹水腫瘍レベルも、特により長い時間点（２４及び４８時間）でリポソームグループに於てより一層高い。これらのデータから、ＰＥＧリポソームによって薬剤が腫瘍に選択的に送達されることが確認される。
　【０１８１】
　【表９】
　【０１８２】
（例１３：通常のリポソームと比較したＰＥＧリポソームの腫瘍による吸収）
　６匹のマウスの２つのグループに１０５〜１０６のＣ−２６結腸癌細胞を皮下注射し、腫瘍を約１ｃｍ３のサイズに達するまで（注射後約２週間）皮下空間内で成長させた。次いで動物の各グループに、例４中に記載した様に放射性ガリウムが積載された通常のリポソーム（１００ｎｍ　ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ，１：１）又はＰＥＧリポソーム（１００ｎｍ　ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１０：３：１）のどちらかの０．５ｍｇを注射した。各グループからマウス３匹を、処理後２、２４及び４８時間で屠殺し、腫瘍を切除し、体重をはかり、ガンマカウンターを用いて放射能の量を定量した。結果を次表中に示し、１グラムの組織あたりの注射された薬用量のパーセントとして表わす。
　【０１８３】
　【表１０】
　【０１８４】
（例１４：無傷の腫瘍へのリポソーム溢出）
（直接顕微鏡視覚化）
　メトキシＰＥＧ（分子量１９００）及びジステアリルＰＥ（ＤＳＰＥ）から成るＰＥＧ−ＰＥを例２の様に製造した。ＰＥＧ−ＰＥ脂質をＨＳＰＣ、及びコレステロールとともに、０．１５：１．８５：１のモル割合で処方した。コロイド状金（ｇｏｌｄ）粒子を含有するようにＰＥＧ−リポソームを製造した（ホング）。生じるＭＬＶを、上述の様に押出しによって分粒し、平均０．１ミクロンサイズとした。取り込まれていない材料をゲル濾過によって除去した。懸濁液中の最終リポソーム濃度は約１０μｍｏｌ／ｍｌであった。
　【０１８５】
　最初の実験で、正常マウスに上記リポソーム処方物０．４ｍｌをＩＶ注射した。注射後２４時間で、動物を屠殺し、除去された肝臓の切片を、標準水溶性プラスチック樹脂に固定した。厚い部分をミクロトームで切断し、Ｊａｎｎｓｅｎ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇｓｂｒｉｄｇｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）による“インテンス２”システムキットで提供される説明書に従って硝酸銀溶液を用いてその切片を着色した。更にその切片をエオシン及びヘマトキシリンで着色した。
　【０１８６】
　図１３は、典型的な肝臓切片の写真であり、より小さい、不規則な形のクッパー細胞、たとえば細胞２０が、より大きいもっと規則的な形の肝細胞、たとえば肝細胞２２の間に示される。クッパー細胞は、無傷のリポソームの大きい濃度を示し、これは、小さい、暗く着色されたかたまり、たとえば図１３中の２４として示される。肝細胞は、予想される様に全くリポソームを含まない。
　【０１８７】
　第二実験で、Ｃ−２６結腸癌（約１０６細胞）を、マウス肝臓中に移植した。移植後１４日で、動物に上記リポソーム０．５ｍｇをＩＶ注射した。２４時間後、動物を屠殺し、肝臓を灌流し、包埋し、切開し、上述の様に着色した。切片を毛管供給腫瘍域に関して調べた。１つの例となる域を、図１４に示し、それは癌細胞、たとえば細胞２８の域に供給する毛管２６を示す。これらの細胞は、特徴的な着色パターンを有し、しばしば有糸分裂の種々の段階で暗く着色された核を含む。図中の毛管は、内皮バリヤー３０、及び下記の様に基底膜３２に沿って並ぶ。
