【事件の表示】
　特許第３０３２０８５号「プロテインＣを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤」の請求項１〜９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３０３２０８５号の請求項１〜４に係る特許を取り消す。
【理　由】
１．手続の経緯
　本件特許第３０３２０８５号発明は、平成４年６月１９日（パリ条約による優先権主張１９９１年６月２０日、オーストリア国）に特許出願され、平成１２年２月１０日にその特許権の設定登録がされたものである。その後、三浦敬明及び帝人株式会社より特許異議申立がされ、当審より取消理由通知がされ、その指定期間内である平成１３年９月３日に訂正請求（後日取下）がされ、その後再度取消理由通知がされ、その指定期間内である平成１５年３月５日に訂正請求がされた。　
　　
２．訂正の適否についての判断
(１)訂正の内容
訂正事項ａ
　特許請求の範囲の請求項１及び６〜９を削除する。
訂正事項ｂ
　請求項２の「 ・・・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しない該プロテインＣを加工することによって、非経口投与が可能な薬剤を得ること；
の組み合わせからなる、・・・薬剤の製造方法。」との記載を
「 ・・・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しない該活性化プロテインＣを加工することによって、非経口投与が可能な薬剤を得ること；
の順序の工程からなる、・・・薬剤の製造方法。」と訂正する。
訂正事項ｃ
　特許請求の範囲内に記載されている請求項２〜５の番号をそれぞれ順に請求項１〜４と訂正する。
　
(２)訂正の適否
  訂正事項ａは、請求項の削除であるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｂは、「・・・の組み合わせからなる」を「順序の工程からなる」と訂正し、「プロテインＣ」を「活性化プロテインＣ」に訂正するものであるが、「順序の工程からなる」への訂正は、工程を単なる組み合わせと工程の順序を特定していないものを請求項に記載の工程順序に限定したものであるから、特許請求の範囲の減縮を目的とする訂正に該当し、「活性化プロテインＣ」への訂正は、前記訂正で工程の順序を特定したことにより、血清アミロイドＰ及び抗体の精製工程がプロテインＣをトロンビンで活性化後の工程に限定されたために、前の工程の生成物と整合させたものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
　訂正事項ｃは、請求項の削除に伴って、請求項の番号を整合させるものであるから、明りょうでない記載の釈明を目的とする訂正に該当する。
　また、これらの訂正は、特許明細書に記載された範囲内のものであり、特許請求の範囲を拡張し、又は変更するものでもない。
　　　
　以上のとおりであるから、上記訂正請求は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項で準用する第１２６条第２〜３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　　
２．本件発明
　請求項１〜４に係る発明は、訂正後の特許請求の範囲に記載された次のとおりのものである。
「【請求項１】・精製プロテインＣを得るために、抗プロテインＣ抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを用いてプロテインＣを精製すること；
・活性化プロテインＣを得るために、該精製プロテインＣをトロンビンで活性化し、次いで該トロンビンを阻害すること；
・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しないプロテインＣを得るために、イオン交換体を用いてクロマトグラフィー的に該活性化プロテインＣから血清アミロイドＰおよび抗体を除去すること；および
・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しない該活性化プロテインＣを加工することによって、非経口投与が可能な薬剤を得ること；
の順序の工程からなる、非経口投与が可能な血栓溶解剤であって、プロテインＣまたは活性化プロテインＣに対する抗体ならびにトロンビン活性が混入していない活性化プロテインＣを含有し、血清アミロイドＰおよび感染性物質を含有しない薬剤の製造方法。
【請求項２】さらに該抗プロテインＣ抗体を感染性物質に対して不活化することを含む請求項１の方法。
【請求項３】感染性物質を不活化するために少なくとも２つの不活化法を適用する請求項２の方法。
【請求項４】抗トロンビンIII−ヘパリン複合体を添加することによって該トロンビンを阻害する請求項１の方法。」
     　
３．引用刊行物の記載の概要
（１）Schwarz et al.,Advances in applied Biotechnology Series Vol.11,Protein C and Related Anticoagulants1990, p.83-89（異議申立人三浦敬明が提出した甲第１号証、以下、刊行物１という。）には、
