(57)【要約】組換え発現ベクター、または組換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む免疫原性組成物を対象に投与することによって、対象における特異的免疫応答を誘発するための方法が本明細書で提供され、そのベクターは、目的とする免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本方法は、免疫原性組成物とともに同時に、または順次でのいずれかでアジュバント組成物を投与することをさらに含む。本発明では、（ａ）組換え発現ベクターを含む、ベクター粒子であって、そのベクターは、目的とする免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター粒子、および（ｂ）少なくとも１つのアジュバントを別々に投与することによって、対象に導入される免疫原に対する免疫応答を誘発するための方法が提供される。このようにしてアジュバントを投与することは、アジュバントの投与がない場合に得られる特異的免疫応答と比較して、免疫原に対する免疫応答を強化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において免疫原に特異的な免疫応答を誘発するための方法であって、前記対象に、（ａ）第１の組成物であって、組換え発現ベクターを含むベクター粒子を含み、前記組換え発現ベクターが前記免疫原をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが少なくとも１つの調節発現配列に動作可能に結合される、第１の組成物と、（ｂ）薬学的に好適なアジュバントを含む第２の組成物と、を同時に、または順次投与することを含み、前記第１の組成物および前記第２の組成物はそれぞれ、薬学的に好適な賦形剤をさらに含む、方法。
【請求項２】
前記第１の組成物および前記第２の組成物は同時に投与され、前記第１の組成物は、第１の部位で前記対象に投与され、前記第２の組成物は、第２の部位で前記対象に投与され、前記第１の部位および前記第２の部位は異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の組成物は、第１の経路を介して前記第１の部位で投与され、前記第２の組成物は、第２の経路を介して前記第２の部位で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の経路および前記第２の経路は異なり、それぞれ、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、および局所から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の経路および前記第２の経路はそれぞれ同一であり、非経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、経皮、経真皮、および局所から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の組成物および前記第２の組成物は、順次投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の組成物は、第１の部位で前記対象に投与され、前記第２の組成物は、第２の部位で前記対象に投与され、前記第１の部位および前記第２の部位は同一であるか、または異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の組成物は、第１の経路を介して前記第１の部位で投与され、前記第２の組成物は、第２の経路を介して前記第２の部位で投与される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の経路および前記第２の経路は異なり、それぞれ、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、および局所から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の経路および前記第２の経路はそれぞれ同一であり、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、および局所から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の部位および前記第２の部位は同一であり、前記第１の経路および前記第２の経路は異なり、それぞれの経路は、非経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、経皮、経真皮、および局所から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の組成物は、前記第２の組成物の投与前に投与される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の組成物は、前記第１の組成物の投与前に投与される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組換え発現ベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、アルファウイルスベクターゲノム、およびプラスミドＤＮＡから選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベクター粒子は、前記レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子、前記ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子、前記ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子、前記アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子、前記アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス随伴ウイルスベクター粒子、前記ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子、または前記アルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクター粒子は、前記レンチウイルスベクター粒子であり、前記レンチウイルスベクターゲノムを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
前記レンチウイルスベクター粒子は、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有するシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含むエンベロープをさらに含み、残基１６０は不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であるかのいずれかであり、Ｅ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質との融合タンパク質の一部ではない、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ベクター粒子は、前記組換え発現ベクターを抗原提示細胞に送達する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗原提示細胞は、樹状細胞である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原は、腫瘍関連抗原である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍関連抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、または卵巣癌抗原から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記前立腺癌抗原は、前立腺酸性フォスファターゼ、前立腺特異抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記腎細胞癌抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫原は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫から選択される感染性微生物由来である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記誘発された免疫応答は、細胞障害性Ｔリンパ球免疫応答を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記誘発された免疫応答は、免疫原特異抗体の産生を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記アジュバントは、非毒性脂質Ａ関連アジュバントである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記非毒性脂質Ａ関連アジュバントは、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＧＬＡは、安定した水中油型エマルジョン中で製剤化される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アジュバントを含む前記第２の組成物は、
（ａ）前記第２の組成物が、単一の組成物として前記第１の組成物とともに投与されるか、または（ｂ）前記第１の組成物および前記第２の組成物が、同一の部位で同一の経路を介して同時に投与されるときに、
前記免疫原に対する前記免疫応答の誘発を阻害する、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する記述
本願は、開示の別個の部分として、その全体で参照することにより組み込まれる、コンピュータ可読形態の配列表（ファイル名：４６４４０Ａ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ、２０１２年２月１４日作成、１５１，６１１バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル）を含有する。
【０００２】
（技術分野）
本開示は、概して、アジュバントを同時に、または順次投与することによって、免疫原に対する特異的免疫応答を強化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の説明
宿主の免疫系は、病原微生物に対する防御応答を迅速かつ特異的に開始するため、また、悪性腫瘍の拒絶に寄与するための手段を提供する。免疫応答は、概して、抗原に特異的な抗体が分化したＢリンパ球によって産生される、体液性応答、および種々の種類のＴリンパ球が種々の機構によって抗原を排除する、細胞媒介応答を含むものとして説明されている。例えば、特定の抗原を認識することが可能である、ＣＤ４（ＣＤ４＋とも呼ばれる）ヘルパーＴ細胞は、免疫応答に関与する免疫系の付加的な細胞を集めるように、サイトカイン等の可溶性メディエーターを放出することによって応答し得る。ＣＤ８（ＣＤ８＋とも呼ばれる）細胞障害性Ｔ細胞もまた、特定の抗原を認識することが可能であり、抗原を持つ細胞または粒子に結合して、破壊または損傷し得る。具体的には、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含む、細胞媒介免疫応答は、腫瘍細胞およびウイルス感染細胞の排除のために重要となり得る。
【０００４】
癌は、広範囲の疾患を含み、世界中で４人中約１人に影響を及ぼしている。ＣＴＬ応答は、有効な癌ワクチンの主要な特徴であり、効果的なＣＤ４Ｔ細胞ヘルプもまた、生産的なＣＤ８Ｔ細胞活性化で重要な役割を果たし、臨床的有益性を提供する可能性が高い。自己樹状細胞（ＤＣ）ベースのワクチンＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（ＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標））が、転移性の去勢耐性前立腺癌の治療のためにＦＤＡによって最近承認されたが、この治療と関連付けられる延命効果は、わずか４．１ヶ月であり、改善の有意な必要性を残している（例えば、非特許文献１を参照）。ポックスウイルスベクターベースのワクチンＰｒｏｓｔＶａｃ（登録商標）ＶＦも、第ＩＩ相で有意な延命効果を示す（例えば、非特許文献２を参照）。Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−ＴおよびＰｒｏｓｔＶａｃ（登録商標）ＶＦ等の積極的免疫療法が、概して、去勢耐性疾患に対する現在の標準治療を含む、化学療法レジメンよりも耐性が高くなっている（例えば、非特許文献３；非特許文献４を参照）。これらの臨床的成功は、改善した患者転帰および延長した生存を提供するように、免疫応答を癌の状態に利用できることを実証する。
【０００５】
多くの外来（つまり、非自己）抗原は、免疫原性が低く、抗原に対する満足できる免疫応答を提供するために、アジュバントの投与を必要とする。アジュバントはまた、体液性応答または細胞媒介応答に向かって免疫応答をバイアスするために使用されてもよく、あるアジュバントはまた、特定の抗体アイソタイプへ抗体応答をバイアスする、または特定のＴ細胞小集団に向かって細胞応答をバイアスするために使用されてもよい。免疫原に対する免疫応答を誘発または強化するためのアジュバントおよび／またはアジュバントの送達モードの選択は、治療および予防ワクチン開発の重要な態様となり得る。
【０００６】
堅調な体液性および／または細胞媒介応答を誘発することが、感染症の成功した予防および治療のために重要である、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、マラリア、抗生物質耐性菌等の感染症微生物に対する、改良型ワクチンを含むワクチンの必要性が存在する。加えて、癌がある患者の生存に対する肯定的な影響にもかかわらず、ワクチン誘発性腫瘍特異免疫と患者有益性との間の明確な関係が、決定的に実証されておらず、改良型癌ワクチン効力のかなりの可能性および必要性が存在することを示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｎｔｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  （２０１０）  ３６３（５）：４１１
【非特許文献２】Ｋａｎｔｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｏｎｃｏｌ．  （２０１０）  ２８（７）：１０９９
【非特許文献３】Ｐｅｔｒｙｌａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  （２００４）  ３５１（１５）：１５１３
【非特許文献４】Ｓｙｌｗｅｓｔｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  （２００５）  ２０２（５）：６７３
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、（ａ）組換え発現ベクターを含む、ベクター粒子であって、そのベクターは、目的とする免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター粒子、および（ｂ）少なくとも１つのアジュバントを別々に投与することによって、対象に導入される免疫原に対する免疫応答を誘発するための方法が提供される。このようにしてアジュバントを投与することは、アジュバントの投与がない場合に得られる特異的免疫応答と比較して、免疫原に対する免疫応答を強化する（または向上させる）。
【０００９】
一実施形態では、（ａ）ベクター粒子を含む、第１の組成物であって、ベクター粒子は、組換え発現ベクターを含み、組換え発現ベクターは、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの調節発現配列に動作可能に結合される、第１の組成物、および（ｂ）薬学的に好適なアジュバントを含む、第２の組成物を、対象に同時に、または順次投与することを含み、第１の組成物および第２の組成物はそれぞれ、薬学的に好適な賦形剤をさらに含む、対象における免疫原に特異的な免疫応答を誘発するための方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、同時に投与され、第１の組成物は、第１の部位で対象に投与され、第２の組成物は、第２の部位で対象に投与され、第１の部位および第２の部位は、異なる。ある実施形態では、第１の組成物は、第１の経路を介して第１の部位で投与され、第２の組成物は、第２の経路を介して第２の部位で投与される。特定の実施形態では、第１の経路および第２の経路は、異なり、それぞれ、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、および局所から選択される。他の特定の実施形態では、第１の経路および第２の経路は、それぞれ同一であり、非経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、経皮、経真皮、および局所から選択される。
【００１０】
対象における免疫原に特異的な免疫応答を誘発するための方法の別の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、順次投与される。１つの特定の実施形態では、第１の組成物は、第１の部位で対象に投与され、第２の組成物は、第２の部位で対象に投与され、第１の部位および第２の部位は、同一であるか、または異なる。さらに別の特定の実施形態では、第１の組成物は、第１の経路を介して第１の部位で投与され、第２の組成物は、第２の経路を介して第２の部位で投与される。ある実施形態では、第１の経路および第２の経路は、異なり、それぞれ、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、および局所から選択される。なおも他の特定の実施形態では、第１の経路および第２の経路は、それぞれ同一であり、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、および局所から選択される。さらに別のある実施形態では、第１の部位および第２の部位は、同一であり、第１の経路および第２の経路は、異なり、それぞれの経路は、非経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、経皮、経真皮、および局所から選択される。１つの特定の実施形態では、第１の組成物は、第２の組成物の投与前に投与される。別の特定の実施形態では、第２の組成物は、第１の組成物の投与前に投与される。
【００１１】
上記および本明細書で説明される方法に関して、組換え発現ベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、アルファウイルスベクターゲノム、およびプラスミドＤＮＡから選択される。より具体的な実施形態では、ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子、ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子、ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス随伴ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクターゲノムを含むヘルペスウイルスベクター粒子、またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子である。さらに別の具体的実施形態では、ベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含む、レンチウイルスベクター粒子である。具体的実施形態では、ベクター粒子は、組換え発現ベクターを抗原提示細胞に送達し、ある特定の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。ある実施形態では、レンチウイルスベクター粒子はさらに、配列番号１と比較して少なくとも１つのアミノ酸変化を有する、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質を含む、エンベロープを含み、残基１６０は、不在であるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸であるかのいずれかであり、Ｅ２糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ３タンパク質との融合タンパク質の一部ではない。具体的実施形態では、ベクター粒子は、組換え発現ベクターを抗原提示細胞に送達し、ある特定の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【００１２】
また、上記および本明細書で説明される方法に関して、免疫原は、腫瘍関連抗原である。特定の実施形態では、腫瘍関連抗原は、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、または卵巣癌抗原から選択される。より具体的な実施形態では、前立腺癌抗原は、前立腺酸性フォスファターゼ、前立腺特異抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原である。なおも他の特定の実施形態では、腎細胞癌抗原は、炭酸脱水酵素ＩＸである。他の具体的実施形態では、免疫原免疫原は、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫から選択される、感染性微生物由来である。
【００１３】
上記および本明細書で説明される方法のある実施形態では、誘発された免疫応答は、細胞障害性Ｔリンパ球免疫応答を含む。なおも他の実施形態では、誘発された免疫応答は、免疫原特異抗体の産生を含む。
【００１４】
上記および本明細書で説明される方法に関して、ある実施形態では、アジュバントは、非毒性脂質Ａ関連アジュバントである。より具体的な実施形態では、非毒性脂質Ａ関連アジュバントは、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）である。別の特定の実施形態では、ＧＬＡは、安定した水中油型エマルジョンの中で製剤化される。
【００１５】
上記および本明細書で説明される方法のさらに他のある実施形態では、アジュバントを含む、第２の組成物は、（ａ）第２の組成物が、単一の組成物として第１の組成物とともに投与される、または（ｂ）第１の組成物および第２の組成物が、同一の部位で同一の経路を介して同時に投与されるときに、免疫原に対する免疫応答の誘発を阻害する。
【００１６】
本明細書で使用されるように、「単離」という用語は、物質がその元の環境（自然発生している場合は自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する自然発生核酸またはポリペプチドは、単離されていないが、自然系の中の既存の物質のうちのいくつかまたは全てから分離された、同一の核酸またはポリペプチドは単離されている。そのような核酸は、ベクターの一部となり得る。ベクターの一部であり得る核酸は、核酸が核酸にとっての自然環境の一部ではないという点で、依然として単離されてもよい。単離されたポリペプチドまたはタンパク質、あるいはその断片は、組成物の構成要素となり得、組成物がポリペプチドにとっての自然環境の一部ではないという点で、依然として単離することができる。「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡの区分を意味し、遺伝子は、コーディング領域「リーダーおよびトレーラー」に先行する、および続く領域、ならびに個々のコーディング区分（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含む。アミノ酸は、本明細書では、当技術分野で一般的な教科書通りの知識である、１文字および３文字コードに従って参照されてもよく、したがって、当業者は、それに精通している。本明細書で使用されるような「融合ポリペプチド」という用語はまた、「融合タンパク質」と交換可能に使用されてもよく、特に指示がない限り、２つの用語は、区別可能な性質または特性を有する分子を示すように意図されていない。
【００１７】
本明細書および添付の請求項で使用されるように、「１つの」、「および」、ならびに「その」という単数形は、文脈が明確に決定付けない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「１つの抗原」という言及は、複数のそのような抗原を含み、「１つの細胞」または「その細胞」という言及は、１つ以上の細胞および当業者に公知であるその同等物（例えば、複数の細胞）という言及を含む等となる。同様に、「１つの化合物」または「１つの組成物」という言及は、複数のそのような化合物または組成物を含み、文脈が明確に決定付けない限り、それぞれ、１つ以上の化合物または組成物を指す。数または数値範囲を指すときの「約」という用語は、参照される数または数値範囲が、実験的可変性内（または統計的実験誤差内）の近似であることを意味し、したがって、数または数値範囲は、記述された数または数値範囲の１％から１５％の間で異なってもよい。「を備える」という用語（および「備える」または「有する」または「含む」等の関連用語）は、他のある実施形態では、例えば、本明細書で説明される任意の合成物、組成物、方法、または過程、あるいは同等物の実施形態が、説明された特徴「から成ってもよい」または「から本質的に成ってもよい」ことを排除することを目的としていない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＡＨ１Ａ５をコードするレンチウイルスベクターがＢＡＬＢ／Ｃマウスに皮下投与され、アジュバントが腹腔内に投与されたときの、ＡＨ１エピトープおよび改変ペプチドＡＨ１Ａ５に対する抗原特異的免疫応答を図示する。ＡＨ１Ａ５をコードするレンチウイルスベクター（ＳｉｎＶａｒ１  ＦＵＷ  ＡＨ１Ａ５（１μｇ  ｐ２４））が、ＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに皮下（ｓ．ｃ．）投与された。グループは、アジュバント、ＧＬＡ（１０μｇ）またはＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ）を腹腔内に注射され、またはＰＢＳ（アジュバントなし）を注射された。１０日後、脾臓細胞が動物から単離され、ＩＣＳ、その後に続いてＦＡＣＳにより、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを判定することによって、ＣＤ８Ｔ細胞応答が評価された。示される値は、ＩＦＮ−γについて陽性であるＣＤ８Ｔ細胞の平均割合±ＳＥＭである。データはまた、レンチウイルスベクターを注射されなかったマウス（未投与）から得られた脾臓細胞からも示されている。
【図２】ＣＤ８Ｔ細胞エピトープＡＨ１Ａ５に対する免疫応答に関する、２つのアジュバント、ＧＬＡおよびリポ多糖類（ＬＰＳ）の作用を図示する。ＡＨ１Ａ５をコードするレンチウイルスベクター（ＳｉｎＶａｒ１  ＦＵＷ  ＡＨ１Ａ５（１μｇ  ｐ２４））が、ＰＢＳ（対照グループ）、４μｇ  ＧＬＡ、２０μｇ  ＧＬＡ、または４μｇ  ＬＰＳと混合され、次いで、ＢＡＬＢ／Ｃマウスのグループに皮下（ｓ．ｃ．）投与された。１０日後、脾臓細胞が各グループ内の動物から単離され、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、その後に続いて蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを判定することによって、ＣＤ８Ｔ細胞応答が評価された。示される値は、ＩＦＮ−γについて陽性であるＣＤ８Ｔ細胞の平均割合±ＳＥＭである。データはまた、レンチウイルスベクターを注射されなかったマウス（ＬＶなし）から得られた脾臓細胞からも示されている。
【図３】細胞内サイトカイン染色による、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を発現する細胞の割合によって判定されるような、３つのエピトープに対するＣＤ８Ｔ細胞応答を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書では、組換え発現ベクターを含むベクター粒子であって、そのベクターは、目的とする免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む、ベクター粒子を投与することによって、対象に導入される免疫原に対する免疫応答（体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）または細胞媒介応答（細胞障害性Ｔ細胞応答を含む）あるいは両方）を誘発するための方法が提供される。本明細書で説明されるように、組換え発現ベクターは、免疫原を持つ、または発現する細胞または粒子（例えば、ウイルス粒子）に含まれる（すなわち、組み込まれる）。組換え発現ベクターはさらに、免疫原をコードするヌクレオチド配列に動作可能に結合される、少なくとも１つの（すなわち、１つ以上の）調節発現配列を含む。本明細書で説明される方法は、免疫原に対する免疫応答を強化する（または向上させる）少なくとも１つのアジュバントを投与することをさらに含む（すなわち、免疫原に対する特異的免疫応答が、アジュバントの投与がない場合に対象において得られる特異的免疫応答と比較して、統計的、生物学的、および／または臨床的に有意に強化される）。
【００２０】
本方法は、ある投与プロトコルが実践されたときに、特定のアジュバントが、発現された目的とする免疫原に対する特異的免疫応答を阻害する（すなわち、低下させる、低減する、無効にする、抑制する、最小限化する、または何らかの方法で悪影響を及ぼす）場合において、特に有用である。例えば、免疫原をコードする組換え発現ベクターを含むベクター粒子と同一の組成物の中で投与されるアジュバントが、免疫原に対する特異的免疫応答を阻害してもよく、または効果的に強化しなくてもよく、あるいはベクター粒子と同一の部位で同一の経路を介して同時に投与されるアジュバントが、免疫原に対する免疫応答を阻害してもよく、または効果的に強化しなくてもよい。いずれの特定の理論によっても拘束されるわけではないが、前述の状況下では、免疫原に特異的な免疫応答は、ベクター粒子の１つ以上の構成要素に対する免疫応答の誘発によって、抑制または最小限化される場合がある。この望ましくない結果は、本明細書で説明される方法を使用することによって無効にされてもよく、アジュバント組成物は、順次投与され、および／または免疫原性組成物と同時に投与される場合、免疫原性組成物と異なる経路を介して、および／または異なる部位で投与される。
【００２１】
本明細書でさらに詳細に説明されるように、免疫原をコードする組換え発現ベクターを含むベクター粒子を対象に投与し、同時に、または順次アジュバントを投与することによって、目的とする免疫原に対する特異的免疫応答を誘発するための方法が提供される。特定の実施形態では、組換え発現ベクターを含むベクター粒子、およびアジュバントは、異なる部位で、および／または異なる経路によって、同時に（または実質的に同時に）投与される。なおも他の実施形態では、組換え発現ベクターを含むベクター粒子、およびアジュバントは、アジュバントによるコードされた目的とする免疫原に対する特異的免疫応答の強化を可能にするために十分である時間間隔で、順次投与される。
【００２２】
理論によって拘束されることを所望するわけではないが、２つ以上の免疫原が免疫原性組成物の中に存在するときに、免疫のある宿主が１つの免疫原に対する免疫応答を生じ、第２の免疫原に対する免疫応答が阻害、最小限化、低下、または抑制される、免疫干渉が起こる場合がある。代替として、または加えて、組換え発現ベクターを含むベクター粒子および／または目的とする免疫原をコードするベクター、およびアジュバントは、望ましくない免疫応答（例えば、目的とする免疫原に対する応答の低いレベルまたは欠如）をもたらす、あるレベルの化学不適合性を示す場合がある。さらに、いずれの特定の理論によっても拘束されるわけではないが、一例として、組換え発現ベクターと、または目的とする免疫原（または複数の免疫原）を発現するための組換え発現ベクターを含むベクター粒子（またはウイルス粒子）と、同一の組成物中で、または同一の部位で同時に送達される、アジュバントは、１つ以上のベクター粒子構成要素に対する特異的免疫応答を誘発または強化し、特定の目的とする免疫原に対する免疫応答を低下させてもよい。代替として、または加えて、アジュバントは、目的とする免疫原の送達に成功するベクターの能力を低下させ得る、１型インターフェロン産生を誘発すること等であるが、それに限定されない、固有の免疫応答を誘発してもよい。本明細書で説明されるように、この問題は、組換え発現ベクターを含むベクター粒子およびアジュバントを、異なる部位で、および／または異なる経路を介して送達することによって、あるいはアジュバントが目的とする免疫原に対する免疫応答を十分に強化するように、ベクター粒子の投与とアジュバントの投与との間に十分な時間を伴って、組換え発現ベクターを含むベクター粒子およびアジュバントを順次送達することによって、克服されてきた。
免疫応答を誘発するための方法
【００２３】
一実施形態では、組換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む、組成物であって、その組換え発現ベクターは、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、組成物（本明細書では第１の組成物または免疫原性組成物とも呼ばれる）を、それを必要としている対象に投与することによって、免疫原に特異的な免疫応答を誘発するための方法が本明細書で提供され、ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの調節発現配列に動作可能に結合される。同時に、または順次、薬学的に好適なアジュバントを含む第２の組成物（本明細書ではアジュバント組成物とも呼ばれる）が、対象に投与される。アジュバントは、アジュバントが免疫原に対する免疫応答を強化するために十分な方式で一度に投与され、つまり、免疫原に特異的な免疫応答（すなわち、体液性応答、細胞媒介応答、または体液性応答および細胞媒介応答の両方）のレベルは、アジュバントがない場合に免疫原が投与されたときの免疫原に特異的な免疫応答のレベルと比較して、統計的、臨床的、および／または生物学的に有意に大きい（または増加させられる）。抗原が、アジュバントがない場合に検出可能な特異的免疫応答を誘発することが不可能である場合において、検出可能な特異的免疫応答の誘発は、免疫応答の強化を表す。
【００２４】
免疫原に対する免疫応答を誘発および／または強化するための本明細書で説明される方法は、組換え発現ベクターを含むベクター粒子と同一の組成物中で、および／または同一の経路を介して同一の部位で同時に投与された場合に、アジュバントが免疫原に対する免疫原を阻害する（すなわち、悪影響を及ぼす、強化することができない、最小限化する、干渉する、低下させる、低減する、抑制する、または無効にする）ときに、特に有用である。本明細書でさらに詳細に説明されるように、免疫原に対する免疫応答の阻害は、２つの別個の組成物中で、異なるときに、異なる部位で、および／または異なる投与経路を介してのいずれかで、アジュバントおよび組換え発現ベクターを投与することによって回避されてもよい。したがって、本明細書で特に指定されない限り、目的とする免疫原をコードする組換え発現ベクターを含むベクター粒子、およびアジュバントは、単一の組成物の中でともに組み合わせられない。言い換えれば、免疫原をコードする組換え発現ベクターを含む、ベクター粒子を含む組成物（すなわち、免疫原性組成物）は、アジュバントが欠けており、アジュバントを含む組成物は、組換え発現ベクターが欠けているか、または目的とする免疫原をコードするベクターを含むベクター粒子が欠けている。本明細書で説明される方法の他の特定の実施形態では、免疫原をコードするベクターを含む組成物、およびアジュバントを含む組成物が同一のときに（すなわち、同時に）投与されるとき、各組成物は、異なる部位で投与される。各組成物が異なる部位で投与されるときに、各組成物は、同一または異なる経路を介して投与されてもよい。代替として、各組成物は、異なる経路を介して、同一の部位で投与されてもよい。
【００２５】
したがって、より具体的な実施形態では、免疫原性組成物およびアジュバント組成物が対象に同時に投与されるときに、免疫原性組成物は、１つの経路（すなわち、第１の経路）を介して投与され、アジュバント組成物は、第２の異なる経路を介して投与される。第１および第２の経路が独立して選択され得る、投与経路は、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、腫瘍内、結節内、胸骨内、海綿体内、耳道内、または尿道内注射あるいは注入を含む、局所、経口、腸内、経鼻（すなわち、鼻腔内）、吸入、髄腔内、直腸内、膣内、眼内、結膜下、舌下、皮内、経真皮、または非経口投与を含むが、それらに限定されない。あるより具体的な実施形態では、第１および第２の経路は、異なり、それぞれ、非経口、経口、腸内、舌下、鼻腔内、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、経皮、経真皮、および局所から選択される。より具体的な実施形態では、第１および第２の経路は、異なり、筋肉内、皮下、経皮、腫瘍内、結節内、鼻腔内、および経口から選択される。免疫原性およびアジュバント組成物は、当技術分野で説明され、本明細書でさらに論議される、異なる経路による送達のために、適切に製剤化される。
