【事件の表示】
　特許第３２９２８７３号「組換肝実質細胞増殖因子」の請求項１に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３２９２８７３号の請求項１に係る特許を取り消す。
【理　由】
〔１〕手続きの経緯：
　本件特許3292873号は、特願平1-142697号（1989.6.5付）出願を優先権主張の基礎とする特願平2-212818号をもとの出願とする特願平9-210195号をもとの出願として分割した特願平10-134313号の特許出願であって、平成14年4月5日に特許権の設定登録がなされ、その後三菱ウエルファーマー株式会社から特許異議の申立てがなされたところ、当審において平成15年5月6日付で取消理由の通知がなされ、その指定期間内に意見書が提出されると共に明細書の訂正請求がなされたものである。
　
〔２〕訂正の請求について：
　本件訂正の要旨は、特許請求の範囲の減縮を目的として請求項１を訂正明細書に記載された請求項１の通りに訂正しようとするものであり、具体的には請求項１から、本出願をもとの出願として分割した特願2000-359532号に係る特許第3318323号特許明細書の請求項１に記載された発明を除く記載に訂正しようとするものである。
　当該訂正は、本件請求項１に記載された発明に包含されていた、上記分割出願に係る特許明細書の請求項１に記載された発明と同一発明を除くものであって、願書に添付した明細書に記載された事項の範囲内において特許請求の範囲を減縮するものであり、かつ特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもないと認められるので、適法なものである。
　
〔３〕異議申立について：
　当審において通知した取消の理由でも指摘したように、本件訂正後の請求項１の記載における「下記の配列（配列A）からなるDNA」は、本件明細書および図面の記載からみて、ラットHGF遺伝子全長の半分にも満たない１部配列であって発現もされておらず、単にヒトHGF遺伝子をクローニングするためのプローブとして用いられたDNAにすぎないから、当該「配列A」からなるDNA自身がHGF活性を有するタンパク質をコードするDNAであるということはできない。
　そうしてみると、本件訂正後の請求項１において、目的とする「HGFポリペプチド」を、そのアミノ酸配列もしくはそれ自身をコードする遺伝子の塩基配列ではなく、当該遺伝子をクローニングするためのプローブの塩基配列、その際のハイブリダイズ条件、形質転換宿主の種類、というプロセスのみを限定したに過ぎないものといえるから、化学物質としての「HGFポリペプチド」を特定するための表現としては明らかに不十分である。
　してみれば、訂正後の請求項１の記載は不明瞭である。
　また、当該訂正後の請求項１の記載が不明瞭なために、本件発明に包含される化学物質群は曖昧で広範なものであるといえるから、実施例に記載された特定のアミノ酸配列を有するヒトHGF、およびそれから無理なく導かれる均等の範囲のHGFポリペプチド（例えば、「当該アミノ酸配列の１もしくは数個のアミノ酸が欠失・置換・付加されたアミノ酸配列を有するHGF」）以外のHGFポリペプチドについては、当業者が容易に実施できないものも包含しており、これらポリペプチド群についての本件明細書中の開示が不十分である。
　したがって、本願は、上記訂正によっても、依然として特許法第4項または第5項および第6項に規定する要件を満たしていない。
　
〔４〕結語
　以上のとおりであるから、本件訂正後の請求項１に係る発明についての特許は、特許法第113条第4項の規定により取り消されるべきものである。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年８月２６日（２００３．８．２６）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
組換肝実質細胞増殖因子
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　　　以下の（ａ）〜（ｂ）
（ａ）以下の塩基配列からなるＤＮＡと６０℃、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及びサケ精巣ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の条件下でハイブリダイズし、かつ肝実質細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）遺伝子コドンの縮重のため、（ａ）に示されるＤＮＡとハイブリッド形成しないが、（ａ）に示されるタンパク質と同じアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするＤＮＡ
の何れかのＤＮＡからなる遺伝子を含有する組換発現ベクターにより、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞又はサルＣＯＳ細胞を形質転換して得られる形質転換体を培養し、発現される組換肝実質細胞増殖因子を単離精製することにより得られる、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞又はサルＣＯＳ細胞由来の肝実質細胞増殖因子とは異なる組換肝実質細胞増殖因子。
但し、下記の組換肝実質細胞増殖因子を除く。
以下の（ａ）〜（ｅ）
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ肝実質細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｃ）配列番号１で表される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡと６０℃、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）及びサケ精巣ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の条件下でハイブリダイズし、かつ肝実質細胞増殖活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
（ｅ）遺伝子コドンの縮重のため、（ｃ）及び（ｄ）に示されるＤＮＡとハイブリッド形成しないが、（ｃ）又は（ｄ）に示されるＤＮＡによりコードされるタンパク質と同じアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするＤＮＡ
