(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
工程（１）：セルロース含有バイオマスの前処理物および失活セルラーゼのスラリーを調製する工程、
工程（２）：工程（１）のスラリーに糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解する工程、
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程
を含み、失活セルラーゼが工程（３）の加水分解残渣を、ｐＨ１１以上、６５℃未満のアルカリ性水溶液に浸漬して調製されたものである、糖液の製造方法。
【請求項２】
失活セルラーゼが少なくともβ−グルコシダーゼを含む、請求項１に記載の糖液の製造方法。
【請求項３】
工程（１）のスラリーがｐＨ３．０〜７．０の範囲である、請求項１または２に記載の糖液の製造方法。
【請求項４】
糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ属微生物由来である、請求項１から３のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【請求項５】
工程（１）における前処理物が希硫酸処理物である、請求項１から４のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルロース含有バイオマスから糖液を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、エネルギー使用量および環境負荷が少ないセルラーゼを使用したセルロース含有バイオマスの加水分解による糖液の製造方法が広く検討されている。しかしながら、セルラーゼを使用する糖液の製造方法の最大の欠点は、セルラーゼの価格が高いため糖液製造コストが増大するという点である。こうした技術課題を解決するために加水分解に使用したセルラーゼを回収再利用する方法が提案されているが、セルロース含有バイオマスを加水分解する際に生じる加水分解残渣にセルラーゼが強く吸着するため、酵素の再利用性が低いということが課題となっている。【０００３】
加水分解残渣に吸着したセルラーゼを脱着し、セルラーゼの回収率を高める方法としては、加水分解残渣をｐＨ８程度のアルカリ水溶液で洗浄する方法（非特許文献１）、セルロース含有バイオマスの加水分解物にノニオン性界面活性剤を添加する方法（特許文献１）などが知られている。一方、セルラーゼの加水分解残渣への吸着を低減する方法としては、セルロース含有バイオマスの加水分解時、水溶性塩類を添加して反応液の電気伝導度を５〜２５ｍＳ／ｃｍに調整する方法（特許文献２）、セルロース含有バイオマスの固形物重量に対して１〜１０重量％の炭酸カルシウム粒子を添加する方法（特許文献３）などが知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開昭６３−８７９９４号公報
【特許文献２】特許第４９４７２２３号公報
【特許文献３】特開２０１２−１００６１７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】D. E. Otterら、“Elution of Trichoderma reesei Cellulose from Cellulose by pH Adjustment with Sodium Hydroxide” Biotechnology Letters (1984) Vol.6、No.6、369-374
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上述したように、セルロース含有バイオマスの加水分解に用いたセルラーゼを回収し、再利用することによりセルラーゼの使用量を削減する試みが種々なされているが、セルラーゼが加水分解残渣に強く吸着するためその回収率は低く、問題の解決には至っていない。【０００７】
そこで本発明は、従来よりも高い効率でセルラーゼを回収できる糖液の製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者が上記課題の解決のため鋭意検討した結果、前処理を施したセルロース含有バイオマスを糸状菌由来セルラーゼにより加水分解する際に失活セルラーゼを添加することにより、糸状菌由来セルラーゼの酵素成分を高い効率で回収することができるということを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明は以下の［１］〜［８］の構成を有する。
［１］以下の工程（１）〜（３）を含む、糖液の製造方法。
工程（１）：セルロース含有バイオマスの前処理物および失活セルラーゼのスラリーを調製する工程、
工程（２）：工程（１）のスラリーに糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解する工程、