（1-1）プロテインＣ濃縮製剤・・・が２ステップ　クロマトグラフィーにより製造された。ヨーロッパとカナダで製造許可されているウイルス不活化処理が施されたプロトロンビン複合体製剤（蒸気加熱処理第IX因子複合体・・・）が、モノクロナル抗体を用いてのイムノアフィニティークロマトクロマトグラフィー法によりプロテインＣを単離するための出発材料として用いられた。・・・投与される患者へのマウス由来ウイルスの感染性を減ずるため、モノクローナル抗体は固定前に化学的なウイルス不活化処理が施された。プロテインＣ溶出液は、更なるウイルス不活化処理を受けたが、この処理はプロテインＣ活性に影響しなかった。残存するマウスイムノグロブリンはイオン交換クロマトグラフィー法により除去された。最終的には、アルブミンで安定剤とした製剤となるが、これにはマウス由来蛋白と同様に凝固因子も含まれていない。（84頁17行〜85頁2行）
と記載されている。
　　
（２）国際特許90/07524号公開パンフレット（異議申立人三浦敬明が提出した甲第２号証、以下、刊行物２という。翻訳文として特開平3-504332号公報を用いる。摘示箇所は翻訳文による）には、次の事項が記載されている。
（2-1）HＰＣ-4はヒトプロテインＣに対するカルシウム依存性モノクローナル抗体である。（3頁左上欄）
（2-2）HＰＣ-4抗体は少なくとも2.6Mのグアニジンまたは・・・上記試薬いずれかで処理することは、出発原料としての抗体を含有する溶液中に存在するウイルスを確実に不活性化し、プロテインＣ最終生産物は、それを調製するために使用した抗体に由来するウイルスで汚染されない。（５頁右上〜左下欄）
（2-3）プロテインＣおよびその他のビタミンK依存性タンパク質は、・・・希釈したヒト血しょう30LからQAEセファデックスQ50・・・に室温で1時間、バッチ的に吸着させ・・・。・・・セファデックスを・・・カラムに充填し、・・・洗浄後、プロテインＣを・・・で溶離した。・・・血清アミロイドＰ、すなわち、Ｃａ2+の存在でセファデックスに結合するタンパク質による汚染は、QAEセファデックスイオン交換クロマトグラフィーで除去された。（9頁右下欄〜10頁左上欄）
（2-4）市販のビタミンK依存性血しょうタンパク質濃縮物を血しょうの代わりに使用した場合、濃縮物はプロテインCのHＰＣ-4結合に対応できる緩衝液に再構成され・・・、バッチまたはカラムでHＰＣ-4−Affi−Gel 10樹脂に直接かけられる。・・・プロテインCをHＰＣ-4樹脂から溶離後、QAEクロマトグラフィーはアフィニティー樹脂で処理される原料中に血清アミロイドPが存在する場合のみ必要である。(10頁右上欄）
　　
（３）特表昭60-501859号（異議申立人三浦敬明が提出した甲第３号証、以下、刊行物３という。）には、トロンビンを用いるプロテインＣの活性化方法について、
（3-1）・・・蛋白質Ｃの溶液をヒトのα−トロンビン・・・でインキュベートした。
　活性化処理の進行に続いて蛋白質Ｃ−トロンビン　インキュベート混合物の20λ分別量を周期的に取り出し、ヘパリンとアンチトロンビンIIIとの混合物・・・を用いてトロンビンを中和し・・・。・・・蛋白質Ｃは充分活性化され蛋白質Ｃａにされた。
　トロンビンは上に記載したとおりにしてヘパリン及びアンチトロンビンIIIで中和させることによるかあるいはインキュベート混合物をスルホプロピル　セファデックスC-50のカラム中に通過させる・・・ことによるかのいずれかにより蛋白質Ｃａ溶液から除去されることができる。別法としては不溶性トロンビン−セファロース・・・が蛋白質Ｃを活性化するために使用されることが出来、この場合においてトロンビンの除去はおだやかに遠心分離することにより簡単に行なわれる。（3頁左下欄〜右下欄）
と記載されている。
　　
（４）J. Clin. Invest.,Vol.68,Nov., 1981,p.1221-1228（異議申立人三浦敬明が提出した甲第４号証、以下、刊行物４という。）には、「イヌへの活性化プロテインＣの注入による線溶活性の発生」と題して次の事項が記載されている。
(4-1）モングレル犬にネンブタールナトリウムを静脈内投与して麻酔した。プロテイン溶液を前足の静脈に注射によって投与した。血液試料を外部頚静脈に挿入した2インチ、18ゲージの静脈内カテーテルを介して採取した。(1222頁左欄21〜26行）
(4-2)全血（2.5ml）を採取し、pH5.5、3.8%クエン酸塩、280μlを含有する17×100-mmポリスチレン管に加え、直ぐにボルテックスミキサーで混合した。これに比放射能〜167μCi/mgをもつ125Ｉ−ヒトフィブリノーゲン10μgを添加し、再び全血を混合した。0.15M NaCl、20mM Tris HCl、pH7.4、100μl中に5Uウシトロンビンで血液をクロット化した。トロンビンは血液を撹拌している間に加えられた。血液は室温５分間でクロット化することができ、それから丸い木製のアプリケータで管壁に付着しているクロットを取り除いた。クロットを37℃の水浴中でインキュベートして、30分、１時間及びその後１時間間隔で、クロットのまわりから血清試料100-μlを採取し、400-μlプラスチックマイクロ遠心管（Bio−Rad　Laboratories）内に入れた。該管をベックマン遠心機Ｂで５分間遠心分離した。次に30μl血清を赤血球ペレットの上部から取り、Biovial中に入れ、125Ｉ−フィブリン−分解生成物含量をベックマンガンマカウンター内で試料をカウントすることにより決定した。（1222頁左欄31〜50行）