　【０１８８】
　リポソーム、たとえばリポソーム３４は、内皮バリヤー及び基底膜の腫瘍側の毛管に隣接した腫瘍域中で濃密に濃縮され、多くのリポソームも、腫瘍細胞のまわりの細胞間液体中に分散されることが、図１４に見いだされる。
　【０１８９】
　図１５は、上記動物からの肝臓腫瘍の他の域を示す。リポソームは、癌細胞を浸した細胞間液体中に見られる。
　【０１９０】
　第三実験に於て、Ｃ２６結腸癌細胞を、動物に皮下注射し、２８日間動物中で成長させた。その後、動物に上記リポソーム０．５ｍｇをＩＶ注射した。２４時間後、動物を屠殺し、腫瘍塊を切除した。包埋後、腫瘍塊をミクロトームで切開し、上述の様に着色した。図１６は腫瘍細胞の領域を示し、有糸分裂の終りの段階である図中の中央の細胞３６を有する。小さい、暗く着色されたリポソームは、細胞間液体中に見られる。
　【０１９１】
（例１５：腫瘍処置法）
　ＰＥＧ‐ＰＥ，ＰＧ，ＰＨＥＰＣ及びコレステロール及びα−ＴＣをモル割合０．３：０．３：１．４：１：０．２で含有する小胞形成脂質を、クロロホルム中に溶解し、２５μｍｏｌリン脂質／ｍｌの最終脂質濃度とした。脂質混合物を減圧下で薄いフィルムにまで乾燥した。フィルムを、０．１２５Ｍ硫酸アンモニウム溶液で水和し、ＭＬＶを形成した。ＭＬＶ懸濁液を、ドライアイスアセトン浴中での凍結及び解凍を３回し、分粒して８０〜１００ｎｍとした。アンモニウムイオン勾配を実質上例１０に記載した様に生じさせた。リポソームにエピルビシンを積載し、ドキソルビシンに関して例１０に記載した様に、遊離のもの（未結合薬剤）を除いた。取り込まれた薬剤の最終濃度は、約５０〜１００μｇ薬剤／μｍｏｌ脂質であった。エピルビシンＨＣｌ及びドキソルビシンＨＣｌの市販生成物は、病院薬局から入手した。
　【０１９２】
　約１０６細胞のＣ−２６結腸癌細胞を、マウス３５匹を有する３つのグループに皮下注射した。グループを５つの７匹の動物サブグループに分けた。
　【０１９３】
　図１７のＡ中に示された腫瘍抑制実験に関して、各サブグループに腫瘍細胞移植後１，８及び１５日目に生理食塩水ベヒクルコントロール（白まる）、エピルビシン６ｍｇ／ｋｇ（白三角）、ドキソルビシン６ｍｇ／ｋｇ（黒まる）又は２つの薬用量で薬剤積載されたリポソーム（ＰＥＧ−ＤＯＸリポソーム）、６ｍｇ／ｋｇ（黒三角）及び１２ｍｇ／ｋｇ（白四角）のどれかを０．５ｍｌ　ＩＶ注射した。各グループを２８日間追跡した。腫瘍サイズを、各動物で５、７、１２、１４、１７、２１、２４及び２８日目で測定した。各時点で、各サブグループ中の腫瘍の成長（個々の動物の平均腫瘍サイズとして表わす）を、図１７のＡ中にプロットする。
　【０１９４】
　この図に関して、６ｍｇ／ｋｇでは遊離ドキソルビシンも遊離エピルビシンも、生理食塩水コントロールと比較して腫瘍成長を著しく抑制しなかった。対照的に、両方の薬用量でＰＥＧリポソームに取り込まれたエピルビシンは、著しく腫瘍成長を抑制する。腫瘍移植後１２０日で動物の生存に関して、生理食塩水、エピルビシン又はドキソルビシングループ中の動物は生き残らなかったが、６ｍｇ／ｋｇリポソームエピルビシン及び１２ｍｇ／ｋｇリポソームエピルビシングループ中では、７匹のうち５匹及び７匹のうち７匹がそれぞれ生存した。
　【０１９５】
