【事件の表示】
　特許第３０６８６４４号「異化性腸管関連疾患および宿主防衛機構障害の治療用医薬組成物」の請求項１〜８に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０６８６４４号の請求項１〜８に係る特許を取り消す。
【理　由】
１．手続きの経緯
　本件特許第３０６８６４４号の請求項１〜８に係る発明は、平成２年６月４日に国際特許出願（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３０９５、パリ条約による優先権主張、１９８９年６月２日、米国）され、平成１２年５月１９日に特許権の設定の登録がされた。その後、特許異議の申立てがされ、当審により取消理由が通知された後、意見書提出の指定期間内である平成１３年１１月２２日に、明細書の訂正の請求がされたものである。
     　
２．訂正請求について
（１）訂正の内容
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１の　
「【請求項１】動物の正常時の食餌に含まれるより多い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体を含むことを特徴とする動物の病理的な腸の透過性を治療するための医薬組成物。」
を、
「【請求項１】動物の正常時の食餌に含まれるより多い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体を含むことを特徴とする動物の病理的な腸の透過性を治療するための医薬組成物であって、前記治療が前記腸の透過性の増加を防ぎ病原性微生物による感染率を低下させることによってされるものであり、および前記病理的な腸の透過性が異化機能障害の結果によるものでないことを特徴とする医薬組成物。」
に訂正する。
　
訂正事項ｂ
　特許請求の範囲の請求項３の
「【請求項３】前記腸の透過性は、本質的に異化機能障害に伴うものであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。」
を、
「【請求項３】前記動物は化学療法を受けたか、化学療法で治療されていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。」
に訂正する。
　
訂正事項ｃ
　特許請求の範囲の請求項４の
「【請求項４】前記異化機能障害は、外科手術，敗血症，火傷，カロリー消耗，化学療法，放射線治療または治療されていない糖尿病の結果起きるものであることを特徴とする請求項３に記載の医薬組成物。」
を、
「【請求項４】前記動物は骨髄移植を受けたか、骨髄移植の治療を受けていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。」
に訂正する。
　
（２）訂正の適否
　訂正事項ａは、特許請求の範囲の請求項１において、「前記治療が前記腸の透過性の増加を防ぎ病原性微生物による感染率を低下させることによってされるものであり、および前記病理的な腸の透過性が異化機能障害の結果によるものでない」という要件を付加するものである。
　そして、本件明細書には、「“病的腸透過性”とは、病的状態に伴なう腸壁透過性の亢進を指す。・・・そのような腸透過性は、癌化学療法剤の投与,TPN,その他の損傷や病的状態と関係がある。」（特許公報４頁右欄３０〜３４行）と記載されており、病理的な腸の透過性の増加を防ぐことで病原性微生物による感染率が低下することは当業者に明らかである。
　また、「前記病理的な腸の透過性が異化機能障害の結果によるものでない」ことに関しては、特許明細書の「本発明は、GLNの必要性が増大している全ての異化機能不全に用いることを意図している。このような異化機能不全は、消化管の臓器や細胞、または他の細胞や臓器系と関連がある可能性がある。非経口食投与中の小腸絨毛の萎縮は通常は、腸細胞に対する直接的な異化作用に起因して発現するのではなく、むしろ患者の食事中にGLNが欠けていることに起因する。」（特許公報４頁右欄１４〜２０行）との記載からみて、例えば静脈栄養供給などの非経口食投与に伴うもののような、腸細胞に対する直接的な異化作用に起因するといえないようなものは、これに該当すると認められる。
　したがって、訂正事項ａは、特許明細書に記載された事項の範囲内で、特許請求の囲の減縮を目的とする訂正であって、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものではない。
　  
　訂正事項ｂは、特許請求の範囲の請求項１を引用する請求項３の発明において、対象動物を「化学療法を受けたか、化学療法で治療されている」ものに特定するものである。
　上に引用した本件特許公報４頁右欄１４〜２０行及び同３０〜３４行の記載によれば、本件発明は、「直接的な異化作用に起因するものに限らず、GLNの必要性が増大している全ての異化機能不全を意図し」ており、「異化機能不全は、消化管の臓器や細胞、または他の細胞や臓器系と関連がある可能性がある」のであって、かつ「病的な腸透過性は、癌化学療法剤の投与,TPN,その他の損傷や病的状態と関係がある。」とされている。
　そうすると、訂正事項ｂは、特許明細書に記載された事項の範囲内で、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正であって、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものともいえない。
　
　訂正事項ｃは、特許請求の範囲の請求項１を引用する請求項３をさらに引用する請求項４の発明において、対象動物を外科手術のひとつである「骨髄移植を受けたか、骨髄移植の治療を受けている」ものに特定し、引用する請求項を請求項１とするものである。
　そして、「異化作用（または機能障害）は、解剖学的構造の分解が起る生理学的状態である。このような状態は骨格筋だけでなく、腸管内層にも影響を及ぼすのが特徴である。組織損傷をもたらす異化作用は、手術，敗血症，火傷，癌化学療法，放射線療法／傷害、または糖質コルチコイド療法に続発することが多く、しばしば不十分な食物摂取に伴なって発現する。・・・例えば骨髄移植を受けた患者では、移植前後の放射線および／または化学療法は移植片対宿主疾患の頻発と協同して異化性で重篤な栄養傷害を惹起する。このような患者では、・・・中心静脈栄養法（TPN）が必要となる」（特許公報２頁左欄２０〜３３行）との記載からみて、骨随移植は、組織損傷をもたらす異化作用を伴う手術の１例であって中心静脈栄養法（TPN）を必要とするものと理解できる。
　そうすると、訂正事項ｃは、特許明細書に記載された事項の範囲内で、特許請求の囲の減縮を目的とする訂正であって、実質上特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものともいえない。
 　
　したがって、本件訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する同条第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについての判断
（１）本件発明
  上記２．に示したように本件訂正は認められるから、本件特許の請求項１〜８に係る発明は、訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜８に記載された以下のとおりのものである。
　
【請求項１】動物の正常時の食餌に含まれるより多い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体を含むことを特徴とする動物の病理的な腸の透過性を治療するための医薬組成物であって、前記治療が前記腸の透過性の増加を防ぎ病原性微生物による感染率を低下させることによってされるものであり、および前記病理的な腸の透過性が異化機能障害の結果によるものでないことを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】前記腸の透過性は、本質的に静脈栄養供給に伴うものであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】前記動物は化学療法を受けたか、化学療法で治療されていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】前記動物は骨髄移植を受けたか、骨髄移植の治療を受けていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】前記動物はヒトであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】グルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体の非経口による投与の量が、１日に、体重１キログラム当たり0.2ないし3.0グラムの率であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】グルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体の非経口による前記投与の量は、１日に、体重の１キログラム当たり0.3ないし2.5グラムの率であることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】グルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体の非経口による前記投与の量は、１日に、体重１キログラム当たり0.4ないし2.0グラムの率であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。」た次のとおりのものである。
     　
（２）刊行物に記載された発明
　当審で通知した取消理由に引用した刊行物１〜４には、それぞれ以下の事項が記載されている。
　
刊行物１　Journal of Parenteral and Enteral Nutrition, Vol.12, No.4, p325-331, 1988
　　　　　　(特許異議申立人の提出した甲第１号証)
　
(1-1)「・・・これまでの研究は、成分栄養剤には存在しないグルタミン（GLN）が腸における好ましい酸化性基質であり、腸の損傷後の回復を容易にするらしいことを示唆している。本研究では腸損傷の致死的モデルにおける栄養状態、腸の形態、細菌転流および生存率に与えるグルタミン補充−成分栄養剤（GLN‐ED）の効果を調べた。・・・第一の実験では、２％ＧＬＮがまたは等量のグリシン（対照）を補充した胃内成分栄養剤をラットに与えた。・・・GLN−EDは体重減少の有意な低下、窒素滞留の改善、空腸および結腸の粘膜重量、蛋白質およびDNA含有量の増加をもたらした。
　第二の実験では、・・・対照食動物はMTX投与後１２０時間以内に死んだ。GLN−ED群は有意に長く生存し、死亡率も有意に低下した。
　第三の実験では、・・・MTX投与動物に腸菌血症が明らかにされた。GLN‐EDは菌血症の発生率を有意に減少させた。
　これらの実験はGLN‐EDが致死的全腸炎モデルにおいて栄養状態の有意な改善、腸損傷の減少、細菌転流の減少をおこし、生存率を改善することを示した。」（３２５頁要約：訳文１頁）
　
(1-2)「MTXを投与し、GLNを与えた動物からの結腸および小腸は、GLNを補充しないMTX動物に比較して単位長さあたりの重量、粘膜重量、およびDNAおよび蛋白質含有量が有意に大きい。我々の結果は、化学的に誘起した別の陽炎モデル（５−フルオロウラシル）においてGLN補充が粘膜の細胞数を保存することを報告した O'Dwyer らの結果と一致する。」（３２９頁右欄下から１８行〜下から１１行：訳文９頁１１〜１５行）
    
(1-3)「グルタミンを補充した成分栄養剤はメトトレキセート誘起性全腸炎モデルの腸粘膜損傷を有意に減少させた。腸内細菌の転流に対する粘膜透過性は有意に減少し、生存率は有意に改善した。本研究の結果、メトトレキセートによる化学療法を始める患者らは彼らの栄養剤にグルタミンを添加することによって利益を得られることが示唆される。」（３３０頁左欄下から８行〜最下行：訳文１０頁２１〜２５行）
　
刊行物２　Surgical Forum, Vol.37, p56-58, October, 1986
　　　　　　(特許異議申立人の提出した甲第2号証)
　
(2-1)「非経口栄養剤（parenteral nutrition）は、小腸の粘膜萎縮を惹起する。この応答は胃腸の分泌物及び栄養ホルモン類の減少に関連しており、また、腸細胞増殖に必要な特異的栄養物の不足に関連する，グルタミン（GLN）は小腸にとって主要な酸化的燃料であるが、標準的非経口溶液には含まれていない。食餌性 GLN の影響を決定するために、我々はこのアミノ酸の変化する濃度で強化した非経口栄養剤の投与に対する小腸の応答を評価した。」（５６頁第１パラグラフ：訳文１頁（１）欄）
　
(2-2)「経口食コントロールと対比して ＩＶ栄養（審決注：静脈内栄養補給）を受けた全ラットにおいて、湿重量、DNA量、蛋白量及び絨毛の高さが減少した（表１参照）。GLN含有溶液の注入後血漿GLN濃度は増加した。GLNを含まない溶液を受けたラットと比較して、空腸の粘膜重量は著しく増加した。・・・２％及び３％濃度のGLN注入後、粘膜の DNA 及び全厚みの空腸の DNA は増加した。・・・。非経口栄養溶液 へのGLNの供給は、動物をiv栄養に維持したとき、空腸の粘膜重量、DNA量及び絨毛の高さにおける増加をもたらす。小腸の粘膜量の増加は小腸の機能及び小腸内栄養取り込み能を改善する。」（５７頁結果と考察の欄：訳文１〜２頁（３）欄）
   
刊行物３　特表昭63-501214号公報　(特許異議申立人の提出した甲第3号証)
　
(3-1)「１．動物の通常の食餌に含まれる量よりも多量のグルタミンまたはその類縁体の治療有効量を該動物に投与することからなる、該動物の異化機能障害を治療する方法。
２．異化機能障害が腸内性または腸外性のものである第１項に記載の方法。
３．腸内性機能障害が実質的に静脈内栄養補給に伴って起るものである第２項記載の方法。
４．腸内性機能障害が小腸に影響するものである第３項に記載の方法。
・・・・
１３．腸外投与が１日当たり体重1kgにつきグルタミンまたはグルタミン類縁体０．２〜３．０gの割合で行なわれた第９項に記載の方法。
１４．腸外投与が１日当たり体重1kgにつきグルタミンまたはグルタミン類縁体０．３〜２．５gの割合で行なわれる第１３項に記載の方法。
１５．腸外投与が１日当たり体重1kgにつきグルタミンまたはグルタミン類縁体０．４〜２．０gの割合で行なわれる第１４項に記載の方法。」（特許請求の範囲）
　
(3-2)「異化機能障害とは、解剖学的構造の崩解を生じるような生理的状態である。このような状態に罹る解剖学的構造は骨格筋および腸内層である。そのような異化作用はしばしば外科手術、敗血症、火傷、癌治療、放射線治療／傷害、副腎皮質ステロイド治療に伴って生じ、またしばしば不適当な飼料摂取をもたらす。このような異化機能傷害は、死亡および廃疾の主原因であり、グルタミン代謝異常を特徴とする。」（２頁左下欄１〜７行）
　
(3-3)「「全非経口栄養物（TPN）」なる用語は、すべての栄養要求を満たすための患者に静注にて投与する処方を示す場合に用いる。この全非経口栄養物の処方は、経腸処方とは異なり、一般にグルタミンは含まない。・・・
　全非経口栄養物は絨毛萎縮をもたらし、その現象は一般に経口食事投与を再開するとなくなる。」（３頁右下欄９行〜４頁左上欄５行）
　
(3-4)「本発明はグルタミンの要求が増すあらゆる異化機能障害に用いることを意図している。これらの異化機能障害は腸内的または腸外的のいずれも含まれる。例えば、TPN食餌を投与した場合に生じる小腸の絨毛萎縮は腸内異化機能障害である。絨毛萎縮は腸細胞に対する直接的異化作用によって起こるのではなく、むしろ患者に与える非経口的食餌中のグルタミン欠損によって通常起こる。」（５頁右上欄５〜１０行）
　
(3-5)「本発明が適用される動物はヒトを含めて一般に哺乳動物として分類されるものである。」（５頁右上欄１４〜１５行）
　
(3-6)「本発明方法が有効な異化機能障害に適用されるときの「実質的に伴った」なる用語は、グルタミンの生化学的要求が異化機能障害中またはその後に生じるものまたはそれに関連したものを意味する。」（５頁左下欄２〜４行）
　
(3-7)「静脈内投与の場合のグルタミン投与割合は0.1g/kg/日またはそれ以上である。そのような投与割合は0.2〜3.0g/kg/日、好ましくは0.3〜2.5g/kg/日、さらに好ましくは0.4〜2.0g/kg/日である。」（５頁右下欄最下行〜６頁左上欄４行）
　
(3-8)「本発明はまた本発明の成分および異化機能障害抑制用医薬からなる医薬または医薬用組成物に関する。」（６頁右上欄５〜６行）
　
(3-9)「動物に静脈内栄養を維持する場合、非経口溶液にグルタミンを添加すると、空腸粘膜重量、DNA含量および絨毛高さの増大を生じる。小腸の粘膜量の増加は小腸機能を改善し、腸内栄養の取り込みを促進し得る。」（２３頁左下欄６〜９行）
　
(3-10)実施例８　５−フルオロウリシル処理後のグルタミン強化非経口的栄養の影響
　非経口的食餌の間、栄養溶液にアミノ酸、グルタミン（GLN）を添加すると、腸の細胞充実性を有意に高める。・・・
　5FU処置は、腸重量、DNAおよびタンパク質を減少させた。通常溶液を与えた動物に比較すると、GLNを与えたラットは有意に大きい粘膜量を有していた。GLNの添加は、長期の動物において生存が増すことに関連していた。栄養溶液にGLNを添加することは、小腸の細胞充実性を改善し、5FUの胃腸毒性を緩和する。この様な治療は、胃腸壁防御を害している患者の罹病率および死亡率を減少させることができる。（２３頁右下欄下から５行〜２３頁左下欄７行）
　
刊行物４　Clinical Research, Vol.35, No.3, p369A, 1987
　　　　　　(特許異議申立人の提出した甲第4号証)
　
(4-1)「化学療法剤及び放射線療法は、一般に、胃腸粘膜及び白血球を含む迅速に分割する正常細胞に対して毒性の副作用を有している。グルタミン（GLN）は腸及び刺激を受けたリンパ球に対して重要な酸化的燃料であることが示されてきているので、我々は、５−フルオロウラシル（５‐FU）の毒性量の投与後におけるGLN‐補充静脈内栄養剤の、小腸粘膜細胞及び循環白血球（WBC）に対する効果を比較検討した。」（３６９A頁右下の論文４〜１１行：訳文（１）欄）
　
(4-2)「雄性ウイスターラット（約２００g）に５‐FU（０‐２００mg／kg IP）を与え、次いで、３時間後から、長期留置頸静脈カテーテルを経て中心静脈栄養（TPN）を維持した。TPN溶液は０または２g／１００mlのGLNを含んでいる。１５０mg ５‐FU／kgの投与４日後、・・・GLN−補充TPNを受けた動物においては、粘膜DNA量（１１３．７±１９．７ vs ８０．０±６．７mg／cm）または絨毛の高さ（２６０±８ vs ２２４±４μm）によって分析されるように、粘膜の細胞性は顕著に増加した（P＜０．０５）。・・・GLN−補充TPNはまた、５‐FU後の生存率向上傾向をもたらした。我々は、IV及びおそらく経口食へのGLNの添加は、化学療法の結果として起こる罹患率及び死亡率を減少させる役割を演じると考えられる。」（３６９A頁右下の論文１１行〜下から２行：訳文（２）欄）
　
（３）対比・判断
　刊行物3には、「動物の通常の食餌に含まれている量よりも多量のグルタミンまたはその類縁体の治療有効量を該動物に投与することからなる、該動物の異化機能障害を治療する方法」（請求項１）及びこの方法のための医薬組成物が記載されている(3-1)(3-8)。