【００２６】
他の具体的実施形態では、免疫原性組成物およびアジュバント組成物がそれぞれ、対象に同時に投与されるときに、組成物は、対象の異なる部位で投与されてもよい。異なる部位は、免疫原に対する免疫応答の誘発または強化を可能にするように、相互から十分に物理的に分離される。各組成物が異なる部位で投与されるときに、組成物は、同一の経路を介して投与されてもよく、または異なる経路を介して投与されてもよい。一例として、および例証のみの目的で、免疫原性組成物は、対象の四肢（例えば、腕）に皮下または筋肉内投与されてもよく、アジュバント組成物は、対象の異なる四肢（例えば、脚）に、それぞれ、皮下または筋肉内投与されてもよい。付加的な一例として、異なる部位におけるが、同一の経路による、各組成物の同時投与は、四肢（例えば、腕または脚）に対する免疫原性組成物の投与と、同一の種類の別の（または第２の）四肢に対するアジュバント組成物の投与とを含んでもよい。他の特定の実施形態では、免疫原性組成物およびアジュバント組成物が同一の部位で同時に投与されるときに、免疫原性およびアジュバント組成物のうちのそれぞれに対する投与経路は、異なり、それぞれ、経口、腸内、非経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、経皮、経真皮、舌下、および局所から選択される。一例として、１つの組成物は、摂取されるように経口で送達されてもよく、第２の組成物は、舌下に送達されてもよい。別の実施例として、１つの組成物は、ある部位で筋肉内に送達されてもよく、第２の組成物は、ほぼ同一の部位（例えば、同一の腕または同一の脚）において皮下に、または経皮的に送達されてもよい。
【００２７】
投与経路の選択は、送達される組成物、対象の年齢、および対象の体重を含む、いくつかの要因に依存するであろう。投与経路および投与の部位は、典型的には、最も安全な方式で対象に送達される組成物中の活性成分の量を最大限化するように選択される。免疫原性組成物および／またはアジュバント組成物の筋肉内投与のための典型的な部位は、前外側大腿筋および三角筋を含む。ヒトでは、三角筋の筋肉内注射は、典型的には、成人、ある場合においては、子供および１０代、ならびに１歳から２歳の間の幼児にワクチンを送達するために、ワクチン分野の当業者によって使用される。前外側大腿内の外側広筋が、典型的には、乳児（すなわち、１歳未満）の筋肉内注射に推奨され、また、より年長の子供および成人での筋肉内送達の部位であってもよい。代替として、ヒトでの筋肉内注射の部位は、腹側臀筋領域であってもよい。当業者であれば、免疫原性組成物が背側臀筋部位または臀部の上外側四半部に送達された場合、ワクチンの準最適送達が起こる場合があると理解するであろう。
【００２８】
一例として、免疫原性またはアジュバント組成物の皮下投与のための典型的な部位は、前外側大腿筋を覆う脂肪組織または三頭筋を覆う脂肪組織を含む。大腿筋は、ヒト乳児に対する組成物の皮下投与のための好ましい部位である。経皮投与は、三角筋または前外側大腿筋におけるものであってもよい。
【００２９】
別の実施形態では、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、組換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む、第１の組成物、およびアジュバントを含む第２の組成物は、順次投与される。ある実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバント組成物の前に投与される（すなわち、アジュバント組成物は、免疫原性組成物の投与の後に投与される）。他のある実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物の投与の前に投与される（すなわち、免疫原性組成物は、アジュバント組成物の投与の後に投与される）。
【００３０】
より具体的な実施形態では、免疫原性組成物およびアジュバント組成物がそれぞれ、それを必要としている対象に順次投与されるときに、各投与は、数時間または数日で分離される。ある実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバント組成物の投与の少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、または少なくとも１２時間、または少なくとも１８時間前に投与される。他の特定の実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバント組成物の投与の少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、または少なくとも７日前に投与される。さらに他のある実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物の前に投与され、免疫原性組成物の投与の少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、または少なくとも１２時間、または少なくとも１８時間前に投与される。なおも他の具体的実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物の前に投与され、免疫原性組成物の投与の少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、または少なくとも７日前に投与される。各組成物の投与間の最適な時間間隔は、適切に設計された前臨床および臨床研究により、当業者によって判定されてもよい。最適な時間間隔は、目的とする免疫原および／または投与される特定のアジュバントに依存してもよい。
【００３１】
なおも他の実施形態では、免疫原性組成物およびアジュバント組成物はそれぞれ、それを必要としている対象に１回よりも多く（例えば、２回、３回、または４回）順次投与される。具体的実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物と同一の回数で投与されてもよい。さらに別の実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物よりも少ない回数で投与されてもよい。非限定的実施例として、免疫原性組成物が１回よりも多く投与されるときに、アジュバント組成物は、免疫原性組成物の任意の後続の（すなわち、第２、第３、または第４の）投与の前または後ではなく、免疫原性組成物の第１の投与の前または後のみ投与されてもよい。さらに別の具体的実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物が投与されるよりも多くの回数で投与されてもよい。
【００３２】
他の実施形態では、アジュバント組成物は、免疫原性組成物よりも少なくとも１回多く投与されてもよい。例えば、アジュバントが固有の（または非特異的）免疫応答を含むことが可能である場合、アジュバント組成物は、固有の免疫応答を誘発または刺激するように、免疫原性組成物の投与前に十分な時間間隔で投与されてもよい。次いで、アジュバント組成物は、免疫原性組成物の第１の投与とともに、同時に（その同時投与は、異なる部位で、または異なる経路を介してもよい）または順次投与されてもよい。
【００３３】
アジュバント組成物および免疫原性組成物が順次投与されるときに、組成物のうちのそれぞれは、同一の経路を介して投与されてもよく、または異なる経路によって投与されてもよい。独立して選択され得る、アジュバントおよび免疫原性組成物のうちのそれぞれの送達のための投与経路は、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿体内、耳道内、または尿道内注射あるいは注入を含む、局所、経口、腸内、経鼻（すなわち、鼻腔内）、吸入、髄腔内、直腸内、膣内、眼内、結膜下、舌下、皮内、腫瘍内、結節内、経真皮、または非経口投与を含むが、それらに限定されない。ある実施形態では、第１および第２の経路は、異なり、それぞれ、非経口、経口、腸内、舌下、鼻腔内、筋肉内、皮内、腫瘍内、結節内、皮下、経皮、経真皮、および局所から選択される。
【００３４】
免疫原性組成物およびアジュバント組成物が同一の経路によって対象に投与されるときに、組成物のうちのそれぞれは、対象上の同一の部位で投与されてもよく、または対象上の異なる部位で投与されてもよい。他の具体的実施形態では、アジュバント組成物および免疫原性組成物が順次投与されるときに、各組成物は、同じ部位と見なされるように十分近接した部位であるが、異なる経路によって送達されてもよい。非限定的実施例として、免疫原性組成物が、対象の四肢（例えば、腕（三角筋）または脚（大腿筋））に筋肉内投与されてもよく、免疫原性組成物の投与の前または後に、アジュバント組成物が、対象の四肢（例えば、それぞれ、同一の腕（三角筋）または同一の脚（大腿筋））上の同一の部位で皮下投与される。第２の非限定的実施例として、アジュバント組成物が、対象の四肢（例えば、腕（三角筋）または脚（大腿筋））に筋肉内投与されてもよく、アジュバント組成物の投与の前または後に、免疫原性組成物が、対象の四肢（例えば、それぞれ、同一の腕（三角筋）または同一の脚（大腿筋））上の同一の部位で皮下投与される。
【００３５】
上記で論議されるように、投与の部位および経路の選択は、免疫を与えられる対象の年齢、健康状態、および／またはサイズ、組換え発現ベクターまたはベクターを含むベクター粒子、組換え発現ベクターによってコードされる免疫原、および／またはアジュバントを含むが、必ずしもそれらに限定されない要因に依存してもよい。免疫原性組成物の投与によって治療または予防される症状、疾患、または障害、および所望される免疫応答の種類が、免疫原性およびアジュバント組成物の治療的および／または予防的有益性を最大限化するための投与経路および投与部位を判定する際に、当業者によって考慮される付加的な要因であってもよい。
【００３６】
免疫付与プロトコルまたはレジメンの経過中に、免疫原に対する免疫応答のレベルが監視されてもよい。したがって、免疫原性組成物およびアジュバント組成物がそれぞれ対象に投与される回数は、免疫原性組成物の各投与後の免疫原に対する免疫応答のレベルを監視することによって判定されてもよい。免疫応答を監視するための技法および方法は、当技術分野で日常的に実践され、本明細書および当技術分野で説明されている。
免疫原および免疫原性組成物
【００３７】
本明細書で説明されるように、免疫原に対する免疫応答は、アジュバント組成物が、本明細書で詳細に説明される方法に従って宿主に投与されるときに強化される。これらの方法で使用されてもよい免疫原は、特異的免疫応答の誘発が所望される、任意の免疫原を含む。免疫原は、特に、本明細書で説明されるように、アジュバントとともに順次、または同時に投与されたときに、体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）または細胞媒介応答（細胞障害性Ｔ細胞応答を含む）あるいは両方を誘発することが可能である。
【００３８】
細胞媒介免疫応答は、細胞障害性Ｔリンパ球応答を含み、その応答は、免疫原を産生または発現する細胞（例えば、腫瘍細胞、細菌細胞、ウイルス、寄生虫、または真菌細胞）または感染粒子（例えば、ウイルス粒子）を破壊または損傷し得る。体液性応答または細胞媒介免疫応答あるいは両方が、免疫を持つ対象に有益である、疾患または障害と関連付けられる任意の抗原を、免疫原として使用することができる。特定の実施形態では、これらの免疫原は、組換え発現ベクターを含む、本明細書で説明されるベクター粒子を使用して、抗原提示細胞、具体的には樹状細胞に送達されてもよい。
【００３９】
多くの疾患および障害と関連付けられる抗原が、当技術分野で周知である。抗原は、疾患または障害と関連付けられることが以前から知られている場合がある、または当技術分野で公知である任意の方法によって識別されてもよい。例えば、腫瘍関連抗原等の、患者が罹患している癌の種類と関連付けられる抗原が、知られている場合がある、または当技術分野で公知である種々の方法のうちのいずれかによって腫瘍自体から識別されてもよい。ある実施形態では、免疫原は、癌細胞（すなわち、腫瘍細胞）に由来する腫瘍関連抗原（本明細書では腫瘍抗原とも呼ばれる）であり、１つ以上のそのような腫瘍抗原が、癌の免疫療法的治療に有用であり得る。非限定的実施例として、腫瘍関連抗原は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌、中皮腫、卵巣癌、または黒色腫に由来してもよい。これらおよび付加的な腫瘍関連抗原が、本明細書および当技術分野で説明される。
【００４０】
例示的な腫瘍または腫瘍細胞由来抗原は、ＭＡＧＥ  １、３、およびＭＡＧＥ  ４（または国際特許出願公開第ＷＯ９９／４０１８８号で開示されているもの等の他のＭＡＧＥ抗原）、ＰＲＡＭＥ、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  ＥＳＯ  １としても知られている）、ＳＡＧＥ、およびＨＡＧＥ（例えば、国際特許出願公開第ＷＯ  ９９／５３０６１号を参照）またはＧＡＧＥ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８：６２８−３６  （１９９６）；  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｌａｂ．  Ｒｅｓ．  ２７：８１−８６  （１９９７）；  Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ９：６４８−９３  （１９９７）；  Ｃｏｒｒｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．  ８９：  ２９３  （１９９７））を含む。腫瘍抗原のこれらの非限定的実施例は、黒色腫、肺癌、肉腫、および膀胱癌等の広範囲の腫瘍型で発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照されたい。前立腺癌の腫瘍関連抗原は、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性リン酸塩、ＮＫＸ３．１、および前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）（Ｈｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６  １４５２３−２８，  １９９９）を含む。また、Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１７３５−４０，  １９９８；  Ｎｅｌｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９６：３１１４−１９  （１９９９）；第ＷＯ  ９８／１２３０２号；米国特許第５，９５５，３０６号、第５，８４０，８７１号、および第５，７８６，１４８号；国際特許出願公開第ＷＯ  ９８／２０１１７号、第ＷＯ  ００／０４１４９号、第ＷＯ  ９８／１３７４１８号も参照されたい。
【００４１】
免疫原として有用な他の腫瘍関連抗原は、Ｐｌｕ−１（Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４：１５６３３−４５，  １９９９）、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ（Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  １９９，  ２１：６１−７０；米国特許第５，６５４，１４０号）およびＣｒｉｐｔｉｎ（米国特許第５，９８１，２１５号）を含む。加えて、腫瘍抗原は、多くの癌の治療で有用である、短い１０個のアミノ酸の長さのペプチドである、全長性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ、国際特許出願公開第ＷＯ  ９５／２０６００号）等の自己ペプチドホルモンであってもよい。
【００４２】
本明細書で説明されるような免疫原として有用であってもよく、したがって、任意の癌を治療するために有用となり得る、腫瘍抗原は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現等の腫瘍関連抗原発現によって特徴付けられる、癌に由来する腫瘍抗原を含む。免疫原として使用され得る、腫瘍関連抗原は、メラニン細胞・黒色腫系統抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ、およびチロシナーゼ関連タンパク質等の系統特異的腫瘍抗原を含む。例証的な腫瘍関連抗原は、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、およびＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋｓ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、β−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン調節因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、腫瘍関連カルシウムシグナル伝達物質１（ＴＡＣＳＴＤ１）ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特にＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃ族、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０族）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写のシグナル伝達物質および活性化因子ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−２α）、核因子−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）、Ｎｏｔｃｈ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１−４）、ｃ−Ｍｅｔ、ラパマイシンのほ乳類標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌−５Ｔ４、ＳＭ２２−アルファ、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られている）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソセリアン、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子のタンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ｆｏｓ関連抗原１、およびイディオタイプのうちのいずれか１つ以上に由来する、またはそれらを含む、腫瘍抗原を含むが、それらに限定されない。
【００４３】
免疫原はまた、テロメラーゼ酵素、スルビビン、メソテリン、突然変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ転位、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異または野生型ｐ５３、シトクロムＰ４５０  １Ｂ１、およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ等の異常発現イントロン配列等の、腫瘍細胞内で突然変異した遺伝子に、または正常細胞と比較して腫瘍細胞内で異なるレベルにおいて転写された遺伝子に由来する、エピトープ領域またはエピトープペプチドを含む、腫瘍抗原、骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫の中で独特のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性再構成、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７等の癌ウイルス過程に由来するエピトープ領域またはエピトープペプチドを含む腫瘍抗原、エプスタインバールウイルスタンパク質ＬＭＰ２、癌胎児性抗原およびアルファ−フェトプロテイン等の腫瘍選択的発現を伴う非変異癌胎児性タンパク質も含む。また、Ｂｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １２：３３７−６５  （１９９４）；  Ｒｅｎｋｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５０：３−１５  （２００１）も参照されたい。
【００４４】
免疫原は、病原微生物または日和見病原微生物から得られ、またはそれらに由来し、ウイルス、真菌、寄生虫、および細菌を含んでもよい。ある実施形態では、免疫原は、そのような微生物に由来する全長タンパク質を含む。他のある実施形態では、免疫原は、そのようなタンパク質からの１つ以上のエピトープを含有する、１つ以上の免疫原性断片を含む。なおも他の実施形態では、免疫原は、微生物に由来するタンパク質の１つ、２つ、またはそれ以上の疫原性断片を含む、融合ポリペプチドを含む。他の実施形態では、融合ポリペプチドは、特定の微生物に存在する２つ以上のタンパク質のうちのそれぞれに由来する、１つ以上の疫原性断片を含む、キメラポリペプチドであってもよい。融合タンパク質およびキメラタンパク質は、免疫原性ポリペプチドまたはペプチドに加えて、目的とする免疫原に対する免疫応答を強化する、免疫学では担体タンパク質と呼ばれることもある、少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドを含んでもよい。
【００４５】
その抗原が免疫原性組成物で使用するための免疫原として考慮され、本明細書で説明されるベクターおよびベクター粒子によってコードされる、例証的な病原体は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌種、および肺炎連鎖球菌を含む連鎖球菌種を含む。当業者によって理解されるように、本明細書で説明されるような免疫原として使用するためのこれらおよび他の病原微生物に由来するタンパク質は、当技術分野で公知であり、そのようなタンパク質（およびそれらの種）のアミノ酸配列およびタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、出版物で、ならびにＧＥＮＢＡＮＫ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、およびＴｒＥＭＢＬ等の公開データベースで識別されてもよい。
【００４６】
免疫原であってもよく、本明細書で説明されるように使用され得る、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原は、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、またはｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、およびｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のうちのいずれかを含む。ＨＩＶタンパク質およびその免疫原性断片は、当業者に周知であり、いくつかの公開データベースのうちのいずれかで見出され得る（例えば、Ｖｉｄｅｒ−Ｓｈａｌｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ  ２３（１１）：１３１１−１８  （２００９）；  Ｗａｔｋｉｎｓ，  Ｍｅｍ．  Ｉｎｓｔ．  Ｏｓｗａｌｄｏ  Ｃｒｕｚ．  １０３（２）：１１９−２９  （２００８）；  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （４  Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１６１−６８  （２００４））。（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：１２０２２−３２；  Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７６：９３−１０３  （２０００）；  Ｂｙｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：  ７３４９−５６  （１９９８）；  Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １３（５）：  ３８３−９２  （１９９７）；  Ｍｅｎｅｎｄｅｚ−Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１（４）：  １６７−１８１  （１９９８）も参照）。
【００４７】
本明細書で説明される組成物中で免疫原として使用するために考慮され、本明細書で説明されるベクターおよびベクター粒子によってコードされる、単純ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）に由来する抗原は、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質を含むが、それに限定されない。後期遺伝子群は、主に、ビリオン粒子を形成するタンパク質をコードする。そのようなタンパク質は、ウイルスカプシド：ＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８、および主要カプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５、およびＵＬ２７を形成する、（ＵＬ）からの５つのタンパク質を含み、そのそれぞれは、本明細書で説明されるような免疫原として使用されてもよい（例えば、ＭｃＧｅｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  １１７：９０−１０４  （２００６）；  Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ９：  ４２３−２９  （２００６）を参照）。本明細書で免疫原として使用するために考慮される、他の例証的なＨＳＶタンパク質は、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質を含む。ＨＳＶゲノムは、それぞれ、Ｔ細胞応答（ＣＴＬ応答を含む）、Ｂ細胞応答、またはＣＴＬ応答およびＢ細胞応答の両方を誘発するために免疫原として潜在的に使用することができるタンパク質をコードする、少なくとも７４個の遺伝子を含む。
【００４８】
本免疫原性組成物のある実施形態で使用するために考慮される、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に由来する抗原は、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の前初期および初期段階中に発現されるウイルス抗原、糖タンパク質ＩおよびＩＩＩ、カプシドタンパク質、外殻タンパク質、低基質タンパク質ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１、およびＩＥ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８−ＵＬ１５０からの遺伝子クラスタからのタンパク質生成物（Ｒｙｋｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ２００６  Ｊａｎ；８０（２）：７１０−２２）、エンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮ、およびｐｐ１５０を含む。当業者によって理解されるように、本明細書で説明される免疫原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、およびＴｒＥＭＢＬ等の公開データベースで識別されてもよい（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ７１  （２）：  ８６−９３  （Ｍａｒｃｈ  ２００４）  ＰＭＩＤ  １５０２９４００；  Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｎ．  Ｍｅｄ．  ２６７（５）：４８３−５０１  （２０１０）；  Ｍａｒｓｃｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４：７３１−４２  （２００９）を参照）。
【００４９】
ある実施形態で使用するために考慮される、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）に由来する抗原は、ＥＢＶ溶解タンパク質ｇｐ３５０およびｇｐ１１０、エプスタインバール核抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃを含む、潜在サイクル感染中に産生されるＥＢＶタンパク質、ＥＢＮＡ−リーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）、および潜在膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２Ａ、およびＬＭＰ−２Ｂを含む（例えば、Ｌｏｃｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｏｎｔ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：５９１６−２７  （２００８）を参照）。本明細書で説明される免疫原として使用するために考慮される、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に由来する抗原は、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１個のタンパク質のうちのいずれか、またはその免疫原性断片：ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（基質タンパク質）ＳＨ、Ｇ、およびＦ（ウイルス外殻タンパク質）、Ｍ２（第２の基質タンパク質）、Ｍ２−１（伸長因子）、Ｍ２−２（転写調節）、ＲＮＡポリメラーゼ、およびリンタンパク質Ｐを含む。
【００５０】
免疫原として使用するために考慮される、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）に由来する抗原は、ＶＳＶゲノムによってコードされる５つの主要タンパク質のうちのいずれか１つ、およびその免疫原性断片：大型タンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、ヌクレオタンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）、および基質タンパク質（Ｍ）を含む（例えば、Ｒｉｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  （２００９）  （９）：４９９−５０９；  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  （１９９９）  ５３：３０１−１９を参照）。
【００５１】
ある実施形態で使用するために考慮される、インフルエンザウイルスに由来する抗原は、血球凝集素（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ヌクレオタンパク質（ＮＰ）、基質タンパク質Ｍ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２、およびＰＢ２を含む。例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ４３７  （７０６２）：  １１６２−６６を参照されたい。
【００５２】
ウイルス抗原である免疫原の実施例はまた、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（Ｂ型肝炎コアまたは表面抗原、Ｃ型肝炎ウイルスＥ１またはＥ２糖タンパク質、コア、または非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（本明細書で論議されるような、単純ヘルペスウイルスまたは水疱瘡ウイルス糖タンパク質を含む）、感染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、血球凝集素およびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチド、およびロタウイルスポリペプチドを含むが、それらに限定されない。
【００５３】
ある実施形態では、免疫応答を誘発するための免疫原として有用となり得る、細菌抗原は、細菌の外側細胞表面上で暴露されたポリペプチドの一部分または複数部分を有する、抗原を含む。細胞表面上で暴露されたポリペプチド免疫原の部分は、宿主の中の免疫細胞および／または抗体にアクセス可能であり、したがって、本明細書で説明される組換え発現ベクターによってコードされる有用な免疫原であってもよい。
【００５４】
免疫原として使用するために考慮される、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含むブドウ球菌種に由来する抗原は、Ａｇｒ系、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌ系、Ｓａｒ相同体（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺ、およびＴｃａＲ）、Ｓｒｒ系、およびＴＲＡＰ等の毒性調節因子を含む。免疫原としての機能を果たし得る、他のブドウ球菌タンパク質は、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコニターゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡ、およびＣｆｖＢを含む（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２００８  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｅｄ．  Ｊｏｄｉ  Ｌｉｎｄｓａｙを参照）。２種の黄色ブドウ球菌（Ｎ３１５およびＭｕ５０）に対するゲノムが配列決定されており、例えば、ＰＡＴＲＩＣ（ＰＡＴＲＩＣ：  Ｔｈｅ  ＶＢＩ  ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓｎｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  （２００７）  ３５  （Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）  ４０１−４０６．  ＰＭＩＤ：  １７１４２２３５）において、公的に入手可能である。当業者によって理解されるように、免疫原として使用するためのブドウ球菌タンパク質はまた、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、およびＴｒＥＭＢＬ等の他の公開データベースで識別されてもよい。
【００５５】
本明細書で説明される、ある実施形態で免疫原として使用するために考慮される、肺炎連鎖球菌に由来する抗原は、肺炎球菌溶血素、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、およびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ、ＲｒｇＢ、ＲｒｇＣ）を含む。肺炎連鎖球菌の免疫原性タンパク質もまた、当技術分野で公知であり、免疫原として使用するために考慮される（例えば、Ｚｙｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ２０００  ６８（６）：３７４０−４３を参照）。肺炎連鎖球菌の毒性株の完全ゲノム配列が、配列決定されており（例えば、Ｔｅｔｔｅｌｉｎ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  （２００１）  ２９３（５５２９）：４９８−５０６を参照）、当業者によって理解されるように、本明細書で説明される組成物中で使用するための肺炎連鎖球菌タンパク質はまた、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、およびＴｒＥＭＢＬ等の他の公開データベースで識別されてもよい。本開示による免疫原に対する、特に目的とするタンパク質は、肺炎球菌の表面において暴露されることが予測される、毒性因子およびタンパク質を含む（例えば、上記のＴｅｔｔｅｌｉｎ  Ｈ．，  ｅｔ  ａｌ．；  Ｆｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＭＣ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  （２０１０）  Ｊｕｌ  １２；１０：１９０；  Ｒｉｇｄｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  （２００３）  ３８（２）：１４３−６８；  Ｊｅｄｒｚｅｊａｓ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  （２００１）  ６５（２）：１８７−２０７を参照）。