　同一の腫瘍モデルを用いて遅延処置実験の結果を、図１７のＢ及び図１７のＣに示す。同一数の動物に、上述の様に同一数の腫瘍細胞を接種した。図１７のＢ及び図１７のＣの処置グループは、生理食塩水（実線）、エピルビシン６ｍｇ／ｋｇ（黒まる）、遊離エピルビシンプラス空のＰＥＧリポソーム６ｍｇ／ｋｇ（白まる）及びＰＥＧリポソーム中に取り込まれたエピルビシンの２つの薬用量、６ｍｇ／ｋｇ（黒三角）及び９ｍｇ／ｋｇ（白四角）から成っていた。図１７のＡに示した結果と対照的に、２回の処置しかこの実験で行わなかった：図１７のＢにプロットされた結果に関して３及び１０日目；図１７のＣにプロットされた結果に関して１０及び１７日目。重要なことは、ＰＥＧリポソームに取り込まれた薬剤の場合、両方の薬用量レベルでの２つの遅延処置スケジュールは、腫瘍退化を生じるが、遊離薬剤、及び遊離薬剤プラス空のリポソームでの処置グループは、腫瘍成長の速度のおだやかな抑制しか示さなかった。
　【０１９６】
（例１６：腫瘍処置法）
　ＰＥＧ−ＤＯＸリポソームを、ドキソルビシンをリポソームに積載して、６０〜８０μｇ／μｍｏｌ全脂質の最終レベルとした以外は、例１５と同様に製造した。遊離薬剤コントロールとして使用されるドキソルビシンＨＣｌ溶液は、病院薬局で入手した。全部で３０匹のマウスに、１０６のＪ−６４５６リンパ腫細胞をＩＰ注射した。動物を３つの１０匹の動物グループに分け、各々に、生理食塩水ベヒクル、ドキソルビシン溶液１０ｍｇ／ｋｇ、又は１０ｍｇ／ｋｇでリポソームに積載されたドキソルビシンのどれか０．４ｍｌをＩＶ注射した。各グループを、１００日間、生き残る動物の数に関して追跡した。各処置グループに対する生存率を、図１８中にプロットする。
　【０１９７】
　明らかな様に、遊離薬剤（黒まる）は、生理食塩水グループ（黒四角）より生存の点でほとんど向上がない。しかしドキソルビシン積載ＰＥＧ−リポソーム（黒三角形）で処置された動物に於て、４０日間生き残った動物は約５０％、７０日間２０％、実験を１００日で終了するまで生き残ったもの１０％を示した。
　【０１９８】
（例１７：ＰＥＧ−リポソームの減少された毒性）
　遊離ドキソルビシンＨＣｌ、エピルビシンＨＣｌを有する溶液を、上述の様にして得た。薬剤濃度７０−９０μｇ（化合物）／μｍｏｌ（リポソーム脂質）でドキソルビシン又はエピルビシンのどちらかを含有するＰＥＧ−リポソーム処方物を、例１６中に記載した様に製造した。通常のリポソーム（ＰＥＧ‐誘導体化された脂質ではない）に、ドキソルビシンを標準技術を用いて４０μｇ／μｍｏｌ脂質の薬剤濃度で積載した。
　【０１９９】
　５つの処方物の各々を、５ｍｇ／ｋｇの増加量で、１０〜４０ｍｇ薬剤／ｋｇ体重の間の薬用量で３５匹のマウスに投与し、各薬用量に対して５匹をあてた。下記表１１中に示した最大許容薬用量は、１４日以内に注射された動物中で死亡又は劇的な体重損失を生じない最高薬用量である。データから明らかな様に、ＤＯＸ−リポソームもＰＥＧ−ＤＯＸリポソームも遊離形での薬剤のドキソルビシンの許容薬用量の２倍以上であり、ＰＥＧ−ＤＯＸリポソームは、少し高い許容薬用量を示す。同様な結果が、許容エピルビシンの薬用量に関して遊離及びＰＥＧ−リポソーム形で得られた。
　【０２００】
　【表１１】
　【０２０１】
（参考例：腫瘍処置法）
　通常のドキソルビシンリポソーム（Ｌ−ＤＯＸ）を、公知方法に従って製造した。簡単に述べると、モル割合０．３：１．４：１：０．２で卵ＰＧ、卵ＰＣ、コレステロール及びα−ＴＣを有する混合物をクロロホルム中で調製した。溶剤を、減圧下で除き、乾燥脂質フィルムを２−５ｍｇドキソルビシンＨＣｌを含有するＮａＣｌ　１５５ｍＭの溶液で水和した。生じるＭＬＶ製造物を一連のポリカーボネート膜を通して押し出して小型化し、約２５０ｎｍの最終サイズとした。遊離の（取り込まれていない）薬剤を懸濁液のＤｏｗｅｘ樹脂床上の通過によって除去した。最終ドキソルビシン濃度は、脂質１μｍｏｌにつき約４０であった。