　この「異化機能障害」について、刊行物3には、腸内性のもの（請求項２）、「実質的に静脈内栄養補給に伴って起こるもの（請求項３）、小腸に影響するもの（請求項４）、手術、敗血症、火傷、食欲不振、化学療法、放射線治療、または非抑制糖尿病に伴うもの（請求項６）が挙げられている(3-1)。腸内異化機能障害の例としては、直接的な異化作用によっておこるのではないとされる全非経口栄養物（TPN）食餌を投与した場合に生じる小腸の絨毛萎縮を挙げている（3-4）(3-3)。そして、「実質的に伴った」という用語は、グルタミンの生化学的要求が異化機能障害中またはその後に生じるものまたはそれに関連したものを意味するとしている(3-6)。
　そうすると、刊行物３における異化機能障害には、直接的な異化作用によるものではない、例えばTPN食餌を投与した場合に生じる小腸の絨毛萎縮のような静脈内栄養補給に伴って起こる腸内異化機能障害、すなわち本件発明において「異化機能障害の結果によるものでない」として記載しているものを含んでいるということができる。
　そこで、本件発明と刊行物３に記載された発明を対比すると、両者は「動物の正常時の食餌に含まれるより多い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体を含むことを特徴とする医薬組成物であって、異化機能障害の結果によるものでないことを特徴とする医薬組成物。」で一致し、刊行物３には「動物の病理的な腸の透過性を治療するための組成物であって、前記治療が前記腸の透過性の増加を防ぎ病原性微生物による感染率を低下させることによってされるもの」について記載されていない点で相違する。以下、この相違点について検討する。
　
　刊行物３には、静脈内栄養補給により小腸の絨毛萎縮のような腸内異化機能障害がおこること(3-4)、静脈内栄養溶液にグルタミンを添加すると空腸粘膜重量、DNA含量および絨毛高さの増大を生じ、小腸の粘膜量の増加は小腸機能を改善し腸内栄養の取り込みを促進し得ること(3-9)が記載され、その実施例８には５ＦＵ処置及びその後の非経口栄養補給により腸重量、ＤＮＡ及び蛋白質はＧＬＮを添加することにより有意に改善され胃腸壁防御を害している患者の罹病率及び死亡率を改善すること(3-10)が記載されている。（静脈内栄養溶液へのグルタミン添加により、空腸粘膜重量、DNA含量および絨毛高さの増大を生じることは刊行物２にも記載され、５ＦＵ処置により胃腸壁防御を害している患者の罹病率及び死亡率を改善することは刊行物４にも記載されている。）
　ここでいう「胃腸壁防御を害している患者の罹病率及び死亡率を改善する」ことが本件発明における「動物の病理的な腸の透過性を治療であって、前記治療が前記腸の透過性の増加を防ぎ病原性微生物による感染率を低下させることによってされる」ことを示唆していることは、５−ＦＵと同じく化学療法剤であるメトトレキセート（ＭＴＸ）投与により誘発された腸炎において腸内細菌の転流による感染率、死亡率の低下を開示した刊行物１の記載を参照するまでもなく、当業者であれば容易に理解できることである。
　したがって、本件発明は、刊行物１〜４に記載された発明から当業者が容易に発明できたものと認められる。
  　
　請求項２に係る発明は、請求項１に係る発明に「本質的に静脈栄養供給に伴うものであること」という要件を加えたものであるが、刊行物３には「腸内性機能障害が実質的に静脈内栄養補給に伴って起こるものである」（請求項３：(3-1))と記載されており、この点において両者は相違するものではないので、請求項１に係る発明と同様に当業者が容易に発明できたものである。
  　
　請求項３に係る発明は、請求項１に係る発明に「前記動物は化学療法を受けたか、化学療法で治療されていること」という要件を加えたものであるが、刊行物３においても化学療法により治療されたものを対象としている(3-10)から、この点において両者は相違するものではないので、請求項１に係る発明と同様に当業者が容易に発明できたものである。
　
　請求項４に係る発明は、「前記動物は骨髄移植を受けたか、骨髄移植の治療を受けていること」という要件を加えたものであるが、上記２．（２）で述べたとおり、骨随移植は組織損傷をもたらす異化作用を伴う手術の１例であって中心静脈栄養法（TPN）を必要とするものと理解できるところ、刊行物３には、異化機能障害はしばしば外科手術等に伴って生じること(3-2)、異化機能障害は腸内的または腸外的のいずれも含まれ、中心静脈栄養法（TPN）により生じる小腸の絨毛萎縮は腸内異化機能障害であること(3-4)が記載されているから、外科手術である骨随移植後に必要な中心静脈栄養法（TPN）をグルタミンを含有したものとすることは当業者が容易になし得ることと認められる。
　したがって、請求項４に係る発明は、請求項１に係る発明と同様に当業者が容易に発明できたものである。
　
　請求項５に係る発明は、動物をヒトに特定するものであるが、刊行物３の発明では、適用される動物はヒトを含め一般哺乳動物である(3-5)であるから、この点において両者は相違するものではないので、請求項１に係る発明と同様に当業者が容易に発明できたものである。
　
　請求項６〜８に係る発明は、グルタミンの非経口による投与の量を特定するものであるが、その投与量は刊行物３に記載された「投与割合は0.2〜3.0g/kg/日、好ましくは0.3〜2.5g/kg/日、さらに好ましくは0.4〜2.0g/kg/日である。」と一致しているから、この点は相違点とはなり得ず、いずれも請求項１に係る発明と同様に当業者が容易に発明できたものである。
　
４．むすび
　以上のとおり、本件特許の請求項１〜８に係る発明は、刊行物１〜４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものであるから、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである。
　したがって、本件の請求項１〜８に係る特許は、特許法第１１３条第１項第２号により取り消すべきものである。
  
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年２月１２日（２００４．２．１２）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
異化性腸管関連疾患および宿主防衛機構障害の治療用医薬組成物
【発明の詳細な説明】
　本発明は、アメリカ合衆国公衆衛生研究所外傷センター助成金第　ＧＭ２９３２７−０５号および合衆国陸軍省契約第　ＤＡＭＤ−１７−８１−Ｃ−１２０１　から研究助成金を受けて成されたものであり、本発明については何らかの権利が合衆国政府に付与される。
　　　
関連出願への参照
　本出願は、１９８５年９月１２日に出願された出願第７７５，２１４号（現在は放棄されている）の一部継続出願である出願第９０６，５３０号（出願日：１９８６年９月１２日）の一部継続出願である。
　　　
発明の背景
　　　
発明の分野
　本発明は、腸粘膜・膵萎縮，その他の腸管透過性増強に関連する障害を含む異化性腸管関連疾患，宿主防衛機構障害、および免疫能低下を治療するための医薬組成物に関する。さらに、本発明は、骨髄移植患者の回復を促進するための医薬組成物に関する。
　　　
従来技術の説明
　異化作用（または機能障害）は、解剖学的構造の分解が起る生理学的状態である。このような状態は骨格筋だけでなく、腸管内層にも影響を及ぼすのが特徴である。組織損傷をもたらす異化作用は、手術，敗血症，火傷，癌化学療法，放射線療法／傷害、または糖質コルチコイド療法に続発することが多く、しばしば不十分な食物摂取に伴なって発現する。かかる傷害，疾患，治療は免疫能低下にも繋がることを特徴とする。
　例えば骨髄移植を受けた患者では、移植前後の放射線および／または化学療法は移植片対宿主疾患の頻発と協同して異化性で重篤な栄養傷害を惹起する。このような患者では、口腔・食道粘膜炎，下痢，悪心，嘔吐，口腔乾燥症，味覚傷害を含む多くの要因に起因して中心静脈栄養法（ＴＰＮ）が必要となる（Ｃｕｎｎｉｎｈｇａｍら、
Ｎｕｒｓ．Ｃｌｉｎ．Ｎ．Ａｍｅｒ．
　上記した様々な原因に起因する異化反応，胃腸障害，免疫能低下は、死亡および身体傷害の主因となる可能性がある。これらの臨床的状態は、非必須アミノ酸であるグルタミン（ＧＬＮ）の代謝異常と関連することが多い。ＧＬＮ　は大部分の組織である程度合成可能である。ほとんどのアミノ酸と異なり、ＧＬＮ　は２つのアミン部分を有する。すなわち、αアミノ基とアミド基である。アミド基を持つので、ＧＬＮ　は体内の未梢組織からアンモニアを除去し、窒素を内蔵器官に運ぶことができる。さらに、血中から　ＧＬＮ　を除去する組織は炭素骨格をエネルギー産生に利用することが多い。
　グルタミナーゼとグルタミン合成酵素は、ＧＬＮ　代謝の調節に関与する２種の主な酵素である。グルタミナーゼは　ＧＬＮ　のグルタミン酸塩とアンモニアへの加水分解を触媒し、グルタミン合成酵素はグルタミン酸塩とアンモニアから　ＧＬＮ　の合成を触媒する。ほとんどの組織はこれらの酵素を両方とも有するが、特定の組織によっては一方が他方より活性が高いのが普通である。
　ＧＬＮ　の合成と輸送は主として骨格筋と脳で起こる。次に、ＧＬＮ　は線維芽細胞，造血細胞，リンパ球，腸上皮，腫瘍細胞のような増殖性細胞により消費される。これらの細胞は、グルタミナーゼ活性が高く、細胞内　ＧＬＮ　濃度が低いのが特徴である。この事実は、大きな創傷，感染に伴なう炎症、通常の経腸栄養を妨げる胃腸障害を持つ患者では臨床的に重要であると思われる。何故なら、これらの状況下で細胞型が望ましい増殖を示すかいなかは、充分な　ＧＬＮ　濃度が有るかどうかに依存すると思われるからである。
　胃腸においては　ＧＬＮ　は呼吸の燃料として用いられる。ＧＬＮの腸内投与は腸粘膜による内腔　ＧＬＮ　取込みの増大をもらたし、同時に血中からの　ＧＬＮ　取込みの低下をもたらす。したがって、腸による　ＧＬＮ　の消費は、これら２つの　ＧＬＮ　供給源で平衡を保っている。
　胃腸による　ＧＬＮ　取込みのほとんどは、小腸の絨毛を覆っている上皮細胞を経由して発現する。小腸で起こる　ＧＬＮ　代謝は腸の主要なエネルギー源であり、他の組織からの窒素と炭素を処理することにより、肝での尿素生成と糖新生のための前駆物質を産生する。
　Ｂａｓｋｅｒｖｉｌｌｅ　ら（
Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，
６１
　Ｍａｒｔｉｎ　ら（米国特許第２，２８３，８１７号）は、食事補助剤でなく、解毒剤として用いられる　ＧＬＮ　含有組成物を開示している。この特許においては、ＧＬＮ　が他のアミノ酸と相乗作用を期待して組み合わされ、毒素に直接作用して有害作用を阻害する。
　Ｓｈｉｖｅ　ら（米国特許第２，８６８，６９３号）では、消化性潰瘍治療用の　ＧＬＮ　含有組成物が開示されている。
　ＧＬＮ　の保護作用についての証拠は、さらに　Ｏｋａｂｅ　ら、
Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ
２０
　非必須アミノ酸である　ＧＬＮ　は標準的な非経口栄養溶液中には存在しないが、小腸にとっては好ましい酸化燃料であり（Ｗｉｎｄｍｅｕｌｌｅｒ，Ｈ．Ｇ．，
Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｌ
５３
Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｆｏｒｕｍ　３７
Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．３５
Ｓｕｒｇｅｒｙ，９４（２）
Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
　現在では、十分に摂食できない患者に必要な栄養は経腸または非経口食の投与で得られる。経腸食は通常、鼻腔を経て胃または十二指腸領域に挿入するか、または例えば胃瘻造設術や空腸瘻造設術におけるように外科的に植込んだ小口腔のチューブを用いて与えられる。現在利用可能な腸栄養処方は４種類に区分できる。すなわち、成分アミノ酸，ポリマーアミノ酸，モジュラーアミノ酸，変質アミノ酸である。これらの処方には　ＧＬＮ　が含有されている。しかしながら、これらの腸栄養食中の栄養分の含量は一般的に健常人の必要栄養に基づいており、異化性疾患患者の必要栄養には基づいていない。
　成分処方は最低限の消化作用を必要とし、主として小さいペプチドおよび／またはアミノ酸，ブドウ糖オリゴ糖類，植物油または中鎖脂肪から成る。
　ポリマー処方では、例えば大豆蛋白，ラクトアルブミン，カゼインのような複合栄養素が蛋白源として、アルトデキストリンやコーンシロップ固形物が炭水化物源として、植物油や乳脂肪が脂肪源として用いられている。
　モジュール食は、蛋白，炭水化物または脂肪をモノマーあるいはポリマー処方と組み合わせることにより調製でき、特殊な栄養要求に応えることができる。
　変質アミノ酸組成物から成る処方は主として、窒素代謝の遺伝的欠陥や窒素蓄積の後天的傷害を持つ患者に使用される。この目的は、有害と思われるある種のアミノ酸の取込みを制限することが多い。
　非経口食は普通静脈内投与（ｉ．ｖ．）される。これらの静注液は、容易に同化できる糖類，アミノ酸，電解質のような単純物質から成る無菌溶液である。
　“中心静脈栄養法”（ＴＰＮ）という用語は、総ての必要栄養量を静脈経路から得る患者に用いられる処方を表わす。ＴＰＮ　用の処方は経腸栄養処分と異なり、通常は　ＧＬＮ　を含有しない。非経口処方に　ＧＬＮ　が存在しない理由は、室温でそれが不安定であること、アンモニアとピログルタミン酸が投与後に生成されること、についての懸念にもある。ＧＬＮ　からのグルタミン酸生成についても懸念があった。その理由は、グルタミン酸が神経伝達物質として毒性を有する可能性があるからである。実際には、経腸および非経口栄養溶液の　ｐＨ　値では、それらの懸念に充分な理由があるとは考えられない。
　ＴＰＮ　は絨毛萎縮をもたらすが、この現象は一般には経口による摂食に戻れば正常化する。ＴＰＮ　処方は　ＧＬＮ　を欠いているので、このアミノ酸に対する体内の要求は体内組織の合成経路により満たされなければならない。
　臨界的な疾患の患者では、正味の蛋白異化は著明な筋　ＧＬＮ　貯蔵の減少、血漿中　ＧＬＮ　の低下（Ａｓｋａｎａｚｉ　ら、
Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１９２
Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．，１９１
Ａｒｃｈ，Ｓｕｒｇ．，１２０
Ｓｕｒｇｅｒｙ，９４（２）
Ｓｕｒｇｉｃａｌ　Ｆｏｒｕｍ，３４
　ＴＰＮ　は、胃腸粘膜萎縮に加え膵臓重量減少と膵外分泌低下と関係がある（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｃ．Ａ．　ら、
Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　５９
Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　６８
Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３３
Ａｍ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．１２６
Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．５０
Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４９
Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４６
Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｔｒａｃｔ
Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４５
Ｓｕｒｇｅｒｙ　１０４（５）
　骨格筋の衰弱，腸絨毛・膵臓の萎縮，透過性亢進をもたらす腸壁の衰弱，免疫能低下、または　ＴＰＮ　下に発現するその他の異化機能不全は、高濃度は　ＧＬＮ　の投与により防止できることを示した従来の研究はない。
　　　
発明の要約
　本発明においては、腸粘膜・膵臓萎縮を含む異化性腸管関連疾患（異化機能不全），腸透過性亢進，宿主防衛能傷害，免疫能低下（各々癌放射線療法・化学療法または静脈内栄養法に関連する）を示すか、示す危険のある動物、または骨髄移植下の動物に治療有効量の　ＧＬＮ　が投与される。この　ＧＬＮ　量は健常人の食事に通常存在している量より多い。この増加量の　ＧＬＮ　は、ある種の異化機能不全で必要とされる多量の　ＧＬＮ　を補うのに必要である。外からの供給源が無い場合、ＧＬＮ　は上記の異化傷害下の筋組織の分解により得られると思われる。異化機能不全下で筋肉からの　ＧＬＮ　放出が亢進するにも拘らず血漿中　ＧＬＮ　濃度が低下するのは、全身性の　ＧＬＮ　欠乏があることを示している。筋肉からの　ＧＬＮ　放出の亢進にも拘らず、腸粘膜細胞の需要は供給を上回っている。このため、腸絨毛萎縮と腸壁関門の分解が起きやすくなる。この関門の喪失は、腸管関連組織や他のリンパ様組織における免疫能低下と共に感染の重量な素因となる。腸損傷に加え、膵萎縮は同様の状況下でも発症する。
　したがって、本発明は、動物における腸粘膜・膵萎縮を含む異化性腸管関連疾患，腸透過性亢進，宿主防衛能傷害，免疫能低下を治療し、骨髄移植からの回復を促進する方法を提供する。本法は、上記動物に治療有効量の　ＧＬＮ　または　ＧＬＮ　の機能性同族体を投与することから成る。
　ストレスを受けている患者に外因性　ＧＬＮ　を与えると、小腸の代謝要求と免疫系が一層良好に支持され、全身的な蛋白異化の速度が低下する。骨髄移植を受けた患者への　ＧＬＮ　投与は、放射線／化学療法，移植片対宿主疾患、および　ＴＰＮ　に引続く胃腸障害や免疫能低下を改善するのに特に有益である。炎症性腸疾患の患者への　ＧＬＮ　投与も有益である。
　炎症性腸疾患における糖質コルチコイドの治療効果は、その抗炎症作用だけでなく、腸を覆う腸細胞内部での基質代謝を増大する作用にも関連がある。腸細胞に対し一層多量の基質を供給することによる外因性　ＧＬＮ　の投与はまた、血漿および骨格筋の　ＧＬＮ　欠乏を予防することにも貢献する。同様に、ＧＬＮ　は腸未熟の幼時における移植小腸の生着を促進するか、腸代謝を補助すると思われる。
　　　
図面の説明
　第１図は、窒素取込みの関数としての窒素平衡をプロットした図である。
　第２図は、動脈血中の総分鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）濃度を　ＢＣＡＡ　投与速度と比較した実施例５のデータのグラフを示す。データは平均値±ＳＥＭ　を示す。生理食塩水を投与した動物でのデータは含まれていない。
　第３図は、ＢＣＡＡ　流出（後四分体）と　ＢＣＡＡ　注入との関係を示す実施例５のデータのグラフを示す。
　第４図は、術後６時間目の　ＢＣＡＡ　流出（後四分体）と動脈血中　ＢＣＡＡ　濃度の増加を比較した実施例５のデータのグラフを示す。
　第５図は、術後６時間目の窒素流出（後四分体）と　ＢＣＡＡ　流出（後四分体）を比較した実施例５のデータのグラフを示す。
　第６図は、術後６時間目の窒素流出（後四分体）と術後２４時間目に測定した筋細胞内アミノ酸窒素の変化を比較した実施例５のデータのグラフを示す。
　第７図は、同種骨髄移植後の累積窒素平衡に対する高用量　ＧＬＮ−ＴＰＮ　の影響を証明するデータのグラフを示す。
　　　
好適な実施態様の簡単な説明
　本発明者らは、腸粘膜・膵萎縮を含む異化性腸管関連疾患（異化機能不全），腸透過性亢進，宿主防衛機構傷害，免疫能低下を治療する新規な方法を考案した。本発明は、上記の疾患のいずれかに羅患しているか、それを発症する可能性のある動物に治療有効量の　ＧＬＮ　またはその機能性同族体を投与することから成る。この治療有効量は、通常の食事に含まれている量より大きい。ヒトでの通常の食事からの取込み量は、ほぼ２〜４ｇ／日である。