【００５６】
免疫原として使用され得る、細菌抗原の実施例は、アクチノマイセスポリペプチド、バシラスポリペプチド、バクテロイデスポリペプチド、ボルデテラポリペプチド、バルトネラポリペプチド、ボレリアポリペプチド（例えば、ライム病ボレリアＯｓｐＡ）、ブルセラポリペプチド、カンピロバクターポリペプチド、カプノシトファガポリペプチド、クラミジアポリペプチド、コリネバクテリウムポリペプチド、コクシエラポリペプチド、デルマトフィルスポリペプチド、腸球菌ポリペプチド、エールリヒアポリペプチド、大腸菌ポリペプチド、フランシセラポリペプチド、フゾバクテリウムポリペプチド、ヘモバルトネラポリペプチド、ヘモフィルスポリペプチド（例えば、ｂ型インフルエンザ菌外膜タンパク質）、ヘリコバクターポリペプチド、クレブシエラポリペプチド、Ｌ型菌ポリペプチド、レプトスピラポリペプチド、リステリアポリペプチド、マイコバクテリウムポリペプチド、マイコプラズマポリペプチド、ナイセリアポリペプチド、ネオリケッチアポリペプチド、ノカルジアポリペプチド、パスツレラポリペプチド、ペプトコッカスポリペプチド、ペプトストレプトコッカスポリペプチド、肺炎球菌ポリペプチド（すなわち、肺炎連鎖球菌ポリペプチド）（本明細書の説明を参照）、プロテウスポリペプチド、シュードモナスポリペプチド、リケッチアポリペプチド、ロシャリメアポリペプチド、サルモネラポリペプチド、赤痢菌ポリペプチド、ブドウ球菌ポリペプチド、Ａ群溶連菌ポリペプチド（例えば、可能連鎖球菌Ｍタンパク質）、Ｂ群溶連菌（ストレプトコッカス・アガラクチア）ポリペプチド、トレポネーマポリペプチド、およびエルシニアポリペプチド（例えば、ペスト菌Ｆ１およびＶ抗原）を含むが、それらに限定されない。
【００５７】
免疫原となり得る、真菌抗原の実施例は、アブシディアポリペプチド、アクレモニウムポリペプチド、アルテルナリアポリペプチド、アスペルギルスポリペプチド、バシディオボールスポリペプチド、ビポラリスポリペプチド、ブラストミセスポリペプチド、カンジダポリペプチド、コクシジオイデスポリペプチド、コニディオボルスポリペプチド、クリプトコッカスポリペプチド、カーブラリアポリペプチド、表皮菌ポリペプチド、エクソフィアラポリペプチド、ゲオトリクムポリペプチド、ヒストプラズマポリペプチド、マズレラポリペプチド、マラセジアポリペプチド、小胞子菌ポリペプチド、モニリエラポリペプチド、モルティエラポリペプチド、ケカビポリペプチド、ペシロミセスポリペプチド、ペニシリウムポリペプチド、フィアレモニウムポリペプチド、フィアロフォラポリペプチド、プロトセカポリペプチド、シュードアレシェリアポリペプチド、シュードミクロドキウムポリペプチド、ピシウムポリペプチド、リノスポリジウムポリペプチド、リゾプスポリペプチド、スコレコバシディウムポリペプチド、スポロトリクスポリペプチド、ステムフィリウムポリペプチド、トリコフィトンポリペプチド、トリコスポロンポリペプチド、およびキシロハイファポリペプチドを含むが、それらに限定されない。
【００５８】
寄生原生動物抗原の実施例は、バベシアポリペプチド、バランチジウムポリペプチド、ベスノイチアポリペプチド、クリプトスポリジウムポリペプチド、エイメリアポリペプチド、エンセファリトゾーンポリペプチド、エントアメーバポリペプチド、ジアルジアポリペプチド、ハモンディアポリペプチド、ヘパトゾーンポリペプチド、イソスポラポリペプチド、リーシュマニアポリペプチド、ミクロスポリジアポリペプチド、ネオスポラポリペプチド、ノゼマポリペプチド、ペンタトリコモナスポリペプチド、プラスモジウムポリペプチドを含むが、それらに限定されない。蠕虫抗原の実施形態は、アカントケイロネマポリペプチド、アエルロストロンギルスポリペプチド、アンシロストーマポリペプチド、アンギオストロンギルスポリペプチド、アスカリスポリペプチド、ブルギアポリペプチド、ブノストムームポリペプチド、キャピラリアポリペプチド、チャベルチアポリペプチド、クーペリアポリペプチド、クレノソーマポリペプチド、ジクチオカウルスポリペプチド、ジオクトフィーマポリペプチド、ジペタロネーマポリペプチド、裂頭条虫ポリペプチド、ジピリジウムポリペプチド、ディロフィラリアポリペプチド、ドラクンクルスポリペプチド、エンテロビウスポリペプチド、フィラロイデスポリペプチド、ヘモンクスポリペプチド、ラゴキラスカリスポリペプチド、ロア糸状虫ポリペプチド、マンソネラポリペプチド、ムエレリウスポリペプチド、ナノフィエツスポリペプチド、鉤虫ポリペプチド、ネマトジルスポリペプチド、腸結節虫ポリペプチド、オンコセルカポリペプチド、オピストルキスポリペプチド、オステルタギアポリペプチド、パラフィラリアポリペプチド、パラゴニムスポリペプチド、パラスカリスポリペプチド、フィサロプテラ属ポリペプチド、プロトストロンギルスポリペプチド、セタリアポリペプチド、スピロセルカポリペプチド、スピロメトラポリペプチド、ステファノフィラリアポリペプチド、ストロンギロイデスポリペプチド、ストロンギルスポリペプチド、テラジアポリペプチド、トキサスカリスポリペプチド、トキソカラポリペプチド、トリキネラポリペプチド、トリコストロンギルスポリペプチド、トリチュリスポリペプチド、ウンシナリアポリペプチド、およびウケレリアポリペプチド（例えば、熱帯熱マラリア原虫スポロゾイト周囲（ＰｆＣＳＰ）、スポロゾイト表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシル末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）、およびエクスポートされたタンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）、ニューモシスチスポリペプチド、サルコシスチスポリペプチド、住血吸虫ポリペプチド、タイレリアポリペプチド、トキソプラズマポリペプチド、およびトリパノソーマポリペプチドを含むが、それらに限定されない。
【００５９】
外部寄生虫抗原の実施例は、ノミ、カタダニおよび軟ダニ等を含むダニ、ユスリカ、蚊、サシチョウバエ、クロバエ、ウシアブ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエウジ病を引き起こすハエ、およびブヨ等のハエ、アリ、クモ、シラミ、イエダニ、ならびにトコジラミおよびオオサシガメ等の半翅類の昆虫からのポリペプチド（防御抗原ならびにアレルゲンを含む）を含むが、それらに限定されない。
【００６０】
体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）または細胞媒介応答（細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を含む）のいずれか一方、あるいは両方を含む、免疫応答の誘導はまた、緑膿菌、ヒト型結核菌、ハンセン菌、およびリステリアイノキュラ等の付加的な生物の貧食または死滅に寄与し得る。ＣＴＬ免疫応答は、緑膿菌、ヒト型結核菌、ハンセン菌、およびリステリアイノキュラの死滅に寄与する（例えば、２０１０年６月２３日にオンライン公開されたＯｙｋｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０：２４９４８２）を参照）。したがって、本明細書で説明される免疫原性組成物に有用であり、組換え発現ベクターおよびベクターを含むベクター粒子によってコードされ得る、免疫原もまた、これらの細菌に由来してもよい。細菌種のうちのいずれか１つの細菌ゲノムによってコードされ、細菌によって発現される、多数のポリペプチドのアミノ酸配列は、当技術分野および公的に利用可能なタンパク質配列データベースで容易に識別することができる（例えば、Ｓｔｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：９５９  （２０００）も参照）。
【００６１】
本明細書で説明されるような免疫原は、真菌または寄生虫から得られ、またはそれらに由来してもよい。ＣＴＬ免疫応答を含む免疫応答を誘発する、例示的な寄生虫は、マンソン住血吸虫、赤痢アメーバ、トキソプラズマ原虫、および熱帯熱マラリア原虫を含む（例えば、上記のＯｙｋｈｍａｎを参照）。したがって、これらの寄生虫に由来する、またはこれらから得られるタンパク質抗原は、それぞれの寄生虫に対する免疫応答を誘発するために、免疫原として有用であり得る。免疫原はまた、クリプトコックス・ネオフォルマンスおよびカンジダ・アルビカンスを制限なく含む、真菌の種から得られ、またはそれらに由来してもよい（例えば、上記のＯｙｋｈｍａｎを参照）。
【００６２】
免疫原性ポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性断片を含むポリペプチド（例えば、本明細書および／または当技術分野で説明される腫瘍関連抗原および微生物抗原のうちのいずれか）が、免疫原として使用され、本明細書で説明される組換え発現ベクターによってコードされてもよい。免疫原性断片は、少なくとも１つのＴ細胞エピトープまたは少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。免疫原性断片は、免疫原性ポリペプチドの少なくとも１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上の隣接アミノ酸から成ってもよい。免疫原性断片は、線形エピトープを形成する十分な数の隣接アミノ酸を含んでもよく、および／または断片が由来する全長ポリペプチドと同一の（または十分同様の）３次元配座で、断片が折り重なること、および１つまたは複数の非線形エピトープ（当技術分野では配座エピトープとも呼ばれる）を提示することを可能にする、十分な数の隣接アミノ酸を含んでもよい。結合する能力および全長ポリペプチドに特異的に結合する抗体の結合のレベルが、断片に対して、全長ポリペプチドに対するのと実質的に同一であるときに、ポリペプチド断片の３次元配座は、全長ポリペプチドと十分に類似する。
【００６３】
免疫原性断片が全長ポリペプチドと同程度の配座に折り重なるかどうかを評価するための分析は、例えば、天然または折り畳まれていないエピトープに特異的であるモノまたはポリクローナル抗体と反応するタンパク質の能力、他のリガンド結合機能の保持、およびプロテアーゼによる消化に対するポリペプチド断片の感受性または耐性を含む（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  （２００１）を参照）。エピトープ領域を識別するための付加的な方法は、Ｈｏｆｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２９：２７０−２８１  （２００３）；  Ｍａｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５５：２７−４０  （２００１）で説明されている方法を含む。エピトープを識別するための分析は、本明細書で説明され、当業者に公知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ），  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ  （１９９１）で説明されているものを含む。
【００６４】
免疫原性領域および／または目的とする免疫原のエピトープの識別は、当業者によって実験的に、または当業者によって日常的に実践されている方法および技法を使用して、コンピュータ分析およびコンピュータモデリングによって、容易に判定することができる。実験的方法は、一例として、タンパク質の特定の長さの隣接アミノ酸を含む、ポリペプチド断片を合成すること、または１つ以上のプロテアーゼの使用によって断片を生成し、次いで、当技術分野で日常的に実践されている多数の結合分析または免疫測定方法のうちのいずれか１つを使用して、断片の免疫原性を判定することを含む。断片に特異的に結合する抗体（ポリクローナル、モノクローナル、またはその抗原結合断片）の能力を判定するための例示的な方法は、ＥＬＩＳＡ、放射免疫測定、免疫ブロット、競合タンパク結合測定、蛍光活性化細胞選別装置分析（ＦＡＣＳ）、および表面プラズモン共鳴を含むが、それらに限定されない。
【００６５】
目的とするポリペプチドまたはその免疫原性断片の３次元構造の判定は、免疫原性断片が、全長ポリペプチドで見出されるようなアミノ酸の空間的位置付けを保持するかどうかを判定する日常的な方法によって行われてもよい。例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：  １８６８−１８７１  （２００５）；  Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８  （２００５）；  Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０３：１２４４  （２００６）；  Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６  （２００７）；  Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９  （２００７）を参照されたい。また、当技術分野では、細胞膜を横断することが知られている、または考えられる、ポリペプチドの膜貫通区分および膜トポロジーを予測するために有用である、ソフトウェアツール、例えば、ＰＳＯＲＴまたはＰＳＯＲＴ  ＩＩ、およびＳｐｓｃａｎ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）も利用可能である（例えば、Ｎａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２４：３４−３６  （１９９９）を参照）。
【００６６】
別々に、または上記の技法と組み合わせて、目的とするポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を考慮して、当業者であれば、ポリペプチドの潜在的エピトープを識別することができる（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ４：１８１−８６（１９８８）を参照）。別の実施例として、ＨｏｐｐおよびＷｏｏｄｓは、ポリペプチド領域の親水性およびそれらの抗原性との間の密接な相関の実験的実証に基づく、親水性方法を説明している（例えば、Ｈｏｐｐ，  Ｐｅｐｔ．  Ｒｅｓ．  ６：１８３−９０  （１９９３）；  Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  ４６：８５５−６６  （１９８７）を参照）。コンピュータプログラムもまた、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープを識別するために利用可能である。ＥＰＩＰＬＯＴと呼ばれるＢＡＳＩＣプログラムが、１３の異なるスケールを使用して、融通性、親水性、および抗原性プロファイルを計算して描画することによって、それらの一次構造からタンパク質中のＢ細胞抗原部位を予測する（例えば、Ｍｅｎｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ６：１０１−１０５  （１９９０）を参照）。また、Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ９：  ４６５−４７２  （１９９６）；  Ｐｅｌｌｅｑｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｐｉｔｏｐｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”  Ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （ｅｄ．  Ｇ．Ｂ．  Ｗｉｓｄｏｍ），  ｐｐ．  ７−２５；  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ  （１９９４）；  Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ，  “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｔｉｇｅｎｓ”  Ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  （ｅｄ．  Ｍ．Ｈ．Ｖ．  Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ），  Ｖｏｌ．  １，  ｐｐ．  １−２７．  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ  （１９９２）等も参照されたい。
【００６７】
免疫原のＴ細胞エピトープはまた、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５０：  ２１３−２１９  （１９９９））によって、Ｐａｒｋｅｒら（上記参照）によって開発されたアルゴリズムに基づく、ペプチドモチーフ検索プログラムを使用して、またはＤｏｙｔｃｈｉｎｏｖａ  ａｎｄ  Ｆｌｏｗｅｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ８０（３）：２７０−９  （２００２）；  Ｂｌｙｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８：４３４−４３９  （２００２）；  Ｇｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２：６３−６６  （２００３）；  Ｆｌｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １：１６７−１７６  （２００２）；  Ｍａｌｌｉｏｓ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：  ９４２−４８  （２００１）；  Ｓｃｈｉｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．  ２５７：１−１６  （２００１）によって説明されるもの等の方法を使用することによって、識別されてもよい。
【００６８】
本明細書で説明される方法で免疫原として使用され得る、微生物および抗原および腫瘍抗原のエピトープ領域もまた、本明細書で説明される。一例として、Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｖ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  Ｍａｒ  −  Ａｐｒ：  Ｓｕｐｐｌ  ２：ｓ４４３  −  ４４７  （１９８９）；  Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ６：１２４５−４９  （１９８７）；  Ｌａｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｅｐｒ．  Ｒｅｖ．  Ｓｕｐｐｌ  ２：１３１−１３７  （１９８６）；  Ｍｅｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：７０１３  −２７  （１９８６）；  Ｈｏｒｓｆａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ  １２：２１１−１３  （１９９１）；  Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５５：１４３−５２  （１９９０）；  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７：１２３６−３７  （２００１）；  ＤｅＧｒｏｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：４３８５−９５  （２００１）；  ＤｅＬａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３：１７２５−２９  （１９９９）；  Ｃｏｃｈｌｏｖｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５：４７３１−  ４１  （２０００）；  Ｃｏｎｓｏｇｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０３９−４４  （２００３）；  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒ．  １２：５９３−６１０  （１９９６）；  Ｋｗｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２：５８３−８８  （２００１）；  Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６６：６６６５−７０  （２００１）を参照されたい。
【００６９】
抗原特異的Ｔ細胞株またはクローン、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、ウイルス特異的または細菌特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が利用可能である、ある場合において、これらの細胞は、特異的抗原を用いて調製された標的細胞を使用して、関連エピトープの存在を探るために使用されてもよい。そのような標的は、ＣＴＬによる溶解のための標的細胞を感作するために使用されるであろう、ランダムまたは選択された合成ペプチドライブラリを使用して調製することができる。Ｔ細胞株またはクローンが利用可能であるときに関連エピトープを識別することの別のアプローチは、組換えＤＮＡ方法を使用することである。ＣＴＬ感受性標的からの遺伝子またはｃＤＮＡライブラリが最初に調製され、非感受性標的細胞に形質移入される。これは、ＣＴＬエピトープを含有するペプチドのタンパク質前駆体をコードする、遺伝子の識別およびクローン作成を可能にする。この過程での第２のステップは、少なくとも１つのＣＴＬエピトープをコードする領域を絞り込むために、関連クローン遺伝子から切断遺伝子を調製することである。このステップは、遺伝子が大きすぎない場合には随意的である。第３のステップは、ＣＴＬのための標的を感作するために使用される、５〜１０個の残基で重複する、例えば、長さが約１０〜２０個のアミノ酸の合成ペプチドを調製することである。１つまたは複数のペプチドが関連エピトープを含有することが示されるときに、所望であれば、エピトープを含有する最小限のサイズのペプチドを確立するように、より小さいペプチドを調製することができる。これらのエピトープは、必ずしもではないが、典型的には、ＣＴＬエピトープについては９〜１０個の残基、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープについては最大２０または３０個の残基内に含有される。
【００７０】
代替として、エピトープは、溶出ペプチドのアミノ酸配列決定が後に続く、特定の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子によって非共有結合される、ペプチドの直接溶出によって定義することができる（例えば、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．  ２０００  Ｍａｙ；６  Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ２７２−８０を参照）。簡潔に言えば、溶出ペプチドが、ＨＰＬＣ等の精製方法を使用して分離され、個々の分画が、ＣＴＬ溶解のための標的を感作する、またはＨＴＬにおけるサイトカイン分泌の増殖を誘発する能力について試験される。分画がペプチドを含有するものとして識別されたときに、それはさらに精製され、配列分析に提出される。ペプチド配列はまた、タンデム質量分析を使用して判定することもできる。次いで、合成ペプチドが調製され、正しい配列およびペプチドが識別されていることを確証するように、ＣＴＬまたはＨＴＬで試験される。
【００７１】
エピトープはまた、Ｔｈ応答を引き起こす可能性を有するペプチドモチーフを検索する、Ｔ部位プログラム（例えば、Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ７：９３−１００，  １９８８；  Ｄｅａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３：１４５−１５５，  １９９６を参照）等のコンピュータ分析を使用して識別されてもよい。マウスまたはヒトクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣに結合するために適切なモチーフを伴うＣＴＬペプチドは、ＢＩＭＡＳ（Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５２：１６３，  １９９４）および他のＨＬＡペプチド結合予測分析に従って識別されてもよい。簡潔に言えば、例えば、微生物構成要素または抗原、あるいは腫瘍細胞構成要素または腫瘍抗原からのタンパク質配列が、ＭＨＣ結合モチーフの存在について調べられる。各ＭＨＣ対立遺伝子に対して存在する、これらの結合モチーフは、典型的には、９〜１０個の残基の長さである、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドに対する、通常は、位置２（または３）および９（または１０）にある、保存アミノ酸残基である。次いで、ＭＨＣ結合モチーフを持つ配列を含む、合成ペプチドが調製され、後に、そのようなペプチドは、ＭＨＣ分子に結合する能力について試験される。ＭＨＣ結合分析は、多数の空（非占有）ＭＨＣ分子を発現する細胞を使用して（細胞結合分析）、または精製ＭＨＣ分子を使用してのいずれかで、実行することができる。最後に、次いで、ＭＨＣ結合ペプチドが、ヒトリンパ球を使用して生体外で、またはＨＬＡトランスジェニック動物を使用して生体内のいずれかでで、未投与個体においてＣＴＬ応答を誘発する能力について試験される。これらのＣＴＬは、ペプチド感作標的細胞、およびウイルス感染細胞または腫瘍細胞等の抗原を自然に処理する標的を使用して試験される。免疫原性をさらに確認するために、ＨＬＡ  Ａ２トランスジェニックマウスモデルおよび／または種々の生体外刺激分析のうちのいずれかを使用して、ペプチドが試験されてもよい。
【００７２】
ある実施形態では、免疫原（すなわち、腫瘍関連抗原または感染症微生物からの抗原）は、当技術分野で公知であり、それぞれの免疫原に利用可能である、アミノ酸配列内で１つ以上のアミノ酸置換、挿入、または欠失を有する、ポリペプチド種を含む。アミノ酸の同類置換が周知であり、ポリペプチドで自然発生してもよく、またはポリペプチドが組換えによって産生されるときに導入されてもよい。アミノ酸置換、欠失、および追加は、周知で日常的に実践されている突然変異生成方法を使用して、ポリペプチドに導入されてもよい（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ３ｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ  ２００１）を参照）。所望される置換、欠失、または挿入に従って改変された特定のコドンを有する、改変ポリヌクレオチドを提供するために、オリゴヌクレオチド指向部位特異的（または区分特異的）突然変異生成手技が採用されてもよい。免疫原の欠失または切断変異体もまた、所望の欠失に隣接する便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を使用することによって構築されてもよい。制限後に、突出部が充填されてもよく、ＤＮＡが再結紮されてもよい。代替として、アラニンスキャニング突然変異生成、エラーが発生しやすいポリメラーゼ連鎖反応突然変異生成、およびオリゴヌクレオチド指向突然変異生成等のランダム突然変異生成技法が、免疫原ポリペプチド変異体を調製するために使用されてもよい（例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。特定の免疫原（またはそのポリペプチド断片）の変異体は、当技術分野で公知である例示的なアミノ酸配列のうちのいずれかに対して少なくとも８５％、９０％、９５％、または９９％アミノ酸配列識別を有する、ポリペプチド免疫原を含む。
【００７３】
これらのポリペプチド免疫原変異体は、それぞれの免疫原の１つ以上の生物学的活性または機能を保持する。具体的には、免疫原の変異体は、対象における免疫応答（例えば、体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）、細胞媒介応答（すなわち、Ｔ細胞応答（細胞障害性Ｔリンパ球応答を含む））または体液性および細胞媒介応答の両方を誘発する能力を、統計的、臨床的、または生物学的に有意に保持する。多くの分子生物学を考慮して、ポリペプチドにおいて突然変異を誘発し、ポリペプチド断片を調製し、断片および変異体を単離し、所望の生物学的活性を有する同一の免疫原ポリペプチド変異体および断片を分析するために、当技術分野で日常的に実践されている、タンパク質発現、ならびにタンパク質単離技法および方法を、必要以上の実験なしで容易に作製することができる。
【００７４】
当業者に公知である種々の基準は、ペプチドまたはポリペプチド内の特定の位置で置換されるアミノ酸が保守的（または同様）であるかどうかを示す。例えば、同様のアミノ酸または保存アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基と交換されるものである。同様のアミノ酸は、塩基性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、不変極性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、ヒスチジン）、非極性側鎖を伴うアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖を伴うアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を伴うアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン）といった、カテゴリに含まれてもよい。分類することがより困難と見なされるプロリンが、脂肪族側鎖を伴うアミノ酸（例えば、ロイシン、バリン、イソロイシン、およびアラニン）と性質を共有する。ある状況では、グルタミンおよびアスパラギンが、それぞれ、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミド誘導体であるという点で、グルタミン酸に対するグルタミンまたはアスパラギン酸に対するアスパラギンの置換は、同様の置換と見なされてもよい。当技術分野で理解されるように、２つのポリペプチドの間の「類似性」は、ポリペプチドのアミノ酸配列およびそれに対する保存アミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって（例えば、ＧＥＮＥＷＯＲＫＳ、Ａｌｉｇｎ、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、または本明細書で説明され、当技術分野で実践される他のアルゴリズムを使用して）判定される。
【００７５】
免疫原性断片について本明細書で説明されるように、それぞれの変異体が、非変異ポリペプチドまたはその断片と同程度の配座に折り重なるかどうかを評価するための分析は、例えば、天然または折り畳まれていないエピトープに特異的であるモノまたはポリクローナル抗体と反応するタンパク質の能力、リガンド結合機能の保持、プロテアーゼによる消化に対する変異タンパク質の感受性または耐性を含む（上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。そのような変異体は、本明細書で説明される方法、または当業者によって日常的に実践されている、当技術分野で公知である他の方法に従って、識別し、特徴付け、および／または作製することができる。
【００７６】
本明細書で説明される方法に従って対象に投与される免疫原性組成物は、少なくとも１つの薬学的に（または生理学的に）好適な賦形剤を含んでもよい。医薬組成物で使用するために当業者に公知である、任意の生理学的または薬学的に好適な賦形剤または担体（すなわち、活性成分の活性に干渉しない非毒性物質）が、本明細書で説明される免疫原性組成物で採用されてもよい。例示的な賦形剤は、タンパク質の安定性および完全性を維持する、希釈剤および担体を含む。治療的使用のための賦形剤が周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ｇｅｎｎａｒｏ，  ２１ｓｔ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  （２００５））で説明され、本明細書でさらに詳細に説明される。
アジュバントおよびアジュバント組成物
【００７７】
本明細書で説明される方法は、免疫原に対する免疫応答を強化する（または向上させる、増強する）（すなわち、アジュバントの投与がない場合の特異的免疫応答のレベルと比較して、統計的、生物学的、または臨床的に有意に、免疫原に対する特異的免疫応答のレベルを増加させる）ことを目的としている、少なくとも１つのアジュバントを対象に投与することを含む。免疫応答のレベルを判定するための方法および技法が、本明細書でさらに詳細に論議され、当技術分野で日常的に実践されている。
【００７８】
本明細書で説明される方法で使用され得る、例示的なアジュバントは、以下を含むが、必ずしもそれに限定されない。本明細書で説明される方法で使用され得るアジュバントは、免疫原に対する（または免疫原含有細胞または粒子に対する）ＣＴＬ応答を強化する、および／または記憶ＣＤ４Ｔ細胞応答を強化するために有用となり得るアジュバントを含む。所望のアジュバントは、応答の定性的形態に悪影響を及ぼす場合がある、免疫原の立体構造変化を引き起こすことなく、免疫原に対する応答を増強する。好適なアジュバントは、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム）等のアルミニウム塩、または他のアルミニウム含有アジュバント、非限定的実施例として非毒性モノホスホリル脂質Ａ等の非毒性脂質Ａ関連アジュバント（例えば、Ｔｏｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．  ６：９９−１０７  （１９８７）を参照）、本明細書で説明されるＧＬＡ、３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）（例えば、英国特許出願第ＧＢ  ２２２０２１１号を参照）、トリテルペングリコシドまたは南米で見られるキラヤサポナリアモリナの木の樹皮から単離されたサポニンを含む、ＱＳ２１およびＱｕｉｌＡ等のアジュバント（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ｅｄｓ．  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  １９９５）の中のＫｅｎｓｉｌ  ｅｔ  ａｌ．；米国特許第５，０５７，５４０号を参照）を含む。他の好適なアジュバントは、随意に、モノホスホリル脂質Ａ等の免疫刺激剤と組み合わせて、水中油型エマルジョン（スクアレンまたはピーナッツ油）を含む（例えば、Ｓｔｏｕｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３３６，  ８６−９１  （１９９７）を参照）。別の好適なアジュバントは、ＣｐＧである（Ｂｉｏｗｏｒｌｄ  Ｔｏｄａｙ，  Ｎｏｖ．  １５，  １９９８）。他の好適なアジュバントは、トール様受容体作動薬、およびアミノ−アキルグルコサミニド４−リン酸塩（ＡＧＰ）等の脂質Ａ模倣剤（例えば、Ｂａｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ４（７）：１１２９−１１３８  （２００４）で説明されるＲＣ５２７、およびＰｅｒｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  １０（１０）  （ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ３２−Ｓ３７  （２００２）で説明されるＲＣ−５４４）を含む。
【００７９】
