【事件の表示】
　特許第３３３４０２０号「粒子及び細胞測定用シース液」の請求項１ないし４に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３３４０２０号の請求項１ないし３に係る特許を維持する。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第３３３４０２０号の請求項１ないし４に係る発明についての出願は、平成６年１０月２４日に出願され、平成１４年８月２日にその発明について特許権の設定登録がなされ、その後、申立人シスメックス株式会社より特許異議の申立てがなされ、取消理由が通知され、その指定期間内である平成１５年１０月１４日に訂正請求がなされたものである。
２．訂正請求の適否について
　上記訂正請求の適否について、以下検討する。
（１）訂正の内容
＜訂正事項ａ＞
　特許請求の範囲の記載：
「【請求項１】　ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液からなる粒子測定用シース液。
【請求項２】　ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液からなる細胞測定用シース液。
【請求項３】　ノニオン性界面活性剤が式：
　　　Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル又はアルキレン基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］
で示されるものである請求項１又は２記載のシース液。
【請求項４】　浸透圧調整剤の量がシース液の浸透圧を２６０〜４１０ミリオスモス／キログラムに調整するための量であり、緩衝剤の量がシース液のｐＨを６〜８に保つための量である請求項２または３に記載のシース液。」を、
「【請求項１】ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液であって、
　ノニオン性界面活性剤が式：
　　　Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］
で示されるものである粒子測定用シース液。
　【請求頃２】ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液であって、
　ノニオン性界面活性剤が式：
　　　Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］
で示されるものである細胞測定用シース液。
　【請求項３】浸透圧調整剤の量がシース液の浸透圧を２６０〜４１０ミリオスモス／キログラムに調整するための量であり、緩衝剤の量がシース液のｐＨを６〜８に保つための量である請求頃１または２に記載のシース液。」と訂正する。
＜訂正事項ｂ＞
　特許明細書の段落【０００８】の記載：「請求項１記載の発明に係る粒子測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液からなることを特徴とするものである。」を、
「請求項１記載の発明に係る粒子測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液であって、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものであることを特徴として成るものである。」と訂正する。
＜訂正事項ｃ＞
　特許明細書の段落【０００９】の記載：「また請求項２記載の発明に係る細胞測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液からなることを特徴とするものである。」を、
「また請求項２記載の発明に係る細胞測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液であって、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものであることを特徴として成るものである。」と訂正する。
＜訂正事項ｄ＞
　特許明細書の段落【００１０】の記載：「更に請求項３記載の発明に係るシース液は、上記構成に加えて、ノニオン性界面活性剤が式：
　　　Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものであることを特徴として成るものである。」を、
「更に請求頃３記載の発明に係るシース液は、上記構成に加えて、浸透圧調整剤の量がシース液の浸透圧を２６０〜４１０ミリオスモス／キログラムに調整するための量であり、緩衝剤の量がシース液のｐＨを６〜８に保っための量であることを特徴として成るものである。」と訂正する。
＜訂正事項ｅ＞
　特許明細書の段落【００１１】を削除する。
＜訂正事項ｆ＞
　特許明細書の段落【００１４】の記載：「アルキル基やアルキレン基Ｒの炭素数についても上記と同様の傾向があり、すなわち・・・満足に達成される。」を、
「アルキル基Ｒの炭素数についても上記と同様の傾向があり、すなわち・・・満足に達成される。」と訂正する。
＜訂正事項ｇ＞
　特許明細書の段落【００２７】の記載：「本発明によれば、フローサイトメータを使用する粒子及び細胞の測定用シース液にノニオン性界面活性剤を用いているので、細胞溶解を引き起こすことなく、気泡の発生及び保持を防止することができる。しかも、請求項３記載の特定のポリオキシエチレンアルキル系ノニオン性界面活性剤であれば、単純な溶解操作でシース液が調製できるだけでなく、広範な界面活性剤濃度にわたって経時的な体積も小さいまま維持でき、測定の再現性も一段と向上する。」を、