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程。
［２］失活セルラーゼがアルカリ処理失活セルラーゼである、［１］に記載の糖液の製造方法。
［３］失活セルラーゼが工程（３）の加水分解残渣をｐＨ１１以上のアルカリ性水溶液に浸漬して調製されたものである、［１］または［２］に記載の糖液の製造方法。
［４］失活セルラーゼが工程（３）の加水分解残渣を６５℃未満のアルカリ性水溶液に浸漬して調製されたものである、［３］に記載の糖液の製造方法。
［５］失活セルラーゼが少なくとも失活β−グルコシダーゼを含む、［１］から［４］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［６］工程（１）のスラリーがｐＨ３.０〜７.０の範囲である、［１］から［５］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［７］糸状菌由来セルラーゼがトリコデルマ属微生物由来である、［１］から［６］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
［８］工程（１）の前処理が希硫酸処理である、［１］から［７］のいずれかに記載の糖液の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、前処理を施したセルロース含有バイオマスの加水分解残渣への糸状菌由来セルラーゼの吸着を抑制することができ、特に加水分解反応において重要な役割を果たすβ−グルコシダーゼを高い効率で回収および／または再利用することができる。その結果、糖液製造コストを低く抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の糖液の製造方法の実施の形態を示した略図である。
【図２】図２は、本発明の糖液の製造方法において、失活セルラーゼの調製方法の一形態を示した略図である。
【図３】図３は、加水分解残渣を浸漬するアンモニア水溶液のｐＨと、加水分解残渣から回収される失活セルラーゼの量の関係について示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について工程ごとに説明する。
【００１３】
工程（１）：セルロース含有バイオマスの前処理物および失活セルラーゼを含むスラリーを調製する工程
セルロース含有バイオマスは、バガス、スイッチグラス、ネピアグラス、エリアンサス、コーンストーバー、ビートパルプ、綿実殻、パーム殻房、稲わら、麦わら、竹、笹、などの草本系バイオマス、あるいはシラカバ、ブナなどの樹木、廃建材などの木質系バイオマスを挙げることができる。セルロース含有バイオマスは糖から構成されるセルロースおよびヘミセルロースの他に、芳香族高分子であるリグニンなどを含有しているため、前処理を施すことによりセルラーゼによる加水分解効率を向上させることができる。
【００１４】
セルロース含有バイオマスの前処理方法としては、硫酸などによる酸処理、苛性ソーダ、アンモニアなどによるアルカリ処理、水熱処理、亜臨界水処理、微粉砕処理、蒸煮処理が挙げられるが、本発明の糖液の製造方法において最も糸状菌由来セルラーゼの再利用性が高いのは希硫酸処理物を用いた場合であるため、希硫酸処理が好ましく適用される。
【００１５】
セルロース含有バイオマスの前処理物には、セルロース含有バイオマス由来の固形分のほか、セルロース含有バイオマスに含まれるヘミセルロースの一部が加水分解して生じたキシロースを含む溶液成分が含まれる。本発明では前処理物をそのまま後段の工程に用いてもよいし、あるいは固液分離によりキシロースを含む溶液成分を取り除いたものを用いてもよい。
【００１６】
失活セルラーゼとは酵素活性が失われたセルラーゼであり、本発明では、加熱処理、アルカリ処理、酸処理などタンパク質の構造を不安定化する処理を行うことにより、処理前に対する残存酵素活性（β−グルコシダーゼ活性）が１０％未満となったセルラーゼを指す。失活セルラーゼを調製する方法は特に限定されず、上記に例示される処理を１または複数の組み合わせで行うことができるが、本発明ではアルカリ処理によって調製された失活セルラーゼが好ましく用いられる。なお、セルラーゼが失活する温度やｐＨはセルラーゼの種類によって異なるため、使用するセルラーゼに応じて適した変性条件を設定すればよい。
【００１７】
本発明で使用する失活セルラーゼの種類は特に限定されないが、後述の工程（２）での糸状菌由来セルラーゼの前処理物への吸着を防ぐためには、失活セルラーゼも糸状菌由来セルラーゼを用いることが好ましい。糸状菌由来失活セルラーゼの中でも、本発明の効果が高いのは失活β−グルコシダーゼであり、失活セルラーゼは少なくとも失活β−グルコシダーゼを含んでいることが好ましい。
【００１８】