（4-3）活性化プロテインＣをイヌに静脈内投与するとイヌの全血クロット溶解速度が高まる（図１）。血漿中のプロテインＣａ（審決注：以下、ＡＰＣと記述する。）濃度が3μg/mLになるようにＡＰＣがイヌに投与されたとき、投与5分後に採取された血液のクロット溶解速度は、投与前に採取された血液のクロット溶解速度に比べ速かった。ＡＰＣ投与後のクロット溶解速度はしだいに低下し、ＡＰＣ投与35−40分後には投与前と同じになった。同レベルのＡＰＣをin vitroで添加すると、クロット溶解速度は小さいながら、再現性のある高まりを示した。フィブリン分解産物の血清中への遊離と、肉眼的に観察されるクロット溶解の程度は相関していた。ＡＰＣ投与５分後に採取された血液から作られたクロットの完全溶解は、トロンビン添加後60−80分で起こった。ＡＰＣの投与前に作られたクロットあるいはin vitroでＡＰＣを添加した後に作られたクロットの溶解には36時間以上要した。（結果の項、1222頁右欄末10行〜1223頁左欄末24行）
（4-4）ＡＰＣの静脈内注入が至適溶解応答を示した。in vitroでクエン酸血液に等価レベルのＡＰＣを添加するとクロット溶解速度に比較的小さい増加を示した。このことはＡＰＣ自体は溶解を亢進するのにクロット化血液中に必要ないのかも知れないことを示唆する。この可能性を試験するために、我々はイヌにＡＰＣを静脈内投与し、血液を採取し、それからＡＰＣを中和するために抗プロテインＣウサギIgGを添加した（図4）。IgGで処理したイヌの血液は処理しない血液とほとんど同程度のクロット溶解速度を有した。IgGはＡＰＣ投与前のコントロール血液クロットの溶解速度に影響を与えなかった。このことはＡＰＣは形成されたクロット中で直接影響するのではなく、血液循環中で影響することを示唆した。（1224頁右欄4〜19行）
（4-5）生理的濃度になるようにＡＰＣをin vivoで投与すると、全血クロット溶解速度が著しく高まった。この線溶亢進はＡＰＣに特異的で、同族蛋白質のプロトロンビンではクロット溶解速度は増加しなかった。ジイソプロピルフルオロホスフェートでプロテアーゼ活性を失活させたＡＰＣや、前駆体のプロテインCではクロット溶解速度に変化はなかったことから、クロット溶解の亢進にはＡＰＣの活性中心が必要であることがわかった。クロット溶解の活性の亢進は、第一義的には循環するプラスミノゲンアクチベータ（審決注：以下、PAと記述する。）活性が上昇した結果であると考えられる。in vivoでのＡＰＣ注入投与後に見られるPAレベルまで上昇するようにリジン吸着したPAがin vitroで正常血液に加えられると、PAが添加された血液のクロット溶解速度はＡＰＣを投与されたイヌから得られた血液のクロット溶解速度と同じになった。クロット溶解速度の亢進に他の血漿蛋白が関与しているかもしれないが、このPAレベルの上昇は溶解活性を亢進するのに充分である。PAが血管内フィブリノゲン溶解を起こさないことは、ＡＰＣの注入投与を継続してもプラスミノゲンのレベルは正常でありフィブリノゲン分解産物の増加がみられないことから明らかである。このことから、PAは、形成された血液クロット中のフィブリンの存在下でより効果的に作用することが示唆される。（考察の項、1227頁左欄末15行〜右欄6行）　
（4-6）ＡＰＣは血管から直接プラスミノゲンアクチベータを放出しているのではないようである。・・・ＡＰＣをin vitroで血液に加え、その後ＡＰＣを抗体で中和した血液をイヌに戻してもクロット溶解速度が増加した。・・・。これらの知見は、ＡＰＣはScondary messenger又はmessenger同族体を生成し、それが循環するＰＡの活性を高めていることを示唆している。（1228頁左欄12〜29行）
　
（5）特開平1-238536号公報（異議申立人三浦敬明が提出した甲第５号証、以下、刊行物５という。）には次の事項が記載されている。
（5-1）ＡＰＣの調製
　ヒト血漿プロトロンビン複合体の濃縮液・・・が蛋白質Ｃ（ＰＣ）の源泉であった。ＰＣのＬ鎖に対して向けられたモノクローナル抗体（C3という）が調製され、臭化シアンで活性化されたセファロース4B・・・に結合され、緩衝液・・・で希釈したプロトロンビン複合体濃縮液をカラム上に加えた。ＰＣは、2Mのチオシアネートで溶出し、トリスで緩衝した塩水・・・に対して透析した。精製したＰＣは、・・・トロンビン−セファロースビーズを使って活性化した。
　精製したＡＰＣは、SDS−PAGE上に二つのバンドとして現れ、他の蛋白質による有意の汚染（≧5%）は検出されなかった。若干の調合品においては、凝固試験で立証される痕跡量のトロンビンがバイオ−レックス70での吸着またはモノ-Qカラム・・・上での急速蛋白質液体クロマトグラフィー（FPLC）で分離された。（4頁左上〜右上欄）
（5-2）ヒトＡＰＣの単独又は血栓溶解剤（t-PA）との併用での注入は、動脈血栓症をもつヒトの治療薬として使用できる。（７頁右上欄）
　　
３．対比・判断
　以下、プロテインＣはＰＣ、活性化プロテインＣはＡＰＣと、それぞれ略記する。
（１）請求項１に係る発明について
　請求項１に係る発明と刊行物５に記載のＡＰＣの調製方法を対比する。
　刊行物５には、ＡＰＣの調製について、ヒト血漿プロトロンビン複合体の濃縮液を原料として、ＰＣのＬ鎖に対して向けられたモノクローナル抗体を、臭化シアンで活性化されたセファロース4Bに結合したカラムを通してＰＣを得たこと、精製したＰＣをトロンビン−セファロースビーズを使って活性化しＡＰＣを得たこと、精製したＡＰＣは他の蛋白質による有意の汚染は検出されなかったこと、若干の調合品においては痕跡量のトロンビンがモノ-Qカラム上での急速蛋白質液体クロマトグラフィーで分離されたこと（5-1）、及びＡＰＣは注入により動脈血栓症の治療薬として使用できること（5-2）が記載されている。
