(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学バイオセンサーであって、
プリズムと、
前記プリズム上に形成された金属薄膜であって、所定波長の入射光により所定角度でプリズムが照射されると、表面近くに電場を発生するよう構成され、前記電場が、前記金属薄膜の表面に隣接する蛍光クエンチ領域と、前記蛍光クエンチ領域よりも更に表面から離れた位置の蛍光増強領域とを形成する、金属薄膜と、
一端が前記金属薄膜の表面に固定され、他端が蛍光マーカーで修飾された核酸分子であって、標的が結合すると折りたたまれた状態から伸長した状態へ、又は標的が結合すると伸長した状態から折りたたまれた状態へ構造が変化する、核酸分子と、
前記核酸分子が、金属薄膜の表面から離れる方向に伸長するように前記蛍光マーカー又は前記核酸分子に磁力を加える手段と、
を備え、
前記核酸分子が伸長状態にあるとき、前記蛍光マーカーは、前記蛍光増強領域に位置して第１の蛍光シグナルを発し、且つ、前記核酸分子が折りたたまれた状態にあるとき、前記蛍光マーカーは、蛍光クエンチ領域に位置して蛍光シグナルを発さないか、又は第１の蛍光シグナルよりも弱い第２の蛍光シグナルを発し、
前記蛍光マーカーが常磁性を有するか、又は前記核酸分子が、前記蛍光マーカーで修飾された端部において常磁性を有する別の分子で修飾されている、光学バイオセンサー。
【請求項２】
前記バイオセンサーが、表面プラズモン励起増強蛍光分光センサーである、請求項１に記載の光学バイオセンサー。
【請求項３】
前記蛍光マーカーが、前記金属薄膜の表面に導入される試料媒質の密度よりも高い又は低い密度を有する、請求項１または２に記載の光学バイオセンサー。
【請求項４】
前記核酸分子が、前記蛍光マーカーで修飾された端部においてマイクロバブルで修飾されている、請求項１〜３のいずれかに記載の光学バイオセンサー。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかの光学バイオセンサーの使用方法であって、
前記バイオセンサーの金属薄膜表面に試料を導入する工程と、
前記バイオセンサーから蛍光シグナルを測定する工程と、
からなる方法。
【請求項６】
前記核酸分子が金属薄膜の表面から離れる方向に伸長するように、前記蛍光マーカー又は前記核酸分子に外力を加える工程、を更に備える請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）に関し、特に、核酸リガンドの構造変化に基づくＳＰＦＳバイオセンサーに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンシング技術として、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）が知られている。この技術は、例えば、Ｔ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ，Ｗ．ＫｎｏｌｌによるＳｕｒｆａｃｅ−ｐｌａｓｍｏｎ  ｆｉｅｌｄ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇ．Ａｓｐｅｃｔｓ  １７１（２０００年）１１５-１３０頁（「Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ２０００」）や、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｋｎｏｉｒ，Ｆａｎｇ  Ｙｕ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｌｉｆａｎｇ  Ｎｉｕ，Ｅｖｅｌｙｎｅ  Ｌ．ＳｃｈｍｉｄによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎ  Ｆｉｅｌｄ−Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ８：Ｒａｄｉａｔｉｖｅ  Ｄｅｃａｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｇｅｄｄｅｓ及びＬａｋｏｗｉｃｚ編集，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍｅｄｉａ社，ニューヨーク，２００５年）３０５−３３２頁に記載されている。これらの引用文献には、ＳＰＦＳバイオセンサーの一般的な原理及び構成が示されている。ＳＰＦＳによって、先進的なセンシング技術による高感度検出が提供される。
