【事件の表示】
　特許第３３２５５９７号「ポリペプチドの製法」の請求項１ないし９に係る特許に対する特許異議の申立てについて、次のとおり決定する。
【結　論】
　訂正を認める。
　特許第３３２５５９７号の請求項１ないし８に係る特許を維持する。
【理　由】
１． 手続の経緯
　特許第３３２５５９７号に係る発明は、平成４年２月２６日（パリ条約に基づく優先権主張１９９１年２月２６日、英国）に特許出願され、平成１４年７月５日にその特許権の設定登録がなされ、その後、異議申立人小松孝彦より特許異議の申立てがなされ、取消の理由が通知され、その指定期間内である平成１６年１月１６日に訂正請求がされたものである。
　
２． 訂正の適否についての判断
（１）訂正の内容
ア．訂正事項ａ
　請求項１中の「こうして可溶性ポリペプチドを得ることを特徴とする」を「こうして可溶性ポリペプチドが得られ、その際、宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチドはリシンＡ又はその類縁体よりなることを特徴とする」と訂正する。
イ．訂正事項ｂ
　請求項５を削除する。
ウ．訂正事項ｃ
　請求項６を請求項５と訂正し、その中の「請求項５記載の方法」を「請求項４記載の方法」と訂正する。
エ．訂正事項ｄ
　請求項７を請求項６と訂正する。
オ．訂正事項ｅ
　請求項８を請求項７と訂正し、その中の「請求項１から７までのいずれか１項記載の方法」を「請求項１から６までのいずれか１項記載の方法」と訂正する。
カ．訂正事項ｆ
　請求項９を請求項８と訂正する。
キ．訂正事項ｇ
　発明の詳細な説明中の段落【００１３】の「こうして可溶性ポリペプチドを得ることから成る」を「こうして可溶性ポリペプチドが得られ、その際、宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチドはリシンＡ又はその類縁体よりなる」に訂正する。
　
（２）訂正の目的の適否、新規事項の有無及び拡張・変更の存否
　上記訂正事項ａは、特許明細書の請求項５に記載されていた「宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチドはリシンＡ又はその類縁体よりなる」という限定を請求項１に加えたものと解され、特許請求の範囲の減縮を目的とした補正に該当する。また、上記訂正事項ｂ〜ｇは、上記訂正事項ａと整合を図るものであるから、明瞭でない記載の釈明を目的とした明細書の訂正に該当する。また、これらの訂正事項は、いずれも、願書に最初に添付した明細書に記載された事項であるから、新規事項の追加に該当せず、実質的に特許請求の範囲を拡張又は変更するものでもない。
　
（３）むすび
　したがって、上記訂正は、特許法第１２０条の４第２項及び同条第３項において準用する第１２６条第２項及び第３項の規定に適合するので、当該訂正を認める。
　
３． 本件特許に係る発明
　上記２．で示したように上記訂正が認められるから、本件の請求項１〜８に係る発明（以下、「本件発明１」〜「本件発明８」という。）は、上記訂正請求に係る訂正明細書の特許請求の範囲の請求項１〜８に記載された事項により特定されるとおりのものであるが、　特に、独立形式の請求項として記載された本件発明１及び８は、以下のとおりのものである。
　
本件発明１：
「ポリペプチドの製法において、この方法は、前記ポリペプチドを発現することができる宿主を生長培地中で培養し、かつ前記宿主を当初期間の間、この宿主の生長に好適な第１のｐＨ値で培養してポリペプチドを製造し、このｐＨ値を可溶性ポリペプチドの蓄積に好適な第２の値に調節し、かつ前記宿主をさらなる期間の間前記の第２のｐＨ値で培養し、かつ場合により培養の終末部の間に生長培地の温度を低下させ、こうして可溶性ポリペプチドが得られ、その際、宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチドはリシンＡ又はその類縁体よりなることを特徴とする、ポリペプチドの製法。」
　
本件発明８：
「リシンＡの製法において、これは、流加培養型の発酵より成り、ここでリシンＡを発現させることのできるＥ．コリー宿主を、生長培地中で約６．７のｐＨで培養し、このｐＨを５．５より大きくかつ６．７より小さい値に低下させ、かつさらなる期間培養し、場合により、この培養の終末部の間に、生長培地の温度を低下させ、かつこの末端部の間にリシンＡを収穫することより成ることを特徴とするリシンＡの製法。」
　
４． 特許異議申立の理由及び証拠方法
（１）申立の理由の概要
　申立人小松孝彦は、請求項１〜９（訂正後の１〜８）に係る発明について、以下の理由により特許を取り消すべきであると主張している（ここでの請求項の番号は、訂正前のものである）。
　
ａ．請求項１、２に係る発明は、甲第１号証（特開昭６２−５１９８５号公報）、及び、甲第２号証（特開昭６０−１１８１９６号公報）に記載された発明であり、特許法第２９条第１項第３号に該当する。
ｂ．請求項１〜９に係る発明は、甲第１号証、甲第２号証、甲第３号証（J. Biol. Chem., Vol.263 (1988) p.4837-4843）、及び、甲第４号証（FEBS LETT., Vol.216 (1987) p.73-78）に記載された発明に基づき容易に発明をすることができたものであり、特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができないものである。
ｃ．請求項１〜４、７、８に係る発明は、発明の詳細な説明に記載されたものとはいえず、本件特許は、特許法第３６条第５項第１号に規定する要件を満たしていない。
ｄ．請求項１〜９には、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項が記載されておらず、本件特許は、特許法第３６条第５項第２号に規定する要件を満たしていない。
ｅ．請求項１〜４、７、８に係る発明は、発明の詳細な説明において、当業者が容易にその実施ができる程度にその発明の目的、構成、及び効果が記載されておらず、本件特許は、特許法第３６条第４項に規定する要件を満たしていない。
　
（２）刊行物等
　特許異議申立人が証拠として提示した刊行物には、それぞれ、以下のような事項が記載されている。
　
刊行物１　：　特開昭６２−５１９８５号公報（甲第１号証）
　バクテリア培養による細胞外酵素の取得方法について開示され、特に、第２頁右下欄下から５〜２行、第３頁右上欄９〜１５行、第３頁左下欄下から６〜１行、第５頁左下欄７行〜第６頁右上欄７行、及び第６頁右上欄下から５〜１行には、バクテリア培養による細胞外酵素の産生は、細胞の対数増殖期には起こらないこと、ｐＨ値または温度を許容範囲からずらせることで細胞の成長を抑制させ、細胞外酵素を効率よく取得することが記載されている。
　
刊行物２　：　特開昭６０−１１８１９６号公報（甲第２号証）
　ヒトインターフェロン遺伝子を組み入れた発現ベクターを持つ微生物を特定の合成培地で培養し、該ＩＦを著量蓄積させ、これを採取する方法について開示され、特に、第６頁左下欄の実験例２、第７頁左下欄の実験例４、及び第８頁左上欄〜右上欄の実施例１には、培養温度を３７℃から３３℃、２９℃、２５℃と逐次低下させることが記載されている。
　
刊行物３　：　J. Biol. Chem., Vol.263 (1988) p.4837-4843（甲第３号証）
　大腸菌を用いて培養技術によりリシンＡを製造する方法が記載され、特に、第4837頁15〜21行には、遺伝子組換えリシンＡは、３７℃では可溶性で活性を有していたが、４２℃では凝集し、不溶性で活性が低下していたことが記載されている。
　
刊行物４　：　FEBS LETT., Vol.216 (1987) p.73-78（甲第４号証）
　大腸菌を用いて培養技術によりリシンＡを製造する方法が記載されている。
　
５．異議申立の理由ａ．について
　特許法第２９条第１項３号に基づく異議申立がされた訂正前の請求項１及び２については、訂正により、「宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチドはリシンＡ又はその類縁体よりなる」との限定が加えられた。そして、訂正後の請求項１及び２に係る発明は、刊行物１〜４のいずれにも記載されていない。したがって、この理由についての異議申立人の主張は採用できない。
　
６．異議申立の理由ｂ．について
（１）対比・判断
　本件発明１と上記刊行物１に記載された発明（以下、「引用発明」という。）とを対比する。
　後者の「細胞外酵素」及び「バクテリア」は、前者の「ポリペプチド」及び「宿主」に相当するものと認められる。そして、本件発明１の「かつ場合により培養の終末部の間に成長培地の温度を低下させ」は、任意的選択事項なので、本件発明１は、培地の温度を低下させない態様も含んでおり、この点は引用発明との相違点とは認められない。
　したがって、両者は、「ポリペプチドの製法において、前記ポリペプチドを発現することができる宿主を成長培地中で培養し、かつ前記宿主を当初期間の間、この宿主の成長に好適な第１のｐＨ値で培養してポリペプチドを製造し、このｐＨ値を異なる第２の値に調節し、かつ前記宿主をさらなる期間の間前記の第２のｐＨ値で培養し、こうしてポリペプチドが得られ、その際、宿主はバクテリアよりなることを特徴とするポリペプチドの製法」である点で一致するが、以下の（i）、（ii）の点で相違する。
　
（i）前者ではリシンＡ又はその類縁体をＥ．コリーで生産する方法であるのに対し、後者では、細胞外酵素をバクテリアで生産する方法である点
（ii）第２のｐＨ値が、前者では、可溶性リシンＡ又はその類縁体の蓄積に好適な値であるのに対し、後者では、細胞外酵素の最大産生度に対応する成長抑制となるような値である点
　
（２）相違点についての判断
（i）について
　刊行物１に記載された方法は、細胞外酵素を生産する微生物、特にバチルス属微生物、の連続培養による細胞外酵素の生産における問題点を解決しようとするものであって（２頁左下欄下から２行〜３頁右上欄１５行を参照）、「これらの酵素の蓄積（Ausschuttung）は、連続培養装置（ケモスタット）内の有機体によって急速に弱まる」（２頁右下欄７〜９行）、「細胞外酵素の産生は、主として後期対数期および定常期間中にならびに胞子形成の前に起こるが、それに対して対数増殖期には起こらない」（２頁右下欄下から５〜２行）、及び「細胞外酵素の産生が増大すればする程、ますます有機体にとって培地中の炭素源を利用することが困難になる」（３頁左上欄６〜８行）という、細胞外酵素の産生に関する知見がその基礎となっているものと認められる。
　そして、刊行物１に記載された方法においては、「バクテリア」の具体例として記載されているのは、バチルス属のもののみであって、Ｅ．コリーについては全く記載がないし、その生産物は細胞外酵素であって、外来ポリペプチドましてやリシンＡの生産については、全く記載されていない。そして、Ｅ．コリーにおいては、基本的に細胞外へのポリペプチドの分泌は起こらないし、リシンＡ又はその類縁体は、構造、機能等においてバチルス等の細胞外酵素とは全く異なるものである。したがって、刊行物２にＥ．コリーを培養してインターフェロンを生産することが、また、刊行物３、４にＥ．コリーを培養してリシンＡを生産することが記載されていても、本件発明１とは、目的ポリペプチドもそれを生産するバクテリアも全く異なる引用発明を、Ｅ．コリーによるリシンＡ又はその類縁体の生産に適用しようとすることは、当業者が容易に想到し得ることではない。
　
（ii）について
　刊行物１に記載されたバクテリアは具体的にはバチルス属のものであり、しかも生産する目的ポリペプチドが外来のものであることも記載されていない。したがって、刊行物１には、組換えＤＮＡ技術により、Ｅ．コリーにおいて外来ポリペプチドを発現した際に、目的ポリペプチドが封入体のような不溶性の形態を取りやすいとの問題やその解決については、何ら記載も示唆もない。このような刊行物１の記載から、第２のｐＨ値を「可溶性ポリペプチドの蓄積に好適な値」とすることが、当業者が容易に想到しうることであるということはできない。また、刊行物２〜４にも、この点は記載も示唆もされていない。
　
（３）総合的な判断
　上記のように、本件発明１が、引用発明から当業者が容易に想到しうるものであるということはできない。また、他の刊行物２〜４の記載をみても、それらの記載から、本件発明１を当業者が容易に想到しうるものであるということはできない。
　そして、本件発明１は、上記のような構成を採用することにより、各刊行物の記載からは予期できない、不溶性の形態をとり易い組換えリシンＡ又はその類縁体のＥ．コリーにおける生産において、可溶性のリシンＡの収量が向上するという格別顕著な効果が奏される（段落【００８４】〜【００９０】、第１８〜２１図を参照）ものであると認められる。
　したがって、本件発明１は、上記各刊行物に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　さらに、本件発明２〜７は、本件発明１にｐＨ、培養法、培地等に関する限定を加えたものであるから、同様の理由で、上記各刊行物に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　また、本件発明８については、引用発明と、少なくとも上記（i）において相違するものであるから、本件発明１と同様の理由で、上記各刊行物に記載された発明から当業者が容易に発明をすることができたものであるとはいえない。
　
７．異議申立の理由ｃ．について
　この理由についての異議申立人の主張の根拠は、発明の詳細な説明には、具体例としては、ポリペプチドとして「リシンＡ又はその類縁体」が、宿主細胞として「Ｅ．コリー」が記載されているのみであり、その他については開示がないというものである。しかし、上記２．の訂正により、本件発明については、すべて、ポリペプチドが「リシンＡ又はその類縁体」であって宿主細胞が「Ｅ．コリー」であるものに限定されたから、異議申立人のこの主張は採用できない。