の何れかのＤＮＡからなる遺伝子を含有する組換発現ベクターにより、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞又はサルＣＯＳ細胞を形質転換して得られる形質転換体を培養し、発現される組換肝実質細胞増殖因子を単離精製することにより得られる、マウスＣ１２７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞又はサルＣＯＳ細胞由来の肝実質細胞増殖因子とは異なる組換肝実質細胞増殖因子。
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【発明の属する技術分野】
　本発明は肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチド、さらに詳しくは、生体外（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で肝実質細胞の維持、増殖を可能にする生理活性を有する新規なポリペプチド、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ、組換発現ベクター、形質転換体および該ポリペプチドの製造法に関するものである。
　本発明のポリペプチドは肝実質細胞培養試薬、肝再生促進剤、肝機能の基礎的研究、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用の研究、肝癌の発癌研究用、さらに該ポリペプチドに対する抗体を用いる臨床診断試薬、肝疾患治療薬などへの利用が期待出来る。
　【０００２】
　【従来の技術】
　従来、細胞増殖活性を有するポリペプチドとして、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）などが知られている。これらの細胞増殖因子の他に、生体外において肝実質細胞増殖活性を有するポリペプチドが１９８４年に中村らによって再生肝ラット血清より部分精製され、肝実質細胞増殖因子（以下ＨＧＦと略す）と命名された。
　このＨＧＦの発見まで肝実質細胞は、各種の株化細胞が活発に増殖する哺乳動物血清の存在下でも該細胞の増殖が全く認められず、通常約１週間で培養容器の壁からの脱落が起こり、生体外での長期培養は不可能であった。ところが、このＨＧＦの存在下において肝細胞は極めて良好に増殖し、該細胞の培養が可能となった（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，
１２２
　このような状況の下で、本発明者らは、先にラット血小板などの組織からＨＧＦを分離精製して研究を重ね、この血小板由来のＨＧＦは、２種のサブユニットからなり、このＨＧＦは生体外において肝実質細胞を極めて良好に増殖させることを見出すとともにＨＧＦに含有される一部のアミノ酸配列２７残基を同定することに成功した（特願昭６３−３１１８６６号）。
　【０００３】
　【発明が解決しようとする課題】
　生体内ＨＧＦは、肝臓、脳、肺臓、骨髄、ひ臓、胎盤、腎臓などの臓器あるいは血小板や白血球など血液細胞などから極微量分泌されるポリペプチドであるため、原材料組織の入手、ＨＧＦの収量、安定供給など問題点が多い。このＨＧＦを肝実質細胞の培養や肝細胞の研究用として利用するためには、その構造を明らかにしＨＧＦあるいはＨＧＦと同様な活性を有するポリペプチトを遺伝子組換技術を応用して大量に供給することが望まれている。
　【０００４】
　【課題を解決するための手段】
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ラット肝臓ｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーより、ラット血小板由来のＨＧＦのアミノ酸配列に基づいて合成したオリゴヌクレオチドをプローブとして用い、ラットＨＧＦβ鎖ポリペプチドをコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見い出した。さらに、ラット由来の該ｃＤＮＡの全部あるいはその一部をプローブとして、ヒト肝臓ｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡライブラリーよりヒトＨＧＦポリペプチドをコードする塩基配列を含有するｃＤＮＡが得られることを見出した。また、ヒトの肝臓以外の臓器や血液細胞のｃＤＮＡライブラリーよりヒトＨＧＦｃＤＮＡが得られることも見出した。さらに、該ｃＤＮＡを含有する組換発現ベクターによって形質転換された形質転換体、該形質転換体を培養してヒトＨＧＦ遺伝子が発現することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は組換ヒト肝実質細胞増殖因子、ヒト肝実質細胞増殖因子をコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、該ＤＮＡを発現し得る組換発現ベクター、該組換発現ベクターで形質転換された形質転換体および該形質転換体を培養し、該培養物から組換ヒト肝実質細胞増殖因子を採取・製造する方法である。
　【０００５】
　【発明の実施の形態】
　本発明のヒト肝実質細胞増殖因子をコードするＤＮＡ、組換発現ベクター、および形質転換体は、例えば次のようにして調製される。
　すなわち、（１）ラット肝細胞やラット巨核球などの動物組織よりｍＲＮＡまたは染色体ＤＮＡを単離し、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーまたは染色体ＤＮＡライブラリーを作製し、（２）合成オリゴヌクレオチドプローブ、あるいは抗体を用いて動物、例えばラットのＨＧＦのｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを単離するため、上記動物、例えばラット由来のｃＤＮＡライブラリーまたは染色体ライブラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンより目的とするｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡを抽出し、この動物、例えばラット由来のＨＧＦのｃＤＮＡまたは染色体ＤＮＡをプローブとして、ヒトの臓器あるいは血液細胞などのｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンより目的とするヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡを抽出する。また、本発明によって明らかにされたＤＮＡ配列あるいはヒトや動物のＨＧＦのアミノ酸配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチドや本発明により得られたヒトＨＧＦｃＤＮＡやヒトＨＧＦ染色体ＤＮＡなどをプローブに用い、またヒトまたは動物のＨＧＦに対する抗体を用いて、直接ヒトの臓器あるいは血液細胞などから抽出したｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、単離されたクローンより目的とするヒト由来のＨＧＦのｃＤＮＡを抽出することもできる。（３）このヒト由来ＨＧＦのｃＤＮＡよりヒトＨＧＦをコードするｃＤＮＡ断片を制限酵素を用いて切り出し発現用ベクターに組み込み、（４）得られた組換発現ベクターにより宿主細胞を形質転換して形質転換体を得、（５）この形質転換細胞を培養して、その培養上清から本発明のヒトＨＧＦを採取・製造することが出来る。さらに形質転換細胞中の組換発現ベクターから制限酵素処理によって本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤＮＡを得ることが出来る。