「本発明によれば、フローサイトメー夕を使用する粒子及ひ細胞の測定用シース液に特定の構造のノニオン性界面活性剤を用いているので、細胞溶解を引き起こすことなく、気泡の発生及び保持を防止することができる。しかも、請求項１又は２記載の特定のポリオキシエチレンアルキル系ノニオン性界面活性剤であれば、単純な溶解操作でシース液が調製できるだけでなく、広範な界面活性剤濃度にわたって経時的に体積を安定させたまま維持でき、測定の再現性も一段と向上する。」と訂正する。
　
（２）訂正の目的
　訂正事項ａは、訂正前の「ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤」を「式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるもの」に限定する訂正であって、それに伴い請求項の数が減少したものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とするものである。
　また、訂正事項ｂ〜訂正事項ｅおよび訂正事項ｇは、訂正後の特許請求の範囲の記載と発明の詳細な説明の記載との整合性を図るための訂正であって、明りょうでない記載の釈明を目的とするものである。
　そして、訂正事項ｆは、ノニオン性界面活性剤を表す化学式において、「Ｒ」がアルキレン基であることはありえないので、誤記の訂正を目的とするものである。
　
（３）新規事項の有無、拡張・変更
　訂正事項ａ〜訂正事項ｇは、いずれも願書に添付された明細書に記載された事項の範囲内である。
　また、上記訂正事項ａ〜訂正事項ｇは、実質上特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもない。
　
(４）訂正事項の検討結果
　以上のとおりであるから、上記訂正は、特許法等の一部を改正する法律（平成６年法律第１１６号）附則第６条第１項の規定によりなお従前の例によるとされる、特許法第１２０条の４第３項において準用する平成６年法律第１１６号による改正前の特許法第１２６条第１項ただし書き、第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３．特許異議の申立てについて
（１）申立ての理由の概要
　申立人シスメックス株式会社は、次の刊行物１〜刊行物４をそれぞれ甲第１号証、甲第２号証（イ）、甲第２号証（ロ）及び参考資料１として提出して、請求項１ないし４に係る発明は、甲第１号証記載の発明から、あるいは甲第１号証および甲第２号証記載の発明から当業者が容易に発明をすることができたものであるので、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである（申立理由１）と主張し、
　　＜引用刊行物＞
　刊行物１： 特開平１−１０２３６６号公報（甲第１号証）
　刊行物２： 特開平３−２５２５５６号公報（甲第２号証（イ））
　刊行物３： 特開平６−２７３４１３号公報（甲第２号証（ロ））
　刊行物４： 化学大辞典第１８３３頁「非イオン（性）界面活性剤」、１９８９年１０月２０日発行（参考資料１）
　また、本件明細書は、特許法第３６条第４項〜第６項に規定する要件に違反しており特許を受けることができないものである（申立理由２）旨主張している。
　
（２）本件発明
　本件特許の請求項１ないし３に係る発明（以下、それぞれ「本件発明１」、・・・「本件発明３」という。）は、平成１５年１０月１４日付けの訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１ないし３に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】　ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液であって、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものである粒子測定用シース液。
　【請求項２】　ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液であって、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものである細胞測定用シース液。
　【請求項３】　浸透圧調整剤の量がシース液の浸透圧を２６０〜４１０ミリオスモス／キログラムに調整するための量であり、緩衝剤の量がシース液のｐＨを６〜８に保つための量である請求項１または２に記載のシース液。」
　
（３）申立理由１について
（３−１）引用刊行物の記載事項
（ｉ）　刊行物１
　刊行物１には、粒子分析装置用シース液について、（１ａ）特許請求の範囲に、
「１　つぎの（ａ）〜（ｄ）の４成分、すなわち、
　（ａ）緩衝剤、
　（ｂ）浸透圧調整用添加剤、
　（ｃ）ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤、
（ただし、アルキル基の炭素原子数は１０〜２０個であり、オキシエチレンの付加モル数は２０〜６０である。）
　（ｄ）水、
を含有することを特徴とする粒子分析装置用シース液。