　【０２０２】
　マウス７匹の３つのグループに、例１５に詳述した様に１０５〜１０６のＣ−２６結腸癌細胞を皮下接種した。動物を３つの７匹動物処置グループに分け、グループの１つはコントロールとして生理食塩水ベヒクル０．５ｍｌを与えた。他の２つのグループに、ドキソルビシンを遊離薬剤溶液として又は薬用量１０ｍｇ／ｋｇのＬ−ＤＯＸリポソームの形のいずれかで処置した。処置を、腫瘍細胞接種後、８、１５及び２２日目に行った。腫瘍サイズを処置した日及び２８日目に測定した。図１９から明らかな様に、遊離薬剤（黒まる）は腫瘍成長を生理食塩水コントロール（実線）に比して中程度まで抑制した。Ｌ−Ｄｏｘ−処置されたグループ（黒三角）中の腫瘍は、遊離薬剤処置グループに比して僅かに速く、かつ未処置グループの場合よりもほんの少し遅く成長した。この結果は、Ｌ−ＤＯＸ製造物の抗腫瘍活性が遊離薬剤とほぼ同一であり、確かに遊離薬剤の同一薬用量よりも良好でないことを示す。これは、同等の薬用量では、ＰＥＧ−リポソーム中に取り込まれたエピルビシンが、この同一腫瘍モデル中で遊離薬剤よりも極めて良好な抗腫瘍活性を有することを示す例１５（及び図１７のＡ〜Ｃ）に示した結果と著しく対照的である。
　【０２０３】
　本発明は、特に誘導体化された脂質組成物、リポソーム組成物、及びその使用に関して記載し、説明したが、種々の変更及び変化が本発明から離れることなく行われ得ることは明白である。
　【０２０４】
　以下に本発明に関連する文献を文献番号と共に示す。
　【０２０５】
　【表１２】
　【０２０６】
　【表１３】
　【０２０７】
　【発明の効果】
　本発明によれば、腫瘍の標的化に有効であるリポソーム組成物および方法を提供され、これによって全身性の血管外腫瘍中に治療的用量レベルで結像剤または抗腫瘍剤を選択的に局在化させるという効果が得られる。
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　小胞形成脂質アミンをポリアルキルエーテルで誘導体化する、一般反応式を示す。
　【図２】
　シアヌルクロライド結合剤を介してポリエチレングリコールで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応式である。
　【図３】
　ジイミダゾール活性化剤によってポリエチレングリコールで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応式を示す。
　【図４】
　トリフルオロメタンスルホナート試薬によってポリエチレングリコールで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応式を示す。
　【図５】
　ペプチド（Ａ）、エステル（Ｂ）、およびジスルフィド（Ｃ）結合によってポリエチレングリコールで誘導体化された小胞形成脂質を示す。
　【図６】
　ポリ乳酸、またはポリグリコール酸で誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を製造する反応式を示す。
　【図７】