　【０００６】
　以下、本発明の各工程について詳細に説明する。
（１）ｍＲＮＡの単離とｃＤＮＡライブラリーの調製：
　動物、例えばラットまたはヒトのＨＧＦをコードするｍＲＮＡはラットなどの動物またはヒトの肝臓、腎臓、ひ臓、肺臓、脳、骨髄、胎盤などの臓器あるいは白血球、巨核球やリンパ球などの血液細胞などから各々得ることが出来る。例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１８
　また、ヒト肝、脳、胎盤、白血球などのｍＲＮＡのような動物細胞や動物組織などの各種ｍＲＮＡは、市販品としてクロンテック社などから購入して利用することも出来る。
　【０００７】
　これらのｍＲＮＡを鋳型として逆転写酵素やポリメラーゼ・チェーン・リアクション法（ＰＣＲ）を用いて、例えばＨ．Ｏｋａｙａｍａらの方法（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
２
３
２５
８５
　ｍＲＮＡを鋳型として合成されたｃＤＮＡをプラスミドまたはファージに組み込んでｃＤＮＡライブラリーを調製する方法として、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２，Ｐ．２３９）またはＴ．Ｖ．Ｈｙｕｎｈらの方法（ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，
１
　【０００８】
（２）ｃＤＮＡライブラリーのクローニング：
　ｃＤＮＡライブラリーとして得られたプラスミドやファージなどの組換発現ベクターは、大腸菌のような適切な宿主細胞に保持される。宿主となり得る大腸菌としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＮＭ５１４，Ｃ６００（ストラタジーン社）、ＮＭ５２２，ＪＭ１０１（ファルマシア社）などを例示することが出来る。ｃＤＮＡのベクターがプラスミドの場合、塩化カルシウム法、塩化カルシウム・塩化ルビジウム法などを用いて、またｃＤＮＡのベクターがファージの場合、インビトロパッケージング法などを用いてあらかじめ増殖させた宿主細胞に保持させることが出来る（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｒａｔｏｒｙ，１９８２，ｐ．２４９）。
　このようにして得られた形質転換体から、ラットなどの動物またはヒトの肝実質細胞増殖因子の部分のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドを合成し、このオリゴヌクレオチドを３２Ｐ標識して、プローブとして用いてコロニーハイブリダイゼーション法（Ｇｅｎｅ，
１０
１９６
１
　【０００９】
　次に該形質転換体から常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒ，１９８２）に従ってプラスミドやファージなどの組換ＤＮＡを単離し、そのまま、あるいは制限酵素で消化してからｃＤＮＡ塩基配列が決定される。最初に得られた該ラットなどの動物またはヒト由来のｃＤＮＡをプローブとして、同様の方法によってヒトの臓器あるいは血液細胞由来のｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡライブラリーのクローニングを行うことが出来る。ここで用いられるハイブリダイゼーションの方法及び条件は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１ｓｔ　ｅｄ．（１９８２）等に記載の方法及び条件を参照することが出来る。得られたラットなどの動物あるいはヒト由来のＨＧＦのｃＤＮＡの塩基配列は、マクサムとギルバートの化学法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７４
７４
７６
　【００１０】
（３）ヒトＨＧＦ組換発現ベクターの構築：
　クローン化されたヒトＨＧＦのアミノ酸配列の全部あるいはその一部をコードするｃＤＮＡを含有する数種のプラスミドやファージなどの組換ベクターから制限酵素によってｃＤＮＡを切り出し、ヒトＨＧＦの発現に適したベクターのプロモーターの下流に制限酵素とＤＮＡリガーゼを用いて再結合して組換発現ベクターを作製することが出来る。
　より詳しくは、本発明のヒトＨＧＦを効率良く発現させるために組換発現ベクターは転写の下流方向に順番に必要により（１）プロモーター、（２）リボソーム結合部位、（３）開始コドン、（４）本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤＮＡ、（５）終止コドン、（６）ターミネーターを含むように構築される。
　本発明で用いることが出来るＤＮＡのベクターとして、大腸菌由来のプラスミドｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８（東洋紡績）、枯草菌由来のプラスミドｐＵＢ１１０（シグマ社）、酵母由来のプラスミドｐＲＢ１５（ＡＴＣＣ３７０６２）、バクテリオファージλｇｔ１０、λｇｔ１１（ストラタジーン社）、ウイルスＳＶ４０（ＢＲＬ社）、ＢＰＶ（ＡＴＣＣ　ＶＲ−７０３）、レトロウイルスの遺伝子由来のベクターなどが列挙できるが宿主内で複製・増幅可能なベクターであれば特に限定はない。特に、本発明のヒトＨＧＦを簡便に発現させるには、ＳＶ４０のようなウイルスの遺伝子由来のベクターを用いるのが好ましい。
　例えば、前述のクローン化されたヒトＨＧＦをコードするＤＮＡをＳＶ４０ベクターの後期領域に結合した組換発現ベクターは、ＣＯＳ細胞（Ｃｅｌｌ，
２３
　【００１１】