　異化機能不全は、解剖学的構造の分解が起こる正味の異化反応を惹起する状態である。ＧＬＮ　の食餌による投与により、身体が　ＧＬＮ　を合成する必要がないか、骨格筋の分解により　ＧＬＮ　を得る必要がないように、異化異常下での生化学的必要量を満たすようである。
　本発明は、ＧＬＮ　の必要性が増大している全ての異化機能不全に用いることを意図している。このような異化機能不全は、消化管の臓器や細胞、または他の細胞や臓器系と関連がある可能性がある。非経口食投与中の小腸絨毛の萎縮は通常は、腸細胞に対する直接的な異化作用に起因して発現するのではなく、むしろ患者の食事中に　ＧＬＮ　が欠けていることに起因する。
　“経腸”とは、胃と肛門の間の消化管の部分に栄養を投与する方法を指す。
　“非経口”とは、消化管外の領域に栄養分を投与する方法を指す。
　ＧＬＮ　要求の増大を示す非経口的異化機能不全は、敗血症を含む多くの臨床的異常，術中・術後，火傷，カロリー欠乏，制御不能の糖尿病において発現する。
　本発明が有効な動物は通常、人を含む哺乳類に分類される動物である。
　“病的腸透過性”とは、病的状態に伴なう腸壁透過性の亢進を指す。例えば胃に導入したラクツロースの吸収や尿中排泄等の各種手段により検出できるそのような腸透過性は、癌化学療法剤の投与，ＴＰＮ　，その他の損傷や病的状態と関係がある。
　“治療”とは、病的状態を構成する症状または症候群の予防，改善または治療を意味する。
　“膵臓萎縮”とは、膵臓組織または膵臓機能の喪失を指す。
　“免疫能低下”とは、免疫学的機能の減弱を指し、これは試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）か生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で測定できる。このような機能には、光源または分裂刺激物質に応答したリンパ球増殖，抗体反応，細胞性免疫反応（遅発性過敏性反応等）が含まれるが、これらには限定されない。免疫能低下の様々な形態（この用語で意図されたもの全て）は、病原性微生物のような種々の病原体に対する宿主防衛機能の低下をもたらす恐れがある。免疫能低下は化学療法剤による治療から派生する良く知られた結果であり、ある形態の物理的外傷，火傷，栄養不良，糖尿病，その他の病的状態から起こる結果でもある。
　“宿主防衛機構障害”とは、細菌，ウイルス，真菌を含む（但し、これらに限定されない）各種病原微生物による感染に対する感受性の増大を表わす。このような障害は腸壁関門の衰弱から発現し、通常は病原体が粘膜関門を経由し腸内腔から進入するのを防ぐことを可能にする。そのような障害は免疫能低下から起こると思われる（この低下状態では、免疫系の細胞が有する病原体の抗原構造に応答する能力が抑制される）。宿主防衛機構障害は、他の細胞が有する機能の異常（白血球遊走能、食作用，細菌作用等の低下、マクロファージ機能の変質、その他の先天的宿主抵抗機能の異常−これらは従来良く知られている）にも由来する（Ｍｉｍｓ，Ｃ．Ａ．，
Ｔｈｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ
　様々な細胞型の生存または増殖のために組織培養の培地中に　ＧＬＮ　が必要であることは、従来から良く知られている（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，
ＣＵＬＴＵＲＥ　ＯＦ　ＡＮＩＭＡＬ　ＣＥＬＬＳ，Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｂａｓｉｃ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ
ｉｎ
ｖｉｔｒｏ
ｉｎ　ｖｉｖｏ
　本発明の方法が有効な機能不全または症状に適用される“実質的に関係する”という用語は、機能不全中・不全後に生化学的な　ＧＬＮ　要求が起こるような場合を指す。
　ＧＬＮ　の投与は経腸と非経口の両方法により行うことができる。
　ＧＬＮ　の経腸投与法の具体例は、経鼻的に胃または十二指腸領域に挿入するか、または胃瘻造設術や空腸瘻造設術のような場合に外科的に植込んだ小径のチューブの使用である。
　非経口投与法の具体例は、皮下，筋肉内または静脈内注射、および鼻咽頭，粘膜または経皮吸収を含むが、これらには限定されない。ほとんどの症例では　ＧＬＮ　は静脈内投与される。静脈内投与では、液状の治療有効量の　ＧＬＮ　を容器から直接投与する。すなわち、容器からチューブが伸びており、これが注射針に接続され、この注射針が患者の大静脈に刺入されるのである。
　どの投与経路を用いるにせよ、ＧＬＮ　は単独または食事補助剤として投与できる。食事補助剤として用いられる場合、患者に投与する前に　ＧＬＮ　を既存の経腸または非経口食と混合できる。ＧＬＮ　を食餌の他の成分と直接混合せずに投与することも可能である。例えば、ＧＬＮ　を主な静注用ビンに直接添加せず、ピギーバックビンを用いた通常の容器に添加するような静注法である。
　ＧＬＮ　の機能性類縁体，誘導体，置換体，異性体，同族体等の　ＧＬＮ　の特性を有するものは、ＧＬＮ　と同等と考えられる。好適なのは、アミノ基を供与でき、クレブス回路で代謝可能な類縁体である。最も好適なのは、炭素鎖の一末端にアミノ酸残基を、他の末端にアミノ部分を持つ化合物である。
　ＧＬＮ　投与の治療有効容量範囲は、代謝のホメオスタシスを維持するために体内組織の異化または萎縮を防止するのに充分な量である。経腸食では、ＧＬＮ　は０．３ｇ／体重ｋｇ／日以上で投与されるであろう。このような投与速度は、０．３〜２．０ｇ、好ましくは０．３〜１．５ｇ、より好ましくは０．４〜１．０ｇ／体重ｋｇ／日にできるであろう。静脈内投与時の　ＧＬＮ　投与速度は０．１ｇ／体重ｋｇ／日以上であろう。すなわち、０．２〜３．０、好ましくは０．３〜２．５、より好ましくは０．４〜２．０ｇ／体重ｋｇ／日であろう。
　本発明の方法によれば、ＧＬＮ　は、単に既存の食餌処方を適切な濃度の　ＧＬＮ　を含有するように変えることにより投与できると思われる。最も好適には、ＧＬＮ　を無菌の乾燥凍結粉末のような乾燥形状にしておき、投与時に無菌的に水に溶解した後に食餌組成物の他の成分と適切な濃度で混合させる。あるいは、ＧＬＮ　を乾燥処方物の他の成分と予備混合し、投与時に無菌的に水に溶解するか；または凍結乾燥濃縮品として保存しておき、これを使用的に溶解し、適当な濃度で混合する。
　本発明に従う方法による　ＧＬＮ　の使用は、理想的には組成物の調製に適している。これらの組成物は　ＧＬＮ　，ＧＬＮ　含有ジペプチド，ＧＬＮ　塩から成り、これらの成分を単独、または他の化学物質と混合して用いればよい。このその他の化学物質とは、薬学的に許容できる担体や、他の食餌の有効成分（例えば遊離アミノ酸，蛋白水和物、またはオイル）でよい。
　非経口的投与用の薬剤は、無菌の水性または非水性溶液，懸濁液，乳濁液を含む。担体または密封包帯は皮膚透過性を増大し、皮膚からの吸収を高めるのに使用できる。
　本発明はさらに、本発明の成分から成る薬剤または医薬組成物にも関する。この薬剤は、異化機能不全，腸管関連疾患（腸粘膜・膵萎縮を含む），腸透過性亢進，宿主防衛機構障害，免疫能低下を治療し、骨髄移植からの回復を促進するのに用いられる。
　本発明は、異化機能不全を予防または改善する　ＧＬＮ　に富む組成物にも関する。ＧＬＮ　に富む組成物は、治療に有効であり通常食中の量より多い濃度の　ＧＬＮ　を含有する。
　本発明の組成物を入れる容器は、本発明の方法に従う　ＧＬＮ　の投与を容易にするために用いることができる。これらの容器は、例えば患者に投与される　ＧＬＮ　の日用量を入れるように考えられている。
　ＧＬＮ　単独で、または他のアミノ酸と併用して静注するのに適した容器は特に有用である。このような容器は、液状の　ＧＬＮ　含有組成物の容器と、注射針に接続できる液体輸送手段から成る。
　液体輸送手段は、容器中の液状組成物をプラスチックチューブのような注射針に輸送できるものなら何でもよい。
　上記輸送手段に接続された注射針は、直接患者の血管または静注用カテーテルに刺入できるか、または患者に投与する前に他の溶液と混合できるよう輸注ビンに刺入できる。
　上述の開示は一般的に本発明を説明したものである。本発明をより完全に理解するには、以下の特定の実施例を参照されたい。但し、これらの実施例は単に例示のために設けられたものであり、特記しない限り本発明に限定を加えるためのものではない。
実施例１
動物の世話と手術手順
　体重２０から４０ｋｇの２２匹の雑種犬を農場から手に入れた。その農場では雑種犬を規則的に運動させ、そして寄生虫（ｐａｒａｓｉｔｅｓ）の有無をスクリーニングしてあった。すべての雌犬は妊娠していなかった。一方犬舎においては、これらの動物をハーバート医学校の動物に関する委員会および実験動物資源研究所の実験動物の世話と利用に関するガイドライン、国立研究評議会（ＤＨＥＷ　発行、＃ＮＩＨ７８−２３、１９７８年改討）のガイドラインに従って飼養した。これらの動物は２４時間光が照射され、２０℃の一定温度の個別の犬舎に飼った。これらの動物を毎朝２時間運動させ、任意量（ａｄ　ｌｉｂｉｔｕｍ）の水を与え、そして（蛋白質を少なくとも２５％、脂肪１０％、かつ残りのカロリー源は炭水化物として含む）アッグウエイ・レスポンド（Ａｇｗａｙ　Ｒｅｓｐｏｎｄ）２０００　ドライ・ドッグ・チャウ（Ｄｒｙ　Ｄｏｇ　Ｃｈｏｗ：登録商標）を食料として午後１時から３時の間に与えた。５日から７日間、犬小屋の状態に順応させて、この期間内においてこれらの動物をパブロフ台（Ｐａｌｏｖ　ｓｔａｎｄ）に静かに休むように訓練した。基礎サンプルを入手する前日の午後５時にすべての食物を犬小屋から除去した。一晩食物を断った後、犬を少なくとも２０分間歩かせパブロフ台に乗せ、前肢静脈にカニューレを挿入した。犬を少なくとも２０分間パブロフ台で休ませた後、静脈血サンプルをアミノ酸の定量のために採取した。チオペンタール・ナトリウム（アボット研究所（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、５ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈注射を用いて麻酔を急速に誘発させた後、外側広筋の生検を、ベルグストローム（Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６：ｐｐ６９３〜６９７（１９７４）の方法によって得た。その後、この動物を台から下引し５ｍｌ動脈血サンプルを、経皮的穿刺（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ　ｐｕｎｃｔｕｒｅ）により大腿動脈から採取した。
　標準的手術手順の前に、この動物を最低２日間かけて生検から回復させた。外科手術の前の日に、再びすべての食餌を午後５時に犬小屋から取り除いた。午後７時に、犬を２０分間歩かせ手術室に運び、そこでペントバルビタール・ナトリウム（アボット研究所、３０ｍｇ／ｋｇ体重）を静脈内に注射して麻酔をかけた。気管内チューブを置いて、犬に酸素および部屋の空気との混合物を自発呼吸させた。この犬を仰臥位の手術台上に置いてカニューラを経皮的穿刺によって外頚静脈に入れ、上大静脈内に注入した。開始時間を記録した後、注入液を４ｍｌ／ｈｒ／ｋｇの一定の注入量（ＩＭＥＤ　ポンプ（登録商標）、カルフォルニア州サンディエゴ市でこのカニューラを介して投入した。ペニシリンＧ（Ｅ．Ｒ．スクウィッブ（Ｓｑｕｉｂｂ）、プリンストン、ＮＹ；６００ｍｇ）とケフリン（登録商標）（イーライ・リリィー（Ｅｌｉ　Ｌｉｌｌｙ），インディアナポリス，ＩＮ；１ｇｒａｍ）を静脈内に注入した。膀胱にカテーテルを挿入し、初期の尿サンプルを捨て、カテーテルを２４時間採取できるように密閉尿バックに接続した。この犬の腹部と横腹の毛をそり、皮膚を石鹸と水とで洗浄し、ポビドンヨウ素プレップ（ｐｒｅｐ）溶液（クリニパッド（Ｃｌｉｎｉｐａｄ）Ｃｏｒｐ．，ギルフォード（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ），ＣＴ）を用いて支度を整えた。この犬を減菌シートで覆って、腹腔を雌の場合垂直臍下切開し、雄の場合、右正中傍（ｐａｒａｍｅｄｉａｌ）切開した。腸を上腹部の方へ後退させ、露出した腹膜後腔を切開した。右の深位の弓状湾曲腸骨動脈および静脈と中央仙骨動脈を鋭く切開して分離した。シラスティック（ｓｉｌａｓｔｉｃ）で被覆して２．８ｍｍＯＤポリエチレン・カテーテルに接続したポリエチレン管（２．０８ｍｍＯＤ）の６ｃｍの断片からなる特別に調整したカテーテルを、右の深位の弓状湾曲腸骨動脈を介して大動脈に頭蓋から６ｃｍ挿入した。先端が大動脈分岐に１ｃｍ近位にあるが、下腸間膜動脈の遠位に位置する中間仙骨動脈を介して大動脈に同様のカテーテルを、頭蓋から挿入した。第３番目のカテーテルを、右深位にあって腎静脈の遠位に位置する弓状湾曲腸骨静脈を介して、挿入した。すべてのカテーテルを、動かないようにして横腹の刺傷を介して体外に取り出した。その後、腹部をふさぎこの動物を左側に向きを変えた。外側のカテーテルを適宜な長さに切断し、間欠性注射ポート（ｐｏｒｔｓ）（ジェルコ（Ｊｅｌｃｏ：登録商標）、クリチコン（Ｃｒｉｔｉｋｏｎ）社、タンパ（Ｔａｍｐａ）ＦＬ）に接続された鋭い注射針でプラグをして、食塩水を用いて洗い流して、ヘパリン（１，０００ユニット／ｍｌ）で満たし皮下に外側のカテーテルを埋め込んだ。注射ポート（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｐｏｒｔｓ）は、この動物の横腹上に高く、皮膚下で脊柱の近傍に位置している。これにより、カテーテルの注射ポート（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ　ｐｏｒｔｓ）の経皮穿刺によって大動脈および大静脈への接近を容易にした。ケフリン（Ｋｅｆｌｉｎ：登録商標，１グラム）を、静脈カテーテルを介して手術後８時間後と２４時間後に２回さらに投与した。
　手術手順に続いて、この動物を横たえ、麻酔からの回復の間中、熱ランプと毛布で体温を維持した。注入を開始して後約５時間経てから、この動物をパブロフ台に置いて、ｐ−アミノ馬尿酸溶液（ＰＡＨ、食塩中０．５％ｗ／ｖ）を、ハーバート・ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　ｐｕｍｐ）を用いて０．７６ｍ　ｌ／分の速度で、医用仙骨動脈カテーテルを介して遠位大動脈中に注入した。色素を注入してから４０分後、同時に動脈サンプルおよび静脈サンプルを、アミノ酸濃度およびＰＡＨ濃度の測定のために採取した。３組のサンプルを２０分の期間にわたって１０分間隔で吸い出した。その後、カテーテルを水で洗浄し、ヘパリンで満たして、この動物をパブロフ吊り包帯にくるんだ。実験開始後２３時間を経てから、後四分体流出（ｈｉｎｄｑｕａｒｔｅｒ　ｆｌｕｘ）実験を繰り返した。２４時間後、尿の採取を止めた。この動物は静脈経由でにチオペンタール・ナトリウムを前記のように投与されて、前に生検しなかった足の外側広筋の生検を行った。静脈内注入をやめて、この動物を続く２４時間代謝ケージの中に入れた。同ケージでは、この動物に任意量の水を与えたが、食物は与えなかった。
実施例２
注入液
　すべての動物に４ｍｌ／ｈｒ／ｋｇの速度で注入した。５匹の対照動物を０．９％の食塩水に入れた。他の動物は、約０．３１２（Ｎ＝２）または０．６２４（Ｎ＝６）グラムの窒素／２４ｈｒ／ｋｇ体重を与えるように予定した２つの異なった濃度の市販アミノ酸溶液（フレアミン（ＦｒｅＡｍｉｎｅ　ＩＩＩ（登録商標）、アメリカン・マックグロウ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｃｇｒａｗ））を与えた。高投与量は４グラム当量の蛋白質／２４ｈｒ／ｋｇ体重を与えるような意図で行った。３匹の動物を０．３１２グラムの窒素／２４ｈｒ／ｋｇにある　ＧＬＮ　を含有する溶液に入れた。最後の群（Ｎ＝６）は、ＧＬＮ　とフレアミンの等量混合物に入れ、窒素として０．６２４グラム／２４ｈｒ／ｋｇ与えた。ＧＬＮ　溶液を、蒸留水中でＬ−ＧＬＮ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セント・ルイス，ＭＯ）によって溶解し、０．１５７モル溶液を調整し、その後、水酸化ナトリウムでｐＨ＝６．８に調整した。この溶液を０．２２μＭの膜を通して濾過によって滅菌し、４℃で２４時間未満貯蔵した。利用する際の朝に、これらの溶液を、２リットル・バッグ中で必要とする濃度で配合し、使用するまで４℃に維持した。注入の最後にそれぞれのバッグから１０ｍｌの溶液を取り出して、窒素含有量の分析のために−２０℃で貯蔵した。さらに１０ｍｌのサンプルを、前記のようにｐＨ＝４．７５に調整して、ＧＬＮ　含有量の分析のために冷凍貯蔵した。
実施例３
サンプルの調整と分析
　全ての血サンプルと血漿サンプルを氷冷１０％（ｗ／ｖ）過塩素酸の等体積を配合することによって脱蛋白し、その後、２０分間４０℃において３，０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）２ｍｌを、０．２Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．９０）を用いて緩衝して、５Ｎの水酸化ナトリウムを用いてｐＨ＝４．７５〜４．９０に調整し、蒸留水で最終的な体積を４ｍｌにした。これらのサンプルを、ルンド（Ｌｕｎｄ）（ベルグマイヤ（Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ）編集、Ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，第４巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９７４，ｐｐ．１７１９〜１７２２）の方法を変形した酵素ミクロ蛍光分析を用いて　ＧＬＮ　濃度およびグルタミン酸塩濃度を後でバッチ分析するために−２０℃に貯蔵した。
　筋肉生検手順の間、組織を除去した時、ストップ・ウオッチをすぐに始動させた。脂肪と結合組織のない筋肉を切り裂いて、２片の不等量部分に分けた。両者のサンプルの重量を、その後の２分間にわたって少なくとも４回計り、生検に続く重量と時間とを記録した。実際の時間ゼロにおける筋肉の湿重量（ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ）を、時間に対してプロットした重量の最適直線回帰推定から計算した。小さなサンプル（約１５ｍｇ）を９０℃のオーブンにおいて恒量に乾燥して、乾燥した脂肪のない固形物の重量を、石油エーテル中で抽出後採取した。その後、このサンプルを２５０μｌの１Ｎ硝酸中に温浸し、塩素含有量を半自動式滴定器（ラジオメータ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ）、コペンハーゲン）を用い硝酸銀で測定した。血漿の塩素もまた定量し、細胞内水および細胞外水を、同上のベルグマンの方法を用いて計算した。第２番目の筋肉サンプル（約１００ｍｇ）を、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジネーター（ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎ）、ウエストベリ（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ）、ＮＹ）を用いて、氷冷した０．５ｍｌの過塩素酸（１０％　ｗ／ｖ）でホモジネートした。このホモジメートを遠心分離して、上澄み液を酵素性　ＧＬＮ　およびグルタミン酸塩の分析のために調整した。
