(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式：
【化１】
0006620931.tif 000006
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有してなる医薬または農薬。
【請求項３】
抗真菌薬である、請求項２に記載の医薬または農薬。
【請求項４】
カンジダ属およびアスペルギルス属からなる群から選択される属の真菌を標的とするものである、請求項３に記載の医薬または農薬。
【請求項５】
請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法であって、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６７７で表されるストレプトマイセス属細菌またはその変異体を、炭素源を含有する培地で培養して該化合物またはその薬学的に許容される塩を培地中に産生させ、該培養物から該化合物またはその薬学的に許容される塩を回収することを含む、前記方法。
【請求項６】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６７７で表されるストレプトマイセス属細菌。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の母核を有する化合物、抗真菌剤としてのその用途、およびその製造方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、高齢者の増加、高度医療の進展、末期癌患者の免疫不全等、真菌による感染症が増加している。これら感染症は重篤な結果をもたらし致死に至る事も多い。既存の抗真菌薬はその種類も少なく、毒性も高い事から、今までの薬剤と異なる新たな抗真菌剤の母核が望まれている。また抗真菌薬の使用により耐性菌の出現が増加し新たな薬剤の開発が切に望まれている。またキャンディン系抗真菌剤は毒性は低いが、その分子量が大きく、血清との反応性が問題になっている。アゾール系抗真菌薬はその毒性から高濃度の投与が難しいという問題を抱えている。そのため、低分子で血清との反応性が低い、毒性の低い、有効な化合物が強く望まれている。【０００３】
従来、微生物代謝産物からの医薬品シード化合物の探索は、陸上の分離源を中心に採集され微生物分離に供されてきた。現在までに発見された微生物代謝産物はペニシリンやアドリアマイシンをはじめとして、数多くの抗生物質や抗ガン剤が発見され、感染症や癌などの治療薬として利用されてきた。しかし、長期間の継続的探索の結果、陸域から得られる微生物代謝産物は殆ど全て既知化合物となり、新規薬剤の候補となる二次代謝産物の取得は極めて困難となった。このため、天然物創薬企業による新規薬剤開発は急速に縮小した。この状況を打開するため、ケミカルライブラリー（天然物および合成化合物）を用いたスクリーニングが世界的な規模で行われてきた。しかし、結果は予想に反し、ケミカルライブラリーからは、有望な新規薬剤候補化合物が得られなかった。これらの状況から新たな薬剤候補化合物を得る事は極めて困難な状況となった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は当該技術分野における上述の現状に鑑み為されたものであり、有望な創薬シード化合物となり得る新規の母核を有する化合物、抗真菌剤としてのその用途、およびその製造方法等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、新規薬剤候補化合物の探索における上述の現状に鑑み、海洋性の微生物資源に着目した。海洋性の微生物資源はこれまでに殆ど利用されておらず、新規の二次代謝産物発見の大きな可能性を有している。しかし、分離源の採集には特殊な技術が必要とされ、またその培養技術も十分に確立されていない。本発明者らは、海洋からの試料の採集方法、微生物の培養方法や評価方法等について鋭意検討し、抗真菌剤の開発のために有望な微生物株を単離することに成功した。１６Ｓリボソーム塩基配列解析によれば、該微生物株は、ストレプトマイセス属の放線菌であることが分かった。更に、該微生物の培養液から、活性を示す化合物を単離・精製することに成功した。該化合物は、分子量が小さく、血清との反応性も低く、強い抗真菌作用を有していた。また、構造解析の結果、該化合物は新規の母核を有することが分かり、新規薬剤開発のシード化合物として有望であることが分かった。本発明者らは、これらの知見に基づいて更に検討を重ね、本発明を完成させるに至った。【０００６】
即ち、本発明は以下の通りである。
［１］下記式：【０００７】
【化１】
0006620931.tif 000002
【０００８】
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。