本明細書で説明されるように、好適なアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム等のアルミニウム塩である。そのようなアジュバントは、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ２１、ポリグルタミン酸またはポリリシン等の高分子または単量体アミノ酸等の、他の特異的免疫促進物質を伴って、または伴わずに使用することができる。別の部類の好適なアジュバントは、水中油型エマルジョン製剤（本明細書では安定した水中油型エマルジョンとも呼ばれる）である。そのようなアジュバントは、随意に、ムラミルペプチド（例えば、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−イソグル−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトキシプロピルアミド（ＤＴＰ−ＤＰＰ）ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））、または他の細菌細胞壁構成要素等の、他の特異的免疫促進物質とともに使用することができる。水中油型エマルジョンは、（１）Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルダイザ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  Ｎｅｗｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）等のマイクロフルダイザを使用して、サブミクロン粒子に製剤化された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０、および０．５％Ｓｐａｎ  ８５（随意に種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有する）を含有するＭＦ５９（第ＷＯ  ９０／１４８３７号）、（２）サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化された、またはより大きい粒径のエマルジョンを生成するようにボルテックスされた、１０％スクアラン、０．４％Ｔｗｅｅｎ  ８０、５％プルロニックブロックポリマーＬ１２１のいずれか、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、および（３）２％スクアレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ  ８０、およびモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ）から成る群からの１つ以上の細菌細胞壁構成要素、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ（商標））を含有する、Ｒｉｂｉアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ＭＴ）を含む。また、上記で説明されるように、好適なアジュバントは、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，  Ｍａｓｓ．）等のサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（免疫促進複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ等のそれから生成される粒子を含む。他のアジュバントは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）（ヒトで使用するためではなく、ヒト以外に使用するために好適である）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）を含む。他のアジュバントは、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）等のサイトカインを含む。
【００８０】
本明細書で説明される組成物で使用され得る、別のアジュバントは、化学式（Ｉ）によって識別され、グルコピラノシル脂質Ａ（ＧＬＡ）と呼ばれる。
【化１】
2014510721.tif 000002
【００８１】
式中、部分Ａ１およびＡ２は、水素、リン酸、およびリン酸塩の群から独立して選択される。ナトリウムおよびカリウムが、リン酸塩の例示的な対イオンである。部分Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ３−Ｃ２３によって表される、３個から２３個の炭素を有する、ヒドロカルビル基から独立して選択される。さらに明確にするために、ある部分が、複数の構成要素を有する特定群「から独立して選択される」ときに、第１の部分に選択される構成要素は、第２の部分に選択される構成要素の選択肢に決して影響を及ぼさない、または選択肢を限定しないことが理解されるべきであると説明されるであろう。Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が接合される炭素原子は、非対称であり、したがって、ＲまたはＳ立体化学のいずれか一方の中に存在してもよい。一実施形態では、これらの炭素原子の全てがＲ立体化学内にある一方で、別の実施形態では、これらの炭素原子の全てはＳ立体化学内にある。
【００８２】
「ヒドロカルビル」は、完全に水素および炭素から形成された化学部分を指し、炭素原子の配列は、直鎖または分岐、非環状または環状であってもよく、隣接炭素原子間の結合は、完全に単結合であってもよく、すなわち、飽和ヒドロカルビルを提供し、または任意の２つの隣接炭素原子の間に二重または三重結合が存在してもよく、すなわち、不飽和ヒドロカルビルを提供し、ヒドロカルビル基の中の炭素原子の数は、３個から２４個の炭素原子である。ヒドロカルビルは、アルキルであってもよく、代表的な直鎖アルキルは、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル等を含む、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、および同等物を含む一方で、分岐アルキルは、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、および同等物を含む。代表的な飽和環状ヒドロカルビルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、および同等物を含む一方で、不飽和環状ヒドロカルビルは、シクロペンタニルおよびシクロヘキサニル、および同等物を含む。不飽和ヒドロカルビルは、隣接炭素原子間に少なくとも１つの二重または三重結合を含有する（ヒドロカルビルが非環状である場合、それぞれ、「アルケニル」または「アルキニル」と呼ばれ、ヒドロカルビルが少なくとも部分的に環状である場合、それぞれ、シクロアルケニルおよびシクロアルキニルと呼ばれる）。代表的な直鎖および分岐アルケニルは、エチレニル、プロピレニル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、および同等物を含む一方で、代表的な直鎖および分岐アルキニルは、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−メチル−１−ブチニル、および同等物を含む。
【００８３】
式（Ｉ）のアジュバントは、当技術分野で公知である合成方法、例えば、参照することにより本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ２００９／０３５５２８号、ならびに第ＷＯ  ２００９／０３５５２８号で識別される出版物で開示されている合成方法によって得られてもよく、これらの出版物のうちのそれぞれもまた、参照することにより本明細書に組み込まれる。アジュバントのうちのあるものはまた、商業的に得られてもよい。好ましいアジュバントは、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，  Ａｌａｂａｓｔｅｒ  ＡＬのカタログで識別されるような製品番号６９９８００である（以下のＥ１０と組み合わせたＥ１を参照）。
【００８４】
本発明の種々の実施形態では、アジュバントは、式（Ｉ）化学構造を有し、部分Ａ１、Ａ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、およびＲ６は、これらの部分に以前に提供されたオプションの小集団から選択され、これらの小集団は、Ｅ１、Ｅ２等によって以下で識別される。
【００８５】
Ｅ１：Ａ１は、リン酸またはリン酸塩であり、Ａ２は、水素である。
【００８６】
Ｅ２：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ３−Ｃ２１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ５−Ｃ２３ヒドロカルビルである。
【００８７】
Ｅ３：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ５−Ｃ１７アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ７−Ｃ１９ヒドロカルビルである。
【００８８】
Ｅ４：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ７−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
【００８９】
Ｅ５：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ９−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１１−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
【００９０】
Ｅ６：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ９−Ｃ１５アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１１−Ｃ１７ヒドロカルビルである。
【００９１】
Ｅ７：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ７−Ｃ１３アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ９−Ｃ１５ヒドロカルビルである。
【００９２】
Ｅ８：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１−Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１２−Ｃ２０ヒドロカルビルである。
【００９３】
Ｅ９：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１３ヒドロカルビルである。
【００９４】
Ｅ１０：Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、ウンデシルであり、Ｒ２およびＲ４は、トリデシルである。
【００９５】
ある実施形態では、Ｅ２からＥ１０のうちのそれぞれは、実施形態Ｅ１と組み合わせられ、および／またはＥ２からＥ９のヒドロカルビル基は、アルキル基、好ましくは、直鎖アルキル基である。式（Ｉ）のアジュバントは、それぞれ以下で論議される、共アジュバントを随意的に伴って、医薬組成物に製剤化されてもよい。この点に関して、ＧＬＡアジュバント用の水性製剤（ＡＦ）および安定エマルジョン製剤（ＳＥ）等の製剤を提供する、米国特許公開第２００８／０１３１４６６号を参照し、これらの製剤は、式（Ｉ）のアジュバントのうちのいずれかに使用されてもよい。
【００９６】
別の実施形態では、アジュバントは、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ  ２０１０／１４１８６１号で説明されるような合成脂質Ａ型アジュバントであり、以下の化学式（ＩＩ）から選択される構造、
【化２】
2014510721.tif 000003
【００９７】
またはその薬学的に容認可能な塩を有し、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、同一であり、または異なり、−Ｏ−、−ＮＨ−、および−（ＣＨ２）−から独立して選択され、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同一であり、または異なり、任意の発生時に、不在であってもよく、または−Ｃ（＝Ｏ）−のいずれかであってもよく、Ｙ１は、酸性官能基であり、Ｙ２およびＹ３は、同一であり、または異なり、それぞれ、−ＯＨ、−ＳＨ、および酸性官能基から独立して選択され、Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、同一であり、または異なり、それぞれ、Ｃ８−Ｃ１３アルキル基から独立して選択され、Ｒ２およびＲ４は、同一であり、または異なり、それぞれ、Ｃ６−Ｃ１１アルキル基から独立して選択される。
【００９８】
随意に、以下および本明細書でさらに詳細に説明されるように、非限定的実施例として、ＭＰＬとともにアルミニウム塩、ＱＳ２１とともにアルミニウム塩、ＱＳ２１とともにＭＰＬ、ならびに一緒にアルミナアルミニウム塩、ＱＳ２１、およびＭＰＬ等、２つ以上の異なるアジュバントを同時に使用することができる。または、随意に、アルミニウム塩、ＱＳ２１、およびＭＰＬ、またはそれらの全ての組み合わせと組み合わせて、不完全フロイントアジュバントを使用することができる（例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３２，  １７３−１８６  （１９９８）を参照）。
【００９９】
ある実施形態では、式（Ｉ）のアジュバントは、それぞれ以下で論議されるように、上記で説明されるような共アジュバント、または本明細書で説明される、あるいは当技術分野で利用可能である任意の他のアジュバントを随意に伴って、医薬品（またはアジュバント組成物）に製剤化されてもよい。この点に関して、ＧＬＡアジュバント用の水性製剤（ＡＦ）および安定エマルジョン製剤（ＳＥ）等の製剤を提供する、米国特許公開第２００８／０１３１４６６号を参照し、その製剤は、式（Ｉ）のアジュバントのうちのいずれかに対して使用されてもよい。
【０１００】
本明細書で提供されるように、式Ｉのアジュバントは、本明細書では共アジュバントと呼ばれる、第２のアジュバントと組み合わせて使用されてもよい。３つの例示的な実施形態では、共アジュバントは、送達システムであってもよく、または免疫増強物質であってもよく、または送達システムおよび免疫増強物質の両方として機能する組成物であってもよい（例えば、Ｏ’  Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ２１（９）：１５１９−３０  （２００４）を参照）。共アジュバントは、トール様受容体ファミリー生体分子の構成要素を介して動作する、免疫増強物質であってもよい。例えば、共アジュバントは、ＴＬＲ４作動薬、またはＴＬＲ８作動薬、またはＴＬＲ９作動薬のいずれか一方として、その一次作用モードのために選択されてもよい。代替として、または補足として、共アジュバントは、その担体性質のために選択されてもよく、例えば、共アジュバントは、エマルジョン、リポソーム、微小粒子、またはミョウバンであってもよい。
【０１０１】
一実施形態では、共アジュバントは、ミョウバンであってもよく、この用語は、リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）および水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）等のアルミニウム塩を指す。ミョウバンが共アジュバントとして使用されるときに、ミョウバンは、約１００から１，０００μｇ、または２００から８００μｇ、または３００から７００μｇ、または４００から６００μｇの量で、ワクチンの用量内に存在してもよい。式（１）のアジュバントは、典型的には、ミョウバンの量未満の量で存在し、種々の具体的実施形態では、式（１）のアジュバントは、重量基準で、ミョウバンの重量に対して０．１〜１％、または１〜５％、または１〜１０％、または１〜１００％で存在する。
【０１０２】
１つの特定の実施形態では、アジュバントは、ワクチンアジュバント性質を有する、エマルジョンである。そのようなエマルジョンは、水中油型エマルジョンを含む。フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）が、１つのそのようなアジュバントである。別の好適な水中油型エマルジョンは、スクアレン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ（商標）８０表面活性剤としても知られている）、およびトリオレイン酸ソルビタンを含有する、ＭＦ−５９（商標）アジュバントである。スクアレンは、本来は、サメ肝油から得られる天然有機化合物であるが、アマランス種子、米ぬか、小麦胚芽、およびオリーブを含む、植物源（主に植物油）からも入手可能である。他の好適なアジュバントは、鉱油ベースのアジュバントである、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＳＡ  ２０６、およびＭｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）ＩＭＳ  １３１２を含む、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）アジュバント（Ｓｅｐｐｉｃ  Ｉｎｃ．，  Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ  ＮＪ）である。一実施形態では、鉱油が共アジュバント内に存在してもよい一方で、本発明のワクチン組成物の油構成要素は、全て代謝可能な油である。
【０１０３】
共アジュバントとして本明細書で説明される方法の実践で使用され得る、免疫増強物質の実施例は、ＭＰＬ（商標）、ＭＤＰおよび誘導体、オリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、代替的な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）、サポニン、小分子免疫増強物質（ＳＭＩＰ）、サイトカイン、およびケモカインを含む。
【０１０４】
一実施形態では、共アジュバントは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  から市販されている（本来はＲｉｂｉ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｃ．  Ｈａｍｉｌｔｏｎ，  ＭＴによって開発された）、ＭＰＬ（商標）アジュバントである。例えば、Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｍｙｅｒｓ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｐｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｎｅｗｍａｎ，  ｅｄｓ．  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９５）からの第２１章を参照されたい。ＭＰＬ（商標）アジュバントに関係し、また、本明細書で説明される組成物および方法で使用するための共アジュバントとして好適であるものは、ＡＳ０２（商標）アジュバントおよびＡＳ０４（商標）アジュバントである。ＡＳ０２（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（商標）アジュバントおよびＱＳ−２１（商標）アジュバント（本明細書の他の場所で論議されるサポニンアジュバント）の両方を含有する、水中油型エマルジョンである。ＡＳ０４（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（商標）アジュバントおよびミョウバンを含有する。ＭＰＬ（商標）アジュバントは、弱酸性および塩基加水分解でリポ多糖類（ＬＰＳ）を処理し、それに続いて修飾ＬＰＳの精製を行うことによって、サルモネラミネソタＲ５９５のＬＰＳから調製される。
【０１０５】
別の実施形態では、共アジュバントは、キラヤサポナリア樹種の樹皮に由来するもの等のサポリン、または修飾サポリンである（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号、第５，２７３，９６５号、第５，３５２，４４９号、第５，４４３，８２９号、および第５，５６０，３９８号を参照）。Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，  Ｉｎｃ．  Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡによって販売されている製品ＱＳ−２１（商標）アジュバントが、式（１）のアジュバントとともに使用され得る、例示的なサポニン含有共アジュバントである。サポニンに関係する、代替的な共アジュバントは、本来はＩｓｃｏｔｅｃ（スウェーデン）によって開発され、典型的には、キラヤサポナリアに由来するサポリン、または全てハチの巣様構造に形成される、合成類自体、コレステロール、およびリン脂質から形成された、ＩＳＣＯＭ（商標）族のアジュバントである。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、共アジュバントは、共アジュバントとして機能するサイトカインである（例えば、Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  ２１（６）：１４３９−４９  （１９９５）；  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６３（９）：３２４１−４４  （１９９５）；およびＥｇｉｌｍｅｚ，  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  （２００７）の中の第１４章を参照）。種々の実施形態では、サイトカインは、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（例えば、Ｃｈａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ９（３）：２０７−１５  （２００４）；  Ｄｒａｎｏｆｆ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １８８：１４７−５４  （２００２）；および米国特許第５，６７９，３５６号を参照）、またはＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）またはインターフェロン−β（ＩＦＮ−β））、あるいはＩＩ型インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）等のインターフェロン（例えば、Ｂｏｅｈｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：７４９−９５  （１９９７）；およびＴｈｅｏｆｉｌｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３：３０７−３６  （２００５）を参照）、具体的には、インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）（例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７２（７）：３９８３−８８  （２００４）を参照）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）（例えば、Ｐｏｒｔｉｅｌｊｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２（３）：１３３−４４  （２００３）；およびＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３（２）：１３３−４６  （２００３）を参照）、インターロイキン−１５（Ｉｌ−１５）、インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）を含む、インターロイキン、胎児肝臓チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であってもよい。式（Ｉ）のアジュバントは、ワクチン抗原と組み合わせる前にサイトカインとともに共製剤化されてもよく、または抗原、式（Ｉ）のアジュバント、およびサイトカイン共アジュバントは、別々に製剤化され、次いで、組み合わせられてもよい。
【０１０７】
免疫原を含む組成物、あるいは免疫原をコードする組換え発現ベクター、またはベクターを含むベクター粒子を含む、組成物は、アジュバントを含有するものとは別のバイアルの中に包装されて供給される。適切なラベルが、典型的には、意図された治療用途を示す各組成物とともに包装される。アジュバントおよび／または賦形剤の選択肢は、免疫原、組換え発現ベクター、および／またはベクター粒子の安定性、投与経路、投薬スケジュール、およびワクチン接種される種に対するアジュバントの有効性に依存する。ヒトでの投与については、薬学的に容認可能なアジュバントは、関連規制機関によって、ヒトに投与するために承認されている、または承認可能であるものである。例えば、本明細書で論議され、当技術分野で公知であるように、完全フロイントアジュバントは、ヒトに投与するために好適ではない。
【０１０８】
本明細書で説明される方法で使用するために有用なアジュバントは、アジュバントが投与される対象にとって生理学的または薬学的に好適なアジュバントである。アジュバント組成物は、少なくとも１つのアジュバント（すなわち、１つ以上のアジュバント）、および随意に、少なくとも１つの生理学的または薬学的に好適な（または容認可能な）賦形剤を含む。医薬組成物で使用するための当業者に公知である任意の生理学的または薬学的に好適な賦形剤または担体（すなわち、活性成分の活性に干渉しない非毒性物質）が、本明細書で説明されるアジュバント組成物で採用されてもよい。例示的な賦形剤は、アジュバントの構成要素の安定性および完全性を維持する、希釈剤および担体を含む。治療的使用のための賦形剤が周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  （Ｇｅｎｎａｒｏ，  ２１ｓｔ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ  （２００５））で説明され、本明細書でさらに詳細に説明される。
組換え発現ベクター
【０１０９】
一実施形態では、免疫原に対する免疫応答を誘発する、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターが提供される。免疫原の効率的な転写および翻訳を得るために、各ベクターの中のコード化ポリヌクレオチド配列は、コード化ポリヌクレオチド配列に動作可能に結合される、本明細書でさらに詳細に説明される、少なくとも１つの適切な発現制御配列（調節発現配列または特徴とも呼ばれる）（例えば、プロモーター、エンハンサー、リーダー）を含むべきである。したがって、これらの組換え発現ベクターは、免疫原の発現を指図するために、または組換え発現ベクターで変換、形質導入、または形質移入されている、あるいは組換え発現ベクターを含有するベクター粒子が導入されている、任意の適切な宿主細胞の中の少なくとも２つの免疫原の同時発現を指図するために提供される。
【０１１０】
本明細書で説明される組換え発現ベクターは、１つ以上の免疫原（すなわち、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つの免疫原等）をコードしてもよく、その免疫原は、本明細書でさらに詳細に説明される。特定の実施形態では、感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫）からの少なくとも１つ、２つ、または３つ以上の免疫原が、組換え発現ベクターによってコードされてもよい。別の具体的実施形態では、本明細書で説明される組換え発現ベクターは、少なくとも１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の腫瘍関連抗原をコードしてもよい。これらの腫瘍関連抗原は、本明細書でさらに詳細に説明され、例えば、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原（例えば、前立腺酸性フォスファターゼ、前立腺特異抗原、ＮＫＸ３．１、および前立腺特異的膜抗原）、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、結腸直腸癌抗原、肺癌抗原、卵巣癌抗原、または本明細書および当技術分野で説明される任意の癌あるいは腫瘍関連抗原からの腫瘍関連抗原であってもよい。
【０１１１】
組換え発現ベクターは、本明細書で説明される免疫原のうちのいずれか１つ以上の発現に使用されてもよい。特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、所望の免疫応答（すなわち、特異的体液性応答（すなわち、Ｂ細胞応答）および／または免疫原特異的ＣＴＬ応答を含んでもよい特異的細胞媒介免疫応答の誘発）を誘発するであろう、適切な細胞（例えば、抗原提示細胞、すなわち、樹状細胞等の、その細胞表面上でペプチド／ＭＨＣ複合体を表す細胞）または組織（例えば、リンパ系組織）に送達される。したがって、組換え発現ベクターはまた、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、または樹状細胞特異的ＴＲＥ等のリンパ系組織特異的転写調節要素（ＴＲＥ）を含んでもよい。リンパ系組織特異的ＴＲＥは、当技術分野で公知である（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２），  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２，  １０４３−１０５３；  Ｔｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３），  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７７，  １６６３−１６７４；  Ｐｅｎｉｘ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３），  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７８，  １４８３−１４９６を参照）。
【０１１２】
特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡである。本明細書で説明されるような免疫原をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含有する、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡは、当技術分野で周知である標準技法を使用して、容易に構築される。ベクターゲノムは、パッケージングまたは産生細胞株に形質移入することができる、プラスミド形態で構築されてもよい。プラスミドは、概して、細菌の中のプラスミドの複製に有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当技術分野で周知である。加えて、複製の原核生物起源を含むベクターもまた、その発現が薬剤耐性等の検出可能または選択可能なマーカーを与える、遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬剤耐性生成物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。正しいヌクレオチド配列がプラスミドに組み込まれていることを確認する分析のために、プラスミドは、大腸菌の中で複製され、精製され、制限エンドヌクレアーゼ消化および／または従来の方法によって判定されるそのヌクレオチド配列によって分析されてもよい。
【０１１３】
他の特定の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルスベクターである。例示的な組換え発現ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターゲノム、ポックスウイルスベクターゲノム、ワクシニアウイルスベクターゲノム、アデノウイルスベクターゲノム、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノム、ヘルペスウイルスベクターゲノム、およびアルファウイルスベクターゲノムを含む。ウイルスベクターは、生存、弱毒化、複製条件付き、または複製欠損性であってもよく、典型的には、非病原性（欠損性）の複製可能なウイルスベクターである。
【０１１４】
一例として、具体的実施形態では、ウイルスベクターがワクシニアウイルスベクターゲノムであるときに、目的とする免疫原をコードするポリヌクレオチドが、ワクシニアウイルスベクターの非必須部位に挿入されてもよい。そのような非必須部位は、例えば、Ｐｅｒｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５２：２８５  （１９８６）；  Ｈｒｕｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：３４１１  （１９８３）；  Ｗｅｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ４６：５３０  （１９８３）で説明されている。ワクシニアウイルスとともに使用するための好適なプロモーターは、Ｐ７．５（例えば、Ｃｏｃｈｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ５４：３０  （１９８５）を参照）、Ｐ１１（例えば、Ｂｅｒｔｈｏｌｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：２０９６  （１９８５）を参照）、およびＣＡＥ−１（例えば、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：９４３１  （１９８８）を参照）を含むが、それらに限定されない。ワクシニアの高度に弱毒化された株は、ヒトで使用するためにより容認可能であり、特異的ゲノム欠損を含有する、Ｌｉｓｔｅｒ、ＮＹＶＡＣ（例えば、Ｇｕｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：９８５−９８  （２００６）；  Ｔａｒｔａｇｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ８：１４４５−４７  （１９９２）を参照）、またはＭＶＡ（例えば、Ｇｈｅｒａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８６：２９２５−３６  （２００５）；  Ｍａｙｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ３：６−１４  （１９７５）を参照）を含む。また、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（癌治療用のベクターとしてのヤバ様疾患ウイルスの使用を説明する、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：１０３００−３０８  （２００１））、米国特許第５，６９８，５３０号および第６，９９８，２５２号も参照されたい。また、例えば、米国特許第５，４４３，９６４号も参照されたい。また、米国特許第７，２４７，６１５号および第７，３６８，１１６号も参照されたい。
【０１１５】
ある実施形態では、アデノウイルスベクターまたはアデノウイルス随伴ウイルスベクターが、目的とする免疫原を発現するために使用されてもよい。いくつかのアデノウイルスベクター系およびベクターを投与するための方法が説明されている（例えば、Ｍｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８３５８−６１  （１９９８）；  Ｎａｒｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｍ  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １９：９３６−４１  （１９９８）；  Ｍｅｒｃｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：６１８８−９３  （２００４）；米国特許第６，１４３，２９０号、第６，５９６，５３５号、第６，８５５，３１７号、第６，９３６，２５７号、第７，１２５，７１７号、第７，３７８，０８７号、第７，５５０，２９６号を参照）。
【０１１６】
レトロウイルスベクターゲノムは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、同種指向性レトロウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、および組み合わせに基づくものを含んでもよい（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：２７３１−３９  （１９９２）；  Ｊｏｈａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１６３５−４０  （１９９２）；  Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５８−５９  （１９９０）；  Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：２３７４−７８  （１９８９）；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２２２０−２４  （１９９１）；  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １０：４２３９  （１９９０）；  Ｋｏｌｂｅｒｇ，  ＮＩＨ  Ｒｅｓ．  ４：４３  １９９２；  Ｃｏｒｎｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：２１５  （１９９１）を参照）。
