(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-アミノ酸の製造方法であって、
(i) 腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌を培養培地中で培養し、細菌若しくは培養培地又は両方中で前記L-アミノ酸を生産させ、
(ii) 細菌若しくは培養培地又は両方から前記L-アミノ酸を採取することを含み、
前記細菌が、yajL遺伝子を過剰発現するよう改変されていることを特徴とし、
前記L-アミノ酸が、L-アラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、及びL-チロシンからなる群から選択される、L-アミノ酸の製造方法。
【請求項２】
前記細菌が、エシェリヒア(Escherichia)属に属する請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が、エシェリヒアコリ(Escherichia coli)である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子の発現が、改変されていない細菌と比較して増強されるよう、yajL遺伝子のコピー数を増加させるか、又はyajL遺伝子の発現調節配列を改変することにより、前記yajL遺伝子が過剰発現されている請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記L-アミノ酸が、L-アラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、及びL-フェニルアラニンからなる群から選択される請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記L-アミノ酸がL-フェニルアラニンである請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記L-アミノ酸がL-バリンである請求項１乃至５のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物工業に関し、更に詳しくは、yajL遺伝子を過剰発現するよう改変された腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）の細菌の発酵によりL-アミノ酸を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、L-アミノ酸は、天然起源から得られた微生物の株、又はその変異体を利用する発酵法によって工業的に製造されている。典型的には、微生物は、L-アミノ酸の生産収量を増強するよう改変されている。
【０００３】
L-アミノ酸の生産収量を増強するための多数の技術が報告されており、これには組換えDNAを用いて微生物を形質転換すること（例えば、米国特許第4,278,765 A号参照）、及びプロモータ、リーダー配列、及び／又はアテニュエータのような制御領域、又は当業者に公知の他のものを変更すること（例えば、US20060216796 A1 及びWO9615246 A1参照）が含まれる。生産収量を増強するための他の技術には、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は結果的に得られるL-アミノ酸によるフィードバック阻害に対して標的酵素を非感受性にすることが含まれる（例えば、WO9516042 A1、EP0685555 A1又は米国特許第4,346,170 A号、第5,661,012 A号、及び第6,040,160号参照）。
【０００４】
L-アミノ酸の生産収量を増加させるための他の方法には、標的L-アミノ酸の分解に関与する１つの遺伝子又は幾つかの遺伝子、標的L-アミノ酸の前駆体をL-アミノ酸の生合成経路から転用させる遺伝子、炭素、窒素、及びリン酸フラックスの再分布に関与する遺伝子、及びトキシン等をコードする遺伝子等の発現を減衰させるものがある。
【０００５】
yajL遺伝子は、シャペロン、ペプチダーゼ、及びタンパク質DJ-1を含むPfpI/Hsp31/DJ-1スーパーファミリーに属するYajLタンパク質をコードする（Messaoudi N.ら, DJ-1随伴性パーキンソン症候群の原核生物モデルにおける包括的なストレス応答（Global stress response in a prokaryotic model of DJ-1-associated Parkinsonism）, J. Bacteriol., 2013, 195(6):1167-1178）。例えば、大腸菌（E. coli）YajLタンパク質は、ヒトDJ-1、オンコジーン及び神経保護タンパク質（その機能喪失変異体は、ある種の家系性で常染色体性の劣性遺伝性パーキンソン症候群を随伴する）に対して、40％の配列同一性及び類似する三次元構造を有する（Wilson M.A.ら, 大腸菌由来のYajL (ThiJ)タンパク質の原子分解結晶構造：パーキンソン症候群に随伴するタンパク質DJ-1の原核生物の密接な相同体（The atomic resolution crystal structure of the YajL (ThiJ) protein from Escherichia coli: a close prokaryotic homologue of the Parkinsonism-associated protein
DJ-1）, J. Mol. Biol., 2005, 353(3):678-691）。YajL及びDJ-1の結晶構造の高い相同性及び類似性は、タンパク質が類似する機能を有することを示唆する。最近、YajLが、酸化的なストレスや酸化的なストレスに誘導されたタンパク質の凝集に対して、恐らくそのシャペロン機能及び遺伝子発現の調節を介して、細菌を保護することが見出された（Kthiri F.ら, パーキンソン症候群に随伴するタンパク質DJ-1の細菌の相同体であるYajLを欠如した変異体におけるタンパク質の凝集（Protein aggregation in a mutant deficient in YajL, the bacterial homolog of the Parkinsonism-associated protein DJ-1）, J.
Biol. Chem., 2010, 285:10328-10336）。E. coliにおいては、YajLは、酸化的なストレスに際して、シャペロン、プロテアーゼ、リボソームタンパク質、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、及びFeSタンパク質と共に混成ジスルフィドを形成する共有結合性のシャペロンとして機能する（Messaoudi N.ら, J. Bacteriol., 2013, 195(6):1167-1178）。
【０００６】
現在に至るまで、腸内細菌科の改変された細菌株によるL-アミノ酸の生産に対する、yajL遺伝子の過剰発現に由来する効果を示すデータは報告されていない。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の１つの側面は、腸内細菌科に属する細菌であって、Escherichia属に、更に詳しくはEscherichia coli (E. coli) 種に属するものとすることができ、yajL遺伝子を過剰発現するよう改変された細菌を提供することにある。
【０００８】
本発明の他の側面は、後記する腸内細菌科の細菌を使用し、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、又はL-バリンのようなL-アミノ酸を製造する方法を提供することにある。
【０００９】
これらの目的は、Escherichia属に、更に詳しくは、E. coli種に属するものとすることができる、腸内細菌科に属する細菌におけるyajL遺伝子の過剰発現が、限定されるものではないが、特に、L-バリンのようなピルビン酸ファミリーのL-アミノ酸、及びL-フェニルアラニンのような芳香族L-アミノ酸のより高い生産性を、微生物に対して与えることを予期せずに見出したことによって達成された。
【００１０】
本発明の１つの側面は、L-アミノ酸の製造方法であって、
(i) 腸内細菌科のL-アミノ酸生産細菌を培養培地中で培養し、細菌若しくは培養培地又は両方中で前記L-アミノ酸を生産させ、
(ii) 細菌若しくは培養培地又は両方から前記L-アミノ酸を採取することを含み、
細菌が、yajL遺伝子を過剰発現するよう改変されていることを特徴とするL-アミノ酸の製造方法を提供するものである。
【００１１】
本発明の更なる側面は、細菌が、エシェリヒア(Escherichia)属に属する前記方法を提供するものである。
【００１２】
本発明の更なる側面は、細菌が、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)である前記方法を提供するものである。
【００１３】
本発明の更なる側面は、遺伝子の発現が、改変されていない細菌と比較して増強されるよう、yajL遺伝子のコピー数を増加させるか、又はyajL遺伝子の発現調節配列を改変することにより、yajL遺伝子が過剰発現されている前記方法を提供するものである。
【００１４】
本発明の更なる側面は、L-アミノ酸が、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、L-チロシン、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、及びL-バリンからなる群から選択される前記方法を提供するものである。
【００１５】
本発明の更なる側面は、L-アミノ酸が、L-アラニン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-バリン、及びL-フェニルアラニンからなる群から選択される前記方法を提供するものである。
【００１６】
本発明の更なる側面は、L-アミノ酸がL-フェニルアラニンである前記方法を提供するも
のである。
【００１７】
本発明の更なる側面は、L-アミノ酸がL-バリンである前記方法を提供するものである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明を以下に詳細に説明する。
【００１９】
１．細菌
「L-アミノ酸生産細菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地中又は細菌細胞内でL-アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、且つ／又は蓄積を生起する能力を有する腸内細菌科の細菌を意味するものとすることができる。
【００２０】
「L-アミノ酸生産細菌」という記載は、野生株又は親株、例えば、E. coli K-12よりも多い量で培養培地中でL-アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、且つ／又は蓄積を生起することのできる細菌を意味するものとすることもでき、微生物が、0.5 g/L以上又は1.0
g/L以上の量の標的L-アミノ酸の培養培地中の蓄積を生起することができることを意味するものとすることもできる。
【００２１】
「L-アミノ酸生産能力」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地又は細菌細胞からL-アミノ酸を採取することができるようなレベルまで、培養培地中又は細菌細胞内でL-アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、且つ／又は蓄積を生起する細菌の能力を意味するものとすることができる。
【００２２】
「L-アミノ酸」という記載は、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、及びL-バリンを意味するものとすることができる。
【００２３】
「芳香族L-アミノ酸」という記載は、例えば、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、及びL-チロシンを含む。L-ヒスチジンはイミダゾール環のような芳香族部分を有していることから、「芳香族L-アミノ酸」という記載は、前記した芳香族L-アミノ酸の他に、L-ヒスチジンも含むことができる。
【００２４】
「非芳香族L-アミノ酸」という記載は、例えば、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、及びL-バリンを含む。L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、又はL-チロシンのような芳香族アミノ酸の生合成経路は、L-ヒスチジンの生合成経路とは異なることから、「非芳香族L-アミノ酸」という記載は、前記した非芳香族L-アミノ酸の他に、L-ヒスチジンも含むことができる。
【００２５】
１つのL-アミノ酸は、１以上のL-アミノ酸ファミリーに属することができる。例として、L-アミノ酸は、L-アルギニン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、及びL-プロリンを含むグルタミン酸ファミリー； L-システイン、グリシン、及びL-セリンを含むセリンファミリー；L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-イソロイシン、L-リジン、L-メチオニン、及びL-スレオニンを含むアスパラギン酸ファミリー；L-アラニン、L-イソロイシン、L-バリン、及びL-ロイシンを含むピルビン酸ファミリー； 及びL-フェニルアラニン、L-トリプトファン、及びL-チロシンを含む芳香族ファミリーに属するものとすることができる。幾つかのL-アミノ酸は、特定のL-アミノ酸の生合成経路において、中間体アミノ酸となる
ことができるため、前記したアミノ酸のファミリーは、他のL-アミノ酸、例えば、非タンパク新生（non-proteinogenic）L-アミノ酸も含むことができる。例えば、L-シトルリン及びL-オルニチンは、L-アルギニン生合成経路由来のアミノ酸である。したがって、グルタミン酸ファミリーは、L-アルギニン、L-シトルリン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-オルニチン、及びL-プロリンを含み得る。
【００２６】
L-アルギニン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、及びL-バリンが特定の例である。L-アラニン、L-イソロイシン、L-バリン、及びL-ロイシンのようなピルビン酸ファミリーのアミノ酸は、好適な例である。L-フェニルアラニン、L-トリプトファン、及びL-チロシンのような芳香族アミノ酸は、依然として好適な例である。L-バリン及びL-フェニルアラニンは更に好適な例である。
【００２７】
「L-アミノ酸」という記載は、遊離した形態のL-アミノ酸だけを包含するのではなく、L-アミノ酸の塩又は水和物、又はL-アミノ酸と他の有機又は無機化合物とにより形成される付加物をも包含し得るものとする。
【００２８】
腸内細菌科に属する細菌は、Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Klebsiella, Morganella, Pantoea, Photorhabdus, Providencia, Salmonella, Yersinia属等に由来するものとすることができ、L-アミノ酸を生産する能力を有するものとすることができる。特に、NCBI (National Center for Biotechnology Information)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)で使用される分類学によって腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。改変することのできる腸内細菌科に由来する株の例には、Escherichia, Enterobacter又はPantoea属の細菌が含まれる。
【００２９】
ここに開示する主題に従ってEscherichia細菌を取得するために改変することのできるEscherichia細菌の株は、特に限定されず、具体的には、Neidhardtらの研究に記載されているものを使用することができる（Bachmann, B.J.,「E. coli K-12の幾つかの変異体誘導体の誘導と遺伝子型（Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E.