［２］重メタノールを測定溶媒として測定される13C-NMRおよび1H-NMRのスペクトルが下記：【０００９】
【表１】
0006620931.tif 000003
【００１０】
を有することを特徴とする化合物またはその薬学的に許容される塩。
［３］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩を含有してなる医薬または農薬。
［４］抗真菌薬である、上記［３］に記載の医薬または農薬。
［５］カンジダ属およびアスペルギルス属からなる群から選択される属の真菌を標的とするものである、上記［４］に記載の医薬または農薬。
［６］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の製造方法であって、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６７７で表されるストレプトマイセス属細菌またはその変異体を、炭素源を含有する培地で培養して該化合物またはその薬学的に許容される塩を培地中に産生させ、該培養物から該化合物またはその薬学的に許容される塩を回収することを含む、前記方法。
［７］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６７７で表されるストレプトマイセス属細菌またはその変異体。【００１１】
本発明はまた、以下を提供する。
［８］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、該哺乳動物における真菌症の予防または治療方法。
［９］上記［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩の有効量を対象作物および／または対象作物の種子に処理することを含む、植物病害の防除方法。
［１０］哺乳動物における真菌症の予防または治療に使用するための上記［１］または［２］に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の化合物は、分子量が小さく、血清との反応性も低く、強い抗真菌作用を有するため、抗真菌剤として有用である。また、本発明の化合物は、新規の母核を有し、新規薬剤開発用のシード化合物として有望である。本発明はまた、本発明の化合物の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の化合物のＮＭＲ解析の結果を示す図である。
【図２】抗真菌薬感受性試験の結果（ＭＩＣ（μｇ／ｍＬ））を示す図である。ＫＫＲＭは本発明の化合物、ＭＣＦＧはミカファンギン、ＡＭＰＨはアムホテリシンＢ、５−ＦＣはフルシトシン、ＦＬＣＺはフルコナゾール、ＩＴＣＺはイトラコナゾール、ＶＲＣＺはボリコナゾール、ＭＣＺはミコナゾールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１５】
本発明は、下記式：
【００１６】
【化２】
0006620931.tif 000004
【００１７】
で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（以下、これらを総称して本発明の化合物という。）を提供する。ここで、本発明の化合物は、不斉炭素原子に基づく光学異性体、二重結合に基づく幾何異性体等の異性体を１種以上包含し得るが、それらの異性体およびそれらの混合物は全てこの発明の範囲に含まれるものである。また、上記式中、二重結合部分に隣接する波線は、下記２種類の幾何異性体の両方を包含することを意図する。
【００１８】
【化３】
0006620931.tif 000005
【００１９】
薬学的に許容される塩としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩、または酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００２０】
本発明の化合物は、本発明者らが鹿児島県加計呂麻島の海砂から単離したストレプトマイセス属細菌（以下、本発明の細菌ともいう。）またはその変異体を用いて製造することができる。当該細菌は、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託され（受託番号：ＮＩＴＥ  Ｐ−１６７７、寄託日：２０１３年８月１日）、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６７７からブタペスト条約に基づく寄託への移管請求を行い、当該請求が２０１４年７月３０日（移管日）に受領され、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６７７で国際寄託されている。
【００２１】