　刊行物５におけるモノクローナル抗体を結合したセファロース4Bカラムは抗ＰＣ抗体のアフィニティーカラムであることは明らかであり、また、活性化後にトロンビンセファロースビーズを分離する工程についての記載はないものの、これが遠心分離などで分離されることは当業者に自明である。
　本件発明で含有しないとされるトロンビン活性、血清アミロイドＰ及び抗体はいずれも蛋白質であるところ、刊行物５では、若干の調合品に存在する痕跡量のトロンビンも除去されるから、精製ＡＰＣはトロンビンも含め他の蛋白質が混入していないものである。
　そうすると、本件発明の製造方法と刊行物５の調製方法は、
ａ．精製ＰＣを得るために、抗ＰＣ抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを用いてＰＣを精製し；
ｂ．ＡＰＣを得るために、該精製ＰＣをトロンビンで活性化し；
ｃ．トロンビン活性を含め他の蛋白質が混入していない；
ＡＰＣを製造する点で一致し、
１）本件発明ではトロンビンによる活性化後に該トロンビンを阻害するのに対し、刊行物５ではトロンビンセファロースビーズで活性化しトロンビン阻害を行わない点；
２）本件発明は血清アミロイドＰ及び抗体を含有しないものとするためにイオン交換体を用いてクロマトグラフィー的にＡＰＣからこれらを除去するのに対し、刊行物５では痕跡量のトロンビンがある場合はモノ-Qカラム上での急速蛋白質液体クロマトグラフィーで分離するとされている点；
３）本件発明はＡＰＣを加工することにより非経口投与可能な薬剤を得るものであって、この薬剤について、血栓溶解剤であり、抗体、トロンビン及び血清アミロイドＰ並びに感染性物質を含有しないとしているのに対し、後者にはＡＰＣは注入により動脈血栓症をもつヒトの治療薬として使用できることが記載され、ＡＰＣは他の蛋白質を含まないとされているが、感染性物質については言及がない点；
で相違する。
　そこで、これらの相違点について検討する。
　
(ア)相違点１について
　刊行物３には、トロンビンを用いてＰＣをＡＰＣに活性化し、活性化処理の進行に続いてトロンビンをヘパリン及びアンチトロンビンIIIとの混合物で中和させる方法が記載され、この中和によりＡＰＣ溶液からトロンビンを除去できること、別法として活性化に不溶性トロンビン−セファロース（刊行物５のトロンビン−セファロースビーズはこれに相当する）を使用した場合は、トロンビンの除去は穏やかな遠心分離で簡単に行われることが記載されている。
　刊行物５のＰＣをＡＰＣに活性化する方法は、上記刊行物３の別法、すなわち不溶性トロンビン−セファロースであるトロンビン−セファロースビーズによってＰＣを活性化し、その後これを分離する方法であるが、トロンビンでＰＣを活性化し次いでトロンビン活性を阻害（中和と同義である。）する方法も刊行物３に記載されているようにＰＣの活性化方法として知られているのであるから、いずれの方法を採用するかは当業者が適宜に選択し得るものである。
　
(イ)相違点２について
　刊行物１及び２には、ＰＣが血清アミロイドＰや抗体によって汚染されることがあることが記載されており、ＰＣを原料としてその活性化により製造されるＡＰＣが、同じく血清アミロイドＰや抗体に汚染される可能性があることは、当業者であれば十分に予想できる。
　そして、医薬として使用されるＡＰＣが他の蛋白質による汚染がないものであることを要求されるのは当然のことであって、刊行物５でも他の蛋白による汚染がないことを確認し、痕跡量のトロンビンが存在する場合には、モノ−Ｑカラム（これが、イオン交換体を用いたクロマトグラフィーであることは当業者に明らかである。）で分離することが行われる。
　そうすると、刊行物５のＡＰＣの調製方法において痕跡量のトロンビンが存在する場合にその除去のためにイオン交換体によるクロマトグラフィー処理を行うのと同様に、ＡＰＣの製造過程で混入する可能性がある他の蛋白質である血清アミロイド及び抗体を除去するために、それらの除去に有効な手段として刊行物１及び２に記載されたイオン交換クロマトグラフィーを行って他の蛋白質による汚染のない精製ＡＰＣを得ようとすることは、当業者が容易に想到し得ることである。そして、ＰＣからのＡＰＣの製造では、ＰＣ精製後にトロンビンによる活性化という他の蛋白質を導入する処理を行うのであるから、そのような工程で混入する可能性のある蛋白質の除去を工程の最後に行うことは、当業者が適宜になし得ることである。
　
(ウ)相違点3について
　刊行物５には、ＡＰＣが注入により動脈血栓症をもつヒトの治療薬として使用できることが記載されているから、刊行物５の調製方法により得られた他の蛋白汚染のない精製ＡＰＣを加工して非経口投与可能な薬剤とすることは十分に示唆されているといえる。
　そして、このような薬剤にウイルス等の感染性物質を含有しないことが求められるのは当然のことである。（例えば、刊行物１では、ウイルス不活化処理が施されたプロトロンビン複合体製剤を原料とし、化学的なウイルス不活化処理が施されたモノクローナル抗体カラムから溶出したプロテインＣを更にウイルス不活化処理し（1-1）、また、刊行物２では、モノクローナル抗体は完全にウイルスに対して不活化されたもの（2-2）として、ウイルス等の感染性物質を含有しない製品としている。）
　したがって、他の蛋白質の汚染がないだけでなく、感染性物質を含有しないＡＰＣの非経口投与が可能な薬剤とすることは、当業者が容易になし得ることである。