　プロモーターおよびターミネーターに関しても、目的とするヒトＨＧＦをコードする塩基配列の発現に用いられる宿主に対応したものであれば特に限定はない。例えば、プロモーターとして、宿主が大腸菌である場合、ｔｒｐプロモーター、１ａｃプロモーターなどを、宿主が枯草菌である場合、ＳＰ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーターなどを、宿主が酵母である場合、ＧＡＰプロモーター、ＰＧＫプロモーターななどを、宿主がマウス線維芽細胞やチャイニーズハムスター卵巣細胞のような動物細胞の場合、ウイルス由来のＳＶ４０プロモーターやＨＳＶ１　ＴＫプロモーターあるいはメタロチオネインプロモーターやヒートショックプロモーターなどを例示することが出来る。またターミネーターとしては、宿主が大腸菌の場合、ｔｒｐターミネーター、１ｐｐターミネーターなどを、宿主が枯草菌の場合、ａｍｙＦターミネーターなどを、宿主が酵母の場合、ＣＹＣ１ターミネーターなどを、宿主が動物細胞の場合、ＳＶ４０ターミネーター、ＨＳＶ１ＴＫターミネーターなどを例示することが出来る。これらのプロモーターとターミネーターは用いる宿主に応じて適切に組み合わされる。
　【００１２】
　本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有するＤＮＡは、そのＤＮＡが発現されるポリペプチドが、肝実質細胞増殖活性を有するならば特に制限はなく、例えば後述する配列番号１（図５〜図８）に示した塩基配列が例示され、さらには上記塩基配列の一部が置換、欠損、挿入、あるいはこれらが組み合わされた塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
　同様に配列番号２（図５〜図８）に示したアミノ酸配列に関しても、当該アミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。上記のアミノ酸配列の置換、欠失及び／又は付加は、本願優先日前に周知の技術である部位特異的突然変異誘発法等により実施することができ、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８１
１０
３１６
　このような置換、欠失及び／又は付加により得られるものは、例えば、後述の活性測定方法によって容易に評価できる。
　本発明のヒトＨＧＦをコードする塩基配列を含有する該ＤＮＡの翻訳開始コドンとしてＡＴＧ、翻訳終止コドンとしてＴＡＡ、ＴＧＡ、あるいはＴＡＧを有してもよい。また必要に応じて開始コドン、あるいは終始コドンを１つ以上組み合わせたり、他のコドンと組み合わせて配列してもよく、これらに特に限定はない。さらに、この組換発現ベクターで形質転換した宿主の選択マーカーとなり得るアンピシリン耐生遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子など１種または２種以上が該ベクターの適切な位置に含有されていることが好ましい。
　【００１３】
（４）宿主細胞の形質転換とその培養：
　このようにして構築されたヒトＨＧＦ組換発現ベクターは、コンピテント細胞法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，
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２２１
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　【００１４】
　得られた形質転換体は、目的とする組換ヒトＨＧＦを産生させるためにその宿主に応じた適切な培地中で培養される。培地中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミン、血清および薬剤などが含有される。培地の１例としては、形質転換体の宿主が大腸菌の場合、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７２，ｐ．４３１）などを、宿主が酵母の場合、ＹＥＰＤ培地（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｖｏｌ．１，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９７９，ｐ．１１７）などを、宿主が動物細胞の場合、２０％以下のウシ胎児血清を含有するＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬）などを挙げることが出来る。形質転換体の培養は、通常２０℃〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて通気、撹拌が行われる。また、宿主が接着性の動物細胞などの場合は、ガラスビーズ、コラーゲンビース、あるいはアセチルセルロースフォローファイバーなどの担体が用いられる。これら以外の培地組成あるいは培養条件下でも形質転換体が生育すれば実施でき、これらに限定されるものではない。
　【００１５】
（５）ヒトＨＧＦの精製：
　このようにして形質転換体の培養上清中または形質転換体中に生成した組換ヒトＨＧＦは、公知の塩析法、溶媒沈殿法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィなどを組み合わせて分離精製することが出来る。特に、硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、ヘパリンセファロースアフィニティクロマトグラフィ、およびフェニルセファロース逆相クロマトグラフィの組み合せ、あるいは硫酸アンモニウムによる塩析法、Ｓ−セファロースイオンクロマトグラフィ、および抗ＨＧＦ抗体セファロースアフィニティクロマトグラフィの組み合わせなどが好ましく有効な精製法である。
　以上述べた方法によって得られた新規な組換ヒトＨＧＦは、ラット肝およびラット血小板由来ＨＧＦと同様にラット肝実質細胞の増殖を顕著に促進する活性を示した。
　【００１６】
ＨＧＦ活性の測定
　ＨＧＦ活性は、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
８０
１９３
　【００１７】
　【発明の効果】
　本発明によれば、肝実質細胞の生体外での増殖を可能とする新規な生理活性ペプチドが提供される。本発明の組換ヒトＨＧＦは、臨床診断試薬や肝疾患治療薬として有用である。さらに本発明の組換ヒトＨＧＦの作用により増殖維持される肝実質細胞は、例えば肝機能の基礎的研究用、肝実質細胞に対する各種ホルモンや薬剤の作用の研究用、肝癌の発癌研究用、あるいは肝炎ウイルスの生体外培養のための宿主細胞として極めて有用である。
　【００１８】
　【実施例】
　以下、本発明を実施例により、さらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
（１）ラット肝臓ｍＲＮＡの単離：
　ラット肝臓ｍＲＮＡは、グアニジンチオシアン酸法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，