【０００３】
図１Ａは、論文Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ２０００の図５からの引用であり、ＳＰＦＳシステムの構成を示す。図１Ｂは、同論文の図６（ａ）からの引用であり、ＳＰＦＳシステムに用いられるプリズム及びフローセルの構造を示す。以下に、ＳＰＦＳの基本概念を図１、１Ａ及び１Ｂを参照して説明する。ＳＰＦＳバイオセンサーは、ガラス又はプラスチックのプリズム上に金属薄膜を有する。金属は、例えば金、銀、アルミニウム等であってよい。金属膜の表面上には、捕捉分子が固定されている。生物試料は、この金属膜上に導入される。一定の波長の入射光により一定の角度でプリズムが照射されると、金属膜の表面に比較的強い電場が形成される。金属膜によるクエンチがあることから、蛍光励起に最適な位置は、表面から２０ｎｍから数百ｎｍ上方の領域である。一般的な装置では、クエンチ領域は金属表面から約０ｎｍ〜５ｎｍの範囲であり、増強領域は、表面から約１０ｎｍ〜２００ｎｍである。蛍光標識がこの増強領域に捕捉されると、比較的強い蛍光シグナルが発生する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＳＰＦＳバイオセンサーは、蛍光検出に基づいている。従来のＳＰＦＳバイオセンサーでは、タンパク質を検出するために、一般に金属薄膜上に固定された一次抗体に加えて、蛍光標識二次抗体が用いられている。この概略を図１に示す。一次抗体１５は、プリズム１２上の金属薄膜１１上に固定されている。標的１７（即ち、タンパク質等の被検出物質）をバイオセンサーに添加されると、これが固定された一次抗体１５に捕捉される。次いで、蛍光標識された二次抗体１６をバイオセンサーに添加すると、これが標的１７に結合する。一次抗体１５、標的１７及び二次抗体１６により、二次抗体の蛍光標識１６Ｆが金属薄膜１１上方の増強された電場領域内に位置するような構造が形成され、比較的強い蛍光シグナルが発生する。結合していない、又は非特異的な結合を形成している二次抗体については、その蛍光標識が、増強領域外となる金属クエンチ領域又は表面から更に遠くに位置する傾向があるため、励起されない。バイオセンサーを、検出結果を得る前に洗浄することができる。これら複数の工程により、バイオセンサーの使用はより複雑となり、ターンアラウンド時間も長くなっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の実施形態によれば、標識の存在下で構造が変化するＤＮＡリガンドを、ＳＰＦＳバイオセンサー上の分子スイッチとして用い、迅速なターンアラウンド時間で１工程のＳＰＦＳバイオセンシングが実現される。このバイオセンシング法では、標的により引き起こされる構造変化により、ＤＮＡリガンドに固定された蛍光マーカーの位置が、ＳＰＦＳバイオセンサーのクエンチ領域から増強領域へ、又はその逆に変化する。
【０００６】
本発明は、アッセイの工程数を減らすことにより、ＳＰＦＳバイオセンサーのターンアラウンド時間及び複雑さを低減することを目的とする。ＤＮＡナノスイッチ技術とＳＰＦＳを組み合わせた結果、システムについて、高感度、迅速なターンアラウンド時間そして簡便さを実現することができる。
【０００７】
本発明の更なる特徴及び効果は、以下の詳細な説明に記載されており、その一部は詳細な説明から明らかであるか、又は本発明の実施により知られるであろう。本発明の目的及びその他の効果は、詳細な説明及び請求の範囲において特に指摘される構造、そして添付の図面により理解され、達成されるであろう。