　本実験の始めに、血漿濃度と細胞内　ＧＬＮ　濃度とグルタミン酸塩濃度を、前に記載した酵素的方法（Ｍｕｈｌｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒａｎｌ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２４７：Ｅ７５〜Ｅ８３（１９８４））を用いて定量した。他のアミノ酸の濃度を、ｏ−フタルアルデヒドを用いてカラム前誘導した後、自動高速運転液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて定量した。ＧＬＮ　，グラタミン酸塩，プロリン，システイン、およびリジンを除いて、蛋白質に通常見いだされる全アミノ酸を定量した。研究が進むにつれて、ＨＰＬＣ　を用いて　ＧＬＮ−グルタミン酸塩測定のために技術を発揮させた。２つの技術（酵素分析と　ＨＰＬＣ）によって測定したサンプルは、匹敵するグルタミン−グルタミン酸塩濃度を与えた。従って、ＨＰＬＣ　分析だけを、研究の後の箇所で用いた。動脈中および静脈中のサンプルにおける　ＰＡＨ　の濃度を５％のトリクロロ酢酸（Ｍｕｈｌｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，同上）を用いて脱蛋白後、分光光度分析によりした。
　２４時間の注入の間に排出された尿を、密閉尿採取系に採出して、酸性化した冷凍容器中において貯蔵した。アリコートを、バッチ分析のために−２０℃に冷凍した。注入溶液および尿の窒素含有量を、マクロ・キェルダール法（Ｐｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　ｖｏｌ．２，　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，．１９３２年，ｐｐ．５１６〜５３８）によって、同じバッチ内において定量した。
　統計的計算を、標準統計パッケージ（Ｍｉｎｉｔａｂ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ　Ｓｔａｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｔａｔｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，ＰＡ，１９８３）を用いてＩＢＭ　４３４１コンピュータで実行した。その結果を平均±ＳＥＭ　で表現した。対別（ｐａｉｒｅｄ）および非対別（ｕｎｐａｉｒｅｄ）のスチューゲントのｔ−検定を適切なものとして用いた。分散の解析を多重群対照（ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｇｒｏｕｐ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）用に用いた。回帰分析を最小２乗法を用いて実行した。０．３１２グラムの窒素／２４ｈｒ／ｋｇを摂取する群においてサンプルの大きさが小さいために、ほとんどの統計的比較は他の群間に実行するだけであった。
　後四分体（ｈｉｎｄｑｕａｒｔｅｒ）の血流量を前記のように計算し（Ｍｕｈｌｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，同上）、流速を動物の大きさの変動を説明するために体重（ｋｇ）当たりで表わした。アミノ酸の流出速度を血流量と動脈と静脈の濃度差との積として計算した。サンプルの３つの組を抜き取り、流出量は各々の組について計算し、３個の値の平均を決定した（Ｍｕｈｌｂａｃｈｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，同上）。全体血，血漿，細胞内水における全アミノ酸窒素を各々のアミノ酸の窒素含有量を考慮に入れ、合計することによって計算した。
実施例４
血漿および細胞内アミノ酸濃度
　血漿アミノ酸濃度を、手術前および標準的手術後２４時間経過してから測定した。食塩水で措置した動物においては、血漿の全窒素含有量は手術手順によって変化しなかった（表Ｉ）。ＧＬＮ　濃度は一定で留まったが、ＢＣＡＡ　の濃度は上昇し、それらの濃度の合計は、３６２±２１から５０１±９μｍｏｌ／ｌ（ｐ＜０．０１）に上昇した。０．６２４グラムのＮ／２４ｈｒ／ｋｇを摂取する動物においては、血漿窒素濃度が上昇する傾向にあった。このことはアミノ酸および　ＧＬＮ　の混合物を摂取する群においてのみ統計的に有意であった。血漿　ＧＬＮ　濃度はこの群においても上昇した。ＢＣＡＡ　の濃度はアミノ酸注入を受ける全ての動物において上昇した。
　骨格筋肉の窒素濃度は、食塩水の注入の間減少した（表ＩＩ）。全アミノ酸窒素のこの減少は、ＧＬＮ　が２１．４８　±３．２１μｍｏｌ／ｌ細胞内水から１５．８６　±３．８０（ｐ＜０．０５）へ減少することにより直接的に反映されている。細胞内プール（ｐｏｏｌ）における非必須アミノ酸の全量は減少したが、細胞内プールの全必須アミノ酸の合計は変化しなかった。０．６２４グラムのアミノ酸窒素／２４ｈｒ／ｋｇを受ける動物においては、細胞内窒素および　ＧＬＮ　の変化は生じなかった（表ＩＩ）。統計的な有意性はアミノ酸および　ＧＬＮ　の混合物を摂取する動物においてのみ達成されるけれども、より高いアミノ酸負荷を注入することで、ＢＣＡＡ　の細胞内濃度は上昇する傾向にある。手術後のこれらの２つの群においては、必須アミノ酸および非必須アミノ酸の全濃度は有意的に変化しなかった。窒素の高投与を受ける動物と比較して、０．３１２ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇ注入された５匹の動物は、注入された溶液にも拘らず、骨格筋肉細胞内窒素プール（ｐｏｏｌ）を一貫して存続しなかった。細胞内　ＧＬＮ　は３匹の動物において減少し、１匹においては変化せず、１匹については増加した（データは示さない）。
　このように、ＧＬＮ　を有するか、または　ＧＬＮ　を有しないアミノ酸混合物としてのアミノ酸を０．６２４ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇを与え、骨格筋細胞内アミノ酸プールを維持した。細胞内の　ＧＬＮ　の減少によって特徴付けられる細胞内プールにおける減少は、食塩水を摂取する動物において一貫して発生し、低投与量のアミノ酸を摂取する動物においては変動した。個々のアミノ酸窒素流出（ｆｌｕｘ）の合計として計算される正味の後四分体アミノ酸の流出（ｆｌｕｘ）は、食塩水を受け入れる物質における手術後６時間で測定した時、平均して−１９．０５±４．０６μｍｏｌ　Ｎ／ｍｉｎ／ｋｇとなる。これは、０．６２４ｇｍのアミノ酸／２４ｈｒ／ｋｇを受け入れる２群の動物において観測される−７．７０±５．９および−６．５０±１．１８μｍｏｌ　Ｎ／ｍｉｎ／ｋｇの流出速度よりも著しく大きい。しかしながら、後四分体からの　ＧＬＮ　の流出は、３群について変化しなかった。これに対して、ＢＣＡＡ　は、食塩水のみ摂取する犬において放出されるが、高投与量のアミノ酸を摂取する２つの群の動物においては吸収される。ＢＣＡＡ　の後四分体輸血は　ＢＣＡＡ　の投与速度と関係しているように思える。すなわち、後四分体は、食塩水で措置した群における　ＢＣＡＡ　の放出、アミノ酸および　ＧＬＮ　を含有する溶液との平衡および最高の　ＢＣＡＡ　投与を受け入れる群における摂取を証明している。０．３１２ｇｍ／２４ｈｒ／ｋｇを受け入れる５匹の動物において、食塩で措置した犬に匹敵する後四分体の窒素の流出においては著しく変化しなかった。しかしながら、これらの流出（ｆｌｕｘ）のデータにおいてかなりの変動があり、研究している動物の数は少ない。手術後２４時間の実験の後四分体アミノ酸流出は群間に相違がない（表ＩＩＩ）。
　食塩水と共に浸出される５匹の動物中の窒素排出は、０．４９２±０．２２ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇであった。市販のアミノ酸混合物の高投与量を受けた６匹の動物では、測定窒素摂取量は０．６３２±０．００１ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇであり、窒素排出は平均０．６８４±０．０３１（表ＩＶ）であった。１／２量の市販アミノ酸溶液と１／２　ＧＬＮ　からなる溶液を摂取した６匹の動物では、窒素摂取量は排出に匹敵するが、排出の方が多く、平均０．７７５±０．０１９ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇ（ｐ＜０．０５）であった。これらの２グループにおける窒素平衡は、食塩水を受けた動物において、それぞれ平均−０．０５２±０．０３１および−０．１４０±０．０２２ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇ未満のマイナス値であった。ほぼ０．３１２ｇｍ　Ｎ／２４ｈｒ／ｋｇを受けた５匹の動物では、平均窒素排出は食塩水対照で観察された値と、大量の注入窒素を摂取した動物で観察された値との中間であった。総合すれば、これらの研究によれば、窒素平衡は、投与された窒素増加量として、平衡に近付くことが示された（図１）。
　ＧＬＮ　が市販の　ＧＬＮ　フリーのアミノ酸溶液と混合されると、窒素平衡における効果は付加的であった。合計すると、窒素は市販アミノ酸の注入に対応して保持されるか、または溶液が混合された場合は、保持窒素の代わりに　ＧＬＮ　単独が計算された。
　これらの研究によれば、犬における手術ストレスは、負の窒素平衡と、骨格筋肉の細胞内の遊離アミノ酸プールの落ち込みと協同して後四分体からのアミノ酸流出増加によって証明されるように、骨格筋肉の正味蛋白質崩壊を促進することが示される。先行研究によれば、蛋白質消費は、偏食や麻酔に関係しないが、明らかに手術ストレスに対する応答であることが示されていた（Ｋａｐａｄｉａ　等、サージカルフォーラム　３３：１９−２１（１９８２））。食塩水措置グループにおける手術後６時間の後四分体からのアミノ酸放出量は、慣性的にカテーテル注入で吸収させた後の、基礎的条件下で研究された犬において観察された値のほぼ６ないし８倍であった（Ｍｕｌｈｂａｃｈｅｒ　等、アメリカンジャーナルオブフィジオロジー２４７：Ｅ７５−Ｅ８３（１９８４））。この後四分体の窒素放出速度は、細胞内遊離アミノ酸プールの不足によって説明することができず、それ故、骨格筋の正味蛋白質分解量を表している筈である。
　手術前の期間アミノ酸を与えると窒素の損失を補い、血漿アミノ酸濃度を維持または増加させ、かつ骨格筋細胞内の遊離アミノ酸プールの低下を減少させる。これらの効果は注入されたアミノ酸窒素の量に関係すると思われる。アミノ酸を最大量投与したときに身体全体、および後四半部の窒素損失が著しく減少し、また細胞内の　ＧＬＮ　および他のアミノ酸のプールも維持された。これらの結果は、Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｒｙ　１９１：４６５（１９８０）において　Ａｓｋａｎａｚｉ　らにより報告された研究結果とは異なっている。彼らは、ｈｉｐ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　後において患者の細胞内の　ＧＬＮ　および他のアミノ酸濃度の低下は、ぶどう糖およびアミノ酸の注入によっては戻らなかったと報告しているのである。本発明の方法を用いて得られた結果は、この以前の知見が注入されたアミノ酸の量および／または注入物（ｉｎｆｕｓａｔｅ）中における　ＧＬＮ　の欠乏に関連していると思われることを示している。ＧＬＮ　のようなものを単独で用いた場合であり、またフレアミン　ＦｒｅＡｍｉｎｅ（登録商標）を用いた場合であれ、注入したアミノ酸濃度が低ければ（０．３１２ｇｍ　Ｎ／２４　Ｈｒ／Ｋｇ）、動物実験では３／５が細胞内にアミノ酸プールを維持することができなかった。これに対して、アミノ酸の注入速度を高くすれば、細胞内プールを安定化または増大できた。従って、窒素の投与量を適切に定めれば、手術後に骨格筋細胞内のアミノ酸プールを維持することができることと思われる。
　食塩水摂取動物における細胞内遊離アミノ酸プールの変化は　ＧＬＮ　の急激な減少に起因すること大である。食塩を注入した動物における細胞内遊離アミノ酸の変化は、適当量の窒素を用意することによって妨げられた。これは、ＧＬＮ　が商業的に入手できる溶液中に存在しなかった場合ですら起こった。これら環境下で細胞内　ＧＬＮ　が維持されるメカニズムは、ＧＬＮ　合成の　ＧＬＮ　基質がアミノ酸転移を介した　ＢＣＡＡ　から派生したことによると思われるが、明らかではない。理由は説明できないが、正味の　ＧＬＮ　流出量はすべての群で同様であった。ＧＬＮ　の後四分体放出は　ＢＣＡＡ　によっては促進されず、アミノ酸溶液中に　ＧＬＮ　等を用意しておくことによっては減少しなかった。この手術後のモデルの結果は、ＢＣＡＡ　の健常人について報告された効果とは異なっている。健常人では、ロイシンの経口投与に続く　ＢＣＡＡ　の上腕摂取は促進された　ＧＬＮ　の開放と関係していた（Ａｏｋｉ　らによる。Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　６５：１５２２（１９８１））。
　０．６２４ｇｍ　Ｎ／２４　ｈｒ／Ｋｇの速度で投与した２つのアミノ酸溶液の組成には明らかに違いはあるが、２つの動物群において後四分体の窒素放出は同等であった。これは、バランスされた溶液中の必須アミノ酸および　ＢＣＡＡ　の量を　ＧＬＮ　含有溶液中のそれの２倍としたときでも、同じであった。従って、手術ストレスの実験モデルにおいては、バランスされたアミノ酸の処方に　ＧＬＮ　を補充することは、後四分体損失を減少させる上で、少なくとも、標準的にバランスされた処方の少なくとも２倍の濃度と同程度に効果的であった。
　食塩を投与した犬では、ＢＣＡＡ　が骨格筋から放出された。これらのデータから計算される定量的輸送速度は、ＢＣＡＡ　の目立った吸収は、術後の早期を通じ、特に肝臓においてと思われるが、内臓の組織において生じる。ＢＣＡＡ　を用意することでは、おそらく内蔵の必要量を満たし、骨格筋流出を逆転させることによって、かかる転流が補われると考えられる。後四分体の窒素平衡と細胞内窒素プール量との間にも量的な関連がある。細胞内プールが維持されたときには、後四分体は窒素平衡状態に近かった。食塩を投与したときには、細胞内プールにおけるアミノ酸濃度は明らかに枯渇し、後四分体窒素は明らかに失われた。骨格筋のたん白質分解と遊離アミノ酸プールにおける窒素濃度との関係は未知であるが、これらのデータは、骨格筋窒素平衡が細胞内アミノ酸濃度に関連していること、および、ＧＬＮ　が体内のホメオスタシスのバランスを維持する上で重要な役目を演じていることを示している。
実施例５
ＢＣＡＡ　の取り込みおよび筋遊離アミノ酸濃度は術後の筋肉中の窒素平衡を予測する
　骨格筋および全身の蛋白の異化作用を減らすための　ＢＣＡＡ　の注入の有効性を研究するために、種々の濃度の　ＢＣＡＡ　を含むアミノ酸処方を、標準的な開腹および腹膜後の解剖を行っている犬の３グループに対してこの研究では術前に与えた。第４のグループは食塩水のみ与えられた。犬の後四分体の流出技術を用いて、個々の、および全のアミノ酸−窒素変換率が測定され、かつ骨格筋の蛋白の異化作用を評価するのに用いられた。細胞内の遊離アミノ酸濃度は経皮的な筋バイオプシーサンプルにおいて測定された。その作業は、標準化された外科的処置を行った後に、骨格筋アミノ酸代謝過程の規制に対して種々の濃度を変えた　ＢＣＡＡ　を含む静注アミノ酸溶液が有する効果に焦点をあてている。後四分体のアミノ酸の流出と、術後の最初の２４時間中の血漿および骨格筋中の遊離アミノ酸の濃度を測定することによって、ＢＣＡＡ　および他のアミノ酸の注入に対する抗異化的な応答を評価することが可能であった。
Ａ．材料および方法
　１．
動物の手配および研究の手順
　２７頭の雄および非妊娠の雌の雑種犬は、これらの調子が整えられ、かつ寄生虫に対してスクリーニングを行った牧場から得られた。これらの犬は１８キログラムと４０キログラムとの間の体重であり、ハーヴァードメディカルスクール動物保護施設に研究前の少なくとも１週間収容された。全ての手順は、ハーヴァードメディカルスクールの動物委員会および既出の国立研究審議会の実験動物資源研究所の実験動物の保護および利用に関する委員会のガイドラインに従った。動物は２４時間露光状態の犬舎内に個体ごとに収容され、毎朝運動させられた。水は任意に与えられ、プロペットレスポンド２００の乾燥ドッグフード（少なくとも２５重量％の蛋白含有、米国ニューヨーク州シラキュース）の食餌は、日に１回、午後１時と３時の間に与えられた。動物は研究前にパブロフのつり革（ｓｌｉｎｇ）で完全に休めるように訓練された。
　全ての食餌は、基礎研究または施術前の夜、午後５時に犬舎から取り除かれた。基礎研究は、動物が運動をさせられつり革に配置された後の午後８時に行われた。これらの研究は、血漿アミノ酸決定のための、カニューレが挿入された前脚の静脈からの血液サンプルの採集と、細胞内の遊離アミノ酸を定量するためにチオペンタールナトリウム塩（米国イリノイ州北シカゴ、アボット社：５ｍｇ／ｋｇ，ＩＶ）で全身麻酔された個体の外側広筋への経皮針バイオプシーとからなる。バイオプシーをした後に、まだ犬が麻酔状態にある場合に、５ｍｌの動脈血サンプルが全血アミノ酸分析のための大腿部動脈への経皮穿刺によって得られた。
　動物は、さらに研究が行われる前の３日間で回復させられた。施術日の午前７時に、一晩断食した後、再び動物は運動させられ、かつチオペンタールナトリウム塩（米国イリノイ州北シカゴ、アボット社：３０ｍｇ／ｋｇ，ＩＶ）で前脚カニューレを介する麻酔処置された施術室に連れていかれた。気管チューブが通され、動物は室内空気と毎分５リットルで供給される酸素との混合ガスを自発的に吸い込まさせられた。犬は仰向けの姿勢で手術テーブルの上に載せられ、１６番手針のカテーテルを経皮的に外側の頸静脈を介して上部大静脈内に配した。開始時刻を書き留めた後に、食塩水または適当な供試アミノ酸溶液の注入はこの中心のカテーテルを介して　ＩＭＥＤ　ポンプ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）で開始された。セファロチン（米国インディアナ州インディアナポリス、リリー社）がこの手術の終了直前および終了時に投与された。膀胱にはカテーテルが挿入され、残尿を廃棄した後、閉鎖系廃液収集が上記注入の開始時に開始され、２４時間行われた。静脈注射の注入終了後の代謝ケージ中の動物に対する尿も第２度目の２４時間の間、収集された。
　犬の腹部および脇腹は剃られ、石鹸および水で洗浄され、ポビドンヨード溶液で準備された。動物は滅菌した布で覆われ、雌では腹部に臍下中心線の切り込みを介して、および雄では右側のパラメディカルな切り込みを介して入れられた。腸の一部は片側に収縮させられ、末端の大動脈および下部大静脈の周囲の完全な解剖のため、腹膜部分が露出させられた。右側の内部の腸骨近傍の動脈と同様に、右側の曲折的な深遠部の腸骨近傍の動脈および静脈が分離された。２本の動脈は、特別に準備されたカテーテルでカニューレされた。このカテーテルは外径２．８ｍｍのポリエチレンチューブに連結されたポリエチレンチューブ（外径　２．０８ｍｍ）の６ｃｍのセグメントからなる。一方の動脈カテーテルは上記曲折的な腸骨近傍の動脈を介して大動脈中に約６ｃｍの位置まで挿入され、他方の動脈カテーテルは内部の腸骨近傍の動脈を介して、尾部の中腸動脈までは離れているが大動脈の分岐点まで１ｃｍの位置まで挿入された。第３のカテーテルは深部の曲折した腸骨近傍の動脈を介して下部大静脈中に挿入され、腎臓部の動脈までは遠く位置された。全てのカテーテルは動かないようにされ、右側の脇腹の刺し傷を介して体外に出された。腹部は数層で重ねて閉じられ、動物はその左側に向けられた。外部に出されたカテーテルは適当な長さに切断され、短い太針で栓をされ、間欠的なインジェクションポート（米国フロリダ州タンパ、クリチコン、ジェリコ社）でキャップされ、食塩水で洗い流され、ヘパリン（１００μＵ／ｍｌ）で満たされ、皮下に埋め込まれた。インジェクションポートは、経皮突き刺しによって動脈（大動脈）血および静脈（大静脈）血に容易にアクセスできるように脇腹の高い位置に配された。