　また、本件発明では薬剤は血栓溶解剤であるとし、刊行物５ではＡＰＣは動脈血栓症をもつヒトの治療薬として使用できるとしている点は、製造されたＡＰＣ薬剤の用途を記述したものであるが、いずれも非経口的に投与することが可能な品質を備えたＡＰＣを含有する薬剤ということには変わりがなく、用途を付してもそれによって製造工程や製造されたＡＰＣ自体に何ら違いが生じるものではない。したがって、この点をもって製造方法の発明である本件発明と刊行物５の調製方法を構成上区別し得る実質的な相違点ということはできない。
　
　しかも、ＡＰＣに血栓溶解作用があることは、以下に述べるとおり、本件出願前に知られていたものである。　
　
　刊行物４には、ＡＰＣを静脈内投与した後でイヌの頚静脈から採取した全血に125Ｉ-ヒトフィブリノーゲンを添加し、ウシトロンビンで血液をクロット化したこと［（4-1)、（4-2）］、このクロットをインキュベートし、一定時間毎にクロットのまわりから血清を採取し、血清中に含まれる125Ｉ-フィブリノーゲン分解産物量でクロットの溶解を評価したこと（4-2)、ＡＰＣを静脈内に投与するとクロットの溶解速度が増加したこと［（4-3）(4-5)］が記載されている。すなわち、血球などの凝血塊成分が含まれている全血にさらにフィブリノーゲンとトロンビンを加えているのであるから、刊行物４には、ＡＰＣを投与した全血をin vitroで完全に凝血化（クロット化）したものについて、ＡＰＣの投与の有無又は投与時期によってクロットの溶解速度を比較し、ＡＰＣがクロットのフィブリン分解作用を示したことが記載されているといえる。
　さらに、刊行物４には、「PAは、形成された血液クロット中のフィブリンの存在下でより効果的に作用することが示唆される」（4-5）こと、「ＡＰＣは形成されたクロット中で直接影響するのではなく、血液循環中で影響することが示唆される」（4-4）こと、「ＡＰＣはSecondary messengerを生成し、それが循環するＰＡの活性を高める」（4-6）ものであることが記載されており、これらの記載は、血栓溶解にＡＰＣが影響する機構を考察し、血栓が形成された循環血液中にＡＰＣが存在すればよいことを示している。
　したがって、刊行物４には、ＡＰＣが静脈投与により血栓溶解剤となり得ることが十分示唆されている。
　
　特許権者は、ＡＰＣを凝血塊形成前に添加していることを理由に、刊行物４は凝固のプロセスが遅延することか、また防止されることを示しているのであって、in vivoでＡＰＣが既に存在する血栓を分解しうることを示してはいないと主張している。
  しかし、刊行物４の試験では、採取した血液に十分なトロンビンを添加し、十分な凝固反応を行わせ、完全に凝血後（クロット形成後）にクロットからのフィブリンの溶解速度を測定しているのであるから、本件明細書に記載の実験と同じように血栓溶解を示しているといえるのであって、凝固のプロセスが遅延すること、または防止されることを示しているものではない。
　
　以上のように、請求項１に係る発明は、刊行物５に記載のＡＰＣの調整方法に刊行物１〜３に記載されている処理工程を組合わせ、さらに、刊行物４に示されているＡＰＣの血栓溶解作用をその用途として特定したものに過ぎず、刊行物１〜５に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものである。
　よって、請求項１に係る発明の特許は、特許法第２９条第２項の規定に違反してされたものである。
　　
（イ）請求項２〜４に係る発明について
　抗ＰＣ抗体を感染性物質に対して不活化すること（請求項２）は刊行物１（1-1）及び刊行物２（2-2）に記載されており、感染性物質を不活性化するために２つの不活化方法を含むこと（請求項３）については刊行物１で蒸気加熱処理と化学処理の２つの方法が行われ、トロンビンを抗トロンビンIII（＝アンチトロンビンIII）−ヘパリン複合体で阻害すること（請求項４）は刊行物３で行われているから、請求項１に係る発明にこれらの工程を付加する程度のことは当業者が容易になし得るものである。
　したがって、請求項２〜４に係る発明は、刊行物１〜５に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものと認められるから、特許法第２９条第２項の規定に違反して特許されたものである。
　　
４．むすび
　以上のとおりであるから、本件請求項１〜４に係る発明は特許法第２９条に違反して特許されたものであるので、本件特許は特許法第１１３条第１項第２号の規定により取り消すべきものである。
　
　よって、結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１５年８月１１日（２００３．８．１１）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
プロテインＣを含有し血栓溶解活性を有する非経口投与が可能な薬剤
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項
１
・活性化プロテインＣを得るために、該精製プロテインＣをトロンビンで活性化し、次いで該トロンビンを阻害すること；
・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しないプロテインＣを得るために、イオン交換体を用いてクロマトグラフィー的に該活性化プロテインＣから血清アミロイドＰおよび抗体を除去すること；および
・血清アミロイドＰおよび抗体を含有しない該
活性化
の
順序の工程
　【請求項
２
１
　【請求項
３
２
　【請求項
４
１