２　ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤のアルキル基の炭素原子数が１４であり、オキシエチレンの付加モル数が３５〜４５である特許請求の範囲第１項記載の粒子分析装置用シース液。
　　　・・・・・
７　液のｐＨが６．０〜８．５であり、浸透圧が２４５〜３３０ｍＯｓｍ／ｋｇである特許請求の範囲第１項〜第６項のいずれかに記載の粒子分析装置用シース液。」と記載されているとともに、
（１ｂ）その発明が、血球係数の分野におけるシースフローシステムで用いられるシース液での気泡発生抑制のために添加される界面活性剤、たとえばにポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーでは壜点よりはるかに低い温度で粒子分析器でノイズとして係数される「濁り」を生じるなどの問題点を解決したもので、流体系内において気泡の発生を抑制し、かつ粒子に影響を与えず、さらには、また、粒子分析装置用シース液の含有物質として使用した場合において「濁り」を発生させない水溶性界面活性剤を用いたものであることが記載され（２頁左上欄下から３行〜３頁左下欄１行）、
（１ｃ）浸透圧調整用添加剤を所定の浸透圧となるよう添加すること（３頁左下欄２行〜１４行）、また、２−ピリヂオ−１−オキシドナトリウム、８−ヒドロキシキノリンおよびその誘導体、イソチアゼノン誘導体などの防菌剤を添加すること（４頁左上欄１４行〜２０行）、そしてキレート剤を添加すること（４頁右上欄１行〜９行）も記載されている。
（１ｄ）そして、日本油脂（株）製の「ニッサンノニオンＮＳ−２４０（登録商標）」という界面活性剤（ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル）をシース液１ｌ中に０．５５ｇ使用した実施例１〜３が記載され、特に実施例２に、該シース液によって赤血球の溶血がないことを示す第１表が記載されている（４頁右上欄１５行〜５頁右上欄下から７行）。
　
（ii）　刊行物２
　刊行物２には、白血球分類用試薬について、（２ａ）特許請求の範囲に
「（１）　赤血球を溶解し、白血球に作用して白血球を分類・計数可能とする白血球分類用試薬であって、ｐＨが１．５〜５．０、浸透圧が１０〜１２０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、
　一般式
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
　（ここで、Ｒ1−は炭素数１２〜２２のアルキルまたはアルケニルまたはアルキニル基；−Ｒ2−は−Ｏ−，・・・または−ＣＯＯ−；ｎは２０〜１００の整数）で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤を含有することを特徴とする試薬。」と記載され、
（２ｂ）ポリオキシエチレンの付加モル数ｎについて、「ポリオキシエチレンの付加モル数ｎが小さいほど溶血力は強くなることが知られており、上記アクチノールＬ１０の場合にはｎが１０であるため白血球も破壊もしくは収縮されてしまったのである。反対にポリオキシエチレンの付加モル数ｎが大きいほど溶血力は弱くなり、あるいは溶血力が無くなる。」と記載されている（６頁右上欄１７行〜左下欄３行）。
　
（iii）　刊行物３
　刊行物３にも、幼若細胞測定用試薬について、（３ａ）特許請求の範囲に、
「【請求項１】　下記（１）から（４）を含有する幼若白血球を含有する被検試料と混合することにより、幼若白血球の各群を他の細胞群から弁別可能な程度にまで差異を生じさせる幼若細胞測定用試薬：
（１）血球の細胞質および細胞膜を固定化するための次式で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤：
Ｒ1−Ｒ2−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、
Ｒ1は炭素数１０〜２５のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基；
【化１】
　Ｒ2はＯ、・・・　または　ＣＯＯ；
ｎは１０〜４０の整数を表す］
（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤であって以下２つのグループからなる群から選択される少なくとも１種の可溶化剤：
　　・・・　
（３）血球の細胞質および細胞膜を固定化するためのアミノ酸、および
（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇ、電気伝導度を６．０〜９．０ｍＳ／ｃｍにする緩衝液。」
（３ｂ）ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤の付加モル数ｎについて、「一般に、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤は付加モル数ｎが小さいもの程強い溶血力を有し、ｎが大きくなる程溶血力は弱くなることは知られていた。」と記載され（【００２２】）、
（３ｃ）実施例１には、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤であるＣ18Ｈ34−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）16−Ｈを用いた試薬が記載されている（【００３３】）。
　
（iv）　刊行物４