　概２時間を要した、これらの手順に続けて、動物は傍らに置かれ、麻酔からの回復中、ブランケットで体温が維持された。上記の注入および手術の開始後５時間経過してから、動物はパブロフのスリングに配され、パラ−アミノ馬尿酸塩（ＰＡＨ）のＯ０．５％溶液がハーヴァードポンプで０．７ｍｌ／分の速度で末端の大動脈カテーテルに注入された。色素注入の４０分後、アミノ酸および　ＰＡＨ　測定のための１０分間隔で動脈および静脈の同時採取サンプルの３セットが得られた。その後、カテーテルはヘパリンで洗浄されてから満たされた。動物は、注入の開始後２４時間、後四分体の流出研究が繰り返されるまで一定の監視の下、スリングに保持された。この点において、最初の２４時間の尿の採集は終了し、かつ経皮的な後脚のバイオプシーが、再び簡単な一般的な麻酔状態下で、先にバイオプシーを受けていない後脚に対して繰り返し行われた。注入はその後終了し、第２度目の２４時間の期間に代謝ケージ内に置かれた。
　２．
注入溶液
　全ての溶液は４ｍｌ／分／ｋｇの速度で注入された。５匹の対照動物は０．９％食塩水を受け入れた。３つの異なる濃度（全アミノ酸濃度が１１％，２２％または４４％）で　ＢＣＡＡ　を含むアミノ酸溶液（表Ｖ）はアミノ酸を８．５％の標準アミノ酸処方、すなわちフレアミンＩＩＩ（米国カリフォルニア州アーヴィン、アメリカンマックグロー社）に添加することによって調製された。全　ＢＣＡＡ　の注入速度は、それぞれ０．４６、０．９２および８４ｇ／２４時間／ｋｇであった。３つ全てのアミノ酸溶液は等窒素であり、約０．６２４ｇ／２４時間／ｋｇの窒素をバリン：ロイシン：イソロイシン（１：１．３８：１．０５）の一定割合で供するものである。９匹の動物は１１％の食塩水を受け入れ、窒素が０．６２４ｇ／２４時間／ｋｇの溶液を得る。上記の食塩水は２．１３％のフレアミン　ＩＩＩ　に非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）の混合物を溶解させて得られた。６匹の動物において、ＮＥＡＡ　は　Ｌ−ＧＬＮ　単独からなり、そのうち３つについてはフレアミン　ＩＩＩ　に見出された全ての　ＮＥＡＡ（アラニン、グリシン、アルギニン、ヒスチジン、セリンおよびプロリン）の混合物からなり、その組成比もフレアミン　ＩＩＩ　と同様である。６匹の動物は４．２５％のフレアミン　ＩＩＩ　単独（２％　ＢＣＡＡ）を受け入れた。最後の７匹の動物は４４％溶液を得るのに十分な　ＢＣＡＡ　で補われた２．１３％のフレアミン　ＩＩＩ　を受け入れた。この最終処方は　Ｌ−ＧＬＮ　単独（ｎ＝４）として　ＮＥＡＡ　あるいはフレアミン　ＩＩＩ（ｎ＝３）に見出された　ＮＥＡＡ　の混合物を添加することによって等窒素とされた。全ての溶液は０．２μＭのフィルター（ＭＡ，ミリス、ミリポア社）に通すことによって滅菌され、施与前に一晩４℃で保存された。各溶液のサンプル１０ｍｌは注入時期の最後に採取され、マクロキェルダール法による窒素分析のために−２０℃で保存された。
　３．
血液、組織および尿のサンプル調製および分析
　全血およびプラズマのサンプルは等量の氷冷１０％過塩素酸（ＰＣＡ）の添加、およびその後の４℃、７０００ｒｐｍ、２０分間の遠心分離操作によって脱蛋白された。上清のアリコット２ｍｌは０．２Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝４．９０）０．３ｍｌで処理され、再び遠心分離された。上記緩衝液は５Ｎの水酸化カリウムでｐＨ４．７５〜４．９０に調整され、蒸留水で最終容量の４ｍｌとしたものである。その結果得られた上清はその後のバッチ分析のために−２０℃で保存された。
　筋バイオプシーの処理中、ストップウォッチの進行を組織除去の際に開始した。筋肉は脂肪および連結した組織から切り離され、不等の２つの部分に分割された。各サンプルの多数の重量は１分間に１５秒のインターバルで記録され、時間が零の初期の筋肉湿重量は、時間に対してプロットされた重量の最も適した線型減少から算出された。少量サンプル（約１５〜２０ｍｇ）は９０℃のオーブンで衡量になるまで乾燥させられ、脂肪遊離固形物の乾燥重量は石油エーテルによる抽出後に得られた。サンプルはその後１Ｎの硝酸２５０ｍｌ中に浸漬され、塩化物量はセミオートマチック滴定器（コペンハーゲン、ラジオメーター）を用いた硝酸銀との滴定によって測定された。プラズマ塩化物はまた類似の方法によって決定された。細胞内および外の水分は前述したように塩化物の技術を用いて算出された。第２の筋肉サンプル（８０〜１００ｍｇ）は重量測定され、ポリトロンホモジェナイザー（米国ニューヨーク州ウエストバリー、ブリックマン社）を用いて氷冷　ＰＣＡ　０．５ｍｌ中でホモジェネートされた。ホモジェネートは遠心分離され、上清は、血液およびプラズマサンプルに関して記述したように緩衝液の添加およびｐＨ４．７５〜４．９０へのｐＨ調整によって分析のため調製された。
　全血、プラズマおよび筋肉細胞内　ＧＬＮ　およびグルタミン酸塩の濃度はルンド（ＬＵＮＤ，既出）の方法からの酵素的なマイクロ蛍光定量法によって、あるいはプレカラムでｏーフタルアルデヒドとの誘導体化を行った後の自動化された高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；Ｓｍｉｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．８：１７８３−１７９５（１９８５））によって決定された。上記２つの技術は比較可能な結果を出した。プロリン、シスチンおよびリジンを除く他のアミノ酸は類似の　ＨＰＬＣ　法で決定された。動脈血および静脈血中の　ＰＡＨ　の濃度は、５％のトリクロロ酢酸での脱蛋白の後、分光光度的に決定された（Ｍｕｈｌｂａｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２４７：Ｅ７５〜Ｅ８３（１９８４）。
　注入の２４時間中に排出された尿は閉じられた排尿システム内で収集され、酸性化された冷蔵庫内に保存された。アリコットはマクロキェルダール法による窒素の後述のバッチ分析のために−２０℃で冷凍保存された（Ｐｅｔｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎ：Ｑｕａｎｔｉｒａｔｉｖｅ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｉｓｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１１，５１６〜５３８，Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｌｉａｍｓ（１９３２）。他の部分は２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離され、テクニコン自動分析器（米国Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ州テリータウン）で尿およびクレアチニンの後述の分析のために冷凍された。
　４．
計算および統計分析
　後四分体は前述したように算出された
（Ｍｕｈｌｂａｃｈｅｒ，Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，既出）。個々のアミノ酸に関する流出率は血流の生成物および動静脈の濃度差として算出された。サンプルの３セットは各時点ごとに線引され、その流出は各セットごとに算出され、３つの値の意味が決定された。プラズマ、全血および細胞内の窒素濃度と同様に全アミノ酸窒素流出は、測定された全てのアミノ酸の窒素基の総ミリモル数として算出された。骨格筋の遊離細胞内アミノ酸濃度は、細胞内の水分のリットル当たりで表された。
　統計計算は標準統計パッケージ（ペンシルバニア州立大学、同州立単科大学、ミニタブ）を用いて行われた。その結果は±ＳＥＭ　の意味として表記された。対および不対の学生のｔ試験は適当なものとして用いられた。変化の分析には複合グループ比較が用いられた。減少分析は最少二乗法を用いて行われた。
Ｂ．結果
　静注による注入の開始前で、ペントバルビタールナトリウム塩の管理後に短期間に死亡した１頭の犬を除き、全ての動物は手術の手順にもかかわらず生き延びた。この死亡した動物は研究に含まれなかった。手順中の失血は均一で最少のものであった。全てのカテーテルサンプルは、２２％　ＢＣＡＡ　グループにおける動物において開始から時２４間の時点で１つの静脈カテーテルを除いて、開始から６時間および２４時間の時点で特許された。
　開始から６時間の時点における後四分体の血流は食塩水の対照グループにおいて３３６．１±６．８ｍｌ／分／ｋｇであり、処理（１１％　ＢＣＡＡ，３３．３±４．９；２２％　ＢＣＡＡ　４２．４±８．８；４４％　ＢＣＡＡ　２８．７±３．５；有意の差異なし）によって影響されなかった。開始から２４時間の時点における血流に変化はなかった（それぞれ５７．９±１０．２；３８．６±８．２；５４．９±６．５；４９．７±１３．２）。血流速度の上昇傾向および開始から２４時間の時点での可変性の増加傾向は、麻酔状態からの回復後に増大する動物の動的活動に帰することとしてもよい。
　１．
尿として排泄される窒素および窒素平衡
　手術後、排泄された尿の量は、食塩水のみを摂取する犬が少ない量の尿を排泄する傾向があるが、４つの処理グループにおいて比較可能であった（表ＶＩ）。食塩水グループにおいては尿として排泄される窒素の平均は０．４９２±０．２０ｇ／２４時間／ｋｇであった。アミノ酸処理された動物は初めは尿素の形態で、食塩水グループよりも３５〜６５％多い窒素を排泄した。２２％　ＢＣＡＡ　溶液を注入された犬は、１１％　ＢＣＡＡ　グループあるいは４４％ＢＣＡＡ　グループよりも尿素窒素量および総窒素量で有意に少なく排泄した。クレアチニンおよびアンモニアの排泄は全てのグループにおいて比較可能であった。
　血液尿素窒素および血漿クレアチニンは全てのグループから選択された動物において手術前および手術後２４時間測定された。これらの濃度は手術前に全ての動物において正常であり、手術後でも僅かに下がったかあるいは変化はなかった。従って、尿素の排尿速度は尿素生成速度に近かった。１１％および４４％ＢＣＡＡ　溶液を摂取する動物においては観察された速い尿素生成は、平衡とされたアミノ酸混合物への　ＢＣＡＡ　あるいは　ＮＥＡＡ　の添加によって提供された余分の窒素に有意に関連された（ｐ＜０．０５）。
　窒素平衡はアミノ酸投与と否定されなかった。すなわち、注入されたアミノ酸窒素の約５０％は残留した。窒素摂取がアミノ酸を摂取している全ての動物において同様であったので、既に議論した窒素排泄における反復は窒素平衡において影響された（表ＶＩ）。従って、２２％平衡アミノ酸溶液を摂取している動物は、１１％または４４％　ＢＣＡＡ　を含む溶液を摂取している犬よりも窒素保持を有意に大きく達成した。
　２．
全血アミノ酸濃度
　食塩水処理動物においては、全血アミノ酸窒素は手術後６時間の時点で減少したが、２４時間までには手術前の正常の水準に回復した（表ＶＩＩ）。この一時的な低アミノ酸血症は、ある必須アミノ酸（スレオニンおよびチロシン）の有意の減少が起こるが、大部分において非必須アミノ酸（グルタミン、アラニン、アルギニン、セリンおよびアスパラギン）の濃度の減少によって説明された。対照的に、注入されたアミノ酸を摂取している動物は手術後６時間の時点において全血アミノ酸窒素濃度を維持した。これらの濃度水準は２４時間まで上記手術前の対照の濃度水準を増加させた（ｐ＜０．０５）。注入されたアミノ酸を摂取している動物の血液中の特定のアミノ酸の濃度は注入された溶液の組成を反映した。例えば、ＢＣＡＡ　濃度は６時間および２４時間の両時点において　ＢＣＡＡ　投与速度に関連した（図２）。概して、６時間の時点での全血　ＧＬＮ　濃度は手術前の濃度水準を下回った（表ＶＩＩ）。例外は　ＧＬＮ　を強化した１１％　ＢＣＡＡ　溶液を摂取しているグループであった。この溶液は血　ＧＬＮ　濃度が維持されたものであった。これらの動物においては、ＧＬＮ　が非必須の窒素の半分を越えるものを含み、窒素が引き渡された全アミノ酸の４０％を越えるとの説明であった。２４時間までは　ＧＬＮ　含有注入液を摂取している動物は正常の全血　ＧＬＮ　濃度よりも高い傾向にあった。
　３．
骨格筋細胞内遊離アミノ酸
　食塩水処理された動物においては、細胞内遊離アミノ酸窒素が手術前の水準と比較した場合に、手術後２４時間までは有意に減少した（表ＶＩＩＩ）。この変化は大部分（６５％）において、全細胞内遊離アミノ酸プールの主要部分を含む細胞内　ＧＬＮ　中の特徴づけられた効果によって説明された。アミノ酸注入液を摂取している動物では、細胞　ＧＬＮ　が　ＧＬＮ　遊離　１１％　ＢＣＡＡ　溶液を摂取した動物に利用できるようになったが、細胞内窒素は維持された。細胞内　ＧＬＮ　は　ＧＬＮ　強化溶液を摂取している動物において増加する傾向があり、ＢＣＡＡ　濃度は　ＢＣＡＡ　注入速度に比例して増加した。
４．
後四分体のアミノ酸流出
　食塩水処理された動物においては、手術後６時間の時点で後四分体からアミノ酸窒素の正味の放出があった（表ＩＸ）。この増加したアミノ酸放出は、ＢＣＡＡ　を含む、測定された殆ど全てのアミノ酸の放出を反映し加速した。この期間に、グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩は後四分体を交差しての平衡を維持したアミノ酸のみであった。手術後２４時間の時点において、後四分体のアミノ酸窒素の放出速度は減少し、大いに可変であるが、殆ど全てのアミノ酸に関する動静脈の差異は零と区別できなかった。ＧＬＮ　放出はこの時点で持続した。
　アミノ酸注入液を摂取している全てのグループの動物において、６時間の時点で後四分体のアミノ酸窒素の放出は類似しており、食塩水処理された動物の場合より明白に少なかった（ｐ＜０．０５）。６時間の時点での　ＧＬＮ　およびアラニンの放出は食塩水の対照においてよりもアミノ酸を摂取している動物においての方が少ない傾向にあった。ＢＣＡＡ　は食塩水の注入された動物において６時間の時点で放出されたが、これらのアミノ酸はアミノ酸注入液を摂取している犬において吸収された。ＢＣＡＡ　の後四分体における摂取は　ＢＣＡＡ　の投与速度（図３）および　ＢＣＡＡ　濃度（図４）に関連づけられた。
　２４時間の時点で、後四分体のアミノ酸窒素の放出は、全てのアミノ酸注入グループに類似し、６時間の場合に比較して変化がなかった。２４時間の時点で、ＢＣＡＡ　の後四分体の交換は僅かに陽性であり、２２％および４４％　ＢＣＡＡ　グループにおいて高い傾向にあった。この時点で、ＢＣＡＡ　の摂取は血液濃度および　ＢＣＡＡ　投与速度に関連がなかった。
　５．
ＢＣＡＡ　注入、ＢＣＡＡ　後四分体の摂取および後四分体のアミノ酸窒素の放出間の関連性
　６時間の時点での食塩水注入された犬においては、後四分体　ＢＣＡＡ　の放出は加速されたアミノ酸放出と連動していた。アミノ酸注入液を摂取している動物においては、後四分体の窒素平衡は　ＢＣＡＡ　摂取と相互に関連していた（図５）。食塩水を摂取している対照は窒素を摂取していなかったので、この分析には含まれなかった。対照の動物の細胞内の含有物は、よりプラスの傾きを有する減衰線に帰結していた。その相互依存関係は　ＢＣＡＡ　流出が後四分体のアミノ酸窒素流出の刺激の加重に包含されなかったとしても維持された（ｐ＜０．０２，ｒ＝０．４９）。従って、ＢＣＡＡ　流出を除いて窒素流出はまた　ＢＣＡＡ　摂取に関連していた。窒素流出は血液中の総　ＢＣＡＡ　濃度あるいは　ＢＣＡＡ　投与速度とは相互に関連性がなかった。これらの関係のないものは２４時間の時点においては存在しなかった。
　６時間の時点で後四分体のアミノ酸窒素の放出はまた細胞内の遊離アミノ酸窒素プール内での変化を相互関連があった（図６）。細胞内の　ＧＬＮ　での反復は総遊離アミノ酸窒素プール内での変化と緊密に関連性があり（ｐ＜０．００１；ｒ＝０．９０）、従って　ＧＬＮ　プール内の変化はまた後四分体窒素放出（ｐ＜０．０５；ｒ＝０．６６）と明白に関連性があった。これらの数学的関係は後四分体のアミノ酸窒素の放出が細胞内の窒素プールにおける変化に関して訂正された場合に、維持された。流出およびプールの測定は異なる時点でなされたので、細胞内アミノ酸プールにおける２うの異なる変化率を仮定することによってこの訂正がなされた。細胞内プール内の変化が手術後の最初の６時間で発生したものと仮定した。代わりに、その変化が２４時間以上、一定の速度で発生したものと仮定した。細胞内窒素プールの変化とアミノ酸窒素放出との間の関係を変える訂正はなかった。
　ＢＣＡＡ　摂取は、６時間あるいは２４時間の各点で後四分体から離れている増加した　ＧＬＮ　には関連性がなかった。ＢＣＡＡ　摂取は、また骨格筋細胞内の遊離アミノ酸プールで発生した変化にも関連性がなかった（ｒ＝０．１１，不明瞭）。後四分体の窒素流出は予想されることが可能であり、そのデータの可変性の殆どは　ＢＣＡＡ　の６時間流出と遊離アミノ酸窒素プールとが共に用いられた場合に、説明されることが可能であった。その関係式は
　　ｙ＝−９．５８＋０．２７ｘ１＋３．０２ｘ２
ここで、ｙは６時間の時点でアミノ酸窒素流出（μｍｏｌ／分／ｋｇ）であり、ｘ１は６時間の時点で　ＢＣＡＡ　流出（μｍｏｌ／分／ｋｇ）であり、ｘ２は骨格筋細胞内の遊離アミノ酸窒素における変化（手術の前後、ｍｍｏｌ／Ｌ／２４時間）であり、ｎは２２（ｐ＜０．０５，ｒ＝０．８６）であった。
Ｃ．議論
　麻酔状態とされた犬における標準化された開腹術は重病人で観察された胃化的な応答の多くを開始するために示された。尿として排泄される窒素によって測定されたように、トータルの体プロテインの胃化作用は増えている。食塩水を摂取している対照の動物は手術後の最初の２４時間内に約１２〜１５ｇの窒素を排泄した。このモデルでの先の研究は、窒素平衡が食物の摂取にもかかわらず手術手順後の３日間酸性のままであるということを示した（Ｋａｐａｄｉａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｕｒｇ．Ｆｏｒｕｍ　３３：１９−２１（１９８２））。対照的に、対で食餌が与えられた偽装手術（ｓｈａｍｏｐｅｒａｔｅｄ）がなされた動物は術後の初日に窒素平衡に達成した。増加した尿窒素の損失と矛盾せず、かつこれに貢献することに関し、後四分体の、手術後の６時間の時点でトータルのアミノ酸窒素の放出は、一晩の断食後の対照動物で観察された場合の６〜８倍であった（Ｍｕｈｌｂａｃｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，既出）。血液および骨格筋アミノ酸濃度の低下など、食塩水処理された犬での他の変化は、ヒトでの異化作用状態中に報告された反復に類似している（Ａｓｋａｎａｚｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．１９２：７８−８５（１９８０））。このように、犬科のモデルは重病人での反復に類似している術後の応答を示し、従って窒素代謝および骨格筋アミノ酸交換上の外来アミノ酸の効果を調べるのに適している。
　食塩水処理された動物においては、後四分体の、アミノ酸窒素の放出が術後６時間、顕著に増加していた。これは正味の骨格筋の全　ＢＣＡＡ　の放出と連動していた。同時に、全血　ＢＣＡＡ　濃度は変化がなく、内臓器官の　ＢＣＡＡ　の消費骨格筋の放出の加速度とおおよそ等価であった。アミノ酸を摂取している動物においては、後四分体の総アミノ酸放出が弱められ、全血および骨格筋窒素プールが維持され、後四分体は　ＢＣＡＡ　放出の器官から　ＢＣＡＡ　摂取の器官へ変換された。ＢＣＡＡ　およびさらに詳しくはロイシン摂取は骨格筋の増加した　ＧＬＮ　の放出と連動していなかった。