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、血栓溶解活性を有し、プロテインＣまたは活性化プロテインＣに対する抗体ならびにトロンビン活性を含有しない活性化されたプロテインＣを含有する非経口投与が可能な薬剤に関する。
　【０００２】
　これらの薬剤はプロテインＣ欠乏症の治療に適用できると共に、血栓溶解剤として、線維素（フィブリン）溶解剤として、ならびに抗凝固剤として適用できる。
　【０００３】
　【従来の技術とその課題】
　プロテインＣはビタミンＫ依存性の糖タンパク質であり、この糖タンパク質は肝臓で合成され、血漿中で不活性酵素原（チモーゲン）として４μｇ／ｍｌの濃度で循環する。プロテインＣは血管壁の表面（内皮）上のトロンビン−トロンボモジュリン複合体によって活性なセリンプロテアーゼ（活性化プロテインＣ）に変換される。活性化プロテインＣがプロフィブリン溶解特性を有することは知られている。またこれは因子Ｘａが誘導するプロトロンビン活性化（トロンビン生成）の補因子である因子Ｖａ、ならびに因子ＩＸａが誘導する因子Ｘ活性化の補因子である因子ＶＩＩＩａの両方をタンパク加水分解的に分解するので、これは抗凝固効果をも有する。
　【０００４】
　プロテインＣの生体内での活性化は、トロンビンの生成における負のフィードバック反応を構成する。最適な生物活性を発揮するためには補因子（プロテインＳ）が必要である。
　【０００５】
　ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１２０２８およびＥＰ−Ａ−０２８７０２８には、プロテインＣを活性化する方法ならびにアフィニティークロマトグラフィー精製法が記述されている。ＥＰ−Ａ−０２８７０２８によれば、プロテインＣとトロンビン／トロンボモジュリンとの反応は抗トロンビンＩＩＩの添加によって停止する。
　【０００６】
　アフィニティークロマトグラフィーを用いて非滅菌モノクローナル抗体で精製したプロテインＣ調製物を投与する場合、病原体が伝染する危険がある。さらに、微量のトロンビン、微量のネズミ・タンパク質あるいは血清アミロイドＰなどの不純物が、活性化プロテインＣを含有する調製物の投与に際して不利な効果を有するかもしれない。
　【０００７】
　プロテインＣ調製物のウイルス安全性を増大させるために、既にウイルス不活化された出発物質から、ウイルス不活化モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグラフィー精製によってプロテインＣを単離することが、“Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｅｒｉｅｓ”，第１１巻，“Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃ　ａｎｄ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ”（Ｂｒｕｌｅｙ　Ｄ．Ｆ．およびＤｒｏｈａｎ　Ｗ．Ｎ．共編；Ｇｕｌｆ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｐａｒｉｓ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｔｏｋｙｏ），８３−８９頁（１９９０）に提案されている。次いで、その調製物をさらにウイルス不活化処理にかけることができる。
　【０００８】
　ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７５２４から、イオン交換体（セファデックスＱ５０）へのプロテインＣの吸着によって血清アミロイドＰを除去できることが知られている。
　【０００９】
　さらにヘパリン−セファロースへのトロンビンの選択的吸着によって、活性化プロテインＣから微量のトロンビンを除去することができる（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．５９，２７−３５（１９９０））。しかしこの方法にはウイルス不活化のための操作、あるいは血清アミロイドＰを除去するための操作が含まれていない。
　【００１０】
　ＥＰ−Ａ−０３１８２０１には、活性化プロテインＣを単独で、あるいは血栓溶解的に活性な物質と組み合わせて使用することによって、動脈血栓症または血栓閉塞状態を防止し得ることが述べられている。活性化プロテインＣの抗血栓症活性は実施例によって立証されている。
　【００１１】
　本発明の目的は、特に高純度の活性化プロテインＣを含有する、最初に限定した種類の薬剤を提供することにある。
　【００１２】
　【課題を解決するための手段】
　本発明の薬剤は血清アミロイドＰおよび感染性物質を含有しないことを特徴とする。
　【００１３】
　本発明の薬剤はいかなる副反応も示さず、血栓溶解療法は線維素原（フィブリノーゲン）の低下または出血を誘発しない。
　【００１４】
　本発明の薬剤は、特にＬｙｓ−プラスミノーゲンまたはウロキナーゼと組み合わせると、驚くほど良い血栓溶解活性を有し、したがって血栓症を防止する能力が高いことがわかった。
　【００１５】
　本発明は、活性化プロテインＣの投与が血栓溶解的に活性な酵素プラスミンの生物内での遊離に関与し、したがって生体内での血栓溶解活性を増大させるという発見に基づいている。したがって、本発明の薬剤は血栓溶解剤としての使用に適している。さらに、その血栓溶解活性が適用した投与量の関数であり、したがって、使用する活性化プロテインＣがトロンビン活性および血清アミロイドＰを含有しなければ、その至適活性を示すこともわかった。