【０００８】
例示され広く記載されるように、これらの目的および／または他の目的を達成するため、本願発明は光学バイオセンサーを提供する。当該光学バイオセンサーは、
プリズムと、
前記プリズム上に形成された金属薄膜であって、所定波長の入射光により所定角度でプリズムが照射されると、表面近くに電場を発生するよう構成され、前記電場が、前記金属薄膜の表面に隣接する蛍光クエンチ領域と、前記蛍光クエンチ領域よりも更に表面から離れた位置の蛍光増強領域とを形成する、金属薄膜と、
一端が前記金属薄膜の表面に固定され、他端が蛍光マーカーで修飾された核酸分子であって、標的が結合すると折りたたまれた状態から伸長した状態へ、又は標的が結合すると伸長した状態から折りたたまれた状態へ構造が変化する、核酸分子と、
前記核酸分子が、金属薄膜の表面から離れる方向に伸長するように前記蛍光マーカー又は前記核酸分子に磁力を加える手段と、
を備え、
前記核酸分子が伸長状態にあるとき、前記蛍光マーカーは、前記蛍光増強領域に位置して第１の蛍光シグナルを発し、且つ、前記核酸分子が折りたたまれた状態にあるとき、前記蛍光マーカーは、蛍光クエンチ領域に位置して蛍光シグナルを発さないか、又は第１の蛍光シグナルよりも弱い第２の蛍光シグナルを発し、
前記蛍光マーカーが常磁性を有するか、又は前記核酸分子が、前記蛍光マーカーで修飾された端部において常磁性を有する別の分子で修飾されている。
【０００９】
他の側面では本願発明は、上記光学バイオセンサーの使用方法を提供する。当該方法は、前記バイオセンサーの金属膜表面に試料を導入する工程と、前記バイオセンサーから蛍光シグナルを測定する工程とを含む。
【００１０】
上記の概要の説明及び以下の詳細な説明は、いずれも例示及び説明のためのものであって、請求の範囲に記載の発明のさらなる説明を意図したものであると解される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】従来のＳＰＦＳバイオセンサーの原理及び構成を概略的に示す図である。
【図１Ａ】従来のＳＰＦＳバイオセンサーの原理及び構成を概略的に示す図である。
【図１Ｂ】従来のＳＰＦＳバイオセンサーの原理及び構成を概略的に示す図である。
【図２Ａ】本発明の実施形態に係るＤＮＡ分子スイッチを用いたＳＰＦＳバイオセンサーの原理を概略的に示す図である。
【図２Ｂ】本発明の実施形態に係るＤＮＡ分子スイッチを用いたＳＰＦＳバイオセンサーの原理を概略的に示す図である。
【図３】伸長した蛍光標識付きＤＮＡリガンドを概略的に示し、当該蛍光標識が、増強された電場領域に位置している図である。
【図４】種々のフェルスター距離における、蛍光シグナル強度−距離曲線の例を示す図である。
【図５】本発明の実施形態において分子スイッチとして用いることのできるＤＮＡ分子の例を示す図である。
【図６Ａ】本発明の実施形態において分子スイッチとして用いることのできる、長さを延長したＤＮＡリガンドと延長していないＤＮＡリガンドの例を概略的に示す図である。
【図６Ｂ】本発明の実施形態において分子スイッチとして用いることのできる、長さを延長したＤＮＡリガンドと延長していないＤＮＡリガンドの例を概略的に示す図である。
【図６Ｃ】本発明の実施形態において分子スイッチとして用いることのできる、長さを延長したＤＮＡリガンドと延長していないＤＮＡリガンドの例を概略的に示す図である。
【図７】標的がある場合と無い場合の、ＤＮＡリガンドの蛍光色素の位置分布曲線を示す図である。
【図８Ａ】金属膜上に固定されたＤＮＡ分子の伸長方向を制御する種々の方法を概略的に示す図である。
【図８Ｂ】金属膜上に固定されたＤＮＡ分子の伸長方向を制御する種々の方法を概略的に示す図である。
【図８Ｃ】金属膜上に固定されたＤＮＡ分子の伸長方向を制御する種々の方法を概略的に示す図である。
【図８Ｄ】金属膜上に固定されたＤＮＡ分子の伸長方向を制御する種々の方法を概略的に示す図である。