　この研究は骨格筋アミノ酸放出および筋プロテインの正味の変化が２つの独立した測定から予期され得るということを示している。これらは骨格筋の血管ベッドを交差する　ＢＣＡＡ　流出の速度および骨格筋の遊離アミノ酸プールにおける窒素濃度である。ＧＬＮ　は上記遊離プール中で最も豊富なアミノ酸であるので、その　ＧＬＮ　の濃度の変化はプール全体の変化を主として決定する。事実、遊離の　ＧＬＮ　における変化は全遊離アミノ酸における変化と同様に筋肉の窒素平衡を予測する。
実施例６
腸の切開手術後のグルタミンを豊富に含んだ経口食餌の小腸への効果
Ａ．導入
　部分的な手術後の小腸の代償的成長は、腸壁のすべての層を含むが、柔突起増生により支配される。
　成長する柔突起の高さと陰窩の深さは、腸の残遺物の拡張と伸長に影響をうける（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｎ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９８；ページ１３９３−１４４４（１９７８年））。小腸の切開術後、適切な形態学的また機能的な変化がおこる。経口摂取は腸の切除手術後粘膜の増生の規制に重要な刺激になることが証明されている（Ｌｅｖｉｎｅ　ｅｔａｌ．Ｄｉｇ．Ｄｉｓ，２１：ページ５４２−５４５（１９７６年））。経口の栄養素は通常の粘膜の成長を維持するのに重要であり、もし小腸の手術後経口摂取が維持されなくては、残りの腸は、重量を失い、形成不全になる。腸の切除手術後、腸の短い（ｓｈｏｒｔ　ｂｏｗｅｌ）患者は非経口的な栄養で（生命を）維持され、その生存は残余の腸組織の適応性に左右される。基本的な食餌と非経口的な栄養で、腸の適応性の発達や完全な経口摂取へのゆっくりとした回復に十分な時間が与えられる（Ｗｅｓｅｒ，Ｅ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　７１：ページ１４６−１５０（１９７６年））。
　ＧＬＮ　は腸ほう種（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ）に重要な燃料であり、外科的な緊張のあとに、その使用が増加する（Ｓｏｕｂａ．Ｗ．Ｗ．，
ｅｔ
ａｌ．
Ｓｕｒｇｅｒｙ
　本研究の目的は、組織の緊張と腸の粘膜の増生への刺激をもたらす準総合的（ｓｕｂｔｏｔａｌ）な切開術，生体実験的モデル組織の小腸の粘膜細胞の成長に与える　ＧＬＮ　を含んだ栄養の効果を調べることである。
Ｂ．材料と方法
　１．
動物の準備
　チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリーから購入した重さ１７５−２００グラムの雄のウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ネズミを５日間ラボラトリーで馴化させる。ネズミには、水を自由に与え、プリナ（Ｐｕｒｉｕａ）のチャウ（ｃｈｏｗ）を与える。ネズミは一匹ずつかごに入れ、毎日体重を増やしてゆく。
　馴化後、通常の体重をえたネズミを、ランダムに４つのグループに分ける。
　研究の初日には、ネズミはペントバルビタール（５０ｍｇ／Ｋｇ）の腹腔内（Ｉ．Ｐ．）注射で麻酔される。腹部を中線切開術で開き、トライツ筋の靭帯から、回盲腸部までの小腸の全長を外へ取り出し、長い黒糸で延ばさずに、２回測定する。２回目の測定の平均値を求める。トライツ筋の靭帯へ５ｃｍの所からはじまる小腸の２／３の切開術をランバート（Ｌａｍｂｅｒｔ）法でおこなう（Ｓｕｒｇｅｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｉｇｅｓｔ；ｖｅｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｒａｔ，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃ．Ｔｈｏｍａｓ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄｓ　Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ページ３２−３５，４１３−４１６（１９６５年））。切開術の切り口の縁を、端から端まで６−０のプロレン（ｐｒｏｌｅｎｅ）で吻合術を施す。腸を腹部の空胴へもどし、腹部壁を２−０のプロレン（ｐｒｏｌｅｎｅ）で閉じる。
　対称群（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ）は、小腸の末端装置、すなわちトライツ筋の靭帯から５ｃｍ離れた所を起点にして測定した合計長さの２／３の位置の小腸を切断し、再吻合する、見かけの手術（ｓｈａｍ　ｏｐｒａｔｅ）を受けた。
　動物を、別々に代謝ケージに入れ、外科手術後の当日から、適切な量の炭水化物，脂質，アミノ酸類，ビタミン類と塩類を含んだバランスのとれた食餌（−ＧＬＮ），あるいは非必須アミノ酸類の分画（ｆｒａｃｔｉｏｎ）のかわりに　ＧＬＮ　を用いた所をのぞいて同一の　ＧＬＮ　を含んだ食餌（＋ＧＬＮ）を経口的にひとつがいの動物に与える。ＧＬＮ　の含有量はアミノ酸類の０％か２５％であり、アミノ酸類の−５％を示す　ＧＬＮ　のある通常の食餌とは対照的である。
　２．
グルタミンを含む食餌の準備
　決められた経口的な食餌は、１００ｇ当りの４２７カロリーで、０．２％（Ｗ／Ｗ）の塩化コリン，１０％のトウモロコシ油，４６．９％のデキストリンホワイト（ｄｅｘｔｒｉｎ−ｗｈｉｔｅ），２３．４％の庶糖，５％の塩混合物および０．５％のビタミン混合物を含む。両方の食餌は合計で７．１７％の必須アミノ酸類と、合計で６．８３％の非必須アミノ酸類を含む１４％のアミノ酸類からできている。ＧＬＮ（−ＧＬＮ　を含まない食餌）は、アラニン，アスパラギン，アスパラギン酸，プロリンおよびセリンを各０．９３７％含んでいる。ＧＬＮ　豊富な食餌（＋ＧＬＮ）はこれらの結果アミノ酸０．２３７％と、ＧＬＮ　３．５％を含んでいる。この結果＋ＧＬＮ　の食餌の中で、アミノ酸類の合計の２５％および非必須アミノ酸類の５１％を示す。
　３．
組織の準備
　食餌を与えてから７日後、ネズミは犠牲となった。ネズミは腹腔中のペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を注射され麻酔された。腹部が開かれ、切開術が胸腔部までおこなわれた。左心室に穴をあけ５ｍｌの血液を抜き取り、血液中のアンモニアとプラズマ　ＧＬＮ　のレベルを測定した。血液を抜き取った直後、腸を回収した。小腸全体が腸奨膜に近い腸間膜と注意深く区分されて取り除かれた。取り除かれた腸は、４．５グラム重の固定張力をかけてつるされ、９つの点に印がつけられた。腸の切開術を受けたネズミでは、吻合術をした近傍の５，１０，および１２．５ｃｍの点は空腸の近傍と十二指腸の末端をあらわし、吻合術をした所から離れた２，５，および１０ｃｍの点は、吻合術をした所に近い残余の回腸をあらわし、回盲腸部に近い、５，１０および１５ｃｍの点は回腸の末端をあらわし、これらの点は腸をつき通すまっすぐなピンで印がつけられる。腸は６つの部分に分けられる。みせかけの手術を受けたグループのネズミでは、トライツ筋の靭帯の近傍１ｃｍの所から、近傍の２つの部分に印がつけられ、上方へ向って測定される。部分１ａ，２ａおよび３ａは冷却した食塩水中ですすがれ、緩衝された１０％のフォルマリン液に４時間つけられ、その後固定のために７０％エタノール中に入れられる。部分１ｂ，２ｂおよび３ｂは冷却した食塩水中ですすがれ、それらの管腔が開かれ、湿重量が測られる。腸の部分は５ミリリットルの冷却した食塩水中に運ばれ、鋭利なハサミで細かく刻まれる。ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジェナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）上で、２回，１５秒間（ｔｗｏ　ｆｉｆｔｅｅｎ　ｓｅｃｏｎｄｓ）ホモジェネートされ、ホモジェネートができあがる。その後、３秒間、電力を２に設定し、超音波処理器（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）で超音波処理される。ＤＮＡとたん白質分析用の食塩水でホモジェネートを−３０℃で保存した。
　４．
分析方法
　腸のホモジェネートは、ローリー法（Ｌｏｗｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄ）で、総たん白質として分析された。ＤＮＡは、ブルトン法（ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｂｕｒｔｏｎ）（Ｂｉｏｃｈｅｍ６２：ページ３１５−３２３（１９６５年））により測定された。組織切片はパラフィンにつけられ、ヘマトキシリンとエオシンで着色され、４０倍（４０×）の拡大率の光マイクロスコープで検査される。粘膜の厚さと絨毛の高さを接眼マイクロメータで測定するために、２０個の代表的な高くて方向性のある完璧な絨毛が選ばれ、平均値が得られる。４０倍に拡大された領域の中央の水平ラインにおかれた腸にある絨毛の数がカウントされる。
Ｃ．結果
　最初の５日は、１日に１０グラムから１５グラムの食料の摂取での漸進的増加があり、食摂取が一定であった。
　つがいで食餌を与えられる動物で２回の食餌を同量摂取するにもかかわらず、２つのグループでの体重の増加の割合は手術直後の期間で異なっている。管理された動物では、術後最初の３日間は、体重は一定であり、その後１日に５グラムづつの割合で直線的に増加した。ＧＬＮ　を与えたグループでは、期間的なおくれはなく、手術後の最初の日からすぐに、継続的な体重の増加が１日５グラムの割合ではじまった手術後の２日目，３日目には、ＧＬＮ　を与えたグループでは、管理されたグループにくらべて、体重の増加が著しかった（Ｐ＜０．０５）。両方の食餌を与えた動物ではほぼ同じ割合で体重が増加していったが、ＧＬＮ　を与えられたグループでは体重が手術後８日目までどんどん増加しつづけた（３２．０±２．８対２３．７±３．７グラム累積体重増加，Ｐ＜０．０３）。死骸を分析した結果体重の増加は体全体の水分の累積とは関係なく（７１±１％＋ＧＬＮ　対７３±１％−ＧＬＮ　管理），ＧＬＮ　のやせた体の質量に対する効果と関係があった。手術後最初の３日間での食餌と体重の変化とにおいての　ＧＬＮ　濃度の関係が別の動物を使って研究された。食餌のアミノ酸類の約２５％が最大限の成長の効果をもたらす　ＧＬＮ　として必要とされる。
　２５％の　ＧＬＮ　を含んだ食餌による体重の増加は、空腸と回腸との残余の部分の重量増加と関連があった。手術後３日目では、全小腸組織の重量は、ＧＬＮ　を与えられたグループでは３．５５±０．１６グラムであり、対照のグループでは２．９７±０．１０グラムであった（Ｐ＜０．０５）。
　手術後８日目では、腸の重量はそれぞれ３．３０±０．２３グラム，２．８１±０．１６グラムになった（Ｐ＜０．０５）。ＧＬＮ　を含んだ食餌において、腸の重量の増加と体重の変化全体のたった５％を占めるにすぎない。それゆえ、腸に対して　ＧＬＮ　の摂取の効果はあるが、その効果は腸に限らない。
　空腸と回腸の細胞充実性は、ＤＮＡ　の含有量を測定しかつ、定量組織学により、さらに直接的に評価（ａｓｓｅｓｓ）された（表Ｘ）。ＧＬＮ　摂取に関しては、手術後３日目の空腸での　ＤＮＡ　含有量の著しい増加があり、３日目と８日目の回腸での　ＤＮＡ　含有量の著しい増加があった。手術を受けず、対照動物と比較し、切開術と　ＧＬＮ　を含んだ適切な栄養の食餌の摂取との組合わせにより、手術後３日目で、１ｃｍ当りの空腸の　ＤＮＡ　含有量は５４％の増加となった。この適切な増生は、食餌中に含まれている　ＧＬＮ　をバランスのとれた非必須アミノ酸類の混合物に置き換えることで、半分近くに減少できた。粘膜の厚さの組織学的測定によって、ＤＮＡ　含有量を測定した（表Ｘ）、ＧＬＮ　を含んだ食餌に関しては、空腸と回腸での絨毛の平均的な高さの増加が、手術後３日目と８日目で明白になった。この反応は絨毛に限られていて、陰窩の深さと準粘膜（ｓｕｂｍｕｃｏｓａｌ）の筋の層の厚さは、ＧＬＮ　の効果とは関係がない。
　決められた３ｃｍの空腸の部分を、手術後３日目と８日目に採取し、ＤＮＡ　含有量をホモジェネート化し、分析する（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｋ．，
ｅｔ
ａｌ．
　　＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＋ＧＬＮ　Ｖ．つがいになっていないｔ−テストの−ＧＬＮ
　絨毛の高さへの　ＧＬＮ　の影響は、ＧＬＮ　がアミノ酸類の全重量の２５％を示し、食餌中の非必須アミノ酸類の５１％を示した時に最大になった。より低い濃度では、空腸と回腸とにおいて、持続した影響は明白でなかった。ＧＬＮ　の濃度が３１．２５％へ増加し、他の必須アミノ酸類がさらに減少すると、腸の粘膜への栄養の効果はなくなった。これは、ＧＬＮ　を含む食餌のアミノ酸構成が広範囲に変化し他のアミノ酸類が制限されることに起因する。アミノ酸類の合計の２５％の量の　ＧＬＮ　は、適度ではあるが重要なプラズマ　ＧＬＮ　濃度の増加を生じた（８００±４０対６５４±４８μＭ（３日目），７５１±２２対６７６±２１μＭ（８日目））。グルタミン酸やアンモニアのプラズマレベルではプラズマ濃度の増加はなかった。これゆえ、ＧＬＮ　がアミノ酸類全体の２５％を示す　ＧＬＮ　を含む食餌は、さらに急激な手術後の重量増加と腸の粘膜の増生を生じる。腸の粘膜の増生は、過剰な　ＧＬＮ　やアンモニア，グルタミン酸等の　ＧＬＮ　代謝の最終生成物の蓄積とは関係がない。
　栄養上の支持が必要な患者に適量の経腸の栄養素を与えるのは時には困難であるので、特に病気の過程が胃腸の管道を含む重大なものに関係する場合、栄養上は不適当な食餌の成分である　ＧＬＮ　の効果を評価した。ネズミが同じ６０％の切開手術を受け、その後つがいで食餌のコントロールを受け、あるいは適度のアミノ酸類、ビタミン類そして塩類の入った　ＧＬＮ　を含んだ食餌つまり完壁な食餌であるが全カロリーが５０％少ない食餌を与えられ、ＧＬＮ　を含んだ食餌のグループでは体重がわずかに増加するが、両方の食餌を与えられたグループではほとんど体重の変化はなかった。カロリーの欠乏にもかかわらず、腸の粘膜への　ＧＬＮ　の顕著な影響は明白であった（表ＸＩ）。
　手術後７日目に、コントロールされた食餌にくらべて　ＧＬＮ　を含む食餌では、空腸では粘膜の湿重量が３６％増加し、回腸では４０％増加した。粘膜の　ＤＮＡ　含有量はそれぞれ４８％と３２％増加した。これらの粘膜の細胞充実性の測定は定量組織学研究で確証され、この測定により、空腸と回腸の粘膜の厚さの持続的増加が示された。カロリーの欠乏にもかかわらず、食餌に含まれる　ＧＬＮ　栄養上の影響を与え、腸の粘膜の成長を特別に支持した。
　腸の部分は、表Ｘの説明文にあるように採取され分析された。データは部分的な切開術の７日後に調査された１０組の動物の平均値±ＳＥＭ　をあらわしている。
　　−ＧＬＮ＝０％グルタミン，＋ＧＬＮ＝２５％ＧＬＮ；＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１，つがいになっていないｔ−テストでの＋ＧＬＮ対−ＧＬＮ
　ＧＬＮ　の効果は、ＧＬＮ　を静脈内に投与したときにも表れる。ネズミに、最適な成長を維持できる　ＧＬＮ　含まない形で、腸の部分的な切開術後７日間まったく非経口的な栄養（ＴＰＮ）を与えつづけた時（Ｐｏｐｐ．，ＭＢ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ　Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．３６：１１９ページ（１９８２年））、絨毛の高さは空腸内では減少し、回腸内では変化しない（表ＸＩＩ）。このように、部分的な小腸の切開術の栄養上の刺激は、ＧＩ　管路の管腔から食物をのぞく結果、相殺される（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｇ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　６７：ページ９７５（１９７４年））。
　データは９組の動物の平均値±ＳＥＭ　を表す。−ＧＬＮ＝０％グルタミン，＋ＧＬＮ＝２３％グルタミン，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．００１，つがいになってないｔ−テストでの＋ＧＬＮ対−ＧＬＮ，Ｐ＜０．０５　Ｐｐ０．００５，
　つがいになってないｔ−テストでの切開術前対切開術後、非必須アミノ酸成分（全アミノ酸類の２５％）の分画のかわりに　ＴＰＮ　処方のものに　ＧＬＮ　を加えることにより、切開術後の過増生反応が貯蔵される（表ＸＩＩ）。
　ＧＬＮ　のない　ＰＴＮ　処方のものに比較して、絨毛の高さは、空腸内と回腸内で５４％と３１％それぞれ増加した。これらの動物のデータどうりに、最近の人類の研究でジペプチドのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンを静脈内に栄養として与えることにより手術後の窒素バランスを改善することがわかった（Ｓｔｈｌｅ，Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ　ｉ：ページ２３１（１９８９年））。
Ｄ．ディスカッション
　ＧＬＮ　を含んだ経口的な食餌と静脈への栄養の投与に関するこれらの観察は、非必須アミノ酸　ＧＬＮ　が腸の切開術と手術によるストレス後の必須の栄養になるという仮説と対立する。バランスのとれた洗練された経口的食餌の成分として含まれる時には、ＧＬＮ　は人体組織に一般的な同化すなわち抗異化（ａｎｔｉ−ｃａｔａｂｏｌｉｃ）の効果をもたらし、手術によるストレスに関する体重減少の過渡期間を防ぐ。通常　ＧＬＮ　を高い割合で使用し、ストレスに反応して　ＧＬＮ　抽出を増加させる組織がある腸では、ＧＬＮ　の粘膜への栄養上のはっきりした効果がみられる。その結果、部分的な小腸の切開術に対しての適切な過増生反応が増加し、腸のうつの個体数が増加して、次に絨毛の高さが増加する。全カロリー摂取が不適切であっても、また静脈ルートを通じて全ての栄養が管理されていても、腸の細胞充実性は増加する。
　これらの効果のメカニズムは不明である。ＧＬＮ　は特定の生化学的経路に調節的影響を与えたであろうし、燃料としてまたは生合成の前駆体として働き、分泌促進剤として働き、あるいはこれら全ての機能を行ったのであろう。以下に特別なメカニズムであっても　ＧＬＮ　は腸の粘膜の成長を支持するうえで必須の栄養であることは以上の研究から明らかである。腸の切開術後のやせた体の質量（ｂｏｄｙ　ｍａｓｓ）の増加には、ＧＬＮ　が筋肉や他の組織に対しての同化効果も与える可能性がある。総合すると、実験データは、ＧＬＮ　がストレスの続く期間中条件付きで必須の栄養であるという仮説を支持している。ＧＬＮ　の内部的生成は、不適切であり、プラズムと組織の濃度の低下と、組織の形態学での関連した変化を生じる。外因としての　ＧＬＮ　はフリーＧＬＮ　濃度を保存し腸の粘膜と成長全体への影響を含む栄養上の反応をひきおこす。
実施例７
濃縮グルタミン非経口栄養剤使用の小腸粘膜の保存
　非経口栄養補給の結果、小腸の粘膜が萎縮する（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ　６８：ページ１１７７−１１８３（１９７５年））。