　
８．異議申立の理由ｄ．について
　この理由についての異議申立人の主張の根拠は、「場合により終末部の間に生長培地の温度を低下させ」という点は、構成に必ずしも必要でない事項であり、また、ポリペプチドをリシンＡ又はその類縁体に限定していないことから、特許請求の範囲に、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項のみが記載されているとはいえないというものである。
　しかし、請求項に「場合により」という任意的な選択的特定事項が記載されていたとしても、そのような選択ができるということ自体を含めて、該請求項から、一つの技術的思想が把握できるともいえるから、それのみを理由として、特許請求の範囲に、特許を受けようとする発明の構成に欠くことができない事項のみが記載されていないということはできない。
　また、上記２．の訂正により、本件発明については、すべて、ポリペプチドが「リシンＡ又はその類縁体」に限定された。
　したがって、異議申立人のこの主張は採用できない。
　
９．異議申立の理由ｅ．について
　この理由についての異議申立人の主張の根拠は、発明の詳細な説明には、具体例としては、ポリペプチドが「リシンＡ又はその類縁体」以外である場合や、宿主細胞が「Ｅ．コリー」以外の場合については、目的、構成、及び効果が不明であるというものである。しかし、上記２．の訂正により、本件発明については、すべて、ポリペプチドが「リシンＡ又はその類縁体」であって宿主細胞が「Ｅ．コリー」であるものに限定されたから、異議申立人の主張は採用できない。
　
１０．むすび
　以上のとおりであるから、特許異議申立の理由及び証拠によっては、訂正後の本件請求項１〜８に係る発明を取り消すことができない。
　また、他に本件請求項１〜８に係る発明を取り消すべき理由を発見しない。
　よって結論のとおり決定する。
【異議決定日】
平成１６年２月２日（２００４．２．２）
【訂正の要旨】
審決（決定）の【理由】欄参照。
（５４）【発明の名称】
ポリペプチドの製法
（５７）【特許請求の範囲】
　【請求項１】　ポリペプチドの製法において、この方法は、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を生長培地中で培養し、かつ前記宿主を当初期間の間、この宿主の生長に好適な第１のｐＨ値で培養してポリペプチドを製造し、このｐＨ値を可溶性ポリペプチドの蓄積に好適な第２の値に調節し、かつ前記宿主をさらなる期間の間前記の第２のｐＨ値で培養し、かつ場合により培養の終末部の間に生長培地の温度を低下させ、こうして可溶性ポリペプチド
が
られ、その際、宿主はＥ．コリーより成り、ポリペプチドはリシンＡ又はその類縁体よりなる
　【請求項２】　ｐＨを、第１の値から第２の値にまで低めることにより調節する、請求項１記載の方法。
　【請求項３】　ｐＨを、約６．７の値から５．５より大きくかつ６．７より小さい値にまで調節する、請求項１又は２記載の方法。
　【請求項４】　この方法は、流加培養型の発酵であり、ここで、ｐＨを、流加培養条件に達する前に調節する、請求項１，２又は３記載の方法。
　【請求項
５
４
　【請求項
６
　【請求項
７
６
　【請求項
８
【発明の詳細な説明】
　【０００１】
　【産業上の利用分野】
　本発明は、バイオ技術の分野に関し、特に可溶性組換え分子の製法に関する。
　【０００２】
　【従来の技術】
　一般に、組換え蛋白質は、細菌宿主例えばＥ．コリー中で製造され、この発酵は、生長に好適な条件下で、即ち約３７℃の温度及び約６．８のｐＨで実施される。
　【０００３】
　この発酵法は、通例、宿主の細胞生長要件を満たす栄養物を含有する培地中で実施される。典型的な培地には、細胞成分の合成及び熱量のための炭素及び窒素源、イオン例えばスルフィート、ホスフェート、マグネシウム、カルシウム、鉄及び種々の微量元素を含有する。この生長培地の成分として、酵母エキスもしばしば存在する。例えば、ルリアブイヨン（Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ）は、トリプトン及び塩化ナトリウムに加えて、酵母エキス約０．５％を含有する。最近、ルリアブイヨンに酵母エキスを富化させると、これは、酵母エキスバイオマス１〜３％を含有し、β−ガラクトシダーゼ発現が増加されることが報告された（Ｘ　Ｌｉ、Ｊ．Ｗ．Ｒｏｂｂｉｎｓ及びＫ．Ｂ．Ｔａｙｌｏｒ；Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　
５
　【０００４】
　米国特許第４８９４３３４号明細書には、培養を３７℃でかつ６．８のｐＨで実施し、かつ生長培地の濁りが約１０のＯＤ６８０である場合には、カサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）の２％溶液を添加することよりなるレシチンＡの製法が記載されている。
　【０００５】
　Ｅ．コリー中で組換えＤＮＡ技術により多くのポリペプチドを製造する場合には、このポリペプチドは不溶性の形で、例えば不溶性集合物又は封入体として得られる。この物質を使用すべき際には、これを生物学的に活性な形に再生することを可能にするため、可溶性にすべきである。この可溶化工程は、一般に、化学品例えば、界面活性又はカオトロピック剤（これらは、使用のためには煩雑かつ高価であり、蛋白質を化学的に変性する）の使用を必要とする。
　【０００６】
　組換えリシンＡを製造する際に、不溶性物質が形成される傾向がある。例えば、欧州特許（ＥＰ）第２３７６７６号明細書中には、Ｅ．コリー中、３７℃、ｐＨ６．８でのリシンＡの発現は、不溶性物質をもたらし、これは、尿素とＳＤＳとの混合物での処理により可溶化すべきであることが報告されている。欧州特許第３７６７６号明細書は、リシンＡに関する暗号配列が、Ｅ．コリーＫ１２のアルカリホスファターゼ構造遺伝子（ｐｈｏＡ）のリーダー配列を暗号化するＤＮＡと共に直接読取りフレーム中に配置されている場合に、可溶性リシンＡが製造されることを報告している。
　【０００７】
　リシン及びリシン型分子例えばアプリン（ａｂｒｉｎ）は、植物細胞により製造され、細胞毒特性を有する公知化合物である。この型のトキシンは、ジサルファイド橋を介して連結されている２個のポリペプチド鎖より成る。このポリペプチド鎖の１方（Ａ−鎖）は、トキシン分子の細胞毒特性に第１に責任があり、他方のポリペプチド鎖（Ｂ−鎖）は、トキシン分子を細胞表面に結合可能にする。
　【０００８】
　リシンのこの毒性は、識別可能な次の３つの条件に依存する：
（ｉ）　Ｂ鎖上のガラクトース結合部位と細胞表面上に露呈されている糖蛋白質又は糖脂質との相互作用による細胞表面へのリシン分子の結合；
（ｉｉ）　細胞の細胞質ゾル内への少なくともＡ鎖の侵入；及び
（ｉｉｉ）　ＲＮＡの酵素的分解により蛋白質合成及び最終的細胞死を阻止するリボソームの６０Ｓ−サブユニットになる。
　【０００９】
　Ｂ鎖は、リシン分子を細胞表面に結合するその１次機能は別として、ここで細胞内へのリシンの吸収を促進する重要な２次機能をすると信じられてもいる。従って、分離されたＡ鎖及びＢ鎖は、実質的に無毒性である。それというのも、Ｂ鎖は細胞毒性ではなく、Ａ鎖は細胞表面への結合能力に欠け、Ｂ鎖の不存在では細胞の細胞質ゾル内に侵入する能力に欠けるからである。
　【００１０】
　リシンのＡ鎖の毒性は、無差別に結合するＢ鎖を正常細胞の存在で腫瘍細胞への結合能を有する種々のキャリアで換えることができる場合には、抗腫瘍治療に有用であることが既に暗示されている。従って、リシンＡ及び腫瘍特異性抗体より成る免疫毒素が抗腫瘍治療で使用できることが提案されている。
　【００１１】
　天然源例えばヒマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｓａ）の種子からのリシンＡ鎖の製造は困難である。特に、リシンＡの精製即ちＢ鎖からＡ鎖を分離することは困難である。
　【００１２】
　組換えＤＮＡ技術により、ポリペプチド例えばリシンＡを製造することは可能であるが、なお、可溶性ポリペプチドを製造する改良法は必要である。特に、可溶性リシンＡを製造するための改良法は必要である。
　【００１３】
　【発明の構成】
　本発明によれば、ポリペプチドを製造する方法が提供され、この方法は、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を生長培地中で培養し、かつ前記宿主を当初期間の間、この宿主の生長に好適な第１のｐＨ値で培養してポリペプチドを製造し、このｐＨ値を可溶性ポリペプチドの蓄積に好適な第２の値に調節し、かつ前記宿主をさらなる期間の間前記の第２のｐＨ値で培養し、かつ場合により培養の終末部の間に生長培地の温度を低下させ、こうして可溶性ポリペプチドを得ることより成る。
　【００１４】
　特に、本発明の方法は、少なくとも部分的に、不溶性の形で製造される傾向を有するポリペプチドを製造するために使用できる。
　【００１５】
　本発明を用いて製造することのできるポリペプチドの特別な例には、例えばリシンＡ又はその類縁体が包含される。
　【００１６】
　本発明の１実施態様では、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を培養し、かつこの方法の間に、可溶性ポリペプチドが得られるようにｐＨを調節することにより成る、ポリペプチドの製法が提供される。特に、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を第１期間の間、この宿主の生長に好適な第１ｐＨ値で、生長培地中で培養し、ｐＨを可溶性ポリペプチドの蓄積に好適な第２の値に調節し、かつ、この宿主を、この第２のｐＨ値で更なる期間の間培養することよりなる、ポリペプチドの製造法が提供される。
　【００１７】
　温度が低下される方法において、この方法は、一般に、宿主細胞の生長及び可溶性ポリペプチドの生成に好適な温度で、宿主細胞を培養し、この培養の終末部の間に生長培地（及び従って宿主）を冷却し、かつ、前記終末部の間に宿主を収穫することよりなる。
　【００１８】
　温度は、ポリペプチドを可溶性の形に保持するのに好適な温度が有利である。
　【００１９】
　細菌細胞例えばＥ．コリーの生長に好適である温度は、約２５℃〜約３９℃（例えば３７又は３８℃）であり、至適温度は、約３７℃である。この温度は、可溶性ポリペプチドを生成させる温度であるのが有利であり、一般に、この温度は４０℃を下まわる。一般に、この温度が低下すると、宿主細胞は約２５℃を下まわる温度まで例えば、約１０℃（又はそれ以下）〜約２５℃の範囲の温度まで冷却されることが有利である。
　【００２０】
　細胞内での可溶性ポリペプチド（例えばレシンＡ）の蓄積が高い場所で、かつ最も有利には、最大特異活性の所で又はその付近で冷却を行なうのが有利である。
　【００２１】
　ｐＨを調節する際に、ポリペプチドを発現させることのできる宿主を、生長培地中で、宿主の生長に好適である第１のｐＨ値で第１期間の間培養し、かつこのｐＨを第２の値に調節し、かつこの宿主を、この第２値で更なる期間培養することが一般に有利である。このｐＨは、多くの方法で調節でき、例えば１工程で又は１連の工程で調節することができる。第２のｐＨは、例えば、可溶性ポリペプチドの蓄積に好適である値より成り、ここで、これは、ポリペプチドを可溶性形に保持し、回収することを促進する。
　【００２２】
　従って、特別な１態様で、ポリペプチドの製法が提供され、この方法は、前記ポリペプチドを発現させることのできる宿主を、第１のｐＨ値及びこの宿主の生長及び可溶性ポリペプチドの生成に好適である温度で培養し、この方法の間にｐＨ値を第２のｐＨ値に調節し、かつ場合により、この宿主を、培養の終末部の間に冷却し、かつ可溶性ポリペプチドを含有する宿主を前記の終末部の間に収穫することよりなる。
　【００２３】
　リシンＡの場合に、ｐＨを一般的に調節すると、前記の第２ｐＨ値は、第１ｐＨ値よりも低くなる。他のポリペプチドを得るために、前記の第２ｐＨ値は、ポリペプチドの種類に応じて、第１の値より大きいか又は低くてよい。
　【００２４】
　特別な１態様において、ｐＨを調節する際に、このｐＨ値は、第１の値から第１の値より低い第２の値に変えられる。前記のように、このｐＨは、多くの方法で低められ、例えば、１工程で又は一連の工程で低下されうる。
　【００２５】
　一般に、例えば、短期間でｐＨを第１の値から第２の値に調節することが有利であり、特に、このｐＨは、直接的に、第１の値から第２の値に調節することができる。
　【００２６】
　この培養の第１期間の間のｐＨの特別な値には、例えば、約６〜８の範囲内の値が包含される。第１期間の間のｐＨの有利な値は、例えば６．７又は約６．７である。約６．７であるｐＨ値には、例えば６．７±０．１従って、６．８の値も包含される。
　【００２７】
　培養の更なる期間の間のｐＨの特別な値は、約５．５〜８の範囲特に約６〜８の範囲内の値である。例えば、第１期間の間のｐＨ（即ち前記の第１の値）は、約６．７であり、更なる期間の間の特別なｐＨ値は、６．７より低く、約５．５よりは大きい（殊に約６．０以上）の値である。
　【００２８】
　特に、本発明は、リシンＡ又はその類縁体の製法を提供する。従って、本発明によれば、リシンＡ又はその類縁体の製法が提供され、この方法は、リシンＡ又はその類縁体を発現させることのできる宿主を栄養培地中で、宿主の生長に好適である第１ｐＨで第１期間の間培養し、かつ、この宿主を、前記第１ｐＨ値よりも低いｐＨで、更なる期間の間培養し、かつ、場合により、この宿主をこの培養の終末部の間に冷却し、かつ前記終末部の間にこの宿主を収穫することより成る。
　【００２９】