　刊行物４には、非イオン（性）界面活性剤について、「ノニオン界面活性剤ともいう。界面活性剤のうち、親水基が非イオン性のもの。親水基としてよく用いられるのは酸化エチレン基（−ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−）で、この基の数が多くなるに従い親水性が徐々に増す。他方、親油基の炭素数が増すと、親油性が徐々に増す。したがって、親水性、親油性をいろいろに変えた界面活性剤が得られる（→ＨＬＢ）。親油基をＲとして、ＲＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ（エーテル型）、ＲＣＯＯ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＨ（エステル型）がある。前者にはＲとしてアルキル基の場合（ポリオキシエチレンアルキルエーテル）、アルキルベンゼンの場合（ポリオキシエチレンアルキルフェノール）がある。また、親水基としてＯＨ基を多く含むソルビタン、ショ糖のエステル（ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル）、グリセリン誘導体のモノグリセリドなどもよく用いられる。この仲間は水中で電離しないので、無機塩の影響も受けにくく、生体に対する作用も少ない。しかし洗浄作用は大きく、泡立ちは比較的少ない。」と記載されている。
　
（３−２）本件発明１と刊行物１記載の発明との対比・検討
　本件発明の防黴剤は、特許明細書の【００１９】に記載されているように、シース液の長期保存による黴、細菌の発生を抑制することのできるもので、適当な殺菌剤でよいから、刊行物１記載のシース液において使用される殺菌剤と格別相違するものとは認められないので、本件発明１と刊行物１記載の発明とを対比すると、両者は、「ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液からなる粒子測定用シース液」である点で一致するものの、次の点で相違する。
（相違点）
　ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が、本件発明１では、式：
　　　　Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］のポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤であるのに対して、刊行物１発明では、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル系界面活性剤である点。
　
　そこで、この相違点について検討する。
  本件特許明細書によれば、本件発明は、単純な溶解操作により保持気泡による問題点を確実に解消し、再現性の良い粒子及び細胞の測定が行えるシース液を提供することを目的とするものであり（【０００７】参照）、上記式のポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤の「Ｒの炭素数」と「エチレンオキシドの付加数ｎ」とは、細胞の溶解力、界面活性剤の溶解度、曇点などに密接に関係し、Ｒ＝Ｃ8〜Ｃ22、ｎ＝２５〜３５の範囲内で、本件発明の目的が満足に達成されるものである（【００１４】参照）。
　刊行物２〜刊行物４には、「Ｒの炭素数」と「エチレンオキシドの付加数ｎ」がほぼ同様の式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ　で示されるポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が記載されているが、刊行物２〜刊行物４には、粒子及び細胞の測定のためのシース液に、刊行物１記載のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル系界面活性剤に代えて、本件発明１で選択使用されるものを適用することを教示する記載はない。そして、刊行物１の記載と合わせれば、刊行物２〜刊行物４にポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤が、気泡発生を抑制し保持気泡による問題点を解決することが示唆されているといえるとしても、粒子及び細胞測定用シース液において再現性の良い粒子及び細胞の測定が行える適性を有することまで示唆する記載があるということはできない。
  そうすると、本件発明１は、刊行物１〜刊行物４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものということはできない。
　
（３−３）本件発明２〜３についての検討
　そして、請求項２ないし３は、請求項１を引用するものであり、本件発明２および本件発明３は、本件発明１について検討したと同様に、刊行物１〜刊行物４に記載された発明に基づいて、当業者が容易に発明できたものということはできない。
（３−４）検討結果
　したがって、対比、検討したところによれば、申立理由（１）による申立ては、理由がない。
　
（４）申立理由（２）について
（４−１）申立人の指摘事項
　申立人は、明細書の記載不備について、次の点を指摘している。
（イ）比較例１〜比較例３のシース液
　本件特許明細書【００２４】〜【００２６】の比較例１〜比較例３記載のシース液は、本件請求項１の発明のシース液を満たすようではあるが、本件明細書に記載の優れた効果を奏するものではない。この点で、比較例１〜比較例３記載のシース液は、本件発明のシース液であるのかどうか明りょうでない。