また、本発明は糖液の製造コストを低減することを課題とするものであるため、失活セルラーゼの調製方法も安価に実施できる方法がより好ましく、具体的には、後述の工程（３）で得られる加水分解残渣をｐＨ１１以上のアルカリ性水溶液に浸漬することによって調製することがより好ましい。工程（３）の加水分解残渣にはセルロースの加水分解に使用した糸状菌由来セルラーゼの一部が吸着しており、これを失活セルラーゼとして再利用できるからである。
【００１９】
加水分解残渣をアルカリ性水溶液に浸漬する際の温度は、加水分解残渣に吸着した糸状菌由来セルラーゼが脱着し、かつ失活するような範囲であれば限定されないが、浸漬温度が高すぎると加水分解残渣から脱着した失活セルラーゼが熱分解を受け、本発明の効果が十分に得られないことがあるため、６５℃未満で行うことが好ましい。
【００２０】
加水分解残渣を浸漬する時間は特に限定されないが、浸漬の時間が短すぎると失活セルラーゼの回収量が不十分な場合があり、一方、時間が長すぎると失活セルラーゼが熱分解を受ける場合があるため、１０分間〜６時間浸漬を行うのが好ましく、３０分間〜３時間がさらに好ましい。
【００２１】
加水分解残渣の浸漬は公知の方法で実施できる。例えば加水分解残渣を浸漬タンクに回収し、さらにアルカリ水溶液を添加して撹拌してもよいし、ＷＯ２０１１／１１５０３９号に記載されるように固液分離後のプレス濾過装置にアルカリ水溶液を通液することで加水分解残渣を浸漬してもよい。
【００２２】
セルロース含有バイオマスの前処理物および失活セルラーゼを含むスラリーの固形物濃度は特に限定されないが、１〜３０重量％の範囲が好ましい。固形物濃度が低いと加水分解により生成する糖濃度が低く、発酵原料として利用しにくい場合がある。一方、濃度が高すぎるとハンドリングが困難になることがある。
【００２３】
工程（２）：工程（１）のスラリーに糸状菌由来セルラーゼを添加して加水分解する工程
本発明では、セルロース含有バイオマスの加水分解に糸状菌由来セルラーゼを使用する。糸状菌としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、セルロモナス属（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、ムコール属（Ｍｕｃｏｒ）、タラロマイセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、などの微生物を挙げることができる。また、これら微生物に変異剤あるいは紫外線照射などで変異処理を施すことによりセルラーゼ生産性が向上した変異株由来のセルラーゼであってもよい。
【００２４】
糸状菌の中でもトリコデルマ属は、セルロースの加水分解において比活性の高い酵素成分を培養液中に大量に生産するため本発明において好ましく使用することができる。トリコデルマ属由来セルラーゼの具体例としては、トリコデルマ・リーセイＱＭ９４１４（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９４１４）、トリコデルマ・リーセイＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＱＭ９１２３）、トリコデルマ・リーセイＲｕｔＣ−３０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＲｕｔＣ−３０）、トリコデルマ・リーセイＰＣ３−７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＰＣ３−７）、トリコデルマ・リーセイＣＬ−８４７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＣＬ−８４７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ７７（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ７７）、トリコデルマ・リーセイＭＣＧ８０（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ  ＭＣＧ８０）、トリコデルマ・ビリデＱＭ９１２３（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ  ＱＭ９１２３）由来のセルラーゼが挙げられるが、中でもトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼがより好ましい。
【００２５】