coli K-12）」, p. 2460-2488。F.C. Neidhardtら(編集), E. coliとSalmonella: 細胞及び分子生物学（E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology）、第２版、ASM Press, Washington, D.C., 1996中に記載されている）。このE. coli種は特定の例である。E. coliの具体的な例には、E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076)等が含まれ、これらは原型の野生型株であるE. coli K-12株から誘導されたものである。これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）(私書箱（P.O. Box）1549, マナッサス, VA 20108,アメリカ合衆国)から入手可能である。すなわち、それぞれの株に登録番号が与えられており、これらの登録番号を使用して株を注文することができる（www.atcc.org参照）。株の登録番号は、American Type Culture Collectionのカタログに列挙されている。
【００３０】
Enterobacter細菌の例には、Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes等が含まれる。Pantoea細菌の例には、Pantoea ananatis等が含まれる。Enterobacter agglomeransの幾つかの株は、最近、16S rRNAのヌクレオチド配列解析等に基いて、Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis又はPantoea stewartiiに再分類された。腸内細菌科に分類される細菌である限り、属Enterobacter又はPantoeaのいずれかに属する細菌を使用することができる。Pantoea ananatis株を遺伝子工学技術によって育種する場合、Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614), AJ13356株(FERM BP-6615), AJ13601株(FERM BP-7207)及びこれらの誘導体を使用することができる。単離してEnterobacter agglomeransとして寄託した場合、これらの株は、Enterobacter agglomeransとして同定されていた。しかしながら、前記したように、これらは、最近、16S rRNAのヌクレオチド配列決定等に基いて
Pantoea ananatisとして再分類された。
【００３１】
L-アミノ酸生産細菌
腸内細菌科に属し、yajL遺伝子を過剰発現するよう改変され、芳香族又は非芳香族L-アミノ酸を生産することのできる細菌を使用することができる。
【００３２】
細菌は、L-アミノ酸生産能力を固有に有するものとすることができ、又は変異方法又はDNA組換え技術を使用することによってL-アミノ酸生産能力を有するよう改変されたものとすることができる。細菌は、L-アミノ酸を生産する能力を固有に有する細菌中で、yajL遺伝子を過剰発現させることによって取得することができる。代替的に、細菌は、yajL遺伝子を既に過剰発現する細菌に対して、L-アミノ酸を生産する能力を付与することによって取得することができる。
【００３３】
細菌は、L-アミノ酸を単独で、又は２種類以上のL-アミノ酸の混合物として生産することができる。
【００３４】
L-アルギニン生産細菌
L-アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli株237 (VKPM B-7925) (米国特許出願2002/058315 A1)及びその誘導体株（変異体N-アセチルグルタメート合成酵素を保有する(RU2215783)）、E. coli株382 (VKPM B-7926) (EP1170358 A1)、N-アセチルグルタメート合成酵素をコードするargA遺伝子を内部に導入したアルギニン生産株(EP1170361 A1)等が含まれる。
【００３５】
L-アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L-アルギニン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、N-アセチル−γ−グルタミルリン酸還元酵素（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸合成酵素（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）をコードする遺伝子が含まれる。
【００３６】
L-シトルリン生産細菌
L-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli変異体N-アセチルグルタミン酸合成酵素株237/pMADS11, 237/pMADS12, 及び237/pMADS13 (ロシア特許第2215783号, 欧州特許第1170361 B1号, 米国特許第6790647 B2号)、共に変異体フィードバック耐性カルバモイルリン酸合成酵素を保有するE. coli株333 (VKPM B-8084)及び374 (VKPM B-8086)(ロシア特許RU2264459 C2)、α−ケトグルタル酸合成酵素活性が増加すると共にフェレドキシンNADP+還元酵素、ピルビン酸合成酵素又はα−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が付加的に改変されたE. coli株(EP 2133417 A1)、及びコハク酸脱水素酵素及びα−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が減少したP. ananantis株NA1sucAsdhA (米国特許出願第2009286290号)等が含まれる。
【００３７】
L-シトルリンは、L-アルギニン生合成経路の中間体であることから、L-シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L-アルギニン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。この種の遺伝子の例には、限定されるものではないが、N-アセチルグルタミン酸合成酵素（argA）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、N-アセチルグルタミルリン酸還元酵素（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニ
チンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）、又はこれらの組合せが含まれる。
【００３８】
L-シトルリン生産細菌は、いずれかのL-アルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株(VKPM B-7926)から、argG遺伝子によってコードされるアルギノコハク酸合成酵素の不活性化によっても容易に取得することができる。
【００３９】
L-システイン生産細菌
L-システイン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、フィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysE 対立遺伝子により形質転換されたE. coli
JM15(米国特許第6,218,168号, ロシア特許第2279477号)、細胞に有毒な物質を分泌するのに適切なタンパク質をコードする過剰発現した遺伝子を有するE. coli W3110(米国特許第5,972,663号)、低下したシステインデスルホヒドラーゼ活性を有するE. coli株(JP11155571 A2)、cysB遺伝子によってコードされたシステインレギュロン（cysteine regulon）についての正の転写レギュレータの増加した活性を有するE. coli W3110 (WO0127307 A1))等が含まれる。
【００４０】
L-グルタミン酸生産細菌
L-グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli VL334thrC+ (EP 1172433)が含まれる。E. coli VL334 (VKPM B-1641)は、thrC及びilvA遺伝子に変異を有する、L-イソロイシン及びL-スレオニン栄養要求株である(米国特許第4,278,765号)。thrC遺伝子の野生型対立遺伝子は、野生型E. coli株K-12 (VKPM B-7)細胞上で生育させたバクテリオファージP1を使用する一般的なトランスダクションの方法によって転移させた。この結果、L-グルタミン酸を生産することのできるL-イソロイシン栄養要求株VL334thrC+ (VKPM B-8961)を取得した。
【００４１】
L-グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、L-グルタミン酸の生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。この種の遺伝子の例には、グルタミン酸脱水素酵素(gdhA), グルタミン合成酵素(glnA), グルタミン酸合成酵素(gltAB), イソクエン酸脱水素酵素(icdA),
アコニテートヒドラターゼ(acnA, acnB), クエン酸合成酵素(gltA), ホスホエノールピルピン酸カルボキシラーゼ(ppc), ピルビン酸カルボキシラーゼ(pyc), ピルビン酸脱水素酵素(aceEF, lpdA), ピルビン酸キナーゼ(pykA, pykF), ホスホエノールピルビン酸合成酵素(ppsA), エノラーゼ(eno), ホスホグリセロムターゼ(pgmA, pgmI), ホスホグリセリン酸キナーゼ(pgk), グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(gapA), トリオースリン酸イソメラーゼ(tpiA), フルクトース二リン酸アルドラーゼ(fbp), ホスホフルクトキナーゼ(pfkA, pfkB)及びグルコースリン酸イソメラーゼ(pgi)をコードする遺伝子が含まれる。
【００４２】
クエン酸合成酵素遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子及び／又はグルタミン酸脱水素酵素遺伝子の発現が増強されるよう改変された株の例には、EP1078989 A2, EP955368 A2及びEP952221 A2に開示されるものが含まれる。
【００４３】
L-グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L-グルタミン酸生合成経路から分岐させることによりL-グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性を減少させるか、又は除去した株も含まれる。この種の酵素の例には、イソクエン酸リアーゼ(aceA), α−ケトグルタル酸脱水素酵素(sucA), ホスホトランスアセチラーゼ(pta), 酢酸キナーゼ(ack), アセトヒドロキシ酸合成酵素(ilvG), アセト乳酸合成
酵素(ilvI), ギ酸アセチルトランスフェラーゼ(pfl), 乳酸脱水素酵素(ldh)、及びグルタミン酸脱炭酸酵素(gadAB)が含まれる。α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性が欠損するか、又は減少したα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性を有するEscherichia属に属する細菌及びこれらを取得する方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。具体的には、これらの株には以下のものが含まれる：
E. coli W3110sucA::KmR
E. coli AJ12624 (FERM BP-3853)
E. coli AJ12628 (FERM BP-3854)
E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)
【００４４】
E. coli W3110sucA::KmRは、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸脱水素酵素遺伝子（以下では「sucA遺伝子」として言及する）を破損することによって得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素を完全に欠損している。
【００４５】
L-グルタミン酸生産細菌の他の例には、Escherichia属に属し、アスパラギン酸代謝抵抗物質に対して耐性を有する株が含まれる。これらの株は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性が欠損したものとすることもでき、これらの例には、例えば、E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (米国特許第5,908,768号), 低いL-グルタミン酸分解能力を付加的に有するFFRM P-12379 (米国特許第5,393,671号), AJ13138 (FERM BP-5565) (米国特許第6,110,714号)等が含まれる。
【００４６】
L-グルタミン酸生産細菌の例には、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性が欠損しているか、又は減少したα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性を有し、前記したようにして取得することのできる属Pantoeaに属する変異株が含まれる。この種の株には、Pantoea ananatis AJ13356 (米国特許第6,331,419号)が含まれる。Pantoea ananatis AJ13356は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry）（現在は、独立行政法人、製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (NITE IPOD)、〒292-0818
千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 120号室、日本国）において、1998年２月19日に、FERM P-16645の受託番号の下で寄託された。その後、これはブダペスト条約の規定の下で、1999年１月11日に国際寄託へと移管され、FERM BP-6615の受託番号を受けた。Pantoea ananatis AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子(sucA)の破損の結果として、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性を欠損している。前記株は、Enterobacter agglomerans AJ13356として単離されて寄託された際は、Enterobacter agglomeransとして同定された。しかしながら、最近では、16S rRNAのヌクレオチド配列決定等に基いて、これはPantoea ananatisとして再分類された。AJ13356は、前記した寄託においては、Enterobacter agglomeransとして寄託されているが、この明細書の目的のためには、これらはPantoea ananatisとして記載する。
【００４７】
L-ヒスチジン生産細菌
L-ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli株24 (VKPM B-5945, RU2003677), E. coli株80 (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116 - B12121 (米国特許第4,388,405号), E. coli H-9342 (FERM BP-6675)及びH-9343 (FERM BP-6676) (米国特許第6,344,347号), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087), E. coli AI80/pFM201 (米国特許第6,258,554号)等が含まれる。
【００４８】
L-ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L-ヒスチジ
ン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼ(hisG)、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ(hisI)、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ／ホスホリボシル-ATPピロホスファターゼ(hisIE)、ホスホリボシルホルムイミノ-5-アミノイミダゾールカルボキシアミドリボチドイソメラーゼ(hisA)、アミドトランスフェラーゼ(hisH)、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ(hisC)、ヒスチジノールホスファターゼ(hisB)、ヒスチジノール脱水素酵素(hisD)等をコードする遺伝子が含まれる。