（ロ）式中の「Ｒ」
　式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ
のＲはアルキレン基でも良いとされているが（請求項３、段落【００１４】）、上記式において「Ｒ」は１価の基であり、２価の基であるアルキレン基を取り得るのかどうか不明である。
（ハ）従来技術に対する効果
　本件明細書では、従来技術として、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型のノニオン界面活性剤を利用したシース液を挙げていて、このシース液について、赤血球など細胞に対する溶解力が強いため、サンプル流中の細胞がシース液と接触するような設定の場合、細胞に影響を及ぼすという問題点が依然として残っていた、と記載している。
　甲第１号証の実施例２には、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型のノニオン界面活性剤を利用したシース液が赤血球に影響を及ぼさないことが明記されている。
　本件明細書に記載された従来技術に対する効果は、信憑性に乏しいものであり、また、従来技術より本件発明が優れた効果を有することを立証するための実験データの記載もなく、本件特許明細書は本件発明の効果の記載が不明瞭である。
　
（４−２）検討
　申立理由２で指摘された上記（イ）〜（ハ）について検討する。
（ｉ）（イ）について
　前記訂正事項ａにより、「ノニオン性界面活性剤」は「式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ8〜Ｃ22のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるもの」に限定された。
　この訂正により、比較例１〜比較例３のシース液は、本件発明のシース液でないことが明りょうになった。
（ii）（ロ）について
　式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ−ＨのＲが「アルキレン基」であることは、本件明細書から削除された（前記訂正事項ａ〜ｃ、訂正事項ｅ参照）。
（iii）（ハ）について
　本件明細書には、本件発明の実施例（実施例１〜実施例２）が、従来技術（比較例１〜比較例３）に比較して優れた効果を奏することが示されている。また、界面活性剤における疎水基と赤血球の溶血作用とには関連があり（特許異議意見書に添付された資料１（藤本武彦著「全訂版　新・界面活性剤入門」三洋化成株式会社、昭和５６年１０月１日発行、第３２７〜３２８頁）参照）、一般に知られたフェニル基の疎水性を勘案すると、本件明細書に、刊行物１のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型ノニオン界面活性剤赤血球の溶血性について確認している実施例２との比較実験例が記載されていないことを以て、本件発明を当業者が実施することができないほどに、明細書の効果についての記載の信憑性に乏しいということはできず、本件明細書の「発明の詳細な説明」には、当業者が容易にその実施をすることができる程度に、その発明の効果が記載されているということができる。
　
（４−３）検討結果
　したがって、上記検討したように、申立理由（２）による申立ては、理由がない。
　
４．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立ての理由および証拠によっては、本件請求項１ないし３に係る発明の特許を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１ないし３に係る発明の特許を取り消すべき理由を発見しない。
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
粒子及び細胞測定用シース液
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液
であって、
　
ノニオン性界面活性剤が式：
　　
Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ８〜Ｃ２２のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものである
　【請求項２】　ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液
であって、
　
ノニオン性界面活性剤が式：
　　
Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ
［式中、ＲはＣ８〜Ｃ２２のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものである
　【
請求項３
１
２