【図８Ｅ】金属膜上に固定されたＤＮＡ分子の伸長方向を制御する種々の方法を概略的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施形態では、標的の存在下で構造が変化するＤＮＡリガンドを、ＳＰＦＳセンサーの分子スイッチ（ＤＮＡナノスイッチともいう。）として用いる。この技術によれば、ＳＰＦＳバイオセンサーのクエンチ領域及び増強領域でのＤＮＡの構造変化を用いて、１工程のアッセイが実現される。
【００１３】
図２Ａは、本発明の実施形態に係るＳＰＦＳにおけるＤＮＡ分子スイッチの使用の基本概念を概略的に示す図である。分子スイッチにはＤＮＡ分子２２を採用しており、その一端は、センサーの金属表面２１上に固定され、他端は、蛍光色素２２Ｆで修飾されている。標的２３（例えば、タンパク質分子又はその他の生物分子又は試薬）の非存在下では、ＤＮＡ分子２２は折りたたまれており、蛍光色素２２Ｆは、金属表面２１の近くである金属クエンチ領域に位置し、クエンチされている（図２Ａ左側参照。）。標的２３の存在下では、ＤＮＡ構造２２は、伸長形状へと変化し、蛍光色素２２Ｆは、増強された電場領域に位置することとなって、比較的強い蛍光シグナルを発する（図２Ａ右側参照。）。
【００１４】
図２Ｂは、本発明の別の実施形態に係るＳＰＦＳに用いることのできる別のＤＮＡ分子スイッチを概略的に示す図であり、ＤＮＡ分子２２’は、標的２３の非存在下では展開して、ＤＮＡの他端にある蛍光色素２２Ｆが比較的強いシグナルを発するが、標的の存在下では折りたたまれて、蛍光色素がクエンチされる。このバイオセンサーは、その他の点では図２Ａのものと同様である。図２Ａ及び２Ｂには示していないが、バイオセンサーのプリズムが、図１に示す構成と同様に金属薄膜２１の下に位置している。
【００１５】
このバイオセンサーを用いる際は、蛍光シグナルが測定可能となるまでに、標的を含む試料を導入する１工程のみを要する。
【００１６】
論文Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ２０００に記載されるように、金属表面から短距離の位置で最も強い蛍光シグナルが得られる。当該論文に記載の情報（例えば、論文の図３及びそれに関連する記載）に基づくと、例えば論文で示された例によれば、蛍光シグナルに最適な表面からの高さは、好ましくは１０ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜３０ｎｍである。よって、蛍光シグナルについて高いシグナル−ノイズ比を得るためには、蛍光色素が、標的の存在下（図２Ａの例の場合。図２Ｂの例の場合は標的の非存在下）では蛍光シグナルが最も高くなると見込まれる位置にあり、標的の非存在下（存在下）では、蛍光シグナルが最も低くなると見込まれる位置にあることが重要である。上記の例では、標的の非存在下では、色素は、表面からの高さが５ｎｍ未満の空間内、好ましくはできる限り表面近くにあるべきであり、また、ＤＮＡリガンドが標的に結合したときには、色素は、蛍光シグナルが最大に近い位置、例えば金属表面から１０ｎｍ〜１００ｎｍ、より好ましくは１０ｎｍ〜３０ｎｍの位置にあるべきである。これを実現するには、図３に示すように、（標的の存在下又は不存在下における）ＤＮＡリガンドの長さ及びＤＮＡリガンドの伸長方向が重要である。
【００１７】
蛍光強度曲線における最適距離は、フェルスター距離である蛍光クエンチの半径（ｄ０）によって変わる。フェルスター半径ｄ０は、ドナー及びアクセプターの種類、蛍光の波長及び媒質の屈折率によって決まる。よって、ｄ０は、ドナー及び／又はアクセプターの材料、及び／又は添加剤や温度等といった媒体の屈折率を左右する要因を選択することにより調節することができる。ｄ０の値は、通常５ｎｍ〜１０ｎｍの範囲である。図４に、３種類の異なるｄ０値における蛍光強度曲線を示す。このように、ＳＰＦＳバイオセンサーとしてのＤＮＡリガンドの最適長は、ｄ０値によって変わり、多くの場合、最適長は約１０ｎｍ〜３０ｎｍとなるはずである。
【００１８】