【００４９】
hisG及びhisBHAFIによってコードされるL-ヒスチジン生合成酵素は、L-ヒスチジンによって阻害され、したがって、L-ヒスチジン生産能力も、ATPホスホリボシルトランスフェラーゼに、フィードバック阻害に対する耐性を与える変異を導入することによって効率的に増強することができることが知られている（ロシア特許第2003677号及び第2119536号）。
【００５０】
L-ヒスチジン生産能力を有する株の特定の例には、L-ヒスチジン生合成酵素をコードするDNAを担持するベクターにより形質転換されたE. coli FERM-P 5038及び5048 (JP 56-005099 A)、アミノ酸の搬出のための遺伝子であるrhtにより形質転換されたE. coli株(EP1016710 A2)、スルファグアニジン、DL-1,2,4-トリアゾール-3-アラニン、及びストレプトマイシン耐性を付与されたE. coli 80株(VKPM B-7270, RU2119536)等が含まれる。
【００５１】
L-イソロイシン生産細菌
L-イソロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、6-ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異株(JP 5-304969 A)、チアイソロイシン及びイソロイシンヒドロキサメートのようなイソロイシンアナログに対する耐性を有する変異株、及びDL-エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対する耐性を付加的に有する変異株(JP 5-130882 A)が含まれる。加えて、スレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキサメート合成酵素のようなL-イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子により形質転換された組換え株も、親株として使用することができる(JP 2-458 A, EP0356739 A1及び米国特許第5,998,178号)。
【００５２】
L-ロイシン生産細菌
L-ロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ロイシンに対して（例えば、株57 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号)）又はβ-2-チエニルアラニン、3-ヒドロキシロイシン、4-アザロイシン、5,5,5-トリフルオロロイシンを含むロイシンアナログに対して（JP 62-34397 B及びJP 8-70879 A）耐性であるE. coli株；WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法によって得られたE. coli株；E. coli H-9068 (JP 8-70879 A)等が含まれる。
【００５３】
細菌は、L-ロイシン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。例には、leuABCDオペロンの遺伝子が含まれ、これは、L-ロイシンによるフィードバック阻害から解放されたイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする変異体leuA遺伝子によって代表されるものとすることができる（米国特許第6,403,342号）。加えて、細菌は、細菌細胞からL-アミノ酸を分泌させるタンパク質をコードする１以上の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。この種の遺伝子の例には、b2682及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)が含まれる。
【００５４】
L-リジン生産細菌
Escherichiaファミリーに属するL-リジン生産細菌の例には、L-リジンアナログに対する耐性を有する変異株が含まれる。L-リジンアナログは、Escherichia属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、培地中にL-リジンが存在する場合は、完全に又は部分的
に脱感作される。L-リジンアナログの例には、限定されるものではないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、S-(2-アミノエチル)-L-システイン(AEC)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等が含まれる。これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異株は、Escherichia属に属する細菌を従来の人工的な変異誘発処理に供することによって取得することができる。L-リジンを生産するのに有用な細菌株の特定の例には、E.
coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照)及びE. coli
VL611が含まれる。これらの微生物においては、L-リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。
【００５５】
L-リジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、L-リジン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリネート合成酵素(dapA)、アスパルトキナーゼ(lysC)、ジヒドロジピコリネート還元酵素(dapB)、ジアミノピメレート脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメレート脱水素酵素(ddh) (米国特許第6,040,160号)、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc)、アスパルテートセミアルデヒド脱水素酵素(asd)、及びアスパルターゼ(aspA) (EP1253195 A1)をコードする遺伝子が含まれる。加えて、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子(cyo) (EP1170376 A1)、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ(pntAB) (米国特許第5,830,716 A号)をコードする遺伝子、ybjE遺伝子(WO2005/073390)又はこれらの組合せの増加したレベルの発現を有し得る。
【００５６】
L-アミノ酸生産細菌は、L-アミノ酸生合成経路からの分岐を生起し、結果的に他の化合物の生産に至る反応を触媒する酵素の活性が低減しているか、又はこの活性を有さないものとすることができる。また、細菌は、L-アミノ酸の合成又は蓄積に対して負に作用する酵素の活性が低減しているか、又はこの活性を有さないものとすることもできる。L-リジン生産に関与するこの種の酵素の例には、ホモセリン脱水素酵素、リジンデカルボキシラーゼ(cadA, ldcC)、リンゴ酸酵素（malic enzyme）等が含まれ、これらの酵素の活性を減少させるか、又は欠失させた株は、WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175等に開示されている。
【００５７】
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子の両方の発現は、リジンデカルボキシラーゼ活性を減少させるか、又は欠失させるために減少させることができる。両方の遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載された方法によって減少させることができる。
【００５８】
L-リジン生産細菌の例には、E. coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株(WO2006/078039)を含むものとすることができる。この株は、リジンデカルボキシラーゼをコードする破損したcadA及びldcC遺伝子を有するWC196株に、リジン生合成遺伝子を含むプラスミドpCABD2（米国特許第6,040,160号）を導入することによって構築された。
【００５９】
WC196株は、W3110株から育種されたものであり、これは、位置352のスレオニンがイソロイシンにより置き換えられた変異体アスパルトキナーゼIIIをコードする変異体lysCを用いて、W3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を置き換え、結果的にL-リジンによるフィードバック阻害を脱感作させ（米国特許第5,661,012号）、この結果得られた株にAEC耐性を付与することにより、E. coli K-12から誘導されたものである(米国特許第5,827,698号)。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所（National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science
and Technology）（現在は、NITE IPOD、〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 120号室、日本国）において、1994年12月６日に寄託され、FERM P-14690の受託番号を割り当てられた。その後、これはブダペスト条約の規定の下で、1995年９月29日に国際寄託へと移管され、FERM BP-5252の受託番号が割り当てられた(米国特許第5,827,698号)
。
【００６０】
WC196ΔcadAΔldcC株自体も、L-リジン生産細菌の例である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所（National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology）（現在は、NITE IPOD、〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 120号室、日本国）において、2008年10月７日に、FERM BP-11027の受託番号の下で、国際寄託として寄託された。
【００６１】
L-メチオニン生産細菌
L-メチオニン生産細菌及びL-メチオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia細菌株、例えば株AJ11539 (NRRL
B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401), AJ 11542 (NRRL B-12402) (特許GB2075055); 株218 (VKPM B-8125) (特許RU2209248)及び73 (VKPM B-8126) (特許RU2215782)（L-メチオニンアナログであるノルロイシン等に耐性である）等が含まれる。株E. coli 73は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、2001年５月14日に、受託番号VKPM B-8126の下で寄託され、ブダペスト条約の下で、2002年２月１日に国際寄託に移管された。更に、メチオニンリプレッサ欠損株並びにホモセリントランススクシニラーゼ及びシスタチオニンγ−合成酵素(JP 2000-139471 A)のようなL-メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子により形質転換された組換え株も、親株として使用することができる。
【００６２】
L-オルニチン生産細菌
L-オルニチン生産細菌は、argF及びargI遺伝子の両方によってコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化により、いずれかのL-アルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株(VKPM B-7926)から容易に取得することができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化のための方法は、ここに記載されている。
【００６３】
L-フェニルアラニン生産細菌
L-フェニルアラニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), 変異体pheA34遺伝子を保有するE. coli HW1089 (ATCC 55371)
(米国特許第5,354,672号), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 (米国特許第4,407,952号)が含まれる。また、E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662)及びE. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB]（AJ 12604 (FERM BP-3579)として命名された）も親株として使用することができる (EP488424 B1)。更に、yedA遺伝子又はyddG遺伝子によってコードされるタンパク質の増強された活性を有するEscherichia属に属するL-フェニルアラニン生産細菌も使用することができる (米国特許出願2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００６４】
L-プロリン生産細菌
L-プロリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli 702ilvA (VKPM B-8012)が含まれ、これはilvA遺伝子を欠損し、L-プロリンを生産することのできるものである(EP1172433 A1)。細菌は、L-プロリン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。L-プロリン生産細菌中で使用することのできるこの種の遺伝子の例には、L-プロリンによるフィードバック阻害が脱感作されたグルタミン酸キナーゼ
をコードするproB遺伝子が含まれる(DE3127361 A1)。加えて、細菌は、細菌細胞からL-アミノ酸を分泌するタンパク質をコードする１以上の遺伝子の発現を増強することにより改良することができる。この種の遺伝子は、b2682及びb2683遺伝子(ygaZH遺伝子) (EP1239041 A2)によって例示される。
【００６５】
L-プロリンを生産する活性を有するEscherichia属に属する細菌の例には、次のE. coli株が含まれる：NRRL B-12403及びNRRL B-12404 (GB特許2075056), VKPM B-8012 (ロシア特許出願第2000124295号), DE3127361 A1に記載されたプラスミド変異体, Bloom F.R.らにより「第15回マイアミ冬季シンポジウム（The 15th Miami winter symposium）」, 1983, p.34に記載されたプラスミド変異体等。
【００６６】
L-スレオニン生産細菌
L-スレオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (米国特許第5,175,107号, 米国特許第5,705,371号), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (米国特許第5,631,157号), E. coli NRRL-21593 (米国特許第5,939,307号), E. coli FERM BP-3756 (米国特許第5,474,918号), E. coli FERM BP-3519及びFERM BP-3520 (米国特許第5,376,538号), E. coli MG442 (Gusyatinerら、Genetika (ロシア語), 1978, 14:947-956), E. coli VL643及びVL2055 (EP1149911 A2)等が含まれる。
【００６７】