糸状菌由来セルラーゼは、セルロースおよび／またはヘミセルロースを加水分解してグルコースやキシロースなどの単糖を生成する活性を有する酵素組成物であり、酵素成分としてセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼおよびβ−キシロシダーゼからなる群から選択される１種以上を含むことが好ましい。例えばトリコデルマ・リーセイ由来セルラーゼの酵素成分としては、セロビオハイドラーゼＩ、セロビオハイドラーゼＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、エンドグルカナーゼＩＩＩ、β−グルコシダーゼ、キシラナーゼ、β−キシロシダーゼ、などが例示され、こうした複数の酵素成分の協奏効果あるいは補完効果により効率的なセルロースおよび／またはヘミセルロースの加水分解を実施することができるため、本発明において好ましく使用される。
【００２６】
セロビオハイドラーゼは、セルロース鎖の加水分解によりセロビオースを放出する酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．９１としてセロビオハイドラーゼに帰属される酵素群が記載されている。セロビオハイドラーゼＩはセルロース鎖の還元末端側から、セロビオハイドラーゼＩＩは非還元末端側から加水分解反応を開始する。
【００２７】
エンドグルカナーゼは、セルロース鎖の中央部分から加水分解することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．４としてエンドグルカナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００２８】
β−グルコシダーゼとは、セロオリゴ糖あるいはセロビオースに作用することをと特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．２１としてβ−グルコシダーゼに帰属する酵素群が記載されている。
【００２９】
キシラナーゼとは、ヘミセルロースあるいは特にキシランに作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．８としてキシラナーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００３０】
β−キシロシダーゼとは、キシロオリゴ糖に作用することを特徴とする酵素の総称であり、ＥＣ番号：ＥＣ３．２．１．３７としてβ−キシロシダーゼに帰属される酵素群が記載されている。
【００３１】
こうしたセルラーゼ成分は、ゲル濾過、イオン交換、二次元電気泳動などの公知手法により分離し、分離した成分のアミノ酸配列をデータベースと比較することにより同定することができる。なお、アミノ酸配列の分析にはＮ末端分析、Ｃ末端分析、質量分析など公知の分析手法を用いればよい。
【００３２】
また、糸状菌由来セルラーゼの酵素活性は、アビセル分解活性、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）分解活性、セロビオース分解活性、キシラン分解活性、マンナン分解活性などといった多糖の加水分解活性によって評価することができる。アビセル分解活性を示す主たる酵素は、セルロース末端部分から加水分解する特徴を有するセロビオハイドラーゼである。セロビオース分解活性を示す主たる酵素は、β−グルコシダーゼである。ＣＭＣ分解活性に関与する主たる酵素は、セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼである。キシラン分解活性を示す主たる酵素はキシラナーゼ、β−キシロシダーゼである。ここで“主たる”という意味は、最も分解に関与することが知られていることからの表現であり、これ以外の酵素成分もその分解に関与していることを意味している。
【００３３】
糸状菌は培養液中にセルラーゼを産生するため、その培養液を粗酵素剤としてそのまま使用してもよいし、公知の方法で酵素群を精製し、製剤化したものを糸状菌由来セルラーゼ混合物として使用してもよい。糸状菌由来セルラーゼを精製し、製剤化したものとして使用する場合、プロテアーゼ阻害剤、分散剤、溶解促進剤、安定化剤など、酵素以外の物質を添加したものを使用してもよい。なお、本発明ではこれらの中でも粗酵素物が好ましく使用される。粗酵素物は、糸状菌がセルラーゼを産生するよう調製した培地中で、任意の期間該微生物を培養した培養上清に由来する。使用する培地成分は特に限定されないが、セルラーゼの産生を促進するためにセルロースを添加した培地が一般的に使用できる。そして、粗酵素物として、培養液をそのまま、あるいはトリコデルマ菌体を除去したのみの培養上清が好ましく使用される。
【００３４】