　【００１６】
　また本発明は、上述の薬剤を得る方法であって、次の手段：
・抗プロテインＣ抗体（任意に、感染性物質に対して不活化したもの）によるアフィニティークロマトグラフィーを用いてプロテインＣを精製する；
・精製したプロテインＣをトロンビンで活性化した後、トロンビンを阻害する；
・イオン交換体を用いてクロマトグラフィー的に、活性化プロテインＣから血清アミロイドＰおよび抗体を除去する；
・非経口投与が可能な薬剤に加工する；
の組み合わせを特徴とする方法に関する。
　【００１７】
　本発明の方法の好ましい態様は、感染性物質を不活化するために少なくとも２つの手段を採用することを特徴とする。
　【００１８】
　本発明の薬剤は、特に純粋な形態の活性化プロテインＣを含有する。抗トロンビンＩＩＩ−ヘパリン複合体の形態でトロンビン１単位当たり０．０１〜０．１ＩＵ抗トロンビンＩＩＩを用いて、トロンビンを阻害し、次いでその反応混合物からトロンビンを除去することが最善の方法である。抗トロンビンＩＩＩ−ヘパリン複合体はトロンビンに対して、抗トロンビンＩＩＩ単独よりもかなり高い親和性を有し、それゆえに活性化プロテインＣからのトロンビンの分離がより容易に実行できる。
　【００１９】
　微量のトロンビンを含有しないことに加えて、ネズミ・タンパク質（抗体類）および血清アミロイドＰもイオン交換体でのクロマトグラフィー精製を用いて本発明の薬剤から除去されており、さらに本発明の薬剤はウイルス不活化処理をいくつか組み合わせることによって、ウイルス安全（ウイルス感染の危険がない）であると見なし得る。酵素原を得るために、既にウイルスを不活化した出発物質（プロトロンビン複合体）をウイルス不活化モノクローナル抗体でのアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。トロンビンによる活性化の後、活性化プロテインＣを再度ウイルス不活化処理に付す。既知の不活化法（例えば、ＥＰ−Ａ−０１５９３１１、ＥＰ−Ａ−００５００６１、ＥＰ−Ａ−０１３１７４０）を用いてヒト病原性微生物を不活化することができる。
　【００２０】
　トロンビンの阻害は抗トロンビンＩＩＩ−ヘパリン複合体の添加によって達成することが有利である。
　【００２１】
　以下に、活性化プロテインＣを含有する医薬組成物の製造、ならびに動物モデル中で観測したその血栓溶解活性について、より詳細に記述する。
　【００２２】
　【実施例】
実施例１
プロテインＣの製造
　市販のプロトロンビン複合体濃縮物から得た粗プロテインＣ画分から、純粋なプロテインＣを回収した。精製は、モノクローナル抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって達成した。モノクローナル抗プロテインＣ抗体を次のように製造した。
　【００２３】
　ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、２週間間隔で腹腔内注射することによりヒトプロテインＣ　１００μｇで免疫化した。６週間後、ヒトプロテインＣをさらに５０μｇ注射し、その３日後に融合を実行した。骨髄腫細胞株（Ｐ３−Ｘ−６３−ＡＧ８−６５３、１．５ｘ１０７細胞）を１．７ｘ１０８のマウス脾臓細胞と混合し、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｅｓｔｅｉｎの改良法に従って、ＰＥＧ１５００を用いて融合した（Ｋｏｈｌｅｒ　Ｇ．，Ｍｉｌｅｓｔｅｉｎ　Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ　２５６（１９７５），４９５−４９７）。
　【００２４】
　ＥＬＩＳＡを用いて検定した陽性クローンを２回サブクローニングした。プリスタン（Ｐｒｉｓｔａｎ）処理の２週間後、ＢＡＬＢ／Ｃマウス１匹あたり５ｘ１０６ハイブリドーマ細胞を注射することによって、腹水産生を達成した。
　【００２５】
　硫酸アンモニウム沈殿後、ＱＡＥ−セファデックスでクロマトグラフィーを行い、さらにセファデックスＧ２００でクロマトグラフィーを行うことによって、腹水から免疫グロブリンを精製した。ネズミ・ウイルスの伝染の危険性を減じるために、固定化に先立って抗体をさらにウイルス不活化操作に付した。このよにして得たモノクローナル・プロテインＣ抗体をＣＮＢｒ−活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア）に結合させた。アフィニティークロマトグラフィーによるプロテインＣの精製には次の緩衝液を使用した。
吸着緩衝液：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ベンズアミジン；
洗浄緩衝液：２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１Ｍ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　ベンズアミジン、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４；
溶出緩衝液：３Ｍ　ＮａＳＣＮ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１Ｍ　ＮａＣｌ、０．５ｍＭ　ベンズアミジン、２ｍＭ　ＥＤＴＡ。
　【００２６】