１８
６９
　【００１９】
（２）ラット肝由来のｃＤＮＡライブラリーの作製：
　上記（１）で得られたポリ（Ａ）ＲＮＡ、５μｌを鋳型としてｃＤＮＡ合成システム・プラス（アマシャム社）を用いてＧｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ，
２５
１
　【００２０】
（３）ＤＮＡプローブの合成：
　本発明者が見出した下記ラットＨＧＦβ鎖Ｎ末端アミノ酸配列１５個
（式中、Ｖはバリン、Ｎはアスパラギン、Ｇはグリシン、Ｉはイソロイシン、Ｐはプロリン、Ｔはトレオニン、Ｑはグルタミン、Ｗはトリプトファン、Ｍはメチオニンを示す）
をコードする塩基配列を推定し、オリゴヌクレオチド
５’ＡＣＣＡＴＣＣＡＩＣＣＩＡＣＩＧＴＩＧＴＩＴＧＩＧＴＩＧＧＩＡＴＩＣＣＩＴＴＩＡＣＩＡＣ３’（Ｉはイノシンを表す）
をＤＮＡシンセサイザー３８１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）により合成した。得られたオリゴヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（東洋紡績）を用いて［γ３２Ｐ］ＡＴＰ（アマシャム社）により標識してＤＮＡプローブを作製した。
　【００２１】
（４）ラットＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの部分単離とその塩基配列の決定：
　上記（２）で得られた約５×１０５個の組換ファージを３７℃で１５分間約８×１０９個の大腸菌ＮＭ５１４（ストラタジーン社）に感染させた後、約５０℃に加温した０．７％の寒天を含むＬＢ培地２７０ｍｌに添加し、２３ｃｍ×２３ｃｍのＬＢ寒天培地プレート６枚に均一に流延した。空気中、３７℃で１２時間培養後、プラークの生じたプレート上にニトロセルロースフィルターを約３０秒間密着させた。このニトロセルロースフィルターを１．５Ｍ　ＮａＣｌおよび０．１Ｎ　ＮａＯＨからなるアルカリ溶液に５分間浸漬し、さらに０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２×ＳＳＣ緩衝液からなる中性溶液に１５分間浸漬した。風乾後、８０℃、２時間熱処理してニトロセルロースフィルターに各プラークのＤＮＡを固定化した。得られたニトロセルロースフィルターは、６×ＳＳＣ緩衝液、５×デンハート溶液、５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ、および１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．０、からなるハイブリダイゼーション溶液に浸漬し、６５℃で５時間前処理した。１００℃で５分間熱処理した上記（３）の３２Ｐ標識合成オリゴヌクレオチド（約３×１０８ｃｐｍ）プローブとサケ精巣ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の混合溶液を添加し、４５℃で１６時間ハイブリダイゼーション反応を行った。反応後、ニトロセルロースフィルターは５０℃で０．１％ＳＤＳを含む６×ＳＳＣ緩衝液によって３回洗浄してから風乾した。このニトロセルロースフィルターを増感スクリーン、ライトニングプラス（デュポン社）とＸ線フィルム、ＲＸ（富士写真フィルム）に密着させ、−８０℃で３０時間露光した。得られた３個の陽性プラーク採取し、上記と同じ方法によって２次スクリーニングを行い、得られた１個の陽性クローンをＲＢＣ１と命名した。このＲＢＣ１ファージを常法により増殖させ、ＲＢＣ１ｃＤＮＡを単離精製した。得られたｃＤＮＡの塩基配列は、シーケネース（ユナイテッド　ステート　バイオケミカル社）を用いてジデオキシ法によって決定した。図１にＲＢＣ１ｃＤＮＡの全塩基配列を示す。ＲＢＣ１ｃＤＮＡは、ラットＨＧＦβ鎖をコードする塩基配列（第１番目から６９９番目）を含有する。
　【００２２】
（５）ヒトＨＧＦ遺伝子ＤＮＡの単離と塩基配列の決定：
　ヒト正常肝臓ｍＲＮＡ（クロンテック社）５μｇを鋳型にして上記（２）と同様にしてヒト肝由来のｃＤＮＡを合成した。１本鎖ｃＤＮＡの収量は、１１００ｎｇであった。得られたｃＤＮＡの２００ｎｇをアガロース電気泳動に供し、分画した４〜７ｋｂのｃＤＮＡをジーンクリーン（バイオ１０１社）で抽出した後、上記（２）と同様にしてｃＤＮＡライブラリー（Ｉ）を調製した。ｃＤＮＡ１μｇから２×１０５個の組換ファージを得た。マルチプライムＤＮＡ標識システム（アマシャム社）を用いて［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したＲＢＣ１ｃＤＮＡをプローブとして、ハイブリダイゼーション反応温度および洗浄温度を６０℃、洗浄液は０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ緩衝液とした以外は（４）と同様に、ヒト肝由来ｃＤＮＡライブラリー（Ｉ）の１次スクリーニングおよび２次スクリーニングを行い、陽性クローンＨＢＣ２５を得た。ＨＢＣ２５ファージから常法により単離、精製したＨＢＣ２５ｃＤＮＡを塩基配列解析および制限酵素切断解析に供した。図２（ａ）にＨＢＣ２５ｃＤＮＡの制限酵素地図、図３にＨＢＣ２５ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す。次にＨＢＣ２５ｃＤＮＡに含有する５’ＴＣＡＴＡＡＴＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＴ３’の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザー３８１Ａ（アプライドバイオシステムズ社）により合成した。この合成ＤＮＡ０．７５μｇをプライマーとし、ヒト肝ｍＲＮＡ２０μｇを鋳型としてｃＤＮＡ０．４μｇを合成し、同様にしてｃＤＮＡライブラリー（ＩＩ）を調製した。このｃＤＮＡライブラリー（ＩＩ）から［α３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識したＨＢＣ２５ｃＤＮＡの０．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片をプローブして陽性クローンＨＡＣ１９を得た。図２（ｂ）にＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図、図４にＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す。このようにして得られたＨＢＣ２５ｃＤＮＡおよびＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列を組み合わせたヒトＨＧＦコード領域の全塩基配列およびその塩基配列から演繹されるアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および配列番号２並びに図５〜図８に示す。