粗酵素物中の各酵素成分の重量比は特に限定されるものではないが、例えば、トリコデルマ・リーセイ由来の培養液には、５０〜９５重量％のセロビオハイドラーゼが含まれており、残りの成分にエンドグルカナーゼ、β−グルコシダーゼなどが含まれている。また、トリコデルマ属の微生物は、強力なセルラーゼ成分を培養液中に生産する一方で、β−グルコシダーゼに関しては、その多くを細胞内あるいは細胞表層に保持しているため培養液中のβ−グルコシダーゼ活性は低い。そこで、粗酵素物に、さらに異種または同種のβ−グルコシダーゼを添加してもよい。異種のβ−グルコシダーゼとしては、アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼが好ましく使用できる。アスペルギルス属由来のβ−グルコシダーゼとして、ノボザイム社より市販されているＮｏｖｏｚｙｍｅ１８８などを例示することができる。また、トリコデルマ属の微生物に遺伝子を導入し、その培養液中に産生されるよう遺伝子組換えされたトリコデルマ属の微生物を培養し、β−グルコシダーゼ活性の向上した培養液を用いてもよい。
【００３５】
加水分解反応の温度は、４０〜６０℃の範囲であることが好ましく、特にトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、４５〜５５℃の範囲であることがより好ましい。加水分解反応の時間は、２時間〜２００時間の範囲であることが好ましい。２時間未満であると、十分な糖生成量が得られないことがある。一方で、２００時間を超えるとセルラーゼの失活が進み、回収セルラーゼの再利用性に悪影響を及ぼすことがある。
【００３６】
加水分解に供される工程（１）のスラリーのｐＨ、すなわち加水分解反応のｐＨは、ｐＨ３．０〜７．０の範囲が好ましく、ｐＨ４．０〜６．０の範囲であることがさらに好ましい。糸状菌由来セルラーゼとしてトリコデルマ属由来セルラーゼを使用する場合、その反応最適ｐＨは５．０である。さらに、加水分解の過程でｐＨの変化が起きるため、反応液に緩衝液を添加する、あるいは酸やアルカリを用いて一定ｐＨを保持しながら実施することが好ましい。
【００３７】
工程（３）：工程（２）の加水分解物を溶液成分と加水分解残渣に固液分離し、溶液成分を限外濾過膜に通じて濾過して非透過液として糸状菌由来セルラーゼを回収し、透過液として糖液を回収する工程
工程（２）の加水分解物を固液分離して得られる溶液成分には糸状菌由来セルラーゼ成分および糖成分が含まれ、これらは限外濾過膜を用いた濾過によって分離することができる。
【００３８】
限外濾過膜とは、分画分子量が５００〜２００，０００となる膜のことであり、ウルトラフィルトレーション膜、ＵＦ膜などとも呼ばれるものである。また、限外濾過膜は、孔径が小さすぎて膜表面の細孔径を電子顕微鏡等で計測することが困難であり、平均細孔径の代わりに分画分子量という値を孔径の大きさの指標とすることになっている。分画分子量とは、日本膜学会編膜学実験シリーズ  第ＩＩＩ巻  人工膜編  編集委員／木村尚史・中尾真一・大矢晴彦・仲川勤（１９９３年、共立出版）  Ｐ９２に、『溶質の分子量を横軸に、阻止率を縦軸にとってデータをプロットしたものを分画分子量曲線とよんでいる。そして阻止率が９０％となる分子量を膜の分画分子量とよんでいる。』とあるように、限外濾過膜の膜性能を表す指標として当業者には周知のものである。
【００３９】
限外濾過膜を用いた糸状菌由来セルラーゼ成分と糖成分の分離においては、その分画分子量は糖液の主成分の単糖であるグルコース（分子量１８０）やキシロース（分子量１５０）を透過し、糸状菌由来セルラーゼを阻止できるものであれば限定されないが、分画分子量５００〜５０，０００の範囲が好ましく、酵素反応に阻害的作用を示す夾雑物質を酵素と分離するという観点から、より好ましくは分画分子量５，０００〜５０，０００の範囲であり、さらに好ましくは分画分子量１０，０００〜３０，０００の範囲である。
【００４０】
限外濾過膜の素材としては、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリアクリロニトリル（ＰＡＮ）、ポリフッ化ビニルデン（ＰＶＤＦ）、再生セルロース、セルロース、セルロースエステル、スルホン化ポリスルホン、スルホン化ポリエーテルスルホン、ポリオレフィン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリ４フッ化エチレンなどを使用することができるが、再生セルロース、セルロース、セルロースエステルはセルラーゼによる分解を受けるため、ＰＥＳ、ＰＶＤＦなどの合成高分子を素材とした限外濾過膜を使用することが好ましい。
【００４１】
限外濾過膜の膜形態としては、平膜型、スパイラル型、チューブラー型、中空糸型など適宜の形態のものが使用できる。具体的には、ＤＥＳＡＬ社のＧ−５タイプ、Ｇ−１０タイプ、Ｇ−２０タイプ、Ｇ−５０タイプ、ＰＷタイプ、ＨＷＳＵＦタイプ、ＫＯＣＨ社のＨＦＭ−１８０，ＨＦＭ−１８３、ＨＦＭ−２５１、ＨＦＭ−３００、ＨＦＫ−１３１、ＨＦＫ−３２８、ＭＰＴ−Ｕ２０、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｐ、ＭＰＳ−Ｕ２０Ｓ、Ｓｙｎｄｅｒ社のＳＰＥ１、ＳＰＥ３、ＳＰＥ５、ＳＰＥ１０、ＳＰＥ３０、ＳＰＶ５、ＳＰＶ５０、ＳＯＷ３０、旭化成株式会社製のマイクローザ（登録商標）ＵＦシリーズの分画分子量３，０００から１０，０００に相当するもの、日東電工株式会社製のＮＴＲ７４１０、ＮＴＲ７４５０などが挙げられる。