本菌は気菌糸の色は灰色系であり、胞子鎖は短めの螺旋形態を示す。可溶性色素は黄色系の色素を産生する。裏面の色はクリーム色から薄い黄色系の色を示す。熟成した胞子は胞子塊を形成する。
【００２２】
該変異体は、本発明の細菌に由来する菌株であり、かつ本発明の化合物を産生し得る限り特に限定されない。例えば、該変異体は、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が本発明の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列と同一（即ち、１００％一致）であるか、あるいは実質的に同一（例えば、後述するような、変異原性物質等の存在下での変異により作製した場合）である。該変異体はまた、本発明の細菌と類似の形態的、生理学的特徴を示す。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、「本発明の細菌の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列と実質的に同一」のヌクレオチド配列とは、比較されるヌクレオチド配列が少なくとも９９％以上、好ましくは９９．１％以上、より好ましくは９９．２％以上、更に好ましくは約９９．５％以上のヌクレオチド配列同一性を有することをいう。ヌクレオチド配列の同一性は自体公知の方法により決定することができ、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；フィルタリング=ON；マッチスコア=1；ミスマッチスコア=-3）にて計算することができる。
【００２４】
該変異体は、例えば、本発明の細菌を改変処理することにより作製できる。このような改変処理としては、例えば、変異原性物質等の存在下での変異、本発明の細菌の有用性を高め得る遺伝子（例えば、本発明の化合物の産生能を増大させる遺伝子）の導入、および本発明の細菌が保有する遺伝子の破壊、ならびにこれらの操作の組合せなどが挙げられる。
【００２５】
本発明の細菌またはその変異体は、炭素源を含む栄養培地中で培養して維持・増殖させることができる。炭素源としては例えば、糖類（例：グルコース、ガラクトース等の単糖類、スクロース等の二糖類、スターチ等の多糖類）、およびグリセリン等が挙げられ、好ましくはスターチである。栄養培地は好ましくは窒素源も含み、窒素源としては、カジトン、イーストエキス、肉エキス、モルトエキス等が挙げられる。また、培地中にNaH2PO4を添加することで、本発明の化合物の早期の産生を促すことができる。更に、培地中に海水を含有することも好ましく、その濃度としては通常海水濃度（即ち、人工海水38.4g/L）の10%-40％程度が挙げられる。従って、培地の人工海水濃度としては、例えば0.384g/L〜38.4g/L、好ましくは1.92g/L〜13.04g/L、より好ましくは3.84g/L〜15.36g/Lである。塩分としては、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム、塩化カリウム等が挙げられる。例示的な培地の組成は、スターチ4%、肉エキス0.4%、カジトン0.4%、NaH2PO4 0.1%であり得、また通常海水濃度の10%の液体培地であり得る。その他の培養条件としては、pH 6.8〜7.5（例えば7.0）、25〜35℃（例えば28℃）での撹拌培養が挙げられる。
【００２６】
本発明の細菌またはその変異体を、上述したような培養条件で例えば２〜１４日間培養することにより、培養物中に本発明の化合物を産生させることができる。培養物中から、本発明の化合物を回収、好ましくは単離、精製することができる。単離、精製は、当該技術分野において周知の方法を用いて行うことができ、例えば、濃縮、抽出、クロマトグラフィー、再沈殿、再結晶等の手段を用いることができる。
【００２７】
本発明の化合物は、後述の実施例に示される通り、広範な真菌に対して強い抗真菌活性を有する。そのため、本発明の化合物は、例えば抗真菌剤として有用である。従って、本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含有する抗真菌薬（本発明の抗真菌薬ともいう。）を提供する。本発明の抗真菌薬は、医薬としてまたは農薬として使用され得る。
【００２８】
本発明の抗真菌薬の標的となる真菌としては、例えば、カンジダ属（例：Candida albicans、Candida parapsilosis、Candida tropicalis、Candida krusei、Candida glabrata、Candida quilliermondii、Candida lusitaniae等）、アスペルギルス属（例：Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavus、Aspergillus niger、Aspergillus terreus等）、トリコフィトン属（例：Trichophyton rubrum、Trichophyton mentagrophytes、Trichophyton tonsurans、Microsporum canis、Microsporum gypseum、Trichophyton verrucosum等）等の真菌が挙げられるがこれらに限定されない。また、真菌症としては、特に限定されず、深部皮膚真菌症、深在性真菌症、菌腫、または真菌血症が挙げられる。