【０１１７】
より具体的な実施形態では、組換え発現ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターゲノムである。ゲノムは、ヒト遺伝子治療用途のために識別されるものを含む、多数の好適で利用可能なレンチウイルスゲノムベースのベクターのうちのいずれかに由来することができる（例えば、Ｐｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ２：１７７−２１１  （２００１）を参照）。好適なレンチウイルスベクターゲノムは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、ＨＩＶ−２、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびマエディ／ビスナウイルスに基づくものを含む。レンチウイルスの望ましい特性は、それらが分裂および非分裂細胞の両方に感染することができるが、標的細胞は分裂細胞である、または分裂するように刺激される必要がないことである。概して、ゲノムおよびエンベロープ糖タンパク質は、結果として生じるウイルスベクター粒子が偽型であるように、異なるウイルスに基づくであろう。ベクターゲノムの安全性特徴が、望ましくは組み込まれる。安全性特徴は、自己不活性化ＬＴＲおよび非統合ゲノムを含む。例示的なベクターは、パッケージングシグナル（ｐｓｉ）、Ｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、スプライスドナー、スプライス受容体、中央ポリプリン路（ｃＰＰＴ）、およびＷＰＲＥ要素を含有する。ある例示的な実施形態では、ウイルスベクターゲノムは、ＨＩＶ−１ゲノムまたはＳＩＶゲノム等のレンチウイルスゲノムからの配列を含む。ウイルスゲノム構造は、レンチウイルスの５’および３’ＬＴＲからの配列を含んでもよく、具体的には、レンチウイルスの５’ＬＴＲおよびレンチウイルスの不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列を含む。ＬＴＲ配列は、任意の種からの任意のレンチウイルスからのＬＴＲ配列であってもよい。例えば、それらは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶ、またはＢＩＶからのＬＴＲ配列であってもよい。典型的には、ＬＴＲ配列は、ＨＩＶ  ＬＴＲ配列である。
【０１１８】
ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化３’ＬＴＲを含んでもよい（例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：  ９８７３，  １９９８；  Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８１５０，  １９９８を参照、その両方ともそれらの全体で組み込まれる）。自己不活性化ベクターは、概して、ベクター統合中に５’ＬＴＲの中へコピーされる、３’長末端反復（ＬＴＲ）からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有する。ある場合において、３’ＬＴＲのＵ３要素は、そのエンハンサー配列、ＴＡＴＡボックス、Ｓｐ１、およびＮＦ−カッパＢ部位の欠失を含有する。自己不活性化３’ＬＴＲの結果として、入力および逆転写後に生成されるプロウイルスは、不活性化５’ＬＴＲを含むであろう。根拠は、ベクターゲノムの動員のリスクおよび近くの細胞プロモーターに対するＬＴＲの影響を低減することによって、安全性を向上させることである。自己不活性化３’ＬＴＲは、当技術分野で公知である任意の方法によって構築されてもよい。
【０１１９】
随意に、レンチウイルス５’ＬＴＲからのＵ３配列は、異種プロモーター配列等のウイルス構造の中のプロモーター配列と交換されてもよい。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を増加させることができる。エンハンサー配列もまた、含まれてもよい。パッケージング細胞株の中のウイルスＲＮＡゲノムの発現を増加させる、任意のエンハンサー／プロモーターの組み合わせが使用されてもよい。一実施例では、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター配列が使用される（例えば、米国特許第５，３８５，８３９号および第５，１６８，０６２号を参照）。
【０１２０】
ある実施形態では、統合欠損性となるようにレンチウイルスベクターゲノムを構築することによって、挿入突然変異のリスクが最小限化される。非統合ベクターゲノムを産生するように、種々のアプローチを追求することができる。これらのアプローチは、不活性インテグラーゼでタンパク質をコードするように、ｐｏｌ遺伝子のインテグラーゼ酵素構成要素に対する突然変異を操作することを伴う。ベクターゲノム自体は、例えば、一方または両方の付着部位を突然変異または欠失させること、あるいは欠失または修飾を通して３’ＬＴＲ近位ポリプリン路（ＰＰＴ）を非機能的にすることによって、統合を防止するように修飾することができる。加えて、非遺伝学的アプローチが利用可能であり、これらは、インテグラーゼの１つ以上の機能を阻害する医薬剤を含む。アプローチは、相互排他的ではなく、つまり、それらのうちの１つよりも多くを一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼおよび付着部位は、非機能的となり得る、またはインテグラーゼおよびＰＰＴ部位は、非機能的となり得る、または付着部位およびＰＰＴ部位は、非機能的となり得る、またはそれらの全ては、非機能的となり得る。
【０１２１】
インテグラーゼは、ウイルス二本鎖平滑末端ＤＮＡの開裂、および染色体標的部位の二本鎖の中の５’−リン酸塩に末端を接合することに関与する。インテグラーゼは、亜鉛結合モチーフ（ＨＨＣＣ）を含有するＮ末端ドメイン、触媒コアおよび逆ＤＤ３５Ｅモチーフ（ＨＩＶ−１の中のＤ６４、Ｄ１１６、Ｅ１５２）を含有する中央ドメインコア、およびＤＮＡ結合性質を有するＣ末端ドメインといった、３つの機能ドメインを有する。インテグラーゼに導入される点突然変異は、正常な機能を乱すために十分である。多くのインテグラーゼ突然変異が構築され、特徴付けられている（例えば、Ｐｈｉｌｐｏｔｔ  ａｎｄ  Ｔｈｒａｓｈｅｒ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：４８３，  ２００７；  Ａｐｏｌｏｎｉａ，  Ｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｂｍｉｔｔｅｄ  ｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ，  Ａｐｒｉｌ  ２００９，  ｐｐ，  ８２−９７；  Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９：  ２７２９，  １９９５；  Ｎｉｇｈｔｉｎｇａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １３：  １１２１，  ２００６を参照）。インテグラーゼタンパク質をコードする配列は、好ましくは、逆転写酵素活性または核標的化を有意に低下することなく、タンパク質を不活性にするように欠失または突然変異させることができ、それにより、標的細胞ゲノムに対するプロウイルスの統合を防止するのみである。容認可能な突然変異は、インテグラーゼ触媒作用、鎖移転、ａｔｔ部位に対する結合、宿主染色体ＤＮＡに対する結合、および他の機能を低減することができる。例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶインテグラーゼの残基３５における単一のアスパラギン酸からアスパラギンに対する置換が、ウイルスＤＮＡ統合を完全に無効にする。インテグラーゼの欠失は、概して、Ｃ末端ドメインに限定されるであろう。残基２３５−２８８のためのコード配列の欠失は、有用な非機能的インテグラーゼをもたらす（例えば、Ｅｎｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６９：２７２９，  １９９５を参照）。さらなる実施例として、例えば、Ａｓｐ６４（残基番号がＨＩＶ−１に対して与えられ、他のレンチウイルスまたはレトロウイルスからのインテグラーゼに対する対応残基番号は、当業者によって容易に判定することができる）（例えば、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ）、Ａｓｐ１１６（例えば、Ｄ１１６Ｎ）、Ａｓｎ１２０（例えば、Ｎ１２０Ｋ）、Ｇｌｕ１５２、Ｇｌｎ１４８（例えば、Ｑ１４８Ａ）、Ｌｙｓ１５６、Ｌｙｓ１５９、Ｔｒｐ２３５（例えば、Ｗ２３５Ｅ）、Ｌｙｓ２６４（例えば、Ｋ２６４Ｒ）、Ｌｙｓ２６６（例えば、Ｋ２６６Ｒ）、Ｌｙｓ２７３（例えば、Ｋ２７３Ｒ）といった、突然変異を生成することができる。他の突然変異を構築し、統合、導入遺伝子発現、および任意の他の望ましいパラメータについて試験することができる。これらの機能の分析は周知である。突然変異は、核酸配列の部位指向性突然変異生成および化学合成を含む、種々の技法のうちのいずれかによって生成することができる。１つの突然変異を行うことができ、またはこれらの突然変異のうちの１つより多くは、インテグラーゼの中に存在することができる。例えば、���ンテグラーゼは、２つのアミノ酸、３つのアミノ酸、４つのアミノ酸等において突然変異を有してもよい。
【０１２２】
代替として、またはインテグラーゼ突然変異体の使用と組み合わせて、Ｕ３およびＵ５の中の付着部位（ａｔｔ）も突然変異させることができる。インテグラーゼは、これらの部位に結合し、３’−末端ジヌクレオチドは、ベクターゲノムの両端において開裂される。ＣＡジヌクレオチドは、陥凹３’末端に位置し、ＣＡは、処理のために必要とされ、ヌクレオチドの突然変異は、宿主染色体に対する統合を阻止する。ＣＡジヌクレオチドのＡは、統合のための最重要ヌクレオチドであり、ゲノムの両端における突然変異は、最良の結果を生じるであろう（例えば、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３：９０１１  （１９９９）を参照）。１つの例示では、各端におけるＣＡは、ＴＧに変更される。他の例示では、各端におけるＣＡは、一方の端ではＴＧ、他方の端ではＧＴに変更される。他の例示では、各端におけるＣＡが欠失され、他の例示では、ＣＡのＡが各端において欠失される。
【０１２３】
統合はまた、３’ＬＴＲの近位に位置する、ポリプリン路（ＰＰＴ）の突然変異または欠失によって阻害することもできる（例えば、第ＷＯ  ２００９／０７６５２４号を参照）。ＰＰＴは、プラス鎖ＤＮＡ合成のためのプライマー結合部位としての機能を果たすことができる、約１５個のヌクレオチドのポリプリン配列である。この場合において、ＰＰＴの突然変異または欠失は、逆転写過程を標的にする。特定の機構にとらわれることを所望するわけではないが、ＰＰＴを突然変異または欠失させることによって、線形ＤＮＡの産生が根本的に低減され、本質的に１−ＬＴＲ  ＤＮＡサークルのみが産生される。統合は、線形二本鎖ＤＮＡベクターゲノムを必要とし、統合は、それがないと本質的に排除される。本明細書で記述されるように、ＰＰＴは、突然変異によって、または欠失によって、非機能的にすることができる。典型的には、約１５ｎｔのＰＰＴ全体が欠失されるが、いくつかの実施形態では、１４ｎｔ、１３ｎｔ、１２ｎｔ、１１ｎｔ、１０ｎｔ、９ｎｔ、８ｎｔ、７ｎｔ、６ｎｔ、５ｎｔ、４ｎｔ、３ｎｔ、および２ｎｔのより短い欠失が行われてもよい。突然変異が行われるときに、典型的には、特にＰＰＴの５’半分の中で行われる（例えば、ＭｃＷｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：１１１５０，  ２００３を参照）が、最初の４つの塩基の中の単一または二重突然変異は、依然として転写を低減させる。ＰＰＴの３’末端において行われる突然変異は、概して、より劇的な影響を及ぼす（例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７０：５２８８，  １９９６を参照）。
【０１２４】
ベクターゲノムを非統合性にするためのこれらの異なるアプローチは、個別に、または組み合わせて使用することができる。１つよりも多くのアプローチを使用することは、重複機構を通してフェイルセーフベクターを構築するために使用されてもよい。したがって、ＰＰＴ突然変異または欠失は、ａｔｔ部位突然変異または欠失と、あるいはインテグラーゼ突然変異と組み合わせることができ、あるいはＰＰＴ突然変異または欠失は、ａｔｔ部位突然変異または欠失およびインテグラーゼ突然変異の両方と組み合わせることができる。同様に、ａｔｔ部位突然変異または欠失およびインテグラーゼ突然変異は、相互と、あるいはＰＰＴ突然変異または欠失と組み合わせられてもよい。
【０１２５】
本明細書で説明されるように、レンチウイルスベクター構造は、ほ乳類細胞内の発現のためのプロモーターを含有する。本明細書でさらに詳細に論議されるプロモーターは、例えば、ヒトユビキチンＣプロモーター（ＵｂｉＣ）、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターを含む。Ｕ３領域は、直接上流にＰＰＴ（ポリプリン路）配列を含んでもよい。ある具体的実施形態では、（３’末端における）少なくとも３つの異なるＵ３領域のうちのいずれか１つが、レンチウイルスベクターに含まれてもよい（配列番号２１−２３を参照）。構造は、Ｕ３領域内に欠失を含有する。ＳＩＮ構造は、ＴＡＴＡボックスを除去し、それにより、ＬＴＲプロモーター活性を無効にする、Ｕ３内の約１３０個のヌクレオチドの欠失を有する（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：  ８１５０，  １９９８；  Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：  ３１９４，  １９８６を参照）。構造７０３および７０４内の欠失は、レンチウイルスベクターからの発現を増加させる（例えば、Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒａｐｙ  １６：  １９６８，  ２００８を参照）。加えて、構造７０４は、ベクターの統合を減少させる、３’ＰＰＴの欠失を含有する（例えば、第ＷＯ  ２００９／０７６５２４号を参照）。また、そのそれぞれがその全体で参照することにより組み込まれる、米国特許出願第１２／８４２，６０９号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４２８７０号も参照されたい。
調節発現配列
【０１２６】
本明細書で説明されるように、組換え発現ベクターは、少なくとも１つの調節発現配列を含む。ある実施形態では、組換え発現ベクターがウイルスベクターゲノムを含むときに、少なくとも１つの免疫原の発現が、特定の標的細胞内で所望される。典型的には、例えば、レンチウイルスベクターでは、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列が、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列の間に位置する。さらに、コード化ヌクレオチド配列は、好ましくは、他の遺伝子または調節配列または特徴、例えば、特定の方式で免疫原の発現を調節する、プロモーターまたはエンハンサーを含む転写調節配列との機能的関係で、動作可能に結合される。ある場合においては、有用な転写調節配列は、時間的および空間的の両方で、活性に対して高度に調節されるものである。コードされたポリペプチドの発現を調節するために使用され得る、発現制御要素は、当技術分野で公知であり、誘導型プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、および他の調節配列を含むが、それらに限定されない。
【０１２７】
免疫原および任意の他の発現可能配列をコードする、ポリヌクレオチドは、典型的には、内部プロモーター／エンハンサー調節配列と機能的関係にある。レンチウイルスベクター構造に関して、「内部」プロモーター／エンハンサーは、ウイルスベクター内の５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ配列の間に位置し、目的とするコード化ポリヌクレオチド配列に動作可能に結合されるものである。内部プロモーター／エンハンサーは、それと機能的関係にある遺伝子の発現を増加させることが知られている、任意のプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせであってもよい。「機能的関係」および「動作可能に結合される」とは、制限なく、プロモーターおよび／またはエンハンサーが適切な分子と接触させられたときに目的とする配列が発現されるように、配列が、プロモーターおよび／またはエンハンサーに対して正しい場所および配向にあることを意味する。
【０１２８】
内部プロモーター／エンハンサーの選択肢は、免疫原の所望の発現パターンおよび既知のプロモーター／エンハンサーの特異的性質に基づく。したがって、内部プロモーターは、構成的に活性であってもよい。使用され得る、構成的プロモーターの非限定的実施例は、ユビキチン（例えば、米国特許第５５１０４７４号、第ＷＯ  ９８／３２８６９号を参照）、ＣＭＶ（例えば、Ｔｈｏｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１：６５９，  １９８４；米国特許第５１６８０６２号を参照）、ベータアクチン（Ｇｕｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  １９８９  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：４８３１−４８３５）、およびｐｇｋ（例えば、Ａｄｒａ  ｅｔ  ａｌ．  １９８７  Ｇｅｎｅ  ６０：６５−７４；  Ｓｉｎｇｅｒ−Ｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．  １９８４  Ｇｅｎｅ  ３２：４０９−４１７；およびＤｏｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９８２  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：２６３５−２６３７を参照）のためのプロモーターを含む。
【０１２９】
代替として、プロモーターは、組織特異的プロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、標的細胞特異的プロモーターである。例えば、プロモーターは、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＴＬＲ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ＢＤＣＡ−３、ＤＥＣ−２０５、ＤＣＩＲ２、マンノース受容体、デクチン−１、Ｃｌｅｃ９Ａ、ＭＨＣクラスＩＩを含む、樹状細胞によって発現される任意の生成物から由来のものとなり得る。加えて、プロモーターは、免疫原の誘発型発現を可能にするように選択されてもよい。テトラサイクリン応答系、ｌａｃオペレーター・リプレッサー系、ならびに熱ショック、メタロチオネインプロモータ等の金属イオン、インターフェロン、低酸素症、プロゲステロンまたはグルココルチコイド受容体プロモーター等のステロイド、ＶＥＧＦプロモーター等の放射を含む、種々の環境または生理学的変化に応答するプロモーターを含む、誘導型発現のためのいくつかの体系が当技術分野で公知である。プロモーターの組み合わせはまた、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列のうちのそれぞれの所望の発現を得るために使用されてもよい。当業者であれば、生物または目的とする標的細胞内のポリヌクレオチド配列の所望の発現パターンに基づいて、プロモーターを選択することができるであろう。
【０１３０】
ウイルスベクターゲノムを含む、組換え発現ベクターは、少なくとも１つのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ応答プロモーターを含んでもよい。このプロモーターは、目的とするポリヌクレオチド配列に動作可能に結合することができ、また、終止配列に結合することもできる。加えて、１つよりも多くのＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターが組み込まれてもよい。ＲＮＡポリメラーゼＩＩおよびＩＩＩプロモーターは、当業者に周知である。好適な一連のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、例えば、Ｐａｕｌｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．  ２８，  ｐｐ  １２８３−１２９８  （２０００）で見出すことができる。ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩプロモーターはまた、下流ＲＮＡコード配列を転写するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩに指図することができる、任意の合成または工学的ＤＮＡ断片を含む。さらに、ＲＮＡポリメラーゼＩＩまたはＩＩＩ（Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩ）プロモーター、あるいはウイルスベクターゲノムの一部として使用されるプロモーターは、誘導型となり得る。任意の好適な誘導型Ｐｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩプロモーターを、本明細書で説明される方法とともに使用することができる。特に適したＰｏｌ  ＩＩまたはＩＩＩプロモーターは、Ｏｈｋａｗａ  ａｎｄ  Ｔａｉｒａ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｖｏｌ．  １１，  ｐｐ  ５７７−５８５  （２０００）  およびＭｅｉｓｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｖｏｌ．  ２９，  ｐｐ  １６７２−１６８２  （２００１）で提供されている、テトラサイクリン応答プロモーターを含む。
【０１３１】
内部エンハンサーはまた、目的とするポリヌクレオチド配列の発現を増加させるように、ウイルスベクターゲノムを含む組換え発現ベクターの中に存在してもよい。例えば、ＣＭＶエンハンサー（例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ４１：５２１，  １９８５を参照）が使用されてもよい。ＨＩＶ、ＣＭＶ等のウイルスゲノム内、およびほ乳類ゲノム内の多くのエンハンサーが識別され、特徴付けられている（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的に利用可能なデータベースを参照）。エンハンサーは、異種プロモーターと組み合わせて使用することができる。当業者であれば、所望の発現パターンに基づいて適切なエンハンサーを選択することができるであろう。
【０１３２】
特定の標的細胞に対するウイルスベクターゲノムを含む組換え発現ベクターの送達を標的にするとき、ベクターゲノムは、通常、標的細胞によって認識され、目的とする配列、ウイルス構成要素（ベクターがウイルスベクターであるとき）、および本明細書で論議される他の配列に動作可能に結合される、プロモーターを含有するであろう。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに対する結合および転写が起こることを可能にする、核酸配列によって形成される発現制御要素である。プロモーターは、誘発型、構成的、時間的に活性、または組織特異的であってもよい。誘発型プロモーターの活性は、生物または非生物因子の存在または不在によって誘発される。誘発型プロモーターは、生物の発達のある段階、その製造、または特定の細胞で、それらが動作可能に結合される遺伝子の発現をオンまたはオフにすることができるため、遺伝子工学において有用なツールとなり得る。誘導型プロモーターは、化学的に調節されたプロモーター、および物理的に調節されたプロモーターとしてグループ化することができる。典型的な化学的に調節されたプロモーターは、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、テトラサイクリン応答プロモーター）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体（ＧＲ）ベースのプロモーター、ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）ベースのプロモーター、蛾のエクジソン受容体ベースのプロモーター、およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーに基づくプロモーター）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネイン遺伝子ベースのプロモーター）、および病原性関連プロモーター（例えば、シロイヌナズナおよびトウモロコシ病原体関連（ＰＲ）タンパク質ベースのプロモーター）を含むが、それらに限定されない。典型的な物理的に調節されたプロモーターは、温度調節プロモーター（例えば、熱ショックプロモーター）、および光調節プロモーター（例えば、ダイズＳＳＵプロモーター）を含むが、それらに限定されない。他の例示的なプロモーターは、他の場所で、例えば、米国特許商標局のデータベースを検索することによって識別することができる、特許および公開特許出願で説明されている。
【０１３３】
当業者であれば、特定の状況に基づいて適切なプロモーターを選択することができるであろう。プロモーターを発現されるポリヌクレオチド配列に動作可能に結合するための方法のように、多くの異なるプロモーターが当技術分野で周知である。天然プロモーター配列および多くの異種プロモーターの両方が、パケージング細胞および標的細胞内の発現を指図するために使用されてもよい。典型的には、異種プロモーターは、概して、天然プロモーターと比較して、所望のタンパク質のより優れた転写および高い収率を可能にするために使用される。
【０１３４】
プロモーターは、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、およびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られてもよい。プロモーターはまた、そのようなプロモーターが標的細胞と適合するならば、例えば、異種ほ乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター、または天然配列と通常は関連付けられるプロモーターである。一実施形態では、プロモーターは、ウイルス発現系内の天然発生ウイルスプロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、樹状細胞特異的プロモーターである。樹状細胞特異的プロモーターは、例えば、ＣＤ１１ｃプロモーターとなり得る。
【０１３５】
転写は、エンハンサー配列をベクターに挿入することによって増加させられてもよい。エンハンサーは、典型的には、その転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常は、長さが約１０から３００ｂｐである、ＤＮＡのｃｉｓ作用要素である。多くのエンハンサー配列は、現在、ほ乳類遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトプロテイン、およびインスリン）から、および真核細胞ウイルスから知られている。実施例は、複製起点の後半側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後半側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。エンハンサーは、抗原特異的ポリヌクレオチド配列に対する位置５’または３’においてベクターに挿入されてもよいが、好ましくは、プロモーターからの部位５’に位置する。
【０１３６】
発現ベクターはまた、転写の終止のため、およびｍＲＮＡを安定させるために必要な配列を含有してもよい。これらの配列は、しばしば、真核生物またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’および時には３’非翻訳領域で見出され、当技術分野で周知である。
【０１３７】
ウイルスベクターゲノムを含む、組換え発現構造はまた、付加的な遺伝要素を含有してもよい。構造に含まれ得る要素の種類は、決して限定されず、特定の結果を達成するように選択されてもよい。例えば、標的細胞内の組換え発現ベクターまたはウイルスゲノムの核移行を促進するシグナルが、含まれてもよい。そのようなシグナルの実施例は、ＨＩＶ−１フラップシグナルである。標的細胞内のプロウイルス統合部位の特性化を促進する、付加的な調節配列が含まれてもよい。例えば、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列が、構造に含まれてもよい。例えば、ニワトリβ−グロビンからの絶縁体配列もまた、ウイルスゲノム構造に含まれてもよい。この要素は、メチル化および異質染色質化により、標的細胞内の統合プロウイルスをサイレンシングする機会を低減させる。加えて、絶縁体は、染色体上の統合部位における周辺ＤＮＡからの正または負の位置効果から、内部エンハンサー、プロモーター、および外因性ポリヌクレオチド配列を保護してもよい。加えて、ベクターゲノムを含む組換え構造は、目的とする遺伝子の発現を強化するように設計されている、１つ以上の遺伝要素を含有してもよい。例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素（ＷＲＥ）が、構造の中へ配置されてもよい（例えば、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４：３６６８−３６８１；  Ｄｅｇｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １１：１７９−１９０を参照）。
【０１３８】
組換え発現ベクターがウイルスベクターゲノムであるときに、ウイルスベクターゲノムは、典型的には、ウイルスベクターゲノム構造の産生のためにパッケージングまたは産生細胞株に形質移入され得る、プラスミド内で構築される。プラスミドは、概して、細菌内のプラスミドの複製のために有用な配列を含む。そのようなプラスミドは、当技術分野で周知である。加えて、原核生物の複製起点を含むベクターもまた、その発現が薬剤耐性等の検出可能または選択可能なマーカーを与える、遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌薬剤耐性生成物は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を与えるものである。
【０１３９】
ある構成では、組換え発現ベクターは、樹状細胞（ＤＣ）成熟／刺激因子をコードする、ポリヌクレオチド配列を含有する。例示的な刺激性分子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＴＮＦα、Ｂ７．１、Ｂ７．２、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬剤誘発型ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）、および同等物を含む。これらのポリヌクレオチドは、典型的には、樹状細胞内のコード配列の発現を指図する、１つ以上の調節要素の制御下にある。樹状細胞の成熟は、成功したワクチン接種に寄与する（例えば、Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ５：２９６−３０６  （２００５）；  Ｓｃｈｕｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：１３８−１４７  （２００３）；  Ｆｉｇｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １０：４７５−４８０  （２００４）を参照）。成熟は、Ｔ細胞プライミングのために特殊化された細胞の中への抗原捕捉に活発に関与する細胞からＤＣを変換することができる。例えば、ＣＤ４−ヘルパーＴ細胞上のＣＤ４０ＬによるＣＤ４０の係合は、ＤＣ成熟のための重要なシグナルであり、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強力な活性化をもたらす。そのような刺激性分子はまた、成熟因子または成熟刺激因子とも呼ばれる。免疫チェックポイントは、癌における機能的細胞生免疫の活性化に対する有意な障壁を表し、ＣＴＬＡ４およびプログラム死１（ＰＤ−１）を含むＴ細胞上の阻害リガンドに特異的なアンタゴニスト抗体は、臨床で評価されている標的作用物質の実施例である。慢性感染症および癌における有意な耐性機構は、高レベルのＰＤ−１を発現する、抗原特異的Ｔ細胞の機能的消耗である。非限定的実施例として、治療免疫の有効性が、免疫チェックポイント制御との組み合わせによって有意に強化されることが示されているため、免疫チェックポイントを阻害することに対する代替的なアプローチは、プログラム死（ＰＤ）リガンド１および２（ＰＤ−Ｌ１／Ｌ２）の発現を阻害することであると当業者によって理解することができる。阻害を達成するための１つの方法は、関連分子のうちの１つ以上をコードする、レンチウイルスベクターゲノム等のウイルスベクターゲノムが形質導入されたＤＣ内のＰＤ−Ｌ１／Ｌ２の発現を抑制する、本明細書で説明されるもの等のＲＮＡ分子の発現によるものである。ＤＣの成熟または免疫チェックポイント、例えば、ＰＤ−１リガンド等の特定の要素の発現は、ＭＨＣ  ＩＩ等の表面マーカーの上方調節のフローサイトメトリ分析によって、ならびに例えば、本明細書で説明される技法および方法を行うことによる、発現されたケモカインおよびサイトカインのプロファイリングによって、特徴付けることができる。
【０１４０】
検出可能な生成物、通常は、タンパク質をコードする配列を、所望の免疫原を発現している細胞の識別を可能にするように含むことができる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の緑色マーカータンパク質が、目的とするポリヌクレオチド配列とともに組換え発現構造に組み込まれる（すなわち、少なくとも１つの免疫原をコードする）。他の場合において、タンパク質は、抗体によって検出可能であってもよく、またはタンパク質は、検出可能な生成物を生じるように物質に作用する酵素であってもよく、または形質移入あるいは形質導入標的細胞の選択を可能にする、例えば、ハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性を与える、タンパク質生成物であってもよい。典型的な選択遺伝子は、真核細胞で使用するために好適な抗生物質または他の毒素、例えば、当技術分野で公知である中でも、ネオマイシン、メトトレキサート、ブラストサイジンに対する耐性を与える、または栄養要求性欠損を補完する、または媒体から保留された重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。選択可能なマーカーは、随意に、別個のプラスミド上に存在し、共トランスフェクションによって導入することができる。
【０１４１】
本明細書で説明されるベクター粒子に関して、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列、および本明細書で説明されるようなエンベロープ分子をコードする配列、またはパッケージング細胞内の所望のベクター粒子の産生のために必要な１つ以上のＤＣ突然変異因子のうちの２つ以上を含む、１つ以上のマルチシストロン性発現単位が使用されてもよい。マルチシストロン性ベクターの使用は、必要とされる核酸分子の総数を削減し、したがって、複数のベクターゲノムからの協調発現と関連付けられる、起こり得る困難を回避してもよい。マルチシストロン性ベクターでは、発現される種々の要素は、１つ以上のプロモーター（および必要に応じて他の発現制御要素）に動作可能に結合される。いくつかの構成では、マルチシストロン性ベクターは、少なくとも１つの（すなわち、１つ以上の）目的とする免疫原をコードする配列、レポーター生成物をコードする配列、および１つ以上のベクター粒子構成要素をコードする配列を含む。組換え構造が免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、ある実施形態では、構造は、随意に、ＤＣ成熟因子をコードする。ある他の実施形態では、マルチシストロン性ベクターは、免疫原、ＤＣ成熟因子、および随意に発現ベクターがウイルス発現ベクターであるときにウイルス構成要素のうちのそれぞれをコードする、ポリヌクレオチド配列を含む。