【００４２】
限外濾過膜の非透過液として回収される糸状菌由来セルラーゼは、セルロース含有バイオマスの加水分解に再利用することができる。本発明では、回収セルラーゼを再利用することによりセルラーゼの使用量が減り、糖液製造コストを削減することができる。なお、回収セルラーゼを用いてセルロース含有バイオマスの加水分解を行う場合、回収セルラーゼ単独では十分な糖収量を得ることができないことがあり、そのような場合、回収セルラーゼに未使用の糸状菌由来セルラーゼを新たに添加してもよい。未使用の糸状菌由来セルラーゼの添加量が増加するとコスト面で不利になるため、十分な糖収量を得るために必要最低限の未使用セルラーゼを添加することが好ましい。
【００４３】
限外濾過膜の透過液として回収される糖液は単糖であるキシロースおよびグルコースを主成分とするものであり、そのままでも後述の発酵工程での発酵原料として使用可能であるが、発酵工程の効率を高めるためにさらに糖濃度を高める濃縮処理を行ってもよい。糖液の濃縮処理は、蒸発濃縮、減圧濃縮、膜濃縮などを例示することができるが、エネルギー使用量が少なく、糖液に含まれる発酵阻害物質を分離することが可能なＷＯ２０１０／０６７７８５号に記載される、ナノ濾過膜および／または逆浸透膜に通じて濾過する方法により、糖成分が濃縮された濃縮糖液を得ることができる。
【００４４】
本発明により得られた糖液を発酵原料として化学品を生産する能力を有する微生物を生育させることで、各種化学品を製造することができる。ここでいう発酵原料として微生物を生育させるとは、糖液に含まれる糖成分あるいはアミノ源を微生物の栄養素として利用し、微生物の増殖、生育維持を行うことを意味している。化学品の具体例としては、アルコール、有機酸、アミノ酸、核酸など発酵工業において大量生産されている物質を挙げることができる。こうした化学品は、糖液中の糖成分を炭素源として、その代謝の過程において生体内外に化学品として蓄積生産する。微生物によって生産可能な化学品の具体例として、エタノール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、グリセロールなどのアルコール、酢酸、乳酸、ピルビン酸、コハク酸、リンゴ酸、イタコン酸、クエン酸などの有機酸、イノシン、グアノシンなどのヌクレオシド、イノシン酸、グアニル酸などのヌクレオチド、カダベリンなどのアミン化合物を挙げることができる。さらに、本発明の糖液は、酵素、抗生物質、組換えタンパク質などの生産に適用することも可能である。こうした化学品の製造に使用する微生物に関しては、目的の化学品を効率的に生産可能な微生物であればよく、大腸菌、酵母、糸状菌、担子菌などの微生物を使用することができる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４６】
（参考例１）セルロース含有バイオマス前処理物の調製
セルロース含有バイオマス（コーンコブ）をその２倍重量の硫酸１％水溶液に浸し、１５０℃で３０分オートクレーブ（日東高圧株式会社製）にて処理したものをセルロース含有バイオマス前処理物とし、以下の実施例に使用した。【００４７】
（参考例２）タンパク質濃度の測定
タンパク質濃度は、市販のタンパク質濃度測定試薬（Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄプロテインアッセイ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）を使用した。室温に戻したタンパク質濃度測定試薬２５０μＬに希釈したセルラーゼ溶液を５μＬ添加し、室温で５分間静置後の５９５ｎｍにおける吸光度をマイクロプレートリーダー（ＰＯＷＥＲＳＣＡＮ  ＨＴ、大日本住友製薬株式会社製）で測定した。牛血清アルブミン水溶液を標準液とし、検量線に照らし合わせてセルラーゼ溶液のタンパク質濃度を算出した。【００４８】
（参考例３）β−グルコシダーゼ活性の測定
糸状菌由来セルラーゼの活性はβ−グルコシダーゼ活性を指標とし、以下に示す方法で測定した。【００４９】
１．１ｍＭ  ４−ニトロフェニル−β−Ｄ−グルコピラノシドを含む５５ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）０．９ｍＬに酵素液を０．１ｍＬ加え、３０℃で反応を行った（基質の終濃度１ｍＭ、緩衝液の終濃度５０ｍＭ）。１０分間正確に反応させた後、０．１ｍＬの２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を添加して反応を停止させ、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｔｅｓｔ）。ブランクとして、基質溶液に２Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液、酵素液の順に添加したものについても同様に４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（ＯＤｂｌａｎｋ）。上記反応系で１分間に１μｍｏｌの４−ニトロフェノールを生成する酵素量を１Ｕと定義し、活性値（Ｕ／ｍＬ）を下記式に従って算出した。なお、上記反応系における４−ニトロフェノールのミリモル分子吸光係数は１７．２Ｌ／ｍｍｏｌ／ｃｍである。