　血液中のリポソーム存在時間のプロットであり、これは種々の量のホスファチジルグリセロールを含有するポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）リポソームに関してＩＶ注射後時間の関数として注射された薬用量パーセントで表される。
　【図８】
　図７のプロットと同様のプロットであり、これは主として不飽和のリン脂質成分から成るリポソームの血中存在時間を示す。
　【図９】
　図７のプロットと同様のプロットであり、これはＰＥＧ被覆されたリポソーム（黒三角）、および従来の被覆されていないリポソーム（黒丸）の血中存在時間を示す。
　【図１０】
　ビーグル犬の血中からのドキソルビシンのクリアランスのキネティックスを示すプロットであり、遊離形態で（白丸）、飽和リン脂質および水素化ホスファチジルイノシトール（ＨＰＩ）によって形成されたリポソームによって（白四角）、およびＰＥＧで被覆されたリポソームによって（白三角）ＩＶ投与された薬剤に関する。
　【図１１】
　遊離形態（図１１のＡ）およびＰＥＧ−リポソーム形態（図１１のＢ）でＩＶ投与された薬剤について、心臓（黒菱形）、筋肉（黒丸）、および腫瘍（黒三角）による血中からのドキソルビシンの吸収の時間経過のプロットである。
　【図１２】
　マウスの腹腔内（ＩＰ）に移植されたＪ−６４５４腫瘍細胞による血中からのドキソルビシンの吸収の時間経過のプロットであり、薬剤全体（黒菱形）を、腫瘍に結び付いた薬剤（黒丸）およびリポソームに結び付いた形態（黒三角）として測定した。
　【図１３】
　正常肝臓中のクッパー細胞中におけるリポソームの局在化（濃く染色された小さい粒子）を示す光学顕微鏡写真である。
　【図１４】
　肝臓の毛細管が腫瘍細胞に供給する領域に移植されたＣ−２６結腸癌の間質液中におけるリポソームの局在化（濃く染色された小さい粒子）を示す光学顕微鏡写真である。
　【図１５】
　肝臓に移植されたＣ−２６腫瘍細胞の活発に分裂する領域におけるリポソームの局在化（濃く染色された小さい粒子）を示す光学顕微鏡写真である。
　【図１６】
　または皮下に移植されたＣ−２６腫瘍細胞の活発に分裂する領域におけるリポソームの局在化（濃く染色された小さい粒子）を示す光学顕微鏡写真である。
　【図１７】
　Ｃ−２６結腸癌の皮下移植後の日数に対する腫瘍サイズの生長を示すプロットであって、生理食塩水コントロール（白丸）、６ｍｇ／ｋｇのドキソルビシン（黒丸）、６ｍｇ／ｋｇのエピルビシン（白三角）、またはＰＥＧ−リポソームに取り込まれたエピルビシンの２種の薬用量（６ｍｇ／ｋｇ（黒三角）または１２ｍｇ／ｋｇ（白四角））で、１日目、８日目、および１５日目に処置されたマウス；生理食塩水（実線）、６ｍｇ／ｋｇのエピルビシン（黒丸）、６ｍｇ／ｋｇのエピルビシンおよび空のリポソーム（白丸）、またはＰＥＧ−リポソームに取り込まれた２種の薬用量（６ｍｇ／ｋｇ（黒三角）および９ｍｇ／ｋｇ（白四角））で、３日目および１０日目（図１７のＢ）、または１０日目および１７日目（図１７のＣ）に処置されたマウスに関する。
　【図１８】
　Ｊ−６４５６リンパ腫の腹腔内移植後の日数に対する生存率を示すプロットであり、遊離形態（黒丸）またはＰＥＧ−リポソーム形態（黒三角）のドキソルビシンで処置された動物、または未処置の動物（黒四角）に関する。
　【図１９】
　Ｃ−２６結腸癌の皮下移植後の日数における腫瘍サイズの生長を、図１７と同様にプロットしたものであり、生理食塩水コントロールで処置された動物（実線）、または１０ｍｇ／ｋｇのドキソルビシンの遊離形態（黒丸）または従来のリポソーム（黒三角）で処置された動物に関する。