【０１４２】
マルチシストロン性発現ベクター内で発現される各構成要素は、同一のプロモーターからの種々のタンパク質の別個の発現を可能にするように、例えば、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素またはウイルス２Ａ要素によって、分離されてもよい。ＩＲＥＳ要素および２Ａ要素は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第４，９３７，１９０号；ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｔｒａｆｆｉｃ  ５：  ６１６−６２６を参照）。一実施形態では、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびゾーシーアシグナウイルス（ＴａＶ）（例えば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２２：  ５８９−５９４を参照）からの２Ａ様配列と結合されたフーリン開裂部位配列（ＲＡＫＲ）（例えば、Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３：  ５８４−５９０を参照）等のオリゴヌクレオチドが、マルチシストロン性ベクター内の遺伝要素を分離するために使用される。特定のマルチシストロン性ベクターの有効性は、標準プロトコルを使用して遺伝子のうちのそれぞれの発現を検出することによって、容易に試験することができる。
【０１４３】
特定の例示では、ウイルスベクターゲノムは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー／プロモーター配列、ＨＩＶ５’ＬＴＲからのＲおよびＵ５配列、パッケージング配列（ψ）、ＨＩＶ−１フラップシグナル、内部エンハンサー、内部プロモーター、目的とする遺伝子、ウッドチャック肝炎ウイルス応答要素、ｔＲＮＡアンバーサプレッサー配列、そのエンハンサー配列の欠失を伴うＵ３要素、ニワトリβ−グロビン絶縁体、ならびに３’ＨＩＶ  ＬＴＲのＲおよびＵ５配列を含む。いくつかの例示では、ベクターゲノムは、無傷レンチウイルス５’ＬＴＲおよび自己不活性化３’ＬＴＲを含む（例えば、Ｉｗａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １５：１２０，  １９９９を参照）。
【０１４４】
ベクターゲノムの構築は、制限なく、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９  ａｎｄ  ２００１  ｅｄｉｔｉｏｎｓ；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ）；  Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９７））；および“ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”  （Ａｌａｎ  Ｊ．  Ｃａｎｎ，  Ｅｄ．，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  （２０００）で説明されているような、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、変換、プラスミド精製、およびＤＮＡ配列決定の標準技法を含む、当技術分野で公知である任意の好適な遺伝子工学技法を使用して達成することができ、先述のそれぞれは、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０１４５】
ほ乳類細胞内の一過性の発現のために構築されたベクターもまた、使用されてもよい。宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、順に、発現ベクター内の免疫原特異的ポリヌクレオチドによってコードされる高レベルのポリペプチドを合成するように、一過性の発現は、宿主細胞内で効率的に複製することができる発現ベクターの使用を伴う。上記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ｐｐ．  １６．１７−１６．２２，  １９８９を参照されたい。ポリペプチドの発現に対する適応のために好適な他のベクターおよび方法は、当技術分野で周知であり、特定の状況に容易に適合される。
【０１４６】
本明細書で提供される教示および当技術分野での知識を使用することによって、当業者であれば、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターでパッケージング細胞を形質移入し、好適な技法を使用して発現を測定する、例えば、緑色蛍光タンパク質複合体からの蛍光を測定することによって、特定の発現系の有効性を試験することができると認識するであろう。他の好適なレポーター遺伝子も、当技術分野で周知である。
【０１４７】
免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え発現ベクターが、免疫原の産生のために使用されてもよい。組換え発現ベクターは、免疫原をコードするポリヌクレオチドに動作可能に結合される、プロモーターまたはエンハンサー等の少なくとも１つの調節発現配列を含む。発現ベクターのうちのそれぞれは、それぞれの免疫原の組換え産生のための適切な宿主細胞を変換、形質導入、または形質移入するために使用されてもよい。免疫原の産生のための好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、および高等真核細胞（例えば、ＣＨＯおよびＣＯＳ）を含む。免疫原はそれぞれ、タンパク質分野で公知であり、日常的に実践されている、種々の単離方法（例えば、濾過、透析濾過、クロマトグラフィ（親和性クロマトグラフィ、高圧液体クロマトグラフィを含む）、および予備電気泳動）のうちのいずれか１つを使用して、それぞれの宿主細胞または宿主細胞培養から単離されてもよい。ある実施形態では、本明細書で説明されるように、次いで、単離された免疫原は、免疫原性組成物を提供するように、薬学的に好適な賦形剤とともに製剤化されてもよい。
【０１４８】
組換え技術によってポリペブチドを産生するための特定の方法が、概して周知であり、日常的に使用されている。例えば、分子生物学手順が、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって説明されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９；また、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  （２００１）も参照）。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５４６３  （１９７７））、およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ配列決定ハンドブックで説明されるように、行うことができ、それに対する改良を含む。
ベクター粒子
【０１４９】
別の実施形態では、ベクター粒子が提供される。ベクター粒子は、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、本明細書で説明される組換え発現ベクターのうちのいずれか１つを含む。ある他の実施形態では、ベクター粒子は、特異的免疫応答を誘発する、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含む、１つの組換え発現ベクター（第１の組換え発現ベクターとも呼ばれる）を含む、組換え発現系を含む。また、本明細書では、標的細胞に対する（本明細書で説明されるような）少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチドを送達するための方法が提供される。特定の実施形態では、標的細胞は、抗原提示細胞である免疫細胞であり、より具体的な実施形態では、本明細書で説明されるように、標的細胞は、樹状細胞である。そのような方法は、ポリヌクレオチドを送達する媒介物との標的細胞の接触（すなわち、相互作用を可能にすること）を含む。本明細書で詳細に説明される特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを送達するための方法は、免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含有する、組換え発現ベクターを含むベクター粒子を対象に投与することによって、細胞に接触することを含む。ベクター粒子、組換え発現ベクター、ポリヌクレオチド、および免疫原は、本明細書でさらに詳細に論議される。
【０１５０】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫応答の開始および制御のための必須抗原提示細胞である。ＤＣは、２つの経路に沿って発達することができ、１つの経路は、単球から独立しており、第２の経路は、単球に由来する（Ｍｏ−ＤＣ）。血中単球は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いた培養時に、ヒトでの生体内を含む（例えば、Ｄｈｏｄａｐｋａｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ  １０４（２），  １７３  （１９９９）；  Ｓｃｈｕｌｅｒ−Ｔｈｕｒｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５（６），  ３４９２  （２０００）を参照）、樹状形態および適応免疫性を開始する強い能力を取得する（例えば、Ｂｅｎｄｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９６（２），  １２１  （１９９６）；  Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７９（４），  １１０９  （１９９４）を参照）。より効果的な免疫原特異的Ｔ細胞応答は、生体外細胞操作を必要とすることなく、特に、免疫原を生体内のＭｏ−ＤＣに直接効率的に送達するレンチウイルスベクター粒子系で、ベクター粒子ワクチンを使用することによって達成されてもよい。ヒトＭｏ−ＤＣは、高レベルの２つのＣ型レクチン受容体である、マンノース受容体（ＭＭＲ）およびＤＣ特異的細胞間接着分子−３−結合ノンインテグリン（ＤＣ−ＳＩＧＮ）を発現する。本明細書でさらに詳細に説明されるように、免疫原の発現は、標的ＤＣ−ＳＩＧＮに設計された組換えレンチウイルスベクターを使用して、Ｍｏ−ＤＣへ標的化されてもよい。
【０１５１】
ＤＣ−ＳＩＧＮに選択的に結合する工学的シンドビスウイルス（ＳＩＮ）糖タンパク質から成る、ＤＣ−ＳＩＧＮ標的化エンベロープ、ＳＶＧｍｕが、説明されるように修飾されている（本明細書の説明、および米国特許出願第１２／８４２，６０９号、および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４２８７０号を参照）。レンチウイルスベクターは、マウスでの単一免疫付与後に、高度に機能的なＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を誘発した（例えば、Ｄａｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ  （２００９）；  Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２６（３），  ３２６  （２００８）を参照）。このプロトタイプは、２つの主要な修飾によって有意に進展させられてきた。本明細書で説明される、このレンチウイルスベクターは、普遍的なヘパラン受容体に対する結合を防止するように修飾される（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（９），  ７３５７  （１９９８）を参照）、ＤＣ−ＳＩＧＮ受容体を介して真皮ＤＣに感染することが知られているアルボウイルスである、天然ＳＩＮに基づく糖タンパク質エンベロープ（ＳＩＮｖａｒ１と称される）を含む（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（２４），  １１８４９  （２０００）；  Ｋｌｉｍｓｔｒａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７（２２），  １２０２２  （２００３）を参照）。ＳＩＮｖａｒ１エンベロープは、親ＳＶＧｍｕエンベロープと比較して、増加した生産性および生体内機能の両方を与える。ベクターはまた、突然変異インテグラーゼ（ｐｏｌＤ６４Ｖ）の組み合わせを通して、冗長的に統合不能であり、それを非機能的にし（例えば、Ａｐｏｌｏｎｉａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １５（１１），  １９４７  （２００７）を参照）、ＬＴＲのＵ３領域（ａｔｔまで）および３’ＬＴＲポリプリン路（ＰＰＴ）からベクター骨格を欠失させる。したがって、無効インテグラーゼに加えて、ベクター骨格の組成物は、全長ベクターゲノムの転写を防止し（自己不活性化突然変異）、染色体の統合のためのテンプレートではない、感染ＤＣ内の単一ＬＴＲ逆転写エピソーム性ｄｓＤＮＡサークルをもたらす（例えば、Ｂａｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １６（１２），  １９６８  （２００８）；  Ｂｒｅｃｋｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  （２０１０）；  Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  １０（１）：１３９  （２００４）を参照）。Ｒｅｖを除く調節および付属タンパク質の全てを含む、親ＨＩＶゲノムの約７５％が、ＤＣ−ＮＩＬＶから除去されている。単一の注射後、ＤＣ−ＮＩＬＶは、高度に堅調な腫瘍抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を誘発する。レンチベクターワクチン接種の有効性は、少なくとも部分的に、ＴＬＲ３およびＴＬＲ７パターン認識受容体の係合に依存している（例えば、Ｂｅｉｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  （２００９）；上記のＢｒｅｃｋｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。ＤＣ−ＮＩＬＶは、その統合の相手に対する同等規模の免疫応答を誘発することができ、同種プライムブーストレジメンで使用することができる。
【０１５２】
ある実施形態では、ベクター粒子は、ウイルスベクター粒子であり、他のある実施形態では、ベクター粒子は、例えば、リステリア・モノサイトジェネス、サルモネラ菌、ウシ型結核菌、大腸菌、赤痢菌、およびエルシニア菌等の細菌に由来する粒子である（例えば、Ｐａｔｅｒｓｏｎ，  Ｓｅｍｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  （２０１０）  ２２：１８３；  Ｌｏｅｓｓｎｅｒ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  （２００４）  ４：１５７；  Ｄａｕｄｅｌ，  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  （２００７）  ６：９７）を参照）。例示的なウイルスベクター粒子は、レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子、ポックスウイルスベクターゲノムを含むポックスウイルスベクター粒子、ワクシニアウイルスベクターゲノムを含むワクシニアウイルスベクター粒子、アデノウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルスベクター粒子、アデノウイルス随伴ウイルスベクターゲノムを含むアデノウイルス随伴ウイルスベクター粒子、ヘルペスウイルスベクターゲノム（例えば、単純ヘルペスウイルスＩまたはＩＩ）を含むヘルペスウイルスベクター粒子、またはアルファウイルスベクターゲノムを含むアルファウイルスベクター粒子を含む。
【０１５３】
より具体的な実施形態では、ベクター粒子は、（上記で詳細に説明される）レンチウイルスベクターゲノムを含むレンチウイルスベクター粒子である。特に、ＤＣに対する少なくとも１つの免疫原をコードする配列を送達するためのレンチウイルスベクター粒子（また、レンチウイルス粒子であるビリオンと呼ばれてもよい）を使用することによって、細胞を標的にし、かつ樹状細胞（ＤＣ）を標的にするために、方法および組成物が本明細書で提供される。レンチウイルスベクター粒子は、シンドビスウイルスＥ２に由来するエンベロープ糖タンパク質変異体と、目的とする配列、および随意に他の構成要素を含む、ゲノムを含む組換え発現構造とを含む。糖タンパク質変異体は、参照シンドビスウイルス株であるＨＲからの糖タンパク質と比較して、ヘパラン硫酸に対する低減した結合を示す。エンベロープ糖タンパク質は、レンチウイルスベクター粒子による樹状細胞の感染を促進する。本明細書で使用されるような、感染を「促進する」は、形質導入を促進するのと同一であり、標的細胞に対する偽型レトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の受容体媒介侵入を促進または強化することにおいて、単独で、または他の分子と協力して作用する、エンベロープ糖タンパク質の役割を指す。
【０１５４】
一般に、レンチウイルスベクター粒子は、１つ以上のプラスミドベクター、および／または機能的ベクター粒子を生成するために必要な構成要素をともにコードする統合要素を含有する、細胞株によって産生される。これらのレンチウイルスベクター粒子は、典型的には、複製可能でなく、すなわち、単回の感染のみが可能である。最も頻繁に、産生細胞染色体に安定して組み込まれた、複数のプラスミドベクターまたは個々の発現カセットが、レンチウイルスベクター粒子を生成する種々の遺伝構成要素を分離するために使用されるが、レンチウイルス構成要素の全てを有する、単一のプラスミドベクターを使用することができる。１つの例示では、パッケージング細胞株が、ＬＴＲ、ｃｉｓ作用パッケージング配列、および目的とする配列（すなわち、１つの免疫原をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列）を含む、ウイルスベクターゲノムを含有する１つ以上のプラスミド、ウイルス酵素および構造構成要素（例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ）をコードする少なくとも１つのプラスミド、およびアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする少なくとも１つのプラスミドで形質移入される。ウイルス粒子は、細胞膜を通して出芽し、典型的には、目的とする配列および樹状細胞を標的にするアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有する、２つのＲＮＡゲノムを含む、コアを含む。ある実施形態では、アルボウイルス糖タンパク質は、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質であり、糖タンパク質は、参照株ＨＲからのＥ２と比較して、ヘパラン硫酸に対する低減した結合を有するように設計される。これは、通常、ＨＲ  Ｅ２糖タンパク質配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化を伴う。同様に、Ｅ２糖タンパク質は、樹状細胞に対する標的特異性を増加させるように設計されてもよい。
【０１５５】
理論によって拘束されることを所望するわけではないが、細胞表面に対するウイルス粒子の結合は、エンドサイトーシスを誘発し、ウイルスをエンドソームに持ち込み、膜融合をトリガし、ウイルスコアがサイトゾルに侵入することを可能にすると考えられる。統合レンチウイルスベクター粒子を利用する、ある実施形態については、逆転写および核に対する生成物の移動後に、ウイルスのゲノムは、標的細胞ゲノムに統合し、目的とする配列を標的細胞のゲノムに組み込む。しかしながら、挿入突然変異生成の機会を低減するため、および指定免疫原の一過性の発現を促進するために、他の実施形態は、非統合レンチウイルスベクター粒子（すなわち、標的細胞ゲノムに統合しないもの）を利用するが、代わりに、エピソームから目的とする配列を発現する。いずれか一方の場合において、次いで、感染ＤＣは、目的とする配列（例えば、免疫原および随意に刺激性分子）を発現する。次いで、免疫原は、樹状細胞によって処理し、ＴおよびＢ細胞に提示することができ、抗原特異的免疫応答を生成する。上記で説明される特異的経路は、樹状細胞が抗原特異的免疫応答を刺激することができる限り必要とされない。
【０１５６】
ウイルス粒子は、予防および治療効果を提供するために対象に投与することができる。樹状細胞の感染および免疫原生成物の発現後に、免疫応答が生成物へ生成される。
ウイルスベクターエンベロープ
【０１５７】
節足動物媒介性ウイルス（アルボウイルス）は、蚊等の感染節足動物ベクターによって、ヒト、ウマ、または鳥等の宿主に移されるウイルスである。アルボウイルスはさらに、正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムおよび糖タンパク質含有エンベロープを有する、アルファウイルスおよびフラビウイルスを含む、ウイルスの亜科に分けられる。例えば、デング熱ウイルス、黄熱病ウイルス、および西ナイル熱ウイルスは、フラビウイルス族に属し、シンドビスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスは、アルファウイルス族の構成要素である（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６，  ４９９２  （１９９２）を参照）。シンドビスウイルスのエンベロープは、融合に関与すると考えられるＥ１、および細胞結合に関与すると考えられるＥ２といった、２つの膜貫通糖タンパク質を含む（例えば、Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３，  １３  （２００５）を参照）。シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質は、オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスを含む、他のレトロウイルスを偽型化することが知られている。
【０１５８】
本明細書で論議されるように、アルボウイルスエンベロープ糖タンパク質は、レンチウイルスベースのベクターゲノムを偽型化するために使用することができる。「偽型」レンチウイルスは、レンチウイルスゲノムとは明確に異なるウイルスによってコードされる、１つ以上のエンベロープ糖タンパク質を有する、レンチウイルス粒子である。エンベロープ糖タンパク質は、本明細書で説明されるように修飾され、突然変異させられ、または設計されてもよい。したがって、本明細書で説明されるレンチウイルスベクター粒子は、アルボウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、アルファウイルスまたはフラビウイルスエンベロープ糖タンパク質、例えば、修飾され、突然変異させられ、または設計され得るＥ２糖タンパク質を用いて偽型化される、レンチウイルスを含む。レンチウイルスはまた、ＶＳＶ−Ｇ、インフルエンザウイルス、アレナウイルス、ラブドウイルス、オルトミクソウイルス、ＨＩＶ１、ＨＩＶ２、およびＳＩＶを含む、他のエンベロープを用いて偽型化されてもよい。
【０１５９】
シンドビスウイルスおよび他のアルファウイルスのエンベロープは、ウイルス粒子膜の脂質重層に組み込み、典型的には、２つの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２の複数のコピーを含む。各核糖タンパク質は、膜貫通領域を有し、Ｅ２が、約３３個の残基の細胞質ドメインを有する一方で、Ｅ１の細胞質尾部は、非常に短い（約２個の残基）。Ｅ１およびＥ２の両方は、膜貫通領域の中または付近に付着したパルミチン酸を有する。Ｅ２は最初に、フーリンまたは他のＣａ２＋依存性セリンプロテイナーゼによって、Ｅ２およびＥ３と呼ばれる小糖タンパク質の中へ開裂される、前駆タンパク質として合成される。Ｅ２およびＥ１をコードする配列の間には、６Ｋと呼ばれるタンパク質をコードする配列が位置する。Ｅ３および６Ｋは、それぞれ、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質を膜の中へ転座させる働きをする、シグナル配列である。シンドビスウイルスゲノムでは、シンドビスエンベロープタンパク質のためのコード領域は、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥ１をコードする配列を含む。本明細書で使用されるように、アルボウイルスウイルスの「エンベロープ」は、少なくともＥ２を含み、また、Ｅ１、６Ｋ、およびＥ３を含んでもよい。シンドビスウイルス株ＨＲのエンベロープ糖タンパク質の例示的な配列は、配列番号１７として提示される。他のアルボウイルスエンベロープ糖タンパク質の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公的に利用可能なデータベースで見出すことができる。例えば、デングウイルス糖タンパク質をコードする配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＧＱ２５２６７７．１（とりわけＧｅｎＢａｎｋ）およびＮＣＢＩにおけるウイルス変異データベース（ＧｅｎＢａｎｋ受およびウイルス変異データベースは、エンベロープ糖タンパク質配列について参照することにより組み込まれる）で見出すことができ、ベネズエラウマ脳炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする例示的な配列は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＮＰ＿０４０８２４．１（エンベロープ糖タンパク質の配列について参照することにより組み込まれる）で見出すことができる。
【０１６０】
アルファウイルス、特にシンドビスウイルスに対する樹状細胞上の細胞受容体は、現在まで決定的に識別されていないが、１つの受容体は、ＤＣ−ＳＩＧＮであると考えられる（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７：１２０２２，  ２００３を参照）。「付着」、「結合」、「標的」、および同等物等といった用語の使用は、交換可能に使用され、シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質と細胞構成要素との間の相互作用の機構を示すように意図されていない。ＤＣ−ＳＩＧＮ（樹状細胞特異的ＩＣＡＭ−３（細胞内接着分子３）−結合ノンインテグリン、ＣＤ２０９としても知られている）は、物質の急速な結合およびエンドサイトーシスが可能なＣ型レクチン様受容体である（例えば、Ｇｅｉｊｔｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２：  ３３−５４，  ２００４を参照）。Ｅ２は、ＤＣ−ＳＩＧＮを通して、樹状細胞へウイルスを標的にすると考えられる。本明細書で示されるように、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現しない同質遺伝子細胞よりも良好に（少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍良好に）シンドビスウイルスＥ２を用いて偽型化されたウイルスベクター粒子によって形質導入される。どのようにしてＥ２糖タンパク質がウイルス感染を促進するかという機構は、おそらくＤＣ−ＳＩＧＮに対する直接結合、または配座の変化を引き起こすこと、あるいは何らかの他の機構を通して、ＤＣ−ＳＩＧＮを伴うと考えられる。実際の機構に関わらず、Ｅ２による標的化は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞、すなわち、樹状細胞にとって優先的である。
【０１６１】
シンドビスウイルスはまた、ヘパラン硫酸を介して細胞に結合するとも考えられる（例えば、Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：  ７３５７，  １９９８；  Ｂｕｒｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：  ７３４９，  １９９８を参照）。ヘパラン硫酸および他の細胞表面グリコサミノグリカンが、ほとんどの細胞型の表面上で見出されるため、ヘパラン硫酸とシンドビスエンベロープ糖タンパク質との間の相互作用を低減させることが望ましい。これは、ヘパラン硫酸に対するシンドビスウイルスエンベロープの結合を軽減すること、または樹状細胞に対するシンドビスウイルスエンベロープの結合を増加させること、例えば、親和力を増加させること、あるいは両方によって、達成することができる。結果として、他の細胞型によって発現されてもよく、たとえエンベロープがＤＣ−ＳＩＧＮに特異的であっても起こり得る、他の分子に対する非特異的結合が低減され、向上した特異性は、所望の免疫応答を低減し得る副作用、または他の細胞型の標的外形質導入と関連付けられる副作用等の望ましくない副作用を回避する働きをしてもよい。代替として、またはＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞の比較的特異的な形質導入の利点に加えて、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質を用いて偽型化されたウイルス粒子は、ＶＳＶ−Ｇ等の糖タンパク質を用いて偽型化されたウイルス粒子と比べて、他の利点を提供してもよい。そのような利点の実施例は、低減した補体媒介性溶解および／または低減した神経細胞標的化を含み、その両方は、ＶＳＶ−Ｇ偽型ウイルス粒子の投与と関連すると考えられる。
【０１６２】
種々の例示では、レンチウイルスベクター粒子は、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する細胞に特異的に結合し、ヘパラン硫酸に対する低減または無効化した結合を有する。つまり、シンドビスウイルスエンベロープＥ２糖タンパク質は、他の細胞型に対してＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞へウイルスを優先的に方向付けるように修飾されてもよい。そのようなエンベロープ糖タンパク質は、骨髄性またはリンパ球様細胞等のヘパリン硫酸を普遍的に発現する他の細胞型に対して、樹状細胞、特に、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞に優先的に結合する。以下で説明されるように、この優先的結合は、理想的には、樹状細胞、特に、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞の優先的感染をもたらす。いくつかある研究の中でも、構造研究および分子モデリングから得られる情報に基づいて、エンベロープタンパク質の変異体配列、特に、Ｅ２およびＥ１糖タンパク質は、糖タンパク質がエンベロープタンパク質としてのそれらの機能を維持するが、所望の結合特異性、親和力、または結合のレベルを有するように、設計および生成される。候補変異体配列は、各糖タンパク質について生成され、最も望ましい特性を伴うエンベロープ糖タンパク質を識別するように、以下で説明される方法または当技術分野で公知である他の方法を使用して、分析されてもよい。
【０１６３】
シンドビスＥ２のある変異体配列は、配列番号１と比較して、残基１６０において少なくとも１つのアミノ酸改変を有する。残基１６０は、欠失されるか、またはグルタミン酸以外のアミノ酸に変更される。改変は、最も一般的には、少なくとも１つのアミノ酸の置換であるが、代替として、１つ以上のアミノ酸の追加または欠失となり得る。好ましくは、任意の付加的なアミノ酸は、数が少なく、安全性を低下し得る抗原エピトープ（例えば、血球凝集素タグ配列）を含まない。２つ以上の改変があるときに、それらは、両方と同一の種類（例えば、置換）または異なる種類（例えば、置換および欠失）のものとなり得る。複数の改変が、タンパク質配列内で分散する、または隣接して位置することができる。
【０１６４】
一例として、変異体配列は、配列番号１の約５０から約１８０の残基に及ぶ領域内に、少なくとも１つのアミノ酸改変を含む。この領域内には、ヘパラン硫酸に対する結合に関与するアミノ酸がある。Ｅ２の正味正電荷を低減することによって、ヘパラン硫酸との静電相互作用を低減することができ、ヘパラン硫酸に対する減少した結合をもたらす。この領域中の正電荷を持つアミノ酸の候補は、残基６３、７０、７６、８４、９７、１０４、１２９、１３１、１３３、１３９、１４８、１４９、１５９におけるリシン、および残基６５、９２、１２８、１３７、１５７、１７０、１７２におけるアルギニンを含む（例えば、Ｂｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３４７：  １８３−１９０，  ２００６を参照）（配列番号１を参照）。これらのアミノ酸のうちの少なくともいくつかは、ヘパラン硫酸に結合するＥ２に直接関わる。正味正電荷は、リシンまたはアルギニンの欠失、あるいは中性または負電荷を持つアミノ酸とのリシンまたはアルギニンの置換によって低減することができる。例えば、これらのリシンおよびアルギニンのうちの１つ以上は、グルタミンまたはアスパラギン酸と交換されてもよい。ある実施形態は、リシン７０、７６、または１５９の少なくとも１つの置換を有する。Ｅ２糖タンパク質の例示的なアミノ酸配列は、配列番号３（例えば、残基６６から４８８）、４（例えば、残基６６から４８８）、および５（例えば、残基６６から４８６）に記載されている。Ｅ２がＥ３を伴うポリタンパク質として発現される場合において、天然Ｅ３／Ｅ２開裂部位に隣接して位置するリシンが維持され、つまり、認識配列および開裂部位は改変されていない。代替として、天然エンドペプチダーゼ開裂部位が、異なるエンドペプチダーゼの認識配列と交換される。
【０１６５】
Ｅ２のある変異体もまた、樹状細胞に対する結合に正の影響を及ぼす方法で修飾される。参照ＨＲ配列内の残基１６０において見出されるグルタミン酸の改変は、樹状細胞に対する結合を向上させることができる（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４，  １１８４９，  ２０００を参照）。残基１６０の欠失または残基１６０の置換等の改変が、ある変異体で見出される。特定の変異体では、電荷を持たないアミノ酸が、Ｇｌｕに置換され、他の変異体では、非酸性アミノ酸が、Ｇｌｕに置換される。典型的には、Ｇｌｕ１６０は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、またはイソロイシンを含む、小型または脂肪族アミノ酸のうちの１つと交換される。
【０１６６】
他の変異体は、２つ以上のアミノ酸改変を含む。典型的には、これらの変異体では、改変のうちの１つは、Ｇｌｕ１６０であり、残りの改変は、配列番号１の約５０から約１８０の残基に及ぶ領域内のリシンおよびアルギニンのうちの１つ以上の変化である。変異体のうちのあるものは、非酸性残基に対するＧｌｕ１６０の改変または欠失、および非塩基性アミノ酸を用いたリシン７０、リシン７６、またはリシン１５９の１つ以上の改変を含む。いくつかの特異的変異体は、Ｇｌｙに対するＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対するＬｙｓ７０、およびＧｌｕに対するＬｙｓ１５９、Ｇｌｙに対するＧｌｕ１６０、Ｇｌｕに対するＬｙｓ７０、７６、および１５９、Ｇｌｕ１６０の欠失およびＧｌｕに対するＬｙｓ７０および１５９、ならびにＧｌｕ１６０の欠失およびＧｌｕに対するＬｙｓ７０、７６、および１５９を含む。例えば、アミノ酸が欠失または挿入された場合に、それに従って番号付けが適応するように、本明細書で使用される位置の番号付けは、配列番号１を参照して行われることが理解される。例えば、残基１が不在の場合には、位置１６０は、位置１５９を指す。
【０１６７】