β−グルコシダーゼ活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ＯＤｔｅｓｔ−ＯＤｂｌａｎｋ）×１．１（ｍＬ）×酵素希釈倍率｝／｛１７．２×１０（分間）×０．１（ｍＬ）｝。【００５０】
（参考例４）セルロース含有バイオマスの加水分解物からのセルラーゼの回収
（工程１：セルロース含有バイオマス前処理物のスラリーの調製）
参考例１に従い調製したセルロース含有バイオマス前処理物１．０ｇ（絶乾重量）を５０ｍＬ容遠沈管に秤量し、７．０ｍＬの水に懸濁した。ｐＨを測定したところｐＨ２．３であったため、スラリーのｐＨが５．０になるまで１０％アンモニア水溶液を添加し、さらに総重量が１０ｇになるまで水を添加して固形物濃度１０％のスラリーを調製した。【００５１】
（工程２：糸状菌由来セルラーゼによる加水分解）
糸状菌由来セルラーゼとして、市販のセルラーゼ酵素液（“アクセルレースデュエット”ジェネンコア製）を使用した。参考例２に従ってセルラーゼ酵素液のタンパク質濃度を測定したところ、その濃度は４０ｇ／Ｌであった。工程（１）のスラリーにセルラーゼ酵素液０．２ｍＬを添加し、５０℃で２４時間、ハイブリダイゼーションローテーター（日伸理化株式会社製  ＳＮ−０６ＢＮ）を用いて回転混和した。【００５２】
（工程３：糸状菌由来セルラーゼと糖液の回収）
工程２の加水分解物を遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）にて固液分離し、上清８ｇと加水分解残渣２ｇを得た。加水分解残渣を８ｍＬの水で再懸濁し、再度遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）を行うことで、加水分解残渣に残った溶液成分を回収した。回収した上清を合一し、ポアサイズ０．２２μｍの精密濾過膜（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  材質：親水性ＰＶＤＦ、メルクミリポア製）に通じて微粒子を除いた後、分画分子量１０，０００の限外濾過膜（ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０  材質：ＰＥＳ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｓｔｅｄｉｍ  ｂｉｏｔｅｃｈ製）を用いて濾過した。非透過液が１ｍＬ以下になるまで８，０００Ｇにて遠心濾過し、脱塩のため非透過液を超純水で１０倍以上に希釈し、再度、非透過液が１ｍＬ程度になるまで８，０００Ｇにて遠心濾過した。透過液は糖液として回収し、非透過液は回収セルラーゼ液として回収した。【００５３】
（参考例５）アルカリ処理による失活セルラーゼの調製
ｐＨ１１．０のアンモニア水溶液７．０ｍＬにセルラーゼ酵素液０．１ｍＬ（“アクセルレース（登録商標）デュエット”、ジェネンコア製）を添加し、５０℃で１時間保温することにより失活セルラーゼ溶液を調製した。参考例３に従って失活セルラーゼのβ−グルコシダーゼ活性測定を行ったところ、活性は検出されず、β−グルコシダーゼ活性が１００％消失したことを確認した。【００５４】
（参考例６）アルカリ処理による失活β−グルコシダーゼの調製
ｐＨ１１．０のアンモニア水溶液１．０ｍＬに０．０７５ｍＬのアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来β−グルコシダーゼ（品番：Ｅ−ＢＧＬＵＣ、Ｍｅｇａｚｙｍｅ製）を添加し、約２５℃の室温下で１時間静置することにより失活β−グルコシダーゼ溶液を調製した。参考例３に従って失活β−グルコシダーゼ溶液の活性を測定したところ、残存活性は処理前に対し２．１％を示し、失活β−グルコシダーゼが得られたことを確認した。【００５５】
（参考例７）加水分解残渣のアルカリ性水溶液への浸漬による失活セルラーゼの調製
参考例４に従い糖液を製造し、加水分解残渣をｐＨ１１．０またはｐＨ１１．５のアンモニア水溶液７．０ｍＬで懸濁し、約２５℃の室温下で回転混和した。１時間後、遠心分離（８，０００Ｇ、１０分間）を行い、上清を失活セルラーゼ溶液として回収した。参考例３に従ってβ−グルコシダーゼ活性測定を行ったところ、活性は検出されず、β−グルコシダーゼ活性が１００％消失したことを確認した。【００５６】
（比較例１）失活セルラーゼを含まないセルロース含有バイオマス加水分解物からの酵素回収