　リシンＡの類縁体には、細胞毒活性を示し、１個以上のアミノ酸変更（欠失、付加、置換）によりリシンＡの構造とは異なっているリシンＡと関連している１次構造を有し、細胞毒活性の欠如の結果をもたらさない、ポリペプチドが包含される。リシンＡを発現させることのできる宿主の製造は、例えば、欧州特許（ＥＰ）第１４５１１１号、国際特許（ＷＯ）第８５／３５０８号明細書及びＬａｍｂ等によるＥｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８５、
１４８
　【００３０】
　前記のように、細胞毒特性を有するポリペプチド例えばリシンＡは、腫瘍の治療に使用するための免疫毒素の製造に使用できる。一般に、このような免疫毒素は、処置されるべき腫瘍およびトキシンに対して特異的な抗体よりなる。免疫毒素の製造の例は、公開されたＰＣＴ特許出願（ＷＯ）第８５／００３５０８号明細書中に記載されている。
　【００３１】
　一般に、例えば、この宿主は、細菌細胞例えばＥ．コリー細胞より成るのが有利である。リシンＡの場合には、この宿主はＥ．コリー菌株例えばＤＳ４１０より成るのが有利である。
　【００３２】
　この宿主を、一般に、宿主の細胞生長要件を満たす栄養を含有する培地中で培養する。従って、この培地は、一般に、細胞成分の合成及びエネルギーのための炭素及び窒素源、イオン例えば、スルフェート、ホスフェート、マグネシウム、カルシウム、鉄及び微量元素を含有する。
　【００３３】
　この発酵の過程の間に、この発酵培地に酵母エキスを添加するのが有利である。この酵母エキスの添加の方法は、以下の記載に包含される。
　【００３４】
　宿主は、ポリペプチド（例えばリシンＡ又はその類縁体）に関してコードし、適当なコントロール配列例えばプロモータ配列、リボソーム結合部位及び転写ターミネーター配列のコントロール下にあるＤＮＡ配列を含有する。適当なプロモータ配列の特別な例は、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモータ配列及びＴ７Ａ３プロモータである。他のプロモータ例えばｌａｃ又はｔａｃ−プロモータも使用できる。従って、例えば、この宿主は、リシンＡに関してコード化し、ｔｒｐ又はＴ７Ａ３プロモータのコントロール下にあるＤＮＡ配列を有していてよい。
　【００３５】
　特に有利な１態様において、本発明の方法は、流加培養型（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｔｙｐｅ）の発酵より成る。
　【００３６】
　ここで使用されている、流加培養−型（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｔｙｐｅ）の方法とは、栄養例えば炭素源又は消耗時に微生物の生長を限定する多くの栄養を含有するバッチ生長培地を使用する発酵法である。この栄養が消耗されると、その栄養（ｎｕｔｒｉｅｎｔ／ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ）の供給が開始される。この栄養の供給が必要になる時点は、流加培養条件の開始に一致する。この発酵培地には、全般的に、又はこの発酵の間の段階で他の栄養を供給することができる。
　【００３７】
　この方法が流加培養発酵法より成る場合には、流加培養条件に達する時点又はそれ以前に、有利には流加培養地条件に達する前にｐＨを低めることができる。
　【００３８】
　有利な１態様では、リシンＡを製造するための流加培養型の発酵法が提供され、この方法は、リシンＡを発現させることのできるＥ．コリー宿主を、約６．７のｐＨ値で第１期間の間培養し、かつ、この宿主を、前記の６．７より低いｐＨで更なる期間培養することよりなる。
　【００３９】
　本発明の有利な１態様によれば、リシンＡ又はその類縁体を製造するための流加培養型の発酵法が提供され、この方法は、リシンＡ又はその類縁体を発現させることのできる宿主を、生長培地中で、宿主の生長及び可溶性リシンＡ又はリシンＡ類縁体の生成に好適な第１のｐＨ値及び温度で第１期間の間培養し、流加培養条件が達成される前に前記第１の値より低い第２の値までｐＨを調節し、場合により、培養の終末部の間に、この生長培地を、リシンＡを可溶性形に保持するのに好適な温度まで冷却し、前記終末部の間に細胞を収穫することより成る。
　【００４０】
　本発明で特許請求されている方法の実施に先立ち、流加培養型の発酵法は、この発酵法の終りに回収されうる可溶性リシンＡの収率を減少させる結果をもたらすことが判明した。意外にも、流加培養条件の達成の前に冷却を行なう場合に、ポリペプチドの高水準が可溶性形に保持でき、従って、可溶性ポリペプチドの収穫を促進することが発見された。
　【００４１】
　従って、本発明のもう１つの態様では、次の方法よりなるリシンＡ又はその類縁体を製造する方法が提供される：
（ａ）　リシンＡ又はその類縁体を発現させることのできる宿主を、生長培地中で、この宿主の生長及び可溶性リシンＡ又はその類縁体の生成に好適である温度で培養し、
（ｂ）　この生長培地を、この宿主の生長に必須の栄養の消耗に達する（即ち流加培養条件に達する）前に、この宿主の生長に好適でない温度まで冷却し、かつ
（ｃ）　前記栄養の消耗に達する前に細胞を収穫する。
　【００４２】
　この方法は、この方法が流加培養相に入る前に収穫を行なう流加培養法に類似していることが明らかである。従って、宿主の生長のために必須の栄養の消耗が起る時点は、流加培養条件に達する時点と等しい。栄養消耗に達する前に冷却を行ない、有利に、例えば栄養消耗に達する直前に行なう。
　【００４３】
　宿主はＯＤ５５０＝約５０で炭素限定されて処方されている培地中で生長させることができ、ＯＤ５５０が約５０の場合又はＯＤ５５０が５０に達する前に、この宿主を含有する発酵培地を冷却する。
　【００４４】
　特に、リシンＡの製造のための流加培養法で温度を低めることが望ましい場合には、この方法は次の工程を包含していてよい：
（ａ）　リシンＡを発現させることのできるＥ．コリー宿主を栄養培地中で、約３７℃〜３９℃の範囲の温度で培養し、
（ｂ）　この発酵培地を、流加培養条件に達する前に約２５℃より下まわる温度まで冷却し、
（ｃ）　宿主細胞を流加培養条件に達する前に収穫する。
　【００４５】
　特別な温度の例は、前記のものである。従って、約１０℃（又はそれ以下）から約２５℃の範囲の温度まで冷却することができる。
　【００４６】
　前記したように、酵母エキスを添加することもできる。このような方法は、前記の方法がリシンＡ又はその類縁体を発現させることのできる宿主を生長培地中で培養し、この培養の間に酵母エキスを含有する補充物をこの生長培地に添加するような方法も含める。
　【００４７】
　酵母エキスは、単一バッチ法、一連のアリコート又は実質的な連続的供給の方法で添加することができる。この酵母エキスは、一般に、宿主の生長相の間に添加する。例えば、酵母エキスを含む補充物の添加は、培養の開始後の予め決められた時間で開始するのが有利である。この時間の特別な例は、流加培養条件が達成される前の時点である。
　【００４８】
　酵母エキスを含む補充物の添加速度は、この生長培地の酵母エキスが消耗されないようにするのが有利である。従って、この生長培地の当初組成物中に酵母エキスが含有される場合には、補充物の添加を、当初組成物中に存在する酵母エキスが消費される前に開始するのが有利である。酵母エキス供給の好適な速度には、例えば約０．８５〜３．４ｇ／ｌ・ｈの範囲の供給速度が包含される。供給の特別な速度は、１〜２ｇ／ｌ・ｈの範囲殊に１．７ｇ／ｌ・ｈである。
　【００４９】
　前記のように、宿主細胞は、一般に、細菌細胞例えばＥ．コリーより成っていてよく、例えば、この宿主細胞がリシンＡを発現させることのできるものであるのが有利である。
　【００５０】
　発酵は、一般に、宿主の生長に好適である温度で実施される。細菌細胞例えばＥ．コリーの生長に特に好適である温度は、約３７℃である。この温度は、培養の間に（殊に、培養の終末部の間に）、前記のように低下させることができる。
　【００５１】
　Ｅ．コリー菌株ＤＳ４１０は、可溶性リシンＡ製造時に意想外に有効であることも判明した。前記のように、一般に、ｐＨを調節しかつ／又は温度を低めるのが有利である。
　【００５２】
　収穫の後に、細胞を処理してリシンＡを回収する。この処理は、通例、細胞を崩壊させ、他の蛋白質物質から、１以上の抽出工程で粗製リシンＡポリペプチドを分離し、かつ更に、ゲル濾過、光速液体クロマトグラフィ又は他の慣用の精製法により、リシンＡを精製することよりなる。
　【００５３】
　本発明の方法は、可溶性ポリペプチドの製造に有利であることが判明した。
　【００５４】
　一般に、本発明の方法は、可溶性形のポリペプチドの生成及び／又は回収に有利である。殊に、この方法の間に、生長培地のｐＨを調節することにより、可溶性ポリペプチドの高収率が得られることが判明した。意想外に、培養の終末部の間に生長培地を冷却し、この終末部の間に細胞を収穫すると、可溶性ポリペプチドの高収率が回収されうることも判明した。この冷却工程は、特に有利であることが判明した。それというのも、これは、収穫の前に遅延があっても、可溶性ポリペプチドの高収率が得られる大きな処理範囲をもたらすからである。
　【００５５】
　ｐＨを調節し任意の冷却工程を行なう流加培養法が特に有利であることが判明した。
　【００５６】
　ポリペプチドがリシンＡである方法において、本発明の方法は、特に有利であることが判明した。
　【００５７】
　得られる可溶性リシンＡの収率は、この方法の間に酵母エキスを添加する際に高められることが判明した。ｐＨも調節される方法殊に、ｐＨが調節される流加培養法は、予想外に、可溶性リシンＡの高収率を与えることが判明した。
　【００５８】
　Ｅ．コリーＤＳ４１０も、予想外に、可溶性リシンＡの製造に有利であることが判明した。この方法の間に酵母エキスを添加すると、この収率は高められることも判明した。
　【００５９】
　【実施例】
　次に、実施例を用い、図面と関連させて、本発明を詳説する：
　図１は、ｐＩＣＩ００２０の構成を説明している図であり；
　図２は、ｐＴＢ３４４の構成を説明している図であり；
　図３は、ｐＩＣＩ００４２の構成を説明している図であり；
　図４は、ｐＩＣＩ１０７９の構成を説明している図であり；
　図５は、ｐＩＣＩ１１８７の構成を説明している図であり；
　図６は、Ｅ．コリーリゼートのクマシーブルー染色ＳＤＳゲルを示す図であり、ここでトラックＡは、ｐＩＣＩ１１０２、ＢはｐＩＣＩ００２０であり、Ｃは分子量マーカーであり；
　図７は、ピークＲがリシンＡを示しているｐＩＣＩ１１０２のゲルプロフィルを示す図であり、
　図８は、ｐＩＣＩ１１０２により産生されたリシンＡのウェスタンブロットであり、ここでトラック１は分子量マーカーであり、２及び３は、非−リシン産生クローンであり、４はｐＩＣＩ１１０２であり、５はｐＩＣＩ００２０（対照プラスミド−非リシンＡ配列）であり；
　図９は、ｐＩＣＩ１１０２の部分配列であり；
　図１０は、ｐＩＣＩ１１０２の構成を説明している図であり；
　図１１は、プラスミドの製造で用いられているフラグメントを示す図であり、
　図１２は、ｐＩＣＩ００４２のプラスミド地図であり、
　図１３は、転写ターミネーターの配列を示す図であり、
　図１４は、ｐＩＣＩ１０７９のプラスミド地図であり、
　図１５、図１６及び図１７は、それぞれＤＳ４１０に関するバイオマス、全リシンＡ蓄積及び可溶性フラクション中のリシンＡの分配率に及ぼす流加培養発酵の影響を示す図であり；
　図１８、図１９、図２０及び図２１は、それぞれ、バイオマス濃度、全リシンＡ蓄積、可溶性フラクション中の可溶性リシンＡ分配率及び可溶性リシンＡの収率に及ぼすｐＨの影響を示す図であり；
　図２２は、使用ｐＨプロフィルを示す図であり；
　図２３、図２４及び図２５は、冷却の影響を示す図である。
　【００６０】
　生長培地
　
ＬＣＭ５０の組成
　このＬＣＭ５０生長培地中の酵母エキスの濃度は各々の例中に詳述する。
　【００６１】
　微量元素溶液（ＴＥＳ）は次の組成を有する：　　　％／脱イオン水１０ｍｌ
　　ＡｌＣｌ３・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０
　　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８
　　ＫＣｒ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　０．２
　　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２
　　Ｈ３ＢＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１
　　ＫＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０
　　ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２．０
　　ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０９
　　Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　０．４
　　ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．４
菌株
　ここで使用されるＥ．コリー菌株は、自由に入手可能である。例えばＥ．コリーＭＭ２９４及びＷ３１１０は、自由に入手可能である。ＭＭ２９４及びＷ３１１０は、例えば、Ｅ．コリー・ジェネティック・ストック・センター（Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｓｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｙｅｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ）から入手できる。Ｗ３１１０のΔｌａｃ誘導体は、当業者により容易に製造される。