ある実施形態では、Ｅ２タンパク質は、最初に、少なくともＥ３と融合して、またはリーダー配列と融合して、ポリタンパク質として発現される。リーダー配列がＥ３または別の配列であるかどうかにかかわらず、ウイルスエンベロープ内のＥ２は、Ｅ３または他のリーダー配列を含まないべきである。言い換えれば、Ｅ２は、好ましくは、Ｅ３／Ｅ２融合タンパク質（例えば、ＳＶＧｍｕと呼ばれるＥ３／Ｅ２融合タンパク質）ではない。ある実施形態では、Ｅ２は、Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１ポリタンパク質の一部として発現される。シンドビスウイルスは、ポリタンパク質の一部としてＥ２を自然に発現し、Ｅ３／Ｅ２、Ｅ２／６Ｋ、および６Ｋ／Ｅ１のための接合領域は、エンドペプチダーゼによって認識および開裂される配列を有する。通常、Ｅ３／Ｅ２接合は、残基６５および６６の間でフーリンまたはフーリン様セリンエンドペプチダーゼによって開裂される。フーリンは、２つのアミノ酸によって分離される対合アルギニン残基に対する特異性を有する。フーリンによるＥ３／Ｅ２開裂を維持するために、残基６２−６６（ＲＳＫＲＳ；配列番号２６）は、２つのアミノ酸の分離を伴う２つのアルギニン残基、およびセリン残基を維持するべきである。代替として、異なる開裂配列を、Ｅ３／Ｅ２フーリン開裂配列または他の開裂配列のうちのいずれかの代わりに使用することができる。制限なく、アスパラギン酸エンドペプチダーゼ（例えば、カテプシンＤ、キモシン、ＨＩＶプロテアーゼ）、システインエンドペプチダーゼ（ブロメライン、パパイン、カルパイン）、金属エンドペプチダーゼ（例えば、コラゲナーゼ、サーモリシン）、セリンエンドペプチダーゼ（例えば、キモトリプシン、因子ＩＸａ、因子Ｘ、トロンビン、トリプシン）、ストレプトキナーゼを含む、エンドペプチダーゼのために、認識および開裂部位を組み込むことができる。これらの酵素のための認識および開裂部位配列は周知である。
【０１６８】
すでに記述されているもの以外のＥ２の中のアミノ酸もまた、改変されてもよい。概して、変異体Ｅ２配列は、参照Ｅ２配列に対する少なくとも８０％配列アミノ酸識別を有するであろう、またはそれは、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％配列識別を有してもよい。したがって、上記で説明される変異体Ｅ２糖タンパク質のうちのいずれかは、上記で説明される突然変異（位置１６０における突然変異、または約５０から約１８０、例えば、７０、７６および／または１５９の残基に及ぶ領域中のリシンおよびアルギニンのうちの１つ以上における突然変異を含むが、それらに限定されない）のうちのいずれかを伴って、参照Ｅ２配列のうちのいずれかに対する少なくとも８０％配列アミノ酸識別、例えば、配列番号１、３（例えば、残基６６から４８８）、４（例えば、残基６６から４８８）、または５（例えば、残基６６から４８６）の成熟Ｅ２糖タンパク質配列を有してもよい。変異体糖タンパク質は、Ｅ２を含むエンベロープを有するウイルス粒子による、樹状細胞の感染を促進する能力等の、生物学的機能を示すべきである。実験は、ウイルス集合の種々の態様、細胞表面に対する付着、および感染において重要な役割を有すると考えられる、エンベロープ糖タンパク質の領域を識別している。変異体を作製するときに、以下の情報をガイドラインとして使用することができる。ほぼ残基４０８から４１５である、Ｅ２の細胞質尾部が、ウイルス集合のために重要である（例えば、その全体で組み込まれる、Ｗｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：  ４４５８−４４６８，  ２００６を参照）。他の領域が、二次構造（ほぼ残基３３−５３）を形成することに関与し、かつ輸送およびタンパク質安定性（ほぼ残基８６−１１９）に関与する（例えば、その全体で組み込まれる、Ｎａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６３：１２４−１４７，  ２００７を参照）。変異体は、ほぼ残基３７０−３８０で膜に及ぶ領域の疎水性を保持してもよい。変異体は、Ｎ結合型糖鎖合成部位の残基ＮＩＴ（残基１９６−１９８）およびＮＦＴ（残基３１８−３２０）の一方または両方を保持してもよく、かつパルミトイル化される部位（Ｃ−３９６、Ｃ４１６、およびＣ４１７）のうちの１つ以上を保持してもよい（例えば、その全体で参照することにより本明細書に組み込まれる、Ｓｔｒａｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．  ５８，  ４９１−５６２，  １９９４；  ｐｐ．  ４９９−５０９を参照）。他方で、Ｅ２の多くの領域は、有害な事象を伴わずに改変されてもよい。例えば、Ｅ２の中の多くの異なる位置におけるトランスポゾンの挿入が、依然として生存ウイルスをもたらした（例えば、上記のＮａｖａｒａｔｍａｒａｊａｈを参照）。
【０１６９】
ある実施形態では、タグペプチドが、Ｅ３、６Ｋ、またはＥ１タンパク質に組み込まれてもよい。いくつかの目的で、タグがＥ２に組み込まれてもよいが、タグはヒト患者に投与するための製品で使用するためには望ましくない。短い配列（例えば、５−３０個のアミノ酸）である、タグペプチドは、エンベロープ発現およびウイルス粒子の中のその存在の検出を促進するために使用することができる。検出目的で、タグ配列は、典型的には、抗体または化学物質によって検出可能となるであろう。タグの別の用途は、ウイルス粒子の精製を促進することである。タグの結合パートナーを含有する基質は、ウイルスを吸収するために使用することができる。ウイルスの溶出は、結合パートナーからタグを変位させる部分を用いた治療によって達成することができ、またはタグ配列が開裂可能な配列と結合しているときに、適切なエンドペプチダーゼを用いた治療がウイルスの放出を便宜的に可能にするであろう（例えば、ＱｉａＧＥＮ（登録商標）カタログ、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍを参照）。タグペプチドの除去は、概して、動物対象でのウイルス粒子使用の安全目的で望ましい。タグが除去されない場合、タグに対する免疫応答が起こってもよい。
【０１７０】
好適なタグは、制限なく、とりわけ、抗体が市販されている、ＦＬＡＧ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号３５）（その全体で組み込まれる米国特許第４，７０３，００４号）、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ（Ｈｉｓ）（その全体で組み込まれる米国特許第４，５６９，７９４号）、チオレドキシン、ＨＡ（血球凝集素）タグを含む。ポリ（Ｈｉｓ）は、ニッケルまたはコバルト等の結合金属イオンを含有する、親和性媒体上に吸収し、低ｐＨ媒体で溶出することができる。
【０１７１】
ベクター粒子は、樹状細胞を標的にするウイルスに組み込まれたエンベロープ糖タンパク質の特異性を判定するように評価されてもよい。例えば、骨髄細胞の混合群を、対象から得て生体外で培養することができる。代替として、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する、または発現しない同質遺伝子細胞株を得て使用することができる。組換えウイルスを、骨髄細胞または同質遺伝子細胞株の混合群に投与することができ、ウイルスに組み込まれたレポーターの発現を、培養細胞の中で分析することができる。ある実施形態は、細胞の混合群が別個の部分に分割され、次いで、それらが減少する量のウイルス（例えば、各部分において２倍、５倍、１０倍少ないウイルス）で別々に培養される、限界希釈分析を採用してもよい。いくつかの実施形態では、混合細胞群の中の感染細胞の少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、７０％、８０％、あるいは９０％、または少なくとも約９５％が、ＤＣ−ＳＩＧＮを発現する樹状細胞である。ある実施形態では、感染樹状細胞対感染非樹状細胞（または非ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞）の比は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０，０００：１、またはそれ以上である。限界希釈については、より優れた選択性が、典型的には、入力ウイルスのより高い希釈（すなわち、より少ない量）で見られる。
【０１７２】
偽型ウイルス粒子の活性は、種々の技法のうちのいずれかによって判定することができる。例えば、感染効率性（ＩＵ、感染単位）を測定する好ましい方法は、ウイルス粒子を細胞に投与し、ベクターゲノム内でコードされた生成物の発現を測定することによる。分析することができる任意の生成物が使用されてもよい。１つの便利な種類の生成物は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光タンパク質である。使用することができる他の生成物は、細胞表面上で発現されるタンパク質（例えば、抗体結合による検出）、酵素、および同等物を含む。生成物が抗原であり、細胞が樹状細胞である場合、免疫応答を判定することによって、感染性／活性を評価することができる。さらに、ほ乳類における副作用を解明することが可能である。樹状細胞を特異的に標的にする能力はまた、例えば、以下で説明されるような細胞培養において、直接試験することもできる。
【０１７３】
本明細書で説明されるウイルス粒子を含む、ベクター粒子はまた、調製し、それらの選択性および／または標的細胞膜の貫通を促進するそれらの能力について試験することもできる。未修飾糖タンパク質とともにエンベロープを有するウイルス粒子を、比較のための対照として使用することができる。簡潔に言えば、エンベロープ糖タンパク質のための受容体を発現する細胞は、標準感染分析を使用して、ウイルスに感染させられる。特定時間後、例えば、感染後４８時間で、細胞を収集することができ、ウイルスに感染した細胞の割合を、例えば、フローサイトメトリによって判定することができる。選択性は、ウイルスに感染した細胞の割合を計算することによって採点することができる。同様に、ウイルス力価に対する変異体エンベロープ糖タンパク質の影響は、変異体エンベロープを含むウイルスに感染した細胞の割合を、対応する野生型（未修飾）エンベロープ糖タンパク質を含むウイルスに感染した割合で割ることによって、定量化することができる。特に好適な変異体は、選択性および感染力価の最良の組み合わせを有するであろう。いったん変異体が選択されると、活性を低下させることなく、これらのウイルスを濃縮できることを確認するように、ウイルス濃度分析を行うことができる。ウイルス上清が収集され、超遠心分離によって濃縮される。ウイルスの力価は、ウイルス原液の限定希釈およびエンベロープ糖タンパク質のための受容体を発現する細胞の感染によって、上記で説明されるようにウイルスによって発現される生成物の発現を測定して、判定することができる。
【０１７４】
標的細胞の中に対するレンチウイルスベクター粒子の侵入が、別の種類の活性の評価である。ＢｌａＭ−Ｖｐｒ（ベータ−ラクタマーゼＶｐｒ）融合タンパク質が、ＨＩＶ−１ウイルス浸透を評価するために使用されており、ＢｌａＭおよびＥ１またはＥ２／Ｅ１融合タンパク質等のシンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質の融合は、融合および標的細胞の中に対する侵入を促進することにおけるエンベロープタンパク質の有効性を評価するために使用することができる。ウイルス粒子は、例えば、ウイルス要素、ＢｌａＭ−Ｖｐｒ、および目的とする変異体エンベロープ（および適切である場合は親和性分子）を含む、１つ以上のベクターとのパッケージング細胞の一過性の形質移入によって、調製されてもよい。結果として生じるウイルスは、分子を発現する細胞に感染するために使用することができ、標的分子（または親和性分子）は、（抗体等の）結合の遊離阻害剤の不在または存在下で特異的に結合する。次いで、細胞は、ＣＯ２独立媒体で洗浄し、ＣＣＦ２染料（Ａｕｒｏｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を装填することができる。開裂反応の完了を可能にするための室温での培養後、細胞をパラホルムアルデヒドによって固定し、フローサイトメトリおよび顕微鏡検査によって分析することができる。青色細胞の存在は、細胞質の中へのウイルスの侵入を示し、遮断抗体が追加されたときは、より少ない青色細胞が期待されるであろう（例えば、Ｃａｖｒｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１１５１−５４，  ２００２を参照）。
【０１７５】
侵入が低いｐＨに依存しているかどうかを調査するため、および所望のｐＨ依存性を伴うエンベロープ糖タンパク質を識別するために、ＮＨ４ＣｌまたはｐＨを改変する他の化合物を、感染ステップで追加することができる（ＮＨ４Ｃｌがエンドソームの酸性コンパートメントを中和するであろう）。ＮＨ４Ｃｌの場合、青色細胞の消滅は、ウイルスの侵入が低ｐＨ依存性であることを示すであろう。加えて、活性がｐＨ依存性であることを確認するために、塩化アンモニウム、クロロキン、コンカナマイシン、バフィロマイシンＡ１、モネンシン、ニゲリシン等のリソソーム作用剤が、培養緩衝剤の中へ追加されてもよい。これらの薬剤は、エンドソームコンパートメント内のｐＨを上昇させる（例えば、Ｄｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｂｉｏｌ．  ２００，  １−８，  １９９７を参照）。これらの薬剤の阻害作用は、ウイルス融合および侵入のためのｐＨの役割を明らかにするであろう。異なる融合性分子を表すウイルス間の異なる侵入動態が比較されてもよく、最も好適なものが特定の用途のために選択されてもよい。
【０１７６】
逆転写を監視し、ウイルス侵入の動態の指示としてウイルスＤＮＡ合成の動態を測定するために、ＰＣＲベースの侵入分析を利用することができる。例えば、特定のエンベロープタンパク質分子を含む、ウイルス粒子が、２９３Ｔ細胞、ＤＣ、またはエンベロープタンパク質分子のための適切な結合パートナー（受容体）を発現するように設計されている、あるいは自然に発現する、任意の他の細胞等の標的細胞を用いて培養される。即時に、または（感染が起こることを可能にするための）時間増分後のいずれかで、非結合ウイルスが除去され、細胞のアリコートがウイルス核酸について分析される。ＤＮＡが、これらのアリコートから抽出され、概して、ＬＴＲ特異的プライマーで準備された半定量分析において、増幅分析を受ける。ＬＴＲ特異的ＤＮＡ生成物の出現は、ウイルス侵入の成功を示す。
【０１７７】
ウイルスベクター粒子を用いたウイルス感染後に、免疫原が標的樹状細胞によって発現される。生体外で接触した場合には、標的樹状細胞は、例えば、注射によって、患者に戻され、そこで、所望の抗原に対する免疫応答を生成することが可能である免疫細胞と相互作用する。好ましい実施形態では、組換えウイルスが患者に注射され、原位置で標的化樹状細胞を形質導入する。次いで、樹状細胞は、治療される疾患または障害と関連付けられる特定の抗原を発現し、患者は、疾患または障害に対する有効な免疫応答を開始することができる。
【０１７８】
ウイルスベクターゲノムは、１つよりも多くの免疫原をコードするポリヌクレオチド配列を含有してもよく、標的樹状細胞の形質導入時に、細胞に送達される各免疫原に対する免疫応答を生成する。いくつかの実施形態では、免疫原は、単一の疾患または障害に関係する。他の実施形態では、免疫原は、複数の疾患または障害に関係する。
【０１７９】
ベクター粒子のうちのいくつかでは、ＤＣの成熟を活性化および／または刺激するＤＣ成熟因子が、目的とする免疫原をコードする配列と併せて送達される。ある代替実施形態では、ＤＣは、ベクター粒子の送達の前に、それと同時に、またはその後に、ＤＣ成熟因子の送達によって活性化される。ＤＣ成熟因子は、ベクター粒子の投与とは別に提供されてもよい。
【０１８０】
本明細書で説明されるように、１つ以上の免疫変調またはＤＣ成熟因子は、ベクター粒子に含有される１つ以上の配列によってコードし、粒子が樹状細胞に侵入または感染した後に発現させることができる。免疫変調因子をコードする配列はまた、パッケージング細胞株内の１つ以上の免疫原をコードするベクター粒子と同時形質移入される、別個のベクターの中で提供することもできる。
【０１８１】
本明細書で説明される方法は、対象における養子免疫療法に使用されてもよい。上記で説明されるように、免疫応答が所望される、免疫原が識別される。所望の免疫原をコードするポリヌクレオチドが得られ、ベクター粒子の中へパッケージ化される。標的樹状細胞は、患者から得られ、所望の免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター粒子で形質導入される。次いで、樹状細胞は、患者に戻される。
【０１８２】
ベクター粒子（例えば、本明細書で説明されるウイルスベクター粒子）は、生体内で注射されてもよく、そこで、粒子は、ＤＣに感染し、目的とする免疫原をコードするヌクレオチド配列を送達する。ウイルス粒子の量は、少なくとも３×１０６感染単位（ＩＵ）であり、少なくとも１×１０７ＩＵ、少なくとも３×１０７ＩＵ、少なくとも１×１０８ＩＵ、少なくとも３×１０８ＩＵ、少なくとも１×１０９ＩＵ、または少なくとも３×１０９ＩＵとなり得る。選択された間隔で、例えば、ベクター粒子に含まれる組換え発現ベクターの中に存在するポリヌクレオチド配列によって共発現される場合、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ等のマーカー発現を観察することによって、発現を測定するために、受容者のリンパ系器官からのＤＣが使用されてもよい。核酸監視技法および逆転写酵素（ＲＴ）活性の測定もまた、ベクター粒子がレンチウイルスベクター粒子であるときにベクター粒子の生体内分布を分析するために使用することができる。ベクター粒子（レンチウイルスベクター粒子を含む）で治療した受容者の末梢血単核球、リンパ節、脾臓、または悪性あるいは標的病原体感染組織からのＴ細胞が、抗原刺激に対する応答の規模および耐久性から測定されてもよい。上皮細胞およびリンパ球様細胞等のＤＣ以外の組織細胞が、生体内遺伝子送達の特異性について分析されてもよい。
免疫応答
【０１８３】
本明細書で説明されるように、免疫原に対する免疫応答を誘発するための方法が提供される。免疫応答に関与する免疫系の細胞は、概して、免疫細胞と呼ばれ、リンパ球および補助細胞等の非リンパ球様細胞を含む。リンパ球は、外来抗原を特異的に認識して、それに応答する細胞であり、補助細胞は、ある抗原に特異的ではないが、免疫応答の認知および活性化段階に関与する細胞である。例えば、単核食細胞（マクロファージ）、他の白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球を含む顆粒球）、および樹状細胞が、免疫応答の誘発において補助細胞として機能する。外来抗原によるリンパ球の活性化は、抗原を排除するように機能する、多数のエフェクター機構の誘発または誘出につながる。エフェクター機構に影響を及ぼす、または関与する、単核食細胞等の補助細胞はまた、エフェクター細胞とも呼ばれる。
【０１８４】
リンパ球の主要な部類は、大型顆粒リンパ球である、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。Ｂ細胞は、抗体を産生することが可能である。Ｔリンパ球はさらに、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋（本明細書および当技術分野ではＣＤ４とも呼ばれる））および細胞溶解または細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋（本明細書および当技術分野ではＣＤ８とも呼ばれる））に細分される。ヘルパー細胞は、Ｔ細胞ならびにＢ細胞およびマクロファージを含む他の細胞の増殖および分化を推進するサイトカインを分泌し、炎症性白血球を集めて活性化する。調節Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細胞と呼ばれる、Ｔ細胞の別の部分群が、免疫系の活性化を活発に抑制し、病理的自己反応性、つまり、自己免疫疾患を予防する。
【０１８５】
免疫応答を誘発するための本明細書で説明される方法は、本明細書および当技術分野ではＢ細胞応答とも呼ばれる、体液性応答を誘発してもよく、または種々の種類のＴ細胞（すなわち、Ｔリンパ球）を伴う細胞媒介免疫応答を誘発してもよい。体液性応答は、抗原（または免疫原）に特異的に結合する抗体の産生を含む。抗体は、形質細胞として知られている、分化したＢリンパ球によって産生される。細胞媒介応答では、種々の種類のＴリンパ球が、いくつかの機構によって抗原を排除するように作用する。例えば、特異的抗原を認識することが可能であるヘルパーＴ細胞が、免疫応答に関与する免疫系の付加的な細胞を集めるように、サイトカイン等の可溶性メディエーターを放出することによって応答してもよい。また、細胞障害性Ｔ細胞もまた、抗原を特異的に認識することが可能であり、抗原を持つ細胞または粒子に結合し、破壊または損傷することによって応答してもよい。
【０１８６】
宿主または対象における免疫応答は、本明細書で説明され、当業者が精通するであろう、任意の数の周知の免疫学的方法によって判定されてもよい。本明細書で説明されるように、免疫応答の存在およびレベルを判定するための方法および技法は、例えば、蛍光共鳴エネルギー転移、蛍光偏光、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移、シンチレーション近接分析、レポーター遺伝子分析、蛍光消光酵素基質、発色酵素基質および電気化学発光、免疫測定法（酵素免疫蛍光測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法、免疫ブロット法、免疫組織化学、および同等物等）、表面プラズモン共鳴、レポーター遺伝子を使用するもの等の細胞ベースの分析、および機能分析（例えば、免疫機能および免疫応答性を測定する分析）を含む。
【０１８７】
そのような分析は、可溶性抗体、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、およびＴＧＦ−β）、リンフォカイン、ケモカイン、ホルモン、成長因子、および同等物等の可溶性メディエーター、ならびに他の可溶性小ペプチド、炭水化物、ヌクレオチドおよび／または脂質メディエーターの存在およびレベルの生体内または生体外判定を含むが、それらに限定されない。免疫測定法はまた、免疫系の細胞の改変した機能または構造性質、例えば、細胞増殖、改変した部分、特異的遺伝子発現または細胞溶解挙動等の特殊化活性の誘発、刺激に応答した樹状細胞の成熟等の細胞成熟、Ｔｈ１応答とＴｈ２応答との間の関係の改変、改変した表面抗原発現プロファイルまたはアポトーシス（プログラム細胞死）の発生を含む、免疫系の細胞による細胞分化を分析することによって、細胞活性化状態変化を判定することを含む。これらおよび同様の分析を行うための手順は、例えば、Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ：  Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  １９９８）で見出され得る。また、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；  Ｗｅｉｒ，  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ  （１９８６）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｇｉｉ  （ｅｄｓ．）  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ  （１９７９）；  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１３０９  （１９９８）およびその中で引用された参考文献も参照されたい。
【０１８８】
目的とする免疫原に特異的に結合する抗体の存在および／またはレベルを判定することは、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、免疫ブロット法、向流免疫電気泳動、放射免疫測定法、ドットブロット分析、阻害または競合分析、および同等物を含む、当技術分野で日常的に実践されているいくつかの免疫測定法のうちのいずれか１つを使用して、判定されてもよい（例えば、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８８）を参照）。免疫測定法はまた、免疫原に特異的に結合する抗体の部類およびアイソタイプを判定するように行われてもよい。免疫原に特異的に結合し、免疫を持つ対象における抗体特異的免疫応答を検出する免疫測定法で対照として使用され得る、抗体（そのポリクローナルおよび／またはモノクローナルあるいは抗原結合断片）は、概して、当業者に公知である種々の技法のうちのいずれかによって調製されてもよい。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８８）；  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  ＩＬＡＲ  Ｊ．  ４６：３１４−１９  （２００５）；  （Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５−９７  （１９７６）；  Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：５１１−１９  （１９７５）；  Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １：２．５．１−２．６．７  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９１）；米国特許第４，９０２，６１４号、第４，５４３，４３９号、および第４，４１１，９９３号；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｋｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．）  （１９８０）；  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （ｅｄｓ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８８）を参照されたい。また、例えば、Ｂｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄ．  ７０：９８６−９２  （２００４）；  Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：２５７−５９  （２００４）も参照されたい。免疫原またはその免疫原性断片、あるいは免疫原またはその免疫原性断片を持つ細胞または粒子は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれか一方の産生のために、動物に免疫を与えるために使用されてもよい。
【０１８９】
サイトカインのレベルは、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色、およびフローサイトメトリ、ならびにそれらの組み合わせ（例えば、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリ）を含む、本明細書で説明され、当技術分野で実践される方法に従って判定されてもよい。免疫応答の抗原特異的誘出または刺激に起因する、免疫細胞増殖およびクローン性増殖は、脾臓細胞またはリンパ節からの細胞等のリンパ球を単離し、抗原で細胞を刺激し、ＭＴＴ分析および同等物等のトリチウム化チミジンまたは非放射分析の組み込み等により、サイトカイン産生、細胞増殖、および／または細胞生存を測定することによって、判定されてもよい。Ｔｈ１免疫応答とＴｈ２免疫応答との間の平衡に対する本明細書で説明される免疫原の作用は、例えば、ＩＦＮ−、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、およびＴＮＦ−β等のＴｈ１サイトカイン、ならびにＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１３等の２型サイトカインのレベルを判定することによって、調べられてもよい。
【０１９０】
ＣＴＬ免疫応答のレベルおよび記憶ＣＤ４Ｔ細胞応答のレベルは、本明細書で説明され、当技術分野で日常的に実践されている、多数の免疫学的方法のうちのいずれか１つによって判定されてもよい。ＣＴＬ免疫応答のレベルは、本明細書で説明される組成物、ベクター、またはベクター粒子のうちのいずれか１つの投与の前に判定され、次いで、記憶ＣＤ４Ｔ細胞ヘルプを提供する組成物、ベクター、またはベクター粒子の１回以上の投与後の適切な時点でのＣＴＬ免疫応答のレベルと比較するために使用されてもよい。ＣＴＬ活性を判定するための細胞毒性分析が、当技術分野で日常的に実践されている、いくつかの技法および方法のうちのいずれか１つを使用して行われてもよい（例えば、Ｈｅｎｋａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｐａｕｌ  （ｅｄ．）  （２００３  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ），ページ１１２７−５０の中の“Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ”、およびその中で引用された参考文献を参照）。
【０１９１】
例えば、アジュバントを含む組成物、および免疫原をコードするポリヌクレオチドを含有する、ベクター粒子を含む組成物が、本明細書で説明される方法に従って投与されるときに、ＣＴＬ免疫応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答のレベルは、ベクター粒子と同一の組成物の中のアジュバントを投与することと比較して強化される（向上させられる）。例えば、５０％向上が、細胞内サイトカイン染色、ＥＬＩＳＰＯＴ、または両方の組成物の投与後の１〜４週間にわたるＬｕｍｉｎｅｘによる可溶性サイトカイン分泌の測定等の機能的Ｔ細胞分析によって測定されたときに観察されてもよい。
【０１９２】
本明細書で使用されるように、結合パートナーまたは抗体は、抗体が、好ましくは、約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上の親和定数Ｋａを伴って、検出可能なレベルで免疫原またはその免疫原性断片と反応する場合に、目的とする免疫原に「免疫特異的」、「特異的」である、または「特異的に結合」するといわれる。その同種抗原に対する抗体の親和性はまた、解離定数ＫＤとして一般的に表され、抗体は、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合に、目的とする免疫原に特異的に結合する。
【０１９３】
結合パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技法を使用して、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ５１：６６０  （１９４９））によって説明されている技法によって、および表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；  ＢＩＡｃｏｒｅ（商標），  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）によって、容易に判定することができる。表面プラズモン共鳴については、標的分子が固相上で固定化され、フローセルに沿って流れる移動相内で結合パートナー（またはリガンド）に暴露される。固体化標的に対するリガンド結合が起こる場合、局所的屈折率が変化し、反射光の強度の変化を検出することによってリアルタイムで監視することができる、ＳＰＲ角度の変化につながる。結合反応の関連および解離相の見掛けの速度定数をもたらすように、ＳＰＲシグナルの変化率を分析することができる。これらの値の比は、見掛けの平衡定数（親和性）を生じる（例えば、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５３：２５６０−２５６５  （１９９３）を参照）。
【０１９４】
本明細書で説明される方法に従って、少なくとも１つの免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを含有する、ベクター粒子を含む組成物、およびアジュバントを含む組成物を受容した対象における免疫原に対する免疫応答の存在およびレベルを判定するために、生物学的サンプルが対象から得られてもよい。本明細書で使用されるような「生物学的サンプル」は、血液サンプル（それから血清または血漿が調製されてもよい）、生検標本、体液（例えば、肺洗浄、腹水、粘膜洗浄、滑液）、骨髄、リンパ節、組織外植片、臓器培養、または対象あるいは生物学的起源からの任意の他の組織あるいは細胞調製であってもよい。
【０１９５】
免疫応答を判定するための本明細書で説明される全ての免疫測定法および方法に関して、当業者であれば、また、これらの方法を実践するときに、どの対照が適切に含まれるかを容易に認識および理解するであろう。反応構成要素の相互作用を可能にするために十分な反応構成要素の濃度、緩衝剤、温度、および期間を、本明細書で説明され、当業者が精通している方法に従って、判定および／または調整することができる。
使用方法および組成物
【０１９６】
いったん抗原が免疫応答を誘発するための免疫応答として識別および選択されると、所望の免疫原をコードするポリヌクレオチド配列が、識別および選択される。次いで、ポリヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクター、またはベクターを含むベクター粒子が、少なくとも１つの薬学的に好適な賦形剤または担体とともに免疫原性組成物の中で製剤化される。本明細書で説明されるように、アジュバントは、少なくとも１つの薬学的に好適な賦形剤または担体とともに製剤化される。免疫原性組成物およびアジュバント組成物の両方は、それぞれ、免疫原およびアジュバントのため、ならびに投与経路（または様態）のために適切な方式で製剤化される。
【０１９７】
本明細書で説明されるように、少なくとも１つの免疫原または免疫原性組成物が、有効な体液性応答および／または有効な細胞媒介免疫応答（細胞障害性Ｔ細胞応答を含んでもよい）であってもよい、有効な免疫応答を誘発するために十分な量で、それを必要としている対象に投与される。本明細書で説明されるように、対象に投与されるアジュバントまたはアジュバント組成物は、少なくとも１つの免疫原に対する免疫応答を強化する、または向上させる。
【０１９８】
したがって、免疫原性組成物、組換え発現ベクター、およびベクター粒子は、疾患または障害、例えば、感染症または癌を予防（例えば、その発生または再発の可能性を低減する）および／または治療するための方法で有用であり得る。予防または治療される感染症は、免疫原が由来する感染症微生物（例えば、ウイルス、細菌、寄生虫、または真菌）によって引き起こされる。治療される疾患または障害が癌であるときに、免疫原は、特定の癌細胞のうちの１つ以上によって発現されると考えられている、または知られている、腫瘍関連抗原である。対象に投与されてもよい種々の免疫原のうちのそれぞれ、および関連感染性生物または癌のうちのそれぞれが、本明細書で詳細に説明される。
【０１９９】
これらの方法で使用され得る、例示的な免疫原およびアジュバントが、本明細書で詳細に説明される。特定の具体的実施形態では、感染性微生物（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生虫）からの少なくとも１つ、２つ、または３つ以上の免疫原が、ベクター粒子に組み込まれ、免疫原性組成物に含まれる、組換え発現ベクターに組み込まれたヌクレオチド配列によってコードされてもよい。一例として、少なくとも１つ、２つ、または３つ以上の免疫原は、本明細書および当技術分野でさらに詳細に説明される、少なくとも１つ、２つ、または３つ以上のＨＩＶ抗原を含む。別の具体的実施形態では、組換え発現ベクターによってコードされ、本明細書で説明される方法で使用される、少なくとも１つ、２つ、または３つ以上の免疫原は、少なくとも１つ、２つ、または３つ以上の腫瘍関連抗原を含んでもよい。これらの腫瘍関連抗原は、本明細書でさらに詳細に説明され、例えば、腎細胞癌抗原からの腫瘍関連抗原（例えば、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ））、前立腺癌抗原（例えば、前立腺酸性フォスファターゼ、前立腺特異抗原、ＮＫＸ３．１、および前立腺特異的膜抗原）、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、結腸直腸癌抗原、肺癌抗原、卵巣癌抗原、または本明細書および当技術分野で説明される任意の癌あるいは腫瘍関連抗原であってもよい。
【０２００】
医学分野の当業者によって理解されるように、「治療する」および「治療」という用語は、対象（すなわち、患者）の疾患、障害、または症状の医学的管理を指す（例えば、Ｓｔｅｄｍａｎ’ｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙを参照）。一般に、適切な用量および治療レジメンは、治療および／または予防有益性を提供するために十分な量で、免疫原およびアジュバントを提供する。治療および／または予防の有益性は、例えば、向上した臨床転機、治療的処置および予防的または予防対策の両方を含み、目的は、望ましくない生理学的変化または障害を予防する、または減速する、または遅らせる（減少させる）こと、あるいはそのような疾患または障害の拡張または重症度を予防する、または減速する、または遅らせる（減少させる）ことである。対象を治療するための有益または所望の臨床結果は、治療される疾患または障害に起因する、または関連する症状の軽減、減少、または緩和、症状の減少した発生、向上した生活の質、より長い無病状態（すなわち、それに基づいて疾患の診断が行われる、対象が疾患を提示するであろう可能性または傾向を減少させる）、疾患の程度の縮小、安定した（または悪化しない）病状、疾患の進行の遅延または減速、病状の改善または緩和、検出可能であろうと検出不可能であろうと、（部分的であろうと完全であろうと）寛解、および／または全生存を含むが、それらに限定されない。「治療」はまた、対象が治療を受容していなかった場合の期待生存と比較したときに、生存を延長することを意味することもできる。治療を必要としている対象は、疾患または障害をすでに持っている対象、ならびに疾患または障害を持つ傾向がある、あるいは発現するリスクがある対象を含む。予防的治療を必要としている対象は、病状または疾患が予防されるものである（すなわち、疾患または障害の発生または再発の可能性を減少させる）対象を含む。