参考例４に従って糖液の製造を行い、回収セルラーゼ液を得た。ただし、工程（１）の固形物濃度１０％のスラリー（ｐＨ５．０）を調製する際に、水またはｐＨ１１．０のアンモニア水溶液を使用した。回収セルラーゼ液は参考例３に従って活性測定を行った。【００５７】
（実施例１）失活セルラーゼを含むセルロース含有バイオマス加水分解物からの酵素回収
参考例４の工程（１）において、固形物濃度１０％のスラリー（ｐＨ５．０）を調製する際に、参考例５または参考例７で調製した失活セルラーゼ溶液、あるいは参考例６で調製した失活β−グルコシダーゼ溶液を水の代わりに使用した。他は参考例４と同様に糖液の製造を行い、回収セルラーゼ液を得た。回収セルラーゼ液は参考例３に従って活性測定を行った。【００５８】
比較例１および実施例１の回収セルラーゼ液の酵素活性を相対活性として表１にまとめた。失活セルラーゼまたは失活β−グルコシダーゼを添加することにより、回収セルラーゼ液の酵素活性は大幅に向上した。【００５９】
【表１】
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【００６０】
（実施例２）加水分解残渣の浸漬ｐＨの失活セルラーゼ回収量への影響
参考例７において、加水分解残渣の浸漬を水またはｐＨ９．０〜１１．５のアンモニア水溶液で行い、その上清を回収した。上清に含まれる糸状菌由来セルラーゼの量を調べるため、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った［ゲル濃度１５％の標準ミニスラブサイズゲル（ｅ−ＰＡＧＥＬ  Ｅ−Ｔ／Ｒ１５Ｌ、アトー製）使用、サンプルアプライ量：５μＬ、２０ｍＡ、７５分間］（図３）。その結果、ｐＨ１１．０以上のアンモニア水溶液を使用した場合に加水分解残渣から糸状菌由来セルラーゼが多く溶出することが確かめられた。【００６１】
また、失活セルラーゼ溶液に含まれる酵素成分について調べるため、ｐＨ１１．０、ｐＨ１１．５の失活セルラーゼの中で最もメジャーなバンドを切り出し、トリプシンによるゲル内消化を行って得られたペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる質量分析に供した。ペプチドの質量データを用いたＭａｓｃｏｔ検索によりタンパク質を同定した結果、ｐＨ１１．０の失活セルラーゼにはセロビオハイドラーゼＩが、ｐＨ１１．５の失活セルラーゼにはβ−グルコシダーゼが最も多く含まれることがわかった。さらに、ｐＨ１１．０の失活セルラーゼにおいて、２番目にメジャーなバンドを切り出し、同様の操作を行ったところ、β−グルコシダーゼと同定され、どちらの失活セルラーゼにもβ−グルコシダーゼが含まれることが確認できた。【００６２】
なお、アンモニア水溶液のｐＨによって溶出する糸状菌由来セルラーゼの量が異なるため、溶出した糸状菌由来セルラーゼが失活セルラーゼかどうかは、セルラーゼ酵素液０．１ｍＬをそれぞれのｐＨのアンモニア水溶液７ｍＬに溶解し、約２５℃の室温下で１時間アルカリ処理を行った場合の残存活性が１０％未満になるかどうかで判断した。アルカリ処理液の活性を表２に示す。ｐＨ１０．５以上で残存活性が１０％未満となり、失活セルラーゼが得られることを確認した。【００６３】
【表２】
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【００６４】
（実施例３）加水分解残渣の浸漬温度の影響
参考例７において、ｐＨ１１．０のアンモニア水溶液を使用し、加水分解残渣の浸漬を約２５℃の室温〜９５℃の範囲で実施した。得られた失活セルラーゼ溶液について、実施例２と同様の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施したところ、６５℃以上で徐々に失活セルラーゼのバンドがぼやけ、分解を受けていることが示唆された。【００６５】
（実施例４）加水分解残渣の浸漬に用いるアルカリの種類の影響
参考例７において、加水分解残渣を浸漬する際、ｐＨ１１．０の水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、またはリン酸三ナトリウム水溶液を使用して失活セルラーゼ溶液を調製した。その他は実施例１と同様の方法で回収セルラーゼ液を得、参考例３に従って活性測定を行った。その結果を相対活性として表３に示した。いずれのアルカリを使用した場合にも、回収セルラーゼ液の相対活性はアンモニアを使用した場合と同等であった。【００６６】
【表３】
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【産業上の利用可能性】
【００６７】
本発明で得られる糖液は、種々の発酵産物の糖原料として使用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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