　【００６２】
　Ｅ．コリーＤＳ４１０は、公知であり（Ｄｏｕｇａｎ及びＳｈｅｒｒａｔｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１５１、ｐ１５１−１６０、１９７７）、公開されたゲノタイプＦ−　
ａｒａ
ａｚｉ
ｔｏｎＡ
ｌａｃＹ
ｍｉｎＡ
ｍｉｎＢ
ｒｐｓＬ
ｍａｌＡ
ｘｙｌ
ｍｔｌ
ｔｈｉ
　【００６３】
例１
　Ｅ．コリー菌株ＭＭ２９４，ＤＳ４１０，およびＷ３１１０Δｌａｃと呼ばれるＷ３１１０のΔｌａｃ誘導体を、ｐＩＣＩ　１１８７を用いて形質転換した。
　生じた菌株ＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）、ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＷ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）を精製し、グリセロールストック中で−８０℃で維持した。それぞれの培養基のアリコートをストックから除去し、Ｌ−テトラサイクリンの寒天プレートに画線培養し、単一コロニーを３７℃で一晩中生長させた後に分離した。
　【００６４】
　ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）、Ｗ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）の単一コロニーを除去し、別々にＬ−テトラサイクリンブイヨン１０ｍｌに再懸濁させ、１００μｌをただちに、Ｌ−テトラサイクリンブイヨン７５ｍｌを含有する１０個の２５０ｍｌの三角フラスコにそれぞれ接種した。往復振盪器で３７℃で１６時間生長させた後、１０個のそれぞれのセットのフラスコの内容物を集め、ＬＣＭ５０（酵母エキス１０ｇ／ｌ）を含有する３つの別々の発酵槽に接種するために使用した。
　【００６５】
　発酵は３７℃の温度で、２Ｍ硫黄および６Ｍ水酸化ナトリウム溶液の自動添加により調節してｐＨ６で実施した。溶存酸素圧（ｄＯＴ）設置点は５０％の空気飽和であり、最初に発酵槽の攪拌速度の自動調整により制御した。発酵槽への空気流は常に、１容量容量／分（ＶＶＭ）に相当する２０Ｌ／分である。
　【００６６】
　発酵は１４．２５時間行なわれ、この時間の間に光学密度（ＯＤ５５０）、細胞乾燥重量、細胞中のリシンＡの蓄積および分配率を測定するためにサンプルを取った。リシンＡ蓄積は、公知のように、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査することにより測定した。細胞の細胞質（可溶性）および封入体（不溶性）フラクション中のリシンＡの分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波処理溶菌にかけることにより測定した。
　【００６７】
　プラスミドｐＩＣＩ　１１８７に対するＥ．コリー宿主菌株の変化は、可溶性の細胞質フラクション中に分配されたリシンＡの水準における予想外の変化を引き起こした。第１表は、ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）、Ｗ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）菌株について、発酵の終了（１４．２５時間）での、得られたバイオマス、全リシンＡ蓄積および可溶性フラクション中に分配しているリシンＡのパーセンテージを表わした。
　【００６８】
　　＊　ＴＭＰは全微生物タンパク質を表わす
　Ｅ．コリー宿主菌株の変化により、リシンＡの分配率における劇的変化を引き起こすことができる。
　【００６９】
例２
　菌株ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）、Ｗ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）を用いるＬＣＭ５０増殖培地（酵母エキス２０ｇ／ｌ）を用いて、例１に記載した発酵工程を繰り返した。酵母エキスの溶液（３３３ｇｌ−１）を、発酵槽に接種した後４．２５ｈから、０．８５ｇｌ−１ｈ−１で発酵槽中に供給した。この酵母エキスの供給速度を、発酵槽に接種した後５．７５ｈで、１．７ｇｌ−１ｈ−１に増大させた。発酵槽中の炭素源が枯渇した場合、（ｄＯＰ中の急速増加を引き起こす）、グリセロール（７１４ｇｌ−１）および硫酸アンモニウム（１４３ｇｌ−１）を含んだ飼料を、発酵槽中に細菌の酸素取り上げ速度を制限する速度でポンプ輸送した。
　【００７０】
　高めたバッチ酵母エキス濃度及び発酵の間の酵母エキス溶液の供給を除いて、３つの発酵槽の培地及び発酵条件は、例１に記載された工程と同様である。
　【００７１】
　この実施例に記載した発酵工程は、例１と比較して、全て３つの菌株のバイオマスにおける改良、菌株ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）、Ｗ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）の可溶性フラクション中に分配されたリシンＡの量の改良および、全菌株の可溶性リシンＡの全収量における改良を生じさせた。第２表は、最終的なバイオマス濃度、全リシンＡ蓄積、可溶性フラクション中に分配されたリシンＡのパーセンテージ、および発酵の終了時（１６．２５時間）の可溶性リシンＡの計算された収量を表わす。
　【００７２】
　　＊　発酵ブイヨン１リットルあたり可溶性リシンＡの計算した収量ｍｇ
　（１）は、約１５０〜２００ｍｇ−１の例１に記載した発酵工程での３つの菌株に対する可溶性リシンＡの計算した収量と比較した。
　【００７３】
　ＬＣＭ５００中の酵母エキス濃度が１０ｇ／Ｌであり、酵母エキスを発酵槽中に供給するおよび／または酵母エキスを０．８５ｇｌ−１ｈ−１、１．７ｇｌ−１ｈ−１または３．４ｇｌ−１ｈ−１で発酵槽中にポンプ供給する場合に、同じ結果が得られた。
　【００７４】
　酵母エキスの供給は、このように、可溶性フラクション中に分配されたリシンＡの％および発酵ブイヨン１リットルあたりの可溶性リシンの収量を増大させることができる。
　【００７５】
例３
　Ｅ．コリー菌株ＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）、Ｗ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）を用いて、Ｌトリプトファン１００ｍｇｌ−１を追加したＬＣＭ５０増殖培地（酵母エキス１０ｇ／ｌ）を用いて、例１に記載した発酵工程を繰り返した。Ｌ−トリプトファン溶液（１０ｇｌ−１）は、発酵の間中、９０ｍｇｌ−１ｈ−１で発酵槽中にポンプ供給される。
　【００７６】
　第３表は、３つの菌株についての発酵の終了時（１４．２５ｈ）で、バイオマス濃度、全リシンＡ蓄積および可溶性フラクション中に分配されたリシンＡのパーセンテージを比較している。Ｌ−トリプトファンの補充および供給は、公知のようにトリプトファンプロモータの活性に影響を及ぼすために実施した。例１及び特に例２に記載した発酵工程と比較して、不利な効果が全般的に観察された。菌株ＭＭ２９４（ｐＩＣＩ　１１８７）はより高いバイオマスを製造するが、可溶性フラクション中に分配するリシンＡのパーセンテージは減少した。菌株ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）およびＷ３１１０Δｌａｃ（ｐＩＣＩ　１１８７）はリシンＡの分配率において変化を示さなかったが、製造されたバイオマスの水準は減少した。例２に記載した酵母エキスを用いて達成された結果は、添加した酵母エキスが著しい量のトリプトファンを含有するため、最も意想外であった。
　【００７７】
例４
　例２の発酵工程を、ＬＣＭ５０（酵母エキス２０ｇ／ｌ）中のＥ．コリー菌株ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）を用いて繰り返した。
　【００７８】
　この発酵は、３７℃の温度で、２Ｍ硫黄および６Ｍ水酸化ナトリウム溶液の自動添加により調節されたｐＨ６．７で実施した。溶存酸素圧（ｄＯＴ）設置点は５０％空気飽和であり、最初に発酵槽の攪拌速度の自動調節により制御した。発酵槽への空気流は、最初に、１容量容量／分（ＶＶＭ）に相当する２０Ｌ／分であり、発酵槽の攪拌速度が最大に達した場合に手作業で４５Ｌ／分に増大させた。この発酵は、３４時間実施され、この時間の間に光学密度（ＯＤ５５０）、細胞乾燥重量、細菌細胞中のリシンＡの蓄積および分配率を測定するためにサンプルを取った。リシンＡの蓄積は、公知のように、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査することにより測定した。細胞の細胞質（可溶性）および封入体（不溶性）フラクション中のリシンＡの分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波処理溶菌にかけることにより測定した。酵母エキス（３３３ｇｌ−１）の溶液は、接種の後４．５時間に、発酵槽へ１．７ｇｌ−１ｈ−１でポンプ供給された。
　【００７９】
　接種の後の１２〜１３時間の間に、発酵における炭素源の供給は枯渇し、５０％空気飽和からｄＯＴにおいて急速増加を引き起こす。この時点から、グリセロール（７１４ｇｌ−１）および硫酸アンモニウム（１４３ｇｌ−１）を含有する飼料を、細菌の酸素取り込み速度（ＯＵＲ）を発酵槽の最大酸素移動速度の約８０％までに制限する速度で、発酵槽へポンプ供給し、その間にｄＯＴは５０％空気飽和に戻り、次いでこれを維持した。
　【００８０】
　バイオマス製造での流加発酵（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）、全リシンＡ蓄積および可溶性フラクション中でのリシン分配率への影響は、図１５，１６および１７にそれぞれ表わした。流加発酵を開始した時点は、それぞれの図に表示した（ＦＢ）。可溶性フラクション中でのリシン分配率に関する流加発酵の効果は明らかである。
　【００８１】
例５
　ＤＳ４１０（ｐＩＣＩ　１１８７）のシングルバイアルをストックから除去し、この培養１００μｌを除去し、即座にＬ−テトラサイクリンブイヨン６００ｍｌを含有する３つの２リットルの三角フラスコにそれぞれ接種した。往復振盪機上で３７℃で１６時間培養した後、フラスコの内容物を、ＬＣＭ５０増殖培養地（酵母エキス２０ｇ／ｌ）を含有する３つの発酵槽に接種するために用いた。
　【００８２】
　この発酵は３７℃で、２Ｍ硫酸および６Ｍ水酸化ナトリウム溶液の自動添加により制御するつぎのｐＨで実施した。
　【００８３】
（Ａ）　発酵の間じゅうｐＨ６．７
（Ｂ）　接種後１０時間までｐＨ６．７、その後ｐＨ６．０に調節
（Ｃ）　接種後１０時間までｐＨ６．７、その後ｐＨ７．６に調節
　この溶存酸素圧（ｄＯＴ）設定点は５０％空気飽和であり、最初に発酵槽攪拌速度を自動調節することにより制御した。発酵槽への空気流は、最初に１容量容量／分に相当して２０Ｌ／分であり、発酵槽攪拌速度が最大（１０００ｒｐｍ）にたした場合に４５Ｌ／分に手作業で増大させた。この発酵槽への空気流は、発酵の後半に向かう場合、手作業で２０Ｌ／分に減少させ、攪拌速度は自動的に約５００ｒｐｍに減少した。
　【００８４】
　この発酵は２３時間実施され、この時間の間に、光学密度（ＯＤ５５０）、細胞乾燥重量、可溶性フラクション中のリシンＡの蓄積および分配率を測定するためにサンプルを取った。リシンＡの蓄積は、公知のように、試料採取した細菌の全ての細胞リゼイトのクーマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ）染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを走査することにより測定した。細胞の細胞質（可溶性）および封入体（不溶性）フラクション中のリシンＡの分配率は、公知のように、試料採取した細菌を音波処理溶菌にかけることにより測定した。
　【００８５】
　酵母エキス（３３３ｇｌ−１）の溶液は、接種の後４．５時間から発酵槽へ１．７ｇｌ−１ｈ−１でポンプ供給された。
　【００８６】
　発酵において炭素源が枯渇する場合（５０％空気飽和からｄＯＴにおいて急速増加が引き起こされる）、グリセロール（７１４ｇｌ−１）および硫酸アンモニウム（１４３ｇｌ−１）を含有する飼料を、細菌の最大炭素需要に適合するために十分な速度で、発酵槽にポンプ供給した。この制限された炭素源および硫黄アンモニウムの供給速度は、次いで発酵の残りの間、変化させなかった。
　【００８７】
　３つの異なるｐＨ制御体系（Ａ，ＢおよびＣ）の効果を図１８，１９，２０および２１に示し、これはバイオマス濃度、全リシンＡ蓄積、可溶性フラクション中に分配するリシンＡのパーセンテージおよび可溶性リシンＡの計算された収量をそれぞれ示す。図２２は発酵の間の増殖培地のｐＨを表わす。ｐＨ６．７〜ｐＨ６．０への変更の可溶性リシンの収量に関する有利な効果が明らかに示されている。
　【００８８】
例６
　例４に記載した発酵工程を繰り返すが、発酵槽の接種後１１．５時間に、発酵温度を次第に減少させた。
　【００８９】
　リシン可溶性の意想外な持続が観察された。図２３，２４および２５は得られた結果を示した。図２５は工程中の発酵温度を表わした。
　【００９０】
プラスミドの製造
　次に、先に使用したｐＩＣＩ　１１８７の製造を表わした。組換えリシンＡを製造するために使用したベクターの誘導における多様な中間工程を記載した。
　【００９１】
実験手順
１．　合成オリゴヌクレオチド