株TDH-6は、thrC遺伝子を欠損すると共に、ショ糖同化性であり、そのilvA遺伝子はリーキー変異を有する。この株は、rhtA遺伝子にも変異を有し、これにより高濃度のスレオニン又はホモセリンに対する耐性が与えられている。株B-3996はプラスミドpVIC40を含み、これは変異体thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010誘導ベクター中に挿入することによって取得された。この変異体thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼホモセリン脱水素酵素Iをコードする。株B-3996は、1987年11月19日に、All-Union Scientific Center of Antibiotics (ロシア連邦 (Russian Federation), 117105 モスクワ (Moscow), Nagatinskaya Street 3-A)において、受託番号RIA 1867の下で寄託された。また、この株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny proezd, 1モスクワ (Moscow) 117545, ロシア連邦 (Russian Federation))において、1987年４月７日に、受託番号VKPM B-3996の下でも寄託された。
【００６８】
L-スレオニン生産細菌を誘導するための親株として、E. coli VKPM B-5318 (EP0593792
A1)を使用することもできる。株B-5318は、イソロイシンに関して原栄養性であり、温度感受性のラムダファージC1リプレッサ及びPRプロモータにより、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が交換されている。株VKPM B-5318は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika（1 Dorozhny proezd, 1 モスクワ117545, ロシア連邦）において、1990年３月３日に受託番号VKPM B-5318の下で寄託された。
【００６９】
細菌は、次の遺伝子の１以上の発現を増強するために付加的に改変することができる：−スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼホモセリン脱水素酵素Iをコードする変異体thrA遺伝子；
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子；
−スレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子；
−スレオニン及びホモセリン排出系の推定膜貫通タンパク質をコードするrhtA遺伝子；
−アスパルテート−β−セミアルデヒド脱水素酵素をコードするasd遺伝子；及び
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子。
【００７０】
E. coliのアスパルトキナーゼI及びホモセリン脱水素酵素IをコードするthrA遺伝子は、既に解明されている(KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都遺伝子ゲノム百科事典）, エントリー番号b0002; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 337〜2,799; 遺伝子ID: 945803)。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に局在している。
【００７１】
E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0003; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 2,801〜3,733; 遺伝子ID: 947498)。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に局在している。
【００７２】
E. coliのスレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0004; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3,734〜5,020; 遺伝子ID: 945198)。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrB遺伝子とyaaX遺伝子との間に局在している。これら３つの遺伝子の全ては、単一のスレオニンオペロンthrABCとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響を与えるアテニュエータ領域を、望ましくはオペロンから除去する(WO2005049808 A1, WO2003097839
A1)。
【００７３】
L-スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼI及びホモセリン脱水素酵素Iをコードする変異体thrA遺伝子、並びにthrB及びthrC遺伝子は、L-スレオニン生産性E. coli株VKPM B-3996中に存在する周知のプラスミドpVIC40から、１つのオペロンとして取得することができる。プラスミドpVIC40は、米国特許第5,705,371号に詳細に記載されている。
【００７４】
E. coliのスレオニン及びホモセリン排出系のタンパク質（内側膜輸送体）をコードするrhtA遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0813; GenBank受託番号NC_000913.2;ヌクレオチド位置: 848,433〜849,320, 相補; 遺伝子ID: 947045)。rhtA遺伝子は、glnHPQオペロンに近接したE. coli K-12の染色体上のdps遺伝子とompX遺伝子との間に局在しており、これはグルタミン輸送系の構成要素をコードする。rhtA遺伝子は、ybiF遺伝子と同一である(KEGGエントリー番号B0813)。
【００７５】
E. coliのアスパルテート−β−セミアルデヒド脱水素酵素をコードするasd遺伝子は、既に解明されている(KEGGエントリー番号b3433; GenBank受託番号NC_000913.2;ヌクレオチド位置: 3,571,798〜3,572,901, 相補; 遺伝子ID: 947939)。asd遺伝子は、E. coli K-12の染色体上の同一のストランド（反対側のストランド上のyhgN遺伝子）上のglgB遺伝子とgntU遺伝子との間に局在している。
【００７６】
また、E. coliのアスパルテートアミノトランスフェラーゼをコードするaspC遺伝子も、既に解明されている(KEGGエントリー番号b0928; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 983,742〜984,932, 相補; 遺伝子ID: 945553)。aspC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上で、反対側のストランド上のycbL遺伝子と同一のストランド上のompF遺伝子との間に局在している。
【００７７】
L-トリプトファン生産細菌
L-トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、変異体trpS遺伝子によってコードされるトリプトファニル-tRNA合成酵素が欠損したE. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122)及びJP6015/pMU91 (DSM10123) (米国特許第5,756,345号)、セリンによるフィードバッ
ク阻害から解放されたホスホグリセレート脱水素酵素をコードするserA対立遺伝子及びトリプトファンによるフィードバック阻害から解放されたアントラニレート合成酵素をコードするtrpE対立遺伝子を有するE. coli SV164 (pGH5) (米国特許第6,180,373号)、酵素トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B-12263)及びAGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) (米国特許第4,371,614号)、ホスホエノールピルビン酸生産能力が増強されたE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps (WO9708333, 米国特許第6,319,696号)等が含まれ、これらを使用することができる。yedA遺伝子又はyddG遺伝子によってコードされる同定されたタンパク質の増強された活性を有するEscherichia属に属するL-トリプトファン生産細菌も使用することができる (米国特許出願2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1)。
【００７８】
L-トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、アントラニレート合成酵素、ホスホグリセレート脱水素酵素、及びトリプトファン合成酵素から選択される１以上の酵素の活性が増強された株も含まれる。アントラニレート合成酵素及びホスホグリセレート脱水素酵素は、両方ともL-トリプトファン及びL-セリンによるフィードバック阻害を受けることから、フィードバック阻害を脱感作する変異をこれらの酵素に導入することができる。この種の変異を有する株の特定の例には、脱感作したアントラニレート合成酵素を保有するE. coli SV164、及びE. coli SV164にプラスミドpGH5 (WO 94/08031)（フィードバック脱感作ホスホグリセレート脱水素酵素をコードする変異体serA遺伝子を含む）を導入することにより得られる形質転換体株が含まれる。
【００７９】
L-トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、脱感作したアントラニレート合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンを導入した株も含まれる(JP 57-71397 A, JP 62-244382 A, 米国特許第4,371,614号)。更に、L-トリプトファン生産能力は、トリプトファンオペロン(trpBA)の内のトリプトファン合成酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって与えることができる。トリプトファン合成酵素は、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によってコードされるα及びβサブユニットにより構成される。加えて、L-トリプトファン生産能力は、イソクエン酸リアーゼ−リンゴ酸合成酵素オペロンの発現を増強することによって改良することができる(WO2005/103275)。
【００８０】
L-バリン生産細菌
L-バリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するよう改変された株が含まれる(米国特許第5,998,178号)。生産されるL-バリンによってオペロンの発現が減衰されないよう、減衰に必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去することが望ましい。更に、オペロン内のilvA遺伝子は、スレオニンデアミナーゼ活性が減少するよう、望ましくは破損させるものとする。
【００８１】
L-バリン生産細菌を誘導するための親株の例には、アミノアシル-tRNA合成酵素の変異を有する変異株も含まれる(米国特許第5,658,766号)。例えば、イソロイシンtRNA合成酵素をコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970を使用することができる。E. coli VL1970は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、1988年６月24日に、受託番号VKPM B-4411の下で寄託された。
【００８２】
更に、生育にリポ酸を要求し且つ／又はH+-ATPaseを欠如する変異株も、親株として使用することができる(WO96/06926)。
【００８３】
L-バリン生産細菌を誘導するための親株の例には、E. coli H-81株(VKPM B- 8066；例えば、EP1942183 B1参照), NRRL B-12287及びNRRL B-12288 (米国特許第4,391,907号), V
KPM B-4411 (米国特許第5,658,766号), VKPM B-7707 (欧州特許出願EP1016710 A2)等も含まれる。
【００８４】
腸内細菌科に属する本発明の細菌は、yajL遺伝子を過剰発現するよう改変されている。
【００８５】
「yajL遺伝子を過剰発現するよう改変された細菌」という記載は、改変された細菌内においては、前記したように、また後記するように、改変されていない株、例えば、野生型又は親株と比較して、YajLのような対応する遺伝子タンパク質産物の全酵素活性が増加しているか、又は改変されていない株、例えば、野生型又は親株におけるそのレベルよりyajL遺伝子の発現レベルが高いような様式で、細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。前記比較のための対照として用いられる改変されていない株の例には、Escherichia属に属する微生物の野生型株、例えば、E. coli MG1655株(ATCC 47076), W3110株(ATCC 27325)等が含まれるものとすることができる。
【００８６】
「yajL遺伝子を過剰発現する」という記載は、YajLタンパク質のような対応する遺伝子タンパク質産物の全酵素活性が、改変されていない株と比較して、例えば、細菌ゲノムにおけるyajL遺伝子を導入し且つ／又はそのコピー数を増加させるか、又は前記遺伝子によってコードされるタンパク質の分子当りの活性（比活性として言及することができる）を増加させることによって増加したことを意味するものとすることができる。細胞当りのYajLタンパク質の活性が、改変されていない株の活性の150％以上、200％以上、300％以上増加するよう、細菌を改変することができる。YajLのシャペロン活性を使用し、mg当りのタンパク質の比酵素活性を決定することができる。例えば、クエン酸合成酵素を対照タンパク質として使用し、還元又は酸化条件下でYajLのリフォールディング活性（refolding activity）を測定することができる(Kthiri F.ら、J. Biol. Chem., 2010, 285:10328-10336)。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準品として使用し、ブラッドフォードタンパク質アッセイによって決定することができる(Bradford M.M., Anal. Biochem., 1976, 72:248-254)。
【００８７】
「yajL遺伝子を過剰発現する」という記載は、yajL遺伝子の発現レベルが、改変されていない株のそのレベルより高いことを意味するものとすることもできる。したがって、「yajL遺伝子を過剰発現する」という記載は、「yajL遺伝子の発現を増強する」という記載と等価である。
【００８８】
yajL遺伝子の発現を増強するのに使用することのできる方法には、限定されるものではないが、当業者に公知の遺伝子工学手法に従って、細菌のゲノム中で（染色体中で且つ／又は自律的に複製可能なプラスミド中で）yajL遺伝子のコピー数を増加させ、且つ／又は腸内細菌科の細菌内でyajL遺伝子のコピー数及び／又は発現レベルを増加させることのできるベクター中にyajL遺伝子を導入することが含まれる。
【００８９】
ベクターの例には、限定されるものではないが、広範な宿主範囲のプラスミド、例えば、pMW118/119, pBR322, pUC19等が含まれる。例えば、相同組換え、Muドリブンインテグレーション等により、多コピー（multiple copies）のyajL遺伝子を細菌の染色体DNA中に導入することもできる。相同組換えは、染色体DNA中の多コピーを備える配列を使用して実施することができる。染色体DNA中の多コピーを備える配列には、限定されるものではないが、転位因子（transposable element）の末端に存在する逆方向反復（inverted repeat）又は反復性のDNAが含まれる。加えて、yajL遺伝子をトランスポゾンに取り込み、これを転移させて多コピーのyajL遺伝子を染色体DNA中に導入することができる。Muドリブンインテグレーションを使用することにより、１回の実行の間に３コピーを超える遺伝子を染色体DNAに導入することができる(Akhverdyan V.Z.ら, Biotechnol. (ロシア語), 2007, 3:3-20)。
【００９０】
yajL遺伝子発現の増強は、yajL遺伝子の隣接する調節領域の改変（修飾）によりyajL遺伝子の発現レベルを増加させるか、ネイティブな且つ／又は改変された外来の調節領域（regulatory regions）を導入することによって達成することもできる。調節領域又は配列は、プロモータ、エンハンサ、アテニュエータ及び終止シグナル、アンチ終止シグナル、リボソーム結合部位（RBS）及び他の発現制御因子（例えば、リプレッサ又はインデューサが結合する領域及び／又は例えば転写されたmRNAにおける転写及び翻訳調節タンパク質のための結合部位）によって例示することができる。この種の調節領域は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F.とManiatis T., 「分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載されている。遺伝子（１又は複数）の発現を制御する領域の改変は、公知の方法を使用する細菌ゲノムにおける改変された遺伝子（１又は複数）のコピー数の増加と組合せることができる（例えば、Akhverdyan V.Z.ら, Appl. Microbiol. Biotechnol., 2011, 91:857-871; Tyo K.E.J.ら, Nature Biotechnol., 2009, 27:760-765参照）。