　この反応は、胃腸の分泌と栄養ホルモンの減少、そして腸皮膚の増殖に必要な特定の栄養の相対的欠如にも関連している。ＧＬＮ　は小腸の主な酸素燃料であるが、標準的経口溶剤中にはない。食餌の　ＧＬＮ　の影響を測定するため、このアミノ酸の濃度を変えて、濃縮した経口溶剤を服用した場合の小腸の反応を測定した。
Ａ．材料と方法
　条件づけされた雄のウィスタ・ネズミ（ｎ＝４２，重量２１０−２３０９）に頚静脈カテーテル挿入を受けさせて、拘束されない動物に長時間注入が可能なスイベル・アセンブリ（Ｓｗｉｖｅｌ　ａｓｓｅｍｂｌｙ）を取り付けた（Ｂｕｒｔ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔａｌ．，Ｊ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３８：Ｈ５９９−６０３（１９８０年））。
　すべてのネズミを個々の代謝かごの中にいれ、水を飲むことだけ許可した。管理された動物に、０．９％食塩水を注入し、プルナ・ラット・チャウ・アド・リビタムを与えた。３つのグループのネズミに栄養を与えた。すべての栄養溶剤は、等窒素含有（０．９ｇ窒素／１００ｍｌ），等カロリー（９８Ｋｃａｌ／１００ｍｌ）であり、等濃度の必須アミノ酸，非必須アミノ酸とぶどう糖を含有している。各溶液の非必須アミノ酸の成分は、０．１ｇ／１００ｍｌまたは３ｇ／１００ｍｌの　ＧＬＮ　濃度を得るように調整した。経口溶液を、４８ｍｌ／２４時間の速度で注入した。尿の量と窒素排出量とを毎日測定した。動物は、栄養注射を７日間行った後死亡し、ＧＬＮ　およびアンモニア濃度を測定するために血液を得た。腸の決められた切片から、十分な厚みの空腸節（ｊｅｊｕｎａｌ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ）および粘膜の標本を得た。全てのサンプルを計量し、ＤＮＡ　およびたん白質について均等質の評価分析を行った。５μｍの厚みの組織パラフィン切片を準備した。空腸の柔突起の高さ、数および粘膜の厚みの測定を盲検方式（ｂｌｉｎｄｅｄ　ｆａｓｈｉｏｎ）で行った。
Ｂ．結果とディスカッション
　経口的に食餌を管理して与えられている場合と比較して、ｉ．ｖ．栄養を受けたすべてのネズミで、湿重量，ＤＮＡ，たん白質，そして絨毛の高さが減少した。（表ＸＩＩＩ）ＧＬＮ　を含有した溶液の注入後、プラズマ濃度は増加した。ＧＬＮ　を含まない溶液を受けたネズミと比較して、空腸の粘膜の重量は著しく増加した。統計上反応は顕著でないのに、全厚みの空腸の重さは　ＧＬＮ　の摂取につれて増加傾向になった。２％と３％の濃度で　ＧＬＮ　を注入後、粘膜の　ＤＮＡ　と全厚みの空腸の　ＤＮＡ　は増加した。これらの変化は、粘膜成長の組織学的証明と一致していた。絨毛の高さと粘膜の厚さは、投与される　ＧＬＮ　の量に比例して投与量依存方法では増加した。動物はすべて窒素バランスが陽性であるが、２％の　ＧＬＮ　溶液を投与されたネズミは実験中ずっと、最大限の窒素量を保持した。非経口の溶液での　ＧＬＮ　の含有は、動物ではｉ．ｖ．栄養を受けている時に、空腸の粘膜の重量，ＤＮＡ　含有量および絨毛の高さを増加する。小腸の粘膜質量の増加により小腸の機能を高め、小腸内の栄養の摂取を高めることができる。現在、標準非経口溶液に含まれていない　ＧＬＮ　は粘膜を支持するのに必要な栄養素である。
　　＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０２５，＊＊＊Ｐ＜０．００５対Ｏ　ＧＬＮ
　　ＧＬＮ＝グルタミン
実施例８
５−フルオロウラシル処理後のグルタミン強化非経口栄養供給の効果
　ＧＬＮ−添加非経口栄養供給が障害後の腸粘膜の保存または修復に有利であるか否かを決定するために、動物およびヒトの　ＧＩ　粘膜に対する顕著な毒性を有する化学療法剤である、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）（Ｍｕｇｇｉａ　ｅｔ　ａｌ．，１９６３；Ｒｏｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，１９７０；Ｂｏｕｎｕｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９７７；Ｓｔａｎｆｏｒｄ　ｅｔ　ａｌ．，１９７７；Ｓｈａｗ　ｅｔ　ａｌ．，１９７９）の投与量（ドース）を増加しつつ処理する前およびその直後に　ＧＬＮ−強化栄養を４日間投与した。
Ａ．材料および方法
　１．
動物の準備
　ラットを準備し、本質的に前記実施例６および実施例７に記載されたように収容し、ランダムにグループ分けして０または２ｇ　ＧＬＮ／ｄｌ　を含有する非経口栄養溶液を摂取させた。
　２．
５−ＦＵ　誘起　ＧＩ　障害および　ＧＬＮ　注入
　ラットに前記のようにカテーテル挿入し、麻酔回複後最低３時間後、動物群は腹腔内注射により　５−ＦＵ　を１００、１５０または２００ｍｇ／ｋｇ摂取させた。対照群は０．９％食塩水（５−ＦＵ　０ｍｇ／ｋｇ）の注射を受けた。各投与量群は　ＧＬＮ　を０％または２％摂取した。栄養注入は、４６ｍｌ／２４の速度で　５−ＦＵ　または食塩水の投与から４時間後に開始され、４日間継続された。これらの時間を選んだのは、実験により　５−ＦＵ　による損傷からの粘膜の回復がこのステージに行われており、粘膜の再生に対する　ＧＬＮ　の効果はこの時期に見られる蓋然性が高いことが示されているからである。
　３．
腸障害の誘起前の　ＧＬＮ　給餌
　カテーテル挿入後、ラットは１２時間は半強栄養におよびその後８日間全強栄養（０または　２ＧＬＮ／ｄｌ）を摂取させた。５−ＦＵ　を非経口給餌の第４日目に腹腔内投与し、ラットを４日後に犠牲に供した。単一の投与量の　５−ＦＵ（１５０ｍｇ／ｋｇ）を選択したのは、死亡率を増加せずに一般的な倦怠感と重篤な腸障害を誘起するからである。尿窒素排出を毎日測定し、窒素平衡を計算した。
　４．
組織サンプリング
　血液および腸組織をサンプリングし、上記各実施例に記載のように分析のために準備した。ヘモグロビン、白血球および血小板の数を、５−ＦＵ　の種々の投与量の一般的な血液学的毒性の指標（メジャー）として決定した。
　５．
分析方法および統計的方法
　分析はすべて前記実施例６および７に記載したように行った。統計的解析は、食物および　５−ＦＵ　投与量の双方を比較した分散の２方向解析を使用して行った。不対ｔテストを使用して２つの処理群を　５−ＦＵ　の１つの投与量において比較した。差は、＜０．０５のｐ値において統計的に有意とみなした。
Ｂ．結果
　１．
障害後の非経口給餌効果
　動物は　５−ＦＵ　注射後約３６時間は一般に元気であり、その時間経過後、昏睡状態になった。実験に使用した６０匹中５匹は技術的理由（カテーテルが機能しなかったり、注入ポンプの故障）から除外され、６匹（ＧＬＮ　給餌群から２匹、対照群から４匹）は　５−ＦＵ　処理のために死亡した。分析した４９匹のうち、２３匹は　ＧＬＮ　を０％摂取し、２６匹は　ＧＬＮ　を２％摂取した。
　ａ．腸指数
　空腸湿重量、ＤＮＡ　および蛋白はすべて　５−ＦＵ　投与後減少した。しかし、これらの指標は、ＧＬＮ　を摂取した動物では無　ＧＬＮ　対照よりもすべて有意に高い。この差は粘膜の指標である重量、ＤＮＡ　および蛋白についてはかなり大であった（表ＸＩＶ　およびＸＶ）。顕微鏡検査により、ＧＬＮ　ラットでは、粘膜の厚さおよ絨毛の高さの指標に反映された腸の構造の保存が実証された（表ＸＩＶ　およびＸＶ）。
　ｂ．血液学
　ヘモグロビン濃度は　５−ＦＵ　のすべての投与量で維持されたが、用いた食餌療法とは無関係にすべての薬物措置動物において循環白血球カウントおよび血小板カウントの顕著な減少があった（表ＸＩＶ　およびＸＶ）。
　２．
障害前の非経口給餌の効果
　５−ＦＵ　使用後の非経口給餌を与えられたラットとは対照的に、ここでは死亡率が著しく増加し、０％ＧＬＮ　群の１２匹の動物中６匹が死亡したのに対して　ＧＬＮ　給餌群の１２匹中２匹が死亡した。この差はｐ＝０．０６のレベルでのみ統計的に有意であった（フィッシャーの精密テスト）。
　ａ．腸指数
　空腸湿重量は、粘膜　ＤＮＡ　および蛋白と同様に、ＧＬＮ　給餌動物では有意に高いが、全厚　ＤＮＡ　および蛋白は前記２つの群において差が無かった（表ＸＩＶ　およびＸＶ）。組織学的分析により、ＧＬＮ　摂取動物における粘膜厚と絨毛高さの増加に関する生化学的知見が確認された。
　ｂ．血液学
　いずれの群においても血液学的パラメータに差が検知できなかった。ヘモグロビンは維持されたが、白血球カウントおよび血小板カウントは食餌に無関係に落ち込んだ（表ＸＩＶ　およびＸＶ）。
　３．
５−ＦＵ　後の血漿　ＧＬＮ　およびアミノ酸
　血漿　ＧＬＮ　は、食餌中に　ＧＬＮ　が存在しないときでさえも、５−ＦＵ　投与後すべての動物において上昇した。この代謝状態において筋肉からの　ＧＬＮ　の放出が増加することは、腸の細胞性が減少すること（および多分ある程度の　５−ＦＵ　誘起腎毒性）と組み合わされて、循環　ＧＬＮ　レベルの増加を説明することができるかも知れない。
　４．
窒素平衡
　実験の最初のシリーズにおいて２％ＧＬＮ　を摂取した動物に窒素保持が改善されることが証明された。同様の変化が、ＧＬＮ　添加非経口栄養を　５−ＦＵ　措置前に摂取した動物に、認められた。毎日の窒素平衡は、ＧＬＮ　給餌群においては給餌６日目までは有意に大きかった。累積的窒素保持は、０％ＧＬＮ　ラットに対する７３６±１４９ｍｇであったのに比べて、２％ＧＬＮ　ラットでは１１０６±８５ｍｇであった（ｐ＜０．０５）。
参考例１
放射線照射、化学療法および骨髄移植後のグルタミン強化非経口栄養の効果
　この実験は、全身放射線照射および／または化学療法を受けつつある患者に食餌ＧＬＮの供給が窒素平衡を変えるか、臨床結果を改善するか、および全体的回復を促進するかについて、無作意抽出された盲検臨床試験で決定するために行われた。
　実験の人数は自己由来または同種の骨髄移植の原簿（プロトコル）に既に登録された患者を含んでいた。
Ａ．材料と方法
　１．
患者
　患者は自己由来または同種の骨髄移植治療プロトコルに既に登録されたものから募集した。これらのプロトコルから選ばれる資格のある患者は１８才から６０才の男性もしくは女性で、最初の寛解（同種移植組織）における急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、第２の寛解における　ＡＭＬ（自己由来移植組織）、骨髄性異形成症候群、リンパ腫、再生不良性貧血および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を含む他の白血病と診断されたものである。このプロトコルの患者は非経口栄養を必要とし、注入のためにささげられた中心線を持っていた。彼等は正常な肝機能（全ビリルビン＜３ｍｇ／ｄｌ）、正常な腎機能（クレアチニン＜１．２ｍｇ／ｄｌ）、糖尿病の不存在（インスリンまたは経口血糖低下剤なしに血糖＜２００ｍｇ／ｄｌ）を持っていた。彼等は病気の安定期（例えば、寛解）にあった。患者の体重損失は自身の理想体重の２０％以下であった。
　２．
実験仕様
　患者は標準または　ＧＬＮ　含有　ＴＰＮ　の２つの群の一方にランダムに分けられた。食餌は等窒素および等カロリーであるが、標準処方として　Ｏ　ＧＬＮ　を含有し、実験溶液では０．５７ｇ　ＧＬＮ／ｋｇ　体重／日を含有していた。患者、骨髄移植医および実験者らには治療群に関しては伏せられた。この仕様の下では、個体の電解質要求は臨床条件に応じて時間変動することがあり、医師は、実験者およびニュトリションサポートサービスと相談しながら、溶液の電解質含有量を血中濃度と臨床状態に応じて変えてもよい。
　担当医師が許可すれば実験期間中自由に経口栄養を摂取した。毎日の経口カロリー、蛋白、脂肪および炭水化物の摂取量を記録した。
　盲検テスト溶液の投与は骨髄移植の日（０日と呼称する）の後５日以内に開始された。初期平衡化期間である３日経過後、すべての尿および便の捕集を次の７日間に各２４時間開始した。その次の７日間は捕集を行わず、続く７日間（すなわち、移植後ほぼ３週目）に再び開始した。捕集は午後４時から午後４時までであり、溶液袋が吊され９０名の看護スタッフにより投与される時間に対応している。
　血液を毎週抜き取り、ＧＬＮ、グルタミン酸塩、アンモニア、アミノ酸、Ｃ−反応性蛋白およびプレアルブミンを検査した。他の血液サンプルは　ＴＰＮ　および器官機能を監視するために主治医が得た。
　患者は、目隠しされない（ｕｎｂｌｉｎｄｅｄ）実験薬剤師が無作意抽出し、治療群と対照群に分けた。これらの群は診断に対してバランスをとり、かつ、第１の寛解における　ＡＭＬ　群内でこれらの群は治療（全身照射有りまたは無し）に対してもバランスをとった。
　カロリー要求量の平均５０％である任意経口摂取の連続３日により示されるように、患者が　ＴＰＮ　をもはや必要としなくなった時に実験を終了した。５０％経口摂取の３日目は　ＴＰＮ　の終りと定義される。全ての場合に、患者が最終の結果分析に含められるのは、ＴＰＮ　が必要とされる期間の、必要とされるカロリーおよび盲検溶液の蛋白の最低６０％を摂取したときだけである。プロトコルは、盲検溶液を全く摂取せず連続５日間が経過したならばその患者は実験から除外されることを要求している。
３．
栄養摂取
　カロリー摂取は身長および体重に応じて評価された代謝速度の約１．５倍に設定した。非蛋白カロリー摂取は約７０％のデキストロースと３０％の脂肪エマルジョンであった。蛋白摂取は１．５ｇ／ｋｇ／日であった。電解質と無機質（ミネラル）を血中濃度が正常範囲内になるように十分量添加した。ビタミン類を　ＭＶＩ−１２　として１０ｍ　ｌ／２４時間添加した。ＴＰＮ　溶液を午後４時から午後４時までのスケジュールで病棟看護人により投与された。理想体重を２０％越える患者では、カロリーおよび蛋白の必要量は年齢と性別に対する理想体重に基づいている。
　４．
薬物治療
　薬物治療および非　ＴＰＮ　溶液はすべてこれらの患者に彼等の医師が必要と見なす所に従って投与された。患者が摂取した薬剤と溶液はすべて記録された。
　５．
追加の評価方法および終点
　患者は、身体の組成（ＴＰＮ−ＡＭＬ　および−後）、中腕筋塊（治療前および後）、握力強さ（ＴＰＮ−前、７日目、２１日目および　ＴＰＮ−後）、ラクツロース透過性（７日目、２１日目および　ＴＰＮ−後）、敗血症重篤度スコア（毎週）、移植片宿主病、粘膜炎スコア（週３回）、安寧の全体的評価（ＴＰＮ−前および−後）について評価された。
　評価された主要な終点はつぎのものを含む：（１）窒素平衡（１週目および２週目）；（２）３−メチルヒスチジンおよびクレアチニンの分泌（１週目および３週目の５−７日の間に捕集された３尿値の平均）；（３）ＣＲＰ（の最初の４−６週間の平均）；（４）身体組成；（５）平均週間敗血症スコア；（６）平均週間発熱および毎日最高温度の週平均；および（７）平均週間　ＧＶＨ　グレード。
　評価された主要でない終点は次のものを含む：（１）単位の日（移植の時から、Ｔ＝０）；（２）移植から再コンタミネーションまでの日数；（３）病院のチャージ、全抗生物質チャージ；（４）注文された抗生物質掛ける投与された日数、すなわち抗生物質日数−ＴＰＮを与えている間のみ、かつ、既知または疑われた感染症にたいする患者の治療に添加された抗生物質をカウントするのみ；（５）白血球のカウントが＞５００および１，００細胞／ｃｍ３に復帰するまでの日数；（６）移植から絶対好中性球カウントが＞５００細胞・ｃｍ３に復帰するまでの日数；（７）ラクツロース透過性、２つの平衡実験期間の終りの２つの機会に測定；（８）輸血された血小板および赤血球の単位；（９）５０％経口摂取または排出までの　ＴＰＮ　投与日数；および（１０）安寧感。
Ｂ．結果
　２人の患者で得られた結果を図７および表ＸＶＩに示す。高投与量の　ＧＬＮ　と併用する　ＴＰＮ　は移植患者の臨床状態の顕著な改善を誘起した。この治療は、負の窒素平衡の増加を防止し、口粘膜炎の重篤度（主に化学療法により誘起された）を低下させ、かつ、示された３つの臨床的判断基準により評価（アセス）されたように患者の全体的健康を改善した。ＧＬＮ　はこのクラスの重篤度の患者の健康に一時的軽減効果を有することが結論される。
　１　標準食餌療法に添加された追加の抗生物質の数量と患者に抗生物質投与を継続した日数との積
　２　臨床的決定がなされ開放されるまで患者が保護的環境（空気層流室）におかれる日数（判断基準は、ＷＢＣ＞１０００、発熱なし、口で食事する用意ができていること、等を含む）。
　３　「汚染された」個体との身体的接触が許可されるまで患者が無菌に保たれる日数。これも臨床的決定である。
　４　口粘膜炎を重篤度の増加につれ０から４のスケールで臨床的等級付け
参考例２
グルタミン強化非経口栄養の膵の外分泌に対する効果
　全非経口栄養（ＴＰＮ）は腸と膵臓の萎縮（ａｔｒｏｐｈｙ）と膵臓の外分泌不全とに関連する。最近の実験によれば、ＧＬＮ　を静注給餌に添加すると　ＴＰＮ　関連腸萎縮が弱められることが実証されている。さらに、以前の実験によれば、ＧＬＮ　は、標準アミノ酸処方には存在しないが、膵臓の好適な酸化燃料であること、および多量の外から投与された　ＧＬＮ　は膵臓の外分泌組織により消費されることが示されている。しかし、ＧＬＮ　添加静脈内給餌の膵臓に対する効果は報告されていない。この実験は２ｇ／１００ｍｌＧＬＮ　強化食餌（グルタミン）か等窒素、等カロリーの　ＧＬＮ　抜き食餌（対照）のいずれかの静脈内注入の実験室ラットの外分泌膵臓の組成および構造に対する効果を調べた。
Ａ．材料および方法
　１．
動物の準備
　雄ウィスターラットを実施例６−８に記載のように飼養した。標準プリナ・ラット・チャウの食餌で飼養する間に満足な体重増加を示したラットのみを実験した。第１の実験（ｎ＝３２）ではすべての動物が腸間膜小腸の６０％切除と頚静脈カテーテル挿入を受けたのに対して、第２の実験の動物（ｎ＝２４）は頚静脈カテーテル挿入とシャム小腸切除とを受けた。チャウ飼養動物（ｎ＝１８）は対照として含めた。
　これらの手術手順は実施例６に記載のように行った。実験した６９匹のラットのうち、チャウ飼養群から除外されたラットは無かったが、ＴＰＮ　群からは１３匹のラットが除外された。これはカテーテル敗血症、吻合漏れ、腸閉塞、ポンプ機能不全またはカテーテル閉鎖のためである。
　２．
実験プロトコル
　小腸切除をしまたはせずにカテーテル挿入した後、動物を無作意抽出し、標準ラット・チャウを経口的に（チャウ）、標準非経口栄養液を　ＧＬＮ　無し（対照）に、または２％ＧＬＮ　強化溶液（グルタミン）を、一定の静脈内注入により７日間摂取させた。
　静脈内食餌はラットを飼育するのに必須のすべての栄養を提供した（Ｐｏｐｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．３６：１１１９−１１２８（１９８２））。これらの溶液は調製され無菌状態に保たれた。非経口食餌は等カロリー（１．１３ｋｃａｌ／ｍｌ）等窒素（９６ｍｇ／ｍｌ）であり、非必須アミノ酸の組成のみが相異していた。
　回復後、ラットを代謝ケージ内に個別に収容し、カテーテルは、栄養溶液の連続注入の間無制約の運動を可能にするスイベル装置（インステック・ラボラトリーズ社）に取り付けられた。外科手術後の最初の１６時間に動物は０．９％正常食塩水を１ｃｃ／時間の速度で摂取したが経口摂取は無かった。すべての動物が手術後１日目から実験の終りまで水道水への自由接近が許された。手術後１日目に　ＴＰＮ　使用された動物は対照または　ＧＬＮ　強化食餌２４ｍｌを摂取しグルコース注入に適応することを許された。手術後２日目に始まり、実験の残りの期間中継続して、十分な量（４８ｍｌ／日）の非経口的食餌が投与された。チャウ飼養された動物は、常に与えられた飼料をすべて消費したが、これらの動物はカロリー濃度において　ＴＰＮ　飼養ラットの２４時間カロリー摂取とほぼ等しい量のチャウを与えられた。このように、チャウ飼養された動物は最初の２４時間はプリナ・ラット・チャウ８ｇをその後は１６ｇ／日を与えられた。これらの動物の静脈カテーテルは手術後２日目に閉鎖された。手術後２日目から毎日尿を酸性化されたウェル内に捕集し、アリコートを酸性化された容器内に−２０℃で貯蔵した。尿の体積を毎日記録した。