【０２０１】
組換え発現ベクターおよびベクター粒子は、薬学的または生理学的に容認可能または好適な賦形剤または担体の中で、対象に投与されてもよい。薬学的に容認可能な賦形剤は、ヒトまたはヒト以外のほ乳類対象を含むヒト以外の対象に投与するために好適である、本明細書でさらに詳細に説明される、生物学的適合性媒介物、例えば、生理食塩水である。治療的有効量は、治療されたヒトまたはヒト以外の動物において、医学的に望ましい結果を生じることが可能であるポリヌクレオチドの量を提供する（すなわち、統計的に、生物学的に、および／または有意に、免疫原に特異的な免疫応答（細胞障害性Ｔ細胞応答を含む、体液性および／または細胞媒介応答）を誘発または強化するように、十分な量の免疫原が発現される）。医学分野で周知であるように、いずれか１人の患者のための投与量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、一般的健康、および同時に投与されている他の薬剤を含む、多くの因子に依存する。用量は様々となるが、組換え発現ベクターを含むベクター粒子の投与のための好ましい用量は、ベクターポリヌクレオチド分子の約１０６から１０１２個のコピーを提供するために十分である。
【０２０２】
本明細書で説明される免疫原性およびアジュバント組成物を含む、医薬組成物は、医学分野の当業者によって判定されるような、治療（または予防）される疾患に適切な方式で投与されてもよい。適切な用量ならびに投与の好適な持続時間および頻度は、患者の状態、患者の疾患の種類および重症度、活性成分の特定の形態、および投与の方法等の因子によって判定されるであろう。一般に、適切な用量および治療レジメンは、（より頻繁な完全または部分寛解、あるいはより長い無病および／または全体生存、あるいは症状の重症度の低下等の向上した臨床転機を含む、本明細書で説明されるような）治療および／または予防的有益性を提供するために十分な量で組成物を提供する。予防的使用については、用量は、疾患または障害を予防する、疾患または障害の発生を遅延させる、あるいは疾患または障害と関連付けられる疾患の重症度を減少させるために十分となるべきである。
【０２０３】
一般に、用量の中に存在する、または用量の中に存在するコード化ポリヌクレオチドによって原位置で産生される、本明細書で説明されるような融合ポリペプチドを含む免疫原の量は、宿主の１ｋｇにつき約０．０１μｇから約１０００μｇに及ぶ。効果的な治療法を提供するために十分である最小投与量の使用が、通常は好ましい。患者は、概して、治療または予防されている症状に好適な分析を使用して、治療または予防的有効性について監視されてもよく、その分析は、当業者が精通するようになり、本明細書で説明されるものである。液体形態で投与されるときに、好適な用量サイズは、患者のサイズとともに様々となるが、典型的には、１０〜６０ｋｇの対象にとっては約１ｍｌから約５００ｍｌ（１ｋｇにつき約０．０１μｇから約１０００μｇを含む）に及ぶであろう。最適な用量が、概して、実験モデルおよび／または臨床試験を使用して判定されてもよい。最適な用量は、対象の体質量、体重、血液量に依存してもよい。本明細書で説明されるように、適切な用量はまた、患者（例えば、ヒト）の状態、つまり、疾患の状態、一般健康状態、ならびに年齢、性別、および体重、および医学分野の当業者によく知られている他の因子に依存してもよい。
【０２０４】
医薬組成物は、例えば、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、胸骨内、海綿体内、耳道内、または尿道内注射あるいは注入を含む、局所、経口、腸内、経鼻（すなわち、鼻腔内）、吸入、髄腔内、直腸、膣内、眼内、結膜下、舌下、皮内、結節内、腫瘍内、経真皮、または非経口投与を含む、任意の適切な投与方式のために製剤化されてもよい。投与の方法は、本明細書でさらに詳細に説明される。
【０２０５】
非経口投与のために、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、または緩衝剤を含む。経口投与のために、上記の賦形剤のうちのいずれか、あるいはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、カオリン、グリセリン、デンプンデキストリン、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、グルコース、蔗糖、および／または炭酸マグネシウム等の固体賦形剤または担体が、採用されてもよい。
【０２０６】
免疫原性組成物、および組換えベクター構造またはベクター粒子を含む組成物が、免疫原の有効用量を提供する任意の経路による送達のために製剤化されてもよい。そのような投与方法は、経口投与または注射による送達を含み、液体の形態であってもよい。液体医薬組成物は、例えば、注射用蒸留水、食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル溶液、等張食塩水、溶媒または懸濁媒体としての機能を果たし得る固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒等の滅菌希釈剤、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張性の調整のための緩衝剤および薬剤のうちの１つ以上を含んでもよい。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、またはガラスあるいはプラスチックでできた複数の用量バイアルに封入することができる。生理食塩水の使用が好ましく、注射用医薬組成物は、好ましくは、無菌である。
【０２０７】
本明細書で説明される組換え発現ベクター等の核酸分子を含む、医薬組成物については、核酸分子は、核酸を含む、当業者に公知である種々の送達系、ならびに、例えば、本明細書で提供されるようなベクター粒子および組換え発現構造等の細菌、ウイルス、およびほ乳類発現系のうちのいずれかの中に存在してもよい。そのような発現系にポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を組み込むための技法が、当業者に周知である。他のある実施形態では、ＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５−４９，  １９９３で説明され、Ｃｏｈｅｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１−１６９２，  １９９３によって論評されているように、「裸」であってもよい。裸ＤＮＡの取り込みは、細胞の中へ効率的に輸送される生体分解性ビーズ上にＤＮＡを被覆することによって、増加させられてもよい。
【０２０８】
核酸分子は、当技術分野で説明されるいくつかの方法のうちのいずれか１つに従って、細胞の中へ送達されてもよい（例えば、Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ２：１３９  （１９９２）；  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ｅｄ．  Ａｋｈｔａｒ，  １９９５，  Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｅｍｂｒ．  Ｂｉｏｌ．  １６：１２９−４０  （１９９９）；  Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｈａｎｄｂ．  Ｅｘｐ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  １３７：１６５−９２  （１９９９）；  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  ７５２：１８４−９２  （２０００）；米国特許第６，３９５，７１３号；国際特許出願公開第ＷＯ  ９４／０２５９５号）；  Ｓｅｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８７：８５３−５９  （２０００）；  Ｓｅｌｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．  ２３：１０３−１２  （２００２）；米国特許出願公開第２００１／０００７６６６号および第２００３／０７７８２９号を参照）。当業者に公知である、そのような送達方法は、イオントフォレシスによる、または生体分解性ポリマーヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  １０：１０６８−７４  （１９９９）；  Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願公開第ＷＯ  ０３／４７５１８号および第ＷＯ  ０３／４６１８５号を参照）、ポリ（乳酸−コ−グリコール）酸（ＰＬＧＡ）およびＰＬＣＡ微小球（ペプチドおよびポリペプチドおよび他の物質の送達にも有用である）（例えば、米国特許第６，４４７，７９６号；米国特許出願公開第２００２／１３０４３０号を参照）、生体分解性ナノカプセル、および生体接着微小球等の他の媒介物への組み込みによる、またはタンパク性ベクター（国際出願公開第ＷＯ  ００／５３７２２号）による、リポソームの中のカプセル化を含むが、それらに限定されない。別の実施形態では、核酸分子は、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＧＡＬ）またはポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−ｔｒｉ−Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＰＥＩ−ＰＥＧ−ｔｒｉＧＡＬ）誘導体等のその誘導体とともに製剤化する、または錯体を形成することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号も参照）。
【０２０９】
本明細書で説明される方法の特定の実施形態では、対象は、ヒトまたはヒト以外の動物である。本明細書で説明される治療を必要としている対象は、本明細書で説明される疾患、障害、または状態の症状または続発症を示し得る、あるいは疾患、障害、または状態を発現するリスクがあり得る。治療され得る、ヒト以外の動物は、ほ乳類、例えば、ヒト以外の霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラ、および同等物）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、アレチネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目の動物、ブタ（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、および他の家庭、農場、および動物園の動物を含む。
【０２１０】
本明細書で提供される組成物は、種々の形態、例えば、固体、液体、粉末、水性、または凍結乾燥形態となり得る。ウイルスベクター粒子および細菌ベクター粒子を含むベクター粒子、免疫原性組成物、および組換え発現ベクターを投与するための好適な医薬品賦形剤および担体の実施例が、当技術分野で公知である。そのような賦形剤、担体、および／または添加剤は、従来の方法によって製剤化することができ、好適な用量で対象に投与することができる。本明細書で説明される組成物に含まれ得る、脂質、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、およびキレート剤等の安定剤は、体内での分解からの組成物および組成物の構成要素の保護を支援することができる。
【０２１１】
本明細書で提供される、ウイルスベクター粒子および細菌ベクター粒子を含むベクター粒子、免疫原性組成物、アジュバント組成物、および組換え発現ベクターは、キットとしてパッケージ化することができる。キットは、随意に、方法を実践するための使用説明書、デバイス、付加的な試薬、ならびに管、コンテナ、例えば、バイアル、および注射器等の構成要素等の、１つ以上の構成要素を含むことができる。例示的なキットは、随意に、使用説明書、ベクター粒子、組換え発現ベクター、または対象の中の免疫原を検出するためのデバイスまたは試薬、および対象に１つまたは複数の組成物を投与するためのデバイスを含むことができる。
【０２１２】
免疫原をコードするポリヌクレオチドを含むキットもまた、本明細書で考慮される。そのようなキットはまた、ウイルスパッケージング構成要素をコードする少なくとも１つのプラスミド、およびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含んでもよい。いくつかのキットは、ウイルスパッケージング構成要素をコードする少なくとも１つのプラスミド、シンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクター、および少なくとも１つのＤＣ成熟因子をコードするベクターを含有するであろう。
【０２１３】
目的とする配列をコードする（典型的には、抗原または免疫原をコードする）ウイルスベクター、および随意に、ＤＣ成熟因子をコードするポリヌクレオチド配列を含む、キットもまた、本明細書で考慮される。いくつかのキットでは、キットは、ウイルスパッケージング構成要素をコードする少なくとも１つのプラスミド、およびシンドビスウイルスＥ２糖タンパク質変異体をコードするベクターを含む。
【０２１４】
キットはまた、説明書を含有してもよい。説明書は、典型的には、組成物を投与するための対象の適正な状態、適正な投与量、および適正な投与方法を判定するための方法を含む、投与のための方法を説明する。説明書はまた、治療期間の持続時間にわたって対象を監視するためのガイダンスを含むこともできる。
【０２１５】
本明細書で提供されるキットはまた、組換え発現ベクターを含むベクター粒子を含む、免疫原性組成物、および／またはアジュバント組成物を対象に投与するためのデバイスを含むこともできる。薬剤またはワクチンを投与するための当技術分野で公知である種々のデバイスのうちのいずれかを、本明細書で提供されるキットに含むことができる。例示的なデバイスは、皮下注射針、静脈注射用針、カテーテル、無針注射デバイス、吸入器、および点眼器等の液体分注器を含むが、それらに限定されない。典型的には、組成物を投与するためのデバイスは、キットの能動構成要素と適合する。例えば、高圧注射デバイス等の無針注射デバイスは、高圧注射によって損傷されないベクター粒子、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドとともにキットに含むことができるが、典型的には、高圧注射によって損傷され得るベクター粒子、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドを含むキットには含まれない。
【０２１６】
他の実施形態および用途が、本開示に照らして当業者に明白となるであろう。以下の実施例は、種々の実施形態を例証するものとして提供されるのみであり、決して本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２１７】
実施例１
免疫原に対する免疫応答：アジュバントおよび異なる部位における免疫原をコードするレンチウイルスベクターの投与
【０２１８】
この実施例は、アジュバントが、免疫原をコードするレンチウイルスベクターとは別に、異なる部位で投与される、免疫原に対するＣＤ８Ｔ細胞免疫応答に対する作用を説明する。
【０２１９】
樹状細胞標的化非統合レンチウイルスベクター（ＤＣ−ＮＩＬＶ）と称される、これらの実験に使用されるベクターは、ＤＣに選択的に侵入するために修飾シンドビスウイルスエンベロープ糖タンパク質を使用する、自己不活性化統合欠損性レンチベクターである。糖タンパク質エンベロープ（ＳＩＮｖａｒ１と称される）が、以前に説明されたように開発され（例えば、米国特許出願第１２／８４２，６０９号；国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０４２８７０号を参照）、本明細書で説明される実験に使用された。簡潔に言えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）からの天然エンベロープ糖タンパク質である。ベクターは、冗長的に統合不能である。Ｒｅｖを除く調節および付属タンパク質の全てを含む、親ＨＩＶゲノムの７５パーセントが、ＤＣ−ＮＩＬＶから除去されている。
【０２２０】
ＡＨ１Ａ５をコードするＤＣ−ＮＩＬＶ（１μｇ  ｐ２４）がＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下投与され、アジュバントが腹腔内に投与されたときに、抗原特異的免疫応答が判定された。ＡＨ１Ａ５（ＳＰＳＹＡＹＨＱＦ；配列番号２５）は、ＣＴ２６結腸癌細胞からの免疫優勢ＣＤ８Ｔ細胞エピトープであり、内因性マウス白血病ウイルスのｇｐ７０タンパク質に由来する、ＡＨ１（ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ，配列番号３５）の高親和性改変ペプチドである（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：９７３０  （１９９６）を参照）。ＣＤ８Ｔ細胞応答が、ＡＨ１Ａ５およびその低親和性関連ペプチドＡＨ１の両方に対して測定された。マウスは、ＰＢＳ中のアジュバントＧＬＡ（１０μｇ）またはＰＢＳ中のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（５０μｇ）のいずれか一方を腹腔内に注射され、またはＰＢＳ単独（アジュバントなし）を注射された。１０日後、脾臓細胞が動物から単離され、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、その後に続いて蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により、ＩＦＮ−γ−分泌ＣＤ８Ｔ細胞の頻度を測定することによって、免疫応答が評価された。結果が図１に提示されている。データはまた、レンチウイルスベクターを注射されなかったマウス（未投与）から得られた脾臓細胞からも示されている。
【０２２１】
これらのデータは、第２の注射部位で送達されるアジュバントが、ベクターワクチンによって誘発される免疫応答を増強できることを示す。さらに、この強化効果は、トール様受容体４作動薬であるＧＬＡにとって明白であった。
実施例２
免疫原に対する免疫応答：免疫原をコードするレンチウイルスベクターと混合されたアジュバントの同時投与
【０２２２】
この実施例は、アジュバントが、免疫原をコードするレンチウイルスベクターと混合され、アジュバントおよびベクターの両方がともに投与されるときの、免疫原に対するＣＤ８Ｔ細胞免疫応答に対する作用を説明する。
【０２２３】
ＣＤ８Ｔ細胞エピトープＡＨ１Ａ５に対する免疫応答に対する、ＧＬＡおよびリポ多糖類（ＬＰＳ）といった２つのアジュバントの作用が判定された。ＡＨ１Ａ５をコードするＤＣ−ＮＩＬＶ（１μｇ  ｐ２４）が、ＰＢＳ（対照グループ）、４μｇ  ＧＬＡ、２０μｇ  ＧＬＡ、または４μｇ  リポ多糖類（ＬＰＳ）と混合され、次いで、ＢＡＬＢ／ｃマウスのグループに皮下（ｓ．ｃ．）投与された。１０日後、脾臓細胞が各グループ内の動物から単離され、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、その後に続いて蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのレベルを判定することによって、ＣＤ８Ｔ細胞応答が評価された。結果が図２に提示されている。データはまた、レンチウイルスベクターを注射されなかったマウス（ＤＣ−ＮＩＬＶなし）から得られた脾臓細胞からも示されている。
【０２２４】
これらのデータは、ワクチンアジュバントのための通常の実践のように、ＧＬＡがレンチベクターワクチンとともに同時に投与されるときに、驚いたことに、これがワクチン誘発性免疫応答の阻害をもたらすことを示し、実施例１のようなワクチンベクターおよびアジュバントの投与を分離する重要性を強調する。阻害作用は、ＧＬＡの独特の属性ではなかったが、アジュバントＬＰＳでも観察され、一般に、アジュバントがベクターワクチンとともに同時に投与されることに不適合であることを示す。
実施例３
免疫原に対する免疫応答：異なる臨床的関連経路を介した、アジュバントおよび免疫原をコードするレンチウイルスベクターの投与
【０２２５】
この実施例は、免疫原をコードするレンチウイルスベクターが皮下投与され、アジュバントが筋肉内に投与されるときの、免疫原に対するＣＤ８Ｔ細胞免疫応答に対する作用を説明する。
【０２２６】
３つのエピトープに対するＣＤ８Ｔ細胞応答が、エピトープのうちのそれぞれを含む、組換えポリペプチド抗原をコードするＤＣ−ＮＩＬＶの免疫を持ったＣ５７ＢＬ／６マウスで判定された。エピトープは、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス糖タンパク質（ＧＰ３３：配列ＫＡＶＹＮＦＡＴＭ）、ニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ２５７：配列ＳＩＩＮＦＥＫＬ）、およびサル免疫不全ウイルスＧａｇタンパク質（ＳＩＶ  Ｇａｇ：配列ＡＡＶＫＮＷＭＴＱＴＬ）由来であった。マウスは、皮下にＤＣ−ＮＩＬＶ（１μｇ  ｐ２４）を受容し、ならびに安定した水中油型エマルジョン（ＳＥ）中のＧＬＡ（０．１６〜２０μｇ）またはＳＥ単独（０μｇ）の用量範囲の筋肉内投与を受容した。第１２日に、脾臓細胞が動物から単離され、細胞内サイトカイン染色により、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−２を発現する細胞の割合判定することによって、ＣＤ８Ｔ細胞応答が評価された。結果が図３に提示されている。
【０２２７】
これらのデータは、ＧＬＡがまた、実施例１で説明される腹腔内経路よりも臨床的に関連性がある注射部位である、筋肉内経路を介して送達されたときに、皮下ベクター免疫付与を強化することにも有効であることを示す。データはまた、ＧＬＡアジュバントの第２の部位適用が、広い用量範囲にわたって免疫応答を強化することに有効であることも示す。
【０２２８】
上記で説明される種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するように組み合わせることができる。実施形態の実施例は、以下を含む。
【０２２９】
１Ａ．対象における免疫原に対する免疫応答を誘発するための方法であって、（ａ）免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター粒子を含む第１の組成物、および（ｂ）アジュバントを含む第２の組成物を投与することを含む、方法。第１および第２の組成物は、別個の組成物であることが理解される。また、免疫原をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、本明細書で説明されるような組換え発現ベクターの一部であることも理解される。したがって、ベクター粒子は、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター粒子を含む、組換え発現ベクターを含む。
【０２３０】
実施形態の他の実施例は、随意に、本明細書で説明される方法および使用の説明書とともに、別個のコンテナの中に、ベクター粒子を含む組成物、およびアジュバントを含む組成物を含有してもよい、キットまたはパッケージを含む。したがって、これらの実施形態の実施例は、以下を含む。
【０２３１】
１Ｂ．（ａ）免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター粒子を含む第１の組成物と、（ｂ）アジュバントを含む第２の組成物とを含む、キット。第１および第２の組成物は、別個の組成物であることが理解される。
【０２３２】
本発明のこれらの態様は、以下の実施形態の全てを含む。
【０２３３】
２．組成物が、アジュバントを含む別個の組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、免疫原に対する免疫応答を誘発する際に使用するための、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター粒子を含む組成物。この種類の実施形態は、組成物が、アジュバントを含む別個の組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、免疫原に対する免疫応答を誘発する際に使用するための薬剤の調製のためのそのようなベクター粒子の使用を含むことが理解される。免疫応答を誘発する方法、ならびにそのような方法で使用するための組成物およびベクター粒子の種類に関する、本明細書の説明の全ては、免疫応答を誘発する際に使用するためのそのような組成物、ならびに免疫応答を誘発するための薬剤の調製での使用に適用される。
【０２３４】
３．組成物が、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、ベクター粒子を含む別個の組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、非特異的免疫応答を含む免疫応答を強化する際に使用するためのアジュバントを含む、組成物。アジュバントは、ベクター粒子によって誘発される免疫応答を強化することが期待される。この種類の実施形態は、組成物が、ベクター粒子を含む別個の組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、免疫原に対する免疫応答を誘発する際に使用するための薬剤の調製のためのそのようなアジュバントの使用を含むことが理解される。免疫応答を誘発する方法、ならびにそのような方法で使用するための組成物およびベクター粒子の種類に関する、本明細書の説明の全ては、免疫応答を誘発する際に使用するためのそのような組成物、ならびに免疫応答を誘発するための薬剤の調製での使用に適用される。
【０２３５】
４．ベクター粒子が、細胞、ウイルスベクター粒子、またはウイルス様粒子、随意に、アルボウイルスからの糖タンパク質を用いて偽型化されたレンチウイルスベクター粒子である、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２３６】
５．ベクター粒子が、アルファウイルス、随意に、シンドビスウイルス、および随意に、位置１６０において突然変異を含むシンドビスウイルスからの糖タンパク質を用いて偽型化されたレンチウイルスベクター粒子である、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２３７】
６．アジュバントがＴＬＲリガンド、例えば、［ＴＬＲ４、ＴＬＲ８、またはＴＬＲ９］リガンドである、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２３８】
７．先行実施形態のうちのいずれかであって、アジュバントは、ＴＬＲ４作動薬、随意に、非毒性脂質Ａ関連アジュバント、随意に、モノホスホリル脂質Ａ、または３  Ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、または脂質Ａ模倣剤、または上記で説明されるような式ＩのＧＬＡ、または式（Ｉａ）のＧＬＡであり、
【化３】
2014510721.tif 000004
【０２３９】
またはその薬学的に容認可能な塩であり、式中、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、Ｃ１１−Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２およびＲ４は、Ｃ１２−Ｃ２０アルキルであり、より具体的な実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が、Ｃ１１−１４アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ１２−１５アルキルである、上記に記載される式（Ｉａ）を有し、さらなるより具体的な実施形態では、ＧＬＡは、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６が、Ｃ１１アルキルであり、Ｒ２およびＲ４が、Ｃ１３アルキルである、上記に記載される式（Ｉａ）を有し、またはＧＬＡは、以下の化学式（Ｉｂ）から選択される構造、
【化４】
2014510721.tif 000005
【０２４０】
またはその薬学的に容認可能な塩を有し、式中、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、およびＬ６は、同一であり、または異なり、−Ｏ−、−ＮＨ−、および−（ＣＨ２）−から独立して選択され、Ｌ７、Ｌ８、Ｌ９、およびＬ１０は、同一であり、または異なり、任意の発生時に、不在であってもよく、または−Ｃ（＝Ｏ）−のいずれかであってもよく、Ｙ１は、酸性官能基であり、Ｙ２およびＹ３は、同一であり、または異なり、それぞれ、−ＯＨ、−ＳＨ、および酸性官能基から独立して選択され、Ｙ４は、−ＯＨまたは−ＳＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ６は、同一であり、または異なり、それぞれ、Ｃ８−Ｃ１３アルキル基から独立して選択され、Ｒ２およびＲ４は、同一であり、または異なり、それぞれ、Ｃ６−Ｃ１１アルキル基から独立して選択される。実施形態の実施例では、ＧＬＡは、０．１〜１０μｇ／注射の量で、または０．２〜５μｇ／注射の量で、または０．５〜２．５μｇ／注射の量で存在し、注射は、少なくとも５０Ｋｇ体質量の個人に与えられる。
【０２４１】
８．アジュバントを含む組成物が、免疫原性抗原を実質的に欠いている組成物である、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２４２】
９．アジュバントを含む組成物が、第２の共アジュバント、随意に、水中油型エマルジョンを含む、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２４３】
１０．２つの組成物が、異なる部位で、随意に、異なる投与経路によって、同時に投与される、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２４４】
１１．２つの組成物が、随意に異なる部位で、および随意に、異なる投与経路によって、順次投与される、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２４５】
１２．投与経路が、非経口、腸内、経口、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、結節内、鼻腔内、経真皮、吸入、粘膜、または局所である、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２４６】
１３．ベクター粒子を含む組成物が、皮下に、または皮内に投与される、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２４７】
１４．アジュバントを含む組成物が、皮下に、または筋肉内に、または経口の好ましい経路で投与される、実施形態１２〜１３のうちのいずれか。
【０２４８】
１５．ベクター粒子が樹状細胞に優先的に結合する、先行実施形態のうちのいずれか。随意に、ベクター粒子は、自己樹状細胞に優先的に感染し、例えば、感染樹状細胞対感染非樹状細胞（または非ＤＣ−ＳＩＧＮ発現細胞）の比は、少なくとも約２：１、少なくとも約３：１、少なくとも約４：１、少なくとも約５：１、少なくとも約６：１、少なくとも約７：１、少なくとも約８：１、少なくとも約９：１、少なくとも約１０：１、少なくとも約２０：１、少なくとも約３０：１、少なくとも約４０：１、少なくとも約５０：１、少なくとも約１００：１、少なくとも約２００：１、少なくとも約５００：１、少なくとも約１０００：１、少なくとも約５０００：１、少なくとも約１０，０００：１、またはそれ以上である。
【０２４９】
１６．免疫原が、腫瘍関連抗原、例えば、腎細胞癌抗原、前立腺癌抗原、中皮腫抗原、膵臓癌抗原、黒色腫抗原、乳癌抗原、肺癌抗原、または卵巣癌抗原、随意に、前立腺酸性フォスファターゼ、前立腺特異抗原、ＮＫＸ３．１、または前立腺特異的膜抗原、または随意に、炭酸脱水酵素ＩＸである、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２５０】
１７．免疫原が、感染性微生物由来である、例えば、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原である、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２５１】
１８．免疫応答が、免疫原特異的抗体応答または免疫原特異的Ｔ細胞応答である、先行実施形態のうちのいずれか。
【０２５２】
１９．実施形態１８は、測定可能な免疫原特異的抗体応答または測定可能な免疫原特異的Ｔ細胞応答を含む。
【０２５３】
２０．免疫応答を誘発することを伴う、先述の方法、組成物、および使用はまた、例えば、腫瘍関連抗原に対する免疫応答の場合には、癌を治療または予防するため、あるいはウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、または寄生虫抗原に対する免疫応答の場合には、感染症を治療または予防するために使用されることも期待される。
【０２５４】
２１．組成物が、先述のアジュバントのうちのいずれかを含む組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、癌を予防または治療する際に使用するための、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、先述のベクター粒子のうちのいずれかを含む組成物。
【０２５５】
２２．組成物が、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、先述のベクター粒子のうちのいずれかを含む組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、癌を予防または治療する際に使用するための、先述のアジュバントのうちのいずれかを含む組成物。
【０２５６】
２３．組成物が、先述のアジュバントのうちのいずれかを含む組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、感染症を予防または治療する際に使用するための、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、先述のベクター粒子のうちのいずれかを含む組成物。
【０２５７】
２４．組成物が、免疫原をコードするポリヌクレオチドを含む、先述のベクター粒子のうちのいずれかを含む組成物とともに投与するためのものであることを特徴とする、感染症を予防または治療する際に使用するための、先述のアジュバントのうちのいずれかを含む組成物。
【０２５８】
２５．先述のベクター粒子のうちのいずれかを含む別個の組成物とともに同時に投与するための、先述のアジュバントのうちのいずれかを含む組成物。
【０２５９】
これらの実施形態は、そのような使用のための薬剤の調製でのそれぞれの組成物の使用を含むことが理解される。
【０２６０】
本明細書で参照され、および／または出願データシートに記載される、全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許出版物は、それらを全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、その上さらなる実施形態を提供するために、種々の特許、出願、および出版物の概念を採用する必要がある場合に、修正することができる。
【０２６１】
上記の説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に行うことができる。一般に、以下の請求項では、使用される用語は、請求項を、本明細書および請求項で開示される具体的実施形態に限定すると解釈されるべきではないが、そのような請求項が享受できる同等物の全範囲とともに、全ての可能な実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、請求項は、本開示によって限定されない。
【図１】
2014510721.tif 000006
【図２】
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【図３】
2014510721.tif 000008
【配列表】
2014510721000001.app
【国際調査報告】
2014510721.tif 000009
2014510721.tif 000010
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