ＤＮＡ分子スイッチとして作用することのできるＤＮＡリガンドの一つが、Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２０１２年９月１９日，１３４（３７）（「Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ  ２０１２」）に記載されており（図５参照）、これを当該論文に基づき再現する。この論文に記載のＤＮＡ分子は、ＤＮＡの一方の末端が蛍光マーカー（蛍光色素）「Ｆ」により修飾されており、他方の末端がクエンチモジュール「Ｑ」により修飾されている。標的（抗体）の非存在下においてＤＮＡが折りたたまれると、蛍光色素Ｆ及びクエンチモジュールＱが互いに近接する位置となり、蛍光がクエンチされる。標的の存在下においてＤＮＡが展開されると、蛍光色素ＦはクエンチモジュールＱによるクエンチを受けなくなる。このＤＮＡリガンドの当初折りたたまれている部分は、標的が結合すると１２ｎｍの長さに伸長する。
【００１９】
このＤＮＡを、本発明の実施形態に係るＳＰＦＳバイオセンサー用途に適合させてもよい。ＤＮＡの蛍光色素Ｆを持たない端部は、ＳＰＦＳセンサーの金属膜に固定される。ＤＮＡが折りたたまれると、色素の蛍光は金属薄膜によりクエンチされるので、クエンチモジュールＱは不要である。しかし、クエンチモジュールＱは、折りたたまれた状態における蛍光シグナルを更に減少させるので、任意で設けることができる。
【００２０】
ＳＰＦＳセンサーにおける蛍光の最適領域は、フェルスター半径（ｄ０）によって変わるため、伸長したＤＮＡにこの領域に蛍光色素を配置するのに十分な長さが無い場合には、金属表面２１から１０ｎｍ〜３０ｎｍの範囲となる最適位置に蛍光色素が配置されるように、さらにＤＮＡ配列を追加することができる。ｄ０＝５の場合には、蛍光シグナルが最も強くなる位置は、約１０ｎｍであり（図４参照。）、論文Ｖａｌｌｅｅ−Ｂｅｌｉｓｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１２に記載されるＤＮＡリガンド６１を改変すること無く用いることができる（図６Ａ参照）。一方、ｄ０＝１０の場合には、蛍光シグナルが最も強くなる位置は約２０ｎｍであり、この場合、ＤＮＡリガンドが展開されたときに蛍光シグナルが最も強くなる領域に蛍光標識が位置するように、ＤＮＡリガンドの長さを延長する必要がある。例えば、さらなるＤＮＡ配列６２を、ＤＮＡリガンド６１の折りたたまれる部分の両末端に追加することができ、蛍光色素及び固定部位は、延長したＤＮＡの遠位端に配される（図６Ｂ参照）。あるいは、複数のＤＮＡ分子６１を縦列に並べて繋いで長さを延長することもできる（図６Ｃ参照）。図６Ｃには、２個の抗体（標的）がタンデムＤＮＡリガンドに結合している様子が示されている。
【００２１】
試料中での蛍光色素の位置は、伸長したＤＮＡ分子が常に膜表面と直交する角度で完全に伸びているわけではないことから、分布を示す傾向がある。ＤＮＡスイッチは、標的が存在するときに最も強い蛍光シグナルをもたらし、標的が存在しないときには最も弱い蛍光シグナルをもたらす位置分布を示すように選択され、調節されるべきである。図７において、曲線７１は、標的が存在しない場合の蛍光色素の位置分布の例（ｇ（ｄ））を示し、曲線７２は、標的が存在する場合の蛍光色素の位置分布の例（ｈ（ｄ））を示し、曲線７３は、距離の関数としての蛍光シグナル強度の例（ｆ（ｄ））である。試料からのシグナル強度は、位置分布と蛍光強度との積である。
シグナル = o f(d) * h(d) dd
ノイズ = o f(d) * g(d) dd
【００２２】
ＤＮＡ分子の伸長した長さが、蛍光シグナルが最も強くなる位置とほぼ同じである場合、ＤＮＡ分子の伸長方向は、金属表面に対して垂直であることが望ましい。ＤＮＡが伸長したときの位置分布は、狭くすることが望ましい。これは、伸長方向を制御する技術により達成することができる。換言すれば、ＤＮＡ分子の伸長方向は、磁力、電気力及び／又は浮力等の外力により制御することができる。図８Ａ〜８Ｅに、種々の外力を加える手段を用いてＤＮＡの伸長方向を制御する例を概略的にいくつか示す。