　【００２３】
　ヒトＨＧＦの全ｃＤＮＡ塩基配列から、ヒトＨＧＦの翻訳開始コドンは１番目のＡＴＧであり、終止コドンは２１８５番目のＴＡＧと推定される。これらの開始および終止コドンの間のヒトＨＧＦのｃＤＮＡ塩基配列は７２８アミノ酸残基からなるポリペプチドをコードし、１番目のＭｅｔに続くアミノ酸配列はＬｅｕに富み、３１番目のＧｌｙまでがＨＧＦ分泌のためのシグナル配列であった。同様にヒトＨＧＦβ鎖のＮ末端は、４９５番目のＶａｌと推定される。また、ヒトＨＧＦの糖鎖の結合部位は、Ａｓｎ−ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアミノ酸配列を有する２９４番目、４０２番目、５６６番目、および６５３番目のＡｓｎと推定される。
　配列番号２に示すヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコンピューターによりホモロジー検索を行った結果、ヒトＨＧＦはプラスミノーゲン、プラスミン、カリキュレインや凝固因子ＸＩＩなどのセリンプロテアーゼとホモロジーをもつことが見出された。即ち、ヒトＨＧＦはそのα−鎖にクリングル構造と推定される配列を４箇所持っており、またそのβ−鎖は上記セリンプロテアーゼのプロテアーゼ領域に類似している。しかし、セリンプロテアーゼの活性中心と推定されているＳｅｒとＨｉｓがヒトＨＧＦのβ−鎖ではＴｙｒ（６７３番目）とＧｌｎ（５３４番目）にそれぞれ置換されている。
　【００２４】
（６）サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築：
　サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＵＫ［ｈＨＧＦＩ］の構築図を、図９に示す。上記（５）で得られたＨＡＣ１９ファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＳｃａＩで消化し、アガロース電気泳動により０．９ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。同様にＨＢＣ２５ファージＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩとＳｍａＩで消化し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。これらのＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素ＢａｍＨＩとＳｍａＩで消化したブルースクリプトＫＳＭ１３＋（ストラタジーン社）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してプラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦＩ］を得た。
　得られたｐＢＳ［ｈＨＧＦＩ］を制限酵素ＸｂａＩとＳｍａＩで消化した。制限酵素ＸｂａＩとＳｍａＩであらかじめ消化したＣＯＳ細胞用発現ベクターｐＥＵＫ−Ｃ１（クロンテック社）と３．０ｋｂＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＵＫ［ｈＨＧＦＩ］を得た。
　【００２５】
（７）サルＣＯＳ細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の発現：
　得られたｐＥＵＫ［ｈＨＧＦＩ］プラスミドをエタノール沈殿した後、１０ｍＭ　ＰＢＳ緩衝液に溶解し、２０μｇ／ｍｌに調製した。次に、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬）中で増殖させた対数増殖期のＣＯＳ−１細胞（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１６５０）を１０ｍＭ　ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄した後トリプシン処理した。同緩衝液で３回洗浄後、細胞濃度２×１０７個／ｍｌになるように再び同緩衝液に浮遊化した。先に調製したプラスミド溶液２５０μｌと細胞浮遊液２５０μｌを混合し、氷冷下で１０分間放置した。この氷冷したプラスミド・細胞混液に高電圧パルス遺伝子導入装置ＺＡ−１２００（ＰＤＳ社）を用いて、印加電圧４ｋＶ／ｃｍ、パルス時間２０ミリ秒の条件下で高電圧パルスをかけた。得られた細胞を上記の培地で希釈し、３７℃、５％ＣＯ２存在下にて３日間培養した。培養３日目の培養上清中のＨＧＦ活性を前述のラット肝実質細胞を用いて測定したところ、５０単位／ｍｌであった。
　一方、ＨＧＦｃＤＮＡを挿入していない発現ベクター，ｐＥＵＫ−Ｃ１を同じ方法によりＣＯＳ−１細胞に導入して培養したが、その培養上清中には、ＨＧＦ活性を認めなかった。
　【００２６】
実施例２
（１）マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築：
　マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦＩＩ］の構築図は、図１０に示す。実施例１で得られたＨＡＣ１９ファージＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩとＳｃａＩで消化し、アガロース電気泳動により０．９ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。同様にＨＢＣ２５ファージＤＮＡを制限酵素ＳｃａＩとＰｓｔＩで消化し、２．１ｋｂのＤＮＡ断片を分離・精製した。これらのＤＮＡ断片をあらかじめ制限酵素ＢａｍＩとＰｓｔＩで消化したブルースクリプトＫＳＩＩ＋（ストラタジーン社）と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合してプラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦＩＩ］（微工研菌寄第１１０５０号）を得た。プラスミドｐＢＰＭＴを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）でリン酸基を除去した部位に、プラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦＩＩ］（微工研菌寄第１１０５０号）を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩとＮａｅＩで消化しＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、アガロース電気泳動により分離・精製した３．０ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。得られたヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦＩＩ］は、ＭＴ−１プロモーターとＳＶ４０初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒトＨＧＦ遺伝子を有し、この発現ベクターによるマウスＣ１２７細胞の形質転換は、ウシパピロマウイルス（ＢＰＶ）遺伝子により行われる。また形質転換された細胞の選択は、トランスポゾンＴｎ５のｎｅｏ遺伝子（Ｇｅｎｅ，