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、粒子及び細胞測定用シース液に関し、詳しくは、フローサイトメータを使用して粒子及び細胞、特に赤血球を溶解処理された血球を光学的に測定し、白血球を分類する方法に使用するフローサイトメータのフローセル内の泡の発生の防止に有用なシース液に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　従来から光の散乱による細胞又は微粒子の識別又は分析にフローサイトメータが使用されている。図１に示されるこの細胞測定装置（フローサイトメータ）の流動細胞測定器４は、サンプル粒子からの光散乱を測定するために設計されている。すなわち、測定される粒子を含んだ試料液１３が流動細胞測定器４に導かれ、そこでレーザー光源１からのレーザー光が照射光集束用レンズ２及び３を経て照射され、前方散乱光は照射光ストッパ７を介し直射光が停止され散乱光のみが前方散乱光検出用レンズ８を経て前方散乱光検出器９により測定され、検出器により測定された電圧レベルが分析器１０に入力される。一方流動測定器４における側方散乱光は側方散乱光検出用レンズ５を経て側方散乱光検出器６により測定され、検出器により測定された電圧レベルが分析器１０に入力される。この分析器１０の両電圧レベルに基づいて表示装置１１に前方および側方散乱光による二次元分布図（スキャッタグラム）が表示される。
　【０００３】
　この流動細胞測定器４の粒子測定機構を図２〜４に基づいて説明する。図において測定粒子を含むサンプル液流１３Ａは、その周囲をシース液流１２により包囲された状態で流動細胞測定器４を構成する流動細胞測定室１６中へ流動室から液流の太さを狭めつつ導かれ、流動細胞測定室１６において照射光線（レーザービーム）１４を照射されて前方及び側方散乱光を生じることになる。このとき、通常は図４に示されるように、測定される細胞（または微粒子）１５はサンプル液流１３Ａにより囲撓されていてシース液流１２に直接接触することがない。しかしながら、サンプル流量を減らしシース流量を増加させると図３に示されるように、サンプル液流１３Ａはしぼられ、測定される細胞１５がシース液流１２と直接接触する場合も時として生じる。したがって、シース液の組成は細胞１５に分壊、破壊を生じる怖れのないものでなければならない。
　【０００４】
　このような条件に適合させるものとして、マイクロフィルターなどの適当なフィルターにより濾過して粒子を除去した蒸留水または生理的食塩水がシース液として使用されてきた。
　【０００５】
　【発明が解決しようとする課題】
　しかしながら、このような従来の蒸留水または生理的食塩水のみよりなるシース液にあっては、表面張力が大きいためシース液中に気泡を発生させやすいという欠点があった。図２に示されるように、サンプル液流１３Ａの出口のシース液流１２中に気泡が存在すると、気泡が上記両方の液流と共に流動細胞測定器４を構成する流動細胞測定室１６中へ流入する。そして流動細胞測定室１６中に気泡が存在すると、この気泡によりサンプル液流１３Ａの流れが影響を受けて流動細胞測定室１６の中心からはずれて流動細胞測定室１６の端部へ蛇行して照射光線１４に照射されて細胞から散乱される散乱光が弱まったり、極端な場合には照射光線光１４の照射経路からサンプル液流１３Ａがそれたり、更に断面が四角形の流動細胞測定室１６の四隅部に気泡が保持され、この保持気泡によりサンプル液流１３Ａの流れの方向が変動するなどして測定の再現性を低下させる原因となっていた。
　【０００６】
　このような従来のシース液の気泡保持の問題点を解決するものとして、例えば、特開昭６２−８７２３３号公報に記載された末端１級ヒドロキシ基のポリオール共重合体であるノニオン性界面活性剤を利用したシース液が提案された。このシース液によれば、保持気泡による問題点は解決されるものの、ポリオール共重合体分子中のプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドの両成分の繰返し単位数が約３９〜約７７と大きく、従って可成り分子量及び親油性が大きいため水に難溶性であるため、シース液を調製する際に溶解撹拌しにくい。そして、シース液として使用したとき、液の濁りが生じ、粒子検出に影響することが報告されている。
　前記問題点を解決するために、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル型のノニオン界面活性剤を利用したシース液が提案されているが、赤血球など細胞に対する溶解力が強いため、サンプル流中の細胞がシース液と接触するような設定の場合、細胞に影響を及ぼすという問題点が依然として残っていた。
　【０００７】
　本発明は、このような従来の課題に鑑みてなされたものであり、単純な溶解操作により保持気泡による問題点を確実に解消し、再現性の良い粒子及び細胞の測定が行えるシース液を提供することを目的とする。
　【０００８】
　【課題を解決するための手段】
　請求項１記載の発明に係る粒子測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液
であって、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ８〜Ｃ２２のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものであることを特徴として成る
　【０００９】
　また請求項２記載の発明に係る細胞測定用シース液は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤、浸透圧調整剤、緩衝剤、キレート剤及び防黴剤を混合した水溶液
であって、ノニオン性界面活性剤が式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ［式中、ＲはＣ８〜Ｃ２２のアルキル基を表わし、ｎは２５〜３５の整数である］で示されるものであることを特徴として成る