　３．
組織の準備および分析手順
　動物を手術後８日目の実験の終りに再度体重測定し、ペントバルビタール（４５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し血液を心臓からヘパリン化シリンジ内に抜き取った。全血　ＧＬＮ　およびグルタミン酸塩濃度をこれらのサンプルについて前記の方法に従い、逆相高速液体クロマトグラフィを使用して測定した（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ，Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　８：１７８３−１７９５（１９８５））。
　放血後、膵臓の小片（３×３ｍｍ）を脾臓部と胃部との接合においてこの腺の中央部分から直ちに切除し、２．５％グルタルアルデヒド緩衝溶液中に固定し、組織学のために処理するまで４℃で貯蔵した。膵臓の残部は注意深く切開し、隣接する腸間膜の脂肪組織およびリンパ組織から分離した。膵臓切除は盲検様式で行った。膵臓を秤量し、氷冷蒸留水に希釈（１：１０、重量／体積）し、ポリトロン組織ホモジナイザーで３０秒間ホモジナイズした。ホモジネートを３０秒間超音波処理し、ＤＮＡ、蛋白および酵素含有量を分析するまで−７０℃で貯蔵した。肝臓は切除し、秤量し、９０℃で７２時間乾燥して乾燥重量を測定した。
　４．
生化学的評価
　各日からの尿のアリコートをプールして累積的日別窒素平衡を評価した。酸性化された尿素サンプルの窒素含有量をマクロキェルダール技法を使用して決定した。膵臓のホモジネートの蛋白含有量をローリー法（Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５（１９５１））により測定し、ＤＮＡ　をバートンの方法（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｋ．Ａ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．６２：３１５−３２２（１９６５））の変法を使用して測定した。各膵臓ホモジネートの一部を蛋白濃度２００μｇｍ／ｍｌまで０．０１％牛血清アルブミン含有バッファで希釈し、酵素活性を決定するまで−２０℃で貯蔵した。希釈サンプルのアミラーゼ活性をバーンフェルド法（Ｂｅｒｎｆｅｌｄ，Ｐ．，Ａｍｙｌａｓｅ：ａｌｐｈａ　ａｎｄ　ｂｅｔａ，Ｉｎ：Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　ＳＰ，ｅｄｓ．Ｋａｐｌａｎ　ＮＯ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｄ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１４９−１５８（１９５５））の変法を用いて測定し、トリプシン活性をハメル法（Ｈｕｍｍｅｌ　Ｂ．Ｃ．，Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７（１２）：１３９３−１３９９（１９５９））にりより決定した。トリプシノーゲンの活性化はサンプル４００μｌをぶたエンテロキナーゼ０．０４９２μｇと３７℃で４時間インキュベートすることにより行われた。リパーゼ活性はコダック・エクタケム７００アナライザでモータの２点速度法（Ｍａｕｃｋ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｌｉｎ．（１９８４））を使用して測定した。酵素活性は１分間当りの生成物マイクロモルのユニット（Ｕ）で表わされている（１ＫＵ＝１０３ユニット）。
　５．
膵臓の組織学
　膵臓組織を４℃で２．５％燐酸グルタルアルデヒド・バッファ中で固定し、１％四酸化オスミウム中で室温で２時間後固定した。この組織標本をアルコール昇級列中で脱水しアラルダイトに包埋した。光学顕微鏡検査のため、１μ厚のセクションを１．０トルイジンブルーで染色した。ＬＫＢ　ノバ・ウルトラミクロトームを使用して電子顕微鏡検査用の６００−８００厚のセクションを調製した。これらのセクションをウラニルアセテートおよび酢酸鉛で染色し、次いでフィリップス３０１透過型電子顕微鏡で検査した。電子顕微鏡で房状細胞を撮影し、最終倍率２７９３×および７１２７×で実用プリントに拡大した。
　６．
データ分析
　結果を平均±この平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）で表す。膵臓の湿重量、ＤＮＡ　および蛋白含有量は全膵臓当りおよび体重１００ｇ当りで表す。膵臓の重量および蛋白含有量は細胞の大きさの指標として　ＤＮＡ　のｍｇ当りでも計算した。理想的には、これらの指標について、大きさが１００ないし３００ｇの間の雄ウィスターラットで全体重と全膵臓湿重腸との間には線形関係が存在するので、体重に対して較正した後に群同士の間で比較がなされた。膵臓酵素活性（ユニット／ｍｇ　蛋白）は全腺含有量としておよび比活性（ユニット／ｍｇ　膵臓　ＤＮＡ）として表す。チモーゲン（酵素原）顆粒の平均直径分布はウェイベル法（Ｗｅｉｂｅｌ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌ．３，ｅｄ．Ｍ．Ａ．Ｈａｙａｔ，Ｖａｎ　Ｎｏｓｔｒａｎｄ　Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，ＮＹ（１９７３））に従って計算した。
　分散の２方向分析を使用して　ＧＬＮ　と腸切除の効果を評価した（Ｗｉｎｅｒ，Ｂ．Ｊ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｉｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｄｅｓｉｇｎ（２ｎｄ　ｅｄ．）ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌ，ＮＹ（１９７１））。分散分析が有意の主要効果を示したら、ＧＬＮ　強化食餌を与えられた動物とそれらの適当な対照との間の計画された事後比較のために不対ｔ検定が使用された。膵臓萎縮の程度を実証するためにチャウ飼養された動物が含められているが、全体治療効果の分析には含められていない。差は確率（ｐ）値が０．０５未満のときは統計的に有意とみなされた。
Ｂ．結果
　１．
体重、窒素平衡ならびに血漿グルタミンおよびグルタミン酸塩
　体重および窒素平衡の変化は、小腸を切除しまたはしなかった、ＧＬＮ　飼養された動物および対照動物と同様であった（表ＸＶＩＩ）。小腸切除を受けた動物では、血漿　ＧＬＮ　濃度（１１４３±７５対８９０±４１、ＧＬＮ　対対照、ｐ＜０．０５）および血漿グルタミン酸塩濃度（１７７±１２対１４４±８、ＧＬＮ　対対照、ｐ＜０．０５）はＧＬＮ　群では対照群よりも有意に高かった。ＧＬＮ　飼養動物と対照動物との間には他には有意の差は見られなかった。
　２．
膵臓の指標
　ＴＰＮ　飼養動物は、チャウ飼養動物と比べて有意に小さい平均膵臓湿重量（３３−４３％）、低い蛋白含有量（２５−５８％）および　ＤＮＡ　含有量（１４−３０％）を持っていた（表ＸＶＩＩＩ）。
　非切除動物では、ＧＬＮ　注入は、対照と比べて体重１００ｇ当りの膵臓重量（２２％）、ＤＮＡ（３２％）および蛋白（２４％）の増加と関連していた。これらの差は膵臓重量（ｐ＜０．０５）およびＤＮＡ（ｐ＜０．００５）に対してはそれぞれ有意であったが膵臓蛋白（ｐ＝０．０６）に対しては有意ではなかった。これらの動物では、膵臓蛋白／ＤＮＡ比および膵臓重量／ＤＮＡ比有意な差がなかった（表ＸＶＩＩＩ）。
　小腸６０％切除を受け　ＧＬＮ　飼養された動物の膵臓は対照と比べて体重１００ｇ当り全膵臓蛋白が大きかった（３１％、ｐ＜０．０５）。全　ＤＮＡ　含有量、膵臓重量／ＤＮＡ比および蛋白／ＤＮＡ比は有意の差が無かった。ただし、後者は　ＧＬＮ　群では２０％大きかった。
　３．
膵臓酵素
　ＴＰＮ　飼養された動物はチャウ飼養された動物に比べて全膵臓酵素活性が低下していた（表ＸＩＸ）。切除動物では、全膵臓トリプシノーゲン（ｐ＜０．００５）およびトリプシノーゲン比活性（ｐ＜０．００５）は　ＧＬＮ　群では対照群よりも有意に大きかった。酵素顔料または比活性には　ＧＬＮ　飼養された動物と対照動物鍍の間で他に差は無かった。
　４．
膵臓組織学および微細構造
　外分泌性膵臓組織およびランゲルハンス島は光学顕微鏡下ではすべての動物で正常に見えた。ＧＬＮ　強化食餌を与えられたラットに見られる体重または蛋白含有量の増加を説明する膵臓炎または浮腫の証拠は無かった。非切除　ＴＰＮ　飼養された動物に対するチモーゲン顆粒の平均プロフィル直径（ｍｅａｎ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｄｉａｍｅｔｅｒ）はチャウ飼養されたラットにおけるよりも有意に小さかった（ＧＬＮ　に対して３．８８±０．０６、対照に対して３．８０±０．０５、および対照に対して４．６９±０．１０、１方向　ＡＮＯＶＡ　によりｐ＜０．０５）。グルタミン群および対照群は有意の差が無かった。同様に配向された房状単位のプロフィルを比較すると、細胞体積密度、チモーゲン顆粒の数、およびチモーゲン顆粒により占められる細胞体積の％面積の増加が対照動物に比べ　ＧＬＮ　飼養された動物において明らかであった。
　５．
結合シリーズからの治療効果の分析
　ＧＬＮ−強化食餌を与えられた動物または小腸切除を受けた動物は有意に血漿中の　ＧＬＮ（ｐ＜０．０２）濃度およびグルタミン酸塩（ｐ＜０．０２）濃度が上昇していた。ＧＬＮ　注入は累積的窒素平衡に影響しなかったが腸切除は有意の負の効果を示した。膵臓重量は（ｐ＜０．０００１）、蛋白含有量（ｐ＜０．００２）、および　ＤＮＡ　含有量（ｐ＜０．０００４）は　ＧＬＮ　を与えられた動物では有意に高く、これらの効果は腸切除とは無関係であった。腸切除は全膵臓蛋白含有量（ｐ＜０．００６）および膵臓蛋白／ＤＮＡ比（ｐ＜０．０５）を有意に低下させた。
　ＧＬＮ　飼養された動物はトリプシノーゲン含有量（ｐ＜０．０２）およびリパーゼ含有量（Ｐ＜０．０３）が有意に増加している。全アミラーゼ含有量および全酵素比活性は　ＧＬＮ　注入により影響されなかった。腸切除はトリプシノーゲン、アミラーゼおよびリパーゼの全含有量および各比活性に深甚な負の効果（ｐ＜０．０００１）があった。
　結論として、ＧＬＮ　添加　ＴＰＮ　は、対照の食餌を摂取した動物において、膵臓重量（１４−２２％）、ＤＮＡ　含有量（１２−３２％）および蛋白（２４−３１％）の喪失を有意に減少させた。全体の　ＧＬＮ　飼養された動物は全膵臓トリプシノーゲン含有量（５３％）およびリパーゼ含有量（３０％）を有意に増加させたが、酵素の比活性には差が無かった。下がって、ＧＬＮ　は　ＴＰＮ　の間膵臓外分泌組織のための重要な栄養物である。静脈内栄養補給中の膵臓に対する　ＧＬＮ　の栄養効果は臨床的に重要な意味を含むものである。
参考例３
経小腸基礎食餌を与える間グルタミンは膵臓萎縮を防止する。
　生体外（インビトロ）実験は、ＧＬＮ　が膵臓の重要な呼吸燃料であるが　ＧＬＮ　を添加した経小腸食餌の、膵臓の構造および機能に果す役割が未知であることを実証している。標準的な、ＧＬＮ　添加された基礎食餌の、手術ストレスに続く膵臓および小腸の成長に対する影響は、雄ウィスターラット（ｎ＝２５、体重１９５〜２１０ｇ）で調べた。中央腸間膜小腸の６０％切除および胃フィステル形成の後、ラットは無作為抽出されチャウ（ｃｈｏｗ）あるいは標準的基礎食餌の連続注入（ＣＯＮ）あるいは等窒素，等カロリーの２ｇｍ／１００ｍｌ　ＧＬＮ　添加食餌（ＧＬＮ）を受けた。上記２つの基礎食餌は、それらの非必須窒素源のみが異なっている。実験期間中、毎日採尿が行われ、窒素平衡が調べられた。ラットを犠牲に供したとき、体重が調べられ、ＧＬＮ，グルタンミン酸塩（ＧＬＵ）およびアンモニアのために血液が採取された。肝臓，小腸および膵臓を切り取り、それら重さを秤量し、また、これらは、その　ＤＮＡ　およびタンパク質の含有量を分析し、組織研究用に準備した。肝臓および膵臓を脂肪および酵素の含有量が分析された。上記分析等のデータの一部は、下記の表ＸＸにおいて平均±ｓｅｍ　で示される。
　　＊：Ｐ＜０．０５対　ＣＯＮ；＃：Ｐ＜０．００５　チャウ　対　ＣＯＮ　または　ＧＬＮ（ＡＮＯＶＡ）
　上記基礎食餌を与えると、チャウを与えた動物の膵臓の重さが減少した。ＧＬＮ　は、膵臓の重さの減少を顕著に弱め、膵臓のタンパク質含有量を増加させた。また、ＧＬＮ　は　ＣＯＮ　群と比較して肝臓の湿重量の増加を防止した。ＧＬＮ　群のデータと　ＣＯＮ　群のデータを合わせると、膵臓の重量および　ＤＮＡ　は血漿中　ＧＬＮ　の濃度ではなく血漿中の　ＧＬＵ　濃度（ｐ＜０．０３）に関係づけられた。それは体重および窒素平衡が　ＣＬＮ　群と　ＣＯＮ　群との間では同様であるため、ＧＬＮ　の効果は手術後期間の膵臓塊に異的であると思われる。これらの知見は、ＧＬＮ　は、手術ストレスに続く胃腸組織のための条件的必須栄養物であるという仮設をさらに裏付けるものである。
実施例９
グルタミン強化被経口栄養は、５−フルオロウラシルにより誘起される腸壁へのダメージを抑制する。
　ラクツロースは非代謝性の糖であり、この糖は、胃腸管経路で十分には吸収されない。炎症性腸疾患のような胃腸の病気では、ラクツロースはその粘膜の間隙を通って吸収され、それによってラクツロースは尿中に排出される。従って、尿中のラクツロースの量は、腸の粘膜障壁を通る漏出の尺度である（ｍｅｎｚｉｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．５５０：１０４２−１０４７（１９７４））。
　ラットを、上記実施例８で述べた５−フルオロウラシルで処置した。１００ｍｇ／ｍｌの等浸透圧液としたラクツロース２ｍｌを強制飼養によって注入し、その後２４時間にわたって採尿し、凍らせた。尿中ラクツロースは、Ｚｉｅｇｌｅｒ　等（Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１２３：１３１３−１３１９（１９８８））に記載のように、酵素的に決定された。
　１回の　５−ＦＵ　注入による処置は、２４時間にわたってラクツロースの腸透過性を増加することが解った。この透過性の増加は処置後２４時間から４８時間の間に頂点に達した。ＧＬＮ　に強化　ＴＰＮ　を摂取した動物は、標準的　ＴＰＮ　を与えられた動物に較べ３日間にわたって腸透過性を顕著に減少させた。例えば、５−ＦＵ　の注入後の４８時間から７２時間における２４時間のラクツロースの排出は、ＧＬＮ　措置ラットにおいて３２から１７μｍｏｌｅｓに減少した。
　ＧＬＮ　は、化学療法薬の使用に供なう透過性の上昇から腸管壁を腸の透過性の増加を防ぐことが結論される。この効果は　ＧＩ　経路を介した感染を防ぐ上で最重要なものと期待され、また、上記参考例１に記載のように、骨髄移植を受けた患者のより急速な回復におそらく寄与している。
参考例４
グルタミンは　ＴＰＮ　の免疫抑制効果を緩和する
　ラットには、参考例２（材料と方法，セクション２）に記載したように実験室のチャウ，ＴＰＮ　あるいは　ＧＬＮ　添加　ＴＰＮ　のいずれかが与えられる。処置開始７日後、動物を犠牲に供し、脾臓，胸腺および腸間膜リンパ節を採取した。標準的な技術（Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ　Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２参照）を用いて、これらの組織から細胞懸濁液を調製した。ミトゲンの存在による生体外でのリンパ球増殖反応が、この分野では良く知られた方法を用いて行われた。チャウ群と比較すると、ＴＰＮ　群は１週間で５０％リンパ球の反応性を著しく減少させた。このような抑制は、非経口的溶液における　ＧＬＮ　の存在によって逆転された。すなわち、ＧＬＮ　処置がなされたラットは、ＴＰＮ　動物と対照チャウ飼養ラットの中間のリンパ球反応性を示した。
　従って、非経口的溶液に　ＧＬＮ　が存在すると、ＧＬＮ　の存在しない　ＴＰＮ　によって生じる免疫抑制状態が著しく緩和される。上記実施例９で述べたような腸粘膜障壁の破壊は、免疫機能低下（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）と結合して　ＴＰＮ　を与え続けらえた動物の感染に対する影響の受け易さを増大させる。この影響の受け易さは、（免疫機能低下による）同様に腸管を通って侵入する細菌や他の微生物に対してだけでなく他の経路によるものい対影響の受け易さもおそらく増大させるであろう。ＧＬＮ　の添加された　ＴＰＮ　は、従っていくつかの独立した機序によって寄主防御を促進することを可能にする。骨髄移植を受けた患者の改善された感染状態（上記参考例１参照）は、以上のような　ＧＬＮ　の“寄主に有利な（ｐｒｏ−ｈｏｓｔ）”作用の強力な証拠を提示するものである。
　本発明は十分に述べられたので、本発明の要旨および範囲から逸脱せずかつ過度の実験を要さずに、広い範囲の均等のパラメータ，濃度および条件で、同様の実施が行われ得ることは当業者にとって明らかであろう。
　本発明は、その特定の実施例に関連して説明したが、さらなる変形が可能であることは理解されよう。本出願は、本発明のあらゆる変形，利用あるいは改造を範囲とするものであり、これらは一般に、本発明の原理を伴ない、本発明の分野における公知あるいは慣用的実施の範囲内にあるような本開示からの逸脱また、添付された請求の範囲において示される構成要件に適用されるような本開示からの逸脱を含むものである。
（５７）【特許請求の範囲】
１．動物の正常時の食餌に含まれるより多い、治療有効量のグルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体を含む動物の病理的な腸の透過性を治療するための医薬組成物であって、前記治療が前記腸の透過性の増加を防ぎ病原性微生物による感染率を減少させることによってされるものであり、および前記病理的な腸の透過性が異化機能障害の結果によるものでないことを特徴とする医薬組成物。
２．前記腸の透過性は、本質的に静脈栄養供給に伴うものであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
３．前記動物は化学療法を受けたか、化学療法で治療されていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
４．前記動物は骨髄移植を受けたか、骨髄移植の治療を受けていることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
５．前記動物はヒトであることを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
６．グルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体の非経口による投与の量が、１日に、体重１キログラム当たり０．２ないし３．０グラムの率であることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
７．グルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体の非経口による前記投与の量は、１日に、体重の１キログラム当たり０．３ないし２．５グラムの率であることを特徴とする請求項６に記載の医薬組成物。
８．グルタミンまたはグルタミンの特徴を保持する機能性類縁体の非経口による前記投与の量は、１日に、体重１キログラム当たり０．４ないし２．０グラムの率であることを特徴とする請求項７に記載の医薬組成物。