【００９１】
yajL遺伝子発現を増強させる例示的なプロモータは、ネイティブなyajLプロモータより強い強力なプロモータとすることができる。例えば、lacプロモータ、trpプロモータ、trcプロモータ、tacプロモータ、ラムダファージのPR又はPLプロモータは全て、強力なプロモータであることが知られている。腸内細菌科に属する細菌において高いレベルの遺伝子発現を与える強力なプロモータを使用することができる。代替的に、例えば、yajL遺伝子のプロモータ領域に変異を導入してより強いプロモータ機能を取得し、かくしてプロモータの下流に局在するyajL遺伝子の転写レベルの増加に帰着させることにより、プロモータの効果を増強させることができる。更に、シャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno (SD)）配列中で、且つ／又はSD配列と開始コドンとの間のスペーサ中で、且つ／又はリボソーム結合部位における開始コドンから直ぐ上流且つ／又は下流の配列において幾つかのヌクレオチドを置換すると、mRNAの翻訳効率に対して大きく影響を与えることが知られている。例えば、開始コドンに先行する３つのヌクレオチドの性状に依存して、20倍範囲の発現レベルが認められた（Gold L.ら, Annu. Rev. Microbiol., 1981, 35:365-403; Hui A.ら, EMBO J., 1984, 3:623-629）。
【００９２】
コピー数、遺伝子の存在又は非存在は、例えば、染色体DNAの制限処理を行った後に、遺伝子配列に基いたプローブを使用するサザンブロッティング、蛍光インサイツハイブリダイゼーション(FISH)等を行うことによって測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的RT-PCR等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されたmRNAの量を測定することによって決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、SDS-PAGEを行った後にイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング解析）、又はタンパク質サンプルの質量分析解析等を行うことを含む公知の方法によって測定することができる。
【００９３】
プラスミドDNAの調製、消化、DNAの連結及び形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の組込み等のようなDNAの組換え分子の操作及び分子クローン化のための方法は、当業者に周知の通常の方法とすることができる。これらの方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F.とManiatis T., 「分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)又はGreen M.R.とSambrook J.R., 「分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第４版, Cold Spring Harbor Laboratory
Press (2012); Bernard R. Glick, Jack J. PasternakとCheryl L. Patten, 「分子バイオテクノロジー：組換えDNAの原理と応用（Molecular Biotechnology: principles and applications of recombinant DNA」, 第４版, Washington, DC, ASM Press (2009)に記載されている。
【００９４】
yajL遺伝子は、酸化的ストレス耐性シャペロン（oxidative-stress-resistance chaperone） YajL (KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（京都遺伝子ゲノム百科事典）, エントリー番号b0424; Protein Knowledgebase（プロテイン・ナレッジベース）, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号Q46948)をコードする。yajL遺伝子(GenBank受託番号NC_ 000913.2; ヌクレオチド位置: 442275〜442865, 相補; 遺伝子ID: 945066)は、E. coli株K-12の染色体上で同一のストランド上のpanE遺伝子と反対側のストランド上のthiI遺伝子との間に局在している。yajL遺伝子のヌクレオチド配列、及びyajL遺伝子によってコードされるYajLタンパク質のアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２にそれぞれ示す。幾つかの微生物においては、YajLタンパク質は、チアミン代謝に関与するThiJとして誤って記載されている（EcoGene: EG13272; http://www.ecogene.org/old/geneinfo.php?eg_id=EG13272）。この表現型は、現在では隣接するthiI遺伝子に帰するものとされている（T. Begley, 私信（personal communication）（Mueller E. G.ら、tRNAにおける4-チオウリジンの生成に関与する遺伝子の同定（Mueller E.G. et al., Identification of a gene involved in the generation of 4-thiouridine in tRNA）で引用された）, Nucleic Acids Res., 1998, 26(11):2606-2610）。
【００９５】
腸内細菌科の属、種、又は株の間でDNA配列に幾分かの相違があり得ることから、yajL遺伝子は、配列番号１に示す遺伝子に限定されず、配列番号１に対する変異体ヌクレオチド配列又は相同体であって、YajLタンパク質の変異体をコードする遺伝子を含み得る。
【００９６】
「変異体タンパク質」という記載は、１つ又は幾つかのアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、及び／又は付加のいずれであるかに拘らず、配列番号２と比較して、配列中に１つ又は幾つかの変更を有するが、YajLタンパク質のものと類似する活性又は機能を依然として維持するか、又はYajLタンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないタンパク質を意味するものとすることができる。変異体タンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。これは、厳密には限定されるものではないが、配列番号２において、１〜30、他の例では１〜15、他の例では１〜10、更に他の例では１〜５とすることができる。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、このため、この種の変更によって活性又は機能が影響を受けないか、又はYajLの三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないためである。したがって、yajL遺伝子によってコードされるタンパク質変異体は、YajLタンパク質の活性又は機能が維持されるか、又はYajLの三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていない限り、コンピュータプログラムBLASTを使用した場合、配列番号２に示す全アミノ酸配列に対して70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、又は99％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有し得る。
【００９７】
１つ又は幾つかのアミノ酸残基の例示的な置換、欠失、挿入、及び／付加は、保存的な変異（１又は複数）とすることができる。代表的な保存的な変異は、保存的な置換である。保存的な置換は、限定されるものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合は互いにPhe, Trp及びTyrの間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合はAla, Leu, Ile及びValの間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合はGlu, Asp, Gln, Asn, Ser, His及びThrの間で、置換部位が極性アミノ酸である場合はGln及びAsnの間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合はLys, Arg及びHisの間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合はAsp及びGluの間で、置換部位が水酸基を有するアミノ酸である場合はSer及びThrの間で置換が生起する置換とすることができる。保存的な置換の例には、AlaについてのSer又はThrの置換、ArgについてのGln, His又はLysの置換、AsnについてのGlu, Gln, Lys, His又はAspの置換、AspについてのAsn, Glu又はGlnの置換、CysについてのSer又はAlaの置換、GlnについてのAsn, Glu, Lys, His, Asp又はArgの置換、GluについてのAsn, Gln, Lys又はA
spの置換、GlyについてのProの置換、HisについてのAsn, Lys, Gln, Arg又はTyrの置換、IleについてのLeu, Met, Val又はPheの置換、Leu についてのIle, Met, Val又はPheの置換、LysについてのAsn, Glu, Gln, His又はArgの置換、MetについてのIle, Leu, Val又はPheの置換、PheについてのTrp, Tyr, Met, Ile又はLeu の置換、SerについてのThr又はAla の置換、Thr についてのSer又はAlaの置換、TrpについてのPhe又はTyrの置換、TyrについてのHis, Phe又はTrpの置換、及びValについてのMet, Ile又はLeuの置換が含まれる。
【００９８】
変異体タンパク質の活性又は機能が維持され、YajLタンパク質のものと類似するか、又はYajLの三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないものとなるよう、変異（１又は複数）が、アミノ酸配列中の異なる位置（１又は複数）における１以上の二次的な変異（１又は複数）によって補償される限り、１又は幾つかのアミノ酸残基の例示的な置換、欠失、挿入、及び／付加は、非保存的な変異（１又は複数）とすることもできる。
【００９９】
タンパク質又はDNAの相同性の程度を評価するために、BLASTサーチ、FASTAサーチ及びClustalW法のような幾つかの計算方法を使用することができる。BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)サーチは、プログラムblastp, blastn, blastx, megablast, tblastn及びtblastxによって用いられるヒューリスティックなサーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel K.とAltschul S.F. (「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列特徴の統計的な有意性を評価する方法」（Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence
features by using general scoring schemes） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「分子配列におけるマルチプルな高スコアリング断片についての応用と統計」（Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences） Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877)の統計的な方法を使用するその所見に有意性を帰するものである。コンピュータプログラムBLASTにより、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性が計算される。FASTAサーチ法は、Pearson W.R. (「FASTP及びFASTAを用いる迅速で感度の高い配列比較」（Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA）, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98)に記載されている。ClustalW法は、Thompson J.D.ら(「CLUSTAL W：配列の重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及びウエイトマトリックス選択により斬新的なマルチプル配列の並びの感度を改良する」（CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice）, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680)に記載されている。
【０１００】
更に、yajL遺伝子は、変異体ヌクレオチド配列とすることができる。「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、標準的な遺伝子コード表(例えば、Lewin B., 「遺伝子VIII」（Genes VIII）, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458参照)に従ういずれかの同義アミノ酸コドンを使用して「変異体タンパク質」をコードするヌクレオチド配列を意味するものとすることができる。したがって、yajL遺伝子は、遺伝子コードの縮退のため、変異体ヌクレオチド配列とすることができる。
【０１０１】
また、「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、限定されるものではないが、緊縮条件下で、配列番号１に示す配列に相補的なヌクレオチド配列、又は緊縮条件下でヌクレオチド配列から調製することのできるプローブ（ただし、これは活性のある、又は機能性のタンパク質をコードする）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を意味するものとすることもできる。「緊縮条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、コンピュータプログラムBLASTを使用した場合に、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、又は99％以上のパラメータ「同一性」として特定される相
同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。例えば、緊縮条件は、60℃又は65℃において、１×SSC（標準クエン酸ナトリウム又は標準塩化ナトリウム）の塩濃度、0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、又は他の例では、0.1×SSC、0.1％SDSで１回以上洗浄すること、又は他の例では、２回又は３回洗浄することにより例示されるものとすることができる。洗浄の継続時間は、ブロッティングのために使用する膜の種類に依存し、通常は、製造業者によって推奨されたものとすることができる。例えば、緊縮条件下において、アマシャム・ハイボンド（Amersham Hybond）（登録商標）-N+の正に帯電したナイロン膜（GEヘルスケア(GE Healthcare)）についての推奨された洗浄の継続時間は15分である。洗浄工程は、２〜３回行うことができる。プローブとして、配列番号１に示す配列に相補的な配列の一部を使用することもできる。この種プローブは、配列番号１に示す配列に基いて調製したプライマとしてのオリゴヌクレオチド、及びテンプレートとしてのヌクレオチド配列を含むDNA断片を使用し、PCRによって作製することができる。プローブの長さは、>50 bpであることが推奨されており、これは、ハイブリダイゼーション条件に依存して適切に選択することができ、通常は100 bp〜１kbpである。例えば、約300 bpの長さを有するDNA断片をプローブとして使用する場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、50℃、60℃又は65℃で２×SSC、0.1％SDSにより例示されるものとすることができる。