　【００１０】
　更に請求項３記載の発明に係るシース液は、上記構成に加えて、
浸透圧調整剤の量がシース液の浸透圧を２６０〜４１０ミリオスモス／キログラムに調整するための量であり、緩衝剤の量がシース液のｐＨを６〜８に保つための量であることを特徴として成る
　【００１２】
　本発明のシース液の調製に有用なポリオキシエチレンアルキルエーテル系ノニオン性界面活性剤は、フローサイトメータの流動細胞測定室内の気泡の発生の防止乃至低減と発生した気泡の流路外への迅速な流出のために必要なものである。このノニオン性界面活性剤は、一般式：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｈ、［式中、Ｒ及びｎは上記に定義した通りである］により示されるものである。
　【００１３】
　フローサイトメータによって粒子及び細胞を測定するとき、サンプル液流、シース液流の流量によって図３に示すように粒子や細胞がシース液に接触することがあるので、シース液は粒子、特に細胞に影響を与えるものであってはならない。一般に、上記の型の界面活性剤は、細胞を溶解する作用がある。しかしながら、エチレンオキシドの付加モル数（上記の式のｎ）が多くなると細胞に対する溶解力が低下する。従って、エチレンオキシドの付加モル数の多い界面活性剤を使用すれば、ノニオン性界面活性剤の表面張力の低下、浸透力の増大などの作用を十分発揮できる濃度まで添加量を増加しても細胞を溶解することがない。しかしながら、付加モル数が多くなり過ぎるとノニオン性界面活性剤の浸透力、洗浄力が低下し、シース液としての効果が半減する。
　【００１４】
　
アルキル基Ｒ
　【００１５】
　本発明のシース液に有用な浸透圧調整剤は、細胞が安定して存在できる浸透圧、すなわちシース液の浸透圧を２６０〜４１０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏに調整するものであり、好ましくは塩素または臭素のアルカリ金属塩が挙げられ、そして最も好ましくは塩化ナトリウムである。しかして、シース液の浸透圧が低過ぎると細胞が膨潤し、極端な場合には細胞が破裂し、一方浸透圧が高過ぎると細胞が収縮し、測定精度が低下するため、シース液を上記の浸透圧に調整するための量が使用され、一般に蒸留水１０００ｍｌ当り９．０ｇの塩化ナトリウムが使用されることが多い。
　【００１６】
　本発明のシース液に使用するのに適する緩衝剤は、シース液のｐＨを約６．８〜７．６に維持する緩衝剤である。適当な緩衝剤としてはリン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ベロナールナトリウム−塩酸、コリジン−塩酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン一塩酸が例示される。
　【００１７】
　一般に、６〜８のｐＨ範囲からはずれると細胞形態に影響が生じ、例えば赤血球は上記ｐＨ範囲外のシース液に接触すると、ｐＨ６未満では正常赤血球から有口赤血球へ変化し、一方８を越えたｐＨでは正常赤血球から有棘赤血球へ変化する。ｐＨ７．４が細胞のｐＨと同じであり、細胞形態を変化させることなく再現性の良い細胞の測定を行うためには、緩衝剤の量としてはｐＨを６〜８に維持する量が使用される。
　【００１８】
　キレート剤は、本発明のシース液の長期間の保存、使用上での金属イオンによる沈殿を防止するために金属イオンとキレートを形成するために使用するものであって、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（ＥＤＴＡ−２Ｎａ）などの公知のキレート剤が通常シース液中で０．３重量％の濃度にて使用される。
　【００１９】
　本発明のシース液への使用に適する防黴剤は、シース液の長期保存による黴、細菌の発生を抑制することができるものであって、添加量は防黴剤の種類によって異なる。適当な防黴剤としては２−フェノキシエタノール、１−ヒドロキシピリジン−２−チオンナトリウム、その他適当な殺菌剤が挙げられる。なお、上記の薬剤類のうち、ラテックス粒子、例えばポリスチレン粒子をフローサイトメータにより測定する場合には、浸透圧調整剤、緩衝剤をシース液中に含まなくても再現性良く測定できることは言うまでもない。
　【００２０】
　【実施例】
　以下、本発明を細胞、具体的には白血球の分類用シース液を例にとって実施例に基づいて説明する。
　【００２１】
　実施例１
　以下の組成成分を一度にビーカーに入れ、ゆっくり攪拌して溶液を調製し、次いで、この溶液を０．２μポアのミクロフィルターで濾過して適当な容器に入れた。
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　９．０　ｇ
　　リン酸２水素カリウム　　　　　　　　　　　０．９１ｇ
　　リン酸水素２ナトリウム（１２水塩）　　　　９．５５ｇ
　　ＥＤＴＡ−２Ｎａ　　　　　　　　　　　　　０．３　ｇ
　　２−フェノキシエタノール　　　　　　　　　３．３　ｇ
　　ＰＯＥ（３０）ラウリルエーテル　　　　　　２．５　ｇ
　　蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ
　上記の組成中、ＰＯＥ（３０）ラウリルエーテルは、Ｃ１２Ｈ２５−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３０−Ｈを意味する。