１９
　【００２７】
（２）マウスＣ１２７細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の発現：
　ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦＩＩ］は、Ｗｉｇｌｅｒらの方法（Ｃｅｌｌ，
１１
　上記（１）で得られた２０μｇのｐＢＰＭＴ［ｈＨＧＦＩＩ］プラスミドを０．５Ｍ塩化カルシウム２４０μｌに溶解し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２８０ｍＭ　ＮａＣｌおよび１．５ｍＭ　リン酸ナトリウムからなる２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１），２４０μｌを撹拌しながら加えた。室温で３０分撹拌を続けプラスミドとリン酸カルシウムの共沈殿を形成させた。あらかじめ、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社）および１０ｍＭグルタミンを添加したＤＭＥＭ培地（日水製薬）を用いて５×１０５個のＣ１２７細胞を５％ＣＯ２の存在下で３７℃、２４時間培養した。培地交換した後、プラスミドとリン酸カルシウム共沈殿を加え、室温で２０分放置した。さらに、３７℃で４時間インキュベートした後、培地を除去し、１５％グリセリンを添加した１×ＨＥＰＥＳ緩衝液を加え室温で５分放置した。培地で細胞を洗浄した後、培地交換し、さらに３７℃で２日間インキュベートした。細胞を１０倍に希釈して１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（シグマ社）を含む同培地を用いて５％ＣＯ２の存在下で３７℃、７日間培養して形質転換細胞を得た。得られた細胞株から培養上清中のＨＧＦ活性の高い細胞を限界希釈法でスクリーニングしヒトＨＧＦ高産生株ＢＰＨ８９を得た。この細胞の培養上清中のＨＧＦ産生能は、２．３万単位／ｌ／日であった。
　【００２８】
実施例３
（１）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦの発現ベクターの構築：
　チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＶＥ［ｈＨＧＦＩＩ］の構築図は、図１１に示す。プラスミドｐＥＶＳＶＥを制限酵素ＥｃｏＲＶで消化後、細菌性アルカリフォスファターゼ（ＢＡＰ）でリン酸基を除去した部位に、実施例２で得られたプラスミドｐＢＳ［ｈＨＧＦＩＩ］（微工研菌寄第１１０５０号）を制限酵素ＸｂａＩとＳａｌＩとＮａｅＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした後、アガロース電気泳動により分離・精製した３．０ｋｂのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼにより挿入した。得られたヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＶＥ［ｈＨＧＦＩＩ］は、ＳＶ４０初期プロモーターとＳＶ４０の初期遺伝子のポリ（Ａ）付加シグナルの間にヒトＨＧＦ遺伝子を有する。また、形質転換された細胞の選択は、マウスＤＨＦＲ遺伝子にＳＶ４０初期プロモーターとポリ（Ａ）付加シグナルを連結したＤＨＦＲキメラ遺伝子により可能となる。
　【００２９】
（２）チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞の形質転換とヒトＨＧＦ遺伝子の発現：
　ヒトＨＧＦ発現ベクターｐＥＶＳＶＥ［ｈＨＧＦＩＩ］は、実施例２と同様にしてチャイニーズハムスターＣＨＯ細胞のジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）欠損ＣＨＯ　ＤＵＫＸ細胞に導入した。得られた細胞株は、リボヌクレオシドとデオキシヌクレオシドを含まず、透析した１０％ウシ胎児血清（キブコ社）と１％グルタミンと５０ｎＭメソトレキセートを含むα−ＭＥＭ培地（フローラボラトリー社）を用いて培養した。発生したコロニーは、安定なヒトＨＧＦ高産生株を得るために、同培地において１８世代まで増殖させた。得られた細胞株は、安定にヒトＨＧＦを産生し、ＣＨＯ−１と名付けた。この細胞のヒトＨＧＦ産生能は、３．１万単位／ｌ／日であった。
　【００３０】
実施例４
　実施例２で得られたヒトＨＧＦ産生マウスＣ１２７組換細胞株ＢＰＨ８９の培養上清液より組換ヒトＨＧＦを精製した。
（１）陽イオン交換クロマトグラフィー
　ＢＰＨ８９株の培養液４００ｍｌに、終濃度０．０１％となるようにＴｗｅｅｎ８０を添加し、ステリベクスＨＶフィルター（日本ミリポア・リミテッド）により濾過した。この濾液に１／２０容の１Ｍ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）緩衝液を加え、緩衝液Ａ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ　８０、ｐＨ８．５）で平衡化したＳ−セファロースＦＦ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１．６ｃｍ、高さ５ｃｍ）に添加した。緩衝液Ａで未吸着物質を洗浄後、０．１５Ｍから１．０ＭのＮａＣｌによる直線濃度勾配（全量１００ｍｌ）で、吸着物を溶出した。クロマトパターンを図１２に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、Ｓ−セファロース溶出液とした。
　【００３１】
（２）アフィニティクロマトグラフィー：