【００２３】
図８Ａは、磁力による制御を示し、蛍光色素が常磁性を有するか、あるいはＤＮＡが自由末端（即ち、金属表面２１に固定されていないＤＮＡ末端）において常磁性を有する別の分子により修飾されている。外部磁場が試料に加えられる。
【００２４】
図８Ｂは、電気による制御を示し、蛍光色素が正電荷（又は負電荷）を帯びているか、あるいはＤＮＡが自由末端において正電荷（又は負電荷）を帯びた別の分子により修飾されている。適当な方向の外部電場が試料に加えられる。図８Ｃは、電気による制御の別の例を示し、ＤＮＡ分子が（ＤＮＡ本来の帯電である）負電荷を帯びており、金属薄膜の表面も同じく負に帯電されている。
【００２５】
図８Ｄは、浮力による制御を示し、蛍光色素の密度が試料媒質よりも低いか、あるいはＤＮＡが自由末端においてマイクロバブルにより修飾されて浮力を作り出している。マイクロバブルは、既知の技術用いて作成される。金属薄膜は、試料媒質の下方に位置し、ＤＮＡ分子は上向きに伸長する。図８Ｅは、浮力による制御の別の例を示し、蛍光色素の密度が試料媒質よりも大きい。ここでは、金属薄膜２１は試料媒質の上方に位置し、ＤＮＡ分子は下向きに伸長する。
【００２６】
試料は、リガンドを含めその分子のほとんどが電荷を帯びており、また、試料媒質の密度は患者によって様々となる傾向があることから、電気や浮力による制御では信頼性が低くなるおそれがあり、磁力による制御が本目的にはより好適である。
【００２７】
これらのＤＮＡ伸長方向の制御技術において、外力（磁気、電気、浮力）は、標的が存在しないときにＤＮＡを折りたたみ構造に保つ力よりも弱くあるべきであることに留意する必要がある。
【００２８】
シグナル−ノイズ比を高める別の技術として、標的が存在しないときに、蛍光分子を金属表面に集めてノイズを減少させる技術がある。これを実現するには、金属膜表面を、蛍光色素又は蛍光色素が結合したＤＮＡ末端と相互作用するように改変することができる。
【００２９】
上述したように、ＤＮＡが折りたたまれているときに蛍光がクエンチされるように、クエンチモジュールをＤＮＡ分子の固定末端近くに取り付ける必要はないが、そうしたクエンチモジュールを有していれば、ノイズが減少してシグナル−ノイズ比が高くなるので有利である。
【００３０】
上記した方法は、分析物（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、代謝産物、ウイルス、細胞等）の存在下で構造が変化する他のＤＮＡ分子スイッチにも適用することができる。
【００３１】
本発明の範囲又は精神から逸脱しない限り、本発明のＳＰＦＳバイオセンサー及び関連する方法に様々な改良及び変更を加えうることは、当業者にとって明白であろう。よって本発明は、以下のクレーム及びその均等の範囲内となる改良及び変更が包含するものと意図されている。
【図１】
0006495440.tif 000002
【図１Ａ】
0006495440.tif 000003
【図１Ｂ】
0006495440.tif 000004
【図２Ａ】
0006495440.tif 000005
【図２Ｂ】
0006495440.tif 000006
【図３】
0006495440.tif 000007
【図４】
0006495440.tif 000008
【図５】
0006495440.tif 000009
【図６Ａ】
0006495440.tif 000010
【図６Ｂ】
0006495440.tif 000011
【図６Ｃ】
0006495440.tif 000012
【図７】
0006495440.tif 000013
【図８Ａ】
0006495440.tif 000014
【図８Ｂ】
0006495440.tif 000015
【図８Ｃ】
0006495440.tif 000016
【図８Ｄ】
0006495440.tif 000017
【図８Ｅ】
0006495440.tif 000018