　合成オリゴヌクレオチドは、リシン遺伝子の特異的ＤＮＡ変更を導くために使用した。引き続き記載した全てのオリゴヌクレオチドはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８０ＡのＤＮＡ合成装置で、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．により提供された手引書に従って、５′−ジメトキシトリチル塩基保護されたヌクレオシド−２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミジットおよび制御孔ガラス担体に連結させた保護されたヌクレオシドから０．２マイクロモル規模で製造した。
　【００９２】
　それぞれのオリゴヌクレオチドを、固体担体から切り離し、全ての保護基を除去した後に、水（１ｍｌ）に溶かし、濃度の測定のために２６０ｎｍでの吸光度の測定を使用した。
　【００９３】
２．　酵素
　多様な制限エンドヌクレアーゼおよびＤＮＡ変性酵素は、次に記載する操作において使用される。これらは多くの供給元（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ＭａｎｎｈｅｉｍまたはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の一つから得られ、反応条件に関する製造説明書に従って使用した。
　【００９４】
３．　ジェネクリーン（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ（ＴＭ））
　このキットは１）　６Ｍヨウ化ナトリウム、２）　塩化ナトリウム／水　エタノール／水洗浄を製造するための塩化ナトリウム、トリスおよびＥＤＴＡの濃溶液；３）　グラスミルク（Ｇｌａｓｓｍｉｌｋ（ＴＭ））−水中のシリカマトリックスの懸濁液１．２５ｍｌを含有する１．５ｍｌバイアルからなる。
　【００９５】
　これは、ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよびＧｉｌｌｅｓｐｉｅの方法（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｄｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ＵＳＡの会報（１９７９）７６版、６１５頁に公開）を基礎とするＤＮＡ精製のための技術である。
　【００９６】
　もう一つは、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ”Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載された方法のいくつかが使用できる。
　【００９７】
４．　シーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＴＭ））
　化学的に変成したＴ７　ＤＮＡポリメラーゼ
　ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎの方法（“Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ＵＳＡ（１９８７）ｖｏｌ　８４　ｐｐ４７６７−４７７１に公開）を基礎とする。
　【００９８】
５．　ｐＩＣＩ発現ベクターの組み立て
５．ａ）　ｐＩＣＩ　００２０
　プラスミドベクターｐＩＣＩ　００２０は、ｐＡＴ１５３ベースのプラスミドであり、この中で、６５１　ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＡｃｃＩ領域は、
　（１）　合成Ｅ．コリー　ｔｒｐ　プロモータおよびｔｒｐリーダーリボソーム結合部位
　（２）　翻訳開始コドン
　（３）　ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＳａｌＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを含有するＭ１３ｍｐ１８から誘導された多重制限酵素認識配列
　（４）　合成転写末端配列
からなる１６７　ｐｂ　ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩフラグメントに置き換えられる。
　【００９９】
　この領域のＤＮＡ配列は図１１に表わした。
　【０１００】
　合成ｔｒｐプロモータ配列を含有するプラスミドベクターの組み立て法は公開されている（Ｗｉｎｄａｓｓ　ｅｔ　ａｌ　Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０　ｐ６６３９−６６５７，１９８２）。プロモータフラグメントは、酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｐａＩを用いた消化および電気溶離（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＦｒｉｓｔｓｃｈおよびＳａｍｂｒｏｏｋ，ＣＳＨ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにより出版、第２版１９８９および後に“Ｍａｎｉａｔｉｓ”として報告）によりアガロースゲルからの適当なバンドの精製の後で、このようなベクターから単離される。
　【０１０１】
　本来のｔｒｐリーダーリボソーム結合部位、翻訳開始コドンおよび３′ＫｐｎＩクローニング部位を提供するプロモータフラグメントのＨｐａＩ末端にリゲートすることとなる相補性合成オリゴヌクレオチドのペアが製造される。このようなオリゴヌクレオチドは、等モル濃度で混合され、１００℃に加熱されることによりアニーリングし、引き続きゆっくりと室温に冷却される。
　【０１０２】
　このプロモータフラグメントおよびアニーリングしたオリゴヌクレオチドを、次にリゲートし、適当なバンドをポリアクリルアミドゲルから電気溶離により単離した。次に、このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位中にクローンしたｔｒｐアテニュエーター配列（合成オリゴヌクレオチドから生成した）を含有し、かつアテニュエーターに対して３′に付加的にＣｌａＩ制限部位を導入しているＭｌ３ｍｐ１８ベクター誘導体とリゲートさせた。このリゲートしたＤＮＡを、ＣａＣｌ２法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ８２）によりコンピテントしたＥ．コリー菌株ＪＭ１０９へトランスフェクションした。平板培養し、このプレートをインキュベートした後、プラークを、あらかじめ単離したＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩプロモータフラグメントのニックトトランスレーション法により生成した３２Ｐ標識プローブを用いるＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｅｓ（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　４ｐ４１）の方法によりスクリーニングした。一本鎖ＤＮＡはポジティブのハイブリット形成プラークから、標準方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　４ｐ２９）により製造し、いくつかのサプライヤー、たとえばシークエナーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によりキャットの形で提供されているように、Ｍ１３万能プライマーおよびサンガーダイデオキシチェインターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ　ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ　ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いて配列決定させた。
　【０１０３】
　ＲＦ　ＤＮＡは、プロモータ／リポソーム結合部位／アテニュエーターが確認された一つの単離物から製造された。このＤＮＡは、ＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩを用いて消化され、適当なフラグメントが、前記したようにポリアクリルアミドゲルから単離される。プラスミドｐＡＴ１５３は酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃＩを用いて消化され、単離したプロモータフラグメントとリゲートされた。リゲートされたＤＮＡは、コンピテントしたＥ．コリーＨＢ１０１（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を形質転換するために用いられ、およびアンピシリン耐性コロニーが選択された。
　【０１０４】
　多数のクローンからなるプラスミドＤＮＡが製造され、ＤＮＡ配列はＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩ部位の間の領域から誘導される。正確なプロモータ／アテニュエーター領域を含有すると確認されたクローンは、ｐＩＣＩ　００２０と命名した。
　【０１０５】
　この組み立て法は図１に略述した。
　【０１０６】
５．ｂ）　ｐＩＣＩ　００４２
　ｐＩＣＩ　００４２（図１２）はプラスミドであり、その中で、ｐＡＴ１５３の抗生物質耐性マーカーは、プラスミドＲＰ４からの単一な誘導テトラサイクリン耐性遺伝子により置き換えられる（遺伝子ｔｅｔＡによりコード化され、ｔｅｔＲ遺伝子の製造により調節される）。この遺伝子は、Ｋｌｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６１　ｐ３２６−３３２，１９８５）により特徴が示された。プラスミド安定機能（ｃｅｒ）も組み込まれていた。これは、製造工程の全てのパートにおいて、β−ラクタム抗生物質にとっての必要物を除き、最終生成物においてこれについて分析させる。この新規の耐性マーカーは抗生物質の存在でのみ表現されるため、ｔｅｔＡ遺伝子生物は、プラスミドをテトラサイクリンの不在で維持する培養中の組換えリシンＡの潜在的汚染物ではない。
　【０１０７】
　このベクターの生成における最初の段階はｐＡＴ１５３の誘導体を製造することであり、これからテトラサイクリン耐性をコード化する遺伝子を完全に除去された。合成オリゴヌクレオチドの相補性ペアは、ｐＡＴ１５３からのＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩフラグメントを、その後のクローニングのための多様なユニーク制限エンドヌクレアーゼを含有する短い配列に置き換えるために設計された。
　【０１０８】
　ｐＡＴ１５３プラスミドＤＮＡは酵素ＥｃｏＲＩおよびＡｖａＩにより消化され、２．１７５ＫｂｐプラスミドＤＮＡフラグメントはＧｅｎｅｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ　１０１，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いる０．７％アガロースゲルから、製造説明書に従って単離した。テトラサイクリン耐性遺伝子を含有する１．４２５Ｋｂｐフラグメントはこのようにして除去される。
　【０１０９】
　このオリゴヌクレオチド（ｅｘｐ７９および８０）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてホスホリレート化され、等モル量を一緒にアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチドのサンプルを、次いで、ｐＡＴ１５３からのプラスミドフラグメントとリゲートした。リゲートしたＤＮＡをＥ．コリーＨＢ１０１（ＢＲＬ）中へ形質転換させ、アンピシリン耐性コロニーを選択した。
　【０１１０】
　多様なコロニーを、小規模プラスミドＤＮＡ製造のために取り（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ２５に明らかにされたようなＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙの方法）、所望の組み立てを、適当な酵素、たとえばＥｃｏＲＩ、ＡｖａＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限分析により確認した。正確な制限パターンを有するものとして確認された３つの単離物の構造は、ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ部位右回りプライマー（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いるＤＮＡ配列分析により確認された。単離物をｐＩＣＩ　００１９と命名した。
　【０１１１】
　ＲＰ４プラスミドＤＮＡは、現存のストックから、ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙ（Ｍａｎｉａｔｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ２９）の方法により単離した。このＤＮＡは、ＢｇｌＩＩを用いて、次いで部分的にはＸｍａＩ（２５℃で、３５分まで）を用いて、多様な時点でサンプルを取りながら、ｔｅｔＲおよびｔｅｔＡを含有する２．４５Ｋｂｐフラグメントが明らかに確認されるまで完全に切断した。ｐＵＣ８　ＤＮＡのサンプル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）はＢａｍＨＩおよびＸｍａＩを用いて完全に消化させた。リゲーションはテトラサイクリン耐性遺伝子をｐＵＣ８へ挿入するために行なった。リゲートしたＤＮＡは、ＣａＣｌ２法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ８２）によりコンピテントしたＥ．コリーＣ６００（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ，Ｒ．Ｋ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　３９　ｐ４４０，１９５４）を形質転換するために用いられ、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。プラスミドＤＮＡは８クローンから製造され（ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙ）、ＲＰ４　ｔｅｔＲおよびＡ遺伝子の存在は、制限分析により確認された。これらの単離物の一つをｐＴＢ３４４と命名した。