　詳細：プロトロンビン複合体濃縮物を吸着緩衝液に溶解した（モノクローナル抗体カラム２０ｍｌについて約１０ｇのプロトロンビン複合体濃縮物を使用した）。次いで、溶解したプロトロンビン複合体濃縮物を濾過し、２００００ｒ．ｐ．ｍ．で１５分間遠心分離し、０．８μｍフィルターを通して滅菌濾過した。溶解し滅菌濾過したこのプロトロンビン複合体濃縮物を１０ｍｌ／時間の流量でカラムに添加した。次いで、このカラムを洗浄緩衝液で洗浄することによりタンパク質を除去し、最後に溶出緩衝液を５ｍｌ／時間の流量で流すことによって、結合したプロテインＣを溶出させ、その分画を集めた。溶出したプロテインＣを緩衝液（０．２ｍｏｌ／ｌ　Ｔｒｉｓ、０．１５Ｍ　グリシン、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３）に対して透析した。プロテインＣ抗原濃縮物をＬａｕｒｅｌｌが記述した方法を用いて決定し、プロタック（Ｐｒｏｔａｃ）活性化を用いてプロテインＣ活性を決定した。
　【００２７】
　得られたプロテインＣ含有溶液を滅菌濾過し、凍結乾燥し、８０℃±５℃および１３７５±３５ｍｂａｒで１時間蒸気処理することによってウイルスを不活化した。
　【００２８】
実施例２
活性化プロテインＣの製造
　精製したプロテインＣの活性化を次のように行った：プロテインＣ　１０ｇを緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）に６ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、１００ｍＭ　ＮａＣｌおよび１０ｍＭ　クエン酸ナトリウム緩衝液に溶解したヒトウイルス不活化トロンビン　１４．４ｍｇと共に３７℃で３時間インキュベートした。１２００Ｕの抗トロンビンＩＩＩ−ヘパリン複合体を用いてこの反応を停止させた。
　【００２９】
　この後、Ｑ−セファロースを用いて、活性化プロテインＣのさらなる精製を行った。この目的のために、１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム中で吸着を行い、１Ｍ　ＮａＣｌ溶液で溶出を実行した。
　【００３０】
　この溶出液を限外濾過し、滅菌濾過し、それぞれ５ｍｌの単位で滅菌的に充填し、凍結乾燥した。
　【００３１】
　５ｍｌの体積に溶解する際、この調製物の組成を次のようにした。
　【表１】
　　タンパク質：　　　　　　　　　　１．５ｍｇ／ｍｌ
　　ａＰＣ（活性化プロテインＣ）：　２０４Ｕ／ｍｌ（色素原基質Ｓ２３６６（Ｋａｂｉ）のアミド加水分解に関して）
　　ＮａＣｌ：　　　　　　　　　　　１５０ｍＭ
　　クエン酸ナトリウム：　　　　　　　１５ｍＭ
　　ｐＨ：　　　　　　　　　　　　　７．５
　【００３２】
　この調製物はプロテインＣおよびトロンビンに対する抗体を含有せず（免疫学的に決定した）、さらに血清アミロイドＰを含有しなかった（電気泳動的に決定した）。
　【００３３】
実施例３
動物モデル
　ヒト活性化プロテインＣの血栓溶解特性を、文献で知られており、血栓溶解性物質を試験するための標準であると考えられているモデルで評価した。Ｄ．Ｃｏｌｌｅｎが１９８３年に記述したモデルを、１２５Ｉ−フィブリノーゲンの代わりに１２３Ｉ−フィブリノーゲンを用い、ガンマカメラ（Ｅｌｓｃｉｎｔ　ＡＰＥＸ　４０９ＡＧ，シングル・ピンホール・コリメーター）を使用することによって改良した。
　【００３４】
　麻酔したウサギ・ハイプノルム（Ｈｙｐｎｏｒｍ；ジャンセン（Ｊａｎｓｅｎｎ））の左頚静脈を露出させ、その顔面枝中にカテーテルを固定した。約１．５ｃｍの距離にわたって頚静脈を圧搾した後、１００μｌの１２３Ｉ−フィブリノーゲン−ウサギ血液混合物をカテーテルを通して添加した。３０分後、鉗子を除去した。ａＰＣを大腿深静脈を通して１時間注入した。ガンマカメラを１２３Ｉ−フィブリノーゲン血栓上の距離２ｃｍに設置した。放射活性を２時間測定し、連続的に記録した。その値を１２３Ｉ−フィブリノーゲンの減衰によって補正した。血栓溶解速度を血栓中の放射活性の低下として表した。
　【００３５】
　それぞれの投与量群について４匹の動物を用いた。１つの群は、ビタミン−Ｋ−依存性凝固因子の合成を排除するために、クマリン（４−ヒドロキシクマリン（シグマ）、５ｍｇ／ｋｇ　ｉ．ｖ．９日間）で予備処置した。抗凝固化動物中の血栓は正常な（即ち、非抗凝固化）ウサギの血液−フィブリノーゲン混合物によって形成させた。
　【００３６】
　ａＰＣの注入は服量依存性の血栓溶解をもたらした。即ち、８０、１５０、２００および５００Ｕ／ｋｇはそれぞれ２１、２４、４０および５８％の血栓溶解を誘発した。緩衝液で処理した動物は同じ２時間の測定時間中に１２％の溶解を示したに過ぎなかった。抗凝固化動物は溶解耐性であり、４００Ｕ／ｋｇで１８％より高い溶解を示さなかった。これは、ビタミン−Ｋ−依存性タンパク質（例えばプロテインＳ、プロテインＺ、プロトロンビン）がａＰＣの生体内での血栓溶解効果にとって必要であることを立証している。
　【００３７】
　これらの結果を添付の図１にグラフ化して表す。横座標は投与量（単位／ｋｇ）を表し、縦座標は血栓溶解効果（溶解率（％））を表す。
　【００３８】
　ａＰＣがａＰＣとｔ−ＰＡの組み合わせより静脈血栓の溶解に適していることが立証された。５００単位ａＰＣ／ｋｇおよび０．４ｍｇ　ｔ−ＰＡ／ｋｇを投与したところ、約３３％の溶解（ａＰＣを単独で適用した場合と比較して５８％）しか観測できなかった。
【図面の簡単な説明】
　【図１】　活性化プロテインＣの生体内での血栓溶解活性の投与量依存性を表す。横座標は投与量（単位／ｋｇ）を表し、縦座標は血栓溶解効果（溶解率（％））を表す。