【０１０２】
種E. coliのYajLタンパク質をコードする遺伝子は既に解明されていることから（前記参照）、YajLタンパク質をコードするyajL遺伝子及びYajLタンパク質の変異体タンパク質をコードする変異体ヌクレオチド配列は、yajL遺伝子のヌクレオチド配列に基いて調製されたプライマを利用する腸内細菌科に属する細菌からのPCR (ポリメラーゼ連鎖反応；White T.J.ら、ポリメラーゼ連鎖反応（The polymerase chain reaction）, Trends Genet.,
1989, 5:185-189参照)；又は例えば、ヒドロキシルアミンを用いた試験管内で野生型yajL遺伝子を含むDNAを処理することによる部位特異的変異誘発方法、又はこの種の処理に通常使用される紫外線（UV）照射又はN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)及び亜硝酸のような変異剤を用いて、微生物、例えば、野生型yajL遺伝子を保有する腸内細菌科に属する細菌を処理する方法；又は全長の遺伝子として化学的に合成された構造によって取得することができる。他の微生物のYajLタンパク質又はその変異体タンパク質をコードする遺伝子は、類似する様式で取得することができる。
【０１０３】
「野生型タンパク質」という記載は、腸内細菌科の野生型又は親細菌株、例えば野生型E. coli MG1655株によって天然に生産されるネイティブタンパク質を意味するものとすることができる。野生型タンパク質は、野生型細菌のゲノム中に天然に存在する「野生型遺伝子」又は「改変されていない遺伝子」によってコードされることができる。
【０１０４】
ここに記載する細菌は、例えば、前記したDNAを細菌中に導入することにより、L-アミノ酸を生産する能力を固有に有する細菌を改変し、yajL遺伝子を過剰発現させることによって取得することができる。代替的に、ここに記載する細菌は、yajL遺伝子を過剰発現するよう既に改変された細菌に対して、L-アミノ酸を生産する能力を付与することにより取得することができる。
【０１０５】
細菌は、既に言及した性質に加えて、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の栄養要求、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性のような他の特定の性質を有するものとすることができる。
【０１０６】
２．方法
本発明の方法は、L-アラニン、L-アルギニン、L-アスパラギン、L-アスパラギン酸、L-シトルリン、L-システイン、L-グルタミン酸、L-グルタミン、グリシン、L-ヒスチジン、
L-イソロイシン、L-ロイシン、L-リジン、L-メチオニン、L-オルニチン、L-フェニルアラニン、L-プロリン、L-セリン、L-スレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、及びL-バリンのようなL-アミノ酸、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。L-アミノ酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養してL-アミノ酸を生産させ、分泌させ、且つ／又は培養培地中に又は細菌細胞内に蓄積させ、培養培地及び／又は細菌細胞からL-アミノ酸を採取する工程を含むものとすることができる。L-アミノ酸は、その塩若しくは水和物の形態、又はその組合せとして製造することができる。例えば、L-アミノ酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩を、この方法によって製造することができる。L-アミノ酸は、例えば、他の有機若しくは無機化合物とのその付加物の形態で製造することができる。特に、L-アミノ酸のモノクロロハイドレート塩は、L-リジンのモノクロロハイドレート塩のような方法により製造することができる。
【０１０７】
細菌の培養、及び培地等からのL-アミノ酸の採取及び精製は、微生物を使用してL-アミノ酸を製造する従来の発酵法に類似する様式で行うことができる。L-アミノ酸の製造のための培養培地は、合成又は天然培地、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機及び無機成分を含む典型的な培地とすることができる。炭素源としては、グルコース、ショ糖、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物のような糖類；エタノール、グリセリン、マンニトール、及びソルビトールのようなアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、及びコハク酸のような有機酸；脂肪酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムのような無機アンモニウム塩；大豆加水分解物のような有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。イオウ源は、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等を含むものとすることができる。ビタミンB1のようなビタミン；要求物質、例えば、有機栄養素、例えば、アデニン及びRNAのような核酸、又は酵母エキス等は、例え微量であっても、適量存在するものとし得る。これらの他、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を、必要に応じて添加し得る。
【０１０８】
培養は、好気的条件下で16〜72時間、又は32〜68時間行うことができ；培養の際の培養温度は、30〜45℃以内、又は30〜37℃以内で調節することができ；pHは、５〜８、又は６〜7.5に調整することができる。pHは、無機若しくは有機の酸性又はアルカリ性物質、並びにアンモニアガスを使用することにより調整することができる。
【０１０９】
培養の後、細胞及び細胞の残骸のような固体を、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、標的L-アミノ酸を、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、及び結晶化のような従来の技術のいずれかの組合せにより、発酵液から回収することができる。
【実施例】
【０１１０】
以下の限定的ではない実施例を参照し、本発明を以下に更に詳しく説明する。
【０１１１】
実施例１．yajL遺伝子を過剰発現するよう改変したE. coli L-バリン生産株の構築
１．１． yajLの調節領域を改変したE. coli MG1655株の構築
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって開発され、「λRed/ET-媒介組込み」（λRed/ET-mediated integration）と呼ばれる方法を使用し(Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)、E. coli中でのyajL遺伝子の発現を変更した。この手順に従い、yajL遺伝子及びクロラムフェニコール耐性（CmR）を与える遺伝子に隣接する領域及びテンプレート染色体中のプロモータに隣接する領域の両方に相同なPCRプライマP1（配列番号３）及びP2（配列番号４）を構築した。lacZの上流のTGGCAA
（5'-末端から3'-末端）として-35領域の構造を有するtac様プロモータを含むクロラムフェニコール耐性E. coli株MG1655の染色体（Katashkina J.L.ら, 細菌の染色体上に局在する遺伝子の発現レベルの調整（Tuning the expression level of a gene located on a bacterial chromosome）, Mol. Biol. (モスク、ロシア語(Mosk., in Russian)), 2005, 39(5):719-726中の表１、クローン７参照）を、PCR反応におけるテンプレートとして使用した。PCRの条件は次の通りとした：95℃で３分の変性；35サイクルのプロフィール：95℃で１分、58℃で１分、72℃で１分、；最後の伸長：72℃で５分。得られたDNA断片１（1,768 bp）（配列番号５）は、アガロースゲル中で精製し、温度感受性の複製開始点を有するプラスミドpKD46を含む株E. coli MG1655 (ATCC 47076)のエレクトロポーレーションに使用した。プラスミドpKD46 (Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)は、ファージλの2,154 nt (31088〜33241)のDNA断片を含み（GenBank受託番号: J02459）、アラビノース誘導性のParaBプロモータの調節下にあるλRed相同組換え系の遺伝子（γ、β、及びエクソ遺伝子）を含む。プラスミドpKD46は、株E. coli MG1655の染色体へのDNA断片の組込みのために必要である。
【０１１２】
エレクトロコンピテント細胞は、次のようにして調製した：アンピシリン（100 mg/L）を含有するLB培地(Sambrook J.とRussell D.W., 分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual） (第３版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)中で、E. coli MG1655細胞を30℃で一夜生育させ、アンピシリン（100 mg/L）及びL-アラビノース（１mM）を含有する５mLのSOB培地(Sambrook J., Fritsch E.F. とManiatis T.、分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual） (第２版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を用いて、培養物を100倍に希釈した。得られた培養物を通気しながら（250 rpm）30℃で約0.6のOD600まで生育させた後、100倍に濃縮し、氷冷した脱イオンH2Oを用いて３回洗浄することによりエレクトロコンピテントとした。70 μLの細胞と約100 ngのDNA断片１とを使用してエレクトロポーレーションを行った。その後、１mLのSOC培地(Sambrook J., Fritsch E.F.とManiatis T.、分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）
(第２版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)を用いて、37℃で2.5時間、細胞をインキュベートし、LB培地(Sambrook J.とRussell D.W., 分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）(第３版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)、寒天(1.5％)及びクロラムフェニコール(20 mg/L)を含む平板上に置き、37℃で生育させてCmR組換え体を選択した。pKD46プラスミドを除去するために、クロラムフェニコール(20 mg/L)を含むL寒天上で42℃で１回継代を行い、アンピシリンに対する感受性について、得られたコロニーを試験した。このようにして、株E. coli MG1655 Ptac7-yajLを取得した。
【０１１３】
１．２．yajLの調節領域の改変の検証
CmR遺伝子（cat）でマークしたyajL遺伝子のプロモータ領域の置換を含む変異体は、部位特異的プライマP3（配列番号６）及びP4（配列番号７）を使用するPCRによって検証した。PCRの条件は次の通りとした：94℃で３分の変性；30サイクルのプロフィール：94℃で30秒、58℃で30秒、72℃で２分；最後の伸長：72℃で６分。テンプレートとしての親株E. coli MG1655由来の染色体DNAを用いる反応で取得したDNA断片２は、966 bpの長さであった（配列番号８）。テンプレートとしての変異株E. coli MG1655 Ptac7-yajL由来の染色体DNAを用いる反応で取得したDNA断片３は、1,820 bpの長さであった（配列番号９）。
【０１１４】
１．３．E. coli L-バリン生産株の構築
P1トランスダクション(Miller, J.H.「分子遺伝学の実験」（"Experiments in Molecular Genetics"）, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1972))によって、Ptac7プロモータの制御下のyajL遺伝子を、バリン生産性E. coli株H81（ロシア特許第2355763号, EP1942183 B1）内に導入した。E. coli MG1655 Ptac7-yajL株（実施例１．
１参照）を供与体として使用した。株H81は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、2001年１月30日に、受託番号VKPM B-8066の下で寄託された後、2002年２月１日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。Ptac7-yajLカセットを保有するE. coli H81変異体は、LB培地、寒天（1.5％）及びクロラムフェニコール（20 mg/L）を含有する平板上で選択した。こうして、株E. coli H81 Ptac7-yajLを取得した。yajL遺伝子のプロモータ領域の交換は、実施例１のセクション１．２に記載したようにPCRによって検証した。
【０１１５】
実施例２．E. coli H81 Ptac7-yajL株によるL-バリンの生産
LB培地(Sambrook J.とRussell D.W., 分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual） (第３版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に記載されているように、lysogenic broth又はLuria-Bertani培地としても言及される)中で、改変したE. coli H81 Ptac7-yajL及び対照E. coli H81株を、それぞれ32℃で18時間培養した。その後、20×200 mmの試験管内の２mLの発酵培地に、0.2 mLの得られた培養物を接種し、グルコースが消費されるまで、約29のOD550に至るまで、250 rpmでロータリーシェーカー上で32℃で66時間培養した。
【０１１６】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとした：
グルコース            60.0
(NH4)2SO4              15.0
KH2PO4                 1.5
MgSO4・7H2O            1.0
チアミン-HCl          0.1
CaCO3                 25.0
LB培地                10％（v/v）
【０１１７】
グルコース及びCaCO3を以下のように別個に殺菌した以外は、発酵培地は116℃で30分間殺菌した。グルコースは110℃で30分間、CaCO3は116℃で30分間殺菌した。pHは、KOH溶液により7.0に調整した。
【０１１８】
培養の後、蓄積されたL-バリンを、薄層クロマトグラフィ（TLC）を使用して測定した。TLCプレート（10×20 cm）は、非蛍光インジケータを含むSorbfil（登録商標）シリカゲル(Sorbpolymer（登録商標）, Krasnodar, ロシア連邦)の0.11 mmの層を用いて被覆した。Camag Linomat（登録商標）の５サンプルアプリケータを用いて、サンプルをプレート上に適用した。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール：酢酸エチル：25％アンモニア水：水（16 : 16 : 5 : 10, v/v）からなる移動相を用いて展開した。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％, w/v）を可視化試薬として使用した。展開の後、プレートを乾燥させ、winCATS（登録商標）ソフトウェア(version 1.4.2)を使用し、520 nmでの検出による吸光度モードで、Camag TLC Scanner 3（登録商標）を用いてスキャンした。
【０１１９】
３つの独立した試験管発酵の結果を表１に示す。表１から分かるように、改変されたE.