　【０１１２】
　テトラサイクリン耐性遺伝子を、次に、ｐＩＣＩ　００１９からのＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩフラグメントをｐＴＢ３４４からの相応するフラグメントに置き換えることにより、ｐＩＣＩ　００１９（前記した）中に挿入した。これは、結果として、ｐＩＣＩ　００１９中のアンピシリン耐性遺伝子の大半がテトラサイクリン耐性遺伝子に置き換えられることになる。プラスミドＤＮＡの消化およびリゲート、引き続きＥ．コリー　Ｃ６００の形質転換の後、コロニーを、表現形、つまりＴｃＲおよびＡｐＳに基づき選択した。プラスミドＤＮＡをこのような４つのクローンから製造し、酵素、たとえばＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩ／ＳｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｔｙＩ／ＳａｌＩおよびＡｖａＩ／ＰｓｔＩの組み合わせを用いて消化させた。制限パターンを製造した全ての４つのクローンは所望の組み立てと一致している。これらの一つをｐＴＢ３５１と表わした。
　【０１１３】
　ＳｕｍｍｅｒおよびＳｈｅｒｒａｔｔ（Ｃｅｌｌ　３６　ｐ１０９７−１１０３，１９８４）は、ＣｏｌＥＩ（たとえばｐＡＴ１５３）から誘導されたプラスミドの不安定性が、親プラスミド中に存在する２８３ｂｐ配列、ｃｅｒの損失を引き起こすことを明らかにした。この配列は、プラスミドオリゴマーの形成の妨害を補助し、後者は、いまだ不確定の方法で分配されるプラスミドを崩壊させると思われる。このｃｅｒ配列（Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ　ＭＧＧ　２０１，ｐ３３４−３３８，１９８５）は、Ｐｒｏｆ．ｄ．ＳｃｈｅｒｒａｔｔによりｐＵＣ１８（ｐＫＳ４９２）中にクローンされたフラグメントの形で、念入りに製造された。ｐＫＳ４９２プラスミドＤＮＡは、ＢａｍＨＩおよびＴａｑＩを用いて消化させ、２８９ｂｐのｃｅｒ含有フラグメントを放出させた。プラスミドｐＴＢ３５１ＤＮＡ（ｄａｍ−宿主Ｅ．コリー　ＧＭ４８から単離、Ａｒｒａｊ，Ｊ．Ａ．およびＭａｒｉｎｕｓ，Ｍ．Ｇ．Ｊ．Ｂａｃｔ．１５３　ｐ５６２−５６５，１９８３）を、ＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで完全に消化させ、所望のｐＫＳ４９２ＤＮＡとリゲートさせた。コンピテントＥ．コリー　Ｃ６００のリゲートしたＤＮＡを用いた形質転換の後、テトラサイクリン耐性コロニーを選択した。推定クローンから酵素、ＡｖａＩ、ＭｌｕＩおよびＰｖｕＩを用いたプラスミドＤＮＡの制限分析は、ｃｅｒの存在の確認のために用いられた。正確な構造を有する単離物の一つをｐＩＣＩ００４２と命名した。
　【０１１４】
　このようなプラスミドの組み立ては、図２および図３に概略した。
　【０１１５】
５．ｃ）　ｐＩＣＩ　１０７９
　プラスミドベクターｐＩＣＩ　１０７９は、アンピシリン耐性のｐＡＴ１５３誘導プラスミドであり、これは、ＥｃｏＲＩおよびＳｔｙＩ制限部位の間に次の要素：
（ｉ）　　　ファージλからのＣＩ８５７遺伝子
（ｉｉ）　　λＰＬプロモータ
（ｉｉｉ）　合成リボソーム結合部位
（ｉｖ）　　合成インターフェロンα２遺伝子配列
（ｖ）　　　ファージＴ４からＳａｌＩおよびＳｔｙＩ制限部位の間に誘導された合成転写ターミネーター配列を含有する。この転写ターミネーターのＤＮＡ配列は図１３に記載した。ｐＩＣＩ　１０７９は図１４に示した。
　【０１１６】
　ｐＩＣＩ　１０７９は、ブタペスト条約に基づき寄託されている。この寄託はＮＣＩＭＢ，２３　Ｓｔ　Ｍａｃｈａｅｒ　Ｄｒｉｖｅ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，Ｓｃｏｔｌａｎｄで行なわれた。
　【０１１７】
　このプラスミドは、リシンＡ発現クローンｐＩＣＩ　１１８５（下記の７．ｄ参照）の生成のためのＴ４転写ターミネーターの供給源を提供するために用いられた。このプラスミドの生成のための出発点は、ｐＩＣＩ　１０４３である。ｐＩＣＩ　１０４３はｐＩＣＩ　００２０（前記の３．ａ参照）をベースとしたプラスミドであり、この中で、λＰＬプロモータおよびインターフェロンα２遺伝子を含有する発現カセット（Ｅｄｇｅ　ｅｔ　ａｌ　Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１　ｐ６４１９−６４３５，１９８３）はＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の間に存在する。
　【０１１８】
　オリゴヌクレオチドの相補的ペアは、５′ＳａｌＩおよび３′ＳｐｈＩ付着末端を有するバクテリオファージＴ４の遺伝子３２から転写ターミネーターの生成のために合成される。このフラグメントを、ＳａｌＩおよびＳｐｈＩで完全に消化したｐＩＣＩ　１０４３から単離したプラスミドフラグメントとリゲートした。このように製造した中間プラスミド（ｐＩＣＩ　１０７８）は、Ｔ４ターミネーターおよびｔｒｐアテニュエーター配列の両方を連結して含有する。
　【０１１９】
　相補的オリゴヌクレオチドの第２のペアは、次に、ｐＩＣＩ　１０７８のＳｐｈＩおよびＳｔｙＩ部位の間へ挿入することにより、ｔｒｐアテニュエーター配列（およびテトラサイクリン耐性遺伝子の残りの部分）を置き換えるために使用した。ユニークＢａｍＨＩ部位は、この合成フラグメントの中で導入された。
　【０１２０】
　この操作を、図４に概略した。
　【０１２１】
６．　リシンＡ発現クローンの生成
６．ａ）　ｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡの製造
　リシンＡに対するｃＤＮＡを含有するクローン（ｐＵＣ８ＲＡ）を生成した。このクローンは、プラスミドｐＵＣ８（Ｖｉｅｒｉａ，Ｊ　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．Ｇｅｎｅ，１９，ｐ２５９，１９８２）中の公開されたｃＤＮＡ配列（Ｌａｍｂ，Ｉ．Ｆ．，Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８５，１４８，ｐ２６５−２７９）に従って、リーダー配列中の塩基番号−７４からＢ−鎖内（塩基番号８５７）でＢａｍＨＩ部位までＡ鎖ｃＤＮＡを含有する。さらに、部位突然変異は、成熟リシンＡの最終コマンドに対して３′付近の翻訳終止コマンドを生成するために用いられた（Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｍ　ｅｔ　ａｌ　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２１６，Ｐ７３−７８に報告）。全体のＡ鎖をコード化する領域はこのクローンからＢａｍＨＩフラグメントに含まれる。
　【０１２２】
　小量のｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡは、創作者から得られた。後の保持のために、このＤＮＡの希釈液を、Ｅ．コリー　ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の形質転換のために使用し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。このクローンからのプラスミドＤＮＡは変更Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ２５）により製造した。このＤＮＡサンプルは、ＢａｍＨＩおよびＢａｎＩを用いて別々に消化し、アガロース上で電気泳動の後に、ＤＮＡのオリジナルサンプルの相応する消化物と比較した。制限パターンにおける差異は観察されず、これに基づき２つのＤＮＡサンプルは同一と断定された。
　【０１２３】
６．ｂ）　Ｍ１３へのサブクローニング
　ｐＵＣ８ＲＡプラスミドＤＮＡのＢａｍＨＩ消化物およびファージＭ１３菌株Ｋ１９（Ａｎｇｌｉａｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からのＲＦ（複製型）ＤＮＡは、標準の条件（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ６８）を用いて「ショットガン」リゲートした。対照リゲーションも実施される。これらのリゲートされたＤＮＡは、ＣａＣｌ２法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ８２）によりコンピテントにしたＥ．コリー菌株ＴＧｌ（Ｇｉｂｓｏｎ，１９８４／Ａｎｇｌｉａｎ）を形質転換するために用いられた。
　【０１２４】
　有効リゲーションおよび組換えファージを表わす形質転換頻度は子孫に現われた。組換えファージは、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）遺伝子の破壊のためＩＰＴＧ＋Ｘ−ｇｅｌ（ＢＲＬ）含有プレート上に透明プラークを生じることが予想される。野生型ファージは、βガラクトシダーゼによるＸ−ｇａｌの転換のため青色プラークを生じる。
　【０１２５】
　多数の透明プラークを一本鎖ＤＮＡの製造のために取った。溶菌したファージ懸濁液の直接ゲル電気泳動は、ファージクローンが、リシンＡ鎖コード化配列を配列決定により確認されたかなりの大きさの挿入物を含有することを示した。成熟リシンＡコード化配列の１８２塩基だけが確認されたが、これは完全なリシンＡ遺伝子の存在についての十分な形跡として受け取られた。このクローンはＭ１３Ｋ１９ＲＡと命名した。
　【０１２６】
６．ｃ）　Ｍ１３Ｋ１９ＲＡの突然変異誘発
　成熟リシンＡの開始部でｐＩＣＩ発現ベクターと一致するＫｐｎＩ部位の生成のために、次の変化（アンダーラインで示した）が必要である：
を次のように変化させ：
　【０１２７】
　【化１】
　【０１２８】
ＡＴＧコドンがオーバーラップするＫｐｎＩ部位が生じる。ＫｐｎＩフラグメントを含有するリシンＡを、突然変異体から取り出し、一連のＩＣＩ発現ベクター中に挿入することができる。２つのＮ末端アミノ酸修飾が行なわれた（ｉｌｅ−ｐｈｅからｍｅｔ−ｖａｌ）。
　【０１２９】
　Ｍ１３Ｋ１９ＲＡから製造した一本鎖ＤＮＡは、それぞれの突然変異戦略のための突然変異誘発工程のための鋳型である。この戦略のための突然変異的な全ての変化を誘導する一本鎖オリゴヌクレオチド（ＤＴＲ１６）が合成された。
　【０１３０】
　多様な手引書が、部位突然変異による特異的ＤＮＡ配列変化の導入のために存在する。以下に概略したこれらの手引書は、キットの形で提供されているような、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．，１９８５，１３　ｐ８７４９−８７６４および１９８６，１４，ｐ９６７９−９６９８）の方法を用いて達成され、その製造手引書に従って使用した。
　【０１３１】
　この方法の原則は、一本鎖ＤＮＡ鋳型に突然変異オリゴヌクレオチドを挿入し、ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰαＳを組み込んだ相補的鎖を合成することである。このヌクレオチドの使用は、ホスホロチオエート結合の形成を生じさせ、この結合は特定の制限酵素（たとえばＮｃｉＩ）により分解されない。第２の鎖の合成の後に、ＮｃｉＩは親鎖の切開のために用いられ、エキソヌクレアーゼＩＩＩは突然変異点を過ぎて後方を消化させるために添加した。ＤＮＡポリメラーゼＩは親鎖を最合成させる。結果として、この突然変異オリゴヌクレオチドは最合成の鋳型として行動し、この突然変異は、形質転換する前に双方の鎖に導入される。全子孫の９６％までの突然変異頻度が要求され、スクリーニングはＤＮＡ配列分析のためランダムでプラークをピッキングすることにより簡単に行なわれた。
　【０１３２】
　ここでの実験において、４つのプラークの中の４つが正確に突然変異を起こしていた。
　【０１３３】
　突然変異体（ＭＲＡ１６）が選択されてから、ＲＦ　ＤＮＡが製造され、新たに生成された制限フラグメント、たとえばＫｐｎＩの存在について確認した。
　【０１３４】
６．ｄ）　クローニング、発現および最初の特性表示
　発現ベクター（セクション５参照）の一連のｐＩＣＩは、Ｔｒｐプロモータに隣接したユニークＫｐｎＩ制限部位中に、クローンされたＤＮＡフラグメントを受け入れることができる。ＫｐｎＩ部位は翻訳開始コドン（ＡＴＧ）をオーバーラップし、これはこのプロモータのＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ部位（ＡＧＧＡ）から８ｂｐ下方に位置している。
　【０１３５】
　ＭＲＡ１６の配列の確認の後、大規模の（−５μｇ　ＲＦ　ＤＮＡ）ＫｐｎＩ消化を行ない、関連するリシンＡコード化ＤＮＡフラグメントを、製造手引書に従って、アガロースゲル（Ｎｕ−Ｓｉｅｖｅ　ＧＴＧ　アガロース、ＦＭＣ　Ｂｉｏ−生成物）から、切除したゲルスライスのフェノール抽出により単離した。