　Ｓ−セファロース溶出液を１Ｎ酢酸でｐＨ７．５に調整後、２倍容の０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０を含む蒸留水で希釈し、緩衝液Ｂ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ７．５）で平衡化したヘパリン・セファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社製、カラムサイズ内径１ｃｍ、高さ３ｃｍ）に添加した。緩衝液Ｂでカラムを洗浄後、０．３Ｍから２．０ＭのＮａＣｌによる直線勾配（全量３０ｍｌ）により溶出した。そのクロマトパターンを図１３に示す。ＨＧＦ活性をもつ画分を集め、ヘパリン溶出液とした。
　【００３２】
（３）逆相ＨＰＬＣ：
　０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、ｖ／ｖ％）を含む蒸留水で平衡化したＣ４　ＲＰ−３０４カラム（バイオラッド社製、内径４．６ｍｍ、高さ２５０ｍｍ）にヘパリン溶出液を添加し、０．１％ＴＦＡを含む０％から９０％へのアセトニトリルの濃度勾配により溶出を行った。組換ヒトＨＧＦは約４０％のアセトニトリル濃度にて溶出させた。そのクロマトグラムを図１４に示す。精製された組換ヒトＨＧＦの収量は約２５μｇであり、培養上清液からの活性回収率は約２５％であった。
　【００３３】
（４）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動：
　前記３段のクロマトグラフィーで精製された組換ヒトＨＧＦを２−メルカプトエタノール還元下及び非還元下ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動にかけた。結果を図１５に示す。精製組換ＨＧＦは、非還元条件（２−ＭＥ（−））では分子量７万〜９万の単一バンドを示し、還元条件下（２−ＭＥ（＋））では、分子量６万〜７．５万のα鎖と分子量３万〜４万のβ鎖に分かれた。即ち、組換ＨＧＦはα鎖とβ鎖からなるヘテロダイマーであることが示された。またβ鎖が２本のバンドに分離し、β鎖に付加される糖鎖の本数に差のあることを示した。
　【００３４】
（５）α鎖およびβ鎖のＮ末端アミノ酸配列：
　精製組換ＨＧＦのα鎖とβ鎖を分離し、それぞれのＮ末端アミノ酸配列を調べた。精製標品を４Ｍグアニジン存在下にて６０℃、３０分間処理し、２−メルカプトエタノールにて還元した。次いで、モノヨード酢酸ナトリウムを添加してＳＨ基をアルキル化し、反応液をマイクロボンダスフェアーＣ４カラム（ウォーターズ社）による逆相ＨＰＬＣにかけ、α鎖とβ鎖を分離した。溶出は０．１％ＴＦＡを含む水とアセトニトリルによった。このようにして得られたα鎖とβ鎖をプロティンシークエンサーにかけた結果、下記に示すアミノ酸配列が得られた。
　これらの配列は配列番号１（図５〜図８）のＨＧＦコード領域の全塩基配列より推定されたアミノ酸配列（配列番号２）の３２〜５１番目および４９５〜５０１番目に一致した。
　【００３５】
（６）アミノ酸組成および糖組成：
　精製組換ＨＧＦを０．２％フェノールを含む６Ｎ　ＨＣｌにて１１０℃、２４時間処理して加水分解し、アミノ酸分析機にかけ、アミノ酸組成を調べた。その結果は下表に示したように、ＤＮＡ塩基配列より推定したアミノ酸組成値と精製組換標品による実測値は非常によく一致した。
　【００３６】
　【００３７】
　さらに精製組換ＨＧＦを２．５Ｎ　ＴＦＡ中で、１１０℃、６時間加熱処理し、陰イオン交換樹脂を用いたＨＰＬＣにて糖分析を行った。その結果、アスパラギン配糖体特有のマンノース、ガラクトース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミンが検出され、組換ＨＧＦは糖蛋白質であることが確認された。
　【００３８】
（７）組換ヒトＨＧＦの肝細胞増殖活性：
　ラット初代培養肝実質細胞は、現在知られているｉｎ　ｖｉｔｒｏの系の中では最もｉｎ　ｖｉｖｏに近い肝機能を持つ系である。「ＨＧＦ活性の測定法」に記述した方法に従って得たラット肝実質細胞に対し、精製した組換ヒトＨＧＦを添加したところ、１ｎｇ／ｍｌの濃度で強い細胞増殖を誘起し、１０ｎｇ／ｍｌでその効果は最大に達した。この培養系に増殖活性を示す因子は他にもインスリンやＥＧＦがあるが、組換ヒトＨＧＦは単独で両者よりも強い活性を有し、かつこれら３者の共存下では相加的な作用を示した。従って、組換ヒトＨＧＦは現在知られている因子のなかでは、生体外肝細胞に対し最も強力な増殖活性をもつ物質ということができる。
　【００３９】
　【００４０】
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　ＲＢＣ１ｃＤＮＡの塩基配列を示す図である。
　【図２】
　ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの制限酵素地図（ａ）およびＨＡＣ１９ｃＤＮＡの制限酵素地図（ｂ）を示す図である。
　【図３】
　ＨＢＣ２５ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す図である。
　【図４】
　ＨＡＣ１９ｃＤＮＡの塩基配列の一部を示す図である。
　【図５】
　ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号１〜６２４）とそのアミノ酸配列を示す図である。
　【図６】
　ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号６２５〜１２４８）とそのアミノ酸配列を示す図である。
　【図７】
　ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号１２４９〜１８７２）とそのアミノ酸配列を示す図である。
　【図８】
　ヒトＨＧＦコード領域の塩基配列（塩基番号１８７３〜２１８７）とそのアミノ酸配列を示す図である。
　【図９】
　サルＣＯＳ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築図である。
　【図１０】
　マウスＣ１２７細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築図である。
　【図１１】
　チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞用ヒトＨＧＦ発現ベクターの構築図である。
　【図１２】
　Ｓ−セファロース溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
　【図１３】
　ヘパリン溶出液のフラクションと溶出成分の吸光度およびそれらのＤＮＡ合成活性との関係を示す線図である。
　【図１４】
　逆相ＨＰＬＣにおいて、通液したアセトニトリル濃度と、溶出した成分の吸光度との関係を示す線図である。
　【図１５】
　精製組換ＨＧＦの還元下および非還元下でのＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す図である。