coli H81 Ptac7-yajL株は、親E. coli H81株と比較すると、より高い量のL-バリンを蓄積することができた。
【０１２０】
【表１】
0006447633.tif 000002
【０１２１】
実施例３．yajL遺伝子を過剰発現するよう改変されたE. coli L-フェニルアラニン生産株の構築
実施例１のセクション１．３に記載されたようにして、E. coli MG1655 htrE:(PL-yddG) [MUDaroG4-pheAfbr-aroL]としても知られているE. coli DV269 (TyrA-LAA)株にPtac7-yajL断片を導入した。E. coli MG1655 Ptac7-yajL（実施例１．１参照）を供与体として使用した。E. coli DV269 (TyrA-LAA)株の構築は、Doroshenko V.G.ら, tryA ssrA様タグを付した対立遺伝子を使用するL-フェニルアラニン生産性チロシン原栄養性E. coli株の構築（Construction of an L-phenylalanine-producing tyrosine-prototrophic Escherichia coli strain using tyrA ssrA-like tagged alleles）, Biotechnol. Lett., 2010, 35:1117-1121に記載されている。Ptac7-yajLカセットを保有するE. coli DV269 (TyrA-LAA)変異体は、LB培地、寒天（1.5％）及びクロラムフェニコール（20 mg/L）を含有する平板上で選択した。このようにして、株E. coli DV269 (TyrA-LAA) Ptac7-yajLを取得した。
【０１２２】
実施例４．E. coli DV269 (TyrA-LAA) Ptac7-yajL株によるL-フェニルアラニンの生産
L-フェニルアラニン生産性E. coli DV269 (TyrA-LAA) Ptac7-yajL及び対照E. coli DV269 (TyrA-LAA)株の新鮮な生育細胞をL-寒天平板から108 CFU/mL（コロニー形成単位、colony-forming unit, CFU）の量で取り、15×150 mmの試験管中の３mLのLB培地に接種し、ロータリーシェーカー上で250 rpmで34℃で３時間培養した。その後、20×200 mLの試験管内の２mLの発酵培地に、0.2 mLの得られた培養物を接種し、グルコースが消費されるまで、約6.5〜７のOD540に至るまで、240 rpmでロータリーシェーカー上で34℃で30時間培養した。
【０１２３】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りである：
グルコース               50.0
(NH4)2SO4                 0.6
K2HPO4・3H2O              0.6
FeSO4・7H2O              0.01
MnSO4・5H2O              0.01
酵母エキス               2.0
CaCO3                    20.0
【０１２４】
グルコースは別に殺菌した。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌した。
【０１２５】
培養の後、蓄積されたL-フェニルアラニンを、薄層クロマトグラフィ（TLC）を使用して測定した。TLCプレート（10×20 cm）は、非蛍光インジケータを含むSorbfilシリカゲル(Sorbpolymer, Krasnodar, ロシア連邦)の0.11 mmの層を用いて被覆した。Camag Linomat の５サンプルアプリケータを用いて、サンプルをプレート上に適用した。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール：酢酸エチル：25％アンモニア水：水（16 : 16 : 3 : 5, v/v）からなる移動相を用いて展開した。アセトン中のニンヒドリンの溶液（１％, w/v）を可視化試薬として使用した。展開の後、プレートを乾燥させ、winCATSソフトウェア(vers
ion 1.4.2)を使用し、520 nmでの検出による吸光度モードで、Camag TLC Scanner 3を用いてスキャンした。
【０１２６】
10の独立した試験管発酵の結果を表２に示す。表２から分かるように、改変されたE. coli DV269 (TyrA-LAA) Ptac7-yajL株は、親E. coli DV269 (TyrA-LAA)株と比較すると、より高い量のL-フェニルアラニンを蓄積することができた。
【０１２７】
【表２】
0006447633.tif 000003
【０１２８】
実施例５．E. coli 382 Ptac7-yajL株によるL-アルギニンの生産
L-アルギニン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE.
coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクション（Miller, J.H. (1972), 分子遺伝学の実験（Experiments in Molecular Genetics）, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によってアルギニン生産性E. coli株382へと転移させ、株382 Ptac7-yajLを取得した。株382は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、2000年４月10日に、受託番号VKPM B-7926の下で寄託された後、2001年５月18日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。
【０１２９】
E. coli株382及び382 Ptac7-yajLを、３mLの栄養ブロス（nutrient broth）中で37℃で18時間振盪しながら（220 rpm）別々に培養し、得られた培養物の0.3 mLを、20×200 mmの試験管内の２mLの発酵培地中に接種し、ロータリーシェーカー上で（220 rpm）32℃で48時間培養する。
【０１３０】
培養の後、培地中に蓄積されるL-アルギニンの量を、ブタン-1-オール：酢酸：水＝4 :
1 : 1 (v/v)からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィによって決定する。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用する。L-アルギニンを含むスポットを切り出し、CdCl2の0.5％水溶液を用いてL-アルギニンを溶出させ、L-アルギニンの量を、540 nmで分光光学的に見積もる。
【０１３１】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース               48.0
(NH4)2SO4                 35.0
KH2PO4                    2.0
MgSO4・7H2O               1.0
チアミン-HCl             0.0002
酵母エキス               1.0
L-イソロイシン           0.1
CaCO3                    5.0
【０１３２】
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌する。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌する。pHは7.0に調整する。
【０１３３】
実施例６．E. coli JM15(ydeD) Ptac7-yajLによるL-システインの生産
L-システイン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE.
coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L-システイン生産性E. coli株JM15(ydeD)へと転移させ、株JM15(ydeD) Ptac7-yajLを取得する。
【０１３４】
E. coli JM15(ydeD)は、E. coli JM15 (米国特許第6,218,168号)の誘導体であり、これは膜タンパク質をコードするydeD遺伝子を有するDNAにより形質転換されており、何らかのL-アミノ酸の生合成経路には関与していない(米国特許第5,972,663号)。
【０１３５】
発酵条件及びL-システイン生産の評価のための手順は、米国特許第6,218,168号の実施例６に詳細に記載されている。
【０１３６】
実施例７．E. coli VL334thrC+ Ptac7-yajLによるL-グルタミン酸の生産
L-グルタミン酸生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、E. coliのL-グルタミン酸生産性株VL334thrC+ (EP1172433 A1)へと転移させ、株VL334thrC+Ptac7-yajLを取得する。株VL334thrC+は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、2004年12月６日に、受託番号VKPM B-8961の下で寄託された後、2004年12月８日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。
【０１３７】
E. coli株VL334thrC+及びVL334thrC+Ptac7-yajLを、L-寒天平板上で37℃で18〜24時間別々に培養する。その後、１白金耳の細胞を、２mLの発酵培地を含む試験管に移す。振盪しながら30℃で３日間培養を実施する。
【０１３８】
培養の後、培地中に蓄積するL-グルタミン酸の量を、ブタン-1-オール：酢酸：水＝4 :
1 : 1 (v/v)からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィによって決定し、続いて、ニンヒドリン（アセトン中の１％溶液）による染色、0.5％CdCl2を用いる50％エタノール中での化合物の溶出、そして更に540 nmでのL-グルタミン酸の量の見積もりを行う。
【０１３９】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース               60.0
(NH4)2SO4                 25.0
KH2PO4                    2.0
MgSO4・7H2O               1.0
チアミン-HCl             0.1
L-イソロイシン           0.07
CaCO3                    25.0
【０１４０】
グルコースとCaCO3とは別々に殺菌する。pHは7.2に調整する。
【０１４１】
実施例８．E. coli 57 Ptac7-yajLによるL-ロイシンの生産
L-ロイシン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、E.