　【０１３６】
　ｐＩＣＩ　００２０（５ａ参照）は、ＫｐｎＩで消化され、次に、子牛腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ−Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて脱ホスホリレートした。後の処理は、リゲーションの際のベクターの再環化を防ぎ、これは形質転換子孫中の親の高い割合を導く。
　【０１３７】
　リゲーションは、多様な戦略のために、８：１（ｗ／ｗ）〜１：３のプラスミドベクター対単離したフラグメントの割合で始めた。ホスファターゼ処理、リガーゼ活性等の効果を試験するための対照リゲーションを包含した。このリゲーション条件は、使用したＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　ｏｒ　Ａｍｅｒｓｈａｍ）の供給源にとって適当であった。反応物は一般に１５℃で一晩中インキュベートした。
　【０１３８】
　それぞれのリゲーション（５μｌ）反応物の５０％を１００μｌまで１×ＴＮＥ（トリス５０ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭ）で希釈し、コンピテントＥ．コリー　ＤＳ４１０２００μｌを添加した。標準の形質転換手引書（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ７４）に従って、細胞を、ストレプトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加されたＬ寒天上にプレートし、３７℃で一晩中インキュベートした。Ｅ．コリー　ＤＳ４１０は染色体ストレプトマイシン耐性遺伝子を有している。
　【０１３９】
　形質転換プレートはインキュベートの後に試験された。一般に、５〜１０倍以上のクローンが、リガーゼなしの対照と比較したリゲーションにおいて見られた。これらのいくつかの場合、リガーゼの存在又は不在で産生されるクローンの数においてわずかな差異が生じ、ベクターの不完全な消化または乏しいリガーゼ活性を示す。
　【０１４０】
　形質転換体、さらに関連する対照を、ハイブリダイゼーションスクリーニングのためのＬ寒天プレート上に置いたニトロセルロースフィルターに取った（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ９８に記載されたように、ＧｒｕｎｓｔｅｉｎおよびＨｏｇｎｅｓｓの方法を基礎とする）。インキュベートの後、コロニーを１０％ＳＤＳおよび１ＭＮａＯＨを用いてその場で溶菌し、１Ｍトリス（ｐＨ７．５）を用いて中和し、真空中で８０℃で３時間乾燥した。
　【０１４１】
　ハイブリダイゼーションプローブを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いる突然変異オリゴヌクレオチドの３２Ｐ標識により生成した。このフィルターは、室温で試験され、次いで５５〜６５℃までの範囲内で洗浄し、オートラジオグラフィーの前に、非特異的結合カウントを除去した。特異的ハイブリダイゼーションは推定のリシンＡＤＮＡ含有クローンを示す。
　【０１４２】
　小規模ＤＮＡ製造（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１ｐ２５に特徴付けられたように、ＨｏｌｍｅｓおよびＱｕｉｇｌｅｙまたはＢｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙの方法による）はポジティブな雑種形成クローンから作られた。このＤＮＡは、関連する制限酵素、たとえばＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩを用いて消化され、アガロースゲル上での電気泳動により分析した。ベクターＤＮＡおよび突然変異ＲＦ　ＤＮＡは、これらの酵素により切断され、正確なクローンについて予想されるフラグメントサイズが立証された。
　【０１４３】
　それぞれのクローンの大規模プラスミドＤＮＡ製造（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ−Ｄｏｌｙ）は、より詳細な制限分析、たとえばＣｌａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ、ＫｐｎＩおよびＳｃａＩのために使用された。アガロースゲル上で、これらの消化物は挿入されたフラグメントのサイズ、この配向の表示、およびいくつかのユニークリシンＡ−鎖酵素部位の獲得を示した。
　【０１４４】
６．ｅ）　発現調査
　ハイブリダイゼーションおよび制限スクリーニングによりポジティブと同定されたこれらのクローンは、全細胞リゼイトのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によりリシンＡの発現について試験した。発現調査のための標準条件を次に示す：
１）　Ｌ−ブイヨン＋抗生物質１０ｍｌに単一コロニーを接種し、温和に振盪させながら一晩中３７℃で生長させた。
　【０１４５】
２）　一晩たったＬ−ブイヨン７５０μｌを取り、マイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中で、（６５００ｒｐｍで１分）細胞をペレット化させた。
　【０１４６】
３）　ペレットをＭ９培養基（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ａｐｐｅｎｄｉｘ　Ａ．３）３００μｌ＋０．０２％のカゼイン水解物＋０．２％グルコース＋チアミン５０μｇ／ｍｌに再懸濁させ、同様のもの１０ｍｌへ接種した。
　【０１４７】
４）　温和に振盪させながら７時間または一晩中３７℃でインキュベートした。
　【０１４８】
５）　インキュベートの後、ＯＤ５４０を測定し、セルをペレット化させ、ＯＤ５４０＝１０ｐｅｒ　ｍｌまで、Ｌｅｒｍｍｌｉ飼料衝撃液（Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｃｈａｐｔｅｒ　１８ｐ５３）中に再懸濁させた。１５分間煮沸した。
　【０１４９】
６）　全細胞リゼイト２０μｌをＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に移し、電気泳動し、クーマシーブルーで染色し、脱色し、可視化した。
　【０１５０】
　ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調査したクローンの中の一つだけは、−２９ＫＤの等しい分子量を有する付加的バンドを示した（非グリコシル化した、成熟リシンＡに対して評価されたものと同じ）。ゲル走査は、全細胞タンパク質の５〜１０％の細胞内まで発現レベルを示した。このクローンはｐＩＣＩ　１１０２と、命名した。
　【０１５１】
　ｐＩＣＩ　１１０２の組み立ては図５に概略した、発現調査の結果は図６および図７に示した。
　【０１５２】
６．ｆ）　組換えリシンＡのウェスタントランスファーおよび免疫検出
　組換えリシンＡ−鎖タンパク質の確認は、まず、ＳＤＳ−ポリアクリレートアミドゲルのクーマシーブルー染色により観察し、ウェスタンブロットにより確認された。タンパク質バンドはニトロセルロースフィルターに移され、リシンＡに特異的な抗体、引き続きペルオキシダーゼにより標識付けしたアンチグロブリンを用いて検出した。
　【０１５３】
　１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、８ｍＡで一晩中経過させ、少なくとも３０分間トランスファー緩衝液中で平衡させた。
　【０１５４】
　次に、ゲル上のタンパク質バンドを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｔｒａｎｓ　Ｂｌｏｔ装置中で７０Ｖで電気泳動により、ニトロセルロース膜に移した。このフィルターは、乾燥した後、封止したプラスチックバック中で−２０℃で貯蔵することができる。
　【０１５５】
　リシンＡ．１は、ウサギにおいて、リシンＡの合成ペプチドフラグメントに対抗する多クローン性抗体である。予備の調査はリシンＡについての良好な親和性を示すが、多数のＥ．コリータンパク質とのかなりの公差反応性を示す。この交差反応性により引き起こされる高いバックグラウンドを克服するため、抗体はＥ．コリーリゼイトで予備インキュベートした。
　【０１５６】
　このように、Ｅ．コリー菌株ＤＳ４１０のＬ−ブイヨン一晩培養液１０ｍｌを、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞をペレット化させた。このペレットを細胞緩衝液５ｍｌに再懸濁させ、氷上で３０秒間隔で冷却しながら、４〜６μで６×１０秒バーストで音波処理した。
　【０１５７】
　音波処理物０．５ｍｌを、次に、リシンＡ．１抗血清０．５ｍｌと混合し、室温で９０分間インキュベートした。細胞の残骸は５分間１３０００ｒｐｍでスピンダウンし上澄みを−２０℃で貯蔵した。
　【０１５８】
　ウェスタントランスファーからのニトロセルロースフィルターは、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン中で室温での一晩のインキュベーションによりブロックした。（ＰＢＳ　ツイーン＝ＰＢＳ１リットルあたりツイーン２０　５ｍｌ）。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン中のブロックされたリシンＡ．１抗体の１／４０００希釈液を用いて、室温で２時間（または一晩中）インキュベートした。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ／ツイーン中のヤギ−抗−ウサギ抗血清の１／１０００希釈液を用いて１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳ／ツイーン中のウサギペルオキシダーゼ−抗−ペルオキシダーゼ抗血清のｌ／５０００希釈液と共に、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ／ツイーン中で３×３分間洗浄した。ＰＢＳで１２０ｍｌにし、過酸化水素１２μｌを含有するメタノール２０ｍｌ中の４−クロロナフトール（６０ｍｇ）の溶液中で浸漬することにより展開した。バンドが可視化するとすぐにこの膜を溶液から除去し、乾燥し、撮影した。
　【０１５９】
　典型的なウェスタンブロット分析を図８に示した。
　【０１６０】
６．ｇ）　組換えリシンＡタンパク質の生物学的アッセイ
　この目的は、Ｅ．コリー細胞からリシンＡ鎖精製の間に生成した試料を、無細胞試験管内タンパク質合成アッセイにおける生物学的活性についての試験を行なうことができる条件を確定することであった。
　【０１６１】
　ウサギの網状赤血球リゼイトを、ＡｌｌｅｎおよびＳｃｈｗｅｅｔ（Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９６２），２３７，７６０−７６７）の方法により製造した。このアッセイは、新規に合成されたタンパク質中へ１４Ｃ標識ロイシンの組み込みの欠乏により、無細胞系におけるタンパク質合成の阻害を証明した。
　【０１６２】
６．ｇ　ｉ）　アッセイ手引書
　ストック溶液：１ｍＭアミノ酸混合物−ロイシン。ロイシンを除く全てのＬ−アミノ酸を１ｍＭで含有する溶液（ＮａＯＨでｐＨ７．４に調節し、−７０℃で貯蔵）。
　【０１６３】
　　溶液Ａ
　　酢酸マグネシウム　　　　　　　　　　　　　　　　　４０ｍＭ
　　酢酸アンモニウム　　　　　　　　　　　　　　　　　２Ｍ
　　トリス（ＨＣｌでｐＨ７．４、４℃で貯蔵）　　　　　０．２Ｍ
　　溶液Ｂ
　　ＡＴＰ（シグマ　Ａ５３９４）　　　　　　　　　　　２４６ｍｇ／ｍｌ
　　ＧＴＰ（シグマ　Ｇ８７５２）　　　　　　　　　　　２４．４ｍｇ／ｍｌ
　　アッセイ混合物：アミノ酸混合物　　　　　　　　　　１ｍｌ
　　溶液Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｌ
　　溶液Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１ｍｌ
　　クレアチンホスフェート　　　　　　　　　　　　　　１０３ｍｇ
　　クレアチンキナーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　１ｍｇ
　　Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５１０μｌ
　　Ｌ−１４Ｃ−ロイシン（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ，ＮＥＣ−２７９Ｅ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６００μｌ（６０μＣｉ）
　　反応混合物：テストサンプル　　　　　　　　　　　　２５μｌ
　　アッセイ混合物　　　　　　　　　　　　　　　　　　１２．５μｌ
　　ウザギ網状赤血球リゼイト　　　　　　　　　　　　　２５μｌ
　　ブランク溶液はＰＢＳ中のＢＳＡ２ｍｇ／ｍｌ
　全てのアッセイは２重で行なった。
　【０１６４】
　アッセイ混合物１２．５μｌを無菌ガラス管に置いた。ブランクのために最初の４つにＰＢＳ中のＢＳＡ　２５μｌを添加した。テストサンプル２５μｌを残りの試験管に添加した。０．１Ｍ　ＫＯＨ　１ｍｌを最初の２つの試験管に添加した（バックグラウンドブランク）。これらの試験管を水浴中で２８℃に平衡させた。ウサギ網状赤血球リゼイト（液体窒素温度から溶かした）２５μｌを、２０秒間隔でそれぞれの試験管に添加した。最初の試験管を１２分間インキュベートした際に、０．１Ｍ　ＫＯＨ　１ｍｌを、再び２０秒間隔でそれぞれの試験管に添加し、全ての試験管を１２分間インキュベートさせた。２０％の過酸化水素を２滴、それぞれの試験管に添加し、引き続き２０％ＴＣＡ１ｍｌを添加した。試験管内容物を混合し、少なくとも１時間、または一晩中４℃で放置した。沈殿物を、２．５ｃｍのＧＦＣディスクで濾過し、５％ＴＣＡ３×４ｍｌで洗浄し、シンチレーションバイアルに移し、シンチラント（Ｒｅａｄｙ−Ｓｏｌｖ．ＭＰ，Ｂｅｃｋｍａｎ）１０ｍｌを添加した。１時間後にこのバイアルを振盪し、計測した。