【００２９】
本発明の抗真菌薬を農薬として使用する場合の対象作物は特に限定されるものではないが、例えば、穀類（例えば、イネ、オオムギ、コムギ、ライムギ、オートムギ、トウモロコシ、高粱等）、豆類（大豆、小豆、そら豆、えんどう豆、落花生等）、果樹・果実類（リンゴ、柑橘類、梨、ブドウ、桃、梅、桜桃、クルミ、アーモンド、バナナ、イチゴ等）、野菜類（キャベツ、トマト、ほうれん草、ブロッコリー、レタス、タマネギ、ネギ、ピーマン等）、根菜類（ニンジン、馬鈴薯、サツマイモ、大根、蓮根、かぶ等）、加工用作物類（綿、麻、コウゾ、ミツマタ、菜種、ビート、ホップ、サトウキビ、テンサイ、オリーブ、ゴム、コーヒー、タバコ、茶等）、瓜類（カボチャ、キュウリ、スイカ、メロン等）、牧草類（オーチャードグラス、ソルガム、チモシー、クローバー、アルファルファ等）、芝類（高麗芝、ベントグラス等）、香料等用作物類（ラベンダー、ローズマリー、タイム、パセリ、胡椒、しょうが等）、花卉類（キク、バラ、蘭等）等の植物が挙げられる。本発明の抗真菌薬は、その有効量を対象作物および／または対象作物の種子に処理することにより、該作物における上述したような真菌と関連する病害を防除するために用いることができる。
【００３０】
該農薬は、以下のような形態で使用することができ、通常、製剤分野で慣用される補助剤と一緒に使用される。本発明の化合物は公知の方法で、例えば乳剤原液、噴霧可能なペースト、噴霧または希釈可能な溶液、希釈乳剤、水和剤、水溶剤、粉剤、粒剤、フロアブル剤、ドライフロアブル剤、燻煙剤、燻蒸剤、そして例えばポリマー物質によるカプセル剤に製剤される。
【００３１】
添加剤および担体としては、固形剤を目的とする場合は、大豆粉、小麦粉等の植物性粉末、珪藻土、燐灰石、石膏、タルク、ベントナイト、クレイ等の鉱物性微粉末、安息香酸ソーダ、尿素、芒硝等の有機および無機化合物が使用される。
【００３２】
液体の剤型を目的とする場合は、植物油、鉱物油、ケロシン、キシレンおよびトルエンのような芳香族炭化水素、ホルムアミド、ジメチルホルムアミドのようなアミド類、ジメチルスルホキシドのようなスルホキシド類、メチルイソブチルケトンおよびアセトンのようなケトン類、トリクロルエチレン、水等を溶剤として使用する。これらの製剤において、均一なかつ安定な形態を取るために必要ならば界面活性剤を添加することもできる。このようにして得られた水和剤、乳剤、水溶液、フロアブル剤、ドライフロアブル剤は水で所定の濃度に希釈して懸濁液あるいは乳濁液として、粉剤、粒剤はそのまま、土壌または植物に散布する方法で使用される。
【００３３】
本発明の化合物を含む農薬中の有効成分含有量および施用量は、剤型や、施用の対象とする真菌の種類、対象作物等に応じて広範囲に変えることができる。
【００３４】
一方、本発明の抗真菌薬を医薬として使用する場合、治療対象、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）に対して経口または非経口（例えば、静注、筋注、皮下投与、直腸投与、経皮投与）のいずれかの投与経路で投与することができる。
【００３５】
本発明の抗真菌薬を経皮的に投与する場合、上記有効成分の他、油性基剤、乳化剤および乳化安定剤、溶解補助剤、粉末成分、高分子成分、粘着性改良剤、被膜形成剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、保型剤、保湿剤、皮膚保護剤、清涼化剤、香料、着色剤、キレート剤、潤沢剤、血行促進剤、収斂剤、組織修復促進剤、制汗剤、植物抽出成分、動物抽出成分、抗炎症剤、鎮痒剤等を必要に応じて配合することができる。これらの添加物はいずれも、一般に製剤に用いられるものが使用できる。
【００３６】
本発明の抗真菌薬は、有効成分以外の上記成分等を医薬製剤分野で慣用されている方法により、クリーム剤、液剤、ローション剤、乳剤、チンキ剤、軟膏剤、水性ゲル剤、油性ゲル剤、エアゾール剤、パウダー剤、シャンプー、石鹸、または爪塗布用エナメル剤等の外用薬として製剤化して使用することができる。
【００３７】