coliのL-ロイシン生産性株57 (VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号)へと転移させ、株57Ptac7-yajLを取得する。株57は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、1997年５月19日に、受託番号VKPM B-7386の下で寄託された。
【０１４２】
E. coli株57及び57 Ptac7-yajLを、L-寒天平板上で37℃で18〜24時間別々に培養する。種培養を取得するために、ショ糖（４％）を補填した２mLのLブロス(Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) 「分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を含む20×200 mmの試験管中で、32℃で18時間ロータリーシェーカー（250 rpm）上で株を生育させる。その後、発酵培地に、0.2 mLの種材料（10％）を接種する。20×200 mmの試験管中の２mlの最小発酵培地中で発酵を行う。250 rpmで振盪しながら32℃で48〜72時間細胞を生育させる。培地中に蓄積するL-ロイシンの量を、ブタン-1-オール：酢酸：水＝4 : 1 : 1 (v/v)からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィによって決定する。
【０１４３】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース               60.0
(NH4)2SO4                 25.0
K2HPO4                    2.0
MgSO4・7H2O               1.0
チアミン-HCl             0.01
CaCO3                    25.0
【０１４４】
グルコースは別に殺菌する。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌する。pHは7.2に調整する。
【０１４５】
実施例９．E. coli AJ11442 Ptac7-yajLによるL-リジンの生産
L-リジン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L-リジン生産性E. coli株AJ11442へと転移させ、AJ11442 Ptac7-yajL株を取得する。株AJ11442は、工業技術院生命工学工業技術研究所（National Institute of Bioscience and Human-Technology of Agency of Industrial Science and Technology）（現在は、独立行政法人、製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (NITE IPOD)、〒292-0818  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ 120号室、日本国）において、1981年５月１日に、受託番号FERM P-5084の下で寄託された。その後、これは1987年10月29日にブダペスト条約の規定の下に国際寄託へと移管され、FERM BP-1543の受託番号を受けた。pCABD2プラスミドは、L-リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するジヒドロジピコリネート合成酵素をコードするdapA遺伝子、L-リジンによるフィードバック阻害を脱感作する変異を有するアスパルトキナーゼIIIをコードするlysC遺伝子、ジヒドロジピコリネート還元酵素をコードするdapB遺伝子、及びジアミノピメレート脱水素酵素をコードするddh遺伝子を含む（米国特許第6,040,160号）。
【０１４６】
E. coli株AJ11442及びAJ11442Ptac7-yajLを、ストレプトマイシン（20 mg/L）を含有するL培地中で、37℃で別々に培養し、0.3 mLの得られた培養物を、500 mLのフラスコ中で要求される薬剤を含む20 mLの発酵培地中に接種する。往復シェーカーを使用し、115 rpmの攪拌速度で、37℃で16培養を実施する。培養の後、培地中のL-リジン及び残余のグルコースの量を、公知の方法によって決定する(バイオテックアナライザー（Biotech-analyzer） （登録商標）AS210, サクラ精機株式会社（Sakura Seiki Co.）)。その後、それぞれの株について、消費されたグルコースに対するL-リジンの収率を計算する。
【０１４７】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース                40.0
(NH4)2SO4                  24.0
K2HPO4                     1.0
MgSO4・7H2O                1.0
FeSO4・7H2O                0.01
MnSO4・5H2O                0.01
酵母エキス                2.0
【０１４８】
pHはKOHにより7.0に調整し、培地は115℃で10分間オートクレーブする。グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌し、最終濃度30
g/Lとなるよう培地に添加する。
【０１４９】
実施例１０．E. coli 702ilvA Ptac7-yajLによるL-プロリンの生産
L-プロリン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、プロリン生産性E. coli株702ilvAへと転移させ、株702ilvA Ptac7-yajLを取得する。株702ilvAは、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、2000年７月18日に、受託番号VKPM B-8012の下で寄託された後、2001年５月18日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。
【０１５０】
E. coli株702ilvA及び702ilvA Ptac7-yajLを、L-寒天平板上で37℃で18〜24時間別々に培養する。その後、実施例７（L-グルタミン酸の生産）と同じ条件下で、これらの株を培養する。
【０１５１】
実施例１１．E. coli B-3996 Ptac7-yajLによるL-スレオニンの生産
L-スレオニン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE.
coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L-スレオニン生産性E. coli株VKPM B-3996へと転移させ、株B-3996 Ptac7-yajLを取得する。株B-3996は、All-Union Scientific Center of Antibiotics (ロシア連邦, 117105 モスクワ, Nagatinskaya Street, 3-A)において、1987年11月19日に、受託番号RIA 1867の下で寄託された。また、この株は、Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) FGUP GosNII Genetika (1 Dorozhny Proezd, 1モスクワ117545, ロシア連邦)において、1987年４月７日に、受託番号VKPM B-3996の下でも寄託された。
【０１５２】
E. coli株VKPM B-3996及びB-3996 Ptac7-yajLを、L-寒天平板上で37℃で18〜24時間別々に培養する。種培養を取得するために、グルコース（４％）を補填した２mLのLブロス(Sambrook, J.とRussell, D.W. (2001) 「分子クローン化：実験室マニュアル（Molecular
Cloning: A Laboratory Manual）」, 第３版, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を含む20×200 mmの試験管中で、32℃で18時間ロータリーシェーカー（250 rpm）上で株を生育させる。その後、発酵培地に、0.2 mL（10％）の種材料を接種する。20×200 mmの試験管中の２mlの最小発酵培地中で発酵を行う。250 rpmで振盪しながら32℃で65時間細胞を生育させる。
【０１５３】
培養の後、培地中に蓄積するL-スレオニンの量を、ブタン-1-オール：酢酸：水＝4 : 1
: 1 (v/v)からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィによって決定する。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用する。L-スレオニンを含むスポットを切り出し、CdCl2の0.5％水溶液を用いてL-スレオニンを溶出させ、L-スレオニンの量を、540 nmで分光光学的に見積もる。
【０１５４】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース                80.0
(NH4)2SO4                  22.0
NaCl                      0.8
KH2PO4                    2.0
MgSO4・7H2O               0.8
FeSO4・7H2O               0.02
MnSO4・5H2O               0.02
チアミン-HCl             0.0002
酵母エキス               1.0
CaCO3                    30.0
【０１５５】
グルコース及び硫酸マグネシウムは別々に殺菌する。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌する。pHは7.0に調整する。抗生物質は、殺菌の後に培地に導入する。
【０１５６】
実施例１２． E. coli SV164(pGH5) Ptac7-yajLによるL-トリプトファンの生産
L-トリプトファン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L-トリプトファン生産性E. coli株SV164(pGH5)へと転移させ、株SV164(pGH5) Ptac7-yajLを取得する。株SV164は、トリプトファンによるフィードバック阻害から解放されたアントラニル酸合成酵素をコードするtrpE対立遺伝子を有する。プラスミドpGH5は、セリンによるフィードバック阻害から解放されたホスホグリセリン酸脱水素酵素をコードする変異体serA遺伝子を保有する。株SV164(pGH5)は、米国特許第6,180,373号又はEP0662143 B1に詳細に記載されたものである。
【０１５７】
E. coli株SV164(pGH5)及びSV164(pGH5) Ptac7-yajLを、テトラサイクリン（20 mg/L、pGH5プラスミドのマーカー）を補填した３mlの栄養ブロス（nutrient broth）中で37℃で18時間別々に振盪しながら培養する。得られた培養物（それぞれ0.3 mL）を、20×200 mmの試験管内のテトラサイクリン（20 mg/L）を含む３mLの発酵培地中に接種し、ロータリーシェーカーを用いて250 rpmで37℃で48時間培養する。培養の後、培地中に蓄積するL-トリプトファンの量を、TLCによって決定する。非蛍光インジケータを含むSorbfilシリカゲル(Stock Company Sorbpolymer, Krasnodar, ロシア連邦)の0.11 mmの層を用いて被覆した10×15 cmのTLCプレートを使用する。Sorbfilプレートは、プロパン-2-オール：酢酸エチル：25％アンモニア水：水＝40 : 40 : 7 : 16 (v/v)からなる移動相を用いて展開する。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用する。発酵培地の成分を表３に列記するが、殺菌の際の逆行的な相互作用を回避するために、表に示すように、別々のグループ（A, B, C, D, E, F及びH）で殺菌すべきものとする。
【０１５８】
【表３】
0006447633.tif 000004
【０１５９】
実施例１３．E. coli 382ΔargG Ptac7-yajLによるL-シトルリンの生産
L-シトルリン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE.
coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L-シトルリン生産性E. coli株382ΔargGへと転移させ、株382ΔargG Ptac7-yajLを取得する。株382ΔargGは、Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET-媒介組込み」（λRed/ET-mediated integration）と呼ばれる方法により(Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)、382株(VKPM B-7926)の染色体上のargG遺伝子の欠失によって取得する。この手順により、argG遺伝子及びテンプレートプラスミドにおいて抗生物質耐性を与える遺伝子に隣接する領域の両方に相同なPCRプライマを構築する。プラスミドpMW118-λattL-cat-λattR (WO05/010175)を、PCR反応におけるテンプレートとして使用する。
【０１６０】
E. coli株382ΔargG及び382ΔargG Ptac7-yajLを、３mLの栄養ブロス（nutrient broth）中で37℃で18時間振盪しながら別々に培養し、得られた培養物の0.3 mLを、20×200 mmの試験管内の２mLの発酵培地中に接種し、ロータリーシェーカー上で32℃で48時間培養する。
【０１６１】
培養の後、培地中に蓄積するL-シトルリンの量を、ブタン-1-オール：酢酸：水＝4 : 1
: 1 (v/v)からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィによって決定する。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用する。シトルリンを含むスポットを切り出し、CdCl2の0.5％水溶液を用いてL-シトルリンを溶出させ、L-シトルリンの量を、540 nmで分光光学的に見積もる。
【０１６２】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース                48.0
(NH4)2SO4                  35.0
KH2PO4                      2.0
MgSO4・7H2O                1.0
チアミン-HCl              0.0002
酵母エキス                1.0
L-イソロイシン            0.1
L-アルギニン              0.1
CaCO3                      5.0
【０１６３】
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌する。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌する。pHは7.0に調整する。
【０１６４】
実施例１４．E. coli 382ΔargFΔargI Ptac7-yajLによるL-オルニチンの生産
L-オルニチン生産に対するyajL遺伝子の過剰発現の効果を試験するために、前記したE.
coli MG1655 Ptac7-yajL株の染色体由来のDNA断片を、P1トランスダクションによって、L-オルニチン生産性E. coli株382ΔargFΔargIへと転移させ、株382ΔargFΔargI Ptac7-yajLを取得する。株382ΔargFΔargIは、Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET-媒介組込み」（λRed/ET-mediated integration）と呼ばれる方法により(Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645)、382株(VKPM B-7926)の染色体上のargF及びargI遺伝子の継続的な欠失によって取得する。この手順により、argF又はargI遺伝子及びテンプレートプラスミドにおいて抗生物質耐性を与える遺伝子に隣接する領域の両方に相同な２対のPCRプライマを構築する。プラスミドpMW118-λattL-cat-λattR (WO05/010175)を、PCR反応におけるテンプレートとして使用する。
【０１６５】
E. coli株382ΔargFΔargI及び382ΔargFΔargI Ptac7-yajLを、３mLの栄養ブロス（nutrient broth）中で37℃で18時間振盪しながら別々に培養し、得られた培養物の0.3 mLを、20×200 mmの試験管内の２mLの発酵培地中に接種し、ロータリーシェーカー上で32℃で48時間培養する。
【０１６６】
培養の後、培地中に蓄積するオルニチンの量を、ブタン-1-オール：酢酸：水＝4 : 1 :
1 (v/v)からなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィによって決定する。アセトン中のニンヒドリンの溶液（２％）を可視化試薬として使用する。オルニチンを含むスポットを切り出し、CdCl2の0.5％水溶液を用いてオルニチンを溶出させ、オルニチンの量を、540 nmで分光光学的に見積もる。
【０１６７】
発酵培地の組成（g/L）は次の通りとする：
グルコース              48.0
(NH4)2SO4                35.0
KH2PO4                   2.0
MgSO4・7H2O              1.0
チアミン-HCl             0.0002
酵母エキス               1.0
L-イソロイシン           0.1
L-アルギニン             0.1
CaCO3                    5.0
【０１６８】
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌する。CaCO3は、180℃で２時間乾熱殺菌する。pHは7.0に調整する。
【０１６９】
この発明を、その好適な態様を参照して詳細に説明したが、この発明の範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。ここに引用した全ての参考文献は、この出願の一部として参考によりここに組み入れるものとする。