　次に血液の２００倍の希釈液１００ｍｌに上記の界面活性剤入りのシース液を５％から順次添加率を変更してフローサイトメータの流動細胞測定室中へ導入し、添加直後と添加２分後の体積の相違±２以内をもって合格範囲としてシース液の評価を行った。結果を下記に示す。
　上記の結果から、このシース液では界面活性剤の濃度が０．０２５％から１．６６７％までの広い範囲にわたって体積変化が小さく充分使用でき、すなわち、界面活性剤濃度の可成りの変動があってもシース液の保持気泡に起因する問題が生じなく、しかもシース液流とサンプル液流の流量に多少の変動があっても充分に再現性の良い測定結果が得られることがわかる。
　【００２２】
　実施例２
　以下の組成のシース液を実施例１と同様の手順により調製した。下記の組成中、ＰＯＥ（３０）オレイルエーテルは、Ｃ１８Ｈ３５−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３０−Ｈを意味する。
　　塩化ナトリウム　　　　　　　　　　　　　　９．０　ｇ
　　トリス（オキシメチル）アミノメタン　　　　２．０　ｇ
　　塩酸（３５％）　　　　　　　　　　　　　　１．３４ｇ
　　ＥＤＴＡ−２Ｎａ　　　　　　　　　　　　　０．３　ｇ
　　２−フェノキシエタノール　　　　　　　　　３．３　ｇ
　　ＰＯＥ（３０）オレイルエーテル　　　　　　２．５　ｇ
　　蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０００ｍｌ
　上記のシース液を使用した以外は実施例１と同じ手順を繰返してシース液の評価を行った。結果を下記に示す。
　上記の結果から、このシース液では界面活性剤の濃度が０．０２５％から２．５０％の範囲にわたって、実施例１と同様に満足な結果が得られることがわかる。
　【００２３】
　実施例３
　ノニオン性界面活性剤：Ｒ−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＨのＲの炭素数８（オクチル）及び２２（ドエイコシル）についてエチレンオキシドの付加モル数ｎ＝３０に関して上記実施例１及び２と同様の手順を行ったが、Ｃ８については実施例１と類似の結果を、Ｃ２２については実施例２と類似の結果を得た。またＲの炭素数１６（ステアリル）についてｎを２５及び３５に関して上記の同様の評価を行い、ｎ＝２５については実施例１より多少見劣りするものの界面活性剤濃度１．４２９％まで満足な結果を、ｎ＝３５については実施例２とほぼ同様の結果を得た。
　【００２４】
　比較例１
　実施例２におけるエチレンオキシドの付加モル数ｎ＝３０を１５に変えた以外は実施例２と同様の手順を繰返してシース液の評価を行った。結果を以下に示す。
　上記の結果から、界面活性剤濃度が０．００２％から０．００５％という低濃度のしかも狭い濃度範囲では体積変化については、満足な結果が得られるものの、アワをおさえるシース液としては不十分であり、多少でも濃度が上昇し、例えば濃度０．０１０％では２分間の間に大きな体積変化を生じ、実用的にフローサイトメータで粒子測定を行う際には濃度変動を極めて厳密に抑制しなければならなく、シース液として実際に使用することが困難であることがわかる。
　【００２５】
　比較例２
　実施例１におけるアルキル基Ｒの炭素数を１６（ステアリル）に増加したが、代わりにエチレンオキシドの付加モル数ｎを１５に減少した以外は実施例１と同じ手順を繰返してシース液の評価を行った。結果を以下に示す。
　上記の結果から、界面活性剤濃度が０．００２％という低濃度だけで満足な結果が得られるものの、多少でも濃度が上昇し、例えば濃度０．００５％では２分間の間に大きな体積変化が生じ、このような低濃度での厳密な管理は実際上困難であり、しかも界面活性剤濃度がこれを下回ると気泡の発生防止、気泡離脱性能とも低下し、実用性に乏しいことがわかる。
　【００２６】
　比較例３
　比較例２におけるエチレンオキシドの付加モル数ｎ＝１５を２０に増加した以外は比較例２と同じ手順を繰返してシース液の評価を行った。結果を以下に示す。
　上記の結果から、実施例１及び２と同様の実用的な界面活性剤濃度でのシース液の評価試験においては、期待した実用的な性能が得られないことがわかる。
　【００２７】
　【発明の効果】
　本発明によれば、フローサイトメータを使用する粒子及び細胞の測定用シース液に
特定の構造の
請求項１又は２
経時的に体積を安定させたまま
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　本発明のシース液を使用するフローサイトメータの光学系の説明図である。
　【図２】
　流動細胞測定器の流動細胞測定室付近の拡大説明図である。
　【図３】
　流動細胞測定室内の流れの説明図（サンプル液流の太さが細胞に比べて小さい場合）である。
　【図４】
　流動細胞測定室内の流れの説明図（サンプル液流の太さが細胞に比べて大きい場合）である。
　【符号の説明】
　１　レーザ光源　　　　　　　　　２　レンズ（照射光集束用）
　３　レンズ（照射光集束用）　　　４　流動細胞測定器
　５　レンズ（側方散乱光検出用）　６　側方散乱光検出器
　７　照射光ストッパ　　　　　　　８　レンズ（前方散乱光検出用）
　９　前方散乱光検出器　　　　　　１０　分析器
　１１　表示装置　　　　　　　　　１２　シース液流
　１３…試料液　　　　　　　　　　１３Ａ　サンプル液流
　１４　照射光線（レーザービーム）　１５　細胞
　１６　流動細胞測定室