　【０１６５】
６．ｇ．　ｉｉ）　Ｅ．コリーリゼートを用いるための技術の確立
　Ｌ−ブイヨン一晩培養液１０ｍｌを３７℃で生長させた。アリコート４００μｌを１３０００ｒｐｍで３０秒間ペレット化させ、上澄み液の大半をデカントした。
　【０１６６】
　このペレットに、ドライアイス／ＥｔＯＨ中での急速冷凍、引き続き３７℃で解凍を２回行なった。トリスＨＣｌ　ｐＨ８．０　５０ｍＭ中の２５％のスクロース１２μｌを添加し、引き続きリゾチームの１０ｍｇ／ｍｌ溶液４μｌを添加した。
　【０１６７】
　１５分間氷上でインキュベートした後、０．２５Ｍ　ＥＤＴＡ　８μｌを添加し、１５分間インキュベートを続けた。サンプルを水で４００μｌに希釈することにより、浸透圧により溶菌を起こさせた。この方法は１ｍｌあたり８０〜１００のバイアル細胞数を製造した。
　【０１６８】
　このリゼイトのアリコート２５μｌをアッセイ反応混合物に添加する場合、新たに合成されたタンパク質への１４Ｃ−ロイシンの組み込みのレベルは、リゼートを除いてブランクの−１０％であった。これは、リシンＡ８ｎｇ／ｍｌにより製造されたものと同様の阻害のレベルであった。Ｅ．コリーリゼイトの希釈物を、次に製造し、このアッセイを繰り返した。この結果は、ブランクのものと等しくなるまで、最小の１６−倍の希釈物がリゼイトの効果の減少のために必要であったことを明らかに示した。
　【０１６９】
　Ｅ．コリーの溶菌およびＥ．コリーリゼイトはリシンＡ毒性に影響を及ぼさないことを可能なかぎり確実にするため、２対照アッセイを行なった。最初は、植物由来のリシンＡを、１６倍希釈Ｅ．コリー細胞ペレットに添加し、細胞溶菌後のアッセイ混合物中の８ｎｇ／ｍｌの最終濃度にした。双方のこの対照は、リシンＡの阻害活性に関してリゼイトまたは溶菌手順からの有害な影響を示さなかった。
　【０１７０】
　これらの技術は、生化学的活性、ｐＩＣＩ　１１０２からの組換えリシンＡおよび次に記載するクローンの合成を確認するために用いた。
　【０１７１】
６．ｈ）　ＤＮＡ配列分析
　プラスミドＤＮＡ配列決定は、ｐＩＣＩ　１１０２の分析のために用いた。この選択した手引書は、Ｚａｇｕｒｓｋｙ　ｅｔ　ａｌ（Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｖｏｌ　２，Ｎｏ．５）から修正され、プライマーのアニーリングの前の二本鎖プラスミドＤＮＡのアルカリ性変性および多様な製造元からキッド形（たとえばシーケナーゼ（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で提供されるような標準の手順による配列決定を包含する。β−ラクタマーゼの３′末端で取り付けるためのオリゴヌクレオチドおよび多数のＡ鎖中間プライマーを使用する際に、プロモータおよびリシンＡ遺伝子の双方の鎖の配列決定が可能であった。
　【０１７２】
　この最初に配列決定データは、付加的ＫｐｎＩフラグメントがプロモータとリシンＡをコード化する配列との間に存在するという意想外の結果を示した。すなわち：
　【０１７３】
　【化２】
　【０１７４】
　付加的ＫｐｎＩフラグメントは、Ｍ１３Ｋ１９ＲＡから得られ、制限酵素部位に加えてｐＵＣ８ＲＡからクローンしたリシンリーダー配列を含む。リシンＡ鎖の５′領域は突然変異誘発の間に誘導される塩基変化を含む。
　【０１７５】
　この配列の調査は、最初の翻訳開始コドン（ＡＴＧ）がシリンＡをコード化する領域の枠外にあることを表わす。さらに、枠内の終止コドン（ＴＡＧ）はリシンＡ開始コドンおよび第２のＡＴＧからの翻訳の再開始することができる推定Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（ＡＧＧＡ）の前にある。
　【０１７６】
　その後の調査は、意想外に、Ｅ．コリー中のリシンＡ鎖の蓄積レベルに関して、この付加的ＤＮＡフラグメントが、これを削除してあるものからのクローンと比較して明かな利点を与えたことを表わした。
　【０１７７】
　ｐＩＣＩ　１１０２に含まれるリシンＡ遺伝子の完全ＤＡＮ配列は図９に示した。
　【０１７８】
７．　引き続くリシンＡ発現クローンの生成
７．ａ）　サブクローニングさせるためのリシンＡクローンｐＩＣＩ　１１０２の突然変異
　リシンＡ発現について完全な方向で、偶発的に生成したｐＩＣＩ　１１２０からの２つのＫｐｎＩフラグメントをサブクローニングすることは困難である。従って、単一塩基置換（ＡからＴ）により、最初のＫｐｎＩ認識部位を変更することを計画した。これは、この部位でのＫｐｎＩ開裂を妨げ、単一のＫｐｎＩフラグメントのｔｒｐ／ＲＢＳベクターへの部位へサブクローニングさせる。ＫｐｎＩ認識部位（ＧＧＴＡＣＣ）のアデニンを、チミン（たとえばＧＧＴＴＣＣ）に置換する際に、リシンＡの最初の残基は変更しない（ＧＴＡ／ＧＴＴ＝Ｖａｌ）。たとえば：
　【０１７９】
　【化３】
　【０１８０】
を次の用の変化させる：
　【０１８１】
　【化４】
　【０１８２】
　この変化を製造するために合成したオリゴヌクレオチドが、アンダーラインで示した塩基は突然変異的変化を表わす次の配列：
を有する。
　【０１８３】
　比較による発現調査のために、突然変異したリシンＡフラグメントをｔｒｐ発現ベクターの部位へクローンすることを計画した。ｐＩＣＩ　００２０へのクローニングは、単一塩基置換が合った場合に、発現に関する効果を測定するために、ｐＩＣＩ　１１０２との比較を提供する。
　【０１８４】
７．ｂ）　突然変異誘発
　突然変異誘発のための鋳型はＭＲＡ１６であり、これはｐＩＣＩ　１１０２中に存在する２つのＫｐｎＩフラグメントを含むＭ１３クローンである。突然変異誘発の後に、所望の突然変異を有する単離体は、ランダムサンプリングおよび突然変異オリゴヌクレオチドが特異的に結合する部位にわたるＤＮＡ配列測定により確認された。
　【０１８５】
　突然変異した鋳型は、ＭＲＡ２２と命名された。これは、さらに、非特異的突然変異の不在の確認のために、完全なリシンＡをコード化する配列のＤＮＡ配列測定により分析された。
　【０１８６】
７．ｃ）　サブクローニング
　突然変異した一本鎖ＤＮＡは、単一プラークを製造するコンピテントＥ．コリーＴＧＩ細胞に形質転換するために用いられた。次に、個々のプラークをピッキングし、複製型（ＲＦ、二本鎖）ＤＮＡを、塩化セシウム／エチジウムブロミド浮遊密度勾配でバンド形成させることにより精製した。精製したＲＦＤＮＡはＫｐｎＩにより完全に消化された。クローニングは、適当なＫｐｎＩ切断により消化したＲＦ　ＤＮＡと、ホスファターゼ処理した発現ベクターとのショットガンリゲーションにより、またはアガロースゲルからのその精製後のリシンＡの特異的リゲーションにより行なわれた。リゲートしたＤＮＡはＥ．コリーＧｌまたはＨＢ１０１へ形質転換された。
　【０１８７】
　リシンＡを含有するクローンは、他のリシンＡを含有するクローン（ｐＩＣＩ　１１２１）から単離したＫｐｎＩフラグメントのランダムヘキサヌクレオチドプライミングにより製造した３２Ｐ標識リシンＡプローブを用いるハイブリダイゼーションスクローニングにより同定された。ポジティブなハイブリダイゼーションを示すコロニーは、さらにＫｐｎＩ単一消化およびＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ二重消化を用いるプラスミドＤＮＡの制限分析によりスクリーニングした。ＫｐｎＩは挿入されたフラグメントのサイズを同定し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩはフラグメントの配向を測定する。
　【０１８８】
　発現のための完全な配向においてリシンＡフラグメントを有しているとして確認されたクローンは、クローン選択成長およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析、引き続きクーマシー染色および複製ゲルのウェスタンブロッテイングにかけられる。これらのクローン中のシリンＡ蓄積のレベルは、ｐＩＣＩ　１１０２から検出したものと同様であった。
　【０１８９】
　単離物を選択し、ｐＩＣＩ　１１３１と命名した。
　【０１９０】
７．ｄ）　択一的転写ターミネーター要素の使用
　これら実験において、ｔｒｐプロモータおよびリシンＡフラグメントは、酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いた消化により切り取られる。後者の酵素は、リシンＡをコードする配列の３′末端およびｔｒｐＡ転写ターミネータとの間を開裂する。生じたフラグメントは、アガロースゲル（２％ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロース、ＦＭＣ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）から切り取られ、フェノールおよびクロロホルム抽出により、引き続きエタノール沈殿により精製した。この精製したフラグメントは、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩにより切断されたｐＩＣＩ　１０７９とリゲートされた。後者のプラスミドはユニークＳａｌＩとＳｐｈＩ部位との間にＴ４ターミネータを有する。
　【０１９１】
　リゲートしたＤＮＡは、コンピテントしたＥ．コリーＨＢ１０１（ＢＲＬ）を形質転換するために用いられ、ハイブリダイゼーションスクリーニングは、先の実験においてと同様に、リシンＡ　ＤＮＡの存在を検出するために用いられた。ポジティブにハイブリッドしたクローンはプラスミドＤＮＡ製造のために、引き続いて適当なサイズのフラグメントの存在を確認すると共に、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩを用いた制限分析のために制限される。
　【０１９２】
　完全な組み立てを有する単離物を同定し、ｐＩＣＩ　１１８５と命名した。
　【０１９３】
７．ｅ）　択一的プラスミドバックグラウンドの使用
　プラスミドＤＮＡは、ｐＩＣＩ　１１８５から製造され、ｔｒｐプロモータ／ＲＢＳ１／リシンＡ（ＭＲＡ２２）フラグメント／Ｔ４ターミネータを有する発現カセットを切り取ると共に、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩを用いて消化した。このフラグメントは、６．ｄに概略した方法により単離され、ＥｃｏＲＩおよびＳｐｈＩにより切断したｐＩＣＩ　００４２とリゲートさせた。
　【０１９４】
　リゲートしたＤＮＡは、Ｅ．コリーＨＢ１０１を形質転換するために用いられた。ＨＢ１０１形質転換は、Ｌ寒天＋テトラサイクリンにプレートし、３７℃で一晩中インキュベートし、コロニーを３２Ｐ標識リシンＡ　ＤＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。
　【０１９５】
　両方の場合において、ポジティブに同定されたクローンは、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｈＩおよびＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ消化を用いるプラスミドＤＮＡの制限分析により確認した。３つの単離物が同定され、この一つの（ｐＩＣＩ　１１８７）は前記した形質転換において用いられた。図１０にｐＩＣＩ　１１８７の組み立てを概略した。
　【０１９６】
　次のものは、本発明において参照された配列のリストである。この配列は、通常５′から３′の方向で記載されている。
　【０１９７】
【図面の簡単な説明】
　【図１】
　ｐＩＣＩ　００２０の構成を説明する図；
　【図２】
　ｐＴＢ３４４の構成を説明する図；
　【図３】
　ｐＩＣＩ　００４２の構成を説明する図；
　【図４】
　ｐＩＣＩ　１０７９の構成を説明する図；
　【図５】
　ｐＩＣＩ　１１８７の構成を説明する図；
　【図６】
　Ｅ．コリーリゼートのクマシーブルー染色ＳＤＳゲルを示す図、
　【図７】
　ピークＲがリシンＡを示しているｐＩＣＩ　１１０２のゲルプロフィルを示す図、
　【図８】
　ｐＩＣＩ　１１０２により産生されたリシンＡのウェスタンブロットを示す図、
　【図９】
　ｐＩＣＩ　１１０２の部分配列を示す図、
　【図１０】
　ｐＩＣＩ　１１０２の構成を説明する図、
　【図１１】
　プラスミドの製造で用いられるフラグメントを示す図、
　【図１２】
　ｐＩＣＩ　００４２のプラスミド地図、
　【図１３】
　転写ターミネーターの配列を示す図、
　【図１４】
　ｐＩＣＩ　１０７９のプラスミド地図、
　【図１５】
　ＤＳ４１０に関するバイオマスに及ぼす流加培養の影響を示す図；
　【図１６】
　ＤＳ４１０に関する全リシン蓄積に及ぼす流加培養の影響を示す図、
　【図１７】
　ＤＳ４１０に関する可溶性フラクション中のリシンＡの分配率に及ぼす流加培養の影響を示す図
　【図１８】
　バイオマス濃度に及ぼすｐＨの影響を示す図
　【図１９】
　全シリンＡ濃度に及ぼすｐＨの影響を示す図
　【図２０】
　可溶性フラクション中の可溶性リシンＡ分配率に及ぼすｐＨの影響を示す図
　【図２１】
　可溶性リシンＡの収量に及ぼすｐＨの影響を示す図
　【図２２】
　使用ｐＨプロフィルを示す図
　【図２３】
　可溶性リシンの収率（％）に及ぼす冷却の影響を示す図
　【図２４】
　可溶性リシンの収量（ｍｇ／ｌ）に及ぼす冷却の影響を示す図、
　【図２５】
　発酵温度と時間の関係を示す図