本発明の抗真菌薬を経口的に投与する場合、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤、トローチ剤等の経口投与に適した剤形に調製することができる。これらの製剤は経口剤のために通常用いられている賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、界面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等の添加剤を用いて常法により製造することができる。
【００３８】
以下、実施例等を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等により限定されない。
【実施例】
【００３９】
実施例１：Streptomyces sp. A84株の単離および解析
鹿児島県加計呂麻島の海砂から分離源を採集した。採集した試料から菌株を単離し、単離した微生物株を抗真菌活性を指標とした評価スクリーニングに供した。その結果、有望な菌株が得られたので、それを更に精査した。
該菌株を16S rRNAの系統分類法による解析に供したところ、生産菌はストレプトマイセス属の放線菌であり、近縁種としてはStreptomyces nodosus（98.8%相同性）およびStreptomyces glomeratus（99.0%相同性）であった。最も近縁であるStreptomyces glomeratusとの塩基配列の相同性は99.0%であったため、新種の可能性が示唆された。本菌株をStreptomyces sp. A84株と命名した。Streptomyces sp. A84株を千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託し（受託番号：Ｐ−０１６７７，寄託日：２０１３年８月１日）、ＮＩＴＥ  Ｐ−０１６７７からブタペスト条約に基づく寄託への移管請求を行い、当該請求が２０１４年７月３０日（移管日）に受領され、受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０１６７７で国際寄託されている。【００４０】
実施例２：A84株の生産培地の検討
A84株の生産培地について検討した。
培地検討の結果、下記の培地において良好な生産性を示した。
培地組成：
スターチ      4%
カジトン      0.1%
NaH2PO4        0.1%
人工海水（マリンアート  スーパーフォーミュラ１、富田製薬製）
0.384%
pH            7.0
培養条件として300ml容三角フラスコに培地100mlを入れ28℃、200rpm、2-4日培養した。【００４１】
実施例３：活性成分の分離・精製および解析
A84株を実施例２に記載の組成の培地100mlを入れた300ml容三角フラスコに接種し、28℃、200rpm（ロータリーシェーカー）で3日間培養した。培養液を等量の酢酸エチルを用いて溶媒抽出した後、酢酸エチルを濃縮した。乾燥試料を少量のメタノールに溶解し、ODSカラムを用いたHPLCでカラムクロマト分離を実施し精製を行った（９５％純度以上、１００μｇ/１Ｌ）。【００４２】
活性成分のLC/MS分析、NMR解析、旋光度測定を行った。測定条件は以下の通りである。LC/MS：
装置：型番Agilent6540
イオン源:AJS-ESI、ESI、APC1
NMR：
装置：ECA-600（日本電子製）
マグネット：SCM 14.o1T
ボア径：54mm
プローブ：3mm、5mm、10mm
測定溶媒：重メタノール
旋光度：
旋光度計：P-1030（日本分光製）
溶媒：メタノール（HPLC用）
試料濃度：4mg/ml
温度：28
セル：3.5mmX10.0mmφ、円筒型硝子セル（mod.CG3-10）
λ：589nm
その結果、分子式はC15H19NO2、分子量は245.1416と決定され、NMRスペクトルは図１に示される通りに決定された。また、比旋光度は-3.25000 deg（Avg）、旋光度は-0.0013 deg（Avg）であった。【００４３】
実験例１：抗真菌活性の測定
微量液体希釈法により最少発育阻止濃度（MIC）を測定した。測定は、酵母様真菌ＦＰ'栄研'（栄研化学株式会社）を用い、製品の説明書に従って行った。【００４４】
各種薬剤の各菌種に対するMIC（μg/mL）を図２に示す。本発明の活性成分は、Candida spp.およびAspergillus spp.に対して良好な活性を示した。
【産業上の利用可能性】
【００４５】
本発明の化合物は、分子量が小さく、血清との反応性も低く、強い抗真菌作用を有するため、抗真菌剤として有用である。また、本発明の化合物は、新規の母核を有し、新規薬剤開発用のシード化合物として有望である。本発明はまた、本発明の化合物の製造方法を提供する。【００４６】
本出願は、日本で出願された特願２０１３−１７８７０７（出願日：２０１３年８月２９日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
0006620931.tif 000007
【図２】
0006620931.tif 000008